ES2612512T3 - Procedimiento para tratar el material celulósico y enzimas CBHII/CEL6A útiles en el mismo - Google Patents

Procedimiento para tratar el material celulósico y enzimas CBHII/CEL6A útiles en el mismo Download PDF

Info

Publication number
ES2612512T3
ES2612512T3 ES10796442.1T ES10796442T ES2612512T3 ES 2612512 T3 ES2612512 T3 ES 2612512T3 ES 10796442 T ES10796442 T ES 10796442T ES 2612512 T3 ES2612512 T3 ES 2612512T3
Authority
ES
Spain
Prior art keywords
polypeptide
cbhii
cel6a
cellulosic material
enzymes
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
ES10796442.1T
Other languages
English (en)
Inventor
Terhi Puranen
Sauli Toikka
Kim Langfelder
Jari VEHMAANPERÄ
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Roal Oy
Original Assignee
Roal Oy
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Roal Oy filed Critical Roal Oy
Application granted granted Critical
Publication of ES2612512T3 publication Critical patent/ES2612512T3/es
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12N9/2405—Glucanases
    • C12N9/2434—Glucanases acting on beta-1,4-glucosidic bonds
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C11—ANIMAL OR VEGETABLE OILS, FATS, FATTY SUBSTANCES OR WAXES; FATTY ACIDS THEREFROM; DETERGENTS; CANDLES
    • C11D—DETERGENT COMPOSITIONS; USE OF SINGLE SUBSTANCES AS DETERGENTS; SOAP OR SOAP-MAKING; RESIN SOAPS; RECOVERY OF GLYCEROL
    • C11D3/00—Other compounding ingredients of detergent compositions covered in group C11D1/00
    • C11D3/16—Organic compounds
    • C11D3/38—Products with no well-defined composition, e.g. natural products
    • C11D3/386—Preparations containing enzymes, e.g. protease or amylase
    • C11D3/38645—Preparations containing enzymes, e.g. protease or amylase containing cellulase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12N9/2405—Glucanases
    • C12N9/2434—Glucanases acting on beta-1,4-glucosidic bonds
    • C12N9/2437—Cellulases (3.2.1.4; 3.2.1.74; 3.2.1.91; 3.2.1.150)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/14—Preparation of compounds containing saccharide radicals produced by the action of a carbohydrase (EC 3.2.x), e.g. by alpha-amylase, e.g. by cellulase, hemicellulase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/02—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group
    • C12P7/04—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group acyclic
    • C12P7/06—Ethanol, i.e. non-beverage
    • C12P7/08—Ethanol, i.e. non-beverage produced as by-product or from waste or cellulosic material substrate
    • C12P7/10—Ethanol, i.e. non-beverage produced as by-product or from waste or cellulosic material substrate substrate containing cellulosic material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01091—Cellulose 1,4-beta-cellobiosidase (3.2.1.91)
    • D—TEXTILES; PAPER
    • D06—TREATMENT OF TEXTILES OR THE LIKE; LAUNDERING; FLEXIBLE MATERIALS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
    • D06M—TREATMENT, NOT PROVIDED FOR ELSEWHERE IN CLASS D06, OF FIBRES, THREADS, YARNS, FABRICS, FEATHERS OR FIBROUS GOODS MADE FROM SUCH MATERIALS
    • D06M16/00—Biochemical treatment of fibres, threads, yarns, fabrics, or fibrous goods made from such materials, e.g. enzymatic
    • D06M16/003—Biochemical treatment of fibres, threads, yarns, fabrics, or fibrous goods made from such materials, e.g. enzymatic with enzymes or microorganisms
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02E—REDUCTION OF GREENHOUSE GAS [GHG] EMISSIONS, RELATED TO ENERGY GENERATION, TRANSMISSION OR DISTRIBUTION
    • Y02E50/00—Technologies for the production of fuel of non-fossil origin
    • Y02E50/10—Biofuels, e.g. bio-diesel

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Textile Engineering (AREA)
  • Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

Procedimiento para tratar material celulósico con un polipéptido CBHII/Cel6A o una preparación enzimática que comprende dicho polipéptido, en el que dicho polipéptido CBHII/Cel6A presenta una actividad de celobiohidrolasa y comprende una secuencia de aminoácidos que presenta una identidad de por lo menos 78% respecto al polipéptido de longitud completa de SEC ID nº 12, o un fragmento del mismo que presenta una actividad de celobiohidrolasa, y en el que dicho procedimiento comprende las etapas siguientes: i) producir dicho polipéptido CBHII/Cel6A o una preparación enzimática que comprende dicho polipéptido o un microorganismo fermentativo que produce dicho polipéptido; ii) hacer reaccionar el material celulósico con dicho polipéptido CBHII/Cel6A o la preparación enzimática que comprende dicho polipéptido o el microorganismo fermentativo que produce dicho polipéptido; y iii) obtener un material celulósico parcial o completamente hidrolizado; en el que el polipéptido CBHII/Cel6A es activo a una temperatura de entre 50ºC y 70ºC.

Description

imagen1
imagen2
imagen3
imagen4
imagen5
imagen6
imagen7
imagen8
5
15
25
35
45
55
65
La "celobiohidrolasa" o "CBH" tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a enzimas que cortan los enlaces 1,4-beta-D-glucosídicos de polímeros tales como la celulosa desde el extremo reductor o no reductor y producen principalmente celobiosa. También se denominan exoglucanasas o 1,4-beta-D-glucano celobiohidrolasas o celulosa 1,4-beta-celobiosidasas. Las CBH presentan una estructura modular que consiste en dominios diferentes, tales como un dominio catalítico y un dominio de unión a celulosa N-o C-terminal (DUC). También existen celeobiohidrolasas en la naturaleza que no presentan DUC. Las CBH también pueden presentar dominios adicionales de función desconocida. Los diferentes dominios habitualmente se unen entre sí mediante un conector O-glucosilado o péptido bisagra rico en glicina, prolina, serina o treonina.
El término "celobiohidrolasa II" o "celobiohidrolasa CBHII" o "celobiohidrolasa CBHII/Cel6A" o "celulasa CBHII/Cel6A" o "polipéptido CBHII/Cel6A" o "enzima CBHII/Cel6A" se refiere, en relación a la presente invención, a un enzima 1,4-β-D-glucano celobiohidrolasa clasificado como EC 3.2.1.91 por la nomenclatura de la unión internacional de bioquímica y biología molecular (IUBMB, por sus siglas en inglés; ver http:/www.iubmb.org). Basándose en sus similitudes estructurales, las celobiohidrolasas II o las celobiohidrolasas CBHII/Cel6A de la presente invención se clasifican en la familia 6 de glucosil hidrolasas (GH6), las cuales presentan secuencias de aminoácidos y estructuras tridimensionales similares (Henrissat, 1991; Henrissat y Bairoch, 1993, 1996; Henrissat et al., 1998; ver también http:/www.cazy.org/fam/GH6.html). Debido a que existe una relación directa entre la secuencia y las similitudes de pliegue, dicha clasificación se cree que refleja las características estructurales de los enzimas mejor que únicamente su especificidad de sustrato, ayuda a revelar las relaciones evolutivas entre los enzimas y proporciona una cómoda herramienta para obtener información sobre los mecanismos.
La expresión "actividad de celobiohidrolasa" o "actividad de CBH" tal como se utiliza en la invención se refiere a la actividad hidrolítica que actúa sobre los enlaces 1,4-beta-D-glucosídicos en la celulosa, celotriosa, celotetraosa o en cualquier polímero de glucosa unido mediante enlaces beta-1,4 que libera principalmente celobiosa del extremo reductor o no reductor de la cadena polimérica. La rotura enzimática de un enlace glucosídico es un proceso estereoselectivo, en el que la configuración en entorno al centro anomérico (carbono C1) puede invertirse o conservarse. Ambos mecanismos contienen una pareja de residuos ácido carboxílico dispuestos en cada extremo del enlace que debe cortarse. Los enzimas inversores utilizan un mecanismo de único desplazamiento, mientras que los enzimas conservadores implican una reacción de doble desplazamiento (Sinnott, 1990; Withers y Aebersold, 1995). Habitualmente se determina el curso estereoquímico de la hidrólisis mediante RMN de protones, en la que los protones α-y β-anoméricos proporcionan diferentes desplazamientos químicos (Withers et al., 1986).
La expresión "actividad de celobiohidrolasa II" o "actividad de CBHII/Cel6A" tal como se utiliza en la invención se refiere a actividad hidrolítica que actúa sobre los enlaces 1,4-beta-D-glucosídicos en la celulosa, celotriosa, celotetraosa o en cualquier polímero de glucosas unidas mediante enlace beta-1,4, liberando principalmente celobiosa del extremo no reductor de la cadena polimérica. El mecanismo de reacción de las celobiohidrolasas CBHII/Cel6A es la inversión.
Los procedimientos de análisis de la actividad de celulasa son bien conocidos en la literatura y se hace referencia a los mismos en, por ejemplo, Ghose (1987), Tomme et al. (1988) y van Tilbeurgh et al. (1988). La actividad global de celulasa se mide comúnmente como actividad degradadora de papel de filtro (UPF). La actividad de celobiohidrolasa puede analizarse utilizando celodextrinas solubles pequeñas y sus glucósidos cromogénicos, tales como 4metilumbeliferil-beta-D-glucósidos. Las celobiohidrolasas CBHII/Cel6A pueden identificarse basándose en el resultado de la reacción de hidrólisis; los enzimas CBHII/Cel6A no pueden cortar el enlace heterosídico de los oligosacáridos cromogénicos pequeños (van Tilbeurgh et al., 1988). La actividad de celobiohidrolasa también puede analizarse en celulosa microcristalina, tal como Avicel Ph 101, tal como se utiliza en el Ejemplo 3. la formación de azúcares reductores solubles tras la hidrólisis puede determinarse mediante el procedimiento de la hidrazida de ácido para-hidroxibenzoico (PAHBAH) (Lever, 1972) utilizando una curva estándar de celobiosa, el procedimiento de Somogyi-Nelson (Somogyi, 1952), el procedimiento de ferricianuro alcalino (Robyt y Whelan, 1972), el procedimiento de 2,2'-bichinconinato (Waffenschmidt y Jaenicke, 1987) o el procedimiento del ácido dinitrosalicílico (DNS) de Miller (1959). Entre otros sustratos celulósicos se incluyen, por ejemplo, la celulosa Solka-Floc o la celulosa hinchada con ácido fosfórico (Karlsson et al., 2001).
La celobiohidrolasa II también puede identificarse en un ensayo de transferencia western o un ensayo ELISA utilizando anticuerpos policlonales o monoclonales generados contra el polipéptido CBHII/Cel6A purificado.
De esta manera, la expresión "celobiohidrolasa CBHII/Cel6A" se refiere a enzimas celobiohidrolasa II que son elementos de la familia 6 de glucosil-hidrolasas, que presentan tanto un pliegue conservado como la estereoquímica de la reacción de hidrólisis.
La expresión "temperatura moderada" o "temperatura convencional" en el contexto de la presente invención se refiere a temperaturas utilizadas comúnmente en la hidrólisis de la celulosa y correspondientes a las temperaturas óptimas o estabilidades térmicas de los enzimas utilizados en dichos procedimientos. De esta manera, las expresiones se refieren a intervalos de temperatura de entre 30ºC y 45ºC.
La expresión "temperatura elevada" o "temperatura alta" se refiere a intervalos de temperatura de entre 45ºC y 70ºC.
10
imagen9
5
15
25
35
45
55
65
conector flexible y altamente glucosilado o región bisagra, tal como se pone de manifiesto a partir de las secuencias de aminoácidos de SEC ID nº 12, SEC ID nº 14, SEC ID nº 15 y SEC ID nº 16.
El término "fragmento" tal como se da a conocer se refiere a un polipéptido que no presenta uno o más residuos aminoácidos desde el extremo N-terminal y/o C-terminal del polipéptido de longitud completa de SEC ID nº 12, SEC ID nº 14, SEC ID nº 15 o SEC ID nº 16, tal como la forma madura del polipéptido u otra parte enzimáticamente activa del polipéptido. El fragmento todavía presenta la actividad catalítica esencial o actividad de celobiohidrolasa de la celobiohidrolasa CBHII/Cel6A de longitud completa y propiedades sustancialmente similares, tales como la dependencia y estabilidad frente al pH y la temperatura y la especificidad de sustrato. Los polipéptidos dados a conocer en SEC ID nº 12, SEC ID nº 14, SEC ID nº 15 y SEC ID nº 16 contienen naturalmente un DUC N-terminal y un conector. Estas regiones conectoras o DUC nativas pueden sustituirse por, por ejemplo, un DUC de una especie de Trichoderma o de Chaetomium. Los enzimas CBHII/Cel6A de la invención pueden utilizarse en las aplicaciones también sin una secuencia de señal y/o DUC o la secuencia de señal y/o el DUC puede obtenerse a partir de diferentes enzimas de los microorganismos anteriormente indicados o de microorganismos diferentes o puede incorporarse sintética o recombinantemente al dominio catalítico de los enzimas anteriormente indicados.
El término "identidad" tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a la identidad entre dos secuencias de aminoácidos comparados entre sí dentro de la región de secuencia correspondiente que presenta aproximadamente la misma cantidad de aminoácidos. Por ejemplo, puede compararse la identidad de una secuencia de longitud completa o de una secuencia madura de las dos secuencias de aminoácidos. Además, puede compararse la identidad de una secuencia de longitud completa o de una secuencia madura que no presenta el DUC N-terminal de las dos secuencias de aminoácidos. De esta manera, la comparación de, por ejemplo, las secuencias de CBHII/Cel6A, incluyendo el DUC y/o las secuencias de señal con secuencias que no presentan dichos elementos, no se encuentra dentro del contexto de la invención. La identidad de las secuencias de longitud completa puede medirse mediante la utilización de, por ejemplo, la alineación de ClustalW (por ejemplo en www.ebi.ac.uk/Tools/Clustalw) con una matriz tal como la siguiente: BLOSUM, apertura de hueco: 10, extensión de hueco: 0,5, o utilizando un programa de Clone Manager (versión 9) (Scientific and Educational Software, Care, EEUU), incluyendo las funciones "Comparar dos secuencias/Global/Comparar secuencias" como aminoácidos/matriz de puntuación BLOSOM62, tal como se indica en el Ejemplo 1.
Las secuencias de aminoácidos de las dos moléculas que deben compararse pueden diferir en una o más posiciones, que, sin embargo, no alteran la función biológica o estructura de las moléculas. Dichas "variantes" pueden producirse naturalmente debido a diferentes organismos hospedadores o mutaciones en la secuencia de aminoácidos, por ejemplo como variante alélica dentro de la misma cepa, especie o género, o pueden conseguirse mediante mutagénesis específica. Según una forma de realización, pueden comprender sustituciones, deleciones, combinaciones o inserciones de aminoácidos de una o más posiciones en la secuencia de aminoácidos, aunque todavía funcionen de manera sustancialmente similar a los enzimas definidos en SEC ID nº 12, SEC ID nº 14, SEC ID nº 15 o SEC ID nº 16, es decir, comprenden una variante que presenta actividad celulolítica.
Según una forma de realización, en un procedimiento de tratamiento de material celulósico, que incluye también material lignocelulósico con un polipéptido CBHII/Cel6A o una composición enzimática que comprende dicho polipéptido o tal como en un bioprocedimiento consolidado, el material celulósico puede tratarse con un microorganismo fermentador que produce dicho polipéptido, en el que el polipéptido CBHII/Cel6A muestra actividad de celobiohidrolasa y comprende una secuencia de aminoácidos que presenta una identidad de por lo menos 76% respecto al polipéptido de longitud completa de SEC ID nº 12, una identidad de por lo menos 76% respecto al polipéptido de longitud completa de SEC ID nº 14, una identidad de por lo menos 95% respecto al polipéptido de longitud completa de SEC ID nº 15 o una identidad de por lo menos 91% respecto al polipéptido de longitud completa de SEC ID nº 16, o un fragmento o variante de los mismos con propiedades similares. Dicho enzima es capaz de hidrolizar material celulósico, incluyendo lignocelulosa a temperaturas moderadas a elevadas. Dicho procedimiento comprende las etapas siguientes: i) producción de un polipéptido CBHII/Cel6A de la invención o una composición enzimática que comprende dicho polipéptido o un microorganismo fermentador que produce dicho polipéptido, ii) reaccionar del material celulósico con el polipéptido CBHII/Cel6A de la invención o la composición enzimática que comprende dicho polipéptido o el microorganismo fermentador productor de dicho polipéptido, y iii) obtención de material celulósico parcial o totalmente hidrolizado, incluyendo material lignocelulósico hidrolizado.
Los enzimas celobiohidrolasa CBHII/Cel6A útiles para tratar o hidrolizar material celulósico son "obtenibles de" cualquier organismo, incluyendo plantas. Preferentemente, los enzimas CBHII/Cel6A se originan a partir de microorganismos, por ejemplo bacterias u hongos. Según una forma de realización, las bacterias pueden ser, por ejemplo, de un género seleccionado de entre Bacillus, Azospirillum, Streptomyces y Pseudomonas. Según una forma de realización, el enzima se origina a partir de hongos (incluyendo hongos filamentosos y levaduras), por ejemplo de un género seleccionado de entre el grupo que consiste en las levaduras Schizosaccharomyces, Kluyveromyces, Pichia, Saccharomyces, Candida y Yarrowia, o de los hongos filamentosos Achaetomium, Acremonium, Aspergillus, Aureobasidium, Botrytis, Chaetomium, Chrysosporium, Cryptococcus, Collybia, Fomes, Fusarium, Humicola, Hypocrea, Lentinus, Magnaporthea, Melanocarpus, Mucor, Myceliophthora, Myriococcum, Neocallimastix, Neurospora, Paecilomyces, Penicilliium, Phanerochaete, Phlebia, Pleurotus, Podospora, Polyporus, Pycnoporus, Rhizoctonia, Schizophyllum, Scytalidium, Talaromyces, Thermoascus, Thielavia, Trametes y
12
imagen10
imagen11
5
15
25
35
45
55
65
enzimáticas complementadas con las celobiohidrolasas CBHII/Cel6A fúngicas At_ALKO4245_Cel6A, Ma_ALKO42237_Cel6A o Ct_ALKO4265_Cel6A en la hidrólisis de madera dura sometida a explosión de vapor es mucho mejor que el rendimiento de las mezclas enzimáticas sin dicha complementación. En los experimentos realizados a 55ºC (figura 4A), se encontró que la cantidad de azúcares liberada del sustrato de madera dura se incrementaba en 12%, 14% y 26% mediante la complementación con Ma_ALKO4237_Cel6A, Ct_ALKO4265_Cel6A
o At_ALKO4245_Cel6A en la MEZCLA 2, respectivamente. Se encontró que el enzima ALKO4245 de Acremonium thermophilum era el enzima CBHII/Cel6A de mejor rendimiento de entre los estudiados en la presente memoria. El enzima At_ALKO4245_Cel6A mostró una hidrólisis incrementada también a 37ºC, añadido en la mezcla de Trichoderma del estado de la técnica (MEZCLA ENZIMAS T.REESEI) (figura 4B9 o en el producto comercial (MEZCLA ACC) (figura 4C).
También se obtuvieron resultados similares en las mazorcas de maíz sometidas a explosión con vapor (figura 5). La MEZCLA 2 de enzima termofílico se complementó con el enzima At_ALKO4245_Cel6A de la invención. La cantidad agrupada de glucosa y xilosa tras 72 horas de hidrólisis era notablemente más elevada que sin dicha complementación.
Según una forma de realización, el procedimiento de tratamiento del material celulósico y lignocelulósico, tal como material lignocelulósico que incluía hemicelulosa, pectina y lignina, implica la utilización de una o más de las celobiohidrolasas CBHII/Cel6A de la invención como "composición enzimática" o "preparación enzimática" que comprende por lo menos un enzima adicional capaz de hidrolizar dicho material. Los enzimas adicionales pueden seleccionarse de entre el grupo de celobiohidrolasa, endoglucanasa, beta-glucosidasa, beta-glucanasa, xiloglucanasa, xilanasa, beta-xilosidasa, mananasa, beta-manosidasa, α-glucuronidasa, acetil-xilán-esterasa, αarabinofuranosidasa, α-galactosidasa, pectinasa, que ipmlica endo-y exo-α-L-arabinasas, α-galactosidasa, endo-y exo-galactoronasa, endopectinliasa, pectinesterasa, pectato liasa, fenol-esterasa, ligninasa que implica lignina peroxidasa, peroxidasa dependiente de manganeso, enzima generador de H2O2 y lacasa con o sin un mediador.
Según una forma de realización, la preparación o composición enzimática comprende por lo menos uno de los enzimas indicados anteriormente. Puede contener enzimas en forma por lo menos parcialmente purificada y aislada. Incluso puede consistir esencialmente del enzima o enzimas deseados. Alternativamente, la preparación puede ser un medio de cultivo o filtrado agotado que contiene uno o más de los enzimas deseados. Preferentemente, la preparación enzimática es medio de cultivo agotado. La expresión "medio de cultivo agotado" se refiere al medio de cultivo del hospedador que comprende los enzimas producidos. Preferentemente, las células hospedadoras se separan de dicho medio después de la producción. La preparación o composición enzimática también puede ser un "caldo de cultivo completo" obtenido opcionalmente después de eliminar el/los hospedador/hospedadores o microorganismo/microorganismos de producción sin ningún procesamiento o producción posterior del enzima o enzimas celulolíticos deseados. En el "bioprocedimiento consolidado", la composición enzimática o por lo menos algunos de los enzimas de la composición enzimática puede ser producido por el microorganismo fermentador.
La expresión "polipéptido aislado" en el presente contexto puede referirse simplemente a que las células y residuos celulares han sido eliminados del medio de cultivo que contiene el polipéptido. Convenientemente, los polipéptidos son aislados, por ejemplo mediante la adición de polímeros aniónicos y/o catiónicos, al medio de cultivo agotado con el fin de potenciar la precipitación de células, residuos celulares y algunos enzimas que presentan actividades secundarios no deseadas. A continuación, el medio se filtra utilizando un agente de filtración inorgánico y un filtro para eliminar los sedimentos formados. Después, el filtrado se procesa adicionalmente utilizando una membrana semipermeable para eliminar el exceso de sales, azúcares y productos metabólicos.
Además de la actividad enzimática, la preparación puede contener aditivos, tales como mediadores, estabilizadores, tampones, conservantes, surfactantes y/o componentes del medio de cultivo. Los aditivos preferentes son los que se utilizan comúnmente en preparaciones enzimáticas destinadas a una aplicación particular. La preparación enzimática puede encontrarse en forma de líquido, polvos o granulado.
Según una forma de realización de la invención, la preparación enzimática comprende una mezcla de CBH, EG y BG, opcionalmente junto con enzimas degradadores de la hemicelulosa en combinación con las celobiohidrolasas CBHII/Cel6A de la invención. Pueden utilizarse diferentes mezclas y combinaciones enzimáticas para adecuarse a diferentes materiales de sustrato y condiciones del procedimiento. Por ejemplo, en el caso de que el procedimiento de degradación deba llevarse a cabo a una temperatura elevada, se seleccionan enzimas termoestables.
La "hemicelulosa" es un grupo heterogéneo de polímeros de carbohidrato que contiene principalmente diferentes glucanos, xilanos y mananos. La hemicelulosa consiste en un esqueleto lineal con residuos unidos mediante enlace β-1,4, sustituidos con cadenas laterales cortas que habitualmente contienen grupos ácido acetilo, ácido 4-Oglucurónico, L-arabinosa y galactosilo. La hemicelulosa puede entrecruzarse químicamente con lignina y celulosa. Entre los "enzimas degradadores de xilano", o "xilanasas", se incluyen enzimas tanto exohidrolíticos como endohidrolíticos, tales como endo-1,4-beta-D-xilanasa (EC 3.2.1.8) o exo-1,4-beta-D-xilosidasa (EC 3.2.1.37), que descomponen la hemicelulosa en xilosas. Los gluco-y galacto-mananos son hidrolizados por las endo-1,4-betamananasas (EC 3.2.1.78) y la beta-manosidasa (EC 3.2.1.25), rindiendo beta-D-manosa. Entre los enzimas capaces de eliminar los sustituyentes de cadena lateral se incluyen α-glucuronidasas, acetil-xilán-esterasas, α
15
imagen12
imagen13
imagen14
imagen15
imagen16
imagen17
imagen18
imagen19
imagen20
imagen21
imagen22
imagen23
imagen24
imagen25
imagen26
imagen27
imagen28
imagen29

Claims (1)

  1. imagen1
    imagen2
    imagen3
ES10796442.1T 2009-12-30 2010-12-30 Procedimiento para tratar el material celulósico y enzimas CBHII/CEL6A útiles en el mismo Active ES2612512T3 (es)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
FI20096412A FI122937B (fi) 2009-12-30 2009-12-30 Menetelmä selluloosamateriaalin käsittelemiseksi sekä tässä käyttökelpoiset CBH II/Cel6A entsyymit
FI20096412 2009-12-30
PCT/EP2010/070927 WO2011080317A2 (en) 2009-12-30 2010-12-30 Method for treating cellulosic material and cbhii/cel6a enzymes useful therein

Publications (1)

Publication Number Publication Date
ES2612512T3 true ES2612512T3 (es) 2017-05-17

Family

ID=46752271

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES10796442.1T Active ES2612512T3 (es) 2009-12-30 2010-12-30 Procedimiento para tratar el material celulósico y enzimas CBHII/CEL6A útiles en el mismo

Country Status (10)

Country Link
US (2) US8580552B2 (es)
EP (1) EP2519630B1 (es)
CN (1) CN102712917B (es)
AP (1) AP3652A (es)
BR (1) BR112012016320B8 (es)
CA (1) CA2785944C (es)
DK (1) DK2519630T3 (es)
ES (1) ES2612512T3 (es)
FI (1) FI122937B (es)
WO (1) WO2011080317A2 (es)

Families Citing this family (29)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7407788B2 (en) * 2002-11-21 2008-08-05 Danisco A/S, Genencor Division BGL7 beta-glucosidase and nucleic acids encoding the same
CA2787719A1 (en) * 2010-02-11 2011-08-18 Dsm Ip Assets B.V. Polypeptide having cellobiohydrolase activity and uses thereof
EP2569426A4 (en) 2010-05-14 2013-10-09 Codexis Inc ZELLBIOHYDROLASE VARIANTS
DK2668268T3 (en) * 2011-01-26 2017-09-11 Novozymes Inc POLYPEPTIDES WITH CELLOBIO HYDROLASE ACTIVITY AND POLYNUCLEOTIDES CODING THEM
MX2013007720A (es) 2011-01-26 2013-08-09 Novozymes As Polipeptidos que tienen actividad celobiohidrolasa y polinucleotidos que codifican para los mismos.
WO2012149403A1 (en) * 2011-04-27 2012-11-01 Codexis, Inc. Cellobiohydrolase variants
BR112014003740A2 (pt) 2011-08-23 2018-08-14 Codexis Inc variantes da celobiohidrolase
US9708591B2 (en) 2011-11-18 2017-07-18 Novozymes Inc. Polypeptides having endoglucanase activity and polynucleotides encoding same
CN104053666A (zh) * 2011-11-18 2014-09-17 诺维信股份有限公司 具有内切葡聚糖酶活性的多肽和编码该多肽的多核苷酸
WO2013126230A1 (en) * 2012-02-23 2013-08-29 Purdue Research Foundation Novel lignases and aldo-keto reductases for conversion of lignin-containing materials to fermentable products
WO2013166312A1 (en) * 2012-05-02 2013-11-07 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Biofuel production enzymes and uses thereof
US8975058B2 (en) 2012-05-24 2015-03-10 Roal Oy Endoglucanases for treatment of cellulosic material
US9458440B2 (en) 2012-06-07 2016-10-04 Roal Oy Proteins for the treatment of cellulosic material
FI124477B (en) 2012-06-07 2014-09-15 Roal Oy New proteins for the treatment of cellulose materials
US9434929B2 (en) 2012-10-26 2016-09-06 Roal Oy Esterases useful in the treatment of cellulosic and lignocellulosic material
US9850512B2 (en) 2013-03-15 2017-12-26 The Research Foundation For The State University Of New York Hydrolysis of cellulosic fines in primary clarified sludge of paper mills and the addition of a surfactant to increase the yield
CN103343111B (zh) * 2013-07-05 2015-08-26 山东尤特尔生物科技有限公司 一种嗜热毛壳菌纤维素酶及其制备方法和应用
CN103509727A (zh) * 2013-09-17 2014-01-15 山东农业大学 表达9家族糖苷水解酶基因CtAA9c的毕赤酵母工程菌株
CN103484390A (zh) * 2013-09-17 2014-01-01 山东农业大学 表达9家族糖苷水解酶基因CtAA9b的毕赤酵母工程菌株
CN103525709B (zh) * 2013-09-27 2015-09-09 中国科学院成都生物研究所 一种普通镰刀菌、制备降粘酶的方法及其应用
CN103556474B (zh) * 2013-10-23 2016-01-06 浙江省纺织测试研究院 一种废旧纺织品中的纤维素纤维酶处理回收法
US9951363B2 (en) 2014-03-14 2018-04-24 The Research Foundation for the State University of New York College of Environmental Science and Forestry Enzymatic hydrolysis of old corrugated cardboard (OCC) fines from recycled linerboard mill waste rejects
WO2016054194A1 (en) * 2014-09-30 2016-04-07 1/1Danisco Us Inc Compositions comprising beta-mannanase and methods of use
CN106190874B (zh) * 2015-05-06 2020-06-26 中国科学院天津工业生物技术研究所 一种强化丝状真菌蛋白质生产的方法
CN106243391B (zh) * 2016-08-05 2018-12-11 南京林业大学 透明木材的制备方法
CN106282142B (zh) * 2016-08-05 2019-05-31 南京林业大学 一种β-甘露糖苷酶含量低的α-半乳糖苷酶的制备方法
US20180265910A1 (en) * 2017-03-17 2018-09-20 New England Biolabs, Inc. Cleavage of Fucose in N-Glycans
CN108976302B (zh) * 2018-08-17 2021-04-13 中国科学院青岛生物能源与过程研究所 用于催化木质纤维素糖化的纤维小体酶制剂
CN110755459B (zh) * 2019-11-22 2021-06-29 广西南亚热带农业科学研究所 一种番荔枝叶多酚的提取工艺

Family Cites Families (26)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB8610600D0 (en) 1986-04-30 1986-06-04 Novo Industri As Transformation of trichoderma
DE69518751T2 (de) 1994-06-03 2001-02-15 Novo Nordisk Biotech, Inc. Gereinigte scytalidium lacassen und nukleinsäuren dafür kodierend
US5770418A (en) 1994-06-24 1998-06-23 Novo Nordisk A/S Purified polyporus laccases and nucleic acids encoding same
US6008029A (en) 1995-08-25 1999-12-28 Novo Nordisk Biotech Inc. Purified coprinus laccases and nucleic acids encoding the same
US7883872B2 (en) 1996-10-10 2011-02-08 Dyadic International (Usa), Inc. Construction of highly efficient cellulase compositions for enzymatic hydrolysis of cellulose
DE69922978T2 (de) 1998-10-06 2005-12-08 Emalfarb, Mark Aaron, Jupiter Transformationsystem in filamentösen fungiziden chrysosporium-wirtszellen
CN1190373C (zh) 2000-02-17 2005-02-23 里索国家实验室 处理木质纤维素材料的方法
ES2266265T3 (es) 2000-09-25 2007-03-01 Iogen Energy Corporation Metodo para la produccion de glucosa con una mezcla de celulosa que comprende una celulosa modificada.
CN1620501A (zh) 2001-06-26 2005-05-25 诺维信公司 具有纤维二糖水解酶i活性的多肽和编码多肽的多核苷酸
US20040005674A1 (en) 2002-04-30 2004-01-08 Athenix Corporation Methods for enzymatic hydrolysis of lignocellulose
US7348168B2 (en) 2002-12-20 2008-03-25 Novozymes A/S Polypeptides having cellobiohydrolase II activity and polynucleotides encoding same
WO2005067531A2 (en) 2004-01-16 2005-07-28 Novozymes Inc. Methods for degrading lignocellulosic materials
ES2389442T3 (es) 2004-02-06 2012-10-26 Novozymes Inc. Polipéptidos con actividad de aumento celulolítica y polinucleótidos que los codifican
DE602005021479D1 (de) 2004-04-16 2010-07-08 Ab Enzymes Oy Verfahren und dna-konstrukte zur erhöhung des produktionsniveaus von kohlenhydrat abbauenden enzymen in filamentösen pilzen
WO2006074005A2 (en) 2004-12-30 2006-07-13 Genencor International, Inc. Variant hypocrea jecorina cbh2 cellulases
MX2007008050A (es) * 2005-01-06 2007-08-21 Novozymes Inc Polipeptidos que tienen actividad de celobiohidrolasa y polinucleotidos que codifican para los mismos.
CN1757709A (zh) 2005-07-15 2006-04-12 山东农业大学 表达cbh2基因的酵母工程菌株及其构建方法
FI120045B (fi) 2005-12-22 2009-06-15 Roal Oy Selluloosamateriaalin käsittely ja siinä käyttökelpoiset entsyymit
MY160710A (en) 2006-02-10 2017-03-15 Verenium Corp Cellulolytic enzymes, nucleic acids encoding them and methods for making and using them
NZ598285A (en) 2007-01-30 2013-10-25 Syngenta Participations Ag Enzymes for the treatment of lignocellulosics, nucleic acids encoding them and methods for making and using them
US7923236B2 (en) 2007-08-02 2011-04-12 Dyadic International (Usa), Inc. Fungal enzymes
NZ601191A (en) 2007-10-03 2014-01-31 Verenium Corp Xylanases, nucleic acids encoding them and methods for making and using them
CN101910406A (zh) 2007-11-01 2010-12-08 诺维信股份有限公司 减少氧化还原活性金属离子对纤维素材料酶水解抑制作用的方法
CA2709371A1 (en) * 2007-12-19 2009-07-09 Novozymes A/S Polypeptides having cellulolytic enhancing activity and polynucleotides encoding same
CA2709485A1 (en) 2007-12-19 2009-07-09 Novozymes A/S Polypeptides having cellulolytic enhancing activity and polynucleotides encoding same
BRPI0906959A2 (pt) 2008-01-18 2015-07-14 Iogen Energy Corp Variantes de celulase com inibição reduzida por glicose

Also Published As

Publication number Publication date
FI122937B (fi) 2012-09-14
FI20096412A0 (fi) 2009-12-30
US9200267B2 (en) 2015-12-01
CN102712917A (zh) 2012-10-03
BR112012016320A2 (pt) 2017-02-21
WO2011080317A2 (en) 2011-07-07
AP2012006392A0 (en) 2012-08-31
DK2519630T3 (en) 2017-02-06
US20140065693A1 (en) 2014-03-06
US20110159544A1 (en) 2011-06-30
US8580552B2 (en) 2013-11-12
CN102712917B (zh) 2015-09-23
WO2011080317A3 (en) 2011-10-13
CA2785944A1 (en) 2011-07-07
CA2785944C (en) 2019-07-16
FI20096412A (fi) 2011-07-01
EP2519630B1 (en) 2016-11-02
EP2519630A2 (en) 2012-11-07
AP3652A (en) 2016-04-01
BR112012016320B8 (pt) 2022-09-27
BR112012016320B1 (pt) 2021-04-20

Similar Documents

Publication Publication Date Title
ES2612512T3 (es) Procedimiento para tratar el material celulósico y enzimas CBHII/CEL6A útiles en el mismo
TWI391489B (zh) 處理纖維素材料之方法及用於彼之酶類
Ezeilo et al. Enzymatic breakdown of lignocellulosic biomass: the role of glycosyl hydrolases and lytic polysaccharide monooxygenases
Andberg et al. Swollenin from Trichoderma reesei exhibits hydrolytic activity against cellulosic substrates with features of both endoglucanases and cellobiohydrolases
JP5932648B2 (ja) 新規なグリコシルヒドロラーゼ酵素及びその用途
JP6148183B2 (ja) セルラーゼ組成物並びにこれを用いリグノセルロース系バイオマスの発酵性糖質への変換を向上させる方法
Tabka et al. Enzymatic saccharification of wheat straw for bioethanol production by a combined cellulase xylanase and feruloyl esterase treatment
Sulzenbacher et al. Structure of the endoglucanase I from Fusarium oxysporum: Native, cellobiose, and 3, 4-epoxybutyl β-D-cellobioside-inhibited forms, at 2.3 Å resolution
Wang et al. Characterization of a novel thermostable β-glucosidase from a metagenomic library of termite gut
Poidevin et al. Insights into exo-and endoglucanase activities of family 6 glycoside hydrolases from Podospora anserina
US9624482B2 (en) Thermophilic cellobiohydrolase
US20190345459A1 (en) Enzyme complex for lignocellulosic material degradation
Huy et al. Putative endoglucanase PcGH5 from Phanerochaete chrysosporium is a β-xylosidase that cleaves xylans in synergistic action with endo-xylanase
Couturier et al. Fungal enzymatic degradation of cellulose
Rashmi et al. Microbial xyloglucanases: a comprehensive review
US11242514B2 (en) Endocellulases and uses thereof
Maurelli et al. Evidence that the xylanase activity from Sulfolobus solfataricus Oα is encoded by the endoglucanase precursor gene (sso1354) and characterization of the associated cellulase activity
Texier et al. Redefining Xyn A from Penicillium funiculosum IMI 378536 as a GH7 cellobiohydrolase
US20140030769A1 (en) Free enzyme and cellulosome preparations for cellulose hydrolysis
Silveira et al. The essential role of plant cell wall degrading enzymes in the success of biorefineries: current status and future challenges
Ueda et al. Heterologous expression and characterization of a cold-adapted endo-1, 4− β− glucanase gene from Bellamya chinensis laeta
Momeni Structural insights into the catalytic mechanism, protein dynamics, inhibition and thermostability of GH7 cellobiohydrolases
Zhang et al. Optimization of cellulolytic enzyme systems for lignocellulose hydrolysis
Lagu Expression and characterization of fungal exocellulases
Haddad Momeni Structural insights into the catalytic mechanism, protein dynamics, inhibition and thermostability of GH7 cellobiohydrolases