ES2612512T3 - Procedimiento para tratar el material celulósico y enzimas CBHII/CEL6A útiles en el mismo - Google Patents

Procedimiento para tratar el material celulósico y enzimas CBHII/CEL6A útiles en el mismo Download PDF

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Abstract

Procedimiento para tratar material celulósico con un polipéptido CBHII/Cel6A o una preparación enzimática que comprende dicho polipéptido, en el que dicho polipéptido CBHII/Cel6A presenta una actividad de celobiohidrolasa y comprende una secuencia de aminoácidos que presenta una identidad de por lo menos 78% respecto al polipéptido de longitud completa de SEC ID nº 12, o un fragmento del mismo que presenta una actividad de celobiohidrolasa, y en el que dicho procedimiento comprende las etapas siguientes: i) producir dicho polipéptido CBHII/Cel6A o una preparación enzimática que comprende dicho polipéptido o un microorganismo fermentativo que produce dicho polipéptido; ii) hacer reaccionar el material celulósico con dicho polipéptido CBHII/Cel6A o la preparación enzimática que comprende dicho polipéptido o el microorganismo fermentativo que produce dicho polipéptido; y iii) obtener un material celulósico parcial o completamente hidrolizado; en el que el polipéptido CBHII/Cel6A es activo a una temperatura de entre 50ºC y 70ºC.

Description

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La "celobiohidrolasa" o "CBH" tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a enzimas que cortan los enlaces 1,4-beta-D-glucosídicos de polímeros tales como la celulosa desde el extremo reductor o no reductor y producen principalmente celobiosa. También se denominan exoglucanasas o 1,4-beta-D-glucano celobiohidrolasas o celulosa 1,4-beta-celobiosidasas. Las CBH presentan una estructura modular que consiste en dominios diferentes, tales como un dominio catalítico y un dominio de unión a celulosa N-o C-terminal (DUC). También existen celeobiohidrolasas en la naturaleza que no presentan DUC. Las CBH también pueden presentar dominios adicionales de función desconocida. Los diferentes dominios habitualmente se unen entre sí mediante un conector O-glucosilado o péptido bisagra rico en glicina, prolina, serina o treonina.
El término "celobiohidrolasa II" o "celobiohidrolasa CBHII" o "celobiohidrolasa CBHII/Cel6A" o "celulasa CBHII/Cel6A" o "polipéptido CBHII/Cel6A" o "enzima CBHII/Cel6A" se refiere, en relación a la presente invención, a un enzima 1,4-β-D-glucano celobiohidrolasa clasificado como EC 3.2.1.91 por la nomenclatura de la unión internacional de bioquímica y biología molecular (IUBMB, por sus siglas en inglés; ver http:/www.iubmb.org). Basándose en sus similitudes estructurales, las celobiohidrolasas II o las celobiohidrolasas CBHII/Cel6A de la presente invención se clasifican en la familia 6 de glucosil hidrolasas (GH6), las cuales presentan secuencias de aminoácidos y estructuras tridimensionales similares (Henrissat, 1991; Henrissat y Bairoch, 1993, 1996; Henrissat et al., 1998; ver también http:/www.cazy.org/fam/GH6.html). Debido a que existe una relación directa entre la secuencia y las similitudes de pliegue, dicha clasificación se cree que refleja las características estructurales de los enzimas mejor que únicamente su especificidad de sustrato, ayuda a revelar las relaciones evolutivas entre los enzimas y proporciona una cómoda herramienta para obtener información sobre los mecanismos.
La expresión "actividad de celobiohidrolasa" o "actividad de CBH" tal como se utiliza en la invención se refiere a la actividad hidrolítica que actúa sobre los enlaces 1,4-beta-D-glucosídicos en la celulosa, celotriosa, celotetraosa o en cualquier polímero de glucosa unido mediante enlaces beta-1,4 que libera principalmente celobiosa del extremo reductor o no reductor de la cadena polimérica. La rotura enzimática de un enlace glucosídico es un proceso estereoselectivo, en el que la configuración en entorno al centro anomérico (carbono C1) puede invertirse o conservarse. Ambos mecanismos contienen una pareja de residuos ácido carboxílico dispuestos en cada extremo del enlace que debe cortarse. Los enzimas inversores utilizan un mecanismo de único desplazamiento, mientras que los enzimas conservadores implican una reacción de doble desplazamiento (Sinnott, 1990; Withers y Aebersold, 1995). Habitualmente se determina el curso estereoquímico de la hidrólisis mediante RMN de protones, en la que los protones α-y β-anoméricos proporcionan diferentes desplazamientos químicos (Withers et al., 1986).
La expresión "actividad de celobiohidrolasa II" o "actividad de CBHII/Cel6A" tal como se utiliza en la invención se refiere a actividad hidrolítica que actúa sobre los enlaces 1,4-beta-D-glucosídicos en la celulosa, celotriosa, celotetraosa o en cualquier polímero de glucosas unidas mediante enlace beta-1,4, liberando principalmente celobiosa del extremo no reductor de la cadena polimérica. El mecanismo de reacción de las celobiohidrolasas CBHII/Cel6A es la inversión.
Los procedimientos de análisis de la actividad de celulasa son bien conocidos en la literatura y se hace referencia a los mismos en, por ejemplo, Ghose (1987), Tomme et al. (1988) y van Tilbeurgh et al. (1988). La actividad global de celulasa se mide comúnmente como actividad degradadora de papel de filtro (UPF). La actividad de celobiohidrolasa puede analizarse utilizando celodextrinas solubles pequeñas y sus glucósidos cromogénicos, tales como 4metilumbeliferil-beta-D-glucósidos. Las celobiohidrolasas CBHII/Cel6A pueden identificarse basándose en el resultado de la reacción de hidrólisis; los enzimas CBHII/Cel6A no pueden cortar el enlace heterosídico de los oligosacáridos cromogénicos pequeños (van Tilbeurgh et al., 1988). La actividad de celobiohidrolasa también puede analizarse en celulosa microcristalina, tal como Avicel Ph 101, tal como se utiliza en el Ejemplo 3. la formación de azúcares reductores solubles tras la hidrólisis puede determinarse mediante el procedimiento de la hidrazida de ácido para-hidroxibenzoico (PAHBAH) (Lever, 1972) utilizando una curva estándar de celobiosa, el procedimiento de Somogyi-Nelson (Somogyi, 1952), el procedimiento de ferricianuro alcalino (Robyt y Whelan, 1972), el procedimiento de 2,2'-bichinconinato (Waffenschmidt y Jaenicke, 1987) o el procedimiento del ácido dinitrosalicílico (DNS) de Miller (1959). Entre otros sustratos celulósicos se incluyen, por ejemplo, la celulosa Solka-Floc o la celulosa hinchada con ácido fosfórico (Karlsson et al., 2001).
La celobiohidrolasa II también puede identificarse en un ensayo de transferencia western o un ensayo ELISA utilizando anticuerpos policlonales o monoclonales generados contra el polipéptido CBHII/Cel6A purificado.
De esta manera, la expresión "celobiohidrolasa CBHII/Cel6A" se refiere a enzimas celobiohidrolasa II que son elementos de la familia 6 de glucosil-hidrolasas, que presentan tanto un pliegue conservado como la estereoquímica de la reacción de hidrólisis.
La expresión "temperatura moderada" o "temperatura convencional" en el contexto de la presente invención se refiere a temperaturas utilizadas comúnmente en la hidrólisis de la celulosa y correspondientes a las temperaturas óptimas o estabilidades térmicas de los enzimas utilizados en dichos procedimientos. De esta manera, las expresiones se refieren a intervalos de temperatura de entre 30ºC y 45ºC.
La expresión "temperatura elevada" o "temperatura alta" se refiere a intervalos de temperatura de entre 45ºC y 70ºC.
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conector flexible y altamente glucosilado o región bisagra, tal como se pone de manifiesto a partir de las secuencias de aminoácidos de SEC ID nº 12, SEC ID nº 14, SEC ID nº 15 y SEC ID nº 16.
El término "fragmento" tal como se da a conocer se refiere a un polipéptido que no presenta uno o más residuos aminoácidos desde el extremo N-terminal y/o C-terminal del polipéptido de longitud completa de SEC ID nº 12, SEC ID nº 14, SEC ID nº 15 o SEC ID nº 16, tal como la forma madura del polipéptido u otra parte enzimáticamente activa del polipéptido. El fragmento todavía presenta la actividad catalítica esencial o actividad de celobiohidrolasa de la celobiohidrolasa CBHII/Cel6A de longitud completa y propiedades sustancialmente similares, tales como la dependencia y estabilidad frente al pH y la temperatura y la especificidad de sustrato. Los polipéptidos dados a conocer en SEC ID nº 12, SEC ID nº 14, SEC ID nº 15 y SEC ID nº 16 contienen naturalmente un DUC N-terminal y un conector. Estas regiones conectoras o DUC nativas pueden sustituirse por, por ejemplo, un DUC de una especie de Trichoderma o de Chaetomium. Los enzimas CBHII/Cel6A de la invención pueden utilizarse en las aplicaciones también sin una secuencia de señal y/o DUC o la secuencia de señal y/o el DUC puede obtenerse a partir de diferentes enzimas de los microorganismos anteriormente indicados o de microorganismos diferentes o puede incorporarse sintética o recombinantemente al dominio catalítico de los enzimas anteriormente indicados.
El término "identidad" tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a la identidad entre dos secuencias de aminoácidos comparados entre sí dentro de la región de secuencia correspondiente que presenta aproximadamente la misma cantidad de aminoácidos. Por ejemplo, puede compararse la identidad de una secuencia de longitud completa o de una secuencia madura de las dos secuencias de aminoácidos. Además, puede compararse la identidad de una secuencia de longitud completa o de una secuencia madura que no presenta el DUC N-terminal de las dos secuencias de aminoácidos. De esta manera, la comparación de, por ejemplo, las secuencias de CBHII/Cel6A, incluyendo el DUC y/o las secuencias de señal con secuencias que no presentan dichos elementos, no se encuentra dentro del contexto de la invención. La identidad de las secuencias de longitud completa puede medirse mediante la utilización de, por ejemplo, la alineación de ClustalW (por ejemplo en www.ebi.ac.uk/Tools/Clustalw) con una matriz tal como la siguiente: BLOSUM, apertura de hueco: 10, extensión de hueco: 0,5, o utilizando un programa de Clone Manager (versión 9) (Scientific and Educational Software, Care, EEUU), incluyendo las funciones "Comparar dos secuencias/Global/Comparar secuencias" como aminoácidos/matriz de puntuación BLOSOM62, tal como se indica en el Ejemplo 1.
Las secuencias de aminoácidos de las dos moléculas que deben compararse pueden diferir en una o más posiciones, que, sin embargo, no alteran la función biológica o estructura de las moléculas. Dichas "variantes" pueden producirse naturalmente debido a diferentes organismos hospedadores o mutaciones en la secuencia de aminoácidos, por ejemplo como variante alélica dentro de la misma cepa, especie o género, o pueden conseguirse mediante mutagénesis específica. Según una forma de realización, pueden comprender sustituciones, deleciones, combinaciones o inserciones de aminoácidos de una o más posiciones en la secuencia de aminoácidos, aunque todavía funcionen de manera sustancialmente similar a los enzimas definidos en SEC ID nº 12, SEC ID nº 14, SEC ID nº 15 o SEC ID nº 16, es decir, comprenden una variante que presenta actividad celulolítica.
Según una forma de realización, en un procedimiento de tratamiento de material celulósico, que incluye también material lignocelulósico con un polipéptido CBHII/Cel6A o una composición enzimática que comprende dicho polipéptido o tal como en un bioprocedimiento consolidado, el material celulósico puede tratarse con un microorganismo fermentador que produce dicho polipéptido, en el que el polipéptido CBHII/Cel6A muestra actividad de celobiohidrolasa y comprende una secuencia de aminoácidos que presenta una identidad de por lo menos 76% respecto al polipéptido de longitud completa de SEC ID nº 12, una identidad de por lo menos 76% respecto al polipéptido de longitud completa de SEC ID nº 14, una identidad de por lo menos 95% respecto al polipéptido de longitud completa de SEC ID nº 15 o una identidad de por lo menos 91% respecto al polipéptido de longitud completa de SEC ID nº 16, o un fragmento o variante de los mismos con propiedades similares. Dicho enzima es capaz de hidrolizar material celulósico, incluyendo lignocelulosa a temperaturas moderadas a elevadas. Dicho procedimiento comprende las etapas siguientes: i) producción de un polipéptido CBHII/Cel6A de la invención o una composición enzimática que comprende dicho polipéptido o un microorganismo fermentador que produce dicho polipéptido, ii) reaccionar del material celulósico con el polipéptido CBHII/Cel6A de la invención o la composición enzimática que comprende dicho polipéptido o el microorganismo fermentador productor de dicho polipéptido, y iii) obtención de material celulósico parcial o totalmente hidrolizado, incluyendo material lignocelulósico hidrolizado.
Los enzimas celobiohidrolasa CBHII/Cel6A útiles para tratar o hidrolizar material celulósico son "obtenibles de" cualquier organismo, incluyendo plantas. Preferentemente, los enzimas CBHII/Cel6A se originan a partir de microorganismos, por ejemplo bacterias u hongos. Según una forma de realización, las bacterias pueden ser, por ejemplo, de un género seleccionado de entre Bacillus, Azospirillum, Streptomyces y Pseudomonas. Según una forma de realización, el enzima se origina a partir de hongos (incluyendo hongos filamentosos y levaduras), por ejemplo de un género seleccionado de entre el grupo que consiste en las levaduras Schizosaccharomyces, Kluyveromyces, Pichia, Saccharomyces, Candida y Yarrowia, o de los hongos filamentosos Achaetomium, Acremonium, Aspergillus, Aureobasidium, Botrytis, Chaetomium, Chrysosporium, Cryptococcus, Collybia, Fomes, Fusarium, Humicola, Hypocrea, Lentinus, Magnaporthea, Melanocarpus, Mucor, Myceliophthora, Myriococcum, Neocallimastix, Neurospora, Paecilomyces, Penicilliium, Phanerochaete, Phlebia, Pleurotus, Podospora, Polyporus, Pycnoporus, Rhizoctonia, Schizophyllum, Scytalidium, Talaromyces, Thermoascus, Thielavia, Trametes y
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enzimáticas complementadas con las celobiohidrolasas CBHII/Cel6A fúngicas At_ALKO4245_Cel6A, Ma_ALKO42237_Cel6A o Ct_ALKO4265_Cel6A en la hidrólisis de madera dura sometida a explosión de vapor es mucho mejor que el rendimiento de las mezclas enzimáticas sin dicha complementación. En los experimentos realizados a 55ºC (figura 4A), se encontró que la cantidad de azúcares liberada del sustrato de madera dura se incrementaba en 12%, 14% y 26% mediante la complementación con Ma_ALKO4237_Cel6A, Ct_ALKO4265_Cel6A
o At_ALKO4245_Cel6A en la MEZCLA 2, respectivamente. Se encontró que el enzima ALKO4245 de Acremonium thermophilum era el enzima CBHII/Cel6A de mejor rendimiento de entre los estudiados en la presente memoria. El enzima At_ALKO4245_Cel6A mostró una hidrólisis incrementada también a 37ºC, añadido en la mezcla de Trichoderma del estado de la técnica (MEZCLA ENZIMAS T.REESEI) (figura 4B9 o en el producto comercial (MEZCLA ACC) (figura 4C).
También se obtuvieron resultados similares en las mazorcas de maíz sometidas a explosión con vapor (figura 5). La MEZCLA 2 de enzima termofílico se complementó con el enzima At_ALKO4245_Cel6A de la invención. La cantidad agrupada de glucosa y xilosa tras 72 horas de hidrólisis era notablemente más elevada que sin dicha complementación.
Según una forma de realización, el procedimiento de tratamiento del material celulósico y lignocelulósico, tal como material lignocelulósico que incluía hemicelulosa, pectina y lignina, implica la utilización de una o más de las celobiohidrolasas CBHII/Cel6A de la invención como "composición enzimática" o "preparación enzimática" que comprende por lo menos un enzima adicional capaz de hidrolizar dicho material. Los enzimas adicionales pueden seleccionarse de entre el grupo de celobiohidrolasa, endoglucanasa, beta-glucosidasa, beta-glucanasa, xiloglucanasa, xilanasa, beta-xilosidasa, mananasa, beta-manosidasa, α-glucuronidasa, acetil-xilán-esterasa, αarabinofuranosidasa, α-galactosidasa, pectinasa, que ipmlica endo-y exo-α-L-arabinasas, α-galactosidasa, endo-y exo-galactoronasa, endopectinliasa, pectinesterasa, pectato liasa, fenol-esterasa, ligninasa que implica lignina peroxidasa, peroxidasa dependiente de manganeso, enzima generador de H2O2 y lacasa con o sin un mediador.
Según una forma de realización, la preparación o composición enzimática comprende por lo menos uno de los enzimas indicados anteriormente. Puede contener enzimas en forma por lo menos parcialmente purificada y aislada. Incluso puede consistir esencialmente del enzima o enzimas deseados. Alternativamente, la preparación puede ser un medio de cultivo o filtrado agotado que contiene uno o más de los enzimas deseados. Preferentemente, la preparación enzimática es medio de cultivo agotado. La expresión "medio de cultivo agotado" se refiere al medio de cultivo del hospedador que comprende los enzimas producidos. Preferentemente, las células hospedadoras se separan de dicho medio después de la producción. La preparación o composición enzimática también puede ser un "caldo de cultivo completo" obtenido opcionalmente después de eliminar el/los hospedador/hospedadores o microorganismo/microorganismos de producción sin ningún procesamiento o producción posterior del enzima o enzimas celulolíticos deseados. En el "bioprocedimiento consolidado", la composición enzimática o por lo menos algunos de los enzimas de la composición enzimática puede ser producido por el microorganismo fermentador.
La expresión "polipéptido aislado" en el presente contexto puede referirse simplemente a que las células y residuos celulares han sido eliminados del medio de cultivo que contiene el polipéptido. Convenientemente, los polipéptidos son aislados, por ejemplo mediante la adición de polímeros aniónicos y/o catiónicos, al medio de cultivo agotado con el fin de potenciar la precipitación de células, residuos celulares y algunos enzimas que presentan actividades secundarios no deseadas. A continuación, el medio se filtra utilizando un agente de filtración inorgánico y un filtro para eliminar los sedimentos formados. Después, el filtrado se procesa adicionalmente utilizando una membrana semipermeable para eliminar el exceso de sales, azúcares y productos metabólicos.
Además de la actividad enzimática, la preparación puede contener aditivos, tales como mediadores, estabilizadores, tampones, conservantes, surfactantes y/o componentes del medio de cultivo. Los aditivos preferentes son los que se utilizan comúnmente en preparaciones enzimáticas destinadas a una aplicación particular. La preparación enzimática puede encontrarse en forma de líquido, polvos o granulado.
Según una forma de realización de la invención, la preparación enzimática comprende una mezcla de CBH, EG y BG, opcionalmente junto con enzimas degradadores de la hemicelulosa en combinación con las celobiohidrolasas CBHII/Cel6A de la invención. Pueden utilizarse diferentes mezclas y combinaciones enzimáticas para adecuarse a diferentes materiales de sustrato y condiciones del procedimiento. Por ejemplo, en el caso de que el procedimiento de degradación deba llevarse a cabo a una temperatura elevada, se seleccionan enzimas termoestables.
La "hemicelulosa" es un grupo heterogéneo de polímeros de carbohidrato que contiene principalmente diferentes glucanos, xilanos y mananos. La hemicelulosa consiste en un esqueleto lineal con residuos unidos mediante enlace β-1,4, sustituidos con cadenas laterales cortas que habitualmente contienen grupos ácido acetilo, ácido 4-Oglucurónico, L-arabinosa y galactosilo. La hemicelulosa puede entrecruzarse químicamente con lignina y celulosa. Entre los "enzimas degradadores de xilano", o "xilanasas", se incluyen enzimas tanto exohidrolíticos como endohidrolíticos, tales como endo-1,4-beta-D-xilanasa (EC 3.2.1.8) o exo-1,4-beta-D-xilosidasa (EC 3.2.1.37), que descomponen la hemicelulosa en xilosas. Los gluco-y galacto-mananos son hidrolizados por las endo-1,4-betamananasas (EC 3.2.1.78) y la beta-manosidasa (EC 3.2.1.25), rindiendo beta-D-manosa. Entre los enzimas capaces de eliminar los sustituyentes de cadena lateral se incluyen α-glucuronidasas, acetil-xilán-esterasas, α
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