CN110755459B - 一种番荔枝叶多酚的提取工艺 - Google Patents

一种番荔枝叶多酚的提取工艺 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种番荔枝叶多酚的提取工艺，属于生物技术领域。本发明先对番荔枝叶进行预处理，然后进行两次酶解，再用乙醇结合超声提取后恒温振荡提取，得到番荔枝叶多酚提取粗液，最后进行除杂纯化，得到番荔枝叶多酚浓缩液。本发明的番荔枝叶多酚的提取工艺能够显著提升番荔枝叶多酚的提取率，生产所需的试剂与设备少，生产成本低，经过验证，本发明的方法准确可靠，可用于工业化生产，具有较好的应用价值。

Description

一种番荔枝叶多酚的提取工艺
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种番荔枝叶多酚的提取工艺。
背景技术
植物多酚是植物体内一类复杂的次生代谢产物，是从植物中分离提取出的多酚类物质的统称，如功效显著的茶多酚、葡萄多酚、苹果多酚等。植物多酚来源丰富，具有极强的抗氧化和清除自由基的能力，具有抗炎抑菌、抗病毒、抗龋齿、抗肿瘤、降脂减肥、降糖、抑制心脑血管疾病等多种功效，广泛应用于食品、保健品、医药、工业等重要领域，已成为现今天然产品的开发和利用的研究热点。
番荔枝(学名：Annona squamosa Linn.)番荔枝科、番荔枝属落叶小乔木，中国浙江、台湾、福建、广东、广西、海南和云南等省区均有栽培。果食用，外形酷似荔枝，故名“番荔枝”，为热带地区著名水果，含蛋白质2.34％，脂肪0.3％，糖类20.42％；种子含油量达20％；树皮纤维可造纸；根可药用，治急性赤痢、精神抑郁、脊髓骨病；果实可治恶疮肿痛，补脾。刺果番荔枝是番荔枝中食用与药用价值较高的品种之一，其果实口感清甜，富含维生素B6，具有美容养颜、清热解毒等功效；其种子、叶片、茎和根中的番荔枝内酯类化合物、生物碱类、酚类等成分较为丰富，在抗肿瘤、抗寄生虫、抗疟等方面具有重要价值。
目前，国内外对于番荔枝的研究主要集中在番荔枝碱、内酯、皂素、多糖的提取以及风味制品的工艺等方面，而关于番荔枝叶多酚的提取研究较少，目前提取番荔枝叶多酚的方法一般为：将番荔枝叶与体积分数为50％的乙醇溶液按照200:1mL/g的液料比混合均匀，然后置于超声清洗机中于30℃下超声提取20min。该方法的多酚提取量仅为15.4434mg/g，多酚提取率很低，不利于工业化生产应用。因此研究更优化的番荔枝叶多酚提取工艺，获取高提取率的番荔枝叶多酚，对番荔枝叶多酚药用价值的进一步研究及应用具有重要意义。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明提供一种番荔枝叶多酚的提取工艺，本发明先对番荔枝叶进行预处理，然后进行两次酶解，再用乙醇结合超声提取后恒温振荡提取，得到番荔枝叶多酚提取粗液，最后进行除杂纯化，得到番荔枝叶多酚浓缩液，番荔枝叶多酚得率高。
本发明通过以下技术方案实现：
一种番荔枝叶多酚的提取工艺，包括以下步骤：
(1)原料预处理：将番荔枝叶放入挤压机进行挤压破碎，然后放入超微粉碎机进行粉碎；
(2)一次酶解：将粉碎的番荔枝叶放入混合酶解液A中进行酶解，酶解温度45-50℃，酶解时间60-90min，然后灭酶，干燥，得到固体物质Ⅰ；所述混合酶解液A为含有纤维素酶、果胶酶、木质素过氧化物酶、锰过氧化物酶的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液Ⅰ，pH为4.7-5.3；
(3)二次酶解：将得到的固体物质Ⅰ放入混合酶解液B中进行酶解，酶解温度50-55℃，酶解时间30-60min，然后灭酶，干燥，得到固体物质Ⅱ；所述混合酶解液B为含有纤维素酶、木质素过氧化物酶、锰过氧化物酶、β-葡萄糖苷酶的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液Ⅱ，pH为4.7-5.3；
(4)提取：将得到的固体物质Ⅱ与体积分数为30～80％的乙醇溶液按照30:1～80:1mL/g的液料比混合均匀，然后置于超声清洗机中进行超声提取10-20min，再转移至恒温振荡器中振荡提取20～120min，得到番荔枝叶多酚提取粗液；
(5)除杂：往番荔枝叶多酚提取粗液中加入混合絮凝剂吸附杂质，然后过滤，将滤液过膜后离心，然后将得到的上清液用旋转蒸发仪进行浓缩，再干燥，得到番荔枝叶多酚浓缩液。
木质素过氧化物酶(LiP)，可在木素聚合物内形成自由基，导致键稳定变差从而破坏木质素大分子。
锰过氧化物酶的降解机制为：以二价锰离子为电子供体，在过氧化氢和二羧酸螯合剂存在的条件下，氧化二价锰离子成具有高度活性的三价锰离子，三价锰离子与二羧酸螯合剂形成稳定的高氧化还原电势的复合物，进而氧化降解木质素。
β-葡萄糖苷酶(β-D-Glucosidase，EC3.2.1.21)，又称β-D-葡萄糖苷葡萄糖水解酶，别名龙胆二糖酶、纤维二糖酶(cellobias，CB或β-G)和苦杏仁苷酶。它属于纤维素酶类，是纤维素分解酶系中的重要组成成分，能够水解结合于末端非还原性的β-D-葡萄糖键，同时释放出β-D-葡萄糖和相应的配基。
作为技术方案的优选，所述混合酶解液A中纤维素酶、果胶酶、木质素过氧化物酶、锰过氧化物酶的质量比为10-20:8:3:3，混合酶的加入量为20-30mg/g番荔枝叶。
作为技术方案的优选，所述混合酶解液B中纤维素酶、木质素过氧化物酶、锰过氧化物酶、β-葡萄糖苷酶的质量比为2-4:1:1:1，混合酶的加入量为10-20mg/g番荔枝叶。
作为技术方案的优选，所述灭酶为将酶解完成的混合酶解液立即采用紫外线照射15-30min。
作为技术方案的优选，所述超声清洗机的超声功率为250-350W，温度设置为50-60℃；所述恒温振荡器的振荡频率为80-100W，温度为60-70℃。
作为技术方案的优选，步骤(4)为，将得到的固体物质Ⅱ与体积分数为30～50％的乙醇溶液按照60:1～80:1mL/g的液料比混合均匀，然后置于超声清洗机中进行超声提取10-20min，再转移至恒温振荡器中振荡提取80～120min，得到番荔枝叶多酚提取粗液。
作为技术方案的进一步优选，步骤(4)为，将得到的固体物质Ⅱ与体积分数为41％的乙醇溶液按照70:1mL/g的液料比混合均匀，然后置于超声清洗机中进行超声提取10-20min，再转移至恒温振荡器中振荡提取97min，得到番荔枝叶多酚提取粗液。
作为技术方案的优选，所述混合絮凝剂含有壳聚糖和海藻酸钠，混合絮凝剂的加入量为1-3g/L提取粗液，吸附时间为1-2h。
作为技术方案的优选，所述膜为D101大孔吸附树脂。
作为技术方案的优选，所述离心的转速为10000-12000rpm，温度为3-5℃，时间为30-40min。
本发明的方法适合所有品种的番荔枝叶多酚的提取，特别是刺果番荔枝叶多酚的提取。
与现有技术相比，本发明的优点及有益效果为：
(1)本发明先对番荔枝叶进行预处理，通过挤压破碎及超微粉碎初步破坏番荔枝叶的细胞壁结构，再通过两次酶解，进一步破坏番荔枝叶的细胞壁结构，有利于浸提时叶中的多酚溶出，因而有利于提高番荔枝叶多酚的得率。
(2)本发明通过两次酶解充分破坏番荔枝叶细胞壁的结构，一次酶解使用的混合酶包括纤维素酶、果胶酶、木质素过氧化物酶、锰过氧化物酶，各组分之间协同作用，能够有效酶解番荔枝叶中的纤维素、半纤维素、果胶等物质；二次酶解使用的混合酶包括纤维素酶、木质素过氧化物酶、锰过氧化物酶、β-葡萄糖苷酶，基于不同木质素酶对各种木质素结构单元降解的偏好性及降解作用的协同增效，实现结构多样性丰富的大分子木质素各基团和连键的协同氧化降解，进一步破坏纤维素、半纤维素的顽固结构，确保浸提时叶中的多酚能充分溶出。
(3)本发明采用超声提取及恒温振荡提取的方式，并且控制乙醇体积分数30～80％，液料比30:1～80:1mL/g，超声提取10-20min，振荡提取20～120min，番荔枝叶多酚提取量为22.2391～28.485mg/g；特别是当乙醇体积分数41％，液料比70:1mL/g，超声提取10-20min，振荡提取97min时，番荔枝叶多酚提取量达到最高，为28.485mg/g。相比于现有技术，本发明的多酚提取量增加了44.0-84.4％，可见本发明的方法能够显著提升番荔枝叶多酚的提取率。
(4)本发明的提取工艺经过验证，准确可靠，可用于工业化生产，生产所需的试剂与设备少，生产成本低，具有较好的应用价值。
具体实施方式
下面将结合具体实施例对本发明进一步详细说明，但不限于本发明的保护范围。
实施例1
一种番荔枝叶多酚的提取工艺，包括以下步骤：
(1)原料预处理：将刺果番荔枝叶放入挤压机进行挤压破碎，然后放入超微粉碎机进行粉碎；
(2)一次酶解：将粉碎的番荔枝叶放入混合酶解液A中进行酶解，酶解温度48℃，酶解时间75min，然后灭酶，干燥，得到固体物质Ⅰ；所用混合酶解液A为含有质量比为15:8:3:3的纤维素酶、果胶酶、木质素过氧化物酶、锰过氧化物酶的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液Ⅰ，pH为5.0，混合酶的加入量为30mg/g番荔枝叶；
(3)二次酶解：将得到的固体物质Ⅰ放入混合酶解液B中进行酶解，酶解温度54℃，酶解时间40min，然后灭酶，干燥，得到固体物质Ⅱ；所用混合酶解液B为含有质量比为4:1:1:1的纤维素酶、木质素过氧化物酶、锰过氧化物酶、β-葡萄糖苷酶的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液Ⅱ，pH为5.0，混合酶的加入量为20mg/g番荔枝叶；
(4)提取：将得到的固体物质Ⅱ与体积分数为30～80％的乙醇溶液按照30:1～80:1mL/g的液料比混合均匀，然后置于超声清洗机中进行超声提取10min，超声清洗机的超声功率为250W，温度设置为60℃，再转移至恒温振荡器中振荡提取20～120min，恒温振荡器的振荡频率为85W，温度为70℃，得到番荔枝叶多酚提取粗液；
(5)除杂：往番荔枝叶多酚提取粗液中加入含有壳聚糖和海藻酸钠的混合絮凝剂吸附杂质，加入量为2g/L提取粗液，吸附时间为1.5h，然后过滤，将滤液过D101大孔吸附树脂后离心，离心的转速为12000rpm，温度为4℃，时间为30min，然后将得到的上清液用旋转蒸发仪进行浓缩，再置于电热恒温鼓风干燥箱中50℃烘烤，得到番荔枝叶多酚浓缩液。
经测定，本实施例提取的多酚含量为22.2391～27.5605mg/g。
实施例2
一种番荔枝叶多酚的提取工艺，包括以下步骤：
(1)原料预处理：将刺果番荔枝叶放入挤压机进行挤压破碎，然后放入超微粉碎机进行粉碎；
(2)一次酶解：将粉碎的番荔枝叶放入混合酶解液A中进行酶解，酶解温度47℃，酶解时间80min，然后灭酶，干燥，得到固体物质Ⅰ；所用混合酶解液A为含有质量比为17:8:3:3的纤维素酶、果胶酶、木质素过氧化物酶、锰过氧化物酶的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液Ⅰ，pH为4.9，混合酶的加入量为28mg/g番荔枝叶；
(3)二次酶解：将得到的固体物质Ⅰ放入混合酶解液B中进行酶解，酶解温度53℃，酶解时间50min，然后灭酶，干燥，得到固体物质Ⅱ；所用混合酶解液B为含有质量比为2:1:1:1的纤维素酶、木质素过氧化物酶、锰过氧化物酶、β-葡萄糖苷酶的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液Ⅱ，pH为4.9，混合酶的加入量为18mg/g番荔枝叶；
(4)提取：将得到的固体物质Ⅱ与体积分数为30～50％的乙醇溶液按照60:1～80:1mL/g的液料比混合均匀，然后置于超声清洗机中进行超声提取10min，超声清洗机的超声功率为250W，温度设置为60℃，再转移至恒温振荡器中振荡提取80～120min，恒温振荡器的振荡频率为90W，温度为70℃，得到番荔枝叶多酚提取粗液；
(5)除杂：往番荔枝叶多酚提取粗液中加入含有壳聚糖和海藻酸钠的混合絮凝剂吸附杂质，加入量为2g/L提取粗液，吸附时间为1.5h，然后过滤，将滤液过D101大孔吸附树脂后离心，离心的转速为12000rpm，温度为4℃，时间为30min，然后将得到的上清液用旋转蒸发仪进行浓缩，再置于电热恒温鼓风干燥箱中50℃烘烤，得到番荔枝叶多酚浓缩液。
经测定，本实施例提取的多酚含量为22.8445～28.4838mg/g。
实施例3
一种番荔枝叶多酚的提取工艺，包括以下步骤：
(1)原料预处理：将刺果番荔枝叶放入挤压机进行挤压破碎，然后放入超微粉碎机进行粉碎；
(2)一次酶解：将粉碎的番荔枝叶放入混合酶解液A中进行酶解，酶解温度49℃，酶解时间70min，然后灭酶，干燥，得到固体物质Ⅰ；所用混合酶解液A为含有质量比为16:8:3:3的纤维素酶、果胶酶、木质素过氧化物酶、锰过氧化物酶的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液Ⅰ，pH为5.1，混合酶的加入量为26mg/g番荔枝叶；
(3)二次酶解：将得到的固体物质Ⅰ放入混合酶解液B中进行酶解，酶解温度52℃，酶解时间55min，然后灭酶，干燥，得到固体物质Ⅱ；所用混合酶解液B为含有质量比为3:1:1:1的纤维素酶、木质素过氧化物酶、锰过氧化物酶、β-葡萄糖苷酶的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液Ⅱ，pH为5.1，混合酶的加入量为16mg/g番荔枝叶；
(4)提取：将得到的固体物质Ⅱ与体积分数为41％的乙醇溶液按照70:1mL/g的液料比混合均匀，然后置于超声清洗机中进行超声提取15min，超声清洗机的超声功率为300W，温度设置为55℃，再转移至恒温振荡器中振荡提取97min，恒温振荡器的振荡频率为95W，温度为65℃，得到番荔枝叶多酚提取粗液；
(5)除杂：往番荔枝叶多酚提取粗液中加入含有壳聚糖和海藻酸钠的混合絮凝剂吸附杂质，加入量为2.5g/L提取粗液，吸附时间为1.5h，然后过滤，将滤液过D101大孔吸附树脂后离心，离心的转速为11000rpm，温度为4℃，时间为35min，然后将得到的上清液用旋转蒸发仪进行浓缩，再置于电热恒温鼓风干燥箱中50℃烘烤，得到番荔枝叶多酚浓缩液。
经测定，本实施例提取的多酚含量为28.485±0.1081mg/g。
实施例4
一种番荔枝叶多酚的提取工艺，包括以下步骤：
(1)原料预处理：将刺果番荔枝叶放入挤压机进行挤压破碎，然后放入超微粉碎机进行粉碎；
(2)一次酶解：将粉碎的番荔枝叶放入混合酶解液A中进行酶解，酶解温度46℃，酶解时间85min，然后灭酶，干燥，得到固体物质Ⅰ；所用混合酶解液A为含有质量比为12:8:3:3的纤维素酶、果胶酶、木质素过氧化物酶、锰过氧化物酶的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液Ⅰ，pH为5.2，混合酶的加入量为24mg/g番荔枝叶；
(3)二次酶解：将得到的固体物质Ⅰ放入混合酶解液B中进行酶解，酶解温度51℃，酶解时间60min，然后灭酶，干燥，得到固体物质Ⅱ；所用混合酶解液B为含有质量比为3:1:1:1的纤维素酶、木质素过氧化物酶、锰过氧化物酶、β-葡萄糖苷酶的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液Ⅱ，pH为5.2，混合酶的加入量为14mg/g番荔枝叶；
(4)提取：将得到的固体物质Ⅱ与体积分数为40％的乙醇溶液按照70:1mL/g的液料比混合均匀，然后置于超声清洗机中进行超声提取15min，超声清洗机的超声功率为300W，温度设置为55℃，再转移至恒温振荡器中振荡提取100min，恒温振荡器的振荡频率为85W，温度为65℃，得到番荔枝叶多酚提取粗液；
(5)除杂：往番荔枝叶多酚提取粗液中加入含有壳聚糖和海藻酸钠的混合絮凝剂吸附杂质，加入量为1.5g/L提取粗液，吸附时间为1.5h，然后过滤，将滤液过D101大孔吸附树脂后离心，离心的转速为11000rpm，温度为3℃，时间为35min，然后将得到的上清液用旋转蒸发仪进行浓缩，再置于电热恒温鼓风干燥箱中50℃烘烤，得到番荔枝叶多酚浓缩液。
经测定，本实施例提取的多酚含量为28.4257±0.0493mg/g。
实施例5
一种番荔枝叶多酚的提取工艺，包括以下步骤：
(1)原料预处理：将刺果番荔枝叶放入挤压机进行挤压破碎，然后放入超微粉碎机进行粉碎；
(2)一次酶解：将粉碎的番荔枝叶放入混合酶解液A中进行酶解，酶解温度50℃，酶解时间60min，然后灭酶，干燥，得到固体物质Ⅰ；所用混合酶解液A为含有质量比为20:8:3:3的纤维素酶、果胶酶、木质素过氧化物酶、锰过氧化物酶的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液Ⅰ，pH为4.7，混合酶的加入量为22mg/g番荔枝叶；
(3)二次酶解：将得到的固体物质Ⅰ放入混合酶解液B中进行酶解，酶解温度50℃，酶解时间60min，然后灭酶，干燥，得到固体物质Ⅱ；所用混合酶解液B为含有质量比为2:1:1:1的纤维素酶、木质素过氧化物酶、锰过氧化物酶、β-葡萄糖苷酶的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液Ⅱ，pH为4.7，混合酶的加入量为12mg/g番荔枝叶；
(4)提取：将得到的固体物质Ⅱ与体积分数为50％的乙醇溶液按照30:1～80:1mL/g的液料比混合均匀，然后置于超声清洗机中进行超声提取20min，超声清洗机的超声功率为350W，温度设置为50℃，再转移至恒温振荡器中振荡提取60min，恒温振荡器的振荡频率为80W，温度为60℃，得到番荔枝叶多酚提取粗液；
(5)除杂：往番荔枝叶多酚提取粗液中加入含有壳聚糖和海藻酸钠的混合絮凝剂吸附杂质，加入量为3g/L提取粗液，吸附时间为1h，然后过滤，将滤液过D101大孔吸附树脂后离心，离心的转速为10000rpm，温度为3℃，时间为40min，然后将得到的上清液用旋转蒸发仪进行浓缩，再置于电热恒温鼓风干燥箱中50℃烘烤，得到番荔枝叶多酚浓缩液。
经测定，本实施例提取的多酚含量为23.2591～27.1044mg/g，当液料比为70:1mL/g时，提取的多酚含量为27.6130±0.1461mg/g。
实施例6
一种番荔枝叶多酚的提取工艺，包括以下步骤：
(1)原料预处理：将刺果番荔枝叶放入挤压机进行挤压破碎，然后放入超微粉碎机进行粉碎；
(2)一次酶解：将粉碎的番荔枝叶放入混合酶解液A中进行酶解，酶解温度45℃，酶解时间90min，然后灭酶，干燥，得到固体物质Ⅰ；所用混合酶解液A为含有质量比为10:8:3:3的纤维素酶、果胶酶、木质素过氧化物酶、锰过氧化物酶的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液Ⅰ，pH为5.3，混合酶的加入量为20mg/g番荔枝叶；
(3)二次酶解：将得到的固体物质Ⅰ放入混合酶解液B中进行酶解，酶解温度55℃，酶解时间30min，然后灭酶，干燥，得到固体物质Ⅱ；所用混合酶解液B为含有质量比为4:1:1:1的纤维素酶、木质素过氧化物酶、锰过氧化物酶、β-葡萄糖苷酶的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液Ⅱ，pH为5.3，混合酶的加入量为10mg/g番荔枝叶；
(4)提取：将得到的固体物质Ⅱ与体积分数为50％的乙醇溶液按照50:1mL/g的液料比混合均匀，然后置于超声清洗机中进行超声提取20min，超声清洗机的超声功率为350W，温度设置为50℃，再转移至恒温振荡器中振荡提取20～120min，恒温振荡器的振荡频率为100W，温度为60℃，得到番荔枝叶多酚提取粗液；
(5)除杂：往番荔枝叶多酚提取粗液中加入含有壳聚糖和海藻酸钠的混合絮凝剂吸附杂质，加入量为1g/L提取粗液，吸附时间为2h，然后过滤，将滤液过D101大孔吸附树脂后离心，离心的转速为10000rpm，温度为5℃，时间为40min，然后将得到的上清液用旋转蒸发仪进行浓缩，再置于电热恒温鼓风干燥箱中50℃烘烤，得到番荔枝叶多酚浓缩液。
经测定，本实施例提取的多酚含量为24.4782～27.1044mg/g，当提取时间为100min时，提取的多酚含量为27.1044±0.2146mg/g。
需要说明的是，本发明采用《植物生理学实验》(ISBN:978565506598)第133～135页中记载的多酚含量的测定方法对提取得到的番荔枝叶多酚浓缩液的多酚含量进行测定。
将本发明的番荔枝叶多酚的提取量与现有技术进行比较，如表1所示：
表1本发明的番荔枝叶多酚的提取量与现有技术的对比表
Figure BDA0002285185930000081
从表1可以看出，本发明的多酚提取量为22.2391～28.485mg/g，相比于现有技术，本发明的多酚提取量增加了44.0-84.4％，可见本发明的方法能够显著提升番荔枝叶多酚的提取率。
为了进一步说明本发明的提取效果，采用响应面法对本发明的提取工艺进行验证，验证过程如下：
以乙醇体积分数、液料比、振荡提取时间为自变量，以番荔枝叶多酚含量为响应值，设计3因素3水平的响应曲面分析实验，3个因素的编码水平见表2。
表2响应曲面设计试验因素水平和编码
Figure BDA0002285185930000082
Figure BDA0002285185930000091
根据表2的自变量编码水平，响应曲面分析试验设计与结果如表3所示，共17个试验点，其中5个为中心点，重复试验3次，用来估计试验误差，其他的12个点为析因点，用来分析A乙醇体积分数、B液料比、C振荡提取时间三个因素对番荔枝叶多酚含量的影响。
表3响应曲面试验设计与结果
Figure BDA0002285185930000092
根据表3的数据，建立以A、B、C为自变量的关于多酚含量Y的多元二次回归模型，根据Design Expert 8.0.6.1对表3试验数据进行多元回归拟合，得到番荔枝叶多酚提取率对乙醇体积分数(A)、液料比(B)、振荡提取时间(C)3个因素的二次多项回归模型：Y＝28.43+0.76A+0.11B－0.13C+0.38AB+0.015AC－0.11BC－2.66A2－1.91B2－0.39C2。
由回归方程可靠性分析可知回归决定系数R2＝0.9998，说明有99.98％的相应面值符合此模型，试验因素影响较大，相关性高；调整决定系数R2 adj＝0.9995，说明有99.95％的试验数据变化可用此模型作参考；模型的噪信比为26.09，大于4，说明方程合理；变异系数CV为0.16％，数值较小，说明此方程具有较高的可靠性混入稳定性。
对回归方程系数显著性进行检验，结果如表4所示。
表4回归方程系数显著性检验结果
Figure BDA0002285185930000101
注：*差异显著(p＜0.05)，**差异极显著(p＜0.01)。
由表4可知，该响应曲面模型极显著(p＜0.01)，失拟项P值为0.7396不显著，表明该方程具有较高的拟合度，试验误差小，该方程的一次项和二次项中的A2、B2、C2均表现出极显著差异(p＜0.01)，因素AB、BC表现出极显著差异(p＜0.01)，AC差一步显著(p＞0.05),综上此模型具有应用意义，可用于试验分析。
对建立的二次回归方程求最大值，得到本发明的理论最佳工艺条件为：乙醇体积分数41.45％、液料比70.49:1、振荡提取时间96.64min，在此条件下番荔枝叶多酚提取率的理论预测值为28.4942mg/g。根据实际试验操作的需要，将上述条件修正为乙醇体积分数41％、料液比70:1、振荡提取时间97min，并以此工艺条件进行3次平行试验进行验证，得到番荔枝叶多酚的提取率为28.485±0.1081mg/g，接近于理论值。因此本实施例3中的番荔枝叶多酚提取工艺为最优选工艺。

Claims (9)

1.一种番荔枝叶多酚的提取工艺，其特征在于，包括以下步骤：
（1）原料预处理：将番荔枝叶放入挤压机进行挤压破碎，然后放入超微粉碎机进行粉碎；
（2）一次酶解：将粉碎的番荔枝叶放入混合酶解液A中进行酶解，酶解温度45-50 ℃，酶解时间60-90 min，然后灭酶，干燥，得到固体物质Ⅰ；所述混合酶解液A为含有纤维素酶、果胶酶、木质素过氧化物酶、锰过氧化物酶的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液Ⅰ，pH为4.7-5.3；
（3）二次酶解：将得到的固体物质Ⅰ放入混合酶解液B中进行酶解，酶解温度50-55 ℃，酶解时间30-60 min，然后灭酶，干燥，得到固体物质Ⅱ；所述混合酶解液B为含有纤维素酶、木质素过氧化物酶、锰过氧化物酶、β-葡萄糖苷酶的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液Ⅱ，pH为4.7-5.3；
（4）提取：将得到的固体物质Ⅱ与体积分数为30～80%的乙醇溶液按照30:1～80:1 mL/g的液料比混合均匀，然后置于超声清洗机中进行超声提取10-20 min，再转移至恒温振荡器中振荡提取20～120 min，得到番荔枝叶多酚提取粗液；
（5）除杂：往番荔枝叶多酚提取粗液中加入混合絮凝剂吸附杂质，然后过滤，将滤液过D101大孔吸附树脂后离心，然后将得到的上清液用旋转蒸发仪进行浓缩，再干燥，得到番荔枝叶多酚浓缩液。
2.根据权利要求1所述的番荔枝叶多酚的提取工艺，其特征在于，所述混合酶解液A中纤维素酶、果胶酶、木质素过氧化物酶、锰过氧化物酶的质量比为10-20:8:3:3，混合酶的加入量为20-30 mg/g番荔枝叶。
3.根据权利要求1所述的番荔枝叶多酚的提取工艺，其特征在于，所述混合酶解液B中纤维素酶、木质素过氧化物酶、锰过氧化物酶、β-葡萄糖苷酶的质量比为2-4:1:1:1，混合酶的加入量为10-20 mg/g番荔枝叶。
4.根据权利要求1所述的番荔枝叶多酚的提取工艺，其特征在于，所述灭酶为将酶解完成的混合酶解液立即采用紫外线照射15-30 min。
5.根据权利要求1所述的番荔枝叶多酚的提取工艺，其特征在于，所述超声清洗机的超声功率为250-350 W，温度设置为50-60 ℃；所述恒温振荡器的振荡频率为80-100 W，温度为60-70 ℃。
6.根据权利要求1所述的番荔枝叶多酚的提取工艺，其特征在于，步骤（4）为，将得到的固体物质Ⅱ与体积分数为30～50%的乙醇溶液按照60:1～80:1 mL/g的液料比混合均匀，然后置于超声清洗机中进行超声提取10-20 min，再转移至恒温振荡器中振荡提取80～120min，得到番荔枝叶多酚提取粗液。
7.根据权利要求6所述的番荔枝叶多酚的提取工艺，其特征在于，步骤（4）为，将得到的固体物质Ⅱ与体积分数为41%的乙醇溶液按照70:1 mL/g的液料比混合均匀，然后置于超声清洗机中进行超声提取10-20 min，再转移至恒温振荡器中振荡提取97 min，得到番荔枝叶多酚提取粗液。
8.根据权利要求1所述的番荔枝叶多酚的提取工艺，其特征在于，所述混合絮凝剂含有壳聚糖和海藻酸钠，混合絮凝剂的加入量为1-3 g/L提取粗液，吸附时间为1-2 h。
9.根据权利要求1所述的番荔枝叶多酚的提取工艺，其特征在于，所述离心的转速为10000-12000 rpm，温度为3-5 ℃，时间为30-40 min。
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