CN103525709B - 一种普通镰刀菌、制备降粘酶的方法及其应用 - Google Patents

一种普通镰刀菌、制备降粘酶的方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种普通镰刀菌，利用该普通镰刀菌制备降粘酶的方法及其应用。针对现有技术中降低甘薯发酵醪液粘度存在的缺陷，本发明提供了一种能够生产降粘酶的菌种。普通镰刀菌CBS131819采集自随机选取的自然状下腐烂的甘薯块茎，已保藏于荷兰皇家艺术与科学学院荷兰微生物菌种保藏中心，保藏日期2012年1月27日。普通镰刀菌CBS131819可应用于制备降粘酶，所产降粘酶活性高、用量少、作用时间短、降粘效果好。该菌可应用于甘薯块茎发酵醪液降粘，并可进一步应用于甘薯类燃料乙醇发酵工艺的前期降粘预处理中。

Description

一种普通镰刀菌、制备降粘酶的方法及其应用
技术领域
本发明涉及一种普通镰刀菌、利用该菌种制备降粘酶的方法及其应用，特别是涉及一种可应用于甘薯块茎发酵降粘的普通镰刀菌及其应用，属于微生物及微生物发酵领域。
背景技术
生物质燃料乙醇即采用植物等生物质原料发酵生产无水乙醇，再加入体积比5%左右的变性剂（一般为无铅汽油或无铅的烃类）使之成为含水量小于0.8%且不可食用的变性无水乙醇。燃料乙醇是一种良好的汽油增氧剂与辛烷值调和组分，能有效降低汽车尾气中的一氧化碳含量，从而真正实现节能减排。生物质燃料乙醇作为一种可再生能源，因其能缓解能源危机，稳定粮食生产，增加就业机会和农民收入，减少环境污染而备受关注并成为各国竞相研发的重要课题之一。2007年，我国正式宣布停止一切以粮食原料生产燃料乙醇的项目，鼓励发展甘薯、甘蔗、甜高粱等非粮食原料生产燃料乙醇。甘薯燃料乙醇发酵醪液是一种典型的非牛顿流体（一般的发酵液粘度小于0.1Pa.S），具有粘度大的特点（≥100Pa.S），对发酵过程中传质传热等产生影响，从而降低发酵效率、延长发酵时间、减少最终乙醇浓度，并且容易堵塞管路、增加能耗。因而醪液粘度高是甘薯高浓度发酵生产燃料乙醇的瓶颈之一。
现有技术中，降低甘薯发酵醪液粘度基本有两种方法，一是添加发酵用水降低粘度，二是添加木聚糖酶、纤维素酶、果胶酶等商品酶或者其混合物，促进α-淀粉酶与淀粉颗粒接触，提高淀粉颗粒利用效率。这两种方法均存在各自的技术缺陷：前者不仅增加了生产用水量，还降低了酒精成品产量，不能解决实际问题；后者使用商品酶作为一种快速预处理方法，增加了生产成本，不利于燃料乙醇规模化生产。
发明内容
本发明的目的就是针对现有技术的不足，提供一种能够生产降粘酶的菌种，及其制备降粘酶以及在甘薯发酵降粘中的应用。
为实现上述目的，本发明首先提供一种普通镰刀菌：
普通镰刀菌XYL-1，保藏于CBS-KNAW，保藏号为CBS131819，保藏日期为2012年1月27日。
普通镰刀菌CBS131819属普通镰刀菌（Fusarium commune），已保藏于荷兰皇家艺术与科学学院荷兰微生物菌种保藏中心（RoyalNetherlands Academy of Arts and Sciences,The Centraalbureau voorSchimmelcultures，CBS-KNAW)，保藏日期2012年1月27日，保藏编号CBS131819。CBS-KNAW机构地址：8Uppsalalaan，3584CT，荷兰乌得勒支（Uppsalalaan8,3584CT Utrecht the Netherlands）。
普通镰刀菌CBS131819采集自随机选取的自然状下腐烂的甘薯块茎。筛选过程为：腐烂的甘薯块茎制成菌悬液，经梯度稀释后接种至筛选培养基，30℃培养3d，PDA培养基分离培养，30℃培养7d，刚果红染液染色，挑选出黄色透明圈大且明显的菌株。筛选培养基的组成为：木聚糖(Xylan)10g/L，酵母膏4.5g/L，(NH4)2SO44.5g/L，NaCl5.0g/L，K2HPO42.0g/L，MgSO4·7H2O0.4g/L，琼脂15g/L，pH6.0。刚果红染液染色步骤为：菌落挑取后，利用1%刚果红染液染色10min，倒掉染色液然后用1mol/L NaCl溶液润洗3次，每次10min。
本发明菌落在PDA培养基上菌丝白色，菌丝发达，疏松，四周扩展。显微镜下观察，菌株小型分生孢子卵形或微弯曲成肾型，大型分生孢子镰刀型，两端稍尖，3～5个分隔。
普通镰刀菌CBS131819可应用于降粘酶制备。
本发明还提供一种降粘酶制备方法，其技术方案如下：
一种降粘酶制备方法，其特征在于：将普通镰刀菌CBS131819接种于发酵培养基，30℃、130rpm下培养4d～5d，制得降粘酶粗酶液；所述发酵培养基是（g/L）：风干玉米芯20、蛋白胨3.0、酵母膏0.5、KH2PO42.0、(NH4)2SO41.5、MgSO4·7H2O0.15、CaCl20.3、FeSO4·7H2O0.0005、ZnSO4·7H2O0.0014、MnSO4·H2O0.0016、COCl2·6H2O0.0016、Tween-803.3、pH5.0。
在优选条件下，发酵培养基是（g/L）：风干玉米芯20、KH2PO42.0、NH4NO34.5、MgSO4·7H2O0.15、CaCl20.3、FeSO4·7H2O0.0005、ZnSO4·7H2O0.0014、MnSO4·H2O0.0016、COCl2·6H2O0.0016、Tween-803.3、pH6.5。
以上述方法制得的降粘酶粗酶液，是多种酶的混合液，Pedersen etal.(2009)经报道的AZCL分析方法分析显示，降粘酶粗酶液组成为：内切-1,4-β-D-木聚糖酶32（蓝色水解环直径/mm，下同），内切-纤维素酶19.5，内切-1,4-β-D-半乳聚糖酶15.6，内切-1,4-β-D-甘露聚糖酶15，内切-1,5-α-L-阿拉伯聚糖酶14，α-淀粉酶14，β-葡聚糖酶13，内切-1,3-β-D-葡聚糖酶7，鼠李糖半乳聚糖醛酸裂解酶10。基于此，本发明提供一种降粘酶组合物，具体技术方案是：
一种降粘酶组合物，其特征在于：依照如下方法制得：将普通镰刀菌CBS131819接种于发酵培养基，30℃、130rpm下培养4d～5d，制得降粘酶组合物；所述发酵培养基是如下二种之一：
发酵培养基一（g/L）：风干玉米芯20、蛋白胨3.0、酵母膏0.5、KH2PO42.0、(NH4)2SO41.5、MgSO4·7H2O0.15、CaCl20.3、FeSO4·7H2O0.0005、ZnSO4·7H2O0.0014、MnSO4·H2O0.0016、COCl2·6H2O0.0016、Tween-803.3、pH5.0；
发酵培养基二（g/L）：风干玉米芯20、KH2PO42.0、NH4NO34.5、MgSO4·7H2O0.15、CaCl20.3、FeSO4·7H2O0.0005、ZnSO4·7H2O0.0014、MnSO4·H2O0.0016、COCl2·6H2O0.0016、Tween-803.3、pH6.5。
上述降粘酶组合物可以经离心，取上清液0.22μm过滤器过滤提纯。
利用上述方法制得的降粘酶组合物，本发明进一步提供一种甘薯块茎发酵降粘的方法，其技术方案如下：
一种利用上述降粘酶组合物实施的甘薯块茎发酵降粘的方法，其特征在于：向甘薯块茎浆中添加反应酶液，50℃、180rpm条件下灭菌2h；所述反应酶液是降粘酶粗酶液。
在优选条件下，上述方法的甘薯块茎浆制备方法是：步骤S1、甘薯块茎原料洗净、打浆制得甘薯块茎原浆；步骤S2、按照90～150KNU/kg淀粉在甘薯块茎原浆中添加α-淀粉酶，80℃～90℃反应至碘反应为红棕色，冷却至室温后按甘薯块茎原浆料水重量比3:1加水；115℃条件下灭菌20min，制得甘薯块茎浆。
上述甘薯块茎发酵降粘的方法可以应用于甘薯燃料乙醇发酵工艺中。具体是应用于鲜甘薯类燃料乙醇发酵工艺的前期降粘预处理中。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：（1）提供了新的普通镰刀菌CBS131819（普通镰刀菌XYL-1）；（2）普通镰刀菌CBS131819可应用于制备降粘酶，普通镰刀菌CBS131819所产降粘酶活性高、用量少、作用时间短、降粘效果好；（3）普通镰刀菌CBS131819可应用于甘薯块茎发酵醪液降粘；（4）利用普通镰刀菌CBS131819实施的甘薯块茎发酵降粘方法可应用于甘薯燃料乙醇发酵工艺中。
具体实施方式
下面结合优选实施例、对照例对本发明技术方案作进一步的描述。
实施例一
本实施例记载普通镰刀菌CBS131819的筛选方法。
腐烂甘薯块茎：自然状态下腐烂甘薯块茎。
筛选过程为：随机取自然状态下腐烂甘薯块茎5g于100mL三角瓶，加入20mL无菌水，室温180rpm，30min，得到菌悬液；按照经典的涂布稀释平板法，经10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7梯度稀释后，分别取100μL10-5，10-6，10-7浓度的菌悬液涂布于筛选培养基上，30℃培养3d，挑取平板上生长较大的单菌落到PDA斜面培养基上分离培养，30℃培养7d，然后用刚果红染液染色，挑选出黄色透明圈大且明显的菌株。
筛选培养基的组成为：木聚糖(Xylan)10g/L，酵母膏4.5g/L，(NH4)2SO44.5g/L，NaCl5.0g/L，K2HPO42.0g/L，MgSO4·7H2O0.4g/L，琼脂15g/L，pH6.0。
刚果红染液染色步骤为：菌落挑取后，利用1%刚果红染液染色10min，倒掉染色液然后用1mol/L NaCl溶液润洗3次，每次10min。
本实施例筛选得到的菌落在PDA培养基上菌丝白色，菌丝发达，疏松，四周扩展。显微镜下观察，菌株小型分生孢子卵形或微弯曲成肾型，大型分生孢子镰刀型，两端稍尖，3～5个分隔。经鉴定属普通镰刀菌（Fusarium commune），命名为普通镰刀菌XYL-1。
实施例二
本实施例记载普通镰刀菌CBS131819制备降粘酶的方法。
发酵培养基（g/L）：风干玉米芯20、蛋白胨3.0、酵母膏0.5、KH2PO42.0、(NH4)2SO41.5、MgSO4·7H2O0.15、CaCl20.3、FeSO4·7H2O0.0005、ZnSO4·7H2O0.0014、MnSO4·H2O0.0016、COCl2·6H2O0.0016、Tween-803.3、pH5.0。
制备操作：将普通镰刀菌CBS131819接种于50mL发酵培养基，30℃、130rpm下培养4d，制得降粘酶粗酶液。
实施例三
本实施例记载普通镰刀菌CBS131819制备降粘酶的方法，其与实施例二相同之处不再重复，其不同之处在于，将普通镰刀菌CBS131819接种于发酵培养基，30℃、130rpm下培养5d，制得降粘酶粗酶液。
实施例四
本实施例记载普通镰刀菌CBS131819制备降粘酶的方法。
优选发酵培养基（g/L）：风干玉米芯20、蛋白胨3.0、酵母膏0.5、KH2PO42.0、(NH4)2SO41.5、MgSO4·7H2O0.15、CaCl20.3、FeSO4·7H2O0.0005、ZnSO4·7H2O0.0014、MnSO4·H2O0.0016、COCl2·6H2O0.0016、Tween-803.3、pH5.0。
制备操作同实施例二。
实施例五
本实施例记载普通镰刀菌CBS131819制备降粘酶的方法，其与实施例四相同之处不再重复，其不同之处在于：将普通镰刀菌CBS131819接种于优选发酵培养基，30℃、130rpm下培养5d，制得降粘酶粗酶液。
实施例六
本实施例记载普通镰刀菌CBS131819制备降粘酶的方法，其与实施例五相同之处不再重复，其不同之处在于：将普通镰刀菌CBS131819接种于200ml发酵培养基（其中普通镰刀菌CBS131819接种量与发酵培养基用量放大相同倍数），30℃、130rpm下培养5d，制得降粘酶粗酶液。
实施例七
本实施例记载甘薯块茎发酵降粘的方法。
粘度测定仪器：上海尼润智能科技有限公司生产的RDV-2+PRO型数字式旋转粘度计。
α-淀粉酶标准酶活力为90KNU/g，酶活定义为在37℃，pH5.6时，每小时水解5.26克淀粉的酶量为1个KNU。
步骤S1、甘薯块茎原料洗净、打浆制得甘薯块茎原浆。
步骤S2、按照90～150KNU/kg淀粉在甘薯块茎原浆中添加α-淀粉酶，80℃～90℃反应至碘反应为红棕色，冷却至室温后按甘薯块茎原浆料水重量比3:1加水；115℃条件下灭菌20min，制得甘薯块茎浆。
步骤S3、降粘酶粗酶液经离心，取上清液经0.22μm过滤器过滤制得反应酶液。
步骤S4、向步骤S2所得甘薯块茎浆中添加反应酶液，50℃、180rpm条件下反应2h，测量粘度值；降粘酶粗酶液来源、加入量及降粘效果如下表1所示。
对照处理：取50g或100g步骤S2所得甘薯块茎浆加入2mL或4mL无菌水，50℃、180rpm条件下作用2h后，测定粘度值为19686mPa.s～23042.5mPa.s。
表1反应酶液及粘度测定结果
NO.降粘酶粗酶液来源 反应酶液加入量 粘度下降率
1实施例二 2mL/50g甘薯块茎浆 60.47%
2实施例三 2mL/50g甘薯块茎浆 67.89%
3实施例四 2mL/50g甘薯块茎浆 71.09%
4实施例五 2mL/50g甘薯块茎浆 85.33%
5实施例六 4mL/100g甘薯块茎浆 77.12%
测试例一
本测试例记载对实施例四、五、六所得降粘酶粗酶液组分的测定。
采用Pedersen et al.(2009)经报道的AZCL分析方法测定降粘酶粗酶液组成及活性，结果显示降粘酶清液的组成为：
内切-1,4-β-D-木聚糖酶32（蓝色水解环直径/mm，下同），内切-纤维素酶19.5，内切-1,4-β-D-半乳聚糖酶15.6，内切-1,4-β-D-甘露聚糖酶15，内切-1,5-α-L-阿拉伯聚糖酶14，α-淀粉酶14，β-葡聚糖酶13，内切-1,3-β-D-葡聚糖酶7，鼠李糖半乳聚糖醛酸裂解酶10。
参考文献：Pedersen M,Hollensted M,Lange L,Andersen B.Screeningfor cellulose and hemicellulose degrading enzymes from the fungal genusUlocladium.Inter Biodeter Biodegr2009;63:484-9.
对照例一
本对照例记载现有技术采用果胶酶降粘的试验。
甘明哲等（2009）通过优化，获得的鲜甘薯最佳预处理条件为：料水比2:l、126℃、pH2.5条件下预处理5min，液化，糖化时加入果胶酶40U/g醪液，纤维素酶0.5U/g醪液。糖化2h后，粘度4.5×104mPa.s。（果胶酶：购自广州中凯生物制品公司，7万单位/g;维素酶：购自上海博奥生物科技有限公司，1.万单位/g），而采用传统糖化工艺，糖化2h后，粘度大于1.0×105mPa.s。
参考文献：甘明哲等.适合鲜甘薯原料乙醇发酵的低粘度快速糖化预处理.应用与环境生物学报,2009年02期.

Claims (7)

1.普通镰刀菌(Fusarium commune)XYL-1，保藏于CBS-KNAW，保藏号为CBS131819，保藏日期为2012年1月27日。
2.根据权利要求1所述的普通镰刀菌(Fusarium commune)XYL-1在制备降粘酶中的应用。
3.一种降粘酶制备方法，其特征在于：将权利要求1所述的普通镰刀菌(Fusarium commune)XYL-1接种于发酵培养基，30℃、130rpm下培养4d～5d，制得降粘酶粗酶液；所述发酵培养基是如下二种之一：
发酵培养基一：风干玉米芯20、蛋白胨3.0、酵母膏0.5、KH2PO42.0、(NH4)2SO4 1.5、MgSO4·7H2O 0.15、CaCl2 0.3、FeSO4·7H2O 0.0005、ZnSO4·7H2O 0.0014、MnSO4·H2O 0.0016、COCl2·6H2O 0.0016、Tween-80 3.3、pH 5.0，各组分单位是g/L；
发酵培养基二：风干玉米芯20、KH2PO4 2.0、NH4NO3 4.5、MgSO4·7H2O 0.15、CaCl2 0.3、FeSO4·7H2O 0.0005、ZnSO4·7H2O0.0014、MnSO4·H2O 0.0016、COCl2·6H2O 0.0016、Tween-80 3.3、pH 6.5，各组分单位是g/L。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述发酵培养天数为5d。
5.一种降粘酶组合物，其特征在于：依照如下方法制得：将权利要求1所述的普通镰刀菌(Fusarium commune)XYL-1接种于发酵培养基，30℃、130rpm下培养4d～5d，制得降粘酶粗酶液，离心，取上清液0.22μm过滤器过滤提纯，制得降粘酶组合物；所述发酵培养基是如下二种之一：
发酵培养基一：风干玉米芯20、蛋白胨3.0、酵母膏0.5、KH2PO42.0、(NH4)2SO4 1.5、MgSO4·7H2O 0.15、CaCl2 0.3、FeSO4·7H2O 0.0005、 ZnSO4·7H2O 0.0014、MnSO4·H2O 0.0016、COCl2·6H2O 0.0016、Tween-80 3.3、pH 5.0，各组分单位是g/L；
发酵培养基二：风干玉米芯20、KH2PO4 2.0、NH4NO3 4.5、MgSO4·7H2O 0.15、CaCl2 0.3、FeSO4·7H2O 0.0005、ZnSO4·7H2O0.0014、MnSO4·H2O 0.0016、COCl2·6H2O 0.0016、Tween-80 3.3、pH 6.5，各组分单位是g/L。
6.利用权利要求5所述的降粘酶组合物实施的甘薯块茎发酵降粘的方法，其特征在于：向甘薯块茎浆中添加反应酶液，50℃、180rpm条件下反应2h；所述反应酶液是降粘酶组合物。
7.根据权利要求6所述的甘薯块茎发酵降粘的方法在甘薯燃料乙醇发酵中的应用。
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