CN108191971A - 重组人金属硫蛋白Ⅲα片段纯品的制备方法 - Google Patents

Abstract

一种重组人金属硫蛋白Ⅲα片段纯品的制备方法，步骤：制备融合蛋白溶液；制备融合蛋白粗品；制备巯基峰流穿液；制备酶切液；制备含重组人金属硫蛋白IIIα片段的上清液；制备穿透液；对得到的穿透液用超滤膜超滤脱盐，再上样于经缓冲液平衡的阴离子交换层析柱，再由洗脱液进行梯度洗脱，分瓶收集，取巯基峰洗脱液超滤脱盐，冷冻干燥成冻干粉，得到成品。在获得高纯度重组人金属硫蛋白Ⅲα片段的同时，降低制备成本；促进金属硫蛋白空间结构的正确折叠，减少金属硫蛋白活性损失；使得获得的重组人金属硫蛋白IIIa片段具有正确的空间结构及理想的生物活性。

Description

重组人金属硫蛋白Ⅲα片段纯品的制备方法

技术领域

本发明属于蛋白质纯化技术领域，涉及一种重组人金属硫蛋白Ⅲα片段纯品的制备方法。

背景技术

金属硫蛋白（英文名称为：Metallothionein；英文缩写为：MT）是一类富含半胱氨酸的小分子蛋白质，最早是由美国科学家Margoshes和Vallee在1957年从马肾中发现的，由于其分子富含半胱氨酸并且可以螯合金属离子，因而得名。MT广泛存在于哺乳动物中，而且在植物和微生物中也存在类似蛋白。在哺乳动物中，MT具有非常保守的一级结构和相似的立体结构，通常由60-61个氨基酸组成，其中三分之一为半胱氨酸，以CXXC和CXC（注：C为半胱氨酸缩写，X为其他氨基酸）等方式分布于分子内，没有二硫键，芳香族氨基酸和组氨酸。

MT具有并非限于如下例举的功能：在体内参与体内微量金属元素（Zn、Cu和Co等）的运输、储存和代谢；参与体内重金属（Hg、Cd和Pb）解毒；参与抗辐射，尤其是在细胞核DNA辐射受损需要修复时，可以清除自由基保护机体，其清除自由基，特别是羟基自由基的能力，比SOD强100多倍，促进细胞生长、机体发育和能量代谢等。金属硫蛋白通常包含两个独立结构域，即α结构域和β结构域，两个结构域都具有独立的生物学功能。

金属硫蛋白III即MT3发现于1991年，最初是从正常人大脑中分离得到一种神经生长抑制因子，发现其与金属硫蛋白高度同源，因此命名为金属硫蛋白III。研究发现，MTIII与老年痴呆关系密切，成为近年来的研究热点。

重组人金属硫蛋白IIIa片段的研究最早由北京大学蛋白质工程实验室茹炳根教授完成，其成功构建了GST-MTIII-α原核表达载体，实现了MTIII-α在大肠杆菌内的可溶性大量表达。通过GST亲和层析柱酶切及进一步纯化，得到了MTⅢα片段并通过实验研究表明，与天然结构高度一致，具有天然的生物活性。该成果已由茹炳根教授的学生王寒松于2000年6月发表在其硕士研究生学位论文《人金属硫蛋白-3α结构域的表达及性质研究》中（文中所涉及的菌种的保藏号为：CGMCC No.14832）。但由于GST亲和层析柱成本高，不适于大规模工业制备。故探索适于工业化生产的成本相对低廉的制备方法具有积极意义，下面将要介绍的技术方案便是在这种背景下产生的。

发明内容

本发明的任务在于提供一种重组人金属硫蛋白Ⅲα片段纯品的制备方法，该方法有助于摒弃GST亲和层析柱而藉以显著降低制备成本、有利于防止酶切后金属硫蛋白片段出现大量聚合而藉以避免因聚合导致的沉淀析出等活性损失和有益于去除空间构象不正确的金属硫蛋白组分而藉以得到正确空间结构及生物活性的重组人金属硫蛋白Ⅲα片段。

本发明的任务是这样来完成的，一种重组人金属硫蛋白Ⅲα片段纯品的制备方法，包括以下步骤：

A)制备融合蛋白溶液，先将收集的重组人金属硫蛋白菌泥重悬于第一缓冲液，再进行超声破碎，而后离心分离，收集第一上清液，得到融合蛋白溶液，所述的融合蛋白溶液为含有重组人金属硫蛋白IIIα片段的融合蛋白溶液；

B)制备融合蛋白粗品，用硫酸铵对由步骤A）得到的第一上清液进行分级沉淀并且控制分级沉淀的工艺参数，得到融合蛋白粗品；

C)制备巯基峰流穿液，先将由步骤B）得到的融合蛋白粗品重悬于第二缓冲液中，得到重悬液，并用pH调节剂对重悬液的pH值进行调节，再离心分离而藉以除去不溶的杂蛋白，收集第二上清液，将该第二上清液上样于经第二缓冲液预平衡的分子筛层析柱，收集巯基峰流穿液；

D)制备酶切液，先用超滤膜对由步骤C）得到的巯基峰流穿液超滤并浓缩，得到浓缩液，再对该浓缩液的pH值进行调节，而后加入硫酸锌和凝血酶并搅拌，得到酶切液；

E)制备含重组人金属硫蛋白IIIα片段的上清液，先对由步骤D）得到的酶切液加热而藉以使杂质蛋白热变沉淀，再离心分离，得到上层的含重组人金属硫蛋白IIIα片段的上清液；

F)制备穿透液，向由步骤E）得到的含重组人金属硫蛋白IIIα片段的上清液中加入电导率调节剂对电导率进行调整，直至含重组人金属硫蛋白IIIα片段上清液的电导率与第三缓冲液的电导率相当，再将调整了电导率的所述含重组人金属硫蛋白IIIα片段的上清液上样于经第三缓冲液预先平衡的疏水层析柱，收集穿透液，待用；

G)制备成品，先对由步骤F）得到的穿透液用超滤膜超滤脱盐，再上样于经第四缓冲液平衡的阴离子交换层析柱，再由第四缓冲液与第五缓冲液组成的洗脱液进行梯度洗脱，分瓶收集，取巯基峰洗脱液超滤脱盐，冷冻干燥成冻干粉，得到重组人金属硫蛋白Ⅲα片段纯品。

在本发明的一个具体的实施例中，步骤A）中所述的第一缓冲液与所述的重组人金属硫蛋白菌泥的体积质量比为2-4∶1；

在本发明的另一个具体的实施例中，所述的第一缓冲液为pH为6.6-7.8的一倍磷酸盐缓冲溶液（1×PBS）。

在本发明的又一个具体的实施例中，步骤B）中所述的用硫酸铵对所述第一上清液进行分级沉淀包括一级沉淀和二级沉淀，所述的控制分级沉淀的工艺参数是指控制一级沉淀的工艺参数和控制二级沉淀的工艺参数。

在本发明的再一个具体的实施例中，所述的控制一级沉淀的工艺参数为：先对所述第一上清液的温度调节，再在搅拌状态下徐缓加入固体硫酸铵至百分饱和度为20%-40%，待硫酸铵完全溶解后，静置，得到一级沉淀物；所述的控制二级沉淀的工艺参数为：先对所述的一级沉淀物离心分离，收集上层液，再对上层液的温度调节，而后在搅拌状态下缓慢加入固体硫酸铵将所述的上层液的百分饱和度提高至60%-80%，待硫酸铵完全溶解后再次静置，得到二级沉淀物，再经离心分离，得到所述的融合蛋白粗品。

在本发明的还有一个具体的实施例中，所述的对所述第一上清液的温度调节是将第一上清液的温度调节至20-30℃，所述的静置是在20-30℃下静置80-100min；所述的对上层液的温度调节是将上层液的温度调节为20-30℃，所述的再次静置是在20-30℃下静置过夜。

在本发明的更而一个具体的实施例中，步骤C）中所述的第二缓冲液为30mmol/L的并且pH值为7.8-8.2的三（羟甲基）氨基甲烷盐酸缓冲液（Tris-Hcl）；所述的用pH调节剂对重悬液的pH值进行调节是指用1mol/L的三（羟甲基）氨基甲烷水溶液将重悬液的pH值调节至7.5-8.5；所述的分子筛层析柱为分子筛葡聚糖凝胶G75层析柱。

在本发明的进而一个具体的实施例中，步骤D）中所述的用超滤膜对所述巯基峰流穿液超滤是指用10K超滤膜对巯基峰流穿液超滤，所述浓缩是将经超滤后的巯基峰流穿液浓缩5倍；所述的对浓缩液的pH值进行调节是采用1mol/L的三（羟甲基）氨基甲烷将浓缩液的pH值调节至7.8-8.2；所述加入硫酸锌的加入量为使所述酶切液中硫酸锌的最终浓度达到0.1mmol/L；所述的凝血酶的加入量为每100g所述重组人金属硫蛋白菌泥中加入10000U；所述搅拌是在温度为20-25℃下缓慢搅拌14-18h。

在本发明的又更而一个具体的实施例中，步骤E）中所述的对酶切液加热的加热温度为60-70℃，加热时间为2-5min；。

在本发明的又进而一个具体的实施例中，步骤F）中所述的电导率调节剂为硫酸铵；所述的第三缓冲液为pH值为6.5-7.3的30mmol/L的三（羟甲基）氨基甲烷盐酸缓冲液，并加入硫酸铵至硫酸铵的最终浓度为1mol/L；所述的电导率为190-210ms/cm；所述的疏水层析柱为苯基-琼脂糖凝胶层析柱。

在本发明的还进而一个具体的实施例中，步骤G）中所述的超滤膜为3K的超滤膜，所述的第四缓冲液为pH为7.8-8.2的30mmol/L的三（羟甲基）氨基甲烷盐酸缓冲液；所述的阴离子交换层析柱为DEAE琼脂糖凝胶层析柱；所述的第五缓冲液为pH为7.8-8.2的300mmol/L的三（羟甲基）氨基甲烷盐酸缓冲液；所述的洗脱液的体积为3-5倍于所述DEAE琼脂糖凝胶柱层析柱的体积；所述的洗脱液梯度洗脱是指第四缓冲液与第五缓冲液由二元梯度泵梯度混合洗脱，梯度比例变化为在3-5个DEAE琼脂糖凝胶层析柱的体积洗脱时间内，第四缓冲液的量从起始时的100%直至逐渐减量到最后的0%，而第五缓冲液的量从起始时的0%逐渐增量到最后的100%。

本发明提供的技术方案的技术效果在于：由于采用了分子筛层析柱、疏水层析柱以及阴离子交换层析柱三类不同层析柱的搭配，因而在得以获得高纯度重组人金属硫蛋白Ⅲα片段的同时，避免使用昂贵的GST亲和层析柱，显著地降低了制备成本（不到已有技术制备成本的50%）；由于向酶切液中加入硫酸锌，因而既可促进金属硫蛋白空间结构的正确折叠并且有效地防止金属硫蛋白片段聚合析出，又能减少金属硫蛋白活性损失；由于疏水层析柱的使用可以有效的分离并除去空间构象不正确的蛋白片段，从而使得获得的重组人金属硫蛋白IIIa片段具有正确的空间结构及理想的生物活性。

具体实施方式

实施例1：

A)制备融合蛋白溶液，先将收集的重组人金属硫蛋白菌泥重悬于第一缓冲液，再进行超声破碎，而后离心分离，收集第一上清液，得到融合蛋白溶液，所述的融合蛋白溶液为含有重组人金属硫蛋白IIIα片段的融合蛋白溶液，在本步骤中，前述的第一缓冲液与收集的重组人金属硫蛋白菌泥的体积比为2∶1，前述的第一缓冲液为pH7.8的一倍磷酸盐缓冲溶液（即为1×PBS），前述的收集的重组人金属硫蛋白菌泥是指：在对重组人金属硫蛋白工程菌发酵后经离心收集发酵菌体，前述的重组人金属硫蛋白工程菌保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，该保藏管理中心的地址为：“北京市朝阳区北辰西路1号院3号”（中国科学院微生物研究所；邮编100101）；重组人金属硫蛋白工程菌的保藏编号为：（GMCCNO.14832），在本实施例中，前述收集的重组人金属硫蛋白菌泥选自由中国江苏省苏州汇涵医用科技发展有限公司生产的并且在本申请提出以前向外销售的牌号为JSHH-MT-H的重组人金属硫蛋白菌泥；

B)制备融合蛋白粗品，用硫酸铵对由步骤A）得到的第一上清液进行分级沉淀并且控制分级沉淀的工艺参数，得到融合蛋白粗品，在本步骤中，前述的分级沉淀包括一级沉淀和二级沉淀，一级沉淀的工艺参数为：先对前述第一上清液的温度调节至20℃，再在搅拌状态下徐缓加入固体硫酸铵至百分饱和度为40%，待硫酸铵完全溶解后在30℃下静置80min，得到一级沉淀物；二级沉淀的工艺参数为：先对前述的一级沉淀物离心分离，收集上层液，再对上层液的温度调节至30℃，而后在搅拌状态下缓慢加入固体硫酸铵将所述上层液的百分饱和度提高至60%。待硫酸铵完全溶解后在30℃下再次静置过夜，得到二级沉淀物，再经离心分离，得到前述的融合蛋白粗品，前述第二沉淀实质上是在第一级沉淀的固体硫酸铵的百分饱和度40%的基础上提高到60%；

C)制备巯基峰流穿液，先将由步骤B）得到的融合蛋白粗品重悬于第二缓冲液中，得到重悬液，并用pH调节剂对重悬液的pH值进行调节，再离心分离而藉以除去不溶的杂蛋白，收集第二上清液，将该第二上清液上样于经第二缓冲液预平衡的分子筛层析柱，收集巯基峰流穿液，在本步骤中前述的第二缓冲液为30mmol/L的并且pH值为7.8的三（羟甲基）氨基甲烷盐酸缓冲液（Tris-Hcl）；前述的用pH调节剂对重悬液的pH值进行调节是指用1mol/L的三（羟甲基）氨基甲烷水溶液将重悬液的pH值调节至8；前述的分子筛层析柱为分子筛葡聚糖凝胶G75层析柱；

D)制备酶切液，先用10K超滤膜对由步骤C）得到的巯基峰流穿液超滤并将巯基峰流穿液浓缩至其体积的五分之一，即浓缩5倍，得到浓缩液，再对该浓缩液的pH值进行调节，而后加入硫酸锌和凝血酶并搅拌，得到酶切液，在本步骤中前述的对浓缩液的pH值进行调节是采用1mol/L的三（羟甲基）氨基甲烷将浓缩液的pH值调节至8.2；前述加入硫酸锌的加入量为使前述酶切液中硫酸锌的最终浓度为0.1mmol/L，前述的凝血酶的加入量为每100g的重组人金属硫蛋白菌泥中加入10000U；前述搅拌是在温度为20℃下缓慢搅拌18h，由于空间结构折叠正确的金属硫蛋白分子内部需要螯合大量的金属离子，该金属离子通常为锌，因而加入硫酸锌，在金属硫蛋白形成空间结构初期提供一定量的锌是十分必要的也是十分有益的；

E)制备含重组人金属硫蛋白IIIα片段的上清液，先对由步骤D）得到的酶切液加热至60℃，在60℃下维持5min（即持续加热5min）而藉以使杂质蛋白热变沉淀，再离心分离，得到上层的含重组人金属硫蛋白IIIα片段的上清液；

F)制备穿透液，向由步骤E）得到的含重组人金属硫蛋白IIIα片段的上清液中加入电导率调节剂对电导率进行调整，直至含重组人金属硫蛋白IIIα片段上清液的电导率与第三缓冲液的电导率相当，再将调整了电导率的所述含重组人金属硫蛋白IIIα片段的上清液上样于经第三缓冲液预先平衡的疏水层析柱，收集穿透液，待用，在本步骤中，前述的电导率调节剂为硫酸铵；前述的第三缓冲液为pH值为7.3的30mmol/L的三（羟甲基）氨基甲烷盐酸缓冲液，并加入硫酸铵至硫酸铵的最终浓度为1mol/L；前述的电导率为190ms/cm；前述的疏水层析柱为苯基-琼脂糖凝胶层析柱，因空间结构折叠正确的金属硫蛋白由于内部螯合了大量的金属离子，其空间结构具有一定的刚性，即便在高盐环境下其疏水集团亦不易与疏水层析介质相互作用，即不会挂在柱上而从穿透液中流出，相反空间结构折叠不正确的则吸附在柱上，本步骤中利用疏水层析柱即利用苯基-琼脂糖凝胶层析柱可将其分离，从而使得获得的重组人金属硫蛋白IIIa片段具有正确的空间结构及理想的生物活性；

G)制备成品，先对由步骤F）得到的穿透液用3K超滤膜超滤脱盐，再上样于经第四缓冲液平衡的阴离子交换层析柱，再由第四缓冲液与第五缓冲液组成的洗脱液进行梯度洗脱，分瓶收集，取巯基峰洗脱液超滤脱盐，冷冻干燥成冻干粉，得到重组人金属硫蛋白Ⅲα片段纯品，在本步骤中，前述的第四缓冲液为pH为8.2的30mmol/L的三（羟甲基）氨基甲烷盐酸缓冲液；前述的阴离子交换层析柱为DEAE琼脂糖凝胶层析柱；前述的第五缓冲液为pH为7.8的300mmol/L的三（羟甲基）氨基甲烷盐酸缓冲液；所述的洗脱液的体积为5倍于所述DEAE琼脂糖凝胶柱层析柱的体积，前述的洗脱液梯度洗脱是指第四缓冲液与第五缓冲液由二元梯度泵梯度混合洗脱，梯度比例变化为：在5个DEAE琼脂糖凝胶层析柱的体积洗脱时间内，第四缓冲液的量从起始时的100%直至逐渐减量到最后的0%，而第五缓冲液的量从起始时的0%逐渐增量到最后的100%。

实施例2：

仅将步骤A）中的第一缓冲液与收集的重组人金属硫蛋白菌泥的体积比改为4∶1，将第一缓冲液的pH值改为pH6.6；将步骤B）中的对调节第一上清液的温度改为25℃，在搅拌状态下徐缓加入固体硫酸铵的百分饱和度改为30%，将待硫酸铵完全溶解后的静置温度改为25℃并将静置时间改为90min，将对上层液的调节温度改为20℃，将在搅拌状态下缓慢加入固体硫酸铵对上层液的百分饱和度提高程度改为70%，将再次静置的温度改为20℃；将步骤C）中的第二缓冲液的pH值改为8.2，将重悬液的pH值改为8，将步骤D）中的三（羟甲基）氨基甲烷对浓缩液的pH值调节的pH值改为8，将搅拌温度和时间分别改为22℃和16h；将步骤E）中的对酶切液加热的加热温度并维持的时间分别改为65℃和3min；将步骤F）中的第三缓冲液的pH值改为6.5，将电导率改为210ms/cm；将步骤G）中的第四缓冲液的pH改为8，将第五缓冲液的pH改为8.2，将洗脱液的体积改为4倍于DEAE琼脂糖凝胶柱层析柱的体积，将梯度比例变化改为：在4个DEAE琼脂糖凝胶层析柱的体积洗脱时间内，第四缓冲液的量从起始时的100%直至逐渐减量到最后的0%，而第五缓冲液的量从起始时的0%直至逐渐增量至最后的100%。

实施例3：

仅将步骤A）中的第一缓冲液与收集的重组人金属硫蛋白菌泥的体积比改为3∶1，将第一缓冲液的pH值改为pH7.2；将步骤B）中的对调节第一上清液的温度改为30℃，在搅拌状态下徐缓加入固体硫酸铵的百分饱和度改为20%，将待硫酸铵完全溶解后的静置温度改为20℃并将静置时间改为100min，将对上层液的调节温度改为25℃，将在搅拌状态下缓慢加入固体硫酸铵对上层液的百分饱和度提高程度改为80%，将再次静置的温度改为25℃；将步骤C）中的第二缓冲液的pH值改为8，将重悬液的pH值改为8.5，将步骤D）中的三（羟甲基）氨基甲烷对浓缩液的pH值调节的pH值改为7.8，将搅拌温度和时间分别改为25℃和14h；将步骤E）中的对酶切液加热的加热温度并维持的时间分别改为70℃和2min；将步骤F）中的第三缓冲液的pH值改为6.8，将电导率改为200ms/cm；将步骤G）中的第四缓冲液的pH改为8.2，将第五缓冲液的pH改为8，将洗脱液的体积改为3倍于DEAE琼脂糖凝胶柱层析柱的体积，将梯度比例变化改为：在3个DEAE琼脂糖凝胶层析柱的体积洗脱时间内，第四缓冲液的量从起始时的100%直至逐渐减量到最后的0%，而第五缓冲液的量从起始时的0%直至逐渐增量至最后的100%。

蛋白纯度常规检测法可采用：SDS（十二烷基硫酸钠）-聚丙烯酰胺凝胶电泳法，本实施例1至3中所生产最终产品蛋白纯度均大于95%，在电泳中均显示单一条带。操作方法可参考2015年药典通则0541电泳法第五法 ：SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法。

Claims (11)

1.一种重组人金属硫蛋白Ⅲα片段纯品的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

A)制备融合蛋白溶液，先将收集的重组人金属硫蛋白菌泥重悬于第一缓冲液，再进行超声破碎，而后离心分离，收集第一上清液，得到融合蛋白溶液，所述的融合蛋白溶液为含有重组人金属硫蛋白IIIα片段的融合蛋白溶液；

B)制备融合蛋白粗品，用硫酸铵对由步骤A）得到的第一上清液进行分级沉淀并且控制分级沉淀的工艺参数，得到融合蛋白粗品；

C)制备巯基峰流穿液，先将由步骤B）得到的融合蛋白粗品重悬于第二缓冲液中，得到重悬液，并用pH调节剂对重悬液的pH值进行调节，再离心分离而藉以除去不溶的杂蛋白，收集第二上清液，将该第二上清液上样于经第二缓冲液预平衡的分子筛层析柱，收集巯基峰流穿液；

D)制备酶切液，先用超滤膜对由步骤C）得到的巯基峰流穿液超滤并浓缩，得到浓缩液，再对该浓缩液的pH值进行调节，而后加入硫酸锌和凝血酶并搅拌，得到酶切液；

E)制备含重组人金属硫蛋白IIIα片段的上清液，先对由步骤D）得到的酶切液加热而藉以使杂质蛋白热变沉淀，再离心分离，得到上层的含重组人金属硫蛋白IIIα片段的上清液；

F)制备穿透液，向由步骤E）得到的含重组人金属硫蛋白IIIα片段的上清液中加入电导率调节剂对电导率进行调整，直至含重组人金属硫蛋白IIIα片段上清液的电导率与第三缓冲液的电导率相当，再将调整了电导率的所述含重组人金属硫蛋白IIIα片段的上清液上样于经第三缓冲液预先平衡的疏水层析柱，收集穿透液，待用；

G)制备成品，先对由步骤F）得到的穿透液用超滤膜超滤脱盐，再上样于经第四缓冲液平衡的阴离子交换层析柱，再由第四缓冲液与第五缓冲液组成的洗脱液进行梯度洗脱，分瓶收集，取巯基峰洗脱液超滤脱盐，冷冻干燥成冻干粉，得到重组人金属硫蛋白Ⅲα片段纯品。

2.根据权利要求1所述的重组人金属硫蛋白Ⅲα片段纯品的制备方法，其特征在于步骤A）中所述的第一缓冲液与所述的重组人金属硫蛋白菌泥的体积质量比为2-4∶1。

3.根据权利要求1或2所述的重组人金属硫蛋白Ⅲα片段纯品的制备方法，其特征在于所述的第一缓冲液为pH为6.6-7.8的一倍磷酸盐缓冲溶液。

4.根据权利要求1所述的重组人金属硫蛋白Ⅲα片段纯品的制备方法，其特征在于步骤B）中所述的用硫酸铵对所述第一上清液进行分级沉淀包括一级沉淀和二级沉淀，所述的控制分级沉淀的工艺参数是指控制一级沉淀的工艺参数和控制二级沉淀的工艺参数。

5.根据权利要求4所述的重组人金属硫蛋白Ⅲα片段纯品的制备方法，其特征在于所述的控制一级沉淀的工艺参数为：先对所述第一上清液的温度调节，再在搅拌状态下徐缓加入固体硫酸铵至百分饱和度为20%-40%，待硫酸铵完全溶解后，静置，得到一级沉淀物；所述的控制二级沉淀的工艺参数为：先对所述的一级沉淀物离心分离，收集上层液，再对上层液的温度调节，而后在搅拌状态下缓慢加入固体硫酸铵将所述的上层液的百分饱和度提高至60%-80%，待硫酸铵完全溶解后再次静置，得到二级沉淀物，再经离心分离，得到所述的融合蛋白粗品。

6.根据权利要求5所述的重组人金属硫蛋白Ⅲα片段纯品的制备方法，其特征在于所述的对所述第一上清液的温度调节是将第一上清液的温度调节至20-30℃，所述的静置是在20-30℃下静置80-100min；所述的对上层液的温度调节是将上层液的温度调节为20-30℃，所述的再次静置是在20-30℃下静置过夜。

7.根据权利要求1所述的重组人金属硫蛋白Ⅲα片段纯品的制备方法，其特征在于步骤C）中所述的第二缓冲液为30mmol/L的并且pH值为7.8-8.2的三（羟甲基）氨基甲烷盐酸缓冲液（Tris-Hcl）；所述的用pH调节剂对重悬液的pH值进行调节是指用1mol/L的三（羟甲基）氨基甲烷水溶液将重悬液的pH值调节至7.5-8.5；所述的分子筛层析柱为分子筛葡聚糖凝胶G75层析柱。

8.根据权利要求1所述的重组人金属硫蛋白Ⅲα片段纯品的制备方法，其特征在于步骤D）中所述的用超滤膜对所述巯基峰流穿液超滤是指用10K超滤膜对巯基峰流穿液超滤，所述浓缩是将经超滤后的巯基峰流穿液浓缩5倍；所述的对浓缩液的pH值进行调节是采用1mol/L的三（羟甲基）氨基甲烷将浓缩液的pH值调节至7.8-8.2；所述加入硫酸锌的加入量为使所述酶切液中硫酸锌的最终浓度达到0.1mmol/L；所述的凝血酶的加入量为每100g所述重组人金属硫蛋白菌泥中加入10000U；所述搅拌是在温度为20-25℃下缓慢搅拌14-18h。

9.根据权利要求1所述的重组人金属硫蛋白Ⅲα片段纯品的制备方法，其特征在于步骤E）中所述的对酶切液加热的加热温度为60-70℃，加热时间为2-5min；。

10.根据权利要求1所述的重组人金属硫蛋白Ⅲα片段纯品的制备方法，其特征在于步骤F）中所述的电导率调节剂为硫酸铵；所述的第三缓冲液为pH值为6.5-7.3的30mmol/L的三（羟甲基）氨基甲烷盐酸缓冲液，并加入硫酸铵至硫酸铵的最终浓度为1mol/L；所述的电导率为190-210ms/cm；所述的疏水层析柱为苯基-琼脂糖凝胶层析柱。

11.根据权利要求1所述的重组人金属硫蛋白Ⅲα片段纯品的制备方法，其特征在于步骤G）中所述的超滤膜为3K的超滤膜，所述的第四缓冲液为pH为7.8-8.2的30mmol/L的三（羟甲基）氨基甲烷盐酸缓冲液；所述的阴离子交换层析柱为DEAE琼脂糖凝胶层析柱；所述的第五缓冲液为pH为7.8-8.2的300mmol/L的三（羟甲基）氨基甲烷盐酸缓冲液；所述的洗脱液的体积为3-5倍于所述DEAE琼脂糖凝胶柱层析柱的体积；所述的洗脱液梯度洗脱是指第四缓冲液与第五缓冲液由二元梯度泵梯度混合洗脱，梯度比例变化为在3-5个DEAE琼脂糖凝胶层析柱的体积洗脱时间内，第四缓冲液的量从起始时的100%直至逐渐减量到最后的0%，而第五缓冲液的量从起始时的0%逐渐增量到最后的100%。