CN104830690A

CN104830690A - 活性工程酵母的制备方法

Info

Publication number: CN104830690A
Application number: CN201510274687.2A
Authority: CN
Inventors: 赵德刚; 宋莉; 刘宗
Original assignee: Guizhou University
Current assignee: Guizhou University
Priority date: 2015-05-27
Filing date: 2015-05-27
Publication date: 2015-08-12

Abstract

本发明提供了一种活性工程酵母的制备方法。发明通过真空冷冻干燥法对诱导表达的基因工程酿酒酵母进行干燥制备，生产含有鸡干扰素药用蛋白的饲用微生态制剂。本发明制备获得的饲用工程酵母菌存活率高达80.81%，这为生产酵母添加剂进行家禽疫病防治奠定了工艺基础。本发明方法简单易行，成本低廉，使用效果好。

Description

活性工程酵母的制备方法

技术领域

本发明涉及生物科学技术领域，尤其是一种活性工程酵母的制备方法。

背景技术

酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）是一种良好的营养与保健饲料添加剂，其活性与功能密切相关。作为最早用于基因工程的酵母菌株，酿酒酵母表达的重组蛋白能有效保持生物学活性，人类已经获得一些通过酿酒酵母表达系统生产的重要药用蛋白（宋宏新等, 2001）。鸡γ干扰素（ChIFN-γ）具有高效免疫调节、抗病毒、抗肿瘤细胞增殖、提高抗逆性和促进生长等多种重要生理功用，是养禽业中防治鸡新城疫、传染性支气管炎、传染性法氏囊、减蛋综合征等多种病毒性传染病的重要药物。对表达具有极高临床价值的ChIFN-γ活性酿酒酵母工程菌进行生产，用于家禽饲料添加剂，可以实现畜牧业中干扰素的便利、低成本供给和产业化生产等问题。

发明内容

本发明的目的是：提供一种活性工程酵母的制备方法，它能获得具有高活性，且可供制备活性酵母干粉的工程菌，以克服现有技术的不足。

本发明是这样实现的：活性工程酵母的制备方法，包括下列步骤：

1）工程菌株的发酵：利用SC选择培养基进行工程菌筛选，将基因工程酵母菌株接种于SC选择培养基上，在30℃下倒置培养至单菌落长出后，挑取活化后的单菌落于YPD酵母菌完全液体培养基中过夜培养；

2）重组蛋白的诱导表达：利用质量百分比浓度为3%的半乳糖溶液作为诱导剂作为诱导剂，将过夜活化培养的菌种接种到诱导培养基中,使其OD₆₀₀为0.4，并在30℃、200rpm的条件下振荡培养，实现诱导重组蛋白的表达；

3）表达蛋白检测：利用聚丙烯酰胺凝胶电泳、酶联免疫吸附试验和质谱相结合的方式检测重组蛋白的表达情况；

4）工程菌的真空冷冻干燥：将诱导表达的菌液在5000rpm下离心20min，收集菌体，加入保护剂并混合均匀后进行真空冷冻干燥，通过菌体含水量测定和显微镜检测相结合进行干燥工艺参数的控制工程酵母菌粉的含水量为5-6%，显微镜检测的标准是，工程酵母菌粉的细胞存活率为75以上%；；

5）活性酵母检测：以存活率为指标，利用血球计数板法进行活菌计数；通过对复性后的制备干粉酵母的不同时段的生长曲线测定和活菌数统计，判断制备酵母的活性质量，即复性后的工程酵母细胞形态正常与否和存活率。

步骤4）中所述的保护剂中包括质量百分比浓度为12-16g/100mL的脱脂奶粉、质量百分比浓度为12-16g/100mL蔗糖以及质量百分比浓度为1.0-1.3g/100mL聚乙二醇，其余为水。

步骤4）所述的真空冷冻干燥为，先在﹣80℃预冷冻1h，放入真空冷冻干燥机进行干燥，温度为﹣80℃，真空度为3～10Pa，干燥时间为8 -10 h。

由于采用了以上技术方案，与现有技术相比，本发明通过真空冷冻干燥法对诱导表达的基因工程酿酒酵母进行干燥制备，生产含有鸡干扰素药用蛋白的饲用微生态制剂。本发明制备获得的饲用工程酵母菌存活率高达80.81%，这为生产酵母添加剂进行家禽疫病防治奠定了工艺基础。本发明方法简单易行，成本低廉，使用效果好。

附图说明

图 1 INVSC1/pYEIFNG工程菌株裂解蛋白的SDS-PAGE电泳检测；

图1中，M: 标准分子量蛋白; 1: INVSC1菌株; 2、3: INVSC1/pYEIFNG13菌株；

图 2 rChIFNG表达蛋白的ELISA检测；

图3 INVSC1/pYEIFNG13重组蛋白的质谱检测图谱；

图4 样品酵母在真空冷冻干燥过程中的含水量变化；

图5 真空冷冻干燥制备的酵母干粉及其显微活性观察；

图6 活性酵母的生长曲线。

具体实施方式

本发明的实施例1：活性工程酵母的制备方法，

1．菌株

ChIFN-γ基因工程酿酒酵母INVSc1/ChIFNG菌株为贵州大学农业生物工程研究院创制保存。

2．工程菌株的筛选培养

（1）INVSc1/ChIFNG保种菌株于Ura缺陷SC酵母筛选培养基平板中划线活化，28℃培养24～48h。

（2）挑取活化的酵母单菌落于15 mL SC选择培养基中，置30℃、200r/min 过夜振荡培养，测定菌液OD₆₀₀值。

3．酵母工程菌的诱导表达

（1）SC菌体培养液于 1500×g、常温离心 5 min，弃上清后的沉淀重悬于50 mL已添加半乳糖的YPD诱导培养基中，并保证最终OD₆₀₀=0.4。

（2）菌体重悬液于30℃、200r/min 过夜振荡培养12h，测定OD₆₀₀数值后，1500×g、4℃离心5min，弃上清。

（3）用500μL灭菌水重悬细胞后，10000 r/min 离心 30 s，弃上清，菌体–80℃保存备用。

4.干扰素重组蛋白的检测

（1）酵母细胞裂解

a 将–80℃诱导重组蛋白后的工程菌体取出，重悬于500μL裂解缓冲液中，1500×g、4 ℃离心 5 min，弃上清。

b 根据以上3（2）步骤中诱导培养基菌液OD₆₀₀数值，加入适量的裂解液重悬菌体沉淀，使其OD₆₀₀=50~100。

c 加入等体积的酸洗玻璃珠，涡旋振荡30s后冰浴30s，重复4次该过程以充分裂解细胞。

d 裂解细胞液于4 ℃、10000 r/min ，离心10min，上清置﹣20℃保存备用。

（2）SDS-PAGE 电泳检测表达产物

a 样品处理：上述4（1）d步骤中制备的酵母细胞裂解液上清加入等体积的 2×SDS-PAGE 样品处理液（50mM pH 6.8 Tris-HCl，5%巯基乙醇，2%SDS，0.1%溴酚蓝，10%甘油），沸水浴中煮10 min后，10000 r/min 离心 2min，取上清液上样电泳。

b 采用5%浓缩胶、12%分离胶，120V浓缩胶、200V分离胶电泳1h后，染色液（45%甲醇，10%乙酸，0.25%考马斯亮蓝 R-250）常温过夜染色。弃去染色液，用蒸馏水把胶面漂洗2~3次，然后加入脱色液（25%甲醇，10%乙酸），脱色3~4 次至背景清晰透明。

（3）重组蛋白的酶联免疫吸附试验（ELISA）定量分析

采用上述4（1）所述方法制备工程酵母蛋白裂解液，使用美国RB公司的 Chook IFN-γ ELISA Kit测定重组干扰素蛋白含量，利用碧云天的BCA蛋白浓度测定试剂盒测定酵母总蛋白，根据吸光值OD₄₅₀和样品稀释倍数计算重组蛋白占酵母菌体总蛋白的比例。

（4）表达产物的质谱检测

采用上述3所述方法对INVSC1/pYE-IFNG13工程菌株进行诱导表达，采用上述4（1）所述方法裂解细胞提取总蛋白后进行SDS-PAGE电泳，用考马斯亮蓝染胶脱色液（50％ACN（乙腈）、100mM NH₄HCO₃、pH8.0）对胶块进行脱色处理；使用Promega 的trypsin酶液对胶块进行酶解处理；将经酶解处理的清液进行冷冻干燥处理后复溶于0.1%的甲酸水（质谱级）溶液中；2000 ×g 离心20 min，小心取上清到内衬管中，上质谱仪分析。

5. 工程菌的真空冷冻干燥

保护剂采用优化后的质量浓度，蔗糖（14.44g/100mL）、脱脂奶粉（10.08g/100mL）及的聚乙二醇（1.11g/100mL）均用蒸馏水配制灭菌后于4℃冰箱保存备用。在无菌条件下，按保护剂与菌体体积比1:1加入保护剂，混匀后室温平衡30min，干燥培养皿中混合液的厚度控制在5cm左右。将保护剂与菌体混合液置-80℃冰箱预冻时间1 h后，在-80℃、3～10Pa真空度条件下低温真空干燥8 h-10 h，干燥过程中对菌体含水量和菌体形态保持进行监测。

6. 酵母活性检测

冻干酵母粉复性后检测活菌数，计算菌体存活率，然后接种到YPD完全培养基中，在30℃、200r/min条件下振荡培养，分别测定0、2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24h生长时的OD₆₀₀值，绘制生长曲线。活菌计数采用血球计数板法，每个样品重复三次，取平均值计算细胞存活率，计算公式为：细胞存活率（%）=活细胞个数/（活细胞个数+死细胞个数）。

（二）结果

1. 重组干扰素蛋白的SDS-PAGE电泳鉴定

INVSc1/pYEIFNG13工程菌株经半乳糖诱导后，采用酸性玻璃珠裂解酵母细胞提取总蛋白。SDS-PAGE电泳图谱（图1）经BIO-RAD的Image Lab软件分析，在39.0KDa大小位置检测到目标条带。

2. 重组蛋白的ELISA定量分析

对工程酵母诱导表达蛋白进行的ELISA检测分析得到，13号菌株INVSc1/pYEIFNG13中重组蛋白表达量最高（图2），含量为44.29 ng/L，rChIFN-γ蛋白占菌体总蛋白的1.438×10^-6%

3. 重组干扰素蛋白的质谱分析

INVSC1/pYEIFNG13工程菌株经半乳糖诱导后，采用酸性玻璃珠裂解酵母细胞提取总蛋白，对其总蛋白进行质谱分析。质谱分析结果（图3）表明：在经半乳糖诱导表达后的INVSC1/pYEIFNG13酵母工程菌株的总蛋白中检测到rChIFN-γ肽段。

4. 工程菌的真空冷冻干燥

采用蔗糖、脱脂奶粉或聚乙二醇保护剂对低温真空干燥的工程菌体进行保护，在-80℃、3～10Pa真空度条件下低温真空干燥8 h后，工程酵母粉的含水量降至5.63%（图4），成粉质量好（图5），酵母菌体形态正常（图5）。

5. 制备的酵母活性检测

通过本发明中所述的低温真空冻干法制备的酿酒工程酵母菌株，复性后经不同时段的生长曲线测定表明（图6），其发酵生长正常，适应期是0~6h、对数生长期为6~16h、在16h之后达到稳定期。采用14.44g/100mL蔗糖、10.08g/100mL脱脂奶粉和1.11g/100mL聚乙二醇的组合保护剂，酿酒酵母工程菌菌体存活率达到80.81%。

本发明所述并不限于具体实施方式中所述的实施例，本领域技术人员根据本发明的技术方案得出其他的实施方式，同样属于本发明的技术创新范围。显然本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术范围内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。

Claims

1.一种活性工程酵母的制备方法，其特征在于：包括下列步骤：

2）重组蛋白的诱导表达：利用质量百分比浓度为3%的半乳糖溶液作为诱导剂，将过夜活化培养的菌种接种到诱导培养基中,使其OD₆₀₀为0.4，并在30℃、200rpm的条件下振荡培养，实现诱导重组蛋白的表达；

4）工程菌的真空冷冻干燥：将诱导表达的菌液在5000rpm下离心20min，收集菌体，加入保护剂并混合均匀后进行真空冷冻干燥，通过菌体含水量测定和显微镜检测相结合进行干燥工艺参数的控制；工程酵母菌粉的含水量为5-6%，显微镜检测的标准是，工程酵母菌粉的细胞存活率为75以上%；

5）活性酵母检测：以存活率为指标，利用血球计数板法进行活菌计数；通过对复性后的制备干粉酵母的不同时段的生长曲线测定和活菌数统计，判断制备酵母的活性质量。

2.根据权利要求1所述的活性工程酵母的制备方法，其特征在于：步骤4）中所述的保护剂中包括质量百分比浓度为12-16g/100mL的脱脂奶粉、质量百分比浓度为12-16g/100mL蔗糖以及质量百分比浓度为1.0-1.3g/100mL聚乙二醇，其余为水。

3.根据权利要求1所述的活性工程酵母的制备方法，其特征在于：步骤4）所述的真空冷冻干燥为，先在﹣80℃预冷冻1h，放入真空冷冻干燥机进行干燥，温度为﹣80℃，真空度为3～10Pa，干燥时间为8 -10 h。