CZ304925B6 - Prostředek obsahující enzym a použití enzymu - Google Patents

Prostředek obsahující enzym a použití enzymu Download PDF

Info

Publication number
CZ304925B6
CZ304925B6 CZ2002-2007A CZ20022007A CZ304925B6 CZ 304925 B6 CZ304925 B6 CZ 304925B6 CZ 20022007 A CZ20022007 A CZ 20022007A CZ 304925 B6 CZ304925 B6 CZ 304925B6
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
enzyme
composition
infection
plc
feed
Prior art date
Application number
CZ2002-2007A
Other languages
English (en)
Other versions
CZ20022007A3 (cs
Inventor
David M. Anderson
Lin Liu
Humg-Yu Hsiao
Douglas W. Fodge
Original Assignee
Eli Lilly And Company
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=22617824&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=CZ304925(B6) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Eli Lilly And Company filed Critical Eli Lilly And Company
Publication of CZ20022007A3 publication Critical patent/CZ20022007A3/cs
Publication of CZ304925B6 publication Critical patent/CZ304925B6/cs

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
    • A61K38/46—Hydrolases (3)
    • A61K38/47—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2), e.g. cellulases, lactases
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23K—FODDER
    • A23K20/00—Accessory food factors for animal feeding-stuffs
    • A23K20/10—Organic substances
    • A23K20/189—Enzymes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
    • A61K38/46—Hydrolases (3)
    • A61K38/465—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1), e.g. lipases, ribonucleases
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/10—Antimycotics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P33/00—Antiparasitic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P33/00—Antiparasitic agents
    • A61P33/02—Antiprotozoals, e.g. for leishmaniasis, trichomoniasis, toxoplasmosis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y301/00—Hydrolases acting on ester bonds (3.1)
    • C12Y301/04—Phosphoric diester hydrolases (3.1.4)
    • C12Y301/04011—Phosphoinositide phospholipase C (3.1.4.11)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01078—Mannan endo-1,4-beta-mannosidase (3.2.1.78), i.e. endo-beta-mannanase
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Animal Husbandry (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Fodder In General (AREA)
  • Coloring Foods And Improving Nutritive Qualities (AREA)

Abstract

Prostředek, který obsahuje (i) enzym vybraný z fosfatidylinositol-specifické fosfolipázy C nebo fosfatidylinositol-specifické fosfolipázy D a (ii) fyziologicky přijatelný nosič pro uvedený enzym je v předmětném řešení ve formě určené pro orální podání. Také je popsáno použití uvedeného enzymu pro výrobu léčiva pro léčbu nebo zmírnění rizika infekce zažívacího traktu, kde uvedené léčivo je určeno pro orální podání. Enzym je účelně endo-1,4-.beta.-D-mannanasa.

Description

Oblast techniky
Předkládaný vynález se týká prostředků obsahujících enzymy a použití enzymů jako antiinfekčních činidel, v souvislosti s léčbou nebo snížením rizika infekcí zažívacího traktu. Předkládaný vynález se konkrétně také týká prostředků, které obsahují endo-1,4- β-D-mannanasu.
Dosavadní stav techniky
V roce 1998 vRevision of the World Population Estimates and Projections předpokládala the United Nations Department of Economic and Sociál Affairs Population Division, že světová populace dosáhne v roce 1999 6 miliard. Zpráva také předpokládala, že zvýšení populace z 5 na 6 miliard bude trvat pouze 12 let, ve srovnání se zvýšením z 1 na 2 miliardy, které trvalo 123 let.
V polovině 21. století se předpokládá populace mezi 7,3 a 10,7 miliardami. Vzestup populace v poslední dekádě je částečně způsoben úspěchy v produkci potravin v důsledku aplikací technologií a intenzifikace produkce potravin. Pro další růst populace budou potřeba ještě účinnější pokroky v produkci potravin.
Jeden způsob pro zefektivnění produkce masa zahrnuje používání antimikrobiálních sloučenin a antibiotik ve zvířecím krmivu. Ve velkých farmách je šíření infekce v podmínkách stád velmi rychlé. Různá onemocnění jsou proto kontrolována profylaktickým nebo terapeutickým používáním těchto substancí, například je běžné používání chemických činidel v potravě pro kontrolu kokcidiových infekcí (zde se používá například salinomycin, monensin, roxarson (3-nitro), halquinol, carbadox a olaquindox), stejně jako antimikrobiální antibiotika (například bacitracin, virginiamycin, tylosín, tetracyklin, chlortetracyklin, penicilín, oleandomycin, novobiocin, lincomycin, bambermyciny, apramycin, spiramycin, erythromycin, neomycin a další). Je dobře známo, že tyto postupy podporují růst a zlepšují přeměnu krmivá.
Nárůst mnohotné antibiotické rezistence u lidských patogenů, jako je Staphylococcus aureus, Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenza, Neisseria gonorrhoeae a Mycobacterium tuberculosis, budí obavy, že rezistence na antibiotika vzniklá u mikrobů asociovaných se zvířaty na farmách, může migrovat na lidské patogeny prostřednictvím přenosných faktorů lékové rezistence. Existují důkazy, že zvířata krmená antibiotiky jsou zdrojem bakterií s přenosnými faktory rezistence. Viz Hooge, Feedstuffs 71(20):59, 1999. Ačkoliv jsou antibiotika používaná u zvířat a u člověka obvykle odlišná, mají podobné mechanismy účinku, což může vést ke zkřížené rezistenci. V jednom případě jsou fluorochinolony schválené pro léčbu infekcí E. coli (colibacilosi) u některých zvířat také používána v humánní medicíně, viz výše Hooge. Nedávno FDA/CVM navrhl odebrání schválení pro použití fluorchinolonu enrofloxacinu u drůbeže z důvodu vzniku kampylobakteru rezistentního na fluorchinolon ajeho přenosu na člověka, viz Murhead, S. Feedstuffs 72(45):14, 2000.
V oblasti masného průmyslu také panuje obava ze snížení zisků a návratu zvířecích chorob po zákazu používání antibiotik a antimikrobiálních činidel v potravě. V roce 1986 například Švédsko zakázalo používání antibiotik v krmivu a zvýšil se počet onemocnění zvířat. Toto bylo doprovázeno zvýšeným používáním terapeutických antibiotik, což vedlo k celkovému zvýšení používání antibiotik v krmivu a zvýšil se počet onemocnění zvířat. Toto bylo doprovázeno zvýšeným používáním terapeutických antibiotik, což vedlo k celkovému zvýšení používání antibiotik, stejně jako ke zvýšení nákladů na produkci masa, viz Smith, Freedstuffs 71(13):1, 1999. V prosinci
1998 Rada ministrů EU rozhodla zakázat používání šesti antimikrobiálních činidel, která byla formálně schválena jako činidla podporující růst přidávaná do krmivá (Úřední věstník Evropských společenství 29. 12. 98, Nařízení Rady č. 282 1/98 týkající se směrnice 70/524). V srpnu
1999 byly také zakázány dvě přísady na bázi chinoxalinu v důsledku zbytků v mase. Důsledkem těchto zákazů bylo také zvýšení prevalence onemocnění formálně považovaných za vymýcené,
- 1 CZ 304925 B6 včetně nekrotické enteritidy u broilerů, enteritidy způsobené Clostridium perfringens u odstavených selat, dysenterie prasat a spirochetového průjmu a E. coli-asociovaného průjmu, viz Miller, United States Animal Health Association, 1999 Proceedings „Antibiotic Usages in Food Animal Production and Resistance-European Perspective.“
Udává se 30 000 lidských úmrtí za rok způsobených nosokomiálními infekcemi rezistentními patogeny, ale mnohem méně úmrtí na infekce patogeny z potravy. Žádné z úmrtí na potravinové patogeny není spojeno s rezistentními na antibiotika (viz Smith, výše). Tak není jasné, zda používání antibiotik při produkci masa přispívá k problému nosokomiálních infekcí rezistentními patogeny u člověka. Dalším problémem je chybění nových antibiotik pro léčbu infekcí způsobených rezistentními patogeny, viz Henry, C. M., Chemical and Engineering News, 6. 3. 2000, str. 41-58. To může znamenat, že když se vyvine patogen významně rezistentní na antibiotika, nemusí být žádné antibiotikum pro léčbu infekce k dispozici. Obtíže při vývoji nových antibiotik, velikost trhu a regulační nařízení způsobily, že většina farmaceutických firem přesunula svůj zájem pryč od vývoje nových antibiotik, zejména pro použití u zvířat. Nová navržená pravidla pro registraci léčiv pro použití u zvířat jsou tak obtížná, že byl vývoj takových léků zastaven. Viz Smith, výše. Nicméně, existuje několik malých společností zabývajících se vývojem nových antibiotik (Henry, výše).
V některých zvířecích populacích je infekce již pandemická. Například ptačí kokcidióza je onemocnění, které je pouze zvládáno, nikoliv pod skutečnou kontrolou. Prakticky všechna hejna jsou infikována a chemická činidla proti kokcidióze jsou běžně střídavě přidávána do potravy, aby se kontrolovalo poškození a omezil vznik rezistentních kmenů. Kokcidióza stojí producenty drůbeže ročně 350 milionů dolarů na ztrátách a nákladech na léky, jako je salinomycin, viz Suszkiw, USDA Agricultural Research Service News, October 28, 1997. V roce 1999 se předpokládalo, že léky proti kokcidiose budou stát v USA přibližně 114 milionů dolarů. Viz Frost & Sullivan, US. Pharmaceutical Products for Food Animals, Report 5245-54, 1995.
Existuje jasná potřeba nových a účinnějších metod pro léčbu infekcí zažívacího traktu u zvířat, která jsou chována v intenzifikovaných chovech. Tato potřeba je založena na potřebě dosažení lepší účinnosti produkce pro potřeby rychle rostoucí světové populace. Lepší kontrola střevních infekcí garantuje rychlejší růst a lepší účinnost krmení. Existuje také potřeba alternativy k používání antibiotik při produkci zvířat, která by řešila možný problém vzniku antibiotické rezistence u lidských patogenů.
Při použití léčby na bázi enzymů, která působí jinak než všechna antibiotika, neexistuje riziko stimulace vývoje rezistentních patogenních mikroorganismů, které by mohly být problémem pro člověka. Protože enzymy jsou proteiny, neexistuje možnost, že by byla nebezpečná chemická rezidua inkorporována v masových výrobcích, jak je tomu u některých antibiotik a činidel proti kokcidiose, viz American Feed Control Officials lne., Oficial Publication, 1999, „Drugs and Feed Additives, Section 30.0 Enzymes, str. 206 až 217, ISBN 1-878341-10-3.
Podstata vynálezu
Předmětem tohoto vynálezu je prostředek, jehož podstata spočívá v tom, že obsahuje (i) enzym vybraný z fosfatidylinositol-specifické fosfolipázy C nebo fosfatidylinositol-specifické fosfolipázy D a (ii) fyziologicky přijatelný nosič pro uvedený enzym, kde uvedený prostředek je ve formě určené pro orální podání.
Výhodné provedení tohoto vynálezu představuje prostředek, jehož podstata spočívá v tom, že má alespoň jeden z dále uvedených znaků:
- jedná o krmivo;
- je prostý jiného antiinfekčního činidla, než je uvedený enzym;
-2CZ 304925 B6
- uvedeným enzymem je fosfatidylinositol-specifická fosfolipáza D;
- uvedeným enzymem je fosfatidylinositol-specifická fosfolipáza C;
- dále zahrnuje stabilizátor, karbohydrátový nosič nebo konzervační přísadu;
- stabilizátorem je pufr, karbohydrát nebo glykol;
- karbohydrátový nosič je vybrán ze skupiny zahrnující xylózu, fruktózu, glukózu, sorbitol a maltotriózu;
- konzervační přísada je vybrána ze skupiny zahrnující propylparaben, sorbát sodný, sorbát draselný a askorbylpalmitát;
- uvedeným nosičem je poživatina, do které je svrchu zmíněný enzym zapracován;
- uvedenou poživatinou je krmivo pro zvířata, složené ze zrnitého materiálu, zdroje proteinů, vitaminů, aminokyselin a minerálů;
- uvedeným zrnitým materiálem je kukuřice, čirok, pšenice, ječmen nebo oves;
- zdrojem proteinů jsou fazole nebo hrách;
- uvedený prostředek je v pevné nebo kapalné formě;
- uvedený enzym je obsažen v tabletě nebo v obalu želatinové kapsle;
- uvedený enzym je připraven z kmene Bacillus cereus;
- uvedený kmen Bacillus cereus je ATCC 7004 nebo ATCC 6464;
- uvedený enzym je získán expresí rekombinantní DNA v hostitelském organismu;
- uvedený hostitelský organismus je z kmene Bacillus megaterium;
- uvedený enzym je přítomen v dávce od 200 IU/kg do 4000 IU/kg krmivá.
Předmětem tohoto vynálezu je také použití enzymu vybraného z fosfatidylinositol-specifické fosfolipázy C nebo fosfatidylinositol-specifické fosfolipázy D pro výrobu léčiva pro léčbu nebo zmírnění rizika infekce zažívacího traktu, kde uvedené léčivo je určeno pro orální podání.
Výhodné provedení tohoto vynálezu představuje použití, jehož podstata spočívá v tom, že má alespoň jeden z dále uvedených znaků:
- uvedený enzym je jediným antiinfekčním činidlem přítomným v uvedeném léčivu;
- uvedená infekce je způsobena protozoámím, bakteriálním, kvasinkovým nebo mykotickým patogenem;
- uvedená infekce je způsobena protozoámím patogenem rodu Eimeria;
- uvedená infekce je způsobena protozoámím patogenem rodu Cryptosporidium;
- uvedená infekce je způsobena bakteriálním patogenem rodu Clostridium;
- uvedený enzym je připraven z kmene Bacillus cereus;
- uvedený kmen Bacillus cereus je ATCC 7004 nebo ATCC 6464;
- uvedený enzym je získán expresí rekombinantní DNA v hostitelském organismu;
- uvedený hostitelský organismus je z kmene Bacillus megaterium;
- uvedený enzymem je fosfatidylinositol-specifická fosfolipáza D;
- uvedeným enzymem je fosfatidylinositol-specifická fosfolipáza C.
Předmětem tohoto vynálezu je rovněž prostředek, jehož podstata spočívá vtom, že obsahuje (i) endo-l,4-|3-D-mannanasu a (ii) fyziologicky přijatelný nosič pro uvedený enzym, kde uvedený prostředek je ve formě určené pro orální podání a kde uvedená endo-l,4-fy-D-mannanasa je jediným antiinfekčním činidlem přítomným v uvedeném prostředku a je přítomna v množství účinném pro léčbu nebo zmírnění rizika infekce zažívacího traktu.
Výhodné provedení tohoto vynálezu představuje též prostředek, jehož podstata spočívá v tom, že má alespoň jeden z dále uvedených znaků:
-3 CZ 304925 B6
- uvedeným nosičem je poživatina, do které je uvedený enzym zapracován;
- uvedenou poživatinou je krmivo pro zvířata složené ze zrnitého materiálu, zdroje proteinů, vitaminů, aminokyselin a minerálů;
- uvedeným zrnitým materiálem je kukuřice, čirok, pšenice, ječmen nebo oves;
- zdrojem proteinů jsou fazole nebo hrách;
- uvedený prostředek je v pevné nebo kapalné formě;
- uvedený enzym je obsažen v tabletě nebo v obalu želatinové kapsle;
- uvedený enzym je připraven z kmene Bacillus lentus;
- uvedený enzym je produkován hostitelským organismem, který je podroben rekombinantní expresi DNA;
- uvedená endo-l,4-[3-D-mannanasa je produkovaná Bacillus lentus s označením ATCC 55045;
- dále zahrnuje stabilizátor, karbohydrátový nosič nebo konzervační přísadu;
- stabilizátorem je pufr, karbohydrát nebo glykol;
- karbohydrátový nosič je vybrán ze skupiny zahrnující xylózu, fruktózu, glukózu, sorbitol a maltotriózu;
- konzervační přísada je vybrána ze skupiny zahrnující propylparaben, sorbát sodný, sorbát draselný a askorbylpalmitát;
- endo-1,4-fy-D-mannanasa se používá pro výrobu orální dávkové formy léčiva pro léčbu nebo zmírnění rizika infekce zažívacího traktu, kde endo-1,4-(3-D_mannanasa je jediným antiinfekčním činidlem přítomným v léčivu;
- uvedená infekce je způsobena protozoámím, bakteriálním, kvasinkovým nebo mykotickým patogenem;
- uvedená infekce je způsobena protozoámím patogenem rodu Eimeria;
- uvedená infekce je způsobena protozoámím patogenem rodu Cryptosporidium;
- uvedená infekce je způsobena bakteriálním patogenem rodu Clostridium;
- uvedený enzym je připraven z kmene Bacillus lentus;
- uvedený enzym je získán expresí rekombinantní DNA v hostitelském organismu;
- endo-l,4-|3-D-mannanasa je produkována Bacillus lentus s označením ATCC 55045;
- enzym je přítomen v koncentraci 200 IU/kg krmivá;
infekce je způsobena virovým patogenem.
Na základě předkládaného vynálezu je možné poskytnout enzymatickou léčbu pro snížení dopadu infekcí zažívacího traktu. Byl nalezen mechanismus snížení dopadu infekce zažívacího traktu, kde uvedený mechanismus interferuje s vazbou patogenů na buňky zažívacího traktu. Ještě dále předmět vynálezu umožňuje zvýšení přírůstku hmotnosti a konverze krmivá u zvířat, která jsou infikována patogeny způsobujícími infekce nebo nekrotizující enteritidu. Předmět předkládaného vynálezu poskytuje dávkovou formu určenou pro orální podání, která je účinná pro zlepšení stavu jedince infikovaného mikrobiálním patogenem nebo rizikového z hlediska takové infekce. Pro splnění těchto a dalších znaků vynález také v jednom aspektu poskytuje prostředek obsahující (i) enzym, který štěpí vazbu, která uskutečňuje uvolňování proteinu nebo karbohydrátu z buněčného povrchu, kde enzym je jiný než endo-l,4-|3-D-mannanasa, a (ii) fyziologicky přijatelný nosič pro enzym, kde prostředek je ve formě určené pro orální podání a neobsahuje jiné antiinfekční činidlo než enzym. V jednom provedení štěpí daný enzym vazbu, která uvolňuje protein buněčného povrchu.
Dále předkládaný vynález umožňuje způsob léčby nebo zmírnění rizika infekce zažívacího traktu, který zahrnuje orální podání jedinci trpícímu infekci nebo rizikovému z hlediska infekce účinného množství enzymu, který štěpí vazbu, která uvolňuje protein nebo karbohydrát z buněčného
-4CZ 304925 B6 povrchu, kde enzym je jiný než endo-l,4-|3-D-mannanasa. Dále způsob nezahrnuje podání jiného antiinfekčního činidla než enzymu. Infekce může být způsobena prvoky, jako je Eitneria a Cryptosporidium, bakteriemi, jako je Clostridium, houbami nebo kvasinkami.
Dále vynález poskytuje prostředek obsahující (i) enzym, který štěpí vazbu, která uvolňuje protein nebo karbohydrát z buněčného povrchu (ii) fyziologicky přijatelný nosič pro enzym, kde prostředek je ve formě určené pro orální podání a neobsahuje antiinfekční činidlo jiné než enzym.
Dále předkládaný vynález umožňuje způsob léčby nebo zmírnění rizika infekce zažívacího traktu, který zahrnuje orální podání - jedinci trpícímu infekci nebo rizikovému z hlediska infekce účinného množství enzymu, který štěpí vazbu, která uvolňuje protein nebo karbohydrát z buněčného povrchu, kde způsob nezahrnuje společné podání antimikrobiálně účinného množství jiného antiinfekčního činidla s enzymem.
Další předměty, vlastnosti a výhody předkládaného vynálezu budou jasné z následujícího podrobného popisu. Podrobný popis a příklady provedení ukazují konkrétní výhodná provedení, ale jsou uvedena pouze pro ilustraci, protože odborníkovi v oboru jsou zřejmé různé modifikace a variace předkládaného vynálezu. Dále, příklady demonstrují princip předkládaného vynálezu, ale neilustrují použití předkládaného vynálezu na všechny příklady infekcí, kde by je odborník v oboru pokládal za použitelné.
Objasnění výkresů
Obr. 1 ukazuje anti-kryptosporidiální aktivitu rekombinantního PI-PLC enzymu produkovaného kmenem Bacillus megaterium.
Podrobný popis vynálezu
Bylo zjištěno, že enzymy určité třídy, charakterizované schopností štěpit vazbu, která uvolňuje proteiny no karbohydráty buněčného povrchu, vykazují pro orálním podání významnou antibiotickou aktivitu, která je účinná například při léčbě infekcí zažívacího traktu. Mezi takové třídy enzymů patří například sfingomyelinasy a fosfolippázy typu C a D a enzymy podobné specificky. Příklady této třídy jsou proto enzymy, které uvolňují glykoproteiny nebo karbohydráty, které jsou zakotveny v membráně vazbou na fosfatidylinositol. Proto je enzym fosfatidylinositol-specifická fosfolippáza C (E. C. 3.1.4.10), též známý pod zkratkou PI-PLC nebo jako 1-fosfatidylinositolfosfodiesteráza, členem této třídy. Jiným příkladem je glykosylfosfatidylinositol-specifická fosfolippáza D, nebo GPI-PLD (Low a Prasad, Proč. Nati. Acad. Sci. 85: 980-984, 1988).
GPI-PLD a PI-PLC enzymy byly popsány z eukaryotických zdrojů, viz Low, „Degradation of glykosyl-fosfatidylinositol anchors by specific fosfolippázes“, kapitola 2, str. 35-63, v MOLECULAR AND CELL BIOLOGY OF MEMBRANE PROTEINS: GLYKOLIPID ANCHORS OF CELL-SURFACE PROTEINS, A. J. Turner (ed.), Ellis Horwood, New York, 1990; Low a Prasad, Proč. Nati. Acad. Sci. 85:980-984, 1988; Essen et al., Nátuře 380:595-602, 1996; a Essen et al., Biochemistry 36:2753-2762, 1997. PI-PLC byly popsány z prokaryotických zdrojů, včetně extracelulámí produkce bakteriemi. Mezi známé bakteriální zdroje PI-PLC patří Bacillus cereus (Stem a Logan, J. Bacterioí. 85:369-381, 1963; Stein a Logan, J. Bacterioí. 90: 6981, 1965; Ikezawa et al., Biochimica et Biophysica Acta 450:154-164, 1976; Griffith et al., Methods in Enzymology 197:493-502, 1991; Volwerk et al., J. Cell. Biochem. 39:315-325, 1989; a Kuppe et al., J. Bacterioí. 171:6077-6083, 1989), Bacillus thuringiensis (Ikezawa a Taguchi, Methods in Enzymology 71:731-741, 1981; Japonská patentová přihláška JP 55034039), Staphylococcus aureus (Low a Finean, Biochem. J. 162:235-240, 1977) a Clostridium novyi (Taguchi a Ikezawa, Arch. Biochem,. Biophys. 186:196-201, 1978).
-5CZ 304925 B6
Vylepšené enzymové testovací techniky pro PI-PLC enzym jsou založeny na fluorescentním substrát, viz Hendrickson el al., Biochemistry 31:12169-12172, 1992; Hendrickson, Anal. Biochem. 219:1-8, 1994; Hendrickson et al., Bioorg. Med. Chem. Letters. 1:619-622, 1991.
Bez definitivní vazby na jakoukoliv teorii předkladatelé vynálezu předpokládají, že enzym PIPLC může štěpit fosfatidylinositol-glykolipidové zakotvení proteinů buněčného povrchu ajiných glykosyl-fosfatidylinositolů, viz Low, výše; Low a Saltiel, Science 239: 268-275, 1988. Například různé povrchové glykoproteiny a jiné povrchové proteiny a karbohydráty několika jednobuněčných parazitů jsou zakotveny glykosyl-fosfatidylinositolovými lipidy (GPI zakotvení) a jsou senzitivní na trávení a uvolňování PI-PLC. Ilustrativní druhy náleží k rodu Schistosoma, Toxoplasma, Plasmodium, Trypanosoma a Leishmania (Low, výše), stejně jako Eimeria, Babesia, Theileria, Giardia, Leptomonas a Entamoeba, viz McConville a Ferguson, Biochemical J. 294: 305-324, 1993; Pearce a Sher, J. lmmunol. 142:979-984, 1989; Sauma et al., Mol. Med. Biochem., Parasitol. 46:73-80, 1991; Hawn a Strand, Mol. Med Biochem. Parasitol. 59:73-82, 1993.
Tento mechanismus zakotvení složek buněčného povrchu se zdá být univerzální pro eukaryotické buňky v rozsahu od kvasinek k savcům. Přítomnost GPI zakotvení u Giardia lamblia, která je považována za velmi primitivní eukaryotický organismus, naznačuje, že se tento typ zakotvení vyvinul u eukaryot časně. V souladu s tímto předpokladem je objev nového fosfoglycerolipidu GlcNal-6-myo-inositol-P-dialkylglycerolu u archaebakterií (Nishihara et al., J. Biol. Chem. 267:12432-12435, 1992), kde tato sloučenina je základem pro komplexnější eukaryotické GPI kotevní struktury, které se vyvinuly později. U protozoí je GPI kotevní systém využíván více než u vyšších eukaryot a existují důkazy, že struktury zakotvené přes GPI jsou významné pro přežívání parazitů v hmyzích a savčích hostitelích (McConville a Ferguson, výše). Například může být hojná přítomnost různých povrchových glykoproteinů mechanismem bránícím útoku imunitního systému.
Prvok Eimeria tenella obsahuje fosfatidylinositolem zakotvené struktury podobně glykoproteinu/glykolipidu Trypanosa brucei. Tyto struktury se považují za významné pro vazbu na membránu a následnou infekci, viz Gumett et al., Mol. Med. Biochem. Parasitol. 41:177-186, 1990. Eimeriové struktury jsou štěpeny lippázou trypanosom a Bacillus thuringiensis PI-PLC (Gumett, výše). In vivo zpracování parazitů PI-PLC, pokud bude proveditelné, pravděpodobně pomůže imunitnímu systému hostitele a bude interferovat s vazbou a infekcí patogenů vstupujících do organismu zažívacím traktem. Eimerie jsou rozšířeným a nákladným problémem v drůbežářském průmyslu. Jiný protozoámí parazit, Cryptosporidium parvum, je značně rozšířen a způsobuje akutní průjmová onemocnění u člověka a mnoha zvířat. Sporozoitový protein, GPI5/45/60, je patrně podle DNA sekvence GPI-vázaný protein, a monoklonální protilátky proti tomuto proteinu inhibují infekci (Strong, W. B., et al., Infection and Immunity 68: 4117-4134, 2000; Cevallos, A. M., et al., Infection and Immunity 68: 41084116, 2000). Proto je C. parvum dalším patogenem potenciálně léčitelným PI-PLC.
Prokaryotické bakterie neobsahují povrchové glykoproteiny a karbohydráty zakotvené fosfatidylinositolem (McConville a Ferguson, výše), ale PI-PLC může stále ještě redukovat bakteriální infekce interferencí s procesem navázání. Patogenní E. coli a mnoho dalších dobře známých patogenních Enterobacteriaceae exprimují bakteriální adhesin FimH, 29 kD lektin vážící manosu, kteiý je přítomen na distálním konci fimbrií. Abraham et al., Nátuře 336: 682-684, 1988. Bylo prokázáno, že tento adhesin se váže na CD48 žímých buněk, tj. na molekulu zakotvenou GPI, viz Malaviya et al, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 96:8110-8115, 1999. In vitro trávení PI-PLC redukuje vazbu mutantního GPI-zakotveného receptorů pro difterický toxin (z Corynebacterium diphtheria) na myší NIH3T3 buňky, viz Lanzrein et al., EMBO J. 15:725-734, 1996. Dále, alfa toxin Clostridium septicum a aerolysin Aeromonas hydrophila jsou oba navázané na buněčný povrch přes C-terminální GPI-zakotvení a mohou být odstraněny z povrchu buněk pomocí PIPLC, viz Gordon et al., J. Biol. Chem. 274: 27274-27280, 1999.
-6CZ 304925 B6
Mechanismus účinku PI-PLC v redukci účinnosti bakteriální infekce souvisí s uvolněním vazebného místa pro CD48 z žímých buněk hostitele. Také vazba FimH na žímé buňky spouští zánětlivou reakci. Podle předkládaného vynálezu může tedy snížení počtu vazebných míst také redukovat zánět, který může být nadměrný a škodlivý pro střevní tkáň samotnou, protože zánětlivá reakce zahrnuje uvolňování faktoru nekrosy nádorů α (Malaviya, výše). Tak může mechanismem redukce zánětu a související sekrece faktoru nekrosy nádorů zpracování fosfolippázou podle předkládaného vynálezu zmírnit příznaky charakterizující onemocnění jako je syndrom dráždivého tračníku, colitis a Crohnova nemoc, viz van Deventer. S. J., Ann. Rheum. Dis. 58(1):1114— 1120 (listopad 1999).
Předkládaný vynález může být také účinný in vivo proti virovým infekcím, tím, že narušuje vazbu mezi virem a buňkou, kterou virus infikuje. Ve světle objevů podle předkládaného vynálezu týkajících se účinnosti orálního podání je zajímavé, že zpracování viru chřipky fosfolippázou C, způsobující uvolnění přibližně 50 % virového fosfolipidu, vede k významnému snížení infektivity v kuřecích embryích. Viz Mizutani et al., Nátuře 204:781-782, 1964. Naopak, zpracování kultivovaných fibroblastů z kuřecích embryí fosfolippázou C, izolovanou z Clostridium perfringens, významně snižuje následnou infekci buněk Semliki Forest virem, viz Friedman a Pastan, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 59:1371-1378, 1968. Ačkoliv se v oboru nepřikládá těmto jevům žádný terapeutický význam, jsou v souladu s jedním mechanismem, který je podkladem předkládaného vynálezu, konkrétně se štěpením ligandu na povrchu patogenu a/nebo jeho příslušného receptoru na buněčné membráně, což narušuje interakci, která je nezbytná pro infekci.
Jiným způsobem, jak může být předkládaný vynález účinný v prevenci virové infekce, je narušení vazby virových GPI-zakotvených proteinů na citlivé buňky. Příkladem GPI-zakotveného proteinu, který je senzitivní na PI-PLC trávení, je Dengue Virus NS1 (nonstrukturální protein 1), viz Jacobs et al., FASEBJ 14:1603-1610, 2000. Existuje několik příkladů GPI-zakotvených proteinů hostitelských buněk, které jsou vazebnými místy pro virus. Těmito příklady jsou lidské Echoviry 6,7,12 a 21 a Enterovirus 70, které se váží na GPI-zakotvený CD55 (faktor akcelerující rozklad, DAF), viz Clarkson et al., J. Virology 69 : 5497-5501, 1996; Bergeison, et al., Proč. Nati. Acad Sci. USA 91: 6245-6248, 1994; a Kamauchow, et al., J. Virology 70: 5143-5152, 1996. Infekce psím parvovirem (CPV) může být blokována in vitro předchozím ošetřením kočičích buněk PIPLC, viz Barbis a Parrish, Brazilian J. Med. Biol. Res. 27:401-407, 1994.
Některé buněčné povrchové receptory, domněle důležité pro inicializační infekce, jsou navázány na membrány mechanismy jinými než jsou GPI zakotvení. Mezi takové mechanismy patří struktury jako jsou estery cholesterolu (Rostand a Esko, J. Biol. Chem. 268:24053-24059, 1993), nefosfoiylované glykosfingolipidy (Karlsson, Ann Rev. Biochem 58: 309-350, 1989) a jiné fosfolipidy, jako je fosfatidylethanolamin a fosfatidylserin, viz Sylvester, Infect. Immun. 64:4060-4066, 1996.
Z důvodů uvedených výše může být cílené ovlivnění takových struktur vhodnými esterázami, cerebrosidázami, karbohydrázami a fosfolipázami aktivními v uvolňování takových struktur z povrchu buněk výhodné, při orálním podání podle předkládaného vynálezu, pro léčbu infekcí zažívacího traktu.
V důsledku univerzálního charakteru povrchových proteinů a karbohydrátů navázaných na fosfatidylinositol u eukaryot, má terapeutický způsob podle předkládaného vynálezu, zahrnující podání enzymu, akutně nebo profylakticky, pro štěpení zakotvení takových povrchových proteinů a/nebo karbohydrátů buněčného povrchu, rozsáhlé použití při léčbě protozoámích, bakteriálních, mykotických a virových infekcí zažívacího traktu. Z tohoto hlediska je klíčovým aspektem předkládaného vynálezu průkaz toho, že enzym, který je aktivní ve štěpení povrchových složek buněčného povrchu, může být podán orálně jako antiinfekční činidlo aje účinný in vivo. Významné je to, že ačkoliv je vhodný representativní enzym, PI-PLC, dostupný od roku 1960, nebyl doposud takový způsob navržen.
-7CZ 304925 B6
Jiným aspektem předkládaného vynálezu je použití enzymu, jak byl popsán výše, jako účinného anti-infekčního činidla při přípravě zvířecího krmivá, kde toto činidlo může léčit nebo zmírnit riziko infekcí zažívacího traktu u zvířat, která konzumují toto krmivo. Krmivá obsahující endo1,4-[3-D-mannanasu, jsou známá a některé práce přisuzují mannanase antimykotickou aktivitu. Viz WO 00/21381 (PCT/EP99/07835) a Kudo et al., Experentia 48:227-261, 1992. V těchto případech je mannanasa kombinována se známým antibiotikem, ačkoliv byl obecně popsán mysl použití enzymu v krmivu neobsahujícím antibiotikum. Adams, Feed Mix (Speciál 2000), str. 16 18.
V jednom aspektu se tedy vynález týká prostředků, včetně krmiv, které obsahují enzym charakterizovaný výše uvedenou štěpící aktivitou, který je již jiný než mannanasa, nebo přesněji jiný než endo-l,4-|3-D-mannanasa, kteiý se liší od enzymu specifického pro mannan ve specificitě štěpení, jak je popsáno v ENZYME NOMENCLATURE 1992 (Academie Press) (viz kapitoly 3.2.1.77, 3.2.1.78, 3.2.1.101, 3.2.1.106, 3.2.1.130, a 3.2.1.137). Dále předkládaný vynález zahrnuje prostředky, které obsahují takový enzym, včetně mannanasy, ale které neobsahují jiné antiinfekční činidlo.
Tak mohou být podle předkládaného vynálezu extracelulámí enzymové přípravky, získané od Bacillus cereus a standardizované na obsah PI-PLC, použity pro významné zlepšení přírůstků hmotnosti a konverze krmivá v přítomnosti infekce. Toto je překvapivé, protože B. cereus je oportunní patogen, který často způsobuje potravinovou gastrointeritidu a B. cereus-endophthalmitidu.
Dřívější práce popisují, že injekce extracelulámího enzymu B. anthracis nebo B. cereus králíkům způsobuje fosfázemii a případně smrt. Například viz Stein a Logan, J. Bacteriol. 85: 369-381, 1963. Proto je překvapivé, že extracelulámí enzym od patogenu, který způsobuje gastrointeritidu, může mít kurativní efekt v souvislosti s nemocemi způsobenými bakteriální infekcí.
Bacillus cereus vyrábí mnoho enzymů aktivních na extracelulámí membráně a cytolytických toxinů, včetně PI-PLC a Cereolysinu AB, který se skládá z fosfolippázy C a sfingomyelinasy, viz Gilmore, J. Bacteriol. 171:744-753, 1989. Ve výše uvedeném enzymovém přípravku je jako aktivní složka obsažena fosfatidylinositol-specifická fosfolippáza C [např. 3.1.4.10], produkovaná B. cereus. Enzymová léčba podle překládaného vynálezu funguje stejně účinně jako kokcidiostatická a antibiotická léčba. Proto je tato léčba účinným a komerčně životaschopným přístupem pro léčbu infekcí zažívacího traktu, zejména tehdy, když jsou v současnosti používané substance zakázány.
Pokud nejsou potaženy, mohou být enzymy ireversibilně inaktivovány žaludeční tekutinou. US patent 4,079,125 popisuje vylepšené prostředky obsahující enzym s enterálním potahem určené pro savce s deficitem enzymu. Překvapivě vede přidání PI—PLC do zvířecího krmivá bez potahu k účinné léčbě patogenní infekce.
Enzymové prostředky podle předkládaného vynálezu jsou připraveny jako sušené, pevné nebo kapalné orální prostředky. Takové prostředky obvykle obsahují stabilizační činidla, jako jsou pufry, karbohydráty a/nebo glykoly. Sušené prostředky obsahující enzym se stabilním obsahem, vhodné, podle předkládaného vynálezu, pro inkorporací v tabletách nebo kapslích, mohou být připraveny lyofilizaci, sušením postřikem v sušičce s fluidním ložem s inertním nebo karbohydrátovým nosičem, nebo za použití odpařovacích technik společně se stabilizačními činidly vytvářejícími sklovinu, viz Franks et al., Biopharm. 4:38-55, 1991. Jiným způsobem je použití srážení solí, například srážení síranem amonným nebo rozpouštědlem, jako je například aceton (pro přípravu prášku), a potom sušení a smísení s nosičem.
Některé karbohydráty, zejména monosacharidy, disacharidy a nižší oligosacharidy, jsou významnými karbohydráty vytvářejícími sklovinu. Příklady karbohydrátů použitelných jako nosiče jsou xylóza, fruktóza, glukóza, sorbitol a maltotrióza, jak jsou popsány v Franks, výše. Výběr karbo-8CZ 304925 B6 hydrátového nosiče je založen na kompatibilitě s enzymem, nízké hygroskopické tendenci a výhodné křivce přechodu ve sklovinu. Stabilizační činidlo trehalóza je zejména vhodné pro přípravu biologických činidel stabilních při teplotě místnosti, viz U.S. patent 4,891,319; Roser, Biopharm. 4 (8): 47-53,1991; Colaco et al., Bio/Technology 10:1007-1011,1992; Aldridge, Genetic Engineering News, 15. 3. 1995, str. 10 - 11.
Enzymy pro předkládaný vynález mohou být připraveny v kapalné formě, například jako sirupy se sorbitolem nebo glycerolem, za účelem snížení aktivity ve vodě a pro stabilizování proteinu. Takové roztoky jsou obvykle před farmaceutickým použitím sterilně přefiltrovány.
Jak bylo uvedeno výše, týká se předkládaný vynález v jednom aspektu podání enzymu jako složky krmivá. Krmivo se skládá obvykle hlavně ze zrnitého materiálu, zdroje proteinů, vitamínů, aminokyselin a minerálů. Zrnitým materiálem je obvykle kukuřice, čirok, pšenice, ječmen nebo oves. Zdrojem proteinů mohou být například fazole nebo hrách. Příkladem minerálů, aminokyselin a vitamínů jsou Bi2, A, kyselina pantothenová, niacin, riboflavin, K, DL-methionin, L-lysin, cholin-chlorid, kyselina listová, fosforečnan vápenatý, magnesium-sulfonát, síran draselný, uhličitan sodný, chlorid sodný, selenitan sodný, oxid manganičitý, jodid vápenatý, oxid měďnatý, oxid zinečnatý a D-aktivovaný živočišný sterol.
Pro použití v krmivu může být kapalný prostředek obsahující enzym připraven se solí (například NaCl, 15 až 18% hmotn./hmotn.) nebo sirupem pro snížení aktivity ve vodě a pro prevenci růstu mikrobů v koncentrovaném produktu. Další konzervační činidla, jako je benzoan sodný, propylparaben, sorban sodný nebo draselný a askorbyl-palmitát, jsou příklady schválených chemických konzervačních činidel, které mohou být také použita pro prevenci růstu mikroorganismů v produktu, viz Association of American Feed Control Officials, lne., Official Publication 2000, Part 18, „Chemical Preservatives“ str. 215-217, ISBN 1-878341-11-1. Tato konzervační činidla mohou být zapracována do krmivá po peletování za použití automatizované postřikové technologie s velkým ředěním činidel. Viz Fodge et al., Feedstuffs, 29. 9. 1997. Takové kapalné přípravky mohou obsahovat stabilizační karbohydráty, jako je sorbitol nebo glycerol, pokud jsou kompatibilní. Materiály, které jsou žádoucími složkami krmivá, jako jsou jiné enzymy a vitamíny, mohou být obsaženy pro zvýšení účinnosti.
V případech, že je krmivo použito v nepeletované formě (tj. bez tepelného zpracování), mohou být enzymy podle předkládaného vynálezu připraveny ve formě suchého koncentrátu určeného pro přidání do mísícího zařízení pro přípravu krmivá. Takové suché enzymové koncentráty se připraví nejprve zahuštěním kapalného enzymového prostředku za použití 10 Kd NMWC nebo jiného vhodného ultrafiltru, při kterém se dosáhne vysokého procenta obsahu enzymu, a potom smísením s velmi suchým nosičem, jako jsou kukuřičná zrna, sójová zrna, nebo inertní materiál nebo nerozpustná sůl, které jsou schválené pro použití v krmivu, viz Official Publication, American Feed Contral Officials, výše, Part 582, „Substances generally regarded as safe in animal feeds“.
Existuje mnoho technik pro přípravu enzymů dostatečně stabilních pro tolerování procesu peletování v některých mlecích zařízeních pro krmivo, za zachování dostatečné aktivity při nízkých teplotách takže jsou tyto enzymy potom funkční v zažívacím traktu. Je známo, že modifikací proteinové struktury, primárně v důsledku změn kódujících DNA sekvence, nebo sekundárně v důsledku chemických modifikací, je možno dosáhnout vyšší stability enzymů vůči inaktivaci. Jednou ilustrací takové modifikace je použití chemického zesítění krystalů enzymů, viz Collins et al., Organic Process Research and Development 2(6):400^406, 1998. Jiným přístupem pro zvýšení stability enzymu pro předkládaný vynález je změna aminokyselin mutagenesí genu, který kóduje daný enzym, nebo získání genů nebo částí genů pro výrobu nových genů, viz Crameri et al., Nátuře 391:288-291, 1998; Arnold, Nátuře Biotechnol. 16:617-6 18, 1998b; Zhao et al., Nátuře Biotechnol. 16:258-235, 1998; Zhao a Arnold, Protein Eng. 12:47-53, 1999. Je také možná mutace a selekce pro „řízenou evoluci“ enzymů s požadovanými vlastnostmi, viz napří-9CZ 304925 B6 klad Giver et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 95:12809-12813, 1998; Liao et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 83:576-580, 1986; Cherry et al., Nátuře Biotechnol 17:379-384, 1999.
Některé proteinové modifikace, včetně glykosylace. PEGylace a sukcinylace, mohou také zvyšovat stabilitu a měnit optimální Ph, což jsou charakteristiky, které mohou být optimalizovány pro enzym, který má být použit v předkládaném vynálezu. Proto mohou být použity známé protokoly pro přípravu modifikovaných enzymů, které se potom testují podle uvedených příkladů na vhodnost k použití ve způsobech podle předkládaného vynálezu.
Účinnou metodou pro produkci PI-PLC je klonování genu B. cereus do B. megaterium. Expresní systém (Rygus a Hillen, Appl. Microbiol. Bacteriol. 35:594-599, 1991) využívá elementy z Bacillus megaterium xylózového regulonu (Rygus et al., Arch. Microbiol. 155:535-542, 1991), aje komerčně dostupný od BIO101 Corp. (Vista, Califomia). Byla připravena fúze mezi PI-PLC genovou vedoucí kódující sekvencí a prvními třemi aminokyselinami B. megaterium xylA genu, a tato fuze byla připravena v plazmidu stabilizovaném tetracyklinovou rezisencií a regulovaném represorem reagujícím na xylózu. Kmeny tohoto typu, s amplifikovanou expresí, poskytují vhodné prostředky pro produkci komerčně použitelných množství PI-PLC, který by byl potom inkorporován do zvířecího krmivá způsobem podle předkládaného vynálezu.
Některé izoláty Bacillus cereus produkují antibiotika, jako je tunicamycin. Viz Kainogashira et al., Agric. Biol. Chem. 52:859-861, 1988. Jiný izolát Bacillus cereus (ATCC 53522) je popsán v U.S. patentech 4,877,738 a 5,049,379, jako biologické kontrolní činidlo pro prevenci hniloby a hnití kořenů u rostlin. Předpokládá se, že tento efekt je důsledkem účinku dvou antibiotik, označených jako „Zwittermicin“, což je 396 Da lineární aminopolyol, a „Antibiotikum B“, což je aminoglykosid. V příkladech uvedených dále je účinek těchto dvou antibiotik eliminován tím, že se možná antibiotika s nízkou molekulovou hmotností vyloučila z enzymového prostředku.
Konkrétně, bezbuněčné fermentační medium se zahustilo pomocí membrány s limitem propustnosti 10 Kd. Koncentrát, obsahující proteiny větší než 10 Kd, se použil pro další zpracování. Antibiotika s malou molekulovou hmotností, jako jsou antibiotika popsaná v Handelsman, výše, procházejí tímto filtrem. Dále se srážení síranem amonným použilo pro vysrážení proteinů s vysokou molekulovou hmotností, což zanechá materiál s nízkou molekulovou hmotností v roztoku. Po opětovném rozpuštění materiálu vysráženého síranem amonným se získaný roztok enzymu dialyzuje proti pufru, což je další zpracování, které odstraní antibiotika s nízkou molekulovou hmotností. Nakonec se protein podruhé vysráží, opět síranem amonným, pro odstranění jakékoliv další sloučeniny s nízkou molekulovou hmotností z roztoku.
Kombinované použití těchto zpracování silně eliminuje možnost, že pozorované antibiotické účinky jsou způsobeny antibiotiky s nízkou molekulovou hmotností, jako jsou antibiotika produkovaná ATCC 6464 nebo ATCC 7004. Fermentační medium se také testovalo, za použití testovacího kmene E. coli, na přítomnost antibiotik, ale nebyla detekována žádná antibiotická aktivita. Předkládaný vynález je dále popsán na následujících ilustrativních příkladech.
Příklad 1: Příprava zmrazených zásobních kultur Bacillus cereus ATCC 6464 a ATCC 7004
Fioly s lyofilizovanými buňkami z ATCC se otevřely a naočkovaly se do Vizd media složeného z Amberferm 4015 (Red Star) 10 g/1, Amberex 695 (Red Star) 5 g/1 a chloridu sodného 5 g/1, pH 7,0, a provedla se kultivace při 30 °C. Iniciální kultura se naočkovala na LB Broth agarové plotny a získané jednotlivé kolonie se naočkovaly zpět do 20 ml Vizd media ve 250 ml baňce s přepážkou (Bellco) a provedla se kultivace za třepání při 30 °C. Když hustota kultury dosáhla OD60 1,5, přidal se sterilní glycerol na přibližně 10 % obj./obj. a fioly obsahující 1,8 ml kultury se zmrazily při -80 °C.
- 10CZ 304925 B6
Příklad 2: Kultivace ATCC 6464 a ATCC 7004 izolátů Bacillus cereus pro produkci fosfatidylinositol-specifické fosfolippázy C
Dva Biostat C fermentory, každý o objemu 30 litrů, se naplnily mediem následujícího složení, ve vodovodní vodě: Nutrient Broth č. 2 (Oxoid) v koncentraci 25 g/1, Trypton (Difco) v koncentraci 10 g/1, kvasinkový extrakt (Difco) v koncentraci 10 g/1 a Mazu DPI OP Modli protipěnivé činidlo (BASF) v koncentraci 0,1 ml/1. Počáteční objem vsádky byl 9,5 1 a medium se sterilizovalo při 121 °C po dobu 40 minut. Iniciální pH se upravilo po sterilizaci plynným amoniakem na 7,0.
Očkovací kultury se připravily v 500 ml stejného media v 4-litrové třepací baňce opatřené přepážkou napojené na aspirátor (Bellco) s napojenými silikonovými hadicemi s konektory pro inokulaci. Baňky se sterilizovaly vautoklávu při 121 °C po dobu 50 minut před inokulaci 1,8 ml zmrazené zásobní kultury připravené z ATTC zásilky (příklad 1). Očkovací kultury se kultivovaly při 30 °C po dobu 5,5 hodiny s třepáním při 200 otočkách za minutu v inkubační třepačce s řízeným prostředím. (NBS model G-25). Před naočkováním měla ATC 7004 kultura OD600 1,53 a pH 6,58. ATCC 6464 kultura měla ODé0o 1,28 a pH 6,79.
500 ml očkovacích kultur se naočkovalo do 30 1 fermentorů a provedla se fermentace za následujících podmínek: teplota 30 °C, míšení 600 otáček za minutu, průtok vzduchu 10 1/min. a tlak 0,5 Baru. ODéoo iniciální kultury bylo 0,81. Po 6 hodinách se fermentace ukončila s konečným OD60o 22,1 (ATCC 7004) a OD6oo 24,2 (ATCC 6464). Fermentace se prováděla bez řízení pH a konečné pH bylo 8,17 (ATCC 7004) a pH 8,13 (ATCC 6464). Medium se odstranilo z fermentorů a před dalším zpracováním se ochladilo na teplotu 8 °C.
Fermentace se provedla podruhé za použití v podstatě identického postupu s oběma ATCC izoláty Bacillus cereus. V tomto případě se očkovací kultury použily v šesti hodinách s OD600 2,86 (ATCC 7004) a OD600 1,98 (ATCC 6464), a pH 6,69 (ATCC 7004) a pH 6,65 (ATCC 6464). Hlavní fermentace se prováděly po dobu 6,5 hodin s OD60o 35,9 (ATCC 7004) a OD600 3 3,6 (ATCC 6464). Koneční pH bylo 8,38 (ATCC 7004) a pH 8,47 (ATCC 6464) v době ochlazení.
Příklad 3: Odstranění buněk filtrací a zahuštění PI-PLC enzymu
Buňky se odstranily a promyly se z každé ze čtyř fermentačních vsádek popsaných v příkladu 2 za použití dvou AIG Technology (UFP-500-K-6A) 3 mm filtrů z dutých vláken s limitem propustnosti 500 000 (500 Kd NMWC) navázaných na sebe konci. Ochlazené medium se pumpovalo skrz filtry a pomocí peristaltické pumpy rychlostí přibližně 2 litry za minutu s recyklací zpět do zásobníku. Permeát obsahující enzym se odebíral do zásobníku chlazeného na ledu. Počáteční objem media obsahujícího buňky, který byl přibližně 9 litrů, se zahustil na přibližně 2 litry, a potom se zahájila diafíltrace za použití 10 mM Tris-HCl, pH 8,5. Po získání celkového objemu permeátu přibližně 14 litrů se promývání buněk ukončilo.
500 Kd permeát přibližně 14 litrů z každého fermentoru) se zahustil za použití dvou A/G Technology (UFP-10-C-4XTCA) 0,5 mm filtrů z dutých vláken s limitem propustnosti 10000 (10 Kd), které byly na sebe navázány konci. Použilo se stejné pumpování s recyklací koncentrátu s tou výjimkou, že permeát se odstraňoval. Finální koncentrát o objemu přibližně 500 ml z každého fermentoru se uschoval pro další zpracování.
Příklad 4: Další přečištění a zahuštění PI-PLC enzymu
Kd ultrafiltrační koncentrát (příklad 3) získaný z každé fermentace Bacillus cereus, se upravil na 80% saturaci síranem amonným a mísil se na ledu po dobu 60 mnut. Roztok se odstřeďoval po dobu 15 minut při 6000 otočkách za minutu na Srovall GSA rotoru. Supematant se odstranil a
-11 CZ 304925 B6 sraženina se rozpustila v minimálním objemu 10 mM Tris-HCl, 0,2 mM EDTA (pH 7,5) a potom se dialyzovala za studená proti stejnému pufru.
Protein v každém koncentrátu se měřil za použití testu vazby barviva (BioRad) a stanovila se koncentrace PI-PLC (Hendrickson et al., Bioorg. Med. Chem. Letters 1:619-622, 1991) za použití detekční metody na bázi HPLC a fluorescentního substrátu (Molecular Probes, lne., P-3 764, 1-pyrenbutyl-myo-inositol-l-fosfát, litná sůl). Tabulka 1 shrnuje data z tohoto testu a určuje přibližnou čistotu a celkový obsah enzymu pro každou čistou bází získanou pro každý ze čtyř přípravků. Enzymové přípravky byly uskladněny při -20 °C do dalšího zpracování.
Tabulka 1. Souhrn analýzy přípravků surového enzymu PI-PLC
Enzym. přípravek ATCC kmen č. Protein mg/l Specif. aktivita U/ml1 Celkem mg proteinu v prostř. Předpokl. čistota2 Celkem mg PI- PLC na čistou bázi
1 7004 1,86 1,75 325 2,92 9,49
2 6464 1,44 0,52 345 0,867 2,99
3 7004 1,35 4,42 208 7,36 15,3
4 6464 2,06 1,72 256 1,95 5,00
1 U =jednotka= 1 mikromol/minutu.
2 podle předpokladu, že 100% čistý protein má specifickou aktivitu 60 U/mg (Hendrickson, výše).
Příklad 5: Sloučení a zahuštění enzymových přípravků před aplikací do zvířecího krmivá
Enzymové prostředky 1, 2, 3 a 4 se smísí ze zisku celkového objemu 675 ml. Pomalu se přidá síran amonný (492 g) a roztok se mísí na ledu po dobu několika minut. Roztok se odstředí za zisku pelety. Peleta se rozpustí v minimálním množství 20 mM fosfátového pufru (pH 7,0).
Získaný roztok měl objem 70,9 ml a hustotu 1,057 g/cm2. Koncentrace proteinu byla přibližně 25,5 mg/ml. Aktivita PI-PLC byla přibližně 1,13 U/mg s čistotou PI-PLC 1,88%. Roztok se zmrazil při -20 °C a potom se rozmrazil a použil se uniformně pro zpracování 200 liber (90,8 kg) kuřecího krmivá.
Příklad 6: Klonování a exprese Bacillus cereus PI-PLC genu v Bacillus megaterim
Byl sekvencován gen kódující fosfatidylinositol-specifickou fosfolippázu C (PI-PLC). Viz Kuppe et al., J. Bacteriol. 171:6077-6083, 1989. Za použití PCR technologie byl PI-PLC gen klonován z Bacillus cereus (ATCC 6464) chromosomální DNA. Použil se expresní vektor pMEGA (BIO 101, Vista, CA), pro Bacillus megaterium. Dva PCR primery, konkrétně 5'GACTAGTAATAAGAAGTTAATTTTG-3' (primer 1) a 5'-CGGGATCCATATTGGTTGGTTATTGG-3' (primer 2) se navrhly se Spěl místem v primeru-1 a BamHI místem v primerů 2.
PCR-amplifikovaný PI-PLC gen se potom ligoval do pMEGA Spel-BamHI místa za zisku plazmidu pCG682. PI-PLC protein se fúzoval s prvními třemi aminokyselinami xylA genového produktu v Spěl místu expresního vektoru. Exprese PI-PLC genu byla pod kontrolou xylA pro- 12CZ 304925 B6 motoru. Fermentace v baňce za třepání byla použita pro hodnocení produkce fosfatidylinositolspecifícké fosfolippázy C v Bacillus megaterium. LB medium s 10 pg/ml tetracyklinu (20 ml) se naočkovalo 0,2 ml očkovací kultury a provedla se inkubace při 37 °C za třepání při 250 otáčkách za minutu. Při OD6oo přibližně 0,5 se přidalo 5 g/1 D(+)-xylózy pro indukci xylA promotoru. Po 3 hodinách se supematant získal odstředěním. Aktivita fosfatidylinositol-specifřcké fosfolippázy C se měřila metodou fluorescenčního substrátu (Hendrickson, et al., Biochemistry 31: 12169— 12 172, 1992; Hendrickson, Anal. Biochem. 219: 1-8, 1994), za použití 1-pyrenbutyl-myoinositol-1-fosfátového substrátu (Molecular Probes, Eugen, OR) a pomocí HPLC detekce.
Tabulka 2: Měření exprese PI-PLC
Testovaný materiál přidání xylosy Specifická aktivita (jednotky/mg proteinu)
Frakce buněčného lyzátu
B. megaterium/pCG682 - 0
B. megaterium/pCG682 + 0,436
B. megczterium/pCG6S2 - 0
B. megaterium/pCG682 + 0,365
Frakce fermentačního média
B. megaterium/pCG6S2 - 0
B. megaterium/pCG682 + 4,087
B. megaterium/pCG682 - 0
B. megaterium/pCG682 + 4,56
Tato data ukazují, že většina PI-PLC byla extracelulámě a že exprese probíhala pouze po přidání D(+)xylózy (Tabulka 2). Předpokládá se, že tento rekombinantní kmen má alespoň 15násobek produktivity (mg/l/OD) průměrného přirozeného kmene, který je kultivován způsobem podle příkladu 2.
Příklad 7: Fermentace B. megaterium pro produkci PI-PLC
B. megaterium/pCG682 popsaný v příkladu 6 se použil pro produkci PI-PLC fermentací. Medium (PM) pro očkování a fermentací obsahovalo 20 g/1 Amberferm 4015 (Universal Flavors Bionutrients, Indianapolis, IN), 10 g/1 Amberex 695 kvasinkového extraktu (Universal Flavors Bionutrients, Indianapolis, IN), 10 g/1 NZ Čase Plus (Quest International, Hoffman Estates, IL), 2,0 g/1 K2HPO4, 0,1 g/1 MgSO4.7 H2O a 2,0 g/1 glukózy iniciálně a 12,5 mg/1 tetracyklinu. pH bylo upraveno na 7,5.
Inokulační stadium (500 ml v 2,8-1 baňce s přepážkou) se zahájilo naočkováním z inokulační zásobní baňky a provedlo se třepání při 250 otočkách za minutu při 30 °C. Inokulační baňky se připravily přidáním jediné kolonie kultivované na LB agarové plotně do 20 ml PM v 250 ml třepací baňce. O kultivaci na přibližně 1,0 OD60o při 30 °C se přidalo 5 ml 50% sterilního glycerolu, směs se promísila a roztok se rozdělil do 2 ml plastových zkumavek a zmrazil se při -60 °C.
500 ml očkovací baňky se použily po růstu na přibližně 1,2 až 1,8 OD60o nm po 9 hodinách třepání. Dvě baňky se použily pro inokulaci 60 1 fermentorů naplněného 50 1 stejného media sterilizovaného párou. Tetracyklin se sterilně přefiltroval (0,2 micronový filtr) jako 1% roztok ve 40%
- 13 CZ 304925 B6 ethanolu a přidal se po sterilizaci a ochlazení na 30 °C. Ve fermentorech se 0,1 ml/1 Mazu DF1OPMOD11 antipěnivého činidla (BASF, Gumee, IL) také přidal o iniciální vsádky a během fermentace se přidávalo toto činidlo podle potřeby pro prevenci pěnění. Podmínky pro první fermentaci byly následující: podtlak 0,5 až 2,5 psig; teplota 30 °C ± 0,5 °C; třepání 200 až 450 otoček za minutu; přívod vzduchu 25 až 50 SLPM; rozpuštěný kyslík - 25 %. pH se upravovalo na 6,9 až 8,1 za použití 21,25% H3PO4 nebo 5N NaOH. Když OD60o dosáhlo 8 až 10, byly obsahy použity pro naočkování 600 1 fermentoru obsahujícího 425 1 stejného media.
Podmínky pro 600 1 fermentací byly následující: podtlak 0,5 až 2,5 psig; teplota 30 °C ± 0,5 °C; třepání 100 až 300 otoček za minutu; přívod vzduchu 250 až 500 SLPM; rozpuštěný kyslík - > 25%. pH se upravovalo na 6,9 až 8,1 za použití 21,25% H3PO4 nebo 5N NaOH. Když se po 5 hodinách vyčerpala počáteční glukóza a OD60o bylo přibližně 17, přidalo se xylózové medium (presterilizované autoklávováním při 121 °C během 20 minut) skládající se z 10 kg D-(+V xylózy a 10 litrů vody). D-xylóza se získala od Varsal Instruments, New Jersey. Medium se přidávalo zpočátku rychlostí 25 ml/minutu po dobu 1,5 hodiny, a potom se rychlost zvýšila na 43 ml/minutu. Tato druhá rychlost se udržovala do té doby, než bylo spotřebováno všech 22,5 litrů xylózového media. Procento rozpuštěného kyslíku se udržovalo pomocí zvyšování přívodu vzduchu po 50 SLPM až do 500 SLPM. Když byl přívod vzduchu 500 SLPM, tak se zvýšila rychlost odstřeďování. Fermentace se ukončila po 20 hodinách. Po 17 hodinách se akumulovalo 7440 U/l (jednotek definovaných v příkladu 4).
Fermentační medium se odebíralo za použití Pall Filtron CIO Skid a čtyř CellFio Microgon modulů (0,2 pm póiy membrány, vlákna průměru 1 mm s 3,33 m2. Permeát z 0,2 pm membrány se zahustil za použití LT100 Pall Filtron Skid AG/Technologies Size 85 10K ultrafiltrační membránou. Výsledný koncentrát měl objem 10 litrů a byl zmrazen při -20 °C.
Příklad 8: Bacillus cereus fermentační medium neobsahuje antibiotickou aktivitu
Fermentace s Bacillus cereus (ATCC 7004) se provedla způsobem popsaným v příkladu 2 s tou výjimkou, že počáteční objem byl zvýšen na 20 litrů. Test na přítomnost antibiotik se provedl s E. coli MG1655 jako testovacím kmenem a s výsledným fermentačním mediem nebo s částečně přečištěným PI-PLC připraveným způsobem podle příkladů 3 až 5. Test se provedl jako test na desce obsahující kolečka enzymu. Viz Brantner, Pharmazie 52(1):34^10, 1997. Nebyly pozorovány žádné zóny projasnění okolo koleček obsahujících vzorky enzymu, což ukazuje na nepřítomnost antibiotické aktivity.
Příklad 9: PI-PLC test s fluorescenčním testem na mikrotitrační plotně
Byl vyvinut lepší biochemický test na PI-PLC, než je test podle Hendrickson et al. (výše) použitý v příkladu 4. Substrát 4—methylumbelliferyl-myo-inositol-l-fosfát, N-methyl-morfolinová sůl, se získal od Biosynth (Napervilie, Illinois). Reakce se sledovaly na Flouroscan II čtečce fluorescence na mikrotitračních plotnách získané od MTX Lab Systems (Vienna, Virginia). Pro testování fermentačního media nebo enzymových koncentrátů se reakce 200 μί provedly v černých mikrotitračních plastových plotnách složených z 10 mM Tris-Cl, 0,16% deoxycholatu, 0,8 mM 4-methylumbelliferyl-myo-inositol-l-fosfátu, N-methyl-morfolinové soli, a ředěný enzym při pH 8,0. Pokud to bylo potřebné, tak se ředění enzymu provedly v 0,1 % roztoku BSA ve vodě. Reakce se sledovaly při 37 °C po dobu 30 minut s odečítáním ve 2minutovým intervalech za sledování uvolňování methylumbelliferonu ze substrátu s excitací při 350 nm a emisí při 450 nm.
Korelace jednotek fluorescencen na mikromoly methylumbelliferonu se použila pro výpočet vzniklých jednotek (mikromolů za minutu) na dávku přidaného roztoku enzymu. Reakce při pH 8,0 je kompromisem mezi pH optimálním pro enzym a pH pro maximální fluorescenci methy- 14CZ 304925 B6 lumbelliferonu (pH 10). Při pH 9,0 a vyšším se rychlost neenzymatického uvolňování methylumbelliferonu stala signifikantní. Za těchto podmínek je specifická aktivita (U/mg) přibližně 39,3vyšší než při použití metody dle Hendrickson et al. (výše). Pro účinnost testování v pokusech se zvířecím krmivém se jednotky změřené za použití tohoto testu konvertovaly na ekvivalent Hendricksonových jednotek pro usnadnění srovnání s testy použitými před tímto testem.
Příklad 10: test PI-PLC přidaného v účinných dávkách do zvířecího krmivá
Senzitivnější varianta testu na PI-PLC na bázi 4—methylumbelliferyl-myo-inositol-l-fosfátu, N-methyl-morfolinové soli (příklad 9) byla navržena pro měření enzymu po přidání do zvířecího krmivá, a tato varianta použití jednoho pH pro test a druhého pH pro měření fluorescence. Enzym se extrahoval z testovaného krmivá odvážením 4 g krmivá a přidáním těchto 4 g do 20 ml 10 mM Tris-Cl (pH 7,5) s 0,1 % deoxycholátem za zisku 20 g/1 krmivá. Kaše se potom třepala vNBS G-25 mísícím zařízení (New Brunswick Scientific) po dobu 1 hodiny při teplotě místnosti a 250 otočkách za minutu. Kaše se odstředila při 13,000 otáčkách za minutu na IEC Micromax mikroodstředivce s 1,5 ml mikrocentrifugačními zkumavkami. Vhodná ředění extraktu se připravila v 0,1 % BSA (hovězím sérovém albuminu). Vzorky extrahované z krmivá za použití 10 U/0,454 kg se naředily.
První stupeň reakce: Připravily se následující zkumavky: Standardy při ředění 1:00 nebo 1:200 0,12 U/ml PI-PLC (jednotky podle příkladu 4) a kontrolní roztoky neobsahující enzym. Reakční směsi se zakryly folií pro chránění před světlem.
μΐ Tris-HCl, 0,10 M, pH 6,0 μΐ deoxycholátu (0,8%) μΐ PI-PLC substrátu (4 mM)
100 μΐ enzymu
200 pL/zkumavku = celkový objem při 25 °C
Ve dvou dobách (30 minut a 60 minut) se odebralo 0,10 ml každé reakční směsi. Alikvoty se zahřívaly při 65 °C po dobu 15 minut pro ukončení reakce enzymu a potom se ochladily na ledu. Nakonec se vzorky odstředily při 12,000 otáčkách za minutu na mikroodstředivce během 5 minut.
Odečet na fluormetru - 120 μΐ 0,10 M Tris pufru (pH 8,0) se přidalo do mikrotitrační jamky v černé plastové plotně a potom se přidalo 80 μΐ reakční směsi, jak je popsáno v příkladu 7. Odečetly se kontrolní hodnoty pro pozadí. Vypočetla se rychlost produkce fluorescenčních jednotek za minutu. Jednotky fluorescence se přeměnily na mikromoly produktu reakce a vypočetly se enzymové jednotky extrahované na původních 0,454 kg krmivá.
Příklad 11: Pokusy s krmením kuřat a expozicí patogenu
I. Pokus 1 s krmením brojlerů
První pokus s krmením se provedl s brojlery stáří jeden den. Připravilo se typické uniformní kuřecí krmivo označené jako „startovací krmivo“, které bylo vyrobeno tak, aby splňovalo nebo převyšovalo National Research Councifs NUTRIENT REQUIREMENTS FOR POULTRY (9 vydání, 1994), a toto se podávalo ve formě krmné směsi. Kuřata se rozdělila do boxů (30,48 x 60,96 cm) do čtyřech terapeutických skupin, kde v každé skupině byly čtyři další skupiny s 6 kuřaty na box (tabulka 3). Voda a krmivo se podávaly ad libitum během 21 denního testovacího období. Rozdělení kuřat do skupin a boxů bylo náhodné. Všechny boxy, krmítka a zásobníky na vodu byly před testem dezinfikovány. Světlo bylo kontinuální (24 hodin denně) ze stropních
- 15CZ 304925 B6 lamp. Tělesná hmotnost se hodnotila pouze v den 1 a v den 21. Spotřeba krmivá se měřila v den 21.
V den 5 se všechna kuřata infikovala 200,000 oocystami na kuře Eimeria acervulina orálním 5 podáním tekutiny. V den 7 byla všechna kuřata dále infikována vodou 500,000 Clostridium perfringers. V negativní kontrole (TI) nebyla žádná léčba infekce. V pozitivní kontrole (T2) se do krmivá přidalo kokcidiostatikum a antibiotikum. Jednalo se o kokcidiostatikum Sacox (Salinomycin v dávce 60 g/tunu) a antibiotikum BMD-50 (50 g/tunu). Pro léčené skupiny T3 a T4 se krmivo ošetřené přirozeným PI-PLC enzymem (přibližně 0,34 gramů PI-PLC na čistý základ ío krmivá) podávalo ode dne 5, tj. od orální podání Eimeria acervulina. Všechna krmivá byla připravena v jedné vsádce a potom byla tato vsádka rozdělena pro přidání antibiotika (Testovací skupina T2) nebo enzymu (Testovací skupiny T3 a T4). Výsledky analýzy hmotnosti kuřat jsou uvedeny v tabulce 4 a výpočty poměru krmivo/přírůstek hmotnosti jsou uvedeny v tabulce 5.
Tabulka 3: Experimentální léčba v pokusu I krmení brojlerů
Testovací skupina Popis Testovaný materiál Replikace Kuřat na replikaci
TI negativní kontrola žádný 4 6
T2 pozitivní kontrola kokcidiostatikum a salinomycin 4 6
T3 PI-PLC, přirozený 0,34 g enzymu/tunu (čistého základu) 4 6
T4 PI-PLC, přirozený 0,34 g enzymu/tunu (čistého základu) 4 6
Tabulka 4: Průměrná tělesná hmotnost (g) v den 21
Repl. Léčba
TI T2 T3 T4
1 323,00 341,67 377,83 366,67
2 326,67 321,33 383,83 361,17
3 299,33 337,33 378,83 361,33
4 211,67 254,00 374,33 403,40
Průměr 290,17 313,58 378,71 373,14
STÁT b b a a
S.D. 46,52 35,22 3,40 17, 61
C.V. 16,03 11,23 0, 90 4,72
-16CZ 304925 B6
Tabulka 5: Průměrná konverze krmivá (0 až 21 dnů) korigovaná na váhu mortality kuřat
Rcpl. Léč ?a
TI T2 T3 T4
1 1.486 1.569 1.407 1.445
2 1.562 1.532 1.423 1.421
3 1.524 1.562 1.432 1.406
4 1.760 1.462 1.438 1.404
Průměr 1.583 1.531 1.425 1.419
STÁT b b a a
S.D. 0.11 0.04 0.01 0.02
C.V. 6.68 2.78 0.82 1.17
V obou uvedených tabulkách jsou průměry v řádkách bez společného písmena statisticky významně odlišné (p < 0,05), podle Duncanova testu signifikance.
II. Pokus 2 s krmením brojlerů
Druhý pokus s krmením se provedl s kuřecími samci věku jeden den. Základní krmivo bylo navrženo tak, aby splňovalo nebo přesahovalo National Research Councďs Nutrient Requirements for Poultry (9 vydání, 1994) a připravilo se ve formě krmné směsi pro zajištění uniformity. Test io byl proveden v randomizováných skupinách boxů, zaslepeně, a testoval se vliv PI-PLC vyrobeného z přirozeného zdroje, Bacillus cereus (přirozený typ PI-PLC), nebo z rekombinantního Bacillus megaterium, na stav brojlerů v 21 dnech věku. Přirozený zdroj také obsahuje jiné enzymy, ale PI-PLC připravený z Bacillus megaterium je vysoce přečištěný a byl dále přečištěn ultrafiltrací za použití 30-Kd NMWC membrány. Kuřata byla infikována v den 8 věku ptačí kokcidií (200000 oocyst E. acervulina na kuře, ve vodě) a v 10 dnu věku Clostridium perfringens (100000 na kuře, ve vodě). Každá z 9 typů léčby (tabulka 6) byla provedena 1 Okřát nebo na 10 boxech. Každý box obsahoval 6 vakcinováných (Newcastle-Bronchitis, Merks) Cobb x Cobb brojlerů s prostorem 12,192 cm2/ptáka. Mrtví ptáci, pokud byly takoví, se neodstraňovali po dnu 8., krmivo se podávalo ve formě krmné směsi ad libitum během celého testu (den 0 až den 21).
Běžná a nezpracovaná bazální krmná směs neobsahující antibiotika se podávala všem ptákům ode dne 0 do dne 7. Potom se od dne 8 do dne 21 podávalo devět zpracovaných krmiv ve formě krmné směsi. Bazální startovací krmivo pro brojlery obvykle obsahuje 22 % surového proteinu, s obsahem ME (metabolizovatelné energie) 1400 kcal/0,454 kg.
Tabulka 6: Experimentální zpracování krmivá pro brojlery v pokusu 2
Zpracování Testovaná složka Infekce1
TI žádná +
T2 Bacitracin-methylen-salicylát (BMD 50 g/tunu) a Salinomycin (Sacox, 60 g/tunu) +
T3 Rekombinantní PI-PLC (3 U/lb) produkovaný Bacillus megaterium +
T4 Rekombinantní PI-PLC (10 U/lb) produkovaný Bacillus megaterium +
T5 Rekombinantní PI-PLC (30 U/lb) produkovaný Bacillus megaterium +
T6 Rekombinantní PI-PLC (90 U/lb) produkovaný Bacillus megaterium +
T7 PI-PLC (10 U/lb) s další extracelulámí enzymy z Bacillus megaterium +
T8 žádná žádná
T9 Rekombinantní PI-PLC (90 U/lb) produkovaný Bacillus megaterium žádná
- 17CZ 304925 B6 1 200 000 oocyst E. acervulina se podalo na kuře ve vodě v den 7 a v den 10 se podalo 100 000 Clostridium perfringens na kuře ve vodě.
Tabulka 7: Pokus 2 s krmením brojlerů
léčba 1 2 3 4 5 6 7 8 9
infekce + + + + + + - -
medikace typ PI-PLC cíl U/lb naměřený průměr U/lb - + - - - - - - -
Rec1 Rec' RecJ Rec1 wf Rec*
- - 3 10 30 90 10 - 90
036 0.32 032* 0.71 1.74 5.96 2.46 0.12 5.94
hmot. přírůstek v dny 8-21 309.72 333.83 32334 324.78 320.64 32839 298.98 326.12 338.8
cd ab bc ab bc ab D Ab a i
konverze krmivá v dny 8-21 (korigovaná) 1.859 1.642 1.702 1.732 1.699 1.739 1.876 1.651 1.650
c a ab b ab b C A a
Průměrné skóre střevních lézí 1.447 0.833 1.120 1.133 0.842 0.808 1367 0.983 0.847
d A bc bc a a Cd ab a
'Rekombinovaná PI-PLC produkovaný Bacillus megaterium.
2Přirozený PI-PLC z Bacillus cereus.
3Dávka PI-PLC byla příliš nízká pro efektivní extrakci a měření a jevila se jako základní hodnota pozadí.
V prvním pokusu, kde se bakteriální infekce podala ve vodě k napájení (příklad 11-1). Byla ve všech kriteriích léčba přirozeným PI-PLC produkovaným Bacillus cereus stejně dobrá nebo lepší než léčba Salinomycinem + BMD (Tabulky 4 až 5). Ve druhém testu s rekombinantním PI-PLC (příklad 11 —II, Tabulka 7), kde byl PI-PLC přidán v různých koncentracích, byla zjištěna dávková závislost snížení skóre střevních lézí a konverze krmivá (T3-T6) a zvýšení přírůstku hmotnosti. Dále léčba rekombinantním PI-PLC, v dávce 90 U/0,454 kg, za absence léčby Salinomycinem + BM7D, snižovala skóre střevních lézí a měla pozitivní efekt na konverzi krmivá a přírůstek hmotnosti. Přirozený PI-PLC z Bacillus cereus neúčinkoval v tomto testu tak dobře jako rekombinantní PI-PLC při stejné koncentraci (10 U/lb) (0,454 kg)).
III. Pokus III s krmením brojlerů s enzymy PI-PLC a endo-l,4-D-mannanasou
Pokus se provedl v randomizovaných Petersime boxech pro testování vlivu PI-PLC a endo-1,4β-D-mannanasy (U.S. Patent 5429828) na stav brojlerů v den 21 věku. Ptáci byli infikováni v 8 den věku ptačí kokcidií (75000 Encervulina oocyst a 1,250 E. maxima oocyst na ptáka orálně v nápoji) a v den 11, 12 a 13 věku Clostridium perfringens (orálně v nápoji každý den 1 ml čerstvého kultivačního media obsahujícího 108 cfu/ml). Každá terapie (tabulka 8) se skládala z 8 provedení nebo boxů a v každém boxu bylo umístěno 14 Mareks-vakcinovaných, Cobb x Cobb brojlerů (počet byl snížen na 10 v den 14, protože 4 ptáci byli odebráni z každého boxu a byly skórováni na leze) s prostorem na ptáka 10,97 cm2. Mrtví ptáci se odstraňovali z boxů při zjištění a nenahrazovali se. Krmivo se podávalo ve formě krmné směsi ad libitum během celého testu (den 0 až den 21).
-18CZ 304925 B6
Krmivo se podávalo ve formě krmné směsi ode dna 0 do dne 21 věku. Bazální krmivo bylo typické startovací krmivo pro brojleiy obsahující 22 % surového proteinu s ME 1400 kcal/lb (0,454 kg).
Tabulka 8: Experimentální léčba v pokusu krmení brojlerů III
Léčba Medikace1 2 3 * * Infekce0 PI-PLC Mannanasaz
1 + — - -
2 + — - 100 MU/T
3 - + -
4 - + - 100 MU/T
5 + Přirozený PI-PLC (10 U/lb) produkovaný Bacillus cereus
6 + Rekombinantní PI-PLC (30 U/lb) produkovaný Bacillus megaterium
7 + Rekombinantní PI-PLC (10 U/lb) produkovaný Bacillus megaterium 100 MU/T
8 + Rekombinantní PI-PLC (30 U/lb) produkovaný Bacillus megaterium 100 MU/T
9 + + — -
10 + + Rekombinantní PI-PLC (30 U/lb) produkovaný Bacillus megaterium
1 Krmivo obsahující bacitracin-methylen-disalicylát (BMD, 50 g/t) a salinomycin (Sacox, io 60 g/t).
2 100 MU/t je rovno 100 χ 106 * jednotkám na tunu krmivá 3 Ptáci byli infikováni v 8 den věku ptačí kokcidií 75000 Eacervulina oocyst a 1,250 E. maxima oocyst na ptáka orálně v nápoji a v den 11, 12 a 13 věku Clostridium perfringens orálně v nápoji každý den 1 ml čerstvého kultivačního media obsahujícího 108 cfu/ml.
Konverze krmivá se upravila z hlediska rozdílů v průměrné hmotnosti ptáků pro účely srovnání léčby. Infekce zhoršovala AF/G (konverzi krmivá korigovanou na hmotnost) o přibližně 23 % (0,147 AF/G jednotek). Použití salinomycinu a BMD zcela obnovilo AF/G na normální hodnoty, ale tato dvě chemická činidla nebyla lepší než kombinace β-mannanosy a PI-PLC v redukci střevních lézí způsobených infekcí. 100 MU β-mannanasy na tunu buď samostatně nebo v kombinaci s PI-PLC částečně ruší škodlivé následky infekce, jak je patrné z 65% až 70% zlepšení AF/G vzhledem k infikovaným kontrolám (viz T3 vs TI), β-mannanasa snižovala skóre střevních lézí způsobených E. acervulina více než E. maxima. Částečné obnovení AF/G bylo
-19CZ 304925 B6 dosaženo u infikovaných kuřat léčených PI-PLC v krmivu, ale bylo odstraněno pouze 33 až 41 % zhoršení. Nicméně v obou třídách PI-PLC snižoval skóre střevních lézí způsobených oběma druhy Eimeria. V případě E. maxima byla redukce lézí statisticky významná. Výsledky jsou uvedeny v tabulce 9.
Tabulka 9: Pokus s krmením brojlerů III s PI-PLC a endo-l,4-|3-D-mannanasou při infekci kuřat E. acervulina, E. maxima a C. perfringens
Popis léčby Spotřeba krmivá Konv. krmivá Hm. přírůstek ž.hm Skóre lézí Hm.
I1^ M“ β-man· nanasa PI- PLC den 0-21 den 8-21 den 0-21 den 8-21 den 0-21 den 8-21 den 21 E. acer. E. max. af/gj v. léčba I
1 ns ano ne ne 11,178“ 8,866' 1,433*’ 1,446“* 0,659' 0,540' 0,701' 0,00' 0,00' 1,433
2 ne ano 100 MUA ne 11,230' 8,841* 1,402' l,424d 0,678* 0,548' 0,720' 0,00' 0,00' 1,416
3 ano ne ne ne 10,497“ 1,669' 1,704' 0,538’ 0,429' 0,579“ 1,38* 1,56' 1,579
4 ano ne 100 MUA ne 10,787““ 8,435*“ 1,501“ 1,536' 0,611“ Ó3901 0,652“ 1,16” 1,44” 1,465
5 ano ne ne lxRec lOU/lb 10,456“ 8,228““ 1,560“ l,591b 0,594' 0,477’ 0,635' 1,34' l,19b‘ 1,512
6 ano ne ne 3xReo 30U/lb 10,266“ 7,982' 1,572' 1,621“ 0,597' 0,483b 0,638' 1,16“ 1,13'd 1,526
7 ano ne 100 MUrt lxRec lOU/lb 10,533“' 8,227““ 1,514“ 1,536' 0,598' 0,482’ 0,639' l,09b l,25b‘ 1,469
8 ano ne 100 MUrt 3xRec 30U/Ib 10,496“ 8,156*“ 1,516“ 1,562*““ 0,601' 0,478’ 0,643' 1,25* Ιββ·6'1 1,474
9 ano ano ne ne 11,060““ 8,658* 1,423' 1,447“ 0,650' 0,522' 0,692' l,03b 0,88“ 1,416
10 ano ano ne 3xReo 30U/lb 10,666·*“ 8,359““ 1,430' 1,444“ 0,647“ 0,526' 0,688“ 1,03’ 1,13c 1,420
’l = infekce 2M = medikace (Salinomycin 60 g/t) a BMD (50 g/t)) 3AF/G - hmotnost upravená na konverzi krmivá (ošetření 1 lb^i - ošetření x lbden2i)/3 + spotřebované krmivo/přírůstek hmotnosti(deno-2i))
PI-PLC jednotky jsou podle příkladu 4.
Hemicell MU = milion jednotek ChemGen.
IV. Pokus IV s krmením brojlerů
Pokus se provedl v randomizovaných Petersime boxech pro testování vlivu PI-PLC, mannanasy (U.S. Patent 5429828) a mykotické mannanasy na stav brojlerů v den 21 věku. Ptáci byli infikováno v 8 den věku kokcidií (75000 E.acervulina oocyst a 1,250 E. maxima oocyst na ptáka orálně v nápoji) a v den 11, 12 a 13 věku Clostridium perfringens (orálně v nápoji každý den 1 ml čerstvého kultivačního media obsahujícího 108 cfu/ml). Každá terapie (tabulka 8) se skládala z 8 provedení nebo boxů a v každém boxu bylo umístěno 14 Mareks-vakcinovaných, Cobb x Cobb brojlerů (počet byl snížen na 10 v den 14, protože 4 ptáci byli odebráni z každého boxu a byly skórováni na léze) s prostorem na ptáka 10,97 cm2. Ptáci se nenahrazovali. Krmivo a voda se podávaly ad libitum během celého testu (den 0 až den 21). Krmivo se podávalo ve formě krmné směsi ode dne 0 do dne 21 věku. Bazální krmivo bylo typické kukuřičné/sójové startovací krmivo pro brojlery obsahující 22 % surového proteinu s ME 1400 kcal/lb (0,454 kg).
Výsledky shrnuté v tabulce 10 ukazují reprodukovatelný přínos přidání buď PI-PLC nebo mannanasy do krmivá brojlerů infikovaných dvěma druhy ptačí kokcidie a Clostridium perfringens, kde toto přidáno vedlo k zlepšení jak v přírůstku hmotnosti, tak v konverzi krmivá. Důležité je, že tato studie ukázala, že PI-PLC nebo mannanasa, při kombinaci se salinomycinem, ale bez antibiotika BMD (testy 6 a 5) obnovuje stav kuřat prakticky na stav neinfikovaných jedinců (č. 1 a 2). Toto je důkazem antibakteriálního účinku. V tomto případě účinkoval PI-PLC/Salinomycin o něco lépe než mannanasa a lépe než současné přidávání kombinace BMD a salinomycinu při léčbě infikovaných hejn (test 4).
-20CZ 304925 B6
Tabulka 10: Pokus IV s krmením brojlerů
Test ť M} i skóre lézi konverze krmivá hmot. přírůstek živá hmotnost denz2J
E acer. E max.
Upper Mi ' Λ&ΐβ-21 den $-21 den (p2l 1 den 8-21
1 - - - 0.00 0.00 1.652 1.694 0.527 0.427 0.565
2 - - B/S 0.00 0.00 1.612 1.656 0.546 0.437 0.583
3 + - - 2.44 2.31 1.813 1.909 0.394 0296 0.432
10 + - B 2.25 1.94 1.707 1.770 0.453 0.352 0.490
7 - S 1.00 1.09 1.709 1.719 0.458 0368 0.496
4 + - B/S 0.59 1.63 1.585 1.671 0.509 0397 0.547
16 + PI-PLC - 225 1.50 1.701 1.778 0.451 0.347 0.486
9 + PI-PLC B 2.03 1.34 1.760 1.844 0.445 0342 0.482
6 + PI-PLC S 1.06 1.28 1.584 1.613 0.526 0.419 0.564
12 + Man. - 1.94 134 1.803 1.849 0.433 0338 0.483
13 + Man. 5x - 2.13 2.00 1.740 1.813 0.437 0339 0.471
8 + Man. B 2.09 1.34 1.707 1.772 0.448 0348 0.486
5 + Man. S 0.97 1.09 1.652 1.688 0.500 0397 0.538
11 Man. B/S 0.78 1.16 1.622 1.666 0302 0390 0340
’l = Infekce: infikování v den 8 věku 75000 oocyst E. acervulina a 1250 oocyst E.maxima na ptáka orálně v nápoji a v den 11, 12 a 13 věku Clostridium perfringens orálně v nápoji každý den 1 ml čerstvého kultivačního media obsahujícího 108 cfu/ml.
2E = Enzymy: PI-PLC = rekombinantní PI-PLC produkovaný B. megaterium přidaný v dávce 30 U/lb. Jednotky jsou definovány jako v příkladu 4; Man. = B. lentus endo-l,4-(3-D-mannanasa (U.S. Patent 5429828) přidaná v dávce 121 MU/tunu (miliony ChemGen jednotek/tunu), nebo 5x při 506 MU/tunu.
3M = Medikace (B = BMD při 50 g/tunu); S = Salinomycin (v dávce 60 g/tunu).
Příklad 12: Stanovení vlivu enzymů na životaschopnost a buněčnou invazi sporozoitů Eimeria acervulina a Eimeria tenella in vitro.
Sporozoity Eimeria acervulina nebo sporozoity Eimeria tenella a kultura fetálních buněk křečci ledviny se připravily publikovanými metodami, viz Augustine, Avian a Poultry Biology Reviews 11:113-122, 2000. Pro ošetření buněk se buněčné kultury převrstvily ředěními enzymů podle tabulky 11 a testovaly se na morfologické změny během 5 až 45 minut po převrstvení. Po 45 minutách se monovrstevné kultuiy dvakrát promyly a potom se naočkovaly neošetřenými sporozoity E. acervulina nebo E. tenella. Pro aplikaci během infekce se sporozoity suspendovaly ve vhodném ředění enzymu a naočkovaly se ihned do buněčné kultury. Po 45 minutách inkubace se kultury fixovaly, barvily se a kvantifikovala se invaze.
Pozorovaly se změny morfologie sporozoitů nebo buněk během léčby enzymem. Při koncentracích enzymů použitých v těchto pokusech nebyly zaznamenány morfologické změny. Invaze sporozoitů do kultivovaných buněk se měřila po dvou způsobech ošetření buněk enzymem, stejně jako bez ošetření enzymem, histologickým barvením a mikroskopicky. Viz Augustine, výše.
Data v Tabulce 11 ukazují signifikantní redukci invaze sporozoitů jak pro E. acervulina, tak pro E. tenella. Oba relativně málo přečištěné přípravky PI-PLC enzymu z extracelulámího media B. cereus, a vysoce přečištěný rekombinantní PI-PLC produkovaný v rekombinantním B. megaterium, vedly ke statisticky významné redukci invaze ve většině pokusů. I při dávce přibližně jedné poloviny přirozeného přípravku z PI-PLC byl rekombinantní PI-PLC prostředek stále aktivní.
-21 CZ 304925 B6
Tak bylo předléčení buněk enzymem a vymytí enzymu stejně účinné jako přidání enzymu současně během infekce. Nicméně, podle pokusů s extrakci enzymu z krmivá nevedou dva kroky promytí pravděpodobně k odstranění veškerého enzymu.
Enzymový prostředek s endo-1,4-|3-D-mannanasou také způsoboval statisticky signifikantní redukci invaze ve dvou pokusech, kdy byly buňky předléčby enzymem před infekcí. Tyto pozitivní výsledky byly dosaženy vjednom pokusu s každým typem patogenů. Tak účinkuje mannanasa stejně dobře jako B. cereus PI-PLC přípravek v redukci invaze sporozoitů in vitro.
o
Tabulka 11: In vitro invaze BHK buněk sporozoity Eimeria acervulina nebo Eimeria tenella s a bez ošetření enzymem ťtcdléSeaí bunčk
Enzymy a koncentrace enzymem následované promytím Aplikace enzymu během infekce
JE. acervulina sporozoity Testi Testi Tesil Test 2
Kontrola 22 ±1* 33±4* 50±4* 35±7*
PI-PLC z B. cereus 0.0403 U/mL 15 ± lb 26±l*k 3317® 25 + 2 u
PI-PLC z rekombinantního B. megateriaum1 0.261 U/mL 14 ± 1b 22 + lb 16±2‘ 18± Iu
PI-PLC z rekombinantního B. megateriaum 2 0.0261 U/mL 18 ± llb 26 ± I *b 36 ± 3 k 9±2‘
endo-1,4-fi-D-mannanasÍi 5100 U/mL 16 ± 1b 29±2lb ND4 ND
E tenella sporozoity Testi Test 2 Tese 1 Test 2
Kontrola 44±2* 26±4* 63±5* 42 +4*
PI-PLCfrom B. cereus1 0.0403 U/mL 38±2 21 ±2* 52+ 13 “ 37 + 2*11
PI-PLC z rekombinantního B. megateriaum 0.261 U/mL 30 + 1' 15 ±0* 28±2b 39±4λ
PI-PLC z rekombinantního B. megateriaum1 0.0261 U/mL ND 17 ± 11 18 ± 1' 29±lb
endo-1.4-fi, -D-mannanaso/ 5100 U/mL 35 ± 1 * 19±5* 46±6*b ND
Počty invazí jsou udávány jako průměr ± standardní odchylka z průměru měřeného z 1 až 3 kry15 cích sklíček/aberaci (BHK buňky byly kultivovány na krycích sklíčkách vložených do kultivačních disků). Průměry v testovaných skupinách s různými indexy se statisticky významně liší (P < nebo = 0,05).
1 Extracelulámí enzym z B. cereus dialyzovaný ve fosfátem pufrovaném salinickém roztoku, jednotky standardizované způsobem podle příkladu 4.
2 Extracelulámí enzym z rekombinantního B. megaterium dialyzovaný ve fosfátem pufrovaném salinickém roztoku, jednotky standardizované způsobem podle příkladu 4.
3 Mannanasa získaná z Bacillus lentus způsobem podle U.S. Patentu 5429828 a dialyzovaná do fosfátem pufrovaného salinického roztoku, jednotky jsou definovány podle ChemGen Corp. testu redukce sacharidů.
4 ND = nestanoveno.
-22CZ 304925 B6
Příklad 13: Hodnocení PI-PLC pro Cryptosporidiovou infekci in vitro
Enzym PI-PLC se hodnotil na anti-kryptosporidiovou aktivitu a toxicitu při koncentracích v rozmezí od 0,001 do 30 U/ml a test se provedl na 4denních Madin-Darby buňkách psí ledviny (MDCK). Enzymové jednotky byly definovány stejně jako v příkladu 4, ale měřeny byly podle příkladu 9. Použitým enzymovým prostředkem byl prostředek z rekombinantního Bacillus megaterium. Léčba byla zahájena 3 hodiny po infekci a pokračovala po dobu 48 hodin.
Chemiluminiscenční imunotest. Před infekcí se oocysty promyly a resuspendovaly se v DMEM bázi s 0,75% taurocholátem sodným a inkubovaly se po dobu 10 minut při 37 °C (You et al., FEMS Microbiol. Letters 136:251-256, 1996; You et al., J. Antimicrobial. Chemother. 41:293296, 1998). Excystační směs se naředila Ultraculture mediem, rychle se přenesla na plotny obsahující MDCK buňky, při 100% konfluenci, a udržovala se v Ultraculture mediu po dobu 4 dnů. Inokulum se inkubovalo s buňkami po dobu 3 hodin před promytím PBS a nahrazením čerstvým Ultraculture mediem s nebo bez testovaného enzymu. Plotny se inkubovaly při 37 °C, v 5% atmosféře CO2, po dobu 48 hodin. Kultury se promyly PBS a fixovaly se Bouinovým roztokem.
Fixované plotny se promyly TBST pufrem (20 mM Tris-HCl (pH 7,5), 150 mM NaCl, 0,05% Tween 20) a blokovaly se 1% BSA-TBST (TBST pufr obsahující 1% hovězí sérový albumin) po dobu 30 minut při 25 °C za mírného třepání. Králičí anti-Cryptosporidium parvum sérum (ředění 1:200) se aplikovalo na plotny a provedla se inkubace po dobu 1 hodiny. Po promytí TBST se vzorky sekvenčně inkubovaly s kozí protilátkou proti králičímu IgG značenou biotinem a streptavidinem značenou křenovou peroxidasou (pracovní ředění, 1:1000, KPL lne., Gaithersburg, MD). Obohacený luminol (4-jodfenol a peroxid vodíku, Aldrich Chemical Co. Inc.. Milwaukee, Wl) se použil jako substrát. Plotny se odečítaly za použití ML3000 Luminometer (Dynatech Lab., Chantilly, VA) a určily se relativní světelné jednotky (RLU). Průměry RLU se vypočetly ze 4 jamek a všechny pokusy se opakovaly alespoň dvakrát.
Test toxicity. Enzym se testoval za použití komerčního testu redukce tetrazolinového barviva (CellTiter 96; Promega Corp., Madison, Wl, USA). Stručně, každá koncentrace enzymu uvedená dále se vnesla do 96-jamkové plotny obsahující konfluentní monovrstvu MDCK buněk. Každé ředění se hodnotilo v trojím provedení. Enzym se inkuboval na monovrstvách při 37 °C a 5% CO2. Po 48 hodinách se plotny vyvíjely po dobu 1 hodiny a odečítaly se v ELISA čtečce ploten při 490 nm. Výsledky byly zaznamenány a analyzovány. Procento toxicity se vypočetlo odečtením průměrné OD kontrolního media bez enzymu od průměrné OD s enzymem a potom dělením OD media a násobením 100. Skóre cytotoxicity byly následující:
Toxicita % Skóre až 5 % 0 až 25 % 1 až 50 % 2 až 75% 3 až 100% 4
Signifikantní toxicita byla pozorována pro 3U/ml nebo vyšší koncentrace enzymu. Žádná významná toxicita nebyla pozorována pro tento enzym v rozmezí 0,1 až 1 U/ml (tabulka 12). Proto byla sada pokusů s tímto rozmezím koncentrace (1,0 U/ml nebo nižší) provedena pro stanovení aktivity enzymu a specificity enzymu. V prvním pokusu byly MDCK buňky infikovány excystovanými sporozoity. Po 3tříhodinové inkubaci se monovrstva buněk promyla a enzym se přidal v různých koncentracích na dobu 48 hodin. Jak je uvedeno v tabulce 13, vykazoval enzym antikryptosporoidální aktivitu v rozmezí 0,1 až 1 U/ml in vitro. Přibližně 50% inhibice bylo dosaženo při koncentraci 0,1 U/ml (Obr. 1).
-23 CZ 304925 B6
Tabulka 12. Toxicita rekombinantního PI-PLC připraveného vB. megaterium pro monovrstvu MDCK buněk
Koncentrace %Toxicity (95% CL) Skóre toxicity
10 U/ml 83 4
3 57 3
1 13 1
0,3 11 1
0,1 10 1
Tabulka 13. Aktivita rekombinantního PI-PLC enzymu v buněčných kulturách MDCK buněk infikovaných C. parvum
Léčba U/ml Procentuální inhibice Průměrný počet Cryptosporidií na jamku mikrotitrační plotny 95% CL
Po infekci na 3 hodiny 1 77,36 285,28 0,01
0,3 77,26 286,5 0,04
0,1 52,74 595,53 0,18
0,03 27,62 912,15 0,22
0,01 7,33 1167,78 0,09
Infikované - 0 1260,18 0,09
Neinfikované - 100 0 0,02
Druhá sada pokusů se provedla pro hodnocení specificity enzymu. Sporozoity se ošetřily enzymem v různých koncentracích po během 45 minut a krátce se promyly. Ošetřené sporozoity se potom nechaly infikovat neošetřené hostitelské buňky a nechaly se vyvíjet a množit po dobu 48 hodin. V samostatném pokusu se hostitelské buňky inkubovaly s různými koncentracemi enzymu, promyly se a infikovaly se neošetřenými sporozoity. Jakje uvedeno dále (Tabulkl4), ošetření sporozoitů nebo hostitelských buněk enzymem vedlo k částečné inhibici. Dávková závislost pro inhibici nebyla při těchto koncentracích pozorována. To může být způsobeno krátkou inkubační dobou enzymu s hostitelskými buňkami nebo s parazitem (45 minut) nebo částečným nebo nekompletním štěpením receptorů hostitele/parazita. Dále, na infekci se patrně podílejí jiné receptoiy hostitele/parazita, které mohou být příčinou růstu pozorovanému v hostitelských buňkách.
-24CZ 304925 B6
Tabulka 14: Ošetření sporozoitů nebo MDCK buněk před infekcí a vliv ošetření na infektivitu C. parvum df Prům&ný počet
Tr< léčba PI-PLC U/mll/ml % lt inhibice on kryptosporidií na jamku mikrotitrační plotny 95% CL
Sporozoiti před 1 6727 412.4U 0.02
infekcí 0.3 65.64 433.04 0.06
0.1 57.40 536.80 0.03
0.03 58.13 527.59 0.03
0.01 56.98 542.15 0.01
Hostitelské buňky ošetřené před inf. 1 68.76 393.64 0.12
0.3 50.07 629.24 0.26
0.1 63.82 455.88 0.19
0.03 58.53 522.66 0J2
0.01 56.84 543.85 07Í0
Infikované 0 1260.18 0.09
Neinfikované 100 0 (L02
Příklad 14. Hodnocení PI-PLC při Cryptosporidiové infekci in vivo
Enzym se hodnotil na antikryptosporidiovou účinnost za použití myšího modelu imunodeficitních SCID myší. Stručně, inokulum oocyst se připravilo promytím přečištěným oocyst (skladovaných <6 měsíců) 0,1% BSA, PBS (pH 7,2) pro odstranění dvojchromanu draselného. SCID myši (4 až 5 týdnů staré) se infikovaly 106 oocystami (I0WA kmen) a léčily se způsobem uvedeným dále. ío Od myší se odebíraly vzorky stolice, přečistily se přes diskontinuální sacharosu a testovaly se na obsah parazitů pomocí průtokové cytometrie, jak bylo popsáno dříve. Viz Arrowwood et al., J.
Parasitol. 81: 404-409, 1995.
Tabulka 15. Léčebné režimy pro terapeutické pokusy
Skupina myší A B C
Počet myší 10 10 10
Inokulační dávka 10 10 10
Sloučenina PI-PLC PI-PLC Placebo
Dávka (mg/kg) 90 U/ml 30 U/ml PBS
Způsob podání vkrmivu vkrmivu vkrmivu
Frekvence Ad lib Ad lib Ad lib
Granulované myší krmivo se potáhlo buď 30 nebo 90 U/lb (0,434 mg) PI-PLC v PBS nebo PBS. Všechny myši se krmily ad libitum. Myším se podávalo krmivo ihned po injekci. Vzorky stolice a hmotnost se odebíraly a určovaly dvakrát týdně. Spotřeba krmivá se měřila denně. Myší se utra20 tily injekcí 0,2 cm3 100 mg/ml Ketamin, 100 mg/ml, Xylazinu a 0,9% NaCl).
Průměrné množství potravy zkonzumované na den a myš a průměrné hmotnosti myší jsou uvedeny v tabulce 16. Během 3-týdenního období nebyly pozorovány statisticky významné rozdíly ve spotřebě krmivá či hmotnosti.
-25CZ 304925 B6
Tabulka 16: Spotřeba krmivá a přírůstek hmotnosti u myší
Dny zpracované skupiny Zkonzumované krmivo (g)/ myš/den Hmotnost (g)
3 AVG AVG
A (90U/lb) 7.56 16.67
B(30U/Ib) 6.13 17.055
C(PBS kontrola 5.46 16.88
7 AVG AVG
A 8.31 16.95
B 8.51 16.91
C 727 16.89
10 AVG AVG
A 8.55 17.29
B 7.93 17.08
C 7.1.1 16.97
14 AVG AVG
A 7.78 17.43
B 8.06 17.62
C 7.55 17.38
17 AVG AVG
A 8.52 17.64
B 8.53 17.84
C 7.79 17.59
21 AVG AVG
A 7.89 18.25
B 822 18.62
C 8.51 18.14
24 AVG AVG
A 9.79 182
B 8.3 18.63
C 8.22 18.33
Účinnost ve 3 týdnu po infekci. Vzorky stolice se odebraly za 3, 4 a 4,5 týdne po infekci a počet Cryptosporidií se měřil u SCID myší a u kontrolních skupin, jak je uvedeno v tabulce 17. Jak je uvedeno, myši léčené enzymem vykazovaly snížení počtu parazitů. V léčebných skupinách byl pozorován obsah parazitů (34 až 54%). Některá z těchto snížení byla statisticky významná při hodnocení za použití ANO V A statistické analýzy (jak je uvedeno dále a označeno symboly. Enzym vykazoval potenciál jako anti-kryptosporidální terapeutické činidlo. Vyšší dávky enzymu nebo lepší dodání enzymu do místa infekce může zvýšit jeho účinnost a může být předmětem ío dalších pokusů.
Tabulka 17: Účinnost PI-PLC in vivo pro redukci kryptosporidií ve stolici
Obsah %
terap. Dávka skupina enzymu (U/lb) r- parazitů inhibice —, (oocysty/100 ul) (SD) den 21 11 • Obsah % parazitů inhibicei (oocysty/100 μΐ) ' Obsah parazitů % (oocysty/100 μΐ) inhibice (SD)den28
Pl-PLC 90 22.7(11.4) 44.0 26.3 (14) 48.9 87.5(52.9) 34.0
PI-PLC 30 16.2(4.7) 52.0 23.4(11) 54.6 74.3(89.7)’ 40.0
PBS kontrola 33.5 (162) 50.4(29) 132.1(89.)
-26CZ 304925 B6 * hodnoty p byly statisticky významné při 0,05 nebo méně + hodnota p byla 0,08 nebo menší
Příklad 15: Ověření enzymu v krmivu použitém při testování růstu
Test na PI-PLC extrahovaný z krmivá použitého výše se provedl způsobem popsaným v příkladu
10. Výsledky jsou shrnuty v tabulkách 18 až 19.
Tabulka 18: Cryptosporidiový test, myší krmivo
Léčba Kontrola 30 U/lb 90 U/lb
cílová hodnota U/lb 0 30 90
Typ PI-PLC Rekombinantní z B. megaterium Rekombinantní z B. megaterium
PI-PLC šarže č. - 45-46 SF 45-46 SF
Extrahováno U/lb 0 22,8 66,1
% extrahovaného z cílového 76,0 73,4
Účinnost extrakce z krmivá se významně liší podle typu krmivá. Extrakce z myšího krmivá vykazuje 73,4 až 76% účinnost (Tabulka 18). Do tří různých přípravků kuřecího krmivá vyrobených na třech různých místech bylo opatrně přidáno 45 nebo 180 U/lb rekombinantního PI-PLC, a potom byl PI-PLC ihned extrahován a testován za použití způsobu podle příkladu 9 na to, zda je obsah PI-PLC v krmivu v rozmezí testovacího způsobu podle příkladu 9 (tabulka 19).
Tabulka 19: Testování účinnosti extrakce z různých kuřecích krmiv a kukuřičné moučky
.Zdroj kuřecího krmivá í kukuřičná moučka
Zdroj 7 Zdroj 2 Zdroj 3
přidaná konc. U/lb 180 45 180 45 180 45 180 45
extrahováno U/lb 128 9.3 53.2 3.66 82.7 8.46 134.4 33
% extrahovaných přidaných jednotek i 71.1 20.7 29.6 8.1 45.9 18.8 74.7 73.3
Je vidět, že účinnost extrakce z kukuřičné moučky je podobná účinnosti extrakce z myšího krmivá. Nicméně, extrakce z některých vzorků kuřecího krmivá byla v tomto pokusu, a také v dalších pokusech, o něco horší.
-27CZ 304925 B6
V testu uvedené v tabulce 20 bylo podíl extrahovatelného enzymu přibližně 30 až 45% teoretického obsahu PI-PLC, zatímco β-mannanasa byla snadno extrahovatelná s výtěžkem přibližně 100%. Přibližně 45% extrakce byla nejlepší extrakcí z tohoto krmivá v testu extrakce uvedeném výše. Tak jsou výsledky testu pro jednotku extrahovanou z 0,454 kg krmivá uvedené v tabulce 20 v rozmezí očekávaném pro použitý obsah.
Tabulka 20: Ověření obsahu enzymu v krmivu z pokusu III krmení brojlerů
Léčba č. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Infekce ! - + + T + + + +
Medikace i + + - - - - - - +
Cíl (U/ml) i o 0 0 0 10 30 10 30 0 30
Typ PI-PLC 1 - - - - WT Rec Rec Rec - Rec
testy sU/Ib PI-PLC
Průměr U/lb 1 0.94 0.76 0.79 0.7 3.08 11.48 4.56 10.18 9.49
% cíle 1 - - - - 30.75 3827 45.57 33.93 31.64
cli MU/tunu 1 - 100 - 100 - - 100 100 - -
riCtrilCeli. ΠιαΠΠαΠαοα 1 - + - - - + + - -
testy s MU/tunu mannanasy
MU/tunu - 124.9 - 135.5 - - 153.5 172.0 - -
%cíle - 124.9 - 135.5 - - 153.5 172.0 - -
Ačkoliv byla popsána určitá provedení a podrobnosti předkládaného vynálezu, bude odborníkům v oboru jasné, že existují různé změny a modifikace vynálezu, které spadají do jeho rozsahu.

Claims (56)

  1. PATENTOVÉ NÁROKY
    1. Prostředek, vyznačující se tím, že obsahuje (i) enzym vybraný zfosfatidylinositol-specifické fosfolipázy C nebo fosfatidylinositol-specifické fosfolipázy D a (ii) fyziologicky přijatelný nosič pro uvedený enzym, kde uvedený prostředek je ve formě určené pro orální podání.
  2. 2. Prostředek podle nároku 1, vyznačující se tím, že se jedná o krmivo.
  3. 3. Prostředek podle nároku 1 nebo 2, vyznačující se tím, zeje prostý jiného antiinfekčního činidla, než je uvedený enzym.
  4. 4. Prostředek podle nároku 1, vyznačující se tím, že uvedeným enzymem je fosfatidylinositol-specifická fosfolipáza D.
  5. 5. Prostředek podle nároku 1, vyznačující se tím, že uvedeným enzymem je fosfatidylinositol-specifická fosfolipáza C.
  6. 6. Prostředek podle nároku 1, vyznačující se tím, že dále zahrnuje stabilizátor, karbohydrátový nosič nebo konzervační přísadu.
  7. 7. Prostředek podle nároku 6, vyznačující se tím, že stabilizátorem je pufr, karbohydrát nebo glykol.
    -28CZ 304925 B6
  8. 8. Prostředek podle nároku 6, vyznačující se tím, že karbohydrátový nosič je vybrán ze skupiny zahrnující xylózu, fruktózu, glukózu, sorbitol a maltotriózu.
  9. 9. Prostředek podle nároku 6, vyznačující se tím, že konzervační přísada je vybrána ze skupiny zahrnující propylparaben, sorbát sodný, sorbát draselný a askorbylpalmitát.
  10. 10. Prostředek podle nároku 1, vyznačující se tím, že uvedený nosič je poživatina, do které je uvedený enzym zapracován.
  11. 11. Prostředek podle nároku 10, vyznačující se tím, že uvedená poživatina je krmivo pro zvířata, složené ze zrnitého materiálu, zdroje proteinů, vitaminů, aminokyselin a minerálů.
  12. 12. Prostředek podle nároku 11, vyznačující se tím, že uvedený zrnitý materiál je kukuřice, čirok, pšenice, ječmen nebo oves.
  13. 13. Prostředek podle nároku 11, vyznačující se tím, že zdrojem proteinů jsou fazole nebo hrách.
  14. 14. Prostředek podle nároku 1, vyznačující se tím, že uvedený prostředek je v pevné nebo kapalné formě.
  15. 15. Prostředek podle nároku 1, vyznačující se tím, že uvedený enzym je obsažen v tabletě nebo v obalu želatinové kapsle.
  16. 16. Prostředek podle nároku 1, vyznačující se tím, že uvedený enzym je připraven z kmene Bacillus cereus.
  17. 17. Prostředek podle nároku 16, vyznačující se tím, že uvedený kmen Bacillus cereus ATCC 7004 nebo ATCC 6464.
  18. 18. Prostředek podle nároku 1, vyznačující se tím, že uvedený enzym je získán expresí rekombinantní DNA v hostitelském organismu.
  19. 19. Prostředek podle nároku 18, vyznačující se tím, že uvedený hostitelský organismus je z kmene Bacillus megaterium.
  20. 20. Prostředek podle nároku 2, vyznačující se tím, že uvedený enzym je přítomen v dávce od 200 IU/kg do 4 000 IU/kg krmivá.
  21. 21. Použití enzymu vybraného z fosfatidylinositol-specifické fosfolipázy C nebo fosfatidylinositol-specifické fosfolipázy D pro výrobu léčiva pro léčbu nebo zmírnění rizika infekce zažívacího traktu, kde uvedené léčivo je určeno pro orální podání.
  22. 22. Použití podle nároku 21, kde uvedený enzym je jediným antiinfekčním činidlem přítomným v uvedeném léčivu.
  23. 23. Použití podle nároku 21, kde uvedená infekce je způsobena protozoámím, bakteriálním, kvasinkovým nebo mykotickým patogenem.
  24. 24. Použití podle nároku 23, kde uvedená infekce je způsobena protozoámím patogenem rodu Eimeria.
  25. 25. Použití podle nároku 23, kde uvedená infekce je způsobena protozoámím patogenem rodu Criptosporidium.
    -29CZ 304925 B6
  26. 26. Použití podle nároku 23, kde uvedená infekce je způsobena bakteriálním patogenem rodu Clostridium.
  27. 27. Použití podle nároku 21, kde uvedený enzym je připraven z kmene Bacillus cereus.
  28. 28. Použití podle nároku 27, kde uvedený kmen Bacillus cereus je ATCC 7004 nebo ATCC 6464.
  29. 29. Použití podle nároku 21, kde uvedený enzym je získán expresí rekombinantní DNA v hostitelském organismu.
  30. 30. Použití podle nároku 29, kde uvedený hostitelský organismus je z kmene Bacillus megaterium.
  31. 31. Použití podle nároku 21, kde uvedeným enzymem je fosfatidylinositol-specifická fosfolipáza D.
  32. 32. Použití podle nároku 21, kde uvedeným enzymem je fosfatidylinositol-specifická fosfolipáza C.
  33. 33. Prostředek, vyznačující se tím, že obsahuje (i) endo-1,4-|3-D-mannanasu a (ii) fyziologicky přijatelný nosič pro uvedený enzym, kde uvedený prostředek je ve formě určené pro orální podání a kde uvedená endo-1,4-(3-D-mannanasa je jediným antiinfekčním činidlem přítomným v uvedeném prostředku aje přítomna v množství účinném pro léčbu nebo zmírnění rizika infekce zažívacího traktu.
  34. 34. Prostředek podle nároku 33, vyznačující se tím, že uvedeným nosičem je poživatina, do které je uvedený enzym zapracován.
  35. 35. Prostředek podle nároku 34, vyznačující se tím, že uvedenou poživatinou je krmivo pro zvířata složené ze zrnitého materiálu, zdroje proteinů, vitaminů, aminokyselin a minerálů.
  36. 36. Prostředek podle nároku 35, vyznačující se tím, že uvedeným zrnitým materiálem je kukuřice, čirok, pšenice, ječmen nebo oves.
  37. 37. Prostředek podle nároku 35, vyznačující se tím, že zdrojem proteinů jsou fazole nebo hrách.
  38. 38. Prostředek podle nároku 33, vyznačující se tím, že uvedený prostředek je v pevné nebo kapalné formě.
  39. 39. Prostředek podle nároku 33, vyznačující se tím, že uvedený enzym je obsažen v tabletě nebo obalu želatinové kapsle.
  40. 40. Prostředek podle nároku 33, vyznačující se tím, že uvedený enzym je produkován kmenem Bacillus lentus.
  41. 41. Prostředek podle nároku 33, vyznačující se tím, že uvedený enzym je produkován hostitelským organismem, kteiý je podroben rekombinantní expresi DNA.
  42. 42. Prostředek podle nároku 33, vyznačující se tím, že uvedená endo-1,4-J3-Dmannanasa je produkovaná Bacillus lentus s označením ATCC 55045.
    -30CZ 304925 B6
  43. 43. Prostředek podle nároku 33, vyznačující se tím, že dále zahrnuje stabilizátor, karbohydrátový nosič nebo konzervační přísadu.
  44. 44. Prostředek podle nároku 43, vyznačující se tím, že stabilizátorem je pufr, karbohydrát nebo glykol.
  45. 45. Prostředek podle nároku 43, vyznačující se tím, že karbohydrátový nosič je vybrán ze skupiny zahrnující xylózu, fruktózu, glukózu, sorbitol a maltotriózu.
  46. 46. Prostředek podle nároku 43, vyznačující se tím, že konzervační přísada je vybrána ze skupiny zahrnující propylparaben, sorbát sodný, sorbát draselný a askorbylpalmitát.
  47. 47. Použití endo-l,4-p-D-mannanasy pro výrobu orální dávkové formy léčiva pro léčbu nebo zmírnění rizika infekce zažívacího traktu, kde endo-l,4-(3-D-mannanasa je jediným antiinfekčním činidlem přítomným v léčivu.
  48. 48. Použití podle nároku 47, kde uvedená infekce je způsobena protozoámím, bakteriálním, kvasinkovým nebo mykotickým patogenem.
  49. 49. Použití podle nároku 48, kde uvedená infekce je způsobena protozoámím patogenem rodu Eimeria.
  50. 50. Použití podle nároku 48, kde uvedená infekce je způsobena protozoámím patogenem rodu Cryptosporidium.
  51. 51. Použití podle nároku 48, kde uvedená infekce je způsobena bakteriálním patogenem rodu Clostridium.
  52. 52. Použití podle nároku 47, kde uvedený enzym je připraven z kmene Bacillus lentus.
  53. 53. Použití podle nároku 47, kde uvedený enzym je získán expresí rekombinantní DNA v hostitelském organismu.
  54. 54. Použití podle nároku 47, kde endo-l,4-(3-D-mannanasa je produkována Bacillus lentus s označením ATCC 55045.
  55. 55. Prostředek podle nároku 2, vyznačující se tím, že enzym je přítomen v koncentraci 200 IU/kg krmivá.
  56. 56. Použití podle nároku 47, kde infekce je způsobena virovým patogenem.
    1 výkres
CZ2002-2007A 1999-12-10 2000-12-08 Prostředek obsahující enzym a použití enzymu CZ304925B6 (cs)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US16993599P 1999-12-10 1999-12-10

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CZ20022007A3 CZ20022007A3 (cs) 2002-11-13
CZ304925B6 true CZ304925B6 (cs) 2015-01-28

Family

ID=22617824

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ2002-2007A CZ304925B6 (cs) 1999-12-10 2000-12-08 Prostředek obsahující enzym a použití enzymu

Country Status (31)

Country Link
US (2) US6780628B2 (cs)
EP (1) EP1239872B1 (cs)
JP (1) JP4871473B2 (cs)
KR (1) KR100639746B1 (cs)
CN (3) CN102172262B (cs)
AR (2) AR026764A1 (cs)
AT (1) ATE481981T1 (cs)
AU (1) AU782831B2 (cs)
BR (1) BRPI0016231B8 (cs)
CA (1) CA2394856C (cs)
CL (1) CL2008000057A1 (cs)
CO (1) CO5280226A1 (cs)
CR (1) CR6674A (cs)
CZ (1) CZ304925B6 (cs)
DE (1) DE60045010D1 (cs)
DK (1) DK1239872T3 (cs)
ES (1) ES2353371T3 (cs)
HU (1) HU230301B1 (cs)
IL (2) IL150048A0 (cs)
IN (1) IN247731B (cs)
MX (1) MX264033B (cs)
MY (1) MY124714A (cs)
NZ (1) NZ519404A (cs)
PH (1) PH12000003381B1 (cs)
PL (1) PL203054B1 (cs)
PT (1) PT1239872E (cs)
RU (1) RU2272419C2 (cs)
SK (1) SK287956B6 (cs)
TW (1) TWI255189B (cs)
UA (1) UA78486C2 (cs)
WO (1) WO2001041785A2 (cs)

Families Citing this family (31)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
UA78486C2 (uk) 1999-12-10 2007-04-10 Хемджен Корпорейшн Композиція для перорального введення птахам та тваринам для лікування або зниження ризику інфекції травного тракту (варіанти), її застосування (варіанти) та спосіб лікування або зниження ризику інфекцій травного тракту (варіанти)
US7247299B2 (en) * 2002-11-27 2007-07-24 Kemin Industries, Inc. Antimicrobial compounds from Bacillus subtilis for use against animal and human pathogens
US7566447B2 (en) * 2003-05-15 2009-07-28 Iogenetics, Llc Biocides
US8703134B2 (en) 2003-05-15 2014-04-22 Iogenetics, Llc Targeted cryptosporidium biocides
US8394379B2 (en) * 2003-05-15 2013-03-12 Iogenetics, Llc Targeted cryptosporidium biocides
US20050014932A1 (en) * 2003-05-15 2005-01-20 Iogenetics, Llc Targeted biocides
US8431123B2 (en) 2003-07-14 2013-04-30 Cls Therapeutics Limited Method for treating systemic bacterial, fungal and protozoan infection
WO2006130034A1 (fr) 2005-04-25 2006-12-07 Dmitry Dmitrievich Genkin Procede pour prolonger la duree de vie d'animaux ou de l'humain
US8710012B2 (en) 2003-07-14 2014-04-29 Cls Therapeutics Limited Method for treating oncological diseases
US8388951B2 (en) 2003-07-14 2013-03-05 Cls Therapeutics Limited Method for treating systemic DNA mutation disease
CA2585017A1 (en) * 2004-10-20 2006-12-14 Iogenetics, Llc Biocides
PL1973561T3 (pl) * 2005-12-15 2011-08-31 Elanco Us Inc Enzymy do zmniejszania stresu immunologicznego
EP1981355B1 (en) * 2006-01-23 2018-03-14 Hill's Pet Nutrition, Inc. Methods for reducing food intake and controlling the weight of animals
RU2319481C1 (ru) * 2006-10-20 2008-03-20 Илья Николаевич Медведев Способ коррекции уровня оксида азота в крови поросят с острым катаральным энтеритом
KR20090087095A (ko) 2006-11-28 2009-08-14 드미트리 드미트리에비치 겐킨 조직의 세포외공간에서 증가된 데옥시리보핵산 함량과 관련된 인간 질병을 치료하는 방법 및 이 방법을 수행하기 위한 약학 제제
CA2689302C (en) * 2007-06-08 2015-08-25 Australian Poultry Crc Pty Ltd. Clostridial toxin netb
RU2440369C2 (ru) * 2007-08-03 2012-01-20 Бёрингер Ингельхайм Ветмедика Гмбх ГЕНЫ И БЕЛКИ Brachyspira hyodysenteriae И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ
DK2225356T3 (en) * 2007-12-20 2014-11-17 Danisco Us Inc Enzymatic prevention and control of biofilm
WO2009100456A2 (en) * 2008-02-08 2009-08-13 Prothera, Inc. Inhibition and treatment of gastrointestinal biofilms
RU2380901C1 (ru) * 2008-08-13 2010-02-10 Государственное научное учреждение Ставропольский научно-исследовательский институт животноводства и кормопроизводства Российской академии сельскохозяйственных наук Способ повышения однородности стада, живой массы, конверсии корма при выращивании цыплят
JP6046168B2 (ja) 2012-02-16 2016-12-14 イーライ リリー アンド カンパニー 動物排泄物の環境影響を減少させるための方法および組成物
US10617743B2 (en) 2014-06-19 2020-04-14 Cls Therapeutics Limited Method to improve safety and efficacy of anti-cancer therapy
TWI656872B (zh) 2014-11-13 2019-04-21 美商益農美國公司 甲基鹽黴素於豬飼料中之抗病毒效果
US11701410B2 (en) 2015-05-22 2023-07-18 Cls Therapeutics Limited Extracellular DNA as a therapeutic target in neurodegeneration
CN106119221A (zh) * 2016-06-28 2016-11-16 浙江省农业科学院 磷脂酰肌醇特异性磷脂酶c基因、载体、工程菌及应用
CN106318925B (zh) * 2016-08-19 2021-04-02 浙江省农业科学院 利用枯草芽孢杆菌高效表达pi-plc基因的方法
CN106615691B (zh) * 2016-10-11 2019-07-02 上海国龙生物技术集团有限公司 一种抗感染酶复合剂及其在饲料中的应用
US10501730B2 (en) * 2017-05-30 2019-12-10 Ab Enzymes Oy Mannanase variants
JP2021510539A (ja) 2018-01-16 2021-04-30 シーエルエス セラピューティクス リミテッドＣＬＳ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ Ｌｉｍｉｔｅｄ デオキシリボヌクレアーゼ（ＤＮａｓｅ）活性を有する酵素の肝臓発現による疾患の処置
EP3759496A1 (en) * 2018-03-02 2021-01-06 Evonik Operations GmbH In vitro method for detecting intestinal barrier failure in animals by determining ovotransferrin
RU2720471C1 (ru) * 2019-03-21 2020-04-30 Федеральное Государственное бюджетное научное учреждение "Федеральный научный центр биологических систем и агротехнологий российской академии наук" Кормовая добавка для цыплят-бройлеров

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1997041739A1 (en) * 1996-05-03 1997-11-13 Chemgen Corporation Hemicellulase use in feeds with low caloric content

Family Cites Families (21)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB1509866A (en) 1975-06-10 1978-05-04 Johnson & Johnson Enteric coated digestive enzyme compositions
JPS5534039A (en) 1978-08-30 1980-03-10 Hiroo Ikezawa Preparation of phsophatidylinositol phospholipase c from bacillus thuringiensis
EP0229810B1 (en) 1985-07-09 1991-10-16 Quadrant Bioresources Limited Protection of proteins and the like
US5049379A (en) 1987-07-27 1991-09-17 Wisconsin Alumni Research Foundation Fungicidal toxin and method and inoculum for controlling root rot and damping off
US4877738A (en) 1986-07-25 1989-10-31 Wisconsin Alumni Research Foundation Biological control of damping off and root rot and inoculum preparation therefor
JPH0338530A (ja) * 1989-07-03 1991-02-19 Ajinomoto Co Inc 抗真菌剤
US5487897A (en) * 1989-07-24 1996-01-30 Atrix Laboratories, Inc. Biodegradable implant precursor
ES2114889T3 (es) 1990-05-29 1998-06-16 Chemgen Corp Suplemento de semicelulasa que mejora el rendimiento energetico de alimentos que contienen hemicelulosa y producto alimentario para animales.
EP0477739A3 (en) * 1990-09-27 1992-12-09 F. Hoffmann-La Roche Ag Glycosyl-phosphatidylinositol-specific phospholipase d
CA2114122A1 (en) * 1991-07-24 1993-02-04 Thomas Sai Ying Ko Therapeutic compositions and methods
JPH07184642A (ja) * 1993-12-27 1995-07-25 Toagosei Co Ltd ホスホリパーゼｃの生産方法
EP0743017B1 (en) * 1995-05-15 2004-09-29 DSM IP Assets B.V. Application of phospholipases in animal feed
MY134684A (en) * 1995-05-15 2007-12-31 Gist Brocades Bv Application of phospholipases in animal feed
JPH08332032A (ja) * 1995-06-12 1996-12-17 Showa Denko Kk 動物経口物用酵素剤及びその用途
JP3914585B2 (ja) * 1995-10-19 2007-05-16 イーエヌ大塚製薬株式会社 マクロファージ一酸化窒素産生亢進剤
US6162473A (en) * 1996-05-03 2000-12-19 Chemgen Corporation Hemicellulase use in feeds with low caloric content
JPH1045581A (ja) * 1996-07-29 1998-02-17 Hideyo Yamaguchi 好中球機能低下抑制剤又は感染防御剤
AU4772597A (en) * 1996-10-31 1998-05-22 Novo Nordisk A/S Novel phospholipase, production and use thereof
KR20010089301A (ko) * 1998-10-15 2001-09-29 윌리암 로엘프 드 보에르 동물 사료에서 항미생물 효소
UA78486C2 (uk) 1999-12-10 2007-04-10 Хемджен Корпорейшн Композиція для перорального введення птахам та тваринам для лікування або зниження ризику інфекції травного тракту (варіанти), її застосування (варіанти) та спосіб лікування або зниження ризику інфекцій травного тракту (варіанти)
US20020116028A1 (en) * 2001-02-20 2002-08-22 Wilson Greatbatch MRI-compatible pacemaker with pulse carrying photonic catheter providing VOO functionality

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1997041739A1 (en) * 1996-05-03 1997-11-13 Chemgen Corporation Hemicellulase use in feeds with low caloric content

Also Published As

Publication number Publication date
IN2002DE00585A (cs) 2009-03-20
CN102172262A (zh) 2011-09-07
CN1433319A (zh) 2003-07-30
DE60045010D1 (de) 2010-11-04
US6780628B2 (en) 2004-08-24
US20020048576A1 (en) 2002-04-25
HUP0203402A3 (en) 2004-12-28
CZ20022007A3 (cs) 2002-11-13
BR0016231A (pt) 2003-06-24
SK8262002A3 (en) 2002-12-03
IL150048A0 (en) 2002-12-01
BRPI0016231B8 (pt) 2021-05-25
PL356175A1 (en) 2004-06-14
AR026764A1 (es) 2003-02-26
CA2394856C (en) 2011-05-10
JP2003520207A (ja) 2003-07-02
HU230301B1 (hu) 2015-12-28
PL203054B1 (pl) 2009-08-31
TWI255189B (en) 2006-05-21
WO2001041785A2 (en) 2001-06-14
KR100639746B1 (ko) 2006-10-30
CN101327320A (zh) 2008-12-24
EP1239872B1 (en) 2010-09-22
AU2577601A (en) 2001-06-18
MXPA02005735A (es) 2003-10-14
ATE481981T1 (de) 2010-10-15
CR6674A (es) 2007-02-22
CL2008000057A1 (es) 2008-03-14
IL150048A (en) 2016-09-29
WO2001041785A3 (en) 2002-01-24
DK1239872T3 (da) 2010-10-25
MY124714A (en) 2006-06-30
CO5280226A1 (es) 2003-05-30
PT1239872E (pt) 2010-12-03
US20040223961A1 (en) 2004-11-11
PH12000003381B1 (en) 2010-04-16
RU2272419C2 (ru) 2006-03-27
US7723091B2 (en) 2010-05-25
ES2353371T3 (es) 2011-03-01
BRPI0016231B1 (pt) 2016-10-04
AU782831B2 (en) 2005-09-01
IN247731B (cs) 2011-05-13
EP1239872A2 (en) 2002-09-18
UA78486C2 (uk) 2007-04-10
KR20020069204A (ko) 2002-08-29
CN102172262B (zh) 2014-03-05
SK287956B6 (sk) 2012-07-03
AR089799A2 (es) 2014-09-17
JP4871473B2 (ja) 2012-02-08
MX264033B (es) 2009-01-22
CA2394856A1 (en) 2001-06-14
HUP0203402A2 (hu) 2003-02-28
NZ519404A (en) 2004-05-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CZ304925B6 (cs) Prostředek obsahující enzym a použití enzymu
CZ20031900A3 (cs) Směs mikrobiálních enzymů
US20170156371A1 (en) Enzymes for reduced immunological stress
KR20020070313A (ko) 동물 사료용 첨가제
EP0681787B1 (en) Use of an enzyme for manufacturing an agent for the treatment and/or prophylaxis of coccidiosis
WO2025059424A1 (en) Pro-biotic compositions and methods for treatment of stress

Legal Events

Date Code Title Description
MK4A Patent expired

Effective date: 20201208