BRPI0620155B1

BRPI0620155B1 - Composição adequada para administração oral a um animal compreendendo uma enzima redutora de estresse imunológico em um veículo aceitável por via oral

Info

Publication number: BRPI0620155B1
Application number: BRPI0620155-5A
Authority: BR
Inventors: David M Anderson; Humg-Yu Hsiao; Lin Liu
Original assignee: Lilly Co Eli
Priority date: 2005-12-15
Filing date: 2006-12-14
Publication date: 2015-07-21
Also published as: MX2008007735A; RU2465005C2; US20070141041A1; ES2361819T3; NZ569186A; EP2263685A3; SV2008002942A; US20170156371A1; SI1973561T1; GT200600512A; KR101399205B1; AR057247A1; ZA200805780B; TWI402039B; CR10116A; CN105831428A; US20110171345A1; KR101454032B1; HN2008000906A; ATE497779T1

Description

"COMPOSIÇÃO ADEQUADA PARA ADMINISTRAÇÃO ORAL A UM ANIMAL COMPREENDENDO UMA ENZIMA REDUTORA DE ESTRESSE IMUNOLÓGICO EM UM VEÍCULO ACEITÁVEL POR VIA ORAL" .

Campo da invenção A presente invenção fornece composições e métodos para redução do estresse imunológico e melhoria da performance do crescimento animal. Em particular, a invenção fornece composições que compreendem enzimas que são eficazes para reduzir estresse imunológico ou que são eficazes para tratar ou evitar infecção ou que são eficazes para melhorar a performance do crescimento animal. A invenção também fornece métodos de uso de tais composições.

Fundamento Um animal pode experimentar estresse imunológico por inúmeras razões, incluindo exposição a um antigeno que é reconhecido pelo sistema imune do animal. Um antígeno pode despertar uma resposta imune que é uma resposta imune adap-tativa ou que é uma resposta imune inata. Quando uma resposta imune é ativada, o animal experimenta estresse imunológico, uma vez que seu sistema imune responde à ameaça percebida. Freqüentemente, o estresse imunológico atrasa a performance de crescimento do animal.

Proteínas de fase aguda (APP) são um grupo de proteínas sangüíneas cuja concentração no sangue muda quando um animal experimenta estresse, como infecção, inflamação, trauma cirúrgico, ou outros desafios internos ou externos. Veja, por exemplo, Murata e cols., V&t. J, 168: 28 (2004) . Acredita-se que APP tenham um papel em uma resposta imune inata do animal. Por exemplo, APP podem estar envolvidas na restauração da homeostasia e contenção de crescimento mi~ crobiano até que seja desenvolvida uma imunidade adquirida APP incluem proteínas "negativas" cuja concentração diminui com estresse, e proteínas "positivas" cuja concentração aumenta com estresse. Veja, por exemplo, Murata e cols., supra. APP negativas incluem albumina e transferrina. APP positivas incluem proteínas sintetizadas por hepatócitos após estímulo por citocinas prõ-inflamatórias e liberadas na corrente sangüínea, como haptoglobina, proteína C-reativa, amilóide A sérico, ceruloplasmina, fibrinogênio, e α-1-ãcido glicoproteína (AGP). A produção extra-hepãtica de APP também foi relatada para a maioria das espécies de mamíferos. Jd. Acredita-se que citocinas pró-inflamatórias como interleucina-6 (IL-6) e fator de necrose tumoral (TNF-ct) sejam os principais mediadores de síntese de APP no fígado. Inflamação, infecção ou dano tecidual ativa a liberação de citocinas por células orientadas para defesa, assim induzindo a síntese de APP. A indução de APP positivas também é associada com uma diminuição na síntese de APP negativas. Id. Métodos de quantificação de APP foram estabelecidos, e a concentração de APP circulantes (por exemplo, níveis séricos de APP) foi correlacionada à severidade da condição do animal. Id. Portanto, a concentração das APP também pode ser usada como um indicador do nível de estresse imunolõgico de um animal.

Um sistema imune do animal pode reconhecer antígenos que não representam uma ameaça real à saúde do animal, como ingredientes derivados de plantas e animais em composições de ração animal. Esses antígenos podem ativar uma resposta imune, como uma resposta imune inata, dessa forma fazendo o animal passar por estresse imunológico. Essa resposta de estresse pode ser identificada e monitorada por meio da concentração sérica de APP.

Mesmo quando o antigeno ativador imune não representa uma ameaça real à saúde do animal, a resposta de estresse pode ter um efeito prejudicial. Isso pode ser observado como uma diminuição na eficiência do alimento, uma diminuição na taxa de ganho de peso ou uma diminuição no peso, um aumento na suscetibilidade à infecção, ou um aumento na temperatura corporal, por exemplo. 0 uso de anticorpos, como anticorpos anti-fosfolipase A2, para reduzir inflamação gastrointestinal em animais foi descrito. Veja, por exemplo, a Patente U.S. No. 6.383.485. Foram descritas composições de alimento que compreendem uma hemicelulase capaz de degradar hemicelulose que contém β~ manana (por exemplo, uma hemicelulase tipo β-mananase), como endo-1,4^-mananase, ou uma fosfolipase, como fosfolipase A2, para melhor eficiência do alimento. Veja, por exemplo, WO 97/41739, Patente U.S. No. 6.162.473, e Patente U.S. No. 6.183.739.

Foram descritas do mesmo modo composições de alimento que compreendem uma enzima, como PI-PLC, que cliva uma ligação, assim efetuando a liberação de uma proteína ou carboidrato de superfície celular, para o tratamento ou prevenção de infecção do trato digestivo. Veja, por exemplo, WO 01/41785. Walsh e cols. , «7. Anim. Sei. 73: 1074 (1995) discutem composições de alimento que compreendem enzimas de glicanase que clivam um substrato de glicano de ligação misto, como 1,4^-glicanase que cliva β-1,3,β-1,4-substratos mistos. Em outros testes, no entanto, nem PI-PLC nem 1,4-p-glicanase apresentaram atividade de redução do estresse imunolõgico. Não houve qualquer descrição até agora de uma composição de alimento que compreenda uma enzima que seja outra que não uma hemicelulase de tipo β-mananase ou uma fosfolipase e que esteja presente em uma quantidade eficaz para reduzir estresse imunológico.

Portanto, há uma necessidade por composições e metodologia para a redução do estresse imunológico em animais.

Sumário da invenção Uma modalidade fornece a composição adequada para administração oral a um animal que compreende uma enzima redutora de estresse imunológico em um veiculo aceitável por via oral. A composição é selecionada do grupo que consiste em: (i) uma ração animal que compreende uma quantidade da enzima eficaz para diminuir o nível de proteína de fase aguda positiva no animal, aumentar o nível de proteína de fase aguda negativa no animal, e/ou melhorar a performance de crescimento do animal; (ii) uma composição líquida outra que não uma ração animal que compreende pelo menos 40.000 UI enzima/L; e (iii) uma composição sólida outra que não uma ração animal que compreende pelo menos 40.000 UI de enzima/kg. A enzima é outra que não uma hemicelulase ou fosfolipase de tipo β-mananase, e, se a enzima compreende 1,3^-glicanase, a composição é selecionada do grupo que consiste em (i) uma ração animal que compreende pelo menos 20 IU de alimento de 1,3-β-glicanase/kg; (ii) uma composição líquida outra que não uma ração animal que compreende pelo menos 155.000 UI de 1,3-β- glicanase/L, e (iii) uma composição sólida outra que não uma ração animal que compreende pelo menos 300.000 UI de 1,3-p-glicanase/kg.

Em uma modalidade, a composição é uma ração animal que compreende pelo menos 20 UI de enzima/kg de alimento. Em uma outra modalidade, a composição é uma composição sólida outra que não uma ração animal que compreende pelo menos 80.000 UI de enzima/kg, ou pelo menos 160.000 UI de enzima/kg.

Em uma modalidade, a composição é uma ração animal que compreende um ingrediente que induz uma resposta imune no animal e uma enzima compreende uma enzima que degrada o referido ingrediente. Em uma modalidade, o ingrediente é um antígeno apresentado por um microorganismo patogênico.

Em uma modalidade, a enzima compreende 1,3-β-glicanase. Em uma modalidade, a enzima compreende 1,3-β-glicanase e a composição é selecionada do grupo que consiste em (i) uma ração animal que compreende pelo menos 30 UI de 1,3-p-glicanase/kg de alimento; (ii) uma composição líquida outra que não uma ração animal que compreende pelo menos 230.000 UI de 1,3-p-glicanase/L; e (iii) uma composição sólida outra que não uma ração animal que compreende pelo menos 450.000 UI de 1,3-p-glicanase/kg.

Uma outra modalidade fornece uma composição adequada para administração oral a um animal que compreende duas ou mais enzimas redutoras de estresse imunológico , em que a composição compreende pelo menos uma enzima redutora de estresse imunológico outra que não 1,4-p-mananase e 1,3-β-glicanase. A composição é selecionada do grupo que consiste em (i) uma ração animal que compreende uma quantidade das referidas enzimas redutoras de estresse imunológico eficazes para diminuir o nível de proteína de fase aguda positiva no referido animal, aumentar o nível de proteína de fase aguda negativa no referido animal, e/ou melhorar a performance de crescimento do animal; {ii) uma composição líquida outra que não uma ração animal que compreende pelo menos uma enzima redutora de estresse imunológico em uma quantidade de pelo menos 40.000 UI enzima/L; e (iii) uma composição sólida outra que não uma ração animal que compreende pelo menos uma enzima redutora de estresse imunológico em uma quantidade de pelo menos 40.000 UI de enzima/kg.

Em uma modalidade, a composição é uma ração animal que compreende pelo menos uma enzima redutora de estresse imunológico em uma quantidade de pelo menos 2 0 UI de enzima/kg de alimento. Em uma outra modalidade, a composição é uma composição sólida outra que não uma ração animal que compreende pelo menos uma enzima redutora de estresse imunológico em uma quantidade de pelo menos 80.000 UI de enzima/kg, ou pelo menos 160.000 UI de enzima/kg.

Em modalidades específicas, a composição é selecionada do grupo que consiste em (i) uma composição que compreende 1,4-p-mananase e quitanase; (ii) uma composição que compreende 1,4-p-mananase e xiloglicanase; (iii) uma composição que compreende 1,4-p-mananase e arabinanase; (iv) uma composição que compreende 1,3-p-glicanase e quitanase; (v) uma composição que compreende 1,3-β-glicanase e xiloglicanase; (vi) uma composição que compreende 1,3-p-glicanase e arabinanase; e (vii) uma composição que compreende 1,4-p-mananase, 1,3-p-glicanase e arabinanase.

Uma outra modalidade fornece uma composição adequada para administração oral a um animal que compreende 1,4-β-mananase e 1,3-p-glicanase. A composição é selecionada do grupo que consiste em (i) uma ração animal que compreende 1,4-β-mananase e pelo menos 20 UI de 1,3-x-glicanase/kg de alimento, (ii) uma composição líquida outra que não uma ração animal que compreende 1,4-β-mananase e pelo menos 155.000 UI de 1,3-β -glicanase/L, e (iii) uma composição sólida outra que não uma ração animal que compreende 1,4-β-mananase e pelo menos 300.000 UI de 1,3-p-glicanase/kg. Sm uma modalidade, a composição é selecionada do grupo que consiste em (i) uma ração animal que compreende 1,4-β-mananase e pelo menos 30 UI de 1,3-p-glicanase/kg de alimento; (ii) uma composição líquida outra que não uma ração animal que compreende 1,4-β-mananase e pelo menos 230.000 UI de 1,3^-glicanase/L, e (iii) uma composição sólida outra que não uma ração animal que compreende 1,4-β-mananase e pelo menos 450.000 UI de 1,3-β-glicanase/kg. Em uma modalidade, a composição também compreende uma ou mais enzimas redutoras adicionais de estresse imunológico.

Uma outra modalidade fornece um método de melhoria da performance de crescimento do animal e/ou redução de estresse imunológico em um animal, que compreende a administração por via oral ao animal de qualquer uma das composições acima descritas.

Em uma modalidade, o animal é administrado com ura ingrediente que induz uma resposta imune no animal e uma composição compreende pelo menos uma enzima redutora de estresse imunológico que degrada o ingrediente. Em uma modalidade, o ingrediente e enzima são administrados na mesma composição. Em uma modalidade, a composição é uma ração animal. Em uma modalidade, o ingrediente é um antígeno apresentado por um microorganismo patogênico.

Uma outra modalidade fornece um método de prevenção ou tratamento de infecção associada com um microorganismo patogênico que apresenta um antígeno, que compreende a administração por via oral a um animal em necessidade deste de qualquer uma das composições acima descritas, em que a composição compreende pelo menos uma enzima redutora de estresse imunológico que degrada o antígeno.

Breve descrição dos desenhos Figura 1 mostra o melhor ajuste de curva (e equação polinomial subjacente) para cálculo da concentração de a-1-ãcido glicoproteína de galinha (AGP) em amostras de plasma de galinhas de teste com dados obtidos no Exemplo 1.

Figura 2 é um gráfico Box and Wisker que mostra os níveis de AGP em soro de galinha de galinhas de teste, como descrito no Exemplo 2. A faixa dos dados é representada pelas linhas verticais. A caixa representa a faixa dos dados com um desvio padrão da média. A linha horizontal indica a média de dados.

Figura 3 mostra os níveis de AGP de soro de galinhas que recebem um de vários diferentes alimentos, incluindo alimentos de acordo com a invenção e alimentos de técnica prévia, como descrito no Exemplo 3.

Figura 4 mostra o melhor ajuste de curva {e equação polinomial subjacente) para cálculo da concentração de AGP em amostras de plasma de perus de teste com dados obtidos no Exemplo 8.

Descrição detalhada Como usado na discussão a seguir, os termos "um" ou "uma" devem englobar um ou mais, a menos que especificado de outro modo.

Como aqui usado, o termo "animal" refere-se a qualquer animal, incluindo humanos e outros animais, como animais não humanos, incluindo animais de companhia como cães e gatos, rebanhos, como vacas e outros ruminantes, búfalo, cavalos, porcos, carneiro, aves (por exemplo, galinha, patos, perus e gansos) e animais de aqüicultura (por exemplo, peixe, camarão e enguias).

Na presente descrição, as frases "enzima que degrada um antígeno" e "enzima que degrada um ingrediente" significam que a enzima converte o antígeno ou ingrediente a uma forma que não é reconhecida pelo sistema imune do animal. A capacidade de uma enzima de degradar um antígeno ou ingrediente pode ser identificada por medição da concentração sérica de APP no animal, segundo a qual uma diminuição na concentração sérica de APP positiva, ou um aumento na concentração sérica de APP negativo, indica que a enzima degradou o antígeno ou ingrediente.

Como acima observado, o termo "APP" inclui proteínas "negativas" cuja concentração diminui com estresse, e proteínas "positivas" cuja concentração aumenta com estresse. A invenção inclui composições e métodos que aumentam a concentração de proteínas de fase aguda negativas cuja concentração tipicamente diminui com estresse, bem como as composições e métodos que diminuem a concentração de proteínas de fase aguda positivas cujas concentrações tipicamente aumentam com estresse. Para conveniência, na discussão que se segue, a invenção é exemplificada com referência ao efeito das composições e métodos sobre as proteínas de fase aguda positivas. Portanto, o termo "APP" na discussão que se segue geralmente se refere a quaisquer uma ou mais proteínas de fase aguda positivas associadas com uma resposta de estresse do animal. Deve ser entendido que as composições e métodos aqui descritos como diminuindo a concentração de "APP" {em referência a proteínas de fase aguda positivas) também são úteis para aumento da concentração de proteínas de fase aguda negativas.

Um aspecto da invenção relaciona-se a uma composição que compreende uma enzima que é eficaz para reduzir o estresse imunológico experimentado por um animal. Para conveniência, essas enzimas são aqui referidas como enzimas "redutoras do estresse imunológico " . Como aqui usado, o termo "enzima redutora de estresse imunológico " significa qualquer enzima que degrada um antígeno ou padrão molecular que é reconhecido pelo sistema imune do animal, por exemplo, um antígeno ou padrão molecular que ativa uma resposta imune, assim fazendo o animal experimentar estresse imunológico. O termo "padrão molecular" como aqui usado inclui padrões moleculares gerais que são ligados por receptores no contexto do sistema imune inato, como padrões moleculares que são comumente associados com patógenos.

De acordo com uma modalidade, a enzima redutora de estresse imunológico não é uma hemicelulase tipo β-mananase. De acordo com aquela modalidade, a enzima redutora de estresse imunológico não é endo-1,4-P-D-mananase. De acordo com uma outra modalidade, a enzima não é uma fosfolipase. De acordo com uma outra modalidade, a enzima redutora de estresse imunológico não é 1,4-p-D-glicanase. De acordo com uma outra modalidade, a enzima redutora de estresse imunológico não é PI- PLC. De acordo com uma outra modalidade, a enzima redutora de estresse imunológico não é uma hemicelulase tipo β-mananase ou uma fosfolipase. De acordo com ainda uma outra modalidade, a enzima redutora de estresse imunológico não é uma hemicelulase tipo β-mananase, não é 1,4-p-glicanase, e não é uma fosfolipase. De acordo com uma modalidade adicional, a enzima redutora de estresse imunológico não é uma hemicelulase tipo β-mananase, não é 1,4-p-glicanase, não é uma fosfolipase, e não é PI-PLC. De acordo com um aspecto de qualquer uma das modalidades acima descritas, a enzima não é 1,3-p-glicanase.

Embora não desejando estar atado por qualquer teoria, os presentes inventores acreditam que a degradação pela enzima redutora de estresse imunológico do antígeno ou padrão molecular inibe ou reduz a resposta imune ativada pelo antígeno ou padrão molecular, assim reduzindo o estresse imunológico do animal. A redução no estresse imunológico pode ser identificada e monitorada por medição da concentração sérica de APP do animal, com o uso de métodos conhecidos na técnica para quantificação de APP. Exemplos de tais métodos são referidos em Murata, e cols., supra, e são descritos e referidos em Hulten e cols., Vet. Microbiol. 95: 75 (2003) e Holt e cols., supra, bem como no Exemplo 1 abaixo.

Em uma modalidade relacionada, a invenção fornece métodos para redução do estresse imunológico in um animal que compreende a administração ao animal de uma composição que compreende uma quantidade de uma enzima redutora de estresse imunológico eficaz para reduzir o nível de APP no animal.

Inúmeras diferentes proteínas de fase aguda positivas foram identificadas, incluindo α-1-ácido glicoproteína (AGP), ceruloplasmina (Cp), proteínas da família de coletina (por exemplo, proteínas surfactantes pulmonares, lectina de ligação de conglutinina e manana), fibrinogênio (Fb), proteína C-reativa (CRP), haptoglobina, inibidores da protease (por exemplo, α-1-antitripsina, a-1-antiquimiotripsina, e α-2-macroglobulina) e amilóide-A sérico (SAA). Outras APP potenciais incluem proteína de ligação de lipopolissacarídeo (LBP), proteína de ligação de fosfolipídeo como anexinas e Proteína de Fase Aguda Principal (MAP). Murata, e cols, supra. As concentrações séricas de qualquer uma dessas ou de outras APP podem ser usadas para identificar, avaliar e monitorar a atividade da enzima de acordo com a invenção.

Diferentes APP podem ter papéis mais significativos nas respostas de estresse de diferentes animais. Por exemplo, AGP é conhecida por ser clinicamente importante em gado, e está associada com infecção em porções, cães, gatos e aves (incluindo galinha). Cp foi relatada como sendo um indicador de infecção em gado, cavalos, e galinhas. CRP foi identificada em ruminantes, cavalos, porcos, cães, e gatos, embora não tenha sido demonstrado que CRP seja uma APP em gado. CRP mostrou estar associada com infecção em cavalos e porcos. Fb é um indicador confiável de inflamação, infecção bacteriana ou trauma cirúrgico em gado e carneiros, e está associado com infecção em cavalos. Hp é uma APP em inúmeros animais de reprodução e de companhia, incluindo ruminantes como gado, carneiro, porcos, cavalos, e cães. SAA foi associado com inflamação e infecção em gado e com infecção em cavalos, porcos, animais de companhia como cães, e galinha. Um aumento nos níveis do leite de SAA foi encontrado em vacas e ovelhas com mastite. LBP sérica foi associada com infecção em gado, assim como foram níveis locais de anexinas (na superfícies do epitélio secretor em pulmões de gado infectado). MAP é relatada como sendo um indicador de infecção em porcos. Adicionalmente, embora transferrina seja comumente considerada uma proteína de fase aguda negativa, ela parece ter um papel como uma proteína de fase aguda positiva em galinhas. Murata, e cols , supra; Holt e cols., Poultry Sei. 81: 1295-1300 (2002). Outros relataram que SAA e Hp, bem como CRP e MAP, estão associados com infecção em porcos. Hulten e cols., supra.

Em algumas modalidades, as composições da invenção compreendem uma quantidade de enzima redutora de estresse imunológico que é eficaz para diminuir a concentração sérica de APP em um animal. A quantidade pode variar dependendo do animal e uma enzima redutora de estresse imunológico , e pode ser determinada facilmente por aqueles habilitados na técnica com o uso de métodos conhecidos na técnica. Por exemplo, níveis séricos de APP do animal podem ser medidos antes e subseqüentemente à administração da enzima, ou níveis séricos de APP de animais de controle e tratados equivalentes podem ser comparados, (com relação a isso, pode ser vantajoso comparar animais de controle e tratados da mesma idade, uma vez que os níveis de APP podem mudar com a idade. Por exemplo, nós constatamos que os níveis séricos de AGP aumentam com a idade da galinha. Uma diminuição na concentração sérica de APP associada com administração da enzima indica que uma quantidade eficaz de enzima foi administrada.

Em outras modalidades, as composições da invenção compreendem uma quantidade de enzima redutora de estresse imunológico que é eficaz para melhorar a performance de crescimento do animal (também referida como "performance viva", particularmente no campo de aves domésticas). Como aqui usado, a frase "performance de crescimento do animal" inclui qualquer parâmetro que reflita o crescimento do animal, incluindo conversão do alimento, absorção de água, conteúdo de água das fezes, uniformidade do peso corporal em um a rebanho ou grupo de animais, habitabilidade, e mortalidade. Embora não desejando estar atado a qualquer teoria, acredita-se que, sob algumas condições, o feito da enzima redutora de estresse imunológico sobre a concentração de APP é mascarado por fatores como fatores que induzem estresse imunológico , como a presença de uma infecção de baixo nível em um grupo de animais ou condições de habitação estressantes. Sob tais condições, a enzima redutora de estresse imunológico pode, todavia, ser eficaz para melhorar a performance de crescimento do animal. Portanto, a performance de crescimento do animal é uma medida alternativa da eficácia das composições e métodos d ,v a presente invenção. A composição pode ser qualquer composição adequada para administração a um animal. Em uma modalidade, a composição é adequada para administração oral. Em uma modalidade específica, a composição que é adequada para administração oral é geralmente reconhecida como segura para administração oral a um animal. Em uma outra modalidade específica, a composição que é adequada para administração oral contém apenas ingredientes, e quantidades dos referidos ingredientes, que são geralmente reconhecidos como seguros para administração oral a um animal. Em uma outra modalidade específica, a composição que é adequada para administração oral não contém qualquer ingrediente, ou quantidades dos referidos ingredientes, que não são geralmente reconhecidos como seguros para administração oral a um animal. Em uma outra modalidade específica, a composição que é adequada para administração oral contém apenas ingredientes, e quantidades dos referidos ingredientes, que são permitidos, ou que não são proibidos, para administração oral a um animal. Em uma outra modalidade específica, a composição que é adequada para administração oral não contém quaisquer ingredientes, ou quantidades dos referidos ingredientes, que não são permitidos, ou que não são proibidos, para administração oral a um animal.

Em algumas modalidades, a composição compreende um veículo aceitável por via oral para a enzima. Como aqui usado, "veículo aceitável por via oral" inclui qualquer veículo fisiologicamente aceitável adequado para administração oral. Veículos aceitáveis por via oral incluem, sem limitação, composições de ração animal, composições aquosas, e composições líquidas e sólidas adequadas para uso em produtos de ração animal e/ou para administração oral a um animal. Veículos adequados são conhecidos na técnica, e incluem aqueles descritos na Patente U.S. 6.780.628.

Em algumas modalidades, a composição é uma ração animal. Como aqui usado, o termo "ração animal" tem seu sentido convencional no campo de administração animal. Por exemplo, ração animal inclui materiais comestíveis que são consumidos por rebanho por seu calor nutricional. Ração animal inclui rações, por exemplo, composições que estão de acordo com as necessidades nutricionais de um animal, e também incluem composições que não estão de acordo com as necessidade nutricionais de um animal.

Em exemplos específicos de tal modalidade, a quantidade de enzima é de pelo menos cerca de 50.000 unidades internacionais (UI) por U.S. tonelada de alimento, pelo menos cerca de 60.000 UI por tonelada de alimento, pelo menos cerca de 70.000 UI por tonelada de alimento, pelo menos cerca de 80.000 UI por tonelada de alimento, pelo menos cerca de 90.000 UI por tonelada de alimento, pelo menos cerca de 100.000 UI por tonelada de alimento, pelo menos cerca de 200.000 UI por tonelada de alimento, ou pelo menos cerca de 500.000 UI por tonelada de alimento, ou maior.

Em outros exemplos específicos, a invenção fornece uma ração animal que compreende uma quantidade de enzima redutora de estresse imunológico de pelo menos cerca de 20 Ul/kg de alimento, como pelo menos 20 Ul/kg de alimento, pelo menos a 25 Ul/kg de alimento, pelo menos at 30 Ul/kg de alimento, pelo menos a 3 5 Ul/kg de alimento, pelo menos a 40 Ul/kg de alimento, pelo menos at 45 Ul/kg de alimento, pelo menos 50 Ul/kg de alimento, ou mais. Embora não desejando estar atado a qualquer teoria, acredita-se que uma ração animal que compreende uma quantidade de enzima redutora de estresse imunológico of pelo menos cerca de 20 Ul/kg de alimento será eficaz para diminuir o nível de proteína de fase aguda positiva no referido animal, aumentar o nível de proteína de fase aguda negativa no referido animal, e/ou melhorar a performance de crescimento do animal.

Portanto, em algumas modalidades, a invenção fornece uma ração animal que compreende uma quantidade de enzima redutora de estresse imunológico eficazes para diminuir o nível de proteína de fase aguda positiva no animal, aumentar o nível de proteína de fase aguda negativa no animal, e/ou melhorar a performance de crescimento do animal A composição de alimento pode ser preparada por métodos conhecidos na técnica. Por exemplo, enzima redutora de estresse imunológico pode ser adicionada aos outros ingredientes do alimento em qualquer estágio durante o processo de fabricação, como considerado adequado por aqueles habilitados na técnica. Em uma modalidade, a enzima é fornecida como uma solução, como um concentrado de enzima líquida que é adicionado a outros ingredientes do alimento durante o processo de fabricação. Alternativamente, uma solução que contém a enzima é pulverizada sobre a forma final da ração animal. Em uma outra modalidade, a enzima é fornecida como uma composição sólida (como um pó), como uma composição sólida que é adicionada a outros ingredientes do alimento durante o processo de fabricação. Métodos de exemplo para a fabricação do alimento que contém a enzima são descritos em WO 97/41739.

Em algumas modalidades, a composição é outra que não uma ração animal. Por exemplo, a composição pode ser uma composição líquida outra que não uma ração animal ou uma composição sólida outra que não uma ração animal. Tais composições podem ser adequadas para administração direta a um animal ou podem ser usadas como um aditivo alimentar {por exemplo, adicionado ao alimento antes da alimentação) ou um suplemento alimentar (incluindo suplementos que são diluídos com outros componentes do alimento antes da alimentação e suplementos que são oferecidos a um animal com base em escolha livre, separada). Exemplos de uma composição líquida outra que não uma ração animal incluem concentrados de enzima líquida, incluindo concentrados de enzima líquida que são tipicamente diluídos ou combinados com outros ingredientes antes da administração oral a um animal.

Em modalidades em que a composição é uma composição líquida outra que não uma ração animal, como uma solução de enzima, a composição ou solução líquida pode compreender pelo menos cerca de 40.000 unidades internacionais (UI) por litro de solução, como pelo menos 40.000 UI/L, pelo menos 50.000 UI/L, pelo menos 60.000 UI/L, pelo menos 70.000 UI/L, pelo menos 80.000 Ul/L, pelo menos 90.000 UI/L, pelo menos 100.000 Ul/L, pelo menos cerca de 500.000 UI/L, pelo menos cerca de 600.000 UI/L, pelo menos cerca de 700.000 UI/L, pelo menos cerca de 800.000 UI/L, pelo menos cerca de 900.000 UI/L, pelo menos cerca de 1.000.000 UI/L, pelo menos cerca de 2.000.000 UI/L, ou pelo menos cerca de 5.000.000 UI/L.

Em algumas modalidades, uma quantidade de composição líquida outra que não uma ração animal, como cerca de 500 mL de solução, é aplicada ou combinada com uma quantidade de alimento, como a uma tonelada de alimento, para chegar a formulações de alimento com níveis de enzima acima descritos. Em outras modalidades, uma quantidade de composição líquida outra que não uma ração animal é aplicada ou combinada com uma quantidade de alimento para preparar uma ração animal com uma quantidade de enzima eficaz para diminuir o nível de proteína de fase aguda positiva no animal, aumentar o nível de proteína de fase aguda negativa no animal, e/ou melhorar a performance de crescimento do animal.

Acredita-se que composições de concentrado de enzima líquida atualmente disponíveis (outra que não as composições de 1,3-p-glicanase discutidas abaixo) que são adequadas para administração oral compreendem muito menos que pelo menos cerca de 40.000 UI/L de uma enzima redutora de estresse imunológico , se houver, e não são eficazes para diminuir o nível de proteína de fase aguda positiva, aumentar o nível de proteína de fase aguda negativa, e/ou melhorar a performance de crescimento do animal, quando usadas de acordo com suas instruções.

Em modalidades em que a composição é uma composição sólida outra que não uma ração animal, a composição pode compreender pelo menos cerca de 40.000 UI//kg. como pelo menos 40.000 Ul/kg. pelo menos 50.000 Ul/kg. pelo menos 60.000 Ul/kg. pelo menos 70.000 Ul/kg. pelo menos 80.000 Ul/kg. pelo menos 90.000 Ul/kg. pelo menos 100.000 Ul/kg. pelo menos 120.000 Ul/kg. pelo menos 140.000 Ul/kg. pelo menos 160.000 Ul/kg. pelo menos 180.000 Ul/kg. pelo menos 200.000 Ul/kg, ou mais.

Em algumas modalidades, uma quantidade de uma composição sólida outra que não uma ração animal é aplicada ou combinada com uma quantidade de alimento para chegar a formulações de alimento com níveis de enzima acima descritos. Em outras modalidades, uma quantidade de composição sólida outra que não uma ração animal é combinada com uma quantidade de alimento para preparar uma ração animal com uma quantidade de enzima eficazes para diminuir o nível de proteína de fase aguda positiva no animal, aumentar o nível de proteína de fase aguda negativa no animal, e/ou melhorar a performance de crescimento do animal.

Acredita-se que composições sólidas de enzima em pó atualmente disponíveis que são adequadas para administração oral compreendem muito menos que pelo menos cerca de 40.000 Ul/kg de uma enzima redutora de estresse imunológico , se houver, e não são eficazes para diminuir o nível de proteína de fase aguda positiva, aumentar o nível de proteína de fase aguda negativa, e/ou melhorar a performance de crescimento do animal, quando usadas de acordo com suas instruções.

Como convencional na técnica, o termo "UI" ou "unidade internacional" refere-se a uma quantidade de enzima que catalisará a transformação de 1 micromol do substrato por minuto sob condições que são ótimas para a enzima, equivalentes de peso a unidades internacionais das enzimas redutoras de estresse imunológico são conhecidos na técnica e podem ser determinados com o uso de ensaios padrão.

Ensaios padrão de exemplo para enzimas redutoras de estresse imunológico representativas são apontados abaixo.

Em uma modalidade, a enzima é expressa por uma planta que é usada em ração animal. Por exemplo, milho pode ser geneticamente modificado para expressar uma enzima redutora de estresse imunológico e o produto do milho geneticamente modificado resultante pode ser usado no alimento. A produção também pode ser efetuada com outros sistemas geneticamente modificados ou classicamente modificados como bactérias, por exemplo, E. coli, Bacillus sp., Lactobacillus; leveduras, por exemplo, Pichia, Yarrow, Saccharomyces, Schizosaccharomyces (por exemplo, Schizosaccharomyces pon±> , Hansenula, Kluyveromyces, Candida) , e outros fungos, como Aspergillus, Rhizopus, Tricoderma, Humicola, Penicillium, e Humicola.

De acordo com uma outra modalidade, a enzima redutora de estresse imunológico é fornecida em uma cápsula ou comprimido para ingestão oral. A invenção também engloba modalidades em que a enzima é administrada por outras vias, como intravenosa, peritoneal, ou subcutânea, como um componente da composição formulada para tal administração de acordo com práticas farmacológicas conhecidas.

Um sistema imune do animal pode reconhecer como um antígeno ou padrão molecular certos ingredientes de uma composição de alimento que não representam uma ameaça real à saúde do animal. No entanto, o ingrediente ativa uma resposta imune que faz o animal experimentar estresse imunológico, e que pode ser identificada e monitorada por um aumento na concentração sérica de uma ou mais APP. Embora não desejando estar atado a qualquer teoria, os presentes inventores acreditam que essa resposta imune "desnecessária e contraprodutiva" pode envolver receptores de reconhecimento de padrão (PRR), como aqueles envolvidos no sistema imune inato. 0 sistema imune inato fornece uma resposta imune que não depende de reconhecimento de antígeno específico. Veja, por exemplo, Tosi, J. Allergy Clin. Immunol. 116: 241 (2005). Um aspecto do sistema imune inato imune envolve PRR, que reconhecem e ligam padrões moleculares associados a patógeno, transduzindo de sinais de resposta imune. Veja, por exemplo, Fabrick e cols., J Biol. Chem, 279: 26605 (2004). Exemplos de PRR incluem receptores Toll-like (TLR) que reconhecem uma faixa de padrões moleculares e geram sinais intracelulares para ativação de uma escala de respostas do hospedeiro. Veja, por exemplo, Tosi, supra; Blach-Olszewska, Arch. Immunol. Ther. Exp. 53: 245 (2005). Foram identificados PRR/TLR que reconhecem manose (por exemplo, Blach-Olszewska, supra), 1,3-p-glucano (por exemplo, Rice e cols., J. Leukoc. Biol. 72:140 (2002)), lipopolissacarídeo e fosforilcolina (por exemplo, Baumgarth e cols., Semin, Immunopathol. 26: 347 (2005)), ácido lipoteicóico, modulina solúvel em fenol, muramil dipeptídeo e peptidoglicano (por exemplo, Fournier e cols., Clin. Microbiol. Rev. 18: 521 (2005). Receptores imunomoduladores para manana (por exemplo, Klabunde e cols., Parasitol. Res. 88: 113 (2002) (lectina de ligação a manana)), e N-acetil-D-glicosamina e N-acetil-D-manosamina (por exemplo, Hansen e cols., J Immunol. 169: 5726 (2002)). TLRs para RNA de filamento duplo (por exemplo, Bell e cols., Proc. Nat '1 Acad. Sei. USA 102: 10976 (2005)) e DNA com padrões de metilação que diferem de DNA endógeno (por exemplo, Huang e cols., J. Iimunol. 175: 3964 (2005); Nonnemacher e cols. , Infect. Irrnun. 71: 850 (2003)) também foram identificados.

Embora esses padrões moleculares estejam associados com microorganismos patogênicos (por exemplo, bactérias, vírus, fungos e protozoãrios) eles também são apresentados por algumas moléculas não patogênicas, como ingredientes de ração animal. Uma resposta imune inata a moléculas não patogênicas que apresentam esses padrões moleculares submete desnecessariamente um animal a estresse imunológico, e pode afetar prejudicialmente a eficiência do alimento do animal, retardar a taxa de ganho de peso do animal ou resultar em perda de peso, tornar o animal mais suscetível à infecção, aumento da temperatura corporal do o animal, ou ter um impacto negativo sobre a saúde de animal ou eficiência da utilização da energia do alimento (calorias). A resposta imune inata resultante da função de MBL (lectina de ligação de manose), por exemplo, induz a respostas poderosas. Foi mostrado que mutação de um dos genes de ligação de manose em camundongo paradoxalmente permite a sobrevivência a partir de uma dose para peritonite séptica aguda normalmente letal (Takahashi, K. e cols., Microbes Infect. 4 (8): 773-784, 2002). 0 estresse imunológico de resposta imune inata agressiva é mais letal que a infecção nesse case. β-manana é um componente de produtos de soja e de alimentos animais com base em soja. Formas de alto peso molecular de β-manana presentes em ração animal podem ativar uma resposta imune inata "desnecessária e contraprodutiva", assim submetendo o animal a estresse imunolõgico. Os presentes inventores constataram que esse estresse imunolõgico pode ser reduzido ou evitado com o uso de uma hemicelulase tipo β-mananase, endo-1,4-p-D-mananase, uma enzima que degrada β-mananas (por exemplo β-galactomanana, β-glicomanana), assim reduzindo ou evitando a resposta imune a β-manana. Como mostrado nos Exemplos abaixo, a redução no estresse imunolõgico é refletida co uma diminuição na concentração sérica de APP. α-mananase, que degrada α-manana, é útil como uma enzima redutora de estresse imunolõgico de acordo com a invenção. α-manana não é considerada como sendo uma hemicelulose porque ela não partilha propriedades características de hemiceluloses.

No campo de enzimas industriais, o termo "hemicelulase" foi usado como um nome comercial para β-mananase. Do mesmo modo, patentes e publicações de co-autoria pelos inventores usam o termo "hemicelulase" para se referir a β-mananase, incluindo endo-1,4~p-D-mananase. Veja, por exemplo, Patente U.S. No. 6.162.473. Em outros contextos, o termo "hemicelulase" pode ser mais amplo, englobando glicanases e xilanases além de mananase, como explicado abaixo. 0 termo "hemicelulose" foi criado para descrever material de carboidrato de planta obtido por extração com uma solução alcalina diluída que é hidrolisada mais facilmente que celulose. Veja, por exemplo, Schulze, E. , Berichte der Deutschen Botanischen Gesellschaf, 24: 2277 (1891); Schulze, E., J. Physiol. Chem. 16: 387 (1892). Desde então, "hemicelulose" foi criado para especificar polissacarídeos de planta insolúveis em água associados com celulose, outros que não pectina e amidos e polissacarídeos em seiva de planta, que são solúveis em soluções alcalinas diluídas. Veja, por exemplo, Whisler e cols., "Hemiceluloses," in IV POLISACCHARIDE CHEMISTRY 112 (Academic Press, 1953) . Xilana, β-mananas e galactanas são geralmente consideradas como sendo hemiceluloses, embora algumas β-mananas, como goma de Locust bean e goma guar galacotmananas são facilmente solúveis. Árvores de madeira macia têm um lote de β-mananas associado com sua celulose e madeiras duras têm um lote de xilanas.

Em contraste a hemiceluloses, α-mannana é associada com paredes de células füngicas, como Saccharomyces, não é um componente estrutural da madeira, e é uniformemente encontrada em glicoproteínas eucarióticas que são geralmente solúveis em água. portanto, α-manana não é considerada como sendo uma hemicelulose, e α-mananase não é uma hemicelulase. α-mananase é útil como uma enzima redutora de estresse imunológico de acordo com a presente invenção porque ela degrada α-mananas que são reconhecidas por um sistema imune do animal, mas que não são associadas a patógenos. O sistema imune inato imune é sensível a manana porque polímeros que contêm manose são encontrados na superfície de vários patógenos.

Outros ingredientes da ração que podem ser reconhecidos por um sistema imune do animal incluem β-1,3-glucano (um componente estrutural comum de materiais de planta), complexos de glicoproteína ligados em N (encontrados, , por exemplo, em produto de soja) , RNA de duplo filamento de plantas, animais ou micróbios, e DNA de micróbios, plantas ou animais com um padrão de metilação estranho (não endógeno). Portanto, de acordo com uma modalidade, a invenção fornece uma composição que compreende uma ou mais enzimas redutoras de estresse imunológico que degradam um ou mais desses ou outros ingredientes da ração. Em uma modalidade relacionada, a invenção fornece métodos para redução do estresse imunológico em um animal que compreende a administração ao animal de uma composição que compreende uma quantidade eficaz de tal enzima ou enzimas. Exemplos específicos de enzimas redutoras de estresse imunológico e os antígenos que elas degradam são apresentados na tabela a seguir. A invenção engloba composições que compreendem outras enzimas redutoras de estresse imunológico que degradam os mesmos antígenos ou diferentes, bem como as o uso de tais outras enzimas para reduzir estresse imunológico.

De acordo com algumas modalidades, a invenção fornece uma composição que compreende duas ou mais enzimas redutoras de estresse imunológico. Em uma modalidade, pelo menos uma das duas ou mais enzimas não é 1,4-p-mananase ou 1,3-β—glicanase. Em uma outra modalidade, a composição compreende 1,4-p-mananase e 1,3-β—glicanase.

Em uma modalidade específica, a composição é uma ração animal que compreende 1,4-p-mananase e pelo menos cerca de 20 UI de 1,3-β-glicanase/kg de alimento, como pelo menos 20 Ul/kg de alimento, pelo menos 25 Ul/kg de alimento, pelo menos 30 Ul/kg de alimento, pelo menos 35 Ul/kg de alimento, pelo menos 40 Ul/kg de alimento, pelo menos 45 Ul/kg de alimento, pelo menos 50 Ul/kg de alimento, ou mais de 1,3-β-glicanase.

Em uma outra modalidade específica, a composição é uma composição líquida outra que não uma ração animal que compreende 1,4^-mananase e pelo menos cerca de 155.000 UI de 1,3-β-glicanase/L, como pelo menos 155.000 UI/L, pelo menos 230.000 UI/L, pelo menos 300.000 UI/L, pelo menos 380.000 UI/L, ou more, de 1,3-β-glicanase.

Em uma outra modalidade específica, a composição é uma composição sólida outra que não uma ração animal que compreende l,4-p-mananase e pelo menos cerca de 300.000 UI de 1,3-p-glicanase/kg, como pelo menos 300.000 Ul/kg, pelo menos 450.000 Ul/kg, pelo menos 600.000 Ul/kg, pelo menos 750.000 Ul/kg, pelo menos 900.000 Ul/kg, ou mais de 1,3-β-glicanase.

Em uma outra modalidade, a composição compreende 1,4-β-mananase e xiloglicanase. Em uma outra modalidade, a composição compreende 1,3^-glicanase e xiloglicanase. Em uma outra modalidade, a composição compreende 1,4-β-mananase e quitinase. Em uma outra modalidade, a composição compreende 1,3^-glicanase e quitanase. Em uma outra modalidade, a composição compreende 1,4^-mananase e arabinanase. Em uma outra modalidade, a composição compreende 1,3-β-glicanase e arabinanase. Em uma outra modalidade, a composição compreende 1,4^-mananase, 1,3-β-glicanase e arabinanase.

Será entendido que essas combinações são de exemplo apenas, e a invenção inclui composições que compreendem outras combinações de enzimas redutoras de estresse imunológico. Por exemplo, a invenção inclui composições que compreendem qualquer uma ou mais das enzimas redutoras de estresse imunológico acima listadas e/ou discutidas abaixo e 1,4~β-mananase.

Estresse imunológico causado por um ingrediente da ração pode não ser sempre uma resposta de sistema imune inato imune. Ê bem conhecido que uma certa pequena percentagem de crianças se alimentam de fórmulas de substituição de leite humano com base em proteína de soja desenvolvem uma forte reação intestinal prejudicial com base em imunologia {veja o relato do "Committee on nutrition", American Academy of Pediatrics, Pediatrics 101 (1): p 148, (1998)). Glicoproteínas ligadas em N em soja, por exemplo β-conglicinina, algumas vezes referidas como 7S globulina (Ogawa T, e cols., Biosci. Biotechnol. Biochem. 59(5):831-833, 1995; Burks AW, e cols., J Pediatr. Gastroenterol. NuLr. 8(2):195-203, 1989) podem ser antígenos fortes e são reconhecidos como tendo qualidades antinutricionais. β-conglicinina é deliberadamente removida de preparações isoladas de proteína de soja usadas para suplementos nutricionais a despeito de sua contribuição para proteína total. A Hidrólise destrói a antigenicidade. Em adição, nós constatamos que uma fração de glicoproteína 7S de soja enriquecida usada na alimentação de galos foi menos bem digerida que uma outra fração de proteína de soja glicosilada.

Exemplos de enzimas adequadas para degradação de carboidratos em glicoproteínas ligadas em N incluem a-fucosidases como a-1,2-fucosidase e a-1,3-1,4-fucosidase, α-manosidases como a-1,6-manosidase, a-1,2-manosidase, e a-1,3-manosidase, β-l,4-galactosidase, endo-β-Ν- acetilglicosaminidase F (endo F), peptídeo-N-(N-acetil-beta-glicosaminil)asparagina amidase F (PNGase F) , PNGase A, endo^-N-acetilglicosaminidase H (endoH) , endo D, endo C, a-N-acetilgalacosamidase, β-l, 3-galactosidase, endo-N-acil-neuraminidase (endo N) , a-2,3-neuraminidase, a-2,6- neuraminidase, a-2,8-neuraminidase, β-Ν- acetilhexosaminidase, endo^-N-galactodsidase, endo-a-N-acetilgalactosaminidase, endo-α-Ι,6-D-mananase, arabihogalactanase, α-galactosidase, β-galactosidase.

Essas enzimas são conhecidas na técnica e algumas são disponíveis a partir de fontes comerciais. Alternativamente, enzimas redutoras de estresse imunológico podem ser obtidas de microorganismos que produzem enzimas, como bactérias, fungos e leveduras. Adicionalmente, as enzimas podem ser obtidas co o uso de métodos de tecnologia recombinante conhecidos na técnica, por exemplo, por modificação genética de uma célula hospedeira para produzir uma enzima, por exemplo, causando a transcrição e tradução de um gene que codifica a enzima. As seqüências de aminoácidos de inúmeras enzimas set apresentadas acima são conhecidas na técnica. Com o uso daquelas seqüências ou seqüências de nucleotídeos conhecidas que codificam aquelas seqüências, aqueles habilitados na técnica podem desenhar genes adequados para expressão recombinante das enzimas. Adicionalmente ou alternativamente, uma seqüência de nucleotídeos que codifica uma enzima redutora de estresse imunológico conhecida pode ser usada para marcar uma biblioteca de DNA para identificar outras seqüências de nucleotídeos que codificam enzimas redutoras de estresse imunológico. Como conhecido na técnica, tal biblioteca de DNA pode ser derivada de um organismo definido ou população de organismos, ou pode ser obtida de fontes naturais e assim representa DNA dos microorganismos que são difíceis de serem cultivados.

Em modalidades em que a composição compreende uma combinação de enzimas, a enzima pode ser produzida individualmente, por organismos separados, ou duas ou mais das enzimas podem ser produzidas por um organismo único. Por exemplo, um organismo único pode ser recombinantemente projetado para produzir duas ou mais enzimas por métodos conhecidos na técnica.

Como acima discutido, um sistema imune do animal reconhece inúmeros diferentes padrões moleculares apresentados por microorganismos patogênicos, incluindo lipopolissacarídeo (associado com, por exemplo, bactérias gram-negativas), flagelos bacterianos contendo a proteína conservada flagelina, peptidoglicano (associado com, por exemplo, bactérias gram-positivas), ácido lipotecóico (associado com, por exemplo, bactérias gram-positivas) é ligado pela lectina de tipo C L-Ficolina, (Lynch, N.J., e cols., J. Immunology 172: 1198-1202, 2004), fosforlcolina (associada com, por exemplo, bactérias gram-positivas e gram-negativas), DNA (como DNA bacteriano com motivos não metilados de CpG, veja, Van Uden and Raz, J. Allergy Clin iMnunol, 104(5):902-10, 1999.), e RNA de filamento duplo e 3pRNA (Hornung, e cols., Science 314: 994-997, 2006). A resposta imune a essas moléculas inclui um aumento na APP sérica.

Outros padrões moleculares patogênicos incluem moléculas contendo N-acetilglicosamine e moléculas contendo N-acetilmanosamine. A especificidade de ligação exata de todas as coletinas (lectina de ligação a manose é uma coletina ou lectina de tipo C) pode não ser conhecida, mas a ligação a inúmeros diferentes patógenos bacterianos é observada, por exemplo, por H-ficolina, proteína A associada a surfactante (SP-A), e conglutinina. Compostos como N-acetilglicosamina e N-acetilmanosamina podem inibir a ligação e assim são parte da especificidade de ligação de reconhecimento de padrão (Haurum, J.S., e cols., Biochemical J. 293 (3) : 873-878, 1993).

Exemplos de outros antigenos e padrões moleculares que podem ser visados para degradação de enzima de acordo com a invenção incluem lipoproteínas bacterianas (Hacker, H. e cols., J Exper. Med. 192 (4): 595-600, 2000); ligação de β-1,3-glucano pela coletina Dectina-1 (Adachi, Y., e cols., Infection and Inmunity 72 (7): 4159-4171, 2004); flagelina (que liga TLF5) (Honko, A.N., and Mizel, S.B., Immunol. Res. 33 (1) : 83-101, 2005); fucosil glicoconjugados; a- Gal-ceramida; fibrinogênio; sulfato de heparina; gal-sacarideo sulfatado; quitosana, N-acetilglicosamina; asialoglicoproteína; e R-galactosídeos. A classe de receptores chamada receptores scavenger (SR) são estruturalmente relacionados a alguns receptores da resposta imune inata, e podem criar estresse imunológico. Acredita-se que SR estão envolvidos na reciclagem e limpeza de apoptose ou de células danificadas. Os receptores scavenger (SR) expressos por macrófagos e células dendríticas são também receptores para o sistema imune inato. Além disso, alguns SR reconhecem patógenos e alguns receptores imunes inatos são importantes para apoptose. Assim, de acordo com uma modalidade da invenção, os alvos de ligação de padrão molecular de SR são visados para degradação da enzima.

Tal alvo de ligação de padrão molecular de SR é lipoproteína de baixa densidade oxidada (LDL). Os receptores chamados LOX-l (Peiser, L. , e cols. , Current Opinion in Immunology 14:123-128, 2002) SR-PSOX/CXCL-16 (Fukumoto, N., e cols., J. Immunol. 173(3): 1620-1627, 2004) e CD36 (Bruni, F. , e cols., Clin. AppL Thromb. Hemost. 119(4): 417-28, 2005) ligam LDL oxidada que pode estar presente am alguns alimentos, particularmente alimentos que contêm subprodutos animais como produtos do sangue.

Um alvo de ligação de padrão molecular de SR é fosfatidilserina (PS) e liso fosfatidilserina (lyso PS). SR para PS inclui SR-PSOX/CXCL-16 e outros receptores PS (Schlegel, R.A. and Williamson, P. , Cell Death Differ. 8 (6): 545-548, 2001). A exposição a fosfolipídeos de fosfatidilserina pode levar a respostas inflamatórias e fosfolipídeos de fosfatidilserina estão presentes na maioria das rações em algum nível.

Hialuronana é abundante em fluidos extracelulares em animais, mas é também reconhecido por mecanismos de sistema imune/scavenger, por exemplo, em cicatrização de ferimentos. Veja, por exemplo, Jameson, e cols., J. Expt. Medicine 210 (8): 1269-1279, 2005. Penas de galinhas so uma fonte comercial de hialuronana, tipicamente usada na forma purificada de ácido hialurônico. Portanto, farinha de aves feita de subprodutos do processamento da carne pode conter hialuronana, freqüentemente em quantidades abundantes. Hialuronidase (EC 3.2.1.35), que degrada hialuronana e ácido hialurônico, é útil como uma enzima redutora de estresse imunológico de acordo com a invenção, particularmente no contexto de animais que são alimentados com farinha de aves. Por exemplo, hialuronidase é útil na redução do estresse imunológico associado com alimentação de farinha de aves.

Enzimas que degradam qualquer um desses padrões moleculares assim inibem ou reduzem a resposta imune, dessa forma reduzindo o estresse imunológico do animal. Por exemplo, são conhecidas DNAases e nucleases não específicas que degradam RNA de filamento duplo e DNA bacteriano. Enzimas de restrição de endonuclease específicas para motivos de CG metilados em DNA não mamífero são conhecidas. Enzimas que degradam fosforilcolina incluem fosforilcolina hidrolase, fosfatase alcalina, fosfatase ácida, fosforilcolina esterase, e fosforilcolina fosfatase.

Essa redução do estresse pode ser identificada e monitorada por medição do nível sérico de APP, como acima descrito, concentrações séricas de APP diminuídas refletindo o estresse imunológico reduzido.

Como acima observado, a composição compreende uma quantidade de enzima redutora de estresse imunológico que é eficaz para diminuir o nível de proteína de fase aguda no animal. Essa quantidade pode variar de animal para animal, e de enzima para enzima, mas pode ser determinada facilmente por aqueles habilitados na técnica, por exemplo, por medição dos níveis de APP, como acima descrito. Por exemplo, níveis séricos de APP do animal podem ser medidos antes e subseqüentemente à administração da enzima, ou níveis séricos de APP de animais de controle e tratados podem ser comparados. Em modalidades em que a quantidade eficaz é avaliada por medição dos níveis séricos de APP antes e subseqüentemente à administração da enzima, a medição subseqüente pode ser feita a partir de pelo menos cerca de um dia a pelo menos cerca de vários dias ou mais após a administração inicial da enzima. Uma diminuição na concentração sérica de APP associada com administração da enzima indica que uma quantidade eficaz de enzima foi administrada. Deve ser entendido, no entanto, que os níveis de APP geralmente diminuem à medida que a resposta imune adaptativa do animal é efetuada.

De acordo com algumas modalidades, a presente invenção fornece composição que compreende 1,3-p-glicanase em uma quantidade eficaz para diminuir o nível de proteína de fase aguda positiva no referido animal, aumentar o nível de proteína de fase aguda negativa no referido animal, e/ou melhorar a performance de crescimento do animal. Em uma modalidade específica, a composição é uma ração animal que compreende pelo menos cerca de 20 UI de 1,3-β-glicanase/kg de alimento, como pelo menos 20 Ul/kg de alimento, pelo menos 25 Ul/kg de alimento, pelo menos 30 Ul/kg de alimento, pelo menos 35 Ul/kg de alimento, pelo menos 40 Ul/kg de alimento, pelo menos 45 Ul/kg de alimento, pelo menos 50 Ul/kg de alimento, ou mais de 1,3^-glicanase. Em uma outra modalidade específica, a composição é uma composição líquida outra que não na ração animal que compreende pelo menos cerca de 155,000 UI de 1,3-β-glicanase/L, como pelo menos 155.000, pelo menos 230.000 Ul/L, pelo menos 300.000 Ul/L, pelo menos 380.000 Ul/L, ou mais de 1,3-p-glicanase. Em uma outra modalidade específica, a composição é uma composição sólida outra que não uma ração animal que compreende pelo menos cerca de 300.000 UI de 1,3-β-glicanase/kg, como pelo menos 300.000 Ul/kg, pelo menos 450.000 Ul/kg, pelo menos 600.000 Ul/kg, pelo menos 750.000 Ul/kg, pelo menos 900.000 Ul/kg, ou mais de 1,3-p-glicanase.

Em algumas modalidades de ração animal em que a enzima compreende l,3~P-glicanase, a enzima pode estar presente em uma quantidade que é pelo menos cerca de 100.000 UI por tonelada de alimento.

Essas quantidades são muito maiores que o conteúdo de 1,3-p-glicanase de aditivos de enzima de alimento comercial e rações comercialmente disponíveis, que os presentes inventores analisaram e constataram que fornecem no máximo de cerca de 10.000 Ul/tonelada de alimento, cerca de 72.500 Ul/L de composição líquida não alimentar, ou cerca de 150.000 Ul/kg de composição sólida não alimentar. Os presentes inventores não acreditam que 10.000 Ul/tonelada de alimento de 1,3-p-glicanase seriam eficazes para reduzir APP, e confirmaram essa crença experimentalmente. Os presentes inventores também determinaram experimentalmente que produtos comerciais como Avizyme (Danisco A/S, Langebrogade 1, Dk-1001, Copenhagen, Denmark) e Rovobio (Adisseo France SAS, 42, Aveniie Aristide Briand, BP100, 92164 Antony Cedex,) e rações comerciais que compreendem quantidades padrão de β-1,3-1,4-glicanase (Brewzyme BG plus, Dyadic International, 140 Intracoastal Pointe Drive, Suite 404, Júpiter, Florida 33477-5094), xilanase (Multifect XL, Genencor International, Inc., 925 Page Mill Road, Paio Alto, CA), PI-PLC (ChemGen Corp., 211 Perry Parkway, Gaithersburg, MD) e amilase (Amylase FRED, Genencor International, Inc., 925 Page Mill Road, Paio Alto, CA) map reduzem APP. Veja, o Exemplo 3 abaixo e a Figura 3. Nos casos em que a atividade de 1,3-p-glicanase está presente, ela está dentro das baixas escalas acima notadas e não são eficazes para reduzir AGP.

Em uma outra modalidade, a enzima redutora de estresse imunológico é fornecida como um componente de uma composição que também compreende o antígeno ou padrão molecular que contém compostos que são degradados pela enzima. Por exemplo, a invenção inclui uma ração animal que compreende β-l,3-glucano e uma 1,3-p-glicanase; uma ração animal que compreende DNA ou RNA de filamento duplo e uma DNAase e nucleases não específicas; uma ração animal que compreende uma glicoproteína ligada em N e uma endo- ou exocarboidrase, N-glicanase, ou PNGase, ou qualquer uma das outras enzimas set acima apresentadas. Outras combinações adequadas de antígenos e enzimas redutoras de estresse imunológico serão aparentes para aqueles habilitados na técnica, e são englobadas pela invenção.

Nessa modalidade, é esperado que os níveis séricos de APP permaneçam elevados desde que a composição seja administrada. Assim, se a quantidade eficaz de enzima redutora de estresse imunológico é avaliada por medição dos níveis séricos de APP antes e subsequentemente â administração da enzima, a medição subseqüente pode ser feita dias ou semanas depois da administraçao inicial da enzima.

Como acima observado, a invenção inclui métodos de redução de estresse imunológico em um animal, que compreendem a administração ao animal de uma composição que compreende uma enzima redutora de estresse imunológico em uma quantidade eficaz para diminuir o nível de proteína de fase aguda no animal. A composição pode ser qualquer composição acima descrita, incluindo uma composição oral, coma ração animal, uma composição líquida outra que nao uma ração animal, ou uma composição sólida outra que não uma ração animal. O animal pode ser qualquer animal, incluindo um humano, e pode ser um animal saudável ou um animal que sofre de infecção ou de outra doença ou condição. A invenção também inclui métodos de melhoria da performance de crescimento do animal, que compreendem a administração ao animal de uma composição que compreende uma enzima redutora de estresse imunológico. Em algumas modalidades, a composição compreende uma quantidade de enzima redutora de estresse imunológico eficaz para melhorar a performance de crescimento do animal. A composição pode ser qualquer composição acima descrita, incluindo uma composição oral, uma ração animal, uma composição líquida outra que não uma ração animal, ou uma composição sólida outra que não uma ração animal. O animal pode ser qualquer animal, incluindo um humano, e pode ser um animal saudável ou um animal que sofre de infecção ou de outra doença ou condição.

Em uma modalidade, a enzima é expressa por uma planta que é usada em ração animal. Por exemplo, milho pode ser geneticamente modificado para expressar uma enzima redutora de estresse imunológico e o produto do milho geneticamente modificado resultante pode ser usado no alimento.

Em uma modalidade, o animal é administrado com uma enzima redutora de estresse imunológico e também é administrado com o antígeno (por exemplo, a molécula que contém padrão degradado pela enzima). A enzima e antígeno podem ser administrados separadamente ou simultaneamente como parte das mesmas composições ou de composições diferentes. Em uma modalidade, o animal é administrado com um alimento que compreende o antígeno ou molécula que contém padrão, e é separadamente administrado com uma composição que compreende a enzima redutora de estresse imunológico. Em uma outra modalidade, o animal é administrado com um alimento que compreende o antígeno ou molécula que contém padrão e um suplemento de alimento que compreende a enzima. Em uma outra modalidade, o animal é administrado com um alimento que compreende tanto o antígeno quanto a enzima.

Um outro aspecto da invenção fornece composições e métodos para redução do estresse imunológico por prevenção e tratamento de infecção causada por microorganismos patogênicos. Algumas vezes animais consomem composições, como água ou ração animal, que compreendem microorganismos patogênicos (por exemplo, bactérias, vírus, fungos e protozoãrios), ou são expostos a tais patogenos. A presente invenção fornece composições que compreendem uma enzima que degrada componentes chave do microorganismo patogênico (ou seja, um "componente patogênico")/ em uma quantidade eficaz para diminuir a infecção e portanto, o nível de APP expressas no animal que responde à infecção. A composição é útil para a redução do estresse imunológico através da prevenção ou minimização da infecção assim diminuindo o estresse imunológico causado diretamente pelo patógeno. Em um aspecto particular dessa modalidade, a invenção fornece um método de prevenção e tratamento de infecção do trato digestivo.

Por degradação dos componentes do patógeno, as enzimas também podem tratar ou prevenir a infecção. Ou seja, porque um componente patogênico é degradado, o patogeno perde sua capacidade de infectar o hospedeiro. Essa diminuição na infecção real resulta em estresse imunológico reduzido e redução na APP sérica por um mecanismo diferente que o acima descrito, mas na prática indistinguível em termos da redução observada de APP. Há pelo menos três ocasiões em que o tratamento enzimático pode ter um resultado positivo. Se a estrutura molecular do patógeno degradada pela enzima está envolvida na ligação do patógeno às células hospedeiras, a primeira etapa necessária para infecção, ou qualquer outra etapa chave necessária para infecção bem sucedida, então o tratamento enzimático deve ajudar. Alternativamente, a estrutura de ligação na célula hospedeira deve ser modificada. Por exemplo, inúmeros patógenos bacterianos e de protozoários interagem com proteoglicanos na superfície de células hospedeiras eucarióticas, particularmente proteoglicanos sulfatados {Flekenstein, J.M. e cols., Infection and Iimunity 70 (3): 15301537, 2002). A aplicação de enzimas como heparinase, e N-acetilglicosamina-4-sulfatase, ou arilsulfatases pode reduzir a interação e infecção.

Em uma segunda ocasião a estrutura molecular do patógeno degradada pode ser uma toxina que rompe as funções metabólicas da célula alvo. Em uma terceira ocasião, o componente patogênico degradado pela enzima deve estar envolvido no mecanismo do patógeno para- escapar da resposta imune do hospedeiro. Numerosos mecanismos de evasão de resposta imune se desenvolveram em patógenos que variam de imitar a aparência exterior das células hospedeiras para inibir a resposta imune, por exemplo, reações de complemento ou apoptoses. A redução ou prevenção da infecção também pode ser avaliada por medição das APP séricas, com maiores níveis de APP sendo associados com infecção.

Enzimas que degradam componentes patogênicos, como aquelas acima descritas, são conhecidas na técnica. Por exemplo, uma endosialidase derivada de um bacteriófago mostrou evitar a letalidade de infecção sistêmica por E. coli Kl de ratos por degradação da cápsula de PSA (ácido poli-siálico) na superfície bacteriana. Embora a degradação do carboidrato capsular não tenha efeito sobre a viabilidade da E. coli in vitro, a perda da cápsula in vivo permite o reconhecimento e controle da infecção pelo sistema imune si=o hospedeiro eliminando a letalidade {Mushtaq, N. , e cols. Antimicrobial Agents and ChemoTherapy 48(5):1503-1508, 2004). A cápsula de PSA permite que superfície de E. coli se pareça como uma célula hospedeira assim esquivando-se de respostas imunes inatas do hospedeiro. Uma outra enzima conhecida útil na presente invenção é heparinase I (Neutralase, Ibex Technologies, Canada). Várias enzimas são disponíveis de fontes comerciais ou podem ser obtidas de microorganismos que produzem enzimas, como bactérias, e fungos incluindo leveduras, ou podem ser produzidas de forma recombinante, como acima discutido.

Enzimas desejadas podem ser produzidas por técnicas de DNA recombinante quando o gene que codifica para a enzima é conhecido. Os avanços de metodologia de seqüenciamento de DNA rápido resultaram em grandes bases de dados públicas de proteínas e suas seqüências codificadoras de gene, como NCBI Genbank. Com o uso de tecnologia de seqüenciamento rápido de, por exemplo, 454 Life Sciences (454 Life Sciences, 20 Commercial Street, Branford, CT 06405), um genoma bacteriano típico pode ser seqüenciado em quatro horas. Um gene previamente conhecido da nova enzima desejada do genoma pode ser obtido por probing do genoma com o uso, por exemplo, de sequências codif icadoras previamente identificadas do mesmo tipo ou de tipos similares de enzimas descritos em bases de dados comerciais ou públicas, usando programas de computador facilmente disponíveis como Blast. Aqueles habilitados na técnica podem identificar DNA no genome que tem um nível limiar de homologia à seqüência conhecida e outras propriedades da região codificadora do gene, e assim isolar e amplificar o gene usando, por exemplo, tecnologia de reação de cadeia de polimerase (PCR) . O gene pode ser então expresso em um hospedeiro e suas propriedades enzimáticas da proteína desejadas podem ser confirmadas.

Se uma atividade da enzima desejada não é previamente conhecida, então ela pode ser localizada com o uso de técnicas de enriquecimento de microbiologia padrão selecionando para crescimento no substrato. Micróbios que usam o substrato como a única fonte de carbono ou nitrogênio deve expressar enzimas capazes de degradar o composto alvo. Para desenvolver produção econômica, há a escolha de melhorar a produção daquela enzima que usa métodos clássicos de mutação/seleção ou enriquecimento com o microorganismo produtor, ou através de métodos de expressão de DNA recombinante bem conhecidos na técnica. A composição que compreende uma enzima redutora de estresse imunológico que degrada um microorganismo patogênico pode ser qualquer composição adequada para administração a um animal, incluindo composições adequadas para administração oral a um animal, as acima descritas.

Como acima observado, a composição pode compreender uma quantidade de enzima que é eficaz para diminuir o nível de proteína de fase aguda positiva (ou aumentar o nível de proteína de fase aguda negativa) no animal e/ou melhorar a performance de crescimento do animal. Essa quantidade pode variar de animal para animal, e de enzima para enzima, mas pode ser determinada facilmente por aqueles habilitados na técnica, por exemplo, por medição dos níveis de APP e/ou monitoramento da performance de crescimento do animal, como acima descrito e como conhecido na técnica.

Em uma modalidade, a enzima redutora de estresse imunológico que visa um antígeno patogênico é fornecida como um componente de uma ração animal. Em um exemplo dessa modalidade, a quantidade de enzima é pelo menos cerca de 100.000 UI/tonelada de alimento.

Em uma outra modalidade, a enzima redutora de estresse imunológico que visa um antígeno patogênico é fornecida como um componente da composição que também compreende o antígeno patogênico. Por exemplo, a invenção inclui uma ração animal que compreende (A) um microorganismo patogênico que apresenta um antígeno como lipopolissacarídeo, peptidoglicano, ácido lipotecóico, fosforilcolina, RNA de filamento duplo e DNA e (B) enzima que degrada o antígeno. Organismos patogênicos oem ter uso em alimento devido à natureza inerente das condições não sanitárias causadas pelo denso crescimento de animais em situações de produção.

Como acima observado, a invenção inclui métodos de redução de estresse imunológico em um animal e/ou de melhoria da performance de crescimento do animal, que compreendem a administração ao animal de uma composição que compreende uma enzima redutora de estresse imunológico. Em uma modalidade, o animal é administrado com a a enzima redutora de estresse imunológico que degrada um antígeno patogênico e também é administrado com o antígeno patogênico. A enzima e antígeno podem ser administrados separadamente ou simultaneamente como parte das mesmas composições ou de composições diferentes. Em uma modalidade, o animal é administrado com um alimento que compreende o antígeno, e é separadamente administrado com uma composição que compreende a enzima. Em uma outra modalidade, o animal é administrado com um alimento que compreende o antígeno e um suplemento de alimento que compreende a enzima. Em uma outra modalidade, o animal é administrado com um alimento que compreende tanto o antígeno quanto a enzima.

Os exemplos a seguir também ilustram a invenção, mas a invenção não é limitada às modalidades especificamente exemplificadas. EXEMPLO 1 Uma ração animal que compreende hemicelulase (endo-1,4-P-mananase) foi preparada e administrada a galinhas e os níveis de AGP foram medidos, como descrito em maiores detalhes abaixo.

Um total de 4.000 pintos machos de um dia de idade Cobb X Cobb foram colocados aleatoriamente em 8 tratamentos experimentais, e cada tratamento foi replicado 10 vezes: Desenho experimental: 8 Tratamentos N° total de viveiros: 80 N° total de tratamentos: 8 N° de aves por viveiro; 50 N° de viveiros por Tratamento; 10 N° de aves por Tratamento: 500 Dois dos oito tratamentos compreenderam enzimas redutoras de estresse de acordo com a invenção: Tratamento 3 (mananase na forma de caldo de célula total evaporado de fermentação de B. lentus aplicado em aproximadamente 100 MU/ton nas dietas basais) e Tratamento 6 (mananase na forma de sobrenadante centrifugado livre de células de caldo de fermentação de B. lentus aplicado em aproximadamente 30 MU/ton nas dietas basais). Tratamento 8 foi um controle sem enzima adicionada. (1 MU = 4.000 UX) Os lotes de alimentação basal foram divididos igualmente em oito partes e cada um foi pulverizado com a quantidade adequada dos materiais de teste. As rações inicial e de crescimento continham 90 g/ton Cobon (um medicamento anticoccidial do tipo ionoforo) mais 50 g/ton de BMD (antibiótico). As rações finais não eram medicadas.

As dietas iniciais foram oferecidas a todas as avès de um dia de idade até 21 dias de idade, as dietas de crescimento de 22-35 dias, e Dietas finais de 36-42 dias. As dietas e água era fornecidas à vontade. As dietas foram apresentadas às aves como farelos/péletes durante todos os períodos de alimentação. Água da torneira foi usada como água de beber e suprida por uma rede de sistema de água interno.

Composição e análise das dietas basais experimentais Duas aves de cada um dos dez viveiros nos Tratamentos 3, 6 and 8 foram aleatoriamente selecionadas para análise do sangue ao final dos 42 dias após pesagem, para um total de 20 aves das 500 por tratamento. Amostras foram coletadas em gelo em tubos de coleta de sangue contendo o anticoagulante heparina, e plasma foi obtido por centrifugação.

Amostras de plasma sanguíneo foram analisadas para a-1-ácido glicoproteína de galinha com o uso de um kit de ensaio com base em imunodifusão de Cardiotech Services, Inc. {Louisville, KY) . Amostras de soro retiradas de duas aves/viveiro foram adicionadas às placas de teste (5 por cavidade) e a algumas cavidades padrão AGP pura foi adicionada em concentrações que variam em até 1.000 μg/mL. Anéis de precipitina foram medidos co o uso de escala de medição de anel de precipitina ao diâmetro mais próximo de 0,1 mm.

Uma equação polinomial foi usada para fornece o melhor ajuste de curva com os dados e para permitir o rápido cálculo da concentração de AGP nas amostras de plasma como mostrado na Figura 1.

As medições dos diâmetros do anel de precipitina para todas as amostras de soro de galinha recuperadas e a concentração calculada de AGP para cada ave são mostrados na tabela abaixo. As aves alimentadas com mananase têm, na média, uma diminuição estatisticamente muito significativa na concentração média de AGP comparada às aves de controle. Amostras de sangue de 42 dias (y = AGP pg/ml; x= medida do anel em mm) EXEMPLO 2 Um outro experimento que usa hemicelulase (endo-1,4-β-mananase) foi conduzido. Nesse experimento, grupos de galinhas (10 viveiros cada, com 50 aves por viveiro) foram alimentadas com uma de quatro dietas: Tratamento 1 (controle): alimento compreendendo antibiótico BMD pulverizado pós peletização com uma formulação de controle, e 35% sorbitol com corante de alimento marrom, aplicado em 100 ml/tonelada de alimento.

Tratamento 2 (controle): alimento sem antibiótico BMD pulverizado pós peletização com uma formulação de controle que compreende 35% sorbitol com corante de alimento marrom, aplicado em 100 ml/tonelada de alimento.

Tratamento 3: alimento pulverizado pós peletização com uma formulação que compreende hemicelulase (endo-l,4-p~ mananase) derivada de B. lentus, aplicada em 100 ml/tonelada de alimento.

Tratamento 4: Alimento formulado com uma composição em pó (adicionado no misturador antes da peletização) que compreende hemicelulase (endo-1,4-p-mananase) derivada de B. lentus a 454 g de composição adicionada/tonelada de alimento para gerar 100 MU/tonelada de alimento. (1 MU = 4.000 UI) Os pintos tinham 1 dia de idade no início do experimento.

As dietas foram fornecidas â vontade. Alimentos inicial (dias 0-21), de crescimento (dias 21-35) e final (dias 35-42) com as seguintes composições foram usados como os alimentos de base: Quantidades esperadas Ingredientes adicionados No dia 21 aproximadamente 3 ml de sangue foram coletados de 3 aves por viveiro (30 por grupo) . O sangue foi colocado em um tubo heparinizado e levemente misturado. Os tubos foram lentamente centrifugados e então o soro foi removido. As amostras de soro foram colocadas em tubos com tampa e rotulados com número do viveiro. O soro foi congelado para subsequente análise de AGP, como descrito no Exemplo 1 acima. Os anéis de imunodifusão usados para quantificar a a-1 ácido glicoproteína de galinha são facilmente medidos, altamente reprodutíveis e exibem um coeficiente de variação de 4% ou menos.

Os resultados medidos de 21 dias de 3 0 aves por tratamento são mostrados na tabela abaixo e graficamente na Figura 2. Pode ser observado que deixando o antibiótico (BMD) fora da dieta cria-se um grande e significativo aumento no nível plasmático de AGP (comparar Tratamento 1 e Tratamento 2) . A adição de formulação de hemicelulase (endo 1,4-p-mananase) na dieta sem BMD (Tratamentos 3 e 4) restaurou a AGP ao nível observado com uso de antibiótico, indicando uma redução significativa do estresse imunolócrico. _______________________________________________ A performance de crescimento das aves também foi avaliada com os resultados resumidos na tabela abaixo. Performance de crescimento 1 FCR= Conversão de ração 2 Peso Adj. FCR = peso ajustado para conversão raçao 3 CV do ID = coeficiente de variação em pesos individuais Portanto, tanto a conversão de alimento quanto a conversão de alimento ajustada por peso foram melhoradas em 21 dias com significância estatística as aves que recebem β-mananase. Isso indica que a redução na AGP sérica pode se traduzir em significância real para a performance do animal. EXEMPLO 3 A capacidade de outras enzimas comumente usadas na ração animal foi avaliada para seu possível efeito sobre AGP. Rações iniciais de galinha de tipo comercial (de baixa energia metabólica) foram compostas com elementos comumente usados nos Estados Unidos. Essas rações {em forma de massa ou de farelo) foram oferecidas à vontade da data da chegada do pinto até o dia 21 do estudo. Alimentos de tratamento experimental foram preparados a partir dessa ração inicial basal. As rações de tratamento foram misturadas para assegurar uma distribuição uniforme do respectivo artigo de teste.

Composição e análise de dietas basais experimentais BMD 50 g/t e Salinomicina 60 g/t foram adicionados a todas as rações.

Preparações de enzimas (1 MU = 4.000 UI) PreDaracÕes de enzimas: informações adicionais ChemGen MU = 4.000 UI; AXC - unidades de xilanase definidas por Adisseo; AGL - unidades de glicanase definidas por Adisseo; * - nível aproximado medido por ChemGen Corp. por ensaio de açúcar redutor A ração e água eram disponíveis a vontade por todo o experimento. No dia 15, as aves nos tratamentos 17,. 18, 19, 20, e 21 foram inoculadas por via oral com um inóculo misto contendo aproximadamente 30.000 oocistos de E. acervulina por ave, 2.500 oocistos de E. maxima por ave, e 25.000 oocistos de E. tenella por ave. Os procedimentos de inoculação de oocistos coccidiais são descritos em SPR SOP: INI.002.

As médias para ganho de peso por gaiola, consumo de ração, e conversão de ração são determinadas. Os resultados são apresentados abaixo. Apenas animais que recebem a amostra 17 foram infectados. _____________,___________ Nós descobrimos que rações comerciais que compreendem quantidades padrão de amilase, x,3-glicanase, 1(4-glicanase, xilanase e PI-PLC não reduzíramos níveis de AGP. De fato, apenas hemicelulase (endo-1,4-p-mananase) mostrou um efeito significativo sobre os níveis de AGP. Adicionalmente, a comparação do tratamento 1 e 17 mostra claramente que AGP é uma APP altamente responsiva em galinhas porque a infecção aumentou o nível de AGP a 82 pg/mL. Veja também a Figura 3. EXEMPLO 4 Ração animal de teste que compreende 1,3-p-glucano é formulada para incluir l,3-p-glicanase em uma concentração de 400.000 UI (100 ChemGen MU) por tonelada de alimento. A ração animal de teste é administrada a galinhas de teste, enquanto as galinhas de controle recebem a mesma ração animal (que compreende 1,3-p-glucano) sem l,3-P-glicanase. Após 21 e 42 dias nesse regime, os níveis séricos sangüíneos de AGP são avaliados como acima descrito. Galinhas que recebem a ração animal formulada com enzima têm níveis de AGP significativamente menores que os animais de controle. As galinhas de teste também exibem maior eficiência da alimentação e melhor ganho de peso guando comparadas às galinhas de controle. EXEMPLO 5 Ração animal de teste que compreende uma fonte de DNA bacteriano (por exemplo Biolys Lisina ou outro produto de fermentação contendo produto de célula) é formulada para incluir nuclease não específica derivada de Cyanobacterium Anabaena sp, 7120 (NucA) , uma das nucleases não específicas mais ativas conhecidas (Meiss, G. e cols., Eur. Biochem. 251(3): 924-934, 1998). A enzima é adicionada em uma concentração de 1 X 107 Unidades de Kunitz de enzima/kg de ração ou aproximadamente 1 mg (base pura) por kg de ração. A ração animal de teste é administrada a galinhas de teste, enquanto as galinhas de controle recebem a mesma ração animal (que compreende DNA bacteriano) sem nuclease não específica. Após 21 e 42 dias nesse regime, os níveis séricos sangüíneos de AGP são avaliados como acima descrito. Galinhas que recebem a ração animal formulada com enzima têm níveis de AGP significativamente menores que os animais de controle. EXEMPLO 6 Ração animal de teste que compreende carne e farinha de osso, farinha de sangue ou outro subproduto derivado de animal é formulada para incluir fosfatidilserina descarboxilase em uma concentração de 400.000 Ul/ton de ração. A ração animal de teste é administrada a galinhas de teste, enquanto as galinhas de controle recebem a mesma ração animal sem fosfatidilserina descarboxilase. Após 21 ou 42 dias nesse regime, os níveis séricos sangüíneos de AGP são avaliados como acima descrito. Galinhas que recebem a ração animal formulada com enzima têm níveis de AGP significativamente menores que os animais de controle. EXEMPLO 7 Ração animal de teste que compreende farinha de soja ou outra farinha derivada de planta é formulada para incluir uma enzima α-mananase e/ou l,3-P~glicanase derivada de B, lentus, cada uma em uma concentração de 400.000 Ul/ton de alimento. A ração animal de teste é administrada a galinhas de teste, enquanto as galinhas de controle recebem a mesma ração animal sem α-mananase ou 1,3-β-glicanase. Após 21 ou 42 dias nesse regime, os níveis séricos sangüíneos de AGP são avaliados como acima descrito. Galinhas que recebem a ração animal formulada com enzima têm níveis de AGP significativamente menores que os animais de controle. EXEMPLO 8 Nesse exemplo Hemicell® mananase adicionada a ração (uma dieta convencional de milho-soja) reduz al-ácido glicoproteína (AGP) em soro de peru enquanto também melhora a performance de crescimento. 0 experimento consistiu em 48 viveiros de 11 perus (colocação inicial). Os seis tratamentos foram replicados em 8 blocos, randomizados em blocos de seis viveiros cada: Um tratamento que compreendeu enzimas redutoras de estresse de acordo com a invenção, Tratamento l (Hemicell® comercial com 100 MU/ton de ração) foi analisado para AGP. (1 MU = 4.000 UI) . Tratamento 2 foi uma ração de controle sem enzima adicionada. A ração foi misturada para assegurar a distribuição uniforme de rações basais entre os tratamentos. Todas as enzimas foram misturadas (pulverizadas) para assegurar a distribuição uniforme de enzimas de teste e para assegurar condição de ração similar entre os tratamentos. Cada vez que a ração de tratamento foi feita, uma amostra do início, meio e final de cada ração de tratamento foi misturada para formar uma amostra composta. Uma amostra foi retirada de cada um dos compostos para cada tratamento, e para verificação do nível da enzima.

As dietas de perus alimentados nesse estudo para Tratamentos 1 e 2 são descritas em detalhes abaixo nas tabelas a seguir. As tabelas mostram a composição de componentes, os níveis calculados de nutrientes e finalmente alguns valores nutrientes medidos com a ração retornada. As dietas são representativas do que deve ser usado em uma operação de crescimento comercial de perus e assim a dieta é ajustada várias vezes por todo o período de 20 semanas. As composições da dieta foram modificadas em 6, 9, 12, 15 e 18 semanas.

As composições da dieta em cada período são levemente diferentes para Tratamentos 1 e 2. É bem conhecido que Hemicell® mananase tem o efeito de aumento do conteúdo de energia eficaz de rações (veja a Patente US 6.162.473). Por essa razão, as dietas do Tratamento 1 são formuladas com menos calorias que as dietas do Tratamento 2 para minimizar a diferença de crescimento entre Tratamentos 1 e 2 para o objetivo desse estudo.

Composição de nutrientes e niveis de nutrientes calculados, 0-9 semanas Composição de nutrientes e níveis de nutrientes calculados, 9-15 semanas Composição de nutrientes e níveis de nutrientes calculados, 15-20 semanas Análise da dieta rações retornadas, 0-12 semanas Medições de Glicoproteína: Sangue foi obtido ao final do experimento de quatro aves por viveiro selecionadas aleatoriamente dos tratamentos 1,2, e 5, O sangue foi coletado em tubos contendo anticoagulante EDTA, misturados então centrifugados para precipitar as células totais.

Placas de teste de AGP de peru foram obtidas de Cardiotech Services (Louisville, KY) . O teste de AGP ê um teste com base em imunodifusão. Volumes iguais de amostras de teste ou séricas foram adicionados nas cavidades da placa de imunodifusão como recomendado pelo fabricante, então depois de dois dias de incubação em temperatura ambiente, o diâmetro dos anéis de imunoprecipitação resultantes foi medido.

Uma amostra de padrão de AGP de peru purificada fornecida no kit foi testada em várias concentrações para fazer uma curva padrão como mostrado na Figura 4. Uma equação de ajuste de curva polinomial desenvolvida a partir dos padrões foi usadas para calcular o nível plasmático de AGP de peru nas amostras de teste. Cálculo dos níveis de AGP e análise estatística com teste T de Students Outliers > 2 desvios padrão da média removida A AGP plasmática média para um grupo tratado com enzima foi significativamente menor que a do controle não tratado. Para essa análise, um outlier foi removido da análise de cada grupo. Esses podem ser aves que experimentaram uma quantidade incomum de estresse devido a dano ou infecção. A AGP reduzida causada por alimentação de enzima foi correlacionada com a performance de ave melhorada estatisticamente significativa como mostrado abaixo no Tratamento 1 (mananase) vs Tratamento 2. Resultados com 140 dias de crescimento Aves que recebem ração com mananase tiveram maior ganho de peso médio em 3,7%, conversão de ração diminuída em 2,3 % e diminuição no CV (coeficiente de variação desvio padrão/média) de uniformidade de peso corporal. A redução no estresse imunolôgico como indicado por níveis séricos reduzidos de AGP correlaciona-se com várias medições de melhoria do crescimento. EXEMPLO 9 Nesse exemplo 1,4-β-mananase de B. lentus, 1,3-β-glicanase de B. lentus, e uma combinação das duas enzimas foram adicionadas à ração (uma dieta convencional de milho-soja). Cada tratamento de enzima melhorou a performance de crescimento em perus fêmeas Nicholas 700 de 6 semanas de idade, com resultados atingidos pela combinação sendo inesperadamente maior que os resultados atingidos com tratamentos que usam apenas uma das enzimas. 0 experimento usou 80 viveiros de 40 perus fêmeas. Os tratamentos foram replicados em dez (10) blocos, com oito tratamentos (sete tratamentos com enzima e um controle negativo) randomizados em cada bloco.

Tratamento 3 usou a composição que compreende uma enzima redutora de estresse imunológico de acordo com a invenção, 1,4-P-mananase a 100 MU/ton de ração. Tratamento 6 também usou a composição que compreende uma enzima redutora de estresse imunológico de acordo com a invenção, 1f3-p-glicanase a 60 MU/ton de ração. Tratamento 8 usou a combinação de composição de acordo com a invenção, compreendendo 1,4-p-mananase a 100 MU/ton de raçao e 1,3-β-glicanase a 60 MU/ton de ração. Tratamento 1 foi uma ração de controle sem enzima adicionada. (1 MU = 4.000 UI) A ração foi misturada para assegurar a distribuição uniforme de rações basais entre os tratamentos. Todas as enzimas foram misturadas (pulverizadas) para assegurar a distribuição uniforme de enzimas de teste e para assegurar condição de ração similar entre os tratamentos. Cada vez que a ração de tratamento foi feita, uma amostra do início, meio e final de cada ração de tratamento foi misturada para formar uma amostra composta. Uma amostra foi retirada de cada um dos compostos para cada tratamento, e para verificação do nível da enzima. A ração das dietas dos perus nesse estudo são rações de peru comerciais típicas. As dietas são representativas do que deve ser usado em uma operação de crescimento comercial de perus e assim a dieta foi ajustada depois de 3 semanas. Os resultados de crescimento para Tratamentos 1, 3, 6 e 8 são mostrados na tabela abaixo. (1MU = 4000ÜI) Observação 1: Conversão de ração está corrigida para a mortalidade.

Observação 2: A conversão ajustada ao peso para cada tratamento é calculada da seguinte forma: (a) o peso vivo médio de todo o teste é subtraído do peso vivo médio para o tratamento, resultando na Quantidade A; (b) a Quantidade A é dividida por 6, resultando na Quantidade B; (c) a Quantidade B é subtraída da conversão de ração que resulta na conversão de ração ajustada ao peso para o tratamento. Os dados estatísticos são mostrados para o teste LSD; P < 0,05.

Em comparação ao Tratamento 1 (controle), rebanhos de peru que recebem Tratamento 3 (ração com 1,4-p-mananase) tiveram um peso vivo médio numericamente aumentado e uma conversão de ração numericamente melhorada (diminuída). De modo similar, rebanhos de peru que recebem Tratamento 6 (ração com 1,3-p-glicanase) tiveram um peso vivo médio melhorado estatisticamente significativo e uma conversão de ração melhorada estatisticamente significativa (diminuída).

De modo surpreendente, rebanhos de peru quer, recebem Tratamento 8 (ração com uma combinação de 1,4-p-mananase e 1,3-p-glicanase) tiveram um peso vivo médio melhorado muito estatisticamente significativo e uma conversão de ração melhorada muito estatisticamente significativa (diminuída). Os resultados observados com Tratamento 8 foram maiores que o que pode ser explicado por um efeito aditivo das duas enzimas administradas individualmente. Portanto, a combinação de tratamento que compreende 1,4-P-mananase e Xt3-p-glicanase produziu uma melhoria inesperadamente grande na performance de crescimento. EXEMPLO 10 Nesse exemplo, i,3-P-glicanase de B. lentus, xiloglicanase de B. lentus e uma combinação das duas enzimas foram adicionadas à ração (uma dieta convencional de milho-soja). Cada tratamento de enzima melhorou a performance de crescimento em frangos macho broiler de 35 dias de idade, com resultados atxngidos pela combinação sendo inesperadamente maior que os resultados atingidos com tratamentos que usam apenas uma das enzimas. 0 experimento usou 49 viveiros de 44 frangos machos Cobb x Cobb. Os tratamentos foram replicados em sete blocos, com sete tratamentos (seis tratamentos com enzima e um controle negativo) randomizados em cada bloco.

Tratamento 4 usou a composição que compreende uma enzima redutora de estresse imunológico de acordo com a invenção, 1,3-p-mananase a 70 MU/ton de ração. Tratamento 5 também usou a composição que compreende uma enzima redutora de estresse imunológico de acordo com a invenção, xiloglicanase at 100 MU/ton de ração. Tratamento 6 usou a combinação de composição de acordo com a invenção, compreendendo xiloglicanase a 100 MU/ton de ração e 1,3-β-glicanase a 60 MU/ton de ração. Tratamento 1 foi uma ração de controle sem enzima adicionada. (1 MU = 4.000 UI) A ração foi misturada para assegurar a distribuição uniforme de rações basais entre os tratamentos. Todas as enzimas foram misturadas (pulverizadas) para assegurar a distribuição uniforme de enzimas de teste e para assegurar condição de ração similar entre os tratamentos. Cada vez que a ração de tratamento foi feita, uma amostra do início, meio e final de cada ração de tratamento foi misturada para formar uma amostra composta. Uma amostra foi retirada de cada um dos compostos para cada tratamento, e para verificação do nível da enzima. A ração das dietas nesse estudo são rações de galinha broller comerciais típicas. As dietas são representativas do que deve ser usado em uma operação de crescimento comercial de broilers e assim a dieta foi ajustada depois de 3 semanas. Os resultados de crescimento para Tratamentos 1, 4, 5 e 6 depois de 35 dias de crescimento são mostrados na tabela abaixo. {1 MU = 4.000 UI) Observação 1: Conversão de ração está corrigida para a mortalidade.

Observação 2: A conversão ajustada ao peso para cada tratamento é calculada como acima descrito. Os dados estatísticos são mostrados para o teste LSD; P < 0,05.

Em comparação ao Tratamento 1 (controle), as galinhas que recebem o Tratamento 4 (1,3-p-glicanase) tiveram um peso vivo médio numericamente aumentado e uma conversão de ração numericamente melhorada (diminuída). De modo similar, as galinhas que recebem Tratamento 5 (ração com xiloglicanase) tiveram um peso vivo médio numericamente aumentado e uma conversão de ração numericamente aumentada (diminuída).

Galinhas que recebem Tratamento 6 (uma combinação de 1,3-p-mananase e xiloglicanase) atingiram melhorias em seu peso vivo médio e conversões de maiores que o efeito observado quando as enzimas foram administradas individualmente. Portanto, a combinação de tratamento que compreende 1,3-P-mananase e xiloglicanase atingiu uma melhoria significativa na performance de crescimento. EXEMPLO 11 Redução de APP séricas de galinha por Aplicação de enzimas na ração.

Galinhas broilers cresceram do dia 1 ao dia 14 e receberam uma dieta inicial típica de milho-soja (como mostrado na Tabela de Composição de Dieta abaixo) com várias enzimas adicionadas (como resumido em uma tabela de enzimas abaixo). Os tamanhos das amostras para cada tipo de enzima incluíam três gaiolas com oito aves por gaiola. Composição da dieta Enzimas A "esterase" no Tratamento J ê uma enzima não caracterizada de um gene de B. lentus no mesmo óperon com xilanase. O substrato para essa enzima não foi identificado. Sua determinação como uma "esterase" é baseada na similaridade da seqüência de DNA desse gene a outros genes conhecidos de esterase. A atividade da esterase não foi determinada, mas deve ser similar ao nível de xilanase se as duas proteínas tiverem atividades específicas similares. A 1,4-P-galactanase e 1,3-galactanase foram medidas usando um ensaio de açúcar redutor com substrato de pectina.

Em 14 dias, o soro sangüíneo foi coletado de todas as aves e as amostras foram analisadas para conteúdo de al-ácido glicoproteína (AGP) como acima descrito. O nível médio de al-ácido glicoproteína de cada grupo de tratamento é mostrado na tabela acima.

Como refletido na tabela, em relação ao Tratamento A (sem enzima), Tratamentos Η, I e J resultaram em in redução de AGP sérico.

Tratamento H (quitinase mais 1,4-p-mananase) gerou resultados significativos após apenas duas semanas de crescimento. Embora a quantidades de enzimas estivesse em níveis que não mostram a resposta em outros tratamentos (comparar a Tratamento G com uma quantidade comparável de de quitinase e Tratamentos E e F com uma quantidade comparável de 1,4-p-mananase), a combinação de quitinase e 1,4-p-mananase resultou em significativa redução de AGP, que pode não ser prevista a partir dos resultados obtidos quando apenas uma enzima foi usada.

Tratamento I (1,3-P-glicanase e 1,4-p-mananase) gerou resultados notáveis, embora não claramente estatisticamente significativos nesse experimento (valor P de 0,125). Em outros testes de duração mais longa, tratamento com 1,3-β-glicanase e 1,4-p-mananase tiveram um efeito significativo sobre o nível de AGP.

Comparação do Tratamento J (xilanase, 1,4-P-mananase, esterase,- P=0,083 vs Tratamento A controle) ao Tratamento F (xilanase + 1,4-p-mananase, sem "esterase") revela que Tratamento J gerou um efeito notável, quando Tratamento F não mostrou redução de AGP. EXEMPLO 12 Esse exemplo testa a hipótese de que a alteração de uma composição de ração para incluir ingredientes que estimulam o sistema imune inato imune aumentará níveis séricos de APP.

Um teste de galinha broiler de 21 das foi realizado com o uso de dieta basal de milho-soja com uma dieta de alta energia de óleo de soja como controle. Para obter dietas de teste, a dieta de controle foi modificada para conter materiais práticos suspeitos de ter componentes estimulantes imunes embora mantenham o mesmo valor nutricional equivalente aproximado. As dietas de teste incluíam as seguintes variações: Milho/soja / controle de óleo de soja Inclusão de Óleo misturado AV (óleo misturado vegetal animal);

Inclusão de lecitina de soja;

Inclusão de farinha de ave; DDGS (grãos de destilação e subproduto solúvel da manufatura do etanol) inclusão a 5% com casca de soja;

Inclusão de DDGS a 15% w/o casca de soja.

As dietas são descritas em maiores detalhes nas tabelas abaixo. A mistura AV e lecitina de soja devem conter fosfolipídeos que compreendem a fosfatidilserina estimuladora do sistema imune inato imune. A farinha de ave pode conter fosfatidilserina, hialuronana, e vários estimuladores microbianos derivados dos dejetos ou crescimento microbiano secundário que pode ocorrer antes do processamento. Espera-se que os DDGS contenham abundante resíduo de levedura, incluindo paredes celulares que compreendem α-manana, 1,3-p-glucano e quitina, bem como potencialmente estimulam polímeros de carboidrato não fermentado do substrato de fermentação original.

Composições de dieta _________________________ a BPM das aves (por refeição de produto); b DDGS (destilador de grãos secos e solúveis); c Mistura AV (óleo de mistura animal e vegetal); d adição de cascas de soja à dieta da refeição das aves equaliza o teor de manana para compensar a farinha de soja reduzida.

Para cada dieta, galinhas broilers (Cobb x Cobb) cresceram nas gaiolas de bateria Petersime com oito aves por gaiola (0586,21 cm2 por ave) . Depois de 21 dias, os níveis séricos de AGP de cada ave foram analisados como descrito em exemplos prévios.

As dietas modificadas mostraram clara evidência de estimulação do sistema imune inato com base em aumentos significativos na AGP sérica nos 21 dias, como mostrado na seguinte tabela. Os dados também enfatizam as oportunidades para reduzir estresse imunológico causado por componentes da dieta de acordo com a invenção, como pelo uso de composições que compreendem enzimas que degradam ingredientes que induzem estresse imunológico. EXEMPLO 13 Esse exemplo demonstra a eficácia de composições que compreendem 1,3-p-glicanase na redução do estresse imunológico associado com 1,3-p-glucano, que está presente em material alimentício e, em virtude de sua associação com paredes celulares fúngicas, é um padrão molecular aparentemente reconhecido universalmente pelo sistema imune inato de animais. Os resultados mostram que, como 1,4-p- mananase, 1,3-β-glicanase reduz os níveis séricos de APP e melhora a performance de crescimento do animal.

Galinhas broilers (Cobb x Cobb) cresceram do dia 1 ao 21 e receberam uma dieta típica de baixo teor de gordura de milho/farinha de soja mostrada na Tabela abaixo. Em dois casos, as dietas foram suplementadas por pulverização uniforme das soluções concentradas de enzima líquida preparadas a partir de fermentações de B. lentus para aplicar 400.000 Ul/ton de 1,4-p-mananase ou 264.000 Ul/ton de 1,3-β-glicanase. (nesse caso, uma tonelada representa 2.000 lbs. ou 907,4 kg.) Composição da dieta Para cada tipo de dieta, as aves cresceram em três gaiolas de bateria Petersime com oito aves por gaiola (0586,21 cm2 por ave). Depois de 21 dias, os níveis séricos de AGP de cada ave foram analisados como descrito em exemplos prévios.

Os pesos das aves e ração consumida foram determinados com a utilização de procedimentos padrão e a conversão da ração foi calculada. Os resultados são mostrados na tabela abaixo. WAFC (conversão de ração ajustada ao peso) é calculada como se segue: WAFC = FC - 2,204 * ((W-Wa)/3) Em que FC = peso de ração consumida /peso ganho Wa = peso médio de todas as aves no experimento W = ganho de peso vivo médio por gaiola_______ Tanto 1,4-p-mananase quanto 1,3-P-glicanase reduziram os níveis séricos de αΐ-ácido glicoproteína (AGP). Ambos tratamentos de enzima reduziram a conversão de ração ajustada ao peso, e a redução no grupo de raçao de 1,3-β-glicanase foi estatisticamente significativa. EXEMPLO 14 Um experimento de galinha broiler foi conduzido em gaiolas de bateria Petersime com ração e métodos descritos no Exemplo 13 acima, exceto por diferentes tratamentos de enzima, como resumido na tabela abaixo.

Liticase, um produto bruto de 1,3-p-glicanase obtido por fermentação de Arthrobacter luteus, foi obtida de Sigma Chemical Company, St. Louis Mo. A atividade de liticase foi determinada pelo método de açúcar redutor descrito abaixo e 60 MU/ton (equivalente a 240.000 Ul/ton) foi aplicado. De acordo com o fabricante, esse produto também contém outras atividades, incluindo atividade de quitinase, que não foi medida. __________ (1 MU = 4.000 UI) Níveis aumentados de 1,3-P-glicanase produziram um efeito aumentado sobre o nível de AGP (por exemplo, uma resposta à dose) de até cerca de 30 MU/ton {120.000 Ul/ton). Espera-se que quando se fornece esse tipo de ração animal com cerca de 30 MU/ton (120,000 UX/ton) de 1,3-β-glicanase haja uma redução do estresse imunolõgico , refletida em um nível reduzido de AGP sérica e/ou em um aumento da performance de crescimento do animal.

Os resultados também mostram que xiloglicanase foi eficaz na redução dos níveis séricos de AGP. Xiloglicanase (EC 3.2.1.151) é uma 1,4-p-glicanase com especificidade para xiloglucano, um polímero estrutural em plantas.

Com exceção da Liticase, todas as enzimas usadas nesse exemplo foram produzidas por B. lentus. Liticase é produzida por A. luteus, que foi reclassifiçada como Cellulosimicrobium cellulans. Demonstrou-se que a fermentação de A. luteus produz várias formas de 1,3-β-glicanase. Veja, por exemplo, (Ferrer, P. Microb. Cell Factories 5: 10, 2006, publicado online em 17 de março de 2006. doi: 10.1186/1.475-2.859- 5-10). Os resultados acima mostram que Liticase reduziu a AGP sérica de galinhas pelo menos tão bem quanto a preparação de 1,3-p-glicanase de B. lentus, indicando que a fonte da enzima não é importante. Ou seja, enzimas de qualquer fonte podem ser usadas de acordo com a invenção. Também é possível que quitinase (relatada por Sigma como estando presente em Liticase) pode ter aumentado a performance do tratamento com Liticase. EXEMPLO 15 Os ensaios seguintes podem ser usados para avaliar a atividade da enzima. (I) Xiloglicanase A atividade de xiloglicanase pode ser testada com o uso do seguinte protocolo: Reagente DNS: 10 g/L de NaOH, 2 g/L de fenol, 10 g/L de ácido dinitrossalicílico, 1.200 g/L de tetra-hidrato de tartarato de potássio sódio são preparados diariamente. Imediatamente antes do uso, é adicionado 0,5 g/L de sulfito de sódio anidro.

Soluções padronizadas e curva-padrão: é preparada uma série de soluções padronizadas de D-(+)-manose dissolvido em agia na faixa de concentração de 0,1 a 0,5 g/litro. E adicionado 0,6 mL de cada padrão de manose {em duplicata ou triplicata) a 1,5 mL da solução de trabalho de DNS em 13 x tubos de vidro de 10 0 mm. Uma amostra com uma alíquota de 0,6 mL de água pode ser usada como reagente vazio para zerar o espectrofotômetro. As soluções são aquecidas em um banho de água fervente por 5 minutos, resfriadas até a temperatura ambiente, e a absorvência é lida a 55 0 nm. O resultado esperado é uma dose-resposta linear entre 0,20 e 1,2 o.D. unidades. A inclinação da curva-padrão (O.D 550/g/L de manose) é calculada somente a partir da porção linear da curva. Com essa inclinação, o valor do g/L de açúcar redutor é determinado nas reações enzimáticas.

Substrato xiloglucano: Xiloglucano (Tamarind) é obtido de Megazyme International Ireland Ltd., Bray, Co., Irlanda, é dissolvido a 5 g/L em 50 mM de tampao Tris, pH 7,5, com glicose 0,05%.

Condições de reação: é usado 0,25 mL de 5 g/L de substrato xiloglucano com uma diluição de enzima de 0,05 mL em 50 mM de tampão Tris, e a mistura de reação é incubada a 40°C. É adicionado 0,75 mL de reagente DNS para interromper a reação, e a mistura de reação interrompida é aquecida em um banho de água em ebulição por cinco minutos, e depois resfriada, antes da leitura da absorvência a 550 nm. Um ponto de tempo zero com a solução da enzima é usado para determinar o nível de base. Cálculo: uma MU de xiloglicanase de ChemGen é definida como a habilidade para produzir 0,72 grama de açúcar redutor por minuto (usando manose pura, um açúcar redutor, como padrão). Uma MU ChemGen é equivalente a 4.000 UI. Em outras palavras, uma U de CG é equivalente a 25 0 UI (UI = 1,0 μτηοΐ/minuto) . (II) β-l,3-glicanase A atividade de β-l,3-glicanase pode ser testada com o uso do seguinte protocolo: Esse ensaio usa o mesmo reagente DNS, soluções padronizadas, curva-padrão e cálculo de unidade de enzima e quantidade de diluição descritos acima para o ensaio de xiloglicanase. 0 tampão usado é o tampão de 50 mM de MOPS (ácido 4-morfolinopropanossulfônico, FW = 209,26) em pH 6,5.

Substrato CM Pachyman: carboximetil Pachyman (CM

Pachyman, CMP) é obtido de Megazyme International Ireland Ltd., Bray,Co., Irlanda. O substrato CMP é preparado a 5 g/L por adição lenta de CMP em uma solução tampão de 50 mM de MOPS em agitação rápida (pH 6,5) a cerca de 90°C. O pó da enzima é bem dispersado, e o vaso é coberto ou lacrado firmemente, enquanto a suspensão é aquecida lentamente até a ebulição e fervida em fogo brando por 3 0 minutos com agitação em uma placa de agitação aquecida, para obter um gel bem hidratado sem pequenos grumos de gel não hidratados visíveis na solução. A solução é resfriada até a temperatura ambiente, estocada a 4°C quando não utilizada, e bem misturada antes do uso após a estocagem.

Condições de reação: é usado 0,25 mL de 5 g/L de substrato CM Pachyman com diluição de enzima de 0,05 mL em tampão MOPS, e a mistura de reação é incubada a 40°C por vários tempos, até 45 minutos. É acrescentado 0,75 mL de reagente DNS para interromper a reação. A mistura de reaçao interrompida é aquecida por um banho de água em ebulição por cinco minutos, e depois resfriada, antes da leitura da absorvência a 550 nm. Um ponto de tempo zero com a solução da enzima é usado para determinar o nível de base. (III) Quitinase A atividade de quitinase pode ser determinada com o uso do substrato fluorogênico de quitina descrito em Thompson e cols., Appl. Environ. Microbiol. 67: 4.001-008 (2001), 4-metilumbeliferil-beta-D-N,N',N'1,N'''-tetraacetilquitotetraosideo. O substrato é dissolvido em DMSO a 2,5 mM.

Em um ensaio exemplar, 20 pL de substrato de quitina (2,5 mM) são usados com 150 pL de tris (20,0 mM, pH 7,5). A mistura de substrato é colocada em uma placa de microtitulação negra de 98 poços, e pré-aquecida até 37°C por 10 minutos. São iniciadas diversas réplicas de reações por adição de 30 pL de enzima diluída, e a incubação é continuada a 37°C. As reações individuais são interrompidas em 2, 4, 6, 8 e 10 minutos com 50 pL de 3 MNa2Ca03. A fluorescência é lida em uma leitora de placas de microtitulação (Fluoroscan II) com o uso de comprimentos de onda do filtro da banda de excitação de 355 e do filtro de emissão de 460 nm. A enzima é diluída de tal modo que a 4-metilumbeliferona é produzida em uma taxa linear para o termo da reação e dentro da faixa de uma curva-padrão produzida sob condições idênticas ao ensaio da enzima, mas sem a presença de enzima e substrato. A liberação de um micromol de 4-metilumbeliferona por minuto é definida como uma UI. É feita uma curva-padrão é com várias concentrações entre zero e 1 x 104 micromol de 4-metilumbeliferona em 200 pL de solução de tampão de reação, seguida por adição de 50 pL de 3 MNa2Ca03.

Embora a invenção tenha sido descrita e exemplificada com detalhes suficientes para que aqueles habilitados nessa técnica possam produzi-la e usá-la, várias alternativas, modificações e aperfeiçoamentos devem ficar evidentes, sem se afastar do espírito e escopo da invenção. Os exemplos aqui apresentados são representativos de modalidades preferidas, são exemplares, e não devem ser considerados limitações sobre o escopo da invenção. Modificações e outros usos ocorrerão àqueles habilitados na técnica. Essas modificações estão englobadas dentro do espírito da invenção, e são definidas pelo escopo das reivindicações.

Ficará facilmente evidente para aqueles habilitados na técnica que podem ser feitas várias substituições e modificações â invenção aqui revelada, sem se afastar do escopo e espírito da invenção.

Todas as patentes e publicações mencionadas NE especificação são indicativas dos níveis daqueles habilitados na técnica à qual a invenção pertence. Todas as patentes e publicações são aqui incorporadas por referência, na mesma medida como se cada publicação individual fosse específica e individualmente indicada para ser incorporada por referência.

Claims

1. Composição adequada para administração oral a um animal, caracterizada pelo fato de que compreende uma enzima redutora de estresse imunológico em um veiculo aceitável por via oral, e de que é selecionada do grupo que consiste em: (i) uma ração animal que compreende pelo menos 2 0 UI de enzima/kg de alimento; (ii) uma composição liquida diferente de uma ração a-nimal que compreende pelo menos 40.000 UI de enzima/L; e (iii) uma composição sólida diferente de uma ração a-nimal que compreende pelo menos 40.000 UI de enzima/kg, sendo que: (a) a referida enzima é selecionada do grupo consistindo em: 1,3-p-glicanase, a-1,β-manosidase, a-1,2- manosidase, a-1,3-manosidase, endo-α-Ι,β-D-mananase e fos-fatase alcalina, e (b) se a referida enzima compreende 1,3-p-glicanase, a referida composição é selecionada do grupo que consiste em (i) uma ração animal que compreende pelo menos 20 UI de 1,3-p-glicanase/kg de alimento; (ii) uma composição liquida diferente de uma ração animal que compreende pelo menos 155.000 UI de 1,3-p-glicanase/L, e (iii) uma composição sólida diferente de uma ração animal que compreende pelo menos 300.000 UI de 1,3-p-glicanase/kg.

2. Composição, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que é uma ração animal que compreende pelo menos 20 UI de enzima/kg de alimento.

3. Composição, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que é uma composição sólida diferente de uma ração animal que compreende pelo menos 80.000 UI de enzima/kg.

4. Composição, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que é uma composição sólida diferente de uma ração animal que compreende pelo menos 160.000 UI de enzima/kg.

5. Composição, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que é uma ração animal que compreende um ingrediente que induz uma resposta imune no animal e sendo que a enzima é uma enzima que degrada o referido ingrediente.

6. Composição, de acordo com a reivindicação 5, caracterizada pelo fato de que o referido ingrediente é um antigeno apresentado por um microorganismo patogênico.

7. Composição, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que é uma composição liquida diferente de uma ração animal compreendendo pelo menos 2.000.000 UI da referida enzima redutora de estresse imuno-lógico/L.

8. Composição, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a enzima compreende 1,3-β-glicanase.

9. Composição, de acordo com a reivindicação 8, caracterizada pelo fato de que a composição é selecionada do grupo que consiste em (i) uma ração animal que compreende pelo menos 30 UI de 1,3-p-glicanase/kg de alimento; (ii) uma composição liquida diferente de uma ração animal que compreende pelo menos 230.000 UI 1,3-p-glicanase/L; e (iii) uma composição sólida diferente de uma ração animal que compreende pelo menos 450.000 III de 1,3-p-glicanase/kg.

10. Composição, de acordo com a reivindicação 8, caracterizada pelo fato de que a composição, em um ração animal, compreende 1,3-p-glicanase emu ma quantidade selecionada do grupo consistundo em: pelo menos 50.000 Ul/tonelada de alimento; pelo menos 60.000 Ul/tonelada de alimento; pelo menos 70.000 Ul/tonelada de alimento; pelo menos 80.000 Ul/tonelada de alimento; pelo menos 90.000 Ul/tonelada de alimento; pelo menos 100.000 Ul/tonelada de alimento; pelo menos 200.000 Ul/tonelada de alimento; e pelo menos 500.000 Ul/tonelada de alimento.

11. Composição, de acordo com a reivindicação 8, caracterizada pelo fato de que a composição é uma ração animal compreendendo 1,3-p-glicanase em uma quantidade selecionada do grupo consistindo em: pelo menos 25 Ul/kg de a-limento, pelo menos 30 Ul/kg de alimento, pelo menos 35 Ul/kg de alimento, pelo menos 40 Ul/kg de alimento, pelo menos 45 Ul/kg de alimento, e pelo menos 50 Ul/kg de alimento .

12. Composição, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a enzima compreende ainda uma enzima selecionada do grupo que consiste em quitinase, xi-loglicanase e arabinanase.

13. Composição, de acordo com reivindicação 12, caracterizada pelo fato de que é selecionada do grupo que consiste em (i) uma composição que compreende 1,4-β-mananase e quitanase; (ii) uma composição que compreende 1,4-p-mananase e xiloglicanase; (iii) uma composição que compreende 1,4-p-mananase e arabinanase; (iv) uma composição que compreende 1,3-p-glicanase e quitanase; (v) uma composição que compreende 1,3-β- glicanase e xiloglicanase; (vi) uma composição que compreende 1,3-p-glicanase e arabi-nanase; e (vii) uma composição que compreende 1,4-β-mananase, 1,3-p-glicanase e arabinanase.

14. Composição, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que é selecionada do grupo que consiste em (i) uma ração animal que compreende 1,4-β-mananase e pelo menos 20 UI de 1,3^-glicanase/kg de alimento, (ii) uma composição liquida diferente de uma ração animal que compreende 1,4^-mananase e pelo menos 155.000 UI de 1,3^-glicanase/L, e (iii) uma composição sólida diferente de uma ração animal que compreende 1,4^-mananase e pelo menos 300.000 UI de 1,3^-glicanase/kg.

15. Composição, de acordo com a reivindicação 14, caracterizada pelo fato de que é selecionada do grupo que consiste em (i) uma ração animal que compreende 1,4-β-mananase e pelo menos 30 UI de 1,3^-glicanase/kg de alimento; (ii) uma composição liquida diferente de uma ração animal que compreende 1,4^-mananase e pelo menos 230.000 UI de 1,3^-glicanase/L; e (iii) uma composição sólida diferente de uma ração animal que compreende 1,4^-mananase e pelo menos 450.000 UI de 1,3^-glicanase/kg.

16. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 15, caracterizada pelo fato de que é para uso na melhoria da performance de crescimento do animal e/ou a redução do estresse imunológico em um animal.

17. Composição, de acordo com a reivindicação 16, caracterizada pelo fato de que é administrado ao animal um ingrediente que induz uma resposta imune no animal e sendo que a composição compreende pelo menos uma enzima redutora de estresse imunológico que degrada o referido ingrediente.

18. Composição, de acordo com a reivindicação 17, caracterizada pelo fato de que é uma ração animal.

19. Composição, de acordo com a reivindicação 17, caracterizada pelo fato de que o referido ingrediente é um antigeno apresentado por um microorganismo patogênico.

20. Composição, de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que compreende 1,4-p-mananase e 1,3-p-glicanase.

21. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 15, caracterizada pelo fato de ser para o preparo de um medicamento para a prevenção ou tratamento de infecção associada a um microorganismo patogênico que apresenta um antigeno, no qual a composição compreende pelo menos uma enzima redutora de estresse imunológico que degrada o referido antigeno.

22. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 15, caracterizada pelo fato de que é para uso na prevenção ou tratamento de infecção associada a um microorganismo patogênico que apresenta um antigeno, sendo que a composição compreende pelo menos uma enzima redutora de estresse imunológico, exceto hemicelulase tipo β-mananase, que degrada o referido antigeno.