KR101454032B1

KR101454032B1 - 면역학적 스트레스 감소를 위한 효소

Info

Publication number: KR101454032B1
Application number: KR1020087017119A
Authority: KR
Inventors: 데이비드 엠. 안더손; 훔그-유 흐시아오; 린 리우
Original assignee: 일라이 릴리 앤드 캄파니
Priority date: 2005-12-15
Filing date: 2006-12-14
Publication date: 2014-10-27
Also published as: ES2361819T3; IL192088A0; AU2006329927B2; US8778648B2; PE20070840A1; CL2011000941A1; NZ569186A; CA2633066A1; US20110171345A1; US20110171344A1; ECSP088578A; DE602006020074D1; HRP20080319A2; CR10116A; MX2008007735A; BRPI0620155B1; DK1973561T3; SI1973561T1; CN101374544B; US20110177195A1

Abstract

본 발명은 동물에서 양성 급성기 단백질 농도의 감소, 동물에서 음성 급성기 단백질 농도의 증가, 및/또는 동물 성장 능력의 개선에 유효한 양의 1 이상의 면역 스트레스-감소 효소를 포함하는 동물의 경구 투여에 적합한 조성물 및 이러한 조성물을 사용하는 방법을 제공한다. 본 발명의 조성물은 동물 사료 조성물, 동물 사료 이외의 액체 조성물, 및 동물 사료 이외의 고체 조성물을 포함한다.

면역 스트레스-감소 효소, 양성 급성기 단백질 농도의 감소, 음성 급성기 단백질 농도의 증가, 성장 능력 개선

Description

면역학적 스트레스 감소를 위한 효소{ENZYMES FOR REDUCED IMMUNOLOGICAL STRESS}

본 발명은 면역학적 스트레스의 감소 및 동물 성장 능력의 개선을 위한 조성물 및 방법을 제공한다. 특히, 본 발명은 면역학적 스트레스의 감소에 유효하거나, 또는 감염 치료 또는 예방에 유효하거나, 또는 동물 성장 능력의 개선에 유효한 효소를 포함하는 조성물을 제공한다. 본 발명은 또한 조성물을 사용하는 방법을 제공한다.

동물은 동물의 면역계에 의해 인식되는 항원에의 노출을 포함하여, 많은 이유로 면역학적 스트레스를 겪을 수 있다. 항원은 후천성 면역 반응 또는 선천성 면역 반응인 면역 반응을 유발할 수 있다. 면역 반응이 유발되면, 동물은 이의 면역계가 반응하여 위협을 인지하여 면역학적 스트레스를 겪게된다. 종종, 면역학적 스트레스는 동물 성장 능력을 방해한다.

급성기 단백질 (APP)은 동물이 스트레스, 예컨대 감염, 염증, 수술적 외상, 또는 다른 내부 또는 외부의 도전을 겪을 때 혈액 농도가 변화하는 혈액 단백질 군이다. 예를 들어, 문헌 [Murata et al, Vet. J. 168: 28 (2004)] 참조. APP는 동물의 선천성 면역 반응에 일정한 역할을 하는 것으로 생각된다. 예를 들어, APP는 후천성 면역이 발달할 때까지 항상성을 복원하고 미생물 성장을 억제하는데 관련될 수 있다.

APP는 스트레스시 농도가 감소하는 "음성" 단백질 및 스트레스시 농도가 증가하는 "양성" 단백질을 포함한다. 예를 들어, 문헌 [Murata et al, supra] 참조. 음성 APP는 알부민 및 트랜스페린을 포함한다. 양성 APP는 전염증성 사이토킨에 의한 자극시 간세포에 의해 합성되며 혈류, 예컨대 합토글로빈, C-반응성 단백질, 혈청 아밀로이드 A, 세룰로플라스민, 피브리노겐, 및 α-1-산 당단백질 (AGP)로 방출되는 단백질을 포함한다. APP의 간외 생성 또한 대부분의 포유동물 종에서 보고되어 있다. 상기 동일 문헌 참조. 전염증성 사이토킨 예컨대 인터루킨-6 (IL-6) 및 종양 괴사 인자 α (TNF-α)는 간에서의 APP 합성의 주요 매개자로 생각된다. 염증, 감염 또는 조직 손상은 방어-지향성 세포에 의한 사이토킨 방출을 유발하여, APP 합성을 유도한다. 양성 APP의 유도는 음성 APP의 합성 감소와 연관되어 있다. 상기 동일 문헌 참조.

APP의 정량화 방법은 확립되어 있으며, 순환하는 APP 농도 (예를 들어, APP의 혈청 농도)는 동물 상태의 심각도와 상호관계가 있다. 상기 동일 문헌 참조. 따라서, APP 농도는 동물의 면역 스트레스 수준의 표지로서 사용될 수 있다.

동물의 면역계는 동물의 건강에 실제 위협을 주지 않는 항원, 예컨대 동물 사료 조성물 중의 식물- 및 동물-유래된 성분을 인지할 수 있다. 이러한 항원은 면역 반응, 예컨대 선천성 면역 반응을 유발하여, 동물을 면역학적 스트레스에 노출시킬 수 있다. 이러한 스트레스 반응은 혈청 APP 농도를 통해 확인 및 관리될 수 있다.

면역-유발 항원이 동물의 건강에 실제 위협을 주지 않았던 경우에도, 스트레스 반응은 유해 작용을 가질 수 있다. 이에 의해 예를 들어, 사료 효율의 감소, 체중 증가율의 감소나 체중의 감소, 감염에의 감수성 증가, 또는 체온의 증가가 관찰될 수 있다.

동물에의 위장 염증을 감소시키기 위한 항체, 예컨대 항-포스포리파제 A2 항체의 사용이 기술되어 있다. 예를 들어, 미국 특허 6,383,485 참조. 사료의 효율을 개선시키기 위해, β-만난-함유 헤미셀룰로스 (예를 들어, β-만난아제형 헤미셀룰라제), 예컨대 엔도-1,4-β-만난아제, 또는 포스포리파제, 예컨대 포스포리파제 A2를 분해할 수 있는 헤미셀룰라제를 포함하는 사료 조성물은 기술되어 있다. 예를 들어, WO 97/41739, 미국 특허 6,162,473, 및 미국 특허 6,183,739 참조.

또한, 소화관 감염의 치료 또는 예방을 위해, 결합을 분해시켜 세포-표면 단백질 또는 탄수화물을 방출시키는 효소, 예컨대 PI-PLC를 포함하는 사료 조성물이 기술되어 있다. 예를 들어, WO 01/41785. 문헌 [Walsh et al., J. Anim. Sci. 73: 1074 (1995)]은 혼합된 연결 글루칸 기질을 분해하는 글루카나제 효소, 예컨대 혼합된 β-1,3, β-1,4-기질을 분해하는 1,4-β-글루카나제를 포함하는 사료 조성물을 언급한다. 하지만, 본원의 시험에서, PI-PLC 및 1,4-β-글루카나제 어느 것도 면역-스트레스 감소 활성을 나타내지 못하였다.

지금까지 면역학적 스트레스의 감소에 유효량으로 존재하는 β-만난아제형 헤미셀룰라제 또는 포스포리파제 이외의 효소를 포함하는 사료 조성물은 공지되어 있지 않다.

따라서 동물에서 면역학적 스트레스의 감소를 위한 조성물 및 방법이 필요하다.

[발명의 요약]

일 실시태양은 경구적으로 허용되는 담체 중 면역 스트레스-감소 효소를 포함하는 동물의 경구 투여에 적합한 조성물을 제공한다. 조성물은

(i) 동물에서 양성 급성기 단백질 농도의 감소, 동물에서 음성 급성기 단백질 농도의 증가, 및/또는 동물 성장 능력의 개선에 유효한 양의 효소를 포함하는 동물 사료;

(ii) 40,000 IU 이상의 효소/L을 포함하는 동물 사료 이외의 액체 조성물; 및

(iii) 40,000 IU 이상의 효소/kg을 포함하는 동물 사료 이외의 고체 조성물

로 이루어진 군으로부터 선택된다. 상기 효소는 β-만난아제형 헤미셀룰라제 또는 포스포리파제 이외의 것이고, 만약 상기 효소가 1,3-β-글루카나제를 포함하는 경우에는, 조성물은

(i) 20 IU 이상의 1,3-β-글루카나제/사료 kg을 포함하는 동물 사료;

(ii) 155,000 IU 이상의 1,3-β-글루카나제/L을 포함하는 동물 사료 이외의 액체 조성물; 및

(iii) 300,000 IU 이상의 1,3-β-글루카나제/kg을 포함하는 동물 사료 이외의 고체 조성물

로 이루어진 군으로부터 선택된다.

일 실시태양에서 조성물은 20 IU 이상의 효소/사료 kg을 포함하는 동물 사료이다. 또다른 실시태양에서, 조성물은 80,000 IU 이상의 효소/kg, 또는 160,000 IU 이상의 효소/kg을 포함하는 동물 사료 이외의 고체 조성물이다.

일 실시태양에서, 상기 조성물은 동물에서 면역 반응을 유도하는 성분을 포함하는 동물 사료이고, 이 때 상기 효소는 상기 성분을 분해하는 효소를 포함한다. 일 실시태양에서, 성분은 병원성 미생물에 의해 발현되는 항원이다.

일 실시태양에서, 효소는 1,3-β-글루카나제를 포함한다. 일 실시태양에서, 효소는 1,3-β-글루카나제이고, 조성물은

(i) 30 IU 이상의 1,3-β-글루카나제/사료 kg을 포함하는 동물 사료;

(ii) 230,000 IU 이상의 1,3-β-글루카나제/L을 포함하는 동물 사료 이외의 액체 조성물; 및

(iii) 450,000 IU 이상의 1,3-β-글루카나제/kg을 포함하는 동물 사료 이외의 고체 조성물

로 이루어지는 군으로부터 선택된다.

또다른 실시태양은 1,4-β-만난아제 및 1,3-β-글루카나제 이외의 1 이상의 면역 스트레스-감소 효소를 포함하는, 2 이상의 면역 스트레스-감소 효소를 포함하는 동물의 경구 투여에 적합한 조성물을 제공한다. 상기 조성물은

(i) 동물에서 양성 급성기 단백질 농도의 감소, 동물에서 음성 급성기 단백질 농도의 증가, 및/또는 동물 성장 능력의 개선에 유효한 양의 면역 스트레스-감소 효소를 포함하는 동물 사료;

(ii) 40,000 IU 이상의 효소/L 양의 1 이상의 면역 스트레스-감소 효소를 포함하는 동물 사료 이외의 액체 조성물; 및

(iii) 40,000 IU 이상의 효소/kg 양의 1 이상의 면역 스트레스-감소 효소를 포함하는 동물 사료 이외의 고체 조성물

로 이루어지는 군으로부터 선택된다.

일 실시태양에서, 조성물은 20 IU 이상의 효소/사료 kg 양의 1 이상의 면역 스트레스-감소 효소를 포함하는 동물 사료이다. 또다른 실시태양에서, 조성물은 80,000 IU 이상의 효소/kg 또는 160,000 IU 이상의 효소/kg 양의 1 이상의 면역 스트레스-감소 효소를 포함하는 동물 사료 이외의 고체 조성물이다.

특이적 실시태양에서, 조성물은

(i) 1,4-β-만난아제 및 키타나제를 포함하는 조성물;

(ii) 1,4-β-만난아제 및 자일로글루카나제를 포함하는 조성물;

(iii) 1,4-β-만난아제 및 아라비난아제를 포함하는 조성물;

(iv) 1,3-β-글루카나제 및 키타나제를 포함하는 조성물;

(v) 1,3-β-글루카나제 및 자일로글루카나제를 포함하는 조성물;

(vi) 1,3-β-글루카나제 및 아라비난아제를 포함하는 조성물; 및

(vii) 1,4-β-만난아제, 1,3-β-글루카나제 및 아라비난아제를 포함하는 조성물

로 이루어지는 군으로부터 선택된다.

또다른 실시태양은 1,4-β-만난아제 및 1,3-β-글루카나제를 포함하는 동물의 경구 투여에 적합한 조성물을 제공한다. 상기 조성물은

(i) 1,4-β-만난아제 및 20 IU 이상의 1,3-β-글루카나제/사료 kg을 포함하는 동물 사료;

(ii) 1,4-β-만난아제 및 155,000 IU 이상의 1,3-β-글루카나제/L을 포함하는 동물 사료 이외의 액체 조성물; 및

(iii) 1,4-β-만난아제 및 300,000 IU 이상의 1,3-β-글루카나제/kg을 포함하는 동물 사료 이외의 고체 조성물

로 이루어지는 군으로부터 선택된다. 일 실시태양에서, 조성물은

(i) 1,4-β-만난아제 및 30 IU 이상의 1,3-β-글루카나제/사료 kg을 포함하는 동물 사료;

(ii) 1,4-β-만난아제 및 230,000 IU 이상의 1,3-β-글루카나제/L을 포함하는 동물 사료 이외의 액체 조성물; 및

(iii) 1,4-β-만난아제 및 450,000 IU 이상의 1,3-β-글루카나제/kg을 포함하는 동물 사료 이외의 고체 조성물

로 이루어지는 군으로부터 선택된다. 일 실시태양에서, 조성물은 1 이상의 또다른 면역 스트레스-감소 효소를 추가로 포함한다.

또다른 실시태양은 상기 기술된 임의의 조성물을 동물에 경구 투여하는 것을 포함하는, 동물 성장 능력의 개선 및/또는 동물의 면역 스트레스 감소 방법을 제공한다.

일 실시태양에서, 상기 동물에 동물의 면역 반응을 유도하는 성분을 투여하고, 이 때 상기 조성물은 상기 성분을 분해하는 1 이상의 면역 스트레스-감소 효소를 포함한다. 일 실시태양에서, 성분 및 효소를 동일한 조성물로 투여한다. 일 실시태양에서, 조성물은 동물 사료이다. 일 실시태양에서, 성분은 병원성 미생물에 의해 발현되는 항원이다.

또다른 실시태양은 항원을 분해하는 1 이상의 면역 스트레스-감소 효소를 포함하는, 상기 기술된 임의의 조성물을 필요로 하는 동물에 경구 투여하는 것을 포함하는, 항원을 발현하는 병원성 미생물과 연관된 감염의 예방 또는 치료 방법을 제공한다.

도 1은 실시예 1에서 수득한 데이터를 사용하여 시험 닭의 혈장 시료에서의 닭 α-1-산 당단백질 (AGP)의 농도를 계산하기 위한 최선의 곡선 피팅 (및 기재 다항식)을 나타낸다.

도 2는 실시예 2에 기술된 바와 같은, 시험 닭으로부터의 닭 혈청에서의 AGP 농도를 그래프로 보여주는 복스 및 위스커(Box and Wisker) 플롯이다. 데이터 범위는 수직선으로 표현된다. 박스는 평균의 일 표준 편차 내의 데이터 범위를 나타낸다. 수평선은 데이터 평균을 나타낸다.

도 3은 실시예 3에 기술된 바와 같은, 본 발명에 따른 사료 및 종래 기술 사료를 포함하는 몇몇 다양한 사료 중 하나를 투여받은 닭으로부터의 혈청 AGP 농도 를 보여준다.

도 4는 실시예 8에서 수득된 데이터를 사용하여 시험 칠면조의 혈장 시료에서의 AGP 농도를 계산하기 위한 최선의 곡선 피팅 (및 기재 다항식)을 나타낸다.

[발명의 상세한 설명]

본원에 사용된 용어 "a" 또는 "an"(단수형태)은 달리 나타내지 않는 한 1 이상을 포함하는 것으로 이해되어야만 한다.

본원에 사용된 용어 "동물"은 인간 및, 반려 동물 예컨대 개 및 고양이, 가축류, 예컨대 소 및 다른 반추동물, 물소, 말, 돼지, 양, 가금류 (예를 들어, 닭, 오리, 칠면조, 및 거위) 및 수산 동물 (예를 들어, 생선 및 새우 및 뱀장어)를 포함하는 다른 동물, 예컨대 비인간 동물을 포함하는 임의의 동물을 지칭한다.

본원에서 어구 "항원 분해 효소" 및 "성분 분해 효소"는 항원 또는 성분을 동물의 면역계에 의해 인지되지 않는 형태로 전환시키는 효소를 의미한다. 효소의 항원 또는 성분 분해능은 동물의 혈청 APP 농도를 측정함으로써 확인될 수 있으며, 이에 따라 양성 APP 혈청 농도의 감소, 또는 음성 APP의 혈청 농도의 증가는 효소가 항원 또는 성분을 분해하였음을 나타낸다.

상기 나타낸 바와 같이, 용어 "APP"는 스트레스시 농도가 감소하는 "음성" 단백질 및 스트레스시 농도가 증가하는 "양성" 단백질을 포함한다. 본 발명은 스트레스시 농도가 통상적으로 감소하는 음성 급성기 단백질의 농도를 증가시키는 조성물 및 방법, 뿐 아니라 본 발명은 스트레스시 농도가 통상적으로 증가하는 양성 급성기 단백질의 농도를 감소시키는 조성물 및 방법을 포함한다. 편의상, 하기에 서는 본 발명은 양성 급성기 단백질에 대한 조성물 및 방법의 작용을 참조하여 예시한다. 따라서, 일반적으로 하기에서 논의되는 용어 "APP"는 동물의 스트레스 반응과 연관된 임의의 1 이상의 양성 급성기 단백질을 지칭한다. "APP" (양성 급성기 단백질을 지칭함)의 농도를 감소시키는 본원에 기술된 조성물 및 방법은 음성 급성기 단백질 농도의 증가에도 또한 유용한다.

본 발명의 일면은 동물이 겪게되는 면역학적 스트레스를 감소시키는데 유효한 효소를 포함하는 조성물에 관한 것이다. 편의상, 본원에서는 이러한 효소를 "면역 스트레스-감소" 효소로 지칭한다. 본원에 사용된 용어 "면역 스트레스-감소 효소"는 동물의 면역계에 의해 인지되는 항원 또는 분자 패턴, 예를 들어 면역 반응을 유발하여, 동물이 면역학적 스트레스를 겪게하는 항원 또는 분자 패턴을 포함하는 임의의 효소를 의미한다. 본원에 사용된 용어 "분자 패턴"은 선천성 면역계와 관련된 수용체에 의해 결합되는 일반적인 분자 패턴, 예컨대 통상적으로 병원체와 연관있는 분자 패턴을 포함한다.

일 실시태양에 따르면, 면역 스트레스-감소 효소는 β-만난아제형 헤미셀룰라제가 아니다. 본 실시태양에 따르면, 면역 스트레스-감소 효소는 엔도-1,4-β-D-만난아제가 아니다. 또다른 실시태양에 따르면, 효소는 포스포리파제가 아니다. 또다른 실시태양에 따르면, 면역 스트레스-감소 효소는 1,4-β-D-글루카나제가 아니다. 또다른 실시태양에 따르면, 면역 스트레스-감소 효소는 PI-PLC가 아니다. 또다른 실시태양에 따르면, 면역 스트레스-감소 효소는 β-만난아제형 헤미셀룰라제 또는 포스포리파제가 아니다. 또다른 실시태양에 따르면, 면역 스트레스-감소 효소는 β-만난아제형 헤미셀룰라제가 아니며, 1,4-β-글루카나제가 아니고, 포스포리파제가 아니다. 또다른 실시태양에 따르면, 면역 스트레스-감소 효소는 β-만난아제형 헤미셀룰라제가 아니고, 1,4-β-글루카나제가 아니며, 포스포리파제가 아니고, PI-PLC가 아니다. 상기 기술한 실시태양 중 임의의 일 측면에 따르면, 효소는 1,3-β-글루카나제가 아니다.

임의의 이론에 구속되는 것은 아니지만, 본 발명자들은 항원 또는 분자 패턴의 면역 스트레스-감소 효소의 분해가 항원 또는 분자 패턴에 의해 유발되는 면역 반응을 억제 또는 감소시켜, 동물의 면역학적 스트레스를 감소시킨다고 생각한다. APP의 정량화에 대해 당업계에 공지된 방법을 사용하여, 동물의 혈청 APP 농도를 측정함으로써 면역학적 스트레스의 감소를 확인 및 관리할 수 있다. 이러한 방법의 예는 문헌 [Murata, et al. , supra]을 참조하며, 문헌 [Hulten et al., Vet. Microbiol. 95: 75 (2003)] 및 [Holt et al., supra]에 기술된 것을 참조할 뿐 아니라, 하기 실시예 1을 참조한다.

관련된 실시태양에서, 본 발명은 동물의 APP 농도를 감소시키는데 유효한 양의 면역 스트레스-감소 효소를 포함하는 조성물을 동물에 투여하는 것을 포함하는 동물에서의 면역학적 스트레스의 감소 방법을 제공한다.

α-1-산 당단백질 (AGP), 세룰로플라스민 (Cp), 집합계(collection family)의 단백질 (예를 들어, 폐 계면활성 단백질, 콘글루티닌 및 만난-결합 렉틴), 피브리노겐 (Fb), C-반응성 단백질 (CRP), 합토글로빈, 프로테아제 억제제 (예를 들어, α-1-항트립신, α-1-항키모트립신, 및 α-2-매크로글로불린) 및 혈청 아밀로이드- A (SAA)를 포함하는 많은 다양한 양성 급성기 단백질이 동정되어 있다. 다른 가능한 APP는 리포폴리사카라이드-결합 단백질 (LPB), 인지질-결합 단백질 예컨대 아넥신 및 주요 급성기 단백질 (MAP)을 포함한다. 문헌 [Murata, et al., supra]. 이러한 또는 다른 APP 중 어느 하나의 혈청 농도는 본 발명에 따른 효소 활성을 확인, 평가 및 관리하는데 사용될 수 있다.

다양한 APP는 다양한 동물의 스트레스 반응에 보다 상당한 역할을 할 수 있다. 예를 들어, AGP는 소에서 임상적으로 중요한 것으로 공지되어 있으며, 돼지, 개, 고양이 및 닭 (암탉 포함)에서 감염과 연관되어 있다. Cp는 소, 말, 및 닭에서 감염의 표지로 보고되어 있다. CRP는 반추동물, 말, 돼지, 개, 및 고양이에서 동정되지만, CRP가 소의 APP라는 것은 증명되지 않았다. CRP는 말 및 돼지의 감염과 연관되어 있는 것으로 밝혀져 있다. Fb는 소 및 양에서 염증, 박테리아성 감염 또는 수술적 외상의 신뢰성 있는 표지이고, 말의 감염과 연관되어 있다. Hp는 많은 제품 및 반추동물 예컨대 소, 양, 돼지, 말, 및 개를 포함하는 반려 동물에서의 APP이다. SAA는 소의 염증 및 감염, 및 말, 돼지, 반려 동물 예컨대 개, 및 닭의 감염과 연관되어 있다. SAA 우유 농도의 증가는 유선염이 있는 소 및 암양에서 확인된다. 혈청 LBP는 소의 감염과 연관되어 있으며, 이는 (감염된 소의 폐에 있는 분비 상피 표면 상에서) 아넥신의 국소 농도를 갖는다. MAP는 돼지에서의 감염의 표지로 보고되어 있다. 추가적으로, 트랜스페린은 통상적으로 음성 급성기 단백질로 여겨지지만, 이는 닭에서의 양성 급성기 단백질로서 일정한 역할을 하는 것 같다. 문헌 [Murata, et al, supra]; [Holt et al. , Poultry Sci. 81 : 1295-1300 (2002)]. 다른 문헌들도 SAA 및 Hp 뿐 아니라 CRP 및 MAP가 돼지의 감염과 연관되어 있다는 것을 보고한다. 문헌 [Hulten et al., supra].

몇몇 실시태양에서, 본 발명의 조성물은 동물의 APP의 혈청 농도를 감소시키는데 유효한 양의 면역 스트레스-감소 효소를 포함한다. 그 양은 동물 및 면역 스트레스-감소 효소에 따라 다양할 수 있으며, 당업계에 공지된 방법을 사용하여 당업자가 쉽게 결정할 수 있다. 예를 들어, 동물의 혈청 APP 농도를 효소 투여 전 및 후에 측정할 수 있거나, 또는 치료 동물 및 대조군 동물의 혈청 APP 농도를 비교할 수 있다. (이와 관련하여, 동일한 연령의 치료 동물 및 대조군 동물을 비교하는 것이 유리할 수 있는데, 이는 연령에 따라 APP 농도가 변화하기 때문이다. 예를 들어, 혈청 AGP 농도는 닭 연령에 따라 증가하는 것이 밝혀져 있다.) 효소 투여와 연관된 혈청 APP 농도의 감소는 유효량의 효소가 투여되었음을 나타낸다.

다른 실시태양에서, 본 발명의 조성물은 동물 성장 능력 (또한 가금류 분야에서는 특히 "생장 능력"이라고 지칭함)의 개선에 유효한 양의 면역 스트레스-감소 효소를 포함한다. 본원에 사용된 어구 "동물 성장 능력"은 사료 전환율, 물 흡수율, 대변 물 함량, 동물 떼 또는 군 내의 체중의 균일성, 생존율, 및 치사율을 포함하는 동물 성장을 반영하는 임의의 파라미터를 포함한다. 임의의 이론에 구속되는 것은 아니지만, 몇몇 상태 하에, APP 농도에 대한 면역 스트레스-감소 효소의 작용은 면역 스트레스-유도 인자와 같은 인자, 예컨대 동물 군의 저농도 감염 또는 스트레스성 생장 상태의 존재에 의해 차폐된다. 그럼에도 불구하고, 이러한 상태 하에서 면역 스트레스-감소 효소는 동물 성장 능력의 개선에 유효할 수 있다. 따 라서, 동물 성장 능력은 본 발명의 조성물 및 방법의 효과의 또다른 척도이다.

조성물은 동물에의 투여에 적합한 임의의 조성물일 수 있다. 일 실시태양에서, 조성물은 경구 투여에 적합하다. 일 특이적 실시태양에서, 경구 투여에 적합한 조성물은 일반적으로 동물에의 경구 투여에 안전한 것으로 인정된다. 또다른 특이적 실시태양에서, 경구 투여에 적합한 조성물은 일반적으로 동물에의 경구 투여에 안전한 것으로 인정된 성분, 및 이러한 성분의 일정량만을 함유한다. 또다른 특이적 실시태양에서, 경구 투여에 적합한 조성물은 일반적으로 동물에의 경구 투여에 안전한 것으로 인정되지 않은 임의의 성분, 또는 이러한 성분의 일정량을 함유하지 않는다. 또다른 특이적 실시태양에서, 경구 투여에 적합한 조성물은 동물에의 경구 투여에 허락되거나 또는 이러한 투여가 금지되지 않는 성분, 및 이러한 성분의 일정량만을 함유한다. 또다른 특이적 실시태양에서, 경구 투여에 적합한 조성물은 동물에의 경구 투여에 허락되지 않거나 또는 이러한 투여가 금지된 성분, 또는 이러한 성분의 일정량을 함유하지 않는다.

몇몇 실시태양에서, 조성물은 효소에 경구적으로 허용되는 담체를 포함한다. 본원에서 사용된 "경구적으로 허용되는 담체"는 경구 투여에 적합한 임의의 생리학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 경구적으로 허용되는 담체는 동물 사료 제품에의 사용 및/또는 동물에의 경구 투여에 적합한 동물 사료 조성물, 수성 조성물, 및 액체 및 고체 조성물을 비제한적으로 포함한다. 적합한 담체는 당업계에 공지되어 있으며, 미국 특허 6,780,628에 기술된 것들을 포함한다.

몇몇 실시태양에서, 조성물은 동물 사료이다. 본원에 사용된 용어 "동물 사 료"는 동물 축사의 분야에서의 이의 통상적인 의미를 갖는다. 예를 들어, 동물 사료는 이들의 영양학적 수치를 위해 가축류에서 소비되는 식용 물질을 포함한다. 동물 사료는 배급 사료(feed rations), 예를 들어, 동물의 영양학적 요구를 충족시키는 조성물을 포함하며, 나아가 동물의 영양학적 요구를 충족시키지 않는 조성물도 포함한다.

이러한 실시태양의 특이적 예에서, 효소의 양은 약 50,000 국제 단위 (IU) 이상/사료 ton(U.S.), 약 60,000 IU 이상/사료 ton, 약 70,000 IU 이상/사료 ton, 약 80,000 IU 이상/사료 ton, 약 90,000 IU 이상/사료 ton, 약 100,000 IU 이상/사료 ton, 약 200,000 IU 이상/사료 ton, 또는 약 500,000 IU 이상/사료 ton, 또는 그 이상이다.

다른 특이적 예에서, 본 발명은 약 20 IU 이상/사료 kg, 예컨대 20 IU 이상/사료 kg,약 25 IU 이상/사료 kg, 약 30 IU 이상/사료 kg, 약 35 IU 이상/사료 kg, 40 IU 이상/사료 kg, 45 IU 이상/사료 kg, 50 IU 이상/사료 kg, 또는 그 이상의 양의 면역 스트레스-감소 효소를 포함하는 동물 사료를 제공한다. 임의의 이론에 구속되는 것은 아니지만, 약 20 IU 이상/사료 kg 양의 면역 스트레스-감소 효소를 포함하는 동물 사료가 상기 동물에서 양성 급성기 단백질 농도의 감소, 상기 동물에서 음성 급성기 단백질 농도의 증가, 및/또는 동물 성장 능력의 개선에 유효할 것이다.

따라서, 몇몇 실시태양에서, 본 발명은 동물에서 양성 급성기 단백질 농도의 감소, 동물에서 음성 급성기 단백질 농도의 증가, 및/또는 동물 성장 능력의 개선 에 유효한 양의 면역 스트레스-감소 효소를 포함하는 동물 사료를 제공한다.

사료 조성물은 당업계에 공지된 방법에 의해 제조될 수 있다. 예를 들어, 면역 스트레스-감소 효소가 제조 과정 동안의 임의의 단계에서 다른 사료 성분에 첨가될 수 있으며, 이는 당업자에 의해 적절하게 고려된다. 일 실시태양에서, 효소는 용액, 예컨대 제조 과정 동안 다른 사료 성분에 첨가되는 액체 효소 농축물로서 제공된다. 별법으로, 효소-함유 용액은 동물 사료의 실질적으로 최종 형태에 분무된다. 또다른 실시태양에서, 효소는 고체 조성물 (예컨대 분말), 예컨대 제조 과정 동안 다른 사료 성분에 첨가되는 고체 조성물로서 제공된다. 효소-함유 사료 제조에 대한 예시적 방법은 WO 97/41739에 기술되어 있다.

몇몇 실시태양에서, 조성물은 동물 사료 이외의 것이다. 예를 들어, 조성물은 동물 사료 이외의 액체 조성물 또는 동물 사료 이외의 고체 조성물일 수 있다. 이러한 조성물은 동물에의 직접 투여에 적합할 수 있거나 또는 사료 첨가물 (예를 들어, 공급 전에 사료에 첨가됨) 또는 사료 보충물 (공급 전에 다른 사료 성분으로 희석되는 보충물 및 자유롭게 선택되는 별도의 기재 상에서 동물에게 제공되는 보충물)로서 사용될 수 있다. 동물 사료 이외의 액체 조성물의 예는 동물에의 경구 투여 전에 다른 성분으로 통상적으로 희석되거나 또는 이와 조합된 액체 효소 농축물을 포함하는 액체 효소 농축물을 포함한다.

조성물이 동물 사료 이외의 액체 조성물, 예컨대 효소 용액인 실시태양에서, 액체 조성물 또는 용액은 약 40,000 국제 단위 (IU) 이상/용액 L, 예컨대 40,000 IU 이상/L, 50,000 IU 이상/L, 60,000 IU 이상/L, 70,000 IU 이상/L, 80,000 IU 이 상/L, 90,000 IU 이상/L, 100,000 IU 이상/L, 약 500,000 IU 이상/L, 약 600,000 IU 이상/L, 약 700,000 IU 이상/L, 약 800,000 IU 이상/L, 약 900,000 IU 이상/L, 약 1,000,000 IU 이상/L, 약 2,000,000 IU 이상/L, 또는 약 5,000,000 IU 이상/L을 포함할 수 있다.

몇몇 실시태양에서, 일정량의 동물 사료 이외의 액체 조성물, 예컨대 약 500 mL 용액을 일정량의 사료, 예컨대 1톤의 사료에 적용시키거나 또는 조합시켜 상기 기술된 효소 농도를 갖는 사료 제제를 제조한다. 다른 실시태양에서, 일정량의 동물 사료 이외의 액체 조성물을 일정량의 사료에 적용시키거나 또는 조합시켜 동물에서 양성 급성기 단백질 농도의 감소, 동물에서 음성 급성기 단백질 농도의 증가, 및/또는 동물 성장 능력의 개선에 유효한 양의 효소를 갖는 동물 사료를 제조한다.

경구 투여에 적합한 현재 입수가능한 액체 효소 농축 조성물 (상기 논의한 1,3-β-글루카나제 조성물 이외의 것)은, 있다고 하더라도, 약 40,000 IU 이상/L 보다 적은 양의 면역 스트레스-감소 효소를 포함하는 것으로 여겨지며, 이들의 지시서에 따라 사용하는 경우 양성 급성기 단백질 농도의 감소, 음성 급성기 단백질 농도의 증가, 및/또는 동물 성장 능력의 개선에 유효하지 않다.

조성물이 동물 사료 이외의 고체 조성물인 실시태양에서, 조성물은 약 40,000 IU 이상/kg, 예컨대 40,000 IU 이상/kg, 50,000 IU 이상/kg, 60,000 IU 이상/kg, 70,000 IU 이상/kg, 80,000 IU 이상/kg, 90,000 IU 이상/kg, 100,000 IU 이상/kg, 120,000 IU 이상/kg, 140,000 IU 이상/kg, 160,000 IU 이상/kg, 180,000 IU 이상/kg, 200,000 IU 이상/kg, 또는 그 이상을 포함할 수 있다.

몇몇 실시태양에서, 일정량의 동물 사료 이외의 고체 조성물을 일정량의 사료에 적용시키거나 또는 조합시켜 상기 기술된 효소 농도를 갖는 사료 제제를 제조한다. 다른 실시태양에서, 일정량의 동물 사료 이외의 고체 조성물을 일정량의 사료와 조합시켜 동물에서 양성 급성기 단백질 농도의 감소, 동물에서 음성 급성기 단백질 농도의 증가, 및/또는 동물 성장 능력의 개선에 유효한 양의 효소를 갖는 동물 사료를 제조한다.

경구 투여에 적합한 현재 입수가능한 고체 효소 분말 조성물은, 있다고 하더라도, 약 40,000 IU 이상/kg 보다 적은 양의 면역 스트레스-감소 효소를 포함하는 것으로 여겨지며, 이들의 지시서에 따라 사용하는 경우 양성 급성기 단백질 농도의 감소, 음성 급성기 단백질 농도의 증가, 및/또는 동물 성장 능력의 개선에 유효하지 않다.

당업계에서 통상적인 용어 "IU" 또는 "국제 단위(international unit)"는 효소에 최적인 상태 하에 1 분 당 1 μmol의 기질 변환을 촉매화하는 효소의 양을 지칭한다. 면역 스트레스-감소 효소의 국제 단위에 등가인 중량은 당업계에 공지되어 있으며 표준 분석을 사용하여 결정될 수 있다. 대표적인 면역 스트레스-감소 효소의 예시적 표준 분석은 하기 개괄한다.

일 실시태양에서, 효소는 동물 사료에 사용되는 식물에 의해 발현된다. 예를 들어, 옥수수는 유전적으로 변형되어 면역 스트레스-감소 효소를 발현할 수 있으며 생성된 유전자 변형 옥수수 제품은 사료에 사용될 수 있다. 또한 다른 유전자 변형 또는 통상적 변형계 예컨대 박테리아, 예를 들어, 대장균(E. coli), 바실 러스 균주(Bacillus sp.), 락토바실러스(Lactobacillus); 효모, 예를 들어, 피키아(Pichia), 야로우(Yarrow), 사카로마이세스(Saccharomyces), 시조사카로마이세스(Schizosaccharomyces) (예를 들어, 시조사카로마이세스 폼(Schizosaccharomyce pomb), 한세눌라(Hansenula), 클루베로마이세스(Kluyveromyces), 칸디다(Candida)), 및 다른 진균, 예컨대 아스페르길루스(Aspergillus), 리조푸스(Rhizopus), 트리코데르마(Tricoderma), 후미콜라(Humicola), 페니실룸(Penicillium), 및 후미콜라를 사용하여 제품을 실시할 수 있다.

또다른 실시태양에 따르면, 면역 스트레스-감소 효소는 경구 섭취를 위한 캡슐 또는 정제로 제공된다. 본 발명은 또한 다른 경로, 예컨대 정맥, 복막, 또는 피하를 통해, 공지된 생리학적 관행에 따라 이러한 투여를 위해 제제화된 조성물의 성분으로서 효소를 투여하는 실시태양을 포함한다.

동물의 면역계는 동물의 건강에 실제 위협을 주지 않는 사료 조성물의 임의의 성분을 항원 또는 분자 패턴으로서 인지할 수 있다. 그럼에도 불구하고, 성분은 동물이 면역학적 스트레스를 겪게 하며, 1 이상의 APP의 혈청 농도의 증가를 통해 확인 및 관리될 수 있는 면역 반응을 유발한다. 임의의 이론에 구속되는 것은 아니지만, 본 발명자들은 이러한 "불필요하고 역효과의" 면역 반응이 패턴 인식 수용체 (PRR), 예컨대 선천성 면역계에 연관된 것들을 포함할 수 있다고 생각한다.

선천성 면역계는 특이적 항원 인식에 의존하지 않는 면역 반응을 제공한다. 예를 들어, 문헌 [Tosi, J. Allergy Clin. Immunol. 116: 241 (2005)] 참조. 선천성 면역계의 일 측면은 병원체와 연관된 분자 패턴을 인지하고 결합하여, 면역 반 응 신호를 도입시키는 PRR을 포함한다. 예를 들어, 문헌 [Fabrick et al.,J. Biol. Chem. 279: 26605 (2004)] 참조. PRR의 예는 분자 패턴의 범위를 인지하며 숙주 반응 범위의 활성화를 위한 세포내 신호를 생성하는 톨-유사(Toll-like) 수용체 (TLR)를 포함한다. 예를 들어, 문헌 [Tosi, supra; Blach-Olszewska, Arch. Immunol. Ther. Exp. 53: 245 (2005)] 참조. 만노스 (예를 들어, [Blach-Olszewska, supra]), 1,3-β-글루칸 (예를 들어, [Rice et al., J. Leukoc. Biol. 72:140 (2002)]), 리포폴리사카라이드 및 포스포릴콜린 (예를 들어, [Baumgarth et al., Semin. Immunopathol. 26: 347 (2005)]), 리포테이코산, 페놀-가용성 모둘린, 무라밀 디펩티드 및 펩티도글리칸 (예를 들어, [Fournier et al, Clin. Microbiol. Rev. 18: 521 (2005)])을 인지하는 PRR/TLR이 동정되었다. 만난 (예를 들어, [Klabunde et al., Parasitol. Res. 88: 113 (2002)] (만난-결합 렉틴)), 및 N-아세틸-D-글루코사민 및 N-아세틸-D-만노스아민 (예를 들어, [Hansen et al, J. Immunol. 169: 5726 (2002)])에 대한 면역조절 수용체가 동정되었다. 이중 나선 RNA (예를 들어, [Bell et al, Proc. Nat'I Acad. Sci. USA 102: 10976 (2005)]) 및 내인성 DNA (예를 들어, [Huang at al, J. Immunol 175: 3964 (2005)]; [Nonnemacher et al, Infect. Immun. 71: 850 (2003)])와 상이한 메틸화 패턴을 갖는 DNA에 대한 TLR 또한 동정되었다.

이러한 분자 패턴은 병원성 미생물 (예를 들어, 박테리아, 바이러스, 진균 및 원생동물)과 연관되어 있지만, 이들은 또한 몇몇 비병원성 분자, 예컨대 동물 사료 성분에 의해 발현된다. 이러한 분자 패턴을 발현하는 비병원성 분자에 대한 선청성 면역 반응은 동물에 불필요한 면역학적 스트레스를 주며, 동물의 사료 효율에 유해한 영향을 미칠 수 있고, 동물의 체중 증가율을 느리게 하거나 또는 체중을 감소시킬 수 있으며, 동물을 감염에 더욱 민감하게 하거나, 동물의 체온을 증가시키거나, 또는 동물의 건강 또는 식품 에너지 (칼로리) 이용 효율에 부정적인 영향을 미친다. MBL (만노스-결합 렉틴) 작용에 의해 생성된 선천성 면역 반응은 강한 반응을 유도한다. 마우스에서의 만노스 결합 단백질의 유전자 중의 하나의 돌연변이가 역설적이게도 일반적인 치명적 급성 패혈성 복막염 도전으로부터 생존할 수 있게 함이 밝혀졌다 (Takahashi, K. et al, 미생물 Infect. 4 (8): 773-784, 2002). 공격적인 선천성 면역 반응으로부터의 면역 스트레스는 이러한 경우 감염보다 더욱 치명적이다.

β-만난은 대두 제품 및 대두-기재의 동물 사료의 성분이다. 동물 사료에 존재하는 β-만난의 고분자량 형태는 "불필요하고 역효과의" 선천성 면역 반응을 유발하여, 동물에 면역학적 스트레스를 줄 수 있다. 본 발명자들은 β-만난 (예를 들어 β-갈락토만난, β-글루코만난)을 분해하는 효소인 β-만난아제형 헤미셀룰라제, 엔도-1,4-β-D-만난아제를 사용함으로써 이러한 면역학적 스트레스를 감소 또는 예방시킬 수 있어서, β-만난에 대한 면역 반응을 감소 또는 예방할 수 있음을 발견하였다. 하기 실시예에서 나타낸 바와 같이, 면역학적 스트레스의 감소는 혈청 APP 농도의 감소를 반영한다.

α-만난을 분해하는 α-만난아제는 본 발명에 따른 면역-스트레스 감소 효소로서 유용하다. α-만난은 헤미셀룰로스인 것으로 고려되지 않는데, 이는 이것이 헤미셀룰로스의 특징적인 성질을 공유하지 않기 때문이다.

산업적 효소의 분야에서, 용어 "헤미셀룰라제"는 β-만난아제에 대한 상품명으로 사용되었다. 유사하게, 본 발명자에 의한 특허 및 공개 공보에서 사용된 용어 "헤미셀룰라제"는 엔도-1,4-β-D-만난아제를 포함하는 β-만난아제를 지칭한다. 예를 들어, 미국 특허 6,162,473. 다른 문맥에서, 용어 "헤미셀룰라제"는 하기 설명하는 바와 같이 만난아제 이외에 글루카나제 및 자일라나제를 포함하여, 보다 넓은 의미일 수 있다.

용어 "헤미셀룰로스"은 셀룰로스보다 더욱 쉽게 가수분해되며 묽은 알킬리성 용액으로의 추출을 통해 수득되는 탄수화물 식물 물질을 기술하기 위해 만들어진 신조어이다. 예를 들어, 문헌 [Schulze, E., Berichte der Deutschen Botanischen Gesellschaf, 24: 2277 (1891)]; S[chulze, E., Z. Physiol Chem. 16: 387 (1892)] 참조. 이 때 이후로, "헤미셀룰로스"는 묽은 알킬리 용액에 가용성인 식물 수액 중 펙틴 및 전분 및 폴리사카라이드 이외의 셀룰로스와 연관된 수불용성 식물 폴리사카라이드를 지칭하게 되었다. 예를 들어, 문헌 [Whisler et ah, "Hemicelluloses," in IV POLYSACCHARIDE CHEMISTRY 112 (Academic Press, 1953)] 참조. 자일란, β-만난 및 갈락탄은 일반적으로 헤미셀룰로스로 생각되지만, 로커스트 콩 검(Locust bean gum) 및 구아 검 갈락토만난과 같은 몇몇 β-만난은 꽤 가용성이다. 침엽수 나무는 이들의 셀룰로스와 연관된 β-만난이 많으며, 활엽수는 자일란이 많다.

헤미셀룰로스와는 대조로, α-만난은 진균, 예컨대 사카로마이세의 세포 벽 과 연관되어 있으며, 목재의 구조적 성분이 아니고, 일반적으로 수용성인 진핵생물적 당단백질에서 균일하게 발견된다. 따라서, α-만난은 헤미셀룰로스로 고려되지 않으며, α-만난아제는 헤미셀룰라제가 아니다. α-만난아제는 본 발명에 따른 면역 스트레스-감소 효소로 유용한데, 이는 이것이 동물의 면역계에 의해 인지되는 α-만난을 분해하지만, 병원체와는 연관되어 있지 않기 때문이다. 선천성 면역계는 만난에 민감한데, 이는 만노스 함유 중합체가 많은 병원체의 표면에서 발견되기 때문이다.

동물의 면역계에 의해 인지될 수 있는 다른 사료 성분은 β-1,3-글루칸 (식물 물질의 공통 구조적 성분), N-연결된 당단백질 복합체 (예를 들어, 대두 제품에서 발견됨), 식물, 동물 또는 미생물로부터의 이중 나선 RNA, 및 외래 (비내인성) 메틸화 패턴을 갖는 미생물, 식물 또는 동물로부터의 DNA를 포함한다. 일 실시태양에 따르면, 본 발명은 이러한 또는 다른 사료 성분 중 1 이상을 분해하는 1 이상의 면역 스트레스-감소 효소를 포함하는 조성물을 제공한다. 관련된 실시태양에서, 본 발명은 유효량의 이러한 효소를 포함하는 조성물을 동물에 투여하는 것을 포함하는, 동물에서의 면역학적 스트레스의 감소 방법을 제공한다. 이들을 분해하는 면역 스트레스-감소 효소 및 항원의 특이적 예는 하기 표에 나타낸다. 본 발명은 동일 또는 상이한 항원을 분해하는 다른 면역 스트레스-감소 효소를 포함하는 조성물 뿐 아니라, 면역학적 스트레스의 감소에 대한 이러한 다른 효소의 용도를 포함한다.

몇몇 실시태양에 따르면, 본 발명은 2 이상의 면역 스트레스-감소 효소를 포함하는 조성물을 제공한다. 일 실시태양에서, 2 이상의 효소 중 1 이상은 1,4-β-만난아제 또는 1,3-β-글루카나제가 아니다. 또다른 실시태양에서, 조성물은 1,4- β-만난아제 및 1,3-β-글루카나제를 포함한다.

일 특이적 실시태양에서, 조성물은 1,4-β-만난아제 및 약 20 IU 이상의 1,3-β-글루카나제/사료 kg, 예컨대 20 IU 이상/사료 kg, 25 IU 이상/사료 kg, 30 IU 이상/사료 kg, 35 IU 이상/사료 kg, 40 IU 이상/사료 kg, 45 IU 이상/사료 kg, 50 IU 이상/사료 kg, 또는 그 이상의 1,3-β-글루카나제를 포함하는 동물 사료이다.

또다른 특이적 실시태양에서, 조성물은 1,4-β-만난아제 및 약 155,000 IU 이상의 1,3-β-글루카나제/L, 예컨대 155,000 IU 이상/L, 230,000 IU 이상/L, 300,000 IU 이상/L, 380,000 IU 이상/L, 또는 그 이상의 1,3-β-글루카나제를 포함하는 동물 사료 이외의 액체 조성물이다.

또다른 특이적 실시태양에서, 조성물은 1,4-β-만난아제 및 약 300,000 IU 이상의 1,3-β-글루카나제/kg, 예컨대 300,000 IU 이상/kg, 450,000 IU 이상/kg, 600,000 IU 이상/kg, 750,000 IU 이상/kg, 900,000 IU 이상/kg, 또는 그 이상의 1,3-β-글루카나제를 포함하는 동물 사료 이외의 고체 조성물이다.

또다른 실시태양에서, 조성물은 1,4-β-만난아제 및 자일로글루카나제를 포함한다. 또다른 실시태양에서, 조성물은 1,3-β-글루카나제 및 자일로글루카나제를 포함한다. 또다른 실시태양에서, 조성물은 1,4-β-만난아제 및 키티나제를 포함한다. 또다른 실시태양에서, 조성물은 1,3-β-글루카나제 및 키타나제를 포함한다. 또다른 실시태양에서, 조성물은 1,4-β-만난아제 및 아라비난아제를 포함한다. 또다른 실시태양에서, 조성물은 1,3-β-글루카나제 및 아라비난아제를 포함한 다. 또다른 실시태양에서, 조성물은 1,4-β-만난아제, 1,3-β-글루카나제 및 아라비난아제를 포함한다.

이러한 조합은 단지 예시일 뿐이며, 본 발명은 면역 스트레스-감소 효소의 다른 조합을 포함하는 조성물을 포함함이 이해될 것이다. 예를 들어, 본 발명은 상기 기술되고/되거나 하기 논의되는 면역 스트레스-감소 효소 중 임의의 1 이상 및 1,4-β-만난아제를 포함하는 조성물을 포함한다.

사료 성분에 의해 야기되는 면역 스트레스가 언제나 선천성 면역계 반응인 것은 아니다. 임의의 소량 백분율의 유아에게 공급되는 콩 단백질-기재의 인간 우유-대체제는 매우 유해한 면역학적-기재의 창자 반응을 유발하는 것으로 주지되어 있다 ([report from Committee on nutrition, American Academy of Pediatrics, Pediatrics 101 (1): p 148, (1998)] 참조). 때때로 7S 글로불린으로서 지칭되는 콩에 있어 N-연결된 당단백질, 예를 들어 β-콘글리시닌은 ([Ogawa T, et al, Biosci. Biotechnol. Biochem. 59(5):831-833, 1995]; [Burks AW, et al, J Pediatr. Gastroenterol. Nutr. 8(2):195-203, 1989]) 강한 항원일 수 있으며, 항-영양학적 양을 갖는 것으로 인지된다. β-콘글리시닌은 총 단백질에 대한 이의 기여에도 불구하고 영양학적 보충물에 대해 사용되는 콩 단백질 분리 제제로부터 의도적으로 제거된다. 가수분해는 항원성을 파괴시킨다. 나아가, 본원 발명자들은 수탉 사료에 사용되는 풍부한 7S 콩 당단백질 분획물이 또다른 덜 글리코실화된 콩 단백질 분획물보다 덜 잘 소화된다는 것을 발견하였다.

N-연결된 당단백질 중의 탄수화물을 분해하는데 적합한 효소의 예는 α-푸코 시다제 예컨대 α-1,2-푸코시다제 및 α-1,3-1,4-푸코시다제, α-만노시다제 예컨대 α-1,6-만노시다제, α-1,2-만노시다제, 및 α-1,3-만노시다제, β-1,4-갈락토시다제, 엔도-β-N-아세틸글루코스아미니다제 F (엔도 F), 펩티드-N-(N-아세틸-베타-글루코사미닐)아스파라긴 아미다제 F (PNGase F), PNGase A, 엔도-β-N-아세틸글루코스아미니다제 H (엔도 H), 엔도 D, 엔도 C, α-N-아세틸갈라코스아미다제, β-1,3-갈락토시다제, 엔도-N-아실-뉴라미니다제 (엔도 N), α-2,3-뉴라미니다제, α-2,6-뉴라미니다제, α-2,8-뉴라미니다제, β-N-아세틸헥소스아미니다제, 엔도-β-N-갈락토시다제, 엔도-α-N-아세틸글락토스아미니다제, 엔도-α-1,6-D-만난아제, 아라비노갈락타나제, α-갈락토시다제, β-갈락토시다제를 포함한다.

이러한 효소는 당업계에 공지되어 있으며 몇몇은 상업적 공급원으로부터 입수가능하다. 별법으로, 면역 스트레스-감소 효소는 효소, 예컨대 박테리아, 진균 및 효모를 생성하는 미생물로부터 수득될 수 있다. 추가적으로, 효소는 당업계에 공지된 재조합 기술 방법을 사용하여 수득될 수 있는데, 예를 들어 숙주 세포에의 유전자 조작을 통해, 예를 들어, 효소를 코딩하는 유전자의 전사 및 번역을 유도하여 효소를 생성할 수 있다. 상기 기술된 많은 효소의 아미노산 서열은 당업계에 공지되어 있다. 이러한 서열 또는 이러한 서열을 코딩하는 공지된 뉴클레오티드 서열을 사용하여, 당업자는 효소의 재조합 발현에 적합한 유전자를 고안할 수 있다. 추가적으로 또는 별법으로, 공지된 면역 스트레스-감소 효소를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 사용하여 DNA 라이브러리를 탐침하여, 면역 스트레스-감소 효소를 코딩하는 다른 뉴클레오티드 서열을 동정할 수 있다. 당업계에 공지된 바와 같이, 이러한 DNA 라이브러리는 정의된 유기체 또는 유기체 집단으로부터 유래할 수 있거나, 또는 천연 공급원으로부터 수득하여, 배양이 어려운 미생물의 DNA를 밝혀낼 수 있다.

조성물이 효소의 조합을 포함하는 실시태양에서, 효소는 별도의 유기체를 통해 개별적으로 생성될 수 있거나, 또는 2 이상의 효소가 단일 유기체를 통해 생성될 수 있다. 예를 들어, 단일 유기체는 당업계에 공지된 방법을 통해 재조합 과정을 거쳐 2 이상의 효소를 생성할 수 있다.

상기 논의한 바와 같이, 동물의 면역계는 리포폴리사카라이드 (예를 들어, 그람 음성 박테리아와 연관됨), 보존된 단백질 플라겔린를 함유하는 박테리아성 플라겔라(flagella), 펩티도글리칸 (예를 들어, 그람 양성 박테리아와 연관됨), C형 렉틴 L-피콜린에 의해 결합되는 리포테코산 (예를 들어, 그람 양성 박테리아와 연관됨) (Lynch, N. J., et al, J.Immunology 172: 1198-1202, 2004), 포스포릴콜린 (예를 들어, 그람 양성 및 그람 음성 박테리아와 연관됨), DNA (예컨대 CpG 비메틸화 잔기를 갖는 박테리아성 DNA, 문헌 [Van Uden and Raz, J Allergy CHn Immunol. 104(5):902-10, 1999] 참조), 및 이중 나선 RNA 및 3pRNA (Hornung, et. al,. Science 314: 994-997, 2006)를 포함하는 병원성 미생물에 의해 발현되는 많은 다양한 분자 패턴을 인지한다. 이러한 분자에 대한 면역 반응은 혈청 APP의 증가를 포함한다.

다른 병원성 분자 패턴은 N-아세틸글루코사민 함유 분자 및 N-아세틸만노스아민 함유 분자를 포함한다. 모든 콜렌틴의 정확한 결합 특이성 (만노스-결합 렉 틴은 콜렉틴 또는 C형 렉틴임)은 공지되어 있지 않을 수 있으나, 많은 다양한 박테리아성 병원체에 대한 결합은 예를 들어, H-피콜린, 계면활성제-연관 단백질 A (SP-A), 및 콘글루티닌을 통해 관찰된다. N-아세틸글루코사민 및 N-아세틸만노스아민과 같은 화합물은 결합을 억제할 수 있으며, 이에 따라 패턴 인식 결합 특이성의 부분인 것으로 생각된다 (Haurum, J.S., et al, Biochemical J. 293 (3) : 873-878, 1993).

본 발명에 따른 효소 분해를 표적화할 수 있는 다른 항원 및 분자 패턴의 예는 박테리아성 지단백질 (Hacker, H. et al., J. Exper. Med. 192 (4): 595-600, 2000); 콜렉틴 덱틴-1에 의한 β-1,3-글루칸 결합 (Adachi, Y., et al., Infection and Immunity 72 (7): 4159-4171, 2004); 플라겔린 (TLF5에 결합함) (Honko, A.N., 및 Mize1, S.B., Immunol. Res. 33 (1): 83-101, 2005); 푸코실 당포합체; α-Gal-세라마이드; 피브리노겐; 헤파린 술페이트; 황산화 Gal-사카라이드; 키토산, N-아세틸글루코사민; 아시알로당단백질; 및 β-갈락토시드를 포함한다.

스캐빈저 수용체 (SR)라 불리는 수용체 계열은 몇몇 선천성 면역 반응 수용체와 구조적으로 관련되어 있으며, 면역 스트레스를 생성할 수 있다. SR은 아폽토시스 또는 달리 손상된 세포의 재순환 및 제거에 연관된 것으로 생각된다. 대식세포 및 수지상 세포에 의해 발현되는 스캐빈저 수용체 (SR)는 또한 선천성 면역계에 대한 수용체이다. 더욱이, 몇몇 SR은 병원체를 인지하며, 몇몇 선천성 면역 수용체는 아폽토시스에 중요한 것으로 밝혀졌다. 이에 따라 본 발명의 일 실시태양에 따르면, SR의 분자 패턴 결합 표적은 효소 분해에 대한 표적이 된다.

이러한 일 SR 분자 패턴-결합 표적은 산화된 저밀도 지단백질 (LDL)이다. LOX-L라 불리는 수용체 (Peiser, L., et al, Current Opinion in Immunology 14:123-128, 2002) SR-PSOX/CXCL-16 (Fukumoto, N., et al., J. Immunol. 173(3): 1620-1627, 2004) 및 CD36 (Bruni, F., et al, Clin. Appl. Thromb. Hemost. 119(4): 417-28, 2005)은 몇몇 사료, 특히 동물 부산물 분말 예컨대 혈분을 함유하는 사료에 존재할 수 있는 산화된 LDL에 결합한다.

또다른 SR 분자 패턴 결합 표적은 포스파티딜세린 (PS) 및 리소 포스파티딜세린 (lyso PS)이다. PS에 대한 SR은 SR-PSOX/CXCL-16 및 다른 PS 수용체를 포함한다 (Schlegel, R.A. and Williamson, P., Cell Death Differ. 8 (6): 545-548, 2001). 포스파티딜세린 인지질에의 노출은 염증 반응을 유발할 수 있으며, 포스파티딜세린 인지질은 대부분의 사료에 어느 정도의 농도로 존재하는 것으로 생각된다.

히알루로난은 동물의 세포외 체액에 풍부할 뿐 아니라, 예를 들어, 상처 치료에 있어 선천성 면역/스캐빈저 시스템 메카니즘에 의해 인지된다. 예를 들어, 문헌 [Jameson, et al, J. Expt. Medicine 210 (8): 1269-1279, 2005] 참조. 닭 볏은 히알루로난의 상업적 공급원이며, 통상적으로 히알루론산의 정제형으로 사용된다. 따라서 육류 가공의 부산물로부터 제조된 육류분은 히알루로난을 종종 풍부한 양으로 함유할 수 있다. 히알루로난 및 히알루론산을 분해하는 히알루로니다제 (EC 3.2.1.35)는 특히 육류분을 공급받는 동물과 관련에서 본 발명에 따른 면역-스트레스 감소 효소로서 유용하다. 예를 들어, 히알루로니다제는 육류분의 공급과 연관된 면역 스트레스를 감소시키는데 유용하다.

이에 따라 이러한 임의의 분자 패턴를 분해하는 효소는 면역 반응을 억제 또는 감소시키며, 따라서 동물의 면역학적 스트레스를 감소시킨다. 예를 들어, 이중 나선 RNA 및 박테리아성 DNA를 분해하는 DNAase 및 비특이적 뉴클레아제가 공지되어 있다. 비포유동물성 DNA 중 메틸화 CG 잔기에 특이적인 제한 엔도뉴클레아제 효소가 공지되어 있다. 포스포릴콜린을 분해하는 효소는 포스포릴콜린 히드롤리아제, 알킬리성 포스파타제, 산 포스파타제, 포스포릴콜린 에스테라제, 및 포스포릴콜린 포스파타제를 포함한다.

이러한 스트레스 감소는 혈청 APP의 농도를 측정함으로써 확인 및 관리될 수 있으며, 상기 기술된 바와 같이, 감소된 혈청 APP 농도는 감소된 면역학적 스트레스를 반영한다.

상기 나타낸 바와 같이, 조성물은 동물에서 급성기 단백질의 농도를 감소시키는데 유효한 양의 면역 스트레스-감소 효소를 포함한다. 이러한 양은 동물에 따라, 그리고 효소에 따라 다양할 수 있으나, 예를 들어, 상기 기술된 바와 같이 APP 농도를 측정함으로써 당업자에 의해 쉽게 결정될 수 있다. 예를 들어, 동물의 혈청 APP 농도는 효소의 투여 전 및 후에 측정될 수 있거나 또는 치료 동물 및 대조군 동물의 혈청 APP 농도를 비교할 수 있다. 효소의 투여 전 및 후의 혈청 APP 농도를 측정함으로써 유효량을 평가하는 실시태양에서, 후 측정은 최초의 효소 투여 후 약 1 일 이상에서 약 수 일 또는 그 이상에서 행해질 수 있다. 효소의 투여와 연관된 혈청 APP 농도의 감소는 유효량의 효소를 투여하였음을 나타낸다. 하지만, APP 농도는 일반적으로 동물의 후천성 면역 반응이 일어남에 따라 감소되는 것으로 이해되어야만 한다.

몇몇 실시태양에 따르면, 본 발명은 상기 동물에서 양성 급성기 단백질 농도의 감소, 상기 동물에서 음성 급성기 단백질 농도의 증가, 및/또는 동물 성장 능력의 개선에 효과적인 유효량의 1,3-β-글루카나제를 포함하는 조성물을 포함한다. 일 특이적 실시태양에서, 조성물은 약 20 IU 이상의 1,3-β-글루카나제/사료 kg, 예컨대 20 IU 이상/사료 kg, 25 IU 이상/사료 kg, 30 IU 이상/사료 kg, 35 IU 이상/사료 kg, 40 IU 이상/사료 kg, 45 IU 이상/사료 kg, 50 IU 이상/사료 kg, 또는 그 이상의 1,3-β-글루카나제를 포함하는 동물 사료이다. 또다른 특이적 실시태양에서, 조성물은 약 155,000 IU 이상의 1,3-β-글루카나제/L, 예컨대 155,000 IU 이상/L, 230,000 IU 이상/L, 300,000 IU 이상/L, 380,000 IU 이상/L, 또는 그 이상의 1,3-β-글루카나제를 포함하는 동물 사료 이외의 액체 조성물이다. 또다른 특이적 실시태양에서, 조성물은 약 300,000 IU 이상의 1,3-β-글루카나제/kg, 예컨대 300,000 IU 이상/kg, 450,000 IU 이상/kg, 600,000 IU 이상/kg, 750,000 IU 이상/kg, 900,000 IU 이상/kg, 또는 그 이상의 1,3-β-글루카나제를 포함하는 동물 사료 이외의 고체 조성물이다.

효소가 1,3-β-글루카나제를 포함하는 몇몇 동물 사료 실시태양에서, 효소는 약 100,000 IU 이상/사료 ton의 양으로 존재할 수 있다.

이러한 양은 상업적 사료 효소 첨가물 및 상업적으로 입수가능한 사료의 1,3-β-글루카나제 함량보다 훨씬 많은 것인데, 본 발명자들은 이러한 상업품을 분 석하여, 많아야 약 10,000 IU/사료 ton, 약 72,500 IU/비사료 액체 조성물 L, 또는 약 150,000 IU/비사료 고체 조성물 kg을 제공하는 것임을 밝혔다. 본 발명자들은 10,000 IU/사료 ton의 1,3-β-글루카나제가 APP를 감소시키는데 유효할 것이라고 생각하지 않으며, 이를 실험적으로 확인하였다. 본 발명자들은 또한 상업적 제품 예컨대 아비자임(Avizyme) (Danisco A/S, Langebrogade 1, Dk-1001, Copenhagen, Denmark) 및 로보비오(Rovobio) (Adisseo France SAS, 42, Avenue Aristide Briand, BPlOO, 92164 Antony Cedex) 및 표준량의 β-1,3-1,4-글루카나제를 포함하는 상업적 사료 (Brewzyme BG plus, Dyadic International, 140 Intracoastal Pointe Drive, Suite 404, Jupiter, Florida 33477-5094), 자일라나제 (Multifect XL, Genencor International, Inc., 925 Page Mill Road, Palo Alto, CA), PI-PLC (ChemGen Corp., 211 Perry Parkway, Gaithersburg, MD) 및 아밀라제 (Amylase FRED, Genencor International, Inc., 925 Page Mill Road, Palo Alto, CA)가 APP를 감소시키지 않음을 실험적으로 결정하였다. 하기 실시예 3 및 도 3 참조. 1,3-β-글루카나제 활성이 존재하는 경우에, 이는 상기 나타낸 적은 범위내이며, AGP를 감소시키는데 유효하지 않다.

또다른 실시태양에서, 면역 스트레스-감소 효소는 효소에 의해 분해되는 항원 또는 분자 패턴 함유 화합물을 또한 포함하는 조성물의 성분으로서 제공된다. 예를 들어, 본 발명은 β-1,3-글루칸 및 1,3-β-글루카나제를 포함하는 동물 사료; DNA 또는 이중 나선 RNA 및 DNAase 또는 비특이적 뉴클레아제를 포함하는 동물 사료; N-연결된 당단백질 및 엔도- 또는 엑소-카르보히드라제, N-글리카나제, 또는 PNGase, 또는 상기 기술된 임의의 다른 효소를 포함하는 동물 사료를 포함한다. 항원 및 면역 스트레스-감소 효소의 다른 적합한 조합은 당업자에게 명백할 것이며, 본 발명에 포함된다.

이러한 실시태양에서, 혈청 APP 농도는 조성물이 투여되는 한 높게 유지될 것으로 기대된다. 따라서, 효소 투여 전 및 후의 혈청 APP 농도를 측정함으로써 면역 스트레스-감소 효소의 유효량을 평가하는 경우에, 후 측정은 효소의 최초 투여 후 수 일 또는 수 주에 행해질 수 있다.

상기 나타낸 바와 같이, 본 발명은 동물에서 급성기 단백질의 농도를 감소시키는데 유효량의 면역 스트레스-감소 효소를 포함하는 조성물을 동물에 투여하는 것을 포함하는, 동물의 면역 스트레스 감소 방법을 포함한다. 조성물은 경구 조성물, 예컨대 동물 사료, 동물 사료 이외의 액체 조성물, 또는 동물 사료 이외의 고체 조성물을 포함하는 상기 기술된 임의의 조성물일 수 있다. 동물은 인간을 포함하는 임의의 동물일 수 있으며, 건강한 동물 또는 감염 또는 다른 질병 또는 상태를 앓고 있는 동물일 수 있다.

본 발명은 또한 면역 스트레스-감소 효소를 포함하는 조성물을 동물에 투여하는 것을 포함하는, 동물 성장 능력 개선 방법을 포함한다. 몇몇 실시태양에서, 조성물은 동물 성장 능력 개선에 유효한 양의 면역 스트레스-감소 효소를 포함한다. 조성물은 경구 조성물, 동물 사료, 동물 사료 이외의 액체 조성물, 또는 동물 사료 이외의 고체 조성물을 포함하는 상기 기술된 임의의 조성물일 수 있다. 동물은 인간을 포함하는 임의의 동물일 수 있으며, 건강한 동물 또는 감염 또는 다른 질병 또는 상태를 앓고 있는 동물일 수 있다.

일 실시태양에서, 효소는 동물 사료에 사용되는 식물에 의해 발현된다. 예를 들어, 옥수수는 유전자 조작되어 면역 스트레스-감소 효소를 발현할 수 있으며, 생성된 유전자 변형 옥수수 제품은 사료에 사용될 수 있다.

일 실시태양에서, 동물에 면역 스트레스-감소 효소를 투여하며, 또한 항원 (예를 들어, 효소에 의해 분해되는 패턴 함유 분자)을 투여한다. 효소 및 항원은 동일 또는 상이한 조성물의 일부로서 별도로 또는 동시에 투여될 수 있다. 일 실시태양에서, 동물에 항원 또는 패턴 함유 분자를 포함하는 사료를 투여하며, 별도로 면역 스트레스-감소 효소를 포함하는 조성물을 투여한다. 또다른 실시태양에서, 동물에 항원 또는 패턴 함유 분자를 포함하는 사료 및 효소를 포함하는 사료 보충물을 투여한다. 또다른 실시태양에서, 동물에 항원 및 효소 둘 다를 포함하는 사료를 투여한다.

본 발명의 또다른 측면은 병원성 미생물에 의해 야기되는 감염의 예방 및 치료에 의해 면역학적 스트레스를 감소시키기 위한 조성물 및 방법을 제공한다. 때때로 동물은 병원성 미생물 (예를 들어, 박테리아, 바이러스, 진균 및 원생동물)을 포함하는 물 또는 동물 사료와 같은 조성물을 섭취하거나, 또는 다른 경로로 이러한 병원체에 노출된다. 본 발명은 감염을 감소시켜 감염에 반응하는 동물에서 발현되는 APP의 농도를 감소시키기에 유효한 양의, 병원성 미생물의 주요 성분(즉, "병원성 성분")을 분해하는 효소를 포함하는 조성물을 제공한다. 조성물은 병원체에 의해 직접 야기되는 감염을 예방 또는 최소화시킴으로써 면역학적 스트레스를 감소시키는 과정에 의한 면역학적 스트레스의 감소에 유용하다. 이러한 실시태양의 일 특정 측면에서, 본 발명은 소화관 감염의 예방 및 치료 방법을 제공한다.

병원체 성분을 분해함으로써, 효소는 또한 감염을 치료 또는 예방할 수 있다. 즉, 병원성 성분을 분해하기 때문에, 병원체는 이의 숙주의 감염능을 잃게 될 것이다. 실제 감염의 이러한 감소는 상기 기술된 것 이외의 다양한 메카니즘을 통해 면역 스트레스를 감소시키고 혈청 APP를 감소시키는 결과를 가져올 것이지만, 실제로 관찰되는 APP 감소의 면에서는 구별할 수 없을 수 있다. 효소적 처리가 양성 결과를 가져올 수 있는 최소한의 3개의 시나리오가 있다. 효소에 의해 분해된 병원체 분자 구조가 병원체가 숙주 세포에 결합하는 단계, 감염에 요구되는 제1 단계, 또는 성공적 감염에 필요한 임의의 다른 주요 단계와 관련있는 경우, 이 때 효소적 처리가 도움이 될 수 있다. 별법으로, 숙주 세포에의 결합 구조는 변형될 수 있다. 예를 들어 많은 박테리아성 및 원생동물성 병원체는 진핵생물성 숙주 세포 표면 상의 프로테오글리칸, 특히 황산화 프로테오글리칸과 상호작용하는 것으로 밝혀졌다(Flekenstein, J.M. et al, Infection and Immunity 70 (3): 1530-1537, 2002). 헤파리나제, 및 N-아세틸글루코사민-4-술파타제, 또는 아를리술파타제와 같은 효소의 적용은 상호작용 및 감염을 감소시킬 수 있다.

제2 시나리오에서, 분해된 병원체 분자 구조는 표적 세포의 대사성 기능을 방해하는 독소일 수 있다. 제3 시나리오에서, 효소에 의해 분해되는 병원성 성분은 숙주 면역 반응을 회피하는 병원체의 메카니즘과 연관되어 있을 수 있다. 수많은 면역 반응 회피 메카니즘은 숙주 엘(ell) 외부 모양을 모방하도록 병원체를 진 화시켜 면역 반응, 예를 들어 보체 반응 또는 아폽토시스를 억제한다. APP의 보다 높은 농도는 감염과 연관되어 있는데, 감염의 감소 또는 예방은 또한 혈청 APP를 측정함으로써 평가될 수 있다.

병원성 성분을 분해하는 효소, 예컨대 상기 기술된 것들은 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 박테리오파지에서 유래된 엔도시알리다제는 박테리아 표면 상의 PSA (폴리시알산) 캡슐을 분해함으로써 래트의 대장균 KI 전신성 감염의 치사성을 예방하는 것으로 밝혀져 있다. 캡슐화된 탄수화물을 분해하는 것은 시험관내에서는 대장균의 생존성에 영향을 주지 못하지만, 생체내에서 캡슐의 손실은 인지되어 숙주 면역계에 의한 감염을 조절할 수 있게 하여, 치사성을 없애준다 (Mushtaq, N., et al. Antimicrobial Agents and Chem다른apy 48(5): 1503-1508, 2004). PSA 캡슐은 대장균 표면이 숙주 세포처럼 보이게 하여, 숙주 선천성 면역 반응을 회피하게 해준다. 본 발명에 유용한 또다른 공지된 효소는 헤파리나제 I (Neutralase, Ibex Technologies, Canada)이다. 많은 효소는 상업적 공급원으로부터 입수가능하거나 또는 효소를 생성하는 미생물, 예컨대 박테리아, 및 효모를 포함하는 진균을 통해 수득할 수 있거나, 또는 상기 논의한 바와 같이 재조합적으로 제조될 수 있다.

바람직한 효소는 효소를 코딩하는 유전자가 공지된 경우 재조합 DNA 기법을 통해 제조될 수 있다. 신속한 DNA 서열분석 방법론의 진보는 단백질 및 이들의 유전자 코딩 서열의 큰 공중 데이터베이스, 예컨대 NCBI Genbank를 생성시켰다. 예를 들어, 454 라이프 사이언스 (454 Life Sciences, 20 Commercial Street, Branford, CT 06405)로부터의 신속한 서열분석 기술을 사용하여, 통상적 박테리아성 게놈을 4 시간 안에 서열화시킬 수 있다. 신규한 원하는 효소 게놈에 대해 이전에 공지되지 않은 유전자는 예를 들어 상업적 또는 공중 데이터베이스에 기술된 효소의 동일한 형태 또는 유사한 형태로부터의 사전에 확인된 코딩 서열을 사용하고, 블라스트(Blast)와 같은 쉽게 입수가능한 컴퓨터 프로그램을 사용함으로써, 게놈의 탐침을 통해 수득될 수 있다. 당업자는 유전자-코딩 영역의 공지된 서열 및 다른 성질에 대해 상동성의 한계 농도를 갖는 게놈의 DNA를 확인할 수 있으며, 이 때 예를 들어, 중합효소 연쇄 반응 (PCR) 기술을 사용하여 유전자를 분리 및 증폭시킬 수 있다. 이 때 유전자는 숙주에서 발현될 수 있으며, 이의 원하는 단백질 효소적 성질을 확인할 수 있다.

원하는 효소 활성이 사전에 공지된 것이 아닌 경우, 이 때 이는 기질 상에서의 성장에 대해 선택적인 표준 미생물학 증균(enrichment) 기법을 사용하여 확인할 수 있다. 기질을 단독 탄소 또는 질소 공급원으로 사용하는 미생물은 표적 화합물을 분해할 수 있는 효소를 발현하여야만 한다. 경제적인 제조법을 개발하기 위해, 미생물 제조에 관한 고전적인 돌연변이/선택 또는 증균 방법을 사용하거나, 또는 당업계에 주지된 재조합 DNA 발현 방법을 통해 이러한 효소의 제조를 개선시키는 것을 선택할 수 있다.

병원성 미생물을 분해하는 면역 스트레스-감소 효소를 포함하는 조성물은 상기 기술된 바와 같이 동물의 경구 투여에 적합한 조성물을 포함하는, 동물에의 투여에 적합한 임의의 조성물일 수 있다. 상기 나타낸 바와 같이, 조성물은 동물에 서 양성 급성기 단백질 농도의 감소 (또는 음성 급성기 단백질 농도의 증가) 및/또는 동물 성장 능력의 개선에 유효한 양의 효소를 포함할 수 있다. 이러한 양은 동물에 따라, 그리고 효소에 따라 다양할 수 있으나, 예를 들어, 상기 기술되었으며, 당업계에 공지된 바와 같이, APP 농도를 측정하고/하거나 동물 성장 능력을 관리함으로써 당업자에 의해 쉽게 결정될 수 있다.

일 실시태양에서, 병원성 항원을 표적화하는 면역 스트레스-감소 효소는 동물 사료의 성분으로서 제공된다. 이러한 실시태양의 일례에서, 효소의 양은 약 100,000 IU 이상/사료 ton이다.

또다른 실시태양에서, 원성 항원을 표적화하는 면역 스트레스-감소 효소는 병원성 항원 또한 포함하는 조성물의 성분으로서 제공된다. 본 발명은 (A) 항원 예컨대 리포폴리사카라이드, 펩티도글리칸, 리포테코산, 포스포릴콜린, 이중 나선 RNA 및 DNA를 발현하는 병원성 미생물 및 (B) 항원 분해 효소를 포함하는 동물 사료를 포함한다. 병원성 유기체는 제조 상황에서 동물의 빽빽한 성장에 의해 야기되는 비위생적인 상태의 고유한 성질에 의해 사료에서 발견될 수 있다.

상기 나타낸 바와 같이, 본 발명은 면역 스트레스-감소 효소를 포함하는 조성물을 동물에 투여하는 것을 포함하는, 동물의 면역 스트레스 감소 및/또는 동물 성장 능력의 개선 방법을 포함한다. 일 실시태양에서, 동물에 병원성 항원을 분해하는 면역 스트레스-감소 효소를 투여하고, 또한 병원성 항원을 투여한다. 효소 및 항원을 동일 또는 상이한 조성물의 부분으로서 별도로 또는 동시에 투여할 수 있다. 일 실시태양에서, 동물에 항원을 포함하는 사료를 투여하며, 별도로 효소를 포함하는 조성물을 투여한다. 또다른 실시태양에서, 동물에 항원을 포함하는 사료 및 효소를 포함하는 사료 보충물을 포함한다. 또다른 실시태양에서, 동물에 항원 및 효소 둘 다를 포함하는 사료를 투여한다.

다음의 실시예는 본 발명을 더욱 예시하지만, 본 발명은 특이적으로 예시된 실시태양에 제한되지 않는다.

실시예 1

하기 상세하게 설명하는 바와 같이, 헤미셀룰라제 (엔도-1,4-β-만난아제)를 포함하는 동물 사료를 제조하여 닭에게 투여하고 AGP 농도를 측정하였다.

총 4000 마리의 1 일 연령 수컷 Cobb X Cobb 병아리를 무작위로 8개의 실험 처리군으로 배당하고, 각 처리군을 10개로 나누었다(replicate).

실험적 고안: 8 처리군

총 우리 수: 80

총 처리군 수: 8

우리 당 새의 수: 50

처리군 당 우리 수: 10

처리군 당 새의 수: 500

2 종의 8개의 처리군은 본 발명에 따른 스트레스-감소 효소를 포함하였다: 처리군 3 (기초 식이물에 약 100 MU/ton으로 적용된 바실러스 렌투스(B. lentus) 발효물의 증발된 전세포 브로쓰(broth) 형태의 만난아제) 및 처리군 6 (기초 식이 물에 약 30 MU/ton으로 적용된 바실러스 렌투스 발효물 브로쓰의 무세포 원심분리된 상등액 형태의 만난아제). 처리군 8은 어떠한 효소도 없는 대조군이었다. (1 MU = 4000 IU)

기초 분말 사료 뱃치를 8개의 부분으로 균등하게 나누고, 각각에 적절량의 시험 물질을 분무하였다. 초기물질(Starter) 및 성장물질(Grower) 사료는 90 g/ton 코본(Cobon) (이온운반체 형태의 항콕시듐 약물) 및 50 g/ton BMD (항생제)를 함유하였다. 최후물질(Finisher) 사료에는 약물을 넣지 않았다.

초기물질 식이물을 모든 새에 1 일부터 21 일까지 제공하였고, 성장물질 식이물을 22-35 일에, 최후물질 식이물을 36-42 일에 제공하였다. 식이물 및 물을 임의로 제공하였다. 모든 공급 기간 동안 식이물은 부스러기/펠렛으로서 새에게 제공되었다. 음용수로서 수돗물을 사용하였고 내부 물 시스템 네트워크를 통해 공급하였다.

처리군 당 500 마리 중 총 20 마리의 새에 대해 무게를 단 후, 42 일 째에 혈액 분석을 위해 처리군 3, 6 및 8의 10개의 우리 각각으로부터의 2 마리의 새를 무작위로 선택하였다. 시료를 항-응고제 헤파린을 함유하는 혈액 수집 튜브 중의 얼음 상에 모았고, 혈장을 원심분리를 통해 얻었다.

카르디오테크 서비스 인크.(Cardiotech Services, Inc., Louisville, KY)로부터의 면역확산 기재의 분석 키트를 사용하여 혈액 혈장 시료를 닭 α-1-산 당단백질에 대해 분석하였다. 2 마리의 새/우리로부터 얻은 혈청 시료를 시험 플레이트 (5 μL/웰)에 첨가하고, 몇몇 웰에는 1000 μg/mL 이하의 농도 범위로 표준 순 수 AGP를 첨가하였다. 0.1 mm 지름에 가장 가까운 침전물 고리 측정 스케일을 이용하여 침전물 고리를 측정하였다.

도 1에 도시한 바와 같이, 데이터에 대한 최선의 곡선 피팅을 제공하기 위해 다항식을 사용하여 혈장 시료 중 AGP의 농도를 신속하게 계산하였다.

모든 회수된 닭 혈청 시료에 대한 침전물 고리 지름의 측정값 및 각각의 새에 대한 AGP 농도 계산치를 하기 표에 나타내었다. 평균적으로 만난아제를 먹은 새는 대조군 새와 비교하여 평균 AGP 농도가 매우 통계적으로 유의하게 감소하였다.

실시예 2

헤미셀룰라제 (엔도-1,4-β-만난아제)를 이용하여 또다른 실험을 수행하였다. 이 실험에서, 닭 (각각 10 개의 우리, 우리 당 50 마리의 새를 가짐)의 군에 4개의 식이물 중 1개를 먹였다.

처리군 1 (대조군): 대조군 제제 및 갈색 식품 염료를 갖는 35% 소르비톨을 100 ml/사료 ton으로 적용하여 분무 후-펠렛화(sprayed post-pelleting)한 BMD 항생제를 포함하는 사료.

처리군 2 (대조군): 갈색 식품 염료를 갖는 35% 소르비톨을 포함하는 대조군 제제를 100 ml/사료 ton으로 적용하여 분무 후-펠렛화한 BMD가 없는 사료.

처리군 3: 바실러스 렌투스로부터 유래된 헤미셀룰라제 (엔도-1,4-β-만난아제)를 포함하는 제제를 100 ml/사료 ton으로 적용하여 분무 후-펠렛화한 사료.

처리군 4: 바실러스 렌투스로부터 유래된 헤미셀룰라제 (엔도-1,4-β-만난아제)를 포함하는 분말 조성물을 454 g의 조성물/사료 ton으로 첨가하여 (펠렛화 전에 혼합기에 첨가됨) 100 MU/사료 ton을 제공하도록 제제화된 사료. (1 MU = 4000 IU)

닭의 연령은 실험 시작시 1 일이었다.

식이물을 임의로 제공하였다. 다음의 조성을 갖는 초기물질 (0-21 일), 성장물질 (21-35 일) 및 최후물질 (35-42 일) 사료를 기초 사료로서 사용하였다.

21 일에, 우리(군 당 30개) 당 3 마리의 새로부터 약 3 ml의 혈액을 모았다. 혈액을 헤파린화된 튜브에 두고 약하게 혼합시켰다. 튜브를 천천히 원심분리시킨 후, 혈청을 제거하였다. 혈청 시료를 캡이 있는 튜브에 두고 우리 번호를 표지하 였다. 혈청을 실시예 1에 기술된 바와 같은 후속하는 AGP 분석을 위해 냉동시켰다. 닭 αl 산 당단백질의 정량화에 사용된 면역확산 고리는 쉽게 측정되었고, 재현성이 높았으며, 4% 미만의 변동 계수를 나타내었다.

처리군 당 30 마리 새의 21 일째의 평균 결과를 하기 표에 나타내었고 도 2에 도시하였다. 항생제 (BMD)가 없는 식이물은 혈장 AGP 농도를 매우 상당히 증가시켰음을 알 수 있다(처리군 1 및 처리군 2 비교). 헤미셀룰라제 (엔도-1,4-β-만난아제) 제제를 BMD이 없는 식이물에 첨가한 것은 (처리군 3 및 4) AGP를 항생제 사용시 나타난 농도로 복원시켰으며, 이는 면역학적 스트레스가 상당히 감소되었음을 나타낸다.

닭의 성장 능력 또한 평가하였는데, 이 결과를 하기 표에 요약하였다.

이에 따라 사료 전환율 및 체중 조정된 사료 전환율 모두는 β-만난아제를 공급받은 닭에서 21 일째에 통계적 유의성 하에 개선되었다. 이는 혈청 AGP의 감소가 상당한 실제 동물 능력으로 전환될 수 있음을 나타낸다.

실시예 3

동물 사료에 공통적으로 사용된 다른 효소가 AGP에 작용할 수 있는 능력에 대해 평가하였다. 상업적 유형의 닭 초기물질 사료(ration) (저 대사성 에너지)를 미국에서 공통으로 사용되는 사료와 배합하였다. 이러한 사료 (곤죽형(mash) 또는 부스러기형)를 시험 21 일까지 병아리에 임의로 공급하였다. 이러한 기초 초기물질 사료로부터 실험 처리군 사료를 제조하였다. 처리군 사료를 혼합하여 각각의 시험군의 균일한 분배를 보장하였다.

사료 및 물을 시험 동안 임의로 이용가능하게 하였다. 15 일째, 새 당 약 30,000 아이메리아 아세불리나(E. acervulina)의 난모세포, 새 당 2,500 아이메리아 맥시마(E. maxima)의 난모세포, 및 새 당 25,000 아이메리아 테넬라(E. tenella)의 난모세포를 함유하는 혼합된 접종원을 처리군 17, 18, 19, 20, 및 21의 새에 경구적으로 접종시켰다. 콕시듐(Coccidial) 난모세포 접종 과정은 SPR SOP: INl.002에 기술되어 있다.

우리 체중 증가, 사료 소비, 및 사료 전환율의 평균을 측정하였다. 그 결과를 하기 나타내었다. 시료 17을 제공받은 동물만이 감염되었다.

본 발명자들은 표준량의 아밀라제, 1,3-글루카나제, 1,4-글루카나제, 자일라나제 및 PI-PLC를 포함하는 상업적 사료는 AGP 농도를 감소시키지 못하였음을 발견하였다. 실제, 헤미셀룰라제 (엔도-1,4-β-만난아제)만이 AGP 농도에 상당한 작용을 나타내었다. 추가적으로, 처리군 1 및 17을 포함하는 것은 AGP가 닭의 고 반응성 APP임을 명백히 보여주는데, 이는 감염에 의해 AGP 농도가 82 μg/mZ로 증가되었기 때문이다. 도 3 참조.

실시예 4

1,3-β-글루칸을 포함하는 시험 동물 사료를 400,000 IU (100 켐젠 MU)/사료 ton 농도의 1,3-β-글루카나제를 포함하도록 제제화하였다. 시험 동물 사료를 시험 닭에 투여하였고, 대조군 닭에는 1,3-β-글루카나제가 없는 동일한 동물 사료 (1,3-β-글루칸 포함)를 투여하였다. 이 요법의 21 일 및 42 일째에, 혈액 혈청 AGP 농도를 상기 기술된 바와 같이 평가하였다. 효소-제제화된 동물 사료를 투여 받은 닭은 대조군 동물보다 상당히 낮은 AGP 농도를 가졌다. 시험 닭은 또한 대조군 닭과 비교하여 높은 사료 효율 및 체중 증가의 개선을 나타내었다.

실시예 5

박테리아성 DNA의 공급원 (예를 들어 Biolys ® Lysine 또는 세포 생성물을 함유하는 다른 발효물 제품)을 포함하는 시험 동물 사료를 공지된 가장 활성이 있는 비특이적 뉴클레아제 중 하나인 사이노박테리아 아나배나 종(Cyanobacterium Anabaena sp.) 7120 (NucA)로부터 유래된 비특이적 뉴클레아제를 포함하도록 제제화하였다 (Meiss, G. et al, Eur. J. Biochem. 251(3): 924-934, 1998). 효소를 1 X 10⁷ 쿠니츠 유닛(Kunitz Units) 효소/사료 kg 또는 약 1 mg (순수 기재)/사료 kg의 농도로 첨가하였다. 시험 동물 사료를 시험 닭에 투여하였고, 대조군 닭에는 비특이적 뉴클레아제가 없는 동일한 동물 사료 (박테리아성 DNA 포함)를 투여하였다. 이 요법의 21 일 또는 42 일째에, 혈액 혈청 AGP 농도를 상기 기술된 바와 같이 평가하였다. 효소-제제화된 동물 사료를 투여받은 닭은 대조군 동물보다 상당히 낮은 AGP 농도를 가졌다.

실시예 6

육류 및 골분, 혈분 또는 다른 동물 유래된 부산물을 포함하는 시험 동물 사료를 400,000 IU/사료 ton 농도의 포스파티딜세린 데카르복실라제를 포함하도록 제제화하였다. 시험 동물 사료를 시험 닭에 투여하였고, 대조군 닭에는 포스파티딜세린 데카르복실라제가 없는 동일한 동물 사료를 투여하였다. 이 요법의 21 일 또 는 42 일째에, 혈액 혈청 AGP 농도를 상기 기술된 바와 같이 평가하였다. 효소-제제화된 동물 사료를 투여받은 닭은 대조군 동물보다 상당히 낮은 AGP 농도를 가졌다.

실시예 7

시험 동물 사료 대두분 또는 다른 식물 유래된 분말을 각각 400,000 IU/사료 ton 농도의 바실러스 렌투스로부터 유래된 α-만난아제 및/또는 1,3-β-글루카나제 효소를 포함하도록 제제화하였다. 시험 동물 사료를 시험 닭에 투여하였고, 대조군 닭에는 α-만난아제 또는 1,3-β-글루카나제가 없는 동일한 동물 사료를 투여하였다. 이 요법의 21 일 및 42 일째에, 혈액 혈청 AGP 농도를 상기 기술된 바와 같이 평가하였다. 효소-제제화된 동물 사료를 투여받은 닭은 대조군 동물보다 상당히 낮은 AGP 농도를 가졌다.

실시예 8

본 실시예에서, 사료에 첨가된 헤미셀(Hemicell)® 만난아제 (통상적인 옥수수-대두 식이물)는 칠면조 혈청에서 α1 산 당단백질 (AGP)의 감소를 나타내었고, 생장 성장 능력의 개선 또한 나타내었다. 실험은 11 마리 수컷 칠면조 (초기 배치)의 48개의 우리로 구성되었다. 6개의 처리군을 8 블록으로 나누었고(replicate), 6개의 우리 각각의 불록내에서 무작위화시켰다.

새의 수/처리군: 88

복제(Reps) 수/처리군: 8

총 처리군 수: 6

총 우리 수: 48

총 새의 수: 528

본 발명에 따른 스트레스-감소 효소를 포함하는 하나의 처리군인, 처리군 1 (100 MU/사료 ton을 갖는 상업적 헤미셀®)을 AGP에 대해 분석하였다. (1 MU = 4000 IU) 처리군 2는 첨가된 효소가 없는 대조군 시료였다.

처리군 간에 기초 사료의 균일한 분배를 보장하도록 사료를 혼합하였다. 처리군 간의 시험 효소의 균일한 분배를 보장하고 유사한 사료 상태를 보장하도록 모든 효소를 혼합 (분무) 시켰다. 각각의 시간에 대한 처리군 사료를 제조하였는데, 각 처리군 사료의 초기, 중반, 및 마지막으로부터의 시료를 혼합하여 복합 시료를 형성하였다. 각 처리군에 대한 복합재로부터 하나의 시료를 추출하여 효소 농도를 확인하였다.

본 연구에서 처리군 1 및 2에 공급된 칠면조 식이물은 하기 표에서 상세하게 기술하였다. 표는 성분의 조성, 영양물의 농도의 계산치 및 환류된(returned) 사료에서 몇몇 영양물의 최종 측정치를 보여준다. 본 식이물은 상업적 칠면조 성장 작용에 사용될 수 있는 것을 나타내며, 이에 따라 식이물은 20-주 기간을 통해 수차례 조정된다. 식이물 조성을 6, 9, 12, 15 및 18 주에 변화시켰다.

각각의 기간에서의 식이물 조성은 처리군 1 및 2에 대해 약간 상이하였다. 헤미셀® 만난아제가 사료의 유효한 에너지 함량을 증가시키는 작용을 갖는다는 것은 주지되어 있다 (미국 특허 6,162,473 참조). 이러한 이유로, 본 연구의 목적에 있어 처리군 1 및 2 간의 성장 차이를 최소화하기 위해, 처리군 1의 식이물을 처리 군 2의 식이물보다 적은 칼로리를 갖도록 제제화하였다.

당단백질 측정:

처리군 1, 2, 및 5로부터 무작위로 선택된 우리 당 4 마리의 새로부터 시험의 마지막에 혈액을 얻었다. 혈액을 EDTA 항응고제를 함유하는 튜브에 모으고, 혼합시키고 원심분리시켜 전세포를 침전시켰다.

카디오테크 서비스 (Cardiotech Services, Louisville, KY)로부터 칠면조 AGP 시험 플레이트를 얻었다. AGP 시험은 면역확산에 기초한 시험이다. 시험물 또는 혈청 시료의 동일한 부피를 제조사가 추천한 바대로 면역확산 플레이트 웰에 첨가한 후, 실온에서 2 일 배양하여, 생성된 면역침전물 고리의 지름을 측정하였다.

키트에 제공된 정제된 칠면조 AGP 표준물의 시료를 몇 가지 농도에서 시험하여 도 4에 나타낸 바와 같은 표준 곡선을 만들었다. 표준물로부터 얻은 곡선 피팅 다항식을 이용하여 시험 시료에서의 칠면조 혈장 AGP 농도를 계산하였다.

효소 처리된 군에 대한 평균 혈장 AGP는 미처리된 대조군보다 상당히 낮았다. 이러한 분석에 있어서, 하나의 이상치를 각각의 군의 분석으로부터 제거하였다. 이들은 상처 또는 감염에 의해 특정량의 스트레스를 겪은 새일 수 있다. 하기 처리군 1 (만난아제) vs. 처리군 2에 나타낸 바와 같이, 효소 공급에 의해 야기된 AGP의 감소는 새의 생장 능력의 개선과 통계적으로 유의하게 상호관계가 있었다.

만난아제를 갖는 사료를 투여받은 새는 평균 체중이 3.7%만큼 보다 증가하였고, 사료 전환율이 2.3%만큼 감소하였으며, 체중 균일성의 CV (변동 계수 = 표준 편차/평균)가 감소하였다. 감소된 AGP 혈청 농도에 의해 나타내는 바와 같은 면역 스트레스의 감소는 성장 개선의 몇몇 측정과 상호관계가 있었다.

실시예 9

본 실시예에서, 바실러스 렌투스로부터의 1,4-β-만난아제, 바실러스 렌투스로부터의 1,3-β-글루카나제, 및 두 효소의 조합을 사료 (통상적인 옥수수-대두 식이물)에 첨가하였다. 각각의 효소 처리군은 6 주 연령의 니콜라스(Nicholas) 700 마리의 암컷 칠면조에서의 생장 성장 능력을 개선시켰는데, 조합에 의해 달성된 결과는 단지 하나의 효소를 사용한 처리군에 의해 달성된 결과보다 예상치 못하게 높았다.

본 실험은 40 마리의 암컷 칠면조의 80 개의 우리를 사용하였다. 처리군을 10개의 블록으로 나누었고(replicate), 각각의 블록을 무작위로 8개의 처리군 (7 개의 효소 처리군 및 1 개의 음성 대조군)으로 나누었다.

처리군 3은 본 발명에 따른 면역 스트레스-감소 효소인 1,4-β-만난아제를 100 MU/사료 ton 포함하는 조성물을 사용하였다. 처리군 6 또한 본 발명에 따른 면역 스트레스-감소 효소인 1,3-β-글루카나제를 60 MU/사료 ton 포함하는 조성물을 사용하였다. 처리군 8은 100 MU/사료의 1,4-β-만난아제 및 60 MU/사료 ton의 1,3-β-글루카나제를 포함하는, 본 발명에 따른 조합 조성물을 사용하였다. 처리군 1은 첨가된 효소가 없는 대조군 사료였다. (1 MU = 4000 IU)

처리군 간에 기초 사료의 균일한 분배를 보장하도록 사료를 혼합하였다. 처리군 간의 시험 효소의 균일한 분배를 보장하고 유사한 사료 상태를 보장하도록 모 든 효소를 혼합 (분무) 시켰다. 각각의 시간에 대한 처리군 사료를 제조하였는데, 각 처리군 사료의 초기, 중반, 및 마지막으로부터의 시료를 혼합하여 복합 시료를 형성하였다. 각 처리군에 대한 복합재로부터 하나의 시료를 추출하여 효소 농도를 확인하였다.

본 연구에서 공급된 칠면조 식이물은 통상적 상업적 칠면조 사료였다. 표는 성분의 조성, 영양물의 농도의 계산치 및 되돌아온 사료에서 몇몇 영양물의 최종 측정치를 보여준다. 본 식이물은 상업적 칠면조 성장 작용에 사용될 수 있는 것을 나타내며, 이에 따라 식이물은 3 주 후 조정하였다. 처리군 1, 3, 6 및 8에 대한 성장 결과를 하기 표에 나타내었다.

각주 1: 사료 전환율은 보정된 치사율이다.

각주 2: 각 처리군에 대해 체중-조정된 사료 전환율을 다음과 같이 계산하였 다:

(a) 처리군의 평균 생체중에서 전체 시험의 평균 생체중을 빼서 양 A를 얻었다.

(b) 양 A를 6으로 나누어 양 B를 얻었다.

(c) 사료 전환율로부터 양 B를 빼서 처리군에 대해 체중-조정된 사료 전환율을 얻었다.

나타난 통계는 LSD 시험에 관한 것이고, P < 0.05이다.

처리군 1 (대조군)과 비교하여 처리군 3 (1,4-β-만난아제를 갖는 사료)을 투여받은 칠면조 암탉은 수치적으로 개선된 평균 생체중 및 수치적으로 개선된 (감소된) 사료 전환율을 가졌다. 유사하게, 처리군 6 (1,3-β-글루카나제를 갖는 사료)을 투여받은 칠면조 암탉은 통계적으로 유의한 개선된 평균 생체중 및 통계적으로 유의한 개선된 (감소된) 사료 전환율을 가졌다.

놀랍게도, 처리군 8 (1,4-β-만난아제 및 1,3-β-글루카나제의 조합을 갖는 사료)을 투여받은 칠면조 암탉은 특히 매우 통계적으로 유의한 개선된 평균 생체중 및 특히 매우 통계적으로 유의한 개선된 (감소된) 사료 전환율을 가졌다. 처리군 8을 사용하여 관찰된 결과는 개별적으로 투여된 2개의 효소의 첨가 효과에 의해 설명될 수 있는 것보다 큰 것이었다. 따라서 1,4-β-만난아제 및 1,3-β-글루카나제를 포함하는 조합 처리군은 성장 능력에 있어 예상치못한 큰 개선을 나타내었다.

실시예 10

본 실시예에서, 바실러스 렌투스로부터의 1,3-β-글루카나제, 바실러스 렌투 스로부터의 자일로글루카나제, 및 두 효소의 조합을 사료 (통상적인 옥수수-대두 식이물)에 첨가하였다. 각각의 효소 처리군은 35 일 연령의 수컷 식용 영계에서의 생장 성장 능력을 개선시켰는데, 조합에 의해 달성된 결과는 단지 하나의 효소를 사용한 처리군에 의해 달성된 결과보다 높았다.

본 실험은 44 마리의 Cobb x Cobb 수컷 닭의 49 개의 우리를 사용하였다. 처리군을 7개의 블록으로 나누었고(replicate), 각각의 블록을 무작위로 7 개의 처리군 (6 개의 효소 처리군 및 1 개의 음성 대조군)으로 나누었다.

처리군 4는 본 발명에 따른 면역 스트레스-감소 효소인 1,3-β-글루카나제를 70 MU/사료 ton 포함하는 조성물을 사용하였다. 처리군 5 또한 본 발명에 따른 면역 스트레스-감소 효소인 자일로글루카나제를 100 MU/사료 ton 포함하는 조성물을 사용하였다. 처리군 6은 70 MU/사료의 1,3-β-글루카나제 및 100 MU/사료 ton의 자일로글루카나제를 포함하는, 본 발명에 따른 조합 조성물을 사용하였다. 처리군 1은 첨가된 효소가 없는 대조군 사료였다. (1 MU = 4000 IU)

본 연구에서 공급된 식이물은 통상적 식용 영계 사료였다. 본 식이물은 상업 적 칠면조 성장 작용에 사용될 수 있는 것을 나타내며, 이에 따라 식이물은 3 주 후 조정하였다. 35 일 성장 후의 처리군 1, 4, 5, 및 6에 대한 성장 결과를 하기 표에 나타내었다.

각주 1: 사료 전환율은 보정된 치사율이다.

각주 2: 각 처리군에 대해 체중-조정된 사료 전환율을 상기 기술된 바와 같이 계산하였다. 나타난 통계는 LSD 시험에 관한 것이고, P < 0.05이다.

처리군 1 (대조군)과 비교하여 처리군 4 (1,3-β-글루카나제)를 투여받은 닭은 수치적으로 개선된 평균 생체중 및 수치적으로 개선된 (감소된) 사료 전환율을 가졌다. 유사하게, 처리군 5 (자일로글루카나제를 갖는 사료)을 투여받은 닭은 통계적으로 유의한 개선된 평균 생체중 및 통계적으로 유의한 개선된 (감소된) 사료 전환율을 가졌다.

처리군 6 (1,3-β-글루카나제 및 자일로글루카나제의 조합을 갖는 사료)을 투여받은 닭은 2개의 효소를 개별적으로 투여시 관찰되는 효과보다 큰 평균 생체중 및 사료 전환율의 개선을 달성하였다. 따라서 1,3-β-글루카나제 및 자일로글루카나제를 포함하는 조합 처리군은 성장 능력에 있어 상당한 개선을 달성하였다.

실시예 11

사료에의 효소의 적용에 의한 닭 혈청 APP의 감소

닭 영계를 1에서 14 일로 성장시키고 다양한 효소가 첨가된(하기 표에 요약된 효소) 통상적 옥수수-대두 초기물질 식이물 (하기 표에 나타낸 식이물 조성을 가짐)을 투여하였다. 각각의 효소 유형에 대한 시료 크기는 우리 당 8 마리의 새를 갖는 3개의 우리를 포함하였다.

처리군 J에서의 "에스테라제"는 자일라나제를 갖는 동일한 오페론의 바실러스 렌투스 유전자로부터의 특징이 없는 효소이다. 이러한 효소에 대한 기질은 동정되지 않았다. 이의 "에스테라제"로서의 평가는 다른 공지된 에스테라제 유전자에 대한 본 유전자의 DNA 서열의 유사성에 기초한 것이다. 에스테라제 활성은 측정되지 못하였으나, 2 개의 단백질이 유사한 특이적 활성을 가지는 경우 자일라나제 농도에 대해 유사할 것이다.

펙틴 기질을 갖는 환원 당 분석법을 사용하여 1,4-β-갈락타나제 및 1,3-갈락타나제를 측정하였다.

14 일에, 모든 새로부터 혈액 혈청을 모으고, 상기 기술된 바와 같이 시료를 α1-산 당단백질 (AGP) 함량에 대해 분석하였다. 각 처리군으로부터의 α-1-산 당단백질의 평균 농도를 상기 표에 나타내었다.

표에 반영된 바와 같이, 처리군 A (효소 없음)에 대해 처리군 H, I 및 J는 혈청 AGP의 감소를 나타내었다.

단지 2 주 성장 후에도 처리군 H (키티나제 및 1,4-β-만난아제)는 상당한 결과를 수득하였다. 효소의 양은 다른 처리군에서 반응을 나타내지 못하였던 농도이었음에도 (상당량의 키티나제를 갖는 처리군 G 및 상당량의 1,4-β-만난아제를 갖는 처리군 E 및 F와 비교), 키티나제 및 1,4-β-만난아제의 조합은 상당한 AGP 감소를 나타내었는데, 이는 단지 하나의 효소만을 사용시 수득되는 결과로부터는 예측될 수 없는 것이었다.

처리군 I (1,3-β-글루카나제 및 1,4-β-만난아제)는 현저한 결과를 수득하였으마, 이 실험은 명백하게 통계적으로 유의하지 않았다 (p 값: 0.125). 보다 긴 기간의 다른 시험에서, 1,3-β-글루카나제 및 1,4-β-만난아제를 갖는 처리군은 AGP 농도에 상당한 영향을 미쳤다.

처리군 J (자일라나제, 1,4-β-만난아제, 에스테라제; P=O.O83 vs 처리군 A 대조군)과 처리군 F (자일라나제 + 1,4-β-만난아제, "에스테라제" 없음)의 비교시, 처리군 J가 현저한 효과를 나타내었고, 처리군 F는 AGP 감소를 나타내지 않았다.

실시예 12

본 실시예에서는 선천성 면역계를 자극하는 성분을 포함하도록 사료 조성물 을 변경하는 것이 혈청 APP 농도를 증가시킬 것이라는 가설을 시험하였다.

기초 옥수수-대두 식이물을 사용하고, 대조군으로서 콩기름 고에너지 식이물을 사용하여 21 일 닭 영계 시험을 수행하였다. 시험 식이물을 얻기 위하여, 대조 식이물을 면역 자극 성분을 갖는다고 여겨지는 실제 물질을 함유하도록 재질시켰고, 다만 거의 동일한 등가의 영양학적 수치를 유지시켰다. 시험 식이물은 다음의 변형을 포함하였다.

옥수수/콩/콩기름 대조군

AV 블렌드유 (동물 식물성 블렌드유) 포함;

콩 레시틴 포함;

육류분 포함;

콩껍질을 갖는 5%의 DDGS (에탄올 제조로부터 주정박 및 가용성 부산물) 포함;

콩껍질이 없는 15%의 DDGS 포함.

식이물에 대해서는 하기 표에서 상세하게 기술하였다.

AV 블렌드 및 콩 레시틴을 선천성 면역계 자극제 포스파티딜세린을 포함하는 인지질을 함유하도록 추출하였다. 육류분은 포스파티딜세린, 히알루로난, 및 고기 부스러기로부터 유래한 다양한 미생물 자극제 또는 가공 전에 발생할 수 있는 2차 미생물 성장물을 함유할 수 있다. DDGS를 α-만난, 1,3-β-글루칸 및 키틴, 뿐 아니라 원래의 발효물 기질로부터의 잠재적으로 자극하는(potentially stimulating) 발효되지 않은,탄수화물 중합체를 포함하는 세포 벽을 포함하는 풍부한 효모 잔류 물을 갖도록 추출하였다.

각각의 식이물에 있어서, 우리 (새 당 0.631 sq. ft) 당 8 마리의 새가 있는 3개의 피터심(Petersime) 좁은 우리에서 닭 영계 (Cobb x Cobb)를 성장시켰다. 21 일 후, 각각의 새의 혈청 AGP 농도를 상기 실시예에 기술한 바와 같이 분석하였다.

하기 표에 나타낸 바와 같이, 개질된 식이물은 21 일에 혈청 AGP의 상당한 증가에 기초한 선천성 면역계 촉진의 명백한 증거를 보여주었다. 데이터는 또한 본 발명에 따른 식이물 성분, 예컨대 면역 스트레스 유도 성분을 분해하는 효소를 포함하는 조성물의 사용을 통해 야기된 면역 스트레스를 감소시킴을 나타낸다.

실시예 13

본 실시예는 사료에 존재하며, 진균의 세포 벽과의 연관성으로 인해, 동물의 선천성 면역계에 의해 일반적으로 명백히 인지되는 분자 패턴인 1,3-β-글루칸과 연관된 면역 스트레스를 감소시키는 1,3-β-글루카나제를 포함하는 조성물의 효능을 입증한다. 결과는 1,4-β-만난아제와 마찬가지로, 1,3-β-글루카나제는 APP의 혈청 농도를 감소시키고 동물 성장 능력을 개선시켰음을 나타내었다.

닭 영계 (Cobb x Cobb)를 하기 표에 나타낸 통상적 저지방 옥수수/대두분 식이물을 사용하여 1 일에서 21 일로 성장시켰다. 2개의 케이스에서, 바실러스 렌투스 발효물로부터 제조된 액체 효소 농축 용액을 균일하게 분무하여 400,000 IU/ton 1,4-β-만난아제 또는 264,000 IU/ton 1,3-β-글루카나제에 적용시킴으로써 식이물을 보충하였다. (본 케이스에서, ton은 2000 lbs. 또는 907.4 kg을 나타낸다)

각각의 식이물 유형에 있어, 우리 (새 당 0.631 sq. ft) 당 8 마리의 새가 있는 3개의 피터심 좁은 우리에서 새를 성장시켰다. 21 일 후, 각각의 새의 혈청 AGP 농도를 상기 실시예에 기술한 바와 같이 분석하였다. 새의 체중 및 소비된 사료는 표준 과정을 이용하여 결정하였고, 사료 전환율을 계산하였다. 결과를 다음의 표에 나타내었다.

WAFC (체중 조정된 사료 전환율)를 다음과 같이 계산하였다:

WAFC = FC - 2.204 * ((W-Wa)/3)

여기서,

FC = 소비된 사료의 무게/증가된 체중

Wa = 시험에 이써 모든 새의 평균 체중

W = 우리 당 평균 생체중 증가

1,4-β-만난아제 및 1,3-β-글루카나제 모두 α1-산 당단백질 (AGP)의 혈청 농도를 감소시켰다. 두 효소 처리군은 체중 조정된 사료 전환율을 감소시켰고, 1,3-β-글루카나제 공급된 군에서의 감소는 통계적으로 유의하였다.

실시예 14

하기 표에 요약한 바와 같이, 상이한 효소 처리군을 사용한 것을 제외하고는, 상기 실시예 13에 기술된 사료 및 방법을 사용하여 피터신 좁은 우리에서 닭 영계 시험을 수행하였다.

아트로박터 루테우스(Arthrobacter luteus)의 발효로부터 수득된 조 1,3-β-글루카나제 제품인 리티카제(Lyticase)를 시그마 케미컬 컴퍼니(Sigma Chemical Company, St. Louis Mo.)로부터 입수하였다. 리티카제 활성을 하기 기술된 환원 당 방법을 통해 결정하고 60 MU/ton (240,000 IU/ton와 등가임)을 적용시켰다. 제조사에 따르면, 본 제품은 또한 키티나제 활성을 포함하여, 다른 활성을 함유하는데, 이에 대해서는 측정하지 않았다.

증가된 농도의 1,3-β-글루카나제는 약 30 MU/ton (120,000 IU/ton) 이하의AGP 농도 (예를 들어, 용량 반응)에 증가된 영향을 미쳤다. 약 30 MU/ton (120,000 IU/ton) 1,3-β-글루카나제를 갖는 이러한 동물 사료 유형을 제공함으로써, 면역 스트레스의 감소를 기대하게 되는데, 이는 혈청 AGP의 감소된 농도 및/또는 개선된 동물 성장 능력을 반영하는 것이다.

결과는 또한 자일로글루카나제가 혈청 AGP 농도의 감소에 유효함을 나타내었다. 자일로글루카나제 (EC 3.2.1.151)는 식물의 구조 중합체인 자일로글루칸에 특이성을 갖는 1,4-β-글루카나제이다.

리티카제를 제외하고는, 본 실시예에 사용된 모든 효소를 바실러스 렌투스로부터 제조하였다. 리티카제는 셀룰로시마이크로비움 셀룰란(Cellulosimicrobium cellulans)으로 재분류된 아트로박터 루테우스(A. luteus)로부터 제조하였다. 아트로박터 루테우스의 발효를 통해 여러가지 형태의 1,3-β-글루카나제를 제조하였다. 예를 들어, 문헌 [Ferrer, P. Microb Cell Factories 5:10, 2006, published online 2006 March 17. doi: 10.1186/1475-2859- 5-10] 참조. 상기 결과는 리티카제 뿐 아니라 바실러스 렌투스 1,3-β-글루카나제 제제 또한 닭 혈청 AGP를 적어도 감소시킴을 보요주는데, 이는 효소의 공급원이 중요하지 않음을 나타낸다. 즉, 임의의 공급원으로부터의 효소가 본 발명에 사용될 수 있다. 또한 키티나제 (리티카제에 존재하며 Sigma에 의해 보고됨)는 리티카제 처리군의 개선된 능력을 가질 수 있다.

실시예 15

다음의 분석법은 효소 활성의 평가에 사용될 수 있다.

(I) 자일로글루카나제

다음의 프로토콜을 사용하여 자일로글루카나제 활성을 분석하였다.

DNS 시약: 10 g/L NaOH₅ 2 g/L 페놀, 10 g/L 디니트로살리실산, 1200 g/L 칼슘 나트륨 타르트레이트 테트라히드레이트를 매일 제조하였다. 사용 직전에, 0.5 g/L 무수 나트륨 술파이트를 첨가하였다.

표준 용액 및 표준 곡선: 0.1 내지 0.5 g/L의 농도 범위로 물에 용해된 일련의 D-(+)-만노스 표준 용액을 제조하였다. 0.6 mL의 각각의 만노스 표준물 (2벌 또는 3벌)을 13 x 100 mm 유리 튜브 중 1.5 mL DNS 작업 용액에 첨가하였다. 물의 0.6 mL 분취액을 갖는 시료를 분광광도계의 0에 대한 시약 블랭크로 사용하였다. 용액을 끓는 수조에서 5 분 동안 가열시키고, 상온으로 냉각시킨 후, 550 nm에서의 흡수를 읽었다. 0.20 내지 1.2 O.D. 유닛 사이에서의 직선 용량 반응이 예상된 결 과였다. 단지 곡선의 직선 부분으로부터 표준 곡선의 경사도 (O.D 550/g/L 만노스)를 계산하였다. 이 곡선에서, 환원 당 g/L의 수치를 효소 반응에서 결정하였다.

자일로글루칸 기질: 자일로글루칸 (Tamarind)을 메가짐 인터내셔널 아일랜드 사 (Megazyme International Ireland Ltd., Bray, Co., Ireland)로부터 입수하여, 0.05% 글루코스를 갖는 pH 7.5의 50 mM Tris 완충액에 5 g/L 용해시켰다.

반응 조건: 0.25 mL의 5 g/L 자일로글루칸 기질을 50 mM Tris 완충액 중 0.05 mL 효소 희석액과 함께 사용하여, 반응 혼합물을 40℃에서 인큐베이션시켰다. 0.75 mL DNS 시약을 첨가하여 반응을 중지시키고, 중지된 반응 혼합물을 5 분 동안 끓는 수조에서 가열시킨 후, 냉각시켜, 550 nm에서의 흡수를 읽었다. 효소 용액에서의 0시 지점을 사용하여 배경 농도를 결정하였다.

계산: 켐젠 자일로글루카나제 MU는 분 당 0.72 g의 환원 당의 생성능으로 정의된다 (표준 물로서 환원 당인 순수한 만노스를 사용함). 1 켐젠 MU는 4000 IU와 등가이다. 즉, 1 CG U는 250 IU와 등가이다 (IU = 1.0 μmol/분).

(II) B-1,3-글루카나제

다음의 프로토콜을 사용하여 B-1,3-글루카나제 활성을 분석하였다.

본 분석은 자일로글루카나제 분석에서 기술된 바와 동일한 DNS 시약, 표준 용액, 표준 곡선, 및 효소 유닛 계산 및 희석량을 사용하였다. 사용된 완충액은 pH 6.5의 5O mM MOPS (4-모르폴린프로판술폰산, FW=209.26) 완충액이었다.

CM 파키만(pachyman) 기질: 카르복심 에틸 파키만 (CM 파키만, CMP)을 메가 짐 인터내셔널 아일랜드 사 (Bray,Co., Ireland)로부터 입수하였다. 약 90℃에서 50 mM MOPS 완충액 용액 (pH 6.5)을 빠르게 교반시키면서 천천히 CMP를 첨가함으로써 5 g/L의 CMP 기질을 제조하였다. 효소 분말을 잘 분신시키고, 용기를 덮거나 또는 꽉 밀봉시키고, 현탁액을 가열-교반 플레이트에서 교반시키면서 천천히 가열시켜 끓여서 30 분 동안 약하게 끓게 하여, 용액에 어떠한 작은 덩어리의 비수화된 겔도 보이지 않도록 잘 수화된 겔을 얻었다. 용액을 실온으로 냉각시켜, 사용하지 않을 때에는 4℃에서 저장하고, 저장 후 사용 전에 잘 혼합시켰다.

반응 조건: 0.25 mL의 5 gL CM 파키만 기질을 MOPS 완충액 중 0.05 mL 효소 희석액과 함께 사용하여 반응 혼합물을 45 분 이하의 다양한 시점 동안 40℃에서 인큐베이션시켰다. 0.75 mL DNS 시약을 첨가하여 반응을 중지시키고, 중지된 반응 혼합물을 5 분 동안 끓는 수조에서 가열시킨 후, 냉각시켜, 550 nm에서의 흡수를 읽었다. 효소 용액에서의 0시 지점을 사용하여 배경 농도를 결정하였다.

(III) 키티나제

문헌 [Thompson et al.,Appl. Environ. Microbiol. 67: 4001-008 (2001)]에 기술된 형광성 키틴 기질인 4-메틸움벨리페릴-베타-D-N, N',N'',N'''-테트라아세틸키토테트라오시드을 사용하여 키타나제 활성을 결정하였다. 기질을 2.5 mM의 DMSO에 용해시켰다.

예시적 분석에서, 20 μL 키틴 기질 (2.5 mM)을 150 μL tris (20.0 mM, pH 7.5)과 함께 사용하였다. 기질 혼합물을 검정 98 웰 미량역가 플레이트에 두고 10 분 동안 37℃로 사전가열시켰다. 30 μL 묽은 효소를 첨가하여 다수의 동일 한(replicaes) 반응을 시작하고 37℃에서 계속 인큐베이션시켰다. 각각의 반응을 50 μL 3 M Na₂CaO₃을 사용하여 2, 4, 6, 8 및 10 분에서 중지시켰다. 여기 355 nm 밴드 통과 필터 및 방출 460 nm 밴드 통과 필터 파장을 사용하는 미량역가 플레이트 리더 (Fluoroscan II)에서 형광을 읽었다. 반응 기간 동안 및 효소 및 기질이 없는 효소 분석과 동일한 상태 하에 생성된 표준 곡선의 범위 내에서 선형(linear rate)의 4-메틸움벨리페론이 형성되도록 효소를 희석시켰다. 분 당 1 μmol의 4-메틸움벨리페론의 방출을 1 IU로 정의하였다. 200 μL 반응 완충액 용액 중 0 내지 1x10^-4 μmol 4-메틸움벨리페론 사이의 몇개의 농도를 이용하여 표준 곡선을 만든 후, 50 μL 3 M Na₂CaO₃을 첨가하였다.

본 발명은 당업자가 이를 만들고 이용하도록 충분히 상세하게 기술하고 예시하였지만, 다양한 변화, 변형, 및 개선이 본 발명의 취지 및 범위를 벗어나지 않는 한 명백하여야만 한다. 본원에서 제공된 실시예는 바람직한 실시태양을 나타낼 뿐이며, 예시적이고, 본 발명의 범위를 제한하려는 의도는 없다. 당업자는 이를 변형시키고 다르게 사용할 것이다. 이러한 변형은 본 발명의 범위에 포함되며 특허청구범위에 의해 정의된다.

본 발명의 범위 및 취지를 벗어나지 않는 한 본원에 기술된 본 발명에 대해 다양한 치환 및 변형이 일어날 수 있음은 당업자에게 명백할 것이다.

명세서에 언급된 모든 특허 및 공개 공보는 본 발명이 속하는 당업계의 숙련된 기술자의 수준을 나타낸다. 모든 특허 및 공개 공보는 각각의 공개 공보가 특 히 개별적으로 참조문헌으로 지적되는 정도로 본원에 참고문헌으로 인용된다.

Claims

(i) 엔도-1,4-β-만난아제,

(ii) 1,3-β-글루카나제, 및

(iii) 경구적으로 허용되는 담체

를 포함하고, 사료 1 kg 당 상기 엔도-1,4-β-만난아제 20 IU 이상 및 상기 1,3-β-글루카나제 30 IU 이상을 포함하며, 동물에게 경구 투여하기에 적합한, 동물에서 감염을 치료 또는 완화시키거나 동물 성장 능력을 개선시키기 위한 동물 사료 조성물.
삭제
(i) 엔도-1,4-β-만난아제,

(ii) 1,3-β-글루카나제, 및

(iii) 경구적으로 허용되는 담체

를 포함하고, 1 L 당 상기 엔도-1,4-β-만난아제 40,000 IU 이상 및 상기 1,3-β-글루카나제 230,000 IU 이상을 포함하는, 동물에서 감염을 치료 또는 완화시키거나 동물 성장 능력을 개선시키기 위한, 동물 사료 이외의 액체 조성물.
(i) 엔도-1,4-β-만난아제,

(ii) 1,3-β-글루카나제, 및

(iii) 경구적으로 허용되는 담체

를 포함하고, 1 kg 당 상기 엔도-1,4-β-만난아제 40,000 IU 이상 및 상기 1,3-β-글루카나제 450,000 IU 이상을 포함하는, 동물에서 감염을 치료 또는 완화시키거나 동물 성장 능력을 개선시키기 위한, 동물 사료 이외의 고체 조성물.
제1항에 있어서, 곡물 물질, 단백질 공급원, 비타민, 아미노산 또는 무기질을 포함하는 동물 사료인 조성물.
제5항에 있어서, 상기 곡물 물질이 옥수수, 수수, 밀, 보리 또는 귀리이고, 단백질 공급원이 대두, 콩류 또는 완두류인 조성물.
삭제
제5항에 있어서, 동물에서 면역 반응을 유도하고 엔도-1,4-β-만난아제에 의해 분해되는 β-만난을 포함하는 동물 사료인 조성물.
제1항에 있어서, 엔도-1,4-β-만난아제가 바실러스 렌투스(Bacillus lentus)에 의해 생성된 것인 조성물.
제3항에 있어서, 엔도-1,4-β-만난아제가 바실러스 렌투스에 의해 생성된 것인 조성물.
제4항에 있어서, 엔도-1,4-β-만난아제가 바실러스 렌투스에 의해 생성된 것인 조성물.
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
(i) 엔도-1,4-β-만난아제,

(ii) 자일라나제,

(iii) 에스테라제, 및

(iv) 경구적으로 허용되는 담체

를 포함하고, 사료 1 kg 당 상기 엔도-1,4-β-만난아제 20 IU 이상을 포함하며, 동물에게 경구 투여하기에 적합한, 동물에서 감염을 치료 또는 완화시키거나 동물 성장 능력을 개선시키기 위한 동물 사료 조성물.
(i) 엔도-1,4-β-만난아제,

(ii) 자일라나제,

(iii) 에스테라제, 및

(iv) 경구적으로 허용되는 담체

를 포함하고, 1 L 당 상기 엔도-1,4-β-만난아제 40,000 IU 이상을 포함하는, 동물에서 감염을 치료 또는 완화시키거나 동물 성장 능력을 개선시키기 위한, 동물 사료 이외의 액체 조성물.
(i) 엔도-1,4-β-만난아제,

(ii) 자일라나제,

(iii) 에스테라제, 및

(iv) 경구적으로 허용되는 담체

를 포함하고, 1 kg 당 상기 엔도-1,4-β-만난아제 40,000 IU 이상을 포함하는, 동물에서 감염을 치료 또는 완화시키거나 동물 성장 능력을 개선시키기 위한, 동물 사료 이외의 고체 조성물.
삭제
(i) 엔도-1,4-β-만난아제,

(ii) 키티나제, 및

(iii) 경구적으로 허용되는 담체

를 포함하고, 사료 1 kg 당 상기 엔도-1,4-β-만난아제 20 IU 이상을 포함하며, 동물에게 경구 투여하기에 적합한, 동물에서 감염을 치료 또는 완화시키거나 동물 성장 능력을 개선시키기 위한 동물 사료 조성물.
(i) 엔도-1,4-β-만난아제,

(ii) 키티나제, 및

(iii) 경구적으로 허용되는 담체

를 포함하고, 1 L 당 상기 엔도-1,4-β-만난아제 40,000 IU 이상을 포함하는, 동물에서 감염을 치료 또는 완화시키거나 동물 성장 능력을 개선시키기 위한, 동물 사료 이외의 액체 조성물.
(i) 엔도-1,4-β-만난아제,

(ii) 키티나제, 및

(iii) 경구적으로 허용되는 담체

를 포함하고, 1 kg 당 상기 엔도-1,4-β-만난아제 40,000 IU 이상을 포함하는, 동물에서 감염을 치료 또는 완화시키거나 동물 성장 능력을 개선시키기 위한, 동물 사료 이외의 고체 조성물.
비-인간 동물에게 제1항에 따른 조성물을 경구 투여하는 것을 포함하는, 비-인간 동물에서 감염을 치료 또는 완화시키거나 동물 성장 성능을 개선시키는 방법.
제24항에 있어서, 상기 조성물이 곡물 물질, 단백질 공급원, 비타민, 아미노산 또는 무기질을 포함하는 동물 사료인 방법.
제25항에 있어서, 상기 곡물 물질이 옥수수, 수수, 밀, 보리 또는 귀리이고, 단백질 공급원이 대두, 콩류 또는 완두류인 방법.
삭제
제25항에 있어서, 조성물이 동물에서 면역 반응을 유도하고 엔도-1,4-β-만난아제에 의해 분해되는 β-만난을 포함하는 동물 사료인 방법.
제24항에 있어서, 엔도-1,4-β-만난아제가 바실러스 렌투스에 의해 생성된 것인 방법.
삭제