CN110616208A - 基于流体力学的谷氨酰胺转氨酶优化发酵方法 - Google Patents

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Abstract

一种基于流体力学的谷氨酰胺转氨酶优化发酵方法，通过改变搅拌桨及操作条件，来改善茂源链霉菌细胞培养环境的剪切力、供氧和混合环境，通过流体力学条件的调控使链霉菌的细胞生长和代谢处于有利于的方法来提高谷氨酰胺转氨酶合成，从而提高其的发酵产量。通过提升氧传质速率系数、控制剪切力在较低水平，为发酵罐提供了较佳的细胞培养环境，从而提升微生物表达TG酶的水平、提高其发酵产量，在40立方米工业规模发酵罐、发酵26小时的酶活达47.9U/mL，为至今吨级规模发酵罐的最高报道水平，产生良好经济效益。

Description

基于流体力学的谷氨酰胺转氨酶优化发酵方法
技术领域
本发明涉及的是一种生物工程领域的技术，具体是一种改善发酵体系的流体力学环境来增强谷氨酰胺转氨酶发酵产量的方法。
背景技术
茂源链霉菌来源的谷氨酰胺转氨酶(TG酶)(蛋白质-谷氨酸-γ-谷氨酰胺转移酶，EC2.3.2.13，Microbial transglutaminase)作为新型蛋白食品的食品添加剂，能催化蛋白质肽健中谷氨酰胺残基的γ-羧酰胺基和伯胺之间的酰胺基的转移反应，使得蛋白质发生交联。生产谷氨酰胺转氨酶普遍存在着发酵产酶低、酶活不稳定等多种问题，现有技术一般通过挑选高产的菌种、优化培养基成分、添加适当的诱导因子来促进发酵、优化发酵条件等能够提升摇瓶与小罐规模的一定发酵水平，但如何提高TG酶在大罐规模的发酵生产水平，涉及发酵过程放大的关键因子，由于该链霉菌生理代谢的复杂性以及菌丝体的剪切敏感性，一直是学术界和工业界关注的研发课题。
发明内容
本发明针对现有技术存在的上述不足，提出一种基于流体力学的谷氨酰胺转氨酶优化发酵方法，通过改变搅拌桨及操作条件，来改善细胞培养环境的剪切力、供氧和混合环境，通过流体力学条件的调控使链霉菌的细胞生长和代谢处于有利于的方法来提高谷氨酰胺转氨酶合成，从而提高其发酵产量。通过提升氧传质速率系数(kLa)、控制剪切力在较低水平，为发酵罐提供了较佳的细胞培养环境，从而提升微生物表达TG酶的水平、提高其发酵产量。
本发明是通过以下技术方案实现的：
本发明包括以下步骤：
步骤1)挑取斜面培养的孢子进行恒温的种子培养；
所述的种子培养，采用内含液体种子培养基的摇瓶或发酵罐，在24-30℃环境下实现。
所述的种子培养具体为：挑取斜面培养的孢子至容积250mL且内含30-50mL液体种子培养基的摇瓶中，24-30℃恒温摇瓶培养，摇床转速100-250rpm，培养20-32h，用于10立升发酵罐的发酵；或者是挑取斜面培养的孢子至容积为4000L且内含2800L液体种子培养基的发酵罐中(内径140cm、内深350cm)，24-30℃恒温培养，设置发酵罐中的搅拌器为三层抛物线型搅拌桨(直径45cm、桨间距90cm，最底层桨距罐底25-45cm)，搅拌转速40-120rpm，通气量8-100m3/h，培养20-38h得到菌体。
所述的孢子来自一种高产谷氨酰胺转氨酶的茂源链霉菌(Streptoverticilliummobaraense)菌株(YRZ170817NTG31)，保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏号为CGMCC15353，保藏日期为2018.2.12。
所述的液体种子培养基的组分为(g/L)：甘油20-30、鱼粉蛋白胨20-35、酵母粉3-10、玉米浆0-5、MgSO4·7H2O 1-3、K2HPO4·3H2O 1-5，该液体种子培养基的pH为7.4，优选经121℃环境下灭菌20min。
步骤2)将种子培养液接种于具有搅拌器的发酵罐中进行量产培养；
所述的量产培养，采用内径19cm、内深35.3cm的10立升发酵罐或内径280cm、内深650cm的40立方米发酵罐，在30-37℃环境下实现。
所述的量产培养具体为：采用250mL步骤1中得到的种子培养液，在无菌条件下按5-15％接种量接入装有5.8立升发酵培养基的10立升发酵罐进行发酵，该发酵罐内设有六叶平翼桨、六斜叶桨、抛物线型桨、四翼桨或其组合的搅拌器；或者是采用4000L步骤1中得到的种子培养液，在无菌条件下按5-15％接种量接入装有28立方米发酵培养基的40立方米发酵罐；该发酵罐内设有抛物线型桨、四翼桨或其组合的搅拌器。
所述的搅拌器在量产培养过程中全程使用，当采用10立升发酵罐时，通气量为0.1-3.0vvm，搅拌转速在50-700rpm，搅拌器的结构的直径为发酵罐内径的1/3-1/2，采用距离罐底6-12cm的单层桨布置或下部的搅拌桨距离罐底2-4cm，两桨之间的距离5-9cm的双层桨布置；当发酵过程中溶氧低于5％时，调节通气量和搅拌转速，使整个发酵过程中溶氧维持在5％以上，发酵共持续了24-36h；当采用40立方米发酵罐时，通气量为70-800m3/h，搅拌转速在40-200rpm，搅拌器的的直径为发酵罐内径的1/3-1/2，采用下部的搅拌桨距离罐底50-90cm，两桨之间的距离100-160cm的三层或四层桨布置。当发酵过程中溶氧低于1％时，调节通气量和搅拌转速，发酵时长22-32小时。
所述的发酵培养基的组分为(g/L)：甘油20-50、鱼粉水解液50-150、酵母粉5-10、玉米浆5-20、MgSO4·7H2O 1-5、K2HPO4·3H2O 1-10、(NH4)2SO4 1-10、Na2SO3 1-10、促进剂5-20，余量为水；该发酵培养基的pH为7.4，优选经121℃环境下灭菌20-40min。
上述促进剂为：磷酸镁与磷酸氢镁的混合物，其质量比为(1:1)-(1:5)。
技术效果
与现有技术相比，本发明在使发酵罐内的剪切力比较低的情况下，显著改善了发酵罐的供氧能力和径向混合状态；由此产生的技术效果包括：
(1)本发明采用调控发酵液的流体力学环境条件的方法，在实验室发酵罐和工业生产罐中，显著提高了TG酶的产量，所提出的策略简便实用，产生了经济效益。
(2)本发明通过采用不同的搅拌桨及操作条件，发现在发酵中后期需要较高的氧供应有利于产酶，而转速增大引起的剪切力会损伤菌丝体，采用四翼桨可以较好地达到混合供氧与剪切力的平衡，具有一定的优势，即：在四翼桨发酵罐的培养中，在发酵中后期提升转速，这是调控TG酶生产的一种有效方法，不仅节省发酵成本，也有利于精准调控。
附图说明
图1为实施例采用六平翼桨的10立升发酵罐进行TG酶发酵的a)细胞量(PVC)及b)酶活(以OD525表示)变化的动态曲线示意图；
图2为实施例采用不同组合桨的10立升发酵罐中测得的kLa值；
图3为实施例工业生产罐中采用四翼桨测得的kLa值；
图4为实施例在工业发酵罐的茂源链霉菌培养产TG酶活的动态变化。
具体实施方式
实施例1
本实施例采用10立升、内径19cm、内深35.3cm的发酵罐进行TG酶发酵，发酵罐内设置的搅拌桨的直径为7.5-8.6cm，采用双层六平翼桨结构，其中下部的搅拌桨距离罐底4cm，两桨之间的距离8-9cm，具体步骤如下：
①于洁净工作台中，将在固体培养基上活化好的细菌接种于30mL液体种子液培养基中，24-30℃条件下振荡培养20-32h，得到一级种子液；
②按照5-15％的接种量接种于上述10立升发酵罐，该发酵罐内预装5.8L液体发酵培养基，发酵温度30℃，起始转速为300rpm、通气量为1vvm(kLa＝125/h)，其中kLa值是据动态法-氮气排空法测得。当发酵过程中溶氧低于10％时，通气量升到1.5vvm(kLa＝135/h)，当发酵过程中溶氧再次低于10％时，#2、#3、#4发酵罐的搅拌转速分别提升到400rpm(kLa＝180/h)，450rpm(kLa＝220/h)，500rpm(kLa＝235/h)，在所有的发酵过程中溶氧维持在3％以上，发酵共持续了30h。
③利用N-α-苄氧羟基-谷氨酰胺-甘氨酸作为底物的比色法进行TG酶酶活的测定[Junqua M,Duran R,Gancet C,Goulas P.1997.Optimization of microbial transgh|lanfinase production using experimental designs.Appl Microbiol Biotechnol 48:730-734]，结果如图1所示，表明相对较低的搅拌转速有利于TG酶的发酵生产，这是因为六平翼桨是一种产生高剪切力的搅拌桨，剪切力大、不利于菌丝体发酵产酶。
实施例2
针对10立升、内径19cm、内深35.3cm的发酵罐，采用六斜叶桨、四翼桨、抛物线型搅拌桨组合的搅拌器，其直径为8.5-9.2cm，采用双层桨结构，其中下部的搅拌桨距离罐底4-6cm，两桨之间的距离6.8-12cm。
如图2所示，为搅拌转速分别为300、400和500rpm、通气量为1.0vvm条件下，不同组合桨的发酵罐的氧速率传递系数(kLa值)。
据此，本实施例采用在相同操作条件下具有较高kLa值、即较强供氧能力的“六斜叶桨(下)+四翼桨(上)”、“四翼桨(上)+四翼桨(下)”这两种组合，进行TG酶的发酵，搅拌转速分别为：300rpm(空白柱)，400rpm(灰色填充柱)，500rpm(斜线填充柱)；通气量为1.0vvm，组合桨种类：四翼桨+四翼桨；四翼桨(上)+六斜叶桨(下)；六斜叶桨(上)+四翼桨(下)；六斜叶桨+六斜叶桨；抛物线型桨+抛物线型桨。
本实施例采用上述发酵罐的不同搅拌桨组合，考察了其流体力学环境对茂源链霉菌产TG酶的影响，具体步骤如下：
①于洁净工作台中，将在固体培养基上活化好的细菌接种于30mL液体种子液培养基中，24-30℃条件下振荡培养20-32h，得到一级种子液；
②按照5-15％的接种量接种于上述10立升发酵罐，该发酵罐内预装5.8L液体发酵培养基，发酵温度30℃，起始转速为300rpm、通气量为1vvm，当发酵过程中溶氧低于20％时，搅拌转速提升到400rpm、通气量升到1.5vvm，当发酵过程中溶氧再次低于10％时，搅拌转速提升到450-500rpm，在整个发酵过程中溶氧维持在5％以上，发酵持续了30h。
③利用N-α-苄氧羟基-谷氨酰胺-甘氨酸作为底物的比色法进行TG酶酶活的测定，结果表1所示，在“六斜叶桨(下)+四翼桨(上)”组合发酵与“四翼桨(上)+四翼桨(下)”组合发酵条件，TG酶在后者的组合情况下酶活(以OD525表示)较高；而细胞量(PVC)在两种发酵罐的情形，相差不大。
表1在“六斜叶桨(下)+四翼桨(上)”组合发酵与“四翼桨(上)与四翼桨(下)”组合发酵条件的茂源链霉菌产TG酶的细胞量(PVC)及酶活(OD525)的动态变化。
实施例3
本实施例在10立升发酵罐中的TG酶发酵，该发酵罐中设置双层四翼桨结构的搅拌器，四翼桨的直径为8.5-9.2cm，其中下部的搅拌桨距离罐底4-6cm，两桨之间的距离6.8-12cm，具体步骤如下：
①于洁净工作台中，将在固体培养基上活化好的细菌接种于30mL液体种子液培养基中，24-30℃条件下振荡培养20-32h，得到一级种子液；
②按照5-15％的接种量接种于上述10立升发酵罐，该发酵罐内预装5.8L液体发酵培养基，发酵温度设定为30℃，起始转速为300rpm、通气量为1vvm(kLa＝70/h)，其中kLa值是根据动态法-氮气排空法测得。当发酵过程中溶氧低于20％时，将搅拌转速在相同的四个发酵罐下分别提升到450rpm(kLa＝101/h)、550rpm(kLa＝122/h)、650rpm(kLa＝148/h)、750rpm(kLa＝165/h)，在所有的发酵过程中溶氧没有跌到零，发酵共持续了33h。
如表2所示，相对于450rpm较低的转速，在550rpm条件下，由于氧供应的增大，发酵产酶较高；但是，在进一步增大氧供应、搅拌转速调到650rpm或750rpm时，由于较高转速引起的剪切力对菌丝体发酵的损害，TG酶活较低。
表2
如表2所示，采用径向流的四翼桨、在适当的操作条件下，即发酵后期的搅拌转速维持在550rpm，可以达到发酵高产，与传统发酵相比，不仅节省发酵成本，也有利于精准调控。
实施例4
本实施例在40立方米工业发酵罐的茂源链霉菌发酵生产TG酶，该发酵罐中设置三层四翼桨与顶层抛物线型搅拌桨的四层桨结构搅拌器，搅拌器中各搅拌桨的直径均为发酵罐内径的1/3-1/2，下部的搅拌桨距离罐底50-90cm，两桨之间的距离100-150cm。
如图3所示，为发酵罐中测得上述搅拌器的kLa值：对于采用四层抛物线圆盘涡轮桨的原发酵罐的kLa值相对较小，例如，在100m3/h通气量、转速为95rpm时，仅57.6/h。与实验室发酵罐中的测定一样，其kLa值是根据动态法-氮气排空法测得。
本实施例具体步骤如下：
①于洁净工作台中，将在固体培养基上活化好的孢子接种于2.8立方米液体种子液培养基中，24-30℃条件下搅拌培养，搅拌转速40-120rpm，培养20-38h，得到一级种子液；
②按照5-15％的接种量接种于40立方米发酵罐，装28立方米液体发酵培养基，当发酵过程中溶氧低于1-10％时，调节通气量和搅拌转速，搅拌转速在起始、4小时、8小时、10小时分别为70、70、90、100rpm，对应的通气量分别为100、300、500、700m3/h，发酵温度全程控制在30℃或34℃条件进行发酵生产，持续了26h。
③利用N-α-苄氧羟基-谷氨酰胺-甘氨酸作为底物的比色法进行TG酶酶活的测定。安装了三层四翼桨组合顶层抛物线圆盘涡轮桨的工业发酵罐在30℃的发酵结果如图4所示，在22、24、26小时的酶活(OD525)分别为0.352、0.508、0.569，而对照四层抛物线圆盘涡轮桨的发酵罐在相同时间点的酶活只有0.267、0.290、0.334。在34℃发酵温度条件下，三层四翼桨与顶层抛物线型桨组合的工业发酵罐的TG发酵生产，在26小时酶活(OD525)高达0.704，该值通过标样对照测定确认，实际酶活值达47.9U/mL，为至今吨级规模发酵罐的最高报道水平。
在工业发酵罐的发酵过程中，测定发酵液的粘度获知，发酵起始的粘度为1-5mPa·s(毫帕秒)，随着发酵进程，迅速上升，到发酵中后期高达800-1500mPa·s(毫帕秒)，与所观察到的发酵液流动状态一致，即，流体流动显著变慢；特别是在使用传统搅拌桨的情形、径向混合表现出较为严重的不均匀性，而采用三层四翼桨的搅拌器装置或其与顶层抛物线型桨组合的四层桨的搅拌器装置，所观察到的整个发酵过程中的流体混合效果良好。
根据上述实施例证实采用具有较好供氧能力和径向混合效果强、且剪切力较低的四翼桨，其实验室发酵罐和工业发酵罐的发酵，均有利于TG酶的发酵生产，无论最高产量和单位时间的生产率均有显著提升、对照生产罐提高了70％，并且能耗反而低于对照的传统搅拌桨发酵罐，并且与较高温度(34℃)的发酵条件集成，TG酶的产量获进一步提增，为工业生产产生经济效益。
上述具体实施可由本领域技术人员在不背离本发明原理和宗旨的前提下以不同的方式对其进行局部调整，本发明的保护范围以权利要求书为准且不由上述具体实施所限，在其范围内的各个实现方案均受本发明之约束。

Claims (9)

1.一种基于流体力学的谷氨酰胺转氨酶优化发酵方法，其特征在于，包括：挑取斜面培养的孢子进行恒温的种子培养，再将种子培养液接种于具有搅拌器的发酵罐中进行量产培养得以实现；
所述的孢子来自一种高产谷氨酰胺转氨酶的茂源链霉菌(Streptoverticilliummobaraense)菌株(YRZ170817NTG31)，保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏号为CGMCC15353，保藏日期为2018.2.12；
所述的搅拌器为六叶平翼桨、六斜叶桨、抛物线型桨、四翼桨或其组合的搅拌器。
2.根据权利要求1所述的谷氨酰胺转氨酶优化发酵方法，其特征是，所述的种子培养，采用内含液体种子培养基的摇瓶或发酵罐，在24-30℃环境下实现。
3.根据权利要求1或2所述的谷氨酰胺转氨酶优化发酵方法，其特征是，所述的种子培养具体为：挑取斜面培养的孢子至容积250mL且内含30-50mL液体种子培养基的摇瓶中，24-30℃恒温摇瓶培养，摇床转速100-250rpm，培养20-32h，用于10立升发酵罐的发酵；或者是挑取斜面培养的孢子至容积为4000L且内含2800L液体种子培养基的发酵罐中，24-30℃恒温培养，设置发酵罐中的搅拌器为三层抛物线型搅拌桨，搅拌转速40-120rpm，通气量8-100m3/h，培养20-38h得到菌体；
所述的4000L发酵罐为内径140cm、内深350cm；
所述的抛物线型搅拌桨为直径45cm、桨间距90cm，最底层桨距罐底25-45cm。
4.根据权利要求1或2所述的谷氨酰胺转氨酶优化发酵方法，其特征是，所述的液体种子培养基的组分为(g/L)：甘油20-30、鱼粉蛋白胨20-35、酵母粉3-10、玉米浆0-5、MgSO4·7H2O 1-3、K2HPO4·3H2O 1-5。
5.根据权利要求1所述的谷氨酰胺转氨酶优化发酵方法，其特征是，所述的量产培养，采用内径19cm、内深35.3cm的10立升发酵罐或内径280cm、内深650cm的40立方米发酵罐，在30-37℃环境下实现。
6.根据权利要求1或5所述的谷氨酰胺转氨酶优化发酵方法，其特征是，所述的量产培养具体为：采用250mL种子培养液，在无菌条件下按5-15％接种量接入装有5.8立升发酵培养基的10立升发酵罐进行发酵，该发酵罐内设有六叶平翼桨、六斜叶桨、抛物线型桨、四翼桨或其组合的搅拌器；或者是采用4000L种子培养液，在无菌条件下按5-15％接种量接入装有28立方米发酵培养基的40立方米发酵罐；该发酵罐内设有抛物线型桨、四翼桨或其组合的搅拌器。
7.根据权利要求6所述的谷氨酰胺转氨酶优化发酵方法，其特征是，所述的搅拌器在发酵过程中全程使用，当采用10立升发酵罐时，通气量为0.1-3.0vvm，搅拌转速在50-700rpm，搅拌器的结构的直径为发酵罐内径的1/3-1/2，采用距离罐底6-12cm的单层桨布置或下部的搅拌桨距离罐底2-4cm，两桨之间的距离5-9cm的双层桨布置；当发酵过程中溶氧低于5％时，调节通气量和搅拌转速，使整个发酵过程中溶氧维持在5％以上，发酵共持续了24-36h；当采用40立方米工业发酵罐时，通气量为70-800m3/h，搅拌转速在40-200rpm，搅拌器的的直径为发酵罐内径的1/3-1/2，采用下部的搅拌桨距离罐底50-90cm，两桨之间的距离100-160cm的三层或四层桨布置；当发酵过程中溶氧低于1％时，调节通气量和搅拌转速，发酵时长22-32小时。
8.根据权利要求1或5所述的谷氨酰胺转氨酶优化发酵方法，其特征是，所述的发酵培养基的组分为(g/L)：甘油20-50、鱼粉水解液50-150、酵母粉5-10、玉米浆5-20、MgSO4·7H2O1-5、K2HPO4·3H2O 1-10、(NH4)2SO4 1-10、Na2SO3 1-10、促进剂5-20，余量为水。
9.根据权利要求8所述的谷氨酰胺转氨酶优化发酵方法，其特征是，所述的促进剂为：磷酸镁与磷酸氢镁的混合物，其质量比为(1:1)-(1:5)。
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