KR20190052697A - 암의 신규한 항원 지표를 표적화하는 ｃａｒ 요법을 위한 보편적 플랫폼 - Google Patents

암의 신규한 항원 지표를 표적화하는 ｃａｒ 요법을 위한 보편적 플랫폼 Download PDF

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KR20190052697A
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cell
acar
tumor
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기드온 그로스
메라브 베이만
윌리엄 깁슨
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가비쉬-가릴리 바이오 어플리케이션스 리미티드.
임팩트-바이오 리미티드.
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Abstract

효과기 면역 세포의 원치 않는 활성화를 방지하거나 또는 감쇠시킬 수 있는 억제 키메라 항원 수용체 (iCAR)를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자로서, 여기서 iCAR은 이형접합성 (LOH)의 손실로 인하여 포유동물 종양 세포에 존재하지 않지만, 관련 포유동물 정상 조직의 모든 세포 상에 적어도 존재하는 다형성 세포 표면 에피토프의 단일 대립유전자 변이체에 특이적으로 결합하는 세포외 도메인; 및 효과기 면역 세포를 억제하는 적어도 하나의 신호 전달 성분을 포함하는 세포내 도메인을 포함하는 핵산 분자가 제공된다. 핵산 분자를 포함하는 벡터 및 형질도입된 효과기 면역 세포 및 형질도입된 효과기 면역 세포를 투여하는 것을 포함하는 암의 치료를 위한 방법이 추가로 제공된다.

Description

암의 신규한 항원 지표를 표적화하는 ＣＡＲ 요법을 위한 보편적 플랫폼
본 발명은 종양 세포의 표면 상에 발현되는 항원을 인식하는 활성화 키메라 항원 수용체 (aCAR), 억제성 CAR (iCAR) 및 보호성 CAR (pCAR) (이형접합성 상실 (loss of heterozygosity, LOH)로 인하여 종양에 의한 것이 아닌 정상 세포에 의해 발현되는 동일하거나 또는 다른 세포 표면 항원의 대립유전자 변이체에 대해 유도임)을 이용하는, 입양 세포 이식에 의한 암 면역요법의 기술분야에 관한 것이다.
건강한 조직이 아닌 종양 세포에 의해서만 배타적으로 발현되는 표적화가능 항원의 동정은 의심할 여지 없이 오늘날 암 면역요법의 주요 과제이다. T 세포가 종양 세포를 근절할 수 있다는 임상 증거는 암을 치료하기 위해 T 세포를 이용하기 위한 고도의 다양한 방법을 평가하는 다수의 연구로부터 비롯된다 (Rosenberg and Restifo, 2015). 이는 기증자 림프구 주입, 종양-침윤성 림프구 (TIL)의 입양 이식, CAR를 통해 사전-선택된 항원에서 유전적으로 재유도된 T 세포 (Gross and Eshhar, 2016a) 또는 T 세포 수용체 (TCR)로의 치료, 면역 체크포인트 억제제 또는 적극적 예방접종의 사용과 함께 골수 이식을 이용한다. 이들 중에서, 능동 면역화를 위한 상이한 전략 및 유전자 조작된 T 세포의 사용은 최소의 부작용으로 지속적인 임상 반응을 발취할 수 있는 후보 항원에 대한 기존의 정보를 필요로 한다. 한편, 문헌[S. Rosenberg, "Finding suitable targets is the major obstacle to cancer gene therapy" (Rosenberg, 2014)]에 의한 최근 보고의 제목에 명시된 바와 같다.
MHC-독립적인 방식으로 선택되는 항원에 대한 T 세포 (또는 면역계의 다른 킬러 세포 예컨대 자연 킬러 (NK) 세포 및 사이토카인-유도성 킬러 세포)를 유전적으로 재유도하는 키메라 항원 수용체 (또는 CAR)를 사용하는 개념은 최초로 1980년 말에 그로스(Gross) 및 에스할(Eshhar)에 의해 도입되었다 (Gross 등, 1989). 이들은 T-세포 활성화를 가능하게 하는 CD3-ζ 또는 FcRγ 사슬의 면역스용체 티로신-기반 활성화 모티프를 포함하는 신호전달 성분에 유연한 힌지 및 막투과성 캐노닉 모티프(transmembrane canonic motif)를 통해 융합된 세포외 단쇄 항체 가변 절편 (scFv)을 인코딩한 키메라 유전자로부터 합성하여 생성된다. 현재, CAR은 수십 건의 임상 시험에서 조사되고 있으며, 지금까지 B 세포 악성 종양에서 예외적으로 높은 효능을 나타내고 있다 (Dotti 등, 2014; Gill and June, 2015; Gross and Eshhar, 2016a). CAR-T 세포 요법의 안전성은 대개 종양과 건강한 조직을 구별할 수 있는 능력에 의해 결정된다. 임상적 및 전임상 연구에서 보고된 부정적 자가면역 효과에 대한 주요한 위험 및 직접적 원인은 표적 항원의 종양외 발현으로부터 발생된 오프-종양, 온-타겟 독성(off-tumor, on-target toxicity)이다 (본 발명자의 최근 검토 (Gross and Eshhar, 2016b) 및 (Klebanoff 등, 2016)에서 상세하게 다룸). 이러한 위험과 관련하여, 현재 CAR 요법에 대해 임상적으로 또는 전임상적으로 시험되는 공유된, 비-돌연변이된 세포 표면 항원은 일반적으로 이의 조직 분포 및 발현 방식에 따라 다수의 카테고리로 분류될 수 있다:
- 엄밀히 말하면 종양-특이적 항원. 아마도 미리 임상적으로 조사된 이러한 그룹에서의 유일한 구성원은 표피 성장 인자 수용체 (EGFRvIII)의 변이체 III로서, 이는 교모세포종에서 빈번하게 과발현되고, 또한 이는 정상 조직이 아닌 비-소세포 폐암 및 전립선암, 유방암, 및 목과 난소의 암에서 발견된다.
- 종양 상에서 그리고 건강하지 않은 조직에서 발현되는 표면 항원. 이러한 그룹에서의 잠재적인 CAR 항원은 주로 B 세포 계통으로 제한되는 분화 관련 분자이다. 이들 (및 다수의 임상 시험에서의 표적 항원) 중에서 CD19, B 세포 분화시의 매우 초기에 얻어지고, B 세포 수용체 (BCR)에 의한 신호 전달에 관여하는 pan-B 세포 마커이다. 막성 전립선 항원은 이러한 범주 내의 다른 부류의 항원으로 구성된다.
- 비-악성 종양-촉진 세포에 의해 전형적으로 발현되는 항원. 이러한 하나의 항원은 섬유아세포 활성화 단백질 (FAP), 세포 표면 세린 프로테아제 (이는 다양한 원발성 및 전이성 암에서 종양 관련 섬유아세포에 의해 거의 변함없이 발현됨)이다. 다른 항원은 혈관 내피 세포 성장 인자 (VEGF)이고, 이는 종양 혈관신생 과정에서 고도로 발현되고, 이는 일반적으로 많은 중요한 기관의 혈관 및 림프 내피 세포에서 발현된다.
- 중요한 건강한 조직과 공유된 종양 관련 항원 (TAA).
전임상 및 임상 연구에서 현재 평가되는 대부분의 다른 TAA는 종양에 의해 과발현되고, 그러나 보통 낮은 수준으로 본질적인 정상 조직에 존재한다.
CAR T 세포 요법에서의 자가면역을 다루기 위해 고안된 광범위한 전략은 일단 손실이 이미 분명한 경우에서 전달된 T 세포를 제거하거나, 또는 억제하는 경향이 있는 것 (반동적 조치)과 최초 위치에서 잠재적 손실을 보호하는 목적을 가진 것 (능동적 조치)으로 나눌 수 있다 (Gross and Eshhar, 2016a). 반동적 방법은 종종 자살 유전자, 예컨대 단순 헤르페스 바이러스 싸이미딘 키나아제 (HSV-tk) 및 iC9, 절단된 인간 카스파제 9 및 돌연변이된 FK506-결합 단백질을 포함하는 융향 폴리펩티드를 사용한다. 다른 방법은 대파괴가 진행되는 조작된 세포를 선택적으로 제거하는 항체, 또는 최근 입증된 바와 같이 세포내 신호전달 도메인에의 CAR 인식 모이어티의 결합을 지배하는 이종이량체화된 소분자 제제를 이용한다 (Wu 등, 2015). 일부 능동적 조치가 CAR T 세포의 생체내 지속성 또는 기능 (예를 들어, 유전자 전달을 위한 mRNA 전기천공법의 사용)을 제한하기 위해 설계되고, 다른 것을 직접적으로 비-종양 조직에 대한 손상을 회피하기 위해 치료적 CAR의 항원 선택도를 증가시키는 중요한 과제를 다룬다. 이들 중 2개는 CAR T 세포에 의해 안전하게 표적화될 수 있는 종양 항원의 범위를 잠재적으로 넓힐 수 있기 때문에 특정 관심을 높인다:
- 조합적 (또는 '분할') 항원 인식. 종양-특이적 표면 항원이 드물기 때문에, 주어진 종양에 의해 공동 발현되는 종양-관련 항원으로 반드시 분류되지 않는 2개의 상이한 항원의 조합은 새로운 종양-특이적 표지를 정의할 수 있다. 이러한 항원 쌍에 대한 CAR T 세포의 활성을 제한하는 것은 중요한 안전 게이지를 제공하고, 결과적으로 종양-특이적 표적의 스펙트럼을 확장시키고, 이는 상당한 치료적 가치가 있을 수 있다. 제2 및 제3 세대 CAR은 CAR 엔도도메인에서의 2개 이상의 신호전달 부분의 결합(tethering)을 통해 단일 항원을 결합하는 경우에 활성화 및 보조자극 신호를 갖는 치료적 T 세포를 제공하도록 설계되었다. 그러나, 활성화와 보조자극이 두 CAR들 사이에서 상이한 항원에 대한 각각 특이적인 동일한 T-세포에서 분리되는 경우, 만발 반응(full blown response)은 2개의 항원의 존재 하에서만 달성될 수 있는 2개의 상보적인 신호의 협력을 요구할 것이다. 이러한 원리는 다수의 전임상 연구에서 입증되었다 (Kloss 등, 2013; Lanitis 등, 2013; Wilkie 등, 2012; WO 2016/126608).
의심할 여지 없이 흥미롭게도, 이러한 방법은 유효한 온-타겟, 온-종양 T 세포 반응성만을 허용할 것인 최적의 균형에 도달되도록 활성화 및 보조자극의 두 신호의 강도의 세심한 적정(titration)의 필요성을 여전히 직면하고 있다. 이러한 균형이 일상적으로 임상적 설정에서 달성될 수 있는지 여부는 여전히 의문의 여지가 있다.
유일하게 두 항원의 독특한 조합을 발현하는 세포를 표적화하는 T 세포 반응을 제한하는 완전히 새로운 반응은 최근에 공개되었다 (Roybal 등, 2016a). 이의 핵심 요소는 '유전자 스위치'로서 작용하고, 이는 노치 (Notch)를 포함하는 다수의 세포 표면 수용체의 작용 방식을 이용한다. 이러한 수용체의 이의 리간드에의 결합 이후, 이는 전사 인자로서 기능을 하는 세포 핵으로 전위시키는 세포내 도메인의 유리를 야기하는 이중 절단을 진행한다. 이 원리의 구현은 2개의 유전자의 작용 T 세포로의 동시-유입을 수반한다. 첫번째 것은 구조적으로 발현되며, 제1 항원에서 유도되는 인식 모이어티를 가진 이러한 키메라 절단가능 수용체를 인코딩한다. 표적 세포의 표면 상의 이러한 항원과의 결합은 제2 항원에서 유도되는 제2 유전자를 인코딩한 통상적인 CAR의 발현을 활성화시킬 것이다. 표적 세포는 이것이 이 제2 항원을 공동 발현시키는 경우에만 사멸될 것이다.
억제 CAR. 오프-종양 반응성(off-tumor reactivity)은 CAR-재유도된 킬러 세포가 정상 조직을 공유할 때에 발생된다. 이 정상 조직이 종양에 존재하지 않는 다른 표면 항원을 발현하는 경우, 억제 신호전달 모이어티를 갖는 이러한 비-공유된 항원을 표적화하는 추가의 CAR의 유전자-변형된 세포에서의 공동-발현은 정상 조직에 의해 T 세포 활성화를 방지할 수 있다.
활성화 도메인 (예컨대 FcRγ 또는 CD3-ζ) 대신에 iCAR은 T 세포 활성화와 길항작용을 할 수 있는 억제 수용체, 예컨대 CTLA-4, PD-1 또는 NK 억제 수용체로부터 유도된 신호전달 도메인을 가진다. 종양을 갖는 후보 aCAR 항원을 공유하는 정상 조직이 종양을 공유하지 않는 다른 표면 항원을 발현하는 경우, 이러한 비-공유된 항원을 표적화하는 동일한 T 세포에 의해 발현되는 iCAR이 정상 조직을 보호할 수 있다 (도 1).
각각이 체세포로 재배열된 유전자 세그먼트에 의해 인코딩된 독특한 2개-사슬 TCR을 발현하는 T 세포와 달리, NK 세포는 항원-특이적 수용체를 발현하지 않는다. 대신, NK 세포는 감염된 그리고 건강한 세포의 세포 표면에서 다수의 활성화 및 억제 리간드를 각각 인식하는, 다수의 생식세포-인코딩된 활성화 및 억제 수용체를 발현한다. KIR3DL1과 같은 NK 억제 수용체에 기초한 iCAR의 보호 능력이 기재되어 있다 (US 9,745,368). KIR3DL1 및 다른 NK 억제 수용체는 신속하고 포괄적인 방식으로 면역학적 시냅스를 분해하는 것에 의해 역할을 한다. 단일 NK 세포가 억제 및 활성화 두 리간드를 발현하는 내성 세포를 보전하며, 동시에 결합된 감수성 세포 (유일하게 활성화 리간드만을 발현함)를 사멸할 수 있다는 강력한 증거가 존재한다 (Abeyweera 등, 2011; Eriksson 등, 1999; Treanor 등, 2006; Vyas 등, 2001). 이러한 정교한 능력은 결과적으로 세포용해 과립의 세포외배출에 영향을 미치는 각각의 면역 시냅스에서 형성되는 신호 전달 분자의 상이한 공간적 조직화에 의해 지배된다 (검토를 위해 (Huse 등, 2013)을 참조한다). 보다 최근에 Fedorov 등(Fedorov 등, 2013a; WO 2015/142314)은 성공적으로 이러한 목적을 위해 PD-1 및 CTLA-4의 세포내 도메인을 이용하였다. NK 억제 수용체와는 달리, 이들 iCAR의 억제 효과는 전체 세포에 영향을 미쳤다. 그러나 이러한 효과는 일시적이었고, 이후 aCAR 항원만을 발현하는 표적 세포와 만나는 경우에 전체 T-세포 활성화가 가능하다.
iCAR 및 aCAR에 의해 표적화된 항원의 조직 분포는 임상적 효능을 저해하지 않고 최대 안전성을 부여하는데 필요한 iCAR의 최적의 작용 방식에 영향을 미친다. 예를 들어, 보호되어야 하는 정상 조직(들)과 종양의 해부학적 부위들이 교차하지 않는 경우에, 일시적 억제 (CTLA-4- 또는 PD-1 유사)로 충분할 것이다. 그러나, 이러한 부위가 중첩되는 경우, 유일하게 시냅스-제한 억제 (즉, NK 작용 방식)만이 치료 세포의 지속적 마비를 방지하고, 이의 종양파괴성 활성을 가능하게 한다. 온-표적 오프-종양 반응성을 감소시키기 위한 iCAR을 사용하는 방법은 정상 조직에 존재하나 종양 세포에서 하향조절되는 항원의 심각한 결핍이란 단점을 겪는다.
차세대 시퀀싱 (NGS)은 특정 종양 생검에서 모든 단백질-코딩 유전자 (전체 게놈의 ~1%)의 DNA 서열의 결정 및 동일한 환자의 건강한 조직 (보통 백혈구에서 추출)의 것과의 암 '엑솜'의 비교를 가능하게 한다. 엑솜 시퀀싱은 생검 제거후 수일 내에 상대적으로 적은 비용으로 완료될 수 있다. 이와 동시에, 전사체 분석 (RNA-seq)은 동일한 세포 샘플에 의해 실제로 발현된 유전자에 대한 상보적인 정보를 제공할 수 있다.
각 개개의 종양의 돌연변이 현상이 독특하는 것은 점점 분명해지고 있다 (Lawrence 등, 2013; Vogelstein 등, 2013). 비동의적 돌연변이의 결과로서, 종양 세포는 잠재적으로 자신의 HLA 생성물 중 하나 이상에서 환자의 면역 시스템으로 개별적 세트의 네오펩티드를 제공할 수 있다. 사실상, 최근 환자 자신의 CD8 또는 CD4 T 세포 레퍼토리에 의해 인식되어 면역 요법의 표적이 될 수 있는 종양-특이적 네오에피토프를 확인하는데 막대한 노력이 이루어지고 있다 (검토를 위해 (Blankenstein 등, 2015; Van Buuren 등, 2014; Heemskerk 등, 2013; Overwijk 등, 2013; Schumacher and Schreiber, 2015)을 참조한다). 그러나, 누적된 결과물은 신생항원-기반 T 세포 면역요법은 더 높은 돌연변이 부하, 예컨대 흑색종 및 폐암을 나타내는 암에서 보다 효과적일 가능성이 있지만, 그러나, 소수의 돌연변이를 갖는 대부분의 암에서 종종 효과를 나타내지 못할 수 있음을 제시하고 있다 (Savage, 2014 Schumacher and Schreiber, 2015). 또한, 상당한 종양내 이질성 (Burrell 등, 2013)은 돌연변이-손실 변이체의 출현을 회피하도록 다수의 항원의 동시 공동-표적화를 수반하고, 이는 유용한 면역원성 네오펩티드의 희소성의 관점에서 점점 요구된다.
대체적으로, 유전자적으로 재유도된 킬러 세포의 입양 이식을 통한 암 면역요법에 대해 적합한 표적을 확인하는 시급한 필요성이 여전히 충족되지 않고 있다.
발명의 요약
일 양태에서, 본 발명은 효과기 면역 세포의 바람직하지 않은 활성화를 예방하거나 또는 감쇠시킬 수 있는 억제 키메라 항원 수용체 (iCAR)를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자를 제공하고, 여기서 iCAR은 이형접합성 (LOH)의 손실로 인해 포유동물 종양 세포에서 존재하지 않지만 적어도 관련 포유동물 정상 조직의 모든 세포 상에 적어도 존재하는 다형성 세포 표면 에피토프의 단일 대립유전자 변이체에 특이적으로 결합하는 세포외 도메인; 및 효과기 면역 세포를 억제하는 하나 이상의 신호 전달 성분을 포함하는 세포내 도메인을 포함한다.
추가적인 양태에서, 본 발명은 본원에 정의된 본 발명의 핵산 분자, 및 적어도 하나의 조절 성분, 예컨대 핵산 분자에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 벡터를 제공한다.
다른 양태에서, 본 발명은 본원에 정의된 바와 같이 본 발명에 따라 효과기 면역 세포의 바람직하지 않은 활성화를 예방하거나 또는 감쇠시킬 수 있는 억제 키메라 항원 수용체 (iCAR)를 제조하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 (i) 알려진 변이체의 적어도 하나의 데이터베이스로부터의 단백질-인코딩 유전자의 인간 게놈 변이체의 목록을 검색하는 단계; (ii) (a) 대응하는 기준 대립유전자와 비교하여 각각의 유전자에 의해 인코딩되는 단백질의 아미노산 서열 변이를 초래하는 변이를 초래하는 변이체를 선별하는 것, (b) 인코딩된 단백질의 세포외 도메인에서 아미노산 서열 변이가 존재하는 유전자의 변이체를 선별하는 것, (c) 하나의 종양에서 적어도 이형접합성 (LOH)의 손실을 겪는 유전자의 변이체를 선별하는 것, 및 (d) (c)에 따라 LOH를 겪는 적어도 하나의 종양의 유래의 조직에서 적어도 발현하는 유전자의 변이체를 선별하고, 이에 의해 LOH로 인해 적어도 하나의 종양에서 손실되고, 적어도 하나의 종양의 유래의 조직에서 적어도 발현되는 각각의 유전자에 의해 인코딩된 단백질에서의 세포외 도메인에 아미노산 서열 변이를 갖는 변이체의 목록을 얻음으로써 (i)에서 검색된 변이체의 목록을 필터링하는 단계; (iii) (ii)에서 수득된 목록으로부터 적어도 하나의 단일 변이체를 포함하는 서열 영역을 한정하고, 적어도 하나의 단일 변이체를 포함하는 서열 영역 및 대응하는 기준 대립유전자를 포함하는 서열 영역을 서브-클로닝하고 발현시킴으로써 각각의 에피토프 펩티드를 수득하는 단계; (iv) (iii)에서 수득된 클로닝된 서열 영역에 의해 인코딩된 에피토프 펩티드 또는 상응하는 기준 대립유전자에 의해 인코딩된 에피토프 펩티드에 특이적으로 결합하는 iCAR 결합 도메인을 선별하는 단계; 및 (vii) 각각이 (iv)에서 정의된 바와 같은 iCAR 결합 도메인을 포함하는 본원에서 정의된 iCAR을 제조하는 단계를 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 (i) 본원에 정의된 iCAR을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산 분자를 갖는 종양 관련 항원에 유도되는 TCR-조작된 효과기 면역 세포를 형질주입시키거나 또는 세포를 본원에 정의된 벡터에 형질도입하는 단계; 또는 (ii) 미접촉 효과기 면역 세포를 본원에 정의된 iCAR을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산 분자 및 본원에 정의된 aCAR을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산 분자에 형질주입시키거나; 또는 효과기 면역 세포를 본원에 정의된 벡터에 형질도입시키는 단계를 포함하는 안전한 효과기 면역 세포의 제조 방법을 제공한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 본원에 기재된 바와 같은 본 발명의 방법에 의해 수득된 안전한 효과기 면역 세포를 제공한다. 안전한 효과기 면역 세포는 외인성 T 세포 수용체 (TCR) 및 iCAR을 발현하는 재유도화된 T 세포일 수 있으며, 여기서 외인성 TCR은 항원의 비-다형성 세포 표면 에피토프 또는 다형성 세포 표면 에피토프의 단일 대립유전자 변이체로 유도되고, 여기서 상기 에피토프는 종양 관련 항원이거나 또는 관련 종양 및 정상 조직의 세포에 의해 적어도 공유되고, iCAR은 본원에 정의된 바와 같고; 또는 안전한 효과기 면역 세포는 재유도된 효과기 면역 세포 예컨대 본원에 정의된 iCAR 및 aCAR을 발현하는 자연 킬러 세포 또는 T 세포이다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 LOH를 특징으로 하는 종양을 갖는 대상체에 대한 개인화된 바이오마커를 선별하는 방법으로서, (i) 대상체로부터 종양 생검을 수득하는 단계; (ii) 대상체로부터의 정상 조직의 샘플, 예를 들어 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)를 수득하는 단계; 및 (iii) LOH로 인해 종양의 세포에 의해 발현되지는 않지만 정상 조직의 세포에 의해 발현되는 다형성 세포 표면 에피토프의 단일 대립유전자 변이체를 동정하여 개인화된 바이오 마커를 동정하는 단계를 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 LOH를 특징으로 하는 종양을 갖는 환자에서 암을 치료하기 위한 방법을 제공하며, 상기 방법은 본원에 정의된 효과기 면역 세포를 환자에게 투여하는 단계를 포함하며, 여기서 iCAR은 이형접합성 (LOH)의 손실로 인해 종양의 세포에는 존재하지 않지만, 환자의 관련 포유동물 정상 조직의 모든 세포 상에 적어도 존재하는 다형성 세포 표면 에피토프를 인코딩하는 단일 대립유전자 변이체에 대해 유도된다.
또 다른 추가의 양태에서, 본 발명은 LOH를 특징으로 하는 종양을 갖는 환자의 치료에 사용하기 위한 본원에 정의된 안전한 효과기 면역 세포에 관한 것이고, 여기서 iCAR은 이형접합성 (LOH)의 손실로 인해 종양의 세포에는 존재하지 않지만, 환자의 관련 포유동물 정상 조직의 모든 세포 상에 적어도 존재하는 다형성 세포 표면 에피토프를 인코딩하는 단일 대립유전자 변이체에 대해 유도된다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 LOH를 특징으로 하는 종양을 갖는 환자에서 암을 치료하기 위한 방법에 관한 것이고, 상기 방법은 (i) 정상 조직의 세포에 의해 발현된 LOH로 인한 종양의 세포에 의해 발현되지 않는 다형성 세포 표면 에피토프의 단일 대립유전자 변이체를 동정하기 위해 정보를 확인하거나 또는 수신하는 단계; (ii) 항원의 비다형성 세포 표면 에피토프 또는 다형성 세포 표면 에피토프의 단일 대립유전자 변이체를 동정하기 위해 정보를 확인하거나 또는 수신하는 단계; (iii) 본원에서 정의된 바와 같은 iCAR을 정의하는 하나 이상의 핵산 분자 및 본원에서 정의된 바와 같은 aCAR을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 하나 이상의 핵산 분자, 또는 하나 이상의 벡터를 선별하거나 또는 수신하는 단계로서, 여기서 iCAR은 (i)의 세포 표면 에피토프에 특이적으로 결합하는 세포외 도메인을 포함하고; aCAR은 (ii)의 세포 표면 에피토프에 특이적으로 결합하는 세포외 도메인을 포함하는 단계; (iv) (iii)의 핵산 분자로 효과기 면역 세포를 형질주입시키거나 또는 (iii)의 벡터로 효과기 면역 세포를 형질도입함으로써 안전한 재유도된 효과기 면역 세포의 적어도 하나의 집단을 준비하거나 또는 공급받는 단계; 및 (v) (iv)의 안전한 재유도된 면역 효과기 세포의 적어도 하나의 집단을 상기 암 환자에게 투여하는 단계를 포함한다.
유사한 양태에서, 본 발명은 LOH를 특징으로 하는 종양을 갖는 환자에서 암을 치료하기 위한 안전한 재유도된 면역 효과기 세포의 적어도 하나의 집단을 제공하며, 여기서 안전한 재유도된 면역 세포는 (i) LOH로 인해 종양의 세포에 의해 발현되지 않으나, 정상 조직의 세포에 의해 발현되는 다형성 세포 표면 에피토프의 단일 대립유전자 변이체를 동정하기 위해 정보를 확인하거나 또는 수신하는 단계, (ii) 항원의 비다형성 세포 표면 에피토프 또는 다형성 세포 표면 에피토프의 단일 대립유전자 변이체를 동정하기 위해 정보를 확인하거나 또는 수신하는 단계로서, 상기 에피토프는 종양 관련 항원이거나 또는 상기 암환자에서의 관련 종양 및 정상 조직의 적어도 세포에 의해 공유되는 단계; (iii) 본원에 정의된 iCAR을 정의하는 하나 이상의 핵산 분자 및 본원에 정의된 aCAR을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 적어도 하나의 핵산 분자, 또는 본원에 정의된 적어도 하나의 벡터를 선별하거나 또는 수신하는 단계로서, iCAR은 (i)의 세포 표면 에피토프에 특이적으로 결합하는 세포외 도메인을 포함하고; aCAR은 (ii)의 세포 표면 에피토프에 특이적으로 결합하는 세포외 도메인을 포함하는 단계; (iv) (iii)의 핵산 분자로 효과기 면역 세포를 형질주입시키거나 또는 (iii)의 벡터로 효과기 면역 세포를 형질도입함으로써 안전한 재유도된 효과기 면역 세포의 적어도 하나의 집단을 준비하거나 또는 수신하는 단계에 의해 수득된다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 2개 이상의 핵산 분자의 조합에 관한 것이고, 각각은 상이한 수의 조절된 효과기 면역 세포 활성화 시스템을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하며, 상기 핵산 분자는 단일 연속 핵산 분자의 일부이거나 또는 이를 형성하거나, 또는 2개 이상의 별개의 핵산 분자를 포함하고, 여기서 조절된 효과기 면역 활성화 시스템은 효과기 면역 세포를 킬러 종양 세포로 유도하며, 상기 킬러 종양 세포는 이형접합성 (LOH)의 손실로 인하여 하나 이상의 염색체 또는 그의 분획을 손실하고 관련 정상 조직의 세포를 공유하고, 여기서 (a) 제1 구성원은 항원의 비다형성 세포 표면 에피토프 또는 상이한 다형성 세포 표면 에피토프의 단일 대립유전자 변이체에 특이적으로 결합하는 제1 세포외 도메인을 포함하는 활성화 키메라 항원 수용체 (aCAR)를 포함하고, 상기 비다형성 또는 다형성 세포 표면 에피토프는 종양-관련 항원이거나 또는 관련 비정상 및 정상 포유동물 조직의 세포에 의해 공유되거나; (b) 제2 구성원은 LOH로 인해 비정상적인 포유동물 조직에 의해 발현되지 않지만 관련 포유동물 정상 조직의 모든 세포 상에 존재하는 다형성 세포 표면 에피토프의 단일 대립유전자 변이체에 특이적으로 결합하는 제2 세포외 도메인을 포함하는 조절 폴리펩티드를 포함한다.
도 1은 iCAR의 개념을 나타낸다 ((Fedorov 등, 2013a)로부터 가져옴).
도 2는 aCAR/pCAR 분자 설계 및 작용 방식을 나타낸다. 정상 세포 상의 이의 항원에 대한 pCAR의 결합, 이들이 aCAR 항원을 발현하는지 여부는 급속 RIP 및 폴리펩티드의 3개의 별개의 절편으로의 분해를 야기하는 것으로 예상된다.
도 3a-c는 HLA 클래스 I 유전자좌에 대해 인코딩된 염색체 영역에서 LOH를 겪는 종양 샘플의 백분율을 나타낸다. TCGA 데이터베이스의 종양 유형에서의 A. HLA-G, B. HLA-A, C. ZNRD1. 신장 혐색소 [KICH], 부신피질 암종 [ACC], 췌장 선암종 [PAAD], 육종 [SARC], 신장 신장 유두상 세포 암종 [KIRP], 식도 암종 [ESCA], 폐 편평상피 세포 암종 [LUSC], 신장 투명 신세포 암종 [KIRC], 방광 요상피 암종 [BLCA], 난소 장액 낭샘암종 [OV], 흉선종 [THYM], 자궁경부 편평상피 세포 암종 및 자궁경내 선암종 [CESC], 두경부 편평상피 세포 암종 [HNSC], 유방 침습성 암종 [BRCA], 위 선암종 [STAD], 림프양 신생물 미만성 큰 B-세포 림프종 [DLBC], 다형상 교모세포종 [GBM], 결장 선암종 [COAD], 직장 선암종 [READ], 폐 선암종 [LUAD], 고환 생식세포 종양 [TGCT], 중피종 [MESO], 담관암종 [CHOL], 자궁 암육종 [UCS], 피부 흑색종 [SKCM], 자궁 체부 자궁내막암종 [UCEC], 뇌 저급 신경아교종 [LGG], 전립선 선암종 [PRAD], 간 간세포 암종 [LIHC], 갑상선 암종 [THCA], 크롬친화세포종 및 부신경절종 [PCPG], 급성 골수 백혈병 [LAML], 포도막 흑색종 [UVM].
도 4a-b는 HLA 클래스 I 유전자좌를 인코딩하는 염색체 영역에서 LOH를 겪는 종양 샘플의 백분율을 나타낸다. 도 1의 동일한 종양 유형에서의 A. HLA-B, B. HLA-C.
문헌[A. G. Knudson (Knudson Jr., 1971), Devilee, Cleton-Jansen and Cornelisse stated in the opening paragraph of their essay titled 'Ever since Knudson' (Devilee 등, 2001): "Many publications have documented LOH on many different chromosomes in a wide variety of tumors, implicating the existence of multiple TSGs. Knudson's two-hit hypothesis predicts that these LOH events are the second step in the inactivation of both alleles of a TSG"]에 의해 1971에 제시했던 종양 억제 유전자 (TSG)의 혁신적인 개념을 언급한다.
인간 암에서의 유전 불안정성에 대한 이의 주요 검토(Lengauer 등, 1998)에 있어서, Lengauer, Kinzler 및 Vogelstein은 하기를 기록하였다: "핵형 연구는 대다수의 암의 손실되거나 또는 얻은 염색체를 가지는 것을 나타내었고, 분자 연구는 핵형 데이터가 이러한 변화의 실제 범위를 실제로 과소평가하는 것을 나타낸다. 이형접합성의 손실, 즉, 종양에서의 모계 또는 부계 대립유전자의 손실이 널리 퍼지고, 반대 대립유전자를 얻는 것에 의해 종종 수반된다. 종양은 예를 들어 모계 염색체 8을 손실할 수 있고, 한편 부계 염색체 8을 복제하고, 정상 염색체 8 핵형, 그러나 비정상적인 염색체 8 '대립유전자형'을 가진 세포가 남겨진다. 결장, 유방, 췌장, 또는 전립선의 '평균' 암은 이의 대립유전자의 25%가 손실되고, 이의 대립유전자의 절반 이상을 손실하는 것이 종양에 대해 드문 일이 아니다." 이러한 관찰은 보강되고, 다수의 보고서에서 실질적으로 모든 암종을 포함하는 거의 모든 인간 암으로 확장된다 (검토를 위해 (McGranahan 등, 2012)를 위해 참조한다). 거의 모든 사람 종양은 전체 염색체, 전체 염색체 암 또는 다양한 크기의 하위-염색체 영역의 다중 손실을 나타내는 것이 현재 명백하게 확립되었다. 새로운 알로리즘이 엑소좀 서열 데이터에 기초하여 임의의 주어진 세포 샘플에서 LOH 프로파일의 결정을 위해 빠르게 개발되고 있다 (예를 들어, Sathirapongsasuti 등, 2011). 통계적 성향은 일부 해석의 유효성이 현재 논의될 수 있지만, 이러한 알고리즘은 사전-NGS 기간에서의 이러한 목적을 위해 이용되는 LOH 프로파일을 확립하기 위해 대부분의 다른 방법을 개선하고, 대체할 가능성이 있다.
초기 LOH 사건은 둘러싼 정상 세포에서가 아닌 동일한 조직의 전암성 세포에서 검출될 수 있다 (Barrett 등, 1999). LOH는 비가역적이고, 사건은 누적될 수 있고, 이로써 종양 이형접합성은 종양 진행에 걸친 손실의 누적을 반영한다. 말기 LOH 사건에서 상이한 종양 하위클론이 개발될 수 있고, 주어진 환자에서의 전암성 세포, 추정상 종양 줄기 세포 및 모든 종양 하위클론에 의해 공유되는 최소 LOH 특성의 존재는 규칙이 될 것으로 예상된다. 이러한 '트렁크(trunk)' LOH 패턴은 동일한 환자에서 모든 종양 세포를 함께 포괄하는 제한된 세트의 부분적으로 중첩되는 특징을 생성할 것이다.
심한 LOH 발생의 피할 수 없는 결과는 결실된 염색체 물질 상에 잔류하는 모든 다른 유전자의 부수적인 손실이고, 이는 자연적으로 막투과 단백질을 인코딩하는 다수의 유전자를 포함한다. 그들의 동일성과 관련하여, 3,702개의 다른 인간 세포 표면 단백질(서파시옴(surfaceome))의 카탈로그가 편집되었다 (Da Cunha 등, 2009). 서파시옴 유전자의
Figure pct00001
42%의 발현은 넓은 조직 분포를 보이며, 한편
Figure pct00002
85 유전자는 조사된 모든 조직에 의해 발현되고, 이는 하우스키핑 유전자의 특징이다. 이들 유전자는 후보 물질이며, 이의 상이한 다형성 변이체가 본 발명의 iCAR 및 aCAR에 대한 표적으로 역할을 할 수 있다.
보다 최근에는, Bausch-Fluck 등(Bausch-Fluck 등, 2015)은 이의 화학단백질 체세포 표면 캡쳐 기술을 적용하여 41 인간 세포 유형에서의 1492 세포 표면 당단백질의 조합된 세트를 확인하였다. 서파시옴의 대부분은 임의의 주어진 종양에 의해 발현되는 것으로 예상되며, 각각은 구별되는 프로파일을 나타낸다. 세포 표면 단백질을 인코딩한 유전자는 다른 모든 유전자보다 이의 인코딩 영역에서의 단일-뉴클레오티드 다형성 (SNP)을 위해 약간 풍부한 것으로 밝혀졌다 (Da Cunha 등, 2009). 희소한 다형성 인-프레임 삽입 및 결실은 변이체의 수에 기여하고, 펩티드 서열-변경 (비동의성) SNP보다 폴리펩티드 생성물에 대해 더 강한 구조적 효과를 발휘할 가능성이 있다. 전체적으로, 전형적인 게놈은 비동의성 변이체를 갖는 10,000 내지 12,000 부위 및 190-210 인-프레임 삽입/결실을 함유한다 (Abecasis 등, 2010; Auton 등, 2015). 이러한 변이체는 고도의 다형성 유전자 예컨대 HLA 유전자좌와 같은 게놈 전반에 균일하게 분포되지 못하거나 (http://www.ebi.ac.uk/imgt/hla/stats.html) 또는 특정 G 단백질 결합 수용체 (GPCR) 유전자 (Lee 등, 2003; Rana 등, 2001)는 별개의 변이체 "핫스팟"을 생성한다. LOH 관련 핫스팟의 다른 층은 다른 암에서의 특정 염색체, 또는 염색체 암 (예를 들어, 소세포 페암에서의 3p 및 17p (Lindblad-Toh 등, 2000), 대장암에서의 17P 및 18q (Vogelstein 등, 1989), 유방암에서의 17q 및 19 (Li 등, 2014; Wang 등, 2004), 흑색종에서의 9P (Stark and Hayward, 2007), 교모세포종에서의 10q (Ohgaki 등, 2004) 등)의 빈번한 손실로부터 비롯된다.
표면 단백질에서의 대립유전자 변이에서의 상당한 부분은 원칙적으로 고도의 특이적인 mAb에 의해 다른 변이체로부터 인식되고 구별될 수 있는 별개의 대립유전자-제한 에피토프를 잠재적으로 생성하는, 각 유전자 생성물의 세포외 부분에 영향을 줄 것이다. 단일 아미노산만 (예를 들어, 절묘한 특이성을 갖는 Ras 종양유전자의 점 돌연변이 생성물을 인식하는 mAb의 초기의 예를 참조한다(Carney 등, 1986))에서 차이가 있는 동일한 단백질의 2개의 변이체를 구별하는 mAb가 단리될 수 있음을 잘 문서화되어 있다. 증가적으로, 단일 아미노산에 대해 특이적인 2개의 mAb는 이의 중쇄 및 경쇄 V 유전자 집단으로부터 구조적으로 별개의 가변 영역을 사용할 수 있다 (Stark and Caton, 1991). 최근에, Skora 등 (Skora 등, 2015)은 돌연변이된 KRAS 및 EGFR 단백질 및 이의 야생형 대응체 (두 경우 하나의 아미노산에서 차이가 있음)로부터 유래된 HLA-I-결합된 네오펩티드를 구분할 수 있는 펩티드-특이적 scFv의 단리를 보고하였다.
종양 세포의 모두 함께 취해진 독특한 항원 특징이 나타나며, 이는 개개의 환자의 전신에서의 모든 다른 세포와 이의 확실한 구별을 가능하게 할 수 있다. 이는 LOH로 인해 종양 세포 표면에서는 부재이나, 이러한 유전자를 발현하는 기원 또는 다른 조직의 암 조직의 정상 세포 상에 존재하는 대립유전자 변이체의 의해 인코딩된 모든 막투과 단백질을 포함한다. 당연히 LOH에 의해 영향을 받은 각 유전자는 진정한 하우스키핑 유전자를 제외하고 조직 분포의 뚜렷한 패턴을 특징으로 한다. 대다수의 이러한 유전자는 형질전환된 표현형의 유지 또는 종양 형성에 직접적으로 관여하는 것으로 예상되지 않으며, 이러한 의미에서, 이의 손실은 '패신저' 특징이다.
위에서 제시한 이론적 근거는 독특한 분자 묘사는 정상 세포에 존재하는 수많은 다형성 표면 구조의 부재에 의해 표시되는 거의 모든 종양에 대해 불가피하게 LOH에 의해 형상화된다. 표적가능한 세트의 항원 에피토프에 대한 개개의 종양의 가정된 이러한 특징을 전환시키는 것은 특정 '부재'의 인식을 표적 세포 사멸을 유발할 수 있는 활성화된 신호로 번역하기 위한 실용적인 면역학적 전략을 수반한다. 중요하게는, 온 표적 오프 종양 반응성이 엄격하게 회피되는 것을 보장하기 위한 안전한 장치의 편입은 이러한 전량의 향후 임상 구현에 매우 유리하게 작용할 것이다.
본 발명은 한 쌍의 유전자의 각각의 치료적 킬러 세포에서의 공동-발현을 통한 이러한 극복 과제를 다룬다. 이러한 쌍에서의 하나의 파트너는 활성화 CAR (aCAR)를 인코딩하고, 다른 것은 보호 CAR (pCAR) 또는 억제 CAR (iCAR)를 인코딩한다.
본 발명은 정상 세포를 안전하게 유지하면서 종양 세포의 특이적 표적화를 가능하게 하는 새로운 방법을 제공한다는 것을 강조한다. 본원에 제공된 개념은 iCAR (또는 pCAR)에 대한 새로운 표적의 확인을 위해 제공되며, 이러한 표적은 다형성 세포 표면 에피토프의 단일 대립유전자 변이체를 포함하는 것으로 정의되며, 이는 정상 조직 상에 발현된 채로 유지하면서, 이들이 잔류하는 염색체 영역의 LOH로 인해 종양 세포로부터 손실된다. 다형성 변이 때문에, 2개의 대립유전자를 구분하고, 종양 세포에서 손실된 대립유전자만을 표적화하는 것이 가능하다. 또한, 표적 항원은 반드시 그 자체가 종양 억제 유전자, 또는 암과 관련되는 것으로 예상되는 유전자일 수 있고, 이는 LOH에 의해 손실된 영역에 있도록 이것이 선택되고, 이에 따라 간단하게 이러한 유전자에 연결될 수 있기 때문이다. 이는 암 요법에서 최근 이용되거나 또는 제안된 방법과 개념적으로 상이하며, 이는 종양 관련 항원 또는 다형성과 무관하게 종양에서 하향조절되는 항원을 표적화한다.
상기 구별은 중요하며, 이는 게놈 사건인 LOH이 손실된 대립유전자을 다시 얻을 매우 희박한 가능성과 함께 종양으로부터 특정 변이체의 총 손실을 야기한다. LOH 사건이 종양의 발달시에 매우 초기에 일어나고, 이는 전이성 종양을 포함하는 전암성 조직으로부터 유래된 모든 종양 세포에서의 균일한 표적 특징을 보장한다. 추가적으로, LOH는 암의 거의 모든 유형에서 발생되고, 이러한 개념은 이에 따라 모든 이러한 암 유형에 관련된 마커를 개발하기 위한 범용 도구로서 신뢰된다. LOH 사건이 어느 정도 무작위적이기 때문에, 본 발명은 환자에서 발생한 특정 LOH 사건에 기초하여 각각의 암 환자에 대해 개인화된 종양 마커의 선별을 위해 제공한다. 상기 도구는 이러한 개념을 실시하기 위해 의지되며, aCARs 및 iCARs은 잘 알려져 있으며, 예를 들어 WO 2015/142314 및 US 9,745,368에 교시된 바와 같이 본 기술분야에 잘 알려진 방법을 사용하여 용이하게 제조될 수 있으며, 이 둘은 본원에 완전하게 개시된 바와 같이 본원에 참조로 편입되어 있다.
하나의 전략에 따라, 주어진 쌍에서의 2개의 CAR은 본 특허가 이형접합성인 동일한 표적 유전자의 상이한 대립유전자 변이체의 생성물을 인식한다. 기본 원칙은 하기와 같다: aCAR은 주어진 종양 세포에 의해 발현되고 LOH의 영향을 받지 않는 선택된 세포 표면 단백질의 대립유전자 변이체를 표적화하고, 한편 pCAR 또는 iCAR은 LOH로 인하여 이러한 종양 세포로부터 손실된 동일한 유전자의 대립유전자 변이체에 의해 인코딩된 생성물을 표적화한다. 상기 유전자를 발현하는 개개의 이 환자의 다른 정상 조직에서, 두 대립유전자가 존재하며, 동일하게 작용하는 것으로 알려져 있고, 즉 발현은 모든 조직에서 이대립인자성이다 (이는 무작위적으로 단일대립유전자성 발현을 무작위적으로 나타낼 수 있는 다른 유전자와 대조됨, (Chess, 2012; Savova 등, 2016)). 하나의 시나리오에서, 2개의 CAR은 단백질 생성물 상의 동일한 위치에 잔류하는 2개의 관련 에피토프를 표적화하고, 이는 하나 또는 소수의 아미노산만 상이하다. 다른 시나리오에서, aCAR은 동일한 단백질상의 비다형성 에피토프를 표적화하고, 한편 pCAR 또는 iCAR은 대립유전자 특이적이다. 이러한 경우, 정상 세포 상에서 aCAR 에피토프의 밀도는 일반적으로 iCAR 또는 pCAR 것보다 2배 더 높을 것이다.
pCAR 또는 iCAR이 하우스키팅 유전자의 단백질 생성물을 표적화함에 따라 다른 전략을 이용한다. 정의에 의해, 이러한 유전자는 신체의 모든 세포 상에 존재하기 때문에, 이들은 pCAR 또는 iCAR에 대해 안전한 표적이다. 즉, pCAR 또는 iCAR이 주어진 환자가 이형접합체인 하우스키핑 유전자의 구성원 생성물을 표적화하는 경우, LOH로 인해 이러한 대립유전자가 손실된 종양 세포를 제외하고 신체에서의 모든 세포는 보호될 것이다. 이러한 전략은 pCAR 또는 iCAR의 것으로부터의 aCAR 표적 유전자 생성물을 분리할 수 있다. 사실상, aCAR은 이후 종양에 의해 발현된 임의의 비-다형성 에피토프일 수 있다. 이러한 전략의 변형은 비다형성 종양 관련 항원을 표적화하는 공지된 aCAR을 이용할 것이고, 예를 들어, iCAR 또는 pCAR와 조합하여 임상 사용시 또는 임상 시험에서의 조사 하의 aCAR은 주어진 환자가 이형접상성이고, 종양의 유래의 조직에서 적어도 발현되고, 바람직하게는 aCAR 표적 항원이 발현되는 추가적인 생존 정상 조직에서 발현되는 유전자의 구성원 생성물에 대해 유도된다.
iCAR에 의해 전송되는 억제 신호는 aCAR 신호보다 엄격하고 영구적으로 우세하고, iCAR과 aCAR 사이의 교차-인식이 발생되지 않음에 주의해야 한다. iCAR의 우위는 두 대립유전자를 발현하는 정상 세포와 만나는 경우에 킬러 세포의 활성화가 보호될 것임을 보장한다. 그러나, 이러한 기본 브레이크는 종양 세포와의 결합시 작동하지 않을 것이다: 이러한 표적 항원의 부재시 iCAR은 억제 신호를 전달하지 않고, 이에 따라 예상되는 aCAR 매개 세포 활성화 및 후속 종양 세포 용해를 일으킨다.
iCAR 기술은 면역 체크포인트를 기반으로 할 수 있다. 이와 관련하여, PD-1 및 CTLA-4의 조절 성분이 iCAR 신호전달 성분으로서 혼입되는 경우에 잠재적 T 세포 억제 능력을 가지는 것의 입증은 장려되지만, 이러한 관찰의 일반성은 최근 의문이 제기되었다 (Chicaybam and Bonamino, 2014, 2015). 또한, 이러한 체크포인트에 의해 유발된 정확한 분자 경로는 완전하게 이해되지 않지만, 이의 결합은 근위 및 원위 메커니즘을 통해 T 세포 활성화를 감쇠시키고, 이는 T 세포가 동시발생되는 활성화 자극에 비반응성이 되게 한다 (Nirschl and Drake, 2013). 이에 따라, PD-1과 CTLA-4 iCAR에 의해 보장된 불활성화 상태는 사실상 일시적이고, 비가역성일 수 있지만 (Fedorov 등, 2013b), 이는 iCAR 및 aCAR 표적 모두를 발현하는 조직에서의 T 세포 활성화를 가능하게 하지 않는다. 대조적으로, 수용체를 활성화하는 것에 대한 NK 억제 수용체의 우위는 건강한 세포가 시간 메커니즘보다 공간적 메커니즘을 통해 NK 세포 공격으로부터 회피되는 것을 보장한다 (Long 등, 2013). 단일 NK 세포는 억제성이면서 활성화된 리간드 모두를 발현하는 내성 세포를 회피할 수 있지만, 유일하게 활성화 리간드만을 발현하는 동시에 결합하는 민감성 세포를 사멸시킬 수 있다는 강력한 증거가 존재한다. 이러한 정교한 능력은 세포 용해 과립의 세포외배출에 결과적으로 영향을 주는 개개의 면역 시냅스 각각에서 형성되는 신호 전달 분자의 상이한 공간적 조직에 의해 지배된다 (예를 들어, Abeyweera 등, 2011; Eriksson 등, 1999; Treanor 등, 2006; Vyas 등, 2001; US 9,745,368).
iCAR에 의해 가해진 조절에 기초한 전략은 상기 설명된 바와 같이 aCAR 활성보다의 iCAR 활성의 우세에 좌우된다. 일 양태에서, 본 발명은 시냅스-선택적 방식으로 CAR T 세포에서 작동되고, 공동-발현된 aCAR보다 완전한 우세를 보장하도록 설계된 본원에 pCAR ('보호성 CAR의 경우, 도 1 참조)로 명명되는 전체 새로운 유형의 iCAR을 소개한다.
1. 2개의 상이한 폴리펩티드 생성물 상에 이들을 유전적으로 배치함으로써 인식 단위 및 공동-자극된 성분 (예를 들어, CD28, 4-1BB)으로부터 aCAR (FcRγ/CD3-ζ)의 활성화 모이어티를 분해함. aCAR 기능에 필수적인 이러한 성분의 재결합은 각각의 폴리펩티드 상에 혼입된 각각의 결합 부위를 별개로 가교결합할 수 있는 이종이량체화 약물의 첨가에 의해서만 일어날 것이다 (도 2b). 이종이량체화 약물에 의해 유사하게 분리 인식 및 활성화 모이어티를 가교결합시킴으로써 완전하게 작용화된 CAR의 재구성은 최근 Wu 등에 의해 보고되었다 (Wu 등, 2015). 이러한 목적을 위해, 이러한 저자는 FK506 결합 단백질 도메인 (FKBP, 104 아미노산) 및 FKBP-라파마이신 결합 도메인 (FRB, 89 아미노산)의 T2089L 돌연변이체 (라파마이신 유사체 AP21967의 존재 하에 이종이량체화됨, (반응식 I))을 사용하였다. 이 약물은 라파마이신에 비해 1000-배 적은 면역억제 활성을 가졌고 (Bayle 등, 2006; Graef 등, 1997; Liberles 등, 1997), 이는 상업적으로 이용가능하다 (ARGENTTM, 조절된 이종이량체화 키트, ARIAD).
반응식 I. AP21967의 구조
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2. PCAR 인식 단위 및 손실된 활성화 도메인을 각각 막내 절단 부위를 함유하는 RIP 제어 수용체의 막투과 도메인의 2개의 표면 상에서의 이식 (도 2a). pCAR의 이의 항원에의 결합은 우선 엑토도메인을 제거하는 세포외 디스인테그린 및 메탈로프로테이나아제 (ADAM) 부류의 구성원에 의해 그리고 이후 pCAR의 세포내 도메인을 배출하는 세포내 γ-세크라타제에 의해 인코딩된 폴리펩티드의 이중 절단을 유발할 것이다. 이러한 사건은 절단된 aCAR의 능력을 파괴하여 이의 손실된 활성화 성분의 기능성, 막고정 구조로의 접근을 가능하게 하고, 이로써 작동 모드가 얻어진다 (도 2c). 이러한 원리는 종양 세포 상의 2개의 상이한 항원의 동시적 인식에 대한 CAR T 세포 활성을 제한하도록 설계된 새로운 유전적 스위치의 개발시 최근에 이용되었고, 이는 노치 수용체 (Morsut 등, 2016; Roybal 등, 2016b) 또는 상피 세포 부착 분자 (EpCAM, Pizem, Y., M.Sc. 본 발명자의 감독 하의 논문)에 적용되고, 이 둘은 RIP를 통해 작용화된 익히 연구된 수용체이다. 이러한 연구에서, 하나의 항원에 대한 RIP-기반 CAR의 결합은 유전자-조작된 세포내 도메인을 방출하고, 이는 제2 CAR의 발현을 일으켜 세포 핵으로 전위된다. 이와 달리, 본 발명은 본 발명은 보호 항원의 존재 하에 임의의 잠재적 aCAR 활성을 무력화시키기 위해 유일하게 이러한 공정을 이용한다.
상기 기재된 목적된 작용 방식은 국소적 효과를 가하여 이로서 인접한 aCAR만이 영향을 받고, 더 이상 이의 항원에 생산적으로 결합하여 면역학적 시냅스를 형성할 수 없다. 결과적으로, 심지어 더 많은 수의 비-종양 세포와의 aCAR의 다중 상호작용이 일어날 수 있는 경우에, 이는 단지 세포가 완전한 추가의 상호작용을 할 수 있도록 일시적이거나 비기능성일 것으로 예상된다.
이의 aCAR 대응체보다의 pCAR의 우세는 이러한 시스템에 내재된 것이며, 이는 aCAR의 기능이 pCAR의 존재에 완전하게 좌우되기 때문이다. 주어진 T 세포에서 pCARs의 상대적인 단점은 활성화 도메인의 결핍으로 인하여 aCAR가 비기능성이 되게 할 것이다.
인식 도메인 및 활성화 도메인 모두가 원형질막에 국소화된다 (Wu 등, 2015). 따라서, 원형질막으로부터의 활성화 도메인을 탈착시키는 2차 절단은 이러한 도메인이 비기능성이 되게 하고, 원하지 않는 세포 활성화를 방지할 것이다.
aCAR과 pCAR은 상호 배타적인 메커니즘을 통해 기능하도록 설계된다. 절단이 진행되게 하는 pCAR의 능력은 억제 신호전달의 강도에 좌우되지 않고, 이로써 신호전달 결과에 대한 완료가 일어나지 않는다. pCAR이 절단되는 한, aCAR은 각각의 항원과의 이의 상호 작용의 상대성에 상관없이 작용하지 않을 수 있고, 이는 또 다른 중요한 안전 수준을 보장한다.
모든 관련 기술은 이의 표적에 aCAR 및 pCAR 또는 iCAR의 특이적 결합을 부여하는 인식 모이어티를 조작하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 이러한 iCAR-aCAR 라이브러리를 포함하는 인식 모이어티는 조합 디스플레이 라이브러리로부터 이상적으로 선택된 마스터 인식 모이어티 집단으로부터 유도될 수 있고, 이로써 하기와 같다:
- 총체적으로, 선택된 인식 모이어티는 모든 22 인간 상염색체의 2개의 암 각각에 존재하는 다수의 유전자의 세포-표면 생성물을 표적화한다. 이웃하는 유전자 사이의 거리가 짧을수록 적용 범위가 더 커지므로 사용의 보편성이 더 커진다.
- 각각의 선택된 유전자에 대해, 한 세트의 대립유전자-특이적 인식 모이어티가 단리되며, 각각은 인간 개체군에서 유세한 상이한 대립유전자 변이체 사이의 엄격한 구별이 가능하다. 표적화된 변이체의 수가 많을수록 환자에게 제공할 수 있는 치료 유전자 쌍의 수가 많아진다.
주어진 대립유전자 생성물은 각 경우에서 특별한 LOH 패턴에 따라 한 환자에서의 잠재적인 pCAR 또는 iCAR 표적 및 동일한 대립유전자를 가진 다른 환자에서의 유용한 aCAR 표적이 될 수 있다. 따라서, 적절한 인식 부위 유전자가 확인됨에 따라, 각각은 pCAR 또는 iCAR 및 aCAR 유전자 스캐폴드 모두 상에 이식될 것이다. 따라서, 동일한 유전자의 대립유전자 변이체에 대한 모든 인식 모이어티가 유사한 범위의 결합 친화도를 갖는 것이 바람직하다. 이러한 주어진 일련의 인식 모이어티 내에서, pCAR-aCAR 또는 iCAR-aCAR 쌍의 모든 가능한 조합은 사전조합되어 전체 집단에서의 이 유전자의 잠재적 대립유전자 합성물의 최고 범위를 보장할 수 있다.
보다 일반적인 시나리오에서, 환자는 주요 대립유전자와 이형접합성이며, 소수의 것인 이의 생성물은 비동의성 SNP 또는 덜 빈번하게는 인델의 결과로서 인코딩된 폴리펩티드와 함께 단일 위치에서 상이하다. 덜 일반적인 시나리오에서, 환자는 2개의 별개의 위치에서 주요의 것과 상이한 2개의 소수의 대립유전자에 대해 이형접합성이다. 개개의 환자에서의 상기 유전자를 수반하는 특정 LOH 사건에 따라, 주어진 변이체 에피토프는 한 환자에서 iCAR 표적으로, 다른 표적에서 aCAR 표적으로 역할을 할 수 있다.
변이체 특이적 mAb (즉, 소수 대립유전자 'a'에 의해 코딩되는 에피토프에 특이적인 mAb)의 동정은 본 기술분야에 잘 알려져 있고, 원칙적으로 이는 임의의 종래의 항원 결정기에 대한 mAb의 동정과 유사하고, 이는 보통 예를 들어 파지 (Barbas 등, 2004), 리보솜 (Hanes 등, 1997) 또는 효모 (Chao 등, 1997) 디스플레이 기술을 이용하여 재조합 항체 scFv 라이브러리의 고 처리량 스크리닝을 통해 최상으로 달성될 수 있다. 라이브러리 스크리닝에 사용되는 항원은 2개의 대립유전자 (전형적으로 길이가 15-20 아미노산 이상) 사이의 변이의 위치 사이에 있는 합성 펩타이드, 상업적으로 이용가능하거나 또는 본 기술분야에서 활동하는 다수의 회사 중 하나에 의해 맞춤-합성될 수 있는 재조합 전장 폴리펩티드, 또는 심지어 유전자 전달에 의해 높은 수준으로 상기 대립유전자 변이체를 발현하는 전체 세포 (예를 들어, pGEM4Z/A64 벡터로의 체외 mRNA 전사를 위한 템플레이트로서 클론화된 전장 cDNA를 인코딩하는 mRNA의 전기천공법 (Boczkowski 등, 2000))일 수 있고, 동일한 세포에 대해 수행된 공제(subtraction) 단계 이후 이러한 대립유전자가 발현되지 않는다. 이러한 방법은 잘 알려져 있고, 예를 들어 문헌[Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Fourth Edition) Green and Sambrook, Cold Spring Harbor Laboratory Press; Antibodies: A Laboratory Manual (Second Edition), Edited by Edward A. Greenfield, 2012 CSH laboratory press; Using Antibodies, A laboratory manual by Ed Harlow and David Lane, 1999 CSH laboratory press]에 기재되어 있다.
정의에 따라, 주요 대립유전자 ('A')에 의해 인코딩된 상응하는 에피토프 (동일 위치의 경우)는 단일 아미노산 (SNP) 또는 길이 (인델)의 동정에서 'a'에 의해 생성된 것과 상이한 독특한 항원 결정기를 생성한다. 이 결정기는 원칙적으로 상기의 것, 또는 다른 항체 디스플레이 스크리닝 기술에 의해 동정된 상이한 세트의 mAb에 의해 인식될 수 있다. 2개의 세트의 동정된 mAb 각각에서의 별개의 구성원의 2개의 에피토프 사이에서 구분하는 능력, 즉, 'A'가 아닌 대립유전자 'a'의 생성물을 결합시키는 제1 세트로부터의 항체 및 'a'가 아닌 'A'를 상호결합시키는 제2 세트로부터의 Ab는 종래의 결합 분석법 예컨대 ELISA 또는 유동 세포 계측법을 사용하여 결정될 수 있다 (Skora 등, 2015). 대안적으로, 'a'-결합 Ab가 동정되고, 이는 'A'를 결합하지 않고, 이의 단백질 서열이 결정되고, 계산 방법이 'a'가 아닌 'A'를 결합하는 '상보적' 항체 scFv의 서열을 예상하기 위해 잠재적으로 사용될 수 있다. 이러한 계산 방법에 대해 예를 들어 (Sela-Culang 등, 2015a,b)을 참조한다.
표적 유전자로서 HLA-부류 I 유전자좌 유전자 HLA-A, HLA-B 및 HLA-C를 나타내는 개별적 예에서, 이용가능한 다수의 대립유전자-특이적 단클론 항체, 예를 들어 실시예 3에 열거된 항체가 존재한다.
이들 항체의 가변 영역을 인코딩하는 서열은 관련 하이브리도마로부터 용이하게 클로닝될 수 있고, 예를 들어 문헌[Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Fourth Edition) Green and Sambrook, Cold Spring Harbor Laboratory Press; Antibodies: A Laboratory Manual (Second Edition), Edited by Edward A. Greenfield, 2012 CSH laboratory press; Using Antibodies, A laboratory manual by Ed Harlow and David Lane, 1999 CSH laboratory press]에 개시된 바와 같이 널리 이용가능한 도구를 사용하여 CAR 구조로의 혼입에 적합한 특정 HLA 부류-I 대립유전자 에피토프 변이체에 대해 scFv를 인코딩하는 유전자를 구축하는데 사용될 수 있다.
본 발명은 LOH로 인해 종양 세포에서 손실되고, 세포 표면 생성물을 인코딩하고, 여기서 DNA 서열에서의 변이가 인코딩된 단백질의 세포외 도메인에서의 아미노산 서열에서의 변이를 야기한다. 공공 국립 연구소 건강의 TCGA 데이터 포털 (https://gdc.cancer.gov/)에서 이용가능한 일반 공중에게 공개된 다수의 데이터베이스 예컨대 TCGA(이는 그 중에서 http://www.cbioportal.org에서의 TCGA 데이터에 대한 다양한 종양 유형 및 cbio 포탈에서의 유전자의 상대적 복제 수를 추정하는데 사용될 수 있는 데이터를 제공함 (Cerami 등, 2012, Gao 등, 2013)); 그 중에서도 다양한 집단에서의 SNP 변이체의 대립유전자 빈도를 제공하는 엑솜 집합체 컨소시엄(ExAC) 데이터베이스 (exac.broadinstitute.org, Lek 등, 2016); 유전자의 조직 발현 데이터를 포함하는 유전자형-조직 발현 (GTEX) 데이터베이스 v6p (dbGaP Accession phs000424.v6.p1); 및 단백질의 구조 정보를 제공하는 데이터베이스, 예컨대 인간 단백질 Atlas(Human Protein Atlas) (Uhlen 등, 2015); 세포 표면 단백질 Atlas (Bausch-Fluck 등, 2015), N-글리코실화 세포-표면 단백질의 질량 분석기 기반 데이터베이스, 및 UniProt 데이터베이스 (www.uniprot.org/downloads)로부터 정보를 받았다.
본 발명은 또한 LOH를 겪는 발현된 세포 표면 단백질을 인코딩하는 유전자의 게놈 전체 동정 방법을 제공한다. 동정된 유전자는 다음 기준을 충족해야 한다: 1) 유전자는 막투과 단백질을 인코딩하고 - 이에 따라 iCAR 결합을 가능하게 하는 세포 표면에 발현된 부분을 가짐; 2) 유전자는 적어도 2개의 발현된 대립유전자 (확인된 적어도 한 민족 집단에서의 경우)를 가짐; 3) 그 유전자에 대해 발견된 대립유전자 변이는 단백질의 세포외 영역에서 참조 서열과 관련하여 아미노산 변화를 야기함; 4) 유전자는 암에서 LOH를 겪는 염색체 부위에 위치함; 5) 유전자는 LOH를 겪는 것으로 밝혀진 해당 영역에서의 종양 유형의 유래 조직에서 발현된다.
원칙적으로, 상기 기재된 바와 같은 iCAR 결합을 위해 표적을 인코딩하는 유전자는 데이터베이스 마이닝에의서만이 아닌 본 기술분야에 공지된 임의의 방법에 의해 식별될 수 있다. 예를 들어, LOH의 개념은 새로운 것은 아니며, 특정 종양에서의 특이적 유전자, 염색체, 또는 게놈/염색체 영역에 대한 LOH 정보는 문헌에서 이미 공개되어 있고, 후보 유전자는 따라서 이용가능한 공보로부터 유래될 수 있다. 대안적으로, 이러한 정보는 마이크로 프로브와 같은 염색체 마커 전체 게놈 혼성화에 의해 (Medintz 등, 2000, Genome Res. 2000 Aug; 10(8): 1211-1218) 또는 임의의 적합한 방법에 의해 (Ramos and Amorim, 2015, J. Bras. Patol. Med. Lab. 51(3):198-196) 찾을 수 있다.
유사하게는, 대립유전자 변이체에 관한 정보는 다양한 데이터베이스에서 공개적으로 이용가능하며, 또한 의심되는 영역의 게놈 시퀀싱에 의해 개인화된 경우에 대해 용이하게 수득될 수 있다. 또한, 단백질 구조 및 발현 패턴에 관한 정보는 공개적으로 입수 가능하며 상기 기재된 바와 같이 용이하게 접근가능하다.
따라서, 수많은 유전자와 SNP에 대한 다양한 기준에 대한 정보가 공개되어 있고, 이를 검색하는 기술이 일반적으로 알려져 있기 때문에, 응용분야의 주요 새로운 점은 iCAR 인식을 위해 표적을 선택하는 기준으로서의 LOH를 사용하는 것과 특정 환자에서 손실된 특정 대립유전자에 기초한 개인화 치료의 개념이다.
비제한적인 예로서, 다양한 빈도수로 HLA-A, HLA-B 및 HLA-C는 다수의 종양 유형에서 상대적으로 빈번한 사건이고 (도 4 참조), 이는 이러한 유전자가 본 발명의 목적을 위해 iCAR 인식의 표적으로 사용하기에 좋은 후보가 되게 한다.
pCAR 또는 iCAR 표적이 없는 건강한 필수 조직에서 정상 세포에 대한 aCAR 표적의 인식은 유해하고 엄격하게 금지된다. 이와 관련하여, 본원에 제시된 pCAR-aCAR 또는 iCAR-aCAR 쌍의 개념은 하기와 같이 페일-세이프(fail-safe) 활성화 스위치를 구성한다: i) (aCAR 및 pCAR 또는 iCAR가 동일한 유전자의 상이한 생성물을 표적화하는 경우에서) 선택된 유전자가 발현되지 않는 세포는 aCAR 표적 항원의 부재로 인해 표적화되지 않을 것이고; ii) 이 동일한 유전자를 발현하는 정상 세포는 두 대립유전자를 공동 발현할 것이고, pCAR 또는 iCAR의 우세로 인해 표적화되지 않을 것이고; iii) pCAR 또는 iCAR가 다형성 하우스키핑 유전자의 생성물을 표적화하는 경우에서, 신체에서의 모든 세포는 보호될 것이다. iv) aCAR 표적을 발현하나 pCAR 또는 iCAR 표적을 발현하지 않는 종양 세포만 공격을 받는다.
위에서 강조한 바와 같이, 활성화 신호보다의 억제 신호의 영구적인 우세는 절대적으로 필수적이다. 따라서, aCAR 유전자가 이의 iCAR 보호가 없는 경우에 언제든지 주어진 킬러 세포에서 발현되지 않도록 보장하는 것이 중요하다. 이는 단일 사슬 생성물로서 이러한 iCAR-aCAR 유전자 쌍의 탠덤 어셈블리(tandem assembly)를 통해 또는 예를 들어 내부 리보솜 진입 부위 또는 다수의 바이러스 자가-절단 2A 펩티드 중 하나에 기초한 적합한 이중-시스트론 양상을 통해 실시될 수 있다. 이중-시스트론 발현에 대해 보고된 방대한 양의 데이터에 의해 제시되는 바와 같이, iCAR 유전자는 항상 바람직한 화학양론을 보장하기 위해 이의 aCAR 대응물의 업스트림에 항상 위치할 것이다. 물론, pCAR-aCAR 유전자 쌍을 사용하는 경우에 이것은 문제가 되지 않는다.
iCAR의 우세를 보장하는 또 다른 매력적인 선택사항은 활성화/보조 자극 부분으로부터 aCAR 인식 모이어티를 분리하여 이로써 두 개체는 유일하게 이종이량체화 소분자의 존재 하에 하나의 기능성 수용체로 어셈블링될 수 있다. 적절한 시점, 투여량, 및 위치에 의해 이러한 수용체의 작동 상태를 엄격하게 조절하는 능력은 항종양 CAR의 맥락에서 최근 입증되었다 (Wu 등, 2015).
또한, 예상된 우세는 또한 선택된 aCAR 플랫폼의 신호 강도와 '경쟁해야 하는' 선택된 iCAR 설계의 세포내 부분에 혼입된 iCAR 신호전달 성분의 특정 조성에 대해 내재될 가능성이 있다. 이러한 능력은 또한 각각의 표적 에피토프 (상기에서 언급함)에 대한 2개의 인식 모이어티의 상대적 친화도 및 이의 상호작용의 전체적인 가능성에 의해 영향을 받을 것이다. 후자와 관련하여, 제안된 전략은 유리한 iCAR/aCAR 화학양론 및 정상 세포 상의 이의 각각의 표적 에피토프의 균형된 분포 모두를 보장한다. 또 다시, 이는 pCAR-aCAR 유전자 쌍을 사용할 때 문제가 되지 않는다.
안전성을 더욱 확실하게 하기 위해, 예컨대 자살 유전자의 사용 또는 일시적인 발현을 위한 mRNA 전기천공의 사용과 같은 CAR 및 TCR 면역요법의 기술분야에서 현재 실시되는 다른 종래의 수단이 이용될 수 있다.
LOH는 종종 주어진 유전자의 단 하나의 대립유전자를 가진 세포를 남겨두며, 이는 '복제수 중성'-LOH를 야기하는 잔류 염색체 또는 염색체 부분의 복제에 의해 달성된다 (Lo 등, 2008; O'Keefe 등, 2010; Sathirapongsasuti 등, 2011). 이러한 상황에서, 에피토프-손실 변이체의 출현은 2개의 독립적인 사건을 요구하며, 이는 이에 따라 가능성이 낮다. 유전자 변형 세포의 상이한 분율로의 다수의 pCAR-aCAR 또는 iCAR-aCAR 쌍을 발현하는 것은 심지어 '복주세 손실' LOH 경우에서 돌연변이 회피체(mutational escapee)의 출연을 방지할 것이고, 이는 표적 대립유전자의 단일 복제만이 유지된다.
상기의 관점에서, 하나의 양태에서, 본 발명은 효과기 면역 세포의 바람직하지 않은 활성화를 방지하거나 또는 감쇠시킬 수 있는 억제 키메라 항원 수용체 (iCAR)를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자를 제공하며, 상기 iCAR은 이형접합성 (LOH)의 손실로 인하여 포유동물 종양 세포에 존재하지 않지만, 관련 포유동물 정상 조직의 모든 세포 상에 적어도 존재하는 다형성 세포 표면 에피토프의 단일 대립유전자 변이체에 특이적으로 결합하는 세포외 도메인; 및 효과기 면역 세포를 억제하는 적어도 하나의 신호 전달 성분을 포함하는 세포내 도메인을 포함한다.
특정 구현예에서, 다형성 세포 표면 에피토프는 종양 억제 유전자 또는 종양 억제 유전자에 유전적으로 연결된 유전자에 의해 인코딩된 항원의 일부이고, 이는 이러한 유전자는 종양에서의 LOH로 인해 손실될 가능성이 있다. 추가적으로, 다형성 세포 표면 에피토프는 암세포에서 LOH를 종종 겪게 되는 염색체 또는 염색체 암, 예컨대, 비제한적으로 염색체 암 3p, 6p, 9p, 10q, 17p, 17q, 또는 18q, 또는 염색체 19에 일반적으로 잔류하는 유전자에 의해 인코딩된 항원의 일부일 수 있다. 이러한 에피토프는 본원에 기재된 상대적 데이터베이스에서 용이하게 확인될 수 있다.
특정 구현예에서, 다형성 세포 표면 에피토프는 하우스키핑 유전자 생성물, 예컨대 미분류된 AP2S1, CD81, GPAA1, LGALS9, MGAT2, MGAT4B, VAMP3; 세포 접착 단백질 CTNNA1 NM_001903, CTNNB1, CTNNBIP1 NM_020248, CTNNBL1 NM_030877, CTNND1 NM_001085458 델타 카테닌; 채널 및 수송체 ABCB10 NM_012089, ABCB7 NM_004299, ABCD3 NM_002857, ABCE1 NM_002939, ABCF1 NM_001090, ABCF2 NM_005692, ABCF3 NM_018358, CALM1 [1][7] 칼모둘린 그랩스 칼슘 이온, MSFD10 일명 TETRAN 또는 테트라사이클린 수송체에 유사 단백질 [1]과 유사한 MFSD11 NM_024311, MFSD12 NM_174983, MFSD3 NM_138431, MFSD5 NM_032889, SLC15A4 NM_145648, SLC20A1 NM_005415, SLC25A11[1] 미토콘드리아 옥소글루타레이트/말레이트 캐리어, SLC25A26 NM_173471, SLC25A28 NM_031212, SLC25A3 NM_002635, SLC25A32 NM_030780, SLC25A38 NM_017875, SLC25A39 NM_016016, SLC25A44 NM_014655, SLC25A46 NM_138773, SLC25A5 NM_001152, SLC27A4 NM_005094, SLC30A1 NM_021194, SLC30A5 NM_022902, SLC30A9 NM_006345, SLC35A2 NM_005660, SLC35A4 NM_080670, SLC35B1 NM_005827, SLC35B2 NM_178148, SLC35C2 NM_015945, SLC35E1 NM_024881, SLC35E3 NM_018656, SLC35F5 NM_025181, SLC38A2 NM_018976, SLC39A1 NM_014437, SLC39A3 NM_144564, SLC39A7 NM_006979, SLC41A3 NM_017836, SLC46A3 NM_181785, SLC48A1 NM_017842, ACVRL1 TGF 베타 수용체 부류 오슬러-웨버-량뒤 증후군과 유사한 수용체 ACVR1 NM_001105, ACVR1B NM_004302, CD23[1] FCER2 저친화도 IgE 수용체 (렉틴); 및 HLA/면역글로불린/세포 인식기 BAT1 일명 DDX39B (이는 RNA 스플라이싱에 관여됨), BSG Basigin 면역글로불린 상과, 세포외 메탈로프로테이나아제, MIF 마크로파지 이동 억제 인자, TAPBP [위키페디아]의 것이다.
특정 구현예에서, 하우스키핑 유전자는 HLA 유형 I, G-단백질-결합된 수용체 (GPCR), 이온 채널 또는 수용체 티로신 키나아제, 바람직하게는 HLA-A, HLA-B 또는 HLA-C이다.
임의의 관련 기술은 이의 표적에 특이적으로 결합하는 aCAR 및 pCAR 또는 iCAR에 부여된 인식 모이어티를 조작하기 위해 사용될 수 있다. 특정 구현예에서, 세포외 도메인은 (i) 항체, 이의 유도체 또는 절편, 예컨대 인간화된 항체; 인간 항체; 항체의 기능성 절편; 단일-도메인 항체, 예컨대 나노바디; 재조합 항체; 및 단일 사슬 가변 절편 (ScFv); (ii) 항체 모방체 예컨대 결합 분자; 어피린, 어피머, 어피틴; 알파바디; 안티칼린; 아비머; DARPin; 피노머; 쿠니츠 도메인 펩티드; 및 모노바디; 또는 (iii) 압타머를 포함한다. 바람직하게는, 세포외 도메인은 ScFv를 포함한다.
특정 구현예에서, 포유동물 조직은 인간 조직이고, 다른 구현예에서, 관련 포유동물 정상 조직은 종양이 발달되는 정상 조직이다.
특정 구현예에서, 효과기 면역 세포는 T 세포, 자연 킬러 세포 또는 사이토카인-유도 킬러 세포이다.
특정 구현예에서, 효과기 면역 세포를 억제할 수 있는 적어도 하나의 신호 전달 성분은 면역 체크포인트 단백질, 예컨대 PD1; CTLA4; BTLA; 2B4; CD160; CEACAM, 예컨대 CEACAM1; KIRs, such as KIR2DL1, KIR2DL2, KIR2DL3, KIR2DL4, KIR2DL5A, KIR2DL5B, KIR3DL1, KIR3DL2, KIR3DL3, LIR1, LIR2, LIR3, LIR5, LIR8 및 CD94-NKG2A; LAG3; TIM3; T 세포 활성화의 V-도메인 Ig 억제제 (VISTA); INterferon 유전자의 자극제 (STING); 면역수용체 티로신-기반 억제 모티프 (ITIM)-함유 단백질, T 세포의 면역 글로불린과 ITIM 도메인 (TIGIT), 아데노신 수용체 (예를 들어, A2aR)로 이루어진 군으로부터 선택된 면역 체크포인트 단백질에 대해 상동성이다.
특정 구현예에서, 면역 체크포인트 단백질은 자연 킬러 세포 억제 수용체, 예를 들어, KIR, 예컨대 KIR2DL1, KIR2DL2, KIR2DL3, KIR2DL4, KIR2DL5A, KIR2DL5B, KIR3DL1, KIR3DL2, KIR3DL3; 또는 백혈구 Ig-유사 수용체, 예컨대 LIR1, LIR2, LIR3, LIR5, LIR8; 및 CD94-NKG2A, C-유형 렉틴 수용체 (CD94를 갖는 이종이량체를 형성하고, 2 ITIM을 함유함)이다.
iCAR에서 킬러 세포 수용체를 제조하고 이를 사용하는 방법은 제9,745,368호에 기재되어 있고, 이는 본원에 완전하게 개시된 것처럼 참조로 포함되어 있다.
특정 구현예에서, 상기 구현예의 임의의 하나의 세포외 도메인은 가요성 힌지 및 막투과 캐노닉 모티브를 통해 융합된다.
특정 구현예에서, iCAR은 에프린 수용체 (예를 들어, EPHA 7) 및 클라우딘을 포함하지 않는 항원의 단일 대립유전자 변이체에 유도되거나 또는 이에 특이적으로 결합된다.
특정 구현예에서, iCAR은 HLA-A 유전자, HLA-B 유전자 또는 HLA-C 유전자의 단일 대립유전자 변이체에 의해 인코딩되는 에피토프에 유도되거나 또는 이에 특이적으로 결합된다.
추가의 양태에서, 본 발명은 상기 구현예 중 임의의 하나에서 정의된 본 발명의 핵산 분자, 및 적어도 하나의 조절 성분, 예컨대 핵산 분자에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 벡터를 제공한다.
특정 구현예에서, 벡터는 추가로 항원의 비다형성 세포 표면 에피포트 또는 다형성 세포 표면 에피토프의 단일 대립유전자 변이체를 특이적으로 결합하는 세포외 도메인으로서, 여기서 에피토프는 종양-관련 항원이거나 또는 관련 종양 및 정상 조직의 세포에 의해 공유되는 세포외 도메인, 및 효과기 면역 세포를 활성화하고 및/또는 공동자극되는 적어도 하나의 신호 전달 성분을 포함하는 세포내 도메인을 포함하는 aCAR를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자를 포함한다.
특정 구현예에서, 벡터에 포함된 핵산에 의해 인코딩되는 aCAR의 세포외 도메인은 항원의 비다형성 세포 표면 에피토프에 특이적으로 결합하고, iCAR의 세포외 도메인은 상기 aCAR 결합의 세포외 도메인에 대한 것보다 상이한 항원의 다형성 세포 표면 에피토프의 단일 대립유전자 변이체에 특이적으로 결합한다.
특정 구현예에서, 벡터에 포함된 핵산에 의해 코딩되는 iCAR의 세포외 도메인은 HLA-A 유전자, HLA-B 유전자 또는 HLA-C 유전자의 단일 대립유전자 변이체에 대해 유도되거나 또는 이에 특이적으로 결합한다.
특정 구현예에서, 벡터에 포함된 핵산에 의해 코딩되는 aCAR의 세포외 도메인은 표 1에 열거된 항원, 예컨대 CD19로부터 선택된 비다형성 세포 표면 에피토프에 유도되거나 또는 이에 특이적으로 결합된다.
특정 구현예에서, 벡터에 포함된 핵산에 의해 코딩되는 iCAR의 세포외 도메인은 HLA-A 유전자, HLA-B 유전자 또는 HLA-C 유전자의 단일 대립유전자 변이체에 대해 유도되거나 또는 이에 특이적으로 결합되며; 벡터에 포함된 핵산에 의해 코딩되는 aCAR의 세포외 도메인은 표 1에 열거된 항원, 예컨대 CD19로부터 선택된 비다형성 세포 표면 에피토프에 유도되거나 또는 이에 특이적으로 결합된다.
특정 구현예에서, 효과기 면역 세포를 활성화하거나 또는 공동-자극되는 aCAR의 적어도 하나의 신호 전달 요소는 예를 들어 CD3ζ 또는 FcRγ 사슬의 면역수용체 티로신-기반 활성화 모티프 (ITAM); 양전하 하전된 아미노산 잔기, 또는 양전하 하전된 측쇄 또는 예를 들어, KIR2DS 및 KIR3DS의 활성화 KIR 막투과 도메인, 또는 어댑터 분자 예컨대 DAP12; 또는 예를 들어 CD27, CD28, ICOS, CD137 (4-1BB) 또는 CD134 (OX40)의 공동-자극된 신호 전달 성분을 포함하는 활성화 킬러 세포 면역글로불린-유사 수용체 (KIR)의 막투과 도메인에 대해 상동성이다.
특정 구현예에서, 벡터의 뉴클레오티드 서열은 aCAR에 대해 인코딩된 뉴클레오티드 서열과 iCAR에 대해 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열 사이의 내부 리보솜 진입 부위 (IRES)를 포함한다. 일반적으로, aCAR에 대해 인코딩하기 위한 뉴클레오티드 서열 및 iCAR에 대해 인코딩하기 위한 뉴클레오타이드 서열은 임의의 순차적인 순서일 수 있고, 그러나 특정 구현예에서, aCAR에 대해 인코딩하기 위한 뉴클레오티드 서열은 iCAR에 대해 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열의 다운스트림에 있다.
특정 구현예에서, 벡터의 뉴클레오타이드 서열은 aCAR에 대해 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열과 iCAR에 대해 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열 사이의 바이러스 자가-절단 2A 펩타이드를 포함한다. 특히, 바이러스 자가-절단 2A 펩타이드는 토세아 아사인아 바이러스 (TaV)로부터의 T2A, 구제역 바이러스 (FMDV)로부터의 F2A, 말 비염 A 바이러스 (ERAV)로부터의 E2A 및 돼지 테스코바이러스-1 (PTV1)의 P2A로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
특정 구현예에서, 벡터는 상기 iCAR에 유연한 링커를 통해 연결된 구성적 aCAR을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
면역 세포는 예를 들어 RNA 형질주입에 의해 또는 진핵 세포 또는 바이러스 벡터에서 복제 및/또는 전사에 적합한 플라스미드에 혼입시킴으로써 본원에 기재 된 적절한 핵산 분자로 형질주입시킬 수 있다. 특정 구현예에서, 벡터는 레트로 바이러스 또는 렌티 바이러스 벡터로부터 선택된다.
레트로 바이러스 벡터 및 적절한 패키징 라인의 조합이 또한 사용될 수 있고, 여기서 캡시드 단백질은 인간 세포를 감염시키는데 기능적일 수 있다. 다수의 양쪽성 바이러스-생성 세포주는 공지되어 있고, 이는 문헌[PA12 (Miller, 등 (1985) Mol. Cell. BioI. 5:431-437); PA317 (Miller, 등 (1986) Mol. Cell. Bioi. 6:2895-2902)]; 및 문헌[CRIP (Danos, et ai. (1988) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 85:6460-6464)]을 포함한다. 대안적으로, 비-양쪽성 입자, 예컨대 VSVG, RD 114 또는 GAL V 엔벨로프(envelope)와의 위형인 입자가 사용될 수 있다. 세포는 추가로 예를 들어 문헌[Bregni, et ai. (1992) Blood 80: 1418-1422]의 방법에 의해, 또는 문헌[Xu, et ai. (1994) Exp. Hemat. 22:223-230; and Hughes, et ai. (1992) J Clin. Invest. 89: 1817]의 방법에 의해 바이러스 상등액 단독 또는 농축된 벡터 저장액으로의 배양에 의해 생산자 세포를 갖는 직접 공동-배양액에 의해 형질도입된다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 상기 정의된 바와 같은 본 발명에 따라 효과기 면역 세포의 바람직하지 않은 활성화를 방지하거나 또는 감쇠시킬 수 있는 억제 키메라 항원 수용체 (iCAR)를 제조하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 (i) 공지된 변이체의 적어도 하나의 데이터베이스로부터 단백질-인코딩 유전자의 인간 게놈 변이체의 목록을 검색하는 단계; (ii) (a) 이의 해당하는 기준 대립유전자와 비교하여 각각의 유전자에 의해 인코딩되는 단백질에서의 아미노산 서열 변이를 야기하는 변이체를 선별하는 것, (b) 아미노산 서열 변이가 인코딩된 단백질의 세포외 도메인 내에 존재하는 유전자의 변이체를 선별하는 것, (c) 적어도 하나의 종양에서 이형접합성 (LOH)의 손실을 겪는 유전자의 변이체를 선별하는 것, 및 (d) (c)에 따라 LOH를 겪는 적어도 하나의 종양의 유래의 조직에서 적어도 발현되는 유전자의 변이체를 선별하는 것에 의해 (i)에서 검색된 변이체의 목록을 필터링하는 단계; (iii) (ii)에서 얻은 목록으로부터 적어도 하나의 단일 변이체를 포함하는 서열 영역을 한정하고, 적어도 하나의 단일 변이체를 포함하는 서열 영역 및 상응하는 기준 대립유전자를 포함하는 서열 영역을 서브-클로닝하고, 발현하여 각각의 에피토프 펩티드를 수득하는 단계; (iv) 클론화된 서열 영역에 의해 인코딩된 에피토프 펩타이드, 또는 (iii)에서 얻은 해당하는 기준 대립유전자에 의해 인코딩된 에피토프 펩타이드에 특이적으로 결합하는 iCAR 결합 도메인을 선별하는 단계; 및 (vii) 각각이 (iv)에 정의된 바와 같은 iCAR 결합 도메인을 포함하는 상기 본원에 정의된 iCAR을 제조하는 단계를 포함한다.
특정 구현예에서, 선택된 유전자의 후보 변이체는 특정 종양 유형에서 적어도 2%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 100%으로 LOH를 겪고 있다.
특정 구현예에서, 선택된 각각의 변이체에 대한 소수 대립유전자 빈도는 적어도 하나의 집단에서 1, 2, 3, 4 또는 5% 이상이다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 안전한 효과기 면역 세포의 제조 방법을 제공하며, 이는 하기 단계를 포함한다: (i) 종양-관련 항원에 유도된 TCR-조작된 효과기 면역 세포를 상기 정의된 바와 같은 iCAR을 인코딩한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산 분자로 형질주입되거나 또는 세포를 제9항의 벡터로 형질도입시키는 단계; 또는 (ⅱ) 미접촉 효과기 면역 세포를 상기 정의된 바와 같은 iCAR을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열 및 상기 정의된 바와 같은 aCAR을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산 분자로 형질주입시키거나; 또는 효과기 면역 세포를 상기 정의된 바와 같은 벡터로 형질도입시키는 단계.
또 다른 양태에서, 본 발명은 전술한 바와 같은 본 발명의 방법에 의해 수득된 안전한 효과기 면역 세포를 제공한다. 안전한 효과기 면역 세포는 외인성 T 세포 수용체 (TCR) 및 iCAR을 발현하는 재유도화된 T 세포일 수 있고, 여기서 외인성 TCR은 항원의 비다형성 세포 표면 에피토프 또는 다형성 세포 표면 에피토프에 유도되고, 상기 에피토프는 관련 종양 항원이거나 또는 관련 종야 또는 정상 조직의 세포에 의해 적어도 공유되거나, iCAR은 상기 정의된 바와 같거나; 또는 안전한 효과기 면역 세포는 재유도된 효과기 면역 세포 예컨대 자연 킬러 세포 또는 T 세포 (상기 정의된 바와 같은 iCAR 및 aCAR를 발현함)이다.
특정 구현예에서, 안전한 효과기 면역 세포는 항원의 비다형성 세포 표면 에피토프에 특이적으로 결합하는 세포외 도메인을 포함하는 aCAR 및 상기 aCAR의 세포외 도메인이 결합하는 상이한 항원의 다형성 세포 표면 에피토프의 단일 대립유전자 변이체에 특이적으로 결합하는 세포외 도메인을 포함하는 iCAR을 이의 표면에 발현한다. 특정 구현예에서, iCAR의 세포외 도메인은 상기 aCAR의 세포외 도메인이 결합하는 동일한 항원의 상이한 다형성 세포 표면 에피토프의 단일 대립유전자 변이체를 결합하거나; 또는 iCAR의 세포외 도메인은 상기 aCAR의 세포외 도메인이 결합하는 동일한 다형성 세포 표면 에피토프 영역의 상이한 단일 대립유전자 변이체에 특이적으로 결합한다.
특정 구현예에서, 세포 표면 상에 발현되는 aCAR의 세포외 도메인은 표 1에 열거된 항원, 예컨대 CD19으로부터 선택된 비다형성 세포 표면 에피토프에 특이적으로 결합한다.
특정 구현예에서, 세포 표면 상에 발현되는 iCAR의 세포외 도메인은 HLA-A 유전자, HLA-B 유전자 또는 HLA-C 유전자의 단일 대립유전자 변이체에 대해 유도되거나 또는 이에 특이적으로 결합된다.
특정 구현예에서, 세포 표면 상에 발현되는 iCAR의 세포외 도메인은 HLA-A 유전자, HLA-B 유전자 또는 HLA-C 유전자의 단일 대립유전자 변이체에 대해 유도되거나 또는 이에 특이적으로 결합하며; 세포 표면 상에 발현되는 aCAR의 세포외 도메인은 표 1에 열거된 항원, 예컨대 CD19으로부터 선택된 비다형성 세포 표면 에피토프에 유도되거나 또는 이에 특이적으로 결합한다.
특정 구현예에서, aCAR 및 iCAR은 개별 단백질로서 세포 표면 상에 존재한다.
특정 구현예에서, iCAR을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열의 세포 표면 상의 발현 수준은 aCAR을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열의 발현 수준 이상이다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 LOH를 특징으로 하는 종양을 갖는 대상체에 대해 개인화된 바이오마커를 선택하는 방법을 제공하며, 상기 방법은, (ⅰ) 대상으로부터 종양 생검을 수득하는 단계; (ⅱ) 대상체로부터의 정상 조직의 샘플, 예를 들어, PBMC를 수득하는 단계; (iii) LOH로 인해 종양의 세포에 의해 발현되지는 않지만 정상 조직의 세포에 의해 발현되는 다형성 세포 표면 에피토프의 단일 대립유전자 변이체를 동정함으로써 대상체에 대한 개인화된 바이오마커를 동정하는 단계를 포함한다.
특정 구현예에서, 바이오마커는 대상체의 치료를 맞춤화하기 위해 사용되고, 이로써 상기 방법은 추가로 상기 정의된 효과기 면역 세포를 환자에게 투여하는 것을 포함하는 LOH를 특징으로 하는 종양을 갖는 환자에서 암을 치료하는 단계를 포함하며, 여기서 iCAR은 (iii)에서 동정된 단일 대립유전자 변이체에 유도된다.
추가의 양태에서, 본 발명은 상기 정의된 효과기 면역 세포를 환자에게 투여하는 것을 포함하는 LOH를 특징으로 하는 종양을 갖는 환자에서 암의 치료 방법을 제공하며, 여기서 iCAR은 이형접합성 (LOH)의 손실로 인한 종양의 세포에 존재하지 않지만 환자의 관련 포유동물 정상 조직의 모든 세포 상에 적어도 존재하는 다형성 세포 표면 에피토프를 인코딩하는 단일 대립유전자 변이체에 유도된다.
유사한 양태에서, 본 발명은 상기 정의된 바와 같은 효과기 면역 세포를 환자에게 투여하는 것을 포함하는, LOH를 특징으로 하는 종양을 갖는 대상체에서 종양 부담을 감소시키는 방법을 제공하며, 여기서 iCAR은 이형접합성 (LOH)의 손실로 인한 종양의 세포에 존재하지 않지만 환자의 관련 포유동물 정상 조직의 모든 세포 상에 적어도 존재하는 다형성 세포 표면 에피토프를 인코딩하는 단일 대립유전자 변이체에 유도된다.
다른 유사한 양태에서, 본 발명은 상기 정의된 바와 같은 효과기 면역 세포를 환자에게 투여하는 것을 포함하는, LOH를 특징으로 하는 종양을 갖는 대상체의 생존률을 증가시키는 방법을 제공하며, 여기서 iCAR은 이형접합성 (LOH)의 손실로 인한 종양의 세포에 존재하지 않지만 환자의 관련 포유동물 정상 조직의 모든 세포 상에 적어도 존재하는 다형성 세포 표면 에피토프를 인코딩하는 단일 대립유전자 변이체에 유도된다.
다른 추가의 양태에서, 본 발명은 LOH를 특징으로 하는 종양을 갖는 환자에서 치료하거나, 종양 부담을 감소시키거나, 또는 생존률을 증가시키기 위한 상기 정의된 바와 같은 안전한 효과기 면역 세포에 유도되고, 여기서 iCAR은 이형접합성 (LOH)의 손실로 인한 종양의 세포에 존재하지 않지만 환자의 관련 포유동물 정상 조직의 모든 세포 상에 적어도 존재하는 다형성 세포 표면 에피토프를 인코딩하는 단일 대립유전자 변이체에 유도된다.
또 다른 추가의 양태에서, 본 발명은 LOH를 특징으로 하는 종양을 갖는 환자에서 암을 치료하는 방법에 관한 것이고, 상기 방법은 (i) LOH로 인해 종양의 세포에 의해 발현되지 않지만, 정상 조직의 세포에 의해 발현되는 다형성 세포 표면 에피토프의 단일 대립유전자 변이체를 동정하기 위해 정보를 확인하거나 또는 수신하는 단계, (ii) 항원의 비다형성 세포 표면 에피토프 또는 다형성 세포 표면 에피토프의 단일 대립유전자 변이체를 동정하기 위해 정보를 확인하거나 또는 수신하는 단계로서, 상기 에피포트는 종양 관련 항원이거나 또는 상기 암 환자에서의 적어도 관련 종양 및 정상 조직의 세포에 의해 공유되는 단계; (iii) 본원에서 정의된 바와 같은 iCAR을 정의하는 하나 이상의 핵산 분자 및 본원에서 정의된 바와 같은 aCAR을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 하나 이상의 핵산 분자, 또는 본원에서 정의된 바와 같은 하나 이상의 벡터를 선별하거나 또는 수신하는 단계로서, 여기서 iCAR은 (i)의 세포 표면 에피토프에 특이적으로 결합하는 세포외 도메인을 포함하고; aCAR은 (ii)의 세포 표면 에피토프에 특이적으로 결합하는 세포외 도메인을 포함하는 단계; (iv) (iii)의 핵산 분자로 효과기 면역 세포를 형질주입시키거나 또는 (iii)의 벡터로 효과기 면역 세포를 형질도입함으로써 안전한 재유도된 효과기 면역 세포의 적어도 하나의 집단을 준비하거나 또는 수신하는 단계; 및 (v) (iv)의 안전한 재유도된 면역 효과기 세포의 적어도 하나의 집단을 상기 암 환자에게 투여하는 단계를 포함한다.
유사한 양태에서, 본 발명은 LOH를 특징으로 하는 종양을 갖는 환자에서 암을 치료하기 위한 안전한 재유도된 면역 효과기 세포의 적어도 하나의 집단을 제공하며, 여기서 안전한 재유도된 면역 세포는 (i) LOH로 인해 종양의 세포에 의해 발현되지 않으나, 정상 조직의 세포에 의해 발현되는 다형성 세포 표면 에피토프의 단일 대립유전자 변이체를 동정하기 위해 정보를 확인하거나 또는 수신하는 단계, (ii) 항원의 비다형성 세포 표면 에피토프 또는 다형성 세포 표면 에피토프의 단일 대립유전자 변이체를 동정하기 위해 정보를 확인하거나 또는 수신하는 단계로서, 상기 에피토프는 종양 관련 항원이거나 또는 상기 암환자에서의 관련 종양 및 정상 조직의 적어도 세포에 의해 공유되는 단계; (iii) 본원에 정의된 iCAR을 정의하는 하나 이상의 핵산 분자 및 본원에 정의된 aCAR을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 적어도 하나의 핵산 분자, 또는 본원에 정의된 적어도 하나의 벡터를 선별하거나 또는 수신하는 단계로서, iCAR은 (i)의 세포 표면 에피토프에 특이적으로 결합하는 세포외 도메인을 포함하고; aCAR은 (ii)의 세포 표면 에피토프에 특이적으로 결합하는 세포외 도메인을 포함하는 단계; (iv) (iii)의 핵산 분자로 효과기 면역 세포를 형질전환시키거나 또는 (iii)의 벡터로 효과기 면역 세포를 형질도입함으로써 안전한 재유도된 효과기 면역 세포의 적어도 하나의 집단을 준비하거나 또는 수신하는 단계에 의해 수득된다.
암의 치료 또는 암의 치료에 사용하기 위한 안전한 면역 효과기 세포에 관한 상기 구현예 중 임의의 하나를 언급하는 특정 구현예에서, (i) iCAR의 세포외 도메인은 aCAR의 세포외 도메인이 결합하는 것과 상이한 항원인, 항원의 다형성 세포 표면 에피토프의 단일 대립유전자 변이체를 특이적으로 결합하고; (ii) 상기 iCAR의 세포외 도메인은 상기 aCAR의 세포외 도메인이 결합하는 동일한 항원의 상이한 다형성 세포 표면 에피토프의 단일 대립유전자 변이체에 특이적으로 결합하고; 또는 (iii) 상기 iCAR의 세포외 도메인은 상기 aCAR의 세포외 도메인이 결합하는 동일한 다형성 세포 표면 에피토프의 상이한 단일 대립유전자 변이체에 특이적으로 결합한다.
특정 구현예에서, 치료는 암 환자에게 (iii)의 aCAR을 발현하지만 (iii)의 iCAR이 결핍된 면역 효과기의 적어도 하나의 집단을 투여하는 단계를 포함하는 치료와 비교하여 감소된 온-표적, 오프-종양 반응성을 야기한다.
특정 구현예에서, 상기 정의된 바와 같이 암을 치료하는데 사용되는 안전한 효과기 면역 세포는 이의 표면 상에 종양-관련 항원 또는 항원의 비다형성 세포 표면 에피토프에 특이적으로 결합하는 세포외 도메인을 포함하는 aCAR 및 상기 aCAR의 세포외 도메인이 결합하는 상이한 항원인 HLA-A, HLA-B 또는 HLA-C와 같은 하우스키핑 단백질 또는 종양의 유래의 조직에서 적어도 발현되는 항원의 다형성 세포 표면 에피토프의 단일 대립유전자 변이체에 특이적으로 결합하는 세포외 도메인을 포함하는 iCAR을 발현한다.
특정 구현예에서, 1개 초과의 집단의 면역 효과기 세포가 투여되며, 상이한 집단은 상이한 쌍의 aCAR 및 iCAR (상이한 유전자 생성물의 세포 표면 에피토프에의 특이적인 결합을 가짐)을 발현한다.
특정 구현예에서, 암의 치료 방법에서 사용되는 안전한 효과기 면역 세포는 T 세포, 자연 킬러 세포 또는 사이토카인 유도 킬러 세포로부터 선택된다. 특정 구현예에서, 안전한 효과기 면역 세포는 자가 또는 범용 (동종이계) 효과기 세포이다. 특정 구현예에서, 상기 정의된 암의 치료 방법에서의 임의의 하나에서 사용되는 iCAR은 aCAR의 표적 항원이 존재하는 환자의 모든 조직에 관한 것이고, 여기서 aCAR의 표적 항원이 항원의 비다형성 세포 표면 에피토프이거나 또는 다형성 세포 표면 에피토프의 단일 대립유전자 변이체가 존재하고, 상기 에피토프는 종양 관련 항원이거나 또는 관련 종양 및 정상 조직의 세포에 의해 적어도 공유된다.
특정 구현예에서, 암은 급성 골수 백혈병 [LAML], 부신피질 암종 [ACC], 방광 요상피 암종 [BLCA], 뇌 저급 신경아교종 [LGG], 유방 침습성 암종 [BRCA], 자궁경부 편평상피 세포 암종 및 자궁경내 선암종 [CESC], 담관암종 [CHOL], 결장 선암종 [COAD], 식도 암종 [ESCA], 다형상 교모세포종 [GBM], 두경부 편평상피 세포 암종 [HNSC], 신장 혐색소 [KICH], 신장 투명 신세포 암종 [KIRC], 신장 신장 유두상 세포 암종 [KIRP], 간 간세포 암종 [LIHC], 폐 선암종 [LUAD], 폐 편평상피 세포 암종 [LUSC], 림프양 신생물 미만성 큰 B-세포 림프종 [DLBC], 중피종 [MESO], 난소 장액 낭샘암종 [OV], 췌장 선암종 [PAAD], 크롬친화세포종 및 부신경절종 [PCPG], 전립선 선암종 [PRAD], 직장 선암종 [READ], 육종 [SARC], 피부 흑색종 [SKCM], 위 선암종 [STAD], 고환 생식세포 종양 [TGCT], 흉선종 [THYM], 갑상선 암종 [THCA], 자궁 암육종 [UCS], 자궁 체부 자궁내막암종 [UCEC], 포도막 흑색종 [UVM]으로부터 선택된다.
특정 구현예에서, 암, 상기 언급된 암 유형 중 임의의 하나를 치료하기 위한 iCAR은 HLA-A 유전자, HLA-B 유전자 또는 HLA-C 유전자의 단일 대립유전자 변이체에 대해 유도되거나 또는 이에 특이적으로 결합된다.
특정 구현예에서, 암, 상기 언급된 암 유형 중 임의의 하나를 치료하는데 사용되는 aCAR은 표 1에 열거된 항원, 에컨대 CD19으로부터의 비다형성 세포 표면 에피토프에 유도되거나 또는 이에 구체적으로 결합된다.
특정 구현예에서, 암, 상기 언급된 암 유형 중 임의의 하나를 치료하는데 사용되는 iCAR은 HLA-A 유전자, HLA-B 유전자 또는 HLA-C 유전자의 단일 대립유전자 변이체에 유도되거나 또는 이에 특이적으로 결합되고; 상기 언급된 암 유형 중 임의의 하나를 치료하는데 사용되는 aCAR은 표 1에 열거된 항원, 에컨대 CD19으로부터의 비다형성 세포 표면 에피토프에 유도되거나 또는 이에 구체적으로 결합된다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 각각 상이한 수의 조절된 효과기 면역 세포 활성화 시스템을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 둘 이상의 핵산 분자의 조합에 관한 것이고, 상기 핵산 분자는 단일 연속 핵산 분자의 일부이거나 또는 이를 형성하거나, 또는 2개 이상의 별개의 핵산 분자를 포함하고, 여기서 조절된 효과기 면역 활성화 시스템은 효과기 면역 세포를 킬러 종양 세포로 유도하며, 상기 킬러 종양 세포는 이형접합성 (LOH)의 손실로 인하여 하나 이상의 염색체 또는 그의 분획을 손실하고 관련 정상 조직의 세포를 공유하고, 여기서 (a) 제1 구성원은 항원의 비다형성 세포 표면 에피토프 또는 상이한 다형성 세포 표면 에피토프의 단일 대립유전자 변이체에 특이적으로 결합하는 제1 세포외 도메인을 포함하는 활성화 키메라 항원 수용체 (aCAR)를 포함하고, 상기 비다형성 또는 다형성 세포 표면 에피토프는 종양-관련 항원이거나 또는 관련 비정상 및 정상 포유동물 조직의 세포에 의해 공유되거나; (b) 제2 구성원은 LOH로 인해 비정상적인 포유동물 조직에 의해 발현되지 않지만 관련 포유동물 정상 조직의 모든 세포 상에 존재하는 다형성 세포 표면 에피토프의 단일 대립유전자 변이체에 특이적으로 결합하는 제2 세포외 도메인을 포함하는 조절 폴리펩티드를 포함한다.
특정 구현예에서, 제1 구성원은 (a) 효과기 면역 세포를 활성화하고 및/또는 동시-자극하는 적어도 하나의 신호 전달 성분을 포함하는 세포내 도메인을 더 포함하는 구성적 aCAR; 및 (b) 이종이량체화 소분자 및 임의로 적어도 하나의 동시-자극 신호 전달 성분에 대한 결합 부위의 제1 구성원을 포함하나, 활성화 신호 전달 성분이 결핍된 세포내 도메인을 더 포함하는 조건적 aCAR로부터 선택되고; 제2 구성원은 (c) 효과기 면역 세포를 억제하는 적어도 하나의 신호 전달 성분을 포함하는 세포내 도메인을 더 포함하는 억제 키메라 항원 수용체 (iCAR); 또는 (d) 쉐데이즈에 대한 기질을 포함하는 세포외 조절 영역; 막내-절단 프로테아제에 대한 기질을 포함하는 막투과 캐노닉 모티프; 및 세포내 도메인으로서 효과기 면역 세포를 활성화하고 및/또는 동시-자극하는 적어도 하나의 신호 전달 성분을 포함하는 세포내 도메인 및 이종이량체화 소분자에 대한 결합 부위의 제2 구성원을 더 포함하는 보호 키메라 항원 수용체 (pCAR)이다.
특정 구현예에서, (i) iCAR 또는 pCAR의 세포외 도메인은 aCAR의 세포외 도메인이 결합하는 것과 상이한 항원인, 항원의 다형성 세포 표면 에피토프의 단일 대립유전자 변이체를 특이적으로 결합하거나; (ii) 상기 pCAR 또는 iCAR의 세포외 도메인은 상기 aCAR의 세포외 도메인이 결합하는 동일한 항원의 상이한 다형성 세포 표면 에피토프의 단일 대립유전자 변이체를 특이적으로 결합하거나; 또는 (iii) 상기 pCAR 또는 iCAR의 세포외 도메인은 상기 aCAR의 세포외 도메인이 결합되는 동일한 다형성 세포 표면 에피토프의 상이한 단일 대립유전자 변이체를 특이적으로 결합한다.
특정 구현예에서, 쉐데이즈에 대한 기질은 디스인테그린 및 메탈로프로테이나아제 (ADAM) 또는 베타-세크리타아제1 (BACE1)에 대한 기질이다. 특정 구현예에서, 기질은 세포외 도메인의 일부를 형성하고, Lin 12/노치 반복 및 ADAM 프로테아제 절단 부위를 포함한다.
일반적으로, ADAM 절단을 예측하는 일관된 서열 모티프가 존재하지 않지만, Caescu 등(Caescu 등, 2009)은 표 2에서 대다수의 ADAM10 및/또는 ADAM17 기질 서열을 개시하고 있고, 이는 본원에 전체적으로 개시된 바와 같이 참조로 포함되어 있고, 이는 본 발명의 pCAR에서의 ADAM에 대한 기질로서 작용할 수 있다. 특정 구현예에서, ADAM 기질 서열은 아밀로이드 전구체 단백질, BTC, CD23, 콜라겐, DII-1, 에볼라 당단백질, E-카데린, EGF, 에피레굴린, Fas 리간드, 성장 호르몬 수용체, HB-EGF, II형 인터루킨 IL-6 수용체, L-셀렉틴, N-카데린, 노치, p55 TNF 수용체, p75 TNF 수용체, Pmel17, 프리온 단백질, 수용체-유형 단백질 티로신 포스파타아제 Z, TGF-α, TNF 또는 TR의 것이다 (Caescu 등, 2009).
본 발명의 pCAR에서의 ADAM10 절단 서열을 사용하는 것이 유리할 수 있으며, 이는 ADAM10이 예를 들어 림프구에 대한 비슷한 높은 수준에서 구조적으로 존재한다. ADAM10과 대조적으로, 가장 가까운 TACE/ADAM17은 자극받지 않은 세포에 대해 단지 낮은 수준으로만 검출된다. T 세포 모세포 상의 ADAM17 표면 발현이 자극에 의해 빠르게 유도된다 (Ebsen 등, 2013).
Hemming 등(Hemming 등, 2009)은 BACE1 절단을 예측하는 일관된 서열 모티프는 기질 대 비-기질에서 동정되지 않았으나, 표 1에서 BAC1 절단 서열을 갖는 다수의 BACE1 기질을 개시하고 있고, 이는 본원에서 그 전체가 개시된 것과 같이 참조로 편입되어 있고, 이는 본 발명의 pCAR에서의 BACE1에 대한 기질로서 역할을 할 수 있다.
특정 구현예에서, 막내-절단 프로테아제에 대한 기질은 SP2, γ-세크리타제, 신호 펩티드 펩티다아제 (spp), spp-유사 프로테아제 또는 정사방형 프로테아제에 대한 기질이다.
Rawson 등 (Rawson, 2013)은 SP2 기질이 적어도 하나의 2형 막관통 나선을 가지고, SP2 기질에 나선-불안정화 모티프, 예컨대 Asp-Pro 모티프를 포함한다. 이 논문에서, 표 1에 SP2-절단 서열을 갖는 다수의 SP2 기질을 개시하고 있으며, 이는 본 발명의 pCAR에서 SP2에 대한 기질로 작용할 수 있고, 이는 그 전문이 본원에 개시된 것과 같이 본원에 참조로 편입되어 있다.
Haapasalo 및 Kovacs (Haapasalo and Kovacs, 2011)은 아밀로이드-β 단백질 전구체 (AβPP)는 프레세닐린 (PS)-의존성 γ-세크리타아제 (PS/γ-세크리타아제)에 대한 기질이고, 적어도 90개의 추가의 단백질은 이러한 효소 복합체에 의해 유사한 단백질 분해를 겪는 것을 교시하고 있다. γ-세크리타아제 기질은 일부 일반적인 특징을 가진다: 대부분의 기질 단백질은 I-형 막투과 단백질이고; PS/γ-세크리타아제-매개된 γ-유사 절단 (AβPP에서의 ε-절단에 해당함, 이는 AICD를 배출함)은 막투과 및 세포질 도메인의 경계에서 또는 그 부근에서 일어난다. ε-유사 절단 분위는 라이신 및/또는 아르기닌 잔류물에 풍부한 한 구역의 소수성 아미노산 서열의 부근에 있다. PS/γ-세크리타아제 절단은 절단 부위에 있거나 또는 이에 인접한 특정 아미노산 표적이 아닌, 아마도 막투과 도메인의 입체형태 상태에 좌우되는 것으로 보여준다. Haapasalo 및 Kovacs는 표 1에서 γ-세크리타아제 기질의 목록을 개시하고 있고, 이는 본 발명의 pCAR에서 γ-세크리타아제에 대한 기질로서 역할을 할 수 있고, 이의 절단 서열은 그 전문이 본원에 개시된 것과 같이 본원에 참조로 편입되어 있다.
Voss 등 (Voss 등, 2013)은 지금까지 기질 내의 1차 서열 성분에 기초한 공통 절단 부위가 GxGD 아스파르틸 프로테아제 (spps)에 대해 기재되어 있지 않음을 교시하고 있다. 막 단백질의 막관통 도메인은 α-나선 편향(α-helical confirmation)을 우선적으로 채택하고, 이에서 이의 펩타이드 결합은 프로테아제에 거의 접근할 수 없다. 막투과 도메인이 막내 단백질분해에 대해 민감성이 되게 하도록, 이에 따라 이의 α-나선 함량은 헬릭스 불안정화 아미노산에 의해 감소되게 할 필요가 있는 것으로 상정된다. 이러한 가설과 일치되게, 다양한 신호 펩티드는 SPP에 의해 이의 단백질 분해 과정을 결정적으로 영향을 미치는 이의 h-영역 내의 헬릭스 불안정화 아미노산을 함유하는 것으로 나타낸다. 또한, 신호 펩티드의 h-영역 내의 극성 잔기는 SPP에 의한 분리에 영향을 미칠 수 있고, 예를 들어 다양한 HCV 균주의 신호 펩티드 내의 세린 및 시스테인 잔기는 SPP 절단에 중요하다. 이러한 극성 잔기가 또한 신호 펩티드의 나선 함량에 간단하게 영향을 미치는지 여부 또는 특히 하이드록실 또는 설프하이드릴기가 SPP에 의한 분리를 유발하는데 필요한지 여부는 아직 완전하게 이해되지 않는다. 유사하게는, SPPL2b에 의한 Bri2 막투과 도메인의 절단은 Bri2 막투과 도메인의 α-나선 함량이 감소되는 경우에 상당하게 증가시키고 있다. 흥미롭게도, 추정되는 나선 불안정화 효능을 갖는 4개의 잔기 중 단지 하나의 아미노산 잔기만이 인지질 기반 환경에서 Bri2 막투과 도메인의 α-나선 함량을 감소시켰다. 이는 α-나선 막투과 도메인의 불안정화는 간단하게 특정 아미노산 잔기에 의해 야기되지 않고, 아미노산의 배경 및 위치가 이들의 나선 불안정화 잠재성을 결정하고, 이에 따라 SPP/SPPL에 의한 막내 단백질 분해에 대한 막투과 도메인의 접근가능성을 결정한다. Voss 등은 추가로 표 1에서 spp 및 spp-유사 기질의 목록을 개시하고 있고, 이의 절단 서열은 그 전문이 본원에 개시된 것과 같이 본원에 참조로 편입되어 있고, 이는 본 발명의 pCAR에서 spp에 대한 기질로 작용할 수 있다.
Bergbold 등(Bergbold and Lemberg, 2013)은 정사방형 프로테아제의 경우, 기질 인식을 위한 2개의 상이한 모델이 제시되었음을 교시하고 있다. 제1 모델에서, 정사방형 활성 부위의 근접되는 멤브레인의 함침하는 것과 조합되는 기질 펩티드 골격의 입체구조 유연성이 특이성을 제공하는데 충분하다. 잘-특성화된 초파리 기질 Spitz, 글리신-알라닌 모티프는 장사방형 활성 부위로의 막투과 도메인이 펼쳐지게 하는 나선 파단으로서 역할을 하는 것을 나타내었다. 제2 모델은 정사방형 프로테아제가 주로 절단 부위를 둘러싼 특정 서열을 인식하고, 막투과 나선-불안정화 잔기가 일부 기질에 대해서만 요구되는 제2 특징인 것을 제시한다. 특정 서열은 아직 확인되지 않았다. Bergbold 등은 표 2에서 정사방형 프로테아제 기질의 목록을 개시하고 있고, 이의 절단 서열은 그 전문이 본원에 개시된 것과 같이 본원에 참조로 편입되어 있고, 이는 본 발명의 pCAR에서 정사방형 프로테아제에 대한 기질로서 역할을 할 수 있다.
상기 검토에서와 같이, 대부분의 경우에서 막내 절단 프로테아제에 대한 공통 모티프가 아직 확립되어 있지 않고, 막내 절단 프로테아제 기질을 동정하기 위한 검정이 상기 본원에 인용된 문헌에서 기재된 바와 같이 본 기술분야에 공지되어 있기 때문에, pCAR 그 자체로 동정된 아미노산 서열을 포함할 수 있으며, 막투과 나선-불안정화 잔기를 더 포함할 수 있다.
특정 구현예에서, 기질은 막투과 캐노닉 모티프의 일부를 형성하고, 이는 노치, ErbB4, E-카데린, N-카데린, 에프린-B2, 아밀로이드 전구체 단백질 또는 CD44의 막투과 도메인과 상동성이고/이로부터 유도된다.
특정 구현예에서, 이는 별개의 단백질로서 상기 조건적 aCAR의 세포외 도메인 및 세포내 도메인을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 여기서 각각의 도메인은 독립적으로 막투과 캐노닉 모티프에 융합되고, 이종이량체화 소분자에 대한 결합 부위의 상이한 구성원을 포함한다.
특정 구현예에서, 이종이량체화 소분자에 대한 결합 부위의 제1 및 제2 구성원의 각각은 하기로부터 선택된 단백질로부터 유도된다: (i) 타크로리무스 (FK506) 결합 단백질 (FKBP) 및 FKBP; (ii) FKBP 및 칼시뉴린 촉매 서브유닛 A (CnA); (iii) FKBP 및 시클로필린; (iv) FKBP 및 FKBP-라파마이신 관련 단백질 (FRB); (v) 자이레이즈 B (GyrB) 및 GyrB; (vi) 디하이드로폴레이트 환원효소 (DHFR) 및 DHFR; (vii) DmrB 단일이량체화 도메인 (DmrB) 및 DmrB; (viii) PYL 단백질 (일명 아브시스산 수용체 및 RCAR) 및 ABI; 및 (ix) GAI 애기 장대 단백질 (일명 지베렐린산 인센서티브 및 DELLA 단백질 GAI; GAI) 및 GID1 애기 장대 단백질 (또한 지베렐린 수용체 GID1; GID1).
정의:
본원에 사용된 용어 "핵산 분자"는 DNA 또는 RNA 분자를 나타낸다.
본원에서 사용된 용어 "게놈 변이체"는 동일 게놈 위치에서 기준 또는 공통 서열과 비교하여 서열화된 샘플에서 게놈 수준에서 적어도 하나의 뉴클레오타이드의 변화를 지칭한다.
변이체와 관련하여 본원에 사용된 용어 "상응하는 기준 대립유전자"는 변이체와 동일한 게놈 위치에 있는 기준 또는 공통 서열 또는 뉴클레오타이드를 의미한다.
용어 "세포외 도메인"은 단백질과 관련하여 본원에 사용된 바와 같이 세포막 외부에 있는 단백질의 영역을 의미한다.
본원에서 사용된 용어 "이형 접합성의 상실"또는 "LOH"는 체세포에서 2개의 염색체의 하나의 복제에서 완전한 염색체 또는 그의 일부와 같은 염색체 물질의 손실을 의미한다.
변이체 또는 기준 대립유전자와 관련하여 사용되는 용어 "서열 영역"은 변이체의 위치로부터 업스트림에서 시작되고, 다운스트림에서 종료되는 서열을 의미하고, 이는 항체로 인식될 수 있는 "에피토프 펩티드"로 번역될 수 있다.
다형성 세포 표면 에피토프의 단일 대립유전자 변이체에 특이적으로 결합하는 scFv와 같은 세포외 도메인의 맥락에서 본원에서 사용된 용어 "특이적 결합"은 하나의 대립유전자 변이체에 대한 scFv의 상대적인 결합 및 동일한 다형성 세포 표면 에피토프의 상응하는 상이한 대립유전자 변이체에 결합하는 이의 불능을 언급한다. 이는 사용되는 특이적 CAR의 결합활성 (T 세포 상의 CAR 복제의 수, 표적 세포 (또는 보호되는 세포)의 표면 상의 항원 분자의 수) 및 사용되는 특이적 CAR의 친화도에 좌우되기 때문에, 기능적 정의는 특이적 scFv는 그것이 특이적인 다형성 세포 표면 에피토프의 단일 대립유전자 변이체에 대해 ELISA에서 중요한 신호를 제공하거나, scFv를 나타내는 CAR로 형질 감염된 세포는 다형성 세포 표면 에피토프의 단일 대립유전자 변이체로 명확하게 표지될 것이며, 한편 동일한 다형성 세포 표면 에피토프의 상응하는 상이한 대립유전자 변이체를 사용하는 동일한 검정이 임의의 검출가능한 신호를 제공하지 않을 것이다.
본원에 사용된 용어 "치료하는"은 원하는 생리적 효과를 얻는 수단을 지칭한다. 그 효과는 질환 및/또는 질환에 기인한 증상을 부분적으로 또는 완전하게 치료하는 관점에서 치료적일 수 있다. 상기 용어는 질환을 억제하는 것, 즉, 이의 발달을 방지하는 것; 또는 질환의 완화, 즉 질환의 차도를 일으키는 것을 지칭한다.
본원에서 사용된 용어 "대상체", "사람" 또는 "동물" 또는 "환자" 또는 "포유동물"은 진단, 예후 또는 치료가 요구되는 임의의 대상, 특히 포유 동물 대상, 예를 들어, 인간을 지칭한다.
본 발명에 따라 사용하기 위한 약학 조성물은 하나 이상의 생리학적으로 허용 가능한 캐리어 또는 부형제를 사용하여 종래의 방식으로 제형화될 수 있다. 캐리어(들)은 조성물의 다른 성분과 상용성인 의미에서 "허용가능성"이어야 하고, 이의 수용자에게 유해하지 않아야 한다.
캐리어, 투여 방식, 투여 형태 등의 하기 예시는 담체, 투여 방식, 투여 형태 등이 본 발명과 함께 사용될 수 있는 공지된 가능성으로서 열거되어 있다. 그러나, 당업자는 선택된 제제 및 투여 방식이 먼저 그것이 원하는 결과를 달성하는지를 결정하기 위해 시험되어야 한다는 것을 이해할 것이다.
투여 방법은 비제한적으로, 비경구, 예를 들어 정맥내, 복강내, 근육내, 피하, 점막 (예를 들어, 경구, 비강내, 협측, 질내, 직장, 안와내), 척추강내, 국소 및 피부내 경로를 포함한다. 투여는 전신적 또는 국소적일 수 있다. 특정 구현예에서, 약제학적 조성물은 경구 투여에 적합하다.
용어 "캐리어"는 활성제가 투여되는 희석제, 보조제, 부형제 또는 비히클을 지칭한다. 약제학적 조성물 내의 캐리어는 결합제, 예컨대 미세결정질 셀룰로오스, 폴리비닐피롤리돈 (폴리비돈 또는 포비돈), 트라가칸트 검, 젤라틴, 전분, 락토오스 또는 락토스 일수화물; 붕해제 예컨대 알긴산, 옥수수 전분 등; 윤할제 또는 계면활성제, 예컨대 마그네슘 스테아레이트 또는 소듐 라우릴 술페이트; 및 활택제, 예컨대 콜로이드 이산화규소를 포함할 수 있다.
경구 투여의 경우, 약제학적 제제는 액체 형태, 예를 들어, 용액, 시럽 또는 현탁액일 수 있거나, 또는 사용하기 이전에 물 또는 다른 적합한 비히클로 재구성하기 위한 약품으로서 존재할 수 있다. 이러한 액체 제제는 약학적으로 허용가능한 첨가제, 예를 들어 현탁화제 (예를 들어, 소르비톨 시럽, 셀룰로오스 유도체 또는 수소화된 식용 지방); 유화제 (예를 들어, 레시틴 또는 아카시아); 비수성 비히클 (예를 들어, 아몬드 오일, 유성 에스테르 또는 분획된 식물성 오일); 및 방부제 (예를 들어, 메틸 또는 프로필-p-하이드록시벤조에이트 또는 소르브산)과 함께 종래의 수단에 의해 제조될 수 있다. 약제학적 조성물은 예를 들어, 약제학적으로 허용가능한 부형제 예컨대 결합제 (예를 들어, 사전젤라틴화된 옥수수 전분, 폴리비닐 피롤리돈 또는 하이드록시프로필 메틸셀룰로오스); 충전제 (예를 들어, 락토오스, 미세결정질 셀룰로오스 또는 인산수소칼슘); 윤활제 (예를 들어, 마그네슘 스테아레이트, 활석 또는 실리카); 붕해제 (예를 들어, 감자 전분 또는 나트륨 전분 글리콜레이트); 또는 습윤제 (예, 라우릴 황산나트륨)와 함께 종래의 수단으로 제조된 정제 또는 캡슐의 형태를 가질 수 있다. 상기 정제는 본 기술분야에 잘 알려진 방법에 의해 코팅될 수 있다.
경구 투여용 제제는 활성 화합물의 제어된 방출을 제공하도록 적절하게 제형화될 수 있다.
협측 투여의 경우, 상기 조성물은 종래의 방식으로 제형화된 정제 또는 로젠지의 형태를 가질 수 있다.
상기 조성물은 주사, 예를 들어 볼러스 주사 또는 연속 주입에 의한 비경구 투여를 위해 제형화될 수 있다. 주사를 위한 제형은 방부제가 첨가된, 예를 들어, 앰플 또는 다중복용 컨테이너에서의 단일 복용 형태로 존재할 수 있다. 상기 조성물은 유성 또는 수성 비히클 중의 현탁액, 용액 또는 에멀젼과 같은 형태를 가질 수 있고, 현락제, 안정화제 및/또는 분산제와 같은 제형화제를 함유할 수 있다. 대안적으로, 활성 성분은 사용하기 전에 적합한 비히클, 예를 들어 살균된 파이로젠 무함유 물로 구성화하기 위한 분말 형태일 수 있다.
상기 조성물은 또한 예를 들어 종래의 좌약 염기 예컨대 코코아 버터 또는 기타 글리세리드를 함유하는 좌약 또는 정체 관장과 같은 직장 조성물로 제형화될 수 있다.
흡입에 의한 투여의 경우, 본 발명에 따른 사용을 위한 조성물은 종래에 적합한 추진체, 예를 들어, 디클로로디플루오로메탄, 트리클로로플루오로메탄, 디클로로테트라플루오로에탄, 이산화탄소 또는 다른 적절한 가스를 사용하여 가압된 팩 또는 분무기로부터의 에어로졸 분무 제공의 형태로 전달된다. 가압된 에어로졸의 경우, 복용 단위는 계량된 양을 전달하기 위한 밸브를 제공함으로써 결정될 수 있다. 흡입기 또는 취입기에 사용하기 위한, 예를 들어, 젤라틴의 캡슐 및 카트리지는 화합물 및 적합한 분말 염기 예컨대 락토오스 또는 전분의 분말 혼합물을 함유하도록 제형화될 수 있다.
본원에 사용된 용어 "말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)"는 림프구, 단구 또는 대 식세포와 같은 둥근 핵을 갖는 임의의 혈액 세포를 지칭한다. 혈액으로부터 PBMC를 단리하는 방법은 당업자에게 용이하게 자명하다. 비제한적인 예는 혈장층 아래에 버피 코트를 형성하는 단구 및 림프구를 갖는 혈액층을 분리하는 친수성 다당류인 피콜(ficoll)로부터 이러한 세포의 추출이거나 또는 기능자에게 적혈구 및 백혈구가 부족한 혈장이 기증자에게 반환되는 백혈구 농축물의 제조인 백혈구 분반술이다.
명료성의 목적으로, 그리고 교시의 범위를 결코 제한하지 않기 위해, 달리 지시되지 않는 한, 양, 백분율 또는 비율 및 본원에 인용된 다른 수치를 나타내는 모든 숫자는 모든 경우에서 용어 "약"이 선행되는 것으로 해석되어야 한다. 따라서, 본 명세서에 인용된 수치 파라미터는 원하는 결과에 따라 변화될 수 있는 근사값이다. 예를 들어, 각각의 수치 파라미터는 보고된 유효 자릿수의 수와 일반적인 반올림 기법을 적용하여 해석될 수 있습니다.
본원에서 사용된 용어 "약"은 표시된 값보다 10% 이하 또는 이상의 값이 또한 포함됨을 의미한다.
실시예
실시예 1. 발현된 세포 표면 단백질을 인코딩하고, 이형접합성 (LOH)의 손실을 겪는 다형성 유전자의 게놈-전체 식별
iCAR 표적으로 작용할 수 있는 유전자를 동정하기 위해서, 하기 요건을 이용하였다:
1. 상기 유전자는 막투과 단백질을 인코딩하고 - 이에 따라 iCAR 결합을 가능하도록 세포 표면 상에 발현되는 부분을 가짐.
2. 상기 유전자는 적어도 2개의 발현된 대립유전자를 가지고 있다 (적어도 한 민족 집단에서 확인).
3. 상기 유전자에 대해 발견된 대립유전자는 상기 단백질의 세포외 영역에서의 기준 서열에 대해 아미노산 변화를 일으킨다.
4. 상기 유전자는 암에서 LOH를 겪는 염색체 부위에 위치한다.
5. 상기 유전자는 상응하는 영역이 LOH를 겪는 것으로 밝혀진 종양 유형의 기원 조직에서 발현된다.
대립유전자 동정:
엑솜 집합체 컨소시엄 데이터베이스 (ExAC, exac.broadinstitute.org)가 분석에 대한 입력값으로 사용되었다. ExAC 데이터베이스는 총 60,706의 엑솜의 다양한 개체군-수준 서열 분석 연구로부터의 엑솜의 편집물이다 (Lek 등, 2016). ExAC는 변이체 대립유전자의 카운트의 수 (대립유전자 빈도 - 염색체의 총 수 중의 변이체 대립유전자의 카운트의 수)와 비교하여 기준 대립유전자의 카운트의 수를 포함하는 각 변이체에 대한 정보를 포함한다. 대립유전자 빈도 정도는 표 2에 상술된 바와 같은 데이터베이스 내의 하위집단으로 연장되고, 임계치는 적어도 하나의 집단에서 5% 이상의 대립유전자 빈도이었다.
[표 2] ExAC 데이터베이스 내의 하위집단
Figure pct00004
상기 열거된 요건에 따라, 하기 필터를 ExAC 데이터베이스에서 검색된 변이체에 적용하였다:
1) 변이체는 인코딩된 단백질의 아미노산 조성에 영향을 미쳐야 하고, ii) 변이체는 ExAC 데이터베이스에 나타나는 적어도 하나의 집단에서 0.05 (5 %) 이상의 소수 대립유전자 빈도를 가져야 한다. 소수 대립유전자는 0.5 (50%) 초과의 대립유전자 분획을 가진 시나리오에 대해 분석이 수집되었다. 일정 부위에 3개 초과의 대립유전자가 관찰되는 경우, 이후 가장 우세한 치환기가 사용되었다.
2) 변이체 (이 경우 단일 뉴클레이티드 다형성 (SNP))는 변이체는 하기 변이체 부류 중 임의의 것으로 분류된 경우에 단백질의 조성에 영향을 미치는 것으로 주석이 붙었다: '미스센스_변이체(missense_variant)', '인프레임_결실(inframe_deletion)', '출발_손실(start_lost)', '중단_획득(stop_gained)', '인프레임_삽입(inframe_insertion)', '중단_보유_변이체(stop_retained_variant)', '프레임시프트_변이체(frameshift_variant)', '중단-손실(stop_lost)', '코딩_서열_변이체(coding_sequence_variant)', '단백질_변경_변이체(protein_altering_variant)'.
상기 분석은 9,362,319 개의 SNP 변이체로 시작되었으며, 이 중에서 29,904 개의 변이체가 이러한 상기 2개의 필터를 통과하였다. 이러한 변이체는 단백질 아미노산 서열에 대해 영향을 미치는 5% 이상의 소수 대립유전자 빈도를 갖는 대립유전자를 갖는 10,322 개의 유전자에 속한다. 이러한 2개의 필터와 일치하는 모든 대립유전자는 이 분석에 포함되었다.
발현된 유전자의 동정:
유전자형-조직 발현 (GTEX) 데이터베이스 v6p (dbGaP Accession phs000424.v6.p1)은 다양한 조직 유형으로 발현되는 유전자의 동정을 위해 사용되었다 (https://gtexportal.org/home, Consortium GT. Human genomics, 2015). GTEX 데이터베이스는 다양한 건강한 조직 유형의 8,555 개의 인간 샘플의 RNA 시퀀싱으로 구성된다.
TCGA 데이터베이스에 분석이 있는 각 종양 유형에 상응하는 기원의 조직에서의 각각의 유전자의 평균 발현 수준이 또한 포함되었다. 이러한 데이터를 수득하기 위해, 본 발명자는 상응하는 정상 조직에 대한 종양 유형의 맵핑을 생성하였다. 예를 들어, TCGA 데이터베이스로부터의 췌장암 데이터는 GTEX의 췌장 조직으로 주석으로 주석이 붙여진다. 이러한 경우에서, 맵핑은 종양 유형에 대한 명확한 기원 조직이 없기 때문에 근사치이다. 예를 들어, 교모세포종 발현 데이터는 GTEX에서 뇌로 주석이 붙은 모든 조직으로부터 맵핑되었다.
특정 조직에서 과발현된 유전자는 양호한 aCAR 표적이 가능성이 있다. 반면, 모든 조직에 걸처 균일한 발현을 갖는 유전자는 더 나은 aCAR 표적이 될 가능성이 있다.
유전자는 이것이 하기 기준을 충족시키는 경우에 "보편적으로 발현된" 것으로 정의된다: (i) 조직에 걸친 평균 발현은 10 RPKM (백만개 매핑된 판독에 대한 전사의 킬로베이스당 판독(Reads Per Kilobase of transcript per Million mapped reads) 초과이었다. (ii) 적어도 발현을 가진 조직은 1 초과의 RPKM을 가졌다. (iii) 평균 RPKM에 비교되는 조직에 걸친 중앙 RPKM에서의 표준 편차의 비는 1 미만이었다. 오직 1,092 개의 유전자는 이전 단계에서 검색된 10,322 개의 유전자 중 보편적으로 발현된 것으로 주석이 붙었다.
세포-표면 단백질의 주석:
CAR-T 매개 치료제에 대한 양호한 표적인 단백질의 경우, 이의 일부는 세포의 표면 상에 발현될 것이 요구된다. 본 발명자는 세포-표면 단백질을 동정하는 것을 보조하기 위해서 다수의 데이터베이스를 사용하였다. 제1 데이터베이스는 인간 단백질 Atlas (Human Protein Atlas)이고, 이는 32개 상이한 조직을 분석하기 위해 사용되는 24,028 개의 항체에서 유래한 분석이다 (Uhlen 등, 2015). 제2 데이터베이스는 세포 표면 단백질 Atlas (Cell Surface Protein Atlas)이고, 이는 N-글리코실화된 세포-표면 단백질의 데이터베이스에 기초한 질량분석법이다. 제3 데이터베이스는 고-처리량 면역형광을 사용하는 최근 공개된 분석이고, 세포 표면 발현을 포함하는 단백질의 세포 이하 국소화를 확인하기 위해 자동화된 이미지 분석이다 (Thul 등, 2017). 각각의 SNP는 단백질이 나타낸 데이터베이스의 수가 주석이 붙었다. 모든 3개의 데이터베이스에서의 유전자에 의해 인코딩된 단백질은 "고 신뢰도"로 세포-표면에서 발현되는 것으로 언급되고, 2개의 데이터베이스는 "중간 신뢰도"이고, 하나의 데이터베이스는 "저 신뢰도"를 가진다. 표 3에 나타난 바와 같이, 10,322 개의 유전자 중 3,359 개의 유전자가 상술한 바와 같이 막 발현의 임의의 증거를 가졌다.
[표 3] 막 발현의 증거에 기초한 유전자의 분포
Figure pct00005
막 단백질의 하나의 대립유전자가 손실된 암 세포만을 효과적으로 인식하기 위한 iCAR의 경우, 단백질의 구조는 인코딩된 대립유전자에 기초하여 충분하게 상이하여야 한다. SIFT (Tolerant로부터의 Sorting　Intolerant) 알고리즘은 단백질 변이체는 단백질 구조에 대한 효과를 가질 것인지 여부를 예상할 것을 시도하며, 이에 따라 기능한다 (Ng and Henikoff, 2003). 평점은 0(유해함)으로부터 1(양성임)의 범위일 수 있다. SIFT 평점 (버전 시프트 5.2.2)는 평점이 있는 있는 모든 SNP에 포함된다.
단백질의 세포외 부분에 속하는 대립유전자의 분류:
대립유전자를 인식하는 iCAR의 경우, 대립유전자는 단백질의 세포외 부분에 있어야 한다. 각 SNP에 대해, 공통 번역(consensus translation)에 영향을 주는 아미노산의 위치를 추출하였고, www.uniprot.org/downloads로부터 다운로드된 UniProt 데이터베이스로부터의 세포외로서 주석이 붙은 도메인과 비교되었다. 다수의 부정 오류(false negative)가 모든 단백질의 도메인의 특성화의 부족으로 인해 가능하다. 1146 유전자에서의 총 4577 개의 SNP가 세포외로 주석이 붙었다.
LOH를 겪는 종양의 비율
양호한 iCAR 표적은 큰 부분의 종양에서 이형접합성 (LOH)의 손실을 겪는 SNP일 것이다. 세그먼트 복제수 파일을 TCGA 데이터베이스의 cbio 포털 http://www.cbioportal.org로부터 다운로드받았다 (Cerami 등, 2012, Gao 등, 2013). 각 유전자에 대해 LOH를 겪는 TCGA 데이터베이스에서 32개의 종양 중 종양의 비율은 하기에 HLA 유전자에 대해 보다 상세하게 하기 기재된 바와 같이 결정하였다.
실시예 2. HLA 부류-I 단백질의 이형접합성 손실
HLA 부류-I 유전자를 하기 이미 알려진 특성으로 인해 제1 세트의 잠재적인 iCAR 표적으로 선택하였다: 두 대립유전자로부터 발현된 세포-표면 단백질, 넓은 조직 분포, 높은 수준의 다형성 및 종양 회피의 기작으로서의 종양에서의 문서화된 LOH. 이에 따라, 본 발명자는 HLA 부류-I 단백질이 다양한 종양 유형에서 손실되는 속도를 결정함으로써 분석을 시작하였다. 본 발명자는 표 4에 열거된 HLA-A, B 및 C의 게놈 유전자좌에서 이형접합성 손실의 존재에 대해 이러한 복제수 프로파일을 분석하였다.
[표 4] HLA-I 게놈 유전자좌
Figure pct00006
TCGA로부터 공개적으로 입수할 수 있는 수천개의 종양 샘플에 대한 SNP 검정 데이터는 복제수 계산을 위한 공급원으로서 역할을 할 수 있고, 공개 NIH TCGA 데이터 포털 (https://gdc.cancer.gov/)에 대해 이용가능한 모든 종양 유형에 대해 HLA LOH 빈도를 예상하기 위해 사용하였다.
LOH 분석(call)이 게놈 위치의 변화에 견고한지를 결정하기 위해, 본 발명자는 HLA-A (ZNRD1, 도 3c)의 대해 다운스트림에 그리고 업스트림 (HLA-G, 도 3a)에 위치하는 유전자의 LOH 패턴을 시험하였고, 모든 유전자가 HLA-A (도 3b)와 같이 동이한 패턴의 LOH를 나타내는 것으로 결론내렸다.
모든 HLA 부류-I 유전자 (HLA-A, B, C)가 예상된 바와 같이 염색체 6의 암 상의 주요 조직 적합성 유전자좌 (MHC)에서 서로 가까이에 염색체가 위치하기 때문에, 이들 모두는 종양 유형 (각각 HLA-B 및 C에 대해 도 4a 및 4b)에 걸쳐 LOH의 동일한 패턴 및 빈도를 나타내는 것으로 밝혀졌다.
상기를 기초하여, 도 4에 나타난 바와 같이, 본 발명자는 HLA 부류-I 영역 LOH가 다수의 종양에서 공통된 사건이나, LOH의 백분율은 종양 유형들 사이에서 변화되는 것으로 결론내렸다. 이에 따라, HLA 유전자는 iCAR 표적의 좋은 후보이다.
실시예 3. LOH의 면역세포화학 검증 및 대립유전자 특이적 항체의 특이성
상이한 종양에서 확인된 다수쌍의 보존되고, 손실된 대립유전자 변이체가 선택되고, 폴리펩티드 생성물은 변이체-특이적 mAb의 생성을 위한 역할을 할 것이다. 후보 mAb의 차별화된 능력은 하기와 같은 이중 염색 및 유동 세포 계측법 또는 면역조직화학법에 의해 분석되었다:
IHC 프로토콜
대립유전자-특이적 항-HLA 항체:
Figure pct00007
냉동 조직 샘플 -
냉동 조직은 대개 포르말린 기반의 용액에서 고정되고, 샘플의 저온절삭을 가능하게 하는 OCT (Optimal Cutting Temperature 화합물)에 포매시킨다. OCT 내의 조직은 -80℃에서 냉동되어 유지된다. 냉동된 블록을 절편화하기 이전에 -80℃에서 빼내고, 저온 저장 장치 챔버에서에서 평형화시키고, 얇은 절편 (대개 5-15 μm 두께)으로 절단한다. 절편은 조직학적 슬라이드 상에 배치된다. 슬라이드를 -20℃ 내지 -80℃에서 저장될 수 있다. IHC 염색 전에 슬라이드를 실온 (RT)에서 10-20분 동안 해동시킨다.
파라핀-포매된 조직 -
조직을 포름알데히드 고정 용액에 포매시킨다. 파라핀 왁스의 첨가 이전에, 조직은 실온에서 특정 시간 및 기간 동안 증가되는 농도의 에탄올 (70%, 90%, 100%) 및 크실렌에 점차적으로 함침되어 탈수된다. 이후, 조직은 파라핀 왁스에 포매된다.
파라핀-포매된 조직을 마이크로톰에서 5-15μm 두께의 절편으로 자른 다음, 56℃ 수조에 부유시키고, 조직학 슬라이드에 배치한다. 슬라이드는 실온으로 유지될 수 있다.
IHC 염색 이전에 파라핀-포매된 절편은 재수화 단계가 요구된다-
재수화 - 크실렌(2 x 10min)에 함침시키고, 이후 감소된 농도의 에탄올 - 100% X2 (각 10분)에 함침시켜 절편을 재수화시킨다
95% 에탄올 - 5 분
70% 에탄올 - 5 분
50% 에탄올 - 5 분
dH2O에서 세정
면역형광 검출:
1. 10분 동안 세척 버퍼 (PBSX1)에서 슬라이드를 재수화시킨다. 세척 버퍼를 배출한다
2. 항원 복구를 수행한다 - 필요시 (열 유도 항원 복구 또는 효소 복구)
3. 세포내 항원의 경우, 투과화를 수행하고 - RT에서 10분 동안 PBSX1 중의 0.1% triton X-100에서 슬라이드를 배양한다.
4. 차단 - 30분 동안 블로킹 버퍼에서 조직을 차단한다. 블로킹 버퍼는 검출 방법에 좌우되며, 보통 PBSX1 중의 5% 동물 혈청 또는 PBSX1 중의 1% BSA이다.
5. 1차 항체 - 항체 제조사 지시에 따라 배양 버퍼 (즉, 1% BSA, PBS 중의 1% 당나귀 혈청, 기타 배양 버퍼가 또한 사용될 수 있음) 중에 1차 항체를 희석한다. 4℃에서 밤새 희석된 1차 항체에서 조직을 배양한다. 1차 항체는 상술된 바와 같은 단클론성 항-HLA-A, 항-HLA-B 또는 항-HLA-C일 수 있다.
컨쥬게이션된 1차 항체가 사용되는 경우, 광으로부터 보호하고, 단계 8을 진행한다
음성 대조군으로서, 1차 항체가 없는 배양 버퍼 단독과 함께 조직을 배양한다
또한, 실험에서 사용된 단클론성 항체의 동형 매칭 대조군(isotype matched control)을 실시한다.
6. 세척 - 세척 버퍼 중에서 슬라이드를 세척한다 - 3 X 5-15분.
7. 2차 항체 - 항체 제조사 지시에 따라 배양 버퍼 중에서 2차 항체를 희석한다. 실온에서 30-60분 동안 희석된 2차 항체 중에 조직을 배양한다. 빛으로부터 보호한다.
8. 세척 - 세척 버퍼 중에서 슬라이드를 세척한다 - 3 X 5-15분.
9. DAPI 염색 - DAPI 배양 버퍼 (~300nM - 3μM)를 희석한다. 300μM의 DAPI 용액을 각 절편에 첨가한다. 실온에서 5-10분 동안 배양한다.
10. 세척 - X1 PBS로 1회 슬라이드를 세척한다
11. 안티페이드 장착 매체를 장착한다.
12. 슬라이드를 빛으로부터 보호한 채로 유지한다.
13. 형광 현미경을 사용하여 슬라이드를 시각화한다
염색체 검출:
1. 10분 동안 (PBSX1)에서 슬라이드를 재수화한다. 세척 버퍼를 배출한다
2. 항원 복구를 수행한다 - 필요시 상기를 참조한다
3. HRP 시약의 경우, 적어도 15분 동안 메탄올 중의 3.0% 과산화수로로 내인성 과산화효소 활성을 차단한다
4. 5분 동안 dH2O에 이를 함침시켜 절편을 세척한다
5. 새포내 항원의 경우, 투과화(permeabilization)를 수행하고 - RT에서 10분 동안 PBSX1 중의 0.1% triton X-100에서 슬라이드를 배양한다
6. 차단 - 30분 동안 블로킹 버퍼에서 조직을 차단한다. 블로킹 버퍼는 검출 방법에 좌우되며, 보통 PBSX1 중의 5% 동물 혈청 또는 PBSX1 중의 1% BSA이다.
7. 1차 항체 - 항체 제조사 지시에 따라 배양 버퍼 (즉, 1% BSA, PBS 중의 1% 당나귀 혈청, 기타 배양 버퍼가 또한 사용될 수 있음) 중에 1차 항체를 희석한다. 4℃에서 밤새 희석된 1차 항체에서 조직을 배양한다.
8. 세척 - 세척 버퍼에서 슬라이드를 세척한다 - 3 X 5-15분.
9. 2차 항체 - 실온에서 50-60분 동안 HRP-컨쥬게이션된 2차 항체 중에 조직을 배양한다.
10. 세척 - 세척 버퍼 중에서 슬라이드를 세척한다 (3 X 5-15분).
11. 제조사의 지침에 따라 ABC-HRP 시약을 첨가한다. 실온에서 60분 동안 배양한다.
12. 제조사의 지침에 따라 DAB 용액 (또는 다른 발색원)을 제조하고, 조직 절편에 도포한다. 발색 반응이 에피토프 부위를 갈색으로 만든다 (보통 수초 - 10 분). 신호의 강도가 이미징에 적합할 때 다음 단계로 진행한다.
13. 세척 - 세척 버퍼 중에서 슬라이드를 세척한다 - 3 X 5-15분.
14. dH2O 중에서 슬라이드를 세척한다 - 2 X 5-15분.
15. 핵 염색 - 헤마톡실린 용액을 첨가한다. 실온에서 5분 동안 배양한다.
16. 조직 절편을 탈수시킨다 -
95% 에탄올 - 2 X 2 분.
100% 에탄올 - 2 X 2 분.
크실렌 - 2 X 2 분.
17. 안티페이드 장착 매체를 장착한다.
18. 명시야 조명을 사용하여 슬라이드를 시각화한다
실시예 4. CAR-T 구조
이 연구의 목적은 CAR-T 요법의 온-타겟 "오프-종양" 효과를 억제할 것인 합성 수용체를 생성하는 것이다. 이 범위에서, 활성 및 억제 CAR로 구성된 CAR 구조물의 라이브러리가 확립될 것이다.
제1 세트의 구조체는 HLA-유형 I 서열 (예를 들어, HLA-A2)에에서 유도된 억제 CAR 및 종양 항원 (예를 들어 CD19)에 대한 활성화 CAR을 포함할 것이다. 다음 세트의 구조체는 본 발명자의 생물 정보학 분석에 의해 확인된 표적 항원에 유도된 CAR 서열을 포함할 것이다. 표적 후보는 제시된 기준 (예를 들어, 표적 발현 패턴, 표적 발현 수준, 항원성 등)에 따라 우선 순위가 결정될 것이다.
iCAR 구조체의 경우, 본 발명자는 HLA-A2 scFV의 다운스트림에 있는 PD-1 (아미노산 145-288) 또는 CTLA4 (아미노산 161-223)의 최초 주석이 붙은 세포외 도메인에 막투과 및 세포내 도메인을 융합할 것이다. iCAR 검출 및 분류의 경우, 리포터 유전자 (즉, GFP, DsRED, RFP, mCherry 등)가 IRES 서열 또는 2A 서열을 통해 iCAR 서열 하류에 혼입될 것이다.
HLA-A2 scFv는 클론화되고, 실시예 2에 상기 열거된 항체 중 임의의 하나를 발현하는 하이브리도마로부터 구조화된다.
aCAR 구조체의 경우, CD19 scFv는 제2 세대 (CD8 또는 CD28 힌지, CD28 막투과, CD28 또는 41BB 공동 자극 1 및 CD3ζ) 또는 제3 세대 CAR (CD8 또는 CD28 힌지, CD28의 막투과, CD28 및 41BB 및 CD3ζ)융합될 것이고, aCAR 검출 및 분류의 경우, 리포터 유전자 (즉, GFP, DsRED, RFP, mCherry 등)은 IRES 서열 또는 2A 서열을 통해 iCAR에 대한 다운스트림에 혼입될 것이다.
aCAR 및 iCAR 서열 모두는 레트로바이러스 또는 렌티바이러스 전이 벡터에 클로닝되고, 이후 예를 들어 HEK-293T과 같은 적절합 패키징 세포를 사용하여 바이러스 입자 생성을 위해 사용될 것이다.
쥬르카트, 쥬르카트-NFAT-루시퍼라아제 및 활성화 T 세포 (건강한 공여자로부터 유래됨)는 상이한 감염 다중도 (MOI)에서 aCAR, iCAR 또는 둘 모두로 형질도입된다. 리포터 유전자 발현에 기초한 FACS 선별은 상이한 수준의 aCAR, iCAR 또는 둘 모두를 발현하는 세포 집단의 분류 및 선별을 위해 사용될 것이다.
표적 세포의 준비 -
생체외 재조합 시스템은 오프-표적 세포에 대하여 aCAR의 활성을 억제하는데 있어서의 iCAR 구조체의 기능을 시험하기 위해 확립될 것이다. 이 목적을 위해, aCAR 에피토프, iCAR 에피토프 또는 둘 모두를 발현하는 표적 세포가 생성될 것이다. aCAR 에피토프를 발현하는 재조합 세포는 온-표적 '온-종양' 세포를 나타낸 것이고, 한편 aCAR 및 iCAR 에피토프 모두를 발현하는 세포는 온 표적 '오프-종양' 건강한 세포를 나타낼 것이다.
본 발명자의 제1 iCAR/aCAR 세트는 각각 HLA-A2, CD19일 것이기 때문에, HLA-A2, CD19 또는 둘 모두를 발현하는 재조합 세포는 이러한 유전자에 대해 코딩된 발현 벡터로 세포주 (즉, Hela, Hela-루시퍼라아제 또는 라지(Raji))를 형질주입함으로써 생성될 것이다. 재조합 CD19 및 HLA A-2 발현의 검출을 위해, 두 유전자는 단백질 태그 (즉, HA 또는 Flag 또는 Myc 등)에 융합될 것이다.
검정 -
iCAR의 억제 효과는 생체 외 및 생체 내에서 시험될 것입니다.
생체 외 검정에서, 본 발명자는 사이토카인 분비 및 세포 독성 효과를 측정하는데 초점을 맞추고, 한편, 생체 내에서 본 발명자는 iCAR 억제 및 온-표적 오프 종양 이종이식에 대해 보호를 평가할 것이다. 본 발명자는 리포터 유전자를 사용하여 iCAR/aCAR 이중 양성이 되는 T 세포를 분류함으로써 iCAR이 없는 T 세포가 결과를 해하는 것을 제한할 것이다. iCAR 차단 활성에 대한 음성 대조군으로서 본 발명자는 모의 형질주입된 CAR를 사용할 수 있다.
생체 외 분석-
루시페라제 세포독성 검정 - 재조합 표적 세포 (T)는 반딧불이 루시퍼라아제를 발현하도록 조작될 것이다. 생체 외 루시퍼라제는 Bright-Glo 루시퍼라제 검정 (Promega)에 따라 수행될 것이다. 형질도입된 효과기 (E) T 세포 (두 iCAR 및 aCAR 또는 aCAR 또는 모의 CAR로 형질도입됨)는 표적 비에 대해 상이한 효과기에서 HLA-A2, CD19 또는 둘 다를 발현하는 재조합 세포와 함께 24-48 시간 동안 배양될 것이다. 세포 사멸은 Bright-Glo 루시퍼라아제로 정량화될 것이다.
본 발명자는 iCAR/aCAR 발현 수준에 따라 형질도입된 T 세포 집단을 분류하거나 또는 이의 CD19 또는 HLA-A2 발현 수준에 따라 재조합 표적 세포의 하위 집단을 선택함으로써 '오프-종양' 세포독성을 최적화할 수 있다.
iCAR 형질도입된 T 세포가 생체외에서 '온-종양'과 '오프-종양' 세포 사이에서 차별화되는지를 시험하기 위해, 본 발명자는 1:1 비로의 '온-종양' 및 '오프-종양'의 혼합물과 함께 배양된 형질도입된 T 세포의 사멸 효과를 시험할 것이다. 온 종양 재조합 세포는 루시퍼라아제 발현에 의해 '오프-종양' 재조합 세포로부터 구분될 것이다 (단지 하나의 세포 집단은 일정 시점에서 루시퍼라아제 유전자를 발현하도록 조작될 것이다). 사멸은 Bright-Glo 루시퍼라아제 검정 (Promega)을 사용하여 공동-배양의 24-48 이후에 정량화될 것이다.
활성화된 절단된 카스파제 3에 대한 항체에 의한 CTL 유도된 세포 사멸의 카스파제 3-검출
CTL이 표적 세포를 사멸시키는 경로 중 하나는 Fas 리간드를 통해 세포 사멸을 유도하는 것에 의한다. CASP3 단백질은 시스테인-아스파트산 프로테아제 (카스파제) 계열의 구성원이다. 카스파제의 순차적 활성화는 세포 사멸의 실행 단계에서 중요한 역할을 한다. 프로-카스파제 3의 카스파제 3로의 절단은 구조 변화와 촉매 활성의 발현을 초래한다. 카스파제 3의 절단된 활성화된 형태는 단클론성 항체에 의해 특별하게 인식될 수 있다.
형질도입된 T 세포는 2-4시간 동안 CFSE로 사전에 표지화된 '온-종양' 또는 '오프-종양' 재조합 세포와 함께 배양될 것이다. 표적 세포 사멸은 유동 세포 계측법에 의해 정량화될 것이다. 세포는 투과화되고, 내부 염색 키트 (Miltenyi)에 의해 고정되고, 활성화된 카스파제 3 (BD bioscience)에 대한 항체로 염색될 것이다.
시간 경과 마이크로 CTL-
표적 세포는 리포터 유전자 (예를 들어, mCherry)로 표지화될 것이다. 형질도입된 T 세포는 최대 5일 동안 '온-종양' 또는 '오프-종양'과 함께 배양될 것이다. 시간 경과 현미경 검사는 사멸을 시각화하기 위해 사용될 것이다. 대안적으로, 종점 시간에서 표적 세포 수를 결정하기 위한 살아있는 세포수 염색 및 CountBright 비드 (Invitrogen)를 사용하여 유동 세포 분석이 수행될 것이다.
aCAR/iCAR로 형질도입된 T 세포가 생체 외 표적을 식별할 수 있는지 여부를 확인하기 위해서, 본 발명자는 상이한 리포터 단백질 (예를 들어 GFP 및 mCherry)로 각각의 재조합 표적 세포를 표지화할 것이다. 형질도입된 T 세포 (효과기 세포)는 E/T의 1:1 비에서의 재조합 세포 (표적 세포)와 함께 공동 배양될 것이다.
사이토카인 방출 -
형질도입된 T 세포는 재조합 표적 세포와 함께 배양될 것이고, 사이토카인 생성 (IL2 및 INFγ)은 BioLegend의 ELISA MAXTM Deluxe 세트 키트에 따라 세포 배양액 상청액에서의 사이토카인 분비를 측정함으로써, 또는 T 세포 생성 사이토카인의 백분율의 유동 세포 계측법에 의해 정량화될 것이다. 유동 세포 계측법의 경우, 본 발명자는 사이토카인의 분비를 방지하기 위해서 Golgi 중단을 사용할 것이다. 표적 세포와의 형질도입된 T 세포의 6 및 18-24 시간의 배양 이후에 T 세포는 내부 염색 키트 (Miltenyi)에 의해 퍼머되고 (permed), 고정되고, T 세포 마커 (CD3 및 CD8) 및 사이토카인 IL2 및 INFγ에 대한 항체로 염색될 것이다.
CD107a에 대한 염색
T 세포의 탈과립화는 CD107a, 리소좀 관련 막 단백질 (LAMP-1)의 표면 발현에 의해 동정될 수 있다. LAMP-1의 표면 발현은 CD8 T 세포 세포 독성과 상관되는 것으로 나타났다. 이러한 분자는 리소좀의 관내 측면 상에 배치된다. 활성화시, CD107a는 활성화된 림프구의 세포막 표면으로 전달된다. CD107a는 일시적으로 세포 표면 상에 발현되어, 세포 내 이입 경로를 통해 재내재화된다. 따라서, CD107a 검출은 세포 자극 과정에서 항체 염색에 의해 그리고 모넨신의 첨가 (세포내 이입된 CD107a 항체 복합체의 산성화 및 후속 분해를 방지하기 위함)에 의해 최대화된다.
본 발명자는 모네신의 존재 하에 6-24시간 동안 표적 세포와 함께 형질도입된 T 세포를 배양할 것이고, T 세포 표면 마커 (CD3,CD8)에 대한 컨쥬게이션된 항체 및 CD107a에 대한 컨쥬게이트화된 항체를 사용하는 유동 세포 계측법에 의한 CD8 T 세포 상의 CD107a 발현을 관찰할 것이다.
생체내
NOD/SCID/γc-마우스는 종양 세포를 정맥으로 접종받을 것이다. 종양 세포의 한 가지 가능성은 반딧불이 루시퍼라아제를 조작할 것인 CD19 포지티브 NALM 6 (ATCC, 인간 B-ALL 세포주) 세포일 수 있다. 또한, '온-표적' '오프-종양' 세포의 확립을 위해, NALM 6은 또한 iCAR 에피토프 (예를 들어, HLA-A2)를 발현하도록 조작될 것이고, 이로써 건강한 세포를 나타낸다. 마우스는 연구 그룹으로 나누어질 것이고, 하나의 그룹은 NALM 6 세포가 주입될 것이고, 한편 다른 것은 iCAR 에피토프를 발현하는 NALM-6을 주입할 것이다. 몇일 이후, 마우스는 aCAR, aCAR/iCAR로 형질도입된 T 세포 및 비형질도입된 T 세포을 가지거나 또는 T 세포가 없는 대조군 그룹은 정맥 내로 주입될 것이다. 마우스는 희생될 것이고, 종양 부담은 총 플럭스에 따라 정량화될 것이다.
iCAR 구조체를 발현하는 T 세포가 표적 세포와 오프 표적 세포 사이의 차별화가 가능한지 여부를 시험하기 위해, 본 발명자는 '온-종양'/'오프-종양 NALM-6 세포의 1:1 혼합물을 마우스에 주입할 것이고, 이후 aCAR 단독 또는 aCAR 및 iCAR 둘 모두를 발현하는 형질도입된 T 세포의 주입이 후속된다. 희생시키는 경우에 비장과 골수에서 '온-종양' 및 '오프-종양 세포의 존재 하의 마우스는 2개의 마크, CD19와 iCAR 에피토프에 대한 유동 세포 계측법으로 분석될 것이다.
부록
[표 1]
I. ClinicalTrials.gov에 등록된 시험에서 평가된 CAR 표적 항원
Figure pct00008
Figure pct00009
II. 다른 CAR 표적 항원
Figure pct00010
약어: ADP, 아데노신 디포스페이트; ALL, 급성 림프아구성 백혈병; AML, 급성 골수성 백혈병; APRIL, 증식-유도 리간드; BAFF, TNF 계열의 B 세포 활성화 인자; BCMA, B 세포 성숙 항원; BCR, B 세포 수용체; BM, 골수; CAIX, 탄산탈수소효소 IX; CAR, 키메라성 항원 수용체; CEA, 암종배아 항원; CLL, 만성 림프구성 백혈병; CNS, 중추신경계; CSPG4, 콘드로이틴 설페이트 프로테오글리칸 4; DC, 수지상 세포; ECM, 세포외 기질; EGFR, 표피 성장 인자 수용체; EGFRvIII, EGFR의 변이체 III; EphA2, 에리트로포이에틴-생성 간세포 암종 A2; FAP, 섬유모세포 활성화 단백질; FR-α, 엽산 수용체-알파; GBM, 다형상 교모세포종; GPI, 글라이코포스파티딜이노시톨; H&N, 두경부; HL, 호지킨 림프종; Ig, 면역글로불린; L1-CAM, L1 세포 유착 분자; MM, 다발성 골수종; NB, 신경교세포종; NF-κB, 핵 인자-κB; NHL, 비-호지킨 림프종; NK, 자연 킬러; NKG2D-L, NKG2D 리간드; PBMC, 말초 혈액 단핵 세포; PC, 형질 세포; PLL, 전림프구성 백혈병; PSCA, 전립선 줄기 세포 항원; PSMA, 전립선-특이적 막 항원; RCC, 신장 세포 암종; ROR1, 수용체 티로신 키나제-유사 고아 수용체 1; TCL, T 세포 백혈병/림프종; Th2, T 헬퍼 2; TNBC, 삼중-음성 유방암; TNFR, 종양 괴사 인자 수용체; VEGFR-2, 혈관 내피 성장 인자-2.
참고문헌
Figure pct00011
Figure pct00012
Figure pct00013
Figure pct00014
Figure pct00015
Figure pct00016
Figure pct00017
Figure pct00018
Figure pct00019

Claims (42)

  1. 효과기 면역 세포의 원치 않는 활성화를 방지하거나 또는 감쇠시킬 수 있는 억제 키메라 항원 수용체 (iCAR)를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자로서, 여기서 iCAR은 이형접합성 (LOH)의 손실로 인하여 포유동물 종양 세포에 존재하지 않지만, 관련 포유동물 정상 조직의 모든 세포 상에 적어도 존재하는 다형성 세포 표면 에피토프의 단일 대립유전자 변이체에 특이적으로 결합하는 세포외 도메인; 및 효과기 면역 세포를 억제하는 적어도 하나의 신호 전달 성분을 포함하는 세포내 도메인을 포함하는 핵산 분자.
  2. 제1항에 있어서, 상기 다형성 세포 표면 에피토프는 하우스키핑 유전자 생성물, 예컨대 HLA 유형 I, G-단백질-결합 수용체 (GPCR), 이온 채널 또는 수용체 티로신 키나아제, 바람직하게는 HLA-A, HLA-B 또는 HLA-C의 것인 핵산 분자.
  3. 제1항에 있어서, 상기 세포외 도메인은 (i) 항체, 이의 유도체 또는 절편, 예컨대 인간화된 항체; 인간 항체; 항체의 기능성 절편; 단일-도메인 항체, 예컨대 나노바디; 재조합 항체; 및 단일 사슬 가변 절편 (ScFv); (ii) 항체 모방체; 예컨대 어피바디 분자; 어피린, 어피머, 어피틴; 알파바디; 안티칼린; 아비머; DARPin; 피노머; 쿠니츠 도메인 펩티드; 및 모노바디; 또는 (iii) 압타머를 포함하는 핵산 분자.
  4. 제1항에 있어서, 상기 포유동물 조직은 인간 조직이고, 상기 관련 포유동물 정상 조직은 종양이 발달된 정상 조직인 핵산 분자.
  5. 제1항에 있어서, 상기 효과기 면역 세포는 T 세포, 자연 킬러 세포 또는 사이토카인-유도된 킬러 세포인 핵산 분자.
  6. 제1항에 있어서, 상기 효과기 면역 세포를 억제할 수 있는 적어도 하나의 신호 전달 성분은 면역 체크포인트 단백질의 신호 전달 성분과 상동성인 핵산 분자.
  7. 제6항에 있어서, 상기 면역 체크포인트 단백질이 PD1; CTLA4; BTLA; 2B4; CD160; CEACAM, 예컨대 CEACAM1; KIRs, such as KIR2DL1, KIR2DL2, KIR2DL3, KIR2DL4, KIR2DL5A, KIR2DL5B, KIR3DL1, KIR3DL2, KIR3DL3, LIR1, LIR2, LIR3, LIR5, LIR8 및 CD94-NKG2A; LAG3; TIM3; T 세포 활성화의 V-도메인 Ig 억제제 (VISTA); INterferon 유전자의 자극제 (STING); 면역수용체 티로신-기반 억제 모티프 (ITIM)-함유 단백질, T 세포의 면역 글로불린과 ITIM 도메인 (TIGIT), 아데노신 수용체 (예를 들어, A2aR)로 이루어진 군으로부터 선택되는 핵산 분자.
  8. 제1항에 있어서, 상기 세포외 도메인은 가요성 힌지 및 막투과성 캐노닉 모티 (transmembrane canonic motif)을 통해 상기 막내 도메인에 융합되는 핵산 분자.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항의 핵산 분자 및 적어도 하나의 조절 성분, 예컨대 핵산 분자에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 벡터.
  10. 제9항에 있어서, 상기 항원의 비다형성 세포 표면 에피토프 또는 다형성 세포 표면 에피토프의 단일 대립유전자 변이체를 특이적으로 결합하는 세포외 도메인으로서, 상기 에피토프는 종양-관련 항원이거나 또는 관련 종양 및 정상 조직의 세포에 의해 적어도 공유되는 세포외 도메인, 및 효과기 면역 세포를 활성화하고 및/또는 공동-자극하는 적어도 하나의 신호 전달 성분을 포함하는 세포내 도메인을 포함하는 aCAR을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자를 더 포함하는 벡터.
  11. 제10항에 있어서, 상기 aCAR의 세포외 도메인이 항원이 비다형성 세포 표면 에피토프에 특이적으로 결합하고, iCAR의 세포외 도메인이 상기 aCAR의 세포외 도메인이 결합되는 것과 상이한 항원의 다형성 세포 표면 에피토프의 단일 대립유전자 변이체를 특이적으로 결합하는 벡터.
  12. 제10항 또는 제11항에 있어서, 상기 aCAR의 세포외 도메인이 CD19와 같은 표 1에 열거된 항원으로부터 선택된 비다형성 세포 표면 에피토프에 특이적으로 결합되는 벡터.
  13. 제10항에 있어서, 효과기 면역 세포를 활성화하거나 또는 공동-자극하는 상기 적어도 하나의 신호 전달 성분은 예를 들어 CD3ζ 또는 FcRγ 사슬의 면역수용체 티로신-기반 활성화 모티프 (ITAM); 활성화 킬러 세포 면역글로불린-유사 수용체 (KIR), 예컨대 KIR2DS 및 KIR3DS, 또는 어댑터 분자 예컨대 DAP12; 또는 예를 들어 CD27, CD28, ICOS, CD137 (4-1BB) 또는 CD134 (OX40)의 공동-자극된 신호 전달 성분과 상동성인 벡터.
  14. 제10항에 있어서, 상기 뉴클레오티드 서열이 aCAR에 대해 인코딩된 뉴클레오티드 서열과 iCAR에 대해 인코딩된 뉴클레오티드 서열 사이의 내부 리보솜 유입 부위 (IRES)를 포함하는 벡터.
  15. 제14항에 있어서, 상기 aCAR에 대해 인코딩된 뉴클레오티드 서열이 iCAR에 대해 인코딩된 뉴클레오티드 서열의 다운스트림에 있는 벡터.
  16. 제10항에 있어서, 상기 뉴클레오티드 서열이 aCAR에 대해 인코딩된 뉴클레오티드 서열과 iCAR에 대해 인코딩된 뉴클레오티드 서열 사이에 바이러스 자가-절단 2A 펩티드를 포함하는 벡터.
  17. 제16항에 있어서, 상기 바이러스 자가-절단 2A 펩티드가 토세아 아사인아 바이러스 (TaV)로부터의 T2A, 구제역 바이러스 (FMDV)로부터의 F2A, 말 비염 A 바이러스 (ERAV)로부터의 E2A 및 돼지 테스코바이러스-1 (PTV1)의 P2A로 이루어진 군으로부터 선택되는 벡터.
  18. 제10항에 있어서, 상기 iCAR에의 유연한 링커를 통해 연결된 상기 구성적 aCAR을 인코딩한 뉴클레오티드 서열을 포함하는 벡터.
  19. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같이, 효과기 면역 세포의 원치 않는 활성화를 방지하거나 또는 감쇠시킬 수 있는 억제 키메라 항원 수용체 (iCAR)의 제조 방법으로서,
    (i) 공지된 변이체의 적어도 하나의 데이터베이스로부터의 단백질-인코딩 유전자의 인간 게놈 변이체의 목록을 검색하는 단계;
    (ii) (a) 대응하는 기준 대립유전자와 비교하여 각각의 유전자에 의해 인코딩되는 단백질에서 아미노산 서열 변이를 초래하는 변이체를 선별하는 것,
    (b) 인코딩된 단백질의 세포외 도메인에서 아미노산 서열 변이가 존재하는 유전자의 변이체를 선별하는 것,
    (c) 적어도 하나의 종양에서 이형접합성 (LOH)의 손실을 겪는 유전자의 변이체를 선별하는 것, 및
    (d) (c)에 따라 LOH를 겪는 적어도 하나의 종양의 유래의 조직에서 적어도 발현하는 유전자의 변이체를 선별하여,
    이에 의해 LOH로 인해 적어도 하나의 종양에서 손실되고, 적어도 하나의 종양의 유래의 조직에서 적어도 발현되는 각각의 유전자에 의해 인코딩된 단백질에서의 세포외 도메인에 아미노산 서열 변이를 갖는 변이체의 목록을 얻음으로써 (i)에서 검색된 변이체의 목록을 필터링하는 단계;
    (iii) (ii)에서 수득된 목록으로부터 적어도 하나의 단일 변이체를 포함하는 서열 영역을 한정하고, 적어도 하나의 단일 변이체를 포함하는 서열 영역 및 대응하는 기준 대립유전자를 포함하는 서열 영역을 서브 클로닝하고 발현시킴으로써 각각의 에피토프 펩티드를 수득하는 단계;
    (iv) (iii)에서 수득된 클로닝된 서열 영역에 의해 인코딩된 에피토프 펩티드, 또는 상응하는 기준 대립유전자에 의해 인코딩된 에피토프 펩티드에 특이적으로 결합하는 iCAR 결합 도메인을 선별하는 단계; 및
    (vii) 각각 (iv)에서 정의된 바와 같은 iCAR 결합 도메인을 포함하는 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에서 정의된 iCAR을 제조하는 단계를 포함하는 제조 방법.
  20. 제19항에 있어서, 각각의 변이체에 대한 소수 대립유전자 빈도가 1, 2, 3, 4 또는 5% 이상인 방법.
  21. 안전한 효과기 면역 세포의 제조 방법으로서, (i) 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항의 iCAR을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산 분자로 종양 관련 항원에 유도되는 TCR-조작된 효과기 면역 세포를 형질주입시키거나 또는 세포를 제9항의 벡터에 형질도입하는 단계; 또는 (ii) 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항의 iCAR을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산 분자 및 제10항 내지 제13항 중 어느 한 항에 정의된 aCAR을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산 분자로 미접촉 효과기 면역 세포를 형질주입시키거나; 또는 제10항 내지 제18항 중 어느 한 항의 벡터로 효과기 면역 세포를 형질도입시키는 단계를 포함하는 안전한 효과기 면역 세포의 제조 방법.
  22. 제21항의 방법에 의해 수득되는 안전한 효과기 면역 세포.
  23. 제22항에 있어서, 항원의 비다형성 세포 표면 에피토프에 특이적으로 결합하는 세포외 도메인을 포함하는 aCAR 및 상기 aCAR의 세포외 도메인이 결합하는 상이한 항원의 다형성 세포 표면 에피토프의 단일 대립유전자 변이체에 특이적으로 결합하는 세포외 도메인을 포함하는 iCAR을 이의 표면 상에 발현하는 안전한 효과기 면역 세포.
  24. 제22항 또는 제23항에 있어서, 상기 aCAR의 세포외 도메인이 CD19와 같은 표 1에 열거된 항원으로부터 선택된 비다형성 세포 표면 에피토프에 특이적으로 결합되는 안전한 효과기 면역 세포.
  25. 제22항에 있어서, 상기 aCAR 및 iCAR이 별개의 단백질로서 세포 표면 상에 존재하는 안전한 효과기 면역 세포.
  26. 제22항에 있어서, iCAR을 인코딩하는 상기 뉴클레오티드 서열의 발현 수준이 aCAR을 인코딩하는 상기 뉴클레오티드 서열의 발현 수준 이상인 안전한 효과기 면역 세포.
  27. LOH을 특징으로 하는 종양을 갖는 대상체에 대한 개인화된 바이오마커의 선별 방법으로서,
    (i) 대상체로부터 종양 생검을 수득하는 단계;
    (ii) 대상체로부터의 정상 조직의 샘플, 예를 들어 PBMC를 수득하는 단계; 및
    (iii) LOH로 인해 종양의 세포에 의해 발현되지는 않지만 정상 조직의 세포에 의해 발현되는 다형성 세포 표면 에피토프의 단일 대립유전자 변이체를 동정하고,
    이로써 대상체에 대한 개인화된 바이오 마커를 동정하는 단계를 포함하는 선별 방법.
  28. LOH를 특징으로 하는 종양을 갖는 환자에서의 암의 치료 방법으로서, 상기 환자에게 제22항의 효과기 면역 세포를 투여하는 단계를 포함하고, 여기서 iCAR이 이형접합성 (LOH)의 손실로 인해 종양 세포에서 존재하지 않지만, 환자의 관련 포유동물 정상 조직의 모든 세포 상에 적어도 존재하는 다형성 세포 표면 에피토프를 인코딩하는 단일 대립유전자 변이체에 유도되는 치료 방법.
  29. 제22항에 있어서, LOH를 특징으로 하는 종양을 갖는 환자에서 사용하기 위한 안전한 효과기 면역 세포로서, 여기서 iCAR이 이형접합성 (LOH)의 손실로 인해 포유동물 종양 세포에서 존재하지 않지만, 환자의 관련 포유동물 정상 조직의 모든 세포 상에 적어도 존재하는 다형성 세포 표면 에피토프를 인코딩하는 단일 대립유전자 변이체에 유도되는 안전한 효과기 면역 세포.
  30. 제29항에 있어서, 상기 치료는 암 환자에게 (iii)의 aCAR을 발현하지만 (iii)의 iCAR이 결핍된 면역 효과기 세포의 적어도 하나의 집단을 투여하는 단계를 포함하는 치료와 비교하여 감소된 온-표적, 오프-종양 반응성을 야기하는 안전한 효과기 면역 세포.
  31. 제29항에 있어서, 이의 표면 상에 종양-관련 항원 또는 항원의 비다형성 세포 표면 에피토프에 특이적으로 결합하는 세포외 도메인을 포함하는 aCAR 및 상기 aCAR의 세포외 도메인이 결합하는 것과 상이한 항원인 HLA-A와 같은 하우스키핑 단백질 또는 종양의 유래의 조직에서 적어도 발현되는 항원의 다형성 세포 표면 에피토프의 단일 대립유전자 변이체에 특이적으로 결합하는 세포외 도메인을 포함하는 iCAR을 발현시키는 안전한 효과기 면역 세포.
  32. 제28항에 있어서, 자가 또는 범용 (동종이계) 효과기 세포인 안전한 효과기 면역 세포.
  33. 제28항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, T 세포, 자연 킬러 세포 또는 사이토카인 유도 킬러 세포로부터 선택되는 안전한 효과기 면역 세포.
  34. 2개 이상의 핵산 분자의 조합으로서, 각각의 하나는 상이한 수의 조절된 효과기 면역 세포 활성화 시스템을 인코딩한 뉴클레이티드 서열을 포함하고, 상기 핵산 분자는 단일 연속 핵산 분자를 형성하거나 또는 2개 이상의 별개의 핵산 분자를 포함하고, 상기 조절된 효과기 면역 활성화 시스템은 이형접합성 (LOH)의 손실로 인하여 하나 이상의 역색체 또는 이의 절편이 손실된 킬러 세포에 효과기 면역 세포를 유도하고, 관련 정상 조직의 세포를 보존하며, 여기서,
    (a) 제1 구성원은 항원의 비다형성 세포 표면 에피토프 또는 상이한 다형성 세포 표면 에피토프의 단일 대립유전자 변이체에 특이적으로 결합하는 제1 세포외 도메인을 포함하는 활성화 키메라 항원 수용체 (aCAR) 폴리펩티드를 포함하고, 상기 비다형성 또는 다형성 세포 표면 에피토프는 종양-관련 항원이거나 또는 관련 비정상 및 정상 포유동물 조직의 세포에 의해 공유되거나;
    (b) 제2 구성원은 LOH로 인해 비정상적인 포유동물 조직에 의해 발현되지 않지만 관련 포유동물 정상 조직의 모든 세포 상에 존재하는 다형성 세포 표면 에피토프의 단일 대립유전자 변이체에 특이적으로 결합하는 제2 세포외 도메인을 포함하는 조절 폴리펩티드를 포함하는, 2개 이상의 핵산 분자의 조합.
  35. 제34항에 있어서, 제1 구성원은,
    (a) 효과기 면역 세포를 활성화하고 및/또는 공동-자극하는 적어도 하나의 신호 전달 성분을 포함하는 세포내 도메인을 더 포함하는 구성적 aCAR; 및
    (b) 이종이량체화 소분자 및 임의로 적어도 하나의 공동-자극 신호 전달 성분에 대한 결합 부위의 제1 구성원을 포함하나, 활성화 신호 전달 성분이 결핍된 세포내 도메인을 더 포함하는 조건적 aCAR로부터 선택되고; 제2 구성원은,
    (c) 효과기 면역 세포를 억제하는 적어도 하나의 신호 전달 성분을 포함하는 세포내 도메인을 더 포함하는 억제 키메라 항원 수용체 (iCAR); 또는
    (d) 쉐데이즈에 대한 기질을 포함하는 세포외 조절 영역; 막내-절단 프로테아제에 대한 기질을 포함하는 막투과 캐노닉 모티프; 및 세포내 도메인으로서 효과기 면역 세포를 활성화하고 및/또는 공동-자극하는 적어도 하나의 신호 전달 성분을 포함하는 세포내 도메인 및 이종이량체화 소분자에 대한 결합 부위의 제2 구성원을 더 포함하는 보호 키메라 항원 수용체 (pCAR)인 조합.
  36. 제34항 또는 제35항에 있어서,
    (i) iCAR 또는 pCAR의 세포외 도메인은 aCAR의 세포외 도메인이 결합하는 것과 상이한 항원인, 항원의 다형성 세포 표면 에피토프의 단일 대립유전자 변이체를 특이적으로 결합하거나, (ii) 상기 pCAR 또는 iCAR의 세포외 도메인은 상기 aCAR의 세포외 도메인이 결합하는 동일한 항원의 상이한 다형성 세포 표면 에피토프의 단일 대립유전자 변이체를 특이적으로 결합하거나; 또는
    (iii) 상기 pCAR 또는 iCAR의 세포외 도메인은 상기 aCAR의 세포외 도메인이 결합되는 동일한 다형성 세포 표면 에피토프의 상이한 단일 대립유전자 변이체를 특이적으로 결합하는 조합.
  37. 제34항에 있어서, 쉐데이즈에 대한 상기 기질은 디스인테그린 및 메탈로프로테이나아제 (ADAM) 또는 베타-세크리타아제 1 (BACE1)에 대한 기질인 조합.
  38. 제37항에 있어서, 상기 기질은 세포외 도메인의 일부를 형성하고, Lin 12/노치 반복 및 ADAM 프로테아제 절단 부위를 포함하는 조합.
  39. 제34항에 있어서, 막내-절단 프로테아제에 대한 상기 기질은 SP2, γ-세크리타제, 신호 펩티드 펩티다아제 (spp), spp-유사 프로테아제 또는 정사방형 프로테아제에 대한 기질인 조합.
  40. 제39항에 있어서, 상기 기질은 막투과성 캐노닉 모티프의 일부를 형성하고, 노치, ErbB4, E-카데린, N-카데린, 에프린-B2, 아밀로이드 전구체 단백질 또는 CD44의 막투과 도메인과 상동성이고/이로부터 유도되는 조합.
  41. 제34항에 있어서, 별개의 단백질로서 상기 조건적 aCAR의 세포외 도메인 및 세포내 도메인을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 여기서 각각의 도메인은 독립적으로 막투과 캐노닉 모티프에 융합되고, 이종이량체화 소분자에 대한 결합 부위의 상이한 구성원을 포함하는 조합.
  42. 제34항에 있어서, 이종이량체화 소분자에 대한 상기 결합 부위의 제1 및 제2 구성원의 각각의 하나는 하기로부터 선택된 단백질로부터 유도되는 조합:
    (i) 타크로리무스 (FK506) 결합 단백질 (FKBP) 및 FKBP;
    (ii) FKBP 및 칼시뉴린 촉매 서브유닛 A (CnA);
    (iii) FKBP 및 시클로필린;
    (iv) FKBP 및 FKBP-라파마이신 관련 단백질 (FRB);
    (v) 자이레이즈 B (GyrB) 및 GyrB;
    (vi) 디하이드로폴레이트 환원효소 (DHFR) 및 DHFR;
    (vii) DmrB 단일이량체화 도메인 (DmrB) 및 DmrB;
    (viii) PYL 단백질 (일명 아브시스산 수용체 및 RCAR) 및 ABI; 및
    (ix) GAI 애기 장대 단백질 (일명 지베렐린산 인센서티브 및 DELLA 단백질 GAI; GAI) 및 GID1 애기 장대 단백질 (또한 지베렐린 수용체 GID1; GID1).
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