CN109796532A

CN109796532A - 靶向成纤维激活蛋白α的结合单元及其应用

Info

Publication number: CN109796532A
Application number: CN201711146783.4A
Authority: CN
Inventors: 李宗海; 王鹏
Original assignee: Keji Biomedical (shanghai) Co Ltd; Shanghai Cancer Institute
Current assignee: Clegg Medical Co ltd
Priority date: 2017-11-17
Filing date: 2017-11-17
Publication date: 2019-05-24
Also published as: WO2019096261A1; US11447570B2; EP3712179A1; EP3712179A4; JP2021509820A; US20200347151A1

Abstract

本发明涉及特异性结合FAPα的结合单元，编码此类结合单元的多核苷酸，包含此类多核苷酸的载体和宿主细胞。本发明还涉及用于生成该抗原结合单元的方法和使用本发明的FAPα特异性结合单元治疗疾病的方法。本发明的特异性结合FAPα的结合单元能够有效结合表达FAPα的肿瘤细胞，而包含所述结合单元的免疫效应细胞对表达FAP的肿瘤细胞表现出显著的杀伤能力。

Description

靶向成纤维激活蛋白α的结合单元及其应用

技术领域

本发明涉及生物医药领域；具体地说，本发明涉及特异性结合FAPα的结合单元，编码此类结合单元的多核苷酸，包含此类多核苷酸的载体和宿主细胞。本发明还涉及用于生成该抗原结合单元的方法和在疾病的治疗中使用它的方法。

背景技术

成纤维细胞激活蛋白α(Fibroblast activation proteinα,FAPα)是特异性表达于肿瘤相关成纤维细胞(CAF)表面的一种抗原分子(NCBI Reference Sequence:NP_001278736.1)，属于丝氨酸蛋白酶家族，具有胶原酶和二肽基肽酶活性，在肿瘤宿主界面基质的降解和重建中发挥着重要的作用，参与肿瘤的生长、浸润和转移，FAPα选择性表达于90％以上的恶性上皮肿瘤(如乳腺癌、卵巢癌、肺癌、结肠癌、胰腺癌、皮肤黑色素瘤、肾癌、膀胱癌等)的基质，胚胎组织、愈合创面及生理性重建的器官中，而在正常成体组织中一般不表达。这些特点使FAPα成为多种肿瘤的成像、诊断以及治疗的抗原靶标。

人FAPα最初是使用单克隆抗体(mAb)F19(记载于WO93/05804，ATCC编号HB8269)在培养的成纤维细胞中鉴定的。基于F19抗体的人源化开发了西罗珠单抗(Sibrotuzumab)/BIBH1，一项利用西罗珠单抗进行的I期研究证明了¹³¹I标记的抗体的特异性肿瘤积累(Scott et al.,Clin Cancer Res 9,1639-1647(2003))。然而，未偶联的西罗珠单抗在具有转移性结肠直肠癌的患者中的一项早期II期试验因抗体缺少抑制肿瘤发展的功效而停止(Hofheinz et al.,Inkologie 26,44-48(2003))。

因此，本领域仍然需要增强的治疗方法，包括靶向FAPα、具有改良功效的抗体来治疗癌症。

发明内容

本发明目的在于发现特异性结合FAPα的结合单元，包括但不限于抗体以及开发靶向FAPα的免疫效应细胞。

在第一方面，本发明提供一种抗原结合单元，所述抗原结合单元包含轻链CDR区和重链CDR区，所述的重链CDR包含HCDR1，HCDR2，和HCDR3；所述的轻链CDR区包含LCDR1，LCDR2，和LCDR3；

其中，所述的HCDR1，HCDR2和HCDR3的序列独立选自下组：SEQ ID NO:1-3、7和8，所述的LCDR1，LCDR2和LCDR3的序列独立选自下组：SEQ ID NO:4-6、9和10。

在具体的实施方式中，所述的HCDR1具有SEQ ID NO:1或7所示的序列，所述的HCDR2具有SEQ ID NO:2或8所示的序列，所述的HCDR3具有SEQ ID NO:3所示的序列。

在具体的实施方式中，所述的HCDR1，HCDR2和HCDR3的序列选自以下任一组：

A.SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3；

B.SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:3。

在具体的实施方式中，所述的LCDR1具有SEQ ID NO:4或9所示的序列，所述的LCDR2具有SEQ ID NO:5或10所示的序列，所述的LCDR3具有SEQ ID NO:6所示的序列。

在具体的实施方式中，所述的LCDR1，LCDR2和LCDR3的序列选自以下任一组：

A.SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6；

B.SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:6。

在具体的实施方式中，所述的HCDR1具有SEQ ID NO:1或7所示的序列，所述的HCDR2具有SEQ ID NO:2或8所示的序列，所述的HCDR3具有SEQ ID NO:3所示的序列，所述的LCDR1具有SEQ ID NO:4或9所示的序列，所述的LCDR2具有SEQ ID NO:5或10所示的序列，所述的LCDR3具有SEQ ID NO:6所示的序列。

在具体的实施方式中，所述的HCDR1含有SEQ ID NO:1所示的序列、所述的HCDR2含有SEQ ID NO:2所示的序列、所述的HCDR3含有SEQ ID NO:3所示的序列、所述的LCDR1含有SEQ ID NO:4所示的序列、所述的LCDR2含有SEQ ID NO:5所示的序列、所述的LCDR3含有SEQID NO:6所示的序列；或者

所述的HCDR1含有SEQ ID NO:7所示的序列、所述的HCDR2含有SEQ ID NO:8所示的序列、所述的HCDR3含有SEQ ID NO:3所示的序列、所述的LCDR1含有SEQ ID NO:4所示的序列、所述的LCDR2含有SEQ ID NO:5所示的序列、所述的LCDR3含有SEQ ID NO:6所示的序列；或者

所述的HCDR1含有SEQ ID NO:1所示的序列、所述的HCDR2含有SEQ ID NO:2所示的序列、所述的HCDR3含有SEQ ID NO:3所示的序列、所述的LCDR1含有SEQ ID NO:9所示的序列、所述的LCDR2含有SEQ ID NO:10所示的序列、所述的LCDR3含有SEQ ID NO:6所示的序列。

在具体的实施方式中，所述的抗原结合单元具有SEQ ID NO:11或15所示的重链可变区，和SEQ ID NO:13或17所示的轻链可变区。

在优选的实施方式中，所述抗原结合单元是抗体，优选单克隆抗体或其活性片段。

在第二方面，本发明提供第一方面所述的抗原结合单元的突变体，所述突变体与第一方面所述的抗原结合单元竞争结合FAPα。

在具体的实施方式中，所述突变体与第一方面所述的抗原结合单元在轻链可变区序列上有90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的相同性；或者，所述突变体与权利要求1-8任一所述的抗原结合单元在在重链可变区序列上有90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的相同性；

优选地，所述突变体与第一方面所述的抗原结合单元在轻链CDR区，例如轻链CDR1或CDR2的序列上有70％以上；优选地，75％以上；更优选地，80％以上的相同性；或者，所述突变体与第一方面所述的抗原结合单元在重链CDR区，例如重链CDR1或CDR2的序列上有60％以上；优选地，70％以上；更优选地，80％以上的相同性。

在具体的实施方式中，所述突变体与第一方面所述的抗原结合单元竞争结合FAPα上同一结合表位。

在第三方面，本发明提供一种抗原结合单元，所述抗原结合单元包含轻链CDR区和重链CDR区，所述的重链CDR包含HCDR1，HCDR2和HCDR3；所述的轻链CDR区包含LCDR1，LCDR2和LCDR3，其中，所述的HCDR1，HCDR2和HCDR3独立选自与SEQ ID NO:1-3、7、8中任一序列至少80％、优选至少85％、更优选至少90％、更优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相似性的序列，所述的LCDR1，LCDR2和LCDR3独立选自与SEQ ID NO:4-6、9、10中任一序列至少80％、优选至少85％、更优选至少90％、更优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相似性的序列。

A.SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3；

B.SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:3。

A.SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6；

B.SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:6。

在第四方面，本发明提供一种抗原结合单元，所述的抗原结合单元具有与SEQ IDNO:11或15所示的重链可变区的序列具有至少80％、优选至少85％、更优选至少90％、更优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相似性的序列，和与SEQ IDNO:13或17所示的轻链可变区具有至少80％、优选至少85％、更优选至少90％、更优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相似性的序列。

在第五方面，本发明提供第一到第四方面所述的抗原结合单元或抗原结合单元突变体，所述的抗原结合单元是单克隆抗体、全人抗体、人源化抗体、嵌合抗体。

在具体的实施方式中，所述的抗原结合单元是scFv、Fv、Fab、(Fab)2或者单域抗体。

在第六方面，本发明提供编码第一到第五方面所述的抗原结合单元的核酸。

在第七方面，本发明提供一种表达载体，其包含第六方面所述的核酸。

在第八方面，本发明提供一种宿主细胞，其包含第七方面所述的表达载体或基因组中整合有第六方面所述的核酸。

在第九方面，本发明提供一种双价蛋白，由第五方面所述的scFv序列与一个或多个重链恒定区域融合所形成具有人免疫球蛋白Fc区的抗体；

优选地，所述的人免疫球蛋白Fc区连接有缀合物；优选的，所述缀合物优选自荧光染料、细胞毒素、放射性同位素。

在第十方面，本发明提供一种多功能免疫辍合物，所述的多功能免疫辍合物包括:

第一到第五方面所述的抗原结合单元，以及与之连接的功能性分子；其中，所述的功能性分子选自:

(a)靶向肿瘤表面标志物的分子，包括结合免疫细胞表面标志物的抗体或配体；较佳地，所述的免疫细胞表面标志物包括:CD3，CD16，CD28；更佳地，所述的结合免疫细胞表面标志物的抗体是抗CD3抗体；最佳地，所述的靶向免疫细胞的表面标志物的分子是结合T细胞表面标志物的抗体；

(b)抑制肿瘤的分子,包括抗肿瘤的细胞因子或抗肿瘤的毒素，较佳的，所述的细胞因子包括:IL-12、IL-15、I型干扰素、TNF-alpha；

(c)靶向免疫细胞的表面标志物的分子或可检测标记物。

在第十一方面，本发明提供一种嵌合抗原受体，所述嵌合抗原受体的胞外域包含第一到第五方面所述的抗原结合单元，该抗原结合单元优选单链抗体或单域抗体。

在优选的实施方式中，所述嵌合抗原受体还包含跨膜域及胞内信号域，

所述的跨膜域，较佳地，选自TCR的α、β、zeta链，CD3ε，CD3ζ，CD4，CD5，CD8α，CD9，CD16，CD22，CD27，CD28，CD33，CD37，CD45，CD64，CD80，CD86，CD134，CD137，CD152，CD154，和PD1的跨膜区；更佳地，选自CD8α，CD4，CD45，PD1，CD154和CD28的跨膜域；

和/或

所述胞内信号域包含一个或多个共刺激信号域和/或初级信号域；其中，所述的共刺激信号域，较佳地，选自CARD11，CD2，CD7，CD27，CD28，CD30，CD40，CD54，CD83，OX40，CD137，CD134，CD150，CD152，CD223，CD270，PD-L2，PD-L1，CD278，DAP10，LAT，NKD2C SLP76，TRIM，FcεRIγ，MyD88，和41BBL的胞内信号区；和/或所述初级信号域选自TCRξ、FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε，CD5，CD22，CD79a，CD79b，CD278(也称作“ICOS”)和CD66d，和CD3ζ；更佳地，选自CD137，CD134，CD28和OX40；和/或所述初级信号域选自CD3ζ。

在优选的实施方式中，所述的跨膜域选自CD8α或CD28，所述共刺激信号域选自CD137或CD28的胞内信号域，所述初级信号域选自CD3ζ。

在具体的实施方式中，所述的嵌合抗原受体包括如下顺序连接的抗体，跨膜区和胞内信号区：

第一到第五方面所述的抗原结合单元、CD8和CD3ζ；

第一到第五方面所述的抗原结合单元、CD8、CD137和CD3ζ；

第一到第五方面所述的抗原结合单元、CD28分子的跨膜区、CD28分子的胞内信号区和CD3ζ；或

第一到第五方面所述的抗原结合单元、CD28分子的跨膜区、CD28分子的胞内信号区、CD137和CD3ζ。

在第十二方面，本发明提供编码第十一方面所述的嵌合抗原受体的核苷酸序列。

在第十三方面，本发明提供一种表达载体，所述表达载体包含第十二方面所述的核苷酸序列。

在第十四方面，本发明提供一种病毒，所述的病毒包含第十三方面所述的表达载体。

在第十五方面，本发明提供一种基因修饰的免疫细胞，其转导有第十二方面所述的核苷酸序列、或第十三方面所述的表达载体、或第十四方面所述的病毒；或者，其表达第十一方面所述的嵌合抗原受体。

在优选的实施方式中，所述的免疫细胞包括但不限于以下细胞及其组合：T淋巴细胞，NK细胞或NKT细胞。

在具体的实施方式中，所述基因修饰的免疫细胞还表达有除嵌合抗原受体之外的其他序列，所述其他序列包括细胞因子、另一种嵌合抗原受体、趋化因子受体、降低PD-1表达的siRNA或者阻断PD-L1的蛋白、TCR、或安全开关；

较佳地，所述的细胞因子包括IL-12、IL-15、IL-21、或I型干扰素；

较佳地，所述趋化因子受体包括CCR2、CCR5、CXCR2、或CXCR4；

较佳地，所述安全开关包括iCaspase-9、Truancated EGFR或RQR8。

在第十六方面，本发明提供第一到第五方面所述的抗原结合单元、或第九方面所述的双价蛋白、或第十方面所述的免疫辍合物、或第十一方面所述的嵌合抗原受体、或第十二方面所述的核苷酸序列、或第十三方面所述的表达载体、或第十四方面所述的病毒、或第十五方面所述的免疫细胞的用途，用于制备治疗、预防或诊断高表达FAPα相关的疾病的药物或试剂。

在具体的实施方式中，所述的高表达FAPα相关的疾病是肿瘤。

在具体的实施方式中，所述的肿瘤是乳腺癌、卵巢癌、肺癌、结肠癌、胰腺癌、皮肤黑色素瘤、肾癌、膀胱癌。

在第十七方面，本发明提供一种药物组合物，所述药物组合物包含第一到第五方面所述的抗原结合单元或编码该抗原结合单元的核酸；或

第九方面所述的双价蛋白；或

第十方面所述的免疫辍合物或编码该辍合物的核酸；或

第十一方面所述的嵌合抗原受体或编码该嵌合抗原受体的核酸；或

第十五方面所述的基因修饰的免疫细胞。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1显示了SDS PAGE分析镍柱纯化重组human FAPα_His(huFAP),mouse FAP_His(mFAP)的结果；

图2显示了ELISA测定噬菌体克隆表达上清液和重组huFAPa，mFAP的结合；

图3显示了FACs检测部分纯化的克隆和U-87MG以及A549细胞的结合；

图4显示了Biacore测定1A7、8E3(scFv)结合huFAP，mFAP的亲和力；

图5显示了抗体1A7、8E3与亲本抗体10A4的序列比对(scFv)；

图6为SDS PAGE分析纯化的抗体1A7、8E3(scFv_Fc)；

图7为Western blot检测3T3-mFAP，HT1080-huFAPα稳转细胞系的结果；

图8为FACs检测3T3-mFAP(a)，HT1080-huFAPα(b)稳转细胞系的结果；

图9显示了FACs测定抗体10A4、1A7、8E3(scFv_Fc)与U-87MG、3T3-mFAP、HT1080-huFAPα细胞的结合；

图10是利用Anti-Flag抗体FACs检测3T3-mFAP(a)、HT1080-huFAP(b)稳转细胞系中mFAPα及huFAPα的表达；

图11是FACs检测hu8E3-28Z CAR在T细胞中的表达；

图12是细胞毒性检测表达hu8E3-28Z CAR的T细胞对3T3-mFAP(a)及H1080-huFAPα(b)细胞的杀伤。

具体实施方式

发明人经过广泛而深入的研究，出乎意料地发现特异性结合FAP的抗体，在此基础上开发了特异性靶向FAP的免疫效应细胞。本发明的抗体能够有效结合表达FAP的肿瘤细胞，本发明的免疫效应细胞对表达FAP的肿瘤细胞表现出显著的杀伤能力，从而能够有效而安全地应用于多发性骨髓瘤等恶性肿瘤的治疗。在此基础上完成了本发明。

以下具体说明详尽地展示了本文所公开的实施方案。应当理解，本说明书并非意欲仅限于此处所公开的具体的实施方案，而是可以发生改变。本领域技术人员将理解，本说明书中所公开的内容可以有多种改变或变化，而均涵盖于所公开的范围和原则之内。除非另有说明，每个实施方案均可与任何其他实施方案任意组合。

本文所公开的某些实施方案包含了数值范围，并且本发明的某些方面可采用范围的方式描述。除非另有说明，应当理解数值范围或者以范围描述的方式仅是出于简洁、便利的目的，并不应当认为是对本发明的范围的严格限定。因此，采用范围方式的描述应当被认为具体地公开了所有可能的子范围以及在该范围内的所有可能的具体数值点，正如这些子范围和数值点在本文中已经明确写出。

当涉及可测量值比如量、暂时持续时间等时，术语“约”是指包括指定值的±20％、或在某些情况下±10％、或在某些情况下±5％、或在某些情况下±1％、或在某些情况下±0.1％的变化。

术语定义

本文所用的术语具有与本领域技术人员常规理解相似的含义。为清晰起见，现对其中一些术语定义如下。

本文所用的术语“FAPα”是指成纤维细胞激活蛋白α。人成纤维细胞激活蛋白α由760个氨基酸残基组成的跨膜蛋白(NCBI Reference Sequence:NP_001278736.1)。如果没有特别说明，本文中的FAPα是指人成纤维细胞激活蛋白α。鼠的成纤维细胞激活蛋白由761个氨基酸残基组成(由760个氨基酸残基组成的跨膜蛋白，NCBI Reference Sequence:NP_032012.1)。

本文所用的术语“结合单元”、“抗原结合单元”或“抗原结合蛋白”具有相同的含义，在本文可以互换使用，是指免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的任何形式的免疫活性部分；即，包含特异性结合抗原或与抗原免疫反应的抗原结合位点的分子。结构上，最简单的天然产生的抗体(例如，IgG)具有四个多肽链，通过二硫键相互连接的两个重(H)链和两个轻(L)链。免疫球蛋白代表了包括几种分子类型在内的一大族分子，例如IgD、IgG、IgA、IgM和IgE。抗原结合单元包括但不限于Fv、scFv、dFv、dAb、二链抗体、三链抗体、四链抗体、结构域Ab、Fab片段、Fab’、(Fab’)₂、双特异性抗体和多特异性的抗体。

本文所用的术语“竞争结合”是指两种或多种物质与结合对象的同一位置，例如，某抗原的同一结合表位相结合；换言之，结合在同一结合对象上的不同位置的不同物质不存在本文所述的“竞争结合”的关系。

本文所用的术语“抗原结合单元”还包括多物种来源的免疫球蛋白分子，包括无脊椎动物和脊椎动物。应用于抗原结合单元的术语“人”是指由人类基因或其片段表达的免疫球蛋白分子。应用于非人(例如啮齿动物或灵长类动物)抗体的术语“人源化”是包含源自非人免疫球蛋白的最小序列的杂交免疫球蛋白、免疫球蛋白链或其片段。对于其大部分，人源化抗体是人免疫球蛋白(受者抗体(recipient antibody))，其中来自受者互补决定区(CDR)的残基被来自具有所需特异性、亲和力和容量的非人物种(如小鼠、大鼠、兔或灵长动物)的CDR(供者抗体)的残基取代。在某些情况中，非人免疫球蛋白的Fv框架区(FR)残基被相应的人残基取代。另外，人源化抗体可以包含既不在受者抗体也不在输入的CDR或框架序列中发现的残基。进行这些修饰以进一步完善和优化抗体性能和在引入人体时最大程度降低免疫原性。一般而言，人源化抗体包含基本上全部的至少一个和通常两个可变域，其中全部或基本上全部CDR区域对应于非人免疫球蛋白的CDR区域且全部或基本上全部FR区域为非人免疫球蛋白序列的FR区域。

本文所用的术语“抗体”，作为本领域已知的那些术语，指免疫系统的抗原结合蛋白。如本文提到的术语“抗体”包括具有抗原结合区域的完整的全长抗体及其中“抗原结合部分”或“抗原结合区域”保留的其任何片段、或其单链例如单链可变片段(scFv)。天然抗体指包含通过二硫键互联的至少两条重(H)链和两条轻(L)链或其抗原结合片段的糖蛋白。术语“抗体”还包括抗体(特别是本文所述抗体)的所有重组形式，例如在原核细胞中表达的抗体，未糖基化的抗体以及与抗原结合的抗体片段和下文所诉的衍生物。每条重链由重链可变区(本文缩写为V_H)和重链恒定区组成。每条轻链由轻链可变区(本文缩写为V_L)和轻链恒定区组成。V_H和V_L可进一步细分为称为互补性决定区(CDR)的高变区，它们散布在称为构架区(FR)的更保守区域中。每条V_H和V_L由三个CDR和四个FR组成，从氨基端至羧基端按以下顺序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重链和轻链的可变区含有与抗原相互作用的结合结构域。抗体的恒定区可介导该免疫球蛋白与宿主组织或因子的结合，所述宿主组织或因子包括免疫系统的多种细胞(如效应细胞)和经典补体系统的第一成分(C1q)。

本文所用的术语“Fab”或“Fab区”包括包含V_H、C_H1、V_L和C_L免疫球蛋白结构域的多肽。Fab可以指分离的该区域，或者位于全长抗体或抗体片段环境中的该区域。

本文中的术语“Fc”或“Fc区”包括包含除第一恒定区免疫球蛋白结构域以外的抗体恒定区的多肽。因而，Fc指IgA、IgD和IgG的最后两个恒定区免疫球蛋白结构域，和IgE和IgM的最后三个恒定区免疫球蛋白结构域，和这些结构域N端的柔性铰链。对于IgA和IgM，Fc可包括J链。对于IgG，Fc包括免疫球蛋白结构域Cγ2和Cγ3和在Cγ1和Cγ2之间的铰链。虽然Fc区的边界可以改变，但人IgG重链Fc区通常定义为在其羧基端包含残基C226或P230，其中编号是根据Kabat的EU索引。对于人IgG1，Fc在本文定义为包含残基P232至其羧基端，其中编号是根据Kabat中的EU索引。Fc可以指分离的该区域，或者位于Fc多肽，例如抗体，环境中的该区域。

本文中使用的术语“亲本抗体”或“亲本免疫球蛋白”包括未修饰的抗体，所述抗体之后经修饰产生变体。所述亲本抗体可以使天然存在的抗体，或者天然存在的抗体的变体或改造版本。亲本抗体可以指抗体本身，包含所述亲本抗体的组合物，或其编码氨基酸序列。本文中使用的术语“亲本抗体”或“亲本免疫球蛋白”包括之后经修饰产生人源化抗体的鼠抗体或嵌合抗体。

本文中使用的术语“变体抗体”或“抗体变体”或“变体”包括由于相比亲本的至少一个氨基酸修饰，而不同于亲本抗体序列的抗体序列。抗体变体可以指抗体本身，也可以指包含所述亲本抗体的组合物。在具体的实施方式指，本文所述的变体抗体的轻链可变区序列与亲本抗体的轻链可变区序列有90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的相同性；本文所述的变体抗体的重链可变区序列与亲本抗体的重链可变区序列有90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的相同性。在优选的实施方式中，本文所述的变体抗体的轻链CDR区，例如轻链CDR1或CDR2的序列与亲本抗体的轻链CDR区，例如轻链CDR1或CDR2序列有70％以上的相同性；优选地，75％以上的相同性；更优选地，80％以上的相同性；本文所述的变体抗体的重链CDR区，例如重链CDR1或CDR2的序列与亲本抗体的重链CDR区，例如重链CDR1或CDR2序列有60％以上的相同性；优选地，70％以上的相同性；更优选地，80％以上的相同性。

术语“氨基酸修饰”包括氨基酸取代、添加和/或缺失，“氨基酸取代”意指用另一种氨基酸替换亲本多肽序列中特定位置上的氨基酸。例如，取代R94K指94位的精氨酸被赖氨酸替换，本文中使用的“氨基酸插入”意指在亲本多肽序列中的特定位置添加氨基酸。文中使用的“氨基酸缺失”或“缺失”意指去除亲本多肽序列中特定位置上的氨基酸。

本文中使用的术语“保守修饰”或“保守序列修饰”意指不显著影响或改变含有所述氨基酸序列的抗体的结合特征的氨基酸修饰。此类保守修饰包括氨基酸取代、插入和缺失。可通过本领域已知的标准技术将修饰导入本发明的抗体中，例如定点诱变和PCR介导的诱变。保守的氨基酸取代是用具有相似侧链的氨基酸残基替换氨基酸残基的取代。本领域已经定义了具有相似侧链的氨基酸残基家族。这些家族包括含碱性侧链的氨基酸(例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如，天冬氨酸、谷氨酸)、不带电的极性侧链(例如，甘氨酸、天冬酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)、非极性侧链(例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)、β分支侧链(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳香族侧链(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。因而，可以用其他相同侧链家族的氨基酸残基替换本发明抗体的CDR区中或框架区中的一个或多个氨基酸残基，并可以测试所改变的抗体(变体抗体)保留的功能。

抗体片段包括但不限于：(i)由V_L、V_H、C_L和C_H1结构域组成的Fab片段，包括Fab’和Fab’-SH，(ii)V_H和C_H1结构域组成的Fd片段，(iii)由单个抗体的V_L和V_H结构域组成的Fv片段；(iv)由单个可变区组成的dAb片段(Ward等，1989，Nature 341：544-546)；(v)F(ab’)₂片段，包含2个连接的Fab片段的二价片段；(vi)单链Fv分子抗原结合位点(Bird等，1988，Science 242：423-426；Huston等，1988，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 85:5879-5883)；(vii)双特异性单链Fv二聚体(PCT/US92/09965)；(viii)“二体”或“三体”，通过基因融合构建的多价或多特异性片段(Tomlinson等，2000，Methods Enzymol.326:461-479；WO94/13804；Holliger等，1993,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 90:6444-6448)；和(ix)与相同或不同抗体遗传融合的scFv(Coloma&Morrison,1997,Nature Biotechnology 15,159-163)。

根据恒定区基因测定，将抗体分类，也称为同种型。人的恒定轻链分为К(CК)和λ(Cλ)轻链。重链分为μ、δ、γ、α或ε，并分别定义抗体的同种型IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。IgG类是最常用于治疗目的的。在人中，该类别包括亚类IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。在小鼠中，该类别包括亚类IgG1、IgG2a、IgG2b和IgG3。IgM具有亚类，包括但不限于IgM1和IgM2。IgA具有若干亚类，包括但不限于IgA1和IgA2。因而，本文中使用的“同种型”意指通过恒定区的化学和抗原特征定义的免疫球蛋白的任何类或亚类。已知的人免疫球蛋白同种型是IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2、IgM1、IgM2、IgD和IgE。

抗FAPα的抗体

在本公开中，描述了具有基于scFv的抗原结合区域的抗原结合蛋白，包括抗体。其中使用重组FAPα，从人scFv噬菌体展示文库选择scFv。

在一些实施方案中，本发明包括具有scFv序列的抗体，所述scFv序列与一个或多个重链恒定区域融合以形成具有人免疫球蛋白Fc区的抗体以产生双价蛋白，从而增加抗体的总体亲和力和稳定性。此外，Fc部分允许将其他分子(包括但不限于荧光染料、细胞毒素、放射性同位素等)与例如用于抗原定量研究中的抗体直接缀合，以便固定抗体用于亲和力测量、用于定向递送治疗药、使用免疫效应细胞测试Fc介导的细胞毒性和许多其它应用。

本文提供的结果突出表现出本发明抗体在靶向FAPα时的特异性、灵敏性和效用。

本发明的分子基于使用噬菌体展示鉴定和选择单链可变片段(scFv)，所述单链可变片段的氨基酸序列赋予分子针对FAPα的特异性并且形成本发明的全部抗原结合蛋白的基础。因此，所述scFv可以用来设计一系列不同“抗体”分子，包括例如全长抗体、其片段如Fab和F(ab’)₂、融合蛋白(包括scFv_Fc)、多价抗体、即，具有针对相同抗原或不同抗原的多于一种特异性的抗体，例如，双特异性T细胞结合抗体(BiTE)、三抗体等(见Cuesta等，Multivalent antibodies:when design surpasses evolution,Trends inBiotechnology 28:355-362,2010)。

在抗原结合蛋白是全长抗体的一个实施方案中，本发明抗体的重链和轻链可以是全长(例如，抗体可以包括至少一条并优选地两条完整重链，和至少一条并优选地两条完整轻链)或可以包括抗原结合部分(Fab、F(ab’)₂、Fv或scFv)。在其他实施方案中，抗体重链恒定区选自例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgA1、IgA2、IgD和IgE。抗体类型的选择将取决于所设计的抗体欲引发的免疫效应子功能。在构建重组免疫球蛋白时，各种免疫球蛋白同种型的恒定区的适宜氨基酸序列和用于产生广泛种类抗体的方法是本领域技术人员已知的。

在另一方面，本发明提供了结合FAPα的抗原结合单元，其包括选自SEQ ID NO:11、15的重链可变区序列。

在另一方面，本发明提供了结合FAPα的抗原结合单元，其包括选自SEQ ID NO:13、17的轻链可变区序列。

考虑到这些重链和轻链可变区序列各自可以结合FAPα，可以“混合和匹配”重链和轻链可变区序列来产生本发明的抗FAPα的结合分子。

在另一个方面，本发明提供了结合FAPα的抗体或其片段的变体。因而本发明提供了抗体或其片段，具有与本发明抗体的重链或轻链的可变区序列至少80％相同的重链和/或轻链可变区。优选的，重链和/或轻链可变区的氨基酸序列同一性是至少85％，更优选至少90％，最优选至少95％，特别是96％，更特别97％，甚至更特别98％，最特别99％，包括例如80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％和100％。

抗FAPα的抗体特性

评估抗体，例如抗FAP的抗体的结合能力的标准测定是本领域已知的，包括例如ELISA、Biacore、Western印迹和流式细胞仪分析。合适的测定详细描述在实施例中。

核酸、载体和宿主细胞

本发明还提供了编码结合FAPα的抗体和其片段分离的核酸、载体以及包含所述核酸或载体的宿主细胞。核酸可位于完整细胞中、细胞裂解液中或者以部分纯化的或基本纯化的形式。

可以使用标准的分子生物学技术获得本发明的核酸，例如可以通过标准的PCR扩增或cDNA克隆技术，获得编码抗体的轻链和重链或者编码VH和VL区段的cDNA。对于从免疫球蛋白基因文库获得的抗体(例如，使用噬菌体展示技术)，可以从文库回收编码抗体的一种或多种核酸。向宿主细胞中导入外源核酸的方法是本领域普遍已知的，并可随所使用的宿主细胞而变化。

为了表达蛋白质，可以将编码本发明抗体的核酸整合到表达载体中。多种表达载体可用于蛋白质表达。表达载体可包括自我复制的染色体外载体，或整合到宿主基因组中的载体。用于本发明的表达载体包括但不限于使蛋白质能够在哺乳动物细胞、细菌、昆虫细胞、酵母和体外系统中表达的那些。如本领域已知的，多种表达载体是可商业或其他方式获得的。可用于本发明中来表达抗体。

本发明的优点：

1.本发明提供了特异性结合FAPα的抗体；

2.本发明提供了特异性靶向FAPα的免疫效应细胞；和

3.本发明的抗体能够有效结合表达FAPα的肿瘤细胞，本发明的免疫效应细胞对表达FAP的肿瘤细胞表现出显著的杀伤能力。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1.FAPα重组蛋白的制备

体外合成人FAPα的胞外段Leu26-Asp760基因，在该基因C端插入His标签，中间以“GS”相连接，形成融合表达蛋白human FAPα_His(SEQ ID NO:19)，相对应的基因序列如SEQID NO:20所示。

体外合成鼠的FAP胞外段基因(Leu26-Asp761)C端插入His标签，中间以“GS”相连接，形成融合表达蛋白mouse FAPα_His(SEQ ID NO:21)，相对应的基因序列如SEQ ID NO:22所示。

采用293F细胞分别瞬时转染表达human FAPα_His和mouse FAPα_His，转染的方法参照293F细胞的使用说明书。转染后采用镍柱亲和纯化。

纯化后SDS-PAGE电泳，结果如图1所示，E2中都得到了纯度较高的目的蛋白。

用0.22um的膜过滤后，使用截流量为10KD的millipore超滤管进行浓缩，浓缩至体积1ml以内，使用PD-Midi脱盐柱脱盐，收集得到人和鼠的FAPα重组蛋白。

实施例2.使用全人噬菌体展示文库筛选针对FAP特异的scFv

本发明使用的噬菌体展示文库为本申请人构建的全人的天然的scFv噬菌体文库，库容为1E+11。利用本领域技术人员已知的筛选方法，包被10ug/ml抗原human FAPα于免疫管，将噬菌体文库加入包被了human FAPα的免疫管中结合1.5小时，筛选和富集与FAPα特异性结合的scFv噬菌体克隆。

通过针对FAPα的标准ELISA方法确定阳性克隆，共筛选了1344个克隆，挑取其中ELISA结合信号最高的96个克隆(图2)，经测序，得到16个单一的序列，表达纯化这16个克隆并通过Biacore测定亲和力。结果如表1所示：

表1

FACs检测和内源性表达FAPα的U-87MG细胞(购自中国科学院细胞库)结合，不表达FAPα的A549细胞(购自中国科学院细胞库)做为阴性对照细胞。使用Guava easyCyteTM HTSystem仪器检测，结果如图3所示，抗体10A4特异性的结合U-87MG细胞。

经测序分析，10A4的重链可变区为SEQ ID NO:11所示的序列，重链的HCDR1、HCDR2、HCDR3的序列分别如SEQ ID NO:1、2、3所示。10A4的轻链可变区为SEQ ID NO:13所示的序列，轻链的LCDR1、LCDR2、LCDR3的序列分别如SEQ ID NO:4、5、6所示。

实施例4.抗体10A4的亲和力成熟文库的构建以及亲和力成熟文库的筛选

基于抗体10A4的亲和力成熟文库的构建保留了轻链以及重链的CDR3区域，通过简并引物，分别随机化轻链的CDR1和CDR2或者重链的CDR1和CDR2构建了两个亲和力成熟文库。具体构建方法简述如下：

首先基于抗体10A4的scFv(氨基酸序列SEQ ID NO:23，核苷酸序列SEQ ID NO:24)构建模板质粒。对于轻链CDR1和CDR2随机化的噬菌体文库，使用引物LMF(SEQ ID NO:41)和F10L1R(SEQ ID NO:45)PCR扩增片段1；使用引物F10L2F(SEQ ID NO:46)和FdR(SEQ ID NO:44)PCR扩增片段2；通过搭桥PCR连接片段1和片段2得到含有随机化序列的scFv全长，然后用NcoI和NotI酶切全长片段，通过T4连接酶连接入同样酶切的模板质粒中。并电转化至TG1感受态细胞中，库容为1.5E+9。对于重链CDR1和CDR2随机化的噬菌体文库，使用引物LMF(SEQ ID NO:41)和F10H1R(SEQ ID NO:42)，PCR扩增片段3；使用引物F10H2F(SEQ ID NO:43)和FdR(SEQ ID NO:44)，PCR扩增片段4；然后通过搭桥PCR连接片段3和片段4得到含有随机化序列的scFv全长，然后用NcoI和NotI酶切全长片段，通过T4连接酶连接入同样酶切的模板质粒中。并电转化至TG1感受态细胞中，库容为6.6E+8。

亲和力成熟文库的筛选与实施例2中的描述基本一致。包被5ug/ml或者1ug/ml抗原human FAPα于免疫管，将噬菌体文库加入包被了human FAPα的免疫管中结合1.5小时，经筛选和富集，得到与human FAPα特异性结合的scFv噬菌体克隆。

通过标准ELISA方法确定阳性克隆，挑取ELISA信号高的克隆表达纯化，经Biacore测定(见图4)，得到2个克隆(1A7、8E3)表现比亲本抗体10A4要好，亲本抗体10A4对人FAPα的亲和力为197nM，如图4所示，抗体1A7对人FAPα的亲和力为13.5nM，相比10A4提高了14倍，抗体8E3对人FAPα的亲和力为81.6nM，相比10A4提高了2.4倍。两个抗体都与鼠FAP结合，亲和力分别为112nM和267nM。

对1A7、8E3进行测序，测序的结果显示，与亲本抗体10A4相比，抗体1A7一共有7处点突变，其中2处位于重链的CDR1，第31位由Ser变成Pro，第33位由Ala变成Thr；有5处位于重链的CDR2，第52位由Ile变成Val，第54位有Ile变成Asn，第55位由Phe变成Val，第57位由Thr变成Val，第59位由Asn变成Thr。抗体8E3一共有6处点突变，其中4处位于轻链的CDR1，第32位由Ser变成Pro，第35位由Tyr变成Phe，第37位由Tyr变成His，第39位由Asp变成Tyr；有两处位于轻链的CDR2，第55位由Leu变成Val，第57位由Ser变成Gly。

序列比对的结果见图5所示，抗体同一性的比较发现：1A7和10A4相比，重链的CDR1的序列具有60％的相似性，重链的CDR2具有70.5％的相似性，重链的CDR3具有100％的相似性，重链可变区具有93.9％的相似性(共116个氨基酸，7个不同)。8E3和10A4相比，轻链的CDR1的序列具有75％的相似性(共16个氨基酸，4个不同)，轻链的CDR2具有71.4％的相似性(共7个氨基酸，2个不同)，轻链的CDR3具有100％的相似性，轻链可变区具有94.6％的相似性(共113个氨基酸，6个不同)。

实施例5.scFv_Fc融合抗体的构建及其在真核细胞中的瞬转表达纯化

分别针对10A4、1A7、8E3的V_H和V_L片断设计引物，引入由15个柔性氨基酸(GGGGSGGGGSGGGGS)组成的linker连接组成scFv(10A4，SEQ ID NO:23；1A7，SEQ ID NO:25；8E3，SEQ ID NO:27)；在V_H上游引入Nhe I的酶切位点和保护碱基，在V_L的下游引入BamHI的酶切位点和保护碱基。1％琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物并纯化回收。酶切后连接入含有人IgG1重链恒定区的Fc段Asp104-Lys330的V152(购自上海锐劲生物技术有限公司)真核表达载体中。采用293fectin^TM Transfection reagent(Invitrogen,12347-019)或者聚乙烯亚胺(PEI)(Sigma-Aldrich,408727)瞬时转染对数生长期的293F细胞。转染5-7天后收集培养上清通过Protein A进行亲和纯化。SDS PAGE分析纯化产物，如图6所示，还原条件下，条带大小为50kD，符合预期。

实施例6.HT1080-huFAPα,3T3-mFAP稳转细胞系的构建

1.慢病毒包装质粒pWPT-huFAPα_Flag，pWPT-mFAP_Flag的构建

体外合成huFAPa的全长序列，并在C端插入Flag标签(SEQ ID NO:29)，并通过MluI/SalI双酶切，插入同样双酶切的慢病毒包装质粒pWPT中。体外合成mFAPa的全长序列，并在C端插入Flag标签(SEQ ID NO:30)，并通过MluI/SalI双酶切，插入同样双酶切的慢病毒包装质粒pWPT中。

2.mFAP病毒液和huFAPα病毒液的制备

接种6×10⁶细胞至培养皿中，当细胞汇合度为70％-80％时进行转染，转染前1h把293T的培养基更换为完全培养基。在EP管中加入800ul DMEM，随后加入5ug pWPT-mFAP-Flag质粒，7.5ug psPAX.2质粒，2.5ug pMD2.G质粒涡旋振荡8s混匀；然后在另一个EP管中，加入800ul DMEM和45uL 1ug/ul PEI室温下静置5分钟。将质粒混合液逐滴加入PEI孵育液中，混匀室温静置20分钟。然后将配置的质粒/PEI混合液逐滴加入细胞中。转染6小时候，将培养基更换为新鲜的完全培养基。转染72小时候，收集细胞培养上清，4度，3000rpm离心15分钟，取上清用0.45um滤膜过滤，得到mFAP病毒液。

huFAP病毒液的制备方法同mFAP病毒液的制备。

3.病毒感染细胞

第一天，接种1×10⁵ 3T3细胞于6cm培养皿。第二天，弃上清并加入1ml新鲜的完全培养基，然后加入4ml mFAP病毒液液和终浓度为6ug/ml的polybrene培养，得到3T3-huFAP混合克隆细胞。

采用huFAPα病毒感染HT1080细胞，方法同mFAP病毒液感染3T3细胞。

4.3T3-mFAP、HT1080-huFAPα混合克隆Western blot鉴定

3T3-huFAP混合克隆细胞或者HT1080-huFAPα混合克隆细胞以蛋白裂解液裂解，离心后取上清进行BCA测定浓度，以3T3作为阴性对照，一抗：anti-FLAG-HRP(M2)，1:400稀释用。结果如图7所示。

5.流式检测

分别将HT1080-huFAPα和3T3-mFAP的混合克隆细胞消化后计数，以有限稀释法进行单克隆铺板，得到HT1080-huFAPα和3T3-mFAP的稳转细胞系。分别取4×105cells进行流式检测，使用Guava easyCyteTM HT System仪器检测。结果如图8所示，两株稳转细胞系中都能检测到FAP的表达。

采用Anti-Flag抗体流式检测3T3-mFAP，HT1080-huFAPα细胞系，取1×10⁶个细胞进行流式检测，结果如图10所示，通过检测FAP上携带的Flag标签，在两株稳转细胞系中都能检测到FAP的表达。

实施例7.FACs测定抗体10A4、1A7、8E3的scFv_Fc与U-87MG、3T3-mFAP、HT1080-huFAPα细胞的结合

以3T3细胞和HT1080细胞做为阴性对照细胞。具体步骤为：收获细胞，用生长培养基洗涤细胞一次，重悬于PBS中，调整细胞浓度为4E+5细胞/ml。在冰上将200nM抗体与细胞育30分钟。其后与FITC标记的抗人IgG第二抗体孵育。两次洗涤之后，使用GuavaeasyCyteTM HT System仪器检测。

结果如图9所示，抗体10A4能结合稳定转染的huFAPα的HT1080细胞系，稳定转染mFAP的3T3细胞系以及内源性表达huFAPα的U-87MG细胞，但是不结合不表达huFAPα的HT1080细胞系，非特异性的结合3T3细胞系。抗体8E3和阴性细胞系3T3、HT1080都不结合，但是和FAP表达阳性的细胞系HT1080-huFAPα、3T3-mFAP、U-87MG都结合。抗体1A7和阴性细胞系3T3、HT1080都不结合，和HT1080-huFAPα、3T3-mFAP都结合，但是不结合U-87MG细胞。

实施例8.靶向FAPα的嵌合型抗原受体(CAR)修饰的T细胞的制备

1.慢病毒包装质粒pRRL-hu8E3-28Z的构建

以PRRLSIN-cPPT.EF-1α为载体，构建了表达抗体10A4、1A7、8E3的二代嵌合抗原受体的慢病毒质粒，包括PRRLSIN-cPPT.EF-1α-10A4-28Z、PRRLSIN-cPPT.EF-1α-1A7-28Z以及PRRLSIN-cPPT.EF-1α-8E3-28Z。10A4-28Z序列由CD8α信号肽(SEQ ID NO:32)、10A4scFv(SEQ ID NO:24)、CD8hinge(SEQ ID NO:34)、CD28跨膜区(SEQ ID NO:36)和胞内信号传导结构域(SEQ ID NO:38)以及CD3的胞内段CD3ξ(SEQ ID NO:40)组成；1A7-28Z序列由CD8α信号肽(SEQ ID NO:32)、1A7scFv(SEQ ID NO:26)、CD8hinge(SEQ ID NO:34)、CD28跨膜区(SEQ ID NO:36)和胞内信号传导结构域(SEQ ID NO:38)以及CD3的胞内段CD3ξ(SEQ IDNO:40)组成；8E3-28BB序列由CD8α信号肽(SEQ ID NO:32)、8E3-scFv(SEQ ID NO:28)、CD8hinge(SEQ ID NO:34)、CD28跨膜区(SEQ ID NO:36)和胞内信号传导结构域(SEQ IDNO:38)以及CD3的胞内段CD3ξ(SEQ ID NO:40)组成。

2.质粒转染293T包装hu8E3-28Z慢病毒

a)取293T细胞消化后以1.25×10⁷铺至15cm平皿，37℃培养至细胞汇合度为70％-80％，将上清换成10mL新鲜的10％FBS培基。

b)配制质粒/PEI混合液

取pRRL-hu8E3-28Z 13.7ug、pVSV.G 6.3ug、RRE 16.4ug、REV 16.4ug，加入2200uLDMEM中孵育。对应PEI量为165ul(1ug/ul)，加入2200uL DMEM中孵育5min。将质粒混合液加入PEI孵育液中，混匀，室温孵育20min，得到质粒/PEI混合液。

c)将b)配制的质粒/PEI混合液逐滴加入a)的细胞中，混匀，5h后进行换液，72h后收集病毒上清，以0.45um滤膜过滤后，加入PEG8000，4℃纯化过夜，4000rpm、4℃离心，收集病毒沉淀，得到hu8E3-28Z慢病毒。

3.重组人慢病毒感染T细胞

a)将PBMC培养于AIM-V培基(Gibco,#0870112)+2％human AB serum(Gemini,#100-512)中，加入重组人IL-2(500U/ml)(上海华新生物高技术有限公司)，按照1:1(细胞:磁珠)比例加入CD3/CD28磁珠(Invitrogen，#21013)活化T细胞，48小时后感染。

b)Retronectin(Takara,#T100A)包板4℃过夜，浓度5μg/ml。将活化好的T细胞按照1×10⁶个细胞/ml的密度加入Retronectin包好的板中，加入步骤2中收集的高纯度病毒后(MOI≈10)，1800rpm，32℃离心40min，离心完后放入培养箱中培养48h，换液(AIM-Ⅴ培基+2％human AB serum、IL-2 500U/ml)，去磁珠，其后细胞以5×10⁵个细胞/ml的密度培养6-10天，得到感染了hu8E3-28Z病毒的T细胞，即表达8E3-28Z(SEQ ID NO:48)的T细胞。

取5×10⁵个8E3-28Z T细胞及未感染病毒的T细胞进行流式检测，检测8E3-28ZCAR在T细胞中的的表达，检测仪器为Beckman Coulter Epics XL Flow Cytometer，结果如图11所示，在感染了hu8E3-28Z病毒的T细胞中都能检测到hu8E3-28Z CAR的表达。

实施例9.8E3-28Z的CAR T细胞的细胞毒性检测

取实施例8制备的hu8E3-28Z T细胞，检测对3T3-mFAP及H1080-huFAPα细胞的杀伤，方法如下：

将3T3-mFAP单克隆细胞消化后计数，取表达8E3-28Z CAR的T细胞离心后计数。以3T3-mFAP细胞为靶细胞，效应细胞为表达8E3-28Z CAR的T细胞，效靶比分别为3:1、1:1、1:3，靶细胞数量为10000/孔，根据不同效靶比设定不同数量效应细胞(即30000/孔，10000/孔，3333/孔)。各组均设5个复孔。共孵育18h后通过CytoTox96非放射性细胞毒性试剂盒(Promega，#G1780)检测上清中LDH含量，计算其杀伤活性。具体参照CytoTox96非放射性细胞毒性试剂盒说明书。表达8E3-28Z CAR的T细胞对3T3、H1080及H1080-huFAPα细胞的杀伤毒性实验与3T3-mFAP细胞相同。

如图12所示，表达8E3-28Z CAR的T细胞能够特异性杀伤表达鼠FAPα的3T3-mFAP细胞及表达人FAPα的H1080-huFAPα细胞。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110> 科济生物医药（上海）有限公司

上海市肿瘤研究所

<120> 靶向成纤维激活蛋白α的结合单元及其应用

<130> P2017-2238

<160> 48

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Ser Tyr Ala Ile Ser

1 5

<210> 2

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe Gln

1 5 10 15

Gly

<210> 3

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Asp Ala Ala Asp Arg Asp Tyr

1 5

<210> 4

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser Asn Gly Tyr Asn Tyr Leu Asp

1 5 10 15

<210> 5

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

Leu Gly Ser Asn Arg Ala Ser

1 5

<210> 6

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

Gln Gln Arg Asn Asn Lys Asn Arg Thr

1 5

<210> 7

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

Pro Tyr Thr Ile Ser

1 5

<210> 8

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

Gly Ile Val Pro Asn Val Gly Val Ala Thr Tyr Ala Gln Lys Phe Gln

1 5 10 15

Gly

<210> 9

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Pro Asn Gly Phe Asn His Leu Tyr

1 5 10 15

<210> 10

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

Val Gly Gly Asn Arg Ala Ser

1 5

<210> 11

<211> 116

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Asp Ala Ala Asp Arg Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val

100 105 110

Thr Val Ser Ser

115

<210> 12

<211> 348

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

caggtgcaat tggtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctgggtcctc ggtgaaggtc 60

tcctgcaagg cctccggagg cacattcagc agctacgcta taagctgggt gcgacaggcc 120

cctggacaag ggctcgagtg gatgggaggg atcatcccta tctttggtac agcaaactac 180

gcacagaagt tccagggcag ggtcaccatt actgcagaca aatccacgag cacagcctac 240

atggagctga gcagcctgag atctgaggac accgccgtgt attactgtgc gagagatgct 300

gctgataggg actactgggg ccaagggacc accgtgaccg tctcctca 348

<210> 13

<211> 113

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly

1 5 10 15

Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser

20 25 30

Asn Gly Tyr Asn Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Leu Gly Ser Asn Arg Ala Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg

85 90 95

Asn Asn Lys Asn Arg Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105 110

Arg

<210> 14

<211> 339

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

gatattgtta tgactcaatc tccactgtct ctgccggtga ctccaggcga accggcgagc 60

atttcttgcc gttccagcca gtctctgctg cactccaacg gctacaacta tctcgattgg 120

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tccggtgtac cggaccgttt cagcggctct ggatccggca ccgatttcac gttgaaaatc 240

agccgtgttg aagcagaaga cgtgggcgtt tattactgtc agcagcgtaa taataagaat 300

cgtacttttg gtcaaggcac caaggtcgaa attaaacgt 339

<210> 15

<211> 116

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Pro Tyr

20 25 30

Thr Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Gly Ile Val Pro Asn Val Gly Val Ala Thr Tyr Ala Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Asp Ala Ala Asp Arg Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val

100 105 110

Thr Val Ser Ser

115

<210> 16

<211> 348

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

caggtgcaat tggtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctgggtcctc ggtgaaggtc 60

tcctgcaagg cctccggagg cacattcagc ccctacacta taagctgggt gcgacaggcc 120

cctggacaag ggctcgagtg gatgggaggg atcgtcccta atgttggtgt agcaacctac 180

gcacagaagt tccagggcag ggtcaccatt actgcagaca aatccacgag cacagcctac 240

atggagctga gcagcctgag atctgaggac accgccgtgt attactgtgc gagagatgct 300

gctgataggg actactgggg ccaagggacc accgtgaccg tctcctca 348

<210> 17

<211> 113

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly

1 5 10 15

Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Pro

20 25 30

Asn Gly Phe Asn His Leu Tyr Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Val Gly Gly Asn Arg Ala Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg

85 90 95

Asn Asn Lys Asn Arg Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105 110

Arg

<210> 18

<211> 339

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

gatattgtta tgactcaatc tccactgtct ctgccggtga ctccaggcga accggcgagc 60

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agccgtgttg aagcagaaga cgtgggcgtt tattactgtc agcagcgtaa taataagaat 300

cgtacttttg gtcaaggcac caaggtcgaa attaaacgt 339

<210> 19

<211> 743

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

Leu Arg Pro Ser Arg Val His Asn Ser Glu Glu Asn Thr Met Arg Ala

1 5 10 15

Leu Thr Leu Lys Asp Ile Leu Asn Gly Thr Phe Ser Tyr Lys Thr Phe

20 25 30

Phe Pro Asn Trp Ile Ser Gly Gln Glu Tyr Leu His Gln Ser Ala Asp

35 40 45

Asn Asn Ile Val Leu Tyr Asn Ile Glu Thr Gly Gln Ser Tyr Thr Ile

50 55 60

Leu Ser Asn Arg Thr Met Lys Ser Val Asn Ala Ser Asn Tyr Gly Leu

65 70 75 80

Ser Pro Asp Arg Gln Phe Val Tyr Leu Glu Ser Asp Tyr Ser Lys Leu

85 90 95

Trp Arg Tyr Ser Tyr Thr Ala Thr Tyr Tyr Ile Tyr Asp Leu Ser Asn

100 105 110

Gly Glu Phe Val Arg Gly Asn Glu Leu Pro Arg Pro Ile Gln Tyr Leu

115 120 125

Cys Trp Ser Pro Val Gly Ser Lys Leu Ala Tyr Val Tyr Gln Asn Asn

130 135 140

Ile Tyr Leu Lys Gln Arg Pro Gly Asp Pro Pro Phe Gln Ile Thr Phe

145 150 155 160

Asn Gly Arg Glu Asn Lys Ile Phe Asn Gly Ile Pro Asp Trp Val Tyr

165 170 175

Glu Glu Glu Met Leu Ala Thr Lys Tyr Ala Leu Trp Trp Ser Pro Asn

180 185 190

Gly Lys Phe Leu Ala Tyr Ala Glu Phe Asn Asp Thr Asp Ile Pro Val

195 200 205

Ile Ala Tyr Ser Tyr Tyr Gly Asp Glu Gln Tyr Pro Arg Thr Ile Asn

210 215 220

Ile Pro Tyr Pro Lys Ala Gly Ala Lys Asn Pro Val Val Arg Ile Phe

225 230 235 240

Ile Ile Asp Thr Thr Tyr Pro Ala Tyr Val Gly Pro Gln Glu Val Pro

245 250 255

Val Pro Ala Met Ile Ala Ser Ser Asp Tyr Tyr Phe Ser Trp Leu Thr

260 265 270

Trp Val Thr Asp Glu Arg Val Cys Leu Gln Trp Leu Lys Arg Val Gln

275 280 285

Asn Val Ser Val Leu Ser Ile Cys Asp Phe Arg Glu Asp Trp Gln Thr

290 295 300

Trp Asp Cys Pro Lys Thr Gln Glu His Ile Glu Glu Ser Arg Thr Gly

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Trp Ala Gly Gly Phe Phe Val Ser Thr Pro Val Phe Ser Tyr Asp Ala

325 330 335

Ile Ser Tyr Tyr Lys Ile Phe Ser Asp Lys Asp Gly Tyr Lys His Ile

340 345 350

His Tyr Ile Lys Asp Thr Val Glu Asn Ala Ile Gln Ile Thr Ser Gly

355 360 365

Lys Trp Glu Ala Ile Asn Ile Phe Arg Val Thr Gln Asp Ser Leu Phe

370 375 380

Tyr Ser Ser Asn Glu Phe Glu Glu Tyr Pro Gly Arg Arg Asn Ile Tyr

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Arg Ile Ser Ile Gly Ser Tyr Pro Pro Ser Lys Lys Cys Val Thr Cys

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His Leu Arg Lys Glu Arg Cys Gln Tyr Tyr Thr Ala Ser Phe Ser Asp

420 425 430

Tyr Ala Lys Tyr Tyr Ala Leu Val Cys Tyr Gly Pro Gly Ile Pro Ile

435 440 445

Ser Thr Leu His Asp Gly Arg Thr Asp Gln Glu Ile Lys Ile Leu Glu

450 455 460

Glu Asn Lys Glu Leu Glu Asn Ala Leu Lys Asn Ile Gln Leu Pro Lys

465 470 475 480

Glu Glu Ile Lys Lys Leu Glu Val Asp Glu Ile Thr Leu Trp Tyr Lys

485 490 495

Met Ile Leu Pro Pro Gln Phe Asp Arg Ser Lys Lys Tyr Pro Leu Leu

500 505 510

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Ala Val Asn Trp Ile Ser Tyr Leu Ala Ser Lys Glu Gly Met Val Ile

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Ala Leu Val Asp Gly Arg Gly Thr Ala Phe Gln Gly Asp Lys Leu Leu

545 550 555 560

Tyr Ala Val Tyr Arg Lys Leu Gly Val Tyr Glu Val Glu Asp Gln Ile

565 570 575

Thr Ala Val Arg Lys Phe Ile Glu Met Gly Phe Ile Asp Glu Lys Arg

580 585 590

Ile Ala Ile Trp Gly Trp Ser Tyr Gly Gly Tyr Val Ser Ser Leu Ala

595 600 605

Leu Ala Ser Gly Thr Gly Leu Phe Lys Cys Gly Ile Ala Val Ala Pro

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Val Ser Ser Trp Glu Tyr Tyr Ala Ser Val Tyr Thr Glu Arg Phe Met

625 630 635 640

Gly Leu Pro Thr Lys Asp Asp Asn Leu Glu His Tyr Lys Asn Ser Thr

645 650 655

Val Met Ala Arg Ala Glu Tyr Phe Arg Asn Val Asp Tyr Leu Leu Ile

660 665 670

His Gly Thr Ala Asp Asp Asn Val His Phe Gln Asn Ser Ala Gln Ile

675 680 685

Ala Lys Ala Leu Val Asn Ala Gln Val Asp Phe Gln Ala Met Trp Tyr

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Ser Asp Gln Asn His Gly Leu Ser Gly Leu Ser Thr Asn His Leu Tyr

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Thr His Met Thr His Phe Leu Lys Gln Cys Phe Ser Leu Ser Asp Gly

725 730 735

Ser His His His His His His

740

<210> 20

<211> 2229

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

ctgcggccca gccgggtgca caacagcgag gagaacacca tgcgggccct gaccctgaag 60

gacatcctga acggcacctt cagctacaag accttcttcc ccaactggat cagcggccag 120

gagtacctgc accagagcgc cgacaacaac atcgtgctgt acaacatcga gaccggccag 180

agctacacca tcctgagcaa ccggaccatg aagagcgtga acgccagcaa ctacggcctg 240

agccccgacc ggcagttcgt gtacctggag agcgactaca gcaagctgtg gcggtacagc 300

tacaccgcca cctactacat ctacgacctg agcaacggcg agttcgtgcg gggcaacgag 360

ctgccccggc ccatccagta cctgtgctgg agccccgtgg gcagcaagct ggcctacgtg 420

taccagaaca acatctacct gaagcagcgg cccggcgacc cccccttcca gatcaccttc 480

aacggccggg agaacaagat cttcaacggc atccccgact gggtgtacga ggaggagatg 540

ctggccacca agtacgccct gtggtggagc cccaacggca agttcctggc ctacgccgag 600

ttcaacgaca ccgacatccc cgtgatcgcc tacagctact acggcgacga gcagtacccc 660

cggaccatca acatccccta ccccaaggcc ggcgccaaga accccgtggt gcggatcttc 720

atcatcgaca ccacctaccc cgcctacgtg ggcccccagg aggtgcccgt gcccgccatg 780

atcgccagca gcgactacta cttcagctgg ctgacctggg tgaccgacga gcgggtgtgc 840

ctgcagtggc tgaagcgggt gcagaacgtg agcgtgctga gcatctgcga cttccgggag 900

gactggcaga cctgggactg ccccaagacc caggagcaca tcgaggagag ccggaccggc 960

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aagatcttca gcgacaagga cggctacaag cacatccact acatcaagga caccgtggag 1080

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gacagcctgt tctacagcag caacgagttc gaggagtacc ccggccggcg gaacatctac 1200

cggatcagca tcggcagcta cccccccagc aagaagtgcg tgacctgcca cctgcggaag 1260

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tgctacggcc ccggcatccc catcagcacc ctgcacgacg gccggaccga ccaggagatc 1380

aagatcctgg aggagaacaa ggagctggag aacgccctga agaacatcca gctgcccaag 1440

gaggagatca agaagctgga ggtggacgag atcaccctgt ggtacaagat gatcctgccc 1500

ccccagttcg accggagcaa gaagtacccc ctgctgatcc aggtgtacgg cggcccctgc 1560

agccagagcg tgcggagcgt gttcgccgtg aactggatca gctacctggc cagcaaggag 1620

ggcatggtga tcgccctggt ggacggccgg ggcaccgcct tccagggcga caagctgctg 1680

tacgccgtgt accggaagct gggcgtgtac gaggtggagg accagatcac cgccgtgcgg 1740

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gccgagtact tccggaacgt ggactacctg ctgatccacg gcaccgccga cgacaacgtg 2040

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catcatcat 2229

<210> 21

<211> 744

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

Leu Arg Pro Ser Arg Val Tyr Lys Pro Glu Gly Asn Thr Lys Arg Ala

1 5 10 15

Leu Thr Leu Lys Asp Ile Leu Asn Gly Thr Phe Ser Tyr Lys Thr Tyr

20 25 30

Phe Pro Asn Trp Ile Ser Glu Gln Glu Tyr Leu His Gln Ser Glu Asp

35 40 45

Asp Asn Ile Val Phe Tyr Asn Ile Glu Thr Arg Glu Ser Tyr Ile Ile

50 55 60

Leu Ser Asn Ser Thr Met Lys Ser Val Asn Ala Thr Asp Tyr Gly Leu

65 70 75 80

Ser Pro Asp Arg Gln Phe Val Tyr Leu Glu Ser Asp Tyr Ser Lys Leu

85 90 95

Trp Arg Tyr Ser Tyr Thr Ala Thr Tyr Tyr Ile Tyr Asp Leu Gln Asn

100 105 110

Gly Glu Phe Val Arg Gly Tyr Glu Leu Pro Arg Pro Ile Gln Tyr Leu

115 120 125

Cys Trp Ser Pro Val Gly Ser Lys Leu Ala Tyr Val Tyr Gln Asn Asn

130 135 140

Ile Tyr Leu Lys Gln Arg Pro Gly Asp Pro Pro Phe Gln Ile Thr Tyr

145 150 155 160

Thr Gly Arg Glu Asn Arg Ile Phe Asn Gly Ile Pro Asp Trp Val Tyr

165 170 175

Glu Glu Glu Met Leu Ala Thr Lys Tyr Ala Leu Trp Trp Ser Pro Asp

180 185 190

Gly Lys Phe Leu Ala Tyr Val Glu Phe Asn Asp Ser Asp Ile Pro Ile

195 200 205

Ile Ala Tyr Ser Tyr Tyr Gly Asp Gly Gln Tyr Pro Arg Thr Ile Asn

210 215 220

Ile Pro Tyr Pro Lys Ala Gly Ala Lys Asn Pro Val Val Arg Val Phe

225 230 235 240

Ile Val Asp Thr Thr Tyr Pro His His Val Gly Pro Met Glu Val Pro

245 250 255

Val Pro Glu Met Ile Ala Ser Ser Asp Tyr Tyr Phe Ser Trp Leu Thr

260 265 270

Trp Val Ser Ser Glu Arg Val Cys Leu Gln Trp Leu Lys Arg Val Gln

275 280 285

Asn Val Ser Val Leu Ser Ile Cys Asp Phe Arg Glu Asp Trp His Ala

290 295 300

Trp Glu Cys Pro Lys Asn Gln Glu His Val Glu Glu Ser Arg Thr Gly

305 310 315 320

Trp Ala Gly Gly Phe Phe Val Ser Thr Pro Ala Phe Ser Gln Asp Ala

325 330 335

Thr Ser Tyr Tyr Lys Ile Phe Ser Asp Lys Asp Gly Tyr Lys His Ile

340 345 350

His Tyr Ile Lys Asp Thr Val Glu Asn Ala Ile Gln Ile Thr Ser Gly

355 360 365

Lys Trp Glu Ala Ile Tyr Ile Phe Arg Val Thr Gln Asp Ser Leu Phe

370 375 380

Tyr Ser Ser Asn Glu Phe Glu Gly Tyr Pro Gly Arg Arg Asn Ile Tyr

385 390 395 400

Arg Ile Ser Ile Gly Asn Ser Pro Pro Ser Lys Lys Cys Val Thr Cys

405 410 415

His Leu Arg Lys Glu Arg Cys Gln Tyr Tyr Thr Ala Ser Phe Ser Tyr

420 425 430

Lys Ala Lys Tyr Tyr Ala Leu Val Cys Tyr Gly Pro Gly Leu Pro Ile

435 440 445

Ser Thr Leu His Asp Gly Arg Thr Asp Gln Glu Ile Gln Val Leu Glu

450 455 460

Glu Asn Lys Glu Leu Glu Asn Ser Leu Arg Asn Ile Gln Leu Pro Lys

465 470 475 480

Val Glu Ile Lys Lys Leu Lys Asp Gly Gly Leu Thr Phe Trp Tyr Lys

485 490 495

Met Ile Leu Pro Pro Gln Phe Asp Arg Ser Lys Lys Tyr Pro Leu Leu

500 505 510

Ile Gln Val Tyr Gly Gly Pro Cys Ser Gln Ser Val Lys Ser Val Phe

515 520 525

Ala Val Asn Trp Ile Thr Tyr Leu Ala Ser Lys Glu Gly Ile Val Ile

530 535 540

Ala Leu Val Asp Gly Arg Gly Thr Ala Phe Gln Gly Asp Lys Phe Leu

545 550 555 560

His Ala Val Tyr Arg Lys Leu Gly Val Tyr Glu Val Glu Asp Gln Leu

565 570 575

Thr Ala Val Arg Lys Phe Ile Glu Met Gly Phe Ile Asp Glu Glu Arg

580 585 590

Ile Ala Ile Trp Gly Trp Ser Tyr Gly Gly Tyr Val Ser Ser Leu Ala

595 600 605

Leu Ala Ser Gly Thr Gly Leu Phe Lys Cys Gly Ile Ala Val Ala Pro

610 615 620

Val Ser Ser Trp Glu Tyr Tyr Ala Ser Ile Tyr Ser Glu Arg Phe Met

625 630 635 640

Gly Leu Pro Thr Lys Asp Asp Asn Leu Glu His Tyr Lys Asn Ser Thr

645 650 655

Val Met Ala Arg Ala Glu Tyr Phe Arg Asn Val Asp Tyr Leu Leu Ile

660 665 670

His Gly Thr Ala Asp Asp Asn Val His Phe Gln Asn Ser Ala Gln Ile

675 680 685

Ala Lys Ala Leu Val Asn Ala Gln Val Asp Phe Gln Ala Met Trp Tyr

690 695 700

Ser Asp Gln Asn His Gly Ile Ser Ser Gly Arg Ser Gln Asn His Leu

705 710 715 720

Tyr Thr His Met Thr His Phe Leu Lys Gln Cys Phe Ser Leu Ser Asp

725 730 735

Gly Ser His His His His His His

740

<210> 22

<211> 2232

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 22

ctgcggccca gccgggtgta caagcccgag ggcaacacca agcgggccct gaccctgaag 60

gacatcctga acggcacctt cagctacaag acctacttcc ccaactggat cagcgagcag 120

gagtacctgc accagagcga ggacgacaac atcgtgttct acaacatcga gacccgggag 180

agctacatca tcctgagcaa cagcaccatg aagagcgtga acgccaccga ctacggcctg 240

agccccgacc ggcagttcgt gtacctggag agcgactaca gcaagctgtg gcggtacagc 300

tacaccgcca cctactacat ctacgacctg cagaacggcg agttcgtgcg gggctacgag 360

ctgccccggc ccatccagta cctgtgctgg agccccgtgg gcagcaagct ggcctacgtg 420

taccagaaca acatctacct gaagcagcgg cccggcgacc cccccttcca gatcacctac 480

accggccggg agaaccggat cttcaacggc atccccgact gggtgtacga ggaggagatg 540

ctggccacca agtacgccct gtggtggagc cccgacggca agttcctggc ctacgtggag 600

ttcaacgaca gcgacatccc catcatcgcc tacagctact acggcgacgg ccagtacccc 660

cggaccatca acatccccta ccccaaggcc ggcgccaaga accccgtggt gcgggtgttc 720

atcgtggaca ccacctaccc ccaccacgtg ggccccatgg aggtgcccgt gcccgagatg 780

atcgccagca gcgactacta cttcagctgg ctgacctggg tgagcagcga gcgggtgtgc 840

ctgcagtggc tgaagcgggt gcagaacgtg agcgtgctga gcatctgcga cttccgggag 900

gactggcacg cctgggagtg ccccaagaac caggagcacg tggaggagag ccggaccggc 960

tgggccggcg gcttcttcgt gagcaccccc gccttcagcc aggacgccac cagctactac 1020

aagatcttca gcgacaagga cggctacaag cacatccact acatcaagga caccgtggag 1080

aacgccatcc agatcaccag cggcaagtgg gaggccatct acatcttccg ggtgacccag 1140

gacagcctgt tctacagcag caacgagttc gagggctacc ccggccggcg gaacatctac 1200

cggatcagca tcggcaacag cccccccagc aagaagtgcg tgacctgcca cctgcggaag 1260

gagcggtgcc agtactacac cgccagcttc agctacaagg ccaagtacta cgccctggtg 1320

tgctacggcc ccggcctgcc catcagcacc ctgcacgacg gccggaccga ccaggagatc 1380

caggtgctgg aggagaacaa ggagctggag aacagcctgc ggaacatcca gctgcccaag 1440

gtggagatca agaagctgaa ggacggcggc ctgaccttct ggtacaagat gatcctgccc 1500

ccccagttcg accggagcaa gaagtacccc ctgctgatcc aggtgtacgg cggcccctgc 1560

agccagagcg tgaagagcgt gttcgccgtg aactggatca cctacctggc cagcaaggag 1620

ggcatcgtga tcgccctggt ggacggccgg ggcaccgcct tccagggcga caagttcctg 1680

cacgccgtgt accggaagct gggcgtgtac gaggtggagg accagctgac cgccgtgcgg 1740

aagttcatcg agatgggctt catcgacgag gagcggatcg ccatctgggg ctggagctac 1800

ggcggctacg tgagcagcct ggccctggcc agcggcaccg gcctgttcaa gtgcggcatc 1860

gccgtggccc ccgtgagcag ctgggagtac tacgccagca tctacagcga gcggttcatg 1920

ggcctgccca ccaaggacga caacctggag cactacaaga acagcaccgt gatggcccgg 1980

gccgagtact tccggaacgt ggactacctg ctgatccacg gcaccgccga cgacaacgtg 2040

cacttccaga acagcgccca gatcgccaag gccctggtga acgcccaggt ggacttccag 2100

gccatgtggt acagcgacca gaaccacggc atcagcagcg gccggagcca gaaccacctg 2160

tacacccaca tgacccactt cctgaagcag tgcttcagcc tgagcgacgg atcccatcat 2220

caccatcatc at 2232

<210> 23

<211> 244

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 23

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Asp Ala Ala Asp Arg Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val

100 105 110

Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly

115 120 125

Gly Gly Ser Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val

130 135 140

Thr Pro Gly Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu

145 150 155 160

Leu His Ser Asn Gly Tyr Asn Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro

165 170 175

Gly Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Leu Gly Ser Asn Arg Ala Ser

180 185 190

Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr

195 200 205

Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys

210 215 220

Gln Gln Arg Asn Asn Lys Asn Arg Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val

225 230 235 240

Glu Ile Lys Arg

<210> 24

<211> 732

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 24

caggtgcaat tggtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctgggtcctc ggtgaaggtc 60

tcctgcaagg cctccggagg cacattcagc agctacgcta taagctgggt gcgacaggcc 120

cctggacaag ggctcgagtg gatgggaggg atcatcccta tctttggtac agcaaactac 180

gcacagaagt tccagggcag ggtcaccatt actgcagaca aatccacgag cacagcctac 240

atggagctga gcagcctgag atctgaggac accgccgtgt attactgtgc gagagatgct 300

gctgataggg actactgggg ccaagggacc accgtgaccg tctcctcagg tggaggcggt 360

tcaggcggag gtggttctgg cggtggcgga tcggatattg ttatgactca atctccactg 420

tctctgccgg tgactccagg cgaaccggcg agcatttctt gccgttccag ccagtctctg 480

ctgcactcca acggctacaa ctatctcgat tggtacctgc aaaaaccggg tcagagccct 540

cagctgctga tctacctggg ctctaaccgc gcttccggtg taccggaccg tttcagcggc 600

tctggatccg gcaccgattt cacgttgaaa atcagccgtg ttgaagcaga agacgtgggc 660

gtttattact gtcagcagcg taataataag aatcgtactt ttggtcaagg caccaaggtc 720

gaaattaaac gt 732

<210> 25

<211> 244

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 25

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Pro Tyr

20 25 30

Thr Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Gly Ile Val Pro Asn Val Gly Val Ala Thr Tyr Ala Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Asp Ala Ala Asp Arg Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val

100 105 110

Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly

115 120 125

Gly Gly Ser Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val

130 135 140

Thr Pro Gly Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu

145 150 155 160

Leu His Ser Asn Gly Tyr Asn Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro

165 170 175

Gly Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Leu Gly Ser Asn Arg Ala Ser

180 185 190

Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr

195 200 205

Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys

210 215 220

Gln Gln Arg Asn Asn Lys Asn Arg Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val

225 230 235 240

Glu Ile Lys Arg

<210> 26

<211> 732

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 26

caggtgcaat tggtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctgggtcctc ggtgaaggtc 60

tcctgcaagg cctccggagg cacattcagc ccctacacta taagctgggt gcgacaggcc 120

cctggacaag ggctcgagtg gatgggaggg atcgtcccta atgttggtgt agcaacctac 180

gcacagaagt tccagggcag ggtcaccatt actgcagaca aatccacgag cacagcctac 240

atggagctga gcagcctgag atctgaggac accgccgtgt attactgtgc gagagatgct 300

gctgataggg actactgggg ccaagggacc accgtgaccg tctcctcagg tggaggcggt 360

tcaggcggag gtggttctgg cggtggcgga tcggatattg ttatgactca atctccactg 420

tctctgccgg tgactccagg cgaaccggcg agcatttctt gccgttccag ccagtctctg 480

ctgcactcca acggctacaa ctatctcgat tggtacctgc aaaaaccggg tcagagccct 540

cagctgctga tctacctggg ctctaaccgc gcttccggtg taccggaccg tttcagcggc 600

tctggatccg gcaccgattt cacgttgaaa atcagccgtg ttgaagcaga agacgtgggc 660

gtttattact gtcagcagcg taataataag aatcgtactt ttggtcaagg caccaaggtc 720

gaaattaaac gt 732

<210> 27

<211> 244

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 27

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Asp Ala Ala Asp Arg Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val

100 105 110

Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly

115 120 125

Gly Gly Ser Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val

130 135 140

Thr Pro Gly Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu

145 150 155 160

Leu His Pro Asn Gly Phe Asn His Leu Tyr Trp Tyr Leu Gln Lys Pro

165 170 175

Gly Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Val Gly Gly Asn Arg Ala Ser

180 185 190

Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr

195 200 205

Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys

210 215 220

Gln Gln Arg Asn Asn Lys Asn Arg Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val

225 230 235 240

Glu Ile Lys Arg

<210> 28

<211> 732

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 28

caggtgcaat tggtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctgggtcctc ggtgaaggtc 60

tcctgcaagg cctccggagg cacattcagc agctacgcta taagctgggt gcgacaggcc 120

cctggacaag ggctcgagtg gatgggaggg atcatcccta tctttggtac agcaaactac 180

gcacagaagt tccagggcag ggtcaccatt actgcagaca aatccacgag cacagcctac 240

atggagctga gcagcctgag atctgaggac accgccgtgt attactgtgc gagagatgct 300

gctgataggg actactgggg ccaagggacc accgtgaccg tctcctcagg tggaggcggt 360

tcaggcggag gtggttctgg cggtggcgga tcggatattg ttatgactca atctccactg 420

tctctgccgg tgactccagg cgaaccggcg agcatttctt gccgttccag ccagtctctg 480

cttcacccca acggcttcaa ccatctctat tggtacctgc aaaaaccggg tcagagccct 540

cagctgctga tctacgtggg gggtaaccgc gcttccggtg taccggaccg tttcagcggc 600

tctggatccg gcaccgattt cacgttgaaa atcagccgtg ttgaagcaga agacgtgggc 660

gtttattact gtcagcagcg taataataag aatcgtactt ttggtcaagg caccaaggtc 720

gaaattaaac gt 732

<210> 29

<211> 2341

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 29

acgcgtccta gcgctaccgg tcgccaccat gaagacttgg gtaaaaatcg tatttggagt 60

tgccacctct gctgtgcttg ccttattggt gatgtgcatt gtcttacgcc cttcaagagt 120

tcataactct gaagaaaata caatgagagc actcacactg aaggatattt taaatggaac 180

attttcttat aaaacatttt ttccaaactg gatttcagga caagaatatc ttcatcaatc 240

tgcagataac aatatagtac tttataatat tgaaacagga caatcatata ccattttgag 300

taatagaacc atgaaaagtg tgaatgcttc aaattacggc ttatcacctg atcggcaatt 360

tgtatatcta gaaagtgatt attcaaagct ttggagatac tcttacacag caacatatta 420

catctatgac cttagcaatg gagaatttgt aagaggaaat gagcttcctc gtccaattca 480

gtatttatgc tggtcgcctg ttgggagtaa attagcatat gtctatcaaa acaatatcta 540

tttgaaacaa agaccaggag atccaccttt tcaaataaca tttaatggaa gagaaaataa 600

aatatttaat ggaatcccag actgggttta tgaagaggaa atgcttgcta caaaatatgc 660

tctctggtgg tctcctaatg gaaaattttt ggcatatgcg gaatttaatg atacggatat 720

accagttatt gcctattcct attatggcga tgaacaatat cctagaacaa taaatattcc 780

atacccaaag gctggagcta agaatcccgt tgttcggata tttattatcg ataccactta 840

ccctgcgtat gtaggtcccc aggaagtgcc tgttccagca atgatagcct caagtgatta 900

ttatttcagt tggctcacgt gggttactga tgaacgagta tgtttgcagt ggctaaaaag 960

agtccagaat gtttcggtcc tgtctatatg tgacttcagg gaagactggc agacatggga 1020

ttgtccaaag acccaggagc atatagaaga aagcagaact ggatgggctg gtggattctt 1080

tgtttcaaca ccagttttca gctatgatgc catttcgtac tacaaaatat ttagtgacaa 1140

ggatggctac aaacatattc actatatcaa agacactgtg gaaaatgcta ttcaaattac 1200

aagtggcaag tgggaggcca taaatatatt cagagtaaca caggattcac tgttttattc 1260

tagcaatgaa tttgaagaat accctggaag aagaaacatc tacagaatta gcattggaag 1320

ctatcctcca agcaagaagt gtgttacttg ccatctaagg aaagaaaggt gccaatatta 1380

cacagcaagt ttcagcgact acgccaagta ctatgcactt gtctgctacg gcccaggcat 1440

ccccatttcc acccttcatg atggacgcac tgatcaagaa attaaaatcc tggaagaaaa 1500

caaggaattg gaaaatgctt tgaaaaatat ccagctgcct aaagaggaaa ttaagaaact 1560

tgaagtagat gaaattactt tatggtacaa gatgattctt cctcctcaat ttgacagatc 1620

aaagaagtat cccttgctaa ttcaagtgta tggtggtccc tgcagtcaga gtgtaaggtc 1680

tgtatttgct gttaattgga tatcttatct tgcaagtaag gaagggatgg tcattgcctt 1740

ggtggatggt cgaggaacag ctttccaagg tgacaaactc ctctatgcag tgtatcgaaa 1800

gctgggtgtt tatgaagttg aagaccagat tacagctgtc agaaaattca tagaaatggg 1860

tttcattgat gaaaaaagaa tagccatatg gggctggtcc tatggaggat acgtttcatc 1920

actggccctt gcatctggaa ctggtctttt caaatgtggt atagcagtgg ctccagtctc 1980

cagctgggaa tattacgcgt ctgtctacac agagagattc atgggtctcc caacaaagga 2040

tgataatctt gagcactata agaattcaac tgtgatggca agagcagaat atttcagaaa 2100

tgtagactat cttctcatcc acggaacagc agatgataat gtgcactttc aaaactcagc 2160

acagattgct aaagctctgg ttaatgcaca agtggatttc caggcaatgt ggtactctga 2220

ccagaaccac ggcttatccg gcctgtccac gaaccactta tacacccaca tgacccactt 2280

cctaaagcag tgtttctctt tgtcagacga ttacaaagac gatgacgaca agtaagtcga 2340

c 2341

<210> 30

<211> 2344

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 30

acgcgtccta gcgctaccgg tcgccaccat gaagacatgg ctgaaaactg tctttggagt 60

taccaccctg gctgcgcttg ctttagtggt gatatgcatt gtcttacgtc cctcaagagt 120

ttacaaacct gaaggaaaca caaagagagc tcttaccttg aaggatattt taaatggaac 180

attctcatat aaaacatatt ttcccaactg gatttcagaa caagaatatc ttcatcaatc 240

tgaggatgat aacatagtat tttataatat tgaaacaaga gaatcatata tcattttgag 300

taatagcacc atgaaaagtg tgaatgctac agattatggt ttgtcacctg atcggcaatt 360

tgtgtatcta gaaagtgatt attcaaagct ctggcgatat tcatacacag cgacatacta 420

catctacgac cttcagaatg gggaatttgt aagaggatac gagctccctc gtccaattca 480

gtatctatgc tggtcgcctg ttgggagtaa attagcatat gtatatcaaa acaatattta 540

tttgaaacaa agaccaggag atccaccttt tcaaataact tatactggaa gagaaaatag 600

aatatttaat ggaataccag actgggttta tgaagaggaa atgcttgcca caaaatatgc 660

tctttggtgg tctccagatg gaaaattttt ggcatatgta gaatttaatg attcagatat 720

accaattatt gcctattctt attatggtga tggacagtat cctagaacta taaatattcc 780

atatccaaag gctggggcta agaatccggt tgttcgtgtt tttattgttg acaccaccta 840

ccctcaccac gtgggcccaa tggaagtgcc agttccagaa atgatagcct caagtgacta 900

ttatttcagc tggctcacat gggtgtccag tgaacgagta tgcttgcagt ggctaaaaag 960

agtgcagaat gtctcagtcc tgtctatatg tgatttcagg gaagactggc atgcatggga 1020

atgtccaaag aaccaggagc atgtagaaga aagcagaaca ggatgggctg gtggattctt 1080

tgtttcgaca ccagctttta gccaggatgc cacttcttac tacaaaatat ttagcgacaa 1140

ggatggttac aaacatattc actacatcaa agacactgtg gaaaatgcta ttcaaattac 1200

aagtggcaag tgggaggcca tatatatatt ccgcgtaaca caggattcac tgttttattc 1260

tagcaatgaa tttgaaggtt accctggaag aagaaacatc tacagaatta gcattggaaa 1320

ctctcctccg agcaagaagt gtgttacttg ccatctaagg aaagaaaggt gccaatatta 1380

cacagcaagt ttcagctaca aagccaagta ctatgcactc gtctgctatg gccctggcct 1440

ccccatttcc accctccatg atggccgcac agaccaagaa atacaagtat tagaagaaaa 1500

caaagaactg gaaaattctc tgagaaatat ccagctgcct aaagtggaga ttaagaagct 1560

caaagacggg ggactgactt tctggtacaa gatgattctg cctcctcagt ttgacagatc 1620

aaagaagtac cctttgctaa ttcaagtgta tggtggtcct tgcagccaga gtgttaagtc 1680

tgtgtttgct gttaattgga taacttatct cgcaagtaag gaggggatag tcattgccct 1740

ggtagatggt cggggcactg ctttccaagg tgacaaattc ctgcatgccg tgtatcgaaa 1800

actgggtgta tatgaagttg aggaccagct cacagctgtc agaaaattca tagaaatggg 1860

tttcattgat gaagaaagaa tagccatatg gggctggtcc tacggaggtt atgtttcatc 1920

cctggccctt gcatctggaa ctggtctttt caaatgtggc atagcagtgg ctccagtctc 1980

cagctgggaa tattacgcat ctatctactc agagagattc atgggcctcc caacaaagga 2040

cgacaatctc gaacactata aaaattcaac tgtgatggca agagcagaat atttcagaaa 2100

tgtagactat cttctcatcc acggaacagc agatgataat gtgcactttc agaactcagc 2160

acagattgct aaagctttgg ttaatgcaca agtggatttc caggcgatgt ggtactctga 2220

ccagaaccat ggtatatcat ctgggcgctc ccagaatcat ttatataccc acatgacgca 2280

cttcctcaag caatgctttt ctttatcaga cgattacaaa gacgatgacg acaagtgagt 2340

cgac 2344

<210> 31

<211> 21

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 31

Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu

1 5 10 15

His Ala Ala Arg Pro

20

<210> 32

<211> 63

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 32

atggccttac cagtgaccgc cttgctcctg ccgctggcct tgctgctcca cgccgccagg 60

ccg 63

<210> 33

<211> 45

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 33

Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala

1 5 10 15

Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly

20 25 30

Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp

35 40 45

<210> 34

<211> 135

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 34

accacgacgc cagcgccgcg accaccaaca ccggcgccca ccatcgcgtc gcagcccctg 60

tccctgcgcc cagaggcgtg ccggccagcg gcggggggcg cagtgcacac gagggggctg 120

gacttcgcct gtgat 135

<210> 35

<211> 27

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 35

Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu

1 5 10 15

Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val

20 25

<210> 36

<211> 81

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 36

ttttgggtgc tggtggtggt tggtggagtc ctggcttgct atagcttgct agtaacagtg 60

gcctttatta ttttctgggt g 81

<210> 37

<211> 41

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 37

Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr

1 5 10 15

Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro

20 25 30

Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser

35 40

<210> 38

<211> 123

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 38

aggagtaaga ggagcaggct cctgcacagt gactacatga acatgactcc ccgccgcccc 60

gggccaaccc gcaagcatta ccagccctat gccccaccac gcgacttcgc agcctatcgc 120

tcc 123

<210> 39

<211> 113

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 39

Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly

1 5 10 15

Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr

20 25 30

Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys

35 40 45

Pro Gln Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln

50 55 60

Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu

65 70 75 80

Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr

85 90 95

Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro

100 105 110

Arg

<210> 40

<211> 339

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 40

agagtgaagt tcagcaggag cgcagacgcc cccgcgtacc agcagggcca gaaccagctc 60

tataacgagc tcaatctagg acgaagagag gagtacgatg ttttggacaa gagacgtggc 120

cgggaccctg agatgggggg aaagccgcag agaaggaaga accctcagga aggcctgtac 180

aatgaactgc agaaagataa gatggcggag gcctacagtg agattgggat gaaaggcgag 240

cgccggaggg gcaaggggca cgatggcctt taccagggtc tcagtacagc caccaaggac 300

acctacgacg cccttcacat gcaggccctg ccccctcgc 339

<210> 41

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 41

caggaaacag ctatgaccat gattac 26

<210> 42

<211> 75

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 42

cactcgagcc cttgtccagg ggcctgtcgc acccamnnmn nmnnmnnmnn mnngaatgtg 60

cctccggagg ccttg 75

<210> 43

<211> 80

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 43

cctggacaag ggctcgagtg gatgggannk atcnnkcctn nknnkggtnn kgcannktac 60

gcacagaagt tccagggcag 80

<210> 44

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 44

gacgttagta aatgaatttt ctgtatgagg 30

<210> 45

<211> 89

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 45

cagctgaggg ctctgacccg gtttttgcag gtaccamnng agmnnmnnmn ngccmnnmnn 60

mnnmnncaga gactggctgg aacggcaag 89

<210> 46

<211> 68

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 46

cgggtcagag ccctcagctg ctgatcnnkn nknnknnknn kcgcgcttcc ggtgtaccgg 60

accgtttc 68

<210> 47

<211> 42

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 47

Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met

1 5 10 15

Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe

20 25 30

Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu

35 40

<210> 48

<211> 470

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 48

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Asp Ala Ala Asp Arg Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val

100 105 110

Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly

115 120 125

Gly Gly Ser Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val

130 135 140

Thr Pro Gly Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu

145 150 155 160

Leu His Pro Asn Gly Phe Asn His Leu Tyr Trp Tyr Leu Gln Lys Pro

165 170 175

Gly Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Val Gly Gly Asn Arg Ala Ser

180 185 190

Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr

195 200 205

Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys

210 215 220

Gln Gln Arg Asn Asn Lys Asn Arg Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val

225 230 235 240

Glu Ile Lys Arg Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala

245 250 255

Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg

260 265 270

Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys

275 280 285

Asp Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser

290 295 300

Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg

305 310 315 320

Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro

325 330 335

Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe

340 345 350

Ala Ala Tyr Arg Ser Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro

355 360 365

Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly

370 375 380

Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro

385 390 395 400

Glu Met Gly Gly Lys Pro Gln Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu

405 410 415

Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile

420 425 430

Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr

435 440 445

Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met

450 455 460

Gln Ala Leu Pro Pro Arg

465 470

Claims

1.一种抗原结合单元，所述抗原结合单元包含轻链CDR区和重链CDR区，所述的重链CDR包含HCDR1，HCDR2，和HCDR3；所述的轻链CDR区包含LCDR1，LCDR2，和LCDR3；

2.如权利要求1所述的抗原结合单元，其特征在于，所述的HCDR1具有SEQ ID NO:1或7所示的序列，所述的HCDR2具有SEQ ID NO:2或8所示的序列，所述的HCDR3具有SEQ ID NO:3所示的序列。

3.如权利要求2所述的抗原结合单元，其特征在于，所述的HCDR1，HCDR2和HCDR3的序列选自以下任一组：

A.SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3；

B.SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:3。

4.如权利要求1所述的抗原结合单元，其特征在于，所述的LCDR1具有SEQ ID NO:4或9所示的序列，所述的LCDR2具有SEQ ID NO:5或10所示的序列，所述的LCDR3具有SEQ ID NO:6所示的序列。

5.如权利要求4所述的抗原结合单元，其特征在于，所述的LCDR1，LCDR2和LCDR3的序列选自以下任一组：

A.SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6；

B.SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:6。

6.如权利要求1所述的抗原结合单元，其特征在于，所述的HCDR1具有SEQ ID NO:1或7所示的序列，所述的HCDR2具有SEQ ID NO:2或8所示的序列，所述的HCDR3具有SEQ ID NO:3所示的序列，所述的LCDR1具有SEQ ID NO:4或9所示的序列，所述的LCDR2具有SEQ ID NO:5或10所示的序列，所述的LCDR3具有SEQ ID NO:6所示的序列。

7.如权利要求6所述的抗原结合单元，其特征在于，

所述的HCDR1含有SEQ ID NO:1所示的序列、所述的HCDR2含有SEQ ID NO:2所示的序列、所述的HCDR3含有SEQ ID NO:3所示的序列、所述的LCDR1含有SEQ ID NO:4所示的序列、所述的LCDR2含有SEQ ID NO:5所示的序列、所述的LCDR3含有SEQ ID NO:6所示的序列；或者

8.如权利要求1-7任一所述的抗原结合单元，其特征在于，所述的抗原结合单元具有SEQ ID NO:11或15所示的重链可变区，和SEQ ID NO:13或17所示的轻链可变区。

9.权利要求1-8任一所述的抗原结合单元的突变体，与权利要求1-8任一所述的抗原结合单元竞争结合FAPα。

10.如权利要求9所述的突变体，其特征在于，所述突变体与权利要求1-8任一所述的抗原结合单元在轻链可变区序列上有90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的相同性；或者，所述突变体与权利要求1-8任一所述的抗原结合单元在在重链可变区序列上有90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的相同性；

优选地，所述突变体与权利要求1-8任一所述的抗原结合单元在轻链CDR区，例如轻链CDR1或CDR2的序列上有70％以上；优选地，75％以上；更优选地，80％以上的相同性；或者，所述突变体与权利要求1-8任一所述的抗原结合单元在重链CDR区，例如重链CDR1或CDR2的序列上有60％以上；优选地，70％以上；更优选地，80％以上的相同性。

11.如权利要求9所述的突变体，其特征在于，所述突变体与权利要求1-8任一所述的抗原结合单元竞争结合FAPα上同一结合表位。

12.一种抗原结合单元，所述抗原结合单元包含轻链CDR区和重链CDR区，所述的重链CDR包含HCDR1，HCDR2和HCDR3；所述的轻链CDR区包含LCDR1，LCDR2和LCDR3，其中，所述的HCDR1，HCDR2和HCDR3独立选自与SEQ ID NO:1-3、7、8中任一序列至少80％、优选至少85％、更优选至少90％、更优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相似性的序列，所述的LCDR1，LCDR2和LCDR3独立选自与SEQ ID NO:4-6、9、10中任一序列至少80％、优选至少85％、更优选至少90％、更优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相似性的序列。

13.如权利要求12所述的抗原结合单元，其特征在于，所述的HCDR1具有SEQ ID NO:1或7所示的序列，所述的HCDR2具有SEQ ID NO:2或8所示的序列，所述的HCDR3具有SEQ ID NO:3所示的序列。

14.如权利要求13所述的抗原结合单元，其特征在于，所述的HCDR1，HCDR2和HCDR3的序列选自以下任一组：

A.SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3；

B.SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:3。

15.如权利要求12所述的抗原结合单元，其特征在于，所述的LCDR1具有SEQ ID NO:4或9所示的序列，所述的LCDR2具有SEQ ID NO:5或10所示的序列，所述的LCDR3具有SEQ IDNO:6所示的序列。

16.如权利要求15所述的抗原结合单元，其特征在于，所述的LCDR1，LCDR2和LCDR3的序列选自以下任一组：

A.SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6；

B.SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:6。

17.如权利要求12所述的抗原结合单元，其特征在于，所述的HCDR1具有SEQ ID NO:1或7所示的序列，所述的HCDR2具有SEQ ID NO:2或8所示的序列，所述的HCDR3具有SEQ ID NO:3所示的序列，所述的LCDR1具有SEQ ID NO:4或9所示的序列，所述的LCDR2具有SEQ ID NO:5或10所示的序列，所述的LCDR3具有SEQ ID NO:6所示的序列。

18.如权利要求17所述的抗原结合单元，其特征在于，

19.一种抗原结合单元，其特征在于，所述的抗原结合单元具有与SEQ ID NO:11或15所示的重链可变区的序列具有至少80％、优选至少85％、更优选至少90％、更优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相似性的序列，和与SEQ ID NO:13或17所示的轻链可变区具有至少80％、优选至少85％、更优选至少90％、更优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相似性的序列。

20.如权利要求1-19任一项所述的抗原结合单元或抗原结合单元的突变体，其特征在于，所述的抗原结合单元是单克隆抗体、全人抗体、人源化抗体、嵌合抗体。

21.如权利要求1-19所述的抗原结合单元，其特征在于，所述的抗原结合单元是scFv、Fv、Fab、(Fab)₂或者单域抗体。

22.编码权利要求1-21中任一所述的抗原结合单元的核酸。

23.一种表达载体，其包含权利要求22所述的核酸。

24.一种宿主细胞，其包含权利要求23所述的表达载体或基因组中整合有权利要求22所述的核酸。

25.一种双价蛋白，由权利要求21所述的scFv序列与一个或多个重链恒定区域融合所形成具有人免疫球蛋白Fc区的抗体；

26.一种多功能免疫辍合物，其特征在于，所述的多功能免疫辍合物包括:

权利要求1-21任一所述的抗原结合单元，以及与之连接的功能性分子；其中，所述的功能性分子选自:

(c)靶向免疫细胞的表面标志物的分子或可检测标记物。

27.一种嵌合抗原受体，其特征在于，所述嵌合抗原受体的胞外域包含权利要求1-21任一所述的抗原结合单元，该抗原结合单元优选单链抗体或单域抗体。

28.如权利要求27所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述的嵌合抗原受体包括如下顺序连接的抗体，跨膜区和胞内信号区:

权利要求1-21任一所述的抗原结合单元、CD8和CD3ζ；

权利要求1-21任一所述的抗原结合单元、CD8、CD137和CD3ζ；

权利要求1-21任一所述的抗原结合单元、CD28分子的跨膜区、CD28分子的胞内信号区和CD3ζ；或

权利要求1-21任一所述的抗原结合单元、CD28分子的跨膜区、CD28分子的胞内信号区、CD137和CD3ζ。

29.编码权利要求27或28所述的嵌合抗原受体的核苷酸序列。

30.一种表达载体，其特征在于，包含权利要求29所述的核苷酸序列。

31.一种病毒，其特征在于，所述的病毒包含权利要求30所述的表达载体。

32.一种基因修饰的免疫细胞，其特征在于，

其转导有权利要求29所述的核苷酸序列、

或权利要求30所述的表达载体、

或权利要求31所述的病毒、

或其表达权利要求27或28所述的嵌合抗原受体。

33.如权利要求32所述的基因修饰的免疫细胞，其特征在于，还表达有除嵌合抗原受体之外的其他序列，所述其他序列包括细胞因子、另一种嵌合抗原受体、趋化因子受体、降低PD-1表达的siRNA或者阻断PD-L1的蛋白、TCR、或安全开关；

较佳地，所述趋化因子受体包括CCR2、CCR5、CXCR2、或CXCR4；

较佳地，所述安全开关包括iCaspase-9、Truancated EGFR或RQR8。

34.如权利要求1-21任一所述的抗原结合单元、或权利要求25所述的双价蛋白、或权利要求26所述的免疫辍合物、或权利要求27或28所述的嵌合抗原受体、或权利要求29所述的核苷酸序列、或权利要求30所述的表达载体、或权利要求31所述的病毒、或权利要求32或33所述的免疫细胞的用途，用于制备治疗、预防或诊断高表达FAPα相关的疾病的药物或试剂。

35.如权利要求34所述的用途，所述的高表达FAPα相关的疾病是肿瘤。

36.如权利要求35所述的用途，所述的肿瘤是乳腺癌、卵巢癌、肺癌、结肠癌、胰腺癌、皮肤黑色素瘤、肾癌、膀胱癌。

37.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包含权利要求1-21中任一所述的抗原结合单元或编码该抗原结合单元的核酸；或

权利要求25中所述的双价蛋白；或

权利要求26中所述的免疫辍合物或编码该辍合物的核酸；或

权利要求27或28所述的嵌合抗原受体或编码该嵌合抗原受体的核酸；或

权利要求32或33中所述的基因修饰的免疫细胞。