CN101370832B

CN101370832B - 结合多肽及其用途

Info

Publication number: CN101370832B
Application number: CN200680052290.8A
Authority: CN
Inventors: 萨克德夫·S·西德休; 萨拉·C·伯塔兰; 弗雷德里克·A·费洛斯
Original assignee: Genentech Inc
Current assignee: Genentech Inc
Priority date: 2005-12-02
Filing date: 2006-12-01
Publication date: 2014-07-02
Anticipated expiration: 2026-12-01
Also published as: CN101370832A

Abstract

本发明提供DR5和HER-2的抗体或其抗原结合片段。抗体和/或其抗原结合片段包含具有高度限制性氨基酸序列多样性的变体CDR。本发明还提供这些多肽与异源多肽的融合多肽，所述异源多肽例如噬菌体或病毒外壳蛋白的至少一部分、标记和接头。此外，提供用于治疗癌症和免疫相关病症的组合物和方法。

Description

结合多肽及其用途

相关申请

本申请不是一份临时申请，要求享有2005年12月2日提交的US 60/742,185和2006年6月22日提交的US 60/805,553的优先权，在此这些申请的所有内容都引入作为参考。

发明背景

本发明总体上涉及用极度有限的氨基酸库多样化处理得到的变体CDR，以及包含大量这种序列的文库。本发明还涉及包含这些变体CDR的融合多肽。本发明还涉及用于鉴定新的结合多肽的方法和组合物，这些多肽用于治疗或者用作制剂。

背景

噬菌体展示技术提供了用于生成和选择能与配体诸如抗原结合的新蛋白质的有力工具。使用噬菌体展示技术，容许生成可快速分拣那些能以高亲和力与靶抗原结合的序列的蛋白质变体大型文库。将编码变异多肽的核酸与编码病毒外壳蛋白诸如基因III蛋白或基因VIII蛋白的核酸序列融合。已经开发了单价噬菌体展示系统，其中将编码蛋白质或多肽的核酸序列与编码基因III蛋白一部分的核酸序列融合。(Bass，S.Proteins 8：309(1990)；Lowman and Wells Methods：A Companion to Methods inEnzymology 3：205(1991))。在单价噬菌体展示系统中，基因融合物以低水平表达，而野生型基因III蛋白也表达，使得(病毒)颗粒的感染性得到保留。生成肽文库和筛选那些文库的方法已经公开于许多专利(例如美国专利No.5,723,286、美国专利No.5,432,018、美国专利No.5,580,717、美国专利No.5,427,908和美国专利No.5,498,530)。

证明肽在丝状噬菌体表面上表达和功能性抗体片段在大肠杆菌周质中表达对于开发噬菌体展示抗体文库是重要的。(Smith等Science 228：1315(1985)；Skerra and Pluckthun Science 240：1038(1988))。已经以多种方式制备了抗体或抗原结合多肽的文库，包括通过插入随机DNA序列来改变单一基因或者通过克隆一族相关基因。使用噬菌体展示来展示抗体或抗原结合片段的方法已经记载于美国专利No.5,750,373、5,733,743、5,837,242、5,969,108、6,172,197、5,580,717和5,658,727。然后对文库筛选具有期望特征的抗体或抗原结合蛋白的表达。

噬菌体展示技术在制备具有期望特征的抗体方面相对于常规杂交瘤和重组方法具有数项优势。此技术容许以较少的时间、无需使用动物就开发出具有多样序列的大型抗体文库。杂交瘤的制备或人源化抗体的制备动则就需要数月制备。另外，由于不需要进行免疫，可以对有毒的或具有低抗原性的抗原生成噬菌体抗体文库(Hogenboom Immunotechniques 4：1-20(1988))。噬菌体抗体文库还可用于生成和鉴定新的人抗体。

作为极其多种疾患的治疗剂，抗体已经变得非常有用。例如，HER-2(一种肿瘤抗原)的人源化抗体可用于癌症的诊断和治疗。其它抗体，诸如抗INF-γ抗体可用于治疗炎性疾患，诸如克罗恩氏病。

噬菌体展示文库已经用于自经免疫的和未免疫的人、种系序列、或未接触抗原的B细胞Ig全集生成人抗体(Barbas & Burton Trends Biotech14：230(1996)；Griffiths等EMBO J.13：3245(1994)；Vaughan等Nat.Biotech.14：309(1996)；Winter EP 0368684B1)。已经使用多种淋巴样组织生成了未接触抗原的或非免疫性抗原结合文库。这些文库中的一些可以通过商业途径购买，诸如那些由Cambridge Antibody Technology和Morphosys开发的文库(Vaughan等Nature Biotech 14：309(1996)；Knappik等J.Mol.Biol.296：57(1999))。然而，这些文库中的许多具有有限的多样性。

自噬菌体展示文库中鉴定和分离高亲和力抗体的能力在分离用于治疗用途的新的人抗体中是重要的。传统上认为自文库中分离高亲和力抗体至少部分依赖于文库的容量、细菌细胞的生产效率、和文库的多样性。参见例如Knappik等J.Mol.Biol.296：57(1999)。由于抗体或抗原结合蛋白的不正确折叠和终止密码子的存在，文库的容量会因低效生产而缩小。如果抗体或抗原结合结构域没有得到正确折叠，那么在细菌细胞中的表达会受到抑制。可以通过突变可变/恒定界面的表面转角中的残基或选定的CDR残基来提高表达。(Deng等J.Biol.Chem.269：9533(1994)；Ulrich等PNAS，92：11907-11911(1995)；Forsberg等J.Biol.Chem.272：12430(1997))。在细菌细胞中生成噬菌体抗体文库时，框架区的序列是提供正确折叠的一个因素。

生成抗体或抗原结合蛋白的多样性文库对于分离高亲和力抗体也是重要的。已经使用多种方法生成了在有限CDR中具有多样性的文库。参见例如Tomlinson Nature Biotech.18：989-994(2000)。CDR3区是受关注的，部分因为常常发现它们参与抗原结合。重链上的CDR3区的长度、序列和结构构象变化极大。

其它人也已经通过在每个位置使用所有20种氨基酸来随机化重链和轻链可变域CDR区而产生了多样性。认为使用所有20种氨基酸会产生变异抗体序列的大大多样性并增加鉴定到新抗体的机会。(Barbas PNAS 91：3809(1994)；Yelton，DE J.Immunology 155：1994(1995)；Jackson，J.R.J.Immunology 154：3310(1995)；Hawkins，RE J.Mol.Biology 226：889(1992))。

也试图通过在有些CDR中限制氨基酸替代组以反映天然存在抗体中的氨基酸分布来创建多样性。参见Garrard &Henner，Gene(1993)，128：103；Knappik et al.，J.Mol.Biol.(1999)，296：57。然而，这些尝试获得了不同程度的成功，而且尚未以系统的和定量的方式应用。在CDR区中创建多样性同时将氨基酸变化的数目最小化是一项挑战。另外，在有些情况中，一旦依照一组标准生成了第一文库，可能希望进一步增强该第一文库的多样性。然而，这要求第一文库具有足够的多样性，且仍然保持足够小的容量，从而可导入更多的多样性而不显著超越实际限制，诸如产率等。

有些小组报告了生成蛋白质所需的氨基酸全集最小数目的理论和实验分析。然而，这些分析一般在范围和本质方面受到限制，而且关于使用一组受限制的氨基酸类型来生成具有复杂功能的多肽的可行性仍然存在重大怀疑和疑问。参见例如Riddle et al.，Nat.Struct.Biol.(1997)，4(10)：805-809；Shang et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1994)，91：8373-8377；Heinz et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1992)，89：3751-3755；Regan & Degrado，Science(1988)，241：976-978；Kamtekeret al.，Science(1993)，262：1680-1685；Wang & Wang，Nat.Struct.Biol.(1999)，6(11)：1033-1038；Xiong et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1995)，92：6349-6353；Heinz et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1992)，89：3751-3755；Cannata et al.，Bioinformatics(2002)，18(8)：1102-1108；Davidson et al.，Nat.Struct.Biol.(1995)，2(10)：856-863；Murphy et al.，Prot.Eng.(2000)，13(3)：149-152；Brown & Sauer，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1999)，96：1983-1988；Akanuma et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.(2002)，99(21)：13549-13553；Chan，Nat.Struct.Biol.(1999)，6(11)：994-996。

如此，仍然需要改进包含具有足够程度序列多样性的功能性多肽、仍足以适应致力于进一步多样化、高产率表达等的进一步操作的文库的生成方法。本文描述的发明满足了这一需要并提供了其它好处。

发明公开

本发明提供用于制备包含变体CDR(variant CDR)的多肽的简单而灵活的方法，该CDR包含有限多样化的序列，但是仍保留与靶标抗原的结合能力。传统方法的理论在于仅当特定的CDR或者所有的CDR被多样化时才使得靶标结合物(target binder)产生足够的多样化，传统观念认为足够的多样化依赖于最大范围内的氨基酸取代(通常用全部或大部分的20种氨基酸进行取代)，与此不同的是，本发明提供制备高质量的靶标结合物的方法，该方法不依赖于使参考多肽或来源抗体的特定CDR或特定数量的CDR发生多样化。本发明至少部分地基于令人惊奇地意外发现包括能够结合靶标抗原的功能性多肽的高质量的高度变化的文库可以通过用非常有限数量的氨基酸残基使最少数量的氨基酸位置发生多样化来制备。本发明的方法使用编码少数氨基酸的限制性密码子套组(restricted codon set)，因而快速、便捷而且灵活。序列的多样性有限，从而由本发明的方法制备的多肽群体(例如文库)较小，因此，如果需要或者期望得到，可以使这些群体进一步多样化。这是一个通常不能由常规方法产生的优点。本发明所制备的候选结合物多肽具有高质量的靶标结合特性，并且具有能够在细菌培养物中高产的结构特点。本发明提供制备这些结合物多肽的方法，使用这些多肽的方法，以及包括这些多肽的组合物。

一个方面，本发明提供融合多肽，其包括被多样化的CDR和异源多肽序列(在某些具体实施方案中，病毒多肽的至少一部分的序列)，作为感兴趣靶标的候选结合物的单个多肽和作为感兴趣的靶标的候选结合物的大量独特多肽的一个成员。包括这种多肽的组合物(例如文库)可用于多种应用中，例如，作为结合感兴趣的靶标的候选免疫球蛋白多肽(例如，抗体和抗体片段)的集合。这种多肽还可以用非免疫球蛋白支架(例如，蛋白质，例如人生长激素等)来制备。本发明包括多个方面，包括按照本发明的方法制备的多核苷酸和多肽，以及用于实施本发明的方法的系统、试剂盒和产品，和/或使用本发明的多肽/多核苷酸和/或组合物。

一个方面，本发明提供制备多肽的方法，该多肽至少包括选自由H1、H2、H3、L1、L2和L3组成的组的一种、两种、三种、四种、五种或全部的变体CDR，其中所述多肽能够结合感兴趣的靶标抗原，该方法包括在参照CDR中确定至少一个(或者任何多个到所有的)对应于变体CDR的溶剂可及且高度变化的氨基酸位置；和(ii)用限制性密码子套组(下文提供“限制性密码子套组”的定义)产生不同拷贝(variant copy)的CDR，改变溶剂可及且高度变化的位置上的氨基酸。

本发明方法的各个方面以及具体实施方案可用于制备和/或使用包括大量本发明的多肽的集合，特别是用于选择和确定感兴趣的靶标抗原的候选结合物。例如，本发明提供制备一种包括大量多肽的组合物的方法，各种多肽至少包括选自由H1、H2、H3、L1、L2和L3组成的组的一种、两种、三种、四种、五种或全部的变体CDR，其中所述多肽能够结合感兴趣的靶标抗原，该方法包括在参照CDR中确定至少一个(或者任何多个到所有的)对应于变体CDR的溶剂可及且高度变化的氨基酸位置；和(ii)用限制性密码子套组产生不同拷贝的CDR，改变溶剂可及且高度变化的位置上的氨基酸；其中大量多肽是通过用一套寡核苷酸扩增模板多核苷酸来制备的，该寡核苷酸在编码变体氨基酸的序列中具有高度受限的简并性(highlyrestricted degeneracy)，其中所述受限的简并性表明了限制性密码子套组的密码子序列数量的有限。

在另一个实施例中，本发明提供一种方法，包括：构建一种包括多核苷酸序列的表达载体，该多核苷酸序列编码来源抗体的轻链、重链或者轻链和重链两者的可变区，所述抗体至少包括选自由CDRL1、L2、L3、H1、H2和H3组成的组的一个、两个、三个、四个、五个或全部的变体CDR；并且用限制性密码子套组在至少一个(或者任何多个到所有的)溶剂可及且高度变化的氨基酸位置上至少突变来源抗体的至少一个、两个、三个、四个、五个或全部CDR。

在另一个实施例中，本发明提供一种方法，包括：构建一种展示大量本发明的多肽的噬菌体文库或噬菌粒文库；在适合噬菌粒结合到靶标抗原的条件下，将噬菌粒文库与靶标抗原接触；和将结合的噬菌粒与那些不结合靶标抗原的噬菌粒分离开。

在说明书描述的任何一种本发明的方法中，溶剂可及的和/或高度变化的氨基酸位置可以是满足说明书描述的标准的任何一个位置，特别是说明书描述的位置的任何组合，例如所描述的本发明多肽的位置的任何组合(如说明书较为详细地描述的)。合适的变异氨基酸可以是满足说明书描述的标准的任何氨基酸，例如下文较为详细描述的本发明的多肽中的变异氨基酸。

在CDR中设计多样性包括在CDR的长度上和/或序列方面设计多样性。例如，使CDRH3的长度多样化，例如，长7-21个氨基酸，和/或使其序列多样化，例如用限制性密码子套组编码的氨基酸在高度变化的和/或溶剂可及的位置上进行改变。在一些具体实施方案中，一部分CDRH3的长度在5-21个、7-20个、9-15个或11-13个氨基酸的范围内，并且在一个或多个由限制性密码子套组编码的位置上具有变异氨基酸，该密码子套组编码有限数量的氨基酸，例如密码子套组编码少于19个、15个、10个、8个、6个、4个或2个氨基酸。在一些具体实施方案中，C-末端具有氨基酸序列AM、AMDY或DY。

在一些具体实施方案中，本发明多肽可以是多种形式的，只要保留了该多肽的靶标结合功能。在一些具体实施方案中，本发明多肽是一种融合多肽(即来自异源多肽的两种或多种序列的融合物)。具有被多样化的CDR的本发明的多肽可制备成与病毒外壳蛋白的至少一部分融合的融合多肽，例如，用于噬菌体展示。用于展示本发明的多肽的病毒外壳蛋白包括蛋白质pIII、主要外壳蛋白pVIII、Soc(T4噬菌体)、Hoc(T4噬菌体)、gpD(λ噬菌体)、pVI，或其变体或片段。在一些具体实施方案中，融合多肽被融合到病毒外壳蛋白的至少一部分上，例如病毒外壳蛋白选自由pIII、pVIII、Soc、Hoc、gpD、pVI，及其变体或片段组成的组。

在一些具体实施方案中，具有被多样化的CDR的多肽是一种或多种抗体可变区，抗体可变区可以多种形式展示在病毒表面上，包括ScFv、Fab、ScFv₂、F(ab′)₂和F(ab)₂。为了以二价形式展示多肽，在某些具体实施方案中，融合蛋白包括二聚化结构域。二聚化结构域包括二聚化序列和/或包括一个或多个半胱氨酸残基的序列。直接或间接地将二聚化结构域连接到重链的可变区或恒定区的C-末端(例如，CH1)。二聚化结构域的结构是可变的，这取决于抗体可变区是否被制备成具有病毒外壳蛋白成分的融合蛋白(例如，二聚化结构域后没有琥珀终止密码子)或者抗体可变区是否被制备成绝大部分不具有病毒外壳蛋白成分(例如，二聚化结构域后有琥珀终止密码子)。当抗体可变区被制备成绝大部分具有病毒外壳蛋白成分的融合蛋白时，一个或多个二硫键和/或单个二聚化序列被提供用于二价展示。如果抗体可变区被制备成绝大部分不与病毒外壳蛋白成分融合(例如具有琥珀终止密码子)，二聚化结构域可以包含半胱氨酸残基和二聚化序列两者。

此外，可选择地，融合多肽包含用于纯化、检测和/或筛选的标记，例如FLAG、poly-his、gD标记、c-myc、荧光蛋白或β-半乳糖苷酶。在一个具体实施方案中，融合多肽包括与多肽标记融合的轻链可变区或恒定区。

本发明的另一个方面，从单个来源或模板分子中获得多肽，例如抗体可变区。对该来源或模板分子进行选择或设计，以具有某些特性，例如在原核生物或真核生物的细胞培养物中进行生产时的产量高和稳定性好，和/或能够接纳不同长度的CDRH3区。当作为具有噬菌体外壳蛋白成分的融合蛋白呈现时，可以改变模板分子的序列，以提高可变区的折叠性能和/或展示能力。例如，来源抗体可包括人源化抗体4D5可变区的氨基酸序列(轻链可变区(图1；SEQ ID NO：1))；(重链可变区(图1；SEQ ID NO：2))。例如，在抗体的重链或轻链的可变区中，对框架区残基进行修饰或改变而不同于来源或模板分子，提高抗体可变区的折叠性能、产量、展示能力或亲合力。在一些具体实施方案中，当来源分子的框架位置上的氨基酸与通常存在于天然存在的抗体的该位置上或者亚组共有序列中的一个或多个氨基酸不同时，选择对框架残基进行修饰以区别于来源或模板分子。将那些位置上的氨基酸变换成最通常存在于天然存在的抗体或者亚组共有序列中的该位置上的氨基酸。在一个具体实施方案中，重链的框架残基71可以是R、V或A。在另一个实施例，重链的框架残基93可以是S或A。在还有另一个实施例，框架残基94可以是R、K或T，或者由MRT编码。在另一个实施例，框架残基93是A，而框架残基94是R。在还有另一个实施例，重链的框架残基49可以是丙氨酸或甘氨酸。轻链的框架残基也可以被改变。例如，位置66上的氨基酸可以是精氨酸或者甘氨酸。野生型人源化抗体4D5-8轻链或重链序列的框架区示于图6中(分别是SEQ ID NO：6-9和10-13)。变体形式的人源化抗体4D5-8轻链和重链序列的框架区示于图7(分别为SEQ ID NO：14-17和18-21)，其中轻链在位置66上被修饰，而重链在位置71、73和78上被修饰。

本发明的方法能够制备大量不同的多肽，这些多肽包括不同组(set)的CDR序列。在一个具体实施方案中，用说明书描述的本发明的方法制备一个或多个文库。筛选结合靶标抗原的文库，靶标抗原例如人DR5和HER-2。

提供被随机化处理来产生多样性的免疫球蛋白重链可变区。在一个具体实施方案中，多肽包括一种免疫球蛋白重链可变区，其中：

(i)CDRH1包括氨基酸序列G-F-X1-I-X2-X3-X4-X5-I-H(SEQ ID NO：22)，其中依照Kabat编号体系，G是位置26和X1是位置28；其中X1选自S和Y；其中X2选自Y和S；其中X3选自Y和S；其中X4选自Y和S；而其中X5选自Y和S；

(ii)CDRH2包括氨基酸序列：

X1-I-X2-P-X3-X4-G-X5-T-X6-Y-A-D-S-V-K-G(SEQ ID NO：23)，其中依照Kabat编号体系，X1是位置50；其中X1选自Y和S；其中X2选自Y和S；其中X3选自Y和S；其中X4选自Y和S；其中X5选自Y和S；而其中X6选自Y和S；和

(iii)CDRH3包括氨基酸序列：

X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13-X14-X15-X16-D-Y(SEQ ID NO：31)，其中依照Kabat编号体系，X1是位置95，和其中X1选自R、Y和M；X2选自Y和R；X3选自Y、S、R、P和G，X4选自Y和S；X5选自Y、S、R和H；X6选自R、Y和S；X7选自G、Y和S；X8选自R、Y和S；X9选自G、Y和S；X10选自R、Y和S；X11选自G、Y和S；X12选自S、Y、R、G和A；X13选自G和Y；X14选自L、M、R、G和A；和X15选自G、F和L，或者不存在；而X16是F，或者不存在。

在另一个具体实施方案中，多肽包括一种免疫球蛋白重链可变区，其中：

(i)CDRH1包括氨基酸序列G-F-X1-I-X2-X3-X4-X5-I-H(SEQ ID NO：22)，其中依照Kabat编号体系，G是位置26和X1是位置28；其中X1选自Y和S；其中X2选自Y和S；其中X3选自Y和S；其中X4选自Y和S；和其中X5选自Y和S；

(ii)CDRH2包括氨基酸序列：

X1-I-X2-P-X3-X4-G-X5-T-X6-Y-A-D-S-V-K-G(SEQ ID NO：23)，其中依照Kabat编号体系，X1是位置50；其中X1选自Y和S；其中X2选自Y和S；其中X3选自Y和S；其中X4选自Y和S；其中X5选自Y和S；和其中X6选自Y和S；以及

(iii)CDRH3包括氨基酸序列：

X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13-X14-X15-X16-X17-X18-X19-D-Y(SEQ ID NO：24)，其中依照Kabat编号体系，X1是位置95，和其中X1-X6各个位置上的氨基酸选自摩尔比为50％Y、25％S和25％G的氨基酸集合；其中X7-X17各个位置上的氨基酸选自摩尔比为50％Y、25％S和25％G的氨基酸集合，或不存在；其中X18选自G和A；和其中X19选自I、M、L和F。

(ii)CDRH2包括氨基酸序列：

(iii)CDRH3包括氨基酸序列：

X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13-X14-X15-X16-X17-X18-X19-D-Y(SEQ ID NO：26)，其中依照Kabat编号体系，X1是位置95，和其中X1-X6各个位置上的氨基酸选自摩尔比为25％Y、50％S和25％R的氨基酸集合；其中X7-X17各个位置上的氨基酸选自摩尔比为25％Y、50％S和25％R的氨基酸集合，或不存在；其中X18选自G和A；和其中X19选自I、M、L和F。

(ii)CDRH2包括氨基酸序列：

(iii)CDRH3包括氨基酸序列：

X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13-X14-X15-X16-X17-X18-X19-D-Y(SEQ ID NO：27)，其中依照Kabat编号体系，X1是位置95，和其中X1-X6各个位置上的氨基酸选自摩尔比为38％Y、25％S、25％G和12％R的氨基酸集合；其中X7-X17各个位置上的氨基酸选自摩尔比为38％Y、25％S、25％G和12％R的氨基酸集合，或不存在；其中X18选自G和A；和其中X19选自I、M、L和F。

(ii)CDRH2包括氨基酸序列：

(iii)CDRH3包括氨基酸序列：

X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13-X14-X15-X16-X17-X18-X19-D-Y(SEQ ID NO：28)，其中依照Kabat编号体系，X1是位置95，和其中X1-X6各个位置上的氨基酸选自摩尔比为20％Y、26％S、26％G、13％R、1％A、1％D、1％E、1％F、1％H、1％I、1％K、1％L、1％M、1％N、1％P、1％Q、1％T、1％V和1％W的氨基酸集合；其中X7-X17各个位置上的氨基酸选自摩尔比为20％Y、26％S、26％G、13％R、1％A、1％D、1％E、1％F、1％H、1％I、1％K、1％L、1％M、1％N、1％P、1％Q、1％T、1％V和1％W的氨基酸集合，或不存在；其中X18选自G和A；和其中X19选自I、M、L和F。

一个方面，CDRH1包括至少一种选自SEQ ID NO：524-540和189-294的任何一种的氨基酸序列，或者选自图11A或图15所示任一序列的至少一种CDRH1氨基酸序列。CDRH2包括至少一种选自SEQ ID NO：541-557和295-400的氨基酸序列，或者选自图11A或图15所示任一序列的至少一种CDHR2氨基酸序列。CDRH3包括至少一种选自SEQ ID NO：558-574和401-506的氨基酸序列，或者选自图11A或图15所示任一序列的至少一种CDHR3氨基酸序列。

另一个方面，CDRH3包括选自R和Y的X1；X3是S；X8是S；X9是Y；和X10是Y或R。在另一个具体实施方案中，CDRH3包括氨基酸序列X1-R-S-Y-R-Y-G-S-Y-X10-G-S-Y-X14-F-D-Y(SEQ ID NO：575)。

另一个方面，多肽结合人DR5，或者结合人DR5和鼠DR5。在一些具体实施方案中，所述多肽是一种抗体。

在一个具体实施方案中，抗体包括重链可变区，该重链可变区包括：i)包括氨基酸序列GFYISSSSIH(SEQ ID NO：576)的CDRH1；ii)包括氨基酸序列SISPSSGSTYYADSVKG(SEQ ID NO：577)的CDRH2；和iii)包括氨基酸序列YRSYRYGSYYGSYGFDY(SEQ ID NO：578)的CDRH3。在一个具体实施方案中，抗体包括重链可变区，该重链可变区包括：i)包括氨基酸序列GFYIYSSSIH(SEQ ID NO：579)的CDRH1；ii)包括氨基酸序列SISPSSGYTSYADSVKG(SEQ ID NO：580)的CDRH2；和iii)包括氨基酸序列RRSYRYGSYRGSYAFDY(SEQ ID NO：581)的CDRH3。

另一个方面，多肽进一步包括轻链可变区，其中

(i)CDRL3包括氨基酸序列Q-Q-X1-X2-X3-X4-P-X5-T(SEQ ID NO：25)；其中X1在位置91上，并选自Y、H和S；X2选自Y和S；X3选自Y、S和T；X4选自Y、S和T；和X5选自S、P和Y。在一个具体实施方案中，CDRL1包括氨基酸序列RASQDVTAVA(SEQ ID NO：29)。在一个具体实施方案中，CDRL2包括氨基酸序列SASSLYS(SEQ ID NO：30)。

在另一个具体实施方案中，多肽包括免疫球蛋白重链可变区，其中(i)CDRH1包括氨基酸序列G-F-X1-I-X2-X3-X4-X5-I-H(SEQ ID NO：22)；其中按照Kabat编号，X1在位置28上，并选自S和Y；X2选自S和Y；X3选自S和Y；X4选自S和Y；和X5选自S和Y；(ii)CDRH2包括氨基酸序列X1-I-X2-P-X3-X4-G-X5-T-X6-Y-A-D-S-V-K-G(SEQ ID NO：23)；其中按照Kabat编号，X1在氨基酸位置50上，并选自S和Y；X2选自S和Y；X3选自S和Y；X4选自S和Y；X5选自S和Y；和X6选自S和Y；和(iii)CDRH3包括氨基酸序列X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-D-Y(SEQ ID NO：582)，其中按照Kabat编号，X1在氨基酸位置95上，并选自Y和R；X2选自Y、S和R；X3选自S、G、Y和H；X4选自S、G、Y和R；X5选自G和A；X6选自F、M、L和A；和X7选自F、M和L，或者缺失。

一个方面，CDRH1包括至少一种选自SEQ ID NO：189-198的任何一种的氨基酸序列。CDRH2包括至少一种选自SEQ ID NO：295-304的氨基酸序列。CDRH3包括至少一种选自SEQ ID NO：401-410的氨基酸序列。

在另一个具体实施方案中，多肽包括免疫球蛋白重链可变区，其中(i)CDRH1包括氨基酸序列G-F-X1-I-X2-X3-X4-X5-I-H(SEQ ID NO：22)；其中按照Kabat编号，X1在位置28上，并选自S和Y；X2选自S和Y；X3选自S和Y；X4选自S和Y；和X5选自S和Y；(ii)CDRH2包括氨基酸序列X1-I-X2-P-X3-X4-G-X5-T-X6-Y-A-D-S-V-K-G(SEQ ID NO：22)；其中按照Kabat编号，X1在氨基酸位置50上，并选自S和Y；X2选自S和Y；X3选自S和Y；X4选自S和Y；和X5选自S和Y；和(iii)CDRH3包括氨基酸序列X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-D-Y(SEQ ID NO：583)，其中按照Kabat编号，X1在氨基酸位置95上，并选自Y、S和G；X2选自Y、S、G、R、A和M；X3选自G、Y、S和R；X4选自G、Y和F；X5选自Y、S、N和G；X6选自Y、R、H和W；X7选自G和A；和X8选自F、M、L和I。

一个方面，CDRH1包括至少一种选自SEQ ID NO：199-216的任何一种的氨基酸序列。CDRH2包括至少一种选自SEQ ID NO：305-322的氨基酸序列。CDRH3包括至少一种选自SEQ ID NO：411-428的氨基酸序列。

在另一个具体实施方案中，多肽包括免疫球蛋白重链可变区，其中

(i)CDRH1包括氨基酸序列G-F-X1-I-X2-X3-X4-X5-I-H(SEQ ID NO：22)；其中按照Kabat编号，X1在位置28上，并选自S和Y；X2选自S和Y；X3选自S和Y；X4选自S和Y；和X5选自S和Y；

(ii)CDRH2包括氨基酸序列

X1-I-X2-P-X3-X4-G-X5-T-X6-Y-A-D-S-V-K-G(SEQ ID NO：23)；其中按照Kabat编号，X1在氨基酸位置50上，并选自S和Y；X2选自S和Y；X3选自S和Y；X4选自S和Y；和X5选自S和Y；以及

(iii)CDRH3包括氨基酸序列

X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13-X14-X15-X16-X17-X18-X19-D-Y(SEQ ID NO：584)，其中X1在氨基酸位置95上，并选自Y、S、R、G和E；X2选自Y、S、R和G；X3选自S、Y、G和W；X4选自S、Y、G和Q；X5选自G、Y和S；X6选自G、Y、S、R和V；X7选自S、Y、G和R；X8选自Y、S、G、R、P和V；X9选自G、A、Y、S和R；X10选自M、F、G、Y、S和R；X11选自A、Y、S、G和R或者不存在；X12选自I、M、F、L、A、G、S、Y、R和T，或者不存在；X13选自F、M、L、G、A、Y、T和S，或者不存在；X14选自L、M、F、I、G、Y、A和T或者不存在；X15选自M、L、Y、G和R，或者不存在；X16选自Y和G，或者不存在；X17选自R、M和G，或者不存在；X18选自P和A，或者不存在；和X18是L，或者不存在。

在另一个具体实施方案中，多肽包括免疫球蛋白重链可变区，其中：

(i)CDRH1包括氨基酸序列G-F-X1-I-X2-X3-X4-X5-I-H，其中依照Kabat编号体系，G是位置26，而X1是位置28；和其中X1-X5是除了半胱氨酸外的天然存在的氨基酸；

(ii)CDRH2包括氨基酸序列：

X6-I-X7-P-X8-X9-G-X10-T-X11-Y-A-D-S-V-K-G，其中依照Kabat编号体系，X6是位置50，和其中X6-X11是除了半胱氨酸外的天然存在的氨基酸；和

(iii)CDRH3包括氨基酸序列：X12-X13-X14-X15-X16-(X17)_n-X18-X19-D-Y，其中依照Kabat编号体系，X12是位置95，和其中n是将保留重链可变区的功能活性的合适的数，和其中X12-X19是除了半胱氨酸外的天然存在的氨基酸。

一个方面，n是1-12。一个方面，X1选自Y和S；X2选自Y和S；X3选自Y和S；X4选自Y和S；X5选自Y和S，和X6选自Y和S。一个方面，X6选自Y和S；X7选自Y和S；X8选自Y和S；X9选自Y和S；X10选自Y和S；和X11选自Y和S。一个方面，X12-X17各个位置上的氨基酸选自摩尔比为50％Y、25％S和25％G的氨基酸集合，X18选自G和A，和X19选自I、M、L和F。在一个可供选择方面，X12-X17各个位置上的氨基酸选自摩尔比为25％Y、50％S和25％R的氨基酸集合，X18选自G和A，和X19选自I、M、L和F。在另一个可供选择方面，X12-X17各个位置上的氨基酸选自摩尔比为38％Y、25％S、25％G和12％R的氨基酸集合，X18选自G和A，和X19选自I、M、L和F。在另一个可供选择方面，X12-X17各个位置上的氨基酸选自摩尔比为20％Y、26％S、26％G、13％R、1％A、1％D、1％E、1％F、1％H、1％I、1％K、1％L、1％M、1％N、1％P、1％Q、1％T、1％V和1％W的氨基酸集合，X18选自G和A，和X19选自I、M、L和F。一个方面，CDRH1包括选自SEQ ID NO：217-294或者图11中的CDRH1序列的任何一种的氨基酸序列。一个方面，CDRH2包括选自SEQ ID NO：323-400或者图11中的CDRH2序列的任何一种的氨基酸序列。一个方面，CDRH3包括选自SEQ ID NO：429-506或者图11中的CDRH3序列的任何一种的氨基酸序列。

在另一个具体实施方案中，提供包括免疫球蛋白重链可变区的多肽，其中：

(i)CDRH1包括氨基酸序列G-F-X1-I-X2-X3-X4-X5-I-H(SEQ ID NO：____)，其中依照Kabat编号体系，G是位置26和X1是位置28；和其中X1-X5是除了半胱氨酸外的天然存在的氨基酸；

(ii)CDRH2包括氨基酸序列：

X6-I-X7-P-X8-X9-S-X10-T-X11-Y-A-D-S-V-K-G(SEQ ID NO：____)，其中依照Kabat编号体系，X6是位置50，和其中X6-X11是除了半胱氨酸外的天然存在的氨基酸；和

(iii)CDRH3包括氨基酸序列：X12-X13-X14-(X15)_n-X16-X17(SEQID NO：____)，其中依照Kabat编号体系，X14是位置95，和其中n是将保留重链可变区的功能活性的合适的数，和其中X12-X17是除了半胱氨酸外的天然存在的氨基酸。

一个方面，n是1-14。另一个方面，X1选自Y和S；X2选自Y和S；X3选自Y和S；X4选自Y和S；和X5选自Y和S。另一个方面，X1选自W和S；X2选自W和S；X3选自W和S；X4选自W和S；和X5选自W和S。另一个方面，X1选自R和S；X2选自R和S；X3选自R和S；X4选自R和S；和X5选自R和S。另一个方面，X1选自F和S；X2选自F和S；X3选自F和S；X4选自F和S；和X5选自F和S。另一个方面，X6选自Y和S；X7选自Y和S；X8选自Y和S；X9选自Y和S；X10选自Y和S；和X11选自Y和S。另一个方面，X6选自W和S；X7选自W和S；X8选自W和S；X9选自W和S；X10选自W和S；和X11选自W和S。另一个方面，X6选自R和S；X7选自R和S；X8选自R和S；X9选自R和S；X10选自R和S；和X11选自R和S。另一个方面，X6选自F和S；X7选自F和S；X8选自F和S；X9选自F和S；X10选自F和S；和X11选自F和S。另一个方面，X12选自Y和S；X13选自Y和S；X14选自Y和S；X15选自Y和S；X16选自G和A；和X17选自F、L、I和M。另一个方面，X12选自W和S；X13选自W和S；X14选自W和S；X15选自W和S；X16选自G和A；和X17选自F、L、I和M。另一个方面，X12选自R和S；X13选自R和S；X14选自R和S；X15选自R和S；X16选自G和A；和X17选自F、L、I和M。另一个方面，X12选自F和S；其中X13选自F和S；X14选自F和S；X15选自F和S；X16选自G和A；和X17选自F、L、I和M。

另一个方面，X12-X15各个位置上的氨基酸选自S，以及A、C、F、G、I、L、N、P、R、T、W和Y之一；X16选自G和A；和X17选自F、L、I和M。

(i)CDRH1包括氨基酸序列G-F-X1-I-X2-X3-X4-X5-I-H，其中依照Kabat编号体系，G是位置26和X1是位置28；其中X1选自Y和S；其中X2选自Y和S；其中X3选自Y和S；其中X4选自Y和S；和其中X5选自Y和S；

(ii)CDRH2包括氨基酸序列：

X1-I-X2-P-X3-X4-G-X5-T-X6-Y-A-D-S-V-K-G，其中依照Kabat编号体系，X1是位置50；其中X1选自Y和S；其中X2选自Y和S；其中X3选自Y和S；其中X4选自Y和S；其中X5选自Y和S；和其中X6选自Y和S；和

(iii)CDRH3包括氨基酸序列：

X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13-X14-X15-X16-X17-X18-X19，其中依照Kabat编号体系，X1是位置95，和其中X1-X17各个位置上的氨基酸选自S，以及A、C、F、G、I、L、N、P、R、T、W和Y之一，或不存在；其中X18选自G和A；和其中X19选自F、L、I和M。

一个方面，CDRH1包括至少一种选自SEQ ID NO：816-842的任何一种的氨基酸序列，或者选自图21A所示任一序列的至少一种CDRH1氨基酸序列。CDRH2包括选自SEQ ID NO：843-869的至少一种氨基酸序列，或者选自图21A所示任一序列的至少一种CDRH2氨基酸序列。CDRH3包括至少一种选自SEQ ID NO：870-896的氨基酸序列，或者选自图21A所示任一序列的至少一种CDRH3氨基酸序列。

(i)CDRH1包括氨基酸序列G-F-X1-I-X2-X3-X4-X5-I-H，其中依照Kabat编号体系，G是位置26和X1是位置28；其中X1-X5的各个位置上的氨基酸选自S，以及Y、W、R或F之一；

(ii)CDRH2包括氨基酸序列：

X1-I-X2-P-X3-X4-G-X5-T-X6-Y-A-D-S-V-K-G，其中依照Kabat编号体系，X1是位置50；其中X1-X6的各个位置上的氨基酸选自S，以及Y、W、R或F之一；和

(iii)CDRH3包括氨基酸序列：

X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13-X14-X15-X16-X17-X18-X19，其中依照Kabat编号体系，X1是位置95，和其中X1-X19的各个位置上的氨基酸选自S，以及Y、W、R或F之一，或不存在；其中X18选自G和A；和其中X19选自F、L、I和M。

一个方面，CDRH1包括至少一种选自SEQ ID NO：924-950的任何一种的氨基酸序列，或者选自图24A所示任一序列的至少一种CDRH1氨基酸序列。CDRH2包括选自SEQ ID NO：951-977的至少一种氨基酸序列，或者选自图24A所示任一序列的至少一种CDRH2氨基酸序列。CDRH3包括至少一种选自SEQ ID NO：978-1004的氨基酸序列，或者选自图24A所示任一序列的至少一种CDRH3氨基酸序列。

一个方面，多肽结合人HER-2。在一些具体实施方案中，多肽包括抗体。在一个具体实施方案中，抗体包括重链可变区，该重链可变区包括

i)包括氨基酸序列GFSIYSSYIH(SEQ ID NO：821)的CDRH1；

ii)包括氨基酸序列SIYPYSGYTSYADSVKG(SEQ ID NO：848)的CDRH2；和

iii)包括氨基酸序列WWSSAFDY(SEQ ID NO：875)的CDRH3。在另一个具体实施方案中，抗体包括重链可变区，该重链可变区包括：

i)包括氨基酸序列GFSIWWSWIH(SEQ ID NO：932)的CDRH1；

ii)包括氨基酸序列SISPSSGWTSYADSVKG(SEQ ID NO：959)的CDRH2；和

iii)包括氨基酸序列WWSSAMDY(SEQ ID NO：986)的CDRH3。在另一个具体实施方案中，抗体包括重链可变区，该重链可变区包括：

i)包括氨基酸序列GFSISSSYIH(SEQ ID NO：944)的CDRH1；

ii)包括氨基酸序列SIYPYSGYTSYADSVKG(SEQ ID NO：971)的CDRH2；和

iii)包括氨基酸序列YYSYALDY(SEQ ID NO：998)的CDRH3。在另一个具体实施方案中，抗体包括重链可变区，该重链可变区包括

i)包括氨基酸序列GFYISSSSIH(SEQ ID NO：230)的CDRH1；

ii)包括氨基酸序列YIYPSSGYTSYADSVKG(SEQ ID NO：336)的CDRH2；和

iii)包括氨基酸序列GYYYSYYSGYALDY(SEQ ID NO：442)的CDRH3。

另一个方面，抗体进一步包括轻链可变区，该轻链可变区包括CDRL3序列，其中CDRL3包括氨基酸序列Q-Q-X1-X2-X3-X4-P-X5-T(SEQ ID NO：25)，其中按照Kabat编号，X1在位置91上，并选自S和Y；X2选自S、Y和F；X3选自Y、S和F；X4选自Y和S；X5选自S和Y。

在另一个具体实施方案中，提供包括免疫球蛋白轻链可变区的多肽，其中CDRL3包括氨基酸序列：Q-Q-X1-X2-X3-X4-P-X5-T(SEQ ID NO：____)，其中依照Kabat编号体系，X1是位置91，其中X1选自Y和S，其中X2选自Y和S；其中X3选自Y和S；其中X4选自Y和S；和其中X5选自Y和S。在另一个具体实施方案中，多肽包括免疫球蛋白轻链可变区，其中CDRL3包括氨基酸序列：Q-Q-X1-X2-X3-X4-P-X5-T，其中依照Kabat编号体系，X1是位置91，和其中X1-X5各个位置上的氨基酸选自S，以及Y、W、R和F之一。一个方面，CDRL3包括选自SEQ ID NO：83-188、507-523、789-815和897-923或者图11、15、21或24中的CDRL3序列的任何一种的氨基酸序列。

在另一个具体实施方案中，提供包括免疫球蛋白轻链可变区的多肽，其中：

(i)CDRL1包括第一共有高变序列或其变体，与相应的共有高变序列相比，该变体在一个或多个位置上包括取代；

(ii)CDRL2包括第二共有高变序列或其变体，与相应的共有高变序列相比，该变体在一个或多个位置上包括取代；和

(iii)CDRL3包括氨基酸序列：Q-Q-X1-X2-X3-(X4)_n-X5-X6-T(SEQID NO：____)，其中X1-X6是除了半胱氨酸外的任何天然存在的氨基酸，和其中依照Kabat编号体系，X1是位置91。

一个方面，依照Kabat编号体系，X1是位置91，X1选自Y和S；X2选自Y和S；X3选自Y和S；X4选自Y和S；X5选自P和L；和X6选自F、L、I和V。一个方面，n是1-3。一个方面，CDRL3包括选自SEQ ID NO：83-188、507-523、789-815和897-923或者图11、15、21或24中的CDRL3序列的任何一种的氨基酸序列。一个方面，第一共有高变序列是R-A-S-Q-D-V-N-T-A-V-A(SEQ ID NO：29)。一个方面，第二共有高变序列是S-A-S-S-L-Y-S(SEQ ID NO：30)。

(iii)CDRL3包括氨基酸序列：Q-Q-X1-X2-X3-X4-P-X5-T(SEQ IDNO：____)，其中X1-X5是除了半胱氨酸外的任何天然存在的氨基酸，和依照Kabat编号体系，X1是位置91。

一个方面，依照Kabat编号体系，X1是位置91，X1选自Y和S，X2选自Y和S；X3选自Y和S；X4选自Y和S；和X5选自Y和S。另一个方面，依照Kabat编号体系，X1是位置91，X1-X5各个位置上的氨基酸选自S，以及Y、W、R和F之一。一个方面，CDRL3包括选自SEQ ID NO：83-188、507-523、789-815和897-923或者图11、15、21或24中的CDRL3序列的任何一种的氨基酸序列。一个方面，第一共有高变序列是R-A-S-Q-D-V-N-T-A-V-A(SEQ IDNO：29)。一个方面，第二共有高变序列是S-A-S-S-L-Y-S(SEQ ID NO：30)。

在某些具体实施方案中，多肽包括至少两个抗体可变区，包括：(a)包括上述重链多肽的任何一种的重链抗体可变区，和(b)包括上述轻链多肽的任何一种的轻链抗体可变区。

在某些具体实施方案中，提供一种抗体，该抗体包括按照上述重链多肽的任何一种的免疫球蛋白重链可变区的多肽，和包括按照上述轻链多肽的任何一种的免疫球蛋白轻链可变区的多肽。

在某些方面，上述多肽和抗体进一步包括连接到重链抗体可变区的C-末端区域上的二聚化结构域。在某些方面，二聚化结构域包括亮氨酸拉链结构域或者包括至少一个半胱氨酸残基的序列。在某些方面，二聚化结构域包括抗体的铰链区和亮氨酸拉链。在某些方面，二聚化结构域是单个半胱氨酸。

在一个具体实施方案中，提供包括上述多肽的任何一种的融合多肽，其中包括上述多肽的抗体可变区被融合到病毒外壳蛋白的至少一部分上。一个方面，病毒外壳蛋白选自由蛋白pIII、主要外壳蛋白pVIII、Soc、Hoc、gpD、pvl，及其变体组成的组。一个方面，融合多肽在可变区和病毒外壳蛋白之间进一步包括二聚化结构域。在该方面，可变区是重链可变区。另一个方面，融合多肽进一步包括融合到肽标记上的可变区。在该方面，可变区是轻链可变区。在另一个方面，肽标记选自由gD、c-myc、poly-his、荧光蛋白和β-半乳糖苷酶组成的组

在一个具体实施方案中，一种或多种上述多肽进一步包括抗体可变区的框架区FR1、FR2、FR3和/或FR4，对应于变异的CDRH1、CDRH2、CDRH3和/或CDRL3，其中该框架区从单个抗体模板中获得。在某些这种具体实施方案中，各个框架区包括氨基酸序列，对应于抗体4D5(SEQ ID NO：6-9和10-13)或者抗体4D5变体(SEQ ID NO：14-17和18-21)的框架区氨基酸序列。

在一个具体实施方案中，提供一种文库，其包括大量一种或多种上述多肽，其中该文库至少具有1×10⁴种截然不同的抗体可变区序列。

在另一个具体实施方案中，提供制备包括大量多肽的组合物的方法，包括：

(a)制备大量多肽，其包括：

(i)CDRH1，包括氨基酸序列G-F-X1-I-X2-X3-X4-X5-I-H(SEQ ID NO：____)，其中依照Kabat编号体系，G是位置26和X1是位置28；其中X1选自Y和S；其中X2选自Y和S；其中X3选自Y和S；其中X4选自Y和S；和其中X5选自Y和S；

(ii)CDRH2，包括氨基酸序列：

X1-I-X2-P-X3-X4-G-X5-T-X6-Y-A-D-S-V-K-G(SEQ ID NO：____)，其中依照Kabat编号体系，X1是位置50；其中X1选自Y和S；其中X2选自Y和S；其中X3选自Y和S；其中X4选自Y和S；其中X5选自Y和S；和其中X6选自Y和S；和

(iii)CDRH3，包括氨基酸序列：

X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13-X14-X15-X16-X17-X18-X19-D-Y(SEQ ID NO：____)，其中依照Kabat编号体系，X1是位置95，和其中X1-X6各个位置上的氨基酸选自摩尔比为50％Y、25％S和25％G的氨基酸集合；其中X7-X17各个位置上的氨基酸选自摩尔比为50％Y、25％S和25％G的氨基酸集合，或不存在；其中X18选自G和A；和其中X19选自I、M、L和F。

一个方面，该方法进一步包括：

(b)制备大量多肽，该多肽包括：

(i)CDRL1，包括第一共有高变序列或其变体，与相应的共有的高变序列相比，该变体在一个或多个位置上包括取代；

(ii)CDRL2，包括第二共有高变序列或其变体，与相应的共有的高变序列相比，该变体在一个或多个位置上包括取代；和

(iii)CDRL3，包括氨基酸序列：Q-Q-X1-X2-X3-X4-P-X5-T(SEQ IDNO：____)，其中依照Kabat编号体系，X1是位置91，和其中X1选自Y和S，其中X2选自Y和S；其中X3选自Y和S；其中X4选自Y和S；和其中X5选自Y和S。

一个方面，大量多肽是由大量多核苷酸编码的。

(a)制备大量多肽，该多肽包括：

(ii)CDRH2，包括氨基酸序列：

(iii)CDRH3，包括氨基酸序列：

X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13-X14-X15-X16-X17-X18-X19-D-Y(SEQ ID NO：____)，其中依照Kabat编号体系，X1是位置95，和其中X1-X6各个位置上的氨基酸选自摩尔比为25％Y、50％S和25％R的氨基酸集合；其中X7-X17各个位置上的氨基酸选自摩尔比为25％Y、50％S和25％R的氨基酸集合；其中X18选自G和A；和其中X19选自I、M、L和F。

一个方面，该方法进一步包括：

(b)制备大量多肽，该多肽包括：

一个方面，大量多肽是由大量多核苷酸编码的。

(a)制备大量多肽，该多肽包括：

(ii)CDRH2，包括氨基酸序列：

(iii)CDRH3，包括氨基酸序列：

X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13-X14-X15-X16-X17-X18-X19-D-Y(SEQ ID NO：____)，其中依照Kabat编号体系，X1是位置95，和其中X1-X6各个位置上的氨基酸选自摩尔比为38％Y、25％S、25％G和12％R的氨基酸集合；其中X7-X17各个位置上的氨基酸选自摩尔比为38％Y、25％S、25％G和12％R的氨基酸集合，或不存在；其中X18选自G和A；和其中X19选自I、M、L和F。

一个方面，该方法进一步包括：

(b)制备大量多肽，该多肽包括：

(i)CDRL1，包括第一共有高变序列或其变体，与相应的共有高变序列相比，该变体在一个或多个位置上包括取代；

(ii)CDRL2，包括第二共有高变序列或其变体，与相应的共有高变序列相比，该变体在一个或多个位置上包括取代；和

一个方面，大量多肽是由大量多核苷酸编码的。

(a)制备大量多肽，该多肽包括：

(ii)CDRH2，包括氨基酸序列：

(iii)CDRH3，包括氨基酸序列：

X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13-X14-X15-X16-X17-X18-X19-D-Y(SEQ ID NO：____)，其中依照Kabat编号体系，X1是位置95，和其中X1-X6各个位置上的氨基酸选自摩尔比为20％Y、26％S、26％G、13％R、1％A、1％D、1％E、1％F、1％H、1％I、1％K、1％L、1％M、1％N、1％P、1％Q、1％T、1％V和1％W的氨基酸集合；其中X7-X17各个位置上的氨基酸选自摩尔比为20％Y、26％S、26％G、13％R、1％A、1％D、1％E、1％F、1％H、1％I、1％K、1％L、1％M、1％N、1％P、1％Q、1％T、1％V和1％W的氨基酸集合，或不存在；其中X18选自G和A；和其中X19选自I、M、L和F。

一个方面，该方法进一步包括：

(b)制备大量多肽，该多肽包括：

(i)CDRL1，包括第一共有高变序列或其变体，与相应的共有高变序列相比该变体，在一个或多个位置上包括取代；

一个方面，第一共有高变序列包括Kabat共有CDRL1序列。在这样一个方面，第一共有高变序列是R-A-S-Q-D-V-N-T-A-V-A(SEQ ID NO：29)。一个方面，第二共有高变序列包括Kabat共有CDRL2序列。在这样一个方面，第二共有高变序列是S-A-S-S-L-Y-S(SEQ ID NO：30)。一个方面，大量多肽是由大量多核苷酸编码的。

在一个具体实施方案中，提供制备包括大量多肽的组合物的方法，包括：

(a)制备大量多肽，该多肽包括：

(i)CDRH1，包括氨基酸序列G-F-X1-I-X2-X3-X4-X5-I-H(SEQ ID NO：22)，其中依照Kabat编号体系，G是位置26和X1是位置28；其中X1选自Y和S；其中X2选自Y和S；其中X3选自Y和S；其中X4选自Y和S；和其中X5选自Y和S；

(ii)CDRH2，包括氨基酸序列：

X1-I-X2-P-X3-X4-G-X5-T-X6-Y-A-D-S-V-K-G(SEQ ID NO：23)，其中依照Kabat编号体系，X1是位置50；其中X1选自Y和S；其中X2选自Y和S；其中X3选自Y和S；其中X4选自Y和S；其中X5选自Y和S；和其中X6选自Y和S；和

(iii)CDRH3，包括氨基酸序列：

X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13-X14-X15-X16-X17-X18-X19-D-Y(SEQ ID NO：24)，其中依照Kabat编号体系，X1是位置95，和其中X1选自Y、S、R、G和E；X2选自Y、S、G、R、M和A；X3选自G、Y、S、R、W和H，X4选自Y、S、G、R、F和Q；X5选自G、Y、N、A和S；X6选自F、M、L、A、R、G、H、W、V、Y和S；X7选自M、L、G、A、、R、F、Y和S，或者不存在；X8选自M、L、F、I、、R、G、、P、V、Y和S，或者不存在；X9选自G、Y、R和S，或者不存在；X10选自M、F、G、Y、R和S，或者不存在；X11选自A、G、Y、R、和S，或者不存在；X12选自I、M、L、F、A、G、、R、T、Y和S，或者不存在；X13选自F、M、L、G、A、T、Y和S，或者不存在；X14选自L、F、M、I、G、A、T和Y，或者不存在；X15选自M、Y、G、L和R，或者不存在；X16选自Y和G，或者不存在X17选自R、M和G，或者不存在X18选自P和A，或者不存在；和X19是L，或不存在。

一个方面，CDRH1包括选自SEQ ID NO：189-294的氨基酸序列。一个方面，CDRH2包括选自SEQ ID NO：295-400的氨基酸序列。一个方面，CDRH3包括选自SEQ ID NO：401-506的氨基酸序列。

一个方面，该方法进一步包括：

(b)制备大量多肽，该多肽包括：

(iii)CDRL3，包括氨基酸序列：Q-Q-X1-X2-X3-X4-P-X5-T(SEQ IDNO：25)，其中依照Kabat编号体系，X1是位置91，和其中X1选自Y和S，其中X2选自Y和S；其中X3选自Y和S；其中X4选自Y和S；和其中X5选自Y和S。

一个方面，大量多肽是由大量多核苷酸编码的。

(a)制备大量多肽，该多肽包括：

(ii)CDRH2，包括氨基酸序列：

(iii)CDRH3，包括氨基酸序列：

X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13-X14-X15-X16-X17-X18-X19-D-Y(SEQ ID NO：____)，其中依照Kabat编号体系，X1是位置95，和其中X1-X17各个位置上的氨基酸选自S，以及A、C、F、G、I、L、N、P、R、T、W或Y之一，或不存在；其中X18选自G和A；和其中X19选自F、L、I和M。

一个方面，该方法进一步包括：

(b)制备大量多肽，该多肽包括：

(a)制备大量多肽，该多肽包括：

(i)CDRH1，包括氨基酸序列G-F-X1-I-X2-X3-X4-X5-I-H(SEQ ID NO：____)，其中依照Kabat编号体系，G是位置26和X1是位置28；其中X1-X5各个位置上的氨基酸选自S，以及Y、W、R或F之一；

(ii)CDRH2，包括氨基酸序列：

X1-I-X2-P-X3-X4-G-X5-T-X6-Y-A-D-S-V-K-G(SEQ ID NO：____)，其中依照Kabat编号体系，X1是位置50；其中X1-X6各个位置上的氨基酸选自S，以及Y、W、R或F之一；和

(iii)CDRH3，包括氨基酸序列：

X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13-X14-X15-X16-X17-X18-X19(SEQ ID NO：____)，其中依照Kabat编号体系，X1是位置95，和其中X1-X17各个位置上的氨基酸选自S，以及Y、W、R或F之一，或不存在；其中X18选自G和A；和其中X19选自F、L、I和M。

一个方面，该方法进一步包括：

(b)制备大量多肽，该多肽包括：

(iii)CDRL3，包括氨基酸序列：Q-Q-X1-X2-X3-X4-P-X5-T(SEQ IDNO：____)，其中依照Kabat编号体系，X1是位置91，和其中X1-X5各个位置上的氨基酸选自S，以及Y、W、R或F之一。

在一个具体实施方案中，提供制备上述CDRH1、CDRH2、CDRH3、CDRL1、CDRL2和CDRL3序列中的一种或多种的方法，包括：

(a)构建包含多核苷酸序列的表达载体，该多核苷酸编码来源抗体的轻链可变区、重链可变区，或者轻链可变区和重链可变区两者，包括选自由CDRL1、CDRL2、CDRL3、CDRH1、CDRH2和CDRH3组成的组的至少1个、2个、3个、4个、5个或全部的来源抗体CDR；和

(b)突变至少1个、2个、3个、4个、5个或全部的来源抗体CDR，以生成一个或多个上述高变区。

在一个具体实施方案中，提供选择结合靶标抗原的多肽的方法，包括：

(a)制备具有大量一种或多种上述多肽的组合物；

(b)从组合物中选择一种或多种结合靶标抗原的多肽；

(c)将一种或多种结合靶标抗原的多肽与不结合靶标抗原的多肽分离开；和

(d)确定一种或多种对靶标抗原具有期望的亲合力的结合靶标抗原的多肽。

在一个具体实施方案中，提供从抗体可变区文库中选择结合靶标抗原的一种抗原结合可变区的方法，包括：

(a)将一种或多种上述文库与靶标抗原接触；

(b)将一种或多种特异性结合靶标抗原的多肽与不特异性结合靶标抗原的多肽分离开，收集一种或多种特异性结合靶标抗原的多肽，和在一系列溶液中温育一种或多种特异性结合靶标抗原的多肽，该系列溶液包括浓度从约0.1nM-约1000nM渐减的靶标抗原；和

(c)选择一种或多种特异性结合靶标抗原的多肽，该多肽能够结合最低浓度的靶标抗原或者具有约0.1nM-约200nM的亲合力。

一个方面，靶标抗原是HER2或DR5。一个方面，靶标抗原的浓度约100-250nM。一个方面，靶标抗原的浓度约25-100nM。在一些具体实施方案中，一种或多种文库，克隆或多肽用一组包含靶标抗原的抗原筛选。在一些具体实施方案中，选择特异性结合靶标抗原而基本上不与平板上的其它抗原的任何一种发生交叉反应的那些克隆或多肽。该组抗原包括至少三种和多达100种不同的抗原。在某些情形下，该组抗原包括3-100种、3-50种、3-25种，或者3-10种不同抗原。

在一个具体实施方案中，提供从多肽文库中筛选结合靶标抗原的多肽的方法，包括：

(a)在适合结合的条件下，将包括大量任何上述多肽的文库与被固定的靶标抗原接触，分离一种或多种特异性结合靶标抗原的多肽；

(b)将一种或多种特异性结合靶标抗原的多肽与不特异性结合靶标抗原的多肽分离开，收集一种或多种特异性结合靶标抗原的多肽，获得富含一种或多种特异性结合靶标抗原的多肽的亚组；和

(c)可选择地，至少重复步骤(a)-(b)两次，每次重复使用从前一轮选择中获得的富含一种或多种特异性结合靶标抗原的多肽的亚组。

一个方面，该方法进一步包括：

(d)在适合结合的条件下，用浓度范围在约0.1nM到约1000nM的被标记的靶标抗原与所述亚组一起孵育，形成混合物；

(e)将所述混合物与能结合靶标抗原上的标记的固定试剂接触；

(f)检测一种或多种特异性结合被标记的靶标抗原的多肽，和从被标记的抗原中收集一种或多种特异性结合被标记的靶标抗原的多肽；和

(g)可选择地，至少重复步骤(d)-(f)两次，每次重复使用从前一轮选择中获得的富含一种或多种特异性结合被标记的靶标抗原的多肽的亚组，并使用浓度低于前一轮选择的被标记的靶标抗原。

一个方面，该方法进一步包括往混合物中添加过量的未被标记的靶标抗原，和温育该混合物一段时间，该时间足以收集一种或多种以低亲合力特异性结合靶标抗原的多肽。在一些具体实施方案中，在任何一种本说明书描述的方法中，文库、克隆或多肽的一种或多种用包括靶标抗原的一组抗原筛选。在一些具体实施方案中，筛选那些特异性结合靶标抗原而基本上不与组内的其它抗原的任何一种发生交叉反应的克隆或多肽。该组抗原包括至少3种和多达100种不同抗原。在某些情形下，该组抗原包括3-100种、3-50种、3-25种，或者3-10种不同抗原。

在一个具体实施方案中，提供分离一种或多种以高亲合力特异性结合靶标抗原的多肽的方法，包括：

(a)将包括大量任何上述多肽的文库与浓度至少约0.1nM到约1000nM的靶标抗原接触，以分离一种或多种特异性结合靶标抗原的多肽；

(b)从靶标抗原中收集一种或多种特异性结合靶标抗原的多肽，获得富含一种或多种特异性结合靶标抗原的多肽的亚组；和

(c)可选择地，至少重复步骤(a)-(b)两次，每次重复使用从前一轮选择中获得的富含一种或多种特异性结合靶标抗原的多肽的亚组，使用浓度低于前一轮选择的靶标抗原，分离一种或多种在最低靶标抗原浓度下特异性结合靶标抗原的多肽。

在一个具体实施方案中，提供从包括大量任何上述多肽的文库中选择一种或多种结合靶标抗原的多肽的分析方法，包括：

(a)在适合在被标记的靶标抗原和一种或多种特异性结合靶标抗原的多肽形成一种或多种复合物的条件下，将文库与浓度至少约0.1nM到约1000nM的被标记的靶标抗原接触；

(b)从被标记的靶标抗原中分离一种或多种复合物和分离一种或多种特异性结合靶标抗原的多肽，获得富含一种或多种特异性结合靶标抗原的多肽的亚组；和

(c)可选择地，至少重复步骤(a)-(b)两次，每次使用从前一轮选择中获得的亚组，使用浓度低于前一轮选择的靶标抗原。

一个方面，该分析方法进一步包括往一种或多种复合物中添加过量的未被标记的靶标抗原。一个方面，重复步骤(a)和(b)两次，其中第一轮选择中的靶标抗原的浓度约100nM到约250nM，其中第二轮选择中的靶标抗原的浓度约25nM约100nM，和其中第三轮选择中的靶标抗原的浓度约0.1nM到约25nM。

在一个具体实施方案中，提供筛选包含大量任何上述多肽的文库的方法，包括：

(a)在适合多肽结合到靶标抗原上的条件下，用靶标抗原温育第一文库样本；

(b)在缺乏靶标抗原时，温育第二文库样本；

(c)在适合多肽结合到固定的靶标抗原上的条件下，将第一样本和第二样本各自与固定的靶标抗原接触；

(d)检测各个样本中结合到固定的靶标抗原上的多肽；和

(e)计算来自第一样本的结合多肽的量与来自第二样本的结合多肽的量的比率，确定多肽对靶标抗原的亲合力。

一个方面，靶标抗原是DR5或HRR-2。一个方面，靶标抗原的浓度约100到约250nM。一个方面，靶标抗原的浓度约25到约100nM。在一些具体实施方案中，文库、克隆或多肽的一种或多种用包括靶标抗原的一组抗原筛选。在一些具体实施方案中，筛选那些特异性结合靶标抗原而基本上不与组内的其它抗原的任何一种发生交叉反应的克隆或多肽。该组抗原包括至少3种和多达100种不同抗原。在某些情形下，该组抗原包括3-100种、3-50种、3-25种，或者3-10种不同抗原。

在一个具体实施方案中，一种或多种上述多肽特异性结合人DR5。一个方面，多肽是特异性结合人DR5的抗体。在一个方面，抗体包括4D5抗体的框架区。在一个方面，抗体包括4D5抗体变体的框架区。在一个方面，抗体是一种单克隆抗体。在一个方面，抗体是一种双特异性抗体。在一个方面，抗体是一种合成抗体。

在一个具体实施方案中，抗DR5的抗体包括免疫球蛋白重链可变区，其中：(i)CDRH1包括氨基酸序列G-F-X1-I-X2-X3-X4-X5-I-H(SEQ ID NO：22)，其中依照Kabat编号体系，G是位置26而X1是位置28；其中X1选自S和Y；其中X2选自Y和S；其中X3选自Y和S；其中X4选自Y和S；和其中X5选自Y和S；(ii)CDRH2包括氨基酸序列：

X1-I-X2-P-X3-X4-G-X5-T-X6-Y-A-D-S-V-K-G(SEQ ID NO：23)，其中依照Kabat编号体系，X1是位置50；其中X1选自Y和S；其中X2选自Y和S；其中X3选自Y和S；其中X4选自Y和S；其中X5选自Y和S；和其中X6选自Y和S；和(iii)CDRH3包括氨基酸序列：

X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13-X14-X15-X16-D-Y(SEQID NO：31)，其中依照Kabat编号体系，X1是位置95，和其中X1选自R、Y和M；X2选自Y和R；X3选自Y、S、R、P和G，X4选自Y和S；X5选自Y、S、R和H；X6选自R、Y和S；X7选自G、Y和S；X8选自R、Y和S；X9选自G、Y和S；X10选自R、Y和S；X11选自G、Y和S；X12选自S、Y、R、G和A；X13选自G和Y；X14选自L、M、R、G和A；和X15选自G、F和L，或者不存在；和X16是F，或者不存在。

在另一个具体实施方案中，抗DR5的抗体包括免疫球蛋白重链可变区，其中：(i)CDRH1包括氨基酸序列G-F-X1-I-X2-X3-X4-X5-I-H(SEQ ID NO：22)，其中依照Kabat编号体系，G是位置26和X1是位置28；其中X1选自Y和S；其中X2选自Y和S；其中X3选自Y和S；其中X4选自Y和S；和其中X5选自Y和S；(ii)CDRH2包括氨基酸序列：

在另一个具体实施方案中，抗DR5的抗体包括免疫球蛋白重链可变区，其中：

(i)CDRH1包括氨基酸序列G-F-X1-I-X2-X3-X4-X5-I-H(SEQ ID NO：22)，其中依照Kabat编号体系，G是位置26和X1是位置28；其中X1选自Y和S；其中X2选自Y和S；其中X3选自Y和S；其中X4选自Y和S；和其中X5选自Y和S；(ii)CDRH2包括氨基酸序列：

在一些具体实施方案中，抗DR5的抗体包括CDRH1，该CDRH1包括选自图15中所示的SEQ ID NO：524-540的任何一种的氨基酸序列。抗DR5的抗体还包含CDRH2，该CDRH2包括选自图15中所示的SEQ ID NO：541-557的任何一种的氨基酸序列。抗DR5的抗体还包含CDRH3，该CDRH3包括选自图15中所示的SEQ ID NO：558-574的任何一种的氨基酸序列。一个方面，特异性结合人DR5的抗体包括与图15中Fabs 1-17的任何一种所示的CDRH1、CDRH2、CDRH3和CDRL3序列相对应的CDRH1、CDRH2、CDRH3和CDRL3序列。

在一些具体实施方案中，抗DR5的抗体包括CDRH3，其中氨基酸位置X1是位置95，并选自R和Y；X3是位置97，并且为S；X8是氨基酸位置100b，并且为S；X9是氨基酸位置100c，并且为Y；和X10是氨基酸位置100d，并且为Y或R。在一个具体实施方案中，CDRH3包括氨基酸序列X1-R-S-Y-R-Y-G-S-Y-X10-G-S-Y-X14-F-D-Y(SEQ ID NO：575)。在一个特定的具体实施方案中，抗DR5的抗体包括重链可变区，其包括：i)包括氨基酸序列GFYISSSSIH的CDRH1(SEQ ID NO：576)；ii)包括氨基酸序列SISPSSGSTYYADSVKG的CDRH2(SEQ ID NO：577)；和iii)包括氨基酸序列YRSYRYGSYYGSYGFDY的CDRH3(SEQ ID NO：578)。在另一个特定的具体实施方案中，抗DR5的抗体包括重链可变区，其包括：i)包括氨基酸序列GFYIYSSSIH的CDRH1(SEQ ID NO：579)；ii)包括氨基酸序列SISPSSGYTSYADSVKG的CDRH2(SEQ ID NO：580)；和iii)包括氨基酸序列RRSYRYGSYRGSYAFDY的CDRH3(SEQ ID NO：581)。

在一些具体实施方案中，抗DR5的抗体包括CDRH1，该CDRH1包括氨基酸序列GFXIIX2SSSIH(SEQ ID NO：598)，X1和X2是Y或S，在其它具体实施方案中，抗DR5的抗体包括CDRH2，其包括氨基酸序列X1ISPX3X4GYTX6YADSKVG(SEQ ID NO：599)并且其中X1、X3、X4和X6是Y或S。在另一个具体实施方案中，抗DR5的抗体包括CDRH3，该CDRH3包括氨基酸序列YRX3YRYGX8X9X10GSYX14X15DY(SEQ ID NO：596)，其中X3选自Y、S、R、P和G；X8选自R、Y和S；X9选自G、Y和S；X10选自S、Y和R；X14选自G和A；和X15选自L和F。

在一些具体实施方案中，抗DR5的抗体以1-20nM的IC₅₀结合人DR5。在其它具体实施方案中，抗DR5的抗体结合人DR5和小鼠DR5。

抗DR5的抗体可选择地进一步包含轻链可变区，其中(i)CDRL3包括氨基酸序列Q-Q-X1-X2-X3-X4-P-X5-T(SEQ ID NO：25)；其中X1是位置91，并选自Y、H和S；X2选自Y和S；X3选自Y、S和T；X4选自Y、S和T；和X5选自S、P和Y。抗DR5的抗体还可选择地包含轻链可变区，其中CDRL3包括氨基酸序列QQXIX2X3SPST(SEQ ID NO：597)，其中X1、X2和X3是Y或S。轻链可变区可进一步包含CDRL3，该CDRL3包括选自由图15中所示的SEQ ID NO：507-523组成的组的氨基酸序列。所述抗体还可进一步包含CDRL1，该CDRL1包括氨基酸序列RASQDVNTAVA(SEQ ID NO：29)。所述抗体还可进一步包含CDRL2，该CDRL2包括氨基酸序列SASSLYS(SEQ ID NO：30)。

一个方面，筛选特异于DR5的抗体的激动剂活性或拮抗剂活性。可以在DR5受体信号转导分析中进行筛选这种抗体，例如本说明书中描述的凋亡分析。与对照相比，激动剂抗体增加凋亡，而拮抗剂抗体降低凋亡。

在一个具体实施方案中，提供编码上述特异性结合人DR5的抗体的任何一种的分离多核苷酸。在一个具体实施方案中，提供包括编码上述特异性结合人DR5的抗体的任何一种的分离多核苷酸的载体。在一个具体实施方案中，提供用载体转化的宿主细胞，该载体包括编码上述特异性结合人DR5的抗体的任何一种的分离多核苷酸。在一个具体实施方案中，提供制备抗体的方法，包括培养用载体转化的宿主细胞，该载体包括编码上述特异性结合人DR5的抗体的任何一种的分离多核苷酸。一个方面，该方法进一步包括从宿主细胞培养物中收集抗体。一个方面，该方法进一步包括从宿主细胞的培养液中收集抗体。

在一个具体实施方案中，提供用一种或多种特异性结合人DR5的上述抗体治疗需要该治疗的哺乳动物中的异常血管生成相关紊乱病症的方法，包括给哺乳动物施用一种或多种抗体的步骤。在一些具体实施方案中，抑制凋亡的DR5抗体可以用于期望抑制细胞死亡的状况中(例如黄斑变性(macular degeneration))。一个方面，紊乱病症是癌症。在一些具体实施方案中，抗DR5的抗体增加凋亡。在一个这种方面，所述癌症选自乳腺癌、结肠癌、非小细胞肺癌、非何杰金淋巴瘤(non-Hodgkins limphoma，NHL)、肾癌(renal cancer)、前列腺癌、肝癌(liver cancer)、头颈部的癌症(head and neckcancer)、黑素瘤、卵巢癌、间皮瘤(mesothelioma)和多发性骨髓瘤(multiplemyeloma)。另一个方面，该治疗进一步包括与抗体一起同时或序贯给予第二种治疗剂的步骤。在一个这种方面，第二种治疗剂选自抗血管生成剂、抗肿瘤剂(anti-neoplastic agent)、化疗剂和细胞毒性剂。

在一个具体实施方案中，提供治疗患有炎症或免疫紊乱病症或者存在发展为炎症或免疫紊乱病症的风险的哺乳动物的方法，包括给哺乳动物施用一种或多种特异性结合人DR5的上述抗体的一种或多种Fab的步骤。一个方面，炎症或免疫紊乱病症是风湿性关节炎。在一些具体实施方案中，抗DR5的抗体增强凋亡。

本说明书描述的方法还用于分离抗HER-2的抗体。在一个具体实施方案中，抗HER-2的抗体包括免疫球蛋白重链可变区，其中(i)CDRH1包括氨基酸序列G-F-X1-I-X2-X3-X4-X5-I-H(SEQ ID NO：22)，其中依照Kabat编号体系，X1是位置28，并选自Y和S；X2选自Y和S；X3选自Y和S；X4选自Y和S；和X5选自Y和S；(ii)CDRH2包括氨基酸序列：

X1-I-X2-P-X3-X4-G-X5-T-X6-Y-A-D-S-V-K-G(SEQ ID NO：23)，其中依照Kabat编号体系，X1是位置50，并选自Y和S；X2选自Y和S；X3选自Y和S；X4选自Y和S；X5选自Y和S；和X6选自Y和S；和(iii)CDRH3包括氨基酸序列X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-D-Y(SEQ ID NO：582)，其中按照Kabat编号，X1是氨基酸位置95并选自Y和R；X2选自Y、S和R；X3选自S、G、Y和H；X4选自S、G、Y和R；X5选自G和A；X6选自F、M、L和A；和X7选自F、M和L，或者缺失。

在另一个具体实施方案中，抗HER-2的抗体包括免疫球蛋白重链可变区，其中(i)CDRH1包括氨基酸序列G-F-X1-I-X2-X3-X4-X5-I-H(SEQ IDNO：22)；其中依照Kabat编号体系，X1是位置28，并选自S和Y；X2选自S和Y；X3选自S和Y；X4选自S和Y；和X5选自S和Y；(ii)CDRH2包括氨基酸序列：X1-I-X2-P-X3-X4-G-X5-T-X6-Y-A-D-S-V-K-G(SEQ ID NO：23)，其中依照Kabat编号体系，X1是位置50，并选自S和Y；X2选自S和Y；X3选自S和Y；X4选自S和Y；X5选自S和Y；和X6选自S和Y；和(iii)CDRH3包括氨基酸序列X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-D-Y(SEQ ID NO：583)，其中按照Kabat编号，X1是氨基酸位置95，并选自Y、S和G；X2选自Y、S、G、R、A和M；X3选自G、Y、S和R；X4选自G、Y和F；X5选自Y、S、N和G；X6选自Y、R、H和W；X7选自G和A；和X8选自F、M、L和I。

在另一个具体实施方案中，抗HER-2的抗体包括免疫球蛋白重链可变区，其中(i)CDRH1包括氨基酸序列G-F-X1-I-X2-X3-X4-X5-I-H(SEQ IDNO：22)；其中依照Kabat编号体系，X1是位置28，并选自S和Y；X2选自S和Y；X3选自S和Y；X4选自S和Y；和X5选自S和Y；(ii)CDRH2包括氨基酸序列：X1-I-X2-P-X3-X4-G-X5-T-X6-Y-A-D-S-V-K-G(SEQ ID NO：23)，其中依照Kabat编号体系，X1是位置50，并选自S和Y；X2选自S和Y；X3选自S和Y；X4选自S和Y；X5选自S和Y；和X6选自S和Y；和(iii)CDRH3包括氨基酸序列

在还有另一个具体实施方案种，抗HER-2的抗体包括免疫球蛋白重链可变区，其中：(i)CDRH1包括氨基酸序列G-F-X1-I-X2-X3-X4-X5-I-H(SEQID NO：22)，其中依照Kabat编号体系，G是位置26和X1是位置28；其中X1选自Y和S；其中X2选自Y和S；其中X3选自Y和S；其中X4选自Y和S；和其中X5选自Y和S；(ii)CDRH2包括氨基酸序列：

X1-I-X2-P-X3-X4-G-X5-T-X6-Y-A-D-S-V-K-G(SEQ ID NO：23)，其中依照Kabat编号体系，X1是位置50；其中X1选自Y和S；其中X2选自Y和S；其中X3选自Y和S；其中X4选自Y和S；其中X5选自Y和S；和其中X6选自Y和S；以及(iii)CDRH3包括氨基酸序列：

在还有另一个具体实施方案中，抗HER-2抗体包含免疫球蛋白重链可变区，其中：(i)CDRH1包括氨基酸序列G-F-X1-I-X2-X3-X4-X5-I-H(SEQID NO：22)，其中依照Kabat编号体系，G是位置26和X1是位置28；其中X1选自Y和S；其中X2选自Y和S；其中X3选自Y和S；其中X4选自Y和S；和其中X5选自Y和S；(ii)CDRH2包括氨基酸序列：

在还有另一个具体实施方案中，抗HER-2的抗体包括免疫球蛋白重链可变区，其中：(i)CDRH1包括氨基酸序列G-F-X1-I-X2-X3-X4-X5-I-H(SEQID NO：22)，其中依照Kabat编号体系，G是位置26和X1是位置28；其中X1选自Y和S；其中X2选自Y和S；其中X3选自Y和S；其中X4选自Y和S；和其中X5选自Y和S；(ii)CDRH2包括氨基酸序列：

在另一个具体实施方案中，抗HER-2的抗体包括免疫球蛋白重链可变区，其中：

在另一个具体实施方案中，抗HER-2的抗体包括免疫球蛋白重链可变区，其中：(i)CDRH1包括氨基酸序列G-F-X1-I-X2-X3-X4-X5-I-H(SEQ IDNO：22)，其中依照Kabat编号体系，G是位置26和X1是位置28；其中X1选自Y和S；其中X2选自Y和S；其中X3选自Y和S；其中X4选自Y和S；和其中X5选自Y和S；(ii)CDRH2包括氨基酸序列：

X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13-X14-X15-X16-X17-X18-X19(SEQ ID NO：____)，其中依照Kabat编号体系，X1是位置95，和其中X1-X19的各个位置上的氨基酸选自S，以及A、C、F、G、I、L、N、P、R、T、W或Y之一，或不存在；其中X18选自G和A；和其中X19选自F、L、I和M，或者不存在。

在另一个具体实施方案中，抗HER-2的抗体包括免疫球蛋白重链可变区，其中：(i)CDRH1包括氨基酸序列G-F-X1-I-X2-X3-X4-X5-I-H(SEQID NO：22)，其中依照Kabat编号体系，G是位置26和X1是位置28；其中X1选自Y和S；其中X2选自Y和S；其中X3选自Y和S；其中X4选自Y和S；和其中X5选自Y和S；(ii)CDRH2包括氨基酸序列：

X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13-X14-X15-X16-X17-X18-X19(SEQ ID NO：____)，其中依照Kabat编号体系，X1是位置95，和其中X1-X19的各个位置上的氨基酸选自S，以及Y、W、R或F之一，或不存在；其中X18选自G和A；和其中X19选自F、L、I和M。

在一些具体实施方案中，抗HER-2的抗体包含CDRH1，该CDRH1包括选自由图11中所示的SEQ ID NO：189-294组成的组的氨基酸序列。抗HER-2的抗体包含CDRH2，该CDRH2包括选自由图11中所示的SEQ ID NO：295-400组成的组的氨基酸序列。抗HER-2的抗体包含CDRH3，该CDRH3包括选自由图11中所示的SEQ ID NO：401-506组成的组的氨基酸序列。在一些具体实施方案中，抗HER-2的抗体可以包含CDRH1，该CDRH1包括选自由图21A中所示的SEQ ID NO：816-842组成的组的氨基酸序列。抗HER-2的抗体可以包含CDRH2，该CDRH2包括选自由图21A中所示的SEQ ID NO：843-869组成的组的氨基酸序列。抗HER-2的抗体可以包含CDRH3，该CDRH3包括选自由图21A中所示的SEQ ID NO：870-896组成的组的氨基酸序列。在一些具体实施方案中，抗HER-2的抗体可以包含CDRH1，该CDRH1包括选自由图24A中所示的SEQ ID NO：924-950组成的组的氨基酸序列。抗HER-2的抗体可以包含CDRH2，该CDRH2包括选自由图24A中所示的SEQID NO：951-977组成的组的氨基酸序列。抗HER-2的抗体可以包含CDRH3，该CDRH3包括选自由图24A中所示的SEQ ID NO：978-1004组成的组的氨基酸序列。

一个方面，特异性结合人HER2的抗体包括与图11中的Fab1-106的任何一种所示的CDRH1、CDRH2、CDRH3和CDRL3序列相对应的CDRH1、CDRH2、CDRH3和CDRL3序列。一个方面，特异性结合人HER2的抗体包括与图21A中的克隆B1-B28的任何一种所示的CDRH1、CDRH2、CDRH3和CDRL3序列相对于的CDRH1、CDRH2、CDRH3和CDRL3序列。另一个方面，特异性结合人HER2的抗体包括与图24A中的克隆G29-G61的任何一种所示的CDRH1、CDRH2、CDRH3和CDRL3序列相对于的CDRH1、CDRH2、CDRH3和CDRL3序列。

在一些具体实施方案中，抗HER-2的抗体包括CDRH1，该CDRH1包括氨基酸序列GFSIX2X3SYIH(SEQ ID NO：588)，其中X2和X3是Y或S。抗HER-2的抗体还包含CDRH2，该CDRH2包括氨基酸序列SIYPX3SGYTSYADSKVG(SEQ ID NO：589)，其中X3是Y或S。抗HER-2的抗体可进一步包含轻链可变区，该可变区包括CDRL3，该CDRL3包括氨基酸序列QQSYYX4PST(SEQ ID NO：587)，其中X4是Y或S。

在一些具体实施方案中，抗HER-2的抗体包括氨基酸序列GFX1ISYSSIH(SEQ ID NO：590)，其中X1是Y或S。抗HER-2的抗体可进一步包含CDRH2，该CDRH2包括氨基酸序列SIYPX3YGX5TX6YADSKVG(SEQ ID NO：591)，其中X3、X5和X6是Y或S。

在另一个具体实施方案中，抗HER-2的抗体包括CDRH1，该CDRH1具有氨基酸序列GFXIISSSSIH(SEQ ID NO：593)，其中X1是Y或S。抗HER-2的抗体可进一步包含CDRH2，该CDRH2具有氨基酸序列X1IX2PSSGYTX6YADSKVG(SEQ ID NO：594)，其中X1、X2和X6是Y或S。抗HER-2的抗体可进一步包含CDRH3，该CDRH3具有氨基酸序列XIX2X3X4YYSYYX10GX12X13X14DY(SEQ ID NO：592)，其中X1选自Y、S和R；X2选自Y和S；X3选自G、Y和S；X4选自G、Y和S；X4选自Y、S、R和G；X10选自Y、S和G；X12选自Y、S、G和R；X13选自G和A，X14选自I、F、M和L。

在一些具体实施方案中，抗HER-2的抗体可选择地进一步包含轻链可变区，该轻链可变区包括CDRL3序列，其中该CDRL3包括氨基酸序列Q-Q-X1-X2-X3-X4-P-X5-T(SEQ ID NO：25)，其中按照Kabat编号，X1是位置91，并选自S和Y；X2选自S、Y和F；X3选自Y、S和F；X4选自Y和S；X5选自S和Y。所述轻链可变区可进一步包含CDRL3，该CDRL3包括选自由图11中所示的SEQ ID NO：83-188，图21A中所示的SEQ ID NO：789-815和图24A中的SEQ ID NO：897-923组成的组的氨基酸序列。抗体还可进一步包含CDRL1，该CDRL1包括氨基酸序列RASQDVNTAVA(SEQ ID NO：29)。抗体还可进一步包含CDRL2，该CDRL2包括氨基酸序列SASSLYS(SEQID NO：30)。

一个方面，多肽是一种特异性结合HER2的抗体。在一个这种方面，抗体包括4D5抗体的框架区。在一个这种方面，抗体包括4D5抗体变体的框架区。在一个这种方面，抗体是一种单克隆抗体。在一个这种方面，抗体是一种双特异性抗体。

在一个具体实施方案中，提供编码上述特异性结合HER2的抗体的任何一种的分离多核苷酸。在一个具体实施方案中，提供包括编码上述特异性结合HER2的抗体的任何一种的分离多核苷酸的载体。在一个具体实施方案中，提供用载体转化的宿主细胞，该载体包括编码上述特异性结合HER2的抗体的任何一种的分离多核苷酸。在一个具体实施方案中，提供制备一种抗体的方法，包括培养用包括编码上述特异性结合HER2的抗体的任何一种的分离多核苷酸的载体转化的宿主细胞，表达该多核苷酸。一个方面，该方法进一步包括从宿主细胞培养物中收集抗体。一个方面，该方法进一步包括从宿主细胞培养液中收集抗体。

在一个具体实施方案中，使用一种或多种上述特异性结合HER2的抗体治疗HER2相关紊乱病症的方法，包括给哺乳动物施用一种或多种抗体的步骤。另一个方面，该治疗进一步包括与抗体一起同时或序贯给予第二种治疗剂的步骤。在一个这种方面，第二种治疗剂选自抗血管生成剂、抗肿瘤剂、化疗剂和细胞毒性剂。

在一个具体实施方案中，提供治疗患有HER2相关紊乱病症或者存在发展为HER2相关紊乱病症的风险的哺乳动物的方法，包括给哺乳动物施用一种或多种特异性结合HER2的上述抗体的一种或多种Fab的步骤。在一个具体实施方案中，一种或多种上述多肽特异性结合HER2。

一个方面，本发明的多肽包括重链和轻链的抗体可变区的至少一种或者两者，其中抗体可变区包括1个、2个或3个本说明书描述的变体CDR(例如，如前面所述)。

在一些具体实施方案中，本发明的多肽(特别是那些包括抗体可变区的多肽)进一步包括抗体的框架序列，例如，对应于变体CDR的抗体可变区的FR1、FR2、FR3和/或FR4，该FR序列从单个抗体模板获得。在一个具体实施方案中，FR序列是从人抗体获得。在一个具体实施方案中，FR序列是从人共有序列(例如，亚组III共有序列)获得。在一个具体实施方案中，框架序列包含本说明书描述的被修饰的共有序列(例如，在重链的位置49、71、93和/或94，和/或轻链的位置66上包括修饰)。在一个具体实施方案中，框架区具有来自野生型人源化抗体4D5-8的轻链和重链的框架区的序列(示于图16(分别为SEQ ID NO：6-9和10-13))。在一个具体实施方案中，框架区具有突变模式的人源化抗体4D5-8的轻链和重链的框架区的序列，其中轻链的位置66被修饰，而重链在位置71、73和78上被修饰(示于图17中(SEQID NO：14-17和18-21))。

在一些具体实施方案中，本发明的多肽包括轻链和重链的抗体可变区，其中轻链可变区包括至少1个、2个或3个选自由CDR L1、L2和L3组成的组的变体CDR，而重链可变区包括至少1个、2个或3个选自由CDR H1、H2和H3组成的组的变体CDR，

在一些具体实施方案中，本发明的多肽是一种ScFv。在一些具体实施方案中，该多肽是一种Fab片段。在一些具体实施方案中，多肽是一种F(ab)₂或F(ab’)₂。因此，在一些具体实施方案中，本发明的多肽进一步包括二聚化结构域。在一些具体实施方案中，二聚化结构域位于抗体重链或轻链可变区与病毒外壳蛋白的至少一部分之间。二聚化结构域包含二聚化序列，和/或包括一个或多个半胱氨酸残基的序列。所述二聚化结构域可直接或间接地连接到重链可变区或恒定区的C-末端。二聚化结构域的结构是可变的，这取决于抗体可变区是否与病毒外壳蛋白成分一起作为融合蛋白成分而制备(二聚化结构域后无琥珀密码子)，或者抗体可变区作为主要成分制备，而无病毒外壳蛋白成分(例如，二聚化结构域后有琥珀终止密码子)。抗体可变区主要是与病毒外壳蛋白成分一起制备成融合蛋白时，一种或多种二硫键和/或单个二聚化序列被提供用于二价展示。对于抗体可变区作为主要成分制备，而不与病毒外壳蛋白成分融合时(例如有琥珀终止密码子)，虽然不是必须，但是优选具有包含半胱氨酸残基和二聚化序列的二聚化结构域。在一些具体实施方案中，F(ab)₂的重链在二聚化结构域而不包括铰链区发生二聚化。二聚化结构域可包含亮氨酸拉链序列(例如，GCN4序列，如GRMKQLEDKVEELLSKNYHLENEVARLKKLVGERG(SEQ ID NO：3))。

在一些具体实施方案中，本发明的多肽进一步包括融合到轻链可变区上的轻链恒定区，在一些具体实施方案中，该轻链可变区包括至少1个、2个或3个变体CDR。在本发明的多肽的一些具体实施方案中，多肽包括融合到重链可变区上的重链恒定区，在一些具体实施方案中，重链可变区包括至少1个、2个或3个变体CDR。

在一些情形下，优选突变框架残基，使得其相对于参照多肽或来源抗体来说是变异的。例如，重链的框架残基71可以是氨基酸R、V或A。在另一个实施例，重链的框架残基93可以是氨基酸S或A。在还有另一个实施例，重链的框架残基94可以是氨基酸R、K或T，或者由MRT编码。在还有另一个实施例中，重链的框架残基49可以是氨基酸A或G。还可以突变轻链的框架残基。例如，轻链的框架残基66可以是氨基酸R或G。

如本说明书所述，变体CDR(variant CDR)是指与单个参照多肽/来源抗体的相应CDR相比序列发生变化的CDR。因此，在某些具体实施方案中，本发明的多肽的CDR对应于单个参照多肽或来源抗体的CDR套组。本发明的多肽可包含变体CDR的任何一种或其组合。例如，本发明的多肽可包含变体CDRH1和变体CDRH2。本发明的多肽可包含变体CDRH1、变体CDRH2和变体CDRH3。在另一个实施例，本发明的多肽可包含变体CDRH1、变体CDRH2、变体CDRH3和变体CDRL3。在另一个实施例，本发明的多肽可包括变体CDRL1、变体CDRL2和变体CDRL3。本发明的任何多肽进一步可包含变体CDRL3。本发明的任何多肽可进一步包含变体CDRH3。

在一个具体实施方案中，本发明的多肽包括一种或多种在图7、19和22中描述的变体CDR序列。在一个具体实施方案中，本发明的多肽包括一种或多种在图11A中描述的变体CDR序列。在一个具体实施方案中，本发明的多肽包括一种或多种在图15中描述的变体CDR序列。在另一个具体实施方案中，本发明的多肽包括一种或多种在图21A-21B中描述的变体CDR序列。在另一个具体实施方案中，本发明的多肽包括一种或多种在图24A中描述的变体CDR序列。

本发明的多肽可以与另一种多肽复合在一起。例如，本发明提供包括两种多肽的多肽复合物，其中各个多肽是本发明的多肽，和其中所述多肽之一包括变异的CDRH1、CDRH2和CDRH3的至少1个，2个或全部，和其它多肽包括变异的轻链CDR(例如，CDRL3)。多肽复合物可包含第一多肽和第二多肽(其中第一多肽和第二多肽是本发明的多肽)，其中第一多肽包括至少1个、2个或3个变异的轻链CDR，和第二多肽包括至少1个、2个或3个变异的重链CDR。本发明还提供包括相同的变体CDR序列的多肽复合物。复合可以通过任何合适的方法来调节，包括在二聚化/多聚化结构域上发生二聚化/多聚化，例如本说明书中描述的那些方法或者共价相互作用(例如通过二硫键)(其在某种意义上是二聚化结构域的一部分，例如二聚化结构域含有亮氨酸拉链序列和半胱氨酸)。

另一个方面，本发明提供包括本发明的多肽和/或多核苷酸的组合物。例如，本发明提供包括大量本说明书描述的本发明的多肽的任何一种的组合物。所述大量多肽包含由大量多核苷酸编码的多肽，该多核苷酸用一组在编码变异的氨基酸的序列中包括简并性的寡核苷酸制备，其中所述简并性是编码变异的氨基酸的限制性密码子套组的多种密码子序列的简并性。包括本发明多核苷酸或多肽或文库的组合物可以制备成试剂盒或产品的形式(可选择地与使用说明书、缓冲液等一起包装)。

一个方面，本发明提供编码本说明书描述的本发明的多肽的多核苷酸。另一个方面，本发明提供包括编码本发明的多肽的序列的载体。载体可以是例如可复制的表达载体(例如，可复制的表达载体可以是M13、fl、fd、Pf3噬菌体或其衍生物，或者lambdoid噬菌体，例如λ、21、phi80、phi81、82、424、434等，或其衍生物)。载体可包含连接到编码本发明的多肽的序列上的启动子区。启动子可以是任何适合表达多肽的启动子，例如lac Z启动子，碱性磷酸酶pho A启动子(Ap)、噬菌体l_PL启动子(温度敏感型启动子)、tac启动子，色氨酸启动子和噬菌体T7启动子。因此，本发明还提供包括选自前述一种或多种启动子的载体。

按照实施人员的需要和期望，可以任何合适的形式展示本发明的多肽。例如，本发明的多肽可展示在病毒表面，例如，噬菌体或噬菌粒病毒颗粒。因此，本发明提供包括本发明的多肽和/或编码本发明的多肽的多核苷酸的病毒颗粒。

一个方面，本发明提供包括大量本发明的多肽或多核苷酸的群体，其中各类多肽或多核苷酸是本说明书描述的本发明的多肽或多核苷酸。

在一些具体实施方案中，多肽和/或多核苷酸以文库的形式提供，例如，包括至少约1×10⁴、1×10⁵、1×10⁶、1×10⁷、1×10⁸种大量本发明的不同多肽和/或多核苷酸序列的文库。另一个方面，本发明还提供包括大量本发明的病毒或病毒颗粒的文库，各种病毒或病毒颗粒展示本发明的多肽。本发明的文库包含展示任意数量的不同多肽(序列)的病毒或病毒颗粒，例如，至少约1×10⁴×10⁵、1×10⁶、1×10⁷、1×10⁸种不同多肽。

另一个方面，本发明提供包括多核苷酸或载体的宿主细胞，该载体包括编码本发明的多肽的序列。

另一个方面，本发明提供选择结合特异性靶标抗原的高亲合力结合物的方法。在某些这种具体实施方案中，特异性靶标抗原包括但是不限于HER2或DR5。

本发明的方法提供具有一个或多个被多样化的CDR区的多肽群体(例如，多肽(例如，抗体可变区)的文库)。对这些文库进行分选(选择)和/或筛选，确定靶标抗原的高亲合力结合物。一个方面，根据是否与靶标抗原结合以及亲合力的大小，从文库中选择多肽结合物。采用这些选择策略中的一种或多种所选择出来的多肽结合物，再根据亲合力和/或特异性进行筛选，所述特异性指仅结合靶标抗原而不结合非靶标抗原。

一个方面，本发明方法包括制备具有一个或多个被多样化的CDR区的大量多肽，在适合结合的条件下，将大量多肽与靶标抗原接触，从大量多肽中分选与靶标抗原结合的结合物；将靶标抗原的结合物与那些不结合的物质分离开；分离结合物；和确定高亲合力的结合物(或者具有期望结合亲合力的任何结合物)。结合靶标抗原的结合物的亲合力可用本领域知晓的各种技术来确定，例如，如本说明书中描述的竞争性ELISA。可选择地，多肽可融合到多肽标记上，例如gD、多聚组氨酸或FLAG，这些标记可用于分选结合物，以及用于分选靶标抗原。

另一个具体实施方案提供从抗体可变区文库中分离或选择结合靶标抗原的抗体可变区的方法，所述方法包括：a)在适合结合的条件下，将包括大量本发明的多肽的群体与被固定的靶标抗原接触，分离靶标抗原多肽结合物；b)将多肽结合物与非结合物分离开，和将结合物从靶标抗原上洗脱下来；c)可选择地，重复步骤a-b至少一次(在一些具体实施方案中，至少两次)。

在一些具体实施方案中，该方法还可进一步包含：d)在适合结合的条件下，将多肽结合物与浓度范围在0.1nM-1000nM的被标记的靶标抗原一起温育，形成混合物；e)将混合物与结合靶标抗原上的标记的固定试剂接触；f)从标记靶标抗原上洗脱多肽结合物；g)可选择地，重复d)到f)至少一次(在一些具体实施方案中，至少两次)，每次接连使用更低浓度的被标记的靶标抗原。可选择地，该方法可包含往混合物中添加过量的未被标记的靶标抗原，温育一段时间，该时间足以将亲合力低的结合物从被标记的靶标抗原上洗脱下来。

本发明的另一个方面提供分离或选择靶标抗原的高亲合力结合物(或具有期望结合亲合力的结合物)的方法。在一个具体实施方案中，所述方法包括：a)将包括大量本发明的多肽的群体与靶标抗原接触，其中抗原的浓度范围在约0.1nM-1000nM，分离靶标抗原的多肽结合物；b)将多肽结合物与靶标抗原分离开；c)可选择地，重复步骤a-b至少一次(在一些具体实施方案中，至少两次)，每次接连使用更低浓度的靶标抗原，分离结合最低浓度靶标抗原的多肽结合物；d)将多肽结合物与靶标抗原的数种不同稀释液一起温育，确定多肽结合物的IC50，选择高亲合力(或任何期望的亲合力)结合最低浓度靶标抗原的多肽结合物；和e)确定对靶标抗原具有期望亲合力的多肽结合物。所述亲合力可以是，例如，约0.1nM-200nM、0.5nM-150nM、1nM-100nM和/或25nM-75nM。

另一个具体实施方案提供分离或选择多肽结合物的分析方法，包括(a)在适合结合的条件下，将包括大量本发明的多肽的群体与被标记的靶标抗原接触，其中被标记的靶标抗原以浓度范围为0.1nM-1000nM提供，形成多肽结合物和被标记的靶标抗原的复合物；b)将复合物和多肽结合物与被标记的靶标抗原分离开；c)可选择地，重复步骤a-b至少一次，每次使用更低浓度的靶标抗原。可选择地，该方法进一步包含将多肽结合物和靶标抗原的复合物与过量的未被标记的靶标抗原接触。在一个具体实施方案中，所述方法的步骤重复两次，第一轮选择中的靶标浓度范围为约100nM-250nM，第二轮选择(如果实施)的范围为约25nM-100nM，和第三轮选择(如果实施)的范围为约0.1nM-25nM。

本发明还包括筛选包括大量本发明的多肽的群体的方法，所述方法包括：a)在适合多肽结合到靶标抗原上的条件下，将第一多肽群体样本与靶标抗原一起温育；b)第二多肽群体样本进行类似温育，但是没有靶标抗原；(c)在适合多肽结合到被固定的靶标抗原上的条件下，将第一样本和第二样本各自与被固定的靶标抗原接触；d)检测各个样本中结合到被固定的靶标抗原上的多肽的数量；e)通过计算第一个样本中被结合的特定多肽的数量与第二样本中被结合的特定多肽的数量的比率，确定特定多肽对靶标抗原的亲合力。

对按照本说明书描述所制备的文库进行筛选，筛选结合特定靶标抗原而不结合非靶标抗原的多肽。一个方面，本发明提供筛选多肽的方法，例如从抗体可变区文库中筛选结合特定靶标抗原的本发明的抗体可变区，所述方法包括：a)制备包括大量本发明的多肽的群体；b)在适合结合的条件下，将多肽群体与靶标抗原接触；c)将文库中结合物多肽与非结合物多肽分离开；d)通过确定结合物多肽是否结合到非靶标抗原上，确定靶标抗原的特异性结合物多肽；和e)分离靶标抗原的特异性结合物多肽。在一些具体实施方案中，步骤(e)包括从靶标抗原上洗脱结合物多肽，和扩增编码所述结合物多肽的可复制表达载体。在一些具体实施方案中，一种或多种文库、克隆或多肽用一组包含靶标抗原的抗原筛选。在一些具体实施方案中，筛选那些特异性结合靶标抗原而基本上不与该组中的任何其它抗原发生交叉反应的克隆或多肽。该组抗原包括至少3种和多达100种不同的抗原。在某些情形下，该组抗原包括3-100种，3-50种，3-25种，或者3-10种不同抗原。

上述分选/选择方法任何一种的组合可以与所述筛选方法联合使用。例如，在一个具体实施方案中，首先选择结合被固定的靶标抗原的多肽结合物。然后从结合被固定的靶标抗原的多肽结合物中筛选结合靶标抗原而不结合非靶标抗原的多肽结合物。如果需要，可以对特异性结合靶标抗原的多肽结合物进行扩增。通过与一定浓度的被标记的靶标抗原接触来形成复合物，从这些多肽结合物选择亲合力较高的多肽结合物，其中被标记的靶标抗原的浓度范围为约0.1nM-约1000nM，并通过与结合靶标抗原上的标记的试剂接触，分离复合物。然后，从被标记的靶标抗原上洗脱多肽结合物，而可选择地，重复数轮选择，而每次使用更低浓度的被标记的靶标抗原。可用这种选择方法分离结合物多肽，然后进行高亲合力筛选，采用例如实施例2和4中描述的液相ELISA分析方法或者本领域知晓的其它常规方法。用于本发明方法中的本发明的多肽群体以适合选择/筛选步骤的任何形式提供。例如，多肽不含可溶形式、被连接到基质上，或者存在于病毒颗粒的表面，例如噬菌体或噬菌粒颗粒表面。在本发明的方法的一些具体实施方案中，大量多肽是由大量以文库形式提供的可复制载体编码的。在本说明书描述的选择/筛选方法中，编码结合物多肽的载体被进一步扩增来提供足量多肽，以用于选择/筛选步骤的循环(如下文指出，这在本发明的方法中是可选择的)。

在一个具体实施方案中，本发明提供选择结合靶标抗原的多肽的方法，包括：

a)制备包括大量如本说明书描述的本发明的多肽的组合物；

b)从组合物中选择结合靶标抗原的多肽结合物；

c)将多肽结合物与非结合物分离开；

d)从分离的多肽结合物中确定具有期望亲合力性的结合物。

在另一个具体实施方案中，本发明提供从抗体可变区文库中选择结合靶标抗原的抗原结合可变区的方法，包括：

a)将本发明的抗体可变区文库(如本说明书描述)与靶标抗原接触；

b)将结合物与非结合物分离开，和从靶标抗原上洗脱结合物，并在含有含量在约0.1nM-1000nM浓度内逐步降低的靶标抗原的溶液中温育结合物；

c)选择能够结合最低浓度的靶标抗原且亲合力约0.1nM-200nM的结合物。

在一些具体实施方案中，靶标抗原的浓度约100-250nM，或约25-100nM。

在一个具体实施方案中，本发明提供从多肽文库中选择结合靶标抗原的多肽的方法，包括：

a)在适合结合的条件下，将包括大量本发明的多肽的文库(如本说明书描述)与被固定的靶标抗原接触，分离靶标抗原的多肽结合物；

b)将文库中的多肽结合物与非结合物分离开，从靶标抗原上洗脱结合物，获得富含结合物的亚组；和

c)可选择地，重复步骤a-b至少一次(在一些具体实施方案中，至少两次)，每次重复使用从前一轮选择中获得的结合物亚组。

在一些具体实施方案中，本发明的方法还可进一步包含步骤：

d)在适合结合的条件下，将多肽结合物亚组与浓度范围为0.1nM-1000nM的被标记的靶标抗原一起温育，形成混合物；

e)将混合物与能结合靶标抗原上的标记的固定剂接触；

f)检测结合到被标记的靶标抗原上的多肽结合物，并从被标记的靶标抗原上洗脱多肽结合物；

g)可选择地，重复步骤d)-f)至少一次(在一些具体实施方案中，至少两次)，每次重复使用从前一轮选择中获得的结合物亚组，并使用浓度低于前一轮的被标记的靶标抗原。

在一些具体实施方案中，这些方法进一步包括往混合物中添加过量的未标记的靶标抗原，温育一段时间，该时间足以从被标记的靶标抗原上洗脱低亲合力的结合物。

在另一个具体实施方案中，本发明提供分离靶标抗原的高亲合力结合物的方法，包括：

a)将包括大量本发明的多肽的文库(如本说明书描述)与浓度至少约0.1nM-1000nM的靶标抗原接触，分离靶标抗原的多肽结合物；

b)将多肽结合物与靶标抗原分离开，获得富含多肽结合物的亚组；和

c)可选择地，重复步骤a)和b)至少一次(在一些具体实施方案中，至少两次)，每次重复使用从前一轮选择中获得的结合物亚组，并使用浓度低于前一轮的靶标抗原，分离结合到最低浓度的靶标抗原上的多肽结合物。

一个方面，本发明提供从包括大量本发明的多肽的文库(如本说明书描述)中选择多肽结合物的分析方法，包括：

a)在适合结合的条件下，将文库与浓度范围为0.1nM-1000nM的被标记的靶标抗原接触，形成多肽结合物和被标记的靶标抗原的复合物；

b)将复合物和多肽结合物与被标记的靶标抗原分离开，获得富含结合物的亚组；

c)可选择地，重复步骤a-b至少一次(在一些具体实施方案中，至少两次)，每次使用从前一轮选择获得的结合物亚组，并使用浓度低于前一轮的靶标抗原。

在一些具体实施方案中，该方法还可进一步包括往多肽结合物和靶标抗原的复合物中添加过量的未被标记的靶标抗原。在一些具体实施方案中，重复上述步骤至少一次(在一些具体实施方案中，至少两次)，第一轮选择中的靶标抗原的浓度为约100nM-250nM，和第二轮选择中的靶标抗原的浓度约25nM-100nM，和第三轮选择中的靶标抗原的浓度约0.1nM-25nM。

另一个方面，本发明提供筛选包括大量本发明的多肽的文库的方法，所述方法包括：

a)在适合多肽结合到靶标抗原上的条件下，将第一文库样本与一定浓度的靶标抗原一起温育；

b)无靶标抗原时，温育第二文库样本；

c)在适合多肽结合到被固定的靶标抗原上的条件下，将第一样本和第二样本与被固定的靶标抗原接触；

d)检测各个样本中结合到被固定的靶标抗原上的多肽；

e)通过计算第一样本中被结合的多肽的数量与第二样本中被结合的多肽的数量的比率，确定多肽对靶标抗原的亲合力。

包括本发明的多肽结合物的诊断和治疗用途。在诊断应用中，本发明提供确定是否存在感兴趣的蛋白质的方法，包括将疑似含有该蛋白质的样本暴露给本发明的结合物多肽，和确定结合物多肽(binder polypeptide)是否结合该样本。对于该用途来说，本发明提供包括结合物多肽和结合物多肽用于检测蛋白质的使用说明书的试剂盒。

本发明进一步提供：编码结合物多肽的分离核酸；包括该核酸的载体，可选择地，该核酸被可操作地连接到能被用该载体转化的宿主细胞识别的控制序列上；用该载体转化的宿主细胞；制备结合物多肽的方法，包括培养宿主细胞以表达核酸，可选择地，从宿主细胞培养物中收集结合物多肽(例如，从宿主细胞培养液中收集)。

本发明还提供包括本发明的结合物多肽和载体(例如医学上可接受的载体)或稀释剂的组合物。该用于治疗目的的组合物是无菌的，并被冷冻干燥。还包括本发明的结合物多肽在制备用于治疗本说明书描述的症状的药剂的用途。所述组合物还可进一步包含第二种治疗剂，例如化疗剂、细胞毒性剂或抗血管生成剂。

本发明进一步提供用于治疗哺乳动物的方法，包括给哺乳动物施用有效量的本发明的结合物多肽。在该方法中被治疗的哺乳动物可以是非人的哺乳动物，例如适合收集基础数据的灵长类动物，或者啮齿类动物(例如，小鼠或大鼠或兔子)。非人的哺乳动物可以是健康的(例如用于毒理学研究)，或者可以是患有将用感兴趣的结合物多肽治疗的紊乱病症。在一个具体实施方案中，哺乳动物是患有与DR5相关的紊乱病症。在另一个具体实施方案中，哺乳动物是患有与HER2相关的紊乱病症。

在一个具体实施方案中，哺乳动物患有异常血管生成的疾病或者存在发展为异常血管生成的风险(例如，病理性血管生成)。在一个特定具体实施方案中，所述病症是选自结肠癌、肾细胞癌、卵巢癌、肺癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、支气管肺泡癌和胰腺癌组成的组的癌症。在另一个具体实施方案中，紊乱病症是由眼新血管形成引起的疾病，例如，糖尿病失明、视网膜病、原发性糖尿病性视网膜病、年老引起的黄斑退化和虹膜发红(rubeosis)。在另一个具体实施方案中，将被治疗的哺乳动物患有水肿或存在发展为水肿的风险(例如，与脑瘤相关的水肿，与中风(stroke)相关的水肿或者脑水肿)。在另一个具体实施方案中，哺乳动物患有紊乱或疾病或者存在发展成紊乱或疾病的风险，该紊乱或疾病选自由类风湿性关节炎、炎症性肠疾病、顽固性腹水(refractory ascites)、牛皮癣银屑病(psoriasis)、肉样瘤病(sarcoidosis)、动脉硬化、脓毒病(sepsis)、烧伤和胰腺炎组成的组。按照另一个具体实施方案，哺乳动物患有泌尿生殖器性疾病或者存在发展成泌尿生殖器性疾病的风险，该泌尿生殖器性疾病选自多囊性卵巢病(POD)、子宫内膜异位和子宫纤维瘤(uterine fibroid)。在一个具体实施方案中，紊乱是由细胞存活失控引起的疾病(例如，细胞死亡数量异常)，包括但是不限于免疫系统的癌症、紊乱，神经系统的紊乱和血管系统的紊乱。本发明的结合物多肽的施用量是治疗紊乱病症的治疗有效量。在增大给药剂量的试验中，各种剂量的结合物多肽被施用给哺乳动物。在另一个具体实施方案中，将治疗有效量的结合物多肽施用给人患者，治疗该患者中的紊乱病症。

在一个具体实施方案中，可用于治疗肿瘤、癌和与异常血管生成相关的其它紊乱病症的本发明的结合物多肽是Fab或scFv抗体，这些紊乱包括本说明书描述的炎症或免疫学紊乱病症和/或糖尿病或其它的胰岛素相关紊乱。因此，这种结合物多肽可用于制备成治疗炎症或免疫疾病的药物。患有本说明书描述的紊乱或疾病或者存在发展为该紊乱或疾病的哺乳动物可通过施用第二种治疗剂来治疗，该第二种治疗剂与本发明的多肽(例如抗体)一起同时、顺序或组合施用。应当理解，除了第二种治疗剂，其它治疗剂也可施用给哺乳动物或者用于制备成治疗期望症状的药物。

这些多肽可用于解释宿主基质细胞协同作用在植入性非宿主肿瘤生长中的作用，例如在植入人肿瘤的小鼠模型中。这些多肽可用于确定能够逃避治疗处理的人肿瘤的方法中，在用本发明的多肽处理后，观察或监控植入到啮齿动物或兔子中的肿瘤的生长。本发明的多肽还可用于研究和评价本发明的多肽和其它治疗剂的组合的治疗效果。通过给患有疾病或类似疾病的动物施用多肽，并确定该疾病的一种或多种症状是否减轻，本发明的多肽可用于研究感兴趣的靶标分子在其它疾病中的作用。

为了清楚起见，在本说明书的描述中，除了特别的或者上下文中另外指出，所有的氨基酸编号按照Kabat等人的方法(参见下文“定义”中的进一步详细描述)。

附图简介

图1描述了4D5轻链和重链的可变区的序列(分别为SED ID NO：1和2)。

图2给出人源化4D5的3D建模结构，显示形成连续区域(contiguouspatch)的CDR残基。连续区域由CDRL1中的氨基酸残基28、29、30、31和32；CDRL2的氨基酸残基50和53；CDRL3的氨基酸残基91、92、93、94和96；CDRH1中的氨基酸残基28、30、31、32、33；和CDRH2中的氨基酸残基50、52、53、54、56、和58构成。

图3显示来自Kabat数据库的人抗体轻链CDR序列中的氨基酸频率(通过单字母代码确定)。特定氨基酸位置上的氨基酸的频率表示为该位置上频率最高的氨基酸位于左边，继续到右边频率最低的氨基酸。氨基酸下方的数字代表Kabat数据库中的天然存在的序列的编号，该序列在该位置上具有该氨基酸。

图4显示来自Kabat数据库的人抗体重链CDR序列中的氨基酸频率(通过单字母代码确定)。特定氨基酸位置上的氨基酸的频率是以该位置上频率最高的氨基酸位于左边，继续到右边频率最低的氨基酸。氨基酸下方的数字代表Kabat数据库中的天然存在的序列的编号，该序列在该位置上具有该氨基酸。还给出了框架氨基酸位置71、93和94。

图5示例性地图解说明双顺反子载体，该载体可以表达分开的转录本，用于展示F(ab)₂。合适的启动子启动第一和第二顺反子的表达。第一个顺反子编码分泌信号序列(malE或stII)、轻链可变区和恒定区以及gD标记。第二顺反子编码分泌信号，编码重链可变区和恒定区1(CH1)和半胱氨酸二聚化结构域和病毒外壳蛋白的至少一部分的序列。

图6描述huMAb4D5-8的轻链和重链的框架区序列。上标/粗体的数字指示对应于Kabat的氨基酸位置。

图7描述huMAb4D5-8轻链和重链的经修饰的/变异的框架区序列。上标/粗体的数字指示对应于Kabat的氨基酸位置。

图8图解说明YSGR-A、YSGR-B、YSGR-C和YSGR-D文库中的各个被多样化的CDR位置的随机化方案，如实施例1中所述。

图9A-9D显示用于构建YSGR-A、YSGR-B、YSGR-C和YSGR-D文库的突变寡核苷酸，如实施例3中所述。等摩尔DNA的简并性用密码子套组(codeset)表示(W＝A/T，K＝G/T，M＝A/C，N＝A/C/G/T，R＝A/G，S＝G/C，Y＝T/C)。密码子套组在IUB码中给出。H3-A6-H3-A17寡核苷酸中的符号“XXX”分别代表摩尔比为50/25/25的编码Tyr/Ser/Gly的密码子。H3-B6-H3-B17寡核苷酸中的符号“XXX”分别代表摩尔比为25/50/25的编码Tyr/Ser/Arg的密码子。H3-C6-H3-C17寡核苷酸中的符号“XXX”分别代表摩尔比为38/25/25/12的编码Tyr/Ser/Gly/Arg的密码子。H3-D6到H3-D17的寡核苷酸中的符号“XXX”分别代表摩尔比为20/26/26/13/1/1/1/1/1/1/1/1/1/1/1/1/1/1/1的编码Tyr/Ser/Gly/Arg/Ala/Asp/Glu/Phe/His/Ile/Lys/Leu/Met/Asn/Pro/Gln/Thr/Val/Trp的密码子。

图10给出在用人DR5或人HER-2进行5轮选择后，文库YSGR-A-D的富集比率(enrichment ratio)，如实施例2所述。数值表示为X/Y，X代表独特克隆的数量，而Y代表特异性结合人DR5或人HER-2的克隆的数量。特异性克隆被确定为那些结合人DR5或人HER-2的数量比结合牛血清白蛋白(BSA)的数量至少大10倍的克隆(基于450nm的ELISA信号读数)。

图11A给出106个结合人HER-2的克隆的CDRH1、CDRH2、CDRH3和CDRL3的序列。图11B给出图11A中列举的各个克隆的ELISA分析结果。粗体数字指示强烈结合(信号为2-10)。

图1 2给出人HER-2的特异性结合物的CDRL3、CDRH1、CDRH2和CDRH3的氨基酸序列，如实施例2所述，该结合物分离自YSGR-A-D文库，具有短的(例如6-7个残基)CDRH3区。给出了CDRL3、CDRH1和CDRH2的共有序列(克隆编号对应于图11中所示的数字)。

图13给出人HER-2的特异性结合物的CDRH1、CDRH2和CDRH3的氨基酸序列，如实施例2所述，该结合物分离自YSGR-A-D文库，具有8个氨基酸的CDRH3区。给出了CDRH1、CDRH2和CDRH3的共有序列(克隆编号1-19分别对应于图11中所示的克隆编号：17、97、18、19、98、99、100、20、21、22、23、24、101、102、25、103、26、27和28)。

图14给出人HER-2的特异性结合物的CDRH1、CDRH2和CDRH3的氨基酸序列，如实施例2所述，该结合物分离自YSGR-A-D文库，具有中等长度(例如大约12-14个氨基酸)的CDRH3区。给出了CDRH1、CDRH2和CDRH3的共有序列。将一些CDRH3序列移码两个氨基酸，使得CDRH3序列从位置97，而不是位置95开始来确定共有序列。

图15给出人DR5的结合物的CDRL3、CDRH1、CDRH2和CDRH3序列，以及一些人DR5的结合物的IC₅₀。

图16给出人DR5的特异性结合物的CDRL3、CDRH1、CDRH2和CDRH3的氨基酸序列，如实施例2中所述，该结合物分离自YSGR-A-D文库。给出了结合人DR5的克隆的IC50。还确定了与鼠DR5发生交叉反应的克隆。给出了CDRL3、CDRH1、CDRH2和CDRH3的共有序列(克隆编号1-11对应于图15中的克隆编号10、11、12、8、7、13、5、9、6、15和14)。

图17给出了人DR5的特异性结合物的结合曲线，该结合物分离自YSGR-A-D文库。一些特异性结合物还结合鼠DR-5。

图18给出了描述Apo-2L配体、YSD1抗体和BFD1抗体结合到DR5受体上的3D模型。抗体的结合区彼此重叠。这些抗体的结合部位明显不同于Apo-2L配体的结合部位的大部分残基。

图19A和19B图解说明二元(Binary)H3文库(SAH3、SCH3、SFH3、SGH3、SIH3、SLH3、SNH3、SPH3、SRH3、STH3、SWH3和SYH3)的各个被多样化的CDR位置的随机化方案，如实施例4中所述。指明的氨基酸位置按照Kabat编号。

图20A-20L给出用于构建二元H3文库(SAH3(图20A)、SCH3(图20B)、SFH3(图20C)、SGH3(图20D)、SIH3(图20E)、SLH3(图20F)、SNH3(图20G)、SPH3(图20H)、SRH3(图20I)、STH3(图20J)、SWH3(图20K)和SYH3(图20L))的突变寡核苷酸，如实施例4中所述(SEQ IDNO：618-788)。等摩尔DNA的简并性用密码子套组表示(W＝A/T，K＝G/T，M＝A/C，N＝A/C/G/T，R＝A/G，S＝G/C，Y＝T/C)。密码子套组用IUB码表示。

图21A给出HER2的特异性结合物的CDRL3、CDRH1、CDRH2和CDRH3的氨基酸序列，该特异性结合物从汇集的二元H3文库(SXH3)中分离，如实施例5中所述(SEQ ID NO：789-896)。图21B给出图21A中所示的各个克隆的ELISA分析结果。浓阴影指示强结合(信号为2-10)。

图22图解说明二元表面文库(SY、SW、SR和SF)中的各个被多样化的CDR位置的随机化方案，如实施例6中所述。指明的氨基酸位置按照Kabat编号。

图23给出用于构建某些二元Surface文库(SW、SR和SF)的突变寡核苷酸，如实施例6中所述(SEQ ID NO：1005-1013)。等摩尔DNA的简并性用密码子套组表示(W＝A/T，K＝G/T，M＝A/C，N＝A/C/G/T，R＝A/G，S＝G/C，Y＝T/C)。密码子套组用IUB码表示。

图24A给出HER2的特异性结合物的CDRL3、CDRH1、CDRH2和CDRH3的氨基酸序列，该特异性结合物从汇集的二元surface文库(SX-surface)中分离，如实施例8中所述(SEQ ID NO：897-1004)。图24B给出图24A中所示的各个克隆的ELISA分析结果。浓阴影指示强结合(信号为2-10)，淡阴影指示弱结合(信号为0.25-2)。

图25图表描述含有不同二元氨基酸组合(Ser：Tyr，Ser：Trp，Ser：Arg，或Ser：Phe)的Fab的特异性，这些Fab从二元SXH3文库或二元SX-surface文库中获得。

图26A和B描述来自三种HER2-结合克隆(克隆B11、克隆G54和克隆YSGR-A-42)的可溶Fab蛋白质结合固定的HER2的表面胞质基因组共振结合分析结果。克隆B11的k_a为1.9×10⁶ M^-1s^-1、k_d为1.7×10^-3S^-1和K_D为890pM。克隆G54的k_a为2.0×10⁵M^-1s^-1、k_d为2.2×10^-3s^-1和K_D为11nM。克隆YSGR-A-42的k_a为2.7×10⁶M^-1s^-1、k_d为1.5×10^-3s^-1和K_D为570pM。

图27给出从YSGR(克隆A-42)、SX-surface(克隆G37和G54)和SXH3文库(克隆B11)的每一种中分离的抗HER2的fab与NR6或H2NR6-4D5细胞结合的流式细胞计数分析结果，如实施例7中所述。

图28给出HER2-结合的IgGs B11，G37、G54、YSGR-A-42、YSGR-A-27、B27、G43和YSGR-D-104中的每一个的CDRH1、CDRH2、CDRH3和CDRL3的序列。图28还给出各个克隆的Fab型式(version)的IC50值。

图29给出实施例7中描述的竞争性结合分析结果，确定各个指定的HER2特异性IgG与Omnitarg、Herceptin和其它各种IgG竞争结合HER2的能力。

实施本发明的模式

本发明提供的新的非常规的、极大简化并灵活的新方法，用于多样化处理CDR序列(包括抗体可变区序列)，和用于制备具有多样性、通常是具有大量多种被多样化的CDR(包括抗体可变区序列)的文库。这种文库提供组合文库，可用于例如，选择和/或筛选具有期望活性的合成抗体的克隆，所述活性例如结合亲合性和亲和性。这些文库可用于和提供确定免疫球蛋白的多肽序列，该多肽序列能够与广泛的各种靶标抗原相互作用。例如，包括本发明的被多样化的免疫球蛋白多肽的文库以噬菌体展示方式表达，特别可用于选择和/或筛选感兴趣的抗原结合分子的高通量的、有效的自动化系统。本发明的方法被设计来为靶标抗原提供高亲合力的结合物，而对来源或模板分子进行最小改变，并且当在细胞培养物中制备抗体或抗原结合片段时，产量良好。

本发明的方法和组合物提供众多的其它优点。例如，可以使用编码有限数量氨基酸的密码子套组，制备相对简单的变体CDR序列(与使用编码最大量氨基酸的密码子套组的传统方法相反)，同时为独特的靶标结合序列保留足够大的多样性。按照本发明制备的序列群体的简化特性(通常相对较小)使得一旦该群体或其亚组已经被确定具有期望特性时，可以进一步被多样化。

通过本发明的方法获得的靶标抗原结合物的序列的简化特性(simplified nature)为个性化地进一步进行序列修饰来获得期望结果留下了极大的空间。例如，在亲和力成熟、人源化等中，常规地进行这种序列修饰。在仅编码有限数量氨基酸的限制性密码子套组的基础上进行多样化，有可能用不同的限制性密码子套组靶向不同的表位，因此，与基于最大量氨基酸的随机化相比，从业人员更能够控制该多样化方法。使用限制性密码子套组的额外优点在于可以从该方法中去除不期望的氨基酸，例如甲硫氨酸或终止密码子，从而提高文库的整体质量和产量。此外，在某些情形下，有望限制潜在结合物的构象多样性。本发明的方法和组合物为实现该目的提供了弹性。例如，在序列中存在某些氨基酸时，例如酪氨酸时，会产生较少的旋转构象。

定义

氨基酸在本文中以单字母代码或三字母代码或二者表示。

术语“亲和纯化”指基于分子对化学制品或结合配偶物的特异性吸引或结合以形成组合体或复合物从而容许将该分子与杂质分开的同时保持结合或吸引至配偶物部分(moiety)来纯化分子。

术语“抗体”以最广义使用，明确覆盖单一单克隆抗体(包括激动性和拮抗性抗体)、具有多表位特异性的抗体组合物、亲和力成熟的抗体、人源化抗体、嵌合抗体、以及抗原结合片段(例如Fab、F(ab′)₂和Fv)，只要它们展现出期望的拮抗特性。在一个实施方案中，术语“抗体”还包括人抗体。在用于本文时，“抗体可变域”指抗体分子的轻链和重链中包含互补决定区(CDR；即CDR1、CDR2和CDR3)及框架区(FR)的部分。V_H指重链可变域。V_L指轻链可变域。根据本发明所使用的组合物和方法，归为CDR和FR的氨基酸位置可以依照Kabat(Sequences of Proteins of Immunological Interest(National Institutes of Health，Bethesda，Md.，1987和1991))来定义。抗体或抗原结合片段的氨基酸编号方式也依照Kabat的。

在用于本文时，术语“互补决定区(CDR；即CDR1、CDR2、和CDR3)指抗体可变域中其存在是抗原结合所必需的氨基酸残基。每个可变域通常具有三个CDR，鉴定为CDR1、CDR2和CDR3。每个互补决定区可以包含来自如Kabat定义的“互补决定区”的氨基酸残基(即大约是轻链可变域的残基24-34(L1)、50-56(L2)和89-97(L3)及重链可变域的残基31-35(H1)、50-65(H2)和95-102(H3)；Kabat等，Sequences of Proteins of Immunological Interest，5th Ed.Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，MD.(1991))和/或来自“高变环”的残基(即大约是轻链可变域的残基26-32(L1)、50-52(L2)和91-96(L3)及重链可变域的残基26-32(H1)、53-55(H2)和96-101(H3)；Chothia and Lesk J.Mol.Biol.196：901-917(1987))。在有些情况中，互补决定区可以包含来自Kabat定义的CDR和高变环二者的氨基酸。例如，抗体4D5重链的CDRH1包含氨基酸26-35。4D5抗体中CDRL1(依照Kabat定义)的共有序列为R-A-S-Q-D-V-N-T-A-V-A(SEQ ID NO：29)。4D5抗体中CDRL2(依照Kabat定义)的共有序列为S-A-S-S-L-Y-S(SEQ ID NO：30)。

“框架区”(以下的“FR”)指可变域中CDR残基以外的残基。每个可变域通常具有四个FR，鉴定为FR1、FR2、FR3和FR4。如果CDR是依照Kabat定义的，那么轻链FR残基位于大约轻链残基1-23(LCFR1)、35-49(LCFR2)、57-88(LCFR3)、和98-107(LCFR4)，而重链FR残基位于大约重链残基1-30(HCFR1)、36-49(HCFR2)、66-94(HCFR3)、和103-113(HCFR4)。如果CDR包含来自高变环的氨基酸残基，那么轻链FR残基位于大约轻链残基1-25(LCFR1)、33-49(LCFR2)、53-90(LCFR3)、和97-107(LCFR4)，而重链FR残基位于大约重链残基1-25(HCFR1)、33-52(HCFR2)、56-95(HCFR3)、和102-113(HCFR4)。在有些情况中，在CDR包含来自Kabat定义的CDR和高变环二者的氨基酸时，FR残基可做相应的调整。例如，当CDRH1包含氨基酸H26-H35时，重链FR1残基位于1-25位，而FR2残基位于36-49位。

在用于本文时，“密码子套组(codon set)”指用于编码期望变异氨基酸的一套不同核苷酸三联体序列。可以通过例如固相合成来合成一套寡核苷酸，其包括呈现密码子集所提供的核苷酸三联体的所有可能组合并编码期望氨基酸组的序列。一种标准形式的密码子命名是IUB码，其是本领域已知的且在本文中有记载。密码子套组通常以3个斜体大写字母表示，例如NNK、NNS、XYZ、DVK等等。如此，在某些位置具有选定核苷酸“简并性”的寡核苷酸的合成是本领域众所周知的，例如TRIM法(Knappek等J.Mol.Biol.296：57-86(1999))；Garrard & Henner Gene 128：103(1993))。此类具有某些密码子套组的寡核苷酸集可以使用商品化核酸合成仪来合成(可购自例如Applied Biosystems，Foster City，CA)，或者可以通过商业途径获得(例如购自Life Technologies，Rockville，MD)。因此，一套具有特定密码子套组的合成的寡核苷酸通常包括具有不同序列(在整个序列中由密码子套组所建立的差异)的多种寡核苷酸。寡核苷酸，在依照本发明使用时，具有容许与可变域核酸模板杂交的序列，而且还可以但非必须包含可用于例如克隆目的的限制酶位点。

术语“受限制的密码子套组(restricted codon set)”及其变化形式在用于本文时指比生成序列多样性的本领域方法通常所用的密码子套组编码数目有限得多的氨基酸的密码子套组。在本发明的一个方面，用于序列多样化的受限制的密码子套组编码2-10种、2-8种、2-6种、2-4种、或仅2种氨基酸。在有些实施方案中，用于序列多样化的受限制的密码子套组编码至少2种但不超过10种或更少、8种或更少、6种或更少、4种或更少氨基酸。在一个典型的实施例中，使用四项密码子套组(tetranomial codon set)。四项密码子套组的例子包括RMC，RMG，RRC，RSA，MKC，YMT，RST，KMT，SRC，MRT和WMT，正如本领域知道的。在另一个典型的实施例中，使用二元密码子套组(binomial codon set)。二元密码子套组的例子包括TMT，KAT，YAC，WAC，TWC，TYT，YTC，WTC，KTT，YCT，MCG，SCG，MGC，SGT，GRT，GKT和GYT。合适的受限制密码子的确定，及特定受限制密码子编码的具体氨基酸的确定是本领域技术人员众所周知的且显而易见的。适用于CDR序列多样化的氨基酸可以凭经验确定和/或由本领域知道的标准来指导(例如包括疏水性和亲水性氨基酸类型的组合等)。

“Fv”片段是包含完整抗原识别和结合位点的抗体片段。此区由紧密结合(该结合的本质可以是共价的，例如在scFv中)的一个重链可变域和一个轻链可变域的二聚体组成。正是在这种构造中，每个可变域的三个CDR相互作用而在V_H-V_L二聚体表面上确定了抗原结合位点。六个CDR或其子集赋予抗体以抗原结合特异性。然而，即使是单个可变域(或只包含对抗原特异性的三个CDR的半个Fv)也具有识别和结合抗原的能力，只是通常亲和力低于完整结合位点。

“Fab”片段包含轻链的可变域和恒定域及重链的可变域和第一恒定域(CH1)。F(ab′)₂抗体片段包含一对Fab片段，这对Fab片段一般通过它们之间的铰链半胱氨酸在它们羧基末端附近共价连接。本领域还知道抗体片段的其它化学偶联形式。

“单链Fv”或“scFv”抗体片段包含抗体的V_H和V_L结构域，其中这些结构域存在于一条多肽链上。一般而言，Fv多肽在V_H与V_L结构域之间还包含多肽接头，使得scFv能够形成结合抗原所需的结构。关于scFv的综述参见Pluckthun，在Rosenburg and Moore编的《(The Pharmacology of MonoclonalAntibodies》第113卷中，Springer-Verlag，New York，pp.269-315(1994)。

术语“双抗体”指具有两个抗原结合位点的小型抗体片段，该片段在同一条多肽链(V_H及V_L)中包含相连的重链可变域(V_H)和轻链可变域(V_L)。通过使用过短的接头使得同一条链上的两个结构域之间不能配对，迫使这些结构域与另一条链的互补结构域配对，从而产生两个抗原结合位点。双抗体更完整的记载于例如EP 404,097；WO 93/11161；Hollinger等Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：6444-6448(1993)。

表述“线性抗体”指Zapata等Protein Eng，8(10)：1057-1062(1995)中所描述的抗体。简言之，这些抗体包含一对串联的Fd区段(V_H-C_Hl-V_H-C_Hl)，该区段与互补的轻链多肽一起形成一对抗原结合区。线性抗体可以是双特异性的，或者是单特异性的。

术语“单克隆抗体”在用于本文时指从一群基本上同质的抗体获得的抗体，即构成群体的各抗体个体是相同的，除了可以以极小量存在的可能的天然存在突变形式外。单克隆抗体是高度特异性的，针对单一抗原性位点。此外，与典型的包含针对不同决定簇(表位)的不同抗体的常规(多克隆)抗体制备物不同，每种单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。修饰语“单克隆”指示抗体从基本上同质的抗体群获得的特征，不应解释为要求通过任何特定方法来生成抗体。例如，将依照本发明使用的单克隆抗体可通过最初由Kohler等Nature 256：495(1975)记载的杂交瘤方法来制备，或者可通过重组DNA方法来制备(参见例如美国专利No.4,816,567)。“单克隆抗体”还可使用例如Clackson等Nature 352：624-628(1991)和Marks等J.Mol.Biol.222：581-597(1991)中记载的技术从噬菌体抗体库分离。

单克隆抗体在本文中明确包括“嵌合”抗体(免疫球蛋白)，其中重链和/或轻链的一部分与衍生自特定物种或属于特定抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，而链的剩余部分与衍生自另一物种或属于另一抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，以及此类抗体的片段，只要它们展现出期望的生物学活性(美国专利No.4,816,567；Morrison等Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81：6851-6855(1984))。

非人(例如鼠)抗体的“人源化”形式指最低限度包含衍生自非人免疫球蛋白的序列的嵌合抗体。在极大程度上，人源化抗体指人免疫球蛋白(受体抗体)中的高变区残基用具有期望特异性、亲和力和能力的非人物种(供体抗体)诸如小鼠、大鼠、兔或非人灵长类动物的高变区残基替换的免疫球蛋白。在有些情况中，将人免疫球蛋白的Fv框架区(FR)残基用相应的非人残基替换。此外，人源化抗体可包含在受体抗体中或在供体抗体中没有找到的残基。进行这些修饰是为了进一步改进抗体的性能。一般而言，人源化抗体将包含至少一个、通常两个基本上整个如下的可变域，其中所有或基本上所有高变环对应于非人免疫球蛋白的高变环，且所有或基本上所有FR是人免疫球蛋白序列的FR区。人源化抗体任选还将包含至少部分免疫球蛋白恒定区(Fc)，通常是人免疫球蛋白的恒定区。更多细节参见Jones等Nature 321：522-525(1986)；Riechmann等Nature 332：323-329(1988)；Presta Curr.Op.Struct.Biol.2：593-596(1992)。

“物种依赖性抗体”指对来自第一哺乳动物物种的抗原的结合亲和力强于对来自第二哺乳动物物种的该抗原同系物的亲和力的抗体。通常，物种依赖性抗体“特异性结合”人抗原(即结合亲和力(K_d)数值不超过大约1×10^-7M，例如不超过大约1×10^-8M，又例如不超过大约1×10^-9M)，但是对来自第二非人哺乳动物物种的该抗原同系物的结合亲和力比对人抗原的结合亲和力弱至少大约50倍、或至少大约500倍、或至少大约1000倍。物种依赖性抗体可以是上文所定义的各种类型抗体中的任一种，但是优选人源化抗体或人抗体。

在用于本文时，“抗体突变体”或“抗体变体”指物种依赖性抗体的氨基酸序列变体，其中物种依赖性抗体的一个或多个氨基酸残基发生了修饰。此类突变体与物种依赖性抗体必然具有小于100％的序列同一性或相似性。在一个实施方案中，抗体突变体所具有的氨基酸序列与物种依赖性抗体的重链或轻链可变域的氨基酸序列具有至少75％、例如至少80％、例如至少85％、例如至少90％、和例如至少95％的氨基酸序列同一性或相似性。关于此序列的同一性或相似性在本文中定义为在比对序列并在必要时引入缺口以实现最大百分比序列同一性后，候选序列中与物种依赖性抗体残基相同(即相同残基)或相似(即根据共同侧链特性来自同一组的氨基酸残基，见下文)的氨基酸残基的百分比。N-末端、C-末端、或内部的延伸、删除、或插入可变域以外的抗体序列都不应视为影响序列同一性或相似性。

“分离的”抗体指已经鉴定且自其天然环境的成分分开和/或回收的抗体。其天然环境的污染性成分指将会干扰该抗体的诊断或治疗用途的物质，可包括酶、激素、和其它蛋白质性质或非蛋白质性质的溶质。在某些实施方案中，将抗体纯化至(1)根据Lowry法的测定，抗体重量超过95％，例如重量超过99％，(2)足以通过使用转杯式测序仪获得至少15个残基的N-末端或内部氨基酸序列的程度，或(3)根据还原性或非还原性条件下的SDS-PAGE及使用考马斯蓝或优选的银染色，达到同质。既然抗体天然环境的至少一种成分不会存在，那么分离的抗体包括重组细胞内的原位抗体。然而，分离的抗体通常将通过至少一个纯化步骤来制备。

术语“拮抗剂”以最广义使用，包括在体外、原位或在体内部分或完全阻断、抑制或中和本文所述靶分子(例如DR5或HER-2)的一种或多种生物学活性的任何分子。DR5的此类生物学活性的例子包括Apo2L/TRAIL结合至DR5、诱导凋亡、以及文献中所报告的。HER-2的此类生物学活性的例子包括配体诸如调蛋白的结合、HER-2的酪氨酸磷酸化、增殖及凋亡的诱导、以及文献中所报告的。拮抗剂可以以直接或间接方式发挥功能。例如，拮抗剂可以在体外、原位或在体内由于其直接结合靶分子的结果发挥功能而部分或完全阻断、抑制或中和靶分子配体的一种或多种生物学活性。拮抗剂还可以在体外、原位或在体内由于例如阻断或抑制另一种效应物分子的结果间接发挥功能而部分或完全阻断、抑制或中和靶分子的一种或多种生物学活性。拮抗剂分子可包括“双重”拮抗剂活性，其中该分子能够部分或完全阻断、抑制或中和靶分子的生物学活性。

术语“激动剂”以最广义使用，包括在体外、原位、或在体内部分或完全增强、刺激、或激活本文所述靶分子(例如DR5或HER-2)的一种或多种生物学活性的任何分子。DR5的此类生物学活性的例子包括Apo2L的结合、凋亡、以及文献中所报告的。HER-2的此类生物学活性的例子包括配体诸如调蛋白的结合、受体的酪氨酸磷酸化、增殖及凋亡的诱导、以及文献中所报告的。激动剂可以直接或间接方式发挥功能。例如，激动剂可以在体外、原位、或在体内由于其直接结合靶分子从而引起受体活化或信号转导的结果发挥功能而部分或完全增强、刺激、或激活靶分子的一种或多种生物学活性。激动剂还可以在体外、原位、或在体内由于例如刺激另一种效应物分子继而引起靶分子活化或信号转导的结果间接发挥功能而部分或完全增强、刺激、或激活靶分子的一种或多种生物学活性。设想了激动剂可作为间接发挥功能来增强或提高靶分子活化或活性的增强剂分子。例如，激动剂可增强哺乳动物中内源Apo-2L的活性。这可通过例如预复合DR5或者通过稳定相应配体与DR5受体的复合物来实现。

“细胞”、“细胞系”和“细胞培养物”在本文中可互换使用，而且此类名称包括细胞或细胞系的所有后代。如此，例如术语像“转化子”和“(经)转化细胞”包括原代受试细胞及由其衍生的培养物，不管传代的次数。还应理解，所有后代在DNA内容上可能不是精确相同的，这是由于有意或无意的突变。本发明包括与最初对转化细胞所筛选的具有相同功能或生物学活性的突变后代。在意指不同的名称时，上下文会有清楚表述。

“控制序列”涉及表达手段时指在特定宿主生物体中表达可操作连接的编码序列所必需的DNA序列。例如，适于原核生物的控制序列包括启动子、任选的操纵基因序列、核糖体结合位点、和可能的其它目前了解不多的序列。已知真核细胞利用启动子、多腺苷酸化信号、和增强子。

术语“外壳蛋白”指至少一部分存在于病毒颗粒表面上的蛋白质。从功能观点看，外壳蛋白指在宿主细胞中的病毒装配过程中与病毒颗粒有关联的且直到它感染另一宿主细胞仍然与装配好的病毒结合的任何蛋白质。外壳蛋白可以是主要外壳蛋白(major coat protein)，或者可以是次要外壳蛋白。“主要”外壳蛋白一般指以至少约5个、至少约7个、至少约10个拷贝的蛋白质或更多存在于病毒外壳中的外壳蛋白。主要外壳蛋白可以以数以十计、数以百计、或甚至数以千计的“拷贝数/病毒粒”存在。主要外壳蛋白的例子有丝状噬菌体的p8蛋白。

化学实体在特定测定法中的“检测限制”指该实体在该测定法的背景水平之上可检测到的最小浓度。例如，在噬菌体ELISA中，展示特定抗原结合片段的特定噬菌体的“检测限制”指特定噬菌体所产生的ELISA信号高于不展示该抗原结合片段的对照噬菌体所产生的ELISA信号时的噬菌体浓度。

“DR5受体”或“DR5”在用于本文时涵盖天然序列受体和受体变体。这些术语涵盖在多种哺乳动物(包括人)中表达的DR5受体。DR5受体可以是内源表达的，像多种人组织谱系中天然发生的，或者可以是通过重组或合成方法表达的。“天然序列DR5受体”包括与衍生自自然界的DR5受体具有相同氨基酸序列的多肽。如此，天然序列DR5受体可具有来自任何哺乳动物的天然存在DR5受体的氨基酸序列。此类天然序列DR5受体可以从自然界分离，或者可以通过重组和/或合成手段生成。术语“天然序列DR5受体”明确涵盖该受体的天然存在的截短或分泌形式(例如包含例如胞外结构域序列的可溶形式)、天然存在的变体形式(例如可变剪接形式)、及天然存在的等位变体。受体变体可以包括天然序列DR5受体的片段或删除突变体。人DR5的411个氨基酸的序列显示于表1，而且就是1998年11月19日公布的WO 98/51793的图3A的序列。本领域知道人DR5的一种转录剪接变体。此DR5剪接变体编码440个氨基酸的人DR5序列，如1998年8月20日公布的WO 98/35986的图3B和3C所示。鼠DR5及DR5胞外结构域的多肽序列也显示于下文表1。

DR5的生物学活性包括：(a)具有在体内或回体在至少一种类型的哺乳动物癌细胞或病毒感染细胞中诱导或刺激或发送凋亡信号的能力；(b)能够结合天然存在Apo2L/TRAIL多肽。用于测定生物学活性诸如凋亡的测定法可使用本领域已知方法来进行，诸如DNA断裂(参见例如Marsters et al.，Curr.Biology，6：1669(1996))、胱天蛋白酶灭活、DR5结合(参见例如WO 98/51793，公布于1998年11月19日)。术语“凋亡”和“凋亡活性”以广义使用，指哺乳动物中有序或受控形式的细胞死亡，通常伴随着一种或多种特征性细胞事件，包括细胞质浓缩、质膜微绒毛丧失、细胞核节段化、染色体DNA降解或线粒体功能丧失。例如可以通过本领域已知的细胞存活力测定法(例如Alamar蓝测定法或MTT测定法)、FACS分析、胱天蛋白酶活化、DNA片段化(参见例如Nicoletti et al.，J.Immunol.Methods 139：271-279(1991))、及多聚ADP核糖聚合酶、“PARP”、切割测定法来测定和测量这种活性。

“DR5受体抗体”、“DR5抗体”或“抗DR5抗体”以广义使用，指结合至少一种形式的DR5受体的抗体。任选的是，DR5抗体与异源序列或分子融合或连接。优选的是，异源序列容许或帮助抗体形成更高等级或寡聚复合物。任选的是，DR5抗体结合DR5受体但不与任何其它Apo-2L受体(例如DR4、DcR1或DcR2)结合或发生交叉反应。任选的是，该抗体是DR5信号活性的激动剂。

任选的是，根据BIAcore结合测定法(如本文所述)的测量，本发明的DR5抗体在约0.1nM到约20mM的浓度范围内结合DR5受体。任选的是，在有些实施方案中，根据结合测定法(诸如下文实施例中所描述的竞争噬菌体ELISA)的测量，本发明的抗体呈现出约1nM到约20nM的IC50值。

术语“Apo2L/TRAIL”、“Apo-2L”和“TRAIL”在本文中用于指包含表1所示氨基酸序列的氨基酸残基114-281(含)、残基95-281(含)、残基92-281(含)、残基91-281(含)、残基41-281(含)、残基15-281(含)或残基1-281(含)的多肽序列，以及上述序列的生物学活性片段、删除、插入或替代变体。Apo-2L多肽可以由WO2005100399图1所述和所示天然核苷酸序列来编码。

“融合蛋白”和“融合多肽”指两个部分共价连接到一起的多肽，其中每个部分是具有不同特性的多肽。所述特性可以是生物学特性，诸如体外或体内活性。所述特性还可以是简单的化学或物理特性，诸如结合靶抗原、催化反应等。所述两个部分可以通过单一肽键或者包含一个或多个氨基酸残基的肽接头直接相连。一般而言，所述两个部分和所述接头彼此在同一读码框内。在某些实施方案中，多肽的两个部分是从异源或不同的多肽得到的。

“异源DNA”指被导入宿主细胞的任何DNA。DNA可以衍生自多种来源，包括基因组DNA、cDNA、合成DNA、及这些的融合物和组合物。DNA可以包括来自与宿主或受体细胞相同的细胞或细胞类型的DNA，或者来自不同细胞类型例如来自哺乳动物或植物的DNA。DNA可以任选的包含标志物或选择基因，例如抗生素抗性基因、温度抗性基因等。

在用于本文时，“高度多样性位置”指位于轻链和重链可变区内的如下氨基酸位置，在比较已知的和/或天然存在的抗体或抗原结合片段的氨基酸序列时，该位置呈现许多不同氨基酸。高度多样性位置典型的在CDR区内。一方面，Kabat，Sequences of Proteins of Immunological Interest(NationalInstitutes of Health，Bethesda，Md.，1987 and 1991)所提供的数据促进了确定已知的和/或天然存在的抗体中的高度多样性位置的能力。位于http/www.bioinf.org.uk.abs.structures.html的基于因特网的数据库提供了轻链(http/www.bioinf.org.uk.abs.lc.align)和重链(http/www.bioinf.org.uk.abs.hc.align)序列的广泛收集和比对，促进了这些序列中高度多样性位置的确定。依照本发明，若某氨基酸位置具有约2种-约11种、约4种-约9种、和/或约5种-约7种不同的可能氨基酸残基变异，则它是高度多样性的。在有些实施方案中，若某氨基酸位置具有至少约2种、至少约4种、至少约6种、和/或至少约8种不同的可能氨基酸残基，则它是高度多样性的。

在用于本文时，“文库”或“库”指众多抗体或抗体片段序列(例如本发明的多肽)，或者编码这些序列的核酸，变异氨基酸组合方面不同的序列根据本发明方法导入这些序列。

“连接”指在两个核酸片段之间形成磷酸二酯键的过程。为了两个片段的连接，片段的末端必须彼此相容。在有些情况中，末端在内切核酸酶消化后是直接相容的。然而，可能必须在内切核酸酶消化后首先将普通生成的交错末端转变成平末端，使之相容供连接用。为了将末端变平，将DNA用约10个单位的DNA聚合酶I的Klenow片段或T4 DNA聚合酶在存在四种脱氧核糖核苷酸三磷酸时在合适的缓冲液中于15℃处理至少15分钟。然后将该DNA通过酚-氯仿抽提和乙醇沉淀或者通过硅土纯化来纯化。将要连接到一起的DNA片段以大致等摩尔的量置于溶液中。该溶液还含有ATP、连接酶缓冲液、和连接酶诸如T4 DNA连接酶(大约10个单位/0.5μgDNA)。如果要将DNA连接入载体，那么首先将载体通过适当限制性内切核酸酶的消化来线性化。然后将线性化的片段用细菌碱性磷酸酶或小牛肠磷酸酶处理以防止连接步骤期间的自身连接。其它连接方法是本领域众所周知的。

“突变”指相对于参照核苷酸序列(诸如野生型序列)的核苷酸删除、插入、或替代。

在用于本文时，“天然的”或“天然存在的”抗体指自非合成来源，例如自回体获得的已分化的抗原特异性B细胞或其对应的杂交瘤细胞系，或者自得自动物血清的抗体鉴定的抗体。这些抗体可包括任何类型的免疫应答中生成的抗体，或是天然的或是以其它方式诱导的。天然抗体包括构成或编码这些抗体的氨基酸序列和核苷酸序列，例如Kabat数据库中所鉴定的。在用于本文时，天然抗体不同于“合成抗体”，合成抗体指相对于来源或模板序列已经改变(例如通过在某个位置用不同的氨基酸替代、删除、或添加一个或多个氨基酸，所述不同氨基酸提供了不同于来源抗体序列的抗体序列)的抗体序列。

“可操作连接的”在涉及核酸时意味着该核酸与另一核酸序列处于功能性相互关系中。例如，若前序列(presequence)或分泌前导序列(secretory leader)的DNA表达成参与多肽分泌的前蛋白质(preprotein)，则它与该多肽的DNA可操作连接；若启动子或增强子影响编码序列的转录，则它与该序列可操作连接；或者，若核糖体结合位点的位置促进翻译，则它与编码序列可操作连接。一般而言，“可操作连接的”意味着相连的DNA序列是相邻的，而且在分泌前导序列的情况中意味着附带的且处于同一阅读框内。然而，增强子不必相邻。所述连接可以通过在方便的限制性位点处的连接来实现。若没有此类位点，则依照常规实践使用合成的寡核苷酸衔接头或接头。

“噬菌体展示”是一种将变异多肽作为与外壳蛋白至少一部分的融合蛋白展示在噬菌体(例如丝状噬菌体)颗粒表面上的技术。噬菌体展示的效用在于能够对随机化蛋白质变体的大型文库快速且高效分选那些能以高亲和力与靶抗原结合的序列的实情。肽和蛋白质文库在噬菌体上的展示已经用于对数以百万计的多肽筛选那些具有特异性结合特性的多肽。多价噬菌体展示法已经用于展示小随机肽和小蛋白，其通过与丝状噬菌体的基因III或基因VIII融合来实现。Wells and Lowman Curr.Opin.Struct.Biol.3：355-362(1992)及其中引用的参考文献。在单价噬菌体展示中，将蛋白质或肽文库与基因III或其一部分融合，并在存在野生型基因III蛋白时以低水平表达，使得噬菌体颗粒展示一个拷贝的融合蛋白或者不展示融合蛋白。亲合效应(avidity effect)相对于多价噬菌体得到了降低，使得分选基于内在的配体亲和力，而且使用噬菌粒载体，这简化了DNA操作。Lowman and Wells Methods：A companion to Methods in Enzymology 3：205-0216(1991)。

“噬菌粒”是具有细菌复制起点(例如ColE1)和一个拷贝的噬菌体基因区间的质粒载体。噬菌粒可利用任何已知噬菌体，包括丝状噬菌体和λ类噬菌体。质粒一般也包含抗生素抗性的可选择标志物。克隆入这些载体的DNA区段可以像质粒一样扩增。在给容纳这些载体的细胞提供生成噬菌体颗粒所必需的所有基因时，质粒的复制模式变成滚环复制，以生成质粒DNA的一条链的拷贝，并包装噬菌体颗粒。噬菌粒可形成感染性或非感染性噬菌体颗粒。此术语包括这样的噬菌粒，它们包含与异源多肽基因连接成基因融合物的噬菌体外壳蛋白基因或其片段，使得异源多肽展示在噬菌体颗粒的表面上。

术语“噬菌体载体”指包含异源基因且能够复制的双链复制型噬菌体。噬菌体载体具有容许噬菌体复制和噬菌体颗粒形成的噬菌体复制起点。在某些实施方案中，噬菌体是丝状噬菌体，诸如M13、fl、fd、Pf3噬菌体或其衍生物，或者是λ类噬菌体，诸如λ、21、

82、424、434等或其衍生物。

“寡核苷酸”指通过已知方法(诸如磷酸三酯、亚磷酸酯、或亚磷酰胺化学，使用诸如1988年5月4日公布的EP 266,032中披露的固相技术，或者通过Froeshler et al.，Nucl.Acids，Res.，14：5399-5407(1986)披露的脱氧核苷H-膦酸酯中间物)化学合成的长度较短的单链或双链多聚脱氧核苷酸。其它方法包括下文定义的聚合酶链反应和其它自身引发方法和固体支持物上的寡核苷酸合成。所有这些方法记载于Engels et al.，Agnew.Chem.Int.Ed.Engl.，28：716-734(1989)。这些方法在基因的整个核酸序列是已知的或者可得到与编码链互补的核酸序列时是有用的。或者，如果靶氨基酸序列是已知的，那么可以使用每种氨基酸残基的已知且优选的编码残基推断潜在的核酸序列。寡核苷酸可以在聚丙烯酰胺凝胶或分子大小排阻柱上或者通过沉淀来纯化。

当DNA与非核酸杂质分开时，该DNA是“纯化的”。杂质可以是极性的、非极性的、离子的等。

“源抗体(source antibody)”在用于本文时指其抗原结合序列充当模板序列用于进行依照本文所述标准的多样化的抗体或抗原结合片段。在某些实施方案中，抗原结合序列一般包括抗体可变区，及至少一个CDR，包括框架区。

在用于本文时，“溶剂可及位置”指源抗体或抗原结合片段重链和轻链可变区中根据抗体或抗原结合片段的结构、结构整合(ensemble)和/或建模结构确定为潜在触及溶剂和/或接触分子(诸如抗体特异性抗原)的氨基酸残基位置。这些位置通常发现于CDR中和蛋白质外部上。如本文所定义的抗体或抗原结合片段的溶剂可及位置可使用本领域已知的多种算法来确定。在某些实施方案中，溶剂可及位置是使用来自抗体(或其一部分，例如抗体可变域或CDR区段)三维模型的坐标而确定的，使用计算法程序，诸如Insight II程序(Accelrys，San Diego，CA)。溶剂可及位置还可以使用本领域已知的算法来确定(例如Lee and Richards，J.Mol.Biol.55，379(1971)andConnolly，J.Appl.Cryst.16，548(1983))。溶剂可及位置的确定可使用适于蛋白质建模的软件和自抗体(或其一部分)得到的三维结构信息来进行。可用于这些目的的软件包括SYBYL Biopolymer Module软件(TriposAssociates)。一般而言，在某些实施方案中，若算法(程序)要求用户输入大小参数，计算中所使用的探针的“大小”设为半径大约1.4埃或更小。另外，Pacios((1994)″ARVOMOL/CONTOUR：molecular surface areas and volumeson Personal Computers.″Comput.Chem.18(4)：377-386记载了使用供个人计算机用的软件确定溶剂可及区域和面积的方法。

“转录调控元件”包含以下构件中的一种或多种：增强子元件、启动子、操纵基因序列、阻抑物基因、和转录终止序列。这些构件是本领域众所周知的。美国专利No.5,667,780。

“转化子”指根据与DNA有关的表型(例如由DNA所编码的蛋白质赋予的抗生素抗性)的表达，已经摄取并维持DNA的细胞。

“转化”指细胞摄取DNA并成为“转化子”的过程。DNA摄取可以是永久的或瞬时的。

“人抗体”指拥有与由人生成的抗体的氨基酸序列对应的氨基酸序列和/或使用本文所公开的用于生成人抗体的任何技术生成的抗体。人抗体的这种定义明确排除包含非人抗原结合残基的人源化抗体。

“亲和力成熟的”抗体指在抗体的一个或多个CDR中具有一处或多处改变、导致该抗体对抗原的亲和力与没有这些改变的亲本抗体相比有所改进的抗体。在某些实施方案中，亲和力成熟的抗体将具有纳摩尔或甚至皮摩尔量级的对靶抗原的亲和力。亲和力成熟的抗体可通过本领域已知规程来生成。Marks et al.，Bio/Technology 10：779-783(1992)记载了通过VH和VL结构域改组进行的亲和力成熟。以下文献记载了CDR和/或框架残基的随机诱变：Barbas et al.，Proc.Nat.Acad.Sci.USA 91：3809-3813(1994)；Schier etal.，Gene 169：147-155(1 995)；Yelton et al.，J.Immunol.155：1994-2004(1995)；Jackson et al.，J.Immunol.154(7)：3310-9(1995)；Hawkins et al.，J.Mol.Biol.226：889-896(1992)。

“Kd”或“Kd值”是一分子与另一分子相互作用的解离常数。在一个实施方案中，通过放射性标记蛋白质结合测定法(RIA)来测量Kd值。在一个实施方案中，DR5或HER-2的RIA可以分别使用Fab型式的抗DR5或HER-2抗体及DR5或HER-2分子如测量Fab对DR5或HER-2的溶液结合亲和力的下述测定法所述进行，即在存在未标记DR5或HER-2分子的滴定系列的条件下，用最小浓度的¹²⁵I标记的DR5或HER-2平衡Fab，然后用抗Fab抗体包被的平板捕捉结合的DR5或HER-2分子(Chen，et al.，(1999)J MolBiol 293：865-881)。为了确定测定条件，用50mM碳酸钠(pH9.6)中的5μg/ml捕捉用抗Fab抗体(Cappel Labs)包被微量滴定板(Dynex)过夜，随后用PBS中的2％(w/v)牛血清清蛋白在室温(约23℃)封闭2-5小时。在非吸附平板(Nunc#269620)中，将100pM或26pM[¹²⁵I]-DR5或HER-2与连续稀释的目的Fab混合，例如Fab-12(Presta et al.，(1997)Cancer Res.57：4593-4599)。然后将目的Fab保温过夜；不过，保温可持续65小时以保证达到平衡。此后，将混合物转移至捕捉板以进行室温保温1小时。然后除去溶液，并用含0.1％Tween-20的PBS洗板8次。平板干燥后，加入150μl/孔闪烁液(MicroScint-20；Packard)，然后在Topcount伽马计数器(Packard)上对平板计数10分钟。选择各Fab给出小于或等于最大结合之20％的浓度用于竞争性结合测定法。

依照另一实施方案，Kd或Kd值可以通过表面等离振子共振测定法使用BIAcore^TM-2000或BIAcore^TM-3000仪器(BIAcore，Inc.，Piscataway，NJ)来测量。在一个实施方案中，抗DR5或HER-2分子抗体对DR5或HER-2分子的Kd值是使用BIAcore^TM分析依照下述方案测定的。简而言之，依照供应商的说明书用盐酸N-乙基-N’-(3-二甲基氨基丙基)-碳化二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)活化羧甲基化右旋糖苷生物传感器芯片(CM5，BIAcore Inc.)。用10mM乙酸钠pH4.8将人DR5或HER-2分子稀释至5μg/ml(约0.2μM)，然后以5μl/分钟的流速注入至获得约10个响应单位(RU)的偶联蛋白质。注入人DR5或HER-2后，注入1M乙醇胺以封闭未反应基团。为了进行动力学测量，在25℃以约25μl/分钟的流速注入在含0.05％Tween-20的PBS(PBST)中两倍连续稀释的Fab(0.78nM至500nM)。使用简单一对一朗格缪尔(Langmuir)结合模型(BIAcore Evaluation Softwareversion 3.2)通过同时拟合结合和解离传感图计算结合速率(k_on)和解离速率(k_off)。平衡解离常数(Kd)以比率k_off/k_on计算。参见例如Chen，Y.，et al.，JMol Biol 293：865-881(1999)。

“病症”指任何会受益于使用本发明物质/分子或方法的治疗的疾患。这包括慢性和急性病症或疾病，包括那些使哺乳动物倾向于所讨论病症的病理状况。本文中待治疗的病症的非限制性例子包括恶性和良性肿瘤；非白血病和淋巴样恶性肿瘤；神经元、神经胶质、星形细胞、下丘脑和其它腺体、巨噬细胞、上皮、基质和囊胚腔病症；及炎性、免疫学相关病症。

术语“细胞增殖性病症”和“增殖性病症”指与一定程度的异常细胞增殖有关的病症。在一个实施方案中，细胞增殖性病症指癌症。

“肿瘤”在用于本文时指所有肿瘤性细胞生长和增殖，无论是恶性的还是良性的，及所有癌前(pre-cancerous)和癌性细胞和组织。术语“癌症”、“癌性”、“细胞增殖性紊乱”、“增殖性紊乱”和“肿瘤”在本文中提到时并不互相排斥。

术语“癌症”和“癌性”指或描述哺乳动物中特征通常为细胞生长/增殖不受调控的生理疾患。癌症的例子包括但不限于癌、淋巴瘤、母细胞瘤、肉瘤、和白血病。此类癌症的更具体例子包括鳞状细胞癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺的腺癌、肺的鳞癌、腹膜癌、肝细胞癌、胃肠癌、胰腺癌、成胶质细胞瘤、宫颈癌、卵巢癌、肝癌(liver cancer or hepatic carcinoma)、膀胱癌、肝瘤(hepatoma)、乳腺癌、结肠癌、结肠直肠癌、子宫内膜癌或子宫癌、唾液腺癌、肾癌(kidney cancer)、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、及各种类型的头和颈癌。

术语“免疫相关疾病”指哺乳动物中由哺乳动物免疫系统成分引起、介导、或以其它方式促成发病的疾病。还包括刺激或干预免疫应答对疾病发展具有改善作用的疾病。该术语包括自身免疫病、免疫介导的炎性疾病、非免疫介导的炎性疾病、感染性疾病、和免疫缺陷病。可依照本发明治疗的免疫相关和炎性疾病的例子，其中有些是免疫或T细胞介导的，包括系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、幼年型慢性关节炎、脊椎关节病、系统性硬化(硬皮病)、特发性炎性肌病(皮肌炎、多肌炎)、斯耶格伦氏(Sjogren)综合征、系统性血管炎、结节病、自身免疫性溶血性贫血(免疫性全血细胞减少症、阵发性夜间血红蛋白尿)、自身免疫性血小板减少症(特发性血小板减少性紫癜、免疫介导的血小板减少症)、甲状腺炎(格雷夫斯氏(Graves)病、桥本氏(Hashimoto)甲状腺炎、幼年型淋巴细胞性甲状腺炎、萎缩性甲状腺炎)、糖尿病、免疫介导的肾病(肾小球肾炎、肾小管间质性肾炎)、中枢和周围神经系统的脱髓鞘病诸如多发性硬化、特发性脱髓鞘多神经病或格-巴二氏(Guillain-Barré)综合征、和慢性炎性脱髓鞘多神经病、肝胆病诸如传染性肝炎(甲型、乙型、丙型、丁型、戊型和其它非嗜肝病毒肝炎)、自身免疫性慢性活动性肝炎、原发性胆汁性肝硬化、肉芽肿性肝炎、和硬化性胆管炎、炎性和纤维化肺病诸如炎性肠病(溃疡性结肠炎、克罗恩氏(Crohn)病)、麸胶敏感性肠病、和惠普尔氏(Whipple)病、自身免疫或免疫介导的皮肤病包括大疱性皮肤病、多形红斑和接触性皮炎、银屑病、变应性疾病诸如哮喘、变应性鼻炎、特应性皮炎、食物超敏感性和荨麻疹、和肺的免疫学疾病诸如嗜曙红细胞性肺炎。

“自身免疫病”在本文中以广义、一般意义使用，指哺乳动物中因哺乳动物个体对其自身组织组分的体液或细胞免疫应答而破坏正常或健康组织的病症或疾患。例子包括但不限于系统性红斑狼疮、甲状腺炎、类风湿性关节炎、银屑病、多发性硬化、自身免疫性糖尿病和炎性肠病(IBD)。

在用于本文时，“治疗”或“处理”指试图改变所治疗个体或细胞的自然进程的临床干预，可以是为了预防或在临床病理学的进程中进行。治疗的期望效果包括预防疾病的发生或复发、缓解症状、削弱疾病的任何直接或间接病理学后果、预防转移、减缓疾病进展的速率、改善或减轻疾病状态、及免除或改善预后。在有些实施方案中，本发明的抗体用于延迟疾病或病症的发生/发展。

“有效量”指在必需的剂量和时间上有效实现期望的治疗或预防效果的量。

本发明的物质/分子、激动剂或拮抗剂的“治疗有效量”可根据诸如个体的疾病状态、年龄、性别和体重及该物质/分子、激动剂或拮抗剂在个体中引发期望应答的能力等因素而变化。治疗有效量还指该物质/分子、激动剂或拮抗剂的治疗有益效果胜过任何有毒或有害后果的量。“预防有效量”指在必需的剂量和时间上有效实现期望的预防效果的量。通常而非必然，由于预防剂量是在疾病发作之前或在疾病的早期用于受试者的，因此预防有效量将低于治疗有效量。

为了治疗的目的，“哺乳动物”指归入哺乳类的任何动物，包括人，家畜和牲畜，非人灵长类动物、及动物园、运动或宠物动物，诸如犬、马、猫、牛等。

术语“抗肿瘤组合物(anti-neoplastic composition)”指可用于治疗癌症的组合物，其包含至少一种活性治疗剂，例如“抗癌剂”。治疗剂(抗癌剂)的例子包括但不限于例如化疗剂、生长抑制剂、细胞毒剂、放射疗法中所使用的药剂、抗血管发生剂、凋亡剂、抗微管蛋白剂、和其它用于治疗癌症的药剂诸如抗CD20抗体、表皮生长因子受体(EGFR)拮抗剂(例如酪氨酸激酶抑制剂)、HER1/EGFR抑制剂(例如erlotinib(Tarceva^TM)、血小板衍生生长因子抑制剂(例如Gleevec^TM(Imatinib Mesylate))、COX-2抑制剂(例如塞来考昔(celecoxib))、干扰素、细胞因子、能与ErbB3、ErbB4、PDGFR-β、BlyS、APRIL、BCMA或VEGF受体中的一种或多种靶物结合的拮抗剂(例如中和性抗体)、TRAIL/Apo2、及其它生物活性和有机化学剂等。本发明还包括它们的组合。

术语“表位标记的”在用于本文时指与“表位标签”融合的抗体突变体。表位标签多肽具有足够残基以提供表位而可制备针对其的抗体，但又足够短使得其不干扰抗体突变体的活性。表位标签优选还是相当独特的，使得针对它的抗体基本上不与其它表位发生交叉反应。合适的标签多肽通常具有至少6个氨基酸残基，通常在约8个和约50个氨基酸残基之间(在某些实施方案中，在约10个和约20个氨基酸残基之间)。例子包括但不限于流感HA标签多肽及其抗体12CA5(Field et al.Mol.Cell.Biol.8：2159-2165(1988))；c-myc标签及针对它的8F9、3C7、6E10、G4、B7和9E10抗体(Evanet al.，Mol.Cell.Biol.5(12)：3610-3616(1985))；及单纯疱疹病毒糖蛋白D(gD)标签及其抗体(Paborsky et al.，Protein Engineering 3(6)：547-553(1990))。在某些实施方案中，表位标签是“补救受体结合表位”。

术语“细胞毒剂”在用于本文时指抑制或防止细胞的功能和/或引起细胞破坏的物质。该术语意图包括：放射性同位素，例如At²¹¹、I¹³¹、I¹²⁵、Y⁹⁰、Re¹⁸⁶、Re¹⁸⁸、Sm¹⁵³、Bi²¹²、P³²和Lu的放射性同位素；化疗剂，例如甲氨蝶呤(methotrexate)、阿霉素(adriamycin)、长春花生物碱类(vinca alkaloids)(长春新碱(vincristine)、长春碱(vinblastine)、依托泊苷(etoposide))、多柔比星(doxorubicin)、美法仑(melphalan)、丝裂霉素(mitomycin)C、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、柔红霉素(daunorubicin)或其它嵌入剂；酶及其片段，诸如溶核酶；抗生素；和毒素，诸如小分子毒素或者细菌、真菌、植物或动物起源的酶活毒素，包括其片段和/或变体；及下文披露的各种抗肿瘤药或抗癌药。下文记载了其它细胞毒剂。杀肿瘤药引起肿瘤细胞的破坏。

“化疗剂”指可用于治疗癌症的化学化合物。化疗剂的实例包括烷化剂类(alkylating agents)，诸如塞替派(thiotepa)和CYTOXAN

环磷酰胺(cyclophosphamide)；磺酸烷基酯类(alkyl sulfonates)，诸如白消安(busulfan)、英丙舒凡(improsulfan)和哌泊舒凡(piposulfan)；氮丙啶类(aziridines)，诸如苯佐替派(benzodepa)、卡波醌(carboquone)、美妥替派(meturedepa)和乌瑞替派(uredepa)；乙撑亚胺类(ethylenimines)和甲基蜜胺类(methylamelamines)，包括六甲蜜胺(altretamine)、三乙撑蜜胺(triethylenemelamine)、三乙撑磷酰胺(triethylenephosphoramide)、三乙撑硫代磷酰胺(triethylenethiophosphoramide)和三羟甲蜜胺(trimethylolomelamine)；番荔枝内酯类(acetogenin)(尤其是布拉他辛(bullatacin)和布拉他辛酮(bullatacinone))；δ-9-四氢大麻酚(tetrahydrocannabinol)(屈大麻酚(dronabinol)，MARINOL

)；β-拉帕醌(lapachone)；拉帕醇(lapachol)；秋水仙素类(colchicines)；白桦脂酸(betulinicacid)；喜树碱(camptothecin)(包括合成类似物托泊替康(topotecan)(HYCAMTIN

)、CPT-11(伊立替康(irinotecan)，CAMPTOSAR)、乙酰喜树碱、东莨菪亭(scopoletin)和9-氨基喜树碱)；苔藓抑素(bryostatin)；callystatin；CC-1065(包括其阿多来新(adozelesin)、卡折来新(carzelesin)和比折来新(bizelesin)合成类似物)；鬼臼毒素(podophyllotoxin)；鬼臼酸(podophyllinic acid)；替尼泊苷(teniposide)；隐藻素类(cryptophycins)(特别是隐藻素1和隐藻素8)；多拉司他汀(dolastatin)；duocarmycin(包括合成类似物，KW-2189和CB1-TM1)；艾榴塞洛素(eleutherobin)；pancratistatin；sarcodictyin；海绵抑素(spongistatin)；氮芥类(nitrogen mustards)，诸如苯丁酸氮芥(chlorambucil)、萘氮芥(chlornaphazine)、胆磷酰胺(cholophosphamide)、雌莫司汀(estramustine)、异环磷酰胺(ifosfamide)、双氯乙基甲胺(mechlorethamine)、盐酸氧氮芥(mechlorethamine oxide hydrochloride)、美法仑(melphalan)、新氮芥(novembichin)、苯芥胆甾醇(phenesterine)、泼尼莫司汀(prednimustine)、曲磷胺(trofosfamide)、尿嘧啶氮芥(uracil mustard)；亚硝脲类(nitrosoureas)，诸如卡莫司汀(carmustine)、氯脲菌素(chlorozotocin)、福莫司汀(fotemustine)、洛莫司汀(lomustine)、尼莫司汀(nimustine)和雷莫司汀(ranimustine)；抗生素类，诸如烯二炔类抗生素(enediyne)(如加利车霉素(calicheamicin)，尤其是加利车霉素γ1I和加利车霉素ωI1(参见例如Agnew，Chem.Intl.Ed.Engl.33：183-186(1994))；蒽环类抗生素(dynemicin)，包括dynemicin A；埃斯波霉素(esperamicin)；以及新制癌素(neocarzinostatin)发色团和相关色蛋白烯二炔类抗生素发色团)、阿克拉霉素(aclacinomycin)、放线菌素(actinomycin)、氨茴霉素(anthramycin)、偶氮丝氨酸(azaserine)、博来霉素(bleomycin)、放线菌素C(cactinomycin)、carabicin、洋红霉素(carminomycin)、嗜癌霉素(carzinophilin)、色霉素(chromomycin)、放线菌素D(dactinomycin)、柔红霉素(daunorubicin)、地托比星(detorubicin)、6-二氮-5-氧-L-正亮氨酸、ADRIAMYCIN

多柔比星(doxorubicin)(包括吗啉代多柔比星、氰基吗啉代多柔比星、2-吡咯代多柔比星和脱氧多柔比星)、表柔比星(epirubicin)、依索比星(esorubicin)、伊达比星(idarubicin)、麻西罗霉素(marcellomycin)、丝裂霉素类(mitomycins)诸如丝裂霉素C、霉酚酸(mycophenolic acid)、诺拉霉素(nogalamycin)、橄榄霉素(olivomycin)、培洛霉素(peplomycin)、potfiromycin、嘌呤霉素(puromycin)、三铁阿霉素(quelamycin)、罗多比星(rodorubicin)、链黑菌素(streptonigrin)、链佐星(streptozocin)、杀结核菌素(tubercidin)、乌苯美司(ubenimex)、净司他丁(zinostatin)、佐柔比星(zorubicin)；抗代谢物类，诸如甲氨蝶呤和5-氟尿嘧啶(5-FU)；叶酸类似物，诸如二甲叶酸(denopterin)、甲氨蝶呤、蝶酰三谷氨酸(pteropterin)、三甲曲沙(trimetrexate)；嘌呤类似物，诸如氟达拉滨(fludarabine)、6-巯基嘌呤(mercaptopurine)、硫咪嘌呤(thiamiprine)、硫鸟嘌呤(thioguanine)；嘧啶类似物，诸如安西他滨(ancitabine)、阿扎胞苷(azacitidine)、6-氮尿苷、卡莫氟(carmofur)、阿糖胞苷(cytarabine)、双脱氧尿苷(dideoxyuridine)、去氧氟尿苷(doxifluridine)、依诺他滨(enocitabine)、氟尿苷(floxuridine)；雄激素类，诸如卡鲁睾酮(calusterone)、丙酸屈他雄酮(dromostanolone propionate)、表硫雄醇(epitiostanol)、美雄烷(mepitiostane)、睾内酯(testolactone)；抗肾上腺类，诸如氨鲁米特(aminoglutethimide)、米托坦(mitotane)、曲洛司坦(trilostane)；叶酸补充剂，诸如亚叶酸(folinic acid)；醋葡醛内酯(aceglatone)；醛磷酰胺糖苷(aldophosphamide glycoside)；氨基乙酰丙酸(aminolevulinic acid)；恩尿嘧啶(eniluracil)；安吖啶(amsacrine)；bestrabucil；比生群(bisantrene)；依达曲沙(edatraxate)；地磷酰胺(defosfamide)；地美可辛(demecolcine)；地吖醌(diaziquone)；elfornithine；依利醋铵(elliptinium acetate)；埃坡霉素(epothilone)；依托格鲁(etoglucid)；硝酸镓；羟脲(hydroxyurea)；香菇多糖(lentinan)；氯尼达明(lonidamine)；美登木素生物碱类(maytansinoids)，诸如美登素(maytansine)和美登醇(maytansinol)；安丝菌素(ansamitocin)；米托胍腙(mitoguazone)；米托蒽醌(mitoxantrone)；莫哌达醇(mopidamol)；二胺硝吖啶(nitracrine)；喷司他丁(pentostatin)；蛋氨氮芥(phenamet)；吡柔比星(pirarubicin)；洛索蒽醌(losoxantrone)；2-乙基酰肼(ethylhydrazide)；丙卡巴肼(procarbazine)；PSK

多糖复合物(JHS Natural Products，Eugene，OR)；雷佐生(razoxane)；根霉素(rhizoxin)；西索菲兰(sizofiran)；螺旋锗(spirogermanium)；细交链孢菌酮酸(tenuazonic acid)；三亚胺醌(triaziquone)；2，2′，2″-三氯三乙胺；单端孢菌素类(trichothecenes)(尤其是T-2毒素、疣孢菌素(verrucarin)A、杆孢菌素(roridin)A和蛇行菌素(anguidin))；乌拉坦(urethan)；长春地辛(vindesine)(ELDISINE，FILDESIN

)；达卡巴嗪(dacarbazine)；甘露醇氮芥(mannomustine)；二溴甘露醇(mitobronitol)；二溴卫矛醇(mitolactol)；哌泊溴烷(pipobroman)；gacytosine；阿糖胞苷(arabinoside)(“Ara-C”)；塞替派(thiotepa)；类紫杉醇(taxoids)，例如TAXOL

紫杉醇(paclitaxel)(Bristol-Myers squibb Oncology，Princeton，N.J.)、ABRAXANE^TM不含克列莫佛(Cremophor)，清蛋白改造的纳米颗粒剂型紫杉醇(American Pharmaceutical Partners，Schaumberg，Illinois)和TAXOTERE

多西他塞(doxetaxel)(

-Poulenc Rorer，Antony，France)；苯丁酸氮芥(chlorambucil)；吉西他滨(gemcitabine)(GEMZAR

)；6-硫鸟嘌呤(thioguanine)；巯基嘌呤(mercaptopurine)；甲氨蝶呤(methotrexate)；铂类似物，诸如顺铂(cisplatin)和卡铂(carboplatin)；长春碱(vinblastine)(VELBAN

)；铂；依托泊苷(etoposide)(VP-16)；异环磷酰胺(ifosfamide)；米托蒽醌(mitoxantrone)；长春新碱(vincristine)(ONCOVIN

)；奥沙利铂(oxaliplatin)；亚叶酸(leucovorin)；长春瑞滨(vinorelbine)(NAVELBINE

)；能灭瘤(novantrone)；依达曲沙(edatrexate)；道诺霉素(daunomycin)；氨基蝶呤(aminopterin)；伊本膦酸盐(ibandronate)；拓扑异构酶抑制剂RFS 2000；二氟甲基乌氨酸(DMFO)；类维A酸(retinoids)，诸如维A酸(retinoic acid)；卡培他滨(capecitabine)(XELODA

)；任何上述物质的药学可接受盐、酸或衍生物；以及两种或多种上述物质的组合，诸如CHOP(环磷酰胺、多柔比星、长春新碱和泼尼松龙联合疗法的缩写)和FOLFOX(奥沙利铂(ELOXATIN^TM)联合5-FU和亚叶酸的治疗方案的缩写)。

该定义还包括作用为调节、降低、阻断、或抑制可促进癌生长的激素效果的抗激素剂，且常常是系统或全身治疗的形式。它们自身可以是激素。实例包括抗雌激素类和选择性雌激素受体调节剂类(SERM)，包括例如他莫昔芬(tamoxifen)(包括NOLVADEX

他莫昔芬)、EVISTA

雷洛昔芬(raloxifene)、屈洛昔芬(droloxifene)、4-羟基他莫昔芬、曲沃昔芬(trioxifene)、那洛昔芬(keoxifene)、LY117018、奥那司酮(onapristone)和FARESTON

托瑞米芬(toremifene)；抗孕酮类；雌激素受体下调剂类(ERD)；功能为抑制或关闭卵巢的药剂，例如促黄体生成激素释放激素(LHRH)激动剂，诸如LUPRON

和ELIGARD

醋酸亮丙瑞林(leuprolide acetate)、醋酸戈舍瑞林(goserelin acetate)、醋酸布舍瑞林(buserelin acetate)和曲普瑞林(triptorelin)；其它抗雄激素类，诸如氟他米特(flutamide)、尼鲁米特(nilutamide)和比卡米特(bicalutamide)；及抑制在肾上腺中调节雌激素生成的芳香酶的芳香酶抑制剂，诸如例如4(5)-咪唑、氨鲁米特(aminoglutethimide)、MEGASE

醋酸甲地孕酮(megestrol acetate)、AROMASIN

依西美坦(exemestane)、福美坦(formestane)、法倔唑(fadrozole)、RIVISOR

伏罗唑(vorozole)、FEMARA

来曲唑(letrozole)和ARIMIDEX

阿那曲唑(anastrozole)。另外，化疗剂的这种定义包括二膦酸盐类(bisphosphonates)，诸如氯膦酸盐(clodronate)(例如BONEFOS

或OSTAC

)、DIDROCAL

依替膦酸钠(etidronate)、NE-58095、ZOMETA

唑来膦酸/唑来膦酸盐(zoledronic acid/zoledronate)、FOSAMAX

阿伦膦酸盐(alendronate)、AREDIA

帕米膦酸盐(pamidronate)、SKELID

替鲁膦酸盐(tiludronate)或ACTONEL

利塞膦酸盐(risedronate)；以及曲沙他滨(troxacitabine)(1，3-二氧戊环核苷胞嘧啶类似物)；反义寡核苷酸，特别是抑制牵涉异常(abberant)细胞增殖的信号途经中的基因表达的反义寡核苷酸，诸如例如PKC-α、Raf、H-Ras和表皮生长因子受体(EGF-R)；疫苗，诸如THERATOPE

疫苗和基因疗法疫苗，例如ALLOVECTIN

疫苗、LEUVECTIN

疫苗和VAXID

疫苗；LURTOTECAN

拓扑异构酶1抑制剂；ABARELIX

rmRH；lapatinib ditosylate(ErbB-2和EGFR双重酪氨酸激酶小分子抑制剂，也称为GW572016)；及任何上述物质的药学可接受盐、酸或衍生物。

“生长抑制剂”在用于本文时指在体外或在体内抑制其生长依赖于目的靶分子活性的细胞生长的化合物或组合物。因此，生长抑制剂可以是显著降低处于S期的靶分子依赖性细胞的百分比的药剂。生长抑制剂的例子包括阻断细胞周期行进(处于S期以外的位置)的药剂，诸如诱导G1停滞和M期停滞的药剂。经典的M期阻断剂包括长春药类(vincas)(长春新碱(vincristine)和长春碱(vinblastine))、紫杉烷类(taxanes)、和拓扑异构酶II抑制剂诸如多柔比星(doxorubicin)、表柔比星(epirubicin)、柔红霉素(daunorubicin)、依托泊苷(etoposide)和博来霉素(bleomycin)。那些阻滞G1的药剂也溢出进入S期停滞，例如DNA烷化剂类诸如他莫昔芬(tamoxifen)、泼尼松(prednisone)、达卡巴嗪(dacarbazine)、双氯乙基甲胺(mechlorethamine)、顺铂(cisplatin)、甲氨蝶呤(methotrexate)、5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil)和ara-C。更多信息可参见《The Molecular Basis of Cancer》，Mendelsohn和Israel编，第1章，题为“Cell cycle regulation，oncogenes，andantieioplastic drugs”，Murakaini等人，WB Saunders，Philadelphia，1995，尤其是第13页。紫杉烷类(紫杉醇(paclitaxel)和多西他赛(docetaxel))是衍生自紫杉树的抗癌药。衍生自欧洲紫杉的多西他赛(TAXOTERE

，Rhone-Poulenc Rorer)是紫杉醇(TAXOL，Bristol-Myers Squibb)的半合成类似物。紫杉醇和多西他赛促进由微管蛋白二聚体装配成微管并通过防止解聚使微管稳定，导致对细胞中有丝分裂的抑制。

“多柔比星(Doxorubicin)”是蒽环类抗生素。多柔比星的完整化学名是(8S-顺式)-10-[(3-氨基-2，3，6-三脱氧-α-L-来苏-吡喃己糖基)氧基]-7，8，9，10-四氢-6，8，11-三羟基-8-(羟基乙酰基)-1-甲氧基-5，12-萘二酮。

(8S-cis)-10-[(3-amino-2，3，6-trideoxy-α-L-lyxo-hexapyranosyl)oxy]-7，8，9，10-tetrahydro-6，8，11-trihydroxy-8-(hydroxyacetyl)-1-methoxy-5，12-naphthacenedione

术语“前体药物”在用于本申请时指与母药(parent drug)相比对肿瘤细胞的细胞毒性较小并能够酶促活化或转变为更具活性母药形式的药用活性物质的前体或衍生物形式。参见例如Wilman“Prodrugs in CancerChemotherapy”，Biochemical Society Transactions，1 4，pp.3 75-3 82，6 1 5thMeeting Belfast(1 986)和Stella等“Prodrugs：A Chemical Approach to TargetedDrug Delivery”，Directed Drug Delivery，Borchardt等，编，pp.247-267，Humana Press(1985)。本发明的前体药物包括但不限于含磷酸盐/酯前体药物、含硫代磷酸盐/酯前体药物、含硫酸盐/酯前体药物、含肽前体药物、D-氨基酸修饰前体药物、糖基化前体药物、含β-内酰胺前体药物、含任选取代苯氧基乙酰胺的前体药物或含任选取代苯乙酰胺的前体药物、可转化为更具活性而无细胞毒性的药物的5-氟胞嘧啶和其它5-氟尿苷前体药物。可衍生为本发明使用的前体药物形式的细胞毒性药物的例子包括但不限于上文描述的那些化疗剂。

对于治疗类风湿性关节炎(“RA”)，可以用本发明的抗体连同任何一种或多种下列药物来处理患者：DMARD(缓解病情的抗风湿药)(例如甲氨喋呤)、NSAI或NSAID(非类固醇抗炎药)、HUMIRA^TM(adalimumab；AbbottLaboratories)、ARAVA

(来氟米特)、REMICADE

(infliximab；CentocorInc.，Malvern，Pa)、ENBREL^TM(依那西普；Immunex，WA)、和COX-2抑制剂。常用于RA的DMARD是羟氯喹、柳氮磺吡啶、甲氨喋呤、来氟米特、依那西普、infliximab、硫唑嘌呤、D-青霉胺、金(口服)、金(肌肉内)、米诺环素、环孢霉素、和葡萄球菌蛋白质A免疫吸附。adalimumab是结合TNF-α的人单克隆抗体。infliximab是结合TNF-α的嵌合单克隆抗体。依那西普是由人75kD(p75)肿瘤坏死因子受体(TNFR)的胞外配体结合部分与人IgG1的Fc部分相连组成的“免疫粘附素”融合蛋白。关于RA的常规处理参见如“Guidelines for the management of rheumatoid arthritis”，Arthritis & Rheumatism 46(2)：328-346，2002年2月。在一个具体的实施方案中，可连同甲氨喋呤(MTX)用本发明的CD20抗体处理RA患者。MTX的例示性剂量是约7.5-25mg/kg/周。MTX可口服和皮下施用。

对于治疗强直性脊柱炎、银屑病关节炎和克罗恩氏病，可以用本发明的抗体连同例如Remicade

(infliximab；来自Centocor Inc.，Malvern，Pa)、和/或ENBREL(依那西普；Immunex，WA)来处理患者。

对于治疗SLE，可以用本发明的抗体连同例如高剂量的皮质类固醇类和/或环磷酰胺(HDCC)来处理患者。

对于治疗银屑病，可以给患者施用本发明的抗体连同表面治疗剂诸如表面类固醇类、蒽林、钙泊三烯、氯倍他索、和他扎罗汀或者连同甲氨喋呤、类维A类、环磷酰胺、PUVA和UVB疗法。在一个实施方案中，用抗体与环孢霉素顺序或同时治疗银屑病患者。

“分离的”核酸分子指已经鉴定且与抗体核酸的天然来源中通常与之关联的至少一种污染性核酸分子分开的核酸分子。分离的核酸分子不同于在自然界中发现它时的形式或背景。分离的核酸分子因此与存在于天然细胞中时的核酸分子有区别。然而，分离的核酸分子包括通常表达该抗体的细胞中所包含的核酸分子，例如当所述核酸分子在所述细胞中的染色体定位不同于它在天然细胞中的染色体定位时。

表述“控制序列”指在特定宿主生物体中表达可操作连接的编码序列所必需的DNA序列。例如，适于原核生物的控制序列包括启动子、任选的操纵基因序列、和核糖体结合位点。已知真核细胞利用启动子、多腺苷酸化信号、和增强子。

起始或参照多肽(例如源抗体或其可变域/CDR)的“变体”或“突变体”，诸如融合蛋白(多肽)或异源多肽(对噬菌体是异源的)指这样的多肽：1)具有与起始或参照多肽不同的氨基酸序列；且2)通过天然的或人工的(人为的)诱变而衍生自起始或参照多肽。此类变体包括例如目的多肽氨基酸序列内的残基删除、和/或插入、和/或替代。例如，使用包含受限制的密码子套组、编码包含变异氨基酸(相对于在来源抗体/抗原结合片段的相应位置找到的氨基酸)的序列的寡核苷酸生成的本发明融合多肽将是相对于来源抗体和/或抗原结合片段和/或CDR的变异多肽。如此，变异的CDR指包含相对于起始或参照多肽序列(诸如来源抗体和/或抗原结合片段和/或CDR的序列)的变异序列的CDR。变异氨基酸在此语境中指与在起始或参照多肽序列(诸如来源抗体和/或抗原结合片段和/或CDR)中相应位置找到的氨基酸不同的氨基酸。删除、插入、和替代的任何组合可用来获得最终的变体或突变体构建物，只要最终的构建物具有期望的功能性特征。在本文所述的有些例子中，结合物序列包含点突变，诸如删除或添加。氨基酸变化还可改变多肽的翻译后加工，诸如改变糖基化位点的数目或位置。用于生成多肽的氨基酸序列变体的方法记载于美国专利No.5,534,615，明确收入本文作为参考。

“野生型”或“参照”序列或者“野生型”或“参照”蛋白/多肽(诸如外壳蛋白、或者来源抗体的CDR或可变域)的序列可以是通过引入突变来衍生变异多肽的参照序列。一般而言，给定蛋白质的“野生型”序列指在自然界中最常见的序列。类似的，“野生型”基因序列指该基因在自然界中最常找到的序列。可以通过天然过程或者通过人诱导的手段将突变引入“野生型”基因(及如此由它编码的蛋白质)。此类过程的产物是最初“野生型”蛋白质或基因的“变体”/“变异”或“突变体”/“突变”形式。

“众多(plurality)”物质，诸如本发明的多肽或多核苷酸，在用于本文时，一般指两种或多种类型或种类的物质的集合。如果两种或多种物质在特定特征方面(诸如在特定氨基酸位置找到的变异氨基酸)彼此不同，那么就说有两种或多种类型或种类的物质。例如，如果除了变体CDR的序列或者除了特定溶剂可及且高度多样性氨基酸位置的变异氨基酸，有两种或多种本发明的多肽基本上相同，或者序列相同，那么就说有众多本发明的多肽。在另一个例子中，如果除了编码变体CDR的序列或者除了编码特定溶剂可及且高度多样性氨基酸位置的变异氨基酸的序列，有两种或多种本发明多核苷酸基本上相同或者序列相同，那么就说有多种本发明的多核苷酸。

本发明提供用于制备和分离结合靶标抗原的新多肽的方法，例如抗体或者抗原结合片段，它们对所选择的抗原具有高亲合力。通过用限制性密码子套组突变(多样化处理)来源抗体轻链可变区和/或重链可变区中的一个或多个选定的氨基酸位置，制备在至少一个CDR序列中具有变异氨基酸的结合物多肽的文库，其中变异氨基酸的类型保持最少(即，19种和更少，15种和更少，10种和更少，8种和更少，6种和更少，4种和更少或者仅2种，但是通常至少2种)，制备大量不同的结合物多肽。氨基酸位置包括溶剂可及的那些位置，例如通过分析来源抗体的结构确定的位置，和/或那些在已知的和/或天然存在的免疫球蛋白多肽中高度变化的位置。本发明的限制性多样化特性提供了进一步优点，即还可以按照从业人员的需要或期望，对额外的氨基酸位置而不是高度变化的和/或溶剂可及的位置进行多样化处理；这些具体实施方案的实施例在本说明书中描述。

在某些具体实施方案中，溶剂可及的和高度变化的氨基酸位置是抗体可变区的CDR区中的那些位置，CDR区选自由CDRL1、CDRL2、CDRL3、CDRH1、CDRH2、CDRH3以及它们的混合组成的组。氨基酸位置各自用编码有限数量氨基酸的限制性密码子套组来突变，对氨基酸的选择一般与在各个位置上通常存在的氨基酸无关。在一些具体实施方案中，当突变CDR区中的溶剂可及的和高度变化的位置时，选择编码2-10个，2-8个，2-6个，2-4个和/或仅2个氨基酸的密码子套组。在一些具体实施方案中，当突变CDR区中的溶剂可及的和高度变化的位置时，选择编码2-19个，2-15个，2-10个，3-9个，4-8个和/或5-7个氨基酸的密码子套组。在一些具体实施方案中，密码子套组编码至少2个，19个或更少，15个或更少，10个或更少，8个或更少，6个或更少，4个或更少个氨基酸。CDR序列还通过改变长度来多样化。例如，对于CDRH3而言，制备具有不同长度的变体CDRH3区，和/或用限制性密码子套组在选定的位置上进行随机化。

用仅编码有限数量氨基酸的密码子套组，设计包括变体CDR的多肽的文库的多样性，以将最少但是足够数量的序列多样性导入到CDR中。在CDR中发生突变的位置的数量最小化，而各个位置上的变异氨基酸被设计成包括有限数量的氨基酸，与通常被认为存在于已知和/或天然存在的CDR的该位置上的氨基酸无关。在某些具体实施方案中，包括至少一个CDR的单个抗体用作来源抗体。令人惊奇的是，用单一来源抗体作为模板，并用异常有限的氨基酸取代定向进行特定位置的多样性，可制备在序列和大小上具有多样性的抗体可变区的文库。

设计抗体可变区的多样性

在本发明的一个方面，制备高质量的抗体可变区文库。文库具有CDR序列的不同的序列的有限多样性，例如，抗体可变区的多样性。文库包括一种或多种抗原的高亲合力结合抗体可变区，该抗原例如DR5和人HER-2。通过选择在单个来源抗体中的溶剂可及的和高度变化的氨基酸位置，并用限制性密码子套组在至少一个CDR中的那些位置上进行突变，设计该文库的多样性。在某些具体实施方案中，限制性密码子套组编码少于19个、15个、10个、8个、6个，或4个氨基酸，或者仅编码2个氨基酸。

一个来源抗体是人源化的抗体4D5，但是多样化的方法可应用于序列已知的其它来源抗体。来源抗体可以是天然存在的抗体、合成抗体、重组抗体、人源化抗体、种系来源的抗体、嵌合抗体、亲合力成熟的抗体，或其抗原结合片段。抗体可从多种哺乳动物物种中获得，包括人、小鼠和大鼠。在一些具体实施方案中，来源抗体是一种在一轮或多轮初步亲合力筛选后，但是在亲合力成熟步骤之前获得的抗体。当在细胞培养物中制备时，可以选择或修饰来源抗体，以提供高产量和高稳定性。

抗体4D5是一种特异于被称作为HER-2(erbB2)的癌症相关抗原的人源化抗体。该抗体包括具有共有框架区的可变区；少数位置在提高人源化抗体亲合力的过程中恢复为小鼠序列。人源化抗体4D5的序列和晶体结构在US 6,054,297、Carter等人，PNAS 89：4285(1992)中有描述，晶体结构示于J Mol.Biol.229：969(1993)和在线：http:

//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/mmdb/mmdbsrv.cgi？form＝6&db＝t&Dopt＝s&uid＝990，http:

//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/mmdb/mmdbsrv.cgi？form＝6&db＝t&Dopt＝s&uid＝991，和http:

//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/mmdb/mmdbsrv.cgi？form＝6&db＝t&Dopt＝s& uid＝992。

在抗体可变区中产生多样性的标准是突变溶剂可及的位置(如上文定义)上的残基。这些位置通常存在于CDR中，并且通常位于蛋白质的外部。在某些具体实施方案中，采用计算机程序，例如InsightII程序(Accelrys，San Diego，CA)，使用抗体的三维模型的配位物(coordinate)来确定溶剂可及的位置。溶剂可及的位置还可以用本领域知晓的算法来确定(例如，Lee和Richards，J.Mol.Biol.55，379(1971)和Connolly，J.Appl.Cryst.16，548(1983))。还可以用适合蛋白质建模的软件和从抗体获得的三维结构信息来确定溶剂可及的位置。可用于这些目的的软件包括SYBYLBiopolymer Module软件(Tripos Associates)。通常在某些具体实施方案中，当一种算法(程序)需要使用者输入大小参数时，用于计算的探针的“大小”被设定为半径约

或更小。此外，在单机上使用软件确定溶剂可及的区域的方法已经在Pacios((1994)“ARVOMOL/CONTOUR：molecular surfaceareas and volumes on Personal Computers”，Comput.Chem.18(4)：377-386；和“Variations of Surface Areas and Volumes in Distinct Molecular Surfaces ofBiomolecules.”J.Mol.Model.(1995)，1：46-53)有描述。

在某些情形下，例如，当参照多肽或来源抗体处于3-D折叠结构中时，通过选择共同形成最小连续区域(minimum contiguous patch)的溶剂可及的残基，进一步精确确定溶剂可及的残基的选择。例如，如图2中所示，紧密的(最小的)连续区域由选自人源化4D5的CDRH1/H2/H3/L1/L2/L3的残基形成。紧密的(最小的)连续膜片可仅包含全部CDR的一部分(例如，2-5个CDR)，例如，CDRH1/H2/H3/L3。可选择地，对于形成这种膜片不起作用的溶剂可及的残基不被用于多样化。通过这种标准进行精细选择，从业人员能够按照期望使被多样化的残基的数量最少。例如，H1中的残基28位于所述区域的边缘，可选择地不被用于多样化。然而，只要期望，这种选择标准还可用于选择被多样化的残基，这些残基并不必然地被认为是溶剂可及的。例如，不被认为是溶剂可及的但是在三维折叠结构中与被认为是溶剂可及的其它残基一起形成连续区域(contiguous patch)的残基被选择用于多样化。这样的例子是CDRL1-29。选择这样的残基对于本领域技术人员来说是显然的，并且其合适程度可以通过试验以及依照有经验的从业人员的需要和期望来确定。

从人源化抗体4D5的晶体结构中确定的各个CDR的溶剂可及的位置如下(残基位置依照Kabat)：

CDRL1：28，30，31，32

CDRL2：50，53

CDRL3：91，92，93，94，96

CDRH1：28，30，31，32，33

CDRH2：50，52，52A，53，54，55，56，57，58。

此外，在一些具体实施方案中，CDRL1的残基29由于包含在包括其它溶剂可及的残基的连续区域中而被选择。在本发明的方法和组合物中，上面列举的全部或部分溶剂可及的位置可以是被多样化的。例如，在一些具体实施方案中，在CDRH2中，仅位置50、52、52a、53-56和58被随机化。

突变位置的另一种选择标准是当比较已知的和/或天然的抗体时，在氨基酸序列中具有可变性的那些位置。高度变化的位置是指位于轻链或重链可变区中的氨基酸的位置，当比较已知的和/或天然的抗体/抗原结合片段时，可变区的该位置上出现许多不同的氨基酸。高度变化的位置可以在CDR区中。CDRH3的位置都被认为是高度变化的。在某些具体实施方案中，如果它们在该位置上具有约2个-约19个(尽管如本说明书所述，该数字可在一定范围内变化)不同的可能氨基酸残基变化，则该氨基酸残基是高度变化的。

一个方面，通过Kabat，Sequence of Proteins of Immunological Interest(National Institutes of Health，Bethesda，Md.，1987和1991)提供的数据，便于确定已知的和/或天然存在的抗体中的高度变化的位置。http: //www.bioinf.org.uk/abs/structures.html中的互联网数据库使得更为广泛地收集和比对轻链(http://www.bioinf.org.uk/abs/lc.align和重链(http: //www.bioinf.org.uk/abs/hc.align序列，便于确定这些序列中的高度变化的位置。已知的和/或天然存在的人源化抗体4D5的轻链和重链中溶剂可及位置的多样化显示在图3和4中。

在本发明的一个方面，突变选自由CDRL1、CDRL2、CDRL3、CDRH1、CDRH2、CDRH3以及它们的混合组成的组的至少一个、两个、三个、四个、五个或全部CDR中的高度变化的和溶剂可及的残基(即用本说明书描述的限制性密码子套组进行随机化处理)。例如，用限制性密码子，多样化处理CDRL3和CDRH3中的至少一个溶剂可及的和/或高度变化的残基，可制备多肽群体。因此，本发明用限制性密码子编码的变异氨基酸替换来源抗体可变区的至少一个CDR的至少一个溶剂可及的和高度变化的位置，提供了大量新的抗体序列。例如，在CDRH1的氨基酸位置28、30、31、32、33和/或34的一个或多个上；和/或在CDRH2的氨基酸位置50、52、52a、53、54、55、56和/或58的一个或多个上；和/或在CDRH3的氨基酸位置95-100、100a、100b和100c的一个或多个上；和/或在CDRL1氨基酸位置28、29、30和/或31的一个或多个上；和/或在CDRL2的氨基酸位置50和/或53的一个或多个上；和/或在CDRL3的氨基酸位置91、92、93、94、95和/或96的一个或多个上，变体CDR或者抗体可变区可包含变异的氨基酸。在另一个实施例，在CDRH1的氨基酸位置28、30、31、32和/或33的一个或多个上；和/或在CDRH2的氨基酸位置50、52、53、54、56和/或58的一个或多个上；和/或在CDRH3的氨基酸位置95-100、100a、100b和100c的一个或多个上；和/或在CDRL1的氨基酸位置28、29、30和/或31的一个或多个上；和/或在CDRL2的氨基酸位置50和/或53的一个或多个上；和/或在CDRL3的氨基酸位置91、92、93、94和/或96的一个或多个上，变体CDR或抗体可变区可包含变异的氨基酸，如本说明书所述。这些位置上的变异氨基酸由限制性密码子套组编码。

如上所述，变异氨基酸由限制性密码子套组编码。密码子套组是一套不同的核苷酸三联体序列，可用于形成用于编码一组期望的氨基酸的寡核苷酸。寡核苷酸套组可以合成，例如，通过固相合成，含有体现所有可能的核苷酸三联体组合的序列，所述核苷酸三联体由密码子提供，该序列将编码一组期望的氨基酸。合成在确定位置上具有所选择的核苷酸“简并性”的寡核苷酸的方法是本领域熟知的。这样的具有确定密码子套组的核苷酸可使用可购买得到的核酸合成仪(购自，例如，Applied Biosystems，FosterCity，CA)合成，或者直接购买得到(例如，购自Life Technologies，Rockville，MD)。因此，具有特定密码子套组的合成的寡核苷酸组通常将包括大量具有不同序列的寡核苷酸，其中所述序列的不同通过整条序列中的密码子套组来建立。如本发明中使用的寡核苷酸具有可以与可变区核酸模板杂交的序列，而且还可以包括用于克隆目的的限制性酶切位点。

一个方面，确定用于占据人源化抗体4D5的CDR中的一个或多个溶剂可及的和高度变化的位置的限制性氨基酸集合(repertoire)(基于从业人员的期望，这可基于大量标准中的任何一种，包括期望在特别位置上有特定氨基酸，期望从特别位置上去除特定氨基酸，期望的文库大小，寻找的抗原结合物的特性等)。

已知抗体重链的CDR3(CDRH3)序列、构象和长度具有多样性。CDRH3常常存在于抗原结合口袋的中间，并且常常参与抗原接触。由于难以预测CDRH3的构象，并且在已知的抗体中，该区域中的氨基酸多样性变化尤其大，因此，对CDRH3的设计与其它CDR的设计分别进行。根据本发明，对CDRH3进行设计，在CDRH3中的特定位置上产生多样性，例如，在位置95、96、97、98、99、100、100a、100b和100c上(例如，按照抗体4D5中的Kabat编号)。在一些具体实施方案中，还使用限制性密码子套组改变CDRH3的长度来产生多样性。长度多样性可以是通过经验确定的适合生成含有大比例抗原结合蛋白质的多肽群体的任何范围。例如，包括变体CDRH3的多肽可制备成含有序列X1-X2-X3-X4-X5-(X6)_n-X7-X8-X9-D-Y(SEQ IDNO：4)，其中X1-X9是由限制性密码子套组编码的氨基酸，而n是各种长度，例如，n＝1-11、5-11或7-11。可能的n值的例子是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10和11。用于在CDRH3序列长度上提供多样性的寡核苷酸的示例性具体实施方案包括在图9A-9D、图20A-L和图23中给出的那些序列。

可以预期，在特定CDR中导入变异氨基酸，如在CDRH3中，可以产生文库的序列多样性，例如，将变体CDR与在抗体其它区域中包括变化的其它CDR组合，特别是轻链或重链可变序列中的其它CDR，可以增加序列多样性。可以预期，通过密码子套组，在轻链或重链序列的CDR中导入其它的变异氨基酸，使编码该组成员的核酸序列进一步被多样化。因此，例如，在一个具体实施方案中，可将来自结合靶标抗原的融合多肽的CDRH3序列与被多样化的CDRL3、CDRH1或CDRH2序列，或者被多样化的CDR的任何组合，进行组合。

应当指出，在某些情形下，框架残基相对于来源抗体或抗原结合片段的序列发生改变，例如，为了反映共有序列或者为了提高稳定性或者用于展示。例如，重链中的框架残基49、93、94或71是可改变的。重链的框架残基93可以是丝氨酸或丙氨酸(其是人共有序列在该位置上的氨基酸)。重链的框架残基94可以由苏氨酸变为精氨酸或赖氨酸，来反映框架共有序列。可被改变的框架残基的另一个例子是重链的框架残基71，在Kabat数据库中发现，该残基在约1970种多肽中是R，在约627种多肽中是V，而在约527种多肽中是A。重链的框架残基49可以是丙氨酸或甘氨酸。此外，可选择地，重链可变区的3′N-末端氨基酸可被去除。可选择地，轻链中的氨基酸位置66上的精氨酸可变为甘氨酸。在一个具体实施方案中，重链的框架残基93是丙氨酸，而重链的框架残基94是精氨酸。

一个方面，本发明提供载体构建体，用于制备以极高的亲合力结合潜在配体的融合多肽。这些构建体包含二聚化结构域，当融合多肽中存在该结构域时，用于增加重链二聚化形成Fab或Fab’抗体片段/部分的二聚化的倾向。这些二聚化结构域可包括，例如，重链铰链区序列(例如，包括TCPPCPAPELLG(SEQ ID NO：5)的序列，其可以存在于融合多肽中)。融合噬菌体多肽中的二聚化结构域产生两组融合多肽(LC/HC-噬菌体蛋白/片段(例如pIII))，从而可以在两组融合多肽之间形成合适的键(例如重链内的二硫键)。含有这种二聚化结构域的载体构建体用于在噬菌体上二价展示抗体可变区，例如本说明书描述的被多样化的融合蛋白。在某些具体实施方案中，各个单体抗体片段(融合多肽)融合到二聚化结构域上时，其内在亲合力没有发生显著改变。在某些具体实施方案中，二聚化导致二价噬菌体展示，加大了噬菌体结合的亲合力(avidity)，而显著降低解离速率(off-rate)，这些都可以通过本领域已知的和本说明书描述的方法来确定。本发明的含有二聚化结构域的载体在二聚化结构域后可以包含或不包含琥珀终止密码子。

可以改变二聚化来实现不同的展示特点。二聚化结构域包含的序列可包括半胱氨酸残基、来自全长抗体的铰链区、二聚化序列例如亮氨酸拉链序列或GCN4拉链序列或者它们的组合。二聚化序列在本领域中是已知的，包括例如GCN4拉链序列(GRMKQLEDKVEELLSKNYHLENEVARLKKLVGERG)(SEQ ID NO：3)。在某些具体实施方案中，二聚化结构域位于的重链可变区或恒定区序列的C-末端，和/或位于重链可变区或恒定区序列与任何病毒外壳蛋白成分序列之间。琥珀终止密码子还存在于二聚化结构域的C-末端之中或之后。在一个具体实施方案中，其中存在琥珀终止密码子，二聚化结构域编码至少一个半胱氨酸和二聚化序列如亮氨酸拉链。在另一个具体实施方案中，其中不存在琥珀终止密码子，二聚化结构域包含单个半胱氨酸残基。

本发明的多肽还被融合到其它类型的多肽上，用于展示变异多肽，或者用于多肽的纯化、筛选或分选、和检测。对于涉及噬菌体展示的具体实施方案而言，本发明的多肽融合到整个或者部分病毒外壳蛋白上。病毒外壳蛋白的例子包括蛋白质PIII、主要外壳蛋白、pVIII、Soc、Hoc、gpD、pVI及其变体。此外，依照本发明的方法制备的变异的多肽可选择地融合到多肽标签或标记上，例如FLAG、多聚组氨酸、gD、c-myc、β-半乳糖苷酶等。

可变区被随机化的文库的制备方法

本领域中已经完全建立了将所选择的氨基酸替代到模板核酸中的方法，在本说明书中描述了一些这样的方法。例如，采用Kunkel的方法，用变异氨基酸定向取代在至少一个CDR区中的溶剂可及的和/或高度变化的位置的氨基酸，从而建立文库。参见如，Kunkel等人，Methods Enzymol.(1987)，154：367-382。在下文的实施例中还描述随机化序列的制备。

寡核苷酸的序列包括一种或多种经设计的限制性密码子套组，用于产生不同长度的CDRH3，或者用于多样化处理CDR中的溶剂可及的和高度变化的位置。密码子套组是一组用于编码期望的变异氨基酸的不同核苷酸的三联体序列。密码子套组可用如下依照IUB码给出的指代特定核苷酸或者等摩尔的核苷酸混合物的符号表示。通常，密码子套组用三个大写字母表示，例如，KMT、TMT等。

IUB CODES

G鸟嘌呤

A腺嘌呤

T胸腺嘧啶

C胞嘧啶

R(A或G)

Y(C或T)

M(A或C)

K(G或T)

S(C或G)

W(A或T)

H(A或C或T)

B(C或G或T)

V(A或C或G)

D(A或G或T)

N(A或C或G或T)

例如，在密码子套组TMT中，T是核苷酸胸腺嘧啶；而M是A或C。该密码子套组表示多种密码子，仅编码有限数量的氨基酸，即酪氨酸和丝氨酸。

寡核苷酸或引物组可用标准方法合成。例如，通过固相合成方法，合成一组寡核苷酸，其含有代表由限制性密码子套组提供的核苷酸三联体的所有可能组合并且将编码期望的有限个氨基酸的序列。在特定位置上以选定的核苷酸“简并性”来合成寡核苷酸在本领域中是熟知的。具有确定密码子套组的这种寡核苷酸组可使用购买得到的核酸合成仪(购自，例如，AppliedBiosystems，Foster City，CA)合成，或者直接购买得到(例如，购自LifeTechnologies，Rockville，MD)。因此，具有特定密码子套组的合成的寡核苷酸组通常将包括大量具有不同序列的寡核苷酸，其中所述序列的差异通过整条序列中的密码子套组来建立。如本发明中使用的寡核苷酸具有可以与CDR(例如，如可变区中所包含的)核酸模板杂交的序列，而且还可以包括用于克隆目的的限制性酶切位点。

在一种方法中，用寡核苷酸介导诱变编码来源或模板多肽的核酸序列，例如4D5的抗体可变区的核酸序列，生成编码变异的氨基酸的核酸序列。这种技术在本领域是熟知的，在如Zoller等人，Nucleic Acids Res.10：6487-6504(1987)中所述。简而言之，通过编码期望的限制性密码子套组的寡核苷酸组与DNA模板的杂交，生成编码变异的氨基酸的核酸序列，其中DNA模板是含有可变区核酸模板序列的单链形式的质粒。杂交后，用DNA聚合酶来合成模板的整个第二互补链，该互补链将掺入寡核苷酸引物，并将含有由该寡核苷酸套组提供的限制性密码子套组。编码其它来源或模板分子的核酸是已知的，或者可容易地确定。

通常，使用长至少25个核苷酸的寡核苷酸。最佳的寡核苷酸具有至少12-15个核苷酸，其在编码突变核苷酸的任一侧上完全与模板互补。这确保所述寡核苷酸将适当地与单链DNA模板分子杂交。寡核苷酸容易用本领域知晓的技术合成，例如Crea等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，75：5765(1978)描述的方法。

用来自噬菌M13载体的那些载体(可购买得到的M13mp18和M13mp19载体是合适的)，或那些如Viera等人，Meth.Enzymol.，153：3(1987)描述的含有单链噬菌体的复制起始点的载体来制备DNA模板。因此，将预被突变的DNA插入到这些载体之一中，制备单链模板。单链模板的制备在同上文的Sambrook等人，第4.21-4.41节中描述。

为了改变天然DNA序列，所述寡核苷酸在合适的杂交条件下与所述单链模板杂交。然后加入DNA聚合酶，通常T7 DNA聚合酶或DNA聚合酶I的Klenow片段，用寡核苷酸作为合成引物，合成模板的互补链。因此形成异源双链核酸分子，使得DNA的一条链编码突变形式的基因1，而其它链(起始模板)编码天然的、未改变序列的基因1。然后将该异源双链核酸分子转化到合适的宿主细胞中，通常是原核生物，例如大肠杆菌JM101中。在培养该细胞后，将细胞铺到琼脂平板上，用以放射性同位素磷32标记的寡核苷酸进行筛选，确定含有突变DNA的细菌克隆。

可以改进上面刚描述的方法来生成同质双链核酸分子，其中质粒的两条链都含有突变。改变如下：如下所述，单链寡核苷酸退火到单链模板上。包括三种脱氧核糖核酸、脱氧核糖腺苷(dATP)、脱氧核糖鸟苷(dGTP)和脱氧核糖胸苷(dTT)的混合物与被称作为dCTP-(aS)(可从Amersham获得)的被修饰的硫代脱氧核糖胞苷组合。将该混合物添加到模板-寡核苷酸复合物中。在将DNA聚合酶加入到该混合物中时，生成除了突变碱基外均与模板相同的DNA链。此外，该新的DNA链含有dCTP-(aS)，而不是dCTP，这防止该链被限制性核酸内切酶消化。在双链的异源双链核酸分子的模板链上，用合适的限制性酶产生缺口后，用ExoIII核酸酶或另一种合适的核酸酶越过含有将被突变的位点的区域来消化模板链。然后终止该反应，使分子仅含有部分单链。存在所有四种脱氧核糖核苷三磷酸、ATP和DNA连接酶时，用DNA聚合酶制备完整的双链DNA同质双链分子。然后将该同质双链分子转化到合适的宿主细胞中。

如先前指出，寡核苷酸组的序列长度足够杂交模板核酸，而且还、但不是必须含有限制性位点。可通过来自噬菌M13载体的那些载体，或那些如Viera等人((1987)Meth.Enzymol.，153：3)描述的含有单链噬菌体的复制起始点的载体来制备DNA模板。因此，必须将预被突变的DNA插入到这些载体之一中，制备单链模板。单链模板的制备在同上文的Sambrook等人，第4.21-4.41节中描述。

按照另一种方法，通过上游和下游的寡核苷酸组来制备文库，各个寡核苷酸组具有大量序列不同的寡核苷酸，通过寡核苷酸序列中的提供密码子套组确定不同的序列。可变区模板核酸序列以及上游和下游的寡核苷酸组可用于聚合酶链式反应中，制备PCR产物的文库。PCR产物被称作为“核酸表达盒”，这是由于使用已经建立的分子生物学技术，可将它们与其它相关或不相关的核酸序列融合，例如，病毒外壳蛋白成分和二聚化结构域。

PCR引物的序列包括一个或多个为CDR区中的溶剂可及的和高度变化的位置而设计的密码子套组。如上文所述，密码子套组是用于编码期望的变异氨基酸的不同核苷酸三联体序列组。

寡核苷酸组可用于聚合酶链式反应中，使用可变区核酸模板序列作为模板，生成核酸表达盒。可变区的核酸模板序列可以是含有靶标核酸序列(即，编码取代所靶向的氨基酸的核酸序列)的轻链或重链免疫球蛋白链的任何部分。可变区的核酸模板序列是具有第一核酸链和互补的第二核酸链的双链DNA分子的一部分。可变区的核酸模板序列含有至少一部分可变区，并且具有至少一个CDR。在某些情形下，可变区的核酸模板序列含有一个以上的CDR。可变区的核酸模板序列的上游部分和下游部分被靶向用于与上游寡核苷酸组和下游的寡核苷酸组的成员杂交。

上游引物组的第一寡核苷酸可与第一核酸链杂交，而下游的引物组的第二寡核苷酸可与第二核酸链杂交。寡核苷酸引物可以包括一个或多个密码子套组，并被设计来与可变区的核酸模板序列的一部分杂交。使用这些寡核苷酸，可以在PCR后将一个或多个密码子套组导入到PCR产物(即，核酸表达盒)。与编码抗体可变区核酸序列区域杂交的寡核苷酸引物包括编码被靶向用于氨基酸取代的CDR残基的部分。

还可以合成上游和下游的寡核苷酸组，以在寡核苷酸序列中包括限制性位点。这些限制性位点便于将核酸表达盒[即，PCR反应产物]插入到具有其它抗体序列的表达载体中。在某些具体实施方案中，对限制性位点进行消化，以便于克隆核酸表达盒，而无需导入外来的核酸序列或去除起始的CDR或框架核酸序列。

可将核酸表达盒克隆到任何合适载体中，用于表达部分或完整的含有产生所定向的氨基酸取代的轻链或重链序列。按照本发明中详细描述的方法，将核酸表达盒克隆到载体中，以生产部分或完整的轻链或重链序列，该部分或完整的轻链或重链序列融合到整个或部分病毒外壳蛋白上(即，产生融合蛋白)，并展示在颗粒或细胞的表面。尽管几类载体是可获得的并可用于实施本发明，但是噬菌粒载体相对容易构建并且容易扩增，因而是便利的。噬菌粒载体通常含有各种成分，包括启动子、信号序列、表型选择基因、复制起始位点和本领域技术人员知晓的其它必需成分。

在另一个具体实施方案中，其中特定的变异氨基酸的组合将被表达，所述核酸表达盒含有能够编码整个或部分重链或轻链可变区的序列，并且能编码变异氨基酸的组合。为了制备含有这些变异氨基酸或变异氨基酸的组合的抗体，如制备在文库中，可将核酸表达盒插入到含有额外的抗体序列的表达载体，例如整个或者部分的轻链可变区或恒定区和重链可变区。这些额外的抗体序列还可融合到其它核酸序列上，例如编码病毒外壳蛋白成分的序列，从而生产融合蛋白。

载体

本发明的一个方面包括可复制的表达载体，该载体包括编码基因融合物的核酸序列，其中基因融合物编码融合蛋白，该融合蛋白包括含CDR的多肽(例如抗体可变区)、或抗体可变区和恒定区，它们被融合到整个或部分的病毒外壳蛋白上。还包括多种可复制的表达载体的文库，该载体包括编码大量不同融合蛋白的大量基因融合物，融合蛋白包括大量用上述不同序列制备的融合多肽。该载体包括多种成分，并被构建以允许抗体可变区在不同载体之间移动和/或用于以不同的形式展示融合蛋白。

载体的例子包括噬菌体载体和噬菌粒载体(本说明书对其进行图解说明并在上文中进行了更为详细的描述)。噬菌体载体通常具有噬菌体复制起点，以进行噬菌体复制并形成噬菌体颗粒。噬菌体通常是丝状噬菌体，例如M13、fl、fd、Pf3噬菌体或其衍生物，或者lambdoid噬菌体，例如λ、21、phi80、phi81、82、424、434等，或其衍生物。

病毒外壳蛋白的例子包括感染性蛋白质PIII(有时也被称作p3)、主要外壳蛋白PVIII、Soc(T4)、Hoc(T4)、gpD(λ噬菌体的)、噬菌体小外壳蛋白(minor coat protein)6(pVI)(丝状噬菌体；J Immunol Methods.1999年12月10日；231(1-2)：39-51)、M13噬菌体主要外壳蛋白变体(P8)(Protein Sci 2000年4月；9(4)：647-54)。融合蛋白可在噬菌体表面上展示，而合适的噬菌体系统包括M13KO7辅助噬菌体、M13R408、M13-VCS和Phi X 174、pJuFo噬菌体系统(J Virol.2001年8月；75(15)：7107-13.v)、超级噬菌体(hyperphage)(Nat Biotechnol.2001年1月；19(1)：75-8)。在某些具体实施方案中，辅助噬菌体是M13KO7，而外壳蛋白是M13噬菌体基因III的外壳蛋白。在某些具体实施方案中，宿主是大肠杆菌，和大肠杆菌的蛋白酶缺陷株。载体，例如fth 1载体(Nucleic Acids Res.2001年5月15日；29(10)：E50-0)可用于表达融合蛋白。

表达载体还具有融合到编码含有CDR的融合多肽(例如抗体的各个亚单位，或其片段)的DNA上的分泌信号序列。该序列通常直接位于编码融合蛋白的基因的5′端，因此将被转录在融合蛋白的氨基端。然而，在某些情形下，信号序列被证实不在被分泌蛋白质的编码基因的5′端。该序列靶向这样的蛋白质，该序列附着于该蛋白质，跨越细菌细胞的内膜。编码信号序列的DNA以限制性核酸内切酶片段的形式，从任何编码具有信号序列的蛋白质的基因中获得。合适的原核生物信号序列从编码，例如LamB或OmpF(Wong等人，Gene，68：1931(1983)、MalE、PhoA的基因和其它基因中获得。在一个具体实施方案中，用于实施本发明的原核生物信号序列是Chang等人，Gene 55：189(1987)描述的大肠杆菌热稳定性肠毒素II(STII)的信号序列，和/或malE。

如上文指出，载体通常还包括启动子来起始融合多肽的表达。在原核生物载体中，最常用的启动子包括lac Z启动子系统、碱性磷酸酶pho A启动子(Ap)、噬菌体l_PL启动子(温度敏感型启动子)、tac启动子(trp-lac杂合启动子，受lac阻遏物的调控)、色氨酸启动子和噬菌体T7启动子。对启动子的概述参见同上文的Sambrook等人，第17节。尽管这些启动子是最常用的启动子，也可以使用其它的合适启动子。

所述载体还包括其它核酸序列，例如，编码gD标记、c-Myc表位、多聚组氨酸标记、荧光蛋白(例如GFP)或β-半乳糖苷酶蛋白的序列，这些标记可用于检测或纯化在噬菌体或细胞的表面上表达的融合蛋白。编码例如gD标记的核酸序列还可用于阳性或阴性选择表达融合蛋白的细胞或病毒。在一些具体实施方案中，gD标记被融合到未与病毒外壳蛋白成分融合的抗体可变区上。编码例如多聚组氨酸标记的核酸序列用于通过免疫组织化学确定包括结合特定抗原的抗体可变区的融合蛋白。用于检测抗原结合的标记可融合到未与病毒外壳蛋白成分融合的抗体可变区上，或融合到与病毒外壳蛋白成分融合的抗体可变区上。

用于实施本发明的载体的另一种有用成分是表型选择基因。典型的表型选择基因是那些编码使宿主细胞具有抗生素抗性的蛋白质的基因。作为例证，氨苄青霉素抗性基因(ampr)，和四环素抗性基因(tetr)容易用于该目的。

所述载体还包括含有独特的限制性位点和阻抑性终止密码子的核酸序列。独特的限制性位点可用于将抗体可变区在不同的载体和表达系统之间移动，尤其用于在细胞培养物中制备全长抗体或抗原结合片段。阻抑性终止密码子用于控制融合蛋白的表达水平，且便于纯化可溶性的抗体片段。例如，琥珀终止密码子在supE宿主中被阅读成Gln，可以进行噬菌体展示，而在非supE宿主中，琥珀终止密码子被阅读成终止密码子，生成未融合到噬菌体外壳蛋白上的可溶抗体片段。这些合成序列在载体中被融合到一种或多种抗体可变区上。

有时，使用容易将从载体系统中去除编码感兴趣的抗体序列，例如具有变异氨基酸的CDR的核酸，并插入到另一个载体系统中的载体系统，这是有益的。例如，将适当的限制性位点工程化到载体系统中，便于去除编码具有变异氨基酸的抗体或抗体可变区的核酸序列。将限制性序列选择成载体中的独特序列，便于有效切除并连接到新载体中。然后用载体表达抗体或抗体可变区，而无需外来的融合序列，例如病毒外壳蛋白或其它序列标记。

在编码抗体可变区或恒定区(基因1)和病毒外壳蛋白成分(基因2)的核酸之间，插入编码终止密码子的DNA，这种终止密码子包括UAG(amber)、UAA(ocher)和UGA(opel)(Microbiology，Davis等人，Harper&Row，New York，1980，237，245-47和374)。在野生型宿主细胞中表达的终止密码子导致合成未连接基因2蛋白质的基因1蛋白产物。然而，在阻遏物宿主细胞中培养时时，结果合成可检测到的融合蛋白质。这种阻遏物宿主细胞(suppressor host cell)是熟知的并被描述在例如大肠杆菌阻遏物株(Bullock等人，BioTechniques 5：376-379(1987))中。任何可接受的方法可用于将这样的终止密码子插入到编码融合蛋白的mRNA中。

阻抑性密码子(suppressible codon)可以插入到编码抗体可变区或恒定区的第一基因和编码噬菌体外壳蛋白的至少一部分的第二基因之间。可替代地，通过替换抗体可变区的最后一个氨基酸的三联体或噬菌体外壳蛋白的第一个氨基酸，将阻抑性终止密码子插入到邻近融合位点的位置上。阻抑性终止密码子可以位于二聚化结构域的C-末端或之后。当含有阻抑性密码子的质粒在阻遏物宿主细胞中增殖时，生成可检测到的含有该多肽和外壳蛋白的融合多肽。当该质粒在非阻遏物宿主细胞中增殖时，由于在插入的阻抑性三联体UAG、UAA或UGA处终止，合成基本上未与噬菌体外壳蛋白融合的抗体可变区。在非阻遏物宿主细胞中，由于缺乏与其融合并将其锚定在宿主细胞膜上的噬菌体外壳蛋白，抗体可变区被合成并从宿主细胞中分泌出。

在一些具体实施方案中，被多样化(被随机化)的CDR可在模板序列(在此称作为“终止模板”)中可具有被工程化的终止密码子。由于掺入了包括感兴趣的变异氨基酸的序列的寡核苷酸，可成功地修复模板序列中的终止密码子，上述特征可用于检测和选择被成功多样化的序列。该特征将在下文的实施例中被进一步阐明。

轻链和/或重链抗体可变区或恒定区还可融合到额外的肽序列上，额外的肽序列使得一种或多种融合多肽在病毒颗粒或细胞的表面上发生相互作用。这些肽序列在此被称作为“二聚化结构域”。二聚化结构域包含至少一条或多条二聚化序列，或至少一条包括半胱氨酸残基的序列，或者包括这两种序列。合适的二聚化序列包括具有两亲性α螺旋的蛋白质的那些序列，在该序列中，疏水性残基被有规律地间隔，并通过各个蛋白质的疏水性残基的相互作用形成二聚物；这种蛋白质和蛋白质部分包括，例如亮氨酸拉链区。二聚化结构域还包含一个或多个半胱氨酸残基(例如以在二聚化结构域中以包含抗体铰链区序列的方式提供)。半胱氨酸残基通过形成一个或多个二硫键来产生二聚化。在一个具体实施方案中，其中终止密码子存在于二聚化结构域之后，二聚化结构域包括至少一个半胱氨酸残基。在一些具体实施方案中，二聚化结构域位于抗体可变区或恒定区与病毒外壳蛋白成分之间。

在某些情形下，所述载体编码单链形式的单一抗体-噬菌体多肽，含有例如，融合到外壳蛋白上的重链和轻链可变区。在这种情形下，所述载体被认为是“单顺反子”，在某一启动子的控制下表达一种转录本。例如，载体可利用启动子(例如碱性磷酸酶AP)或Tac启动子)起始表达编码VL和VH结构域的单顺反子序列，在VL和VH结构域之间有一个接头肽。该顺反子序列可以在5’端连接信号序列(例如大肠杆菌malE或热稳定性肠毒素II(STII)信号序列)，以及在3’端连接整个或部分病毒外壳蛋白(例如噬菌体pIII蛋白)。由该具体实施方案的载体编码的融合多肽在本说明书中被称作为“ScFv-pIII”。在一些具体实施方案中，载体进一步在其3’端，在第二可变区序列(例如，VH)和病毒外壳蛋白序列之间，包含编码二聚化结构域(例如亮氨酸拉链)的序列。包括二聚化结构域的融合多肽能够二聚化形成两个scFv多肽的复合物(在本说明书中称作为“(ScFv)2-pIII)”)。

在其它情形下，重链和轻链的可变区作为分别的多肽表达，因此载体是“双顺反子”，可以表达分开的转录本。在这些载体中，使用合适的启动子，例如Ptac或PhoA启动子，起始表达双顺反子信使物。第一个顺反子编码例如轻链可变区和恒定区，在5’端连接信号序列，例如大肠杆菌malE或热稳定性肠毒素II(STII)信号序列，和在3’端连接编码标记序列的核酸序列，例如gD标记的核酸序列。第二个顺反子编码例如重链可变区和恒定区CH1，在5’端连接信号序列，例如大肠杆菌malE或热稳定性肠毒素II(STII)信号序列，和在3’端连接整个或部分的病毒外壳蛋白。

在提供双顺反子信使物并用于展示F(ab’)₂-pIII载体的一个具体实施方案中，合适的启动子，例如Ptac或PhoA(AP)启动子，起始编码轻链可变区和恒定区的第一个顺反子的表达，其可操作地在5’端连接信号序列，如大肠杆菌malE或热稳定性肠毒素II(STII)信号序列，而在3’端连接编码标记序列如gD标记的核酸序列。第二个顺反子编码如重链可变区和恒定区，其可操作地在5’端连接信号序列，例如大肠杆菌malE或热稳定性肠毒素II(STII)信号序列，而在3’端具有包括IgG铰链区序列和亮氨酸拉链序列的二聚化结构域，接着为病毒外壳蛋白至少一部分。

融合多肽的展示

含CDR的多肽(例如，抗体可变区的)融合多肽以各种形式展示在细胞、病毒或噬菌粒的表面上。这些形式包括单链Fv片段(scFv)、F(ab)片段和这些片段的多价形式。例如，多价形式包括ScFv、Fab或F(ab’)的二聚物，在此分别称作为(ScFv)₂、F(ab)₂和F(ab’)₂。多价的展示形式在某些情况下是有利的，其部分原因在于它们具有一个以上的抗原结合位点，从而一般可以鉴定亲合力较低的克隆并且还可以在选择操作中更为有效地分选稀有的克隆。

在噬菌体表面上展示包括抗体片段的融合多肽的方法在本领域是熟知的，在专利申请WO 92/01047和本说明书中有描述。其它专利公开WO92/20791；WO 93/06213；WO 93/11236和WO 93/19172中描述了相关方法，并在此引入作为参考。其它出版物已经报道在噬菌体表面上展示具有抗多种抗原的人为重排的V基因集合的抗体(例如，H.R.Hoogenboom & G.Winter，J.Mol.Biol.227 381-388(1992)；以及如WO 93/06213和WO 93/11236中所述)。

当构建载体用于以scFv形式展示时，该载体包括编码抗体轻链可变区和抗体重链可变区的核酸序列。典型地，编码抗体重链可变区的核酸序列融合到病毒外壳蛋白成分上。所述抗体可变区之一或两者在至少一个CDR区中具有变异氨基酸。编码抗体轻链可变区的核酸序列通过编码肽接头的核酸序列连接到抗体重链可变区上。肽接头通常含有约5-15个氨基酸。可选择地，编码如用于纯化或检测的标记的其它序列被融合到编码抗体轻链可变区或抗体重链可变区或者两者的核酸序列的3’末端上。

当构建载体用于F(ab)展示时，该载体包括编码抗体可变区和抗体恒定区的核酸序列。编码轻链可变区的核酸被融合到编码轻链恒定区的核酸序列上。编码抗体重链可变区的核酸序列被融合到编码重链恒定区CH1的核酸序列上。典型地，编码重链可变区和恒定区的核酸序列被融合到编码整个或部分病毒外壳蛋白的核酸序列上。抗体轻链可变区或者重链可变区之一或两者在至少一个CDR中具有变异氨基酸。在一些具体实施方案中，重链可变区和恒定区与至少一部分病毒外壳蛋白一起作为融合物表达，而轻链可变区和恒定区与重链病毒衣壳融合蛋白分开表达。重链和轻链相互关联，它们通过共价键或非共价键连接。可选择地，编码如用于纯化或检测的多肽标记的其它序列被融合到编码抗体轻链恒定区或抗体重链恒定区或它们两者的核酸序列的3’端上。

在一些具体实施方案中，如F(ab)₂二聚物或F(ab’)₂二聚物的二价成分用于在颗粒表面上展示具有变异氨基酸取代的抗体片段。已经发现，在液相噬菌体抗原结合分析中，F(ab’)₂二聚物通常具有与F(ab)二聚物相同的亲合性，但是由于F(ab’)₂的亲合力(avidity)较高，其解离速率下降。二价形式(例如，F(ab’)₂)可以确定亲和力较低的克隆，并且还可以在选择操作中更为有效地分选稀有的克隆，因此是特别有用的形式。

将载体导入宿主细胞中

将按照本发明所述构建的载体到宿主细胞中，用于扩增和/或表达。可用标准的转化方法将载体导入宿主细胞，包括电穿孔、磷酸钙沉淀等。如果载体是一种感染性颗粒，例如病毒，则载体本身能够进入宿主细胞。转染含有编码基因融合物的可复制表达载体的宿主细胞，并按照标准程序制备噬菌体颗粒，能够获得在表面展示融合蛋白的噬菌体颗粒。

用多种方法将可复制的表达载体导入宿主细胞中。在一个具体实施方案中，用WO/00106717中描述的电穿孔方法，将载体导入细胞中。在标准培养肉汤培养基中培养细胞，可选择地在约37℃下培养约6-48小时(或者达到OD₆₀₀＝0.6-0.8)，然后将肉汤培养基离心，去除上清液(如倒出)。在一些具体实施方案中，初步纯化包括将细胞沉淀重新悬浮在缓冲液(例如1.0mMHEPES pH7.4)中，接着再离心并去除上清液。将得到的细胞沉淀重新悬浮在被稀释的甘油(例如5-20％v/v)中，再重新离心产生细胞沉淀，去除上清液。将细胞沉淀重新悬浮在水或被稀释的甘油中，达到期望的浓度，获得最终的细胞浓度。

在某些具体实施方案中，受体细胞是本发明的电穿孔感受态大肠杆菌菌株，为大肠杆菌菌株SS320(Sidhu等人，Methods Enzymol.(2000)，328：333-363)。在足以将致育附加体(fertility episome)(F′质粒)或XL1-BLUE转移到MC1061细胞中的条件下，用XL1-BLUE细胞突变MC1061细胞来制备菌株SS320。菌株SS320已经于1998年6月18日保藏在美国典型培养物保藏中心(ATCC)，10801 University Boulevard，Manassas，Virginia USA，保藏号为98795。能够使噬菌体在菌株中复制的任何F′附加体都可用于本发明。合适的附加体可以从ATCC保藏的菌株中获得或者购买得到(CJ236、CSH18、DHF′、JM101、JM103、JM105、JM107、JM109、JM110)、KS1000、XL1-BLUE、71-18和其它的)。

在电穿孔过程中使用较高的DNA浓度(约10X)，提高转化效率，并且增加转化到宿主细胞中的DNA的量。使用高的细胞浓度还提高效率(约10X)。被转化的DNA量越大，生成的文库越大，具有更大的多样性，在组合文库中提供更多的独特成员。通常在含有抗生素的溶液中进行培养来选择被转化的细胞。

选择(分选)和筛选结合选定靶标的结合物

从方法学上进行各种改变和变化，使用噬菌体展示来确定靶标抗原的结合物，这在本领域已经充分建立。一种方法涉及构建一族不同的可复制载体，该载体含有可操作地连接到编码融合多肽的融合基因上的转录调控元件，转化合适的宿主细胞，培养被转化的细胞，产生在表面上展示融合多肽的噬菌体颗粒，接着进行选择或分选的操作，将重组噬菌体颗粒与靶标抗原接触，使得颗粒群体的至少一部分结合到靶标上，目的在于相对于在选择操作中不结合的颗粒，增加和富集结合颗粒亚组。通过感染宿主细胞，例如新鲜的XL1-Blue细胞，扩增所选择的集合，用于用相同靶标、以不同或相同的严格条件进行另一轮分选。然后用靶标抗原对生成的变体集合进行筛选，确定高亲合力的新结合蛋白。这些高亲合性的新结合蛋白可用作治疗剂，作为拮抗剂或激动剂，和/或作为诊断和研究试剂。

可在噬菌体、噬菌粒或细胞的表面上表达融合多肽，例如包括变异氨基酸的抗体可变区，然后选择和/或筛选融合多肽组中的成员结合靶标抗原的能力，通常是感兴趣的抗原。选择结合靶标的结合物的操作还包括分选对抗体可变区具有亲合力的一类蛋白质，例如与在噬菌体上展示的抗体或抗体片段结合的蛋白质L或标记特异性抗体，其可用于富集展示正确折叠的抗体片段(融合多肽)的文库成员。

例如DR5受体和HER-2等的靶标蛋白质可分离自天然来源，或通过本领域已知程序用重组方法制备得到。人和鼠的DR5的序列在表1中提供。在Franklin MC.Carey KD.Vajdos FF.Leahy DJ.de Vos AM.Sliwkowski MX.，Insights into ErbB signaling from the structure of the ErbB2-pertuzumabcomplex，Cancer Cell.5(4)：317-28，2004中描述了HER-2 ECD的序列和制备方法。HER-2的胞外结构域氨基酸23-646的序列在Protein DataBankRecord 1S78(2004)中提供。靶标抗原包括许多具有治疗意义的分子。

可使用多种选择(分选)亲合力的策略。一个例子是固相支持(solid-support)法或平板分选法或固定靶向分选法。另一个例子是液相结合法。

对于固相支持法来说，靶标蛋白质可以连接到合适的固体或半固体基质上。这种基质在本领域中是已知的，例如琼脂糖珠、丙烯酰胺珠、玻璃珠、纤维素、各种丙烯酸聚合物、羟烷基异丁烯酸酯凝胶、聚丙烯酸和聚甲基丙烯酸共聚物、尼龙、中性载体和离子载体等。可用所述方法将靶标蛋白质连接到基质上，例如，通过Methods in Enzymology，44(1976)描述的方法或通过本领域已知的其它手段

在将靶标抗原连接到基质上后，在适合噬菌体颗粒群体的至少一个亚组结合被固定的靶标抗原的条件下，将被固定的靶标抗原与表达融合多肽的文库接触。通常，包括pH、离子强度、温度等的条件将模拟生理条件。通过洗涤，将结合被固定的靶标的颗粒(“结合物”)与那些不结合靶标的颗粒分离开。对洗涤条件进行调整，去除除了高亲合力结合物之外的所有其它成分。通过多种方法将结合物从被固定的靶标上分离。这些方法包括用野生型配体进行竞争性分离(例如过量的靶标抗原)、改变pH和/或离子强度，以及本领域的已知方法。结合物选择通常包括用合适的洗脱物质，从亲合性基质上洗脱，如用酸例如0.1M HCl或者配体。使用浓度逐渐升高的配体进行洗脱，能够洗脱亲合力逐渐增大的被展示的结合分子。

分离结合物，用作为结合物的病毒颗粒(以及如果需要，例如当病毒颗粒是噬菌粒时，可以是辅助噬菌体)感染细胞，在合适的宿主细胞中重新扩增，在适合扩增展示期望的融合多肽的颗粒的条件下，培养宿主细胞。然后收集噬菌体颗粒，重复选择操作一次或多次，直到靶标抗原的结合物得到富集。可以采用任意数轮的选择或分选。选择或分选程序之一涉及分离结合物，其结合一般的亲合性蛋白质或者蛋白质L或在被展示的多肽中存在的多肽标记的抗体，例如gD蛋白质或多聚组氨酸标记的抗体。在一轮或多轮的选择或分选中，可以包括反向选择，以分离对一种或多种非靶标抗原也有不期望结合的结合物。

本发明的一个方面涉及使用被称作为“液体结合法(solution-bindingmethod)”的新选择方法，对本发明的文库进行选择。本发明可以进行液相分选，相对于传统的液体分选法，该方法的效率得到极大提高。液体结合方法可以用于从随机文库中寻找初始结合物，或从设计用于改进特定结合克隆或者克隆群体的文库中寻找改进的结合物。该方法包括将大量多肽与用标记分子标记或融合的靶标抗原接触，所述多肽例如那些在噬菌体或噬菌粒颗粒上展示的多肽(文库)。所述标记可以是生物素，或对特异性结合物而言能使用的其它成分。通过在第一液体结合相中使用浓度渐减的被标记的靶标抗原，来改变液相的严格程度。为了进一步提高严格程度，在第一溶液相中与标记靶标初步结合后，在第一溶液结合相后，使用具有高浓度的未被标记的靶标抗原的第二溶液相。通常，在第二相(如果包括)中使用比被标记的靶标高100-1000倍的未被标记的靶标。第一液相的温育时间在数分钟到1～2小时之间变化，或者更长时间以达到平衡。在该第一相中使用较短的结合时间，可能偏向或选择具有高结合速率(on rate)的结合物。第二相中的温育的时间和温度可以改变，以提高严格程度。这提供了偏向选择解离速率低的结合物。在将多数多肽(在噬菌体/噬菌粒颗粒上展示的)与靶标抗原接触后，将结合到被标记的靶标上的噬菌体或噬菌粒颗粒与未结合的噬菌体分离开。通过与被标记的靶标成分接触，并使其与被标记的靶标成分短暂(例如，2-5分钟)结合的分子结合，将来自结合液相的颗粒-靶标混合物分离。被标记的靶标抗原的初始浓度约0.1nM-约1000nM。洗脱被结合的颗粒，进行增殖，用于下一轮分选。在某些具体实施方案中，进行多轮分选，每轮分选使用浓度更低的被标记的靶标抗原。

例如，初步分选或选择使用约100-250nM的被标记的靶标抗原，其应当足以捕获大范围的亲合性，尽管该因素可以通过经验确定和/或满足从业人员的期望。在第二轮选择中，使用约25-100nM的被标记的靶标抗原。在第三轮选择中，使用约0.1-25nM的被标记的靶标抗原。例如，为了改进100nM结合物的亲合力，可以从20nM开始，然后接着进展到使用5和1nM标记的靶标，然后，使用浓度更低的被标记的靶标抗原，例如约0.1nM。

常规液体分选涉及使用珠，如链霉抗生物素包被的珠，采用珠对于使用来说是非常麻烦的，并且通常会导致很低的噬菌体结合物回收效率。使用珠的常规液体分选需要花费2-5分钟以上的时间，其在高通量自动化操作方面的可行性低于上述的本发明。

如本说明书所述，使用固相支持法(solid support)和液体分选法(solutionsorting method)来分离具有期望特性的结合物是有利的。在用靶标抗原选择/分选数轮后，一般从所选择的集合中筛选个别克隆来确定具有期望特性/特征的特定结合物。在一些具体实施方案中，用自动系统进行筛选操作，用于高通量筛选文库候选物。

下文描述了两种主要的筛选方法。但是，本发明的方法中还可以使用本领域知晓的其它方法。第一个筛选方法包括使用被固定的靶标抗原，进行噬菌体ELISA分析，提供用于从非结合克隆中确定特定的结合克隆。通过在用靶标包被的孔以及用BSA或其它非靶标蛋白质包被的孔中同时分析克隆来确定特异性。该分析对于高通量筛选来说是自动化的。

一个具体实施方案提供从抗体可变区文库中选择结合特异性靶标抗原的抗体可变区的方法，生成包括大量多肽的可复制表达载体的文库；在适合结合的条件下，将文库与靶标抗原和至少一种非靶标抗原接触；分离将文库中的多肽结合物与非结合物分开；确定结合靶标抗原而不结合非靶标抗原的结合物；将结合物从靶标抗原上洗脱下来；和扩增可复制的表达载体，该载体包括结合特定抗原的多肽结合物。

第二个筛选分析方法是一种亲合性筛选分析法，提供用于以高通量的方式从低亲合力克隆中筛选具有高亲合力的克隆。在该分析方法中，对各个克隆进行分析时，在短暂(例如，5-15分钟)应用于靶标包被的孔之前，先用某一浓度的靶标抗原温育一段时间(例如，30-60分钟)或者不温育。用通常的噬菌体ELIS方法测定结合的噬菌体，例如使用抗M13 HRP偶联物。两个孔的结合信号的比率指示亲合性，一个孔用靶标抗原预先温育，另一个孔没用靶标抗原预先温育。在第一次温育时，对靶标抗原浓度的选择取决于感兴趣的亲合力的范围。例如，如果期望获得亲合力高于10nM的结合物，通常在第一次温育时使用100nM的靶标抗原。一旦从特定的某轮分选(选择)中发现了结合物，用亲合力筛选分析法对这些克隆进行筛选，确定具有较高亲合力的结合物。

上述的任何分选/选择方法的组合可以与所述筛选方法联合应用。例如，在一个具体实施方案中，首先通过结合到被固定的靶标抗原上来选择多肽结合物。对结合被固定的靶标抗原的多肽结合物进行扩增，筛选结合到靶标抗原上而不结合非靶标抗原的结合物。对特异性结合靶标抗原的多肽结合物进行扩增。通过与一定浓度的被标记的靶标抗原接触而形成复合物，其中被标记的靶标抗原的浓度范围约0.1nM-约1000nM，通过与结合在靶标抗原上的标记结合的试剂接触来分离复合物，从这些多肽结合物中筛选亲合力较高的结合物。然后从被标记的靶标抗原上洗脱多肽结合物，可选择地，重复数轮选择，每次使用较低浓度的被标记的靶标抗原。然后用多种本领域已知的多种方法，(本说明书中已描述了一些这样的方法)，从用这种选择方法分离的高亲合力的多肽结合物中筛选高亲合力的结合物。

这些方法提供用于发现亲合力高的克隆，而无需对大量克隆进行长时间的复杂竞争亲合分析。对许多克隆进行复杂分析的重要方面通常是从选择中寻找最好的克隆的极大障碍。该方法在改进亲合力方面是特别有用的，其中从选择操作中能够获得具有相似亲合力的多种结合物。不同克隆在噬菌体或噬菌粒上的表达/展示的效率差别很大。以较高效率表达的那些克隆被回收的机会较大。也就是说，变体的展示或表达水平不同，使得在选择中产生偏差。本发明的溶液结合分选方法改进了选择操作，用于寻找亲合性高的结合物。该方法是一种亲合力筛选分析法，可以快速而容易地筛选最好的结合物，具有显著优点。

对抗体或抗原结合片段的功能活性做进一步选择，例如，对拮抗剂或激动剂活性进行选择。例如，选择能够抑制HER-2的酪氨酸磷酸化、癌症细胞增殖或诱导癌症细胞凋亡的抗HER-2抗体。确定和测定这些活性的分析方法被描述在如WO98/17797中。

此外，选择能够诱导癌症细胞凋亡和/或抑制炎症细胞功能的抗DR5抗体。在其它具体实施方案中，选择能够与Apo-2L竞争结合DR5的抗DR5的抗体。在其它具体实施方案中，选择能够结合鼠和/或猕猴DR5的抗人DR5的抗体。用本领域已知的方法，例如DNA片段化(参见，例如Marsters等人，Curr.Biology，6：1669(1996))、胱天蛋白酶失活、DR5结合(参见，如1998年11月19日公开的WO 98/51793)等方法，确定生物学活性。通过鉴定是否存在胞质浓缩、浆膜微绒毛丢失、细胞核破碎、染色体DNA降解或者线粒体功能缺失来测定凋亡。例如可以通过本领域知晓的细胞活性分析(例如Alamar蓝分析或者MTT分析)、FACS分析、胱天蛋白酶活化、DNA片段化(参见例如，Nicoletti等人，J.Immunol.Methods，139：271-279(1991)，以及多聚ADP核糖聚合酶、“PARP”、断裂分析来确定和测定这种活性。

在一个具体实施方案中，凋亡分析方法包括在96孔的组织培养板中制备对照标准品和抗DR5的抗体的两倍连续稀释液。对Apo-2配体(氨基酸114-281，在PCT US00/17579中描述)进行测试，用于比较。将Colo-205的(每孔20000个细胞)人结肠癌细胞(ATCC)接种到96孔平板中。该平板在37℃下温育24小时。往孔中加入AlamazBlue(Trek Diagnostic Systems，Inc.)，在24小时的温育时间内持续3小时。用96孔荧光计，在530nm的激发和590nm的发射条件下读取荧光数值。该结果用相对荧光单位(RFU)表示。

在通过结合到靶标抗原上和/或功能性分析鉴定结合物后，提取核酸。然后用所提取的DNA直接转化大肠杆菌宿主细胞，或可替代地，扩增编码序列，例如使用合适的引物进行，并通过任何的典型测序方法进行测序。结合物的可变区DNA用限制性酶消化，然后插入到用于表达蛋白质的载体中。

按照本发明的方法制备包括具有有限序列多样性的CDR的多肽的群体，该群体用于分离抗多种靶标的结合物，这些靶标包括图11、15、21A和24A中所示的那些序列。这些结合物包含一个或多个包括不同序列的变体CDR，变体CDR用有限数量的密码子制备。在一些具体实施方案中，变体CDR是具有序列多样性的CDRH3，序列多样性是由于限制性密码子套组进行氨基酸取代和/或改变CDRH3长度导致氨基酸插入而产生。用于制备本发明的融合多肽的示例性寡核苷酸包括在图9A-D、图20A-L和图23中所列举的那些。可以将一个或多个变体CDR进行组合。在一些具体实施方案中，仅CDRH3被多样化。在其它具体实施方案中，两个或多个重链CDR，包括CDRH3，是变异的。在其它具体实施方案中，除了CDRH3外的一个或多个重链是变异的。在一些具体实施方案中，至少一个重链和至少一个轻链CDR是变异的。在一些具体实施方案中，CDRH1、H2、H3、L1、L2和L3中的至少1个、2个、3个、4个、5个或者全部是变异的。

在某些情形下，将一个或多个被多样化的轻链CDR与新结合物组合是有利的，该新结合物分离自包括一个或多个被多样化的重链CDR的多肽的群体。该方法可被称作为两步法。两步法的一个例子包括，首先在一个或多个文库中确定结合物(通常是亲合力较低的结合物)，该文库是通过随机化一个或多个CDR而制备的，其中各个文库中被随机化的CDR是不同的，而相同的CDR被随机化，CDR被随机化来产生不同的序列。例如通过诱变技术例如Kunkel的方法，或通过将新的轻链文库克隆(剪粘(例如将不同的CDR序列连接在一起))到仅有确定轻链的现有重链结合物中，对来自重链文库的结合物进行随机化处理，在轻链CDR中产生CDR多样性。然后用一种或多种靶标对该集合进行进一步分选，确定亲合力升高的结合物。例如，分选H1/H2/H3中获得的结合物(例如，亲合力低的结合物)可以与L1/L2/L3多样性文库融合，替换起始的确定的L1/L2/L3，其中新文库用感兴趣的靶标进行进一步分选，获得另一个组结合物(例如，亲合力高的结合物)。鉴定新的抗体序列，其对多种靶标抗原的任何一种具有较高的结合亲合力。

在一些具体实施方案中，对包括本发明的多肽的文库进行大量分选循环，其中每轮分选包括将从前一轮获得的结合物与不同于前一轮的靶标抗原的靶标抗原接触。优选地，但是不是必须，靶标抗原在序列上是同源的，例如相关但是不同的多肽家族的成员，例如，但是不限于细胞因子(例如，α干扰素亚型)。

制备包括含有变体CDR的多肽的文库

通过突变抗体可变区的至少一个CDR中的溶剂可及的和/或高度变化的位置，制备变体CDR的多肽的文库。部分或全部的CDR用本发明的方法突变。在一些具体实施方案中，优选通过突变CDRH1、CDRH2和CDRH3中的位置形成单个文库，或突变CDRL3和CDRH3中的位置形成单个文库，或通过突变CDRL3和CDRH1、CDRH2和CDRH3中的位置形成单个文库，制备多样性抗体文库。

制备抗体可变区的文库，例如，在CDRH1、CDRH2和CDRH3中的溶剂可及的和/或高度变化的位置上存在突变的文库。制备另一个文库，在CDRL1、CDRL2和CDRL3中存在突变。这些文库相互组合使用，制备具有期望亲合力的结合物。例如，在一轮或数轮选择结合靶标抗原的重链文库后，将轻链文库替换到该重链结合物群体中，用于进一步选择，以提高结合物的亲合性。

在一个具体实施方案中，在重链序列可变区的CDRH1、CDRH2和/或CDRH3区中，和/或轻链序列可变区的CDRL3区中，用有限组变异氨基酸取代起始氨基酸来制备文库。按照本发明，该文库含有大量的抗体序列，其中序列多样性主要存在于重链序列的CDRH3区中。

一个方面，建立人源化抗体4D5的序列，或人源化抗体4D5序列的框架氨基酸序列的文库。在某些具体实施方案中，用图8中所列“YSGR-A”文库的氨基酸套组至少取代CDRH1的残基28和30-33，CDRH2的残基50、52-54、56和58、CDRH3的残基95、96、97、98、99、100、100a、100b和100c，以及CDRL3的残基91-94和96，来建立文库。在某些具体实施方案中，用图8中所列“YSGR-B”文库的氨基酸套组至少取代CDRH1的残基28和30-33，CDRH2的残基50、52-54、56和58、CDRH3的残基95、96、97、98、99、100、100a、100b和100c，以及CDRL3的残基91-94和96，来建立文库。在某些具体实施方案中，用图8中所列“YSGR-C”文库的氨基酸套组至少取代CDRH1的残基28和30-33，CDRH2的残基50、52-54、56和58、CDRH3的残基95、96、97、98、99、100、100a、100b和100c，以及CDRL3的残基91-94和96，来建立文库。在某些具体实施方案中，用图8中所列“YSGR-D”文库的氨基酸套组至少取代CDRH1的残基28和30-33，CDRH2的残基50、52-54、56和58、CDRH3的残基95、96、97、98、99、100、100a、100b和100c，以及CDRL3的残基91-94和96，来建立文库。100b和100c的氨基酸位置具有不同的字母标识(alphabetical identifier)，这取决于CDRH3的长度，但是这些位置是位置101之前的最后两个CDRH3位置。合适的寡核苷酸序列的例子包括，但是不限于在图9A-D中所列的那些，并且可由本领域技术人员按照本说明书描述的标准来确定。

在某些具体实施方案中，用图19A中所列“SAH3”文库的氨基酸套组至少取代CDRH1的残基28和30-33，CDRH2的残基50、52、53、54、56和58、CDRH3的残基95-100m，以及CDRL3的残基91-94和96，来建立文库。在某些具体实施方案中，用图19A中所列“SCH3”文库的氨基酸套组至少取代CDRH1的残基28和30-33，CDRH2的残基50、52、53、54、56和58、CDRH3的残基95-100m，以及CDRL3的残基91-94和96，来建立文库。在某些具体实施方案中，用图19A中所列“SFH3”文库的氨基酸套组至少取代CDRH1的残基28和30-33，CDRH2的残基50、52、53、54、56和58、CDRH3的残基95-100m，以及CDRL3的残基91-94和96，来建立文库。在某些具体实施方案中，用图19A中所列“SGH3”文库的氨基酸套组至少取代CDRH1的残基28和30-33，CDRH2的残基50、52、53、54、56和58、CDRH3的残基95-100m，以及CDRL3的残基91-94和96，来建立文库。在某些具体实施方案中，用图19A中所列“SIH3”文库的氨基酸套组至少取代CDRH1的残基28和30-33，CDRH2的残基50、52、53、54、56和58、CDRH3的残基95-100m，以及CDRL3的残基91-94和96，来建立文库。在某些具体实施方案中，用图19A中所列“SLH3”文库的氨基酸套组至少取代CDRH1的残基28和30-33，CDRH2的残基50、52、53、54、56和58、CDRH3的残基95-100m，以及CDRL3的残基91-94和96，来建立文库。由于CDRH3的长度是变化的，位置101之前的最后两个位置具有不同的字母标识，这取决于CDRH3的长度，但是这些位置是位置101之前的最后两个CDRH3位置。合适的寡核苷酸序列的例子包括，但是不限于在图20A-20L中所列的那些，并且可由本领域技术人员按照本说明书描述的标准来确定。

在某些具体实施方案中，用图19B中所列“SNH3”文库的氨基酸套组至少取代CDRH1的残基28和30-33，CDRH2的残基50、52、53、54、56和58、CDRH3的残基95-100m，以及CDRL3的残基91-94和96，来建立文库。在某些具体实施方案中，用图19B中所列“SPH3”文库的氨基酸套组至少取代CDRH1的残基28和30-33，CDRH2的残基50、52、53、54、56和58、CDRH3的残基95-100m，以及CDRL3的残基91-94和96，来建立文库。在某些具体实施方案中，用图19B中所列“SRH3”文库的氨基酸套组至少取代CDRH1的残基28和30-33，CDRH2的残基50、52、53、54、56和58、CDRH3的残基95-100m，以及CDRL3的残基91-94和96，来建立文库。在某些具体实施方案中，用图19B中所列“STH3”文库的氨基酸套组至少取代CDRH1的残基28和30-33，CDRH2的残基50、52、53、54、56和58、CDRH3的残基95-100m，以及CDRL3的残基91-94和96，来建立文库。在某些具体实施方案中，用图19B中所列“SWH3”文库的氨基酸套组至少取代CDRH1的残基28和30-33，CDRH2的残基50、52、53、54、56和58、CDRH3的残基95-100m，以及CDRL3的残基91-94和96，来建立文库。在某些具体实施方案中，用图19B中所列“SYH3”文库的氨基酸套组至少取代CDRH1的残基28和30-33，CDRH2的残基50、52、53、54、56和58、CDRH3的残基95-100m，以及CDRL3的残基91-94和96，来建立文库。由于CDRH3的长度是变化的，位置101之前的最后两个位置具有不同的字母标识，这取决于CDRH3的长度，但是这些位置是位置101之前的最后两个CDRH3位置。合适的寡核苷酸序列的例子包括，但是不限于在图20A-20L中所列的那些，并且可由本领域技术人员按照本说明书描述的标准来确定。

在某些具体实施方案中，用图22中所列“SY”文库的氨基酸套组至少取代CDRH1的残基28和30-33，CDRH2的残基50、52、53、54、56和58、CDRH3的残基95-100m，以及CDRL3的残基91-94和96，来建立文库。在某些具体实施方案中，用图22中所列“SW”文库的氨基酸套组至少取代CDRH1的残基28和30-33，CDRH2的残基50、52、53、54、56和58、CDRH3的残基95-100m，以及CDRL3的残基91-94和96，来建立文库。在某些具体实施方案中，用图22中所列“SR”文库的氨基酸套组至少取代CDRH1的残基28和30-33，CDRH2的残基50、52、53、54、56和58、CDRH3的残基95-100m，以及CDRL3的残基91-94和96，来建立文库。在某些具体实施方案中，用图22中所列“SF”文库的氨基酸套组至少取代CDRH1的残基28和30-33，CDRH2的残基50、52、53、54、56和58、CDRH3的残基95-100m，以及CDRL3的残基91-94和96，来建立文库。由于CDRH3的长度是变化的，位置101之前的最后两个位置具有不同的字母标识，这取决于CDRH3的长度，但是这些位置是位置101之前的最后两个CDRH3位置。合适的寡核苷酸序列的例子包括，但是不限于在图23中所列的那些，并且可由本领域技术人员按照本说明书描述的标准来确定。

在某些具体实施方案中，通过汇集其它文库来建立文库。在一个具体实施方案中，本说明书中所用的“SXH3”文库包括SAH3、SCH3、SFH3、SGH3、SIH3、SLH3、SNH3、SPH3、SRH3、STH3、SWH3和SYH3文库。在另一个具体实施方案中，“SX-表面(SX-surface)”文库包括“SY”、“SW”、“SR”和“SF”文库。

在另一个具体实施方案中，用不同的CDRH3设计来分离亲合力高的结合物，和分离针对多种表位的结合物。为了在CDRH3中产生多样性，用不同长度的H3分别构建多种文库，然后组合在一起选择靶标抗原的结合物。在该文库中制备的CDRH3的长度范围在10-21个、11-21个、12-21个、13-21个、14-21个、15-21个、16-21个、17-21个、18-21个、19-21个、20-21个氨基酸，尽管还可能生成不同于此的长度。如上指出，还可以在CDRH1和CDRH2中产生多样性。在一个文库的具体实施方案中，用图9A-D、20A-L和图23中图解说明的寡核苷酸来产生H1和H2中的多样性。还可以使用具有不同序列的其它寡核苷酸。寡核苷酸可以单独或者以多种组合的任一种集合在一起，这取决于从业人员的实际需要和期望。在一些具体实施方案中，重链CDR中被随机化的位置包括图8、9、11、15、19、21、22、23和24中所列的那些。

将多个文库汇集在一起，用本说明书描述的固相支持选择法和液相分选法进行分选。可以采用多种分选策略。例如一种变化方式涉及在结合到固体上的靶标上进行分选，接着分选存在于融合多肽上的标记(例如抗gD标记)，接着在结合到固体上的靶标上进行另一轮分选。可替代地，首先在结合到固体表面上的靶标上进行分选，然后洗脱下来的结合物用浓度下降的靶标抗原进行液相结合来分选。使用不同的分选方法的组合，能够最小化地仅选择高度表达的序列，并选择大量不同的高亲合力克隆。

已经发现，在某些情形下，通过在轻链中产生有限的多样性来进一步改良从上述的汇集文库中分离的结合物的亲合力。轻链多样性可以，但是不是必须通过对CDRL3中的氨基酸位置91-96或其亚组进行多样化处理来产生。在一个具体实施方案中，被随机化的位置是图8、9、11、15、19、21、22、23和24中所列的那些。

可以容易地在细菌和真核生物细胞培养物中高产量地生产分离自这些具体实施方案的文库的高亲合力的结合物。对载体进行设计，以容易地移动序列例如gD标记、病毒外壳蛋白成分序列，和/或添加恒定区序列，用于高产量地生产全长的抗体或抗原结合片段。密码子套组和CDR的任何组合可以按照本发明的方法进行多样化处理。

载体、宿主细胞和重组方法

为了重组生产本发明的抗体多肽，分离编码它的核酸，并将其插入可复制载体，用于进一步克隆(DNA扩增)或表达。可使用常规流程容易的分离编码抗体的DNA并测序(如使用能够与编码抗体重链和轻链的基因特异结合的寡核苷酸探针)。可利用许多载体。载体的选择部分取决于将要使用的宿主细胞。通常，宿主细胞是原核或真核(通常是哺乳动物)起源的。

使用原核宿主细胞生成抗体：

载体构建

可使用标准重组技术来获得编码本发明抗体多肽构件的多核苷酸序列。可从抗体生成细胞诸如杂交瘤细胞分离期望的多核苷酸序列并测序。或者，可使用核苷酸合成仪或PCR技术合成多核苷酸。一旦得到，将编码多肽的序列插入能够在原核宿主中复制并表达异源多核苷酸的重组载体。为了本发明，可使用本领域可获得的且知道的许多载体。适宜载体的选择将主要取决于将要插入载体的核酸的大小和将要用载体转化的具体宿主细胞。根据其功能(扩增或表达异源多核苷酸，或二者兼之)及其与它在其中驻留的具体宿主细胞的相容性，每种载体含有多种构件。载体构件通常包括但不限于复制起点、选择标志基因、启动子、核糖体结合位点(RBS)、信号序列、异源核酸插入片段、和转录终止序列。

一般而言，与宿主细胞一起使用的质粒载体包含衍生自与这些宿主相容物种的复制子和控制序列。载体通常携带复制位点，以及能够在转化细胞中提供表型选择的标志序列。例如，通常用衍生自大肠杆菌物种的质粒pBR322转化大肠杆菌。pBR322包含编码氨苄青霉素(Amp)和四环素(Tet)抗性的基因，由此提供轻松鉴定转化细胞的手段。pBR322、其衍生物、或其它微生物质粒或噬菌体还可包含或经修饰而包含可被微生物生物体用于表达内源蛋白质的启动子。Carter等人，美国专利5,648,237中详细记载了用于表达特定抗体的pBR322衍生物的实例。

另外，可将包含与宿主微生物相容的复制子和控制序列的噬菌体载体用作这些宿主的转化载体。例如，可使用噬菌体诸如λGEM.TM.-11来构建可用于转化易感宿主细胞诸如大肠杆菌LE392的重组载体。

本发明的表达载体可包含两种或多种启动子-顺反子对，它们编码每一种多肽构件。启动子是位于顺反子上游(5′)的非翻译调控序列，它调控顺反子的表达。原核启动子通常分成两类，诱导型的和组成性的。诱导型启动子指响应培养条件的变化(如营养物的存在与否或温度变化)而启动受其控制的顺反子的升高水平转录的启动子。

众所周知受到多种潜在宿主细胞识别的大量启动子。通过限制酶消化切下源DNA中的启动子并将分离的启动子序列插入本发明的载体，由此可将选择的启动子与编码轻链或重链的顺反子DNA可操作连接。天然启动子序列和许多异源启动子都可用于指导靶基因的扩增和/或表达。在有些实施方案中，使用异源启动子，因为与天然靶多肽启动子相比，它们通常容许所表达靶基因的更高转录和更高产量。

适用于原核宿主的启动子包括PhoA启动子、β-半乳糖苷酶和乳糖启动子系统、色氨酸(trp)启动子系统、和杂合启动子诸如tac或trc启动子。然而，在细菌中有功能的其它启动子(诸如其它已知的细菌或噬菌体启动子)也是合适的。它们的核苷酸序列已经发表，由此熟练工作人员能够使用提供任何所需限制位点的接头或衔接头将它们与编码靶轻链和重链的顺反子可操作连接(Siebenlist et al.，Cell 20：269(1980))。

在本发明的一个方面，重组载体内的每个顺反子都包含指导所表达多肽穿膜转运的分泌信号序列构件。一般而言，信号序列可以是载体的构件，或者它可以是插入载体的靶多肽DNA的一部分。为了本发明而选择的信号序列应当是受到宿主细胞识别并加工(即被信号肽酶切除)的信号序列。对于不识别并加工异源多肽的天然信号序列的原核宿主细胞，将信号序列用选自例如下组的原核信号序列替代：碱性磷酸酶、青霉素酶、Ipp、或热稳定的肠毒素II(STII)前导序列、LamB、PhoE、PelB、OmpA和MBP。在本发明的一个实施方案中，表达系统的两个顺反子中都使用的信号序列是STII信号序列或其变体。

在另一方面，依照本发明的免疫球蛋白的生成可在宿主细胞的细胞质中发生，因此不需要在每个顺反子内存在分泌信号序列。在那点上，免疫球蛋白轻链和重链在细胞质内表达、折叠和装配而形成功能性免疫球蛋白。某些宿主菌株(如大肠杆菌trxB^-菌株)提供有利于二硫键形成的细胞质条件，从而容许所表达蛋白质亚基的正确折叠和装配。Proba and Pluckthun，Gene 159：203(1995))。

本发明提供了可调控所表达多肽构件的数量比率，从而将分泌且正确装配的本发明抗体的产量最大化的表达系统。这种调控是至少部分通过同时调控多肽构件的翻译强度而实现的。

Simmons等人，美国专利5,840,523中公开了用于调控翻译强度的一种技术。它在顺反子内利用翻译起始区(TIR)的变体。对于指定TIR，可创建具有一定范围翻译强度的一系列氨基酸或核苷酸序列变体，由此提供针对特定链的期望表达水平调节此因素的方便手段。可通过常规诱变技术导致能改变氨基酸序列的密码子变化(尽管优选核苷酸序列中的沉默变化)从而生成TIR变体。TIR中的改变可包括例如Shine-Dalgarno序列的数目或间距的改变，及信号序列中的改变。用于生成突变型信号序列的一种方法是在编码序列的开端生成不改变信号序列氨基酸序列的“密码子库”(即变化是沉默的)。这可通过改变每个密码子的第三个核苷酸位置来实现；另外，有些氨基酸，诸如亮氨酸、丝氨酸、和精氨酸，具有多种第一个和第二个位置，这可在建库中增加复杂性。Yansura et al.，METHODS：A Companion toMethods in Enzymol.4：151-158(1992)中详细记载了这种诱变方法。

在某些实施方案中，对于载体中的每个顺反子，生成具有一定范围TIR强度的一组载体。这个有限集合提供了每条链的表达水平以及期望抗体产物的产量在各种TIR强度组合下的比较。可通过量化报道基因的表达水平来测定TIR强度，Simmons等人，美国专利5,840,523中有详细描述。根据翻译强度的比较，选择期望的个别TIR在本发明的表达载体构建物中进行组合。

适于表达本发明抗体的原核宿主细胞包括古细菌(Archaebacteria)和真细菌(Eubacteria)，诸如革兰氏阴性或革兰氏阳性生物体。有用细菌的实例包括埃希氏菌属(Escherichia)(如大肠埃希氏菌E.coli)、芽孢杆菌属(Bacillus)(如枯草芽孢杆菌B.subtilis)、肠杆菌属(Enterobacteria)、假单胞菌属(Pseudomonas)(如铜绿假单胞菌P.aeruginosa)物种、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)、粘质沙雷氏菌(Serratia marcescans)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、变形菌属(Proteus)、志贺氏菌属(Shigella)、根瘤菌属(Rhizobium)、透明颤菌属(Vitreoscilla)、或副球菌属(Paracoccus)。在一个实施方案中，使用革兰氏阴性细胞。在一个实施方案中，使用大肠杆菌细胞作为本发明的宿主。大肠杆菌菌株的实例包括菌株W3110(Bachmann，Cellular and Molecular Biology，第2卷，Washington，D.C.，美国微生物学学会，1987，第1190-1219页；ATCC保藏号27,325)及其衍生物，包括具有基因型 W3110ΔfhuA(ΔtonA)ptr3 lac Iq lacL8ΔompTΔ(nmpc-fepE)degP41 kan^R的菌株33D3(美国专利号5,639,635)。其它菌株及其衍生物，诸如大肠杆菌294(ATCC 31，446)、大肠杆菌B、大肠杆菌_λ1776(ATCC 31，537)和大肠杆菌RV308(ATCC 31，608)也是合适的。这些实例只是例示而非限制。本领域知道用于构建具有指定基因型的任何上述细菌衍生物的方法，参见例如Bass et al.，Proteins 8：309-314(1990)。通常必需考虑复制子在细菌细胞中的可复制性来选择适宜的细菌。例如，在使用众所周知的质粒诸如pBR322、pBR325、pACYC177或pKN410来提供复制子时，大肠杆菌、沙雷氏菌属、或沙门氏菌属物种可能适于用作宿主。通常，宿主细胞应当分泌最小量的蛋白水解酶，而且可能希望在细胞培养中掺入额外的蛋白酶抑制剂。

抗体生成

用上述表达载体转化宿主细胞，并在为了诱导启动子、选择转化子或扩增编码期望序列的基因而适当改动的常规营养培养基中进行培养。

转化即将DNA导入原核宿主，使得DNA能够进行复制，或是作为染色体外元件或是通过染色体成分。根据所用宿主细胞，使用适于这些细胞的标准技术进行转化。采用氯化钙的钙处理通常用于具有坚固细胞壁屏障的细菌细胞。另一种转化方法采用聚乙二醇/DMSO。使用的还有一种技术是电穿孔。

在本领域知道的且适于培养选定宿主细胞的培养基中培养用于生成本发明多肽的原核细胞。合适培养基的实例包括添加了必需营养补充物的LB培养基(Luria broth)。在有些实施方案中，培养基还含有根据表达载体的构建而选择的选择剂，以选择性容许包含表达载体的原核细胞生长。例如，向用于培养表达氨苄青霉素抗性基因的细胞的培养基中添加氨苄青霉素。

除了碳、氮、和无机磷酸盐来源以外，还可含有适当浓度的任何必需补充物，或是单独加入或是作为与另一种补充物或培养基的混合物，诸如复合氮源。任选的是，培养基可含有一种或多种选自下组的还原剂：谷胱甘肽、半胱氨酸、胱胺、巯基乙酸盐/酯、二硫赤藓糖醇和二硫苏糖醇。

在合适的温度培养原核宿主细胞。例如，对于培养大肠杆菌，可以使用约20℃至约39℃、约25℃至约37℃、和/或约30℃的温度范围。主要取决于宿主生物体，培养基的pH可以是范围为约5至约9的任何pH。对于大肠杆菌，pH可以是约6.8至约7.4，可以是约7.0。

如果本发明的表达载体中使用诱导型启动子，那么在适于激活启动子的条件下诱导蛋白质表达。在本发明的一个方面，使用PhoA启动子来控制多肽的转录。因此，为了诱导，在磷酸盐限制培养基中培养经过转化的宿主细胞。磷酸盐限制培养基可以是C.R.A.P培养基(参见例如Simmons et al.，J.Immunol.Methods 263：133-147(2002))。根据所采用的载体构建物，可采用多种其它诱导物，正如本领域所知道的。

在一个实施方案中，所表达的本发明多肽分泌到宿主细胞的周质中并从中回收。蛋白质回收通常牵涉破坏微生物，通常通过诸如渗压震扰(osmotic shock)、超声处理或裂解等手段。一旦细胞遭到破坏，可通过离心或过滤清除细胞碎片或整个细胞。可以通过例如亲和树脂层析进一步纯化蛋白质。或者，蛋白质可能转运到培养液中并从中分离。可从培养液清除细胞，并且可以将培养物上清液过滤和浓缩，用于进一步纯化所生成的蛋白质。可使用普遍知道的方法诸如聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)和Western印迹分析进一步分离和鉴定所表达蛋白质。

在本发明的一个方面，通过发酵过程大量进行抗体生产。多种大规模补料-分批发酵流程可用于生产重组蛋白。大规模发酵具有至少1000升的容量；在某些实施方案中，大规模发酵具有约1,000至100,000升的容量。这些发酵罐使用搅拌器叶轮来分配氧和养分，尤其是葡萄糖(常用的碳源/能源)。小规模发酵通常指在体积容量不超过约100升的发酵罐中进行的发酵，范围可以是约1升至约100升。

在发酵过程中，通常在将细胞在合适条件下培养至期望密度(如OD₅₅₀约180-220，在此阶段细胞处于早期稳定期)后启动蛋白质表达的诱导。根据所采用的载体构建物，可使用多种诱导物，正如本领域知道的和上文描述的。可在诱导前将细胞培养更短的时间。通常将细胞诱导约12-50小时，但是可使用更长或更短的诱导时间。

为了提高本发明多肽的产量和质量，可修改多项发酵条件。例如，为了改善所分泌抗体多肽的正确装配和折叠，可使用过度表达伴侣蛋白诸如Dsb蛋白(DsbA、DsbB、DsbC、DsbD和/或DsbG)或FkpA(具有伴侣活性的一种肽基脯氨酰-顺式，反式-异构酶)的额外载体来共转化宿主原核细胞。已经证明伴侣蛋白促进在细菌宿主细胞中生成的异源蛋白质的正确折叠和溶解度。Chen et al.，J.Biol.Chem.274：19601-19605(1999)；Georgiou等人，美国专利6,083,715；Georgiou等人，美国专利6,027,888；Bothmann andPluckthun，J.Biol.Chem.275：17100-17105(2000)；Ramm and Pluckthun，J.Biol.Chem.275：17106-17113(2000)；Arie et al.，Mol.Microbiol.39：199-210(2001))。

为了将所表达异源蛋白质(尤其是对蛋白水解敏感的异源蛋白质)的蛋白水解降至最低，可将蛋白水解酶缺陷的某些宿主菌株用于本发明。例如，可修饰宿主细胞菌株，在编码已知细菌蛋白酶的基因中进行遗传突变，诸如蛋白酶III、OmpT、DegP、Tsp、蛋白酶I、蛋白酶Mi、蛋白酶V、蛋白酶VI及其组合。可以获得有些大肠杆菌蛋白酶缺陷菌株，参见例如Joly etal.，(1998)见上文；Georgiou等人，美国专利5,264,365；Georgiou等人，美国专利5,508,192；Hara et al.，Microbial Drug Resistance 2：63-72(1996)。

在一个实施方案中，在本发明的表达系统中使用蛋白水解酶缺陷且经过过度表达一种或多种伴侣蛋白的质粒转化的大肠杆菌菌株作为宿主细胞。

抗体纯化

在一个实施方案中，进一步纯化本文中生成的抗体蛋白质以获得基本上同质的制品，用于进一步的测定和使用。可采用本领域知道的标准蛋白质纯化方法。下面的流程是合适纯化流程的例示：免疫亲和或离子交换柱上的分馏、乙醇沉淀、反相HPLC、硅土或阳离子交换树脂诸如DEAE上的层析、层析聚焦、SDS-PAGE、硫酸铵沉淀、和使用例如Sephadex G-75的凝胶过滤。

在一个方面，将固定在固相上的蛋白A用于本发明抗体产物的免疫亲和纯化。蛋白A是来自金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureas)的41kD细胞壁蛋白质，它以高亲和力结合抗体Fc区。Lindmark et al.，J.Immunol.Meth.62：1-13(1983))。在某些实施方案中，蛋白A固定其上的固相是具有玻璃或石英表面的柱子。在某些实施方案中，蛋白A固定其上的固相是可控孔径玻璃柱或硅酸柱。在有些应用中，柱子以诸如甘油等试剂包被，试图防止污染物的非特异粘附。

作为纯化的第一步，将衍生自如上所述细胞培养物的制备物施加到蛋白A固定化固相上，使得目的抗体特异结合蛋白A。然后清洗固相以清除与固相非特异结合的污染物。最后通过洗脱从固相回收目的抗体。

使用真核宿主细胞生成抗体：

载体构件通常包括但不限于如下一种或多种：信号序列、复制起点、一种或多种标志基因、增强子元件、启动子、和转录终止序列。

(i)信号序列构件

在真核宿主细胞中使用的载体还可在目的成熟蛋白质或多肽的N端包含信号序列或具有特异切割位点的其它多肽。在某些实施方案中，所选择的异源信号序列是受到宿主细胞识别并加工(即被信号肽酶切除)的。在哺乳动物细胞表达中，可利用哺乳动物信号序列以及病毒分泌前导，例如单纯疱疹病毒gD信号。

将这些前体区的DNA连接到编码抗体的DNA的读码框中。

(ii)复制起点

通常，哺乳动物表达载体不需要复制起点构件。例如，SV40起点通常可能只因包含早期启动子才使用。

(iii)选择基因构件

表达和克隆载体可包含选择基因，也称为选择标志。典型的选择基因编码如下蛋白质：(a)赋予对抗生素或其它毒素的抗性，如氨苄青霉素、新霉素、甲氨蝶呤或四环素；(b)补足相应的营养缺陷；或(c)提供不能从复合培养基获得的关键营养物。

选择方案的一个实例利用药物来阻滞宿主细胞的生长。经异源基因成功转化的那些细胞生成赋予药物抗性的蛋白质，因而幸免于选择方案。此类显性选择的实例使用药物新霉素、霉酚酸和潮霉素。

适于哺乳动物细胞的选择标志的另一个实例是能够鉴定有能力摄取抗体核酸的细胞的选择标志，诸如DHFR、胸苷激酶、金属硫蛋白I和II(例如灵长类金属硫蛋白基因)、腺苷脱氨酶、鸟氨酸脱羧酶等。

例如，首先通过将所有转化子在含有甲氨蝶呤(Mtx，DHFR的一种竞争性拮抗剂)的培养基中进行培养来鉴定经DHFR选择基因转化的细胞。在采用野生型DHFR时，适宜的宿主细胞是DHFR活性缺陷的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系(如ATCC CRL-9096)。

或者，可通过在含有针对选择标志的选择剂诸如氨基糖苷抗生素如卡那霉素、新霉素或G418的培养基中培养细胞来选择经编码抗体、野生型DHFR蛋白、和另一种选择标志诸如氨基糖苷3′-磷酸转移酶(APH)的DNA序列转化或共转化的宿主细胞(特别是包含内源DHFR的野生型宿主)。参见美国专利4,965,199。

(iv)启动子构件

表达和克隆载体通常包含受到宿主生物体识别的启动子，且与抗体多肽核酸可操作连接。已知真核细胞的启动子序列。事实上，所有真核基因都具有富含AT区，它位于起始转录的位点上游约25至30个碱基处。在许多基因的转录起点上游70至80个碱基处发现的另一种序列是CNCAAT(SEQ ID NO：585)区，其中N可以是任何核苷酸。在大多数真核基因的3′端是AATAAA(SEQ ID NO：586)序列，它可能是向编码序列的3′端添加聚腺苷酸(polyA)尾的信号。所有这些序列合适的插入真核表达载体中。

在哺乳动物宿主细胞中由载体转录抗体多肽受到例如从病毒(诸如多瘤病毒、禽痘病毒、腺病毒(诸如2型腺病毒)、牛乳头瘤病毒、禽类肉瘤病毒、巨细胞病毒、逆转录病毒、乙肝病毒、和猿猴病毒40(SV40))基因组获得的、来自异源哺乳动物启动子(如肌动蛋白启动子或免疫球蛋白启动子)的、来自热休克启动子的启动子的控制，倘若这些启动子与宿主细胞系统相容的话。

方便的以SV40限制性片段的形式获得SV40病毒的早期和晚期启动子，该片段还包含SV40病毒复制起点。方便的以HindIII E限制性片段的形式获得人巨细胞病毒的立即早期启动子。美国专利4,419,446中公开了使用牛乳头瘤病毒作为载体在哺乳动物宿主中表达DNA的系统。美国专利4,601,978中记载了该系统的一种修改。关于在小鼠细胞中在来自单纯疱疹病毒的胸苷激酶启动子的控制下表达人β-干扰素cDNA还可参见Reyes et al.，Nature 297：598-601(1982)。或者，可使用劳氏肉瘤病毒长末端重复序列作为启动子。

(v)增强子元件构件

常常通过在载体中插入增强子序列来提高高等真核细胞对编码本发明抗体多肽的DNA的转录。现在知道来自哺乳动物基因(球蛋白、弹性蛋白酶、清蛋白、α-胎蛋白和胰岛素)的许多增强子序列。然而，通常使用来自真核细胞病毒的增强子。实例包括SV40复制起点晚期侧的增强子(bp100-270)、巨细胞病毒早期启动子增强子、多瘤病毒复制起点晚期侧的增强子、和腺病毒增强子。关于激活真核启动子的增强元件还可参见Yaniv，Nature 297：17-18(1982)。增强子可剪接到载体中，位于抗体多肽编码序列的5′或3′位置。在某些实施方案中，增强子位于启动子的5′位点。

(vi)转录终止构件

在真核宿主细胞中使用的表达载体通常还包含终止转录和稳定mRNA所必需的序列。此类序列通常可从真核或病毒DNA或cDNA非翻译区的5′端和偶尔的3′端获得。这些区域包含在编码抗体的mRNA的非翻译区中转录成聚腺苷酸化片段的核苷酸区段。一种有用的转录终止构件是牛生长激素聚腺苷酸化区。参见WO94/11026及其中公开的表达载体。

(vii)宿主细胞的选择和转化

适于克隆或表达本文载体中的DNA的宿主细胞包括本文描述的高等真核细胞，包括脊椎动物宿主细胞。脊椎动物细胞在培养(组织培养)中的繁殖已经成为常规流程。有用哺乳动物宿主细胞系的实例有经SV40转化的猴肾CV1系(COS-7，ATCC CRL 1651)、人胚肾系(293细胞或为悬浮培养而亚克隆的293细胞，Graham et al.，J.Gen.Virol.36：59(1977))、幼仓鼠肾细胞(BHK，ATCC CCL 10)、中国仓鼠卵巢细胞/-DHFR(CHO，Urlaubet al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77：4216(1980))、小鼠塞托利(Sertoli)细胞(TM4，Mather，Biol.Reprod.23：243-251(1980))、猴肾细胞(CV1，ATCCCCL 70)、非洲绿猴肾细胞(VERO-76，ATCC CRL 1587)、人宫颈癌细胞(HELA，ATCC CCL2)、犬肾细胞(MDCK，ATCC CCL 34)、牛鼠(buffalorat)肝细胞(BRL 3A，ATCC CRL 1442)、人肺细胞(W138，ATCC CCL 75)、人肝细胞(Hep G2，HB 8065)、小鼠乳瘤(MMT 060562，ATCC CCL 51)、TRI细胞(Mather et al.，Annals N.Y.Acad.Sci.383：44-68(1982))、MRC 5细胞、FS4细胞和人肝细胞瘤(hepatoma)系(Hep G2)。

为了生成抗体，用上文所述表达或克隆载体转化宿主细胞，并在为了诱导启动子、选择转化子或扩增编码期望序列的基因而适当改动的常规营养培养基中进行培养。

(viii)宿主细胞的培养

可在多种培养基中培养用于生成本发明抗体的宿主细胞。商品化培养基诸如Ham氏F10(Sigma)、极限必需培养基(MEM，Sigma)、RPMI-1640(Sigma)、和Dulbecco氏修改Eagle氏培养基(DMEM，Sigma)适于培养宿主细胞。另外，可使用下列文献中记载的任何培养基作为宿主细胞的培养基：Ham et al.，Meth.Enz.58：44(1979)；Barnes et al.，Anal.Biochem.102：255(1980)；美国专利4,767,704；4,657,866；4,927,762；4,560,655；5,122,469；WO 90/03430；WO 87/00195；或美国专利复审30,985。任何这些培养基可根据需要补充激素和/或其它生长因子(诸如胰岛素、运铁蛋白或表皮生长因子)、盐(诸如氯化钠、钙、镁和磷酸盐)、缓冲剂(诸如HEPES)、核苷酸(诸如腺苷和胸苷)、抗生素(诸如GENTAMYCIN^TM药物)、痕量元素(定义为通常以微摩尔范围的终浓度存在的无机化合物)、和葡萄糖或等效能源。还可以适宜浓度含有本领域技术人员知道的任何其它必需补充物。培养条件诸如温度、pH等即为表达而选择的宿主细胞先前所用的，这对于普通技术人员是显然的。

(ix)抗体的纯化

在使用重组技术时，可在细胞内生成抗体，或者直接分泌到培养基中。如果在细胞内生成抗体，那么首先需要通过例如离心或超滤清除微粒碎片，或是宿主细胞或是裂解片段。如果抗体分泌到培养基中，那么通常首先使用商品化蛋白质浓缩滤器(例如Amicon或Millipore Pellicon超滤单元)浓缩来自这些表达系统的上清液。可在任何上述步骤中包括蛋白酶抑制剂诸如PMSF以抑制蛋白水解，而且可包括抗生素以防止外来污染物的生长。

可使用例如羟磷灰石层析、凝胶电泳、透析和亲和层析来纯化从细胞制备的抗体组合物。蛋白A作为亲和配体的适宜性取决于抗体中存在的任何免疫球蛋白Fc结构域的种类和同种型。蛋白A可用于纯化基于人γ1、γ2、或γ4重链的抗体(Lindmark et al.，J.Immunol.Meth.62：1-13(1983))。蛋白G推荐用于所有小鼠同种型和人γ3(Guss et al.，EMBO J.5：1567-1575(1986))。亲和配体所附着的基质最常用的是琼脂糖，但是可使用其它基质。物理稳定的基质诸如可控孔径玻璃或聚(苯乙烯二乙烯)苯能获得比琼脂糖更快的流速和更短的加工时间。若抗体包含C_H3结构域，则可使用BakerbondABX^TM树脂(J.T.Baker，Phillipsburg，NJ)进行纯化。根据待回收的抗体，也可使用其它蛋白质纯化技术诸如离子交换柱上的分馏、乙醇沉淀、反相HPLC、硅土上的层析、肝素SEPHAROSE^TM上的层析、阴离子或阳离子交换树脂(诸如聚天冬氨酸柱)上的层析、层析聚焦、SDS-PAGE和硫酸铵沉淀。

在任何初步纯化步骤之后，可将含有目的抗体和污染物的混合物进行低pH疏水相互作用层析，使用pH约2.5-4.5的洗脱缓冲液。在某些实施方案中，低pH疏水性相互作用层析在低盐浓度(如约0-0.25M盐)进行。

活性测定法

可通过本领域知道的多种测定法对本发明的抗体鉴定它们的物理/化学特性和生物学功能。

可通过一系列测定法进一步鉴定纯化的免疫球蛋白，包括但不限于N端测序、氨基酸分析、非变性大小排阻高压液相层析(HPLC)、质谱、离子交换层析和木瓜蛋白酶消化。

在某些实施方案中，对本文在生成的免疫球蛋白分析它们的生物学活性。在有些实施方案中，对本发明的免疫球蛋白测试它们的抗原结合活性。本领域知道的且可用于本文的抗原结合测定法包括但不限于使用诸如Western印迹、放射免疫测定法、ELISA(酶联免疫吸附测定法)、“三明治”免疫测定法、免疫沉淀测定法、荧光免疫测定法和蛋白A免疫测定法等技术的任何直接或竞争性结合测定法。

抗体或抗原结合片段可进一步选择功能活性，例如拮抗剂或激动剂活性。例如，抗HER-2抗体可选择抑制HER-2酪氨酸磷酸化、抑制癌细胞增殖、或诱导癌细胞凋亡的能力。用于鉴定和测量这些活性的测定法披露于例如WO98/17797。

另外，抗DR5抗体可选择诱导癌细胞凋亡和/或抑制炎性细胞功能的能力。在其它实施方案中，抗DR5抗体选择与Apo-2L竞争结合DR5的能力。在其它实施方案中，抗人DR5抗体选择与鼠和/或猕猴DR5的结合。用于测定生物学活性的测定法可以使用本领域已知方法进行，诸如DNA断裂(参见例如Marsters et al.，Curr.Biology，6：1669(1996))、胱天蛋白酶灭活、DR5结合(参见例如WO 98/51793，公布于1998年11月19日)。凋亡可以通过鉴定细胞质浓缩、质膜微绒毛丧失、细胞核节段化、染色体DNA降解或线粒体功能丧失来测量。例如可以通过本领域知晓的细胞活力分析(诸如Alamar蓝测定法或MTT测定法)、FACS分析、胱天蛋白酶活化、DNA断裂(参见例如Nicoletti et al.，J.Immunol.Methods，-139：271-279(1991))、和多聚ADP核糖聚合酶、“PARP”、切割测定法来测定和测量这种活性。

在一个实施方案中，作为凋亡测定法，牵涉将对照标准品和抗DR5抗体在96孔组织培养板中2倍连续稀释。测试了5种Apo-2配体(氨基酸114-281，记载于PCT US00/17579)进行比较。将Colo-205(约20000细胞/孔)人结肠癌细胞(ATCC)接种入96孔板。将板于37℃温育24小时。在24小时温育时间的最后3小时将AlamazBlue(Trek Diagnostic Systems，Inc.)加至孔中。使用96孔荧光计读取荧光，激发为530nm，发射为590nm。结果表述为相对荧光单位(RFU)。

在一个实施方案中，本发明设想了具有一些但非所有效应物功能的改良抗体，这使得它在抗体体内半衰期是重要的但某些效应物功能(诸如补体和ADCC)是不必要的或有害的许多应用中成为期望的候选物。在某些实施方案中，测量所生成免疫球蛋白的Fc活性以确保只保留了期望的特性。可进行体外和/或体内细胞毒性测定法以确认CDC和/或ADCC活性的降低/消减。例如，可进行Fc受体(FcR)结合测定法以确认抗体缺乏FcγR结合(因此有可能缺乏ADCC活性)但保留FcRn结合能力。介导ADCC的主要细胞，NK细胞，只表达FcγRIII，而单核细胞表达FcγRI、FcγRII和FcγRIII。Ravetch and Kinet，Annu.Rev.Immunol.9：457-92(1991)第464页表3总结了造血细胞上的FcR表达。美国专利5,500,362或5,821,337中记载了用于评估目的分子的ADCC活性的体外测定法的实例。可用于此类测定法的效应细胞包括外周血单核细胞(PBMC)和天然杀伤(NK)细胞。或者/另外，可在体内评估目的分子的ADCC活性，如在动物模型中，诸如Clynes et al.，PNAS(USA)95：652-656(1998)中所公开的。还可进行Clq结合测定法以确认抗体不能结合Clq且因此缺乏CDC活性。为了评估补体激活，可进行CDC测定法，例如如Gazzano-Santoro et al.，J.Immunol.Methods 202：163(1996)中所述。还可使用本领域知道的方法进行FcRn结合和体内清除/半衰期测定，例如实施例部分中所描述的。

人源化抗体

本发明涵盖人源化抗体。本领域知道用于人源化非人抗体的多种方法。例如，人源化抗体可具有一个或多个从非人来源引入的氨基酸残基。这些非人氨基酸残基常常称为“输入”残基，它们通常取自“输入”可变区。基本上可遵循Winter及其同事的方法进行人源化(Jones et al.，Nature 321：522-525(1986)；Riechmann et al.，Nature 332：323-327(1988)；Verhoeyen et al.，Science239：1534-1536(1988))，即用非人高变区序列替代人抗体的对应序列。因此，此类“人源化”抗体是嵌合抗体(美国专利4,816,567)，其中显著少于完整的人可变区用非人物种的相应序列替代。在实践中，人源化抗体通常是如下人抗体，其中有些高变区残基和可能的有些FR残基用啮齿类抗体类似位点的残基替代。

用于制备人源化抗体的人轻链和重链可变区的选择对于降低抗原性是非常重要的。依照所谓的“最适(best-fit)”方法，用啮齿类抗体的可变区序列对已知人可变区序列的整个文库进行筛选。然后选择与啮齿类最接近的人序列作为人源化抗体的人框架(Sims et al.，J.Immunol.151：2296(1993)；Chothia et al.，J.Mol.Biol.196：901(1987))。另一种方法使用由特定轻链或重链亚类(subgroup)的所有人抗体的共有序列衍生的特定框架。相同框架可用于几种不同的人源化抗体(Carter et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：4285(1992)；Presta et al.，J.Immunol.151：2623(1993))。

更为重要的是，抗体在人源化后保留对抗原的高亲和力和其它有利的生物学特性。为了达到此目的，依照一种方法，通过使用亲本序列和人源化序列的三维模型分析亲本序列和各种概念性人源化产物的过程来制备人源化抗体。通常可获得免疫球蛋白三维模型，这是本领域技术人员所熟悉的。还可获得图解和显示所选候选免疫球蛋白序列的可能三维构象结构的计算机程序。通过检查这些显示图像能分析残基在候选免疫球蛋白序列发挥功能中的可能作用，即分析影响候选免疫球蛋白结合其抗原的能力的残基。这样，可以从受体序列和输入序列中选出FR残基并组合，从而得到期望的抗体特征，诸如对靶抗原的亲和力升高。一般而言，高变区残基直接且最实质的牵涉对抗原结合的影响。

抗体变体

一方面，本发明提供了在构成Fc区的Fc多肽界面中包含修饰的抗体片段，其中该修饰推动和/促进异多聚化。这些修饰包括将突起导入第一Fc多肽和将腔导入第二Fc多肽，其中突起可位于腔中，从而促进第一和第二Fc多肽的复合。本领域知道生成具有这些修饰的抗体的方法，例如美国专利5,731,168中所述。

在有些实施方案中，设想了本文所述抗体的氨基酸序列修饰。例如，可能希望改进抗体的结合亲和力和/或其它生物学特性。抗体的氨基酸序列变体是通过将适宜的核苷酸变化引入抗体核酸或通过肽合成制备的。此类修饰包括例如抗体氨基酸序列内的残基删除和/或插入和/或替代。进行任何删除、插入和替代组合以获得最终的构建物，倘若最终的构建物具有期望的特征。可在制备序列时将氨基酸改变引入主题抗体氨基酸序列。

为了延长包含本发明氨基酸序列的抗体或多肽的半衰期，可如例如美国专利No.5,739,277中所记载的将补救受体结合表位附着于抗体(尤其是抗体片段)。例如，可以将编码补救受体结合表位的核酸分子与编码本发明多肽序列的核酸在同一读码框内相连接，使得由改造后的核酸分子编码的融合蛋白包含补救受体结合表位和本发明的多肽序列。在用于本文时，术语“补救受体结合表位”指IgG分子(例如IgG₁、IgG₂、IgG₃或IgG₄)的Fc区中负责延长IgG分子体内血清半衰期的表位(例如Ghetie，V et al.，(2000)Ann.Rev.Immunol.18：739-766，表1)。其Fc区中有替代且血清半衰期延长的抗体还记载于WO00/42072(Presta，L.)；WO 02/060919；Shields，R.L.，et al.，(2001)JBC 276(9)：6591-6604；Hinton，P.R.，(2004)JBC 279(8)：6213-6216)。在另一个实施方案中，还可以通过例如附着其它多肽序列来延长血清半衰期。例如，可以将本发明的抗体或包含本发明氨基酸序列的其它多肽附着于血清球蛋白或血清清蛋白中结合FcRn受体或血清球蛋白结合肽的那部分，使得血清清蛋白结合该抗体或多肽，例如此类多肽序列披露于WO01/45746。在一个实施方案中，待附着的血清球蛋白肽包含氨基酸序列DICLPRWGCLW(SEQ ID NO：608)。在另一个实施方案中，依照本发明的Fab的半衰期通过这些方法得到了延长。血清清蛋白结合肽序列还可参见Dennis，M.S.，et al.，(2002)JBC 277(38)：35035-35043。

可用于鉴定抗体中作为优选诱变位置的某些残基或区域的方法有“丙氨酸扫描诱变”，如Cunningham and Wells，Science 244：1081-1085(1989)中所述。这里，鉴定一个残基或一组靶残基(如带电荷的残基，诸如精氨酸、天冬氨酸、组氨酸、赖氨酸和谷氨酸)并用中性或带负电荷的氨基酸(例如丙氨酸或多聚丙氨酸)替代，以影响氨基酸与抗原的相互作用。然后通过在或对替代位点引入更多或其它变体，推敲对替代展示功能敏感性的氨基酸位置。由此，尽管用于引入氨基酸序列变异的位点是预先决定的，然而突变本身的本质不必预先决定。例如，为了分析指定位点处突变的后果，在靶密码子或区域进行丙氨酸扫描或随机诱变，并对所表达免疫球蛋白筛选期望的活性。

氨基酸序列插入包括氨基和/或羧基末端的融合，长度范围由一个残基至包含上百或更多残基的多肽，以及单个或多个氨基酸残基的序列内插入。末端插入的例子包括具有N端甲硫氨酰残基的抗体或与细胞毒性多肽融合的抗体。抗体分子的其它插入变体包括将抗体的N或C端与酶(如用于ADEPT)或延长抗体血清半衰期的多肽融合。

另一类变体是氨基酸替代变体。这些变体在抗体分子中有至少一个氨基酸残基用不同残基替代。最有兴趣进行替代诱变的位点包括高变区，但是也设想了FR改变。下表中“优选替代”栏显示了保守替代。如果此类替代导致生物学活性变化，那么可导入下表中称为“例示替代”的更实质变化，或如下文参照氨基酸分类进一步所述，并筛选产物。

对抗体生物学特性的实质性修饰可通过选择对维持以下方面的效果差异显著的替代来实现：(a)替代区域中多肽主链的结构，例如(折叠)片或螺旋构象，(b)靶位点处分子的电荷或疏水性，或(c)侧链的体积。根据其侧链特性的相似性，氨基酸可如下分组(A.L.Lehninger，《Biochemistry》，第2版，第73-75页，Worth Publishers，New York，1975)：

(1)非极性的：Ala(A)、Val(V)、Leu(L)、Ile(I)、Pro(P)、Phe(F)、Trp(W)、Met(M)

(2)不带电荷、极性的：Gly(G)、Ser(S)、Thr(T)、Cys(C)、Tyr(Y)、Asn(N)、Gln(Q)

(3)酸性的：Asp(D)、Glu(E)

(4)碱性的：Lys(K)、Arg(R)、His(H)

或者，根据共同的侧链特性，天然发生残基可如下分组：

(1)疏水性的：正亮氨酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile；

(2)中性、亲水性的：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln；

(3)酸性的：Asp、Glu；

(4)碱性的：His、Lys、Arg；

(5)影响链取向的残基：Gly、Pro；

(6)芳香族的：Trp、Tyr、Phe。

非保守替代需要用这些类别之一的成员替换另一个类别的。还可将此类替代残基引入保守替代位点，或者引入剩余(非保守)位点。

一类替代变体牵涉替代亲本抗体(例如人源化或人抗体)的一个或多个高变区残基。通常，选择用于进一步开发的所得变体相对于产生它们的亲本抗体将具有改进的生物学特性。用于生成此类替代变体的一种便利方法牵涉使用噬菌体展示的亲和力成熟。简而言之，将数个高变区位点(例如6-7个位点)突变，在各个位点产生所有可能的氨基酸替代。如此生成的抗体展示在丝状噬菌体颗粒上，作为与各个颗粒内包装的M13基因III产物的融合物。然后如本文所公开的对噬菌体展示的变体筛选其生物学活性(例如结合亲和力)。为了鉴定用于修饰的候选高变区位点，可进行丙氨酸扫描诱变以鉴定对抗原结合具有重要贡献的高变区残基。或者/另外，分析抗原-抗体复合物的晶体结构以鉴定抗体和抗原之间的接触点可能是有益的。所述接触残基及邻近残基是依照本文详述的技术进行替代的候选位点。一旦产生这样的变体，如本文所述对该组变体进行筛选，可选择在一种或多种相关测定法中具有优良特性的抗体用于进一步的开发。

编码抗体氨基酸序列变体的核酸分子可通过本领域知道的多种方法来制备。这些方法包括但不限于从天然来源分离(在天然发生氨基酸序列变体的情况中)，或者通过对较早制备的变体或非变异型式的抗体进行寡核苷酸介导的(或定点)诱变、PCR诱变和盒式诱变来制备。

可能希望在本发明免疫球蛋白多肽的Fc区中引入一处或多处氨基酸修饰，由此生成Fc区变体。Fc区变体可包括在一个或多个氨基酸位置(包括铰链半胱氨酸)包含氨基酸修饰(如替代)的人Fc区序列(如人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4 Fc区)。

依照此描述和本领域的教导，设想了在有些实施方案中，本发明方法中所使用的抗体与野生型对应抗体相比可在例如Fc区中包含一处或多处改变。与它们的野生型对应物相比，这些抗体仍将基本上保留治疗功效所需要的相同特性。例如，认为可在Fc区中进行将会导致Clq结合和/或补体依赖性细胞毒性(CDC)改变(即或是增强或是削弱)的某些改变，例如WO99/51642中所述。还可参见关注Fc区变体其它实例的Duncan and Winter，Nature 322：738-40(1988)；美国专利5,648,260；美国专利5,624,821；及WO94/29351。

免疫偶联物

本发明还关于包含偶联有细胞毒剂的抗体的免疫偶联物或抗体-药物偶联物(ADC)，所述细胞毒剂诸如化疗剂、药物、生长抑制剂、毒素(如细菌、真菌、植物或动物起源的酶活性毒素或其片段)或放射性同位素(即放射偶联物)。

抗体-药物偶联物在癌症治疗中用于局部投递毒害细胞剂或抑制细胞试剂(即用于杀死或抑制肿瘤细胞的药物)的用途(Syrigos and Epenetos，Anticancer Research 19：605-614(1999)；Niculescu-Duvaz and Springer，Adv.Drg.Del.Rev.26：151-172(1997)；美国专利4,975,278)理论上能将药物部分靶向投递至肿瘤，并在那儿进行细胞内积累，而系统施用这些未经偶联的药物试剂可能在试图消除的肿瘤细胞以外导致不可接受的对正常细胞的毒性水平(Baldwin et al.，Lancet 603-05(1986年5月15日)；Thorpe，“AntibodyCarriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy：A Review”，在《MonoclonalAntibodies′84：Biological And Clinical Applications》中，A.Pinchera等人编，第475-506页，1985)。由此试图获得最大功效及最小毒性。多克隆抗体和单克隆抗体皆有报道可用于这些策略(Rowland et al.，Cancer Immunol.Immunother.21：183-87(1986))。这些方法中所使用的药物包括道诺霉素(daunomycin)、多柔比星(doxorubicin)、甲氨蝶呤(methotrexate)和长春地辛(vindesine)(Rowland et al.，1986，见上文)。抗体-毒素偶联物中所使用的毒素包括细菌毒素诸如白喉毒素、植物毒素诸如蓖麻毒蛋白、小分子毒素诸如格尔德霉素(geldanamycin)(Mandler et al.，Jour.ofthe Nat.Cancer Inst.92(19)：1573-1581(2000)；Mandler et al.，Bioorganic & Med.Chem.Letters 10：1025-1028(2000)；Mandler et al.，Bioconjugate Chem.13：786-791(2002))、美登木素生物碱类(EP 1391213；Liu et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93：8618-8623(1996))、和加利车霉素(Lode et al.，Cancer Res.58：2928(1998)；Hinman et al.，Cancer Res.53：3336-3342(1993))。毒素可通过包括微管蛋白结合、DNA结合或拓扑异构酶抑制在内的机制发挥其毒害细胞和抑制细胞的效果。有些细胞毒药物在与大的抗体或蛋白质受体配体偶联时趋于失活或活性降低。

ZEVALIN

(ibritumomab tiuxetan，Biogen/Idec)是由针对在正常和恶性B淋巴细胞表面上发现的CD20抗原的鼠IgG1κ单克隆抗体与通过硫脲接头-螯合剂所结合的¹¹¹In或⁹⁰Y放射性同位素构成的抗体-放射性同位素偶联物(Wiseman et al.，Eur.Jour.Nucl.Med.27(7)：766-77(2000)；Wiseman et al.，Blood 99(12)：4336-42(2002)；Witzig et al.，J.Clin.Oncol.20(10)：2453-63(2002)；Witzig et al.，J.Clin.Oncol.20(15)：3262-69(2002))。尽管ZEVALIN具有针对B细胞非何杰金氏(Hodgkin)淋巴瘤(NHL)的活性，然而施药在大多数患者中导致严重且长时间的血细胞减少。MYLOTARG^TM(gemtuzumabozogamicin，Wyeth Pharmaceuticals)，即由人CD33抗体与加利车霉素连接而构成的抗体-药物偶联物，在2000年批准用于经注射治疗急性骨髓性白血病(Drugs of the Future 25(7)：686(2000)；美国专利4970198；5079233；5585089；5606040；5693762；5739116；5767285；5773001)。Cantuzumabmertansine(Immunogen Inc.)，即由huC242抗体经二硫化物接头SPP与美登木素生物碱药物部分DM1连接而构成的抗体-药物偶联物，正在进行用于治疗表达CanAg的癌症诸如结肠癌、胰腺癌、胃癌和其它癌的II期试验。MLN-2704(Millennium Pharm.，BZL Biologics，Immunogen Inc.)，即由抗前列腺特异膜抗原(PSMA)单克隆抗体与美登木素生物碱药物部分DM1连接而构成的抗体-药物偶联物，正在进行用于前列腺肿瘤潜在治疗的开发。将多拉司他汀(dolastatin)的合成类似物auristatin肽、auristatin E(AE)和单甲基auristatin(MMAE)与嵌合单克隆抗体cBR96(对癌上的Lewis Y特异)和cAC10(对恶性血液肿瘤上的CD30特异)偶联(Doronina et al.，NatureBiotechnology 21 (7)：778-784(2003))，且正在进行治疗性开发。

上文已经描述了可用于生成此类免疫偶联物的化疗剂。可使用的酶活性毒素及其片段包括但不限于白喉毒素A链、白喉毒素的非结合活性片段、外毒素A链(来自铜绿假单胞菌Pseudomonas aeruginosa)、蓖麻毒蛋白(ricin)A链、相思豆毒蛋白(abrin)A链、蒴莲根毒蛋白(modeccin)A链、α-帚曲霉素(sarcin)、油桐(Aleutites fordii)毒蛋白、香石竹(dianthin)毒蛋白、美洲商陆(Phytolaca americana)毒蛋白(PAPI、PAPII和PAP-S)、苦瓜(Momordicacharantia)抑制物、麻疯树毒蛋白(curcin)、巴豆毒蛋白(crotin)、肥皂草(sapaonaria officinalis)抑制物、白树毒蛋白(gelonin)、丝林霉素(mitogellin)、局限曲菌素(restrictocin)、酚霉素(phenomycin)、依诺霉素(enomycin)和单端孢菌素(trichothecenes)。多种放射性核素可用于生成放射偶联抗体。实例包括²¹²Bi、¹³¹I、¹³¹In、⁹⁰Y和¹⁸⁶Re。抗体和细胞毒剂的偶联物可使用多种双功能蛋白质偶联剂来制备，诸如N-琥珀酰亚氨基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)、亚氨基硫烷(IT)、亚氨酸酯(诸如盐酸己二酰亚氨酸二甲酯)、活性酯类(诸如辛二酸二琥珀酰亚氨基酯)、醛类(诸如戊二醛)、双叠氮化合物(诸如双(对-叠氮苯甲酰基)己二胺)、双重氮衍生物(诸如双(对-重氮苯甲酰基)己二胺)、二异氰酸酯(诸如甲苯2，6-二异氰酸酯)、和双活性氟化合物(诸如1，5-二氟-2，4-二硝基苯)的双功能衍生物。例如，可如Vitettaet al.，Science 238：1098(1987)中所述制备蓖麻毒蛋白免疫毒素。碳-14标记的1-异硫氰酸苯甲基-3-甲基二亚乙基三胺五乙酸(MX-DTPA)是用于将放射性核苷酸与抗体偶联的例示性螯合剂。参见WO 94/11026。

本文还设想了抗体与一种或多种小分子毒素诸如加利车霉素(calicheamicin)、美登木素生物碱类(maytansinoids)、单端孢霉素(trichothecene)和CC1065及这些毒素具有毒素活性的片段的偶联物。

美登素和美登木素生物碱类

在一个实施方案中，本发明的抗体(全长或片段)与一个或多个美登木素生物碱分子偶联。

美登木素生物碱类是通过抑制微管蛋白多聚化来发挥作用的有丝分裂抑制剂。美登素最初从东非灌木齿叶美登木(Maytenus serrata)分离得到(美国专利3,896,111)。随后发现某些微生物也生成美登木素生物碱类，诸如美登醇和C-3美登醇酯(美国专利4,151,042)。例如下列美国专利公开了合成美登醇及其衍生物和类似物：4,137,230；4,248,870；4,256,746；4,260,608；4,265,814；4,294,757；4,307,016；4,308,268；4,308,269；4,309,428；4,313,946；4,315,929；4,317,821；4,322,348；4,331,598；4,361,650；4,364,866；4,424,219；4,450,254；4,362,663；及4,371,533，明确将其公开内容收入本文作为参考。

美登木素生物碱-抗体偶联物

在改进其治疗指数的尝试中，已经将美登素和美登木素生物碱类与特异结合肿瘤细胞抗原的抗体偶联。例如下列专利公开了包含美登木素生物碱类的免疫偶联物及其治疗用途：美国专利5,208,020；5,416,064；及欧洲专利EP 0 425 235 B1，明确将其公开内容收入本文作为参考。Liu et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93：8618-8623(1996)记载了包含与针对人结肠直肠癌的单克隆抗体C242连接的称为DM1的美登木素生物碱的免疫偶联物。发现该偶联物具有针对培养的结肠癌细胞的高度细胞毒性，而且在体内肿瘤生长测定法中显示抗肿瘤活性。Chari et al.，Cancer Research 52：127-131(1992)记载了其中美登木素生物碱经二硫化物接头与结合人结肠癌细胞系上抗原的鼠抗体A7或结合HER-2/neu癌基因的另一种鼠单克隆抗体TA.1偶联的免疫偶联物。在体外在人乳癌细胞系SK-BR-3上测试了TA.1-美登木素生物碱偶联物的细胞毒性，该细胞系每个细胞表达3×10⁵个HER-2表面抗原。药物偶联物达到了与游离美登木素生物碱药物相似的一定程度的细胞毒性，这可通过增加每个抗体分子偶联的美登木素生物碱分子数目来提高。A7-美登木素生物碱偶联物在小鼠中显示低系统性细胞毒性。

抗体-美登木素生物碱偶联物(免疫偶联物)

抗体-美登木素生物碱偶联物可通过将抗体与美登木素生物碱分子化学连接且不显著削弱抗体或美登木素生物碱分子的生物学活性来制备。每个抗体分子偶联平均3-4个美登木素生物碱分子在增强针对靶细胞的细胞毒性中显示功效，且对抗体的功能或溶解度没有负面影响，尽管预计甚至一个分子的毒素/抗体也将较之裸抗体的使用增强细胞毒性。美登木素生物碱类在本领域是众所周知的，而且可通过已知技术合成或从天然来源分离。例如美国专利5,208,020和上文提及的其它专利及非专利发表物中公开了合适的美登木素生物碱类。在某些实施方案中，美登木素生物碱类是美登醇和美登醇分子的芳香环或其它位置经过修饰的美登醇类似物，诸如各种美登醇酯。

本领域知道许多连接基团可用于制备抗体-美登木素生物碱偶联物，包括例如美国专利5,208,020或欧洲专利0 425 235 B1及Chari et al.，CancerResearch 52：127-131(1992)中所公开的。连接基团包括二硫化物基团、硫醚基团、酸不稳定基团、光不稳定基团、肽酶不稳定基团、或酯酶不稳定基团，正如上文所述专利中所公开的。

可使用多种双功能蛋白质偶联剂来制备抗体和美登木素生物碱的偶联物，诸如N-琥珀酰亚氨基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)、琥珀酰亚氨基-4-(N-马来酰亚氨基甲基)环己烷-1-羧酸酯、亚氨基硫烷(IT)、亚氨酸酯(诸如盐酸己二酰亚氨酸二甲酯)、活性酯类(诸如辛二酸二琥珀酰亚氨基酯)、醛类(诸如戊二醛)、双叠氮化合物(诸如双(对-叠氮苯甲酰基)己二胺)、双重氮衍生物(诸如双(对-重氮苯甲酰基)-乙二胺)、二异氰酸酯(诸如甲苯2，6-二异氰酸酯)、和双活性氟化合物(诸如1，5-二氟-2，4-二硝基苯)的双功能衍生物。在某些实施方案中，偶联剂包括N-琥珀酰亚氨基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)(Carlsson et al.，Biochem.J.173：723-737(1978))和N-琥珀酰亚氨基-4-(2-吡啶基硫代)戊酸酯(SPP)，由此提供二硫键连接。

根据连接的类型，可将接头附着于美登木素生物碱分子的多个位置。例如，可使用常规偶联技术通过与羟基的反应来形成酯键。反应可发生在具有羟基的C-3位置、经羟甲基修饰的C-14位置、经羟基修饰的C-15位置、和具有羟基的C-20位置。在一个实施方案中，在美登醇或美登醇类似物的C-3位置形成键连接。

加利车霉素

另一种感兴趣的免疫偶联物包含与一个或多个加利车霉素分子偶联的抗体。加利车霉素抗生素家族能够在亚皮摩尔浓度生成双链DNA断裂。关于加利车霉素家族偶联物的制备参见美国专利5,712,374；5,714,586；5,739,116；5,767,285；5,770,701；5,770,710；5,773,001；5,877,296(都授予美国Cyanamid公司)。可用的加利车霉素结构类似物包括但不限于γ₁ ^I、α₂ ^I、α₃ ^I、N-乙酰基-γ₁ ^I、PSAG和θ^I ₁(Hinman et al.，Cancer Research 53：3336-3342(1993)；Lode et al.，Cancer Research 58：2925-2928(1998)；及上述授予美国Cyanamid公司的美国专利)。可与抗体缀合的另一种抗肿瘤药物是QFA，它是一种抗叶酸药物。加利车霉素和QFA都具有胞内作用位点，且不易穿过质膜。因此，这些试剂经由抗体介导的内在化的细胞摄取大大增强了它们的细胞毒效果。

其它细胞毒剂

可与本发明抗体偶联的其它抗肿瘤剂包括BCNU、链佐星(streptozoicin)、长春新碱(vincristine)、5-氟尿嘧啶、美国专利5,053,394、5,770,710中记载的统称为LL-E33288复合物的试剂家族、及埃斯波霉素类(esperamicins)(美国专利5,877,296)。

可用的酶活性毒素及其片段包括白喉毒素A链、白喉毒素的非结合活性片段、外毒素A链(来自铜绿假单胞菌Pseudomonas aeruginosa)、蓖麻毒蛋白(ricin)A链、相思豆毒蛋白(abrin)A链、蒴莲根毒蛋白(modeccin)A链、α-帚曲霉素(sarcin)、油桐(Aleutites fordii)毒蛋白、香石竹(dianthin)毒蛋白、美洲商陆(Phytolaca americana)毒蛋白(PAPI、PAPII和PAP-S)、苦瓜(Momordica charantia)抑制物、麻疯树毒蛋白(curcin)、巴豆毒蛋白(crotin)、肥皂草(sapaonaria officinalis)抑制物、白树毒蛋白(gelonin)、丝林霉素(mitogellin)、局限曲菌素(restrictocin)、酚霉素(phenomycin)、依诺霉素(enomycin)和单端孢菌素(trichothecenes)。参见例如1993年10月28日公布的WO 93/21232。

本发明还设想了抗体和具有核酸降解活性的化合物(如核糖核酸酶或DNA内切核酸酶，诸如脱氧核糖核酸酶；DNA酶)之间形成的免疫偶联物。

为了选择性破坏肿瘤，抗体可包含高度放射性原子。多种放射性同位素可用于生成放射偶联抗体。实例包括At²¹¹、I¹³¹、I¹²⁵、Y⁹⁰、Re¹⁸⁶、Re¹⁸⁸、Sm¹⁵³、Bi²¹²、P³²、pb²¹²和Lu的放射性同位素。在将偶联物用于检测时，可包含放射性原子用于闪烁照相研究，例如Tc^99m或I¹²³，或是包含自旋标记物用于核磁共振(NMR)成像(也称为磁共振成像，MRI)，诸如碘-123、碘-131、铟-111、氟-19、碳-13、氮-15、氧-17、钆、锰或铁。

可以已知方式将放射性或其它标记物掺入偶联物。例如，可生物合成肽，或是通过化学氨基酸合成法合成肽，其中使用牵涉例如氟-19代替氢的合适氨基酸前体。可经肽中的半胱氨酸残基来附着标记物，诸如Tc^99m或I¹²³、Re¹⁸⁶、Re¹⁸⁸和In¹¹¹。可以经赖氨酸残基来附着钇-90。IODOGEN法(Frakeret al.，Biochem.Biophys.Res.Commun.80：49-57(1978))可用于掺入碘-123。《Monoclonal Antibodies in Immunoscintigraphy》(Chatal，CRC Press，1989)详细记载了其它方法。

可使用多种双功能蛋白质偶联剂来制备抗体和细胞毒剂的偶联物，诸如N-琥珀酰亚氨基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)、琥珀酰亚氨基-4-(N-马来酰亚氨基甲基)环己烷-1-羧酸酯、亚氨基硫烷(IT)、亚氨酸酯(诸如盐酸己二酰亚氨酸二甲酯)、活性酯类(诸如辛二酸二琥珀酰亚氨基酯)、醛类(诸如戊二醛)、双叠氮化合物(诸如双(对-叠氮苯甲酰基)己二胺)、双重氮衍生物(诸如双(对-重氮苯甲酰基)-乙二胺)、二异硫氰酸酯(诸如甲苯2，6-二异氰酸酯)、和双活性氟化合物(诸如1，5-二氟-2，4-二硝基苯)的双功能衍生物。例如，可如Vitetta et al.，Science 238：1098(1987)中所述制备蓖麻毒蛋白免疫毒素。碳-14标记的1-异硫氰酸苯甲基-3-甲基二亚乙基三胺五乙酸(MX-DTPA)是用于将放射性核苷酸与抗体偶联的例示性螯合剂。参见WO94/11026。接头可以是便于在细胞中释放细胞毒药物的“可切割接头”。例如，可使用酸不稳定接头、肽酶敏感接头、光不稳定接头、二甲基接头、或含二硫化物接头(Chari et al.，Cancer Research 52：127-131(1992)；美国专利5,208,020)。

本发明的化合物明确涵盖但不限于用下列交联剂制备的ADC：商品化(如购自Pierce Biotechnology Inc.，Rockford，IL，U.S.A.)的BMPS、EMCS、GMBS、HBVS、LC-SMCC、MBS、MPBH、SBAP、SIA、SIAB、SMCC、SMPB、SMPH、sulfo-EMCS、sulfo-GMBS、sulfo-KMUS、sulfo-MBS、sulfo-SIAB、sulfo-SMCC和sulfo-SMPB、和SVSB(琥珀酰亚胺基-(4-乙烯基砜)苯甲酸酯)。见2003-2004年度应用手册和产品目录(ApplicationsHandbook and Catalog)第467-498页。

抗体-药物偶联物的制备

在本发明的抗体-药物偶联物(ADC)中，将抗体(Ab)经接头(L)与一个或多个药物部分(D)缀合，例如每个抗体偶联约1个至约20个药物部分。可采用本领域技术人员知道的有机化学反应、条件和试剂通过数种路径来制备通式I的ADC，包括：(1)抗体的亲核基团经共价键与二价接头试剂反应，形成Ab-L，随后与药物部分D反应；和(2)药物部分的亲核基团经共价键与二价接头试剂反应，形成D-L，随后与抗体的亲核基团反应。

Ab-(L-D)_p I

抗体的亲核基团包括但不限于：(i)N末端氨基；(ii)侧链氨基，如赖氨酸；(iii)侧链巯基，如半胱氨酸；和(iv)糖基化抗体中糖的羟基或氨基。氨基、巯基、和羟基是亲核的，能够与接头部分上的亲电子基团反应而形成共价键，而接头试剂包括：(i)活性酯类，诸如NHS酯、HOBt酯、卤代甲酸酯、和酸性卤化物；(ii)烷基和苯甲基卤化物，诸如卤代乙酰胺；(iii)醛类、酮类、羧基和马来酰亚胺基团。某些抗体具有可还原的链间二硫键，即半胱氨酸桥。可通过还原剂诸如DTT(二硫苏糖醇)处理使抗体具有与接头试剂缀合的反应活性。每个半胱氨酸桥理论上将形成两个反应性硫醇亲核体。可经由赖氨酸与2-亚氨基硫烷(Traut氏试剂)的反应，导致胺转变为硫醇，从而将额外亲核基团引入抗体。

还可通过修饰抗体来生成本发明的抗体-药物偶联物，即引入可与接头试剂或药物上的亲核取代基反应的亲电子部分。可用例如高碘酸盐氧化剂氧化糖基化抗体的糖，从而形成可与接头试剂或药物部分的胺基团反应的醛或酮基团。所得亚胺Schiff碱基可形成稳定的键，或者可用例如硼氢化物试剂还原而形成稳定的胺连接。在一个实施方案中，糖基化抗体的碳水化合物部分与半乳糖氧化酶或偏高碘酸钠的反应可在蛋白质中生成羰(醛和酮)基团，它可与药物上的适宜基团反应(Hermanson，BioconjugateTechniques)。在另一个实施方案中，包含N末端丝氨酸或苏氨酸残基的蛋白质可与偏高碘酸钠反应，导致在第一个氨基酸处生成醛(Geoghegan &Stroh，Bioconjugate Chem.3：138-146(1992)；US 5362852)。此类醛可与药物部分或接头亲核体反应。

同样，药物部分上的亲核基团包括但不限于：胺、硫醇、羟基、酰肼、肟、肼、缩氨基硫脲、肼羧酸酯、和芳基酰肼基团，它们能够与接头部分上的亲电子基团反应而形成共价键，而接头试剂包括：(i)活性酯类，诸如NHS酯、HOBt酯、卤代甲酸酯、和酸性卤化物；(ii)烷基和苯甲基卤化物，诸如卤代乙酰胺；(iii)醛类、酮类、羧基、和马来酰亚胺基团。

或者，可通过例如重组技术或肽合成来制备包含抗体和细胞毒剂的融合蛋白。DNA的长度可包含各自编码偶联物两个部分的区域，或是彼此毗邻或是由编码接头肽的区域分开，该接头肽不破坏偶联物的期望特性。

在又一个实施方案中，可将抗体与“受体”(诸如链霉亲和素)偶联从而用于肿瘤预先靶向，其中对患者施用抗体-受体偶联物，接着使用清除剂由循环中清除未结合的偶联物，然后施用与细胞毒剂(如放射性核苷酸)偶联的“配体”(如亲合素)。

抗体衍生物

可进一步修饰本发明的抗体以包含本领域知道的且易于获得的额外非蛋白质性质部分。在某些实施方案中，适于抗体衍生化的部分是水溶性聚合物。水溶性聚合物的非限制性实例包括但不限于聚乙二醇(PEG)、乙二醇/丙二醇共聚物、羧甲基纤维素、右旋糖苷、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚-1，3-二氧戊环、聚-1，3，6-三噁烷、乙烯/马来酸酐共聚物、聚氨基酸(均聚物或随机共聚物)、和右旋糖苷或聚(n-乙烯吡咯烷酮)聚乙二醇、丙二醇均聚物、环氧丙烷/环氧乙烷共聚物、聚氧乙烯化多元醇(如甘油)、聚乙烯醇及其混合物。由于其在水中的稳定性，聚乙二醇丙醛在生产中可能具有优势。聚合物可以是任何分子量，而且可以是分支的或不分支的。附着到抗体上的聚合物数目可以变化，而且如果附着了超过一个聚合物，那么它们可以是相同或不同的分子。一般而言，可根据下列考虑来确定用于衍生化的聚合物的数目和/或类型，包括但不限于待改进抗体的具体特性或功能、抗体衍生物是否将用于指定条件下的治疗等。

药用配制剂

包含本发明抗体的治疗用配制剂可通过将具有期望纯度的抗体与任选的生理学可接受的载体、赋形剂或稳定剂(Remington′s PharmaceuticalSciences，16th edition，Osol，A.Ed.，1980)混合，以水溶液、冻干的或其它干燥的形式制备供贮存。可接受的载体、赋形剂或稳定剂在所采用的剂量和浓度对接受者是无毒的，包括缓冲剂，诸如磷酸盐、柠檬酸盐、组氨酸和其它有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(诸如氯化十八烷基二甲基苄基铵；氯化己烷双胺；苯扎氯铵、苯索氯铵；酚、丁醇或苯甲醇；对羟基苯甲酸烷基酯，诸如对羟基苯甲酸甲酯或丙酯；邻苯二酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚)；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，诸如血清清蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，诸如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，诸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其它碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，诸如EDTA；糖类，诸如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；成盐反荷离子，诸如钠；金属复合物(例如Zn-蛋白质复合物)；和/或非离子表面活性剂，诸如TWEEN^TM、PLURONICS^TM或聚乙二醇(PEG)。

本文中的配制剂还可含有所治疗具体适应症所必需的超过一种活性化合物。在某些此类实施方案中，所述化合物具有互补的活性且彼此没有不利的影响。合适的是，此类分子以对于预定目的有效的量组合存在。

活性成分还可包载于例如通过凝聚技术或通过界面聚合制备的微胶囊中(例如分别是羟甲基纤维素或明胶微胶囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊)、在胶状药物投递系统中(例如脂质体、清蛋白微球体、微乳剂、纳米颗粒和纳米胶囊)、或在粗滴乳状液中。此类技术披露于例如Remington′sPharmaceutical Sciences，16th edition，Osol，A.Ed.，1980。

用于体内施用的配制剂必须是无菌的。这可容易的通过例如使用无菌滤膜过滤来实现。

可制备持续释放制剂。持续释放制剂的合适例子包括含有本发明免疫球蛋白的固体疏水性聚合物半透性基质，该基质是定型产品的形式，例如薄膜或微胶囊。持续释放基质的例子包括聚酯、水凝胶(例如聚(2-羟乙基-甲基丙烯酸酯)或聚(乙烯醇))、聚交酯(美国专利No.3,773,919)、L-谷氨酸与L-谷氨酸γ乙酯的共聚物、不可降解的乙烯-乙酸乙烯、可降解的乳酸-乙醇酸共聚物诸如LUPRON DEPOT^TM(由乳酸-乙醇酸共聚物和醋酸亮丙瑞林构成的可注射微球体)及聚-D-(-)-3-羟基丁酸。虽然诸如乙烯-乙酸乙烯和乳酸-乙醇酸等聚合物能够释放分子达100天以上，但是某些水凝胶释放蛋白质的时间较短。当胶囊化免疫球蛋白在体内长时间维持时，它们可能由于暴露于37℃的潮湿环境而变性或聚集，导致生物学活性损失和免疫原性可能改变。可以根据相关机制来设计合理的稳定化策略。例如，如果发现聚集机制是经由硫-二硫化物互换的分子间S-S键形成，那么可通过修饰巯基残基、由酸性溶液冻干、控制湿度、采用适宜添加剂和开发特定聚合物基质组合物来实现稳定。

用途

本发明的抗体可以用于，例如，体外、离体和体内的治疗方法中。本发明抗体作为拮抗剂，用于在体外、离体和体内，部分地或者完全地阻断特异性抗原的活性。而且，至少某些本发明的抗体能够消除来自其它物种的抗原活性。因此，本发明的抗体用于例如，在含有抗原的细胞培养物中，在含有本发明的抗体能与之发生交叉反应的抗原的人受试者或哺乳动物受试者(黑猩猩、狒狒、绒、猕猴和恒河猴、猪或小鼠)中，抑制特异性抗原的活性。在一个具体实施方案中，本发明的抗体用于抑制抗原，使抗体与抗原接触以抑制该抗原的活性。在某些具体实施方案中，抗原是人的蛋白质分子。

在一个具体实施方案中，本发明的抗体可用于抑制患有紊乱(病症)的受试者中的抗原的方法，该抗原活性在该受试者中是有害的，该方法包括给受试者施用本发明的抗体，抑制该受试者中的抗原活性。在某些具体实施方案中，该抗原是人蛋白质分子，而受试者是人受试者。可替代地，受试者可以是表达本发明的抗体与之结合的抗原的哺乳动物。进一步地，受试者是已经导入抗原的哺乳动物(例如，通过施用抗原或者表达抗原转基因)。本发明的抗体施用给人受试者，用于治疗目的。而且，将本发明的抗体施用给非人的哺乳动物，用于兽医目的或者作为人类疾病的动物模型，该非人哺乳动物(例如灵长类动物、猪或小鼠)表达免疫球蛋白能够与之交叉反应的抗原。至于后者，这种动物模型可用于评价本发明的抗体的治疗功效(例如，测试施用的剂量和时程)。

本发明的阻断或拮抗抗体可用于治疗，包括，例如但是不限于，抗HER-2抗体。例如，本发明的抗HER-2的抗体可用于处理、抑制、延缓、防止/延迟复发、减轻或者预防与一种或多种抗原分子的异常表达和/或活性异常相关的疾病、紊乱或者状况，包括但是不限于恶性肿瘤和良性肿瘤；非白血病和淋巴恶性肿瘤；神经细胞、神经胶质细胞、星形胶质细胞、下丘脑的和其它腺体的、巨噬细胞的、上皮的、基质的和囊胚的紊乱；以及炎症的、血管生成的和免疫的紊乱。

一个方面，本发明的阻断抗体特异于配体抗原，并通过阻断或干扰与配体抗原参与的配体-受体相互作用来抑制抗原活性，从而抑制相应的信号路径和其它分子事件或细胞事件。本发明的特征还在于受体特异性抗体，该抗体并不必然地阻碍配体结合，但是干扰受体活化，从而抑制任何通常由配体结合而启动的反应。在某些具体实施方案中，本发明还包括优选地或者专门地结合配体受体复合物的抗体。本发明的抗体还作为特定抗原受体的激动剂，从而加强、提高或者激活配体介导的受体活化的全部或部分活性。

HER-2相关的紊乱或状况和诊断分析在UA6,387,371有描述，该文献在此完全引入作为参考，还参见WO98/17797。给患者施用治疗有效量的抗HER-2受体的抗体，可以抑制肿瘤细胞生长，并可用于治疗癌症。Trastuzumab(Genentech，Inc.)是重组的人源化单克隆抗体，定向于HER-2的细胞外结构域，用于治疗HER-2过度表达/HER-2基因增殖的癌症，特别是转移性乳腺癌(MBC)。这种抗体可用于治疗其它癌症，特别是那些过度表达HER-2的癌症。还可将抗体与其它治疗剂组合施用给患者，例如，paclitaxel或

。

在一些具体实施方案中，抗DR5的抗体诱导癌细胞凋亡。在一些具体实施方案中，抗DR5的抗体是DR5的激动剂。在其它具体实施方案中，所述抗体与Apo-2L竞争结合DR5。

如上指出，本发明的DR5抗体具有各种用途。例如，DR5拮抗性抗体(agonistic antibody)可以用于治疗哺乳动物中的病理性状况的方法中，病理性状况例如癌症或免疫相关性疾病。免疫相关性状况包括类风湿性关节炎，全身性红斑狼疮，硬皮病，先天性炎症性肌病，干燥综合症(sjogrenssyndrome)，全身性血管炎，肉样瘤病(sarcoidosis)，自体免疫性溶血性贫血，甲状腺炎，免疫相关的肾病如肾小球肾炎，脱髓鞘病如多发性硬化，自身免疫性皮肤病如牛皮癣(银屑病)，炎症和滤过性肺病(filtration disease)，和过敏性疾病如哮喘。

本领域有经验的从业人员能够诊断哺乳动物中是否存在本说明书描述的各种病理性状况。诊断技术可从本领域中获得，使得可以例如诊断或检测哺乳动物中的癌症或免疫相关性疾病。例如，可以通过各种技术，包括但是不限于触诊、血液分析、X射线、NMR等，来鉴定癌症。免疫相关性疾病容易被鉴定。例如在全身性红斑狼疮中，该疾病的重要介质是产生对抗自身蛋白质/组织的自身反应性抗体，随后产生免疫介导的炎症。在临床上，多种器官和系统受到影响，包括肾脏、肺、肌肉骨骼系统、粘膜皮肤、眼睛、中枢神经系统、心血管系统、胃肠道、骨髓和血液。开业医生熟悉大量对免疫和/或炎症反应进行干涉将会产生益处的疾病。

在某些具体实施方案中，将包括与细胞毒性剂偶联的抗体的免疫偶联物施用给患者。在一些具体实施方案中，免疫偶联物和/或其所结合的抗原被细胞内在化，导致免疫偶联物杀死其所结合的靶标细胞的治疗效率提高。在一个具体实施方案中，细胞毒性剂靶向或干扰靶标细胞中的核酸。这种细胞毒性剂的例子包括本说明书指出的化疗剂的任何一种(例如美登木素生物碱类(maytansinoids)或加利车霉素(calicheamicin))、放射性同位素或核糖核酸酶或DNA核酸内切酶。

在治疗中，本发明的抗体可以单独使用或与其它组合物联合使用。例如，本发明的抗体可以与另一种抗体、化疗剂(包括化疗剂混合物)、其它细胞毒性剂、抗血管生成剂、细胞因子和/或生长抑制剂共同施用。当本发明的抗体用于抑制肿瘤生长时，尤其期望将其与一种或多种也抑制肿瘤生长的其它治疗剂组合。例如，在一种治疗方案中，例如在治疗本说明书描述的疾病的任何一种中，包括结肠直肠癌、转移性乳腺癌和肾癌，本发明的抗体可以与抗VEGF的抗体(例如，AVASTIN)和/或抗ErbB的抗体(例如

抗HER-2的抗体)组合。可替代地，或另外地，患者可接受组合的放射治疗(例如外部射线照射或用放射性标记的试剂，例如抗体治疗)。上面指出的这种组合治疗包括组合施用(在相同或不同制剂中包括两种或多种试剂)，和分别施用，在分别施用的情形下，在施用附加治疗之前和/或之后施用本发明的抗体。

本发明的抗体(和附加治疗剂)通过任何合适的方式施用，包括肠胃外、腹膜内、肺内和鼻内，如果期望进行局部处理，可以在病灶内施用(intralesional administration)。肠胃外灌注包括肌肉内、静脉内、动脉内、腹膜内或者皮下的施用。此外，抗体适合通过脉冲灌注(pulse infusion)，特别是使用剂量逐渐下降的抗体。可通过任何的合适路径给药，例如通过注射，例如静脉内注射或皮下注射，这部分地取决于施用是暂时的或长期的。

按照符合良好医疗实践的方式来配制、给药和施用本发明的抗体组合物。在此需要考虑的因素包括正治疗的特定紊乱(疾病)、正处理的特定哺乳动物、各个患者的临床状况、紊乱(疾病)的诱因、呈递试剂的部位、施用方法、施用的时序安排，以及开业医生已知的其它因素。抗体不必，但是可选择地与一种或多种目前用于预防或治疗所针对的紊乱的试剂配制在一起。这种其它试剂的有效量取决于制剂中存在的本发明的抗体的含量，紊乱或治疗的类型，以及上述的其它因素。这些试剂通常以与上文所用相同的剂量和施用路径使用，或者或以迄今使用剂量的约1-99％使用。

为了预防或治疗疾病，本发明的抗体的合适剂量(当单独使用或与其它治疗剂如化疗剂组合使用)取决于将要治疗的疾病的类型、抗体类型、疾病的严重性和进程，施用抗体用于预防目还是治疗目的，先前的治疗、患者病史和对抗体的反应，以及主治医生的判断力。适合在一次或在一连串治疗中将抗体施用给患者。根据疾病的类型和严重性，约1μg/kg-15mg/kg(例如0.1mg/kg-10mg/kg)抗体是施用给患者的初始候选剂量，无论是例如，通过一次或多次分别施用，或者通过连续灌注。典型的日剂量范围在约1μg/kg-100mg/kg或更高，取决于上面提及的因素。对于根据状况，在数天或更长时间内进行重复施用来说，持续进行治疗，直到出现期望的疾病症状被抑制。抗体的示例性剂量的范围在约0.05mg/kg-约10mg/kg。因此，将约0.5mg/kg、2.0mg/kg、4.0mg/kg或10mg/kg(或其任何组合)的一种或多种剂量施用给患者。这种剂量可以间歇性施用，例如每周或每三周(例如使得患者接受约2个-约20个剂量，例如约6个剂量的抗体)。开始施用较高的加载剂量(loading dose)，接着施用一个或多个较低的剂量。一种示例性的给药方案包括施用约4mg/kg的初始加载剂量，接着每周维持约2mg/kg抗体的剂量。然而，其它的给药方案也是有用的。通过常规技术和分析方法，容易对这种治疗的进程进行监控。

制品

在本发明的另一个方面，提供了包含可用于治疗、预防和/或诊断上文所述紊乱的物质的制品。制品包括容器和贴在所述容器上或与其相连的标签或包装插页。合适的容器包括例如瓶子、小管、注射器等。容器可用各种材料制成，诸如玻璃或塑料。容器中装有其自身或在联合其它组合物时有效治疗、预防和/或诊断疾患的组合物，而且可具有无菌存取口(例如容器可以是具有皮下注射针头可刺穿的塞子的静脉内溶液袋或小管)。组合物中的至少一种活性剂是本发明的抗体。标签或包装插页指示该组合物用于治疗选择的疾患，诸如癌症。此外，制品可包括(a)其中装有组合物的第一容器，其中所述组合物包含本发明的抗体；和(b)其中装有组合物的第二容器，其中所述组合物包含其它细胞毒剂。本发明此实施方案中的制品还可包括指示第一和第二抗体组合物可用于治疗特定疾患如癌症的包装插页。或者/另外，制品还可包括第二(或第三)容器，其中装有制药学可接受的缓冲剂，诸如注射用抑菌水(BWFI)、磷酸盐缓冲盐水、林格氏(Ringer)溶液和右旋糖溶液。它还可包括商业和用户立场上所需的其它物质，包括其它缓冲剂、稀释剂、滤器、针头和注射器。

已经概括性地描述了本发明，通过参考下面的实施例，将更加容易地理解相同的技术内容，这些实施例用于阐述目的而不被用于限制本发明。

实施例1.构建噬菌体展示的Fab文库，该文库具有富含Tyr、Ser、Gly和Arg的CDR残基。

用噬菌粒载体、Fab-C构建噬菌体展示的Fab文库，该文库展示二价Fab成分，该二价的Fab成分通过插入在Fab重链和基因-3小外壳蛋白(P3C)的C-末端结构域之间的游离半胱氨酸来发生二聚化。该载体按照美国专利申请公开US20050119455和Lee等人，J.Immunol.Meth.284：119-132(2004)中的描述进行构建。该载体(在图5中进行示例性图解说明)包括在IPTG诱导型Ptac启动子控制下的人源化抗体4D5可变区。人源化抗体4D5在重链和轻链中主要含有人共有序列框架区，而CDR区来自特异于HER-2的单克隆抗体。在美国专利US5,821,337和US6,054,297中提供了制备抗HER-2的抗体和确定可变区序列的方法。

构建四种文库：YSGR-A、YSGR-B、YSGR-C和YSGR-D。构建文库，在全部三个重链CDR和轻链CDR3中含有被随机化的残基。各个文库在CDRL3的位置91-94和96，CDRH1的位置28和30-33，CDRH2的位置50、52-54、56和58，和CDRH3的位置95-100、100a、100b和100c上被随机化。在各个随机化位置上允许的氨基酸类型和比率被描述在图8中。此外，CDRH3的长度用寡核苷酸改变，该寡核苷酸用6-17个密码子替换位置95-100a的7个野生型密码子。因此，在某些情形下，对应于重链位置100a的密码子是不存在的(例如，当用诱变寡核苷酸(mutagenic oligonucletide)H3-A6(SEQ ID NO：35)、H3-B6(SEQ ID NO：47)、H3-C6(SEQ ID NO：59)或H3-D6(SEQ ID NO：71)进行突变时，如下文所述。参见图9A-D，那些位置上所允许的氨基酸的类型和比率与图8中描述的CDRH3位置95-100a是相同的。

文库用Kunkel的方法(Kunkel，T.A.，Roberts，J.D.&Zakour，R.A.，Methods Enzymol.(1987)，154，367-382)和先前描述的方法(Sidhu，S.S.，Lowman，H.B.，Cunningham，B.C.&Wells，J.A.，Methods Enzymol.(2000)，328，333-363)来构建。独特的“终止模板”样式的Fab展示载体Fab-C用于制备所有四种文库，如实施例1中所述。

在将被多样化的位置上具有简并性密码子的诱变寡核苷酸用于同时(a)导入CDR多样性和(b)修复终止密码子。那些诱变寡核苷酸的序列示于图9A-9D中。对于所有文库来说，分别用寡核苷酸H1、H2和L3(SEQ IDNO：)将多样性导入CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3中。对于文库YSGR-A而言，用寡核苷酸H3-A6、H3-A7、H3-A8、H3-A9、H3-A10、H3-A11、H3-A12、H3-A13、H3-A14、H3-A15、H3-A16和H3-A17(SEQ ID NO：35-46)的等摩尔混合物将多样性导入CDR-H3中。对于文库YSGR-B来说，用寡核苷酸H3-B6、H3-B7、H3-B8、H3-B9、H3-B10、H3-B11、H3-B12、H3-B13、H3-B14、H3-B15、H3-B16和H3-B17(SEQ ID NO：47-58)的等摩尔混合物将多样性导入CDR-H3中。对于文库YSGR-C而言，用寡核苷酸H3-C6、H3-C7、H3-C8、H3-C9、H3-C10、H3-C11、H3-C12、H3-C13、H3-C14、H3-C15、H3-C16和H3-C17(SEQ ID NO：59-70)的等摩尔混合物将多样性导入CDR-H3中。对于文库YSGR-D来说，用寡核苷酸H3-D6、H3-D7、H3-D8、H3-D9、H3-D10、H3-D11、H3-D12、H3-D13、H3-D14、H3-D15、H3-D16和H3-D17(SEQ ID NO：71-82)的等摩尔混合物将多样性导入CDR-H3中。各个诱变寡核苷酸H3-A6到H3-A17(SEQ ID NO：35-46)，H3-B6到H3-B17(SEQ IDNO：47-58)，H3-C6到H3-C17(SEQ ID NO：59-70)和H3-D6到H3-D17(SEQ ID NO：71-82)在重链位置93上编码丙氨酸。在单个诱变反应中同时导入所有将被随机化的CDR的诱变寡核苷酸，使得同时导入所有的诱变寡核苷酸导致在各个位置上导入所设计的多样性，并同时修复所有的TAA终止密码子。因此，生成开放阅读框，编码融合到同型二聚化半胱氨酸键和P3C上的Fab文库成员。诱变后，将四种文库组合成单个文库，称作为文库YSGR-A-D。

将诱变反应物通过电穿孔导入到大肠杆菌SS320中(Sidhu等人，同上文)。存在M13-KO7辅助噬菌体(New England Biolabs，Beverly，MA)时，培养转化的细胞过夜，制备包裹噬菌粒DNA并在表面上展示Fab片段的噬菌体颗粒。组合文库含有超过3×10¹⁰种独特成员。

实施例2.从首次用于试验的文库YSGR-A-D中选择特异性抗体

来自文库YSGR-A-D(上面实施例1中所述)的噬菌体进行数轮结合选择，富集结合人DR5或HER-2的克隆。用先前描述的方法(Sidhu等人，同上文)进行结合选择。

人DR5序列示于表1中。表1中所示的DR5的胞外结构域用于结合选择。同样地，人HER-2序列的胞外结构域按照Franklin MC.Carey KD.VajdosFF.Leahy DJ.de Vos AM.Sliwkowski MX.Insights into ErbB signaling from thestructure of the ErbB2-pertuzumab complex.Cancer Cell.5(4)：317-28，2004中所述进行制备。在Protein DataBank Record 1S78(2004)中提供了人HER-2ECD的序列(氨基酸23-646)。

在4℃，用5μg/mL靶标蛋白质(人DR5或人HER-2)包被NUNC 96孔Maxisorp免疫平板过夜，并用PBT溶液(还含有0.2％BSA和0.05％Tween 20(Sigma)的磷酸盐缓冲的盐水)封闭2小时。在37℃生长过夜后，用PEG/NaCl沉淀浓缩噬菌体，并重新悬浮在PBT中，如先前所述(Sidhu等人，同上文)。将噬菌体溶液(约10¹²个噬菌体/mL)添加到已包被的免疫平板中。温育2小时，让噬菌体结合，用PBT洗涤平板10次。被结合的噬菌体用0.1M HCl洗脱10分钟，洗脱液用1.0M Tris碱溶液中和。洗脱下来的噬菌体在大肠杆菌XL1-blue中繁殖，用于下一轮选择。

文库用各种靶标蛋白质进行5轮选择。来自各轮选择的各个克隆以96孔的方式和M13-K07一起培养在500μL添加了羧苄青霉素的2YT肉汤培养基中。培养物上清液直接用于噬菌体ELISA(Sidhu等人，同上文)，检测结合用靶标蛋白质包被的平板而不结合用BSA包被的平板的噬菌体所展示的Fab。特定结合物被定义为在靶标蛋白质包被的平板中的ELISA信号比用BSA包被的平板中的信号至少高10倍的那些噬菌体克隆。在4和5轮选择后，筛选结合人DR5或人HER-2的个别克隆。对特异性结合物进行序列分析。还用斑点亲合性ELISA(Spot Affinity ELISA)、特异性ELISA、特异性ELISA对特异性结合物进行分析，对HER2的亲合力用本说明书描述的方法进行分析(参见图11B)。如图10中所示，YSGR-A-D文库生成抗两种靶标蛋白质的特异性结合物。

在240个被鉴定为特异性结合的人HER-2克隆中，106个具有独特的CDR序列(参见图11)。独特序列分为3类：1)6-7个残基的CDRH3序列；2)8个残基的CDRH3序列；和3)序列中具有酪氨酸、丝氨酸和甘氨酸的中等长度CDR序列。

抗HER-2的重链可变区偏爱寡聚物文库中不包括的短CDRH3序列(例如对应于95-100a的位置中的6-7个氨基酸)(参见图12)。CDRH3在位置95的N末端具有保守酪氨酸残基。其它保守位置存在于位置99，其主要是甘氨酸。共有序列显示CDRL3：QQSYYX4PST(SEQ ID NO：587)；CDRH1：GFSIX2X3SYIH(SEQ ID NO：588)；和CDRH2：SIYPX3SGYTSYADSKVG(SEQ ID NO：589)，其中X表示共有残基未被确定的氨基酸位置，其中，每个CDR中的位置X是Y或S。

重链可变区具有CDRH3，CDRH3具有8个氨基酸，在CDRH3的N末端和C末端(在位置95和100a)具有保守的甘氨酸。位置98具有保守的酪氨酸。8个氨基酸的CDRH3的位置99偏爱小氨基酸，例如G、S、A或T。该位置后在位置100上是大氨基酸，例如R、H、Y和W。共有序列为CDRH1：GFX1ISYSSIH(SEQ ID NO：590)；和CDRH2：SIYPX3YGX5TX6YADSKVG(SEQ ID NO：591)，其中X表示共有残基未被确定的氨基酸位置，并且是Y或S。

分析具有中等长度(例如约12-14个氨基酸)CDRH3区的重链可变区，提供CDRH3共有序列X1X2X3X4YYSYYX10GX12X13X14DY(SEQ IDNO：592)，其中X表示共有残基未被确定的氨基酸位置，其中X1选自Y、S和R；X2选自Y和S；X3选自G、Y和S；X4选自Y、S、R和G；X10选自Y、S和G；X12选自Y、S、G和R；X13选自G和A；和X14选自I、F、F和L(参见图14)。由于CDRH3形成一个环，对于某些克隆来说，CDRH3的共有序列通过序列移码2个氨基酸来揭示，以使该序列的位置95与参照序列的位置97比对，在这种情形下，该序列为克隆52的序列。共有序列为CDRH1：GFX1ISSSSIH(SEQ ID NO：593)；和CDRH2：X1IX2PSSGYTX6YADSKVG(SEQ ID NO：594)，其中X表示共有残基未被确定的氨基酸位置，并且是Y或S。

如图11B中所示，数种结合HER2的克隆具有0.1-10nM的IC₅₀。在极大程度上，这些高亲合力的结合物与其它抗原具有很低或没有交叉反应活性，其它抗原例如VEGF、DR5、胰岛素、中性抗生物素(neutravidin)、人生长激素、或人IGF-1

如图10中所示，鉴定了144个克隆，表达作为人DR5的特异性结合物的Fab。如图15中所示，从这144个克隆中序列分析鉴定了18种独特的氨基酸序列。

如下，这些结合物的各个IC₅₀通过竞争性噬菌体ELISA确定。在4℃，NUNC 96孔Maxisorp免疫平板用hDR5-ECD(5ug/ml)包被过夜，并用BSA封闭。展示Fab的噬菌体在大肠杆菌XL1-blue中繁殖，添加了M13-KO7辅助噬菌体。在37℃，2YT培养液中培养过夜，用PEG/NaCl沉淀浓缩噬菌体，重新悬浮在磷酸盐缓冲的盐水(PBS)，0.5％(w/v)BSA，0.1％(v/v)Tween 20(PBT缓冲液)中。将噬菌体在PBT缓冲液中连续稀释，并对结合进行测量，确定在饱和状态下产生约50％信号的噬菌体浓度。确定的亚饱和浓度的噬菌体用hDR5-ECD的系列稀释液预培养2小时，然后转移到用hDR5-ECD包被的分析平板中。温育15分钟后，用PBS、0.05％Tween 20洗涤平板，并用辣根过氧化物酶/抗M13抗体偶联物(在PBT缓冲液中1∶5000稀释)温育30分钟。洗涤平板，用TMB底物显影，用1.0M H₃PO₄淬灭，和在450nm处用分光光度计读数。抗hDR5配体的结合亲合力被确定为IC₅₀值，被定义为其阻断50％噬菌体结合被固定的hDR5-ECD上的hDR5-ECD的浓度。

分析克隆是否结合人DR5的胞外结构域(SEQ ID NO：595)。具有最低IC₅₀的结合物在CDRH1中主要含丝氨酸，而在CDRH3的位置96和99主要为精氨酸。分析重链可变区的CDRH3区，提供CDRH3的共有序列YRX3YRYGX8X9X10GSYX14X15DY(SEQ ID NO：596)，其中X3选自Y、S、R、P和G；X8选自R、Y和S；X9选自G和Y；X10选自S、Y和R，X14选自G和A；和X15选自L和F，其中X为共有残基未被确定的氨基酸位置(参见图16)。还显示CDRL3的共有序列为：QQX1X2X3SPST(SEQ ID NO：597)，其中X1、X2和X3是Y或S；CDRH1：GFX1IX2SSSIH(SEQ ID NO：598)；和CDRH2：X1ISPX3X4GYTX6YADSKVG(SEQ ID NO：599)，其中X是共有残基未被确定的氨基酸位置，并且是Y或S。其中可利用共有序列来形成新的抗体可变区文库。在CDRH3中，位置97、100b、100c、100h和100i上的氨基酸导致较高的亲合力。

用上述竞争性噬菌体ELISA分析克隆是否结合小鼠DR5。从YSGR A-D文库中分离数种克隆，它们结合人DR5和小鼠DR5，尽管其结合小鼠DR5的亲合力低得多(参见图17)。该文库提供用于分离结合小鼠和人DR5的抗体，表明与全部随机CDRH3(所有20种氨基酸)和YS CDRH3文库相比，所鉴定的结合物是独特的。在各个位置上改变氨基酸的多样性，提供结合不同表位并具有独特生物学功能的抗体。结合小鼠和人DR5的抗DR5的抗体结合的表位不同来自先前开发的文库的抗DR5的那些抗体。

实施例3.分析DR5的结合物

Apo 2L配体与人DR5的结合位点先前已经被作图，并且确定了结合位点的晶体结构(参见Hymowitz等人，Molecular Cell 4：564(1999)；WO01/19861)。该晶体结构和模型可用于对抗DR5的抗体的结合进行作图。

先前的研究已经确定了结合人DR5的抗体。这些抗体被称为BDF1和YSD1。抗体BDF1分离自CDR用所有20种氨基酸随机化并且具有如下CDR序列的文库：1)CDRH1的序列为IGKSGIH(SEQ ID NO：600)；2)CDR2的序列为VAVIYPHDGNTAYA(SEQ ID NO：601)；和3)CDRH3的序列为RLALVRMWMD(SEQ ID NO：602)。YSD1抗体分离自CDR位置用酪氨酸和丝氨酸改变并且具有序列为YSSYYSYYYSSSSYSY(SEQ ID NO：603)的CDRH3的文库。这些抗体在人DR5上的结合位点位于该分子的N末端，很少与Apo 2L配体重叠，Apo 2L配体主要存在于C末端(50s环的氨基酸，例如氨基酸50-65，以及90s环的氨基酸，例如DR5的氨基酸91-104)。显示这种抗体的CDRH3区的结合模型示于图18中。BDF1和YSD1的CDRH3重叠，并形成结合DR5的热点(hot spot)。YSD1 CDRH3的结合受酪氨酸介导，而BFD1的结合受LAL序列介导。YSD 1与DR5的结合涉及DR5的亮氨酸、谷氨酰胺、丙氨酸、苯丙氨酸和精氨酸残基。

实施例4.用富含Tyr和Ser残基的CDRH1、H2和L3与富含Ser和Ala、Cys、Phe、Gly、Ile、Leu、Asn、Pro、Arg、Thr、Trp或Tyr残基的CDRH3构建噬菌体展示的Fab文库

如实施例1所述，用噬菌粒载体Fab-C构建菌体展示的Fab文库，Fab文库导致展示二价Fab成分，该二价Fab成分被插入在Fab重链和基因-3小外壳蛋白(P3C)C-末端结构域之间的游离半胱氨酸二聚化。

构建12种文库：SAH3、SCH3、SFH3、SGH3、SLH3、SNH3、SPH3、SRH3、STH3、SWH3和SYH3。在所有三个重链CDR和轻链CDR3中随机化处理残基来构建文库。各个文库在CDRL3的位置91-94和96、CDRH1的位置28和30-33、CDRH2的位置50、52-54、56和58和CDRH3位置95-100、100a-100m上进行随机化。各个随机化位置上允许的氨基酸的类型和比率描述在图19A-19B中。此外，CDRH3的长度用寡核苷酸改变，该寡核苷酸用4-17个密码子替换位置95-100的6个野生型密码子。在那些位置上允许的氨基酸的类型和比率与在图19A-19B中描述的用于CDRH3位置95-100的氨基酸的类型和比率相同。

文库用Kunkel的方法(Kunkel等人，Methods Enzymol.(1987)154：367-382)和先前描述的方法(Sidhu等人，Methods Enzymol.(2000)328，333-363)来构建。独特的“终止模板”样式的Fab展示载体Fab-C用于制备所有四种文库，如实施例1中所述。

在将被多样化的位置上具有简并性密码子的诱变寡核苷酸用于同时(a)导入CDR多样性和(b)修复终止密码子。那些诱变寡核苷酸的序列示于图20A-20L中。对于所有文库来说，分别用寡核苷酸H1、H2和L3(SEQID NO：)将多样性导入CDRH1、CDRH2和CDRL3中。

对于文库SAH3来说，用寡核苷酸H3-SA4、H3-SA5、H3-SA6、H3-SA7、H3-SA8、H3-SA9、H3-SA10、H3-SA11、H3-SA12、H3-SA13、H3-SA14、H3-SA15、H3-SA16和H3-SA17(SEQ ID NO：621-634)的等摩尔混合物将多样性导入CDRH3中。

对于文库SCH3来说，用寡核苷酸H3-SC4、H3-SC5、H3-SC6、H3-SC7、H3-SC8、H3-SC9、H3-SC10、H3-SC11、H3-SC12、H3-SC13、H3-SC14、H3-SC15、H3-SC16和H3-SC17(SEQ ID NO：635-648)的等摩尔混合物将多样性导入CDRH3中。

对于文库SFH3而言，用寡核苷酸H3-SF4、H3-SF5、H3-SF6、H3-SF7、H3-SF8、H3-SF9、H3-SF10、H3-SF11、H3-SF12、H3-SF13、H3-SF14、H3-SF15、H3-SF16和H3-SF17(SEQ ID NO：649-662)的等摩尔混合物将多样性导入CDRH3中。

对于文库SGH3而言，用寡核苷酸H3-SG4、H3-SG5、H3-SG6、H3-SG7、H3-SG8、H3-SG9、H3-SG10、H3-SG11、H3-SG12、H3-SG13、H3-SG14、H3-SG15、H3-SG16和H3-SG17(SEQ ID NO：663-676)的等摩尔混合物将多样性导入CDRH3中。

对于文库SIH3而言，用寡核苷酸H3-SI4、H3-SI5、H3-SI6、H3-SI7、H3-SI8、H3-SI9、H3-SI10、H3-SI11、H3-SI12、H3-SI13、H3-SI14、H3-SI15、H3-SI16和H3-SI17(SEQ ID NO：677-690)的等摩尔混合物将多样性导入CDRH3中。

对于文库SLH3而言，用寡核苷酸H3-SL4、H3-SL5、H3-SL6、H3-SL7、H3-SL8、H3-SL9、H3-SL10、H3-SL11、H3-SL12、H3-SL13、H3-SL14、H3-SL15、H3-SL16和H3-SL17(SEQ ID NO：691-704)的等摩尔混合物将多样性导入CDRH3中。

对于文库SNH3而言，用寡核苷酸H3-SN4、H3-SN5、H3-SN6、H3-SN7、H3-SN8、H3-SN9、H3-SN10、H3-SN11、H3-SN12、H3-SN13、H3-SN14、H3-SN15、H3-SN16和H3-SN17(SEQ ID NO：705-718)的等摩尔混合物将多样性导入CDRH3中。

For文库SPH3而言，用寡核苷酸H3-SP4、H3-SP5、H3-SP6、H3-SP7、H3-SP8、H3-SP9、H3-SP10、H3-SP11、H3-SP12、H3-SP13、H3-SP14、H3-SP15、H3-SP16和H3-SP17(SEQ ID NO：719-732)的等摩尔混合物将多样性导入CDRH3中。

对于文库SRH3而言，用寡核苷酸H3-SR4、H3-SR5、H3-SR6、H3-SR7、H3-SR8、H3-SR9、H3-SR10、H3-SR11、H3-SR12、H3-SR13、H3-SR14、H3-SR15、H3-SR16和H3-SR17(SEQ ID NO：733-746)的等摩尔混合物将多样性导入CDRH3中。

对于文库STH3而言，用寡核苷酸H3-ST4、H3-ST5、H3-ST6、H3-ST7、H3-ST8、H3-ST9、H3-ST10、H3-ST11、H3-ST12、H3-ST13、H3-ST14、H3-ST15、H3-ST16和H3-ST17(SEQ ID NO：747-760)的等摩尔混合物将多样性导入CDRH3中。

对于文库SWH3而言，用寡核苷酸H3-SW4、H3-SW5、H3-SW6、H3-SW7、H3-SW8、H3-SW9、H3-SW10、H3-SW11、H3-SW12、H3-SW13、H3-SW14、H3-SW15、H3-SW16和H3-SW17(SEQ ID NO：761-774)的等摩尔混合物将多样性导入CDRH3中。

对于文库SYH3而言，用寡核苷酸H3-SY4、H3-SY5、H3-SY6、H3-SY7、H3-SY8、H3-SY9、H3-SY10、H3-SY11、H3-SY12、H3-SY13、H3-SY14、H3-SY15、H3-SY16和H3-SY17(SEQ ID NO：775-788)的等摩尔混合物将多样性导入CDRH3中。

在单个诱变反应中同时包括所有将被随机化的CDR的诱变寡核苷酸，使得同时掺入所有的诱变寡核苷酸导致在各个位置上导入所设计的多样性，并同时修复所有的TAA终止密码子。因此，生成开放阅读框，编码融合到同型二聚化半胱氨酸键和P3C上的Fab文库成员。诱变后，将12种文库组合成单个文库，称作为文库SXH3。

将诱变反应物通过电穿孔导入到大肠杆菌SS320中(Sidhu等人，同上文)。存在M13-KO7辅助噬菌体(New England Biolabs，Beverly，MA)时，转化细胞生长过夜，制备包裹噬菌粒DNA并在表面上展示Fab片段的噬菌体颗粒。组合文库含有超过3×10¹⁰种独特成员。

实施例5.从首次用于试验的文库SXH3中选择特异性抗体

来自文库SXH3(上面实施例4中所述)的噬菌体进行数轮结合选择，富集结合人HER2的克隆。用先前描述的方法(Sidhu等人，同上文)进行结合选择。

在4℃，用5μg/mL靶标蛋白质(HER2)包被NUNC 96孔Maxisorp免疫平板过夜，并用PBT溶液(Sigma)封闭2小时。在37℃生长过夜后，用PEG/NaCl沉淀浓缩噬菌体，并重新悬浮在PBT中，如先前所述(Sidhu等人，同上文)。将噬菌体溶液(约10¹²个噬菌体/mL)添加到已包被的免疫平板中。温育2小时，让噬菌体结合，用PBT洗涤平板10次。被结合的噬菌体用0.1M HCl洗脱10分钟，洗脱液用1.0M Tris碱溶液中和。洗脱下来的噬菌体在大肠杆菌XL1-blue中繁殖，用于下一轮选择。

文库用各种靶标蛋白质进行6轮选择。来自各轮选择的各个克隆用96孔的方式和M13-K07一起培养在500μL添加了羧苄青霉素的2YT肉汤培养基中。培养物上清液直接用于噬菌体ELISA(Sidhu等人，同上文)，检测结合用靶标蛋白质包被的平板而不结合用BSA包被的平板的噬菌体所展示的Fab。特定结合物被定义为在靶标蛋白质包被的平板中的ELISA信号比用BSA包被的平板中的信号至少高10倍的那些噬菌体克隆。在4、5和6轮选择后，筛选结合人HER2的个别克隆。对特定结合物进行序列分析。如图21中所示，SXH3文库生成抗靶标蛋白质的特异性结合物。

在72个被鉴定为特异性结合的人HER2克隆中，27个具有独特的CDR序列(参见图21A)。独特序列分为3类：(1)随机化位置限于二元(binary)Tyr/Ser的CDR序列(克隆号B1-5和B28)；(b)随机化位置限于二元Trp/Ser的CDR序列(克隆号B6-24)；(c)随机化位置限于二元Phe/Ser的CDR序列(克隆号B25-27)。这些克隆高度特异于HER2，与五种其它对照蛋白质不发生交叉反应，该五种蛋白质为人VEGF、人DR5、人胰岛素、中性抗生物素、人IGF-1或HGH(参见图21B)。各个克隆的抑制浓度示于图21B中。

噬菌体ELISA用于检测所有克隆与一组除了靶标抗原外的6种抗原发生交叉反应的能力。如所述，以96孔的方式制备噬菌体，噬菌体上清液用PBT缓冲液稀释3倍。将经稀释的噬菌体上清液转移到用人VEGF、HER2、人DR5、人胰岛素、中性抗生物素、人IGF-1、HGH或BSA包被的平板中，室温下轻轻摇动培养1小时。用包括0.05％Tween 20的PBS洗涤平板，并用辣根过氧化物酶/抗M13抗体偶联物(在PT缓冲液中以1∶5000稀释)(Pharmacia)温育30分钟。洗涤平板，用四甲基对二氨基联苯(TMB)底物(Kirkegaard和Perry Laboratories)显影，并用1.0M H₃PO₄淬灭。在450nm处用分光光度计测定吸光度。弱的交叉反应定义为0.2-2.0之间的信号，强的交叉反应定义为约2.0的信号。HER2结合克隆的结果示于图21B中。如图25中所示，在所分离的SXH3克隆中，S:R克隆具有最大的平均非特异性结合(ELISA分析测定450nm处的OD为0.5-0.6)，而S:W、S:Y和S:F克隆各自具有类似的低水平的平均非特异性结合(ELISA分析测定450nm处的OD为0-0.1)。

竞争性噬菌体ELISA用于评价结合HER2的噬菌体所展示的Fab的结合亲合力。如所述，以96孔的方式制备噬菌体，而噬菌体上清液用PBT缓冲液连续稀释，然后在用HER2包被的平板上温育15分钟。平板用包括0.05％Tween 20的PBS洗涤，并用辣根过氧化物酶/抗M13抗体偶联物(在PT缓冲液中以1∶5000稀释)(Pharmacia)温育30分钟。洗涤平板，用四甲基对二氨基联苯(TMB)底物(Kirkegaard和Perry Laboratories)显影，并用1.0MH₃PO₄淬灭。在450nm处用分光光度计测定吸光度，确定在饱和条件下产生约50％信号的噬菌体浓度。确定的亚饱和浓度的噬菌体用PBT缓冲液或者含有250nM HER2-0.12nM HER2的两倍连续稀释的HER2蛋白质的PBT缓冲液两倍稀释。室温下，轻轻摇动混合物，温育1小时，并转移到用HER2包被的平板上，将平板温育15分钟。完全如上对平板进行洗涤和处理。结合亲合力被评定为IC₅₀值(定义为阻断50％噬菌体结合到固定抗原上的抗原浓度)。结果示于图21B中。

实施例6.具有富含Ser和Phe、Arg、Trp或Tyr残基的CDR的噬菌体展示Fab文库的构建

如先前在实施例1中所述，用噬菌粒载体Fab-C构建菌体展示的Fab文库，Fab文库导致展示二价Fab成分，该二价Fab成分被插入在Fab重链和基因-3小外壳蛋白(P3C)C-末端结构域之间的游离半胱氨酸二聚化。

构建4种文库：SFH3、SRH3、SWH3和SYH3。在所有三个重链CDR和轻链CDR3中随机化处理残基来构建文库。各个文库在CDRL3的位置91-94和96、CDRH1的位置28和30-33、CDRH2的位置50、52-54、56和58和CDRH3的位置95-100、100a-100m上进行随机化。各个随机化位置上允许的氨基酸的类型和比率描述在图22中。此外，CDRH3的长度用寡核苷酸改变，该寡核苷酸用4-17个密码子替换位置95-100之间的6个野生型密码子。在那些位置上允许的氨基酸的类型和比率与在图22中描述的用于CDRH3位置95-100的氨基酸的类型和比率相同。

文库用Kunkel的方法(Kunkel，T.A.，Roberts，J.D.&Zakour，R.A.，Methods Enzymol.(1987)，154，367-382)和先前描述的方法(Sidhu，S.S.，Lowman，H.B.，Cunningham，B.C.& Wells，J.A.，Methods Enzymol.(2000)，328，333-363)来构建。独特的“终止模板”样式的Fab展示载体Fab-C用于制备所有四种文库，如实施例1中所述。

在将被多样化的位置上具有简并性密码子的诱变寡核苷酸用于同时(a)导入CDR多样性和(b)修复终止密码子。那些诱变寡核苷酸的序列示于图20和23中。对于文库SF-surface来说，分别用寡核苷酸L3-SF、H1-SF和H2-SF(SEQ ID NO：)将多样性导入CDR-L3、CDR-H1和CDR-H2中(图23)，并用寡核苷酸H3-SF4、H3-SF5、H3-SF6、H3-SF7、H3-SF8、H3-SF9、H3-SF10、H3-SF11、H3-SF12、H3-SF13、H3-SF14、H3-SF15、H3-SF16和H3-SF17(SEQ ID NO：649-662)(图20C)的等摩尔混合物将多样性导入CDR-H3中。

对于文库SR-surface来说，分别用寡核苷酸L3-SR、H1-SR和H2-SR(SEQ ID NO：)(图23)将多样性导入CDR-L3、CDR-H1和CDR-H2中，并用寡核苷酸H3-SR4、H3-SR5、H3-SR6、H3-SR7、H3-SR8、H3-SR9、H3-SR10、H3-SR11、H3-SR12、H3-SR13、H3-SR14、H3-SR15、H3-SR16和H3-SR17(SEQ ID NO：733-746)(图20I)的等摩尔混合物将多样性导入CDR-H3中。

对于文库SW-surface来说，分别用寡核苷酸L3-SW、H1-SW和H2-SW(SEQ ID NO：747-760)(图23)将多样性导入CDR-L3、CDR-H1和CDR-H2中，并用寡核苷酸H3-SW4，H3-SW5、H3-SW6、H3-SW7、H3-SW8、H3-SW9、H3-SW10、H3-SW11、H3-SW12、H3-SW13、H3-SW14、H3-SW15、H3-SW16和H3-SW17(SEQ ID NO：761-774)(图20K)的等摩尔混合物将多样性导入CDR-H3中。

对于文库SY-surface来说，分别用寡核苷酸L3、H1和H2(SEQ ID NO：)(图20A)将多样性导入CDR-L3、CDR-H1和CDR-H2中，并用寡核苷酸H3-SY4、H3-SY5、H3-SY6、H3-SY7、H3-SY8、H3-SY9、H3-SY10、H3-SY11、H3-SY12、H3-SY13、H3-SY14、H3-SY15、H3-SY16和H3-SY17(SEQ ID NO：775-788)(图20L)的等摩尔混合物将多样性导入CDR-H3中。

在单个诱变反应中同时包括所有将被随机化的CDR的诱变寡核苷酸，使得同时掺入所有的诱变寡核苷酸，导致在各个位置上导入所设计的多样性，并同时修复所有的TAA终止密码子。因此，生成开放阅读框，编码融合到同型二聚化半胱氨酸键和P3C上的Fab文库成员。诱变后，将4种文库组合成单个文库，称作为文库SX-surface。

实施例7.从首次用于试验的文库SX Surface中选择特异性抗体

来自文库SX-surface(如上面实施例6中所述)的噬菌体进行数轮结合选择，富集结合人HER2的克隆。用先前描述的方法(Sidhu等人，同上文)进行结合选择。

在4℃，用5μg/mL靶标蛋白质(人HER2)包被NUNC 96孔Maxisorp免疫平板过夜，并用PBT溶液(Sigma)封闭2小时。在37℃生长过夜后，用PEG/NaCl沉淀浓缩噬菌体，并重新悬浮在PBT中，如先前所述(Sidhu等人，同上文)。将噬菌体溶液(约10¹²个噬菌体/mL)添加到已包被的免疫平板中。温育2小时，让噬菌体结合后，用PBT洗涤平板10次。被结合的噬菌体用0.1M HCl洗脱10分钟，洗脱液用1.0M Tris碱溶液中和。洗脱下来的噬菌体在大肠杆菌XL1-blue中繁殖，用于下一轮选择。

文库用各种靶标蛋白质进行6轮选择。来自各轮选择的各个克隆用96孔的方式和M13-K07一起培养在500μL添加了羧苄青霉素的2YT肉汤培养基中。培养物上清液直接用于噬菌体ELISA(Sidhu等人，同上文)，检测结合用靶标蛋白质包被的平板而不结合用BSA包被的平板的噬菌体展示的Fab。特异性结合物被定义为在靶标蛋白质包被的平板中的ELISA信号比用BSA包被的平板中的信号至少高10倍的那些噬菌体克隆。在4、5和6轮选择后，筛选结合人HER2的个别克隆。对特异性结合物进行序列分析。如图24中所示，SX-surface文库生成抗靶标蛋白质的特异性结合物。

在81个被鉴定为特异性结合的HER2克隆中，27个具有独特的CDR序列(参见图24A)。独特序列分为2类：(1)随机化位置限于二元Tyr/Ser的CDR序列(克隆号G49-61)；(b)随机化位置限于二元Trp/Ser的CDR序列(克隆号G29-48)。Tyr/Ser克隆高度特异于HER2，与五种其它对照蛋白质不发生交叉反应，该五种蛋白质为人VEGF、人DR5、人胰岛素、中性抗生物素、人IGF-1或HGH(参见图24B)。但是，某些Trp/Ser克隆会发生交叉反应(参见图24B)。各个克隆的抑制浓度示于图24B中。

噬菌体ELISA用于检测所有克隆与一组除了靶标抗原外的6种抗原发生交叉反应的能力。如上所述，以96孔的方式制备噬菌体，噬菌体上清液用PBT缓冲液稀释3倍。将经稀释的噬菌体上清液转移到用人VEGF、HER2、人DR5、人胰岛素、中性抗生物素、人IGF-1、HGH或BSA包被的平板中，室温下轻轻摇动培养1小时。用包括0.05％Tween 20的PBS洗涤平板，并用辣根过氧化物酶/抗M13抗体偶联物(在PT缓冲液中以1∶5000稀释)(Pharmacia)温育30分钟。洗涤平板，用四甲基对二氨基联苯(TMB)底物(Kirkegaard和Perry Laboratories)显影，并用1.0M H₃PO₄淬灭。在450nm处用分光光度计测定吸光度。弱交叉反应定义为0.2-2.0之间的信号，强交叉反应定义为约2.0的信号。HER2结合SX-surface克隆的结果示于图24B中。如图27中所示，在所分离的SX-surface克隆中，S:R和S:W克隆具有最大的平均非特异性结合(ELISA分析测定450nm处的OD分别为0.5-0.6和约4.0)，而S:Y和S:F克隆各自具有类似的低水平的平均非特异性结合(ELISA分析测定450nm处的OD为0-0.1)。

竞争性噬菌体ELISA用于评价结合HER2的噬菌体所展示的Fab的结合亲合力。如所述以96孔的方式制备噬菌体，而噬菌体上清液用PBT缓冲液连续稀释，然后在用HER2包被的平板上温育15分钟。平板用包括0.05％Tween20的PBS洗涤，并用辣根过氧化物酶/抗M13抗体偶联物(在PT缓冲液中以1∶5000稀释)(Pharmacia)温育30分钟。洗涤平板，用四甲基对二氨基联苯(TMB)底物(Kirkegaard和Perry Laboratories)显影，并用1.0M H₃PO₄淬灭。在450nm处用分光光度计测定吸光度，确定在饱和条件下产生约50％信号的噬菌体浓度。确定的亚饱和浓度的噬菌体用PBT缓冲液或者含有250nM HER2-0.12nM HER2的两倍连续稀释的HER2蛋白质的PBT缓冲液二倍稀释。室温下，轻轻摇动混合物，温育1小时，并转移到用HER2包被的平板上，将平板温育15分钟。完全如上对平板进行洗涤和处理。结合亲合力被评定为IC₅₀值(定义为阻断50％噬菌体结合到固定抗原上的抗原浓度)。结果示于图24B中。

基于该分析，分析来自SXH3文库(实施例6)和YSGR-A-D文库(实施例1)的结合HER2的克隆，从三种克隆(克隆号42(YSGR-A)和B11(SXH3)和G54(SX-surface))中纯化得到可溶的Fab蛋白，并通过表面等离子共振分析其是否结合人HER2。按照Chen等人，J.Mol.Biol.(1999)，293(4)：865-81获得BIAcore

数据。简而言之，用BIAcore

-A100表面等离子共振系统(BIACORE，Inc.，Piscataway，N.J.)测定的结合和解离速率常数计算纯化的Fab对人HER2的结合亲合力。使用N-乙基-N’-(3-二甲基氨基丙基)-碳二亚胺盐酸(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，依照生产商(BIAcore，Inc.，Piscataway，N.J.)的用法说明，将不同浓度的HER2共价偶联到生物传感器芯片上。HER2经缓冲液交换到10mM醋酸钠，pH5.0中，并稀释成约2.5或5.0g/ml的浓度。将等份的HER2以5μL/min的流速注入，获得约50-170个反应单位(RU)的偶联蛋白。注入1M乙醇胺溶液作为阻断剂。对于动力学检测，将各种Fab的两倍连续稀释液注入HBT中，在25℃以10μL/min的速度流过各个流程单元(flow cell)。用BIAevaluation软件包(BIACORE，Inc.，Piscataway，N.J.)，采用二元完全拟合(two-spot global fitting)并结合来自两个流程单元的数据，从结合曲线上确定k_on和k_off值。解离平衡常数K_D计算为K_off/k_on。BIAcore数据总结在图26A和B中。克隆B11的k_a为1.9×10⁶M^-1s^-1，k_d为1.7×10^-3S^-1，而K_D为890pM。用于克隆B11试验的Rmax1为19RU，而用于克隆B11试验的Rmax2为29 RU(图26A)。克隆G54的k_a为2.0×10⁵M^-1s^-1，k_d为2.2×10^-3S^-1，而K_D为11nM。用于克隆G54试验的R_max1为21RU，而用于克隆G54试验的R_max2为34RU图26A)。克隆YSGR-A-42的k_a为2.7×10⁶M^-1s^-1，k_d为1.5×10^-3S^-1，和K_D为570pM。用于克隆42试验的Rmax1为25RU，而用于克隆42试验的Rmax2为38RU(图26B)。与含酪氨酸的克隆(G54)相比，含色氨酸的克隆(B11)具有较大的k_on和相应的较小的K_D。

为了研究抗HER2的抗体与哺乳动物细胞上所表达的HER2的结合情况，通过流式细胞计数，研究从克隆42(YSGR-A)、B11(SXH3)、G54(SX-surface)和G37(SX-surface)中纯化的Fab蛋白与过度表达HER2的NR6成纤维细胞(NR6-HER2)的结合情况。100万个NR6-HER2细胞与10μg/ml Fab温育1小时，接着与偶联Alexa488的小鼠抗人IgG抗体温育1小时。作为阴性对照，对结合不表达的NR6细胞的Fab进行研究。作为阳性对照，使用4D5 Fab。如图27中示例说明，克隆42、B11、G54和G37特异性地结合NR6细胞上的Her2。

用竞争性ELISA检测数种IgG形式的HER2克隆对Herceptin和Omnitarg的结合竞争性(参见图28中相关克隆的CDR序列)。生物素化的HER2蛋白用PBT缓冲液进行连续稀释，从200nM到0.39nM，然后在用纯化的IgG蛋白质所包被的平板上温育15分钟。平板用含有0.05％Tween 20的PBS洗涤，并用辣根过氧化物酶/抗M13抗体偶联物(在PT缓冲液中以1∶5000稀释)(Pharmacia)温育30分钟。洗涤平板，用四甲基对二氨基联苯(TMB)底物(Kirkegaard和Perry Laboratories)显影，并用1.0M H₃PO₄淬灭。在450nm处用分光光度计测定吸光度，确定在饱和条件下产生约50％信号的生物素化HER2的浓度。确定的亚饱和浓度的生物素化HER2用PBT缓冲液或者含有100nM纯化IgG蛋白的PBT缓冲液进行两倍稀释。室温下，轻轻摇动混合物，温育1小时，并转移到用IgG蛋白包被的平板上，将平板温育15分钟。完全如上对平板进行洗涤和处理。如图29中所示，所有结合HER2的IgG都不阻断生物素化的HER2与Omnitarg或Herceptin结合。在两组中，IgG都不阻断任何两者之间的结合。一个组由竞争相同表位的克隆B11、G37、G54和YSGR-A-42构成，并阻断与生物素化HER2的结合，生物素化的HER2先前已经与那些克隆中的任何一种温育。第二组由竞争HER2上的相同表位的克隆YSGR-A-27、B27、G43和YSGR-D-104构成，并阻断与生物素化HER2的结合。组1的克隆全是亲合力高于组2克隆的结合物。

本说明书中引用的所有出版物(包括专利和专利申请)在此被完全引入作为参考。

表1

人DR5-ECD多肽

MSALLILALVGAAVADYKDDDDKLSALITQQDLAPQQRVAPQQKRSSPSEGLCPPGHHIS

EDGRDCISCKYGQDYSTHWNDLLFCLRCTRCDSGEVELSPCTTTRNTVCQCEEGTFREED

SPEMCRKCRTGCPRGMVKVGDCTPWSDIECVHKESGTKHSGEAPAVEETVTSSPGTPASP

CSLS(SEQ ID NO：595)

人DR5多肽

meqrgqnapa asgarkrhgp gpreargarp glrvpktlvl vvaavlllvs aesalitqqdlapqqraapq qkrsspsegl cppghhised grdcisckyg qdysthwndl lfclrctrcd sgevelspctttrntvcqce egtfreedsp emcrkcrtgc prgmvkvgdc tpwsdiecvh kesgiiigvt vaavvlivavfvcksllwkk vlpylkgics ggggdpervd rssqrpgaed nvlneivsil qptqvpeqemevqepaeptg vnmlspgese hllepaeaer sqrrrllvpa negdptetlr qcfddfadlv pfdsweplmrklglmdneik vakaeaaghr dtlytmlikw vnktgrdasv htlldaletl gerlakqkie dhllssgkfm

ylegnadsal s (SEQ ID NO：604)

小鼠DR5 ECD

GLQRPEESPSRGPCLAGQYLSEGNCKPCREGIDYTSHSNHSLDSCILCTVCKEDKVVETR

CNITTNTVCRCKPGTFEDKDSPEICQSCSNCTDGEEELTSCTPRENRKCVSKTAWASWHK

(SEQ ID NO：605)

Apo-2L多肽序列

1

MetAlaMetMetGluValGlnGlyGlyProSerLeuGlyGlnThrCysValLeuIleValIlePheT

hrValLeuLeuGlnSerLeuCys

31

ValAlaValThrTyrValTyrPheThrAsnGluLeuLysGlnMetGlnAspLysTyrSerLysSer

GlyIleAlaCysPheLeuLysGlu

61

AspAspSerTyrTrpAspProAsnAspGluGluSerMetAsnSerProCysTrpGlnValLysTr

pGlnLeuArgGlnLeuValArgLys

91

MetIleLeuArgThrSerGluGluThrIleSerThrValGlnGluLysGlnGlnAsnIleSerProLe

uValArgGluArgGlyProGln

121

ArgValAlaAlaHisIleThrGlyThrArgGlyArgSerAsnThrLeuSerSerProAsnSerLysA

snGluLysAlaLeuGlyArgLys

151

IleAsnSerTrpGluSerSerArgSerGlyHisSerPheLeuSerAsnLeuHisLeuArgAsnGlyG

luLeuValIleHisGluLysGly

181

PheTyrTyrIleTyrSerGlnThrTyrPheArgPheGlnGluGluIleLysGluAsnThrLysAsnA

spLysGlnMetValGlnTyrIle

211

TyrLysTyrThrSerTyrProAspProIleLeuLeuMetLysSerAlaArgAsnSerCysTrpSerL

ysAspAlaGluTyrGlyLeuTyr

241

SerIleTyrGlnGlyGlyIlePheGluLeuLysGluAsnAspArgIlePheValSerValThrAsnGl

uHisLeuIleAspMetAspHis

271

GluAlaSerPhePheGlyAlaPheLeuValGly(SEQ ID NO：606)

Apo-2L序列的氨基酸114-281

VRERGPQRVA AHITGTRGRS NTLSSPNSKN EKALGRKINSWESSRSGHSF LSNLHLRNGE LVIHEKGFYY IYSQTYFRFQEEIKENTKND KQMVQYIYKY TSYPDPILLM KSARNSCWSKDAEYGLYSIY QGGIFELKEN DRIFVSVTNE HLIDMDHEAS FFGAFLVG(SEQ ID NO：607)

序列表

<110>健泰科生物技术公司(GENENTECH，INC.)

<120>结合多肽及其用途

<130>11669.291USU1

<140>NEW FILING

<141>2006-12-01

<150>60/742,185

<151>2005-12-02

<150>60/805,553

<151>2006-06-22

<160>1013

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>109

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的4D5轻链可变区

<400>1

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala

20 25 30

Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ser Ala Ser Ser Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr

100 105

<210>2

<211>120

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的4D5重链可变区

<400>2

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr

20 25 30

Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210>3

<211>35

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的CDRL3

<400>3

Gly Arg Met Lys Gln Leu Glu Asp Lys Val Glu Glu Leu Leu Ser Lys

1 5 10 15

Asn Tyr His Leu Glu Asn Glu Val Ala Arg Leu Lys Lys Leu Val Gly

20 25 30

Glu Arg Gly

35

<210>4

<211>11

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的CDRH3

<220>

<221>M是C_FEATURE

<222>(1)..(1)

<223>X独立地是Y，G，S，R，A，D，E，F，H，I，K，L，M，N，P，Q，T，V或W

<220>

<221>M是C_FEATURE

<222>(2)..(2)

<220>

<221>M是C_FEATURE

<222>(3)..(3)

<220>

<221>M是C_FEATURE

<222>(4)..(4)

<220>

<221>M是C_FEATURE

<222>(5)..(5)

<220>

<221>M是C_FEATURE

<222>(6)..(6)

<220>

<221>M是C_FEATURE

<222>(6)..(6)

<223>X独立地是Y，G，S，R，A，D，E，F，H，I，K，L，M，N，P，Q，T，V或W，并且可以是不同长度

<220>

<221>M是C_FEATURE

<222>(7)..(7)

<220>

<221>M是C_FEATURE

<222>(8)..(8)

<220>

<221>M是C_FEATURE

<222>(9)..(9)

<400>4

Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Asp Tyr

1 5 10

<210>5

<211>12

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的重链铰链序列

<400>5

Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly

1 5 10

<210>6

<211>23

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的huMAb4D5-8LC-FR1

<400>6

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys

20

<210>7

<211>15

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的huMAb4D5LC-FR2

<400>7

Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr

1 5 10 15

<210>8

<211>32

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的huMAb4D5LC-FR3

<400>8

Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr

1 5 10 15

Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys

20 25 30

<210>9

<211>10

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的huMAb4D5LC-FR4

<400>9

Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

1 5 10

<210>10

<211>25

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的huMAb4D5-8HC-FR1

<400>10

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser

20 25

<210>11

<211>13

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的huMAb4D5HC-FR2

<400>11

Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

1 5 10

<210>12

<211>30

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的huMAb4D5HC-FR3

<400>12

Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gln

1 5 10 15

Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

20 25 30

<210>13

<211>11

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的huMAb4D5HC-FR4

<400>13

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

1 5 10

<210>14

<211>23

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的huMAb4D5-8LC-FR1

<400>14

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys

20

<210>15

<211>15

<212>PRT

<213>Artficial

<400>15

Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr

1 5 10 15

<210>16

<211>32

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的huMAb4D5LC-FR3

<400>16

Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr

1 5 10 15

Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys

20 25 30

<210>17

<211>10

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的huMAb4D5LC-FR4

<400>17

Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

1 5 10

<210>18

<211>25

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的huMAb4D5-8HC-FR1

<400>18

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser

20 25

<210>19

<211>13

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的huMAb4D5HC-FR2

<400>19

Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

1 5 10

<210>20

<211>30

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的huMAb4D5HC-FR3

<400>20

Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln

1 5 10 15

Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

20 25 30

<210>21

<211>11

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的huMAb4D5HC-FR4

<400>21

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

1 5 10

<210>22

<211>10

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的CDRH1

<220>

<221>M是C_FEATURE

<222>(3)..(3)

<223>X是Y或S

<220>

<221>M是C_FEATURE

<222>(5)..(5)

<223>X是Y或S

<220>

<221>M是C_FEATURE

<222>(6)..(6)

<223>X是Y或S

<220>

<221>M是C_FEATURE

<222>(7)..(7)

<223>X是Y或S

<220>

<221>M是C_FEATURE

<222>(8)..(8)

<223>X是Y或S

<400>22

Gly Phe Xaa Ile Xaa Xaa Xaa Xaa Ile His

1 5 10

<210>23

<211>17

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的CDRH2

<220>

<221>M是C_FEATURE

<222>(1)..(1)

<223>X是Y或S

<220>

<221>M是C_FEATURE

<222>(3)..(3)

<223>X是Y或S

<220>

<221>M是C_FEATURE

<222>(5)..(5)

<223>X是Y或S

<220>

<221>M是C_FEATURE

<222>(6)..(6)

<223>X是Y或S

<220>

<221>M是C_FEATURE

<222>(8)..(8)

<223>X是Y或S

<220>

<221>M是C_FEATURE

<222>(10)..(10)

<223>X是Y或S

<400>23

Xaa Ile Xaa Pro Xaa Xaa Gly Xaa Thr Xaa Tyr Ala Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210>24

<211>21

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的CDRH3

<220>

<221>M是C_FEATURE

<222>(1)..(1)

<223>X是Y，G或S

<220>

<221>M是C_FEATURE

<222>(2)..(2)

<223>X是Y，G或S

<220>

<221>M是C_FEATURE

<222>(3)..(3)

<223>X是Y，G或S

<220>

<221>M是C_FEATURE

<222>(4)..(4)

<223>X是Y，G或S

<220>

<221>M是C_FEATURE

<222>(5)..(5)

<223>X是Y，G或S

<220>

<221>M是C_FEATURE

<222>(6)..(6)

<223>X是Y，G或S

<220>

<221>M是C_FEATURE

<222>(7)..(7)

<223>X是Y，G或S或无氨基酸

<220>

<221>M是C_FEATURE

<222>(8)..(8)

<223>X是Y，G或S或无氨基酸

<220>

<221>M是C_FEATURE

<222>(9)..(9)

<223>X是Y，G或S或无氨基酸

<220>

<221>M是C_FEATURE

<222>(10)..(10)

<223>X是Y，G或S或无氨基酸

<220>

<221>M是C_FEATURE

<222>(11)..(11)

<223>X是Y，G或S或无氨基酸

<220>

<221>M是C_FEATURE

<222>(12)..(12)

<223>X是Y，G或S或无氨基酸

<220>

<221>M是C_FEATURE

<222>(13)..(13)

<223>X是Y，G或S或无氨基酸

<220>

<221>M是C_FEATURE

<222>(14)..(14)

<223>X是Y，G或S或无氨基酸

<220>

<221>M是C_FEATURE

<222>(15)..(15)

<223>X是Y，G或S或无氨基酸

<220>

<221>M是C_FEATURE

<222>(16)..(16)

<223>X是Y，G或S或无氨基酸

<220>

<221>M是C_FEATURE

<222>(17)..(17)

<223>X是Y，G或S或无氨基酸

<220>

<221>M是C_FEATURE

<222>(18)..(18)

<223>X是G或A

<220>

<221>M是C_FEATURE

<222>(19)..(19)

<223>X是I，M，L或F

<400>24

Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa

1 5 10 15

Xaa Xaa Xaa Asp Tyr

20

<210>25

<211>9

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的CDRL3

<220>

<221>M是C_FEATURE

<222>(3)..(3)

<223>X是Y或S

<220>

<221>M是C_FEATURE

<222>(4)..(4)

<223>X是Y或S

<220>

<221>M是C_FEATURE

<222>(5)..(5)

<223>X是Y或S

<220>

<221>M是C_FEATURE

<222>(6)..(6)

<223>X是Y或S

<220>

<221>M是C_FEATURE

<222>(8)..(8)

<223>X是Y或S

<400>25

Gln Gln Xaa Xaa Xaa Xaa Pro Xaa Thr

1 5

<210>26

<211>21

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的CDRH3

<220>

<221>M是C_FEATURE

<222>(1)..(1)

<223>X是Y，R或S

<220>

<221>M是C_FEATURE

<222>(2)..(2)

<223>X是Y，R或S

<220>

<221>M是C_FEATURE

<222>(3)..(3)

<223>X是Y，R或S

<220>

<221>M是C_FEATURE

<222>(4)..(4)

<223>X是Y，R或S

<220>

<221>M是C_FEATURE

<222>(5)..(5)

<223>X是Y，R或S

<220>

<221>M是C_FEATURE

<222>(6)..(6)

<223>X是Y，R或S

<220>

<221>M是C_FEATURE

<222>(7)..(7)

<223>X是Y，S或R或不存在

<220>

<221>M是C_FEATURE

<222>(8)..(8)

<223>X是Y，S或R或不存在

<220>

<221>M是C_FEATURE

<222>(9)..(9)

<223>X是Y，S或R或不存在

<220>

<221>M是C_FEATURE

<222>(10)..(10)

<223>X是Y，S或R或不存在

<220>

<221>M是C_FEATURE

<222>(11)..(11)

<223>X是Y，S或R或不存在

<220>

<221>M是C_FEATURE

<222>(12)..(12)

<223>X是Y，S或R或不存在

<220>

<221>M是C_FEATURE

<222>(13)..(13)

<223>X是Y，S或R或不存在

<220>

<221>M是C_FEATURE

<222>(14)..(14)

<223>X是Y，S或R或不存在

<220>

<221>M是C_FEATURE

<222>(15)..(15)

<223>X是Y，S或R或不存在

<220>

<221>M是C_FEATURE

<222>(16)..(16)

<223>X是Y，S或R或不存在

<220>

<221>M是C_FEATURE

<222>(17)..(17)

<223>X是Y，S或R或不存在

<220>

<221>M是C_FEATURE

<222>(18)..(18)

<223>X是G或A

<220>

<221>M是C_FEATURE

<222>(19)..(19)

<223>X是I，M，L或F

<400>26

Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa

1 5 10 15

Xaa Xaa Xaa Asp Tyr

20

<210>27

<211>21

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的CDRH3

<220>

<221>M是C_FEATURE

<222>(1)..(1)

<223>X是Y，G，R或S

<220>

<221>M是C_FEATURE

<222>(2)..(2)

<223>X是Y，G，R或S

<220>

<221>M是C_FEATURE

<222>(3)..(3)

<223>X是Y，G，R或S

<220>

<221>M是C_FEATURE

<222>(4)..(4)

<223>X是Y，G，R或S

<220>

<221>M是C_FEATURE

<222>(5)..(5)

<223>X是Y，G，R或S

<220>

<221>M是C_FEATURE

<222>(6)..(6)

<223>X是Y，G，R或S

<220>

<221>M是C_FEATURE

<222>(7)..(7)

<223>X是Y，S，G，R或无氨基酸

<220>

<221>M是C_FEATURE

<222>(8)..(8)

<223>X是Y，S，G，R或无氨基酸

<220>

<221>M是C_FEATURE

<222>(9)..(9)

<223>X是Y，S，G，R或无氨基酸

<220>

<221>M是C_FEATURE

<222>(10)..(10)

<223>X是Y，S，G，R或无氨基酸

<220>

<221>M是C_FEATURE

<222>(11)..(11)

<223>X是Y，S，G，R或无氨基酸

<220>

<221>M是C_FEATURE

<222>(12)..(12)

<223>X是Y，S，G，R或无氨基酸

<220>

<221>M是C_FEATURE

<222>(13)..(13)

<223>X是Y，S，G，R或无氨基酸

<220>

<221>M是C_FEATURE

<222>(14)..(14)

<223>X是Y，S，G，R或无氨基酸

<220>

<221>M是C_FEATURE

<222>(15)..(15)

<223>X是Y，S，G，R或无氨基酸

<220>

<221>M是C_FEATURE

<222>(16)..(16)

<223>X是Y，S，G，R或无氨基酸

<220>

<221>M是C_FEATURE

<222>(17)..(17)

<223>X是Y，S，G，R或无氨基酸

<220>

<221>M是C_FEATURE

<222>(18)..(18)

<223>X是G或A

<220>

<221>M是C_FEATURE

<222>(19)..(19)

<223>X是I，M，L或F

<400>27

Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa

1 5 10 15

Xaa Xaa Xaa Asp Tyr

20

<210>28

<211>21

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的CDRH3

<220>

<221>M是C_FEATURE

<222>(1)..(1)

<223>X是Y，G，S，R，A，D，E，F，H，I，K，L，M，N，P，Q，T，V，或W

<220>

<221>M是C_FEATURE

<222>(2)..(2)

<220>

<221>M是C_FEATURE

<222>(3)..(3)

<220>

<221>M是C_FEATURE

<222>(4)..(4)

<220>

<221>M是C_FEATURE

<222>(5)..(5)

<220>

<221>M是C_FEATURE

<222>(6)..(6)

<220>

<221>M是C_FEATURE

<222>(7)..(7)

<223>X是Y，G，S，R，A，D，E，F，H，I，K，L，M，N，P，Q，T，V，W或无氨基酸

<220>

<221>M是C_FEATURE

<222>(8)..(8)

<220>

<221>M是C_FEATURE

<222>(9)..(9)

<220>

<221>M是C_FEATURE

<222>(10)..(10)

<220>

<221>M是C_FEATURE

<222>(11)..(11)

<220>

<221>M是C_FEATURE

<222>(12)..(12)

<220>

<221>M是C_FEATURE

<222>(13)..(13)

<220>

<221>M是C_FEATURE

<222>(14)..(14)

<220>

<221>M是C_FEATURE

<222>(15)..(15)

<220>

<221>M是C_FEATURE

<222>(16)..(16)

<220>

<221>M是C_FEATURE

<222>(17)..(17)

<220>

<221>M是C_FEATURE

<222>(18)..(18)

<223>X是G或A

<220>

<221>M是C_FEATURE

<222>(19)..(19)

<223>X是I，M，L或F

<400>28

Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa

1 5 10 15

Xaa Xaa Xaa Asp Tyr

20

<210>29

<211>11

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的Kabat共有CDRL1

<400>29

Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala Val Ala

1 5 10

<210>30

<211>7

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的Kabat共有CDRL2

<400>30

Ser Ala Ser Ser Leu Tyr Ser

1 5

<210>31

<211>18

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的CDRH3

<220>

<221>M是C_FEATURE

<222>(1)..(1)

<223>X是R，Y或M

<220>

<221>M是C_FEATURE

<222>(2)..(2)

<223>X是Y或R

<220>

<221>M是C_FEATURE

<222>(3)..(3)

<223>X是Y，S，R，P或G

<220>

<221>M是C_FEATURE

<222>(4).，(4)

<223>X是Y或S

<220>

<221>M是C_FEATURE

<222>(5)..(5)

<223>X是Y，S，R或H

<220>

<221>M是C_FEATURE

<222>(6)..(6)

<223>X是R，Y或S

<220>

<221>M是C_FEATURE

<222>(7)..(7)

<223>X是G，Y或S

<220>

<221>M是C_FEATURE

<222>(8)..(8)

<223>X是R，Y或S

<220>

<221>M是C_FEATURE

<222>(9)..(9)

<223>X是G，Y或S

<220>

<221>M是C_FEATURE

<222>(10)..(10)

<223>X是R，Y或S

<220>

<221>M是C_FEATURE

<222>(11)..(11)

<223>X是G，Y或S

<220>

<221>M是C_FEATURE

<222>(12)..(12)

<223>X是S，Y，R，G或A

<220>

<221>M是C_FEATURE

<222>(13)..(13)

<223>X是G或Y

<220>

<221>M是C_FEATURE

<222>(14)..(14)

<223>X是L，M，R，G或A

<220>

<221>M是C_FEATURE

<222>(15)..(15)

<223>X是G，F，L或无氨基酸

<220>

<221>M是C_FEATURE

<222>(16)..(16)

<223>X是F或无氨基酸

<400>31

Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa

1 5 10 15

Asp Tyr

<210>32

<211>45

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>合成的H1

<400>32

gcagcttctg gcttctmatt tmttmtmtmt atacactggg tgcgt 45

<210>33

<211>58

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>合成的H2

<400>33

ctggaatggg ttgcatmtat ttmtccatmt tggttmtact tmttatgccg atagcgtc 58

<210>34

<211>54

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>合成的L3

<400>34

acttattact gtcagcaatm ttmttmttmt ccatmtacgt tcggacaggg tacc 54

<210>35

<211>60

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>合成的H3-A6

<220>

<221>m是c_feature

<222>(19)..(21)

<223>N19至N21独立地是TAT，TAC，TCA，TCT，TCC，TCG，AGT，AGC，GGA，GGT，GGC或GGG

<220>

<221>m是c_feature

<222>(22)..(24)

<223>N22至N24独立地是TAT，TAC，TCA，TCT，TCC，TCG，AGT，AGC，GGA，GGT，GGC或GGG

<220>

<221>m是c_feature

<222>(25)..(27)

<223>N25至N27独立地是TAT，TAC，TCA，TCT，TCC，TCG，AGT，AGC，GGA，GGT，GGC或GGG

<220>

<221>m是c_feature

<222>(28)..(30)

<223>N28至N30独立地是TAT，TAC，TCA，TCT，TCC，TCG，AGT，AGC，GGA，GGT，GGC或GGG

<220>

<221>m是c_feature

<222>(31)..(33)

<223>N31至N33独立地是TAT，TAC，TCA，TCT，TCC，TCG，AGT，AGC，GGA，GGT，GGC或GGG

<220>

<221>m是c_feature

<222>(34)..(36)

<223>N34至N36独立地是TAT，TAC，TCA，TCT，TCC，TCG，AGT，AGC，GGA，GGT，GGC或GGG

<400>35

gtctattatt gtgctcgcnn nnnnnnnnnn nnnnnng stw tkgactactg gggtcaagga 60

<210>36

<211>63

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>合成的H3-A7

<220>

<221>m是c_feature

<222>(19)..(21)

<220>

<221>m是c_feature

<222>(22)..(24)

<220>

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<221>m是c_feature

<222>(34)..(36)

<220>

<221>m是c_feature

<222>(37)..(39)

<223>N37至N39独立地是TAT，TAC，TCA，TCT，TCC，TCG，AGT，AGC，GGA，GGT，GGC或GGG

<400>36

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gga 63

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<220>

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<220>

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<220>

<221>m是c_feature

<222>(22)..(24)

<220>

<221>m是c_feature

<222>(25)..(27)

<220>

<221>m是c_feature

<222>(28)..(30)

<220>

<221>m是c_feature

<222>(31)..(33)

<220>

<221>m是c_feature

<222>(34)..(36)

<220>

<221>m是c_feature

<222>(37)..(39)

<220>

<221>m是c_feature

<222>(40)..(42)

<223>N40至N42独立地是TAT，TAC，TCA，TCT，TCC，TCG，AGT，AGC，GGA，GGT，GGC或GGG

<400>37

gtctattatt gtgctcgcnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nngstwtkga ctactggggt 60

caagga 66

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<213>人工的

<220>

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<220>

<221>m是c_feature

<222>(19)..(21)

<220>

<221>m是c_feature

<222>(22)..(24)

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<221>m是c_feature

<222>(25)..(27)

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<221>m是c_feature

<222>(28)..(30)

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<221>m是c_feature

<222>(31)..(33)

<220>

<221>m是c_feature

<222>(34)..(36)

<220>

<221>m是c_feature

<222>(37)..(39)

<220>

<221>m是c_feature

<222>(40)..(42)

<220>

<221>m是c_feature

<222>(43)..(45)

<223>N43至N45独立地是TAT，TAC，TCA，TCT，TCC，TCG，AGT，AGC，GGA，GGT，GGC或GGG

<400>38

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<213>人工的

<220>

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<220>

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<222>(19)..(21)

<220>

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<220>

<221>m是c_feature

<222>(25)..(27)

<220>

<221>m是c_feature

<222>(28)..(30)

<220>

<221>m是c_feature

<222>(31)..(33)

<220>

<221>m是c_feature

<222>(34)..(36)

<220>

<221>m是c_feature

<222>(37)..(39)

<220>

<221>m是c_feature

<222>(40)..(42)

<220>

<221>m是c_feature

<222>(43)..(45)

<220>

<221>m是c_feature

<222>(46)..(48)

<223>N46至N48独立地是TAT，TAC，TCA，TCT，TCC，TCG，AGT，AGC，GGA，GGT，GGC或GGG

<400>39

gtctattatt gtgctcgcnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnnn nnnnnnnngs twtkgactac 60

tggggtcaag ga 72

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<213>人工的

<220>

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<220>

<221>m是c_feature

<222>(19)..(21)

<220>

<221>m是c_feature

<222>(22)..(24)

<220>

<221>m是c_feature

<222>(25)..(27)

<220>

<221>m是c_feature

<222>(28)..(30)

<220>

<221>m是c_feature

<222>(31)..(33)

<220>

<221>m是c_feature

<222>(34)..(36)

<220>

<221>m是c_feature

<222>(37)..(39)

<223>N37至N 39独立地是TAT，TAC，TCA，TCT，TCC，TCG，AGT，AGC，GGA，GGT，GGC或GGG

<220>

<221>m是c_feature

<222>(40)..(42)

<220>

<221>m是c_feature

<222>(43)..(45)

<220>

<221>m是c_feature

<222>(46)..(48)

<220>

<221>m是c_feature

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<223>N49至N51独立地是TAT，TAC，TCA，TCT，TCC，TCG，AGT，AGC，GGA，GGT，GGC或GGG

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tactggggtc aagga 75

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<220>

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<221>m是c_feature

<222>(31)..(33)

<220>

<221>m是c_feature

<222>(34)..(36)

<220>

<221>m是c_feature

<222>(37)..(39)

<220>

<221>m是c_feature

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<221>m是c_feature

<222>(43)..(45)

<220>

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<222>(46)..(48)

<220>

<221>m是c_feature

<222>(49)..(51)

<220>

<221>m是c_feature

<222>(52)..(54)

<223>N52至N54独立地是TAT，TAC，TCA，TCT，TCC，TCG，AGT，AGC，GGA，GGT，GGC或GGG

<400>41

gtctattatt gtgctcgcnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnngstwtk 60

gactactggg gtcaagga 78

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<211>81

<212>DNA

<213>人工的

<220>

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<220>

<221>m是c_feature

<222>(19)..(21)

<220>

<221>m是c_feature

<222>(22)..(24)

<220>

<221>m是c_feature

<222>(25)..(27)

<220>

<221>m是c_feature

<222>(28)..(30)

<220>

<221>m是c_feature

<222>(31)..(33)

<220>

<221>m是c_feature

<222>(34)..(36)

<220>

<221>m是c_feature

<222>(37)..(39)

<220>

<221>m是c_feature

<222>(40)..(42)

<220>

<221>m是c_feature

<222>(43)..(45)

<220>

<221>m是c_feature

<222>(46)..(48)

<220>

<221>m是c_feature

<222>(49)..(51)

<220>

<221>m是c_feature

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<220>

<221>m是c_feature

<222>(55)..(57)

<223>N55至N57独立地是TAT，TAC，TCA，TCT，TCC，TCG，AGT，AGC，GGA，GGT，GGC或GGG

<400>42

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wtkgactact ggggtcaagg a 81

<210>43

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<212>DNA

<213>人工的

<220>

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<220>

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<222>(19)..(21)

<220>

<221>m是c_feature

<222>(22)..(24)

<220>

<221>m是c_feature

<222>(25)..(27)

<220>

<221>m是c_feature

<222>(28)..(30)

<220>

<221>m是c_feature

<222>(31)..(33)

<220>

<221>m是c_feature

<222>(34)..(36)

<220>

<221>m是c_feature

<222>(37)..(39)

<220>

<221>m是c_feature

<222>(40)..(42)

<220>

<221>m是c_feature

<222>(43)..(45)

<220>

<221>m是c_feature

<222>(46)..(48)

<220>

<221>m是c_feature

<222>(49)..(51)

<220>

<221>m是c_feature

<222>(52)..(54)

<220>

<221>m是c_feature

<222>(55)..(57)

<220>

<221>m是c_feature

<222>(58)..(60)

<223>N58至N60独立地是TAT，TAC，TCA，TCT，TCC，TCG，AGT，AGC，GGA，GGT，GGC或GGG

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gtctattatt gtgctcgcnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 60

gstwtkgact actggggtca agga 84

<210>44

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<213>人工的

<220>

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<220>

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<222>(19)..(21)

<220>

<221>m是c_feature

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<220>

<221>m是c_feature

<222>(25)..(27)

<220>

<221>m是c_feature

<222>(28)..(30)

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<221>m是c_feature

<222>(31)..(33)

<220>

<221>m是c_feature

<222>(34)..(36)

<220>

<221>m是c_feature

<222>(37)..(39)

<220>

<221>m是c_feature

<222>(40)..(42)

<220>

<221>m是c_feature

<222>(43)..(45)

<220>

<221>m是c_feature

<222>(46)..(48)

<220>

<221>m是c_feature

<222>(49)..(51)

<220>

<221>m是c_feature

<222>(52)..(54)

<220>

<221>m是c_feature

<222>(55)..(57)

<220>

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gtctattatt gtgctcgcnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 60

nnngs twtkg actactgggg tcaagga 87

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<220>

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<221>m是c_feature

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<220>

<221>m是c_feature

<222>(31)..(33)

<220>

<221>m是c_feature

<222>(34)..(36)

<220>

<221>m是c_feature

<222>(37)..(39)

<220>

<221>m是c_feature

<222>(40)..(42)

<220>

<221>m是c_feature

<222>(43)..(45)

<220>

<221>m是c_feature

<222>(46)..(48)

<220>

<221>m是c_feature

<222>(49)..(51)

<220>

<221>m是c_feature

<222>(52)..(54)

<220>

<221>m是c_feature

<222>(55)..(57)

<220>

<221>m是c_feature

<222>(58)..(60)

<220>

<221>m是c_feature

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<220>

<221>m是c_feature

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gtctattatt gtgctcgcnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 60

nnnnnngstw tkgactactg gggtcaagga 90

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<212>DNA

<213>人工的

<220>

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<220>

<221>m是c_feature

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<220>

<221>m是c_feature

<222>(22)..(24)

<220>

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<222>(25)..(27)

<220>

<221>m是c_feature

<222>(28)..(30)

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<221>m是c_feature

<222>(31)..(33)

<220>

<221>m是c_feature

<222>(34)..(36)

<220>

<221>m是c_feature

<222>(37)..(39)

<220>

<221>m是c_feature

<222>(40)..(42)

<220>

<221>m是c_feature

<222>(43)..(45)

<220>

<221>m是c_feature

<222>(46)..(48)

<220>

<221>m是c_feature

<222>(49)..(51)

<220>

<221>m是c_feature

<222>(52)..(54)

<220>

<221>m是c_feature

<222>(55)..(57)

<220>

<221>m是c_feature

<222>(58)..(60)

<220>

<221>m是c_feature

<222>(61)..(63)

<220>

<221>m是c_feature

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<220>

<221>m是c_feature

<222>(67)..(69)

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nnnnnnnnng stwtkgacta ctggggtcaa gga 93

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<212>DNA

<213>人工的

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<220>

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<222>(19)..(21)

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<220>

<221>m是c_feature

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<220>

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<222>(28)..(30)

<220>

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<220>

<221>m是c_feature

<222>(34)..(36)

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<220>

<221>m是c_feature

<222>(19)..(21)

<220>

<221>m是c_feature

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<220>

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<220>

<221>m是c_feature

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<220>

<221>m是c_feature

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<220>

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<220>

<221>m是c_feature

<222>(37)..(39)

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gtctattatt gtgctcgcnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnng stwtkgacta ctggggtcaa 60

gga 63

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<213>人工的

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<223>合成的H3-B8

<220>

<221>m是c_feature

<222>(19)..(21)

<220>

<221>m是c_feature

<222>(22)..(24)

<220>

<221>m是c_feature

<222>(25)..(27)

<220>

<221>m是c_feature

<222>(28)..(30)

<220>

<221>m是c_feature

<222>(31)..(33)

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<220>

<221>m是c_feature

<222>(34)..(36)

<220>

<221>m是c_feature

<222>(37)..(39)

<220>

<221>m是c_feature

<222>(40)..(42)

<223>N40至N42独立地是TAT，TAC，TCA，TCT，TCC，TCG，AGT，AGC，CGA，CGT，CGC，CGG，AGA或AGG

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caagga 66

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<220>

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<220>

<221>m是c_feature

<222>(22)..(24)

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<221>m是c_feature

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<221>m是c_feature

<222>(28)..(30)

<220>

<221>m是c_feature

<222>(31)..(33)

<220>

<221>m是c_feature

<222>(34)..(36)

<220>

<221>m是c_feature

<222>(37)..(39)

<220>

<221>m是c_feature

<222>(40)..(42)

<220>

<221>m是c_feature

<222>(43)..(45)

<223>N43至N45独立地是TAT，TAC，TCA，TCT，TCC，TCG，AGT，AGC，CGA，CGT，CGC，CGG，AGA或AGG

<400>50

gtctattatt gtgctcgcnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnngstwt kgactactgg 60

ggtcaagga 69

<210>51

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<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>合成的H3-B10

<220>

<221>m是c_feature

<222>(19)..(21)

<220>

<221>m是c_feature

<222>(22)..(24)

<220>

<221>m是c_feature

<222>(25)..(27)

<220>

<221>m是c_feature

<222>(28)..(30)

<220>

<221>m是c_feature

<222>(31)..(33)

<220>

<221>m是c_feature

<222>(34)..(36)

<220>

<221>m是c_feature

<222>(37)..(39)

<220>

<221>m是c_feature

<222>(40)..(42)

<220>

<221>m是c_feature

<222>(43)..(45)

<220>

<221>m是c_feature

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<220>

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<220>

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<220>

<221>m是c_feature

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<220>

<221>m是c_feature

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<220>

<221>m是c_feature

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<220>

<221>m是c_feature

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<220>

<221>m是c_feature

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<220>

<221>m是c_feature

<222>(37)..(39)

<220>

<221>m是c_feature

<222>(40)..(42)

<220>

<221>m是c_feature

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<220>

<221>m是c_feature

<222>(46)..(48)

<220>

<221>m是c_feature

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<223>N49至N51独立地是TAT，TAC，TCA，TCT，TCC，TCG，AGT，AGC，CGA，CGT，CGC，CGG，AGA或AGG

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<220>

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<220>

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<220>

<221>m是c_feature

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<220>

<221>m是c_feature

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<220>

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<220>

<221>m是c_feature

<222>(31)..(33)

<220>

<221>m是c_feature

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<220>

<221>m是c_feature

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<220>

<221>m是c_feature

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<220>

<221>m是c_feature

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<220>

<221>m是c_feature

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<220>

<221>m是c_feature

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<220>

<221>m是c_feature

<222>(52)..(54)

<223>N52至N54独立地是TAT，TAC，TCA，TCT，TCC，TCG，AGT，AGC，CGA，CGT，CGC，CGG，AGA或AGG

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gtctattatt gtgctcgcnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnngstwtk 60

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<212>DNA

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<220>

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<220>

<221>m是c_feature

<222>(19)..(21)

<220>

<221>m是c_feature

<222>(22)..(24)

<220>

<221>m是c_feature

<222>(25)..(27)

<220>

<221>m是c_feature

<222>(28)..(30)

<220>

<221>m是c_feature

<222>(31)..(33)

<220>

<221>m是c_feature

<222>(34)..(36)

<220>

<221>m是c_feature

<222>(37)..(39)

<220>

<221>m是c_feature

<222>(40)..(42)

<220>

<221>m是c_feature

<222>(43)..(45)

<220>

<221>m是c_feature

<222>(46)..(48)

<220>

<221>m是c_feature

<222>(49)..(51)

<220>

<221>m是c_feature

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<220>

<221>m是c_feature

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<212>DNA

<213>人工的

<220>

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<220>

<221>m是c_feature

<222>(19)..(21)

<220>

<221>m是c_feature

<222>(22)..(24)

<220>

<221>m是c_feature

<222>(25)..(27)

<220>

<221>m是c_feature

<222>(28)..(30)

<220>

<221>m是c_feature

<222>(31)..(33)

<220>

<221>m是c_feature

<222>(34)..(36)

<220>

<221>m是c_feature

<222>(37)..(39)

<220>

<221>m是c_feature

<222>(40)..(42)

<220>

<221>m是c_feature

<222>(43)..(45)

<220>

<221>m是c_feature

<222>(46)..(48)

<220>

<221>m是c_feature

<222>(49)..(51)

<220>

<221>m是c_feature

<222>(52)..(54)

<220>

<221>m是c_feature

<222>(55)..(57)

<220>

<221>m是c_feature

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<223>N58至N60独立地是TAT，TAC，TCA，TCT，TCC，TCG，AGT，AGC，CGA，CGT，CGC，CGG，AGA或AGG

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<220>

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<220>

<221>m是c_feature

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<220>

<221>m是c_feature

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<220>

<221>m是c_feature

<222>(25)..(27)

<220>

<221>m是c_feature

<222>(28)..(30)

<220>

<221>m是c_feature

<222>(31)..(33)

<220>

<221>m是c_feature

<222>(34)..(36)

<220>

<221>m是c_feature

<222>(37)..(39)

<220>

<221>m是c_feature

<222>(40)..(42)

<220>

<221>m是c_feature

<222>(43)..(45)

<220>

<221>m是c_feature

<222>(46)..(48)

<220>

<221>m是c_feature

<222>(49)..(51)

<220>

<221>m是c_featu re

<222>(52)..(54)

<220>

<221>m是c_feature

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<220>

<221>m是c_feature

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<220>

<221>m是c_feature

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gtctattatt gtgctcgcnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 60

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<220>

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<220>

<221>m是c_feature

<222>(19)..(21)

<220>

<221>m是c_feature

<222>(22)..(24)

<220>

<221>m是c_feature

<222>(25)..(27)

<220>

<221>m是c_feature

<222>(28)..(30)

<220>

<221>m是c_feature

<222>(31)..(33)

<220>

<221>m是c_feature

<222>(34)..(36)

<220>

<221>m是c_feature

<222>(37)..(39)

<220>

<221>m是c_feature

<222>(40)..(42)

<220>

<221>m是c_feature

<222>(43)..(45)

<220>

<221>m是c_feature

<222>(46)..(48)

<220>

<221>m是c_feature

<222>(49)..(51)

<220>

<221>m是c_feature

<222>(52)..(54)

<220>

<221>m是c_feature

<222>(55)..(57)

<220>

<221>m是c_feature

<222>(58)..(60)

<220>

<221>m是c_feature

<222>(61)..(63)

<220>

<221>m是c_feature

<222>(64)..(66)

<223>N64至N66独立地是TAT，TAC，TCA，TCT，TCC，TCG，AGT，AGC，CGA，CGT，CGC，CGG，AGA或AGG

<400>57

gtctattatt gtgctcgcnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 60

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<213>人工的

<220>

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<220>

<221>m是c_feature

<222>(19)..(21)

<220>

<221>m是c_feature

<222>(22)..(24)

<220>

<221>m是c_feature

<222>(25)..(27)

<220>

<221>m是c_feature

<222>(28)..(30)

<220>

<221>m是c_feature

<222>(31)..(33)

<220>

<221>m是c_feature

<222>(34)..(36)

<220>

<221>m是c_feature

<222>(37)..(39)

<220>

<221>m是c_feature

<222>(40)..(42)

<220>

<221>m是c_feature

<222>(43)..(45)

<220>

<221>m是c_feature

<222>(46)..(48)

<220>

<221>m是c_feature

<222>(49)..(51)

<220>

<221>m是c_feature

<222>(52)..(54)

<220>

<221>m是c_feature

<222>(55)..(57)

<220>

<221>m是c_feature

<222>(58)..(60)

<220>

<221>m是c_feature

<222>(61)..(63)

<220>

<221>m是c_feature

<222>(64)..(66)

<220>

<221>m是c_feature

<222>(67)..(69)

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<400>58

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<220>

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<220>

<221>m是c_feature

<222>(19)..(21)

<223>N19至N21独立地是TAT，TAC，TCA，TCT，TCC，TCG，GGA，GGT，GGC，GGG，AGT，AGC，CGA，CGT，CGC，CGG，AGA或AGG

<220>

<221>m是c_feature

<222>(22)..(24)

<223>N22至N24独立地是TAT，TAC，TCA，TCT，TCC，TCG，GGA，GGT，GGC，GGG，AGT，AGC，CGA，CGT，CGC，CGG，AGA或AGG

<220>

<221>m是c_feature

<222>(25)..(27)

<223>N25至N27独立地是TAT，TAC，TCA，TCT，TCC，TCG，GGA，GGT，GGC，GGG，AGT，AGC，CGA，CGT，CGC，CGG，AGA或AGG

<220>

<221>m是c_feature

<222>(28)..(30)

<223>N28至N30独立地是TAT，TAC，TCA，TCT，TCC，TCG，GGA，GGT，GGC，GGG，AGT，AGC，CGA，CGT，CGC，CGG，AGA或AGG

<220>

<221>m是c_feature

<222>(31)..(33)

<223>N31至N33独立地是TAT，TAC，TCA，TCT，TCC，TCG，GGA，GGT，GGC，GGG，AGT，AGC，CGA，CGT，CGC，CGG，AGA或AGG

<220>

<221>m是c_feature

<222>(34)..(36)

<223>N34至N36独立地是TAT，TAC，TCA，TCT，TCC，TCG，GGA，GGT，GGC，GGG，AGT，AGC，CGA，CGT，CGC，CGG，AGA或AGG

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<210>60

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<220>

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<220>

<221>m是c_feature

<222>(19)..(21)

<220>

<221>m是c_feature

<222>(22)..(24)

<220>

<221>m是c_feature

<222>(25)..(27)

<220>

<221>m是c_feature

<222>(28)..(30)

<220>

<221>m是c_feature

<222>(31)..(33)

<220>

<221>m是c_feature

<222>(34)..(36)

<220>

<221>m是c_feature

<222>(37)..(39)

<223>N37至N39独立地是TAT，TAC，TCA，TCT，TCC，TCG，GGA，GGT，GGC，GGG，AGT，AGC，CGA，CGT，CGC，CGG，AGA或AGG

<400>60

gtctattatt gtgctcgcnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnng stwtkgacta ctggggtcaa 60

gga 63

<210>61

<211>66

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>合成的H3-C8

<220>

<221>m是c_feature

<222>(19)..(21)

<220>

<221>m是c_feature

<222>(22)..(24)

<220>

<221>m是c_feature

<222>(25)..(27)

<220>

<221>m是c_feature

<222>(28)..(30)

<220>

<221>m是c_feature

<222>(31)..(33)

<220>

<221>m是c_feature

<222>(34)..(36)

<220>

<221>m是c_feature

<222>(37)..(39)

<220>

<221>m是c_feature

<222>(40)..(42)

<223>N40至N42独立地是TAT，TAC，TCA，TCT，TCC，TCG，GGA，GGT，GGC，GGG，AGT，AGC，CGA，CGT，CGC，CGG，AGA或AGG

<400>61

gtctattatt gtgctcgcnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nng stwtkga ctactggggt 60

caagga 66

<210>62

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<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>合成的H3-C9

<220>

<221>m是c_feature

<222>(19)..(21)

<223>N19至N21独立地是TAT，TAC，TCA，TCT，TCC，TCG，AGT，AGC，GGA，GGT，GGC，GGG，CGA，CGT，CGC，CGG，AGA或AGG

<220>

<221>m是c_feature

<222>(22)..(24)

<223>N22至N24独立地是TAT，TAC，TCA，TCT，TCC，TCG，AGT，AGC，GGA，GGT，GGC，GGG，CGA，CGT，CGC，CGG，AGA或AGG

<220>

<221>m是c_feature

<222>(25)..(27)

<223>N25至N27独立地是TAT，TAC，TCA，TCT，TCC，TCG，AGT，AGC，GGA，GGT，GGC，GGG，CGA，CGT，CGC，CGG，AGA或AGG

<220>

<221>m是c_feature

<222>(28)..(30)

<223>N28至N30独立地是TAT，TAC，TCA，TCT，TCC，TCG，AGT，AGC，GGA，GGT，GGC，GGG，CGA，CGT，CGC，CGG，AGA或AGG

<220>

<221>m是c_feature

<222>(31)..(33)

<223>N31至N33独立地是TAT，TAC，TCA，TCT，TCC，TCG，AGT，AGC，GGA，GGT，GGC，GGG，CGA，CGT，CGC，CGG，AGA或AGG

<220>

<221>m是c_feature

<222>(34)..(36)

<223>N34至N36独立地是TAT，TAC，TCA，TCT，TCC，TCG，AGT，AGC，GGA，GGT，GGC，GGG，CGA，CGT，CGC，CGG，AGA或AGG

<220>

<221>m是c_feature

<222>(37)..(39)

<223>N37至N39独立地是TAT，TAC，TCA，TCT，TCC，TCG，AGT，AGC，GGA，GGT，GGC，GGG，CGA，CGT，CGC，CGG，AGA或AGG

<220>

<221>m是c_feature

<222>(40)..(42)

<223>N40至N42独立地是TAT，TAC，TCA，TCT，TCC，TCG，AGT，AGC，GGA，GGT，GGC，GGG，CGA，CGT，CGC，CGG，AGA或AGG

<220>

<221>m是c_feature

<222>(43)..(45)

<223>N43至N45独立地是TAT，TAC，TCA，TCT，TCC，TCG，AGT，AGC，GGA，GGT，GGC，GGG，CGA，CGT，CGC，CGG，AGA或AGG

<400>62

gtctattatt gtgctcgcnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnngstwt kgactactgg 60

ggtcaagga 69

<210>63

<211>72

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>合成的H3-C10

<220>

<221>m是c_feature

<222>(19)..(21)

<220>

<221>m是c_feature

<222>(22)..(24)

<220>

<221>m是c_feature

<222>(25)..(27)

<220>

<221>m是c_feature

<222>(28)..(30)

<220>

<221>m是c_feature

<222>(31)..(33)

<220>

<221>m是c_feature

<222>(34)..(36)

<220>

<221>m是c_feature

<222>(37)..(39)

<220>

<221>m是c_feature

<222>(40)..(42)

<220>

<221>m是c_feature

<222>(43)..(45)

<220>

<221>m是c_feature

<222>(46)..(48)

<223>N46至N48独立地是TAT，TAC，TCA，TCT，TCC，TCG，AGT，AGC，GGA，GGT，GGC，GGG，CGA，CGT，CGC，CGG，AGA或AGG

<400>63

gtctattatt gtgctcgcnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnngs twtkgactac 60

tggggtcaag ga 72

<210>64

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<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>合成的H3-C11

<220>

<221>m是c_feature

<222>(19)..(21)

<220>

<221>m是c_feature

<222>(22)..(24)

<220>

<221>m是c_feature

<222>(25)..(27)

<220>

<221>m是c_feature

<222>(28)..(30)

<220>

<221>m是c_feature

<222>(31)..(33)

<220>

<221>m是c_feature

<222>(34)..(36)

<220>

<221>m是c_feature

<222>(37)..(39)

<220>

<221>m是c_feature

<222>(40)..(42)

<220>

<221>m是c_feature

<222>(43)..(45)

<220>

<221>m是c_feature

<222>(46)..(48)

<220>

<221>m是c_feature

<222>(49)..(51)

<223>N49至N51独立地是TAT，TAC，TCA，TCT，TCC，TCG，AGT，AGC，GGA，GGT，GGC，GGG，CGA，CGT，CGC，CGG，AGA或AGG

<400>64

gtctattatt gtgctcgcnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn ngstwtkgac 60

tactggggtc aagga 75

<210>65

<211>78

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>合成的H3-C12

<220>

<221>m是c_feature

<222>(19)..(21)

<220>

<221>m是c_feature

<222>(22)..(24)

<220>

<221>m是c_feature

<222>(25)..(27)

<220>

<221>m是c_feature

<222>(28)..(30)

<220>

<221>m是c_feature

<222>(31)..(33)

<220>

<221>m是c_feature

<222>(34)..(36)

<220>

<221>m是c_feature

<222>(37)..(39)

<220>

<221>m是c_feature

<222>(40)..(42)

<220>

<221>m是c_feature

<222>(43)..(45)

<220>

<221>m是c_feature

<222>(46)..(48)

<220>

<221>m是c_feature

<222>(49)..(51)

<220>

<221>m是c_feature

<222>(52)..(54)

<223>N52至N54独立地是TAT，TAC，TCA，TCT，TCC，TCG，AGT，AGC，GGA，GGT，GGC，GGG，CGA，CGT，CGC，CGG，AGA或AGG

<400>65

gtctattatt gtgctcgcnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnngstwtk 60

gactactggg gtcaagga 78

<210>66

<211>81

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>合成的H3-C13

<220>

<221>m是c_feature

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<220>

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<220>

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<222>(25)..(27)

<220>

<221>m是c_feature

<222>(28)..(30)

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<220>

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<220>

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<222>(52)..(54)

<223>N52至N54独立地是TAT，TAC，TCA，TCT，TCC，TCG，AGT，AGC，GGA，GGT，GGC，GGG，CGA，CGT，CGC，CGG.AGA或AGG

<220>

<221>m是c_feature

<222>(55)..(57)

<223>N55至N57独立地是TAT，TAC，TCA，TCT，TCC，TCG，AGT，AGC，GGA，GGT，GGC，GGG，CGA，CGT，CGC，CGG.AGA或AGG

<400>66

gtctattatt gtgctcgcnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnngst 60

wtkgactact ggggtcaagg a 81

<210>67

<211>84

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>合成的H3-C14

<220>

<221>m是c_feature

<222>(19)..(21)

<220>

<221>m是c_feature

<222>(22)..(24)

<220>

<221>m是c_feature

<222>(25)..(27)

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<220>

<221>m是c_feature

<222>(28)..(30)

<220>

<221>m是c_feature

<222>(31)..(33)

<220>

<221>m是c_feature

<222>(34)..(36)

<220>

<221>m是c_feature

<222>(37)..(39)

<220>

<221>m是c_feature

<222>(40)..(42)

<220>

<221>m是c_feature

<222>(43)..(45)

<220>

<221>m是c_feature

<222>(46)..(48)

<220>

<221>m是c_feature

<222>(49)..(51)

<220>

<221>m是c_feature

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<220>

<221>m是c_feature

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<220>

<221>m是c_feature

<222>(58)..(60)

<223>N58至N60独立地是TAT，TAC，TCA，TCT，TCC，TCG，AGT，AGC，GGA，GGT，GGC，GGG，CGA，CGT，CGC，CGG.AGA或AGG

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gtctattatt gtgctcgcnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 60

gs twtkgact actggggtca agga 84

<210>68

<211>87

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>合成的H3-C15

<220>

<221>m是c_feature

<222>(19)..(21)

<220>

<221>m是c_feature

<222>(22)..(24)

<220>

<221>m是c_feature

<222>(25)..(27)

<220>

<221>m是c_feature

<222>(28)..(30)

<220>

<221>m是c_feature

<222>(31)..(33)

<220>

<221>m是c_feature

<222>(34)..(36)

<220>

<221>m是c_feature

<222>(37)..(39)

<220>

<221>m是c_feature

<222>(40)..(42)

<220>

<221>m是c_feature

<222>(43)..(45)

<220>

<221>m是c_feature

<222>(46)..(48)

<220>

<221>m是c_feature

<222>(49)..(51)

<220>

<221>m是c_feature

<222>(52)..(54)

<220>

<221>m是c_feature

<222>(55)..(57)

<220>

<221>m是c_feature

<222>(58)..(60)

<220>

<221>m是c_feature

<222>(61)..(63)

<223>N61至N63独立地是TAT，TAC，TCA，TCT，TCC，TCG，AGT，AGC，GGA，GGT，GGC，GGG，CGA，CGT，CGC，CGG.AGA或AGG

<400>68

gtctattatt gtgctcgcnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 60

nnngstwtkg actactgggg tcaagga 87

<210>69

<211>90

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>合成的H3-C16

<220>

<221>m是c_feature

<222>(19)..(21)

<220>

<221>m是c_feature

<222>(22)..(24)

<220>

<221>m是c_feature

<222>(25)..(27)

<220>

<221>m是c_feature

<222>(28)..(30)

<220>

<221>m是c_feature

<222>(31)..(33)

<220>

<221>m是c_feature

<222>(34)..(36)

<220>

<221>m是c_feature

<222>(37)..(39)

<220>

<221>m是c_feature

<222>(40)..(42)

<220>

<221>m是c_feature

<222>(43)..(45)

<220>

<221>m是c_feature

<222>(46)..(48)

<220>

<221>m是c_feature

<222>(49)..(51)

<223>N49至N51独立地是TAT，TAG，TCA，TCT，TCC，TCG，AGT，AGC，GGA，GGT，GGC，GGG，CGA，CGT，CGC，CGG.AGA或AGG

<220>

<221>m是c_feature

<222>(52)..(54)

<220>

<221>m是c_feature

<222>(55)..(57)

<220>

<221>m是c_feature

<222>(58)..(60)

<220>

<221>m是c_feature

<222>(61)..(63)

<220>

<221>m是c_feature

<222>(64)..(66)

<223>N64至N66独立地是TAT，TAC，TCA，TCT，TCC，TCG，AGT，AGC，GGA，GGT，GGC，GGG，CGA，CGT，CGC，CGG.AGA或AGG

<400>69

gtctattatt gtgctcgcnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 60

nnnnnngstw tkgactactg gggtcaagga 90

<210>70

<211>93

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>合成的H3-C17

<220>

<221>m是c_feature

<222>(19)..(21)

<220>

<221>m是c_feature

<222>(22)..(24)

<223>N21至N24独立地是TAT，TAC，TCA，TCT，TCC，TCG，AGT，AGC，GGA，GGT，GGC，GGG，CGA，CGT，CGC，CGG.AGA或AGG

<220>

<221>m是c_feature

<222>(25)..(27)

<220>

<221>m是c_feature

<222>(28)..(30)

<220>

<221>m是c_feature

<222>(31)..(33)

<220>

<221>m是c_feature

<222>(34)..(36)

<220>

<221>m是c_feature

<222>(37)..(39)

<220>

<221>m是c_feature

<222>(40)..(42)

<220>

<221>m是c_feature

<222>(43)..(45)

<220>

<221>m是c_feature

<222>(46)..(48)

<220>

<221>m是c_feature

<222>(49)..(51)

<220>

<221>m是c_feature

<222>(52)..(54)

<220>

<221>m是c_feature

<222>(55)..(57)

<220>

<221>m是c_feature

<222>(58)..(60)

<223>N58至N60独立地是TAT，TAG，TCA，TCT，TCC，TCG，AGT，AGC，GGA，GGT，GGC，GGG，CGA，CGT，CGC，CGG.AGA或AGG

<220>

<221>m是c_feature

<222>(61)..(63)

<220>

<221>m是c_feature

<222>(64)..(66)

<220>

<221>m是c_feature

<222>(67)..(69)

<223>N67至N69独立地是TAT.TAC，TCA，TCT，TCC，TCG，AGT，AGC，GGA，GGT，GGC，GGG，CGA，CGT，CGC，CGG.AGA或AGG

<400>70

gtctattatt gtgctcgcnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 60

nnnnnnnnng stwtkgacta ctggggtcaa gga 93

<210>71

<211>60

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>合成的H3-C6

<220>

<221>m是c_feature

<222>(19)..(36)

<223>N19至N36是以下核苷酸的任何组合：A，T，C或G，但除外TGT，TGC，TGA，TAA，TAG

<400>71

gtctattatt gtgctcgcnn nnnnnnnnnn nnnnnngstw tkgactactg gggtcaagga 60

<210>72

<211>63

<212>DNA

<213>人工的

<220

<223>合成的H3-C7

<220>

<221>m是c_feature

<222>(19)..(39)

<223>N19至N39是以下核苷酸的任何组合：A，T，C或G，但除外TGT，TGC，TGA，TAA，TAG

<400>72

gtctattatt gtgctcgcnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnng stwtkgacta ctggggtcaa 60

gga 63

<210>73

<211>66

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>合成的H3-C8

<220>

<221>m是c_feature

<222>(19)..(42)

<223>N19至N42是以下核苷酸的任何组合：A，T，C或G，但除外TGT，TGC，TGA，TAA，TAG

<400>73

gtctattatt gtgctcgcnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nng stwtkga ctactggggt 60

caagga 66

<210>74

<211>69

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>合成的H3-C9

<220>

<221>m是c_feature

<222>(19)..(45)

<223>N19至N45是以下核苷酸的任何组合：A，T，C或G，但除外TGT，TGC，TGA，TAA，TAG

<400>74

gtctattatt gtgctcgcnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnngstwt kgactactgg 60

ggtcaagga 69

<210>75

<211>72

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>合成的H3-C10

<220>

<221>m是c_feature

<222>(19)..(48)

<223>N19至N48是以下核苷酸的任何组合：A，T，C或G，但除外TGT，TGC，TGA，TAA，TAG

<400>75

gtctattatt gtgctcgcnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnngs twtkgactac 60

tggggtcaag ga 72

<210>76

<211>75

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>合成的H3-C11

<220>

<221>m是c_feature

<222>(19)..(51)

<223>N19至N51是以下核苷酸的任何组合：A，T，C或G，但除外TGT，TGC，TGA，TAA，TAG

<400>76

gtctattatt gtgctcgcnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn ng stwtkgac 60

tactggggtc aagga 75

<210>77

<211>78

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>合成的H3-C12

<220>

<221>m是c_feature

<222>(19)..(54)

<223>N19至N54是以下核苷酸的任何组合：A，T，C或G，但除外TGT，TGC，TGA，TAA，TAG

<400>77

gtctattatt gtgctcgcnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnngstwtk 60

gactactggg gtcaagga 78

<210>78

<211>81

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>合成的H3-C13

<220>

<221>m是c_feature

<222>(19)..(57)

<223>N19至N57是以下核苷酸的任何组合：A，T，C或G，但除外TGT，TGC，TGA，TAA，TAG

<400>78

gtctattatt gtgctcgcnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnngst 60

wtkgactact ggggtcaagg a 81

<210>79

<211>84

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>合成的H3-C14

<220>

<221>m是c_feature

<222>(19)..(60)

<223>N19至N60是以下核苷酸的任何组合：A，T，C或G，但除外TGT，TGC，TGA，TAA，TAG

<400>79

gtctattatt gtgctcgcnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 60

gs twtkgact actggggtca agga 84

<210>80

<211>87

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>合成的H3-C15

<220>

<221>m是c_feature

<222>(19)..(63)

<223>N19至N63是以下核苷酸的任何组合：A，T，C或G，但除外TGT，TGC，TGA，TAA，TAG

<400>80

gtctattatt gtgctcgcnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 60

nnngstwtkg actactgggg tcaagga 87

<210>81

<211>90

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>合成的H3-C16

<220>

<221>m是c_feature

<222>(19)..(66)

<223>N19至N66是以下核苷酸的任何组合：A，T，C或G，但除外TGT，TGC，TGA，TAA，TAG

<400>81

gtctattatt gtgctcgcnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 60

nnnnnngstw tkgactactg gggtcaagga 90

<210>82

<211>93

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>合成的H3-C17

<220>

<221>m是c_feature

<222>(19)..(69)

<223>N19至N69是以下核苷酸的任何组合：A，T，C或G，但除外TGT，TGC，TGA，TAA，TAG

<400>82

gtctattatt gtgctcgcnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 60

nnnnnnnnng stwtkgacta ctggggtcaa gga 93

<210>83

<211>9

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的HER2结合克隆1CDRL3

<400>83

Gln Gln Ser Tyr Tyr Ser Pro Ser Thr

1 5

<210>84

<211>9

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的HER2结合克隆2 CDRL3

<400>84

Gln Gln Ser Ser Tyr Tyr Pro Ser Thr

1 5

<210>85

<211>9

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的HER2结合克隆3CDRL3

<400>85

Gln Gln Ser Ser Tyr Tyr Pro Ser Thr

1 5

<210>86

<211>9

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的HER2结合克隆4CDRL3

<400>86

Gln Gln Ser Tyr Tyr Ser Pro Ser Thr

1 5

<210>87

<211>9

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的HER2结合克隆5CDRL3

<400>87

Gln Gln Ser Tyr Tyr Tyr Pro Ser Thr

1 5

<210>88

<211>9

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的HER2结合克隆6CDRL3

<400>88

Gln Gln Ser Tyr Tyr Ser Pro Ser Thr

1 5

<210>89

<211>9

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的HER2结合克隆7CDRL3

<400>89

Gln Gln Ser Tyr Tyr Tyr Pro Ser Thr

1 5

<210>90

<211>9

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的HER2结合克隆8CDRL3

<400>90

Gln Gln Tyr Tyr Tyr Tyr Pro Tyr Thr

1 5

<210>91

<211>9

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的HER2结合克隆9CDRL3

<400>91

Gln Gln Tyr Tyr Tyr Ser Pro Ser Thr

1 5

<210>92

<211>9

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的HER2结合克隆10CDRL3

<400>92

Gln Gln Ser Tyr Tyr Tyr Pro Tyr Thr

1 5

<210>93

<211>9

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的HER2结合克隆11 CDRL3

<400>93

Gln Gln Ser Ser Tyr Ser Pro Tyr Thr

1 5

<210>94

<211>9

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的HER2结合克隆12CDRL3

<400>94

Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro Thr

1 5

<210>95

<211>9

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的HER2结合克隆13CDRL3

<400>95

Gln Gln Tyr Ser Tyr Tyr Pro Tyr Thr

1 5

<210>96

<211>9

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的HER2结合克隆14CDRL3

<400>96

Gln Gln Tyr Ser Tyr Tyr Pro Ser Thr

1 5

<210>97

<211>9

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的HER2结合克隆15CDRL3

<400>97

Gln Gln Tyr Ser Tyr Tyr Pro Tyr Thr

1 5

<210>98

<211>9

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<213>人工的

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<211>9

<212>PRT

<213>人工的

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Gln Gln Tyr Ser Tyr Tyr Pro Tyr Thr

1 5

<210>100

<211>9

<212>PRT

<213>人工的

<220>

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<400>100

Gln Gln Tyr Ser Tyr Tyr Pro Ser Thr

1 5

<210>101

<211>9

<212>PRT

<213>人工的

<220>

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Gln Gln Tyr Ser Tyr Tyr Pro Tyr Thr

1 5

<210>102

<211>9

<212>PRT

<213>人工的

<220>

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Gln Gln Tyr Ser Tyr Tyr Pro Tyr Thr

1 5

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<212>PRT

<213>人工的

<220>

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Gln Gln Tyr Ser Tyr Tyr Pro Tyr Thr

1 5

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<212>PRT

<213>人工的

<220>

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Gln Gln Tyr Ser Tyr Tyr Pro Tyr Thr

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<212>PRT

<213>人工的

<220>

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Gln Gln Tyr Ser Tyr Tyr Pro Tyr Thr

1 5

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<212>PRT

<213>人工的

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1 5

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<212>PRT

<213>人工的

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Gln Gln Tyr Ser Tyr Tyr Pro Ser Thr

1 5

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<211>9

<212>PRT

<213>人工的

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Gln Gln Tyr Ser Tyr Tyr Pro Ser Thr

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<211>9

<212>PRT

<213>人工的

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Gln Gln Tyr Ser Tyr Tyr Pro Tyr Thr

1 5

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<211>9

<212>PRT

<213>人工的

<220>

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Gln Gln Tyr Ser Tyr Tyr Pro Tyr Thr

1 5

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<211>9

<212>PRT

<213>人工的

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Gln Gln Ser Ser Tyr Ser Pro Ser Thr

1 5

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<212>PRT

<213>人工的

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Gln Gln Ser Ser Tyr Tyr Pro Tyr Thr

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<212>PRT

<213>人工的

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Gln Gln Ser Tyr Tyr Tyr Pro Ser Thr

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<212>PRT

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Gln Gln Ser Ser Tyr Tyr Pro Tyr Thr

1 5

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<212>PRT

<213>人工的

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<212>PRT

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Gln Gln Ser Tyr Ser Ser Pro Tyr Thr

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<212>PRT

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Gln Gln Ser Tyr Ser Tyr Pro Ser Thr

1 5

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<211>9

<212>PRT

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Gln Gln Ser Phe Ser Tyr Pro Tyr Thr

1 5

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<212>PRT

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Gln Gln Ser Tyr Ser Ser Pro Tyr Thr

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<212>PRT

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Gln Gln Ser Tyr Ser Ser Pro Ser Thr

1 5

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<211>9

<212>PRT

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Gln Gln Ser Tyr Ser Tyr Pro Ser Thr

1 5

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<212>PRT

<213>人工的

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Gln Gln Ser Tyr Ser Ser Pro Tyr Thr

1 5

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<212>PRT

<213>人工的

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Gln Gln Ser Tyr Ser Ser Pro Ser Thr

1 5

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<212>PRT

<213>人工的

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Gln Gln Ser Tyr Ser Ser Pro Ser Thr

1 5

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<212>PRT

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Gln Gln Ser Phe Ser Ser Pro Ser Thr

1 5

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<212>PRT

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Gln Gln Ser Ser Ser Ser Pro Tyr Thr

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<211>9

<212>PRT

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<400>127

Gln Gln Ser Tyr Ser Ser Pro Tyr Thr

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<212>PRT

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Gln Gln Ser Ser Ser Ser Pro Tyr Thr

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<211>9

<212>PRT

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Gln Gln Ser Tyr Ser Ser Pro Ser Thr

1 5

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<211>9

<212>PRT

<213>人工的

<220>

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<400>130

Gln Gln Ser Ser Ser Tyr Pro Tyr Thr

1 5

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<211>9

<212>PRT

<213>人工的

<220>

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<400>131

Gln Gln Ser Tyr Ser Tyr Pro Ser Thr

1 5

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<212>PRT

<213>人工的

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Gln Gln Ser Ser Ser Ser Pro Tyr Thr

1 5

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<211>9

<212>PRT

<213>人工的

<220>

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<400>133

Gln Gln Ser Ser Ser Tyr Pro Tyr Thr

1 5

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<211>9

<212>PRT

<213>人工的

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Gln Gln Ser Ser Ser Tyr Pro Ser Thr

1 5

<210>135

<211>9

<212>PRT

<213>人工的

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Gln Gln Ser Tyr Ser Ser Pro Ser Thr

1 5

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<211>9

<212>PRT

<213>人工的

<220>

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<400>136

Gln Gln Ser Ser Ser Ser Pro Tyr Thr

1 5

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<211>9

<212>PRT

<213>人工的

<220>

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<400>137

Gln Gln Ser Ser Ser Tyr Pro Ser Thr

1 5

<210>138

<211>9

<212>PRT

<213>人工的

<220>

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Gln Gln Ser Ser Tyr Tyr Pro Ser Thr

1 5

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<211>9

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的HER2结合克隆57CDRL3

<400>139

Gln Gln Ser Ser Phe Ser Pro Tyr Thr

1 5

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<211>9

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的HER2结合克隆58CDRL3

<400>140

Gln Gln Ser Ser Ser Tyr Pro Tyr Thr

1 5

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<211>9

<212>PRT

<213>人工的

<220>

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<400>141

Gln Gln Ser Ser Ser Tyr Pro Ser Thr

1 5

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<211>9

<212>PRT

<213>人工的

<220>

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<400>142

Gln Gln Ser Ser Ser Ser Pro Tyr Thr

1 5

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<211>9

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的HER2结合克隆61CDRL3

<400>143

Gln Gln Ser Tyr Ser Ser Pro Tyr Thr

1 5

<210>144

<211>9

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的HER2结合克隆62CDRL3

<400>144

Gln Gln Ser Tyr Ser Ser Pro Ser Thr

1 5

<210>145

<211>9

<212>PRT

<213>人工的

<220>

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<400>145

Gln Gln Ser Tyr Ser Ser Pro Ser Thr

1 5

<210>146

<211>9

<212>PRT

<213>人工的

<220>

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Gln Gln Ser Ser Ser Tyr Pro Tyr Thr

1 5

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<211>9

<212>PRT

<213>人工的

<220>

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<400>147

Gln Gln Ser Phe Ser Ser Pro Tyr Thr

1 5

<210>148

<211>9

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的HER2结合克隆66CDRL3

<400>148

Gln Gln Ser Tyr Ser Tyr Pro Ser Thr

1 5

<210>149

<211>9

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的HER2结合克隆67CDRL3

<400>149

Gln Gln Ser Tyr Ser Ser Pro Tyr Thr

1 5

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<211>9

<212>PRT

<213>人工的

<220>

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<400>150

Gln Gln Tyr Tyr Ser Ser Pro Tyr Thr

1 5

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<211>9

<212>PRT

<213>人工的

<220>

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Gln Gln Ser Ser Ser Tyr Pro Ser Thr

1 5

<210>152

<211>9

<212>PRT

<213>人工的

<220>

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Gln Gln Tyr Tyr Ser Ser Pro Ser Thr

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<211>9

<212>PRT

<213>人工的

<220>

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Gln Gln Ser Ser Tyr Tyr Pro Ser Thr

1 5

<210>154

<211>9

<212>PRT

<213>人工的

<220>

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<400>154

Gln Gln Ser Ser Phe Tyr Pro Ser Thr

1 5

<210>155

<211>9

<212>PRT

<213>人工的

<220>

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<400>155

Gln Gln Ser Ser Tyr Ser Pro Tyr Thr

1 5

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<211>9

<212>PRT

<213>人工的

<220>

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<400>156

Gln Gln Ser Ser Ser Tyr Pro Ser Thr

1 5

<210>157

<211>9

<212>PRT

<213>人工的

<220>

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<400>157

Gln Gln Ser Ser Ser Ser Pro Ser Thr

1 5

<210>158

<211>9

<212>PRT

<213>人工的

<220>

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Gln Gln Tyr Tyr Tyr Tyr Pro Tyr Thr

1 5

<210>159

<211>9

<212>PRT

<213>人工的

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<400>159

Gln Gln Ser Ser Tyr Ser Pro Tyr Thr

1 5

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<211>9

<212>PRT

<213>人工的

<220>

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<400>160

Gln Gln Ser Ser Tyr Ser Pro Tyr Thr

1 5

<210>161

<211>9

<212>PRT

<213>人工的

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Gln Gln Ser Ser Tyr Ser Pro Tyr Thr

1 5

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<211>9

<212>PRT

<213>人工的

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<400>162

Gln Gln Tyr Tyr Ser Ser Pro Tyr Thr

1 5

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<211>9

<212>PRT

<213>人工的

<220>

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<400>163

Gln Gln Ser Tyr Ser Tyr Pro Ser Thr

1 5

<210>164

<211>9

<212>PRT

<213>人工的

<220>

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<400>164

Gln Gln Tyr Ser Tyr Tyr Pro Ser Thr

1 5

<210>165

<211>9

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的HER2结合克隆83CDRL3

<400>165

Gln Gln Ser Ser Tyr Ser Pro Tyr Thr

1 5

<210>166

<211>9

<212>PRT

<213>人工的

<220>

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<400>166

Gln Gln Ser Ser Tyr Ser Pro Tyr Thr

1 5

<210>167

<211>9

<212>PRT

<213>人工的

<220>

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<400>167

Gln Gln Ser Ser Tyr Ser Pro Tyr Thr

1 5

<210>168

<211>9

<212>PRT

<213>人工的

<220>

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<400>168

Gln Gln Ser Ser Tyr Ser Pro Tyr Thr

1 5

<210>169

<211>9

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的HER2结合克隆87CDRL3

<400>169

Gln Gln Tyr Ser Tyr Tyr Pro Ser Thr

1 5

<210>170

<211>9

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的HER2结合克隆88CDRL3

<400>170

Gln Gln Ser Ser Ser Ser Pro Tyr Thr

1 5

<210>171

<211>9

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的HER2结合克隆89CDRL3

<400>171

Gln Gln Ser Ser Tyr Ser Pro Tyr Thr

1 5

<210>172

<211>9

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的HER2结合克隆90CDRL3

<400>172

Gln Gln Ser Ser Tyr Ser Pro Tyr Thr

1 5

<210>173

<211>9

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的HER2结合克隆91CDRL3

<400>173

Gln Gln Ser Ser Ser Ser Pro Tyr Thr

1 5

<210>174

<211>9

<212>PRT

<213>人工的

<220>

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<400>174

Gln Gln Tyr Tyr Ser Ser Pro Tyr Thr

1 5

<210>175

<211>9

<212>PRT

<213>人工的

<220>

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<400>175

Gln Gln Ser Ser Ser Ser Pro Tyr Thr

1 5

<210>176

<211>9

<212>PRT

<213>人工的

<220>

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<400>176

Gln Gln Ser Ser Tyr Tyr Pro Tyr Thr

1 5

<210>177

<211>9

<212>PRT

<213>人工的

<220>

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<400>177

Gln Gln Ser Tyr Tyr Tyr Pro Tyr Thr

1 5

<210>178

<211>9

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的HER2结合克隆96CDRL3

<400>178

Gln Gln Tyr Tyr Tyr Ser Pro Ser Thr

1 5

<210>179

<211>9

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的HER2结合克隆97CDRL3

<400>179

Gln Gln Tyr Ser Tyr Tyr Pro Tyr Thr

1 5

<210>180

<211>9

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的HER2结合克隆98CDRL3

<400>180

Gln Gln Tyr Ser Tyr Tyr Pro Tyr Thr

1 5

<210>181

<211>9

<212>PRT

<213>人工的

<220>

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<400>181

Gln Gln Tyr Ser Tyr Tyr Pro Tyr Thr

1 5

<210>182

<211>9

<212>PRT

<213>人工的

<220>

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<400>182

Gln Gln Ser Ser Tyr Tyr Pro Tyr Thr

1 5

<210>183

<211>9

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的HER2结合克隆101CDRL3

<400>183

Gln Gln Tyr Ser Tyr Tyr Pro Tyr Thr

1 5

<210>184

<211>9

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的HER2结合克隆102CDRL3

<400>184

Gln Gln Tyr Ser Tyr Tyr Pro Tyr Thr

1 5

<210>185

<211>9

<212>PRT

<213>人工

<220>

<223>合成的HER2结合克隆103CDRL3

<400>185

Gln Gln Tyr Ser Tyr Tyr Pro Ser Thr

1 5

<210>186

<211>9

<212>PRT

<213>人工的

<220>

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<400>186

Gln Gln Tyr Ser Ser Ser Pro Ser Thr

1 5

<210>187

<211>9

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的HER2结合克隆105CDRL3

<400>187

Gln Gln Tyr Ser Ser Ser Pro Tyr Thr

1 5

<210>188

<211>9

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的HER2结合克隆106CDRL3

<400>188

Gln Gln Ser Tyr Ser Ser Pro Ser Thr

1 5

<210>189

<211>10

<212>PRT

<213>人工的

<220>

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<400>189

Gly Phe Ser Ile Ser Ser Ser Tyr Ile His

1 5 10

<210>190

<211>10

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的HER2结合克隆2CDRH1

<400>190

Gly Phe Ser Ile Tyr Ser Ser Tyr Ile His

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<211>10

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的HER2结合克隆3CDRH1

<400>191

Gly Phe Ser Ile Ser Ser Ser Tyr Ile His

1 5 10

<210>192

<211>10

<212>PRT

<213>人工的

<220>

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<400>192

Gly Phe Tyr Ile Ser Tyr Ser Tyr Ile His

1 5 10

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<211>10

<212>PRT

<213>人工的

<220>

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Gly Phe Tyr Ile Ser Ser Ser Tyr Ile His

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<211>10

<212>PRT

<213>人工的

<220>

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Gly Phe Ser Ile Ser Tyr Ser Tyr Ile His

1 5 10

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<212>PRT

<213>人工的

<220>

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Gly Phe Ser Ile Tyr Tyr Ser Tyr Ile His

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<212>PRT

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Gly Phe Ser Ile Tyr Ser Ser Tyr Ile His

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Gly Phe Ser Ile Tyr Ser Ser Ser Ile His

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<212>PRT

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Gly Phe Ser Ile Ser Ser Tyr Ser Ile His

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<212>PRT

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Gly Phe Ser Ile Ser Ser Ser Ser Ile His

1 5 10

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<211>10

<212>PRT

<213>人工的

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Gly Phe Tyr Ile Ser Ser Ser Ser Ile His

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<212>PRT

<213>人工的

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Gly Phe Ser Ile Ser Ser Ser Ser Ile His

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<212>PRT

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Gly Phe Tyr Ile Ser Ser Tyr Ser Ile His

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<212>PRT

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Gly Phe Tyr Ile Ser Tyr Ser Ser Ile His

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<212>PRT

<213>人工的

<220>

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Gly Phe Ser Ile Ser Tyr Ser Ser Ile His

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<212>PRT

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Gly Phe Tyr Ile Ser Ser Tyr Ser Ile His

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<212>PRT

<213>人工的

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Gly Phe Ser Ile Ser Tyr Ser Ser Ile His

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<212>PRT

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Gly Phe Tyr Ile Ser Tyr Ser Ser Ile His

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<212>PRT

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Gly Phe Ser Ile Ser Tyr Ser Ser Ile His

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<212>PRT

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Gly Phe Ser Ile Ser Tyr Ser Ser Ile His

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<212>PRT

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Gly Phe Ser Ile Ser Tyr Ser Ser Ile His

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<212>PRT

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Gly Phe Ser Ile Ser Tyr Ser Ser Ile His

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<212>PRT

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Gly Phe Tyr Ile Ser Tyr Ser Ser Ile His

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<212>PRT

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Gly Phe Ser Ile Ser Tyr Ser Ser Ile His

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Gly Phe Ser Ile Ser Tyr Ser Ser Ile His

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Gly Phe Ser Ile Tyr Ser Ser Ser Ile His

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Gly Phe Ser Ile Ser Tyr Ser Ser Ile His

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<212>PRT

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<220>

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Gly Phe Ser Ile Ser Tyr Ser Ser Ile His

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<212>PRT

<213>人工的

<220>

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Gly Phe Ser Ile Ser Ser Ser Ser Ile His

1 5 10

<210>221

<211>10

<212>PRT

<213>人工的

<220>

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Gly Phe Ser Ile Ser Ser Tyr Tyr Ile His

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<212>PRT

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Gly Phe Tyr Ile Ser Ser Ser Ser Ile His

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<212>PRT

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Gly Phe Tyr Ile Ser Ser Ser Ser Ile His

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Gly Phe Ser Ile Ser Ser Ser Ser Ile His

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<212>PRT

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Gly Phe Tyr Ile Ser Ser Tyr Ser Ile His

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<212>PRT

<213>人工的

<220>

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Gly Phe Tyr Ile Ser Ser Ser Ser Ile His

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<211>10

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Gly Phe Ser Ile Ser Ser Ser Ser Ile His

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<212>PRT

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Gly Phe Tyr Ile Ser Ser Ser Ser Ile His

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<211>10

<212>PRT

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Gly Phe Ser Ile Ser Ser Ser Ser Ile His

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<212>PRT

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<220>

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Gly Phe Tyr Ile Ser Ser Ser Ser Ile His

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<212>PRT

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Gly Phe Ser Ile Ser Ser Ser Ser Ile His

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<212>PRT

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Gly Phe Ser Ile Ser Ser Ser Ser Ile His

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<212>PRT

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<220>

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Gly Phe Tyr Ile Ser Ser Ser Ser Ile His

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Gly Phe Tyr Ile Ser Ser Ser Ser Ile His

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<212>PRT

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Gly Phe Tyr Ile Ser Ser Ser Ser Ile His

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<212>PRT

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Gly Phe Tyr Ile Ser Ser Ser Ser Ile His

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<212>PRT

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<220>

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Gly Phe Ser Ile Ser Ser Ser Ser Ile His

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<211>10

<212>PRT

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Gly Phe Ser Ile Ser Ser Ser Ser Ile His

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<212>PRT

<213>人工的

<220>

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Gly Phe Tyr Ile Ser Ser Ser Ser Ile His

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<212>PRT

<213>人工的

<220>

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Gly Phe Tyr Ile Ser Ser Ser Ser Ile His

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Gly Phe Tyr Ile Ser Ser Tyr Ser Ile His

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Gly Phe Tyr Ile Ser Ser Ser Ser Ile His

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<220>

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Gly Phe Tyr Ile Ser Ser Ser Ser Ile His

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Gly Phe Tyr Ile Ser Ser Ser Ser Ile His

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<212>PRT

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Gly Phe Tyr Ile Ser Ser Ser Ser Ile His

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Gly Phe Tyr Ile Ser Ser Tyr Ser Ile His

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Gly Phe Tyr Ile Ser Ser Ser Tyr Ile His

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<212>PRT

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Gly Phe Tyr Ile Ser Ser Ser Ser Ile His

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<212>PRT

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Gly Phe Tyr Ile Ser Ser Tyr Ser Ile His

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<212>PRT

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<220>

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Gly Phe Ser Ile Tyr Tyr Ser Ser Ile His

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Gly Phe Tyr Ile Ser Ser Ser Ser Ile His

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<212>PRT

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<220>

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Gly Phe Tyr Ile Ser Ser Tyr Ser Ile His

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Gly Phe Tyr Ile Ser Tyr Tyr Ser Ile His

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<212>PRT

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<220>

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Gly Phe Tyr Ile Ser Tyr Tyr Ser Ile His

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<212>PRT

<213>人工的

<220>

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Gly Phe Tyr Ile Ser Ser Ser Ser Ile His

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<211>10

<212>PRT

<213>人工的

<220>

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<400>263

Gly Phe Tyr Ile Ser Ser Ser Ser Ile His

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<211>10

<212>PRT

<213>人工的

<220>

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<400>264

Gly Phe Tyr Ile Ser Ser Ser Ser Ile His

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<211>10

<212>PRT

<213>人工的

<220>

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Gly Phe Tyr Ile Ser Ser Ser Ser Ile His

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<212>PRT

<213>人工的

<220>

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Gly Phe Tyr Ile Ser Ser Ser Ser Ile His

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<211>10

<212>PRT

<213>人工的

<220>

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Gly Phe Ser Ile Ser Ser Ser Ser Ile His

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<212>PRT

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<220>

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Gly Phe Ser Ile Tyr Tyr Ser Ser Ile His

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<212>PRT

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<220>

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<400>269

Gly Phe Tyr Ile Ser Ser Ser Tyr Ile His

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<211>10

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的HER2结合克隆82CDRH1

<400>270

Gly Phe Tyr Ile Ser Ser Ser Ser Ile His

1 5 10

<210>271

<211>10

<212>PRT

<213>人工的

<220>

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<400>271

Gly Phe Tyr Ile Ser Ser Ser Ser Ile His

1 5 10

<210>272

<211>10

<212>PRT

<213>人工的

<220>

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<400>272

Gly Phe Ser Ile Ser Ser Ser Ser Ile His

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<211>10

<212>PRT

<213>人工的

<220>

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Gly Phe Ser Ile Ser Ser Ser Ser Ile His

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<211>10

<212>PRT

<213>人工的

<220>

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<400>274

Gly Phe Ser Ile Ser Tyr Ser Ser Ile His

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<212>PRT

<213>人工的

<220>

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<400>275

Gly Phe Tyr Ile Ser Tyr Ser Ser Ile His

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<211>10

<212>PRT

<213>人工的

<220>

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Gly Phe Tyr Ile Ser Ser Ser Ser Ile His

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<212>PRT

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Gly Phe Ser Ile Ser Ser Ser Ser Ile His

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<220>

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Gly

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Gly

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Gly

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Gly

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<212>PRT

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Gly

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<212>PRT

<213>人工的

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Gly

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<212>PRT

<213>人工的

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<213>人工的

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<212>PRT

<213>人工的

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<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的HER2结合克隆64CDRH2

<400>358

Ser Ile Tyr Pro Ser Ser Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210>359

<211>17

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的HER2结合克隆65CDRH2

<400>359

Ser Ile Ser Pro Ser Ser Gly Tyr Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210>360

<211>17

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的HER2结合克隆66CDRH2

<400>360

Ser Ile Tyr Pro Ser Ser Gly Tyr Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210>361

<211>17

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的HER2结合克隆67CDRH2

<400>361

Tyr Ile Ser Pro Ser Ser Gly Tyr Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210>362

<211>17

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的HER2结合克隆68CDRH2

<400>362

Ser Ile Ser Pro Tyr Ser Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210>363

<211>17

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的HER2结合克隆69CDRH2

<400>363

Tyr Ile Tyr Pro Ser Ser Gly Tyr Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210>364

<211>17

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的HER2结合克隆70CDRH2

<400>364

Ser Ile Tyr Pro Tyr Ser Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210>365

<211>17

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的HER2结合克隆71CDRH2

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Ser Ile Ser Pro Tyr Ser Gly Tyr Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210>366

<211>17

<212>PRT

<213>人工的

<220>

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<400>366

Ser Ile Ser Pro Ser Ser Gly Tyr Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210>367

<211>17

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的HER2结合克隆73CDRH2

<400>367

Ser Ile Ser Pro Tyr Ser Gly Tyr Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210>368

<211>17

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的HER2结合克隆74CDRH2

<400>368

Ser Ile Tyr Pro Ser Ser Gly Tyr Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210>369

<211>17

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的HER2结合克隆75CDRH2

<400>369

Ser Ile Tyr Pro Tyr Tyr Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210>370

<211>17

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的HER2结合克隆76CDRH2

<400>370

Tyr Ile Tyr Pro Ser Ser Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210>371

<211>17

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的HER2结合克隆77CDRH2

<400>371

Tyr Ile Ser Pro Ser Ser Gly Tyr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210>372

<211>17

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的HER2结合克隆78CDRH2

<400>372

Ser Ile Ser Pro Ser Ser Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210>373

<211>17

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的HER2结合克隆79CDRH2

<400>373

Ser Ile Ser Pro Ser Ser Gly Tyr Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210>374

<211>17

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的HER2结合克隆80CDRH2

<400>374

Ser Ile Tyr Pro Tyr Ser Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210>375

<211>17

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的HER2结合克隆81CDRH2

<400>375

Tyr Ile Ser Pro Ser Ser Gly Tyr Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210>376

<211>17

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的HER2结合克隆82CDRH2

<400>376

Tyr Ile Ser Pro Ser Ser Gly Tyr Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210>377

<211>17

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的HER2结合克隆83CDRH2

<400>377

Ser Ile Ser Pro Ser Ser Gly Tyr Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210>378

<211>17

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的HER2结合克隆84CDRH2

<400>378

Tyr Ile Ser Pro Tyr Ser Gly Tyr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210>379

<211>17

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的HER2结合克隆85CDRH2

<400>379

Tyr Ile Ser Pro Tyr Ser Gly Tyr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210>380

<211>17

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的HER2结合克隆86CDRH2

<400>380

Tyr Ile Tyr Pro Tyr Ser Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210>381

<211>17

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的HER2结合克隆87CDRH2

<400>381

Ser Ile Ser Pro Ser Tyr Gly Tyr Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210>382

<211>17

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的HER2结合克隆88CDRH2

<400>382

Ser Ile Ser Pro Ser Tyr Gly Tyr Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210>383

<211>17

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的HER2结合克隆89CDRH2

<400>383

Ser Ile Tyr Pro Tyr Ser Gly Tyr Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210>384

<211>17

<212>PRT

<213>人工的

<220>

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1 5 10 15

Gly

<210>385

<211>17

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的HER2结合克隆91CDRH2

<400>385

Tyr Ile Tyr Pro Tyr Ser Gly Tyr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210>386

<211>17

<212>PRT

<213>人工的

<220>

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<400>386

Tyr Ile Ser Pro Ser Ser Gly Tyr Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210>387

<211>17

<212>PRT

<213>人工的

<220>

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<400>387

Tyr Ile Ser Pro Ser Ser Gly Tyr Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210>388

<211>17

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的HER2结合克隆94CDRH2

<400>388

Tyr Ile Ser Pro Ser Tyr Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210>389

<211>17

<212>PRT

<213>人工的

<220>

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<400>389

Ser Ile Ser Pro Ser Ser Gly Tyr Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210>390

<211>17

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的HER2结合克隆96CDRH2

<400>390

Ser Ile Tyr Pro Tyr Ser Gly Tyr Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210>391

<211>17

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的HER2结合克隆97CDRH2

<400>391

Ser Ile Tyr Pro Tyr Tyr Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210>392

<211>17

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的HER2结合克隆98CDRH2

<400>392

Ser Ile Tyr Pro Tyr Tyr Gly Tyr Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210>393

<211>17

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的HER2结合克隆99CDRH2

<400>393

Ser Ile Tyr Pro Tyr Tyr Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210>394

<211>17

<212>PRT

<213>人工的

<220>

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<400>394

Ser Ile Tyr Pro Tyr Tyr Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210>395

<211>17

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的HER2结合克隆101CDRH2

<400>395

Ser Ile Tyr Pro Ser Tyr Gly Tyr Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210>396

<211>17

<212>PRT

<213>人工的

<220>

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Ser Ile Tyr Pro Tyr Tyr Gly Tyr Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210>397

<211>17

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的HER2结合克隆103CDRH2

<400>397

Ser Ile Tyr Pro Tyr Tyr Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210>398

<211>17

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的HER2结合克隆104CDRH2

<400>398

Ser Ile Tyr Pro Ser Ser Gly Tyr Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210>399

<211>17

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的HER2结合克隆105CDRH2

<400>399

Ser Ile Tyr Pro Ser Ser Gly Tyr Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210>400

<211>17

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的HER2结合克隆106CDRH2

<400>400

Ser Ile Tyr Pro Ser Ser Gly Tyr Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210>401

<211>8

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的HER2结合克隆106CDRH2

<400>401

Tyr Tyr Ser Ser Gly Phe Asp Tyr

1 5

<210>402

<211>8

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的HER2结合克隆2CDRH3

<400>402

Tyr Tyr Gly Tyr Gly Met Asp Tyr

1 5

<210>403

<211>8

<212>PRT

<213>人工的

<220>

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<400>403

Tyr Tyr Gly Tyr Gly Leu Asp Tyr

1 5

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<211>8

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的HER2结合克隆4CDRH3

<400>404

Tyr Tyr Gly Tyr Gly Phe Asp Tyr

1 5

<210>405

<211>8

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的HER2结合克隆5CDRH3

<400>405

Tyr Tyr Gly Ser Gly Phe Asp Tyr

1 5

<210>406

<211>8

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的HER2结合克隆6CDRH3

<400>406

Tyr Tyr Gly Gly Ala Phe Asp Tyr

1 5

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<211>9

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的HER2结合克隆7CDRH3

<400>407

Tyr Tyr Gly Arg Gly Ala Met Asp Tyr

1 5

<210>408

<211>9

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的HER2结合克隆8CDRH3

<400>408

Tyr Ser Tyr Ser Gly Ala Leu Asp Tyr

1 5

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<211>9

<212>PRT

<213>人工的

<220>

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<400>409

Tyr Arg Tyr Tyr Gly Ala Leu Asp Tyr

1 5

<210>410

<211>9

<212>PRT

<213>人工的

<220>

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<400>410

Tyr Arg Tyr Gly Gly Ala Met Asp Tyr

1 5

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<211>10

<212>PRT

<213>人工的

<220>

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<400>411

Tyr Tyr Gly Gly Tyr Tyr Gly Met Asp Tyr

1 5 10

<210>412

<211>10

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的HER2结合克隆12CDRH3

<400>412

Tyr Ser Tyr Tyr Tyr Tyr Ala Leu Asp Tyr

1 5 10

<210>413

<211>10

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的HER2结合克隆13CDRH3

<400>413

Ser Ser Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Tyr

1 5 10

<210>414

<211>10

<212>PRT

<213>人工的

<220>

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<400>414

Ser Ser Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Phe Asp Tyr

1 5 10

<210>415

<211>10

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的HER2结合克隆15CDRH3

<400>415

Ser Ser Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Leu Asp Tyr

1 5 10

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<211>10

<212>PRT

<213>人工的

<220>

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<400>416

Ser Gly Gly Tyr Ser Arg Gly Ile Asp Tyr

1 5 10

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<211>10

<212>PRT

<213>人工的

<220>

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<400>417

Gly Tyr Ser Tyr Ser Arg Gly Ile Asp Tyr

1 5 10

<210>418

<211>10

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的HER2结合克隆18CDRH3

<400>418

Gly Tyr Ser Tyr Ser Arg Gly Met Asp Tyr

1 5 10

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<211>10

<212>PRT

<213>人工的

<220>

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Gly Ser Ser Tyr Ser Tyr Gly Met Asp Tyr

1 5 10

<210>420

<211>10

<212>PRT

<213>人工的

<220>

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<400>420

Gly Ser Gly Tyr Gly Tyr Gly Met Asp Tyr

1 5 10

<210>421

<211>10

<212>PRT

<213>人工的

<220>

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<400>421

Gly Ser Gly Tyr Gly Tyr Gly Ile Asp Tyr

1 5 10

<210>422

<211>10

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的HER2结合克隆22CDRH3

<400>422

Gly Arg Arg Tyr Ser Arg Gly Ile Asp Tyr

1 5 10

<210>423

<211>10

<212>PRT

<213>人工的

<220>

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<400>423

Gly Gly Ser Tyr Gly Tyr Gly Met Asp Tyr

1 5 10

<210>424

<211>10

<212>PRT

<213>人工的

<220>

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<400>424

Gly Gly Ser Tyr Gly Tyr Gly Met Asp Tyr

1 5 10

<210>425

<211>10

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的HER2结合克隆25CDRH3

<400>425

Gly Gly Arg Tyr Gly Tyr Gly Leu Asp Tyr

1 5 10

<210>426

<211>10

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的HER2结合克隆26CDRH3

<400>426

Gly Gly Arg Tyr Gly Arg Gly Ile Asp Tyr

1 5 10

<210>427

<211>10

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的HER2结合克隆27CDRH3

<400>427

Gly Gly Gly Tyr Gly Tyr Gly Ile Asp Tyr

1 5 10

<210>428

<211>10

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的HER2结合克隆28CDRH3

<400>428

Gly Gly Gly Tyr Gly Tyr Gly Ile Asp Tyr

1 5 10

<210>429

<211>12

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的HER2结合克隆29CDRH3

<400>429

Tyr Tyr Tyr Ser Gly Gly Ser Tyr Gly Met Asp Tyr

1 5 10

<210>430

<211>12

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的HER2结合克隆30CDRH3

<400>430

Ser Tyr Ser Ser Tyr Tyr Ser Ser Gly Met Asp Tyr

1 5 10

<210>431

<211>12

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的HER2结合克隆31CDRH3

<400>431

Arg Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr Ser Ala Phe Asp Tyr

1 5 10

<210>432

<211>14

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的HER2结合克隆32CDRH3

<400>432

Tyr Tyr Tyr Tyr Ser Tyr Tyr Ser Gly Gly Ala Ile Asp Tyr

1 5 10

<210>433

<211>14

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的HER2结合克隆33CDRH3

<400>433

Ser Tyr Tyr Tyr Ser Tyr Tyr Ser Gly Tyr Gly Met Asp Tyr

1 5 10

<210>434

<211>14

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的HER2结合克隆34CDRH3

<400>434

Ser Tyr Tyr Tyr Ser Tyr Tyr Ser Gly Tyr Gly Leu Asp Tyr

1 5 10

<210>435

<211>14

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的HER2结合克隆35CDRH3

<400>435

Ser Tyr Tyr Tyr Ser Tyr Tyr Tyr Gly Tyr Gly Met Asp Tyr

1 5 10

<210>436

<211>14

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的HER2结合克隆36CDRH3

<400>436

Ser Tyr Tyr Gly Ser Tyr Tyr Tyr Gly Tyr Gly Phe Asp Tyr

1 5 10

<210>437

<211>14

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的HER2结合克隆37CDRH3

<400>437

Ser Ser Tyr Tyr Gly Tyr Tyr Ser Gly Tyr Gly Ile Asp Tyr

1 5 10

<210>438

<211>14

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的HER2结合克隆38CDRH3

<400>438

Ser Ser Tyr Tyr Ser Tyr Tyr Ser Gly Tyr Gly Leu Asp Tyr

1 5 10

<210>439

<211>14

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的HER2结合克隆39CDRH3

<400>439

Gly Tyr Tyr Tyr Ser Tyr Tyr Tyr Gly Tyr Gly Met Asp Tyr

1 5 10

<210>440

<211>14

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的HER2结合克隆40CDRH3

<400>440

Gly Tyr Tyr Tyr Ser Tyr Tyr Tyr Gly Ser Ala Met Asp Tyr

1 5 10

<210>441

<211>14

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的HER2结合克隆41CDRH3

<400>441

Gly Tyr Tyr Tyr Ser Tyr Tyr Ser Gly Tyr Gly Met Asp Tyr

1 5 10

<210>442

<211>14

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的HER2结合克隆42CDRH3

<400>442

Gly Tyr Tyr Tyr Ser Tyr Tyr Ser Gly Tyr Ala Leu Asp Tyr

1 5 10

<210>443

<211>14

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的HER2结合克隆43CDRH3

<400>443

Gly Tyr Tyr Tyr Ser Tyr Tyr Ser Gly Tyr Ala Ile Asp Tyr

1 5 10

<210>444

<211>14

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的HER2结合克隆44CDRH3

<400>444

Gly Tyr Tyr Tyr Ser Tyr Tyr Ser Gly Tyr Ala Met Asp Tyr

1 5 10

<210>445

<211>14

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的HER2结合克隆45CDRH3

<400>445

Gly Tyr Tyr Tyr Ser Tyr Tyr Ser Gly Tyr Gly Ile Asp Tyr

1 5 10

<210>446

<211>14

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的HER2结合克隆46CDRH3

<400>446

Gly Tyr Tyr Tyr Ser Tyr Tyr Ser Gly Tyr Gly Leu Asp Tyr

1 5 10

<210>447

<211>14

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的HER2结合克隆47CDRH3

<400>447

Gly Tyr Tyr Tyr Ser Tyr Tyr Ser Gly Tyr Gly Met Asp Tyr

1 5 10

<210>448

<211>14

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的HER2结合克隆48CDRH3

<400>448

Gly Tyr Tyr Tyr Ser Tyr Tyr Ser Gly Ser Gly Leu Asp Tyr

1 5 10

<210>449

<211>14

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的HER2结合克隆49CDRH3

<400>449

Gly Tyr Tyr Tyr Ser Tyr Tyr Gly Gly Tyr Gly Met Asp Tyr

1 5 10

<210>450

<211>14

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的HER2结合克隆50CDRH3

<400>450

Gly Tyr Tyr Tyr Ser Tyr Tyr Gly Gly Tyr Gly Ile Asp Tyr

1 5 10

<210>451

<211>14

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的HER2结合克隆51CDRH3

<400>451

Gly Tyr Tyr Tyr Ser Tyr Tyr Gly Gly Tyr Gly Met Asp Tyr

1 5 10

<210>452

<211>14

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的HER2结合克隆52CDRH3

<400>452

Gly Tyr Tyr Tyr Ser Tyr Tyr Gly Gly Tyr Gly Met Asp Tyr

1 5 10

<210>453

<211>14

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的HER2结合克隆53CDRH3

<400>453

Gly Tyr Tyr Tyr Ser Tyr Tyr Gly Gly Tyr Gly Met Asp Tyr

1 5 10

<210>454

<211>14

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的HER2结合克隆54CDRH3

<400>454

Gly Tyr Tyr Tyr Ser Tyr Tyr Gly Gly Tyr Gly Leu Asp Tyr

1 5 10

<210>455

<211>14

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的HER2结合克隆55CDRH3

<400>455

Gly Tyr Tyr Tyr Ser Tyr Tyr Gly Gly Tyr Gly Met Asp Tyr

1 5 10

<210>456

<211>14

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的HER2结合克隆56CDRH3

<400>456

Gly Tyr Tyr Tyr Ser Tyr Tyr Gly Gly Tyr Gly Met Asp Tyr

1 5 10

<210>457

<211>14

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的HER2结合克隆57CDRH3

<400>457

Gly Tyr Tyr Tyr Gly Tyr Tyr Ser Gly Tyr Gly Ile Asp Tyr

1 5 10

<210>458

<211>14

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的HER2结合克隆58CDRH3

<400>458

Gly Ser Tyr Tyr Ser Tyr Tyr Ser Gly Tyr Gly Met Asp Tyr

1 5 10

<210>459

<211>14

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的HER2结合克隆59CDRH3

<400>459

Gly Ser Tyr Tyr Ser Tyr Tyr Ser Gly Tyr Ala Ile Asp Tyr

1 5 10

<210>460

<211>14

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的HER2结合克隆60CDRH3

<400>460

Gly Ser Tyr Tyr Ser Tyr Tyr Ser Gly Tyr Ala Phe Asp Tyr

1 5 10

<210>461

<211>14

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的HER2结合克隆61CDRH3

<400>461

Gly Ser Tyr Tyr Ser Tyr Tyr Ser Gly Ser Gly Ile Asp Tyr

1 5 10

<210>462

<211>14

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的HER2结合克隆62CDRH3

<400>462

Gly Ser Tyr Tyr Gly Tyr Tyr Tyr Gly Ser Ala Ile Asp Tyr

1 5 10

<210>463

<211>14

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的HER2结合克隆63CDRH3

<400>463

Gly Ser Tyr Tyr Gly Tyr Tyr Tyr Gly Ser Gly Met Asp Tyr

1 5 10

<210>464

<211>14

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的HER2结合克隆64CDRH3

<400>464

Gly Ser Tyr Tyr Gly Tyr Tyr Ser Gly Ser Gly Met Asp Tyr

1 5 10

<210>465

<211>14

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的HER2结合克隆65CDRH3

<400>465

Gly Ser Gly Tyr Ser Tyr Tyr Gly Gly Tyr Gly Leu Asp Tyr

1 5 10

<210>466

<211>14

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的HER2结合克隆66CDRH3

<400>466

Gly Ser Tyr Ser Gly Tyr Tyr Tyr Gly Tyr Gly Leu Asp Tyr

1 5 10

<210>467

<211>14

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的HER2结合克隆67CDRH3

<400>467

Gly Arg Tyr Ser Gly Tyr Tyr Gly Gly Tyr Gly Met Asp Tyr

1 5 10

<210>468

<211>15

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的HER2结合克隆68CDRH3

<400>468

Tyr Tyr Tyr Ser Ser Gly Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr Ala Phe Asp Tyr

1 5 10 15

<210>469

<211>15

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的HER2结合克隆69CDRH3

<400>469

Tyr Ser Tyr Ser Tyr Tyr Gly Tyr Tyr Gly Ser Gly Met Asp Tyr

1 5 10 15

<210>470

<211>15

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的HER2结合克隆70CDRH3

<400>470

Tyr Arg Ser Tyr Tyr Ser Tyr Arg Tyr Gly Tyr Gly Met Asp Tyr

1 5 10 15

<210>471

<211>15

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的HER2结合克隆71CDRH3

<400>471

Tyr Gly Tyr Tyr Tyr Ser Tyr Tyr Gly Gly Ser Gly Leu Asp Tyr

1 5 10 15

<210>472

<211>15

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的HER2结合克隆72CDRH3

<400>472

Tyr Gly Tyr Tyr Tyr Ser Tyr Tyr Gly Gly Ser Gly Leu Asp Tyr

1 5 10 15

<210>473

<211>15

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的HER2结合克隆73CDRH3

<400>473

Tyr Gly Tyr Ser Tyr Ser Tyr Ser Ser Gly Ser Ala Leu Asp Tyr

1 5 10 15

<210>474

<211>15

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的HER2结合克隆74CDRH3

<400>474

Ser Tyr Tyr Tyr Gly Gly Tyr Tyr Ser Gly Tyr Gly Met Asp Tyr

1 5 10 15

<210>475

<211>15

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的HER2结合克隆75CDRH3

<400>475

Arg Arg Ser Tyr Tyr Ser Tyr Arg Tyr Ser Tyr Gly Leu Asp Tyr

1 5 10 15

<210>476

<211>15

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的HER2结合克隆76CDRH3

<400>476

Arg Arg Ser Tyr Tyr Ser Tyr Ser Arg Ser Tyr Ala Met Asp Tyr

1 5 10 15

<210>477

<211>16

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的HER2结合克隆77CDRH3

<400>477

Tyr Tyr Tyr Gly Tyr Tyr Ser Tyr Tyr Ser Gly Tyr Gly Leu Asp Tyr

1 5 10 15

<210>478

<211>16

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的HER2结合克隆78CDRH3

<400>478

Tyr Tyr Tyr Gly Tyr Tyr Ser Tyr Tyr Gly Gly Ser Gly Leu Asp Tyr

1 5 10 15

<210>479

<211>16

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的HER2结合克隆79CDRH3

<400>479

Tyr Tyr Tyr Gly Tyr Tyr Ser Tyr Tyr Gly Gly Ser Ala Met Asp Tyr

1 5 10 15

<210>480

<211>16

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的HER2结合克隆80CDRH3

<400>480

Tyr Tyr Tyr Ser Gly Gly Ser Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr Ala Phe Asp Tyr

1 5 10 15

<210>481

<211>16

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的HER2结合克隆81CDRH3

<400>481

Tyr Tyr Tyr Ser Tyr Tyr Ser Tyr Tyr Ser Tyr Gly Gly Ile Asp Tyr

1 5 10 15

<210>482

<211>16

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的HER2结合克隆82CDRH3

<400>482

Tyr Tyr Ser Ser Tyr Tyr Ser Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Gly Met Asp Tyr

1 5 10 15

<210>483

<211>16

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的HER2结合克隆83CDRH3

<400>483

Tyr Ser Tyr Tyr Tyr Tyr Ser Tyr Tyr Tyr Gly Ser Ala Met Asp Tyr

1 5 10 15

<210>484

<211>16

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的HER2结合克隆84CDRH3

<400>484

Tyr Ser Tyr Tyr Tyr Tyr Ser Tyr Tyr Ser Gly Tyr Gly Phe Asp Tyr

1 5 10 15

<210>485

<211>16

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的HER2结合克隆85CDRH3

<400>485

Tyr Ser Tyr Tyr Tyr Tyr Ser Tyr Tyr Ser Gly Tyr Gly Phe Asp Tyr

1 5 10 15

<210>486

<211>16

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的HER2结合克隆86CDRH3

<400>486

Tyr Ser Tyr Tyr Tyr Tyr Ser Tyr Tyr Gly Gly Ser Ala Phe Asp Tyr

1 5 10 15

<210>487

<211>16

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的HER2结合克隆87CDRH3

<400>487

Tyr Ser Tyr Tyr Tyr Tyr Ser Tyr Tyr Gly Gly Ser Gly Met Asp Tyr

1 5 10 15

<210>488

<211>16

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的HER2结合克隆88CDRH3

<400>488

Tyr Ser Tyr Tyr Tyr Tyr Ser Tyr Tyr Gly Gly Ser Gly Leu Asp Tyr

1 5 10 15

<210>489

<211>16

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的HER2结合克隆89CDRH3

<400>489

Tyr Ser Tyr Ser Tyr Tyr Gly Tyr Tyr Tyr Gly Ser Gly Leu Asp Tyr

1 5 10 15

<210>490

<211>16

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的HER2结合克隆90CDRH3

<400>490

Tyr Ser Ser Tyr Tyr Tyr Ser Tyr Tyr Ser Gly Ser Gly Leu Asp Tyr

1 5 10 15

<210>491

<211>16

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的HER2结合克隆91CDRH3

<400>491

Ser Ser Tyr Tyr Tyr Tyr Ser Tyr Tyr Gly Gly Ser Gly Ile Asp Tyr

1 5 10 15

<210>492

<211>16

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的HER2结合克隆92CDRH3

<400>492

Arg Ser Tyr Tyr Tyr Tyr Ser Tyr Tyr Tyr Ser Arg Ala Met Asp Tyr

1 5 10 15

<210>493

<211>17

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的HER2结合克隆93CDRH3

<400>493

Ser Tyr Ser Ser Tyr Tyr Ser Tyr Tyr Ser Ser Tyr Gly Gly Met Asp

1 5 10 15

Tyr

<210>494

<211>21

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的HER2结合克隆94CDRH3

<400>494

Tyr Arg Tyr Tyr Tyr Ser Arg Tyr Gly Tyr Arg Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr

1 5 10 15

Arg Ala Leu Asp Tyr

20

<210>495

<211>8

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的HER2结合克隆95CDRH3

<400>495

Arg Tyr Ser Ser Gly Met Asp Tyr

1 5

<210>496

<211>9

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的HER2结合克隆96CDRH3

<400>496

Tyr Ser His Ser Gly Ala Phe Asp Tyr

1 5

<210>497

<211>10

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的HER2结合克隆97CDRH3

<400>497

Gly Tyr Ser Tyr Gly His Gly Ile Asp Tyr

1 5 10

<210>498

<211>10

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的HER2结合克隆98CDRH3

<400>498

Gly Ser Ser Phe Gly Arg Gly Phe Asp Tyr

1 5 10

<210>499

<211>10

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的HER2结合克隆99CDRH3

<400>499

Gly Ser Ser Tyr Ser Trp Gly Leu Asp Tyr

1 5 10

<210>500

<211>10

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的HER2结合克隆100CDRH3

<400>500

Gly Ser Arg Tyr Ser His Gly Met Asp Tyr

1 5 10

<210>501

<211>10

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的HER2结合克隆101CDRH3

<400>501

Gly Ala Ser Tyr Gly Tyr Gly Met Asp Tyr

1 5 10

<210>502

<211>10

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的HER2结合克隆102CDRH3

<400>502

Gly Met Ser Tyr Gly Tyr Gly Met Asp Tyr

1 5 10

<210>503

<211>10

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的HER2结合克隆103CDRH3

<400>503

Gly Gly Arg Tyr Asn His Gly Leu Asp Tyr

1 5 10

<210>504

<211>17

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的HER2结合克隆104CDRH3

<400>504

Glu Tyr Tyr Gln Gly Tyr Gly Pro Tyr Arg Ser Thr Tyr Gly Leu Asp

1 5 10 15

Tyr

<210>505

<211>19

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的HER2结合克隆105CDRH3

<400>505

Ser Ser Trp Ser Ser Arg Gly Val Ser Tyr Ser Arg Thr Ala Gly Gly

1 5 10 15

Met Asp Tyr

<210>506

<211>20

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的HER2结合克隆106CDRH3

<400>506

Glu Gly Tyr Tyr Ser Val Ser Gly Ser Tyr Ser Tyr Ser Thr Arg Gly

1 5 10 15

Gly Pro Asp Tyr

20

<210>507

<211>9

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的DR5结合克隆1CDRL3

<400>507

Gln Gln Tyr Ser Ser Tyr Pro Ser Thr

1 5

<210>508

<211>9

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的DR5结合克隆2CDRL3

<400>508

Gln Gln Tyr Ser Ser Tyr Pro Ser Thr

1 5

<210>509

<211>9

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的DR5结合克隆3CDRL3

<400>509

Gln Gln Tyr Tyr Tyr Tyr Pro Ser Thr

1 5

<210>510

<211>9

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的DR5结合克隆4CDRL3

<400>510

Gln Gln Tyr Ser Ser Tyr Pro Ser Thr

1 5

<210>511

<211>9

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的DR5结合克隆5CDRL3

<400>511

Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro Thr

1 5

<210>512

<211>9

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的DR5结合克隆6CDRL3

<400>512

Gln Gln Tyr Tyr Ser Ser Pro Ser Thr

1 5

<210>513

<211>9

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的DR5结合克隆7CDRL3

<400>513

Gln Gln Tyr Ser Tyr Ser Pro Ser Thr

1 5

<210>514

<211>9

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的DR5结合克隆8CDRL3

<400>514

Gln Gln Tyr Tyr Tyr Ser Pro Ser Thr

1 5

<210>515

<211>9

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的DR5结合克隆9CDRL3

<400>515

Gln Gln Tyr Ser Ser Ser Pro Ser Thr

1 5

<210>516

<211>9

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的DR5结合克隆10CDRL3

<400>516

Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro Thr

1 5

<210>517

<211>9

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的DR5结合克隆11CDRL3

<400>517

Gln Gln Tyr Tyr Ser Ser Pro Ser Thr

1 5

<210>518

<211>9

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的DR5结合克隆12CDRL3

<400>518

Gln Gln Tyr Tyr Ser Ser Pro Tyr Thr

1 5

<210>519

<211>9

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的DR5结合克隆13CDRL3

<400>519

Gln Gln Tyr Tyr Ser Ser Pro Ser Thr

1 5

<210>520

<211>9

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的DR5结合克隆14CDRL3

<400>520

Gln Gln Tyr Ser Ser Ser Pro Ser Thr

1 5

<210>521

<211>9

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的DR5结合克隆15CDRL3

<400>521

Gln Gln Ser Ser Tyr Ser Pro Ser Thr

1 5

<210>522

<211>9

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的DR5结合克隆16CDRL3

<400>522

Gln Gln Tyr Tyr Ser Ser Pro Ser Thr

1 5

<210>523

<211>9

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的DR5结合克隆17CDRL3

<400>523

Gln Gln Tyr Tyr Ser Ser Pro Ser Thr

1 5

<210>524

<211>10

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的DR5结合克隆1CDRH1

<400>524

Gly Phe Ser Ile Tyr Ser Tyr Ser Ile His

1 5 10

<210>525

<211>10

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的DR5结合克隆2CDRH1

<400>525

Gly Phe Ser Ile Tyr Ser Ser Ser Ile His

1 5 10

<210>526

<211>10

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的DR5结合克隆3CDRH1

<400>526

Gly Phe Tyr Ile Tyr Ser Tyr Ser Ile His

1 5 10

<210>527

<211>10

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的DR5结合克隆4CDRH1

<400>527

Gly Phe Ser Ile Tyr Ser Ser Ser Ile His

1 5 10

<210>528

<211>10

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的DR5结合克隆5CDRH1

<400>528

Gly Phe Ser Ile Tyr Ser Ser Ser Ile His

1 5 10

<210>529

<211>10

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的DR5结合克隆6CDRH1

<400>529

Gly Phe Tyr Ile Ser Tyr Ser Ser Ile His

1 5 10

<210>530

<211>10

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的DR5结合克隆7CDRH1

<400>530

Gly Phe Ser Ile Ser Ser Ser Ser Ile His

1 5 10

<210>531

<211>10

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的DR5结合克隆8CDRH1

<400>531

Gly Phe Tyr Ile Ser Ser Ser Ser Ile His

1 5 10

<210>532

<211>10

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的DR5结合克隆9CDRH1

<400>532

Gly Phe Ser Ile Ser Ser Ser Ser Ile His

1 5 10

<210>533

<211>10

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的DR5结合克隆10CDRH1

<400>533

Gly Phe Tyr Ile Tyr Ser Ser Ser Ile His

1 5 10

<210>534

<211>10

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的DR5结合克隆11 CDRH1

<400>534

Gly Phe Ser Ile Ser Ser Ser Ser Ile His

1 5 10

<210>535

<211>10

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的DR5结合克隆12CDRH1

<400>535

Gly Phe Ser Ile Ser Ser Ser Ser Ile His

1 5 10

<210>536

<211>10

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的DR5结合克隆13CDRH1

<400>536

Gly Phe Ser Ile Ser Ser Ser Ser Ile His

1 5 10

<210>537

<211>10

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的DR5结合克隆14CDRH1

<400>537

Gly Phe Tyr Ile Ser Ser Ser Tyr Ile His

1 5 10

<210>538

<211>10

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的DR5结合克隆15CDRH1

<400>538

Gly Phe Tyr Ile Tyr Ser Ser Ser Ile His

1 5 10

<210>539

<211>10

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的DR5结合克隆16CDRH1

<400>539

Gly Phe Tyr Ile Tyr Ser Ser Ser Ile His

1 5 10

<210>540

<211>10

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的DR5结合克隆17CDRH1

<400>540

G1y Phe Tyr Ile Ser Ser Ser Ser Ile His

1 5 10

<210>541

<211>17

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的DR5结合克隆1CDRH2

<400>541

Ser Ile Ser Pro Tyr Tyr G1y Tyr Thr Ser Tyr A1a Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210>542

<211>17

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的DR5结合克隆2CDRH2

<400>542

Ser Ile Tyr Pro Tyr Ser Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210>543

<211>17

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的DR5结合克隆3CDRH2

<400>543

Ser Ile Ser Pro Tyr Tyr Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210>544

<211>17

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的DR5结合克隆4CDRH2

<400>544

Tyr Ile Ser Pro Ser Tyr Gly Tyr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210>545

<211>17

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的DR5结合克隆5CDRH2

<400>545

Ser Ile Ser Pro Tyr Ser Gly Tyr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210>546

<211>17

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的DR5结合克隆6CDRH2

<400>546

Tyr Ile Ser Pro Tyr Ser Gly Tyr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210>547

<211>17

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的DR5结合克隆7CDRH2

<400>547

Ser Ile Ser Pro Ser Tyr Gly Tyr Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210>548

<211>17

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的DR5结合克隆8CDRH2

<400>548

Ser Ile Ser Pro Ser Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210>549

<211>17

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的DR5结合克隆9CDRH2

<400>549

Ser Ile Ser Pro Tyr Tyr Gly Tyr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210>550

<211>17

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的DR5结合克隆10CDRH2

<400>550

Ser Ile Ser Pro Ser Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210>551

<211>17

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的DR5结合克隆11CDRH2

<400>551

Tyr Ile Ser Pro Tyr Ser Gly Tyr Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210>552

<211>17

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的DR5结合克隆12CDRH2

<400>552

Tyr Ile Tyr Pro Tyr Ser Gly Tyr Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210>553

<211>17

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的DR 5结合克隆13CDRH2

<400>553

Ser lle Ser Pro Ser Ser Gly Tyr Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210>554

<211>17

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的DR5结合克隆14CDRH2

<400>554

Ser Ile Ser Pro Ser Tyr Gly Tyr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210>555

<211>17

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的DR5结合克隆15CDRH2

<400>555

Ser Ile Ser Pro Ser Ser Gly Tyr Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210>556

<211>17

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的DR5结合克隆16CDRH2

<400>556

Tyr Ile Ser Pro Tyr Tyr Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210>557

<211>17

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的DR5结合克隆17CDRH2

<400>557

Tyr Ile Ser Pro Ser Tyr Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210>558

<211>16

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的DR5结合克隆1CDRH3

<400>558

Arg Tyr Tyr Ser Tyr Arg Ser Tyr Ser Tyr Tyr Ser Gly Leu Asp Tyr

1 5 10 15

<210>559

<211>16

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的DR5结合克隆2CDRH3

<400>559

Arg Tyr Tyr Ser Ser Ser Tyr Arg Ser Ser Ser Tyr Gly Met Asp Tyr

1 5 10 15

<210>560

<211>16

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的DR5结合克隆3CDRH3

<400>560

Tyr Tyr Tyr Ser Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Ser Tyr Tyr Gly Leu Asp Tyr

1 5 10 15

<210>561

<211>18

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的DR5结合克隆4CDRH3

<400>561

Arg Arg Tyr Ser Arg Tyr Tyr Arg Tyr Ser Ser Arg Tyr Arg Gly Phe

1 5 10 15

Asp Tyr

<210>562

<211>17

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的DR5结合克隆5CDRH3

<400>562

Tyr Arg Ser Tyr Arg Tyr Gly Tyr Tyr Arg Gly Gly Tyr Gly Phe Asp

1 5 10 15

Tyr

<210>563

<211>17

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的DR5结合克隆6CDRH3

<400>563

Tyr Arg Ser Tyr Arg Tyr Gly Tyr Tyr Arg Gly Ser Tyr Ala Leu Asp

1 5 10 15

Tyr

<210>564

<211>17

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的DR5结合克隆7CDRH3

<400>564

Tyr Arg Ser Tyr Arg Tyr Gly Ser Tyr Arg Gly Ser Tyr Gly Phe Asp

1 5 10 15

Tyr

<210>565

<211>17

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的DR5结合克隆8CDRH3

<400>565

Tyr Arg Ser Tyr Arg Tyr Gly Ser Tyr Tyr Gly Ser Tyr Gly Phe Asp

1 5 10 15

Tyr

<210>566

<211>17

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的DR5结合克隆9CDRH3

<400>566

Tyr Arg Arg Tyr Tyr Tyr Gly Tyr Tyr Tyr Gly Gly Tyr Gly Phe Asp

1 5 10 15

Tyr

<210>567

<211>17

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的DR5结合克隆10CDRH3

<400>567

Tyr Arg Arg Tyr Arg Tyr Gly Tyr Tyr Ser Gly Gly Tyr Gly Phe Asp

1 5 10 15

Tyr

<210>568

<211>17

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的DR5结合克隆11CDRH3

<400>568

Tyr Arg Arg Tyr Arg Tyr Gly Ser Tyr Tyr Ser Gly Tyr Ala Phe Asp

1 5 10 15

Tyr

<210>569

<211>17

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的DR5结合克隆12CDRH3

<400>569

Tyr Arg Arg Tyr Arg Tyr Gly Tyr Ser Tyr Gly Ser Tyr Gly Phe Asp

1 5 10 15

Tyr

<210>570

<211>17

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的DR5结合克隆13CDRH3

<400>570

Tyr Arg Gly Tyr Arg Tyr Gly Tyr Tyr Arg Gly Gly Tyr Ala Phe Asp

1 5 10 15

Tyr

<210>571

<211>17

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的DR5结合克隆14CDRH3

<400>571

Arg Arg Tyr Tyr Arg Tyr Gly Tyr Ser Arg Gly Ser Tyr Gly Leu Asp

1 5 10 15

Tyr

<210>572

<211>17

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的DR5结合克隆15CDRH3

<400>572

Arg Arg Ser Tyr Arg Tyr Gly Ser Tyr Arg Gly Ser Tyr Ala Phe Asp

1 5 10 15

Tyr

<210>573

<211>17

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的DR5结合克隆16CDRH3

<400>573

Arg Arg Pro Tyr Arg Tyr Gly Arg Ser Arg Gly Tyr Tyr Ala Phe Asp

1 5 10 15

Tyr

<210>574

<211>17

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的DR5结合克隆17CDRH3

<400>574

Met Arg Arg Tyr His Tyr Gly Arg Tyr Ser Gly Ala Tyr Gly Leu Asp

1 5 10 15

Tyr

<210>575

<211>17

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的CDRH3

<220>

<221>M是C_FEATURE

<222>(1)..(1)

<223>X是R或Y

<220>

<221>M是C_FEATURE

<222>(10)..(10)

<223>X是Y或R

<220>

<221>M是C_FEATURE

<222>(14)..(14)

<223>X是R或Y

<400>575

Xaa Arg Ser Tyr Arg Tyr Gly Ser Tyr Xaa Gly Ser Tyr Xaa Phe Asp

1 5 10 15

Tyr

<210>576

<211>10

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的CDRH1

<400>576

Gly Phe Tyr Ile Ser Ser Ser Ser Ile His

1 5 10

<210>577

<211>17

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的CDRH2

<400>577

Ser Ile Ser Pro Ser Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210>578

<211>17

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的CDRH3

<400>578

Tyr Arg Ser Tyr Arg Tyr Gly Ser Tyr Tyr Gly Ser Tyr Gly Phe Asp

1 5 10 15

Tyr

<210>579

<211>10

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的CDRH1

<400>579

Gly Phe Tyr Ile Tyr Ser Ser Ser Ile His

1 5 10

<210>580

<211>17

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的CDRH2

<400>580

Ser Ile Ser Pro Ser Ser Gly Tyr Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210>581

<211>17

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的CDRH3

<400>581

Arg Arg Ser Tyr Arg Tyr Gly Ser Tyr Arg Gly Ser Tyr Ala Phe Asp

1 5 10 15

Tyr

<210>582

<211>9

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的CDRH3

<220>

<221>M是C_FEATURE

<222>(1)..(1)

<223>X是R或Y

<220>

<221>M是C_FEATURE

<222>(2)..(2)

<223>X是R，S或Y

<220>

<221>M是C_FEATURE

<222>(3)..(3)

<223>X是S，G，Y或H

<220>

<221>M是C_FEATURE

<222>(4)..(4)

<223>X是S，G，Y或R

<220>

<221>M是C_FEATURE

<222>(5)..(5)

<223>X是G或A

<220>

<221>M是C_FEATURE

<222>(6)..(6)

<223>X是F，M，L或A

<220>

<221>M是C_FEATURE

<222>(7)..(7)

<223>X是F，M，L或无氨基酸

<400>582

Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Asp Tyr

1 5

<210>583

<211>10

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的CDRH3

<220>

<221>M是C_FEATURE

<222>(1)..(1)

<223>X是G，S或Y

<220>

<221>M是C_FEATURE

<222>(2)..(2)

<223>X是Y，S，G，R，A或M

<220>

<221>M是C_FEATURE

<222>(3)..(3)

<223>X是G，R，S或Y

<220>

<221>M是C_FEATURE

<222>(4)..(4)

<223>X是F，G或Y

<220>

<221>M是C_FEATURE

<222>(5)..(5)

<223>X是G，N，S或Y

<220>

<221>M是C_FEATURE

<222>(6)..(6)

<223>X是H，R，W或Y

<220>

<221>M是C_FEATURE

<222>(7)..(7)

<223>X是A或G

<220>

<221>M是C_FEATURE

<222>(8)..(8)

<223>X是F，I，L或M

<400>583

Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Asp Tyr

1 5 10

<210>584

<211>21

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的CDRH3

<220>

<221>M是C_FEATURE

<222>(1)..(1)

<223>X是Y，S，R，G或E

<220>

<221>M是C_FEATURE

<222>(2)..(2)

<223>X是Y，S，R或G

<220>

<221>M是C_FEATURE

<222>(3)..(3)

<223>X是S，Y，G或W

<220>

<221>M是C_FEATURE

<222>(4)..(4)

<223>X是S，Y，G或W

<220>

<221>M是C_FEATURE

<222>(5)..(5)

<223>X是G，Y或S

<220>

<221>M是C_FEATURE

<222>(6)..(6)

<223>X是G，Y，S，R或V

<220>

<221>M是C_FEATURE

<222>(7)..(7)

<223>X是S，Y，G或R

<220>

<221>M是C_FEATURE

<222>(8)..(8)

<223>X是Y，S，G，R，P或V

<220>

<221>M是C_FEATURE

<222>(9)..(9)

<223>X是G，A，R，S或Y

<220>

<221>M是C_FEATURE

<222>(10)..(10)

<223>X是M，F，G，Y，S或R

<220>

<221>M是C_FEATURE

<222>(11)..(11)

<223>X是A，G，R，S，Y或无氨基酸

<220>

<221>M是C_FEATURE

<222>(12)..(12)

<223>X是A，F，G，I，L，M，R，S，T，Y或无氨基酸

<220>

<221>M是C_FEATURE

<222>(13)..(13)

<223>X是A，F，G，L，M，S，T，Y或无氨基酸

<220>

<221>M是C_FEATURE

<222>(14)..(14)

<223>X是L，M，F，I，G，Y，A，T或no amion acid

<220>

<221>M是C_FEATURE

<222>(15)..(15)

<223>X是M，L，Y，G，R或无氨基酸

<220>

<221>M是C_FEATURE

<222>(16)..(16)

<223>X是G，Y或无氨基酸

<220>

<221>M是C_FEATURE

<222>(17)..(17)

<223>X是G，R，M或无氨基酸

<220>

<221>M是C_FEATURE

<222>(18)..(18)

<223>X是A，P或无氨基酸

<220>

<221>M是C_FEATURE

<222>(19)..(19)

<223>X是L或无氨基酸

<400>584

Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa

1 5 10 15

Xaa Xaa Xaa Asp Tyr

20

<210>585

<211>6

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>转录起始上游的合成的序列

<220>

<221>m是c_feature

<222>(2)..(2)

<223>N可以是任何核苷酸

<400>585

cncaat 6

<210>586

<211>6

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>合成的信号

<400>586

aataaa 6

<210>587

<211>9

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的CDRL3

<220>

<221>M是C_FEATURE

<222>(6)..(6)

<223>X是Y或S

<400>587

Gln Gln Ser Tyr Tyr Xaa Pro Ser Thr

1 5

<210>588

<211>10

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的CDRH1

<220>

<221>M是C_FEATURE

<222>(5)..(5)

<223>X独立地是Y或S

<220>

<221>M是C_FEATURE

<222>(6)..(6)

<223>X独立地是Y或S

<400>588

Gly Phe Ser Ile Xaa Xaa Ser Tyr Ile His

1 5 10

<210>589

<211>17

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的CDRH2

<220>

<221>M是C_FEATURE

<222>(5)..(5)

<223>X独立地是Y或S

<400>589

Ser Ile Tyr Pro Xaa Ser Gly Tyr Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Lys Val

1 5 10 15

Gly

<210>590

<211>10

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的CDRH1

<220>

<221>M是C_FEATURE

<222>(3)..(3)

<223>X是Y或S

<400>590

Gly Phe Xaa Ile Ser Tyr Ser Ser Ile His

1 5 10

<210>591

<211>17

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的CDRH2

<220>

<221>M是C_FEATURE

<222>(5)..(5)

<223>X独立地是Y或S

<220>

<221>M是C_FEATURE

<222>(8)..(8)

<223>X独立地是Y或S

<220>

<221>M是C_FEATURE

<222>(10)..(10)

<223>X独立地是Y或S

<400>591

Ser Ile Tyr Pro Xaa Tyr Gly Xaa Thr Xaa Tyr Ala Asp Ser Lys Val

1 5 10 15

Gly

<210>592

<211>16

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的CDRH3

<220>

<221>M是C_FEATURE

<222>(1)..(1)

<223>X是Y，S或R

<220>

<221>M是C_FEATURE

<222>(2)..(2)

<223>X是Y或S

<220>

<221>M是C_FEATURE

<222>(3)..(3)

<223>X是G，Y或S

<220>

<221>M是C_FEATURE

<222>(4)..(4)

<223>X是Y，S，R或G

<220>

<221>M是C_FEATURE

<222>(10)..(10)

<223>X是Y，S或G

<220>

<221>M是C_FEATURE

<222>(12)..(12)

<223>X是Y，S，G或R

<220>

<221>M是C_FEATURE

<222>(13)..(13)

<223>X是G或A

<220>

<221>M是C_FEATURE

<222>(14)..(14)

<223>X是M，I，F或L

<400>592

Xaa Xaa Xaa Xaa Tyr Tyr Ser Tyr Tyr Xaa Gly Xaa Xaa Xaa Asp Tyr

1 5 10 15

<210>593

<211>10

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的CDRH2

<220>

<221>M是C_FEATURE

<222>(3)..(3)

<223>X是Y或S

<400>593

Gly Phe Xaa Ile Ser Ser Ser Ser Ile His

1 5 10

<210>594

<211>17

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的CDRH2

<220>

<221>M是C_FEATURE

<222>(1)..(1)

<223>X独立地是Y或S

<220>

<221>M是C_FEATURE

<222>(3)..(3)

<223>X独立地是Y或S

<220>

<221>M是C_FEATURE

<222>(10)..(10)

<223>X独立地是Y或S

<400>594

Xaa Ile Xaa Pro Ser Ser Gly Tyr Thr Xaa Tyr Ala Asp Ser Lys Val

1 5 10 15

Gly

<210>595

<211>184

<212>PRT

<213>人(homo sapiens)

<400>595

Met Ser Ala Leu Leu Ile Leu Ala Leu Val Gly Ala Ala Val Ala Asp

1 5 10 15

Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Leu Ser Ala Leu Ile Thr Gln Gln Asp

20 25 30

Leu Ala Pro Gln Gln Arg Val Ala Pro Gln Gln Lys Arg Ser Ser Pro

35 40 45

Ser Glu Gly Leu Cys Pro Pro Gly His His Ile Ser Glu Asp Gly Arg

50 55 60

Asp Cys Ile Ser Cys Lys Tyr Gly Gln Asp Tyr Ser Thr His Trp Asn

65 70 75 80

Asp Leu Leu Phe Cys Leu Arg Cys Thr Arg Cys Asp Ser Gly Glu Val

85 90 95

Glu Leu Ser Pro Cys Thr Thr Thr Arg Asn Thr Val Cys Gln Cys Glu

100 105 110

Glu Gly Thr Phe Arg Glu Glu Asp Ser Pro Glu Met Cys Arg Lys Cys

115 120 125

Arg Thr Gly Cys Pro Arg Gly Met Val Lys Val Gly Asp Cys Thr Pro

130 135 140

Trp Ser Asp Ile Glu Cys Val His Lys Glu Ser Gly Thr Lys His Ser

145 150 155 160

Gly Glu Ala Pro Ala Val Glu Glu Thr Val Thr Ser Ser Pro Gly Thr

165 170 175

Pro Ala Ser Pro Cys Ser Leu Ser

180

<210>596

<211>17

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的CDRH3

<220>

<221>M是C_FEATURE

<222>(3)..(3)

<223>X是Y，S，R，P或G

<220>

<221>M是C_FEATURE

<222>(8)..(8)

<223>X是R，Y或S

<220>

<221>M是C_FEATURE

<222>(9)..(9)

<223>X是G，Y或S

<220>

<221>M是C_FEATURE

<222>(10)..(10)

<223>X是S，Y或R

<220>

<221>M是C_FEATURE

<222>(14)..(14)

<223>X是G或A

<220>

<221>M是C_FEATURE

<222>(15)..(15)

<223>X是L或F

<400>596

Tyr Arg Xaa Tyr Arg Tyr Gly Xaa Xaa Xaa Gly Ser Tyr Xaa Xaa Asp

1 5 10 15

Tyr

<210>597

<211>9

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的CDRL3

<220>

<221>M是C_FEATURE

<222>(3)..(3)

<223>X独立地是Y或S

<220>

<221>M是C_FEATURE

<222>(4)..(4)

<223>X独立地是Y或S

<220>

<221>M是C_FEATURE

<222>(5)..(5)

<223>X独立地是Y或S

<400>597

Gln Gln Xaa Xaa Xaa Ser Pro Ser Thr

1 5

<210>598

<211>10

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的CDRH1

<220>

<221>M是C_FEATURE

<222>(3)..(3)

<223>X独立地是Y或S

<220>

<221>M是C_FEATURE

<222>(5)..(5)

<223>X独立地是Y或S

<400>598

Gly Phe Xaa Ile Xaa Ser Ser Ser Ile His

1 5 10

<210>599

<211>17

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的CDRH2

<220>

<221>M是C_FEATURE

<222>(1)..(1)

<223>X独立地是Y或S

<220>

<221>M是C_FEATURE

<222>(5)..(5)

<223>X独立地是Y或S

<220>

<221>M是C_FEATURE

<222>(6)..(6)

<223>X独立地是Y或S

<220>

<221>M是C_FEATURE

<222>(10)..(10)

<223>X独立地是y或S

<400>599

Xaa Ile Ser Pro Xaa Xaa Gly Tyr Thr Xaa Tyr Ala Asp Ser Lys Val

1 5 10 15

Gly

<210>600

<211>7

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的BDF1C DRH1

<400>600

Ile Gly Lys Ser Gly Ile His

1 5

<210>601

<211>14

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的BDF1 CDRH2

<400>601

Val Ala Val Ile Tyr Pro His Asp Gly Asn Thr Ala Tyr Ala

1 5 10

<210>602

<211>10

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的BDF1 CDRH3

<400>602

Arg Leu Ala Leu Val Arg Met Trp Met Asp

1 5 10

<210>603

<211>16

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的CDRH3

<400>603

Tyr Ser Ser Tyr Tyr Ser Tyr Tyr Tyr Ser Ser Ser Ser Tyr Ser Tyr

1 5 10 15

<210>604

<211>411

<212>PRT

<213>人(homo sapiens)

<400>604

Met Glu Gln Arg Gly Gln Asn Ala Pro Ala Ala Ser Gly Ala Arg Lys

1 5 10 15

Arg His Gly Pro Gly Pro Arg Glu Ala Arg Gly Ala Arg Pro Gly Leu

20 25 30

Arg Val Pro Lys Thr Leu Val Leu Val Val Ala Ala Val Leu Leu Leu

35 40 45

Val Ser Ala Glu Ser Ala Leu Ile Thr Gln Gln Asp Leu Ala Pro Gln

50 55 60

Gln Arg Ala Ala Pro Gln Gln Lys Arg Ser Ser Pro Ser Glu Gly Leu

65 70 75 80

Cys Pro Pro Gly His His Ile Ser Glu Asp Gly Arg Asp Cys Ile Ser

85 90 95

Cys Lys Tyr Gly Gln Asp Tyr Ser Thr His Trp Asn Asp Leu Leu Phe

100 105 110

Cys Leu Arg Cys Thr Arg Cys Asp Ser Gly Glu Val Glu Leu Ser Pro

115 120 125

Cys Thr Thr Thr Arg Ash Thr Val Cys Gln Cys Glu Glu Gly Thr Phe

130 135 140

Arg Glu Glu Asp Ser Pro Glu Met Cys Arg Lys Cys Arg Thr Gly Cys

145 150 155 160

Pro Arg Gly Met Val Lys Val Gly Asp Cys Thr Pro Trp Ser Asp Ile

165 170 175

Glu Cys Val His Lys Glu Ser Gly Ile Ile Ile Gly Val Thr Val Ala

180 185 190

Ala Val Val Leu Ile Val Ala Val Phe Val Cys Lys Ser Leu Leu Trp

195 200 205

Lys Lys Val Leu Pro Tyr Leu Lys Gly Ile Cys Ser Gly Gly Gly Gly

210 215 220

Asp Pro Glu Arg Val Asp Arg Ser Ser Gln Arg Pro Gly Ala Glu Asp

225 230 235 240

Asn Val Leu Asn Glu Ile Val Ser Ile Leu Gln Pro Thr Gln Val Pro

245 250 255

Glu Gln Glu Met Glu Val Gln Glu Pr0Ala Glu Pro Thr G ly Val Asn

260 265 270

Met Leu Ser Pro Gly Glu Ser Glu His Leu Leu Glu Pro Ala Glu Ala

275 280 285

Glu Arg Ser Gln Arg Arg Arg Leu Leu Val Pro Ala Asn Glu Gly Asp

290 295 300

Pro Thr Glu Thr Leu Arg Gln Cys Phe Asp Asp Phe Ala Asp Leu Val

305 310 315 320

Pro Phe Asp Ser Trp Glu Pro Leu Met Arg Lys Leu Gly Leu Met Asp

325 330 335

Asn Glu Ile Lys Val Ala Lys Ala Glu Ala Ala Gly His Arg Asp Thr

340 345 350

Leu Tyr Thr Met Leu Ile Lys Trp Val Asn Lys Thr Gly Arg Asp Ala

355 360 365

Ser Val His Thr Leu Leu Asp Ala Leu Glu Thr Leu Gly Glu Arg Leu

370 375 380

Ala Lys Gln Lys Ile Glu Asp His Leu Leu Ser Ser Gly Lys Phe Met

385 390 395 400

Tyr Leu Glu Gly Asn Ala Asp Ser Ala Leu Ser

405 410

<210>605

<211>120

<212>PRT

<213>小鼠(Mus musculus)

<400>605

Gly Leu Gln Arg Pro Glu Glu Ser Pro Ser Arg Gly Pro Cys Leu Ala

1 5 10 15

Gly Gln Tyr Leu Ser Glu Gly Asn Cys Lys Pro Cys Arg Glu Gly Ile

20 25 30

Asp Tyr Thr Ser His Ser Asn His Ser Leu Asp Ser Cys Ile Leu Cys

35 40 45

Thr Val Cys Lys Glu Asp Lys Val Val Glu Thr Arg Cys Asn Ile Thr

50 55 60

Thr Asn Thr Val Cys Arg Cys Lys Pro Gly Thr Phe Glu Asp Lys Asp

65 70 75 80

Ser Pro Glu Ile Cys Gln Ser Cys Ser Asn Cys Thr Asp Gly Glu Glu

85 90 95

Glu Leu Thr Ser Cys Thr Pro Arg Glu Ash Arg Lys Cys Val Ser Lys

100 105 110

Thr Ala Trp Ala Ser Trp His Lys

115 120

<210>606

<211>281

<212>PRT

<213>人(homo sapiens)

<400>606

Met Ala Met Met Glu Val Gln Gly Gly Pro Ser Leu Gly Gln Thr Cys

1 5 10 15

Val Leu Ile Val Ile Phe Thr Val Leu Leu Gln Ser Leu Cys Val Ala

20 25 30

Val Thr Tyr Val Tyr Phe Thr Asn Glu Leu Lys Gln Met Gln Asp Lys

35 40 45

Tyr Ser Lys Ser Gly Ile Ala Cys Phe Leu Lys Glu Asp Asp Ser Tyr

50 55 60

Trp Asp Pro Asn Asp Glu Glu Ser Met Asn Ser Pro Cys Trp Gln Val

65 70 75 80

Lys Trp Gln Leu Arg Gln Leu Val Arg Lys Met Ile Leu Arg Thr Ser

85 90 95

Glu Glu Thr Ile Ser Thr Val Gln Glu Lys Gln Gln Asn Ile Ser Pro

100 105 110

Leu Val Arg Glu Arg Gly Pro Gln Arg Val Ala Ala His Ile Thr Gly

115 120 125

Thr Arg Gly Arg Ser Asn Thr Leu Ser Ser Pro Asn Ser Lys Asn Glu

130 135 140

Lys Ala Leu Gly Arg Lys Ile Asn Ser Trp Glu Ser Ser Arg Ser Gly

145 150 155 160

His Ser Phe Leu Ser Asn Leu His Leu Arg Asn Gly Glu Leu Val Ile

165 170 175

His Glu Lys Gly Phe Tyr Tyr Ile Tyr Ser Gln Thr Tyr Phe Arg Phe

180 185 190

Gln Glu Glu Ile Lys Glu Asn Thr Lys Asn Asp Lys Gln Met Val Gln

195 200 205

Tyr Ile Tyr Lys Tyr Thr Ser Tyr Pro Asp Pro Ile Leu Leu Met Lys

210 215 220

Ser Ala Arg Asn Ser Cys Trp Ser Lys Asp Ala Glu Tyr Gly Leu Tyr

225 230 235 240

Ser Ile Tyr Gln Gly Gly Ile Phe Glu Leu Lys Glu Asn Asp Arg Ile

245 250 255

Phe Val Ser Val Thr Asn Glu His Leu Ile Asp Met Asp His Glu Ala

260 265 270

Ser Phe Phe Gly Ala Phe Leu Val Gly

275 280

<210>607

<211>168

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的Apo-2L

<400>607

Val Arg Glu Arg Gly Pro Gln Arg Val Ala Ala His Ile Thr Gly Thr

1 5 10 15

Arg Gly Arg Ser Asn Thr Leu Ser Ser Pro Asn Ser Lys Asn Glu Lys

20 25 30

Ala Leu Gly Arg Lys Ile Asn Ser Trp Glu Ser Ser Arg Ser Gly His

35 40 45

Ser Phe Leu Ser Asn Leu His Leu Arg Asn Gly Glu Leu Val Ile His

50 55 60

Glu Lys Gly Phe Tyr Tyr Ile Tyr Ser Gln Thr Tyr Phe Arg Phe Gln

65 70 75 80

Glu Glu Ile Lys Glu Asn Thr Lys Asn Asp Lys Gln Met Val Gln Tyr

85 90 95

Ile Tyr Lys Tyr Thr Ser Tyr Pro Asp Pro Ile Leu Leu Met Lys Ser

100 105 110

Ala Arg Asn Ser Cys Trp Ser Lys Asp Ala Glu Tyr Gly Leu Tyr Ser

115 120 125

Ile Tyr Gln Gly Gly Ile Phe Glu Leu Lys Glu Asn Asp Arg Ile Phe

130 135 140

Val Ser Val Thr Asn Glu His Leu Ile Asp Met Asp His Glu Ala Ser

145 150 155 160

Phe Phe Gly Ala Phe Leu Val Gly

165

<210>608

<211>6

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的CDRH3

<220>

<221>M是C_FEATURE

<222>(1)..(3)

<223>X是任何氨基酸，但除外半胱氨酸

<220>

<221>M是C_FEATURE

<222>(4)..(4)

<223>X是任何氨基酸，但除外半胱氨酸并且长度可以变化

<220>

<221>M是C_FEATURE

<222>(5)..(6)

<223>X是任何氨基酸，但除外半胱氨酸

<400>608

Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa

1 5

<210>609

<211>9

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的CDRL3

<220>

<221>M是C_FEATURE

<222>(1)..(5)

<223>X是S或下列之一：Y，W，R或F

<220>

<221>m是c_feature

<222>(6)..(6)

<223>Xaa可以是天然存在的任何氨基酸

<220>

<221>m是c_feature

<222>(8)..(8)

<223>Xaa可以是天然存在的任何氨基酸

<400>609

Gln Gln Xaa Xaa Xaa Xaa Pro Xaa Thr

1 5

<210>610

<211>9

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的CDRL3

<220>

<221>M是C_FEATURE

<222>(1)..(5)

<223>X是任何氨基酸，但除外半胱氨酸

<220>

<221>m是c_feature

<222>(6)..(6)

<223>Xaa可以是天然存在的任何氨基酸

<220>

<221>m是c_feature

<222>(8)..(8)

<223>Xaa可以是天然存在的任何氨基酸

<400>610

Gln Gln Xaa Xaa Xaa Xaa Pro Xaa Thr

1 5

<210>611

<211>19

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的CDRH3

<220>

<221>M是C_FEATURE

<222>(1)..(17)

<223>X是S，如下之一：A，C，F，G，I，L，W，P，R，T，W或Y，或不存在

<220>

<221>M是C_FEATURE

<222>(18)..(18)

<223>X是G或A或不存在

<220>

<221>M是C_FEATURE

<222>(19)..(19)

<223>X是F，L，I或M或不存在

<400>611

Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa

1 5 10 15

Xaa Xaa Xaa

<210>612

<211>10

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的CDRH1

<220>

<221>M是C_FEATURE

<222>(3)..(3)

<223>X是S，如下之一：Y，W，R或F

<220>

<221>M是C_FEATURE

<222>(5)..(8)

<223>X是S，如下之一：Y，W，R或F

<400>612

Gly Phe Xaa Ile Xaa Xaa Xaa Xaa Ile His

1 5 10

<210>613

<211>17

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的CDRH2

<220>

<221>M是C_FEATURE

<222>(1)..(1)

<223>X是S，如下之一：Y，W，R或F

<220>

<221>M是C_FEATURE

<222>(3)..(3)

<223>X是S，如下之一：Y，W，R或F

<220>

<221>M是C_FEATURE

<222>(5)..(6)

<223>X是S，如下之一：Y，W，R或F

<220>

<221>M是C_FEATURE

<222>(8)..(8)

<223>X是S，如下之一：Y，W，R或F

<220>

<221>M是C_FEATURE

<222>(10)..(10)

<223>X是S，如下之一：Y，W，R或F

<400>613

Xaa Ile Xaa Pro Xaa Xaa Gly Xaa Thr Xaa Tyr Ala Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210>614

<211>10

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的CDRH1

<220>

<221>M是C_FEATURE

<222>(1)..(5)

<223>X是任何天然存在的氨基酸，但除外半胱氨酸

<220>

<221>m是c_feature

<222>(6)..(8)

<223>Xaa可以是天然存在的任何氨基酸

<400>614

Gly Phe Xaa Ile Xaa Xaa Xaa Xaa Ile His

1 5 10

<210>615

<211>17

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的CDRH2

<220>

<221>M是C_FEATURE

<222>(1)..(1)

<223>X是任何氨基酸，但除外半胱氨酸

<220>

<221>M是C_FEATURE

<222>(3)..(3)

<223>X是任何氨基酸，但除外半胱氨酸

<220>

<221>M是C_FEATURE

<222>(5)..(6)

<223>X是任何氨基酸，但除外半胱氨酸

<220>

<221>M是C_FEATURE

<222>(8)..(8)

<223>X是任何氨基酸，但除外半胱氨酸

<220>

<221>M是C_FEATURE

<222>(10)..(10)

<223>X是任何氨基酸，但除外半胱氨酸

<400>615

Xaa Ile Xaa Pro Xaa Xaa Gly Xaa Thr Xaa Tyr Ala Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210>616

<211>10

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的CDRH3

<220>

<221>M是C_FEATURE

<222>(1)..(5)

<223>X是任何氨基酸，但除外cystine

<220>

<221>M是C_FEATURE

<222>(6)..(6)

<223>X是任何氨基酸，但除外半胱氨酸，并且长度可以变化

<220>

<221>M是C_FEATURE

<222>(7)..(8)

<223>X是任何氨基酸，但除外半胱氨酸

<400>616

Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Asp Tyr

1 5 10

<210>617

<211>21

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的CDRH3

<220>

<221>M是C_FEATURE

<222>(1)..(1)

<223>X是Y，S，G，R或E

<220>

<221>M是C_FEATURE

<222>(2)..(2)

<223>X是Y，S，G，R，M或A

<220>

<221>M是C_FEATURE

<222>(3)..(3)

<223>X是Y，S，G，R，W或H

<220>

<221>M是C_FEATURE

<222>(4)..(4)

<223>X是Y，S，G，R，F或Q

<220>

<221>M是C_FEATURE

<222>(5)..(5)

<223>X是G，Y，N，A或S

<220>

<221>M是C_FEATURE

<222>(6)..(6)

<223>X是F，M，L，A，R，G，H，W，V，Y或S

<220>

<221>M是C_FEATURE

<222>(7)..(7)

<223>X是M，L，G，A，R，F，Y或S或不存在

<220>

<221>M是C_FEATURE

<222>(8)..(8)

<223>X是M，L，F，I，R，G，P，V，Y或S或不存在

<220>

<221>M是C_FEATURE

<222>(9)..(9)

<223>X是G，Y，R或S或不存在

<220>

<221>M是C_FEATURE

<222>(10)..(10)

<223>X是M，F，G，Y，R或S或不存在

<220>

<221>M是C_FEATURE

<222>(11)..(11)

<223>X是A，G，Y，R或S或不存在

<220>

<221>M是C_FEATURE

<222>(12)..(12)

<223>X是I，M，F，A，G，R，T，Y或S或不存在

<220>

<221>M是C_FEATURE

<222>(13)..(13)

<223>X是F，M，L，G，A，T，Y或S或不存在

<220>

<221>M是C_FEATURE

<222>(14)..(14)

<223>X是L，F，M，I，G，A，T或Y或不存在

<220>

<221>M是C_FEATURE

<222>(15)..(15)

<223>X是M，Y，G，L或R或不存在

<220>

<221>M是C_FEATURE

<222>(16)..(16)

<223>X是Y或G或不存在

<220>

<221>M是C_FEATURE

<222>(17)..(17)

<223>X是R，M或G或不存在

<220>

<221>M是C_FEATURE

<222>(18)..(18)

<223>X是G或A

<220>

<221>M是C_FEATURE

<222>(19)..(19)

<223>X是F，M，L或I

<400>617

Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa

1 5 10 15

Xaa Xaa Xaa Asp Tyr

20

<210>618

<211>48

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>合成的寡核苷酸

<400>618

gcagcttctg gcttctmtat ttmttmttmt tmtatacact gggtgcgt 48

<210>619

<211>60

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>合成的寡核苷酸

<400>619

ctggaatggg ttgcatmtat ttmtccatmt tmtggttmta cttmttatgc cgatagcgtc 60

<210>620

<211>54

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>合成的寡核苷酸

<400>620

acttattact gtcagcaatm ttmttmttmt ccatmtacgt tcggacaggg tacc 54

<210>621

<211>54

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>合成的寡核苷酸

<400>621

gtctattatt gtgctcgckc tkctkctkct gstwtkgact actggggtca agga 54

<210>622

<211>57

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>合成的寡核苷酸

<400>622

gtctattatt gtgctcgckc tkctkctkct kctgstwtkg actactgggg tcaagga 57

<210>623

<211>60

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>合成的寡核苷酸

<400>623

gtctattatt gtgctcgckc tkctkctkct kctkctgstw tkgactactg gggtcaagga 60

<210>624

<211>63

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>合成的寡核苷酸

<400>624

gtctattatt gtgctcgckc tkctkctkct kctkctkctg stwtkgacta ctggggtcaa 60

gga 63

<210>625

<211>66

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>合成的寡核苷酸

<400>625

gtctattatt gtgctcgckc tkctkctkct kctkctkctk ctgstwtkga ctactggggt 60

caagga 66

<210>626

<211>69

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>合成的寡核苷酸

<400>626

gtctattatt gtgctcgckc tkctkctkct kctkctkctk ctkctgstwt kgactactgg 60

ggtcaagga 69

<210>627

<211>72

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>合成的寡核苷酸

<400>627

gtctattatt gtgctcgckc tkctkctkct kctkctkctk ctkctkctgs twtkgactac 60

tggggtcaag ga 72

<210>628

<211>75

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>合成的寡核苷酸

<400>628

gtctattatt gtgctcgckc tkctkctkct kctkctkctk ctkctkctkc tgstwtkgac 60

tactggggtc aagga 75

<210>629

<211>78

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>合成的寡核苷酸

<400>629

gtctattatt gtgctcgckc tkctkctkct kctkctkctk ctkctkctkc tkctg stwtk 60

gactactggg gtcaagga 78

<210>630

<211>81

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>合成的寡核苷酸

<400>630

gtctattatt gtgctcgckc tkctkctkct kctkctkctk ctkctkctkc tkctkctg st 60

wtkgactact ggggtcaagg a 81

<210>631

<211>84

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>合成的寡核苷酸

<400>631

gtctattatt gtgctcgckc tkctkctkct kctkctkctk ctkctkctkc tkctkctkct 60

gstwtkgact actggggtca agga 84

<210>632

<211>87

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>合成的寡核苷酸

<400>632

gtctattatt gtgctcgckc tkctkctkct kctkctkctk ctkctkctkc tkctkctkct 60

kctgstwtkg actactgggg tcaagga 87

<210>633

<211>90

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>合成的寡核苷酸

<400>633

gtctattatt gtgctcgckc tkctkctkct kctkctkctk ctkctkctkc tkctkctkct 60

kctkctgstw tkgactactg gggtcaagga 90

<210>634

<211>93

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>合成的寡核苷酸

<400>634

gtctattatt gtgctcgckc tkctkctkct kctkctkctk ctkctkctkc tkctkctkct 60

kctkctkctg stwtkgacta ctggggtcaa gga 93

<210>635

<211>54

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>合成的寡核苷酸

<400>635

gtctattatt gtgctcgcts ctsctsctsc gstwtkgact actggggtca agga 54

<210>636

<211>57

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>合成的寡核苷酸

<400>636

gtctattatt gtgctcgcts ctsctsctsc tscgstwtkg actactgggg tcaagga 57

<210>637

<211>60

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>合成的寡核苷酸

<400>637

gtctattatt gtgctcgcts ctsctsctsc tsctscgstw tkgactactg gggtcaagga 60

<210>638

<211>63

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>合成的寡核苷酸

<400>638

gtctattatt gtgctcgcts ctsctsctsc tsctsctscg stwtkgacta ctggggtcaa 60

gga 63

<210>639

<211>66

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>合成的寡核苷酸

<400>639

gtctattatt gtgctcgcts ctsctsctsc tsctsctsct scgstwtkga ctactggggt 60

caagga 66

<210>640

<211>69

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>合成的寡核苷酸

<400>640

gtctattatt gtgctcgcts ctsctsctsc tsctsctsct sctscgstwt kgactactgg 60

ggtcaagga 69

<210>641

<211>72

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>合成的寡核苷酸

<400>641

gtctattatt gtgctcgcts ctsctsctsc tsctsctsct sctsctscgs twtkgactac 60

tggggtcaag ga 72

<210>642

<211>75

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>合成的寡核苷酸

<400>642

gtctattatt gtgctcgcts ctsctsctsc tsctsctsct sctsctscts cgstwtkgac 60

tactggggtc aagga 75

<210>643

<211>78

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>合成的寡核苷酸

<400>643

gtctattatt gtgctcgcts ctsctsctsc tsctsctsct sctsctscts ctscgstwtk 60

gactactggg gtcaagga 78

<210>644

<211>81

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>合成的寡核苷酸

<400>644

gtctattatt gtgctcgcts ctsctsctsc tsctsctsct sctsctscts ctsctscgst 60

wtkgactact ggggtcaagg a 81

<210>645

<211>84

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>合成的寡核苷酸

<400>645

gtctattatt gtgctcgcts ctsctsctsc tsctsctsctsct sctscts ctsctsctsc 60

gstwtkgact actggggtca agga 84

<210>646

<211>87

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>合成的寡核苷酸

<400>646

gtctattatt gtgctcgcts ctsctsctsc tsctsctsct sctsctscts ctsctsctsc 60

tscgstwtkg actactgggg tcaagga 87

<210>647

<211>90

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>合成的寡核苷酸

<400>647

gtctattatt gtgctcgcts ctsctsctsc tsctsctsct sctsctscts ctsctsctsc 60

tsctscgstw tkgactactg gggtcaagga 90

<210>648

<211>93

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>合成的寡核苷酸

<400>648

gtctattatt gtgctcgcts ctsctsctsc tsctsctsct sctsctscts ctsctsctsc 60

tsctsctscg stwtkgacta ctggggtcaa gga 93

<210>649

<211>54

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>合成的寡核苷酸

<400>649

gtctattatt gtgctcgcty ctyctyctyc gstwtkgact actggggtca agga 54

<210>650

<211>57

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>合成的寡核苷酸

<400>650

gtctattatt gtgctcgcty ctyctyctyc tycgstwtkg actactgggg tcaagga 57

<210>651

<211>60

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>合成的寡核苷酸

<400>651

gtctattatt gtgctcgcty ctyctyctyc tyctycgstw tkgactactg gggtcaagga 60

<210>652

<211>63

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>合成的寡核苷酸

<400>652

gtctattatt gtgctcgcty ctyctyctyc tyctyctycg stwtkgacta ctggggtcaa 60

gga 63

<210>653

<211>66

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>合成的寡核苷酸

<400>653

gtctattatt gtgctcgcty ctyctyctyc tyctyctyct ycgstwtkga ctactggggt 60

caagga 66

<210>654

<211>69

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>合成的寡核苷酸

<400>654

gtctattatt gtgctcgcty ctyctyctyc tyctyctyct yctycgstwt kgactactgg 60

ggtcaagga 69

<210>655

<211>72

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>合成的寡核苷酸

<400>655

gtctattatt gtgctcgcty ctyctyctyc tyctyctyct yctyctycgs twtkgactac 60

tggggtcaag ga 72

<210>656

<211>75

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>合成的寡核苷酸

<400>656

gtctattatt gtgctcgcty ctyctyctyc tyctyctyct yctyctycty cgstwtkgac 60

tactggggtc aagga 75

<210>657

<211>78

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>合成的寡核苷酸

<400>657

gtctattatt gtgctcgcty ctyctyctyc tyctyctyct yctyctycty ctycgstwtk 60

gactactggg gtcaagga 78

<210>658

<211>81

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>合成的寡核苷酸

<400>658

gtctattatt gtgctcgcty ctyctyctyc tyctyctyct yctyctycty ctyctycgst 60

wtkgactact ggggtcaagg a 81

<210>659

<211>84

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>合成的寡核苷酸

<400>659

gtctattatt gtgctcgcty ctyctyctyc tyctyctyct yctycty ctyctyctyctyc 60

gstwtkgact actggggtca agga 84

<210>660

<211>87

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>合成的寡核苷酸

<400>660

gtctattatt gtgctcgcty ctyctyctyc tyctyctyct yctyctycty ctyctyctyc 60

tycgstwtkg actactgggg tcaagga 87

<210>661

<211>90

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>合成的寡核苷酸

<400>661

gtctattatt gtgctcgcty ctyctyctyc tyctyctyct yctyctycty ctyctyctyc 60

tyctycgstw tkgactactg gggtcaagga 90

<210>662

<211>93

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>合成的寡核苷酸

<400>662

gtctattatt gtgctcgcty ctyctyctyc tyctyctyct yctyctycty ctyctyctyc 60

tyctyctycg stwtkgacta ctggggtcaa gga 93

<210>663

<211>54

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>合成的寡核苷酸

<400>663

gtctattatt gtgctcgcrg crgcrgcrgc gstwtkgact actggggtca agga 54

<210>664

<211>57

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>合成的寡核苷酸

<400>664

gtctattatt gtgctcgcrg crgcrgcrgc rgcgstwtkg actactgggg tcaagga 57

<210>665

<211>60

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>合成的寡核苷酸

<400>665

gtctattatt gtgctcgcrg crgcrgcrgc rgcrgcgstw tkgactactg gggtcaagga 60

<210>666

<211>63

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>合成的寡核苷酸

<400>666

gtctattatt gtgctcgcrg crgcrgcrgc rgcrgcrgcg stwtkgacta ctggggtcaa 60

gga 63

<210>667

<211>66

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>合成的寡核苷酸

<400>667

gtctattatt gtgctcgcrg crgcrgcrgc rgcrgcrgcr gcgstwtkga ctactggggt 60

caagga 66

<210>668

<211>69

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>合成的寡核苷酸

<400>668

gtctattatt gtgctcgcrg crgcrgcrgc rgcrgcrgcr gcrgcgstwt kgactactgg 60

ggtcaagga 69

<210>669

<211>72

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>合成的寡核苷酸

<400>669

gtctattatt gtgctcgcrg crgcrgcrgc rgcrgcrgcr gcrgcrgcgs twtkgactac 60

tggggtcaag ga 72

<210>670

<211>75

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>合成的寡核苷酸

<400>670

gtctattatt gtgctcgcrg crgcrgcrgc rgcrgcrgcr gcrgcrgcrg cgstwtkgac 60

tactggggtc aagga 75

<210>671

<211>78

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>合成的寡核苷酸

<400>671

gtctattatt gtgctcgcrg crgcrgcrgc rgcrgcrgcr gcrgcrgcrg crgcgstwtk 60

gactactggg gtcaagga 78

<210>672

<211>81

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>合成的寡核苷酸

<400>672

gtctattatt gtgctcgcrg crgcrgcrgc rgcrgcrgcr gcrgcrgcrg crgcrgcgst 60

wtkgactact ggggtcaagg a 81

<210>673

<211>84

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>合成的寡核苷酸

<400>673

gtctattatt gtgctcgcrg crgcrgcrgc rgcrgcrgcr gcrgcrgcrg crgcrgcrgc 60

gstwtkgact actggggtca agga 84

<210>674

<211>87

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>合成的寡核苷酸

<400>674

gtctattatt gtgctcgcrg crgcrgcrgc rgcrgcrgcr gcrgcrgcrg crgcrgcrgc 60

rgcgstwtkg actactgggg tcaagga 87

<210>675

<211>90

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>合成的寡核苷酸

<400>675

gtctattatt gtgctcgcrg crgcrgcrgc rgcrgcrgcr gcrgcrgcrg crgcrgcrgc 60

rgcrgcgstw tkgactactg gggtcaagga 90

<210>676

<211>93

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>合成的寡核苷酸

<400>676

gtctattatt gtgctcgcrg crgcrgcrgc rgcrgcrgcr gcrgcrgcrg crgcrgcrgc 60

rgcrgcrgcg stwtkgacta ctggggtcaa gga 93

<210>677

<211>54

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>合成的寡核苷酸

<400>677

gtctattatt gtgctcgcak cakcakcakc gstwtkgact actggggtca agga 54

<210>678

<211>57

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>合成的寡核苷酸

<400>678

gtctattatt gtgctcgcak cakcakcakc akcgstwtkg actactgggg tcaagga 57

<210>679

<211>60

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>合成的寡核苷酸

<400>679

gtctattatt gtgctcgcak cakcakcakc akcakcgstw tkgactactg gggtcaagga 60

<210>680

<211>63

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>合成的寡核苷酸

<400>680

gtctattatt gtgctcgcak cakcakcakc akcakcakcg stwtkgacta ctggggtcaa 60

gga 63

<210>681

<211>66

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>合成的寡核苷酸

<400>681

gtctattatt gtgctcgcak cakcakcakc akcakcakca kcgstwtkga ctactggggt 60

caagga 66

<210>682

<211>69

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>合成的寡核苷酸

<400>682

gtctattatt gtgctcgcak cakcakcakc akcakcakca kcakcgstwt kgactactgg 60

ggtcaagga 69

<210>683

<211>72

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>合成的寡核苷酸

<400>683

gtctattatt gtgctcgcak cakcakcakc akcakcakca kcakcakcgs twtkgactac 60

tggggtcaag ga 72

<210>684

<211>75

<212>DNA

<213>人工的

<220>

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<223>合成的寡核苷酸

<400>759

gtctattatt gtgctcgcas cascascasc ascascasca scascascas cascascasc 60

ascascgstw tkgactactg gggtcaagga 90

<210>760

<211>93

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>合成的寡核苷酸

<400>760

gtctattatt gtgctcgcas cascascasc ascascasca scascascas cascascasc 60

ascaseascg stwtkgacta ctggggtcaa gga 93

<210>761

<211>54

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>合成的寡核苷酸

<400>761

gtctattatt gtgctcgcts gtsgtsgtsg gstwtkgact actggggtca agga 54

<210>762

<211>57

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>合成的寡核苷酸

<400>762

gtctattatt gtgctcgcts gtsgtsgtsg tsggstwtkg actactgggg tcaagga 57

<210>763

<211>60

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>合成的寡核苷酸

<400>763

gtctattatt gtgctcgcts gtsgtsgtsg tsgtsggstw tkgactactg gggtcaagga 60

<210>764

<211>63

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>合成的寡核苷酸

<400>764

gtctattatt gtgctcgcts gtsgtsgtsg tsgtsgtsgg stwtkgacta ctggggtcaa 60

gga 63

<210>765

<211>66

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>合成的寡核苷酸

<400>765

gtctattatt gtgctcgcts gtsgtsgtsg tsgtsgtsgt sggstwtkga ctactggggt 60

caagga 66

<210>766

<211>69

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>合成的寡核苷酸

<400>766

gtctattatt gtgctcgcts gtsgtsgtsg tsgtsgtsgt sgtsggstwt kgactactgg 60

ggtcaagga 69

<210>767

<211>72

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>合成的寡核苷酸

<400>767

gtctattatt gtgctcgcts gtsgtsgtsg tsgtsgtsgt sgtsgtsggs twtkgactac 60

tggggtcaag ga 72

<210>768

<211>75

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>合成的寡核苷酸

<400>768

gtctattatt gtgctcgcts gtsgtsgtsg tsgtsgtsgt sgtsgtsgts ggstwtkgac 60

tactggggtc aagga 75

<210>769

<211>78

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>合成的寡核苷酸

<400>769

gtctattatt gtgctcgcts gtsgtsgtsg tsgtsgtsgt sgtsgtsgts gtsggstwtk 60

gactactggg gtcaagga 78

<210>770

<211>81

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>合成的寡核苷酸

<400>770

gtctattatt gtgctcgcts gtsgtsgtsg tsgtsgtsgt sgtsgtsgts gtsgtsggst 60

wtkgactact ggggtcaagg a 81

<210>771

<211>84

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>合成的寡核苷酸

<400>771

gtctattatt gtgctcgcts gtsgtsgtsg tsgtsgtsgt sgtsgtsgts gtsgtsgtsg 60

gstwtkgact actggggtca agga 84

<210>772

<211>87

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>合成的寡核苷酸

<400>772

gtctattatt gtgctcgcts gtsgtsgtsg tsgtsgtsgtsgt sgtsgtsgt sgtsgtsg 60

tsggstwtkg actactgggg tcaagga 87

<210>773

<211>90

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>合成的寡核苷酸

<400>773

gtctattatt gtgctcgcts gtsgtsgtsg tsgtsgtsgt sgtsgtsgts gtsgtsgtsg 60

tsgtsggstw tkgactactg gggtcaagga 90

<210>774

<211>93

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>合成的寡核苷酸

<400>774

gtctattatt gtgctcgcts gtsgtsgtsg tsgtsgtsgt sgtsgtsgts gtsgtsgtsg 60

tsgtsgtsgg stwtkgacta ctggggtcaa gga 93

<210>775

<211>54

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>合成的寡核苷酸

<400>775

gtctattatt gtgctcgctm ttmttmttmt gstwtkgact actggggtca agga 54

<210>776

<211>57

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>合成的寡核苷酸

<400>776

gtctattatt gtgctcgctm ttmttmttmt tmtgstwtkg actactgggg tcaagga 57

<210>777

<211>60

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>合成的寡核苷酸

<400>777

gtctattatt gtgctcgctm ttmttmttmt tmttmtg stw tkgactactg gggtcaagga 60

<210>778

<211>63

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>合成的寡核苷酸

<400>778

gtctattatt gtgctcgctm ttmttmttmt tmttmttmtg stwtkgacta ctggggtcaa 60

gga 63

<210>779

<211>66

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>合成的寡核苷酸

<400>779

gtctattatt gtgctcgctm ttmttmttmt tmttmttmtt mtgstwtkga ctactggggt 60

caagga 66

<210>780

<211>69

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>合成的寡核苷酸

<400>780

gtctattatt gtgctcgctm ttmttmttmt tmttmttmtt mttmtg stwt kgactactgg 60

ggtcaagga 69

<210>781

<211>72

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>合成的寡核苷酸

<400>781

gtctattatt gtgctcgctm ttmttmttmt tmttmttmtt mttmttmtgs twtkgactac 60

tggggtcaag ga 72

<210>782

<211>75

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>合成的寡核苷酸

<400>782

gtctattatt gtgctcgctm ttmttmttmt tmttmttmtt mttmttmttm tgstwtkgac 60

tactggggtc aagga 75

<210>783

<211>78

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>合成的寡核苷酸

<400>783

gtctattatt gtgctcgctm ttmttmttmt tmttmttmtt mttmttmttm ttmtgstwtk 60

gactactggg gtcaagga 78

<210>784

<211>81

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>合成的寡核苷酸

<400>784

gtctattatt gtgctcgctm ttmttmttmt tmttmttmtt mttmttmttm ttmttmtgst 60

wtkgactact ggggtcaagg a 81

<210>785

<211>84

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>合成的寡核苷酸

<400>785

gtctattatt gtgctcgctm ttmttmttmt tmttmttmtt mttmttmttm ttmttmttmt 60

gstwtkgact actggggtca agga 84

<210>786

<211>87

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>合成的寡核苷酸

<400>786

gtctattatt gtgctcgctm ttmttmmttmmt tmmttmmttmmtt mttmmttmttm ttmmttmmttmmt 60

tmtgstwtkg actactgggg tcaagga 87

<210>787

<211>90

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>合成的寡核苷酸

<400>787

gtctattatt gtgctcgctm ttmttmttmt tmttmttmtt mttmttmttm ttmttmttmt 60

tmttmtgstw tkgactactg gggtcaagga 90

<210>788

<211>93

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>合成的寡核苷酸

<400>788

gtctattatt gtgctcgctm ttmttmttmt tmttmttmtt mttmttmttm ttmttmttmt 60

tmttmttmtg stwtkgacta ctggggtcaa gga 93

<210>789

<211>9

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的CDRL3

<400>789

Gln Gln Ser Tyr Tyr Ser Pro Ser Thr

1 5

<210>790

<211>9

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的CDRL3

<400>790

Gln Gln Ser Tyr Tyr Ser Pro Ser Thr

1 5

<210>791

<211>9

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的CDRL3

<400>791

Gln Gln Ser Tyr Tyr Tyr Pro Ser Thr

1 5

<210>792

<211>9

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的CDRL3

<400>792

Gln Gln Ser Tyr Tyr Ser Pro Ser Thr

1 5

<210>793

<211>9

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的CDRL3

<400>793

Gln Gln Ser Tyr Tyr Ser Pro Ser Thr

1 5

<210>794

<211>9

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的CDRL3

<400>794

Gln Gln Tyr Tyr Tyr Ser Pro Ser Thr

1 5

<210>795

<211>9

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的CDRL3

<400>795

Gln Gln Ser Tyr Tyr Tyr Pro Ser Thr

1 5

<210>796

<211>9

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的CDRL3

<400>796

Gln Gln Ser Tyr Tyr Tyr Pro Ser Thr

1 5

<210>797

<211>9

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的CDRL3

<400>797

Gln Gln Ser Tyr Tyr Ser Pro Ser Thr

1 5

<210>798

<211>9

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的CDRL3

<400>798

Gln Gln Ser Tyr Tyr Ser Pro Ser Thr

1 5

<210>799

<211>9

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的CDRL3

<400>799

Gln Gln Ser Tyr Tyr Tyr Pro Ser Thr

1 5

<210>800

<211>9

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的CDRL3

<400>800

Gln Gln Tyr Tyr Tyr Ser Pro Ser Thr

1 5

<210>801

<211>9

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的CDRL3

<400>801

Gln Gln Ser Tyr Tyr Tyr Pro Ser Thr

1 5

<210>802

<211>9

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的CDRL3

<400>802

Gln Gln Tyr Tyr Tyr Tyr Pro Tyr Thr

1 5

<210>803

<211>9

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的CDRL3

<400>803

Gln Gln Ser Tyr Tyr Ser Pro Ser Thr

1 5

<210>804

<211>9

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的CDRL3

<400>804

Gln Gln Tyr Tyr Tyr Tyr Pro Ser Thr

1 5

<210>805

<211>9

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的CDRL3

<400>805

Gln Gln Ser Tyr Tyr Tyr Pro Ser Thr

1 5

<210>806

<211>9

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的CDRL3

<400>806

Gln Gln Tyr Tyr Tyr Ser Pro Ser Thr

1 5

<210>807

<211>9

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的CDRL3

<400>807

Gln Gln Ser Tyr Tyr Ser Pro Ser Thr

1 5

<210>808

<211>9

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的CDRL3

<400>808

Gln Gln Tyr Tyr Tyr Ser Pro Ser Thr

1 5

<210>809

<211>9

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的CDRL3

<400>809

Gln Gln Ser Tyr Tyr Tyr Pro Ser Thr

1 5

<210>810

<211>9

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的CDRL3

<400>810

Gln Gln Ser Tyr Tyr Ser Pro Ser Thr

1 5

<210>811

<211>9

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的CDRL3

<400>811

Gln Gln Ser Tyr Tyr Ser Pro Ser Thr

1 5

<210>812

<211>9

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的CDRL3

<400>812

Gln Gln Tyr Ser Tyr Tyr Pro Tyr Thr

1 5

<210>813

<211>9

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的CDRL3

<400>813

Gln Gln Tyr Ser Ser Tyr Pro Tyr Thr

1 5

<210>814

<211>9

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的CDRL3

<400>814

Gln Gln Tyr Ser Tyr Tyr Pro Tyr Thr

1 5

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<211>9

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的CDRL3

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Gln Gln Ser Tyr Ser Ser Pro Tyr Thr

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<211>10

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的CDRH1

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Gly Phe Tyr Ile Ser Ser Ser Tyr Ile His

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<211>10

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的CDRH1

<400>817

Gly Phe Tyr Ile Ser Ser Ser Tyr Ile His

1 5 10

<210>818

<211>10

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的CDRH1

<400>818

Gly Phe Ser Ile Ser Ser Ser Tyr Ile His

1 5 10

<210>819

<211>10

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的CDRH1

<400>819

Gly Phe Ser Ile Ser Tyr Ser Tyr Ile His

1 5 10

<210>820

<211>10

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的CDRH1

<400>820

Gly Phe Ser Ile Ser Ser Ser Tyr Ile His

1 5 10

<210>821

<211>10

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的CDRH1

<400>821

Gly Phe Ser Ile Tyr Ser Ser Tyr Ile His

1 5 10

<210>822

<211>10

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的CDRH1

<400>822

Gly Phe Ser Ile Ser Tyr Ser Tyr Ile His

1 5 10

<210>823

<211>10

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的CDRH1

<400>823

Gly Phe Ser Ile Ser Ser Ser Tyr Ile His

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<210>824

<211>10

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的CDRH1

<400>824

Gly Phe Ser Ile Tyr Tyr Ser Tyr Ile His

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<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的CDRH1

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Gly Phe Ser Ile Tyr Tyr Ser Tyr Ile His

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<212>PRT

<213>人工的

<220>

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Gly Phe Ser Ile Tyr Ser Ser Tyr Ile His

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<211>10

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<213>人工的

<220>

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Gly Phe Ser Ile Ser Tyr Ser Tyr Ile His

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<212>PRT

<213>人工的

<220>

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Gly Phe Ser Ile Tyr Tyr Ser Tyr Ile His

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<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的CDRH1

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Gly Phe Ser Ile Ser Ser Ser Tyr Ile His

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<211>10

<212>PRT

<213>人工的

<220>

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Gly Phe Ser Ile Ser Tyr Ser Tyr Ile His

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<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的CDRH1

<400>832

Gly Phe Tyr Ile Tyr Ser Ser Tyr Ile His

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<211>10

<212>PRT

<213>人工的

<220>

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Gly Phe Ser Ile Ser Ser Ser Tyr Ile His

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<212>PRT

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<220>

<223>合成的CDRH1

<400>834

Gly Phe Ser Ile Ser Ser Ser Tyr Ile His

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<211>10

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的CDRH1

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Gly Phe Ser Ile Tyr Ser Ser Tyr Ile His

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<211>10

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的CDRH1

<400>836

Gly Phe Ser Ile Ser Ser Ser Tyr Ile His

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<211>10

<212>PRT

<213>人工的

<220>

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Gly Phe Tyr Ile Ser Tyr Ser Tyr Ile His

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<211>10

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<213>人工的

<220>

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<400>838

Gly Phe Ser Ile Ser Tyr Ser Tyr Ile His

1 5 10

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<211>10

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的CDRH1

<400>839

Gly Phe Ser Ile Ser Tyr Ser Ser Ile His

1 5 10

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<211>10

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的CDRH1

<400>840

Gly Phe Ser Ile Ser Tyr Ser Ser Ile His

1 5 10

<210>841

<211>10

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的CDRH1

<400>841

Gly Phe Ser Ile Ser Tyr Ser Ser Ile His

1 5 10

<210>842

<211>10

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的CDRH1

<400>842

Gly Phe Ser Ile Ser Ser Ser Ser Ile His

1 5 10

<210>843

<211>17

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的CDRH2

<400>843

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1 5 10 15

Gly

<210>844

<211>17

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的CDRH2

<400>844

Ser Ile Tyr Pro Tyr Ser Gly Tyr Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210>845

<211>17

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的CDRH2

<400>845

Ser Ile Tyr Pro Tyr Ser Gly Tyr Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210>846

<211>17

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的CDRH2

<400>846

Ser Ile Tyr Pro Tyr Ser Gly Tyr Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210>847

<211>17

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的CDRH2

<400>847

Ser Ile Tyr Pro Tyr Ser Gly Tyr Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210>848

<211>17

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的CDRH2

<400>848

Ser Ile Tyr Pro Tyr Ser Gly Tyr Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

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<211>17

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的CDRH2

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1 5 10 15

Gly

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<211>17

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的CDRH2

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1 5 10 15

Gly

<210>851

<211>17

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的CDRH2

<400>851

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1 5 10 15

Gly

<210>852

<211>17

<212>PRT

<213>人工的

<220>

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Gly

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<211>17

<212>PRT

<213>人工的

<220>

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Gly

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<212>PRT

<213>人工的

<220>

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Gly

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<211>17

<212>PRT

<213>人工的

<220>

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Gly

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<220>

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Gly

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<211>17

<212>PRT

<213>人工的

<220>

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Gly

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<213>人工的

<220>

<223>合成的CDRH2

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Gly

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<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的CDRH2

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Gly

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<220>

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Gly

<210>861

<211>17

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的CDRH2

<400>861

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1 5 10 15

Gly

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<211>17

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的CDRH2

<400>862

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Gly

<210>863

<211>17

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的CDRH2

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Gly

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<211>17

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的CDRH2

<400>864

Ser Ile Tyr Pro Tyr Ser Gly Tyr Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210>865

<211>17

<212>PRT

<213>人工的

<220>

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Gly

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<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的CDRH2

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Gly

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<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的CDRH2

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Gly

<210>868

<211>17

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的CDRH2

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Ser Ile Tyr Pro Tyr Tyr Gly Tyr Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys

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Gly

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<211>17

<212>PRT

<213>人工的

<220>

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Gly

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<211>8

<212>PRT

<213>人工的

<220>

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<213>人工的

<220>

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<211>8

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<213>人工的

<220>

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<213>人工的

<220>

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<213>人工的

<220>

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<220>

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<213>人工的

<220>

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<213>人工的

<220>

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<213>人工的

<220>

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<212>PRT

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<220>

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<213>人工的

<220>

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<220>

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<213>人工的

<220>

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<211>12

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<213>人工的

<220>

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Phe Ser Phe Ser Ser Ser Ser Phe Ala Ile Asp Tyr

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<211>13

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<213>人工的

<220>

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Phe Phe Phe Phe Ser Ser Ser Phe Phe Gly Phe Asp Tyr

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<211>15

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<213>人工的

<220>

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<212>PRT

<213>人工的

<220>

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<213>人工的

<220>

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<212>PRT

<213>人工的

<220>

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<212>PRT

<213>人工的

<220>

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Gln Gln Trp Trp Trp Trp Pro Trp Thr

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<212>PRT

<213>人工的

<220>

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Gln Gln Trp Trp Trp Trp Pro Ser Thr

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<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的CDRL3

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Gln Gln Ser Trp Trp Trp Pro Ser Thr

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<212>PRT

<213>人工的

<220>

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Gln Gln Trp Trp Trp Trp Pro Ser Thr

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<212>PRT

<213>人工的

<220>

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Gln Gln Trp Trp Trp Trp Pro Ser Thr

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<212>PRT

<213>人工的

<220>

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Gln Gln Trp Trp Trp Trp Pro Ser Thr

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<212>PRT

<213>人工的

<220>

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Gln Gln Trp Ser Trp Trp Pro Ser Thr

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<212>PRT

<213>人工的

<220>

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Gln Gln Trp Ser Ser Trp Pro Ser Thr

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<213>人工的

<220>

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Gln Gln Trp Ser Ser Trp Pro Ser Thr

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<211>9

<212>PRT

<213>人工的

<220>

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Gln Gln Ser Ser Ser Ser Pro Ser Thr

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<211>9

<212>PRT

<213>人工的

<220>

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Gln Gln Trp Ser Trp Ser Pro Ser Thr

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<211>9

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的CDRL3

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Gln Gln Trp Ser Ser Trp Pro Ser Thr

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<211>9

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的CDRL3

<400>912

Gln Gln Trp Ser Ser Trp Pro Ser Thr

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<211>9

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的CDRL3

<400>913

Gln Gln Ser Tyr Tyr Ser Pro Ser Thr

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<212>PRT

<213>人工的

<220>

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Gln Gln Tyr Tyr Tyr Ser Pro Ser Thr

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<211>9

<212>PRT

<213>人工的

<220>

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Gln Gln Ser Tyr Tyr Tyr Pro Ser Thr

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<211>9

<212>PRT

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<220>

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<400>916

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<211>9

<212>PRT

<213>人工的

<220>

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Gln Gln Ser Tyr Tyr Tyr Pro Ser Thr

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<211>9

<212>PRT

<213>人工的

<220>

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Gln Gln Ser Tyr Tyr Tyr Pro Ser Thr

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<211>9

<212>PRT

<213>人工的

<220>

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Gln Gln Ser Tyr Tyr Ser Pro Ser Thr

1 5

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<211>9

<212>PRT

<213>人工的

<220>

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<400>920

Gln Gln Ser Ser Ser Ser Pro Ser Thr

1 5

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<211>9

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的CDRL3

<400>921

Gln Gln Ser Tyr Ser Tyr Pro Tyr Thr

1 5

<210>922

<211>9

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的CDRL3

<400>922

Gln Gln Tyr Tyr Ser Ser Pro Tyr Thr

1 5

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<211>9

<212>PRT

<213>人工的

<220>

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<400>923

Gln Gln Tyr Tyr Ser Ser Pro Tyr Thr

1 5

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<211>10

<212>PRT

<213>人工的

<220>

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<400>924

Gly Phe Ser Ile Trp Trp Ser Trp Ile His

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<211>10

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的CDRH1

<400>925

Gly Phe Ser Ile Trp Trp Ser Trp Ile His

1 5 10

<210>926

<211>10

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的CDRH1

<400>926

Gly Phe Ser Ile Trp Trp Ser Trp Ile His

1 5 10

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<211>10

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的CDRH1

<400>927

Gly Phe Ser Ile Trp Trp Ser Trp Ile His

1 5 10

<210>928

<211>10

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的CDRH1

<400>928

Gly Phe Ser Ile Trp Ser Ser Trp Ile His

1 5 10

<210>929

<211>10

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的CDRH1

<400>929

Gly Phe Ser Ile Trp Trp Ser Trp Ile His

1 5 10

<210>930

<211>10

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的CDRH1

<400>930

Gly Phe Ser Ile Ser Trp Ser Trp Ile His

1 5 10

<210>931

<211>10

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的CDRH1

<400>931

Gly Phe Ser Ile Trp Trp Ser Trp Ile His

1 5 10

<210>932

<211>10

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的CDRH1

<400>932

Gly Phe Ser Ile Trp Trp Ser Trp Ile His

1 5 10

<210>933

<211>10

<212>PRT

<213>人工的

<220>

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Gly Phe Ser Ile Trp Trp Ser Trp Ile His

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<211>10

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的CDRH1

<400>934

Gly Phe Trp Ile Trp Ser Ser Ser Ile His

1 5 10

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<211>10

<212>PRT

<213>人工的

<220>

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Gly Phe Trp Ile Trp Ser Ser Ser Ile His

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<211>10

<212>PRT

<213>人工的

<220>

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Gly Phe Ser Ile Ser Ser Ser Trp Ile His

1 5 10

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<211>10

<212>PRT

<213>人工的

<220>

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Gly Phe Ser Ile Ser Ser Ser Ser Ile His

1 5 10

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<211>10

<212>PRT

<213>人工的

<220>

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Gly Phe Trp Ile Trp Ser Ser Ser Ile His

1 5 10

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<211>10

<212>PRT

<213>人工的

<220>

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Gly Phe Ser Ile Trp Ser Ser Ser Ile His

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<211>10

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的CDRH1

<400>940

Gly Phe Ser Ile Tyr Ser Tyr Tyr Ile His

1 5 10

<210>941

<211>10

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的CDRH1

<400>941

Gly Phe Tyr Ile Ser Tyr Ser Tyr Ile His

1 5 10

<210>942

<211>10

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的CDRH1

<400>942

Gly Phe Tyr Ile Ser Ser Ser Tyr Ile His

1 5 10

<210>943

<211>10

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的CDRH1

<400>943

Gly Phe Ser Ile Ser Ser Ser Tyr Ile His

1 5 10

<210>944

<211>10

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的CDRH1

<400>944

Gly Phe Ser Ile Ser Ser Ser Tyr Ile His

1 5 10

<210>945

<211>10

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的CDRH1

<400>945

Gly Phe Ser Ile Tyr Ser Ser Tyr Ile His

1 5 10

<210>946

<211>10

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的CDRH1

<400>946

Gly Phe Tyr Ile Ser Ser Ser Tyr Ile His

1 5 10

<210>947

<211>10

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的CDRH1

<400>947

Gly Phe Tyr Ile Ser Tyr Ser Ser Ile His

1 5 10

<210>948

<211>10

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的CDRH1

<400>948

Gly Phe Tyr Ile Ser Ser Ser Ser Ile His

1 5 10

<210>949

<211>10

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的CDRH1

<400>949

Gly Phe Ser Ile Tyr Tyr Ser Ser Ile His

1 5 10

<210>950

<211>10

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的CDRH1

<400>950

Gly Phe Ser Ile Tyr Tyr Ser Ser Ile His

1 5 10

<210>951

<211>17

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的CDRH2

<400>951

Ser Ile Ser Pro Ser Ser Gly Trp Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210>952

<211>17

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的CDRH2

<400>952

Ser Ile Ser Pro Ser Ser Gly Trp Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210>953

<211>17

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的CDRH2

<400>953

Ser Ile Tyr Pro Ser Ser Gly Tyr Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210>954

<211>17

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的CDRH2

<400>954

Ser Ile Ser Pro Ser Ser Gly Trp Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210>955

<211>17

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的CDRH2

<400>955

Ser Ile Ser Pro Ser Ser Gly Trp Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210>956

<211>17

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的CDRH2

<400>956

Ser Ile Ser Pro Ser Ser Gly Trp Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210>957

<211>17

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的CDRH2

<400>957

Ser Ile Trp Pro Ser Ser Gly Trp Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210>958

<211>17

<2l2>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的CDRH2

<400>958

Ser Ile Ser Pro Ser Ser Gly Trp Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210>959

<211>17

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的CDRH2

<400>959

Ser Ile Ser Pro Ser Ser Gly Trp Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210>960

<211>17

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的CDRH2

<400>960

Ser Ile Ser Pro Ser Ser Gly Trp Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210>961

<211>17

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的CDRH2

<400>961

Trp Ile Ser Pro Ser Ser Gly Ser Thr Trp Tyr Ala Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210>962

<211>17

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的CDRH2

<400>962

Trp Ile Ser Pro Ser Ser Gly Ser Thr Trp Tyr Ala Asp Ser Val Lys

l 5 10 15

Gly

<210>963

<211>17

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的CDRH2

<400>963

Trp Ile Trp Pro Ser Ser Gly Trp Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210>964

<211>17

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的CDRH2

<400>964

Trp Ile Ser Pro Ser Trp Gly Ser Thr Trp Tyr Ala Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210>965

<211>17

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的CDRH2

<400>965

Trp Ile Ser Pro Ser Ser Gly Ser Thr Trp Tyr Ala Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210>966

<211>17

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的CDRH2

<400>966

Trp Ile Ser Pro Ser Ser Gly Ser Thr Trp Tyr Ala Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210>967

<211>17

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的CDRH2

<400>967

Ser Ile Tyr Pro Ser Ser Gly Tyr Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210>968

<211>17

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的CDRH2

<400>968

Ser Ile Tyr Pro Tyr Ser Gly Tyr Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210>969

<211>17

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的CDRH2

<400>969

Ser Ile Tyr Pro Tyr Ser Gly Tyr Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210>970

<211>17

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的CDRH2

<400>970

Ser Ile Tyr Pro Tyr Ser Gly Tyr Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210>971

<211>17

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的CDRH2

<400>971

Ser Ile Tyr Pro Tyr Ser Gly Tyr Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210>972

<211>17

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的CDRH2

<400>972

Ser Ile Tyr Pro Tyr Ser Gly Tyr Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210>973

<211>17

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的CDRH2

<400>973

Ser Ile Tyr Pro Tyr Ser Gly Tyr Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210>974

<211>17

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的CDRH2

<400>974

Ser Ile Ser Pro Tyr Ser Gly Tyr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210>975

<211>17

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的CDRH2

<400>975

Tyr Ile Ser Pro Ser Ser Gly Tyr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210>976

<211>17

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的CDRH2

<400>976

Ser Ile Tyr Pro Tyr Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210>977

<211>17

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的CDRH2

<400>977

Ser Ile Tyr Pro Ser Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210>978

<211>8

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的CDRH3

<400>978

Trp Trp Ser Ser Ala Ile Asp Tyr

1 5

<210>979

<211>8

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的CDRH3

<400>979

Trp Trp Ser Ser Ala Leu Asp Tyr

1 5

<210>980

<211>8

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的CDRH3

<400>980

Trp Trp Ser Ser Ala Leu Asp Tyr

1 5

<210>981

<211>8

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的CDRH3

<400>981

Trp Trp Ser Ser Gly Met Asp Tyr

1 5

<210>982

<211>8

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的CDRH3

<400>982

Trp Trp Ser Ser Ala Leu Asp Tyr

1 5

<210>983

<211>8

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的CDRH3

<400>983

Trp Trp Ser Ser Ala Phe Asp Tyr

1 5

<210>984

<211>8

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的CDRH3

<400>984

Trp Trp Ser Ser Ala Leu Asp Tyr

1 5

<210>985

<211>8

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的CDRH3

<400>985

Trp Ser Ser Ser Ala Phe Asp Tyr

1 5

<210>986

<211>8

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的CDRH3

<400>986

Trp Trp Ser Ser Ala Met Asp Tyr

1 5

<210>987

<211>8

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的CDRH3

<400>987

Trp Ser Ser Trp Gly Leu Asp Tyr

1 5

<210>988

<211>12

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的CDRH3

<400>988

Ser Ser Trp Ser Ser Trp Ser Ser Ala Leu Asp Tyr

1 5 10

<210>989

<211>12

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的CDRH3

<400>989

Ser Ser Trp Ser Ser Trp Ser Ser Ala Leu Asp Tyr

1 5 10

<210>990

<211>12

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的CDRH3

<400>990

Ser Ser Ser Ser Ser Trp Trp Ser Ala Ile Asp Tyr

1 5 10

<210>991

<211>12

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的CDRH3

<400>991

Ser Ser Trp Ser Ser Trp Ser Trp Ala Leu Asp Tyr

1 5 10

<210>992

<211>12

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的CDRH3

<400>992

Ser Ser Trp Ser Ser Trp Ser Ser Ala Met Asp Tyr

1 5 10

<210>993

<211>12

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的CDRH3

<400>993

Ser Ser Trp Ser Ser Trp Ser Ser Ala Met Asp Tyr

1 5 10

<210>994

<211>8

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的CDRH3

<400>994

Tyr Tyr Ser Tyr Ala Leu Asp Tyr

1 5

<210>995

<211>8

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的CDRH3

<400>995

Tyr Tyr Ser Tyr Ala Phe Asp Tyr

1 5

<210>996

<211>8

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的CDRH3

<400>996

Tyr Tyr Ser Tyr Ala Phe Asp Tyr

1 5

<210>997

<211>8

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的CDRH3

<400>997

Tyr Tyr Ser Ser Ala Phe Asp Tyr

1 5

<210>998

<211>8

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的CDRH3

<400>998

Tyr Tyr Ser Tyr Ala Leu Asp Tyr

1 5

<210>999

<211>8

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的CDRH3

<400>999

Tyr Tyr Ser Tyr Ala Phe Asp Tyr

1 5

<210>1000

<211>8

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的CDRH3

<400>1000

Tyr Tyr Ser Tyr Ala Leu Asp Tyr

1 5

<210>1001

<211>14

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的CDRH3

<400>1001

Ser Ser Tyr Ser Tyr Tyr Tyr Tyr Ser Tyr Ala Leu Asp Tyr

1 5 10

<210>1002

<211>15

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的CDRH3

<400>1002

Tyr Tyr Ser Ser Tyr Tyr Ser Tyr Tyr Ser Tyr Ala Leu Asp Tyr

1 5 10 15

<210>1003

<211>18

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的CDRH3

<400>1003

Tyr Tyr Ser Ser Tyr Ser Ser Ser Ser Ser Tyr Tyr Tyr Tyr Ala Phe

1 5 10 15

Asp Tyr

<210>1004

<211>19

<212>PRT

<213>人工的

<20>

<223>合成的CDRH3

<400>1004

Tyr Tyr Ser Ser Ser Ser Ser Tyr Ser Ser Ser Tyr Tyr Tyr Tyr Ala

1 5 10 15

Phe Asp Tyr

<210>1005

<211>48

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>合成的寡核苷酸

<400>1005

gcagcttctg gcttctycat ttyctyctyc tycatacact gggtgcgt 48

<210>1006

<211>60

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>合成的寡核苷酸

<400>1006

ctggaatggg ttgcatycat ttycccatyc tycggttyca cttyctatgc cgatagcgtc 60

<210>1007

<211>54

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>合成的寡核苷酸

<400>1007

acttattact gtcagcaaty ctyctyctyc ccatycacgt tcggacaggg tacc 54

<210>1008

<211>48

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>合成的寡核苷酸

<400>1008

gcagcttctg gcttcmgcat tmgcmgcmgc mgcatacact gggtgcgt 48

<210>1009

<211>60

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>合成的寡核苷酸

<400>1009

ctggaatggg ttgcamgcat tmgcccamgc mgcggtmgca ctmgctatgc cgatagcgtc 60

<210>1010

<211>54

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>合成的寡核苷酸

<400>1010

acttattact gtcagcaamg cmgcmgcmgc ccamgcacgt tcggacaggg tacc 54

<210>1011

<211>48

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>合成的寡核苷酸

<400>1011

gcagcttctg gcttctsgat ttsgtsgtsg tsgatacact gggtgcgt 48

<210>1012

<211>60

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>合成的寡核苷酸

<400>1012

ctggaatggg ttgcatsgat ttsgccatsg tsgggttsga cttsgtatgc cgatagcgtc 60

<210>1013

<211>54

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>合成的寡核苷酸

<400>1013

acttattact gtcagcaats gtsgtsgtsg ccatsgacgt tcggacaggg tacc 54

Claims

1.选择结合特定靶标抗原的多肽的方法，所述方法包括：

(A)制备包含大量多肽的组合物，其中所述多肽包含免疫球蛋白重链可变域和免疫球蛋白轻链可变域，其中：

(i)CDRH1如氨基酸序列G-F-X1-I-X2-X3-X4-X5-I-H(SEQ ID NO：22)所示，其中依照Kabat编号体系，G是位置26且X1是位置28；其中X1选自S和Y；其中X2选自Y和S；其中X3选自Y和S；其中X4选自Y和S；且其中X5选自Y和S；

(ii)CDRH2如氨基酸序列X1-I-X2-P-X3-X4-G-X5-T-X6-Y-A-D-S-V-K-G(SEQ ID NO：23)所示，其中依照Kabat编号体系，X1是位置50；其中X1选自Y和S；其中X2选自Y和S；其中X3选自Y和S；其中X4选自Y和S；其中X5选自Y和S；且其中X6选自Y和S；

(iii)CDRH3

(a)如氨基酸序列X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13-X14-X15-X16-X17-X18-X19-D-Y(SEQ ID NO：24)所示，其中依照Kabat编号体系，X1是位置95，且其中X1-X6各个位置上的氨基酸以摩尔比50％、25％和25％选自Y、S和G；其中X7-X17各个位置上的氨基酸以摩尔比50％、25％和25％选自Y、S和G，或不存在；其中X18选自G和A；且其中X19选自I、M、L和F；

(b)如氨基酸序列X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13-X14-X15-X16-X17-X18-X19-D-Y(SEQ ID NO：26)所示，其中依照Kabat编号体系，X1是位置95，且其中X1-X6各个位置上的氨基酸以摩尔比25％、50％和25％选自Y、S和R；其中X7-X17各个位置上的氨基酸以摩尔比25％、50％和25％选自Y、S和R，或不存在；其中X18选自G和A；且其中X19选自I、M、L和F；

(c)如氨基酸序列X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13-X14-X15-X16-X17-X18-X19-D-Y(SEQ ID NO：27)所示，其中依照Kabat编号体系，X1是位置95，且其中X1-X6各个位置上的氨基酸以摩尔比38％、25％、25％和12％选自Y、S、G和R；其中X7-X17各个位置上的氨基酸以摩尔比38％、25％、25％和12％选自Y、S、G和R，或不存在；其中X18选自G和A；且其中X19选自I、M、L和F；

(d)如氨基酸序列X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13-X14-X15-X16-X17-X18-X19-D-Y(SEQ ID NO：28)所示，其中依照Kabat编号体系，X1是位置95，且其中X1-X6各个位置上的氨基酸以摩尔比20％、26％、26％、13％、1％、1％、1％、1％、1％、1％、1％、1％、1％、1％、1％、1％、1％、1％和1％选自Y、S、G、R、A、D、E、F、H、I、K、L、M、N、P、Q、T、V和W；其中X7-X17各个位置上的氨基酸以摩尔比20％、26％、26％、13％、1％、1％、1％、1％、1％、1％、1％、1％、1％、1％、1％、1％、1％、1％和1％选自Y、S、G、R、A、D、E、F、H、I、K、L、M、N、P、Q、T、V和W，或不存在；其中X18选自G和A；且其中X19选自I、M、L和F；或

(e)如氨基酸序列X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13-X14-X15-X16-X17-X18-X19所示，其中依照Kabat编号体系，X1是位置95，且其中X1-X17各个位置上的氨基酸选自S，以及A、C、F、G、I、L、N、P、R、T、W或Y之一，或不存在；其中X18选自G和A；且其中X19选自F、L、I和M；

(iv)CDRL1如氨基酸序列RASQDVNTAVA(SEQ ID NO：29)所示；

(v)CDRL2如氨基酸序列SASSLYS(SEQ ID NO：30)所示；且

(vi)CDRL3如氨基酸序列Q-Q-X1-X2-X3-X4-P-X5-T(SEQ ID NO：25)所示；其中X1是位置91且选自Y、H和S；X2选自Y和S；X3选自Y、S和T；X4选自Y、S和T；且X5选自S、P和Y；

(B)从所述组合物中选择一种或多种结合靶标抗原的多肽；

(C)将一种或多种结合靶标抗原的多肽与不结合靶标抗原的多肽分离开；并

(D)鉴定一种或多种对靶标抗原具有期望亲和力的结合靶标抗原的多肽，其中所述靶标抗原是HER2。

2.依照权利要求1的方法，其中所述多肽为抗体。

3.依照权利要求1的方法，该方法包括提供包含大量多肽的文库，其中所述文库包含至少1x10⁴种不同多肽。

4.依照权利要求2的方法，该方法包括提供包含大量多肽的文库，其中所述文库包含至少1x10⁴种不同多肽。

5.依照权利要求3的方法，其中所述文库包含至少1x10⁵种不同多肽。

6.依照权利要求4的方法，其中所述文库包含至少1x10⁵种不同多肽。

7.依照权利要求5的方法，其中所述文库包含至少1x10⁶种不同多肽。

8.依照权利要求6的方法，其中所述文库包含至少1x10⁶种不同多肽。

9.依照权利要求7的方法，其中所述文库包含至少1x10⁷种不同多肽。

10.依照权利要求8的方法，其中所述文库包含至少1x10⁷种不同多肽。

11.依照权利要求9的方法，其中所述文库包含至少1x10⁸种不同多肽。

12.依照权利要求10的方法，其中所述文库包含至少1x10⁸种不同多肽。

13.依照权利要求1-12任一项的方法，该方法包括构建展示大量多肽的噬菌体颗粒文库或构建展示大量多肽的噬菌粒颗粒文库；使所述颗粒文库与靶标抗原接触；并将结合靶标抗原的颗粒与不结合靶标抗原的颗粒分开。

14.依照权利要求1-12任一项的方法，该方法包括：

(a)在适合结合的条件下，使包含大量多肽的文库与被固定的靶标抗原接触，分离一种或多种特异性结合靶标抗原的多肽；并

(b)将一种或多种特异性结合靶标抗原的多肽与不特异性结合靶标抗原的多肽分离开，收集一种或多种特异性结合靶标抗原的多肽，获得富含一种或多种特异性结合靶标抗原的多肽的亚组。

15.依照权利要求13的方法，该方法包括：

16.依照权利要求14的方法，该方法进一步包括：

(c)至少重复步骤(a)-(b)两次，每次重复使用从前一轮选择中获得的富含一种或多种特异性结合靶标抗原的多肽的亚组。

17.依照权利要求15的方法，该方法进一步包括：