CN102143977B - 多特异性抗体 - Google Patents

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Abstract

本发明提供多特异性抗体和制备以及使用此类抗体的方法。

Description

多特异性抗体
发明领域
本发明涉及多特异性抗体，以及制备和使用此类抗体的方法。
发明背景
抗体是脊椎动物免疫系统应答异源蛋白、糖蛋白、细胞或其它抗原性异物的攻击产生的特异性免疫球蛋白多肽。这一过程的重要部分是产生特异性结合至特定异物的抗体。此类多肽对特定抗原的结合特异性是高度精制的，个体脊椎动物能够产生的特异性众多，在其复杂性和变异性方面是显著的。成千上万的抗原能够激发应答，每种应答几乎唯一地指向激发该应答的特定抗原。
特异性抗原识别对抗体在适应性免疫应答中发挥功能是必需的。重链(HC)和轻链(LC)的组合联合在所有脊椎动物抗体库的产生中是保守的。然而，在两条链中存在不对称性。HC可变域(VH)含有显著更高的序列多样性，并且比LC可变域(VL)更经常地贡献抗原决定簇识别。LC在确定抗原特异性中的作用通过称为受体编辑的过程显示。VL基因进行性重组以编辑B细胞受体，这是纠正自身反应性抗体前体的主要机制，该前体似乎构成初始库的重要部分(～75％)。证明对轻链的改变将不需要的特异性或多特异性结合清除。
抗体和抗体片段对特定抗原或多种抗原的特异性使得抗体成为理想的治疗剂。抗体和抗体片段可用于靶向特定组织，例如肿瘤，并由此使非特异性靶向的可能副作用最小化。因此，目前存在并且持续存在鉴定和表征治疗性抗体，特别是在治疗癌症和其它增殖性病症中有用的抗体、片段及其衍生物的需要。
发明概述
本发明提供分离的抗体，其包含高变区(HVR)L1序列，该(HVR)L1序列包含序列NIAKTISGY(SEQ ID NO：1)，其中该抗体特异性结合人表皮生长因子受体2(HER2)和血管内皮生长因子(VEGF)。在一个实施方案中，该抗体还包含：包含序列WGSFLY(SEQ ID NO：2)的HVR-L2和/或包含序列HYSSPP(SEQ ID NO：3)的HVR-L3。在另一个实施方案中，该抗体还包含一条、两条、或三条HVR序列，该HVR序列选自(i)HVR-H1，其包含序列NIKDTY(SEQ ID NO：4)；(ii)HVR-H2，其包含序列RIYPTNGYTR(SEQ ID NO：5)；和(iii)HVR-H3，其包含序列WGGDGFYAMD(SEQ IDNO：6)。在另一个实施方案中，该抗体还包含一条、两条、或三条HVR序列，该HVR序列选自(i)HVR-H1，其包含序列NISGTY(SEQ ID NO：7)；(ii)HVR-H2，其包含序列RIYPSEGYTR(SEQ ID NO：8)；和(iii)HVR-H3，其包含序列WVGVGFYAMD(SEQ ID NO：9)。
另一方面，本发明的特征是一种分离的抗体，其包含HVR-L1序列，该HVR-L1序列包含序列X1IX3X4X5X6X7X8X9Y(SEQ ID NO：83)，其中X1是除天冬氨酸以外的任何氨基酸，X3是除脯氨酸以外的任何氨基酸，X4是除精氨酸以外的任何氨基酸，X5是除丝氨酸以外的任何氨基酸，其中该抗体特异性结合HER2和VEGF。在一个实施方案中，包含序列X1IX3X4X5X6X7X8X9Y(SEQ ID NO：83)的抗体在X1具有天冬酰胺，在X3具有丙氨酸，在X4具有赖氨酸，在X5具有苏氨酸，在X7具有丝氨酸，和/或在X8具有甘氨酸，或其任何组合。在本发明这一方面的多种实施方案中，图57中显示的具有大于1、5、或10的F值的任何HVR-L1残基是这样的残基，该残基优选地维持为与在bH1-44或bH1-81的HVR-L1(SEQ ID NO：1)中同样的位点发现的残基相同的残基。在另外的实施方案中，表14显示的具有大于1的ΔΔG值的任何HVR-L1残基是这样的残基，该残基优选地维持为与在bH1-44或bH1-81的HVR-L1(SEQ ID NO：1)中同样的位点发现的残基相同的残基。在一个实施方案中，该抗体包含HVR-H2序列，该HVR-H2序列包含序列RX2X3X4X5X6X7X8X9R(SEQ IDNO：84)。在一个实施方案中，该抗体还包含：包含序列WGSFLY(SEQ IDNO：2)的HVR-L2和/或包含序列HYSSPP(SEQ ID NO：3)的HVR-L3。在另一个实施方案中，该抗体还包含一条、两条、或三条HVR序列，该HVR序列选自(i)HVR-H1，其包含序列NIKDTY(SEQ ID NO：4)；(ii)HVR-H2，其包含序列RIYPTNGYTR(SEQ ID NO：5)；和(iii)HVR-H3，其包含序列WGGDGFYAMD(SEQ ID NO：6)。在另一个实施方案中，该抗体还包含一条、两条、或三条HVR序列，该HVR序列选自(i)HVR-H1，其包含序列NISGTY(SEQ ID NO：7)；(ii)HVR-H2，其包含序列RIYPSEGYTR(SEQ IDNO：8)；和(iii)HVR-H3，其包含序列WVGVGFYAMD(SEQ ID NO：9)。
另一方面，本发明的特征是一种分离的抗体，其包含HVR-H2序列，该HVR-H2序列包含序列RX2X3X4X5X6X7X8X9R(SEQ ID NO：85)，其中X5是除苏氨酸以外的任何氨基酸并且X6是除天冬酰胺以外的任何氨基酸，并且其中该抗体特异性结合HER2和VEGF。在另一个实施方案中，包含序列RX2X3X4X5X6X7X8X9R(SEQ ID NO：84)的抗体在X8具有酪氨酸。在一个实施方案中，包含序列RX2X3X4X5X6X7X8X9R(SEQ ID NO：84)的抗体在X5具有丝氨酸和/或在X6具有谷氨酸。在这一方面的另一个实施方案中，该抗体还包含一条、两条、或三条HVR序列，该HVR序列选自由下述各项组成的组：HVR-L1，其包含序列NIAKTISGY(SEQ ID NO：1)，HVR-L2，其包含序列WGSFLY(SEQ ID NO：2)，和/或HVR-L3，其包含序列HYSSPP(SEQ ID NO：3)。在本文中描述的任何实施方案中，该抗体还包含，一条或两条HVR序列，该HVR序列选自(i)HVR-H1，其包含序列NIKDTY(SEQ ID NO：4)和(ii)HVR-H3，其包含序列WGGDGFYAMD(SEQ ID NO：6)。在另外一个实施方案中，该抗体还包含，一条或两条HVR序列，该HVR序列选自(i)HVR-H1，其包含序列NISGTY(SEQ ID NO：7)和(ii)HVR-H3，其包含序列WVGVGFYAMD(SEQ ID NO：9)。
在本发明这一方面的多种实施方案中，图57中显示的具有大于1、5、或10的F值的任何HVR-H2残基是这样的残基，该残基优选地维持为与在bH1-44或bH1-81的HVR-H2(分别为SEQ ID NOS：8和5)的同样的位点发现的残基相同的残基。在另外的实施方案中，表14显示的具有大于1的ΔΔG值的任何HVR-H2残基是这样的残基，该残基优选地维持为与在bH1-44或bH1-81的HVR-H2(分别为SEQ ID NOS：8和5)中同样的位点发现的残基相同的残基。
在具体实施方案中，该抗体包含：包含NIAKTISGY(SEQ ID NO：1)的HVR-L1序列；包含WGSFLY(SEQ ID NO：2)的HVR-L2序列；包含HYSSPP(SEQ ID NO：3)的HVR-L3序列；包含NIKDTY(SEQ ID NO：4)的HVR-H1序列；包含RIYPTNGYTR(SEQ ID NO：5)的HVR-H2序列；和包含WGGDGFYAMD(SEQ ID NO：6)的HVR-H3序列，或包含：包含NIAKTISGY(SEQ ID NO：1)的HVR-L1序列；包含WGSFLY(SEQ ID NO：2)的HVR-L2序列；包含HYSSPP(SEQ ID NO：3)的HVR-L3序列；包含NISGTY(SEQ ID NO：7)的HVR-H1序列；包含RIYPSEGYTR(SEQ IDNO：8)的HVR-H2序列；和/或包含WVGVGFYAMD(SEQ ID NO：9)的HVR-H3序列。
在又一个具体实施方案中，该分离的抗体包含HVR-L1、HVR-L2、HVR-L3、HVR-H1、HVR-H2、和HVR-H3，其中每条，按顺序，包含序列NIAKTISGY(SEQ ID NO：1)；WGSFLY(SEQ ID NO：2)；HYSSPP(SEQID NO：3)；NIKDTY(SEQ ID NO：4)；RIYPTNGYTR(SEQ ID NO：5)；和WGGDGFYAMD(SEQ ID NO：6)并且特异性地结合HER2和VEGF。在另一个具体实施方案中，该抗体包含HVR-L1、HVR-L2、HVR-L3、HVR-H1、HVR-H2、和HVR-H3，其中每条，按顺序，包含序列NIAKTISGY(SEQ IDNO：1)；WGSFLY(SEQ ID NO：2)；HYSSPP(SEQ ID NO：3)；NISGTY(SEQID NO：7)；RIYPSEGYTR(SEQ ID NO：8)；和WVGVGFYAMD(SEQ IDNO：9)并且特异性地结合HER2和VEGF。
在本文描述的任何方面的多种实施方案中，该抗体以150nM或更强的Kd结合人和鼠VEGF并且以7nM或更强的Kd结合HER2。在另外的实施方案中，该抗体抑制VEGF诱导的细胞增殖和HER2表达细胞的增殖，相对于对照而言。在一个具体实施方案中，该抗体以36nM或更强的Kd结合人和鼠VEGF并且以1nM或更强的Kd结合HER2。在另外一个实施方案中，该抗体抑制VEGF对VEGFR2的结合。
另一方面，本发明的特征是一种分离的抗体，该抗体以150nM或更强的Kd结合人和鼠VEGF并且以7nM或更强的Kd结合HER2并且其中该抗体抑制VEGF诱导的细胞增殖和HER2表达细胞的增殖，相对于对照而言。在一个实施方案中，该抗体以36nM或更强的Kd结合人和鼠VEGF并且以1nM或更强的Kd结合HER2。
又一方面，本发明提供分离的抗体片段，其以58nM或更强的Kd结合人VEGF并且以6nM或更强的Kd结合HER2，和/或抑制VEGF诱导的细胞增殖和HER2表达细胞的增殖，相对于对照而言。在一个具体实施方案中，该抗体片段以33nM或更强的Kd结合人和鼠VEGF并且以0.7nM或更强的Kd结合HER2。在另一个具体实施方案中，该片段是Fab片段或单链可变片段(scFv)。
在上述描述的任何方面中，该抗体可以是单克隆抗体。在所有上述方面的另一个实施方案中，该抗体可以是IgG抗体。在所有上述方面另外的实施方案中，该抗体的框架序列的至少一部分是人共有框架序列。
另一方面，本发明的特征是本文描述的任何抗体的抗体的片段。抗体片段的一个实施方案是包含HVR-L1序列的片段，该HVR-L1序列包含特异性结合HER2和VEGF的序列NIAKTISGY(SEQ ID NO：1)。在另一个实施方案中，该抗体片段还包含一条或两条HVR序列，该HVR序列选自(i)HVR-L2，其包含序列WGSFLY(SEQ ID NO：2)；和(ii)HVR-L3，其包含序列HYSSPP(SEQ ID NO：3)。在另一个实施方案中，该抗体片段还包含一条、两条、或三条HVR序列，该HVR序列选自(i)HVR-H1，其包含序列NIKDTY(SEQ ID NO：4)；(ii)HVR-H2，其包含序列RIYPTNGYTR(SEQID NO：5)；和(iii)HVR-H3，其包含序列WGGDGFYAMD(SEQ ID NO：6)。在另外一个实施方案中，该抗体片段还包含一条、两条、或三条HVR序列，该HVR序列选自(i)HVR-H1，其包含序列NISGTY(SEQ ID NO：7)；(ii)HVR-H2，其包含序列RIYPSEGYTR(SEQ ID NO：8)；和(iii)HVR-H3，其包含序列WVGVGFYAMD(SEQ ID NO：9)。在具体实施方案中，该抗体片段包含：HVR-L1序列，其包含NIAKTISGY(SEQ ID NO：1)；HVR-L2序列，其包含WGSFLY(SEQ ID NO：2)；HVR-L3序列，其包含HYSSPP(SEQ ID NO：3)；HVR-H1序列，其包含NIKDTY(SEQ ID NO：4)；HVR-H2序列，该HVR-H2序列包含RIYPTNGYTR(SEQ ID NO：5)；和HVR-H3序列，其包含WGGDGFYAMD(SEQ ID NO：6)，或包含：HVR-L1序列，该HVR-L1序列包含NIAKTISGY(SEQ ID NO：1)；HVR-L2序列，其包含WGSFLY(SEQ ID NO：2)；HVR-L3序列，其包含HYSSPP(SEQ ID NO：3)；HVR-H1序列，其包含NISGTY(SEQ ID NO：7)；HVR-H2序列，该HVR-H2序列包含RIYPSEGYTR(SEQ ID NO：8)；和HVR-H3序列，其包含WVGVGFYAMD(SEQ ID NO：9)。在一个实施方案中，该片段是Fab片段或单链可变片段(scFv)。在所有上述方面另外的实施方案中，该抗体的框架序列的至少一部分可以是人共有框架序列。
在又一些方面，本发明的特征是多核苷酸，其编码本文描述的抗体或抗体片段，以及包含此类多核苷酸的载体。在具体实施方案中，所编码的抗体包含HVR-L1序列，该HVR-L1序列包含NIAKTISGY(SEQ ID NO：1)。任选地或另外地，该多核苷酸编码的抗体还包含：包含WGSFLY(SEQ IDNO：2)的HVR-L2序列；和/或包含HYSSPP(SEQ ID NO：3)的HVR-L3序列，或其任何组合。另外一方面，该多核苷酸还可编码这样的抗体，该抗体包含下述一条、两条、或三条：HVR-H1序列，其包含NIKDTY(SEQ IDNO：4)；HVR-H2序列，该HVR-H2序列包含RIYPTNGYTR(SEQ ID NO：5)；和HVR-H3序列，其包含WGGDGFYAMD(SEQ ID NO：6)；或编码这样的抗体，所述抗体包含下述一条、两条、或三条：HVR-H1，其包含NISGTY(SEQ ID NO：7)；HVR-H2，其包含RIYPSEGYTR(SEQ ID NO：8)；和/或HVR-H3序列，其包含WVGVGFYAMD(SEQ ID NO：9)。
在本发明另外的方面，该多核苷酸编码：包含序列NISGTY(SEQ IDNO：7)的HVR-H1序列，包含序列RIYPSEGYTR(SEQ ID NO：8)的HVR-H2，或包含序列WVGVGFYAMD(SEQ ID NO：9)的HVR-H3，或其任何组合。
在别的方面，本发明的特征是分离的多核苷酸，其编码包含序列NIAKTISGY(SEQ ID NO：1)的HVR-L1序列，并且，任选地，该多核苷酸还编码一条、两条、或三条HVR序列，该HVR序列选自(i)HVR-H1，其包含序列NIKDTY(SEQ ID NO：4)；(ii)HVR-H2，其包含序列RIYPTNGYTR(SEQ ID NO：5)；和(iii)HVR-H3，其包含序列WGGDGFYAMD(SEQ ID NO：6)。在另外的方面，本发明的特征是分离的多核苷酸，其编码：包含序列NIAKTISGY(SEQ ID NO：1)的HVR-L1序列；和(i)包含序列WGSFLY(SEQ ID NO：2)的HVR-L2序列，或(ii)包含序列HYSSPP(SEQ ID NO：3)的HVR-L3序列，或两者，并且，任选地，该多核苷酸还编码一条、两条、或三条HVR序列，该HVR序列选自(i)HVR-H1，其包含序列NIKDTY(SEQ ID NO：4)；(ii)HVR-H2，其包含序列RIYPTNGYTR(SEQ ID NO：5)；和(iii)HVR-H3，其包含序列WGGDGFYAMD(SEQ ID NO：6)。
又一方面，本发明的特征是分离的多核苷酸，其编码：包含序列NIAKTISGY(SEQ ID NO：1)的HVR-L1序列；包含序列NISGTY(SEQ IDNO：7)的HVR-H1；包含序列RIYPSEGYTR(SEQ ID NO：8)的HVR-H2；和包含序列WVGVGFYAMD(SEQ ID NO：9)的HVR-H3。还一方面，本发明的特征是分离的多核苷酸，其编码：包含序列NIAKTISGY(SEQ ID NO：1)的HVR-L1序列；包含序列WGSFLY(SEQ ID NO：2)的HVR-L2序列；包含序列HYSSPP(SEQ ID NO：3)的HVR-L3序列；包含序列NISGTY(SEQID NO：7)的HVR-H1；包含序列RIYPSEGYTR(SEQ ID NO：8)的HVR-H2；和包含序列WVGVGFYAMD(SEQ ID NO：9)的HVR-H3。
其它方面，本发明的特征是分离的多核苷酸，其编码包含序列NISGTY(SEQ ID NO：7)的HVR-H1序列，分离的多核苷酸，其编码包含序列RIYPSEGYTR(SEQ ID NO：8)的HVR-H2序列，和分离的多核苷酸，其编码包含序列WVGVGFYAMD(SEQ ID NO：9)的HVR-H3序列。另一方面，本发明的特征是分离的多核苷酸，其编码多肽，该多肽包含：包含序列NISGTY(SEQ ID NO：7)的HVR-H1序列；包含序列RIYPSEGYTR(SEQ IDNO：8)的HVR-H2序列；和包含序列WVGVGFYAMD(SEQ ID NO：9)的HVR-H3序列。
在本发明的另外的实施方案中，该分离的多核苷酸编码HVR-L1序列，该HVR-L1序列包含序列X1IX3X4X5X6X7X8X9Y(SEQ ID NO：83)，其中X1是除天冬氨酸以外的任何氨基酸，X3是除脯氨酸以外的任何氨基酸，X4是除精氨酸以外的任何氨基酸，并且X5是除丝氨酸以外的任何氨基酸。在本发明的另一个实施方案中，该多核苷酸编码：包含序列X1IX3X4X5X6X7X8X9Y(SEQ ID NO：83)的HVR-L1序列，其中X1是除Asp以外的任何氨基酸，X3是除脯氨酸以外的任何氨基酸，X4是除精氨酸以外的任何氨基酸，和X5是除丝氨酸以外的任何氨基酸；和包含序列WGSFLY(SEQ ID NO：2)的HVR-L2序列，和/或包含序列HYSSPP(SEQ ID NO：3)的HVR-L3序列。在本发明这一方面的另外的实施方案中，该多核苷酸编码抗体，该抗体包含序列X1IX3X4X5X6X7X8X9Y(SEQ ID NO：83)，其在X1具有天冬酰胺，在X3具有丙氨酸，在X4具有赖氨酸，在X5具有苏氨酸，在X7具有丝氨酸，和/或在X8具有甘氨酸，或其任何组合。在本发明这一方面的多种实施方案中，图57中显示的具有大于1、5、或10的F值的任何HVR-L1残基是这样的残基，该残基优选地维持为与在bH1-44或bH1-81的HVR-L1(SEQ ID NO：1)中同样的位点发现的残基相同的残基。在另外的实施方案中，表14显示的具有大于1的ΔΔG值的任何HVR-L1残基是这样的残基，该残基优选地维持为与在bH1-44或bH1-81的HVR-L1(SEQ ID NO：1)中同样的位点发现的残基相同。
在本发明的另外的实施方案中，该多核苷酸编码HVR-H2序列，该HVR-H2序列包含序列RX2X3X4X5X6X7X8X9R(SEQ ID NO：85)，其中X5是除苏氨酸以外的任何氨基酸并且X6是除天冬酰胺以外的任何氨基酸。另一方面，本发明提供多核苷酸，其编码：包含序列NISGTY(SEQ ID NO：7)的HVR-H1序列；包含序列RX2X3X4X5X6X7X8X9R(SEQ ID NO：85)的HVR-H2序列，其中X5是除苏氨酸以外的任何氨基酸并且X6是除天冬酰胺以外的任何氨基酸；和包含序列WVGVGFYAMD(SEQ ID NO：9)的HVR-H3序列。在本发明另外的实施方案中，该多核苷酸编码HVR-H2序列，该HVR-H2序列包含序列RX2X3X4X5X6X7X8X9R(SEQ ID NO：84)，其在X5具有丝氨酸，在X6具有谷氨酸，和/或在X8具有酪氨酸，或其任何组合。在本发明这一方面的多种实施方案中，图57中显示的具有大于1、5、或10的F值的任何HVR-H2残基是这样的残基，该残基优选地维持为与在bH1-44或bH1-81的HVR-H2(分别为SEQ ID NOS：8和5)的同样的位点发现的残基相同的残基。在另外的实施方案中，表14显示的具有大于1的ΔΔG值的任何HVR-H2残基是这样的残基，该残基优选地维持为与在bH1-44或bH1-81的HVR-H2(分别为SEQ ID NOS：8和5)中同样的位点发现的残基相同的残基。
在又一些方面中，本发明的特征是分离的多肽，其包含：包含序列NIAKTISGY(SEQ ID NO：1)的HVR-L1序列，或分离的多肽，其包含：包含序列NIAKTISGY(SEQ ID NO：1)的HVR-L1序列；包含序列WGSFLY(SEQ ID NO：2)的HVR-L2序列；和/或包含序列HYSSPP(SEQ ID NO：3)的HVR-L3序列。另一方面，本发明提供多肽，其包含HVR-L1序列，该HVR-L1序列包含序列X1IX3X4X5X6X7X8X9Y(SEQ ID NO：83)，其中X1是除天冬氨酸以外的任何氨基酸，X3是除脯氨酸以外的任何氨基酸，X4是除精氨酸以外的任何氨基酸，并且X5是除丝氨酸以外的任何氨基酸。在这一方面的另一个实施方案中，该多肽包含HVR-L1序列X1IX3X4X5X6X7X8X9Y(SEQ ID NO：83)，其中X1是除天冬氨酸以外的任何氨基酸，X3是除脯氨酸以外的任何氨基酸，X4是除精氨酸以外的任何氨基酸，并且X5是除丝氨酸以外的任何氨基酸。任选地，该多肽还包含：包含序列WGSFLY(SEQ ID NO：2)的HVR-L2序列，和/或包含序列HYSSPP(SEQ ID NO：3)的HVR-L3序列。在上述任何方面的具体实施方案中，包括一种多肽，该多肽包含序列X1IX3X4X5X6X7X8X9Y(SEQ ID NO：83)，其在X1存在天冬酰胺，在X3存在丙氨酸，在X4存在赖氨酸，在X5存在苏氨酸，在X7存在丝氨酸，和/或在X8存在甘氨酸，或其任何组合。在本发明这一方面的多种实施方案中，图57中显示的具有大于1、5、或10的F值的任何HVR-L1残基是这样的残基，该残基优选地维持为与在bH1-44或bH1-81的HVR-L1(SEQ ID NO：1)中同样的位点发现的残基相同的残基。在另外的实施方案中，表14显示的具有大于1的ΔΔG值的任何HVR-L1残基是这样的残基，该残基优选地维持为与在bH1-44或bH1-81的HVR-L1(SEQ ID NO：1)中同样的位点发现的残基相同。
本发明还提供多肽，该多肽包含HVR-H2序列，该HVR-H2序列包含序列RX2X3X4X5X6X7X8X9R(SEQ ID NO：85)，其中X5是苏氨酸除以外的任何氨基酸并且X6是除天冬酰胺以外的任何氨基酸。在本发明的另一方面中，该多肽包含：HVR-H2序列RX2X3X4X5X6X7X8X9R(SEQ ID NO：85)，其中X5是除苏氨酸以外的任何氨基酸并且X6是除天冬酰胺以外的任何氨基酸，包含序列NISGTY(SEQ ID NO：7)的HVR-H1序列，和包含序列WVGVGFYAMD(SEQ ID NO：9)的HVR-H3序列。在上述方面的不同实施方案中，该多肽包含HVR-H2序列，该HVR-H2序列包含序列RX2X3X4X5X6X7X8X9R(SEQ ID NO：84)，其在X5具有丝氨酸，在X6具有谷氨酸，和/或在X8具有酪氨酸，或其任何组合。在本发明这一方面的多种实施方案中，图57中显示的具有大于1、5、或10的F值的任何HVR-H2残基是这样的残基，该残基优选地维持为与在bH1-44或bH1-81的HVR-H2(分别为SEQ ID NOS：8和5)的同样的位置发现的残基相同的残基。在另外的实施方案中，表14显示的具有大于1的ΔΔG值的任何HVR-H2残基是这样的残基，该残基优选地维持为与在bH1-44或bH1-81的HVR-H2(分别为SEQ ID NOS：8和5)中同样的位点发现的残基相同的残基。
本发明还提供多肽，该多肽包含以下序列的一条、两条、或三条：HVR-H1序列，其包含序列NISGTY(SEQ ID NO：7)，HVR-H2序列，其包含序列RIYPSEGYTR(SEQ ID NO：8)，和/或HVR-H3序列，其包含序列WVGVGFYAMD(SEQ ID NO：9)，或其任何组合。
在任何上述方面中，该分离的多肽还包含以下序列的一条、两条、或三条：HVR-L1序列，其包含序列NIAKTISGY(SEQ ID NO：1)；HVR-H1，其包含序列NIKDTY(SEQ ID NO：4)；HVR-H2，其包含序列RIYPTNGYTR(SEQ ID NO：5)；和/或HVR-H3，其包含序列WGGDGFYAMD(SEQ IDNO：6)，或其任何组合。
在任何上述方面中，该分离的多肽还包含以下一条、两条、或三条：HVR-L1序列，其包含序列NIAKTISGY(SEQ ID NO：1)；HVR-L2序列，其包含序列WGSFLY(SEQ ID NO：2)；和/或HVR-L3序列，其包含序列HYSSPP(SEQ ID NO：3)，或其任何组合。
在任何上述方面中，该分离的多肽还包含：HVR-H1，其包含序列NIKDTY(SEQ ID NO：4)；HVR-H2，其包含序列RIYPTNGYTR(SEQ IDNO：5)；和/或HVR-H3，其包含序列WGGDGFYAMD(SEQ ID NO：6)，或其任何组合。
在任何上述方面中，该分离的多肽还包含一条、两条、或三条HVR序列，该HVR序列选自：HVR-H1，其包含序列NISGTY(SEQ ID NO：7)；HVR-H2序列，其包含序列RIYPSEGYTR(SEQ ID NO：8)；和/或HVR-H3，其包含序列WVGVGFYAMD(SEQ ID NO：9)，或其任何组合。
在另外的方面，本发明的特征是一种分离的多肽，其包含：包含序列NIAKTISGY(SEQ ID NO：1)的HVR-L1序列，和(i)包含序列WGSFLY(SEQ ID NO：2)的HVR-L2序列，或(ii)包含序列HYSSPP(SEQ ID NO：3)的HVR-L3序列，或两者；和一条、两条或三条HVR序列，该HVR序列选自(i)HVR-H1，其包含序列NISGTY(SEQ ID NO：7)；(ii)HVR-H2，其包含序列RIYPSEGYTR(SEQ ID NO：8)；和/或(iii)HVR-H3，其包含序列WVGVGFYAMD(SEQ ID NO：9)，或其任何组合。
在另外的方面，本发明的特征是一种分离的多肽，其包含：包含序列NIAKTISGY(SEQ ID NO：1)的HVR-L1序列，和(i)包含序列WGSFLY(SEQ ID NO：2)的HVR-L2序列，或(ii)包含序列HYSSPP(SEQ ID NO：3)的HVR-L3序列，或两者；和一条、两条或三条HVR序列，该HVR序列选自(i)HVR-H1，其包含序列NIKDTY(SEQ ID NO：4)；(ii)HVR-H2，其包含序列RIYPTNGYTR(SEQ ID NO：5)；和/或(iii)HVR-H3，其包含序列WGGDGFYAMD(SEQ ID NO：6)，或其任何组合。
在又一些方面中，本发明的特征是包含HVR-H1序列的分离的多肽，该HVR-H1序列包含序列NISGTY(SEQ ID NO：7)，包含HVR-H2序列的分离的多肽，该HVR-H2序列包含序列RIYPSEGYTR(SEQ ID NO：8)，和包含HVR-H3序列的分离的多肽，该HVR-H3序列包含序列WVGVGFYAMD(SEQ ID NO：9)。还一方面，本发明的特征是分离的多肽，其包含：包含序列NISGTY(SEQ ID NO：7)的HVR-H1序列；包含序列RIYPSEGYTR(SEQ ID NO：8)的HVR-H2序列；和包含序列WVGVGFYAMD(SEQ ID NO：9)的HVR-H3序列。
在一个实施方案中，本发明提供一种载体，其包含任何上述描述的本发明的多核苷酸。另一方面，本发明的特征是一种宿主细胞，其包含任何本发明的载体。在一个实施方案中，该宿主细胞是原核的。在另一个实施方案中，该宿主细胞是真核的，例如，哺乳动物细胞。
另一方面，本发明的特征是一种产生上文描述的任何抗体或抗体片段的方法。这种方法包括培养包含载体的宿主细胞并回收该抗体，该载体包含编码该抗体的多核苷酸。在某些实施方案中，该多核苷酸编码HVR-L1序列，该HVR-L1序列包含序列NIAKTISGY(SEQ ID NO：1)，并且，任选地，该多核苷酸还编码：HVR-H1，其包含序列NIKDTY(SEQ ID NO：4)；HVR-H2，其包含序列RIYPTNGYTR(SEQ ID NO：5)；和HVR-H3，其包含序列WGGDGFYAMD(SEQ ID NO：6)。在其它实施方案中，该多核苷酸编码：HVR-L1序列，其包含序列NIAKTISGY(SEQ ID NO：1)；HVR-L2序列，其包含序列WGSFLY(SEQ ID NO：2)；和HVR-L3序列，其包含序列HYSSPP(SEQ ID NO：3)，并且，任选地，该多核苷酸还编码：HVR-H1，其包含序列NIKDTY(SEQ ID NO：4)；HVR-H2，其包含序列RIYPTNGYTR(SEQ ID NO：5)；和HVR-H3，其包含序列WGGDGFYAMD(SEQ ID NO：6)。在另一个实施方案中，该多核苷酸编码：HVR-L1序列，其包含序列NIAKTISGY(SEQ ID NO：1)；HVR-H1，其包含序列NISGTY(SEQ IDNO：7)；HVR-H2，其包含序列RIYPSEGYTR(SEQ ID NO：8)；和HVR-H3，其包含序列WVGVGFYAMD(SEQ ID NO：9)。在又一个实施方案中，该多核苷酸编码：HVR-L1序列，其包含序列NIAKTISGY(SEQ ID NO：1)；HVR-L2序列，其包含序列WGSFLY(SEQ ID NO：2)；HVR-L3序列，其包含序列HYSSPP(SEQ ID NO：3)；HVR-H1，其包含序列NISGTY(SEQ IDNO：7)；HVR-H2，其包含序列RIYPSEGYTR(SEQ ID NO：8)；和HVR-H3，其包含序列WVGVGFYAMD(SEQ ID NO：9)。
在另一些实施方案中，该多核苷酸编码：HVR-H1序列，其包含序列NISGTY(SEQ ID NO：7)，HVR-H2序列，其包含序列RIYPSEGYTR(SEQID NO：8)，或HVR-H3序列，其包含序列WVGVGFYAMD(SEQ ID NO：9)。在又一个实施方案中，该多核苷酸编码多肽，该多肽包含：HVR-H1序列，其包含序列NISGTY(SEQ ID NO：7)；HVR-H2序列，其包含序列RIYPSEGYTR(SEQ ID NO：8)；和HVR-H3序列，其包含序列WVGVGFYAMD(SEQ ID NO：9)。
在一个实施方案中，该宿主细胞是原核的，以及在另一个实施方案中，该宿主细胞是真核的，如哺乳动物细胞。
又一方面，本发明的特征是一种治疗受试者中肿瘤的方法。这种方法包括向所述受试者施用本文描述的抗体或抗体片段，其中所述施用以足以治疗或预防受试者中肿瘤的时间和量施用。在一个实施方案中，该肿瘤是结肠直肠肿瘤、乳腺癌、肺癌、肾细胞癌、神经胶质瘤、成胶质细胞瘤或卵巢癌。在另一个实施方案中，该抗体包含HVR-L1序列并且特异性结合HER2和VEGF，该HVR-L1序列包含序列NIAKTISGY(SEQ ID NO：1)。根据一个实施方案，该抗体还包含一条或两条HVR序列，该HVR序列选自(i)HVR-L2，其包含序列WGSFLY(SEQ ID NO：2)；和(ii)HVR-L3，其包含序列HYSSPP(SEQ ID NO：3)。在另一个实施方案中，该抗体包含一条、两条、或三条HVR序列，该HVR序列选自(i)HVR-H1，其包含序列NIKDTY(SEQ ID NO：4)；(ii)HVR-H2，其包含序列RIYPTNGYTR(SEQ IDNO：5)；和(iii)HVR-H3，其包含序列WGGDGFYAMD(SEQ ID NO：6)。在另外一个实施方案中，该抗体包含一条、两条、或三条HVR序列，该HVR序列选自(i)HVR-H1，其包含序列NISGTY(SEQ ID NO：7)；(ii)HVR-H2，其包含序列RIYPSEGYTR(SEQ ID NO：8)；和(iii)HVR-H3，其包含序列WVGVGFYAMD(SEQ ID NO：9)。在具体实施方案中，该抗体包含：HVR-L1序列，其包含NIAKTISGY(SEQ ID NO：1)；HVR-L2序列，其包含WGSFLY(SEQ ID NO：2)；HVR-L3序列，其包含HYSSPP(SEQ IDNO：3)；HVR-H1序列，其包含NIKDTY(SEQ ID NO：4)；HVR-H2序列，其包含RIYPTNGYTR(SEQ ID NO：5)；和HVR-H3序列，其包含WGGDGFYAMD(SEQ ID NO：6)，并且特异性结合HER2和VEGF。在另一个实施方案中，该抗体包含：HVR-L1序列，其包含NIAKTISGY(SEQID NO：1)；HVR-L2序列，其包含WGSFLY(SEQ ID NO：2)；HVR-L3序列，其包含HYSSPP(SEQ ID NO：3)；HVR-H1序列，其包含NISGTY(SEQ IDNO：7)；HVR-H2序列，其包含RIYPSEGYTR(SEQ ID NO：8)；和HVR-H3序列，其包含WVGVGFYAMD(SEQ ID NO：9)，并且特异性结合HER2和VEGF。
在一个实施方案中，该方法还包括向该受试者施用另外的抗癌治疗。在另一个实施方案中，该另外的抗癌治疗包括另一种抗体、化疗剂、细胞毒性剂、抗血管生成剂、免疫抑制剂、药物前体、细胞因子、细胞因子拮抗剂、细胞毒性放射治疗、皮质类固醇、止吐药、癌症疫苗、止痛剂、或生长抑制剂。
在另一个实施方案中，另外的抗癌治疗是在施用抗体之前或之后施用。在又一个实施方案中，另外的抗癌治疗与抗体同时施用。
又一方面，本发明的特征是一种治疗受试者中自身免疫性疾病的方法。这种方法包括向所述受试者施用本文描述的抗体或抗体片段，其中所述施用以足以治疗或预防受试者中自身免疫性疾病的时间和量施用。在一个实施方案中，该抗体包含HVR-L1序列并且特异性结合HER2和VEGF，该HVR-L1序列包含序列NIAKTISGY(SEQ ID NO：1)。根据一个实施方案，该抗体包含一条或两条HVR序列，该HVR序列选自(i)HVR-L2，其包含序列WGSFLY(SEQ ID NO：2)；和(ii)HVR-L3，其包含序列HYSSPP(SEQ ID NO：3)。在另一个实施方案中，该抗体包含一条、两条、或三条HVR序列，该HVR序列选自(i)HVR-H1，其包含序列NIKDTY(SEQ IDNO：4)；(ii)HW-H2，其包含序列RIYPTNGYTR(SEQ ID NO：5)；和(iii)HVR-H3，其包含序列WGGDGFYAMD(SEQ ID NO：6)。在另外一个实施方案中，该抗体包含一条、两条、或三条HVR序列，该HVR序列选自(i)HVR-H1，其包含序列NISGTY(SEQ ID NO：7)；(ii)HVR-H2，其包含序列RIYPSEGYTR(SEQ ID NO：8)；和(iii)HVR-H3，其包含序列WVGVGFYAMD(SEQ ID NO：9)。在具体实施方案中，该抗体包含：HVR-L1序列，其包含NIAKTISGY(SEQ ID NO：1)；HVR-L2序列，其包含WGSFLY(SEQ ID NO：2)；HVR-L3序列，其包含HYSSPP(SEQ IDNO：3)；HVR-H1序列，其包含NIKDTY(SEQ ID NO：4)；HVR-H2序列，其包含RIYPTNGYTR(SEQ ID NO：5)；和HVR-H3序列，其包含WGGDGFYAMD(SEQ ID NO：6)，并且特异性结合HER2和VEGF，或该抗体包含：HVR-L1序列，其包含NIAKTISGY(SEQ ID NO：1)；HVR-L2序列，其包含WGSFLY(SEQ ID NO：2)；HVR-L3序列，其包含HYSSPP(SEQ ID NO：3)；HVR-H1序列，其包含NISGTY(SEQ ID NO：7)；HVR-H2序列，其包含RIYPSEGYTR(SEQ ID NO：8)；和HVR-H3序列，其包含WVGVGFYAMD(SEQ ID NO：9)，并且特异性结合HER2和VEGF。
还一方面，本发明的特征是一种治疗受试者中涉及HER2异常激活的非恶性疾病的方法。这种方法包括向所述受试者施用本文描述的抗体或抗体片段，其中所述施用以足以治疗或预防受试者中非恶性疾病的时间和量施用。在一个实施方案中，该抗体包含HVR-L1序列并且特异性结合HER2和VEGF，该HVR-L1序列包含序列NIAKTISGY(SEQ ID NO：1)。根据一个实施方案，该抗体包含一条或两条HVR序列，该HVR序列选自(i)HVR-L2，其包含序列WGSFLY(SEQ ID NO：2)；和(ii)HVR-L3，其包含序列HYSSPP(SEQ ID NO：3)。在另一个实施方案中，该抗体还包含一条、两条、或三条HVR序列，该HVR序列选自(i)HVR-H1，其包含序列NIKDTY(SEQ ID NO：4)；(ii)HVR-H2，其包含序列RIYPTNGYTR(SEQ IDNO：5)；和(iii)HVR-H3，其包含序列WGGDGFYAMD(SEQ ID NO：6)。在另外一个实施方案中，该抗体包含一条、两条、或三条HVR序列，该HVR序列选自(i)HVR-H1，其包含序列NISGTY(SEQ ID NO：7)；(ii)HVR-H2，其包含序列RIYPSEGYTR(SEQ ID NO：8)；和(iii)HVR-H3，其包含序列WVGVGFYAMD(SEQ ID NO：9)。在具体实施方案中，该抗体包含：HVR-L1序列，其包含NIAKTISGY(SEQ ID NO：1)；HVR-L2序列，其包含WGSFLY(SEQ ID NO：2)；HVR-L3序列，其包含HYSSPP(SEQ IDNO：3)；HVR-H1序列，其包含NIKDTY(SEQ ID NO：4)；HVR-H2序列，其包含RIYPTNGYTR(SEQ ID NO：5)；和HVR-H3序列，其包含WGGDGFYAMD(SEQ ID NO：6)，并且特异性结合HER2和VEGF，或该抗体包含：HVR-L1序列，其包含NIAKTISGY(SEQ ID NO：1)；HVR-L2序列，其包含WGSFLY(SEQ ID NO：2)；HVR-L3序列，其包含HYSSPP(SEQ ID NO：3)；HVR-H1序列，其包含NISGTY(SEQ ID NO：7)；HVR-H2序列，其包含RIYPSEGYTR(SEQ ID NO：8)；和HVR-H3序列，其包含WVGVGFYAMD(SEQ ID NO：9)，并且特异性结合HER2和VEGF。
本发明另外的方面的特征是本文描述的抗体和抗体片段在治疗受试者中肿瘤、自身免疫性疾病或涉及HER2异常激活的非恶性疾病中的用途，以及在制备用于治疗受试者中肿瘤、自身免疫性疾病或涉及HER2异常激活的非恶性疾病的药物中的用途。在这些用途的一个实施方案中，该抗体包含HVR-L1序列并且特异性结合HER2和VEGF，该HVR-L1序列包含序列NIAKTISGY(SEQ ID NO：1)。根据一个实施方案，该抗体还包含一条或两条HVR序列，该HVR序列选自(i)HVR-L2，其包含序列WGSFLY(SEQ ID NO：2)；和(ii)HVR-L3，其包含序列HYSSPP(SEQ ID NO：3)。在另一个实施方案中，该抗体包含一条、两条、或三条HVR序列，该HVR序列选自(i)HVR-H1，其包含序列NIKDTY(SEQ ID NO：4)；(ii)HVR-H2，其包含序列RIYPTNGYTR(SEQ ID NO：5)；和(iii)HVR-H3，其包含序列WGGDGFYAMD(SEQ ID NO：6)。在另外一个实施方案中，该抗体包含一条、两条、或三条HVR序列，该HVR序列选自(i)HVR-H1，其包含序列NISGTY(SEQ ID NO：7)；(ii)HVR-H2，其包含序列RIYPSEGYTR(SEQ IDNO：8)；和(iii)HVR-H3，其包含序列WVGVGFYAMD(SEQ ID NO：9)。在具体实施方案中，该抗体包含：HVR-L1序列，其包含NIAKTISGY(SEQID NO：1)；HVR-L2序列，其包含WGSFLY(SEQ ID NO：2)；HVR-L3序列，其包含HYSSPP(SEQ ID NO：3)；HVR-H1序列，其包含NIKDTY(SEQ IDNO：4)；HVR-H2序列，其包含RIYPTNGYTR(SEQ ID NO：5)；和HVR-H3序列，其包含WGGDGFYAMD(SEQ ID NO：6)，并且特异性结合HER2和VEGF，或该抗体包含：HVR-L1序列，其包含NIAKTISGY(SEQ ID NO：1)；HVR-L2序列，其包含WGSFLY(SEQ ID NO：2)；HVR-L3序列，其包含HYSSPP(SEQ ID NO：3)；HVR-H1序列，其包含NISGTY(SEQ ID NO：7)；HVR-H2序列，其包含RIYPSEGYTR(SEQ ID NO：8)；和HVR-H3序列，其包含WVGVGFYAMD(SEQ ID NO：9)，并且特异性结合HER2和VEGF。
在本文描述的治疗肿瘤、自身免疫性疾病或涉及HER2异常激活的非恶性疾病的方法的一个实施方案中，该受试者是人。
也考虑了包含本文描述的抗体和抗体片段的试剂盒、组合物、和制品。
附图简述
图1显示多种LC文库中的设计多样性。
图2显示四种轻链文库的总结，该轻链文库用于改变抗-VEGF抗体或抗-HER2抗体以便结合至另外的靶标。斜体的NNK和XYZ是指密码子组。Ys、Ds、Ts和Ss是指这样的软性随机化(soft randomization)，即，通过使酪氨酸、天冬氨酸、苏氨酸和丝氨酸分别在50％的时间出现，并且使20种氨基酸的任何一种在另外50％的时间出现的软性随机化。D/Ds和T/Ts是指这样的软性随机化，即，通过使D或T分别在75％的时间出现，并且使20种氨基酸的任何一种在另外25％的时间出现的软性随机化。
图3显示轻链模板的HC、LC CDR残基的序列。
图4显示轻链CDR的天然和设计多样性。在每个位点，赫赛汀(Herceptin)抗体序列显示于括号内。“*”标出在赫赛汀抗体中不存在的插入。
图5A和5B1-5B2显示从轻链(LC)文库中分离的特异性抗原-结合克隆的序列。图5A显示结合至VEGF、DR5、和Fc的单特异性噬菌体克隆的LC CDR序列，图5B显示结合至VEGF/HER2、DR5/HER2、和Fc/HER2的双特异性Fab。轻链框架和重链序列对应于赫赛汀抗体的轻链框架和重链序列，除了LC框架的R66G替换。
图6的图显示从LC文库获得的抗体的结合特异性。显示了对于抗体bH1、bH3、3-1、bD1、bD2、4-1、和4-5的结果。结合的IgG抗体通过分光光度计检测(在450nm的光密度，y-轴)。测定中包括的蛋白质是(对每种抗体从左至右)人血管内皮生长因子A(hVEGF-A)、hVEGF-C、hVEGF-D、hHER2胞外域(ECD)、表皮生长因子受体胞外域(hEGFR)、人死亡受体5(hDR5)、牛血清白蛋白(BSA)、酪蛋白、胎牛血清(FBS)、WIL2细胞裂解物、和NR6细胞裂解物。
图7显示分选条件和文库C和D的富集。
图8显示VEGF结合物。残基28、30、30a、31、92、93、和93a是完全多样化的。残基32、50、53、91和94是受限制的。残基29、33、和51是有限的(＜3)。
图9显示人VEGF结合物，组合板和溶液选择。
图10A和10B显示结合VEGF和HER2两者的克隆。
图11显示仅结合VEGF并丧失与HER2结合活性的克隆。
图12显示结合至VEGF的克隆。
图13A和13B显示阻断VEGF对VEGFR1-D2或D1的结合的克隆。
图14A和14B显示来自于文库L1/L2/L3-C，D的VEGF结合物和VEGF结合物的亲和力。
图15显示结合hVEGF和HER2两者的克隆。
图16显示在scFv’2形成中使用的和在噬菌体上展示的LC文库结合物。
图17显示多种克隆以Fab或hIgG形式的表达。
图18A和18B显示以hIgG形式结合至hVEGF165的克隆的ELISA。
图19显示以hIgG形式结合至固定蛋白靶标的克隆的ELISA。
图20显示hIgG形式的克隆在HER2和VEGF或DR5存在时的竞争性ELISA。
图21显示对VEGF或HER2的结合的Biacore分析。
图22显示具有从不同结合克隆获得的轻链的IgG或Fab对HER2-ECD或hVEGF的结合。
图23A和23B显示抗-VEGF抗体阻断VEGF与VEGFR1 D 1-3和KDRD1-7的相互作用。
图24显示阻断B20-4.1和VEGF结合的抗体。
图25显示阻断阿瓦斯丁(Avastin)抗体和VEGF结合的抗体。
图26显示结合至HER2或VEGF的双特异性bH1 Fab的晶体结构。
图27的图显示抗-VEGF抗体阻断hVEGF对VEGF受体2(VEGFR2)的结合。
图28显示结合至HER2或VEGF的双特异性bH1 Fab的晶体结构。
图29是系列饼图，显示单个CDR对bH1的结构互补位的贡献。对于VEGF，该互补位的大小为730，对于HER2是690。重链CDR标示为灰色，轻链CDR为白色。
图30显示结合VEGF/HER2的bH1或结合HER2的赫赛汀抗体的CDR环的重叠，方向与图28中相同。
图31显示结合至HER2或VEGF的双特异性bH1 Fab的晶体结构。两种bH1复合物的CDR-L1以相同的方向显示。
图32显示对于VEGF和HER2结合，bH1的能量上重要的结合位点。
图33显示鸟枪法扫描的bH1的密码子。
图34显示文库的构建。
图35显示带有鸟枪法扫描突变的抗体克隆，通过结合至VEGF进行筛选。
图36带有鸟枪法扫描突变的抗体克隆，通过结合至HER2筛选。
图37A-37D显示丙氨酸扫描结果。图37A和37B显示bH1对于(图37A)VEGF结合或(图37B)HER2结合的丙氨酸扫描的结果，和bH1对于(图37C)VEGF结合或(图37D)HER2结合的同源物扫描的结果。
图38显示bH1或赫赛汀抗体突变体的丙氨酸扫描的结果。
图39A1-39A3和39B1-39B3显示bH1 Fab对于VEGF和HER2结合的鸟枪法丙氨酸-和同源物扫描。
图40A-40B显示对于VEGF和HER2结合，bH1的能量上重要的结合位点。
图41显示bH1 VEGF-亲和力成熟克隆序列和对VEGF或HER2的结合亲和力。
图42显示通过抗-VEGF抗体抑制VEGF诱导的HUVEC细胞增殖。
图43显示双特异性抗体对表达在NR6细胞上的HER2的结合。
图44显示bH1对VEGF或HER2的竞争性结合实验的结果。
图45显示bH1和亲和力改善变体bH1-44和bH1-81 IgG体外抑制HER2和VEGF-介导的细胞增殖。
图46显示来自于LC文库的双特异性抗体的结合特异性。
图47显示抗-VEGF抗体阻断VEGF对VEGFR2受体的结合。
图47A显示人VEGF结合，图47B显示鼠VEGF的结合。
图48A和48B显示VEGF和HER2在溶液中为结合至bH1-44双特异性IgG而竞争。
图49A和49B显示双特异性抗体bH1和bH1-44结合至HER2表达鼠成纤维细胞(NR6；图49B)，但不结合至HER2阴性的NR6细胞(图49A)。
图50显示双特异性bH1抗体特异性免疫沉淀来自鼠成纤维细胞(NR6)裂解物的VEGF或HER2，但不沉淀其它蛋白质。
图51显示bH1-44在免疫妥协小鼠中Colo205和BT474M1异种移植物中的肿瘤抑制。
图52A、52B、和53描述示例性受体人共有框架序列，其用于通过下述的序列鉴定物(sequence identifier)实施本发明：
可变重链(VH)共有框架(图52A和52B)
人VH亚群I共有框架区FR1、FR2、FR3、和FR4负型(minus)KabatCDRs(分别为IA：SEQ ID NOS：42-45)
人VH亚群I共有框架区FR1、FR2、FR3、和FR4负型扩展高变区(分别为IB：SEQ ID NOS：46、47、44、和45；分别为IC：SEQ ID NOS：46-48和45；分另为ID：SEQ ID NOS：42、47、49、和45)
人VH亚群II共有框架区FR1、FR2、FR3、和FR4负型Kabat CDRs(分别为IIA：SEQ ID NOS：50-52和45)
人VH亚群II共有框架区FR1、FR2、FR3、和FR4负型扩展高变区(分别为IIB：SEQ ID NOS：53、54、52、和45；分别为IIC：SEQ ID NOS：53-55和45；分别为IID：SEQ ID NOS：53、54、56、和45)
人VH亚群III共有框架区FR1、FR2、FR3、和FR4负型Kabat CDRs(分别为IIIA：SEQ ID NOS：57-59和45)
人VH亚群III共有框架区FR1、FR2、FR3、和FR4负型扩展高变区(分别为IIIB：SEQ ID NOS：60、61、59、和45；分别为IIIC：SEQ ID NOS：60-62和45；分别为IIID：SEQ ID NOS：60、61、63、和45)
人VH受体框架区FR1、FR2、FR3、和FR4负型Kabat CDRs(分别为受体A：SEQ ID NOS：64、58、65、和45)
人VH受体框架区FR1、FR2、FR3、和FR4负型扩展高变区(分别为受体B：SEQ ID NOS：60、61、65、和45；分别为受体C：SEQ ID NOS：60、61、66、和45)
人VH受体2框架区FR1、FR2、FR3、和FR4负型Kabat CDRs(分别为第二受体A：SEQ ID NOS：64、58、67、和45)
人VH受体2框架区FR1、FR2、FR3、和FR4负型扩展高变区(分别为第二受体B：SEQ ID NOS：60、61、67、和45；分别为第二受体C：SEQID NOS：60、61、68、和45；分别为第二受体D：SEQ ID NOS：60、61、69、和45)
可变轻链(VL)共有框架(图53)
人VLκ亚群I共有框架区FRI、FR2、FR3、和FR4(分别为kv1：SEQID NOS：70-73)
人VLκ亚群II共有框架区FRI、FR2、FR3、和FR4(分别为kv2：SEQID NOS：74-76和73)
人VLκ亚群III共有框架区FR1、FR2、和FR3(分别为kv3：SEQ IDNOS：77-79和73)
人VLκ亚群IV共有框架区FR1、FR2、和FR3(分别为kv4：SEQ IDNOS：80-82和73)。
图54显示与HER2、VEGF或两者进行结构接触或能量相互作用的残基。与HER2(浅灰色)、VEGF(灰色)或两者(共享的、黑色)进行结构接触(＞25％埋入)或能量相互作用(G＞10％总结合能量)的残基在结合HER2的bH1表面上作图。
图55显示bH1/VEGF和bH1/HER2结合界面。bH1/VEGF(A)和bH1/HER2(B)结合界面的特写显示VEGF和HER2在抗体结合区的结构差异。VEGF(C)和HER2-ECD(D)的表面表示以相对于bH1Fab相同的方向显示。突出显示与bH1Fab接触的残基(比4.5更近)。bH1的两个表位在化学组成或拓扑学方面没有明显相似性。
图56显示bH1和bH1-44抗体阻断人VEGF对VEGFR1的结合。生物素化的人VEGF165与渐增浓度的IgG(x-轴)孵育，然后在固定的人VEGFR1-Fc上捕获，并通过辣根过氧化物酶-偶联的链亲和素和添加的底物检测(标准化的％OD450，y-轴)。
图57显示bH1和bH1-44突变体的丙氨酸扫描结果。丙氨酸扫描诱变鉴定了对于VEGF和/或HER2结合的功能上重要的残基。F值表示每个扫描的残基对抗原结合的相对贡献。确定了bH1-44与VEGF和HER2的结合的F值(黑条)并与bH1的F值(白条)相对比。括号内的氨基酸标出bH1-44与bH1不同的残基。该图根据图56修改。
图58显示bH1-44 I29A Y32A bH1-44和R50A R58A bH1-44抗体对VEGF和HER2的结合。ELISA结合测定显示bH1-44IgG和两个双突变体结合至生物素化的VEGF109(左)或HER2-ECD(右)，并分别与固定的抗-VEGF抗体或赫赛汀竞争的能力。该I29A/Y32A LC突变体已经丧失了对VEGF的结合，而维持了与bH1-44相似的对HER2的亲和力。R50A/R58AHC突变体已经丧失了对HER2的亲和力，但保留了VEGF结合。
图59显示测热法测量与抗原结合相关的焓变化。图59A-F分别显示如下数据：bH1结合至VEGF，bH1结合至HER2，bH1-44结合至VEGF、bH1-44结合至HER2，bH1-44HC-R50A+R58A结合至VEGF，bH1-44LC-I29A+Y32A结合至HER2。这些图显示单个热脉冲(顶部)和反应热(底部)，其通过整合每个脉冲来计算，作为注射结束时抗体与抗原的比值的函数来作图。焓变化的幅度小，需要相对高蛋白浓度，这使得在亲和力高的时候不能精确估计KD。图59A-D：浓度在10-20μM范围的VEGF109、HER2-ECD溶液通过15次注射浓度在100至200μM的bH1或bH1-44Fab滴定。图59E-F：浓度在10至20μM的VEGF109或HER2-ECD溶液通过20次注射浓度在150至250μM的bH1-44LC-I29A+Y32A Fab或bH1-44HC-R50A+R58A Fab滴定。由于仪器噪音，(图59E)的第1和13次滴定未进行分析。
图60显示bH1变体和赫赛汀抗体的热力学谱。每种双特异性变体(bH1、bH1-81、和bH1-44)具有如下特征的热力学谱，即对VEGF和HER2两者的结合有利的焓和熵。变体HC-R50A+R58A和LC-129A+Y32A(分别丧失对HER2或VEGF的亲和力)显示与bH1-44相似的热力学谱。bH1-44/HER2相互作用的热力学谱与赫赛汀/HER2不同。
图61显示基于丙氨酸扫描诱变数据的对与HER2结合的bH1、bH1-44、和赫赛汀抗体热点的比较。热点残基以灰色突出显示，并在赫赛汀(赫赛汀)结构或bH1 Fab结构(bH1、bH1-44)上作图。热点定义为ΔΔG大于或等于总结合自由能(ΔG)的10％。结构接触位点(在结构中抗原的4.5内)通过浅色虚线描述其轮廓。HC和LC通过黑色虚线分开。下划线残基在序列上与赫赛汀不同。
图62显示bH1-44Fab与VEGF或HER2结合相关的估计的热容量变化。ΔCp从依赖于20和37℃之间ΔH的温度的斜率来确定。在这一范围，基于ΔH和T(对于bH1-44/HER2，R＝0.991；对于bH1-44/VEGF，R＝0.9989)之间的线性关系，ΔCp似乎独立于T。以前Kelley等(Biochemistry，1992)确定了赫赛汀/HER2的ΔCp。
图63A-B显示通过BIAcore测量的bH1-44变体的结合动力学。这些图显示下述结合相互作用之间的代表性应答相对于时间的曲线之间的重合：固定的(A)VEGF109或(B)HER2-ECD和0.5μM的bH1-44Fab(A和B：顶部)、bH1-44-LC-Y32(A：从底部第二；B：从顶部第二)、bH1-44-LC-I29A+Y32A(A：底部；B：从底部第二)、和bH1-44-HC-R50A+R58A(A：从顶部第二；B：底部)溶液。痕迹表示结合至相同的固定的CM5芯片，其在每个Fab运行后再次产生。在0.5μM未检测到bH1-44-LC-I29A+Y32A对VEGF的结合或bH1-44-HC-R50A+R58A对HER2的结合。相对于野生型bH1-44，变体bH1-44-Y32A显示显著弱化的对VEGF的结合。
图64A-D显示bH1-44的特异性决定残基在bH1的晶体结构上作图。对于VEGF结合重要性的残基(LC-I29和LC-Y32：A和B)和对于HER结合重要性的残基(HC-R50和HC-R58；C和D)以深灰色作为棒显示于bH1/VEGF(A和C，2.6分辨率)或bH1/HER2(B和D，2.9分辨率)晶体结构上。残基I29和Y32似乎参与链内相互作用，其用于维持VEGF-结合所必需的CDR-L1环构象。I29在HER2结构中是暴露于溶剂的。Y32依靠HER2堆积，但不参与产生性抗原的接触。R50和R58依靠HER2上的D560和E558堆积，并似乎参与电荷间相互作用。R50和R58在VEGF溶剂结构中是暴露于溶剂的。
图65显示赫赛汀突变体Fabs(R50A、R58A、和R50A/R58A)的表达。
发明详述
本发明提供制备多特异性抗体和抗体片段的方法，和使用这些方法鉴定的抗体以及它们的用途。一般而言，本发明的方法涉及使抗体的轻链可变结构域或重链可变结构域多样化以产生能够稳定在文库中表达的变体。然后从这种文库中选定能够特异性结合两种表位的多样化抗体并进一步表征。
使用本发明的方法鉴定的示例性抗体包括结合HER2(人表皮生长因子受体2)和VEGF(血管内皮生长因子)两者的抗体。特别地，本发明描述的数据(例如下述实施例中描述的数据)显示HER2抗体轻链互补决定区(CDRs)的突变赋予对无关蛋白抗原和HER2的双重结合能力。全面表征了一种双特异性高亲和力的HER2/VEGF抗体。此外，显示了与HER2和VEGF复合的这种双特异性Fab的晶体结构，并通过诱变评价了Fab残基的能量贡献。两种抗原的结合位点广泛重叠；接触HER2的大部分CDR残基也连接VEGF。然而，从能量上而言，重链残基支配HER2的特异性，而轻链支配VEGF的特异性。
HER2/VEGF双特异性抗体体外和体内抑制HER2及VEGF两者介导的细胞增殖。这些结果证明改变抗体轻链可变结构域的序列能够产生具有双重特异性和功能的抗体。例如，bH1-44和bH1-81具有靶向两种肿瘤进展机制的潜能：HER2介导的肿瘤细胞的增殖和VEGF介导的肿瘤血管发生。通过单个抗体共靶向(Co-targeting)两种抗原是联合治疗的备选。
I.定义
术语“多特异性抗体”以最广义使用，具体涵盖包含重链可变结构域(VH)和轻链可变结构域(VL)的抗体，其中VHVL单元具有多表位特异性(即，能够结合一个生物分子上的两个不同表位或在不同生物分子上的每个表位)。此类多特异性抗体包括但不限于全长抗体、具有两个或多个VL和VH结构域的抗体、抗体片段如Fab、Fv、dsFv、scFv、双价抗体(diabodies)、双特异性双体和三价抗体(triabodies)、已被共价或非共价连接的抗体片段。“多表位特异性(Polyepitopic specificity)”是指能够特异性结合相同或不同靶标上的两种或多种不同表位的能力。“单特异性(Monospecific)”是指仅能结合一种表位的能力。根据一个实施方案，多特异性抗体是以5μM至0.001pM、3μM至0.001pM、1μM至0.001pM、0.5μM至0.001pM或0.1μM至0.001pM的亲和力结合至每个表位的IgG1形式。
基本的4链抗体单元是由两条相同的轻链(L)和两条相同的重链(H)构成的异四聚体糖蛋白(IgM抗体由5个基本的异四聚体单元及称作J链的另外多肽组成，因此包含10个抗原结合位点；而分泌型IgA抗体可聚合形成包含2-5个基本的4链单元及J链的多价装配物)。在IgG的情况中，4链单元通常约150,000道尔顿。每条轻链通过一个共价二硫键与重链相连，而两条重链通过一个或多个二硫键彼此相连，二硫键的数目取决于重链的同种型。每条重链和轻链还具有间隔规律的链内二硫桥。每条重链在N-末端具有一个可变结构域(VH)，接着是三个(对于每种α和γ链)和四个(对于μ和ε同种型)恒定结构域(CH)。每条轻链在N-末端具有一个可变结构域(VL)，接着是其另一端的一个恒定结构域(CL)。VL与VH排列在一起，而CL与重链的第一恒定结构域(CH1)排列在一起。特定的氨基酸残基被认为在轻链和重链可变结构域之间形成界面。成对的VH和VL一起形成一个抗原结合位点。关于不同类别抗体的结构和性质，参见如Basic and Clinical Immunology(基本和临床酶学)，第八版，Daniel P.Stites，Abba I.Terr和Tristram G.Parslow(编辑)，Appleton & Lange，Norwalk，CT，1994，第71页和第6章。
来自任何脊椎动物物种的轻链，根据其恒定结构域氨基酸序列，可归入两种称作κ和λ的截然不同型中的一种。根据其重链恒定结构域(CH)氨基酸序列，免疫球蛋白可归入不同的类或同种型。有五类免疫球蛋白：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，分别具有称作α、δ、ε、γ和μ的重链。根据CH序列和功能的较小差异，γ和α类可进一步分为亚类，例如人表达下列亚类：IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。
术语“可变的”指可变结构域中的某些区段在抗体序列中差异广泛的情况。V结构域介导抗原结合并限定特定抗体对其特定抗原的特异性。然而，变异性并非均匀分布于可变结构域跨越的110个氨基酸。事实上，V区由15-30个氨基酸，称作框架区(FR)的相对不变异的区段及将框架区分开的每个长度为9-12个氨基酸，称作“高变区”的极度变异的较短区域构成。天然重链和轻链的可变结构域各自包含四个FR，它们大多采取β-折叠构象，通过形成环状连接且在有些情况中形成β-折叠结构一部分的三个高变区连接。每条链中的高变区通过FR非常接近的保持在一起，并与另一条链的高变区一起促成抗体的抗原结合位点的形成(参见Kabat等，Sequences of Proteins of Immunological Interest(免疫学感兴趣的蛋白质的序列)，第五版.Public Health Service(公共卫生署)，National Institutes ofHealth(国立卫生研究所)，Bethesda，MD.(1991))。恒定结构域不直接参与抗体与抗原的结合，但展现出多种效应器功能，如在抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)中抗体的参与。
术语“高变区”在用于本文时指抗体中负责抗原结合的氨基酸残基。高变区通常包含来自“互补决定区”或“CDR”的氨基酸残基(例如VL中大约为残基24-34(L1)、50-56(L2)和89-97(L3)附近，而VH中大约为残基26-35(H1)、50-65(H2)和95-102(H3)附近(在一个实施方案中，H1大约为残基31-35附近))；Kabat等，Sequences of Proteins of Immunological Interest(免疫学感兴趣的蛋白质的序列)，第五版.Public Health Service(公共卫生署)，National Institutes of Health(国立卫生研究所)，Bethesda，MD.(1991))和/或那些来自“高变环”的残基(例如VL中残基26-32(L1)、50-52(L2)和91-96(L3)，而VH中残基26-32(H1)、53-55(H2)和96-101(H3)；Chothia和Lesk J.Mol.Biol.(分子生物学杂志)196：901-917(1987))。
“框架区”(FR)是CDR残基之外的那些可变结构域残基。每个可变结构域通常具有鉴定为FR1、FR2、FR3和FR4的四个FR。如果所述CDR根据Kabat来定义，轻链FR残基大致位于残基1-23(LCFR1)，35-49(LCFR2)，57-88(LCFR3)，和98-107(LCFR4)，并且重链FR残基大致位于重链残基的残基1-30(HCFR1)，36-49(HCFR2)，66-94(HCFR3)，和103-113(HCFR4)。如果所述CDR包含来自高变环的氨基酸残基，轻链FR残基大致位于轻链中的残基1-25(LCFR1)，33-49(LCFR2)，53-90(LCFR3)，和97-107(LCFR4)，且重链FR残基大致位于重链残基的残基1-25(HCFR1)，33-52(HCFR2)，56-95(HCFR3)，和102-113(HCFR4)。有些情况下，当CDR包含来自根据Kabat定义的CDR和高变环的那些氨基酸时，FR残基会相应调节。例如，当CDRH1包括氨基酸H26-H35时，重链FR1残基在位点1-25且FR2残基在位点36-49。
“人共有框架”是指这样的框架，即在选择人免疫球蛋白VL或VH框架序列中，其代表最常出现的氨基酸残基。一般而言，对人免疫球蛋白VL或VH序列的选择是从可变结构域序列的亚群中选择。一般而言，该序列的亚群是如Kabat中的亚群。在一个实施方案中，对于VL，该亚群是如Kabat中的亚群κI。在一个实施方案中，对于VH，该亚群是如Kabat中的亚群III。
术语“单克隆抗体”在用于本文时指从一群基本上同质的抗体中获得的抗体，即除了可能的变体(该变体可在产生单克隆抗体的过程中出现，此类变体通常少量存在)之外，构成群体的各个抗体基本上相似并结合相同的表位。此类单克隆抗体典型的包括包含结合靶标的可变区的抗体，其中该抗体是通过包括从众多抗体中选择该抗体在内的过程得到的。例如，选择过程可以是从众多克隆诸如杂交瘤克隆、噬菌体克隆或重组DNA克隆的集合中选择独特克隆。应当理解，所选择的抗体可进一步改变，例如为了提高对靶标的亲和力、将抗体人源化、提高其在细胞培养物中的产量、降低其在体内的免疫原性、创建多特异性抗体等，而且包含改变后的可变区序列的抗体也是本发明的单克隆抗体。除它们的特异性外，单克隆抗体制备物的优势在于它们通常未受到其它免疫球蛋白的污染。修饰语“单克隆”表明抗体从基本上同质的抗体群获得的特征，不应解释为要求通过任何特定方法来生产抗体。例如，将根据本发明使用的单克隆抗体可通过多种技术来生成，包括杂交瘤法(例如，Kohler等，Nature(自然)，256：495(1975)；Harlow等，Antibodies：A Laboratory Manual(抗体：实验室指南)，(ColdSpring Harbor Laboratory Press，第二版.1988)；Hammerling等，在：Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas(单克隆抗体和T细胞杂交瘤)563-681，(Elsevier，N.Y.，1981)中、重组DNA法(参见例如，美国专利No.4,816,567)、噬菌体展示技术(参见例如，Clackson等，Nature(自然)，352：624-628(1991)；Marks等，J.Mol.Biol.(分子生物学杂志)，222：581-597(1991)；Sidhu等，J.Mol.Biol.(分子生物学杂志)338(2)：299-310(2004)；Lee等，J.Mol.Biol.(分子生物学杂志)340(5)：1073-1093(2004)；Fellouse，Proc.Nat.Acad.Sci.(美国科学院院刊)USA 101(34)：12467-12472(2004)；和Lee等J.Immunol.Methods(免疫学方法杂志)284(1-2)：119-132(2004)、及用于从具有部分或整个人免疫球蛋白基因座或编码人免疫球蛋白序列的基因的动物生成人或人样抗体的技术(参见例如，WO98/24893，WO/9634096，WO/9633735，和WO/9110741，Jakobovits等，Proc.Natl.Acad.Sci.(美国科学院院刊)USA，90：2551(1993)；Jakobovits等，Nature(自然)，362：255-258(1993)；Bruggemann等，Year in Immuno.(免疫学年鉴)，7：33(1993)；美国专利Nos.5,545,806、5,569,825、5,591,669(均为GenPharm的)；5,545,807；WO 97/17852、美国专利Nos.5,545,807；5,545,806；5,569,825；5,625,126；5,633,425；和5,661,016，和Marks等，Bio/Technology(生物/技术)，10：779-783(1992)；Lonberg等，Nature(自然)，368：856-859(1994)；Morrison，Nature(自然)，368：812-813(1994)；Fishwild等，NatureBiotechnology(自然：生物技术)，14：845-851(1996)；Neuberger，NatureBiotechnology(自然：生物技术)，14：826(1996)；和Lonberg和Huszar，Intern.Rev.Immunol.，13：65-93(1995)。
“完整”抗体是包含抗原结合位点和CL以及至少重链恒定结构域CH1、CH2和CH3的抗体。该恒定结构域可以是天然序列恒定结构域(例如人天然序列恒定结构域)或其氨基酸序列变体。优选地，该完整抗体具有一种或多种效应器功能。
“抗体片段”包含完整抗体的一部分，优选完整抗体的抗原结合区或可变区。抗体片段的例子包括Fab、Fab′、F(ab′)2和Fv片段；双价抗体；线性抗体(参见美国专利No.5,641,870，实施例2；Zapata等，Protein Eng.(蛋白质工程)8(10)：1057-1062(1995))；单链抗体分子；及由抗体片段形成的多特异性抗体。“线性抗体”的表述通常是指Zapata等，Protein Eng.(蛋白质工程)，8(10)：1057-1062(1995)描述的抗体。简言之，这些抗体包含一对串联的Fd片段(VH-CH1-VH-CH1)，其与互补的轻链多肽一起形成一对抗原结合区。线性抗体可以是双特异性的或单特异性的。
用木瓜蛋白酶消化抗体产生称作“Fab”片段的两个相同的抗原结合片段，和一个残余“Fc”片段，其名称反映了它易于结晶的能力。Fab片段由完整轻链及重链可变结构域(VH)和一条重链第一恒定结构域(CH1)组成。胃蛋白酶处理抗体产生一个较大F(ab’)2片段，它粗略相当于两个通过二硫键相连的Fab片段，具有二价抗原结合活性且仍能够交联抗原。Fab’片段因在CH1结构域的羧基末端增加了少数残基(包括来自抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸)而与Fab片段有所不同。Fab’-SH是本文中对其中恒定结构域的半胱氨酸残基携带一个游离硫醇基的Fab’的称谓。F(ab’)2抗体片段最初是作为成对Fab’片段生成的，在Fab’片段之间具有铰链半胱氨酸。抗体片段的其它化学偶联也是已知的。
Fc片段包含通过二硫键保持在一起的两条重链的羧基末端部分。抗体的效应器功能是由Fc区中的序列决定的，该区还是由在某些类型细胞上发现的Fc受体(FcR)所识别的部分。
“Fv”由紧密、非共价结合的一个重链可变结构域和一个轻链可变结构域的二聚体组成。从这两个结构域的折叠中突出了六个高变环(重链和轻链各3个环)，贡献出抗原结合的氨基酸残基并赋予抗体以抗原结合特异性。然而，即使是单个可变结构域(或只包含对抗原特异的三个CDR的半个Fv)也具有识别和结合抗原的能力，尽管亲和力通常低于完整结合位点。
“单链Fv”也可缩写为“sFv”或“scFv”，是包含抗体VH和VL结构域连接成一条多肽链的抗体片段。优选的是，sFv多肽在VH和VL结构域之间还包含多肽接头，使得sFv形成期望的抗原结合结构。关于sFv的综述参见Pluckthun于The Pharmacology of Monoclonal Antibodies(单克隆抗体药理学)，vol.113，Rosenburg和Moore编辑，Springer-Verlag，New York，pp.269-315(1994)；Borrebaeck 1995。
术语“双价抗体(diabodies)”是指如下制备的小抗体片段，通过使用短接头(大约5-10个残基)在VH和VL结构域之间构建sFv片段(见前段)从而获得该V结构域的链间而非链内配对而产生二价片段，即具有两种抗原结合位点的片段。双特异性双价抗体是两种“交叉”的sFv片段的异二聚体，其中两种抗体的VH和VL结构域存在于不同多肽链上。双价抗体在例如EP 404,097；WO 93/11161；和Hollinger等，Proc.Natl.Acad.Sci.(美国科学院院刊)USA，90：6444-6448(1993)中有更充分的描述。
非人(例如啮齿动物)抗体的“人源化”形式指最低限度包含衍生自非人抗体的序列的嵌合抗体。在极大程度上，人源化抗体指人免疫球蛋白(受体抗体)中的受体的高变区残基用具有期望抗体特异性、亲和力和能力的非人物种(供体抗体)诸如小鼠、大鼠、兔或非人灵长类动物的高变区残基替换的人免疫球蛋白。在有些情况中，将人免疫球蛋白的框架区(FR)残基用相应的非人残基替换。此外，人源化抗体可包含在受体抗体或供体抗体中没有找到的残基。进行这些修饰是为了进一步改进抗体的性能。一般而言，人源化抗体将包含基本上全部的至少一个、通常两个如下可变结构域，其中所有或基本上所有高变环对应于非人免疫球蛋白的高变环，且所有或基本上所有FR是人免疫球蛋白序列的FR。人源化抗体任选还将包含至少部分免疫球蛋白恒定区(Fc)，通常是人免疫球蛋白的恒定区。更多细节参见Jones等，Nature(自然)321：522-525(1986)；Riechmann等，Nature(自然)332：323-329(1988)；和Presta，Curr.Op.Struct.Biol.(结构生物学新观点)2：593-596(1992)。
本文所用的“密码子组”指用来编码理想的变异氨基酸的不同核苷酸三联体序列的组。可以合成寡核苷酸组，例如通过固相合成，包括代表由密码子组提供的并会编码理想的氨基酸组的核苷酸三联体的所有可能组合的序列。密码子命名的标准形式是本领域已知并且在本文有描述的IUB密码。密码子组通常用斜体的3个大写字母代表，例如NNK、NNS、XYZ、DVK等(例如NNK密码子是指在密码子中的1和2位点N＝A/T/G/C且在3位点K＝等摩尔比的G/T以编码所有20中天然氨基酸)。所以，本文所用的“非随机密码子组”指编码局部符合、优选完全符合本文描述的氨基酸选择标准的被选氨基酸的密码子组。合成在某些位点具有所选核苷酸“简并性”的寡核苷酸在本领域公知，例如TRIM方法(Knappek等，J.Mol.Biol(分子生物学杂志).296：57-86，1999)；Garrard和Henner，Gene(基因)128：103，1993)。带有特定密码子组的这些组寡核苷酸可以用可商购的核酸合成仪(例如得自Applied Biosystems，Foster City，CA)来合成，或可以购买(例如从Life Technologies，Rockville，MD)。因此，合成具有具体密码子组的寡核苷酸组通常包括具有不同序列的多个寡核苷酸，该不同是由于整体序列内的密码子组产生的。本发明所用的寡核苷酸具有可杂交到可变结构域核酸模板，并且能够但不是必须包括用于例如克隆目的的限制性酶位点的序列。
“结合”目的抗原的本发明的抗体是这样的抗体，其与抗原以足够的亲和力结合，从而该抗体可用作靶向蛋白质或表达该抗原的细胞或组织的诊断和/或治疗剂，并且其不显著与其它蛋白交叉反应。在此类实施方案中，抗体对“非靶标”蛋白结合的程度将小于该抗体与其特定靶标蛋白结合的约10％，这可通过荧光激活细胞分选(FACS)分析或放射免疫沉淀(RIA)或ELISA确定。关于抗体与靶标分子的结合，术语“特异性结合”或“特异性结合至”或“特异于”特定多肽或特定多肽靶标上的表位指可测量出不同于非特异性相互作用的结合(例如，对于bH1-44或bH1-81，非特异性相互作用是对牛血清白蛋白、酪蛋白、胎牛血清、或中性抗生物素蛋白(Neutravidin)的结合)。特异性结合可通过例如测定分子的结合并与对照分子的结合比较来确定。例如，特异性结合可通过与对照分子的竞争来测定，所述对照分子与靶标相似，例如与过量的未标记靶标竞争。在这种情况中，若经标记靶标与探针的结合受到过量未标记靶标的竞争性抑制，则指示特异性结合。用于本文时，术语“特异性结合”或“特异性结合至”或“特异于”特定多肽或特定多肽靶标上的表位可通过下述分子显示，该分子对该靶标具有的Kd为至少大约200nM、备选地至少大约150nM、备选地至少大约100nM、备选地至少大约60nM、备选地至少大约50nM、备选地至少大约40nM、备选地至少大约30nM、备选地至少大约20nM、备选地至少大约10nM、备选地至少大约8nM、备选地至少大约6nM、备选地至少大约4nM、备选地至少大约2nM、备选地至少大约1nM、或更大。在一个实施方案中，该术语“特异性结合”指如下结合，其中分子结合特定多肽或特定多肽上的表位而基本上不结合任何其它多肽或多肽表位。
“结合亲和力”通常指分子(例如抗体)的单一结合位点与其结合配偶体(例如抗原)之间全部非共价相互作用总和的强度。除非另有说明，在用于本文时，“结合亲和力”指反映结合对的成员(例如抗体与抗原)之间1∶1相互作用的内在结合亲和力。分子X对其配偶体Y的亲和力通常可用解离常数(Kd)来表述。理想地，该Kd是大约200nM、150nM、100nM、60nM、50nM、40nM、30nM、20nM、10nM、8nM、6nM、4nM、2nM、1nM、或更强。亲和力可通过本领域知道的常用方法来测量，包括本文中所描述的。低亲和力抗体通常缓慢的结合抗原且趋于容易解离，而高亲和力抗体通常更快速的结合抗原且趋于保持更长时间的结合。本领域知道测量结合亲和力的多种方法，其中任一种都可用于本发明的目的。
在一个实施方案中，根据本发明的“Kd”或“Kd值”是通过表面等离子共振测定法使用BIAcoreTM-2000或BIAcoreTM-3000(BIAcore，Inc.，Piscataway，NJ)在25℃使用固定化抗原CM5芯片在约10个应答单位(RU)测量的。简而言之，依照供应商的说明书用盐酸N-乙基-N’-(3-二甲基氨基丙基)-碳化二亚胺(EDC)和N-羟基-琥珀酰亚胺(NHS)活化羧甲基化右旋糖苷生物传感器芯片(CM5，BIAcore Inc.)。用10mM乙酸钠pH4.8将抗原稀释至5μg/ml(约0.2μM)，然后以5μl/分钟的流速注入至获得约10个应答单位(RU)的偶联蛋白质。注入抗原后，注入1M乙醇胺以封闭未反应基团。为了进行动力学测量，在25℃以约25μl/分钟的流速注入在含0.05％Tween20的PBS(PBST)中的两倍连续稀释的Fab(例如0.78nM至500nM)。使用简单一对一朗格缪尔(Langmuir)结合模型(BIAcore Evaluation Softwareversion 3.2)通过同时拟合结合和解离传感图计算结合速率(kon)和解离速率(koff)。平衡解离常数(Kd)以比率koff/kon计算。参见例如Chen，Y.等，(1999)J.Mol.Biol.(分子生物学杂志)293：865-881。如果根据上文表面等离子共振测定法，结合速率超过106M-1S-1，那么结合速率可使用荧光淬灭技术来测定，即根据分光计诸如配备了断流装置的分光光度计(stop-flow equippedspectrophometer)(Aviv Instruments)或8000系列SLM-Aminco分光光度计(ThermoSpectronic)中用搅拌比色杯(stirred cuvette)的测量，在存在浓度渐增的抗原的条件下，测量PBS，pH 7.2中的20nM抗-抗原抗体(Fab形式)在25℃的荧光发射强度(激发＝295nm；发射＝340nm，16nm带通)的升高或降低。
根据本发明的“结合速率”(on-rate，rate of association，association rate)或“kon”也可如上所述使用BIAcoreTM-2000或BIAcoreTM-3000(BIAcore，Inc.，Piscataway，NJ)利用相同的表面等离子共振技术，在25℃利用固定的抗原CM5芯片以约10个应答单位(RU)来测定。简而言之，依照供应商的说明书用盐酸N-乙基-N’-(3-二甲基氨基丙基)-碳化二亚胺(EDC)和N-羟基-琥珀酰亚胺(NHS)活化羧甲基化右旋糖苷生物传感器芯片(CM5，BIAcore Inc.)。用10mM乙酸钠pH4.8将抗原稀释至5μg/ml(约0.2μM)，然后以5μl/分钟的流速注入至获得约10个应答单位(RU)的偶联蛋白质。注入抗原后，注入1M乙醇胺以封闭未反应基团。为了进行动力学测量，在25℃以约25μl/分钟的流速注入在含0.05％Tween 20的PBS(PBST)中的两倍连续稀释的Fab(例如0.78nM至500nM)。使用简单一对一朗格缪尔(Langmuir)结合模型(BIAcore Evaluation Software version 3.2)通过同时拟合结合和解离传感图计算结合速率(kon)和解离速率(koff)。平衡解离常数(Kd)以比率koff/kon计算。参见例如Chen，Y.等，(1999)J.Mol.Biol.(分子生物学杂志)293：865-881。然而，如果根据上文表面等离子共振测定法，结合速率超过106M-1S-1，那么结合速率优选地使用荧光淬灭技术来测定，即根据分光计诸如配备了断流装置的分光光度计(stop-flow equippedspectrophometer)(Aviv Instruments)或8000系列SLM-Aminco分光光度计(ThermoSpectronic)中用搅拌比色杯的测量，在存在浓度渐增的抗原的条件下，测量PBS，pH 7.2中的20nM抗-抗原抗体(Fab形式)在25℃的荧光发射强度(激发＝295nm；发射＝340nm，16nm带通)的升高或降低。
关于本发明多肽的“有生物学活性的”和“生物学活性”和“生物学特征”的意思是具有结合至生物分子的能力，除非另有说明。
“生物分子”是指核酸、蛋白质、碳水化合物、脂质、及其组合。在一个实施方案中，生物分子天然存在。
在用于描述本文中所公开的各种抗体时，“分离的”指已经鉴定且从其表达所在的细胞或细胞培养物中分开和/或回收的抗体。其天然环境的污染性成分指通常会干扰该多肽的诊断或治疗用途的物质，可包括酶、激素、和其它蛋白质性质或非蛋白质性质的溶质。在优选的实施方案中，将该抗体纯化至(1)足以通过使用转杯式测序仪获得至少15个残基的N-末端或内部氨基酸序列的程度，或(2)根据使用考马斯蓝(或优选银染)非还原性或还原性条件下的SDS-PAGE达到同质。由于多肽天然环境的至少一种成分不会存在，因此分离的抗体包括重组细胞内的原位抗体。然而，分离的多肽通常通过至少一个纯化步骤来制备。
术语“控制序列”指在特定宿主生物体中表达可操作连接的编码序列所必需的DNA序列。例如，适于原核生物的控制序列包括启动子、任选的操纵基因序列、和核糖体结合位点。已知真核细胞能利用启动子、多腺苷酸化信号、和增强子。
若核酸与另一核酸序列处于功能性关系中，则该核酸是“可操作连接”的。例如，若前序列或分泌前导序列的DNA表达成参与多肽分泌的前蛋白，则它与该多肽的DNA可操作连接；若启动子或增强子影响编码序列的转录，则它与该序列可操作连接；或者，若核糖体结合位点的位置促进翻译，则它与编码序列可操作连接。通常，“可操作连接″指相连的DNA序列是相邻的，而且在分泌前导序列的情况中指相邻且处于相同阅读框中。然而，增强子不必相邻。连接可通过在方便的限制性位点处的连接反应来实现。如果没有此类位点，那么可依照常规实践使用合成的寡核苷酸衔接头或接头。
关于本文鉴定的多肽序列的“百分比(％)氨基酸序列同一性”，定义为将候选序列与被比较的多肽序列进行比对(并在必要时导入空隙以获取最大百分比的序列同一性，且不将任何保守置换视为序列同一性的部分)之后，候选序列中的氨基酸残基与被比较的多肽序列中的氨基酸残基相同的百分数。可使用本领域各种方法进行序列比对以便测定氨基酸序列同一性百分比，例如，使用公众可得到的计算机软件如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件。本领域技术人员可以决定测量比对的适当参数，包括对所比较的序列全长获得最大比对所需的任何算法。然而，为此目的，氨基酸序列同一性％值使用序列比较计算机程序ALIGN-2产生。ALIGN-2序列比对计算机程序的作者是Genentech，Inc.，该源代码和用户资料一起已经提交美国版权局(Washington D.C.，20559)，其美国版权注册登记号为TXU510087。公众可通过Genentech，Inc.(South San Francisco，California)得到ALIGN-2程序。ALIGN-2程序应当为在UNIX操作系统，优选在数码UNIXV4.0D使用而进行编制。ALIGN-2程序设定了所有序列比对参数并且不变。
本文描述的氨基酸序列是连续的氨基酸序列，除非另有说明。
根据本发明的“结构上不相似”的生物分子是指不是相同类别的生物分子(蛋白质、核酸、脂质、碳水化合物等)，或者，例如当指蛋白时，相互之间比较，具有低于60％的氨基酸同一性、低于50％的氨基酸同一性、低于40％的氨基酸同一性、低于30％的氨基酸同一性、低于20％的氨基酸同一性或低于10％的氨基酸同一性。
杂交反应的“严格性”可以容易地由本领域普通技术人员确定，而且通常凭经验根据探针长度、洗涤温度、和盐浓度来计算。通常，较长的探针要求较高的温度以正确退火，而较短的探针需要较低的温度。杂交通常依赖于互补链存在于低于其解链温度的环境中时变性DNA重新退火的能力。探针和可杂交序列之间所期望的同源性程度越高，可使用的相对温度也越高。因此可以认为，较高相对温度将趋向于使反应条件更为严格，而较低温度也就较不严格。关于杂交反应严格性的其它细节和解释，参见Ausubel等，Current Protocols in Molecular Biology(现代分子生物学实验方 案)，Wiley Interscience Publishers，(1995)。
本文中所定义的“严格条件”或“高严格性条件”可如下确定：(1)采用低离子强度和高温进行洗涤，例如0.015M氯化钠/0.0015M柠檬酸钠/0.1％十二烷基硫酸钠，50℃；(2)在杂交过程中采用变性剂，诸如甲酰胺，例如50％(v/v)甲酰胺及0.1％牛血清白蛋白/0.1％Ficoll/0.1％聚乙烯吡咯烷酮/50mM磷酸钠缓冲液pH 6.5，含750mM氯化钠、75mM柠檬酸钠，42℃；或(3)在采用50％甲酰胺、5XSSC(0.75M NaCl，0.075M柠檬酸钠)、50mM磷酸钠(pH 6.8)、0.1％焦磷酸钠、5X Denhardt氏溶液、超声波处理的鲑鱼精DNA(50μg/ml)、0.1％SDS、和10％硫酸右旋糖苷的溶液中于42℃杂交过夜，并在42℃于0.2XSSC(氯化钠/柠檬酸钠)中洗涤10分钟，接着在含EDTA的0.1XSSC中于55℃进行10分钟高严格性洗涤。
“中等严格条件″可以如Sambrook等，Molecular Cloning：A LaboratoryManual(分子克隆：实验室指南)，New York：Cold Spring Harbor Press，1989所述来鉴定，包括使用比上文所述较不严格的洗涤溶液和杂交条件(例如温度、离子强度和％SDS)。中等严格条件的一个例子是于37℃在含20％甲酰胺、5XSSC(150mM NaCl，15mM柠檬酸三钠)、50mM磷酸钠(pH 7.6)、5X Denhardt氏溶液、10％硫酸右旋糖苷、和20mg/ml变性剪切的鲑鱼精DNA的溶液中温育过夜，接着在1XSSC中于约37-50℃洗涤滤膜。技术人员将认识到如何根据需要来调整温度、离子强度等以适应诸如探针长度等因素。
抗体“效应器功能”指那些可归于抗体Fc区(天然序列Fc区或氨基酸序列变体Fc区)的生物学活性，且其随抗体同种型而变化。抗体效应器功能的例子包括：C1q结合和补体依赖性细胞毒性；Fc受体结合；抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)；吞噬作用；细胞表面受体(例如B细胞受体)的下调；和B细胞活化。
“抗体依赖性细胞介导的细胞毒性”或“ADCC”指如下细胞毒性形式，其中某些细胞毒性细胞(例如天然杀伤(NK)细胞、嗜中性粒细胞和巨噬细胞)上存在的Fc受体(FcR)所结合的分泌型Ig使这些细胞毒性效应细胞特异性结合携带抗原的靶细胞，随后用细胞毒素杀死该靶细胞。所述抗体“武装”细胞毒性细胞，而且绝对是这类杀伤所必需的。介导ADCC的主要细胞(NK细胞)只表达FcγRIII，而单核细胞表达FcγRI、FcγRII和FcγRIII。Ravetch和Kinet，Annu.Rev.Immunol.(免疫学年度评论)9：457-92(1991)的464页表3总结了造血细胞上的FcR表达。为了评估目的分子的ADCC活性，可进行体外ADCC测定法，诸如美国专利No.5,500,362或5,821,337中所记载的。可用于此类测定法的效应细胞包括外周血单核细胞(PBMC)和天然杀伤(NK)细胞。备选地或额外地，可在体内评估目的分子的ADCC活性，例如在动物模型中，诸如Clynes等Proc.Natl.Acad.Sci.(美国科学院院刊)U.S.A.95：652-656(1998)所披露的。
“Fc受体”或“FcR”描述与抗体Fc区结合的受体。优选的FcR是天然序列的人FcR。此外，优选的FcR是与IgG抗体结合的FcR(γ受体)，而且其包括FcγRI，FcγRII和FcγRIII亚类的受体，包括这些受体的等位变体和可变剪接形式。FcγRII受体包括FcγRIIA(“活化受体”)和FcγRIIB(“抑制受体”)，它们具有相似的氨基酸序列，区别主要在于其胞质结构域。活化受体FcγRIIA在其胞质结构域中包含免疫受体基于酪氨酸的活化基序(ITAM)。抑制受体FcγRIIB在其胞质结构域中包含免疫受体基于酪氨酸的抑制基序(ITIM)(参见综述M.inAnnu.Rev.Immunol.(免疫学年度评论)15：203-234(1997))。FcR的综述参见Ravetch和Kinet，Annu.Rev.Immunol.(免疫学年度评论)9：457-492(1991)；Capel等，Immunomethods(免疫方法)4：25-34(1994)；和de Haas等，J.Lab.Clin.Med.(实验室临床医学杂志)126：330-41(1995)。术语“FcR”在本文中涵盖其它FcR，包括未来将会鉴定的FcR。该术语还包括新生儿受体(FcRn)，它负责将母体的IgG转移给胎儿(Guyer等，J.Immunol.(免疫学杂志)117：587(1976)和Kim等，J.Immunol.(免疫学杂志)24：249(1994))。
“人效应细胞”指表达一种或多种FcR并执行效应器功能的白细胞。优选的是，该细胞至少表达FcγRIII并执行ADCC效应器功能。介导ADCC的人白细胞的例子包括外周血单核细胞(PBMc)、天然杀伤(NK)细胞、单核细胞、细胞毒性T细胞和嗜中性粒细胞；其中优选PBMC和NK细胞。效应细胞可以从天然来源，例如从血液分离。
“补体依赖性细胞毒性”或“CDC”指存在补体时靶细胞的溶解作用。经典补体途径的激活是由补体系统第一组分(C1q)结合与其同族抗原结合的(适当子类的)抗体起始的。为了评估补体激活，可进行CDC测定法，例如Gazzano-Santoro等，J.Immunol.Methods(免疫学方法杂志)202：163(1996)所记载的。
术语“治疗有效量”指治疗受试者中疾病或病症的抗体或抗体片段的量。对于癌症(例如癌性肿瘤)，抗体或抗体片段(例如特异性结合HER2和VEGF的多特异性抗体或抗体片段)的治疗有效量可减少癌细胞数量；减小原发性肿瘤大小；抑制(即减慢到一定程度并优选停止)癌细胞浸润到周围器官中；抑制(即减慢到一定程度并优选停止)肿瘤转移；在一定程度抑制肿瘤生长；和/或在一定程度上缓解一或多种与病症相关的症状。抗体或抗体片段在达到可以预防现存癌细胞生长和/或杀死现存癌细胞的程度时，其可为细胞生长抑制性和/或细胞毒性的。对于癌症治疗，体内效力可以通过，例如评价存活期、疾病进展时间(TTP)、应答率(RR)、应答期、和/或生活质量来测量。
“减小或抑制”的意思是导致优选地20％或更高、更优选地50％或更高、并且最优选地75％、85％、90％、95％、或更高的总体降低。减小或抑制可以涉及在治疗的病症的症状、转移灶的存在或大小、原发性肿瘤的大小、或血管原性病症中血管的大小或数目。
术语“癌症”和“癌性”是指或者描述哺乳动物中一般特征在于细胞生长/增殖不受调控的生理学状态。包含于这种定义的是良性和恶性癌症。癌症的例子包括，但不限于，癌(carcinoma)、淋巴瘤(lymphoma)、母细胞瘤(blastoma)、肉瘤(sarcoma)和白血病(leukemia)。这类癌症的更具体的例子包括鳞状细胞癌(squamous cell cancer)、小细胞肺癌(small-cell lungcancer)、非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer)、肺腺癌(adenocarcinomaof the lung)、肺鳞癌(squamous carcinoma of the lung)、腹膜癌(cancer of theperitoneum)、肝细胞癌(hepatocellular cancer)、胃的或胃癌(gastric or stomachcancer)包括胃肠癌(gastrointestinal cancer)、胰腺癌(pancreatic cancer)、成胶质细胞瘤(glioblastoma)、神经胶质瘤(glioma)、宫颈癌(cervical cancer)、卵巢癌(ovarian cancer)、肝癌(liver cancer)、膀胱癌(bladder cancer)、肝细胞瘤(hepatoma)、乳腺癌(breast cancer)、结肠癌(colon cancer)、结肠直肠癌(colorectal cancer)、子宫内膜或子宫癌(endometrial or uterine carcinoma)、唾液腺癌(salivary gland carcinoma)、肾癌(kidney cancer)例如肾细胞癌(renalcell carcinoma))、肝癌(liver cancer)、前列腺癌(prostate cancer)、外阴癌(vulval cancer)、甲状腺癌(thyroid cancer)、肝癌(hepatic carcinoma)、肛门癌(anal carcinoma)、阴茎癌(penile carcinoma)、黑素瘤(melanoma)、和各种类型的头和颈癌(head and neck cancer)。
“癌症早期”的意思是无侵袭性或转移性的癌症，或分类为0、I、或II期的癌症。
术语“癌前”是指一般在癌症之前或发展成癌症的状态或生长。
“非转移性”是指癌症是良性的，或保持在原发位点并且未侵入淋巴或血管系统或原发位点以外的其它组织。一般而言，非转移性癌症是0、I、或II期癌症中的任何癌症，并且有时是III期癌症。
“涉及HER2异常激活的非恶性疾病或病症”是一种不包括癌症的病况，其中在患有、或倾向于患有该疾病或病症的受试者的细胞或组织中发生HER2的异常激活。所述疾病或病症的实例包括自身免疫性疾病(autoimmune disease)(例如，银屑病(psoriasis))，参见下述定义；子宫内膜异位症(endometriosis)；硬皮病(scleroderma)；再狭窄(restenosis)；息肉(polyps)如结肠息肉(colon polyps)、鼻息肉(nasal polyps)或胃肠息肉(gastrointestinal polyps)；纤维腺瘤(fibroadenoma)；呼吸道疾病(respiratorydisease)(例如、慢性支气管炎(chronic bronchitis)、哮喘(asthma)包括急性哮喘(acute asthma)和过敏性哮喘(allergic asthma)、胆囊纤维化(cystic fibrosis)、支气管扩张(bronchiectasis)、过敏性或其它鼻炎或窦炎(allergic or otherrhinitis or sinusitis)、α1-抗胰蛋白酶缺乏症(α1-anti-trypsin deficiency)、咳嗽(coughs)、肺气肿(pulmonary emphysema)、肺纤维化(pulmonary fibrosis)或高反应性呼吸道病(hyper-reactive airways)、慢性阻塞性肺病(chronicobstructive pulmonary disease)、和慢性阻塞性肺部病症(chronic obstructivelung disorder))；胆囊炎(cholecystitis)；神经纤维瘤病(neurofibromatosis)；多囊肾病(polycystic kidney disease)；炎性疾病(inflammatory diseases)；皮肤病症(skin disorders)，其包括银屑病(psoriasis)和皮炎(dermatitis)；血管病(vascular disease)；涉及血管上皮细胞异常增生的病症；胃肠溃疡(gastrointestinal ulcers)；梅内特里耶病(Menetrier′s disease)、分泌性腺瘤(secreting adenomas)或蛋白损失综合征(protein loss syndrome)；肾病(renaldisorders)；血管源性病症(angiogenic disorders)；眼病(ocular disease)，诸如年龄相关的黄斑变性(age related macular degeneration)、推定的眼组织胞浆菌病综合征(presumed ocular histoplasmosis syndrome)、由增生性糖尿病视网膜病导致的视网膜新血管形成(retinal neovascularization fromproliferative diabetic retinopathy)、视网膜血管化(retinal vascularization)、糖尿病视网膜病(diabetic retinopathy)、或年龄相关的黄斑变性(age relatedmacular degeneration)；骨相关的病理(bone associated pathologies)，如骨关节炎(osteoarthritis)、佝偻病(rickets)和骨质疏松症(osteoporosis)；脑缺血性事件后的损伤(damage following a cerebral ischemic event)；纤维变性或水肿疾病(fibrotic or edemia diseases)，诸如肝硬化(hepatic cirrhosis)、肺纤维化(lung fibrosis)、肉样瘤病(carcoidosis)、甲状腺炎(throiditis)、系统性高粘稠度综合征(hyperviscosity syndrome systemic)、奥斯陆韦伯朗迪病(OslerWeber-Rendu disease)、慢性阻塞性肺病(chronic occlusive pulmonarydisease)、或烧伤(burns)、外伤(trauma)、辐射(radiation)、中风(stroke)、缺氧(hypoxia)或缺血(ischemia)后的水肿；皮肤的超敏反应(hypersensitivityreaction of the skin)；糖尿病视网膜病(diabetic retinopathy)和糖尿病肾病(diabetic nephropathy)；吉兰-巴雷综合征(Guillain-Barre syndrome)；移植物抗宿主病(graft versus host disease)或移植排斥(transplant rejection)；佩吉特病(Paget′s disease)；骨或关节炎症(bone or ioint inflammation)；光老化(photoaging)(例如，由对人皮肤的UV辐射引起的光老化)；良性前列腺肥大(benign prostatic hypertrophy)；某些微生物感染(certain microbialinfections)，包括选自下列各项的微生物病原体：腺病毒(adenovirus)、汉坦病毒属(hantaviruses)、伯氏疏螺旋体(Borrelia burgdorferi)、耶尔森菌属物种(Yersinia spp.)和百日咳博德特氏菌(Bordetella pertussis)；由血小板聚集引起的血栓(thrombus)；生殖病症(reproductive conditions)，如子宫内膜异位症(endometriosis)、卵巢过度刺激综合征(ovarian hyperstimulationsyndrome)、先兆子痫(preeclampsia)、功能障碍性子宫出血(dysfunctionaluterine bleeding)、或月经频多(menometrorrhagia)；滑膜炎(synovitis)；粥样斑(atheroma)；急性和慢性肾病(acute and chronic nephropathies)(包括增生性肾小球肾炎(proliferative glomerulonephritis)和糖尿病诱导的肾病(diabetes-induced renal disease))；湿疹(eczema)；肥厚性瘢痕形成(hypertrophic scar formation)；内毒素性休克(endotoxic shock)和真菌感染(fungal infection)；家族性腺瘤病息肉病(familial adenomatosis polyposis)；神经变性病(neurodedenerative diseases)(例如，阿尔茨海默病(Alzheimer′sdisease)、艾滋病相关的痴呆(AIDS-related dementia)、帕金森病(Parkinson′sdisease)、肌萎缩侧索硬化(amyotrophic lateral sclerosis)、色素性视网膜炎(retinitis pigmentosa)、脊髓性肌萎缩(spinal muscular atrophy)和小脑变性(cerebellar degeneration))；骨髓增生异常综合征(myelodysplasticsyndromes)；再生障碍性贫血(aplastic anemia)；缺血性损伤(ischemicinjury)；肺、肾或肝的纤维化(fibrosis ofthe lung、kidney or liver)；T细胞介导的过敏性疾病(T-cell mediated hypersensitivity disease)；婴儿肥厚性幽门狭窄(infantile hypertrophic pyloric stenosis)；尿路阻塞综合征(urinaryobstructive syndrome)；银屑病关节炎(psoriatic arthritis)；和桥本甲状腺炎(Hasimoto′s thyroiditis)。
本文的“自身免疫性疾病(autoimmune disease)”是这样的疾病或病症，由个体自身的组织引起或针对个体自身的组织或其共分离或表现或由其导致的病况。自身免疫性疾病或病症的实例包括、但不限于关节炎(类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis)，如急性关节炎(acute arthritis)、慢性类风湿性关节炎(chronic rheumatoid arthritis)、痛风性关节炎(gouty arthritis)、急性痛风性关节炎(acute gouty arthritis)、慢性炎性关节炎(chronic inflammatoryarthritis)、退行性关节炎(degenerative arthritis)、感染性关节炎(infectiousarthritis)、莱姆关节炎(Lyme arthritis)、增生性关节炎(proliferative arthritis)、银屑病关节炎(psoriatic arthritis)、脊椎关节炎(vertebral arthritis)、和青少年发作的类风湿性关节炎(juvenile-onset rheumatoid arthritis)、骨关节炎(osteoarthritis)、慢性进展性关节炎(arthritis chronica progrediente)、畸形关节炎(arthritis deformans)、慢性原发性多关节炎(polyarthritis chronicaprimaria)、反应性关节炎(reactive arthritis)、和强直性脊椎炎(ankylosingspondylitis))、炎性过增生性皮肤病(inflammatory hyperproliferative skindiseases)、银屑病(psoriasis)，诸如斑块状银屑病(plaque psoriasis)、滴状银屑病(gutatte psoriasis)、脓疮性银屑病(pustular psoriasis)、和指甲银屑病(psoriasis of the nails)、皮炎(dermatitis)，其包括接触性皮炎(contactdermatitis)、慢性接触性皮炎(chronic contact dermatitis)、变应性皮炎(allergicdermatitis)、变应性接触性皮炎(allergic contact dermatitis)、dermatitisherpetiformis、和特应性皮炎(atopic dermatitis)、x-连锁的高IgM综合征(x-linked hyper IgM syndrome)、荨麻疹(urticaria)，诸如慢性变应性荨麻疹(chronic allergic urticaria)和慢性特发性荨麻疹(chronic idiopathic urticaria)、其包括慢性自身免疫性荨麻疹(chronic autoimmune urticaria)、多肌炎(polymyositis)/皮肌炎(dermatomyositis)、青少年型皮肌炎(juveniledermatomyositis)、中毒性表皮坏死松解症(toxic epidermal necrolysis)、硬皮病(scleroderma)(包括系统性硬皮病(systemic scleroderma))、硬化病(sclerosis)，诸如系统性硬化病(systemic sclerosis)、多发性硬化病(multiplesclerosis)(MS)，如脊髓-视觉MS(spino-optical MS)、原发性进行性MS(primary progressive MS，PPMS)、和复发性缓和性MS(relapsingremitting MS，RRMS)、进行性系统性硬化病(progressive systemic sclerosis)、动脉粥样硬化(atherosclerosis)、动脉硬化(arteriosclerosis)、多发性硬化(sclerosis disseminata)、和共济失调硬化病(ataxic sclerosis)、炎性肠病(inflammatory bowel disease，IBD)(例如、局限性回肠炎(Crohn′s disease)、自身免疫介导的胃肠病(autoimmune-mediated gastrointestinal diseases)、结肠炎(colitis)，诸如溃疡性结肠炎(ulcerative colitis)、溃疡性结肠炎(colitisulcerosa)、微观结肠炎(microscopic colitis)、胶原性结肠炎(collagenouscolitis)、息肉状结肠炎(colitis polyposa)、坏死性小肠结肠炎(necrotizingenterocolitis)、和透壁性结肠炎(transmural colitis)、和自身免疫性炎性肠病(autoimmune inflammatory bowel disease))、坏疽性脓皮病(pyodermagangrenosum)、结节性红斑(erythema nodosum)、原发性硬化性胆管炎(primary sclerosing cholangitis)、巩膜外层炎(episcleritis))、呼吸窘迫综合征(respiratory distress syndrome)，包括成人或急性呼吸窘迫综合征(adult oracute respiratory distress syndrome，ARDS)、脑膜炎(meningitis)、全部或部分葡萄膜炎症(inflammation of all or part of the uvea)、虹膜炎(iritis)、脉络膜炎(choroiditis)、自身免疫性血液病症(an autoimmune hematologicaldisorder)、类风湿性脊柱炎(rheumatoid spondylitis)、突发性听觉丧失(suddenhearing loss)、IgE-介导的疾病(IgE-mediated diseases)，诸如过敏反应(anaphylaxis)与变应性和特异性鼻炎(allergic and atopic rhinitis)、脑炎(encephalitis)，诸如Rasmussen′s脑炎(Rasmussen′s encephalitis)和边缘叶和/或脑干脑炎(limbic and/or brainstem encephalitis)、葡萄膜炎(uveitis)、如前葡萄膜炎(anterior uveitis)、急性前葡萄膜炎(acute anterior uveitis)、肉芽肿性葡萄膜炎(granulomatous uveitis)、非肉芽肿性葡萄膜炎(nongranulomatousuveitis)、晶状体抗原性葡萄膜炎(phacoantigenic uveitis)、后葡萄膜炎(posterior uveitis)、或自身免疫性葡萄糖膜炎(autoimmune uveitis)、具有和不具有肾病综合征(nephrotic syndrome)的肾小球肾炎(glomerulonephritis)(GN)，诸如慢性或急性肾小球肾炎(chronic or acuteglomerulonephritis)，如原发性GN(primary GN)、免疫介导的GN(immune-mediated GN)、膜性GN(membranous GN)(膜性肾病(membranous nephropathy))、特发性膜性GN(idiopathic membranous GN)或特发性膜性肾病(idiopathic membranous nephropathy)、膜或膜性增生性GN(membrano-or membranous proliferative GN)(MPGN)、其包括I型和II型、和迅速进行性GN(rapidly progressive GN)、过敏性病症(allergicconditions)、变态反应(allergic reaction)、湿疹(eczema)，其包括变应性或特应性湿疹(allergic or atopic eczema)、哮喘(asthma)如支气管哮喘(asthmabronchiale)、支气管哮喘(bronchial asthma)、和自身免疫性哮喘(auto-immuneasthma)、涉及T细胞浸润和慢性炎症反应的病症(conditions involvinginfiltration of T cells and chronic inflammatory responses)、慢性肺炎性病(chronic pulmonary inflammatory disease)、自身免疫性心肌炎(autoimmunemyocarditis)、白细胞黏附不足(leukocyte adhesion deficiency)、系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus)(SLE)或系统性红斑狼疮(systemic lupuserythematodes)诸如皮肤性SLE(cutaneous SLE)、亚急性皮肤性红斑狼疮(subacute cutaneous lupus erythematosus)、新生儿狼疮综合征(neonatal lupussyndrome)(NLE)、播散性红斑狼疮(lupus erythematosus disseminatus)、狼疮(lupus)(包括肾炎(nephritis)、大脑炎(cerebritis)、儿童(pediatric)狼疮、非肾(non-renal)狼疮、肾外(extra-renal)狼疮、盘状(discoid)狼疮、脱发(alopecia)狼疮)、青少年发作型(I型)糖尿病(juvenile onset(Type I)diabetes mellitus)、包括儿童胰岛素依赖性糖尿病(pediatric insulin-dependent diabetesmellitus)(IDDM)、成年型糖尿病(adult onset diabetes mellitus)(II型糖尿病)、自身免疫性糖尿病(autoimmune diabetes)、特发性尿崩症(idiopathic diabetesinsipidus)、与由细胞因子和T淋巴细胞介导的急性和迟发型超敏反应(acuteand delayed hypersensitivity)相关的免疫应答、肺结核(tuberculosis)、结节病(sarcoidosis)、肉芽肿病(granulomatosis)，包括淋巴瘤样肉芽肿病(lymphomatoid granulomatosis)、韦格纳肉芽肿病(Wegener′sgranulomatosis)、粒细胞缺乏(agranulocytosis)、血管炎病(vasculitides)、包括脉管炎(vasculitis)(包括大血管脉管炎(large vessel vasculitis)(包括风湿性多肌痛(polymyalgia rheumatica)和巨大细胞(高安)动脉炎(giant cell(Takayasu′s)arteritis))、中血管脉管炎(medium vessel vasculitis)(包括川崎病(Kawasaki′s disease)和结节性多发性动脉炎(polyarteritis nodosa))、微观多发性动脉炎(microscopic polyarteritis)、CNS血管炎(CNS vasculitis)、坏死性、皮肤性、或超敏性血管炎(necrotizing、cutaneous、or hypersensitivityvasculitis)、系统性坏死性血管炎(systemic necrotizing vasculitis)、和ANCA-相关性血管炎(ANCA-associated vasculitis)、诸如丘-施血管炎或综合征(Churg-Strauss vasculitis or syndrome)(CSS))、颞动脉炎(temporal arteritis)、再生障碍性贫血(aplastic anemia)、自身免疫性再生障碍性贫血(autoimmuneaplastic anemia)、Coombs阳性贫血(Coombs positive anemia)、戴-布贫血(Diamond Blackfan anemia)、溶血性贫血(hemolytic anemia)或免疫性溶血性贫血(immune hemolytic anemia)，包括自身免疫性溶血性贫血(autoimmunehemolytic anemia)(AIHA)、恶性贫血(pernicious anemia(anemia perniciosa))、艾迪生病(Addison′s disease)、单纯红细胞性贫血或发育不良(pure red cellanemia or aplasia)(PRCA)、因子VIII缺乏(Factor VIII deficiency)、血友病A(hemophilia A)、自身免疫性中性粒细胞减少(autoimmune neutropenia)、全血细胞减少(pancytopenia)、白细胞减少(leukopenia)、涉及白细胞血细胞渗出的疾病(diseases involving leukocyte diapedesis)、CNS炎性病症(CNSinflammatory disorders)、多器官损伤综合征(multiple organ injurysyndrome)，诸如继发败血病(septicemia)、外伤(trauma)或出血(hemorrhage)的那些、抗原-抗体复合物介导的疾病、抗肾小球基底膜病(anti-glomerularbasement membrane disease)、抗磷脂抗体综合征(anti-phospholipid antibodysyndrome)、变应性神经炎(allergic neuritis)、Bechet′s或Behcet′s病、卡斯尔曼综合征(Castleman′s syndrome)、古德帕斯丘综合征(Goodpasture′ssyndrome)、Reynaud′s综合征、舍格伦综合征(Sjogren′s syndrome)、斯-约二氏综合征(Stevens-Johnson syndrome)、类天疱疮(pemphigoid)，诸如大疱性类天疱疮(pemphigoid bullous)和皮肤类天疱疮(skin pemphigoid)、天疱疮(pemphigus)(包括增生型天疱疮(pemphigus vulgaris)、落叶型天疱疮(pemphigus foliaceus)、天疱疮粘膜性类天疱疮(pemphigusmucus-membrane pemphigoid)、和红斑性天疱疮(pemphiguserythematosus))、自身免疫性多内分泌腺病(autoimmunepolyendocrinopathies)、莱特尔病或综合征(Reiter′s disease or syndrome)、免疫复合物肾炎(immune complex nephritis)、抗体介导的肾炎(antibody-mediated nephritis)、视神经脊髓炎(neuromyelitis optica)、多神经病(polyneuropathies)、慢性神经病(chronic neuropathy)，诸如IgM多神经病(IgM polyneuropathies)或IgM-介导的神经病(IgM-mediated neuropathy)、血小板减少症(thrombocytopenia)(如例如由心肌梗死患者发展的)、其包括血栓性血小板减少性紫癜(thrombotic thrombocytopenic purpura)(TTP)和自身免疫性或免疫介导的血小板减少症(autoimmune or immune-mediatedthrombocytopenia)，如特发性血小板减少症性紫癜(idiopathicthrombocytopenic purpura)(ITP)，其包括慢性或急性ITP(chronic or acuteITP)、自身免疫性睾丸和卵巢疾病(autoimmune disease of the testis andovary)，其包括自身免疫性睾丸炎和卵巢炎(autoimmune orchitis andoophoritis)、原发性甲状腺机能减退症(primary hypothyroidism)、甲状旁腺功能减退症(hypoparathyroidism)、自身免疫性内分泌病(autoimmuneendocrine diseases)，其包括甲状腺炎(thyroiditis)如自身免疫性甲状腺炎(autoimmune thyroiditis)、桥本甲状腺炎(Hashimoto′s disease)、慢性甲状腺炎(chronic thyroiditis)(桥本甲状腺炎(Hashimoto′s thyroiditis))、或亚急性甲状腺炎(subacute thyroiditis)、自身免疫性甲状腺病(autoimmune thyroiddisease)、特发性甲状腺机能减退症(idiopathic hypothyroidism)、格雷夫斯病(Grave′s disease)、多腺体综合征(polyglandular syndromes)如自身免疫性多腺体综合征(autoimmune polyglandular syndromes)(或多腺体内分泌综合征(polyglandular endocrinopathy syndromes))、副肿瘤综合征(paraneoplasticsyndromes)、其包括神经学副肿瘤综合征(neurologic paraneoplasticsyndromes)如兰伯特-伊顿综合征(Lambert-Eaton myasthenic syndrome)或伊顿-兰伯特综合征(Eaton-Lambert syndrome)、僵人综合征(stiff-man orstiff-person syndrome)、脑脊髓炎(encephalomyelitis)如变应性脑脊髓炎(allergic encephalomyelitis)或变应性脑脊髓炎(encephalomyelitis allergica)和实验性变应性脑脊髓炎(experimental allergic encephalomyelitis，EAE)、重症肌无力(myasthenia gravis)如胸腺瘤相关的重症肌无力(thymoma-associated myasthenia gravis)、小脑变性(cerebellar degeneration)、神经性肌强直(neuromyotonia)、视性眼阵挛(opsoclonus)或视性眼阵挛肌阵挛(opsoclonus myoclonus syndrome，OMS)、和感觉神经病(sensoryneuropathy)、多病灶运动神经病(multifocal motor neuropathy)、希恩综合征(Sheehan′s syndrome)、自身免疫性肝炎(autoimmune hepatitis)、慢性肝炎(chronic hepatitis)、狼疮状肝炎(lupoid hepatitis)、巨细胞肝炎(giant cellhepatitis)、慢性活动性肝炎(chronic active hepatitis)或自身免疫性慢性活动性肝炎(autoimmune chronic active hepatitis)、淋巴样间质性肺炎(lymphoidinterstitial pneumonitis)、相对NSIP的闭塞性细支气管炎(非移植性)(bronchiolitis obliterans(non-transplant)vs NSIP)、吉兰-巴雷综合征(Guillain-Barrésyndrome)、贝格尔病(Berger′s disease)(IgA肾病)、特发性IgA肾病(idiopathic IgA nephropathy)、线性IgA皮肤病(linear IgA dermatosis)、原发性胆汁性肝硬变(primary biliary cirrhosis)、肺硬变(pneumonocirrhosis)、自身免疫性肠病综合征(autoimmune enteropathy syndrome)、乳糜泻(Celiacdisease)、腹腔病(Coeliac disease)、口炎性腹泻(celiac sprue)(麸质性肠病(gluten enteropathy))、难治的口炎性腹泻(refractory sprue)、特发性口炎性腹泻(idiopathic sprue)、冷球蛋白血症(cryoglobulinemia)、肌萎缩性侧索硬化(amylotrophic lateral sclerosis)(ALS；卢·盖里格病(Lou Gehrig′s disease))、冠状动脉病(coronary artery disease)、自身免疫性耳病(autoimmune eardisease)如自身免疫性内耳病(autoimmune inner ear disease)(AIED)、自身免疫性听力丧失(autoimmune hearing loss)、视性眼阵挛肌阵挛综合征(opsoclonus myoclonus syndrome，OMS)、多软骨炎(polychondritis)如难治性或复发性多软骨炎(refractory or relapsed polychondritis)、肺泡蛋白沉积症(pulmonary alveolar proteinosis)、淀粉样变性(amyloidosis)、巩膜炎(scleritis)、非癌性淋巴细胞增多症(a non-cancerous lymphocytosis)、原发性淋巴细胞增多症(a primary lymphocytosis)、其包括单克隆B细胞淋巴细胞增多症(monoclonal B cell lymphocytosis)(例如、良性单克隆丙球蛋白病(benign monoclonal gammopathy)和未确定重要性的单克隆丙球蛋白病(monoclonal gammopathy of undetermined significance，MGUS)、周围神经病(peripheral neuropathy)、副肿瘤综合征(paraneoplastic syndrome)、通道病变(channelopathies)如癫痫症(epilepsy)、偏头痛(migraine)、心律不齐(arrhythmia)、肌肉病症(muscular disorders)、耳聋(deafness)、失明(blindness)、周期性瘫痪(periodic paralysis)、和CNS通道病变(channelopathies of the CNS)、孤独症(autism)、炎症性肌病(inflammatorymyopathy)、局灶性节段性肾小球硬化症(focal segmental glomerulosclerosis，FSGS)、内分泌性眼病(endocrine ophthalmopathy)、葡萄膜视网膜炎(uveoretinitis)、脉络膜视网膜炎(chorioretinitis)、自身免疫性肝病(autoimmune hepatological disorder)、纤维肌痛(fibromyalgia)、多发性内分泌衰竭(multiple endocrine failure)、施密特综合征(Schmidt′s syndrome)、肾上腺炎(adrenalitis)、胃萎缩(gastric atrophy)、早老性痴呆(preseniledementia)、脱髓鞘疾病(demyelinating diseases)如自身免疫性脱髓鞘疾病(autoimmune demyelinating diseases)、糖尿病肾病(diabetic nephropathy)、心肌梗死后综合征(Dressler′s syndrome)、斑秃(alopecia areata)、CREST综合征(钙质沉着(calcinosis)、雷诺现象(Raynaud′s phenomenon)、食管活动不良(esophageal dysmotility)、指端硬化(sclerodactyly)、和毛细管扩张(telangiectasia))、男性和女性自身免疫性不育(male and female autoimmuneinfertility)、混合的结缔组织病(mixed connective tissue disease)、恰加斯病(Chagas′disease)、风湿热(rheumatic fever)、复发性流产(recurrent abortion)、农民肺(farmer′s lung)、多形性红斑(erythema multiforme)、心脏切开后综合征(post-cardiotomy syndrome)、库欣综合征(Cushing′s syndrome)、鸟爱好者肺(bird-fancier′s lung)、变应性肉芽肿性血管炎(allergic granulomatousangiitis)、良性淋巴细胞血管炎(benign lymphocytic angiitis)、奥尔波特综合征(Alport′s syndrome)、肺泡炎(alveolitis)如变应性肺泡炎(allergic alveolitis)和纤维化肺泡炎(fibrosing alveolitis)、间质性肺病(interstitial lung disease)、输血反应(transfusion reaction)、麻疯病(leprosy)、疟疾(malaria)、利什曼病(leishmaniasis)、kypanosomiasis、血吸虫病(schistosomiasis)、蛔虫病(ascariasis)、曲霉菌病(aspergillosis)、Sampter′s综合征(Sampter′ssyndrome)、卡布兰综合征(Caplan′s syndrome)、登革热(dengue)、心内膜炎(endocarditis)、心内膜心肌纤维化症(endomyocardial fibrosis)、弥散性间质性肺纤维化(diffuse interstitial pulmonary fibrosis)、间质性肺纤维化(interstitial lung fibrosis)、特发性肺纤维化(idiopathic pulmonary fibrosis)、囊性纤维化(cystic fibrosis)、眼内炎(endophthalmitis)、持久性隆起性红斑(erythema elevatum et diutinum)、胎儿成红细胞增多症(erythroblastosisfetalis)、嗜酸性筋膜炎(eosinophilic faciitis)、舒尔曼综合征(Shulman′ssyndrome)、费尔蒂综合征(Felty′s syndrome)、丝虫病(flariasis)、睫状体炎(cyclitis)如慢性睫状体炎(chronic cyclitis)、异色性睫状体炎(heterochroniccyclitis)、虹膜睫状体炎(iridocyclitis)、或富克斯睫状体炎(Fuch′s cyclitis)、亨诺赫-舍恩莱茵紫癜(Henoch-Schonlein purpura)、人免疫缺陷病毒(HIV)感染(human immunodeficiency virus(HIV)infection)、艾柯病毒感染(echovirus infection)、心肌病(cardiomyopathy)、阿尔茨海默病(Alzheimer′sdisease)、细小病毒感染(parvovirus infection)、风疹病毒感染(rubella virusinfection)、接种后综合征(post-vaccination syndromes)、先天性风疹感染(congenital rubella infection)、埃巴病毒感染(Epstein-Barr virus infection)、流行性腮腺炎(mumps)、埃文斯综合征(Evan′s syndrome)、自身免疫性性腺衰竭(autoimmune gonadal failure)、小舞蹈病(Sydenham′s chorea)、链球菌感染后肾炎(post-streptococcal nephritis)、血栓闭塞性脉管炎(thromboangitisubiterans)、甲状腺毒症(thyrotoxicosis)、脊髓痨(tabes dorsalis)、脉络膜炎(chorioiditis)、巨细胞多肌痛(giant cell polymyalgia)、内分泌性眼病(endocrine ophthamopathy)、慢性过敏性肺炎(chronic hypersensitivitypneumonitis)、干燥性角结膜炎(keratoconjunctivitis sicca)、流行性角结膜炎(epidemic keratoconjunctivitis)、特发性肾病综合征(idiopathic nephriticsyndrome)、微小病变肾病(minimal change nephropathy)、良性家族性和缺血再灌损伤(benign familial and ischemia-reperfusion injury)、视网膜自体免疫(retinal autoimmunity)、关节炎症(joint inflammation)、支气管炎(bronchitis)、慢性闭塞性呼吸道病(chronic obstructive airway disease)、硅肺(silicosis)、口疮(aphthae)、口疮性口炎(aphthous stomatitis)、动脉硬化病(arteriosclerotic disorders)、aspermiogenese、自身免疫性溶血(autoimmunehemolysis)、结节病(Boeck′s disease)、冷球蛋白血症(cryoglobulinemia)、迪皮特朗挛缩(Dupuytren′s contracture)、眼内炎phacoanaphylactica(endophthalmia phacoanaphylactica)、过敏性肠炎(enteritisallergica)、麻风结节性红斑(erythema nodosum leprosum)、自发性面神经麻痹(idiopathic facial paralysis)、慢性疲劳综合征(chronic fatigue syndrome)、风湿热(febris rheumatica)、哈-里综合征(Hamman-Rich′s disease)、感觉神经听力丧失(sensoneural hearing loss)、血红蛋白尿paroxysmatica(haemoglobinuria paroxysmatica)、性腺机能减退(hypogonadism)、地域性回肠炎(ileitis regionalis)、白细胞减少症(leucopenia)、传染性单核细胞增多症(mononucleosis infectiosa)、横断性脊髓炎(traverse myelitis)、原发性特发性粘液性水肿(primary idiopathicmyxedema)、肾病(nephrosis)、眼炎symphatica(ophthalmia symphatica)、肉芽肿性睾丸炎(orchitis granulomatosa)、胰腺炎(pancreatitis)、急性多神经根炎(polyradiculitis acuta)、坏疽性脓皮病(pyoderma gangrenosum)、Quervain′s thyreoiditis、获得性spenic萎缩(acquired spenic atrophy)、由抗精子抗体引起的不育(infertility due to antispermatozoan antibodies)、非恶性胸腺瘤(non-malignant thymoma)、白斑(vitiligo)、SCID和埃巴病毒相关疾病(SCID and Epstein-Barr virus-associated diseases)、获得性免疫缺陷综合征(acquired immune deficiency syndrome)(AIDS)、寄生虫病(parasiticdiseases)如利什曼原虫属(Leishmania)、中毒性休克综合征(toxic-shocksyndrome)、食物中毒(food poisoning)、涉及T细胞浸润的病症(conditionsinvolving infiltration of T cells)、白细胞粘附缺陷(leukocyte-adhesiondeficiency)、与由细胞因子和T-淋巴细胞介导的急性和迟发型超敏反应(acute and delayed hypersensitivity)相关的免疫应答、涉及白细胞血细胞渗出(leukocyte diapedesis)的疾病、多器官损伤综合征(multiple organ injurysyndrome)、抗原-抗体复合物介导的疾病、抗肾小球基底膜病(antiglomerularbasement membrane disease)、变应性神经炎(allergic neuritis)、自身免疫性多内分泌腺疾病(autoimmune polyendocrinopathies)、卵巢炎(oophoritis)、原发性黏液性水肿(primary myxedema)、自身免疫性萎缩性胃炎(autoimmune atrophic gastritis)、交感性眼炎(sympathetic ophthalmia)、风湿性疾病(rheumatic diseases)、混合性结缔组织病(mixed connective tissuedisease)、肾病综合征(nephrotic syndrome)、胰岛炎(insulitis)、多内分泌腺衰竭(polyendocrine failure)、周围神经病(peripheral neuropathy)、I型自身免疫性多内分泌腺综合征(autoimmune polyglandular syndrome type I)、成人型特发性甲状旁腺功能减退(adult-onset idiopathichypoparathyroidism)(AOIH)、全秃(alopecia totalis)、扩张型心肌病(dilatedcardiomyopathy)、获得性大疱性表皮松懈症(epidermolisis bullosa acquisita)(EBA)、血色素沉着病(hemochromatosis)、心肌炎(myocarditis)、肾病综合征(nephrotic syndrome)、原发性硬化性胆管炎(primary sclerosingcholangitis)、化脓性或非化脓性窦炎(purulent or nonpurulent sinusitis)、急性或慢性窦炎(acute or chronic sinusitis)、筛窦、额窦、上颌窦或蝶窦的窦炎(ethmoid、frontal、maxillary、or sphenoid sinusitis)、嗜酸性粒细胞相关病症如嗜酸性细胞增多症(eosinophilia)、肺嗜酸细胞增多性浸润(pulmonary infiltration eosinophilia)、嗜酸性细胞增多性肌痛综合征(eosinophilia-myalgia syndrome)、Loffler′s综合征、慢性嗜酸细胞性肺炎(chronic eosinophilic pneumonia)、热带性肺嗜酸细胞浸润症(tropicalpulmonary eosinophilia)、支气管肺曲霉病(bronchopneumonic aspergillosis)、曲霉肿(aspergilloma)、或含有嗜酸性粒细胞的肉芽肿(granulomascontaining eosinophils)、过敏性反应(anaphylaxis)、血清阴性脊椎关节炎(seronegative spondyloarthritides)、多内分泌自身免疫病(polyendocrineautoimmune disease)、硬化性胆管炎(sclerosing cholangitis)、巩膜、巩膜外层、慢性粘膜皮肤念珠菌病(sclera，episclera，chronic mucocutaneouscandidiasis)、Bruton′s综合征、婴儿一过性低丙种球蛋白血症(transienthypogammaglobulinemia of infancy)、Wiskott-Aldrich综合征、运动失调性毛细血管扩张症(ataxia telangiectasia)、与胶原病相关的自身免疫病症、风湿病(rheumatism)、神经病(neurological disease)、缺血-再灌病症(ischemicre-perfusion disorder)、血压反应减少(reduction in blood pressure response)、血管功能障碍(vascular dysfunction)、antgiectasis、组织损伤、心血管缺血(cardiovascular ischemia)、痛觉过敏(hyperalgesia)、脑缺血症(cerebralischemia)、和伴有血管生成的疾病(disease accompanying vascularization)、变应性超敏感性病症(allergic hypersensitivity disorders)、肾小球肾炎(glomerulonephritides)、再灌注损伤(reperfusion injury)、心肌或其它组织的再灌注损伤(reperfusion injury of myocardial or other tissues)、具有急性炎症成分的皮肤病(dermatoses with acute inflammatory components)、急性化脓性脑膜炎(acute purulent meningitis)或其它中枢神经系统炎性病症(othercentral nervous system inflammatory disorders)、眼和眼窝炎性病症(ocularand orbital inflammatory disorders)、粒细胞输血相关的综合征(granulocytetransfusion-associated syndromes)、细胞因子诱导的毒性(cytokine-inducedtoxicity)、急性严重炎症(acute serious inflammation)、慢性顽固性炎症(chronic intractable inflammation)、肾盂炎(pyelitis)、肺硬变(pneumonocirrhosis)、糖尿病视网膜病变(diabetic retinopathy)、糖尿病大动脉病症(diabetic large-artery disorder)、动脉内增生(endarterial hyperplasia)、消化性溃疡(peptic ulcer)、瓣膜炎(valvulitis)、和子宫内膜异位症(endometriosis)。
“抗血管生成剂”或“血管生成抑制剂”指直接或间接抑制血管生成、脉管生成、或不理想的血管渗透性的小分子量物质、多核苷酸、多肽、分离的蛋白、重组蛋白、抗体或其缀合物或融合蛋白。例如，抗血管生成剂是针对如上文定义的血管生成剂的抗体或其它拮抗剂，例如，针对VEGF的抗体(例如，贝伐珠单抗(bevacizumab)(AVASTIN)、bH1、bH1-44、bH1-81)、针对VEGF受体的抗体、阻断VEGF受体信号传导的小分子(例如，PTK787/ZK2284、SU6668、SUTENT/SU11248(马来酸舒尼替你(sunitinibmalate))、AMG706)。抗血管生成剂还包括天然的血管生成抑制剂，例如血管生成抑制素(angiostatin)、内皮抑制素(endostatin)等。参见，例如，Klagsbrun和D’Amore、Annu.Rev.Physiol.(生理学年度综述)，53：217-39(1991)；Streit和Detmar，Oncogene(癌基因)，22：3172-3179(2003)(例如，表3列出了在恶性黑素瘤中的抗血管生成治疗法)；Ferrara和Alitalo，NatureMedicine(自然医学)5(12)：1359-1364(1999)；Tonini等，Oncogene(癌基因)，22：6549-6556(2003)(例如，表2列出了抗血管生成因子)；以及，Sato Int.J.Clin.Oncol(国际临床肿瘤学杂志)，8：200-206(2003)(例如，表1列出了临床试验中使用的抗血管生成剂)。血管生成的失控可以引起能够通过本发明的组合物和方法治疗的多种病症。这些病症包括非肿瘤(non-neoplastic)和肿瘤病况。
本文所用的术语“细胞毒性试剂”指抑制或阻止细胞功能和/或引起细胞破坏的物质。该术语意在包括放射性同位素(例如，At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、Ra223、P32和Lu的放射性同位素)，化疗剂，例如，甲氨喋呤(methotrexate)、阿霉素(adriamicin)、长春花生物碱(vincaalkaloids)(长春新碱(vincristine)、长春碱(vinblastine)、依托泊苷(etoposide))、多柔比星(doxorubicin)、美法仑(melphalan)、丝裂霉素C(mitomycin C)、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、柔红霉素(daunorubicin)或其它嵌入剂(intercalating agents)、酶及其片段，诸如核酸降解酶(nucleolytic enzymes)、抗生素和毒素，如小分子毒素或细菌、真菌、植物或动物来源的酶活性毒素，包括其片段和/或变体，以及本文公开的多种抗肿瘤药或抗癌药。本文记述了其它的细胞毒性试剂。杀癌细胞剂引起肿瘤细胞的破坏。
“化疗剂”是有效用于治疗癌症的化合物。化疗剂的实例包括烷基化试剂，如塞替哌(thiotepa)和CYTOXAN环磷酰胺(cyclosphosphamide)；烷基磺酸酯(alkyl sulfonates)如白消安(busulfan)，英丙舒凡(improsulfan)和哌泊舒凡(piposulfan)；吖丙啶类(aziridines)如苯佐替派(benzodopa)、卡波醌(carboquone)、美妥替哌(meturedopa)和乌瑞替哌(uredopa)；乙烯亚胺(ethylenimines)和methylamelamines，包括六甲蜜胺(altretamine)、曲他胺(triethylenemelamine)、三亚乙基磷酰胺(trietylenephosphoramide)、塞替哌(triethiylenethiophosphoramide)和三羟甲蜜胺(trimethylolomelamine)；多聚乙酰(acetogenins)(特别是bullatacin和bullatacinone)；Δ-9-四氢大麻酚(delta-9-tetrahydrocannabinol)(屈大麻酚(dronabinol)、MARINOL)；β-拉帕醌(beta-lapachone)；拉帕醇(lapachol)；秋水仙碱(colchicines)；桦木酸(betulinic acid)；喜树碱(camptothecin)(包括合成的类似物托泊替康(topotecan)(HYCAMTIN)、CPT-11(伊立替康(irinotecan)CAMPTOSAR)、乙酰喜树碱(acetylcamptothecin)、scopolectin和9-氨基喜树碱(9-aminocamptothecin))；苔藓抑素(bryostatin)；海绵(callystatin)；CC-1065(包括其阿多来新(adozelesin)、卡折来新(carzelesin)和比折来新(bizelesin)合成类似物)；鬼臼毒素(podophyllotoxin)；鬼臼酸(podophyllinic acid)；替尼泊苷(teniposide)；念珠藻环肽(cryptophycins)(特别是念珠藻环肽1和念珠藻环肽8)；多拉司他汀(dolastatin)；倍癌霉素(duocarmycin)(包括合成的类似物、KW-2189和CB1-TM1)；艾榴素(eleutherobin)；pancratistatin；匍枝珊瑚醇(sarcodictyin)；海绵素(spongistatin)；氮芥(nitrogen mustards)如苯丁酸氮芥(chlorambucil)、萘氮芥(chlomaphazine)、胆磷酰胺(cholophosphamide)、雌莫司汀(estramustine)、异环磷酰胺(ifosfamide)、氮芥(mechlorethamine)、盐酸氧氮芥(mechlorethamine oxide hydrochloride)、美法仑(melphalan)、新氮芥(novembichin)、苯芥胆甾醇(phenesterine)、泼尼莫司汀(prednimustine)、曲磷胺(trofosfamide)、乌拉莫司汀(uracilmustard)；亚硝基脲(nitrosureas)如卡莫司汀(carmustine)、氯脲菌素(chlorozotocin)、福莫司汀(fotemustine)、洛莫司汀(lomustine)、尼莫司汀(nimustine)和雷莫司汀(ranimnustine)；抗生素如烯二炔类(enediyne)抗生素(例如，卡奇霉素(calicheamicin)、特别是卡奇霉素γ1(参见，例如，Agnew，Chem Intl.Ed.Engl.，33：183-186(1994))；达内霉素(dynemicin)，包括达内霉素A；烯二炔蒽环类抗生素(esperamicin)；以及新制癌菌素(neocarzinostatin)生色团和相关色素蛋白烯二炔类抗生素生色团)、阿克拉霉素(aclacinomysins)、放线菌素(actinomycin)、蒽霉素(authramycin)、偶氮丝氨酸(azaserine)、博来霉素(bleomycins)、放线菌素C(cactinomycin)、carabicin、去甲柔红霉素(carminomycin)、嗜癌霉素(carzinophilin)、色霉素(chromomycinis)、放线菌素D(dactinomycin)、柔红霉素(daunorubicin)、地托比星(detorubicin)、6-重氮-5-氧代-L-正亮氨酸(6-diazo-5-oxo-L-norleucine)、ADRIAMYCIN多柔比星(doxorubicin)(包括吗啉代-多柔比星(morpholino-doxorubicin)、氰基吗啉代-多柔比星(cyanomorpholino-doxorubicin)、2-吡咯啉-多柔比星(2-pyrrolino-doxorubicin)和去氧多柔比星(deoxydoxorubicin))、表柔比星(epirubicin)、依索比星(esorubicin)、伊达比星(idarubicin)、马塞罗霉素(marcellomycin)、丝裂霉素(mitomycins)如丝裂霉素C、麦考酚酸(mycophenolic acid)、诺拉霉素(nogalamycin)、橄榄霉素(olivomycins)、培洛霉素(peplomycin)、potfiromycin、嘌呤霉素(puromycin)、三铁阿霉素(quelamycin)、罗多比星(rodorubicin)、链黑霉素(streptonigrin)、链佐星(streptozocin)、杀结核菌素(tubercidin)、乌苯美司(ubenimex)、净司他丁(zinostatin)、佐柔比星(zorubicin)；抗代谢物如甲氨喋呤(methotrexate)和5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil)(5-FU)；叶酸类似物如二甲叶酸(denopterin)、甲氨喋呤、喋罗呤(pteropterin)、三甲曲沙(trimetrexate)；嘌呤类似物如氟达拉滨(fludarabine)、6-巯嘌呤(6-mercaptopurine)、硫咪嘌呤(thiamiprine)、硫鸟嘌呤(thioguanine)；嘧啶类似物如安西他滨(ancitabine)、阿扎胞苷(azacitidine)、6-氮尿苷(6-azauridine)、卡莫氟(carmofur)、阿糖胞苷(cytarabine)、二脱氧尿苷(dideoxyuridine)、去氧氟尿苷(doxifluridine)、依诺他滨(enocitabine)、氟尿苷(floxuridine)；雄激素类诸如卡普睾酮(calusterone)、屈他雄酮丙酸盐(dromostanolone propionate)、环硫雄醇(epitiostanol)、美雄烷(mepitiostane)、睾内酯(testolactone)；抗肾上腺药(anti-adrenals)如氨鲁米特(aminoglutethimide)、米托坦(mitotane)、曲洛司坦(trilostane)；叶酸补偿物如frolinic acid；醋葡醛内酯(aceglatone)；羟醛磷酰胺配糖(aldophosphamideglycoside)；5-氨基酮戊酸(aminolevulinic acid)；恩尿嘧啶(eniluracil)；安吖啶(amsacrine)；bestrabucil；比生群(bisantrene)；依达曲沙(edatraxate)；defofamine；秋水仙胺(demecolcine)；地吖醌(diaziquone)；elfomithine；依利醋铵(elliptinium acetate)；epothilone；依托格鲁(etoglucid)；硝酸镓(galliumnitrate)；羟基脲(hydroxyurea)；香菇多糖(lentinan)；氯尼达明(lonidainine)；美坦生类化合物(maytansinoids)如美坦生(maytansine)和美登木素(ansamitocins)；米托胍腙(mitoguazone)；米托蒽醌(mitoxantrone)；莫哌达醇(mopidanmol)；尼曲吖啶(nitraerine)；喷司他丁(pentostatin)；异丙嗪(phenamet)；吡柔比星(pirarubicin)；洛索蒽醌(losoxantrone)；2-乙基酰肼(2-ethylhydrazide)；丙卡巴肼(procarbazine)；PSK多糖复合物(JHS NaturalProducts(JHS天然产品)，Eugene，OR)；雷佐生(razoxane)；利索新(rhizoxin)；西佐喃(sizofiran)；锗螺胺(spirogermanium)；细格孢氮杂酸(tenuazonic acid)；三亚胺醌(triaziquone)；2，2’，2”-三氯三乙胺(2，2’，2”-trichlorotriethylamine)；单端孢霉烯(trichothecenes)(特别是T-2毒素、verracurin A、杆孢菌素A(roridin A)和anguidine)；乌拉坦(urethan)；长春地辛(vindesine)(ELDISINE、FILDESIN)；达卡巴嗪(dacarbazine)；甘露莫司汀(mannomustine)；二溴甘露醇(mitobronitol)；二溴卫矛醇(mitolactol)；哌泊溴烷(pipobroman)；gacytosine；阿拉伯糖苷(arabinoside)(“Ara-C”)；塞替哌(thiotepa)；紫杉烷类(taxoids)，例如，TAXOL紫杉醇(Bristol-MyersSquibb Oncology，Princeton，新泽西)ABRAXANETM无克列莫佛(Cremophor-free)、紫杉醇的白蛋白改造的纳米颗粒制剂(AmericanPharmaceutical Partners，Schaumberg，伊利诺伊州)；和TAXOTERE多西他赛(doxetaxel)(-Poulenc Rorer、Antony、法国)；chloranbucil；吉西他滨(gemcitabine)(GEMZAR)；6-硫鸟嘌呤(6-thioguanine)；巯嘌呤(mercaptopurine)；甲氨喋呤；铂类似物如顺铂(cisplatin)和卡铂(carboplatin)；长春碱(vinblastine)(VELBAN)；铂；依托泊苷(etoposide)(VP-16)；异环磷酰胺(ifosfamide)；米托蒽醌(mitoxantrone)；长春新碱(vincristine)(ONCOVIN)；奥沙利铂(oxaliplatin)；leucovovin；长春瑞滨(vinorelbine)(NAVELBINE)；诺消灵(novantrone)；依达曲沙(edatrexate)；柔红霉素(daunomycin)；氨基喋呤(aminopterin)；伊班膦酸盐(ibandronate)；拓扑异构酶抑制剂RFS 2000；二氟甲基鸟氨酸(difluorometlhylomithine)(DMFO)；维甲类(retinoids)如视黄酸(retinoicacid)；卡培他滨(capecitabine)(XELODA)；任何上述物质的药用盐、酸或衍生物；以及上述物质中两种或多种的组合，如CHOP，即环磷酰胺、多柔比星、长春新碱和泼尼松龙组合治疗法的缩写，和FOLFOX，使用奥沙利铂(oxaliplatin)(ELOXATINTM)与5-FU和leucovovin联合的治疗方案的缩写。
下列物质也包含在本定义中，它们是：起调控、减少、阻断或抑制可以促进癌症生长的激素的作用的抗激素药剂，所述抗激素药剂通常处在系统治疗或全身治疗形式中。它们可以是激素本身。实例包括抗雌激素药和选择性雌激素受体调节物(SERMs)，包括例如，他莫昔芬(tamoxifen)(包括NOLVADEX他莫昔芬)、EVISTA雷洛昔芬(raloxifene)、屈洛昔芬(droloxifene)，4-羟基他莫昔芬(4-hydroxytamoxifen)，曲沃昔芬(trioxifene)、keoxifene、LY117018、奥那司酮(onapristone)和FARESTON托瑞米芬(toremifene)；抗黄体酮药(anti-progesterones)；雌激素受体下调剂(ERDs)；起作用抑制或关闭卵巢的药剂，例如，促黄体生成激素释放素(leutinizinghormone-releasing hormone)(LHRH)激动剂如LUPRON和ELIGARD醋酸亮丙立德(leuprolide acetate)、醋酸戈舍瑞林(goserelin acetate)、醋酸布舍瑞林(buserelin acetate)和tripterelin；其它抗雄激素药诸如氟他胺(flutamide)、尼鲁米特(nilutamide)和比卡鲁胺(bicalutamide)；和芳香酶抑制剂(aromatase inhibitors)，其抑制芳香酶，该酶调节肾上腺中的雌激素生成，诸如，例如，4(5)-咪唑类(4(5)-imidazoles)、氨鲁米特(aminoglutethimide)、MEGASE醋酸甲地孕酮(megestrol acetate)、AROMASIN依西美坦(exemestane)、赴美司坦(formestanie)、法倔唑(fadrozole)、RIVISOR伏氯唑(vorozole)、FEMARA来曲唑(letrozole)和ARIMIDEX阿那曲唑(anastrozole)。另外，所述化疗剂的定义包括二膦酸盐(bisphosphonates)如氯膦酸盐(clodronate)(例如，BONEFOS或OSTAC)、DIDROCAL依替膦酸盐(etidronate)、NE-58095、ZOMETA唑来膦酸(zoledronic acid)/唑来膦酸盐(zoledronate)、FOSAMAX阿仑膦酸盐(alendronate)、AREDIA帕米膦酸盐(pamidronate)、SKELID替鲁膦酸盐(tiludronate)、或ACTONEL利塞膦酸盐(risedronate)；以及曲沙他滨(troxacitabine)(1，3-二氧戊环核苷胞嘧啶类似物)；反义寡核苷酸、特别是抑制异常细胞增生所涉及的信号传导途径中的基因表达的那些反义寡核苷酸，诸如例如，PKC-α、Raf、H-Ras和表皮生长因子受体(EGF-R)；疫苗诸如THERATOPE疫苗和基因治疗疫苗、例如，ALLOVECTIN疫苗、LEUVECTIN疫苗和VAXID疫苗；LURTOTECAN拓扑异构酶1抑制剂；ABARELIXrmRH；托西拉帕替尼(lapatinib ditosylate)(ErbB-2和EGFR双重酪氨酸激酶小分子抑制剂，也已知为GW572016)；和上述任意物质的药用盐、酸或衍生物。
“生长抑制剂”在用于本文时是指在体外或在体内抑制细胞生长的化合物或组合物。因此，生长抑制剂可以是显著降低S期细胞百分数的药物。生长抑制剂的实例包括阻断细胞周期进展(在除S期以外的阶段)的药剂，诸如，诱导G1停滞和M期停滞的药物。经典的M期阻断剂包括长春花类(vincas)(例如，长春新碱和长春碱)、紫杉烷类(taxanes)和拓扑异构酶II抑制剂如多柔比星、表柔比星、柔红霉素、依托泊苷和博来霉素。那些使G1停滞的药剂还连带使S-期停滞，例如，DNA烷化剂诸如他莫昔芬，泼尼松(prednisone)，达卡巴嗪，氮芥(mechlorethamine)，顺铂，甲氨蝶呤，5-氟尿嘧啶，和ara-C。进一步的信息可以见Murakami等，The Molecular Basis of Cancer(癌症的分子基础)，Mendelsohn和Israel，编，第1章，题目为″Cell cycle regulation，oncogenes，and antineoplastic drugs(细胞周期调控、癌基因和抗肿瘤药物)″(WB Saunders：Philadelphia，1995)、特别是见第13页。紫杉烷类(紫杉醇和多西他赛)均是来源于紫杉树(yew tree)的抗癌药。来源于欧洲紫杉的多西他赛(TAXOTERE，Rhone-Poulenc Rorer)，是紫杉醇(TAXOL，Bristol-Myers Squibb)的半合成类似物。紫杉醇和多西他赛促进由微管蛋白二聚体到微管的组装，并且通过防止解聚而稳定微管，这导致对细胞中有丝分裂的抑制。
“抗癌治疗”在本文中是指减少或者抑制受试者中的癌症的治疗。抗癌治疗的实例包括细胞毒性放射治疗以及对受试者施用治疗有效量的细胞毒性剂、化疗剂、生长抑制剂、癌症疫苗、血管生成抑制剂、药物前体、细胞因子、细胞因子拮抗剂、皮质类固醇、免疫抑制剂、止吐药、抗体或抗体片段、或止痛剂。
术语“药物前体”用在本申请中是指药物活性物质的前体或衍生物形式，其较亲本药物对肿瘤细胞的细胞毒性更小并且能够被酶活化或转化为更具活性的亲本形式。参见，例如，Wilman，″Prodrugs in CancerChemotherapy(癌症化疗中的药物前体)″Biochemical SocietyTransactions(生物化学学会学报)，14，第375-382页，615th Meeting Belfast(1986)和Stella等，″Prodrugs：A Chemical Approach to Targeted Drug Delivery，(药物前体：靶向药物递送的化学方法)″Directed Drug Delivery(定向药物递送)，Borchardt等，(编辑)，第247-267页，Humana Press(1985)。药物前体包括，但不限于，含磷酸盐的药物前体，含硫代磷酸盐的药物前体，含硫酸盐的药物前体，含肽的药物前体，D-氨基酸修饰的药物前体，糖基化药物前体，含β-内酰胺的药物前体，任选取代的含苯氧基乙酰胺的药物前体或任选取代的含苯基乙酰胺的药物前体，可以被转化为更具活性的无细胞毒性的药物的5-氟胞嘧啶和其它5-氟胞嘧啶药物前体。可以被衍生成用于本发明的药物前体形式的细胞毒性药物的实例包括，但不限于，上述那些化疗剂。
术语“细胞因子”是一般性术语，指由一个细胞群释放的对另一个细胞群起细胞间调节剂作用的蛋白。此种细胞因子的实例是淋巴细胞因子(lymphokines)、单核细胞因子(monokines)和传统的多肽激素。细胞因子中包括的是生长激素如人生长激素(HGH)、N-甲硫氨酰基人生长激素和牛生长激素；甲状旁腺素；甲状腺素；胰岛素；前胰岛素(proinsulin)；松弛素；前松弛素；糖蛋白激素如卵泡刺激素(FSH)、甲状腺刺激素(TSH)和促黄体生成素(LH)；表皮生长因子(EGF)；肝细胞生长因子；成纤维细胞生长因子(FGF)；催乳素；胎盘催乳素；肿瘤坏死因子-α和-β；苗勒氏管抑制物质(mullerian-inhibiting substance)；小鼠促性腺激素相关肽；抑制素(inhibin)；活化素(activin)；血管内皮生长因子；整联蛋白(integrin)；血小板生成素(TPO)；神经生长因子如NGF-α；血小板生长因子；转化生长因子(TGFs)如TGF-α和TGF-β；胰岛素样生长因子-I和-II；促红细胞生成素(EPO)；骨诱导因子(osteoinductive factors)；干扰素如干扰素-α、-β和-γ，集落刺激因子(CSFs)如巨噬细胞-CSF(M-CSF)；粒细胞-巨噬细胞-CSF(GM-CSF)；和粒细胞-CSF(G-CSF)；白细胞介素(ILs)如IL-1、IL-1α、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12；肿瘤坏死因子如TNF-α或TNF-β；和其它多肽因子，包括LIF和kit配体(KL)。当用于本文时，术语细胞因子包括来自天然来源或来自重组细胞培养物的蛋白，以及天然序列细胞因子的生物活性等价物。
“细胞因子拮抗剂”意指部分或完全阻断、抑制、或中和至少一种细胞因子的生物学活性的分子。例如，细胞因子拮抗剂可以通过抑制细胞因子表达和/或分泌、或通过结合细胞因子或结合细胞因子受体而抑制细胞因子活性。细胞因子拮抗剂包括抗体，合成的或天然序列的肽，免疫黏附剂(immunoadhesins)，和结合细胞因子或细胞因子受体的小分子拮抗剂。细胞因子拮抗剂任选地与细胞毒性剂缀合或与细胞毒性剂融合。示例性的TNF拮抗剂是伊那西普(etanercept)(ENBREL)、英利昔单抗(infliximab)(REMICADE)和阿达木单抗(adalimumab)(HUMIRATM)。
术语“免疫抑制剂”用在本文中是指起抑制或掩盖被治疗的受试者的免疫系统的作用的物质。这包括抑制细胞因子生成、下调或抑制自身抗原表达、或掩盖MHC抗原的物质。免疫抑制剂的实例包括2-氨基-6-芳基-5-取代的嘧啶(参见美国专利号4,665,077)；麦考酚酸酯(mycophenolatemofetil)如CELLCEPT；硫唑嘌呤(azathioprine)(IMURAN、AZASAN/6-巯嘌呤(6-mercaptopurine)；bromocryptine；达那唑(danazol)；胺苯砜(dapsone)；戊二醛(其掩盖MHC抗原，如在美国专利号4,120,649中所述)；针对MHC抗原和MHC片段的抗-特应抗体；环孢素A(cyclosporin A)；类固醇如皮质类固醇和糖皮质类固醇，例如，泼尼松(predinisone)、泼尼松龙(prednisolone)诸如PEDIAPRED(泼尼松龙磷酸钠)或ORAPRED(泼尼松龙磷酸钠口服溶液)、甲泼尼龙(methylprednisolone)和地塞米松(dexamethasone)；甲氨蝶呤(口服或皮下的)(RHEUMATREX、TREXALLTM)；羟基氯喹(hydroxycloroquine)/氯喹(chloroquine)；硫氮磺吡啶(sulfasalazine)；来氟米特(leflunomide)；细胞因子或细胞因子拮抗剂，包括抗-干扰素-γ、-β、或-α抗体、抗-肿瘤坏死因子-α抗体(英利昔单抗(infliximab)或阿达木单抗(adalimumab))、抗-TNFα免疫黏附素(ENBREL、伊那西普(etanercept))、抗-肿瘤坏死因子-β抗体、抗-白介素-2抗体和抗-IL-2受体抗体；抗-LFA-1抗体、包括抗-CD11a和抗-CD18抗体；抗-L3T4抗体；异源抗-淋巴细胞球蛋白；多克隆或pan-T抗体、或单克隆抗-CD3或抗-CD4/CD4a抗体；含LFA-3结合结构域的可溶肽(WO1990/08187、公开日期为1990年7月26日)；链激酶；TGF-β；链道酶；来自宿主的RNA或DNA；FK506；RS-61443；脱氧精胍菌素(deoxyspergualin)；雷帕霉素(rapamycin)；T-细胞受体(Cohen等，美国专利号5,114,721)；T-细胞受体片段(Offner等，Science(科学)，251：430-432(1991)；WO 1990/11294；Ianeway，Nature(自然)，341：482(1989)；和WO1991/01133)；T细胞受体抗体(EP 340,109)如T10B9；环磷酰胺(CYTOXAN)；胺苯砜(dapsone)；青霉胺(penicillamine)(CUPRIMINE)；血浆交换；或静脉内免疫球蛋白(IVIG)。这些可以单独使用或者彼此联合使用，特别是类固醇和另一种免疫抑制剂组合使用，或者在所述组合之后使用非类固醇药剂的维持给药来减少对类固醇的需求。
“止痛剂”是指起抑制或压制受试者中的疼痛的作用的药物。示例性的止痛剂包括非类固醇消炎药(NSAIDs)，其包括布洛芬(ibuprofen)(MOTRIN)、萘普生(naproxen)(NAPROSYN)、乙酰水杨酸、吲哚美辛(indomethacin)、舒林酸(sulindac)和托美汀(tolmetin)、包括其盐和衍生物，以及用于减轻可能存在的刺痛的各种其它药物，包括抗痉挛药(加巴喷丁(gabapentin)、phenyloin、卡马西平(carbamazepine))或三环抗抑郁药。具体实例包括对乙酰氨基酚(acetaminophen)、阿斯匹林(aspirin)、阿米替林(amitriptyline)(ELAVIL)、卡马西平(TEGRETOL)、phenyltoin(DILANTIN)、加巴喷丁(gabapentin)(NEURONTIN)、(E)-N-香草基-8-甲基-6-noneamid(CAPSAICIN)、或神经阻断剂。
“皮质类固醇”是指具有通用类固醇化学结构的一些合成的或天然存在的物质中的任意一种，其模拟或增大天然存在的皮质类固醇的作用。合成的皮质类固醇的实例包括泼尼松，泼尼松龙(包括甲泼尼龙)、地塞米松(dexamethasone)曲安西龙(triamcinolone)和倍他米松(betamethasone)。
“癌症疫苗”用在本文中是在受试者中刺激抗癌免疫应答的组合物。癌症疫苗典型地由下列组成：可以是受试者自体同源(来自自身)或同种异体(来自他人)的癌症相关物质或细胞(抗原)的资源，以及其它成分(例如，佐剂)，从而进一步刺激并加强针对所述抗原的免疫应答。癌症疫苗理想地导致对受试者免疫系统的刺激，以生成针对一种或数种特异性抗原的抗体，和/或生成攻击具有那些抗原的癌症细胞的杀伤T细胞。
“细胞毒性放射治疗”用在本文中是指抑制或防止细胞功能和/或引起细胞破坏的放射治疗法。放射治疗可以包括，例如，外线束辐射或使用放射性标记药剂如抗体的治疗。该术语意在包括使用放射性同位素(例如，At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、Ra223、p32和Lu的放射性同位素)。
“止吐药”是减轻或防止受试者呕吐的化合物。止吐化合物包括，例如，神经激肽-1受体拮抗剂(neurokinin-1 receptor antagonists)、5HT3受体拮抗剂(如昂丹司琼(ondansetron)、格拉司琼(granisetron)、托烷司琼(tropisetron)和扎托司琼(zatisetron))，GABAB受体激动剂如巴氯芬(baclofen)，皮质类固醇如地塞米松、KENALOG、ARISTOCORT、或NASALIDE、抗多巴胺能药(antidopaminergic)、酚噻嗪类(phenothiazines)(例如丙氯拉嗪(prochlorperazine)、氟奋乃静(fluphenazine)、硫利达嗪(thioridazine)和美索达嗪(mesoridazine))、屈大麻酚(dronabinol)、metroclopramide、多潘立酮(domperidone)、氟哌啶醇(haloperidol)、赛克力嗪(cyclizine)、劳拉西泮(lorazepam)、丙氯拉嗪(prochlorperazine)和左美丙嗪(levomepromazine)。
“受试者”是脊椎动物，优选地是哺乳动物，更优选地是人。哺乳动物包括但不限于农场动物(如奶牛)、运动动物、宠物(如猫、狗和马)、灵长类动物、小鼠和大鼠。
除非另有说明，实施例中提及的商业上可获得的试剂根据厂家的说明书使用。在以下实施例中及在整个说明书中以ATCC登记号码鉴定的那些细胞的来源是美国典型培养物保藏中心(American Type CuIture Collection，Manassas，VA)。除非另有说明，本发明使用重组DNA技术的标准程序，如上文描述的和下述教科书中的那些：Sambrook等，见上文；Ausubel等，Current Protocols in Molecular Biology(现代分子生物学实验方案)(GreenPublishing Associates and Wiley Interscience，N.Y.，1989)；Innis等，PCR Protocols：A Guide to Methods and Applications(PCR实验方案：方法和应用 指南)(Academic Press，Inc.：N.Y.，1990)；Harlow等，Antibodies：A Laboratory Manual(抗体：实验室指南)(Cold Spring Harbor Press：ColdSpring Harbor，1988)；Gait，Oligonucleotide Synthesis(寡核苷酸合成)(IRLPress：Oxford，1984)；Freshney，Animal Cell Culture(动物细胞培养)，1987；Coligan等，Current Protocolsin Immunology(现代酶学实验方案)，1991。
说明书和权利要求书全文中，术语“包含”，或其变化如“包括”或“含有”应理解为包括所述的整体(整数)或成组的整体(整数)但不排除任何其它整体(整数)或成组的整体(整数)。
II.载体、宿主细胞、和重组方法
为了重组生产本发明的抗体，可以分离编码它的核酸，并将其插入可复制载体，用于进一步克隆(DNA扩增)或表达。可使用常规流程容易的分离编码抗体的DNA并测序(如通过使用能够与编码抗体重链和轻链的基因特异结合的寡核苷酸探针)。可利用许多载体。载体的选择部分地取决于待使用的宿主细胞。一般而言，优选的宿主细胞是真核或原核(通常为哺乳动物)来源。应当理解任何同种型的恒定区可用于此目的，包括IgG、IgM、IgA、IgD、和IgE恒定区，并且此类恒定区可从任何人或动物物种获得。
a.使用原核宿主细胞生成抗体：
i.载体构建
可使用标准重组技术来获得编码本发明抗体多肽构件的多核苷酸序列。可从抗体生成细胞诸如杂交瘤细胞分离期望的多核苷酸序列并测序。或者，可使用核苷酸合成仪或PCR技术合成多核苷酸。一旦得到，将编码多肽的序列插入能够在原核宿主中复制并表达异源多核苷酸的重组载体。为了本发明，可使用本领域可获得的且知道的许多载体。适当载体的选择将主要取决于将要插入载体的核酸的大小和将要用载体转化的具体宿主细胞。根据其功能(扩增或表达异源多核苷酸，或二者兼之)及其与它在其中驻留的具体宿主细胞的相容性，每种载体含有多种构件。载体构件通常包括但不限于：复制起点、选择标志基因、启动子、核糖体结合位点(RBS)、信号序列、异源核酸插入片段、和转录终止序列。
一般而言，包含衍生自与宿主细胞相容物种的复制子和控制序列的质粒载体与这些宿主一起使用。载体通常携带复制位点，以及能够在转化细胞中提供表型选择的标志序列。例如，通常用衍生自大肠杆菌物种的质粒pBR322转化大肠杆菌。pBR322包含编码氨苄青霉素(Amp)和四环素(Tet)抗性的基因，由此提供轻松鉴定转化细胞的手段。pBR322、其衍生物、或其它微生物质粒或噬菌体还可包含或经修饰而包含可被微生物生物体用于表达内源蛋白质的启动子。Carter等，美国专利No.5,648,237中详细记载了用于表达特定抗体的pBR322衍生物的实例。
另外，可将包含与宿主微生物相容的复制子和控制序列的噬菌体载体用作这些宿主的转化载体。例如，可使用噬菌体诸如λGEM.TM.-11来构建可用于转化易感宿主细胞诸如大肠杆菌LE392的重组载体。
本发明的表达载体可包含两对或多对启动子-顺反子，它们编码每一种多肽构件。启动子是位于顺反子上游(5’)的非翻译调控序列，它调控顺反子的表达。原核启动子通常分成两类，诱导型的和组成型的。诱导型启动子指响应培养条件的变化(如营养物的存在与否或温度变化)而启动受其控制的顺反子的升高水平转录的启动子。
众所周知受到多种潜在宿主细胞识别的大量启动子。通过限制酶消化切下源DNA中的启动子并将分离的启动子序列插入本发明的载体，由此可将选择的启动子与编码轻链或重链的顺反子DNA可操作连接。天然启动子序列和许多异源启动子都可用于指导靶基因的扩增和/或表达。在有些实施方案中，使用异源启动子，因为与天然靶多肽启动子相比，它们通常容许所表达靶基因的更高转录和更高产量。
适用于原核宿主的启动子包括PhoA启动子、β-半乳糖苷酶和乳糖启动子系统、色氨酸(trp)启动子系统、和杂合启动子诸如tac或trc启动子。然而，在细菌中有功能的其它启动子(诸如其它已知的细菌或噬菌体启动子)也是合适的。它们的核苷酸序列已经发表，由此技术人员能够使用提供任何所需限制位点的接头或衔接头将它们与编码靶轻链和重链的顺反子可操作连接(Siebenlist等，Cell(细胞)20：269(1980))。
在本发明的一个方面，重组载体内的每个顺反子都包含指导所表达多肽穿膜易位的分泌信号序列构件。一般而言，信号序列可以是载体的构件，或者它可以是插入载体的靶多肽DNA的一部分。为了本发明而选择的信号序列应当是受到宿主细胞识别并加工(即被信号肽酶切除)的信号序列。对于不识别和加工异源多肽的天然信号序列的原核宿主细胞，将信号序列用选自例如由下列组成的组的原核信号序列替代：碱性磷酸酶、青霉素酶、Ipp、或热稳定的肠毒素II(STII)前导序列、Lamb、PhoE、PelB、OmpA和MBP。在本发明的一个实施方案中，表达系统的两个顺反子中都使用的信号序列是STII信号序列或其变体。
在另一方面，根据本发明的免疫球蛋白的生成可在宿主细胞的细胞质中发生，因此不需要在每个顺反子内存在分泌信号序列。在那点上，免疫球蛋白轻链和重链在细胞质内表达、折叠和装配而形成功能性免疫球蛋白。某些宿主菌株(如大肠杆菌trxB-菌株)提供有利于二硫键形成的细胞质条件，从而容许所表达蛋白质亚基的正确折叠和装配(Proba和Pluckthum，Gene(基因)159：203(1995))。
适于表达本发明抗体的原核宿主细胞包括古细菌(Archaebacteria)和真细菌(Eubacteria)，诸如革兰氏阴性或革兰氏阳性生物体。有用细菌的实例包括埃希氏菌属(Escherichia)(如大肠埃希氏菌E.coli)、芽孢杆菌属(Bacilli)(如枯草芽孢杆菌B.subtilis)、肠杆菌属(Enterobacteria)、假单胞菌属物种(Pseudomonas)(如铜绿假单胞菌P.aeruginosa)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)、粘质沙雷氏菌(Serratia marcescans)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、变形菌属(Proteus)、志贺氏菌属(Shigella)、根瘤菌属(Rhizobia)、透明颤菌属(Vitreoscilla)、或副球菌属(Paracoccus)。在一个实施方案中，使用革兰氏阴性细胞。在一个实施方案中，使用大肠杆菌细胞作为本发明的宿主。大肠杆菌菌株的实例包括菌株W3110(Bachmann，Cellular and Molecular Biology(细胞和分子生物学)第2卷，Washington，D.C.，美国微生物学学会，1987，第1190-1219页；ATCC保藏号27，325)及其衍生物，包括具有基因型W3110ΔfhuΔ(ΔtonA)ptr3 lac Iq lacL8ΔompTΔ(nmpc-fepE)degP41 kanR的菌株33D3(美国专利No.5,639,635)。其它菌株及其衍生物，诸如大肠杆菌294(ATCC 31，446)、大肠杆菌B、大肠杆菌λ1776(ATCC 31，537)和大肠杆菌RV308(ATCC 31，608)也是合适的。这些实例只是例示而非限制。本领域知道用于构建具有指定基因型的任何上述细菌衍生物的方法，参见例如Bass等，Proteins(蛋白质)8：309-314(1990)。通常必需考虑复制子在细菌细胞中的可复制性来选择适当的细菌。例如，在使用众所周知的质粒诸如pBR322、pBR325、pACYCl77或pKN410来提供复制子时，大肠杆菌、沙雷氏菌属、或沙门氏菌属物种可适于用作宿主。通常，宿主细胞应当分泌最小量的蛋白水解酶，而且可能希望在细胞培养中掺入额外的蛋白酶抑制剂。
ii.抗体生成
用上述表达载体转化宿主细胞，并在为了诱导启动子、选择转化子或扩增编码期望序列的基因而适当改动的常规营养培养基中进行培养。
转化即将DNA导入原核宿主，使得DNA能够进行复制，或是作为染色体外元件或是通过染色体成分。根据所用宿主细胞，使用适于这些细胞的标准技术进行转化。采用氯化钙的钙处理通常用于具有坚固细胞壁屏障的细菌细胞。另一种转化方法采用聚乙二醇/DMSO。使用的还有一种技术是电穿孔。
在本领域知道的且适于培养选定宿主细胞的培养基中培养用于生成本发明多肽的原核细胞。合适培养基的实例包括添加了必需营养补充物的LB培养基(Luria broth)。在有些实施方案中，培养基还含有根据表达载体的构建而选择的选择剂，以选择性容许包含表达载体的原核细胞生长。例如，向用于培养表达氨苄青霉素抗性基因的细胞的培养基中添加氨苄青霉素。
在碳、氮、和无机磷酸盐来源以外，还可含有适当浓度的任何必需补充物，或是单独加入或是作为与另一种补充物或培养基的混合物，诸如复合氮源。任选的是，培养基可含有一种或多种选自由下列组成的组的还原剂：谷胱甘肽、半胱氨酸、胱胺、巯基乙酸(thioglycollate)、二硫赤藓糖醇和二硫苏糖醇。
在合适的温度培养原核宿主细胞。对于培养大肠杆菌，例如，优选的温度范围为约20℃至约39℃、更优选地为约25℃至约37℃、甚至更优选地为约30℃。主要取决于宿主生物体，培养基的pH可以是范围为约5至约9的任何pH。对于大肠杆菌，pH优选为约6.8至约7.4、且更优选地为约7.0。
如果本发明的表达载体中使用诱导型启动子，那么在适于激活启动子的条件下诱导蛋白质表达。在本发明的一个方面，使用PhoA启动子来控制多肽的转录。因此，为了诱导，在磷酸盐限制培养基中培养经过转化的宿主细胞。优选地，磷酸盐限制培养基是C.R.A.P培养基(参见例如Simmons等，J.Immunol.Methods(免疫学方法杂志)263：133-147(2002))。根据所采用的载体构建物，可采用多种其它诱导物，正如本领域所知道的。
在一个实施方案中，所表达的本发明多肽分泌到宿主细胞的周质中并从中回收。蛋白质回收通常牵涉破坏微生物，通常通过诸如渗透压休克(osmotic shock)、超声处理或裂解等手段。一旦细胞遭到破坏，可通过离心或过滤清除细胞碎片或整个细胞。可以通过例如亲和树脂层析进一步纯化蛋白质。或者，蛋白质可被转运到培养液中并从中分离。可从培养液清除细胞，并将培养物上清液过滤和浓缩，用于进一步纯化所生成蛋白质。可使用普遍知道的方法诸如聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)和Western印迹分析进一步分离和鉴定所表达蛋白质。
在本发明的一个方面，通过发酵过程大量进行抗体生产。多种大规模补料-分批发酵流程可用于生产重组蛋白。大规模发酵具有至少1000升的容量，优选地是约1,000至100,000升的容量。这些发酵罐使用搅拌器叶轮来分配氧和养分，尤其是葡萄糖(优选的碳源/能源)。小规模发酵通常指在体积容量不超过约100升的发酵罐中进行的发酵，范围可以是约1升至约100升。
在发酵过程中，通常在将细胞在合适条件下培养至期望密度(如OD550约180-220，在此阶段细胞处于早期稳定期)后启动蛋白质表达的诱导。根据所采用的载体构建物，可使用多种诱导物，正如本领域知道的和上文描述的。可在诱导前将细胞培养较短的时间。通常将细胞诱导约12-50小时，但是可使用更长或更短的诱导时间。
为了提高本发明多肽的产量和质量，可修改多项发酵条件。例如，为了改善所分泌抗体多肽的正确装配和折叠，可使用过度表达伴侣蛋白诸如Dsb蛋白(DsbA、DsbB、DsbC、DsbD和/或DsbG)或FkpA(具有伴侣活性的一种肽基脯氨酰-顺式，反式-异构酶)的额外载体来共转化宿主原核细胞。已经证明伴侣蛋白促进在细菌宿主细胞中生成的异源蛋白质的正确折叠和溶解度。Chen等，(1999)J.Biol.Chem.(生物化学杂志)274：19601-19605；Georgiou等，美国专利No.6,083,715；Georgiou等，美国专利No.6,027,888；Bothmann和Pluckthun(2000)J.Biol.Chem.(生物化学杂志)275：17100-17105；Ramm和Pluckthun，(2000)J.Biol.Chem.(生物化学杂志)275：17106-17113；Arie等，(2001)Mol.Microbiol.(分子微生物学)39：199-210.。
为了将所表达异源蛋白质(尤其是对蛋白水解敏感的异源蛋白质)的蛋白水解降至最低，可将蛋白水解酶缺陷的某些宿主菌株用于本发明。例如，可修饰宿主细胞菌株，在编码已知细菌蛋白酶的基因中进行遗传突变，诸如蛋白酶III、OmpT、DegP、Tsp、蛋白酶I、蛋白酶Mi、蛋白酶V、蛋白酶VI及其组合。可以获得有些大肠杆菌蛋白酶缺陷菌株，参见例如，Joly等，Proc.Natl.Acad.Sci.(美国科学院院刊)USA 95：2773-2777；Georgiou等，美国专利No.5,264,365；Georgiou等，美国专利No.5,508,192；Hara等，Microbial Drug Resistance(微生物药物抵抗)2：63-72(1996)。
在一个实施方案中，在本发明的表达系统中使用蛋白水解酶缺陷且经过表达一种或多种伴侣蛋白的质粒转化的大肠杆菌菌株作为宿主细胞。
iii.抗体纯化
可采用本领域知道的标准蛋白质纯化方法。下面的流程是合适纯化流程的例示：免疫亲和/或离子交换柱上的分级、乙醇沉淀、反相HPLC、硅土或阳离子交换树脂诸如DEAE上的层析、层析聚焦、SDS-PAGE、硫酸铵沉淀、和使用例如Sephadex G-75的凝胶过滤。
在一个方面，将固定在固相上的蛋白A用于本发明的全长抗体产物的免疫亲和纯化。蛋白A是来自金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的41kD细胞壁蛋白质，它以高亲和力结合抗体Fc区。Lindmark等，(1983)J.Immunol.Meth.(免疫学方法杂志)62：1-13。蛋白A固定其上的固相优选是具有玻璃或石英表面的柱子，更优选是可控孔径玻璃柱或硅酸柱。在有些应用中，柱子以诸如甘油等试剂包被，试图用于防止污染物的非特异粘附。
作为纯化的第一步，将衍生自如上所述细胞培养物的制备物施加到蛋白A固定化固相上，使得目的抗体特异结合蛋白A。然后清洗固相以清除与固相非特异结合的污染物。最后通过洗脱从固相回收目的抗体。
b.使用真核宿主细胞生成抗体：
载体构件通常包括但不限于一种或多种如下各项：信号序列、复制起点、一种或多种标志基因、增强子元件、启动子、和转录终止序列。
(i)信号序列构件
在真核宿主细胞中使用的载体还可在目的成熟蛋白质或多肽的N端包含信号序列或具有特异切割位点的其它多肽。优选地选择受到宿主细胞识别并加工(即被信号肽酶切除)的异源信号序列。在哺乳动物细胞表达中，可利用哺乳动物信号序列以及病毒分泌前导序列，例如单纯疱疹病毒gD信号。
将这些前体区的DNA以符合读码框的方式连接至编码抗体的DNA。
(ii)复制起点
通常，哺乳动物表达载体不需要复制起点构件。例如，SV40起点通常可能只因包含早期启动子才使用。
(iii)选择基因构件
表达和克隆载体可包含选择基因，也称为选择标志。典型的选择基因编码如下蛋白质：(a)赋予对抗生素或其它毒素的抗性，如氨苄青霉素、新霉素、甲氨蝶呤或四环素；(b)补足相应的营养缺陷；或(c)提供不能从复合培养基获得的关键营养物。
选择方案的一个实例利用药物来阻滞宿主细胞的生长。经异源基因成功转化的那些细胞生成赋予药物抗性的蛋白质，因而幸免于选择方案。此类显性选择的实例使用药物新霉素(neomycin)、霉酚酸(mycophenolic acid)和潮霉素(hygromycin)。
适于哺乳动物细胞的选择标志的另一个实例是能够鉴定有能力摄取抗体核酸的细胞的选择标志，诸如DHFR、胸苷激酶、金属硫蛋白I和II(优选灵长类金属硫蛋白基因)、腺苷脱氨酶、鸟氨酸脱羧酶等。
例如，首先通过将所有转化子在含有甲氨蝶呤(Mtx，DHFR的一种竞争性拮抗剂)的培养基中进行培养来鉴定经DHFR选择基因转化的细胞。在采用野生型DHFR时，适当的宿主细胞是DHFR活性缺陷的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系(如ATCC CRL-9096)。
或者，可通过在含有针对选择标志的选择剂诸如氨基糖苷抗生素如卡那霉素、新霉素或G418的培养基中培养细胞来选择经编码抗体、野生型DHFR、蛋白、和另一种选择标志诸如氨基糖苷3’-磷酸转移酶(APH)的DNA序列转化或共转化的宿主细胞(特别是包含内源DHFR的野生型宿主)。参见美国专利No.4,965,199。
(iv)启动子构件
表达和克隆载体通常包含受到宿主生物体识别的启动子，且与抗体多肽核酸可操作连接。已知真核细胞的启动子序列。事实上，所有真核基因都具有富含AT区，它位于起始转录的位点上游约25至30个碱基处。在许多基因的转录起点上游70至80个碱基处发现的另一种序列是CNCAAT区，其中N可以是任何核苷酸。在大多数真核基因的3’端是AATAAA序列，它可能是向编码序列的3’端添加聚腺苷酸(polyA)尾的信号。所有这些序列合适的插入真核表达载体中。
在哺乳动物宿主细胞中抗体多肽从载体的转录受到控制，例如被从病毒(诸如多瘤病毒、禽痘病毒、腺病毒(诸如2型腺病毒)、牛乳头瘤病毒、禽类肉瘤病毒、巨细胞病毒、逆转录病毒、乙肝病毒、和猿猴病毒40(SV40))基因组获得的、来自异源哺乳动物启动子(如肌动蛋白启动子或免疫球蛋白启动子)的、来自热休克启动子的启动子的控制，只要这些启动子与宿主细胞系统相容。
方便的以SV40限制性片段的形式获得SV40病毒的早期和晚期启动子，该片段还包含SV40病毒复制起点。方便的以HindIIIE限制性片段的形式获得人巨细胞病毒的立即早期启动子。美国专利4,419,446中公开了使用牛乳头瘤病毒作为载体在哺乳动物宿主中表达DNA的系统。美国专利No.4,601,978中记载了该系统的一种修改。或者，可使用劳氏肉瘤病毒长末端重复序列作为启动子。
(v)增强子元件构件
常常通过在载体中插入增强子序列来提高高等真核细胞对编码本发明的抗体多肽的DNA的转录。现在知道来自哺乳动物基因(球蛋白、弹性蛋白酶、白蛋白、α-胎蛋白和胰岛素)的许多增强子序列。然而，通常使用来自真核细胞病毒的增强子。实例包括SV40复制起点晚期侧的增强子(bp100-270)、巨细胞病毒早期启动子增强子、多瘤病毒复制起点晚期侧的增强子、和腺病毒增强子。关于激活真核启动子的增强子元件还可参见Yaniv，Nature(自然)297：17-18(1982)。增强子可剪接到载体中，位于抗体多肽编码序列的5’或3’位置，但是优选位于启动子的5’位点。
(vi)转录终止构件
在真核宿主细胞中使用的表达载体典型地还包含终止转录和稳定mRNA所必需的序列。此类序列通常可从真核或病毒DNA或cDNA非翻译区的5’端和偶尔的3’端获得。这些区域包含在编码抗体的mRNA的非翻译区中转录成聚腺苷酸化片段的核苷酸区段。一种有用的转录终止构件是牛生长激素聚腺苷酸化区。参见W094/11026及其中公开的表达载体。
(vii)宿主细胞的选择和转化
适于克隆或表达本文载体中的DNA的宿主细胞包括本文描述的高等真核细胞，包括脊椎动物宿主细胞。脊椎动物细胞在培养(组织培养)中的繁殖已经成为常规流程。有用哺乳动物宿主细胞系的实例有经SV40转化的猴肾CV1系(COS-7，ATCC CRL 1651)、人胚肾系(293细胞或为在悬浮培养中生长而亚克隆的293细胞，Graham等，J.Gen.Virol.(基因病毒学杂志)36：59(1977))、幼仓鼠肾细胞(BHK，ATCC CCL 10)、中国仓鼠卵巢细胞/-DHFR(CHO，Urlaub等，Proc.Natl.Acad.Sci.(美国科学院院刊)USA77：4216(1980))、小鼠塞托利(Sertoli)细胞(TM4，Mather，Biol.Reprod.23：243-251(1980))、猴肾细胞(CV1 ATCC CCL 70)、非洲绿猴肾细胞(VERO-76，ATCC CRL-1587)、人宫颈癌细胞(HELA，ATCC CCL2)、犬肾细胞(MDCK，ATCC CCL 34)、牛鼠(buffalo rat)肝细胞(BRL 3A，ATCC CRL1442)、人肺细胞(W138，ATCC CCL 75)、人肝细胞(Hep G2，HB 8065)、小鼠乳瘤(MMT 060562，ATCC CCL 51)、TRI细胞(Mather等，Annals N.Y.Acad.Sci.383：44-68(1982))、MRC 5细胞、FS4细胞、和人肝细胞瘤(hepatoma)系(Hep G2)。
为了生成抗体，用上文所述表达或克隆载体转化宿主细胞，并在为了诱导启动子、选择转化子或扩增编码期望序列的基因而适当改动的常规营养培养基中进行培养。
(viii)宿主细胞的培养
用于生产本发明抗体的宿主细胞可在多种培养基中培养。商品化培养基诸如Ham氏F10(Sigma)、最小必需培养基(MEM，Sigma)、RPMI-1640(Sigma)、和Dulbecco氏改良的Eagle氏培养基(DMEM，西格玛(Sigma))适于培养宿主细胞。另外，可使用下列文献中记载的任何培养基作为宿主细胞的培养基：Ham等，Meth.Enz.58：44(1979)，Barnes等，Anal.Biochem.(分析生物化学)102：255(1980)，美国专利Nos.4,767,704；4,657,866；4,927,762；4,560,655；或5,122,469；WO 90/03430；WO 87/00195；或美国专利Re.30,985。任何这些培养基可根据需要补充激素和/或其它生长因子(诸如胰岛素、运铁蛋白或表皮生长因子)、盐(诸如氯化钠、钙、镁和磷酸盐)、缓冲剂(诸如HEPES)、核苷酸(诸如腺苷和胸苷)、抗生素(诸如GENTAMYCINTM药物)、痕量元素(定义为通常以微摩尔范围的终浓度存在的无机化合物)、和葡萄糖或等效能源。还可以适当浓度含有本领域技术人员知道的任何其它必需补充物。培养条件诸如温度、pH等就是先前为表达而选择用于宿主细胞的，这对于普通技术人员是显然的。
(ix)抗体的纯化
在使用重组技术时，可在细胞内生成抗体，或者直接分泌到培养基中。如果在细胞内生成抗体，那么首先通过例如离心或超滤清除微粒碎片，或是宿主细胞或是裂解片段。如果抗体分泌到培养基中，那么通常首先使用商品化蛋白质浓缩滤器(例如Amicon或Millipore Pellicon超滤单元)浓缩来自这些表达系统的上清液。可在任何上述步骤中包括蛋白酶抑制剂诸如PMSF以抑制蛋白水解，而且可包括抗生素以防止外来污染物的生长。
可使用例如羟磷灰石层析、凝胶电泳、透析和亲和层析来纯化从细胞制备的抗体组合物，亲和层析是一种优选的纯化技术。蛋白A作为亲和配体的适当性取决于抗体中存在的任何免疫球蛋白Fc结构域的种类和同种型。蛋白A可用于纯化基于人γ1、γ2、或γ4重链的抗体(Lindmark等，J.Immunol.Meth.(免疫学方法杂志)62：1-13(1983))。蛋白G推荐用于所有小鼠同种型和人γ3((Guss等，EMBO J.(欧洲分子生物学学会志)5：15671575(1986))。亲和配体所附着的基质最通常是琼脂糖，但是可使用其它基质。物理稳定的基质诸如可控孔径玻璃或聚(苯乙烯二乙烯)苯能获得比琼脂糖更快的流速和更短的加工时间。若抗体包含CH3结构域，则可使用Bakerbond ABXTM树脂(J.T.Baker，Phillipsburg，N.J.)进行纯化。根据待回收的抗体，也可使用其它蛋白质纯化技术诸如离子交换柱上的分级、乙醇沉淀、反相HPLC、硅土上的层析、肝素SEPHAROSETM上的层析、阴离子或阳离子交换树脂(诸如聚天冬氨酸柱)上的层析、层析聚焦、SDS-PAGE、和硫酸铵沉淀。
在任何初步纯化步骤之后，可将含有目的抗体和污染物的混合物进行低pH疏水相互作用层析，使用pH约2.5-4.5的洗脱缓冲液，优选在低盐浓度(如约0-0.25M盐)进行。
免疫缀合物
本发明还提供免疫缀合物(可互换地称为“抗体-药物缀合物”或“ADC”)，其包含偶联至细胞毒性试剂的本文描述的任何抗-Notch1 NRR抗体，所述细胞毒性试剂诸如化疗剂、药物、生长抑制剂、毒素(如细菌、真菌、植物或动物起源的酶活性毒素或其片段)或放射性同位素(即放射缀合物)。
抗体-药物缀合物在癌症治疗中用于局部投递细胞毒性试剂或细胞抑制试剂(即用于杀死或抑制肿瘤细胞的药物)的用途(Syrigos和Epenetos(1999)Anticancer Research(抗癌研究)19：605-614；Niculescu-Duvaz andSpringer(1997)Adv.Drg.Del.Rev.26：151-172；美国专利No.4,975,278)能将药物部分靶向投递至肿瘤，并在那儿进行细胞内积累，而系统施用这些未经偶联的药物试剂可在试图消除的肿瘤细胞以外导致不可接受的对正常细胞的毒性水平(Baldwin等，(1986)Lancet pp.(1986年3月15日)第603-05页；Thorpe，(1985)“Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In CancerTherapy：A Review(肿瘤治疗中细胞毒性试剂的抗体载体)，”在MonoclonalAntibodies′84：Biological And Clinical Applications(单克隆抗体84：生物学和临床应用)中，A.Pinchera等(编辑)，第475-506页)。由此试图获得最大功效及最小毒性。多克隆抗体和单克隆抗体皆有报道可用于这些策略(Rowland等，(1986)Cancer Immunol.Immunother.，21：183-87)。这些方法中所使用的药物包括道诺霉素(daunomycin)、多柔比星(doxorubicin)、甲氨蝶呤(methotrexate)和长春地辛(vindesine)(Rowland等，1986，见上文)。抗体-毒素缀合物中所使用的毒素包括细菌毒素诸如白喉毒素、植物毒素诸如蓖麻毒蛋白、小分子毒素诸如格尔德霉素(geldanamycin)(Mandler等(2000)Jour.of the Nat.Cancer Inst.(国家肿瘤研究所杂志)92(19)：1573-1581；Mandler等，(2000)Bioorganic & Med.Chem.Letters(生物有机和医学化学通讯)10：1025-1028；Mandler等，(2002)Bioconjugate Chem.(生物偶联化学)13：786-791)，美坦生类化合物(maytansinoids)(EP 1391213；Liu等，(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.(美国科学院院刊)USA 93：8618-8623)，和加利车霉素(calicheamicin)(Lode等，(1998)Cancer Res.(肿瘤研究)58：2928；Hinman等，(1993)Cancer Res.(肿瘤研究)53：3336-3342)。毒素可通过包括微管蛋白结合、DNA结合或拓扑异构酶抑制在内的机制发挥其细胞毒性和细胞抑制的效果。有些细胞毒性药物在与大的抗体或蛋白质受体配体偶联时趋于失活或活性降低。
ZEVALIN(替伊莫单抗(ibritumomab tiuxetan)，Biogen/Idec)是由针对在正常和恶性B淋巴细胞表面上发现的CD20抗原的鼠IgG1κ单克隆抗体与通过硫脲接头-螯合剂所结合的111In或90Y放射性同位素构成的抗体-放射性同位素缀合物(Wiseman等，(2000)Eur.Jour.Nucl.Med.27(7)：766-77；Wiseman等，(2002)Blood(血液)99(12)：4336-42；Witzig等，(2002)J.Clin.Oncol.(临床病毒学杂志)20(10)：2453-63；Witzig等，(2002)J.Clin.Oncol.(临床病毒学杂志)20(15)：3262-69)。尽管ZEVALIN具有针对B细胞非何杰金氏(non-Hodgkin)淋巴瘤(NHL)的活性，然而施药在大多数患者中导致严重且长时间的血细胞减少。MYLOTARGTM(吉姆单抗奥佐米星(gemtuzumab ozogamicin)，Wyeth Pharmaceuticals)，即由人CD33抗体与加利车霉素连接而构成的抗体-药物缀合物，在2000年批准用于经注射治疗急性骨髓性白血病(Drugs of the Future(2000)25(7)：686；美国专利Nos.4,970,198；5,079,233；5,585,089；5,606,040；5,6937,62；5,739,116；5,767,285；5,773,001)。Cantuzumab mertansine(Immunogen，Inc.)，即由huC242抗体经二硫化物接头SPP与美坦生类化合物药物部分DM1连接而构成的抗体-药物缀合物，正在进行用于治疗表达CanAg的癌症诸如结肠癌、胰腺癌、胃癌和其它癌的II期试验。MLN-2704(Millennium Pharm.，BZL Biologics，Immunogen Inc.)，即由抗前列腺特异膜抗原(PSMA)单克隆抗体与美坦生类化合物药物部分DM1连接而构成的抗体-药物缀合物，正在进行用于前列腺肿瘤潜在治疗的开发。将多拉司他汀(dolastatin)的合成类似物auristatin肽、auristatin E(AE)和单甲基auristatin(MMAE)与嵌合单克隆抗体cBR96(对癌上的Lewis Y特异)和cAC10(对恶性血液肿瘤上的CD30特异)偶联(Doronina等，(2003)Nature Biotechnology(自然：生物技术)21(7)：778-784)，且正在进行治疗性开发。
本文(例如上文)描述了可用于生成此类免疫缀合物的化疗剂。可使用的酶活性毒素及其片段包括白喉毒素A链、白喉毒素的非结合活性片段、外毒素A链(来自铜绿假单胞菌Pseudomonas aeruginosa)、蓖麻毒蛋白(ricin)A链、相思豆毒蛋白(abrin)A链、蒴莲根毒蛋白(modeccin)A链、α-帚曲霉素(sarcin)、油桐(Aleutites fordii)蛋白、香石竹毒蛋白(dianthinprotein)、美洲商陆(Phytolaca americana)蛋白(PAPI、PAPII和PAP-s)、苦瓜(Momordica charantia)抑制剂、麻疯树毒蛋白(curcin)、巴豆毒蛋白(crotin)、肥皂草(sapaonaria officinalis)抑制剂、白树毒蛋白(gelonin)、丝林霉素(mitogellin)、局限曲菌素(restrictocin)、酚霉素(phenomycin)、依诺霉素(enomycin)和单端孢菌素(trichothecenes)。参见例如1993年10月28日公开的WO 93/21232。多种放射性核素可用于生成放射偶联抗体。实例包括212Bi、131I、131In、90Y、和186Re。抗体和细胞毒性试剂的缀合物可使用多种双功能蛋白质偶联剂来制备，诸如N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)、亚氨基硫烷(IT)、亚氨酸酯(诸如二甲基己二亚酰胺化物)、活性酯类(诸如辛二酸二琥珀酰亚胺基酯)、醛类(诸如戊二醛)、双叠氮化合物(诸如双(对-叠氮苯甲酰基)己二胺)、双重氮衍生物(诸如双(对-重氮苯甲酰基)己二胺)、二异氰酸酯(诸如甲苯2，6-二异氰酸酯)、和双活性氟化合物(诸如1，5-二氟-2，4-二硝基苯)的双功能衍生物。例如，可如Vitettaet等，Science(科学)238：1098(1987)中所述制备蓖麻毒蛋白免疫毒素。碳-14标记的1-异硫氰酸苯甲基-3-甲基二亚乙基三胺五乙酸(MX-DTPA)是用于将放射性核苷酸与抗体偶联的例示性螯合剂。参见WO 94/11026。
本文还设想了抗体与一种或多种小分子毒素诸如加利车霉素(calicheamicin)、美坦生类化合物(maytansinoids)、多拉司他汀(dolastatins)、aurostatins，单端孢霉素(trichothecene)和CC 1065及这些毒素具有毒素活性的片段的缀合物。
i.美坦生(Maytansine)和美坦生类化合物
在一些实施方案中，免疫缀合物包含偶联至一个或多个美坦生类化合物分子的本发明的抗体(全长或片段)。
美坦生类化合物是通过抑制微管蛋白多聚化来发挥作用的有丝分裂抑制剂。美坦生最初从东非灌木齿叶美登木(Maytenus serrata)分离得到(美国专利3,896,111)。随后发现某些微生物也生成美坦生类化合物，诸如美登醇和C-3美登醇酯(美国专利4,151,042)。例如下列美国专利公开了合成美登醇及其衍生物和类似物：4,137,230；4,248,870；4,256,746；4,260,608；4,265,814；4,294,757；4,307,016；4,308,268；4,308,269；4,309,428；4,313,946；4,315,929；4,317,821；4,322,348；4,331,598；4,361,650；4,364,866；4,424,219；4,450,254；4,362,663；和4,371,533。
在抗体药物缀合物中美坦生类化合物药物部分是有吸引力的药物部分，因为它们：(i)相对易于通过发酵或化学修饰、从发酵产物衍生而制备，(ii)易于用适于通过非二硫化物接头偶联至抗体的功能基团衍生化，(iii)在血浆中稳定，和(iv)针对多种肿瘤细胞系有效。
已经公开了含有美坦生类化合物的免疫缀合物、其制备方法及其治疗用途，例如美国专利5,208,020，5,416,064；及欧洲专利EP 0 425 235 B1，明确将其公开内容通过引用并入本文。Liu等，Proc.Natl.Acad.Sci.(美国科学院院刊)USA 93：8618-8623(1996)记载了包含与针对人结肠直肠癌的单克隆抗体C242连接的称为DM1的美坦生类化合物的免疫缀合物。发现该缀合物具有针对培养的结肠癌细胞的高度细胞毒性，而且在体内肿瘤生长测定法中显示抗肿瘤活性。Chari等，Cancer Research(癌症研究)52：127-131(1992)记载了其中美坦生类化合物经二硫化物接头与结合人结肠癌细胞系上抗原的鼠抗体A7或结合HER-2/neu癌基因的另一种鼠单克隆抗体TA.1偶联的免疫缀合物。在体外在人乳癌细胞系SK-BR-3上测试了TA.1-美坦生类化合物缀合物的细胞毒性，该细胞系每个细胞表达3x105个HER-2表面抗原。药物缀合物达到了与游离美坦生类化合物药物相似的一定程度的细胞毒性，这可通过增加每个抗体分子偶联的美坦生类化合物分子数目来提高。A7-美坦生类化合物缀合物在小鼠中显示低系统性细胞毒性。
抗体-美坦生类化合物缀合物可通过将抗体与美坦生类化合物分子化学连接且不显著削弱抗体或美坦生类化合物分子的生物学活性来制备。参见例如，美国专利No.5,208,020(其公开内容通过引用明确并入本文)。每个抗体分子偶联平均3-4个美坦生类化合物分子在增强针对靶细胞的细胞毒性中显示功效，且对抗体的功能或溶解度没有负面影响，尽管预计甚至一个分子的毒素/抗体也将较之裸抗体的使用增强细胞毒性。美坦生类化合物在本领域是众所周知的，而且可通过已知技术合成或从天然来源分离。例如美国专利5,208,020和上文提及的其它专利及非专利发表物中公开了合适的美坦生类化合物。优选的美坦生类化合物是美登醇和美登醇分子的芳香环或其它位置经过修饰的美登醇类似物，诸如各种美登醇酯。
本领域知道许多连接基团可用于制备抗体-美坦生类化合物缀合物，包括例如美国专利5,208,020或欧洲专利0 425 235 B1及Chari等，CancerResearch(癌症研究)52：127-131(1992)，和2004年10月8日提交的美国专利申请No.10/960,602中所公开的，其公开内容通过引用明确并入本文。可如2004年10月8日提交的美国专利申请No.10/960,602所公开的制备包含接头成分SMCC的抗体-美坦生类化合物缀合物。连接基团包括二硫化物基团、硫醚基团、酸不稳定基团、光不稳定基团、肽酶不稳定基团、或酯酶不稳定基团，正如上文所述专利中所公开的，二硫化物和硫醚基团是优选的。另外的连接基团在本文进行了描述和例示。
可使用多种双功能蛋白质偶联剂来制备抗体和美坦生类化合物的缀合物，诸如N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)、琥珀酰亚胺基-4-(N-马来酰亚氨基甲基)环己烷-1-羧酸酯(SMCC)、亚氨基硫烷(IT)、亚氨酸酯(诸如盐酸二甲基己二亚酰胺化物)、活性酯类(诸如辛二酸二琥珀酰亚胺基酯)、醛类(诸如戊二醛)、双叠氮化合物(诸如双(对-叠氮苯甲酰基)己二胺)、双重氮衍生物(诸如双(对-重氮苯甲酰基)-乙二胺)、二异氰酸酯(诸如甲苯2，6-二异氰酸酯)、和双活性氟化合物(诸如1，5-二氟-2，4-二硝基苯)的双功能衍生物。特别优选的偶联剂包括N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)(Carlsson等，Biochem.J.(生物化学杂志)173：723-737(1978))和N-琥珀酰亚氨基-4-(2-吡啶基硫代)戊酸酯(SPP)，由此提供二硫键连接。
根据连接的类型，可将接头附着于美坦生类化合物分子的多个位置。例如，可使用常规偶联技术通过与羟基的反应来形成酯键。反应可发生在具有羟基的C-3位置、经羟甲基修饰的C-14位置、经羟基修饰的C-15位置、和具有羟基的C-20位置。在一个优选实施方案中，在美登醇或美登醇类似物的C-3位置形成键连接。
ii.Auristatin和多拉司他汀
在有些实施方案中，免疫缀合物包含与多拉司他汀(dolastatin)或多拉司他汀肽类似物和衍生物，auristatin偶联的抗体(美国专利No.5,635,483；5,780,588)。多拉司他汀类和auristatin类已经显示出干扰微管动力学、GTP水解、及核和细胞分裂(Woyke等(2001)Antimicrob.Agents and Chemother.45(12)：3580-3584)且具有抗癌(美国专利No.5,663,149)和抗真菌活性(Pettit等，(1998)Antimicrob.Agents Chemother.42：2961-2965)。多拉司他汀或auristatin药物结构部分可经由肽药物结构部分的N(氨基)末端或C(羧基)末端附着于抗体(WO 02/088172)。
例示性的auristatin实施方案包括N-末端连接的单甲基auristatin药物结构部分DE和DF，披露于2004年11月5日提交的“MonomethylvalineCompounds Capable of Conjugation to Ligands(能偶联至配体的单甲基缬氨酸化合物)”，美国序列号No.10/983,340，明确将其公开内容完整收入本文。
典型的是，基于肽的药物结构部分可通过在两个或多个氨基酸和/或肽片段之间形成肽键来制备。此类肽键可依照例如肽化学领域众所周知的液相合成法来制备(参见E.和K.Lübke，“The Peptides(肽)，”volume1，第.76-136页，1965，Academic Press)。Auristatin/多拉司他汀药物结构部分可依照以下文献中的方法来制备：美国专利Nos.5,635,483和5,780,588；Pettit等，(1989)J.Am.Chem.Soc.111：5463-5465；Pettit等，(1998)Anti-Cancer Drug Design(抗癌药物设计)13：243-277；Pettit，G.R.，等，Synthesis(合成)，1996，719-725；和Pettit等，(1996)J.Chem.Soc.PerkinTrans.1 5：859-863；也见Doronina(2003)Nat.Biotechnol.(自然：生物技术)21(7)：778-784；“Monomethylvaline Compounds Capable of Conjugation toLigands(能偶联至配体的单甲基缬氨酸化合物)，”US20050238649，2005年10月27日公开，将其完整收入本文作为参考(披露了例如制备偶联至接头的诸如MMAE和MMAF的单甲基缬氨酸化合物的接头和方法)。
iii.加利车霉素
在其它实施方案中，免疫缀合物包含与一个或多个加利车霉素分子偶联的本发明抗体。加利车霉素抗生素家族能够在亚皮摩尔浓度产生双链DNA断裂。关于加利车霉素家族缀合物的制备参见美国专利Nos.5,712,374，5,714,586，5,739,116，5,767,285，5,770,701，5,770,710，5,773,001，和5,877,296(都授予American Cyanamid Company)。可用的加利车霉素结构类似物包括但不限于γ1 I，α2 I，α3 I，N-乙酰基-γ1 I，PSAG和θI 1(Hinman等，Cancer Research(癌症研究)53：3336-3342(1993)，Lode等，Cancer Research(癌症研究)58：2925-2928(1998)；及上述授予American Cyanamid的美国专利)。可与抗体偶联的另一种抗肿瘤药物是QFA，它是一种抗叶酸药物。加利车霉素和QFA都具有胞内作用位点，且不易穿过质膜。因此，这些试剂经由抗体介导的内在化的细胞摄取大大增强了它们的细胞毒性效果。
iv.其它细胞毒性试剂
可与本发明的抗体偶联的其它抗肿瘤剂包括BCNU、链佐星(streptozoicin)、长春新碱(vincristine)、5-氟尿嘧啶、美国专利Nos.5,053,394和5,770,710记载的统称为LL-E33288复合物的试剂家族、及埃斯波霉素类(esperamicins)(美国专利No.5,877,296)。
可用的酶活性毒素及其片段包括白喉毒素A链、白喉毒素的非结合活性片段、外毒素A链(来自铜绿假单胞菌Pseudomonas aeruginosa)、蓖麻毒蛋白(ricin)A链、相思豆毒蛋白(abrin)A链、蒴莲根毒蛋白(modeccin)A链、α-帚曲霉素(sarcin)、油桐(Aleutites fordii)蛋白、香石竹毒蛋白(dianthinprotein)、美洲商陆(Phytolaca americana)蛋白(PAPI、PAPII和PAP-S)、苦瓜(Momordica charantia)抑制剂、麻疯树毒蛋白(curcin)、巴豆毒蛋白(crotin)、肥皂草(sapaonaria officinalis)抑制剂、白树毒蛋白(gelonin)、丝林霉素(mitogellin)、局限曲菌素(restrictocin)、酚霉素(phenomycin)、依诺霉素(enomycin)和单端孢菌素(trichothecenes)。参见例如1993年10月28日公开的WO 93/21232。
本发明还考虑了以下免疫缀合物，其在抗体和具有核酸降解活性的化合物(如核糖核酸酶或DNA内切核酸酶，诸如脱氧核糖核酸酶；DNA酶)之间形成。
为了选择性破坏肿瘤，抗体可包含高度放射性原子。多种放射性同位素可用于生成放射偶联的抗体。实例包括At211，I131，I125，Y90，Re186，Re188，Sm153，Bi212，P32，Pb212和Lu的放射性同位素。在将缀合物用于检测时，可包含放射性原子用于闪烁照相研究，例如tc99m或I123，或是包含自旋标记物用于核磁共振(NMR)成像(也称为磁共振成像，mri)，诸如碘-123、碘-131、铟-111、氟-19、碳-13、氮-15、氧-17、钆、锰或铁。
可以已知方式将放射性或其它标记物掺入缀合物。例如，可生物合成肽，或是通过化学氨基酸合成法合成肽，其中使用牵涉例如氟-19代替氢的合适氨基酸前体。可经肽中的半胱氨酸残基来附着标记物，诸如Tc99m或I123，Re186，Re188和In111。可以经赖氨酸残基来附着钇-90。IODOGEN法(Fraker等(1978)Biochem.Biophys.Res.Commun.80：49-57可用于掺入碘123。“Monoclonal Antibodies in Immunoscintigraphy(免疫闪烁成像中的单克隆抗体)”(Chatal，CRC Press 1989)详细记载了其它方法。
抗体和细胞毒性试剂的缀合物可使用多种双功能蛋白质偶联剂来制备，诸如N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)、琥珀酰亚胺基-4-(N-马来酰亚氨甲基)环己烷-1-羧酸酯(SMCC)、亚氨基硫烷(IT)、亚氨酸酯(诸如盐酸二甲基己二亚酰胺化物)、活性酯类(诸如辛二酸二琥珀酰亚胺基酯)、醛类(诸如戊二醛)、双叠氮化合物(诸如双(对-叠氮苯甲酰基)己二胺)、双重氮衍生物(诸如双(对-重氮苯甲酰基)己二胺)、二异氰酸酯(诸如甲苯2，6-二异氰酸酯)、和双活性氟化合物(诸如1，5-二氟-2，4-二硝基苯)的双功能衍生物。例如，可如Vitetta et al.，Science(科学)238：1098(1987)中所述制备蓖麻毒蛋白免疫毒素。碳-14标记的1-异硫氰酸苯甲基-3-甲基二亚乙基三胺五乙酸(MX-DTPA)是用于将放射性核苷酸与抗体偶联的例示性螯合剂。参见WO 94/11026。接头可以是便于在细胞中释放细胞毒性药物的“可切割接头”。例如，可使用酸不稳定接头、肽酶敏感接头、光不稳定接头、二甲基接头、或含二硫化物接头(Chari等，Cancer Research(癌症研究)52：127-131(1992)；美国专利No.5,208,020)。
本发明的化合物明确涵盖但不限于用下列交联剂制备的ADC：商品化(如购自Pierce Biotechnology，Inc.，Rockford，IL.，U.S.A)的BMPS、EMCS、GMBS、HBVS、LC-SMCC、MBS、MPBH、SBAP、SIA、SIAB、SMCC、SMPB、SMPH、硫代-EMCS、硫代-GMBS、硫代-KMUS、硫代-MBS、硫代-SIAB、硫代-SMCC、和硫代-SMPB、和SVSB(琥珀酰亚氨基-(4-乙烯基砜)苯甲酸酯)。见2003-2004年度应用手册和产品目录(Applications Handbook and Catalog)第467-498页。
v.抗体-药物缀合物的制备
在本发明的抗体-药物缀合物(ADC)中，将抗体(Ab)经接头(L)与一个或多个药物结构部分(D)偶联，例如每个抗体偶联约1个至约20个药物结构部分。可采用本领域技术人员知道的有机化学反应、条件和试剂通过数种路径来制备通式I的ADC，包括：(1)抗体的亲核基团经共价键与二价接头试剂反应，形成Ab-L，随后与药物结构部分D反应；和(2)药物结构部分的亲核基团经共价键与二价接头试剂反应，形成D-L，随后与抗体的亲核基团反应
Ab-(L-D)p I
接头可由一个或多个接头构件构成。示例性接头构件包括6-马来酰亚胺己酰基(6-maleimidocaproyl，“MC”)、马来酰亚胺基丙酰基(maleimidopropanoyl，“MP”)、缬氨酸-瓜氨酸(“val-cit”)、丙氨酸-苯丙氨酸(“ala-phe”)、对-氨基苯甲氧基羰基(p-aminobenzyloxycarbonyl，“PAB”)、N-琥珀酰亚胺基-4-(2-吡啶基硫代)戊酸酯(“SPP”)、N-琥珀酰亚胺基-4-(N-马来酰亚氨甲基)环己烷-1-羧酸酯(“SMCC’)、和N-琥珀酰亚胺基(4-碘-乙酰基)苯甲酸酯(“SIAB”)。另外的接头构件是本领域已知的，有些在本文进行了描述。也见“Monomethylvaline Compounds Capable of Conjugation toLigands(能偶联至配体的单甲基缬氨酸化合物)，”2004年11月5日提交，美国序列号No.10/983,340，其全文内容通过引用并入本文。
在一些实施方案中，接头可包含氨基酸残基。示例性氨基酸接头构件包括二肽、三肽、四肽、或五肽。示例性二肽包括：缬氨酸-瓜氨酸(vc或val-cit)、丙氨酸-苯丙氨酸(af或ala-phe)。示例性三肽包括：甘氨酸-缬氨酸-瓜氨酸(gly-val-cit)和甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸(gly-gly-gly)。包含氨基酸接头构件的氨基酸残基包括天然存在的那些，以及次级氨基酸(minor aminoacid)和非天然存在的氨基酸类似物，如瓜氨酸。可设计和优化氨基酸接头构件的选择性以用于通过特定的酶(如肿瘤相关的蛋白酶、组织蛋白酶B、C和D、或纤溶酶蛋白酶)进行酶切割。
抗体的亲核基团包括但不限于：(i)N末端氨基；(ii)侧链氨基，如赖氨酸；(iii)侧链巯基，如半胱氨酸；和(iv)糖基化抗体中糖的羟基或氨基。氨基、巯基、和羟基是亲核的，能够与接头部分上的亲电子基团反应而形成共价键，而接头试剂包括：(i)活性酯类，诸如NHS酯、HOBt酯、卤代甲酸酯、和酸性卤化物；(ii)烷基和苯甲基卤化物，诸如卤代乙酰胺；(iii)醛类、酮类、羧基和马来酰亚胺基团。某些抗体具有可还原的链间二硫键，即半胱氨酸桥。可通过还原剂诸如DTT(二硫苏糖醇)处理使抗体具有与接头试剂偶联的反应活性。每个半胱氨酸桥理论上将形成两个反应性硫醇亲核体。可经由赖氨酸与2-亚氨基硫烷(Traut氏试剂)的反应，导致胺转变为硫醇，从而将额外亲核基团引入抗体。通过引入一个、两个、三个、四个、或更多半胱氨酸残基(例如制备包含一个或多个非天然半胱氨酸残基的突变抗体)可将反应性硫醇基引入抗体(或其片段)。
还可通过修饰抗体引入可与接头试剂或药物上的亲核取代基反应的亲电子结构部分来生成本发明的抗体-药物缀合物。可用例如高碘酸盐氧化剂氧化糖基化抗体的糖，从而形成可与接头试剂或药物结构部分的胺基团反应的醛或酮基团。所得亚胺Schiff碱基可形成稳定的键，或者可用例如硼氢化物试剂还原而形成稳定的胺连接。在一个实施方案中，糖基化抗体的碳水化合物部分与半乳糖氧化酶或偏高碘酸钠的反应可在蛋白质中生成羰(醛和酮)基团，它可与药物上的适当基团反应(Hermanson，Bioconjugate Techniques)。在另一个实施方案中，包含N末端丝氨酸或苏氨酸残基的蛋白质可与偏高碘酸钠反应，导致在第一个氨基酸处生成醛(Geoghegan & Stroh，(1992)Bioconjugate Chem.(生物缀合物化学)3：138-146；美国专利No.5,362,852)。此类醛可与药物结构部分或接头亲核体反应。
同样，药物结构部分上的亲核基团包括但不限于：胺、硫醇、羟基、酰肼、肟、肼、缩氨基硫脲、肼羧酸酯、和芳基酰肼基团，它们能够与接头部分上的亲电子基团反应而形成共价键，而接头试剂包括：(i)活性酯类，诸如NHS酯、HOBt酯、卤代甲酸酯、和酸性卤化物；(ii)烷基和苯甲基卤化物，诸如卤代乙酰胺；(iii)醛类、酮类、羧基、和马来酰亚胺基团。
或者，可通过例如重组技术或肽合成来制备包含抗体和细胞毒性试剂的融合蛋白。DNA的长度可包含各自编码缀合物两个部分的区域，或是彼此毗邻或是由编码接头肽的区域分开，该接头肽不破坏缀合物的期望特性。
在又一个实施方案中，可将抗体与“受体”(诸如链霉亲和素)偶联从而用于肿瘤预先靶向，其中对个体施用抗体-受体缀合物，接着使用清除剂由循环中清除未结合的缀合物，然后施用与细胞毒性试剂(如放射性核苷酸)偶联的“配体”(如亲合素)。
药物制剂
包含本发明抗体的治疗剂可通过将具有期望纯度的抗体与任选的生理学可接受的载体、赋形剂或稳定剂(Remington：The Science and Practiceof Pharmacy第20版(2000))混合，以水溶液、冻干的或其它干燥的制剂制备供贮存。可接受的载体、赋形剂或稳定剂在所采用的剂量和浓度对接受者是无毒的，包括缓冲剂，诸如磷酸盐、柠檬酸盐、组氨酸和其它有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(诸如氯化十八烷基二甲基苄基铵；氯化己烷双胺；苯扎氯铵、苯索氯铵；酚、丁醇或苯甲醇；对羟基苯甲酸烷基酯，诸如对羟基苯甲酸甲酯或丙酯；邻苯二酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚)；低分子量(少于约10个残基)多肽：蛋白质，诸如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，诸如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，诸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其它碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，诸如EDTA；糖类，诸如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；成盐平衡离子，诸如钠；金属复合物(例如Zn-蛋白质复合物)；和/或非离子表面活性剂，诸如TWEENTM、PLURONICSTM或聚乙二醇(PEG)。
本文中的制剂还可含有超过一种所治疗具体适应症所必需的活性化合物，优选活性互补且彼此没有不利影响的那些。合适的是，此类分子以对于预定目的有效的量组合。
活性成分还可包载于例如通过凝聚技术或通过界面聚合制备的微胶囊中(例如分别是羟甲基纤维素或明胶微胶囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊)、包载在胶状药物投递系统中(例如脂质体、清蛋白微球体、微乳剂、纳米颗粒和纳米胶囊)、或包载在粗滴乳状液中。此类技术披露于Remington：The Science and Practice of Pharmacy第20版(2000)。
将要体内施用的制剂必需是无菌的。这可方便地通过无菌滤膜过滤完成。
可制备持续释放制剂。持续释放制剂的合适例子包括含有本发明的免疫球蛋白的固体疏水性聚合物半透性基质，该基质是定型产品的形式，例如薄膜或微胶囊。持续释放基质的例子包括聚酯、水凝胶(例如聚(2-羟乙基-甲基丙烯酸酯)或聚(乙烯醇))、聚交酯(美国专利No.3,773,919)、L-谷氨酸与γ乙基-L-谷氨酸酯的共聚物、不可降解的乙烯-乙酸乙烯、可降解的乳酸-乙醇酸共聚物诸如LUPRON DEPOTTM(由乳酸-乙醇酸共聚物和醋酸亮丙瑞林构成的可注射微球体)及聚-D-(-)-3-羟基丁酸。虽然诸如乙烯-乙酸乙烯和乳酸-乙醇酸等聚合物能够释放分子达100天以上，但是某些水凝胶释放蛋白质的时间较短。当封装的免疫球蛋白在体内长时间维持时，它们可能由于暴露于37℃的潮湿环境而变性或聚集，导致生物学活性损失和免疫原性可能改变。可以根据相关机制来设计合理的稳定化策略。例如，如果发现聚集机制是经由硫-二硫化物互换的分子间S-S键形成，那么可通过修饰巯基残基、由酸性溶液冻干、控制湿度、采用适当添加剂和开发特定聚合物基质组合物来实现稳定。
III.治疗用途
本文描述的结合HER2和VEGF两者的抗体和抗体片段(例如，bH1-44或bH1-88或其片段)可用于治疗肿瘤，包括癌前的、非转移性的、和癌性肿瘤(例如，早期癌症)，用于治疗自身免疫性疾病，用于治疗血管发生病症，用于治疗涉及HER2异常激活的疾病，或用于治疗有发生癌症(例如乳癌、结肠直肠癌、肺癌、肾细胞癌、神经胶质瘤、或卵巢癌)、血管发生病症、自身免疫性疾病、或涉及HER2异常激活的疾病的风险的受试者。
术语癌症包括一组增殖性病症，包括但不限于癌前生长、良性肿瘤、和恶性肿瘤。良性肿瘤维持局限在原始位点并且没有浸润、侵袭或转移至远方位点的能力。恶性肿瘤将侵袭并破坏其周围的其它组织。它们也获得了从其起始处剥离并扩散至身体其它部分的能力(转移)，通常通过血流或通过淋巴结所在的淋巴系统转移。原发肿瘤通过它们所发生的组织类型进行分类；转移瘤通过衍生癌细胞的组织类型进行分类。经过一段时间，恶性肿瘤的细胞变得更加异常并显得更不像正常细胞。这种癌细胞的外观变化称为肿瘤分级，并且癌细胞被描述为良好分化的、中度分化的、较差分化的或未分化的。良好分化的细胞显得非常正常并且类似于它们所来源的正常细胞。未分化的细胞是变得如此异常的细胞以至于不能确定该细胞的来源。
肿瘤可以是实体瘤或非实体瘤或软组织肿瘤。软组织肿瘤的实例包括白血病(例如，慢性髓细胞性白血病(chronic myelogenous leukemia)、急性髓细胞性白血病(acute myelogenous leukemia)、成人急性淋巴细胞性白血病(adult acute lymphoblastic leukemia)、急性骨髓性白血病(acute myelogenousleukemia)、成熟急性B细胞型淋巴细胞性白血病(mature B-cell acutelymphoblastic leukemia)、慢性淋巴细胞性白血病(chronic lymphocyticleukemia)、前淋巴细胞性白血病(polymphocytic leukemia)、或毛细胞性白血病(hairy cell leukemia))、或淋巴瘤(lymphoma)(例如，非霍奇金淋巴瘤(non-Hodgkin′s lymphoma)、皮肤T细胞淋巴瘤(cutaneous T-cell lymphoma)、或霍奇森病(Hodgkin′s disease)。实体瘤包括血液、骨髓、或淋巴系统之外的任何身体组织的癌症。实体瘤可进一步分为上皮细胞来源的那些和非上皮细胞来源的那些。上皮细胞实体瘤的实例包括胃肠道、结肠、乳房、前列腺、肺、肾、肝、胰、卵巢、头和颈、口腔、胃、十二指肠、小肠、大肠、肛门、胆囊、阴唇，鼻咽，皮肤，子宫，男性生殖器，泌尿器官，膀胱癌及皮肤的肿瘤。非上皮来源的实体瘤包括肉瘤(sarcomas)、脑肿瘤(braintumors)、和骨肿瘤(bone tumors)。
上皮癌通常从良性肿瘤发展为前侵袭期(例如，原位癌)，至恶性癌症，其已经渗透基底膜并侵入上皮下基质。
结合VEGF和HER2两者的多特异性抗体(例如，bH1-44或bH1-88或其片段)理想地用于治疗乳腺癌、结肠直肠癌、肺癌、肾细胞癌、神经胶质瘤、或卵巢癌。
现已确定血管发生参与多种病症的发病。这些包括实体瘤和转移灶、动脉粥样硬化(atherosclerosis)、晶状体后纤维组织增生症(retrolentalfibroplasia)、血管瘤(hemangiomas)、慢性炎症(chronic inflammation)、眼内新生血管疾病如增殖性视网膜病(proliferative retinopathies)，例如，糖尿病性视网膜病(diabetic retinopathy)、与年龄相关的黄斑退行性改变(age-related macular degeneration，AMD)，新生血管性青光眼(neovascularglaucoma)、移植的角膜组织和其它组织的免疫排斥、类风湿性关节炎和牛皮癣。Folkman等，J.Biol.Chem.，267：10931-10934(1992)；Klagsbrun等，Annu.Rev.Physiol.53：217-239(1991)；和Garner A.，″Vascular diseases″，在：Pathobiology of Ocular Disease.A Dynamic Approach，Garner A.，KlintworthGK，编辑，第二版(Marcel Dekker，NY，1994)，第1625-1710页中。
异常血管发生出现在疾病状态中新血管生长过度、不足或不适当(例如从医学角度不需要的血管发生的位置、时间或开始)的情况或当其导致疾病状态时。“过度、不适当或失控的血管发生”出现在新血管生长导致疾病状态的加重或导致疾病状态时，例如在癌中，特别是血管化的实体瘤和转移瘤(包括结肠、肺癌(特别是小细胞肺癌)或前列腺癌)，由眼部新生血管化导致的疾病，特别是糖尿病性失明，视网膜病、原发性糖尿病性视网膜病或与年龄相关的黄斑退行性改变(AMD)、糖尿病性黄斑水肿(diabeticmacular edema)、脑水肿(cerebral edema)(例如，与急性中风/闭合性头颅伤/外伤相关的脑水肿)、滑膜性炎症(synovial inflammation)、类风湿性关节炎中血管翳(pannus)形成、骨化性肌炎(myositis ossificans)、肥厚骨形成(hypertropic bone formation)、顽固性腹水(refractory ascites)、多囊性卵巢病(polycystic ovarian disease)、第三体液分区疾病(3rd spacing of fluid diseases)(胰腺炎(pancreatitis)、间隔综合征(compartment syndrome)、烧伤(burns)、肠病(bowel disease)、子宫平滑肌瘤(uterine fibroids)、早产(premature labor)、角的新生血管形成(neovascularization of the angle)(发红(rubeosis))；恶性肺渗液(malignant pulmonary effusions)、脉管再狭窄(vascular restenosis)、血管母细胞瘤(haemangioblastoma)诸如血管瘤(haemagnioma)；炎性肾疾病、诸如肾小球肾炎(glomerulonephritis)、特别是系膜增生性肾小球肾炎(mesangioproliferative glomerulonephritis)、溶血性尿毒症综合征(haemolyticuremic syndrome)、糖尿病肾病(diabetic nephropathy)或超敏性肾小球硬化症(hypertensive nephrosclerosis)；各种炎性疾病、诸如关节炎、特别是类风湿性关节炎、炎性肠病、牛皮癣、牛皮癣关节炎(psoriatic arthritis)、牛皮癣斑块(psoriatic plaques)、肉样瘤病(sarcoidosis)、动脉性动脉硬化症以及移植后发生的疾病、肾同种异体移植物排斥、子宫内膜异位症((endometriosis)或慢性哮喘以及超过70种其它疾病。新血管可为患病组织提供营养，破坏正常组织，并且在癌症中，新血管允许肿瘤细胞逃逸进入循环并定位在其它器官中(肿瘤转移)。血管发生不足见于导致疾病状态恶化的不足的血管发生，例如在诸如冠状动脉疾病、中风以及延迟的伤口愈合等疾病中。此外，溃疡、中风以及心脏病发作可由通常为自然病愈所需的血管发生的缺失而导致。本发明涉及使用特异性结合VEGF和HER2两者的抗体(例如bH1-81或bH1-44抗体)治疗有患上述疾病风险或患有上述疾病的患者。
其它可作为接受本发明组合物的候选者的患者患有或有可能患纤维脉管组织异常增生、红斑痤疮(acne rosacea)、获得性免疫缺陷综合征、动脉阻塞(artery occlusion)、异位角膜炎(atopic keratitis)、细菌性溃疡、白塞病(Bechets disease)、血液携带的肿瘤(blood borne tumors)、颈动脉阻塞疾病(carotid obstructive disease)、脉络膜新生血管化(choroidalneovascularization)、慢性炎症(chronic inflammation)、慢性视网膜剥离(chronic retinal detachment)、慢性葡萄膜炎(chronic uveitis)、慢性玻璃体炎(chronic vitritis)、角膜接触镜过度磨损(contact lens overwear)、角膜移植物排斥(corneal graft rejection)、角膜新生血管化(corneal neovascularization)、角膜移植物新生血管化(corneal graft neovascularization)、局限性回肠炎(Crohn’s disease)、伊尔斯病(Eales disease)病、流行性角膜结膜炎(epidemickeratoconjunctivitis)、真菌性溃疡(fungal ulcers)、单纯疱疹感染(Herpessimplex infections)、带状疱疹感染(Herpes zoster infections)、高粘度综合征(hyperviscosity syndromes)、卡波西肉瘤(Kaposi’s sarcoma)、白血病(leukemia)、脂质变性(lipid degeneration)、莱姆病(Lyme’s disease)、边缘角质层分离(marginal keratolysis)、蚕食性角膜溃疡(Mooren ulcer)、麻风病(leprosy)除外的分支杆菌感染、近视(myopia)、眼新生血管疾病(ocularneovessel disease)、视窝(optic pits)、Osler-Weber综合征(Osler-Weber-Rendu)、骨关节炎、派杰病(Paget’s disease)、扁平部睫状体炎(pars planitis)、类天疱疮(pemphigoid)、phylectenulosis、多动脉炎(polyarteritis)、激光后并发症(post-laser complications)、原生动物感染(protozoan infections)、弹性假黄色瘤(pseudoxanthoma elasticum)、翼状胬肉(pterygium)、干性角膜炎(keratitis sicca)、辐射状角膜切开术(radialkeratotomy)、视网膜新生血管化(retinal neovascularization)、早产儿视网膜病(retinopathy of prematurity)、晶状体后纤维增生症(retrolentalfibroplasias)、结节病(sarcoid)、巩膜炎(scleritis)、镰状细胞性贫血(sickle cellanemia)、Sogren’s综合征、实体瘤、Stargart’s病、Steven’s Johnson病、上边缘角膜炎(superior limbic keratitis)、梅毒(syphilis)、系统性红斑狼疮(systemic lupus)、Terrien’s边缘变性(marginal degeneration)、弓形体病(toxoplasmosis)、尤文肉瘤(tumors of Ewing sarcoma)、神经母细胞瘤(tumorsof neuroblastoma)、骨肉瘤(tumors of osteosarcoma)、视网膜母细胞瘤(tumorsof retinoblastoma)、横纹肌肉瘤(tumors of rhabdomyosarcoma)、溃疡性结肠炎、静脉阻塞(vein occlusion)、维生素A缺乏、Wegener’s肉样瘤病(Wegener’s sarcoidosis)、与糖尿病相关的不良血管生成、寄生虫疾病、异常伤口愈合、手术、损伤或外伤(例如急性肺损伤/ARDS)后肥大、毛发生长抑制、排卵与黄体形成抑制、植入抑制和子宫内胚胎发育抑制。
抗-血管发生治疗可用于以下疾病的常规治疗：移植物排斥、肺的炎症、原发性肺动脉高压(primary pulmonary hypertension)、肾病综合征(nephroticsyndrome)、先兆子痫(preeclampsia)、和胸腔积液(Pleural effusion)、特征为不良脉管通透性的疾病和病症、例如、与脑肿瘤有关的水肿、与恶性疾病有关的腹水、Meigs’综合征、肺的炎症、肾病综合征、心包积液(诸如与心包炎相关的心包积液)、心血管疾病相关的通透性如心肌梗塞和中风等之后的状态和脓毒症(sepsis)。
其它根据本发明的血管发生依赖性疾病包括血管纤维瘤(angiofibroma)(易于出血的异常血管)、新血管性青光眼(眼内血管生长)、动静脉畸形(AVM；arteriovenous malformations)(动静脉之间异常联系)、非联合性骨折(nonunion fractures)(不愈合骨折)、动脉粥样硬化斑块(atherosclerotic plaques)(动脉硬化)、脓性肉芽肿(pyogenic granuloma)(血管组成的常见皮肤损伤)、硬皮症(scleroderma)(结缔组织病的一种形式)、血管瘤(hemangioma)(血管组成的肿瘤)脑(脊)膜瘤(meningioma)、甲状腺超常增生(thyroid hyperplasias)(包括Grave′s病)、沙眼(trachoma)(导致第三世界中的失明的主要原因)、血友病性关节(hemophilic joints)、滑膜炎(synovitis)、皮炎(dermatitis)、血管粘连，和肥厚性疤痕(hypertrophic scars)(异常疤痕形成(abnormal scar formation))。
IV.剂量和制剂
可以与优良医学实践一致的方式配制、剂量给药和施用抗体(例如bH1-44或bH1-81)或抗体片段组合物。在此内容中考虑的因素包括所治疗的具体病症、所治疗的具体哺乳动物、受试者个体的临床状态、病症的起因、投递药剂的部位、施药的方法、施药的日程安排、和医学从业人员知道的其它因素。确定待施用的抗体或抗体片段的“治疗有效量”需要考虑以上因素，这是预防、缓解或治疗癌症或自身免疫性病症所需的最小量。抗体或抗体片段不是必需而是任选与目前用于预防或治疗癌症或自身免疫性病症或发生癌症或自身免疫性病症的风险的一种或多种药剂一起配制。此类其它药剂的有效量取决于制剂中存在的抗体或抗体片段的量、病症或治疗的类型、和上文讨论的其它因素。这些通常是以与上文所用相同剂量和施用途径使用，或是迄今所用剂量的大约1-99％。一般而言，对癌症的减轻或治疗涉及减少与癌症相关的一种或多种症状或医学问题，药物的治疗有效量可通过下述各项之一或其组合获得：减少(至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％或更多)癌细胞数量；减小或抑制肿瘤大小或肿瘤负荷；抑制(即减慢到一定程度和/或停止)癌细胞浸润到周围器官中；在腺瘤的情况下减少激素的分泌；减小血管密度；抑制肿瘤转移；降低或抑制肿瘤生长；和/或在一定程度上缓解一或多种与癌症相关的症状。在一些实施方案中，抗体或抗体片段用于预防受试者中癌症或自身免疫性病症的发生或复发。
一个实施方案中，本发明可用于延长易患或被诊断患有癌症或自身免疫性病症的人类患者的生存期。生存期定义为首次给予药物到死亡的时间。生存期可通过治疗组相对于对照组的分段危险率(stratified hazardratio)(HR)来测定，其代表治疗过程中患者死亡的危险性。
另一实施方案中，本发明的治疗显著增加易患或被诊断患有癌症的人类患者组中的反应率，所述患者用多种抗癌疗法治疗。反应率定义为对所述治疗有反应的被治疗患者的百分比。一方面，与单独的手术、放疗、或化疗治疗的组相比，本发明利用抗体或抗体片段和手术、放疗、或一或多种化疗剂的联合治疗显著增加被治疗患者组中的反应率，该增加具有低于0.005的χ2(Chi-square)p-值。
在美国专利申请公开No.20050186208中描述了癌症治疗中疗效的另外的测量。
治疗用制剂可通过将具有期望纯度的活性成分与任选的生理学上可接受的载体、赋形剂或稳定剂(Remington′s Pharmaceutical Sciences(第20版)，编辑A.Gennaro，2000，Lippincott，Williams & Wilkins，Philadelphia，PA)使用本领域已知的标准方法混合而制备。可接受的载体包括盐水或缓冲剂，诸如磷酸盐、柠檬酸盐和其它有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，诸如血清清蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，诸如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，诸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其它碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，诸如EDTA；糖醇，诸如甘露醇、或山梨醇；成盐平衡离子，诸如钠；和/或非离子表面活性剂，诸如TWEENTM、PLURONICSTM或PEG。
任选地，但优选地，制剂含有药学上可接受的盐，优选为氯化钠，且优选大约为生理浓度。任选地，本发明的制剂可包含药学上可接受的防腐剂。在一些实施方案中，防腐剂浓度范围在0.1至2.0％，典型地为v/v。适当的防腐剂包括制药领域已知的那些。优选的防腐剂是苯甲醇、酚、间甲酚、对羟基苯甲酸甲酯和对羟基苯甲酸丙酯。任选地，本发明的制剂可包含浓度为0.005至0.02％的药学上可接受的表面活性剂。
本文中的制剂还可含有超过一种所治疗具体适应症所必需的活性化合物，优选活性互补且彼此没有不利影响的那些。合适的是，此类分子以对于预定目的有效的量组合。
活性成分还可包载于例如通过凝聚技术或通过界面聚合制备的微胶囊中(例如分别是羟甲基纤维素或明胶微胶囊和聚(甲基丙烯酸甲酯微胶囊))、包载在胶状药物投递系统中(例如脂质体、清蛋白微球体、微乳剂、纳米颗粒和纳米胶囊)、或包载在粗滴乳状液中。此类技术披露于例如Remington′s Pharmaceutical Sciences，见上文。
可制备持续释放制剂。持续释放制剂的合适例子包括含有抗体的固体疏水性聚合物半透性基质，该基质是定型产品的形式，例如薄膜或微胶囊。持续释放基质的例子包括聚酯、水凝胶(例如聚(2-羟乙基-甲基丙烯酸酯)或聚(乙烯醇))、聚交酯(美国专利No.3,773,919)、L-谷氨酸与γ乙基-L-谷氨酸酯的共聚物、不可降解的乙烯-乙酸乙烯、可降解的乳酸-乙醇酸共聚物诸如LUPRON DEPOTTM(由乳酸-乙醇酸共聚物和醋酸亮丙瑞林构成的可注射微球体)及聚-D-(-)-3-羟基丁酸。虽然诸如乙烯-乙酸乙烯和乳酸-乙醇酸等聚合物能够释放分子达100天以上，但是某些水凝胶释放蛋白质的时间较短。当封装的抗体在体内长时间维持时，它们可能由于暴露于37℃的潮湿环境而变性或聚集，导致生物学活性损失和免疫原性可能改变。可以根据相关机制来设计合理的稳定化策略。例如，如果发现聚集机制是经由硫-二硫化物互换的分子间S-S键形成，那么可通过修饰巯基残基、由酸性溶液冻干、控制湿度、采用适当添加剂和开发特定聚合物基质组合物来实现稳定。
本文描述的抗体和抗体片段(例如bH1-44或bH1-81或其片段)依照已知的方法施用给人类受试者，诸如，作为推注或通过一段时间的连续输注的静脉内施用，通过肌肉内的、腹膜内的、脑脊内的、皮下的、关节内的、滑膜内的、鞘内的、口腔的、局部的、或吸入途径。如果VEGF和/或HER2的拮抗作用与广泛的副作用或毒性相关，局部施用可以是特别期望的。离体(ex vivo)策略也可在治疗性应用中使用。离体策略涉及通过编码抗体或抗体片段的多核苷酸转染或转导从受试者获得的细胞。该转染或转导的细胞然后回输至受试者。该细胞可以是许多类型，包括但不限于造血细胞(例如骨髓细胞、巨噬细胞、单核细胞、树突细胞、T细胞或B细胞)、成纤维细胞、上皮细胞、内皮细胞、角质细胞或肌细胞。
在一个实例中，当病症或肿瘤的位置允许时，抗体(例如，bH1-44或bH1-81)或抗体片段局部施用，例如通过直接注射，并且该注射可周期性地重复。抗体或抗体片段也可全身投递给受试者或直接投递至肿瘤细胞，例如投递至肿瘤或手术切除肿瘤后的瘤床，以预防或降低局部复发或转移。
V.制品和试剂盒
本发明另一个实施方案是制品，其含有在治疗自身免疫性疾病和癌症中有用的材料。该制品包括容器和在容器上或与容器一起的标签或包装说明书(package insert)。适合的容器包括，例如，瓶子、小瓶、注射器等。所述容器可以由各种材料诸如玻璃或塑料制成。容器装有对于所述疾患的治疗有效的组合物，并且可以具有无菌的存取口(例如，所述容器可以是具有可被皮下注射针刺穿的塞子的静脉内溶液袋或小瓶)。组合物中至少一种活性试剂是本发明的多特异性抗体或抗体片段。标签或包装说明书标明该组合物是用于治疗特定的病症。标签或包装说明书还包括向患者施用抗体组合物的说明书。也考虑了包含本文描述的联合治疗的制品和试剂盒。
包装说明书是指常规地在治疗产品的商业化包装中包含的说明书，其含有关于适应症、用法、剂量、施用、禁忌症和/或关于使用此类治疗产品的警告的信息。在其它实施方案中，包装说明书标明该组合物是用于治疗乳腺癌、结肠直肠癌、肺癌、肾细胞癌、神经胶质瘤或卵巢癌。
另外，制品可以进一步包括第二容器，其中装有制药学可接受的缓冲液，例如抑菌性注射用水(BWFI)、磷酸盐缓冲盐水、林格氏溶液和右旋糖溶液。它可以进一步包括从商业和用户立场出发的其它材料，包括其它的缓冲液、稀释剂、滤器、针和注射器。
还提供多种目的中有用的试剂盒，例如从细胞中纯化或免疫沉淀VEGF或HER2。为分离和纯化VEGF、或HER2，该试剂盒可含有偶联至珠子(例如琼脂糖珠子)的VEGF/HER2抗体(例如，bH1-44或bH1-81)。可提供试剂盒，其含有用于体外检测和定量VEGF或HER2(例如在ELISA或蛋白质印迹中)的抗体。如同制品中一样，该试剂盒包含容器和伴随该容器或在容器上的标签或说明书。该容器装有包含至少一种本发明的多特异性抗体或抗体片段的组合物。可包括另外的容器，该容器含有，例如，稀释剂和缓冲液或对照抗体。标签或说明书可提供对组合物的描述以及对预期的体外或诊断用途的说明。
认为前文的书面描述足以使本领域技术人员实施本发明。提供下述实施例仅为了说明用途，无意以任何方式限制本发明的范围。事实上，根据前文描述，对本文显示和描述的发明以外的多种修改对本领域技术人员来说是明显的并落入所附权利要求的范围。
实施例
实施例1.文库设计和构建
抗体的抗原-结合位点通过重链(HC)和轻链(LC)的可变结构域(VH，VL)的结合形成，所述重链(HC)和轻链(LC)的可变结构域(VH，VL)各含有三个CDR环，用于抗原识别。在许多情形中，这两种可变结构域之一，通常是VH，决定抗原特异性。具有转基因HC而非完整LC所有组成成分的小鼠产生中和抗体效价(Senn等，Eur.J.Immunol.(欧洲免疫学杂志)33：950-961，2003)。我们开始研究抗体的双特异性可以如何发生和VH和VL结构域的不同应用是否可以容许双抗原结合特异性。
采用半经验式方法发现用于多样化氨基酸组成和抗体轻链的CDR长度和文库模板的设计，所述文库模板容许生成可以从其中选择特异性结合蛋白抗原的抗体的功能性噬菌体展示抗体文库。约1500个人κ轻链序列的CDR区的序列和长度多样性，如Kabat数据库中所示，起指导文库设计过程的作用。靶向溶剂暴露的残基以进行随机化。修改随机位置的子集以表示这样的氨基酸，所述氨基酸是这些位点处的天然所有组成成分的一部分，而随机化其余位点，以包括全部20种天然存在的氨基酸。
具体地，以下所述的轻链模板(可变结构域)如本文中所述进行修饰(随机化加下划线的残基)(SEQ ID NO：10)。
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQD 28 VNTAVAWYQQKPGKAPKLLIYS 50 ASFLYS
GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQH 91 YTTPPTFGQGTKVEIKRTVAAPS
VFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDS
TYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
基于3个人Fab和scFv模板生成4组文库，其中靶向不同位置组以进行随机化(图1)。
在所有文库中，重链保持与其由文库模板定义的序列一致。重链模板(可变结构域)序列如下所述(SEQ ID NO：11)。
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNG
YTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDYW
GQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTS
GVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKT
H
文库设计总结在图1和图2中。所有的文库模板含有包含在CDR L1中的终止密码子(Sidhu等，2004)，以防止噬菌体展示抗体文库成员中的模板轻链的存在。模板CDR序列总结在图3中。
在一个实例中，我们在HER2-特异性抗体的LC可变结构域中引入突变，以确定可以结合不同蛋白抗原同时保持初始结合特异性的变体。我们采用保守的方法来随机化LC CDR，从而生成可以稳定表达的变体。选择12个溶剂暴露的LC CDR位点以进行随机化：CDR1中5个(28，29，30，31，32)，CDR2中3个(50，51，53)和CDR3中4个(91，92，93，94)。此外，为了指导选定位点处氨基酸多样性的设计，这些位置的天然多样性通过分析约1500个人κLC CDR序列来检验(Johnson和Wu，Nucleic Acids Res.(核酸研究)28：214，2000；Chothia和Lesk，J.Mol.Biol.(分子生物学杂志)196：901，1987)(图4)。完全随机化一些具有相对高天然多样性的位置(30，31，50，92，93)，同时将其他位置限制为少至2种氨基酸类型，从而模拟天然抗体。天然LC CDR1和CDR3的长度变化也反映在文库中(图4)。在图4中，X表示如所示以低频设计的氨基酸类型。长度多样性通过在残基30和31之间和残基93和94之间插入1-5个残基来构建。
LC文库是生产性幼稚所有组成成分(图1)。列出来自在四轮选择结束时筛选95个随机克隆的结果。具体地，选择新结合特异性如关于固定靶标(VEGF，DR5，和人Fc)所述地进行(Sidhu等，J.Mol.Biol.(分子生物学杂志)338：299，2004)。4轮选择后，利用ELISA测定95个噬菌体克隆与靶标，HER2，和非靶标蛋白，BSA的结合，从而确保特异性结合。为了富集维持HER2结合的靶标结合克隆，进行关于HER2的最后一轮选择。对阳性克隆进行测序。为了确定最高亲合力结合剂，通过竞争ELISA确定抗原结合的IC50(Sidhu等，J.Mol.Biol.(分子生物学杂志)338：299，2004)。显示通过序列分析确定的单一克隆数和维持HER2结合的单一克隆(双特异性克隆)数。这些克隆针对无关抗原，诸如BSA显示最小背景结合信号。
表1.轻链文库选择总结
阳性％ 单一序列 HER2阳性
人Fc融合 63 61个中31个 1
hVEGF 77 74个中41个 41个中30个
DR5长 85 82个中5个 5个中2个*
*＝弱结合信号
靶标 双特异性，筛选 双特异性，选择
人Fc融合 31个中1个 未确定
hVEGF 41个中30个 94个中94个
DR5长 5个中2个* 7**个中2个
*＝弱结合信号Her2
**＝弱结合信号DR5
针对三种蛋白抗原：人血管内皮生长因子(hVEGF)，死亡受体5(DR5)，和IgG的补体结合片段(Fc)的选择产生许多结合克隆(图5A)。一些克隆失去关于HER2的结合亲和性，同时其他克隆保持HER2结合并由此是双特异性的。具有新的结合特异性的131个单一赫赛汀抗体变体的序列分析确定与赫赛汀抗体相比的氨基酸置换和插入(图5B)。
突变数在3-17范围内。保持HER2结合的克隆(双特异性克隆)含有比失去HER2结合的那些克隆平均更少的突变。保持赫赛汀抗体CDR-L3序列是优选的但不足以保存HER2结合。这与这样的报告相一致，即赫赛汀抗体CDR-L3是关于HER2结合的最重要LC CDR(Kelley和O’Connell，Biochemistry(生物化学)32：6828.1993)。代表性VEGF结合克隆表述为Fab和IgG蛋白(表2)。
表2.由赫赛汀抗体的轻链文库分离的代表性抗体(SEQ IDNOS：12-23)。
a与赫赛汀抗体的差别以粗体表示。
为了证明这些抗体特异性结合它们的同族抗原并不与其他蛋白非特异性相互作用，我们显示对一组哺乳动物细胞溶解产物和非抗原蛋白不存在可检测的结合。该测定验证纯IgGs或Fabs的单-和双-特异性(图6)。
LC文库-来源的单特异性抗体的平衡结合亲和性(KD)在15-150nM范围内。双特异性抗体以高nM至低μM的亲和性结合新抗原(即VEGF)并以低nM亲和性结合HER2(表2)。在表2中所示的抗体中，抗体bH1对两种不同蛋白抗原VEGF(KD＝300nM)和HER2(KD＝26nM)展示出最高双特异性结合。
材料
酶和M13-KO7辅助噬菌体来自New England Biolabs(新英格兰生物实验室)。大肠杆菌(E.coli)XL1-蓝来自Stratagene。牛血清清蛋白(BSA)、卵清蛋白、和吐温20来自Sigma(西格玛)。Neutravidin、酪蛋白、和Superblock来自Pierce。固定蛋白G和抗M13缀合的辣根过氧化物酶(HRP)来自GE Healthcare(GE卫生保健)(Piscataway，NJ)。Maxisorp免疫板来自NUNC(Roskilde，丹麦)。四甲基联苯胺(TMB)底物来自Kirkegaard和Perry实验室(Gaithersburg，MD)。所有蛋白抗原由Genentech，Inc的研究小组生成。DNA简并性利用IUB编码表示并表示等摩尔混合物，除非另外指明：N＝A/C/G/T，D＝A/G/T，V＝A/C/G，B＝C/G/T，H＝A/C/T，K＝G/T，M＝A/C，R＝A/G，S＝G/C，W＝A/T，Y＝C/T。
例如，在某些随机化位置处，野生型密码子通过编码全部20种天然氨基酸的简并NNK密码子(等摩尔比，N＝A/T/G/C，K＝G/T)来代替。XYZ密码子指在密码子三联体各位置处具有不等的核苷酸比的密码子。X包含38％G，19％A，26％T和17％C；Y包含31％G，34％A，17％T和18％C；且Z包含24％G和76％C。
用于文库构建的噬菌粒载体
使用标准分子生物学技术来进行载体构建。构建三个模板，以进行文库生成。所有模板均是基于修饰的人源化4D5(第8版)(Lee等，2004a)的重链文库中使用的质粒pV0354的衍生物。
2C4Fab-C模板噬菌粒pJB0290通过将2C4重链可变结构域克隆到pV0354-Fab-C载体中构建，所述pV0354-Fab-C载体含有碱性磷酸酶启动子(Lowman等，1991)和Fab轻链和重链的stII分泌信号。设计在重链可变结构域1的C端含有单半胱氨酸，以容许二价M13噬菌体展示2C4Fab，如前所述(Lee等，2004b)。通过利用Kunkel等的方法的位点定向诱变将2C4轻链CDR引入Fab-C载体(Kunkel等，1987)。表位标记物(gD标记物)(Lasky和Dowbenko，1984)添加在轻链的C端，以容许如所述地确定展示水平(Sidhu等，2004)。Fab12-G文库模板pV1283通过将高度展示的重链可变结构域克隆到pV0354-Fab-C中来创建，并且修饰轻链可变结构域以包含Fab-12的CDR-L3(人源化A4.6.1，即抗-VEGF抗体)高度展示的VH通过淘选固定抗gD抗体，由Fab文库中选择，所述Fab文库利用鸟枪丙氨酸扫描诱变(Liang等，2006；Vajdos等，2002)随机化G6Fab的重链CDR残基，其CDR-L3转化为Fab-12(Y91STVPW96；SEQ ID NO：24)。设计和构建噬菌粒pV1384，其在M13噬菌体颗粒表面上二价地展示4d5(LC-R66G)scFv，由前述模板pS2018修饰而来(Sidhu等，2004)。scFv片段在轻链和重链之间的连接区中包含gD表位标记物。LC构架残基Arg66突变为Gly66，其是在超过95％的天然κ轻链中该位置处的普遍残基。突变R66G仅稍微(＜2倍)减少赫赛汀抗体与HER2的结合亲和性，如Kelley和Connell(Biochemistry(生物化学)32：6828，1993)中所述。文库模板的CDR序列总结在图3中。
文库构建
如所述利用寡核苷酸-定向诱变创建噬菌体展示文库(Sidhu等，2004)。文库模板载体含有终止密码子(TAA)，所述终止密码子(TAA)包含在CDR-L1中，其在利用简并寡核苷酸的诱变反应过程中修复，所述简并寡核苷酸在编码CDR-L1，CDR-L3(全部文库)，CDR-L2(L1/L2/L3-A，-B，-C，+L4-D)和轻链构架3(L1/L4和L1/L2/L3+L4-D)的序列上退火。文库诱变反应根据Kunkel等的方法执行(Kunkel等，1987)。文库的轻链CDR设计在图1中描述，其总结在各位置处为不同文库使用的简并密码子。三种或四种寡核苷酸对各CDR以一定比例混合，以编码各靶向位置处所需的氨基酸类型频率，从而随机化(图4)。寡核苷酸以不同的比率组合，从而调整多样性，以反映所选位置处天然轻链κ序列中的氨基酸频率。关于CDR1，三种含关于位置91-94的密码子的寡核苷酸：CAT NNK NNK RST(SEQ ID NO：25)，KMT XYZ XYZ RST(SEQ ID NO：26)，或DGG XYZXYZ RST(SEQ ID NO：27)以1∶3∶1比率混合。XYZ是NNK的变化，其关于各位点具有等比例的A/G/T/C，从而减小脂肪族疏水性氨基酸的范围(Lee等，J.Mol.Biol.(分子生物学杂志)340：1073，2004)。关于CDR2，四种含关于位置50-53的密码子的寡核苷酸：NNK GST TCC NNK(SEQ IDNO：28)，TGG GST TCC NNK(SEQ ID NO：29)，KGG GST TCC TMT(SEQID NO：30)，或NNK GST TCC TMT(SEQ ID NO：31)以1∶1∶2∶10的比率混合。关于CDR3，各长度是比率为1∶1∶2的三种含关于位置28-33的密码子的寡核苷酸：G70A70C70RTT NNK NNK TAC STA(SEQ ID NO：32)，G70A70C70RTT NNK NNK DGG STA(SEQ ID NO：33)，或G70A70C70RTTNNK NNK NMT STA(SEQ ID NO：34)的混合物。G70A70C70是“软”密码子，其容许70％指定的核苷酸和各10％其他三种核苷酸，编码～50％Glu和～50％其他氨基酸。
许多具有κLCs的代表性抗体的结构分析显示CDR1具有最广的构象范围，其可能是环长度(位置24和34之间的11-17个残基)变化的结果。不同的CDR-L1长度(长度11-16)因此属于该文库。天然CDR-L3也变化长度(位置89-96之间的7-10个残基的长度)，这由文库设计反映(长度8-10；图4)。
图1显示轻链天然多样性和实际文库设计的比较。将诱变产物汇集到一个反应/文库中并电穿孔到用KO7辅助噬菌体增补的大肠杆菌SS320细胞中并在30℃生长过夜(Lee等，J.Mol.Biol.(分子生物学杂志)340：1073，2004)。在各电穿孔反应中使用～1011个细胞和～5-10μg DNA。纯化文库噬菌体(Sidhu等，J.Mol.Biol.(分子生物学杂志)338：299，2004)。转化体数量范围为109-1010。噬菌体表面上完整Fabs或scFv的展示水平在ELISA结合测定中确定，其中测试来自各文库的96个随机选择的克隆结合抗gD抗体的能力。展示水平范围为5-25％(图2)。25％的展示抗体的克隆保持HER2结合。测序约150个展示克隆，以与设计多样性相比，检验实际文库多样性。功能性展示文库成员的一部分(～30％)保持赫赛汀抗体CDR-L2和/或CDR-L3序列，这归因于不完全诱变(CDR-1中的模板终止密码子确保表达的scFvs中该CDR的100％突变)。这些由实际文库多样性序列分析排除。在大多数随机化位置处，展示克隆的噬菌体展示文库的多样性不显著(p＞0.05，比值比检验)偏离设计的多样性。例外是CDR-L1的位置29，其中发现与Ile相比，Val稍微过量体现(over-represented)(p＝0.005)，和CDR-L2的位置51和53，其中Gly和Ser分别比Ala和Tyr更普遍(p＜0.01)。
实施例2.评价文库性能
文库分类和筛选
当特异性结合多种蛋白抗原的抗体可以在4-5轮分类后分离时，认为文库具有功能性。已知许多蛋白靶标容许功能性固定用于文库淘选，并且已经由验证的噬菌体展示文库中生成了特异性抗体(Fellouse等，2005)(Lee等，2004a)。为了评价各组文库，我们选择这些靶标的子集来选择(图2)。使文库经历最初一轮使用抗gD抗体或蛋白L作为捕获靶标的结合选择，从而消除其中已经缺失Fab/scFv基因的克隆，随后进行4-5轮抗原选择。备选地，它们在不需要用抗gD或蛋白L预选择的条件下，直接经历靶标结合选择。NUNC 96-孔Maxisorp板用抗原(5μg/ml)包被过夜并用交替的封闭剂封闭1小时(图7)。在第一选择周期中，将1013个噬菌体/ml的噬菌体溶液加入至包被的免疫板。噬菌体浓度在各轮选择中减小。在免疫板上温育噬菌体溶液以容许结合固定抗原后，用PBS，0.5％吐温20重复洗涤该板。为了增加严谨性，在各轮选择中减少温育时间(第一轮4小时，第二轮3小时，第三轮3小时，第四轮2小时，第五轮1.75小时)并且增加洗涤次数(图7)。结合的噬菌体用0.1M HCl洗脱30分钟，并且用1.0M Tris碱中和洗出液。计算噬菌体回收/抗原包被免疫板孔，并与无包被抗原的封闭孔进行比较，以研究展示特异性结合靶抗原的Fabs或scFvs的噬菌体克隆的富集(图7)。洗脱的噬菌体在大肠杆菌中扩增并用于下一轮选择。来自第4轮和第5轮的随机克隆被选择以进行筛选，并利用噬菌体ELISA来测定，其中与靶标和抗gD的结合与无关蛋白(BSA)的结合进行比较，从而检查非特异性结合。认为结合抗gD抗体和靶标但不结合非特异性蛋白的克隆为特异性阳性。文库L1/L3，L1/L4，L1/L2/L3-A，L1/L2/L3-B_1和L1/L2/L3-B_2不产生任何特异性阳性克隆，而文库L1/L2/L3-C和L1/L2/L3+L4-D容许分离针对靶抗原的特异性抗体。
例如，来自第四轮的随机克隆利用噬菌体ELISA来测定，其中单独扩增的克隆与靶标和HER2的结合与非靶标蛋白(BSA)的结合相比较，从而测试结合特异性。为了富集维持HER2结合的噬菌体克隆，将第三轮和第四轮VEGF或DR5选择中洗脱的噬菌体进行扩增并在HER2包被孔上进行另一轮选择。阳性克隆的VL和VH区通过PCR来扩增并测序。
hFC，hVEGF，和hDR5-1f的击中率分别是63％，77％，和85％。阳性克隆的VL区如所述通过PCR扩增并测序(Sidhu等，2004)。阳性特异性结合剂的DNA序列分析揭示单一克隆的百分比51％(hFC)，55％(hVEGF)，和6.1％(hDR5-1f)。单一hVEGF结合克隆的序列总结在图8中。
hVEGF结合克隆的组合板和溶液选择
观察到hVEGF结合克隆在四轮分类后的高度多样性。为了确定高亲和性hVEGF结合克隆，在第四轮基于板的分类后采用基于溶液的选择方法。50nM生物素化hVEGF用由第四轮固定抗原选择繁殖的噬菌体来温育。室温摇动下温育2小时后，在neutravidin包被和封闭的免疫板上捕获hVEGF结合的噬菌体，随后反复洗涤。如前所述洗脱、筛选、和测序噬菌体克隆。来自最后的溶液选择步骤的hVEGF结合克隆的序列参见图9。由文库L1/L2/L3-C和L1/L2/L3+L4-D分离双特异性克隆
文库L1/L2/L3-C和L1/L2/L3+L4-D的文库模板是由hu4D5抗体修饰的scFv片段，其以高亲和性结合Her2。通过CDR区的丙氨酸-扫描诱变对hu4D5-5关于Her2结合的功能性互补位进行绘图显示重链残基贡献于结合的大多数自由能，而单独轻链残基贡献较少的程度(Kelley和O′Connell，1993)。与人Her2-ECD复合的赫赛汀抗体Fab的原子结构分析证明尽管轻链参与形成抗原接触，但是重链提供与抗原的大部分结构界面(Cho等，Nature(自然)421：756，2003)。我们观察到功能性轻链文库的一些成员依赖赫赛汀抗体模板保持Her2结合能力。在试图由功能性文库L1/L2/L3-C和L1/L2/L3+L4-D分离能够结合Her2和第二抗原的双特异性scFv片段中，应用两种策略。在一种方法中，来自前述靶抗原选择的阳性克隆通过ELISA筛选，以获得保持Her2结合的那些。能够结合Her2的特异性阳性克隆百分比取决于第二抗原特异性而变化。61个单一hFc特异性阳性克隆中仅1个仍结合Her2(1.6％)，41个单一hVEGF结合克隆中30个仍结合Her2(73％)，且5个单一hDR5结合剂中2个仍结合Her2(40％)。另外，采用基于选择的方法，通过由hVEGF和hDR5结合抗体集合中选择Her2结合剂，来分离双特异性抗体。通过在Her2包被(5μg/ml)和BSA封闭的Maxisorp免疫板上温育2x1013个噬菌体/ml 1小时，对来自第四轮靶抗原分类的洗出液进行另外一轮选择。用PBS，0.5％吐温20洗涤板15次，并如前所述洗脱结合的噬菌体。选择随机克隆并测定Her2，抗gD和靶标结合，并与对无关蛋白(BSA)的非特异性结合比较。测试的全部192个克隆被确定为特异性阳性，并如前所述测序。测序揭示94个单一序列。总之，该方法由94个测试的单一克隆生成94个Her2/hVEGF双特异性克隆(100％)(图8)。所有由这两种分离策略分离的单一hVEGF/Her2双特异性抗体的序列总结在图10A和10B中。失去所有可检测的与Her2的结合的分离克隆的序列显示在图11中。在具有双特异性的克隆中，几乎全部保持赫赛汀抗体CDR-L3，这使得维持CDR-L3可能对维持HER2结合很重要。在hDR5的情形中，7个单一Her2-结合克隆中2个是双特异性(29％，12个测序的克隆)。双特异性克隆之一在CDR-L3中具有一些同源变化。
hVEGF结合克隆的高通量特征
使用96孔形式的高通量单点竞争性ELISA(Sidhu等，2004)来筛选hVEGF的高亲和性克隆并研究VEGFR1封闭特性。简言之，Maxisorp免疫板用2μg/ml hVEGF109包被，4℃过夜并用1％(w/v)BSA封闭1小时。大肠杆菌XL1-蓝中的噬菌体克隆在增补了羧苄西林(carbenicillin)和M13-KO7辅助噬菌体的150μl的2YT培养液中生长；该培养物在96孔形式中在37℃摇动生长过夜。包含噬菌体的培养物上清在添加或不添加100nM hVEGF109的PBST(具有0.05％吐温20和0.5％(w/v)BSA的PBS)中稀释5倍，以用于亲和性筛选。关于受体封闭筛选，hVEGF包被孔在有或无VEGFR1结构域1-3(D1-3)和VEGFR1结构域2(D2)的条件下温育，之后添加五倍稀释的噬菌体上清(Liang等，2006；Wiesmann等，1997)。在室温下温育1小时后，将混合物转移至用hVEGF109包被的板并温育10分钟。该板用PBT(具有0.05％吐温20的PBS)洗涤并与在PBST中稀释5000倍达到1nM的抗M13抗体辣根过氧化物酶缀合物一起温育30分钟。将该板洗涤，用TMB底物显色约5分钟，用1.0M H3PO4猝灭，并在450nm处通过分光光度法读数。在单点亲和性测定中，存在溶液相hVEGF109条件下的吸光度与缺乏溶液相hVEGF109条件下的吸光度的比率用作亲和性的指示。低比率应该表明大多数Fab-噬菌体在最初温育阶段中结合溶液相hVEGF109，并且因此，难以通过固定的hVEGF109来捕获。首先的41个单一颗粒的高通量亲和性测定结果总结在图12中。类似地，关于封闭测定，低比率表明克隆与hVEGF109的结合通过hVEGF109-VEGFR1相互作用封闭，这说明一些克隆在VEGF上具有与各种VEGF受体片段的重叠结合位点(表位)(图13A和13B)并且这些克隆可能展示封闭抗体。
双特异性hVEGF/Her2克隆的高通量特征
应用如以上部分中所述的相同的原理，从而容许分离对hVEGF和Her2具有高亲和性的克隆，从而进一步表征(图14A)。高通量单点竞争性ELISA，通过用2μg/ml hVEGF109，和Her2-ECD在4℃包被Maxisorp免疫板过夜和随后用1％(w/v)BSA封闭1小时，用于筛选关于hVEGF和Her2的高亲和性克隆。在前述单点ELISA筛选中确定为双特异性的噬菌体克隆如前所述生长并在添加或不添加20nM Her2-ECD和50nM hVEGF的条件下温育。在室温下温育1小时后，将溶液应用于包被的免疫板并且如前部分所述记录并分析结合信号。选择关于hVEGF和Her2均具有低比率的克隆，以进一步表征。选择在单点竞争性ELISA中生成最低信号比的hVEGF-特异性和hVEGF/Her2双特异性噬菌体克隆，从而通过竞争ELISA以及来自最初单点ELISA筛选的DR5-结合和DR5/Her2双特异性噬菌体克隆和来自组合的板和溶液选择的VEGF结合克隆来进行亲和性测量。噬菌体克隆通过在增补羧苄西林和KO7辅助噬菌体的25ml 2YT培养物中30℃生长过夜，由单菌落繁殖。通过在PEG/NaCl中沉淀纯化的噬菌体首先在PBST中连续稀释并测试与抗原包被的板的结合。提供50-70％饱和信号的稀释物用于溶液结合测定中，其中噬菌体首先与渐增浓度的抗原一起温育1-2小时并然后转移至抗原包被的板10-15分钟，以捕获未结合的噬菌体。IC50计算为抑制50％噬菌体结合固定抗原的溶液结合阶段中抗原的浓度(Lee等，2004a)。图14B描述由其计算由板分类策略分析的hVEGF结合克隆的IC50的曲线。IC50值范围是22nM至＞1μM(图14B)。关于通过组合板和基于溶液的选择分离的hVEGF结合剂的IC50值的范围是41nM-226nM(图9)。DR5-结合克隆的IC50值的范围是20nM至＞1μM。hVEGF/Her2双特异性克隆的IC50值总结在图15中。
实施例3.表征来自轻链文库的抗体
scFvs向Fabs的转化
为了测试如噬菌体上展示的scFvs’2向Fabs的转化是否影响来自文库的结合克隆的亲和性，选择2种克隆(3-7抗hVEGF和4-1抗hDR5)来转化为Fab并在噬菌体上展示。关于选择的hVEGF和DR5scFv片段的噬菌粒DNA的VL区用限制酶来消化，这裂解编码CDR-L1的区域的DNA上游(EcoRV)和编码CDR-L3的区域的下游(KpnI)。将消化的DNA片段通过融合于M13基因-3小外壳蛋白的C端，连接到类似消化的为Fab hu4D5的噬菌体展示而设计的载体(pAP2009)中(Lee等，2004b)。由此生成的双顺反子噬菌粒含有与C端处的表位(gD)标记物融合的轻链和在碱性磷酸酶启动子控制下通过C端与M13小外壳蛋白(p3)的基因融合的重链(VH和CH1)。第一可读框编码多肽，所述多肽由stII分泌信号及随后的Fab4D5轻链组成，其CDR被3-7抗hVEGF和4-1抗hDR5 scFv’2的CDR替代，随后是gD标记物表位。第二开发阅读框编码融合多肽，其由以下各种组成：stII分泌信号、Fab4D5重链、琥珀(TAG)终止密码子、Gly/Ser连接序列和g3蛋白(cP3)的c-端结构域。在用M13-KO7共感染的大肠杆菌XL-1蓝中的表达导致生成展示3-7和4-1scFv’2的Fab形式的M13噬菌体。使用竞争性噬菌体ELISA将噬菌体展示的scFvs和Fabs关于hVEGF和hDR5的亲和性评估为IC50值。来自两种不同形式的数据具有良好的一致性(数据未显示)。
为了容许在M13噬菌体的表面上展示bH1 Fab，修饰质粒pAP2009以编码bH1Fab。bH1 Fab形式在关于LC和HC文库的分别三个LC CDRs中或三个HC CDRs中用作包含终止密码子(TAA)的文库模板。单独的重链和轻链丙氨酸和同源物扫描文库如前所述构建(Vajdos等，J.Mol.Biol.(分子生物学杂志)320：415，2002)。简并性范围为1x105-1x108且实际文库尺寸由6x109至4x1010。文库如上所述构建。关于固定靶标进行两至三轮选择(VEGF，HER2-ECD，蛋白L，或抗gD mIgG)(Vajdos等，J.Mol.Biol.(分子生物学杂志)320：415，2002)。靶标结合克隆通过关于靶标结合的噬菌体ELISA和随后的DNA测序和序列比对来筛选，从而计算各位置处的野生型/突变比。针对展示和蛋白折叠作用来校正来自VEGF和HER2结合克隆的约100个单一序列的序列分析的比率，这通过除以由多于100个抗gD结合克隆的序列计算的比率，以生成Fwt/mut值来实现。由于只有Fab重链融合于噬菌体外壳，所以融合于轻链的gD标记物的噬菌体展示是轻链和重链适当折叠和连接的指示。一致地，蛋白L结合Fab的轻链上的非线性表位也导致与gD标记物选择类似的野生型/突变比。利用如Vajdos等中所述的公式ΔΔG＝RTln(Ka，wt/Ka，mut)＝RTln(Fwt/mut)将Fwt/mut值转化为ΔΔG(J.Mol.Biol.(分子生物学杂志)320：415，2002)。
作为自由人Fab和IgG表达文库结合剂
为了精确确定抗体的亲和性、特异性和其他性质，选择来自在竞争ELISA实验中表现出最高亲和性的各特异性组的代表性克隆来作为自由Fab和hIgG表达(图16)。将轻链和重链的可变结构域克隆到载体中，所述载体是以前为在大肠杆菌中的Fab表达或在哺乳动物细胞中的瞬间人IgG表达而设计的(Lee等，2004a)。Fab蛋白通过如所述地，使转化的34B8大肠杆菌细胞在完全C.R.A.P.培养基中，30℃，生长26小时来生成(Presta等，1997)。hIgGs通过瞬间转染293细胞来表达，并且hIgG用蛋白A亲合层析法来纯化(Fuh等，J.Biol.Chem.(生物化学杂志)273：11197，1998)。用蛋白G亲合层析法纯化1L大肠杆菌培养物。用PBS洗柱并用100mM乙酸洗脱Fab蛋白并针对PBS透析。在蛋白A亲合柱上纯化4L大肠杆菌培养物，随后如前所述进行阳离子交换层析法(Muller等，1998)。蛋白浓度通过分光光度法来确定。Fab的终产率典型为0.8-15mg/l，其由小规模摇瓶生长纯化。IgG产率在小规模培养中中等-高，6.7-60mg/l(图17)。纯化蛋白首先利用大小排阻层析法和光散射来表征，从而确保该蛋白不表现出显著水平的蛋白凝聚(＜5％)。
简言之，表达的Fabs和hIgGs通过ELISA筛选与其各自抗原的结合。发现除一个变体以外，全部结合它们的同族抗原。克隆4-6在转化为Fab和hIgG时，失去hDR5结合能力。所选的抗VEGF克隆，其针对较短形式hVEGF109产生，使用标准ELISA(H3，H4_N，H4_D hIgG)和竞争ELISA(bH1，3-1，3-6，3-7hIgG)来测试其与hVEGF165的结合。G6hIgG(Fuh等，2006)用作阳性对照(图18A和18B)。如所预料地，全部克隆结合hVEGF165。
为了研究蛋白凝聚程度，所选克隆通过大小排阻层析法(SEC)分析，随后作为纯化的Fab和IgG进行光散射(LS)分析。样品在PBS中以浓度0.5mg/ml(hIgG)和1mg/ml(Fab)来测定。对于所有样品，在给定浓度观察到最大5％凝聚(图17)，这在我们以前对其他噬菌体展示来源的抗体观察到的范围内。克隆3-6和3-7没有在预测的时间点出现，这提示这些再格式化的IgG和Fab表现出凝聚和或与树脂的非特异性相互作用(数据未显示)。将这些克隆从经历进一步分析的克隆组中取出。
为了消除交叉反应性和非特异性结合，我们在标准ELISA测定中研究高浓度(100nM)所选hIgG与一组固定的一组蛋白靶标包括全细胞溶解产物、同族抗原、和同源物的结合。除抗原外，我们固定鼠科形式的hVEGF，以测试抗hVEGF克隆的交叉物种反应性。具体地，蛋白组在Maxisorp板上固定，并用处于PBS中的1％BSA封闭1小时。hIgGs(或Fabs)在PBST中稀释至浓度100或500nM并转移至包被的板。1小时温育后，用HRP-缀合的蛋白A洗涤和温育该板。结合信号通过添加TMB底物显色约5分钟，用1M H3PO4猝灭，并通过分光光度法在A450读数。测试的hIgGs特异性结合其抗原。克隆bH1和3-1对鼠科VEGF(mVEGF)表现出交叉反应性(图19)。
为了测定双特异性抗体bH1、H3(抗hVEGF/Her2)、和D1(抗hDR5/Her2)是否可以同时结合它们同族抗原或该抗原是否竞争抗体结合，以浓度2μg/ml固定hVEGF和hDR5。固定浓度hIgG与Her2-ECD的连续稀释物一起温育，随后在固定的抗原上捕获hIgG。在各情形中，发现Her2-ECD结合与结合于其他抗原竞争(图20)。
为了精确地确定IgGs和Fabs的亲和性(即由文库分离的抗hVEGF和抗hVEGF/Her2 Fab和IgG)和为了研究实时结合特征，我们在具有固定的hVEGF，mVEGF，DR5，和Her2-ECD CM5传感芯片的BIAcoreTM-3000(BIAcore，Uppsala，瑞典)仪上，根据研究的分析物，以反应单位(RU)40-300，使用表面等离振子共振(SPR)测定。固定如所述进行(Chen等，1999)。为了最小化二价IgG分析物的亲合力影响，在这些情形中较低密度的配体靶定在传感芯片上。将在比评估的KD(基于竞争ELISA实验)约低10倍至高10倍的浓度范围内浓度渐增的样品以22-30μl/分钟来注射，并且结合反应通过参考流动细胞中减去RU来校正。另外，对反应进行双重参照，以通过从与样品缓冲液(具有0.05％吐温20的PBS)一起注射的配体-缀合的流动细胞中减去RU来标准化仪器漂移。为了Fab的动力学分析，使用1∶1Langmuir结合模型来计算kon和koff。当必要时(在高分析物浓度)，应用具有质量-转移限制的1∶1Langmuir结合模型。关于IgG分析物，使用具有或不具有质量-转移限制的二价分析物结合模型(BIAcore评估软件3.2)。在H3 hIgG、H4_N Fab、和H4_D hIgG的情形中，反应与动力结合模型的拟合不令人满意。因此，应用稳态结合分析，其中平衡反应针对分析物浓度作图。将KD评估为EC50。BIAcore结合分析的总结可以参见图21。发现hVEGF结合抗体3-1、3-6和3-7的亲和性在纳摩尔范围内。分析的双特异性抗体(bH1，H3，H4_N，H4_D)对hVEGF显示出低微摩尔至微摩尔亲和性。相反，对Her2的亲和性范围为8-59nM(Fab)。
为了研究抗hVEGF结合剂bH1，H3，和H4_N的轻链是否可以在不依赖相关重链的序列的条件下结合hVEGF，通过将轻链可变结构域克隆至2C4 Fab表达载体pJB0524中而使轻链可变结构域嫁接到抗Her2 2C4 Fab上，由此替代2C4轻链可变结构域。Fab如前所述表达。bH1/2C4和H3/2C4嵌合Fabs不以可检测的水平表达。分离H4_N/2C4嵌合Fab蛋白并测试与hVEGF(bH1初始特异性)和Her2(bH1，2C4初始特异性)的结合。通过标准ELISA结合测定没有检测到与hVEGF和Her2的结合(图22)。该结果表明bH1的重链是抗原结合所需要的。
抗hVEGF表位的比较
试图粗略定位hVEGF上的抗hVEGF抗体表位，我们研究了这些新分离的抗VEGF抗体与其他hVEGF结合抗体和具有已知结合位点的VEGF受体竞争的能力(Fuh等，2006；Muller等，1998；Wiesmann等，1997)。该测定以竞争ELISA形式进行，其中VEGFR1(Flt)结构域1-3和抗hVEGF抗体阿瓦斯丁(IgG)，B20-4.1(IgG)，G6(Fab)，和KDR结构域1-7Fc融合蛋白以2μg/ml固定在Maxisorp免疫板上。溶液竞争结合测定使用以纯化的IgG蛋白的连续稀释物平衡的生物素化的VEGF，并且未结合的生物素-VEGF用Maxisorb板上包被的固定化Fab或IgG来捕获并用链亲和素-缀合的HRP来检测(Lee等，J.Mol.Biol.(分子生物学杂志)340：1073，2004)。封闭hVEGF以使其避免结合其他hVEGF结合抗体或hVEGF受体的抗体可能共享重叠表位。高浓度(μM)的双特异性hVEGF/Her2-结合抗体，bH1，容许竞争封闭hVEGF与其受体，VEGFR1和VEGFR2的结合，这提示bH1表位与VEGFR1(图23)和VEGFR2(图24)充分重叠。另外，bH1封闭hVEGF与B20-4.1的结合(图24)。H3，H4_N，和H4_D也封闭hVEGF结合于这两种受体，其指向与bH1类似的表位(图23)。不完全的封闭特征可能是它们对hVEGF的相对低的亲和性的结果(图21)。相反，3-1不封闭hVEGF结合VEGFR1，甚至在最高浓度(0.5μM)时(图23)。此外，我们不能检测到阿瓦斯丁抗体的3-1 hIgG封闭(图25)。然而，3-1 hIgG封闭hVEGF结合于VEGFR2(KDR)(图23)以及B20-4.1(图24)。这些结果表明与其他抗体相比，3-1具有单一表位。
实施例4.bH1，抗hVEGF/Her2双特异性抗体的结构-功能研究
为了阐明bH1与其两种抗原VEGF和HER2的相互作用天性，进行结构和功能研究。赫赛汀抗体和bH1的区别在于CDR-L1(V29NTA32对比I29PRSISGY32；SEQ ID NOS：35和36)和CDR-L2(S50ASF53对比W50GSY53；SEQ ID NOS：37和38)。bH1抗VEGF/Her2基于其双特异性天性及其对VEGF和Her2的相对高亲和性，被选为用于结构表征的代表。为了研究VEGF和Her2上的功能和结构表位，我们使bH1 Fab与VEGF109和hHer2的胞外结构域复合结晶，并通过X射线结晶学解释这两种复合物的结构。另外，我们如所述地，利用组合的噬菌体展示文库进行丙氨酸和同源物鸟枪扫描分析(Vajdos等，2002)。
bH1 Fab表达、纯化、结晶和数据收集
如前所述，表达、重折叠和纯化人VEGF的受体结合部分，其由残基8-109组成(Christinger等，1996)。如前所述，表达和纯化Her2的胞外结构域的残基1-624(Franklin等，2004；Hudziak和Ullrich，1991)。
为了大规模bH1 Fab制备，由10升大肠杆菌发酵获得全细胞沉淀。将220克细胞浆解冻到1L PBS，25mM EDTA，1mM PMSF中。混合物匀浆并然后通过微射流均质机(microfluidizer)两次。混悬液再以12k，250ml等分试样离心90分钟。然后将蛋白以5ml/分钟加载到用PBS平衡的蛋白G柱(25ml)上。该柱用平衡缓冲液洗涤并然后用0.58％乙酸洗脱。馏分通过SDS PAGE测定(数据未显示)。汇集含有bH1 Fab的馏分并然后加载到用20mM MES pH 5.5平衡的50ml阳离子交换SP琼脂糖柱(Pharmacia)上。Fab用处于平衡缓冲液中的氯化钠梯度来洗脱。该梯度到0.5M NaCl，20mM MES pH 5.5是线性的。含有Fab的馏分通过SDS-PAGE确定(数据未显示)，并汇集。bH1 Fab以浓度约0.5M的NaCl洗脱。Fab浓度通过测量A280来确定。bH1 Fab的终产率是67mg/l发酵器生长。
通过以2∶1摩尔比混合纯化的bH1 Fab和VEGF或Her2 ECD获得复合物，并关于VEGF-Fab复合物在25mM Tris-HCl，pH 7.5和0.3M氯化钠中，和关于Her2 ECD-Fab复合物用25mM Tris-HCl，pH 8和0.15M氯化钠，通过大小排阻层析法(SP-200，Pharmacia)来纯化。由此生成的复合物的组合物通过SDS PAGE(数据未显示)来验证。浓缩蛋白复合物并在结晶试验中使用。在19℃利用蒸汽-扩散法的最初悬滴实验在bH1-VEGF复合物的情形中，在1周内，由14种不同条件形成小同晶型晶体。bH1-Her2复合物的晶体在1周内在4种条件中出现。在各情形中，选择来自一种条件的晶体，以进一步最优化。
为了bH1 Fab-VEGF(8-109)的结晶，等体积蛋白复合物溶液(10.6mg/ml蛋白，300mM NaCl，25mM Tris-HCl pH 7.5)和含有0.15M D，L苹果酸pH 7.0，20％PEG3350的结晶缓冲液混合并在19℃平衡。24小时后出现大晶体，其属于具有晶胞大小a＝100.6，b＝198.0，c＝77.7的空间群C2221。晶体形式在不对称单元中包含1个Fab和1个VEGF单体。数据收集前，晶体通过在人造母液中含有5％，10％，和15％甘油的液滴之间传递来低温保护，随后在液氮中速冻。数据以Advanced Light Source(高级光源)(Berkeley)的光线传输线(beamline)5.0.1收集到2.6
bH1 Fab-Her2(1-624)的晶体通过混合蛋白溶液(11mg/ml，25mM TrispH 8和150mM氯化钠)和含有25％w/v PEG2000，0.1M MES pH 6.5的结晶缓冲液来获得。晶体在12小时后出现，其属于具有晶胞大小a＝62.3，b＝115.1，c＝208.2的空间群P212121。该晶体在不对称单元中含有1个Her2-Fab复合物。数据收集前，在具有20％乙二醇作为低温保护剂的液氮中速冻晶体。数据以Advanced Light Source(高级光源)(Berkeley)的光线传输线5.0.1收集到2.9
数据处理、结构确定、和精细化
数据利用Denzo和Scalepack来处理(Otwinowski，1997)。bH1 Fab复合物的结构通过Phaser来解释(L.C.Storoni，2004；Read，2001)。bH1-Fab-VEGF(8-109)复合物利用来自前述VEGF-Fab复合物(2FJG)的VEGF和含有赫赛汀抗体Fab-Her2复合物(1N8Z)的可变结构域VL/VH或恒定结构域CH1/CL的Fab片段的坐标解释。
Her2的片段和来自Her2-Fab复合物1N8Z的赫赛汀抗体Fab的可变结构域在解释bH1-Her2结果时作为研究模型使用。bH1 Fab的恒定结构域不能利用赫赛汀抗体Fab恒定部分作为搜索模型(1N8Z)发现并且必须通过赫赛汀抗体Fab-Her2复合物结构手动指导停靠(dock)。模型构建和精细化分别利用程序Refmac(Collaborative Computational Project(合作计算机项目)，1994)和Coot(Emsley和Cowtan，2004)进行。立体化学参数利用MolProbity(Lovell等，Proteins(蛋白)50：437(2003))分析。结构关于Fab-VEGF复合物精细化至Rvalue＝0.22和Rfree＝0.27并且关于Fab-Her2复合物精细化至Rvalue＝0.25和Rfree＝0.31。对与VEGF以及Her2-ECD复合的bH1 Fab的晶体结构进行建模。一些bH1 Fab残基在抗原的4.5，4.0，和3.5内。相同抗体上关于两种抗原的两个互补位(抗体上与抗原结合的区域)显著重叠，并且来自轻链和重链二者的残基涉及与两种抗原的结合。bH1结合VEGF上与阿瓦斯丁抗体相似的表位，并且bH1与赫赛汀抗体结合基本相同表位上的Her2。
与HER2的胞外结构域(ECD)(残基1-624)和与VEGF受体结合结构域(残基8-109)结合的bH1 Fab晶体结构分别以2.9和2.6的分辨率来确定(图26和表3)。图26显示与赫赛汀抗体/HER2复合物重叠的bH1Fab/HER2晶体结构，和bH1 Fab/VEGF复合物的晶体结构。
在bH1/HER2复合物中，Fab以与赫赛汀抗体类似的方式结合HER2的结构域IV(Cho等，Nature(自然)421：756，2003)；两种复合物以Cα位置均方根偏差(r.m.s.d.)2.3重叠。在VEGF复合物中，bH1识别与VEGF受体VEGFR1和VEGFR2和其他VEGF抗体的结合位点重叠的表位(Wiesmann等，Cell(细胞)91：695，1997；Muller等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(美国国家科学院学报)94：7192，1997)。一致地，观察到bH1封闭VEGF与其受体的结合(图27)。关于图27中所示的数据，用渐增浓度的IgG(x轴)平衡生物素化的人VEGF165。未结合的hVEGF165在固定化VEGFR2-ECD Fc融合上捕获并通过分光光度法检测(450nm处的光密度，y-轴)。
如图28中所示，关于bH1上VEGF和HER2的结合位点广泛重叠。连接HER2的14个残基中的12个也接触VEGF。这两个结合位点包括来自HC以及LC的CDR残基。在HER2复合物中，LC和HC CDRs贡献近似相等的抗原接触面积(分别53％和47％)，而在VEGF复合物中，LC CDRs贡献接近70％的包埋表面(图29)。赫赛汀抗体和bH1上的HER2结合位点相似，并且区别仅在于CDR-L1和CDR-L2区，其中赫赛汀抗体序列在bH1中不是保守的(图28)。在图28中，bH1或赫赛汀抗体Fab表面上的残基根据由VEGF或HER2包埋的程度来阴影化(暗色阴影和白色字母＞75％包埋，中度阴影和白色字母50-75％包埋，浅色阴影和黑色字母25-49％包埋)。画下划线的残基在bH1和赫赛汀抗体之间不同。白色虚线表示轻链和重链的分界。
表3.结晶学研究
Rsyma＝∑I-<I> ∑I.<I>是单一反射波的对称相关观察的平均强度。
R因子b＝∑F0-Fc ∑I F0.Rfree计算为R，例外为由所有精细化排除5％反射波。
*括号内的值表示最高分辨率外壳(shell)的值。
与HER2复合的bH1Fab的构象与VEGF结合的Fab的构象显著相似(r.m.s.d.＝0.7，Cα)。这两种bH1 Fab结构的CDR彼此并与母体赫赛汀抗体Fv和bH1 Fv(HER2)r.m.s.d.＝0.6，与赫赛汀抗体Fv和bH1 Fv(VEGF)r.m.s.d.＝1.2充分重叠。CDR-L1是例外并且在这两种复合物结构中显著不同；偏差为4.6(残基27-32的Cα)。图30显示与VEGF结合的bH1 Fab的CDR构象与HER2-结合的bH1和赫赛汀抗体明显类似，区别为CDR-L1。图30是作为VEGF-结合的bH1(暗色阴影)，HER2-结合的bH1(白色)和HER2结合的赫赛汀抗体(浅色阴影)的管的CDR环的重叠。CDR-L1环在两种bH1结构中表现出显著不同的构象(关于bH1残基27-32，r.m.s.d.Cα＝4.6)(图31)。在HER2复合物中，CDR-L1最少地参与抗原相互作用并且部分环(残基28-30b)似乎是灵活的。关于VEGF结合，完整环充分形成并贡献26％的由VEGF包埋的表面积。
CDR-L1中的两个残基，即Ile30c和Tyr32，具有不同的构象并在bH1与HER2或VEGF结合中起不同作用。在HER2复合物中，Ile30c的侧链包埋在由CDR-L1和CDR-L3残基形成的疏水性中心中。在VEGF复合物中，该侧链形成与VEGF的疏水性接触。Tyr32的Cα在两种结构中处于相同位置，但是它的侧链旋转～130度。在HER2复合物中，Tyr32针对受体包装，而在VEGF复合物中，侧链与Ile29一起形成疏水性中心并支持CDR-L1和CDR-L3的构象。CDR-L1构象通过Tyr32和LC构架残基Gly72之间的氢键进一步稳定。结构分析验证Tyr32对VEGF结合非常关键，因为不耐受对丙氨酸或苯丙氨酸的突变。与VEGF结合相反，Tyr32到丙氨酸的突变(返回赫赛汀抗体残基)对HER2结合是优选的。两种复合物的重叠揭示VEGF在其HER2结合状态中会与CDR-L1的Tyr32冲突(图31)。在图31中，残基Tyr32，Ile30c，Ile29，和Gly72的侧链显示为棒状。具有高于平均值的温度因子的残基以较暗阴影显示(残基28-30b)。Tyr32和Gly72之间的氢键由虚线表示。
以上结果表明重排CDR-L1的能力是bH1双特异性所必需的。CDR-L1的相似构象灵活性已经显示在天然抗体的抗原识别中起作用(Jimenez等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(美国国家科学院学报)100：92，2003；Mylvaganam等，J.Mol.Biol.(分子生物学杂志)281：301，1998)。图26，28，30，31，和32利用PYMOL(DeLano Scientfic，San Carlos，CA)由晶体结构坐标(PDB码，3BDY，3BE1，1N8Z)生成。
bH1鸟枪扫描
为了研究bH1Fab的抗原结合位点，进行利用噬菌体-展示Fab文库的鸟枪扫描组合诱变(Vajdos等，J.Mol.Biol.(分子生物学杂志)320：415，2002；Weiss等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(美国国家科学院学报)97：8950，2000)。关于抗原(hVEGF和Her2-ECD)的结合选择以分离功能性克隆及随后进行DNA测序容许计算各不同位点处的野生型/突变体比(Vajdos等，2002)。这些比率然后用于确定各扫描的侧链对VEGF和Her2结合的贡献。该结果容许定位结合VEGF和Her2的功能性互补位。
bH1鸟枪文库设计
CDR中的溶剂暴露残基利用噬菌体-展示文库来筛选，其中容许野生型残基作为丙氨酸或野生型(丙氨酸扫描)或作为同源物残基或野生型(同源物扫描)变化。遗传密码的天性还需要使除Wt/丙氨酸或Wt/同源物残基以外一些其他置换包括在该文库中(图33)。构建单独的重链和轻链丙氨酸和同源物扫描文库。该文库描述在图34中。简并性范围为1.3x105至1.3x108且实际文库尺寸为6x109至4x1010。
构建鸟枪扫描文库
如上所示，为了容许M13噬菌体表面上bH1 Fab的展示，利用标准分子生物学技术，将设计用于在与M13基因-3小外壳蛋白C端结构域融合的噬菌体上展示hu4D5Fab的前述质粒AP2009修饰为编码bH1Fab。轻链的C端含有表位(gD)标记物。bH1Fab的“终止模板”形式用作文库模板(Sidhu等，2004)。轻链丙氨酸和同源物扫描文库在CDR-L1，CDR-L2和CDR-L3中具有终止密码子，并且重链丙氨酸和同源物文库在各重链CDR含有终止密码子。文库通过前述方法(Sidhu等，2004)，利用Kunkel诱变(Kunkel等，1987)，在各自终止模板上构建。
文库选择
NUNC 96-well Maxisorp免疫板用5μg/ml捕获靶标(hVEGF109，Her2-ECD或抗gD mIgG)来包被并用处于PBS中的1％BSA(w/v)来封闭。如所述，来自上述文库的噬菌体与KO7辅助噬菌体(NEB)一起繁殖(Lee等，2004a)。加入文库噬菌体溶液，从而以浓度1013个噬菌体颗粒/ml包被板并在RT温育1-2小时。该板用PBST洗涤8次，并随后用0.1M HCl洗脱结合的噬菌体30分钟。如前所述确定各轮选择后的富集。2轮靶标选择后，关于除针对hVEGF分类的LC-Ala和LC-Hom以外的所有文库观察到50-1000倍富集，LC-Ala和LC-Hom显示出5-10倍富集。如所述，选择来自表现出50-1000倍富集的各文库的许多随机克隆来测序(Sidhu等，2004)。关于hVEGF结合，在噬菌体ELISA中筛选文库LC-Ala(Sidhu等，2000)。选择表现出比用BSA包被的对照板高至少两倍的hVEGF ELISA信号的克隆来测序。使LC-Hom文库进行1轮另外的针对hVEGF的选择，随后进行噬菌体ELISA筛选和VEGF-结合克隆测序。
DNA序列分析
翻译和比对来自不同靶标选择的各文库的高质量序列(数据未显示)。来自进行分析的各文库的许多序列总结在下表4中。
表4.分析的序列数量
文库 总序列
LCA-V2b 51
LCH-V3 79
LCA-H2 97
LCH-H2 50
LCA-gD 112
LCH-gD 120
LCA-pL 60
LCH-pL 65
HCA-V2 100
HCH-V2 96
HCA-H2 81
HCH-H2 96
HCA-gD 105
HCH-gD 105
HCA-p1 102
HCH-p1 99
在各不同位置处计算Wt/Mut比(图35和图36)，从而容许计算如列出的Fwt/mut值(图35和图36)，其如所述地通过使来自靶标选择的比除以来自展示选择的比来针对展示校正(Vajdos等，2002)。高于1的Fwt/mut值表明Wt在该位置处是优选的且小于1的Fwt/mut值表明突变是优选的。Fwt/mut＞5说明其在抗原结合中的重要作用。各扫描的CDR残基的重要性图示在图37A-37D中。结果显示来自重链和轻链二者的残基对两种抗原(Her2和hVEGF)结合作出积极贡献。bH1轻链和重链残基对Her2结合的影响与其母体抗体hu4D5的影响进行比较(Kelley和O′Connell，1993)(图38)。
图39A和图39B显示bH1Fab关于与VEGF和HER2结合的鸟枪丙氨酸-和同源物扫描。丙氨酸(m1)突变，或另外的突变(m2，m3；归因于鸟枪-丙氨酸密码子的局限性)，或对同源氨基酸(m4)的影响计算为野生型和突变体在与人VEGF(图39A)或HER2(图39B)结合的克隆中的发生率(wt/mut)。在只出现野生型残基的情形中，该比率显示为大于“＞”野生型计数。氨基酸置换(m1-m4)的同一性显示为F值的上标。当野生型残基是丙氨酸时，其被甘氨酸(m1)置换。“*”表示bH1残基在VEGF或HER2复合物形成时包埋的程度(*25-49％易接近面积包被，**50-75％易接近面积包被，***大于或等于75％易接近面积包被)。
对积极的相互作用显著贡献的残基构成功能性互补位，这构成结构性结合位点的子集。与抗原接触的位点之间的广泛重叠相反，两个功能性互补位显示出有限的重叠(图32和40)。具体地，基于鸟枪扫描诱变，ΔΔG值(y-轴，kcal/mol)针对各种突变为丙氨酸(黑条)或同源氨基酸(白条)，关于VEGF(图40A)或HER2(图40B)结合作图。表示下限，因为在该位置处没有观察到突变。“*”表示在VEGF或HER2复合物形成时bH1残基表面积包埋的程度。(*25-49％包埋，**50-75％，***＞75％)。VEGF结合相互作用主要通过具有CDR-L1的Tyr32和CDR-L3的His91作为中心热点的LCCDRs(ΔΔGwt/ala＞1.5kcal/mol)来介导。HER2结合主要由HC CDRs来贡献。图32显示这样的晶体结构，其中bH1和赫赛汀抗体残基基于它们的功能重要性在Fab表面上阴影化(暗色阴影和白色字母，ΔΔG≥1.5kcal/mol；中度阴影和黑色字母，1≤ΔΔG＜1.5kcal/mol；浅色阴影和黑色字母，0.5≤ΔΔG＜1kcal/mol丙氨酸突变)。图28中黑色虚线勾画出接触面积。白色虚线描述轻链和重链的分隔。
关于VEGF结合和HER2结合，功能性互补位残基跨越HC和LC分布，这意味着这两条链的协同作用。CDR-H3的Trp95是这两种相互作用的唯一共同热点残基(ΔΔGwt/ala＞1.5kcal/mol)。如上所示，VEGF结合相互作用主要通过LC CDRs介导，而HER2结合通过HC CDRs控制。与赫赛汀抗体相比，具有较弱HER2结合亲和性(300倍)的bH1保持关于HER2结合的相同中心热点残基(Arg50，Trp95，和Tyr100a)，而外周残基的重要性重新分配(图32)。总之，重链中的贡献hu4D5/Her2结合的大部分重要侧链对bH1/Her2结合仍重要(ΔΔG＞1.5kcal/mol)。存在一些变化。轻链残基在贡献中具有更多改组——一些残基变得不太重要且一些更重要。总之，功能位点是来自bH1-VEGF和bH1-Her2复合物的晶体结构的结构界面的一部分。
简言之，bH1与两种结构无关的大蛋白的相互作用通过在与各抗原的积极相互作用中加入不同组bH1残基来表征。尽管关于两种不同抗原的两种广泛重叠结合位点中的大部分表现出单一构象，一个CDR环(L1)的灵活性促进HER2和VEGF二者的顺应。该机制暗示在结合无关小半抗原或肽的多特异性抗体中观察到的分子多用性。以前的研究描述由在单一抗体构象的空间不同区域处区别性定位小配体(Sethi等，Immunity(免疫学)24：429，2006)或通过抗原结合位点的多种先存构象(James等，Science(科学)299：1362，2003)介导的多特异性。抗体分子在抗原识别中的多用性通过何种限制的LC突变可以生成结合两种无关蛋白抗原的抗体来强调。
bH1亲和力成熟
在可以获得结构和功能结果前，为了试图研究bH1的VEGF结合亲和性是否通过最优化轻链序列来增加，构建文库，其中使基于h4D542Fab晶体结构(Eigenbrot et al.，2001)s处于高度溶剂可接近位置处的CDR残基多样化，假定所述CDR残基密切类似bH1 Fab。容许靶定残基作为野生型或少数同源残基而变化(图34)。文库如“Construction of shotgun scanninglibraries(构建鸟枪扫描文库)”部分中所述构建。如所述地，使用基于溶液的选择法来选择较高亲和性VEGF-结合剂。进行两轮基于溶液的选择。严谨性在各轮选择中，通过将生物素化VEGF的浓度由第一轮中的50nM减至第二轮中的20nM而增加。由最后一轮选择测序138个克隆。发现大部分克隆是单一的。使用固定的VEGF(8-109)、抗gD抗体、和Her2-ECD的高通量ELISA测定法用于确定结合VEGF，Her2-ECD，和抗gD mIgG但不结合BSA的克隆。VEGF-ELISA结合信号通过抗gD ELISA信号标准化，从而评估VEGF结合克隆的相对亲和性。选择具有高VEGF/抗gD比的克隆来进一步表征。所选克隆关于VEGF和Her2的亲和性通过竞争ELISA作为如前所述的噬菌体-展示Fabs来评估。bH1变体与母体bH1克隆相比，表现出提高的VEGF结合-亲和性。有趣地，一些克隆关于Her2结合具有稍微提高的IC50值，尽管不进行关于Her2的基于亲和性的选择。这显示可能在不显著影响Her2结合能力的条件下亲和力成熟bH1克隆以获得VEGF结合。存在一些VEGF-亲和性提高的克隆，其与母体bH1克隆相比显示减小Her2结合亲和性。该结果说明轻链主动有助于bH1与Her2的结合能力，尽管基于bH1-Her2复合物结构和鸟枪丙氨酸扫描分析，重链是结合能量的主要贡献者。表征的克隆的序列和IC50值总结在图41中。这样的发现，即大部分序列是单一的，提示这些变体的轻链序列尚未对VEGF结合完全最优化，并且可能通过额外轮选择进一步亲和性改进bH1克隆。
如图5中所示，可以获得并通常可应用单Fab关于两种抗原的显著亲和性提高。例如，人VEGF的KD从250(bH1；IgG)增加至41(bH1-81；IgG)或16nM(bH1-44；IgG)，且HER2的KD从21(bH1；IgG)增加至7(bH1-81；IgG)或1nM(bH1-44；IgG)。
亲和性通过在bH1的HC和LC CDRs中引入突变来提高。基于关于本文中所述VEGF和HER2的功能性互补位的信息选择位置。通过如本文中所述选择和筛选噬菌体展示文库，在两步中分离bH1变体。改进的克隆bh1-81通过基于亲和性选择所述轻链同源物鸟枪扫描文库来分离。在第二步中，通过随机化残基bH1-81，从文库中分离最高亲和性克隆(bH1-44)。具体地，设计这样的寡核苷酸，使在bH1-81(表5)的HC和LC中的随机化位点(表5)在各位点处编码～50％野生型和50％全部其他19种氨基酸(Gallop等，Journal of Medicinal Chimistry(医学化学杂志)37：1233，1994)。
bH1亲和性-提高变体(表5)的KDs关于Fab片段和IgG抗体来测量。Fab片段和IgG抗体分别在大肠杆菌和293细胞中表达，并如本文中所述纯化。如Lee等中所述，使用BIAcore3000的表面等离振子共振(SPR)测量用于确定Fab片段和IgG抗体的结合亲和性(J.Mol.Biol.(分子生物学杂志)340：1073，2004)。为了研究抗体作为单价Fab片段的亲和性，将抗原(hVEGF109，鼠科VEGF102，和HER2ECD)以低密度固定在BIAcoreCM5芯片上。Fab片段的连续稀释物与固定的抗原相接触并通过SPR测量结合反应。使用1∶1Langmuir结合模型来计算kon，koff，和KD。为了确定IgG抗体的KD，通过固定的抗Fc抗体在BIAcore CM5芯片上捕获IgG并使其暴露于hVEGF109，鼠科VEGF102，和HER2-ECD的连续稀释物。关于HER2，使用简单的1∶1Langmuir结合模型来确定KD，而VEGF需要二价分析物模型。所有实验在30℃进行。
表5以粗体显示随机化位置并总结bH1，bH1-81，和bH1-44的CDR序列(SEQ ID NOS：1-9和39-41)以及它们的亲和性(如通过表面等离振子共振确定)。
表5.具有提高的双亲和性的bH1变体
ND＝未确定。
抗体关于人VEGF109，鼠科VEGF102，和HER2ECD的单价亲和性通过BIAcore来测量。表5显示各结合相互作用的代表性解离常数(Kd)。VEGF(VEGF109)的受体结合片段用于BIAcore实验中，因为bH1变体在溶液竞争实验中，以类似的亲和性结合全长蛋白(VEGF165)和VEGF109(数据未显示)。使用不同的测定形式和评估模型来计算如本文中所述的Fab片段/IgG抗体的Kd。不同的测定/评估形式对各种相互作用产生一致的解离常数。
实施例5.在细胞测定中分析IgG活性
为了确定bH1和3-1抗体是否可以抑制hVEGF165诱导的人脐静脉内皮(HUVEC)细胞增殖，在增殖测定中测试它们。人脐静脉内皮细胞(HUVEC)(Cambrex，East Rutherford，NJ)如所述生长和测定(Fuh等，J.Biol.Chem.(生物化学杂志)273：11197，1998)。将约4000个HUVEC涂布在96孔细胞培养板的各孔中并在增补1.0％(v/v)胎牛血清的Dulbecco改良Eagle′s/F-12培养基(1∶1)(测定培养基)中温育18小时。然后向细胞中加入具有固定量的VEGF(0.2nM终浓度)的新鲜测定培养基和渐增浓度的抗VEGF抗体(例如，bH1)，所述新鲜测定培养基首先滴定为可以刺激次于最大的DNA合成的VEGF水平。37℃温育18小时后，用0.5μCi/孔的[3H]胸苷脉冲细胞24小时，并收获从而用TopCount微板闪烁计数器来计数。结果证明3-1和bH1二者均可通过防止hVEGF诱导的信号传导和随后的增殖来抑制VEGF诱导的HUVEC细胞生长。阿瓦斯丁抗体(抗VEGF)用作阳性对照且赫赛汀抗体用作阴性对照(图42)。
为了研究双特异性抗Her2/VEGF抗体与哺乳动物细胞上表达的Her2的结合，通过流式细胞仪研究bH1和bH3抗体与过表达Her2的NR6成纤维细胞(NR6-Her2)的结合。将一百万个NR6-Her2细胞用100μg/ml Fab和IgG温育1小时，随后用Alexa488-缀合的鼠科抗人IgG抗体温育1小时。作为阴性对照，研究Fab和IgG与非表达NR6细胞的结合。如图43中所示，bH1和bH3作为Fab和作为IgG，特异性结合NR6细胞上的Her2。
图44显示关于bH1与VEGF或HER2竞争结合实验的结果。bH1抑制VEGF诱导的人脐静脉内皮细胞增殖(HUVEC)，其具有200nM的IC50，这与其300nM的亲和性相一致，还在5天温育后抑制表达HER2的乳腺癌细胞系BT474的增殖，尽管由于其降低的亲和性而具有比赫赛汀抗体更低的效率(图45)。赫赛汀IgG抗体和贝伐珠单抗(bevacizumab)(抗VEGF)起对照作用。如图45中所示，bH1-81和bH1-44抗体抑制VEGF-诱导的HUVEC细胞增殖和BT474细胞生长达到比bH1更大的程度。bH1变体增加的效力与其相对亲和性相关。最高亲和性变体，bH1-44，分别以与贝伐珠单抗或赫赛汀抗体相似的效力抑制HUVEC和BT474细胞的生长。
为了进行这些实验，用渐增浓度的人IgG处理VEGF-刺激的HUVECs并如Liang等中所述地测量2天温育后的增殖抑制(J.Biol.Chem.(生物化学杂志)281：951，2006)。乳腺癌细胞BT474在增补10％FBS的RPMI培养基中培养。关于测定，在96孔板中每孔涂布104个细胞，并在37℃温育过夜(18小时)。将渐增浓度的人IgG加至细胞。然后将细胞在37℃温育5天，随后根据制造商的说明添加10％AlamarBlue(BiosourceInternational(国际生物来源)，Camarillo，CA)。表达HER2的细胞增殖的抗体依赖性抑制通过在6小时后测量荧光信号来确定。
实施例6.分析结合特异性
确定源自LC文库的抗体的结合特异性。与多种固定化纯化蛋白或细胞溶解产物包括同族抗原结合的IgG通过ELISA来测定。所述抗原用浓度15μg/mL的hIgG固定和温育1小时。通过分光光度计检测结合的IgG(450nm处的光密度；y-轴；图46)。该测定中包括的蛋白是(图46中左到右)：血管内皮生长因子A(VEGF)，鼠科血管内皮生长因子(鼠科VEGF)，血管内皮生长因子C，(hVEGF-C)，血管内皮生长因子D，(hVEGF-D)，HER2胞外结构域(HER2ECD)，表皮生长因子受体胞外结构域(hEGFR)，ErbB3/HER3胞外结构域(HER3ECD)，人死亡受体5(hDR5)，牛血清清蛋白(BSA)，酪蛋白，胎牛血清(FBS)，Neutravidin，5％乳，小鼠成纤维细胞细胞溶解产物，和掺有hVEGF-A或HER2 ECD的小鼠成纤维细胞细胞溶解产物。在图46中，误差柱表示重复的标准误差平均值(SEM)。没有测定抗体bH3，3-1，bD1，bD2，4-1，和4-5与鼠科VEGF，HER3 ECD，Neutravidin，5％乳，掺有hVEGF-A的细胞溶解产物，和掺有HER2 ECD的细胞溶解产物的结合。
还确定多种抗体(阿瓦斯丁抗体，赫赛汀抗体，bH1，bH3，bH4，bH1-81，和bH1-44)封闭VEGF与VEGF受体结合的能力(图47)。生物素化人VEGF165(图47A)或鼠科VEGF164(图47B)用渐增浓度的IgG(x-轴)来平衡。未结合的VEGF在固定化的人VEGFR2-ECD Fc融合蛋白捕获并通过分光光度计检测(处于450nm的光密度，y-轴)。关于VEGFR1也观察到类似的抑制。抗VEGF抗体封闭VEGF与VEGF受体的结合。
显示抗原VEGF和HER2在溶液中竞争结合bH1-44双特异性IgG抗体(图48)。浓度为0.1nM的人bH1-44 IgG抗体与0.1nM生物素化人VEGF165一起，在存在渐增浓度的HER2ECD的条件下温育。bH1-44通过固定化的抗人Fc来捕获并且bH1-44-结合的生物素-VEGF使用链亲和素-HRP来检测。利用结合HER2上非重叠表位的鼠科抗HER2抗体和随后HRP-缀合的山羊抗小鼠IgG来检测结合捕获bH1-44的HER2 ECD(图48A)。浓度为0.2nM的人bH1-44 IgG与0.6nM生物素化HER2一起，在存在渐增浓度的人VEGF165的条件下温育。bH1-44通过固定化的抗人Fc来捕获并且bH1-44-结合的生物素-HER2使用链亲和素-HRP来检测(图48B)。
bH1和bH1-44与细胞的特异性结合也通过使用FACS(荧光活化细胞分类；图49)来检测。双特异性抗体(bH1和bH1-44)结合表达HER2的小鼠成纤维细胞(NR6)(图49B)但不结合HER2阴性NR6细胞(图49A)。50-100万细胞与15μg/mL hIgG一起在冰上温育1小时。与细胞结合的第一抗体利用第二荧光PE缀合的山羊抗人IgG来检测。细胞利用FACS Calibur流式细胞仪来分析。bH1和bH1-44不与HER2的大鼠直向同源物交叉反应，因为没有检测到与用大鼠neu(HER2的大鼠直向同源物)转染的小鼠成纤维细胞的结合。
为了进一步表征bH1抗体变体bH1-81和bH1-44的特异性，进行免疫测定实验并且bH1抗体变体显示出由小鼠成纤维细胞(NR6)溶解产物中特异性免疫沉淀VEGF或HER2，而非其他蛋白(图50)。将NR6细胞非特异性生物素化、溶胞、并细胞膜蛋白去污剂溶解。对应于500-1000万细胞/mL的NR6细胞、掺有0.1μg/mL生物素化VEGF165的NR6细胞、或过表达HER2的NR6细胞的细胞溶解产物与15μg/mL抗体一起温育。利用蛋白A-包被的琼脂糖珠来捕获抗体并洗脱结合的蛋白。洗脱的蛋白通过SDS-PAGE分离。将对应于约25-50,000个细胞的细胞溶解产物和来自约0.12-0.25百万个细胞的免疫沉淀物加载到凝胶上。捕获的是生物素化蛋白通过利用链亲和素-HRP的Western印迹来检测。
实施例7.在体内测定中分析IgG活性
为了评估这些抗体体外的双活性是否转化为相应的体内活性，我们使用小鼠异种移植物肿瘤模型，其已知应答于由抗VEGF抗体(Colo205，结肠直肠癌细胞系)或赫赛汀抗体(BT474M1，乳腺癌细胞系)进行的治疗。具体地，将Colo205异种移植物用于nu/nu小鼠中，并且将BT474M1异种移植物用于米色裸XID小鼠中。所有动物研究均符合美国实验室动物护理授权协会(American Association for Accreditation of Laboratory AnimalCare)和Genentech机构动物护理和使用委员会(Genentech InstitutionalAnimal Care and Use Committee)的指导。
具体地，BT474M1(内部)和Colo205(ATCC，Manassas，VA)细胞在RPMI培养基/10％胎牛血清中培养。将悬浮在Hank缓冲盐溶液(HBSS)和基质胶(matrigel)(1∶1)混合物中的5×106个BT474M1细胞注射到皮下植入雌二醇小丸的Harlan米色裸XID小鼠(Indianapolis，IN)的乳房脂肪垫中。关于Colo205异种移植物，将处于HBSS中的5×106个Colo205细胞皮下注射到Charles River nu/nu小鼠(Hollister，CA)中。当平均肿瘤尺寸达到～200mm3时，将小鼠随后分组为7组，每组8只小鼠(BT474M1)或10只小鼠(Colo205)。每周一次腹膜内施用抗体。肿瘤尺寸每周测量两次。体积计算为V＝0.5ab2(a是肿瘤的最长尺寸且b与a垂直)。统计学评价使用单向分析及随后的双尾student t检验。由于多次比较(Bonferroni)的α水平的调整不改变我们的结果的显著性。部分反应(PR)定义为与V0相比肿瘤体积减小50-99％的反应。在第一和第三次处理后7天时收集血清样品。人抗体的浓度利用ELISA来确定。驴抗人IgG Fc固定在免疫板上。血清稀释物和抗体标准在该板上温育2小时。结合的抗体通过辣根过氧化物酶缀合的山羊抗人IgG Fc及随后的TMB底物/1M磷酸来检测。在450/620nm处读板。利用4参数运算来确定样品浓度。
bH1-44处理组与用抗VEGF(B20-4.1)(Liang等，J.Biol.Chem.(生物化学杂志)281：951，2006)，赫赛汀抗体，或组合(赫赛汀抗体+抗VEGF)处理的组比较，从而进一步确定bH1-44抗体能够抑制VEGF和HER2介导的肿瘤生长。在所有组中，抗体在处理开始后7天时以高水平(由ELISA评估)存在于来自Colo205异种移植物的血清，这表明正常的药物动力学(表6)。
表6.抗体血清水平
关于各组，n＝5；SD＝标准偏差
以10mg/kg每周给药的bH1-4与对照抗体相比，抑制Colo205肿瘤生长(p＜0.0001，n＝10)，其具有与抗VEGF(10mg/kg/周)类似的功效，而赫赛汀抗体对Colo205生长没有影响(p＝0.12，n＝10)。如预期地，组合处理显示与单独抗VEGF类似的功效。以10和20mg/kg/周施用的bH1-44抗体产生剂量依赖性反应。在BT474M1模型中，在用bH1-44抗体(10mg/kg/周，p＝0.0005，n＝8和20mg/kg/周，p＝0.0001，n＝7)处理的小鼠组中观察到显著的肿瘤生长抑制。类似于用赫赛汀抗体或赫赛汀/抗VEGF组合给药的组，超过一半的用bH1-44抗体处理的肿瘤表现出由初始体积退化超过50％(即部分反应，图51)。在另一方面，单独的抗VEGF与对照相比，对BT474M1仅表现出适度生长抑制作用(p＝0.06，n＝7)并且不表现出部分反应。双特异性bH1-44抗体因此显示抑制对体内肿瘤生长重要的两种不同机制。
以上结果表明bH1抗体(例如，bH1-44和bH1-81)的亲和性提高变体抑制对体内肿瘤生长重要的两种机制的潜力。
实施例8.表征VEGF和HER2与bH1和bH1-44的结合界面
为了进一步比较bH1和bH1-44的结构特征，确定VEGF和HER2与这些抗体的结合界面。表7中列出的结构接触基于晶体结构坐标3BDY(bH1/VEGF)和3BE1(bH1/HER2)来确定。利用程序XSAE来计算结合界面。该程序将界面定义为极性、疏水性和混合的。表7列出当HER2或VEGF结合时＞25％总表面积包埋的bH1残基。表7还列出bH1残基的4.5以内的VEGF和HER2残基。当复合物形成时包埋的各残基的表面积基于晶体结构3BDY，3BE1，和1N8Z(PDB)的坐标，利用IMOL来计算。表11中报告的极性和疏水性界面面积反映极性界面面积和半混合的。报告的疏水性界面面积由疏水性面积和半混合的组成。
晶体结构和丙氨酸扫描显示bH1在HER2上与赫赛汀抗体保持相同的结合表位(Bostrom等，2009)。与HER2复合的赫赛汀Fab的晶体结构充分重叠到bH1/HER2复合物上(r.m.s.d为0.8)(Bostrom等，2009；Cho等，2003)。此外，基于丙氨酸扫描诱变贡献超过10％的总结合能量的赫赛汀抗体残基是保守的，且它们中的许多也是bH1和bH1-44结合热点的一部分(Bostrom等，2009；Kelley和O′Connell，1993)(表14，图62)。bH1/VEGF和bH1/HER2之间的界面分别包埋1506和1579，并且主要是疏水性的(分别地，60％和63％)。赫赛汀/HER2结合界面与bH1/HER2界面(1524，60％疏水性，表11)具有类似的尺寸和组成，并且也通过高度形状互补性来表征(表8)(Bostrom等，2009)。
表7.H1Fab/HER2ECD和bH1/Fab/VEGF109的复合物的结构接触列表。该表列出当HER2和VEGF结合时具有＞25％总表面积包埋的残基。列出bH1残基4.5内的VEGF和HER2残基。当复合物形成时包埋的各残基的表面积基于晶体结构3BDY，3BE1，和1N8Z(PDB)的坐标利用IMOL来计算。
抗体和抗原之间的形状互补性(在表8中由Sc表示)如所述确定(Lawrence等，1993)。bH1/VEGF和bH1/HER2复合物中的高度形状互补性，类似于赫赛汀抗体和HER2之间的互补性，处于报告的抗体-抗原复合物的范围内(Sc～0.64-0.68；Lawrence等，1993)。HER2与bH1在其VEGF-结合的构象或VEGF与bH1在其HER2-结合的形式中的重叠揭示当使抗体与无关抗原并置时观察到极少形状互补性(Sc～0.35；Lawrence等，1993)。该结果证明bH1重排以适应两种不同抗原的程度。
表8.bH1用于结合HER2和VEGF的不同表面构象
*＝中值形状互补性统计值
bH1的亲和性通过从bH1的噬菌体展示抗体文库中选择高亲和性变体bH1-44来提高。鸟枪丙氨酸扫描诱变证明bH1-44保持bH1的抗原结合的热点(表9A-B，10，和14)。bH1-44的鸟枪丙氨酸扫描诱变利用以上关于bH1的鸟枪丙氨酸扫描诱变描述的技术来进行。
在表9A-B中，突变对丙氨酸(m1)，或另外的突变(m2，m3；由于鸟枪密码子的局限性)，或对同源氨基酸(m4)的影响计算为VEGF(表9A)或HER2(表9B)结合克隆的野生型(wt)或wt/mut的发生率。当wt是丙氨酸时，其被甘氨酸(m1)置换。wt/mut比针对蛋白折叠/表达作用，通过从展示选择用wt/mut比相除以获得F值来校正。展示选择通过选择结合蛋白L的克隆来独立地进行，蛋白L结合抗体轻链的非线性表位。由于只有Fab重链融合于噬菌体外壳蛋白(p3)，蛋白L结合表明轻链和重链的适当折叠和结合。
在表10中，列出在晶体结构中接触VEGF和/或HER2的bH1和bH1-44的抗体残基。用于结合的高能热点通过导致ΔΔGwt/ala大于相互作用的约10％的总结合能量的抗体残基来定义。
表11中的数据表明结合界面的极性和尺寸在bH1/VEGF，bH1/HER2，和赫赛汀/HER2复合物之间相似。各界面的极性利用XSAE来分析。表11中描述的全部数字表示以为单位的面积，除非另外说明。
表9A.bH1-44 Fab关于结合VEGF的鸟枪丙氨酸-和同源物-扫描。
NA＝突变未包括。
表9B.bH1-44Fab关于结合HER2的鸟枪丙氨酸-和同源物-扫描。
NA＝突变未包括。
表10.关于VEGF和HER2的结构和功能性互补位
表11.bH1/VEGF，bH1/HER2，和赫赛汀/HER2复合物的结合界面的极性和尺寸。
HER2/VEGF双特异性bH1-44抗体保持赫赛汀抗体的HER2结合动力学
进行表面等离子共振来研究bH1及其Fab变体与固定化的VEGF或HER2的结合动力学(表12)。利用BIAcore 3000进行基于SPR的测定。VEGF109和HER2胞外结构域以容许50-150RU范围内的Rmax的密度固定在CM5芯片上。处于具有0.05％吐温20的PBS中的Fab连续稀释物以30μl/min来注射。结合反应通过由空白流动细胞中减去反应和通过针对缓冲液作用标准化来校正。使用1∶1Langmuir拟合模型来评估ka(开比率)和kd(关比率)。由ka和kd的比来确定KD值。
bH1 Fab/VEGF相互作用通过相对高的开比率(kon＝3.7×104)和快关比率(koff＝0.013)来表征，这导致中等KD 300nM。bH1/HER2相互作用(KD＝26nM，kon＝9.6×104，koff＝2.4×10-3)的亲和性低于具有较低开比率和较快关比率的赫赛汀/HER2相互作用(KD＝0.5nM，kon＝7.1×105，koff＝3.5×10-4)52倍。亲和性提高的bH1变体，bH1-81和bH1-44，展示VEGF和HER2相互作用的开比率和关比率二者的提高。高亲和性克隆bH1-44以与赫赛汀(KD＝0.2nM，表12)类似的亲和性结合HER2。
表12描述在30℃利用BIAcore通过表面等离子共振测量确定的bH1变体和赫赛汀抗体的动力学特征。在这些实验中，Fabs结合于固定化的VEGF或HER2，且开比率(ka)，关比率(kd)，和解离常数(KD)利用1∶1Langmuir结合拟合模型来确定。bH1-44抗体具有与赫赛汀抗体类似的动力学特性和关于HER2的亲和性。失去与VEGF或HER2结合的两种双突变体(bH1-44I29A+Y32A和bH1-44R50A+R58A)保持动力学特征和关于其他抗原的亲和性。
表12.bH1变体和赫赛汀抗体的动力学特征。
NB＝无可检测的结合。
双特异性抗体以类似的热力学性质与HER2和VEGF相互作用
bH1 Fab变体与两种抗原，VEGF(VEGF的受体结合结构域，VEGF8-109)和HER2胞外结构域(ECD)之间的相互作用的焓(ΔH)和熵(ΔS)变化也利用等温滴定热量测定(ITC)来确定(图59A-F，图60，表13)。
Fabs与人VEGF109和HER2的胞外结构域之间的相互作用的微量热测量在VP-ITC滴定热量计(Microcal Inc.)上，如所述进行(Starovasnik等，1999)。将蛋白溶液充分透析到磷酸盐缓冲液盐水中。抗原和Fabs在相同容器中透析，从而最小化由于缓冲液组成区别引起的混合热影响。将浓度100-220μM的Fabs滴定到浓度为10-22μM的抗原溶液中(HER2-ECD或VEGF109)。该抗原浓度是精确焓测量所需的，但是在结合亲和性高的情形中排除KD的确定。进行15或20次注射，从而获得2倍过量的抗体。确定反应热，减去Fab稀释(Fab dilution)热，并计算ΔH。
使用通过表面等离子共振确定的解离常数(KD)(表12)，根据下式来计算结合自由能(ΔG)：
ΔG＝RT ln(KD)
根据下式计算结合时的熵变(ΔS)：
ΔS＝(ΔH-ΔG)/T，其中T是温度(K)。
为了确定ΔCp，以20-37℃范围内的不同温度，如上所述进行微量热测量。
通过将ΔH作为温度的函数绘图的线性回归来确定ΔCp(图62)。
首先表征双特异性抗体，bH1，与其两种抗原，VEGF和HER2中任一种的相互作用。bH1与VEGF和HER2的结合表现出类似的热力学性质(表13)。在30℃，pH 7.4的PBS中测量的两种相互作用是放热的(关于VEGF和HER2，分别为ΔH＝-2.4kcal/mol和-2.4kcal/mol，表13，图60)，其具有高度有利的熵变，所述熵变对结合能作出贡献(关于VEGF和HER2，分别为-TΔS＝-6.6kcal/mol和-7.9kcal/mol，表13，图60)。
表13以kcal/mol为单位描述ΔG(结合自由能)，ΔS(熵变)，和ΔH(焓变)。显示的亲和性在至少两个独立实验中，利用通过BIAcore在30℃进行的动力学分析来测量。ΔH利用ITC测量并代表2或3个独立测量的平均值后面是标准偏差。ΔG和ΔS如上所述计算。
高亲和性变体bH1-81和bH1-44展示出与bH1相似的热力学特征。它们与VEGF和HER2的相互作用也通过有利焓和熵来表征(表13，图60)。关于VEGF相互作用，亲和性提高与显著更有利的焓变(在30℃，ΔH＝-7.1(关于bH1-44)对比-2.4kcal/mol(关于bH1))和略微较低的正向熵变(在30℃，-TΔS＝-6.6(关于bH1-44)对比-4.7(关于bH1)，表13，图60)相关。关于HER2的提高的亲和性还与更有利的焓变(ΔH＝-5.3对比-2.4kcal/mol，30℃，表13，图60)相关。
表13.关于bH1变体和赫赛汀抗体的抗原结合亲和性和热力学。
bH1-44和赫赛汀以不同的热力学与HER2相互作用
与双特异性抗体相反，HER2/赫赛汀相互作用通过在无任何显著熵变(-TΔS＝-0.3kcal/mol，图60，表13)条件下的大的有利焓变(ΔH＝-13.6kcal/mol)来表征(Kelley等，1992)。尽管bH1-44以与赫赛汀类似的亲和性与HER2相互作用，结合自由能由较大熵成分(-TΔS＝-8.1kcal/mol，30℃)和较小焓成分(ΔH＝-5.3kcal/mol，30℃)组成。不同的热力学性质对比赫赛汀和bH1-44之间的HER2结合特征的许多相似性，这包括亲和性、动力学和许多能量热点的残基。尽管对HER2贡献超过10％总结合能的赫赛汀的热点残基与bH1和bH1-44的那些相似，但是存在一些明显的区别。
表14显示通过丙氨酸扫描诱变确定的关于HER2结合的bH1，bH1-44，和赫赛汀抗体热点。诱变如Kelley等，1993中所述进行。表14中的数字代表当残基突变为丙氨酸时结合自由能的变化(ΔΔGwt-mut)。表14中的热点残基阴影化并定义为大于或等于10％总结合自由能(ΔG)的ΔΔG。
残基LC-Thr94，HC-Tyr33，HC-Asp98在序列bH1中保守，但是具有不同的HER2结合功能(表14，图61)。因此，募集VEGF结合的赫赛汀的抗原结合位点中的突变似乎已经对抗原结合位点产生一些基础改变，所述改变影响与HER2的相互作用。双特异性抗体通过利用不同的HER2识别策略来适应引入的突变，所述识别策略导致与赫赛汀相等的关于HER2的高度亲和性。令人感兴趣地注意到，除bH1-44的LC-Ser94以外，与bH1相比将关于HER2的亲和性提高超过100倍的突变不是结合热点的一部分，但是似乎最优化现存的相互作用。
双特异性相互作用中的大阴性热容
为了进一步理解驱使双特异性相互作用的一般能量和它们如何与单特异性母体赫赛汀的相互作用相区别，进行了一系列实验来研究以下三种Fab/抗原相互作用：bH1-44与VEGF或HER2，和赫赛汀与HER2。双特异性相互作用的热容通过确定20℃-37℃范围内多温度下的结合焓(ΔH)来测量(ΔT＝17℃，图62，表15)。热容(ΔCp)是ΔH和温度(T)的函数并且可以通过以下等式来描述：
ΔCp＝δ(ΔH)/δT
ΔCp通过线性回归，由ΔH的温度依赖性斜率来评估(图62，表15)。bH1-44的ΔCp关于与VEGF的相互作用被确定为-400cal/molK，且关于与HER2的相互作用被确定为-440cal/molK。大阴性热容表示如前所述的疏水性作用的重要性(Kauzmann，1959)，这与两种复合物中的结构界面的疏水性的性质相一致(表11)。赫赛汀/HER2的ΔCp，其先前以类似的温度间隔确定为-370cal/molK(Kelley等，1992)，小于bH1-44/HER2的ΔCp，但是仍表示疏水性作用在HER2结合中的重要作用。
结合自由能的总熵变(ΔS)是来自三种来源的熵变的总和(Murphy等，1994)：与结合表面的去溶剂化相关的熵变(ΔSSOLV)，来自失去旋转和平移自由度的熵变(ΔSRT)，和由于相互作用分子的构造和构象动力学变化的熵变(ΔSCONF)。
(1)ΔSTOT＝ΔSSOLV+ΔSRT+ΔSCONF
典型地，只有ΔSSOLV是阳性的，而ΔSRT和ΔSCONF均是阴性的。cratic熵项，ΔSRT，关于两分子的结合可以如所述评估为-8cal/Kmol(Murphy等，1994)。ΔSSOLV可以被假设受到归因于非极性表面积包埋的疏水性作用的控制并可以被描述为ΔCp的函数：
(2)ΔSSOLV＝ΔCp ln(T/T*)，T*＝385K
ΔSCONF可以由此评估为：
(3)ΔSCONF＝ΔSTOT-ΔSRT-ΔSSOLV
根据等式(3)，ΔSSOLV针对bH1-44/VEGF被评估为96calmol-1K-1，针对bH1-44/HER2被评估为105calmol-1K-1，并针对赫赛汀/HER2被评估为89calmol-1K-1(表15)。这翻译为ΔSCONF针对bH1-44/VEGF为-72calmol-1K-1，针对bH1-44/HER2为-70calmol-1K-1，且针对赫赛汀/HER2为-80calmol-1K-1(表15)。
为了检验双特异性Fabs与其母体赫赛汀相比的总结构稳定性，进行利用不同扫描热量测量(DSC)的热量变性实验。热量变性实验在来自MicrocalInc的不同扫描热量计上进行。Fabs针对10mM乙酸钠pH 5，150mM氯化钠透析。将溶液调节为浓度0.5mg/ml并以1℃/min的速度加热到95℃。对融化特征进行基线校正和标准化。融化温度(TM)利用由制造商提供的软件来确定。如所预期地，没有一种Fabs展示可逆的热变性特征(Kelley等，1992)(数据未显示)。双特异性变体的TM(关于bH1，bH1-81，和bH1-44分别为77.2℃，75.6℃，74.3℃，表16)略低于赫赛汀的TM(82.5℃)，但是是高的并在已经针对其他治疗性抗体报告的范围内(Garber和Demarest，2007)。具有关于仅VEGF或HER2的高亲和性的bH1变体的结合动力学和热力学
令人感兴趣地，双特异性抗体由共享VEGF/HER2结合位点的完全不同区域获得大部分它们的结合能。这些数据显示双特异性抗体的VEGF或HER2结合功能可以在不影响剩余结合特异性的条件下被选择性破坏。结构研究表明bH1关于VEGF和HER2的结构互补位显著重叠，但是bH1和bH1-44的鸟枪丙氨酸诱变证明VEGF和HER2相互作用由两个独特的具有少量重叠的CDR残基组介导(图54和57，表9A，9B，和10)。bH1和bH1-44的鸟枪丙氨酸扫描表明一些CDR残基对结合VEGF或HER2排他地重要(图54和57，表9A，9B，和10)，包括对VEGF结合重要的LC-Ile29，LC-Tyr32，和对HER2结合重要的HC-Arg50，HC-Arg58(图54和57，表9和10)。为了验证这些残基侧链中各相互作用中的独特重要性，将各残基在bH1-44(LC-Ile29，LC-Tyr32，HC-Arg50，HC-Arg58)或赫赛汀(HC-Arg50，HC-Arg58)支架中单独地或组合地突变为丙氨酸，并将突变体表达为Fabs和IgGs。
编码通过重链融合于基因III的N端的bH1-44或赫赛汀Fabs的载体用作用于Kunkel诱变的模板(Kunkel等，1987)。将寡核苷酸设计为用于在所选择的位置处引入所需的丙氨酸突变。Fab丙氨酸突变体表达为噬菌体，且结合通过竞争ELISA来验证(图58)。然后将重链和轻链可变结构域克隆到Fab和IgG表达载体中，并且Fabs和IgGs如所述表达和纯化(Bostrom等，2009)。SDS-PAGE验证正确的蛋白尺寸(图65)。大小排阻层析显示小于5％的聚集水平。
与两种抗原的结合通过竞争ELISA和/或BIAcore来检验。bH1-44支架中的所有单丙氨酸突变将结合减少到不同程度(数据未显示)。最醒目的单突变是LC-Y32A，其显著破坏VEGF结合，同时保持HER2结合亲和性和动力学(表12，图58，和图63)。双突变I29A+Y32A(LC)或R50A+R58A(HC)几乎分别完全破坏与VEGF或HER2的结合，同时保持关于其他抗原的结合亲和性和动力学(表12，图58，和图63)。赫赛汀支架中的丙氨酸突变HC-R50A，HC-R58A也破坏与HER2的结合到不同程度，而双突变体HC R50A+R58A不显示可检测的HER2结合(表12)。
其次分析双突变体的热力学参数并将其与bH1-44的值进行比较。bH 1-44突变体LC-I29A+Y32A和HC-R50A+R58A分别与HER2或VEGF的结合自由能由焓和熵的有利贡献获得(关于VEGF，ΔH＝-7.7和-TΔS＝-3.9，关于HER2，ΔH＝-6.4和-TΔS＝-7.6，表13，图60)，其近似等于在30℃测量的bH1-44(表13，图60)。因此，双突变体展示与bH1-44相同的热力学和动力学性质。
特异性改变的残基的功能的结构基础
其次，分析与VEGF或HER2复合的bH1的晶体结构(Bostrom等，2009)，以揭示各抗原复合物中的结合决定簇的特异性相互作用(图64)。由此获得的分析解释两种特异性确定残基的突变如何破坏关于一种抗原的结合能力但不影响关于其他抗原的亲和性、动力学和结合热力学。bH1的CDR-L1含有来自赫赛汀的大部分序列变化，并且对于VEGF结合很重要。bH1的CDR-L1的构造在两种复合物结构中显著不同；平均偏差为4.6(残基27-32的Cα)。相反地，与VEGF复合的bH1 Fab的总构造与HER2-结合的Fab的总构造明显类似(r.m.s.d.＝0.7，关于398个主链原子，Cα)。CDR-L1环构成26％的VEGF包埋的表面积，而该环位于HER2互补位的周围并最小地参与HER2接触。
两种复合物的重叠表明VEGF与Tyr32和CDR-L1在其HER2-结合的构造中的相邻残基冲突。Tyr32残基的主链Cα原子在两种结构中处于相同位置处，但是其侧链旋转～130°。在VEGF复合物中，Tyr32和Ile29似乎在容许VEGF结合所需的CDR-L1构造中起结构作用。Tyr32突变为Ala或Phe对于VEGF结合不被容许(Bostrom等，2009)。尽管Tyr32的侧链指向HER2，其似乎不参与生产性抗原接触。Ile29远离HER2，其侧链暴露于溶剂并且Ile29和Tyr32突变为Ala对于HER2结合是被充分容许的。
表14.由丙氨酸扫描诱变确定的bH1，bH1-44，和赫赛汀热点关于HER2结合的比较
a与赫赛汀抗体不同的bH1/bH1-44残基。c表示bH1/VEGF或bH1/HER2复合物结构中的接触残基。(-)表示赫赛汀抗体在该位置处无残基。
表15.VEGF和HER2相互作用的热力学参数
SCONF＝STOT-SSOLV-SRT如由Murphy等，Proteins(蛋白)，1994所述。SRT关于单结合反应评估为-8cal/molK。SSOLV＝ΔS*+ΔCpln(T/Ts*)，其中T＝303.15，Ts*＝385.15且ΔS*～0。
表16.双特异性Fabs和赫赛汀抗体的融化温度(TM)
还检查关于bH1/HER2复合物中的HER2结合的独特重要残基的结构。Arg50和Arg58的侧链针对bH1-HER2结构中HER2上的酸性残基(Glu558和Asp560)包装(pack)(图64)。相互作用似乎是高度侧链特异性的，因为突变为Lys以及Ala是破坏性的(Bostrom等，2009)。然而，在VEGF结果中，Arg50和Arg58是溶剂暴露的且远离VEGF，且充分容许突变为Ala或Lys(Bostrom等，2009)。
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本说明书中引用或参考的全部专利、专利申请、专利申请出版物和其他出版物均通过参考引入本文中，如同各单独的全部专利、专利申请、专利申请出版物或出版物特别并单独通过参考引入时指示的相同范围。

Claims (26)

1.一种分离的抗体，其包含高变区(HVR)L1序列，该(HVR)L1序列由序列NIAKTISGY(SEQ ID NO:1)组成，其中所述抗体特异性结合人表皮生长因子受体2(HER2)和血管内皮生长因子(VEGF)，其中所述抗体还包含HVR-L2，其由序列WGSFLY(SEQ ID NO:2)组成；和HVR-L3，其由序列HYSSPP(SEQ ID NO:3)组成，
其中所述抗体还包含HVR-H1，其由序列NIKDTY(SEQ ID NO:4)组成；HVR-H2，其由序列RIYPTNGYTR(SEQ ID NO:5)组成；和HVR-H3，其由序列WGGDGFYAMD(SEQ ID NO:6)组成，
其中框架序列的至少一部分是人共有框架序列。
2.分离的抗体，其包含高变区(HVR)L1序列，该(HVR)L1序列由序列NIAKTISGY(SEQ ID NO:1)组成，其中所述抗体特异性结合人表皮生长因子受体2(HER2)和血管内皮生长因子(VEGF)，其中所述抗体还包含由序列WGSFLY(SEQ ID NO:2)组成的HVR-L2；和由序列HYSSPP(SEQ IDNO:3)组成的HVR-L3，
其中所述抗体还包含HVR-H1，其由序列NISGTY(SEQ ID NO:7)组成；HVR-H2，其由序列RIYPSEGYTR(SEQ ID NO:8)组成；和HVR-H3，其由序列WVGVGFYAMD(SEQ ID NO:9)组成，
其中框架序列的至少一部分是人共有框架序列。
3.权利要求1的抗体，其中所述抗体以150nM或更强的Kd结合人和鼠VEGF并且以7nM或更强的Kd结合HER2。
4.权利要求1的抗体，其中所述抗体抑制VEGF诱导的细胞增殖和HER2表达细胞的增殖，相对于对照而言。
5.权利要求1的抗体，其中所述抗体抑制VEGF对VEGF受体2(VEGFR2)的结合。
6.权利要求1-5中任意一项的抗体，其中所述抗体是单克隆抗体。
7.权利要求1-5中任意一项的抗体，其中所述抗体是IgG抗体。
8.权利要求1-5中任意一项的抗体的片段，其中所述片段特异性结合HER2和VEGF，其中所述抗体片段选自由Fab，Fab’，F(ab’)2，Fv，scFv和双价抗体组成的组。
9.权利要求8的片段，其中所述片段是Fab片段或单链可变片段(scFv)。
10.一种多核苷酸，其编码权利要求1-9中任意一项的抗体或抗体片段。
11.一种载体，其包含权利要求10的多核苷酸。
12.权利要求11的载体，其中该载体是表达载体。
13.一种宿主细胞，其包含权利要求11或12的载体。
14.权利要求13的宿主细胞，其中该宿主细胞是原核的。
15.权利要求13的宿主细胞，其中该宿主细胞是真核的。
16.权利要求15的宿主细胞，其中该宿主细胞是哺乳动物的。
17.一种产生权利要求1-9中任意一项的抗体或抗体片段的方法，所述方法包括培养包含载体的宿主细胞并回收所述的抗体，该载体包含权利要求10的多核苷酸。
18.权利要求17的方法，，其中该宿主细胞是原核的。
19.权利要求17的方法，其中该宿主细胞是真核的。
20.权利要求19的方法，其中该宿主细胞是哺乳动物的。
21.权利要求1-9中任意一项的抗体或抗体片段在制备用于治疗受试者中肿瘤的试剂盒中的应用，其中所述抗体或抗体片段用于向所述受试者施用，其中所述施用以足以治疗或预防所述受试者中所述肿瘤的时间和量施用，其中所述肿瘤是结肠直肠肿瘤、乳腺癌、胃癌、肺癌或卵巢癌。
22.权利要求21的应用，其中所述治疗还包括另外的抗癌治疗。
23.权利要求22的应用，其中所述另外的抗癌治疗包括另一种抗体或抗体片段、化疗剂、细胞毒性剂、抗血管生成剂、免疫抑制剂、药物前体、细胞因子、细胞因子拮抗剂、细胞毒性放射治疗、皮质类固醇、止吐药、癌症疫苗、止痛剂、或生长抑制剂。
24.权利要求22的应用，其中所述另外的抗癌治疗是在施用权利要求1-9中任意一项的抗体或抗体片段之前或之后施用。
25.权利要求22的应用，其中所述另外的抗癌治疗与权利要求1-9中任意一项的抗体或抗体片段同时施用。
26.权利要求21的应用，其中所述受试者是人。
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Lucy J.Holt et al..Domain antibodies:proteins for therapy.《TRENDS in Biotechnology》.2003,第21卷(第11期),第484-490页.
基因工程双特异性抗体构建模式研究进展;解志刚等;《军事医学科学院院刊》;20040830;第28卷(第4期);第375-378页 *
解志刚等.基因工程双特异性抗体构建模式研究进展.《军事医学科学院院刊》.2004,第28卷(第4期),第375-378页.

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