MXPA06001319A

MXPA06001319A - Anticuerpos anti-vegf.

Info

Publication number: MXPA06001319A
Application number: MXPA06001319A
Authority: MX
Inventors: Christian Wiesmann
Original assignee: Genentech Inc
Priority date: 2003-08-01
Filing date: 2004-07-30
Publication date: 2006-05-04
Also published as: JP5162644B2; US8092797B2; IL173317A; NZ575674A; SG145725A1; US7691977B2; NZ545135A; EA200600344A1; SG193170A1; US20070141065A1; CA2533297C; US20110020346A1; OA13225A; CA2932216A1; US8101177B2; KR101644717B1; AU2004262006A1; US20150232549A1; KR20110059806A; JP2011046732A

Abstract

Se describen anticuerpos anti-VEGF y variantes de los mismos, incluyendo aquellos que tienen una alta afinidad para el enlace a la VEGF. Tambien se proporcionan metodos para utilizar la tecnologia de despliegue de fago con librerias candidas para generar y seleccionar anticuerpos anti-VEGF con un enlace deseado y otras actividades biologicas. Ademas estan contemplados los usos de los anticuerpos sinteticos en la investigacion, diagnostico y aplicaciones terapeuticas.

Description

ANTICUERPOS ANTI-VEGF SOLICITUDES RELACIONADAS La presente solicitud reclama el beneficio de las Solicitudes Provisionales Norteamericanas Series Nos. 60/491,877, presentada el 1 de agosto de 2003; 60/516,495, presentada el 1 de noviembre de 2003; 60/570,912, presentada el 12 de marzo de 2004; 50/571,239, presentada el 13 de mayo de 2004; 60/576,315, presentada el 1o de junio de 2004; y 60/580,757, presentada el 18 de junio de 2004. Campo del Invento La presente invención se refiere de manera general a secuencias de polipéptidos seleccionados por anti-VEGF y anticuerpos con propiedades benéficas para propósitos de investigación, terapéuticos y de diagnóstico. Antecedentes del Invento Angiogénesis y VEGF. La angiogénesis es un evento celular importante en el cual las células endoteliales vasculares se proliferan, podan y reorganizan para formar nuevos vasos para la red vascular existente previamente. Existen evidencias de que el desarrollo del suministro vascular es esencial para procesos proliferativos normales y patológicos (Folkman and Klagsbrun (1987) Science 235:442-447). El suministro de oxígeno y nutrientes, así como la eliminación de productos catabólicos, representan pasos con rango limitado en la mayoría de los procesos de crecimiento que ocurren en organismos multicelulares. Por lo tanto, generalmente se ha asumido que es necesario el compartimento celular, a pesar de que no es suficiente, no únicamente para ei desarrollo del órgano y diferenciación durante la embriogénesis, sino también para curación de heridas y funciones reproductoras en adultos. La angiogénesis también está implicada en la patogénesis de una variedad de padecimientos, incluyendo pero sin limitarse a, retinopatías proliferativas, degeneración macular relacionada con la edad, tumores, artritis reumatoide (RA), y psoriasis. La angiogénesis es una cascada de procesos que consiste en: 1) degradación de la matriz extracelular de un punto de reunión local después de la liberación de proteasa, 2) proliferación de células endoteliales capilares, y 3) migración de túbulos capilares hacia el estímulo angiogénico. Ferrara y Asociados (1992) Endocrine Rev. 13:18-32. En virtud de la remarcable importancia fisiológica y patológica de la angiogénesis, se ha dedicado mucho trabajo a la explicación de factores con la capacidad de regular este proceso. Se sugiere que el proceso de angiogénesis esté regulado por un equilibrio entre moléculas pro y anti-angiogénicas, y es deriva en varias enfermedades, especialmente cáncer. Carmeliet and Jain (2000) Nature 407:249-257. El factor de crecimiento celular endotelial vascular (VEGF), un mitogén potente para células endoteliales vasculares, ha sido reportado como un regulador pivotal de angiogénesis tanto normal, como anormal. Ferrara and Davis-Smyth (1997) Endocrine Rev. 18:4-25; Ferrara (1999) J. Mol. Med. 77:527-543. En comparación con otros factores de crecimiento que contribuyen a los procesos de formación vascular, VEGF es único en su alta especificidad para células endoteliales dentro del sistema vascular. La evidencia reciente indica que VEGF es esencial para vasculogénesis y angiogénesis embriónica. Carmeliet y Asociados (1996) Nature 380:435-439; Ferrara y Asociados (1996) Nature 380:439-442. Además, se requiere VEGF para la proliferación cíclica de vasos sanguíneos en el tracto reproductor femenino y para crecimiento de huesos y formación de cartílagos. Ferrara y Asociados (1998) Nature Med. 4:336-340; Gerber y Asociados (1999) Nature Med. 5:623-628. Además de ser un factor angiogénico en angiogénesis y vasculogénesis, VEGF, como un factor de crecimiento pleiotrópico, exhibe múltiples efectos biológicos en otros procesos fisiológicos, tal como supervivencia de célula endotelial, permeabilidad del vaso y vasodilatación, quimiotaxis de monocitos e influjo de calcio. Ferrara and Davis-Smyth (1997), supra. Además, los estudios recientes han reportado efectos mitogénicos de VEGF en algunos tipos de célula no endotelial, tal como células epiteliales de pigmento retinal, células de ducto pancreático y células de Schwann. Guerrin y Asociados (1995) J. Cell Physiol. 164:385-394; Oberg-Welsh y Asociados (1997) Mol. Cell. Endocrinol. 126:125-132; Sondell y Asociados (1999) J. Neurosci. 19:5731-5740. La evidencia substancial también implica el papel importante de VEGF en el desarrollo de condiciones o enfermedades que comprenden angiogénesis patológica. El mARN de VEGF se sobreexpresa mediante la mayoría de los tumores humanos examinados (Berkman y Asociados, J. Clin. Invest. 91:153-159 (1993); Brown y Asociados, Human Pathol. 26:86-91 (1995); Brown y Asociados, Cáncer Res. 53:4727-4735 (1993); Mattern y Asociados, Brit. J. Cáncer, 73:931-934 (1996); y Dvorak y Asociados, Am. J. Pathol. 146:1029-1039 (1995)). Asimismo, la concentración de VEGF en fluidos de los ojos está altamente correlacionada con la presencia de la proliferación activa de vasos sanguíneos en pacientes con diabetes y otras retinopatías relacionadas con isquemia (Aiello y Asociados, N. Engl. J. Med. 331:1480-1487 (1994)). Además, los estudios recientes han demostrado la localización de VEGF en membranas neovasculares coroidales en pacientes afectados por AMD (López y Asociados, Invest. Ophtalmo. Vis. Sci. 37:855-868 (1996)). El reconocimiento de VEGF como un regulador primario de angiogénesis en condiciones patológicas, ha conducido a numerosos intentos de bloquear las actividades VEGF. Los anticuerpos receptores de anti-VEGF inhibidores, construcciones receptores solubles, estrategias anti-sentido, aptámeros de ARN contra VEGF e inhibidores de cinasa de tirosina de receptor (RTK) VEGF de bajo peso molecular, todos han sido propuestos para utilizarse en la interferencia con señalización VEGF (Siemeister y Asociados, Cáncer Metástasis Rev. 17:241-248 (1998). De hecho, los anticuerpos de neutralización anti-VEGF han mostrado suprimir el crecimiento de una variedad de líneas celulares de tumor humano en ratones rasurados (Kim y Asociados, Nature 362:841-844 (1993); Warren y Asociados, J. Clin. Invest. 95:1789-1797 (1995); Borgstróm y Asociados, Cáncer Res. 56:4032-4039 (1996); y Melnyk y Asociados, Cáncer Res. 56:921-924 (1996)), y también inhiben la angiogénesis intraocular en modelos de padecimientos retínales isquémicos (Adamis y Asociados, Aren. Ophthalmol. 114:66-71 (1996)). Por consiguiente, los anticuerpos monoclonales anti-VEGF u otros inhibidores de la acción VEGF, son candidatos prometedores para el tratamiento de tumores sólidos en varios padecimientos neovasculares intraoculares. Aunque la molécula VEGF se activa en células de tumor, y sus receptores se activan en células endoteliales vasculares infiltradas por tumor, la expresión de VEGF y sus receptores permanece baja en células normales que no están asociadas con angiogénesis. Anticuerpos Terapéuticos Los anticuerpos monoclonales pueden ser fabricados utilizando tecnología ADN recombinante. Se ha difundido mucho el uso de anticuerpos monoclonales, particularmente los que se derivan de roedores, sin embargo, los anticuerpos no humanos con frecuencia son antigénicos en humanos. La técnica ha intentado superar este problema construyendo anticuerpos "quiméricos", en donde se acopla un dominio de enlace de antígenos no humanos a un dominio constante de humano (Cabilly y Asociados, Patente Norteamericana No. 4,816,567). El isotipo del dominio constante de humano puede ser seleccionado para diseñar el anticuerpo quimérico para participación en una citotoxicidad celular dependiente el anticuerpo (ADCC) y citotoxicidad dependiente de complemento. En un esfuerzo adicional para resolver las funciones de enlace de antígenos de anticuerpo sin minimizar el uso de secuencias heterólogas en anticuerpos humanos, se han generado anticuerpos humanizados para varios antígenos en donde se ha substituido substancialmente menos de un dominio variable humano intacto en regiones a través de la secuencia correspondiente procedente de una especie no humana. Por ejemplo, los residuos de roedor (CDR) han sido substituidos por los segmentos correspondientes de un anticuerpo humano. En la práctica, los anticuerpos humanizados normalmente son anticuerpos humanos en donde se substituyen ciertos residuos de región de determinación de compíementariedad (CDR) y posiblemente algunos residuos de región de estructura (FR), por los residuos procedentes de sitios análogos en anticuerpos de roedores. Jones y Asociados, Nature 321:522-525 (1986); Riechmann y Asociados, Nature 332:323-327 (1988); Verhoeyen y Asociados, Science 239:1534-1536 (1988). Varios anticuerpos VEGF anti-humano humanizados han sido generados en forma exitosa, y han mostrado significativas actividades inhibidoras huVEGF tanto in vitro como in vivo. Pesta y Asociados (1997) Cáncer Research 57:4593-4599; Chen y Asociados (1999) J. Mol. Biol. 293:865-881. Un anticuerpo anti-VEGF humanizado específico, en anticuerpo Avastin R, se utiliza normalmente en varias pruebas clínicas para tratar varios tumores sólidos; y otra variante de alta afinidad del anticuerpo anti-VEGF humanizado normalmente se prueba en forma clínica para tratar neovascularización coroidal relacionada con degeneración macular por edad (AMD). Antes de administrar un anticuerpo terapéutico a un humano, generalmente se recomiendan estudios preclínicos en mamíferos no humanos, para evaluar la eficacia y/o toxicidad del anticuerpo. Idealmente, los anticuerpos sometidos a estos estudios tienen la capacidad de reconocer y reaccionar con alta potencia a un antígeno objetivo endógeno para el animal huésped, tal como un ratón o primate no humano. Despliegue de Fagos La tecnología de despliegue de fagos ha proporcionado una poderosa herramienta para generar y seleccionar proteínas novedosas que enlazan a un ligando, tal como un antígeno. Utilizando la técnica de despliegue de fagos, se pueden generar grandes bibliotecas de variantes de proteínas y clasificarse rápidamente para aquellas frecuencias que enlazan a un antígeno objetivo con alta afinidad. Los ácidos nucleicos que codifican los polipéptidos variantes, se fusionan a una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína de recubrimiento viral, tal como la proteína de gen III ó la proteína de gen VIII. Se han desarrollado sistemas de despliegue de fagos monovalentes, en donde la secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína o polipéptido se fusiona a una secuencia de ácido nucleico que codifica una parte de la proteína del gen III. (Bass, S., Proteins, 8:309 (1990); Lowman and Wells, Methods: A Companion to Methods in Enzymology, 3:205 (1991)). En un sistema de despliegue de fagos monovalente, la fusión de gen se expresa en bajos niveles y las proteínas de gen III tipo natural también se expresan de modo que se retenga su capacidad de infección de las partículas. Los métodos para generar bibliotecas de péptidos y clasificar dichas bibliotecas, han sido descritos en muchas patentes (por ejemplo, Patente Norteamericana No. 5,723,286, Patente Norteamericana No. 5,432,018, Patente Norteamericana No. 5,580,717, Patente Norteamericana No. 5,427,908, y Patente Norteamericana No. 5,498,530). La demostración de expresión de los péptidos en la superficie de fagos filamentosos y la expresión de fragmentos de anticuerpo funcional en el periplasma de E. coli, fue importante en el desarrollo de bibliotecas de despliegue de fagos de anticuerpo (Smith y Asociados, Science (1985), 228:1315; Skerra and Pluckthum, Science (1988), 240:1038). Las bibliotecas de anticuerpos o polipéptidos de enlace de antígeno se han preparado en una cantidad de formas, incluyendo alterar un solo gen insertando secuencias de ADN aleatorias o clonando una familia de genes relacionados. Los métodos para desplegar anticuerpos o fragmentos de enlace de antígenos utilizando despliegue de fagos, se ha descrito en las Patentes Norteamericanas Nos. 5,750,373; 5,733,743; 5,837,242; 5,969,108; 6,172,197; 5,580,717, y 5,658,727. Posteriormente la biblioteca se clasifica con respecto a la expresión de anticuerpos o proteínas de enlace de antígenos con características deseadas. La tecnología de despliegue de fagos tiene diversas ventajas con respecto a métodos recombinantes e hibridomas convencionales para preparar anticuerpos con las características deseadas. Esta tecnología permite el desarrollo de grandes bibliotecas de anticuerpos con diversas secuencias en menos tiempo y sin el uso de animales. La preparación de hibridomas o preparación de anticuerpos humanizados puede requerir fácilmente varios meses de preparación. Además, ya que no se requiere inmunización, las bibliotecas de anticuerpos de fagos pueden generarse para antígenos que son tóxicos o que tienen baja antigenicidad (Hogenboom, Immunotechniques (1988), 4:1-20). También se pueden utilizar bibliotecas de anticuerpos de fagos para generar e identificar anticuerpos terapéuticos novedosos. Las bibliotecas de despliegue de fagos se han utilizado para generar anticuerpos humanos procedentes de secuencias de línea germinal, humana no inmunizada, inmunizada, o repertorios Ig de célula B na'íve (Barbas & Burton, Trends Biotech. (1996), 14:230; Griffiths y Asociados, EMBO J. (1994), 13:3245; Vaughman y Asociados, Nat. Biotech. (1996), 14:309; Winter EP 0368 684 B1). Las bibliotecas de enlace de antígeno Na'íve o no inmunes han sido generadas utilizando una variedad de tejidos linfoidales. Algunas de estas bibliotecas están comercialmente disponibles, tales como las desarrolladas por Cambridge Antibody Technology and Morphosys (Vaughan y Asociados (1996) Nature Biotech. 14:309; Knappik y Asociados (1999) J. Mol. Biol. 296:57). Sin embargo, muchas de estas bibliotecas tienen diversidad limitada. La capacidad para identificar y aislar anticuerpos de alta afinidad a partir de una biblioteca de despliegue de fagos, es importante para aislar anticuerpos novedosos para uso terapéutico. El aislamiento de anticuerpos de alta afinidad a partir de una biblioteca depende del tamaño de la biblioteca, la eficiencia de producción en células bacterianas y la diversidad de la biblioteca. Ver por ejemplo la Publicación de Knappik y Asociados, J. Mol. Biol. (1999), 296:57. El tamaño de la biblioteca se disminuye a través de la ineficiencia de producción debido a un doblez inadecuado del anticuerpo o proteína de enlace de antígenos y la presencia de codones de detención. Se puede inhibir la expresión bacteriana si el dominio que enlaza al anticuerpo o antígeno no está doblado en forma adecuada. La expresión se puede mejorar mutando residuos en turnos en la superficie de la interfase variable/constante, o en residuos CDR seleccionados (Deng y Asociados, J. Biol. Chem. (1994), 269:9533, Ulrich y Asociados, PNAS (1995), 92:11907-1 911; Forsberg y Asociados, J. Biol. Chem. (1997), 272:12430). La secuencia de la región de estructura es un factor para proporcionar un doblez adecuado, cuando se producen bibliotecas de fagos de anticuerpos en células bacterianas. La generación de una diversa biblioteca de anticuerpos o proteínas de enlace de antígenos, también es importante para el aislamiento de anticuerpos de alta afinidad. Las bibliotecas con diversificación en CDRs limitados, han sido generados utilizando una variedad de métodos. Ver por ejemplo, la Publicación de Tomlinson, Nature Biotech. (2000), 18:989-994. Las regiones CDR3 son de interés en parte, debido a que con frecuencia se encuentran en la participación del enlace de antígenos. Las regiones CDR3 en la cadena pesada varían en gran parte en tamaño, secuencia y conformación estructural. También otros han generado diversidad aleatorizando regiones CDR de las cadenas variables pesadas y ligeras utilizando los 20 aminoácidos en cada posición. Se consideró que utilizando los 20 aminoácidos, se podría obtener como resultado una gran diversidad de secuencias de anticuerpos de variantes e incrementar la oportunidad de identificar anticuerpos novedosos (Barbas, PNAS 91:3809 (1994); Yelton, DE, J. Immunology, 155:1994 (1995); Jackson, J. R., J. Immunology, 154:3310 (1995) y Hawkins, RE, J. Mol. Biology, 226:889 (1992)). También han habido intentos para crear diversidad, restricción del grupo de substituciones de aminoácido en algunos CDRs para reflejar la distribución de aminoácidos en anticuerpos que ocurren en forma natural. Ver, Garrard & Henner, Gene (1993), 128:103; Knappik y Asociados, J. Mol. Biol. (1999), 296:57. Sin embargo, estos intentos han tenido un éxito variado y no han sido aplicados en una forma sistemática y cuantitativa. El crear diversidad en las regiones CDR y al mismo tiempo minimizar el número de cambios en aminoácidos ha sido un gran desafío. Sumario de la Invención La presente invención proporciona anticuerpos y secuencias de polipéptidos novedosos. La presente invención también proporciona anticuerpos con la capacidad de enlazar a VEGF de roedor y VEGF humano con valores Kd dentro de 10 dobleces de cada valor y tienen la capacidad de inhibir el enlace de VEGF a un receptor de VEGF. De acuerdo con una modalidad, el anticuerpo tiene la capacidad de enlazar ya sea a uno o ambos de muíante VEGF humano Gly88Ala (G88A) o Gly88Ser (G88S) con un valor Kd 10 veces mayor al valor Kd del VEGF humano no mutado. La presente invención proporciona anticuerpos que tienen la capacidad de enlazar a un VEGF humano y a un VEGF de ratón con valores Kd que son 10 nM o menos a una temperatura de 25°C y tienen la capacidad de inhibir el enlace de VEGF a un receptor VEGF. De acuerdo con otra modalidad los valores Kd son 2nM o menos. De acuerdo con otra modalidad, los valores Kd son 0.1 nM ó menos. De acuerdo con otra modalidad, un anticuerpo de la presente invención enlaza a VEGF con un Kd no mayor a aproximadamente 1 nM, o no más de aproximadamente 500 pM. La presente invención también proporciona anticuerpos que tienen la capacidad de enlazar a un VEGF humano y a * ya sea uno o varios mutantes G88A y G88S del VEGF humano con valores Kd que son dem10 nM o menos y que tienen la capacidad de inhibir el enlace de VEGF a un receptor VEGF. En otra modalidad, los anticuerpos se enlazan a un VEGF humano y ya sea a uno o ambos mutantes G88A y G88S de VEGF humano con valores Kd que son de 10 nM o menos. De acuerdo con otra modalidad, un anticuerpo de la presente invención tiene un en-rango (kon) de enlace a VEGF humano y/o ratón que es de 1.0 ó más (10 M"1S"1). De acuerdo con otra modalidad, el en-rango es de 5.0 ó más (10 " S"1). De acuerdo aún con otra modalidad, el en-rango es de 10.0 ó más (10 M'1S"1). De acuerdo con otra modalidad, los anticuerpos de la presente invención hacen menos del 80% de contacto con el área de superficie total (angstrom2) del G88 del VEGF humano. De acuerdo con otra modalidad, los anticuerpos de la presente invención hacen menos del 70% de contacto con el área de superficie total (angstrom2) de G88 del VEGF humano. De acuerdo con otra modalidad, los anticuerpos de la presente invención hacen menos del 60% de contacto con el área de superficie total (angstrom2) de G88 del VEGF humano. De acuerdo con otra modalidad, los anticuerpos de la presente invención hacen menos del 1% de contacto con el área de superficie total (angstrom2) de G88 del VEGF humano. Así como anticuerpos generalmente capaces de enlazar VEGF de ratón. El receptor VEGF que será inhibido de enlazar a VEGF, puede ser el receptor VEGF 1 (Flt-1), el receptor VEGF 2 (Flt-1), o ambos receptores. De acuerdo con una modalidad, un anticuerpo de la presente invención hace contacto con las 20 hélices del VEGF. De acuerdo con otra modalidad, un anticuerpo de la presente invención hace contacto con los 80 lazos de VEGF. De acuerdo aún con otra modalidad, un anticuerpo de la presente invención hace contacto con las 20 hélices y los 80 lazos del VEGF humano. De acuerdo con una modalidad, un anticuerpo de la presente invención tiene afinidad relativa para, o tiene la capacidad de contactar con cualesquiera de los residuos F17, M18, Q22, Y25, D63, L66, C104 y P106 de VEGF humano. De acuerdo con otra modalidad, un anticuerpo de la presente invención tiene afinidad relativa para, o tiene la capacidad de contactar con F17, M18, Q22, Y25, D63, L66, C104 y P106 de VEGF humano. De acuerdo con otra modalidad, un anticuerpo de la presente invención tiene afinidad relativa para, o tiene la capacidad de contactar con los residuos F17 e Y21 de VEGF humano. De acuerdo con otra modalidad, un anticuerpo de la presente invención tiene afinidad relativa para, o tiene la capacidad de contactar con los residuos Y25 de VEGF humano. De acuerdo con otra modalidad, un anticuerpo de la presente invención tiene afinidad relativa para, o tiene la capacidad de contactar con los residuos M18 y Q89 de VEGF humano. De acuerdo con otra modalidad, un anticuerpo de la presente invención tiene afinidad relativa para, o tiene la capacidad de contactar con los residuos 18, Y21 y Y25 de VEGF humano. De acuerdo con una modalidad preferida, un anticuerpo de la presente invención tiene una combinación de tres o más de cualesquiera de las modalidades antes mencionadas. En una modalidad adicional, un anticuerpo de la presente invención tiene un epítope funcional aquí descrito. De acuerdo con una modalidad, el epítope funcional de un anticuerpo de acuerdo con la presente invención, incluye el residuo F17 de VEGF humano. De acuerdo con otra modalidad, el epítope funcional de un anticuerpo de acuerdo con la presente invención incluye los residuos F17 e I83 de VEGF humano. De acuerdo con una modalidad adicional, el epítope funcional de un anticuerpo de acuerdo con la presente invención incluye los residuos F17, I83 y Q89 de VEGF humano. De acuerdo con una modalidad adicional, el epítope funcional de un anticuerpo de acuerdo con la presente invención incluye los residuos F17 y M18 de VEGF humano. En una modalidad adicional, el epítope funcional incluye los residuos F17, M18, e I89 de VEGF humano. De acuerdo con una modalidad adicional, el epítope funcional de un anticuerpo de acuerdo con la presente invención incluye los residuos F17, Y21 e Y25 de VEGF humano. De acuerdo con una modalidad adicional, el epítope funcional de un anticuerpo de acuerdo con la presente invención incluye los residuos F17, Y21, Q22, Y25, D63, e I83 de VEGF humano. De acuerdo con una modalidad adicional, el epítope funcional de un anticuerpo de acuerdo con la presente invención incluye los residuos F17, Y21, Y25, y Q89 de VEGF humano. De acuerdo con una modalidad adicional, el epítope funcional de un anticuerpo de acuerdo con la presente invención incluye los residuos F17, M18, D19, Y21, Y25, Q89, 191, K101, E103, y C104 de VEGF humano. De acuerdo con una modalidad adicional, el epítope funcional de un anticuerpo de acuerdo con la presente invención incluye los residuos F17, Y21, Q22, Y25, D63, 183 y Q89 de VEGF humano. Un epítope funcional de un anticuerpo de la presenste invención puede incluir una combinación de cualquiera de los residuos seleccionados a partir del grupo que consiste en F17, 18, Y21, Q22, Y25, K48, D63, L66, M81, I83, H86, Q89, 191, C104, y P106 de VEGF humano. De acuerdo con otra modalidad, el epítope funcional incluye los residuos F17, M18, Y21, Q22, Y25, K48, D63, L66, M81, I83, H86, Q89, 191, C104 y P106 de VEGF humano. De acuerdo con una modalidad, un anticuerpo de la presente invención comprende un CDR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos contigua XTX2FX4X5X6X7 (SEQ ID NO:915), en donde: X, es Y ó F; X2 es V ó A; X4 es F ó Y; X5 es L ó A; X6 es P ó A; y X7 es Y ó F. De acuerdo con otra modalidad, el anticuerpo comprende además un CDR-H2 que tiene una secuencia de aminoácidos contigua GX2TPX5G (SEQ ID NO:1 ), en donde: X2 es I ó V, u otro aminoácido hidrofóbico; y X5 es cualquier residuo de aminoácido. De acuerdo aún con otra modalidad, el anticuerpo aún comprende un CDR-H1 que tiene una secuencia de aminoácidos contigua X^aXszlH (SEQ ID NO:2), en donde: Xi es cualquier residuo de aminoácido; X2 es Y ó F; y X3 es W ó L. De acuerdo con una modalidad preferida, el anticuerpo comprende además el CDR-L1 , CDR-L2, y CDR-L3 de cualesquiera de los anticuerpos de la figura 7. De acuerdo con otra modalidad, el CDR-L1 se localiza aproximadamente en los residuos 28 a 33, el CDR-L2 se localiza aproximadamente en los residuos 50 a 55; y el CDR-L3 se localiza aproximadamente en los residuos 91 a 96. De acuerdo con otra modalidad, el CDR-H1 se localiza aproximadamente en los residuos 30 a 33, el CDR-H1 se localiza aproximadamente en los residuos 50 a 58; y el CDR-H1 se localiza aproximadamente en los residuos 90 a 100a. De acuerdo con una modalidad preferida, el anticuerpo comprende las regiones de estructura de anticuerpo G6, de anticuerpo G6-23 o el anticuerpo G6-31. De acuerdo con otra modalidad, el anticuerpo comprende los CDRs de cadena ligera o la región variable de cadena ligera del anticuerpo G6, el anticuerpo G6-23 o el anticuerpo G6-31. De acuerdo con una modalidad, un anticuerpo de la presente invención es un anticuerpo que comprende: a) un CDR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos contigua X1X2X3X4X5L (SEQ ID NO:916), en donde: X y X2 son cualquier aminoácido; ya sea X3 ó X4 o tanto X3 como X4 son R; X5 es S ó A; y b) CDR-L1 que comprende una secuencia de aminoácidos contigua X1X2 3 (SEQ ID NO:917), en donde: X2 y 3 son cualquier residuo de aminoácido; y (c) un CDR-L3 que comprende una secuencia de aminoácidos contigua SXTXZXSPL (SEQ ID NO:918), en donde: Xi y X2 son cualquier residuo de aminoácidos; y X3 es S ó A. De acuerdo con una modalidad preferida, el anticuerpo comprende las regiones de estructura del anticuerpo B20-4.1 o el anticuerpo B20-4. De acuerdo con otra modalidad, el anticuerpo comprende los CDRs ó la región variable de la región variable de cadena pesada B20. De acuerdo con otra modalidad, la ?t?2?3 (SEQ ID NO:917) del CDR-L2 se codifica mediante X1ASX4LX6 (SEQ ID NO:919), en donde X4 y X6 son cualquier aminoácido. De acuerdo con otra modalidad, el CDR-L1 se localiza en aproximadamente en los residuos 28 a 33, el CDR-L2 se localiza aproximadamente en los residuos 50 a 55; el CDR-L3 se localiza aproximadamente en los residuos 91 a 96. De acuerdo con otra modalidad, el CDR-H1 se localiza aproximadamente en los residuos 30 a 33, el CDR-H2 se localiza aproximadamente en los residuos 50 a 58; el CDR-L3 se localiza aproximadamente en los residuos 94 a 100a.

También se contempla un anticuerpo que comprende una secuencia CDR-H3 de cualesquiera de los anticuerpos de las figuras 7, 24 a 29 y 34 a 43 y comprende opcionalmente un CDR-H2 y/o un CDR-H1 del mismo anticuerpo de las figuras 7, 24 a 29 y 34 a 43. Asimismo, se contempla un anticuerpo seleccionado del grupo que consiste en anticuerpos de serie G6, un anticuerpo de serie B20, un anticuerpo de serie YADS y un anticuerpo de serie YS. Además, otro anticuerpo de la presente invención es un anticuerpo, que comprende una región variable de cualesquiera de los anticuerpos de las figuras 7, 24 a 29 y 34 a 43. De acuerdo con una modalidad preferida, los anticuerpos de la presente invención se sintetizan a través de métodos recombinantes en lugar de producirse directamente de un hibridoma o derivarse de una secuencia de anticuerpos de un hibridoma. En una modalidad preferida, el anticuerpo enlaza a hVEGF con un valor Kd no mayor a aproximadamente 2 nM, no mayor a aproximadamente 1 nM, o no mayor a aproximadamente 500 pM. De acuerdo con una modalidad, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal. De acuerdo con otra modalidad, el anticuerpo es un anticuerpo multiespecífico (por ejemplo, un anticuerpo biespecífico). En una modalidad adicional de la presente invención, el anticuerpo anti-hVEGF de alta afinidad también tiene la capacidad de enlazar a un VEGF procedente de una especie mamífera no humana con valores Kd comparables con, o al menos 10 veces mayo al valor Kd de su enlace a hVEGF. Dichos anticuerpos con altas afinidades de enlace con especies cruzadas son particularmente útiles para investigación preclínica, así como para aplicaciones de diagnóstico y terapéuticas. Algunos de los anticuerpos proyectados para uso terapéutico se generaron utilizando un antígeno humano objetivo, en la forma del inmunogén. El anticuerpo resultante puede ser "dependiente de la especie", es decir, al mismo tiempo que enlaza en forma específica a un antígeno humano, puede ser mucho menos efectivo en el enlace a un homólogo de dicho antígeno procedente de un mamífero no humano. Esto se descubrió en la presente invención como problemático, particularmente cuando el mamífero no humano es uno en el cual se llevarán a cabo estudios preclínicos del anticuerpo. Un ejemplo es el anticuerpo anti-VEGF, el anticuerpo AvastinMR utilizado para tratamiento de cánceres. Aunque el anticuerpo AvastinMR tuvo una fuerte afinidad de enlace con el VEGF humano (es decir, Kd 1.8 nM), la afinidad del VEGF de murido no fue adecuada para llevar a cabo experimentos en modelos de ratón. En un aspecto, los anticuerpos son anticuerpos sintéticos que comprenden al menos un CDR variante en sus dominios variables, en donde el CDR variante comprende aminoácidos variantes en al menos un solvente accesible y una posición de aminoácidos altamente diversa, en donde el aminoácido variante está codificado por un grupo de codón no aleatorio, y en donde al menos el 70% de los aminoácidos codificados por el grupo no aleatorio, son aminoácidos objetivo para dicha posición en dominios variables de anticuerpos conocidos. El anticuerpo puede tener un dominio variable de cadena pesada que comprende al menos 1, 2, ó 3 CDRs variantes seleccionados del grupo que consiste en CDR H1, H2, y H3. Preferentemente, el dominio variable de cadena pesada comprende un CDR H3 variante. El anticuerpo también puede tener un dominio variable de cadena ligera que comprende al menos 1, 2, ó 3 CDRs variantes seleccionados del grupo que consiste en CDR L1, L2, y L3. De acuerdo con otra modalidad, un anticuerpo de la presente invención enlaza a VEGF humano y un VEGF de roedor con una afinidad deseada, pero no enlaza a cualesquiera o todos de los homólogos relacionados con VEGF seleccionados del grupo que consiste en VEGF-B humano, VEGF-D, y PIGF-2. De acuerdo con una modalidad preferida, un anticuerpo de la presente invención tiene una combinación de tres o más de cualesquiera de las modalidades antes mencionadas. De acuerdo con otra modalidad, un anticuerpo Fab de la presente invención se conjuga con un agente que incrementará la vida promedio del anticuerpo Fab. De acuerdo con una modalidad preferida, el agente es un polipéptido que comprende la secuencia DICLPRWGCLW. En una modalidad preferida, los anticuerpos de la presente invención no enlazan a PIGF, VEGF-D, ó VEGF-B. La presente invención también proporciona un método para seleccionar un anticuerpo hVEGF de una biblioteca de anticuerpos sintéticos, en donde el método comprende: a) generar la biblioteca de anticuerpos sintéticos que tienen una diversidad designada en al menos uno de los CDRs; b) contactar la biblioteca con hVEGF para formar enlazadores; c) separar los enlazadores de los no enlazadores, y eluir los enlazadores del hVEGF objetivo e incubar los enlazadores en una solución con cantidades en disminución del hVEGF objetivo en una concentración de desde 0.1 n hasta 1000 nM; y c) seleccionar los enlazadores que pueden enlazar con la concentración más baja del VEGF objetivo y que tienen una afinidad de aproximadamente 500 pM a 2 nM. También se contemplan variantes de anticuerpos sintéticos con afinidades de enlace mejoradas a hVEGF ó a VEGF de especies no humanas, o ambos. En la presente invención se contemplan varias formas del anticuerpo y variantes. Por ejemplo, el muíante de anticuerpo puede ser un anticuerpo de longitud total (por ejemplo, teniendo una región constante de inmunoglobulina humana) o un fragmento de anticuerpo (por ejemplo, Fab ó F(ab')2). Además, el muíante de anticuerpo puede estar etiquetado con una etiqueta detectable, inmovilizado en una fase sólida y/o conjugado con un compuesto heterólogo (íal como un ageníe ciíofóxico). También se coníemplan los usos de diagnóstico y terapéuticos para el anticuerpo. En una aplicación de diagnóstico, la presente invención proporciona un método para determinar la presencia de una proteína de interés que comprende exponer una muestra de la que se sospecha contiene la proteína para el mutante de anticuerpo y determinar el enlace del mutante de anticuerpo a la muestra. Para este uso, la presente invención proporciona un equipo que comprende el mutante de anticuerpo e instrucciones para utilizar el mutante de anticuerpo para detectar la proteína. La presente invención comprende además: ácido nucleico aislado que codifica el anticuerpo; un vector que comprende el ácido nucleico, opcionalmente, enlazado en forma operable para controlar las secuencias reconocidas por una célula huésped transformada con el vector; una célula huésped transformada con el vector; un proceso para producir anticuerpo que comprende cultivar esta célula huésped de modo que se exprese el ácido nucleico, y opcionalmente, recuperar el mutante de anticuerpo del cultivo de la célula huésped (por ejemplo, del medio de cultivo de célula huésped). La presente invención también proporciona una composición que comprende el anticuerpo y un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable. Esta composición para uso terapéutico es estéril y puede ser liofilizada.

También se contempla el uso de un anticuerpo o polipéptido de la presente invención, en la fabricación de un medicamento para tratar una indicación aquí descrita. La composición puede comprender además un segundo agente terapéutico tal como un agente quimioterapéutico, un agente citotóxico o un agente anti-angiogénico . La presente invención proporciona además un método para tratar un mamífero, en donde el método comprende administrar al animal una cantidad efectiva del anticuerpo. El mamífero que será tratado con el método, puede ser un mamífero no humano, por ejemplo, un primate adecuado para reunir datos preclínicos o un roedor (por ejemplo un ratón, conejo o rata). El mamífero no humano puede ser saludable (por ejemplo, en estudios toxicológ icos) o puede padecer de una enfermedad que será tratada con el anticuerpo de interés. En una modalidad, el mamífero padece de, o está en riesgo de desarrollar angiogénesis anormal (por ejemplo, angiogénesis patológica). En una modalidad específica, el padecimiento es un cáncer seleccionado del grupo que consiste en cáncer colorrectal, carcinoma de célula renal, cáncer de ovario, cáncer de pulmón, cáncer de pulmón de célula no pequeña (NSCLC), carcinoma broncoalveolar y cáncer pancreático. En otra modalidad, el padecimiento es una enfermedad originada por una neovascularización ocular, por ejemplo, ceguera diabética, retinopatías, retinopatía principalmente diabética, degeneración macular inducida por la edad y rubeosis. En otra modalidad, el mamífero que será tratado padece o está en riesgo de desarrollar un edema (por ejemplo, edema asociado con tumores de cerebro, edema asociado con ataque o edema cerebral). En otra modalidad, el mamífero padece de o está en riesgo de desarrollar un padecimiento o enfermedad seleccionada del grupo que consiste en artritis reumatoide, enfermedad de intestino inflamatorio, ascitos refractarios, psoriasis, sarcoidosis, arterieesclerosis arterial, sepsis, quemaduras y pancreatitis. De acuerdo con otra modalidad, el mamífero padece de o está en riesgo de desarrollar una enfermedad genitourinaria seleccionada del grupo que consiste en enfermedad de ovario poliquístico (POD), endometriosis y fibroides uterinos. La cantidad de anticuerpo administrado será una cantidad terapéuticamente efectiva para tratar el padecimiento. En estudios de aumento de dosis, se pueden administrar al mamífero una variedad de dosis del anticuerpo. En otra modalidad, se administra una cantidad terapéuticamente efectiva del anticuerpo a un paciente humano para tratar un padecimiento en el paciente. En una modalidad preferida, los anticuerpos de la presente invención útiles para tratar enfermedades inflamatorias o inmunes aquí descritas (por ejemplo, artritis reumatoide) son anticuerpos Fab ó scFv, especialmente anticuerpos Fab ó scFv derivados de series G6 de anticuerpos o la serie B20 de anticuerpos. Los anticuerpos que no originan agregación de VEGF y no se agregan así mismo, tal como la serie B20 de los anticuerpos IgG son particularmente útiles para tratar enfermedades inflamatorias e inmunes. Por consiguiente, dichos anticuerpos pueden utilizarse en la fabricación de un medicamento para tratar una enfermedad inflamatoria o inmune. Un mamífero que padece de, o está en riesgo de desarrollar un padecimiento o enfermedad aquí descrita puede tratarse, administrando un segundo agente terapéutico, en forma simultánea, en secuencias o en combinación con un anticuerpo de la presente invención. Deberá quedar entendido que se pueden administrar al mamífero otros agentes terapéuticos, además del segundo agente terapéutico, o utilizarse en la fabricación de un medicamento para las indicaciones deseadas. Estos anticuerpos y polipéptidos pueden utilizarse para comprender el papel de la colaboración de la célula estromal huésped en el crecimiento de tumores no huésped implantados, tales como en modelos de ratón en donde se han implantado tumores humanos. Estos anticuerpos y polipéptidos pueden utilizarse en métodos para identificar tumores humanos que pueden escapar al tratamiento anti-VEGF, observando o monitoreando el crecimiento del tumor implantado en el roedor o conejo después del tratamiento con anticuerpos anti-VEGF de la presente invención. Los anticuerpos y polipéptidos de la presente invención, también pueden ser utilizados para estudiar y evaluar terapias de combinación con anticuerpos anti-VEGF de la presente invención y otros agentes terapéuticos. Los anticuerpos y polipéptidos de la presente invención, se pueden utilizar para estudiar el papel de VEGF en otras enfermedades administrando los anticuerpos o polipéptidos a un animal que padece de la enfermedad, de una enfermedad similar y determinar si se pueden aliviar uno o más síntomas de la enfermedad. Breve Descripción de los Dibujos La figura 1, es una ilustración esquemática de varios tipos de fragmentos de anticuerpos útiles para el despliegue de fagos. La figura 2, compara los cambios residuales dentro de los CDRs de cadena pesada de la plantilla del anticuerpo h4D5 y cuatro anticuerpos sintéticos novedosos seleccionados (SEQ ID NO:921-928). También se comparan enlaces VEGF de los cuatro anticuerpos. La figura 3, ilustra las capacidades de receptores VEGF (Flt-d2 y KDR) para bloquear los enlaces VEGF de los anticuerpos anti-VEGF novedosos. Y0959A, un variante anti-VEGF, se utilizó como control.

La figura 4, muestra que el anticuerpo G6 se enlaza en forma específica tanto a hVEGF como mVEGF, pero no a antígenos relacionados con VEGF. La figura 5, muestra que G6 puede bloquear en forma efectiva tanto hVEGF como mVEGF enlazando al receptor KDR. Se utilizó Fab-12 e Y0317 como controles. La figura 6, muestra los efectos de G6 en proliferación HUVEC inducida por VEGF. La figura 7, ilustra los pasos para generar anticuerpos anti-VEGF de alta afinidad y la lista de residuos de afinidades de enlace relacionadas con diversas variantes G6 con afinidad mejorada (SEQ ID NO:44-84). La figura 8, compara los enlaces VEGF de G6, G6-23 y Fab-12. Los rangos de asociación (en rango) tanto para hVEGF como mVEGF se midieron con el tiempo; se describen el Kon, off y Kd calculados. La figura 9, compara el enlace VEGF en rangos de G6 y variantes mejorados en forma adicional de G6-23. La figura 10, ilustra los efectos de antagonistas VEGF (G6-23 y Flt1-3Fc) en pesos corporales de ratones neonatos y rangos de supervivencia. La figura 11, ilustra los efectos de G6-23 en el crecimiento de tumores en ratones rasurados con células de tumor de humano xenoinjertados (células KM12 y células SW480), tal como se mide mediante volúmenes de tumor durante el número de días de tratamiento. La figura 12, muestra expresiones VEGF (tanto hVEGF como mVEGF) en ratones con xenoinjerto KM12 en la presencia o ausencia de G6-23. La figura 13, ilustra los efectos de antagonistas VEGF (G6-23 y Flt-1-3Fc) en crecimiento de tumor en ratones rasurados con tumor de ratón xenoinjertado (LL2), tal como se mide a través de volúmenes de tumor durante el número de días de tratamiento. Las figuras 14A y 14B, describen codones designados para perdigonada de codones de exploración de G6 y G6-23. Para cada exploración, se diseñaron codones de perdigonada de degeneración para cadena pesada (A) y cadena ligera (B,) para codificar el aminoácido y alanina tipo natural (m1) en exploración de alanina o un aminoácido similar (m4) en exploración homologa tanto para G6 como G6-23 Fab. Los codones de perdigonada son representados por el código IUB (K = G/T, M = A/C, R = A/G, S = G/C, V=A/C/G, W = A/T, Y=C/T). En algunos residuos ocurren más substituciones (m2, m3, y m5), debido a la naturaleza del código genético. En el caso de alanina tipo natural, se diseñó el codón de perdigonada para codificar alanina y glicina. Cada residuo en los CDRs está denotado por el código de una sola letra del aminoácido, seguido de un número que denota su posición de acuerdo con el esquema de Kabat y Asociados, 1987. En posiciones en donde difieren las secuencias de G6 y G6-23, se mostraron en dos letras, por ejemplo, Q89 denota la posición 89 la cual es GIn ó Lys en G6 ó G6-23, respectivamente. Los asteriscos (*) indican codones de exploración tanto de alanina como homologas que codifican una substitución común. La figura 15, proporciona información con respecto a la construcción de bibliotecas de exploración de perdigonada G6 y G6-23. Las bibliotecas de exploración de perdigonada se llevaron a cabo para mutar codones para los residuos indicados en la cadena pesada (he) o ligera (le) de G6 y G6-23, ya sea con codones de perdigonada de exploración de alanina-homóloga (figuras 14A y B). En total, se construyeron ocho bibliotecas utilizando los oligonucleótidos mutagénicos tal como se muestra en el ejemplo 1. La diversidad teórica de cada biblioteca, número total de combinaciones de aminoácidos codificado por los oligonucleótidos mutagénicos, tuvo un excedente de al menos 100 veces a través de la diversidad real de la biblioteca construida. Las figuras 16A y 16B, describen los resultados de exploraciones de perdigonada de cadena pesada G6 y G6-23. El efecto de cada mutación (figura 14A y B) en los residuos CDR de cadena pesada de (A) G6 y (B) G6-23 se evaluaron calculando las proporciones de wt/mut de secuencias de clones funcionales, ya sea de las bibliotecas de exploración de alanina (m1, m2, y m3) o las bibliotecas de exploración homologa (m4 y m5), aisladas después de la selección de enlace ya sea a hVEGF) selección objetivo o un anticuerpo marcado anti-gD (selección de despliegue). Para proporcionar un estimado cuantitativo del efecto de cada mutación en la afinidad de enlace de G6 y G6-23 para hVEGF, la proporción de función (Fwt/mut) en cada sitio de mutación, se derivó de dividir la proporción wt/mut procedente de la selección objetivo entre la de la selección de despliegue. Se indican efectos perjudiciales a través de valores Fwt/mut mayores a 1.0, y las mutaciones que dan como resultado efectos significativamente perjudiciales (Fwt/mut>10) se muestran con letras negritas. No se observaron diversas mutaciones entre la selección objetivo y únicamente se puede definir un límite inferior para su proporción wt/mut; por consiguiente, el valor Fwt/mut se indicó como un signo más grande. Las figuras 17A y B, describen los resultados de la exploración de perdigonada de cadena ligera G6 y G6-23. El efecto de cada mutación (figura 14A y B) en los residuos CDR de cadena pesada de (A) G6 y (B) G6-23 se evaluaron calculando las proporciones de wt/mut de secuencias de clones funcionales, ya sea de las bibliotecas de exploración de alanina (m1, m2, y m3) o las bibliotecas de exploración homóloga ( m4 y m5), aisladas después de la selección de enlace ya sea a hVEGF (selección objetivo) o a un anticuerpo marcado anti-gD (selección de despliegue). Para proporcionar un estimado cuantitativo del efecto de cada mutación en la afinidad de enlace de G6 y G6-23 para hVEGF, la proporción de función (Fwt/mut) en cada sitio de mutación, se derivó de dividir la proporción wt/mut procedente de la selección objetivo entre la de la selección de despliegue. Se indican efectos perjudiciales a través de valores Fwt/mut mayores a 1.0, y mutaciones que dan como resultado efectos significativamente perjudiciales (Fwt/mut>10) se muestran con letras negritas. La figura 18, es una comparación de las actividades de enlace relativas de los mutantes de punto FabG6 y G6-23 para hVEGF con valores de función (Fwt/mut) procedentes de la exploración de perdigonada. Las actividades de enlace relativas de cada proteína muíante para hVEGF, se evaluaron con IC50, mut/IC50, proporción wt, una medida de la reducción en dobleces en la actividad de la hVEGF debido a cada mutación de punto. El IC50, valores wt de G6 y G6-23 son 2.5 nM y 20 pM, respectivamente. La proporción sin mostrar el error estándar se estimó de modo que el error promedio es de +1-5%. Las proporciones de mutaciones significativamente perjudiciales no pueden ser cuantif icadas en forma precisa debido a que no se observó inhibición en la concentración más alta de hVEGF (1 µ? y 0.1 µ? para G6 y G6-23, respectivamente) utilizado en el ensayo y se muestra únicamente como un límite inferior (>400 y >5000 para mutantes G6 y G6-23, respectivamente) para reducción en dobleces en el enlace VEGF. Los valores de función (Fwt/mut) de la exploración de perdigonada fueron de las figuras 16 y 17. Los valores DDGmut-wt para explorar ambas mutagénesis, se calcularon utilizando la ecuación tal como se indica en la leyenda de las figuras 22A y 22B. La figura 19, describe las afinidades de enlace relativas tal como se miden a través de ensayos ELISA de fago para muíante de alanina simple hVEGF - 09 derivado de fago para enlazar a diferentes versiones de los anticuerpos anti-hVEGF o los receptores h VEGF (G6, G6-23, y B20-4 Fabs, anticuerpo monoclonal A4.6.1 y receptores Flt-1 (1-3), F It- 1 D2 y KDR-lg, respectivamente). Los efectos de los mutantes de alanina simples derivados de fago de hVEGF en la afinidad de enlace del anticuerpo anti-hVEGF y el receptor hVEGF se evaluaron como los valores IC50 relativos, los cuales se calcularon como IC50, Ala/ID50,wt a partir de ensayos ELISA. Un número mayor a 1.0, indica reducción en la afinidad de enlace y cualquier variante con valores IC50 relativos significativos mayores a 10 fueron señalados con letras negritas. Los valores IC0,wt de G6 y G6-23 fueron 2.5 nM y 20 pM, respectivamente. La proporción sin mostrar el error estándar se estimó de modo que el error promedio es de +/-5%. Los ensayos ELISA de fago requirieron enlace substancial del fagémido mutante a su proteína objetivo para generar una señal medible, los no enlazadores (NB) podrían no ser cuantificados en forma precisa sino ser interpretados por tener una afinidad de enlace reducida en gran medida (mayor a un valor IC50 de 1000). El asterisco (*) indica los datos de exploración de alanina en hVEGF para Fab-12 y receptores hVEGF fueron de la Publicación de Muller y Asociados, (1997) PNAS EUA 94:7192-7197 y Li y Asociados, (2000) Cáncer Res. 57:4593-4599. Las figuras 20A y 20B describen resultados de la exploración de perdigonada de cadena pesada FabG6 y G6-23. Los valores Fwt/mut midieron los efectos de alanina CDRs de cadena pesada FabG6 y G6-23 (barras negras) o substituciones homologas (barras blancas) en la afinidad de enlace para hVEGF. Los datos de exploración de perdigonada para (A) cadena pesada de FabG6 fueron a partir de la figura 16A, y para (B) cadena pesada FabG6-23 fueron para la figura 16B. Las figuras 21A y 21B describen los resultados de la exploración de perdigonada de cadena ligera FabG6 y G6-23. Los valores Fwt/mut midieron los efectos de alanina CDRs de cadena ligera FabG6 y G6-23 (barras negras) o substituciones homologas (barras blancas) en la afinidad de enlace de hVEGF. Los datos de exploración de perdigonada de (A) la cadena ligera FabG6 fueron a partir de la figura 17A y para (B) la cadena ligera FabG6-23 fueron para la figura 17B. Las figuras 22A y 22B reportan los valores DDGAIa-wt para la exploración de perdigonada de FabG6 y G6-23. Los valores DDGAIa-wt que miden los efectos de (A) substituciones de alanina CDRs de FabG6 y (B) FabG6-23 en la afinidad de enlace para hVEGF se calcularon utilizando la ecuación biofísica ecuación biofísica (DDGAIa-wt=RTIn(Ka,wt/Ka,Ala) = RT1 n(Fwt/Ala) tal como se describió previamente (Weiss y asociados., (2000) PNAS EUA 97:8950-8954) y los valores Fwt/Ala fueron a partir de las figuras 16 y 17. La figura 23 describe los resultados de sensogramas para la inyección de 100n de Fab a una temperatura de 25°C sobre hVEGF inmovilizado en un chip BIAcore. Se demostró la mejoría en-rango para la variante G6 con la sustitución de alanina en la posición 58 de CDR-H2. La mejoría adicional en-rango también se puede observar para esta variante con la sustitución de valina en la posición 51 de CDR-H2. Esta figura fue generada utilizando el software versión GraphPad Prism 4.0 (http://www.graph ad.com).

La figura 24, muestra las secuencias de aminoácido de la cadena ligera Fab G6 y la cadena pesada Fab G6, respectivamente (SEQ ID NO. 28-29). Los subrayados indican residuos en el CDR1-LC, CDR2-LC y CDR3-LC ó CDR1-HC, CDR2-HC ó CDR3-HC de acuerdo con el sistema de numeración de Kabat. La figura 25, muestra la secuencia de aminoácidos de la cadena ligera Fab G6-23 y de la cadena pesada Fab G6-23, así como las secuencias de aminoácidos de las cadenas ligeras Fab G6-31 y Fab G6-8 (SEQ ID NO. 30-33). Los subrayados indican la posición de los CDRs de acuerdo con el sistema de numeración de Kabat. La figura 26, muestra la secuencia de aminoácidos de las cadenas ligeras y pesadas de Fab G6-23.1 y G6-23.2 (SEQ ID NO. 34-36). Los subrayados indican la posición de los CDRs de acuerdo con el sistema de numeración de Kabat. La figura 27, muestra la secuencia de aminoácidos de las cadenas ligeras y pesadas Fab B20 (SEQ ID NO. 37-38). Los subrayados indican la posición de los CDRs de acuerdo con el sistema de numeración de Kabat. La figura 28, muestra un resumen de los enlazadores de alta afinidad de VEGF derivados de la biblioteca a base de B20 (SEQ ID NO. 85-140). La figura 29, muestra la secuencia de aminoácidos de las cadenas ligeras y pesadas Fab B20-4 y B20-4.1 (SEQ ID NO. 39-41). La figura 30, muestra la mejoría de afinidad del G6 de Fab anti-mVEGF a través de aleatorización de cadena ligera. (A) los sensogramas para la inyección de 500nM de Fab a una temperatura de 37°C sobre el chip BIAcore inmovilizado con mVEGF, demuestra las mejorías en fuera-de rango y en-rango; (B) el rango observado (Kobs, s"1) de la formación de complejos entre G6 y los Fabs y mVEGF variantes, ya que el rango de la disminución de intensidad de fluorescencia se trazó contra las concentraciones de mVEGF (nM) utilizadas y la pendiente basada en el análisis de pseudo-primer orden fue el en-rango (x 109 M"1 s"1). La figura 31, muestra que G6 puede bloquear en forma efectiva el enlace tanto de hVEGF como mVEGF al receptor Flt-1. Se utilizaron como controles Fab- 2 y Y0317. La figura 32, muestra los valores en-rangos, fuera-rangos, Kd y los valores IC50 del VEGF de proteína-humana de Fab o las interacciones de VEGF de proteína-ratón Fab a una temperatura de 25°C y 37°C utilizando los métodos de resonancia de plasmon de superficie (SPR) con BIAcore o ensayos de enlace de solución con ELISA de competición o extinción de fluorescencia con Fab-12 y Y0317 como comparación "NB" indica no enlazador, "ND" indica no determinado.

Las figuras 33A a 33E, muestran la inhibición del crecimiento de tumor HM7 en ratones desprotegidos después de la administración del anticuerpo G6, el anticuerpo G6-31, el anticuerpo Y0317 y el anticuerpo Avastin™ en (A) dosis de 0.1 mg/kg dos veces a la semana, (B) dosis de 0.25 mg/kg dos veces a la semana; (C) dosis de 0.5 mg/kg dos veces a la semana; (D) dosis de 2 mg/kg dos veces a la semana y (E) dosis de 5 mg/kg dos veces a la semana. Se utilizó como control un anticuerpo anti-hierba de margarita. La figura 34. muestra un resumen de diversas variantes G6 (A) cadena ligera y (B) cadena pesada con base en la secuencia y los análisis IC50 (SEQ ID NOS 361-488). El IC50 tipo natural refleja el valor obtenido en los diferentes experimentos. Las posiciones de aminoácidos variadas se muestran con letras negritas. Los residuos que difieren de G6 tipo natural se señalan de manera especial. Los residuos se hacen notar a través del código de aminoácido de una sola letra y un número que denote su posición de acuerdo con el esquema de Kabat y asociados, 1987. La figura 35, muestra un resumen de diversas variantes G6-23 (A) cadena ligera y (B) cadena pesada con base en la secuencia y análisis IC50 (SEQ ID NO. 141-272). El IC50 tipo natural refleja el promedio de los valores obtenidos en los diferentes experimentos. Las posiciones de aminoácidos variados se muestran con letras negritas. Los residuos que difieren del G6 tipo natural se señalan de manera especial. Los residuos se hacen notar a través del código de aminoácidos de una sola letra y un número que denota su posición de acuerdo con el esquema de Kabat y asociados, 1987. La figura 36, muestra partes de las secuencias de aminoácidos de anticuerpos YADS-1, YADS-2 y YADS-3 y otros clones (SEQ ID NO. 489-560). Se representan secuencias de tres enlazadores hVEGF seleccionados de la biblioteca YADS-II. Los residuos que no fueron aleatorizados en la biblioteca, se sombrean en color gris. La figura 37, muestra las secuencias de aminoácidos de un grupo de anticuerpos serie YADS (SEQ ID NO. 273-332). Se representan secuencias de clones únicos obtenidos de la clasificación de la biblioteca YADS-A contra hVEGF. Los residuos que no fueron aleatorizados en la biblioteca se sombrean con color gris. La figura 38, muestran secuencias de aminoácidos de un grupo de anticuerpos serie YADS (SEQ ID NO. 333-360). Se representan secuencias de clones únicos obtenidos de la clasificación de la biblioteca YADS-B contra hVEGF. Los residuos que no fueron clasificados en la biblioteca se sombrean con color gris.

La figura 39, muestra las secuencias Fab de anticuerpos YADS2 y YADS3 (SEQ ID NO. 19-24). Las partes con letras negritas indican residuos de región variable. Las partes subrayadas indican residuos aproximados de CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3, CDR-H1, CDR-H2 ó CDR-H3. La figura 40, muestra variantes NNK del anticuerpo YADS2 (SEQ ID NO. 723-794). "x" indica un codón de detención o una secuencia no legible. La figura 41, muestra secuencias de aminoácidos de un grupo de anticuerpos serie YS (SEQ ID NO. 795-914). Las secuencias de enlazadores obtenidos de la selección de la biblioteca YS-A y YS-B. La figura 42, muestra secuencias CDR de anticuerpos anti-VEGF de las bibliotecas YS (SEQ ID NO. 561-722). Los clones 1 a 52 fueron seleccionados de la biblioteca B, en tanto que los clones 53 a 63 fueron seleccionados de la biblioteca A. De izquierda a derecha, las columnas 1 a 5 de CDR-L3 se refieren a posiciones 91, 92, 93, 94 y 96, respectivamente; las columnas 1 a 5 de CDR-H1 se refieren a las posiciones 28, 30, 31, 32 y 33; las columnas 1 a 6 de CDR-H2 se refieren a las posiciones 50, 52, 53, 54, 56 y 58; y las columnas 1 a 15 de CDR-H3 se refieren a las posiciones 95, 96, 97, 98, 99, 100 y 100a-i de acuerdo con la numeración de Kabat.

La figura 43, muestra una secuencia del Fab YS1. Las posiciones con letras negritas indican residuos en la región variable (SEQ ID NO. 42-43). Descripción Detallada del Invento I. Definiciones El término "anticuerpo" se utiliza en el sentido más amplio y cubre de manera específica anticuerpos monoclonales (incluyendo anticuerpos monoclonales de longitud total), anticuerpos policlonales, anticuerpos multiespecíficos (por ejemplo, anticuerpos biespecíf icos), y fragmentos de anticuerpos, siempre que exhiban la actividad biológica deseada. Una "polipéptidos serie G6" de acuerdo con la presente invención, es un polipéptido incluyendo un anticuerpo de acuerdo con la presente invención, que se deriva de una secuencia de un anticuerpo G6 o un anticuerpo derivado de G6 de acuerdo con cualesquiera de las figuras 7, 24-26 y 34 y 35 y enlaza a VEGF humano con una afinidad deseada de acuerdo con la presente invención (por ejemplo, 10nm o menos, 2nM o* menos, 1 nM o menos, 0.1nM o menos, 500pM o menos para la versión Fab del anticuerpo a una temperatura de 25°C). Un "polipéptido serie B20" de acuerdo con la presente invención, es un polipéptido incluyendo un anticuerpo de acuerdo con la presente invención, que se deriva de una secuencia del anticuerpo B20 o un anticuerpo derivado de B20 de acuerdo con cualesquiera de las figuras 27 a 29 y enlaza a VEGF con una afinidad deseada de acuerdo con la presente invención. Un "polipéptido serie YADS" o "polipéptido YADS" de acuerdo con la presente invención es un polipéptido incluyendo un anticuerpo de acuerdo con la presente invención, que se deriva de una secuencia del anticuerpo YADS de acuerdo con las figuras de la 36 a la 40 y enlaza a VEGF con una afinidad deseada de acuerdo con la presente invención. Un "polipéptido serie YADS-2" o "polipéptido YADS2" de acuerdo con la presente invención, es un polipéptido incluyendo un anticuerpo de acuerdo con la presente invención, que se deriva de una secuencia del anticuerpo YADS2 de acuerdo con la figura 36 o la figura 39 y que enlaza a VEGF con una afinidad deseada de acuerdo con la presente invención. Un "polipéptido serie YADS-3" o "polipéptido YADS3" de acuerdo con la presente invención, es un polipéptido incluyendo un anticuerpo de acuerdo con la presente invención, que se deriva de una secuencia del anticuerpo YADS3 de acuerdo con la figura 36 y la figura 39 y que enlaza a VEGF con una afinidad deseada de acuerdo con la presente invención. Un "polipéptido serie YS" o "polipéptido YS" de acuerdo con la presente invención, es un polipéptido incluyendo un anticuerpo de acuerdo con la presente invención, que se deriva de una secuencia de un anticuerpo YS de acuerdo con las figuras 41 a 43 y enlaza a VEGF con una afinidad deseada de acuerdo con la presente invención. De acuerdo con una modalidad preferida, el polipéptido serie G, polipéptido serie B20, polipéptido YADS, el polipéptido serie YADS2, el polipéptido serie YADS3, o el polipéptido serie YS enlazan a VEGF de mamífero humano o no humano, con un valor Kd 10 veces mayor entre cada uno. De acuerdo con una modalidad, ios valores kD para dichos anticuerpos que enlazan a VEGF humano y a VEGF de ratón son de 10nM. En otra modalidad, los anticuerpos enlazan a VEGF de humano y VEGF de ratón con valores Kd de 2nM o menos. En otra modalidad, los anticuerpos enlazan a VEGF de humano con valores Kd de 1 nM o menos. Las afinidades de dichos polipéptidos series G6, serie B20, serie YADS, series YS para VEGF pueden mejorarse a través de algunos métodos, por ejemplo, tal como las técnicas de despliegue de fagos aquí consideradas. Tal como se utiliza en la presente invención, el término "dominio variable de anticuerpo" se refiere a las partes de las cadenas ligeras y pesadas de las moléculas de anticuerpo que incluyen secuencias de aminoácidos de las Regiones de Determinación de Complementariedad (CDRs; es decir, CDR1, CDR2, y CDR3) y las Regiones de Estructura (FRs). VH se refiere al dominio variable de la cadena pesada. VL se refiere al dominio variable de la cadena ligera. De acuerdo con los métodos utilizados en la presente invención, las posiciones de aminoácidos asignadas a los CDRs y FRs pueden definirse de acuerdo con Kabat (Secuencias de Proteínas de Interés Inmunológíco (Instituto Nacional de Salud, Bethesda, Md., 1987 y 1991)). La numeración de aminoácidos de los anticuerpos o fragmentos de enlace de antígenos, también son de acuerdo con las de Kabat. Tal como se utiliza en la presente invención, el término "Regiones de Determinación de Complementariedad (CDRs; es decir, CDR1, CDR2, y C D R 3 ) " se refieren a los residuos de aminoácido de un dominio variable de anticuerpos cuya presencia son necesarias para el enlace de antígenos. Cada dominio variable normalmente tiene tres regiones CDR identificadas como CDR1, CDR2, y CDR3. Cada región de determinación de complementariedad puede comprender residuos de aminoácidos de una "región de determinación de complementariedad" tal como lo define Kabat (por ejemplo aproximadamente residuos 24 a 34(L1), 50 a 56 (L2) y 89-97 (L3) en el dominio variable de cadena ligera y 31 a 35 (H1), 50 a 65 (H2) y 95-102 (H3) en el dominio variable de cadena pesada; Kabat y asociados Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a, Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)) y/o los residuos de un "lazo hipervariable" (por ejemplo, aproximadamente residuos 26-32 (L1), 50-52 (L2) y 91-96 (L3) en el dominio variable de cadena ligera y 26-32 (H1), 53-55 (H2) y 96-101 (H3) en el dominio variable de cadena pesada; Chothia y Lesk J. Mol. Biol.. 196:901-917 (1987)). En algunos casos, una región de determinación de complementariedad puede incluir aminoácidos tanto de una región CDR definida de acuerdo con Kabat como un lazo hipervariable. Por ejemplo, la CDRH1 de la cadena pesada del anticuerpo 4D5 incluye aminoácidos del 26 a 135. Las "regiones de estructuras" (en lo sucesivo FR) son los residuos de dominio variable además de los residuos CDR. Cada dominio variable normalmente tiene cuatro FRs identificadas como FR 1 , FR2, FR3, y FR4. Si los CDRs se definen de acuerdo con Kabat, los residuos FR de cadena ligera se colocan aproximadamente en los residuos 1 a 23 (LCFR1), 35-49 (LCFR2), 57-88 (LCFR3), y 98-107 (LCFR4) y los residuos FR de cadena pesada se colocan aproximadamente en los residuos 1-30 (HCFR1), 36-49 (HCFR2), 66-94 (HCFR3), y 103-113 (HCFR4) en los residuos de cadena pesada. Si los CDRs comprenden residuos de aminoácidos de lazos hipervariables, los residuos FR de cadena ligera se colocan aproximadamente en los residuos 1-25 (LCFR1), 33-49 (LCFR2), 53-90 (LCFR3), y 97-107 (LCFR4) en la cadena ligera y los residuos FR de cadena pesada se colocan aproximadamente en los residuos 1-25 (HCFR1 ), 33-52 (HCFR2), 56-95 (HCFR3), y 102-113 (HCFR4) en los residuos de cadena pesada. En algunos casos, cuando el CDR comprende aminoácidos tanto de un CDR tal como lo define Kabat, y los de un lazo hipervariable, los residuos FR se ajustarán de manera correspondiente. Por ejemplo, cuando CDRH1 incluye aminoácidos H26-H35, los residuos FR1 de cadena pesada están en las posiciones 1 a 25 y los residuos FR2 están en las posiciones 36 a 49. Tal como se utiliza en la presente invención, el término "ajuste de codón" se refiere a un ajuste de diferentes secuencias de triplete de nucleótidos que se utilizan para codificar los aminoácidos variantes deseados. Se puede sintetizar un grupo de oligonucleótidos, por ejemplo, a través de síntesis de fase sólida, incluyendo secuencias que representan todas las posibles combinaciones de tripletes de nucleótidos proporcionados por el ajuste de codón, y que codificarán el grupo de aminoácidos deseados. Una forma estándar de designación de codón es la del código IUB, el cual es conocido en la técnica y se describe en la presente invención. Un ajuste de codón normalmente esta representado por tres letras mayúsculas en cursivas, es decir NNK, NNS, XYZ, DVK y similares. Un "grupo de codón no aleatorio" tal como se utiliza en la presente invención, se refiere por lo tanto a un grupo de codón que codifica aminoácidos seleccionados que cumplen parcial, preferentemente completamente, con el criterio para la selección de aminoácidos tal como se describe en la presente invención. La síntesis de oligonucleótidos con "degeneración" de nucleótidos seleccionada en ciertas posiciones, es bien conocida en la técnica, por ejemplo el método TRIM (Knappek y asociados; J. Mol. Biol .. (1999), 296:57-86); Gerrard & Henner, Gene (1993), 128:103). Dichos grupos de oligonucleótidos que tienen ciertos ajustes de codón pueden ser sintetizados utilizando sintetizadores de ácido nucleico comerciales (disponibles, por ejemplo en Applied Biossystems, Foster City, CA) o pueden ser obtenidos en forma comercial (por ejemplo, de Life Technologies, Rockville, MD). Por consiguiente, un grupo de oligonucleótidos sintetizado que tienen un ajuste de codón en particular, incluirá normalmente una pluralidad de oligonucleótidos con diferentes secuencias, las diferencias establecidas por el grupo de codón dentro de la secuencia general. Los oligonucleótidos, tal como se utiliza de acuerdo con la presente invención, tienen secuencias que permiten la hibridación a una plantilla de ácido nucleico de dominio variable y también pueden, pero no de manera necesaria, incluir sitios de enzima de restricción útiles, por ejemplo, para propósitos de clonación. Un fragmento "Fv" es un fragmento de anticuerpo que contiene un reconocimiento de antígeno completo y un sitio de enlace. Esta región consiste en un dímero de un dominio variable de cadena pesada y uno de cadena ligera en estrecha asociación, que puede ser covalente por naturaleza, por ejemplo en scFv. Es en esta configuración en la que tres CDRs de cada dominio variable interactúan para definir un sitio de enlace de antígenos en la superficie del dímero VH-VL. En forma colectiva, los seis CDRs o un subgrupo de los mismos confieren especificidad de enlace de antígenos para el anticuerpo. Sin embargo, incluso un solo dominio variable (o la mitad de un Fv que comprende únicamente tres CDRs específicos para un antígeno) tiene la capacidad de reconocer y enlazar al antígeno, aunque normalmente con una afinidad menor que en todo el sitio de enlace. El fragmento "Fab" contiene un dominio variable y constante de la cadena ligera y un dominio variable y el primer dominio constante (CH1) de la cadena pesada. Los fragmentos de anticuerpo F(ab')2 comprenden un par de fragmentos Fab los cuales generalmente están enlazados en forma covalente cerca de su término carboxi mediante cisteínas de vínculo entre ellos. También se conocen en la técnica otros acoplamientos químicos de fragmentos de anticuerpos. Los fragmentos de anticuerpos "Fv de una sola cadena" o "scFv" comprenden dominios Vh y VL del anticuerpo, en donde estos dominios se encuentran en una sola cadena de péptido. Generalmente el polipéptido Fv comprende además un eniazador de polipéptidos entre los dominios VH y Vu, lo cual permite al scFv formar la estructura deseada para el enlace de antígenos. Para una revisión de scFv, ver la publicación de Pluckthun en The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, Vol 113, Rosenburg y Moore eds. Springer-Verlag, Nueva York, p 269-315 (1994). El término "diacuerpos", se refiere a fragmentos de anticuerpo pequeños con dos sitios de enlace de antígenos, en donde los fragmentos comprenden un dominio variable de cadena pesada, (VH) conectado a un dominio variable de cadena ligera (VL) en la misma cadena de polipéptido (VH y VL). Al utilizar un enlazador que sea demasiado corto para permitir el emparejamiento entre los dos dominios en la misma cadena, los dominios se obligan a emparejarse con los dominios complementarios de otra cadena y crear dos sitios de enlace de antígenos. Los diacuerpos se describen en forma más completa, por ejemplo, en la Patente No. EP 404,097; en la publicación WO 93/11161; y en el texto de Hollinger y asociados., Proc. Nati, Acad. Sci. EUA, 90:6444- 6448 (1993). La expresión "anticuerpos lineales", se refiere a los anticuerpos descritos en la publicación de Zapata y asociados., Protein Eng. 8(10): 1057-1062 (1995). En síntesis, estos anticuerpos comprenden un par de fragmentos Fd tándem (VH-CH 1 -VH-CH 1 ), los cuales, junto con los polipéptidos de cadena ligera complementarios, forman un par de regiones de enlace antígeno. Los anticuerpos lineales pueden ser biespecíficos o monoespecíficos. El término "anticuerpo monoclonal", tal como se utiliza en la presente invención se refiere a un anticuerpo obtenido de una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos, es decir, los anticuerpos individuales que comprenden la población, son idénticos excepto por posibles mutaciones que ocurren naturalmente, que pueden estar presentes en cantidades menores. Los anticuerpos monoclonales son altamente específicos, siendo dirigidos contra un solo sitio antigénico. Además, en contraste con preparaciones de anticuerpos convencionales (policlonales), las cuales normalmente incluyen diferentes anticuerpos dirigidos contra diferentes determinantes (epítopes), cada anticuerpo monoclonal se dirige contra un solo determinante en el antígeno. El modificador "monoclonal" indica el carácter del anticuerpo tal como se obtiene a partir de una población sustancialmente homogénea de anticuerpos, y no será construido como requiriendo la producción del anticuerpo a través de cualquier método en particular. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales que serán utilizados de acuerdo con la presente invención, pueden elaborarse mediante el método de hibridoma descrito primero por Kohler y asociados Nature 256:495 (1975), o pueden ser mediante métodos de ADN recombinantes (ver por ejemplo la Patente Norteamericana No. 4,816,567). Los "anticuerpos monoclonales" también pueden ser aislados de bibliotecas de anticuerpos de fagos, utilizando las técnicas descritas en la publicación de Claxon y asociados., Nature 352:624-628 (1991) y Marks y asociados J. Mol. Biol.. 222:581-597 (1991), por ejemplo. Los anticuerpos monoclonales de la presente invención incluyen en forma específica anticuerpos "quiméricos" (inmunogiobulinas) en donde una parte de la cadena pesada y/o ligera es idéntica a, u homologa a las secuencias correspondientes en anticuerpos derivados de una especie en particular o que pertenece a una clase o subclase de anticuerpos en particular, en tanto que el resto de la cadena (s) es idéntica a, u homologa a las secuencias correspondientes en anticuerpos derivados de otras especies o que pertenecen a otra clase o subclase de anticuerpos, así como fragmentos de dichos anticuerpos siempre que exhiban la actividad biológica deseada (Patente Norteamericana No. 4,816,567; y Publicación Morrison y asociados., Proc. Nati. Acad. Sci EUA 81:6851-6855 (1984)). Las formas "humanizadas" de anticuerpos no humanos (por ejemplo múridos) son anticuerpos quiméricos que contienen una secuencia mínima deriva de inmunoglobuiina no humana. Para la mayor parte, los anticuerpos humanizados son inmunoglobulinas humanas (anticuerpo receptor) en donde los residuos de una región hipervariable del receptor, se reemplazan por residuos de una región hipervariable de una especie no humana (anticuerpos del donante) tal como ratón, rata, conejo o primate no humano, que tienen la especificidad, afinidad y capacidad deseadas. En algunos casos los residuos de la región de la estructura Fv (FR) de la inmunoglobuiina humana, se reemplazan por residuos no humanos correspondientes. Además, los anticuerpos humanizados pueden comprender residuos que no se encuentran en el anticuerpo receptor o en el anticuerpo del donante. Estas modificaciones se hacen para refinar en forma adicional el desempeño del anticuerpo. En general el anticuerpo humanizado comprenderá sustancialmente todos de al menos uno, y normalmente dos dominios variables, en donde todos o sustancialmente todos los lazos hipervariables corresponden a los de una inmunoglobulina no humana y todas o sustancialmente todas las regiones FR son aquellas de una secuencia de inmunoglobulina humana. El anticuerpo humanizado puede comprender opcionalmente al menos una parte de una región constante de inmunoglobulina (Fe), normalmente la de una inmunoglobulina humana. Para detalles adicionales ver la publicación de Jones y asociados., Nature 321:522-525 (1986); Riechmann y asociados. Nature 332:323-329 (1988); y Presta, Curr. Op. Struct. Bioi.. 2:593-596 (1992).

Un "anticuerpo dependiente de la especie" es uno que tiene una afinidad de enlace más fuerte para un antígeno procedente de una primera especie de mamífero que la que tiene para un homólogo de dicho antígeno a partir de una segunda especie de mamífero; normalmente el anticuerpo dependiente de la especie "enlaza en forma específica" a un antígeno de humano (por ejemplo, tiene un valor de afinidad de enlace (Kd) no mayor a aproximadamente 1 x 10"7 M, preferentemente no mayor a 1 x 10~8 M y lo más preferentemente no mayor a 1 x 10"9 M) pero tiene una afinidad de enlace para un homólogo del antígeno a partir de una segunda especie de mamífero no humano la cual es al menos aproximadamente 50 veces, o aproximadamente 500 veces o al menos aproximadamente 1000 veces más débil que su afinidad de enlace con el antígeno de humano.

El anticuerpo dependiente de la especie puede ser cualesquiera de los diversos tipos de anticuerpos que se definieron anteriormente, aunque preferentemente es un anticuerpo humano o humanizado. Tal como se utiliza en la presente invención el término "muíante de anticuerpo" o "variante de anticuerpo" se refiere a una variante de secuencia de aminoácido del anticuerpo dependiente de la especie en donde uno o más de los residuos de aminoácidos del anticuerpo dependiente de la especie ha sido modificado. Dichos mutantes necesariamente tienen menos del 100% de identidad de secuencia o similitud con el anticuerpo dependiente de la especie. En una modalidad preferida, el muíante del anticuerpo tendrá una secuencia de aminoácidos que tiene al menos el 75% de identidad de la secuencia de aminoácidos o similitud con la secuencia de aminoácidos ya sea del dominio variable de cadena variable o ligera del anticuerpo dependiente de las especies más preferentemente el 80%, más preferentemente al menos el 85%, más preferentemente al menos el 90% y lo más preferentemente al menos el 95%. La identidad o similitud con respecto a estas secuencias se define en la presente invención como el porcentaje de residuos de aminoácidos en la secuencia candidata que son idénticos, (es decir el mismo residuo) o similar (es decir residuos de aminoácidos del mismo grupo con base en las propiedades de cadena lateral común, ver más adelante) con los residuos de anticuerpo dependiente de las especies, después de alinear las secuencias e introducir aberturas, si es necesario, para lograr el porcentaje máximo de identidad de secuencia. Ninguna de las extensiones, eliminaciones o inserciones de terminal-N, terminal-C o internas en la secuencia del anticuerpo fuera del dominio variable, deben de construirse de modo que afecte la identidad o similitud de secuencia. Para incrementar la vida promedio de los anticuerpos o polipéptido que contiene la secuencia de aminoácidos de la presente invención, se puede adherir un epítope de enlace del receptor de rescate al anticuerpo (especialmente un fragmento de anticuerpo) tal como se describe en la Patente Norteamericana No. 5,739,277. Por ejemplo, una molécula de ácido nucleico que codifica el epítope de enlace del receptor de rescate puede enlazarse en la estructura a un ácido nucleico que codifica una secuencia de polipéptidos de la presente invención, de modo que codifica una secuencia de polipéptidos de la presente invención, de modo que la proteína de fusión expresada por la molécula de ácido nucleico construida comprenda el epítope de enlace del receptor de rescate y una secuencia de polipéptidos de la presente invención. Tal como se utiliza en la presente invención, el término "epítope de enlace del receptor de rescate" se refiere a un epítope de la región Fe de una molécula IgG (por ejemplo, lgG-i , lgG2, lgG3, ó lgG4) que es responsable de incrementar la vida promedio del suero ¡n vivo de la molécula IgG (por ejemplo, Ghetie, V y asociados., (2000) Ann. Rev. Immunol. 18:739-766, Tabla 1). Los anticuerpos con sustituciones en un región Fe de los mismos y vidas promedio de suero incrementadas también se describen en la publicación WO 00/42072) (Presta, L.), publicación WO 02/060919; Shields, R.L. y asociados, (2001 ) JBC 276(9):6591-6604; Hinton, P.R. (2004) JBC 279(8):6213-6216). En otra modalidad, también se puede incrementar la vida promedio de suero, por ejemplo, adhiriendo otras secuencias de polipéptido. Por ejemplo, los anticuerpos de la presente invención u otro polipéptido que contiene las secuencias de aminoácidos de la presente invención, pueden adherirse a la albúmina de suero o a una parte de la albúmina de suero que enlaza al receptor FcRn o un péptido de enlace de albúmina de suero de modo que la albúmina de suero enlace al anticuerpo o polipéptido, por ejemplo, dichas secuencias de polipéptido se describen en la publicación WO01/45746. En una modalidad preferida, el péptido de albúmina de suero que será adherida comprende una secuencia de aminoácidos de CICLPRWGCLW. En otra modalidad, la vida promedio de un Fab de acuerdo con la presente invención, se incrementa a través de estos métodos. Ver también la publicación de Dennis, M.S. y asociados., (2002) JBC 277 (38): 35035-35043 con respecto a secuencias de péptido de enlace de albúmina. Un anticuerpo "aislado" es uno que ha sido identificado, separado y/o recuperado de un componente de su ambiente natural. Los componentes contaminantes de su ambiente natural, son materiales que podrían interferir con los usos de diagnóstico terapéutico del anticuerpo, y pueden incluir enzimas, hormonas y otras soluciones proteínaceas o no proteínaceas. En modalidades preferidas, el anticuerpo será purificado (1) a más del 95% en peso del anticuerpo tal como se determina a través del método de Lowry y los más preferentemente a más del 99% en peso, (2) un grado suficiente para obtener al menos 15 residuos de la secuencia de aminoácidos de terminal-N o interna a través del uso de un secuenciador de copa de giros, o (3) para homogeneizar a través de SDS-PAGE bajo condiciones de reducción o sin reducción utilizando tinción azul Coomassie o, preferentemente de plata. El anticuerpo aislado, incluye el anticuerpo ¡n situ dentro de células recombinantes, ya que al menos un componente del ambiente natural del anticuerpo no estará presente. Sin embargo, en forma ordinaria el anticuerpo aislado será preparado a través de al menos un paso de purificación.

Un "factor o agente angiogénico" es un factor de crecimiento que estimula el desarrollo de los vasos sanguíneos, por ejemplo promueve la angiogenesis, crecimiento de célula endotelial, estabilidad de vaso sanguíneo y/o vasculogénesis, etc. Por ejemplo, los factores angiogénicos, incluyen, pero no se limitan a, VEGF y elementos de la familia VEGF, familia PIGF, PDGF, familia de factor de crecimiento de fibroblasto (FGFs), ligantes TIE (Angiopoyetinas), efrinas, Del-1, factores de crecimiento de fibroblasto: acídico (aFGF) y de base (bFGF), Folistatina, factor de estimulación de colonia de granulocito (G-CSF), factor de crecimiento de Hepatocitos (HGF)/factor de dispersión (SF), I nterleucia-8 (IL-8), Leptina, Midkina, factor de crecimiento de Plancenta, factor de crecimiento de célula endotelial derivada de plaquetas (PD-ECGF), factor de crecimiento derivada de plaquetas, especialmente PDGF-BB ó PDGFR-beta, Pleiotrofina (PTN), Progranulina, Proliferina, factor-alfa de crecimiento (TGF-alfa), factor-beta de crecimiento (TGF-beta), factor-alfa de necrosis de tumor (TNF-alfa), factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF)/factor de permeabilidad vascular (VPF), etc. También podría incluir factores que aceleran la curación de heridas, tales como hormona de crecimiento, factor de crecimiento tipo insulina-1 (IGF-I), VIGF, factor de crecimiento epidérmico (EGF), CTGF y elementos de su familia, y TGF-alfa, y TGF-beta. Ver por ejemplo la publicación de Klagsbrun y D'Amore, Annu. Rev. Physiol., 53:217-39 (1991); Streit y Detmar, Oncogene, 22:3172-3179 (2003); Ferrara & Alitalo, Nature Medicine 5 ( 12): 1359-1364 (1999); Tonini y asociados., Oncogene, 22:6549-6556 (2003) (por ejemplo, Tabla 1 que describe factores angiogénicos conocidos); y Sato Int. J. Clin. Oncol., 8:200-206 (2003). Un "agente anti-angiogénesis" o "inhibidor de angiogenesis" se refiere a una sustancia de poco peso molecular, un polinucleótido , un polipéptido, una proteína aislada, una proteína recombinante, un anticuerpo o conjugados o proteínas de fusión de los mismos que inhibe la angiogenesis, vasculogénesis o permeabilidad vascular indeseable, ya sea directa o indirectamente. Deberá quedar entendido que el agente anti-angiogénesis incluye aquellos agentes que enlazan y bloquean la actividad angiogénica del factor angiogénico o su receptor. Por ejemplo, un agente anti-angiogénesis es un anticuerpo u otro antagonista para un agente angiogénico tal como se definió anteriormente, por ejemplo, anticuerpos para VEGF-A o para el receptor VEGF-A (por ejemplo, receptor KDR o receptor Flt- ), inhibidores anti-PDGFR tales como Gleevec™ (Imatinib Mesylate). Los agentes anti-angiogénesis también incluyen inhibidores de angiogénesis nativos, por ejemplo angiostatina, endostatina, etc. Ver por ejemplo Klagsbrun y D'Amore, Annu. Rev. Physiol. 53:217-39 (1991); Streit y Detmar, Oncogene, 22:3172-3179 (2003) (por ejemplo, la tabla 3 que describe terapia anti-angiogénica en melanoma maligno); Ferrara & Alitalo, Nature Medicine 5(12): 1359-1364 (1999); Tonini y asociados., Oncogene, 22:6549-6556 (2003) (por ejemplo, la tabla 2 que describe factores anti-angiogénicos conocidos); y Sato Int. J. Clin. Oncol., 8:200-206 (2003) (por ejemplo, la tabla 1 que describe agentes anti-angiogénicos utilizados en pruebas clínicas). El "Kd" ó "valor Kd" de acuerdo con la presente invención, es en una modalidad preferida medido a través de un ensayo de enlace VEGF radioetiquetado (RIA) llevado a cabo con la versión Fab del anticuerpo y una molécula VEGF tal como se describe a través del siguiente ensayo que mide la afinidad de enlace de la solución de Fabs para VEGF equilibrando Fab con una concentración mínima de VEGF (109) etiquetado con (125l) en la presencia de una serie de titulación de VEGF no etiquetado, capturando posteriormente el VEGF enlazado con una placa recubierta con anticuerpos anti-Fab (Chen, y asociados., (1999) J. Mol. Biol. 293:865-88 ). Para establecer condiciones para el ensayo, se recubrieron durante la noche placas de microtitulación (Dynex) con 5 g/ml de una anticuerpo anti- Fab de captura (Cappel Labs) en 50 mM de carbonato de sodio (pH 9.6), y subsecuentemente se bloquearon con 2% (p/v) de albúmina de suero bovino en PBS durante dos a cinco horas a temperatura ambiente (aproximadamente 23°C). En un placa no adsorbente (Nunc #269620), 100 pM [125I]VEGF(109) con diluciones en serie de un Fab de interés, por ejemplo, Fab-12 (Presta y asociados., (1997) Cáncer Res. 57:4593-4599). El Fab de interés posteriormente se incubó durante la noche; sin embrago, la incubación puede continuar durante 65 horas para asegurar que se logre el equilibrio. Posteriormente la mezclas se transfieren a la placa de captura para incubación a temperatura ambiente durante una hora. La solución se elimina posteriormente y la placa se lava ocho veces con 0.1% de Tween-20 en PBS. Cuando las placas se han secado, se agregan 150 µ?/depósito de centellante (MicroScint-20; Packard) y las placas se cuentan en un contador de rayos gama Topcount (Packard) durante diez minutos. Las concentraciones de cada Fab, que producen menos o igual al 20% de enlace máximo se eligen para utilizarse en ensayos de enlace competitivos. De acuerdo con otra modalidad, el Kd o valor Kd se mide utilizando ensayos de resonancia de plasmon de superficie utilizando un BIAcore™-2000 o un Bl Acore™-3000 (BIAcore, Inc., Piscataway, NJ) a un temperatura de 25°C con hVEGF (8- 109) inmovilizados, chips CM5 a -10 unidades de respuesta (RU). En síntesis, se activan chips de biosensor de dextrano carboximetilado (CM5, BIAcore Inc.) con clorhidrato de N-etil-N'-(3-dimetilaminopropil)-carbodiimida (EDC) y N-hidroxisuccinimida (NHS) de acuerdo con las instrucciones del proveedor. El VEGF humano se diluye con 10 mM de acetato de sodio, pH 4.8 en 5 µ9/??? (~0.2µ?) antes de la inyección en un rango de flujo de 5 µ?/minuto para lograr aproximadamente 10 unidades de respuesta (RU) de proteína acoplada. Después de la inyección de VEGF humano, se inyecta 1 M de etanolamina para bloquear los grupos no reactivados. Para medidas cinéticas, se inyectaron diluciones en serie de dos dobleces de Fab (0.78 nM a 500 nM) en PBS con 0.05% Tween 20 (PBST) a una temperatura de 25°C en un rango de flujo de aproximadamente 25 µ?/min. Los rangos de asociación (kon) y los rangos de disociación (koff) se calcularon utilizando un modelo de enlace Langmuir uno a uno simple (BIAcore Evaluation Software versión 3.2) mediante ajuste simultáneo del sensograma de asociación y disociación. La constante de disociación de equilibrio (Kd) se calculó como la proporción k0ff/kon- Ver por ejemplo Chen, Y., y asociados, (1999) J. Mol. Biol. 293:865-881. Si el en-rango excede 106 M"1 S"1 a través del ensayo de resonancia de plasmon de superficie anterior, entonces el en-rango se puede determinar utilizando una técnica de extinción fluorescente que mide el incremento o disminución en intensidad de emisión de fluorescencia (excitación = 295 nm; emisión = 340 nm, 16 nm banda-pase) a una temperatura de 25°C de un anticuerpo 20nM anti-VEGF (forma Fab) en PBS, pH 7.2, en la presencia de concentraciones en incremento de la forma corta de VEGF humano (8-109) o VEGF de ratón tal como se mide en un espectrómetro, tal como un espectrómetro equipado con flujo de detención (Aviv Instruments) o un espectrofotómetro SL -Aminco serie 8000 (ThermoSpectronic) con una cubeta agitada. El término "en-rango" o "rango de asociación" o "asociación de rango" o "kon" de acuerdo con la presente invención, se determina preferentemente con la misma técnica de resonancia de plasmon de la superficie descrita anteriormente utilizando BIAcore™-2000 o un BIAcore™-3000 (BIAcore, Inc., Piscataway, NJ) a una temperatura de 25°C con hVEGF inmovilizado (8-109) CM5 chips en -10 unidades de respuesta ( U). En síntesis, se activan los chips de biosensor de dextrano carboximetilado (CM5, BIAcore Inc.) con clorhidrato de N-etil-N'-(3-dimetiIaminopropil)-carbodiimida (EDC) y N-hidroxisuccinimida (NHS) de acuerdo con las instrucciones del proveedor. El VEGF humano se diluye con acetato de sodio 10mM, pH de 4.8, en 5µg/ml (~0.2µ?) antes de la inyección en un rango de flujo de 5µ?/??????? para lograr aproximadamente 10 unidades de respuesta ( U) de proteína acoplada. Posteriormente, se utiliza la inyección de 1M de etanolamina para bloquear los grupos no reactivados. Para medidas cinéticas, se inyectan diluciones en serie de dos dobleces de Fab (0.78 nM a 50 nM) en PBS con 0.05% Tween 20 (PBST) a una temperatura de 25°C en un rango de flujo de aproximadamente 25 µ?/min. Los rangos de asociación (kon) y rangos de disociación (k0ff), se calcularon utilizando un modelo de enlace Langmulr uno a uno simple (BIAcore Evaluation Software versión 3.2) mediante ajuste simultáneo del sensograma de asociación y disociación. La constante de disociación de equilibrio (Kd) se calculó como la proporción k0ff/k0n- Ver por ejemplo la publicación de Chen, Y,, y asociados., (1999) J. Mol Biol. 293:865-881. Sin embargo, si el en-rango excede 106 M"1 S" a través del ensayo de resonancia de plasmon de superficie anterior, entonces el en-rango se determina preferentemente utilizando una técnica de extinción fluorescente que mide el incremento o disminución en intensidad de emisión de fluorescencia (excitación = 295 nm; emisión = 340 nm, banda-pase 16 nm) a una temperatura de 25°C de un anticuerpo anti-VEGF 20 nM (forma Fab) en PBS, pH 7.2, en la presencia de concentraciones en incremento de la forma corta humana (8-109) o VEGF de ratón tal como se mide en un espectrómetro, tal como un espectrofotómetro equipado con flujo de detención (Aviv Instruments) o un espectrofotómetro SLM-Aminco serie 8000 (ThermoSpectronic) con una cubeta. El término "epítope funcional" de acuerdo con la presente invención, se refiere a residuos de aminoácidos de un antígeno que contribuyen en forma genética al enlace de una anticuerpo. La mutación de cualesquiera de los residuos que contribuyen en forma energética del antígeno (por ejemplo, mutación de VEGF tipo natural mediante mutación de alanina u homologa) interrumpirá el enlace del anticuerpo, de modo que la proporción de afinidad relativa (VEGFmutante IC50/VEGF tipo natural IC50) del anticuerpo sea mayor a 5 (ver ejemplo 2). En una modalidad preferida, la proporción de afinidad relativa se determina a través de un ensayo ELISA que despliega fagos que se enlaza a la solución. En síntesis, se recubrieron inmunoplacas Maxisorp (NUNC) de 96 depósitos durante la noche a una temperatura de 4°C con una forma Fab del anticuerpo que será probado en una concentración de 2 g/ml en PBS, y se bloquearon con PBS 0.5% BSA y 0.05% Tween20 (PBT) durante 2 horas a temperatura ambiente. Las diluciones en serie del fago que despliega mutantes de punta de alanina hVEGF (residuos 8-109) o hVEGF tipo natural (8-109) en PBT, se incubaron primero en las placas recubiertas con Fab durante 15 minutos a temperatura ambiente, y las placas se lavaron con PBS, 0.05% Tween20 (PBST). El fago enlazado se detecta con un conjugado de peroxidasa de rábano de anticuerpo monoclonal anti-M13 (Amersham Pharmacia) diluido 1:5000 en PBT, desarrollado con sustrato 3,3', 5,5'-tetrametilbenzidina (T B, Kirkegaard & Perry Labs, Gaithersburg , MD) durante aproximadamente 5 minutos, extinguido con 1.0 M H3P04 y leído espectrofotométrica a 450 nm. La proporción de los valores IC50 (IC50,ala/IC50,peso) representa el doblez de reducción en la afinidad de enlace (la afinidad de enlace relativa). Para ensayos de enlace competitivo, se recubrieron placas Maxisorb y se bloquearon tal como se definió anteriormente, y se elaboraron diluciones de tres dobleces en series VEGF no etiquetado (109) en regulador PBS/Tween en un placa Nunc. Se agregó [ 25l] EGF(109), seguido de la adición de una concentración fija del Fab de interés. Las concentraciones finales del Fab de interés son 100 pM y 10 pM, respectivamente. Después de la incubación (tal como se describió anteriormente), se capturó el VEGF enlazado y se cuantificó tal como se describió anteriormente. Los datos de ensayo se analizaron utilizando un programa de computadora para llevar a cabo análisis Scatchard (P. Munson y asociados, (1980) Anal. Biochem. (1980) 107:220-239) para la determinación de las constantes de enlace, Kd. Tal como se utiliza en la presente invención, el término "biblioteca" se refiere a una pluralidad de anticuerpos o secuencias de fragmentos de anticuerpos (por ejemplo, polipéptldos de la presente invención), o los ácidos nucleicos que codifican dichas secuencias, haciendo diferentes las secuencias en la combinación de aminoácidos variantes que se introducen en estas secuencias de acuerdo con los métodos de la presente invención. El término "despliegue de fagos" es una técnica a través de la cual se despliegan polipéptidos variantes en la forma de proteínas de fusión al menos a una parte de la proteína cubierta en la superficie del fago, por ejemplo, partículas del fago filamentoso. Una utilidad del despliegue de fago descansa en el hecho de que las bibliotecas grandes de variante de proteína aleatorizadas, pueden clasificarse en forma rápida y eficiente con respecto a las secuencias que enlazan a un antígeno objetivo con alta afinidad. El despliegue de péptidos y bibliotecas de proteína en el fago han sido utilizadas para clasificar millones de polipéptidos para unos con propiedades de enlace específicas. Se han utilizado métodos de despliegue de fagos polivalentes para desplegar péptidos aleatorios pequeños y proteínas pequeñas a través de fusiones ya sea al gen III o gen VIII de fagos filamentosos. Consultar la publicación de Lowman, Curr. Opin. Struct. B i o I .. 3:355-362 (1992), y las referencias aquí mencionadas. En un despliegue monovalente, se fusiona una biblioteca de proteína o péptido con un gen III o una parte del mismo, y se expresa en bajos niveles en la presencia de proteína de gen III tipo natural, de modo que las partículas de fago desplieguen una copia o ninguna de las proteínas de fusión. Se reducen los efectos de avidez con relación al fago polivalente de modo que la clasificación es sobre la base de afinidad de ligante intrínseco y se utilizan vectores fagémicos los cuales simplifican las manipulaciones de ADN. Ver la publicación de Lowman y Wells, Methods: A companion to Methods in Enzymology, 3:205-0216 (1991). Un "fagémido" es un vector de plásmido que tiene origen bacteriano de réplica, por ejemplo Co1E2 y una copia de una región ¡ntergémica de un bacteriófago. El fagémido puede utilizarse en cualquier bacteriófago conocido, incluyendo el bacteriófago filamentoso y bacteriófago lamboide. El plásmido también contendrá generalmente un marcador seleccionable para resistencia a antibióticos. Los segmentos de ADN clonados en estos vectores, pueden ser propagados como plásmidos. Cuando las células albergan estos vectores, se abastecen con todos los genes necesarios para la producción de partículas de fago, el modo de réplica de los cambios de plásmido para enrolar la réplica de círculos para generar copias de una hebra del ADN de plásmido y empacar partículas de fagos. El fagémido puede formar partículas de fago infecciosas o no infecciosas. El término incluye fagémidos que contienen el gen de proteína de recubrimiento del fago o fragmento del mismo enlazado a un gen polipéptido heterólogo como una fusión de gen, de modo que el polipéptido heterólogo se despliegue en la superficie de la partícula de fago. El término "vector de fagos" significa una forma de réplica con hebra doble de un bacteriófago que contiene un gen heterólogo y con capacidad de réplica. El vector de fago tiene un origen de fago de réplica que permite la réplica de fago y formación de réplica de fago. El fago es preferentemente un bacteriófago filamentoso, tal como un fago M13, f1, fd, Pf3 o un derivado del mismo, o un fago lambdoide, tal como lambda, 21, phi80, ph i 81 , 82, 424, 434, etc. o un derivado de los mismos. Tal como de utiliza en la presente invención, el término" posición accesible del solvente" se refiere a una posición de un residuo de aminoácido en las regiones variables de las cadenas pesadas y ligeras de un anticuerpo fuerte o un fragmento de enlace de antígenos que se determina con base en la estructura, el ensamble de estructuras y/o estructura modelada del anticuerpo o fragmento de enlace de antígenos, como potencialmente disponibles para acceso de solventes y/o contacto con una molécula, tal como un antígeno específico de anticuerpos. Estas posiciones normalmente se encuentran en los CDRs y en el exterior de la proteína. Las posiciones accesibles del solvente de un fragmento de enlace de anticuerpos o antígenos, tal como se define en la presente invención, se pueden determinar utilizando cualquier número de algoritmos conocidos en la técnica. Preferentemente, las posiciones accesibles del solvente se determinaron utilizando coordenadas de un modelo de tercera dimensión de un anticuerpo, utilizando preferentemente un programa de computadora, tal como el programa Insightll (Accelrys, San Diego, CA). Las posiciones accesibles del solvente también pueden determinarse utilizando algoritmos conocidos en la técnica (ver la publicación de Lee y Richards, J. Mol. Biol.. 55, 379 (1971) y Connolly, J. Appl. Cryst. 16, 548 (1983)). La determinación de las posiciones accesibles del solvente se pueden llevar a cabo utilizando un software adecuado para modelado de proteína e información estructural de tercera dimensión obtenida de un anticuerpo. El software que puede utilizarse para estos propósitos incluye el software de Módulo Biopolymer SYBYL (Tripos Associates). General y preferentemente, cuando un algoritmo (programa) requiere un parámetro de tamaño de entrada el usuario, el "tamaño" de una sonda que se utilizará en el cálculo se ajusta aproximadamente a 1.4 Ángstrom ó con un radio más pequeño. Además, la determinación de los métodos de regiones y área accesibles de solvente utilizando el software para computadoras personales, ha sido descrito por Pacios (1994) "ARVOMOL/CONTOUR: molecular surface áreas and volumes on Personal Computers". Comput. Chem. 18(4):377-386; y (1995). "Variations of Surface Areas and Volumes in District Molecular Surfaces of Biomolecules", J. Mol. Model. 1 :46-53). El término "tratamiento" se refiere tanto a tratamiento terapéutico como a medidas profilácticas y preventivas. Los que necesitan del tratamiento, incluyen aquellos que ya tienen el padecimiento, así como aquellos en los que se puede evitar el padecimiento. Un "padecimiento" es cualquier condición que pueda beneficiarse del tratamiento con el anticuerpo. Por ejemplo, mamíferos que padecen de o que necesitan profilaxis contra angiogénesis anormal (angiogénesis excesiva, inadecuada o no controlada) o permeabilidad vascular. Esto incluye padecimientos crónicos y agudos o enfermedades que incluyen aquellas condiciones patológicas que predisponen al mamífero al padecimiento en cuestión. Los ejemplos sin limitación de padecimientos que serán tratados en la presente invención, incluyen tumores malignos y benignos; malignidades no leucémicas y linfoides; padecimientos neuronales, gliales, astrocitales, hipotalámicos y de otras glándulas, de macrófago, epiteliales, estromales y blastocoélicos; y padecimientos inflamatorios, angiogénicos e inmunológicos. El término "angiogénesis anormal" ocurre cuando los nuevos vasos sanguíneos ya sea crecen en forma excesiva, insuficiente o inadecuada (por ejemplo, la ubicación, sincronización o generación de angiogénesis que es indeseada desde un punto de vista médico) en un estado de enfermedad, o de modo que origine un estado de enfermedad. La angiogénesis excesiva, inadecuada o no controlada ocurre cuando existe un nuevo crecimiento de vasos sanguíneos que contribuye al empeoramiento del estado de enfermedad u origina un estado de enfermedad, tal como cáncer, especialmente tumores sólidos vascularizados y tumores metastáticos (incluyendo cáncer de colon, de pulmón (especialmente cáncer de pulmón de célula pequeña) o cáncer de próstata), enfermedades originadas por neovascularización ocular, especialmente ceguera diabética, retinopatías, principalmente retinopatía diabética o degeneración macular inducida por la edad o rubeosis; psoriasis, artritis psoriática, hemangioblastoma tal como hemangioma; enfermedades renales inflamatorias, tal como glomerulonefritis, especialmente glomerulonefritis mesangioproliferativa, síndrome urémico hematolítico, nefropatía diabética o nef roesclerosis hipertensa; diversas enfermedades inflamatorias, tales como artritis, especialmente artritis reumatoide, enfermedad de intestino inflamatorio, psoriasis, sarcoidosis, arterieesclerosis arterial y enfermedades que ocurren después de transplantes, endometriosis o asma crónica y más de otras 70 condiciones. Los nuevos vasos sanguíneos pueden alimentar los tejidos enfermos, destruir tejidos normales y en el caso de cáncer, los nuevos vasos sanguíneos pueden permitir que las células escapen a la circulación y se carguen en otros órganos (metástasis de tumor). La angiogénesis insuficiente ocurre cuando existe un crecimiento inadecuado de vasos sanguíneos que contribuye al empeoramiento de un estado de enfermedad, por ejemplo, en enfermedades tales como enfermedad de arteria coronaria, ataques y curación de heridas retardada. Además, pueden resultar úlceras, ataques fulminantes y ataques al corazón de la ausencia de angiogénesis que normalmente se requiere para una curación natural. La presente invención, contempla el tratamiento de pacientes que están en riesgo de desarrollar las enfermedades antes mencionadas.

Otros pacientes que son candidatos para recibir los anticuerpos o polipéptidos de la presente invención, que tienen o están en riesgo de desarrollar proliferación anormal de tejido fibrovascular, acné rosa, síndrome de inmunodeficiencia adquirida, oclusión arterial, queratitis atópica, úlceras bacterianas, enfermedad de Bechets, tumores sanguíneos de nacimiento, enfermedad obstructiva de carótida, neovascularización coroidal, inflamación crónica, separación de retina crónica, uveítis crónica, vitritis crónica, quienes portan lentes de contacto, rechazo a injerto de córnea, neovascularización de córnea, neovascularización de injerto de córnea, enfermedad de Crohn, enfermedad de Eales, queratoconjuntivitis epidémica, úlceras fúngicas, infecciones de herpes simplex, infecciones de herpes zoster, síndrome de hiperviscosidad, sarcoma de Kaposi, leucemia, degeneración de lípidos, enfermedad de Lyme, queratólisis marginal, úlcera de Moren, infecciones micobacterianas además de lepra, miopía, enfermedad neovascular ocular, cavidades ópticas, síndrome de Osler-Weber (Osler-Weber-Rendu), osteoartritis, enfermedad de Pagets, pars planitis, penfigoide, filectenulosis, poliarteritis, complicaciones posteriores a terapias con láser, infecciones de protozoarios, seudoxantoma elástico, pterigión keratitis sicca, queratotomía radial, neovascularización retinal, retinopatía prematuro, fibroplasias retrolentales, sarcoides, escleritis, anemia drepanocítica, síndrome de Sogrens, tumores sólidos, enfermedad de Stargarts, enfermedad de Steven's Johnson, queratitis límbica superior, sífilis, lupus sistémico, degeneración marginal de Terrien, toxoplasmosis, trauma, tumores de sarcoma Ewing, tumores de neuroblastoma , tumores de osteosarcoma, tumores de retinoblastoma, tumores de rabdomiosarcoma, colitis ulcerativa, oclusión de venas, deficiencia de vitamina A y sarcoidosis Wegeners, angiogénesis no deseada asociada con diabetes, enfermedades de parásitos, curación anormal de heridas, hipertrofia después de cirugía, lesiones o trauma, inhibición de crecimiento de cabello, inhibición de ovulación y formación de cuerpo lúteo, inhibición de implantación e inhibición de desarrollo del embrión en el útero . Las terapias anti-angiogénesis son útiles en el tratamiento general de rechazo a injertos, inflamación de pulmón, síndrome nefrótico, preeclamsia, efusión pericardíaca, tal como la que se asocia con pericarditis y efusión pleural, enfermedades y padecimientos caracterizados por permeabilidad vascular no deseada, por ejemplo, edema asociado con tumores de cerebro, ascitos asociados con malignidades, síndrome de Meigs, inflamación de pulmón, síndrome nefrótico, efusión pericardíaca, efusión pleural, permeabilidad asociada con enfermedades cardiovasculares tal como la condición posterior a infartos al miocardio y ataques y similares. Otras enfermedades dependientes de angiogénesis de acuerdo con la presente invención, incluyen angiofibroma (sangre anormal de vasos que están propensos a sangrado), giaucoma neovascular (crecimiento de vasos sanguíneos en el ojo), malformaciones arterivenéreas (comunicación anormal entre arterias y venas), fracturas sin unión (fracturas que no sanan), placas ateroescleróticas (endurecimiento de arterias), granuloma piogénico (lesión de piel común compuesta de vasos sanguíneos), esclerodermia (una forma de enfermedad de tejido conectivo), hemangioma (tumor compuesto de vasos sanguíneos), tracoma (que lleva a la causa de ceguera en el tercer mundo), uniones hemofílicas, adhesiones vasculares y cicatrices hipertróficas (formación anormal de cicatriz). El término "VEGF" o " VEGF" tal como se utiliza en la presente invención se refiere al factor de crecimiento de célula endotelial vascular humano de 165 aminoácidos y a los factores de crecimiento de célula endotelial vascular humano de 121, 189 y 206 aminoácidos relacionados, tal como se describió en la Publicación de Leung y Asociados, Science, 246:1306 (1989), y Houck y Asociados, Mol. Endocrin., 5:1806 (1991), junto con las formas alélicas y procesadas que ocurren en forma natural de las mismas. El término "VEGF" también se refiere a VEGFs de una especie no humana, tal como ratón, rata o primate. Algunas veces, el VEGF de una especie específica está indicado por términos tales como hVEGF para VEGF humano, mVEGF para VEGF de múrido, etc. El término "VEGF" también se utiliza para referirse a formas truncadas del polipéptido que comprende aminoácidos 8 a 109 ó 1 a 109 del factor de crecimiento de célula endotelial vascular humana de 165 aminoácidos. La referencia a cualesquiera de las formas de VEGF, puede identificarse en la presente solicitud, por ejemplo a través de "VEGF (8-109)", "VEGF (1-109)", o "VEGF 65". Las posiciones de aminoácidos para un VEGF nativo "truncado" se enumeran tal como se indica en la secuencia VEGF nativa. Por ejemplo, la posición de aminoácidos 17 (metionina) en el VEGF nativo truncado, también es la posición 17 (metionina) en el VEGF nativo. El VEGF nativo truncado tiene afinidad de enlace para los receptores KDR y Flt-1 comparables con VEGF nativo. El término "VEGF variante" tal como se utiliza en la presente invención, se refiere a un polipéptido VEGF que incluye una o más mutaciones de aminoácidos en la secuencia VEGF nativa. Opcionalmente, una o más mutaciones de aminoácidos incluyen substituciones de aminoácidos. Para los propósitos de designación a corto plazo de variantes VEGF aquí descritas, se debe observar que los números se refieren a la posición de residuos de aminoácidos a lo largo de la secuencia de aminoácidos del VEGF nativo putativo (proporcionado en la Publicación de Leung y Asociados, supra y Houck y Asociados, supra). El término "cáncer" y "cancerígeno", se refiere o describe la condición fisiológica en mamíferos que normalmente está caracterizada por un crecimiento celular no regulado. Los ejemplos de cáncer incluyen pero no se limitan a, carcinoma, linfoma, blastoma, sarcoma y leucemia. Los ejemplos más particulares de dichos cánceres incluyen cáncer de célula escamosa, cáncer de pulmón de célula pequeña, cáncer de pulmón de célula no pequeña, cáncer gastrointestinal, cáncer pancreático, glioblastoma, cáncer cervical, cáncer de ovarios, cáncer de hígado, cáncer de vejiga, hepatoma, cáncer de seno, cáncer de colon, cáncer colo-rectal, carcinoma endometrial, carcinoma de glándula salival, cáncer de riñon, cáncer renal, cáncer de próstata, cáncer de vulva, cáncer de tiroides, carcinoma hepático, y varios tipos de cáncer de cabeza y cuello. El término "mamífero", para los propósitos de tratamiento, se refiere a cualquier animal clasificado como mamífero, incluyendo humanos, animales domésticos y de granja, primates no humanos, y animales de zoológico, de deportes o mascotas, tales como perros, caballos, gatos, vacas, etc.

El término "composición anti-neoplástica" se refiere a una composición útil para tratar cáncer, la cual comprende al menos un agente terapéutico activo por ejemplo "agente anti-cáncer". Los ejemplos de agentes terapéuticos (agentes anti-cáncer) incluyen, pero no se limitan a, por ejemplo, agentes quimioterapéuticos, agentes inhibidores de crecimiento, agentes citotóxicos, agentes utilizados en terapia de radiación, agentes anti-angiogénesis, agentes apoptóticos, agentes anti-tubulina y otros agentes para tratar cáncer, tal como anticuerpos anti-HER-2, anticuerpos anti-CD20, un antagonista del receptor de factor de crecimiento epidérmico (EGFR) (por ejemplo, un inhibidor de cinasa de tirosina), inhibidor HER1/EGFR (por ejemplo erlotinib (TarcevaMR), inhibidores del factor de crecimiento derivado de plaquetas (por ejemplo, GleevecMR (Imatinib Mesylate)), un inhibidor COX-2 (por ejemplo, celecoxib), interferonas, citocinas, antagonistas (por ejemplo, anticuerpos de neutralización que enlazan a uno o más de los siguientes receptores ErbB2, ErbB3, ErbB4, PDGFR-beta, BlyS, APRIL, BC A ó VEGF, TRAIL/Apo2, y otros agentes químicos bioactivos y orgánicos, etc. Las combinaciones de los mismos están incluidas en la presente invención. El término "etiquetado con epítope" cuando se utiliza en la presente invención, se refiere a un mutante de anticuerpo fusionado a una "marca de epítope". El polipéptido de marca de epítope tiene suficientes residuos para proporcionar un epítope contra el cual se puede elaborar un anticuerpo, aún es lo suficientemente corto para no interferir con la actividad del mutante del anticuerpo. La marca de epítope también es preferentemente bastante única, de modo que el anticuerpo en contra no reaccione en forma substancialmente cruzada con otros epítopes. El polipéptido de marca adecuado, tiene generalmente al menos 6 residuos de aminoácidos y normalmente entre aproximadamente 8 y 50 residuos de aminoácidos (preferentemente entre aproximadamente 9 y 30 residuos). Los ejemplos incluyen el polipéptido de marca flu HA y su anticuerpo 12CA5 (Field y Asociados, Mol. Cell Biol. 8:2159-2165 (1988); la marca c-myc y los anticuerpos en contra 8F9, 3C7, 6E10, G4, B7, y 9E10 (Evan y Asociados, Mol. Cell. Biol. 5(12):3610-3616 (1985)); y la marca de glucoproteína de D (gD) de virus de herpes simplex y su anticuerpo (Paborsky y Asociados, Protein Engineering 3(6):547-553 (1990)). En ciertas modalidades, la marca de epítope es un "epítope de enlace de receptor salvaje". El término "agente citotóxico", tal como se utiliza en la presente invención se refiere a una substancia que inhibe o previene la función de células y/o origina la destrucción de las mismas. El término está proyectado para incluir isótopos radioactivos "por ejemplo, I131, I125, Y90, y Re186), agentes quimioterapéuticos y toxinas tales como toxinas enzi máticamente activas de origen bacteriano, fúngico, de plantas o animales o fragmentos de las mismas. Un "agente quimioterapéutico" es un compuesto químico útil en el tratamiento de cáncer. Los ejemplos de agentes quimioterapéuticos incluyen agentes de alquilación tales como tiotepa y ciclofosfamida CYTOXAN®; sulfonatos de alquilo tales como busulfan, improsulfan y piposulfan; aziridinas tales como benzodopa, carboquona, meturedopa, y uredopa; etileniminas y metilamelaminas incluyendo altretamina, trietilenemelamina, trietilenefosforamida, trietiienotiofosforamida y trimetilolomelamina; acetogeninas (especial bulatacina y bulatacinona); una camptotecina (incluyendo topotecan análogo sintético); briostatina; callistatina; CC-1065 (incluyendo sus análogos sintéticos de adozelesina, carzelesina y bizelesina); criptoficinas (particularmente criptoficina 1 y criptoficina 8); dolastatina; duocarmicina (incluyendo los análogos sintéticos, KW-2 89 y CB1-TM1); eleuterobina; pancratistatina; una sarcodictina; espongistatina; mostazas de nitrógeno tales como clorambucil, clornafazina, colofosfamida, estramustina, ifosfamida, mecloretamina, clorhidrato de óxido de mecloretamina, melfalan, novembiquina, fenesterina, prednimustina, trofosfamida, mostaza de uracilo; nitrosoureas tales como carmustina, clorozotocina, fotemustina, lomustina, nimustina y ranimustina; anticuerpos tales como los antibióticos de enediina (por ejemplo, calicheamicina, especialmente calicheamicina gamma li y calicheamicina gammall (ver por ejemplo, Angew, Chem. Intl. Ed. Enql., 33:183-186 (1994)); dinemicina, incluyendo dinemicina A; bisfosfonatos, tales como clordronato; una esperamicina; así como cromoforo de neocarzinostatina y cromoforos antibióticos de enediina de cromoproteína relacionada, aclacinomisinas, actinomicina, autramicina, azaserina, bleomicinas, cactinomicina, carabicina, carminomicina, carzinofilina, cromomicinis, dactinomicina, daunorrubicina, detorrubicina, 6-diazo-5-oxo-L-norleucina, doxorrubicina ADRIA YCIN® (incluyendo morfolino-doxorrubicina, cianomorfolino-doxorrubicina, 2-pirrolino-doxorrubicina y desoxidoxorrubicina), epirrubicina, esorrubicina, idarrubicina, marcelomicina, mitomicinas tales como mitomicina C, ácido micofenólico, nogalamicina, olivomicinas, peplomicina, potfiromicina, puromicina, quelamicina, rodorrubicina, estreptonigrina, estreptozocina, tubercidina, ubenimex, zinostatina, zorrubicina; anti-metabolitos tales como metotrexato y 5-fluorouracilo (5-FU); análogos de ácido fólico tales como denopterina, metotrexato, pteropterina, trimetrexato, análogos de purina tales como fludarabina, 6-mercaptopurina, tiamiprina, tioguanina; análogos de pirimidina tales como ancitabina, azacitidina, 6-azauridina, carmofur, citarabicina, didesoxiuridina, doxifluridina, enocitabina, floxuridina; andrógenos tales como calusterona, propionato de dromostanolona, epitiostanol, mepitlostano, testolactona; anti-adrenérgicos tales como aminoglutetimida, mitotano, trilostano; rellenador de ácido fólico tal como ácido frolínico; aceglatona; glucósida de aldofosfamida; ácido aminolevulínico; eniluracilo; amsacrina; bestrabucilo; bisantreno; edatraxato; defofamina; demecolcina; diaziquona; elfornitina; acetato de eliptinio; una epotilona; etoglucido; nitrato de galio; hidroxiurea; lentinano; lonidainina; maitansinoides tales como maitansina y ansamitocinas; mitoguazona; mitoxantrona; mopidanmol; nitraerina; pentostatina; fenamet; pirarrubicina; losoxantrona; ácido podofilínico; 2-etilhidrazida; procarbazina; complejo de polisacárido PSK® (JHS Natural Products, Eugene, OR); razoxano; tizoxina; sizofirano; espirogermanio; ácido tenuazónico; triazipona; 2,2',2"-triclorotrietilamina; tricotecenos (especialmente toxina T-2, verracurina A, roridina A y anguidina); uretano; vindesina; dacarbazina; manomustina; mitobronitol; mitolactol; pipobroman; gacitosina; arabinosida ("Ara-C"); ciclofosfamida; tiotepa; taxoides, por ejemplo paclitaxel TAXOL® (Bristol-Myers Squibb Oncology; Princeton, N. J.), formulación de paclitaxel de nanopartículas construida con albúmina libre de Cremophor ABRAXANEMR (American Pharmaceutical Partners, Schaumberg, Illinois), y doxetaxel TAXOTERE® (Rhone-Poulenc Rorer, Antony, Francia); cloranbucil; gemcitabina GEMZAR®; 6-tioguanina; mercaptopurina; metotrexato; análogos de platina tales como cisplatina y carboplatin; vinblastina; platino; etoposida (VP-16); ifosfamida; mitoxantrona; vincristina; vinorelbina NAVELBINE®; novantrona; teniposida; edatrexato; daunomicina; aminopterina; xeloda; ibandronato; irinotecan (Camptosar, CPT-11) (incluyendo el régimen de tratamiento de irinotecan con 5-FU y leucovoran); inhibidor de topoisomerasa RFS 2000; difluorometilornitina (DMFO); retinoides tales como ácido retinoico; capecitabina; combretastatina; leucovorina (LV); oxaliplatina, incluyendo el régimen de tratamiento de oxaliplatina (FOLFOX); inhibidores de PKC-alfa, Raf, H-Ras, EGFR (por ejemplo, erlotinib (TarcevaMR)) y VEGF-A que reducen la proliferación celular y las sales farmacéuticamente aceptables, ácidos o derivados de cualesquiera de los anteriores. También incluidos en estas definiciones están agentes anti-hormonales que actúan para regular o inhibir la acción de hormonas en tumores, tales como anti-estrógenos y moduladores de receptor de estrógeno selectivo (SERMs), incluyendo, por ejemplo, tamoxifen (incluyendo tamoxifen NOLVADEX®), raloxifeno, droloxifeno, 4-hidroxitamoxifen, trioxifeno, queoxifeno, LY117018, onapristona y toremifeno FARESTON; inhibidores de aromatasa que inhiben la aromatasa enzimática, que regula la producción de estrógenos en las glándulas suprarrenales, tales como, por ejemplo, 4(5)-¡midazoles, aminoglutetimida, acetato de megestrol MEGASE®, exemestano AROMASIN®, formestanie, fadrozol, vorozol RIVISOR®, letrozol FEMARA®, y anastrozol ARIMIDEX®; y anti-andrógenos tales como flutamida, nilutamida; bicalutamida, leuprolida y goserelina; así como troxacitabina (un análogo de citosina de nucleósido 1 , 3-dioxolano); oligonucleótidos anti-sentido, particularmente aquellos que inhiben la expresión de genes en trayectorias de señalización implicadas en proliferación aberrante de células, tales como, por ejemplo PKC-alfa, Raf y H-Ras, ribozimas, tales como inhibidor de expresión VEGF (ribozima ANGIOZYME®) y un inhibidor de expresión HER2; vacunas tales como vacunas de terapia genética, por ejemplo, vacuna ALLOVECTIN®, vacuna LEUVECTIN®, y vacuna VAXID®; rlL-2 PROLEUKIN®; inhibidor de topoisomerasa LURTOTECAN®; mRH ABARELIX®; Vinorelbina y esperamicinas (ver la Patente Norteamericana No. 4,675,187), y sales farmacéuticamente aceptables, ácidos o derivados de cualesquiera de los anteriores.

El término "profármaco" tal como se utiliza en la presente solicitud, se refiere a un precursor o derivado de una sustancia farmacéuticamente activa que es menos citotóxica para células de tumor, en comparación con el fármaco de origen y tiene la capacidad de ser activada en forma enzimática o convertida en la forma de origen más activa. Ver la Publicación de Wilman, "Prodrugs in Cáncer Chemotherapy" Biochemical Society Transactions, 14, páginas 375-382, 615° eeting Belfast (1986) y Stella y Asociados, "Prodrugs: A Chemical Approach to Targeted Drug Delivery", Directed Drug Delivery, Borchardt y Asociados, (ed.). páginas 247-267; Humana Press (1985). Los profármacos de la presente invención incluyen, pero no se limitan a, profármacos que contienen fosfato, profármacos que contienen tiofosfato, profármacos que contienen sulfato, profármacos que contienen péptidos, profármacos modificados por ácido D-amino, profármacos glicosilados, profármacos que contienen ß-lactam, profármacos que contienen fenoxiacetamida opcionalmente substituida o profármacos que contienen fenilacetamida opcionalmente substituida, 5-fluorocitosina y otros profármacos de 5-fluorouridina que pueden ser convertidos en el fármaco libre citotóxico más activo. Los ejemplos de fármacos citotóxicos que pueden ser derivados en una forma de profármaco para utilizarse en la presente invención, incluyen pero no se limitan a, los agentes quimioterapéuticos descritos anteriormente. Para el tratamiento de artritis reumatoide, el paciente puede ser tratado con un anticuerpo de la presente invención junto con uno o más de los siguientes fármacos: DMARDS (fármacos anti-reumáticos que modifican la enfermedad (por ejemplo metotrexato), NSAI y NSAID (fármacos anti-inflamatorios sin esteroides), HU IRAMR (adalimumab, Abbott Laboratories), ARAVA® (leflunomida), REM I CADE® (infliximab; Centocor Inc., de Malvem, Pa.), EN B RELMR (etanercept; Immunex, WA), inhibidores de COX-2. Los DMARDs que se utilizan comúnmente en RA son hidroxicloroquina, sulfasalazina, metotrexato, leflunomida, etanercept, infliximab, azatioprina, D-penicilamina, Gold (oral), Gold (intramuscular), minociclina, ciclosporina, inmunoadsorción de proteína estafilococal. El adalimumab es un anticuerpo monoclonal humano que enlaza a TNF. El infliximab es un anticuerpo monoclonal quimérico que enlaza TNF. El etanercept es una proteína de fusión "inmunoadhesina" que consiste en una parte de enlace de ligante extracelular del receptor de factor de necrosis de tumor (TNFR) de 75 kD (p75) de humano enlazada a la parte Fe de un lgG1 de humano. Para tratamiento convencional de RA, ver por ejemplo la Publicación de "Guidelines for the management of rheumatoid arthritis" Arthritis & Rheumatism 46(2):328-346 (Febrero de 2002). En una modalidad específica, el paciente RA se trata con un anticuerpo CD20 de la presente invención junto con metotrexato (MTX). Una dosis de ejemplo de MTX es de aproximadamente 7.5 a 25 mg/kg/semana. El MTX puede ser administrado oralmente o en forma subcutánea. Para el tratamiento de espondilitis de anquilosamento, artritis psoriática y enfermedad de Crohn, el paciente puede tratarse con un anticuerpo de la presente invención junto con, por ejemplo, Remicade® (infliximab; de Centocor Inc., de Malvern, Pa.), EMBREL (etanercept; Immunex, WA). Para tratamientos para SLE, el paciente puede ser tratado con un anticuerpo de la presente invención, por ejemplo, junto con una alta dosis de corticoesteroides y/o ciclofosfamida (HDCC). Para el tratamiento de psoriasis, se puede administrar a los pacientes un anticuerpo de la presente invención junto con tratamientos tópicos, tales como esteroides tópicos, antralina, calcipotrieno, clobetasol, y tazaroteno, o con metotrexato, retinoides, ciclosporina, terapias de PUVA y UVB. En una modalidad, el paciente con psoriasis se trata con el anticuerpo en forma de secuencias o en forma concurrente con ciclosporina. Una molécula de ácido nucleico ''aislada", es una molécula de ácido nucleico que se identifica y separa de al menos un molécula de ácido nucleico contaminante, con la cual se asocia ordinariamente en la fuente natural del ácido nucleico del anticuerpo. Una molécula de ácido nucleico aislada es diferente en la forma o ajuste en el cual se encuentra por naturaleza. Las moléculas de ácido nucleico aisladas, se distinguen por consiguiente de la molécula de ácido nucleico conforme existe en células naturales. Sin embargo, una molécula de ácido nucleico aislada incluye una molécula de ácido nucleico contenida en células que expresan ordinariamente el anticuerpo, en donde por ejemplo, la molécula de ácido nucleico está en una ubicación cromosomal diferente a la de las células naturales. La expresión "secuencias de control" se refiere a secuencias de ADN necesarias para la expresión de una secuencia de codificación enlazada en forma operable en un organismo huésped en particular. Las secuencias de control que son adecuadas para procarióticos , por ejemplo, incluyen un promotor, opcionalmente una secuencia operadora y un sitio de enlace de ribosomas. Las células eucarióticas se conocen por utilizar promotores, señales de poliadenilación y aumentadores. El ácido nucleico está "enlazado en forma operable", cuando se coloca en una relación funcional con otra secuencia de ácido nucleico. Por ejemplo, el ADN de una secuencia o líder de segregación está enlazado en forma operable al ADN de un polipéptido, si se expresa como una preproteína que participa en la secreción del polipéptido; un promotor o aumentador está enlazado en forma operable a una secuencia de codificación si afecta la transcripción de la secuencia; o un sitio de enlace de ribosomas está enlazado en forma operable a una secuencia de codificación, si se coloca para facilitar la traducción. Generalmente, el término "enlazado en forma operable" significa que las secuencias de ADN que están enlazadas están contiguas, y, en el caso del líder de segregación, contiguas y en fase de lectura. Sin embargo, los aumentadores no tienen que estar contiguos. El enlace se logra mediante ligación en los sitios de restricción convenientes. Si dichos sitios no existen, se utilizan adaptadores o enlazadores de oligonucleótidos sintéticos de acuerdo con la práctica convencional. Tal como se utiliza en la presente invención, las expresiones "célula", "línea celular" y "cultivo celular" se utilizan de manera intercambiable y todos son designaciones que incluyen progenie. Por lo tanto, las palabras "transformadores" y "células transformadas" incluyen la célula sujeto primaria y cultivos derivados de la misma sin importar el número de transferencias. También quedará entendido que toda la progenie puede no ser precisamente idéntica en el contenido de ADN, debido a mutaciones deliberadas o inadvertidas. Se incluyen progenies de mutantes que tienen la misma función o actividad biológica tal como se clasifican en la célula transformada en forma original. En donde se proyectan designaciones distintas, se aclarará en el contexto. II. Modos para llevar a cabo la presente invención. Anticuerpos anti-VEGF de alta afinidad sintéticos La presente invención proporciona anticuerpos anti-VEGF novedosos, con alta afinidad de enlace a VEGF. Los métodos de ejemplo para generar anticuerpos se describen con mayor detalle en las siguientes secciones. Los anticuerpos anti-VEGF novedosos se seleccionan utilizando el antígeno VEGF derivado de una primera especie de mamíferos. Preferentemente, el antígeno es VEGF humano (hVEGF). Sin embargo, los VEGFs de otras especies, tales como VEGF de múrido (mVEGF) también se pueden utilizar como el primer antígeno objetivo. Los antígenos VEGF de diversas especies de mamíferos pueden aislarse de fuentes naturales. En otras modalidades, el antígeno se produce en forma recombinante o se elabora utilizando otros métodos sintéticos conocidos en la técnica.

El anticuerpo seleccionado normalmente tendrá una afinidad de enlace suficientemente fuerte para el primer antígeno VEGF. Por ejemplo, el anticuerpo puede enlazar a hVEGF con un valor kD no mayor a 5 nM, preferentemente no mayor a aproximadamente 2 nM, y más preferentemente no mayor a aproximadamente 500 pM. Las afinidades de anticuerpo pueden determinarse a través de un ensayo a base de resonancia de plasmón de superficie (tal como el ensayo BIAcore que se describe en los ejemplos); ensayo inmunoabsorbente enlazado por enzima (ELISA); y ensayos de competición (por ejemplo, RIA's), por ejemplo. Asimismo, el anticuerpo puede someterse a otros ensayos de actividad biológica, por ejemplo, con el objeto de evaluar su efectividad como terapéutico. Dichos ensayos se conocen en la técnica y dependen del antígeno objetivo y uso pretendido del anticuerpo. Los ejemplos incluyen el ensayo de inhibición HUVEC (tal como se describe en los ejemplos que se encuentran más adelante); ensayos de inhibición de crecimiento de células de tumor (tal como se describe por ejemplo en la Publicación WO 89/06692); ensayos de citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo (ADCC) y de citotoxicidad transmitida por complemento (CDC) (Patente Norteamericana No. 5,500,362); y actividad agonística o ensayos de hematopoyesis (ver Publicación WO 95/27062). Para la clasificación de anticuerpos que enlazan a un epítope en particular en el antígeno de interés, se puede llevar a cabo un ensayo de bloqueo cruzado de rutina, tal como el que se describe en la Publicación de Antibodies, A. Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow and David Lañe (1988). Como alternativa, se puede llevar a cabo el mapeo de epítopes, por ejemplo tal como se describe en la Publicación de Champe y Asociados, J. Biol. Chem. 270:1388-1394 (1995), para determinar si el anticuerpo enlaza a un epítope de interés. Posteriormente se puede determinar la especificidad de especie de los anticuerpos novedosos. La afinidad de enlace del anticuerpo para un homólogo del antígeno utilizado para seleccionar el anticuerpo (en donde el homólogo es de la "segunda especie de mamíferos") se evalúa utilizando técnicas tales como las descritas anteriormente. En modalidades preferidas, las segundas especies de mamíferos es un mamífero no humano al cual se administrará el anticuerpo en estudios preclínicos. Por consiguiente, la segunda especie de mamífero puede ser un primate no humano, tal como mono rhesus, cinomolgus, baboon, chimpancé y macaco. En otra modalidad, la segunda especie mamífera puede ser, por ejemplo, un roedor (por ejemplo, ratón o rata), gato o perro. Aunque el método preferido de la presente invención para determinar la dependencia de las especies (y para evaluar los mutantes de anticuerpos con propiedades mejoradas; ver más adelante) es para cuantificar la afinidad de enlace de anticuerpos, en otras modalidades de la presente invención, se evalúan una o más propiedades biológicas del anticuerpo sintético o variantes de anticuerpos además de, o en lugar de, determinaciones de afinidad de enlace. Anteriormente se describieron ensayos biológicos de ejemplo. Dichos ensayos son particularmente útiles cuando proporcionan una indicación de la efectividad terapéutica del anticuerpo. Normalmente, aunque no de manera necesaria, los anticuerpos que muestran propiedades mejoradas en dichos ensayos, tendrán una afinidad de enlace mejorada. Por lo tanto, en una modalidad de la presente invención, cuando el ensayo de elección es un ensayo de actividad biológica diferente a un ensayo de afinidad de enlace, el anticuerpo dependiente de la especie normalmente tendrá una "actividad biológica" utilizando un "materia" (por ejemplo, antígeno, célula, tejido, órgano o animal completo) de la segunda especie de mamíferos que es de al menos 50 veces, o al menos aproximadamente 500 veces o al menos aproximadamente 1000 veces menos efectivo que su actividad biológica en un ensayo correspondiente utilizando reactivos de la primera especie de mamíferos. Posteriormente el anticuerpo dependiente de la especie se altera para generar un mutante de anticuerpo el cual tiene una afinidad de enlace más fuerte para el antígeno procedente de la segunda especie de mamíferos, que el anticuerpo dependiente de la especie. El muíante de anticuerpo tiene preferentemente una afinidad de enlace para el antígeno del mamífero no humano, la cual es al menos aproximadamente 10 veces más fuerte, preferentemente al menos aproximadamente 20 veces más fuerte, más preferentemente al menos aproximadamente 50 veces más fuerte, y algunas veces al menos aproximadamente 100 veces ó 200 veces más fuerte, que la afinidad de enlace del anticuerpo dependiente de la especie para el antígeno. El aumento en afinidad de enlace deseado requerido dependerá de la afinidad de enlace inicial del anticuerpo dependiente de la especie. Cuando el ensayo utilizado es un ensayo de actividad biológica, el muíante de aníicuerpo tiene preferentemente una actividad biológica en el ensayo de elección, la cual es al menos aproximadamente 10 veces mejor, preferentemeníe al menos aproximadamente 20 veces mejor, más preferentemente al menos aproximadamente 50 veces mejor, y algunas veces aproximadamente 100 veces ó 200 veces mejor, que la actividad biológica del anticuerpo dependiente de la especie en este ensayo. Para generar el mutante de anticuerpos, se introducen una o más alteraciones de aminoácidos (por ejemplo substituciones) en una o más regiones hipervariables del anticuerpo dependiente de la especie. Como alternativa, o en adición, se puede introducir una o más alteraciones (por ejemplo, substituciones) de los residuos de región de estructura en el anticuerpo dependiente de la especie, en donde esto da como resultado una mejoría en la afinidad de enlace del mutante de anticuerpo del antígeno procedente de la segunda especie de mamífero. Los ejemplos de residuos de la región de estructura para modificación incluyen los que enlazan el antígeno directamente en forma no covalente (Amit y Asociados, Science 233:747-753 (1986)); interactúan con/efectúan la conformación de un CDR (Chothia y Asociados, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)); y/o participan en la interfase VL-VH (Patente EP 239,400 B1). En ciertas modalidades, la modificación de uno o más de dichos residuos de región de estructura, dan como resultado un aumento de la afinidad de enlace del anticuerpo del antígeno procedente de la segunda especie de mamíferos. Por ejemplo, de aproximadamente 1 hasta aproximadamente 5 residuos de estructura pueden alterarse en esta modalidad de la presente invención. Algunas veces, esto puede ser suficiente para producir un mutante de anticuerpo adecuado para utilizarse en ensayos preclínicos, incluso cuando ninguno de los residuos de región hipervariable ha sido alterado. Sin embargo, normalmente el anticuerpo mutante comprenderá alteraciones hipervariables de la región hipervariable. Los residuos de la región hipervariable que se alteran pueden cambiarse en forma aleatoria, especialmente cuando la afinidad de enlace de inicio del anticuerpo dependiente de la especie para el antígeno procedente de la segunda especie de mamíferos, es tal que dichos mutantes de anticuerpo producidos en forma aleatoria pueden ser clasificados fácilmente. Un procedimiento útil para generar dichos mutantes de anticuerpo es denominado "mutagénesis de exploración de alanina" (Cunningham and Wells, Science 244:1081-1085 (1989)). Aquí, se reemplazan uno o más de los residuos de región hipervariable por residuos de alanina o polialanina para afectar la interacción de los aminoácidos con el antígeno procedente de la segunda especie de mamíferos. Los residuos de región hipervariable que demuestran sensibilidad funcional para las substituciones, se refinan posteriormente introduciendo mutaciones adicionales en o para los sitios de substitución. Por lo tanto, aunque el sitio para introducir una variación de secuencia de aminoácidos es predeterminado, no necesita ser predeterminada la naturaleza de la propia mutación. Los mutantes-ala producidos de esta forma, son clasificados con respecto a su actividad biológica, tal como aquí se describe. Otro procedimiento para generar dichos mutantes de anticuerpos comprende maduración de afinidad utilizando despliegue de fagos (Hawkins y Asociados, J. Mol. Biol. 254:889-896 (1992) y Lowman y Asociados, Biochemistry 3 (45):10832-10837 (1991)). En síntesis, se mutan varios sitios de región hipervariable (por ejemplo, 6 a 7 sitios), para generar todas las posibles susbtituciones amino en cada sitio. Los mutantes de anticuerpos generados de esta forma se despliegan en un modo monovalente a partir de las partículas de fago filamentoso como fusiones para el producto de gen III de M13 empaquetado con cada partícula. Las mutantes desplegadas por fagos posteriormente se clasifican con respecto a su actividad biológica (por ejemplo, afinidad de enlace) tal como aquí se describe. La presente invención también proporciona un método más sistemático para identificar residuos de aminoácido que hay que modificar. De acuerdo con este método, se identifican los residuos de región hipervariable en el anticuerpo dependiente de las especies que están involucradas en el enlace del antígeno procedente de la primera especie de mamífero y los residuos de región hipervariable involucrados en el enlace de un homólogo de dicho antígeno procedente de la segunda especie de mamíferos. Para lograr esto, se puede llevar a cabo una exploración de una alanina de los residuos de región hipervariable del anticuerpo dependiente de la especie, con cada mutante-ala que está siendo probado con respecto al enlace al antígeno a partir de la primera y segunda especies de mamíferos. Como alternativa, las estructuras de cristal de rayos X de los complejos de anticuerpos-antígenos se analizan para contactar residuos, así como para rodear residuos (tal como se describe en los ejemplos). Los residuos de región hipervariable involucrados en el enlace del antígeno procedente de la primera especie de mamífero (por ejemplo humano) y los que se involucran en el enlace del homólogo del antígeno procedente de la segunda especie de mamíferos (por ejemplo, mamíferos no humanos) se identifican de esta forma. Preferentemente, los residuos involucrados en forma significativa en el enlace del antígeno procedente de la segunda especie de mamíferos (por ejemplo mamífero no humano) pero no el antígeno procedente de la primera especie de mamíferos (por ejemplo, humano) se eligen como candidatos de modificación. En otra modalidad, los residuos involucrados en forma significativa en el enlace del antígeno procedente tanto de la primera como de la segunda especie de mamíferos se seleccionan para ser modificados (por ejemplo, ver ejemplos que se encuentran más adelante). Aún en otra modalidad, aunque menoé preferida, se seleccionan para modificación los residuos involucrados en el enlace del antígeno de la primera especie de mamíferos, pero no la segunda especie de mamíferos. Dicha modificación puede comprender la eliminación del residuo o inserción de uno o más residuos adyacentes al mismo. Sin embargo, normalmente la modificación involucra la substitución del residuo por otro aminoácido. Normalmente se puede iniciar con una substitución conservadora, tal como la que se muestra más adelante bajo el encabezado de "substituciones preferidas". Si las. substituciones dan como resultado un cambio en la actividad biológica (por ejemplo afinidad de enlace) entonces se introducen más cambios substanciales, denominados "substituciones de ejemplo" en las siguiente tabla, o tal como se describirá de manera adicional más adelante con referencia a las clases de aminoácidos, y los productos clasificados.

Substituciones preferidas Residuos Substituciones Substituciones Originales de Ejemplo Preferidas Ala (A) val; leu; ile val Arg(R) lys; gln; asn lys Asn ( ) gln; his; lys; arg gln Asp (D) glu glu Cys (C) ser ser Gln(Q) asn asn Glu (E) asp asp Gly(G) pro; ala ala His (H) asn; gln; lys; arg arg Ile(I) leu; val; met; ala; leu phe; norJeucina Leu (L) norleucina ; ile; val; ile met; ala; phe Lys(K) arg; gln; asn arg Met(M) leu; phe; ile leu Phe (F) leu; val; ile; ala; tyr leu Pro (P) ala ala Ser(S) thr Thr(T) ser ser Trp(W) tyr; phe tyr Tyr(Y) trp; phe; thr; ser phe Val(V) ile; leu; met; phe; leu ala; norleucina Incluso se pueden lograr modificaciones más substanciales en las propiedades biológicas de los anticuerpos, seleccionando substituciones que difieren significativamente en su efecto en mantener, (a) la estructura del esqueleto del polipéptido en el área de la substitución, por ejemplo, en la forma de una hoja o conformación helicoidal, (b) la carga o hidrofobicidad de la molécula en el sitio objetivo, o (c) el volumen de la cadena lateral. Los residuos que ocurren naturalmente se dividen en grupos con base en las propiedades de cadena lateral comunes: (1) hidrofóbico; norleucina, met, ala, val, leu, ile; (2) hidrofílicos neutrales: cys, ser, thr, asn, gln; (3) ácido: asp, glu ; (4) básico: his, lys, arg; (5) residuos que influencian la orientación de la cadena: gly, pro; y (6) aromático: trp, tyr, phe. Las substituciones sin conservadores comprenderán el intercambio de un miembro de una de estas clases por otra clase . En otra modalidad, los sitios seleccionados para modificación tienen afinidad madura utilizando despliegue de fagos (ver anteriormente). Las moléculas de ácido nucleico que codifican los mutantes de secuencia de aminoácidos se preparan a través de una variedad de métodos conocidos en la técnica. Estos métodos incluyen, pero no se limitan a, mutagénesis transmitida por oligonucleótidos (o dirigida al sitio), mutagénesis PCR y mutagénesis de cinta de un muíante preparado anteriormente o una versión sin mutante del anticuerpo dependiente de la especie. El método preferido para elaborar mutantes es mutagénesis dirigida al sitio (ver por ejemplo la Publicación de Kunkel, Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 82:488 (1985)). En ciertas modalidades, el mutante de anticuerpo tendrá únicamente un solo residuo de región hipervariable substituido. En otras modalidades, dos o más de los residuos de región hipervariable del anticuerpo dependiente de la especie habrán sido substituidos, por ejemplo, de aproximadamente 2 hasta aproximadamente 10 substituciones de región hipervariable. Por ejemplo, la variante del anticuerpo anti-VEGF murinizado del ejemplo que se encuentra más adelante, tuvo cuatro substituciones de región hipervariable. Ordinariamente, el mutante de anticuerpos con propiedades biológicas mejoradas tendrá una secuencia de aminoácidos que tiene al menos el 75% de identidad de secuencia de aminoácidos o similitud con la secuencia de aminoácidos ya sea del dominio variable de cadena pesada o ligera del anticuerpo dependiente de las especies, más preferentemente al menos el 80%, más preferentemente al menos el 85%, más preferentemente al menos el 90% y lo más preferentemente al menos el 95%. La identidad o similitud con respecto a esta secuencia, se define en la presente invención como el porcentaje de residuos de aminoácido en la secuencia candidata que son idénticos (es decir, el mismo residuo) similares (es decir residuo de aminoácido del mismo grupo con base en las propiedades de cadena lateral en común, ver más adelante) con residuos de anticuerpos dependientes de las especies, después dé alinear las secuencias e introducir aberturas, si es necesario, para lograr el porcentaje máximo de identidad de la secuencia. Ninguna de las extensiones, eliminaciones o inserciones de terminal-N, terminal-C, o internas en las secuencias de anticuerpos fuera del dominio variable, deberán construirse de modo que afecten la identidad o similitud de la secuencia. Después de la producción de un mutante de anticuerpo, se determina la actividad biológica de dicha1 molécula con relación al anticuerpo dependiente de la especie. Tal como se observó anteriormente, esto puede comprender determinar la afinidad de enlace y/o otras actividades biológicas del anticuerpo. En una modalidad preferida de la presente invención, se preparó anteriormente un panel de mutantes de anticuerpos y se clasificaron con respecto a la afinidad del enlace del antígeno procedente de la segunda especie de mamífero. Uno o más de los mutantes de anticuerpo seleccionados de esta clasificación inicial, se someten opcionalmeníe a uno o más ensayos de actividad biológica adicional para confirmar que el mutante del anticuerpo con afinidad de enlace mejorada es útil, por ejemplo, para estudios preclínicos. En modalidades preferidas, el mutante de anticuerpo retiene la capacidad de enlace de antígeno procedente de la primera especie de mamíferos con una afinidad de enlace similar al anticuerpo dependiente de la especie. Esto se puede lograr evitando la alteración de los residuos de región hipervariable involucrados en el enlace del antígeno procedente de la primera especie de mamíferos. En otras modalidades, el mutante de anticuerpos puede tener una afinidad de enlace significativamente alterada para el antígeno procedente de la primera especie de mamíferos (por ejemplo, la afinidad de enlace para dicho antígeno es preferentemente mejor, aunque puede ser peor que el anticuerpo dependiente de la especie). El mutante de anticuerpo ya seleccionado, puede ser sometido a modificaciones adicionales, que dependen con frecuencia del uso pretendido del anticuerpo. Dichas modificaciones pueden comprender alteración adicional de la secuencia de aminoácidos, fusión al polipéptido heterólogo y/o modificaciones covalentes tales como las que se elaboran más adelante. Con respecto a las alteraciones de la secuencia de aminoácidos, se elaboraron anteriormente modificaciones de ejemplo. Por ejemplo, cualquier residuo de cisteína que no esté involucrado en mantener la conformación adecuada del muíante del anticuerpo también será substituido, generalmente con serina, para mejorar la estabilidad oxidativa de la molécula y prevenir la reticulación aberrante. De manera inversa, los enlaces de cisteína pueden agregarse al anticuerpo para mejorar su estabilidad (particularmente cuando el anticuerpo es un fragmento de anticuerpos tal como un fragmento Fv). Otro tipo de mutantes de aminoácido tiene un patrón de glucosilación alterado. Esto se puede lograr eliminando una o más . porciones de carbohidratos que se encuentran en el anticuerpo, y/o agregando uno o más sitios de glucosilación que no se encuentran en el anticuerpo. La glucosilación de los anticuerpos normalmente es ya sea enlazada por N ó enlazada por O. Enlazado-N se refiere a la adhesión de la porción de carbohidrato a la cadena lateral de un residuo de asparagina. La asparagina-X-serina y la asparagina-X-treonina de las secuencias de tripéptido, en donde X es cualquier aminoácido excepto prolina, son las secuencias de conocimiento para la adhesión enzimática de la porción de carbohidrato a la cadena lateral de asparagina. Por lo tanto, la presencia de cualesquiera de estas secuencias de tripéptido en un polipéptido crea un sitio de glucosilación potencial. La glucosilación enlazada-0 se refiere a la-adhesión de una de las N-aceilgalactosamina, galactosa, o xilosa de azúcares a un hidroxiaminoácido, más comúnmente serina o treonina, aunque también se puede utilizar 5-hidroxiprolina o 5-hidroxilisina. La adición de los sitios de glucosilación al anticuerpo, se logra en forma conveniente alterando la secuencia de aminoácido de modo que contenga una o más de las secuencias de tripéptidos antes descritas (para sitios de glucosilación enlazados-N). También se puede hacer la alteración a través de la adición de, o en sustitución de, uno o más residuos de serina o treonina para la secuencia del anticuerpo original (para sitios de glucosilación enlazados-O). Las técnicas para producir anticuerpos, las cuales pueden ser dependientes de la especie y por consiguiente requerir modificación de acuerdo con las técnicas elaboradas en la presente invención, son tal como se indica a continuación: A. Generación de Anticuerpos Anti-VEGF de Alta Afinidad a Partir de Bibliotecas de Fago de Anticuerpos Sintético La presente Invención también proporciona un método para generar y seleccionar anticuerpos anti-VEGF de alta afinidad novedosos utilizando un método de despliegue de fagos único. El método comprende la generación de las bibliotecas de fago de anticuerpos sintéticos con base en una sola plantilla de estructura, el diseño de suficientes diversidades dentro de dominios variables, despliegues de polipéptidos que tienen dominios variables diversificados, selección de anticuerpos candidatos con alta afinidad para el antígeno VEGF objetivo, y aislamiento de los anticuerpos seleccionados. Los detalles de los métodos de despliegue de fagos pueden encontrarse, por ejemplo, en la Solicitud Provisional Norteamericana No. 60/385,338 (presentada el 3 de junio del 2002) y solicitudes relacionadas, cuyas descripciones totales están incorporadas en forma expresa a la presente invención como referencia. En un aspecto, las bibliotecas de anticuerpos utilizadas en la presente invención, pueden ser generadas mutando las posiciones accesibles de solvente y/o altamente diversas en al menos un CDR de un dominio variable de anticuerpo. Algunos o todos de los CDRs pueden ser mutados utilizando los métodos aquí proporcionados. En algunas modalidades, puede ser preferible generar diversas bibliotecas de anticuerpos mutando posiciones en CDRH1, CDRH2, y CDRH3 mutando posiciones en CDRL3 y CDRH3 para formar una sola biblioteca o mutando posiciones en CDRL3 y CDRH1, CDRH2 y CDRH3 para formar una sola biblioteca. Se puede generar una biblioteca de dominios variables de anticuerpos, por ejemplo, teniendo mutaciones en las posiciones accesibles de solventes y/o altamente diversas de CDRH1, CDRH2 y CDRH3. Se puede generar otra biblioteca teniendo mutaciones en CDRL1, CDRL2 y CDRL3. Estas bibliotecas también pueden ser utilizadas junto con cada una de las otras para generar enlazadores de afinidad deseadas. Por ejemplo, después de una o más vueltas de selección de bibliotecas de cadena pesada para enlazar a un antígeno objetivo, se puede reemplazar una biblioteca de cadena ligera en la población de los enlazadores de cadena pesada para vueltas de selección adicionales, para incrementar la afinidad de los enlazadores. Preferentemente, se crea una biblioteca mediante la sustitución de aminoácidos originales con aminoácidos variantes en la región CDRH3 de la región variable de la secuencia de cadena pesada. La biblioteca resultante puede contener una pluralidad de secuencias de anticuerpos, en donde la diversidad de secuencias está principalmente en la región DCRH3 de la secuencia de cadena pesada. En un aspecto, se crea la biblioteca dentro del contexto de la secuencia 4D5 del anticuerpo humanizado o en la secuencia de 4D5 del anticuerpo humanizado. Preferentemente, la biblioteca es creada mediante la sustitución al menos de los residuos 95 a 100a de la cadena pesada con los aminoácidos codificados por el ajuste de codón DVK, en donde el ajuste de codón DVK se utiliza para codificar un grupo de aminoácidos variantes para cada una de estas posiciones. Un ejemplo de un grupo de oligonucieótidos que es útil para crear estas sustituciones comprende la secuencia (DVK)7. En algunas modalidades, se crea una biblioteca mediante la sustitución de los residuos 95 a 100a con aminoácidos codificados por los grupos de codón tanto DVK como NNK. Un ejemplo de un grupo de oligonucieótidos que es útil para crear estas sustituciones, comprende la secuencia (DVK)6(NNK). En otra modalidad, se crea una biblioteca mediante la sustitución al menos de los residuos 95 a 100a con aminoácidos codificados por grupos de codón tanto DVK como NNK. Un ejemplo de un grupo de oligonucieótidos que es útil para crear estas sustituciones, comprende la secuencia (DVK)5(NNK). Otro ejemplo de un grupo de oligonucieótidos que es útil para crear estas sustituciones comprende las secuencias (NNK)6. Otros ejemplos de secuencias de oligonucieótidos adecuados pueden ser determinadas por un experto en la técnica de acuerdo con el criterio aquí descrito.

En otra modalidad, se utilizan diferentes diseños CDRH3 para aislar enlazadores de alta afinidad y para aislar enlazadores para una variedad de epítopes. El rango de longitudes de CDRH3 generada en esta biblioteca es de 11 a 13 aminoácidos, aunque también se pueden generar diferentes longitudes a esta. Se puede expandir la diversidad H3 utilizando grupos de codón NNK, DVK y NVK, así como una diversidad más limitada en la terminal-N y/o terminal-C. También se puede generar diversidad en CDRH1 y CDRH2. Los diseños de las diversidades CDR-H1 y H2 siguen la estrategia de dirigirse al repertorio de anticuerpos naturales miméticos tal como se describe con la modificación que se enfoca en la diversidad en una forma que coincide en forma más cercana con la diversidad natural que el diseño anterior. Para la diversidad en CDRH3, se pueden construir múltiples bibliotecas por separado con diferentes longitudes de H3 y posteriormente combinarse para seleccionar enlazadores para antígenos objetivo. Las bibliotecas múltiples pueden ser reunidas y clasificadas utilizando métodos de selección de soporte sólido y de clasificación de solución tal como se describió anteriormente y como se describirá más adelante en la presente invención. Se pueden emplear estrategias de clasificación múltiple. Por ejemplo, una variación comprende clasificar un enlace objetivo a un sólido, seguido de clasificar una etiqueta que puede encontrarse en el polipéptido de fusión (por ejemplo etiqueta anti-gD) y seguido de otra clasificación en el enlace objetivo al sólido. Como alternativa, las bibliotecas pueden ser clasificadas primero en un enlace objetivo a una superficie sólida, posteriormente los enlazadores eluidos se clasifican utilizando enlace de fase de solución con concentraciones en disminución del antígeno objetivo. Al utilizar combinaciones de diferentes métodos de clasificación se proporciona una minimización de la selección de únicamente secuencias expresadas en forma superior y proporciona la selección de un número de diferentes clones de alta afinidad. Los enlazadores de alta afinidad para el antígeno VEGF objetivo pueden aislarse de las bibliotecas. La limitación en diversidad en la región H1/H2 disminuye la degeneración aproximadamente 104 a 105 veces y permite más diversidad H3 que proporciona más enlazadores de alta afinidad. Utilizando bibliotecas con diferentes tipos de diversidad en CDRH3 (por ejemplo, utilizando DVK ó NVT) se proporciona el aislamiento de enlazadores que pueden enlazar a diferentes epítopes de un antígeno objetivo. De los enlazadores aislados de las bibliotecas reunidas tal como se describió anteriormente, se ha descubierto que la afinidad puede mejorarse en forma adicional proporcionando diversidad limitada en la cadena ligera. La diversidad de cadena ligera se genera en esta modalidad, tal como se indica en CDRL1: la posición de aminoácido 28 es codificada por RDT; la posición de aminoácido 29 es codificada por RKT; la posición de aminoácido 30 es codificada por RVW; la posición de aminoácido 31 es codificada por ANW; la posición de aminoácido 32 es codificada por THT; opcionalmente, la posición de aminoácido 33 es codificada por CTG; en CDRL2: la posición de aminoácido 50 es codificada por KBG; la posición de aminoácido 53 es codificada por AVC; y opcionalmente, la posición de aminoácido 55 es codificada por GMA; en CDRL3: la posición de aminoácido 91 es codificada por T T ó SRT o ambas; la posición de aminoácido 92 es codificada por DMC; la posición de aminoácido 93 es codificada por RVT; la posición de aminoácido 94 es codificada por NHT; y la posición de aminoácido 96 es codificada por TWT ó YKG o ambas. En otra modalidad, se genera una biblioteca o bibliotecas con diversidad en las regiones CDRH1, CDRH2, y CDRH3. En esta modalidad, la diversidad en CDRH3 es generada utilizando una variedad de longitudes de regiones H3 y utilizando principalmente el grupo de codón XYZ y NNK o NNS. Las bibliotecas se pueden formar utilizando oligonucleótidos individuales y agrupados o oligonucleótidos que pueden ser agrupados para formar un subgrupo de bibliotecas. Las bibliotecas de esta modalidad pueden ser clasificadas contra enlace objetivo al sólido. Los clones aislados de múltiples clasificaciones pueden ser clasificados para especificidad y afinidad utilizando ensayos ELISA. Para especificidad, los clones pueden ser clasificados contra los antígenos objetivo deseados, así como otros antígenos no objetivo. Los enlazadores para el antígeno VEGF objetivo pueden ser clasificados por afinidad en el ensayo ELISA de competición de enlace de solución o ensayo de competición de manchado. Se pueden aislar enlazadores de alta afinidad a partir de la biblioteca utilizando los grupos de codón XYZ preparados tal como se describió anteriormente. Estos enlazadores pueden producirse fácilmente en la forma de anticuerpos o fragmentos de enlace de antígenos con una alta producción en el cultivo celular. En algunas modalidades, puede ser recomendable generar bibliotecas con una mayor diversidad en longitudes de la región CDRH3. Por ejemplo, puede ser recomendable generar bibliotecas con regiones CDRH3 que fluctúan de 7 a 19 aminoácidos. Los enlazadores de alta afinidad aislados de las bibliotecas de estas modalidades, se pueden producir fácilmente en altas producciones en el cultivo de célula bacteriana y eucariótica. Los vectores pueden ser diseñados para eliminar fácilmente las secuencias tales como etiquetas gD, secuencia de componente de proteína de recubrimiento viral, y/o para agregarse en secuencias de región constante para proporcionar la producción de los anticuerpos de longitud total o los fragmentos de enlace de antígenos con un alto rendimiento. Se puede combinar una biblioteca con mutaciones en CDRH3 con una biblioteca que contiene versiones variantes de otros CDRs, por ejemplo, CDRL1 , CDRL2, CDRL3, CDRH1 y/o CDRH2. Por lo tanto, en una modalidad, se combina una biblioteca CDRH3 con una biblioteca CDRL3 creada dentro del contexto de la secuencia de anticuerpo 4D5 humanizada con aminoácidos variantes en las posiciones 28, 29, 30, 31 y/o 32 utilizando grupos de codones predeterminados. En otra modalidad, se puede combinar una biblioteca con mutaciones para el CDRH3 con una biblioteca que comprende dominios variables de cadena pesada CDRH1 y/o CDRH2 variantes. En una modalidad, se crea la biblioteca CDRH1 con la secuencia de anticuerpo 4D5 humanizado con aminoácidos variantes en las posiciones 8, 30, 31, 32 y 33. Se puede crear una biblioteca CDRH2 con la secuencia del anticuerpo 4D5 humanizado, con aminoácidos variantes en las posiciones 50, 52, 53, 54, 56 y 58, utilizando los grupos de codón predeterminados. B. Vectores, Células Huésped v Métodos Recombinantes El anticuerpo anti-VEGF de la presente invención, puede ser producido en forma recombinante, utilizando técnicas y materiales que se pueden obtener fácilmente. Para producción recombinante de un anticuerpo anti-VEGF, el ácido nucleico de codificación es aislado y se inserta en un vector replicable para clonación adicional (amplificación del ADN) o para expresión. El ADN que codifica el anticuerpo es aislado fácilmente o sintetizado utilizando procedimientos convencionales (por ejemplo, utilizando sondas de oligonucleótidos que tienen la capacidad de enlazar en forma específica a ADNs que codifican las cadenas pesadas y ligeras del anticuerpo). Están disponibles muchos vectores. Los componentes del vector generalmente incluyen, pero no se limitan a, uno o más de los siguientes: una secuencia de señal, un origen de réplica, uno o más genes marcadores, un elemento aumentador, un promotor, y una secuencia de terminación de trascripción . (i) Componente de secuencia de señal. El anticuerpo de la presente invención puede producirse en forma recombinante no únicamente directamente, sino también como un polipéptido de fusión con un polipéptido heterólogo el cual es preferentemente una secuencia de señal u otro polipéptido que tiene un sitio de disociación específico en el término-N de la proteína o polipéptido maduro. La secuencia de señal heteróloga seleccionada preferentemente, es una que es reconocida y procesada (por ejemplo disasociada a través de una peptidasa de señal) a través de la célula huésped. Para células huésped procarióticas que no reconocen y procesan la secuencia de señal de anticuerpo nativo, la secuencia de señal se sustituye por una secuencia de señal procariótica seleccionada, por ejemplo, del grupo de la fosfatasa alcalina, penicilinasa, 1pp, o líderes de enterotoxina II estable con calor. Para la secreción de levadura, la secuencia de señal nativa puede ser sustituida, por ejemplo, por el líder de invertasa de levadura, el líder de factor alfa (incluyendo líderes de factor de Sccharomyces y Kluyveroyces) , o el líder de fosfatasa de ácido, o el líder de glucoamilasa C. albicans o la señal descrita en la publicación WO 90/13646. En expresión de células de mamífero, las secuencias de señal de mamífero así como los líderes de segregación viral, por ejemplo, la señal gD de Herpes Simple están disponibles. El ADN para dicha región precursora está ligada en la estructura de lectura al ADN que codifica el anticuerpo. (i¡) Origen de componente de réplica.

Tanto los vectores de expresión como de clonación contienen una secuencia de ácido nucleico que permite al vector replicarse en una o más células huésped seleccionadas. Generalmente, en vectores de clonación esta secuencia es una secuencia que permite al vector replicarse en forma independiente del ADN cromosomal huésped e incluye orígenes de réplica o secuencias de réplica en forma autónoma. Dichas secuencias son bien conocidas para una variedad de bacteria, levadura y víruses. El origen de réplica del pBR322 de plásmido es adecuado para la mayor parte de las bacterias Gram-negativas, el origen de plásmido 2µ es adecuado para levadura, y diversos orígenes virales (SV40, Polioma, adenovirus, VSV ó BPV) son útiles para clonación de vectores en células mamíferas. Generalmente, el origen del componente de réplica no se necesita para vectores de expresión de mamífero (el origen SV40, normalmente puede ser utilizado únicamente debido a que contiene el promotor temprano). (iii) Selección de componente de gen Los vectores de expresión y clonación pueden contener un gen de selección, también denominado un marcador seleccionable. Los genes de selección típicos que codifican proteínas que (a) confieren resistencia a antibióticos u otras toxinas, por ejemplo, ampicilina, nemicina, metotrexato, o tetraciclina, (b) deficiencias auxotróficas de complemento, o (c) suministro de nutrientes críticos no disponibles del medio de complejo, por ejemplo, el gen que codifica racemasa D-alanina para Bacilli. Un ejemplo de un esquema de selección utiliza un fármaco para arrestar el crecimiento de una célula huésped. Las células que son transformadas en forma exitosa con un gen heterólogo, producen una proteína que confiere resistencia a fármacos y por lo tanto sobrevive el régimen de selección. Los ejemplos de dicha selección dominante utilizan la neomicina, ácido micofenólico e higromicina de fármacos. Otro ejemplo de marcadores seleccionables adecuados para células de mamíferos son aquellos que permiten la identificación de células competentes para tomar el ácido nucleico del anticuerpo, tal como DHFR, cinasa de timidina, metalotioneina-l y —II, preferentemente genes de metalotioneina, deaminasa de adenosina, descarboxilasa de ornitina, etc. Por ejemplo, las células transformadas con el gen de selección DHFR se identifican primero cultivando todos los transformantes en un medio de cultivo que contiene metotrexato (Mtx), un antagonista competitivo de DHFR. Una célula huésped adecuada, cuando DHFR tipo natural se emplea, es la línea celular de ovario de hámster Chino (CHO) con deficiencia en actividad DHFR. Como alternativa, las células huésped (particularmente huéspedes tipo natural que contienen DHFR endógeno) transformadas o co-transformadas con secuencias de ADN que codifican el anticuerpo, proteína DHFR tipo natural, y otros marcadores seleccionables tales como 3'-fosfotransferasa de aminoglucósido (APH) pueden ser seleccionados mediante crecimiento celular en un medio que contiene una agente de selección para el marcador seleccionable, tal como un antibiótico aminoglucosídico, por ejemplo, canamicina, neomicina o G418. Ver la Patente Norteamericana No. 4,965,199. Un gen de selección adecuado para utilizarse en levadura, es el gen trp1, que se encuentra en el plásmido de levadura YRp7 (Stinchcomb y asociados., Nature, 282:39 (1979)). El gen trp1 proporciona un marcador de selección para una cepa muíante de levadura que carece de la capacidad de crecer en triptofán, por ejemplo, ATCC No. 44076 ó PEP4-1. Jones, Genetics, 85:12 (1997). La presencia de la lesión trp 1 en el genoma de célula huésped de levadura, proporciona posteriormente un ambiente efectivo para detectar la transformación mediante crecimiento en la ausencia de triptofán. Similarmente, las cepas de levadura con deficiencia de Leu2 (ATCC 20,622 ó 38,626) se complementan a través de plásmidos conocidos que contienen el gen Leu2. Además, los vectores derivados de pKD1 de plásmido circular 1.6µG? pueden ser utilizados para transformación de levaduras Kluveromyces. Como alternativa, un sistema de expresión para la producción a gran escala de quimisina de becerro recombinante se reportó para K. Lactis. Van den Berg, Bio/Technology, 8:135 (1990). Los vectores de expresión de copias múltiples estables para secreción de albúmina de suero humano recombinante madura a través de cepas industriales de Kluyveromyces también han sido descritas. Fleer y asociados., Bio/Technology, 9:968-975 (1991 ). (iv) Componente de promotor Los vectores de expresión y clonación normalmente contienen un promotor que es reconocido por el organismo huésped y está enlazado en forma operativa al ácido nucleico de anticuerpo. Los promotores adecuados para utilizarse con huésped procarióticos incluyen el promotor phoA, ß-lactamasa y sistemas de promotor de lactosa, fosfatasa alcalina, un sistema promotor de triptofan (trp), y promotores híbridos, tales como promotor tac. Sin embargo, son adecuados otros promotores bacterianos conocidos. Los promotores para utilizarse en sistemas bacterianos también contendrán una secuencia Shine-Dalgarno (S.D.) enlazado en forma operativa al ADN que codifica el anticuerpo. Las secuencias promotoras son conocidas para eucarióticos. Virtualmente todos los genes eucarióticos tienen una región rica en AT localizado en aproximadamente 25 a 30 bases de corriente ascendente desde el sitio en donde se inicio la trascripción. Otra secuencia encontró una corriente ascendente de 70 a 80 bases desde el inicio de trascripción de muchos genes en una región CNCAAT en donde N puede ser cualquier nucleótido. En el extremo 3' de la mayor parte de los genes eucarióticos se encuentra una secuencia AATAAA que puede ser la señal para la adición de la cola poli A al extremo 3' de la secuencia de codificación. Todas estas secuencias se insertan en forma adecuada en vectores de expresión eucariótica. Los ejemplos de secuencias de promoción adecuadas para utilizarse con huéspedes de levadura, incluyen los promotores para cinasa 3-fosfoglicerato u otras enzimas glucolíticas, tales como enolasa, deshidrogenasa de gliceraldehído-3-fosfato, hexoquinasa, descarboxi lasa de piruvato, fosfofructocinasa, isomerasa de g!ucosa-6-fosfato, mutasa de 3-fosfoglicerato, cinasa de piruvato, isomerasa de triosefosfato , isomerasa de fosfoglucosa, y glucocinasa.

Otros promotores de levadura, los cuales son promotores inducibles que tienen la ventaja adicional de trascripción controlada por condiciones de crecimiento, son las regiones promotoras para deshidrogenasa de alcohol 2, isocitocromo C, fosfatasa de ácido, enzimas de degradación asociadas con metabolismo de nitrógeno, metalotioneina, deshidrogenasa de gliceraldehído-3-fosfato y enzimas responsables de la utilización de maltosa y galactosa. Los vectores y promotores adecuados para utilizarse en la expresión de levadura se describen en forma adicional en la Patente EP 73,657. Los aumentadores de levadura también se utilizan de manera conveniente con promotores de levadura. La trascripción de anticuerpos de vectores en células huésped de mamíferos, se controla, por ejemplo, a través de promotores obtenidos de los genomas de virus estables como virus de polioma, viruspox de aves de corral, adenovirus (tal como Adenovirus 2), virus de papiloma de bovino, virus de sarcoma avian, citomegalovirus, un retrovirus, virus de hepatitis-B y más preferentemente Virus de Simio 40 (SV40), procedentes de los promotores de mamífero heterólogos, por ejemplo, el promotor de actina o un promotor de inmunoglobulina, de promotores de ataque cardíaco, siempre que dichos promotores sean compatibles con los sistemas de célula huésped. Los promotores tempranos y tardíos del virus SV40 se obtienen de manera conveniente en la forma de un fragmento de restricción SV40 que también contiene el origen de réplica viral SV40. El promotor temprano inmediato del citomegalovirus humano se obtiene de manera conveniente como un fragmento de restricción Hindlll E. Un sistema para expresa ADN en huéspedes de mamíferos, utilizando el virus de papiloma de bovino como un vector, se describe en la Patente Norteamericana No. 4,419,446. Una modificación de este sistema se describe en la Patente Norteamericana No. 4,601,978. También ver la publicación de Reyes y asociados., Nature 297:598-601 (1982) en la expresión de cADN de ß-interferón de humano en células de ratón bajo el control de un promotor de cinasa de timidina procedente de virus de herpes simples. Como alternativa, se puede utilizar como el promotor la repetición de terminal larga de virus de sarcoma rous. (v) Componente de elemento aumentador. La trascripción de un ADN que codifica el anticuerpo de la presente invención a través de eucariótos superiores, con frecuencia es incrementada por la inserción de una secuencia aumentadora en el vector. Se conocen muchas secuencias aumentadoras de genes de mamíferos (globina, elastasa, albúmina, a-fetoproteína, e insulina). Sin embargo, normalmente se utilizará un aumentador de un virus de célula eucariótica. Los ejemplos incluyen el aumentador SV40 en el lado tardío del origen de réplica (pb 100-270), el aumentador promotor temprano de citomegalovirus, el aumentador de polioma en el lado tardío del origen de réplica y los aumentadores de adenovirus. Ver también la publicación de Yaniv, Nature 297:17-18 (1982) en los elementos de aumento para activación de promotores eucarióticos. El aumentador puede ser dividido en el vector en una posición 5' o 3' para la secuencia que codifique el anticuerpo, aunque preferentemente se localiza en el sitio 5' del promotor. (vi) Componente de terminación de trascripción. Los vectores de expresión utilizados en células huésped eucarióticas (células de levadura, hongos, insectos, plantas, animales, humanos o nucleadas de otros organismos multicelulares) también contendrán secuencias necesarias para el término de la trascripción y para estabilizar el mARN. Dichas secuencias están disponibles normalmente en el extremo 5', y ocasionalmente 3', regiones no traducidas de ADNs ó cADNs eucarióticos o virales. Estas regiones contienen segmentos de nucleótidos trascritos como fragmentos poliadenilados en la parte no traducida del mARN que codifica el anticuerpo. Un componente de término de trascripción útil es la región de poliadenilación de hormona de crecimiento de bovino. Ver la publicación WO94/11026 y el vector de expresión ahí descrito. (vii) Selección y transformación de células huésped.

Las células huésped adecuadas para clonación o expresión de los vectores de ADN en los vectores de la presente invención, son las células procariotas de levadura, o eucariotas superiores descritas anteriormente. Los procariotos adecuados para este propósito incluyen eubacteria, tales como organismos Gram-negativo ó Gram-positivo, por ejemplo, Enterobacterias tales como Escherichia, por ejemplo, E. Coli, Enterobacter, Erwlnia, Klebsiella, Proteus, Salmonella, por ejemplo, Salmonella typhimurium, Serratla, por ejemplo Serratia marcescans, y Shigella, así como Bacilli tal como B. subtilis y B. licheniformis (por ejemplo, B. licheniformis 41 P descrito en la Patente DD 266,710 publicada el 12 de abril de 1989), Pseudomonas tal como P. Aeruginosa, y Streptomyces. Un huésped de clonación de E.. coli preferido es E. coli 294 (ATCC 31,446), aunque también son adecuadas otras cepas tales como E. coli B. E. coli X1776 (ATCC 31,537), y E. coli W3110 (ATCC 27,325). Estos ejemplos son ilustrativos en lugar de limitantes. Además de los procariotos, los microbios eucarióticos tales como hongos filamentosos o levaduras son huéspedes de expresión adecuados para vectores de codificación de anticuerpos. Saccharomyces cerevisiae, o levadura de pastelería común, es el más comúnmente utilizando entre los microorganismos huéspedes eucarióticos inferiores. Sin embargo, un número de otros géneros, especies y cepas, están disponibles comúnmente y son útiles en la presente invención, tales como Schizosaccharomyces pombe; Kluyveromyces huéspedes tales como K. ¡actis, K. fragilis (atcc 12,424), K. bulgaricus (ATCC 16,045), K. wicheramii (atcc 24,178), K. waltii (ATCC 56,500), K. drosophilarum (ATCC 36,906), K. thermotolerans, y K. marxianus; yarrowia (Patente EP 402,226); Pichia pastoris (EP 183,070); Candida; Trichoderma reesia (EP 244,234); Neurospora crassa; Schwanniomyces tal como Schwanniomyces occidentalis; y hongos filamentosos tales como Neurospora, Penicillium, Tolypocladium, y huéspedes Aspergillus tales como A. nidulans y A. níger. Las células huésped adecuadas para la expresión de anticuerpos glucosilados se derivan de organismos, multicelulares. Los ejemplos de células invertebradas incluyen células plantas e insectos. Numerosas cepas y variantes baculovirales y células huésped de insecto permisibles correspondientes de huéspedes tales como Spodoptera frugiperda (caterpillar), Aedes aegypti (mosquito), Aedes albopictus (mosquito), Drosophila melanogaster (fruitfly) y Bómbix mori han sido identificadas. Están públicamente disponibles una variedad de cepas virales para transfección, por ejemplo variante L-1 de Autographa californica NPV y la cepa Bm-5 de Bómbix mori NPV, y dichos víruses pueden ser utilizados como el virus de la presente invención, particularmente para la transfección de células Spodoptera frugiperda . Los cultivos de células de plantas de algodón, maíz, papa, frijol soya, petunia, tomate y tabaco, también pueden ser utilizados como huéspedes. Sin embargo, ha habido un mayor interés en las células vertebradas, y en la propagación de células vertebradas en cultivo (cultivo de tejido) se ha vuelto un procedimiento de rutina. Los ejemplos de líneas celulares de huésped de mamífero útiles son la línea CV1 de riñon de mono transformada mediante SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); la línea de riñon embriónico de humano (293 ó 293 células subclonadas para crecimiento en cultivo de suspensión, Graham y asociados., J. Gen. Virol. 36:59 (1977); células de riñon de hámster bebe (BHK, ATCC CCL 10); células de ovario de hámster Chino/-DHFR (CHO, Urlaub y asociados., Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 77:4216 (1980)); células sertoli de ratón (TM4, Mather, Biol.. Reprod. 23:243-251 (1980)); células de riñon de mono (CVINATCC CCL 70); células de riñon de mono verde africano (VERO-76, ATCC CRL-1587); células de carcinoma cervical humano (HELA, ATCC CCL 2); células de riñon canino (MDCK, ATCC CCL 34); células de hígado de rata búfalo (BRL, 3A, ATCC CRL 1442); células de pulmón humano (W138, ATCC CCL 75); células de hígado humano (Hep G2, HB 8065); tumor mamario de ratón (MMT 060562, ATCC CCL51); células TRI (Mather y asociados., Annals N.Y. Acad. Sci. 383-44-68 (1982)); células MRC 5; células FS4; y una línea de hepatoma humano (Hep G2). Las células huésped se transforman con los vectores de expresión y clonación antes descritos para la producción de anticuerpos y se cultivan en medios nutrientes convencionales según sea adecuado para inducir promotores, seleccionar transformantes o amplificar los genes que codifican las secuencias deseadas. (viii) Cultivo de células huésped. Las células huésped utilizadas para producir el anticuerpo de la presente invención, pueden ser cultivadas en una variedad de medios. Los medios comercialmente disponibles tal como Ham's F10 (Sigma), Medio Esencial Mínimo ((MEM), (Sigma), RPMI-1640 (Sigma), y Medio de Eagle Modificado por Dulbecco ((D EM), Sigma) son adecuados para cultivar las células huésped. Además, cualesquiera de los medios descritos en la publicación de Ham y asociados., Meth. Enz. 58:44 (1979), Bañes y asociados., Anal. Biochem. 102:255 (1980), Patentes Norteamericanas Nos. 4,767,704; 4,657,866; 4,927,762; 4,560;655; o 5,122,469; publicación número WO 90/03430; y WO 87/00195; o Patente Norteamericana No. 30,985 pueden ser utilizados como medios de cultivo para células huésped. Cualesquiera de estos medios pueden ser suplementados según sea necesario y/o otros factores de crecimiento (tal como factor de crecimiento de insulina, transferrina, o epidérmic), sales (tales como cloruro de sodio, calcio, magnesio, y fosfato), reguladores (tales como HEPES), nucleótidos (tales como adenosina y timidina), antibióticos (tales como fármaco GENTAMYCI N™), oligoelementos (definidos como compuestos inorgánicos que normalmente se encuentran en concentraciones finales en el rango micromolar), y glucosa o una fuente de energía equivalente. Cualesquiera otros suplementos necesarios también pueden ser incluidos en concentraciones adecuadas que podrían ser conocidas para los expertos en la técnica. Las condiciones de cultivo, tales como temperatura, pH y similares, son las que se utilizaron previamente con la célula huésped seleccionada para expresión, y podrán ser apreciadas por los expertos en la técnica. (ix) Purificación de anticuerpos Cuando se utilizan técnicas recombinantes, el anticuerpo puede ser producido en forma intracelular, en el espacio periplásmico o segregado directamente en el medio. Si se produce el anticuerpo en forma intracelular, como primer paso, se eliminan los residuos de particulado, ya sea de células huésped o fragmentos Usados, por ejemplo, mediante centrifugación o ultrafiltración. La publicación de Cárter y asociados, Bio/Technology 10:163-167 (1992) describe un procedimiento para aislar anticuerpos que son' segregados al espacio periplásmico de E. coli. En síntesis, se descongela la pasta celular en la presencia de acetato de sodio (pH 3.5), EDTA y fenilmetilsulfonilfluoruro (PMSF) durante aproximadamente 30 minutos. Se pueden eliminar los residuos celulares mediante centrifugación. Cuando el anticuerpo es segregado en el medio, los sobrenadantes de dichos sistemas de expresión se concentran generalmente primero utilizando un filtro de concentración de proteínas comercialmente disponible, por ejemplo, una unidad de ultrafiltración Amicon o Millipore Pellicon. Se puede incluir un inhibidor de proteasa tal como PMSF en cualesquiera de los pasos anteriores para inhibir la proteolisis y se pueden incluir antibióticos para evitar el crecimiento de contaminantes adventicios. La composición de anticuerpos preparada de las células puede ser purificada utilizando, por ejemplo, cromatografía de hidroxilapatita, electroforesis de gel, diálisis, y cromatografía por afinidad, siendo la técnica de purificación preferida de la cromatografía por afinidad. La capacidad de adaptación de la proteína A como un ligante de afinidad, depende de las especies e isótopo de cualquier dominio Fe de inmunoglobulina que se encuentra en el anticuerpo. La proteína A también puede ser utilizada para purificar anticuerpos que se basan en cadenas pesadas ?1, ?2, ó ?4 de humano (Lindmark y asociados., J. Immunol. Meth. 62:1-13 (1983)). La proteína G es recomendada para todos los isótopos de ratón y para ?3 de humano (Guss y asociados., EMBO J. 5:15671575 (1986)). La matriz a la cual se adhiere el ligante de afinidad es la mayoría de las veces agarosa aunque están disponibles otras matrices. Las matrices mecánicamente estables tales como vidrio o poli(estirenodivinil)benceno de poro controlado permiten rangos de flujo más rápidos y tiempos de procesamiento menores de los que se pueden lograr con agarosa. Cuando el anticuerpo comprende un dominio CH3, una resina Bakerbond ABX™ (J. T. Baker, Phillipsburg, NJ) es útil para la purificación. Otras técnicas para la purificación de proteína, tales como fraccionado en una columna de intercambio de iones, precipitación de etanol, HPCL de Fase Inversa, cromatografía sobre sílice, cromatografía sobre cromatografía de heparina SEFAROSA™ en una resina de intercambio de aniones o cationes (tal como columna de ácido poliaspártico), cromatoenfoque, SDS-PAGE, y precipitación de sulfato de amonio también están disponibles dependiendo del anticuerpo que será recuperado. Después de cualquier paso de purificación preliminar, se puede someter la mezcla que comprende el anticuerpo de interés y los contaminantes, a una cromatografía de interacción hidrofóbica de pH bajo utilizando un regulador de elusión en un pH de entre 2.5-4.5, llevándose a cabo preferentemente en bajas concentraciones de sal (por ejemplo, de aproximadamente 0-0.25M de sal). C. Formulaciones Farmacéuticas. Las formulaciones terapéuticas de anticuerpo se preparan para almacenamiento mezclando el anticuerpo que tiene el grado de pureza deseado con vehículos fisiológicamente aceptables opcionales, excipientes o estabilizadores (Remington's Pharmaceutical Sciences 16 th edition, Osol, A. Ed. (1980)), en la forma de formulaciones liofilizadas o soluciones acuosas. Los vehículos, excipientes, o estabilizadores aceptables son no tóxicos para los receptores en las dosis y concentraciones empleadas, e incluyen reguladores tales como fosfato, citrato y otros ácidos orgánicos; antioxidantes incluyendo ácido ascórbico y metionina; preservativos (tales como cloruro de amonio de octadecildimetilbencilo; cloruro de haxametonio; cloruro de benzalconio, cloruro de bencetonio, fenol, alcohol bencílico o butílico; parabenos de alquilo tales como paraben de metilo o propilo; catecol; resorcinol; ciclohexanol ; 3-pentanol; y m-cresol); polipéptidos de bajo peso molecular (menor a aproximadamente 10 residuos); proteínas tales como albúmina de suero, gelatina, o inmunoglobulinas; polímeros hidrofílicos tal como polivinilplrrolidona; aminoácidos tales como glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina o lisina; monosacáridos, disacáridos, y otros carbohidratos incluyendo glucosa, mañosa, o dextrinas, agentes de quelación tal como EDTA; azúcares tales como sacarosa, mannitol, trehalosa, o sorbltol; contraiones de formación de sal tales como sodio; complejos de metal (por ejemplo, complejos de proteína Zn); y/o tensioactivos no iónicos tales como TWEEN™, PLURONICS™ o polietilénglicol (PEG). La formulación de la presente invención también puede contener más de un compuesto activo según sea necesario, para la indicación que en particular que esté siendo tratada, preferentemente aquellos con actividades complementarias que no se afecten en forma adversa entre sí. Por ejemplo, puede ser recomendable proporcionar en forma adicional un agente inmunosupresor. Dichas moléculas se encuentran presentes en forma adecuada en combinación y en cantidades que son efectivas para el propósito proyectado.

Los ingredientes activos también pueden ser atrapados en microcápsulas preparadas, mediante técnicas de coaservación o mediante polimerización interfacial, por ejemplo hidroximetilcelulosa o microcápsula-gelatina y microcápsula de poli-(metilmetacilato), respectivamente, en sistemas de suministro de fármacos coloidales (por ejemplo liposomas, microesferas de albúmina, microemulsiones, nanopartículas y nanocápsulas) o en microemulsiones. Dichas técnicas se describen en la publicación de Remington's Pharmaceutical Sciences 16a edición, Osol, A. Ed. (1980). Las formulaciones que serán utilizadas para administración ¡n vivo deben ser estériles. Esto se logra fácilmente mediante filtración a través de membranas de filtración estériles. Se pueden preparar preparaciones de liberación sostenida. Los ejemplos adecuados de preparaciones de liberación sostenida incluyen matrices semipermeables de polímeros hidrofóbicos que contienen anticuerpo, en donde las matrices están en la forma de artículos con forma, por ejemplo películas o microcápsulas. Los ejemplos de matrices de liberación sostenida incluyen poliésteres, hidrogeles (por ejemplo, poli(2-hidroetiI-metacrilato), o poli(vinilalcohol)), poliláctidos (Patente Norteamericana No. 3,773,919), copolímeros de ácido L-glutámico y etil-L-glutamato ?, etileno-acetato de vinilo no degradable, copolímeros de ácido láctlco-ácido glucólico degradables tales como LUPRON DEPOT™ (microesferas inyectables compuestas de copolímero de ácido láctico-ácido glucólico y acetato de leuprolida), y ácido poli-D-(-)-3-hidroxibutírico. Aunque los polímeros tales como etileno-acetato de vinilo y ácido láctico-ácido glucólico permiten la liberación de moléculas durante 100 días, ciertos hidrogeles liberan proteínas durante períodos de tiempo más cortos. Cuando los anticuerpos encapsulados permanecen en el cuerpo durante largo tiempo, pueden desnaturalizarse o agregarse como resultado de la exposición a la humedad a una temperatura de 37°C, dando como resultado una perdida de actividad biológica y posibles cambios en la inmunogenicidad. Se pueden considerar estrategias racionales para estabilización dependiendo del mecanismo involucrado. Por ejemplo, si el mecanismo de agregación es descubierto como una formación de enlace S-S intermolecular a través del intercambio de tio-disulfuro, se puede lograr la estabilización modificando los residuos de sulfhid rilo, liofilizando de soluciones de ácido, controlando el contenido de humedad, utilizando aditivos adecuados y desarrollando composiciones de matriz de polímero específicas. D. Usos No Terapéuticos para el Anticuerpo Los anticuerpos de la presente invención, pueden ser utilizados como agentes de purificación de afinidad. En este proceso, los anticuerpos son inmovilizados en una fase sólida tal como resina Sefadex o papel de filtro, utilizando métodos bien conocidos en la técnica. El anticuerpo inmovilizado se contacta con una muestra que contiene el antígeno que será purificado, y posteriormente el soporte se lava con un solvente adecuado que eliminará sustancialmente todo el material en la muestra excepto el antígeno que será purificado, el cual se enlaza al anticuerpo inmovilizado. Finalmente, el soporte se lava con otro solvente adecuado, tal como regulador de glicina, pH 5.0, que liberará el antígeno del anticuerpo. Los anticuerpos de la presente invención, también pueden ser útiles en ensayo de diagnóstico, por ejemplo, para detectar la expresión de un antígeno de interés en células específicas, tejidos o suero. Para aplicaciones de diagnóstico, el anticuerpo normalmente será etiquetado con una porción detectable. Están disponibles numerosas etiquetas que pueden ser agrupadas generalmente en las siguientes categorías: (a) Radioisótopos, tales como 35S, C, 25l, 3H, y 3 . El anticuerpo puede ser etiquetado con radioisótopo utilizando las técnicas descritas en Current Protocols ¡n Immunlogy, Volúmenes 1 y 2, Coligen y asociados., Ed. Wiley-lnterscience, Nueva York, Nueva York, Pubs. (1991) por ejemplo la radioactividad puede ser medida utilizando conteo por centelleo. (b) Etiquetas fluorescentes tales como quelados de tierra rara (quelados de europio) o fluorescencia y sus derivados, rodamina y sus derivados, dansilo, Lissamina, ficoeritrina y Rojo Texas están disponibles. Por ejemplo, las etiquetas fluorescentes pueden ser conjugadas para el anticuerpo utilizando las técnicas que se describen en la publicación de Current Protocols in Immunology, supra, por ejemplo, Se puede cuantificar la fluorescencia utilizando un fluorímetro. (c) Están disponibles varias etiquetas de enzimas-sustratos y la Patente Norteamericana No. 4,275,149 proporciona una revisión de algunas de estas. La enzima generalmente cataliza una alteración química del sustrato cromogénico el cual puede medirse utilizando varias técnicas. Por ejemplo, la enzima puede catalizar un cambio de color en un sustrato, el cual puede ser medido en forma espectrofotométrica. Como alternativa, la enzima puede alterar la fluorescencia o quimioluminiscencia del sustrato. Las técnicas para cuantificar un cambio en fluorescencia se describieron anteriormente. El sustrato quimioluminiscente se vuelve electrónicamente excitado a través de una reacción química y posteriormente puede emitir luz la cual puede ser medida (utilizando un quimioluminómetro, por ejemplo), o donar energía a un aceptor fluorescente. Los ejemplos de etiquetas enzimáticas incluyen luciferaza (por ejemplo, luciferaza de luciérnaga y luciferaza bacteriana;" Patente Norteamericana No. 4,737,456), luciferina, 2,3-dihidroftalazinadionas, deshidrogenase de malato, ureasa, peroxidasa, tal como peroxidasa de rábano (HRPO), fosfatasa alcalina, ß-galactosidasa, glucoamilasa, lisozima, oxidasas de sacárido (por ejemplo, oxidas de glucosa, oxidasa de galactosa, y deshidrogenase de glucosa-6-fosfato), oxidasas hetrocíclicas (tales como uricasa y oxidasa de xantina), lactoperoxidasa, microperoxidasa, y similares. Las técnicas para conjugar enzimas para anticuerpos se describen en la publicación de O'Sullivan y asociados, Methods for the Preparation of Enzime-Antibody Conjugates para utilizarse en Inmunoensayo de Enzimas, en la publicación de Methods in Enzym. (ed J. Langone & H. Van Vunakis), Academic press, Nueva York, 73:147-166 (1981). Los ejemplos, de combinaciones de sustratos-enzimas incluyen, por ejemplo: (i) Peroxidasa de rábano (HRPO) con peroxidasa de hidrógeno como un sustrato, en donde la peroxidasa de hidrógeno oxida un precursor de tinta (por ejemplo diamina de ortofenileno (OPD) o clorhidrato de bencidina 3, 3', 5,5'-tetrametilo (TMB)); (ii) Fosfatas alcalina (AP) con fosfato de para-Nitrofenilo como el sustrato cromogénico; y (iii) ß-D-galactosidasa (ß-D-Gal) con un sustrato cromogénico (por ejemplo, p-nitrofenilo-p-D-galactosidasa) o sustrato fluorogénico 4-metilumbell¡feril-p-D-galactosidasa. Otras numerosas combinaciones de enzimas-sustratos están disponibles para los expertos en la técnica. Para una revisión general de estas, ver las Patentes orteamericanas Nos. 4,275,149 y 4,318,980. Algunas veces, la etiqueta se conjuga en forma indirecta con el anticuerpo. Los expertos en la técnica estarán atentos de las diversas técnicas para lograr esto. Por ejemplo, el anticuerpo puede ser conjugado con biotina y cualesquiera de las tres categorías amplias de etiquetas mencionadas anteriormente pueden ser conjugadas con avidina. La biotina enlaza selectivamente a avidina, y por lo tanto, la etiqueta puede ser conjugada con el anticuerpo en esta forma indirecta. Como alternativa, para lograr la conjugación de la etiqueta con el anticuerpo, el anticuerpo se conjuga con un hapteno pequeño (por ejemplo, digoxina) y uno de los diferentes tipos de etiqueta mencionados anteriormente, se conjuga con un anticuerpo anti-hapteno (por ejemplo anticuerpo anti-dioxina). Por lo tanto, la se puede lograr la conjugación indirecta con el anticuerpo. En otra modalidad de la presente invención, el anticuerpo no necesita ser etiquetado, y la presencia del mismo puede detectarse utilizando un anticuerpo etiquetado que enlace al anticuerpo. Los anticuerpos de la presente invención, pueden ser empleados en cualquier método de ensayo conocido tal como ensayos de enlace competitivo, ensayos de emparedados directos y ensayos de Inmunoprecipitación. Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, p. 147-158 (CRC Press, Inc. 1987). Los ensayos de enlace competitivos dependen de la capacidad de un estándar etiquetado para completarse con el análisis de la muestra de prueba, para enlazar con una cantidad limitada de anticuerpo. La cantidad de antígeno en la muestra de prueba es inversamente proporcional a la cantidad de estándar que se enlaza a los anticuerpos. Para facilitar la determinación de la cantidad de estándar que se enlazará, los anticuerpos generalmente son insolubilizados antes o después de la competición, de modo que el estándar y el material para análisis que se enlazan a los anticuerpos puedan ser separados de manera conveniente del estándar y del material para análisis los cuales permanecen sin enlazar. Los ensayos de emparedado comprenden el uso de dos anticuerpos, cada uno con la capacidad de enlazar a una diferente parte inmunogénica o epítope, de la proteína que será detectada. En un ensayo de emparedado el material para análisis de la muestra de prueba se enlaza a través de un primer anticuerpo el cual se inmoviliza en un soporte sólido, y posteriormente se enlaza a un segundo anticuerpo al material para análisis, formando de esta manera un complejo insoluble de tres partes. Ver por ejemplo la Patente Norteamericana No, 4,376,110. El segundo anticuerpo puede ser etiquetado por sí mismo con una porción detectable (ensayos de emparedado directos) o puede ser medido utilizando un anticuerpo de anti-inmunoglobulina que es etiquetado con una porción detectable (ensayo de emparedado indirecto). Por ejemplo, un tipo de ensayo de emparedado es un ensayo ELISA, en cuyo caso la porción detectable es una enzima. Para inmunohistoquímica, la muestra de tumor puede ser fresca o congelada o puede ser incrustada en parafina y fijada en un conservador tal como formalina, por ejemplo. Los anticuerpos pueden ser utilizados par ensayos de diagnóstico in vivo. Generalmente, el anticuerpo se etiqueta con un radionúclido (tal como 111ln, "Te, 4C, 31I, 25l, 3H, 32P ó 35S) o una tinta, de modo que el tumor pueda ser localizado utilizando inmunoscintiografía. En una modalidad, un método para detectar VEGF en una muestra biológica (por ejemplo, tejido, sangre, suero, fluido espinal) o una muestra biológica preparada, pueden comprender el paso de contactar un anticuerpo de la presente invención con la muestra, y observar el anticuerpo anti-VEGF enlazado al VEGF en la muestra, o determinar la cantidad del anticuerpo anti-VEGF enlazado a VEGF en la muestra. En otra modalidad, un método para detectar VEGF en un sujeto comprende el paso de administrar un anticuerpo de la presente invención al sujeto, y observar el anticuerpo anti-VEGF enlazado al VEGF en el sujeto, o determinar la cantidad del anticuerpo anti-VEGF enlazado a VEGF en el sujeto (por ejemplo, humano, ratón, conejo, etc). E. Equipos de Diagnóstico Como asunto de conveniencia, el anticuerpo de la presente invención puede proporcionarse en un equipo, por ejemplo, una combinación empacada de reactivos en cantidades predeterminadas con instrucciones para llevar a cabo el ensayo de diagnóstico. Cuando el anticuerpo se etiqueta con una enzima, el equipo incluirá sustratos y cofactores requeridos por la enzima (por ejemplo, un precursor de sustrato que proporciona el cromoforo o fluoroforo detectable). Además, se pueden incluir otros aditivos tales como estabilizadores, reguladores (por ejemplo, un regulador de bloque o regulador de lisis) y similares. Las cantidades relativas de los diversos reactivos pueden variarse ampliamente para proporcionar concentraciones en la solución de los reactivos, las cuales optimizan sustancial mente la sensibilidad del ensayo.

Particularmente, los reactivos pueden proporcionarse en la forma de polvos secos, normalmente liofilizados incluyendo excipientes los cuales en la disolución, proporcionarán una solución de reactivo que tiene la concentración apropiada. F. Usos In Vivo del Anticuerpo Se contempla que el anticuerpo de la presente invención pueda ser utilizado para tratar a un mamífero..En una modalidad, el anticuerpo se administra a un mamífero no humano para los propósitos de obtener datos preciínicos, por ejemplo. Los mamíferos no humanos de ejemplo que serán tratados incluyen primates, perros, gatos, roedores y otos mamíferos no humanos, en los cuales se llevan a cabo estudios preciínicos. Dichos mamíferos pueden ser modelos animales establecidos para una enfermedad que será tratada con el anticuerpo, o pueden ser utilizados para estudiar toxicidad del anticuerpo de interés. En cada una de estas modalidades, los estudios de escala de dosis pueden llevarse a cabo en el mamífero. Cuando el anticuerpo es un anticuerpo anti-VEGF, se puede administrar por ejemplo a una roedor huésped en un modelo de tumor sólido. Además, o como alternativa, el anticuerpo se utiliza para tratar a un humano, por ejemplo, a un paciente que padece de una enfermedad o padecimiento que podría beneficiarse de la administración del anticuerpo. Las condiciones que pueden ser tratadas con el anticuerpo son muchas e incluyen condiciones que surgen de, o que se exacerban a través de angiogenesis anormal, por ejemplo, a través de angiogenesis excesiva inadecuada o no controlada. Por ejemplo, dichas condiciones incluyen, cáncer tal como cáncer colorectal y NSCLS y otras descritas anteriormente, y enfermedades inflamatorias tales como artritis reumatoide y otras descritas anteriormente. Las siguientes referencias describen linfomas y CLL, sus diagnósticos, tratamientos y procedimientos médicos estándar para medir la eficacia del tratamiento. Canellos GP, Lister, TA, Sklar JL: The Lymphomas. W.B. Saunders Company, Philadelphia, 1998; van Besien K y Cabanillas, F: Clinical Manifestations, Staging y Treatment of Non-Hodkin's Lymphoma, Cap. 70, p 1293-1338, en: Hematology, Basic Principies and Practice, 3ra ed. Hoffman y asociados (editores). Churchill Livingstone, Cap. 72, p 1350-1362, in Hematology, Basic Principies and Practice, lera., ed. Hoffman y asociados (editores). Churchill Livingstone, Philadelphia, 2000. Los parámetros para evaluar la eficacia o éxito de tratamiento de una enfermedad autoinmune o relacionada con el sistema autoinmune, serán conocidos para el especialista en la enfermedad. Generalmente, el especialista verá la reducción en los signos y síntomas de la enfermedad específica. A continuación se describe lo siguiente a manera de ejemplos: En una modalidad, los métodos y composiciones de la presente invención son útiles para tratar artritis reumatoide. RA esta caracterizada por inflamación de uniones múltiples, pérdida de cartílago y erosión de huesos que conduce a la destrucción de uniones y finalmente a función de uniones reducidas. Además, ya que RA es una enfermedad sistémica, puede tener efectos en otros tejidos tales como pulmones, ojos y médula ósea. Los anticuerpos que enlazan a VEGF pueden utilizarse como terapia de primera línea en pacientes con RA temprano (en metrotexato naive (MTX), o en combinación con, por ejemplo, MTX o ciclofosfamida. O, los anticuerpos se pueden utilizar en el tratamiento como terapia de segunda línea para pacientes quienes fueron DMARD y/o MTX refractarios, en combinación con, por ejemplo, MTX. En una modalidad preferida, los anticuerpos que enlazan a VEGF de la presente invención se administran a mamíferos quienes son DMARD y/o MTX refractario. Los anticuerpos anti-VEGF son útiles para evitar y controlar el daño de uniones, retrasar el daño estructural, disminuir el dolor asociado con inflamación en RA y reducir de manera general los signos y síntomas en RA de moderada severa. El paciente RA puede ser tratado con los anticuerpos anti- VEGF de la presente invención, antes, después o junto con el tratamiento con otros fármacos utilizados para tratar RA (ver más adelante la sección de terapia de combinación). En una modalidad, los pacientes quienes tuvieron previamente fármacos antirreumáticos de modificación de la enfermedad con falla y/o tuvieron una respuesta inadecuada al metotrexato solo, se tratan con un anticuerpo que enlaza anti-VEGF. En otra modalidad, a los pacientes se les administra un anticuerpo anti-VEGF de la presente invención además de ciclofosfamida o anticuerpo que enlaza anti-VEGF además de metotrexato. Un método para evaluar la eficacia de tratamiento en RA se basa en el criterio del American CoIIege of Rheumatology (ACR), el cual mide el porcentaje de mejoría, entre otras cosas, en uniones hinchadas y tendones. El paciente RA puede ser calificado por ejemplo, como ACR 20 (20 por ciento de mejoría) en comparación con falta de tratamiento de anticuerpos (por ejemplo línea de base antes de tratamiento) o tratamiento con placebo. Otras formas de evaluar la eficacia del tratamiento con anticuerpos incluye calificación por rayos X tal como rayos X Sharp que se utiliza para calificar el daño estructural, tal como erosión de huesos y estrechamiento del espacio en las uniones. Los pacientes también pueden ser evaluados para la prevención de, o mejoría en cuanto a discapacidad con base en la calificación del Cuestionario de Evaluación de Salud [HAQ], calificación AIMS, SF-36 en períodos de tiempo durante o después del tratamiento. El criterio ACR 20 puede incluir el 20% de mejoría tanto en conteo de unión Tender (dolorosa) como en conteo de unión hinchada además de un 20% en mejoría en al menos 3 de 5 medidas adicionales. 1. - evaluación de dolor del paciente a través de la escala análoga visual (VAS), 2. - evaluación global del paciente de actividad de enfermedad (VAS), 3. - evaluación global del especialista de la actividad de la enfermedad (VAS), 4. - discapacidad autoevaluada por parte del paciente medida a través del Cuestionario de Evaluación de Salud, y 5.- reactivos de fase aguda, CRP ó ESR. En la ACR 50 y 70 se definen en forma análoga. Preferentemente, al paciente se le administra una cantidad de anticuerpo que enlaza a anti-VEGF de la presente invención, solo o en combinación con otros agentes para tratar artritis reumatoide en forma efectiva para lograr al menos una calificación de ACR 20, preferentemente al menos ACR 30, más preferentemente al menos ACR 50, incluso más preferentemente al menos ACR 70, lo más preferentemente al menos ACR 75 y más. La artritis psoriática tiene características radiográficas únicas y distintas. Para artritis psoriática, se puede evaluar la erosión de articulaciones y el estrechamiento del espacio en las articulaciones a través de la calificación Sharp. Los anticuerpos que enlazan a anti-VEGF descritos en la presente invención, se pueden utilizar para prevenir el daño en las articulaciones, así como para reducir los signos de la enfermedad y síntomas del padecimiento. El anticuerpo se administra a través de cualquier medio adecuado, incluyendo, parenteral, subcutáneo, intraperitoneal, intrapulmonar e intranasal, y si se desea para tratamiento inmunosupresor, administración intralesión. Las infusiones parenterales incluyen administración intramuscular, intravenosa, intraarterial, intraperitoneal, o subcutánea. Además, el anticuerpo se administra en forma adecuada mediante infusión por pulsación, particularmente con dosis en disminución del anticuerpo. Preferentemente la dosis se proporciona a través de inyecciones, lo más preferentemente inyecciones intravenosas o subcutáneas, dependiendo en parte de si la administración es breve o crónica. Para la prevención o tratamiento de la enfermedad, la dosis de anticuerpo adecuada dependerá del tipo de enfermedad que será tratada, la severidad y curso de la enfermedad, si el anticuerpo se administra para propósitos preventivos o terapéuticos, la terapia previa, la historia clínica del paciente y respuesta al anticuerpo, y el juicio del médico tratante. El anticuerpo se administra en forma adecuada al paciente en una vez o a través de una serie de tratamientos. Dependiendo del tipo y severidad de la enfermedad, una dosis de aproximadamente 1 µ9/?<9 a 15 mg/kg (por ejemplo 0.1-20 mg/kg) es una dosis candidata inicial para administrar al paciente, por ejemplo, ya sea a través de una o más administraciones separadas o a través de infusión continua. Una dosis diaria típica puede fluctuar de aproximadamente 1 µ9^? a 100 mg/kg o más, dependiendo de los factores mencionados anteriormente. Para administraciones repetidas a través de varios días o más, dependiendo de la condición, el tratamiento se sostiene hasta que ocurre una supresión deseada de los síntomas de la enfermedad. Sin embargo pueden ser útiles otros regímenes de dosificación. El progreso de esta terapia se puede monitorear fácilmente a través de técnicas y ensayos convencionales. Un régimen de dosis de ejemplo para un anticuerpo anti-LFA-1 o anti-ICAM- se describe en la publicación WO 94/04188. Los regímenes de dosis de ejemplo y combinaciones terapéuticas para tratar cáncer se pueden encontrar en la Solicitud Provisional Norteamericana No. 60/474480, presentada el 30 de mayo del 2003.

La composición de anticuerpo será formulada, dosificada y administrada en una forma consistente con una buena práctica médica. Los factores para consideración dentro de este contexto, incluyen el padecimiento en particular que será tratado, el mamífero particular que será tratado, la condición clínica del paciente individual, el origen del padecimiento, el sitio de suministro del agente, el método de administración, el programa de administración y otros factores conocidos para los especialistas médicos. La "cantidad terapéuticamente efectiva" del anticuerpo que será administrado, estará dirigida por dichas consideraciones, y es la cantidad mínima necesaria para evitar, disminuir o tratar una enfermedad o padecimiento. El anticuerpo no necesita ser, aunque opcionalmente, se formula con uno o mas agentes utilizados normalmente para prevenir o tratar el padecimiento en cuestión. La cantidad efectiva de dichos otros agentes, depende de la cantidad de anticuerpo que se encuentre en la formulación, el tipo de padecimiento o tratamiento, y otros factores que se describieron anteriormente. Éstos se utilizan generalmente en las mismas dosis y con rutas de administración tal como se utilizan posteriormente, o de aproximadamente 1 al 99% de las dosis empleadas hasta ahora. Generalmente, el alivio o padecimiento de una enfermedad o padecimiento comprende disminuir uno o más síntomas o problemas médicos asociados con la enfermedad o padecimiento. En el caso de cáncer, la cantidad terapéuticamente efectiva del fármaco puede lograr una, o una combinación de lo siguiente: reducir el tamaño del tumor; inhibir (es decir, disminuir hasta cierto punto y/o detener) la infiltración de células cancerígenas en órganos periféricos; inhibir la metástasis del tumor, inhibir hasta cierto punto, el crecimiento del tumor y/o aliviar hasta cierto punto uno o más de los síntomas asociados con el cáncer. Hasta el punto en el que el fármaco pueda evitar el crecimiento y/o exterminar las células de cáncer existentes, puede ser citostático y/o citotóxico. En algunas modalidades, se puede utilizar una composición de la presente invención para prevenir la generación o reocurrencia de la enfermedad o padecimiento en el sujeto o mamífero. G. Artículos de Fabricación En otra modalidad de la presente invención, se proporciona un artículo de fabricación que contiene materiales útiles para el tratamiento de los padecimientos descritos anteriormente. El artículo de fabricación comprende un contenedor y una etiqueta. Los contenedores adecuados incluyen, por ejemplo, botellas, frascos, jeringas y tubos de prueba. Los contenedores pueden formarse a partir de una variedad de materiales tales como vidrio o plástico. El contenedor mantiene una composición la cual es efectiva para tratar la condición y puede tener una puerta de acceso estéril (por ejemplo, el contenedor puede ser una bolsa de solución intravenosa o un frasco que tiene un tapón perforable por medio de una aguja de inyección hipodérmica). El agente activo de la composición es el anticuerpo. La etiqueta que está en, o que está asociada en el contenedor, indica que la composición se utiliza para tratar la condición de elección. El artículo de fabricación puede comprender además un segundo contenedor que comprende un regulador farmacéuticamente aceptable, tal como solución salina regulada por fosfato, solución de Ringer y solución de dextrosa. Puede incluir además otros materiales deseables desde un punto de vista comercial y del usuario, incluyendo otros reguladores, diluyentes, filtros, agujas, jeringas e insertos de empaque con instrucciones de uso. Incorporadas en su totalidad a la presente invención como referencia, se encuentran las Solicitudes Provisionales Norteamericanas, de las cuales la presente solicitud reclama el beneficio: USSN 60/491,877, presentada el 1 de agosto del 2003; USSN 60/516,495, presentada el 1 de Noviembre del 2003; USSN 60/570,912, presentada el 12 de mayo, del 2004, USSN 60/571,239, presentada el 13 de mayor del 2004; USSN 60/576,315, presentada el 1 de junio del 2004; y USSN 60/580,757, presentada el 18 de junio del 2004. Los ejemplos que se encuentran a continuación están proyectados exclusivamente para ilustrar la práctica de la presente invención, y no se proporcionan en forma de limitación. Las descripciones de todas las patentes y literaturas científicas aquí mencionadas están incorporadas en forma expresa en su totalidad como referencia. EJEMPLOS Generación de las Bibliotecas de Fago de los Anticuerpos Sintéticos En general, se han desarrollado dos tipos de bibliotecas de anticuerpo de combinación, distinguidos por la fuente de repertorios. La mayoría de las bibliotecas hasta la fecha son bibliotecas de anticuerpos "naturales" que utilizan los repertorios naturales como la fuente de su diversidad, en donde los genes en la forma de ARN de mensajes de células inmune procedentes de animales o humanos na'i've o inmunizados, fueron amplificados y clonados en vector para el despliegue de fagos u otra tecnología de despliegue tal como nbosoma o despliegue de levadura. Los anticuerpos naturales normalmente tienen múltiples estructuras, las cuales junto con las secuencias CDRs variables y la recombinación de cadena ligera y de cadena pesada hacen la diversidad de la biblioteca. El tamaño de la biblioteca determina el desempeño de las mismas, ya que los repertorios fueron en general mayores al tamaño de la biblioteca (Marks y asociados). La biblioteca sintética, por otra parte, es una nueva ramificación de la biblioteca en donde la diversidad está diseñada y construida en la biblioteca con ADN sintético. Se han utilizado estructuras simples o múltiples. Para una biblioteca de estructura simple, la fuente de la diversidad depende únicamente de la degeneración del ADN sintético diseñado para crear los diversos lazos CDR. Tanto el diseño de diversidad como el tamaño de las bibliotecas son importantes para el desempeño de la misma, lo cual se mide a través de la afinidad de los anticuerpos encontrados de las bibliotecas. Se desarrolló una estrategia para construir una biblioteca de fago de anticuerpo sintética al momento de elaborar la plantilla de una sola estructura. Los residuos fueron seleccionados de los lazos CDR que son ya sea solventes expuestos o altamente variables en repertorios de anticuerpo naturales de acuerdo con la base de datos de Kabat y fueron randomizados mimetizando la diversidad natural utilizando codones diseñados a la medida. También se exploró la restricción de la aleatorizacion de la cadena pesada, lo cual contribuye con frecuencia a la principal interacción de enlace con el antígeno, entre anticuerpos naturales, y se descubrió que fue suficiente encontrar enlazadores para los objetivos na'íve. Una de las razones de restringir la diversidad es que la abertura entre la degeneración del ADN y el tamaño de la biblioteca de fago práctica, no es significativamente importante y el espacio de la secuencia será cubierta con una densidad suficiente. La primera librería fue construida en una estructura 4D5 humanizada con una cadena pesada aleatorizada y una cadena ligera fija en el formato de la cadena simple Fv (scFv). Para el múrido de antígeno objetivo VEGF (mVEGF), se encontraron muchos enlazadores únicos. Las bibliotecas fueron generalmente mejoradas en forma adicional sintonizando en forma fina la diversidad de CDR-H1 y H2 o la cadena ligera para mimetizar en forma cercana la diversidad natural, y explorando el diseño de diversidad de CDR-H3 en el formato Fab de despliegue. Ver la figura 1 para ilustraciones de diferentes tipos de bibliotecas de anticuerpos. Se descubrieron bibliotecas con diferentes diseños de CDR-H3 de tamaño similar que resultaron en enlazadores de hVEGF y mVEGF con afinidad sub-nM. La afinidad de estos enlazadores puede ser mejorada al rango pM a través de un segundo paso de aleatorización de sus CDRs de cadena ligera. Para detalles de estrategias y métodos para generar bibliotecas de anticuerpos sintéticas con una sola plantilla, ver por ejemplo la Solicitud Provisional de Patente Norteamericana No. USSN 60/385,338 (presentada el 3 de junio del 2002), cuya descripción total esta incorporada de manera expresa a la presente invención. Por lo tanto, se pueden encontrar anticuerpos novedosos con alta afinidad tanto para VEGF humano como para VEGF de ratón en diversas bibliotecas de fago de anticuerpos sintéticos con base en una sola plantilla de estructura. Ejemplo 1 - Anticuerpos derivados de G6 y B20 (a) Selección de Clones Fab Anti-VEGF de Alta Afinidad Los procedimientos de selección para clones Fab anti-VEGF de alta afinidad consistieron en varias combinaciones de clasificaciones soportadas por sólidos y de enlace por solución. En las clasificaciones soportadas por sólidos, la biblioteca de fago de anticuerpo fue lavado con batea con antígeno objetivo recubierto sobre una inmunoplaca Maxisorp NUNC 96-depósitos a una concentración de 5 µ9/?t??. En el método de clasificación de enlace de solución, se incubó la biblioteca de fagos con una concentración en disminución de antígeno biotinilado en solución, el cual posteriormente fue capturado por neutravidina recubierto en la placa Maxisorp de 96 depósitos (2-5 µg/mI). La concentración en disminución permitió más restricción en lavado con batea para pescado para enlazadores más apretados. Para el antígeno objetivo mVEGF, se desarrolló una estrategia de clasificación de dos pasos de modo que, en el paso 1, se aislaron enlazadores potentes de las bibliotecas na'íve por medio de la selección soportada por sólidos, y en forma subsecuente en el paso 2, los enlazadores de afinidad más fuerte pueden ser aislados de los más débiles a través del método de enlace de solución progresiva con una concentración en disminución del antígeno objetivo. Para la clasificación rápida de estos enlazadores, se utilizó el ensayo ELISA de enlace de competición de una sola mancha de alto rendimiento. Se amplificó una pequeña cantidad de mVEGF (25nM) en este ensayo, para clasificar 16 clones de cada biblioteca después de una clasificación de 3 vueltas. Como resultado de la combinación de clasificaciones soportadas por sólidos, y de enlace de solución, se identificaron tres clones Fab, G6, B29 y C3, todos de la biblioteca NNK, como enlazadores de alta afinidad. Y después de la clasificación de la quinta vuelta de la clasificación, la biblioteca completa fue dominada por el clon G6. En forma interesante, se descubrió B20, el cual vino de la biblioteca NVT, a través de la clasificación de enlace de solución sola. Esto sugiere que se pueden encontrar más clones a través de diferentes estrategias de métodos de clasificación, lo cual puede influenciar a diferentes clones. Con diferentes diseños de bibliotecas, se deben identificar también más clones de enlace VEGF con distintas secuencias. Los cuatro clones únicos con distintas secuencias, fueron caracterizados primero por su afinidad de enlace al VEGF de múrido y de humano utilizando el ensayo ELISA de enlace de competición a una temperatura de 25°C. Los datos IC50 de los ensayos de enlace de fagos representan un estimado de sus afinidades, y se identificó G6 como el enlazador con mayor afinidad con un IC50 a 0.5-1nM tanto para VEGF de humano como de múrido (Figura 2). (b) Actividades v propiedades Se llevaron a cabo una serie de ensayos in vitro para examinar las propiedades y actividades de los anticuerpos anti-VEGF novedosos seleccionados. Ensayos de Bloqueo de Epítope Primero, se examinaron los clones de fago de anticuerpos con respecto a sus posibles epítopes de enlace en VEGF. Se utilizó un ensayo de bloqueo de fagos en donde el enlace de los clones de fago (en concentración constante) a los depósitos recubiertos con mVEGF, se midieron en la presencia ya sea de un dominio extracelular completo (ECD) de KDR o un segundo dominio de Flt-1 (Flt-1D2). ambos en concentraciones en incremento, respectivamente. El ECD completo de KDR o FIt-1 tiene siete dominios tipo inmunoglobulina, y enlaza a VEGF a través del segundo y tercer dominio. El segundo dominio de Flt-1 solo puede enlazar a VEGF en Kd de 2nM con epítopes conocidos en VEGF, con base en la estructura de cristal publicada del complejo VEGF-VEGFR (Wiesmann y asociados. (1997) Cell 91:695-704). El Kd del ECD KD R que enlaza a VEGF es de aproximadamente 5n . Esperamos que los enlaces de clones de fago sean reducidos con la adición en incrementos de receptores, si los epítopes de un anticuerpo sobre el fago traslapan en forma significativa con el receptor. Para el ensayo de bloqueo del receptor en el nivel de proteína con Fab purificado expresado de E. coli (VEGF de ratón o humano), la placa inmovilizada por receptor VEGF recubierto con baculovirus expresó fragmento ECD Flt-1 (dominio Ig 1-5) (Flt-1 DI-S) directamente, o la fusión KDR-lg expresada por 293 células, el cual presenta ECD KDR (dominio Ig 1-7) como una fusión Fcy capturada con Fcy IgG anti-humano de cabra (Jackson I mmunoResearch Lab. West Grove, PA) cubierta en la inmunoplacas Maxisorp de 96 depósitos y bloqueada con 0.5% de BSA y 0.02% de Tween20. El hVEGF O mVEGF expresado en forma bacteriana biotinilado a 0.2 nM se incubó primero con Fabs anti-VEGF diluidos en serie tres veces, G6, Fab-12 (el Fab del anticuerpo Avastin™), o Y0317 en PBS con 0.05% de Tween 20 (PBST). Después de una incubación de 1 hora a temperatura ambiente, las mezclas fueron transferidas a una placa inmovilizada por receptor VEGF e incubadas durante 10 minutos. El VEGF-A que no fue bloqueado por anti-VEGF fue capturado con depósitos recubiertos por el receptor VEGF y detectado por el conjugado HRP-estreptavidin y desarrollado con sustrato TMB tal como se describió anteriormente. Tal como se muestra en la figura 3, los cuatro clones fueron bloqueados hasta diferentes puntos mediante Flt-1D2 y KDR. Los resultados del ensayo de bloqueo sugieren que estos cuatro clones pueden tener diferentes epítopes de enlace en VEGF, que están traslapados con el epítope de enlace de receptor. Las afinidades de los clones del anticuerpo no se correlacionan con la eficiencia del bloqueo a través del receptor en este ensayo de bloqueo. Y0959, un clon de fagos con epítope conocido se utilizó como un control. Entre los cuatro clones novedosos, G6 y B20 parecieron tener epítopes que se traslapan suficientemente con los de Flt-1 y KDR, ya que sus enlaces a mVEGF fue significativamente reducido en la presencia de los fragmentos del receptor. La diferencia en la eficiencia de bloqueo es pequeña, pero ha sido consistente con múltiples ensayos. Una predicción es que G6 ó B20 tienen epítopes que coinciden con los del receptor en VEGF mucho mejor que Fab-12 o sus variantes, Y0317 y Y0959 (Muller, Y. A., y asociados (1998) Structure 6:1153-1167). Por consiguiente, se procedió a generar la proteína Fab para confirmar el enlace y examinar el epítope. Se eligió G6 primero para estudio en forma adicional, ya que tiene la mayor afinidad tanto con mVEGF como con hVEGF. Especificidad de Enlace y Actividad de Neutralización Para determinar la especificidad de enlace del clon Fab G6, se llevaron a cabo ensayos ELISA utilizando VEGF-A-I65 de humano, ratón, rata y conejo, así como homólogos incluyendo factor de crecimiento de ratón y humano (PIGF-2), mVEGF-D y VEGF-B de humano. El factor de crecimiento de humano y de múrido (PIGF-2), VEGF-D de múrido, VEGF-A de rata y VEGF-B de humano fueron del sistema R&D. Los antígenos probados fueron recubiertos sobre inmunoplaca Maxisorp de 96 depósitos NUNC en una concentración de 21 µg/ml. El enlace con concentraciones en incremento de la proteína Fab G6 se midió a través del conjugado y sustrato de peroxidasa de rábano-Proteína G. Por ejemplo, la proteína Fab fue preparada a partir de E. coli albergando el plásmido de la construcción de expresión Fab G6 bajo el promotor de fosfatasa alcalina y las secuencias líderes de secreción stll, y purificada con columna de afinidad de Proteína G. Se midió a través de ELISA directo el enlace de Fab G6 a VEGF y sus homólogos. Los depósitos recubiertos con homólogo VEGF (en una concentración de 21 µg/ml en PBS) se bloquearon con 0.5% de BSA y 0.05% de Tween20 a una temperatura de 25°C. Se incubó el Fab en concentraciones en incremento con depósitos recubiertos con homólogos VEGF durante 1 hora a 25°C y se midió con conjugado de peroxidasa de rábano de anticuerpo Fab anti-humano diluido en regulador PBT, posteriormente se desarrolló con sustrato TMB. También se llevaron a cabo ensayos de enlace de solución para algunas proteínas incubando 0.5 n de Fab G6 con concentraciones en incremento de un homólogo VEGF durante 1 a 2 horas a una temperatura de 25°C, y se capturó el Fab no enlazado con depósitos recubiertos con VEGF-A y se midió. Tal como se muestra en la figura 4, la proteína Fab G6 enlaza igualmente bien tanto a mVEGF como a hVEGF (aproximadamente 0.6nM y 1.4nM, respectivamente). Además, el anticuerpo G6 no enlazó en lo absoluto a otros homólogos VEGF, y por lo tanto es altamente específico para VEGF. El Fab G6 enlazó a VEGF de rata y ratón con afinidad similar a la de VEGF (datos no mostrados). Para probar si G6 no enlaza únicamente a VEGF con una alta afinidad, sino también tiene la capacidad de bloquear en forma efectiva el enlace de VEGF a receptores VEGF, se llevaron a cabo ensayos de bloqueo en donde se probó ya sea hVEGF o mVEGF con respecto a su enlace a KDR en la presencia de concentraciones en incremento del clon Fab G6. También utilizados como control, fueron los anticuerpos anti-hVEGF, Fab-12 (el Fab o Avastin™) y Y0317, que tienen la capacidad de bloquear en forma efectiva hVEGF pero no enlaza a mVEGF ni bloquea sus actividades. Tal como se muestra en la figura 5, G6 bloqueó en forma efectiva el enlace de hVEGF a KDR con una eficacia similar a la del Fab-12 o Y0317. Además, G6 también bloquear en forma significativa el enlace de mVEGF a KDR. En comparación, ni Fab-12 ni Y0317 mostraron algún efecto de bloqueo en mVEGF. Por lo tanto, el anticuerpo anti-VEGF G6 novedoso de la presente invención, es un anticuerpo anti-VEGF de alta afinidad con la capacidad de bloquear y enlazar VEGF tanto de especies humanas como de múrido. Ensayo a Base de Células Para determinar en forma adicional especificidad de enlace y actividades de bloqueo del anticuerpo G6 novedoso, se llevó a cabo un ensayo a base de células utilizando células endoteliales de vena umbilical humana (HUVECs), en donde se probaron diversos anticuerpos anti-VEGF con respecto a sus capacidades para bloquear la proliferación de célula inducida ya sea por VEGF de humano o de múrido. Básicamente, se sembraron placas de cultivo de tejido de 96 depósitos con 3000 HuVECs por depósito, y se dejaron en ayuno en el medio de ensayo (F12:DMEM 50:50 suplementado con 1.5% (v/v) de suero de bovino fetal diafiltrado) durante 24 horas. La concentración de VEGF utilizada para estimular el crecimiento de las células, se determinó titulando primero para identificar la cantidad de VEGF que puede inducir al 90% de síntesis de ADN máxima. El medio de ensayo fresco con cantidades fijas de VEGF (concentración final de 0.1 nM) y concentraciones en incremento de Fab anti-VEGF se agregaron posteriormente. Después de 24 horas de incubación, las células fueron pulsadas con 0.5 1 µ?? por depósito de [3H] timidina durante 24 horas, y posteriormente se cosecharon en una placa de filtro de 96 depósitos para el conteo a través de un contador gamma TopCount. Aquí, se midió la síntesis de ADN mediante la incorporación de timidina titulada. En este ensayo los anticuerpos anti-VEGF que sirven como el control fueron Fab- 2 y Y0317. Tal como se muestra en la figura 6, el anticuerpo G6 redujo en forma significativa las capacidades tanto de hVEGF y mVEGFs para promover la proliferación HUVEC. Aquí, el experimento de factor de crecimiento de fibroblasto básico (bFGF) sirvió como un control para demostrar que ninguno de los Fabs anti-VEGF utilizados en este ensayo, tuvo alguna toxicidad no específica para las células huésped. (c ) Mejoría de Afinidad de los Anticuerpos Anti-VEGF G6 v B20 Se eligieron dos clones de anticuerpos novedosos, G6 y B20 para la mejoría adicional en afinidades de enlace. Para mejorar la afinidad, se aleatorizaron varios residuos seleccionados del CDR de cadena ligera, ya que ambos clones vienen de una biblioteca únicamente con una cadena pesada aleatorizada y una cadena ligera fija. Los residuos CDR expuestos a la superficie y los residuos que son altamente diversos en la base de datos Kabat de las secuencias de anticuerpos naturales, fueron los elegidos. Se utilizó mutagénesis dirigida al sitio con codones de degeneración diseñados a la medida para generar una diversidad de aminoácidos que mimetizó el repertorio inmune natural en cada sitio CDR en la cadena ligera (Figura 7). La clasificación se llevó a cabo primero agregando la biblioteca sobre hVEGF ó mVEGF inmovilizado sobre la placa de 96 depósitos Maxisorp para maximizar la recuperación de enlazadores, seguido de la clasificación de solución con concentración en disminución de hVEGF ó mVEGF biotinilado en la forma de dos pistas de selección separadas. La concentración de VEGF biotinilado se seleccionó con base en la afinidad inicial del clon para calibrar la presión de selección también se incrementó incubando los enlazadores de fago con un exceso de 1,000 veces de un antígeno no biotinilado en solución para una diferente duración de tiempo a una temperatura diferente después de la incubación inicial y la biblioteca de fagos con VEGF biotinilado y antes de la captura mediante neutravidina recubierta en una placa Maxisorp de 96 depósitos. Como ejemplo de los procesos descritos anteriormente, el G6 que tiene afinidad 1nM fue sometido a una mejoría de afinidad adicional. La primera vuelta de clasificación utilizó el método soportado por sólidos, para capturar todos los clones que aún estaban enlazados a VEGF, y posteriormente en la segunda vuelta de clasificación, se incubó la biblioteca de fagos con 1nM de VEGF. Posteriormente, el enlace de solución utilizó 1nM de hVEGF biotinilado para seleccionar la mayor parte de los enlazadores. Antes de la captura, se agregó 1 µ? de hVEGF no biotinilado y se incubó a RT durante 15 minutos para competir con enlazadores fuera de rangos rápidos. Posteriormente, en las siguientes vueltas de clasificación (3ra y 4ta), se puso más presión de selección en la clasificación de solución utilizando menos hVEGH biotinilado (0.1 nM) para seleccionar y 100nM de hVEGF no biotinilado a una temperatura de 37°C durante 30 minutos o más tiempo (2 horas ó 6 horas) para competir con enlazadores fuera de rango superiores y de pescado para enlazadores fuera de rangos bajos. Se utilizó la misma estrategia para mejorar el clon B20, excepto que se utilizó una condición menos estricta, debido a su baja afinidad contra hVEGF (IC50 ~ 150nM). La pista de selección mVEGF siguió los mismos procedimientos y condiciones que los que se utilizaron con hVEGF. Se calculó el enriquecimiento a través de la proporción de tituladores de fago eluidos para selección sin objetivo biotinilado. Después de la clasificación, se utilizó el ensayo ELISA del enlace de competición de un solo punto de alto rendimiento tal como se describió anteriormente, para clasificar rápidamente los clones con afinidad mejorada. En este ensayo, se aplicó una baja cantidad del hVEGF ó mVEGF (10nM) para clasificar 51 clones de la biblioteca de fagos a base de G6 y 110 clones a partir de la biblioteca de fagos a base de B20 con el control de los enlazadores B20 y G6 tipo natural. Varios clones G6 mejorados, denominados en forma colectiva como variantes G6-II fueron seleccionados y mostraron una afinidad de enlace remarcadamente incrementada tanto para VEGF de humano y múrido con un aumento de cien veces, comparado con los valores IC50 de fago con los clones tipo natural (figura 7). Se descubrió que los clones con muchas secuencias únicas tienen afinidad mejorada, lo que sugiere que existen muchas cadenas ligeras que pueden acomodar la cadena pesada de los clones seleccionados. También es interesante observar que cambiaron las especificidades de enlace de algunos clones. Esto sugiere que la cadena ligera tiene la capacidad de modular la interacción de la cadena pesada dentro de su antígeno lo suficiente para alterar sus especificidades. Como para las secuencias de clon, la mayoría de los clones G6-II fueron diferentes a G6 únicamente en su tercera cadena ligera CDR (CDR-L3). Para generar la proteína Fab o la proteína IgG par ensayos de afinidad y actividad, se clonó la región variable en un plásmido de expresión Fab para la expresión en un E. coli o una célula de mamífero (un vector de fagémido que ha sido modificado eliminando la secuencia que codifica el dominio de terminal-C de la proteína p3 de recubrimiento de fago y agregando una secuencia de término para el enlace de ribosomas de aproximadamente 20 nucleótidos en la corriente descendente a partir del codón de detención en el extremo del primer dominio constante de cadena pesada). La proteína Fab se generó creciendo células E. coli 34B8 transformadas en un medio AP5 a una temperatura de 30°C durante 24 horas tal como se describió anteriormente (Presta, L y asociados. (1997) Cáncer Res. 57:4593-4599). Se purificó IgG con columnas de Proteína A y se purificó Fab con cromatografía de afinidad de Proteína G. El rendimiento de producción de Fab, normalmente fue de 5 a 10 mg/L en un crecimiento en frasco de agitación a pequeña escala y de 0.5 a 3 g/L en crecimiento en fermentador. La producción IgG fue razonablemente mayor en 10-50 mg/L de cultivo a pequeña escala con algunas diferencias de clon a clon. Se seleccionaron tres clones mejorados G6-II, G6-8, G6-23 y G6-31 (ver figura 7 para cambios en residuos en CDRs de cadena ligera) para elaborarse en proteína Fab para la medida de afinidad, mapeo de epítope mediante ensayo de bloqueo de receptor y estudio de actividad en ensayo de inhibición de crecimiento HuVEC. Para las determinaciones de afinidad de los Fabs anti-mVEGF se utilizaron ensayos de plasmon de superficie en un BIAcore™-2000 o un B I Acore™-3000 (BIAcore, Inc., Piscataway, NJ) a una temperatura de 25°C y 37°C con chips mVEGF ó hVEGF CM5 inmovilizados a ~ 100 unidades (RU) tal como se describe (Chen, Y., y asociados (1999) J. Mol. Biol. 293:865-881). En síntesis, se activaron los chips de biosensor de dextrano carboximetilasos (CM5, BIAcore Inc.) con clorhidrato de N~etil-N'-(3-dimetilaminopropil)-carbodümida (EDC) y N-hidroxisuccinimida (NHS) de acuerdo con las instrucciones del proveedor. Se diluyó el VEGF de humano y de múrido con 10 mM de acetato de sodio pH 4.8 en 5µg/ml (-0.2 µ?) antes de inyectarse en un rango de flujo de 5µ?/??????? para lograr aproximadamente 100 unidades de respuesta (RU) de proteína acoplada. Después la inyección de 1 M de etanolamina bloqueó los grupos no reactivados. Para medidas cinéticas, se inyectaron dos diluciones de serie de Fab (100 a 0.78 nM o 3 nM a 500 nM) con 0.05% de Tween 20 (PBST) a una temperatura de 25°C a un rango de flujo de aproximadamente 25 µ?/min. Se calcularon rangos de asociación (kon) y rangos de disociación (k0ff) utilizando un modelo de enlace Langmuir uno a uno simple (BIAcore Evaluation Software versión 3.2) mediante ajuste simultáneo del sensograma de asociación y disociación. La constante de disociación de equilibrio (Kd) se calculó como la porción k0ff/ko n ¦ Ya que el kon de la afinidad mejoró las variantes G6, no se obtuvo como resultado estadísticas satisfactorias con el modelo de enlace disponibles en los métodos de evaluación BIAcore, los ensayos de enlace de competición de solución utilizando proteínas desplegadas por fago, también fueron llevadas a cabo para medir la afinidad relativa de dichos anticuerpos en equilibrio. El VEGF desplegado en el fago se incubó con diluciones en serie de fago a temperatura ambiente durante 20 horas, para llegar al equilibrio y el fago-VEGF no enlazado fue capturado con Fab G6 brevemente (10 minutos) y se midió con anti-M13- HRP y sustrato TMB como se indicó anteriormente. También se llevó a cabo un segundo formato de ensayo de enlace de competición de solución, en donde Fab fue desplegado en el fago e interactúo con diluciones de VEGF para alcanzar el equilibrio (20 h) y se capturó el Fab no enlazado en la placa de 96 depósitos recubierta con VEGF y se midió como se indicó anteriormente. Se promediaron los dos valores IC50 para obtener afinidades de enlace como los IC50 finales. Los enlaces de Fab al mVEGF se ensayaron únicamente con un segundo formato debido a la carencia del reactivo del fago que despliega mVEGF. A partir de los experimentos SPR iniciales, se observó que existe una mejoría kon significativa. Por ejemplo, se descubrió que G6-23 tuvo la mejoría más significativa en un el en-rango a una temperatura de 25°C y 37°C contra tanto VEGF humano como de múrido, y una pequeña reducción en fuera-rango (figura 8). El kon para G6-31 también mejoró en comparación con G6 (datos no mostrados). Además, los ensayos de enlace de competición de solución confirmaron que G6-23 fue el clon con la mayor afinidad mejorada con su alta afinidad de IC50 de 20 pM contra hVEGF y mVEGF (figura 7). También se llevaron a cabo ensayos de extinción fluorescente para determinar los rangos kon de los anticuerpos serie G6 con mayor afinidad. Por consiguiente, se purificaron tres de los FABS madurados por afinidad (G6-8, G6-23 y G6-31) en la forma de proteínas Fab, y se compararon sus afinidades para mVEGF con G6, mediante uso y extinción de fluorescencia en solución para el rango de asociación (en rango, kon) tabla 1 y figuras 30a y 30b. Tabla 1.

Se llevaron a cabo ensayos de extinción de fluorescencia como se indica a continuación. El cambio de intensidad en fluorescencia en la elaboración de complejos del Fab y VEGF, fue utilizado para determinar el rango de asociación tal como se desarrolló para la determinación en-rango de las variantes Fab-12 y VEGF (Marvin J. S. y H. B. Loman (2003) Biochemistry 42:7077-7083). Determinamos primero que la intensidad de fluorescencia con una longitud de onda de excitación de 280 nM del complejo G6 (o variantes)-VEGF, fue inferior a la suma de los componentes individuales utilizando un espectrofotómetro SLM-Aminco serie 8000 (Thermo-Spectronic) agregando 100 nM de VEGF a una cubeta agitada que contiene 20 nM de Fab en PBS, con pH 7.2 a una temperatura de 25°C. Posteriormente, se mezclaron las concentraciones en incremento de VEGF (100-400 nM) con volúmenes iguales de 40 nM de Fab en un espectrofotómetro equipado con detención-de flujo (Aviv Instruments), para observar el rango de la disminución de la intensidad de fluorescencia a una temperatura de 25°C. Para cada experimento, se realizaron nueve medidas por cada concentración y se ajustaron a una curva de un solo exponente. Posteriormente el rango observado se trazó contra concentraciones VEGF para análisis de primer pseudo-orden , y la pendiente es el rango de asociación. Se llevaron a cabo de dos a tres experimentos independientes y las diferentes estuvieron en un 50%. El kon estimado de los clones mejorados del método SPR, fueron -3-6 veces menores a las medidas a través del ensayo de extinción de fluorescencia con base en la solución, en tanto que las medidas kon para el Fab G6 de origen a partir de SPR, fue estadísticamente convincente y tuvieron 1.2 veces de diferencia con ensayos de extinción de fluorescencia. Es posible que al utilizar la tecnología SPR Biacore para medidas en rango rápidas, hubiera límites por las dinámicas de flujo complejas, o pudiera haber ciertas diferencias en comportamientos de proteína entre el clon de origen y clones mejorados por afinidad, aunque no se observaron problemas de agregación con estas proteínas. Con base en los ensayos de fluorescencia, los tres Fabs exhibieron mejorías con respecto a G6 en el en-rango en 6, 8, ó 20 veces con respecto a G6-8, G6-31 , ó G6-23, respectivamente. El Fab-G6-31 también exhibió una mejoría de ~4 veces en el fuera-rango, y como resultado, la afinidad de Fab-G6-31 (Kd = 16 pM) y Fab-C6-23 (Kd = 21 pM) fue de ~ 40-60 veces mejor en comparación con el G6 de origen (Kd = 910 pM). Fue consistente con los ensayos de competición en fase de solución, que mostraron una mejoría de 20 a 60 veces en el valor IC50 para G6-31 (30 pM) ó C6-23 (10 pM) en comparación con G6 (0.67 nM). Aplicamos la estrategia de maduración de afinidad de cadena ligera a otras cinco diferentes secuencias de cadena pesada y se observaron mejorías de 10 a 30 veces en las afinidades de enlace (datos no mostrados). A diferencia de G6, muchos clones mejorados adoptaron nuevas secuencias para los tres CDRs de cadena ligera. Por lo tanto, descubrimos que las tres variantes G6 incrementaron afinidad de enlace tanto para VEGF de humano como de múrido con respecto a G6, predominantemente a través del incremento en el rango de asociación (en rango ó kon). G6-23 tuvo el en-rango más alto y posteriormente fue seguido de G6-8 y posteriormente G6-31. La mejoría en el rango de disociación (fuera de rango o k0ft) fue de 2 a 3 veces con respecto a G6-23, y de 8 a 13 veces con respecto a G6-31 para hVEGF ó mVEGF, respectivamente. En comparación con Fab-12 y Y0317, G6 y G6-23 tuvieron cinéticas de enlace significativamente diferentes (figura 32). G6-23 tuvo un Kd similar a Y0317 aunque cinéticas más rápidas con un en-rango rápido de alrededor de 106 (M"1s"1), y un rango de disociación moderado (fuera de rango k0ff ) en 1-2x104s"1, en tanto que Y0317 tuvo un kon lento en 3x104 M"1s"1, y un k0ff muy lento en ~5x10"6s"1 (figura 32). El ensayo de enlace de competición de solución utilizó antígenos de proteína biotinilados equilibrados con diluciones en serie de Fab o proteína IgG purificadas, y la biotina-antígeno no enlazada fue capturada con Fab ó IgG inmovilizado recubierto sobre placas Maxisorp y se detectó con HRP conjugado por estreptavidin . Como alternativa, las proteínas Fab ó IgG fueron equilibradas con diluciones en serie de antígeno de proteína y el Fab ó IgG no enlazado fue capturado con antígeno inmovilizado y detectado con proteína A-HRP. Para el ensayo de bloqueo de receptor VEGF utilizando Fab purificado, se inmovilizó el receptor VEGF en una placa recubriendo el fragmento ECD Flt-1 (dominio lg-5) ( F 11- 1 D i -5 ) directamente, o cubriendo primero con Fcy e IgG anti-humano de cabra (Jackson ImmunoResearch Lab. West Grove, PA) y posteriormente tratando con receptor de fusión KDR-lgG el cual presentó KDR ECD (Ig dominio 1 a 7) como un dímero, en una inmunoplaca Maxisorp de 96 depósitos. Posteriormente la placa fue bloqueada con 0.5% de BSA y 0.02% de Tween20. Se incubaron concentraciones submolares de hVEGF ó mVEGF biotinilado en 0.2 nM, con Fabs anti-VEGF, G6, G6-II (G6-8, 23, y 31), Fab-12, ó Y0317 en PBST diluidos en serie tres veces. Después de 1 hora de incubación a temperatura ambiente, las mezclas fueron transferidas a la placa que contiene el receptor VEGF inmovilizado e incubadas durante 10 minutos. El VEGF-A que no fue bloqueado por anti-VEGF fue capturado con los depósitos recubiertos con receptor VEGF y detectado mediante conjugado de estreptavidi n-H RP y desarrollado con substrato T B, tal como se describió anteriormente. Los resultados anteriores, muestran que en comparación con el G6 original, los Fabs G6-II seleccionados tienen de hecho actividades de bloqueo incrementadas tanto para hVEGF como mVEGF. Se ha observado un bloqueo fuerte tanto con clones de despliegue de fagos G6 como B20, lo cual sugiere que los epítopes de enlace sobre VEGF, se traslaparon con los epítopes de los receptores. Fab G6 también mostró bloquear el enlace de VEGF tanto de humano como de múrido a Flt-1 ECD (figura 31), en forma eficiente. En comparación, Fab-12 puede bloquear únicamente el enlace de hVEGF pero no de mVEGF al receptor, en forma consistente con más especificidades de enlace. Una variante Fab-12 von afinidad mejorada para hVEGF (Kd = 20 pM), Y0317, adquirió en forma inadvertida cierta afinidad débil para mVEGF (Kd -300 nM a 25C, Y. Chen y H. Lowman, resultados-publicados), y muestra una ligera actividad de bloqueo de receptor para mVEGF en altas concentraciones. La inhibición de la actividad VEGF en el ensayo de crecimiento de célula endotelial (HuVEC) se llevó a cabo tal como se describió anteriormente. Al igual que G6, G6-II inhibió en forma específica el crecimiento de la célula endotelial de vena umbilical de humano estimulada por VEGF de humano y de múrido, pero no el crecimiento estimulado por el factor de crecimiento de fibroblastos básico de humano (bFGF). La concentración requerida para inhibir el 50% del crecimiento de las células estimuladas tanto por VEGF de humano como de múrido (HuVEC IC50) se correlacionó bien con afinidad medida por BIAcore o el ensayo ELISA de enlace de solución a una temperatura de 37°C. En comparación G6, G6-23, y G6-31 mostraron al menos 100 veces de mejoría en la inhibición de crecimiento de HuVECs, estimulado por hVEGF ó mVEGF. También se midieron en los mismos ensayos Fab-12 y Fabs Y0317, para servir como controles. Fab-12 no mostró enlace medible para mVEGF, en tanto que Fab Y0317 puede enlazar a mVEGF con una afinidad de 350 nM. Por consiguiente, tal como se espera, Y0317 y Fab-12 no mostraron efectos inhibidores algunos en el crecimiento de HuVECs transmitido por mVEGF. Nosotros demostramos que muchas variantes G6-II con diferentes cadenas ligeras, pueden tener afinidad mejorada y el ensayo de enlace de solución puede anticipar el resultado de la potencia como inhibidor en el ensayo de célula HuVEC. Se compararon los enlaces VEGF de G6-23 con G6, así como Fab-12. Tal como se muestra en la figura 8, G6-23 tienen un en-rango mejorado en forma significativa para enlazar tanto a hVEGF como a mVEGF. Por lo tanto el fuera-de rango de G6-23, substancialmente similar al de G6, el Kd general de G6-23 es de al menos aproximadamente 7 veces mejor que el de G6 tanto para hVEGF como para mVEGF. Ejemplo 2 - Mapeo de sitios de enlace VEGF en anticuerpos G6 y G6-23 Mapeo funcional de G6 y G6-23 mediante exploración homologa y de alanina de perdigonada El mapeo funcional de G6 y G6-23 mediante exploración homologa y de alanina de perdigonada, se llevó a cabo para identificar residuos que son importantes para el enlace de hVEGF y encontrar residuos que puedan mejorar en forma adicional el enlace de VEGF. Generamos bibliotecas de fago en combinación que permiten residuos CDR de cadena pesada o cadena ligera en bibliotecas por separado ya sea para alanina o tipo natural (exploración de alanina), o ya sea para aminoácido homólogo o tipo natural (exploración homologa). Oliqonucleótidos mutaqénicos para bibliotecas de exploración de perdigonada Los siguientes oligonucleótidos mutagénicos para construcciones de bibliotecas de exploración de alanina (A) y homologas (h) de perdigonada para aleatorizar los residuos CDR en anticuerpos G6 y G6-23, fueron diseñados utilizando los codones de perdigonada previamente descritos (Vajdos y Asociados (2002) J. Mol. Biol. 320:415-428). Las degeneraciones de ADN equimolares están representadas en el código IUB (K-G/T, M = A/C, R = A/G, S = G/C, V=A/C/G, W=A/T, Y = C/T), y los codones de degeneración se muestran con letras negritas. Los siguientes oligonucleótidos fueron generados a través del grupo de síntesis de ADN Genentech.

Oligo Secuencia Hl-A GCA GCT TCT GGC TTC ACC ATT KCC GMT KMT KSG ATA CAC TGG GTG CGT CAG (SEQ ID NO: 3) H2-A AAG GGC CTG GAA TGG GTT GCA GST ATT RCT CCT GST GST GGT KMT ACT KMT TAT GCC GAT AGC GTC AAG GGC (SEQ ID NO: 4) H3-A ACT GCC GTC TAT TAT TGT GCA CGC KYT GYT KYT KYT SYT SCA KMT GCT ATG GAC TAC TGG GGT CAA (SEQ ID NO: 5) Ll-A ACC TGC CGT GCC AGT SMA GMT GYT KCC RCT GST GTA GCC TGG TAT CAA CAG AAA C (SEQ ID NO: 6) L2-A CCG AAG CTT CTG ATT KMT KCC GCA TCC KYT CTC KMT TCT GGA GTC CCT TCT CGC (SEQ ID NO: 7) L3-A1 GCA ACT TAT TAC TGT SMA CAA KCC KMT RCT RCT CCT SCA ACG TTC GGA CAG GGT ACC (SEQ ID NO: ) L3-A2 GCA ACT TAT TAC TGT RMA CAA GST KMT GST RMC CCT KSG ACG TTC GGA CAG GGT ACC (SEQ ID NO: 8) Hl-H GCA GCT TCT GGC TTC ACC ATT KCC GAM TWC YKG ATA CAC TGG GTG CGT CAG (SEQ ID NO: 9) H2-H AAG GGC CTG GAA TGG GTT GCA GST RTT ASC SCA KCT GST GST TWC ASC TWC TAT GCC GAT AGC GTC AAG GGC (SEQ ID NO: 10) H3-H ACT GCC GTC TAT TAT TGT GCA CGC TWC RTT TWC TWC MTC SCA TWC GCT ATG GAC TAC TGG GGT CAA (SEQ ID NO: 1 1) Ll-H ACC TGC CGT GCC AGT SAA GAM RTT KCC ASC KCT GTA GCC TGG TAT CAA CAG AAA C (SEQ ID NO: 12) L2-H CCG AAG CTT CTG ATT TWC KCC GCA TCC TWC CTC TWC TCT GGA GTC CCT TCT CGC (SEQ ID NO: 13) L3-H1 GCA ACT TAT TAC TGT VAR VAR KCC TWC ASC ASC CCT SCA ACG TTC GGA CAG GGT ACC (SEQ ID NO: 14 ) L3-H2 GCA ACT TAT TAC TGT VAR VAR GST TWC KCT RAC CCT TKG ACG TTC GGA CAG GGT ACC (SEQ ID NO: 15) Vectores de plantilla de fagémido para construcciones de bibliotecas de exploración de perdigonada (A) Fagémido pV350-2b. El fagémido pV0350-2b, el cual fue utilizado previamente para desplegar Fab h4D5, un anticuerpo humanizado contra el dominio extracelular (ECD) del receptor de enlace relacionado con EGF 2 (ErbB2), monovalente en la superficie del bacteriófago M13 y el codón de detención contenido (TAA) en los tres CDR en la cadena pesada (he), sirvió como la plantilla para la construcción de la biblioteca de exploración de perdigonada de cadena pesada G6. En forma más específica, se derivó el fagémido pV0350-2b a partir del fagémido pS0643. El vector de fagémido, pS0643 (también conocido como phGHam-g3, por ejemplo Patente Norteamericana No. 5,688,666, ejemplo 8), contiene pBR322 y orígenes de réplica fl, un gen resistente a ampicilina, un promotor de fosfatasa alcalina (phoA) E. coli (Bass y Asociados (1990) Proteins 8:309-314), y una secuencia que codifica una secuencia de señal de secreción stll fusionada para residuos 1-191 de la hormona de crecimiento de humano (hGH) y una secuencia que codifica los residuos de terminal-C 267-421 de la proteína III del fago M13 (en lo sucesivo, cP3 ó plll). El fagémido pS0643 también contiene un sitio Xbal y un codón de detención ámbar seguido del residuo 191 de hGH. La secuencia de señal de secreción stll puede exportar una proteína al periplasma de una célula bacteriana (por ejemplo, una región de cadena ligera (LC) de un anticuerpo). La secuencia que codifica la hormona de crecimiento humano (hGH) fue eliminada del vector pS0643 y reemplazada con un fragmento de ácido nucleico Nsil/Xbal que codifica un fragmento Fab anti-Her2 humanizado (secuencia "h4D5") ligada en estructura con la señal de secreción stll (humAb4D5-8, ver la Publicación de Cárter y Asociados (1992) PNAS 89:4285-4289 o la Patente Norteamericana No. 5,821,337, para la secuencia). El codón de detención ámbar entre el fragmento de cadena pesada y cP3 fue eliminado, y esta modificación ha mostrado incrementar los niveles de Fab desplegado en fagos. El anticuerpo h4D5 es un anticuerpo humanizado que reconoce en forma específica un antígeno asociado con cáncer conocido como Her-2 (erbB2). Se obtuvo la secuencia h4d5 mediante reacción en cadena de polimerasa utilizando la secuencia humAb4D5 versión 8 ("humAb4D5-8") y los cebadores construidos para dar surgimiento a un sitio 5' Nsil y a un sitio 3' Xbal en el producto PCR (Cárter y Asociados (1992) PNAS 89:4285-4289). El producto PCR fue disociado con Nsil y Xbal y ligado en el vector de fagémido pS0643. La secuencia de ácido nucleico h4D5 codifica las regiones CDR modificadas a partir de un anticuerpo monoclonal de ratón específico para Her-2 en una estructura Fab de secuencia de consenso en su mayor parte humana. En forma específica, la secuencia contiene una corriente ascendente de cadena ligera kappa (región LC) de los dominios VH y CH1 (región HC). El método para elaborar el anticuerpo Her-2 e identificar la secuencia de dominio variable se proporciona en las Patentes Norteamericanas Nos. 5,821,337 y 6,054,297. El plásmido pS0643 que contiene 4D5 humanizado (versión 8), se modificó en forma adicional. Por ejemplo, se agrega una etiqueta de epítope de glucoproteína D de flujo de herpes simplex tipo 1 (gD tag -MADPNRFRGKDLGG (SEQ ID NO:_17) en la estructura al término-c de LC utilizando mutagénesis dirigida al sitio. Siguiendo la corriente descendente del codón de detención de LC, un sitio de enlace de ribosoma y una molécula de ácido nucleico que codifica una secuencia de señal stll, fueron ligadas al término-N de la secuencia HC. En consecuencia, la secuencia HC está en la estructura con el dominio de terminal-C del p3 (cP3), una proteína de recubrimiento menor del fago M13. Por lo tanto, un Fab desplegó un fago que puede ser producido a partir de una construcción. Este vector de fagémido Fab es referido como pV0350-2b y se ilustrará en forma esquemática en la figura 1. El gen ligero en pV0350-2b, fue modificado en forma adicional mutando otros cuantos residuos de aminoácido, por ejemplo, Arg66 a un Gly y S93 para Ala. Para generar F(ab)'2 desplegado en fagos, el vector PV0350-4 fue modificado en forma adicional insertando una secuencia GCN4 de cierre de Ieucina dimerizable (GRMKQLEDKVEELLSKNYHLENEVARLKKLVGERG) (SEQ ID NO:18) entre las secuencias HC y cP3 mediante mutagénesis de cinta. El cierre de Ieucina GCN4 lleva dos grupos de polipéptidos de fusión LC/HC-cP3 juntos en el periplasma de E. coli y presenta el dímero en la superficie del fago. Este vector de fagémido F(ab)'2 es referido como pV0350-4, y también se ilustra en forma esquemática en la figura 1. Para la construcción de biblioteca de exploración de perdigonada de cadena pesada G6-23, se construyó el fagémido pW0448-2, introduciendo la secuencia G6-23 CDRL3 en el fagémido pV0350-2b utilizando el método de mutagénesis de Kunkel (Kunkel y Asociados (1991) Methods Enzymol 204:125-139)). También se generó el fagémido pW0448-1 a partir de pV0350-2b como plantilla para la biblioteca de exploración de perdigonada de cadena ligera G6 y G6-23 que contiene el dominio variable de cadena pesada de G6 y el codón de detención (TAA) en los tres CDRs en la cadena ligera.

Construcción de bibliotecas de exploración de perdigonada Se construyeron bibliotecas desplegadas por fagos utilizando el método de mutagénesis de Kunkel tal como se describe (Kunkel y Asociados, 1991, supra). En total, se generaron ocho bibliotecas: hcA-G6, hcA-G6-23, lcA-G6 e lcA-G6-23, fueron bibliotecas de exploración de alanina de cadena pesada (he) o cadena ligera (le) de G6 y G6-23; hcH-G6, hcH-G6-23, lcH-G6, lcH-G6-23 fueron bibliotecas de exploración homologa. La plantilla que contiene el codón de detención TAA en los CDRs de cadena pesada o ligera, se reparó en forma simultánea durante la reacción de mutagénesis a través de los oligonucleótidos mutagénicos anteriores con codones de degeneración designados. Después de la mutagénesis, se electroporaron 10 g de ADN en células SS320 E. coli (células ~1011) (Sidhu y Asociados (2000) Methods Enzymol 328:333-363), los cuales se crecieron durante la noche a una temperatura de 30°C en caldo 2YT suplementado con fago auxiliar M13-K07 (New England Biolabs), 50 pg/ml de carbenicilina y canamicina. Los tamaños de la biblioteca fueron de 2-5x109. Los fagos se concentraron a partir del medio de cultivo mediante precipitación con PEG/NaCI, y se suspendieron nuevamente en solución salina regulada por fosfato (PBS) tal como se describió previamente (Sidhu y Asociados, 2000, supra).

Clasificación de biblioteca y ensayos de clasificación El objetivo de proteína, el anticuerpo marcado con VEGF ó anti-gD (proporcionado por grupos de investigación de Genentech), fue inmovilizado en inmunoplacas Maxisorp de 96 depósitos NUNC (Roskilde, Dinamarca) durante la noche a una temperatura de 4°C, y antes de la clasificación, las placas fueron bloqueadas con albúmina de suero de bovino (BSA, Sigma) durante 2 horas a temperatura ambiente (RT). Las bibliotecas de fagos de la preparación anterior (~1013 fago/ml) fueron incubadas en las inmunoplacas recubiertas con objetivo durante 1 hora a RT para permitir el enlace de fagos. Posteriormente las placas fueron lavadas quince veces con PBS y regulador Tween 20 (PST) al 0.05%, y se eluyeron los fagos enlazados con 0.1 M HCI durante 15 minutos y se neutralizaron con una base Tris 1.0 M. Los fagos eluidos fueron propagados en XL1-azul de E. coli (Stratagene) para una siguiente vuelta de selección. Los clones individuales seleccionados de la segunda vuelta de lavado con batea, fueron crecidos en una placa de 96 depósitos durante la noche a una temperatura de 37°C con 150 µ? de caldo 2YT suplementado con 50 pg/ml de carbenicilina y fago auxiliar M13-VCS (1:2500) (Stratagene). Los sobrenadantes del cultivo se utilizaron directamente en ensayos inmunoabsorbentes enlazados por enzimas competitivos de fagos (ELISAs de fagos) para clasificar las variantes Fab G6 ó G6-23 desplegadas por fago funcionales que enlazan a proteínas objetivo recubiertas en la placa (Sidhu y Asociados, 2000, supra). Los clones que exhibieron tanto señales ELISA de fago positivas para el antígeno VEGF como para el anticuerpo marcado con anti-gD, se sometieron a análisis de secuencia de ADN. Secuenciación y análisis de ADN Los clones funcionales a partir de la clasificación anterior, fueron crecidos en placas de 96 depósitos con 100 pl de caldo 2YT y 50 g/ml de carbenicilina a una temperatura de 37°C durante 2 horas. Una pequeña cantidad de los sobrenadantes de cultivo (1-2 µ?) sirvió como plantillas para PCRs (GeneAmp® PCR System 9700, Applied Biosystems) para amplificar los fragmentos de ADN de fagémido que contienen los genes de cadena ligera y pesada con cebadores de secuenciación para agregar secuencias universales M 13 (-21) en el extremo 5' de los fragmentos amplificados, facilitando de esta forma el uso de los cebadores delanteros M13 en las reacciones de secuenciación. Los fragmentos de ADN amplificados en un formato de 96 depósitos, fueron secuenciados utilizando reacciones de secuenciación de terminación Big-Dye y fueron analizados en un analizador de ADN de 96 capilaridades ABI Prism 3700 (PE Biosystems, Foster City, CA) mediante el grupo de secuenciación de ADN Genentech. Las secuencias fueron analizadas con el programa SGCOUNT, tal como se describió previamente (Weiss y Asociados (2000) PNAS EUA 97:8950-8954). El siguiente número de clones funcionales en el paréntesis seleccionados de cada biblioteca contra el antígeno VEGF, fueron sometidos a análisis de secuencia de ADN: hcA-G6 (107), hcA-G6-23 (124), lcA-G6 (111), IcA-G6-23 (102), hcH-G6 (111), hcH-G6-23 (135), lcH-G6 (106), lcH-G6-23 (97). Para los clones procedentes de la selección de enlace de anticuerpo marcado con anti-gD: hcA-G6 (108), hcA-G6-23 (130), lcA-G6 (116), lcA-G6-23 (98), hcH-G6 (120), hcH-G6-23 (122), lcH-G6 (111), lcH-G6-23 (102). Mutantes de punto Fab G6 y G6-23 y medidas de afinidad Para generar mutantes Fab G6 y G6-23 para medidas de afinidad, utilizamos el plásmido de expresión Fab modificado previamente a partir del vector desplegado por fagos con un promotor de fosfatasa alcalina (phoA) E. coli (Presta y Asociados (1997) Cáncer Res 57:4593-4599). Cada muíante de punto fue construido utilizando el método de mutagénesis dirigida al sitio de Kunkel (Kunkel y Asociados, 1991, supra) con oligonucleótidos diseñados para tener mutaciones de punto dentro de los CDRs. Para producciones de mutantes, se transformaron plásmidos de expresión transformados en células E. coli 34B8 y se recogió una sola colonia y se creció en un medio C.R.A.P. completo (Presta y Asociados, 1997, supra) suplementado con 25 pg/ml de carbenicilina a una temperatura de 30°C durante 24 horas. Las proteínas recombinantes expresadas fueron purificadas a través de una columna de trampa superior de proteína G (Amersham Pharmacia) y cuantif icadas mediante absorción UV a 280 nm (Presta y Asociados, 1997, supra). Las afinidades de enlace de los mutantes Fab G6 y G6-23 fueron evaluadas utilizando una solución competitiva que enlaza a ELISA con un fago de despliegue de hVEGF, tal como se describió. La reducción de dobleces en la actividad de enlace de fagos VEGF tipo natural debido a cada mutación de punto, fue determinada dividiendo el IC50 del muíante de punto G6 ó G6-23 entre el IC50 del Fab G6 ó G6-23 tipo natural, respectivamente. Análisis de ensayo B I ACO R EMR para las variantes G6 y G6-23 Para cinéticas de enlace, se utilizó una medida de resonancia de plasmón de superficie (SRP) con un BIAcoreMR 3000 (BIAcore, Inc., Piscataway, NJ) tal como se describió anteriormente (Karisson & Fált (1997) J. Immunol. Methods 200:121-133). Se activaron chips de biosensor de dextrano carboximetilado (CM5, BIAcore Inc.) con clorhidrato de N-etil-N'-(3-dimetilaminopropil)-carbodi-imida (EDC) y N-hidroxisuccinimida (NHS) de acuerdo con las instrucciones del proveedor. Se diluyó VEGF de humano (hVEGF) con 10 mM de acetato de sodio, pH 4.8 en 5 pg/ml (-0.2 µ?) antes de inyectarse en un rango de flujo de 5 pg/minuto para lograr aproximadamente 100 unidades de respuesta (RU) de la proteína acoplada. Posteriormente la inyección de 1M de etanolamina bloqueó los grupos reactivados. Para medidas de cinéticas, se inyectaron diluciones en serie de dos veces de variantes Fab G6 ó G6-23 (0.7 nM a 100 nM) en PBS con 0.05% Tween 20 (PBST) a una temperatura de 25°C en un rango de flujo de µ?/min. Se calcularon los rangos de asociación (kon) y rangos de disociación ( k0ff ) utilizando un modelo de enlace Langmuir uno a uno simple (BIAcoreMR Evaluation Software versión 3.2). Se calculó la constante de disociación de equilibrio Kd) como la proporción k0ff/k0iT Con base en la selección de la biblioteca de fagos, dos residuos en CDR2 de cadena pesada parecieron ser preferentemente alanina o aminoácido homólogo: HC-Y58 preferentemente es alanina, cHC-151 preferentemente es valina para enlazar a VEGF. Por consiguiente se generó el Fab de proteína muíante con una sola mutación para confirmar el enlace a partir de las bibliotecas de fago. La gráfica superior de la figura 9, muestra que el análisis BIAcore de mutación G6-23-Y58A (G6-23-1) (50 nM) enlaza a un chip recubierto con VEGF de humano mejoró el enlace en-rango en comparación con G6-23, el cual ya había tenido un en-rango muy mejorado en comparación con G6. La gráfica inferior muestra el análisis BIAcore del muíante G6-Y58A (G6-1) ó G6-151V (G6-2) = para el chip recubierto con VEGF. Ambos tuvieron un en-rango mejorado en comparación con G6. De hecho, el muíante doble (Y58A/I51V) tuvo un efeclo adiíivo en la mejoría del en-rango para G6 y G6-23. Resulíados de exploración de perdigonada de G6 y G6-23 Los resulíados tanto de la exploración de perdigonada sobre anticuerpos G6 como G6-23, indicaron que las cadenas laterales CDR de cadena pesada dominaron las interacciones de enlace con hVEGF. Cuando se mapeó en la esírucíura de cristal de rayos X de Fab G6, los residuos funcionalmenfe ¡mporíaníes en la combinación representan una parte del epílope esírucíural, el cual se define a fravés de los residuos en coníacío directo con hVEGF. Los resultados de exploración de alanina de perdigonada revelaron el epítope funcional que comprende la cresla expuesío por solveníe, el cual esíuvo compuesío de los residuos Y32, W33, G54, V96, F97, F98, L99, y Y100a en la cadena pesada y Y49 en la cadena ligera. En forma ¡níeresaníe, los números de residuos funcionalmenle imporíantes revelados por la exploración homologa de perdigonada, fueron significativamente más pequeños y estuvieron contenidos dentro del grupo de residuos que fueron funcionalmente importantes en la exploración de alanina de perdigonada. Estos puntos de calor son W33, G54, V96, F97, y L99 los cuales constituyen un pequeño parche que se traslapó en ambas exploraciones, lo que sugiere que esta superficie hace contacto preciso con el hVEGF de antígenos en donde incluso las substituciones de aminoácidos homologas fueron desestabilisadas. G55 fue substituido con alanina únicamente en la exploración de homólogo y fue altamente interrumpida, de modo que se considera que G55 también está dentro de este parche. Otros residuos importantes revelaron a través de ambas exploraciones en la cadena pesada, G50 y T52, que no son parte de la superficie expuesta por solvente de G6, ya que están enterrados dentro de acuerdo con la información estructural, actuando como cadenas laterales de andamio que se empacan contra residuos en el epítope funcional con el objeto de mantener este epítope en una conformación de enlace competente (C. Wiesmann, resultados no publicados). Como para F95 en CDR-H3 de G6, definitivamente, la substitución de alanina en esta posición en la exploración de alanina fue destructiva; sin embargo, este residuo tiene la capacidad de tolerar la substitución de tirosina en exploración homologa, lo que sugiere que su papel es mantener la integridad de estructura del sitio de enlace de antígenos, lo cual también ha sido confirmado con información estructural. Para Y32, F98, y Y100a, la información estructural demostró que estos residuos de superficie fueron importantes y representaron el 30% de las áreas de superficie enterradas de cadena pesada totales al momento del enlace de hVEGF. Las substituciones de alanina en estos residuos fueron definitivamente interrumpidas en afinidad con proporciones de función significativas (valor Fwt mut) mayor a 30, aún más interesante, toleraron substituciones de aminoácidos homologas (Tyr para Phe y viceversa), lo que sugiere que los anillos aromáticos para estas posiciones hicieron las interacciones importantes con el antígeno hVEGF y la adición o eliminación de grupo hidroxilo no tuvo mucho impacto, lo cual fue distinto de los residuos de andamio anteriores. Ambas exploraciones de perdigonada identificaron nuevas mutaciones en la cadena pesada para una mejoría de afinidad adicional, las cuales fueron 15IV y Y58A. Estas observaciones desconcertantes fueron verificadas a través de la producción de muíante de punto Fab, y probando la actividad de enlace con ELISA competitivo y BIAcoreMR (figura 23 y figura 18). Debido a que 151 y Y58 no son los elementos del epítope estructural (C. Wiesmann, resultados no publicados) se considera que la mejoría de afinidad, especialmente en-rango, con una sola mutación o mutación doble no fue a partir de la introducción de un nuevo contacto con el antígeno hVEGF, sino probablemente a través de la optimización de la integridad de la estructura del lazo CDR-H2, para hacerlo más competente para el enlace de antígenos. Con base en el epítope estructural, los residuos CDR de cadena ligera G6 representaron el 25% de la superficie de epítope estructural total (878Á2) (C. Wiesmann, resultados no publicados). En forma interesante, el único residuo que mostró importancia funcional en ambas exploraciones de perdigonada, fue Y49 en CDR-L2, el cual únicamente soportó el 2% de la superficie del epítope estructural total, lo que sugiere que en la mayor parte de los residuos de epítope estructurales en la cadena ligera no estuvieron involucrados en el contacto energético con el antígeno hVEGF. Esta lectura implica que la cadena ligera G6 es más importante estructuralmente, que funcionalmente, ya que aún retiene la misma secuencia que 4D5, la plantilla utilizada para desplegar la biblioteca de anticuerpos en el fago en donde G6 fue aislado en primer lugar (Cárter y Asociados, 1992). Ejemplo 3 - Anticuerpos derivados de G6 y G6-23 (a) Bibliotecas para selección Se obtuvieron anticuerpos anti-VEGF adicionales clasificando fagos de las bibliotecas de exploración de alanina y homologas de perdigonada que se describen en el ejemplo 2. En forma específica, en residuos particulares, se permitió que variaran los residuos explorados ya sea de tipo natural o alanina (exploración de alanina) o ya sea de tipo natural o un residuo homólogo (exploración de homólogo) (figura 14A y B). Para G6, la exploración de alanina y homologa de perdigonada se llevó a cabo por separado en la cadena ligera G6 y en la cadena pesada, resultando en cuatro bibliotecas. Para G6-23, se llevó a cabo la exploración de alanina y de homólogo de perdigonada en la cadena ligera G6-23, y se llevó a cabo la exploración de homólogo de perdigonada en la cadena pesada G6-23, dando como resultado tres bibliotecas. La biblioteca de exploración de alanina de perdigonada G6-23 no se preparó, debido, tal como se describió anteriormente, a que G6-23 es un anticuerpo de alta afinidad, con la mayor parte de sus residuos importantes para el enlace, localizados en la cadena pesada. La mutación de residuo de cadena pesada alanina, lo cual significa truncar las cadenas laterales de aminoácidos de cadena pesada, es muy probable que desestabilicen el enlace y se obtenga como resultado variantes de anticuerpos con afinidad inferior, (b) Selección de anticuerpos anti-VEGF En la primera vuelta, se utilizó una estrategia de clasificación por placa para la selección. Se inmovilizó el VEGF de humano (hVEGF, proporcionado por Genentech Research Groups) en inmunoplacas axisorp de 96 depósitos (NUNC), incubando depósitos con 5 pg/ml de objetivo de proteína durante la noche a una temperatura de 4°C. Las placas se bloquearon 1% de albúmina de suero bovino (BSA, Sigma) durante 30 minutos en RT. Después de lo cual, se agregó 1% de Tween 20 durante 30 minutos adicionales. Las bibliotecas de fagos descritas anteriormente, fueron incubadas en las inmunoplacas recubiertas con hVEGF a una concentración de -1E13 fago/ml durante 1 hora a RT bajo agitación, para permitir el enlace del Fab desplegado por fago al objetivo. Después del enlace, se lavaron las placas quince veces con PBS suplementado con 0.05% de Tween 20. El fago enlazado fue eluido incubando los depósitos con 0.1 M HCI durante 30 minutos. Las eluciones fueron neutralizadas con una base Tris 1.0 , pH 11. Se infectaron XL1-azuI de E. coli (Stratagene) con el fago eluido y fago auxiliar M13-K07 (New England Biolabs). El fago fue propagado durante la noche para la siguiente vuelta de selección. El cultivo bacteriano fue centrifugado a 8,000 rpm durante 10 minutos en un rotor Sorvall GSA a una temperatura de 4°C y se recolectó el sobrenadante. El fago fue precipitado dei medio a través de la adición de 1/5 volúmenes de PEG/NaCI. Después de 5 minutos de incubación sobre hielo, el fago que contiene el medio de cultivo fue centrifugado a 10 krpm durante 15 minutos en un rotor Sorvall GSA a una temperatura de 4°C y se desechó el sobrenadante. Se suspendió nuevamente el pellet del fago restante en PBS y se centrifugó a 15 krpm durante 5 minutos en un rotor SS-34 a una temperatura de 4°C para peletizar la materia insoluble. El sobrenadante se transfirió a un tubo nuevo y la concentración de fagos se estimó midiendo la absorbancia a 268 nm. Las siguientes vueltas de clasificación, se llevaron a cabo a través de un método de clasificación de fasej solución con rigurosidad en incremento. El fago purificado fue incubado con hVEGF biotinilado durante 1 hora a RT en PBS con 0.05% Tween 20 y 0.5% Superblock (Pierce). Después de tres a diez veces de dilución con el superblock, la mezcla se agregó a depósitos recubiertos con neutravidina bloqueados con 1% de BSA (Sigma) y Tween 20. La biotina conjugada con hVEGF se dejó enlazar a la neutravidina inmovilizada durante 10 minutos. Después de la captura la placa se lavó de 10 a 15 veces con 0.05% de Tween 20 en PBS. Para estudiar el fondo, por ejemplo, el enlace no específico en el fago a neutravidina, se agregó a- un depósito recubierto una reacción de control con carencia del hVEGF biotinilado. La rigurosidad fue incrementada cada vuelta, disminuyendo la concentración de antígenos en la solución, así como la concentración de fagos o incrementando la temperatura. El incremento de número de lavados, también es una forma para lograr condiciones más estrictas. Para la tercera y cuarta vuelta de clasificación se agregó hVEGF no biotinilado a la mezcla de reacción de biotina-hVEGF y el fago de la biblioteca para competir con enlazadores de baja afinidad. Al agregar un exceso de 1,000 veces de competidor durante 30 minutos a una temperatura de 37°C antes de la captura, se puede incrementar la rigurosidad en forma adicional en las últimas vueltas con el objeto de seleccionar enlazadores de mayor afinidad. La manipulación del enlace y las veces de captura, podría incrementar en forma adicional la rigurosidad de vuelta a vuelta. Para G6-23 la concentración de partida del hVEGF biotinilado fue de 1 nM para la biblioteca de perdigonada de cadena pesada y de 0.2 nM para la biblioteca de exploración de perdigonada de cadena ligera. La concentración se disminuyó a 0.5 nM y 0.1 nM respectivamente en la última vuelta. Para G6, con una afinidad de inicio inferior a G6-23, se llevó a cabo la clasificación de biblioteca con condiciones de partida menos estrictas; 5 nM para bibliotecas de cadena pesada y 2 nM para las bibliotecas de cadena ligera, lo cual se disminuyó a 1.75 y 0.5 nM respectivamente, en la última vuelta de clasificación. Para estudiar el enriquecimiento de Fabs específicos de hVEGF desplegados en el fago, se infectaron 90 µ? de E. coli XL-azul (Stratagene) con 10 µ? de elución de fago de las reacciones de enlace de la biblioteca capturada, así como las mezclas del fondo durante 30 minutos a una temperatura de 37°C. Se plaqueó un cultivo de 5 µ? en placas suplementadas con carbenicilina y se incubaron a una temperatura de 37°C durante la noche. El número de partículas de fago en la elución puede calcularse a partir del número de colonias de cada elución. Después de las últimas dos vueltas de clasificación, se plaquearon 50 µ? del cultivo de bacterias que contienen fagémidos antes mencionado, sobre placas suplementadas con carbenicilina y se crecieron durante la noche a una temperatura de 37°C. Los clones resultantes se sometieron a clasificación, (c) ELISA competitivo de un solo punto Para clasificar los clones de alta afinidad, se llevó a cabo un ensayo ELISA competitivo de un solo punto de alto rendimiento en un formato de 96 depósitos. Para ambos anticuerpos, se recolectaron en forma aleatoria aproximadamente 100 clones de las últimas dos vueltas de selección, y se clasificaron en este ensayo. Los clones E. coli XL1-azul que contienen fagémidos fueron crecidos en 400 µ? de caldo 2YT enriquecido, suplementado con carbenicilina y fago auxiliar M13-K07 (New England Biolabs), agitando durante la noche a una temperatura de 37°C. El sobrenadante de cultivo de cada clon fue diluido cinco veces con 0.05% de Tween 20 y 0.05% de BSA en PBS con la adición de hVEGF y también sin esta adición. Después de una incubación de 1 hora agitando a RT, se transfirieron 80 µ? de las reacciones a las inmunoplacas recubiertas con hVEGF y se incubaron durante 10 minutos. La placa se lavó ocho veces con 0.05% de Tween 20 en PBS y se incubaron 30 minutos con 100 µ? de conjugado de rábano de anticuerpo anti-M13 (New England Biolabs) diluido 5000 veces en PBS suplementado con 0.05% de Tween 20 y 0.05% de albúmina de suero bovino (Sigma). Las placas se lavaron ocho veces más y se desarrollaron con el substrato TMB durante 5 minutos. Las reacciones se detuvieron con 1.0 M de H3PO4 y se leyeron en forma espectrofotométrica a 450 nm. Para estimar la afinidad relativa, se calculó la proporción de la densidad óptica en la presencia de hVEGF con la de la ausencia de hVEGF. Una baja proporción sugiere que la mayor parte de Fab desplegado en el fago enlazó a hVEGF en la solución. Como consecuencia se puede enlazar una pequeña cantidad de Fab al hVEGF inmovilizado en la inmunoplaca. Los clones que muestran una menor proporción que el G6 ó G6-23 tipo natural (WT), fueron seleccionados y sus sobrenadantes se utilizaron para infectar XL1-azul. Los fagémidos que contienen bacterias fueron veteados sobre placas de carbenicilina y se crecieron durante la noche a una temperatura de 37°C para secuenciación. La selección de las bibliotecas de cadena pesada G6 dio como resultado no más de tres secuencias únicas de los 33 clones analizados, lo que sugiere que la mayor parte de los cambios en la cadena pesada de G6, dan como resultado la pérdida de afinidad de enlace. Además, todas las variantes de cadena pesada únicas se derivaron de la biblioteca de exploración homologa. Parece que la mutación de alanina en los residuos de cadena pesada G6 puede dar como resultado una pérdida de enlace dramática. Esta tolerancia a los cambios en la selección de la secuencia de aminoácido, soporta la observación de que la cadena pesada de G6 alberga muchos residuos clave para el enlace VEGF. En la tabla 2 que se encuentra a continuación se resume el resultado del ensayo de un solo punto.

Tabla 2 Resultados del ensayo de un solo punto de variantes G6 y G6-23. Se utilizaron criterios de selección similares para ambas bibliotecas de anticuerpos. Sin embargo, un corte inferior se utilizó para la biblioteca G6 LC en comparación con la biblioteca G6 HC, ya que se esperó que las variantes HC mostraran menos mejoría de afinidad en comparación con WT que las variantes LC. Se reunieron bibliotecas de alanina y homologas G6 antes de clasificar para las variantes de cadena pesada y cadena ligera. El número de clones únicos del grupo seleccionado fue determinado mediante secuenciación de ADN. LC-cadena ligera, HC-cadena pesada, WT = tipo natural, Hom = homologa, LC = cadena ligera, HC = cadena pesada, WT = tipo natural, HOM = biblioteca de exploración homologa, ALA = biblioteca de exploración de alanina. (d) Secuenciación y Análisis de ADN Los clones seleccionados de la clasificación de un solo punto se crecieron en placas de 96 depósitos con 100 µ? de caldo 2YT suplementado con carbencilina durante 2 horas. Se sometió a PCR (gene AMP® PCR System 9700, Applied Biosystems), 1 µ? de cultivo con el objeto de amplificar el ADN que codifica la cadena ligera y la cadena pesada de los diferentes clones. Los cebadores utilizados en la reacción PCR fueron diseñados para agregar secuencias universales M13 en el extremo 5' del fragmento amplificado. Al agregar esta secuencia, los cebadores delanteros M13 pueden utilizarse en las siguientes reacciones de secuenciación. Después de la amplificación en un formato de 96 depósitos, los fragmentos de ADN fueron secuenciados a través del grupo de secuenciación de ADN Genentech utilizando reacciones de secuenciación de terminación Big-Dye y fueron analizadas con un analizador de ADN de 96 capilaridades ABI Prims 3700. (PE Biosystems, Fosters City, CA). Las secuencias de cadena pesada y ligera fueron alineadas y se eliminaron las secuencias idénticas. Con base en su secuencia, los clones fueron seleccionados con respecto a determinación de afinidad a través de la medida IC50. (e) Medida de Afinidad en Clones de Fagos Los valores IC50 de los clones de fago fueron determinados mediante ELISA de fago competitivo. Un solo clon de los clones seleccionados se creció en 5 mi de medio 2YT suplementado con 50 µg/ml de carbencilina durante 5 horas. Posteriormente el cultivo fue infectado con fago auxiliar M13-K07 (New England Biolabs) durante 1 hora y fue transferido a 25 mi de cultivo suplementado con 50 µg/ml de carbencilina y 50 µg/ml de canamicina. El fago fue propagado durante la noche a una temperatura de 37°C. Después de la purificación de fago como se describió anteriormente, el fago fue diluido en series con 0.05% de Tween20 y 0.5% de BSA en PBS y se incubó en una inmunoplaca recubierta con hVEGF para evaluar el enlace de antígenos en diferentes concentraciones de fago. La dilución de fago que produjo ~70% de señal de saturación, fue utilizada en el ensayo de determinación IC50. El fago fue incubado con concentraciones en incremento de hVEGF durante la noche a una temperatura de 37°C. El fago no enlazado fue capturado en una inmunoplaca recubierta con hVEGF durante 10 minutos. La placa fue lavada, y el fago enlazado fue detectado con un conjugado de rábano de anticuerpo anti-M13 (New England Biolabs) seguido de desarrollo TMB, tal como se describió anteriormente. La concentración hVEGF que inhibió el 50% del enlace de fago al antígeno inmovilizado, representó el IC50. Las señales, que indican el fago enlazado, fueron trazadas contra la concentración hVEGF, y los datos fueron ajustados a una curva de enlace competitivo a través de regresión no lineal, permitiendo la determinación IC50. Las figuras 34 y 35 muestran los valores IC so de las variantes G6 y G6-23, respectivamente, así como las alteraciones en secuencias en comparación con G6 ó G6-23. A partir del conjunto G6, muchos enlazadores con una afinidad mejor aparente que la de G6 tipo natural fueron identificadas. Se derivaron muchas más variantes G6 mejoradas en afinidad a partir de la biblioteca homologa de cadena ligera (34A). Sin embargo, se seleccionaron dos variantes G6 con mayor afinidad a partir de la biblioteca de exploración homologa de cadena pesada (figura 34B). Algunas variantes G6 mostraron una mejoría de afinidad de hasta cien veces, de acuerdo con las determinaciones IC50. De algunas de las variantes de cadena pesada G6 seleccionada, se diferenciaron únicamente en algunos residuos del G6 tipo natural. Estas mutaciones de cadena pesada fueron localizadas en CDR-H1 y CDR-H2. La naturaleza conservada de la cadena pesada, y en particular CDR-H3, confirmó que la mayor parte de los residuos importantes para el enlace de G6 a hVEGF, se encuentran en esta región. Las mutaciones no fueron más abundantes en las variantes de cadena ligera G6. Estuvieron localizadas principalmente en las regiones CDR-L1 y CDR-L3 indicando que el cambio en los residuos CDR-L2 daña el enlace en lugar de mejorar la afinidad. Parece favorable para el enlace una combinación de mutaciones en CDR-L1 y CDR-L3, permitiendo una mejoría de afinidad significativa en comparación con tipo natural. La mayor parte de las variantes G623, mostraron una afinidad de enlace similar o ligeramente reducida en comparación con tipo natural, de acuerdo con sus valores IC50 (Figura 35). Las variantes con mayor afinidad fueron derivadas de bibliotecas de perdigonada de cadena ligera tanto homologas como de alanina. Se identificaron únicamente un pequeño número de enlazadores de alta afinidad en el conjunto de exploración de perdigonada de cadena pesada. Igual que para G6, los residuos de cadena pesada fueron conservados, y únicamente se estudiaron unas cuantas mutaciones que se encuentran entre los clones. Las variantes de cadena ligera también mostraron un patrón de mutación similar como variantes G6, con la mayor parte de los cambios localizados en CDR-L1 y CDR-L3. Ejemplo 4 - Exploración de Alanina hVEGF para mapear los sitios de enlace de anticuerpo anti-VEGF Para comprender las bases moleculares de la reactividad cruzada de G6 y G6-23 y mapear sus epítopes funcionales, las afinidades de enlace relativas de Fab G6 ó G6-23 para las mutantes hVEGF sustituidas con alanina individuales versus hVEGF tipo natural, se midieron utilizando el ensayo ELISA de fagos de despliegue de hVEGF tal como se describió anteriormente (Muller y asociados., (1997) PNAS EUA 94:7192- 7197). Se mutó hVEGF en sitios cercanos a los epítopes de enlace de Flt-1, KDR, el anticuerpo Avastin™ y Y0317 con el método de mutagénesis de Kunkel y el despliegue de fagos del muíante individual fue generado tal como se describió anteriormente (Muller y asociados., (1997) PNAS EUA 94:7192-7197). Los ensayos de ELISA de fago de enlace de solución fueron utilizados para determinar la afinidad de enlace relativa de cada muíante VEGF versus VEGF tipo natural (wt) en el Fab G6-23, G6-23. En síntesis, se recubrieron durante la noche a una temperatura de 4°C inmunoplacas Maxisorp de 96 depósitos (NUNC), con Fab G6 ó G6-23 a una concentración de 2µg/ml en PBS, y se bloquearon con PBS, 0.5% BSA, y 0.05% Tween20 (PBT) durante 2 horas a temperafura ambienfe. Las diluciones en serie de las muíaníes hVEGF con despliegue de fagos en PBT, fueron incubados primero en las placas recubierías con G6-Fab duraníe 15 minuíos a lemperatura ambiente, y las placas se lavaron con PBS, 0.05% Tween20 (PBST). Se detecíaron los fagos enlazados con conjugado de peroxidasa de rábano de anticuerpo monoclonal anti-M13 (Amersham Pharmacia), diluido 1:5000 PBT, desarrollado con sustrato de 3,3', 5,5'-tetrametilbenzidina (TMB, Kirkegaard & Perry Labs, Gaithersburg, MD) durante aproximadamente 5 minutos, extinguidos con 1.0 M H3P04, y leídos en forma espectrofotométrica a 450 n m . Los valores IC50 relativos (IC5o,Aia/IC5o,wt) para representar el doblez de reducción en afinidad de enlace, y evaluar la contribución de las cadenas laterales individuales de hVEGF para interactuar con Fab G6 ó G6-23 fueron calculados. Las proporciones de IC50 representaron la contribución energética de la cadena lateral individual en la interacción con Fab G6 (figura 19). El doblez general de las mutantes de alanina, especialmente las que tenían reducción significativa en el enlace de G6, fue verificado a través de su tipo casi natural que enlaza a otras moléculas que tienen distintos epítopes en VEGF, tal como el anticuerpo Avastin™, Y0317 ó Flt-1, tal como se mapearon previamente (Figura 19). Es evidente que G6 tuvo un epítope distinto en comparación con el anticuerpo Avastin™ derivado de hibridoma. Todos los residuos hVEGF f uncionalmente importantes para el enlace de G6 fueron conservados entre VEGF de humano y de múrido, explicando de esta forma en parte su reactividad cruzada.

El Fab del anticuerpo Avastin™ (Fab-12) y Y0317, por otra parte, perdieron la mayor parte de su enlace a VEGF al momento de la sustitución de alanina en el residuo GIy88, el cual es Ser en mVEGF. Para visualizar el epítope en la molécula VEGF, se señalaron residuos funcionalmente importantes para enlazar G6 en la superficie de la estructura de cristal hVEGF de acuerdo con sus afinidades relativas para G6. El epítope G6 mapeado para un parche que fue conservado entre VEGF de humano y de ratón y punteado con algunos residuos energéticamente importantes, Fe17, Tir21, Tir, 11 e 83 y Gln89, los cuales se acumularon en proximidad cercana. Esto indica un epítope funcional con una interacción "punto de calor". Comparamos el epítope funcional de G6 con el epítope estructural de Fab-12 (mismo que Y0317) o Flt-1 -1 D2, los residuos VEGF quedaron enterrados al momento de la formación del complejo con estas moléculas con base en la estructura del cristal del complejo. En forma interesante, el epítope funcional de G6 en VEGF coincide con el epítope estructural de Flt-1D2, más cercanamente que el epítope estructural de Fab-12. Además, G6 compartió un punto de calor similar al de Flt-1 para VEGF ya que los residuos Fe17, Tir21 y Tir25 fueron altamente importantes, energéticamente hablando, para ambas interacciones (figura 19). Fab-12 ó Y0317, por otra parte, se centraron en el residuo f uncionalmente importante y no conservado, Gly88, lo cual se considera la razón de su carencia de enlace a mVEGF. Parece que el anticuerpo G6 derivado de biblioteca de fagos, dirigió un epítope conservado en VEGF en un modo casi idéntico al receptor VEGF en tanto que un hibridoma para hVEGF evitó generar un anticuerpo antiratón de auto-reacción. Sin embargo, este fue un traslape suficiente entre los dos epítopes de G6 y Fab-12 ya que el enlace de G6 y Fab-12 (Y0317) a hVEGF fue mutuamente exclusivo (datos no mostrados). La comparación de los sitios importantes en hVEGF para enlazar G6 y G6-23, indicó que los residuos que contribuyen en forma más energética, F17, Y21 y Y25 en 20 hélices y Q89A en 80 lazos, permanecieron iguales, excepto por el impacto de los residuos en el enlace que pareció cambiar (figura 19). Por ejemplo, los residuos Y21 y Q89 cuando cambiaron a alanina, se volvieron como un mayor acierto para G6-23 que para G6. Hubieron sitios que disminuyeron en forma modesta su impacto relativo de su cadena lateral en el enlace a G6-23 en comparación con G6, por ejemplo, 183, H86, y 191A. No hubo residuos nuevos funcionalmente importantes observados para la versión mejorada por afinidad G6-23, para un desorden de contribuciones energéticas entre estos residuos funcionalmente importantes en ambos anticuerpos, lo cual fue consistente con el hallazgo estructural de que posiciones idénticas de hVEGF quedaron enterradas en la elaboración de complejos con G6 ó G6-23 (datos estructurales se encuentran más adelante). Cuando se mapearon estos residuos funcionalmente importantes junto con otros contribuyentes moderados en la estructura hVEGF, parecieron como un parche contiguo dentro del epítope estructural de FIÍ-1D2, los cuales fueron altamente conservados entre VEGF de humano y de ratón, lo cual explica el hecho de que ambos anticuerpos tuvieron afinidad igual para ambos VEGF. Mediante la comparación de huellas del epítope tanto estructural como funcional para G6 en la estructura hVEGF, se mostró claramente que los residuos CDR de cadena pesada hicieron contacto con las posiciones en VEGF, en donde la mutación de alanina fue interrumpida, tal como las 20 hélices y los 80 lazos de hVEGF, mientras que los residuos CDR de cadena ligera hicieron contacto con los 60 lazos de hVEGF en donde las cadenas laterales no fueron funcionalmente tan importantes. Las diluciones de fago que produjeron la señal de enlace sub-máxima (50-70%) fueron utilizadas en el ensayo de competición de solución, en donde el fago hVEGF tipo natural o mutante en regulador PBT, se incubó primero con una concentración en incrementos de Fab G6 ó G6-23 de competición durante de 1 a 2 horas a temperatura ambiente, posteriormente las mezclas fueron transferidas a placas recubiertas con G6-Fab para capturar el fago enlazado durante 15 minutos, y el fago enlazado se detectó tal como se describió anteriormente. Las curvas de competición se ajustaron con un programa de ajuste de curva de regresión no lineal de cuatro parámetros (Kaleidagraph, Synergy Software) para determinar los valores IC50 que fueron calculados como la concentración de Fab G6 ó G6-23 en la etapa de enlace de solución que inhibió que el 50% de los fagos se enlazarán a Fab G6 inmovilizado. La proporción del IC50 de hVEGF mutante versus tipo natural, es la diferencia en dobleces relativa en afinidades de enlace. Para mutantes que tienen un severo enlace reducido a la placa recubierta con G6-Fab, Fab12 (Presta, 1997) o Flt-1DI-5 fueron utilizados como recubrimiento para capturar el fago mutante después de incubaciones con Fab G6 ó G6-23. El enlace de h VEGF a G6, Fab G6-23, Fab12, Fab y Flt-1D1-5 fue mutuamente exclusivo tal como se probó con fago VEGF tipo natural. Ejemplo 5 - Mapeo estructural de sitios de enlace VEGF en G6 y G6-23 y de sitios de enlace G6 en VEGF mediante cristalografía Cristalización de expresión. purificación y análisis estructurales Los residuos 8 a 109 de VEGF humano fueron expresados, redoblados y purificados tal como se describió anteriormente (Christinger, H. W. y asociados, (1996). Prot. Struct. Funct. Genet. 26, 353-357). Se expresó Fab G6 en E. col¡ y la pasta celular se descongeló en PBS, 25 mM EDTA, 1 mM PMSF. La mezcla fue homogeneizada y posteriormente se pasó dos veces a través de un microfluidizador. Posteriormente la suspensión fue centrifugada a 12k durante 60 minutos. La proteína fue cargada en una columna de Proteína G equilibrada previamente con PBS a 5 ml/min. La columna fue lavada con PBS para la línea de base y posteriormente eluida con ácido acético al 0.58%. Se reunieron las fracciones que contienen Fab G6 y se cargaron directamente en una columna SP-sefarosa equilibrada con 20 mM MES, pH 5.5. La proteína fue eluida con un gradiente de sal de 0 a 0.25 M NaCI. El G6 eluido a partir de columna de SP-sefarosa, fue mezclado con hVEGF8-109 y purificado en forma adicional sobre una columna Superdex 200 equilibrada con 30 mM Tris CL, pH 7.5 y 0.4 M NaCI. Las fracciones que contienen el complejo fueron reunidas, concentradas y utilizadas en ensayos de cristalización. Los cristales fueron crecidos a una temperatura de 19°C utilizando el método de difusión por calor en gotas de asentamiento. Se mezclaron en un volumen igual con solución de proteína 2.0 M de sulfato de amonio que contiene regulador de cristalización y 5% de iso-propanol . Los cristales aparecieron después de tres días y pertenecieron al grupo de espacio P3121 con una dimensión celular de a = 117.9 y c = 212.6. Estas formas de cristal contenían un complejo que comprende un dímero y 2 moléculas Fab en la unidad asimétrica. Los cristales fueron lavados en líquido madre, bañados en líquido madre artificial que contiene 25% de glicerol y centelleo congelado en nitrógeno líquido. Se recolectaron los grupos de datos en 2.8 Á en una fuente SSRL Synchrotron en línea de rayo 9-1. Los datos fueron reducidos utilizando los programas DENZO y SCALEPACK (Otwinowski, Z. (1993). DENZO In Data Collection and Processing, L. Sawyer, N. Isaacs, y S. Bailey, eds. (Warrington, UK: 1993). Determinación y Refinamiento de Estructura La estructura fue resuelta mediante reemplazo molecular utilizando las coordenadas de VEGF (a partir de 1FLT de código PDB) dominios constantes y variables del anticuerpo en 1BJ1 (base de datos Brokhaven) y el programa AmoRe (CCP4 1994). Se realizó la construcción del modelo con el programa O y el refinamiento con Refmac (CCP4 1994). El valor R y R libre finales son 19.8% y 23.92%, respectivamente. Se utilizaron los siguientes programas para calcular las áreas de superficie de interacción RESAREA versión 3.2: 05/08/93 y AREAIMOL versión 3.2: 19/12/95. Estos programas son parte de la adaptación CCP4 de Collaborative Computational Project, Número 4, 1994 ("The CCP4 Suite: Programs for Protein Crystallography" Acta Cryst. D50, 760-763). El área de superficie de cada residuo de un anticuerpo anti-VEGF que está enterrado en VEGF (A2) se reporta más adelante junto con el porcentaje del área de superficie total del residuo que está enterrado. También se reporta el área de superficie de residuo de anticuerpo VEGF el cual está enterrado en VEGF (A2), se reporta más adelante junto con el porcentaje del área de superficie total que está enterrado. Ver más adelante los valores para los complejos G6:VEGF, G6-23:VEGF, Fab- 2:VEGF, YADS-1 :VEGF y YADS-2: VEGF. En todos los casos, debido a que VEGF es un dímero, los números de residuo de VEGF que se refieren al monómero 1 (del dímero VEGF) son del 8 al 109 y los números de residuos de VEGF que se refieren al monómero 2 (del dímero VEGF) son del 1008 al 1109. La primera columna en cada tabla que se encuentra más adelante, señala los números de residuos de la proteína que está siendo examinada (ya sea VEGF o un anticuerpo anti-VEGF) (por ejemplo, para la sección (a) que se encuentra más adelante, PHE A 17 se refiere a F17, LYS A1048 se refiere a K48; MET A1081 se refiere a MET 81 ó VEGF). La segunda columna señala la superficie enterrada del residuo (A2). La tercera columna menciona la superficie enterrada de dicho residuo como un porcentaje del área de superficie de todo el residuo. (a) Complejo VEGF:G6 Tabla 3: Residuos de VEGF en contacto con G6.

DIFERENCIA-AREA CADENA A: 825.0 (7.47% del ÁREA total 11043.0 de esta cadena) Tabla 4: Residuos de G6 en contacto con VEGF. Los residuos 1:211 se refieren a la cadena lig residuos 1001:1223 se refieren a la cadena pesada DIFERENCIA-ÁREA CADENA B: 856:0 (4.44% de ÁREA total 19280.0 de esta cadena) DIFERENCIA-ÁREA TOTAL: 1681.0 (5.54% de ÁREA total de todas las cadena) (b) Complejo VEGF:G6-23 Tabla 5: Residuos de VEGF en contacto con G6-23 Los residuos 8 a 109 se relacionan con el monómero 1 (del dímero VEGF). Los residuos 1008-1.109 al monómero (del dímero VEGF).

DIFERENCIA-ÁREA CADENA A: 858:0 (7.65% de ÁREA total 11223.0 de esta cadena) Tabla 6: Residuos de G6-23 en contacto con VEGF. Los residuos 1:211 se refieren a la cadena ligera. Los residuos 1001:1223 se refieren a la cadena pesada.

Residuo No. Superficie Enterrada Sup. Enterrada en% ASPB 28 25.00 27.17% de 92.00 SERB 30 44.00 75.86 % de 58.00 THRB 31 6.00 10.91 %de 55.00 ALA B 32 1.00 33.33 % de 3.00 TYRB 49 21.00 58.33 % de 36.00 PHEB 53 21.00 19.27 %de 109.00 TYRB 92 72.00 71.29 %de 101.00 SER B 1030 18.00 24.00 % de 75.00 ASPB1031 96.00 84.21 % de 114.00 TYRB1032 28.00 48.28 %de 58.00 TRPB1033 47.00 73.44 % de 64.00 ILEB1051 14.00 32.56 % de 43.00 PRO B 1053 29.00 65.91 % de 44.00 ALA B 1054 28.00 57.14 %de 49.00 GLYB1055 51.00 89.47 % de 57.00 GLYB1056 34.00 97.14 % de 35.00 TYRB1057 37.00 21.76 %de 170.00 PHEB1099 1.00 33.33 %de 3.00 PHEB1101 113.00 86.92 % de 130.00 PHEB1102 101.00 84.17 %de 120.00 LEU Bl 103 12.00 80.00 %de 15.00 PRO B 1104 4.00 8.00 % de 50.00 TYRB1105 54.00 68.35 %de 79.00 DIFERENCIA-ÁREA CADENA B: 857:0 (4.38% de ÁREA total 19547.0 de esta cadena) DIFERENCIA TOTAL-ÁREA: 1715.0 (5.57% de ÁREA total 30770.0 de todas las cadenas), (c) VEGF:Fab-12 Tabla 7: Residuos de VEGF en contacto con Fab-12 (1bj1 código PDB) Los residuos 8:109 se relacionan con monómero 1 (del dímero VEGF). Los residuos 1008:1109 al monómero 2 (del dímero VEGF) No. de Residuo Superficie Enterrada Sup. Enterrada en% TYRA 45 30.00 48.39 % de 62.00 LYS A 48 23.00 41.82% de 55.00 GLN A 79 13.00 38.24 % de 34.00 TYRA 45 30.00 48.39 % de 62.00 LYS A 48 23.00 41.82% de 55.00 GLN A 79 13.00 38.24% de 34.00 ILEA 80 1.00 100.00% de 1.00 META 81 37.00 100.00 % de 37.00 ARGA 82 53.00 85.48 % de 62.00 ILEA 83 30.00 71.43% de 42.00 LYS A 84 11.00 20.00 % de 55.00 fflSA 86 77.00 37.93% de 203.00 GLN A 87 119.00 80.95 % de 147.00 GLYA 88 38.00 100.00% de 38.00 GLN A 89 134.00 100.00% de 134.00 fflSA 90 114.00 100.00% de 114.00 ILEA 91 75.00 93.75 % de 80.00 GLYA 92 33.00 100.00% de 33.00 GLUA 93 83.00 62.41 % de 133.00 META 94 5.00 50.00 % de 10.00 PHEA1017 25.00 55.56 % de 45.00 TYRA1021 16.00 21.92% de 73.00 DIFERENCIA-ÁREA CADENA A: 917:0 (8.42% de ÁREA total 10895.0 de esta cadena) Tabla 8: Residuos de Fab-12 en contacto con VEGF Los residuos 1:211 se refieren a la cadena ligera. Los residuos 1001:1223 se refieren a la cadena pesada.

No. de Residuo Superficie Enterrada Sup. Enterrada en% TY B 91 4.00 40.00% de 10.00 SER B 92 12.00 25.00 % de 48.00 THRB 93 2.00 4.44 % de 45.00 VAL B 94 34.00 37.36% de 91.00 TRPB 96 19.00 86.36 % de 22.00 THRB 1030 5.00 11.36 % de 44.00 AS B1031 85.00 80.19% de 106.00 TY B1032 22.00 52.38 % de 42.00 GLYB1033 9.00 100.00% de 9.00 TRPB 1050 53.00 91.38% de 58.00 ASNB1052 31.00 86.11 %de 36.00 TH B 1053 3.00 75.00% de 4.00 TYR B1054 93.00 51.96% de 179.00 THRB1055 6.00 7.41 %de 81.00 THRB1059 29.00 53.70% de 54.00 TYRB 1099 12.00 100.00% de 12.00 PRO Bl 100 13.00 81.25% de 16.00 HISB1101 58.00 56.31 % de 103.00 TYR Bl 102 122.00 95.31 % de 128.00 TYRB 1103 34.00 18.68% de 182.00 GLYB1104 41.00 50.62% de 81.00 SER B 1105 4.00 6.67% de 60.00 SER Bl 106 41.00 77.36% de 53.00 HISB1107 4.00 23.53 % de 17.00 TRPB1108 96.00 97.96% de 98.00 DIFERENCIA-AREACADENA B: 832:0 (4.29% de ÁREA total 19409.0 de esta cadena) DIFERENCIA-ÁREA TOTAL: 1749.0 (5.77% de ÁREA total 30304.0 de todas las cadenas) Los residuos que tienen más de 5 Á2 de área de superficie enterrada y/o 5% más enterrada, se consideraron con un contacto significativo. Estos resultados ayudan a describir las regiones en VEGF y las regiones en los anticuerpos que se contactan entre sí. Junto con los datos funcionales que se relacionan al enlace VEGF, se pueden observar características comunes de las series G6 de los anticuerpos y las series B20 de anticuerpos (datos estructurales no mostrados). Los anticuerpos G6, G6-23 y B20, así como otros enlazados a VEGF tanto de ratón como de humano con afinidades relativamente altas, diferencia de Fab-12 ó Y0317 (datos no mostrados). Las mutaciones VEGF G88A ó G885 de humano afectaron en forma severa el enlace de Fab-12 ó Y0317 a VEGF, en donde la serie G6 de anticuerpos y la serie B20 de anticuerpos (datos estructurales no mostrados) fueron relativamente no afectadas. Además, el enlace de anticuerpos tai como Fab-12 a VEGF, dio como resultado el área de superficie de G88 en un 100% enterrada, en tanto que el enlace de G6 y G6-23 dio como resultado que G88 fuera menos del 66% enterrada. Por lo tanto se considera que aunque el contacto parcial con G88 puede permitir que los anticuerpos tengan la propiedad de reconocer VEGF tanto de ratón como de humano con buena afinidad, no es probable que los anticuerpos que contactan VEGF humano, de modo que el área de superficie de Gly88 VEGF de humano tenga ei 80% o más de enlace a VEGF enterrado tanto de ratón como de humano con buena afinidad. Los resultados del mapeo de epítope funcional también muestran que la huella de la serie G de anticuerpos en VEGF sea diferente a Fab-12, en cuanto a que tiene un mayor contacto que se extiende a las 20 hélices de VEGF (aproximadamente los residuos numerados del 10 al 30 de VEGF humano) así como el contacto de los residuos en los 80 lazos (aproximadamente los residuos numerados 80 a 94 de VEGF humano). Los estudios estructurales se correlacionan con los estudios funcionales (ver figura 19) en que las mutaciones a varios residuos en las 20 hélices, disminuye el enlace de los anticuerpos series G6 y B20. Estos estudios funcionales descritos en la figura 19, indican que los anticuerpos serie G6 y B20 interactúan bien con residuos que son importantes tanto para el enlace Flt-1 y KDR en comparación con A4.61. Ejemplo 6 - Bibliotecas de Diversidad Tetrinominal Para investigar si se puede utilizar pequeños subgrupos de los aminoácidos naturales para generar superficies de enlaces de antígenos, construimos bibliotecas de despliegues de fagos de cadena pesada na'íve de fragmentos de enlace de antígenos (Fabs) con base en Fab4D5 (30) humanizado, los cuales reconocen el dominio extracelular de la cinasa de tirosina de receptor humano ErbB2 (Frendly, B. . y asociados, (1990), Cáncer Res. 50:1550-8). Primero, se modificó un fagémido previamente descrito para desplegar Fab4D5 (Fab'-zip) en la superficie del bacteriófago M13. Se fusionó el gen que codifica el Fab'-zip con el dominio de terminal-C de la proteína de recubrimiento menor gen-3 M13 y se expresó bajo el control del promotor phoA (Lee, V., y asociados., (2004) J. Inmunol. Methods 284:119-132). El fagémido fue modificado a través de una sola mutación en la cadena ligera (R66G) y mediante la introducción de los codones de detención de TAA en los tres CDRs de cadena pesada. Para cada construcción de biblioteca, se utilizó el fagémido resultante (pV-0116c) como la "plantilla de detención" en una reacción de mutagénesis con oligonucleótidos diseñados para reparar en forma simultánea los codones de detención e introducir mutaciones diseñadas en los sitios deseados, tal como se describió previamente (Sidhu, S.S. y asociados (2004) J. Mol. Biol.. 338(2):299-310; Sidhu, SS y asociados., (2000) Methods in Enzymology 328:333-363). a. Construcción de Biblioteca KMT Las posiciones accesibles de solventes dentro de los CDRs de cadena pesada codificadas por el fagémido fueron reemplazadas por un solo tipo de codon de degeneración, KMT, que produjo proporciones iguales de cuatro aminoácidos (Y, A, D, S). El número de posibles combinaciones tetranominales de los 20 aminoácidos naturales, es demasiado grande para ser investigado en forma exhaustiva, y por lo tanto, elegimos combinaciones que cumplieron con dos criterios. En primer lugar, restringimos las combinaciones que pudieran ser accesadas con métodos de síntesis ADN estándar. En segundo lugar, aseguramos que cada grupo tetranominal contuviera al menos un pequeño ácido (glicina, serina o alanina) ya que consideramos que los residuos pequeños podrían proporcionar flexibilidad de formación y evitar el abarrotamiento estérico. Se eligieron un total de 18 posiciones para aleatorización: posiciones 38 y 30 a 33 en CDR-H1; posiciones 50, 52, 53, 54, 56 y 58 en CDR-H2; y posiciones 95-100a en CDR-H3. Cada biblioteca construida contenía ~1010 elementos únicos, y por lo tanto, las diversidades de biblioteca únicamente fueron de aproximadamente un orden de magnitud menor a la diversidad teórica máxima (418 = 7x1010). El nombre de la biblioteca KMT corresponde al codón de degeneración utilizado; las degeneraciones de ADN equimolar se representan a través del código IUB (K =G/T, = A/C, R = A/G, S = G/C, W = A/T, Y =C/T). b. Ensayos de Clasificación y Enlace de la biblioteca KMT El fago procedente de la biblioteca de cadena pesada na'íve fue reciclado a través de vueltas de selección de enlace ya sea con factor de crecimiento endotelial vascular de humano (hVEGF) u otros antígenos en inmunoplacas Maxisorp de 96 depósitos (NUNC) como el objetivo de captura, tal como se describió previamente (Sidhu, S.S. y asociados., (2004) supra; Sidhu, SS y asociados., (2000) Methods ¡n Enzymology 328:333-363). Se eluyeron los fagos enlazados con 0.1 M HCI durante 10 minutos y la solución de agotamiento fue neutralizado con una base Tris 1.0 M. Los fagos se propagaron en E. coli XL1-azul (Estratagen) con la adición del fago auxiliar M13-K07 (New England Biolabs). Después de tres vueltas de selección, los clones individuales fueron crecidos en un formato de 96 depósitos en 500 µ? de caldo de 2YT, supiementado con carbenicilina y M13-K07. Los sobrenadantes del cultivo se utilizaron en los ensayos ELISA de fago para detectar clones positivos que enlazaron a placas recubiertas con antígenos, pero no a placas recubiertas con BSA (Sidhu, S.S. y asociados. (2004) supra). Los clones positivos que fueron sometidos a análisis de secuencia de ADN fueron evaluados con respecto al enlace específico de antígenos con ensayos inmunoabsorbentes enlazados por enzimas de fagos (ELISAs) (Sidhu, S.S. y asociados, (2004) supra). Se clasificaron aproximadamente 100 clones contra cada antígeno y los clones de enlace específico fueron identificados en cada caso. La secuenciación de ADN reveló que el número de clones únicos, se aisló contra cada antígeno. Al menos una biblioteca que contiene tirosina tuvo éxito contra cada antígeno. En particular, la Biblioteca-KMT tuvo éxito contra 3 de los 4 antígenos, y generó 11 clones únicos contra factor de crecimiento endotelial vascular humano (hVEGF). c. Segunda Biblioteca KMT - Diversidad de Cadena Ligera Construimos nuevas versiones de la Biblioteca KMT, en donde las diversidades CDR-H1 y CDR-H2 fueron las mismas que se describió anteriormente, aunque la diversidad de CDR-H3 incrementó permitiendo todas las posibles variaciones de longitud que fluctúan de 3 a 15 residuos insertados entre los residuos 94 y 100b. Todas las bibliotecas reunidas contenían una diversidad de ~1010 elementos únicos que fueron reciclados a través de selecciones para enlace a hVEGF. Las clasificaciones de ELISA de fagos identificaron 93 enlazadores hVEGF y la secuenciación de ADN reveló 15 secuencias únicas (Figura 36). La mayor parte de los clones contuvieron secuencias CDR-H3 con siete residuos insertados, aunque también identificaron clones que contenían inserciones más largas. Los clones únicos fueron sometidos a ELISAs de fago competitivo (Sidhu, S.S. y asociados (2004) supra) y exhibieron afinidades estimadas en los 10 rangos micromolares (datos no mostrados). c. Maduración de Afinidad de Clones Únicos de la Segunda Biblioteca KMT Posteriormente investigamos si los clones anti-VEGF de baja afinidad podrían ser madurados por afinidad para obtener Fabs con afinidades comparables a las de los anticuerpos naturales. Para este fin, recombinamos las 15 cadenas pesadas (Figura 36) con una biblioteca de cadena ligera en donde las 12 posiciones accesibles y un solvente fueron reemplazadas con el mismo codón K T tetranominal. En forma específica, se aleatorizaron las siguientes posiciones de cadena ligera: posiciones 28 a 32 en CDR-L1, posiciones 50 y 53 en CDR-L2, y posiciones 91-94 en CDR-L3. Las bibliotecas contenían ~1010 elementos únicos, que excedieron en gran parte la diversidad teórica de las posibles cadenas ligeras (412 = 2x107). El fagémido seleccionado para el despliegue de una secuencia de cadena pesada y la secuencia de cadena ligera anterior, habían sido modificados mediante la introducción de codones de detención TAA en los tres CDRs de cadena ligera. El fagémido resultante se utilizó como la "plantilla de detención" en una reacción de mutagénesis que reparó los codones de detención e introdujo las mutaciones deseadas tal como se describió anteriormente. Los fagos de la biblioteca de cadena ligera fueron incubados durante 2 horas a temperatura ambiente enPBS, 0.05% Tween 20 (Sigma, 0.5% Superblock (Pierce) con 100 nM de hVEGF biotinilado con reactivo Sulfo-NHS-LC-Biotin (Pierce). El hVEGF biotinilado y los fagos enlazados fueron capturados durante 5 minutos con neutravidina (Pierce) inmovilizada en inmunoplacas Maxisorp. Las placas fueron lavadas con PBS, 0.05% Tween 20 y los fagos enlazados fueron eluidos y propagados para vueltas adicionales de selección, tal como se describió anteriormente.

Después de la selección, los clones individuales se crecieron en un formato de 96 depósitos en 500 µ? de caldo de 2YT suplementado con carbenicilina y M13-K07. Los sobrenadantes se utilizaron en ensayos ELISA de fagos para detectar los clones positivos que enlazaron a las placas recubiertas con antígenos pero no a las placas cubiertas con BSA (Sidhu, S.S. y asociados., (2004) supra). Los clones positivos fueron sometidos a análisis de secuencia de ADN. hVEGF en solución, fue utilizado para una selección altamente estricta. Secuenciamos 256 clones e identificamos 64 cadenas ligeras únicas combinadas con 9 de las 15 cadenas pesadas (9 secuencias superiores en Figura 36). Los ensayos ELISAs de fagos competitivos fueron utilizados para estimar afinidades de clones (Sidhu, S.S. y asociados., (2004) supra). Dichos ensayos ELISAs se llevaron a cabo generalmente como se indica a continuación. Los clones de fago se propagaron a partir de una sola colonia creciendo en 40 mi de cultivo 2YT suplementado con carbenicilina y fago auxiliar K07 durante la noche a una temperatura de 30°C. Los fagos purificados por precipitación PEG/NaCI fueron diluidos primero en serie en PBST y probados para enlace a una placa recubierta con antígeno (hVEGF ó mVEGF). La dilución que produjo del 50 al 70% de señal de saturación, fue utilizada en el ensayo de enlace de solución, en donde los fagos se incubaron primero con una concentración en incremento de antígenos durante de 1 a 2 horas, y posteriormente se transfirieron a la placa recubierta con antígenos para capturar los fagos no enlazados durante de 10 a 15 minutos. Se calculó un IC50 como la concentración de antígenos en la etapa de enlace de solución que inhibió el 50% de los fagos del enlace al antígeno inmovilizado. Los tres clones de fagos con la mayor afinidad fueron YADS1, YADS2 y YADS3, los cuales se convirtieron a Fabs. d. Afinidades de enlace de Fab YADS1, 2 y 3.

Los YADS1, 2 y 3, fueron purificados en la forma de proteínas Fab libres para análisis detallado. A continuación se proporcionar las secuencias de estos Fabs. Ver también figura 39.

Cadena Ligera YADS1 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQASYSSVAWYQQ PGKAPKLLIYAASYLY SGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQSSASPATFGQGTKVEIKRTVAAP SVF1FPPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREA VQAVKVDNALQSGNSQESVTEQDS KDSTYSLSSTLTLSKADYEKíIKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ. ID NO. 19) Cadena Pesada YADS1 MKJ IAFLLASMFVFSIATNAYAEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFDIYDD DIHWVRQAPG GLEWVAYIAPSYGYTDYADSVKGRFTISADTSK TAYLQMNSL RAEDTAVYYCSRSSDASYSYSAMDYWGQGTLVTVSSAST GPSVFPLAPSSKSTS GGTAALGCLV DYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSWTVPSS SLGTQTYICNVNHKPSNTKVD KVEPKSCDKTH (SEQ ID NO.20) Cadena Ligera YADS2 DIQMTQSPSSLSASVGDRVmCRASQSYAYAVAWYQQKPGKAPKLLIYDASYLY SGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQAYSSPDTFGQGTKVEIKRTVAA PSVFIFPPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQ KVDNALQSGNSQESVTEQD SKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO. 21) Cadena Pesada YADS2 MKJCN1AFLLASMFVFSIATNAYAEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFAISDY DIHWVRQAPG GLEWYADIAPY AGATA YADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSL RAEDTAVYYCSRSSYAYYAAMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSG GTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSL GTQTYICNV HKPSNTKVDKKVEPKSCDKTH (SEQ ID NO.22) Cadena Ligera YADS3 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQASYYDVAWYQQKPG APKLLIYAASYLY SGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYYYAPATFGQGTKVE1 RTVA APSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQ DS DSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO.23) Cadena Pesada YADS3 MKKNIAFLLASMFVFSIATNAYAEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSISDYD IHWVRQAPGKGLEWVAAIAPYSGSTYYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLR AEDTAVYYCSRSSYAYYSAMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGT AALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSWTVPSSSLGT QTYIC VNHKPSNTKVDKKVEPKSCD TH (SEQ ID NO.24) Las proteínas Fab fueron purificadas a partir de cultivos en frasco de agitación de E. coli tal como se describió previamente ( uller, YA y asociados., (1998) Structure 6:1153-1167). Generalmente, los dominios variables fueron clonados en vectores diseñados para la expresión Fab en E. coli o la expresión IgG temporal en células de mamífero. El vector de expresión Fab se derivó del fagémido de despliegue de fagos eliminando la secuencia que codifica el cP3 y agregando una secuencia de terminación ? la secuencia (GCTCGGTTGCCGCCGGGCGTTTTTTAT (SEQ ID NO. 920)) en la corriente descendente de aproximadamente 20 nucléotidos desde el codón de detención al final de CH1- La proteína Fab fue generada creciendo las células E. coli 34B8 transformadas en medio AP5 a una temperatura de 30°C durante 24 horas tal como se describió anteriormente (Presta, L. G. y asociados (1997) Cáncer Res. 57, 4593-4599). El Fab fue purificado con cromatografía de afinidad de Proteína G. El rendimiento de producción de Fab, normalmente fue de 5 a 10 mg/L en crecimiento de frasco de agitación a pequeña escala y de 0.5-3 g/L en crecimiento de fermentador. Más adelante se muestran los valores cinéticos de enlace de los Fabs purificados con base en la resonancia de plasmon de superficie. Se inmovilizaron hVEGFg-iQ9 ó mVEGF en los chips CM5 en -100 unidades de respuesta en un Bl Acore™-3000, tal como se describió previamente (Chen, Y., y asociados (1999) J. Mol. Biol.. 293:865-881 ). Las diluciones en serie de las proteína Fab (3-500 nM) fueron inyectadas, y las respuestas de enlace en la célula de flujo hVEGF ó mVEGF fueron corregidas sustrayendo las respuestas de una célula de flujo en blanco. Para análisis cinético, se utilizó un modelo Languir 1:1 con ajustes separados de kon y koff . Los valores Kd fueron estimados a partir de las proporciones de kon y k0ff - Los tres Fabs enlazaron con alta afinidad a hVEGF, pero únicamente dos exhibieron afinidad apreciable con el VEGF de múrido altamente homologo (mVEGF, 90% de identidad de aminoácidos). Consideramos que YADS2 y YADS3 reconocieron VEGF a través de un mecanismo muy similar, ya que exhiben una alta homología de secuencia en su CDRs y enlazaron a VEGF tanto de humano como de múrido. En contraste, YADS1 representó igualmente un modo único de reconocimiento de antígenos ya que contenía secuencias CDR muy diferentes y no reconoció mVEGF. Análisis cinéticos de Fabs que enlazan a VEGF inmovilizado.

Fab nM) hVEGF mVEGF hVEGF mVEGF hVEGF mVEGF YADS1 3x105 ND1 5x10"4 ND1 1.8 ±0.3 >1000 YADS2 1x106 8x105 1x10"2 4x10'3 10±2 5.0 ±0.8 YADS3 1x106 2x106 3x10"3 5x10'3 2.0 ± 0.4 3.7 ±0.6 Los valores podrían no se determinados debido a la baja afinidad de la interacción Ejemplo 7 - Cristalización, Determinación de Estructura y Refinamiento de YADS1 y YADS2 Deseamos estudiar las bases estructurales de los reconocimientos de antígenos, y por lo tanto las estructuras de cristal de YADS1 y YADS2 en el complejo con hVEGF. a. Proteína Fab para análisis de estructura de cristal Todo el caldo celular se obtuvo de una fermentación de E. coli de 10 litros. Las células fueron Usadas con un homogeneizador Manton-Gaulin. La suspensión fue centrifugada, el sobrenadante fue cargado en una columna de proteína A-Sefarosa (Genentech, Inc.), y la columna fue eluida con 0.1 M ácido acético. El pH fue ajustado a 4.0 con 1.0 m Tris, pH 8.0 y la solución de agotamiento fue cargada en una columna SP-Sefarosa (Pharmacia). La columna fue lavada con regulador de equilibrio (20 mM MES, pH 5.5) la proteína Fab fue eluida con un gradiente NaCI en regulador de equilibrio. Los residuos 8 a 109 del VEGF humano fueron expresados, redoblados y purificados tal como se describió previamente (Christinger, H.W. y asociados., (1996). Prot. Struct. Funct. Genet. 26, 353-357). El complejo entre cada Fab y el fragmento de enlace receptor de hVEGF se formó y purificó, tal como se describió anteriormente (Muller, Y. A. (1998), supra). El complejo (en PBS, 25mM EDTA) fue concentrado a una densidad óptica de Se llevaron a cabo experimentos de gota pendiente utilizando el método de difusión por vapor con 10 µ? de gotas que consisten en una proporción de 1:1 de solución de proteína y solución del depósito. La solución del depósito del complejo YADS1 fue de 0.2 M de sulfato de amonio, 25% PEG 3350 (p/v), o.1 M HEPES, pH 7.5. La solución del recipiente para el complejo YADS2 fue de 1.0 M de cloruro de litio, 10% de PEG (p/v), 0.1 M MES, pH 6.0. Después de 1 a 2 semanas a una temperatura de 19°C, los cristales formados por la placa o por rueda crecieron para el complejo YADS1 ó YADS2, respectivamente. Los cristales fueron incubados en una solución de recipiente suplementada con 25% de giicerol antes de la congelación flash. Se recolectó un grupo de datos a partir de un solo cristal congelado en la línea de rayo 5.0.2 déla Fuente Advanced Light (Berkeley) para YADS1 y en la línea de raya 9.2 del Stanford Synchrotron Radiation Laboratory (Stanford University) para YADS2. Los datos fueron procesados utilizando los programas DENZO y SCALEPACK (Otwinowski, Z.M. (1997) Methods Enzymol. 276:307-326). Las estructuras fueron resueltas a través de reemplazo molecular utilizando el programa AmoRe (CCP4 (1994) Acta Cryst. D50:760-763) y las coordenadas de un complejo Fab- hVEGF previamente resuelto (entrada PDB 1BJ1). La estructura fue refinada utilizando los programas REFMAC (CCP4 (1994), supra). Los modelos fueron ajustados en forma manual utilizando O (Jomes, T.A. y asociados (1991) Acta Crystallogra A 47 (Pt2):969-995). Se utilizaron los siguientes programas para calcular las áreas de superficie de la interacción RESAREA versión 3:2: 05/08/93 y AREAI MOL versión 3.2: 19/12/95. Estos programas son parte del Proyecto de Cómputo de Adaptación CCP4, Número 4. 1994 ("The CCP4 Suite: Programs for Protein Crystallography" Acta Cryst. D50, 760-763). Las estructuras de cristales de YADS1 y YADS2 en el complejo con hVEGF, se resolvieron y refinaron a una resolución de 2.65 y 2.8 Á, respectivamente (Tabla 9) Tabla 9 Recolección de datos y estadísticas y refinamientos de complejos hVEGF YADS1 y YADS2.

A. Célula de Unidad YADS 1 YADS 2 Grupo de Espacio P¾ C222, a (A) 83,3 96,5 b(A) 112,5 149,6 c(A) 105,8 117,4 Beta (grados.) 105,8 B. Difracción Datos Resolución (A) 50-2.6 (2.7- 50-2.8 (2.9- 2.6)a 2.8)a No. De Reflexiones 156868 111731 No. de Reflexiones Únicas 41828 20861 Rmergeb 0.066 (0.356)3 0.076 (0.399): Plenitud (%) 99.9 (99.1 )a 97.3 (83.2)a C. Refinamiento Rworkc, Rfreec 0.212, 0.271 0.218, 0.254 No. De átomos sin H 8104 4077 No. De aguas 110 0 Longitud de enlace rmsd (A) 0,011 0,011 Ángulos rmsd (grados) 1 ,2 1,3 a Los valores para la protección de resolución externa se proporcionan en el paréntesis b - <l ki>|)/ ? h k i > I h k i , en donde I hki es la intensidad de reflexión hjkm y <lhki> es la intensidad promedio de observaciones múltiples. cRwork = ? I F0 - FC|/?F0, en donde F0 y Fc son las amplitudes de factor de estructura observados y calculados, respectivamente. Rfree es el factor R de un 5% seleccionado en forma aleatoria de reflexiones que no se utilizaron en el refinamiento. El área de superficie de cada residuo de un anticuerpo anti-VEGF que está enterrado en VEGF (Á2) que es reportado más adelante junto con el porcentaje del área de superficie total que está enterrado. También se reporta el área de superficie de cada residuo de anticuerpo VEGF que está enterrado en VEGF (Á2), se reporta más adelante, juntos con el porcentaje del área de superficie total del residuo que está enterrado. Ver los valores para YADS-1:VEGF y YADS-2:VEGF que se encuentran más adelante. En todos los casos debido a que VEGF es un dímero, los números de residuos de VEGF se refieren al monómero 1 (del dímero VEGF) y son de 8 a 109 y los números de residuos de VEGF que se refiere al monómero 2 (del dímero VEGF) son de 1008 a 1109. La primera columna en cada tabla que se encuentra más adelante señala el número de residuos de la proteína que esta siendo examinada (ya sea VEGF o un anticuerpo anti-VEGF) (por ejemplo, para la sección (a) más abajo, TYR A 45 se refiere a Y45, LYS A1016 se refiere a K16 de VEGF). La segunda columna señala la superficie enterrada de dicho residuo (Á2). La tercera columna señala la superficie enterrada de dicho residuo como un porcentaje del área de superficie de todo el residuo. (a) VEGF:YADS-1 Tabla 10: Residuos de VEGF en contacto con YADS-1 No. de Residuo Superficie Enterrada Sup. Enterrada en % TYR A 45 8.00 20.51 %de 39.00 ILEA 46 36.00 37.89 % de 95.00 LYS A 48 14.00 20.90 % de 67.00 GLNA 79 31.00 81.58% de 38.00 META 81 24.00 75.00 % de 32.00 ARGA 82 7.00 14.58 % de 48.00 ILEA 83 33.00 76.74 % de 43.00 LYS A 84 25.00 40.98% de 61.00 PRO A 85 8.00 14.55% de 55.00 HIS A 86 107.00 54.04% de 198.00 GLNA 87 110.00 71.43% de 154.00 GLYA 88 38.00 95.00% de 40.00 GLNA 89 103.00 88.79% de 116.00 HIS A 90 93.00 75.61 %de 123.00 ILEA 91 71.00 89.87 % de 79.00 GLYA 92 12.00 60.00 % de 20.00 GLU A 93 21.00 17.50% de 120.00 LYS A1016 31.00 25.20 % de 123.00 PHE A1017 21.00 46.67 % de 45.00 META1018 14.00 10.14% de 138.00 ASN Al 062 10.00 28.57 % de 35.00 ASP A1063 6.00 6.38 % de 94.00 GLU A 1064 89.00 49.17% de 181.00 LYS Al 107 0.00 0.00% de 165.00 DIFERENCIA-ÁREA CADENA A: 912.0 (8.16% de área total 11170.0 de esta cadena) DIFERENCIA-ÁREA TOTAL: 912.0 (8.16% de área total 11170.0 de todas las cadenas), (b) VEGF: YADS-2 Tabla 11: residuos de VEGF en contacto con YADS-2 No. De Superficie Enterrada Superficie Enterrada en % Residuo ILEA 46 6.00 8.82% de 68.00 LYS A48 39.00 60.94% de 64.00 GLN A 79 17.00 45.95% de 37.00 MET A 81 29.00 96.67% de 30.00 LILE A 83 32.00 86.49% de 37.00 PRO A 85 22.00 38.60% de 57.00 HIS A86 128.00 64.00% de 200.00 GLN A 87 32.00 23.88% de 134.00 GLYA88 22.00 64.71% de 34.00 GLN A 89 119.00 88.15% de 135.00 HIS A 90 20.00 21.74% de 92.00 ILEA91 55.00 67.07% de 82.00 LYSA1016 1.00 0.87% de 115.00 PHEA1017 45.00 90.00% de 50.00 META 1018 47.00 40.52% de 116.00 TYRA1021 7.00 8.97% de 78.00 ASPA 1063 27.00 36.49% de 74.00 GLYA1065 6.00 13.33% de 45.00 LEU A 1066 32.00 55.17% de 58.00 CYSA1104 3.00 12.50% de 24.00 ARG A 105 7.00 5.65% de 124.00 PRO A 1106 29.00 37.66% de 77.00 DIFERENCIA-ÁREA CADENA A: 725.0 (6.17% de ÁREA total 11744.0 de esta cadena) DIFERENCIA-ÁREA TOTAL: 725.0 (6.17% de ÁREA total 11744.0 de todas las cadenas) Los residuos que tienen más de 5 Á2 de área de superficie enterrada y/o mayor a 5% de área enterrada se consideraron con un contacto significativo. Estos resultados ayudan a describir las regiones en VEGF y las regiones en los anticuerpos que contactan entre sí. Junto con datos funcionales que se relacionan con el enlace VEGF presentado anteriormente, se pueden observar características comunes de las series G6 de los anticuerpos YADS-2 y de los anticuerpos YADS-3. El enlace de anticuerpos, tal como Fab-12 y YADS-1 a VEGF dio como resultado el área de superficie de G88 con un 100% y 95%, respectivamente, enterrado, en tanto que el enlace de G6, G6-23 y YADS-2 dio como resultado un G88 con únicamente el 66% o menos enterrado. Las estructuras Fab estuvieron esencialmente sin cambio en comparación con la estructura del Fab4D5 de origen; Los átomos Ca de las estructuras YADS1 y YADS2 se sobre-impusieron con Fab4D5 con desviaciones de mínimos cuadrados (msd) de 0.87 y 0.55 Á, respectivamente. Los átomos Ca de las moléculas hVEGF en las dos estructuras, se sobre-impusieron también en cada una de las otras con rmsds de 0.7 A para las 87 posiciones Ca. La desviación más grande de 3.7 A ocurre en el residuo de ácido glutámico 64. El lazo que contiene este residuo tiene flexibilidad inherente tal como se muestra en la publicación de Muller y asociados, supra. En ambos complejos, el reconocimiento de antígenos fue completamente transmitido por contacto con los lazos CDR. En términos de área de superficie enterrada, YADS1 utilizó tanto la cadena pesada (498 A2) como la cadena ligera (407 A 2), mientras que YADS2 utilizó la mayor parte de la cadena pesada (543 A2) y una pequeña contribución de la cadena ligera (157 A2). Notablemente, los residuos en las posiciones aleatorizadas tomaron en cuenta esencialmente toda el área de superficie enterrada (98% y 100% para YADS1 y YADS2, respectivamente) y además, el área de superficie enterrada comprendió casi completamente los átomos de cadena lateral (82% y 80% para YADS1 y YADS2, respectivamente). Por lo tanto, ambos Fabs enlazaron a los antígenos a través de interacciones que fueron casi completamente transmitidas por las cadenas laterales localizadas en las posiciones que fueron aleatorizadas en las bibliotecas. En el lado hVEGF, los epítopes estructurales para enlazar a YADS1 y YADS2 traslaparon entre sí, y también, con el epítope estructural enlazando al dominio 2 del receptor hVEGF FIt- 1 (Flt-1 D->, )- Los anticuerpos YADS1 y YADS2 pueden inhibir el enlace de FIt a VEGF de humano in vitro (datos no mostrados), y se espera que inhiban el también enlace de KDR a VEGF de humano. Sin embargo, existen diferencias significativas entre los epítopes estructurales de los dos Fabs. En particular, de los 11 residuos que difieren entre VEGF de humano y de múrido, únicamente el residuo 88 está en contacto con los Fabs, aunque las interacciones que comprenden este residuo explican las diferentes afinidades de YADS1 y YADS2 de mVEGF. En el complejo YADS2, Gly88 está parcialmente expuesta a solvente, en tanto que en el complejo YADS1 está completamente enterrada en la interfase. VEGF de múrido contiene un residuo de serina más grande en la posición 88; esta substitución puede acomodarse fácilmente en el complejo YADS2, aunque en el modelo YADS1, la introducción de una cadena lateral de serina en la posición Gly88 enterrada puede requerir un reajuste importante para el complejo que será conservado. Tal como se describió anteriormente, ambos Fabs enlazan a un antígeno a través de contactos que comprenden casi de manera exclusiva las cadenas laterales en sitios variados. En total, los CDRs de YADS1 y YADS2 contienen 66 residuos derivados de codones aleatorizados, y estos residuos están casi igualmente distribuidos entre los 4 tipos de aminoácidos permitidos en el diseño de la biblioteca. Sin embargo, cuando consideramos el subgrupo de residuos que hace contacto con el antígeno, existe una clara inclinación en cuanto a que 16 tirosinas cuentan para el 50% de los residuos de contacto. De hecho, todas excepto dos de las tirosinas seleccionadas en CDRs de YADS1 y YADS2, hace contacto con el antígeno, y todas las tirosinas contribuyen al 71% del área de superficie enterrada al momento de la elaboración de complejos con hVEGF. Por lo tanto, esencialmente cada cadena lateral de tirosina seleccionada está involucrada en la transmisión directa de reconocimiento de antígenos y, los otros aminoácidos seleccionados aparentemente juegan papeles auxiliares. A pesar de lo predominante de la tirosina en los sitios de enlace de antígenos sintéticos, una revisión del contenido de átomos pesados (sin hidrógenos) de las áreas de superficie enterrada, reveló que las interfases Fab-hVEGF no son más hidrofóbicas que la interfase entre hVEGF y Flt-D2- En el lado hVEGF, la composición de átomos pesados del área de la superficie enterrada es muy similar en los tres casos, estando compuesta predominantemente de carbono aunque también conteniendo proporciones significativas de nitrógeno y oxígeno. Dentro de las áreas de superficie enterrada de los Fabs, los átomos de nitrógeno están casi completamente ausentes, debido a que las cadenas laterales permitidas en las bibliotecas, estuvieron compuestas completamente de carbono, oxígeno e hidrógeno. Sin embargo, ambos Fabs entierran una gran cantidad de átomos de oxígeno al momento del enlace con hVEGF, en ambos casos, la proporción de área de superficie enterrada contribuida por el carbono, es considerablemente menor que la que tiene contribución de carbono para el área de superficie enterrada de Flt-1D2- Por lo tanto, lo predominante de tirosina en los CDRs sintéticos no produce interfases Fab-antígeno altamente hidrofóbicas dominadas por interacciones aromáticas. Por el contrario, los residuos de tirosina hacen contacto específico con una amplia variedad de residuos en la superficie hVEGF, y estas interacciones utilizan tanto los grupos hidroxilo de cadena lateral como anillos aromáticos. Por lo tanto, consideramos la complejidad del sistema inmune natural utilizando bibliotecas sintéticas definidas en forma precisa, y como resultado, tuvimos la capacidad de investigar el papel especial que juega la tirosina en los sitios de enlace de antígenos. Generamos bibliotecas con diversidades restringidas y mostraron las diversas superficies en un andamio fijo formado por las regiones de estructura y residuos CDR enterrada. Nuestros resultados demostraron en forma dramática que, dentro del contexto de un andamio adecuado, la cadena lateral de tirosina tiene la capacidad de transmitir la mayor parte de los contactos necesarios para un reconocimiento de antígenos de alta afinidad. Por lo tanto, parece ser muy probable que la súper abundancia de tirosina en los sitios de enlace de antígeno natural es una consecuencia de la cadena lateral que está particularmente bien adaptada para hacer contactos productivos con el antígeno. Esta suposición también es consistente con la naturaleza química de la tirosina. Tal como se observó previamente, la cadena lateral de tirosina es lo suficientemente grande para barrer grandes volúmenes de espacio únicamente con algunos ángulos de torsión, y puede formar enlaces de hidrógeno, e interacciones electrostáticas atractivas con grupos cargados en forma positiva (Zemlin, M., y asociados, (2003) J. Mol. Biol.. 334:733-749). Además, la cadena lateral de tirosina no cargada evita los efectos de repulsión electrostática, y su hidrofilicidad de rango medio permite adaptarse en forma favorable a ambientes tanto hidrofílicos como hidrofóbicos (Zemlin, (2003), supra; Ivanov, I:, y asociados , (2002) en The Antibodies, eds. Zanetti, M. & Capra, J. (Taylor & Francis, Londres, Nueva York), pp.43-67; Mian, I.S., y asociados, (1991) J. Mol. Biol..217:133-151 ). También observamos que, aunque los residuos de alanina y serina no hacen muchos contactos directos con el antígeno, permitieron la flexibilidad de espacio y de conformación que puede ser crucial para la colocación adecuada de las cadenas laterales de tirosina grandes. Por lo tanto, estos pequeños residuos pueden servir como una función auxiliar para facilitar los contactos productivos entre tirosina y antígeno. Sin embargo, se observó que posiblemente no de manera coincidente, la serina también está altamente abundante en sitios de enlace de antígenos naturales (Mían, (1991), supra). Finalmente, la escasez de los contactos de antígenos transmitidos por aspartato, sugiere que puede ser posible minimizar en forma adicional la diversidad química de estos sitios de enlace de antígenos sintéticos. Ejemplo 8-anticuerpos Anti-VEGF de bibliotecas YADS-A y YADS-B. (a) Construcción de bibliotecas Fab con despliegue de fagos YADS-A y YADS-B. Se construyeron dos bibliotecas con despliegue de fagos (YADS-A y YADS-B), tal como se describe de manera general en el ejemplo 6, con un fagemido previamente descrito diseñado para desplegar porciones Fab bivalentes dimerizadas por un dominio de cierre de leucina, insertado entre la cadena pesada Fab y el dominio de terminal-C de la proteína de recubrimiento menor gen-3 (P3C), excepto que las posiciones siguientes a 4D5, fueron aleatorizadas tal como se indica a continuación: Para la biblioteca YADS-A, se llevaron a cabo dos reacciones de mutagénesis por separado. En la primera reacción, se introdujo la diversidad en CDR-H1, CDR H2 y CDR-H3 con ios oligonucleótidos YADS-H1, YADS-H2 y YADS-H3-7, respectivamente. Esto dio como resultado la introducción de codones de degeneración que codificaron los cuatro aminoácidos de tirosina, alanina, aspartato y serina (YADS). En la segunda reacción, la diversidad fue introducida en CDR-H1, CDR H2 y CDR-H3 con los oligonucleótidos YTNS-H1 , YTNS-H2 y YTNS-H3-7, respectivamente. Esto dio como resultado la introducción de codones de degeneración que codificaron los cuatro aminoácidos de tirosina, treonina, asparagina y serina (YTNS). Se reunieron las dos reacciones. Para la biblioteca YADS-B, se llevaron a cabo 13 reacciones de mutagénesis por separado. Las reacciones dieron como resultado la introducción de codones de degeneración que codificaron los cuatro aminoácidos de tirosina, alanina, aspartato y serina (YADS). ). En cada reacción, la diversidad se introdujo en CDR-H1 y CDR H2 con oligonucleótidos YADS-H1 y YADS-H2. Para cada reacción, se utilizó uno de los siguientes oligonucleótidos para introducir la diversidad en YADS-H3-3, YADS-H3-4, YADS-H3-5, YADS-H3-6, YADS-H3-7, YADS-H3-8, YADS-H3-9, YADS-H3-10, YADS-H3-11 , YADS-H3-12, YADS-H3-13, YADS-H3-14 ó YADS-H3-15. Se reunieron las 13 reacciones. Para ambas bibliotecas, se electroporaron las reacciones de mutagénesis reunidas en E. coli SS320 (Sidhu y asociados, supra). Las células transformadas fueron crecidas durante la noche en la presencia del fago auxiliar M13-K07 (Nueva Inglaterra Biolabs, Beverly, MA) para producir partículas de fagos que encapsulan el ADN de fagémido y despliegan fragmentos Fab en su sus superficies. El tamaño de las bibliotecas YADS-A y YADS-B, fueron ambos de 7 x 109. (b) Selección de anticuerpos específicos anti-hVEGF a partir de bibliotecas na'ive de YADS-A y YADS-B. Los fagos de las bibliotecas YADS-A y YADS-B, fueron reciclados por separado a través de vueltas de selección de enlace para el enriquecimiento de clones que enlazan a h-VEGF. Las selecciones de enlace se llevaron a cabo utilizando métodos descritos previamente (Sidhu y asociados, supra). Se recubrieron inmunoplacas de Maxisorp de 96 depósitos NUNC durante la noche a una temperatura de 4°C con objetivo de captura (5 9/?t??) y se bloquearon durante dos horas con BSA (Sigma). Después del crecimiento durante la noche a una temperatura de 37°C, los fagos se concentraron mediante precipitación con PEG/NaC1 y se suspendieron nuevamente en PBS, 0.5% BSA, 0.05% Tween 20 (Sigma), tal como se describió previamente (Sidhu y asociados, supra). Las soluciones de fagos (~1012 fago/mL) se agregaron a las inmunoplacas recubiertas. Después de una incubación de dos horas para permitir el enlace de fagos, las placas fueron lavadas 10 veces con PBS, 0.05% Tween20. Los fagos enlazados fueron eluidos con 0.1 HC1 durante 10 minutos y el eluente fue neutralizado con base Tris 1.0 M. Los fagos eluidos fueron amplificados en XL1-azul E. coli y utilizados para vueltas de selección adicionales. Las bibliotecas se sometieron a cuatro vueltas de selección contra cada proteína objetivo. Los clones individuales da cada vuelta fueron crecidos en un formato de 96 depósitos en 500 µL· de caldo 2YT suplementado con carbenicilina y 13-VCS, y los sobrenadantes del cultivo se utilizaron directamente en ELISAs de fago (Sidhu y asociados, supra) para detectar los Fabs con despliegue de fagos que enlazan a placas recubiertas con proteína objetivo pero no a placas recubiertas con BSA. Se consideró un clon como enlazador específico, si la señal ELISA en las placas recubiertas con objetivo, fue al menos 20 veces mayor que la de las placas recubiertas con BSA. Se secuenciaron enlazadores específicos, y la secuencia de clones únicos se muestra en las figuras 37 y 38 para las bibliotecas YADS-A y YADS-B, respectivamente. Las secuencias de la figura 37 fueron obtenidas clasificando con VEGF-8 de humano. Las secuencias de la figura 38 se obtuvieron clasificando VEGF de múrido. Ejemplo 9 - variantes NNK de YADS2 (a) Construcción de bibliotecas Fab con despliegue de fagos aleatorizando posiciones seleccionadas de anticuerpo anti-VEGF de YADS2 con codón NNK. Las bibliotecas Fab con despliegue de fagos fueron construidas utilizando un vector de Fagémido que dio como resultado el despliegue de porciones Fab bivalentes dimerizadas por un dominio de cierre de leucina insertada entre la cadena pesada Fab y el dominio de terminal-C de la proteína de recubrimiento menor gen-3 (P3C). Este vector comprendió la secuencia YADS2. Los dominios variables YADS2 de anticuerpo humanizado, se expresaron bajo el control de promotor Ptac inducible por IPTG. Se construyó la biblioteca NNK con residuos aleatorizados en la cadena pesada CDR-3 de YADS2. Los residuos específicos que fueron aleatorizados fueron 50, 95, 97, 99, 100 y 100a de la cadena pesada. En cada una de las posiciones aleatorizadas, se reemplazó un codón tipo natural por un codón NNK de degeneración (N = A/T/G/C, K = G/T en proporción equimolar) que codificó los 20 aminoácidos naturales. Las bibliotecas se construyeron utilizando el método de Kunkel (Kunkel, T.A., Roberts, J.D. & Zakour, R.A., Methods Enzymol. (1987), 154, 367-382) con los métodos previamente descritos (Sidhu, S.S., Lowman, H.B., Cunningham, B.C. & Wells, J.A., Methods Enzymol. (2000), 328, 333-363). Se utilizó una versión única de "plantilla de detención" del vector de despliegue Fab para generar la biblioteca NNK. Utilizamos un fagémido de plantilla que contiene el gen que codifica Fab YADS2 con codones de detención TAA insertados en las posiciones 30, 33, 52, 54, 56, 57, 60, 102, 103, 104, 107, 108, de la cadena pesada. Los oilgonucleótidos mutagénicos con codones NNK de degeneración en las posiciones que serán diversificadas, fueron utilizados para introducir en forma simultánea la diversidad CDR y reparar los codones de detención. La diversidad se introdujo en CDR-H3 con el oligonucleótido denominado NNK-H1 (GCA GCT TCT GGC TTC GCT ATT TAT GAT TAT GAT ATA CAC TGG GTG CGT) (SEQ ID NO. 25), NNK-H2 (CTG GAA TGG GTT GCA NNK ATT GCT CCA TAT GCT GGT GCT ACT GCT TAT GCC GAT AGC GTC) (SEQ ID NO. 26), y NNK-H3 GTC TAT TAT TGT AGC CGC NNK TCT NNK GCT NNK NNK NNK GCT ATG GAC TAC TGG) (SEQ ID NO. 27). Los oligonucleótidos mutagénicos de los tres CDRs de cadena pesada fueron incorporados en forma simultánea en una sola reacción de mutagénesis, de modo que la incorporación simultánea del oligonucleótido mutagénico dio como resultado la introducción de la diversidad diseñada en cada posición y reparó en forma simultánea todos los codones de detención TAA, generando de esta forma una estructura de lectura abierta que codificó un elemento de la biblioteca Fab fusionado a un cierre de leusina de homodimerización y P3C. Se debe observar que el oligonucleótido NNK-H1, no contiene algún codón de degeneración y se agrega a la reacción de mutagénesis para reparar los codones de detención TAA e introducir la secuencia YADS2 tipo natural. Las reacciones de mutagénesis fueron electroporadas en E. coli SS320 (Sidhu y asociados, supra) y las células transformadas se crecieron durante la noche en la presencia del fago auxiliar 13-K07 (Nueva Inglaterra Biolabs, Beverly, MA) para producir partículas de fagos que encapsulan el ADN de fagémido y despliegan fragmentos Fab en sus superficies. Cada biblioteca contenía más de 5 x 109 de miembros únicos. (b) Selección de anticuerpos anti-VEGF específicos a partir de biblioteca NNK. Los fagos de la biblioteca NNK fueron reciclados a través de vueltas de selección de enlace para el enriquecimiento de clones que enlazan A VEGF humano. Las selecciones de enlace se llevaron a cabo utilizando métodos descritos previamente (Sidhu y asociados, supra). Las inmunoplacas Maxisorp de 96 depósitos NUNC fueron recubiertas durante la noche a una temperatura de 4°C con objetivo capturado (5 g/mL) y se bloquearon durante dos horas con TBS de Superbioque (solución salina regulada por tris) (Pierce). Después del crecimiento durante la noche a una temperatura de 37°C, los fagos se concentraron mediante precipitación con PEG/NaC1 y se suspendieron nuevamente en TBS de Superbioque 0.05% Tween 20 (Sigma), tal como se describió previamente (Sidhu y asociados, supra). Soluciones de fagos (~1012 fago/mL) fueron agregadas a las inmunoplacas recubiertas. Después de dos horas de incubación para permitir el enlace de fagos, las placas fueron lavadas 10 veces con PBS, 0.05% Tween 20. Los fagos enlazados fueron eluidos con 0.1 M HC1 durante 10 minutos y el eluente fue neutralizado base tris 1.0 M. Los fagos eluidos fueron amplificados en E. coli XL1-azul y utilizados para vueltas adicionales de selección. Las bibliotecas fueron sometidas a 5 vueltas de selección contra VEGF. Los clones individuales de cada vuelta de selección fueron crecidos en un formato de 96 depósitos de 500 de caldo 2YT suplementado con carbenicilina y M13-VCS, y los sobrenadantes de cultivo se utilizaron directamente en ELISAs de fago (Sidhu y asociados, supra) para detectar los Fabs con despliegue de fagos que enlazan a placas recubiertas con proteína objetivo, pero no a placas recubiertas con BSA. Los enlazadores específicos fueron definidos como los clones de fago que exhibieron una señal ELISA de al menos 15 veces mayor en las placas recubiertas con objetivo en comparación con las placas recubiertas con BSA. Los clones individuales fueron clasificados después de 3 a 5 vueltas de selección para enlace VEGF. Los clones individuales que representan enlazadores específicos fueron sometidos a análisis de secuencia ADN, y las secuencias de las posiciones CDR aleatorizadas se muestran en la figura 40. La afinidad de las diferentes variantes YADS se estimó utilizando un "ensayo ELISA de fago competitivo de dos puntos". Los tres mejores clones fueron producidos como Fab soluble y fueron probados por su afinidad con respecto a hVEGF. Se obtuvieron datos BIAcore de acuerdo con Chen y asociados., J. Mol Bio . (1999), 293(4):865-881. En síntesis, se calcularon afinidades de enlace a partir de las constantes de rango de asociación medidas utilizando sistema de resonancia de plasmón de superficie BIAcore™-3000 (BIAcore, Inc., Piscataway, NJ). Se activó un chip de biosensor para el acoplamiento covalente de VEGF, utilizando clorhidrato de N-etilo-N'-(3-dimetilaminopropilo)-carbodiimida (EDC) y N-hidroxisuccinimida (NHS) de acuerdo con las instrucciones del proveedor (BIAcore, Inc., Piscataway, NJ). hVEGF o mVEGF fueron intercambiados por regulador en 10 mM de acetato de sodio, pH 4.8 y diluidos en aproximadamente 30 mg/ml . Se inyectaron aliquotas de VEGF en un rango de flujo de 2 microL/minuto para lograr aproximadamente 200 a 300 unidades de respuesta (RU) de la proteína acoplada. Se inyectó una solución 1 M de etanolamina como el agente de bloqueo. Para las medidas cinéticas, se inyectaron diluciones en serie de dos veces de Fab en regulador PBS/Tween (0.05% de Tween 20 en solución salina regulada por fosfato) a una temperatura de 25°C en un rango de flujo de 10 microL/minuto. Se calcularon las constantes de disociación de equilibrio, valores Kd de las medidas de resonancia de plasmón de superficie, como k0ff/kon. Los datos BIAcore™ se resumen a continuación.

Ejemplo 10-biblioteca de Diversidad de Binomio. (a) Construcción de bibliotecas Fab con despliegue de fagos con residuos CDR aleatorizados únicamente como Tyr o Ser. Se construyeron bibliotecas Fab con despliegue de fagos, utilizando un vector de fagémido que dio como resultado el despliegue de porciones Fab bivalentes dimerizadas por un dominio de cierre de leucina insertado entre la cadena pesada Fab y el dominio de terminal-C de la proteína de recubrimiento menor de gen-3 (P3C). Este vector comprende los dominios variables del anticuerpo humanizado 4D5 bajo el control del promotor Ptac inducible por IPTG tal como se describió anteriormente. El anticuerpo humanizado 4D5, es un anticuerpo que tiene la mayor parte de las regiones de estructura de secuencia de consenso humano en las cadenas pesadas y ligeras, en las regiones CDR de un anticuerpo monoclonal de ratón específico para Her-2. El método para elaborar el anticuerpo anti-Her-2 y la identidad de la secuencia de dominio variable, se proporcionan en las Patentes Norteamericanas Nos. 5,821 ,337 y 6,054,297. Se construyeron 2 bibliotecas. La biblioteca YS-A fue construida con residuos aleatorizados en los 3 CDRs de cadena pesada, en tanto que la biblioteca YS-B fue construida con residuos aleatorizados en los 3 CDRs de cadena pesada y CDR3 de cadena ligera. Los residuos específicos que fueron aleatorizados se muestran a continuación. Biblioteca Posiciones Aleatorizadas CDRL3 CDRH1 CDRH2 CDRH3 28, 30, 31,32, 50, 52, 53, 54, 95, 96, 97, 98, YS-A 33 56, 58 99, 100, 100a 28, 30,31,32, 50, 52, 53, 54, 95, 96, 97, 98, YS-B 91-94, 96 33 56, 58 99, 100, 100a En cada una de las posiciones aleatorizadas, el codón tipo natural fue reemplazado por un codón TMT de degeneración (M = A/C en proporción equimolar) que codificó Tyr y Ser en una proporción equimolar. Además, la longitud de CDRH3 fue variada utilizando oligonucleótidos que reemplazaron los 7 codones tipo natural entre las posiciones 101 a 107, con diversos números de codones TMT (7 a 20 para la biblioteca YS-A y 7 a 15 para la biblioteca YS-B). Además, el CDRL3 de la biblioteca YS-B fue aleatorizado de modo que el 50% de los miembros de la biblioteca contenían una eliminación en el número de posición 91, en tanto que el otro 50% contenía el residuo Gln tipo natural en esta posición. Se construyeron bibliotecas utilizando el método de Kunkel (Kunkel, T.A., Roberts, J.D. & Zakour, R.A., Methods Enzymol. (1987), 154, 367-382), con métodos previamente descritos (Sidhu, S.S., Lowman, H.B., Cunningham, B.C. & Wells, J.A., Methods Enzymol. (2000), 328, 333-363). Se utilizó una versión única de "plantilla de detención" del vector de despliegue Fab, para generar ambas bibliotecas YS-A y YS-B. Utilizamos un fagémido de plantilla designado pV0350-4 con codones de detención TAA insertados en las posiciones 30, 33, 52, 54, 56, 57, 60, 102, 103, 104, 107, 108, de la cadena pesada. No se introdujeron detenciones en el CDR3 de cadena ligera. Los oilgonucleótidos mutagénicos con codones TMT de degeneración en las posiciones que serán diversificadas, fueron utilizados para introducir en forma simultánea la diversidad CDR y reparar los codones de detención. Para ambas bibliotecas, se introdujo la diversidad en CDR-H1 y CDR-H2 con los oligonucleótidos H1 y H2, respectivamente. Para la biblioteca YS-A, se introdujo la diversidad en CDR-H3 con una mezcla equimolar de oligonucleótidos. Para la biblioteca YS-B, se introdujo la diversidad en CDR-H3 con una mezcla equimolar de oligonucleótidos. Para la biblioteca YS-B, se introdujo la diversidad en CDR-L3 con una mezcla equimolar de oligonucleótidos. Los oligonucleótidos mutagénicos para todos los CDRs que serán aleatorizados se incorporaron en forma simultánea en una sola reacción de mutagénesis, de modo que la incorporación simultánea de todos los oligonucleótidos mutagénicos dio como resultado la introducción de la diversidad designada en cada posición y reparó en forma simultánea todos los codones de detención TAA, generando de esta forma una estructura de lectura abierta que codificó el elemento de biblioteca Fab fusionado a un cierre de leusina de homodimerización y P3C. Las reacciones de mutagénesis fueron electroporadas en E. coli SS320 (Sidhu y asociados, supra) y las células transformadas se crecieron durante la noche en presencia del fago auxiliar M13-K07 (Nueva Inglaterra Biolabs, Beverly, MA) para producir partículas de fagos que encapsularon el ADN de fagémido y desplegaron fragmentos Fab en su sus superficies. Cada biblioteca contenía más de 5 x 109 de miembros únicos. (b) Selección de anticuerpos específicos procedentes de bibliotecas naive YS-A v YS-B Los fagos de la biblioteca YS-A o YS-B, fueron reciclados a través de vueltas de selección de enlace para el enriquecimiento de clones que enlazan a objetivos de interés. Las proteínas objetivo, VEGF8-io9 de humano y VEGF de múrido fueron analizadas por separado con cada biblioteca. Las selecciones de enlace fueron llevadas a cabo utilizando métodos previamente descritos (Sidhu y asociados, supra). Se recubrieron inmunoplacas de Maxisorp de 96 depósitos NUNC durante la noche a una temperatura de 4°C con objetivo de captura (5 g/mL) y se bloquearon durante dos horas con TBS de Superbloque (solución salina regulada por fosfato) (Pierce). Después del crecimiento durante la noche a una temperatura de 37°C, los fagos se concentraron mediante precipitación con PEG/NaC1 y se suspendieron nuevamente en TBS de superbloque, 0.5% BSA, 0.05% Tween 20 (Sigma), tal como se describió previamente (Sidhu y asociados, supra). Se agregaron soluciones de fagos (~1012 fago/mL) a las inmunoplacas recubiertas. Después de dos horas de incubación para permitir el enlace de fagos, las placas fueron lavadas 10 veces con PBS, 0.05% Tween20. Los fagos enlazados fueron eluidos con 0.1 HC1 durante 10 minutos y el eluente fue neutralizado con base Tris 1.0 M. Los fagos eluidos fueron amplificados en XL1-azul E. coli y utilizados para vueltas de selección adicionales. Las bibliotecas se sometieron a 5 vueltas de selección contra cada proteína objetivo, y en cada vuelta, se obtuvieron tituladores para el enlace de fagos ya sea para la proteína objetivo o para los depósitos en blanco cubiertos con TBS de superbloque. El titulador de fagos enlazado a los depósitos recubiertos con objetivo se dividió entre el titulador de fago enlazado a los depósitos en blanco que se definió como una proporción de enriquecimiento utilizada para cuantificar el enlace específico de grupos de fagos a la proteína objetivo; Las proporciones de enriquecimiento mayores indican mayor enlace específico. Se observaron proporciones de enriquecimiento después de 3, 4 ó 5 vueltas de selección. Los clones individuales de cada vuelta de selección fueron crecidos en un formato de 96 depósitos de 500 pL de caldo 2YT suplementado con carbenicilina y M13-VCS, y los sobrenadantes de cultivo fueron utilizados directamente en ensayos ELISAs de fagos (Sidhu y asociados, supra), para-' detectar los Fabs de despliegue de fagos que enlazaron a placas recubiertas con proteína objetivo pero no a placas recubiertas con BSA. Los enlazadores específicos fueron definidos como aquellos clones de fago que exhibieron una señal ELISA de al menos 15 veces mayor en las placas recubiertas con objetivo en comparación con placas recubiertas con BSA. Se clasificaron clones individuales después de dos vueltas de selección para enlazar a VEGF de humano o después de 5 vueltas de selección para las otras proteínas objetivo. Estos datos fueron utilizados para calcular el porcentaje de enlazadores específicos, y los resultados de cada biblioteca contra cada proteína objetivo. Cada biblioteca produjo enlazadores contra cada proteína objetivo. Los clones individuales que representan enlazadores específicos, fueron sometidos a análisis de secuencia de ADN, y las secuencias de las posiciones CDR aleatorizadas se muestran en la figura 41. Se puede observar que, para cada proteína objetivo, fue posible seleccionar enlazadores específicos que contenían únicamente Tyr o Ser en las posiciones aleatorizadas (aunque se observaron algunas mutaciones no diseñadas, las cuales fueron creadas probablemente durante la construcción de bibliotecas, debido posiblemente a impurezas en los oligonucleótidos).

Además, las secuencias de los enlazadores específicos fueron únicas para la proteína objetivo contra la cual se seleccionaron. Dos de los enlazadores descritos en la figura 41 (enlazador hVEGF # 3 y # 18) fueron probadas por su afinidad con respecto a hVEGF y mVEGF. Se obtuvieron datos BIAcore de acuerdo con Chen y asociados al., J. Mol Biol. (1999), 293(4):865-81. En síntesis, las afinidades de enlace del enlazador hVEGF # 3 y # 18 para hVEGF y mVEGF se calcularon a partir de las constantes de rango de asociación y disociación medidas utilizando el sistema de resonancia de plasmón de superficie BIAcore™-3000 (BIAcore, Inc., Piscataway, NJ). Se activó un chip biosensor para el acoplamiento covalente de VEGF, utilizando clorhidrato de N-etiIo-N'-(3-dimetilaminopropilo)-carbodiimida (EDC) y N-hidroxisuccinimida (NHS) de acuerdo con las instrucciones del proveedor (BIAcore, Inc., Piscataway, NJ). hVEGF o mVEGF fue intercambiado por regulador en acetato de sodio 10 mM, pH 4.8 y diluido a aproximadamente 30 mg/ml. Se inyectaron aliquotas de VEGF en un rango de flujo de 2 microL/minuto para lograr aproximadamente de 200 a 300 unidades de respuesta (RU) de la proteína acoplada. Se inyectó una solución de 1 de etanolamina como un agente de bloqueo. Para medidas cinéticas, se inyectaron diluciones en serie de dos veces de Fab en regulador PBS/Tween (0.05% de Tween 20 en solución salina regulada por fosfato) a una temperatura de 25°C en un rango de flujo de 10 microL/minuto. Se calcularon las constantes de disociación de equilibrio, valores Kd de las medidas de resonancia de plasmón de superficie como kofí/k0„. Los datos BIAcore™ se resumen a continuación .

Ejemplo 11 - Anticuerpos YS Anti-VEGF adicionales Construcción y clasificación de biblioteca. Se utilizó un fagémido diseñado para desplegar Fab4D5 bivalente en la superficie del bacteriófago M13, para construir bibliotecas tal como se describió anteriormente. Se utilizó mutagénesis dirigida a oligonucleótidos para reemplazar las posiciones CDR con codones de degeneración TMT, (M = A/C en proporciones iguales). Las posiciones elegidas para aleatorización fueron como se indica a continuación: En CDR-H3, las posiciones de la 95 a la 100a fueron reemplazadas con lazos aleatorios de todas las posibles longitudes que fluctúan de 7 a 20 residuos (biblioteca A) o de 7 a 15 residuos (biblioteca B). Cada biblioteca contenía ~1010 miembros únicos, y por lo tanto, las diversidades de bibliotecas reales fueron comparables con el número máximo de secuencias únicas codificadas por los diseños de bibliotecas (4 x 109). Los fagos de las bibliotecas fueron reciclados a través de vueltas de selección de enlace con antígeno inmovilizado en inmunoplacas Maxisorp de 96 depósitos (NUNC) como el objetivo de captura, tal como se describió previamente (Sidhu, S.S., y asociados, (2000) Methods Enzymol, 328:333-363). Después de 5 vueltas de selección, los fagos fueron producidos a partir de clones individuales crecidos en un formato de 96 depósitos y los sobrenadantes del cultivo se utilizaron en ELISAs de fago para detectar los clones de enlace específico. Los clones de enlace específico se determinaron para hacer Fab-fago que enlazaron al antígeno de cognato pero no exhibieron enlace detectable a otras 7 proteínas. ELISA de fago competitivo. Se utilizó un ensayo ELISA de fago modificado para estimar las afinidades de enlace de Fabs (Sidhu, (2000), supra; Deshayes, H., y asociados, (2000) Chem. Biol.. 9:495-505). Los ensayos ELISA de fagos se llevaron a cabo sobre placas recubiertas con antígeno tal como se describió anteriormente. Los fragmentos de anticuerpo de despliegue de fagos fueron diluidos en serie en PBS, 0.5% (p/v) BSA, 0.1% (v/v) Tween 20, y el enlace se midió para determinar una concentración de fagos proporcionando ~50% de la señal en saturación. Se incubó previamente una concentración de sub-saturación fija durante 2 horas con diluciones en serie de antígeno y posteriormente se transfirieron a placas de ensayo recubiertas con antígenos. Después de 15 minutos de incubación, las placas se lavaron con PBS 0.05% Tween 20 y se incubaron 30 minutos con conjugado de peroxidasa de rábano/anticuerpo anti-M13 (dilución 1:5000) (farmacia). Las placas se lavaron, desarrollaron con substrato TMB (Kirkegaard y Perry Laboratories), se extinguieron con 1.0 M H3PO4, y se leyeron en forma espectrofotométrica a 450 nm. Las afinidades de enlace de los Fabs se determinaron como valores IC50 definidos como la concentración de antígenos que bloquearon el 50% del enlace de fagos al antígeno inmovilizado. La secuenciación de ADN de 184 clones de enlace reveló 63 secuencias únicas mostradas en la figura 42. De manera interesante, los clones de la biblioteca B exhiben homología dentro de las secuencias VDR-L3 y CDR-H3 seleccionadas. En contraste, las secuencias CDR-H3 de los clones de la biblioteca A, exhiben homología entre sí, aunque son muy diferentes a las secuencias de la biblioteca B. Por lo tanto, parece que la naturaleza de la secuencia CDR-L3, tiene influencia en la selección de las secuencias CDR-H3, y como resultado, surgen dos clases distintas de anticuerpos anti-hVEGF a partir de las dos diferentes bibliotecas. Los clones fueron seleccionados mediante ELISA de fago competitivo y exhibieron valores IC50 que fluctúan de aproximadamente 60 nM a más de 5 µ?. Purificación de proteína y análisis de afinidad. Los tres clones anti-hVEGF con las afinidades más altas estimadas (las tres secuencias superiores de la figura 42), se purificaron en la forma de proteínas Fab libres. Las proteínas Fab fueron purificadas a partir de E. coli tal como se describió previamente (Muler, Y. A. y asociados, (1998) Structure 6:1153-1167), Ver figura 43 para secuencia Fab YS1. Las cinéticas de enlace de los Fabs purificados (designados Fab YS1, Fab YS2 y Fab YS3) se estudiaron mediante resonancia de plasmón de superficie. Las cinéticas de enlace se determinaron mediante resonancia de plasmón de superficie utilizando BIAcore™-3000 con hVEGF inmovilizado en los chips C 5 -500 unidades de respuesta tal como se describió previamente (Chen Y. y asociados al., (1999) J. Mol Biol., 293(4):865-881 ). Las diluciones en serie de las proteínas Fab fueron inyectadas, y se corrigieron las respuestas de enlace mediante substracción de respuestas en una célula de flujo en blanco. Para análisis cinético, se utilizó un modelo Langmuir 1:1 de ajustes globales de kon y k0ff. Los valores kü se determinaron a partir de las proporciones de kon y koff.

Fab-YS1 exhibió la mayor afinidad para hVEGF (kd = 60 nM), en tanto que los otros dos Fabs enlazaron aproximadamente 5 veces menos debido a los fuera-de rango más rápidos. Las secuencias de Fab YS1 y Fab YS2, difieren únicamente en tres posiciones, y por lo tanto, estas tres diferencias se toman en cuenta para la afinidad mejorada de YS1 en comparación con YS2.

Inmunohistoquímica. Investigamos la especificidad de Fab-YS1, utilizando la proteína para visualizar VEGF en células de mamífero transfectadas con un gen que codifica VEGF fusionado a proteína de fluorescencia verde (GFP). Las células A673 de humano que expresan VEGF-GFP de múrido fueron teñidas y se generó su imagen, tal como se describe (Peden, A. A., y asociados, (2004) J. Cell. Biol.. 164:1065- 076). En el panel VEGF plus, se incubó previamente Fab-YS1 durante 5 minutos con un exceso de 5 veces de VEGF recombinante antes de ser incubado con las células. La tensión inmunohistoquímica con Fab-YS1 traslapó en forma precisa con la señal de fluorescencia a partir de la fusión VEGF-GFP (datos no mostrados). Además, la señal fue completamente bloqueada incubando Fab-YS1 con hVEGF antes de la tinción. Inmunoprecipitación. También llevamos a cabo inmunoprecipitaciones de hVEGF endógeno y se comparó el desempeño de Fab-YS1 con el del anticuerpo monoclonal anti-hVEGF natural altamente específico (A4.6.1) (Kim, K.J., y asociados, (1992) Growth Factors 7:53-64). Las células A673 se etiquetaron en forma metabólica y se llevaron a cabo inmunoprecipitaciones a partir del medio, tal como se describe (Kim K.J. y asociados, supra) utilizando 15 g de anticuerpo policlonal anti-GFP (Clontech), Fab-YS1 o anticuerpo monoclonal A4.6.1. Se eluyeron complejos inmune mediante ebullición y se resolvieron mediante SDS-PAGE en un gel de acrilamida al 14% bajo condiciones de reducción. El gel se secó y posteriormente se expuso durante la noche a una placa de fosfogeneración de imagen. Ambos anticuerpos inmunoprecipitaron un grupo de bandas idéntico, que probablemente representa las variantes hVEGF generadas mediante división de mARN alternativo (datos no mostrados). Tomados en conjunto, estos resultados muestran que Fab-YS1 enlaza a hVEGF con alta afinidad y con una especifidad comparable a la de un anticuerpo natural, incluso en el milieu celular complejo. Ejemplo 12 - actividades in vivo de los anticuerpos anti-VEGF G6-23 inhibe el crecimiento y supervivencia de ratón neonato. Se inyectaron ratones recién nacidos (C57/BL6) en forma intra-peritoneal (i.p.) un día después del nacimiento con G26-23 IgG (50mg/hg) o Flt-1 (1 -3) Fe (50mg/kg), o controles adecuados, gp 120-Fc, PBS o no se inyectaron. Los pesos corporales se midieron diariamente y se contó el rango de supervivencia de los ratones. Tal como se muestra en la figura 10, G6-23 redujo el peso corporal en forma potencialmente igual que Flt-1 ( -3)Fc, el cual es un antagonista mVEGF conocido. Además, ios rangos de supervivencia de ratón también fueron equivalentes entre los dos grupos. En forma significativa, los resultados de G6-23 indicaron en forma específica que mVEGF fue requerido para el crecimiento y supervivencia de ratones recién nacidos, en tanto que el efecto de Flt-1(1-3)Fc es menos específico ya que se sabe que bloquea no únicamente mVEGF, sino también el factor de crecimiento de placenta (PLGF) y VEGF-B. G6-23 inhibe en forma efectiva el crecimiento de tumores de xenoinjerto en ratones rasurados. KM12 y SW480, dos líneas celulares de cáncer colo-rectal de humano, se crecieron en un cultivo celular primero, y aproximadamente a 106 células de cada línea celular se inyectaron en ratones rasurados huésped. Cuando el tumor alcanzó aproximadamente un tamaño de 100mm3 (una semana después de la inyección), se inyectaron G6-23 ó control (10 mg/kg) dos veces a ia semana (se utilizaron seis ratones rasurados por cada grupo). Los tamaños de tumor se midieron aún hasta el día 13 después de la inyección de anticuerpos. Tal como se muestra en la figura 11, G6-23 fue significativamente efectivo para reducir volúmenes de líneas celulares tanto de KM12 (gráfica izquierda) como de SW480 (gráfica derecha). Las expresiones genéticas tanto de hVEGF como de mVEGF fueron examinadas en ratones de xenoinjerto KM12. Las muestras de tumores y tejidos circundantes fueron extraídas y se utilizó Tagman para cuantificar los niveles de expresión genética. En estos modelos de xenoijerto, el hVEGF vino de las células de tumor K 12 de humano implantadas, en tanto que mVEGF, vino de las células estromales del huésped circundantes. Tal como se muestra en la figura 12, las muestras de los ratones tratados con G6-23 en el día 3 y en el día 13, tuvieron mayores niveles de expresión genética tanto para hVEGF como para mVEGF en comparación con grupos de control. Los resultados indican que aunque los ratones tratados con G6-23 tuvieron un crecimiento de tumor reducido y una vascularidad muy disminuida, las expresiones tanto de mVEGF como de hVEGF fueron activadas en respuesta a la reducción de angiogenesis. Esto también indica que en el sitio de tumor, existe una infiltración significativa de células estromales de ratón, las cuales son una fuente importante de VEGF para la angiogenesis de tumor. Por consiguiente, para estudiar la eficacia en un modelo animal preclínico, tal como el modelo de xenoinjerto aquí descrito, es necesario un anticuerpo con la capacidad de reaccionar en forma cruzada y bloquear tanto hVEGF, y mVEGF. También se utilizaron células de carcinoma de pulmón (LL2) de ratón (Lewis) en un modelo de ratón desprotegido para probar el efecto inhibidor de G6-23. Se administraron aproximadamente 106 células, de células LL2 en una formulación de matrigel en forma subcutánea en el flanco de ratones rasurados de 5 semanas de edad. Posteriormente se trataron 6 ratones con G6-23 a 10 mg/Kg, se inyectaron mediante i.p. dos veces a la semana abarcando un total de 19 días. Otros agentes de control (por ejemplo, mFlt(1-3)-IgG, rag 10) también se utilizaron para tratar grupos de seis ratones. Tal como se muestra en la figura Í3, G6-23 redujo en forma significativa el rango de crecimiento de tumor con un efecto farmacológico comparable con el de mFlt(1-3)-IgG, el cual es conocido por ser multipotente para bloquear no únicamente mVEGF sino también otros factores angiogénicos mPLGF y VEGF-B. Los niveles de suero de G6-23 bioactivo, también fueron medidos. El resultado indica que sus niveles (62-121 ug/ml) también están dentro del rango esperado de un anticuerpo anti-VEGF de neutralización terapéutica. También se utilizaron células HM-7 (Recolección del Cultivo Tipo Americano) para estudiar la inhibición de crecimiento de tumor en ratones rasurados. Se expresaron el anticuerpo G6 IgG, anticuerpo G6-31 IgG, el anticuerpo Avastin™, el anticuerpo Y0317 IgG utilizados en este estudio, y se purificaron a partir de células CHO. Las células HM-7 se mantuvieron en cultivo con medio F 2 : DM EM, suplementado con 10% FBS y 1% de penicilina-estreptomicina y 1% de glutamina. Se crecieron células a una temperatura de 37°C en 5% de C02 hasta la confluencia, se recolectaron, se contaron y se lavaron y resuspendieron en Metrigel estéril a una concentración 25x106 células por mi. Los xenoinjertos se establecieron en ratones XID rasurados hembra color beige de 4 a 6 semanas de edad inyectando 5x106 de células cultivadas HM-7 en el flanco dorsal de los ratones y se dejaron crecer. Después de 48 horas, los tumores fueron palpables en todos los ratones, y los cohortes fueron seleccionados en forma aleatoria (n = 10) para proporcionar controles de día-0. Los ratones restantes se dividieron en 23 grupos y se inyectaron 2 veces a la semana con anticuerpos anti-VEGF diferentes. Los tratamientos para los grupos de estudio son como se indican a continuación: Grupo A (n = 10x1): ratones tratados con MAB de anticuerpo de control (un anticuerpo anti-ambrosia) en 0.1 mi mediante inyección intraperitoneal dos veces/semana con una alta dosis (5 mg/kg). Grupo B (n = 10x5): ratones tratados con anticuerpo G6 IgG en 0.1 mi mediante inyección intraperitoneal dos veces/semana con la misma dosis (0.1, 0.25, 0.5, 2 ó 5 mg/kg). Grupo C (n = 10x5): ratones tratados con anticuerpo Y0317 en 0.1 mi mediante inyección intraperitoneal dos veces/semana con la misma dosis (0.1, 0.25, 0.5, 2 ó 5 mg/kg). Grupo D (n = 10x5): ratones tratados con el anticuerpo Avastin™ en 0.1 mi mediante inyección intraperitoneal dos veces/semana con la misma dosis (0.1, 0.25, 0.5, 2 ó 5 mg/kg). Grupo E (n = 10x5): ratones tratados con anticuerpo G6 31 IgG en 0.1 mi mediante inyección intraperitoneal dos veces/semana con la misma dosis (0.1, 0.25, 0.5, 2 ó 5 mg/kg). Los ratones (n = 10 animales de control y tratados) se exterminaron en los días 4, 7, 11, 14, 17 y 21 después del inicio de las inyecciones, y los tumores fueron cortados y pesados. Los resultados muestran que hubo una supresión significativa de crecimiento de tumor cuando se administraron anticuerpos G6, G6-31, Y0317 y Avastin™ y (p<0.5) (Figuras 33A-E). Los tejidos cortados de los ratones tratados con anticuerpo anti-VEGF, fueron más pequeños de tamaño y menos vascularizados en comparación con los tumores cortados de los ratones control. Tal como se describió anteriormente, el anticuerpo G6 y el G6-23 a diferencia del anticuerpo Avastin™ y el anticuerpo Y0317, pueden enlazar a VEGF de humano y VEGF de ratón, incluyendo VEGF estromal de ratón el cual puede ser activado al momento del implante de tumores colo-rectales de humano en modelos de ratón. La comparación directa de la actividad de los anticuerpos G6 y G6-31, en donde los anticuerpos enlazan epítopes similares, indica que la mayor parte de los puntos de datos del anticuerpo con la mayor afinidad para VEGF-A, el anticuerpo G6-31, tuvo propiedades incrementadas de inhibición de crecimiento del tumor.

Claims

R E I V I N D I C A C I O N E S 1. Un anticuerpo con la capacidad de enlazar a VEGF de ratón y VEGF de humano con valores Kd 10 veces mayor con respecto al otro, y con la capacidad de inhibir el enlace de VEGF a un receptor VEGF. 2. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el anticuerpo tiene la capacidad de enlazar a un mutante VEGF G88A con un valor Kd 10 veces mayor al valor Kd del VEGF de humano no mutado. 3. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el anticuerpo tiene la capacidad de enlazar a un mutante VEGF G88A de humano con un valor Kd que es 10nM o menos. 4. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el anticuerpo contacta a no más del 80% del área de superficie de G88 de VEGF humano. 5. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el receptor es un receptor VEGF 2 (KDR). 6. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el receptor es un receptor VEGF 1 (Flt-1). 7. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el anticuerpo tiene la capacidad de inhibir el enlace de VEGF al receptor VEGF 1 y el receptor VEGF 2. 9. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el anticuerpo enlaza a VEGF de ratón y de humano con valores Kd de 10 nM o menos. 10. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el anticuerpo enlaza a VEGF de humano y de ratón con valores Kd de 2 nM o menos. 11. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el anticuerpo enlaza a VEGF de humano con un en-rango (kon) de 1.0 ó más (10 M"1 S"1). 12. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el anticuerpo enlaza a las 20 hélices de VEGF. 13. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el anticuerpo enlaza a los 80 lazos de VEGF. 14. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el anticuerpo enlaza a las 20 hélices y 80 lazos de VEGF. 15. El anticuerpo de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 11, caracterizado porque el anticuerpo tiene un epítope funcional que comprende el residuo F17 de VEGF de humano. 16. El anticuerpo de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 11, caracterizado porque el anticuerpo tiene un epítope funcional que comprende los residuos F17 y 183 de VEGF humano. 17. El anticuerpo de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 11, caracterizado porque el anticuerpo tiene un epítope funcional que comprende los residuos F17, 183 y Q89 de VEGF humano. 18. El anticuerpo de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 11, caracterizado porque el anticuerpo tiene un epítope funcional que comprende los residuos F17, y M18 de VEGF humano. 19. El anticuerpo de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 11, caracterizado porque el anticuerpo tiene un epítope funcional que comprende los residuos F17, M18 y 189 de VEGF humano. 20. El anticuerpo de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 11, caracterizado porque el anticuerpo tiene un epítope funcional que comprende los residuos F17, Y21 y Y25 de VEGF humano. 21. El anticuerpo de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 11, caracterizado porque el anticuerpo tiene un epítope funcional que comprende los residuos F17, Y21, Q22, Y25, D63 y 183 de VEGF humano. 22. El anticuerpo de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 11, caracterizado porque el anticuerpo tiene un epítope funcional que comprende los residuos F17, Y21, Y25 y Q89 de VEGF humano. 23. El anticuerpo de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 11, caracterizado porque el anticuerpo tiene un epítope funcional que comprende los residuos F17, 18, D19, Y21, Y25, Q89, 191, K101, E103 y C104 de VEGF humano. 24. El anticuerpo de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 11, caracterizado porque el anticuerpo tiene un epítope funcional que comprende los residuos F17, Y21, Q22, Y25, D63, 183 y Q89 de VEGF humano. 25. El anticuerpo de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 11, caracterizado porque el anticuerpo tiene un epítope funcional que comprende una combinación de cualesquiera de los residuos seleccionados del grupo que consiste en F17, M18, Y21, Q22, Y25, K48, D63, L66, 183, H86, Q89, 191, C104 y P106 de VEGF humano. 26. El anticuerpo de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 11, caracterizado porque el anticuerpo tiene un epítope funcional que comprende los residuos F17, 18, Y21, Q22, Y25, K48, D63, L66, 183, H86, Q89, 191, C104 y P106 de VEGF humano. 27. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado porque el anticuerpo comprende un CDR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos contigua X1X2FX4X5X6X7, en donde X2 es V o A; X4 es F o Y; X5 es L o A; X6 es P o A; y X7 es Y o F. 28. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 27, caracterizado porque el CDR-H2 comprende una secuencia de aminoácidos contiguo a GX2TPX5G, en donde X2 es un aminoácido hidrofóbico I o V o algún otro; y X5 cualquier residuo de aminoácidos. 29. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 28, caracterizado porque el CDR-H1 comprende una secuencia de aminoácidos contiguo a XiXaXazlH, en donde Xi es cualquier residuo de aminoácidos; X2 es Y o F; y X3 es W o L. 30. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el anticuerpo comprende la secuencia CDR-H3 de cualesquiera de los anticuerpos de las figuras 7, 24-29 y 34-43. 31. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el anticuerpo comprende una región variable que comprende una secuencia de cualesquiera de los anticuerpos de las figuras 7, 24-29 y 34-43. 32. Un anticuerpo que comprende la secuencia CDR-H1, la secuencia CDR-H2, y la secuencia CDR-H3 de conformidad con cualesquiera de los anticuerpos de las figuras 7, 24-29 y 34-43. 33. Un anticuerpo que comprende una región variable que comprende una secuencia que se describe en cualesquiera de los anticuerpos de las figuras 7, 24-29 y 34-43. 34. El anticuerpo de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 15 y de la 27 a la 30, caracterizado porque comprende además las regiones de estructura del anticuerpo G6. Un anticuerpo que comprende (a) un CDR-L1 que comprende la secuencia aminoácidos contigua X1X2X3 4 5L, en donde: X! y X2 son cualquier aminoácido; Ya sea X3 ó X4 o tanto X3 como X4 sor R; X5 es S o A. (b) un CDR-L2 que comprende una secuencia de aminoácidos contigua ?t?2?3 en donde: Xi es S o A o G; y X2 y X3 son cualquier residuo de aminoácidos. (c) un CDR-L3 que comprende una secuencia de aminoácidos contigua SXTX2X3 L en donde: i y X2 son cualquier residuo de aminoácidos; y X3 es S o A. 36. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 35, caracterizado porque el anticuerpo comprende las regiones de estructura del anticuerpo B20-4.1. 37. El anticuerpo de conformidad con las reivindicaciones de la 27 a la 36, caracterizado porque el anticuerpo enlaza a VEGF de humano y VEGF de ratón con valores Kd en 10 dobleces entre sí. 38. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal. 39. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado porque el anticuerpo es un anticuerpo biespecífico. 40. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el anticuerpo es un anticuerpo sintético. 41. Un anticuerpo sintético con la capacidad de enlazar hVEGF con un valor Kd no mayor a aproximadamente 2 nM. 42. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 41, caracterizado porque el valor Kd es no mayor a aproximadamente 1 nM. 43. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 42, caracterizado porque el valor Kd es no mayor a aproximadamente 500 pM. 44. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 43, caracterizado porque tiene la capacidad de enlazar a un VEGF a partir de una especie de mamífero no humano con un valor Kd que está dentro de 10 dobleces del valor Kd para el enlace de hVEGF. 45. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 44, caracterizado porque el VEGF de un mamífero no humano es VEGF de múrido. 46. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado porque comprende al menos un CDR variante que tiene un aminoácido variante en al menos una posición accesible de solvente y una posición de aminoácido altamente diversa, en donde al aminoácido variante está codificado por un grupo de codón no aleatorio, y en donde al menos el 70% de los aminoácidos codificados por el grupo no aleatorio son aminoácidos objetivo para dicha posición en dominios variables de anticuerpos conocidos. 47. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 46, caracterizado porque tiene un dominio variable de cadena pesada que comprende al menos 1, 2 ó 3 CDRs variantes seleccionados del grupo que consiste en CDR H1 , H2 y H3. 48. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 47, caracterizado porque el dominio variable de cadena pesada comprende una variante CDR H3. 49. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 47, caracterizado porque comprende la siguiente secuencia de aminoácidos como su dominio variable de cadena pesada (VH) y un primer dominio constante de cadena pesada (CH1): EVQLVESGGGLVQPGGSLRSCAASGFTISDYWI HWVRQA PGKGLE WVAG ITPAGG YTYYADS VKG RFTI SADTSKNTAYLQM NSLRAEDTAVYYCARFVFFLP YAM DYWGQGTLVTVSSASTKGP S VFPLAPSS KSTSGGTAALGCLVKDYFPEP VTVSWNSG ALTSG VHTFPAVLQSSGLYSLSS VVTVPSSSLGTQTYICN VNHKPSNTK VDKKVEPKSCDKTH (SEQ ID NO. 29). 50. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 24, caracterizado porque comprende además después de su secuencia de aminoácidos en la forma de su cadena ligera: DIQMTQSPSSLS ASVGDRVTITCRASQDVSTAVAWYQQK PGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDF ATYYCQQSYTTP PTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFI FPPSDEQL S GTAS VVCLLNNFYPREAKVQWKVD ALQSGNSQESVTEQDSK DSTYSLSSTLTLSKAD YEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRG EC (SEQ ID NO. 28). 51. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 21, caracterizado porque tiene un dominio variable de cadena ligera que comprende al menos 1, 2 ó 3 CDRs variantes seleccionados del grupo que consiste en CDR L1 , L2 y L3. 52. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 49, caracterizado porque comprende después de la secuencia de aminoácidos en la forma de su cadena ligera: DIQMTQSPSSLS AS GDRVTITCRASQDVSTAVAWYQQK PGKAPKLLI YSAS FLYSG VPSRFSGSGSGTDFTLTI SSLQPEDF ATYYCKQG YAN PWTFGQGTKVEI KRTVAAPSVF I FPPS DEQLK SGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQES VTEQDS KDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNR G EC (SEQ ID NO. 30). 53. Un método para seleccionar un anticuerpo hVEGF a partir de una biblioteca de anticuerpos sintéticos, que comprende: a) generar la biblioteca de anticuerpos sintéticos teniendo una diversidad designada en al menos uno de los CDRs; b) contactar la biblioteca con un hVEGF para formar enlazadores; c) separar los enlazadores de los no enlazadores y extraer con solventes los enlazadores de hVEGF objetivo e incubar los enlazadores en una solución con cantidades en disminución del hVEGF objetivo en una concentración desde 0.1 nM hasta 1000 nM; y d) seleccionar los enlazadores que pueden enlazar a la concentración más baja del VEGF objetivo y que tienen una afinidad aproximadamente 500 pM a 2 nM. 54. El ácido nucléico aislado que codifica el anticuerpo de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 50. 55. Un vector que comprende el ácido nucléico de conformidad con la reivindicación 54. 56. Una célula huésped transformada con el vector de conformidad con la reivindicación 56. 57. Un proceso para producir un anticuerpo que comprende cultivar la célula huésped de conformidad con la reivindicación 56, de modo que se exprese el ácido nucléico. 58. El proceso de conformidad con la reivindicación 57, caracterizado porque comprende además recuperar el anticuerpo del cultivo de célula huésped. 59. El proceso de conformidad con la reivindicación 58, caracterizado porque el anticuerpo se recupera del medio de cultivo de la célula huésped. 60. Un método para utilizar el anticuerpo de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 52, para tratar un padecimiento asociado con angiogénesis patológica en un mamífero que necesita de dicho tratamiento, en donde el método comprende el paso de administrar el anticuerpo al mamífero. 61. El método de conformidad con la reivindicación 60, caracterizado porque el padecimiento es cáncer. 62. El método de conformidad con la reivindicación 61, caracterizado porque el cáncer es del grupo que consiste en cáncer de seno, cáncer colorectal, cáncer de pulmón de célula no pequeña, linfoma de no-Hodgkins (NHL), cáncer renal, cáncer de próstata, cáncer de hígado, cáncer de cabeza y cuello, melanoma, cáncer de ovario, mesotelioma y mieloma múltiple. 63. El método de conformidad con la reivindicación 62, caracterizado porque el tratamiento comprende además el paso de administrar un segundo agente terapéutico en forma simultánea o en secuencias con el anticuerpo. 64. El método de conformidad con la reivindicación 63, caracterizado porque el segundo agente terapéutico es un agente seleccionado del grupo que consiste en un agente anti-angiogénico, una composición anti-neoplástica, un agente quimioterapóutico y un agente citotóxico. 65. El método de conformidad con la reivindicación 64, caracterizado porque el agente anti-angiogénico es un anticuerpo anti-hVEGF con la capacidad de enlazar al mismo epítope VEGF que el anticuerpo A4.6.1. 66. Un método para tratar a un mamífero que padece de, o que está en riesgo de desarrollar un padecimiento inflamatorio o inmune que comprende el paso de tratar el mamífero con un anticuerpo Fab de cualesquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 51. 67. El método de conformidad con la reivindicación 66, caracterizado porque el padecimiento inflamatorio o inmune es artritis reumatoide. 68. El método de conformidad con la reivindicación 66, caracterizado porque el anticuerpo Fab es un anticuerpo serie G6. 69. El método de conformidad con la reivindicación 66, caracterizado porque el anticuerpo Fab es un anticuerpo serie B20. R E S U M E Se describen anticuerpos anti-VEGF y variantes de los mismos, incluyendo aquellos que tienen alta afinidad para enlazar a la VEGF. También se proporcionan métodos para utilizar tecnología de despliegue de fagos con bibliotecas naíve para generar y seleccionar los anticuerpos anti-VEGF con enlace deseado y otras actividades biológicas. También se contempla en forma adicional usos de los anticuerpos sintéticos en investigación, aplicaciones de diagnóstico y terapéuticas.