KR20220100883A - 환자 샘플의 질량분석법 측정을 위한 베타-락탐 항생제의 유도체화 - Google Patents

환자 샘플의 질량분석법 측정을 위한 베타-락탐 항생제의 유도체화 Download PDF

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KR20220100883A
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하스톤 휘베르튀스 마리아 폰덴호프
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에프. 호프만-라 로슈 아게
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Abstract

본 발명은 항생제 분석물의 유도체화 및 수득된 샘플 중의 유도체화된 항생제 분석물의 양 또는 농도를 결정하는 방법에 관한 것이다.

Description

환자 샘플의 질량분석법 측정을 위한 베타-락탐 항생제의 유도체화
본 발명은 항생제 분석물의 유도체화 및 수득된 샘플 중의 유도체화된 항생제 분석물의 양 또는 농도를 결정하는 방법에 관한 것이다.
배경
β-락탐 항생제는 박테리아에 감염된 환자에게 특정 또는 광범위 항생제로 가장 일반적으로 처방되는 항생제의 부류이다. 이 부류의 항생제는 그람 양성 박테리아에서 가장 우세한 펩티도글리칸 층의 가교를 방해함으로써 작용한다. 이들은 농도에 의존하는 살균 효과를 나타낸다. 따라서 항생제 농도를 MIC 위로 유지하는 것이 중요하다. 그러나 더 높은 농도는 부작용을 유발한다. 더욱이, 이러한 화합물의 약동학은 매우 가변적이므로 예측 불가능한 것으로 보고되었다 (Ronilda D'Cunha et al.; 2018; Antimicrobial Agents and Chemotherapy 62 (9)).
이러한 항생제의 작용 메커니즘은 4-원 β-락탐 고리를 D-알라닐-D-알라닐-트랜스펩티데이스와 반응시켜, 외부 세포벽의 펩티도글리칸 중합체 사이의 가교 형성을 억제하는 것이다.
따라서 상대적으로 불안정한 락탐 모이어티가 이러한 항생제의 작용 메커니즘을 담당한다. 그러나, 이러한 불안정성은 또한 양성자성 용매에 용해될 때 이러한 화합물의 부분적 가수분해를 유발한다. 더욱이 가수분해는 자연적으로 산 또는 염기의 존재에 의해 더욱 촉매화되고 상승된 온도로써 향상된다. 명백하게, 가수분해된 항생제는 더 이상 박테리아 성장을 억제할 수 있는 활성 화합물이 아니다.
치료 약물 모니터링(Therapeutic Drug Monitoring, TDM)은 신체의 약물 농도를 모니터링하기 위해 인간 샘플 물질에서 약물을 정량화하는 것을 목표로 하는 의학 분야이다. 치료 약물 모니터링(TDM) 분야에서 β-락탐 불안정성을 연구하고 해결하기 위한 상당한 노력이 있었으며, 주로 화합물을 천연 (즉 가수분해되지 않은) 형태로 유지하는 것을 목표로 하는 보관 조건에 중점을 둔다 (Zander et al.; 2016; Clinical Chemistry and Laboratory Medicine; 54(2)). 환자 샘플링(예를 들어 혈액 수집) 후에도 가수분해가 계속되므로, 환자의 천연 β-락탐 항생제의 정확한 농도를 얻는 것은 현재 매우 어렵다. 항생제 농도를 주의 깊게 모니터링하는 것이 중요하기 때문에, 인간 및 동물 매트릭스로부터 이러한 화합물을 정량화하는 유효하고 안정적인 방법이 필요하다.
발명의 요약
제1 양태에서, 본 발명은 다음 단계를 포함하는 수득된 샘플 중의 하나 이상의 유도체화된 항생제 분석물의 양 또는 농도를 결정하는 (자동화된) 방법에 관한 것이다
a) 선택적으로, 특히 자기 비드를 사용하여, 샘플을 전처리 및/또는 농축하는 단계, 및
b) 샘플 중의 하나 이상의 항생제 분석물의 양 또는 농도를 결정하는 단계.
제2 양태에서, 본 발명은 다음 단계를 포함하는 수득된 샘플 중의 하나 이상의 항생제 분석물의 양 또는 농도를 결정하는 (자동화된) 방법에 관한 것이다
a) 샘플을 유도체화 시약으로 전처리하는 단계, 여기서 유도체화 시약은 친핵체를 포함함,
b) 선택적으로, 특히 자기 비드를 사용하여, 단계 a) 후 수득된 샘플을 농축하는 단계, 및
c) 단계 a) 후 또는 선택적인 농축 단계 b) 후 수득된 전처리된 샘플 중의 하나 이상의 항생제 분석물의 양 또는 농도를 결정하는 단계.
제3 양태에서, 본 발명은 제1 또는 제2 양태의 방법을 수행하기 위해 조정된 (자동화된) 분석 시스템(특히 LC/MS 시스템)에 관한 것이다.
제4 양태에서, 본 발명은 샘플 중의 하나 이상의 항생제 분석물을 안정화하기에 적합한 친핵성 유도체화 시약을 포함하는 환자 샘플 수집용 샘플링 튜브에 관한 것이다.
제5 양태에서, 본 발명은 샘플 중의 하나 이상의 항생제 분석물의 양 또는 농도 결정을 위한 친핵성 유도체화 시약의 용도에 관한 것이다.
제6 양태에서, 본 발명은 관심 샘플 중의 항생제 분석물을 안정화하기 위한 친핵성 유도체화 시약의 용도에 관한 것이다.
제7 양태에서, 본 발명은 친핵성 유도체화 시약에 의해 안정화된 항생제 분석물에 관한 것이다.
도 1: 피페라실린의 가수분해 경로의 개략도.
도 2: A) 천연 피페라실린(화합물 5); 및 B) 실온의 물에서 단일 가수분해된 피페라실린(9a 또는 9b)의 16 시간에 걸쳐 측정된 피크 면적. 신뢰 적합도와 F-검정이 나타난다. 명확성을 위해, 참조 선이 평균 면적 값을 통해 그려졌다.
도 3: 메로페넴과 여러 상이한 시약: A) 프로필아민; B) 부틸아민, C) 펜틸아민의 유도체화 반응의 개략도.
도 4. 피페라실린과 여러 상이한 시약: A) 프로필아민; B) 부틸아민, C) 펜틸아민의 유도체화 반응의 개략도.
도 5: 두 가지의 MRM 전이에 대해 실온의 물에서 이중 유도체화된 피페라실린(화합물 7)의 16 시간에 걸쳐 측정된 피크 면적. 신뢰 적합도와 F-검정이 나타난다. 명확성을 위해, 참조 선이 평균 면적 값을 통해 그려졌다.
도 6: 여러 상이한 반응 조건에서 시약 프로필아민, 부틸아민, 및 펜틸아민으로 유도된 메로페넴의 측정된 피크 면적.
도 7: 여러 상이한 반응 조건에서 시약 프로필아민, 부틸아민, 및 펜틸아민으로 유도된 피페라질린의 측정된 피크 면적.
도 8: 신호 대 농도의 도식적 표현이 나타난다. 이의 결과는 스파이킹된 농도가 실제 농도보다 높다는 것이며, 실시예 4에 나타나는 바와 같이 보정 오프셋이 실제 농도와 스파이킹된 농도의 차이에 기인한다.
도 9: 실시예 4에 나타난 바와 같은 순수 샘플과 네 가지 농도에 대한 혈청 샘플 간의 면적 비율의 차이.
도 10: 실시예 5의 정밀도 및 정확도 결과.
도 11: 실시예 5에 나타난 바와 같이 두 방법으로부터 상관관계 계산된 농도.
도 12: 실시예 5에 나타난 바와 같이 두 방법으로부터 상관관계 계산된 농도.
도 13: 실시예 5에 나타난 바와 같은 반복실험마다 두 방법 사이의 정확도 차이.
발명의 상세한 설명
본 발명이 아래에서 상세하게 설명되기 전에, 본 발명은 본원에 기재된 특정 방법, 프로토콜 및 시약이 다양할 수 있으므로 이들에 제한되지 않음을 이해해야 한다. 본원에서 사용된 용어는 단지 특정 구체예를 설명하기 위한 것이며, 첨부된 청구범위에 의해서만 제한될 본 발명의 범위를 제한하려는 의도가 아님을 또한 이해해야 한다. 달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 당업자가 일반적으로 이해하는 것과 동일한 의미를 갖는다.
본 명세서의 본문 전체에 여러 문서가 인용된다. 위 또는 아래에 관계 없이, 본원에 인용된 문서 각각은 (모든 특허, 특허 출원, 과학 간행물, 제조업체의 설명서, 지침 등을 포함) 그 전체가 본원에 참조로 포함된다. 그러한 포함된 참조의 정의 또는 교시와 본 명세서에서 인용된 정의 또는 교시가 상충하는 경우, 본 명세서의 본문이 우선한다.
이하에서, 본 발명의 요소가 설명될 것이다. 이들 요소는 특정 구체예와 함께 나열되지만, 추가의 구체예를 생성하기 위해 임의의 방식 및 임의의 수로 조합될 수 있음을 이해해야 한다. 다양한 설명된 예 및 바람직한 구체예는 본 발명을 명시적으로 설명된 구체예로만 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다. 이 설명은 명시적으로 설명된 구체예를 임의의 수의 개시된 및/또는 바람직한 요소와 조합하는 구체예를 지원하고 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 더욱이, 본 출원에서 설명된 모든 요소의 임의의 순열 및 조합은 문맥이 달리 지시하지 않는 한 본 출원의 설명에 의해 개시된 것으로 간주되어야 한다.
정의
단어 "포함하다(comprise)" 및 이의 변형, 예컨대 "포함한다(comprises)" 및 "포함하는(comprising)"은 언급된 정수 또는 단계 또는 정수들 또는 단계들의 군을 포함하지만 임의의 다른 정수 또는 단계 또는 정수들 또는 단계들의 군을 제외하지는 않는 것으로 이해될 것이다.
본 명세서 및 첨부된 청구범위에서 사용된 단수 형태 "a", "an" 및 "the"는 내용이 명백하게 다르게 지시하지 않는 한 복수의 지시 대상을 포함한다.
백분율, 농도, 양 및 기타 수치 데이터는 본원에서 "범위" 형식으로 표현되거나 제시될 수 있다. 그러한 범위 형식은 단지 편의성과 간결성을 위해 사용되므로 범위의 한계로서 명시적으로 언급된 수치 값을 포함할 뿐만 아니라, 각각의 수치 값 및 하위 범위가 명시적으로 언급된 것과 같이 그 범위 내에 모든 개별적인 수치 값 또는 하위 범위를 포함하는 것으로 유연하게 해석되어야 함을 이해해야 한다. 예시로서, "4% 내지 20%"의 수치 범위는 4% 내지 20%의 명시적으로 언급된 값을 포함할 뿐만 아니라, 표시된 범위 내의 개별적인 값 및 하위 범위도 포함하도록 해석되어야 한다. 따라서, 이 수치 범위에 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, … 18, 19, 20 %와 같은 개별 값 및 4-10 %, 5-15 %, 10-20% 등과 같은 하위 범위가 포함된다. 이 동일한 원칙은 최소값 또는 최대값을 언급하는 범위에 적용된다. 또한, 그러한 해석이 범위의 폭 또는 설명되는 특징에 관계없이 적용되어야 한다.
용어 "약"은 수치 값과 관련하여 사용될 때 표시된 수치 값 대비 5% 더 작은 하한을 갖고 표시된 수치 값 대비 5% 더 큰 상한을 갖는 수치 값을 포함함을 의미한다.
"측정", "측정하는" 또는 "결정하는"이라는 용어는 바람직하게는 정성적, 반정량적 또는 정량적 측정을 포함한다.
용어 "자동화"는 주로 자동 장비에 의해 작동되는, 즉 인간이 수행하는 작업의 양과 작업에 걸리는 시간을 감소시키기 위해 기계 또는 컴퓨터에 의해 작동되는 방법 또는 공정을 지칭한다. 따라서, 자동화 방법에서는, 이전에 인간에 의해 수행되었던 업무가 이제 기계 또는 컴퓨터에 의해 수행된다. 일반적으로, 사용자는 도구를 구성하고 공정을 정의하기만 하면 된다. 당업자는 일부 사소한 지점에서 수동 개입이 여전히 필요할 수 있지만 방법의 큰 확장이 자동으로 수행됨을 잘 알고 있다.
본 개시의 맥락에서, 용어 "분석물", "분석물 분자", 또는 "관심 분석물(들)"은 상호 교환적으로 사용되어 분석될 화학종을 지칭한다. 분석하기에 적합한 화학종, 즉 분석물은 살아 있는 유기체에 존재하는 임의의 종류의 분자일 수 있으며, 핵산, 아미노산, 펩타이드, 단백질, 지방산, 지질, 탄수화물, 스테로이드, 케토스테로이드, 세코스테로이드 분자를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 분석물은 또한 제한되는 것은 아니지만 치료 약물, 남용 약물, 독소 또는 이러한 물질의 대사산물과 같은 유기체에 의해 내재화된 임의의 물질일 수 있다. 치료 약물은 항생제, 즉 "항생제 분석물"을 포함한다. 항생제는 미생물 유기체에 대해 활성인 물질이다. 항생제는 일반적으로 작용 메커니즘, 화학 구조, 또는 활성의 스펙트럼에 기반하여 분류된다. 항생제의 한 부류는 β-락탐 항생제이다. β-락탐 항생제(베타-락탐 항생제)는 분자 구조에 베타-락탐 고리를 포함하는 모든 항생제이다. 이들은 페니실린 유도체(페남), 세팔로스포린(세펨), 모노박탐, 카바페넴 및 카바세펨을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 대부분의 β-락탐 항생제는 박테리아 유기체에서 세포벽 생합성을 억제하여 작용하며 가장 널리 사용되는 항생제 그룹이다. 이러한 항생제의 효과는 PBP에 온전하게 도달하는 능력과 페니실린 결합 단백질(PBP)에 결합하는 능력에 의존한다.
분석물은 관심 샘플, 예를 들어 생물학적 또는 임상 샘플에 존재할 수 있다. 용어 "샘플" 또는 "관심 샘플"은 본원에서 상호 교환적으로 사용되고, 조직, 기관 또는 개체의 전체를 나타내도록 의도된, 전형적으로 상기 조직, 기관 또는 개체보다 작은 조직, 기관 또는 개체의 일부 또는 부분을 지칭한다. 샘플을 분석하면 이는 조직 상태 또는 기관 또는 개체의 건강 또는 질병 상태에 대한 정보를 제공한다. 샘플의 예는 혈액, 혈청, 혈장, 활액, 척수액, 소변, 타액, 및 림프액과 같은 유체 샘플, 또는 건조된 혈반 및 조직 추출물과 같은 고체 샘플을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 샘플의 추가 예는 세포 배양물 또는 조직 배양물이다.
본 개시의 맥락에서, 상기 샘플은 "개체" 또는 "대상체"로부터 유래될 수 있다. 전형적으로, 대상체는 포유류이다. 포유류는 가축(예컨대, 소, 양, 고양이, 개, 및 말), 영장류(예컨대, 인간 및 원숭이와 같은 비인간 영장류), 토끼, 및 설치류(예컨대, 마우스 및 래트)를 포함하지만 이에 제한되지는 않는다.
분석되기 전에, 샘플은 샘플- 및/또는 분석물 특이적 방식으로 전처리될 수 있다. 본 개시의 맥락에서, 용어 "전처리"는 원하는 분석물의 후속 분석을 허용하는 데 요구되는 임의의 조치를 지칭한다. 전처리 조치는 전형적으로 고체 샘플의 용출(예를 들어 건조 혈반의 용출), 전혈 샘플에 용혈 시약(hemolizing reagent, HR)의 첨가, 및 소변 샘플에 효소 시약의 첨가를 포함하지만 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 내부 표준물질(internal standard, ISTD)의 첨가가 샘플의 전처리로 간주된다.
전형적으로, 내부 표준물질(ISTD)은 질량 분광 검출 워크플로우(즉, 임의의 전처리, 농축 및 실제 검출 단계를 포함)를 거칠 때 관심 분석물과 유사한 특성을 나타내는 알려진 양의 물질이다. 비록 상기 ISTD가 관심 분석물과 유사한 특성을 나타내지만, 이는 여전히 관심 분석물과 명확하게 구별 가능하다. 예시된 기체 또는 액체 크로마토그래피와 같은 크로마토그래피 분리 동안, ISTD는 샘플로부터의 관심 분석물과 거의 동일한 체류 시간을 갖는다. 따라서, 분석물 및 ISTD가 모두 질량 분석계에 동시에 들어간다. 하지만, ISTD는 상기 샘플로부터의 관심 분석물과 상이한 분자 질량을 나타낸다. 이는 상이한 질량/전하(m/z) 비율에 의해 ISTD로부터의 이온과 분석물로부터의 이온 사이의 질량 분광 구분을 허용한다. 둘 모두 단편화를 거치고 딸 이온을 제공한다. 이러한 딸 이온은 이들의 m/z 비율에 의해 서로 그리고 각각의 모이온으로부터 구별될 수 있다. 결과적으로, 보정 후, ISTD 및 분석물로부터의 신호에 대한 별개의 측정 및 정량화가 실시될 수 있다. ISTD가 공지된 양으로 첨가되었기 때문에, 샘플로부터의 분석물의 신호 강도는 분석물의 특정 정량적 양에 기인할 수 있다. 따라서, ISTD의 첨가는 검출된 분석물의 양에 대한 상대적 비교를 가능하게 하며, 분석물(들)이 질량 분석계에 도달할 때 샘플에 존재하는 관심 분석물(들)의 분명한 식별 및 정량화를 가능하게 한다. 반드시 그런 것은 아니지만 전형적으로, ISTD는 관심 분석물의 동위원소로 표지된 변종(예를 들어 2H, 13C, 또는 15N 등 표지 포함)이다.
본원에서 사용된 용어 "면역글로불린(Ig)"은 면역글로불린 수퍼패밀리의 면역 부여 당단백질을 지칭한다. "표면 면역글로불린"은 막관통 영역에 의해 이펙터 세포의 막에 부착되고 B-세포 수용체, T -세포 수용체, 클래스 I 및 II 주요 조직적합성 복합체 (MHC) 단백질, 베타-2 마이크로글로불린 (~2M), CD3, CD4 및 CDS와 같은 분자를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
전형적으로, 본원에서 사용된 용어 "항체"는 막관통 영역이 결여되어 혈류 및 체강 내로 방출될 수 있는 분비된 면역글로불린을 지칭한다. 인간 항체는 보유하고 있는 중쇄에 따라 다양한 동형으로 분류된다. 그리스 문자인 α, γ, δ, ε 및 μ로 표시되는 5가지 유형의 인간 Ig 중쇄가 있다. 존재하는 중쇄의 유형은 항체의 부류를 정의한다. 즉, 상기 사슬은 각각 상이한 역할을 수행하고 상이한 유형의 항원에 대한 적절한 면역 반응을 지시하는 IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM 항체에서 발견된다. 별개의 중쇄들은 크기 및 구성이 서로 상이하고, 약 450개의 아미노산을 포함할 수 있다 (Janeway et al. (2001) Immunobiology, Garland Science). IgA는 소화관, 호흡기관, 비뇨생식기와 같은 점막 부위뿐만 아니라 타액, 눈물 및 모유에서 발견되며 병원체에 의한 집락화를 예방한다 (Underdown & Schiff (1986) Annu. Rev. Immunol. 4:389-417). IgD는 주로 항원에 노출되지 않은 B 세포 상에서 항원 수용체로 기능하며, 항미생물 인자를 생성하기 위해 호염기구 및 비만 세포를 활성화하는 데 관여한다 (Geisberger et al. (2006) Immunology 118:429-437; Chen et al. (2009) Nat. Immunol. 10:889-898). IgE는 비만 세포 및 호염기구로부터 히스타민의 방출을 촉발하는 알레르기 유발 항원에 결합함으로써 알레르기 반응에 관여한다. IgE는 또한 기생충에 대한 보호에 관여한다 (Pier et al. (2004) Immunology, Infection, and Immunity, ASM Press). IgG는 침입하는 병원체에 대한 항체 기반 면역의 대부분을 제공하며 태아에게 수동 면역을 주기 위해 태반을 통과할 수 있는 유일한 항체 동형이다 (Pier et al. (2004) Immunology, Infection, and Immunity, ASM Press). 인간에게는 4가지 상이한 IgG 하위부류(IgG1, 2, 3, 4)가 있고, 혈청 내 존재비의 순서대로 명명되며, IgG1이 가장 풍부하고(~66%), IgG2(~23%), IgG3(~7%) 및 IgG(~4%)가 그 뒤를 잇는다. 상이한 IgG 부류의 생물학적 프로파일은 각각의 힌지 영역의 구조에 의해 결정된다. IgM은 B 세포의 표면 상에 단량체 형태 및 매우 높은 결합력을 갖는 분비된 오량체 형태로서 발현된다. IgM은 충분한 IgG가 생성되기 전에 B 세포 매개(체액) 면역의 초기 단계에서 병원체를 제거하는 데 관여한다 (Geisberger et al. (2006) Immunology 118:429-437). 항체는 단량체로서 발견될 뿐만 아니라 두 개의 Ig 단위의 이량체(예컨대, IgA), 네 개의 Ig 단위의 사량체(예컨대, 경골 어류의 IgM), 또는 다섯 개의 Ig 단위의 오량체(예컨대, 포유류 IgM)를 형성하는 것으로 공지되어 있다. 항체는 일반적으로 이황화 결합을 통해 연결되고 "Y"자형 거대 분자와 유사한 두 개의 동일한 중쇄 및 동일한 두 개의 경쇄를 포함하는, 네 개의 폴리펩티드 사슬로 만들어진다. 각각의 사슬은 다수의 면역글로불린 도메인을 포함하며, 그 중 일부는 불변 도메인이고 다른 일부는 가변 도메인이다. 면역글로불린 도메인은 두 개의 ~시트에 배열된 7 내지 9 개의 역평행 ~가닥으로 이루어진 2 층 샌드위치로 구성된다. 일반적으로, 항체의 중쇄는 네 개의 Ig 도메인을 포함하고 그 중 세 개는 불변 (CH 도메인:CHI. CH2. Ch3) 도메인이고 그 중 하나는 가변 도메인(V H)이다. 경쇄는 전형적으로 한 개의 불변 Ig 도메인(CL) 및 한 개의 가변 Ig 도메인(VL)을 포함한다. 예시된 바와 같이, 인간 IgG 중쇄는 VwCH1-CH2-CH3(VwCyl-Cy2-Cy3로도 지칭됨) 순서로 N-말단에서 C-말단으로 연결된 네 개의 Ig 도메인으로 구성되는 반면, 인간 IgG 경쇄는 카파 또는 람다 유형(VK-CK 또는 VA.-CA.)인 VL-CL 순서로 N-말단에서 C-말단으로 연결된 두 개의 면역글로불린 도메인으로 구성된다. 예시된 바와 같이, 인간 IgG의 불변 사슬은 447 개의 아미노산을 포함한다. 본 명세서 및 청구범위 전체에 걸쳐, 면역글로불린 중의 아미노산 위치의 넘버링 Kabat, E. A., Wu, T.T., Perry, H. M., Gottesman, K. S., and Foeller, C., (1991) Sequences of proteins of immunological interest, 5thed. U.S. Department of Health and Human Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD에서와 같은 "EU 지수"의 것이다. "Kabat에서와 같은 EU 지수"는 인간 IgG lEU 항체의 잔기 넘버링을 지칭한다. 이에 따라, IgG의 맥락에서 CH 도메인은 하기와 같다: "CHI"는 Kabat에서와 같은 EU 지수에 따른 아미노산 위치 118-220을 지칭하고; "CH2"는 Kabat에서와 같은 EU 지수에 따른 아미노산 위치 237-340를 지칭하고; "CH3"은 Kabat에서와 같은 EU 지수에 따른 아미노산 위치 341-44 7을 지칭한다.
용어 "전장 항체", "원형 항체" 및 "전체 항체"는 하기에 정의된 바와 같은 항체 단편이 아닌, 실질적으로 원형 형태인 항체를 지칭하기 위해 본원에서 상호교환적으로 사용된다. 상기 용어들은 특히 Fc 영역을 포함하는 중쇄를 갖는 항체를 지칭한다.
항체의 파파인 소화는 각각 단일 항원 결합 부위를 갖는 "Fab 단편"("Fab 위치" 또는 "Fab 영역"으로도 지칭됨)으로 불리는 두 개의 동일한 항원 결합 단편, 및 쉽게 결정화하는 능력을 그 이름이 반영하는 잔류 "Fe 단편"("Fe 위치" 또는 "Fe 영역"으로도 지칭됨)을 생성한다. 인간 IgG Fe 영역의 결정 구조가 결정되었다 (Deisenhofer (1981) Biochemistry 20:2361-2370). IgG, IgA 및 IgD 동형에서, Fe 영역은 항체의 두 중쇄의 CH2 및 CH3 도메인에서 유래한 두 개의 동일한 단백질 단편으로 구성되고; IgM 및 IgE 동형에서, Fe 영역은 각 폴리펩타이드 사슬에 세 개의 중쇄 불변 도메인(CH2-4)을 포함한다. 또한, 더 작은 면역글로불린 분자는 자연적으로 존재하거나 인공적으로 구성되었다. 용어 "Fab' 단편"은 Ig 분자의 힌지 영역을 추가로 포함하는 Fab 단편을 지칭하는 한편 "F(ab')2 단편"은 화학적으로 연결되거나 이황화 결합을 통해 연결된 두 개의 Fab' 단편을 포함하는 것으로 이해된다. "단일 도메인 항체(sdAb)" (Desmyter et al. (1996) Nat. Structure Biol. 3:803-811) 및 "나노바디(Nanobody)"는 단일 VH 도메인만을 포함하는 한편, "단일 사슬 Fv (scFv)" 단편은 짧은 링커 펩타이드를 통해 경쇄 가변 도메인에 연결된 중쇄 가변 도메인을 포함한다 (Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 5879-5883). 2가 단일 사슬 가변 단편(di-scFvs)은 두 개의 scFvs (scFvA-scFvB)를 연결하여 조작될 수 있다. 이는 두 개의 VH 및 두 개의 VL 영역을 갖는 단일 펩타이드 사슬을 생성하여, "탠덤 scFvs" (VHA-VLA-VHB-VLB)을 수득함으로써 이루어질 수 있다. 또 다른 가능성은 두 개의 가변 영역이 함께 접히기에는 너무 짧은 링커를 갖는 scFv를 생성하여, scFv가 이량체화되도록 하는 것이다. 일반적으로 5 개 잔기의 길이를 갖는 링커가 사용되어 이러한 이량체를 생성한다. 이 유형은 "디아바디(diabody)"로서 공지되어 있다. V H 및 V L 도메인 사이의 훨씬 더 짧은 링커(한 개 또는 두 개의 아미노산)는 단일특이적 삼량체, 소위 "트리아바디(triabody)" 또는 "트리바디(tribady)"의 형성을 유도한다. 이중특이적 디아바디는 각각 VHA-VLB 및 VHB-VLA 또는 VLA-VHB 및 VLB-VHA의 배열로 사슬에 발현함으로써 형성된다. 단일사슬 디아바디(scDb)는 12-20 개의 아미노산, 바람직하게는 14 개의 아미노산의 링커 펩타이드(P)에 의해 연결된 VHA-VLB 및 VHB-VLA 단편(VHA-VLB-P-VHB-VLA)을 포함한다. "이중특이적 T 세포 관여항체(BiTE)"는 서로 상이한 항체의 2개의 scFv로 이루어진 융합 단백질로서, scFv 중 하나는 CD3 수용체를 통해 T 세포에 결합하고 다른 하나는 종양 특이적 분자를 통해 종양 세포에 결합한다 (Kufer et al. (2004) Trends Biotechnol. 22:238-244). 이중 친화성 재표적화 분자("DART" 분자)는 C-말단 이황화 가교를 통해 추가로 안정화된 디아바디이다.
따라서, 용어 "항체 단편"은 원형 항체의 부분을 지칭하고, 바람직하게는 이의 항원 결합 영역을 포함한다. 항체 단편은 Fab, Fab', F(ab')2, Fv 단편; 디아바디; sdAb, 나노바디, scFv, di-scFv, 탠덤 scFv, 트리아바디, 디아바디, scDb, BiTE 및 DART를 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다.
용어 "결합 친화도"는 일반적으로 분자(예를 들어, 항체)의 단일 결합 부위 및 이의 결합 상대(예를 들어, 항원) 사이의 비공유 상호작용의 총합의 강도를 지칭한다. 달리 지시되지 않는 한, 본원에서 사용된 "결합 친화도"는 결합 쌍의 구성원(예를 들어, 항체 및 항원) 사이의 1:1 상호작용을 반영하는 고유 결합 친화도를 지칭한다. 상대 Y에 대한 분자 X의 친화도는 일반적으로 해리 상수(Kd)로 나타낼 수 있다. 친화도는 표면 플라즈몬 공명 기반 분석(예를 들어, PCT 특허출원 공개공보 WO2005/012359에 기재된 바와 같은 BIAcore 분석); 효소 결합 면역흡수 분석(ELISA); 및 경쟁 분석(예를 들어, RIA)을 비롯한 (그러나 이에 제한되는 것은 아님) 해당 분야에 공지된 통상의 방법들에 의해 측정될 수 있다. 낮은 친화도 항체는 일반적으로 항원에 천천히 결합하고 쉽게 해리되는 경향이 있는 반면, 높은 친화도 항체는 일반적으로 항원에 더 빨리 결합하고 더 오래 결합된 상태로 유지되는 경향이 있다. 결합 친화도를 측정하는 다양한 방법이 당업계에 공지되어 있고, 이들 중 임의의 것이 본 발명의 목적을 위해 사용될 수 있다.
"샌드위치 면역분석"은 관심 분석물의 검출에 널리 사용된다. 이러한 분석에서 분석물은 제1 항체와 제2 항체 사이에 "샌드위치된다". 전형적으로, 샌드위치 분석은 포획 및 검출 항체가 관심 분석물 상의 상이한 비중첩 에피토프에 결합하는 것을 필요로 한다. 적절한 수단으로 상기 샌드위치 복합체를 측정하고 상기 분석물을 정량화한다. 전형적인 샌드위치형 분석에서, 고체상에 결합되거나 이에 결합할 수 있는 제1 항체 및 검출 가능하게 표지된 제2 항체는 각각 상이한 비중첩 에피토프에서 분석물에 결합한다. 제1 분석물 특이적 결합제(예를 들어 항체)는 고체 표면에 공유적으로 또는 수동적으로 결합된다. 고체 표면은 전형적으로 유리 또는 중합체이고, 가장 통상적으로 사용된 중합체는 셀룰로스, 폴리아크릴아미드, 나일론, 폴리스타이렌, 폴리비닐 클로라이드, 또는 폴리프로필렌이다. 고체 지지체는 면역검정을 수행하는데 적합한 튜브, 비드, 마이크로플레이트의 원판, 또는 임의의 다른 표면의 형태일 수 있다. 결합 과정은 당해 분야에 공지되어 있으며 일반적으로 공유적으로 결합되거나 물리적으로 흡착되는 가교로 이루어지고, 중합체-항체 복합체는 테스트 샘플의 제조에서 세척된다. 이후 분취량의 테스트될 샘플을 고체상 복합체에 첨가하고 제1 또는 포획 항체와 상응하는 항원 사이의 결합을 허용하기에 충분한 시간 동안 (예를 들어 2-40 분 또는 더 편리한 경우 밤새) 적합한 조건에서 (예를 들어, 실온 내지 40℃, 예컨대 25℃ 내지 37℃) 인큐베이션한다. 인큐베이션 기간 후, 제1 또는 포획 항체 및 이에 결합된 항원을 포함하는 고체상은 세척될 수 있고, 항원 상의 또 다른 에피토프에 결합하는 이차 또는 표지된 항체와 함께 인큐베이션될 수 있다. 제2 항체는 제1 항체와 관심 항원의 복합체에 대한 제2 항체의 결합을 나타내기 위해 사용되는 리포터 분자에 연결된다.
극도로 다양한 대안의 샌드위치 분석 형식은 결합 쌍의 제1 파트너로 코팅된 고체상, 예를 들어 상자성 스트렙타빈 코팅된 마이크로입자의 사용을 포함한다. 이러한 마이크로입자는 결합 쌍의 제2 파트너(예를 들어 비오틴화된 항체)에 결합된 분석물 특이적 결합제, 분석물을 포함하거나 포함하는 것으로 의심되는 샘플과 혼합 및 인큐베이션되고, 여기서 상기 결합 쌍의 제2 파트너는 상기 분석물 특이적 결합제 및 검출 가능하게 표지된 제2 분석물 특이적 결합제에 결합된다. 당업자에게 명백한 바와 같이, 이러한 성분들은 표지된 항체를 분석물을 통해, 고체상 마이크로입자에 대해 결합 쌍의 제1 파트너 및 결합 쌍의 제2 파트너(에 결합된) 분석물 특이적 결합제를 결합시키기에 충분한 기간 동안 적절한 조건하에 인큐베이션된다. 적절한 경우 이러한 분석은 하나 이상의 세척 단계(들)를 포함할 수 있다.
용어 "검출 가능하게 표지된"은 직접적으로 또는 간접적으로 검출될 수 있는 표지를 포함한다.
직접 검출 가능한 표지는 검출 가능한 신호를 제공하거나 제2 표지와 상호 작용하여 제1 또는 제2 표지에 의해 제공되는 검출 가능한 신호를 변경하여, 예컨대 FRET(형광 공명 에너지 전달)을 제공한다. 형광 염료 및 발광 (화학발광 및 전기화학발광 포함) 염료와 같은 표지는 (Briggs et al "Synthesis of Functionalised Fluorescent Dyes and Their Coupling to Amines and Amino Acids," J. Chem. Soc., Perkin-Trans. 1 (1997) 1051-1058) 검출 가능한 신호를 제공하고 일반적으로 표지화에 적용 가능하다. 한 구체예에서 검출 가능하게 표지된은 검출 가능한 신호를 제공하거나 제공하도록 유도할 수 있는 표지, 즉 형광 표지, 발광 표지(예를 들어 화학발광 표지 또는 전기화학발광 표지), 방사성 표지 또는 금속-킬레이트 기반 표지를 각각 지칭한다.
일반적으로 다음 범주로 그룹화될 수 있는 다양한 표지(염료로도 지칭됨)가 이용 가능하고, 이들 모두 함께 또는 이들 각각이 본 개시내용에 따른 구체예를 나타낸다:
(a) 형광 염료
형광 염료는 예를 들어 Briggs et al "Synthesis of Functionalized Fluorescent Dyes and Their Coupling to Amines and Amino Acids," J. Chem. Soc., Perkin-Trans. 1 (1997) 1051-1058)에 기재된다.
형광 표지 또는 형광단은 희토류 킬레이트(유로퓸 킬레이트), FITC, 5-카르복시플루오레세인, 6-카르복시 플루오레세인을 포함하는 플루오레세인 유형 표지; TAMRA를 포함하는 로다민 유형 표지; 단실; 리사민; 시아닌; 피코에리트린; 텍사스 레드; 및 이들의 유사체를 포함한다. 형광 표지는 본원에 개시된 기술을 사용하여 표적 분자에 포함된 알데하이드 기에 접합될 수 있다. 형광 염료 및 형광 표지 시약은 Invitrogen/Molecular Probes (Eugene, Oregon, USA) 및 Pierce Biotechnology, Inc. (Rockford, Ill.)로부터 상업적으로 입수 가능한 것을 포함한다.
(b) 발광 염료
발광 염료 또는 표지는 화학발광 염료 및 전기화학발광 염료로 더욱 하위범주화될 수 있다.
상이한 부류의 화학발광성 표지는 루미놀, 아크리디늄 화합물, 코엘린테라진 및 유사체, 디옥세탄, 퍼옥시옥살산에 기초한 시스템 및 이들의 유도체를 포함한다. 면역진단 절차를 위해 주로 아크리디늄 기초의 표지가 이용된다 (상세한 개요는 Dodeigne C. et al., Talanta 51 (2000) 415-439에서 제공된다).
전기화학발광 표지로서 사용되는 주요 관련성의 표지는 각각 루테늄 및 이리듐 기반의 전기화학발광 복합체이다. 전기화학발광(ECL)은 고도로 민감하고 선택적인 방법으로서 분석적 적용에서 매우 유용한 것으로 입증되었다. 이는 전극 전위를 적용함으로써 화학발광 분석의 분석적 장점(배경 광학 신호의 부재)을 반응 제어의 용이성과 결합한다. 일반적으로 루테늄 착물, 특히 액상 또는 액체-고체 계면에서 TPA(트리프로필아민)로 재생성하는 [Ru (Bpy)3]2+(~620 nm에서 광자를 방출함)가 ECL-표지로서 사용된다.
전기화학발광(ECL) 분석은 관심 분석물의 존재 및 농도에 대한 민감하고 정확한 측정을 제공한다. 이러한 기법은 적절한 화학적 환경에서 전기화학적으로 산화되거나 환원될 때 발광하도록 유도될 수 있는 표지 또는 다른 반응물을 사용한다. 이러한 전기화학발광은 특정 시간에 특정 방식으로 작업 전극 상에 부과된 전압에 의해 촉발된다. 표지에 의해 생성된 빛이 측정되고 분석물의 존재 또는 양을 나타낸다. 이러한 ECL 기법에 대한 더 자세한 설명에 대해, 미국 특허 제5,221,605호, 미국 특허 제5,591,581호, 미국 특허 제5,597,910호, PCT 공개 출원 WO90/05296, PCT 공개 출원 WO92/14139, PCT 공개 출원 WO90/05301, PCT 공개 출원 WO96/24690, PCT 공개 출원 US95/03190, PCT 출원 US97/16942, PCT 공개 출원 US96/06763, PCT 공개 출원 WO95/08644, PCT 공개 출원 WO96/06946, PCT 공개 출원 WO96/33411, PCT 공개 출원 WO87/06706, PCT 공개 출원 WO96/39534, PCT 공개 출원 WO96/41175, PCT 공개 출원 WO96/40978, PCT/US97/03653 및 미국 특허 출원 08/437,348(미국 특허 제5,679,519호)이 참조된다. Knight, et al.에 의한 ECL의 분석적 적용의 1994년 리뷰(Analyst, 1994, 119: 879-890) 및 이에 인용된 참고 문헌이 또한 참조된다. 한 구체예에서 본 설명에 따른 방법이 전기화학발광 표지를 사용하여 실시된다.
최근에는 또한 이리듐 기반 ECL 표지가 기재되었다 (WO2012107419).
(c) 방사성 표지는 방사성동위원소 (방사성 핵종), 예컨대 3H, 11C, 14C, 18F, 32P, 35S, 64Cu, 68Gn, 86Y, 89Zr, 99TC, 111In, 123I, 124I, 125I, 131I, 133Xe, 177Lu, 211At, 또는 131Bi를 이용한다.
(d) 영상화 및 치료 목적을 위한 표지로 적합한 금속-킬레이트 복합체가 당업계에 널리 공지되어 있다 (US 2010/0111861; US 5,342,606; US 5,428,155; US 5,316,757; US 5,480,990; US 5,462,725; US 5,428,139; US 5,385,893; US 5,739,294; US 5,750,660; US 5,834,461; Hnatowich et al, J. Immunol. Methods 65 (1983) 147-157; Meares et al, Anal. Biochem. 142 (1984) 68-78; Mirzadeh et al, Bioconjugate Chem. 1 (1990) 59-65; Meares et al, J. Cancer (1990), Suppl. 10:21-26; Izard et al, Bioconjugate Chem. 3 (1992) 346-350; Nikula et al, Nucl. Med. Biol. 22 (1995) 387-90; Camera et al, Nucl. Med. Biol. 20 (1993) 955-62; Kukis et al, J. Nucl. Med. 39 (1998) 2105-2110; Verel et al., J. Nucl. Med. 44 (2003) 1663-1670; Camera et al, J. Nucl. Med. 21 (1994) 640-646; Ruegg et al, Cancer Res. 50 (1990) 4221-4226; Verel et al, J. Nucl. Med. 44 (2003) 1663-1670; Lee et al, Cancer Res. 61 (2001) 4474-4482; Mitchell, et al, J. Nucl. Med. 44 (2003) 1105-1112; Kobayashi et al Bioconjugate Chem. 10 (1999) 103-111; Miederer et al, J. Nucl. Med. 45 (2004) 129-137; DeNardo et al, Clinical Cancer Research 4 (1998) 2483-90; Blend et al, Cancer Biotherapy & Radiopharmaceuticals 18 (2003) 355-363; Nikula et al J. Nucl. Med. 40 (1999) 166-76; Kobayashi et al, J. Nucl. Med. 39 (1998) 829-36; Mardirossian et al, Nucl. Med. Biol. 20 (1993) 65-74; Roselli et al, Cancer Biotherapy & Radiopharmaceuticals, 14 (1999) 209-20).
용어 "질량 분석법"("Mass Spec" 또는 "MS")은 질량에 의해 화합물을 식별하기 위해 사용되는 분석 기술에 관한 것이다. MS는 질량 대 전하 비율, 또는 "m/z"에 기반하여 이온을 필터링, 검출 및 측정하는 방법이다. MS 기술은 일반적으로 (1) 화합물을 이온화하여 하전된 화합물을 형성하는 것; 및 (2) 하전된 화합물의 분자량을 검출하고 질량 대 전하 비율을 계산하는 것을 포함한다. 화합물은 임의의 적합한 수단에 의해 이온화되고 검출될 수 있다. "질량 분석계"는 일반적으로 이온화기 및 이온 검출기를 포함한다. 일반적으로, 하나 이상의 관심 분자가 이온화되고, 이온은 이후 질량 분석 기기로 도입되고, 여기서 자기장 및 전기장의 조합으로 인해, 이온이 질량("m") 및 전하("z")에 의존하는 공간 중 경로를 따른다. 용어 "이온화(ionization)" 또는 "이온화하는(ionizing)"은 하나 이상의 전자 단위와 동일한 순 전하를 갖는 분석물 이온을 생성하는 과정을 지칭한다. 음이온은 하나 이상의 전자 단위의 순 음전하를 갖는 것인 한편, 양이온은 하나 이상의 전자 단위의 순 양전하를 갖는 것이다. MS 방법은 음이온이 생성 및 검출되는 "음이온 모드" 또는 양이온이 생성 및 검출되는 "양이온 모드"에서 실시될 수 있다.
"직렬 질량 분석법" 또는 "MS/MS"는 여러 단계의 질량 분석법 선택을 포함하며, 여기서 분석물의 단편화가 단계 사이에서 발생한다. 탠덤 질량 분석계에서, 이온은 질량 분석법의 제1 단계(MS1)에서 이온 소스에서 형성되고 질량 대 전하 비율에 의해 분리된다. 특정 질량 대 전하 비율의 이온(전구체 이온 또는 모 이온)이 선택되고 단편 이온(또는 딸 이온)이 충돌-유도 해리, 이온-분자 반응, 또는 광해리에 의해 생성된다. 이후 생성된 이온이 질량 분석법의 제2 단계(MS2)에서 분리 및 검출된다.
MS에서 대부분의 샘플 워크플로우는 샘플 제조 및/또는 농축 단계를 추가로 포함하고, 여기서 예를 들어 관심 분석물(들)이 예를 들어 기체 또는 액체 크로마토그래피를 사용하여 매트릭스로부터 분리된다. 전형적으로, 질량 분석법 측정을 위해, 다음 세 단계가 수행된다:
1. 관심 분석물을 포함하는 샘플이 일반적으로 양이온과의 부가생성물 형성에 의해, 흔히 양이온으로의 양성자화에 의해 이온화된다. 이온화 소스는 전기분무 이온화(electrospray ionization, ESI) 및 대기압 화학 이온화(atmospheric pressure chemical ionization, APCI)를 포함하지만 이에 제한되지는 않는다.
2. 이온은 질량 및 전하에 따라 분류 및 분리된다. 고자기장 비대칭 파형 이온 이동성 분광법(High-field asymmetric-waveform ion-mobility spectrometry, FAIMS)이 이온 필터로서 사용될 수 있다.
3. 이후 분리된 이온이, 예컨대 다중 반응 모드(multiple reaction mode, MRM)에서 검출되고, 결과가 차트에 표시된다.
용어 "전기분무 이온화" 또는 "ESI"는 용액이 짧은 길이의 모세관을 따라 통과하고, 이의 말단에 높은 양전위 또는 음전위가 인가되는 방법들을 지칭한다. 관의 끝에 도달한 용액은 용매 증기 중의 용액의 매우 작은 액적의 제트 또는 스프레이로 기화된다(분무된다). 액적의 미스트는 응축을 방지하고 용매를 증발시키기 위해 약간 가열되는 증발 챔버를 통해 흐른다. 액적이 작아짐에 따라 전기 표면 전하 밀도는 같은 전하 사이의 자연적인 반발로 인해 이온 및 분자가 방출될 때까지 증가한다.
용어 "대기압 화학 이온화" 또는 "APCI"는 ESI와 유사한 질량 분석법 방법을 지칭하지만; APCI는 대기압에서 플라스마 내에서 발생하는 이온-분자 반응에 의해 이온을 생성한다. 혈장은 분무 모세관과 상대 전극 사이의 전기 방전에 의해 유지된다. 이후 이온은 전형적으로 차동 펌핑된 스키머 스테이지의 세트를 사용하여 질량 분석기로 추출된다. 용매의 제거를 개선하기 위해 건조하고 예열된 N2 가스의 역류가 사용될 수 있다. APCI에서의 기체상 이온화는 덜 극성인 개체 분석에 대해 ESI보다 더 효과적일 수 있다.
"다중 반응 모드" 또는 "MRM"은 전구체 이온 및 하나 이상의 단편 이온이 선택적으로 검출되는 MS 기기의 검출 모드이다.
질량 분석계는 다소 상이한 질량의 이온을 분리하고 검출하기 때문에, 주어진 원소의 상이한 동위원소를 쉽게 구별한다. 따라서 질량 분석법은 저분자량 분석물, 펩타이드, 폴리펩타이드 또는 단백질을 포함하지만 이에 제한되지 않는 분석물의 정확한 질량 측정 및 특징규명을 위한 중요한 방법이다. 이의 적용은 단백질의 식별 및 이들의 번역 후 변형, 단백질 복합체의 해명, 이들의 서브유닛 및 기능적 상호작용뿐만 아니라 단백질체학에서 단백질의 전반적인 측정을 포함한다. 질량 분석법에 의한 펩타이드 또는 단백질의 드 노보 시퀀싱(de novo sequencing)은 전형적으로 아미노산 서열에 대한 사전 지식 없이 수행될 수 있다.
질량 분석 측정은 크로마토그래피 방법, 예컨대 기체 크로마토그래피(GC), 액체 크로마토그래피(LC), 특히 HPLC, 및/또는 이온 이동성-기반 분리 기술을 포함하는 추가 분석 방법과 조합될 수 있다.
용어 "크로마토그래피"는 액체 또는 기체에 의해 운반되는 화학적 혼합물이 화학적 개체가 고정 액체상 또는 고체상 주위에 또는 그 위에 흐를 때 차등 분포의 결과로 성분들로 분리되는 과정을 지칭한다.
용어 "액체 크로마토그래피" 또는 "LC"는 유체가 미분된 물질의 컬럼을 통해, 또는 모세관 통로를 통해 균일하게 스며듦에 따른 유체 용액의 하나 이상의 성분의 선택적 지연 과정을 지칭한다. 지연은 이 유체가 고정상(들)에 대해 이동함에 따라 하나 이상의 고정상과 벌크 유체(즉, 이동상) 사이의 혼합물의 성분의 분포로 인해 발생한다. 고정상이 이동상보다 더 극성인 방법은 (예를 들어, 이동상으로서 톨루엔, 고정상으로서 실리카) 정상 액체 크로마토그래피(normal phase liquid chromatography, NPLC)로 명명되고 고정상이 이동상보다 덜 극성인 방법은 (예를 들어, 이동상으로서 물-메탄올 혼합물 및 고정상으로서 C18 (옥타데실실릴)) 역상 액체 크로마토그래피(reversed phase liquid chromatography, RPLC)로 명명된다.
"고성능 액체 크로마토그래피" 또는 "HPLC"는 고정상의, 전형적으로 조밀하게 패킹된 컬럼을 통해 압력하에 이동상에 힘을 가하여 분리 정도가 증가하는 액체 크로마토그래피의 방법을 지칭한다. 전형적으로, 상기 컬럼은 불규칙하거나 구형 형상인 입자, 다공성 모놀리스 층, 또는 다공성 막으로 구성된 고정상으로써 패킹된다. HPLC는 역사적으로 이동상 및 고정상의 극성에 기초하여 두 가지의 상이한 하위 부류로 나뉜다. 고정상이 이동상보다 더 극성인 방법은 (예를 들어, 이동상으로서 톨루엔, 고정상으로서 실리카) 정상 액체 크로마토그래피(NPLC)로 명명되고 반대는 (예를 들어, 이동상으로서 물-메탄올 혼합물 및 고정상으로서 C18 (옥타데실실릴)) 역상 액체 크로마토그래피(RPLC)로 명명된다. 마이크로 LC는 일반적으로 1 mm 미만, 예를 들어 약 0.5 mm의 좁은 내부 컬럼 직경을 갖는 컬럼을 사용하는 HPLC 방법을 지칭한다. "초고성능 액체 크로마토그래피" 또는 "UHPLC"는, 예컨대 120 MPa(17,405 lbf/in2) 또는 약 1200 기압의 압력을 사용하는 HPLC 방법을 지칭한다. 고속 LC는 <2 cm, 예를 들어 1 cm의 짧은 길이와 함께 상기에서 언급한 직경을 갖는 컬럼을 사용하고, 상기에서 언급한 압력과 함께 상기에서 언급한 유량을 적용하는 LC 방법을 지칭한다 (마이크로 LC, UHPLC). 단기 고속 LC 프로토콜은 단일 분석 컬럼을 사용하는 포획/세척/용출 단계를 포함하고 <1분의 매우 짧은 시간 안에 LC를 실현한다.
추가의 공지 LC 방식은 친수성 상호작용 크로마토그래피(Hydrophilic interaction chromatography, HILIC), 크기 배제 LC, 이온 교환 LC, 및 친화성 LC를 포함한다.
LC 분리는 단일-채널 LC 또는 병렬로 배열된 복수의 LC 채널을 포함하는 다중-채널 LC일 수 있다. LC에서 분석물은 당업자에게 일반적으로 공지된 바와 같이 극성 또는 로그 P 값, 크기 또는 친화성에 따라 분리될 수 있다.
본 발명의 맥락에서, 용어 "복합체"는 특정 화학 구조를 갖는 화학 물질을 지칭한다. 상기 복합체는 하나 이상의 관능 단위를 포함할 수 있다. 각각의 단위가 여러 상이한 관능성을 실현할 수 있고, 또는 둘 이상의 관능 단위가 동일한 관능성을 실현할 수 있다.
본 발명의 맥락에서, 용어 "친핵체"는 화학 결합을 형성하기 위해 전자 쌍을 제공하는 화학종을 지칭한다. 물 매질에 존재하는 친핵체는 -NH2, -OH, -SH, -Se, (R',R'',R''')P, N3-, RCOOH, F-, Cl-, Br-, I-를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 맥락에서, 용어 "친핵성 유도체화 시약" 또는 "친핵체 유도체화 시약"은 이러한 친핵체를 포함하는 시약을 지칭한다. 친핵성 유도체화 시약은 관심 분석물과 같은 관심 물질의 최저 비점유 분자 오비탈(LUMO)을 공격할 수 있는 최고 점유 분자 오비탈(HOMO) 역할을 하는 오비탈을 보유하여, 이에 의해 이전의 친핵성 단위 및 분석물 모이어티로 구성된 새로운 분자를 형성하는 모이어티를 포함한다.
"키트"는 최소 하나의 시약, 예를 들어, 장애 치료를 위한 약제, 또는 구체적으로 본 발명의 바이오마커 유전자 또는 단백질을 검출하기 위한 프로브를 포함하는 임의의 제품(예를 들어 패키지 또는 용기)이다. 키트는 바람직하게는 본 발명의 방법을 수행하기 위한 유닛으로서 홍보, 배포, 또는 판매된다. 전형적으로, 키트는 바이알, 튜브 등과 같은 하나 이상의 용기 수단을 밀폐 수용하도록 구획화된 담체 수단을 추가로 포함할 수 있다. 특히, 각각의 용기 수단은 제1 양태의 방법에서 사용될 개별 요소 중 하나를 포함한다. 키트는 완충제, 희석제, 필터, 바늘, 주사기, 및 사용을 위한 설명서가 있는 패키지 삽입물을 포함하지만 이에 제한되지는 않는 추가의 재료를 포함하는 하나 이상의 다른 용기를 추가로 포함할 수 있다. 표지는 조성물이 특정 적용에 사용됨을 표시하기 위해 용기 상에 존재할 수 있고, 생체 내 또는 생체 외 사용을 위한 지침을 표시할 수도 있다. 컴퓨터 프로그램 코드는 광학 저장 매체(예를 들어, 컴팩트 디스크)와 같은 데이터 저장 매체 또는 장치에 제공되거나 컴퓨터 또는 데이터 처리 장치에 직접 제공될 수 있다. 더욱이, 키트는 보정 목적을 위해 본원의 다른 곳에서 설명된 바이오마커에 대한 표준 양을 포함할 수 있다.
"패키지 삽입물"은 적응증, 사용법, 투여량, 투여, 금기사항, 포장된 제품과 조합될 기타 치료 제품에 대한 정보 및/또는 그러한 치료 제품 또는 의약의 사용에 관한 경고 등을 포함하는, 치료 제품 또는 의약의 상업적 패키지에 관례적으로 포함된 지침을 지칭하기 위해 사용된다.
용어 "샘플링 튜브" 또는 "샘플 수집 튜브"는 수집될 혈액 샘플을 수용하기에 적절한 저장소가 있는 임의의 장치를 지칭한다.
구체예
항생제, 특히 β-락탐 항생제를 측정하기 위해 일반적으로 사용되는 접근법은 이들의 불안정성 완화를 목표로 한다. 대조적으로, 본 발명은 적합한 친핵체와 반응시켜 항생제의 반응성을 완화시키지 않고 이용함으로써 환자 샘플 중의 항생제의 정확한 측정을 제공한다.
제1 양태에서, 본 발명은 다음 단계를 포함하는 수득된 샘플 중의 하나 이상의 유도체화된 항생제 분석물의 양 또는 농도를 결정하는 방법에 관한 것이다
a) 선택적으로, 특히 자기 비드를 사용하여, 샘플을 전처리 및/또는 농축하는 단계, 및
b) 샘플 중의 하나 이상의 항생제 분석물의 양 또는 농도를 결정하는 단계.
구체예에서, 유도체화된 항생제 분석물은 친핵성 유도체화 시약 및 항생제 분석물로 형성된 부가생성물이다. 특정 구체예에서, 유도체화된 항생제 분석물은 친핵성 유도체화 시약 및 항생제 분석물로 형성된 공유 부가생성물이다. 구체예에서, 유도체화된 항생제 분석물은 동일한 비유도체화 항생제 분석물과 비교하여 증가된 안정성을 나타낸다.
구체예에서, 항생제 분석물은 락탐 항생제 분석물이다. 구체예에서, 항생제 분석물은 β-락탐 항생제 분석물이다. 특정 구체예에서, 항생제 분석물은 아목시실린, 암피실린, 바캄피실린, 카르베니실린, 클록사실린, 디클록사실린, 플루클록사실린, 메즐로실린, 나프실린, 옥사실린, 테모실린, 페네티실린, 페니실린 G, 페니실린 V, 피페라실린, 아즐로실린, 피밤피실린, 피브메실리남, 티카르실린, 세파세트릴(세파세트릴), 세파드록실 (세파드록실), 세팔렉신 (세팔렉신), 세팔렉신 (세팔렉신), 세팔로글리신 (세팔로글리신), 세팔로늄 (세팔로늄), 세팔로리딘 (세팔로라딘), 세팔로틴 (세팔로틴), 세팔로틴 (세팔로틴), 세파피린 (세파피린), 세파트리진, 세파자플루르, 세파제돈, 세파졸린 (세파졸린), 세프라딘 (세프라딘), 세프라딘 (세프라딘), 세프록사딘, 세프록사딘, 세프테졸, 세파클로르, 세파만돌, 세프메타졸, 세포니시드, 세포테탄, 세폭시틴, 세프로질 (세프록실), 세푸록심, 세푸조남, 세프카펜, 세프달록심, 세프디니르, 세프디토렌, 세페타메트, 세픽심, 세프메녹심, 세포디짐, 세포탁심, 세프피미졸, 세프포독심, 세프테람, 세프티부텐, 세프티오푸르, 세프티올렌, 세프티족심, 세프트리악손, 세포페라존, 세프타지딤, 세프클리딘, 세페핌, 세플루프레남, 세포셀리스, 세포조프란, 세프피롬, 세프퀴놈, 세프토비프롤, 세프타롤린, 세파클로메진, 세팔로람, 세파파롤, 세프카넬, 세페드롤로르, 세펨피돈, 세페트리졸, 세피비트릴, 세프마틸렌, 세프메피듐, 세포베신, 세폭사졸, 세프로틸, 세프수미드, 세푸라세팀, 세프티옥시드, 세프톨로잔, 이미페넴, 도리페넴, 에르타페넴, 메로페넴, 아즈트레오남, 메실리남, 메탐피실린, 탈람피실린, 에피실린, 설베니실린, 파로페넴, 리티페넴, 비아페넴, 피밤피실린, 클로메토실린, 페나메실린, 헤타실린, 카린다실린, 파니페넴, 티게모남, 카루모남, 노카르디신 A, 페남, 설박탐, 타조박탐, 클라밤, 및 클라불란산으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 특정 구체예에서, 항생제 분석물은 메로페넴 또는 피페라실린이다.
구체예에서, 항생제 분석물은 친핵성 유도체화 시약, 특히 아민 기, 특히 1차 또는 2차 아민, 특히 1차 아민 기를 포함하는 시약으로 유도체화된다. 1차 아민 기는 2차 아민에 비해 인큐베이션 시간이 단축될 수 있다는 장점이 있다. 구체예에서, 항생제 분석물은 3 개 이상의 C-원자, 특히 3 내지 20 개의 C-원자, 특히 3 내지 10 개의 C-원자, 특히 3-5 개의 C-원자, 특히 4 개의 C-원자를 포함하는 친핵성 유도체화 시약으로 유도체화된다. 구체예에서, 항생제 분석물은 선형 또는 분지형 친핵성 유도체화 시약, 특히 선형 아민, 특히 선형 1차 아민, 특히 3 내지 5 개의 C-원자를 포함하는 선형 1차 아민으로 유도체화된다. 구체예에서, 항생제 분석물은 프로필아민, 부틸아민, 또는 펜틸아민, 특히 1차 선형 부틸아민 또는 1차 선형 펜틸아민으로 이루어진 군으로부터 선택된 친핵성 유도체화 시약으로 유도체화된다. 따라서, MS 간섭이 감소되거나 회피될 수 있다.
구체예에서, 유도체화된 항생제 분석물은 그의 화학적 모이어티 중 적어도 하나에서 유도체화된다. 화학 분야의 숙련자는 특히 친핵성 유도체화 시약으로 유도체화하기에 적합한 화학적 모이어티를 잘 알고 있다. 특정 구체예에서, 유도체화된 항생제 분석물은 그의 화학적 모이어티 중 하나, 둘 또는 셋에서 유도체화된다.
항생제 분석물이 메로페넴인 특정 구체예에서, 이는 부틸아민을 포함하는 친핵성 유도체화 시약으로 유도체화된다. 또한 도 3을 참조하라.
항생제 분석물이 피페라실린인 특정 구체예에서, 이는 펜틸아민을 포함하는 친핵성 유도체화 시약으로 유도체화된다.
항생제 분석물이 피페라실린인 특정 구체예에서, 이는 그의 화학적 모이어티 중 둘에서, 특히 β-락탐 고리 및 피페라진 고리에서 펜틸아민을 포함하는 친핵성 유도체화 시약으로 유도체화된다. 또한 도 4를 참조하라.
구체예에서, 유도체화된 항생제 분석물을 포함하는 샘플은 다양한 방법에 의해 전처리 및/또는 농축될 수 있다. 전처리 방법은 혈액 (신선 또는 건조), 혈장, 혈청, 소변, 또는 타액과 같은 샘플 유형에 의존하지만, 농축 방법은 관심 분석물에 의존한다. 전처리 방법이 어떤 샘플 유형에 적합한지는 당업자에게 공지이다. 관심 분석물에 어떤 농축 방법이 적합한지 또한 당업자에게 공지이다.
샘플이 전혈 샘플인 구체예에서, 이는 둘의 사전 정의된 샘플 전처리(pre-treatment, PT) 워크플로우 중 하나에 할당되고, 둘 모두 내부 표준(ISTD) 및 용혈 시약(HR)의 첨가를 포함하며 사전 정의된 인큐베이션 기간(Inc)이 이어지고, 여기서 두 워크플로우 간의 차이는 내부 표준(ISTD) 및 용혈 시약(HR)이 첨가되는 순서이다. 구체예에서, ISTD가 먼저 수득된 샘플에 첨가되고 용혈 시약의 첨가가 이어진다. 구체예에서, 용혈 시약의 첨가 다음에 ISTD가 수득된 샘플에 첨가된다. 구체예에서 물이 용혈 시약으로서, 특히 0.5:1 내지 20:1 mL 물 / mL 샘플의 양으로, 특히 1:1 내지 10:1 mL 물 / mL 샘플의 양으로, 특히 2:1 내지 5:1 mL 물 / mL 샘플의 양으로 첨가된다.
샘플이 소변 샘플인 구체예에서, 이는 다른 둘의 사전 정의된 샘플 PT 워크플로우 중 하나에 할당되고, 둘 모두 ISTD 및 효소 시약의 첨가를 포함하고 사전 정의된 인큐베이션 기간이 이어지고, 여기서 두 워크플로우 간의 차이는 내부 표준 및 효소 시약이 첨가되는 순서이다. 구체예에서, ISTD가 먼저 수득된 샘플에 첨가되고 효소 시약의 첨가가 이어진다. 구체예에서, 효소 시약의 첨가 다음에 ISTD가 수득된 샘플에 첨가된다. 효소 시약은 전형적으로 글루쿠로나이드 절단 또는 단백질 절단 또는 분석물 또는 매트릭스의 임의의 전처리에 사용되는 시약이다. 구체예에서, 효소 시약은 글루쿠로니데이스, (부분) 엑소- 또는 엔도- 탈글리코실화 효소, 또는 엑소- 또는 엔도 프로테이스로 이루어진 군으로부터 선택된다. 구체예에서, 글루코로니데이스가 0.5 - 10 mg/ml의 양, 특히 1 내지 8 mg/ml의 양, 특히 2 내지 5 mg/ml의 양으로 첨가된다.
샘플이 혈장 또는 혈청인 구체예에서, 이는 내부 표준(ISTD)의 첨가만을 포함하고 사전 정의된 인큐베이션 시간이 이어지는 또 다른 사전 정의된 PT 워크플로우에 할당된다.
고려된 샘플 처리, 화학 반응 또는 방법 단계를 위해 선택하는 인큐베이션 시간 및 온도가 당업자에게 공지이며 본원에서 위 또는 아래에 명명된 바와 같다. 특히, 당업자는 예를 들어 높은 온도가 전형적으로 더 짧은 인큐베이션 기간을 유발하고 그 반대의 경우도 마찬가지라는 점에서 인큐베이션 시간 및 온도가 서로 의존함을 알고 있다.
전처리된 샘플은 적어도 하나의 농축 워크플로우를 추가로 거칠 수 있다. 농축 워크플로우는 하나 이상의 농축 방법을 포함할 수 있다. 농축 방법은 당해 분야에서 일반적으로 공지되어 있으며 화학적 침전을 포함하지만 이에 제한되지는 않는 화학적 농축 방법, 및 고체상 추출 방법, 비드 워크플로우, 및 크로마토그래피 방법(예컨대, 기체 또는 액체 크로마토그래피)를 포함하지만 이에 제한되지는 않는 고체상을 사용한 농축 방법을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다.
구체예에서, 제1 농축 워크플로우는 고체상, 특히 분석물 선택적 기를 전처리된 샘플에 운반하는 고체 비드의 첨가를 포함한다. 구체예에서, 제1 농축 워크플로우는 분석물 선택적 기를 전처리된 샘플에 운반하는 자기 또는 상자기 비드의 첨가를 포함한다.
구체예에서, 자기 비드는 프리델 크래프트 알킬화를 통해 과가교결합되고 -OH 기의 첨가로 추가로 개질된 스타이렌 기반 중합체로 코팅된 자기 코어를 포함한다.
구체예에서, 자기 비드는 디아민(예를 들어 TMEDA)을 통해 과가교결합되고 추가로 개질되어 이에 이해 디아민이 또한 측쇄 역할을 하는 (즉 이러한 유형의 비드에서, TMEDA는 사차 및 삼차 아민 관능성을 모두 제공함), 스타이렌 기반 중합체로 코팅된 자기 코어를 포함한다. 이러한 비드의 완전한 설명에 대해 다음을 참조하라: WO 2019/141779
구체예에서, 자기 비드의 첨가는 교반 또는 혼합을 포함한다. 비드의 관심 항생제 분석물(들)을 포획하기 위한 사전 정의된 인큐베이션 기간이 이어진다. 구체예에서, 워크플로우는 자기 비드와 함께 인큐베이션 한 후 세척 단계(W1)를 포함한다. 항생제 분석물(들)에 따라 하나 이상의 추가 세척 단계(W2)가 실시된다. 하나의 세척 단계(W1, W2)는 자석 또는 전자석을 포함한 자기 비드 처리 단위에 의한 자기 비드의 분리, 액체의 흡인, 세척 완충액의 첨가, 자기 비드의 재현탁, 다른 자기 비드의 분리 단계 및 다른 액체의 흡인을 포함하는 일련의 단계를 포함한다. 또한, 세척 단계는 세척 주기의 부피 및 수 또는 조합을 제외하고는 용매의 유형(물/유기/염/pH) 측면에서 상이할 수 있다. 각각의 파라미터를 선택하는 방법은 당업자에게 일반적으로 공지되어 있다. 최종 세척 단계(W1, W2)에 용리 시약의 첨가가 이어지고 자기 비드의 재현탁 및 관심 분석물(들)이 자기 비드로부터 방출되기 위한 사전 정의된 인큐베이션 기간이 이어진다. 이후 결합된 것이 없는 자기 비드가 분리되고 유도체화된 관심 분석물(들)을 포함하는 상청액이 포획된다.
구체예에서, 제1 농축 워크플로우는 매트릭스 선택적 그룹을 보유하는 자기 비드를 전처리된 샘플에 첨가하는 것을 포함한다. 구체예에서, 자기 비드의 첨가는 교반 또는 혼합을 포함한다. 비드의 매트릭스를 포획하기 위한 사전 정의된 인큐베이션 기간이 이어진다. 여기서, 관심 분석물은 자기 비드에 결합하지 않고 상청액에 잔존한다. 그 후, 자기 비드가 분리되고 농축된 관심 분석물(들)을 포함하는 상청액이 수집된다.
구체예에서, 상청액은 제2 농축 워크플로우, 특히 크로마토그래피 농축 워크플로우를 거친다. 본 발명의 구체예에서, 크로마토그래피 분리는 기체 또는 액체 크로마토그래피이다. 두 방법이 모두 당업자에게 일반적으로 공지되어 있다. 구현예들에서, 상기 액체 크로마토그래피는 HPLC, 고속 LC, 마이크로 LC, 흐름 주입, 및 트랩(trap) 및 용출로 이루어진 군으로부터 선택된다. 여기서, 상청액은 LC 스테이션으로 이송되거나 희석액의 첨가에 의한 희석 단계 후 LC 스테이션으로 이송된다. 예를 들어 용매의 유형 (물/유기/염/pH) 및 부피를 변화시켜 여러 상이한 용리 절차/시약이 또한 사용될 수 있다. 다양한 파라미터가 당업자에게 공지이고 쉽게 선택된다.
구체예에서, 제1 농축 공정은 분석물 선택적 자기 비드의 사용을 포함한다. 구체예에서, 제2 농축 과정은 특히 액체 크로마토그래피를 사용하는 크로마토그래피 분리의 사용을 포함한다. 구체예에서, 분석물 선택적 자기 비드를 사용하는 제1 농축 공정은 액체 크로마토그래피를 사용하는 제2 농축 공정 전에 수행된다.
구체예에서, 샘플 중의 하나 이상의 유도체화된 항생제 분석물의 양 또는 농도 결정은 단계 b)에서 수행된다. 당업자에게 공지된 임의의 적합한 방법이 사용될 수 있다. 특정 구체예에서, 단계 b)는 면역학적 방법 또는 질량 분석법을 사용하여 하나 이상의 유도체화된 항생제 분석물의 양 또는 농도를 결정하는 것을 포함한다.
단계 b)가 면역학적 방법을 사용하여 하나 이상의 항생제 분석물의 양 또는 농도를 결정하는 것을 포함하는 구체예에서, 다음 단계가 포함된다:
i) (선택적으로 농축된) 환자의 샘플을 하나 이상의 유도체화된 항생제 분석물에 특이적으로 결합하는 하나 이상의 항체와 인큐베이션하여, 항체와 하나 이상의 유도체화된 항생제 분석물 간의 복합체를 생성하는 단계, 및
ii) 단계 i)에서 형성된 복합체를 정량화함으로써, 환자의 샘플 중의 하나 이상의 유도체화된 항생제 분석물의 양을 정량화하는 단계.
특정 구체예들에서, 단계 i)에서 샘플은 하나 이상의 유도체화된 항생제 분석물에 특이적으로 결합하는 2개의 항체와 함께 인큐베이션된다. 당업자에게 명백한 바와 같이, 샘플은 제1 항체/ 유도체화된 항생제 분석물 /제2 항체 복합체를 형성하기에 충분한 시간 동안 그리고 조건하에서 제1 및 제2 항체와 임의의 원하는 순서로, 즉, 제1 항체 먼저 그리고 그후 제2 항체와, 또는 제2 항체 먼저 그리고 그 후 제1 항체와, 또는 동시에, 접촉될 수 있다. 당업자가 용이하게 이해할 것과 같이, 이는 특이적 항체와 유도체화된 항생제 분석물 간의 복합체의 형성 또는 제1 항체, 유도체화된 항생제 분석물, 제2 항체를 포함하는 이차 또는 샌드위치 복합체의 형성에 충분하거나 적절한 시간 및 조건을 확립하기 위한 일상적인 실험에 불과하다.
항체-분석물 복합체의 검출은 임의의 적절한 수단에 의해 수행될 수 있다. 당업자는 이런 수단/방법에 절대적으로 익숙하다. 구체예에서, 항체/항체들은 직접적으로 또는 간접적으로 검출 가능하게 표지된다. 특정 구체예들에서, 항체는 발광 염료, 특히 화학발광 염료 또는 전기화학발광 염료로 검출가능하게 표지된다.
단계 b)가 질량 분석법을 사용하여 하나 이상의 항생제 유도체화된 항생제 분석물의 양 또는 농도를 결정하는 것을 포함하는 구체예에서, 다음 단계가 포함된다:
(i) 유도체화된 항생제 분석물의 이온이 질량 분광 분석의 제1 단계를 거쳐, 이에 의해 유도체화된 항생제 분석물의 모 이온이 이의 질량/전하 (m/z) 비율에 따라 특징지어짐,
(ii) 유도체화된 항생제 분석물 모 이온의 단편화를 유발시킴, 이에 의해 딸 이온이 생성되고, 여기서 유도체화된 항생제 분석물의 딸 이온은 유도체화된 항생제 분석물 모 이온과 m/z 비율이 상이함, 및
(iii) 유도체화된 항생제 분석물의 딸 이온이 질량 분광 분석의 제2 단계를 거침, 이에 의해 유도체화된 항생제 분석물의 딸 이온은 m/z 비율에 따라 특징지어짐.
구체예에서, 측정된 모 및/또는 단편 이온은 표 1에 나타낸 것이다.
Figure pct00001
구체예에서, 유도체화된 메로페넴+H+의 모 이온은 m/z 값 457.164±0.5에서 측정되고, 유도체화된 피페라실린+H+의 모 이온은 m/z 값 664.235±0.5에서 측정된다.
구체예에서, 유도체화된 메로페넴의 단편 이온은 m/z 값 152±0.5 또는 173±0.5에서 측정되고, 유도체화된 피페라실린의 단편 이온은 m/z 값 270±0.5 또는 464±0.5에서 측정된다.
구체예에서, 방법은 자동화된 방법이다. 특정 구체예에서, 방법은 자동화된 시스템에 의해 수행된다. 특정 구체예에서, 방법은 수동 개입을 포함하지 않는다.
제2 양태에서, 본 발명은 다음 단계를 포함하는 수득된 샘플 중의 하나 이상의 항생제 분석물의 양 또는 농도를 결정하는 방법에 관한 것이다
a) 샘플을 유도체화 시약으로 전처리하는 단계, 여기서 유도체화 시약은 친핵체를 포함함,
b) 선택적으로, 특히 자기 비드를 사용하여, 단계 a) 후 수득된 샘플을 농축하는 단계, 및
c) 단계 a) 후 또는 선택적인 농축 단계 b) 후 수득된 전처리된 샘플 중의 하나 이상의 항생제 분석물의 양 또는 농도를 결정하는 단계.
구체예에서, 항생제 분석물은 락탐 항생제 분석물이다. 구체예에서, 항생제 분석물은 β-락탐 항생제 분석물이다. 특정 구체예에서, 항생제 분석물은 아목시실린, 암피실린, 바캄피실린, 카르베니실린, 클록사실린, 디클록사실린, 플루클록사실린, 메즐로실린, 나프실린, 옥사실린, 테모실린, 페네티실린, 페니실린 G, 페니실린 V, 피페라실린, 아즐로실린, 피밤피실린, 피브메실리남, 티카르실린, 세파세트릴(세파세트릴), 세파드록실 (세파드록실), 세팔렉신 (세팔렉신), 세팔렉신 (세팔렉신), 세팔로글리신 (세팔로글리신), 세팔로늄 (세팔로늄), 세팔로리딘 (세팔로라딘), 세팔로틴 (세팔로틴), 세팔로틴 (세팔로틴), 세파피린 (세파피린), 세파트리진, 세파자플루르, 세파제돈, 세파졸린 (세파졸린), 세프라딘 (세프라딘), 세프라딘 (세프라딘), 세프록사딘, 세프록사딘, 세프테졸, 세파클로르, 세파만돌, 세프메타졸, 세포니시드, 세포테탄, 세폭시틴, 세프로질 (세프록실), 세푸록심, 세푸조남, 세프카펜, 세프달록심, 세프디니르, 세프디토렌, 세페타메트, 세픽심, 세프메녹심, 세포디짐, 세포탁심, 세프피미졸, 세프포독심, 세프테람, 세프티부텐, 세프티오푸르, 세프티올렌, 세프티족심, 세프트리악손, 세포페라존, 세프타지딤, 세프클리딘, 세페핌, 세플루프레남, 세포셀리스, 세포조프란, 세프피롬, 세프퀴놈, 세프토비프롤, 세프타롤린, 세파클로메진, 세팔로람, 세파파롤, 세프카넬, 세페드롤로르, 세펨피돈, 세페트리졸, 세피비트릴, 세프마틸렌, 세프메피듐, 세포베신, 세폭사졸, 세프로틸, 세프수미드, 세푸라세팀, 세프티옥시드, 세프톨로잔, 이미페넴, 도리페넴, 에르타페넴, 메로페넴, 아즈트레오남, 메실리남, 메탐피실린, 탈람피실린, 에피실린, 설베니실린, 파로페넴, 리티페넴, 비아페넴, 피밤피실린, 클로메토실린, 페나메실린, 헤타실린, 카린다실린, 파니페넴, 티게모남, 카루모남, 노카르디신 A, 페남, 설박탐, 타조박탐, 클라밤, 및 클라불란산으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 특정 구체예에서, 항생제 분석물은 메로페넴 또는 피페라실린이다.
구체예에서, 단계 a)에서 샘플은 아민 기, 특히 1차 또는 2차 아민, 특히 1차 아민 기를 포함하는 친핵성 유도체화 시약으로 전처리된다. 구체예에서, 단계 a)에서 샘플은 3 개 이상의 C-원자, 특히 3 내지 20 개의 C-원자, 특히 3 내지 10 개의 C-원자, 특히 3-5 개의 C-원자, 특히 4 개의 C-원자를 포함하는 친핵성 유도체화 시약으로 전처리된다. 구체예에서 단계 a)에서 샘플은 선형 또는 분지형 친핵성 유도체화 시약, 특히 선형 아민, 특히 선형 1차 아민, 특히 3 내지 5 개의 C-원자를 포함하는 선형 1차 아민으로 전처리된다. 구체예에서, 단계 a)에서 샘플은 프로필아민, 부틸아민, 또는 펜틸아민, 특히 1차 선형 부틸아민으로 이루어진 군으로부터 선택된 친핵성 유도체화 시약으로 전처리된다.
특정 구체예에서, 단계 a)에서 샘플은 분석물이 메로페넴인 경우 부틸아민을 포함하는 친핵성 유도체화 시약으로 전처리된다.
특정 구체예에서, 단계 a)에서 샘플은 분석물이 피페라실린인 경우 펜틸아민을 포함하는 친핵성 유도체화 시약으로 전처리된다.
구체예에서, 단계 a)에서 샘플은 용매, 특히 물, CH3CN, THF, 디옥산, DMF, DMSO, 아세톤, t-부틸 알코올, 디글라임, DME, MeOH, EtOH, 1-PrOH, 2-PrOH, 에틸렌 글리콜, 헥사메틸포스포라미드 (HMPA), 헥사메틸포스포러스 트리아미드 (HMPT), 및 글리세린으로 이루어진 군으로부터 선택된 용매, 특히 물, CH3CN, THF, 디옥산, DMF, DMSO, 아세톤, t-부틸 알코올, 디글라임, 및 DME로 구성된 군으로부터 선택된 용매에 포함된 친핵성 유도체화 시약으로 전처리된다.
구체예에서, 단계 a)에서 샘플은 특히 DBU, TEA, DIPEA, Na3PO4, Na2CO3, 및 Cs2CO3으로 이루어진 군으로부터 선택된, 안정하고 물과 혼화성인 비친핵성 염기를 추가로 포함하는 용매에 포함된 친핵성 유도체화 시약으로 전처리된다.
구체예에서, 단계 a)에서 샘플은 샘플이 수득된 직후, 특히 샘플이 수득된 후 10 분 이내에, 특히 샘플이 수득된 후 5 분 이내에 친핵성 유도체화 시약으로 전처리된다.
구체예에서, 단계 a)에서 샘플은 친핵성 유도체화 시약 샘플로 2 분 이상 동안, 특히 5 분 이상 동안, 특히 30 분 이상 동안 전처리된다.
구체예에서, 단계 a) 후 수득된 샘플은 유도체화된 항생제 분석물, 특히 친핵성 유도체화 시약으로 유도체화된 항생제 분석물을 포함한다.
구체예에서, 단계 a) 후 수득된 샘플은 유도체화된 β-락탐 항생제 분석물을 포함하고, 여기서 베타-락탐 모이어티는 친핵체 유도체화 시약과의 반응에 의해 파괴된다. 구체예에서, 단계 a) 후 수득된 샘플은 유도체화된 β-락탐 항생제 분석물을 포함하고, 여기서 항생제 분석물 및 친핵성 유도체화 시약의 공유 부가생성물이 형성된다.
구체예에서, 단계 a) 후 수득된 샘플은 그의 화학적 모이어티 중 적어도 하나에서 유도체화된, 유도체화된 항생제 분석물을 포함한다. 화학 분야의 숙련자는 특히 친핵성 유도체화 시약으로 유도체화하기에 적합한 화학적 모이어티를 잘 알고 있다. 특정 구체예에서, 단계 a) 후에 수득된 샘플은 그의 화학적 모이어티 중 하나, 둘 또는 셋에서 유도체화된, 유도체화된 항생제 분석물을 포함한다.
항생제 분석물이 메로페넴인 특정 구체예에서, 단계 a) 후 수득된 샘플은 유도체화된 메로페넴, 특히 부틸아민을 포함하는 친핵성 유도체화 시약으로 유도체화된 메로페넴을 포함한다. 또한 도 3을 참조하라.
항생제 분석물이 피페라실린인 특정 구체예에서, 단계 a) 후 수득된 샘플은 유도체화된 피페라실린, 특히 부틸아민 또는 펜틸아민을 포함하는 친핵성 유도체화 시약으로 유도체화된 피페라실린을 포함한다. 또한 도 4를 참조하라.
항생제 분석물이 피페라실린인 특정 구체예에서, 단계 a) 후 수득된 샘플은 유도체화된 피페라실린, 특히 그의 화학적 모이어티 중 둘에서 부틸아민 또는 펜틸아민을 포함하는 친핵성 유도체화 시약으로 유도체화된, 특히 β-락탐 고리 및 피페라진 고리에서 유도체화된 피페라실린을 포함한다. 또한 도 4를 참조하라.
구체예에서, 추가적인 전처리 방법이 단계 a)에서 수행될 수 있다. 이들은 샘플을 유도체화 시약으로 전처리하기 전 및 후에 수행될 수 있다. 전처리 방법은 혈액 (신선 또는 건조), 혈장, 혈청, 소변, 또는 타액과 같은 샘플 유형에 의존하지만, 농축 방법은 관심 분석물에 의존한다. 전처리 방법이 어떤 샘플 유형에 적합한지는 당업자에게 공지이다. 관심 분석물에 어떤 농축 방법이 적합한지 또한 당업자에게 공지이다.
샘플이 전혈 샘플인 구체예에서, 이는 둘의 사전 정의된 샘플 전처리(pre-treatment, PT) 워크플로우 중 하나에 할당되고, 둘 모두 내부 표준(ISTD) 및 용혈 시약(HR)의 첨가를 포함하며 사전 정의된 인큐베이션 기간(Inc)이 이어지고, 여기서 두 워크플로우 간의 차이는 내부 표준(ISTD) 및 용혈 시약(HR)이 첨가되는 순서이다. 구체예에서, ISTD가 먼저 수득된 샘플에 첨가되고 용혈 시약의 첨가가 이어진다. 구체예에서, 용혈 시약의 첨가 다음에 ISTD가 수득된 샘플에 첨가된다. 구체예에서 물이 용혈 시약으로서, 특히 0.5:1 내지 20:1 mL 물 / mL 샘플의 양으로, 특히 1:1 내지 10:1 mL 물 / mL 샘플의 양으로, 특히 2:1 내지 5:1 mL 물 / mL 샘플의 양으로 첨가된다.
샘플이 소변 샘플인 구체예에서, 이는 다른 둘의 사전 정의된 샘플 PT 워크플로우 중 하나에 할당되고, 둘 모두 ISTD 및 효소 시약의 첨가를 포함하고 사전 정의된 인큐베이션 기간이 이어지고, 여기서 두 워크플로우 간의 차이는 내부 표준 및 효소 시약이 첨가되는 순서이다. 구체예에서, ISTD가 먼저 수득된 샘플에 첨가되고 효소 시약의 첨가가 이어진다. 구체예에서, 효소 시약의 첨가 다음에 ISTD가 수득된 샘플에 첨가된다. 효소 시약은 전형적으로 글루쿠로나이드 절단 또는 단백질 절단 또는 분석물 또는 매트릭스의 임의의 전처리에 사용되는 시약이다. 구체예에서, 효소 시약은 글루쿠로니데이스, (부분) 엑소- 또는 엔도- 탈글리코실화 효소, 또는 엑소- 또는 엔도 프로테이스로 이루어진 군으로부터 선택된다. 구체예에서, 글루쿠로니데이스가 0.5 - 10 mg/ml의 양, 특히 1 내지 8 mg/ml의 양, 특히 2 내지 5 mg/ml의 양으로 첨가된다.
샘플이 혈장 또는 혈청인 구체예에서, 이는 내부 표준(ISTD)의 첨가만을 포함하고 사전 정의된 인큐베이션 시간이 이어지는 또 다른 사전 정의된 PT 워크플로우에 할당된다.
고려된 샘플 처리, 화학 반응 또는 방법 단계를 위해 선택하는 인큐베이션 시간 및 온도가 당업자에게 공지이며 본원에서 위 또는 아래에 명명된 바와 같다. 특히, 당업자는 예를 들어 높은 온도가 전형적으로 더 짧은 인큐베이션 기간을 유발하고 그 반대의 경우도 마찬가지라는 점에서 인큐베이션 시간 및 온도가 서로 의존함을 알고 있다.
전처리된 샘플은 단계 b)에서 적어도 하나의 농축 워크플로우를 추가로 거칠 수 있다. 농축 워크플로우는 하나 이상의 농축 방법을 포함할 수 있다. 농축 방법은 당해 분야에서 일반적으로 공지되어 있으며 화학적 침전을 포함하지만 이에 제한되지는 않는 화학적 농축 방법, 및 고체상 추출 방법, 비드 워크플로우, 및 크로마토그래피 방법(예컨대, 기체 또는 액체 크로마토그래피)를 포함하지만 이에 제한되지는 않는 고체상을 사용한 농축 방법을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다.
구체예에서, 제1 농축 워크플로우는 고체상, 특히 분석물 선택적 기를 전처리된 샘플에 운반하는 고체 비드의 첨가를 포함한다.
구체예에서, 제1 농축 워크플로우는 분석물 선택적 기를 전처리된 샘플에 운반하는 자기 또는 상자기 비드의 첨가를 포함한다. 구체예에서, 자기 비드는 프리델 크래프트 알킬화를 통해 과가교결합되고 -OH 기의 첨가로 추가로 개질된 스타이렌 기반 중합체로 코팅된 자기 코어를 포함한다. 구체예에서, 자기 비드는 디아민(예를 들어 테트라메틸렌디아민 (TMEDA))을 통해 과가교결합되고 추가로 개질되어 이에 의해 디아민이 또한 측쇄 역할을 하는 (즉 TMEDA가 있는 디아민 비드가 사차 및 삼차 아민 관능성을 모두 제공함), 스타이렌 기반 중합체로 코팅된 자기 코어를 포함한다. 완전한 설명에 대해 예를 들어 WO 2019/141779를 참조하라.
구체예에서, 농축 워크플로우 단계 b)에서 자기 비드를 사용하는 것은 교반 또는 혼합을 포함한다. 비드의 관심 항생제 분석물(들)을 포획하기 위한 사전 정의된 인큐베이션 기간이 이어진다. 구체예에서, 워크플로우는 자기 비드와 함께 인큐베이션 한 후 세척 단계(W1)를 포함한다. 항생제 분석물(들)에 따라 하나 이상의 추가 세척 단계(W2)가 실시된다. 하나의 세척 단계(W1, W2)는 자석 또는 전자석을 포함한 자기 비드 처리 단위에 의한 자기 비드의 분리, 액체의 흡인, 세척 완충액의 첨가, 자기 비드의 재현탁, 다른 자기 비드의 분리 단계 및 다른 액체의 흡인을 포함하는 일련의 단계를 포함한다. 또한, 세척 단계는 세척 주기의 부피 및 수 또는 조합을 제외하고는 용매의 유형(물/유기/염/pH) 측면에서 상이할 수 있다. 각각의 파라미터를 선택하는 방법은 당업자에게 일반적으로 공지되어 있다. 최종 세척 단계(W1, W2)에 용리 시약의 첨가가 이어지고 자기 비드의 재현탁 및 관심 분석물(들)이 자기 비드로부터 방출되기 위한 사전 정의된 인큐베이션 기간이 이어진다. 이후 결합된 것이 없는 자기 비드가 분리되고 유도체화된 관심 분석물(들)을 포함하는 상청액이 포획된다.
구체예에서, 제1 농축 워크플로우는 매트릭스 선택적 그룹을 보유하는 자기 비드를 전처리된 샘플에 첨가하는 것을 포함한다. 구체예에서, 자기 비드의 첨가는 교반 또는 혼합을 포함한다. 비드의 매트릭스를 포획하기 위한 사전 정의된 인큐베이션 기간이 이어진다. 여기서, 관심 분석물은 자기 비드에 결합하지 않고 상청액에 잔존한다. 그 후, 자기 비드가 분리되고 농축된 관심 분석물(들)을 포함하는 상청액이 수집된다. 구체예에서, 상청액은 제2 농축 워크플로우, 특히 크로마토그래피 농축 워크플로우를 거친다. 구체예에서, 크로마토그래피 분리는 기체 또는 액체 크로마토그래피이다. 두 방법이 모두 당업자에게 일반적으로 공지되어 있다. 구현예들에서, 상기 액체 크로마토그래피는 HPLC, 고속 LC, 마이크로 LC, 흐름 주입, 및 트랩(trap) 및 용출로 이루어진 군으로부터 선택된다. 여기서, 상청액은 LC 스테이션으로 이송되거나 희석액의 첨가에 의한 희석 단계 후 LC 스테이션으로 이송된다. 예를 들어 용매의 유형 (물/유기/염/pH) 및 부피를 변화시켜 여러 상이한 용리 절차/시약이 또한 사용될 수 있다. 다양한 파라미터가 당업자에게 공지이고 쉽게 선택된다.
특정 구체예에서, 제1 농축 공정은 분석물 선택적 자기 비드의 사용을 포함한다. 구체예에서, 제2 농축 과정은 특히 액체 크로마토그래피를 사용하는 크로마토그래피 분리의 사용을 포함한다. 구체예에서, 분석물 선택적 자기 비드를 사용하는 제1 농축 공정은 액체 크로마토그래피를 사용하는 제2 농축 공정 전에 수행된다.
구체예에서, 샘플 중의 하나 이상의 유도체화된 항생제 분석물의 양 또는 농도 결정은 단계 c)에서 수행된다. 당업자에게 공지된 임의의 적합한 방법이 사용될 수 있다. 특정 구체예에서, 단계 c)는 면역학적 방법 또는 질량 분석법을 사용하여 하나 이상의 유도체화된 항생제 분석물의 양 또는 농도를 결정하는 것을 포함한다.
단계 c)가 면역학적 방법을 사용하여 하나 이상의 항생제 분석물의 양 또는 농도를 결정하는 것을 포함하는 구체예에서, 다음 단계가 포함된다:
i) 환자의 샘플을 하나 이상의 유도체화된 항생제 분석물에 특이적으로 결합하는 하나 이상의 항체와 인큐베이션하여, 항체와 하나 이상의 유도체화된 항생제 분석물 간의 복합체를 생성하는 단계, 및
ii) 단계 i)에서 형성된 복합체를 정량화함으로써, 환자의 샘플 중의 하나 이상의 항생제 분석물의 양을 정량화하는 단계.
특정 구체예들에서, 단계 i)에서 샘플은 하나 이상의 유도체화된 항생제 분석물에 특이적으로 결합하는 2개의 항체와 함께 인큐베이션된다. 당업자에게 명백한 바와 같이, 샘플은 제1 항체/ 유도체화된 항생제 분석물 /제2 항체 복합체를 형성하기에 충분한 시간 동안 그리고 조건하에서 제1 및 제2 항체와 임의의 원하는 순서로, 즉, 제1 항체 먼저 그리고 그후 제2 항체와, 또는 제2 항체 먼저 그리고 그 후 제1 항체와, 또는 동시에, 접촉될 수 있다. 당업자가 용이하게 이해할 것과 같이, 이는 특이적 항체와 유도체화된 항생제 분석물 간의 복합체의 형성 또는 제1 항체, 유도체화된 항생제 분석물, 제2 항체를 포함하는 이차 또는 샌드위치 복합체의 형성에 충분하거나 적절한 시간 및 조건을 확립하기 위한 일상적인 실험에 불과하다.
항체-분석물 복합체의 검출은 임의의 적절한 수단에 의해 수행될 수 있다. 당업자는 이런 수단/방법에 절대적으로 익숙하다. 구체예에서, 항체/항체들은 직접적으로 또는 간접적으로 검출 가능하게 표지된다. 특정 구체예들에서, 항체는 발광 염료, 특히 화학발광 염료 또는 전기화학발광 염료로 검출가능하게 표지된다.
단계 c)가 질량 분석법을 사용하여 하나 이상의 항생제 유도체화된 항생제 분석물의 양 또는 농도를 결정하는 것을 포함하는 구체예에서, 다음 단계가 포함된다:
(i) 유도체화된 항생제 분석물의 이온이 질량 분광 분석의 제1 단계를 거쳐, 이에 의해 유도체화된 항생제 분석물의 모 이온이 이의 질량/전하 (m/z) 비율에 따라 특징지어짐,
(ii) 유도체화된 항생제 분석물 모 이온의 단편화를 유발시킴, 이에 의해 딸 이온이 생성되고, 여기서 유도체화된 항생제 분석물의 딸 이온은 유도체화된 항생제 분석물 모 이온과 m/z 비율이 상이함, 및
(iii) 유도체화된 항생제 분석물의 딸 이온이 질량 분광 분석의 제2 단계를 거침, 이에 의해 유도체화된 항생제 분석물의 딸 이온은 m/z 비율에 따라 특징지어짐.
구체예에서, 측정된 모 및/또는 단편 이온은 표 1에 나타낸 것이다.
구체예에서, 유도체화된 메로페넴+H+의 모 이온은 m/z 값 457.164±0.5에서 측정되고, 유도체화된 피페라실린+H+의 모 이온은 m/z 값 664.235±0.5에서 측정된다.
구체예에서, 유도체화된 메로페넴의 단편 이온은 m/z 값 152±0.5 또는 173±0.5에서 측정되고, 유도체화된 피페라실린의 단편 이온은 m/z 값 270±0.5 또는 464±0.5에서 측정된다.
구체예에서, 방법은 자동화된 방법이다. 특정 구체예에서, 방법은 자동화된 시스템에 의해 수행된다. 특정 구체예에서, 방법은 수동 개입을 포함하지 않는다.
제3 양태에서, 본 발명은 제1 또는 제2 양태의 방법을 수행하기 위해 조정된 분석 시스템에 관한 것이다.
구체예에서, 시스템은 질량 분석법 시스템, 특히 LC/MS 시스템이다. 구체예에서, 분석 시스템은 자동화된 분석 시스템이다. 특정 구체예에서, 분석 시스템은 수동 개입을 필요로 하지 않는다. 즉 시스템의 작동은 전적으로 자동화된다. 특정 구체예에서, LC/MS 시스템은 자동화된 무작위 접근 LC/MS 시스템이다. 구체예에서, MS 장치는 탠덤 질량 분석계, 특히 삼중 사중극자 장치이다. 구체예에서, LC는 HPLC, 특히 RP-HPLC, 또는 급속 LC이다. 구체예에서, 이온 형성은 전기분무 이온화(ESI) 또는 대기압 화학 이온화(APCI), 특히 양극성 모드 ESI를 기반으로 한다.
제4 양태에서, 본 발명은 샘플 중의 하나 이상의 항생제 분석물을 안정화하기에 적합한 친핵성 유도체화 시약을 포함하는 환자 샘플 수집용 샘플링 튜브에 관한 것이다. 구체예에서, 본 발명은 샘플 중의 하나 이상의 항생제 분석물을 안정화시키는 친핵성 유도체화 시약을 포함하는 환자 샘플 수집용 샘플링 튜브에 관한 것이다.
환자 샘플 수집에 사용하기에 적합한 샘플 수집 튜브는 당업계에서 공지되어 있고 실무자에 의해 일상적으로 사용된다. 당업자는 샘플링 튜브가 바람직하게는 실제로 튜브일 것임을 이해할 것이다. 특히, 샘플링 튜브는 자동화된 분석기, 예를 들어 Roche Diagnostics의 Elecsys® 분석기의 샘플 수용 스테이션의 요건에 맞게 적합화된 크기 및 치수를 갖는다. 샘플링 튜브는 원추형 또는 바람직하게는 둥근 바닥을 가질 수 있다. 임상적 일상에서 시중의 분석기 시스템과 호환되는 표준 튜브 크기가 사용된다. 표준 및 선호되는 튜브는 예를 들어 다음 치수를 갖는다: 13x75 mm; 13x100 mm, 또는 16x100 mm.
구체예에서, 본 발명에 따른 샘플링 튜브는 한 번만 사용된다. 즉 일회용 장치이다. 특정 구체예에서, 본 발명에 따른 샘플링 튜브는 샘플의 수집에 적절할 뿐만 아니라 샘플의 추가 처리를 허용하도록 적합화된다. 친핵성 유도체화 시약이 들어 있는 샘플링 튜브에 샘플을 수집함으로써, 원하는 결과, 즉 항생제 분석물의 유도체화가 달성된다.
구체예에서, 친핵성 유도체화 시약은 아민 기, 특히 1차 또는 2차 아민, 특히 1차 아민 기를 포함한다. 구체예에서, 친핵성 유도체화 시약은 3 개 이상의 C-원자, 특히 3 내지 20 개의 C-원자, 특히 3 내지 10 개의 C-원자, 특히 3-5 개의 C-원자, 특히 4 개의 C-원자를 포함한다. 구체예에서, 친핵성 유도체화 시약은 선형 또는 분지형, 특히 선형 아민, 특히 선형 1차 아민, 특히 3 내지 5 개의 C-원자를 포함하는 선형 1차 아민이다. 구체예에서, 친핵성 유도체화 시약은 프로필아민, 부틸아민, 또는 펜틸아민, 특히 1차 선형 부틸아민 또는 1차 선형 펜틸아민으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
구체예에서, 친핵성 유도체화 시약은 그의 화학적 모이어티 중 적어도 하나에서 항생제 분석물을 유도체화한다. 화학 분야의 숙련자는 특히 친핵성 유도체화 시약으로 유도체화하기에 적합한 화학적 모이어티를 잘 알고 있다. 특정 구체예에서, 친핵성 유도체화 시약은 그의 화학적 모이어티 중 하나, 둘 또는 셋에서 항생제 분석물을 유도체화한다.
특정 구체예에서, 친핵성 유도체화 시약은 항생제 분석물이 메로페넴인 경우 부틸아민을 포함한다.
특정 구체예에서, 친핵성 유도체화 시약은 항생제 분석물이 피페라실린인 경우 펜틸아민을 포함한다.
구체예에서, 친핵성 유도체화 시약은 액체 또는 동결건조 형태로 포함된다. 구체예에서, 친핵성 유도체화 시약은 특히 DBU, TEA, DIPEA, Na3PO4, Na2CO3, 및 Cs2CO3으로 이루어진 군으로부터 선택된, 안정하고 물과 혼화성인 비친핵성 염기를 추가로 포함한다. 구체예에서, 친핵성 유도체화 시약은 용매, 특히 물, CH3CN, THF, 디옥산, DMF, DMSO, 아세톤, t-부틸 알코올, 디글라임, DME, MeOH, EtOH, 1-PrOH, 2-PrOH, 에틸렌 글리콜, 헥사메틸포스포라미드 (HMPA), 헥사메틸포스포러스 트리아미드 (HMPT), 및 글리세린으로 이루어진 군으로부터 선택된 용매, 특히 물, CH3CN, THF, 디옥산, DMF, DMSO, 아세톤, tBuOH, 디글라임, 및 DME로 구성된 군으로부터 선택된 용매에 액체 형태로 포함된다.
제5 양태에서, 본 발명은 샘플 중의 하나 이상의 항생제 분석물의 양 또는 농도 결정을 위한 친핵성 유도체화 시약의 용도에 관한 것이다.
구체예에서, 친핵성 유도체화 시약은 아민 기, 특히 1차 또는 2차 아민, 특히 1차 아민 기를 포함하는 시약이다. 구체예에서, 친핵성 유도체화 시약은 3 개 이상의 C-원자, 특히 3 내지 20 개의 C-원자, 특히 3 내지 10 개의 C-원자, 특히 3-5 개의 C-원자, 특히 4 개의 C-원자를 포함한다. 구체예에서, 친핵성 유도체화 시약은 선형 또는 분지형, 특히 선형 아민, 특히 선형 1차 아민, 특히 3 내지 5 개의 C-원자를 포함하는 선형 1차 아민이다. 구체예에서, 유도체화 시약은 프로필아민, 부틸아민, 또는 펜틸아민, 특히 1차 선형 부틸아민으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
구체예에서, 항생제 물질은 β-락탐 항생제 물질이다. 구체예에서, 항생제 물질은 아목시실린, 암피실린, 바캄피실린, 카르베니실린, 클록사실린, 디클록사실린, 플루클록사실린, 메즐로실린, 나프실린, 옥사실린, 테모실린, 페네티실린, 페니실린 G, 페니실린 V, 피페라실린, 아즐로실린, 피밤피실린, 피브메실리남, 티카르실린, 세파세트릴(세파세트릴), 세파드록실 (세파드록실), 세팔렉신 (세팔렉신), 세팔렉신 (세팔렉신), 세팔로글리신 (세팔로글리신), 세팔로늄 (세팔로늄), 세팔로리딘 (세팔로라딘), 세팔로틴 (세팔로틴), 세팔로틴 (세팔로틴), 세파피린 (세파피린), 세파트리진, 세파자플루르, 세파제돈, 세파졸린 (세파졸린), 세프라딘 (세프라딘), 세프라딘 (세프라딘), 세프록사딘, 세프록사딘, 세프테졸, 세파클로르, 세파만돌, 세프메타졸, 세포니시드, 세포테탄, 세폭시틴, 세프로질 (세프록실), 세푸록심, 세푸조남, 세프카펜, 세프달록심, 세프디니르, 세프디토렌, 세페타메트, 세픽심, 세프메녹심, 세포디짐, 세포탁심, 세프피미졸, 세프포독심, 세프테람, 세프티부텐, 세프티오푸르, 세프티올렌, 세프티족심, 세프트리악손, 세포페라존, 세프타지딤, 세프클리딘, 세페핌, 세플루프레남, 세포셀리스, 세포조프란, 세프피롬, 세프퀴놈, 세프토비프롤, 세프타롤린, 세파클로메진, 세팔로람, 세파파롤, 세프카넬, 세페드롤로르, 세펨피돈, 세페트리졸, 세피비트릴, 세프마틸렌, 세프메피듐, 세포베신, 세폭사졸, 세프로틸, 세프수미드, 세푸라세팀, 세프티옥시드, 세프톨로잔, 이미페넴, 도리페넴, 에르타페넴, 메로페넴, 아즈트레오남, 메실리남, 메탐피실린, 탈람피실린, 에피실린, 설베니실린, 파로페넴, 리티페넴, 비아페넴, 피밤피실린, 클로메토실린, 페나메실린, 헤타실린, 카린다실린, 파니페넴, 티게모남, 카루모남, 노카르디신 A, 페남, 설박탐, 타조박탐, 클라밤, 및 클라불란산으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 특정 구체예에서, 항생제 분석물은 메로페넴 또는 피페라실린이다.
구체예에서, 친핵성 유도체화 시약은 항생제 물질을 안정화시킨다. 구체예에서, 친핵성 유도체화 시약은 샘플 중의 하나 이상의 항생제 분석물의 양 또는 농도를 결정하는 동안 항생제 물질의 가수분해를 방지한다. 구체예에서, 친핵성 유도체화 시약은 항생제 분석물 및 친핵성 유도체화 시약의 공유 부가생성물 형성에 의해 항생제 물질을 안정화시킨다.
구체예에서, 친핵성 유도체화 시약은 그의 화학적 모이어티 중 적어도 하나에서 항생제 분석물을 안정화시킨다. 화학 분야의 숙련자는 특히 친핵성 유도체화 시약으로 유도체화하기에 적합한 화학적 모이어티를 잘 알고 있다. 특정 구체예에서, 친핵성 유도체화 시약은 그의 화학적 모이어티 중 하나, 둘 또는 셋에서 항생제 분석물을 유도체화한다. 특정 구체예에서, 친핵성 유도체화 시약은 그의 β-락탐 고리와 반응함으로써 항생제 분석물을 안정화시킨다.
항생제 분석물이 메로페넴인 특정 구체예에서, 부틸아민을 포함하는 친핵성 유도체화 시약이 메로페넴을 안정화시키기 위해 사용된다. 또한 도 3을 참조하라.
항생제 분석물이 피페라실린인 특정 구체예에서, 부틸아민 또는 펜틸아민을 포함하는 친핵성 유도체화 시약이 피페라실린을 안정화시키기 위해 사용된다. 또한 도 4를 참조하라.
항생제 분석물이 피페라실린인 특정 구체예에서, 부틸아민 또는 펜틸아민을 포함하는 친핵성 유도체화 시약이 그의 화학적 모이어티 중 둘에서 피페라실린을 안정화시키기 위해 사용되고, 특히 β-락탐 고리 및 피페라진 고리에서 유도체화된다. 또한 도 4를 참조하라.
구체예에서, 친핵성 유도체화 시약은 항생제 물질을 2 시간 이상 동안, 4 시간 이상 동안, 8 시간 이상 동안, 12 시간 이상 동안, 15 시간 이상 동안, 24 시간 이상 동안, 48 시간 이상 동안, 7 일 이상 동안, 2 주 이상 동안, 4 주 이상 동안, 2 개월 이상 동안, 3 개월 이상 동안, 4 개월 이상 동안, 5 개월 이상 동안, 또는 6 개월 이상 동안 안정화시켰다. 특정 구체예에서, 친핵성 유도체화 시약은 8 시간 이상 동안, 특히 12 시간 이상 동안 항생제 물질을 안정화시켰다. 특정 구체예에서, 친핵성 유도체화 시약은 항생제 물질을 15 시간 이상 동안 안정화시켰다. 특정 구체예에서, 친핵성 유도체화 시약은 항생제 물질을 적어도 16 시간 동안 안정화시켰다. 특정 구체예에서, 친핵성 유도체화 시약은 항생제 물질을 16 시간 동안 안정화시켰다.
제6 양태에서, 본 발명은 관심 샘플 중의 항생제 분석물을 안정화하기 위한 친핵성 유도체화 시약의 용도에 관한 것이다.
구체예에서, 친핵성 유도체화 시약은 아민 기, 특히 1차 또는 2차 아민, 특히 1차 아민 기를 포함하는 시약이다. 구체예에서, 친핵성 유도체화 시약은 3 개 이상의 C-원자, 특히 3 내지 20 개의 C-원자, 특히 3 내지 10 개의 C-원자, 특히 3-5 개의 C-원자, 특히 4 개의 C-원자를 포함한다. 구체예에서, 친핵성 유도체화 시약은 선형 또는 분지형, 특히 선형 아민, 특히 선형 1차 아민, 특히 3 내지 5 개의 C-원자를 포함하는 선형 1차 아민이다. 구체예에서, 유도체화 시약은 프로필아민, 부틸아민, 또는 펜틸아민, 특히 1차 선형 부틸아민으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
구체예에서, 항생제 물질은 β-락탐 항생제 물질이다. 구체예에서, 항생제 물질은 아목시실린, 암피실린, 바캄피실린, 카르베니실린, 클록사실린, 디클록사실린, 플루클록사실린, 메즐로실린, 나프실린, 옥사실린, 테모실린, 페네티실린, 페니실린 G, 페니실린 V, 피페라실린, 아즐로실린, 피밤피실린, 피브메실리남, 티카르실린, 세파세트릴(세파세트릴), 세파드록실 (세파드록실), 세팔렉신 (세팔렉신), 세팔렉신 (세팔렉신), 세팔로글리신 (세팔로글리신), 세팔로늄 (세팔로늄), 세팔로리딘 (세팔로라딘), 세팔로틴 (세팔로틴), 세팔로틴 (세팔로틴), 세파피린 (세파피린), 세파트리진, 세파자플루르, 세파제돈, 세파졸린 (세파졸린), 세프라딘 (세프라딘), 세프라딘 (세프라딘), 세프록사딘, 세프록사딘, 세프테졸, 세파클로르, 세파만돌, 세프메타졸, 세포니시드, 세포테탄, 세폭시틴, 세프로질 (세프록실), 세푸록심, 세푸조남, 세프카펜, 세프달록심, 세프디니르, 세프디토렌, 세페타메트, 세픽심, 세프메녹심, 세포디짐, 세포탁심, 세프피미졸, 세프포독심, 세프테람, 세프티부텐, 세프티오푸르, 세프티올렌, 세프티족심, 세프트리악손, 세포페라존, 세프타지딤, 세프클리딘, 세페핌, 세플루프레남, 세포셀리스, 세포조프란, 세프피롬, 세프퀴놈, 세프토비프롤, 세프타롤린, 세파클로메진, 세팔로람, 세파파롤, 세프카넬, 세페드롤로르, 세펨피돈, 세페트리졸, 세피비트릴, 세프마틸렌, 세프메피듐, 세포베신, 세폭사졸, 세프로틸, 세프수미드, 세푸라세팀, 세프티옥시드, 세프톨로잔, 이미페넴, 도리페넴, 에르타페넴, 메로페넴, 아즈트레오남, 메실리남, 메탐피실린, 탈람피실린, 에피실린, 설베니실린, 파로페넴, 리티페넴, 비아페넴, 피밤피실린, 클로메토실린, 페나메실린, 헤타실린, 카린다실린, 파니페넴, 티게모남, 카루모남, 노카르디신 A, 페남, 설박탐, 타조박탐, 클라밤, 및 클라불란산으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 특정 구체예에서, 항생제 분석물은 메로페넴 또는 피페라실린이다.
구체예에서, 친핵성 유도체화 시약은 항생제 물질을 안정화시킨다. 구체예에서, 친핵성 유도체화 시약은 샘플 중의 하나 이상의 항생제 분석물의 양 또는 농도를 결정하는 동안 항생제 물질의 가수분해를 방지한다. 구체예에서, 친핵성 유도체화 시약은 항생제 분석물 및 친핵체 유도체화 시약의 공유 부가생성물 형성에 의해 항생제 물질을 안정화시킨다. 구체예에서, 친핵성 유도체화 시약은 항생제 물질을 2 시간 이상 동안, 4 시간 이상 동안, 8 시간 이상 동안, 12 시간 이상 동안, 15 시간 이상 동안, 24 시간 이상 동안, 48 시간 이상 동안, 7 일 이상 동안, 2 주 이상 동안, 4 주 이상 동안, 2 개월 이상 동안, 3 개월 이상 동안, 4 개월 이상 동안, 5 개월 이상 동안, 또는 6 개월 이상 동안 안정화시켰다. 특정 구체예에서, 친핵성 유도체화 시약은 8 시간 이상 동안, 특히 12 시간 이상 동안 항생제 물질을 안정화시켰다. 특정 구체예에서, 친핵성 유도체화 시약은 항생제 물질을 15 시간 이상 동안 안정화시켰다. 특정 구체예에서, 친핵성 유도체화 시약은 항생제 물질을 적어도 16 시간 동안 안정화시켰다. 특정 구체예에서, 친핵성 유도체화 시약은 항생제 물질을 16 시간 동안 안정화시켰다.
제7 양태에서, 본 발명은 친핵성 유도체화 시약에 의해 안정화된 항생제 분석물에 관한 것이다.
구체예에서, 친핵성 유도체화 시약은 샘플 중의 하나 이상의 항생제 분석물의 양 또는 농도를 결정하는 동안 항생제 물질의 가수분해를 방지한다. 구체예에서, 항생제 물질은 항생제 분석물과 친핵성 유도체화 시약의 공유 부가생성물 형성으로 인해 친핵성 유도체화 시약에 의해 안정화된다. 구체예에서, 항생제 물질은 친핵성 유도체화 시약에 의해 2 시간 이상 동안, 4 시간 이상 동안, 8 시간 이상 동안, 12 시간 이상 동안, 15 시간 이상 동안, 24 시간 이상 동안, 48 시간 이상 동안, 7 일 이상 동안, 2 주 이상 동안, 4 주 이상 동안, 2 개월 이상 동안, 3 개월 이상 동안, 4 개월 이상 동안, 5 개월 이상 동안, 또는 6 개월 이상 동안 안정화되었다. 특정 구체예에서, 항생제 물질은 8 시간 이상 동안, 특히 12 시간 이상 동안 친핵성 유도체화 시약에 의해 안정화된다. 특정 구체예에서, 항생제 물질은 15 시간 이상 동안 친핵성 유도체화 시약에 의해 안정화된다. 특정 구체예에서, 항생제 물질은 적어도 16 시간 동안 친핵성 유도체화 시약에 의해 안정화된다. 특정 구체예에서, 항생제 물질은 16 시간 동안 친핵성 유도체화 시약에 의해 안정화된다.
구체예에서, 항생제 물질은 β-락탐 항생제 물질이다. 구체예에서, 항생제 물질은 아목시실린, 암피실린, 바캄피실린, 카르베니실린, 클록사실린, 디클록사실린, 플루클록사실린, 메즐로실린, 나프실린, 옥사실린, 테모실린, 페네티실린, 페니실린 G, 페니실린 V, 피페라실린, 아즐로실린, 피밤피실린, 피브메실리남, 티카르실린, 세파세트릴(세파세트릴), 세파드록실 (세파드록실), 세팔렉신 (세팔렉신), 세팔렉신 (세팔렉신), 세팔로글리신 (세팔로글리신), 세팔로늄 (세팔로늄), 세팔로리딘 (세팔로라딘), 세팔로틴 (세팔로틴), 세팔로틴 (세팔로틴), 세파피린 (세파피린), 세파트리진, 세파자플루르, 세파제돈, 세파졸린 (세파졸린), 세프라딘 (세프라딘), 세프라딘 (세프라딘), 세프록사딘, 세프록사딘, 세프테졸, 세파클로르, 세파만돌, 세프메타졸, 세포니시드, 세포테탄, 세폭시틴, 세프로질 (세프록실), 세푸록심, 세푸조남, 세프카펜, 세프달록심, 세프디니르, 세프디토렌, 세페타메트, 세픽심, 세프메녹심, 세포디짐, 세포탁심, 세프피미졸, 세프포독심, 세프테람, 세프티부텐, 세프티오푸르, 세프티올렌, 세프티족심, 세프트리악손, 세포페라존, 세프타지딤, 세프클리딘, 세페핌, 세플루프레남, 세포셀리스, 세포조프란, 세프피롬, 세프퀴놈, 세프토비프롤, 세프타롤린, 세파클로메진, 세팔로람, 세파파롤, 세프카넬, 세페드롤로르, 세펨피돈, 세페트리졸, 세피비트릴, 세프마틸렌, 세프메피듐, 세포베신, 세폭사졸, 세프로틸, 세프수미드, 세푸라세팀, 세프티옥시드, 세프톨로잔, 이미페넴, 도리페넴, 에르타페넴, 메로페넴, 아즈트레오남, 메실리남, 메탐피실린, 탈람피실린, 에피실린, 설베니실린, 파로페넴, 리티페넴, 비아페넴, 피밤피실린, 클로메토실린, 페나메실린, 헤타실린, 카린다실린, 파니페넴, 티게모남, 카루모남, 노카르디신 A, 페남, 설박탐, 타조박탐, 클라밤, 및 클라불란산으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 특정 구체예에서, 항생제 분석물은 메로페넴 또는 피페라실린이다.
구체예에서, 친핵성 유도체화 시약은 아민 기, 특히 1차 또는 2차 아민, 특히 1차 아민 기를 포함하는 시약이다. 구체예에서, 친핵성 유도체화 시약은 3 개 이상의 C-원자, 특히 3 내지 20 개의 C-원자, 특히 3 내지 10 개의 C-원자, 특히 3-5 개의 C-원자, 특히 4 개의 C-원자를 포함한다. 구체예에서, 친핵성 유도체화 시약은 선형 또는 분지형, 특히 선형 아민, 특히 선형 1차 아민, 특히 3 내지 5 개의 C-원자를 포함하는 선형 1차 아민이다. 구체예에서, 유도체화 시약은 프로필아민, 부틸아민, 또는 펜틸아민, 특히 1차 선형 부틸아민으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
구체예에서, 항생제 분석물은 그의 화학적 모이어티 중 적어도 하나에서 친핵성 유도체화 시약에 의해 안정화된다. 화학 분야의 숙련자는 특히 친핵성 유도체화 시약으로 유도체화하기에 적합한 화학적 모이어티를 잘 알고 있다. 특정 구체예에서, 항생제 분석물은 그의 화학적 모이어티 중 하나, 둘 또는 셋에서 친핵성 유도체화 시약에 의해 유도체화된다. 특정 구체예에서, 항생제 분석물은 그의 β-락탐 고리와 반응함으로써 친핵성 유도체화 시약에 의해 안정화된다.
항생제 분석물이 메로페넴인 특정 구체예에서, 부틸아민을 포함하는 친핵성 유도체화 시약이 메로페넴을 안정화시키기 위해 사용된다. 또한 도 3을 참조하라.
항생제 분석물이 피페라실린인 특정 구체예에서, 부틸아민 또는 펜틸아민을 포함하는 친핵성 유도체화 시약이 피페라실린을 안정화시키기 위해 사용된다. 또한 도 4를 참조하라.
항생제 분석물이 피페라실린인 특정 구체예에서, 부틸아민 또는 펜틸아민을 포함하는 친핵성 유도체화 시약이 그의 화학적 모이어티 중 둘에서 피페라실린을 안정화시키기 위해 사용되고, 특히 β-락탐 고리 및 피페라진 고리에서 유도체화된다. 또한 도 4를 참조하라.
본 발명은 또한 다음 항목에 관한 것이다:
1) 다음 단계를 포함하는, 수득된 샘플 중의 하나 이상의 유도체화된 항생제 분석물의 양 또는 농도를 결정하는 (자동화된) 방법
a) 선택적으로, 특히 자기 비드를 사용하여, 샘플을 전처리 및/또는 농축하는 단계, 및
b) 샘플 중의 하나 이상의 항생제 분석물의 양 또는 농도를 결정하는 단계.
2) 항목 1의 방법, 여기서 항생제 분석물은 락탐 항생제 분석물이다.
3) 항목 1 또는 2의 방법, 여기서 항생제 분석물은 β-락탐 항생제 분석물이다.
4) 항목 1 내지 3 중 어느 하나의 방법, 여기서 항생제 분석물은 아목시실린, 암피실린, 바캄피실린, 카르베니실린, 클록사실린, 디클록사실린, 플루클록사실린, 메즐로실린, 나프실린, 옥사실린, 테모실린, 페네티실린, 페니실린 G, 페니실린 V, 피페라실린, 아즐로실린, 피밤피실린, 피브메실리남, 티카르실린, 세파세트릴(세파세트릴), 세파드록실 (세파드록실), 세팔렉신 (세팔렉신), 세팔렉신 (세팔렉신), 세팔로글리신 (세팔로글리신), 세팔로늄 (세팔로늄), 세팔로리딘 (세팔로라딘), 세팔로틴 (세팔로틴), 세팔로틴 (세팔로틴), 세파피린 (세파피린), 세파트리진, 세파자플루르, 세파제돈, 세파졸린 (세파졸린), 세프라딘 (세프라딘), 세프라딘 (세프라딘), 세프록사딘, 세프록사딘, 세프테졸, 세파클로르, 세파만돌, 세프메타졸, 세포니시드, 세포테탄, 세폭시틴, 세프로질 (세프록실), 세푸록심, 세푸조남, 세프카펜, 세프달록심, 세프디니르, 세프디토렌, 세페타메트, 세픽심, 세프메녹심, 세포디짐, 세포탁심, 세프피미졸, 세프포독심, 세프테람, 세프티부텐, 세프티오푸르, 세프티올렌, 세프티족심, 세프트리악손, 세포페라존, 세프타지딤, 세프클리딘, 세페핌, 세플루프레남, 세포셀리스, 세포조프란, 세프피롬, 세프퀴놈, 세프토비프롤, 세프타롤린, 세파클로메진, 세팔로람, 세파파롤, 세프카넬, 세페드롤로르, 세펨피돈, 세페트리졸, 세피비트릴, 세프마틸렌, 세프메피듐, 세포베신, 세폭사졸, 세프로틸, 세프수미드, 메로페넴, 아즈트레오남, 메실리남, 메탐피실린, 탈람피실린, 에피실린, 설베니실린, 파로페넴, 리티페넴, 비아페넴, 피밤피실린, 클로메토실린, 페나메실린, 헤타실린, 카린다실린, 파니페넴, 티게모남, 카루모남, 노카르디신 A, 페남, 설박탐, 타조박탐, 클라밤, 및 클라불란산으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 특정 구체예에서, 항생제 분석물은 메로페넴 또는 피페라실린이다.
5) 항목 1 내지 4 중 어느 하나의 방법, 여기서 항생제 분석물은 메로페넴 또는 피페라실린이다.
6) 항목 1 내지 5 중 어느 하나의 방법, 여기서 항생제 분석물은 친핵성 유도체화 시약, 특히 아민 기, 특히 1차 또는 2차 아민, 특히 1차 아민 기를 포함하는 시약으로 유도체화된다.
7) 항목 1 내지 6 중 어느 하나의 방법, 여기서 항생제 분석물은 3 개 이상의 C-원자, 특히 3 내지 20 개의 C-원자, 특히 3 내지 10 개의 C-원자, 특히 3-5 개의 C-원자, 특히 4 개의 C-원자를 포함하는 친핵성 유도체화 시약으로 유도체화된다.
8) 항목 1 내지 7 중 어느 하나의 방법, 여기서 항생제 분석물은 선형 또는 분지형 친핵성 유도체화 시약, 특히 선형 아민, 특히 선형 1차 아민, 특히 3 내지 5 개의 C-원자를 포함하는 선형 1차 아민으로 유도체화된다.
9) 항목 1 내지 8 중 어느 하나의 방법, 여기서 항생제 분석물은 프로필아민, 부틸아민, 또는 펜틸아민, 특히 1차 선형 부틸아민으로 이루어진 군으로부터 선택되는 친핵성 유도체화 시약으로 유도체화된다.
10) 항목 1 내지 9 중 어느 하나의 방법, 여기서 농축 단계 a)는 적어도 하나의 농축 워크플로우를 포함한다.
11) 항목 1 내지 9 중 어느 하나의 방법, 여기서 농축 단계 a)는 자기 비드, 특히 타입 A 또는 B 자기 비드를 사용하는 것을 포함한다.
12) 항목 1 내지 11 중 어느 하나의 방법, 여기서 농축 단계 a)는 두 개의 농축 단계, 특히 자기 비드를 사용하는 것을 포함하는 제1 농축 단계, 및 증발을 사용하는 제2 농축 단계를 포함한다.
13) 항목 1 내지 12 중 어느 하나의 방법, 여기서 단계 b)에서 유도체화된 항생제 분석물의 양 또는 농도는 면역학적 분석 또는 LC/MS를 사용하여 결정된다.
14) 항목 1 내지 13 중 어느 하나의 방법, 여기서 단계 b)에서 유도체화된 항생제 분석물의 양 또는 농도는 LC/MS를 사용하여 결정되고, 여기서 LC는 HPLC, 특히 RP-HPLC, 또는 급속 LC이다.
15) 항목 1 내지 14 중 어느 하나의 방법, 여기서 단계 b)에서 유도체화된 항생제 분석물의 양 또는 농도는 LC/MS를 사용하여 결정되고, 여기서 이온 형성은 전기분무 이온화(ESI), 특히 양극성 모드 ESI를 기반으로 한다.
16) 항목 1 내지 15 중 어느 하나의 방법, 여기서 단계 b)에서 유도체화된 항생제 분석물의 양 또는 농도는 LC/MS를 사용하여 결정되고, 여기서 MS 장치는 탠덤 질량 분석계, 특히 삼중 사중극자 장치, 특히 자동화된 무작위 접근 LC/MS 시스템이다.
17) 항목 1 내지 16 중 어느 하나의 방법, 여기서 단계 b)에서 유도체화된 항생제 분석물의 양 또는 농도는 LC/MS를 사용하여 결정되고, 여기서 유도체화된 메로페넴+H+의 모 이온은 m/z 값 457.164±0.5에서 측정되고, 유도체화된 피페라실린+H+의 모 이온은 m/z 값 664.235±0.5에서 측정된다.
18) 항목 1 내지 17 중 어느 하나의 방법, 여기서 단계 b)에서 유도체화된 항생제 분석물의 양 또는 농도는 LC/MS를 사용하여 결정되고, 여기서 유도체화된 메로페넴의 단편 이온은 m/z 값 152±0.5 또는 173±0.5에서 측정되고, 유도체화된 피페라실린의 단편 이온은 m/z 값 270±0.5 또는 464±0.5에서 측정된다.
19) 다음 단계를 포함하는, 수득된 샘플 중의 하나 이상의 항생제 분석물의 양 또는 농도를 결정하는 (자동화된) 방법
a) 샘플을 유도체화 시약으로 전처리하는 단계, 여기서 유도체화 시약은 친핵체를 포함함,
b) 선택적으로, 특히 자기 비드를 사용하여, 단계 a) 후 수득된 샘플을 농축하는 단계, 및
c) 단계 a) 후 또는 선택적인 농축 단계 b) 후 수득된 전처리된 샘플 중의 하나 이상의 항생제 분석물(들)의 양 또는 농도를 결정하는 단계.
20) 항목 19의 방법, 여기서 항생제 분석물은 락탐 항생제 분석물이다.
21) 항목 19 또는 20의 방법, 여기서 항생제 분석물은 β-락탐 항생제 분석물이다.
22) 항목 19 내지 21 중 어느 하나의 방법, 여기서 항생제 분석물은 아목시실린, 암피실린, 바캄피실린, 카르베니실린, 클록사실린, 디클록사실린, 플루클록사실린, 메즐로실린, 나프실린, 옥사실린, 테모실린, 페네티실린, 페니실린 G, 페니실린 V, 피페라실린, 아즐로실린, 피밤피실린, 피브메실리남, 티카르실린, 세파세트릴(세파세트릴), 세파드록실 (세파드록실), 세팔렉신 (세팔렉신), 세팔렉신 (세팔렉신), 세팔로글리신 (세팔로글리신), 세팔로늄 (세팔로늄), 세팔로리딘 (세팔로라딘), 세팔로틴 (세팔로틴), 세팔로틴 (세팔로틴), 세파피린 (세파피린), 세파트리진, 세파자플루르, 세파제돈, 세파졸린 (세파졸린), 세프라딘 (세프라딘), 세프라딘 (세프라딘), 세프록사딘, 세프록사딘, 세프테졸, 세파클로르, 세파만돌, 세프메타졸, 세포니시드, 세포테탄, 세폭시틴, 세프로질 (세프록실), 세푸록심, 세푸조남, 세프카펜, 세프달록심, 세프디니르, 세프디토렌, 세페타메트, 세픽심, 세프메녹심, 세포디짐, 세포탁심, 세프피미졸, 세프포독심, 세프테람, 세프티부텐, 세프티오푸르, 세프티올렌, 세프티족심, 세프트리악손, 세포페라존, 세프타지딤, 세프클리딘, 세페핌, 세플루프레남, 세포셀리스, 세포조프란, 세프피롬, 세프퀴놈, 세프토비프롤, 세프타롤린, 세파클로메진, 세팔로람, 세파파롤, 세프카넬, 세페드롤로르, 세펨피돈, 세페트리졸, 세피비트릴, 세프마틸렌, 세프메피듐, 세포베신, 세폭사졸, 세프로틸, 세프수미드, 세푸라세팀, 세프티옥시드, 세프톨로잔, 이미페넴, 도리페넴, 에르타페넴, 메로페넴, 아즈트레오남, 메실리남, 메탐피실린, 탈람피실린, 에피실린, 설베니실린, 파로페넴, 리티페넴, 비아페넴, 피밤피실린, 클로메토실린, 페나메실린, 헤타실린, 카린다실린, 파니페넴, 티게모남, 카루모남, 노카르디신 A, 페남, 설박탐, 타조박탐, 클라밤, 및 클라불란산으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 특정 구체예에서, 항생제 분석물은 메로페넴 또는 피페라실린이다.
23) 항목 19 내지 22 중 어느 하나의 방법, 여기서 항생제 분석물은 메로페넴 또는 피페라실린이다.
24) 항목 19 내지 23 중 어느 하나의 방법, 여기서 단계 a)에서 샘플은 아민 기, 특히 1차 또는 2차 아민, 특히 1차 아민 기를 포함하는 친핵성 유도체화 시약으로 전처리된다.
25) 항목 19 내지 24 중 어느 하나의 방법, 여기서 단계 a)에서 샘플은 3 개 이상의 C-원자, 특히 3 내지 20 개의 C-원자, 특히 3 내지 10 개의 C-원자, 특히 3-5 개의 C-원자, 특히 4 개의 C-원자를 포함하는 친핵성 유도체화 시약으로 전처리된다.
26) 항목 19 내지 25 중 어느 하나의 방법, 여기서 단계 a)에서 샘플은 선형 또는 분지형 친핵성 유도체화 시약, 특히 선형 아민, 특히 선형 1차 아민, 특히 3 내지 5 개의 C-원자를 포함하는 선형 1차 아민으로 전처리된다.
27) 항목 19 내지 28 중 어느 하나의 방법, 여기서 단계 a)에서 샘플은 프로필아민, 부틸아민, 또는 펜틸아민, 특히 1차 선형 부틸아민으로 이루어진 군으로부터 선택된 친핵성 유도체화 시약으로 전처리된다.
28) 항목 19 내지 27 중 어느 하나의 방법, 여기서 단계 a)에서 샘플은 용매, 특히 물, CH3CN, THF, 디옥산, DMF, DMSO, 아세톤, t-부틸 알코올, 디글라임, DME, MeOH, EtOH, 1-PrOH, 2-PrOH, 에틸렌 글리콜, 헥사메틸포스포라미드 (HMPA), 헥사메틸포스포러스 트리아미드 (HMPT), 및 글리세린으로 이루어진 군으로부터 선택된 용매, 특히 물, CH3CN, THF, 디옥산, DMF, DMSO, 아세톤, tBuOH, 디글라임, 및 DME로 구성된 군으로부터 선택된 용매에 포함된 친핵성 유도체화 시약으로 전처리된다.
29) 항목 19 내지 28 중 어느 하나의 방법, 여기서 단계 a)에서 샘플은 특히 DBU, TEA, DIPEA, Na3PO4, Na2CO3, 및 Cs2CO3으로 이루어진 군으로부터 선택된, 안정하고 물과 혼화성인 비친핵성 염기를 추가로 포함하는 용매에 포함된 친핵성 유도체화 시약으로 전처리된다.
30) 항목 19 내지 29 중 어느 하나의 방법, 여기서 단계 a)에서 샘플은 분석물이 메로페넴인 경우 부틸아민을 포함하는 친핵성 유도체화 시약으로 전처리된다.
31) 항목 19 내지 30 중 어느 하나의 방법, 여기서 단계 a)에서 샘플은 분석물이 피페라실린인 경우 펜틸아민을 포함하는 친핵성 유도체화 시약으로 전처리된다.
32) 항목 19 내지 31 중 어느 하나의 방법, 여기서 단계 a)에서 샘플은 샘플이 수득된 직후, 특히 샘플이 수득된 후 10 분 이내에, 특히 샘플이 수득된 후 5 분 이내에 친핵성 유도체화 시약으로 전처리된다.
33) 항목 19 내지 31 중 어느 하나의 방법, 여기서 단계 a)에서 샘플은 친핵성 유도체화 시약 샘플로 2 분 이상 동안, 특히 5 분 이상 동안, 특히 30 분 이상 동안 전처리된다.
34) 항목 19 내지 33 중 어느 하나의 방법, 여기서 단계 a) 후 수득된 샘플은 유도체화된 항생제 분석물, 특히 친핵성 유도체화 시약으로 유도체화된 항생제 분석물을 포함한다.
35) 항목 19 내지 34 중 어느 하나의 방법, 여기서 단계 a) 후 수득된 샘플은 유도체화된 β-락탐 항생제 분석물을 포함하고, 여기서 베타-락탐 모이어티는 친핵성 유도체화 시약과의 반응에 의해 파괴된다.
36) 항목 19 내지 35 중 어느 하나의 방법, 여기서 농축 단계 b)는 적어도 하나의 농축 워크플로우를 포함한다.
37) 항목 19 내지 36 중 어느 하나의 방법, 여기서 농축 단계 b)는 자기 비드, 특히 타입 A 또는 B 자기 비드를 사용하는 것을 포함한다.
38) 항목 19 내지 37 중 어느 하나의 방법, 여기서 농축 단계 b)는 두 개의 농축 단계, 특히 자기 비드를 포함하는 제1 농축 단계, 및 증발을 사용하는 제2 농축 단계를 포함한다.
39) 항목 19 내지 38 중 어느 하나의 방법, 여기서 단계 c)에서 항생제 분석물의 양 또는 농도는 면역학적 분석 또는 LC/MS를 사용하여 결정된다.
40) 항목 19 내지 39 중 어느 하나의 방법, 여기서 단계 c)에서 항생제 분석물의 양 또는 농도는 LC/MS를 사용하여 결정되고, 여기서 LC는 HPLC, 특히 RP-HPLC, 또는 급속 LC이다.
41) 항목 19 내지 40 중 어느 하나의 방법, 여기서 단계 c)에서 항생제 분석물의 양 또는 농도는 LC/MS를 사용하여 결정되고, 여기서 이온 형성은 전기분무 이온화(ESI), 특히 양극성 모드 ESI를 기반으로 한다.
42) 항목 19 내지 41 중 어느 하나의 방법, 여기서 단계 c)에서 항생제 분석물의 양 또는 농도는 LC/MS를 사용하여 결정되고, 여기서 MS 장치는 탠덤 질량 분석계, 특히 삼중 사중극자 장치, 특히 자동화된 무작위 접근 LC/MS 시스템이다.
43) 항목 19 내지 42 중 어느 하나의 방법, 여기서 단계 c)에서 항생제 분석물의 양 또는 농도는 LC/MS를 사용하여 결정되고, 여기서 유도체화된 메로페넴+H+의 모 이온은 m/z 값 457.164±0.5에서 측정되고, 유도체화된 피페라실린+H+의 모 이온은 m/z 값 664.235±0.5에서 측정된다.
44) 항목 19 내지 43 중 어느 하나의 방법, 여기서 단계 c)에서 항생제 분석물의 양 또는 농도는 LC/MS를 사용하여 결정되고, 여기서 유도체화된 메로페넴의 단편 이온은 m/z 값 152±0.5 또는 173±0.5에서 측정되고, 유도체화된 피페라실린의 단편 이온은 m/z 값 270±0.5 또는 464±0.5에서 측정된다.
45) 항목 1 내지 44 중 어느 하나의 방법을 수행하기 위해 조정된 (자동화된) 분석 시스템 (특히 LC/MS 시스템).
46) 샘플 중의 하나 이상의 항생제 분석물을 안정화하기에 적합한 친핵성 유도체화 시약을 포함하는 환자 샘플 수집용 샘플링 튜브.
47) 수집될 혈액 샘플을 수용하도록 조정된 저장소가 있는 장치 및 샘플 중의 하나 이상의 항생제 분석물을 안정화하기에 적합한 친핵성 유도체화 시약을 포함하는 환자 샘플 수집용 샘플링 튜브.
48) 항목 46 또는 47의 샘플링 튜브, 여기서 친핵성 유도체화 시약은 아민 기, 특히 1차 또는 2차 아민, 특히 1차 아민 기를 포함한다.
49) 항목 46 내지 48 중의 어느 하나의 샘플링 튜브, 여기서 친핵성 유도체화 시약은 3 개 이상의 C-원자, 특히 3 내지 20 개의 C-원자, 특히 3 내지 10 개의 C-원자, 특히 3-5 개의 C-원자, 특히 4 개의 C-원자를 포함한다.
50) 항목 46 내지 49 중 어느 하나의 샘플링 튜브, 여기서 친핵성 유도체화 시약은 선형 또는 분지형, 특히 선형 아민, 특히 선형 1차 아민, 특히 3 내지 5 개의 C-원자를 포함하는 선형 1차 아민이다.
51) 항목 46 내지 50 중 어느 하나의 샘플링 튜브, 여기서 친핵성 유도체화 시약은 프로필아민, 부틸아민, 또는 펜틸아민, 특히 1차 선형 부틸아민으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
52) 항목 46 내지 51 중 어느 하나의 샘플링 튜브, 여기서 친핵성 유도체화 시약은 액체 또는 동결건조 형태로 포함된다.
53) 항목 46 내지 52 중 어느 하나의 샘플링 튜브, 여기서 친핵성 유도체화 시약은 특히 DBU, TEA, DIPEA, Na3PO4, Na2CO3, 및 Cs2CO3로 이루어진 군으로부터 선택된, 안정하고 물과 혼화성인 비친핵성 염기를 추가로 포함한다.
54) 항목 46 내지 53 중 어느 하나의 샘플링 튜브, 여기서 친핵성 유도체화 시약은 용매, 특히 물, CH3CN, THF, 디옥산, DMF, DMSO, 아세톤, tBuOH, 디글라임, DME, MeOH, EtOH, 1-PrOH, 2-PrOH, 에틸렌 글리콜, 헥사메틸포스포라미드 (HMPA), 헥사메틸포스포러스 트리아미드 (HMPT), 및 글리세린으로 이루어진 군으로부터 선택된 용매, 특히 물, CH3CN, THF, 디옥산, DMF, DMSO, 아세톤, tBuOH, 디글라임, 및 DME로 구성된 군으로부터 선택된 용매에 액체 형태로 포함된다.
55) 항목 46 내지 54 중 어느 하나의 샘플링 튜브, 여기서 친핵성 유도체화 시약은 항생제 분석물이 메로페넴인 경우 부틸아민을 포함한다.
56) 항목 46 내지 55 중 어느 하나의 샘플링 튜브, 여기서 친핵성 유도체화 시약은 항생제 분석물이 피페라실린인 경우 펜틸아민을 포함한다.
57) 샘플 중의 하나 이상의 항생제 분석물의 양 또는 농도 결정을 위한 친핵성 유도체화 시약의 용도.
58) 항목 57의 용도, 여기서 친핵성 유도체화 시약은 아민 기, 특히 1차 또는 2차 아민, 특히 1차 아민 기를 포함하는 시약이다.
59) 항목 57 또는 58의 용도, 여기서 친핵성 유도체화 시약은 3 개 이상의 C-원자, 특히 3 내지 20 개의 C-원자, 특히 3 내지 10 개의 C-원자, 특히 3-5 개의 C-원자, 특히 4 개의 C-원자를 포함한다.
60) 항목 57 내지 59 중 어느 하나의 용도, 여기서 친핵성 유도체화 시약은 선형 또는 분지형, 특히 선형 아민, 특히 선형 1차 아민, 특히 3 내지 5 개의 C-원자를 포함하는 선형 1차 아민이다.
61) 항목 57 내지 60 중 어느 하나의 용도, 여기서 유도체화 시약은 프로필아민, 부틸아민, 또는 펜틸아민, 특히 1차 선형 부틸아민으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
62) 항목 57 내지 61 중 어느 하나의 용도, 여기서 항생제 물질은 β-락탐 항생제 물질이다.
63) 항목 57 내지 62 중 어느 하나의 용도, 여기서 항생제 물질은 아목시실린, 암피실린, 바캄피실린, 카르베니실린, 클록사실린, 디클록사실린, 플루클록사실린, 메즐로실린, 나프실린, 옥사실린, 테모실린, 페네티실린, 페니실린 G, 페니실린 V, 피페라실린, 아즐로실린, 피밤피실린, 피브메실리남, 티카르실린, 세파세트릴(세파세트릴), 세파드록실 (세파드록실), 세팔렉신 (세팔렉신), 세팔렉신 (세팔렉신), 세팔로글리신 (세팔로글리신), 세팔로늄 (세팔로늄), 세팔로리딘 (세팔로라딘), 세팔로틴 (세팔로틴), 세팔로틴 (세팔로틴), 세파피린 (세파피린), 세파트리진, 세파자플루르, 세파제돈, 세파졸린 (세파졸린), 세프라딘 (세프라딘), 세프라딘 (세프라딘), 세프록사딘, 세프록사딘, 세프테졸, 세파클로르, 세파만돌, 세프메타졸, 세포니시드, 세포테탄, 세폭시틴, 세프로질 (세프록실), 세푸록심, 세푸조남, 세프카펜, 세프달록심, 세프디니르, 세프디토렌, 세페타메트, 세픽심, 세프메녹심, 세포디짐, 세포탁심, 세프피미졸, 세프포독심, 세프테람, 세프티부텐, 세프티오푸르, 세프티올렌, 세프티족심, 세프트리악손, 세포페라존, 세프타지딤, 세프클리딘, 세페핌, 세플루프레남, 세포셀리스, 세포조프란, 세프피롬, 세프퀴놈, 세프토비프롤, 세프타롤린, 세파클로메진, 세팔로람, 세파파롤, 세프카넬, 세페드롤로르, 세펨피돈, 세페트리졸, 세피비트릴, 세프마틸렌, 세프메피듐, 세포베신, 세폭사졸, 세프로틸, 세프수미드, 세푸라세팀, 세프티옥시드, 세프톨로잔, 이미페넴, 도리페넴, 에르타페넴, 메로페넴, 아즈트레오남, 메실리남, 메탐피실린, 탈람피실린, 에피실린, 설베니실린, 파로페넴, 리티페넴, 비아페넴, 피밤피실린, 클로메토실린, 페나메실린, 헤타실린, 카린다실린, 파니페넴, 티게모남, 카루모남, 노카르디신 A, 페남, 설박탐, 타조박탐, 클라밤, 및 클라불란산으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 특정 구체예에서, 항생제 분석물은 메로페넴 또는 피페라실린이다.
64) 항목 57 내지 63 중 어느 하나의 용도, 여기서 항생제 물질은 메로페넴 또는 피페라실린이다.
65) 항목 57 내지 64 중 어느 하나의 용도, 여기서 친핵성 유도체화 시약은 샘플 중의 하나 이상의 항생제 분석물의 양 또는 농도를 결정하는 동안 항생제 물질의 가수분해를 방지한다.
66) 항목 57 내지 65 중 어느 하나의 용도, 여기서 친핵성 유도체화 시약은 항생제 물질을 7 일 이상 동안, 2 주 이상 동안, 3 주 이상 동안, 4 주 이상 동안, 2 개월 이상 동안, 3 개월 이상 동안, 4 개월 이상 동안, 5 개월 이상 동안, 또는 6 개월 이상 동안 안정화시켰다.
67) 관심 샘플 중의 항생제 분석물을 안정화하기 위한 친핵성 유도체화 시약의 용도.
68) 항목 67의 용도, 여기서 친핵성 유도체화 시약은 아민 기, 특히 1차 또는 2차 아민, 특히 1차 아민 기를 포함하는 시약이다.
69) 항목 67 또는 68의 용도, 여기서 친핵성 유도체화 시약은 3 개 이상의 C-원자, 특히 3 내지 20 개의 C-원자, 특히 3 내지 10 개의 C-원자, 특히 3-5 개의 C-원자, 특히 4 개의 C-원자를 포함한다.
70) 항목 67 내지 69 중 어느 하나의 용도, 여기서 친핵성 유도체화 시약은 선형 또는 분지형, 특히 선형 아민, 특히 선형 1차 아민, 특히 3 내지 5 개의 C-원자를 포함하는 선형 1차 아민이다.
71) 항목 6 내지 70 중 어느 하나의 용도, 여기서 유도체화 시약은 프로필아민, 부틸아민, 또는 펜틸아민, 특히 1차 선형 부틸아민으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
72) 항목 67 내지 71 중 어느 하나의 용도, 여기서 항생제 물질은 β-락탐 항생제 물질이다.
73) 항목 67 내지 72 중 어느 하나의 용도, 여기서 항생제 물질은 아목시실린, 암피실린, 바캄피실린, 카르베니실린, 클록사실린, 디클록사실린, 플루클록사실린, 메즐로실린, 나프실린, 옥사실린, 테모실린, 페네티실린, 페니실린 G, 페니실린 V, 피페라실린, 아즐로실린, 피밤피실린, 피브메실리남, 티카르실린, 세파세트릴(세파세트릴), 세파드록실 (세파드록실), 세팔렉신 (세팔렉신), 세팔렉신 (세팔렉신), 세팔로글리신 (세팔로글리신), 세팔로늄 (세팔로늄), 세팔로리딘 (세팔로라딘), 세팔로틴 (세팔로틴), 세팔로틴 (세팔로틴), 세파피린 (세파피린), 세파트리진, 세파자플루르, 세파제돈, 세파졸린 (세파졸린), 세프라딘 (세프라딘), 세프라딘 (세프라딘), 세프록사딘, 세프록사딘, 세프테졸, 세파클로르, 세파만돌, 세프메타졸, 세포니시드, 세포테탄, 세폭시틴, 세프로질 (세프록실), 세푸록심, 세푸조남, 세프카펜, 세프달록심, 세프디니르, 세프디토렌, 세페타메트, 세픽심, 세프메녹심, 세포디짐, 세포탁심, 세프피미졸, 세프포독심, 세프테람, 세프티부텐, 세프티오푸르, 세프티올렌, 세프티족심, 세프트리악손, 세포페라존, 세프타지딤, 세프클리딘, 세페핌, 세플루프레남, 세포셀리스, 세포조프란, 세프피롬, 세프퀴놈, 세프토비프롤, 세프타롤린, 세파클로메진, 세팔로람, 세파파롤, 세프카넬, 세페드롤로르, 세펨피돈, 세페트리졸, 세피비트릴, 세프마틸렌, 세프메피듐, 세포베신, 세폭사졸, 세프로틸, 세프수미드, 세푸라세팀, 세프티옥시드, 세프톨로잔, 이미페넴, 도리페넴, 에르타페넴, 메로페넴, 아즈트레오남, 메실리남, 메탐피실린, 탈람피실린, 에피실린, 설베니실린, 파로페넴, 리티페넴, 비아페넴, 피밤피실린, 클로메토실린, 페나메실린, 헤타실린, 카린다실린, 파니페넴, 티게모남, 카루모남, 노카르디신 A, 페남, 설박탐, 타조박탐, 클라밤, 및 클라불란산으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 특정 구체예에서, 항생제 분석물은 메로페넴 또는 피페라실린이다.
74) 항목 67 내지 73 중 어느 하나의 용도, 여기서 항생제 물질은 메로페넴 또는 피페라실린이다.
75) 항목 67 내지 74 중 어느 하나의 용도, 여기서 친핵성 유도체화 시약은 항생제 물질의 가수분해를 방지한다.
76) 항목 67 내지 75 중 어느 하나의 용도, 여기서 친핵성 유도체화 시약은 항생제 물질을 7 일 이상 동안, 2 주 이상 동안, 3 주 이상 동안, 4 주 이상 동안, 2 개월 이상 동안, 3 개월 이상 동안, 4 개월 이상 동안, 5 개월 이상 동안, 또는 6 개월 이상 동안 안정화시켰다.
77) 친핵성 유도체화 시약에 의해 안정화된 항생제 분석물.
78) 항목 77의 항생제 분석물, 여기서 친핵성 유도체화 시약은 아민 기, 특히 1차 또는 2차 아민, 특히 1차 아민 기를 포함하는 시약이다.
79) 항목 77 또는 78의 항생제 분석물, 여기서 친핵성 유도체화 시약은 3 개 이상의 C-원자, 특히 3 내지 20 개의 C-원자, 특히 3 내지 10 개의 C-원자, 특히 3-5 개의 C-원자, 특히 4 개의 C-원자를 포함한다.
80) 항목 77 내지 79 중 어느 하나의 항생제 분석물, 여기서 친핵성 유도체화 시약은 선형 또는 분지형, 특히 선형 아민, 특히 선형 1차 아민, 특히 3 내지 5 개의 C-원자를 포함하는 선형 1차 아민이다.
81) 항목 77 내지 80 중 어느 하나의 항생제 분석물, 여기서 유도체화 시약은 프로필아민, 부틸아민, 또는 펜틸아민, 특히 1차 선형 부틸아민으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
82) 항목 77 내지 81 중 어느 하나의 항생제 분석물, 여기서 항생제 물질은 β-락탐 항생제 물질이다.
83) 항목 77 내지 82 중 어느 하나의 항생제 분석물, 여기서 항생제 물질은 아목시실린, 암피실린, 바캄피실린, 카르베니실린, 클록사실린, 디클록사실린, 플루클록사실린, 메즐로실린, 나프실린, 옥사실린, 테모실린, 페네티실린, 페니실린 G, 페니실린 V, 피페라실린, 아즐로실린, 피밤피실린, 피브메실리남, 티카르실린, 세파세트릴(세파세트릴), 세파드록실 (세파드록실), 세팔렉신 (세팔렉신), 세팔렉신 (세팔렉신), 세팔로글리신 (세팔로글리신), 세팔로늄 (세팔로늄), 세팔로리딘 (세팔로라딘), 세팔로틴 (세팔로틴), 세팔로틴 (세팔로틴), 세파피린 (세파피린), 세파트리진, 세파자플루르, 세파제돈, 세파졸린 (세파졸린), 세프라딘 (세프라딘), 세프라딘 (세프라딘), 세프록사딘, 세프록사딘, 세프테졸, 세파클로르, 세파만돌, 세프메타졸, 세포니시드, 세포테탄, 세폭시틴, 세프로질 (세프록실), 세푸록심, 세푸조남, 세프카펜, 세프달록심, 세프디니르, 세프디토렌, 세페타메트, 세픽심, 세프메녹심, 세포디짐, 세포탁심, 세프피미졸, 세프포독심, 세프테람, 세프티부텐, 세프티오푸르, 세프티올렌, 세프티족심, 세프트리악손, 세포페라존, 세프타지딤, 세프클리딘, 세페핌, 세플루프레남, 세포셀리스, 세포조프란, 세프피롬, 세프퀴놈, 세프토비프롤, 세프타롤린, 세파클로메진, 세팔로람, 세파파롤, 세프카넬, 세페드롤로르, 세펨피돈, 세페트리졸, 세피비트릴, 세프마틸렌, 세프메피듐, 세포베신, 세폭사졸, 세프로틸, 세프수미드, 세푸라세팀, 세프티옥시드, 세프톨로잔, 이미페넴, 도리페넴, 에르타페넴, 메로페넴, 아즈트레오남, 메실리남, 메탐피실린, 탈람피실린, 에피실린, 설베니실린, 파로페넴, 리티페넴, 비아페넴, 피밤피실린, 클로메토실린, 페나메실린, 헤타실린, 카린다실린, 파니페넴, 티게모남, 카루모남, 노카르디신 A, 페남, 설박탐, 타조박탐, 클라밤, 및 클라불란산으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 특정 구체예에서, 항생제 분석물은 메로페넴 또는 피페라실린이다.
84) 항목 77 내지 83 중 어느 하나의 항생제 분석물, 여기서 항생제 물질은 메로페넴 또는 피페라실린이다.
85) 항목 77 내지 83 중 어느 하나의 항생제 분석물, 여기서 친핵성 유도체화 시약은 샘플 중의 하나 이상의 항생제 분석물의 양 또는 농도를 결정하는 동안 항생제 물질의 가수분해를 방지한다.
86) 항목 77 내지 85 중 어느 하나의 항생제 분석물, 여기서 유도체화된 β-락탐 항생제 분석물, 여기서 베타-락탐 모이어티는 친핵체 유도체화 시약과의 반응에 의해 파괴된다.
실시예
다음 실시예들은 본원 청구범위 발명을 제한하는 것이 아니라 이를 예시하기 위하여 제공된다.
실시예 1: 천연 피페라실린의 안정성
천연 피페라실린 및 이의 가수분해된 형태의 안정성이 조사되었다 (각각 화합물 5, 9a 및 9b. 피페라실린의 가수분해 경로로부터 (도 1의 개략도 참조) 이 화합물이 피페라진 고리 및 락탐 모이어티 모두에서 가수분해됨이 명백하며, 두 화합물 중 하나만 천연 피페라실린의 손실을 설명하기 위해 모니터링된다). 이를 위해, 이들 화합물을 새로 칭량하고 실온에서 15 분 동안 굴려 1 mg/mL의 농도로 물에 용해시켰다. 이어서, 이들 화합물을 5 μg/mL로 희석하고 적합한 LC-MS/MS 방법으로 0, 2, 4, 6, 8 및 16 시간 시점에서 측정했다. 이를 위해, AB Sciex 6500+ MS에 연결된 Agilent Infinity II 멀티샘플러/펌프 시스템에서 용매 A: 0.1% HCOOH가 있는 물 및 용매 B: 0.1% HCOOH가 있는 CH3CN 및 분당 0.6 mL의 흐름을 사용하는 Sunshell C18, 2.6 μm, 2.1 mm x 50 mm 컬럼이 사용되었다. 피크는 MultiQuant 소프트웨어를 사용하여 적분되었고 이러한 피크의 면적은 도 2A 및 2B의 그래프에 표시된다.
도 2A 및 2B는 천연 피페라실린 (화합물 5) 및 이의 가수분해된 형태 (화합물 9a/9b) 각각에 대한 하나의 MRM 전이에 대해 얻은 영역을 보여준다. 얻어진 피크 면적은 시간 경과에 따라 상당히 변하며 (F-검정, <0.0001의 P 값 산출) 천연 형태의 피크 면적이 감소하고 가수분해된 형태(화합물 9a/9b)의 면적이 상당히 증가함이 (F-검정, <0.0001의 P 값 산출) 명백하다. 그 이유는 (도 1에 도식적으로 설명된 바와 같이) 가수분해이다.
실시예 2: 유도체화된 피페라실린의 안정성
완전한 β-락탐 유도체화가 단순한 프로필아민, 부틸아민 또는 펜틸아민을 사용하여 달성 가능한지 여부를 평가하기 위해, 이러한 친핵체를 메로페넴 및 피페라실린의 용액에 과량으로 첨가했다 (1 μg/mL). 화학적 반응의 개략도에 대해, 메로페넴 및 피페라실린에 대해 각각 도 3 및 4를 참조하라.
피페라실린의 이중 부틸아미드 변종(화합물 7, 도 4 참조)의 안정성은 실시예 1에서와 동일한 프로토콜을 사용하여 2 가지 MRM에서 조사되었다.
도 5는 화합물 7에 대한 두 가지 MRM 전이에 대해 수득된 영역을 보여준다. 얻어진 피크 면적은 시간 경과에 따라 매우 크게 변하지 않는 것, 즉 유도체화된 피페라실린이 가수분해되지 않는 것으로 관찰된다. 이는 0.08 및 0.14의 P 값을 산출하는 F-검정에 의해 더욱 확증되었다.
실시예 3: 환자 샘플 중의 메로페넴 및 피페라실린의 안정화
물에 용해된 유도체화 시약(프로필아민, 부틸아민, 또는 펜틸아민)을 100 μL의 샘플(1 μg/mL의 피페라실린 및 메로페넴 모두로 스파이킹된 혈청)에 첨가했다.
100 μL의 1 μg/mL (1.9*10-9 M) 피페라실린에 대해, 5*108, 2.5*108 또는 2.5*106 당량 (각각 9.8*10-5, 4.8*10-5, 1.9*10-7 몰)의 각각의 유도체화 시약 (20 μL)을 스파이킹된 혈청에 첨가했다. 이후 이 혼합물을 3 분 동안 인큐베이션하고 그 후 pH 조정 시약 (40 μL의 수성 1 M HCOOH (pH 2.5) 또는 500 mM Na3PO4/Na2HPO4 (pH 12))을 첨가했다. 이어서, 자기 비드 (40 μL, 50 mg/mL)를 첨가하고 3 분 동안 인큐베이션했다. 그 다음 상청액을 제거하고 비드를 물 (150 μL)로 두 번 세척했다. 다음으로, 용리액(다양한 수준의 아세토니트릴 (10-90 %, v/v)에서 100 mM HCOOH, 100 mM 피롤리딘이 있거나 pH 조정 시약이 없는 50 μL의 용액)을 첨가했다. 다음으로 상청액 (20 μL)을 물 (20 μL)로 희석했다.
천연 (온전한) 메로페넴과 피페라실린 모두, 및 이들의 유도체화된 생성물 및 가수분해된 화합물을 정량화하기 위해, 모든 화합물에 대해 조정된 MRM 전이를 포함하는 LC-MS/MS 방법이 고안되었다. AB Sciex 6500+ MS에 연결된 Agilent Infinity II 멀티샘플러/펌프 시스템에서 용매 A: 0.1% HCOOH가 있는 물 및 용매 B: 0.1% HCOOH가 있는 CH3CN 및 분당 0.6 mL의 흐름을 사용하는 Cortecs C18+ C18, 2.6 μm, 2.1 mm x 50 mm 컬럼. 유도체화된 항생제 각각(즉 프로필아민, 부틸아민 또는 아밀아민으로 유도체화된 메로페넴(a386) 및 피페라실린(a0387))에 대해, 세 가지의 MRM 전이가 사용되었다. 천연 메로페넴과 피페라실린, 및 이들의 가수분해된 형태(분석물당 2 가지 MRM 전이)가 또한 측정에 포함되었다.
Figure pct00002
메로페넴의 경우, 최고 피크 면적을 갖는 결과가 펜틸아민을 사용할 때 획득된다. 이 항생제의 혈청 중의 1 μg/mL의 농도에서, 펜틸아민 및 최적의 워크플로우를 사용하여, 약 3E6의 영역이 가능해야 한다. 부틸아민을 사용하여, 최적 조건 하에 1E6의 면적을 얻을 수 있다. 도 6을 참조하라.
피페라실린의 경우 최고 피크 면적을 갖는 결과가 부틸아민을 사용할 때 획득된다. 이 항생제의 혈청 중의 1 μg/mL의 농도에서, 부틸아민 및 최적의 워크플로우를 사용하여 (최적의 워크플로우에 대해 다음 섹션 참조), 2E7의 영역이 가능해야 한다. 도 7을 참조하라.
2.5E8 당량의 시약 사용 시 잔류 천연 화합물(온전한 메로페넴 또는 피페라실린)이 용리액에서 발견되지 않음에 주의한다. 이것은 이 짧은 시간에 반응이 정량적임을 보여준다. 또한, 가수분해된 화합물의 양이 증가하지 않음을 관찰했는데, 이는 친핵체의 첨가가 이러한 화합물에서 락탐 모이어티의 가수분해를 촉매화하지 않아, 가수분해된 화합물로부터 온전한 락탐 화합물을 식별하고 정량화할 수 있게 함을 나타낸다.
실시예 3은 유도체화 전략이 세 가지 상이한 친핵성 유도체화 시약과 조합으로 두 가지의 대표적인 β-락탐 항생제에 대해 작동함을 보여주며, 이는 이 방법의 유효성 및 전반적인 견고성을 보여준다. 실시예 4: 혈청 중의 피페라실린의 분해
이 부류의 항생제의 정량화에서 주요 장애물은 도 8에 나타난다. 일반적으로 LC-MS/MS, UV 또는 면역 분석을 통한 정량은 정확한 보정에 의존하므로, 신뢰할 수 있는 보정 방법을 사용하는 것이 명백히 가장 중요하다. 그러나, 여기에 나타날 수 있는 바와 같이, 혈청에 용해된 β-락탐 항생제는 매우 불안정하다. 이의 결과는 스파이킹된 농도가 실제 농도보다 더 높아서, 보정 오프셋을 유발하는 것이고 (도 8 참조) 이는 결국 부정확한 결과를 야기한다.
실시예 4는 천연 β-락탐 항생제가 보정 목적을 위해 사용되는 경우, 이러한 화합물이 여기에서 제안된 유도체화된 화합물보다 더 빠르게 분해됨을 보여준다. 이는 천연 β-락탐 항생제를 사용하는 보정이 부정확한 결과를 산출함을 의미한다. 이러한 이유로 안정화된 (즉 유도체화된 화합물)의 사용은 더 정확한 결과를 산출할 것이다.
실험 설계
본 발명자들은 β-락탐 항생제가 혈청 기반 용액보다 순수 용액(즉 50% CH3CN이 있는 물)에서 더 안정할 것으로 가정했는데, 후자가 가수분해되거나 β-락탐 모이어티와 반응하여 예를 들어 아미드 또는 에스테르를 수득할 고농도의 친핵성 물질을 제공할 것이기 때문이다. 이 가정을 테스트하기 위해, 피페라실린을 물/CH3CN (1:1, v:v)의 용액에 용해시킨 다음, 이후 이를 혈청 및 물/CH3CN의 동일한 용액 스파이킹에 사용했다. 용해는 단지 한 번 수행되는 반면, 혈청 또는 물/CH3CN 중의 이 스탁 용액의 스파이킹은 피페라실린의 네 가지 상이한 농도에 대해 세 번 수행되었다.
측정 전에, 일상적인 임상 진단의 대부분의 방법에는 정제 워크플로우가 수반된다. 유기 용매를 사용한 단백질 침전 후 원심분리로부터 자기 비드의 사용에 의한 정제에 이르는 여러 방법이 사용될 수 있다. MS/MS를 통해 정량화를 수행하는 경우, 바람직하게는 동위원소 표지된 내부 표준(ISTD)이 i) 이 워크플로우 동안의 분석물 손실 및 ii) 보정 샘플과 환자 샘플 간에 상이할 수 있는 이온 억제/증강을 수정하기 위해 이 정제 워크플로우의 시작에서 첨가된다. 이는 피페라실린이 부틸아민을 사용하여 유도체화되는 농축 워크플로우에서 사용되어 디부틸아미드를 생성할 수 있다 (도 4, 화합물 7, 하기 언급된 반응식 참조). 이에 의해, β-락탐 모이어티는 부틸아미드와 반응하고 이 과정 동안 피페라진 모이어티가 반응한다. 바람직하게는, 단일 부틸아미드 사슬 및 페닐 모이어티 상이의 D5-표지를 포함하는 피페라실린의 안정한 유도체인 ISTD가 첨가된다. 따라서 이 ISTD는 β-락탐 모이어티의 분해로 이어지는 친핵성 치환을 거치지 않는다. 그러나, 워크플로우 동안, 피페라진 고리에서 발생하는 두 번째 아미노화가 또한 발생한다 (아래 언급된 반응식 참조). 따라서, 본질적으로 더 안정적인, ISTD는 천연 피페라실린만큼 빠르게 분해되지 않을 것이지만, 피페라진 고리의 아미노화는 부틸아민을 사용한 아미노화가 작용함을 확인하는 인라인 제어이다.
Figure pct00003
피페라실린은 부틸아민을 사용하여 유도체화되어 디부틸아미드를 산출한다.
Figure pct00004
피페라실린-부틸아미드-D5는 부틸아민을 사용하여 유도체화되어 피페라실린-디부틸아미드-D5를 산출한다.
재료 및 방법
재료
피페라실린은 Sigma Aldrich로부터 얻었다.
품질 관리 물질을 Chromsystems로부터 구했고 용해 후 19.2 및 97.9 μg/mL의 농도를 얻었다.
방법
칭량 및 스파이킹
피페라실린을 칭량하고 물/CH3CN (1:1, v:v)에 직접 용해하여 1 mg/mL의 농도를 얻었다. 이후 이 스탁 용액은 혈청 풀 또는 물/CH3CN (1:1, v:v)을 스파이킹하여 1, 10, 50 및 100 μg/mL의 농도를 얻었다. 이 스파이킹은 각 농도에 대해 세 번 반복되었다.
이어서, 모든 샘플을 굴림에 의해 20 분 동안 균질화했다. 다음으로, 샘플은 샘플 제조 모듈에 배치되었고, 여기서 각 샘플은 다음 섹션에 설명된 바와 같이 처리된다.
샘플 제조
바람직하게는, ISTD (피페라실린-부틸아미드-D5, 20 μg/mL, 20 μL)를 스파이킹된 혈청 또는 순수 용액 (50 μL)에 첨가했다. 이 혼합물에, n-부틸아민 (5M, 50 μL)을 첨가했다. 이 혼합물을 먼저 진탕하고 3 분 동안 실온(rt)에서 인큐베이션했다. 그 다음, 자기 비드 (비드타입 B, 50 mg/mL, 40 μL)를 첨가하고, 그 후 혼합물을 다시 진탕하고 약 1 분 동안 인큐베이션했다. 이어서, 자력을 가하여 비드를 용기 측면으로 끌어당기고, 그 후 상청액을 제거했다. 이러한 비드를 물 (150 μL)로 두 번 세척했다. 다음으로, 0.1% HCOOH를 포함하는 아세토니트릴 (50 μL)을 첨가하고, 그 후 혼합물을 다시 진탕하고 1 분 동안 방치했다. 다음으로, 비드를 용기의 측면으로 잡아당긴 후, 20 μL의 상청액을 제거했다. 이후 이 상청액을 물로 희석하고 (1:1, v:v), 그 후 샘플을 LC-MS/MS를 통해 측정했다.
LC-MS/MS 측정
2-배 유도체화된 피페라실린 유도체를 정량화하기 위해 LC-MS/MS 방법이 개발되었다. 다음 표는 이 목적을 위해 어떤 설정에서 어떤 단편이 사용되었는지를 보여준다.
Figure pct00005
LC 방법
Figure pct00006
AB Sciex 6500+ MS에 연결된 Agilent Infinity II 멀티샘플러/펌프 시스템에서 용매 A: 0.1% HCOOH가 있는 물 및 용매 B: 0.1% HCOOH가 있는 CH3CN 및 분당 0.4 mL의 흐름을 사용하는 Kinetex C18, 2.6 μm, 1.0 mm x 50 mm 컬럼, 샘플당 8 μL를 주입.
결과
도 9는 순수 샘플과 네 가지 농도에 대한 혈청 샘플 간의 면적 비율의 차이를 보여준다. 각 농도에 대해, 이 차이는 약 30%인 것으로 나타난다. (내부 표준이 사용될 수 있는 경우에 대해) 면적 비율의 차이는 순수한 샘플 대 혈청 샘플의 샘플 제조에 대해 상이한 분석물 회수율의 차이에 기인할 수 없다. 내부 표준은 이러한 효과를 보완할 것이다. 따라서 차이는 화합물의 반응성 때문일 가능성이 크다. 혈청은 락탐 또는 피페라진 모이어티와 반응할 수 있는 많은 반응성 친핵체를 포함하므로, 스파이킹된 농도는 이 매트릭스에서 순수하게 스파이킹된 동일한 농도에 비해 시간 경과에 따라 감소한다.
이 발견은 시간, 온도, 단백질 농도 또는 다른 친핵성 물질의 농도의 함수인 실제 농도보다 스파이킹된 농도가 더 높기 때문에 이러한 항생제의 정량화에서 함축을 가질 수 있다. 따라서, 보정 표준을 제조하기 위한 스파이킹 재료로서 천연 피페라실린의 사용은 실패할 가능성이 높다. 이는 여기에 설명된 유도체화 방법을 통한 이러한 분석물의 정량화가 더 정확할 것임을 다시 보여준다.
실시예 5: 피페라실린에 대해 일상적으로 사용되는 병원 방법 대 유도체화 방법 비교
β-락탐 항생제의 장기간 안정성 및 정확하고 정밀한 정량화를 보장하기 위해, 본 발명자들은 이 부류의 항생제를 사용하는 전략을 구상한다. 이는 또한 사전 유도체화된 보정제 및 ISTD의 사용을 수반한다. 사내 분석 개발에 이어, 적어도 하나의 병원, 예를 들어 독일 병원에서 일상적으로 사용되는 상용 QC 샘플을 사용하는 실험을 수행했다. 유도체화 방법이 병원에서 일상적으로 사용되는 방법과 어떻게 다른지를 평가하기 위해, 두 방법을 모두 사용하여 23 명의 환자 샘플을 수집하고 측정했다.
실시예 5는 여기에 제시된 유도체화 방법이 일상적인 방법과 잘 연관됨을 보여주지만, 두 방법 간에 평균 20%의 정확도 차이가 관찰된다. 이 정확도의 오프셋은 실시예 4에서 설명된다.
재료 및 방법
재료
유도체화 전략에 사용되는 보정 물질
단일 유도체화된 피페라실린 (피페라실린-부틸아미드) i387-2-2를 칭량하고 혈청에서 분말 형태로 스파이킹하여 이로부터 다음 표의 보정 시리즈를 산출하기 위한 추가 희석을 준비했다.
Figure pct00007
병원 방법에 사용되는 보정 물질
Figure pct00008
병원 방법에 사용되는 품질 관리
Figure pct00009
유도체화 방법 및 병원 방법에 사용되는 품질 관리
Figure pct00010
피페라실린을 포함하는 환자 샘플
Figure pct00011
방법
유도체화 전략을 위한 샘플 제조
바람직하게는, 보정 샘플, QC 샘플 또는 환자 샘플 (50 μL)에 ISTD (피페라실린-부틸아미드-D5, 20 μg/mL, 20 μL)를 첨가했다. 이 혼합물에, n-부틸아민 (5M, 50 μL)을 첨가했다. 이 혼합물을 먼저 진탕하고 3 분 동안 실온에서 인큐베이션했다. 그 다음, 자기 비드 (비드타입 B, 50 mg/mL, 40 μL)를 첨가하고, 그 후 혼합물을 다시 진탕하고 약 1 분 동안 인큐베이션했다. 이어서, 자력을 가하여 비드를 용기 측면으로 끌어당기고, 그 후 상청액을 제거했다. 이러한 비드를 물 (150 μL)로 두 번 세척했다. 다음으로, 0.1% HCOOH를 포함하는 아세토니트릴 (50 μL)을 첨가하고, 그 후 혼합물을 다시 진탕하고 1 분 동안 방치했다. 다음으로, 비드를 용기의 측면으로 잡아당긴 후, 20 μL의 상청액을 제거했다. 이후 이 상청액을 물로 희석하고 (1:1, v:v), 그 후 샘플을 LC-MS/MS를 통해 측정했다. 모든 임상 환자 샘플은 비무작위 방식으로 차례로 처리되었다. 따라서, 샘플 1 및 23의 처리 사이에 약 90 분의 시간 차이가 존재한다. 각 샘플에 대해 처리된 세 번의 반복실험의 측정 사이에는 약 4의 시간 차이가 존재했다.
병원 방법을 위한 샘플 제조
바람직하게는, 보정 샘플, QC 샘플 또는 환자 샘플 (50 μL)에 ISTD (피페라실린-D5, 100 μg/mL, 25 μL)를 첨가했다. 이 혼합물을 짧게 볼텍싱하고 5 분 동안 진탕했다. 이어서 MeOH (325 μL)를 첨가하고 짧게 볼텍싱하고 5 분 동안 진탕했다. 다음으로, 바이알을 원심분리하고 (5 ℃에서 14000 rpm) 상청액 (20 μL)을 물 (180 μL)로 희석했다. 이러한 용액은 LC-MS/MS를 통해 측정되었다. 모든 임상 환자 샘플은 비무작위 방식으로 차례로 처리되었다.
유도체화 방법을 위한 LC-MS/MS 측정
2-배 유도체화된 피페라실린 유도체를 정량화하기 위해 LC-MS/MS 방법이 개발되었다. 다음 표는 이 목적을 위해 어떤 설정에서 어떤 단편이 사용되었는지를 보여준다.
Figure pct00012
유도체화 방법을 위한 LC 방법
Figure pct00013
AB Sciex 6500+ MS에 연결된 Agilent Infinity II 멀티샘플러/펌프 시스템에서 용매 A: 0.1% HCOOH가 있는 물 및 용매 B: 0.1% HCOOH가 있는 CH3CN 및 분당 0.4 mL의 흐름을 사용하는 Kinetex C18, 2.6 μm, 1.0 mm x 50 mm 컬럼, 샘플당 8 μL를 주입.
병원 방법을 위한 LC-MS/MS 측정
Figure pct00014
병원 방법을 위한 LC 방법
Figure pct00015
Waters의 XSelect HSS PFP Van Guard Cartridge (2.1 x 5 mm)가 있는 XSelect HSS PFP 2.5 μm (2.1 x 100 mm) 컬럼을 사용했다. AB Sciex 6500+ MS에 연결된 Agilent Infinity II 멀티샘플러/펌프 시스템에서 용매 A: 0.2 % 포름산이 있는 10 mM 암모늄 포르메이트가 있는 물, 및 용매 B: CH3CN/MeOH (25:75, v:v) 분당 0.5 mL의 흐름, 샘플당 2 μL를 주입.
결과
정밀도 및 정확도
정밀도는 얻은 결과의 분산으로부터 계산될 수 있지만, 정확도는 올바른 또는 이론적 농도가 주어져야만 결정될 수 있다. 실시예 4에서 앞서 설정된 바와 같이, 정확한 농도는 스파이킹된 농도와 동일하지 않고, 이 농도보다 낮은 농도이다. 그럼에도 불구하고, 본원에 설명된 유도체화 방법과 참조 방법의 차이를 계산할 수 있도록, 스파이킹된 농도가 실제 농도와 같다고 가정하고, 이것이 정확하지 않음을 인식한다. 그러나, 정확도의 상대적 척도로서, 이는 여전이 유용한 지표이다.
CV의 측면에서 정밀도는 CV가 4% 미만인 품질 관리 샘플에 대해 매우 낮음을 알 수 있다. 이들 샘플의 정확도는 86.4 및 80%이다. 다시 말해서, 이는 참조 방법에서 사용된 보정제의 스파이킹된 농도가 실제 농도와 동일하다는 가정에 기반한다. 그러나, 실제 정확도는 100%에 가까울 것이다. 또한, 상대 총 오차가 정확도를 기반으로 계산되므로, 이 오차는 도 10에서 계산된 값보다 0에 더 가까울 것이다.
방법 사이의 상관 관계
평가된 두 방법이 어떻게 관련되는지를 확인하기 위해 도 11 및 12가 JMP 버전 14.3을 사용하여 생성되었고 두 방법 사이의 높은 상관관계를 보여주는 R2 및 F-검정이 분석에 포함된다. 도 11은 모든 샘플이 포함된 두 방법 모두의 계산된 농도의 상관관계를 보여준다. 도 12는 명확성을 위해 최고 농도 샘플이 제외되는 두 방법 모두의 계산된 농도의 상관관계를 보여준다. 도 13은 반복실험마다 두 방법 사이의 정확도 차이를 보여준다. 즉 (정확도 유도체화 방법) - (정확도 병원 방법).
유도체화 방법으로 처리된 모든 샘플은 반복실험 1과 3 사이에 약 4시간의 시간 경과로 3번 처리되었으며, 여기서 샘플은 25~30℃의 온도에서 피펫팅 로봇에 방치되었다. 이 시간 차이의 의미는 그림 13에서 명확하게 볼 수 있다. 여기서, 두 방법 사이의 정확도 차이는 반복실험 1에 대해 가장 작은 반면, 반복실험 2 및 3은 훨씬 더 큰 원래 값의 편차를 나타냄을 알 수 있다. 시간 경과에 따른 이러한 분석물의 분해가 상당하기 때문에, 반복실험 2 및 3의 낮은 정확도는 이의 결과이다. 이는 또한 방법 자체가 가능한 것보다 훨씬 더 크기 때문에, 이러한 값으로부터 CV를 계산하려는 임의의 시도가 무의미함을 수반한다. 그럼에도 불구하고, 이것의 흥미로운 결과는, 단일 샘플의 모든 반복실험 사이에 동일한 시간 경과가 있지만, 계산된 농도의 차이가 모든 샘플에 대해 가변적이라는 것이다. 예를 들어, 임상 샘플 42는 4 시간에 걸쳐 약 40% 분해를 나타내는 반면, 임상 샘플 137은 동일한 시간에 걸쳐 약 10% 분해만을 나타낸다. 상이한 임상 샘플이 감소하는 피페라실린 농도 차이를 보인다는 발견은 상이한 임상 샘플이 피페라실린에 대해 상이한 분해 속도론을 나타냄을 시사한다. 이는 샘플을 얻은 후 가능한 한 빨리 환자 샘플을 처리하고 측정하는 것이 절대적으로 중요함을 의미한다. 더욱이, 이것은 또한 스파이킹된 피페라실린을 포함하는 보정 물질 및 피페라실린의 동위원소로 표지된 변종인 ISTD를 사용하는 일상적으로 사용하는 방법이, 실제 값의 과대평가인 부정확한 결과를 유발할 가능성이 있음을 다시 한 번 보여준다.
이 특허 출원은 유럽 특허 출원 19209516.4의 우선권을 주장하며, 여기서 이 유럽 특허 출원의 내용은 본원에 참조로 포함된다.

Claims (15)

  1. 다음 단계를 포함하는, 수득된 샘플 중의 하나 이상의 유도체화된 항생제 분석물의 양 또는 농도를 결정하는 방법:
    a) 선택적으로, 특히 자기 비드를 사용하여, 샘플을 전처리 및/또는 농축하는 단계, 및
    b) 특히 면역학적 분석 또는 LC/MS를 사용하여, 샘플 중의 하나 이상의 항생제 분석물의 양 또는 농도를 결정하는 단계.
  2. 제1항에 있어서, 항생제 분석물은 피페라실린인 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 항생제 분석물은 메로페넴인 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 항생제 분석물은 프로필아민, 부틸아민, 또는 펜틸아민, 특히 1차 선형 부틸아민으로 이루어진 군으로부터 선택되는 친핵성 유도체화 시약으로 유도체화되는 방법.
  5. 다음 단계를 포함하는, 수득된 샘플 중의 하나 이상의 항생제 분석물의 양 또는 농도를 결정하는 방법:
    a) 샘플을 유도체화 시약으로 전처리하는 단계, 여기서 유도체화 시약은 친핵체를 포함함,
    b) 선택적으로, 특히 자기 비드를 사용하여, 단계 a) 후 수득된 샘플을 농축하는 단계, 및
    c) 특히 면역학적 분석 또는 LC/MS를 사용하여, 단계 a) 후 또는 선택적인 농축 단계 b) 후 수득된 전처리된 샘플 중의 하나 이상의 항생제 분석물의 양 또는 농도를 결정하는 단계.
  6. 제5항에 있어서, 항생제 분석물은 β-락탐 항생제 분석물인 방법.
  7. 제5항 또는 제6항에 있어서, 항생제 분석물은 메로페넴 또는 피페라실린인 방법.
  8. 제5항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 a)에서 샘플은 샘플이 수득된 직후, 특히 샘플이 수득된 후 10 분 이내에, 특히 샘플이 수득된 후 5 분 이내에 친핵성 유도체화 시약으로 전처리되는 방법.
  9. 제5항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 a) 후 수득된 샘플은 유도체화된 항생제 분석물, 특히 친핵성 유도체화 시약으로 유도체화된 항생제 분석물을 포함하는 방법.
  10. 제5항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 농축 단계 b)는 적어도 하나의 농축 워크플로우를 포함하는 방법.
  11. 샘플 중의 하나 이상의 항생제 분석물을 안정화하기에 적합한 친핵성 유도체화 시약을 포함하는 환자 샘플 수집용 샘플링 튜브.
  12. 수집될 혈액 샘플을 수용하도록 조정된 저장소가 있는 장치 및 샘플 중의 하나 이상의 항생제 분석물을 안정화하기에 적합한 친핵성 유도체화 시약을 포함하는 환자 샘플 수집용 샘플링 튜브.
  13. 샘플 중의 하나 이상의 항생제 분석물의 양 또는 농도 결정을 위한 친핵성 유도체화 시약의 용도.
  14. 관심 샘플 중의 항생제 분석물을 안정화하기 위한 친핵성 유도체화 시약의 용도.
  15. 친핵성 유도체화 시약에 의해 안정화된 항생제 분석물.
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