CN111781384A - 检测M型磷脂酶A2受体IgG和IgG4的免疫分析试剂盒及其检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种同时检测M型磷脂酶A2受体(PLA2R)不同表位决定簇自身抗体IgG及其IgG4亚型的双标记时间分辨荧光免疫分析方法，属于临床免疫学检测领域。微孔板分别包被有经纯化的PLA2R不同表位决定簇的重组抗原，加入经稀释的待测患者血清，再加入Eu3+‑抗人IgG4单克隆抗体和Sm3+‑羊抗人IgG抗体，标记免疫反应结束后，没有连接的Eu3+‑抗人IgG4单克隆抗体和Sm3+‑羊抗人IgG抗体将会被洗涤除去。加入增强液后，用时间分辨荧光仪测定分别检测Eu3+和Sm3+的荧光信号，根据标准曲线得到样品中PLA2R不同表位的IgG抗体和IgG4抗体的浓度和两者的比值。本发明相关的试剂盒可以同时检测PLA2R不同表位决定簇IgG4和IgG的含量，并得到两者的比值，提高效率，为临床应用提供便利。
Description
技术领域
同时检测M型磷脂酶A2受体(PLA2R)不同表位决定簇自身抗体IgG及其IgG4亚型的双标记时间分辨荧光免疫分析试剂盒及其检测方法，具体涉及对血清中PLA2R不同表位决定簇自身抗体IgG及其IgG4亚型含量的检测，属于临床免疫学检测领域。
背景技术
膜性肾病(membranous nephrophathy，MN)属于自身免疫性疾病，是肾病综合征的一种常见病理类型，在四十岁以上的肾病综合征患者中排第一位。其中约有80％为无明显原因引起的特发性膜性肾病(idiopathic MN,IMN)，其余为有因可循的继发性MN(SecondaryMN,SMN)。SMN常见的诱因有：系统性红斑狼疮，类风湿性关节炎，乙肝病毒感染，以及药物、毒物、肿瘤或环境因素等。
MN的诊断除了高尿蛋白、低血浆白蛋白这两项必要因素之外，必须依赖肾活检确诊病理类型，进而指导临床治疗，虽然肾活检作为金标准准确可靠，但具有侵入性，费用高，存在固有的医疗风险。因此，找到一种肾穿刺的替代手段、一种有助于高效诊断和监测治疗IMN的指标是近期研究的重点。2009年Beck等人发现IMN患者的肾小球足细胞上出现了M型磷脂酶A2受体(PLA2R)阳性高表达，同时患者血清中含高浓度的自身免疫性PLA2R-IgG抗体。经过十年研究总结，普遍认为PLA2R-IgG抗体是IMN已知的血清学标志物，PLA2R抗体检测是理想的、潜在可替代肾活检的有效手段。
通过对PLA2R的进一步研究，得知在IMN的发病过程中会有PLA2R抗体表位的迁移，虽然PLA2R抗原有十个结构域，但主要在CysR、CTLD1和CTLD7结构域中存在独立的表位，并且CysR是主要的免疫优势表位，这三些表位会产生相应的抗体，其中CTLD7单独表达的多肽活性不高，要与CTLD6或CTLD8同时存在，以CTLD67、CTLD78、CTLD678时会有更好的活性，见图1。通过对患者治疗的观察，IMN患者表位谱会发生改变，其中针对CysR抗PLA2R抗体的活性与良好的预后相关，而针对CTLD1和CTLD7的抗体活性与不良的预后相关。如果对能够建立一种针对PLA2R不同抗原表位的自身抗体检测方法，将对IMN患者在临床诊断、病情评估和预后分析等方面提供巨大的帮助。
近期研究发现IgG四个亚型含量在IMN和SMN中差异很大，IMN中IgG1和IgG4占主导地位，狼疮性MN中IgG1～IgG3含量较高，肿瘤相关性MN中IgG1和IgG2含量较高。Huang等人发现IMN患者中有76％的IgG亚型是IgG4，而在SMN中60％的亚型是IgG1。Beck等报导IMN患者中PLA2R-IgG4在总PLA2R-IgG占主导地位。因此，检测M型磷脂酶A2受体不同表位决定簇(CysR、CTLD1、CTLD67、CTLD78、CTLD678)自身抗体IgG及其IgG4亚型将有利于IMN的鉴别诊断和判断IMN疾病的顽固程度。
近年发展的时间分辨荧光免疫分析法(TRFIA)，采用解离增强技术可以将荧光信号放大100万倍，与现有ELISA、CLIA检测技术相比，TRFIA技术的灵敏度高，测量范围宽，而且还具有操作简便、快速，标记物制备简便和有效期长，标准曲线剂量范围宽，不污染环境，自动化程度高，适合临床大量样品的检测等多种优点。另外TRFIA独有的双标记技术可以完美的进行两个指标的同时检测，通过Eu标记抗人IgG4，Sm标记抗人IgG，进行TRFIA的双标记检测，在同一个包被孔中一次加样操作，可以得到PLA2R同一个表位的IgG4和IgG的浓度及两者的比值，大大简化了操作步骤，而且采用两个指标同时检测，其比值会更准确。
采用双标记的时间分辨荧光免疫分析技术(TRFIA)建立同时检测PLA2R不同表位抗原决定簇IgG4和IgG的方法，并得到两者的比值，将有助于IMN的鉴别诊断、治疗方案选择和预后评估
发明内容
本发明的目的在于提供一种同时检测PLA2R不同表位抗原决定簇自身抗体IgG及其IgG4亚型的试剂盒及其检测方法，用于对血清中PLA2R不同表位抗原决定簇自身抗体IgG及其IgG4亚型含量的检测。
本发明提供一种同时检测M型磷脂酶A2受体不同表位决定簇自身抗体IgG及其IgG4亚型的时间分辨荧光免疫分析试剂盒，试剂盒由包被板(1)，分析缓冲液(2)，抗PLA2R自身抗体标准品(3)，铕标记的鼠抗人IgG4抗体(4)，钐标记的羊抗人IgG抗体(5)，浓缩清洗液(6)，增强液(7)所组成。
所述包被板(1)的制备如下：用50mmol/L(pH 9.6)Na2CO3-NaHCO3缓冲液将纯化的PLA2R不同表位抗原决定簇蛋白(CysR或CTLD1或CTLD67或CTLD78或CTLD678)稀释至2.5μg/mL作为包被液，在96微孔板各孔中加100μL，4℃放置过夜；弃去包被液，用50mmol/L(pH 9.6)Na2CO3-NaHCO3缓冲液洗涤3次；然后每孔加200μl含3g/L BSA的上述缓冲液封闭，4℃放置过夜。弃去封闭液，拍干后真空抽干，板条密封后置-20℃冷冻保存待用，一个试剂盒中可以有5块不同表位抗原决定簇蛋白(CysR或CTLD1或CTLD67或CTLD78或CTLD678)包被的96微孔板。
按质量百分比计所述缓冲液的制备如下：6.06g三羟甲基氨基甲烷和8.8g NaCl溶于去离子水中，用盐酸调节pH值为7.8，然后加入5g的BSA、1g的NaN3，定容至1L。
抗PLA2R自身抗体标准品的制备如下：将针对PLA2R不同表位都有高浓度自身抗体的血清，用分析缓冲液稀释抗PLA2R的特异性IgG到系列浓度为标准品，0U/ml浓度点为分析缓冲液。
铕标记的鼠抗人IgG4抗体的制备方法如下：取抗人IgG4抗体l mg，采用超滤管转换缓冲条件至0.155moL/L NaCl的Na2CO3-NaHCO3(50mmoL/L，pH 8.5)缓冲液中。在含0.2mg的Eu3 +-N2-[p-异氰酸-苄基]-二乙烯三胺四乙酸(Eu3+-DTTA)冻干粉的小瓶中加入l mg/0.5ml的抗人IgG4抗体，25℃磁力搅拌反应20小时。反应液经用80mmoL/L tris-HCl pH 7.8缓冲液平衡的Sepharose CL-6B柱(1×40cm)层析，采用DELFIA-1420时间分辨荧光免疫分析仪检测Eu3+荧光值，收集蛋白峰，用缓冲液稀释后分装冻干保存。
钐标记的羊抗人IgG抗体的制备方法如下：同样地，将抗人IgG抗体l mg转换缓冲条件后加入含0.2mg的Sm3+-DTTA中，反应20小时后用Sepharose CL-6B进行分离纯化，采用DELFIA-1420时间分辨荧光免疫分析仪检测Sm3+荧光值，收集蛋白峰后分装冻干保存。
洗涤液的制备如下：取12.1lg的Tris，312.43g的NaCl，27.74g的Tween-20和1g的Triton X-100加入去离子水中，完全溶解后，用盐酸调pH至7.8，然后加去离子水定容至1L，分装，置于2-8℃下保存，即得。
增强液的制备如下：所述的增强液为含体积浓度为3.6‰的冰醋酸，0.5g/L的醋酸钠，0.05g/L的β-萘甲酰三氟丙酮，0.03g/L的三辛基氧化膦和体积浓度为1‰的Triton X-100的混合溶液。
所述的同时检测M型磷脂酶A2受体不同表位决定簇自身抗体IgG及其IgG4亚型的双标记时间分辨荧光免疫分析试剂盒的检测方法，将标准品或1:100稀释的待测血清加入PLA2R不同表位决定簇(CysR或CTLD1或CTLD67或CTLD78或CTLD678)包被的微孔板中，100μl/孔，25℃振荡反应1小时，用洗涤液冲洗4次，每孔加入100μl用反应缓冲液稀释的Eu3+-抗人IgG4单克隆抗体和Sm3+-羊抗人IgG抗体，25℃继续振荡反应1小时，用洗涤液冲洗6次，每孔加入增强液100μl，25℃振荡反应5分钟后，在DELFIA-1420时间分辨荧光免疫分析仪上分别检测Eu3+和Sm3+的荧光信号，根据标准曲线得到样品中抗PLA2R不同表位决定簇IgG和IgG4的浓度。
所述样品的处理方法具体如下：
本发明的有益效果：本发明相关的试剂盒可以提供一种同时检测抗PLA2R不同表位决定簇IgG和IgG4的浓度，并得到两者的比值。提高效率，为临床应用提供了便利。
本发明通过Eu3+标记抗人IgG4，Sm3+标记抗人IgG，进行TRFIA的双标记检测,在同一个包被孔中一次加样操作，可以得到抗PLA2R不同表位决定簇IgG和IgG4的浓度及两者的比值，大大简化了操作步骤，而且采用两个指标同时检测，其比值会更准确。
附图说明
图1为本发明PLA2R独立表位及其抗体示意图。
图2为本发明免疫分析试剂盒的结构示意图。
其中：1、盒体；2、分析缓冲液；3、抗PLA2R自身抗体标准品；4、铕标记的羊抗人IgG抗体；5、浓缩清洗液；6、增强液；7、包被板；8、铕标记的羊抗人IgG4抗体。
具体实施方式
下述实施例中涉及试剂或仪器的均为市售产品，不同厂家的产品在技术效果上并不会带来明显差别。
实施例
所述包被板的制备如下：用50mmol/L(pH 9.6)Na2CO3-NaHCO3缓冲液将纯化的PLA2R不同表位决定簇的重组蛋白(CysR或CTLD1或CTLD67或CTLD78或CTLD678)稀释至2.5μg/mL作为包被液，在96微孔板各孔中加100μL，4℃放置过夜；弃去包被液，用50mmol/L(pH 9.6)Na2CO3-NaHCO3缓冲液洗涤3次；然后每孔加200μl含3g/L BSA的上述缓冲液封闭，4℃放置过夜。弃去封闭液，拍干后真空抽干，板条密封后置-20℃冷冻保存待用。
所述抗PLA2R自身抗体标准品的制备如下：通过初步实验，在膜性肾病患者中筛选出一个含高浓度Anti-PLA2R自身抗体的血清，将高浓度的抗PLA2R自身抗体血清通过偶联有PLA2R重组抗原的亲和层析柱纯化，得到抗PLA2R的特异性IgG，再测定其中IgG和IgG4的含量，用分析缓冲液稀释抗PLA2R的特异性IgG到系列浓度为标准品，0U/ml浓度点为分析缓冲液。
所述铕标记的鼠抗人IgG4抗体(4)的制备方法如下：取抗人IgG4抗体l mg，采用超滤管转换缓冲条件至0.155moL/L NaCl的Na2CO3-NaHCO3(50mmoL/L，pH 8.5)缓冲液中。在含0.2mg的Eu3+-N2-[p-异氰酸-苄基]-二乙烯三胺四乙酸(Eu3+-DTTA)冻干粉的小瓶中加入lmg/0.5ml的抗人IgG4抗体，25℃磁力搅拌反应20小时。反应液经用80mmoL/L tris-HCl pH7.8缓冲液平衡的Sepharose CL-6B柱(1×40cm)层析，采用DELFIA-1420时间分辨荧光免疫分析仪检测Eu3+荧光值，收集蛋白峰，用缓冲液稀释后分装冻干保存。
所述钐标记的羊抗人IgG抗体(5)的制备方法如下：同样地，将抗人IgG抗体l mg转换缓冲条件后加入含0.2mg的Sm3+-DTTA中，反应20小时后用Sepharose CL-6B进行分离纯化，采用DELFIA-1420时间分辨荧光免疫分析仪检测Sm3+荧光值，收集蛋白峰后分装冻干保存。
PLA2R自身抗体的校准品溶液：将高浓度PLA2R抗体稀释成不同浓度的校准品制备得到；
所述的反应缓冲液的制备为6.06g三羟甲基氨基甲烷和8.8g NaCl溶于去离子水中，用盐酸调节pH值为7.8，然后加入5g的的BSA、1g的NaN3；
所述的浓缩清洗液为含12.1lg/L的Tris，312.43g/L的NaCl，27.74g/L的Tween-20，1g/L的Triton X-100，以盐酸调节pH为7.8的缓冲溶液；
所述的增强液为含体积浓度为3.6‰的冰醋酸，0.5g/L的醋酸钠，0.05g/L的β-萘甲酰三氟丙酮，0.03g/L的三辛基氧化膦和体积浓度为1‰的Triton X-100的混合溶液；
本实施提供了一种同时检测M型磷脂酶A2受体不同表位决定簇自身抗体IgG及其IgG4亚型的时间分辨荧光免疫分析试剂盒，由以下部分：包被板(1)，分析缓冲液(2)抗PLA2R自身抗体标准品(3)，铕标记的鼠抗人IgG4抗体(4)，钐标记的羊抗人IgG抗体(5)，浓缩清洗液(6)，增强液(7)所组成。
所述的基于同时检测M型磷脂酶A2受体不同表位决定簇自身抗体IgG及其IgG4亚型的双标记时间分辨荧光免疫分析试剂盒，所述试剂盒包含：
所述的浓缩清洗液，60mL；
所述的增强液，60mL；
所述的反应缓冲液，60mL；
所述铕标记的抗人IgG4抗体溶液，1.5mL；
所述钐标记的抗人IgG抗体溶液，1.5mL；
所述抗PLA2R不同表位抗原决定簇自身抗体标准品溶液，0-100U/ml，每瓶2mL；
所述的96孔包被板5块，分别包被了CysR、CTLD1、CTLD67、CTLD78、CTLD678等重组抗原。
1、使用之前将所有试剂回升至室温(18-30℃)。
2、使用之后立即将所有试剂放回2-8℃。
3、如果样品量大建议使用多通道移液器。
4、在所有恒温孵育过程中避免光线照射，用盖子盖住微孔。
5、取出需用数量的微孔板及框架，将不用的微孔板放进原锡箔袋中并且与提供的干燥剂一起重新密封,保存于2-8℃。
本发明提供了一种制备所述的基于同时检测M型磷脂酶A2受体不同表位决定簇自身抗体IgG及其IgG4亚型的双标记时间分辨荧光免疫分析试剂盒的方法，具体检测步骤如下：
样品处理：全血标本于1000g离心15分钟，取上清液备用。
分别取包被有PLA2R不同表位决定簇CysR、CTLD1、CTLD67、CTLD78、CTLD678等的5块板条(也可以取其中的任几块包被板的组合进行实验操作，如CysR、CTLD1、CTLD67，如CysR、CTLD1、CTLD78，如CysR、CTLD1、CTLD678，如CysR、CTLD67，如CysR、CTLD678，如CysR、CTLD78等)。将标准品或1:100稀释的待测血清加入PLA2R不同表位决定簇重组蛋白包被的微孔板中，100μl/孔，25℃振荡反应1小时，用洗涤液冲洗4次，每孔加入100μl用反应缓冲液1：50稀释的Eu3+-抗人IgG4单克隆抗体和Sm3+-羊抗人IgG抗体，25℃继续振荡反应1小时，用洗涤液冲洗6次，每孔加入增强液100μl，25℃振荡反应5分钟后，在DELFIA-1420时间分辨荧光免疫分析仪上分别检测Eu3+和Sm3+的荧光信号，根据标准曲线得到样品中抗PLA2R不同表位抗原决定簇的IgG和IgG4的浓度并计算两者比值。之后利用统计绘制标准曲线和计算样品浓度。
以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征和本发明的优点,对于本领域技术人员而言,显然本发明不限于上述示范性实施例的细节。
发明的精神或基本特征的情况下,能够以其他的具体形式实现本发明。因此,无论从哪一点来看,均应将实施例看作是示范性的,而且是非限制性的,本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定,因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。
此外,应当理解,虽然本说明书按照实施方式加以描述,但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案,说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见,本领域技术人员应当将说明书作为一个整体,各实施例中的技术方案也可以经适当组合,形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。
Claims (11)
1.检测M型磷脂酶A2受体IgG和IgG4的免疫分析试剂盒，其特征在于由以下部分：包被板(1)、分析缓冲液(2)、抗PLA2R自身抗体标准品(3)、铕标记的鼠抗人IgG4抗体(4)、钐标记的羊抗人IgG抗体(5)、浓缩清洗液(6)和增强液(7)和盒体8所组成。
2.如权利要求1所述的检测M型磷脂酶A2受体IgG和IgG4的免疫分析试剂盒，其特征在于所述包被板(1)的制备如下：包被板(1)包被固相PLA2R不同表位抗原(CysR或CTLD1或CTLD67或CTLD78或CTLD678)，用50mmol/L(pH9.6)Na2CO3-NaHCO3缓冲液将纯化的PLA2R不同表位抗原稀释至2.5μg/mL作为包被液，分别在96微孔板各孔中加100μL，4℃放置过夜；弃去包被液，用50mmol/L(pH9.6)Na2CO3-NaHCO3缓冲液洗涤3次；然后每孔加200μl含3g/LBSA的上述缓冲液封闭，4℃放置过夜，弃去封闭液，拍干后真空抽干，板条密封后置-20℃冷冻保存待用。
3.如权利要求1所述的检测M型磷脂酶A2受体IgG和IgG4的免疫分析试剂盒，其特征在于按质量百分比计所述分析缓冲液(2)的制备如下：取6.06g三羟甲基氨基甲烷和8.8gNaCl溶于去离子水中，用盐酸调节PH值为7.8，然后加入5gBSA、1g的NaN3，随后加去离子水定容至1L，分装，置于2-8℃下保存即得。
4.如权利要求1所述的检测M型磷脂酶A2受体IgG和IgG4的免疫分析试剂盒，其特征在于抗PLA2R自身抗体标准品(3)的制备如下：通过初步实验，在膜性肾病患者中筛选出一个含高浓度Anti-PLA2R不同表位决定簇自身抗体的血清，将高浓度的抗PLA2R不同表位决定簇自身抗体血清用分析缓冲液稀释到系列浓度为标准品，0U/ml浓度点为分析缓冲液。
5.如权利要求1所述的检测M型磷脂酶A2受体IgG和IgG4的免疫分析试剂盒及其检测方法，其特征在于铕标记的鼠抗人IgG4抗体(4)的制备方法如下：取抗人IgG4抗体lmg，采用超滤管转换缓冲条件至0.155moL/LNaCl的Na2CO3-NaHCO3(50mmoL/L，pH8.5)缓冲液中，在含0.2mg的Eu3+-N2-[p-异氰酸-苄基]-二乙烯三胺四乙酸(Eu3+-DTTA)冻干粉的小瓶中加入lmg/0.5ml的抗人IgG4抗体，25℃磁力搅拌反应20小时，反应液经用80mmoL/Ltris-HClpH7.8缓冲液平衡的SepharoseCL-6B柱(1×40cm)层析，采用DELFIA-1420时间分辨荧光免疫分析仪检测Eu3+荧光值，收集蛋白峰，用缓冲液稀释后分装冻干保存。
6.如权利要求1所述的检测M型磷脂酶A2受体IgG和IgG4的免疫分析试剂盒，其特征在于钐标记的羊抗人IgG抗体(5)的制备方法如下：同样地，将抗人IgG抗体lmg转换缓冲条件后加入含0.2mg的Sm3+-DTTA中，反应20小时后用SepharoseCL-6B进行分离纯化，采用DELFIA-1420时间分辨荧光免疫分析仪检测Sm3+荧光值，收集蛋白峰后分装冻干保存。
7.如权利要求1所述的检测M型磷脂酶A2受体IgG的免疫分析试剂盒，其特征在于洗涤液(6)的制备如下：14.5mmol/LNaCl、0.2mL/LTween-80和0.2％NaN3的50mmol/LpH7.8的Tris-HCl。
8.如权利要求1所述的检测M型磷脂酶A2受体IgG和IgG4的免疫分析试剂盒，其特征在于增强液(7)的制备如下：体积浓度为3.6‰的冰醋酸，0.5g/L的醋酸钠，0.05g/L的β-萘甲酰三氟丙酮，0.03g/L的三辛基氧化膦和体积浓度为1‰的TritonX-100的混合溶液。
9.如权利要求1所述的检测M型磷脂酶A2受体IgG和IgG4的免疫分析试剂盒，其特征在于将标准品或1:100稀释的待测血清分别加入PLA2R不同表位决定包被的不同的微孔板中，100μl/孔，25℃振荡反应1小时，用洗涤液冲洗4次，每孔加入100μl用反应缓冲液稀释的Eu3 +-抗人IgG4单克隆抗体和Sm3+-羊抗人IgG抗体，25℃继续振荡反应1小时，用洗涤液冲洗6次，每孔加入增强液100μl，25℃振荡反应5分钟后，在DELFIA-1420时间分辨荧光免疫分析仪上分别检测Eu3+和Sm3+的荧光信号，根据标准曲线得到样品中抗PLA2R不同表位抗原决定簇IgG和IgG4的浓度。
10.一种检测M型磷脂酶A2受体IgG和IgG4的免疫分析试剂盒的检测方法，包括权利要求1-8所述的检测M型磷脂酶A2受体IgG的免疫分析试剂盒，其特征在于所述样品的处理方法具体如下：
S1、分别取所述PLA2R不同表位抗原决定簇自身抗体校准品溶液和待测样品，分别与所述包被PLA2R不同表位抗原决定簇抗原(CysR或CTLD1或CTLD67或CTLD78或CTLD678)微孔板混合，然后进行孵育备用；
S2、将S1步骤中的孵育后的溶液吸弃上清液，然后加入所述洗涤液清洗；
S3、将所述分析缓冲液稀释的铕标记的鼠抗人IgG4抗体溶液和钐标记的羊抗人IgG抗体溶液加入步骤S2中的清洗后的微孔板中，进行振荡孵育，然后用所述洗涤液进行清洗，然后加入所述增强液振荡反应；
S4、采用时间分辨荧光免疫分析仪分别测定S3步骤中的增强后的溶液中铕和钐的荧光值，分别获得所述PLA2R不同表位抗原决定簇自身抗体校准品溶液和待测样品的荧光值，然后分别根据所述PLA2R不同表位抗原决定簇自身抗体校准品溶液中所述PLA2R不同表位抗原决定簇IgG和IgG4抗体的浓度和其各自对应的荧光值绘制标准曲线，然后将所述待测样品的对应荧光值代入对应的所述PLA2R不同表位抗原决定簇IgG标准曲线或IgG4标准曲线中，计算得到所述待测样品中PLA2R不同表位抗原决定簇IgG和IgG4的浓度的含量，并计算两者比值。
11.如权利要求9所述的检测M型磷脂酶A2受体IgG和IgG4的免疫分析试剂盒的检测方法，其特征在于检测PLA2R不同表位抗原决定簇IgG和IgG4。其中检测的PLA2R表位可以是CysR、CTLD1、CTLD67、CTLD78、CTLD678的全部，也可以是其中的任几项的组合，如CysR、CTLD1、CTLD67，如CysR、CTLD1、CTLD78，如CysR、CTLD1、CTLD678，如CysR、CTLD67，如CysR、CTLD678，如CysR、CTLD78等。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication | ||
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Application publication date: 20201016 |