KR101521565B1

KR101521565B1 - 생체 분자 분석 키트 및 분석 방법

Info

Publication number: KR101521565B1
Application number: KR1020120101054A
Authority: KR
Inventors: 임흥빈
Original assignee: 단국대학교 산학협력단
Priority date: 2012-08-24
Filing date: 2012-09-12
Publication date: 2015-05-21
Also published as: EP2889622A1; US10281461B2; KR20140026989A; WO2014030985A1; KR101543583B1; DK3073266T3; US20150219640A1; EP3073266B1; EP3073266A1; EP2889622A4; KR20140026990A; ES2688380T3

Abstract

생체 분자 분석 키트 및 분석 방법이 제공된다. 본 발명의 일 실시예에 따른 생체 분자 분석 키트는 분석 대상 생체 분자와 특이적으로 결합하는 제1 결합 수단을 포함하는 제1 미소 입자, 및 분석 대상 생체 분자와 비특이적으로 결합하는 제2 결합 수단을 포함하는 제2 미소 입자를 포함한다.

Description

생체 분자 분석 키트 및 분석 방법 {Biomolecules analysis kit and analysis method using the same}

본 발명은 생체 분자 분석 키트 및 분석 방법으로서, 보다 상세하게는 항생제 또는 암세포 등과 같은 생체 분자를 신속하고 정확하게 분석하기 위한 분석 키트 및 분석 방법에 관한 것이다.

항생제 또는 암세포 등과 같은 생체 분자를 신속하고 정확하게 분석하는 것은 사회 전반적인 의료 및 보건 측면에서 매우 중요하다. 예를 들면, 엔로플록사신(enrofloxacin)과 같은 생체 분자는 인간과 가축의 의학 치료에 널리 사용되는 플루오로퀴놀론 커맨드(fluoroquinolones command)에 주로 사용되는 항생제 중 하나인데, 적용 분야에 따라 그의 부작용이 작은 경우부터 매우 심한 경우까지 있다. 인간 건강에 대한 위험성 때문에, 미국 식품의약국(food and drug administration, FDA)와 세계보건기구(world health organization, WHO)와 같은 조직들은 엔로플록사신의 용법에 대한 규정을 발효하였고, 유럽연합(European union, EU)는 엔로플록사신에 대한 최대 잔류 한계를 설정하였다. 따라서, 식료품 등에서 이러한 항생제 잔류물의 주의 깊은 모니터링이 인간 건강에 중요하다.

그 동안 고압 액체 크로마토그래피(high pressure liquid chromatography, HPLC), 액체 크로마토그래피 질량분석법(liquid chromatography mass spectrometry, LC-MS), 모세관 전기 영동(capillary electrophoresis), ELISA(enzime linked immunosorbent assay) 등과 같은 다양한 생체 분자 분석 장치 및 분석 방법이 개발되었다. 그들 중에, HPLC와 LC-MS가 현재 고해상도의 가장 민감한 분석 기술이지만, 그들은 힘과 시간을 소요하는 방법으로, 정교한 작동 및 전처리를 필요로 한다. ELISA는 신속한 분석을 제공하지만, 복잡한 실험 과정 및 정량화에 대한 상대적으로 낮은 감도의 단점이 있다.

이에, 본 발명이 해결하고자 하는 과제는 생체 분자를 신속하고 정확하게 분석하기 위한 분석 키트 및 분석 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 과제들은 이상에서 언급한 기술적 과제로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 기술적 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

상기 과제를 달성하기 위한 본 발명의 일 실시예에 따른 생체 분자 분석 키트는 분석 대상 생체 분자와 특이적으로 결합하는 제1 결합 수단을 포함하는 제1 미소 입자, 및 분석 대상 생체 분자와 비특이적으로 결합하는 제2 결합 수단을 포함하는 제2 미소 입자를 포함한다.

상기 다른 과제를 달성하기 위한 본 발명의 일 실시예에 따른 생체 분자 분석 방법은 분석 대상 생체 분자와 특이적으로 결합하는 제1 결합 수단을 포함하는 제1 미소 입자를 준비하는 단계, 분석 대상 생체 분자와 비특이적으로 결합하는 제2 결합 수단을 포함하는 제2 미소 입자를 준비하는 단계, 및 제1 미소 입자와 제2 미소 입자를 분석 대상 생체 분자와 혼합하는 단계를 포함한다.

기타 실시예들의 구체적인 사항들은 상세한 설명 및 도면들에 포함되어 있다.

본 발명의 실시예들에 의하면 적어도 다음과 같은 효과가 있다.

즉, 미소 분포된 생체 분자의 존재와 함유량을 신속히 알 수 있다.

또한, 미소 분포된 생체 분자의 존재와 함유량을 간단한 방법으로 정확하게 알 수 있다.

본 발명에 따른 효과는 이상에서 예시된 내용에 의해 제한되지 않으며, 더욱 다양한 효과들이 본 명세서 내에 포함되어 있다.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 생체 분자 분석 키트의 구성도이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 생체 분자 분석 키트와 분석 대상 생체 분자와의 결합 관계를 도시한 구성도이다.
도 3는 본 발명의 일 실시예에 따른 생체 분자 분석 방법을 개략적으로 나타낸 순서도이다.
도 4은 본 발명의 다른 실시예에 따른 생체 분자 분석 키트의 구성도이다.
도 5은 본 발명의 다른 실시예에 따른 생체 분자 분석 방법을 개략적으로 나타낸 순서도이다.
도 6는 생체 분자 중 엔로플록사신 및 시프로플록사신의 전처리 공정의 개략도이다.
도 7의 (a)는 플루오레세인 이소티오시아네이트가 도핑된 코어-쉘 나노파티클의 주사전자현미경 이미지이고, (b)는 레이저 없는 비형광 이미지이고, (c)는 레이저를 통한 플루오레세인 이소티오시아네이트가 도핑된 코어-쉘 나노파티클의 형광 이미지이다.
도 8은 본 발명의 일 실시예에 따른 생체 분자 분석 키트를 이용하여 생체 분자 중 엔로플록사신를 분석하는 실험 절차에 대한 개략도이다.
도 9은 본 발명의 일 실시예에 따른 생체 분자 분석 키트 및 레이저 유도 형광 현미경을 이용하여 도시한 엔로플록사신의 검량선(a)과 효소 결합 면역흡착 분석법을 이용하여 도시한 엔로플록사신의 검량선(b)이다.
도 10는 코어-쉘 나노파티클 상의 항체의 양를 측정하는 방법의 개략도이다.
도 11의 (a)는 플루오레세인 이소티오시아네이트가 태그된 2차 항체의 검량선이고, (b)는 사이아닌이 도핑된 코어-쉘 나노파티클의 검량선이다.

본 발명의 이점 및 특징, 그리고 그것들을 달성하는 방법은 첨부되는 도면과 함께 상세하게 후술되어 있는 실시예들을 참조하면 명확해질 것이다. 그러나 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예들에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 것이며, 단지 본 실시예들은 본 발명의 개시가 완전하도록 하며, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이며, 본 발명은 청구항의 범주에 의해 정의될 뿐이다.

소자(elements) 또는 층이 다른 소자 또는 층"위(on)"로 지칭되는 것은 다른 소자 바로 위에 또는 중간에 다른 층 또는 다른 소자를 개재한 경우를 모두 포함한다. 명세서 전체에 걸쳐 동일 참조 부호는 동일 구성 요소를 지칭한다.

비록 제1, 제2 등이 다양한 구성요소들을 서술하기 위해서 사용되나, 이들 구성요소들은 이들 용어에 의해 제한되지 않음은 물론이다. 이들 용어들은 단지 하나의 구성요소를 다른 구성요소와 구별하기 위하여 사용하는 것이다. 따라서, 이하에서 언급되는 제1 구성요소는 본 발명의 기술적 사상 내에서 제2 구성요소일 수도 있음은 물론이다.

이하, 도면을 참조하여 본 발명의 실시예들에 대하여 설명한다.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 생체 분자 분석 키트(100)의 구성도이다. 도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 생체 분자 분석 키트(100)와 분석 대상 생체 분자(300)와의 결합 관계를 도시한 구성도이다. 이하, 도 1 및 도 2를 참조하여, 본 발명의 일 실시예에 따른 생체 분자 분석 키트(100)에 대해 설명한다.

본 발명의 일 실시예에 따른 생체 분자 분석 키트(100)는 분석 대상 생체 분자(300)와 특이적으로 결합하는 제1 결합 수단(111)을 포함하는 제1 미소 입자(110), 및 분석 대상 생체 분자(300)와 비특이적으로 결합하는 제2 결합 수단(121)을 포함하는 제2 미소 입자(120)를 포함한다.

생체 분자는 생체에서 배출되거나 분리되는 물질로서, 생체에서 생성되는 물질뿐만 아니라, 생체에 투입되어 일정 시간 잔류하는 물질을 포함할 수 있다. 예를 들어, 생체 분자는 항생제, 핵산, 호르몬, 효소, 세포, 종양, 암세포, 세균, 바이러스 및 이들의 분비물 등을 포함할 수 있다. 상기 항생제의 예로는 엔로플록사신, 시프로플록사신, 살리노마이신, 페니실린, 세팔로스포린, 모토박탐, 카바페넴, 암피실린, 카르복시페니실린, 세팔로스포린, 네오마이신, 겐타마이신, 이세파마이신, 시소마이신, 에리트로마이신, 클래리트로마이신, 반코마이신, 타이코플라닌, 린코마이신, 술파티아졸, 테트라사이클린, 옥시테트라사이클린, 설파메라진 등을 들 수 있다.

제1 미소 입자(110)는 적어도 하나 이상의 제1 결합 수단(111)을 포함할 수 있다. 제1 미소 입자(110)가 포함하는 제1 결합 수단(111)의 수는 조절이 가능할 수 있다.

생체 분자는 적어도 일부분이 제1 결합 수단(111)과 특이적으로 결합할 수 있다. 여기서, 제1 결합 수단(111)이 분석 대상 생체 분자(300)와 특이적으로 결합한다는 것의 의미는, 제1 결합 수단(111)이 분석 대상 생체 분자(300)와만 결합한다는 것의 의미일 수 있다. 따라서, 분석 대상 생체 분자(300)가 특정 조건 하에서 제1 미소 입자(110)와 혼합되면, 제1 결합 수단(111)과의 특이적 결합을 매개하여 제1 미소 입자(110)와 결합할 수 있다.

상기 특이적 결합의 예로는 항원 항체결합, 유전자의 상보적 결합 등을 들 수 있다.

예를 들어, 생체 분자가 특정 항원으로 인식되는 부위를 포함할 경우, 제1 결합 수단(111)은 그에 대한 특이적 항체를 포함할 수 있다. 상기 항체는 단일 클론 항체 또는 다중 클론 항체일 수 있다. 여기서, 단일 클론 항체는 상대적으로 크기가 작을 뿐만 아니라, 하나의 항체에 분석 대상이 아닌 생체 분자가 결합할 가능성이 낮으므로, 분석 민감도가 우수하다. 예시적인 실시예에서, 항체는 하나의 분석 대상 생체 분자(300)와만 결합하고, 그 크기가 작아 주변 분자와의 상호작용이 작은 단일 클론 항체일 수 있다.

생체 분자가 뉴클레오티드 중합체를 포함할 경우, 제1 결합 수단(111)은 그에 상보적으로 결합하는 단일 가닥 뉴클레오티드 중합체일 수 있다. 여기서, 상기 단일 가닥 뉴클레오티드 중합체는 올리고뉴클레오티드일 수 있다. 올리고뉴클레오티드는 상술한 단일 클론 항체와 같이 그 크기가 작아 주변 분자와의 상호작용이 낮아 분석 대상 생체 분자의 검출 민감도를 향상시킬 수 있다.

제1 미소 입자(110)는 또한 광학 발현부(112)를 포함할 수 있다. 광학 발현부(112)는 그 존부 및/또는 존재량에 관한 정보가 광학적인 측정에 의해 가능한 부위일 수 있다. 이와 같은 관점에서, 광학 발현부(112)는 형광 물질, 발광 물질, 또는 금속 물질 등이나 이들의 조합을 포함하여 이루어질 수 있다.

예를 들어, 광학 발현부(112)가 형광 물질을 포함하여 이루어진 경우, UV 조사에 의해 발광되어 특정 파장의 가시광선을 방출하기 때문에, 제1 미소 입자(110)의 존부 및 존재량이 확인될 수 있다. 여기서, 상기 형광 물질로는 플루오레세인 이소티오시아네이트(Fluorescein isothiocyanate, FITC), 사이아닌(Cyanine, Cy), 또는 로다민 B 이소티오시아네이트(rhodamine B isothiocyanate, RhBICT) 등이 예시될 수 있다.

광학 발현부(112)가 발광 물질을 포함하여 이루어진 경우, 발광액과의 접촉에 의해 가시광선을 방출하기 때문에, 제1 미소 입자(110)의 존부 및 존재량이 확인될 수 있다.

광학 발현부(112)가 금속 물질을 포함하여 이루어진 경우, X선 조사 장치 또는 유도 결합 플라즈마 질량분석기(inductively coupled plasma mass spectrometry, ICP-MS) 등에 의해 그 존부 및 존재량이 확인될 수 있다. 여기서, 광학적 검출이 가능한 다양한 금속이 적용될 수 있고, 각 금속이 보유하는 고유한 색상이 검출에 활용될 수 있다.

광학 발현부(112)는 비드 형상으로 구성될 수 있다. 예를 들어, 하나의 제1 미소 입자의 광학 발현부(112)는 하나의 비드로 이루어질 수 있다. 다른 예시적인 실시예에서, 하나의 제1 미소 입자의 광학 발현부(112)는 매트릭스 및 그에 분산된 복수의 비드를 포함하여 전체가 개략적인 비드 형상을 가질 수도 있다. 여기서, 상기 매트릭스는 고분자 수지이고, 비드는 상술한 형광 물질, 발광 물질 또는 금속 물질일 수 있다.

본 발명의 몇몇 실시예에서, 제1 미소 입자(110)는 광학 발현부(112)를 코팅하는 코팅층(113)을 더 포함할 수 있다. 도면에서는 예시적인 실시예로서, 코팅층(113)이 비드 형상의 광학 발현부(112) 표면 전체를 커버하도록 형성되며, 코팅층(113)의 두께가 일정한 경우를 도시하지만, 이에 제한되지 않으며, 코팅층(113)의 두께가 불균일하거나, 코팅층(113)이 광학 발현부(112)를 일부만 커버하고, 다른 일부는 노출할 수도 있다.

광학 발현부(112)는 상대적으로 내측에 배치되고, 코팅층(113)은 상대적으로 외측에 배치된다. 제1 미소 입자(110)는 광학 발현부(112)를 코어로 하고, 코팅층(113)을 쉘로 하는 코어-쉘 나노파티클일 수 있다.

코팅층(113)은 투명한 물질로 이루어질 수 있다. 예를 들어, 코팅층(113)은 실리카로 이루어질 수 있다. 광학 발현부(112)가 코팅층(113)에 의해 커버되어 있으므로, 제1 미소 입자(110)의 광학 발현부(112)가 다양한 외부 요인들로부터 보호될 수 있고, 따라서, 광학 발현부(112)의 광학적 특징이 유지될 수 있다. 예를 들어, 광학 발현부(112)가 형광 물질을 포함하여 이루어진 경우, 광퇴색(photobleaching)이 감소될 수 있다. 따라서, 광학 발현부(112)의 광학적 특징이 유지될 수 있으므로, 광학적 측정시 측정 민감도가 개선될 수 있다.

또한, 제1 미소 입자(110)에는 다양한 종류의 광학 발현부(112)가 포함될 수 있고, 상기 다양한 종류의 광학 발현부(112)를 각각 별도로 취급하는 것은 공정상 매우 번거로울 수 있다. 따라서, 제1 미소 입자(110)에 포함될 수 있는 다양한 종류의 광학 발현부(112)를 실리카로 이루어진 일정한 코팅층(113)으로 코팅하면, 상기 실리카로 이루어진 코팅층(113) 상에 특정 결합 수단을 결합하는 공정은 통일이 가능하므로, 제1 미소 입자(110)의 제조 공정의 단순화 측면에서도 유리할 수 있다.

제2 결합 수단(121)이 분석 대상 생체 분자(300)와 비특이적으로 결합한다는 것의 의미는, 제2 결합 수단(121)이 분석 대상 생체 분자(300)뿐만 아니라 분석 대상이 아닌 생체 분자와도 결합한다는 것의 의미일 수 있다. 즉, 제2 결합 수단(121)에 결합된 생체 분자는 분석 대상 생체 분자(300) 및/또는 분석 대상이 아닌 생체 분자를 포함할 수 있다.

제2 결합 수단(121)은 분석 대상 생체 분자(300)와 화학적으로 결합하는 작용기일 수 있다. 즉, 제2 결합 수단(121)과 분석 대상 생체 분자(300)는 작용기를 매개로 화학적으로 결합할 수 있다. 작용기는 알데하이드기, 에테르기, 에스터기, 케톤기, 설파이드기, 티올기, 아릴기, 아민기, 카르복실기, 및 히드록시기 중 적어도 어느 하나를 포함할 수 있다. 바람직하게 작용기는 일반적인 생체 분자와 결합 구조를 형성할 수 있는 작용기인 아민기, 카르복실기, 및 히드록시기 중 적어도 어느 하나를 포함할 수 있다.

제2 미소 입자(120)는 적어도 하나 이상의 제2 결합 수단(121)을 포함할 수 있다. 제2 미소 입자(120)가 포함하는 제2 결합 수단(121)의 수는 조절이 가능할 수 있다.

분석 대상 생체 분자(300)에는 제2 미소 입자(120)의 제2 결합 수단(121)에 대응하는 별도의 결합 수단이 존재하고, 상기 별도의 결합 수단은 제2 결합 수단(121)과 비특이적으로 결합할 수 있다. 예를 들어, 이에 제한되는 것은 아니지만, 작용기가 아민기이고 분석 대상 생체 분자(300)가 카르복실기를 포함하고 있거나, 작용기가 카르복실기고 분석 대상 생체 분자(300)가 아민기를 포함하고 있으면, 분석 대상 생체 분자(300)와 제2 미소 입자(120)는 아마이드 결합을 할 수 있고, 상기 아마이드 결합은 제2 미소 입자(120)와 분석 대상 생체 분자(300)를 결합시킬 수 있다.

제2 미소 입자(120)는 자성 물질(122)을 포함할 수 있다. 자성 물질(122)이란 자력을 가하면 유동하는 성질을 가진 물질을 의미할 수 있다. 자성 물질(122)은 비드 형상으로 이루어질 수 있다. 자성 물질(122)은 제2 미소 입자(120) 또는 제1 미소 입자(110)-분석 대상 생체 분자(300)-제2 미소 입자(120) 결합체의 분리를 위한 것일 수 있다. 즉, 자성 물질(122)을 이용함으로써, 제2 미소 입자(120) 또는 제1 미소 입자(110)-분석 대상 생체 분자(300)-제2 미소 입자(120) 결합체가 포함된 용액에서 제2 미소 입자(120) 또는 제1 미소 입자(110)-분석 대상 생체 분자(300)-제2 미소 입자(120) 결합체를 농축시켜 측정 민감도를 높일 수 있다. 여기서, 농축의 의미는 주변의 다른 물질들을 제외하고 특정 물질만을 분리한다는 의미일 수 있다.

제2 미소 입자(120)의 자성 물질(122)은 코팅층(123)으로 코팅될 수 있다. 즉, 제2 미소 입자(120)도 제1 미소 입자(110)와 같이 코어-쉘 나노파티클일 수 있다. 자성 물질(122)을 코팅하는 코팅층(123)은 상술한 제1 미소 입자(110)의 광학 발현부(112)를 코팅하는 코팅층(123)과 실질적으로 동일할 수 있다. 구체적으로, 제1 미소 입자(110)의 광학 발현부(112)의 코팅층(123)과 동일한 물질로 구성될 수 있다. 또한, 광학 발현부(112)와 자성 물질(122)은 동일한 공정에서 코팅될 수도 있다. 상술한 광학 발현부(112)가 코팅되어 있는 것과 같이, 자성 물질(122)이 코팅되어 있음으로 인하여, 제2 미소 입자(120)의 자성 물질(122)은 다양한 외부 요인들로부터 보호될 수 있다.

또한, 상술한 제1 결합 수단(111) 및 제2 결합 수단(121)이 스위칭될 수 있다. 즉, 분석 대상 생체 분자(300)와 특이적으로 결합하는 제1 결합 수단(111)은 자성 물질(122)을 포함하는 입자와 결합될 수 있으며, 분석 대상 생체 분자(300)와 비특이적으로 결합하는 제2 결합 수단(121)은 광학 발현부(112)를 포함하는 입자와 결합될 수 있다.

도 3는 본 발명의 일 실시예에 따른 생체 분자 분석 방법을 개략적으로 나타낸 순서도이다. 이하, 도 3을 참조하여, 본 발명의 일 실시예에 따른 생체 분자 분석 방법에 대해 설명한다.

본 발명의 일 실시예에 따른 생체 분자 분석 방법은 분석 대상 생체 분자(300)와 특이적으로 결합하는 제1 결합 수단(111)을 포함하는 제1 미소 입자(110)를 준비하는 단계(S1), 분석 대상 생체 분자(300)와 비특이적으로 결합하는 제2 결합 수단(121)을 포함하는 제2 미소 입자(120)를 준비하는 단계(S21), 및 제1 미소 입자(110)와 제2 미소 입자(120)를 분석 대상 생체 분자(300)와 혼합하는 단계(S3)를 포함한다. 제1 미소 입자(110)와 제2 미소 입자(120)를 분석 대상 생체 분자(300)와 혼합하면, 제1 미소 입자(110)의 제1 결합 수단(111)이 분석 대상 생체 분자(300)와 특이적으로 결합하고, 제2 미소 입자(120)의 제2 결합 수단(121)이 동일한 분석 대상 생체 분자(300)와 비특이적으로 결합하여, 제1 미소 입자(110)-분석 대상 생체 분자(300)-제2 미소 입자(120)의 결합체를 구성할 수 있다.

여기서, 제1 미소 입자(110)가 포함하고 있는 제1 결합 수단(111)의 수는 측정 민감도와 검출 한계에 대한 중요한 인자일 수 있다. 즉, 제1 미소 입자(110)에는 하나의 광학 발현부(112)가 존재할 수 있고, 하나의 광학 발현부(112)에 의해 측정되는 값이 몇 개의 분석 대상 생체 분자(300)를 의미하는지는 측정 민감도에 직접적으로 영향을 주는 요소일 수 있다. 따라서, 제1 미소 입자(110)가 포함하고 있는 제1 결합 수단(111)의 수를 측정하는 것이 필요할 수 있다.

제1 미소 입자(110)가 포함하고 있는 제1 결합 수단(111)의 수를 측정하기 위하여, 분석 대상 생체 분자(300)와 특이적으로 결합하는 제1 결합 수단(111)을 포함하는 제1 미소 입자(110)를 준비하는 단계(S1) 후에, 제1 결합 수단(111)과 특이적으로 결합하는 제3 결합 수단(231)을 포함하는 제3 미소 입자(230)를 상기 제1 미소 입자(110)와 혼합하여 결합시키는 단계, 및 제1 미소 입자(110) 및 제3 미소 입자(230)의 결합 비율을 측정하는 단계를 더 포함할 수 있다.

후술하겠지만, 본 명세서에서 제3 미소 입자(230) 및 제3 결합 수단(231)이라고 지칭되는 것은 본 발명의 다른 실시예에 따른 생체 분자 분석 키트(200)에 포함되는 구성 요소와 동일할 수 있으므로, 이하, 도 3뿐만 아니라 본 발명의 다른 실시예에 따른 생체 분자 분석 키트(200)의 구성도인 도 4도 참조하여 설명한다.

제3 결합 수단(231)은 제1 미소 입자(110)를 항원으로 인식하는 항체 또는 제1 미소 입자(110)와 상보적으로 결합하는 단일 가닥 뉴클레오티드 중합체일 수 있다. 예를 들어, 이에 한정되는 것은 아니지만, 제3 결합 수단(231)은 단일 클론 항체일 수 있다. 또한, 제3 결합 수단(231)은 올리고뉴클레오티드일 수 있다.

또한, 제3 미소 입자(230)는 광학 발현부(232)를 포함할 수 있으며, 광학 발현부(232)는 형광 물질, 발광 물질, 및 금속 물질 중 적어도 어느 하나일 수 있다. 제3 미소 입자(230)의 광학 발현부(232)는 제1 미소 입자(110)의 광학 발현부(112)처럼 코팅층(113)으로 코팅되어 있지 않을 수 있다. 또한, 제3 미소 입자(230)의 광학 발현부(232)가 발광 물질로 이루어진다면, 일반적으로, 발광 물질은 안정적인 구조를 가지고 있으므로, 제3 미소 입자(230)의 광학 발현부(232)는 코팅이 불필요할 수 있다. 즉, 제3 미소 입자(230)의 광학 발현부(232)는 제3 결합 수단(231)에 태그되어 있을 수 있다.

또한, 제1 미소 입자의 광학 발현부(112)와 제3 미소 입자(230)의 광학 발현부(232)는 상이한 파장의 빛을 흡수하거나 반사할 수 있다. 구체적으로 제1 미소 입자의 광학 발현부(112)와 제3 미소 입자(230)의 광학 발현부(232)는 상이한 물질로 이루어질 수 있다.

구체적인 제1 미소 입자(110)가 포함하고 있는 제1 결합 수단(111)의 수를 측정하는 방법은, 먼저, 제1 미소 입자(110)와 제3 미소 입자(230)를 준비하고, 이들을 혼합하여 제1 미소 입자(110)와 제3 미소 입자(230)의 결합체를 형성할 수 있다. 다음으로 제1 미소 입자(110)의 광학 발현부(112)가 흡수 또는 반사하는 파장의 빛과, 제3 미소 입자(230)의 광학 발현부(232)가 흡수 또는 반사하는 파장의 빛을 제1 미소 입자(110)와 제3 미소 입자(230)의 결합체에 조사하여 두 개의 검량선을 도시할 수 있다. 두 개의 검량선을 비교분석하면 제1 미소 입자(110)가 몇 개의 제1 결합 수단(111)을 포함하고 있는지를 알 수 있다.

제2 미소 입자(120)는 자성 물질(122)을 포함할 수 있으며, 분석 대상 생체 분자(300)와 비특이적으로 결합하는 제2 결합 수단(121)을 포함하는 제2 미소 입자(120)를 준비하는 단계(S21) 후에, 제2 미소 입자(120)를 포집하여 농축시키는 단계(S22)를 더 포함할 수 있다. 즉, 제2 미소 입자(120)가 포함된 용액에서 제2 미소 입자(120)만을 선별하여 분리할 수 있다.

또한, 제1 미소 입자(110)와 제2 미소 입자(120)를 분석 대상 생체 분자(300)와 혼합하는 단계(S3) 후에, 제2 미소 입자(120)를 포집하여 농축시키는 단계(S4)를 더 포함할 수도 있다. 여기서, 제2 미소 입자(120)는 분석 대상 생체 분자(300)와 결합되어 있는 상태이고, 분석 대상 생체 분자(300)는 제1 미소 입자(110)와 결합되어 있는 상태이므로, 제2 미소 입자(120)를 포집하면 제1 미소 입자(110)-분석 대상 생체 분자(300)-제2 미소 입자(120)의 결합체가 포집되어 농축될 수 있다. 즉, 제1 미소 입자(110)-분석 대상 생체 분자(300)-제2 미소 입자(120)의 결합체가 포함된 용액에서 제1 미소 입자(110)-분석 대상 생체 분자(300)-제2 미소 입자(120)의 결합체만을 선별하여 분리할 수 있다.

제2 미소 입자(120)는 자력을 가지는 수단, 예컨대, 영구 자석, 전자석등의 자기장을 형성하는 장치로 포집할 수 있다. 상기 제2 미소 입자(120)를 포집하는 두 단계(S22, S4)는 병행될 수 있지만, 이들 중 어느 한 단계만 진행될 수도 있다. 제2 미소 입자(120) 또는 제1 미소 입자(110)-분석 대상 생체 분자(300)-제2 미소 입자(120) 결합체만을 농축시켜 다른 물질의 간섭을 최소화 함으로써, 분석 대상 생체 분자(300)에 대한 측정 민감도를 높일 수 있다.

제1 미소 입자(110)와 제2 미소 입자(120)를 분석 대상 생체 분자(300)와 혼합하는 단계(S3) 후에, 분석 대상 생체 분자(300)의 농도를 측정하는 단계(S5)를 더 포함할 수 있다. 분석 대상 생체 분자(300)의 농도는, 레이저 유도 형광 현미경(laser induced fluorescence microscopy, LIFM)을 이용하여 제1 미소 입자(110)의 광학 발현부(112)를 측정할 수 있다. 또한, 분석 대상 생체 분자(300)의 농도는 원심 분리법(centrifuge method)을 이용하여 측정할 수 있다. 구체적으로, 제1 미소 입자(110)-분석 대상 생체 분자(300)-제2 미소 입자(120) 결합체는 상대적으로 주변의 다른 물질들에 비하여 질량이 크기 때문에, 원심 분리법을 이용할 수 있다. 이 밖에 X선 조사 장치 또는 유도 결합 플라즈마 질량분석기(inductively coupled plasma mass spectrometry, ICP-MS)를 이용하여 분석 대상 생체 분자(300)의 농도를 측정할 수도 있다.

본 발명의 일 실시예에 따른 생체 분자 분석 키트(100)를 이용하면, 미소 분포된 생체 분자의 존재와 함유량을 신속히 알 수 있다. 또한, 미소 분포된 생체 분자의 존재와 함유량을 간단한 방법으로 정확하게 알 수 있다. 구체적으로 기존의 ELISA와 비교할 때 더욱 간단한 방법으로 증가된 검출 한계 및 더 높은 신뢰성을 나타낼 수 있다. 더 나아가, 제1 미소 입자(110)가 포함하고 있는 제1 결합 수단(111)의 수를 측정하는 단계 또는 제2 미소 입자(120)를 포집하는 단계를 추가하여, 분석 대상 생체 분자(300)의 측정 민감도를 더욱 향상시킬 수 있다.

도 4은 본 발명의 다른 실시예에 따른 생체 분자 분석 키트(200)의 구성도이다. 이하에서는, 도 1 및 도 2에 도시된 생체 분자 분석 키트(100)의 도면에 나타낸 각 엘리먼트와 실질적으로 동일한 엘리먼트는 중복 설명을 생략한다.

본 발명의 다른 실시예에 따른 생체 분자 분석 키트(200)는, 상술한 본 발명의 일 실시예에 따른 생체 분자 분석 키트(100)와 같이, 분석 대상 생체 분자(300)와 특이적으로 결합하는 제1 결합 수단(211)을 포함하는 제1 미소 입자(210), 및 분석 대상 생체 분자(300)와 비특이적으로 결합하는 제2 결합 수단(221)을 포함하는 제2 미소 입자(220)를 포함하고, 추가적으로, 제1 미소 입자(210)와 특이적으로 결합하는 제3 결합 수단(231)을 포함하는 제3 미소 입자(230)를 포함할 수 있다.

상술하였듯이, 제2 미소 입자(220)는 자성 물질(222)을 포함할 수 있고, 자성 물질(222)은 실리카로 이루어진 코팅층(223)으로 코팅되어 있을 수 있다. 또한, 제3 결합 수단(231)은 제1 미소 입자(210)를 항원으로 인식하는 항체 또는 제1 미소 입자(210)와 상보적으로 결합하는 단일 가닥 뉴클레오티드 중합체일 수 있다. 또한, 제3 미소 입자(230)는 광학 발현부(232)를 포함하며, 광학 발현부(232)는 형광 물질, 발광 물질, 및 금속 물질 중 적어도 어느 하나일 수 있다. 바람직하게는, 제3 미소 입자(230)는 제3 결합 수단(231)에 코팅되지 않은 발광 물질이 태그되어 구성될 수 있다. 따라서, 상술한 본 발명의 일 실시예와 같이 광학 발현부(232)에 실리카로 코팅을 하고, 코팅층 상에 특정한 결합 수단을 결합시키는 공정을 생략할 수 있어 더욱 간단하게 생체 분자 분석 키트(200)를 구성할 수 있다.

광학 발현부(232)를 포함하고 있는 제3 결합 수단(231)이 존재하므로, 제1 미소 입자(210)는 제1 결합 수단(211)만으로 이루어질 수 있다. 따라서, 제1 결합 수단(211)과 광학 발현부(112)를 결합시키는 공정이 불필요하여, 제1 미소 입자(210)의 제조가 용이할 수 있다.

도 5은 본 발명의 다른 실시예에 따른 생체 분자 분석 방법을 개략적으로 나타낸 순서도이다. 설명의 편의 상, 도 3에 도시된 생체 분자 분석 방법의 도면에 나타낸 각 단계와 실질적으로 동일한 단계는 동일 부호로 나타내고, 중복 설명을 생략한다.

본 발명의 다른 실시예에 따른 생체 분자 분석 방법은, 제1 미소 입자(210)와 제2 미소 입자(220)를 분석 대상 생체 분자(300)와 혼합하는 단계(S3) 이후에, 제1 미소 입자(210)와 특이적으로 결합하는 제3 결합 수단(231)을 포함하는 제3 미소 입자(230)를 투입하는 단계(S3)를 더 포함할 수 있다.

비록 제1 미소 입자(210)와 특이적으로 결합하는 제3 결합 수단(231)을 포함하는 제3 미소 입자(230)를 투입하는 단계(S3)가 더 추가되지만, 상술한 바와 같이 제1 미소 입자(210) 및 제3 미소 입자(230)의 구조가 간단하여 제조가 용이하므로, 더욱 간단한 공정으로 생체 분자를 분석 할 수 있다.

도 6는 생체 분자 중 엔로플록사신 및 시프로플록사신의 전처리 공정의 개략도이다. 도 7의 (a)는 플루오레세인 이소티오시아네이트가 도핑된 코어-쉘 나노파티클의 주사전자현미경 이미지이고, (b)는 레이저 없는 비형광 이미지이고, (c)는 레이저를 통한 플루오레세인 이소티오시아네이트가 도핑된 코어-쉘 나노파티클의 형광 이미지이다. 도 8은 본 발명의 일 실시예에 따른 생체 분자 분석 키트(100)를 이용하여 생체 분자 중 엔로플록사신를 분석하는 실험 절차에 대한 개략도이다. 도 9은 본 발명의 일 실시예에 따른 생체 분자 분석 키트(100) 및 레이저 유도 형광 현미경을 이용하여 도시한 엔로플록사신의 검량선(a)과 효소 결합 면역흡착 분석법을 이용하여 도시한 엔로플록사신의 검량선(b)이다. 도 10는 코어-쉘 나노파티클 상의 항체의 양를 측정하는 방법의 개략도이다. 도 11의 (a)는 플루오레세인 이소티오시아네이트가 태그된 2차 항체의 검량선이고, (b)는 사이아닌이 도핑된 코어-쉘 나노파티클의 검량선이다.

이하, 도 6 내지 도 11를 참조하여 본 발명의 구체적인 제조예 및 실험예들에 대하여 설명한다.

< 제조예 1> 전처리된 엔로플록사신 및 시프로플록사신 시료 제조

도 6을 참조하면, 0.5g의 고기 샘플이 분쇄되고, 이후, 표준 엔로플록사신 (3-13ng/mL, pH 6-7) 및 시프로플록사신(3-13ng/mL, pH 5-6)이 혼합되었다. 샘플 전처리는 단백질과 지방 제거의 전제 조건이기 때문에, 4mL의 아세토니트릴(CH₃CN)이 용매로 사용되었고, 보텍싱(vortexing)하고 초음파처리한 후 원심분리하는 것에 의해 침전물이 분리되었다. 상기 여과물이 지방을 제거하기 위해 헥산(C₆H₁₄)으로 처리되었다. 추가 보텍싱 및 초음파 처리 후 0.2㎛의 PTFE 시린지 필터를 이용하여 상층액이 필터링되었다.

< 제조예 2> 엔로플록사신 및 시프로플록사신 분석 키트 제조

(1) FITC 도핑된 코어-쉘 나노파티클 상에 항체 고정

FITC(fluorescein isothiocyanate, 90%, Sigma-Aldrich) 도핑된 코어-쉘 나노파티클의 코어는 리버스 마이크로 에멀젼(reverse microemulsion) 방법에 의해 합성되었고, 이후 그 표면이 실리카 쉘 내로 개조(modified)되었다. 코어-쉘 나노파티클의 안정성이 분석 성능에 직접 영향을 주기 때문에, 입자 크기 및 분포가 정량화를 위해 제어되었다. 도 7을 참조하면, 표면에 카르복실기를 갖는 합성된 코어-쉘 실리카 나노파티클의 평균 직경은 SEM(scanning electron microscopy) 이미지로부터 30개의 입자를 평균한 결과 62.7±6.4로 측정되었다. 상기 입자는 상대적으로 균일하고 구형이었다. 코어에서의 FITC의 존재가 LIFM을 이용하여 그린 형광을 검출하는 것에 의해 확인되었다.

FITC 도핑된 코어-쉘 나노파티클이 5mM의 3-(아미노프로필) 트리에톡시실란(APTEOS, 99%, Sigma-Aldrich)와 반응하여 아민기로 관능기화되었다. 항체의 고정을 위해 DMSO 용액에서 0.01g의 석시닉 언하이드리드(succinic anhydride, 99%, Sigma-Aldrich)를 이용하여 카르복실기가 또한 실온에서 관능기화되었다. 2mL의 아세톤을 첨가한 후, 10분간 4000rpm으로 원심분리하여 FITC 도핑된 코어-쉘 나노파티클이 수집되었다. PBS(phosphate-buffered saline) 버퍼(x10, Sigma-Aldrich)에서 10㎕의 IgM(인간 혈장으로부터 수득, 95%, Abcam, UK)을 첨가하는 것에 의해 FITC 도핑된 코어-쉘 나노파티클 상에 항체가 고정화되었다. 고정 효능을 증가시키기 위해, 카르복실기를 활성화하도록 N-(3-디메틸아미노프로필)-N'-에틸카르보디이미드(EDC) 및 N-히드록시석시니미드(NHS) (2:1)의 혼합물이 제로 렝스 크로스링커(zero length cross linker)로서 사용되었다. 시프로플록사신의 항체 고정도 동일한 방법으로 진행하였다.

(2) 아민기가 결합된 코어-쉘 자성 물질 제조

표준 또는 섞인(spiked) 샘플 용액으로부터 항생제를 선택적으로 추출하기 위해 아민으로 관능기화된 자성 물질(크기 4.5㎛, Dynabeads M-270 Amine, Invitrogen)이 제조되었다. 자성 물질도 상술한 바와 같이 실리카로 코팅하였다.

< 제조예 3> 코어-쉘 나노파티클 상의 항체의 양 분석 키트 제조

제조예 2의 (1)에서 FITC 대신에 사이아닌5(Cy5)를 사용한 것을 제외하고는, 제조예 2의 (1)과 실질적으로 동일한 방법으로 엔로플록사신의 항체가 하나 이상 결합된 코어-쉘 나노파티클을 제조하였다. 한편, FITC에 가교제인 EDC, NHS 를 2:1 의 비율로 함께 넣어 주고, 엔로플록사신의 항체에 특이적인 이차 항체를 100ul 첨가하여 2시간 동안 반응시켰다.

더욱 상세히 설명하면, 50 ㎕의 Cy5 도핑된 코어-쉘 나노파티클이 엔로플록사신 항체로서 10 ㎕의 IgM과 반응되었다. 그후, FITC가 태그된 147 ㎕의 2차 항체(Dylight 488, Abcam, UK)가 태깅을 위해 첨가되었고, 비반응된 항체가 PBS로 세척되었다.

< 실험예 1> 제조예 1의 전처리 시료 및 제조예 2의 분석 키트를 이용한 엔로플록사신의 농도 분석

도 8을 참조하면, 제조예 1에서 제조된 전처리 엔로플록사신 시료와 제조예 2에서 제조된 엔로플록사신 분석 키트가 반응되었다. 이 순간, 첨가된 엔로플록사신 분석 키트는 30ng/mL의 표준 엔로플록사신보다 약 2배였다. 또한, 실온에서 1시간 동안 반응한 후, 용액 혼합물이 결합된 입자 산물을 수집하기 위해 영구 자석으로 처리되었고, PBS 버퍼로 세척되었다.

이미지화 및 양적 형광 검출을 위해 CCD 카메라(Micro Publisher 5.0, Q-Imaging)를 갖는 실험실에서 구축한(lab-built) LIFM 및 PMT(photomultiplier tube)가 사용되었다. 코어에 도핑된 FITC의 여기(excitation)를 위해 473nm DPSS 레이저(50mW, BL473T-050, SLOC)가 사용되었고, 525±25nm의 간섭 필터(interference filter, FF02-525, Semrock)가 PMT의 정면에 배치되었다. PMT에 의해 검출된 광자(photon)가 광자 카운팅 시스템(photon counting system, C3866 and M8784, Hamamatsu)에 의해 카운트되었다.

도 9를 참조하면, 도 9의 검량선 (a)로부터 54pg/mL(±3pg/mL)의 검출 한계가 얻어졌다. 또한, 선형회귀계수(linear regression coefficient)는 0.9998이 나왔다. 또한, 최적화 후, 3-13ng/mL의 참조 엔로플록사신을 섞는 것에 의해 78.1-103%의 리커버리(recoveries)가 얻어졌다.

< 실험예 2> 제조예 3의 분석 키트를 이용한 코어-쉘 나노파티클 상의 항체의 양 분석

제조예 3에서 제조된 코어-쉘 나노파티클 상의 항체의 양 분석 키트를 이용하여, 코어-쉘 나노파티클 상의 항체의 양 분석하였다. 도 10을 참조하면, LIFM을 이용한 Cy5의 측정을 위해 632.8nm의 He-Ne 레이저 및 692±25nm의 간섭 필터가 각각 여기 및 파장 선택을 위해 사용되었다.

결과로서, 도 11을 참조하면, 검량선(calibration curve)을 이용하여 각 코어-쉘 나노파티클 상에 고정된 IgM의 수를 계산하면 약 0.9였다.

< 비교예 1> 코어-쉘 나노파티클 상의 항체의 양 분석

ELISA 키트(MaxSignal, BIOO Scientific, USA)가 제조자의 지시 매뉴얼에 따라 사용되어 엔로플록사신을 검출하였다. 50㎕의 표준 또는 엔로플록사신으로 섞여 처치된 샘플 및 100 ㎕의 엔로플록사신 항체가 샘플 웰(well)에서 혼합되었다. 실온에서 30분간 인큐베이션된 후, 상기 웰 플레이트는 세척되고 건조되었다. 이후, 150 ㎕의 HRP(horseradish peroxidase)-접합된 항체가 각 웰에 첨가되었고, 실온에서 30분간 인큐베이션되었다. 이후, 100 ㎕의 스톱 버퍼가 첨가되어 효소 반응을 정지시켰다. 450nm의 파장에서 마이크로플레이터 리더 상에서 흡광도(absorbance)가 측정되었다.

도 9를 다시 참조하면, 도 9의 검량성 (b)로부터 검출 한계가 1.0ng/mL(±0.1ng/mL)이 나왔다. 또한, 선형회귀계수는 0.974가 나왔다. 또한, 최적화 후, 3-13ng/mL의 참조 엔로플록사신을 섞는 것에 의해 69.2-76.9%의 리커버리가 얻어졌다.

이상에서 본 발명의 실시예를 중심으로 설명하였으나 이는 단지 예시일 뿐 본 발명을 한정하는 것이 아니며, 본 발명이 속하는 분야의 통상의 지식을 가진 자라면 본 발명의 실시예의 본질적인 특성을 벗어나지 않는 범위에서 이상에 예시되지 않은 여러 가지의 변형과 응용이 가능함을 알 수 있을 것이다. 예를 들어, 본 발명의 실시예에 구체적으로 나타난 각 구성 요소는 변형하여 실시할 수 있다. 그리고 이러한 변형과 응용에 관계된 차이점들은 첨부된 청구 범위에서 규정하는 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 할 것이다.

100, 200: 생체 분자 분석 키트
110, 210: 제1 미소 입자
111, 211: 제1 결합 수단
112, 232: 광학 발현부
113, 123, 223: 코팅층
120, 220: 제2 미소 입자
121, 221: 제2 결합 수단
122, 222: 자성 물질
230: 제3 미소 입자
231: 제3 결합 수단
300: 분석 대상 생체 분자

Claims

제1 광학 발현부 코어(core), 상기 제1 광학 발현부의 표면에 코팅된 제1 실리카 쉘(shell) 및 상기 제1 실리카 쉘 상에 배치되고 분석 대상 생체 분자와 특이적으로 결합하는 제1 결합 수단을 포함하는 제1 미소 입자;
자성물질, 상기 자성물질의 표면에 코팅된 제2 실리카 쉘 및 상기 제2 실리카 쉘 상에 배치되고 상기 분석 대상 생체 분자와 비특이적으로 결합하는 제2 결합 수단을 포함하는 제2 미소 입자; 및
상기 제1 광학 발현부와 상이한 광학적 특성을 가진 제2 광학 발현부와 상기 제1 미소 입자와 특이적으로 결합하는 제3 결합 수단을 포함하는 제3 미소 입자;
를 포함하는 생체 분자 분석 키트.
제 1항에 있어서,
상기 제1 결합 수단은 상기 분석 대상 생체 분자를 항원으로 인식하는 항체 또는 상기 분석 대상 생체 분자와 상보적으로 결합하는 단일 가닥 뉴클레오티드 중합체이고,
상기 제2 결합 수단은 상기 분석 대상 생체 분자와 화학적으로 결합하는 작용기인 생체 분자 분석 키트.
제 2항에 있어서,
상기 항체는 단일 클론 항체이고,
상기 뉴클레오티드 중합체는 올리고뉴클레오티드인 생체 분자 분석 키트.
제 2항에 있어서,
상기 작용기는 아민기, 카르복실기, 및 히드록시기 중 적어도 어느 하나를 포함하는 생체 분자 분석 키트.
제 4항에 있어서,
상기 분석 대상 생체 분자와 상기 제2 미소 입자는 아마이드 결합을 하는 생체 분자 분석 키트.
제 1항에 있어서,
상기 제1 광학 발현부는 형광 물질, 발광 물질, 및 금속 물질 중 적어도 어느 하나인 생체 분자 분석 키트.
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제 1항에 있어서,
상기 제3 결합 수단은 상기 제1 미소 입자를 항원으로 인식하는 항체 또는 상기 제1 미소 입자와 상보적으로 결합하는 단일 가닥 뉴클레오티드 중합체인 생체 분자 분석 키트.
제 1항에 있어서,
상기 제2 광학 발현부는 형광 물질, 발광 물질, 및 금속 물질 중 적어도 어느 하나인 생체 분자 분석 키트.
제1 광학 발현부 코어(core), 상기 제1 광학 발현부의 표면에 코팅된 제1 실리카 쉘(shell) 및 상기 제1 실리카 쉘 상에 배치되고 분석 대상 생체 분자와 특이적으로 결합하는 제1 결합 수단을 포함하는 제1 미소 입자를 준비하는 단계;
상기 제1 광학 발현부와 상이한 광학적 특성을 가진 제2 광학 발현부와 상기 제1 미소 입자와 특이적으로 결합하는 제3 결합 수단을 포함하는 제3 미소 입자를 준비하는 단계;
상기 제1 미소 입자와 상기 제3 미소 입자를 혼합하여 결합체를 형성하는 단계;
상기 제1 미소 입자의 제1 광학 발현부가 흡수 또는 반사하는 파장의 빛과, 상기 제3 미소 입자의 제2 광학 발현부가 흡수 또는 반사하는 파장의 빛을 상기 결합체에 조사하는 단계;
자성물질, 상기 자성물질의 표면에 코팅된 제2 실리카 쉘 및 상기 제2 실리카 쉘 상에 배치되고 상기 분석 대상 생체 분자와 비특이적으로 결합하는 제2 결합 수단을 포함하는 제2 미소 입자를 준비하는 단계; 및
상기 결합체와 상기 제2 미소 입자를 상기 분석 대상 생체 분자와 혼합하는 단계;
를 포함하는 생체 분자 분석 방법.
삭제
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제 15항에 있어서,
상기 제2 미소 입자를 준비하는 단계 후에, 상기 제2 미소 입자를 포집하는 단계;를 더 포함하는 생체 분자 분석 방법.
제 15항에 있어서,
상기 결합체와 상기 제2 미소 입자를 상기 분석 대상 생체 분자와 혼합하는 단계 후에,
상기 제2 미소 입자를 포집하는 단계;를 더 포함하는 생체 분자 분석 방법.
제 15항에 있어서,
상기 결합체와 상기 제2 미소 입자를 상기 분석 대상 생체 분자와 혼합하는 단계 후에,
상기 분석 대상 생체 분자의 농도를 측정하는 단계;를 더 포함하는 생체 분자 분석 방법.