KR101149418B1 - 세균양 측정 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 형광나노입자 결합물을 이용하여 세균의 양을 측정하는 방법에 관한 것으로서, 본 발명의 목적은, 세균에 부착된 형광나노입자 결합물로부터 발산되는 형광의 세기를 이용하여 세균의 양을 측정할 수 있는, 세균양 측정 방법을 제공하는 것이다. 이를 위해 본 발명은, 시료 상에 제각기 다양하게 형성된 서로 다른 세균들 중 특정세균의 집합체인 특정세균 집단이 따로 분리되는 제 1 단계; 상기 특정세균 집단에 속한 특정세균에 대항하는 항체가 포함된 형광나노입자 결합물이 상기 특정세균 집단에 투입됨에 따라, 상기 특정세균이 상기 형광나노입자 결합물과 부착되고, 상기 형광나노입자 결합물을 부착한 특정세균이 표지(標識)되는 제 2 단계; 상기 특정세균과 미부착된 형광나노입자 결합물이 제거되는 제 3 단계; 및 상기 특정세균에 부착된 상기 형광나노입자 결합물로부터 인지되는 형광의 세기가 기설치된 세균양 측정 장치에 의해 측정됨으로 말미암아 상기 특정세균의 양(量)도 상기 세균양 측정 장치를 통해 예측되는 제 4 단계를 포함하며, 상기 형광나노입자 결합물은 10 내지 80 nmol을 갖는 형광나노입자(QD)의 표면에 생체분자인 아비딘층을 형성시킨 후 상기 아비딘층에 바이오틴이 결합된 항체를 반응시켜 형성되며, 상기 제 2 단계 중 상기 특정세균과 상기 형광나노입자 결합물 간 부착 과정은 상기 특정세균이 상기 바이오틴이 결합된 항체와 우선 반응하고 상기 아비딘층이 상기 바이오틴과 반응함에 의해 실시되는 것을 특징으로 한다.
형광나노입자 결합물, 세균, 형광

Description

세균양 측정 방법{METHOD FOR MEASURING THE AMOUNT OF BACTERIA}
본 발명은 세균의 양을 측정하는 방법에 관한 것으로서, 특히, 형광나노입자 결합물을 이용하여 세균의 양을 측정하는 방법에 관한 것이다.
농식품 중 위해물질 오염과 잦은 식중독 사고 발생으로 인하여 소비자의 농식품 안전성에 대한 우려가 증가하고 있으며, 늘어나는 외국 농산물의 수입으로 인한 농축산물 가격 저하 등으로 우리 농업은 큰 어려움을 겪고 있다.
농식품 안전성 저해요소 중 가장 비중이 큰 식중독 관련 사고 발생은 최근 10여 년간 세계적으로 증가하고 있는 추세이며, 농식품 안전성 향상을 위한 HACCP나 GAP와 같은 많은 노력에도 불구하고 우리나라에서도 식중독 발생이 계속 증가하고 있다. 식중독 사건 발생은 식중독 환자의 치료에 따른 직접적인 경제적 피해뿐만 아니라, 관련 농식품의 회수와 이에 따른 소비 저하로 인하여 막대한 경제적 손실이 발생한다. 농식품의 유통전 가공/생산 공정에서 식중독균 오염을 조기진단하여 확산을 방지한다면, 식중독사고 발생후 회수에 따른 막대한 경제적 손실을 줄일 수 있으며 농식품의 안전성 향상으로 소비자의 수요를 높여 농민의 수익을 늘릴 수 있다.
그러나, 현재 사용되는 식중독균 검사방법은 몇 단계의 세균 배양을 필요로 하여 검사 결과를 얻기까지 며칠의 시간이 소요되므로, 검사시간 장기화에 따른 농식품의 보관 및 유통비용의 증가가 불가피하다.
우리나라의 식중독 사고 중 가장 큰 비중을 차지하는 원인균 중의 하나인 살모넬라는 막대모양의 그람(Gram) 음성 간균으로 편모를 지녀 운동성이 있으며, 식수나 달걀 및 닭고기와 같은 식품 등을 통하여 인체에 질병을 유발시키는 대표적인 병원성 세균으로서 전 세계적으로 식중독 사고를 가장 많이 일으키는 원인균으로 알려져 있다. 최근 미국에서는 살모넬라에 감염된 토마토에 의해 발생한 식중독사고의 여파로 대형 식품업체에서 토마토 제품을 철수 시키는 등 살모넬라로 인한 피해가 매년 발생하고 있다.
살모넬라균을 검출하기 위한 전통적인 방법은 증식배양, 선택배양 및 생화학검사를 포함한 3~5일의 분석시간이 소요되며, 이 때문에 식중독 사고 발생 이후 식중독 원인균을 분리할 목적으로 사용될 뿐 조기에 세균을 검출하여 식중독을 차단하는 것은 불가능하다. 식생활 패턴의 변화에 기인한 대량급식 및 외식의 증가와 가공 농산물의 대규모 유통으로 인한 대형 식중독 사고의 방지와 오염 농산물의 회수에 따른 막대한 비용의 낭비를 막기 위해서는 기존 분석방법의 단점을 보완할 수 있는 신속한 식중독균 검출기술의 개발이 시급하다.
최근 들어 생물학적 요소로 이루어진 감지물질을 이용한 바이오센서가 의료용을 포함한 여러 산업분야에서 높은 활용 가능성을 보여주고 있으며, 식품 및 농/축산물 안전성 분야에서도 식중독균의 신속검출기술 개발을 가능케 할 기술로서 많 은 기대를 받고 있다. 바이오센서는 생물학적 요소로 이루어진 감지물질을 이용하여 특정 물질에 대한 선택성과 측정 감도를 높일 수 있는 있으며, 이러한 장점 때문에 농식품 분야에서도 위해물질의 신속검출기술 개발을 가능케 할 기술로서 많은 기대를 받고 있다(Easter and Gilbson, 1985; Mello and Kubota, 2002).
최근에는 바이오센서 사용시 요구되는 전처리 과정에 소요되는 시간을 줄이고, 측정시간을 줄이면서 측정 감도를 높일 수 있는 형광나노입자 결합물에 대한 연구가 활발히 수행되고 있다(Gerwen 등, 1998; Kim 등, 2007; Wang 등, 2008). 생체분자 하나의 크기에 해당하는 나노 단위에서는 물질이 기존에 알려진 바와 다른 물리/화학적 특성을 나타내게 된다. 이러한 특성을 이용할 경우 기존 바이오센서에서 실용화에 필요한 표적 생체물질 검출의 감도 향상, 비특이 결합으로 인한 잡음 신호의 최소화, 현장 실시간 진단에 필요한 소형화 등을 만족시킨 형광나노입자 결합물을 개발할 수 있다.
그러나, 형광나노입자 결합물을 이용하여 세균, 특히, 살모넬라균과 같은 식중독균의 양을 측정하는 방법은 아직 개발되지 못하고 있는 실정이다.
상기와 같은 문제점을 해결하기 위한 본 발명의 목적은, 세균에 부착된 형광나노입자 결합물로부터 발산되는 형광의 세기를 이용하여 세균의 양을 측정할 수 있는, 세균양 측정 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 세균양 측정 방법은, 시료 상에 제각기 다양하게 형성된 서로 다른 세균들 중 특정세균의 집합체인 특정세균 집단이 따로 분리되는 제 1 단계; 상기 특정세균 집단에 속한 특정세균에 대항하는 항체가 포함된 형광나노입자 결합물이 상기 특정세균 집단에 투입됨에 따라, 상기 특정세균이 상기 형광나노입자 결합물과 부착되고, 상기 형광나노입자 결합물을 부착한 특정세균이 표지(標識)되는 제 2 단계; 상기 특정세균과 미부착된 형광나노입자 결합물이 제거되는 제 3 단계; 및 상기 특정세균에 부착된 상기 형광나노입자 결합물로부터 인지되는 형광의 세기가 기설치된 세균양 측정 장치에 의해 측정됨으로 말미암아 상기 특정세균의 양(量)도 상기 세균양 측정 장치를 통해 예측되는 제 4 단계를 포함하며, 상기 형광나노입자 결합물은 10 내지 80 nmol을 갖는 형광나노입자(QD)의 표면에 생체분자인 아비딘층을 형성시킨 후 상기 아비딘층에 바이오틴이 결합된 항체를 반응시켜 형성되며, 상기 제 2 단계 중 상기 특정세균과 상기 형광나노입자 결합물 간 부착 과정은 상기 특정세균이 상기 바이오틴이 결합된 항체와 우선 반응하고 상기 아비딘층이 상기 바이오틴과 반응함에 의해 실시되는 것을 특징으로 한다.
본 발명은 세균에 부착된 형광나노입자 결합물로부터 발산되는 형광의 세기를 이용하여 세균의 양을 측정하는 것으로서, 본 발명에 적용되는 식중독균 검출용 형광나노입자 결합물는 검출 감도가 매우 우수할 뿐만 아니라 기존 3~5일 이상 걸리던 검출 시간을 몇 시간 이내로 단축할 수 있는바, 본 발명에 의해 식품안전성이 크게 향상될 수 있다는 효과가 있다. 즉, 본 발명은 105 cfu/ml 정도의 식중독균을 30분 정도의 시간 내에 검출할 수 있어 매우 효율적이다.
또한, 본 발명은 향후, 식중독균 검출을 위한 고효율의 휴대형 식중독균 검출기 개발의 발판이 되는 선행 단계로서의 의미를 가지고 있다.
또한, 본 발명은 특정 식중독균에 특이적으로만 반응하는 생물학적 반응물질과 형광분석법을 유기적으로 결합시킨 것으로서, 식중독균 분리 및 농축 방법, 나노형광입자 표지 방법 등 개별적인 기술들을 내포하고 있으며, 식중독균의 검출 감도 또는 검출 시간 등에서 높은 경쟁력을 가지고 있다.
이하, 첨부된 도면을 참조하여 본 발명이 상세히 설명된다.
도 1은 본 발명에 따른 세균양 측정 방법의 일실시예 흐름도이다.
본 발명은 식품 관련 식중독 사고의 원인이 되는 병원성 세균을 형광나노입자 결합물을 이용하여 신속하게 검출하기 위한 것으로서, 시료에서 세균 집단을 분리하여 농축하는 단계(10), 세균의 항체가 고정화된 형광나노입자 결합물을 세균 집단에 투입하여 세균만을 표지하는 단계(20), 세균 집단에서 세균에 부착되지 않은 형광나노입자 결합물을 제거하는 단계(30) 및 세균에 부착된 형광나노입자 결합물에서 발생되는 형광의 세기를 이용하여 시료의 특정세균(특히, 식중독균) 오염 여부 또는 세균의 양을 측정하는 단계(40)를 포함하여 구성되어 있다. 한편, 본 발명은 다양한 종류의 세균의 양을 측정하기 위해 적용될 수 있으나, 이하에서는, 설명의 편의상 식중독균의 하나인 살모넬라균(특정세균으로도 호칭함)의 집단을 특징세균 집단(살모넬라균의 집합체인 것으로 정의함)으로 하여 본 발명이 설명된다.
시료에서 세균 집단을 분리하여 농축하는 단계(10)에서는 특정세균의 항체가 고정화 되어있는 마이크로 자석입자가 이용된다. 즉, 항원항체 반응에 의해 자석입자가 시료속의 세균에 부착되면, 자력이 센 자석을 이용하여 시료에서 특정세균의 집단(이하, 간단히 '세균 집단'이라 함)을 분리해 낸다. 부연하여 설명하면, 본 발명은 살모넬라균에 부착되지 않은 나노입자-항체 결합물에 의한 간섭신호를 제거하고, 식중독균 농축을 통한 검출 성능을 향상시키기 위해 분자식별부가 부착된 세균만을 시료에서 분리하기 위해, 표면에 살모넬라 항체층이 형성된 마이크로 크기(2~3㎛)의 초소형 플라스틱 자석입자를 이용하였다. 즉, 자석입자를 통해 시료에서 세균 집단만이 분리되어 농축될 수 있다. 여기서, 살모넬라균(세균 집단)의 분리를 위한 초소형 자석입자의 분리 성능은, 서로 다른 농도의 살모넬라균이 부착된 유리 슬라이드 표면에 초소형 자석입자를 주입하고 세척한 다음, 살모넬라균과 초소형 입자의 결합을 전자주사현미경으로 확인하는 방법으로 조사될 수 있다.
세균 집단에 형광나노입자 결합물을 투입하여 세균만을 표지하는 단계(20)에서는, 형광나노입자 결합물이 이용된다. 즉, 자외선이 조사되면 형광을 발생하는 형광나노입자 표면에 특정 식중독균의 항체를 고정화시켜 생성된 형광나노입자 결합물을, 시료에서 분리 및 농축된 세균 집단에 반응시켜 형광나노입자 결합물로 특정세균(식중독균, 살모넬라균)을 표지한다.
세균 집단에서 세균에 부착되지 않은 형광나노입자 결합물을 제거하는 단계(30)에서는, 형광나노입자 결합물이 투입된 세균 집단을 세척한 후 자석을 이용한 또 한차례의 분리 및 농축 과정을 통해, 세균(식중독균)에 부착되지 않은 형광나노입자 결합물이 제거된다.
세균의 양을 측정하는 단계(40)는 다음과 같이 진행된다. 즉, 분리 및 농축되고 형광나노입자 결합물로 표지된 세균(식중독균)만이 포함된 세균 집단에 자외선(파장 450nm 이하의 광)을 조사하면, 세균에 표지된 형광나노입자 결합물이 형광을 발생하며, 이 형광의 세기는 세균의 농도에 비례하므로, 이를 이용하여 초기 시료에 오염되어있던 세균(식중독균)의 양을 측정할 수 있다.
즉, 본 발명은 시료에서 세균 집단만을 추출하고(10), 추출된 세균 집단에 형광나노입자 결합물을 투입한 후(20), 세균과 결합되지 않은 형광나노입자 결합물만을 다시 추출해 냄으로써, 세균의 양과 형광나노입자 결합물의 양이 비례하도록 하고 있다. 이후, 형광나노입자 결합물의 형광의 양이 측정됨으로써(40), 세균의 양 또한 측정될 수 있다.
도 2는 본 발명에 따른 세균양 측정 방법에 적용되는 형광나노입자 결합물을 구성하는 형광나노입자의 예시도이며, 도 3은 본 발명에 따른 세균양 측정 방법에 적용되는 형광나노입자 결합물 중 세균과 결합되는 분자식별부의 예시도이다. 즉, 도 2 및 도 3은 본 발명에 따른 세균양 측정 방법 중 형광나노입자 결합물들을 세균 집단에 투입하는 단계(20)에서 이용되는 형광나노입자 결합물의 구조 및 특징을 설명하기 위한 것이다.
세균, 특히, 식중독균 검출을 위한 형광나노입자 결합물에 응용 가능한 나노기술로는, 탄소나노튜브, 금속나노입자, 형광나노입자 등이 있으며, 본 발명은 이 중 재료의 확보가 가능하며 문헌조사 결과 보다 높은 식중독균 검출 성능을 낼 수 있는 형광나노입자를 식중독균 검출용 형광나노입자 결합물의 응용 기술로 이용한다.
형광나노입자의 크기는 도 2에 도시된 바와 같이 15~20nm 정도이고, 내부는 카드뮴과 셀레늄의 혼합체(CdSe)로 이루어지며 광학적 특성을 좋게하기 위하여 외부는 황화아연(ZnS) 막으로 덮여있다. 적정 형광표지를 위한 형광나노입자의 농도는, 형광나노입자가 다른 농도로 희석된 일련의 시료의 형광 신호를 상용 형광스텍트로미터(FluoroLog 3 Spectrofluorometer, Horiba)를 이용하여 측정한 뒤 검출 가능하면서 신호의 포화를 일으키지 않는 농도 범위를 찾는 방법으로 선정되는 것이 바람직하다.
한편, 시료에 오염된 세균(식중독균)을 인식하는 형광나노입자 결합물의 분자식별부는, 도 3에 도시된 바와 같이, 특정세균(식중독균)에만 반응하는 항체(antibody)를 도 2에 도시된 바와 같은 형광나노입자의 표면에 고정화시키는 방법으로 개발된다.
여기서, 항체의 고정화방법은 이전에 수행되었던 연구에서 좋은 결과를 나타내었던 아비딘-바이오틴 결합을 이용하여 이루어진다. 아비딘-바이오틴 고정화방법은 화학적 공유결합력에 버금가는 결합력으로 생물분자들을 반응시키는 방법으로서, 반응 과정이 비교적 용이하여 바이오센서 연구에 많이 사용되고 있다.
즉, 본 발명에 적용되는 형광나노입자 결합물는 형광나노입자에, 세균과 반응하는 항체가 결합되어 형성되는 것으로서, 형광나노입자와 항체가 결합되는 도 3에 도시된 바와 같은 분자식별부의 제작과정은, 도 2의 형광나노입자의 제일 바깥쪽 표면에 생체분자인 아비딘(avidin) 층을 형성시키고, 여기에 바이오틴(biotin)이 결합된 항체(antybody)를 반응시키는 순서로 진행된다.
도 4는 본 발명에 따른 세균양 측정 방법 중 형광나노입자 결합물이 세균과 결합된 상태를 나타내는 예시도로서, 세균에 부착되지 않는 형광나노입자 결합물을 제거하는 단계(30)를 거친 후에 남아 있는 세균 집단의 상태를 나타낸 것이다.
즉, 본 발명은 형광나노입자 결합물이 투입된 세균 집단을 세척한 후 자석을 이용한 또 한차례의 분리 및 농축 과정을 통해, 세균(식중독균)에 부착되지 않은 형광나노입자 결합물을 제거하는바(30), 상기 과정을 거친 후, 모든 형광나노입자 결합물들은 도 4에 도시된 바와 같이, 세균과 결합되어 있다. 여기서, 형광나노입자 결합물들은 도 2 및 도 3에서 설명된 바와 같이, 형광나노입자와 항체가 결합된 것으로서, 특히, 형광나노입자 결합물의 항체가 세균과 결합되어 있다.
도 5는 본 발명에 따른 세균양 측정 방법의 원리를 설명하기 위한 예시도로서, 특히, 세균의 양을 측정하는 단계(40)에서의 형광나노입자 결합물의 작동 원리를 설명하기 위한 것이다.
세균(식중독균)을 포획하고 형광 신호를 발생시키는 형광나노입자 결합물는, 고정화 단백질인 아비딘과 항체의 바이오틴 결합 방법을 이용하여 형광나노입자의 표면에 살모넬라 항체를 고정화시키는 방법으로 제작되며, 대표적인 식중독균인 살모넬라균 검출을 위한 작동원리는 도 5와 같다. 즉, 도 3에서 설명된 바와 같이 형광나노입자 결합물 분자식별부를 제작하고, 이 형광나노입자 결합물을 시료에 넣어주면 항원-항체의 특이적 반응에 의해 살모넬라균에 형광나노입자 결합물이 부착된다. 형광나노입자 결합물이 부착된 살모넬라균에 450nm 근방의 여기광(UV)을 조사하면 형광나노입자 결합물는 도 5에 도시된 바와 같이 형광(Fluorescence)을 일으키게 된다. 이 형광의 세기는 시료에 포함된 살모넬라균의 수와 비례하여 증가하므로, 발생되는 형광신호를 분석하면 농산물에 오염된 살모넬라 식중독균이 정량적으로 검출될 수 있다. 이때, 형광나노입자 결합물의 분자식별부와 살모넬라균의 부착특성 및 검출 유효성은 다양한 형태의 세균양 측정 장치를 이용한 실험을 통해 분석되었다. 이러한 실험에 사용된 검출 대상 세균은 Salmonella typhimurium이었으며, 105~108 cfu/ml로 살모넬라균을 표준인산용액에 희석시킨 시료를 이용하여 살모넬라균 농도에 따른 형광신호 변화를 측정하였다. 식중독균 신속검출을 위한 형광나노입자 결합물의 검출 한계는 낮을수록 좋으므로, 증균 배양시 최대 균수가 더 이상 증가하지 않거나 낮은 균수에서 충분한 검출신호가 나올 경우 시료의 최대 세균수는 109 cfu/ml 이 아닌 108 cfu/ml을 사용하였다.
한편, 형광나노입자 결합물과 세균이 결합되어 있는 세균 집단에서 형광나노입자 결합물의 형광의 세기를 측정한 후, 이를 이용하여 세균의 양을 측정하는 방법은 이하에서 설명될 세균양 측정 장치를 통해 이루어질 수 있다.
도 6은 본 발명에 따른 세균양 측정 방법에 적용되는 세균양 측정 장치의 예시도로서, 본 발명에 따른 세균양 측정 방법 중, 형광나노입자 결합물에서 발생되는 형광의 세기를 이용하여 세균의 양을 측정하는 단계(40)에서 세균의 양을 측정하기 위해 적용되는 세균양 측정 장치를 나타낸 것이다. 한편, 본 발명에 적용되는 세균양 측정 장치는, 형광의 세기를 측정하기 위해 현재 이용되고 있는 다양한 종류의 형광검출기를 이용하여 구성될 수 있다. 또한, 도 6에 도시된 세균양 측정 장치는 본 발명에 따른 세균양 측정 방법을 도출해 내기 위한 실험 과정에서, 형광의 세기를 측정하거나 형광나노입자 결합물의 특성을 분석하기 위한 용도로도 사용되는 것으로서, 이러한 용도로 사용되는 경우에는 형광영상 확대장치라고도 언급된다.
즉, 도 6은 고정용 세균양 측정 장치를 나타낸 것으로서, 특히, 실험실 등에서 이용될 수 있는 세균양 측정 장치를 나타낸 것이다. 형광나노입자 결합물에서 발생되는 형광은 형광검출기(100)에서 검출되고, 형광검출기에서 검출된 형광의 양(세기)에 대한 정보는 세균양측정기(200)에서 산출되며, 세균양측정기는 측정된 형광의 양을 이용하여 세균의 양을 측정할 수도 있다. 즉, 본 발명에 적용되는 세균양 측정 장치는 도 6에 도시된 바와 같이, 형광을 검출하는 형광검출기(100) 및 형광검출기에서 검출된 형광을 이용하여 형광의 세기 및 세균의 양을 측정하는 세균양측정기(200)로 구성될 수 있다.
형광검출기(100)는, 아주 작은 크기의 형광나노입자 결합물이 세균(식중독균)에 부착되는 특성을 분석하고, 형광나노입자 결합물의 분자식별부의 작동여부를 구명하기 위한 것으로서, 자외선 LED 램프, 형광영상 측정용 광학기기, 형광 검출부, 현미경용 대물렌즈, CCD 카메라, 암상자 등을 포함하여 구성될 수 있다. 자외선 LED 램프는, 형광을 일으키기 위한 여기광원으로서, 450 nm 파장을 갖는 LED 광원이 이용된다. 세균에 부착된 형광나노입자 결합물의 미약한 형광을 측정하기 위한 형광 검출부는, 여기광 필터, 방사광 필터, 이분광 분리기로 구성된다. 형광나노입자 결합물의 형광의 세기는 매우 미약하여 외부광의 영향을 받기 때문에, 세균양 측정 장치는 도 6에 도시된 바와 같이 슬라이딩 도어를 장착한 암상자를 이용하여 형광 이외의 외부 광원을 차단시킨다. 살모넬라 세균은 길이 1~3㎛, 폭 1~2㎛ 정도의 크기를 가지므로 확대 영상을 통한 분석을 위해, 세균양 측정 장치에는, 광학 20배 대물렌즈를 이용하여 최대 2000배로 형광영상을 확대할 수 있는 광학기기가 배치되어 있다. 또한, 형광나노입자 결합물의 미약한 형광영상을 획득하기 위하여, 세균양 측정 장치에는 최소조명 0.001 lux 이하에서도 작동되는 고감도 CCD 카메라가 배치되어 있다. 한편, 상기한 바와 같이 본 발명에 적용되는 형광검출기(100)는 현재 일반적으로 이용되고 있는 다양한 종류의 형광검출기가 적용될 수 있는바, 그에 대한 상세한 설명은 생략된다. 또한, 도 6에 도시된 형광검출기(100)는 상기한 바와 같이 형광영상 확대장치로도 이용될 수 있다.
세균양측정기(200)는 형광검출기에서 검출된 형광의 세기를 측정한 후, 이를 이용하여 세균의 양을 측정하기 위한 것으로서, 형광검출기로부터 전송된 데이터를 이용하여 세균의 양을 측정할 수 있는 프로세서가 내장되어 있는 단말기가 적용될 수 있는바, 현재 연산 처리 장치로 널리 이용되고 있는 개인용 컴퓨터(PC)가 적용될 수 있다.
도 7 내지 도 9는 본 발명에 따른 세균양 측정 방법에 적용되는 세균양 측정 장치의 또 다른 예시도로서, 특히, 사용자가 식중독균이 검출된 현장에 나가, 간편하게 사용할 수 있는 이동용 형광검출기를 나타낸 것이다. 즉, 본 발명은 형광의 세기를 측정하기 위하여, 도 7 내지 도 9에 도시된 바와 같은 형태의 형광검출기를 이용할 수도 있다.
먼저, 도 7은 본 발명에 적용되는 세균양 측정 장치를 나타낸 것으로서, 특히, 소형의 형광검출기 및 소형의 형광검출기로부터 형광 정보를 무선 또는 유선으로 전송받아 형광의 세기 또는 세균의 양을 측정할 수 있는 세균양측정기를 나타내고 있다. 즉, 본 발명은 현장에서의 식중독균 검출을 위해, 도 7에 도시된 바와 같은 소형 형광검출기(PicoFluor, Turner Biosystems)를 이용하여 나노형광나노입자 결합물의 형광신호를 측정하는 한편, PC와 같은 세균양측정기가 소형 형광검출기에서 전송된 형광신호를 이용하여 형광의 양(세기) 및 세균양을 측정하고 있다.
다음으로, 도 8은 세균양 측정 장치 중 형광검출기를 나타낸 것으로서, 특히, 형광검출기로 이용되는 소형 형광분광기 및 소형 형광분광기에서 발생되는 스펙트럼을 나타낸 것이다. 즉, 본 발명은 나노입자가 부착된 살모넬라균의 형광 검출을 위해, 소형 형광분광기(USB4000, OceanOptics)와 자외선 광원(365~395nm)을 이용하여 세균양 측정 장치를 구성할 수도 있다. 즉, 도 8에 도시된 소형 형광분광기는 형광필터와 시료용기를 담을 수 있는 작은 측정블록을 이용하여 나노물질에서 발생하는 형광신호만을 측정할 수 있다.
마지막으로, 도 9 역시 본 발명에 적용되는 세균양 측정 장치 중 형광검출기를 나타낸 것이다. 즉, 도 9에 도시된 형광검출기는 사용자가 휴대하고 다니기 편리하도록 제작된 휴대형 형광검출기를 나타낸 것으로서, 도 6에 도시된 형광검출기(100)를 휴대형으로 개조한 것이다. 일반적으로, 형광나노입자 결합물에서 발생되는 형광신호는 매우 미약하기 때문에, 식중독균 검출 성능을 향상시키기 위해서는 보다 높은 감도의 세균양 측정 장치가 요구된다. 따라서, 일반적인 상용 고성능 세균양 측정 장치는 도 6에 도시된 바와 같이, 모두 실험실에서 사용하기 위해 제작된 것으로서, 현장에서 형광나노입자 결합물의 신호처리기용으로 사용될 수는 없었다. 따라서, 현장에서의 식중독균 검출을 위해, 본 발명은 실리콘 PMT(Photomultiplier) 센서를 이용한 미세 형광신호 고감도 증폭 장치를 이용하여 형광검출기를 구성할 수 있다. 즉, 도 9에 도시된 바와 같은 휴대형 형광검출기는, 형광나노입자 결합물의 형광을 일으키는 UV LED모듈, 시료를 담고 암환경을 제공하는 시료홀더, 형광신호를 측정하는 실리콘 PMT, 세균양 측정기(PC)와의 데이터 통신을 위한 USB 통신부를 포함하여 구성된다.
상기한 바와 같이, 본 발명은 형광나노입자 결합물의 제작과 이를 이용한 식중독균 검출을 위한 최적 반응 프로토콜을 구명하기 위하여 상용 고감도 형광분광기(FluoroLog 3, Horiba)와 같은 형광검출기를 이용하여 각요인별 식중독균의 농도에 따른 형광나노입자 결합물의 형광신호를 측정하여 분석하였다. 형광나노입자 결합물 제작 요인은 형광나노입자 결합물 구성시약 반응순서와 나노입자 농도 변화로서 이에 따른 형광 특성을 구명하였다. 또한, 형광나노입자 결합물의 현장 사용을 위한 휴대형 세균양 측정 장치의 식중독균의 검출 성능도 세균수가 서로 다른 살모넬라균으로 준비된 시료를 이용하여 실시하였다.
상기에서는 본 발명에 대한 구체적인 내용이 설명되었으며, 이하에서는, 본 발명에 따른 세균양 측정 방법이 도출되기까지의 각종 실험 또는 분석 결과가 설명된다.
도 10은 나노입자의 형광 특성 및 적정 농도를 나타낸 그래프로서, 식중독균 검출에 적합한 바이오나노 기술 구명에 적용된다.
즉, 살모넬라의 형광을 일으키기 위한 나노입자의 적정농도를 결정하기 위하여 나노입자의 농도가 100~0.01pmol 되도록 일련의 시료를 준비한 다음 형광스펙트로미터를 이용하여 시료로부터의 형광신호를 측정하였다. 도 10에서 보듯이 1pmol 이하의 농도에서는 형광신호가 미약하여 거의 검출할 수 없었고, 100 pmol 보다 큰 농도에서는 형광신호의 포화가 일어났다. 따라서, 살모넬라에 부착된 나노물질의 농도가 10~100pmol일 때 형광신호 분석을 통한 살모넬라균의 정량분석에 가장 적정 한 것으로 나타났다. 나노입자의 부착효율이 10% 이하인 것을 고려하면 살모넬라 검출을 위해 시료에 반응시켜야 할 나노입자의 농도는 이보다 10배 이상 커야 할 것으로 판단된다.
도 11은 형광나노입자 결합물로 검출된 살모넬라 식중독균의 확대 형광 영상의 예시도로서, 2000배 확대된 영상이다.
형광나노입자 결합물의 분자식별부인 나노입자-항체 결합물이 실제로 1~2㎛ 크기의 살모넬라 세균에 부착되었는지를 도 6에 도시된 형광영상 확대장치를 이용하여 분석한 결과가 도 11에 도시되어 있다. 2000배 확대 형광영상에서 보듯이 형광나노입자 결합물이 살모넬라 세균에 골고루 부착되어 형광을 나타내어 형광나노입자 결합물의 검출부가 제대로 작동하였고, 이를 이용하여 살모넬라 세균을 검출 가능함을 확인할 수 있었다.
도 12는 살모넬라 세균수에 따른 형광영상 신호를 나타낸 예시도이다.
식중독균 검출용 형광나노입자 결합물 개발 후, 설계된 형광나노입자 결합물의 분자식별부가 실제로 효과적으로 살모넬라균을 검출하는지를, 제작된 형광영상 확대장치를 이용하여 조사하였다. 조사방법은 유리 슬라이드 위에 살모넬라균을 서로 다른 농도(105~108 cfu/ml)로 부착시킨 다음 나노입자와 항체로 이루어진 분자식별부를 같은 농도로 주입하고, 표준인산용액으로 세척한 다음, 도 5와 같이 세균에 부착된 나노입자의 형광을 측정하는 방식으로 수행하였다. 형광나노입자 결합물의 분자식별부 성능 기초시험 결과 도 12와 같이 세균수의 증가에 따라 형광신호가 증가하여 개발된 형광나노입자 결합물이 효과적으로 살모넬라균을 검출하는 것으로 나타났다.
도 13은 소형 형광검출기에 의한 나노입자 형광 측정 결과를 나타낸 그래프로서, 도 7에 도시된 소형 형광검출기를 이용한 그래프이다. 또한, 도 14는 나노입자 농도에 따른 소형 형광분광기의 형광신호 변화를 나타낸 그래프로서, 도 8에 도시된 소형 형광분광기의 신호를 나타낸 것이다.
본 발명은 상기한 바와 같이, 도 7에 도시된 소형 형광검출기 또는 도 8에 도시된 소형 형광분광기를 이용하여, 형광검출기가 구성될 수 있는바, 소형 형광검출기를 이용하여 나노 형광입자의 형광신호 검출 시험 결과, 나노입자 농도가 100 pmol/ml에서 검출기가 포화되었다. 소형 형광검출기를 이용하였을 때 시료에 더 이상 많은 나노입자가 포함되어 있으면 신호를 측정할 수가 없어 높은 농도의 세균 오염은 측정하기 어렵고, 낮은 농도의 나노입자가 있을 땐 신호의 크기가 작아 제한된 범위의 세균 농도 범위만을 측정할 수 있는 것으로 판단되었다.
또한, 형광스펙트로미터(FluorLog 3)를 이용하여 선정된 적정 농도인 10~100 pmol의 나노입자 시료를 이용하여 도 8에 도시된 소형 형광분광기의 성능을 시험한 결과, 이 농도의 나노입자가 발생하는 형광신호가 너무 미약하여 같은 농도의 나노입자로부터의 형광신호를 측정할 수 없었다. 소형 형광분광기로 측정 가능한 나노입자의 농도는 10nmol 이상인 것으로 실험 결과 조사되었다. 도 14에 나노입자의 농도가 10~80 nmol로 변화할 때의 세균양 측정 장치의 신호를 나타내었다.
도 15는 살모넬라균과 마이크로 구슬 결합 영상을 나타낸 예시도이고, 도 16은 살모넬라균수에 따른 초소형 입자 부착 SEM 영상을 나타낸 예시도로서, 살모넬 라균 검출 성능 향상을 위한 전처리 기술 개발과 관련된 예시도들이다.
살모넬라균 검출 성능을 높이기 위한 전처리 기술 시험결과 ,도 15의 전자주사현미경 영상에서처럼 살모넬라균에 초소형 입자가 부착되어 이를 이용하여 시료에서 살모넬라균을 선택적으로 분리하여 농축할 수 있는 것을 확인할 수 있었다.
또한, 도 16에서 보듯이 살모넬라균의 농도에 따라 부착된 마이크로 구슬의 수가 비례적으로 변화하여 마이크로 구슬을 이용하여 시료에서 살모넬라균을 효과적으로 분리 가능함을 확인하였다.
도 17은 시약 반응순서에 따른 검출 성능을 나타낸 그래프이고, 도 18은 나노 형광입자 농도 증가시 시약 반응순서에 따른 형광나노입자 결합물 검출 성능을 나타낸 그래프이며, 도 19는 휴대형 형광검출기를 이용한 형광나노입자 결합물의 살모넬라균 검출 성능을 나타낸 그래프로서, 형광나노입자 결합물의 살모넬라균 검출 성능 시험과 관련된 그래프이다.
형광나노입자 결합물의 살모넬라균 검출 성능 시험은 상용 고감도 형광분광기(FluoroLog 3, Horiba)를 이용하여 각요인별 식중독균의 농도에 따른 형광나노입자 결합물의 형광신호를 측정하는 방법으로 수행하였다. 형광나노입자 결합물 제작 및 검출요인은 시약 반응 순서와 나노입자 농도 변화였으며, 시약 반응순서는 1) 모든 시약을 함께 반응, 2) 부분 결합물 형성후 반응, 3) 단계별로 순차적으로 반응의 세 가지였다. 반응순서 1은 살모넬라 항체, 전처리용 초소형 입자, 나노 형광입자를 시료에 한꺼번에 넣고 반응시킨 다음 최종 결합물을 분리하여 형광신호를 측정하였고, 반응순서 2는 항체와 나노 형광입자 그리고 전처리용 초소형 입자와 시료의 살모넬라균을 먼저 반응시킨 다음 이후 이들 결합물을 최종 반응시켜 형광신호를 측정하였으며, 반응순서 3은 시료에 전처리용 초소형 입자, 항체, 나노 형광입자 순으로 차례로 반응시킨 다음 형광 신호를 측정하였다. 각 반응순서에 따른 살모넬라균 검출 성능은 그림 19와 같이 모두 108 cfu/ml였다.
형광나노입자 결합물의 살모넬라균 검출 성능을 향상시키기 위하여 나노 형광입자의 농도를 2배 증가시킨 다음 검출 시험을 수행한 결과 도 18과 같이 형광신호의 감도 향상과 함께 검출 한계를 향상시킬 수 있었다. 나노 형광입자의 농도가 높아졌을 때 반응순서에 따른 형광 반응은 형광나노입자 결합물 부분 결합물 형성후 반응시 (반응순서 2) 감도가 가장 높았고, 이때 살모넬라균 검출한계는 106 cfu/ml 였다.
현장에서의 식중독균 검출 가능성을 구명하기 위하여 전처리 기술을 이용하여 시료의 살모넬라균을 선별 분리한 다음 자체 개발한 휴대형 세균양 측정 장치를 이용하여 표준버퍼에 접종된 살모넬라균 검출 시험을 수행한 결과 도 19와 같이 108 cfu/ml의 검출 한계를 나타내었다.
형광나노입자 결합물을 이용한 살모넬라균 검출 시험결과 세균수에 따라 형광신호가 변화하여 살모넬라균을 효과적으로 검출할 수 있는 것으로 판단되었으며, 농식품에 포함된 미량의 살모넬라 세균을 검출하기 위해서는 PMT (Photo Multiplier Tube)와 같이 보다 미약한 형광신호를 검출할 수 있는 센서를 이용한 민감한 세균양 측정 장치의 개발과 검출 감도를 높일 수 있는 농축기술의 향상이 뒤따라야 할 것으로 판단된다.
상기한 바와 같이, 본 발명은 대표적인 식중독균인 살모넬라 세균의 신속 검출용 바이오센서의 성능을 높이는데 적합한 나노바이오 기술의 구명과 적용 가능성을 조사하기 위하여 개발되었으며, 본 발명의 결과는 다음과 같다.
첫째, 식중독균 검출에 적합한 바이오나노 기술로 형광을 일으키는 나노입자를 선정하였고, 기초요인 시험 결과 형광스펙트로미터를 형광신호 측정에 이용할 경우 시료에 배합시켜주어야 할 나노입자의 농도는 100 pmol 이상이 필요한 것으로 조사되었다.
둘째, 나노입자의 살모넬라균 형광 표지 특성을 구명하기 위하여 형광영상 확대장치, 소형 형광분광기, 휴대형 형광검출기를 개발하였다. 형광영상 확대장치를 이용하여 2000배 확대한 영상의 분석을 통해 설계된 형광나노입자 결합물의 검출부가 식중독균을 효과적으로 검출 가능함을 확인하였다.
셋째, 형광나노입자 결합물의 분자식별부로는 아비딘-바이오틴 방법으로 항체가 결합된 나노입자-항체 결합물을, 시료에서의 세균 분리를 위해서는 마이크로 구슬을 사용하는 것이 효과적인 것으로 조사되었다.
넷째, 상용 고감도 형광분광기(FluoroLog 3, Horiba)를 이용한 형광나노입자 결합물 시약 적정농도 및 반응 프로토콜 구명 시험 결과, 형광나노입자 결합물 부분 결합물 형성후 반응시 형광신호의 감도가 가장 높았으며, 이때 살모넬라균 검출한계는 106 cfu/ml (PBS버퍼)였다.
다섯째, 형광나노입자 결합물의 신호를 현장에서 측정할 수 있는 형광 검출기를 PMT (Photomultiplier) 센서를 이용하여 개발하였다. 이 형광 검출기를 이용하여 마이크로 구슬 전처리 기술을 이용하여 시료에서 선별분리한 살모넬라균 검출 결과 검출한계는108 cfu/ml (PBS버퍼)였다.
이상 설명한 내용을 통해 당업자라면 본 발명의 기술사상을 일탈하지 아니하는 범위에서 다양한 변경 및 수정이 가능함을 알 수 있을 것이다. 따라서, 본 발명의 기술적 범위는 명세서의 상세한 설명에 기재된 내용으로 한정되는 것이 아니라 특허 청구의 범위에 의해 정하여 져야만 할 것이다.
도 1은 본 발명에 따른 세균양 측정 방법의 일실시예 흐름도.
도 2는 본 발명에 따른 세균양 측정 방법에 적용되는 형광나노입자 결합물을 구성하는 형광나노입자의 예시도.
도 3은 본 발명에 따른 세균양 측정 방법에 적용되는 형광나노입자 결합물 중 세균과 결합되는 분자식별부의 예시도.
도 4는 본 발명에 따른 세균양 측정 방법 중 형광나노입자 결합물이 세균과 결합된 상태를 나타내는 예시도.
도 5는 본 발명에 따른 세균양 측정 방법의 원리를 설명하기 위한 예시도.
도 6은 본 발명에 따른 세균양 측정 방법에 적용되는 세균양 측정 장치의 예시도.
도 7 내지 도 9는 본 발명에 따른 세균양 측정 방법에 적용되는 세균양 측정 장치의 또 다른 예시도.
도 10은 나노입자의 형광 특성 및 적정 농도를 나타낸 그래프.
도 11은 형광나노입자 결합물로 검출된 살모넬라 식중독균의 확대 형광 영상의 예시도.
도 12는 살모넬라 세균수에 따른 형광영상 신호를 나타낸 예시도.
도 13은 소형 형광검출기에 의한 나노입자 형광 측정 결과를 나타낸 그래프.
도 14는 나노입자 농도에 따른 소형 형광분광기의 형광신호 변화를 나타낸 그래프.
도 15는 살모넬라균과 마이크로 구슬 결합 영상을 나타낸 예시도.
도 16은 살모넬라균수에 따른 초소형 입자 부착 SEM 영상을 나타낸 예시도.
도 17은 시약 반응순서에 따른 검출 성능을 나타낸 그래프.
도 18은 나노 형광입자 농도 증가시 시약 반응순서에 따른 형광나노입자 결합물 검출 성능을 나타낸 그래프.
도 19는 휴대형 형광검출기를 이용한 형광나노입자 결합물의 살모넬라균 검출 성능을 나타낸 그래프.
<도면의 주요부분에 대한 부호의 설명>
100 : 형광검출기 200 : 세균양 측정기

Claims (7)

  1. 시료 상에 제각기 다양하게 형성된 서로 다른 세균들 중 특정세균의 집합체인 특정세균 집단이 따로 분리되는 제 1 단계;
    상기 특정세균 집단에 속한 특정세균에 대항하는 항체가 포함된 형광나노입자 결합물이 상기 특정세균 집단에 투입됨에 따라, 상기 특정세균이 상기 형광나노입자 결합물과 부착되고, 상기 형광나노입자 결합물을 부착한 특정세균이 표지(標識)되는 제 2 단계;
    상기 특정세균과 미부착된 형광나노입자 결합물이 제거되는 제 3 단계; 및
    상기 특정세균에 부착된 상기 형광나노입자 결합물로부터 인지되는 형광의 세기가 기설치된 세균양 측정 장치에 의해 측정됨으로 말미암아 상기 특정세균의 양(量)도 상기 세균양 측정 장치를 통해 예측되는 제 4 단계를 포함하며,
    상기 형광나노입자 결합물은 10 내지 80 nmol을 갖는 형광나노입자(QD)의 표면에 생체분자인 아비딘층을 형성시킨 후 상기 아비딘층에 바이오틴이 결합된 항체를 반응시켜 형성되며,
    상기 제 2 단계 중 상기 특정세균과 상기 형광나노입자 결합물 간 부착 과정은 상기 특정세균이 상기 바이오틴이 결합된 항체와 우선 반응하고 상기 아비딘층이 상기 바이오틴과 반응함에 의해 실시되는 것을 특징으로 하는 세균양 측정 방법.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 제 1 단계는,
    상기 특정세균 집단이 상기 특정세균의 항체가 고정된 2 내지 3㎛의 자석입자에 의해 분리 형성되는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 세균양 측정 방법.
  3. 제 1 항에 있어서, 상기 제 1 단계는,
    상기 특정세균의 항체가 형성된 자석입자가 상기 시료에 투입되는 단계;
    항원항체 반응에 의해 상기 자석입자가 상기 시료 속의 특정세균에 부착되는 단계; 및
    상기 자석입자가 강자성체에 의해 끌려옴에 따라 상기 특정세균이 상기 특정세균 집단에 속하게 되는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 세균양 측정 방법.
  4. 제 1 항에 있어서,
    상기 제 2 단계 중 상기 형광나노입자 결합물이 상기 특정세균 집단에 투입되는 과정에 이용되는 상기 형광나노입자 결합물은,
    자외선이 조사되면 형광을 발생시키는 상기 형광나노입자 표면에 상기 특정세균의 항체를 고정화시켜 생성되는 것을 특징으로 하는 세균양 측정 방법.
  5. 삭제
  6. 제 1 항에 있어서, 제 3 단계는,
    상기 형광나노입자 결합물이 투입된 특정세균 집단을 표준인산용액으로 세척한 후, 강자성체를 이용한 다른 한차례 분리 과정을 통해 상기 특정세균에 미부착된 형광나노입자 결합물을 제거하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 세균양 측정 방법.
  7. 제 1 항에 있어서, 제 4 단계는,
    상기 세균양 측정 장치가 기구비된 LED(Light Emitting Diode)램프를 이용해 450nm 파장을 갖는 자외선을 생성시켜 상기 세균 집단에 조사하는 단계; 및
    상기 세균양 측정 장치가 기구비된 실리콘 PMT(Photo Multiplier Tube)를 이용하여 상기 형광나노입자 결합물의 형광나노입자부터 발생되는 형광의 세기를 측정하는 단계를 포함하는 세균양 측정 방법.
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