TW201630939A - 人化抗ｃｘｃｒ５抗體類、彼之衍生物類及彼等之用途 - Google Patents

人化抗ｃｘｃｒ５抗體類、彼之衍生物類及彼等之用途 Download PDF

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Abstract

本發明涉及與CXCR5特異性結合並能例如抑制CXCR5功能的人類化抗體。本發明還包括利用該抗體治療或預防與CXCR5相關的疾病或障礙。

Description

人化抗CXCR5抗體類、彼之衍生物類及彼等之用途
本發明係關於抗CXCR5的抗體及其在改善、治療或預防哺乳動物包括人類的疾病或障礙中的用途，這些疾病或障礙源自不適宜的CXCR5活性或代謝或例如病原體對CXCR5活性或代謝的不恰當或不正常的使用。目的抗體可阻斷配體例如CXCL13與其受體例如CXCR5的結合。本發明還披露了含有目的抗體及其衍生物的預防、免疫治療和診斷組合物以及它們在預防或治療哺乳動物包括人類的疾病的方法中的用途，這些疾病是由CXCR5+細胞例如B淋巴細胞的不適宜代謝和/或活性而引起的。這類疾病包括由炎症引起或以炎症為特徵的自身免疫缺陷和疾病，例如其中CXCR5發生上調的類風濕性關節炎(RA)。
CXCR5也被稱為Burkitt淋巴瘤受體(BLR1)、CD185、MDR15和MGC117347。它是G蛋白偶聯受體，也是CXC趨化因子受體家族的成員。其中一個配體是被稱為CXCL13的BLC，它是B細胞的化學引誘物。
未加工的CXCR5前體長度為372個胺基酸，分子量為42KD。
CXCR5參與了B細胞在特定解剖腔內的遷移和定位。基因剔除小鼠缺乏外周淋巴結，其具有較少的培氏斑和降低的B細胞量。
本發明之概述
本發明提供了特異結合CXCR5的新穎人類化和人抗體以及它們的片段和衍生物。一部分所述抗體及其CXCR5結合片段經改造可防止鏈內二硫鍵的形成，從而產生在體內生產和使用過程中穩定的分子。其他目的抗體經改造可儘量減少與FcR的結合。某些所關注的CXCR5抗體與CXCL13競爭結合CXCR5。其他抗體降低CXCR5活性。
本發明包括所述抗體的可變重鏈和輕鏈的胺基酸序列及其對應的核酸序列。
本發明的另一實施例包括所述抗體的互補決定區域(CDR)序列，以得到包括一個或多個CDR區域或源自CDR區域的結合分子，它們保留了母分子結合CXCR5的能力，其中CDR得自母分子。
目的抗體可為防止CXCL13或其他配體結合到CXCR5+細胞例如B細胞的抗體。
本發明的另一實施例包括攜帶有本發明所述抗體序列 的細胞系和載體(vector)。
本發明的另一實施例是所述抗體在製備用於治療與CXCR5功能和代謝有關的疾病和障礙的藥劑或組合物中的用途。
本發明的另一實施例是這些抗體在治療與非典型或異常CXCR5生物學和功能相關的障礙中的用途。
本文還敘述了其他特點和優點，將在下列實施例中顯現。
本發明之詳述
本發明不局限於本文所述的具體方法學、實驗方案、細胞系、載體或試劑，這是因為它們可發生變動，而不偏離本發明的精神和範圍。而且，本文所使用的術語僅出於例示具體實施例之目的，並非意在限制本發明之範圍。除非另有定義，本文所使用的所有技術和科學術語和任何首字母縮略詞的含義與本發明領域技術人員通常理解的含義相同。實施本發明時可使用任何類似或相當於本文所述的方法和材料，本文僅敘述了例示性方法、設備和材料。
出於敘述和披露可能與本發明一同使用和可能在本發明中使用的所報道的蛋白質、酵素、載體、宿主細胞和方法學的目的，本文所提及的所有專利和出版物均藉引用之方式整體併入。但是，這些不應解讀為承認在先發明揭示了本發明。
在教示製備和使用CXCR5相關的方法和目的產物之 前，提供了一些術語和短語的下列非限制性定義，以指導技術人員。
「CXCR5」涉及淋巴細胞尤其是B細胞特別是原初B細胞中天然存在的分子；涉及從這些細胞分離出的分子；涉及使用已知材料和方法並使用編碼CXCR5的核酸經重組製備的分子；以及涉及CXCR5的某些部分，例如胞外(EC)區域，其保留有與實施本發明有關的特點和性質，例如結合CXCL13。可溶的CXCR5分子可基本上由CXCR5的EC域組成，其一般包括該分子的前60個胺基酸，即CXCR5的胺基端。
CXCR5是非混雜受體。CXCL13是CXCR5的配體，並在基質細胞例如濾泡樹突狀細胞和淋巴組織中呈組成型表現。CXCL13特異吸引B細胞和一小群稱為輔助性濾泡T細胞(TFH)的T細胞。考慮到免疫系統中的T細胞和B細胞之間有許多交互作用，這點可能並不出人意料。而且，活化的T細胞誘導或上調CXCR5表現。業已發現淋巴細胞浸潤到三級異位生發中心(GC)與預先具有這類非典型淋巴結樣結構的某些疾病的病情加重和耐受崩潰緊密相關。使用體內鼠模型，例如CXCR5-/-和CXCL13-/-小鼠，受體或配體的缺乏導致GC精細結構因T細胞和B細胞定位以及可能的交互作用發生改變而發生變化。這些小鼠還可受保護，防止發生嚴重的膠原誘導的關節炎(CIA)。由於CXCR5選擇性表現於與RA發病相關的成熟B細胞上，阻斷該受體可調節受累個體的致關節炎抗原 反應。業已表明使用生物製品(即抗TNFα和抗CD20抗體，利妥昔單抗)治療類風濕性關節炎有臨床效果，具體而言，接受B細胞導向療法的患者其臨床徵兆和症狀表現出長期改善。選擇性靶向僅表現於成熟B細胞和B輔助性T細胞的CXCR5，不會影響B細胞的發育或使患者免疫力受損。與利妥昔單抗不同的是，本發明抗體是不介導細胞毒性的中和抗體。
「CXCR5疾病」是一種疾病、障礙、症狀、異常等，其特徵或誘因是CXCL13或其他CXCR5配體過表現或量升高、B細胞量升高、B細胞活性量升高、CXCR5量升高或CXCR5不適當的代謝或活性。
所謂「B細胞活性」是指高於正常B細胞量，其可是局部的，或是某種生物現象或B細胞功能的表現，例如抗體表現、Bruton’s酪胺酸激酵素的存在或活性、CD19的表現或存在、B細胞活化因子的表現或存在等。
就抗體鏈多肽序列而言，短語「基本相同」可理解為表現出與參照多肽序列至少70%、80%、90%、95%或更多的序列相同度的抗體鏈。就核酸序列而言，該術語可理解為表現出與參照核酸序列至少85%、90%、95%、97%或更高的序列相同度的核苷酸序列。
術語「相同度」或「同源性」可指候選序列中核苷酸鹼基或胺基酸殘基與相應序列進行比較，經比對序列和引入間隔(若有必要)以實現整段序列的最大相同百分數且不把任何保守性取代視為部分序列相同度後，二者殘基相 同的比例。無論N端或C端延伸或插入均不應理解為降低相同度或同源性。用於比對的方法和電腦程式均可獲得，並為本領域所熟知。可使用序列分析軟體測量序列相同度。
短語和術語抗體或抗原的「功能片段、變異體、衍生物或類似物」等以及它們的形式是具有與所關注之全長抗體或抗原的生物活性性質相同的化合物或分子。例如，抗CXCR5抗體的功能片段或類似物是可結合CXCR5分子的片段或類似物，或是可防止或實質降低配體例如CXCL13或激動或拮抗性抗體結合CXCR5的能力的片段或類似物。一個實施例是scFV分子。就CXCR5而言，其變異體或衍生物是與天然存在的CXCR5不一樣的分子，但卻可用於本發明的目的，例如儘管與野生型CXCR5不相同，但可用作免疫原誘導產生選擇性結合野生型CXCR5的抗體。
「取代型」變異體是一段天然序列中至少一個胺基酸殘基被除去並被一個不同的胺基酸插入其相同位置的變異體。所述取代可為單個的，其中該分子中僅有一個胺基酸被取代；或可為多個的，其中該相同分子有兩個或更多的胺基酸被取代。多個取代可位於連續的位點。同樣，一個胺基酸可被多個殘基取代，其中該變異體包括取代和插入。「插入型」變異體是一個或多個胺基酸被插入到緊鄰一段天然序列某個特定位置處的胺基酸的變異體。緊鄰胺基酸意指藉該胺基酸的α-羧基或α-胺基官能基連接。 「刪除型」變異體是天然胺基酸序列中一個或多個胺基酸被除去的變異體。通常情況下，刪除型變異體在其分子的特定區域內有一個或兩個胺基酸被刪除。
術語「抗體」被用於最寬泛的含義，具體涵蓋單株抗體(包括全長單株抗體)、多株抗體、多特異性抗體(例如雙特異性抗體)、攜帶一個或多個CDR或源自CDR序列的抗體片段或合成多肽，只要這些多肽表現出所需的生物活性。抗體(Ab)和免疫球蛋白(Ig)是具有相同結構特徵的醣蛋白。一般情況下，抗體被認為是具有確定或公認的特異性的Ig。因此，儘管抗體表現出與特異靶的結合特異性，但免疫球蛋白包括抗體和其他缺乏靶特異性的抗體樣分子。本發明所述抗體可為任何種類(例如IgG、IgE、IgM、IgD、IgA等)、或亞類(例如IgG1、IgG2、IgG2a、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2等)的抗體(「類型」和「種類」、以及「亞型」和「亞類」在本文中可互換使用)。天然或野生型(即得自未人工操縱的群體成員)抗體和免疫球蛋白通常為約150,000道爾頓的異四聚體醣蛋白，其由兩個相同的輕鏈(L)和兩個相同的重鏈(H)組成。每條重鏈的一端具有一個可變域(VH)，隨後是一系列恆定域。每條輕鏈的一端具有一個可變域(VL)，另一端具有一個恆定域。所謂「未人工操縱」意指未經處理以含有或表現外源抗原結合分子。野生型可指一個群體中最普遍的等位基因或種類或指得自未操縱動物的抗體，後者相比較於得自某種形式的操縱例如誘變、使用重組方法 等以改變該抗原結合分子的胺基酸的等位基因或多型性或變異體或衍生物。
正如本文所使用，「抗CXCR5抗體」意指可特異結合本文所定義的人CXCR5的抗體或源自這些抗體的多肽(衍生物)，其包括但不限於抑制或實質降低CXCR5與其配體的結合或抑制CXCR5活性的分子。
就抗體的可變域而言，術語「可變」係指抗體之間有廣泛序列差異的相關分子的某些部分，且被用於特異識別和針對其特異靶而結合某特異抗體。但是，可變性在抗體的整個可變域內不是均勻分佈的。可變性集中在被稱為互補決定區域(CDR；即CDR1、CDR2和CDR3)或超變區的三個區段，它們均位於輕鏈和重鏈的可變域內。可變域內保守程度更高的部分被稱為框架(FR)區或框架序列。天然重鏈和輕鏈的每個可變域均包括四個FR區，其主要採用β-折疊構型，它們藉三個CDR連接起來，CDR形成環連接β-折疊結構並在某些場合下形成部分的β-折疊結構。每條鏈的CDR通常被FR區或來自其他鏈的CDR維繫在一起，促進抗體靶結合位點(表位或決定簇)的形成(參看Kabat等人Sequences of Proteins of Immunological Interest,National Institute of Health,Bethesda,MD(1987))。正如本文所使用，免疫球蛋白胺基酸的編號是依據Kabat等著的免疫球蛋白胺基酸編號系統而進行的，除非另有說明。一個CDR可具有特異結合同源表位的能力。
術語「抗體片段」係指完整或全長鏈或抗體的一部分，一般是靶結合區域或可變區域。抗體片段的實施例包括但不限於Fab、Fab'、F(ab')2和Fv片段。「功能片段」或「抗CXCR5抗體的類似物」是可防止或實質降低所述受體結合配體或啟動信號轉導的能力的片段或類似物。正如本文所使用，功能片段一般與「抗體片段」含義相同，且就抗體而論，可指能防止或實質降低所述受體結合配體或啟動信號轉導的能力的片段，例如Fv、Fab、F(ab')2。「Fv」片段由一條重鏈的可變域和一條輕鏈的可變域藉非共價結合方式而形成的二聚體(VH-VL二聚體)組成。在該構型中，每個可變域的三個CDR交互作用，以確定VH-VL二聚體表面上的靶結合位點，與完整抗體的情況一樣。所述六個CDR共同賦予完整抗體的靶結合特異性。但是，即使是單個可變域(或僅包括3個特異識別某靶點的CDR的Fv的一半)，仍可具有識別和結合靶的能力。
「單鏈Fv」、「sFv」或「scAb」抗體片段包括抗體的VH和VL結構域，其中這些結構域位於單條多肽鏈上。一般而言，所述Fv多肽還包括一段位於VH和VL區域之間的多肽連接物，其通常為彈性分子，可使sFv形成適合於靶結合的所需結構。
術語「雙體抗體」係指具有兩個抗原結合位點的抗體片段，這些片段可包括與同一多肽鏈的一個輕鏈可變域(VL)結合的一個重鏈可變域(VH)。藉由使用一條過短的連接物使得同一條鏈上的兩個可變域無法配對，所述 雙體抗體區域被迫與另一條鏈的結合區域配對，生成兩個抗原結合位點。
Fab片段含有輕鏈的可變域和恆定域以及重鏈的第一個恆定域(CH1)。Fab'片段與Fab片段的不同之處在於前者在CH1區域的羧基端加入數個殘基，以包括一個或多個來自抗體鉸鏈區的半胱胺酸。藉由裂解位於F(ab')2胃蛋白酵素消化產物的鉸鏈半胱胺酸處的二硫鍵，可生成Fab'片段。對抗體另外進行酵素處理和化學處理可生成其他目的功能片段。
本文所使用的術語「單株抗體」係指得自基本同質抗體群的抗體，即組成該群體的單個抗體除可能有少數天然突變外，均是相同的。
本文的單株抗體具體包括「嵌合」抗體，其中一部分重鏈和/或輕鏈與源自某特定物種或屬於某特定抗體種類或亞類(類型或亞型)的相應序列相同或相似，其中所述鏈的其餘部分與源自另一物種或屬於另一抗體種類或亞類的抗體以及所述抗體片段的相應序列相同或相似，只要這些抗體片段表現出結合CXCR5或影響CXCR5活性或代謝的所需生物活性(美國專利4,816,567；和Morrison等著的Proc Natl Acad Sci USA 81：6851(1984))。因此，來自同一類別抗體的CDR可移植到不同種類或亞類抗體的FR。
單株抗體是高度特異性的抗體，它們識別單個靶位點、表位或決定簇。而且，與通常包括針對抗原不同決定 簇(表位)的不同抗體的常規(多株)抗體製劑不同的是，每個單株抗體針對靶上的單個決定簇。除其特異性以外，單株抗體在宿主細胞內的合成是有利的，不受其他免疫球蛋白的污染，並提供供選殖編碼其抗體鏈的相關基因和mRNA。修飾語「單株」提示得自基本同質抗體群的抗體的性質，其不應理解為需要藉任何特定方法產生所述抗體。例如，用於本發明的單株抗體可從噬菌體抗體庫經使用眾所周知的技術分離或從多株製品純化。依據本發明使用的親代單株抗體可藉由Kohler等人在Nature 256：495(1975)中所述的雜交瘤方法製備，或藉由本領域內眾所周知的重組方法製備。
非人類(例如鼠)抗體的「擬人化」形式是嵌合的免疫球蛋白、免疫球蛋白鏈或它們的片段(例如抗體的Fv、Fab、Fab'、F(ab')2或其他靶結合序列)，與人抗體相比，其含有源自非人類的免疫球蛋白序列。一般而言，所述人類化抗體基本包括一個、典型為兩個的所有可變域，其中所有或基本上所有CDR區域對應於非人類免疫球蛋白的CDR區域，以及所有或基本上所有FR區域是人類免疫球蛋白範本序列的FR區域。所述人類化抗體還可包括至少一部分免疫球蛋白恆定區(Fc)，通常是所選擇的人免疫球蛋白範本的恆定區。一般而言，目的是擁有在人體內免疫原性最低的抗體分子。因此，有可能一個或多個CDR中的一個或多個胺基酸也可被更換成在人宿主體內免疫原性更低的胺基酸，但卻基本不減少所述一個或多個CDR 對CXCR5或CXCL13的特異結合功能。或者，FR可為非人類的，但免疫原性最強的胺基酸被替換為免疫原性較低的胺基酸。但是，上文所討論的CDR移植並非是獲得人類化抗體的唯一途徑。例如，僅修飾CDR區域可能不夠充分，因為框架區殘基參與決定CDR環的三維結構和抗體與其配體的總親和力並非鮮見。因此，可實施任何方法，以使非人類親代抗體分子被修飾為對人免疫原性更低的抗體分子，而且並非總是需要與人抗體的總序列相同。因此，也可藉由例如僅取代數個殘基實現人類化，尤其是取代暴露在抗體分子外且沒有被包埋在該分子內部從而不易接近宿主免疫系統的殘基。本文在取代抗體分子上的「活動」或「彈性」殘基方面教示了該方法，其目標是降低或減少所形成分子的免疫原性，卻不破壞所述抗體對其表位或決定簇的特異性。例如參見Studnicka等著的Prot Eng 7(6)805-814,1994；Mol Imm 44：1986-1988,2007；Sims等著的J Immunol 151：2296(1993)；Chothia等著的J Mol Biol 196：901(1987)；Carter等著的Proc Natl Acad Sci USA 89：4285(1992)；Presta等著的J Immunol 151：2623(1993),WO 2006/042333和美國專利5,869,619。
適應性免疫反應具有兩個主要方面：T淋巴細胞的細胞性免疫反應和分泌抗體的B淋巴細胞的體液性免疫反應。B細胞的表位可以是線性、連續胺基酸或可以是構形的(Protein Science(2005)14,246)。相反，T細胞表位 是短小的線性胜肽，它們是主要組織相容複合物(MHC)蛋白或人白血球抗原(HLA)I類或II類分子所呈遞的抗原蛋白切割產物。表位呈遞取決於MHC-肽結合和T細胞受體(TCR)交互作用。MHC蛋白為高度多型性的，每個MHC蛋白可結合有限數量的胜肽。因此，宿主體內的MHC等位基因的特定組合限制了感染過程中可能被識別的表位。
藉CD8和CD4蛋白表現可區分兩種基本類型的T細胞，CD8和CD4蛋白決定T細胞是否識別分別由I類或II類分子所呈遞的表位。CD4+ T表位被抗原呈現細胞包裹到膜結合囊泡內後，進行加工，其中抗原被蛋白酵素降解成結合MHC II類蛋白的肽片段。相反，CD8+T細胞一般識別被免疫蛋白酶體在細胞溶質中切割成短胜肽的病毒抗原或細胞內表現的自身抗原和蛋白質。切割後，胜肽被與抗原加工相關的轉運蛋白(TAP)移位至內質網，以結合到HLA I抗原上。CD4+ T(輔助性)細胞表位是驅動針對蛋白抗原的T細胞依賴免疫反應的關鍵。
所關注的人類化方法係基於所述抗體的分子彈性在免疫識別中的影響。蛋白質彈性與蛋白分子的分子運動有關。蛋白質彈性是整個蛋白、部分蛋白或單個胺基酸殘基採取構形集合的能力，其中該構形集合中每個構形彼此顯著不同。有關蛋白質彈性的資訊可從蛋白質X射線結晶學實驗(參見例如Kundu等著的2002,Biophys J 83：723-732.)、核磁共振實驗(參見例如Freedberg等著的J Am Chem Soc 1998,120(31)：7916-7923)或進行分子動力學(MD)模擬而獲得。在電腦上進行蛋白質的MD模擬，可藉由計算原子之間的物理交互作用測定所有蛋白質原子在一段時間內的運動。MD模擬的輸出是所研究蛋白在模擬時間段內的軌跡。該軌跡是蛋白質構形即瞬間運動圖的集合，蛋白質構形在模擬期間例如每隔1皮秒(ps)內定期採樣。正是藉由分析瞬間運動圖的集合，人們能夠定量分析蛋白質胺基酸殘基的彈性。因此，就含有彈性殘基的多肽而言，彈性殘基是採取不同構形集合的殘基。MD方法為本領域所周知，參見例如Brooks等著的「Proteins：A Theoretical Perspective of Dynamics,Structure and Thermodynamics」(Wiley,New York,1988)。數種軟體可進行MD模擬，例如Amber(參見Case等著的(2005)J Comp Chem 26：1668-1688),Charmm(參見Brooks等著的(1983)J Comp Chem 4：187-217；和MacKerell等著的(1998)「The Encyclopedia of Computational Chemistry」vol.1：271-177,Schleyer等著的eds.Chichester：John Wiley & Sons)或Impact(參見Rizzo等著的J Am Chem Soc；2000；122(51)：12898-12900)。
大多數蛋白質複合物共用相對較大和較平的被包埋表面，業已表明結合配對組合的彈性提供了其塑性的來源，使其能夠適應彼此的構形(Structure(2000)8,R137-R142)。如上述，「誘導契合(induced fit)」的實例已顯示在蛋白質-蛋白質的介面扮演了極重要的角色。此 外，穩定增長的資料表明蛋白質實際上結合各種形狀、大小和組成的配體(Protein Science(2002)11：184-187)，且構形多樣性似乎是識別不同配對組合能力的基本成分(Science(2003)299,1362-1367)。彈性殘基參與了蛋白質-蛋白質配對組合的結合(Structure(2006)14,683-693)。
彈性殘基可採取許多構形，它們提供了交互作用區域的集合，其有可能被記憶B細胞識別並觸發免疫原性反應。因此，可藉由修飾許多來自框架區的殘基使抗體被人類化，使得構形集合和受修飾抗體所展示的識別區域集合盡可能類似於人抗體所採取的構形集合和識別區域集合。
這一點可藉由以下列方法修飾有限數目的殘基得以實現：(1)構建母體mAb的同源模型，進行MD模擬；(2)分析彈性殘基和鑒定非人抗體分子最靈活的殘基，以及鑒定有可能是異質性或降解反應來源的殘基或基序；(3)鑒定展示出與親代抗體最相似的識別區域集合的人抗體；(4)測定待突變的彈性殘基，可能為異質性和降解來源的殘基或基序也被突變；(5)檢查是否存在已知T細胞或B細胞表位。使用本文所教示的MD計算經使用連續的溶劑模型可發現彈性殘基，該溶劑模型描述了水溶劑與蛋白質原子在模擬期間內的交互作用。
一旦在輕鏈和重鏈的可變域內鑒定出一組彈性殘基，即鑒定出與目的抗體高度類似的一組人重鏈和輕鏈可變區域框架。例如可使用BLAST(基本區域排比搜尋工具) 在抗體人生殖細胞系序列的數據庫中檢索彈性殘基進行上述鑒定。還可藉由比較母體mAb與生殖細胞系經典結構庫的動力學，進行上述鑒定。檢索時排除CDR殘基和鄰近殘基，以確保保留對於抗原的高度親和力。
因此，對目的抗體的分子動力學軌跡與生殖細胞系抗體結構庫的軌跡進行比較。將16D7與49個生殖細胞系結構的庫進行比較。每個抗體所留下的分子動力學軌跡是分子動力學電腦模擬過程中的分子動力學計算結果的集合，其中例如使用約10個不同的構形作為不同的起點，並且對於每個起點進行約10次的分子動力學模擬。藉由系統合併7個最常見的人輕鏈(vκ1、vκ2、vκ3、vκ4、vλ1、vlλ2和vλ3)和7個最常見的重鏈(vh1a、vh1b、vh2、vh3、vh4、vh5和vh6)構建人抗體生殖細胞系的49 3D同源模型(Nucleic Acids Research,2005,Vol.33,Database issue D593-D597)。隨後將16D7的彈性殘基更換為其軌跡與目的抗體最為接近的生殖細胞系結構的相應殘基。
隨後取代彈性殘基。當幾個人殘基表現出類似同源性時，藉由可能影響人類化抗體的溶液行為的殘基性質驅動該選擇。例如，暴露的彈性環上優選極性殘基，而不是疏水殘基。突變可能為不穩定性和異質性來源的殘基，即使它們在CDR上也有發現。這些殘基包括暴露的甲硫胺酸，因為亞碸可能是由氧自由基、對酸敏感的鍵例如Asp-Pro二肽的鍵的蛋白水解(Drug Dev Res(2004) 61：137-154)而形成的；位於暴露的天冬醯胺殘基和隨後的小胺基酸例如Gly、Ser、Ala、His、Asn或Cys處的脫醯胺作用位點(J Chromatog(2006)837：35-43)和N-糖化位點例如Asn-X-Ser/Thr位點。一般情況下，暴露的甲硫胺酸會被Leu所取代，暴露的天冬醯胺會被殼胺醯胺或天冬胺酸所取代，或其隨後殘基會被更換。對於糖化位點(Asn-X-Ser/Thr)而言，可更換Asn或Ser/Thr殘基。
檢查形成的複合序列是否存在已知的B細胞或線性T細胞表位。例如使用披露的Immune Epitope Data Base(IEDB)進行檢索(PLos Biol(2005)3(3)e91)。如果在該複合序列中發現已知表位，則檢索和取代另一組人序列。
與美國專利5,639,641的表面重塑方法不同的是，該方法探討了B細胞介導和T細胞介導的免疫原性反應。該方法還避免了有時使用CDR移植可觀察到的活性丟失問題(美國專利5,530,101)。此外，在設計和選擇過程中還考慮了穩定性和溶解度的問題，從而形成具有低免疫原性、高抗原親和力和改善生物物理性質的優化抗體。
例如美國專利5,639,641披露了用於表面重塑抗體的策略和方法以及降低抗體在不同宿主體內免疫原性的其他方法。簡而言之，在一較佳方法中，(1)生成抗體重鏈和輕鏈可變區域庫的位置比對，得到重鏈和輕鏈可變區域框架表面暴露的位置，其中所有可變區域的比對位置至少約98%是相同的；(2)確定一組重鏈和輕鏈可變區域框 架表面暴露的胺基酸殘基，以用於非人類例如嚙齒動物抗體(或其抗體片段)；(3)鑒定一組與所述嚙齒動物抗體表面暴露的胺基酸殘基最為一致的重鏈和輕鏈可變區域框架表面暴露的胺基酸殘基；以及(4)將步驟(2)所確定的一組重鏈和輕鏈可變區域框架表面的暴露胺基酸替換為步驟(3)所鑒定的一組重鏈和輕鏈可變區域框架表面的暴露胺基酸殘基，除了距離所述嚙齒動物抗體CDR的任何殘基的任何原子5Å以內的胺基酸殘基，以生成保留結合特異性的人類化例如嚙齒動物抗體。
抗體可利用許多其他技術例如CDR移植(EPO 0 239 400；WO 91/09967和美國專利5,530,101以及5,585,089)、鑲飾或表面重塑(EPO 0 592 106；EPO 0 519 596；Padlan,1991,Molec Imm 28(4/5)：489-498；Studnicka等著的1994,Prot Eng7(6)：805-814和Roguska等著的1994,PNAS 91：969-973)和鏈替換(美國專利5,565,332)進行人類化。人抗體可藉許多本領域知曉的方法進行製備，例如但不限於噬菌體展示方法(參見美國專利4,444,887,4,716,111,5,545,806和5,814,318和WO 98/46645,WO 98/50433,WO 98/24893,WO 98/16654,WO 96/34096,WO 96/33735和WO 91/10741)和使用基因轉殖動物例如嚙齒類以及使用嵌合細胞等。
「抗體同源物」或「同源物」係指本文所教示的特異結合CXCR5的任何分子。因此，抗體同源物包括不論修飾與否的天然或重組抗體，它們是保留目的生物性質如結 合CXCR5的抗體部分，例如Fab或Fv分子、單鏈抗體以及攜帶一個或多個CDR區域的多肽等。所述同源物的胺基酸序列無需與天然存在的抗體胺基酸序列相同，但可經改變或修飾以攜帶取代胺基酸、插入胺基酸、刪除胺基酸、除蛋白質上正常存在的20個胺基酸以外的胺基酸等，以獲得具有增強或其他有利性質的多肽。
具有同源序列的抗體是其胺基酸序列與本發明的CXCR5抗體的胺基酸序列具有序列同源性的抗體。較佳情況下，同源性位於本發明抗體的可變區域的胺基酸序列。應用於本文胺基酸序列的「序列同源性」定義為經例如根據Pearson & Lipman,Proc Natl Acad Sci USA 85,2444-2448(1988)的FASTA檢索方法測定與其他胺基酸序列具有至少約90%、91%、92%、93%、94%或更多的序列同源性，更優選為至少約95%、96%、97%、98%或99%的序列同源性。
嵌合抗體是具有不同部分的抗體，其源自不同來源例如不同抗體、不同種類的抗體、不同動物物種，例如具有一個源自鼠單株抗體的可變區以及一個配對的人免疫球蛋白恆定區的抗體等。因此，人類化抗體是一種嵌合抗體。用於生產嵌合抗體的方法為本領域所知曉，例如Morrison,1985,Science 229：1202；Oi等人1.,1986,BioTechniques 4：214；Gillies等著的1989,J Immunol Methods 125：191-202和美國專利5,807,715,4,816,567和4,816,397。
人工抗體包括單鏈抗體、scFv片段、嵌合抗體、雙價抗體、三價抗體、四價抗體和mru(參見Winter & Milstein的綜述，1991,Nature 349：293-299；和Hudson,1999,Curr Opin Imm 11：548-557)，其中每種均具有抗原結合或表位結合能力。在單鏈Fv片段(scFv)中，抗體的VH和VL區域藉彈性胜肽連接起來。一般情況下，所述連接物是約為15個胺基酸的胜肽。如果該連接物小得多，例如5個胺基酸，則形成雙價抗體，其為雙價的scFv二聚體。如果該連接物被減少到不到3個胺基酸殘基，則形成三聚體和四聚體結構，它們分別被稱為三價抗體和四價抗體。抗體的最小結合單元可以是單個CDR，一般為重鏈的2個或3個CDR，其具有足夠的特異識別和結合能力，但也可為CDR序列的任意組合，這可藉由本文所教示的實施方法進行確定。這種片段被稱為分子辨識單元或mru。幾個該類mcr可藉短的連接胜肽連接到一起，從而形成具有高於單個mru親和力的人工結合蛋白。
目的抗體的功能等效物也包括在本發明的範圍以內。術語「功能等效物」包括具有同源系列的抗體、抗體同源物、嵌合抗體、人工抗體和修飾抗體，例如其中每個功能等效物定義為其結合CXCR5的能力、抑制CXCR5信號轉導的能力或功能，或抑制CXCL13和其他配體結合到CXCR5的能力。技術人員會理解名為「抗體片段」的一組分子與名為「功能等效物」的一組有重疊。製備保留CXCR5結合能力的功能等效物的方法為本領域技術人員 知曉，並為例如WO 93/21319,EPO Ser.No.239,400,WO 89/09622,EPO Ser.No.338,745和EPO Ser.No.332,424所披露。
本申請的功能等效物還包括修飾抗體，例如被任何類型的分子經共價連接而修飾的抗體。例如，修飾抗體包括業已被已知的保護/封閉基經過例如糖化、乙醯化、聚乙烯二醇化、脫醯胺化、磷酸化、醯胺化、衍生化、蛋白裂解、連接到細胞配體、連接到毒素或細胞毒性部分或其他蛋白等修飾的抗體。共價連接無需生成不能產生抗獨特型反應的抗體。所述修飾可藉由已知技術實現，其包括但不限於特異化學切割、乙醯化、甲醯化、代謝合成等。此外，被修飾抗體可含有一個或多個非經典的胺基酸。
本領域技術人員可利用許多技術來實現結合親和力的優化。一般情況下，這些技術包括取代目的位置處的各種胺基酸、隨後篩選分析突變多肽對同源抗原或表位的結合親和力。
一旦抗體被鑒定和分離，通常可生成變異抗體或突變體或突變蛋白質，其中例如所述抗體的一個或多個高變區的一個或多個胺基酸殘基被改變。或者，或此外，可向抗體引入框架區殘基的一個或多個變動(例如取代)，而這些變動導致抗體突變體對CXCR5的結合親和力升高。可經修飾的框架區殘基的實施例包括非共價直接結合抗原的殘基(Amit等著的Science 233：747-753(1986))；影響CDR構形或與其交互作用的殘基(Chothia等著的J Mol Biol 196：901-917(1987))；和/或參與VL-VH介面的殘基(EP 239 400)。在某些實施例中，一個或多個這類框架區殘基的修飾導致抗體與同源抗原的結合親和力增加。例如，在本發明的該實施例中可改變約1個到約5個框架區殘基。有時，這足以產生適合用於臨床前試驗的抗體突變體，即使其中沒有改變一個高變區的殘基。但正常情況下抗體突變體可包括一個或多個高變區變動。也可改變恆定區以獲得理想或更加理想的效應物性質。
被變動的高變區殘基可隨機改變，尤其是當親代抗體的初始結合親和力可使隨機產生的抗體突變體容易被本文所教示的檢測進行篩選。
一種獲得抗體突變體例如CDR突變體的方法是「丙胺酸掃描誘變」(Cunningham & Wells,Science 244：1081-1085(1989)和Cunningham & Wells,Proc Nat Acad Sci USA 84：6434-6437(1991))。一個或多個高變區殘基被丙胺酸或聚丙胺酸殘基取代。對所述取代表現出功能敏感性的這些高變區殘基隨後藉由在取代位點引入進一步或其他突變而改進。因此，儘管事先確定了引入胺基酸序列變動的位點，但突變本身的性質無需事先確定。根據被掃描殘基的所需性質，可嘗試使用其他胺基酸進行類似取代。
一種鑒定待修飾胺基酸殘基更為系統的方法包括鑒定參與結合CXCR5的高變區殘基和很少或沒有參與CXCR5結合的高變區殘基。進行非結合高變區殘基的丙胺酸掃 描，其中檢測每個ala突變體對CXCR5的結合是否增強。在另一實施例中，選擇明顯參與CXCR5結合的這些殘基進行修飾。修飾可包括刪除殘基或在目的殘基旁插入一個或多個殘基。但是，正常情況下修飾包括以另一個胺基酸取代殘基。保守性取代可以是第一取代。如果該取代導致生物活性發生變化(例如結合親和力)，那麼可進行另一次保守取代以確定是否得到更多實質性變化。
藉由選擇其性質與正常情況下位於某位點處的胺基酸有更多實質差異的胺基酸，可對抗體範圍和生物性質的呈現進行更為實質性的修飾。因此，在維持下列情況下可進行該取代：(a)多肽骨架取代區域的結構，例如折疊或螺旋構形；(b)該分子在靶位點處的電荷或疏水性，或(c)側鏈的大小。
例如，根據常見側鏈性質，天然存在的胺基酸可分為以下幾組：(1)疏水：甲硫胺酸(M或met)、丙胺酸(A或ala)、纈胺酸(V或val)、白胺酸(L或leu)和異白胺酸(I或ile)；(2)中性、親水：半胱胺酸(C或cys)、絲胺酸(S或ser)、蘇胺酸(T或thr)、天冬醯胺(N或asn)和穀胺醯胺(Q或gln)；(3)酸性：天冬胺酸(D或asp)和穀胺酸(E或glu)；(4)鹼性：組胺酸(H或his)、離胺酸(K或lys )和精胺酸(R或arg)；(5)影響鏈取向的殘基：甘胺酸(G或gly)和脯胺酸(P或pro)，以及(6)芳香：(6)芳香：色胺酸(W或trp)、酪胺酸(Y或tyr)苯丙胺酸(F或phe)。
非保守取代需要以來自另一組的胺基酸調換胺基酸。保守性取代需要以來自組內的胺基酸調換另一胺基酸。
較佳的胺基酸取代包括下列胺基酸取代：(1)降低對蛋白水解的敏感性，(2)降低對氧化的敏感性，(3)改變結合親和力以及(4)賦予或修飾這些類似物的其他生理-化學或功能性質。類似物可包括除天然存在胜肽序列以外的一段序列的各種突變蛋白質。例如，可對天然存在的序列(優選在形成分子間接觸的區域以外的多肽部分)進行單個或多個胺基酸的取代(優選為保守性胺基酸取代)。除R基或側鏈的大小或構形的改變以外，保守性胺基酸取代不應實質性改變母體序列的結構特徵(例如胺基酸取代不應會打斷母體序列中的螺旋，或破壞表現為母體序列特徵的其他類型的二級結構)(Proteins,Structures and Molecular Principles,Creighton,ed.,W.H.Freeman and Company,New York(1984))；Introduction to Protein Structure(Branden & Tooze,eds.,Garland Publishing,New York,N.Y.(1991))；以及Thornton等著的Nature 354：105(1991)。
通常情況下，生物學性質改善的抗體突變體具有與母 體抗人CXCR5抗體的重鏈或輕鏈可變域的胺基酸序列至少75%的胺基酸序列相同度或相似性的胺基酸序列，和至少80%、至少85%、至少90%以及通常為至少95%的相同度。就親代抗體序列而言，相同度或相似性在本文中定義為經比對序列和引入間隔(若有必要)以實現最大程度的序列相同度後，候選序列的胺基酸殘基與親代抗體殘基相同(即相同殘基)或類似(即基於相同側鏈性質而來自同一組的胺基酸殘基，參見上文)的百分比。
或者，藉由重鏈和輕鏈的FR或CDR區域或抗CXCR5抗體的Fc區域的系統突變，可生成抗體突變體。生成抗體突變體的另一種方法包括使用噬菌體展示進行親和力成熟(Hawkins等著的J Mol Biol 254：889-896(1992)和Lowman等著的Biochemistry 30(45)：10832-10838(1991))。已知噬菌體外殼蛋白融合(Smith,Science 228：1315(1985)；Scott & Smith,Science 249：386(1990)；Cwirla等著的Proc Natl Acad Sci USA 8：309(1990)；Devlin等著的Science 249：404(1990)；Wells & Lowman,Curr Opin Struct Biol 2：597(1992)和美國專利5,223,409)可用於將所展示的蛋白或胜肽的表現型與編碼它們的噬菌體顆粒的基因型聯繫在一起。抗體的Fab區域也已被展示在噬菌體上(McCafferty等著的Nature 348：552(1990)；Barbas等著的Proc Natl Acad Sci USA 88：7978(1991)；和Garrard等著的Biotechnol 9：1373(1991))。
單價噬菌體展示由一組作為噬菌體外殼蛋白融合體而 被展示於噬菌體顆粒上的蛋白變異體組成(Bass等著的Proteins 8：309(1990)。以前業已藉由連續應用誘變、單價噬菌體展示和功能分析(Lowman & Wells,J Mol Biol 234：564 578(1993)；美國專利5,534,617)如藉由集中分析抗體的CDR區域(Barbas等著的Proc Natl Acad Sci USA 91：3809(1994)；and Yang等著的J Mol Biol 254：392(1995))實現了親和力成熟或各種蛋白平衡結合親和力的提高。
可在噬菌體顆粒上構建許多(例如106或更多)其序列特定位置上有差異的蛋白變異體的庫，其中每個噬菌體顆粒含有編碼特定蛋白變異體的DNA。經使用固定抗原進行多輪親和力純化後，分離單個噬菌體株，並從DNA推演出所展示蛋白的胺基酸序列。
生成抗體變異體後，可依據本文教示測定該分子相對於親代抗體的生物活性。正如上文指出，該過程涉及測定抗體的結合親和力和/或其他生物活性或物理性質。在本發明的一個較佳實施例中，製備一組抗體突變體，篩選其對抗原的結合親和力。視需要可對選自篩選的一個或多個抗體突變體另外進行一次或多次生物活性測定，以確定抗體突變體具有新的或改進的性質。在一個較佳實施例中，所述抗體突變體保留了與親代抗體類似或更好/更高的結合CXCR5的能力。
通常根據抗體的用途，可對依此選擇的抗體突變體進行進一步修飾。這類修飾可包括進一步改變胺基酸序列， 與異質多肽的融合和/或共價修飾。例如，一般可使用絲胺酸取代未參與維持抗體突變體適宜構形的半胱胺酸殘基，以改善該分子的氧化穩定性和防止異常交聯。相反，可向抗體加入半胱胺酸以提高穩定性(尤其當抗體是抗體片段例如Fv片段時)。
另一類型的抗體突變體具有改變的糖化類型。可藉由刪除抗體上的一個或多個碳水化合物部分和/或加入一個或多個抗體上沒有的糖化位點實現這一點。抗體的糖化一般為N連接到Asn或O連接到Ser或Thr。三肽序列天冬醯胺-X-絲胺酸和天冬醯胺-X-蘇胺酸是碳水化合物部分經酵素催化連接到天冬醯胺側鏈的常見辨識序列，其中X是除脯胺酸以外的任何胺基酸。例如N-乙醯半乳糖胺、半乳糖、海藻糖或木糖連接到羥基胺基酸，大多數為絲胺酸或蘇胺酸，儘管也可使用5-羥脯胺酸或5-羥離胺酸。向原抗體的序列加入或取代一個或多個絲胺酸或蘇胺酸殘基可增加O-連接糖化的概率。
理想情況下可修飾本發明所述抗體的效應物功能，以增強抗體的效用。例如，可在Fc區引入半胱胺酸殘基，從而在該區域形成鏈間二硫鍵。依此生成的同型二聚抗體可具有改善的內化能力和/或增加的補體-介導的細胞殺傷以及抗體依賴的細胞毒性(ADCC)，參見Caron等著的J Exp Med 176：1191-1195(1992)和Shopes,Immunol 148：2918-2922(1993)。或者，可改造具有兩個Fc區的抗體，因而該抗體可具有增強的補體裂解和ADCC能力，參見 Stevenson等著的Anti-Cancer Drug Design 3：219 230(1989)。
抗體的共價修飾涵蓋在本發明的範圍內。可藉由化學合成或藉由抗體的酵素切割或化學切割(若可行)實現這一點。藉由抗體的靶向胺基酸與有機衍生劑發生反應可向抗體分子引入抗體的其他類型共價修飾，其中有機衍生劑可與所選側鏈或與N端或C端殘基反應。
半胱胺醯殘基可與α-鹵代乙酸酯(以及相應的胺)例如氯乙酸或氯乙醯胺發生反應，生成羧甲基或羧醯胺甲基衍生物。還可藉由例如與溴三氟丙酮、α-溴-β-(5-咪唑基)丙酸、氯乙醯磷酸鹽、N-烷基馬來醯亞胺、3-硝基-2-吡啶二硫化物、甲基-2-吡啶二硫化物、對氯汞苯甲酸、2-氯汞-4-硝基苯酚或氯-7-硝基苯並-2-氧雜-1,3-二唑發生反應，衍化得到半胱胺醯殘基。
可藉由與焦碳酸二乙酯在pH 5.5-7.0下反應衍化得到組胺醯殘基。還可使用對溴苯醯基溴，該反應優選在pH 6.0的0.1M二甲胂酸鈉中進行。
離胺醯和α末端殘基可與琥珀酸或其他羧酸酐發生反應，以逆轉殘基的電荷。用於衍化得到含有α-胺基殘基的其他適宜試劑包括亞胺酸酯例如吡啶亞醯胺甲酯、吡哆醛磷酸、吡哆醛、氯硼氫化物、三硝基苯磺酸、O-甲基異脲和2,4-戊二酮，胺基酸可被轉胺酵素以乙醛酸催化。
可藉由與一種或多種常規試劑例如苯乙二醛、2,3-丁二酮、1,2-環己二酮和茚三酮修飾精胺醯殘基。精胺酸殘 基的衍化通常需要鹼性反應條件。而且，這些試劑可與離胺酸以及精胺酸的ε-胺基發生反應。
可使用芳香族重氮化合物或四硝基甲烷進行酪胺醯殘基的特異修飾。例如，使用N-乙醯基咪唑和四硝基甲烷分別形成O-乙醯酪胺醯種類和3-硝基衍生物。使用125I或131I可碘化酪胺醯殘基以製備用於放射免疫分析的標記蛋白。
藉由與碳二亞胺(R-N=C=C-R')反應，羧基側鏈基團(天冬胺醯基或穀胺醯基)可被修飾，其中R和R'可為不同的烷基，例如1-環己基-3-(2-嗎啉-4-乙基)碳二亞胺或1-乙基-3-(4-氮鎓-4,4-二甲戊基)碳二亞胺。而且，天冬胺醯和穀胺醯殘基經與銨離子反應可被轉化為天冬醯胺醯基和穀胺醯胺醯基殘基。
穀胺醯胺和天冬醯胺殘基常在中性或鹼性條件下被脫去醯胺基，分別生成相應的穀胺醯和天冬胺醯殘基。這些殘基脫去醯胺的形式落在本發明的範圍以內。
其他修飾包括脯胺酸和離胺酸的羥化、絲胺醯或蘇胺醯殘基的羥基磷酸化、離胺酸、精胺酸和組胺酸側鏈α-胺基的甲基化(Creighton,Proteins：Structure and Molecular Properties,W.H.Freeman & Co.,San Francisco,pp.79-86(1983))、N端胺基的乙醯化和任意C端羧基的醯胺化。
另一類型的共價修飾涉及藉由化學方式或酵素催化方式將配糖體偶聯到抗體上。這些方法不需要在具有N-連接或O-連接的糖化能力的宿主細胞內產生抗體。根據所 使用的偶聯方法，糖可被連接到：(a)精胺酸和組胺酸；(b)遊離羧基；(c)遊離硫氫基，例如半胱胺酸的硫氫基；(d)遊離羥基，例如絲胺酸、蘇胺酸或羥脯胺酸的羥基；(e)芳香殘基例如苯丙胺酸或色胺酸的芳香殘基；或(f)穀胺醯胺的醯胺基。WO 87/05330和Aplin & Wriston,CRC Crit Rev Biochem,pp.259-306(1981)敘述了這類方法。
可藉由化學或酵素催化方式除去位元於抗體上的任何碳水化合物部分。例如化學去糖化需要抗體與化合物三氟甲磺酸或相當的化合物接觸，從而導致除連接糖基以外的多數或全部糖基的切割，並保持抗體的完整性。例如Hakimuddin等著的Arch Biochem Biophys 259：52(1987)和Edge等著的Anal Biochem 118：131(1981)敘述了化學去糖化。可藉由例如Thotakura等著的Meth Enzymol 138：350(1987)所述的許多內切苷酶和外切苷酶中的任一種實現抗體上碳水化合物部分的酵素催化切割。
另一類型的抗體共價修飾包括依據美國專利4,640,835、4,496,689、4,301,144、4,670,417、4,791,192或4,179,337所述相同的方式將該抗體連接到許多非蛋白質聚合物例如聚乙二醇、聚丙二醇或聚氧化烯類的一種。
獲得突變體或突變蛋白質的另一種較佳技術是藉噬菌體展示進行親和力成熟(Hawkins等著的J Mol Biol 254：889-896(1992)和Lowman等著的Biochemistry 30(45)：10832-10838(1991))。簡而言之，突變幾個高變區位 點(例如6-7個位點)，得到每個位點所有可能的胺基酸取代。依此得到的抗體突變體作為噬菌體顆粒上的融合蛋白以單價被展示於噬菌體顆粒上。表現各種突變體的噬菌體可經歷多輪結合選擇以及隨後對展示出高親和力的突變體而進行的分離和測序。
選擇新結合多肽的方法可使用結構相關多肽的庫。藉由誘變產生與例如噬菌體外殼蛋白融合的結構相關多肽的庫，並將其展示在顆粒表面。隨後這些顆粒與靶分子接觸。將對靶分子具有最高親和力的顆粒從具有低親和力的顆粒分離出來。隨後藉由感染適宜的細菌宿主擴增高親和力的結合顆粒，並重複競爭性結合步驟。重複該過程，直至得到所需親和力的多肽。
或者，還可使用多價噬菌體(McCafferty等著的(1990)Nature 348：552-554和Clackson等著的(1991)Nature 352：624-628)來表現隨機點突變(例如藉使用易錯DNA聚合酶生成)，以生成噬菌體抗體片段的庫，並隨後篩選該庫對CXCR5的親和力(Hawkins等著的(1992)J Mol Biol 254：889-896)。
優選情況下，在親和力成熟過程中，可複製的表現載體處於轉錄調節元件的嚴密調控下，調節培養條件使得展示一個以上融合蛋白拷貝的顆粒的量或數目小於約1%。同樣在優選情況下，展示一個以上融合蛋白拷貝的顆粒的量小於展示單個融合蛋白拷貝的顆粒量的10%。優選情況下該量小於20%。
藉由互換不同抗體鏈框架區內或源自多個抗體的複合FR的不同CDR，可產生功能等效物。因此對於一組特定的CDR而言，藉由取代不同的重鏈例如IgG1-4,、IgM、IgA1-2或IgD，不同種類的抗體有可能生成不同的CXCR5抗體類型和同型。與之類似，藉由將一組特定CDR植入整個合成的框架區內，可產生位於本發明範圍內的人工抗體。
例如，從效應物功能下降的IgG4分子可得到攜帶可變區或一個或多個目的CDR的適宜框架區和Fc部分。
在其他實施例中，為了增強結合CXCR5的目的分子的性質，可對攜帶目的分子抗原結合部分的分子框架部分和/或Fc部分進行某些修飾。例如，可進行胺基酸取代以增強或降低目的性質。因此，IgG4分子中已知可影響功能的位點例如鉸鏈區以及影響效應物功能或影響Fc結合的區域的取代適合進行修飾。使用Kabat編號在胺基酸225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252、253、254、255等處或它們的組合可對IgG4分子進行取代，以獲得所需性質。例如，使用脯胺酸取代絲胺酸241可穩定分子的三級和四級結構(Mol Imm 30(1)105-108,1993)，使用穀胺酸取代白胺酸248可削弱效應物功能(J Imm 164(4)1925-1033,2000；以及Clin Imm 98(2)164-174,2001)。
另一有利性質是獲得結合CXCR5但卻不耗乏B細胞 的抗體衍生物。這在患者的抗體生成沒有受損時是有利的。使用該試劑處理還便於使用聯合療法，其中針對某一特定適應癥的第二藥物作用於B細胞以外的量。例如可以是在T細胞量。
因此，例如處理16D7-HC1-LC3以包含兩個取代S241P和L248E。脯胺酸和穀胺酸殘基賦予結合CXCR5且攜帶IgG4框架區的目的分子的所需性質，例如穩定性和降低的效應物功能。
本發明的抗體片段和功能等效物包括其特異結合CXCR5的程度可被檢測的分子。可檢測程度的結合包括目的抗體結合能力的至少10-100%範圍內的所有值，優選為至少50、60%或70，更優選為至少75%、80%、85%、90%、95%或99%。具有大於目的抗體100%親和力的等效物也包括在內。一般CDR對於表位識別和抗體結合是重要的。
但是，可對組成CDR的殘基進行變動，而不幹擾抗體識別和結合同源表位的能力。例如，可進行不影響表位識別但卻增加抗體對表位的結合親和力的變動。例如，可進行不影響表位識別但卻增加抗體對表位的結合親和力的變動。基於對主要抗體序列的瞭解，幾項研究調查了向抗體序列多個位點引入一個或多個胺基酸變動後對抗體性質的效應，例如結合和表現量(Yang等著的1995,J Mol Biol 254：392-403；Rader等著的1998,Proc Natl Acad Sci USA 95：8910-8915；和Vaughan等著的1998,Nature Biotechnology 16,535-539)。
因此，使用方法例如寡核苷酸介導的定點誘變、盒式誘變、錯配PCR、DNA重排或大腸桿菌的突變株改變重鏈和輕鏈基因的CDR1、CDR2或CDR3或框架區序列，可生成目的抗體的等效物(Vaughan等著的1998,Nat Biotech 16：535-539；和Adey等著的1996,Chap.16,pp.277-291,in Phage Display of Peptides and Proteins,eds.Kay等著的Academic Press)。改變主要抗體核酸序列的方法可導致抗體的親和力提高(Gram等著的1992,Proc Natl Acad Sci USA 89：3576-3580；Boder等著的2000,Proc Natl Acad Sci USA 97：10701-10705；Davies & Riechmann,1996,Immunotech 2：169-179；Thompson等著的1996,J Mol Biol 256：77-88；Short等著的2002,J Biol Chem 277：16365-16370；和Furukawa等著的2001,J Biol Chem 276：27622-27628)。
藉由例如選擇歷經多輪選擇的多個胺基酸變化，可使用重複數輪的「多肽選擇」以選擇越來越高的親和力結合。第一輪選擇後可對配體的其他區域或胺基酸進行其他輪的選擇，其中第一輪選擇涉及對配體或抗體多肽的首個區域的胺基酸進行選擇。重複多輪選擇，直到實現所需的親和力性質。
改良抗體還包括具有改良特徵的抗體，它們藉動物免疫、雜交瘤形成和選擇具有特異特徵的抗體等標準技術而製備。
「拮抗劑」係指可抑制靶分子一種或多種生物活性(例如藉CXCR5的信號轉導)的分子。拮抗劑藉由滅活或殺滅被配體活化的細胞和/或幹擾受體或配體活化(例如酪胺酸激酶活化)或配體結合到受體後的信號轉導，可幹擾受體結合到配體或反之亦然。所述拮抗劑可完全阻斷受體-配體的交互作用，或實質降低這種交互作用。出於本發明的目的，拮抗劑的所有幹擾位點均被視為相當的。因此，包括在本發明範圍內的拮抗劑是結合CXCR5、CXCL13或CXCR5其他配體或CXCR5與其配體例如CXCL13的複合物的拮抗劑(例如中和抗體)；拮抗CXCR5和配體例如CXCL13的交互作用的CXCR5或CXCL13的胺基酸序列的變異體或衍生物；任選融合到異質分子例如免疫球蛋白區域(例如免疫黏合素)的可溶CXCR5；包括CXCR5與另一受體或生物分子的複合物；結合CXCR5的合成或天然序列胜肽等。
「激動劑」係指包括活化CXCR5一種或多種生物活性的蛋白質、多肽、胜肽、抗體、抗體片段、綴合物、大分子、小分子等化合物。激動劑可作為被配體活化的細胞的分裂原或在配體結合到受體後幹擾細胞失活或信號轉導抑制，從而與受體對配體的結合交互作用，反之亦然。出於本發明的目的，激動劑的所有幹擾位點均被視為相當的。因此，包括在本發明範圍內的激動劑是結合CXCR5、CXCL13或CXCR5其他配體或CXCR5與其配體例如CXCL13的複合物的激動劑；促進CXCR5和配體例 如CXCL13交互作用的CXCR5或CXCL13胺基酸序列的變異體或衍生物；任選融合到異質分子例如免疫球蛋白區域(例如免疫黏合素)的可溶CXCR5；包括CXCR5與另一受體或生物分子的複合物；結合CXCR5的合成或天然序列胜肽等。激動劑一般是直接活化CXCR5進行例如信號轉導的實體。
術語「細胞」、「細胞系」和「細胞培養」包括它們的後代。還應理解，由於有意或無意的突變，所有的後代不一定需精確相同，例如DNA含量。包括具有相同目的功能或生物性質的各種後代，其中目的功能或生物性質用於篩選原始細胞。本發明所使用的「宿主細胞」一般是選擇用於設計的原核或真核宿主。
使用核酸「轉化」細胞生物體、細胞或細胞系意為向靶細胞引入一段核酸，使得該核酸作為染色體外元件或經染色體整合可進行複製，以及視情況可進行表現。使用核酸「轉染」細胞或生物體係指細胞或生物體吸收該核酸，例如表現載體，而不論是否有任何編碼序列實際被表現。術語「轉染的宿主細胞」和「轉化的」係指引入一段核酸的細胞。典型的原核宿主細胞包括大腸杆菌各種菌株。典型的真核宿主細胞是哺乳動物細胞，例如中國倉鼠卵巢細胞或來源於人的細胞。被引入的核酸序列可來自與宿主細胞相同或不同的物種，或可為雜交核酸序列，其含有一些外源核酸和一些同源核酸。還可藉轉導或源自病毒的元件感染進行轉化。
術語「載體」意為核酸建構物、載體，其含有核酸、轉殖基因、外源基因或目的基因，它們被可操作地連接到適宜的調控序列以便在適宜的宿主內進行轉殖基因的表現。這類調控序列包括例如影響轉錄的啟動子、控制轉錄的任選操縱子序列、編碼適宜mRNA核糖體結合位點的序列以及調控轉錄和轉譯終止的序列。載體可為質體、噬菌體顆粒或僅僅是潛在的基因組插入物。一旦被轉化到適宜的宿主體內，載體可獨立於宿主的基因組進行複製和發揮功能，或在某些場合下可整合到宿主細胞的基因組上。在本說明書中，「質體」和「載體」可互換使用，因為質體是載體常見的使用形式。但是，本發明旨在包括發揮等效載體功能的其他形式的載體，它們為或正為本領域所知曉，例如病毒、攜帶核酸的合成分子、脂質體等。
就治療而言「哺乳動物」係指可被歸類為哺乳動物的任何動物，其包括人類、家畜和農場動物、人類以外的靈長類和動物園動物、競技動物或玩賞動物，例如狗、馬、貓、牛等。
可在本文所述或本領域知曉的分析中篩選或使用目的抗體。這類分析通常需要可檢測如被標記的試劑。本文所使用的詞語「標記」係指可直接或間接結合到分子或蛋白例如抗體上的可檢測化合物或組合物。標記可本身為可檢測的(例如放射性同位素標記、顆粒或熒光標記)，或就酵素標記而言可催化能被檢測的受質化合物或組合物的化學變化。
正如本文所使用，「固相」意為實體或分子例如本發明所述抗體可黏附其上的非水基質。本文所包括的固相實施例包括部分或全部由玻璃(例如可控孔徑玻璃)、多糖(例如瓊脂糖)、聚丙烯醯胺、聚苯乙烯、聚乙烯醇和矽酮形成的固相。在一些實施例中，根據語境，所述固相可包括分析板的孔；在其他情況下可用於純化柱(例如親和力層析柱)。因此，所述固相可以是紙、珠、塑膠、晶片等，可從許多材料例如硝化纖維素、瓊脂糖、聚苯乙烯、聚丙烯、矽等製備，還可採取許多構型。
可溶CXCR5或其片段例如胞外區域(EC)可用作免疫原產生目的抗體。可從天然來源獲得或分離免疫原，或可藉重組方式製備免疫原。全細胞例如CXCR5+細胞，天然來源的細胞(例如B細胞、B細胞系或癌細胞系)或經重組技術轉化(或轉染)以表現以及可能過表現CXCR5的細胞可用作生產目的抗體的免疫原。同樣，可使用技術領域已知曉的攜帶CXCR5或對應於CXCR5 EC區域的合成胜肽或截短多肽的膜製劑。
CXCR5長約60個胺基酸的EC或EC的部分可用作免疫原。可用於製備抗體的其他形式免疫原例如綴合物，是本領域專業人員顯而易見的。因此，CXCR5或其部分可被連接到載體分子例如白蛋白或KLH上以用作免疫原。毋庸置疑，對於表現CXCR5的細胞，正是EC區域是優選免疫原或該免疫原的部分。
依據為本領域技術人員熟知的方法或例如參見下文， 本領域業已知曉的編碼CXCR5的基因或cDNA可被選殖到質體或其他表現載體，並在眾多表現體系的任意一種中進行表現。由於遺傳密碼的簡並性，進行重組CXCR5或其功能產物的表現時，可使用多個編碼CXCR5蛋白或多肽的核苷酸序列。基於可能的密碼子選擇例如宿主細胞所優選的密碼子，藉選擇組合所述核苷酸序列可發生變動。依據適用於編碼天然CXCR5的核苷酸序列的標準三聯體遺傳密碼，可進行這些組合，而且可考慮所有這些變動。因此，編碼CXCR5的序列可被重新編碼，以含有表現目的胺基酸的密碼子，但三聯體密碼子是宿主細胞例如人細胞的基因表現裝置所偏愛的密碼子。這些多肽中的任意一條可用於動物例如駱駝或其他體系的免疫，以生成結合CXCR5的抗體。
正如上文所提及，若有需要，CXCR5免疫原可表現為融合蛋白，其中CXCR5被連接到融合片段，該融合片段一般是具有一個或多個有利功能的多肽。融合片段通常有助蛋白純化，例如藉由親和層析分離和純化融合蛋白，但也可用於增加免疫原性。使用編碼連接到CXCR5多肽的羧基端和/或胺基端的蛋白質的融合核苷酸序列轉化重組細胞，經培養該重組細胞可產生融合蛋白。融合片段可包括但不限於免疫球蛋白Fc區域、谷胱甘肽-S-轉移酶、β-半乳糖苷酶、可結合到雙價金屬離子的多聚組胺酸片段和麥芽糖結合蛋白。
編碼胺基酸序列突變體的核酸序列可藉由許多本領域 知曉的方法進行製備。這些方法包括但不限於先前製備的目的分子的突變體或非突變體的寡核苷酸-介導(或定點)誘變、PCR誘變和盒式誘變(參見例如Kunkel,Proc Natl Acad Sci USA 82：488(1985))。
本發明抗體或本發明抗體的片段、衍生物或類似物(例如本發明抗體的重鏈或輕鏈、本發明的單鏈抗體或本發明的抗體突變蛋白質)的重組表現包括建構含有編碼本文所述的抗體或抗體片段的多聚核苷酸的表現載體。一旦獲得編碼抗體分子的多聚核苷酸，可藉由本領域知曉的重組DNA技術產生用於生產所述抗體的載體。建構含有抗體編碼序列和適宜轉錄和轉譯調控信號的表現載體。這些方法包括例如體外重組DNA技術、合成技術和體內基因重組。
藉由常規技術將表現載體轉移到宿主細胞體內，隨後藉由常規技術培養被轉染的細胞，以產生本發明的抗體或片段。在本發明的一個方面，編碼重鏈和輕鏈的載體可在宿主細胞內共表現，以表現本文詳述的整個免疫球蛋白分子。
可使用許多宿主/表現載體體系來表現本發明的抗體分子。這些表現體系不僅代表可產生和隨後純化目的編碼序列的載體，還代表了以適宜核苷酸編碼序列轉化或轉染後可原位表現本發明抗體分子的細胞。細菌細胞例如大腸杆菌和真核細胞常用於重組抗體分子的表現，尤其是用於全長重組抗體分子的表現。例如，哺乳動物細胞例如 CHO細胞與例如攜帶來自人巨細胞病毒的主要中間體早期基因啟動子元件的載體是抗體的有效表現體系(Foecking等著的Gene 45：101(1986)；and Cockett等著的Bio/Technology 8：2(1990))。正如本領域所知曉，還可使用植物和植物細胞培養、昆蟲細胞等來生產目的蛋白。
此外，選擇可調節插入序列表現或以所需的特異方式修飾和加工基因產物的宿主細胞。蛋白產物的這些修飾(例如糖化)和加工(例如切割)對於蛋白功能可能是重要的。不同的宿主細胞具有蛋白質及基因產物轉譯後加工和修飾的特有和特異機制。可選擇適宜的細胞系或宿主體系，以確保所表現的目的抗體的正確修飾和加工。因此，可使用擁有用於主要轉錄物適宜加工、基因產物糖化和磷酸化的細胞裝置的真核宿主細胞。這些哺乳動物宿主細胞包括但不限於CHO、COS、293、3T3或骨髓瘤細胞。
穩定表現對於長期高產率生產重組蛋白而言是優選的。例如可改造穩定表現抗體分子的細胞系。與其使用含有病毒複製起點的表現載體，可使用受適宜表現調控元件(例如啟動子、增強子、序列、轉錄終止子、多聚腺苷酸位點等)調控的DNA轉化宿主細胞。引入外源DNA後，可讓改造細胞在富集培養基上生長1至2天，隨後將其轉移至選擇性培養基上。重組質體的選擇性標記賦予對選擇的抗性，使得細胞將質體穩定整合到其染色體上，並在細胞系中擴增質體。這些改造的細胞系不僅可用於抗體製 備，還可用於篩選和評估直接或簡介與抗體分子交互作用的化合物。
可使用許多選擇體系，其包括但不限於單純皰疹病毒胸腺嘧啶激酶(Wigler等著的Cell 11：223(1977))、次黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖轉移酶(Szybalska等著的Proc Natl Acad Sci USA 48：202(1992))、谷胺酸合成酶在蛋胺酸磺醯亞胺的存在下選擇(Adv Drug Del Rev 58,671,2006並參看Lonza Group Ltd.的網站或文獻)以及tk、hgprt或aprt細胞中的腺嘌呤磷酸核糖轉移酶基因(Lowy等著的Cell 22：817(1980))。同樣，可使用抗代謝的抗性作為選擇下列基因的基礎：dhfr，其賦予甲胺蝶呤抗性(Wigler等著的Proc Natl Acad Sci USA 77：357(1980)；O'Hare等著的Proc Natl Acad Sci USA 78：1527(1981))；gpt，其賦予黴酚酸抗性(Mulligan等著的Proc Natl Acad Sci USA 78：2072(1981))；neo，其賦予胺基糖苷G-418抗性(Wu等著的Biotherapy3：87(1991))；以及hygro，其賦予潮黴素抗性(Santerre等著的Gene 30：147(1984))。可常規應用重組DNA技術領域知曉的方法來選擇所需的重組株，這些方法的描述見於例如Ausubel等著的eds.,Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley & Sons(1993)；Kriegler,Gene Transfer and Expression,A Laboratory Manual,Stockton Press(1990)；Dracopoli等著的eds.,Current Protocols in Human Genetics,John Wiley & Sons(1994)；和Colberre- Garapin等著的J Mol Biol 150：1(1981)。
藉由載體擴增可增加抗體分子的表現量(例如參見Bebbington等著的DNA Cloning,Vol.3.Academic Press(1987))。當表現抗體的載體體系中的標記物可擴增時，培養物中抑製劑量的升高會增加標記物基因的拷貝數目。由於被擴增區域與抗體基因有關聯，抗體的產生也會上升(Crouse等人，Mol Cell Biol 3：257(1983))。
可使用本發明的兩種或更多表現載體對宿主細胞進行共轉染，例如第一載體編碼源自重鏈的多肽，而第二載體編碼源自輕鏈的多肽。這兩個載體可含有相同的選擇標記物，這些標記物可使重鏈和輕鏈多肽的表現相同。或者，可使用編碼並可同時表現重鏈和輕鏈多肽的單個載體。在這種情況下，輕鏈應置於重鏈之前，以避免產生過多不含毒性的重鏈(Proudfoot,Nature 322：52(1986)；and Kohler,Proc Natl Acad Sci USA 77：2197(1980))。重鏈和輕鏈的編碼序列可包括cDNA或基因組DNA。
一旦藉由動物、化學合成或重組表現產生本發明的抗體分子，可藉由本領域知曉的任何純化免疫球蛋白分子的方法例如層析(例如離子交換、親和力等，尤其是經蛋白質A和分子排阻層析後對CXCR5進行親和層析)、離心、溶解度差異或藉由蛋白純化的任何其他標準技術純化抗體分子。此外，本發明所述抗體或抗體片段可被融合到本文所述的異質多肽序列或本領域知曉的其他多肽序列，以便於純化。
使用下文實施例所例示的重組CXCR5蛋白免疫小鼠，生成可產生本發明單株抗體的雜交瘤。選擇具有良好治療前景的所得單株，例如防止CXCR5配體結合於CXCR5。隨後修飾所選擇抗體，以得到有利性質，例如具有增強的體內穩定性。
可藉由本領域知曉的任何適宜方法生成本發明所述抗體。本發明所述抗體可包括多株抗體，儘管由於抗體修飾以優化其在人體內的使用以及優化抗體本身的使用，但單株抗體仍是優選的，這是因其生產和操縱特定蛋白方便。製備多株抗體的方法為本領域技術人員所知曉(Harlow等著的Antibodies：a Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,2nd ed.(1988))。
例如，可將本文所例示的免疫原施用給各種宿主動物，其包括但不限於兔、小鼠、駱駝、大鼠等，以誘導產生含特異識別CXCR5的多株抗體的血清。施用免疫原需要一次或多次注射免疫劑和佐劑(若需要)。根據宿主物種，可使用各種佐劑來增加免疫反應，其包括但不限於弗氏佐劑(完全和不完全)、礦物油、凝膠、明礬(氫氧化鋁)、表面活性物質例如溶血卵磷脂、泊洛沙姆多元醇類(pluronic polyols)、聚陰離子、胜肽、油乳狀液、鑰孔帽貝血藍蛋白(KLH)、二硝基苯酚和可潛在使用的人佐劑，例如BCG(卡介苗)和短小棒狀桿菌(Corynebacterium parvum)。可使用佐劑的其他實施例包括MPL-TDM佐劑(單磷醯脂A、合成trehalose dicorynomycolate)。免疫實驗方案為本領域所熟知，它們可藉在所選擇動物體內引發免疫反應的任何方法進行。因此，在不同的時間段內可使用不同的給藥途徑。
一般情況下，藉由多次皮下或腹腔注射或肌肉注射或靜脈注射將免疫原(帶或不帶佐劑)注射到哺乳動物體內。免疫原可包括CXCR5多肽、融合蛋白或它們的變異體，它們可由產生或過產生CXCR5的細胞產生。這些細胞可為天然存在的細胞、天然存在的突變體細胞或遺傳改造細胞。在某些情況下，可使用表現CXCR5的全細胞。根據多肽的性質(即疏水比例、親水比例、穩定性、凈電荷、等電點等)，CXCR5或其部分可被修飾或結合，以在被免疫動物例如哺乳動物體內產生免疫原性或更強的免疫原性。例如，CXCR5或其部分可與載體結合。所述結合包括將活性化學官能團連接到免疫原和待結合的免疫原性蛋白從而形成共價鍵的化學綴合，或包括基於融合蛋白的方法學或本領域技術人員知曉的其他方法。這類載體或免疫原蛋白的實施例包括但不限於KLH、卵白蛋白、血清白蛋白、牛甲狀腺球蛋白、大豆胰蛋白酶抑製劑和混雜的T輔助細胞胜肽。可使用各種佐劑增加上文所述的免疫反應。
一旦得到適宜的製劑，有可能藉已知分離技術例如親和層析、淘選、吸附等從多個抗體中分離出特定的抗體。以這種方式，可獲得用於進一步研究(例如分析序列以獲得一個或多個CDR的胺基酸序列)的單個抗體種類。
本發明所述抗體優選包括單株抗體。可使用例如由Kohler等著的Nature 256：495(1975)；美國專利4,376,110；Harlow等著的Antibodies：A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,2nd ed.(1988)和Hammerling等著的Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas,Elsevier(1981)描述的雜交瘤技術、重組DNA方法例如製備和使用轉染瘤或為技術人員知曉的其他方法製備單株抗體。可用於產生單株抗體的方法的其他實施例包括但不限於人B細胞雜交瘤技術(Kosbor等著的Immunology Today 4：72(1983)；和Cole等著的Proc Natl Acad Sci USA 80：2026(1983))和EBV-雜交瘤技術(Cole等人，Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy,pp.77-96,Alan R.Liss(1985))。這些抗體可為包括IgG、IgM、IgE、IgA和IgD的任何免疫球蛋白類別和其任何亞類的抗體。可在體外或體內培養產生本發明mAb的雜交瘤。
在雜交瘤模型中，對宿主例如小鼠、人類化小鼠、攜帶人免疫系統基因的基因轉殖小鼠、倉鼠、兔、大鼠、駱駝或其他任何適宜的宿主動物進行免疫，以引發產生或可產生特異結合CXCR5的抗體的淋巴細胞。或者，可體外免疫淋巴細胞。使用適宜的融合劑例如聚乙二醇使淋巴細胞隨後與骨髓瘤細胞融合，形成雜交瘤細胞(Goding,Monoclonal Antibodies：Principles and Practice,Academic Press,pp.59-103(1986))。
一般而言，製備產生抗體的雜交瘤時，如欲細胞為人來源的可使用外周血淋巴細胞(「PBL」)，或如欲細胞為非人類來源的則可使用脾臟細胞或淋巴結細胞。永生細胞系通常是轉化的哺乳動物細胞，尤其是嚙齒類、牛或人來源的骨髓瘤細胞。一般使用大鼠或小鼠的骨髓瘤細胞系。可在適宜的培養基上培養雜交瘤細胞，該培養基優選含有可抑制未融合的永生細胞的生長或生存的一種或多種物質。例如，如果母體細胞缺乏次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖基轉移酶(HGPRT或HPRT)，用於雜交瘤的培養基一般會含有次黃嘌呤、胺蝶呤和胸腺嘧啶(「HAT培養基」)和防止缺乏HGPRT的細胞生長的物質。
優選的永生細胞系是有效融合並支持所選擇的產生抗體的細胞穩定高量表現抗體的細胞系，它們對培養基例如HAT培養基敏感。這些骨髓瘤細胞系中有鼠骨髓瘤系，例如源自可從Salk Institute Cell Distribution Center,San Diego,Calif獲得的MOPC-21和MPC-11小鼠腫瘤和可從American Type Culture Collection,Manassas,VA獲得的SP2/0、FO或X63-Ag8-653細胞。
還描述了人骨髓瘤和小鼠-人種間骨髓瘤細胞系用於產生人單株抗體(Kozbor,J Immunol 133：3001(1984)；和Brodeur等著的Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications,Marcel Dekker,Inc,pp.51-63(1987))。還可使用小鼠骨髓瘤細胞系NSO(European Collection of Cell Cultures,Salisbury,Wilshire,UK)。
另外一種選擇是使用電融合而非化學融合來形成雜交瘤。可使用例如Epstein Barr病毒或其他轉化基因而不使用融合，例如參見Zurawaki等著的Monoclonal Antibodies,ed.,Kennett等人，Plenum Press,pp.19-33.(1980)使B細胞無限增殖。還可使用表現免疫球蛋白的基因轉殖小鼠和移植有人B淋巴細胞的重症聯合免疫缺陷(SCID)小鼠。
分析生長有雜交瘤細胞的培養基是否產生識別CXCR5的單株抗體。可藉由免疫沉澱或藉由體外結合測定例如放射免疫分析(RIA)、熒光細胞測量分析(FACS)或酵素連接免疫吸附分析(ELISA)測定雜交瘤細胞所產生的單株抗體的結合特異性。這些技術為本領域知曉，並在技術人員的技藝範圍之內。可藉由例如Scatchard分析(Munson等著的Anal Biochem 107：220(1980))測定單株抗體對CXCR5的結合親和力。
鑒定雜交瘤細胞所產生抗體的所需特異性、親和力和/或活性後，這些株可藉由有限稀釋方法進行次選殖，並按標準方法(Goding,Monoclonal Antibodies：Principles and Practice,Academic Press,pp.59-103(1986)進行培養。適宜的培養基包括例如Dulbecco改良的Eagle培養基(D-MEM)或RPMI-1640培養基。此外，雜交瘤細胞可作為腹水癌在動物體內生長。
藉由常規免疫球蛋白純化方法例如蛋白質A-Sepharose、蛋白質G-Sepharose、羥磷灰石層析、凝膠排 阻層析、凝膠電泳、透析或親和層析從培養基中被適宜分離出經次選殖而分泌的單株抗體。
本領域存在許多用於產生單株抗體的方法，因此本發明不局限於它們僅在雜交瘤中的製備。例如，可藉由重組DNA方法例如美國專利4,816,567所述方法製備單株抗體。在這種情況下，術語「單株抗體」係指源自單個真核生物、噬菌體或原核生物選殖株的抗體。
使用常規方法(例如使用可特異結合編碼鼠抗體重鏈和輕鏈基因的寡核苷酸探針或使用可特異結合編碼來自人、人類化或其他來源抗體的重鏈和輕鏈基因的寡核苷酸探針)可輕易分離和測序編碼本發明所述單株抗體的DNA(Innis等著的PCR Protocols.A Guide to Methods and Applications,Academic(1990)和Sanger等著的Proc Natl Acad Sci 74：5463(1977))。雜交瘤細胞作為這類DNA的來源。分離後，所述DNA可被置於表現載體中，隨後表現載體被轉染到本身不產生免疫球蛋白的宿主細胞例如大腸杆菌細胞、NSO細胞、COS細胞、中國倉鼠卵巢(CHO)細胞或骨髓瘤細胞中，以在重組的宿主細胞體內獲得單株抗體的合成。還可藉由例如用人重鏈和輕鏈恆定區的編碼序列取代同源鼠序列(美國專利4,816,567；和Morrison等著的Proc Natl Acad Sci USA 81：6851(1984))或藉由將非免疫球蛋白多肽的全部或部分編碼序列共價結合到免疫球蛋白編碼序列，從而對所述DNA進行修飾。這些非免疫球蛋白多肽可被替換為本發明抗體的恆定區， 或可被替換為本發明抗體的CXCR5結合位點的可變域，以形成嵌合的二價抗體。
這些抗體可為單價抗體。用於製備單價抗體的方法為本領域所熟知。例如，一種方法涉及免疫球蛋白輕鏈和修飾重鏈的重組表現。重鏈一般在Fc區的任意位點被截短，以防止重鏈交聯。或者，相關半胱胺酸殘基可被另一胺基酸殘基取代或被刪除，以防止交聯。
可藉由已知技術生成識別特異表位的抗體片段。傳統上藉由完整抗體的蛋白裂解消化得到這些片段(例如參見Morimoto等著的J Biochem Biophys Methods 24：107(1992)；and Brennan et al.,Science 229：81(1985))。例如使用酵素如木瓜酵素(產生Fab片段)或胃蛋白酶(產生F(ab')2片段)對免疫球蛋白分子進行蛋白切割，可產生本發明的Fab和F(ab')2片段。F(ab')2片段含有可變區、輕鏈恆定區和重鏈的恆定區CH1域。但是可直接藉由重組的宿主細胞產生這些片段。例如，這些抗體片段可從抗體噬菌體庫分離得到。或者，F(ab’)2-SH片段可直接從大腸杆菌中回收並藉化學方式偶聯形成F(ab’)2片段(Carter等著的Bio/Technology 10：163(1992)。或者，F(ab’)2-SH片段可直接從大腸杆菌中回收並藉化學方式偶聯形成F(ab’)2片段(Carter等著的Bio/Technology 10：163(1992)。根據另一方法，F(ab’)2片段可直接從重組的宿主細胞培養物中分離得到。產生抗體片段的其他技術對於本領域技術人員是顯而易見的。在其他實施例中，最佳抗體是單鏈Fv片段(Fv) (WO 93/16185)。
對於某些用途包括人體內使用抗體和體外檢測而言，可優選使用嵌合的人類化或人抗體。產生嵌合抗體的方法為本領域所知曉，例如參見Morrison,Science 229：1202(1985)；Oi等著的BioTechniques 4：214(1986)；Gillies等著的J Immunol Methods 125：191(1989)；和美國專利5,807,715；4,816,567以及4,816397。
人類化抗體源自在非人類物種體內生成的可結合CXCR5的抗體分子，其中來自結合CXCR5的抗體的一個或多個CDR被插入到來自人免疫球蛋白分子的FR區。使用許多本領域知曉的技術例如CDR移植(EPO 239,400；WO 91/09967；和美國專利5,225,539；5,530,101；以及5,585,089)，鑲飾或表面重塑(EPO 592,106；EPO 519,596；Padlan,Molecular Immunology 28：489(1991)；Studnicka等著的Protein Engineering 7：805(1994)；和Roguska等著的Proc Natl Acad Sci USA 91：969(1994))，以及鏈交換(美國專利5,565,332)可人類化抗體。
人類化抗體具有一個或多個來自非人類來源的胺基酸殘基。這些非人類的胺基酸殘基通常被稱作「導入」殘基，它們一般取自「導入」的可變域。依據Winter及其同事等人的方法(Jones等著的Nature 321：522(1986)；Riechmann等著的Nature 332：323(1988)和Verhoeyen等著的Science 239：1534(1988))藉由以非人類的CDR或 CDR序列的部分替換人抗體的相應序列，可基本上進行人類化。因此，這些「人類化」抗體是嵌合抗體(美國專利4,816,567)，其中實質小於完整人可變域的序列已被來自非人類物種的相應序列所取代。實踐中，人類化抗體一般是人抗體，其中一些CDR殘基和可能部分FR殘基被嚙齒動物抗體的類似位點所取代。可包括一個或多個重鏈域的重鏈恆定區和鉸鏈區可來自任何種類或亞類，以獲得所需效應，例如特定的效應物功能。
通常，人框架區的框架殘基可被來自CDR供體抗體的相應殘基替換，從而改變並有可能提高抗原結合。框架取代可藉本領域知曉方法進行鑒定，例如經建立CDR與框架殘基交互作用的模型來鑒定參與抗原結合的重要框架殘基，以及經序列比較以鑒定特定位置處的異常框架殘基，例如參閱美國專利5,585,089和Riechmann等著的Nature 332：323(1988)。
更為可取的是，人類化抗體保留對CXCR5的高親和力，並且保留或獲得其他有利的生物性質。因此，利用母體序列和人類化序列的三維模型，藉由分析母體序列和各種概念性人類化產物，製備成人類化抗體。三維免疫球蛋白模型通常可為本領域技術人員利用和熟知。可利用圖示和展示所選擇候選免疫球蛋白序列的可能三維構形結構的電腦程式。考量此展示可分析某些殘基在候選免疫球蛋白序列發揮功能中的可能作用，即分析影響候選免疫球蛋白結合CXCR5能力的殘基。藉此種方式，可從接收和導入 序列選擇和合併FR殘基，使得所需抗體特性得到最大化，例如增加對靶抗原的親和力，儘管是CDR殘基直接並最實質性地影響CXCR5結合。還可修飾CDR區域，使其含有一個或多個與得自親代抗體(CDR得自親代抗體)胺基酸不同的胺基酸，以提供增強或不同的目的性質，例如更大的親和力或親抗原性。
可操縱和改變抗體恆定區的某些區域，以提供具有不同與或優於親代抗體性質的抗體同源物、衍生物、片段等。因此，例如許多IgG4抗體在鉸鏈區附近形成鏈內二硫鍵。鏈內二硫鍵可使母體雙價分子變得不穩定，形成含有一條重鏈及與之相連輕鏈的單價分子。這類分子可重新結合，但為隨機結合。
經觀察，修飾IgG4分子鉸鏈區的胺基酸可降低鏈內二硫鍵形成的幾率，從而穩定IgG4分子，這將最大程度降低雙特異性分子形成的幾率。若治療用抗體是IgG4分子，這種修飾則是有利的，這是因為穩定性增強可將最大程度降低分子在生產和製備過程中以及在體內的解離幾率。單價抗體可能沒有與雙價母體分子相同的有效性。例如，當將雙價IgG4輸給患者時，雙價IgG4的比例在兩周內衰變為約30%。位點228的胺基酸取代增強了IgG4穩定性。位於位點228的絲胺酸可為另一胺基酸替換，例如其餘19種胺基酸中的一種。尤其可對重組抗體作出這種變動，其中核酸編碼序列經突變可得到228位點處的胺基酸取代。例如S可被替換為脯胺酸。
另一組適合修飾的胺基酸包括鉸鏈區域的胺基酸，這些胺基酸影響含有重鏈的分子與Fc受體之間的結合和被結合抗體的內化。這類胺基酸包括IgG1分子中從約233至約237的殘基(Glu-Leu-Leu-Gly-Gly)；(SEQ ID NO：49)中從約252至約256的殘基(Met-Ile-Ser-Arg-Thr)和(SEQ ID NO：50)中從約318(Glu)至約331(Pro)的殘基，例如包括Lys320、Lys322和Pro329。
完全人抗體特別適合於人患者的治療性處置。可藉許多本領域知曉的方法製備人抗體，其中包括利用源自人免疫球蛋白序列的抗體文庫而進行的上述噬菌體展示方法，參閱美國專利4,444,887和4,716,111；WO 98/46645,WO 98/50433,WO 98/24893,WO 98/16654,WO 96/34096,WO 96/33735和WO 91/10741。還可利用Cole等人和Boerder等人的技術製備人單株抗體(Cole等著的Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy,Alan R.Liss(1985)；和Boerner等著的J Immunol 147：86(1991))。
還可使用基因轉殖小鼠生產人抗體，這些小鼠不能表現有功能的內源免疫球蛋白，但也表現某些人免疫球蛋白基因。例如，可藉隨機方式或同源重組將人重鏈和輕鏈免疫球蛋白基因複合物引入到小鼠的胚胎幹細胞。或者，除了人重鏈和輕鏈基因以外，可將人的可變區、恆定區和多變區引入到小鼠胚胎幹細胞中。藉由同源重組引入人免疫球蛋白位點，可使小鼠重鏈和輕鏈免疫球蛋白基因分別或同時失去功能。具體而言，JH區的純合缺失可防止內源 抗體生成。被修飾的胚胎幹細胞經擴增，被顯微注射到胚泡中，形成嵌合小鼠。隨後繁育嵌合小鼠，產生表現人抗體的純合後代，例如參閱Jakobovitis等著的Proc Natl Acad Sci USA 90：2551(1993)；Jakobovitis等著的Nature 362：255(1993)；Bruggermann等著的Year in Immunol 7：33(1993)；和Duchosal等著的Nature 355：258(1992))。
使用CXCR5(例如所有或部分CXCR5，如CXCR5的EC域)藉由正常方式免疫基因轉殖小鼠。利用常規雜交瘤技術可從免疫的基因轉殖小鼠得到抗CXCR5的單株抗體。基因轉殖小鼠所攜帶的人免疫球蛋白轉殖基因在B細胞分化過程中發生重排，隨後經歷類別轉換和體細胞突變。因此，利用這種技術有可能產生治療用的IgG、IgA、IgM和IgE抗體。若欲瞭解概況，可參閱Lonberg等著的Int Rev Immunol 13：65-93(1995)。若欲瞭解對生產人抗體和人單株抗體以及生產這類抗體的試驗方案的討論，可參閱例如WO 98/24893；WO 92/01047；WO 96/34096；WO 96/33735；EPO No.0 598 877；和美國專利5,413,923；5,625,126；5,633,425；5,569,825；5,661,016；5,545,806；5,814,318；5,885,793；5,916,771以及5,939,598。此外，例如Amgen(Fremont,CA)、Genpharm(San Jose,CA)和Medarex,Inc.(Princeton,NJ)等公司利用與上述類似的技術可從事抗CXCR5人抗體的生產。
同樣，可免疫移植有人外周血白血球、脾細胞或骨髓(以色列XTL Biopharmaceuticals公司的三體雜交瘤技 術)的小鼠，製備人mAb。可利用被稱為「導向選擇」的技術生成的識別所選擇表位的完全人抗體。在該方法中，使用經選擇的非人類單株抗體如小鼠抗體來引導識別相同表位的完全人抗體的選擇(Jespers等著的Bio/technology 12：899(1988))。
使用重組技術時，抗體變異體可在細胞內、細胞周質空間內產生，或直接被分泌到培養基中。如果抗體變異體是在細胞內產生的，則可首先藉由離心或超濾除去微小碎片，其或是宿主細胞或是被裂解的片段。Carter等著的Bio/Technology 10：163(1992)描述了一種分離被分泌到大腸桿菌周質空間的抗體的方法。簡而言之，細胞漿與乙酸鈉(pH 3.5)和EDTA接觸。可藉由離心除去細胞碎片。當抗體變異體被分泌到培養基中時，一般首先利用市售蛋白質濃縮過濾器如Amicon或Millipore Pellicon的超濾元件濃縮來自這些表現體系的上清液。可加入蛋白酶抑製劑例如PMSF以抑制蛋白酶解，還可加入抗生素以防止外來污染物的生長。
可使用例如羥磷灰石層析、凝膠電泳、透析和親和層析純化從細胞製備的抗體組合物。蛋白質A或蛋白質G是否適合作為親和配體取決於抗體變異體上任意免疫球蛋白Fc域的物種和同型。可使用蛋白質A純化基於人IgG1、IgG2或IgG4重鏈的抗體(Lindmark等著的J Immunol Meth 62：1(1983))。可使用蛋白質G用於小鼠同型和人IgG3(Guss等著的EMBO J 5：1567(1986))。 親和配體所結合的基質通常多數是瓊脂糖，但也可使用其他基質。機械穩定的基質例如可控孔徑玻璃或聚苯乙烯二乙烯苯可實現比瓊脂糖更快的流速和更短的處理時間。當抗體變異體包括CH3域時，可使用Bakerbond ABXTM樹脂(JT Baker；Phillipsburg,NJ)進行純化。還可利用其他蛋白質純化技術，例如離子交換柱分級、乙醇沉澱、反相HPLC、矽膠層析、肝素瓊脂糖層析、陰離子或陽離子交換樹脂層析(例如多聚天冬胺酸柱)、色譜聚焦、SDS-PAGE和硫酸銨沉澱，這取決於待回收的抗體或變異體。
進行任何初步純化步驟後，含有目的抗體或目的變異體和污染物的混合物可進行低pH疏水交互作用層析，其中使用pH約2.5-4.5的洗脫緩衝液，優選在低鹽濃度(例如約0-0.25M鹽)下進行。
而且，利用本領域技術人員所熟知技術，本發明抗體還可用於產生「模擬」CXCR5的抗獨特型抗體(例如參閱Greenspan等著的FASEB J 7：437(1989)和Nissinoff,J Immunol 147：2429(1991))。例如，可使用與配體結合並競爭性抑制其多聚化的抗體，和/或其與CXCR5結合的抗體來產生「模擬」CXCR5和結合域並從而結合和中和CXCR5和/或其配體的抗獨特型。這種中和性抗獨特型或這些抗獨特型的Fab片段可用於治療性療法以中和CXCL13。
本發明的抗體可為雙特異性抗體。雙特異性抗體可為單株抗體，優選為具有至少兩種不同抗原結合特異性的人 或人類化抗體。在本發明中，結合特異性之一針對CXCR5，另一種可針對任何其他抗原，例如細胞表面蛋白、受體、受體亞基、配體、組織特異性抗原、病毒來源的蛋白、病毒編碼的包膜蛋白、細菌來源的蛋白、細菌表面蛋白等。因此另一特異性可以是結合CXCL13。
生產雙特異性抗體的方法是眾所周知的。傳統上，雙特異性抗體的重組生產是基於兩個免疫球蛋白重鏈/輕鏈對的共表現，其中兩條重鏈具有不同的特異性(Milstein等著的Nature 305：537(1983))。由於免疫球蛋白重鏈和輕鏈的隨機分配，雜交瘤(四體雜交瘤)產生10種不同抗體分子的潛在混合物，其中僅有一種具有正確的雙特異性結構。通常藉由親和層析步驟進行正確分子的純化。類似方法披露於WO 93/08829和Traunecker等著的EMBO J 10：3655(1991)。例如Kufer等著的Trends Biotech 22：238-244,2004提供了生產雙特異性抗體的其他方法。
可將具有所需結合特異性的抗體可變域融合到免疫球蛋白的恆定域序列上。優選以包括至少部分鉸鏈區、CH2和CH3區的免疫球蛋白重鏈恆定域進行融合。它可具有首個重鏈恆定區(CH1)，其含有至少在一次融合中出現的輕鏈結合所需的位點。將編碼免疫球蛋白重鏈融合區和免疫球蛋白輕鏈(若需要)的DNA插入到不同的表現載體，並共轉化到適宜的宿主生物體內。若欲瞭解產生雙特異性抗體的更多細節，可參閱例如Suresh等著的Meth Enzym 121：210(1986)。
本發明也考慮了異源偶聯抗體。異源偶聯抗體由兩個共價鍵連接的抗體組成。有人建議用這類抗體對準免疫系統細胞至無用細胞(美國專利4,676,980)。並考慮，該抗體可用合成蛋白化學的已知方法在體外製備，包括涉及交聯劑的那些方法。例如，免疫毒素可用一種二硫化物交換反應或形成硫酯鍵的方式來構建。適合於該目的之試劑的例子包括硫雜環戊烷亞胺鹽(iminothiolate)和甲基-4-巰基丁醯亞胺鹽(methyl-4-mercaptobutyrimidate)，以及如美國專利4,676,980中所披露的那些。
此外，還可產生單域抗體CXCR5。這種技術的某些例子，已在WO9425591談及源自駱駝重鏈Ig的抗體時有所敘述，在US20030130496談及從噬菌體文庫分離單域全人源抗體時也有所敘述。
此外，某些生產單鏈抗體的技術(美國專利4,946,778；Bird,Science 242：423(1988)；Huston et al.,Proc Natl Acad Sci USA 85：5879(1988)；以及Ward,et al.,Nature 334：544(1989))也可適應於生產單鏈抗體。單鏈抗體是藉由將Fv域的重鏈和輕鏈片段以一個胺基酸橋連接生成一個單鏈多肽而形成的。大腸桿菌中的功能Fv片段的組合技術也可以利用(Skerra et al.,Science 242：1038(1988))。
本發明包括了以重組方式與一個多肽融合或化學偶聯(包括共價和非共價偶聯)的抗體。本發明的融合或共軛的抗體可用於簡化純化，參閱例如WO 93/21232；EP 439,095；Naramura et al.,Immunol Lett 39：91(1994)；美國專利5,474,981；Gillies et al.,Proc Natl Acad Sci USA 89：1428(1992)；以及Fell et al.,J Immunol 146：2446(1991)。標記胺基酸序列可以是一個六組胺酸肽(SEQ ID NO：51)，如pQE載體提供的標簽(QIAGEN,Inc.,Chatsworth,CA)，此外，其中許多還可經商業渠道獲得，Gentz et al.,Proc Natl Acad Sci USA 86：821(1989)。其他可用於純化的多肽標簽包括但不限於「HA」標簽，它對應於一個源自流感血凝素蛋白的表位(Wilson et al.,Cell 37：767(1984))以及「flag」標記。
還可創造一種單肽鏈結合分子，其中重鏈和輕鏈Fv域相連。單鏈抗體(「scFv」)和它們的構建方法在例如美國專利4,946,778中有所敘述。或者，Fab可以類似方式構建和表達。與完全的鼠類mAbs相比，所有完全和部分的人源抗體均可具有較小的免疫原性，片段和單鏈抗體也可具有較小的免疫原性。
抗體或抗體片段，可從用McCafferty et al.,Nature 348：552(1990)所述技術產生的抗體噬菌體文庫分離。Clarkson et al.,Nature 352：624(1991)和Marks et al.,J Mol Biol 222：581(1991)分別敘述了使用噬菌體文庫分離鼠類和人源抗體的技術。隨後的出版物敘述了以鏈替換方式生產高親和力(在nm的範圍內)人源抗體的方法(Marks et al.,Bio/Technology 10：779(1992))，以及以組合感染和體內重組作為構建很大噬菌體文庫的策略 (Waterhouse et al.,Nucl Acids Res 21：2265(1993))。因此，這些技術是分離單株抗體的傳統單株抗體雜交瘤技術的可行替代技術。
抗CXCR5抗體是用酶聯免疫吸附分析(ELISA)、FACS、西方免疫印跡技術或本技術領域內已知的其他免疫化學技術檢測的。因此，B細胞或表達CXCR5的細胞可以一種已知的技術用於檢測與其結合的抗體，或者，作為一種設計選擇，以重組方式表達的CXCR5或其一部分如EC域，可附在固相上並作為分析中的捕獲元素。
為了確定某種特定的抗體同源物是否與人類CXCR5結合，任何傳統的結合測定均可應用。有用的CXCR5結合測定包括FACS分析、ELISA分析、放射免疫分析等方法，以檢測抗體與人類CXCR5的結合以及由此而產生的功能。本文所教示的全長和可溶性人類CXCR5在這類分析中是有用的。抗體或同源物與CXCR5或其可溶性片段的結合，可很方便地藉由使用對該物種的免疫球蛋白具有特異性的第二種抗體來檢測，所檢測的抗體或同源物源自上述物種。
為了確定某種特定的抗體或同源物是否顯著地阻斷CXCL13或其他配體與人類CXCR5的結合，任何適宜的競爭分析法均可使用。有用的分析方法包括例如ELISA分析、FACS分析、放射免疫分析等，它們可定量分析抗體或同源物與CXCL13或其他配體與人類CXCR5結合的競爭能力。較佳的是，配體阻斷帶標記人類CXCR5與固 定化抗體或同源物結合的能力得以測量。
藉由測定與人類CXCR5+細胞結合的能力，可以評估抗體或同源物與人類CXCR5結合的能力。在確定某種特定的抗體或同源物是否與人類CXCR5結合的過程中，適合使用的CXCR5+細胞是用編碼全長人類CXCR5並在細胞表面表達CXCR5的DNA轉化的哺乳動物的組織培養細胞，或B細胞系。
抗體或同源物與CXCR5+細胞的結合可藉由使用對同一物種免疫球蛋白具有特異性的帶熒光標記的第二種抗體給細胞染色來檢測，所檢測的抗體同源物源自上述物種。熒光激活細胞分選儀(「FACS」)可用於檢測和量化任何類型的結合，參閱Shapiro,Practical Flow Cytometry(流式細胞儀)，Alan R.Liss,Inc.,New York,N.Y.(1985)。
同樣，抗體同源物阻斷配體如CXCL13與人類CXCR5結合的能力，可藉由將過量配體與CXCR5+細胞一起預溫育並量化結合的配體阻斷抗體或同源物與該細胞結合的程度來確定。抗體同源物與CXCR5+細胞的結合可藉由使用對同一物種免疫球蛋白具有特異性的帶熒光標記的第二種抗體以FACS分析來量化，所檢測的抗體同源物源自上述物種。或者，如本技術領域內周知，可使用帶標記的配體或抗體進行競爭分析。
用於上述分析的配體如CXCL13，可從用該配體基因轉化的細胞提供，或來自實施本文教示的方法獲得或經商 業渠道購買的分離的CXCL13。
為了確定某種特定的抗體或同源物是否未引起體內循環的CXCR5+細胞數目的顯著減少，在給一個具有正常免疫功能的哺乳動物輸入抗體或同源物後24小時內，測定從該哺乳動物分離出的循環CXCR5+細胞的數目，並與輸入前的數目比較，或與輸入了一種具有不相關特異性的同型抗體或同源物而非本發明之抗體或同源物的對照哺乳動物體內的數目比較。輸入了CXCR5抗體或其功能部分或衍生物的動物體內CXCR5+細胞的量化，可藉由下列步驟完成：例如，藉由使用與抗CXCR5抗體以及與對T細胞和B細胞具有特異性的帶標記抗體結合的帶熒光標記的抗體給獲得的細胞染色，然後再進行FACS分析。
本發明之抗體可以抗體識別或特異性結合的CXCR5的表位或部分來描述或規定。該表位或多肽部分可按本文所述而規定，例如根據N端和C端的位置、根據毗連胺基酸殘基的大小、構形表位等。
本發明之抗體也可以交叉反應性來描述或規定。跟與CXCR5有至少95%、至少90%、至少85%、至少80%、至少75%、至少70%、至少有65%、至少有60%、至少55%，以及至少50%同一性(使用本技術領域內已知和本文所述的方法計算)的CXCR5多肽結合的抗體，也包括在本發明內。
本發明之抗體也可以與目的CXCR5的結合親和力來描述或規定。抗CXCR5抗體可以低於約10-7M、低於約 10-6M，或低於約10-5M的KD結合，目的抗體的較高結合親和力可以是有益的，例如具有約10-8至10-15、約10-8至10-12、約10-9至10-11，或約10-8至10-10平衡解離常數或KD的那些抗體。本發明還提供了一些抗體，如本技術領域內任何已知的測定競爭性結合的方法如本文所述的免疫分析所確定，這些抗體競爭性地抑制一種抗體與本發明之表位的結合。在一些較佳的實施例中，抗體競爭性地抑制與表位的結合達至少95%、至少90%、至少85%、至少80%、至少75%、至少70%、至少為60%，或至少50%。
本發明還包括含有目的抗體的共軛物。該共軛物包含兩個主要組分，一個目的抗體和可以是一種細胞結合劑、細胞毒性劑等的第二個組分。
本文所用的術語「細胞結合劑」是指一種能特異性識別細胞表面的分子並與其結合的試劑。因此，細胞結合劑可以是一種CD抗原、病原體抗原如病毒抗原，分化抗原，腫瘤抗原，細胞特異性抗原，組織特異性抗原，Ig或Ig類分子等。
在一個實施例中，該細胞結合劑能特異性識別CXCL13或CXCR5的複合物及其配體，如CXCL13。該共軛物可與靶細胞接觸足夠的時間，讓該共軛物的效應子功能對細胞起作用，和/或讓該共軛物有足夠的時間被細胞內化。
細胞結合劑可以是目前已知或剛為人所知的任何類型，包括肽、非肽、糖、核酸、配體、受體等，或其組 合。該細胞結合劑可以是能與細胞結合的任何化合物，無論是以特異性或非特異性方式結合。一般而言，細胞結合劑可以是一種抗體(尤其是單株抗體)、淋巴因子、激素、生長因子、維生素，營養輸送分子(如轉鐵蛋白)，或其他任何細胞結合分子或物質。
可利用的細胞結合劑的其他例子包括：多株抗體；單株抗體；抗體片段，如Fab、Fab'、F(ab')2以及Fv(Parham,J.Immunol.131：2895-2902(1983)；Spring et al.,J.Immunol.113：470-478(1974)；以及Nisonoff et al.,Arch.Biochem.Biophys.89：230-244(1960))。
第二個組分也可以是一種細胞毒性劑。本文所用的術語「細胞毒性劑」是指一種能降低或阻斷細胞的功能或增長，和/或導致細胞破壞的物質。因此，細胞毒性劑可以是一種紫杉醇、美登素(maytansinoids)，如DM1或DM4、CC-1065或CC-106類似物、蓖麻毒素、絲裂黴素C等。在某些實施例中，如同本發明之共軛物的任何結合劑，細胞毒性劑是以共價鍵與目的抗體直接或藉由一個可切割的或不可切割的連接分子連接的。
適宜的美登素的例子包括美登素醇(maytansinol)和美登素醇類似物。美登素能抑制微管的形成並對哺乳動物細胞具有很強的毒性。
適宜的美登素醇類似物的例子包括含有一個經修飾芳環和在其他位置有修飾的那些美登素醇類似物。在下列美國專利中披露了這類適宜的美登素：4,424,219； 4,256,746；4,294,757；4,307,016；4,313,946；4,315,929；4,331,598；4,361,650；4,362,663；4,364,866；4,450,254；4,322,348；4,371,533；6,333,410；5,475,092；5,585,499；以及5,846,545。
適宜的含有一個經修飾芳環的美登素醇類似物的例子包括：(1)C-19-脫氯(美國專利4,256,746)(例如藉由美坦西醇P2(ansamytocin P2)的LAH還原而製備)；(2)C-20-羥基(或C-20-脫甲基)+/- C-19-脫氯(美國專利4,361,650和4,307,016)(例如用鏈黴菌或放線菌脫甲基或用氫化鋰鋁(LAH)脫氯而製備)；以及(3)C-20-脫甲氧基、C-20-乙醯氧基(-OCOR)，+/-脫氯(美國專利4,294,757)(用醯基氯醯化而製備)。
適宜的在其他位置有修飾的美登素醇類似物的例子包括：(1)C-9-SH(美國專利4,424,219)(藉由美登素醇與H2S或P2S5的反應而製備)；(2)C-14烷氧基甲基(脫甲氧基/CH2OR)(美國專利4,331,598)；(3)C-14-羥甲基或乙醯氧基甲基(CH2OH或CH2OAc)(美國專利4,450,254)(從諾卡氏菌製備)；(4)C-15-羥基/乙醯氧基(美國專利4,364,866)(藉由鏈黴菌使美登素醇轉化而製備)；(5)C-15-甲氧基(美國專利4,313,946和4,315,929)(從Trewia nudiflora分離)；(6)C-18-N-脫甲基(美國專利4,362,663和4,322,348)(藉由鏈黴菌使美登素醇脫甲基化而製備)；以及(7)4,5-脫氧(美國專利4,371,533)(藉由美登素醇的三氯化鈦/LAH還原而 製備)。
細胞毒性共軛物可以體外方法製備。為了將細胞毒性劑、藥物或前體藥與抗體連接，通常使用一個連接基。適宜的連接基是本技術領域內周知的，包括二硫基、硫醚基、酸不穩定基、光不穩定基，肽酶不穩定基以及酯酶不穩定基。例如，利用二硫鍵交換反應，或在目的抗體和藥物或前體藥之間形成硫醚鍵，即可構建共軛物。
如上所討論，本發明提供了編碼本文所披露抗體或其功能變體的分離的核酸序列，含有編碼本發明CXCR5結合多肽的核苷酸序列的載體構建物，含有這種載體的宿主細胞，以及生產多肽的重組技術。
該載體通常包含本技術領域內已知的組分，且一般包括但不限於一個或多個下列元件：一個信號序列、一個複製起點，一個或多個標記或選擇基因，促進和/或加強轉譯的序列，一個增強子等。因此，該表達載體包括一個與適宜的轉錄或轉譯調控核苷酸序列，例如那些源自哺乳動物、微生物、病毒或昆蟲基因的核苷酸序列，可操作地連接的核苷酸序列。其他調控序列的例子包括操作子、mRNA的核糖體結合位點，和/或其他控制轉錄和轉譯(例如其起始和終止)的適宜序列。當調控序列在功能上與相應多肽的核苷酸序列相關時，核苷酸序列就是「可操作地連接的」。因此，如果一個啟動子核苷酸序列控制該核苷酸序列的轉錄，那麼該啟動子核苷酸序列就是與例如抗體重鏈序列可操作地連接的。
此外，編碼與抗體重鏈和/或輕鏈序列非天然相連的相應信號肽的序列，可納入表達載體。例如，一個信號肽(分泌前導)的核苷酸序列可與多肽序列融合，使得該抗體被分泌到周質空間或進入介質。在預定宿主細胞中起作用的信號肽，加強了相應抗體或其部分的細胞外分泌。該信號肽可在細胞分泌抗體時從多肽上裂解。這類分泌信號的例子是眾所周知的並包括例如在美國專利5,698,435、5,698,417，以及6,204,023中所述的那些分泌信號。
載體可以是質體、單鏈或雙鏈病毒載體、單鏈或雙鏈RNA或DNA的噬菌體載體、噬菌體質體、黏接質體或任何其他目的轉基因的載體。採用眾所周知的將DNA和RNA導入細胞的技術，可將這種載體作為聚核苷酸導入細胞。在噬菌體和病毒載體的情況下，也可採用眾所周知的感染及轉導技術，將載體作為包裝或包裹病毒導入細胞。病毒載體可以是可複製型或複製缺陷型。在後一種情況下，病毒的繁殖一般只會在輔助型宿主細胞中發生，並需使用載有產生一個顆粒所必須的各種病毒成分的多種載體。使用源自現有DNA構建物的RNA，無細胞轉譯系統也可用於生產蛋白(參閱例如WO 86/05807和WO 89/01036，以及美國專利5,122,464)。
本發明之抗體可從任何適宜的宿主細胞表達。可用於本發明的宿主細胞的例子包括原核細胞、酵母或較高級的真核細胞，並包括但不限於微生物如用含有本發明抗體編碼序列的重組噬菌體DNA、DNA質體或黏接質體DNA表 達載體轉化的細菌(如大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、腸桿菌，歐文氏菌，肺炎克雷伯氏菌，變形桿菌、沙門氏菌、沙雷氏菌、志賀氏菌，以及桿菌、綠膿桿菌和鏈黴菌)；用含有抗體編碼序列的重組酵母表達載體轉化的酵母(例如釀酒酵母、巴氏酵母、放線菌、克魯維酵母菌、裂殖酵母、念珠菌、木黴菌，鏈孢黴菌，以及絲狀真菌，如鏈孢黴菌、青黴菌、彎頸黴菌和曲黴菌)；用含有抗體編碼序列的重組病毒表達載體(如杆狀病毒)感染的昆蟲細胞系統；用重組病毒表達載體(如花椰菜花葉病毒、CaMV；或煙草花葉病毒，TMV)感染的，或用含有抗體編碼序列的重組質體表達載體(例如Ti質體)轉化的植物細胞系統；或包含重組表達構建物的哺乳動物細胞系統(例如COS、CHO、BHK、293或3T3細胞)。該構建物含有源自哺乳動物細胞基因組的啟動子(例如金屬硫蛋白啟動子)或源自哺乳動物病毒的啟動子(例如腺病毒後期啟動子；或疫苗病毒7.5K啟動子)。
用於原核宿主細胞的表達載體，一般含有一個或多個表型選擇標記基因。表型選擇標記基因可以是，例如一種編碼賦予耐藥性或提供自養要求的蛋白的基因。有用的原核宿主細胞的表達載體的例子包括從經商業渠道獲得的質體如pKK223-3(Pharmacia Fine Chemicals,Uppsala,Sweden)、pGEM1(Promega Biotec,Madison,WI)、pET(Novagen,Madison,WI)以及pRSET(Invitrogen,Carlsbad,CA)系列載體(Studier,J Mol Biol 219：37(1991)；以及 Schoepfer,Gene 124：83(1993))所衍生的那些載體。通常用於重組原核宿主細胞表達載體的啟動子序列包括T7，(Rosenberg et al.,Gene 56：125(1987))、β-內醯胺酶(青黴素酶)、乳糖啟動子系統(Chang et al.,Nature 275：615(1978)；以及Goeddel et al.,Nature 281：544(1979))、色胺酸(trp)啟動子系統(Goeddel et al.,Nucl Acids Res 8：4057(1980))，以及tac啟動子(Sambrook et al.,Molecular Cloning,A Laboratory Manual,2nd ed.,Cold Spring Harbor Laboratory(1990))。
酵母載體往往含有一個複製起點序列，如2μ酵母質體、自主複製序列(ARS)、啟動區、多聚腺苷化序列、轉錄終止序列以及可選擇標記基因。酵母載體的適宜的啟動子序列包括但不限於金屬硫蛋白啟動子、3-磷酸甘油酸激酶(Hitzeman et al.,J Biol Chem 255：2073(1980))或其他糖酵解酶(Holland et al.,Biochem 17：4900(1978))如烯醇化酶、甘油醛-3-磷酸脫氫酶、己糖激酶、丙酮酸脫羧酶、果糖磷酸激酶、葡糖-6-磷酸異構酶、3-磷酸甘油酸變位酶、丙酮酸激酶、丙糖磷酸異構酶、磷酸葡糖異構酶以及葡糖激酶。其他用於酵母表達的適宜載體和啟動子，在Fleer et al.,Gene 107：285(1991)中進一步說明。其他酵母和酵母轉化方案的適宜啟動子和載體是本技術領域內眾所周知的。酵母轉化方案也是眾所周知的。Hinnen et al.,Proc Natl Acad Sci 75：1929(1978)敘述了這樣的一個方案，它在一種選擇性培養基中選擇Trp+轉化。
任何真核細胞培養液都是可行的，無論是源自脊椎動物還是無脊椎動物的培養液。無脊椎動物細胞的例子，包括植物和昆蟲細胞(Luckow et al.,Bio/Technology 6：47(1988)；Miller et al.,Genetic Engineering,Setlow et al.,eds.,vol.8,pp.277-9,Plenum Publishing(1986)；以及Maeda et al.,Nature 315：592(1985))。例如，杆狀病毒系統可用於生產異源蛋白。在昆蟲系統中，苜蓿銀蚊夜蛾核型多角體病毒(Autographa californica nuclear polyhedrosis virus,AcNPV)可作為載體用來表達外源基因。該病毒在草地貪夜蛾(Spodoptera frugiperda)細胞中生長。抗體編碼序列可在AcNPV啟動子(例如多角體蛋白啟動子)的控制下被複殖。其他已經鑒定的宿主包括白紋伊蚊(Aedes)、黑腹果蠅(Drosophila melanogaster)和家蠶(Bombyx mori)。各種各樣的轉染病毒株可從市面上獲得，例如AcNPV的L-1變種和家蠶NPV的Bm-5株。此外，如本技術領域內眾所周知，棉花、玉米、馬鈴薯、大豆、矮牽牛、番茄、煙草的植物細胞培養液也可作為宿主。
脊椎動物細胞、脊椎動物細胞在培養基(組織培養基)中的繁殖，可以是一種常規步驟，雖然苛求細胞系確實存在，它需要例如一種具有獨特因子的專門培養基、飼養細胞等，參閱Tissue Culture,Kruse et al.,eds.,Academic Press(1973)。有用的哺乳動物宿主細胞系的例子為猴腎細胞；人胚腎細胞；幼倉鼠腎細胞；中國倉鼠卵 巢細胞//-DHFR(CHO,Urlaub et al.,Proc Natl Acad Sci USA 77：4216(1980))；小鼠塞爾托利氏細胞；人宮頸癌細胞(例如HeLa)；犬腎細胞；人肺癌細胞；人肝細胞；小鼠乳腺腫瘤；以及NS0細胞。
宿主細胞是用載體轉化以產生抗體，並在常規營養培養基中培養。該培養基含有生長因子、維生素、礦物質等，以及適合於所用細胞和載體的誘導劑。常用的啟動子序列和增強子序列是源自多瘤病毒、腺病毒2、猴病毒40(SV40)以及人的巨細胞病毒(CMV)。源自SV40病毒基因組的DNA序列可用於提供其他遺傳元件，以在哺乳動物宿主細胞(如SV40起點、早期和晚期啟動子、增強子、剪接和多聚腺苷化位點)中表達一個結構基因序列。病毒性早期和晚期啟動子是特別有用的，因為兩者都很容易從病毒基因組作為一個片段獲得。該片段也可能含有一個病毒複製起點。用於哺乳動物宿主細胞的典型表達載體可從商業渠道獲得。
可從商業渠道獲得的培養基如Ham's F10、極限必需培養基(MEM)、RPMI-1640和Dulbecco改良的Eagle培養基(DMEM)都適合於培養宿主細胞。此外，Ham et al.,Meth Enzymol 58：44(1979)和Barnes et al.,Anal Biochem 102：255(1980)，以及美國專利4,767,704；4,657,866；4,560,655；5,122,469；5,712,163；或6,048,728中所述的任何培養基也可作為宿主細胞的培養基使用。這些培養基中任何一種，必要都可補充激素和/ 或其他生長因子(如胰島素，轉鐵蛋白或表皮生長因子)，鹽(如氯化物，如氯化鈉、氯化鈣或氯化鎂；以及磷酸鹽)、緩衝液(如HEPES)、核苷酸(如腺苷和胸苷)、抗生素，痕跡量元素(定義為無機化合物，通常其最終濃度在微摩爾的範圍內)，以及葡萄糖或一種相當的能量來源。任何其他必要的補充，都可以適當的濃度包括在內，作為一項設計選擇。培養基條件，如溫度、pH值等，都是本技術領域內已知適合於細胞的，並使轉基因能夠理想表達。
使用本技術領域內任何已知的方法，就可獲得目的聚核苷酸，並確定該聚核苷酸的核苷酸序列。例如，如果抗體的核苷酸序列是已知的，就可從化學合成的寡核苷酸組裝編碼抗體的聚核苷酸(例如Kutmeier et al.,Bio/Techniques 17：242(1994)所敘述的)，然後擴增連接的寡核苷酸，例如藉由PCR。
或者，編碼抗體的聚核苷酸可從表達相同抗體的核酸細胞產生。如果不具備含有編碼某特定抗體的核酸的殖株，但抗體分子的序列是已知的，則可從適當來源如文庫獲得編碼免疫球蛋白的核酸，這也許是一種對產生抗體的細胞具有特異性的核酸，如選定表達本發明之抗體的雜交瘤細胞。可為PCR擴增配置適宜的引子。然後，使用本技術領域內眾所周知的任何方法，可將PCR所產生的擴增核酸選殖到可複製的選殖載體中去。
一旦核苷酸序列和對應於抗體的胺基酸序列被確定， 就可使用本技術領域內已知的操縱核苷酸序列的方法，如DNA重組技術、定點誘變，PCR等(參閱，例如Sambrook et al.,Molecular Cloning,A Laboratory Manual,2nd ed.,Cold Spring Harbor Laboratory(1990)；以及Ausubel et al.,eds.,Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley & Sons(1998)，操縱該抗體的核苷酸序列以獲得本文所述的等效物，產生含有不同胺基酸序列的抗體，例如，引起胺基酸取代、刪除和/或插入。
可以眾所周知的方法檢查重鏈和/或輕鏈可變域的胺基酸序列，以鑒定CDR序列，例如，藉由與其他重鏈和輕鏈可變域的已知胺基酸序列的比較可確定序列高可變性的區域。使用常規DNA重組技術，可將一個或多個CDR插入構架區，例如插入人的構架區使非人源抗體人類化，如上所述。藉由該構架區與一個或多個CDR的結合而產生的聚核苷酸，可編碼與CXCR5特異性結合的抗體或至少編碼其ED域。例如，這種方法可用於一個或多個參與鏈內二硫鍵可變域半胱胺酸殘基的胺基酸取代或刪除，以產生缺乏一個或多個鏈內二硫鍵的抗體分子。
本發明之抗體或抗體片段可用於在體外或體內檢測一個生物樣本的CXCR5，從而檢測表達CXCR5的細胞。在一個實施例中，本發明的抗CXCR5抗體被用於測定CXCR5在一種組織或源自該組織的細胞中的存在和含量。例如，在用本發明之抗體或抗體片段進行的免疫分析中，可測定CXCR5在該組織或活檢樣本中的含量。組織 或活檢樣本可冷凍或固定。同一方法或其他方法也可用於測定CXCR5的其它性能，如它的含量、細胞定位、mRNA含量、基因突變等等。
上述方法可用於例如為已知或疑患癌症的患者診斷癌症，將該患者的CXCR5含量與一個正常對照或標準相比。本發明的分析也可用於診斷關節炎或其他以B細胞的浸潤和富集以及分化淋巴組織發展為特徵的自身免疫性疾病。
本發明還提供了為了研究或診斷應用而進一步標記的單株抗體、人類化抗體及其抗原表位結合片段。在某些實施例中，該標記是一種放射性標記、熒光團、生色團、顯像劑，或金屬離子。
此外還提供了一種診斷方法，其中將所述標記抗體或其抗原表位結合片段輸給一位疑患癌症、關節炎、自身免疫性疾病或其他CXCR5疾病的患者，該標記在患者體內的分佈予以測量或監視。
本發明之抗體及其片段可作為親和純化劑使用。在此過程中，使用本技術領域已知的方法，將抗體固定在一種固相載體如右旋糖酐或瓊脂糖樹脂或濾紙上。被固定的抗體與含有CXCR5的樣本或載有CXCR5的待純化細胞接觸，然後用一種適宜的溶劑洗滌載體，該溶劑將洗去樣本中除CXCR5或待純化細胞以外幾乎所有的物質，CXCR5或待純化細胞則結合在被固定的本發明之抗體上。最後，用另一種適宜的溶劑(如甘胺酸緩衝液，pH值5.0)洗滌 載體，這將從抗體上釋放CXCR5或細胞。
為了診斷應用，目的抗體通常會用一種可檢測的成分加以標記。有許多標記可供利用，大致可分為以下幾類：(a)放射性同位素，如36S、14C、125I、3H和131I(抗體可用放射性同位素標記，使用Current Protocols in Immunology,vol.12,Coligen et al.,ed.,Wiley-Interscience,New York(1991)所述的技術，例如，放射性可用閃爍計數技術來衡量)；(b)熒光標簽，如稀土螯合物(銪螯合物)、熒光素及其衍生物、羅丹明及其衍生物、丹磺醯、麗絲胺、藻紅蛋白以及得克薩斯紅；熒光標簽可用Current Protocols in Immunology(同上)披露的技術結合到抗體上，例如，熒光可用熒光儀量化；以及(c)有各種酶底物標簽可供利用(美國專利4,275,149提供了一段評述)，酶通常可催化產色底物的化學改變，這可採用各種技術來測量，例如酶可催化底物顏色的變化，這可用分光光度來衡量；或者，酶可以改變底物的熒光或化學發光。定量測定熒光變化的技術是眾所周知的，例如使用發光計，或者該標記可向一種熒光受體提供能量。酶標記的例子包括熒光素酶(例如，螢火蟲熒光素酶和細菌熒光素酶；美國專利4,737,456)、熒光素、2,3-二氫二氮雜萘二酮、蘋果酸脫氫酶、脲酶，過氧化物酶如辣根過氧化物酶(HRPO)、鹼性磷酸酶，β-半乳糖苷酶、葡糖糖化酶、溶菌酶、糖氧化酶(如葡糖氧化酶、半乳糖氧化酶，葡糖-6-磷酸脫氫酶)、雜環氧化酶(如尿酸酶和黃 嘌呤氧化酶)、乳過氧化物酶、微過氧化物酶等。使酶與抗體結合的技術在O'Sullivan et al.,Meth Enz,ed.Langone & Van Vunakis,Academic Press,New York,73(1981)中有所敘述。
當使用這些標記時，有適宜的底物可供利用，例如：(i)對於辣根過氧化物酶可用過氧化氫酶作為底物，過氧化氫酶可氧化一種染料前體(例如鄰苯二胺(OPD)或3,3',5,5'-四甲基聯苯胺鹽酸鹽(TMB))；(ii)對於鹼性磷酸酶(AP)可用對硝基苯磷酸酯作為產色底物；以及(iii)β-D-半乳糖苷酶(β-D-Gal)可用產色底物(例如對硝基苯-β-D-半乳糖苷酶)，或熒光底物如4-甲基傘形酮醯-β-D-半乳糖苷酶。
其他酶-底物組合可供本技術領域專業人員利用。對於一般性評述，可參閱美國專利4,275,149和4,318,980。
有時，標記與抗體是間接地結合。例如，抗體可與生物素結合，上述任何報導子都可與親和素結合，反之亦然。生物素與親和素選擇性地結合，因此，標記可與抗體以間接方式結合。或者，為了實現標記的間接結合，抗體與一種小的半抗原(如地高辛)結合，一種不同類型的標記或上述的報導子與一種抗地高辛抗體結合。因此，使用第二種抗體可以實現標記與抗體或突變蛋白的間接結合。
在本發明的另一個實施例中，抗體不必加以標記，它的存在可使用一種與該抗體結合的標記抗體來檢測，另一種形式的第二抗體。
本發明之抗體可用於任何已知的分析方法，如競爭性結合分析、直接和間接夾心分析以及免疫分析。Zola,Monoclonal Antibodies：A Manual of Techniques(CRC Press,Inc.1987)。
競爭性結合分析取決於一種帶標記的標準物與試驗樣本在與有限量抗體結合過程中的競爭能力。試驗樣本中抗原的量與跟抗體結合的標準物的量成反比。為便於測定跟抗體結合的標準物的量，抗體在競爭之前或之後通常是不溶解的。結果，與抗體結合的標準物和試驗樣本可與未結合的標準物和試驗樣本方便地分離。
夾心分析涉及使用兩種抗體，每一種都有能力與待檢測目標的不同免疫原部分(決定子或抗原表位)結合。在夾心分析中，待分析試驗樣本與直接或間接固定在一種固體載體上的第一種抗體結合，然後直接或間接地加以標記的第二種抗體與已經結合的試驗樣本結合，從而形成一種不溶性三部分複合物，參閱例如美國專利4,376,110。第二種抗體本身可用一種可檢測的成分加以標記(直接夾心分析)，或可用一種抗免疫球蛋白抗體或用可檢測成分加以標記的結合對(例如抗體/抗原、受體/配體、酶/底物)的其他適宜成員測量(間接夾心法)。例如，一種夾心分析是ELISA分析，在這種情況下，該可檢測成分是一種酶。
對於免疫組織化學，細胞或組織樣本可以是新鮮的或冷凍的，或可封在石蠟裏或用一種防腐劑如甲醛固定。
抗體也可用於體內診斷分析。一般而言，抗體的突變體是用放射性核苷酸(如111In、99Tc、14C、131I、3H、32P或35S)標記的，使得表達CXCR5的位點可使用免疫閃爍法定位。
本發明還包括試劑套組，例如包括抗體、其片段、同源物、其衍生物等的試劑套組，例如一種帶標記或具有細胞毒性的共軛物，以及抗體使用說明書、殺死特定類型細胞的共軛物等等。該說明書可包括在體外、體內或體內外使用抗體、共軛物等的指示。抗體可以是液態或固態，通常是凍乾形式。該試劑套組可包含其他適宜的試劑，如緩衝液、重組溶液以及為了預定用途的其他必要成分。成套的預定劑量組合試劑與使用說明書，例如用於治療用途或診斷分析，都是經過精心考慮的。如果抗體是帶標記的，例如用酶標記的，那麼該套組可包括底物和酶所需的輔因子(例如提供可檢測生色團或熒光團的底物前體)。此外，其他添加劑，如穩定劑、緩衝液(例如阻斷緩衝液或裂解緩衝液)等也可包括在內。各種試劑的相對量可以改變而提供試劑溶液的濃縮物，這就提供了用戶靈活性、節省空間、節省試劑等優越性。這些試劑也可以乾粉形式提供，通常是凍乾形式，包括賦形劑，它在溶解時可提供具有適當濃度的試劑溶液。
本發明之抗體可用於治療哺乳動物。在一個實施例中，出於獲得臨床前數據的目的，將目的抗體或等效物輸給一個非人類哺乳動物。代表性的待治療非人類哺乳動 物，包括非人靈長類動物、狗、貓、鼠類以及其他哺乳動物，其中進行了臨床前研究。這種哺乳動物可為一種需用抗體治療的疾病建立動物模型，或可用於研究目的抗體的毒性。在每個這樣的實施例中，可在哺乳動物中進行劑量遞增研究。
一種抗體，無論有無第二個組分(如作為一種治療成分與抗體結合)，無論是單獨或與細胞毒性因子一起施用，均可作為一種治療劑使用。本發明是關於以抗體為基礎的治療，其中涉及給動物、哺乳動物或人施用本發明之抗體，以治療CXCR5介導的疾病、異常或狀況。該動物或患者可以是一個需要特別治療的哺乳動物，例如經診斷患有特殊(例如與CXCR5有關的)疾病的哺乳動物。針對CXCR5的抗體是有用的，例如可用於預防或治療關節炎、炎症，一般而言，移植排斥反應、癌症和自身免疫性疾病。例如，藉由施用在治療上可接受劑量的本發明之抗CXCR5抗體，或多種本發明之抗體或其等效物的混合物，或與其他不同來源的抗體聯合施用，所治療哺乳動物尤其是人的疾病症狀可得以減輕或防止。
本發明的治療化合物包括但不限於本發明之抗體(包括如本文所述的其片段、類似物，等效物和衍生物)、如本文所述的編碼本發明之抗體的核酸(包括其片段、類似物和衍生物)以及如本文所述的抗獨特型抗體。本發明之抗體可用於治療、抑制或預防與CXCR5異常表達和/或活性相關的疾病、異常或狀況，包括但不限於任何一種或多 種本文所述的疾病、異常或狀況。治療和/或預防與CXCR5異常表達和/或活性相關的疾病、異常或狀況包括但不限於減輕與這些疾病、異常或狀況相關的至少一種症狀。如本技術領域內眾所周知或本文所述，本發明之抗體可以藥學上可接受的組合物形式提供。「生理上可接受的」、「藥理學上可接受的」等術語意為已經聯邦或州政府的監管機構批准，或已列入美國藥典或其他普遍公認的用於動物尤其是人類的藥典。
抗CXCR5抗體可以任何可接受方式給哺乳動物施用。輸入方法包括但不限於胃腸外、皮下、腹腔內、肺內、鼻內、硬膜外、吸入和口服途徑；若欲進行免疫抑制治療，則輸入病灶內。胃腸外輸液包括肌內、皮內、靜脈內、動脈內或腹腔內輸入。抗體或組合物可以任何方便途徑施用，例如藉由輸液或快速注射、藉由上皮或黏膜(例如口腔黏膜、直腸和腸道黏膜等)吸收，並可與其他生物活性藥劑一起施用。給藥可以是全身性或局部性。此外，也許需要以任何適當途徑將本發明的治療抗體或組合物輸入中樞神經系統，包括心室內和鞘內注射；心室內注射借助於一心室內導管，例如與一個貯器如奧莫耶貯器(Ommaya reservoir)連接的導管。此外，該抗體適合於以脈衝輸液方式給藥，尤其是以抗體劑量遞減的方式。較佳的是，以注射方式給藥，更佳的是靜脈注射或皮下注射，部分地取決於給藥時間的長短。
各種其他給藥系統是眾所周知的，可用於本發明之抗 體的給藥，包括例如封裝於脂質體、微粒、微膠囊(參閱Langer,Science 249：1527(1990)；Treat et al.,in Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Cancer；Lopez-Berestein et al.,eds.,p.353-365(1989)；以及Lopez-Berestein,ibid.,p.317-327)以及能表達該化合物的重組細胞；受體介導的胞吞(參閱Wu et al.,J Biol Chem 262：4429(1987))；核酸作為逆轉錄病毒或其他載體等組成部分的構建。
活性成分也可封裝在以凝聚技術或界面聚合法製備的微膠囊中，例如分別用於膠體藥物給藥系統(例如脂質體、白蛋白微球、微乳液、納米粒子和納米膠囊)或微乳液的羥甲基纖維素或明膠微膠囊和聚甲基丙烯酸酯微膠囊。Remington's Pharmaceutical Sciences(雷氏藥學大全)，16th edition,A.Osal,Ed.(1980)中透露了這些技術。
也可應用經肺給藥，例如使用一種吸入器或噴霧器，以及用一種霧化劑形成霧狀。抗體也可以乾粉組合物的形式輸入患者肺部，參閱例如美國專利6,514,496。
在一個具體實施例中，也許希望在需要治療的局部區域施用本發明之治療抗體或組合物；這可藉由以下方式實現：例如但不限於，局部輸液、局部敷用、注射、經由導管、以栓劑或植入的方式；所植入的是一種多孔、非多孔或凝膠狀物質，包括薄膜如矽橡膠膜或纖維。較佳的是，當施用本發明之抗體時，應注意採用蛋白不吸收或不吸附的材料。
在另一實施例中，該抗體可經由一種控制釋放系統給藥。在一個實施例中，可使用泵(參閱Langer,Science 249：1527(1990)；Sefton,CRC Crit Ref Biomed Eng 14：201(1987)；Buchwald et al.,Surgery 88：507(1980)；以及Saudek et al.,N Engl J Med 321：574(1989))。在另一實施例中，可使用聚合材料(參閱Medical Applications of Controlled Release,Langer et al.,eds.,CRC Press(1974)；Controlled Drug Bioavailability,Drug Product Design and Performance,Smolen et al.,eds.,Wiley(1984)；Ranger et al.,J Macromol Sci Rev Macromol Chem 23：61(1983)；see also Levy et al.,Science 228：190(1985)；During et al.,Ann Neurol 25：351(1989)；以及Howard et al.,J Neurosurg 71：105(1989))。在又一實施例中，控制釋放系統可放在治療對象的附近。
藉由混合具有所需純度的多肽與任選的「藥學上可接受的」載體、稀釋劑、賦形劑或常用於本技術領域的穩定劑(即緩衝液、穩定劑)、防腐劑、等滲劑、非離子型洗滌劑、抗氧劑以及其他添加劑，參閱Remington's Pharmaceutical Sciences(雷氏藥學大全)，16th ed.,Osol,ed.(1980)，多肽或抗體治療製劑可製備成凍乾製劑或水溶液儲存。這些添加劑在所用劑量和濃度下，對接受治療者一般都沒有毒性，因此，賦形劑、稀釋劑、載體等是藥學上可接受的。
「分離」或「純化」抗體基本上不含細胞物質，或來 自細胞或組織來源或衍生蛋白的培養基的其他污染蛋白，或在化學合成的情況下基本上不含化學前體或其他化合物。「基本上不含細胞物質」這一措詞包括抗體製劑，其中多肽/蛋白從細胞中分離或以重組方式產生，但是與該細胞的組分是分開的。因此，基本上不含細胞物質的抗體包括污染蛋白含量低於約30%、20%、10%、5%、2.5%或1%(乾重)的抗體製劑。當抗體是以重組方式產生時，最好是基本上不含培養基，即以蛋白製劑體積計，培養基含量低於約20%、10%、5%、2.5%或1%。當抗體是以化學合成方式產生時，最好是基本上不含化學前體或其他化合物和試劑，即目的抗體是與化學前體或涉及蛋白合成的其他化合物分開的。相應地，這些抗體製劑含有低於約30%、20%、10%、5%或1%(乾重)的化學前體或目的抗體以外的其他化合物。在本發明一個首選的實施例中，抗體是分離或純化的。
本文所用的術語「低至不可檢測的聚集含量」，是指樣本中含有不超過5%、不超過4%、不超過3%、不超過2個%、不超過1%且往往不超過0.5%的聚集量(按蛋白重量計，例如以高效尺寸排阻層析法(HPSEC)測量)。
本文所用的術語「低至不可檢測的碎片含量」，是指例如在HPSEC所確定的一個單峰處，或還原毛細凝膠管電泳(rCGE)所確定的兩個(2)峰(重鏈和輕鏈)處，樣本中含有等於或高於80%、85%、90%、95%、98%或99%總蛋白，且不含分別高於5%、高於4%、高於3%、 高於2%、高於1%，或高於0.5%總蛋白的其他單峰。本文所用的rCGE是指還原條件下的毛細管膠管電泳，該還原條件足以使抗體或抗體類型或衍生物分子中的二硫鍵還原。
就含有CXCR5抗體或其結合片段的液體製劑而論，本文所用的術語「穩定」和「穩定的」是指製劑中的抗體或其抗原結合片段，在給定的製造、製備、運輸和儲存條件下，對於熱力和化學解折疊、聚集、降解或片段化的抵抗力。本發明的「穩定的」製劑在給定的製造、製備、運輸和儲存條件下，可保持等於或高於80%、85%、90%、95%、98%、99%或99.5%的生物活性。所述抗體製劑的穩定性，可根據聚集、降解或片段化的程度來評估，並與一參照物比較；採用的方法是本技術領域內專業人員已知的，包括但不限於rCGE、十二烷基硫酸鈉聚丙烯醯胺凝膠電泳(SDS-PAGE)以及HPSEC。
術語「載體(carrier)」是指一種與治療劑一起施用的稀釋劑、佐劑、賦形劑或載體。這類生理載體可以是無菌液體，例如水和油，包括來源於石油、動物、植物或合成的油，例如花生油、豆油、礦物油、芝麻油等等。當藥物組合物為靜脈內注射時，水是適宜的載體。鹽水溶液以及葡萄糖和甘油的水溶液也可作為液體載體使用，尤其是用於注射溶液。適宜的醫藥賦形劑包括澱粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明膠、麥芽、大米、麵粉、白堊、矽膠、硬脂酸鈉、單硬脂酸甘油酯、滑石粉、氯化鈉、脫脂奶粉、甘 油、丙二醇、水、乙醇等等。如果需要，該組合物也可含有少量的潤濕劑或乳化劑，或pH緩衝劑。該組合物可採取溶液、懸浮液、乳液、片劑、丸劑、膠囊、粉劑、緩釋配方、肌內貯庫等形式。該組合物可用傳統的黏合劑和載體如甘油三酯配製成栓劑的形式。口服劑配方可含有標準載體，如醫藥級的甘露醇、乳糖、澱粉、硬脂酸鎂、糖精鈉、纖維素、碳酸鎂等。適宜載體的例子在「雷氏藥學大全」(Remington's Pharmaceutical Sciences,Martin)中有所描述。這類組合物將含療效量的抗體，較佳的是純抗體，以及適量的載體以形成適合給患者施用的形式。如本領域內周知，該藥劑將配製成適合於施用的方式。
緩衝劑有助於將pH值維持在近似於生理條件的範圍內。緩衝劑較佳的是處於約2mM至約50mM的濃度範圍。適宜用於本發明的緩衝劑包括有機酸和無機酸及其鹽，例如檸檬酸鹽緩衝劑(例如檸檬酸單鈉-檸檬酸二鈉混合物、檸檬酸-檸檬酸三鈉混合物、檸檬酸-檸檬酸單鈉混合物等)、琥珀酸鹽緩衝劑(例如琥珀酸-琥珀酸單鈉混合物、琥珀酸-氫氧化鈉混合物、琥珀酸-琥珀酸二鈉混合物等)、酒石酸鹽緩衝劑(例如酒石酸-酒石酸鈉混合物、酒石酸-酒石酸鉀混合物、酒石酸-氫氧化鈉混合物等)、富馬酸鹽緩衝劑(例如富馬酸-富馬酸單鈉混合物、富馬酸富馬酸二鈉混合物、富馬酸單鈉-富馬酸二鈉混合物等)、葡糖酸鹽緩衝劑(例如葡糖酸-葡糖酸鈉混合物、葡糖酸-氫氧化鈉混合物、葡糖酸葡糖酸鉀 混合物等)、草酸鹽緩衝劑(例如草酸草酸鈉混合物、草酸-氫氧化鈉混合物、草酸-草酸鉀混合物等)、乳酸鹽緩衝劑(例如乳酸乳酸鈉混合物、乳酸-氫氧化鈉混合物、乳酸-乳酸鉀混合物等)以及乙酸鹽緩衝劑(例如乙酸乙酸鈉混合物、乙酸-氫氧化鈉混合物等)。磷酸鹽緩衝劑、碳酸鹽緩衝劑、組胺酸緩衝劑、三乙胺鹽例如Tris、HEPES以及其它已知的此類緩衝劑均可以使用。
可加入防腐劑以阻滯微生物生長，加入量範圍可為0.2%-1%(w/v)。適用於本發明的防腐劑包括苯酚、苄醇、間甲酚、羥苯甲酸甲酯、羥苯甲酸丙酯、氯化十八烷基二甲基苄基銨、烷基二甲基苄基銨鹵化物(例如氯化物、溴化物和碘化物)、氯化己烷雙胺、羥苯甲酸烷酯如羥苯甲酸甲酯或丙酯、兒茶酚、間苯二酚、環己醇以及3-戊醇。
等滲劑的存在可確保本發明之液體組合物的生理等滲性，其包括多元糖醇、較佳的是三元或三元以上的糖醇，例如甘油、赤蘚醇、阿糖醇、木糖醇、山梨醇以及甘露醇。考慮到其它成分的相對含量，多元醇可以約0.1%至約25%(重)的含量存在，較佳的是1%至約5%。
穩定劑是指種類廣泛的賦形劑，其功能範圍可從填充劑至將治療劑溶解或有助於預防治療劑變性或黏在容器壁上的添加劑。典型的穩定劑可以是多元糖醇；胺基酸，如精胺酸、賴胺酸、甘胺酸、穀胺醯胺、天冬醯胺、組胺酸、胺基丙酸、鳥胺酸、L-亮胺酸、2苯基胺基丙酸、谷胺酸、蘇胺酸等；有機糖或糖醇、如乳糖、海藻糖、水蘇 糖、阿糖醇、赤蘚醇、甘露醇、山梨糖醇、木糖醇、核糖醇、肌醇、半乳糖醇、甘油等，包括環多醇如環己六醇；聚乙二醇；胺基酸聚合物；含硫還原劑，如尿素、谷胱甘肽、硫辛酸、硫基乙醇酸鈉、硫代甘油、α-單硫代甘油和硫代硫酸鈉；低分子量多肽(即<10殘基)；蛋白質，如人血清白蛋白、胎牛血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水聚合物、如聚乙烯吡咯烷酮、糖類；單糖，如木糖、甘露糖、果糖、葡萄糖；二糖，如乳糖、麥芽糖和蔗糖；三糖，如棉子糖；多糖，如右旋糖苷等等。穩定劑含量的範圍為活性蛋白的0.1至10,000倍(重)。
其他各種賦形劑包括填充劑(如澱粉)、螯合劑(如EDTA)、抗氧劑(如抗壞血酸、蛋胺酸或維他命E)以及共溶劑。
根據所治具體病症的需要，本文的配方也可包含一種以上活性化合物，較佳的是那些具有互補活性的化合物；這類互補活性不會在相互之間造成不良影響。例如，也許希望進一步提供一種免疫抑制劑。這類化合物分子以適宜的量結合，以有效地實現預期目的。
本文所用的術語「表面活性劑」是指具有兩親結構的有機物，即具有由相反溶解傾向的基團，通常是一個油溶性烴鏈和一個水溶性離子基，組成的結構。表面活性劑可根據表面活性基團所帶的電荷而劃分為陰離子型、陽離子型和非離子型表面活性劑。表面活性劑經常作為潤濕劑、乳化劑、增溶劑和分散劑，用於各種各樣的醫藥組合物以 及生物材料製劑。
可加入非離子型表面活性劑或洗淨劑(又稱為潤濕劑)以助於治療劑的增溶，並保護治療蛋白以避免振盪引起的聚集，也使得藥劑暴露於表面剪切應力而不會發生蛋白的變性。適宜的非離子型表面活性劑包括聚山梨酯(20、80等)、聚環氧烷(184、188等)、Pluronic®多元醇以及聚氧乙烯山梨糖醇酐單醚(TWEEN-20®、TWEEN-80®等)。非離子型表面活性劑的含量範圍可為約0.05mg/ml至約1.0mg/ml，較佳的是約0.07mg/ml至約0.2mg/ml。
本文所用的術語「無機鹽」是指任何因酸分子中一部分或所有氫原子被金屬或起金屬作用的基團置換而生成的不含碳化合物，並在醫藥組合物和生物材料製劑中經常作為滲透壓調節化合物。最常見的無機鹽是NaCl、KCl、NaH2PO4等。
本發明提供了一種含有抗CXCR5結合化合物或其局部的液體製劑，其pH值範圍為約5.0至約7.0，或約5.5至約6.5，或約5.8至約6.2，或約6.0。
本發明包括在醫生診所或實驗室的醫用冰箱和冷凍室溫度(如約-20℃至約5℃)下儲存時(例如約60天、約120天、約180天、約1年、約2年或以上)具有穩定性的液體製劑，上述穩定性是用例如高效尺寸排出層析法(HPSEC)來評估的。本發明的液體製劑在室溫下也顯示了至少幾小時的穩定性，例如根據HSPEC的評估，在使 用之前穩定1小時、2小時或約3小時。
術語「小分子」和類似術語包括但不限於肽、擬肽類物質、胺基酸、胺基酸類似物、聚核苷酸、聚核苷酸類似物、核苷酸、核苷酸類似物、分子量為每摩爾小於約10,000克的有機或無機化合物(包括雜有機和/或有機金屬化合物)、分子量為每摩爾小於約5,000克的有機或無機化合物、分子量為每摩爾小於約1,000克的有機或無機化合物、分子量為每摩爾小於約500克的有機或無機化合物，以及這類化合物的鹽、酯及其他藥學上可接受的形式。
因此，例如在癌症的情況下，本發明的抗體可以單獨使用，也可與其他類型的癌症治療劑結合使用，包括傳統的化療劑(紫杉醇(paclitaxel)、卡鉑(carboplatin)、順鉑(cisplatin)和阿黴素(doxorubicin))，抗EGFR劑(吉菲特尼(gefitinib)、得舒緩(erlotinib)和西妥昔單抗(cetuximab))，抗血管生成劑(癌思停(bevacizumab)和紓癌特(sunitinib))，以及免疫調節劑如干擾素α和沙利度胺(thalidomide)。
在另一項實施例中，在風濕性疾病如類風濕性關節炎(RA)的情況下，可使用一種含有本發明CXCR結合分子的複合治療劑。例如，一種人類化CXCR5抗體可與一種小分子結合使用，例如病情緩解抗風濕藥，包括但不限於甲胺蝶呤(methotrexate)和吡啶合成抑制劑如來氟洛米(leflunomide)(Mader & Keystone,J Rheum 34 Supp (16-24)2007,Gaffo et al.,Am J Health Syst Pharm 63：2451-2465,2006)。
由於各種形式的目的CXCR5結合分子可以是不清除B細胞的，本發明的分子可與具有重疊作用機制的其他藥物結合，以產生一種附加或協同的終點。因此，例如，第二種藥物可以是在T細胞軸上在細胞因子含量上起作用的藥物。
本文所用的術語「治療劑」是指可用於與異常CXCR5和/或CXCL13代謝和活性相關的疾病、障礙等的治療、管理或改善的任何藥劑。那可能表現於異常B細胞含量或B細胞活性。還有一些在與異常CXCR5和/或CXCL13代謝和活性相關的疾病、障礙等的治療中具有藥理學作用的已知化合物也包括在內。
此外，本發明的抗體可以與各種效應分子綴合，例如異源的多肽、藥物、放射性核苷酸或毒素，參閱例如WO 92/08495；WO 91/14438；WO 89/12624；美國專利5,314,995；以及EPO 396,387。一種抗體及其片段可與一種治療組分綴合，例如一種細胞毒素(例如一種細胞靜止劑或殺細胞劑)、一種治療劑或放射性金屬離子(例如α發射體如213Bi)。細胞毒素或細胞毒性劑包括任何損害細胞的試劑。其例子包括紫杉醇(paclitaxol)、松胞菌素B(cytochalasin B)、短桿菌肽D(gramicidin D)、溴乙啡啶(ethidium bromide)、依米丁(emetine)、絲裂黴素(mitomycin)、依託泊苷(etoposide)、替尼泊苷( tenoposide)、長春新鹼(vincristine)、長春鹼(vinblastine)、秋水仙鹼(colchicine)、艾黴素(doxorubicin)、唐黴素(daunorubicin)、二羥基蒽醌(dihydroxy anthracindione)、米托蒽醌(mitoxantrone)、普卡黴素(mithramycin)、放線菌素(actinomycin D)、1-去氫睾酮(1-dehydrotestosterone)、糖皮質激素(glucocorticoids)、普魯卡因(procaine)、丁卡因(tetracaine)、利度卡因(lidocaine)、普萘洛爾(propranolol)和嘌呤黴素(puromycin)及其類似物或同源物。治療劑包括但不限於抗代謝物(例如甲胺蝶呤(methotrexate)、6-巰基嘌呤(6-mercaptopurine)、6-硫代鳥嘌呤(6-thioguanine)、塞德薩(cytarabine)、5-氟脲嘧啶(5-fluorouracil)和氮烯咪胺(decarbazine))，烷基化劑(例如氮芥(mechlorethamine)、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、苯丙胺酸氮芥(melphalan)、亞硝基脲氮芥(carmustine(BSNU))和洛莫司汀(lomustine(CCNU))、環磷醯胺(cyclophosphamide)、硫酸布他卡因(busulfan)、二溴甘露糖醇(dibromomannitol)、鏈脲佐菌素(streptozotocin)、絲裂黴素C(mitomycin C)和順二氯二胺鉑(II)(DDP)順鉑(cisplatin))，蒽環黴素(anthracyclines)(例如道諾魯比辛(daunorubicin)、道諾黴素(daunomycin)和杜薩魯比辛(doxorubicin))，抗生素(例如更生黴素(dactinomycin)、放線菌素(actinomycin)、博萊黴素( bleomycin)、光神黴素(mithramycin)和胺茴黴素(anthramycin(AMC)))，以及抗有絲分裂劑(例如長春新鹼(vincristine)和長春花鹼(vinblastine))。
使一個治療組分與抗體綴合之類的技術是眾所周知的，參閱例如Arnon et al.,in Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy(單株抗體和癌症治療)，Reisfeld et al.(eds.),p.243-56 Alan R.Liss(1985)；Hellstrom et al.,in Controlled Drug Delivery(控制給藥)，2nd ed.,Robinson et al.,eds.,p.623-53,Marcel Dekker(1987)；Thorpe,in Monoclonal Antibodies '84：Biological And Clinical Applications(生物和臨床應用)，Pinchera et al.,eds.,p.475-506(1985)；Monoclonal Antibodies For Cancer Detection and Therapy(用於癌症檢測和治療的單株抗體)，Baldwin et al.,eds.,p.303-16,Academic Press(1985)；以及Thorpe,et al.,Immunol Rev(免疫學評論)62：119(1982)。或者，一種抗體也可以與第二種抗體綴合，以形成一種異源耦聯抗體，如雙功能抗體，參閱例如美國第4,676,980號專利。
本發明的綴合物可用於改變一定的生物反應，治療劑或藥物組分不應被理解為只限於傳統的化學治療劑。例如，該藥物組分可以是一種具有某種所需生物活性的蛋白或多肽。這類蛋白可包括，例如一種毒素，如相思豆毒蛋白、蓖麻毒蛋白A、假單胞菌屬外毒素，或白喉毒素；一種蛋白，如腫瘤壞死因子、α-干擾素、β-干擾素、神經生 長因子、血小板衍生生長因子、組織纖維蛋白溶酶原活化劑；一種凋亡劑，例如TNF-α、TNF-β、AIM I(WO 97/33899)、AIM II(WO 97/34911)、Fas配體(Takahashi et al.,Int Immunol,6：1567(1994)),VEGF(WO 99/23105)；一種血栓形成劑；一種抗血管生成劑，例如血管生長抑素或內皮細胞抑素；或生物反應修飾劑，例如淋巴因子、白細胞介素-1(IL-1)、白細胞介素-2(IL-2)、白細胞介素-6(IL-6)，粒細胞巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)、粒細胞集落刺激因子(GCSF)或其他生長因子。
用於體內施用的藥劑必須是無菌的。這可藉由例如無菌過濾膜過濾而實現。例如，本發明的液體藥劑可藉由用0.2μm或0.22μm過濾器過濾而滅菌。
可以製備緩釋型製劑。緩釋型製劑的適宜例子包括含有抗體的用固體疏水型聚合物製成的半滲透基質，該基質以成形物體的形式出現，例如薄膜或基質。緩釋型基質的例子包括聚酯、水凝膠(例如聚2-羥乙基甲基丙烯酸酯、聚乙烯醇、聚乳酸酯(美國第3,773,919號專利)、L-谷胺酸和乙基-L-谷胺酸酯的共聚物、不可降解的乙烯-醋酸乙烯酯、可降解的乳酸-乙醇酸共聚物(例如由乳酸-乙醇酸共聚物構成的可注射微球粒)以及聚-D-(-)-3-羥基丁酸。乙烯-醋酸乙烯酯和乳酸-乙醇酸之類的聚合物能夠釋放分子長達100天以上，但某些水凝膠釋放蛋白的時間則較短。取決於所涉及的機制，可以制訂出達到穩定的合理策略。例如，如果發現聚集機制是藉由硫代-二硫化物交 換而形成分子間的S-S鍵，那麼藉由修飾硫氫殘基、從酸性溶液冷凍乾燥、控制濕含量、使用適當的添加劑、胺基酸置換和開發特異的聚合物基質組合物就可以達到穩定。
抗體或其變體和組合物將以符合優良醫療規範的方式配製、定量以及施用。這方面考慮的因素包括包括所治的具體疾病、所治的具體哺乳動物、患者的臨床情況、致病原因、給藥部位、給藥方法、給藥方案以及醫療工作者所知的其他因素。即將施用的抗體或其變體的「有效治療量」將取決於這些考慮，並可以是為了預防、減輕或治療某種CXCR5疾病、症狀或障礙所必須的最低量。
作為一種選擇，抗體或其變體也可與目前用於預防或治療該疾病的一種或多種藥劑配製在一起。上述其他藥劑的有效量取決於藥劑中抗體的含量、疾病或治療的種類，以及上面討論的其他因素。這些量通常與此前所用的劑量一樣且藉由同樣的給藥途徑，或為此前所用劑量的約1至99%。
本文所用的術語「有效量」是指一種治療劑(例如一種預防藥劑或治療藥劑)的量，其足以降低某種CXCR5疾病的嚴重性和/或持續時間，減輕其一種或多種症狀，預防CXCR5疾病的發展或導致CXCR5疾病的消退，或足以產生防止CXCR5疾病或其一種或多種症狀的發展、復發、發作或惡化的效果，或足以加強或改善另一種用於治療CXCR5疾病的治療方式(例如另一種治療藥劑)的預防和/或治療效果。例如，以基線或正常量為基礎，本發 明的治療劑可將升高的B細胞量降低至少5%，較佳的是至少10%、至少15%、至少20%、至少25%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%，或至少100%。在另一項實施例中，一種治療藥劑或預防藥劑的有效量足以將某種CXCR5疾病如關節炎或移植排斥症的症狀降低至少5%，較佳的是至少10%、至少15%、至少20%、至少25%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%，或至少100%作為一種相當的術語，本文也使用「治療有效量」這一術語。
在某種疾病或狀況的治療中，治療用多肽、抗體或其片段的有效量將取決於該疾病或狀況的性質，並可藉由標準的臨床技術測定。當可能時，可先在體外試驗的條件下得出一種劑量-反應曲線以及本發明的醫藥組合物。如果具備一種適宜的動物模型系統，同樣可獲得一種劑量-反應曲線，並運用本技術領域已知的方法外推出一種適宜的人類劑量。但是，基於本技術領域的常識，一種能有效地降低炎症影響的醫藥組合物，可形成的局部治療劑濃度為例如約5至20ng/ml之間，較佳的是約10至20ng/ml之間。在本發明另一項特殊的實施例中，針對造成依賴於B細胞的自體免疫現象或移植排斥現象的細胞，一種能有效 地減緩其增生和存活的醫藥組合物，可形成的局部治療劑濃度為約10至100ng/ml之間。
在一項較佳的實施例中，一種治療用多肽、抗體或其片段的水溶液可以皮下注射的方式施用。每次劑量的範圍按每公斤體重計可為約0.5mg至約50mg，或較佳的是，按每公斤體重計為約3mg至約30mg。針對具體的疾病、患者群體、施用方式等，可採用本技術領域內已知的藥學方法憑經驗確定該劑量。
取決於許多臨床因素，包括疾病類型、疾病嚴重程度以及患者對治療劑的敏感度，皮下注射的劑量安排可在每週一次至每天一次的範圍內變化。
本發明提供了製備抗體或其CXCR5-結合片段的液體製劑的方法，其包括將純化抗體的一部分濃縮至約15mg/ml、約20mg/ml、約30mg/ml、約40mg/ml、約50mg/ml、約60mg/ml、約70mg/ml、約80mg/ml、約90mg/ml、約100mg/ml、約200mg/ml、約250mg/ml、約300mg/ml或更高的最終濃度，例如使用一種具有適當分子量(mw)限度度(例如對於F(ab')2片段的限度度為30KD；對於Fab片段的限度度為10KD)的半滲透膜來進行濃縮，以及任選地採用同樣的半滲透膜將濃縮的抗體部分滲濾至製劑緩衝液中。
此外，本發明也包括了穩定(例如KD穩定)的、改善體內半衰期的產品的液體製劑。因此，本發明的抗體在患者(較佳的是人)體內的半衰期為3天以上、7天以 上、10天以上、15天以上、25天以上、30天以上、35天以上、40天以上、45天以上、2月以上、3月以上、4月以上、5月以上或更長。
為了延長抗體在體內的血清循環，可採用各種各樣的技術。例如，惰性聚合物分子如高分子量聚乙二醇(PEG)，可以藉由PEG的位點特異性綴合或藉由賴胺酸殘基上的ε胺基連接到抗體的N-端或C-端上，其中可以經過一個多功能連接子，也可以不經過。可以採用導致生物活性損失最小的直鏈或支鏈聚合物衍生。綴合程度可藉由SDS-PAGE和質譜密切監測，以確保PEG分子與抗體的妥善綴合。未反應的PEG可藉由尺寸排除法或離子交換色譜法與抗體-PEG綴合物分離。採用本領域專業人員已知的方法，例如本文所述的免疫測定法，可以測定PEG衍生抗體的結合活性以及體內功效。
在體內具有較長半衰期的抗體，也可藉由將一個或多個胺基酸修飾(即取代、插入或缺失)引入IgG恆定區或其FcR結合片段(如Fe或鉸鏈Fe區域片段)來產生，參閱例如WO 98/23289；WO 97/34631；以及美國第6,277,375號專利。
而且，抗體可與白蛋白綴合使得抗體在體內更穩定，或在體內具有較長的半衰期。這些技術是本領域內眾所周知的，參閱例如WO 93/15199、WO 93/15200和WO 01/77137；以及EPO 413,622。抗體也可藉由其他方法來修飾，例如糖基化、乙醯化、磷醯化、醯胺化、用已知保 護劑/封端劑實現衍生化、蛋白水解裂解、與一種細胞配體或其他蛋白實現鍵合等。
在一項實施例中，按照常規步驟將該組合物配製成適合於人類靜脈給藥的醫藥組合物。通常，靜脈給藥的醫藥組合物是以無菌等滲緩衝水溶液配製的溶液。在必要的場合，該組合物也可包含一種穩定劑和局部麻醉劑如利度卡因或其他「卡因」類麻醉劑，以減輕注射部位的疼痛。通常，各種成分是以單位劑量的形式單獨供應或混合後供應，例如作為一種凍乾粉末或無水濃縮物裝在一種密封容器中，如安瓿瓶或小袋，並標明有效成分的量。當醫藥組合物以輸注方式給藥時，可藉由裝有無菌醫藥級水或鹽水的輸注瓶給藥。當醫藥組合物以注射方式給藥時，可提供裝有無菌注射用水或鹽水的安瓿瓶，例如以套組形式提供，使得醫藥成分可在注射前先混合。
本發明也說明，本發明的液體製劑是裝在一種密封容器中，如安瓿瓶或小袋，並標明產品的量。本發明的液體製劑可裝在一種密封容器中，並標明抗體或抗體片段的量和濃度。例如，本發明的液體製劑可裝在一種密封容器中，其CXCR5抗體濃度至少為15mg/ml、20mg/ml、30mg/ml、40mg/ml、50mg/ml、60mg/ml、70mg/ml、80mg/ml、90mg/ml、100mg/ml、150mg/ml、200mg/ml、250mg/ml，或300mg/ml，抗體量為1ml、2ml、3ml、4ml、5ml、6ml、7ml、8ml、9ml、10ml、15ml或20ml。
提供了一種含有對上述疾病治療有用物質的製造產品。該製造產品包括一個容器和一個標簽。適宜的容器包括例如瓶子、小瓶、注射器和試管。容器可用各種材料製造，例如玻璃或塑膠。該容器容納能有效地診斷、預防或治療CXCR5症狀或疾病的組合物，並可設有一個無菌入口(例如該容器可以是一種靜脈注射液小袋或小瓶，設有一個能被皮下注射針頭刺破的塞子。)容器上貼的標簽或附帶的標簽標明該組合物是用於治療所選的症狀。該產品還可包括第二個容器，裝有藥學上可接受的緩衝液，如磷酸緩衝鹽水、任格氏(Ringer's)溶液和葡萄糖溶液。它還可包括從商業和用戶的立場看來所需的其他材料，包括緩衝液、稀釋劑、過濾器、針頭、注射器以及使用說明等附帶文字說明。
在本發明的另一方面，以基因治療的方式，施用含有編碼抗體或其功能衍生物之序列的核酸，以治療、抑制或預防與CXCR5的異常表現和/或活性相關的疾病或障礙。基因治療是指藉由給患者施用一種表現或可表現的目的核酸而進行的治療。在本發明的該實施例中，核酸在介導某種治療作用的目標宿主細胞中並在其作用下，產生被編碼的蛋白。任何可供利用的基因治療方法均可按照本發明而使用。
關於基因治療方法的一般評論，可參閱Goldspiel et al.,Clinical Pharmacy 12：488(1993)；Wu et al.,Biotherapy 3：87(1991)；Tolstoshev,Ann Rev Pharmacol Toxicol 32：573(1993)；Mulligan,Science 260：926(1993)；Morgan et al.,Ann Rev Biochem 62：191(1993)；以及May,TIBTECH 11：155(1993)。
在一個方面，該化合物含有編碼抗體或其功能結合片段的核酸序列，上述核酸序列是在一個適宜的宿主細胞中表現抗體或其片段或嵌合蛋白或重鏈或輕鏈的表現載體的一部分。尤其是，此類核酸序列具有以可操作方式與抗體編碼區以及其他調控序列連接的啟動子，該啟動子是誘導型或組成型啟動子，也可具有組織特異性。
在另一項較佳的實施例中，使用了某些核酸分子，其中抗體編碼序列和任何其他所需序列的側面具有在該基因組所需位點促進同源重組的區域，從而為該編碼抗體的核酸在染色體內的表現創造了條件(Koller,et al.,Proc Natl Acad Sci USA 86：8932(1989)；Zijlstra et al.,Nature 342：435(1989))。在一項特殊的實施例中，被表現的抗體分子是一種單鏈抗體，或者，該核酸序列包括同時編碼該抗體的重鏈和輕鏈或其片段的序列。其他整合方法包括使用特定的能識別特定核酸序列、鋅指等的轉錄因子。
將核酸輸入患者體內的方式可以是直接的，也可以是間接的。在直接情況下，患者是直接與核酸或載有核酸的載體接觸；在間接情況下，首先在體外用核酸轉化細胞，然後移植至患者體內。
在一項實施例中，核酸序列被直接輸入體內，並被表現以產生編碼產物。這可用本技術領域內周知的許多方法 中的任何一種來實現，例如構建和施用作為適宜核酸表現載體一部分的抗體編碼序列，使得該載體進入細胞內，例如藉由使用缺陷型或減毒型逆轉錄病毒或其他病毒載體感染(參閱美國專利4,980,286)；藉由直接注射裸露DNA；藉由使用微粒轟擊(例如基因槍；生物導彈，Dupont)；藉由使用非病毒載體，如含有兩親化合物的合成組合物，該兩親化合物與親水核酸結合並能夠與細胞融合，從而通常含有一個與胞膜結合的疏水部分；藉由用脂質或細胞表面受體或轉染劑塗覆，封裝於脂質體、微粒或微膠囊中；藉由施用與一種肽連接的載體(已知該肽將進入胞核)；藉由施用與一種配體連接的載體(該配體將受到受體介導的胞吞作用，該胞吞作用可用於瞄準特異表現該受體的細胞)(參閱例如，e.g.,Wu et al.,J Biol Chem 262：4429(1987))；等等。在另一實施例中，可形成核酸一配體絡合物，其中該配體含有一種融合病毒肽以擾亂核內體，從而使核酸可避免溶酶體降解。在又一個實施例中，藉由瞄準一個特定的受體，可在體內對準核酸以達到細胞特異的吸收和表現(參閱WO 92/06180；WO 92/22635；WO 92/20316；WO 93/14188以及WO 93/20221)。
關於載體，如本技術領域內周知，例如可以使用一種慢病毒載體。即將用於基因治療的編碼抗體的核酸序列被選殖進一個或多個載體，這些載體有助於把基因傳遞給患者。例如，一種慢病毒可用於將一種轉基因傳給造血幹細胞。顯示逆轉錄病毒載體在基因治療中應用的參考文獻如 下：Clowes et al.,J Clin Invest 93：644(1994)；Kiem et al.,Blood 83：1467(1994)；Salmons et al.,Human Gene Therapy 4：129(1993)；以及Grossman et al.,Curr Opin Gen and Dev 3：110(1993)。
腺病毒也可用於本發明。基於腺病毒的給藥系統的靶器官為肝、中樞神經系統、內皮細胞和肌肉等。腺病毒感染非分裂細胞，這是比先前的逆轉錄病毒載體優越之處。Kozarsky等在Curr Opin Gen Dev 3：499(1993)中回顧了基於腺病毒的基因治療。Bout等在Human Gene Therapy 5：3(1994)中展示了利用腺病毒將基因轉移至恆河猴的呼吸上皮細胞。關於在基因治療中利用腺病毒的其他例子可參閱Rosenfeld et al.,Science 252：431(1991)；Rosenfeld et al.,Cell 68：143(1992)；Mastrangeli et al.,J Clin Invest 91：225(1993)；WO94/12649；以及Wang et al.,Gene Therapy 2：775(1995)。
腺相關病毒(AAV)也可用於基因治療(Walsh et al.,Proc Soc Exp Biol Med 204：289(1993)；以及美國專利5,436,146、6,632,670和6,642,051)。
基因治療的另一種手段涉及以電穿孔、脂質轉染、磷酸鈣介導的轉染或病毒感染等方法將基因轉移至組織培養液的細胞內。通常，該轉移方法包括給細胞引入一種可選擇的標記。然後將細胞置於一個選擇過程中，分離出那些接受並表現引入基因的細胞。然後將那些細胞移入患者體內。
因此，可在生成的重組細胞移入體內之前先將核酸引入細胞。這樣的引入過程可以本技術領域內已知的任何方法實現，包括但不限於轉染、電穿孔、顯微注射、用含有核酸序列的病毒或噬菌體載體感染，細胞融合、染色體介導的基因轉移、微細胞介導的基因轉移、原生質球融合等。將外部基因引入細胞的許多技術都是本領域內周知的(參閱例如Loeffler et al.,Meth Enzymol 217：599(1993)；Cohen et al.,Meth Enzymol 217：618(1993)；以及Cline Pharm Ther 29：69(1985))，並可按照本發明加以利用，但前提是該接受細胞必要的發育和生理功能未受到干擾。該技術應該將核酸穩定地引入細胞，使核酸能被細胞表現、可遺傳並被細胞後代表現。
生成的重組細胞可以本技術領域內已知的各種方法引入患者體內。重組血細胞(例如造血幹細胞或祖細胞)以靜脈注射為佳。預期使用細胞的數量取決於所期待的效果、患者狀況等，可由本技術領域專業人員決定。
出於基因治療目的而可將核酸引入的細胞包括任何所需的、可利用的細胞類型，包括但不限於上皮細胞、內皮細胞、角質細胞、成纖維細胞、肌肉細胞、肝細胞、血細胞如T淋巴細胞和B淋巴細胞、單核細胞、巨噬細胞、中性粒細胞、嗜曙紅細胞、巨核細胞以及粒細胞；各種幹細胞或祖細胞，尤其是造血幹細胞或祖細胞，例如從骨髓、臍帶血液、末梢血液、胎肝等獲得的細胞。
在一項實施例中，用於基因治療的細胞是患者自身 的。編碼本發明之抗體的核酸之引入方式使得該轉基因可由細胞或它們的後代表現，然後該重組細胞被輸入體內以產生治療作用。在一項專門的實施例中，使用了幹細胞或組細胞。任何能被分離並在體外維持的幹細胞和/或組細胞都有可能按照本發明的實施例加以利用(參閱例如WO 94/08598；Stemple et al.,Cell 71：973(1992)；Rheinwald Meth Cell Bio 21A：229(1980)；以及Pittelkow et al.,Mayo Clinic Proc 61：771(1986))。因為CXCR5在例如B細胞上表現，所以血細胞和骨髓細胞是適宜的宿主細胞。但是，本發明關於使用幹細胞宿主的範圍並不包括製備和利用轉基因，以藉由將目的轉基因引入胚胎和胚胎幹細胞而製備轉基因生物體。
本發明藉由給患者施用有效量的例如本發明的液體製劑而提供了治療、預防和改善CXCR5疾病或其一種或多種症狀的方法。患者最好是一種哺乳動物，如非靈長類(例如牛、豬、馬、貓、狗、大鼠等)和靈長類(例如猴如獼猴，以及人類)。在一項首選的實施例中，患者是人。
CXCR5也可表現在某些癌細胞中，如胰腺、結腸、膀胱，以及白血病T細胞(Qinping et al.,Oncogene 24：573-584,2005)，和白血病B細胞(Burkel et al.,Blood,Jul 2007；doi：10.1182/blood-2007-05-089409)，且CXCR5的刺激與癌細胞的增殖相關(Meijer et al.,Canc Res 66：9576-9582,2006)。
因此，目的抗體或其衍生物可用於控制表現CXCR5的癌細胞的增殖，上述癌症是藉由以本文教示的診斷分析來測定CXCR5表現的存在而確定的。目的抗體可降低惡性細胞的浸潤、減少對凋亡的抵抗以及儘量減少增殖。然後給這類患者施用一定量的本文所提供的目的抗體或其衍生物，以抑制癌細胞的增殖。
自身免疫性疾病與CXCL13的異常表現和/或高度表現相關，如狼瘡(Ishikawa et al.,J Exp Med 193：1393-1402,2001)和休格倫氏綜合症(Salomonsson et al.,Scan J Imm 55：336-342,2002；以及Barone et al.,Arth Rheum 52(6)1773-1784,2005)，或與CXCR5的高度表現相關，如重症肌無力(Sims et al.,J Imm 167：1935-1944,2001；Saito et al.,J Neuroimm 55：336-342,2005；以及Tackenberg et al.,Eur J Imm 37：849-863,2007)。因此，用一種目的抗體將CXCL13或CXCR5配體的高含量或高活性降低至最低限度。在以B細胞的高含量、CXCR5或CXCL13或其它CXCR5配體的高含量為特徵的自身免疫性疾病中，如本文所教示，施用了一種其劑量足以抑制B細胞活性的目的抗體。
在多發性硬化症中，觀察到了CXCR5的異常表現(Brain 129(Pt 1)200-211,2006)。
在結腸炎中，CXCR5在GALT的形成和功能中起一定作用(Carlsen et al.,Gut,2002,51(3)364-367)。CXCR5介導的B細胞向腸黏膜固有層的遷移和浸潤，以 及一般的黏膜浸潤(Mazzucchelli et al.,J Clin Invest,1999,104(10)R49-R54)，及其在潰瘍性結腸炎病變部位及其在潰瘍性結腸炎病變部位(其包含異位生發中心)的表現，被一種目的抑制。
在某些情況下和某些症狀如類風濕性關節炎中，B細胞的減少可在減輕症狀方面產生治療效益(Oligino & Dalrymple,Arth Res Ther 5(Suppl 4)S7-S11,2003)。與未患類風濕性關節炎的人相比，CXCR5在關節炎患者的滑液組織中表現含量很高(Schmutz et al.,Arth Res Ther 7：R217-R229,2005)。因此，某些形式的本發明的抗體及其衍生物能夠減少B細胞數量，並能預防B細胞在關節中的浸潤和相互作用。相應地，治療方法可包括給經診斷為關節炎的患者施用一種其劑量足以降低B細胞含量的目的抗體。該抗體可局部地注射至受影響的關節。
在某些情況下，包括牛皮癬關節炎(Canete et al.,Ann Rheum Dis,Jan 12,2007,doi：10：1136/ard.2006.062042)、一般的慢性炎症(Aloisi & Pujol-Borrell,Nat Rev Imm 6：205-217,2006)以及慢性(Baddoura et al.,Am J Trans 5：510-516,2005)和急性(DiCarlo et al.,Am J Trans 7：201-210,2007)的移植排斥，觀察到了異位淋巴樣再生。CXCL13和CXCR5存在於心臟移植的情況(DiCarlo et al.，同上)；CXCL13存在於牛皮癬關節炎的情況(Canete et al.，同上)。如在正常的淋巴結處所發現的那樣，CXCL13和/或CXCR5的存在與B細胞和T細 胞部位的異位淋巴結發展有關。異種抗原的B細胞抗原呈遞也與急性心臟同種異體移植模型有關(Noorchashm et al.,J Imm 177：7715-7722,2006)。
因此，目的抗體可用於減輕發炎和移植排斥。於是在移植手術之前或之後，給患者施用一種其劑量足以降低B細胞活性的本發明之抗體，以減輕發炎、儘量減緩異位生發中心的發展、儘量減少移植後B細胞的恢復，以及儘量降低B細胞異種抗原呈遞。
本發明將以下列非限制性實施例進一步加以說明。這些實施例描述了某些本發明可藉以實施的實施例。
實施例1：免疫原的產生
抗CXCR5單株抗體可以針對用編碼全長人CXCR5並表達於細胞表面上的DNA轉化的CHO細胞(「r-CXCR5-CHO細胞」)產生。用來轉化該細胞的CXCR5序列如NM 001716.2、NC000011.8或NM001716可以從資料庫獲得，並且可以從合適的細胞來源中合成或分離。
將CXCR5可讀框置於表達載體如pCDNA3.1neo_DEST內，並且隨後轉染至300-19細胞(免疫原)。
另外，將具有胺基酸序列MNYPTLEMDLENLEDLFWELDRLDNYNTSLVENHLC(SEQ ID NO：1)的CXCR5 EC結構域藉由羧基末端的半胱胺酸綴合至KLH，並且用作免疫原。腹膜內(IP)施用表達 CXCR5或CXCR5 EC結構域的細胞(0.2ml中的5×106個細胞或100μl緩衝液中的50μg肽，任選地與100μl佐劑如弗氏完全佐劑混合)。抗原注射每隔兩周加以重複直至使用本領域多種已知方法，例如藉由使用例如可以由例如FACS分離的CXCR5+細胞以及例如市售MAB190(R & D Systems)作為陽性對照的ELISA或FACS，在血清中檢測到高滴度CXCR5抗體。
表達CXCR5的細胞在37℃於5%CO2下在補加10%透析的胎牛血清(FBS)(Invitrogen)的RPMI(Invitrogen,Carlsbad,CA)中維持。藉由用補加5mM EDTA的磷酸鹽緩衝(無Ca/Mg)鹽水(CMF-PBS)置換上述培養基並在該緩衝液內收穫細胞而製備用於注射的細胞。收穫的細胞藉由在500×g離心約5分鐘而沉澱、藉由將該沉澱重懸於CMF-PBS中並如前離心而洗滌一次、計數並且藉由將細胞沉澱重懸於CMF-PBS中而調整至用於注射的適宜體積(如0.2ml中的5×106個細胞)。
如所提及，CXCR5表達例如藉由FACS分析法，使用市售CXCR5抗體，如MAB190(R & D)、抗體株RF8B2和2G8(2G8是大鼠抗小鼠CXCR5抗體，而其它的購買抗體是抗人CXCR5抗體)(BD)及2C1(Abnova)以及針對hCXCR5的多種多株抗體，實施本領域已知方法而監測。
為方便質體構建和為了增強CXCR5的表達，產生對應於包含CXCR5核酸編碼序列的前135個堿基對的前導 肽序列的寡核苷酸。所述寡核苷酸在擺動位置內含有一些改變以降低GC含量。全部核苷酸序列改變是沉默性的，即不產生胺基酸序列改變。在寡核苷酸複性後，將改造的前導肽編碼序列藉由PCR-SOE(Ho等，Gene 77：51(1989)和Horton等，BioTechniques 8：528(1990))與編碼序列的剩餘部分連接。
CXCR5的表達在作為免疫原使用之前進行驗證。細胞在含有10%FBS、0.2mM穀胺醯胺和1×非必需胺基酸溶液的RPMI(Invitrogen,Carlsbad,CA)中培養，隨後在T75培養瓶中接種每孔約3-5×105個細胞並且培育大約24-48小時。
轉化或轉染的細胞培養約二周直至不攜帶CXCR5表達質體的細胞藉由抗生素選擇被消除。可以將穩定細胞系的細胞裂解、獲得蛋白質並進行蛋白質印跡分析。
使用用於檢測CXCR5的細胞表面表達的方法，如藉由FACS分析而對穩定或暫態轉染的細胞分析CXCR5的表達。另外，可以將細胞裂解並研究蛋白質，例如藉由蛋白質印跡分析進行。從培養皿中收穫的轉染細胞用磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)洗滌一次並重懸於去離子水中，與等體積2×蛋白質樣品加樣緩衝液(BioRad,Hercules,CA)混合並且隨後在約100℃加熱10分鐘。膜蛋白使用與等體積2×蛋白質樣品加樣緩衝液混合並在100℃加熱10分鐘的條件培養基進行分析。樣品使用4-12%梯度SDS-PAGE而分開。將蛋白質從凝膠轉移至硝酸纖維素膜(BioRad, Hercules,CA)，其中所述的硝酸纖維素膜在轉移蛋白質之前用PBST(含0.05% TWEEN-20®的PBS)中的5%脫脂乳封閉至少一小時。
CXCR5藉由將膜與封閉緩衝液中的CXCR5特異性一級抗體在室溫下溫育振搖至少一小時而檢測。將膜洗滌至少三次並且將封閉緩衝液中的報導分子綴合的第二抗體添加至該膜上並在室溫下溫育振搖至少一小時。將膜在PBST中洗滌三次並且用例如化學發光底物進行顯色。
實施例2：抗CXCR5單株抗體的產生
約4-6周齡的A/J或BALB/cJ小鼠(Jackson Labs,Bar Harbor,ME)用CXCR5轉染的細胞或EC肽免疫。一組小鼠在第0日用與佐劑(CFA)混合的KLH綴合肽的1：1乳劑進行腹膜內初免，在第20日用含IFC(弗氏不完全佐劑)的所述肽和/或在無佐劑的PBS中的細胞進行靜脈內加強免疫，並且最終在第44日用混在IFC中的KLH-肽或在無佐劑的PBS中的細胞進行靜脈內加強免疫。另一組小鼠在第0日進行腹膜內初免，在第15、39、53和67日進行加強免疫，並且最終在第81日進行靜脈內加強免疫(全部小鼠用PBS中的細胞在無佐劑下注射)。對於這兩組小鼠，每一注射含有在大約200μl體積中的大約3×106-2×107個細胞。備選地，肽和/或細胞免疫每隔兩周進行一次，實施3-6次直至獲得想要的抗CXCR5滴度，如藉由FACS分析或ELISA確認。
在最後注射後3日，對小鼠任選地測試血清中的抗CXCR5抗體滴度，將小鼠處死並且取出脾臟並將其置於培養皿中的大約10ml無血清DMEM(Gibco)內。脾細胞使用鉗狀骨針從被膜中撕下並在37℃的10ml無血清IMDM(Cellgro,Herndon,VA)中洗滌兩次。將脾細胞混懸液轉移至15ml錐底管中並且使碎片下沉約2-5分鐘。將含有脾細胞的上清液轉移至新鮮的15ml錐底管中且用IMDM另外洗滌三次直至融合。可以彙集來自小鼠的脾細胞。
任選地，5ml對照性脾飼養細胞的單細胞混懸液從非免疫小鼠中如上文對免疫脾細胞所述加以製備並且置於培養箱(37℃，5%CO2)中直至需要。
用於免疫脾細胞的融合配對組合可以是次黃嘌呤/胺基蝶呤/胸苷(HAT)敏感性非分泌性骨髓瘤細胞系，如P3X63-AG8.653或SP2/0(ATCC,Manassas,VA)或FO_B淋巴母細胞(ATCC,CRL-1646))。融合前，將淋巴樣細胞在IMDM/10% FBS(37℃，7%CO2)中維持，確保該細胞在融合當日處於對數生長期。替代性選擇機制依賴於使用重氮絲胺酸，其一般在融合後1日添加。
所用融合方法是在Lerner(Yale J Biol Med,1981,54(5)387-402)和Gefter等(Somatic Cell Genet,1977,3(2)231-236)中所述方法的綜合。融合前，將彙集的脾細胞用無血清IMDM洗滌三次並計數。另外，緊鄰融合前，將對數期骨髓瘤細胞用無血清IMDM洗滌三次並計數。淋 巴樣細胞在無血清IMDM中重懸至1×107個細胞/ml。對於每次融合，將1-1.5×108個脾細胞與1-3×107個骨髓瘤細胞在50ml錐底聚丙烯管中混合，並且將細胞用無血清IMDM洗滌一次。脾細胞對骨髓瘤細胞的比例是5：1。將該管在500×g離心10分鐘以沉澱細胞。在吸出上清液後，藉由敲擊管底部而柔和地重懸沉澱。隨後將該管置於具有37℃水的燒杯中。全部後繼融合步驟在此燒杯內實施。
其次，將預熱至37℃的1ml聚乙二醇1500(Roche Applied Science,Indianapolis,IN)經約1小時時間緩慢地添加至每個細胞沉澱中，同時柔和地振動試管。細胞在PEG中溫育約一分鐘，隨後經約30秒時間逐滴添加1ml無血清IMDM至每個沉澱中，並且隨後將9ml無血清IMDM經又一分鐘添加至每個沉澱上。將兩支管在室溫於500×g離心10分鐘並且抽出上清液。細胞沉澱重懸在100ml濾過的完全雜交瘤生產培養基(與10%FBS(SeraCare,Millford,MA)、0.2mM L-穀胺醯胺、1×非必需胺基酸溶液、1mM丙酮酸鈉、0.01%青-鏈黴素(Invitrogen)和1×HT補充物(Invitrogen)混合的500ml IMDM(Cellgro))。
將每份100ml細胞混懸液以體積約100μl/孔鋪種在10個96孔平底微量滴定平板中。將平板保持在37℃含7%CO2的培養箱中。在融合後第2日，藉由添加每孔100μl在IMDM中的5.7μM重氮絲胺酸至融合細胞而選擇細 胞。從含有殖株的孔內抽取上清液用於初次篩選，一般在融合後10-14日。融合效率是75-99%(960個可能的孔中720-950個孔形成受到篩選的殖株)。
初次篩選可以是設計旨在檢測與人CXCR5結合的抗體的放射免疫測定法(RIA)。為開展RIA，添加在PBS中親和純化的山羊抗小鼠IgG(Fc片段特異性)(Cappell,Cochranville,PA)至96孔PVC微量滴定平板(50μl/孔)並在4℃溫育過夜。從平板中移去山羊抗小鼠IgG並且將孔用100μl/孔的5%FCS/PBS在室溫封閉1小時。在移去封閉液後，添加淨的雜交瘤培養上清液至孔(50μl/孔)中並在室溫溫育1小時。平板用PBS/0.05% Tween-20洗滌三次。其次，將50μl在PBS/5%FCS中的125I-CXCR5(~20,000cpm)添加至各孔，並且在室溫溫育1小時。最後，孔用PBS/0.05% Tween-20洗滌三次。在拍去全部洗滌緩衝液後，切開平板而將培養孔分開並在γ計數器中分析。向其添加5%FCS/PBS替代培養上清液的孔充當背景孔。
純化的CXCR5根據Bolton-Hunter法，基本上如Bolton-Hunter試劑供應商(New England Nuclear,Boston,MA)所述用125I標記。125I-CXCR5的品質藉由證實標記過程未摧毀由市售CXCR5抗體(R & D或Becton Dickinson,Mountain View,CA)識別的表位而監測。
若上清液樣品在RIA中高於背景大約10倍地受到標記，則認為殖株在初次篩選時呈陽性。將陽性殖株彙集、 擴充並冷凍貯存。
設計雜交瘤初級篩選法以確定抗體是否識別天然CXCR5表位。如此實現這一點，即藉由FACS分析展示在用單株抗體染色的CXCR5+細胞上的細胞表面CXCR5，使結合作用以螢光標記山羊抗小鼠第二抗體可見。若上清液樣品在FACS分析中高於背景大約10倍地受到標記，則認為殖株在初次篩選時呈陽性。另外，為定位由抗體結合的CXCR5表位，用CXCR5抗體實施競爭分析。將陽性殖株選出、擴充並冷凍貯存。
實施例3：用於抗CXCR5單株抗體的基於細胞的結合分析法
基於細胞的結合分析法用來表徵抗CXCR5單株抗體。例如，可以使用上文所述的表達CXCR5的轉染細胞如hCXCR5/HEK293。將全長人CXCR5可讀框選殖至載體例如pCDNA3.1neo DEST(Invitrogen,Carlsbad,CA)。CXCR5編碼區藉由使用人腦及肝臟RNA(Ambion,Inc.,Austin,TX)作為範本的RT-PCR而合成。最終質體構建體CXCR5/CDNA3.1neo表達了全長CXCR5蛋白。表達CXCR5的穩定細胞系藉由使用標準和市售的Lipofectamine 2000試劑套組轉染CXCR5/pCDNA3.1neo質體構建體至CHO或HEK293細胞(ATCC編號CRL-1573)而產生。轉染後，細胞在DMEM中培養過夜，隨後在含有200μg/ml新黴素的培養基中再接並且培養12- 14日。挑出分離的單個集落並且在單獨的孔內培育直至擴增足夠的殖株細胞。抗新黴素的和表達高量CXCR5蛋白的穩定殖株藉由使用抗CXCR5多株抗體(R&D Systems,Minneapolis,MN)或定制產生的多株抗體的FACS分析而鑒定。
天然表達CXCR5的人HS Sultan細胞(ATCC編號CRL-1484)也藉由FACS分析驗證了CXCR5表達。HS Sultan細胞在含有10%胎牛血清、0.2mM穀胺醯胺和0.1%青/鏈黴素溶液(100μg/ml青黴素與10μg/ml鏈黴素)的RPMI 1640中培育。
基於細胞的抗體結合作用可以使用FMATTM(螢光宏觀共聚焦高通量篩選法(fluorescence macro-confocal high-throughput screening))8100 HTS或8200細胞檢測系統(Applied Biosystems,Foster City,CA)，按照由製造商提供的方案進行評估。天然表達CXCR5的或用CXCR5表達構建體穩定轉染的細胞系在96孔平板中接種。備選地，在96孔平板中接種暫態轉染的293T或CHO細胞。細胞以密度5,000-30,000個細胞/每孔接種。20-24小時後，將抗CXCR5單株抗體和FMAT-綴合的山羊抗小鼠IgG抗體一併添加至孔內並且在室溫下溫育1小時、2小時、4小時或過夜。
基於細胞的抗體結合作用還藉由使用表達CXCR5的HEK293/CXCR5穩定細胞系的FAC進行評估。細胞與PBS中的抗CXCR5單株抗體溫育。在洗滌三次後，將細 胞與螢光分子綴合的第二抗體(BD Sciences,Palo Alto,CA)溫育。
結果顯示幾種單株抗體結合從重組質體構建體中表達的CXCR5。例如，測試了抗體株11D6、14C9、19H5、H28、54G6、G7、56H6、79B7和16D7以及抗體16D7的人類化變體16D7-HC1-LC3、16D7-HC1-LC2、16D7-HC1-LC1和16D7-HC2-LC1、陰性對照IL13抗體CA13、陽性對照MAB190、2C1和RF8B2、三種針對IgG1、IgG2a和IgG2b的小鼠同種型對照以及大鼠IgG2b同種型對照(與RF8B2匹配)與被轉染以表達CXCR5的HEK293細胞的結合作用。2C1和MAB190陽性對照抗體與CXCR5細胞結合。RF8B2顯示中等結合量。陰性對照抗體僅顯示背景結合作用。除CA13之外的全部抗體以如親代抗體16D7和79B7那樣的相似結合曲線和滴定動力學與hCXCR5/HEK293細胞結合。
含有CXCR5/neo質體的暫態轉染HEK293細胞也用如上所述的免疫螢光法染色並且藉由螢光顯微鏡觀察。基於細胞的FMAT和FACS分析證實單株抗體確實與從重組質體構建體中或作為培養細胞中天然蛋白質表達的CXCR5結合。陽性結合信號基於顯著高於背景結合作用和陰性雜交瘤株(p>0.01)的FMAT信號讀數而確定。
產生的CXCR5單株抗體(如16D7、14C9、19H5、H28、54G6、G7、56H6及79B7)與EC結構域結合並阻斷CXCL13與細胞上的CXCR5結合。
實施例4：BIACORE親和力分析
來自人和小鼠的CXCR5的胺基末端EC區(胺基酸1-59)隨末端標籤生物素一起合成，並且在正向模式(forward format)Biacore分析法中使用，其中將肽固定於Biacore晶片上並且隨後測定抗體與晶片上的肽相互作用的動力學。合成性肽以大約20個應答單位(RU)固定在Biacore晶片上。隨後使單株抗體按照製造商推薦(GE Healthcare,Piscataway,NJ)暴露於該晶片以便測量動力學。
小鼠抗hCXCR5單株抗體株16D7具有計算的KD 2.16-12M；小鼠/人IgG4嵌合16D7(移植至人IgG4 Fc上的16D7 VH和VL區，其序列是本領域已知的，任選地是密碼子優化的，使用標準方法如選殖法、末端擴增法確認所述區域的質量並選殖所述部分)具有KD 1.41-12M；並且就移植至IgG4主鏈上的16D7的多種人類化變體而言，其中變體的結構及其重鏈和輕鏈的衍生化由用於特定重鏈的「HC_」和用於特定輕鏈的「LC_」術語說明，其中鏈的組成在下文提供，16D7-HC1-LC1具有KD3.11-12M；16D7-HC1-LC2具有KD1.41-12M；16D7-HC2-LC1具有KD2.40-12M；16D7-HC1-LC3具有KD1.21-12M；16D7-HC3-LC4具有KD4.92-12M；16D7-HC3-LC5具有KD1.84-10M並且16D7-HC1-LC6具有KD9.17-11M。
一種含有人類IgG4恆定域並在鉸鏈區內含有兩個胺 基酸取代的人類化和嵌合的16D7、帶有S241P和L248E替代的16D7-HC1-LC3(替代透過採用已知方法和試劑用卡巴特編號進行)，在Biacore晶片上由預固定的小鼠抗人IgG Fc抗體捕獲，並隨後用於反向分析模式Biacore分析法，其中測定了未加標籤的人CXCR5胺基末端肽(胺基酸1-59)與該晶片上的單株抗體相互作用的動力學。該含有人類IgG4恆定域並在鉸鏈區內含有兩個胺基酸取代的人類化和嵌合的16D7的KD被確定是1.13±0.08-11M。使用固定在晶片表面上的生物素化的人肽和該含有人類IgG4恆定域並在鉸鏈區內含有兩個胺基酸取代的人類化和嵌合的16D7作為分析物，以正向分析法測定的KD值與使用反向分析法獲得的那些KD值是一致的。
實施例5：抗CXCR5單株抗體結合活性的蛋白質印跡分析
開展蛋白質印跡法以評估變性條件下抗CXCR5單株抗體對CXCR5的結合活性以及人細胞系中CXCR5和其它CXCR5相關性蛋白質的表達量。蛋白質樣品也從穩定轉染的細胞中，使用M-PER哺乳動物蛋白質提取試劑套組(Pierce,Rockland,IL，目錄編號78501)按照製造商說明書製備，並且在添加等體積的2×蛋白質樣品加樣緩衝液後在70℃加熱10分鐘。全部樣品藉由電泳在4-12%梯度SDS-PAGE凝膠中分開。蛋白質從凝膠轉移至PVDF膜並且施加抗CXCR5單株抗體作為一級檢測抗體至蛋白質 印跡膜上。Alexa 680-綴合的第二抗體用於檢測並且使用Odyssey紅外成像系統(Li-cor,Lincoln,Nebraska)或使用電化學發光法(ECL)掃描該膜。抗人CXCR5的陽性對照抗體如本文中所教授那樣產生。
實施例6：用於監測CXCR5內化FACS分析法
血沉棕黃層細胞從健康志願者(Gulf Coast Blood Center,Houston,TX)獲得。人外周單核細胞(PBMCs)以標準Ficoll-Hypaque梯度方法予以分離。PBMC在96孔平板中於4℃培養(0.5×106個細胞/孔)。各孔含有補加10% FBS的存在或不存在單株抗體(10μg/ml)的0.2ml RPMI 1640。30分鐘後，培養基用補加10% FBS和無抗體的新鮮的冷RPMI 1640替換。將細胞轉移至含5%CO2的37℃增濕組織培養箱。單株抗體處理的細胞在細胞轉移至37℃後立即收穫、2小時或24小時後收穫。細胞用PBS洗滌一次並在含1% BSA的冷PBS(PBSB)中溫育30分鐘。細胞隨後用PE-綴合的抗人CXCR5(BD Biosciences)染色。30分鐘後，細胞用PBSB洗滌三次並在1%多聚甲醛溶液中固定過夜。次日，CXCR5的存在用BD FACSCaliburTM系統流式細胞儀(BD Biosciences,San Jose,CA)分析。
實施例7：FLIPR分析法
胞內鈣的變化藉由鋪種9000個細胞/孔並溫育過夜而 測量。細胞是用人CXCR5穩定轉染的RBL-2H3系。隨後洗滌細胞並且隨後載入在含有2.5mM丙磺舒的緩衝液中的2mM氟-4/AM(Molecular Probes)。細胞暴露於CXCR5單株抗體，隨後用分析緩衝液洗滌。細胞暴露於10nM CXCL13(R & D)。胞內Ca+2的變化使用384-B FLIPR儀(Molecular Devices)記錄。市售抗人CXCR5單株抗體和小鼠IgG1及IgG2b用作對照。
如本文以下所討論，構建了單株抗體16D7的幾種人類化形式，如嵌合16D7(hIgG4嵌合體)、16D7-HC1-LC1、16D7-HC1-LC2、16D7-HC2-LC1、16D7-HC1-LC3、16D7-HC3-LC4、16D7-HC3-LC5和16D7-HC1-LC6，並且對它們測試如由鈣流所示的生物活性。
除陰性對照CA13以外，人類化抗體顯示了與穩定表達CXCR5的轉染細胞上親代16D7抗體等同的信號抵消活性。
實施例8：趨化性分析
將CXCR5+ HS Sultan細胞(ATCC CRL1484)以0.5×106個細胞/孔在100nM CXCL13(R & D)或CTX緩衝液(無酚紅的RPMI，含有1% FBS、0.5% BSA和1nM丙酮酸鈉)存在下添加至transwell平板(Millipore)的上室中並評估到達下室的遊走性細胞。將這兩個室裝配並溫育2小時。下室中的細胞在添加比色試劑(Promega)及在OD490上讀數後進行計數。
將CXCR5特異性遊走確定為遊走的細胞總數與自發遊走性細胞數目之間的差異。若測試抗CXCR5，則細胞在添加至上室之前與該抗體溫育30分鐘。抗體抑制的程度是抗體存在下的特異性遊走與抗體不存在下的遊走量的比率。該比率可以乘以100%以產生公制的抑制百分數。
實施例7的抗體與親代16D7抗體就抵消趨化性的能力加以比較。除陰性對照單株抗體CA13之外的全部人類化抗體以與16D7及79B7、14C9、19H5、H28、54G6、G7、56H6的曲線可比的曲線抵消趨化性。R&D MAB190具有中等活性而H28和Abnova抗體2C1沒有徹底抑制配體誘導的細胞遊走。
實施例9：原代人B細胞反應性分析法
使用Accuspin柱(Sigma)從全血中分離人PBMC。PBMC隨後以二千萬個細胞/ml重懸於BD Stain緩衝液(Becton Dickinson)中。將1μg小鼠抗人CXCR5單株抗體添加至50μl PBMC中並且允許其在4℃結合20分鐘。細胞用BD Stain緩衝液洗滌2次。將1/100稀釋的50μl第二抗體即山羊抗小鼠IgG-PEF(ab')(Beckman Coulter)添加至PBMC-抗體混合物內並且允許其在4℃結合20分鐘。細胞用BD Stain緩衝液洗滌三次。含有1/50稀釋的小鼠抗人CD20-FITC(BD)與CD4-APC(BD)的混合物分別添加至細胞上，所述細胞隨後在4℃溫育20分鐘以評估B/T細胞特異性。細胞用BD Stain緩衝液洗滌三次 並且重懸於250μl BD Stain緩衝液中並且在FACStar Plus上進行FACS分析。小鼠抗人CXCR5抗體(R&D；單株抗體190)用作陽性對照。產生人類化抗體的滴定曲線並且將平螢光強度(MFI)對濃度作圖。
對實施例7的人類化抗體測試與人PMBC的結合作用。
除陰性對照CA13之外，抗體均在人B細胞上結合並且具有相同的滴定曲線。陰性對照CA13僅在顯示背景結合作用。BD的株RF8B2與人PBMC結合不佳。
實施例10：食蟹猴B細胞反應性分析法
食蟹猴(cyno)全血從Bioreclamation,Inc.(Hicksville,NY)獲得。血液在離心後裝入BD細胞製備管(CPT)。將血漿層中所含的食蟹猴PBMC從CPT管中移至一支50ml管而不擾動梯度凝膠層。該管用5ml PBS洗滌以徹底提取全部細胞並且將洗液添加至50ml的新管。將食蟹猴PBMC在4℃於1200轉/分鐘離心10分鐘。將沉澱重懸於1mlBD FACSStain緩衝液(BD)中。每次分析使用一百萬個細胞。將1μg(純化的)小鼠抗人CXCR5單株抗體添加至50μl PBMC並且允許其在4℃結合20分鐘。細胞用BD Stain緩衝液洗滌2次。將1/100稀釋的50μl第二抗體即山羊抗小鼠IgG-PE F(ab')(Beckman Coulter)添加至PBMC-抗體混合物內並且允許其在4℃結合20分鐘。細胞用BD Stain緩衝液洗滌三 次。將含有1/20分別稀釋的小鼠抗人CD20-FITC(BD)和CD4-APC(BD)的混合物添加至細胞上，以便在4℃溫育20分鐘以評估B/T細胞特異性。細胞用BD Stain緩衝液洗滌三次，並且重懸於250μl BD Stain緩衝液中並在FACStar Plus上進行FACS分析。商業性小鼠抗人CXCR5單株抗體(R&D；MAB190)用作陽性對照。
對人CXCR5反應的本發明的小鼠單株11D6與IgG同種型對照比較。測試16D7的人類化形式及市售MAB190對食蟹猴CXCR5的反應性。也測試了79B7。
對CD20和CXCR5呈陽性的細胞用MAB190及11D6找到。另一方面，16D7及其人類化變體以及G7和BD RF8B2及Abnova 2C1均不與食蟹猴B細胞結合。14C9、19H5、H28、54G6、56H6和79B7也結合食蟹猴B細胞。
本發明的CXCR5抗體用來研究外周血細胞。B細胞表達CXCR5並且在至少一個實驗中，發現約10%外周T細胞表達CXCR5。
實施例11：抗CXCR5單株抗體的測序
小鼠單株抗體使用市售同種型試劑套組進行同種分型。對16D7及其它抗CXCR5單株抗體的可變序列測序。總RNA使用Qiagen Qianeasy微量製備試劑套組，按照試劑套組的方案，從約5百萬個雜交瘤細胞中分離。使用Invitrogen Superscript試劑套組(目錄編號11904-018)合成第一鏈cDNA，試劑套組方案如下。
重鏈可變區及輕鏈可變區首先基於Wang等J Immunol Methods.233：167-77,2000中所述方法，使用下列簡並性PCR引子及Taq聚合酶(Roche)擴增。
重鏈：左引子：
1：CTTCCGGAATTCSARGTNMAGCTGSAGSAGTC(SEQ ID NO：2)
2：CTTCCGGAATTCSARGTNMAGCTGSAGSAGTCWGG(SEQ ID NO：3)
重鏈：右引子：GGAGGATCCATAGACAGATGGGGGTGTCGTTTTGGC(SEQ ID NO：4)
輕鏈：左引子：GGAGCTCGAYATTGTGMTSACMCARWCTMCA(SEQ ID NO：5)
輕鏈：右引子：TATAGAGCTCAAGCTTGGATGGTGGGAAGATGGATACAGTTGGTGC(SEQ ID NO：6)
其中R是A或G；N是A、G、T或C；M是A或C；W是A或T；S是G或C；並且Y是C或T。
將PCR產物使用Invitrogen TOPO TA選殖®試劑套組(目錄編號：45-0641)選殖至pCR4-TOPO®並且使用T3和T7引子測序。序列隨後對基因庫資料庫檢索以推導用於選殖全長可變區的前導序列。基於檢索結果，以下引子(Chardes等，FEBS Letters 452：386-394,1999)選擇用 於使用Pfx聚合酶(Invitrogen)的第二輪PCR擴增。
重鏈：左引子：CCAAGCTGTGTCCTRTCC(SEQ ID NO：7)
右引子：CGACAAGTCGACTAGCCCTTGACCAGGCATCC(SEQ ID NO：8)
輕鏈：左引子：WTCTCTRGAGTCAGTGGG(SEQ ID NO：9)
右引子：CGACTAGTCGACTGGTGGGAAGATGGATACAG(SEQ ID NO：10)
將PCR產物使用Invitrogen Zero Blunt® TOPO® PCR選殖試劑套組(目錄編號45-0245)選殖至pCR-Blunt II®-TOPO®並且使用T7引子測序。
一旦測出輕鏈及重鏈的序列，核酸可以被再編碼以優化例如人宿主細胞中的表達。
實施例12：轉染瘤
將NS0-eu細胞培育至密度1×106細胞/ml。細胞維持在指數生長期並且在轉染日前更換培養基。在轉染當日，洗滌40×106個細胞。隨後，將10μg線性化核酸例如輕鏈DNA和10μg線性化重鏈DNA添加至細胞混懸液(總 DNA體積應當少於50μl)並且在冰上孵育培養物15分鐘。把DNA與細胞的混合物轉移至冷凍的透明小容器(0.4cm)並且施加電脈衝(750V和25μF)。透明小容器在電脈衝處理後立即置於冰上並且在冰上保持10-15分鐘。收集細胞並且鋪種。將細胞在5%CO2培養箱中溫育12-16日或直至集落出現。以混懸培養方式培育的細胞集落或細胞的上清液藉由ELISA進行測試並且將陽性轉染瘤在新鮮培養基中選殖。為進一步篩選陽性轉染瘤，實施了滴定ELISA或Biacore分析法。將擴充的轉染瘤在搖瓶中維持並且從上清液中收集抗體或其衍生物。
實施例13：體內分析法
膠原誘導的關節炎(CIA)是充分建立的人RA模型，已經用來證實抗體對TNFα的效力(Williams等，PNAS 1992,89：9784-9788)以及CTLA-4與TNFα融合蛋白(Webb等，Eur J Immunol.1996,26：2320-2328；和Wooley等，J Immunol.1993,151：6602-6607)的效力。一種大鼠抗小鼠CXCR5單株抗體即抗體株1038在CIA的小鼠模型中得到描述，其中DBA/1J小鼠用雞II型膠原免疫並加強免疫。疾病嚴重性(其以肉眼觀察方式藉由測量爪腫脹/發炎而記分)每週監測兩次，同時在研究結束時對收集的關節評估炎症變化、關節翳、軟骨破壞和骨侵蝕。與同種型處理的CIA小鼠相比，抗體株1038在以預防劑量方案施用時顯著地減少疾病嚴重性和關節病理學 (重複測量ANOVA，p<0.05)。
使用急性小鼠模型以評估16D7-HC1-LC3在體內趨化性方面的效力。簡而言之，在免疫細胞如B細胞、T細胞和嗜中性粒細胞上選擇性表達huCXCR5的C57/B16小鼠(8-16周齡)藉由使用CD11a啟動子的傳統轉基因方法而產生。體內趨化性模型是嗜中性粒細胞衍生性模型。當腹膜內施用20μg huCXCL13配體(R&D)時，表達huCXCR5受體的小鼠嗜中性粒細胞應答huCXCL13梯度而遊走至腹膜腔。腹膜腔洗液用來在腹膜內施用huCXCL13 80分鐘後恢復細胞並且使用螢光細胞計數分析法來定量2ml腹腔灌洗樣品中應答於huCXCL13注入而特異性遊走至腹膜腔的表達huCXCR5的嗜中性粒細胞。嗜中性粒細胞藉由表型標記如Ly6G、CD19和CD11b而鑒定。與同種型處理的對照相比時，在注入huCXCL13之前24小時以兩個不同劑量(7.5μg或15μg)皮下施用抗hCXCR5人類化16D7-HC1LC3顯示在減少表達huCXCR5的嗜中性粒細胞應答於huCXCL13時遊走至腹膜腔中的效力，CXCR5抗體處理的兩種樣品在與嗜中性粒細胞的同種型陰性對照量相比時顯示基本上無統計學差異的嗜中性粒細胞量。與所測試CXCR5抗體的較高劑量相比，在1.5μg上的人類化CXCR5抗體顯示低量的嗜中性粒細胞遊走抑制。
實施例14：表面重塑
鼠16D7株的表面重塑按照Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1994)91：969和美國專利5,639,641中所述的步驟進行。
16D7的VL和VH序列對蛋白質數據(Protein Data Bank)(Nucleic Acids Research,28：235-242(2000)檢索或可以登錄網際網路上含有生物大分子的3D座標的蛋白質資料庫(PDB)，並且抽取與16D7的輕鏈及重鏈胺基酸序列最相似的10個輕鏈及重鏈胺基酸序列。PDB身份編碼用於確定所述序列。
其可變輕鏈的10個最接近的同系物是1MJU(J Mol Biol 332：423-435,2003)、1AE6(Proteins 29：161-171,1997)、1QYG(Pozharski等，「三種可卡因類似物複合」的「揭示一個結合位點：抗可卡因抗體的結構研究」部分)、1UZG(J Virol 79：1223,2005)、1UB5(Beuscher等，「在藍色及紫色螢光溫度上藍色螢光抗體19G2的結構和動力學」)、1RUR(Proc Natl Acad Sci USA 110：2247-2252,2004,1FPT(Nat Struct Biol 2：232-243,1995)、1QFU(Nat Struct Biol 6：530-534,1999)、1NAK(Virology 315：159-173,2003)和1CGS(J Mol Biol 236：247-274,1994)(多餘序列被去除)，並且其可變重鏈的10個最接近的同系物是1FNS(Nat Struct Biol 7：881-884,2000)、1OAK(Nat Struct Biol 5：189-194,1998)、1VFB(Proc Natl Acad Sci 91：1089-1093,1994)、1CIC Nature 348：254-257,1990)、1GIG(Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 50：768-777,1994)、1T4K(J Mol Biol 343：1269-1280,2004)、1A7P(Marks等)、1FE8(J Biol Chem 276：9985-9991,2001)、1DL7(J Exp Med 191：2101-2112,2000)和1YY8(Cancer Cell 7：301-311,2005)。所述輕鏈及重鏈最接近的同系物分別是1MJU和1FNS。這兩個序列用來構築可變結構域的同源性模型，該模型隨後藉由原子座標位置的共軛梯度最小化作用，用如在MOE軟體包(Chemical Computing Group,Quebec,CA)中執行的CHARMM22力場(J Comput Chem(1983)4,187；J Comput Chem(1986)7,591)而實現能量最小化。此模型用來定位CDR區和框架殘基。計算對每個抗體可變區的10個最接近同系物的每個可變區殘基的溶劑可及性並且在如Scitegic方法(Hill & Lewicki(2006)Statistics：Methods and Applications,Statsoft,Tulsa,OK)內執行的Excel表格程式中予以平均。具有大於30%平均可及性的位置視為表面殘基。具有25%-30%之間平均可及性的位置也視為依賴與CDR環的接近度。
將鼠16D7可變區的表面位置與人抗體序列中的相應位置比較。這種搜索僅留下了顯示大於30%可及表面積的那些殘基以及顯示大於25%可及表面積並且分佈在溶劑暴露性殘基側翼的少量殘基。包括在完整免疫球蛋白序列中的一些保守殘基以改善搜索的收斂性。僅保留種系序列用於命中分析。選擇具有最多相同表面殘基的人抗體可變區表面，特別考慮在CDR的5.0Å範圍內的位置，以替換鼠 16D7抗體可變區的表面殘基。
序列均不含有免疫表位元資料庫(Immune Epitope database)(IEDB，免疫表位元資料庫和分析資源網站；PLoS Biol.2005；3(3)：e91)中所列的任何已知B細胞或T細胞表位。
鼠16D7可變結構域的原初序列是：輕鏈(對CDR加底線)： (SEQ ID NO：11)；和重鏈(對CDR加底線) (SEQ ID NO：12)。
留下的表面殘基組對於輕鏈搜索包括D1、V3、A7、P9、P15、R16、E17、S18、P45、G46、Q47、D65、R79、R82、E86、K108、E110和K112。
對輕鏈的提交項含有如上所定義的表面殘基組和為BLAST方法收斂而包括的保守胺基酸C23、W40、Q43、Y91、C93、F103、G104、G106及T107。全部其它胺基酸可以是20種天然胺基酸中的任何一種。對IMGT編纂的人種系抗體序列資料庫(國際免疫原資訊系統網站， Molec Immunol,2004,40：647-659)進行BLAST搜索。發現最佳記分匹配是從其中衍生輕鏈LC4的X72482(蛋白質_id=CAA51150.1)。LC5和LC6是VL4(VL意指可變輕鏈)的兩個變體，據稱所述的兩個變體解決了輕鏈中可能有問題的兩個殘基：欲突變成Leu的1個暴露性甲硫胺酸(M51)(LC5和LC6)和1個潛在脫醯胺位點(LC6)其中天冬醯胺N53改變成絲胺酸殘基。總之，對可變輕鏈提出了與親代鼠16D7株相比時含有4-6個突變的3種形式。在下表1中給出相應的突變。給出了序列編號和Kabat編號。
留下的表面殘基組對於可變重鏈包括Q1、Q3、K5、S7、P9、L11、S15、Q16、S20、P41、G42、K43、S61、A62、K64、S65、R70、S74、Q75、Q86、T87、D88、Q103、L106、A111、A112和K113(序列編號)。在BLAST提交項中包含以便收斂該搜索法的非變異胺基酸是：C22、W36、I37、Q39、D89、Y93、C95、W101、G102、G104和T105。對IMGT編纂的人種系抗體序列資料庫進行BLAST搜索。留下了重鏈(HC3)的一種形式。對所述表面殘基組顯示最佳匹配記分的AF062266(蛋白質_id=AAC18304.1)和AY393082(蛋白質_id=AAS86018.1)的兩個VH結構域顯示等效的相似性記分並顯示相同的表面殘基。因此，僅留下含10個突變的該重鏈的單個序列。未留下具有不同表面殘基的記分較低的序列，因為它們具有暗示潛在降低的溶解性的較少極性殘基。
對輕鏈提出三種形式(LC4、LC5和LC6)。藉由可變鏈的表面重塑而導入的各個突變以小寫體標注並且加底線，並且對CDR加底線。下文列出可變區的表面重塑序列，不包括恆定結構域(IgG4)。
LC4： (SEQ ID NO：13)
LC5： (SEQ ID NO：14)
LC6： (SEQ ID NO：15)
對重鏈提出一種形式(VH3)(VH意指可變重鏈)。藉由可變鏈的表面重塑化而導入的突變以小寫體標注並且加底線，並且對CDR加底線。不包括恆定結構域序列。
HC3： (SEQ ID NO：16)
核苷酸序列由OE-PCR產生並選殖至附加型表達載體pXL4214(Durocher等，NAR,2002,30(2),E9)的NheI/HindIII位點內。序列進行密碼子優化以便在人細胞中表達。VL與IGKC(AAH93097)融合。VH與缺少羧基末端Lys(IGHG4△K)的IGHG4(AAH25985)融合。序列藉由雙鏈測序法驗證。
LC4： (SEQ ID NO：17)
(SEQ ID NO：18)
LC5： (SEQ ID NO：19)
(SEQ ID NO：20)
LC6： (SEQ ID NO：21)
(SEQ ID NO：22)
HC3： (SEQ ID NO：23)
(SEQ ID NO：24)
實施例15：人類化
檢索16D7的VL和VH序列並且16D7可變輕鏈最接近的同系物是1MH5、1MJJ和1MJU(J Mol Biol 332：423-435,2003)，具有等效的相似性記分。1MJU因已經測定直至1.22Å解析度的高精度晶體結構而留作範本。發現16D7重鏈最接近的同系物是1FNS(Nat Struct Biol 7：881-884,2000)。1MJU和1FNS的結構用來構築可變結構域的同源性模型，模型隨後用標準方法實現能量最小化。16D7的3D同源性模型的分子動力(MD)計算隨後在廣義波恩內隱溶劑中進行1.7納秒(見Gallicchio和Levy,J Comput Chem 2004,25：479-499)。
MD始於在298.15°K上對來自高斯分佈的速率的初始化，隨後是300皮秒的平衡時間。在MD期間，使用SHAKE演算法(見Barth.等，J Comp Chem,1995,16：1192-1209)約束全部鍵，時間步長是1飛秒(fs)並且基於Verlet積分演算法，並且類比在正則NVT(粒子數、體積和溫度)系綜中在溫度298.15°K上運行。隨後在產 生時間期間儲存1,700次快照，每隔1皮秒1次。鼠抗體的1,700個構形構成對其開展下列分析以鑒定最靈活殘基的系綜。使用在MOE分子建模環境(Molecular Operating Environment(MOE),Chemical Computing Group,Quebec,Canada)中可獲得的科學向量語言(Scientific Vector Language,SVL)來編碼下列分析。首先，將每個快照N最佳地疊加到其前期快照N-1上，以控制在MD建模及計算期間出現的整體旋轉和平移運動。疊加藉由使來自兩次快照中的全部相應原子對之間的均方根距離(RMSD)最小化而獲得。在疊加運用中僅考慮抗體主鏈的重原子。隨後使用相同的疊加方法，將每次快照疊加到中心點快照上。中心點快照是具有離全部構形的平均座標最近的笛卡爾座標的抗體構形。
對於每一個抗體殘基i，計算了在構形j與中心點參考構形k的重原子之間的RMSD。RMSD具有下列式：，dlk定義為在殘基j的重原子l與中心點參考構形k的其對應物之間以埃(Å)為單位表示的歐幾裡德距離。為了重原子l的配對關聯，還考慮了側鏈重原子相對於胺基酸Asp，Leu，Val，Glu，Arg，Phe和Tyr的對稱。每一個殘基的參考構形k均不同，並且對應於如此中心點構形k，其具有離所研究殘基i的全部構形的平均座標最接近的歐幾裡德距離。隨後，對於每個殘基i，獲得1,700個RMSD值的分佈，該分佈反映殘基i的座標在 MD期間的變異。藉由合計所研究抗體的全部殘基的全部RMSD值，獲得全部RMSD的整體分佈。全部RMSD的整體分佈隨後用作參考分佈。若殘基i是高度靈活的，則開展統計檢驗以決定觀察到殘基i的平均RMSD(mi)是否顯著地高於全部殘基的整體平均RMSD(mg)。由於樣本眾多，例如1700個樣本用於抗體株16D7的分析，故使用具有無效假設H0即「觀察到的mi低於整體mg」的一尾Z-檢驗(見Dorofeev和Grant，「即時樣本調查統計。非簡單隨機樣品和加權數據」2006.Cambridge University Press)以根據式：計算統計量Zi，其中從殘基i的RMSD分佈中計算的平均RMSD(mg)是從整體RMSD分佈中計算的平均RMSD，sdi是從殘基i的RMSD分佈中計算的標準差並且n是樣本量，即對於16D7株的分析，n=1,700。計算的Zi隨後與標準正態分佈的累積概率比較，以估計備擇假設即「觀察到的mi高於整體mg」的99.9%顯著性量。這對應於Zi3.08。可以視作靈活性記分的Zi統計量與抗體殘基的重原子的分子量或數目不相關(當分析16D7抗CXCR5模型MD時，r2分別是0.014和0.0009)。
靈活殘基組對於輕鏈包括以下殘基(序列編號)：D1、T14、P15、R16、E17、Q47、D65、S72R79、R82、E86、K108、E110和K112；並且對於重鏈包括以下殘 基：Q1、V2、Q3、L11、S15、Q16、S61、A62、K64、S65、R70、D72、Q75、K81、M82、N83、Q86、Q103、S110、A111、A112和K113。比較16D7的靈活部分與ImMunoGeneTics Database網站2005年9月版中的人抗體序列的相應位置。
表現明顯高的靈活性記分的那些殘基以及維持靈活殘基的3D結構的少量側翼殘基因搜索而保留。
選擇含相同靈活殘基最多的人抗體可變區，特別考慮位於CDR的5.0Å範圍內的位置，以便替換鼠16D7抗體可變區的靈活殘基。將產生的人類化序列就序列相似性而在UniProtKB/SwissProt資料庫中檢索，得出了已經作出合理假設的置信度。全部序列都顯示出與眾多人抗體的高度相似性。此外，序列均不含有IEDB中所列的任何已知B細胞或T細胞表位。
IEDB中的最佳序列匹配對於輕鏈(LC1、LC2和LC3)是KPGQPPRLLIYDASNRATGIPA(SEQ ID NO：25)，其覆蓋CDR2，但是具有顯著的殘基差異，如藉由從IEDB資料庫內的BLAST搜索中獲得的56%序列同一性所代表。
IEDB中的最佳匹配對於重鏈(HC1和HC2)是位於CDR3的起點之前的TDDTAMYYCARI(SEQ ID NO：26)，該序列顯示與肽SEDSALYYCARD(SEQ ID NO：27)的61%序列同一性，這使它不可能是潛在的人T細胞表位(J Exp Med(1995)181,1540)。
鼠16D7可變結構域的原初序列是： 輕鏈(對CDR加底線)： (SEQ ID NO：28)；和重鏈(對CDR加底線)： (SEQ ID NO：29)。
對重鏈提出兩種形式(HC1和HC2)並且對輕鏈提出三種形式(LC1、LC2和LC3)。重鏈的兩種形式分別從AF262096/AAF79987和AB063657/BAC01285.1中衍生。這兩個序列顯示等效的相似性記分，但因為待突變的殘基組似乎是相對不同的並且表現不同的物理-化學性質而得以保留。LC1序列從BAC01682/AB064054.1中衍生並且僅存在兩個待突變的殘基。LC2和LC3是LC1的變體，據稱所述變體解決了輕鏈中可能有問題的兩個殘基：突變成Leu(形式3和4)的暴露甲硫胺酸(M51)和1個潛在脫醯胺位點(形式4)其中天冬醯胺N53改變成絲胺酸殘基。並沒有留下全部組合，但是四個組合覆蓋了最多的待解決關鍵點。使用Kabat編號。
藉由可變鏈的人類化而導入的突變是小寫體並且加底線並且對CDR加底線。不包括恆定結構域。
LC1： (SEQ ID NO：30)
LC2： (SEQ ID NO：31)
LC3： (SEQ ID NO：32)
HC1： (SEQ ID NO：33)
HC2： (SEQ ID NO：34)
嵌合構建體的序列如下：嵌合LC序列 (SEQ ID NO：35)
(SEQ ID NO：36)
嵌合HC序列 (SEQ ID NO：37)
(SEQ ID NO：38)
人類化VL序列
LC1： (SEQ ID NO：39)
(SEQ ID NO：40)
LC2： (SEQ ID NO：41)
(SEQ ID NO：42)
LC3： (SEQ ID NO：43)
(SEQ ID NO：44)
人類化VH序列
HC1： (SEQ ID NO：45)
(SEQ ID NO：46)
HC2： (SEQ ID NO：47)
(SEQ ID NO：48)
實施例16：基於分子動力軌道的人類化
16D7的VL和VH序列在蛋白質資料庫(PDB)(Berman等，Nucleic Acids Research,2000,28：235-242)中檢索並且可變輕鏈最接近的同系物是1MH5、1MJJ和1MJU(J Mol Biol 332：423-435,2003)，具有等效的相似性記分。1MJU因已經測定直至1.22Å解析度的高精度晶 體結構而留作範本。經發現重鏈最接近的同系物是1FNS(Nat Struct Biol 7：881-884,2000)。1MJU和1FNS的結構用來構築可變結構域的同源性模型，該模型隨後使用標準方法實現能量最小化。
16D7的3D同源性模型的分子動力(MD)模擬隨後在廣義波恩內隱溶劑中進行1.1納秒(見Gallicchio和Levy,J Comput Chem 2004,25：479-499)。MD模擬始於在500K上對來自高斯分佈的速率的初始化，隨後是200皮秒(ps)的平衡時間。在MD類比期間，使用SHAKE演算法(見Barth.等，J Comp Chem,1995,16：1192-1209)約束全部鍵，時間步長是1飛秒(fs)，並且基於Verlet積分演算法，類比在正則NVT(粒子數、體積和溫度)系綜中在溫度500K上運行。該模擬以施加至主鏈原子的諧波約束(harmonic constraint)進行。在這個首次模擬的最後1納秒期間提取了10個不同構形，每隔100皮秒1個。
這10個不同構形隨後用作10個不同起點以便在300K溫度上在廣義波恩內隱溶劑中運行10個分子動力模擬持續2.3納秒，同時不對主鏈約束。每個MD模擬始於在298.15K對來自高斯分佈的速率的初始化，隨後是300皮秒的平衡時間。使用SHAKE演算法(見Barth.等，J Comp Chem,1995,16：1192-1209)約束全部鍵，時間步長是1飛秒，並且基於Verlet積分演算法，類比在正則NVT(粒子數、體積和溫度)系綜中在溫度298.15K上 運行。隨後在產生時間期間儲存2,000次快照，每隔1皮秒1次。使用在MOE分子建模環境(Molecular Operating Environment(MOE),Chemical Computing Group,Quebec,Canada)中可獲得的科學向量語言(SVL)來編碼下列的後處理方法。
首先，將每個快照N最佳地疊加到其前期快照N-1上以拋棄在MD建模及計算期間出現的整體旋轉和平移運動。疊加藉由使來自兩次快照中全部成對相應的原子間的均方根距離(RMSD)最小化而獲得。在疊加操作中僅考慮抗體主鏈的重原子。隨後使用相同的疊加方法，將每次快照疊加到中心點快照上。中心點快照是具有離全部構形的平均座標最近的笛卡爾座標的抗體構形。對於10個MD模擬中的每一個，最後2,000個構形用來定量鼠抗體的每個胺基酸相對於該胺基酸的中心點構形的原子位置的偏離。對於每一個抗體殘基i，計算了在構形j與中心點參考構形k的重原子之間的RMSD。RMSD具有下列式：，dlk定義為在殘基j的重原子l與中心點參考構形k的其對應物之間以埃(Å)為單位表示的歐幾裡德距離。對於重原子l的配對關聯，還考慮側鏈重原子相對於胺基酸Asp、Leu、Val、Glu、Arg、Phe和Tyr的對稱。每一個殘基的參考構形k均不同，並且對應於如此中心點構形k，其具有離所研究殘基i的全部構形的平均座標最接近的歐幾裡德距離。
人類化突變藉由確定哪個人抗體種系就其最靈活胺基酸來說與鼠抗體最相似而找到。為做到這一點，將鼠抗體的60個最靈活胺基酸的運動在分子動力模擬的20納秒(10×2納秒)期間與49個人抗體種系同源性模型的相應胺基酸的運動比較，其中已經使用相同方法對每一個人抗體種系同源性模型進行10個分子動力模擬。藉由系統地組合7種最常見的人輕鏈(vκ1、vκ2、vκ3、vκ4、vλ1、vλ2、vλ3)和7種最常見的重鏈(vh1a、vh1b、vh2、vh3、vh4、vh5、vh6)，產生49個3D人抗體種系同源性模型(Nucleic Acids Research，2005，第33卷，資料庫輯D593-D597)。
所述60個最靈活胺基酸不包括CDR中的任何胺基酸及其直接近鄰區，即具有α碳的胺基酸，其中所述的α碳與如在3D同源性模型中所見的CDR胺基酸的任何α碳距離小於5Å。
藉由比較給定胺基酸(i)距離在10個分子動力模擬上平均的如前文所定義的中心點構形的RMSD(Fi)與在10個相同分子動力模擬上平均的鼠抗體的全部胺基酸的RMSD(Fm)而對靈活性定量。若靈活性記分Zi(定義為Zi=(Fi-Fm)/Fm)在0.15以上，則認為某胺基酸是足夠靈活的，以至於潛在地與T-細胞受體相互作用並啟動免疫應答。
使用這種分子動力平均靈活性估計方法，已認為23個胺基酸在鼠16D7抗體的可變區(不包括CDR區及其直 接近鄰區)中是靈活的。
靈活殘基組對於輕鏈包括以下殘基(序列編號)：R16、E17、R44、G46、Q47、S48、R79、R82、E84、E86和E110；並且對於重鏈則包括以下殘基：K5、P41、G42、K43、K64、R70、D72、N73、S74、Q75、Q86和Q103。
定量鼠抗體對49個人種系同源性模型的四維相似性藉由對這60個靈活胺基酸的具體原子的位置採樣，使用10個分子動力類比的全部皮秒快照，借助獨特的三維立體網格進行定量。該網格具有1Å解析度。該三維網格由445740點組成並且已經使用基於抗體的人抗體結晶學模型8FAB(Biochem 30：3739-3748,1991)的三維結構而進行初始化。8FAB模型也用來定位在所述三維網格中採樣的抗體的全部皮秒快照構形。為此目的，將抗體的分子動力的中心點構形疊加到8FAB模型上。這種疊加由比對2個模型的轉動慣量、最小化在2個模型的α碳之間的標量距離而構成。該分子動力類比的全部其餘構形使用相同方法疊加到中心點構形上。
進行了兩種類型的採樣，其對於正進行比較的一對抗體產生兩種相似性(靜電相似性和親脂相似性)。這兩種相似性隨後相加以獲得總相似性。靜電採樣考慮到胺基酸側鏈的全部原子。在網格的一個點上的值x藉由應用如在Amber99力場(Cieplak等；J.Comp.Chem.2001,22：1048-1057)中所述的以原子部分電荷加權的三維高斯函 數f(x)而獲得。使用下式在3個笛卡爾坐標軸上應用該f(x)函數：，x和u分別是網格點和被採樣的胺基酸原子的笛卡爾座標，並且s=r/1.6(r=所述原子的共價半徑)。對胺基酸的全部構形重複採樣並且將獲得的結果在三維網格的全部點上平均。親脂性採樣僅考慮胺基酸側鏈的親脂原子。在該網格的一個點中的值以非加權的相同高斯函數f(x)進行計算。因此，由相同的三維網格對來自正進行比較的兩種抗體的分子動力模擬的兩個皮秒快照構形系綜採樣。抗體a與抗體b之間的靜電相似性(sim-elec)可以用下計算：。親脂相似性以應用於由前述親脂採樣產生的資料的相同式進行計算。
人種系模型vλ2-vh4表現相對於鼠抗體16D7的60個最靈活胺基酸的60個最靈活胺基酸的最高四維相似性(總相似性=50%)。因此已經使用人種系模型vλ2-vh4來替換鼠抗體16D7靈活殘基。兩種序列的胺基酸預先根據相應3D同源性模型的α碳的最佳疊加進行比對。使用BLAST搜索法對產生的人類化序列搜索不想要的基序，如上文第41段中前述。此外，如上文第44段中所述，使用IEDB資料庫對產生的人類化序列搜索已知的B細胞或T細胞表位。
IEDB中的最佳序列匹配對於輕鏈(LC7)是PGKAPQLLIYRMSNL(SEQ ID NO：52)，其覆蓋CDR2。該序列顯示與肽PGKAPKLLIYAASSL(SEQ ID NO：53)的73%序列同一性，其中所述的肽顯示對HLA-DRB1 0404*的結合作用，但是未證實在人中有免疫原性(J Immunol(1995)155,5655)。
IEDB中的最佳匹配對於重鏈(HC4和HC5)是SLIDYGVNWIRQPPG(SEQ ID NO：54)，其中該序列包括CDR1，但是具有顯著的殘基差異，如從IEDB資料庫內的BLAST搜索中獲得的40%序列同一性所代表。
對重鏈獲得了兩種形式(HC4和HC5)並且對輕鏈獲得了一種形式(L7)。重鏈的兩種形式從人種系模型vλ2-vh4中衍生。HC5是HC4的變體，具有旨在對付一個潛在有問題的殘基的額外突變：1個潛在脫醯胺位點，其中天冬醯胺N60改變成脯胺酸殘基。
藉由可變鏈的人類化而導入的突變是小寫體並且加底線，並且對CDR加底線。不包括恆定結構域。
LC7： (SEQ ID NO：55)
HC4： (SEQ ID NO：56)
HC5： (SEQ ID NO：57)
實施例17：藥物動力學
本研究用合適數目的動物實施(例如，在一項研究中用4只；2只用於單次劑量並且2只用於重複劑量，每週5個劑量)，動物是健康、定向育種的雄性食蟹猴，體重2.0-5.4kg並且年齡2-7歲。可以將動物分配至兩個處理組，一個處理組接受對照IgG4抗體並且一個處理組接受人類化16D7。對每組中的猴施用單個靜脈內大丸劑劑量，例如在劑量體積2-3mL/kg中的2.5-10mg/kg或靜脈內5個周劑量。血液樣品在每一劑量施用後的多個時間點上收集並且加工成血漿。使用ELISA對血漿樣品分析總IgG4及CXCR5單株抗體的濃度。
實施例18：比較性研究
某些本發明抗體與市售抗體在並列實驗中進行比較。可從R & D Systems獲得的MAB190是小鼠單株抗體。RF82B是可從BD獲得的大鼠抗人CXCR5。抗體株2C1是可Abnova從獲得的帶GST標籤的小鼠單株抗體。本文中所述的多種人類化抗體使用本領域已知的試劑和方法進行同種分型。例如，本文中教授的那些人類化抗體具有κ輕鏈，眾多人類化抗體是IgG1，而46C9、68D3和H28是IgG2a。大部分的抗體與CXCR5的胺基末端結合並且幾種抗體相互競爭與相同表位元或區域的結合。
BD抗體與人PBMC結合不良。
儘管抗體通常不與食蟹猴細胞結合，然而本發明的 14C9、19H5、H28、54G6、56H6和79B7與食蟹猴細胞結合。
發現16D7具有更高的親和力，至少10倍高於商業抗體，並且具有優於其它抗體100倍的解離速率。
實施例19：放大
每種單株抗體變體在懸浮培養的HEK293FSTM細胞中藉由暫態轉染編碼與293fectinTM(Invitrogen)複合的重鏈或輕鏈的兩個表達質體而產生。在轉染後八日收穫並離心分泌的蛋白質。蛋白質藉由在蛋白A(ProSepvA，Millipore)上的親和層析在用25mM檸檬酸鹽pH 3，0.15M NaCl緩衝液從柱中洗脫後得到純化。單株抗體配製在PBS中並且經0.22μm過濾。蛋白質濃度藉由測量在280nm的吸光度而測定。每一批次由SDS-PAGE(Nupage Bistris/MES-SDS 10%)在還原和非還原條件下分析以確定每種亞基以及單體的純度和分子量。每個蛋白質批量由也凝膠過濾法(Tricorn 10/300 GL Superdex 200)分析以確定單體的均一性和高分子量種類的存在。
從240mL培養物中，可獲得總計30-40mg的8種16D7變異單株抗體並且具有適合用於後繼體外和體內實驗的品質。
本領域技術人員使用不超過常規的實驗將認出或能夠確認本文中所述的本發明具體實施例的眾多等效物。此類等效物意圖包括在下列專利申請範圍內。
<110> SANOFI-AVENTIS
<120> 人類化抗CXCR5抗體、其衍生物及其用途
<130> 190809-14330601
<140>
<141>
<150> 60/968,792
<151> 2007-08-29
<160> 57
<170> PatentIn ver.3.3
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Claims (17)

  1. 一種經分離之抗體或其片段，其特異性結合至人類CXCR5胞外域上的表位與抗CXCR5抗體或其片段所結合者相同，其中該抗CXCR5抗體或其片段包含：(a)包含SEQ ID NO：11之胺基酸序列的輕鏈可變域，以及包含SEQ ID NO：12之胺基酸序列的重鏈可變域；(b)RSSKSLLHSSGKTYLY、RMSNLAS、MQHLEYPYT、GFSLIDYGVN、VIWGDGTTY、及IVY之胺基酸序列；(c)包含SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、或SEQ ID NO：15之胺基酸序列的輕鏈可變域，以及包含SEQ ID NO：16之胺基酸序列的重鏈可變域；(d)RSSKSLLHSSGKTYLY、RLSNLAS、MQHLEYPYT、GFSLIDYGVN、VIWGDGTTY、及IVY之胺基酸序列；(e)RSSKSLLHSSGKTYLY、RLSSNLAS、MQHLEYPYT、GFSLIDYGVN、VIWGDGTTY、及IVY之胺基酸序列；(f)包含SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：19、或SEQ ID NO：21之胺基酸序列的可變輕鏈(VL)，以及包含SEQ ID NO：23之胺基酸序列的可變重鏈(VH)；(g)包含SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：31、或SEQ ID NO：32之胺基酸序列的可變輕鏈，以及包含SEQ ID NO：33或SEQ ID NO：34之胺基酸序列的可變重鏈；(h)RSSKSLLHSSGKTYLY、RMSNLA、MQHLEYPYT、GFSLIDYGVN、VIWGDGTTY、及IVY之胺基酸序列；(i)RSSKSLLHSSGKTYLY、RLSNLA、MQHLEYPYT、GFSLIDYGVN、VIWGDGTTY、及IVY之胺基酸序列；(j)RSSKSLLHSSGKTYLY、RLSSLA、MQHLEYPYT、GFSLIDYGVN、VIWGDGTTY、及IVY之胺基酸序列；(k)包含SEQ ID NO：35之胺基酸序列的可變輕鏈，以及包含SEQ ID NO：37之胺基酸序列的可變重鏈；(l)包含SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：41、或SEQ ID NO：43之胺基酸序列的可變輕鏈，以及包含SEQ ID NO：45或SEQ ID NO：47之胺基酸序列的可變重鏈；(m)包含SEQ ID NO：55之胺基酸序列的可變輕鏈，以及包含SEQ ID NO：56或SEQ ID NO：57之胺基酸序列的可變重鏈；或(n)RSSKSLLHSSGKTYLYW、RMSNLA、MQHLEYPYT、GFSLIDYGVN、VIWGDGTTY、及IVY之胺基酸序列；且其中該抗體或其片段結合至該人類CXCR5胞外域具有10-10M至10-12M的KD。
  2. 一種經分離之抗體或其片段，其特異性結合至人 類CXCR5胞外域上的表位與抗CXCR5抗體或其片段所結合者相同，其中該抗CXCR5抗體或其片段包含SEQ ID NO：32之胺基酸序列的可變輕鏈，以及包含SEQ ID NO：33之胺基酸序列的可變重鏈；且其中該抗體或其片段結合至該人類CXCR5胞外域具有10-10M至10-12M的KD。
  3. 一種經分離之抗體或其片段，其特異性結合至人類CXCR5胞外域上的表位與抗CXCR5抗體或其片段所結合者相同，其中該抗CXCR5抗體或其片段包含RSSKSLLHSSGKTYLY、RLSSLA、MQHLEYPYT、GFSLIDYGVN、VIWGDGTTY、及IVY之胺基酸序列；且其中該抗體或其片段結合至該人類CXCR5胞外域具有10-10M至10-12M的KD。
  4. 如申請專利範圍第1至3項中任一項之抗體或其片段，其中該抗體或其片段另包含一或多個恆定區結構域。
  5. 如申請專利範圍第1至3項中任一項之抗體或其片段，其中該抗體或其片段另包含CH1、CH2、CH3、CL區或它們的組合。
  6. 如申請專利範圍第4項之抗體或其片段，其中該一或多個恆定區結構是源自IgG抗體。
  7. 如申請專利範圍第6項之抗體或其片段，其中該IgG抗體是IgG4抗體。
  8. 如申請專利範圍第1至3項中任一項之抗體或其 片段，其中該抗體或其片段係單鏈Fv抗體。
  9. 一種藥學組成物，其包含治療有效量之如申請專利範圍第1至8項中任一項之抗體或其片段及藥學上可接受之載體(carrier)。
  10. 一種編碼如申請專利範圍第1至8項中任一項之抗體或其片段的經分離之核酸分子。
  11. 一種包含如申請專利範圍第10項之核酸分子的載體(vector)。
  12. 一種包含如申請專利範圍第11項之載體的經分離之宿主細胞。
  13. 一種與CXCR5結合之CXCR5拮抗劑於製備供治療具有CXCR5疾病或症狀之病患的藥物之用途，其中該CXCR5拮抗劑包含如申請專利範圍第1至8項中任一項之抗體或其片段。
  14. 如申請專利範圍第13項之用途，其中該CXCR5疾病或症狀係胰腺癌、結腸癌、膀胱癌、T細胞白血病、B細胞白血病、狼瘡、休格倫氏症(Sjoren's Syndrome)、重症肌無力、多發性硬化症、潰瘍性結腸炎、類風濕性關節炎、牛皮癬關節炎、慢性炎症、或移植排斥。
  15. 如申請專利範圍第14項之用途，其中該CXCR5疾病或症狀是類風濕性關節炎。
  16. 一種製造如申請專利範圍第1至8項中任一項之抗體或其片段的方法，其包含表達如申請專利範圍第11 項之載體於適宜的宿主細胞中。
  17. 一種套組，其包含如申請專利範圍第1至8項中任一項之抗體或其片段及使用說明書。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
TWI808963B (zh) * 2017-03-22 2023-07-21 法商賽諾菲公司 使用人類化抗ｃｘｃｒ５抗體治療狼瘡

Families Citing this family (84)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20120263733A1 (en) * 2002-11-15 2012-10-18 Morehouse School Of Medicine Anti-cxcl9, anti-cxcl10, anti-cxcl11, anti-cxcl13, anti-cxcr3 and anti-cxcr5 agents for inhibition of inflammation
KR101528939B1 (ko) 2006-07-18 2015-06-15 사노피 암 치료를 위한 ｅｐｈａ2에 대한 길항제 항체
SI2195023T1 (en) 2007-08-29 2018-07-31 Sanofi Humanized anti-CXCR5 antibodies, their derivatives and their uses
SG2013061528A (en) * 2008-08-14 2015-03-30 Merck Sharp & Dohme Methods for purifying antibodies using protein a affinity chromatography
FR2945538B1 (fr) 2009-05-12 2014-12-26 Sanofi Aventis Anticorps humanises specifiques de la forme protofibrillaire du peptide beta-amyloide.
AR078470A1 (es) 2009-10-02 2011-11-09 Sanofi Aventis Anticuerpos que se unen especificamente al receptor epha2
EP2470209B1 (en) 2009-11-30 2020-01-01 Biotest AG Humanized anti-il-10 antibodies for the treatment of systemic lupus erythematosus (sle)
AR079645A1 (es) 2009-12-18 2012-02-08 Sanofi Aventis Anticuerpos antagonistas y sus fragmentos fab contra la proteina de las membranas plaquetarias humanas glicoproteina vi (gpvi) y sus usos
EP2397495A1 (en) 2010-06-21 2011-12-21 Sanofi Novel antagonist antibodies and their Fab fragments against GPVI and uses thereof
EP2402371A1 (en) 2010-07-01 2012-01-04 Sanofi Novel antagonist antibodies and their Fab fragments against GPVI and uses thereof
EP2336188A1 (en) 2009-12-18 2011-06-22 Sanofi-Aventis Novel antagonist antibodies and their Fab fragments against GPVI and uses thereof
FR2958936A1 (fr) 2010-04-14 2011-10-21 Sanofi Aventis Proteine de fusion robo1-fc et son utilisation dans le traitement des tumeurs
WO2012010582A1 (en) 2010-07-21 2012-01-26 Roche Glycart Ag Anti-cxcr5 antibodies and methods of use
TWI560199B (en) 2010-08-31 2016-12-01 Sanofi Sa Peptide or peptide complex binding to α2 integrin and methods and uses involving the same
UA112170C2 (uk) 2010-12-10 2016-08-10 Санофі Протипухлинна комбінація, що містить антитіло, яке специфічно розпізнає cd38, і бортезоміб
EP2652508B1 (en) * 2010-12-14 2018-02-07 Jyant Technologies, Inc. The use of anti-cxcl13 and anti-cxcr5 antibodies for the treatment or detection of cancer
AR085302A1 (es) 2011-02-24 2013-09-18 Sanofi Sa Metodo de produccion de anticuerpos sialilados
US8865870B2 (en) 2012-01-20 2014-10-21 Genzyme Corporation Anti-CXCR3 antibodies and methods of use thereof
ES2702246T3 (es) * 2012-03-26 2019-02-28 Sanofi Sa Formulaciones de agente de unión IgG4 estables
JP6265970B2 (ja) * 2012-03-26 2018-01-24 サノフイ 安定なＩｇＧ４に基づく結合剤の製剤
US9592289B2 (en) 2012-03-26 2017-03-14 Sanofi Stable IgG4 based binding agent formulations
KR102367723B1 (ko) 2012-03-28 2022-02-28 사노피 브라디키닌 b1 수용체 리간드에 대한 항체
WO2014003742A1 (en) * 2012-06-27 2014-01-03 Morehouse School Of Medicine Anti-cxcl9, anti-cxcl10, anti-cxcl11, anti-cxcl13, anti-cxcr3 and anti-cxcr5 agents for inhibition of inflammation
WO2014003744A1 (en) * 2012-06-27 2014-01-03 Morehouse School Of Medicine Anti-cxcl9, anti-cxcl 10, anti-cxcl 11, anti-cxcl 13, anti-cxcr3 and anti-cxcr5 agents for inflammatory disorder
PT2922875T (pt) 2012-11-20 2017-05-31 Sanofi Sa Anticorpos anti-ceacam5 e suas utilizações
EP2925779A1 (en) 2012-11-30 2015-10-07 Institut Pasteur Use of anti-fcyri and/or anti-fcyriia antibodies for treating arthritis, inflammation, thrombocytopenia and allergic shock
US10342869B2 (en) 2012-12-07 2019-07-09 The Regents Of The University Of California Compositions comprising anti-CD38 antibodies and lenalidomide
CN105007941B (zh) 2012-12-27 2019-01-25 赛诺菲 抗-lamp1抗体和抗体药物偶联物及其用途
JO3580B1 (ar) * 2013-03-15 2020-07-05 Lilly Co Eli أجسام مضادة لكيموكين elr+ cxc شامل
AU2014261398B2 (en) * 2013-05-02 2019-08-29 Ares Trading S.A Monoclonal antibody directed against CXCR5
EP3995145A1 (en) * 2013-06-24 2022-05-11 NexImmune, Inc. Compositions and methods for immunotherapy
TW201722994A (zh) 2013-08-13 2017-07-01 賽諾菲公司 胞漿素原活化素抑制劑-１（ｐａｉ-１）之抗體及其用途
PE20160244A1 (es) 2013-08-13 2016-05-10 Sanofi Sa Anticuerpos contra el inhibidor del activador de plasminogeno tipo 1 (pai-1) y usos de los mismos
KR20210088756A (ko) * 2014-03-21 2021-07-14 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 단일 도메인 결합 단백질을 생산하는 비-인간 동물
AU2015305850A1 (en) * 2014-08-22 2017-04-06 Sorrento Therapeutics, Inc. Antigen binding proteins that bind CXCR5
EP3970748A1 (en) * 2014-12-24 2022-03-23 NexImmune, Inc. Nanoparticle compositions and methods for immunotherapy
EP4039710A3 (en) 2015-01-23 2022-10-19 Sanofi Anti-cd3 antibodies, anti-cd123 antibodies and bispecific antibodies specifically binding to cd3 and/or cd123
US10973923B2 (en) 2015-06-23 2021-04-13 Bayer Pharma Aktiengesellschaft Site specific homogeneous with KSP inhibitors
AU2016349152A1 (en) 2015-11-03 2018-06-14 Merck Patent Gmbh Bi-specific antibodies for enhanced tumor selectivity and inhibition and uses thereof
CN110498851B (zh) * 2015-11-10 2022-10-11 孙嘉琳 一种抗肿瘤蛋白内皮抑素的衍生物及应用
KR20180123047A (ko) 2016-03-24 2018-11-14 바이엘 파마 악티엔게젤샤프트 효소적으로 절단가능한 기를 갖는 세포독성 활성제의 전구약물
EP3919518A1 (en) 2016-06-15 2021-12-08 Bayer Pharma Aktiengesellschaft Specific antibody-drug-conjugates (adcs) with ksp inhibitors and anti-cd123-antibodies
CN115998858A (zh) 2016-07-05 2023-04-25 赛诺菲 抗体制剂
TWI760345B (zh) * 2016-07-05 2022-04-11 法商賽諾菲公司 抗體調配物
TWI790206B (zh) 2016-07-18 2023-01-21 法商賽諾菲公司 特異性結合至ｃｄ３和ｃｄ１２３的雙特異性抗體樣結合蛋白
KR20190071722A (ko) * 2016-09-26 2019-06-24 엠피오, 아이엔씨. 난자, 수정란 또는 배아의 질 개선제
EP3558387B1 (de) 2016-12-21 2021-10-20 Bayer Pharma Aktiengesellschaft Spezifische antikörper-wirkstoff-konjugate (adcs) mit ksp-inhibitoren
PE20191235A1 (es) * 2016-12-21 2019-09-11 Bayer Pharma AG Conjugados de ligando-farmaco (adcs) con grupos escindibles enzimaticamente
CN110312533B (zh) 2016-12-21 2023-11-03 拜耳公司 具有酶促可裂解的基团的细胞毒性活性剂的前药
TW201840585A (zh) 2016-12-22 2018-11-16 法商賽諾菲公司 用於白斑病的治療的抗人cxcr3抗體
JP2020504744A (ja) 2016-12-22 2020-02-13 サノフイＳａｎｏｆｉ 枯渇活性を有するヒト化ｃｘｃｒ３抗体およびその使用方法
EP3354278A1 (en) 2017-01-31 2018-08-01 Sanofi Neuronal cell protective effect of antibodies specific for the protofibrillar form of the beta-amyloid peptide
KR20190131068A (ko) * 2017-03-22 2019-11-25 사노피 인간화된 항-cxcr5 항체를 사용하는 루푸스의 치료
TWI714854B (zh) * 2017-05-24 2021-01-01 財團法人生物技術開發中心 抗globo h之人類化抗體及其於治療癌症之用途
JP7245793B2 (ja) 2017-06-30 2023-03-24 ザイムワークス ビーシー インコーポレイテッド 安定化したキメラＦａｂ
WO2019108639A1 (en) * 2017-12-01 2019-06-06 Pfizer Inc. Anti-cxcr5 antibodies and compositions and uses thereof
JP2021512103A (ja) 2018-01-31 2021-05-13 バイエル アクチェンゲゼルシャフトＢａｙｅｒ Ａｋｔｉｅｎｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ Ｎａｍｐｔ阻害剤を含む抗体薬物複合体（ａｄｃｓ）
WO2019159193A1 (en) * 2018-02-13 2019-08-22 Indian Institute Of Technology Bombay Novel humanized anti-cd19 chimeric antigen receptor, its nucelic acid sequence and its preparation
MA52177A (fr) * 2018-03-26 2021-02-17 Regeneron Pharma Rongeurs humanisés pour tester des agents thérapeutiques
EP3806908A1 (de) * 2018-06-18 2021-04-21 Bayer Aktiengesellschaft Gegen cxcr5 gerichtete binder-wirkstoff-konjugate mit enzymatisch spaltbaren linkern und verbessertem wirkungsprofil
EP3753954A1 (en) 2019-06-21 2020-12-23 Université de Franche-Comté Anti-cd123 antibodies, anti-cd123 chimeric antigen receptors and anti-cd123 chimeric antigen receptors t cells
DE102019121007A1 (de) 2019-08-02 2021-02-04 Immatics Biotechnologies Gmbh Antigenbindende Proteine, die spezifisch an MAGE-A binden
US20210032370A1 (en) 2019-08-02 2021-02-04 Immatics Biotechnologies Gmbh Recruiting agent further binding an mhc molecule
WO2021144020A1 (en) 2020-01-15 2021-07-22 Immatics Biotechnologies Gmbh Antigen binding proteins specifically binding prame
CN115515643A (zh) 2020-02-28 2022-12-23 建新公司 用于优化的药物缀合的经修饰的结合多肽
WO2023010483A1 (en) * 2021-08-05 2023-02-09 Hifibio (Hk) Limited Anti-human cxcr5 antibody and uses thereof
JP2023522395A (ja) 2020-04-24 2023-05-30 サノフイ 抗ｃｅａｃａｍ５抗体コンジュゲートおよびフォルフォックスを含有する抗腫瘍組み合わせ
US20230181755A1 (en) 2020-04-24 2023-06-15 Sanofi Antitumor combinations containing anti-ceacam5 antibody conjugates, trifluridine and tipiracil
US20230149557A1 (en) 2020-04-24 2023-05-18 Sanofi Antitumor combinations containing anti-ceacam5 antibody conjugates and cetuximab
KR20230005257A (ko) 2020-04-24 2023-01-09 사노피 항-ceacam5 항체 접합체 및 folfiri를 함유하는 항종양 병용물
US20240010749A1 (en) 2020-09-04 2024-01-11 Merck Patent Gmbh Anti-ceacam5 antibodies and conjugates and uses thereof
CN112521499B (zh) * 2020-12-24 2022-10-25 四川大学 抗cxcl13抗体及其用途
JP2024505600A (ja) 2021-02-03 2024-02-06 モーツァルト セラピューティクス， インコーポレイテッド 結合剤およびそれを使用する方法
BR112023018224A2 (pt) * 2021-03-09 2024-01-30 Hifibio Hk Ltd Anticorpo cxcr5 anti-humano e usos do mesmo
WO2022241034A1 (en) * 2021-05-12 2022-11-17 BioLegend, Inc. Anti-ccr8 antibodies, antigen-binding fragments thereof, and agents and compositions and methods for making and using the same
CN113278072B (zh) * 2021-05-25 2023-06-20 河南凯普瑞生物技术有限公司 一种抗体的制备方法
AU2022355388A1 (en) * 2021-09-30 2024-03-14 Betta Pharmaceuticals Co., Ltd Bispecific antibody and application thereof
WO2023076876A1 (en) 2021-10-26 2023-05-04 Mozart Therapeutics, Inc. Modulation of immune responses to viral vectors
CA3237142A1 (en) 2021-11-05 2023-05-11 Sanofi Antitumor combinations containing anti-ceacam5 antibody-drug conjugates and anti-vegfr-2 antibodies
TW202346354A (zh) 2022-03-09 2023-12-01 德商馬克專利公司 抗ceacam5抗體及其結合物及用途
WO2023172968A1 (en) 2022-03-09 2023-09-14 Merck Patent Gmbh Anti-gd2 antibodies, immunoconjugates and therapeutic uses thereof
WO2023212587A1 (en) 2022-04-28 2023-11-02 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Recombinant polypeptides comprising single-domain antibodies targeting herv-k subtype hml-2
WO2024011077A2 (en) 2022-07-04 2024-01-11 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Monoclonal antibodies directed to phosphorylated psd95 and uses thereof
CN117004700A (zh) * 2023-10-07 2023-11-07 北京爱博生生物技术有限公司 单克隆抗体可变区基因高通量测序的方法及其所用组合物与试剂盒

Family Cites Families (118)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3773919A (en) 1969-10-23 1973-11-20 Du Pont Polylactide-drug mixtures
US4179337A (en) 1973-07-20 1979-12-18 Davis Frank F Non-immunogenic polypeptides
US4307016A (en) 1978-03-24 1981-12-22 Takeda Chemical Industries, Ltd. Demethyl maytansinoids
US4275149A (en) 1978-11-24 1981-06-23 Syva Company Macromolecular environment control in specific receptor assays
US4318980A (en) 1978-04-10 1982-03-09 Miles Laboratories, Inc. Heterogenous specific binding assay employing a cycling reactant as label
US4256746A (en) 1978-11-14 1981-03-17 Takeda Chemical Industries Dechloromaytansinoids, their pharmaceutical compositions and method of use
JPS55102583A (en) 1979-01-31 1980-08-05 Takeda Chem Ind Ltd 20-acyloxy-20-demethylmaytansinoid compound
JPS55162791A (en) 1979-06-05 1980-12-18 Takeda Chem Ind Ltd Antibiotic c-15003pnd and its preparation
JPS6023084B2 (ja) 1979-07-11 1985-06-05 味の素株式会社 代用血液
JPS5645483A (en) 1979-09-19 1981-04-25 Takeda Chem Ind Ltd C-15003phm and its preparation
EP0028683A1 (en) 1979-09-21 1981-05-20 Takeda Chemical Industries, Ltd. Antibiotic C-15003 PHO and production thereof
JPS5645485A (en) 1979-09-21 1981-04-25 Takeda Chem Ind Ltd Production of c-15003pnd
US4444887A (en) 1979-12-10 1984-04-24 Sloan-Kettering Institute Process for making human antibody producing B-lymphocytes
US4376110A (en) 1980-08-04 1983-03-08 Hybritech, Incorporated Immunometric assays using monoclonal antibodies
WO1982001188A1 (en) 1980-10-08 1982-04-15 Takeda Chemical Industries Ltd 4,5-deoxymaytansinoide compounds and process for preparing same
US4450254A (en) 1980-11-03 1984-05-22 Standard Oil Company Impact improvement of high nitrile resins
US4315929A (en) 1981-01-27 1982-02-16 The United States Of America As Represented By The Secretary Of Agriculture Method of controlling the European corn borer with trewiasine
US4313946A (en) 1981-01-27 1982-02-02 The United States Of America As Represented By The Secretary Of Agriculture Chemotherapeutically active maytansinoids from Trewia nudiflora
JPS57192389A (en) 1981-05-20 1982-11-26 Takeda Chem Ind Ltd Novel maytansinoid
US4640835A (en) 1981-10-30 1987-02-03 Nippon Chemiphar Company, Ltd. Plasminogen activator derivatives
US4716111A (en) 1982-08-11 1987-12-29 Trustees Of Boston University Process for producing human antibodies
US4560655A (en) 1982-12-16 1985-12-24 Immunex Corporation Serum-free cell culture medium and process for making same
US4657866A (en) 1982-12-21 1987-04-14 Sudhir Kumar Serum-free, synthetic, completely chemically defined tissue culture media
GB8308235D0 (en) 1983-03-25 1983-05-05 Celltech Ltd Polypeptides
US4767704A (en) 1983-10-07 1988-08-30 Columbia University In The City Of New York Protein-free culture medium
US4496689A (en) 1983-12-27 1985-01-29 Miles Laboratories, Inc. Covalently attached complex of alpha-1-proteinase inhibitor with a water soluble polymer
US5807715A (en) 1984-08-27 1998-09-15 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Methods and transformed mammalian lymphocyte cells for producing functional antigen-binding protein including chimeric immunoglobulin
CA1319120C (en) 1985-04-01 1993-06-15 John Henry Kenten Transformed myeloma cell-line and a process for the expression of a gene coding for a eukaryotic polypeptide employing same
US4737456A (en) 1985-05-09 1988-04-12 Syntex (U.S.A.) Inc. Reducing interference in ligand-receptor binding assays
EP0206448B1 (en) 1985-06-19 1990-11-14 Ajinomoto Co., Inc. Hemoglobin combined with a poly(alkylene oxide)
US4980286A (en) 1985-07-05 1990-12-25 Whitehead Institute For Biomedical Research In vivo introduction and expression of foreign genetic material in epithelial cells
US4676980A (en) 1985-09-23 1987-06-30 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Target specific cross-linked heteroantibodies
US5618920A (en) 1985-11-01 1997-04-08 Xoma Corporation Modular assembly of antibody genes, antibodies prepared thereby and use
GB8601597D0 (en) 1986-01-23 1986-02-26 Wilson R H Nucleotide sequences
EP0272253A4 (en) 1986-03-07 1990-02-05 Massachusetts Inst Technology METHOD FOR IMPROVING GLYCOPROTE INSTABILITY.
US5225539A (en) 1986-03-27 1993-07-06 Medical Research Council Recombinant altered antibodies and methods of making altered antibodies
GB8607679D0 (en) 1986-03-27 1986-04-30 Winter G P Recombinant dna product
US4791192A (en) 1986-06-26 1988-12-13 Takeda Chemical Industries, Ltd. Chemically modified protein with polyethyleneglycol
US4946778A (en) 1987-09-21 1990-08-07 Genex Corporation Single polypeptide chain binding molecules
GB8717430D0 (en) 1987-07-23 1987-08-26 Celltech Ltd Recombinant dna product
IL89489A0 (en) 1988-03-09 1989-09-10 Hybritech Inc Chimeric antibodies directed against human carcinoembryonic antigen
WO1989009622A1 (en) 1988-04-15 1989-10-19 Protein Design Labs, Inc. Il-2 receptor-specific chimeric antibodies
WO1989009825A1 (en) 1988-04-16 1989-10-19 Celltech Limited Method for producing recombinant dna proteins
AU631802B2 (en) 1988-06-14 1992-12-10 Cetus Oncology Corporation Coupling agents and sterically hindered disulfide linked conjugates prepared therefrom
US5223409A (en) 1988-09-02 1993-06-29 Protein Engineering Corp. Directed evolution of novel binding proteins
US6048728A (en) 1988-09-23 2000-04-11 Chiron Corporation Cell culture medium for enhanced cell growth, culture longevity, and product expression
US5534617A (en) 1988-10-28 1996-07-09 Genentech, Inc. Human growth hormone variants having greater affinity for human growth hormone receptor at site 1
AU634186B2 (en) 1988-11-11 1993-02-18 Medical Research Council Single domain ligands, receptors comprising said ligands, methods for their production, and use of said ligands and receptors
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
IE63847B1 (en) 1989-05-05 1995-06-14 Res Dev Foundation A novel antibody delivery system for biological response modifiers
CA2018228C (en) 1989-06-05 1996-02-27 Nancy L. Parenteau Cell culture systems and media
US5413923A (en) 1989-07-25 1995-05-09 Cell Genesys, Inc. Homologous recombination for universal donor cells and chimeric mammalian hosts
FR2650598B1 (fr) 1989-08-03 1994-06-03 Rhone Poulenc Sante Derives de l'albumine a fonction therapeutique
US5436146A (en) 1989-09-07 1995-07-25 The Trustees Of Princeton University Helper-free stocks of recombinant adeno-associated virus vectors
GB8928874D0 (en) 1989-12-21 1990-02-28 Celltech Ltd Humanised antibodies
WO1991010741A1 (en) 1990-01-12 1991-07-25 Cell Genesys, Inc. Generation of xenogeneic antibodies
US5314995A (en) 1990-01-22 1994-05-24 Oncogen Therapeutic interleukin-2-antibody based fusion proteins
AU654811B2 (en) 1990-03-20 1994-11-24 Trustees Of Columbia University In The City Of New York, The Chimeric antibodies with receptor binding ligands in place of their constant region
GB9015198D0 (en) 1990-07-10 1990-08-29 Brien Caroline J O Binding substance
ES2108048T3 (es) 1990-08-29 1997-12-16 Genpharm Int Produccion y utilizacion de animales inferiores transgenicos capaces de producir anticuerpos heterologos.
US5661016A (en) 1990-08-29 1997-08-26 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies of various isotypes
US5633425A (en) 1990-08-29 1997-05-27 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5545806A (en) 1990-08-29 1996-08-13 Genpharm International, Inc. Ransgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5625126A (en) 1990-08-29 1997-04-29 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5814318A (en) 1990-08-29 1998-09-29 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
AU660629B2 (en) 1990-10-01 1995-07-06 University Of Connecticut, The Targeting viruses and cells for selective internalization by cells
US5122469A (en) 1990-10-03 1992-06-16 Genentech, Inc. Method for culturing Chinese hamster ovary cells to improve production of recombinant proteins
AU660297B2 (en) 1990-11-09 1995-06-22 Stephen D. Gillies Cytokine immunoconjugates
ATE199647T1 (de) 1991-05-14 2001-03-15 Univ Connecticut Gerichtete abgabe von genen, die immunogene proteine kodieren
DE69233482T2 (de) 1991-05-17 2006-01-12 Merck & Co., Inc. Verfahren zur Verminderung der Immunogenität der variablen Antikörperdomänen
WO1992022635A1 (en) 1991-06-05 1992-12-23 University Of Connecticut Targeted delivery of genes encoding secretory proteins
JP4124480B2 (ja) * 1991-06-14 2008-07-23 ジェネンテック・インコーポレーテッド 免疫グロブリン変異体
US5565332A (en) 1991-09-23 1996-10-15 Medical Research Council Production of chimeric antibodies - a combinatorial approach
WO1993008829A1 (en) 1991-11-04 1993-05-13 The Regents Of The University Of California Compositions that mediate killing of hiv-infected cells
ES2227512T3 (es) 1991-12-02 2005-04-01 Medical Research Council Produccion de anticuerpos contra auto-antigenos a partir de repertorios de segmentos de anticuerpos fijados en un fago.
US5869619A (en) 1991-12-13 1999-02-09 Xoma Corporation Modified antibody variable domains
AU3434393A (en) 1992-01-17 1993-08-03 Regents Of The University Of Michigan, The Targeted virus
FR2686899B1 (fr) 1992-01-31 1995-09-01 Rhone Poulenc Rorer Sa Nouveaux polypeptides biologiquement actifs, leur preparation et compositions pharmaceutiques les contenant.
FR2686901A1 (fr) 1992-01-31 1993-08-06 Rhone Poulenc Rorer Sa Nouveaux polypeptides antithrombotiques, leur preparation et compositions pharmaceutiques les contenant.
DE69334255D1 (de) 1992-02-06 2009-02-12 Novartis Vaccines & Diagnostic Marker für Krebs und biosynthetisches Bindeprotein dafür
CA2076465C (en) 1992-03-25 2002-11-26 Ravi V. J. Chari Cell binding agent conjugates of analogues and derivatives of cc-1065
EP0633943A4 (en) 1992-04-03 1997-05-02 Alexander T Young GENTHERAPY USING TARGETED VIRAL VECTORS.
WO1993021319A1 (en) 1992-04-08 1993-10-28 Cetus Oncology Corporation HUMANIZED C-erbB-2 SPECIFIC ANTIBODIES
ZA932522B (en) 1992-04-10 1993-12-20 Res Dev Foundation Immunotoxins directed against c-erbB-2(HER/neu) related surface antigens
JPH08501085A (ja) 1992-08-26 1996-02-06 プレジデント アンド フェローズ オブ ハーバード カレッジ 抗腫瘍剤としてのサイトカインｉｐ−１０の利用
US5639641A (en) 1992-09-09 1997-06-17 Immunogen Inc. Resurfacing of rodent antibodies
WO1994008598A1 (en) 1992-10-09 1994-04-28 Advanced Tissue Sciences, Inc. Liver reserve cells
EP0673431A1 (en) 1992-12-03 1995-09-27 Genzyme Corporation Gene therapy for cystic fibrosis
DK0698097T3 (da) 1993-04-29 2001-10-08 Unilever Nv Produktion af antistoffer eller (funktionaliserede) fragmenter deraf afledt af Camelidae-immunoglobuliner med tung kæde
US6165463A (en) 1997-10-16 2000-12-26 Inhale Therapeutic Systems, Inc. Dispersible antibody compositions and methods for their preparation and use
CA2219361C (en) 1995-04-27 2012-02-28 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
EP0823941A4 (en) 1995-04-28 2001-09-19 Abgenix Inc HUMAN ANTIBODIES DERIVED FROM IMMUNIZED XENO MOUSES
JPH11514853A (ja) 1995-09-08 1999-12-21 ジエンザイム コーポレイション 遺伝子治療のための改良されたａａｖベクター
AU5711196A (en) 1996-03-14 1997-10-01 Human Genome Sciences, Inc. Apoptosis inducing molecule i
WO1997034631A1 (en) 1996-03-18 1997-09-25 Board Of Regents, The University Of Texas System Immunoglobin-like domains with increased half lives
CA2248868A1 (en) 1996-03-22 1997-09-25 Human Genome Sciences, Inc. Apoptosis inducing molecule ii
US5916771A (en) 1996-10-11 1999-06-29 Abgenix, Inc. Production of a multimeric protein by cell fusion method
WO1998023289A1 (en) 1996-11-27 1998-06-04 The General Hospital Corporation MODULATION OF IgG BINDING TO FcRn
EP1500329B1 (en) 1996-12-03 2012-03-21 Amgen Fremont Inc. Human antibodies that specifically bind human TNF alpha
US6277375B1 (en) 1997-03-03 2001-08-21 Board Of Regents, The University Of Texas System Immunoglobulin-like domains with increased half-lives
CN100387621C (zh) 1997-04-14 2008-05-14 麦可麦脱股份公司 抗人抗原受体的新的生产方法及其用途
US6235883B1 (en) 1997-05-05 2001-05-22 Abgenix, Inc. Human monoclonal antibodies to epidermal growth factor receptor
US6642051B1 (en) 1997-10-21 2003-11-04 Targeted Genetics Corporation Amplifiable adeno-associated virus(AAV) packaging cassettes for the production of recombinant AAV vectors
EP1992633A1 (en) 1997-11-03 2008-11-19 Human Genome Sciences, Inc. VEGI, an inhibitor of angiogenesis and tumor growth
IL144559A0 (en) 1999-03-01 2002-05-23 Genentech Inc Antibodies for cancer therapy and diagnosis
CA2405709A1 (en) 2000-04-12 2001-10-25 Human Genome Sciences, Inc. Albumin fusion proteins
US6333410B1 (en) 2000-08-18 2001-12-25 Immunogen, Inc. Process for the preparation and purification of thiol-containing maytansinoids
JP2004508036A (ja) * 2000-09-08 2004-03-18 マイクロメット　アーゲー 抗体および／またはケモカイン構築物および免疫障害におけるそれらの使用
US7321026B2 (en) 2001-06-27 2008-01-22 Skytech Technology Limited Framework-patched immunoglobulins
JP4556020B2 (ja) * 2001-12-21 2010-10-06 ジェンザイム・コーポレーション 高い有効性を有するケモカインレセプタ結合複素環式化合物
US20050276812A1 (en) 2004-06-01 2005-12-15 Genentech, Inc. Antibody-drug conjugates and methods
AU2003239248A1 (en) * 2002-06-07 2003-12-22 The Government Of The United States, As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Anti-cd30 stalk and anti-cd30 antibodies suitable for use in immunotoxins
WO2004015426A1 (en) * 2002-08-06 2004-02-19 Bayer Healthcare Ag Diagnostics and therapeutics for diseases associated with human cxc chemokine receptor 5(cxcr5)
TW200530269A (en) * 2003-12-12 2005-09-16 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Anti-Mpl antibodies
US20060148009A1 (en) 2004-10-12 2006-07-06 Xencor, Inc. Prediction and assessment of immunogenicity
GB0607774D0 (en) 2006-04-20 2006-05-31 Renovo Group Plc Medicaments
TW200813086A (en) 2006-05-11 2008-03-16 Hoffmann La Roche Immunereconstituted mouse
SI2195023T1 (en) 2007-08-29 2018-07-31 Sanofi Humanized anti-CXCR5 antibodies, their derivatives and their uses

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
TWI808963B (zh) * 2017-03-22 2023-07-21 法商賽諾菲公司 使用人類化抗ｃｘｃｒ５抗體治療狼瘡

Also Published As

Publication number Publication date
HRP20180873T1 (hr) 2018-07-13
SV2010003494A (es) 2011-01-25
IL204173A (en) 2015-06-30
US9815902B2 (en) 2017-11-14
US20170044263A1 (en) 2017-02-16
KR20100061815A (ko) 2010-06-09
PE20090993A1 (es) 2009-07-08
UA117446C2 (uk) 2018-08-10
EP2195023B1 (en) 2018-03-07
MX338474B (es) 2016-04-18
IL238505A0 (en) 2015-06-30
CN104017078A (zh) 2014-09-03
CN101842115A (zh) 2010-09-22
MX338397B (es) 2016-04-15
RU2015147300A (ru) 2019-01-11
US20220073629A1 (en) 2022-03-10
JP2017123866A (ja) 2017-07-20
AU2008296538B2 (en) 2014-08-14
EP3792284A1 (en) 2021-03-17
PA8794201A1 (es) 2009-07-23
JP2010537636A (ja) 2010-12-09
TN2010000092A1 (en) 2011-09-26
US9243067B2 (en) 2016-01-26
SG10201407388XA (en) 2015-01-29
CR20150054A (es) 2015-04-06
US9175087B2 (en) 2015-11-03
NO2195023T3 (zh) 2018-08-04
CN101842115B (zh) 2014-07-30
CN104017079B (zh) 2017-01-04
KR20140117638A (ko) 2014-10-07
JP2015096075A (ja) 2015-05-21
TR201807983T4 (tr) 2018-06-21
PL2195023T3 (pl) 2018-08-31
UA104715C2 (en) 2014-03-11
TW200918558A (en) 2009-05-01
CY1120665T1 (el) 2019-12-11
RU2010111751A (ru) 2011-10-10
US9228019B2 (en) 2016-01-05
AR112564A2 (es) 2019-11-13
NZ583605A (en) 2012-10-26
EP2195023A4 (en) 2012-09-05
US20130243783A1 (en) 2013-09-19
US8647622B2 (en) 2014-02-11
TW201425337A (zh) 2014-07-01
US8980262B2 (en) 2015-03-17
RS57273B1 (sr) 2018-08-31
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