JP7166457B2

JP7166457B2 - ｃ－Ｋｉｔに対するヒト化抗体

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Publication number: JP7166457B2
Application number: JP2021529294A
Authority: JP
Inventors: ジエリュウ，; カビサソンパリ，
Original assignee: Forty Seven Inc
Current assignee: Forty Seven Inc
Priority date: 2018-11-26
Filing date: 2019-11-25
Publication date: 2022-11-07
Anticipated expiration: 2039-11-25
Also published as: UA128431C2; PH12021551126A1; SG11202104441QA; EA202190986A1; KR20210094610A; CO2021006869A2; JP2022507962A; MX2021006134A; US20220127358A1; AU2019386976B2; WO2020112687A2; WO2020112687A3; IL282668A; EP3817773B1; EP3817773A2; PE20211786A1; CR20210272A; AU2019386976A1; SA521422089B1; BR112021008454A2

Description

関連出願の相互参照
本出願では、２０１８年１１月２６日出願の米国特許仮出願第６２／７７１，５２６号の利益を主張し、すべての目的のために、この全体を参照により組み込む。

配列表の参照
本出願は、２０１９年１１月２５日作成のｔｘｔファイル５４０６８７ＵＳＳＬ＿ＳＴ２５３１，４６６バイトにより配列を含み、これを参照により組み込む。

ｃ－Ｋｉｔ（ＣＤ１１７）は、受容体型チロシンキナーゼＩＩＩ型であって、特定の細胞型の増殖を生じる物質であり「スチール（ｓｔｅｅｌ）因子」または「ｃ－Ｋｉｔリガンド」としても知られる幹細胞因子（ＳＣＦ）に結合する。この受容体が幹細胞因子に結合すると、その内因性チロシンキナーゼ活性を活性化する２量体を形成し、次いでこれは、細胞においてシグナルを伝播するシグナル伝達分子をリン酸化および活性化する。ｃ－Ｋｉｔは、骨髄中の特定の型のＨＳＰＣの同定に使用する細胞表面マーカーである。造血幹細胞（ＨＳＣ）、多能性前駆細胞（ＭＰＰ）および骨髄系共通前駆細胞（ＣＭＰ）は、高レベルのｃ－Ｋｉｔを発現する。ｃ－Ｋｉｔに対する抗体は、幹細胞置換療法における内因性細胞の除去に使用可能であると提唱されている（国際公開第２０１６／０３３２０１号、国際公開第２００８／０６７１１５号）。

国際公開第２０１６／０３３２０１号国際公開第２００８／０６７１１５号

本発明では、それぞれ配列番号２～４の、Ｋａｂａｔにより定義されるＣＤＲＨ１、Ｈ２およびＨ３を含む成熟重鎖可変領域、ならびにそれぞれ配列番号６～８の、Ｋａｂａｔにより定義されるＣＤＲＬ１、Ｌ２およびＬ３を含む成熟軽鎖可変領域を含むが、ただし、位置をＫａｂａｔに従って付番して、重鎖６０位のＮからＡ、重鎖６４位のＫからＱおよび軽鎖３０位のＮからＱから選択される１、２または３つのＣＤＲ残基の置換が存在する、ヒトｃ－Ｋｉｔに特異的に結合する抗体を提供する。
必要に応じて、Ｋａｂａｔにより定義されるＣＤＲＨ１、Ｈ２およびＨ３は、それぞれ配列番号２～４であり、Ｋａｂａｔにより定義されるＣＤＲＬ１、Ｌ２およびＬ３は、それぞれ配列番号６～８であるが、ただし、重鎖６４位のＫからＱの置換および軽鎖３０位のＮからＱの置換が存在する。

必要に応じて、Ｋａｂａｔにより定義されるＣＤＲＨ１、Ｈ２およびＨ３は、それぞれ配列番号２～４であり、Ｋａｂａｔにより定義されるＣＤＲＬ１、Ｌ２およびＬ３は、それぞれ配列番号６～８であるが、ただし、重鎖６０位のＮからＡの置換、重鎖６４位のＫからＱの置換および軽鎖３０位のＮからＱの置換が存在する。

必要に応じて、成熟重鎖可変領域は、配列番号１３、１７または２１（ＡＨ２、ＡＨ３またはＡＨ４）に対して少なくとも８５、９０、９５、９８または９９％の配列同一性を示し、成熟軽鎖可変領域は、配列番号５３（ＮＬ２）に対して少なくとも８５、９０、９５、９８、９９％の配列同一性を示すが、ただし、示される配列番号からのいかなる変動もＣＤＲ外である。

必要に応じて、Ｋａｂａｔ付番による重鎖１位は、Ｅである。必要に応じて、成熟軽鎖可変領域の以下の位置は、アミノ酸により以下のように占有される：９位がＬにより占有され、１２位がＰにより占有され、１４位がＴにより占有され、１５位がＰにより占有され、１８位がＰにより占有され、２０位がＳにより占有され、２２位がＳにより占有され、３７位がＬにより占有され、４３位がＳにより占有され、４５位がＱにより占有され、７４位がＫにより占有され、７７位がＲにより占有され、７８位がＶにより占有され、７９位がＥにより占有され、８４位がＧにより占有される。必要に応じて、成熟重鎖可変領域は、配列番号１３、１７または２１から選択される配列を有するが、ただし、１位がＥであってもよく、成熟軽鎖可変領域は、配列番号５３の配列を有する。必要に応じて、成熟重鎖可変領域は、重鎖定常領域に結合し、成熟軽鎖可変領域は、成熟軽鎖定常領域に結合する。必要に応じて、重鎖定常領域は、ヒトＩｇＧ１である。必要に応じて、抗体は、ヒトｃ－Ｋｉｔへの結合がＡＭＧ１９１と比較して増強されている。必要に応じて、抗体は、ＡＤＣＰがＡＭＧ１９１－ＩｇＧ１と比較して増強されている。必要に応じて、抗体は、ＡＤＣＣがＡＭＧ１９１－ＩｇＧ１と比較して増強されている。

本発明では、上記の抗体および薬学的に許容される担体を含む医薬組成物をさらに提供する。

本発明では、内因性ＨＳＰＣを除去する方法であって、有効なレジメンによる上記抗体を、除去を必要とする被験体に投与するステップを含む方法をさらに提供する。

本発明では、ｃ－Ｋｉｔを発現するがんを処置する方法であって、有効なレジメンによる抗体を、がんを有する被験体に投与するステップを含む方法をさらに提供する。

定義
モノクローナル抗体または他の生物学的実体は、単離形態で典型的に提供される。これは、抗体または他の生物学的実体が、典型的に、この生成または精製から生じる干渉タンパク質および他の夾雑物から少なくとも５０％ｗ／ｗ純粋であることを意味するが、モノクローナル抗体が、その使用を促進することが意図される過剰量の薬学的に許容される担体（複数可）または他のビヒクルと混合される可能性は除外しない。モノクローナル抗体は、生成または精製からの干渉タンパク質および夾雑物から少なくとも６０％、７０％、８０％。９０％、９５％または９９％（ｗ／ｗ）純粋であることがある。単離モノクローナル抗体または他の生物学的実体は、その精製後に残存する優勢な高分子種であることが多い。

特異的結合は、大きさが検出可能に高くなり、少なくとも１つの無関係な標的に生じる非特異的結合と識別可能である。特異的結合は、特定の官能基間の結合の形成または特定の空間的適合（例えば、錠と鍵の型）の結果であり得るが、非特異的結合は、通常、ファンデルワールス力の結果である。しかし、特異的結合は、抗体が１つかつ唯一の標的に結合することを必ずしも意味しない。本発明の抗体は、典型的に、少なくとも１０^８、１０^９、１０^１０、１０^１１または１０^１２Ｍ^－１の親和性でｃ－Ｋｉｔに特異的に結合する。

基本的抗体構造単位は、４量体のサブユニットである。各４量体は、ポリペプチド鎖の２つの同一の対を含み、各対は、１つの「軽」鎖（約２５ｋＤａ）および１つの「重」鎖（約５０～７０ｋＤａ）を有する。各鎖のアミノ末端部は、抗原認識の主な原因となる約１００～１１０またはこれよりも多いアミノ酸の可変領域を含む。この可変領域は、切断可能なシグナルペプチドに結合されて最初に発現する。シグナルペプチドを有しない可変領域は、成熟可変領域と呼ばれることがある。したがって、例えば、軽鎖成熟可変領域は、軽鎖シグナルペプチドを有しない軽鎖可変領域を意味する。各鎖のカルボキシ末端部は、エフェクター機能の主な原因となる定常領域を定義する。

軽鎖は、カッパまたはラムダのいずれかに分類される。重鎖は、ガンマ、ミュー、アルファ、デルタ、またはイプシロンに分類され、抗体のアイソタイプはＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびＩｇＥにそれぞれ定義される。軽および重鎖では、可変および定常領域は、約１２またはこれよりも多いアミノ酸の「Ｊ」領域により繋がれ、重鎖はまた、約１０またはこれよりも多いアミノ酸の「Ｄ」領域を含む。一般に、Fundamental Immunology, Paul, W., ed., 2nd ed. Raven Press, N.Y.,1989, Ch. 7を参照されたい（すべての目的のために、この全体を参照により組み込む）。

免疫グロブリン軽または重鎖可変領域（本明細書においてそれぞれ「軽鎖可変ドメイン」（「ＶＬドメイン」）または「重鎖可変ドメイン」（「ＶＨドメイン」）とも呼ぶ）は、３つの「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」により分断される「フレームワーク」領域からなる。フレームワーク領域は、抗原のエピトープへの特異的な結合に関してＣＤＲをアラインメントさせるように作用する。ＣＤＲは、抗原結合の主な原因となる抗体のアミノ酸残基を含む。アミノ末端からカルボキシ末端までに、ＶＬとＶＨの両ドメインは、次のフレームワーク（ＦＲ）およびＣＤＲ領域：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３およびＦＲ４を含む。ＶＬドメインのＣＤＲ１、２および３はまた、本明細書においてそれぞれ、ＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２およびＣＤＲ－Ｌ３と呼び、ＶＨドメインのＣＤＲ１、２および３はまた、本明細書においてそれぞれ、ＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２およびＣＤＲ－Ｈ３と呼ぶ。

アミノ酸の各ＶＬおよびＶＨドメインへの割当は、ＣＤＲの任意の従来定義に従う。従来定義は、Ｋａｂａｔの定義（Kabat, Sequences of Proteins of Immunological Interest (NationalInstitutes of Health, Bethesda, MD, 1987 and 1991)）、Ｃｈｏｔｈｉａの定義（Chothia &Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917, 1987; Chothia et al., Nature 342:878-883, 1989）；ＣＤＲ－Ｈ１はＣｈｏｔｈｉａおよびＫａｂａｔのＣＤＲの複合である、ＣｈｏｔｈｉａＫａｂａｔＣＤＲの複合；ＯｘｆｏｒｄＭｏｌｅｃｕｌａｒの抗体モデル化ソフトウェアにより使用される、ＡｂＭの定義；ならびにＭａｒｔｉｎらの接触の定義（worldwide web bioinfo.org.uk/abs）を含む。Ｋａｂａｔは、種々の重鎖間または種々の軽鎖間の対応する残基を同一の番号に割り当てる、広範に使用される付番の定法（Ｋａｂａｔ付番）を提供している。他に特定しない限り、抗体の可変領域における位置の付番は、Ｋａｂａｔ付番である。抗体が、ＣＤＲの特定の定義（例えば、Ｋａｂａｔ）によるＣＤＲを含むと考えられる場合、この定義は、抗体に存在する最小数のＣＤＲ残基（すなわち、ＫａｂａｔＣＤＲ）を特定する。ＣＤＲの別の従来定義内であるが、特定する定義外である、他の残基も存在することは除外しない。例えば、Ｋａｂａｔにより定義されるＣＤＲを含む抗体は、他の可能性もあるが、特に、ＣＤＲがＫａｂａｔＣＤＲ残基を含み他のＣＤＲ残基を含まない抗体、およびＣＤＲＨ１がＣｈｏｔｈｉａ－Ｋａｂａｔ複合ＣＤＲＨ１であり、他のＣＤＲがＫａｂａｔＣＤＲ残基を含み他の定義に基づくさらなるＣＤＲ残基を含まない抗体を含む。

用語「抗体」は、インタクトな抗体およびその結合断片を含む。典型的には、断片は、別々の重鎖、軽鎖Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆ（ａｂ）ｃ、Ｄａｂ、ナノボディ、およびＦｖを含む標的への特異的結合について、これらが由来するインタクトな抗体と競合する。断片は、組換えＤＮＡ技術により、またはインタクトな免疫グロブリンの酵素的もしくは化学的分離により生成することができる。また、用語「抗体」は、二特異性抗体および／またはヒト化抗体を含む。二特異性または二機能性抗体は、２つの異なる重／軽鎖対および２つの異なる結合部位を有する人工ハイブリッド抗体である（例えば、Songsivilai and Lachmann, Clin. Exp. Immunol., 79:315-321 (1990)；Kostelnyet al., J. Immunol., 148:1547-53 (1992)を参照）。

また、例となる二特異性抗体は、（１）各軽鎖および重鎖が２つの可変ドメインを短いペプチド結合により直列に含む、二重可変ドメイン抗体（ＤＶＤ－Ｉｇ）（Wu et al., Generation and Characterization of a Dual Variable DomainImmunoglobulin (DVD-Ig^TM) Molecule, In: Antibody Engineering,Springer Berlin Heidelberg (2010)）、（２）２つの単一鎖ダイアボディ（diabody）の融合であり、標的抗原のそれぞれに２つの結合部位を有する４価の二特異性抗体が生じる、Ｔａｎｄａｂ、（３）ｓｃＦｖとダイアボディとの組合せであり、多価分子を生じる、フレキシボディ(flexibody)、（４）Ｆａｂに適用する場合、異なるＦａｂ断片に結合する２つの同一のＦａｂ断片からなる３価の二特異性結合タンパク質を得ることができる、プロテインキナーゼＡにおける「２量体形成およびドッキングドメイン」に基づく、いわゆる「ドックアンドロック(dockand lock)」分子、または（５）例えば、ヒトＦｃ領域の両末端に融合する２つのｓｃＦｖを含む、いわゆるスコーピオン分子であり得る。二特異性抗体の調製に有用なプラットフォームの例としては、ＢｉＴＥ（Ｍｉｃｒｏｍｅｔ社）、ＤＡＲＴ（ＭａｃｒｏＧｅｎｉｃｓ社）、ＦｃａｂおよびＭａｂ２（Ｆ－ｓｔａｒ社）、Ｆｃ操作ＩｇＧＩ（Ｘｅｎｃｏｒ社）またはＤｕｏＢｏｄｙ（Ｆａｂアーム交換に基づく、Ｇｅｎｍａｂ社）が挙げられる。

用語「エピトープ」は、抗体が結合する抗原上の部位を指す。エピトープは、１つまたは複数のタンパク質の３次折り畳みにより並置される近接アミノ酸または非近接アミノ酸から形成され得る。近接アミノ酸から形成されるエピトープ（直鎖エピトープとしても知られる）は、変性溶媒への曝露時に典型的に維持されるが、３次折り畳みにより形成されるエピトープ（コンフォメーションエピトープとしても知られる）は、変性溶媒による処理時に典型的に失われる。エピトープは、典型的には、少なくとも３個、より通常は、少なくとも５個または８～１０個のアミノ酸をユニークな空間的コンフォメーションにおいて含む。エピトープの空間的コンフォメーションを決定する方法は、例えば、ｘ線結晶学および２次元核磁気共鳴を含む。例えば、Epitope Mapping Protocols, in Methods in Molecular Biology, Vol. 66,Glenn E. Morris, Ed. (1996)を参照されたい。

抗体間の競合は、試験下の抗体により参照抗体の共通抗原への特異的結合が阻害されるアッセイにより決定する（例えば、Junghans et al., Cancer Res. 50:1495, 1990を参照）。競合結合アッセイにおいて測定したとき過剰量の試験抗体（例えば、少なくとも２×、５×、１０×、２０×または１００×）により参照抗体の結合が少なくとも５０％阻害される場合、試験抗体は、参照抗体と競合する。一部の試験抗体により、参照抗体の結合が少なくとも７５％、９０％または９９％阻害される。競合アッセイにより同定される抗体（競合抗体）は、参照抗体と同一のエピトープに結合する抗体、および参照抗体により結合するエピトープに十分に近位の隣接エピトープに結合して立体障害が生じる抗体を含む。

用語「薬学的に許容される」は、担体、希釈剤、賦形剤もしくは補助剤が、製剤の他の成分と適合し、そのレシピエントに対して実質的には有害でないこと、および／またはこのような担体、希釈剤、賦形剤もしくは補助剤が、ヒトへの非経口投与のための医薬組成物への含有についてＦＤＡにより承認されているか、もしくは承認可能であることを意味する。

用語「被験体」は、予防的または治療的処置のいずれかを受けるヒトおよび他の哺乳動物被験体を含む。

アミノ酸置換を保存的または非保存的置換に分類する目的では、アミノ酸は、以下のようにグループ化する：Ｉ群（疎水性側鎖）：ｍｅｔ、ａｌａ、ｖａｌ、ｌｅｕ、ｉｌｅ；ＩＩ群（中性親水性側鎖）：ｃｙｓ、ｓｅｒ、ｔｈｒ；ＩＩＩ群（酸性側鎖）：ａｓｐ、ｇｌｕ；ＩＶ群（塩基性側鎖）：ａｓｎ、ｇｌｎ、ｈｉｓ、ｌｙｓ、ａｒｇ；Ｖ群（鎖配向に影響する残基）：ｇｌｙ、ｐｒｏ；およびＶＩ群（芳香族側鎖）：ｔｒｐ、ｔｙｒ、ｐｈｅ。保存的置換は、同一クラスにおけるアミノ酸間の置換を含む。非保存的置換は、このようなクラスのうちの１つのメンバーと別のクラスのメンバーとの交換を構成する。

パーセント配列同一性は、Ｋａｂａｔ付番の定法により最大限にアラインメントした抗体配列により決定する。アラインメント後、対象抗体領域（例えば、重または軽鎖の成熟可変領域全体）を参照抗体の同一の領域と比較する場合、対象および参照抗体領域間のパーセント配列同一性は、対象および参照の両抗体領域における同一のアミノ酸により占有された位置の数を、ギャップは計数せずに、２つの領域のアラインメントした位置の総数で割り、１００を掛けてパーセントに変換したものである。

１つまたは複数の列挙する要素を「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」か、または「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」組成物または方法は、詳細には列挙しない他の要素を含み得る。例えば、抗体を「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」か、または「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」組成物は、抗体を単独でまたは他の成分と組み合わせて含み得る。

値の範囲の指定は、範囲内または範囲を画定するすべての整数および範囲内の整数により画定されるすべての部分範囲を含む。

文脈から他に明らかでない限り、用語「約」は、記述される値の非実質的変動、例えば、測定値の標準誤差（例えば、ＳＥＭ）内の値を包含する。

統計学的有意性は、ｐ＜０．０５を意味する。

ヒト化抗体は、非ヒト「ドナー」抗体由来のＣＤＲをヒト「アクセプター」抗体配列に移植する遺伝子操作された抗体である（例えば、Ｑｕｅｅｎの米国特許第５，５３０，１０１号および第５，５８５，０８９号、Ｗｉｎｔｅｒの米国特許第５，２２５，５３９号、Ｃａｒｔｅｒの米国特許第６，４０７，２１３号、Ａｄａｉｒの米国特許第５，８５９，２０５号、ならびにＦｏｏｔｅの米国特許第６，８８１，５５７号を参照）。アクセプター抗体配列は、例えば、成熟ヒト抗体配列、このような配列の複合、ヒト抗体配列のコンセンサス配列、または生殖系列領域配列であり得る。したがって、ヒト化抗体は、完全または実質的にドナー抗体由来のＣＤＲ、ならびに可変領域フレームワーク配列および存在する場合、完全または実質的にヒト抗体配列由来の定常領域を有する抗体である。対応する残基（Ｋａｂａｔにより定義される）の少なくとも８５％、９０％、９５％または１００％がそれぞれのＣＤＲ間で同一である場合、ヒト化抗体のＣＤＲは、非ヒト抗体の対応するＣＤＲに実質的に由来する。Ｋａｂａｔにより定義される対応する残基の少なくとも８５％、９０％、９５％または１００％がヒトアクセプター配列と同一である場合、抗体鎖の可変領域フレームワーク配列または抗体鎖の定常領域は、それぞれヒト可変領域フレームワーク配列またはヒト定常領域に実質的に由来する。

図１Ａおよび１Ｂは、ＨＢ－１０７１６として寄託されたハイブリドーマにより生成したマウス抗ｃ－Ｋｉｔ抗体の成熟重および軽鎖可変領域を示す。図１Ａおよび１Ｂは、ＨＢ－１０７１６として寄託されたハイブリドーマにより生成したマウス抗ｃ－Ｋｉｔ抗体の成熟重および軽鎖可変領域を示す。

図２Ａおよび２Ｂは、本発明の５つのヒト化重鎖成熟可変領域および２つのヒト化軽鎖成熟可変領域の成熟重および軽鎖可変領域をマウスおよびヒトアクセプター配列と比較して示す。ヒト化配列の可変領域フレームワークは、ＡＭＧ１９１のものと同一であるが、ＣＤＲは異なる。図２Ａおよび２Ｂは、本発明の５つのヒト化重鎖成熟可変領域および２つのヒト化軽鎖成熟可変領域の成熟重および軽鎖可変領域をマウスおよびヒトアクセプター配列と比較して示す。ヒト化配列の可変領域フレームワークは、ＡＭＧ１９１のものと同一であるが、ＣＤＲは異なる。

図２Ｃでは、ＡＭＧ１９１の結合を、ＣＤＲ置換を有するそのバリアントと比較する。ＣＤＲ置換バリアントのすべてが、結合の増強を示した。

図２Ｄでは、ＡＭＧ１９１の結合を、他のＣＤＲの置換を有するバリアントと比較する。このようなバリアントは、結合の減少を示した。

図３Ａおよび３Ｂでは、６つのヒト化重鎖成熟可変領域および３つのヒト化軽鎖成熟可変領域の配列をＡＭＧ１９１、マウス配列およびヒトアクセプター配列と比較して提供する。このようなヒト化鎖では、可変領域フレームワークは、ＡＭＧ１９１抗体におけるものと異なる。また、ヒト化鎖の一部は、ＣＤＲにおいて異なる。図３Ａおよび３Ｂでは、６つのヒト化重鎖成熟可変領域および３つのヒト化軽鎖成熟可変領域の配列をＡＭＧ１９１、マウス配列およびヒトアクセプター配列と比較して提供する。このようなヒト化鎖では、可変領域フレームワークは、ＡＭＧ１９１抗体におけるものと異なる。また、ヒト化鎖の一部は、ＣＤＲにおいて異なる。

図３Ｃでは、同一のＣＤＲを有するが可変領域フレームワークが異なる（種々のヒトアクセプター配列の使用から生じる）ヒト化抗体と、ＡＭＧ１９１の結合を比較する。新たなフレームワーク（ＮＦ）を有する抗体は、高い親和性を有する。

図３Ｄでは、ＡＭＧ１９１と比較して新たなフレームワークに基づきＣＤＲ置換をも有するさらなるヒト化バリアントと、ＡＭＧ１９１の結合を比較する。バリアント抗体の３つすべては、高い親和性を有した。

図４では、ＣＤＲ置換および異なる軽鎖可変領域フレームワーク（重鎖可変領域フレームワークは同一）の存在によりＡＭＧ１９１と異なる３つのヒト化抗体と、ＡＭＧ１９１の結合を比較する。バリアント抗体の３つすべては、高い親和性を有した。

図５では、ＡＭＧ１９１、野生型ＩｇＧ１定常領域を有するＡＭＧ１９１のバリアントの食作用活性を、本発明の５つの新たなヒト化抗体と比較する。新たなバリアント、特には、ＨＦ１２およびＮＦ１１２は、特には、低い試験濃度において、食作用の増加を示した。

図６では、ＡＭＧ１９１のＡＤＣＣ活性を、２つの新たなヒト化バリアントＨＦ１１２およびＨＦ１２ならびにアイソタイプ対応無関係対照と比較する。ＨＦ１１２およびＨＦ１２は、さらなるＡＤＣＣ活性を有した。

図７は、ＨＦ１２およびＨＦ１１２によるＳＣＦ誘導ＨＳＰＣ増殖の阻害を、ＡＭＧ１９１、ＡＭＧ１９１－ヒトＩｇＧ１および陰性対照と比較して示す。

図８では、抗ｃ－Ｋｉｔ抗体のマスト細胞脱顆粒を、陽性対照Ａ２３１８７およびＩｇＥ＋抗ＩｇＥと比較する。

配列の簡単な説明
配列番号１～４は、ＨＢ－１０７１６の抗体の成熟重鎖可変領域ならびにＣＤＲ－Ｈ１、Ｈ２およびＨ３である。

配列番号５～８は、ＨＢ－１０７１６の抗体の成熟軽鎖可変領域ならびにＣＤＲ－Ｌ１、Ｌ２およびＬ３である。

配列番号９～１２は、ヒト化重鎖ＡＨ１の成熟重鎖可変領域ならびにＣＤＲ－Ｈ１、Ｈ２およびＨ３である。

配列番号１３～１６は、ヒト化重鎖ＡＨ２の成熟重鎖可変領域ならびにＣＤＲ－Ｈ１、Ｈ２およびＨ３である。

配列番号１７～２０は、ヒト化重鎖ＡＨ３の成熟重鎖可変領域ならびにＣＤＲ－Ｈ１、Ｈ２およびＨ３である。

配列番号２１～２４は、ヒト化重鎖ＡＨ４の成熟重鎖可変領域ならびにＣＤＲ－Ｈ１、Ｈ２およびＨ３である。

配列番号２５～２８は、ヒト化重鎖ＡＨ５の成熟重鎖可変領域ならびにＣＤＲ－Ｈ１、Ｈ２およびＨ３である。

配列番号２９は、ＡＭＧ１９１の成熟重鎖可変領域である。

配列番号３０は、ＩＧＨＶ１－４６＊０１の可変領域配列である。

配列番号３１～３４は、ヒト化軽鎖ＡＬ１の成熟軽鎖可変領域ならびにＣＤＲ－Ｌ１、Ｌ２およびＬ３である。

配列番号３５～３８は、ヒト化軽鎖ＡＬ２の成熟軽鎖可変領域ならびにＣＤＲ－Ｌ１、Ｌ２およびＬ３である。

配列番号３９は、ＡＭＧ１９１の成熟軽鎖可変領域である。

配列番号４０～４３は、ＩＧＫＶ４－１＊０１の可変領域配列および３つのＣＤＲ－Ｌ１、Ｌ２およびＬ３である。

配列番号４４～５０は、ヒト化重鎖ＮＨ、ＮＨ１、ＮＨ２、ＮＨ３、ＮＨ４およびＮＨ５ならびにＩＧＨＶ３－２３＊０１の成熟重鎖可変領域である。

配列番号５１～５４は、ヒト化軽鎖ＮＬ、ＮＬ１、ＮＬ２およびＩＧＫＶ２－２８＊０１の成熟軽鎖可変領域である。

Ｉ．概要
本発明では、ヒトｃ－Ｋｉｔ（ＳｗｉｓｓＰｒｏｔＰ１０７２１）に特異的に結合する抗体を提供する。抗体は、ＨＢ－１０７１６として寄託されたハイブリドーマにより生成される、これまでに開示されているマウス抗ｃ－Ｋｉｔ抗体のヒト化形態を表し、これは、それぞれ配列番号１および５の成熟重および軽鎖可変領域を有する。このマウス抗体は、ＡＭＧ１９１として、これまでにヒト化されている（米国特許第７，９１５，３９１号を参照）。ＡＭＧ１９１のＫａｂａｔＣＤＲは、これらが由来するマウス抗体と同一である。ＡＭＧ１９１は、ＣｒｅａｔｉｖｅＢｉｏｌａｂｓ社から市販されている。

本発明の抗体は、ＨＢ－１０７１６として寄託されたマウス抗体に実質的に由来するＣＤＲをヒトアクセプター配列に移植し、必要に応じて、以下にさらに記載するように特定の位置において置換したものである。

一部の抗体は、ＣＤＲＨ１、Ｈ２およびＨ３を含む、配列番号１の成熟重鎖可変領域、ならびにＣＤＲＬ１、Ｌ２およびＬ３を含む、配列番号５の成熟軽鎖可変領域を含むが、ただし、少なくとも１つのＣＤＲ残基の置換が存在する。ＣＤＲＨ１、Ｈ２およびＨ３は、好ましくは、配列番号２～４をそれぞれ含み、ＣＤＲＬ１、Ｌ２およびＬ３は、好ましくは、配列番号６～８を含む（すなわち、Ｋａｂａｔにより定義される）が、ただし、少なくとも１つのＣＤＲの置換が存在する。ＣＤＲの置換は、位置をＫａｂａｔに従って付番して、好ましくは、重鎖６０位のＮからＡ、重鎖６４位のＫからＱおよび軽鎖３０位のＮからＱから選択される。このような置換は、１、２または３つすべてが存在し得る。一部の抗体は、重鎖６４位および軽鎖３０位における置換を含む。一部の抗体は、重鎖６０位、重鎖６４位および軽鎖３０位における置換を含む。一部の抗体は、重鎖６０位および軽鎖３０位における置換を含む。一部の抗体は、重鎖６０位および重鎖６４位における置換を含む。一部の抗体は、ＫａｂａｔＣＤＲの置換を有しないが、ただし、重鎖６０位および６４位ならびに軽鎖３０位における置換を個々に、または収載する組合せで有する。ＫａｂａｔＣＤＲの他の任意の置換が存在する場合、このような他の置換の存在が１、２、３、４または５つ以下であることが好ましい。

本発明の抗体の一部は、ＡＭＧ１９１に存在する残基と比較してＣＤＲ残基の少なくとも１つの置換の存在により、ＡＭＧ１９１とは異なる。好ましい置換は、位置をＫａｂａｔに従って付番して、重鎖６０位のＮからＡ、重鎖６４位のＫからＱおよび軽鎖３０位のＮからＱである。このような置換は、１、２または３つすべてが存在し得る。一部の抗体は、重鎖６４位および軽鎖３０位における置換を含む。一部の抗体は、重鎖６０位、重鎖６４位および軽鎖３０位における置換を含む。一部の抗体は、重鎖６０位および軽鎖３０位における置換を含む。一部の抗体は、重鎖６０位および重鎖６４位における置換を含む。一部の抗体は、ＡＭＧ１９１のＫａｂａｔＣＤＲと比較して置換を有しないが、ただし、重鎖６０位および６４位ならびに軽鎖３０位における置換を個々に、または収載する組合せで有する。ＫａｂａｔＣＤＲの他の任意の置換が存在する場合、このような他の置換の存在が１、２、３、４または５つ以下であることが好ましい。

重鎖６０位および６４位ならびに軽鎖３０位において個々または組合せでＣＤＲを置換すると、ヒトｃ－Ｋｉｔに対する結合親和性の向上が付与され得る。また、置換は、ある位置のヒト生殖系列残基とのマウス残基の置き換えを表し、これ以外が同じなら、ヒト化抗体のヒト特性が向上する。以下の表１では、ＨＢ－１０７１６として寄託されたマウス抗体、ＡＭＧ１９１および３つの本発明のヒト化抗体において、重鎖６０位および６４位ならびに軽鎖３０位を占有する残基を比較する。
表１

加えて、またはあるいは、本発明のヒト化抗体の一部は、種々の可変領域フレームワーク配列の存在によりＡＭＧ１９１のものとは異なる。ＡＭＧ１９１は、マウスＣＤＲ配列をＩＧＨＶ１－４６＊０１ＩＧＫＶ４－１＊０１の生殖系列フレームワークに重および軽鎖についてそれぞれ移植することにより得られた。本開示では、ＩＧＨ３－２３＊０１の重鎖可変領域フレームワークおよびＩＧＫＶ２－２８＊０１の軽鎖可変領域フレームワークへのＣＤＲの移植を提供する。このようなフレームワークにより、ＡＭＧ１９１のものよりも高い結合親和性が付与されることが見出されている。本発明の一部の好ましい抗体は、ＡＭＧ１９１の重鎖可変領域におけるものと同一の復帰変異を組み込んだＩＧＨＶ１－４６＊０１に基づく重鎖可変領域フレームワークおよびＩＧＫＶ２－２８＊０１に基づく軽鎖可変領域フレームワークを含む。フレームワークのこのような組合せにより、ＡＭＧ１９１と比較した親和性向上の利点が、ＩＧＨ３－２３＊０１の重鎖可変領域フレームワークおよびＩＧＫＶ２－２８＊０１の軽鎖可変領域フレームワークの組合せを有する抗体に対する発現向上の利点と組み合わされる。

したがって、本発明の一部の好ましい抗体は、ＡＨ２、ＡＨ３およびＡＨ４に対応する配列番号１３、１７または２１に指定する鎖のいずれかの配列を有する成熟重鎖可変領域ならびにＮＬ２に対応する配列番号５３の配列を有する成熟軽鎖可変領域を有する。重鎖可変領域配列は、ＣＤＲ置換を重鎖６０位のみ、重鎖６４位のみ、または重鎖６０位および６４位に、すべてＫａｂａｔ付番により有することによって相互に異なる。ＣＤＲ置換を除いて、この重鎖可変領域配列は、ＡＭＧ１９１の成熟重鎖可変領域と同一である。配列番号１３、１７および２１の重鎖配列は、Ｋａｂａｔ７１（ＲからＡ）、７３（ＴからＫ）および７８位（ＶからＡ）における可変領域フレームワーク置換（すなわち、ヒトアクセプター残基をマウスドナーへ）を含む。ＭからＩの６９位におけるさらなる置換が存在する。

配列番号５３の成熟軽鎖可変領域は、ＣＤＲ置換を３０位に有する。また、配列番号５３の成熟軽鎖可変領域は、種々のアクセプターの選択により、可変領域フレームワークのいくつかの位置において、以下のように、ＡＭＧ１９１の成熟軽鎖可変領域とは異なる：
９位がＬにより占有され、
１２位がＰにより占有され、
１４位がＴにより占有され、
１５位がＰにより占有され、
１８位がＰにより占有され、
２０位がＳにより占有され、
２２位がＳにより占有され、
３７位がＬにより占有され、
４３位がＳにより占有され、
４５位がＱにより占有され、
７４位がＫにより占有され、
７７位がＲにより占有され、
７８位がＶにより占有され、
７９位がＥにより占有され、
８４位がＧにより占有される。

配列番号５３の成熟軽鎖可変領域は、ヒト生殖系列由来のマウス残基への可変領域フレームワークのいかなる復帰変異をも含まない。

また、本発明では、例示する配列のバリアントを表す重および軽鎖可変領域を有する抗体を提供する。例えば、本発明は、配列番号１３、１７または２１のいずれかに対して少なくとも８５％、９０％、９５％、９８または９９％の同一性を有する成熟重鎖可変領域、および配列番号５３に対して少なくとも８５％、９０％、９５％、９８％または９９％の配列同一性を有する成熟軽鎖可変領域を有する抗体を含む。示される配列からのいかなる変動も、好ましくは、Ｋａｂａｔにより定義されるＣＤＲ外である。また、変動は、好ましくは、指示する配列（Ｋａｂａｔ付番による７１、７３および７８位）において復帰変異を受ける可変領域フレームワークの位置に存在しない。一部の抗体では、いかなる置換も、Ｋａｂａｔ付番による重鎖６９位には存在しない。一部の抗体では、変動は、可変領域フレームワークの位置（複数可）に存在するが、配列番号５３がＡＭＧ１９１の成熟軽鎖可変領域とは異なるものを除く。他の抗体では、変動は、配列番号５３がＡＭＧ１９１の成熟軽鎖可変領域とは異なる、可変領域フレームワークの位置（複数可）に、必要に応じて、可変領域フレームワークにおける他の位置（複数可）と組み合わせて存在する。一部の抗体では、配列番号５３がＡＭＧ１９１の成熟軽鎖可変領域フレームワークとは異なる、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４または１５個の可変領域フレームワーク残基が維持される。一部の抗体では、変動は、保存的置換（複数可）によるものである。一部の抗体では、重鎖の１位のＱは、Ｅにより交換して、ピログルタミン酸変換の可能性を低下させることができる（Liu, et al., 2011, J. Biol. Chem., 286: 11211-11217）。グルタミン酸（Ｅ）のピログルタミン酸（ｐＥ）への変換は、グルタミン（Ｑ）からよりも緩徐に生じる。グルタミンからｐＥへの変換において１級アミンが失われるため、抗体は、さらに酸性となる。不完全な変換によって抗体において不均一性が生じ、これは、電荷に基づく解析方法を使用すると多重ピークとして観察され得る。不均一性の差は、プロセス制御の欠如を示し得る。

抗体は、ヒトｃ－Ｋｉｔに対する結合親和性、ＡＤＣＰ、ＡＤＣＣおよびＳＣＦ誘導ＨＳＰＣ増殖の阻害について、実施例において提供するアッセイを使用して試験することができる。また、抗体は、国際公開第２０１６／０３３２０１号に記載のように、動物モデルにおいてスクリーニングすることができる。本発明の好ましい抗体は、このようなアッセイを使用して測定した場合、ＡＭＧ１９１またはそのヒトＩｇＧ１型を超える、ヒトｃ－Ｋｉｔに対する結合親和性の増強、ＡＤＣＰの増強および／またはＡＤＣＣの増強および／またはＳＣＦ誘導ＨＳＰＣ増殖の阻害の増強を有する。また、好ましい抗体は、そのリガンドのヒト幹細胞因子へのヒトｃ－Ｋｉｔの結合を阻害する。

また、本発明では、ＡＭＧ１９１またはそのヒトＩｇＧ１型と比較してヒトｃ－Ｋｉｔを発現する細胞に対する、ヒトｃ－Ｋｉｔへの結合および／またはＡＤＣＰおよび／またはＡＤＣＣの増強のための手段を提供し、この場合、増強は、本実施例におけるように測定される。例となる手段は、配列番号１３、１７または２１のいずれかの成熟重鎖可変領域および配列番号５３の成熟軽鎖可変領域を有し、ヒトＩｇＧ１重鎖定常領域およびヒトカッパ軽鎖定常領域を有する抗体である。ＡＭＧ１９１と比較したＣＤＲにおける重鎖６０位のＮからＡ、重鎖６４位のＫからＱおよび／または軽鎖３０位のＮからＱの置換は、例となる手段の増強特性に寄与する。このような手段は、薬学的に活性の担体とともに医薬組成物に組み込むことができる。

抗体は、他の因子もあるが、特に、定常領域の発現または選択の条件に応じて、翻訳後修飾、例えば、グリコシル化を受けていても受けていなくてもよい。

ＩＩ．定常領域の選択
上記の重および軽鎖可変領域は、ヒト定常領域の少なくとも１部分に結合させることができる。定常領域の選択は、抗体依存性細胞媒介細胞傷害、抗体依存性細胞食作用および／または補体依存性細胞傷害を所望するかどうかにある程度依存する。例えば、ヒトアイソタイプＩｇＧ１およびＩｇＧ３は補体依存性細胞傷害を有し、ヒトアイソタイプＩｇＧ２およびＩｇＧ４はこれを有しない。また、ヒトＩｇＧ１およびＩｇＧ３では、ヒトＩｇＧ２およびＩｇＧ４よりも強力な細胞媒介エフェクター機能が誘導される。ヒトＩｇＧ１は、本発明の抗体にとって好ましい。軽鎖定常領域は、ラムダまたはカッパであり得る。

軽および／または重鎖のアミノまたはカルボキシ末端における１つまたはいくつかのアミノ酸、例えば、重鎖のＣ末端リジンは、ある割合またはすべての分子において欠損しているか、または誘導体化され得る。置換を定常領域において行って、エフェクター機能、例えば、補体媒介細胞傷害もしくはＡＤＣＣを低下もしくは上昇させるか、またはグリコシル化部位を除去する（例えば、Winter et al.、米国特許第５，６２４，８２１号；Tso et al.、米国特許第５，８３４，５９７号；およびLazar etal., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 103:4005, 2006を参照）か、あるいはヒトにおいて半減期を延長させることができる（例えば、Hintonet al., J. Biol. Chem. 279:6213, 2004を参照）。抗体の半減期を延長させるための例となる置換としては、２５０位のＧｌｎおよび／または４２８位のＬｅｕが挙げられる（定常領域については、この段落においてＥＵ付番を使用する）。Ｍ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅも、Ｎ４３４ＡまたはＳ、Ｔ２５０ＱおよびＶ３０８９Ｐと同様に半減期を延長させる。２３４、２３５、２３６および／または２３７位のいずれかまたはすべてにおける置換により、Ｆｃγ受容体、特には、ＦｃγＲＩ受容体に対する親和性が低下する（例えば、米国特許第６，６２４，８２１号を参照）。次の置換：Ｆ２４３Ｌ／Ｒ２９２Ｐ／Ｙ３００Ｌ／Ｖ３０５Ｉ／Ｐ３９６Ｌ、Ｆ２４３Ｌ／Ｒ２９２Ｐ／Ｙ３００Ｌ／Ｖ３０５Ｉ／Ｐ３９６Ｌ、Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅ／Ａ３３０Ｌ、Ｓ２９８Ａ／Ｅ３３３Ａ／Ｋ３３４Ａ、Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅ／Ａ３３０ＬおよびＳ２９８Ａ／Ｅ３３３Ａ／Ｋ３３４Ａのいずれかにより、エフェクター機能が上昇する。

ヒト定常領域は、種々の個体間でアロタイプ変動およびイソアロタイプ変動を示す。すなわち、定常領域は、種々の個体の１つまたは複数の多型位置において異なり得る。イソアロタイプは、イソアロタイプを認識する血清が、１つまたは複数の他のアイソタイプの非多型領域に結合するという点においてアロタイプとは異なる。

ＩＩＩ．組換え抗体の発現
ヒト化抗体は、組換え発現により典型的に生成する。組換えポリヌクレオチド構築物は、抗体鎖のコード配列に作動可能に結合する発現制御配列を典型的に含み、天然関連または異種発現制御エレメント、例えば、プロモーターを含む。発現制御配列は、真核または原核宿主細胞を形質転換またはトランスフェクト可能なベクター内のプロモーター系であり得る。ベクターを適切な宿主に組み込むと、宿主は、ヌクレオチド配列の高レベル発現ならびに交差反応する抗体の採取および精製に適する条件下に維持される。

このような発現ベクターは、エピソームまたは宿主染色体ＤＮＡの不可欠な部分のいずれかとして宿主生物において典型的に複製可能である。一般には、発現ベクターは、例えば、アンピシリン耐性またはハイグロマイシン耐性の選択マーカーを含み、所望のＤＮＡ配列により形質転換した細胞の検出を可能とする。

Ｅ．ｃｏｌｉは、抗体、特には、抗体断片を発現させるために有用な１つの原核宿主である。微生物、例えば、酵母も、発現に有用である。サッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）は、発現制御配列、複製起点、終結配列等を所望のとおりに有する、適するベクターを有する酵母宿主である。典型的プロモーターは、３－ホスホグリセリン酸キナーゼおよび他の解糖系酵素を含む。誘導可能な酵母プロモーターは、とりわけ、アルコール脱水素酵素、イソシトクロムＣ、ならびにマルトースおよびガラクトース利用の原因となる酵素由来のプロモーターを含む。

哺乳動物細胞は、免疫グロブリンまたはこの断片をコードするヌクレオチドセグメントを発現させるために使用することができる。Winnacker, From Genes to Clones, (VCH Publishers, NY, 1987)を参照されたい。インタクトな異種タンパク質を分泌可能ないくつかの適する宿主細胞株が開発されており、ＣＨＯ細胞株、種々のＣＯＳ細胞株、ＨｅＬａ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、Ｌ細胞、ならびにＳｐ２／０およびＮＳ０を含む非抗体産生ミエローマを含む。細胞は、非ヒト細胞であり得る。このような細胞のための発現ベクターは、発現制御配列、例えば、複製起点、プロモーター、エンハンサー（Queenet al., Immunol. Rev. 89:49 (1986)）、ならびに必要なプロセシング情報部位、例えば、リボソーム結合部位、ＲＮＡスプライス部位、ポリアデニル化部位、および転写終結配列を含むことができる。発現制御配列は、内因性遺伝子、サイトメガロウイルス（ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ）、ＳＶ４０、アデノウイルス、ウシパピローマウイルス（ｂｏｖｉｎｅｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ）等に由来するプロモーターを含むことができる。Coet al., J. Immunol. 148:1149 (1992)を参照されたい。

あるいは、抗体をコードする配列は、トランスジェニック動物のゲノムへの導入およびトランスジェニック動物の乳における後続の発現のための導入遺伝子に組み込むことができる（例えば、米国特許第５，７４１，９５７号；米国特許第５，３０４，４８９号；および米国特許第５，８４９，９９２号を参照）。適する導入遺伝子は、乳腺特異的遺伝子、例えば、カゼインまたはベータラクトグロブリン由来のプロモーターおよびエンハンサーと作動可能に結合する軽および／または重鎖のコード配列を含む。

目的のＤＮＡセグメントを含むベクターは、細胞宿主の型に応じた方法により宿主細胞に導入することができる。例えば、塩化カルシウムトランスフェクションは、原核細胞に一般に利用されているが、リン酸カルシウム処理、エレクトロポレーション、リポフェクション、微粒子銃、またはウイルスに基づくトランスフェクションは、他の細胞宿主に使用することができる。哺乳動物細胞の形質転換に使用される他の方法は、ポリブレン、原形質融合、リポソーム、エレクトロポレーション、および微量注入の使用を含む。トランスジェニック動物の作製では、導入遺伝子は、受精卵母細胞に微量注入し得るか、胚幹細胞のゲノムに組み込んで、このような細胞の核を除核卵母細胞に導入し得る。

抗体重および軽鎖をコードするベクター（複数可）を細胞培養物に導入して、細胞プールを増殖生産性および産物の質について無血清培地においてスクリーニングすることができる。次いで、最も産生した細胞プールをＦＡＣＳに基づく単一細胞クローニングに供して、モノクローナル系を生成することができる。７．５ｇ／Ｌ培養物よりも大きい産物力価に対応する、１日に１細胞あたり５０ｐｇまたは１００ｐｇを超える特異的生産性を使用することができる。また、単一細胞クローンにより生成した抗体は、濁度、ろ過特性、ＰＡＧＥ、ＩＥＦ、ＵＶスキャン、ＨＰ－ＳＥＣ、炭水化物－オリゴ糖マッピング、質量分析、および結合アッセイ、例えば、ＥＬＩＳＡまたはＢｉａｃｏｒｅについて試験することができる。次いで、選択されたクローンは、複数のバイアルに保存し、後続の使用のために凍結して貯蔵することができる。

発現すると、抗体は、プロテインＡ捕捉、ＨＰＬＣ精製、カラムクロマトグラフィー、ゲル電気泳動等を含む、当技術分野の標準的手順に従って精製することができる（一般には、Scopes, Protein Purification (Springer-Verlag, NY, 1982)を参照）。

抗体の商業生産のための方法を利用することができ、コドン最適化、プロモーターの選択、転写エレメントの選択、ターミネーターの選択、無血清単一細胞クローニング、細胞保存、コピー数の増幅のための選択マーカーの使用、ＣＨＯターミネーター、またはタンパク質力価の向上を含む（例えば、米国特許第５，７８６，４６４号；米国特許第６，１１４，１４８号；米国特許第６，０６３，５９８号；米国特許第７，５６９，３３９号；国際公開第２００４／０５０８８４号；国際公開第２００８／０１２１４２号；国際公開第２００８／０１２１４２号；国際公開第２００５／０１９４４２号；国際公開第２００８／１０７３８８号；国際公開第２００９／０２７４７１号；および米国特許第５，８８８，８０９号を参照）。

ＩＶ．核酸
本発明では、上記の重および軽鎖のいずれかをコードする核酸をさらに提供する。必要に応じて、このような核酸は、単一ペプチドをさらにコードし、定常領域に結合するシグナルペプチドにより発現し得る。核酸のコード配列は、調節配列と作動可能に結合して、コード配列の発現が確実となり得る（例えば、プロモーター、エンハンサー、リボソーム結合部位、転写終結シグナル等）。重および軽鎖をコードする核酸は、単離形態で生じ得るか、または１つまたは複数のベクターにクローニングし得る。核酸は、例えば、固相合成または重複するオリゴヌクレオチドのＰＣＲにより合成することができる。重および軽鎖をコードする核酸は、例えば発現ベクター内に、１つの近接する核酸として繋がれていても、または分離しており、例えば、発現ベクターこれ自体にそれぞれクローニングされていてもよい。

Ｖ．コンジュゲート抗体
本発明の抗体は、細胞傷害性または細胞増殖抑制性部分にコンジュゲートさせて、細胞傷害のさらなる機構をもたらすことができる。

一部のこのような抗体は、免疫毒素として作用するように修飾することができる。例えば、米国特許第５，１９４，５９４号を参照されたい。例えば、植物に由来する細胞毒素であるリシンは、二機能性試薬Ｓ－アセチルメルカプトコハク酸無水物を抗体に、３－（２－ピリジルジチオ）プロピオン酸スクシンイミジルをリシンに使用することにより抗体にカップリングさせることができる。Pietersz et al., Cancer Res. 48(16):4469-4476 (1998)を参照されたい。カップリングすると、リシンのＢ鎖結合活性は失われるが、リシンのＡ鎖の毒性能力も抗体の活性も損なわれない。同様に、リボソーム集合の阻害物質であるサポリンも、化学的に挿入したスルフヒドリル基間のジスルフィド結合を介して抗体にカップリングさせることができる。Politoet al., Leukemia 18:1215-1222 (2004)を参照されたい。

一部のこのような抗体は、放射性同位体に結合させることができる。放射性同位体の例としては、例えば、イットリウム９０（９０Ｙ）、インジウム１１１（１１１Ｉｎ）、１３１Ｉ、９９ｍＴｃ、放射性銀１１１、放射性銀１９９およびビスマス２１３が挙げられる。放射性同位体の抗体への結合は、通常の二機能性キレートを用いて実施し得る。放射性銀１１１および放射性銀１９９の結合では、イオウに基づくリンカーを使用し得る。Hazra et al., Cell Biophys. 24-25:1-7 (1994)を参照されたい。銀放射性同位体の結合では、アスコルビン酸による免疫グロブリンの還元を含み得る。１１１Ｉｎおよび９０Ｙのような放射性同位体では、イブリツモマブチウキセタンを使用することができ、このような同位体と反応して１１１Ｉｎ－イブリツモマブチウキセタンおよび９０Ｙ－イブリツモマブチウキセタンをそれぞれ形成する。Witzig,Cancer Chemother. Pharmacol., 48 Suppl 1:S91-S95 (2001)を参照されたい。

一部のこのような抗体は、毒性化学療法薬、例えば、マイタンシン、ゲルダナマイシン、チューブリン阻害物質、例えば、チューブリン結合剤（例えば、アウリスタチン）または副溝結合剤、例えば、カリケアマイシンとコンジュゲートさせることができる。

ＶＩ．治療適用
本発明の抗体またはこのような抗体を組み込んだ医薬組成物は、種々の状態の処置に使用することができる。例えば、このような抗体は、それを必要とする被験体における内因性造血幹および前駆細胞（ＨＳＰＣ）の除去において使用することができる。内因性ＨＳＰＣの除去は、幹細胞置換療法における最初のステップである。幹細胞置換療法は、一部の点で欠陥を有する内因性ＨＳＰＣの減少または除去、および置換ＨＳＰＣとのこれらの交換を一般に含む。置換ＨＳＰＣは、自家、同種異系または異種であり得る。内因性ＨＳＰＣは、機能または発現を損なう遺伝性変異の結果（例えば、鎌状赤血球貧血またはサラセミア）、血液がんの結果、またはがんの処置において使用される化学療法による損傷の結果として欠陥を有している可能性がある。また、内因性ＨＳＰＣが移植片の免疫攻撃を生じるため、内因性ＨＳＰＣは、移植臓器と組み合わせて交換し得る。

また、ｃ－Ｋｉｔに対する抗体は、ｃ－Ｋｉｔを発現するがんの処置において使用することができる。このようながんは、血液がん、例えば、ＡＭＬおよび固形腫瘍、例えば、マスト細胞がん、精巣間質性がん、胃腸間質性がん、メラノーマ、乳がんおよび肺がんを含む。ｃ－Ｋｉｔの発現は、免疫組織化学アッセイにより決定する場合、好ましくは、組織対応正常対照細胞よりも高いレベルである。

抗体は、意図する目的、例えば、内因性ＨＳＰＣまたはｃ－Ｋｉｔを発現するがん細胞の減少を達成する投与量、投与経路および投与頻度を意味する有効なレジメンにより投与される。一部の場合では、有効性は、個々の患者において、歴史的対照または同一患者における過去の経験と比較して観察することができる。他の場合では、有効性は、処置される患者の集団の前臨床または臨床試験において、処置されない患者の対照集団と比較して実証することができる。

例となる投与量は、固定投与量として、少なくとも０．０５ｍｇ／ｋおよび最大１０ｍｇ／ｋｇであり、例えば、約０．０５～１０ｍｇ／ｋｇまたは０．１～５ｍｇ／ｋｇまたは５～７５０ｍｇである。投与量は、他の因子もあるが、特に、患者の状態および以前の処置に対する応答、もしあれば、処置が予防的または治療的であるか、および障害が急性または慢性であるかに依存する。

投与は、非経口、静脈内、経口、皮下、動脈内、頭蓋内、髄腔内、腹腔内、局所、鼻腔内または筋肉内投与であり得る。一部の抗体は、動脈内または皮下投与により全身循環に投与し得る。静脈内投与は、一定期間、例えば、３０～９０分にわたる、例えば、注入による投与であり得る。

抗体は、１回または複数回、投与し得る。複数回である場合、間隔は、例えば、毎日、毎週、２週毎、毎月または四半期毎であり得る。

ＶＩ．医薬組成物および使用方法
非経口投与のための本発明の抗体を組み込んだ医薬組成物は、無菌および実質的に等張性（２５０～３５０ｍＯｓｍ／ｋｇ水）であり、ＧＭＰ条件下で製造され得る。医薬組成物は、単位用量形態（すなわち、単回投与のための用量）により提供され得る。医薬組成物は、１つまたは複数の薬学的に許容される担体、希釈剤、賦形剤または補助剤を使用して製剤化され得る。製剤は、選択される投与経路に依存する。注射では、抗体は、水溶液中、例えば、生理学的に適合する緩衝液、例えば、ハンクス溶液、リンゲル溶液、または生理食塩水もしくは酢酸緩衝液中に製剤化され得る（注射部位における不快感を低下させるため）。溶液は、調合剤（formulatory agent）、例えば、懸濁化剤、安定化剤および／または分散剤を含み得る。あるいは、抗体は、適するビヒクル、例えば、無菌の発熱物質除去水による構成のために、使用前には凍結乾燥形態であり得る。

レジメンでは、処置される状態の処置において有効な別の薬剤（例えば、がん処置のための化学療法剤または生物製剤）と組み合わせて投与し得る。

処置後、処置された被験体の状態は、処置に応答性の変化（例えば、内因性ＨＳＰＣの数の減少）またはｃ－Ｋｉｔを発現するがん細胞の数の減少についてモニターすることができる。

ＶＩＩ．他の使用
また、本発明の抗体は、イムノアッセイ、例えば、ＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロット、または免疫組織化学によるｃ－Ｋｉｔの検出に使用することができる。このような試験は、がんがｃ－Ｋｉｔを発現し、本発明の方法による処置に適するものとなるかどうかの決定に有用であり得る。また、抗体は、ｃ－Ｋｉｔを発現するＨＳＰＣの親和性クロマトグラフィーによる濃縮に使用することができる。

１．材料および方法
抗体Ｖクローニングおよびシーケンシング。抗ヒトｃ－Ｋｉｔハイブリドーマ細胞株をＡＴＣＣから購入した（ＨＢ－１０７１６）。重（ＶＨ）および軽鎖（ＶＬ）可変領域をクローニングしてＧｅｎｓｃｒｉｐｔによりシーケンシングした。

抗体ヒト化およびＣＤＲ置換。ＨＢ－１０７１６のヒト化を、マウス抗体由来のＣＤＲ残基をヒト生殖系列フレームワーク（ＦＲ）に導入することにより実施した。簡潔には、マウスＶＨを、対応するＣＤＲ残基および少数のフレームワーク（ＦＲ）残基をヒトＩＧＨＶ１－４６＊０１またはＩＧＨＶ３－２３＊０１へ慎重に組み込むことによりヒト化した。マウスＶＬは、対応するＣＤＲ残基および少数のフレームワーク（ＦＲ）残基をヒトＩＧＫＶ４－１＊０１またはＩＧＫＶ２－２８＊０１へ慎重に組み込むことによりヒト化した。マウスおよびヒトのＦＲ残基間の差を個々にモデル化して、ＣＤＲコンフォメーションに対するこれらの考えられる影響を調査した。抗体をさらにヒト化してヒト化抗体の結合親和性を向上させるために、ＣＤＲの残基を選択して、ヒト生殖系列配列の対応するＣＤＲ残基に変異させた。

細胞トランスフェクション。２９３Ｆ細胞をＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（商標）２９３発現培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）下で培養した。一過性トランスフェクションを、抗体重鎖および軽鎖をコードする発現ベクターの同時トランスフェクションにより、２９３ｆｅｃｔｉｎトランスフェクション試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を使用し、製造者の指示に従って実施した。４～５日後、トランスフェクトした細胞の上清を収集して、抗体分泌についてＥＬＩＳＡにより試験した。簡潔には、９６ウェルのプレート（Ｎｕｎｃ社、Ｒｏｓｋｉｌｄｅ、デンマーク）を、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中１ｕｇ／ｍｌのヤギ抗ヒトＦｃガンマ抗体により４℃で１６時間コーティングした。ＰＢＳ中０．４％のＢＳＡによる室温で１時間のブロッキング後、単離した上清を１／３段階希釈により加え、室温で１時間インキュベートした。その後、プレートを３回洗浄して、ＨＲＰコンジュゲートヤギ抗ヒトカッパ特異的抗体とともに室温で１時間インキュベートした。洗浄後、プレートは、ＴＭＢにより展開した。反応は、２ＭのＨ２ＳＯ４により停止させ、ＯＤは、４５０ｎＭにおいて測定した。

抗体精製および特徴付け。培養上清をプロテインＡＳｅｐｈａｒｏｓｅカラム（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ社）に適用した。カラムは、ＰＢＳにより洗浄し、次いで、タンパク質を溶出緩衝液（０．１Ｍのクエン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ３．０）により溶出した。採取した画分を１ＭのトリスｐＨ９．０により中和した。最終的には、精製試料をＰＢＳに対して透析した。溶出抗体画分の純度は、１０％のゲル上、還元または非還元条件下でのドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）により解析した。バンドは、クーマシーブリリアントブルー染色により可視化した。

ＥＬＩＳＡによる抗原結合活性測定。９６ウェルのプレート（Ｎｕｎｃ社、Ｒｏｓｋｉｌｄｅ、デンマーク）を、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中１ｕｇ／ｍｌのヒトｃ－Ｋｉｔ－Ｆｃ融合タンパク質により４℃で１６時間コーティングした。ＰＢＳ中０．４％のＢＳＡによる室温で１時間のブロッキング後、抗ｃ－Ｋｉｔ抗体を１／３段階希釈により加え、室温で１時間インキュベートした。その後、プレートを３回洗浄して、ＨＲＰコンジュゲートヤギ抗ヒトカッパ特異的抗体とともに室温で１時間インキュベートした。洗浄後、プレートは、ＴＭＢにより展開した。反応は、２ＭのＨ２ＳＯ４により停止させ、ＯＤは、４５０ｎＭにおいて測定した。

ｉｎｖｉｔｒｏでの食作用アッセイ。ＭＨＣ－１がん細胞を洗浄して計数し、次いで、１×１０５細胞を含む無血清ＩＭＤＭ２５μＬを各ウェルに加えた。最終濃度１０μｇ／ｍＬの抗体処理物（２５μＬ）をウェルに加えて、３７℃で３０分間インキュベートした。３０分で、ＴｒｙｐＬＥによってこれまでに収集したマクロファージを計数して、５×１０４細胞を無血清ＩＭＤＭ５０μＬ中に播種した。プレートは、３７℃で２時間インキュベートした（エフェクター：標的＝１：２）。パーセント食作用は、フローサイトメトリー解析により算出して、ＧＦＰ＋マクロファージを調べた。

ＡＤＣＣアッセイ。ナチュラルキラー細胞を、ＳｔｅｍｃｅｌｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社（Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ、ＢｒｉｔｉｓｈＣｏｌｕｍｂｉａ、カナダ、カタログ＃１７８５５）のＥａｓｙＳｅｐヒトＣＤ５６陽性選択キットを使用してヒトＰＢＭＣから単離した。単離した細胞を、１０％のＦＢＳおよび１００Ｕ／ｍＬの組換えヒトＩＬ－２（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ社、ＲｏｃｋｙＨｉｌｌ、ＮＪ、カタログ＃２００－０２）を補充したＲＰＭＩ１６４０培地中で終夜培養した。ＧＩＳＴ－Ｔ１細胞を５ｕＭのカルセインＡＭ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ、カタログ＃Ｃ３１００ＭＰ）により３７℃で１０分間標識し、次いで、２回洗浄した。抗ｃ－Ｋｉｔまたはアイソタイプ対照抗体を、０．０００３～３０ｕｇ／ｍＬに１０倍段階希釈して、Ｖ底アッセイプレートに移した。標識したＧＩＳＴ－Ｔ１細胞を、その後、活性化ナチュラルキラー細胞をアッセイプレートに加えて、最終的に１：５の標的対エフェクター比とした。２時間のインキュベーション後、上清を採取して、きれいな平底プレートに移した。プレートは、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘＭ３蛍光プレートリーダー上で励起４９０ｎｍ、発光５２０ｎｍおよびカットオフ５１５ｎｍによりＳｏｆｔＭａｘＰｒｏ７．０ソフトウェアを用いて読み取った。パーセント比溶解（ｐｅｒｃｅｎｔｓｐｅｃｉｆｉｃｌｙｓｉｓ）を相対蛍光単位（ＲＦＵ）に基づいて、次の式：［（試験ＲＦＵ－平均バックグラウンドＲＦＵ）／（平均最大ＲＦＵ－平均バックグラウンドＲＦＵ）］×１００により算出した。この場合、バックグラウンドは、エフェクター細胞＋抗体を有しない標的細胞であり、最大溶解は、エフェクター細胞＋溶解緩衝液を有する標的細胞である。データは、ＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍ７．０５による解析である。パーセント比抗体依存性溶解（ｐｅｒｃｅｎｔｓｐｅｃｉｆｉｃａｎｔｉｂｏｄｙｄｅｐｅｎｄｅｎｔｌｙｓｉｓ）は、抗体濃度に対してプロットした。

ＨＳＰＣ増殖アッセイ。凍結臍帯血ＣＤ３４＋幹／前駆細胞（ＡＬＬＣＥＬＬＳ社、カタログ＃ＣＢ００５Ｆ）を、２０ｎｇ／ｍｌのヒト組換えＳＣＦ（ＳＴＥＭＣＥＬＬｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、カタログ＃７８０６２）、２０ｎｇ／ｍｌの組換えヒトＦｌｔ３リガンド（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ社、カタログ＃３００－１９）および２０ｎｇ／ｍｌの組換えヒトＴＰＯ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ社、カタログ＃３００－１８）を補充した、ＨＳＣ維持培地であるＳｔｅｍＳｐａｎＳＦＥＭＩＩ（ＳＴＥＭＣＥＬＬｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、カタログ＃０９６０５）中に再懸濁した。１ウェルあたり約３０００幹細胞を３つのＣＯＳＴＡＲ超低クラスター９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ社、カタログ＃７００７）上に播種した。プレートを１２５０ｒｐｍにより４℃で５分間遠心分離して、抗ｃ－Ｋｉｔ抗体を有するか、または有しないＨＳＣ維持培地２００ｕｌ中に細胞を三連で再懸濁した。４つの抗ｃ－Ｋｉｔ抗体ＡＭＧ１９１、ＡＭＧ１９１－Ｇ１、ＨＦ１２およびＨＦ１１２を０．１、１、１０および５０ｕｇ／ｍｌの濃度で試験した。細胞増殖は、１、３、５および１１日目にＣｏｕｎｔｂｒｉｇｈｔ絶対計数ビーズ（ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎＴＭ社、カタログ＃Ｃ３６９５０）を使用して試験した。ＡＭＧ１９１は、２９７位のＮ→Ｅ変異を有するためグリコシル化されず、エフェクター機能が低下する。ＡＭＧ１９１－Ｇ１または－ＩｇＧ１は、野生型ヒトＩｇＧ１定常領域を有する。

２．結果
（ａ）抗ｃ－Ｋｉｔハイブリドーマ可変領域クローニングおよびシーケンシング
抗ヒトｃ－Ｋｉｔハイブリドーマ細胞株をＡＴＣＣから購入した（ＨＢ－１０７１６）。ハイブリドーマクローンＨＢ－１０７１６の特異性を、ヒトｃ－Ｋｉｔに結合させるＥＬＩＳＡにより調べた。ＨＢ－１０７１６の重および軽鎖可変領域を、ユニバーサル抗体プライマーを使用してハイブリドーマからクローニングした。各Ｖ遺伝子産物の複数のクローンをシーケンシングして、ＰＣＲにより誘導されたエラーをモニターした。ＨＢ－１０７１６のＶＨおよびＶＬのヌクレオチド配列を決定し、推定したアミノ酸配列を図１ＡおよびＢにそれぞれ示す。

（ｂ）抗体のヒト化およびＣＤＲの置換
ＣＤＲ移植の鋳型として使用するヒト抗体フレームワーク（ＦＲ）を選択するために、マウスＨＢ－１０７１６ＶＬおよびＶＨ領域をヒト生殖系列配列のものと比較した。マウスＨＢ－１０７１６ＶＬ領域のＦＲは、ＩＧＫＶ４－１亜群との高い相同性を有することが見出され、ＶＨ領域のＦＲは、ヒトＩＧＨＶ１－４６亜群との高い相同性を示した。したがって、ヒトＩＧＫＶ４－１およびＩＧＨＶ１－４６由来のＦＲを、ヒト化ＨＢ－１０７１６をデザインするための基礎として使用した。ＨＢ－１０７１６およびＩＧＫＶ４－１／ＩＧＨＶ１－４６配列間で異なり、抗原結合における影響を有し得るＦＲ領域におけるアミノ酸位置を、分子モデル化により同定した。ＦＲにおける同一残基は維持し、非同一残基は、分子モデル化プログラムに基づいて、維持するか、または置換した。さらに、ＶＨおよびＶＬのＣＤＲ領域における残基を分子モデル化により同定した。ＣＤＲ置換は、部位特異的変異誘発により行った。

表２では、生成した新たなヒト化抗体およびこれらの重および軽鎖成熟可変領域成分を要約する。簡潔には、ＡＦと指定する抗体は、ＡＭＧ１９１と同一の可変領域フレームワークを有する。ＮＦと指定する抗体は、ＡＭＧ１９１と異なる可変領域フレームワークを有する。ＨＦと指定する抗体は、ＡＭＧ１９１と同一の重鎖可変領域フレームワークおよび異なる軽鎖可変領域フレームワークを有する。ＨＢ－１０７１６により産生される抗体に関連する、以下の表２の鎖のそれぞれに存在するＣＤＲ置換を、図２Ａ～２Ｂおよび図３Ａ～３Ｂに示す。
表２

Ｈ６０、Ｈ６４およびＬ３０における、単独または組合せによるＣＤＲ置換によって、結合が増加した（ＡＦ１１、ＡＦ１２およびＡＦ１１２、表２、図２Ａ～Ｃ）。最も重要なことには、Ｈ６０およびＨ６４における残基は、ヒト生殖系列配列に復帰変異を導入して、ＡＦ１１、ＡＦ１２およびＡＦ１１２のヒト化抗ｃ－Ｋｉｔ抗体をよりヒト化させた。その上、Ｈ５４、Ｈ９５またはＬ２７における単一アミノ酸ＣＤＲ置換（表２、図２Ａ～Ｂ）により、ＡＦ－２－１、ＡＦ－３およびＡＦ－１－１のヒト化抗ｃ－Ｋｉｔ抗体の結合が損なわれた（図２Ｄ）。

抗ｃ－Ｋｉｔヒト化抗体、ＮＦは、ＩＧＨＶ３－２３＊０１およびＩＧＫＶ２－２８＊０１の種々のヒト生殖系列配列をフレームワークとして使用したＣＤＲ移植により生成した（表２、図３Ａ～Ｂ）。抗体ＮＦは、ＡＭＧ１９１と比較した場合、結合活性の上昇を示した（図３Ｃ）。次いで、Ｈ５４、Ｈ６０、Ｈ６４、Ｈ９５、Ｌ２７およびＬ３０における同一のＣＤＲ置換をＮＦに適用した（表２、図３Ａ～Ｂ）。Ｈ６０、Ｈ６４およびＬ３０におけるＣＤＲ置換は、ＩＧＫＶ４－１／ＩＧＨＶ１－４６フレームワークを有する抗体に機能しただけでなく、ＩＧＨＶ３－２３＊０１／ＩＧＫＶ２－２８＊０１フレームワークを有する抗体にも機能した。Ｈ６０、Ｈ６４およびＬ３０における、単独または組合せによるＣＤＲ置換によって、ＮＦ１１、ＮＦ１２およびＮＦ１１２の結合活性が上昇または維持された（図３Ｄ）。

ヒト化ＨＦ１１、ＨＦ１２およびＨＦ１１２は、表２に示す種々のＶＨおよびＶＬを組み合わせることにより構築し、これらはすべて、ＡＭＧ１９１と比較した場合、結合活性の上昇を示した（図４）。

（ｃ）ヒト化抗ｃ－Ｋｉｔ抗体によりマクロファージ媒介食作用が促進される
次いで、発明者らは、ヒト末梢血由来マクロファージによるヒトがん細胞の食作用を可能とするヒト化抗ｃ－Ｋｉｔ抗体の能力を調査した。ＡＭＧ１９１が、サイレンシングされたＦｃを有するため、発明者らは、ＡＭＧ１９１と同一の配列を有するＡＭＧ１９１－Ｇ１を生成したが、ただし、ＡＭＧ１９１－Ｇ１は、活性ヒトＩｇＧ１Ｆｃ定常領域を有する。ＡＭＧ１９１では、ＰＢＳ対照と比較した場合、食作用が誘導されなかったが、ＡＭＧ１９１－Ｇ１では、活性ヒトＩｇＧ１の足場を有するため、予想通り高い食作用活性が誘導された（図５）。ＡＭＧ１９１－Ｇ１では、０．１、１および１０ｕｇ／ｍｌにおいて同等レベルの食作用活性が誘導された。ＡＭＧ１９１－Ｇ１とは対照的に、ヒト化ＡＦ１２、ＡＦ１１２、ＨＦ１２、ＨＦ１１２およびＮＦ１１２は、低い濃度においてさらに強力であり、０．１、１またはさらに１０ｕｇ／ｍｌにおいてＡＭＧ１９１－Ｇ１のそれよりも高い食作用活性が誘導され、ヒト化ＡＦ１２、ＡＦ１１２、ＨＦ１２、ＨＦ１１２およびＮＦ１１２については低い治療的用量が必要とされることが示唆された（図５）。データは、ＡＭＧ１９１－Ｇ１、ＡＦ１２、ＡＦ１１２、ＨＦ１２、ＨＦ１１２およびＮＦ１１２が、すべてヒトＩｇＧ１型式の抗体であり、ＡＦ１２、ＡＦ１１２、ＨＦ１２、ＨＦ１１２およびＮＦ１１２が、さらに強力であることを示す。これはおそらく、フレームワークおよび／またはＣＤＲ置換に起因する、ＡＦ１２、ＡＦ１１２、ＨＦ１２、ＨＦ１１２およびＮＦ１１２の結合親和性が高いためである。

（ｄ）ヒト化抗ｃ－Ｋｉｔ抗体により強力なＡＤＣＣが誘導される
ＡＤＣＣ活性を誘導するヒト化抗ｃ－Ｋｉｔ抗体の能力をＧＩＳＴ細胞に対して試験した。ＡＭＧ１９１により、試験したいずれの濃度においてもＡＤＣＣは誘導されなかった。ＨＦ１２およびＨＦ１１２により、ＡＤＣＣが用量依存的に媒介された（図６）。

（ｅ）ヒト化抗ｃ－Ｋｉｔ抗体により造血幹／前駆細胞（ＨＳＰＣ）の増殖が阻害される
自己複製能が低下した系統拘束細胞を次第に生成する、階層的に組織化したプロセスにより、造血幹細胞（ＨＳＣ）から成熟造血細胞を発生させた。細胞表面タンパク質チロシンキナーゼｃ－Ｋｉｔは、この同属リガンド、幹細胞因子（ＳＣＦ）と相互作用してＨＳＣの自己複製を調節する。ｃ－ＫｉｔのＳＣＦとの相互作用を遮断することにより、発明者らは、ヒト化抗ｃ－Ｋｉｔ抗体がＨＳＰＣの増殖を阻害可能かどうかを試験した。図７に示すように、ＳＣＦにより、任意の抗体処理物の非存在下でＨＳＰＣの増殖が誘導された。しかし、ＡＭＧ１９１、ＡＭＧ１９１－Ｇ１、ＨＦ１２およびＨＦ１１２により、ＨＳＰＣの増殖が阻害された（図７）。その上、ＨＦ１２およびＨＦ１１２では、ＨＳＰＣ増殖の阻害は、ＡＭＧ１９１およびＡＭＧ１９１－Ｇ１による阻害よりも強力である（図７）。これはおそらく、フレームワークおよび／またはＣＤＲ置換に起因する、ＨＦ１２およびＨＦ１１２の結合親和性が高いためである。

（ｆ）ヒト化抗ｃ－Ｋｉｔによりマスト細胞の有意な脱顆粒は誘導されない

ｃＫＩＴは、造血幹細胞および成熟マスト細胞上で発現される。マスト細胞は、骨髄におけるＣＤ３４＋造血前駆細胞に由来する。種々の末梢組織への遊走時に、このような前駆細胞は、ｃＫＩＴとともに高親和性ＩｇＥ受容体、ＦｃεＲＩを発現する成熟マスト細胞に分化する。抗原が、マスト細胞上のＩｇＥ刺激ＦｃεＲＩに結合すると、脱顆粒ならびに化学媒介因子、例えば、ヒスタミンおよびトリプターゼとともにサイトカイン、ロイコトリエンおよびプロテアーゼの放出が引き起こされる。化学媒介因子の放出により、アレルギーの古典的症候が生じる。臨床使用では、抗ｃ－Ｋｉｔ抗体により造血幹細胞は減少するが、マスト細胞の脱顆粒は誘導されないことが望ましい。

健常ヒトドナーの末梢全血から分化した表現型決定成熟マスト細胞（ＣＤ３４－、ＦｃεＲＩα＋、ｃＫＩＴ＋）を種々の濃度のＨＦ１２およびＨＦ１２ヒト化抗ｃ－Ｋｉｔ抗体（１０、１、０．１および０．０１μｇ／ｍｌ）とともに７時間インキュベートした。Ａ２３１８７（１０μＭ）およびＩｇＥに加えて抗ＩｇＥ（各１０ｕｇ／ｍｌ）を陽性対照として使用した。本発明の方法において記載するように吸光度方法を使用してβヘキソサミニダーゼの放出を測定することにより、脱顆粒を定量した。

ヒト初代マスト細胞は、ｉｎｖｉｔｒｏで分化し、９週の終わりにＣＤ３４－、ＦｃεＲＩα＋およびｃＫＩＴ＋表現型を示し、これは、成熟マスト細胞の表現型特性と一致した。次いで、カルシウムイオノフォアＡ２３１８７、または抗ＩｇＥと組み合わせたＩｇＥにより細胞を刺激した。βヘキソサミニダーゼの放出により測定した場合、Ａ２３１８７およびＩｇＥ＋抗ＩｇＥにより、マスト細胞脱顆粒が効率的に誘導された。

抗ｃ－Ｋｉｔ抗体による細胞の直接的処理または抗ＩｇＧ抗体による抗ｃ－Ｋｉｔ抗体の架橋結合によって、Ａ２３１８７および抗ＩｇＥ処理の脱顆粒と比較した場合、有意なマスト細胞脱顆粒は誘導されなかった（図８）。また、プレート上での抗ｃ－Ｋｉｔ抗体の固定化は、マスト細胞脱顆粒に対してほとんど影響しなかった。また、種々の濃度の抗ｃ－Ｋｉｔ抗体の存在下におけるマスト細胞とＮＫ細胞の同時インキュベーションによって、試験したすべての濃度においてマスト細胞脱顆粒は誘導されなかった。

結論として、カルシウムイオノフォアＡ２３１８７、または抗ＩｇＥと組み合わせたＩｇＥ処理の脱顆粒と比較した場合、抗ｃ－Ｋｉｔ抗体ＨＦ１２およびＨＦ１１２は、ｉｎｖｉｔｒｏでの初代ヒトマスト細胞の脱顆粒に対してほとんど影響しなかった。

上記または下記に引用するすべての特許申請書、ウェブサイト、他の公開文献、受託番号等は、すべての目的のために、個々の各項目を参照によりそのように組み込むと個々に詳細に示す場合と同程度に、この全体を参照により組み込む。配列の種々のバージョンが受託番号とその時々において関連する場合、本出願の有効出願日に受託番号と関連するバージョンを意味する。有効出願日は、適用可能な場合、受託番号を参照して、実際の出願日より前または優先権出願の出願日を意味する。同様に、公開文献、ウェブサイト等の種々のバージョンがその時々において公開される場合、他に指示しない限り、出願の有効出願日に最近に公開されたバージョンを意味する。本開示の任意の特徴、ステップ、要素、実施形態、または態様は、他に詳細に指示しない限り、他の任意のものと組み合わせて使用することができる。本開示は、明確さおよび理解を目的とする例示および例のために、いくぶん詳細に記載されているが、添付の特許請求の範囲内において特定の変更および修飾が行われ得ることは明白である。
本発明は、例えば、以下の項目を提供する。
(項目１)
それぞれ配列番号２～４の、Ｋａｂａｔにより定義されるＣＤＲＨ１、Ｈ２およびＨ３を含む成熟重鎖可変領域、ならびにそれぞれ配列番号６～８の、Ｋａｂａｔにより定義されるＣＤＲＬ１、Ｌ２およびＬ３を含む成熟軽鎖可変領域を含むが、ただし、位置をＫａｂａｔに従って付番して、重鎖６０位のＮからＡ、重鎖６４位のＫからＱおよび軽鎖３０位のＮからＱから選択される１、２または３つのＣＤＲ残基の置換が存在する、ヒトｃ－Ｋｉｔに特異的に結合する抗体。
(項目２)
Ｋａｂａｔにより定義されるＣＤＲＨ１、Ｈ２およびＨ３が、それぞれ配列番号２～４であり、Ｋａｂａｔにより定義されるＣＤＲＬ１、Ｌ２およびＬ３が、それぞれ配列番号６～８であるが、ただし、重鎖６４位のＫからＱおよび軽鎖３０位のＮからＱの前記置換が存在する、項目１に記載の抗体。
(項目３)
Ｋａｂａｔにより定義されるＣＤＲＨ１、Ｈ２およびＨ３が、それぞれ配列番号２～４であり、Ｋａｂａｔにより定義されるＣＤＲＬ１、Ｌ２およびＬ３が、それぞれ配列番号６～８であるが、ただし、重鎖６０位のＮからＡ、重鎖６４位のＫからＱおよび軽鎖３０位のＮからＱの前記置換が存在する、項目１に記載の抗体。
(項目４)
前記成熟重鎖可変領域が、配列番号１３、１７または２１（ＡＨ２、ＡＨ３またはＡＨ４）に対して少なくとも８５、９０、９５、９８、９９％の配列同一性を示し、前記成熟軽鎖可変領域が、配列番号５３（ＮＬ２）に対して少なくとも８５、９０、９５、９８、９９％の配列同一性を示し、示される前記配列番号からのいかなる変動もＫａｂａｔにより定義される前記ＣＤＲ外である、前記項目のいずれかに記載の抗体。
(項目５)
Ｋａｂａｔ付番による重鎖１位が、Ｅである、項目４に記載の抗体。
(項目６)
前記成熟軽鎖可変領域の以下の位置が、アミノ酸により以下：
９位がＬにより占有され、
１２位がＰにより占有され、
１４位がＴにより占有され、
１５位がＰにより占有され、
１８位がＰにより占有され、
２０位がＳにより占有され、
２２位がＳにより占有され、
３７位がＬにより占有され、
４３位がＳにより占有され、
４５位がＱにより占有され、
７４位がＫにより占有され、
７７位がＲにより占有され、
７８位がＶにより占有され、
７９位がＥにより占有され、
８４位がＧにより占有される、
のように占有される、前記項目のいずれかに記載の抗体。
(項目７)
前記成熟重鎖可変領域が、配列番号１３、１７または２１から選択される配列を有するが、ただし、１位がＥであってもよく、前記成熟軽鎖可変領域が、配列番号５３の配列を有する、項目１に記載の抗体。
(項目８)
前記成熟重鎖可変領域が、重鎖定常領域に結合し、前記成熟軽鎖可変領域が、成熟軽鎖定常領域に結合する、前記項目のいずれかに記載の抗体。
(項目９)
前記重鎖定常領域が、ヒトＩｇＧ１である、項目７に記載の抗体。
(項目１０)
ヒトｃ－Ｋｉｔへの結合がＡＭＧ１９１と比較して増強されている、前記項目のいずれかに記載の抗体。
(項目１１)
ＡＤＣＰがＡＭＧ１９１－ＩｇＧ１と比較して増強されている、前記項目のいずれかに記載の抗体。
(項目１２)
ＡＤＣＣがＡＭＧ１９１－ＩｇＧ１と比較して増強されている、前記項目のいずれかに記載の抗体。
(項目１３)
前記項目のいずれかに記載の抗体および薬学的に許容される担体を含む医薬組成物。
(項目１４)
内因性ＨＳＰＣを除去する方法であって、有効なレジメンによる前記項目のいずれかに記載の抗体を、除去を必要とする被験体に投与するステップを含む、方法。
(項目１５)
ｃ－Ｋｉｔを発現するがんを処置する方法であって、有効なレジメンによる前記項目のいずれかに記載の抗体を、前記がんを有する被験体に投与するステップを含む、方法。

Claims

配列番号１３、１７または２１（ＡＨ２、ＡＨ３またはＡＨ４）に対して少なくとも９０、９５、９８、９９％の配列同一性を含む成熟重鎖可変領域、ならびに配列番号５３（ＮＬ２）に対して少なくとも９０、９５、９８、９９％の配列同一性を含む成熟軽鎖可変領域を含む、ヒトｃ－Ｋｉｔに特異的に結合する抗体であって、示される配列番号からのいかなる変動もＫａｂａｔにより定義されるＣＤＲ外であり、かつ、前記抗体がＡＭＧ１９１と比較してヒトｃ－Ｋｉｔへの結合が増強されている、抗体。
Ｋａｂａｔ付番による重鎖１位が、Ｅである、請求項１に記載の抗体。
前記成熟軽鎖可変領域の以下の位置が、アミノ酸により以下：
９位がＬにより占有され、
１２位がＰにより占有され、
１４位がＴにより占有され、
１５位がＰにより占有され、
１８位がＰにより占有され、
２０位がＳにより占有され、
２２位がＳにより占有され、
３７位がＬにより占有され、
４３位がＳにより占有され、
４５位がＱにより占有され、
７４位がＫにより占有され、
７７位がＲにより占有され、
７８位がＶにより占有され、
７９位がＥにより占有され、
８４位がＧにより占有される、
のように占有される、請求項１または２に記載の抗体。
前記成熟重鎖可変領域が、配列番号１３、１７または２１から選択される配列を有するが、ただし、１位がＥであってもよく、前記成熟軽鎖可変領域が、配列番号５３の配列を有する、請求項１に記載の抗体。
前記成熟重鎖可変領域が、重鎖定常領域に結合され、前記成熟軽鎖可変領域が、成熟軽鎖定常領域に結合される、請求項１～４のいずれか一項に記載の抗体。
前記重鎖定常領域が、ヒトＩｇＧ１である、請求項４に記載の抗体。
ＡＤＣＰがＡＭＧ１９１－ＩｇＧ１と比較して増強されている、請求項１～６のいずれか一項に記載の抗体。
ＡＤＣＣがＡＭＧ１９１－ＩｇＧ１と比較して増強されている、請求項１～７のいずれか一項に記載の抗体。
請求項１～８のいずれか一項に記載の抗体および薬学的に許容される担体を含む医薬組成物。
除去を必要とする被験体において、内因性ＨＳＰＣを除去するための、請求項１～８のいずれか一項に記載の抗体を含む組成物。
ｃ－Ｋｉｔを発現するがんを有する被験体において、ｃ－Ｋｉｔを発現するがんを処置するための、請求項１～８のいずれか一項に記載の抗体を含む組成物。