ES2857109T3

ES2857109T3 - Composiciones polipeptídicas de SIRP y métodos de uso

Info

Publication number: ES2857109T3
Application number: ES16797166T
Authority: ES
Inventors: Aaron Michael Ring; Roy Louis Maute; Andrew Curtis Kruse; Aashish Manglik; Kenneth S Lin
Original assignee: Ab Initio Biotherapeutics Inc
Current assignee: Ab Initio Biotherapeutics Inc
Priority date: 2015-05-18
Filing date: 2016-05-17
Publication date: 2021-09-28
Anticipated expiration: 2036-05-17
Also published as: EP3298043B8; DK3298043T3; PL3298043T3; CN107849143B; CA2994935A1; CN114425077A; JP7064234B2; US10774125B2; CN107849143A; HK1252870A1; EP3872086A1; US20180155405A1; WO2016187226A1; US20160340397A1; EP3298043A1; EP3298043B1; JP2018524282A; US20200270324A1; EP3298043A4; US9845345B2

Abstract

Un polipéptido que comprende un polipéptido SIRP-gamma que comprende la secuencia EEELQX1IQPEKLLLVTVGKTATLHCTX2TSX3X4PX5GPX6X7WFRGX8GPGRX9LIYNX10X11X12GX13FPRVTTVSDX14X1 5KRNNMDFSIRISSITPADVGTYYCX16KFRKGX17PEX18VEFKSGPGTEMALGAKPS (SEQ ID NO: 2), en la que X1 es M, I, L o F; X2 es F, I o L; X3 es L, I, V, H, N o D; X4 es F, I, L o V; X5 es V, I, L, P, T o A; X6 es V o I; X7 es L o Q; X8 es V o A; X9 es E o V; X10 es Q, P, L, V, A o E; X11 es K o R; X12 es E, D, K, N, Q o H; X13 es H, P o R; X14 es L, I, V, P, T, A, R, S o G; X15 es T, I, N, F, S, Y, V, A o D; X16 es V o I; X17 es S, R, N, K, T, I o M; y X18 es N, K, D, E, H o Q.

Description

DESCRIPCIÓN

Composiciones polipeptídicas de SIRP y métodos de uso

Referencia cruzada

La presente solicitud reivindica el beneficio de la solicitud provisional de Estados Unidos n.° 62/266.450, presentada el 11 de diciembre de 2015, y la Solicitud Provisional de eE.UU. N.° 62/163.282, presentada el 18 de mayo de 2015.

LISTADO DE SECUENCIAS

La presente solicitud contiene una lista de secuencias que se ha presentado electrónicamente en formato ASCII. Dicha copia en ASCII, creada el 17 de mayo de 2016, se denomina 47815_701_601_SL.txt. y tiene un tamaño 66.023 bytes.

Antecedentes

Las proteínas reguladoras de señales (SIRP) constituyen una familia de glicoproteínas de la superficie celular que se expresan en las células mieloides (incluidos macrófagos, granulocitos, células dendríticas mieloides y mastocitos), linfocitos y células neuronales, y regulan su actividad.

Sumario

Se proporcionan polipéptidos señuelo de SIRP-gamma, SIRP-beta o SIRP-beta2 y análogos de los mismos que pueden denominarse polipéptidos señuelo. En un aspecto, la presente invención proporciona un polipéptido de acuerdo con la reivindicación 1. En otras divulgaciones, el polipéptido comprende un polipéptido SIRP-gamma con la secuencia EEELQMIQPEKLLLVTVGKTATLHCTVTSLLPVGPVLWFRGVGPGRELIYNQKEGHFPRVTTVSDLTKRNNMDFSIRIS SITPADVGTYYCVKFRKGSPENVEFKSGPGTEMALGAKPS (SEQ ID NO: 1). En aspectos adicionales, el polipéptido SIRP-gamma es un 90 % idéntico a un polipéptido SIRP-gamma de tipo salvaje. En aspectos adicionales, el polipéptido SIRP-gamma tiene una sustitución de aminoácidos en M6, V27, L30, L31, V33, V36, L37, V42, E47, Q52, K53, E54, H56, L66, T67, V92, S98 o N101. En aspectos adicionales, el polipéptido SIRP-gamma tiene una sustitución en M6 en el que la sustitución es I, L o F. En aspectos adicionales, el polipéptido SIRP-gamma tiene una sustitución en V27 en el que la sustitución es F, I o L. En aspectos adicionales, el polipéptido SIRP-gamma tiene una sustitución en L30 en el que la sustitución es I, V, H, N o D. En aspectos adicionales, el polipéptido SIRP-gamma tiene una sustitución en L31 en el que la sustitución es F, I o V. En aspectos adicionales, el polipéptido SIRP-gamma tiene una sustitución en V33 en el que la sustitución es I, L, P, T o A. En aspectos adicionales, el polipéptido SIRP-gamma tiene una sustitución en V36 en el que la sustitución es I. En aspectos adicionales, el polipéptido SIRP-gamma tiene una sustitución en L37 en el que la sustitución es Q. En aspectos adicionales, el polipéptido SIRP-gamma tiene una sustitución en V42 en el que la sustitución es A. En aspectos adicionales, el polipéptido SIRP-gamma tiene una sustitución en E47 en el que la sustitución es V. En aspectos adicionales, el polipéptido SIRP-gamma tiene una sustitución en Q52 en el que la sustitución es P, L, V, A o E. En aspectos adicionales, el polipéptido SIRP-gamma tiene una sustitución en K53 en el que la sustitución es R. En aspectos adicionales, el polipéptido SIRP-gamma tiene una sustitución en E54 en el que la sustitución es D, K, N, Q o H. En aspectos adicionales, el polipéptido SIRP-gamma tiene una sustitución en H56 en el que la sustitución es P o R. En aspectos adicionales, el polipéptido SIRP-gamma tiene una sustitución en L66 en el que la sustitución es I, V, P, T, A, R, S o G. En aspectos adicionales, el polipéptido SIRP-gamma tiene una sustitución en T67 en el que la sustitución es I, N, F, S, Y, V, A o D. En aspectos adicionales, el polipéptido SIRP-gamma tiene una sustitución en V92 en el que la sustitución es I. En aspectos adicionales, el polipéptido SIRP-gamma tiene una sustitución en S98 en el que la sustitución es R, N, K, T, I o M. En aspectos adicionales, el polipéptido SIRP-gamma está sustituido en N101 en el que la sustitución es K, D, E, H o Q. En aspectos adicionales, el polipéptido SIRP-gamma tiene la secuencia EEELQX¹IQPEKLLLVTVGKTATLHCTX²TSX³X⁴PX⁵GPX⁶X⁷WFRGX⁸GPGRX⁹LIYNX¹⁰X ¹¹X ¹²GX¹³FPRVTTVSDX¹⁴X ^{1 5}KRNNMDFSIRISSITPADVGTYYCX¹⁶KFRKGX¹⁷PEX¹⁸VEFKSGPGTEMALGAKPS (SEQ ID NO: 2), en la que X ¹es M, I, L o F; X²es F, I, L o V; X³es L, I, V, H, N o D; X⁴es F, I, L o V; X⁵es V, I, L, P, T o A; X⁶es V o I; X⁷es L o Q; X⁸es V o A; X⁹es E o V; X ¹⁰es Q, P, L, V, A o E; X ¹¹es K o R; X ¹²es E, D, K, N, Q o H; X ¹³es H, P o R; X ¹⁴es L, I, V, P, T, A, R, S o G; X ¹⁵es T, I, N, F, S, Y, V, A o D; X-^,6es V o I; X ¹⁷es S, R, N, K, T, I o M; y X ¹⁸es N, K, D, E, H o Q. En aspectos adicionales, el polipéptido SIRP-gamma tiene la secuencia EEELQIIQPEKLLLVTVGKTATLHCTITSLFPVGPVLWFRGVGPGRVLIYNQRQGPFPRVTTVSDTTKRNNMDFSIRISSI TPADVGTYYCIKFRKGSPENVEFKSGPGTEMALGAKPS (SEQ ID NO: 3). En aspectos adicionales, el polipéptido SIRP-gamma tiene la secuencia EEELQIIQPEKLLLVTVGKTATLHCTITSLFPVGPIQWFRGVGPGRVLIYNQRDGPFPRVTTVSDGTKRNNMDFSIRISSI TPADVGTYYCVKFRKGTPEDVEFKSGPGTEMALGAKPS (SEQ ID NO: 4). En aspectos adicionales, el polipéptido SIRP-gamma tiene la secuencia EEELQIIQPEKLLLVTVGKTATLHCTITSLFPVGPIQWFRGVGPGRVLIYNQKDGPFPRVTTVSDGTKRNNMDFSIRISSI TPADVGTYYCVKFRKGSPEDVEFKSGPGTEMALGAKPS (SEQ ID NO: 5). En aspectos adicionales, el polipéptido SIRP-gamma tiene la secuencia EEELQIIQPEKLLLVTVGKTATLHCTITSLFPVGPIQWFRGVGPGRVLIYNQKDGHFPRVTTVSDGTKRNNMDFSIRISSI TPADVGTYYCVKFRKGSPEDVEFKSGPGTEMALGAKPS (SEQ ID NO: 6). En aspectos adicionales, el polipéptido SIRP-gamma tiene la secuencia EEELQIIQPEKLLLVTVGKTATLHCTITSLFPVGPIQWFRGAGPGRVLIYNQRDGPFPRVTTVSDGTKRNNMDFSIRISSI TPADVGTYYCIKFRKGTPEDVEFKSGPGTEMALGAKPS (SEQ ID NO: 7). En aspectos adicionales, el polipéptido SIRP-gamma tiene una de las siguientes secuencias:

HLib1:

EEELQIIQPEKLLLVT V GKT ATLHCTITSHFPV GPIQWFRGV GPGRVLIYN QKDGHFPRV

TTVSDGTKRNNMDFSIRISSITPADVGTYYCVKFRKGSPEDVEFKSGPGTEMALGAKPS

(SEQ ID NO: 8);

HLib2:

EEELQIIQPDKSVLVAAGETATLRCTITSLFPVGPIQWFRGAGPGRVLIYNQRDGPFPRVT

TVSDGTKRNNMDFSIRISS1TPADVGTYYCVKFRKGTPEDVEFKSGPGTEMALGAKPS

(SEQ ID NO: 9);

HLib3:

EEELQ1IQPEKLLLVTVGKTATLHCT1TSLFPVGPVLWFRGVGPGRVLIYNQRQGPFPRVT

TVSDTTKRNNMDFSIRISSITPADVGTYYCVKFRKGTPEDVEFKSGPGTEMALGAKPS

(SEQ ID NO: 10);

HLib4:

EEELQIIQPEKLLLVT V GKT ATLHCTITS LFP V GPIQWFRGV GPGRELIYN AREGRFPR VT

T VS DLTKRNNMDFS IRIS SITP AD V GT Y Y C VKFRKGS PED VEFKS GPGTEM ALG AKPS

(SEQ ID NO: 11);

HMLib1:

EEELQIIQPDKSVLVAAGETATLRCTITSLFPVGPIQWFRGAGPGRVLIYNQRQGPFPRVT

TVSDTTKRNNMDFSIRIGNITPADAGTYYCIKFRKGSPDDVEFKSGAGTELSVRAKPS

(SEQ ID NO: 12);

HMLib2:

EEELQ1IQPEKLLLVTVGKTATLHCT1TSLFPVGPVLWFRGVGPGRVLIYNQRQGPFPRVT

TVSDTTKRNNMDFSIRISSITPADVGTYYCIKFRKGSPENVEFKSGPGTEMALGAKPS

(SEQ ID NO: 3);

HMLib3:

EEELQIIQPEKLLLVT V GKT ATLHCTITSLFP V GPIQWFRGV GPGRVLIYN QREGPFPRVT

TVSDGTKRNNMDFSIRISSITPADVGTYYCVKFRKGSPEDVEFKSGPGTEMALGAKPS

(SEQ ID NO: 13);

HMLib4:

EEELQMIQPEKLLLVTVGKTATLHCTVTSLLPVGPVLWFRGVGPGRELIYNQKEGHFPR

VTTVSDLTKRNNMDFSIRISSITPADVGTYYCVKFRKGSPENVEFKSGPGTEMALGAKPS

(vSEQ ID NO: 42);

HMLib5:

EEELQIIQPDKS VL V A AGETATLRCTITS LFP V GPIQWFRGAGPGRVLIYN QRDGPFPR VT

TVSDGTKRNNMDFSIR1SSITPADVGTYYCIKFRKGIPEDVEFKSGPGTEMALGAKPS

(SEQ ID NO: 14);

HMLib6:

EEELQIIQPDKS VLVAAGETATLRCTITSLFPVGPIQWFRGAGPGRVLIYNQRDGPFPRVT

TVSDGTKRNNMDFSIRISSITPADVGTYYCIKFRKGIPEDVEFKSGPGTXWH (SEQ ID

NO: 15),

en el que X es A, R, N, D, C, Q, E, G, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y o V;

HMLib7:

EEELQIIQPDKS VLVAAGETATLRCTITSLFPVGPIQWFRGAGPGRVLIYNQKDGPFPRVT

TVSDGTKRNNMDFSIRISSITPADVGTYYCIKFRKGTPEDVEFKSGPGTEMALGAKPS

(SEQ ID NO: 16);

MLib1:

EEELQIIQPEKLLLVT V GKT ATLHCTITSLLPV GPIQWFRGV GPGRELIYN QRDGPFPR VT

TVSDGTKRNNMDFSIRISSITPADVGTYYCVKFRKGTPEDVEFKSGPGTEMALGAKPS

(SEQ ID NO: 17);

MLib2:

EEELQIIQPEKLLLVT V GKT ATLHCTLTSLLPV GPILWFRGV GPGRVLIYN QRDGPFPR VT

TVSDGTKRNNMDFSIRISSITPADVGTYYCVKFRKGNPEDVEFKSGPGTEMALGAKPS

(SEQ ID NO: 18);

MLib3:

EEELQLIQPEKLLLVTVGKTATLHCTITSLFPPGPIQWFRGVGPGRVLIYNQKDGPFPRVT

TVSDGTKRNNMDFSIR1SSITPADVGTYYCVKFRKGIPEDVEFKSGPGTEMALGAKPS

(SEQ ID NO: 19);

MLib4:

EEELQIIQPEKLLLVTVGKTATLRCTITSLFPVGPIQWFRGAGPGRVLIYNQRDGPFPRVT

TVSDGTKRNNMDFSIRISSITPADVGTYYCIKFRKGIPEDVEFKSGPGTEMALGAKPS

(SEQ ID NO: 20);

MLib5:

EEELQIIQPEKLLLVT V GKT ATLHCTITSLFPIGPILWFRGV GPGRVLIYN QKDGPFPRVTT

V S DGTKRNNMDF S IRIS S ETPAD V GT Y Y C VKFRKGS PED VEFKS GPGTEM ALG AKPS

(SEQ ID NO: 21);

MLib6:

EEELQMIQPEKLLLVT V GKT ATLHCTITSLFP V GPIQWFRGAGPGRVLIYN QRDGPFPRV

TTVSDGTKRNNMDFSIRISSITPAD V GTYYCIKFRKGIPED VEFKS GPGTEMALGAKPS

(SEQ ID NO: 22);

MLib7:

EEELQIIQPDKSVLVAAGETATLRCT1TSLFPVGPIQWFRGVGPGRVLIYNQKDGPFPRVT

TVSDGTKRNNMDFSIRISSrTPADVGTYYCIKFRKGIPEDVEFKSGPGTEMALGAKPS

(SEQ ID NO: 23);

MLib8:

EEELQIIQPDKSVLVAAGETATLRCTITSLFPVGPIQWFRGAGPGRVLIYNQKDGPFPRVT

TVSDGTKRNNMDFSIRISSITPADVGTYYCIKFRKGTPEDVEFKSGPGTEMALXAKPS

(SEQ ID NO: 24); Q

GV1.2:

EEELQIIQPEKLLLVT V GKT ATLHCTITSLFP V GPIQWFRGV GPGRVLIYN QREGPFPRVT

TVSDGTKRNNMDFSIRISSITPADVGTYYCVKFRKGSPEDVEFKSGPGTEMALGAKPS

(SEQ ID NO: 13).

En realizaciones adicionales, el polipéptido señuelo comprende un polipéptido SIRP-beta con la secuencia EDELQVIQPEKSVSVAAGESATLRCAMTSLIPVGPIMWFRGAGAGRELIYNQKEGHFPRVTTVSELTKRNNLDFSISIS NITPADAGTYYCVKFRKGSPDDVEFKSGAGTELSVRAKPS (SEQ ID NO: 25). En aspectos particulares, el polipéptido SIRP-beta es al menos un 90 % idéntico a un polipéptido SIRP-beta de tipo salvaje. En aspectos adicionales, el polipéptido SIRP-beta tiene una sustitución de aminoácidos en I6, I27, F31, Q37, V47, R53, Q54, P56, T66 o 192. En aspectos adicionales, el polipéptido SIRP-beta tiene una sustitución en V6 en el que la sustitución es I. En aspectos adicionales, el polipéptido SIRP-beta tiene una sustitución en M27 en el que la sustitución es I. En aspectos adicionales, el polipéptido SIRP-beta tiene una sustitución en 131 en el que la sustitución es F. En aspectos adicionales, el polipéptido SIRP-beta tiene una sustitución en M37 en el que la sustitución es Q. En aspectos adicionales, el polipéptido SIRP-beta tiene una sustitución en E47 en el que la sustitución es V. En aspectos adicionales, el polipéptido SIRP-beta tiene una sustitución en K53 en el que la sustitución es R. En aspectos adicionales, el polipéptido SIRP-beta tiene una sustitución en E54 en el que la sustitución es Q. En aspectos adicionales, el polipéptido SIRP-beta tiene una sustitución en H56 en el que la sustitución es P. En aspectos adicionales, el polipéptido SIRP-beta tiene una sustitución en L66 en el que la sustitución es T. En aspectos adicionales, el polipéptido SIRP-beta tiene una sustitución en V92 en el que la sustitución es I. En aspectos adicionales, el polipéptido SIRP-beta tiene la secuencia EDELQIIQPEKSVSVAAGESATLRCAITSLFPVGPIQWFRGAGAGRVLIYNQRQGPFPRVTTVSETTKRNNLDFSISISN ITPADAGTYYCIKFRKGSPDDVEFKSGAGTELSVRAKPS (SEQ ID NO: 26). En aspectos adicionales, el polipéptido SIRP-beta tiene la secuencia EDELQX¹IQPEKSVSVAAGESATLRCAX²TSLX³PVGPIX⁴WFRGAGAGRX⁵LIYNQX⁶X⁷GX⁸PRVTTVSEX⁹KRNNLDFS ISISNITPADAGTYYCX^{- o}KFRKGSPDDVEFKSGAGTELS VRAKPS (SEQ ID NO: 45) en la que X-^,es V o I; X²es M o I; X³es I o F; X⁴es M o Q; X⁵es E o V; X es K o R; X⁷es E o Q; X⁸es H o P; X⁹es L o T; y X ¹⁰es V o I.

En divulgaciones adicionales, el señuelo comprende un polipéptido SIRP-beta2 con la secuencia EEELQVIQPDKSISVAAGESATLHCTVTSLIPVGPIQWFRGAGPGRELIYNQKEGHFPRVTTVSDLTKRNNMDFSIRISN ITPADAGTYYCVKFRKGSPDHVEFKSGAGTELSVRAKPS (SEQ ID NO: 27). En aspectos particulares, el polipéptido SIRP-beta2 es al menos un 90 % idéntico a un polipéptido SIRP-beta2 de tipo salvaje. En aspectos adicionales, el polipéptido SIRP-beta2 tiene una sustitución de aminoácidos en I6, I27, F31, V47, R53, Q54, P56, T66, 192 o D101. En aspectos adicionales, el polipéptido SIRP-beta2 está sustituido en V6 en el que la sustitución es I. En aspectos adicionales, el polipéptido SIRP-beta2 está sustituido en V27 en el que la sustitución es I. En aspectos adicionales, el polipéptido SIRP-beta2 está sustituido en 131 en el que la sustitución es F. En aspectos adicionales, el polipéptido SIRP-beta2 está sustituido en E47 en el que la sustitución es V. En aspectos adicionales, el polipéptido SIRP-beta2 está sustituido en K53 en el que la sustitución es R. En aspectos adicionales, el polipéptido SIRP-beta2 está sustituido en E54 en el que la sustitución es Q. En aspectos adicionales, el polipéptido SIRP-beta2 está sustituido en H56 en el que la sustitución es P. En aspectos adicionales, el polipéptido SIRP-beta2 está sustituido en L66 en el que la sustitución es T. En aspectos adicionales, el polipéptido SIRP-beta2 está sustituido en V92 en el que la sustitución es I. En aspectos adicionales, el polipéptido SIRP-beta2 está sustituido en H101 en el que la sustitución es D. En aspectos adicionales, el polipéptido SIRP-beta 2 tiene la secuencia EEELQIIQPDKSISVAAGESATLHCTITSLFPVGPIQWFRGAGPGRVLIYNQRQGPFPRVTTVSDTTKRNNMDFSIRISNI TPADAGTYYCIKFRKGSPDDVEFKSGAGTELSVRAKPS (SEQ ID NO: 28). En aspectos adicionales, el polipéptido SIRP-beta2 tiene la secuencia EEELQX¹IQPDKSISVAAGESATLHCTX²TSLX³PVGPIQWFRGAGPGRX⁴LIYNQX⁵X⁶GX⁷FPRVTTVSDX⁸TKRNNMD FSIRISNITPADAGTYYCX⁹KFRKGSPDX¹⁰VEFKSGAGTELSVRAKPS (SEQ ID NO: 46) en la que X ¹es V o I; X²es V o I; X³es I o F; X⁴es E o V; X⁵es K o R; X⁶es E o Q; X⁷es H o P; X⁸es L o T; X⁹es V o I; y X ¹⁰es H o D.

En divulgaciones adicionales, se proporciona un polipéptido señuelo seleccionado de un polipéptido SIRP-gamma, SIRP-beta y SIRP-beta2 en el que el polipéptido SIRP-gamma tiene la secuencia EEELQX¹IQPEKLLLVTVGKTATLHCTX²TSX³X⁴PX⁵GPX⁶X⁷WFRGX⁸GPGRX⁹LIYNX¹⁰X ¹¹X ¹²GX¹³FPRVTTVSDX¹⁴X ^{1 5}KRNNMDFSIRISSITPADVGTYYCX¹⁶KFRKGX¹⁷PEX¹⁸VEFKSGPGTEMALGAKPS (SEQ ID NO: 2), en la que X ¹es M, I, L o F; X²es F, I, L o V; X³es L, I, V, H, N o D; X⁴es F, I, L o V; X⁵es V, I, L, P, T o A; X^aes V o I; X⁷es L o Q; X⁸es V o A; X⁹es E o V; X ¹⁰es Q, P, L, V, A o E; X ¹¹es K o R; X ¹²es E, D, K, N, Q o H; X ¹³es H, P o R; X ¹⁴es L, I, V, P, T, A, R, S o G; X ¹⁵es T, I, N, F, S, Y, V, A o D; X ¹⁶es V o I; X ¹⁷es S, R, N, K, T, I o M; y X ¹⁸es N, K, D, E, H o Q, en el que polipéptido SIRP-beta tiene la secuencia EDELQX¹IQPEKSVSVAAGESATLRCAX²TSLX³PVGPIX⁴WFRGAGAGRX⁵LIYNQX⁶X⁷GX⁸FPRVTTVSEX⁹TKRNNLD FSISISNITPADAGTYYCX¹⁰KFRKGSPDDVEFKSGAGTELSVRAKPS (SEQ ID NO: 45) en la que X ¹es V o I; X²es M o I; X³es I o F; X⁴es M o Q; X⁵es E o V; X⁶es K o R; X⁷es E o Q; X⁸es H o P; X⁹es L o T; y X ¹⁰es V o I; y en el que el polipéptido SIRP-beta2 tiene la secuencia EEELQX¹IQPDKSISVAAGESATLHCTX²TSLX³PVGPIQWFRGAGPGRX⁴LIYNQX⁵X⁶GX⁷FPRVTTVSDX⁸TKRNNMD FSIRISNITPADAGTYYCX⁹KFRKGSPDX¹⁰VEFKSGAGTELSVRAKPS (SEQ ID NO: 46) en la que X ¹es V o I; X²es V o I; X³es I o F; X⁴es E o V; X⁵es K o R; X⁶es E o Q; X⁷es H o P; X⁸es L o T; X⁹es V o I; y X ¹⁰es H o D.

En divulgaciones adicionales, el polipéptido señuelo SIRP-gamma, SIRP-beta o SIRP-beta2 bloquea la unión de CD47 a un ligando. En aspectos particulares, el ligando es SIRP-alfa, SIRPgamma o trombospondina-1.

En divulgaciones adicionales, el polipéptido señuelo SIRP-gamma, SIRP-beta o SIRP-beta2 se une a una célula. En aspectos particulares, la célula es una célula tumoral, una célula infectada por virus, una célula infectada por bacteria, glóbulos rojos dañados, una célula de placa arterial, una célula de tejido fibrótico, una célula normal sana, tal como una célula madre hematopoyética, una célula precursora mieloide o linfoide sana o un tipo de célula hematopoyética diferenciada sana tal como linfocito T, B, célula plasmática o célula NK.

En divulgaciones adicionales, el polipéptido SIRP-gamma, SIRP-beta o SIRP-beta2 permite la fagocitosis o CCDA de una célula tumoral, una célula infectada por virus, una célula infectada por bacteria, glóbulos rojos dañados, una célula de placa arterial, una célula de tejido fibrótico, una célula normal sana, tal como una célula madre hematopoyética, una célula precursora mieloide o linfoide sana o un tipo de célula hematopoyética diferenciada sana, tal como linfocito T, B, células plasmáticas o células NK.

En divulgaciones adicionales, el polipéptido señuelo SIRP-gamma, SIRP-beta o SIRP-beta2 se fusiona con una secuencia de Fc de inmunoglobulina. En divulgaciones adicionales, el polipéptido SIRP-gamma, SIRP-beta o SIRP-beta2 es multimérico. En divulgaciones adicionales, el polipéptido SIRP-gamma, SIRP-beta o SIRP-beta2 es monomérico. En divulgaciones adicionales, el polipéptido señuelo comprende además un marcador detectable.

En divulgaciones adicionales, se proporciona una composición que comprende el polipéptido señuelo SIRP-gamma, SIRP-beta o SIRP-beta2 como se ha descrito anteriormente y un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable. En aspectos particulares, la composición comprende adicionalmente un fármaco adicional. En aspectos particulares, el fármaco comprende uno o más de un agente quimioterapéutico, inhibidor de quinasa, inhibidor del proteasoma o inhibidor de la ADN o ARN polimerasa viral. En divulgaciones adicionales, la composición comprende además un anticuerpo monoclonal. En aspectos particulares, el anticuerpo monoclonal se une a un antígeno en una célula cancerosa (por ejemplo, mieloma), una célula inmunitaria, una célula infectada por patógenos o una célula madre hematopoyética. En aspectos adicionales, el antígeno de una célula cancerosa comprende EGFR, Her2/neu, CD19, CD20, CD22, CD25, CD30, CD33, CD38, CD45, CD47, CD56, CD70, CD117 o EpCAM. En aspectos adicionales, el antígeno de la célula inmunitaria comprende Mlprime, CD2, CD3, CD4, CD5, CD8, CD19, CD20, CD22, CD25, CD38, CD56, PD-1, PD-L1, CTLA4, BTLA, TIM3, LAG3, OX40, GITR o CD137 (4-1BB). En aspectos adicionales, el antígeno en una célula infectada por patógenos comprende proteínas de citomegalovirus (CMV), incluyendo UL-18, UL11, pp65, gB y pp150. En aspectos adicionales, el antígeno en una célula infectada por patógenos comprende proteínas de la envoltura del VIH, incluyendo Gp41, Gp120, glicano V1V2 y glicano V3, y hemaglutinina de la gripe. En aspectos adicionales, el antígeno en la célula madre hematopoyética comprende CD11, CD45, CD117 o Sca1.

En divulgaciones adicionales, se proporciona un polipéptido señuelo SIRP-gamma, SIRP-beta o SIRP-beta2 como se ha descrito anteriormente con mayor persistencia. En algunos aspectos, una mayor persistencia de los polipéptidos señuelo SIRP-gamma, SIRP-beta o SIRP-beta2 dan como resultado una semivida aumentada en la superficie celular en comparación con otros polipéptidos SIRP.

En divulgaciones adicionales, se proporciona un polipéptido señuelo SIRP-gamma, SIRP-beta o SIRP-beta2 como se ha descrito anteriormente con mayor ocupación u ocupación del receptor. En algunos aspectos, mayor ocupación del polipéptido señuelo SIRP-gamma, SIRP-beta o SIRP-beta2 da como resultado un aumento de la unión de los polipéptidos señuelo SIRP-gamma, SIRP-beta o SIRP-beta2 a una o más células diana.

En divulgaciones adicionales, se proporciona un ácido nucleico aislado que codifica uno cualquiera de los polipéptidos señuelo anteriores. En divulgaciones adicionales, se proporciona una célula que expresa uno cualquiera de los polipéptidos señuelo anteriores.

En divulgaciones adicionales, se proporciona un método para modular la fagocitosis o CCDA de una célula que expresa CD47, comprendiendo el método poner en contacto la célula con uno cualquiera de los polipéptidos señuelo o las composiciones anteriores. En divulgaciones adicionales, se proporciona un método para tratar a un sujeto que lo necesita, que comprende administrar una cantidad eficaz de uno cualquiera de los polipéptidos señuelo SIRP-gamma, SIRP-beta o SIRP-beta2 o composiciones anteriores. En aspectos particulares, el sujeto tiene cáncer, anemia, infección vírica, infección bacteriana, enfermedad autoinmunitaria, asma, alergia, rechazo de trasplante, aterosclerosis o fibrosis.

En divulgaciones adicionales, se proporciona uno cualquiera de los polipéptidos señuelo SIRP-gamma, SIRP-beta o SIRP-beta2 o composiciones anteriores para su uso en el tratamiento del cáncer, infección vírica, infección bacteriana, enfermedad autoinmunitaria, asma, alergia, rechazo de trasplante, aterosclerosis o fibrosis. En divulgaciones adicionales se proporciona uno cualquiera de los polipéptido señuelo SIRP-gamma, SIRP-beta o SIRP-beta2 o composiciones anteriores para su uso en el preacondicionamiento de un trasplante de células madre hematopoyéticas.

En divulgaciones adicionales, se proporciona un método para visualizar una célula que expresa CD47, comprendiendo el método poner en contacto una población de células con uno cualquiera de los polipéptidos señuelo anteriores y un marcador detectable. En aspectos particulares, la célula es una célula tumoral, una célula infectada por virus, una célula infectada por bacteria, linfocitos T o B autorreactivos, glóbulos rojos dañados, una célula de placa arterial, una célula de tejido fibrótico, una célula normal sana, tal como una célula madre hematopoyética, una célula precursora mieloide o linfoide sana o un tipo de célula hematopoyética diferenciada sana, tal como linfocitos T, B, célula plasmática o célula NK. En aspectos adicionales, el contacto se realiza in vivo. En aspectos adicionales, el contacto se realiza in vitro.

En divulgaciones adicionales, se proporciona un método para purificar una célula que expresa CD47, comprendiendo el método poner en contacto una población de células con uno cualquiera de los polipéptidos señuelo anteriores y un marcador detectable y purificar las células unidas al marcador detectable.

Breve descripción de las figuras

Las figuras 1A y 1B muestran la medición basada en resonancia de plasmón superficial de la afinidad de unión y la cinética de la variante GV3 de SIRP-gamma para CD47 humano. La figura 1A muestra que las concentraciones de la variante GV3 SIRP-gamma incluyen 100 pM, 316 pM, 1 nM, 3,16 nM, 10 nM y 100 nM. Utilizando un modelo de unión Langmuir 1:1, la constante de disociación calculada Kd fue 92 pM. La semivida de disociación calculada T1/2 fue de aproximadamente 44 minutos. La figura 1B muestra una representación gráfica de un CD47 humano biotinilado unido a la variante GV3 de SIRP-gamma.

Las figuras 2A y 2B muestran la medición basada en resonancia de plasmón superficial de la afinidad de unión y la cinética de HAC-GV3, una proteína de fusión de la variante GV3 de SIRP-gamma con la variante HAC de PD-1, para CD47 humano. La figura 2A muestra que las concentraciones de la proteína de fusión HAC-GV3 utilizadas incluyen 100 pM, 316 pM, 1 nM, 3,16 nM, 10 nM y 100 nM. Utilizando un modelo de unión Langmuir 1:1, la constante de disociación calculada Kd fue 160 pM. La semivida de disociación calculada T1/2 fue de aproximadamente 40 minutos. La figura 2B muestra una representación gráfica de un CD47 humano biotinilado unido a la proteína de fusión que comprende la variante GV3 y HAC de SIRP-gamma.

Las figuras 3A y 3B muestran la medición basada en resonancia de plasmón superficial de la afinidad de unión y la cinética de HAC-GV3, una proteína de fusión de la variante GV3 de SIRP-gamma con la variante HAC de PD-1, para PD-L1 humano. La figura 3A muestra que las concentraciones de la proteína de fusión HAC-GV3 utilizadas incluyen 100 pM, 316 pM, 1 nM, 3,16 nM, 10 nM y 100 nM. Utilizando un modelo de unión Langmuir 1:1, la constante de disociación calculada Kd fue 134 pM. La semivida de disociación calculada T1/2 fue de aproximadamente 38 minutos. La figura 3B muestra una representación gráfica de un PD-L1 humano biotinilado unido a HAC-GV3.

Las figuras 4A y 4B muestran la medición basada en resonancia de plasmón superficial de la afinidad de unión y la cinética de unión simultánea tanto de CD47 humano como de PD-L1 humano por HAC-GV3. La figura 4A muestra que, en comparación con el GV3 humano solo, la curva de unión para la proteína de fusión HAC-GV3 mostró un primer pico para unirse a CD47 biotinilado y un segundo pico para unirse a PD-L1. La figura 4B muestra una representación gráfica de un CD47 humano biotinilado unido a la porción GV3 de la proteína de fusión HAC-GV3, en el que la porción HAC está unida a PD-L1.

La figura 5 muestra la medición basada en citometría de flujo del bloqueo de interacciones CD47/SIRP-alfa en la superficie de células CD47+ GFP-luciferasa DLD1-Tg por Gv 3 y HAC-GV3. Se combinaron 50 nM de tetrámeros SIRP-alfa biotinilados con concentraciones de titulación de GV3 o HAC-GV3 en presencia de las células CD47+. El porcentaje de la intensidad de fluorescencia media (% IFM) como lectura de la unión de SIRP-alfa se representa frente a la concentración logarítmica en M.

La figura 6 muestra la medición basada en citometría de flujo del bloqueo de interacciones CD47/SIRP-alfa en la superficie de células CD47+ PD-L1+ GFP-luciferasa DLD1-Tg por Gv 3 y HAC-GV3. Se combinaron 50 nM de tetrámeros SIRP-alfa biotinilados con concentraciones de titulación de GV3 o HAC-GV3 en presencia de las células CD47+ PD-L1+. El porcentaje de la intensidad de fluorescencia media (% IFM) como lectura de la unión de SIRP-alfa se representa frente a la concentración logarítmica en M.

La figura 7 muestra la medición basada en citometría de flujo del bloqueo de interacciones PD-1/PD-L1 en la superficie de células de levadura PD-L1+ humanas por HAC y HAC-GV3. Se combinaron 100 nM de tetrámeros de PD-1 biotinilados con concentraciones de titulación de HAC o HAC-GV3 en presencia de las células de levadura hPD-L1+. El porcentaje de intensidad de fluorescencia media (% IFM) como lectura de la unión de PD-1 se representa frente a la concentración logarítmica en M.

La figura 8 muestra la medición basada en citometría de flujo del bloqueo de interacciones PD-1/PD-L1 en la superficie de células CD47+ PD-L1+ GFP-luciferasa DLD1-Tg por HAC y HAC-GV3. Se combinaron 100 nM de tetrámeros de PD-1 biotinilados con concentraciones de titulación de HAC o HAC-GV3 en presencia de las células CD47+ PD-L1+. El porcentaje de intensidad de fluorescencia media (% IFM) como lectura de la unión de PD-1 se representa frente a la concentración logarítmica en M.

La figura 9 muestra la medición basada en FACS de la fagocitosis por macrófagos humanos derivados de donantes contra la línea celular de cáncer de colon humano DLD1, lo que indica que el microcuerpo GV3 y HAC-GV3 potencian la fagocitosis en una amplia gama de concentraciones de anticuerpos opsonizantes. La evaluación de la fagocitosis se realizó mediante cocultivo de 100.000 células diana y 50.000 macrófagos durante dos horas en placas de fondo en U de 96 pocillos de fijación ultrabaja (Corning) en IMDM GlutaMax (Life Technologies) sin antibióticos ni suero añadido. Los macrófagos se generaron mediante purificación basada en perlas magnéticas de monocitos humanos primarios usando el kit de aislamiento de sangre completa CD14+ (Miltenyi) seguido de 7 días de cultivo con suero humano (Gemini); el día 7, estas células se recolectaron de placas usando TrypLE Express (Life Technologies). Los macrófagos se marcaron con tinción celular rojo/naranja de Calceína AM (Life Technologies) según las indicaciones del fabricante. Las células diana se diseñaron para expresar de forma estable proteína verde fluorescente. Se añadió una forma de microcuerpo dimerizado de HGV3 (GV3mb) o proteína de fusión HAC-GV3 a los pocillos de reacción a una concentración de saturación de 10 nM, mientras que el anticuerpo opsonizante Cetuximab se tituló en tres logs de concentración. Las barras de error representan la desviación estándar de experimentos duplicados. Las reacciones se realizaron en un analizador LSRFortessa equipado con un muestreador automático de alto rendimiento (BD Biosciences). La fagocitosis se evaluó como macrófagos GFP+ expresada como porcentaje del total de macrófagos, como se analizó usando FlowJo v.9.4.10 (Tree Star) y se normalizó como se indica en las leyendas de las figuras.

La figura 10 muestra el esquema experimental para ratones NSG injertados con células de leucemia humana que permiten la aproximación de la cinética de RO humana in vivo

Las figuras 1lA-D muestran que HAC-GV3 logra una ocupación superior del receptor y una persistencia en el tejido en comparación con GV3. La figura 11A muestra la ocupación y persistencia del receptor en las células esplénicas totales. La figura 11B muestra la ocupación y persistencia del receptor en los esplenocitos. La figura 11C muestra la ocupación y persistencia del receptor en células CD47+ PDL1+ humanas. La figura 11D muestra la ocupación y persistencia del receptor en células de melanoma B16-F0.

Descripción detallada

Se proporcionan polipéptidos señuelo de SIRP-gamma, SIRP-beta o SIRP-beta2 y análogos de los mismos que pueden denominarse polipéptidos señuelo. Los polipéptidos señuelo son variantes de las proteínas SIRP-gamma, SIRP-beta o SIRP-beta2 humanas de tipo salvaje. En una divulgación, en el presente documento se proporciona un polipéptido SIRP-gamma, SIRP-beta o SIRP-beta2 soluble, en el que el polipéptido carece de un dominio transmembrana y comprende al menos un cambio de aminoácido con respecto a la secuencia de SIRP-gamma, SIRP-beta o SIRP-beta2 de tipo salvaje, y en el que el cambio de aminoácidos aumenta la afinidad de la unión del polipéptido SIRP-gamma, SIRP-beta o SIRP-beta2 a CD47, por ejemplo, reduciendo la constante de disociación en al menos 10 veces, al menos 20 veces, al menos 50 veces, al menos 100 veces, al menos 500 veces o más.

Las proteínas reguladoras de señales (SIRP) constituyen una familia de glicoproteínas de la superficie celular que se expresan en células mieloides (incluidos macrófagos, granulocitos, células dendríticas mieloides y mastocitos) y células neuronales. Las SIRP constituyen una familia diversa de múltiples genes de receptores inmunitarios que abarcan miembros inhibidores, activadores, no señalizadores y solubles. CD47, una glicoproteína transmembrana ampliamente expresada, funciona como un ligando celular para SIRPa y se une al extremo extracelular NH2-terminal de SIRPa. El papel de SIRPa se ha documentado mejor con respecto a su papel inhibidor en la fagocitosis de las células huésped por macrófagos y la citotoxicidad celular dirigida por anticuerpos (CCDA) por neutrófilos. En particular, la unión de SIRPa en células mieloides por CD47 expresado en células diana, genera una señal inhibidora que regula negativamente la fagocitosis y la CCDA. Los agentes que se unen al CD47 o al SIRPa y antagonizan la interacción CD47:SIRPa actúan sobre la fagocitosis activa de macrófagos y la CCDA de neutrófilos, particularmente hacia las células opsonizadas por anticuerpos (Majeti et al Cell 2009, Chao et al Cell 2010, Zhang et al, Weiskopf et al Science 2013). Los agentes incluyen anticuerpos monoclonales y "señuelos" del receptor soluble CD47 y SIRPa. CD47 también es un ligando para SIRP-gamma, un gen distinto de SIRPa que se expresa en linfocitos de función poco clara. SIRP-beta y SIRP-beta2 también son genes distintos de SIRPa y, a pesar de su similitud en secuencia y estructura con SIRPa, no se unen naturalmente a CD47. Sin embargo, se puede hacer que lo hagan mediante mutación (Hatherly et al, Molecular Cell 2008). En principio, los receptores señuelo basadosen un armazón de SIRP-gamma, SIRP-beta o SIRP-beta2 también podría antagonizar la interacción SIRPa-CD47 para aumentar la fagocitosis de células mieloides o CCDA. Estos señuelos disfrutarían de una gran ventaja sobre los señuelos basados en SIRPa como terapias dirigidas a CD47, ya que el ectodominio de SIRPa es altamente polimórfico entre individuos, aumentando de este modo la probabilidad de inmunogenicidad si el SIRPa se administró como terapéutico recombinante. En cambio, los ectodominios de SIRP-gamma, SIRP-beta y SIRP-beta2 no son ampliamente polimórficos, evitando así secuencias inmunogénicas innecesarias.

En algunas divulgaciones, los polipéptidos SIRP-gamma, SIRP-beta o SIRP-beta2 descritos en el presente documento estimulan la fagocitosis o la CCDA por células mieloides (por ejemplo, macrófagos, monocitos, células dendríticas, neutrófilos, etc.) para eliminar las células patógenas (por ejemplo, células tumorales, células infectadas por virus o bacterias, linfocitos T autorreactivos, etc.). En algunas de estas divulgaciones, las células se eliminan selectivamente, reduciendo así el potencial de efectos secundarios tóxicos. En otras divulgaciones, los mismos polipéptidos podrían usarse para mejorar la eliminación de células endógenas para un efecto terapéutico, tales como los linfocitos B o T en enfermedades autoinmunitarias, asma y alergia, o células madre hematopoyéticas (CMH) para el trasplante de células madre.

En algunas divulgaciones, los polipéptidos SIRP-gamma, SIRP-beta o SIRP-beta2 descritos en el presente documento tienen una mayor ocupación u ocupación del receptor en comparación con otros polipéptidos SIRP conocidos en la técnica. En algunas divulgaciones, los polipéptidos SIRP-gamma, SIRP-beta o SIRP-beta2 descritos en el presente documento tienen una mayor persistencia en comparación con otros polipéptidos SIRP conocidos en la técnica. Ocupación u ocupación del receptor, como se usa en el presente documento, se refiere a la unión a una célula diana, un receptor diana, una proteína diana o tejido diana. Persistencia, como se usa en el presente documento, se refiere tanto a la semivida en suero como a la semivida de la unión a células de los polipéptidos cuando se administran a un individuo, sujeto o paciente.

Polipéptidos SIRP y variantes de los polipéptidos SIRP

Las proteínas reguladoras de señales (SIRP, CD172) son una familia de proteínas de membrana implicadas en la función de los leucocitos. La familia de proteínas SIRP incluye la proteína reguladora de señales Gamma (SIRP-gamma, CD172g), la proteína reguladora de señales beta (SIRP-beta, la proteína reguladora de señales Beta 1, CD172b, SIRP-betal) y la proteína reguladora de señales Beta 2 (SIRP-beta2, PTPN1L).

La secuencia de aminoácidos de SIRP-gamma humana está disponible en la base de datos SWISS-PROT como Q9P1W8. SIRP-gamma incluye tres isoformas. La secuencia de aminoácidos de SIRP-beta humana está disponible en la base de datos SWISS-PROT como 000241 y Q5TFQ8. SIRP-beta incluye tres isoformas. La secuencia de aminoácidos de SIRP-beta2 está disponible en la base de datos SWISS-PROT como Q5JXA9. SIRP-beta2 incluye tres isoformas.

Dentro del alcance de las divulgaciones presentadas en el presente documento se contemplan variantes de los polipéptidos SIRP-gamma, SIRP-beta y SIRP-beta2 que actúan como señuelos para CD47 y activan la fagocitosis. En algunas divulgaciones, un polipéptido señuelo comprende un polipéptido SIRP-gamma, SIRP-beta o SIRP-beta2, en el que el polipéptido comprende al menos una modificación de aminoácido para aumentar la afinidad de la unión del polipéptido señuelo SIRP-gamma, SIRP-beta y SIRP-beta2 a CD47 en comparación con la afinidad por CD47 del correspondiente polipéptido SIRP-gamma, SIRP-beta y SIRP-beta2 de tipo salvaje.

Como se usa en el presente documento, "secuencia sustancialmente idéntica a una secuencia polipeptídica de SIRP-gamma, SIRP-beta o SIRP-beta2 de tipo salvaje" significa que, en una divulgación, una secuencia es al menos un 80 % idéntica a una secuencia polipeptídica de SIRP-gamma, SIRP-beta o SIRP-beta2. En otras divulgaciones, "secuencia sustancialmente idéntica a una secuencia polipeptídica de SIRP-gamma, SIRP-beta o SIRP-beta2 de tipo salvaje" significa que, una secuencia es al menos un 85 % idéntica a una secuencia polipeptídica de SIRP-gamma, SIRP-beta o SIRP-beta2 de tipo salvaje. En otras divulgaciones, "secuencia sustancialmente idéntica a una secuencia polipeptídica de SIRP-gamma, SIRP-beta o SIRP-beta2 de tipo salvaje" significa que, una secuencia es al menos un 90 % idéntica a una secuencia polipeptídica de SIRP-gamma, SIRP-beta o SIRP-beta2. En otras divulgaciones, "secuencia sustancialmente idéntica a una secuencia polipeptídica de SIRP-gamma, SIRP-beta o SIRP-beta2 de tipo salvaje" significa que, una secuencia es al menos un 95 % idéntica a una secuencia polipeptídica de SIRP-gamma, SIRP-beta o SIRP-beta2 de tipo salvaje.

En algunas divulgaciones, los polipéptidos señuelo descritos en el presente documento incorporan homólogos o variantes de alta afinidad de los polipéptidos SIRP-gamma, SIRP-beta o SIRP-beta2 (por ejemplo, variantes de SIRP-gamma, SIRP-beta o SIRP-beta2). En consecuencia, las divulgaciones presentadas en el presente documento abarcan el uso de un polipéptido SIRP-gamma, SIRP-beta o SIRP-beta2 que tiene una secuencia similar a, pero no idénticas a, la secuencia de aminoácidos del polipéptido SIRP-gamma, SIRP-beta o SIRP-beta2 de tipo salvaje. Por lo tanto, también se contempla dentro del alcance de las divulgaciones proporcionadas en el presente documento el uso de un polipéptido SIRP-gamma, SIRP-beta o SIRP-beta2 que tiene una identidad de secuencia del 99 %, el 98 %, el 97 %, el 96 %, el 95 %, el 94 %, el 93 %, el 92 %, el 91 %, el 90 %, el 89 %, el 88 %, el 87 %, el 86 %, el 85 %, el 84 %, el 83 %, el 82 %, el 81 % o el 80 % en comparación con la secuencia del polipéptido SIRP-gamma, SIRP-beta o SIRP-beta2 de tipo salvaje, y que se une con alta afinidad a CD47.

En algunas divulgaciones, una variante del polipéptido SIRP-gamma, SIRP-beta o SIRP-beta2 se modifica para que contengan variaciones conservadoras a fin de cambiar restos no críticos o restos en regiones no críticas. Los aminoácidos que no son críticos se identifican mediante métodos conocidos, tal como mutagénesis dirigida al sitio, cristalización, resonancia magnética nuclear, marcaje de fotoafinidad o mutagénesis de barrido de alanina (Cunningham et al., Science, 244:1081-1085 (1989); Smith et al., J. Mol. Biol., 224:899-904 (1992); de Vos et al., Science, 255:306-312 (1992)). Las proteínas modificadas se prueban para determinar su actividad o capacidad para unirse a CD47 mediante métodos tales como actividad in vitro o actividad in vivo.

En algunas divulgaciones, una variante del polipéptido SIRP-gamma, SIRP-beta o SIRP-beta2 incorpora 1, 2, 3, 4, 5 o más sustituciones de aminoácidos que mejoran la estabilidad del polipéptido SIRP-gamma, SIRP-beta o SIRP-beta2 o con un aminoácido hidrofóbico diferente que mejore la estabilidad del polipéptido SIRP-gamma, SIRP-beta o SIRP-beta2 frente a la oxidación, o con un aminoácido diferente que mejore el polipéptido SIRP-gamma, SIRP-beta o SIRP-beta2 frente a la proteasa. Por lo tanto, una "variante" de SIRP-gamma, SIRP-beta o SIRP-beta2 difiere en la secuencia de aminoácidos de la secuencia representada por un polipéptido SIRP-gamma, SIRP-beta o SIRP-beta2 de tipo salvaje por una o más sustituciones, deleciones, inserciones, inversiones, truncamientos, modificaciones o una combinación de los mismos. Dicha variante contiene opcionalmente sustituciones de aminoácidos que sustituyen un aminoácido dado por otro aminoácido de características similares. Las sustituciones conservadoras incluyen, entre los aminoácidos alifáticos, intercambio de alanina, valina, leucina e isoleucina; intercambio de los restos hidroxilo serina y treonina, intercambio de los restos ácidos aspartato y glutamato, sustitución entre los restos amida asparagina y glutamina, intercambio de los restos básicos lisina y arginina, y reemplazos entre los restos aromáticos fenilalanina y tirosina. Véase Bowie et al., Science, 247:1306-1310 (1990).

El polipéptido SIRP-gamma, SIRP-beta o SIRP-beta2 es una variante, como se describe con detalle a continuación, en formas en las que la variante conserva o mejora la característica de unión a CD47.

En algunas divulgaciones, una variante del polipéptido SIRP-gamma, SIRP-beta o SIRP-beta2 es un fragmento de la proteína SIRP-gamma, SIRP-beta o SIRP-beta2. En algunas divulgaciones, las variantes del polipéptido SIRP-gamma, SIRP-beta o SIRP-beta2 incluyen fragmentos polipeptídicos de SIRP-gamma, SIRP-beta o SIRP-beta2 resistentes a la escisión proteolítica o fragmentos polipeptídicos de SIRP-gamma, SIRP-beta o SIRP-beta2 que contienen uno o más aminoácidos no naturales, tales como D-aminoácidos. Dichos derivados tendrían el beneficio de una mayor semivida circulante, conservando la característica beneficiosa de la unión a CD47.

En otra divulgación, una variante del polipéptido SIRP-gamma, SIRP-beta o SIRP-beta2 comprende un polipéptido señuelo. En determinadas divulgaciones, el polipéptido señuelo comprende un polipéptido SIRP-gamma con la secuencia EEELQMIQPEKLLLVTVGKTATLHCTVTSLLPVGPVLWFRGVGPGRELIYNQKEGHFPRVTTVSDLTKRNNMDFSIRIS SITPADVGTYYCVKFRKGSPENVEFKSGPGTEMALGAKPS (SEQ ID NO: 1), o un polipéptido sustancialmente idéntico a una secuencia de SIRP-gamma de tipo salvaje. En aspectos particulares, el polipéptido SIRP-gamma tiene al menos uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, once, doce, trece, catorce, quince, dieciséis, diecisiete o dieciocho sustituciones de aminoácidos en M6, V27, L30, L31, V33, V36, L37, V42, E47, Q52, K53, E54, H56, L66, T67, V92, S98 o N101. En aspectos adicionales, el polipéptido SIRP-gamma tiene una sustitución en M6 en el que la sustitución es I, L o F. En aspectos adicionales, el polipéptido SIRP-gamma tiene una sustitución en V27 en el que la sustitución es F, I o L. En aspectos adicionales, el polipéptido SIRP-gamma tiene una sustitución en L30 en el que la sustitución es I, V, H, N o D. En aspectos adicionales, el polipéptido SIRP-gamma tiene una sustitución en L31 en el que la sustitución es F, I o V. En aspectos adicionales, el polipéptido SIRP-gamma tiene una sustitución en V33 en el que la sustitución es I, L, P, T o A. En aspectos adicionales, el polipéptido SIRP-gamma tiene una sustitución en V36 en el que la sustitución es I. En aspectos adicionales, el polipéptido SIRP-gamma tiene una sustitución en L37 en el que la sustitución es Q. En aspectos adicionales, el polipéptido SIRP-gamma tiene una sustitución en V42 en el que la sustitución es A. En aspectos adicionales, el polipéptido SIRP-gamma tiene una sustitución en E47 en el que la sustitución es V. En aspectos adicionales, el polipéptido SIRP-gamma tiene una sustitución en Q52 en el que la sustitución es P, L, V, A o E. En aspectos adicionales, el polipéptido SIRP-gamma tiene una sustitución en K53 en el que la sustitución es R. En aspectos adicionales, el polipéptido SIRP-gamma tiene una sustitución en E54 en el que la sustitución es D, K, N, Q o H. En aspectos adicionales, el polipéptido SIRP-gamma tiene una sustitución en H56 en el que la sustitución es P o R. En aspectos adicionales, el polipéptido SIRP-gamma tiene una sustitución en L66 en el que la sustitución es I, V, P, T, A, R, S o G. En aspectos adicionales, el polipéptido SIRP-gamma tiene una sustitución en T67 en el que la sustitución es I, N, F, S, Y, V, A o D. En aspectos adicionales, el polipéptido SIRP-gamma tiene una sustitución en V92 en el que la sustitución es I. En aspectos adicionales, el polipéptido SIRP-gamma tiene una sustitución en S98 en el que la sustitución es R, N, K, T, I o M. En aspectos adicionales, el polipéptido SIRP-gamma está sustituido en N101 en el que la sustitución es K, D, E, H o Q. En aspectos adicionales, el polipéptido SIRP-gamma tiene la secuencia EEELQX¹IQPEKLLLVTVGKTATLHCTX²TSX³X⁴PX⁵GPX⁶X⁷WFRGX⁸GPGRX⁹LIYNX¹⁰X¹¹X ¹²GX¹³FPRVTTVSDX¹⁴X ^{1 5}KRNNMDFSIRISSITPADVGTYYCX¹⁶KFRKGX¹⁷PEX¹⁸VEFKSGPGTEMALGAKPS (SEQ ID NO: 2), en la que X ¹es M, I, L o F; X²es F, I, L o V; X³es L, I, V, H, N o D; X⁴es F, I, L o V; X⁵es V, I, L, P, T o A; X⁶es V o I; X⁷es L o Q; X⁸es V o A; X⁹es E o V; X ¹⁰es Q, P, L, V, A o E; X¹¹es K o R; X ¹²es E, D, K, N, Q o H; X¹³es H, P o R; X¹⁴es L, I, V, P, T, A, R, S o G; X ¹⁵es T, I, N, F, S, Y, V, A o D; X ¹⁶es V o I; X ¹⁷es S, R, N, K, T, I o M; y X¹⁸es N, K, D, E, H o Q. En aspectos adicionales, el polipéptido señuelo tiene la secuencia EEELQIIQPEKLLLVTVGKTATLHCTITSLFPVGPVLWFRGVGPGRVLIYNQRQGPFPRVTTVSDTTKRNNMDFSIRISSI TPADVGTYYCIKFRKGSPENVEFKSGPGTEMALGAKPS (SEQ ID NO: 3). En aspectos adicionales, el polipéptido SIRP-gamma tiene la secuencia EEELQIIQPEKLLLVTVGKTATLHCTITSLFPVGPIQWFRGVGPGRVLIYNQRDGPFPRVTTVSDGTKRNNMDFSIRISSI TPADVGTYYCVKFRKGTPEDVEFKSGPGTEMALGAKPS (SEQ ID NO: 4). En aspectos adicionales, el polipéptido SIRP-gamma tiene la secuencia EEELQIIQPEKLLLVTVGKTATLHCTITSLFPVGPIQWFRGVGPGRVLIYNQKDGPFPRVTTVSDGTKRNNMDFSIRISSI TPADVGTYYCVKFRKGSPEDVEFKSGPGTEMALGAKPS (SEQ ID NO: 5). En aspectos adicionales, el polipéptido SIRP-gamma tiene la secuencia EEELQIIQPEKLLLVTVGKTATLHCTITSLFPVGPIQWFRGVGPGRVLIYNQKDGHFPRVTTVSDGTKRNNMDFSIRISSI TPADVGTYYCVKFRKGSPEDVEFKSGPGTEMALGAKPS (SEQ ID NO: 6). En aspectos adicionales, el polipéptido SIRP-gamma tiene la secuencia EEELQIIQPEKLLLVTVGKTATLHCTITSLFPVGPIQWFRGAGPGRVLIYNQRDGPFPRVTTVSDGTKRNNMDFSIRISSI TPADVGTYYCIKFRKGTPEDVEFKSGPGTEMALGAKPS (SEQ ID NO: 7). En aspectos adicionales, el polipéptido SIRP-gamma tiene una de las siguientes secuencias:

HLib1:

EEELQIIQPEKLLLVT V GKT ATLHCTIT S HFP V GPIQWFRG V GPGR VLIYN QKDGHFPRV

TT V S DGTKRNNMDFS IRIS SITP AD V GT Y Y C VKFRKGSPED VEFKS GPGTEM ALG AKPS

(SEQ ID NO: 8);

HLib2:

EEELQnQPDKSVLVAAGETATLRCTITSLFPVGPIQWFRGAGPGRVFIYNQRDGPFPRVT

TVSDGTKRNNMDFSIR1SS1TPADVGTYYCVKFRKGTPEDVEFKSGPGTEMALGAKPS

(SEQ ID NO: 9);

HLib3:

EEELQIIQPEKLLLVT V GKT ATLHCTITS LFP V GP VLWFRG V GPGRVLIYN QRQGPFPRVT

T VS DTTKRNNMDFS IRIS S ITP AD V GT Y YC VKFRKGTPED VEFKS GPGTEM ALG AKPS

(SEQ ID NO: 10);

HLib4:

EEELQIIQPEKLLLVT V GKT ATLHCTIT S LFP V GPIQWFRG V GPGRELIYN AREGRFPR VT

T VS DLTKRNNMDFS IRIS SITP AD V GT Y Y C VKFRKGS PED VEFKS GPGTEM ALG AKPS

(SEQ ID NO: 11);

HMLibl:

EEELQIIQPDKSVLVAAGETATLRCTITSLFPVGPIQWFRGAGPGRVLIYNQRQGPFPRVT

T VS DTTKRNNMDFSIRIGNITP AD AGT Y Y CIKFRKGS PDD VEFKS G AGTELS VRAKPS

(SEQ ID NO: 12);

HMLib2:

EEELQIIQPEKLLLVTVGKTATLHCTITSLFPVGPVLWFRGVGPGRVLrYNQRQGPFPRVT

TVSDTTKRNNMDFSIRISSITPADVGTYYCIKFRKGSPENVEFKSGPGTEMALGAKPS

(SEQ ID NO; 3);

HMLib3:

EEELQIIQPEKLLLVT V GKT ATLHCTITSLFP V GPIQWFRGV GPGRVLIYN QREGPFPRVT

TVSDGTKRNNMDFSIRISSITPADVGTYYCVKFRKGSPEDVEFKSGPGTEMALGAKPS

(SEQ ID NO: 13);

HMLib4:

EEELQMIQPEKLLLVT V GKT ATLHCT VTS LLP V GP VLWFRG V GPGRELIYN QKEGHFPR

VTT V S DLTKRNNMDF S IRIS S ITP AD V GT Y Y C VKFRKGS PEN VEFKS GPGTEM ALG AKPS

(SEQ ID NO: 42);

HMLib5:

EEELQIIQPDKSVLVAAGETATLRCTITSLFPVGPIQWFRGAGPGRVLIYNQRDGPFPRVT

TVSDGTKRNNMDFSIRISSITPADVGTYYCIKFRKGIPEDVEFKSGPGTEMALGAKPS

(SEQ ID NO: 14);

HMLib6:

EEELQIIQPDKSVLVAAGETATLRCTITSLFPVGPIQWFRGAGPGRVLIYNQRDGPFPRVT

TVSDGTKRNNMDFSIRISSITPADVGTYYCIKFRKGIPEDVEFKSGPGTXWH (SEQ ID

NO: 15),

en el que X es A, R, N, D, C, Q, E, G, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y o V;

HMLib7:

EEELQIIQPDKSVLVAAGETATLRCTrrSLFPVGPIQWFRGAGPGRVLIYNQKDGPFPRVT

TVSDGTKRNNMDFSIR1SSITPADVGTYYCIKFRKGTPEDVEFKSGPGTEMALGAKPS

(SEQ ID NO: 16);

MLib1:

EEELQIIQPEKLLLVTVGKTATLHCTITSLLPVGPIQWFRGVGPGRELIYNQRDGPFPRVT

TVSDGTKRNNMDFSIRISSITPADVGTYYCVKFRKGTPEDVEFKSGPGTEMALGAKPS

(SEQ ID NO: 17);

MLib2:

EEELQIIQPEKLLLVTVGKTATLHCTLTSLLPVGPILWFRGVGPGRVLIYNQRDGPFPRVT

TVSDGTKRNNMDFSIRISSITPADVGTYYCVKFRKGNPEDVEFKSGPGTEMALGAKPS

(SEQ ID NO: 18);

MLib3:

EEELQLIQPEKLLLVT V GKT ATLHCTITSLFPPGPIQWFRGV GPGRVLIYN QKDGPFPRVT

TVSDGTKRNNMDFSIRISSITPADVGTYYCVKFRKGIPEDVEFKSGPGTEMALGAKPS

(SEQ ID NO: 19);

MLib4:

EEELQIIQPEKLLLVTVGKTATLRCTITSLFPVGPIQWFRGAGPGRVLIYNQRDGPFPRVT

TVSDGTKRNNMDFSIRISSITPADVGTYYCIKFRKGIPEDVEFKSGPGTEMALGAKPS

(SEQ ID NO: 20);

MLib5:

EEELQIIQPEKLLLVT V GKT ATLHCTITSLFPIGPILWFRGV GPGRVLIYN QKDGPFPRVTT

V S DGTKRNNMDF S IRIS SITPAD V GT Y Y C VKFRKGS PED VEFKS GPGTEM ALG AKPS

(SEQ ID NO: 21);

MLib6:

EEELQMIQPEKLLLVT V GKT ATLHCTITSLFP V GPIQWFRGAGPGRVLIYN QRDGPFPRV

TT V S DGTKRNNMDF S IRIS S ITPAD V GT Y YCIKFRKGIPED VEFKS GPGTEM ALG AKPS

(SEQ ID NO: 22);

MLib7:

EEELQHQPDKSVLVAAGETATLRCTITSLFPVGPIQWFRGVGPGRVLIYNQKDGPFPRVT

T VS DGTKRNNMDFSIRIS SITP AD V GT YY CIKFRKGIPEDVEFKSGPGTEM ALG AKPS

(SEQ ID NO: 23);

MLib8:

EEELQIIQPDKSVLVAAGETATLRCTITSLFPVGPIQWFRGAGPGRVLIYNQKDGPFPRVT

TVSDGTKRNNMDFSIRISSITPADVGTYYCIKFRKGTPEDVEFKSGPGTEMALXAKPS

(SEQ ID NO: 24); o

GV1.2:

EEELQIIQPEKLLLVT V GKT ATLHCTITSLFP V GPIQWFRGV GPGRVLIYN QREGPFPRVT

TVSDGTKRNNMDFSIRISSITPADVGTYYCVKFRKGSPEDVEFKSGPGTEMALGAKPS

(SEQ ID NO: 13).

En divulgaciones adicionales, el polipéptido señuelo comprende un polipéptido SIRP-beta con la secuencia EDELQVIQPEKSVSVAAGESATLRCAMTSLIPVGPIMWFRGAGAGRELIYNQKEGHFPRVTTVSELTKRNNLDFSISIS NITPADAGTYYCVKFRKGSPDDVEFKSGAGTELSVRAKPS (SEQ ID NO: 25). En aspectos particulares, el polipéptido SIRP-beta es al menos un 90 % idéntico a un polipéptido SIRP-beta de tipo salvaje. En aspectos adicionales, el polipéptido SIRP-beta tiene sustituciones de aminoácidos en V6, M27, 131, M37, E47, K53, E54, H56, L66 o V92. En aspectos adicionales, el polipéptido SIRP-beta tiene una sustitución en V6 en el que la sustitución es I. En aspectos adicionales, el polipéptido SIRP-beta tiene una sustitución en M27 en el que la sustitución es I. En aspectos adicionales, el polipéptido SIRP-beta tiene una sustitución en 131 en el que la sustitución es F. En aspectos adicionales, el polipéptido SIRP-beta tiene una sustitución en M37 en el que la sustitución es Q. En aspectos adicionales, el polipéptido SIRP-beta tiene una sustitución en E47 en el que la sustitución es V. En aspectos adicionales, el polipéptido SIRP-beta

tiene una sustitución en K53 en el que la sustitución es R. En aspectos adicionales, el polipéptido SIRP-beta

tiene una sustitución en E54 en el que la sustitución es Q. En aspectos adicionales, el polipéptido SIRP-beta

tiene una sustitución en H56 en el que la sustitución es P. En aspectos adicionales, el polipéptido SIRP-beta tiene una sustitución en L66 en el que la sustitución es T. En aspectos adicionales, el polipéptido SIRP-beta tiene una sustitución en V92 en el que la sustitución es I. En aspectos adicionales, el polipéptido SIRP-beta tiene la secuencia EDELQIIQPEKSVSVAAGESATLRCAITSLFPVGPIQWFRGAGAGRVLIYNQRQGPFPRVTTVSETTKRNNLDFSISISN ITPADAGTYYCIKFRKGSPDDVEFKSGAGTELSVRAKPS (SEQ ID NO: 26). En aspectos adicionales, el polipéptido SIRP-beta tiene la secuencia EDELQX¹IQPEKSVSVAAGESATLRCAX²TSLX³PVGPIX⁴WFRGAGAGRX⁵LIYNQX⁶X⁷GX⁸FPRVTTVSEX⁹TKRNNLD FSISISNITPADAGTYYCX-^KFRKGSPDDVEFKSGAGTELSVRAKPS (SEQ ID NO: 45) en la que X-^,es V o I; X²es M o I; X³es I o F; X⁴es M o Q; X⁵es E o V; X⁶es K o R; X⁷es E o Q; X⁸es H o P; X⁹es L o T; y X ¹⁰es V o I.

En divulgaciones adicionales, el polipéptido señuelo comprende un polipéptido SIRP-beta2 con la secuencia EEELQVIQPDKSISVAAGESATLHCTVTSLIPVGPIQWFRGAGPGRELIYNQKEGHFPRVTTVSDLTKRNNMDFSIRISN ITPADAGTYYCVKFRKGSPDHVEFKSGAGTELSVRAKPS (SEQ ID NO: 27). En aspectos particulares, el polipéptido SIRP-beta2 es al menos un 90 % idéntico a un polipéptido SIRP-beta2 de tipo salvaje. En aspectos adicionales, el polipéptido SIRP-beta2 tiene sustituciones de aminoácidos en V6, V27, I31, E47, K53, E54, H56, L66, V92 o H101. En aspectos adicionales, el polipéptido SIRP-beta2 está sustituido en V6 en el que la sustitución es I. En aspectos adicionales, el polipéptido SIRP-beta2 está sustituido en V27 en el que la sustitución es I. En aspectos adicionales, el polipéptido SIRP-beta2 está sustituido en 131 en el que la sustitución es F. En aspectos adicionales, el polipéptido SIRP-beta2 está sustituido en E47 en el que la sustitución es V. En aspectos adicionales, el polipéptido SIRP-beta2 está sustituido en K53 en el que la sustitución es R. En aspectos adicionales, el polipéptido SIRP-beta2 está sustituido en E54 en el que la sustitución es Q. En aspectos adicionales, el polipéptido SIRP-beta2 está sustituido en H56 en el que la sustitución es P. En aspectos adicionales, el polipéptido SIRP-beta2 está sustituido en L66 en el que la sustitución es T. En aspectos adicionales, el polipéptido SIRP-beta2 está sustituido en V92 en el que la sustitución es I. En aspectos adicionales, el polipéptido SIRP-beta2 está sustituido en H101 en el que la sustitución es D. En aspectos adicionales, el polipéptido SIRP-beta 2 tiene la secuencia EEELQIIQPDKSISVAAGESATLHCTITSLFPVGPIQWFRGAGPGRVLIYNQRQGPFPRVTTVSDTTKRNNMDFSIRISNI TPADAGTYYCIKFRKGSPDDVEFKSGAGTELSVRAKPS (SEQ ID NO: 28). En aspectos adicionales, el polipéptido SIRP-beta2 tiene la secuencia EEELQX¹IQPDKSISVAAGESATLHCTX²TSLX³PVGPIQWFRGAGPGRX⁴LIYNQX5X⁶GX⁷FPRVTTVSDX⁸TKRNNMD FSIRISNITPADAGTYYCX⁹KFRKGSPDX¹⁰VEFKSGAGTELSVRAKPS (SEQ ID NO: 46) en la que X ¹es V o I; X²es V o I; X³es I o F; X⁴es E o V; X⁵es K o R; Xg es E o Q; X⁷es H o P; X⁸es L o T; X⁹es V o I; y X ^{i 0}es H o D.

En algunas divulgaciones, el polipéptido señuelo bloquea la unión de CD47 a una pareja de unión o ligando. En aspectos particulares, la pareja de unión o ligando comprende uno o más de SIRPalfa (SIRPA), SIRPgamma (SIRPG) o trombospondina-1 (TSP-1, THBS1).

En algunas divulgaciones, el polipéptido señuelo se une a una célula. En aspectos particulares, la unión del polipéptido señuelo a la célula, activa, permite, induce o causa la fagocitosis de la célula por un fagocito, tal como un fagocito profesional (por ejemplo, monocitos, macrófagos, neutrófilos, células dendríticas o mastocitos), un fagocito no profesional (por ejemplo, células epiteliales, células endoteliales, fibroblastos o células mesenquimales) o ambos. En aspectos adicionales, la célula es una célula tumoral, una célula infectada por virus, una célula infectada por bacteria, una célula autorreactiva, tal como un linfocito T o linfocito B autorreactivo, u otras células o tejidos indeseables o patógenos en el cuerpo, tales como glóbulos rojos dañados, placas arteriales o tejido fibrótico. En aspectos adicionales, la célula es una célula normal sana, tal como una célula madre hematopoyética, una célula precursora mieloide o linfoide sana o un tipo de célula hematopoyética diferenciada sana tal como linfocito T, B, células plasmáticas o células NK.

En algunas divulgaciones, el polipéptido señuelo es una quimera o una proteína de fusión. En aspectos particulares, el polipéptido señuelo se fusiona con una secuencia Fc de inmunoglobulina, una proteína fluorescente verde, una proteína fluorescente roja, una biotina, un marcador de HIS, un marcador MYC, un FLAG u otra secuencia polipeptídica. En algunas divulgaciones, el polipéptido señuelo se fusiona con una subunidad de tipo salvaje de PD-1 (PDCD1), PD-L1 (CD274), PD-L2 (PDCD1LG2), CTLA4, TIM3 (HAVCR2), CEACAM1, LAG3, BTLA, TNFRSF14, TIGIT, PVR, LIGHT, IL2, IL12A, IL15, IL10, LILRB1, LILRB2, LILRB3, LILRB4, LILRB5, LILRA1, LILRA2, LILRA3, LILRA4, LILRA5, LILRA6, CD40, CD40L, OX40, OX40L, CD137 (4-1BB, TNFRSF9), TNFSF9 (4-1BBL), B7-H4 (VCTN1), SIRPA, CD47, CD33, CD44, C5, C3 u otras proteínas. En algunas divulgaciones, el polipéptido señuelo se fusiona con una subunidad que es una variante de PD-1 (PDCD1), PD-L1 (CD274), PD-L2 (PDCD1LG2), CTLA4, TIM3 (HAVCR2), CEACAM1, LAG3, BTLA, TNFRSF14, TIGIT, PVR, LIGHT, IL2, IL12A, IL15, IL10, LILRB1, LILRB2, LILRB3, LILRB4, LILRB5, LILRA1, LILRA2, LILRA3, LILRA4, LILRA5, LILRA6, CD40, CD40L, OX40, OX40L, CD137 (4-1BB, TNFRSF9), TNFSF9 (4-1BBL), B7-H4 (VCTN1), SIRPA, CD47, CD33, CD44, C5, C3, u otras proteínas reguladoras inmunitarias, diseñado para la unión de alta afinidad a sus respectivos ligandos. En algunas divulgaciones, el polipéptido señuelo se fusiona con una subunidad que es una variante de PD-1 (PDCD1), PD-L1 (CD274), PD-L2 (PDCD1LG2), CTLA4, TIM3 (HAVCR2), CEACAM1, LAG3, BTLA, TNFRSF14, TIGIT, PVR, LIGHT, IL2, IL12A, IL15, IL10, LILRB1, LILRB2, LILRB3, LILRB4, LILRB5, LILRA1, LILRA2, LILRA3, LILRA4, LILRA5, LILRA6, CD40, CD40L, OX40, OX40L, CD137 (4-1BB, TNFRSF9), TNFSF9 (4-1BBL), B7-H4 (VCTN1), SIRPA, CD47, CD33, CD44, C5, C3, u otras proteínas, diseñado para la unión de afinidad reducida a sus respectivos ligandos. En algunas divulgaciones, el polipéptido señuelo se fusiona con una subunidad que es una variante de PD-1 (PDCD1), PD-L1 (CD274), PD-L2 (PDCD1LG2), CTLA4, TIM3 (HAVCR2), CEACAM1, LAG3, BTLA, TNFRSF14, TIGIT, PVR, LIGHT, IL2, IL12A, IL15, IL10, LILRB1, LILRB2, LILRB3, LILRB4, LILRB5, LILRA1, LILRA2, LILRA3, LILRA4, LILRA5, LILRA6, CD40, CD40L, OX40, OX40L, CD137 (4-1BB, TNFRSF9), TNFSF9 (4-1BBL), B7-H4 (VCTN1), SIRPA, CD47, CD33, CD44, C5, C3, u otras proteínas, diseñado para alterar la afinidad de unión a ligandos adicionales además de sus ligandos naturales. En aspectos adicionales, el polipéptido señuelo se fusiona o se administra en combinación con un anticuerpo monoclonal tal como un anticuerpo anti-CD20, un anticuerpo anti-EGFR, un anticuerpo anti-Her2/Neu (ERBB2), un anticuerpo anti-EPCAM, un anticuerpo dirigido anti-GL2, anti-GD2, anti-GD3, anti-CD2, anti-CD3, anti-CD4, anti-CD8, anti-CD19, anti-CD22, anti-CD30, anti-CD33, anti-CD45, anti-CD47, anti-CD52, anti-CD56, anti-CD70, anti-CD117, un anticuerpo anti-SIRPA, un anticuerpo dirigido anti-CD47, un anticuerpo anti-LILRB1, un anticuerpo dirigido anti-PD-1, un anticuerpo anti-PD-L1, un anticuerpo anti-PD-L2 o cualquier anticuerpo diseñado para unirse a una célula tumoral, una célula infectada por virus o bacterias, una célula inmunitaria, o célula normal sana, o a una citocina, quimiocina u hormona de cualquier tipo.

En algunas divulgaciones, el polipéptido señuelo comprende un polipéptido SIRP-gamma, SIRP-beta o SIRP-beta2 en forma multimérica. En aspectos particulares, el polipéptido señuelo comprende un dímero, un trímero, un tetrámero, un pentámero u otro multímero. En otras divulgaciones, el polipéptido señuelo comprende un polipéptido SIRP-gamma, SIRP-beta o SIRP-beta2 en forma monomérica.

En algunas divulgaciones, el polipéptido señuelo comprende un marcador detectable. En aspectos particulares, el marcador detectable comprende un marcador enzimático, tal como peroxidasa de rábano picante (HRP), fosfatasa alcalina (AP) o glucosa oxidasa. En aspectos adicionales, el marcador detectable comprende un marcador fluorescente, tal como Alexa Fluor® 350, Alexa Fluor® 405, Alexa Fluor® 488, Alexa Fluor® 532, Alexa Fluor® 546, Alexa Fluor® 555, Alexa Fluor® 568, Alexa Fluor® 594, Alexa Fluor® 647, Alexa Fluor® 680, Alexa Fluor® 750, BODIPY® FL, cumarina, Cy®3, Cy®5, Fluoresceína (FITC), Oregon Green®, Pacific Blue™, Pacific Green™, Pacific Orange™, tetrametilrodamina (TRITC), Texas Red® u otro marcador fluorescente. En aspectos adicionales, el marcador detectable comprende un grupo quelante, tal como Cyclen, Cyclam, DO2A, DOTP, DOTMA, TETA, DOTAM, CB-T2A, DOTA o NOTA. En aspectos adicionales, el marcador detectable comprende un isótopo radiactivo (tal como 32P, 33P, 3H, 14C, 125I, 18F, 68Ga, 64Cu, 89Zr, 11C, 13N, 15O, 62Cu, 124I, 76Br, 82Rb u otro isótopo radiactivo.

En divulgaciones adicionales, el polipéptido señuelo es un polipéptido quimérico o de fusión. En divulgaciones adicionales, el polipéptido señuelo comprende una secuencia polipeptídica de SIRP-gamma fusionada a una secuencia polipeptídica que comprende un inhibidor del punto de control inmunitario, una molécula coestimuladora o una citocina o una citocina atenuada, en el que las secuencias están conectadas por un enlazador Gly-Ser de longitud y composición variables. Por ejemplo, la secuencia enlazadora comprende la secuencia GGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 29). También podría variarse el orden de las dos secuencias polipeptídicas en los extremos N o C. En divulgaciones adicionales, el polipéptido señuelo es un agente SIRP-gamma de alta afinidad multiespecífica. En divulgaciones adicionales, el polipéptido señuelo comprende una de las siguientes secuencias:

1) Fusión a inhibidores de puntos de control inmunitarios

a. Antagonista de PD-1/PD-L1

Ejemplo: HAC-GV3 (señuelo PD-1 de alta afinidad fusionado a GV3)

D SPD R PW N PPTFSPALLVVTEG DNATFTCSFSN TSESFH VV W H R ESPSG Q TDTLA AFPEDRS QPGQDARFRVTQ LPNG RDFH M S V V R A R R N D S GTYVCGVISLAPKIQI KESLRAELRVTERGGGGSGGGGSEEELQIIQPEKLLLVTVGKTATLHCTrrSLFPV GPIQW FRG V GPGR V LIYN QKD GHFPR VTTY S DG TK RNNM D F S IRIS SITP AD V GT YYCVK FRK G SPEDVEFK SG PG TEM ALG AK PS (SEQ ID NO: 30);

b. Antagonista de BTLA/CD160

Ejemplo: Señuelo GV3-BTLA

EEELQIIQPEKLLLVT V GKT ATLHCTITSLFP V GPIQW FRGV G PG RVLIYN QKDGH FPRVTT V SDG TK R NNM D FS IRIS S ITP A D VGT Y Y C VK FRK G SPED VEFKS GPGTE M ALG AK PSG GG G SGG G G SW NIHG K ESCDVQ LYIKRQSEH SILAG DPFELECPVK YCANRPH VTW CK LNG TTCVK LEDRQ TSW K EEKNISFFILH FEPVLPNDNG SYRC SA N FQ SN LIESH STTLY V TD V K (SEQ ID NO: 31);

c. Antagonista de fosfatidilserina

Ejemplo: Señuelo GV3-MFGE8

EEELQIIQPEKLLLVT V GKT ATLHCTITSLFP V GPIQW FRGV GPGRVLIYN QKDGH FPRVTT VSDG TK RNNM DFS IRIS SITPAD VGT Y Y C VKFRKGSPED VEFKS GPGTE M ALGAKPS GGGGS GGGGSELN GC ANPLG LK NN SIPDKQIT AS S S YKTW GLHLFS W NPS Y ARLDK Q G NFN A W V AGS Y GNDQW LQ VDLGS S KE VTGIITQG ARN F GS V QF V AS YK V A Y S N D S ANW TE Y QDPRT GS S KIFPGNW DNHS HKKNLFETPILARY V RILPVAW HNRIALRLELLGC (SEQ ID NO: 32);

Ejemplo: Señuelo GV3-Tim1

EEELQIIQPEKLLLVT V GKT ATLHCTITSLFP VGPIQW FRGV GPGRVLIYN QKDGH FPRVTT VSDG TK RNNM DFS IRIS S ITPAD VGT Y Y C VKFRKGSPED VEFKS GPGTE M ALGAKPS GGGGS GGGGS V AGS VKVGGE AGPS VTLPCH Y S G A VT S MC W NRGS C S LFTC QN GIVW TN GTH VT YRK DTR YKLLGDLS RRD V S LTIENT A V S DS G V YCC RVEHRGW FNDM KITVSLEIVPPKVTT (SEQ ID NO: 33);

Ejemplo: Señuelo GV3-Tim3

EEELQIIQPEKLLLVT V GKT ATLHCTITSLFP V GPIQW FRGV GPG RVLIYN QKDGH FPRVTT V SDG TK R NNM D FS IRIS SITPA DV GTYYC VK FRK G SPED VEFKS GPGTE M ALGAKPS GGGGS GGGGS S E VE YR AE V G Q N A YLPCF YTP A APG NL V P V C W GK G ACP VFEC G N V VLRTDERD V N YW T S R YW LN GDFRKGD V S LTIEN V TLADS GIY CCRIQIPGIM NDEKFNLKLVIKPAKVTPA (SEQ ID NO: 34);

Ejemplo: Señuelo GV3-Tim4

EEELQIIQPEKLLLVT V GKTATLHCTITS LFP V GPIQW FRGV GPGRVLIYN QKDGH FPRVTT VSDG TKRNNM DFS IRIS SITPAD VGT Y Y C VKFRKGSPED VEFKS GPGTE M ALG AK PSG GG G SGG G G STSETVVTEVLG H RVTLPCLYSSW SH NSNSM CW G K DQCPYSG CK EALIRTDGM RVTSRK SAKYRLQ G TIPRG DVSLTILNPSESDSG VYC CRIEVPG W FNDVKINVRLNLQRASTTTDEKFNLKLVIKPAKVTPA (SEQ ID NO: 35);

) Fusión a moléculas coestimuladoras

a. agonista de CD40

Ejemplo: GV3-CD40L

EEELQIIQPEKLLLVT V GKT ATLHCTITSLFP V GPIQW FRGV GPGRVLIYN QKDGH FPRVTT VSDG TKRNNM DFS IRIS S ITPAD VGT YY C VKFRKGSPED VEFKS GPGTE M ALG AKPS GGGGSGGGGS GDQNPQIA AH VIS E AS S KTTS VLQW AEKG Y YTM S N NL VTLEN GKQLT VKRQGL Y YIY AQ VTFC S NRE AS S Q APFIAS LCLKS PGRFERILL R A ANTHS S AKPCGQQSIHLGG VFELQPG AS V FV N VTDPS Q V S HGTGFTS F GLLKL

(SEQ ID NO: 36);

b. Agonista de 41BB (CD137)

Ejemplo: GV3-41BBL

EEELQIIQPEKLLLVT V GKT ATLHCTITSLFP V GPIQW FRGV GPGRVLIYN QKDGH FPRVTT VSDG TKRNNM DFS IRIS S ITPAD VGT Y Y C VKFRKGSPED VEFKS GPGTE M ALGAKPSGGGGSGGGGSDPAGLLDLRQGM FAQLVAQNVLLIDGPLSW YSDP GL AG V S LTGGLS YKEDTKELV V AK AG V Y Y VFF QMELRR V V AGEGS GS V S LALH LM PLRSAAGAAALALTVDLPPASSEARNSAFGFQGRLLHLSAGQRLGVHLHTEA RARHAW QLTQGATVLGLFRVTPEIPA (SEQ ID NO: 37);

) Fusión a citocinas y citocinas atenuadas

Ejemplo: GV3-IL2

EEELQIIQPEKLLLVT V GKT ATLHCTITSLFP V GPIQW FRGV GPG RVLIYN QKDGH FPRVTT VSDG TK R NNM D FS IRIS S ITPAD VGT Y Y C VK FRK G SPED VEFKS GPGTE M ALG AKPS GGGGS GGGGS APTS S STKKTQLQLEHLLLDLQM ILN G INN YK NPK L TRM LTFKFYM PKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINV IVLELKGSETTFM CEYADETATIVEFLNRW ITFCQSUSTLT (SEQ ID NO: 38);

Ejemplo: GV3-IL2 (una citocina "atenuada" con mutaciones F42A/D20T)

EEELQIIQPEKLLLVT V GKT ATLHCTITSLFP V GPIQWFRGV GPGRVLIYN QKDGH

FPRVTT VSDGTKRNNM DFS IRIS SITPAD VGT YY C VKFRKGSPED VEFKS GPGTE

M ALGAKPS GGGGS GGGGS APTS S STKKTQLQLEHLLLTLQMILN GINN YKNPKL

TRMLT AKF YMPKKATELKHLQCLEEELKPLEE VLNLAQS KNFHLRPRDLIS NIN V

IVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFCQSUSTLT (SEQ ID NO: 39).

Modificaciones del polipéptido SIRP

Las variantes del polipéptido SIRP-gamma, SIRP-beta o SIRP-beta2 abarcan derivados o análogos en los que (i) un aminoácido está sustituido con un resto de aminoácido que no es uno codificado por el código genético, (ii) el polipéptido maduro se fusiona con otro compuesto, tal como polietilenglicol o (iii) se fusionan aminoácidos adicionales con el polipéptido SIRP-gamma, SIRP-beta o SIRP-beta2, tal como una secuencia líder o secretora o una secuencia para la purificación del polipéptido.

Las modificaciones típicas incluyen, pero sin limitaciones, acetilación, acilación, ADP-ribosilación, amidación, unión covalente de flavina, unión covalente de un resto hemo, unión covalente de un nucleótido o derivado de nucleótido, unión covalente de un lípido o derivado de lípido, unión covalente de fosfatidilinositol, reticulación, ciclación, formación de enlaces disulfuro, desmetilación, formación de enlaces cruzados covalentes, formación de cistina, formación de piroglutamato, formilación, gamma-carboxilación, glucosilación, formación de anclaje a GPI, hidroxilación, yodación, metilación, miristoilación, oxidación, procesamiento proteolítico, fosforilación, prenilación, racemización, selenoilación, sulfatación, adición mediada por ARN de transferencia de aminoácidos a proteínas tal como arginilación y ubiquitinación.

Las modificaciones se realizan en cualquier lugar de un polipéptido SIRP-gamma, SIRP-beta o SIRP-beta2, incluyendo la cadena principal peptídica, las cadenas laterales de aminoácidos y los extremos amino o carboxilo. Ciertas modificaciones de péptidos comunes que son útiles para la modificación del polipéptido SIRP-gamma, SIRP-beta o SIRP-beta2 incluyen glicosilación, unión de lípidos, sulfatación, gamma-carboxilación de restos de ácido glutámico, hidroxilación, bloqueo del grupo amino o carboxilo en un polipéptido, o ambos, por una modificación covalente y ADP-ribosilación.

Por otra parte, uno o más aminoácidos de la secuencia central están alterados, de una manera conservadora de manera que se mantenga o aumente la unión a CD47 requerida. Se realizan sustituciones típicas entre los siguientes grupos de aminoácidos: (a) G, A, V, L e I; (b) G y P; (c) S, C, T, M; (d) F, Y W; (e) H, K y R; y (f) D, E, N y Q. Otras sustituciones incluyen los siguientes grupos: (i) S y T; (ii) P y G; a (iii) A, V, L y I.

También se contemplan dentro del alcance de las divulgaciones proporcionadas en el presente documento modificaciones del polipéptido SIRP-gamma, SIRP-beta o SIRP-beta2 en el que el polipéptido está unido a otro polipéptido con el que normalmente no está asociado (por ejemplo, proteína de fusión de glutatión S-transferasa (GST), fusiones de beta-galactosidasa, fusiones GAL de dos híbridos de levadura, fusiones poli-His, fusiones de Ig y similares). Por lo tanto, un polipéptido SIRP-gamma, SIRP-beta o SIRP-beta2 está opcionalmente unido operativamente, en su extremo N o su extremo C, a un polipéptido heterólogo que tiene una secuencia de aminoácidos no sustancialmente homóloga a la del polipéptido SIRP-gamma, SIRP-beta o SIRP-beta2. "Operativamente unido" indica que el polipéptido SIRP-gamma, SIRP-beta o SIRP-beta2 y el polipéptido heterólogo están ambos en marco. Tal proteína de fusión puede alterar (por ejemplo, mejora, amortigua) la capacidad del polipéptido SIRP-gamma, SIRP-beta o SIRP-beta2, o una variante funcional del mismo, para unirse a CD47. Dicha proteína de fusión también puede alterar (mejorar, amortiguar) la semivida farmacocinética del polipéptido SIRP-gamma, SIRP-beta o SIRP-beta2 en un paciente humano o animal de experimentación. La proteína de fusión también puede alterar la actividad que el polipéptido SIRP-gamma, SIRP-beta o SIRP-beta2 imparte a las células mieloides, incluyendo fagocitosis y CCDA.

Afinidad

Dado que el polipéptido señuelo SIRP-gamma, SIRP-beta o SIRP-beta2 tiene una mayor afinidad por CD47 en comparación con la afinidad por CD47 de un polipéptido SIRP-gamma, SIRP-beta o SIRP-beta2 de tipo salvaje y/o en comparación con la afinidad por CD47 de un polipéptido SIRP-gamma, SIRP-beta o SIRP-beta2 que no tiene un cambio de aminoácido con respecto a una secuencia correspondiente de un polipéptido SIRP-gamma, SIRP-beta o SIRP-beta2 de tipo salvaje (por ejemplo, un polipéptido SIRP-gamma, SIRP-beta o SIRP-beta2 de tipo salvaje, tal como se ha definido anteriormente).

En algunas divulgaciones, el polipéptido señuelo SIRP-gamma, SIRP-beta o SIRP-beta2 tiene una Kd de 1 x 10-7 M o menos (por ejemplo, 10-8 M o menos, 10-9 M o menos, 10-10 M o menos, 10-11 M o menos, 10-12 M o menos, 10-13 M o menos, 10-14 M o menos, 10-15 M o menos o 10-16 M o menos) de afinidad por CD47. En algunos casos, el polipéptido señuelo SIRP-gamma, SIRP-beta o SIRP-beta2 tiene una afinidad por CD47 en un intervalo de 1 fM a 1 pM (por ejemplo, de 1 fM a 800 nM, de 10 fM a 500 nM, de 100 fM a 100 nM, de 500 fM a 50 nM, de 800 fM a 50 nM, de 1 pM a 50 nM, de 10 pM a 50 nM, de 50 pM a 50 nM, de 100 pM a 50 nM, de 500 fM a 100 nM, de 800 fM a 100 nM, de 1 pM a 100 nM, de 10 pM a 100 nM, de 50 pM a 100 nM, o de 100 pM a 100 nM). En algunos casos, el polipéptido señuelo SIRP-gamma, SIRP-beta o SIRP-beta2 se une a CD47 con una afinidad de 1 pM o más (por ejemplo, 800 nM o más, 500 nm o más, 200 nm o más, 100 nm o más, 50 nm o más, 10 nm o más, 1 nm o más, 900 pM o más, 750 pM o más, 500 pM o más, 200 pM o más, 100 pM o más, 10 pM o más, 1 pM o más, etc., donde la afinidad aumenta con valores decrecientes).

En algunas divulgaciones, el polipéptido señuelo SIRP-gamma, SIRP-beta o SIRP-beta2 tiene una afinidad por CD47 que es 2 veces o más (por ejemplo, 5 veces o más, 10 veces o más, 100 veces o más, 500 veces o más, 1000 veces o más, 5000 veces o más, 104 veces o más, 105 veces o más, 106 veces o más, 107 veces o más, 108 veces o más, etc.) mayor que la afinidad por CD47 de un polipéptido SIRP-gamma, SIRP-beta o SIRP-beta2 de tipo salvaje; y/o 2 veces o más (por ejemplo, 5 veces o más, 10 veces o más, 100 veces o más, 500 veces o más, 1000 veces o más, 5000 veces o más, 104 veces o más, 105 veces o más, 106 veces o más, 107 veces o más, 108 veces o más, etc.) mayor que la afinidad por CD47 de un polipéptido SIRP-gamma, SIRP-beta o SIRP-beta2 que no tiene un cambio de aminoácido con respecto a una secuencia correspondiente de un polipéptido SIRP-gamma, SIRP-beta o SIRP-beta2 de tipo salvaje (por ejemplo, un polipéptido SIRP-gamma, SIRP-beta o SIRP-beta2 de tipo salvaje, tal como se ha definido anteriormente).

En algunas divulgaciones, el polipéptido señuelo SIRP-gamma, SIRP-beta o SIRP-beta2 tiene una semivida de disociación por CD47 que es 2 veces o más (por ejemplo, 5 veces o más, 10 veces o más, 100 veces o más, 500 veces o más, 1000 veces o más, 5000 veces o más, 104 veces o más, 105 veces o más, 106 veces o más, 107 veces o más, 108 veces o más, etc.) mayor que la semivida de disociación para CD47 de una proteína SIRP-gamma, SIRP-beta o SIRP-beta2; y/o 2 veces o más (por ejemplo, 5 veces o más, 10 veces o más, 100 veces o más, 500 veces o más, 1000 veces o más, 5000 veces o más, 104 veces o más, 105 veces o más, 106 veces o más, 107 veces o más, 108 veces o más, etc.) mayor que la semivida de disociación para CD47 de un polipéptido señuelo SIRP-gamma, SIRP-beta o SIRP-beta2 que no tiene un cambio de aminoácidos con respecto a una secuencia correspondiente de un polipéptido SIRP-gamma, SIRP-beta o SIRP-beta2 de tipo salvaje (por ejemplo, un polipéptido señuelo SIRP-gamma, SIRP-beta o SIRP-beta2 de tipo salvaje, tal como se ha definido anteriormente). Por ejemplo, en algunos casos, un polipéptido SIRP-gamma, SIRP-beta o SIRP-beta2 de tipo salvaje (como se ha definido anteriormente) tiene una semivida de disociación para CD47 de menos de 1 segundo, mientras que un polipéptido señuelo SIRP-gamma, SIRP-beta o SIRP-beta2 sujeto puede tener una semivida de disociación de 5 segundos o más (por ejemplo, 30 segundos o más, 1 minuto o más, 5 minutos o más, 10 minutos o más, 20 minutos o más, 30 minutos o más, 40 minutos o más, etc.). Por ejemplo, la sustitución de aminoácidos de un polipéptido señuelo SIRP-gamma, SIRP-beta o SIRP-beta2 sujeto puede aumentar la afinidad al disminuir la constante de disociación en al menos 10 veces, al menos 20 veces, al menos 50 veces, al menos 100 veces, al menos 500 veces o más.

La afinidad de unión a CD47 puede determinarse, por ejemplo, mediante la capacidad del polipéptido señuelo SIRP-gamma, SIRP-beta o SIRP-beta2 para unirse a CD47 recubierto en una placa de ensayo; presentado en la superficie de una célula microbiana; en solución; etc. La actividad de unión de los polipéptidos señuelo SIRP-gamma, SIRP-beta o SIRP-beta2 de la presente divulgación a CD47 se pueden analizar inmovilizando el ligando (por ejemplo, CD47) o el polipéptido señuelo SIRP-gamma, SIRP-beta o SIRP-beta2, en una perla, sustrato, célula, etc. Los agentes se pueden añadir en un tampón apropiado y las parejas de unión se pueden incubar durante un período de tiempo a una temperatura determinada. Después de los lavados para eliminar el material no unido, la proteína unida se puede liberar con, por ejemplo, SDS, tampones con un pH alto y similares, y analizarse, por ejemplo, mediante resonancia de plasmón superficial (SPR).

La unión también se puede determinar mediante, por ejemplo, medición de la capacidad de un polipéptido señuelo SIRP-gamma, SIRP-beta o SIRP-beta2 para competir con un polipéptido SIRP-gamma, SIRP-beta o SIRP-beta2 marcado (por ejemplo, un polipéptido SIRP-gamma, SIRP-beta o SIRP-beta2 de tipo salvaje marcado, como se ha definido anteriormente) para unirse a CD47. En consecuencia, la unión relativa se puede evaluar comparando los resultados utilizando un polipéptido señuelo SIRP-gamma, SIRP-beta o SIRP-beta2 sin marcar candidato con los resultados usando un polipéptido SIRP-gamma, SIRP-beta o SIRP-beta2 SIRP-beta o SIRP-beta2 de tipo salvaje sin marcar (como se ha definido anteriormente, un polipéptido señuelo SIRP-gamma, SIRP-beta o SIRP-beta2 que no tiene un cambo de aminoácidos respecto a la secuencia correspondiente de un SIRP-gamma, SIRP-beta o SIRP-beta2 de tipo salvaje).

Se puede usar cualquier método conveniente para generar un polipéptido señuelo SIRP-gamma, SIRP-beta o SIRP-beta2 sujeto. Como un ejemplo no limitante, se puede realizar mutagénesis (comenzando con un polipéptido SIRP-gamma, SIRP-beta o SIRP-beta2 de tipo salvaje o comenzando con un polipéptido señuelo SIRP-gamma, SIRP-beta o SIRP-beta2 con el fin de generar un polipéptido con una afinidad aún mayor) para generar colecciones de polipéptidos señuelo SIRP-gamma, SIRP-beta o SIRP-beta2 mutados. La mutagénesis se puede dirigir para producir cambios en aminoácidos particulares o la mutagénesis puede ser aleatoria. Los polipéptidos señuelo SIRP-gamma, SIRP-beta o SIRP-beta2 pueden someterse a detección selectiva según su capacidad para unirse a una proteína CD47. Por ejemplo, una proteína CD47 (o una variante de una proteína CD47, por ejemplo, una versión que carece de un dominio transmembrana) se puede marcar (por ejemplo, con un marcador directo, tal como un radioisótopo, un resto fluorescente, etc.; o con un marcador indirecto, tal como un antígeno, un marcador de afinidad, biotina, etc.) y después se puede usar para contactar los polipéptidos señuelo SIRP-gamma, SIRP-beta o SIRP-beta2 candidatos (por ejemplo, cuando los polipéptidos señuelo SIRP-gamma, SIRP-beta o SIRP-beta2 candidatos se pueden unir a una superficie sólida o presentarse sobre la membrana de una célula, por ejemplo, una célula de levadura). Variando la concentración de CD47 usado, se pueden identificar los polipéptidos señuelo SIRP-gamma, SIRP-beta o SIRP-beta2 de entre los candidatos (es decir, de entre el conjunto de polipéptidos señuelo SIRP-gamma, SIRP-beta o SIRP-beta2).

Métodos de tratamiento

La invención proporciona el polipéptido según se define en las reivindicaciones para su uso en un método de tratamiento del cáncer, anemia, infección vírica, infección bacteriana, enfermedad autoinmunitaria, asma, alergia, rechazo de trasplante, aterosclerosis o fibrosis. Se proporciona en el presente documento, en algunas divulgaciones, métodos y usos para estimular el sistema inmunológico de un individuo que lo necesita, que comprenden la administración de un polipéptido señuelo descrito en el presente documento (por ejemplo, una variante del polipéptido SIRP-gamma, SIRP-beta o SIRP-beta2). En algunos casos, la administración del polipéptido señuelo descrito en el presente documento induce y/o mantiene la fagocitosis de una célula que expresa CD47. En otros ejemplos, la administración de un polipéptido señuelo descrito en el presente documento induce y/o mantiene la fagocitosis de una célula que no expresa c D47. En algunos casos, la célula es una célula cancerosa, una célula infectada por virus, una célula infectada por bacterias, un linfocito T o B autorreactivo, glóbulos rojos dañados, placas arteriales o tejido fibrótico. En casos adicionales, la célula es una célula normal sana, tal como una célula madre hematopoyética, una célula precursora mieloide o linfoide sana o un tipo de célula hematopoyética diferenciada sana tal como linfocito T, B, células plasmáticas o células NK.

También se proporcionan en el presente documento métodos y usos para el tratamiento del cáncer en un individuo que lo necesite, que comprenden la administración de un polipéptido señuelo como se describe en el presente documento. En algunas de estas divulgaciones, el individuo padece cáncer. En otras divulgaciones, se sospecha que el individuo padece cáncer. En aún otras divulgaciones, el individuo está predispuesto al cáncer (por ejemplo, un individuo predispuesto al cáncer de mama). En determinadas divulgaciones, el cáncer se selecciona entre el grupo que consiste en cáncer de mama, cáncer de pulmón, adenocarcinoma de pulmón, cáncer de pulmón de células escamosas, cáncer de pulmón microcítico, cáncer de pulmón no microcítico, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de cerebro, cáncer abdominal, cáncer de colon, cáncer colorrectal, cáncer esofágico, cáncer parafaríngeo, cáncer gastrointestinal, glioma, cáncer de hígado, cáncer oral, cáncer de lengua, neuroblastoma, osteosarcoma, cáncer de ovario, cáncer renal, cáncer de vejiga urinaria, cáncer del tracto urinario, cáncer de páncreas, retinoblastoma, cáncer de cuello uterino, cáncer de útero, tumor de Wilm, mieloma múltiple, cáncer de piel, linfoma, leucemia, cáncer de sangre, cáncer de tiroides, cáncer de hueso, tumor adenoquístico, condrosarcoma, tumor de las células de los islotes pancreáticos, tumor neuroendocrino, cáncer de próstata, cáncer de ovario, glioblastoma, carcinoma de endometrio, cáncer de endometrio, leiomiosarcoma, cáncer de vesícula biliar, cáncer hepatocelular, cáncer hematológico, mieloma múltiple, leucemia mielógena aguda, leucemia linfoblástica aguda/crónica, leucemia de células pilosas, linfoma folicular, mieloma múltiple, plasmacitoma, linfoma difuso de linfocitos B grandes. En algunas divulgaciones, el cáncer es un cáncer hematológico. En aspectos particulares, el cáncer es mieloma múltiple, leucemias mielógenas agudas/crónicas, leucemia linfoblástica aguda/crónica, leucemia de células pilosas, linfoma folicular, mieloma múltiple, linfoma difuso de linfocitos B grandes o plasmacitoma.

En algunas divulgaciones, el cáncer está asociado a la expresión de CD47, que incluye, entre otros, leucemia mieloide aguda (LMA), Leucemia leucocítica aguda (LLA), linfoma de Hodgkin (LH), linfoma de linfocitos B no Hodgkin (LLBNH), leucemia leucocítica crónica (LLC-B), mieloma múltiple (MM), adenocarcinoma pancreático, tumor neuroendocrino pancreático (TNEPan), glioma, meduloblastoma, astrocitoma, cáncer de próstata, osteosarcoma, cáncer de pulmón microcítico (CPM), cáncer de pulmón no microcítico (CPNM), melanoma, carcinoma de células escamosas de cabeza y cuello, carcinoma de próstata, cáncer de ovario, cáncer de mama, cáncer de colon, cáncer renal y cáncer de vejiga. En algunas divulgaciones, el cáncer está asociado a tumores sólidos. En determinados casos, los tumores sólidos están avanzados, por ejemplo, en estadio 3 o 4. En determinados casos, los tumores sólidos están asociados histológicamente a la expresión del CD47.

Como se usa en el presente documento, en algunas divulgaciones, "tratamiento" o "tratar" o "tratado" se refiere a un tratamiento terapéutico en el que el objetivo es ralentizar (disminuir) una condición fisiológica no deseada, trastorno o enfermedad, o para obtener resultados clínicos beneficiosos o deseados. Para los objetivos descritos en el presente documento, los resultados clínicos beneficiosos o deseados incluyen, pero sin limitaciones, el alivio de los síntomas; la disminución de la extensión de la afección, trastorno o enfermedad; la estabilización (es decir, no empeoramiento) del estado de la afección, trastorno o enfermedad; retraso en la aparición o ralentización de la progresión de la afección, trastorno o enfermedad; mejora de la afección, trastorno o estado de enfermedad; y remisión (ya sea parcial o total), ya sea detectable o indetectable, o mejoría o mejora de la afección, trastorno o enfermedad. El tratamiento incluye provocar una respuesta clínicamente significativa sin niveles excesivos de efectos secundarios. Tratamiento también incluye prolongar la supervivencia en comparación con la supervivencia esperada si no se recibe tratamiento. En otras divulgaciones, "tratamiento" o "tratar" o "tratado" se refiere a medidas profilácticas, en las que el objetivo es retrasar la aparición o reducir la gravedad de una condición fisiológica no deseada, trastorno o enfermedad, tales como, por ejemplo, es una persona que está predispuesta a una enfermedad (por ejemplo, un individuo que porta un marcador genético de una enfermedad como el cáncer de mama).

Los métodos de tratamiento descritos en el presente documento tratan varios estadios del cáncer, incluidos los estadios que están localmente avanzados, metastásicos y/o recurrentes. En la estadificación del cáncer, localmente avanzado se define generalmente como un cáncer que se ha diseminado desde un área localizada a tejidos y/o ganglios linfáticos cercanos. En el sistema de estadificación de números romanos, localmente avanzado generalmente se clasifica en estadio II o III. El cáncer metastásico es un estadio en el que el cáncer se disemina por todo el cuerpo a tejidos y órganos distantes (estadio IV). El cáncer designado como recurrente generalmente se define como que el cáncer ha recurrido, normalmente después de un periodo de tiempo, después de estar en remisión o después de que un tumor haya sido eliminado visiblemente. La recurrencia puede ser local, es decir, aparece en el mismo lugar que el original, o distante, es decir, aparece en una parte diferente del cuerpo. En determinados casos, un cáncer que se puede tratar mediante terapias de combinación descritas en el presente documento es irresecable o no se puede extirpar mediante cirugía.

En algunas de estas divulgaciones, los métodos de tratamiento descritos en el presente documento proporcionan una terapia complementaria a cualquier otra terapia contra el cáncer prescrita para un individuo. En consecuencia, en algunas divulgaciones, los polipéptidos señuelo descritos en el presente documento se administran en combinación con el tratamiento con cualquier otro agente anticanceroso que incluye, entre otros, metotrexato (RHEUMATREX®, ametopterina) ciclofosfamida (CYTOXAN®), talidomida (THALIDOMID®), carboxamida de acridina, actimid®, actinomicina, 17-N-alilamino-17-demetoxigeldanamicina, aminopterina, amsacrina, antraciclina, antineoplásicos, antineoplastón, 5-azacitidina, azatioprina, BL22, bendamustina, biricodar, bleomicina, bortezomib, briostatina, busulfán, caliculina, camptotecina, capecitabina, carboplatino, cetuximab, clorambucilo, cisplatino, cladribina, clofarabina, citarabina, dacarbazina, dasatinib, daunorrubicina, decitabina, ácido dicloroacético, discodermolida, docetaxel, doxorrubicina, epirrubicina, epotilona, eribulina, estramustina, etopósido, exatecan, exisulind, ferruginol, floxuridina, fludarabina, fluorouracilo, fosfestrol, fotemustina, ganciclovir, gemcitabina, hidroxiurea, IT-101, idarrubicina, ifosfamida, imiquimod, irinotecán, irofulveno, ixabepilona, laniquidar, lapatinib, lenalidomida, lomustina, lurtotecán, mafosfamida, masoprocol, mecloretamina, melfalán, mercaptopurina, mitomicina, mitotano, mitoxantrona, nelarabina, nilotinib, oblimersen, oxaliplatino, PAC-1, paclitaxel, pemetrexed, pentostatina, pipobromano, pixantrona, plicamicina, procarbazina, inhibidores del proteasoma (por ejemplo, bortezomib), raltitrexed, rebeccamicina, revlimid®, rubitecán, SN-38, salinosporamida A, satraplatino, estreptozotocina, swainsonina, tariquidar, taxano, tegafururacilo, temozolomida, testolactona, tiotepa, tioguanina, topotecán, trabectedina, tretinoína, triplatino tetranitrato, tris(2-cloroetil)amina, troxacitabina, mostaza de uracilo, valrubicina, vinblastina, vincristina, vinorelbina, vorinostat, zosuquidar o similares.

En divulgaciones adicionales, los métodos de tratamiento descritos en el presente documento, es decir, las formulaciones de polipéptidos señuelo descritas en el presente documento se administran en combinación con anticuerpos monoclonales tales como 3F8, 8H9, abagovomab, abciximab, abituzumab, abrilumab, actoxumab, adalimumab, adecatumumab, aducanumab, afelimomab, afutuzumab, alacizumab pegol, ALD518, alemtuzumab, alirocumab, pentetato de altumomab, amatuximab, anatumomab mafenatox, anetumab ravtansine, anifrolumab, anrukinzumab (IMA-638), apolizumab, arcitumomab, ascrinvacumab, aselizumab, atezolizumab, atinumab, atlizumab (tocilizumab), atorolimumab, bapineuzumab, basiliximab, bavituximab, bectumomab, begelomab, belimumab, benralizumab, bertilimumab, besilesomab, bevacizumab, bezlotoxumab, biciromab, bimagrumab, bimekizumab, bivatuzumab mertansina, blinatumomab, blosozumab, bococizumab, brentuximab vedotina, briakinumab, brodalumab, brolucizumab, brontictuzumab, canakinumab, cantuzumab mertansina, cantuzumab ravansina, caplacizumab, capromab pendetida, carlumab, catumaxomab, inmunoconjugado de cBR96-doxorrubicina, CC49, cedelizumab, certolizumab pegol, cetuximab, Ch.14.18, citatuzumab bogatox, cixutumumab, clazakizumab, clenoliximab, clivatuzumab tetraxetán, codrituzumab, coltuximab ravtansina, conatumumab, concizumab, crenezumab, CR6261, dacetuzumab, daclizumab, dalotuzumab, dapirolizumab pegol, daratumumab, dectrekumab, demcizumab, denintuzumab mafodotina, denosumab, derlotuximab biotina, detumomab, dinutuximab, diridavumab, dorlimomab aritox, drozitumab, duligotumab, dupilumab, durvalumab, dusigitumab, ecromeximab, eculizumab, edobacomab, edrecolomab, efalizumab, efungumab, eldelumab, elgemtumab, elotuzumab, elsilimomab, emactuzumab, emibetuzumab, enavatuzumab, enfortunmab vedotina, enlimomab pegol, enoblituzumab, enokizumab, enoticumab, ensituximab, epitumomab cituxetán, epratuzumab, erlizumab, ertumaxomab, etaracizumab, etrolizumab, evinacumab, evolocumab, exbivirumab, fanolesomab, faralimomab, Farletuzumab, fasinumab, FBTA05, felvizumab, fezakinumab, ficlatuzumab, figitumumab, firivumab, flanvotumab, fletikumab, fontolizumab, foralumab, foravirumab, fresolimumab, fulranumab, futuximab, galiximab, ganitumab, gantenerumab, gavilimomab, gemtuzumab ozogamicina, gevokizumab, girentuximab, glembatumumab vedotina, golimumab, gomiliximab, guselkumab, ibalizumab, ibritumomab tiuxetano, icrucumab, idarucizumab, igovomab, IMAB362, imalumab, imciromab, imgatuzumab, inclacumab, indatuzimab ravtansina, indusatumab vedotina, infliximab, intetumumab, inolimomab, inotuzumab ozogamicina, ipilimumab, iratumumab, isatuximab, itolizumab, ixekizumab, keliximab, labetuzumab, lambrolizumab, lampalizumab, lebrikizumab, lemalesomab, lenzilumab, lerdelimumab, lexatumumab, libivirumab, lifastuzumab vedotina, ligelizumab, lilotomab satetraxetan, lintuzumab, lirilumab, lodelcizumab, lokivetmab, lorvotuzumab mertansina, lucatumumab, lulizumab pegol, lumiliximab, lumretuzumab, mapatumumab, margetuximab, maslimomab, mavrilimumab, matuzumab, mepolizumab, metelimumab, milatuzumab, minretumomab, mitumomab, mogamulizumab, morolimumab, motavizumab, moxetumomab pasudotox, muromonab-CD3, nacolomab tafenatox, namilumab, naptumomab estafenatox, namatumab, natalizumab, nebacumab, necitumumab, nemolizumab, nerelimomab, nesvacumab, nimotuzumab, nivolumab, nofetumomab merpentano, obiltoxaximab, ocaratuzumab, ocrelizumab, odulimomab, ofatumumab, olaratumab, olokizumab, omalizumab, onartuzumab, ontuxizumab, opicinumab, oportuzumab monatox, oregovomab, orticumab, otelixizumab, otlertuzumab, oxelumab, ozanezumab, ozoralizumab, pagibaximab, palivizumab, panitumumab, pankomab, panobacumab, parsatuzumab, pascolizumab, pasotuxizumab, pateclizumab, patritumab, pembrolizumab, pemtumomab, perakizumab, pertuzumab, pexelizumab, pidilizumab, pinatuzumab vedotina, pintumomab, placulumab, polatuzumab vedotina, ponezumab, priliximab, pritoxaximab, pritumumab, PRO 140, quilizumab, racotumomab, radretumab, rafivirumab, ralpancizumab, ramucirumab, ranibizumab, raxibacumab, refanezumab, regavirumab, reslizumab, rilotumumab, rinucumab, rituximab, robatumumab, roledumab, romosozumab, rontalizumab, rovelizumab, ruplizumab, samalizumab, sarilumab, satumomab pendetida, secukinumab, seribantumab, setoxaximab, sevirumab, sibrotuzumab, SGN-CD19A, SGN-CD33A, sifalimumab, siltuximab, simtuzumab, siplizumab, sirukumab, sofituzumab vedotina, solanezumab, solitomab, sonepcizumab, sontuzumab, stamulumab, sulesomab, suvizumab, tabalumab, tacatuzumab tetraxetano, tadocizumab, talizumab, tanezumab, taplitumomab paptox, tarextumab, tefibazumab, telimomab aritox, tenatumomab, teneliximab, teplizumab, teprotumumab, tesidolumab, TGN1412, ticilimumab (tremelimumab), tildrakizumab, tigatuzumab, TNX-650, tocilizumab (atlizumab), toralizumab, tosatoxumab, tositumomab, tovetumab, tralokinumab, trastuzumab, TRBS07, tregalizumab, tremelimumab, tucotuzumab celmoleucina, tuvirumab, ublituximab, ulocuplumab, urelumab, urtoxazumab, ustekinumab, vandortuzumab vedotina, vantictumab, vanucizumab, vapaliximab, varlilumab, vatelizumab, vedolizumab, veltuzumab, vepalimomab, vesencumab, visilizumab, volociximab, vorsetuzumab mafodotina, votumumab, zalutumumab, zanolimumab, zatuximab, ziralimumab o zolimomab aritox.

En divulgaciones adicionales, los métodos de tratamiento descritos en el presente documento, es decir, las formulaciones de polipéptidos señuelo descritas en el presente documento se administran en combinación con un anticuerpo monoclonal dirigido a uno o más de VWF, vimentina, VEGFR2, VEGFR-1, VEGF-A, TYRP1 (glicoproteína 75), receptor de TWEAK, glicosilación específica de tumor de MUC1, antígeno tumoral CTAA16.88, TRAIL-R2, TRAIL-R1, TNF-a, TGF-p, TGF beta 2, TGF beta 1, TFPI, tenascina C, TEMI, TAG-72, receptores de linfocitos T, STEAP1, esfingosina-1-fosfato, SOST, SLAMF7, selectina P, SDC1, esclerostina, RTN4, r On , factor Rhesus, RHD, virus respiratorio sincitial, RANKL, glucoproteína G del virus de la rabia, receptor beta del factor de crecimiento derivado de plaquetas, fosfatidilserina, cotransportador de fosfato-sodio, PDGF-R a, PDCD1, PD-1, PCSK9, oxLDL, OX-40, NRP1, receptor 4 Nocht, receptor 3 Nocht, receptor 2 Nocht, receptor 1 Nocht, NOGO-A, NGF, proteinasa 1 regulada por apoptosis neural, NCA-90 (antígeno de granulocitos), NARp-1, ácido N-glicolilneuramínico, miostatina, glicoproteína asociada a la mielina, mucina CanAg, MUC1, MSLN, MS4A1, MIF, mesotelina, MCP-1, LTA, LOXL2, ácido lipoteicoico, LINGO-1, LFA-1 (CD11a), antígeno Y de Lewis, L-selectina (CD62L), KIR2D, ITGB2 (CD18), ITGA2, receptor de interferón a/p, receptor de interferón, proteína inducida por interferón gamma, integrina avp3, integrina aIIbp3, integrina a7p7, integrina a5p1, integrina a4p7, integrina a4, receptor I de factor de crecimiento de tipo insulina, hemaglutinina de gripe A, ILGF2, IL9, IL6, IL4, IL31RA, IL23, IL17A, receptor de IL-6, IL-6, IL-5, IL-4, IL-23, IL-22, IL-1 p, IL-17A, IL-17, IL-13, IL-12, IL-1, IL 20, IGHE, IgG4, IGF-I, receptor de IGF-1, región Fc de IgE, IFN-y, IFN-a, ICAM-1 (CD54), TNF humano, quinasa del receptor del factor de dispersión humano, Hsp90, HNGF, HLA-DR, VIH-1, complejo de histonas, HHGFR, HGF, HER3, HER2/neu, HER1, antígeno de superficie de la hepatitis B, hemaglutinina, GUCY2C, GPNMB, cadena a del receptor de GMCSF, glipicano 3, gangliósido GD3, GD2, gangliósido GD2, receptor de Frizzled, receptor 1 de folato, folato hidrolasa, dominio B extra de fibronectina, fibrina II, cadena beta, FAP, proteína F del virus respiratorio sincitial, ERBB3, episialina, EpCAM, endotoxina, EGFR, EGFL7, toxina shiga de E. coli de tipo 2, toxina shiga de E. coli de tipo 1, DR5, DPP4, DlL4, dabigatrán, glicoproteína B del citomegalovirus, CTLA-4, CSF2, CSF1R, factor de agregación A, CLDN18.2, ch4D5, CFD, antígeno relacionado con CEA, CEA, CD80, CD79B, CD74, CD70, CD6, CD56, CD52, CD51, CD5, CD44 v6, CD41, ligando de CD40, CD40, CD4, CD38, CD37, CD33, CD30 (TNFRSF8), CD3 épsilon, CD3, CD28, CD274, CD27, CD25 (cadena a del receptor de IL-2), CD23 (receptor de IgE), CD221, CD22, CD200, CD20, CD2, CD19, CD154, CD152, CD15, CD147 (basigina), CD140a, CD125, CD11, CD-18, CCR5, CCR4, CCL11 (eotaxina-1), miosina cardíaca, anhidrasa carbónica 9 (CA-IX), Canis lupus familiaris IL31, CA-125, C5, antígeno C242, receptor de tipo 4 de quimiocina C-X-C, beta-amiloide, BAFF, B7-H3, célula de linfoma B, AOC3 (VAP-1), toxina del ántrax, antígeno protector, angiopoyetina 3, angiopoyetina 2, alfa-fetoproteína, AGS-22M6, antígeno de adenocarcinoma, ACVR2B, quinasa similar al receptor de activina 1, 5T4, 5AC, 4-1Bb o 1-40-p-amiloide.

En divulgaciones adicionales, los métodos de tratamiento descritos en el presente documento, es decir, las formulaciones de polipéptidos señuelo descritas en el presente documento se administran en combinación con radioterapia (por ejemplo, rayos y, rayos X y/o la administración dirigida de radioisótopos a las células tumorales, microondas, radiación UV y similares. En divulgaciones adicionales, los métodos de tratamiento descritos en el presente documento, es decir, los polipéptidos señuelo descritos en el presente documento se administran en combinación con terapia génica. Los genes terapéuticos incluyen una versión antisentido de un inductor de la proliferación celular (oncogén), un inhibidor de la proliferación celular (supresor tumoral) o un inductor de muerte celular programada (gen proapoptótico). En algunas divulgaciones, las terapias de combinación descritas en el presente documento se administran con una cirugía (por ejemplo, resección).

En divulgaciones adicionales, los métodos de tratamiento descritos en el presente documento, es decir, los polipéptidos señuelo descritos en el presente documento se administran en combinación con agentes antidiarreicos, agentes antieméticos, analgésicos, opioides y/o agentes antiinflamatorios no esteroideos.

En divulgaciones adicionales, el polipéptido señuelo descrito en el presente documento (por ejemplo, una composición que comprende un polipéptido SIRP-gamma, SIRP-beta o SIRP-beta2) se administra a un individuo que ha sido tratado previamente con ciclofosfamida, imitanib o daclizumab y/o cualquier otro agente anticanceroso. En otras divulgaciones, un polipéptido señuelo descrito en el presente documento se administra a un individuo que no ha sido tratado previamente con ciclofosfamida y/o cualquier otro agente anticanceroso.

En algunas de las divulgaciones anteriores, el tratamiento con un polipéptido señuelo descrito en el presente documento (por ejemplo, una composición que comprende un polipéptido SIRP-gamma, SIRP-beta o SIRP-beta2) prolonga la vida útil y/o aumenta las tasas de supervivencia de individuos que padecen cáncer. En algunas de las divulgaciones anteriores, el tratamiento con un polipéptido señuelo descrito en el presente documento (por ejemplo, una composición que comprende un polipéptido SIRP-gamma, SIRP-beta o SIRP-beta2) mejora la calidad de vida de un individuo que padece cáncer (por ejemplo, un individuo necesita una dosis más baja de un fármaco anticanceroso que causa efectos secundarios cuando el individuo es tratado con un polipéptido señuelo descrito en el presente documento).

En algunas de las divulgaciones anteriores, el tratamiento con un polipéptido señuelo descrito en el presente documento (por ejemplo, una composición que comprende un polipéptido SIRP-gamma, SIRP-beta o SIRP-beta2) induce y/o mantiene la fagocitosis o la CCDa en un individuo. La fagocitosis incluye la fagocitosis por fagocitos profesionales (por ejemplo, monocitos, macrófagos, neutrófilos, células dendríticas o mastocitos), fagocitos no profesionales (por ejemplo, células epiteliales, células endoteliales, fibroblastos o células mesenquimales) o ambos. La CCDA incluye citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos por células mieloides, incluidos neutrófilos, monocitos y células asesinas naturales. La medición de la fagocitosis y la CCDA se realiza mediante cualquier método conocido, que incluye, por ejemplo, microscopia de fluorescencia o citometría de flujo.

En divulgaciones adicionales, el tratamiento con un polipéptido señuelo descrito en el presente documento (por ejemplo, una composición que comprende un polipéptido SIRP-gamma, SIRP-beta o SIRP-beta2) induce y/o potencia la fagocitosis mediada por células dependiente de anticuerpos (FCDA) o CCDA de células plasmáticas y linfocitos B productores de IgE mediante la combinación de los agentes SIRP-beta o SIRP-gamma con anticuerpos contra Mlprime o CD38 en un individuo con asma o alergia.

También se proporcionan en el presente documento métodos para tratar una infección, trastorno o afección víricos en un individuo, que comprende administrar a un individuo que tiene una infección, trastorno o afección vírica un polipéptido señuelo descrito en el presente documento. En aspectos particulares, la infección, trastorno o afección vírica es crónica. En aspectos adicionales, la infección, trastorno o afección vírica es aguda. En aspectos adicionales, la infección, trastorno o afección vírica es un Adenoviridae tal como, adenovirus; un Herpesviridae tal como Herpes simplex, tipo 1, herpes simple, tipo 2, virus varicela zóster, virus de Epstein-Barr, citomegalovirus humano, herpesvirus humano, tipo 8; Papillomaviridae, tal como el virus del papiloma humano; un Polyomaviridae, tal como virus BK o virus JC; un Poxviridae, tal como el virus de la viruela; un Hepadnaviridae, tal como el virus de la hepatitis B; un Parvoviridae, tal como bocavirus o parvovirus humano; un Astroviridae, tal como astrovirus humano; un Caliciviridae, tal como virus Norwalk; un Picornaviridae, tal como coxsackievirus, virus de la hepatitis A, poliovirus, rinovirus; un Coronaviridae, tal como virus del síndrome respiratorio agudo severo; un Flaviviridae, tal como el virus de la hepatitis C, virus de la fiebre amarilla, virus del dengue, virus del Nilo Occidental; un Togaviridae, tal como el virus de la rubéola; un Hepeviridae, tal como el virus de la hepatitis E; un Retroviridae, tal como el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH); un Orthomyxoviridae, tal como virus de la gripe; un Arenaviridae, tal como el virus Guanarito, virus junin, virus Lassa, virus machupo, virus Sabia; un Bunyaviridae, tal como el virus de la fiebre hemorrágica de Crimea-Congo; un Filoviridae, tal como el virus de ébola, virus de Marburg; un Paramyxoviridae, tal como el virus del sarampión, el virus de las paperas, el virus de la parainfluenza, el virus respiratorio sincitial, el metapneumovirus humano, el virus Hendra, el virus Nipah; un Rhabdoviridae, tal como el virus de la rabia; el virus de la hepatitis D; o un Reoviridae, tal como rotavirus, orbivirus, coltivirus, virus Banna. En aspectos particulares, la infección, trastorno o afección vírica es un virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), citomegalovirus humano, virus de Epstein-Barr, virus de la hepatitis C o virus de la hepatitis B.

También se proporcionan en el presente documento métodos para tratar una infección, trastorno o afección bacteriana en un individuo, que comprenden administrar a un individuo que tiene una infección, trastorno o afección bacteriana un polipéptido señuelo descrito en el presente documento. En aspectos particulares, la infección, trastorno o afección bacteriana es crónica. En otros aspectos, la infección, trastorno o afección bacteriana es aguda. En aspectos adicionales, la infección bacteriana es un Bacillus, tal como Bacillus anthracis o Bacillus cereus; una Bartonella, tal como Bartonella henselae o Bartonella quintana; una Bordetella, tal como Bordetella pertussis; una Borrelia, tal como Borrelia burgdorferi, Borrelia garinii, Borrelia afzelii, Borrelia recurrentis; una Brucella, tal como Brucella abortus, Brucella canis, Brucella melitensis o Brucella suis; una Campylobacter, tal como Campylobacter jejuni; una Chlamydia o Chlamydophila, tal como Chlamydia pneumoniae, Chlamydia trachomatis, Chlamydophila psittaci; un Clostridium, tal como Clostridium botulinum, Clostridium difficile, Clostridium perfringens, Clostridium tetani; una Corynebacterium, tal como Corynebacterium diphtheriae; un Enterococcus, tal como Enterococcus faecalis o Enterococcus faecium; Escherichia, tal como Escherichia coli; una Francisella, tal como Francisella tularensis; un Haemophilus, tal como Haemophilus influenzae; una Helicobacter, tal como Helicobacter pylori; una Legionella,tal como Legionella pneumophila; una Leptospira, tal como Leptospira interrogans, Leptospira santarosai, Leptospira weilii o Leptospira noguchii; una Listeria, tal como Listeria monocytogenes; una Mycobacterium, tal como Mycobacterium leprae, Mycobacterium tuberculosis o Mycobacterium ulcerans; un Mycoplasma, tal como Mycoplasma pneumoniae; una Neisseria, tal como Neisseria gonorrhoeae o Neisseria meningitidis; una Pseudomonas, tal como Pseudomonas aeruginosa; una Rickettsia, tal como Rickettsia rickettsii; una Salmonella, tal como Salmonella typhi o Salmonella typhimurium; una Shigella, tal como Shigella sonnei; un Staphylococcus, tal como Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus saprophyticus; un Streptococcus, tal como Streptococcus agalactiae, Streptococcus pneumoniae, Streptococcus pyogenes; un Treponema, tal como Treponema pallidum; un Vibrio, tal como Vibrio cholerae; una Yersinia, tal como Yersinia pestis, Yersinia enterocolitica o Yersinia pseudotuberculosis.

También se proporcionan en el presente documento métodos para tratar la anemia en un individuo, que comprenden administrar a un individuo que tiene anemia un polipéptido señuelo descrito en el presente documento. En particular, la anemia de las divulgaciones es una talasemia, anemia aplásica, anemia hemolítica, anemia de células falciformes, anemia perniciosa o anemia de fanconi.

También se proporcionan en el presente documento métodos para tratar a una persona que se somete a un trasplante, que comprenden administrar a un individuo que se somete a un trasplante de órgano un polipéptido señuelo descrito en el presente documento. En aspectos particulares, el trasplante es de corazón, pulmón, corazón y pulmón, riñón, hígado, páncreas, intestino, estómago, testículo, mano, córnea, piel, islotes de Langerhans, médula ósea, células madre, sangre, un vaso sanguíneo, una válvula cardíaca o un hueso.

También se proporcionan en el presente documento métodos para tratar a una persona con enfermedad autoinmunitaria que comprenden administrar a un individuo con enfermedad autoinmunitaria un polipéptido señuelo descrito en el presente documento. En aspectos particulares, la enfermedad autoinmunitaria es encefalomielitis diseminada aguda (EMDA), leucoencefalitis hemorrágica necrotizante aguda, enfermedad de Addison, agammaglobulinemia, alopecia areata, amiloidosis, espondilitis anquilosante, nefritis anti-MBG/anti-MBT, síndrome antifosfolipídico (SAF), angioedema autoinmunitario, anemia aplásica autoinmunitaria, disautonomía autoinmunitaria, hepatitis autoinmunitaria, hiperlipidemia autoinmunitaria, inmunodeficiencia autoinmunitaria, enfermedad autoinmunitaria del oído interno (EAOI), miocarditis autoinmunitaria, ooforitis autoinmunitaria, pancreatitis autoinmunitaria, retinopatía autoinmunitaria, púrpura trombocitopénica autoinmunitaria (PTA), enfermedad tiroidea autoinmunitaria, urticaria autoinmunitaria, neuropatías axónicas y neuronales, enfermedad de Balo, enfermedad de Behcet, penfigoide ampolloso, cardiomiopatía, enfermedad de Castleman, enfermedad celíaca, enfermedad de Chagas, síndrome de fatiga crónica, polineuropatía desmielinizante inflamatoria crónica (PDIC), osteomielitis multifocal recidivante iónica (OMRC), síndrome de Churg-Strauss, penfigoide cicatricial/penfigoide mucoso benigno, enfermedad de Crohn, síndrome de Cogans, enfermedad por crioaglutininas, bloqueo cardíaco congénito, miocarditis de Coxsackie, enfermedad CREST, crioglobulinemia mixta esencial, neuropatías desmitelizantes, dermatitis herpetiforme, dermatomiositis, enfermedad de Devic (neuromielitis óptica), lupus discoide, síndrome de Dressler, endometriosis, eosinofílica, esofagitis, fascitis eosinófila, eritema nudoso, encefalomielitis alérgica experimental, síndrome de Evans, fibromialgia, alveolitis fibrosante, arteritis de células gigantes (arteritis temporal), miocarditis de células gigantes, glomerulonefritis, síndrome de Goodpasture, granulomatosis con poliangitis (GPA) (anteriormente denominada granulomatosis de Wegener), enfermedad de Graves, síndrome de Guillain-Barre, encefalitis de Hashimoto, tiroiditis de Hashimoto, anemia hemolítica, púrpura de Henoch-Schonlein, herpes gestacional, hipogammaglobulinemia, púrpura trombocitopénica idiopática (PTI), nefropatía por IgA, enfermedad esclerosante relacionada con IgG4, lipoproteínas inmunorreguladoras, miositis por cuerpos de inclusión, cistitis intersticial, artritis juvenil, diabetes juvenil (diabetes de tipo 1), miositis juvenil, síndrome de Kawasaki, síndrome de Lambert-Eaton, vasculitis leucocitoclástica, liquen plano, liquen escleroso, conjuntivitis leñosa, enfermedad de IgA lineal (EAL), lupus (LES), enfermedad de Lyme, crónica, enfermedad de Meniere, poliangitis microscópica, enfermedad mixta del tejido conectivo (EMTC), úlcera de Mooren, enfermedad de Mucha-Habermann, esclerosis múltiple, miastenia grave, miositis, narcolepsia, neuromielitis óptica (enfermedad de Devic), neutropenia, penfigoide cicatricial ocular, neuritis óptica, reumatismo palindrómico, PANDAS (trastornos neuropsiquiátricos pediátricos autoinmunes asociados a Streptococcus), degeneración cerebelosa paraneoplásica, hemoglobinuria paroxística nocturna (HPN), síndrome de Parry Romberg, síndrome de Parsonnage-Turner, pars planitis (uveítis periférica), pénfigo, neuropatía periférica, encefalomielitis perivenosa, anemia perniciosa, síndrome POEMS, poliarteritis nodosa, síndromes poliglandulares autoinmunes de tipo I, II y III, polimialgia reumática, polimiositis, síndrome postinfarto de miocardio, síndrome de pospericardiotomía, dermatitis por progesterona, cirrosis biliar primaria, colangitis esclerosante primaria, psoriasis, artritis psoriásica, fibrosis pulmonar idiopática, pioderma gangrenoso, aplasia pura de glóbulos rojos, fenómeno de Raynaud, artritis reactiva, distrofia simpática refleja, síndrome de Reiter, policondritis recidivante, síndrome de piernas inquietas, fibrosis retroperitoneal, fiebre reumática, artritis reumatoide, sarcoidosis, síndrome de Schmidt, escleritis, esclerodermia, síndrome de Sjogren, autoinmunidad de esperma y testicular, síndrome de la persona rígida, endocarditis bacteriana subaguda (EBS), síndrome de Susac, oftalmía simpática, arteritis de Takayasu, arteritis temporal/arteritis de células gigantes, púrpura trombocitopénica (PTT), síndrome de Tolosa-Hunt, mielitis transversa, diabetes de tipo 1, colitis ulcerosa, enfermedad del tejido conectivo indiferenciado (ETCI), uveítis, vasculitis, dermatosis vesículobullosa, vitíligo o granulomatosis de Wegener (es decir, granulomatosis con poliangitis (GPA). Las enfermedades descritas anteriormente entran en esta categoría.; la depleción de linfocitos T o B autorreactivos puede ser parte de un régimen para tratar las enfermedades autoinmunitarias de la lista.

Métodos de visualización

También se proporcionan en el presente documento métodos para visualizar una célula que expresa CD47 que comprenden poner en contacto una población de células con un polipéptido señuelo descrito en el presente documento y un marcador detectable. En algunas divulgaciones de los métodos descritos en el presente documento, los métodos incluyen la visualización de una célula tumoral, una célula infectada por virus, una célula infectada por bacterias, un linfocito T autorreactivo, glóbulos rojos dañados, placas arteriales o tejido fibrótico. En divulgaciones adicionales, la célula es una célula normal sana, tal como una célula madre hematopoyética, una célula precursora mieloide o linfoide sana o un tipo de célula hematopoyética diferenciada sana tal como linfocito T, B, células plasmáticas o células NK. En divulgaciones adicionales de los métodos descritos en el presente documento, los métodos incluyen la visualización de una célula in vivo, visualización de una célula ex vivo o visualización de una célula in vitro. En aspectos particulares, el método es microscopia, microscopia de fluorescencia, clasificación de células activadas por fluorescencia o tomografía por emisión de positrones (PET). En aspectos particulares, el marcador detectable comprende un marcador enzimático, tal como peroxidasa de rábano picante (HRP), fosfatasa alcalina (AP) o glucosa oxidasa. En aspectos adicionales, el marcador detectable comprende un marcador fluorescente, tal como Alexa Fluor® 350, Alexa Fluor® 405, Alexa Fluor® 488, Alexa Fluor® 532, Alexa Fluor® 546, Alexa Fluor® 555, Alexa Fluor® 568, Alexa Fluor® 594, Alexa Fluor® 647, Alexa Fluor® 680, Alexa Fluor® 750, BODIPY® FL, cumarina, Cy®3, Cy®5, Fluoresceína (FITC), Oregon Green®, Pacific Blue™, Pacific Green™, Pacific Orange™, tetrametilrodamina (TRITC), Texas Red® u otro marcador fluorescente. En aspectos adicionales, el marcador detectable comprende un isótopo radiactivo (tal como 32P, 33P, 3H, 14C, 1251 u otro isótopo radiactivo. En aspectos adicionales, el método es un diagnóstico.

Dosis

Cuando un polipéptido señuelo SIRP-gamma, SIRP-beta o SIRP-beta2 descrito en el presente documento, (por ejemplo, un polipéptido SIRP-gamma, SIRP-beta o SIRP-beta2 variante) se administra a un individuo, un experto en la materia entiende que la dosis depende de varios factores, incluyendo, pero sin limitación, el peso y el estado de enfermedad del individuo. Generalmente, como se usa en el presente documento, un individuo que recibe un polipéptido señuelo SIRP-gamma, SIRP-beta o SIRP-beta2 descrito en el presente documento (por ejemplo, una composición que comprende un polipéptido SIRP-gamma, SIRP-beta o SIRP-beta2 variante), es un solo organismo. En determinadas divulgaciones, un individuo será un mamífero. Específicamente, un individuo es un ser humano, incluyendo hombre o mujer. En muchas divulgaciones, el individuo será un paciente o un individuo en espera o está bajo atención y tratamiento médico.

En algunas divulgaciones, a un individuo se le administra una dosis normalizada respecto al peso corporal del individuo. En algunas divulgaciones, a un individuo se le administra una dosis de aproximadamente 10 pg/kg, aproximadamente 50 pg/kg, aproximadamente 100 pg/kg, aproximadamente 200 pg/kg, aproximadamente 300 pg/kg, aproximadamente 400 pg/kg, aproximadamente 500 pg/kg, aproximadamente 600 pg/kg, aproximadamente 700 pg/kg, aproximadamente 800 pg/kg, aproximadamente 900 pg/kg, aproximadamente 1.000 pg/kg, aproximadamente 1.100 pg/kg, 1.200 pg/kg, 1.300 pg/kg, 1.400 pg/kg, 1.500 pg/kg, 1.600 pg/kg, 1.700 pg/kg, 1.800 pg/kg, 1.900 pg/kg, aproximadamente 2.000 pg/kg, aproximadamente 3000 pg/kg, aproximadamente 4000 pg/kg, aproximadamente 5000 pg/kg, aproximadamente 6000 pg/kg, aproximadamente 7000 pg/kg, aproximadamente 8000 pg/kg, aproximadamente 9000 pg/kg, aproximadamente 10mg/kg, aproximadamente 20 mg/kg, aproximadamente 30 mg/kg, aproximadamente 40 mg/kg, aproximadamente 50 mg/kg, aproximadamente 60 mg/kg, aproximadamente 70 mg/kg, aproximadamente 80 mg/kg - aproximadamente 90 mg/kg, aproximadamente 100 mg/kg, aproximadamente 200 mg/kg, aproximadamente 300 mg/kg, aproximadamente 400 mg/kg, aproximadamente 500 mg/kg, aproximadamente 600 mg/kg, aproximadamente 700 mg/kg, aproximadamente 800 mg/kg, aproximadamente 900 mg/kg o aproximadamente 1000 mg/kg de un polipéptido señuelo SIRP-gamma, SIRP-beta o SIRP-beta2 descrito en el presente documento (por ejemplo, composición que comprende un polipéptido SIRP-gamma, SIRP-beta o SIRP-beta2 variante), en aplicaciones individuales o acumulativas. En divulgaciones específicas, la dosis administrada al individuo es de aproximadamente 7000 mg/kg de polipéptido señuelo por semana. En divulgaciones específicas, la dosis administrada al individuo es de aproximadamente 70 mg/kg de polipéptido señuelo por semana. En divulgaciones específicas, la dosis administrada al individuo es de aproximadamente 7 mg/kg de polipéptido señuelo por semana. En divulgaciones específicas, la dosis que se administra al individuo es de aproximadamente 1.000 pg de polipéptido señuelo por semana. En divulgaciones específicas, la dosis administrada al individuo es de 500 pg de polipéptido señuelo por semana. En divulgaciones específicas, la dosis administrada al individuo es de 250 pg de polipéptido señuelo por semana. En divulgaciones específicas, la dosis administrada al individuo es de 100 pg de polipéptido señuelo por semana. En divulgaciones específicas, la dosis administrada al individuo es de 50 pg de polipéptido señuelo por semana.

En algunas divulgaciones, un individuo recibirá una dosis del polipéptido señuelo SIRP-gamma, SIRP-beta o SIRP-beta2 descrito en el presente documento (por ejemplo, una composición que comprende un polipéptido SIRP-gamma, SIRP-beta o SIRP-beta2 variante), por ejemplo, varias veces al día, cada día, cada dos días, una vez a la semana, una vez cada dos semanas, una vez cada tres semanas, una vez al mes o cualquier otro régimen posológico adecuado. En una divulgación, un individuo recibirá una dosis del polipéptido señuelo SIRP-gamma, SIRP-beta o SIRP-beta2 como una infusión continua. En una divulgación, la administración rutinaria comprende la administración de una dosis de un polipéptido señuelo descrito en el presente documento una vez a la semana durante un período de tiempo. Por supuesto, el régimen de dosificación comprende opcionalmente otras permutaciones de administración del polipéptido señuelo. Esto es, el polipéptido señuelo se administra una vez, dos veces, tres veces, cuatro veces, cinco veces, seis veces o más veces a la semana, a criterio del médico. En algunas divulgaciones, los individuos recibirán al menos de 5 dosis en un periodo de tiempo. En otras divulgaciones, los individuos recibirán más o menos de 5 dosis. Por lo tanto, en una divulgación, un individuo recibirá una dosis de aproximadamente 10 mg/kg del polipéptido señuelo SIRP-gamma, SIRP-beta o SIRP-beta2 a la semana. Como alternativa, el individuo recibirá dos dosis de 5 mg/kg dos veces a la semana o una dosis diaria de 2 mg/kg durante cinco días.

Estos ejemplos de dosis no son limitantes y solo se usan para ilustrar regímenes de dosificación para administrar aproximadamente 10 mg/kg del polipéptido señuelo SIRP-gamma, SIRP-beta o SIRP-beta2. Por ejemplo, si la dosis adecuada para una situación dada es de 10 mg/kg a la semana, la dosis se divide opcionalmente en cualquier número de permutaciones, por ejemplo, cuatro inyecciones de 2,5 mg/kg a la semana. Esto también es cierto si la dosis adecuada para una situación particular es mayor o menor que 10 mg/kg.

En algunas divulgaciones, el período de tiempo en que se administra un polipéptido señuelo SIRP-gamma, SIRP-beta o SIRP-beta2 d(por ejemplo, una composición que comprende un polipéptido SIRP-gamma, SIRP-beta o SIRP-beta2 variante) al individuo es cualquier periodo adecuado determinado por el estadio de la enfermedad, el historial médico del paciente y el criterio del médico encargado del tratamiento. Los ejemplos de dichos periodos adecuados incluyen, pero sin limitaciones, al menos aproximadamente 3 meses, al menos aproximadamente 4 meses, al menos aproximadamente 5 meses, al menos aproximadamente 6 meses, al menos aproximadamente 7 meses, al menos aproximadamente 8 meses, al menos aproximadamente 9 meses, al menos aproximadamente 10 meses, al menos aproximadamente 11 meses, al menos aproximadamente 12 meses, al menos aproximadamente 13 meses, al menos aproximadamente 14 meses, al menos aproximadamente 15 meses, al menos aproximadamente 16 meses, al menos aproximadamente 17 meses, al menos aproximadamente 18 meses, al menos aproximadamente 19 meses, al menos aproximadamente 20 meses, al menos aproximadamente 21 meses, al menos aproximadamente 22 meses, al menos aproximadamente 23 meses o al menos aproximadamente 24 meses o más. En aspectos particulares, el período de tratamiento continúa durante más de 24 meses, si se desea, tal como durante 30 meses, 31 meses, 32 meses, 33 meses, 34 meses, 35 meses, 36 meses o más de 36 meses. En algunas divulgaciones, el periodo es de 6 meses, 1 año o 2 años.

En otra divulgación, el período de tiempo de dosificación para cualquiera de los métodos descritos en el presente documento es de al menos aproximadamente 2 semanas, al menos aproximadamente 4 semanas, al menos aproximadamente 8 semanas, al menos aproximadamente 16 semanas, al menos aproximadamente 17 semanas, al menos aproximadamente 18 semanas, al menos aproximadamente 19 semanas, al menos aproximadamente 20 semanas, al menos aproximadamente 24 semanas, al menos aproximadamente 28 semanas, al menos aproximadamente 32 semanas, al menos aproximadamente 36 semanas, al menos aproximadamente 40 semanas, al menos aproximadamente 44 semanas, al menos aproximadamente 48 semanas, al menos aproximadamente 52 semanas, al menos aproximadamente 60 semanas, al menos aproximadamente 68 semanas, al menos aproximadamente 72 semanas, al menos aproximadamente 80 semanas, al menos aproximadamente 88 semanas, al menos aproximadamente 96 semanas o al menos aproximadamente 104 semanas.

En algunas divulgaciones, cualquier polipéptido señuelo descrito en el presente documento (por ejemplo, una composición que comprende un polipéptido SIRP-gamma, SIRP-beta o SIRP-beta2 variante) se administra en diferentes fases de tratamiento. Por ejemplo, el polipéptido señuelo SIRP-gamma, SIRP-beta o SIRP-beta2 se administra tanto en una fase de tratamiento como en una fase de mantenimiento. En algunas divulgaciones, la fase de tratamiento comprenderá la administración de la formulación de polipéptido señuelo en dosis semanales, mientras que la fase de mantenimiento es por períodos de tiempo más largos, tal como aproximadamente cada 6 semanas, aproximadamente cada 7 semanas, aproximadamente cada 8 semanas, aproximadamente cada 9 semanas, aproximadamente cada 10 semanas, aproximadamente cada 11 semanas, aproximadamente cada 12 semanas o más. En algunos casos, la dosis administrada en la fase de tratamiento será mayor que la dosis administrada en la fase de mantenimiento. Sin embargo, las fases de tratamiento y mantenimiento están diseñadas para un individuo en particular, por lo que el tiempo y las dosis entre las fases de tratamiento y mantenimiento varían de los ejemplos anteriores. Generalmente, la fase de mantenimiento comienza en cualquier momento que se considere oportuno. Por ejemplo, en algunas divulgaciones, la fase de tratamiento será de ocho semanas y la fase de mantenimiento continuará durante toda la vida del individuo. En otras divulgaciones, sólo se realizará una fase de tratamiento o de mantenimiento.

En aún otras divulgaciones, el polipéptido señuelo descrito en el presente documento (por ejemplo, una composición que comprende un polipéptido SIRP-gamma, SIRP-beta o SIRP-beta2 variante), se administra de forma profiláctica. En estas divulgaciones, la administración de polipéptido señuelo previene la aparición de la enfermedad en un individuo (por ejemplo, un individuo genéticamente predispuesto a desarrollar cáncer, tal como cáncer de mama; un individuo predispuesto a desarrollar una infección bacteriana o vírica; un individuo a punto de someterse a un trasplante de órgano; o un individuo predispuesto a desarrollar anemia o enfermedad autoinmunitaria).

La cantidad de tiempo que un individuo debe permanecer en un polipéptido señuelo descrito en el presente documento es determinada por el médico encargado del tratamiento. En algunos casos, es ventajoso administrar el polipéptido señuelo durante el resto de la vida de un individuo. En algunas de estas divulgaciones, se administra un polipéptido señuelo en cuatro cuadrantes del cuerpo, por ejemplo, los ganglios linfáticos cercanos, (por ejemplo, en cada axila), en cada nalga (por ejemplo, subcutáneamente) y similares. En algunas de estas divulgaciones, se administra un polipéptido señuelo mediante una bomba. En algunas divulgaciones, se implanta una bomba y/o dispositivo de administración en un individuo para permitir una dosificación crónica. Los ejemplos de bombas implantables incluyen y no se limitan a bombas osmóticas Alzet®.

Kits

En el presente documento se proporcionan kits para dispensar los polipéptidos señuelo descritos en el presente documento. Dichos kits comprenden un primer vial de producto farmacéutico que contiene un polipéptido señuelo que comprende un polipéptido SIRP-gamma, SIRP-beta o SIRP-beta2, y un segundo vial que contiene un líquido estéril adecuado como se describe en el presente documento para su reconstitución. En algunas divulgaciones

Por ejemplo, en una divulgación, tales kits comprenden un primer vial, es decir, un vial de producto farmacéutico que contiene 300 |jg de un polipéptido señuelo que comprende un polipéptido SIRP-gamma, SIRP-beta o SIRP-beta2, lo que representa una carga de 120 %. Este exceso está destinado a facilitar la retirada y administración de la dosis especificada. El kit comprende además un segundo vial que contiene hasta 1 ml de solución inyectable de cloruro de sodio al 0,9 %. Después de la reconstitución del producto farmacéutico con 0,6 ml de solución inyectable de cloruro de sodio (0,9 % p/v), un vial de producto farmacéutico da 0,5 ml para la administración correspondiente a 250 jg de un polipéptido señuelo que comprende un polipéptido SIRP-gamma, Polipéptido SIRP-beta o SIRP-beta2. A modo de ejemplo, si la dosis es de 1 mg en total, se requieren 4 viales por dosis.

Ciertas definiciones

Los términos "señuelo", "inhibidor" y "agente bloqueante" como se usan en el presente documento se refieren a moléculas que evitan la unión de c D47 a su pareja de unión. Con fines de desarrollo, la unión se puede realizar en condiciones experimentales, por ejemplo, utilizando proteínas aisladas como parejas de unión, utilizando porciones de proteínas como parejas de unión, utilizando visualización en levadura de proteínas o porciones de proteínas como parejas de unión, y similares. Con fines fisiológicamente relevantes, la unión de CD47 a su pareja de unión es a menudo un acontecimiento entre dos células, donde cada célula expresa una de las parejas de unión. De particular interés es la expresión de polipéptidos SIRP en células fagocitóticas, tales como macrófagos; y la expresión de CD47 en células que podrían ser objetivos de fagocitosis, por ejemplo, células tumorales, células hematopoyéticas circulantes y similares. Los inhibidores pueden identificarse usando ensayos in vitro e in vivo para la unión o señalización de receptor o ligando.

Los términos "polipéptido", "péptido" y "proteína" se utilizan indistintamente en el presente documento para referirse a un polímero de restos de aminoácidos. Los términos también se aplican a polímeros de aminoácidos en los que uno o más restos de aminoácido son un mimético químico artificial de un aminoácido de origen natural correspondiente, así como a polímeros de aminoácidos de origen natural y a polímeros de aminoácidos de origen no natural.

El término "aminoácido" como se usa en el presente documento se refiere a aminoácidos de origen natural y sintético, así como a análogos de aminoácidos y miméticos de aminoácidos que actúan de manera similar a la de los aminoácidos de origen natural. Los aminoácidos de origen natural son los codificados por el código genético, así como aquellos aminoácidos que se modifican después, por ejemplo, hidroxiprolina, gamma-carboxiglutamato, y O-fosfoserina. La expresión "análogos de aminoácidos" como se usa en el presente documento se refiere a compuestos que tienen la misma estructura química básica que la de un aminoácido de origen natural, es decir, un carbono alfa que está unido a un hidrógeno, un grupo carboxilo, un grupo amino y un grupo R, por ejemplo, homoserina, norleucina, sulfóxido de metionina, metil sulfonio de metionina. Dichos análogos tienen grupos R modificados (por ejemplo, norleucina) o estructuras principales peptídicas modificadas, pero retienen la misma estructura química básica que un aminoácido de origen natural. La expresión "miméticos de aminoácidos" como se usa en el presente documento se refiere a compuestos químicos que tienen una estructura que es diferente de la estructura química general de un aminoácido, pero que funcionan de manera similar a un aminoácido de origen natural.

Los términos "receptor", "individuo", "sujeto", "hospedador" y "paciente", se usan indistintamente en el presente documento y hacen referencia a cualquier sujeto mamífero para el que se desea el diagnóstico, tratamiento o terapia, en particular, seres humanos. "Mamífero" a efectos del tratamiento, se refiere a cualquier animal clasificado como mamífero, incluyendo seres humanos, animales domésticos y de granja, y animales de laboratorio, de zoo, deportivos o de compañía, tales como perros, caballos, gatos, vacas, oveja, cabras, cerdos, ratones, ratas, conejos, cobayas, monos, etc. En algunas divulgaciones, el mamífero es ser humano.

Como se usa en el presente documento, "cáncer" incluye cualquier forma de cáncer, incluidos, entre otros, cánceres de tumores sólidos (por ejemplo, de pulmón, próstata, mama, vejiga, colon, ovario, páncreas, riñón, hígado, glioblastoma, meduloblastoma, leiomiosarcoma, carcinomas escamocelulares de cabeza y cuello, melanomas, neuroendocrino; etc.) y cánceres líquidos (por ejemplo, cánceres hematológicos); carcinomas; tumores de tejidos blandos; sarcomas; teratomas; melanomas; leucemias; linfomas; y cánceres de cerebro, incluida la enfermedad residual mínima e incluidos tumores primarios y metastásicos. Cualquier cáncer es un cáncer adecuado para ser tratado mediante los métodos y composiciones objeto.

La expresión "pareja de unión" como se usa en el presente documento se refiere a un miembro de un par de unión específica (es decir, dos moléculas, normalmente dos moléculas diferentes, donde una de las moléculas, por ejemplo, una primera pareja de unión, se une específicamente por medios no covalentes a la otra molécula, por ejemplo, una segunda pareja de unión).

Como se usa en el presente documento, los términos "tratamiento", "tratar", y similares, se refiere a la administración de un agente o a la realización de un procedimiento, con el fin de obtener un efecto. El efecto puede ser profiláctico en lo referente a prevenir completa o parcialmente una enfermedad o un síntoma de la misma y/o puede ser terapéutico en lo referente a una cura parcial o completa para una enfermedad y/o síntomas de la enfermedad. "Tratamiento", como se usa en el presente documento, puede incluir el tratamiento de un tumor en un mamífero, particularmente en un ser humano, e incluye: (a) prevenir la enfermedad o un síntoma de una enfermedad de que aparezca en un sujeto que puede estar predispuesto a la enfermedad pero que aún no ha sido diagnosticado por tenerla (por ejemplo, incluyendo enfermedades que pueden asociarse a o estar causadas por una enfermedad primaria; (b) inhibir la enfermedad, es decir, detener su desarrollo; y (c) aliviar la enfermedad, es decir, provocar la regresión de la enfermedad. El tratamiento puede referirse a cualquier indicio de éxito en el tratamiento o mejora o prevención de un cáncer, incluyendo cualquier parámetro objetivo o subjetivo, tal como atenuación; remisión; disminución de los síntomas o hacer que la enfermedad sea más tolerable para el paciente; ralentización de la tasa de degeneración o disminución; o hacer que el punto final de degeneración sea menos debilitante. El tratamiento o mejora de los síntomas puede basarse en parámetros objetivos o subjetivos; incluidos los resultados de un examen realizado por un médico. En consecuencia, el término "tratar" incluye la administración de los compuestos o agentes de la presente invención para prevenir o retrasar, para aliviar o detener o inhibir el desarrollo de los síntomas o afecciones asociadas al cáncer u otras enfermedades. La expresión "efecto terapéutico" se refiere a la reducción, eliminación o prevención de la enfermedad, síntomas de la enfermedad o efectos secundarios de la enfermedad en el sujeto.

"En combinación con", "terapia combinada" y "productos combinados" se refieren, en determinadas divulgaciones, a la administración concurrente a un paciente de un primer tratamiento y los compuestos como se usan en el presente documento. Cuando se administran en combinación, cada componente se puede administrar al mismo tiempo o de manera secuencial en cualquier orden en distintos momentos en el tiempo. Por lo tanto, cada componente se puede administrar por separado pero lo suficientemente cerca en el tiempo como para proporcionar el efecto terapéutico deseado.

"Unidad de dosificación" se refiere a unidades físicamente discretas adecuadas como dosificaciones unitarias para el paciente en particular a tratar. Cada unidad puede contener una cantidad predeterminada de compuesto(s) activo(s) calculada para producir el(los) efecto(s) terapéutico(s) deseado(s) en asociación con el vehículo farmacéutico necesario. La especificación para las formas de dosificación unitarias de la invención puede dictarse por (a) las características únicas del (los) compuesto(s) activo(s) y el(los) efecto(s) terapéutico(s) a conseguir y (b) por las limitaciones intrínsecas en la técnica de la composición de dicho(s) compuesto(s) activo(s).

"Excipiente farmacéuticamente aceptable" significa un excipiente que es útil en la preparación de una composición farmacéutica que en general es segura, no tóxica y deseable, e incluye excipientes que son aceptables para uso veterinario así como para uso farmacéutico en seres humanos. Dichos excipientes pueden ser sólidos, líquidos, semisólidos o, en caso de una composición en aerosol, gaseosos.

Las expresiones "farmacéuticamente aceptable", "fisiológicamente tolerable" y variaciones gramaticales de las mismas, que se refieren a composiciones, vehículos, diluyentes y reactivos, se usan indistintamente y representan que los materiales pueden administrarse a un ser humano o sobre él sin la producción de efectos fisiológicos indeseables en un grado que prohibiría la administración de la composición.

Una "cantidad terapéuticamente eficaz" significa la cantidad que, cuando se administra a un sujeto para tratar una enfermedad, es suficiente para efectuar dicho tratamiento para la enfermedad.

El término "anticuerpo" se usa en el sentido más amplio y abarca específicamente anticuerpos monoclonales (incluyendo anticuerpos monoclonales de longitud completa), anticuerpos policlonales, anticuerpos multiespecíficos (por ejemplo, anticuerpos biespecíficos), pepticuerpos, anticuerpos humanos, anticuerpos humanizados, anticuerpos de camélidos (incluidos los anticuerpos de un solo dominio de camélidos), anticuerpos alternativos de armazón (por ejemplo, aficuerpos, avímeros, dominios Fn3, DARPin, dominios Kunitz, SMIP, Anticuerpos de dominio, BiTE, adnectinas, nanocuerpos, scFv estables, anticalinas) y fragmentos de anticuerpo, siempre que muestren la actividad biológica deseada. Los "anticuerpos" (Ab) y las "inmunoglobulinas" (Ig) son glucoproteínas que tienen las mismas características estructurales. Aunque los anticuerpos muestran especificidad de unión a un antígeno específico, las inmunoglobulinas incluyen tanto anticuerpos como otras moléculas similares a anticuerpos que carecen de especificidad antigénica.

Ejemplos

Ejemplo 1: Métodos

Expresión y purificación de proteínas. El dominio CD47 de IgSF (restos 1-117), con una mutación C15G y un marcador de 8 histidinas en el extremo C (SEQ ID NO: 40), se secretaron de Trichoplusia ien células (Hi-5) usando baculovirus y se purificaron mediante Ni-NTA. Las variantes de SIRP-gamma, SIRP-beta y SIRP-beta 2 monoméricas se expresaron como fusiones de MBP en el periplasma de BL-21 (DE3) E. coli utilizando un vector de expresión pMalp2X modificado (New England Biolabs) que contiene un sitio de escisión de proteasa de rinovirus 3C después del marcador de MBP y marcador de 8xhistidina en el extremo C (SEQ ID NO:40). Las células se indujeron a una DO-600 de 0,8 con IPTG 1 mM y se incubaron con agitación a 22 °C durante 24 horas. La proteína periplasmática se obtuvo mediante choque osmótico y las proteínas de fusión de MBP se purificaron mediante cromatografía de níquel-ácido nitrilotriacético (Ni-NTA). Las proteínas eluidas se digirieron con proteasa 3C a 4 °C durante 12 horas para eliminar MBP y se purificaron adicionalmente mediante una etapa adicional de cromatografía Ni-NTA. La endotoxina se eliminó usando Triton X-114 como se ha descrito anteriormente y la eliminación de endotoxina se confirmó usando el kit de ensayo de endotoxina LAL cromogénica ToxinSensor (Genscript). SIRP-gamma, Las fusiones SIRP-beta y SIRP-beta2-Fc se produjeron mediante clonación de las variantes de SIRP-gamma, SIRP-beta y SIRP-beta2 en un vector pFUSE-hlgG4-Fc modificado (lnvivogen) con una secuencia señal de IL-2 y una mutación de Ser228 Pro modificada. Las proteínas se expresaron mediante transfección transitoria en células Freestyle 293-F (Invitrogen) y se purificaron sobre columnas de proteína A HiTrap (GE Healthcare).

Las proteínas biotiniladas se obtuvieron mediante expresión con un marcador de péptido aceptor de biotina carboxiterminal (GLNDIFEAQKIEWHE (SEQ ID NO:41) y se purificaron como se ha descrito anteriormente. Las proteínas purificadas se biotinilaron in vitro con ligasa BirA y luego se volvieron a purificar de la mezcla de reacción mediante cromatografía Ni-NTA.

Visualización en levadura y generación de bibliotecas de variantes de SIRP-gamma, SIRP-beta o SIRP-beta2. Los dominios del conjunto V N-terminal de SIRP-gamma, SIRP-beta o SIRP-beta2 se presentaron en la superficie de la cepa BJ5465 de S. cerevisiae en el vector pYDS649HM como se ha descrito. Las bibliotecas se generaron mediante reacciones de PCR de ensamblaje que aleatorizaron los restos de contacto CD47 y los restos hidrófobos del "núcleo" de SIRP-gamma, SIRP-beta o SIRP-beta2 utilizando los conjuntos de cebadores con codones degenerados. Las PCR se amplificaron adicionalmente con cebadores que contenían homología con el vector pYDS649HM, combinado con ADN del vector pYDS649HM linealizado y co-electroporado en levadura BJ5465. Las bibliotecas resultantes contenían 4,0-8,0x108 transformantes.

Selección de biblioteca. La levadura transformada se expandió en medio líquido SD-W a 30 °C y se indujo en medio líquido SG-W a 20 °C. Todos los medios se complementaron con maltosa 100 mM para evitar la floculación. Todas las etapas de selección se llevaron a cabo a 4 °C. Para la primera ronda de selección, 8 x 109 levadura inducida, que representa una cobertura de diez veces el número de transformantes de biblioteca, se resuspendieron en 5 ml de PBE (solución salina tamponada con fosfato suplementada con seroalbúmina bovina al 0,5 % y EDTA 0,5 mM). La levadura se mezcló con 500 pl de microperlas de estreptavidina paramagnética (Miltenyi) que están recubiertas previamente con CD47 biotinilado y la mezcla se incubó con rotación durante una hora. La levadura se sedimentó mediante centrifugación a 5.000 x g durante cinco minutos y se lavó dos veces con 1 ml de PBE. Las levaduras marcadas magnéticamente se resuspendieron en 5 ml de PBE y se separaron con una columna LS MAGS de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Miltenyi). La levadura eluida se sedimentó, se resuspendió en medio SD-W y se expandió para la siguiente ronda de selección. Se realizaron rondas adicionales de selección de manera similar a la primera ronda con las siguientes modificaciones: Se resuspendieron 1 x 108 de levadura en 500 pl de PBE que contenía anticuerpo anti-HA marcado con Alexa Fluor 488 (Cell Signaling) o concentraciones sucesivamente decrecientes de proteína CD47 biotinilada, de 100 nM a 1 nM. Después de la incubación durante una hora, las levaduras se lavaron con PBE y para las selecciones con CD47, se marcaron con estreptavidina-PE (Invitrogen) o estreptavidina-Alexa Fluor 647 (producido internamente) durante 15 minutos. Las levaduras se lavaron dos veces más con PBE y se marcaron magnéticamente con 50 pl de las microperlas anti-fluoróforo apropiadas (anti-FITC, anti-PE o anti-Alexa Fluor 647; Miltenyi) durante 15 minutos. La levadura se lavó una vez, se resuspendió en 3 ml de PBE y se separó con una columna LS como en la primera ronda.

Para las rondas finales de selección, se realizó una selección cinética. Resumiendo, las levaduras se tiñeron con CD47 biotinilado 10 nM durante una hora, se lavaron con PBE y luego se resuspendieron en 500 pl de PBE que contenían CD47 no biotinilado 1 pM. Las células se incubaron a 25 °C durante 300 minutos, después de lo cual se lavaron con PBE helado y se tiñeron con estreptavidina marcada con fluorescencia. A continuación, las levaduras se marcaron conjuntamente con anti-HA marcado con Alexa Fluor 488 y estreptavidina-Alexa Fluor 647 y se seleccionaron con un clasificador de células FACS.

Resonancia de plasmón superficial (SPR). Los experimentos se realizaron con un Biacore T100 a 25 °C. Las concentraciones de proteínas se cuantificaron mediante absorbancia a 280 nm con un espectrómetro Nanodrop2000 (Thermo Scientific). Se utilizó un chip sensor Biacore SA (GE Healthcare) para capturar CD47 biotinilado (Rmáx -150 UR). Se inmovilizó una proteína biotinilada no relacionada con un valor de UR que coincidía con el de la superficie de referencia para controlar la unión no específica. Las mediciones se realizaron con diluciones seriadas de SIRP-gamma, SIRP-beta o SIRP-beta2 variantes en tampón HBS-P (GE Healthcare). La superficie de CD47 se regeneró mediante tres inyecciones de 60 segundos de MgCh 2 M. Todos los datos se analizaron con el software de evaluación Biacore T100 versión 2.0 con un modelo de unión de Langmuir 1:1.

Líneas celulares y transducción de GFP-luciferasa+. Las células DLD-1 (ATCC), células HT-29 (ATCC), células Raji (ATCC), células Jurkat (ATCC) y células 639-V (DSMZ) se cultivaron en Rp MI GlutaMax (Invitrogen) suplementado con suero bovino fetal al 10 % (Omega Scientific), 100 U /ml de penicilina y 100 pg/ml de estreptomicina (Invitrogen). Se generaron líneas de GFP-luciferasa+ mediante transducción usando un vector lentiviral puro basado en VIH pCDH-CMV-MCS-EF1 (Systems Biosciences) diseñado para expresar una proteína de fusión eGFP-Iuciferasa2 (pgl4). Se crearon líneas estables clasificando la expresión de GFP en un clasificador de células FACS.

Ensayos de unión a CD47 basados en células. Se incubaron concentraciones variables de monómeros de SIRP-gamma, SIRP-beta o SIRP-beta2 biotinilados, proteínas de fusión, SIRP-gamma, SIRP-beta o SIRP-beta2-hlgG4 con células cancerosas. La unión de los monómeros biotinilados se detectó usando estreptavidina conjugada con Alexa Fluor 647100 nM como reactivo de tinción secundario y se analiza en un citómetro de flujo Accuri C6 (BD Biosciences). La unión de las proteínas de fusión SIRP-gamma, SIRP-beta o SIRP-beta2 -hlgG4 o los anticuerpos antiCD47 se detectan con anticuerpo de cabra anti-IgG humana (Invitrogen) y se analizan en un citómetro de flujo Accuri C6. Los datos representan la intensidad de fluorescencia media normalizada a la unión máxima para cada clase de reactivos, y los puntos se ajustan a las curvas de dosis-respuesta sigmoideas usando Prism 5 (Graphpad).

Ensayos de bloqueo de CD47 basados en células. Se incubaron variantes de SIRP-gamma, SIRP-beta o SIRP-beta2 biotiniladas con estreptavidina conjugada con Alexa Fluor 647 para formar tetrámeros de variantes de SIRP-gamma, SIRP-beta o SIRP-beta2. Se combinaron tetrámeros variantes de SIRP-gamma, SIRP-beta o SIRP-beta2 100 nM con concentraciones de titulación de antagonistas de CD47 y se añadieron simultáneamente a 50.000 células GFP-luciferasa Raji. Las células se incubaron durante 30 minutos a 4 °C y luego se lavaron para eliminar el tetrámero no unido. Las muestras se tiñeron con DAPI (Sigma) para excluir las células muertas y se ensayó la fluorescencia usando un citómetro de flujo Accuri C6. Los datos representan la media geométrica de la intensidad de la fluorescencia normalizada a la unión máxima del tetrámero y se ajustaron a las curvas de respuesta a la dosis sigmoidea utilizando Prism 5 (Graphpad).

Ensayos de derivación de macrófagos y fagocitosis. Las cámaras del sistema de reducción de leucocitos (LRS) se obtuvieron de donantes anónimos y las células mononucleares de sangre periférica se enriquecieron mediante centrifugación en gradiente de densidad sobre Ficoll-Paque Premium (GE Healthcare). Los monocitos se purificaron en un AutoMACS (Miltenyi) usando microperlas anti-CD 14 (Miltenyi) y se diferenciaron a macrófagos por cultivo durante 7-10 días en IMDM GlutaMax (Invitrogen) suplementado con 10 % de AB-Suero humano (Invitrogen) y 100 U/ml de penicilina y 100 pg/ml de estreptomicina (Invitrogen). Los ensayos de fagocitosis se realizaron mediante cocultivo de 50.000 macrófagos con 100.000 células tumorales GFP+ durante 2 horas, después se analizaron utilizando un analizador de células LSRFortessa con muestreador de alto rendimiento (BD Biosciences). Los anticuerpos utilizados para el tratamiento incluyen: control de isotipo lgG1 de ratón (eBioscience), clon 203 anti-CD47 (eBioscience), anti-EpCam (Biolegend), cetuximab (Bristol-Myers Squibb) y rituximab (Genentech). Los macrófagos se identificaron mediante citometría de flujo con anti-CD14, anticuerpos anti-CD45 o anti-CD206 (Biolegend). Las células muertas se excluyeron del análisis mediante tinción con DAPI (Sigma). La fagocitosis se evaluó como el porcentaje de macrófagos GFP+ y se normalizó a la respuesta máxima de cada donante independiente frente a cada línea celular. La significación estadística se determinó mediante ANOVA de 2 vías con pruebas a posteriori de Bonferroni y, cuando se indicó, los datos se ajustaron a las curvas de respuesta a la dosis sigmoidea utilizando Prism 5 (Graphpad).

Ensayo de fagocitosis basado en FACS. La evaluación de la fagocitosis se realizó mediante cocultivo de 100.000 células diana y 50.000 macrófagos durante dos horas en placas de fondo en U de 96 pocillos de fijación ultrabaja (Corning) en IMDM GlutaMax (Life Technologies) sin antibióticos ni suero añadido. Los macrófagos se generaron mediante purificación basada en perlas magnéticas de monocitos humanos primarios usando el kit de aislamiento de sangre completa CD14+ (Miltenyi) seguido de 7 días de cultivo con suero humano (Gemini); el día 7, estas células se recolectaron de placas usando TrypLE Express (Life Technologies). Los macrófagos se marcaron con tinción celular rojo/naranja de Calceína AM (Life Technologies) según las indicaciones del fabricante. Las células diana se diseñaron para expresar de forma estable proteína verde fluorescente. Se añadieron tratamientos con proteínas al cocultivo de células diana y macrófagos y la mezcla se incubó a 37 °C durante 2 horas. Las reacciones se realizaron en un analizador LSRFortessa equipado con un muestreador automático de alto rendimiento (BD Biosciences). La fagocitosis se evaluó como macrófagos GFP+ expresada como porcentaje del total de macrófagos, como se analizó usando FlowJo v.9.4.10 (Tree Star) y se normalizó como se indica en las leyendas de las figuras.

Ratones. Se utilizaron ratonesNod.Cg-Prkdc^scidIL2rg^tm1Wjl/SzJ (NSG) para todos los experimentos in vivo. Los ratones se injertan con tumores aproximadamente a las 6-10 semanas de edad, y se realizan experimentos con cohortes de 8-15 ratones emparejados por edad y sexo.

Modelos tumorales. Para modelar el cáncer de colon humano, se inyectaron 1 x 10⁵células GFP-luciferasa DLD-1 en las cavidades peritoneales de ratones NSG. El cáncer de vejiga se modela mediante el injerto de 1,25 x 10⁵células GFP-luciferasa 639-V en el tejido subcutáneo dorsal de ratones NSG en Matrigel al 25 % (BD Biosciences). Se injertan 1 x 106 células GFP-luciferasa Raji por vía subcutánea en el flanco inferior para un modelo localizado de linfoma humano. En todos los modelos, el tratamiento se inicia tras la confirmación del injerto y continúa según se indica. Para todos los tratamientos, 200 ^g de las variantes SIRP-gamma, SIRP-beta o SIRP-beta2 o el anticuerpo se administra mediante inyección intraperitoneal en un programa diario. El crecimiento del tumor se monitoriza mediante formación de imágenes de bioluminiscencia y se miden las dimensiones del tumor para calcular los volúmenes de acuerdo con la fórmula del elipsoide (n/6 x longitud x anchura2). La significación estadística se determina mediante la prueba de Mann-Whitney o Kruskai-Wallis con las pruebas a posteriori de Dunn, según corresponda. La supervivencia se analiza mediante la prueba de Mantel-Cox.

Imágenes de bioluminiscencia. Se inyectan a los ratones anestesiados 200 ^l de sal de potasio de D-luciferina (luciérnaga) (Biosynth) reconstituida a 16,67 mg/ml en PBS estéril. Las imágenes de bioluminiscencia se realizan utilizando un espectro IVIS (Caliper Life Sciences) durante 20 minutos para registrar la luminosidad máxima. Los valores máximos de flujo total se evalúan a partir de la región anatómica de interés utilizando Living Image 4.0 (Caliper Life Sciences) y se utilizan para el análisis.

Secuencia de proteínas. Entre las proteínas utilizadas en los ejemplos descritos en el presente documento, se incluyen los siguientes:

SIRPgamma de tipo salvaje:

EEELQMIQPEKLLLVT V GKT ATLHCT VT S LLP V GP VLWFRG V GPGRELIYN QKEGHFPR

VTT V S DLTKRNNMDF S IRIS SITP AD V GT Y Y C VKFRKGS PEN VEFKS GPGTEM ALG AKPS

(SEQ ID NO: 1)

GV1 (SIRPgamma de alta afinidad):

EEELOIIOPEKLLLVT V GKT ATLHCTITS LFP V GP VLWFRG V GPGRYLIYNOROGPFPRV

TT V S DTTKRNNMDF S IRIS S ITP AD V GT Y Y CIKFRKGS PEN VEFKS GPGTEM ALG AKPS

(SEQ ID NO: 3)

GV1.2:

EEELQIIQPEKLLLVT VGKT ATLHCTITS LFP VGPIQWFRG VGPGRVLIYNQREGPFPRVT

T VS DGTKRNNMDF S IRIS S ITP AD V GT Y Y C VKFRKGS PED VEFKS GPGTEM ALG AKPS

(SEQ ID NO: 13)

HGV1:

EEELOIIOPEKLLLVT V GKT ATLHCTITS LFP V GPIO WFRG V GPGRVLIYN ORD GPFPRV

TT V S DGTKRNNMDFS IRIS S ITP AD V GT Y Y CVKFRKGTPED VEFKS GPGTEM ALG AKPS

(SEQ ID NO: 4)

HGV2:

EEELQIIQPEKLLLVT V GKT ATLHCTITS LFP V GPIQWFRGV GPGRVLIYN QKDGPFPRV

TTVSDGTKRNNMDFS IRIS SITPAD V GTYYCVKFRKGSPED VEFKS GPGTEMALGAKPS

(SEQ ID NO: 5)

HGV3:

EEELQIIQPEKLLLVT V GKT ATLHCTITS LFP V GPIQWFRGV GPGRVLIYN QKDGHFPRV

TTVSDGTKRNNMDFS IRIS SITPAD VGTYYCVKFRKGSPED VEFKS GPGTEMALGAKPS

(SEQ ID NO: 6)

MGV1:

EEELOIIOPEKLLLVT V GKT ATLHCTIT S LFP V GPIO WFRGAGPGRVLIYN ORD GPFPRV

TT V S DGTKRNNMDFS IRIS SITP AD V GT Y Y CIKFRKGTPED VEFKS GPGTEM ALG AKPS

(SEQ ID NO: 7)

Restos de la biblioteca de SIRP-gamma:

SIRPbeta de tipo salvaje:

EDELQVIQPEKSVSVAAGESATLRCAMTSLIPVGPMWFRGAGAGRELIYNQKEGHFPR

YTTVSELTKRNNLDFSISISNITPADAGTYYCVKFRKGSPDDVEFKSGAGTELSVRAKPS

(SEQ ID NO: 43)

BV1 (SIRPbeta de alta afinidad):

EDELOIIOPEKS VS V A AGES ATLRC AIT S LFP V GPIO WFRG AG AGR VLIYNOROGPFPRV

TT V S ETTKRNNLDFSISIS NITP AD AGT Y Y CIKFRKGS PDD VEFKS G AGTELS VRAKPS

(SEQ ID NO: 26)

SIRPbeta2 de tipo salvaje:

EEELQVIQPDKSISVAAGESATLHCTVTSLIPVGPIQWFRGAGPGRELIYNQKEGHFPRVT

TVSDLTKRNNMDFSIRISNITPADAGTYYCVKFRKGSPDHVEFKSGAGTELS VRAKPS

(SEQ ID NO: 44)

B2V1 (SIRPbeta2 de alta afinidad):

EEELOIIOPDKSISVAAGESATLHCTITSLFPVGPIOWFRGAGPGRVLIYNORQGPFPRVT

TV S DTTKRNNMDFS IRIS NITP AD AGT Y Y CIKFRKGS PDD VEFKS G AGTELS VRAKPS

(SEQ ID NO: 28)

Las secuencias de proteínas adicionales para el polipéptido SIRP-gamma incluyen:

HLibl:

EEELQIIQPEKLLLVT V GKT ATLHCTITSHFPV GPIQWFRGV GPGRVLIYN QKDGHFPRV

TTVSDGTKRNNMDFSIRISSITPADVGTYYCVKFRKGSPEDVEFKSGPGTEMALGAKPS

(SEQ ID NO: 8);

HLib2:

EEELQIIQPDKSVLVAAGETATLRCTITSLFPVGPIQWFRGAGPGRVLIYNQRDGPFPRVT

TVSDGTKRNNMDFSIR1SSITPADVGTYYCVKFRKGTPEDVEFKSGPGTEMALGAKPS

(SEQ ID NO: 9);

HLib3:

EEELQIIQPEKLLLVTVGKTATLHCTITSLFPVGPVLWFRGVGPGRVLIYNQRQGPFPRVT

TVSDTTKRNNMDFSIRISSITPADVGTYYCVKFRKGTPEDVEFKSGPGTEMALGAKPS

(SEQ ID NO: 10);

HLib4:

EEELQIIQPEKLLLVTVGKTATLHCTITSLFPVGPIQWFRGVGPGRELIYNAREGRFPRVT

TVSDLTKRNNMDFSIRISSITPADVGTYYCVKFRKGSPEDVEFKSGPGTEMALGAKPS

(SEQ ID NO: 11);

HMLib1:

EEELQIIQPDKSVLVAAGETATLRCTITSLFPVGPIQWFRGAGPGRVLIYNQRQGPFPRVT

TVSDTTKRNNMDFSIRIGNITPADAGTYYCIKFRKGSPDDVEFKSGAGTELSVRAKPS

(SEQ ID NO: 12);

HMLib2:

EEELQIIQPEKLLLVTVGKTATLHCT1TSLFPVGPVLWFRGVGPGRVLIYNQRQGPFPRVT

TVSDTTKRNNMDFSIRISSITPADVGTYYCIKFRKGSPENVEFKSGPGTEMALGAKPS

(SEQ ID NO: 3);

HMLib3:

EEELQIIQPEKLLLVT V GKT ATLHCTITSLFP V GPIQWFRGV GPGRVLIYN QREGPFPRVT

TVSDGTKRNNMDFSIRISSITPADVGTYYCVKFRKGSPEDVEFKSGPGTEMALGAKPS

(SEQ ID NO: 13);

HMLib4:

EEELQMIQPEKLLLVT V GKT ATLHCT VT S LLP V GP VLWFRG V GPGRELIYN QKEGHFPR

VTT V S DLTKRNNMDF S IRIS SITP AD V GT Y Y C VKFRKGS PEN VEFKS GPGTEM ALG AKPS

(SEQ ID NO: 42);

HMLib5:

EEELQIIQPDKSVLVAAGETATLRCTITSLFPVGPIQWFRGAGPGRVLIYNQRDGPFPRVT

TVSDGTKRNNMDFSIRISSITPADVGTYYCIKFRKGIPEDVEFKSGPGTEMALGAKPS

(SEQ ID NO: 14);

HMLib6:

EEELQIIQPDKSVLVAAGETATLRCTITSLFPVGPIQWFRGAGPGRVLIYNQRDGPFPRVT TV S DGTKRNNMDFS IRIS S ITP AD V GT Y Y CIKFRKGIPED VEFKS GP GTXWH (SEQ ID NO: 15),

en el que X es A, R, N, D, C, Q, E, G, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y o V;

HMLib7:

EEELQIIQPDKSVLVAAGETATLRCTITSLFPVGPIQWFRGAGPGRVLIYNQKDGPFPRVT

TVSDGTKRNNMDFSIRISSITPADVGTYYCIKFRKGTPEDVEFKSGPGTEM ALG AKPS

(SEQ ID NO: 16);

MLib1:

EEELQIIQPEKLLLVT V GKT ATLHCTITSLLPV GPIQWFRGV GPGRELIYN QRDGPFPRVT

TVSDGTKRNNMDFSIRISSITPADVGTYYCVKFRKGTPEDVEFKSGPGTEMALGAKPS

(SEQ ID NO: 17);

MLib2:

EEELQIIQPEKLLLVT V GKT ATLHCTLTSLLPV GPILWFRGV GPGRVLIYN QRDGPFPRVT

TVSDGTKRNNMDFSIRISSITPADVGTYYCVKFRKGNPEDVEFKSGPGTEMALGAKPS

(SEQ ID NO: 18);

MLib3:

EEELQLIQPEKLLLVTVGKTATLHCTITSLFPPGPIQWFRGVGPGRVLIYNQKDGPFPRVT

TVSDGTKRNNMDFSIRISSITPADVGTYYCVKFRKGIPEDVEFKSGPGTEMALGAKPS

(SEQ ID NO: 19);

MLib4:

EEELQIIQPEKLLLVT V GKT ATLRCTITS LFP V GPIQWFRGAGPGRVLIYN QRDGPFPRVT

T VSDGTKRNNMDFS IRIS SITPAD V GT YY CIKFRKGIPED VEFKS GPGTEMALGAKPS

(SEQ ID NO: 20);

MLib5:

EEELQIIQPEKLLLVT V GKT ATLHCTIT S LFPIGPILWFRG V GPGRVLIYN QKDGPFPRVTT

V S DGTKRNNMDF S IRIS S ETPAD V GT Y Y C VKFRKGS PED VEFKS GPGTEM ALG AKPS

(SEQ ID NO: 21);

MLib6:

EEELQMIQPEKLLLVT V GKT ATLHCTITSLFP V GPIQWFRGAGPGRVLIYN QRDGPFPRV

TTVSDGTKRNNMDFSIRISSITPAD V GTYYCIKFRKGIPED VEFKS GPGTEMALGAKPS

(SEQ ID NO: 22);

MLib7:

EEELQIIQPDKSVLVAAGETATLRCTITSLFPVGPIQWFRGVGPGRVLIYNQKDGPFPRVT

TVSDGTKRNNMDFSIRISSITPADVGTYYCIKFRKGIPEDVEFKSGPGTEMALGAKPS

(SEQ ID NO: 23);

y

MLib8:

EEELQIIQPDKSVLVAAGETATLRCTITSLFPVGPIQWFRGAGPGRVLIYNQKDGPFPRVT

TVSDGTKRNNMDFSIRISSITPADVGTYYCIKFRKGTPEDVEFKSGPGTEMALXAKPS

(SEQ ID NO: 24).

En divulgaciones adicionales, el polipéptido señuelo es un polipéptido quimérico o de fusión. En divulgaciones adicionales, el polipéptido señuelo comprende una secuencia polipeptídica de SIRP-gamma fusionada a una secuencia polipeptídica que comprende un inhibidor del punto de control inmunitario, una molécula coestimuladora o una citocina o una citocina atenuada, en el que las secuencias están conectadas por un enlazador Gly-Ser de longitud y composición variables. En divulgaciones adicionales, el polipéptido señuelo comprende una de las siguientes secuencias:

1) Fusión a inhibidores de puntos de control inmunitarios

a. Antagonista de PD-1/PD-L1

Ejemplo: HAC-GV3 (señuelo PD-1 de alta afinidad fusionado a GV3)

DSPDRPWNPPTFSPALLVVTEGDNATFTCSFSNTSESFHYVWHRESPSGQTDTLA

AFPEDRS QPGQD ARFRVTQLPN GRDFHMS V YR ARRNDS GT Y VCG VIS LAPKIQI

KESLRAELRVTERGGGGSGGGGSEEELQIIQPEKLLLVTVGKTATLHCTrrSLFPV

GPIQWFRG V GPGRVLIYN QKD GHFPR VTT V S DGTKRNNMDF S IRIS SITP AD V GT

YYCVKFRKGSPEDVEFKSGPGTEMALGAKPS (SEQ ID NO: 30);

b. Antagonista de BTLA/CD160

Ejemplo: Señuelo GV3-BTLA

EEELQIIQPEKLLLVT V GKT ATLHCTITSLFP V GPIQWFRG Y GPGRVLIYN QKDGH FPRVTT VSDGTKRNNMDFS IRIS SITPAD VGT YY C VKFRKGSPED VEFKS GPGTE MALGAKPSGGGGSGGGGSWN1HGKESCDVQLYIKRQSEHSILAGDPFELECPVK YCANRPHVTWCKLNGTTCVKLEDRQTSWKEEKNISFFILHFEPVLPNDNGSYRC SANFQSNLIESHSTTLYVTDVK (SEQ ID NO: 31);

Antagonista de fosfatidilserina

Ejemplo: Señuelo GV3-MFGE8

EEELQIIQPEKLLLVT V GKT ATLHCTITSLFP V GPIQWFRG V GPGRVLIYN QKDGH FPRVTT VSDGTKRNNMDFS IRIS S ITPAD VGT YY C VKFRKGSPED VEFKS GPGTE M ALGAKPS GGGGS GGGGSELN GC ANPLGLKNN SIPD KQIT AS S S YKTW GLHLFS WNPSYARLDKQGNFNAWVAGSYGNDQWLQVDLGSSKEVTGIITQGARNFGSV QF V AS YKV AY S NDS ANWTE Y QDPRT GS S KIFPGNWDNHS HKKNLFETPILARY V RILPVAWHNRIALRLELLGC (SEQ ID NO: 32);

Ejemplo: Señuelo GV3-Tim1

EEELQIIQPEKLLLVT V GKT ATLHCTITSLFP V GPIQWFRG V GPGRVLIYN QKDGH FPRVTT VSDGTKRNNMDFS IRIS SITPADV GT YY C VKFRKGSPED VEFKS GPGTE MALGAKPSGGGGSGGGGSVAGSVKVGGEAGPSVTLPCHYSGAVTSMCWNRGS C S LFTC QN GIVWTN GTH VT YRKDTR YKLLGDLS RRD V S LTIENT A V S DS G V Y CC RVEHRGWFNDMKITVSLEIVPPKVTT (SEQ ID NO: 33);

Ejemplo: Señuelo GV3-Tim3

EEELQIIQPEKLLLVT V GKT ATLHCTITSLFP V GPIQWFRG V GPGRVLIYN QKDGH FPRVTT VSDGTKRNNMDFS IRIS S ITPAD VGT YY C VKFRKGSPED VEFKS GPGTE M ALGAKPS GGGGS GGGGS S E VEYRAEVGQN A YLPCFYTPA APGNLVP VC WGK G ACP VFECGNV VLRTDERD VN YWTSRYWLN GDFRKGD V S LTIEN VTLADS GIY CCRIQIPGIMNDEKFNLKLVIKPAKVTPA (SEQ ID NO: 34);

Ejemplo: Señuelo GV3-Tim4

EEELQIIQPEKLLLVT VGKTATLHCTITS LFP V GPIQWFRGV GPGRVLIYN QKDGH FPRVTT VSDGTKRNNMDFS IRIS SITPAD VGT YY C VKFRKGSPED VEFKS GPGTE M ALG AKPS GGGGSGGGGSTS ET V VTE VLGHRVTLPCLY S S WS HN S NS MC W GK DQCPYSGCKEALIRTDGMRVTSRKSAKYRLQGTIPRGDVSLTILNPSESDSGVYC CRIEVPGWFNDVKINVRLNLQRASTTTDEKFNLKLVIKPAKVTPA (SEQ ID NO: 35);

) Fusión a moléculas coestimuladoras

a. agonista de CD40

Ejemplo: GV3-CD40L

EEELQIIQPEKLLLVT V GKT ATLHCTITSLFP V GPIQWFRGV GPGRVLIYN QKDGH FPRVTT VSDGTKRNNMDFS IRIS S ITPAD VGT YY C VKFRKGSPED VEFKS GPGTE MALGAKPSGGGGSGGGGSGDQNPQIAAHVISEASSKTTSVLQWAEKGYYTMSN NLVTLEN GKQLTVKRQGLY YIY AQVTFCSNRE AS S QAPFIAS LCLKSPGRFERILL R A ANTHS S AKPCGQQS1HLGG VFELQPG AS VFVN VTDPS Q V S HGTGFTS F GLLKL (SEQ ID NO: 36);

b. Agonista de 41BB (CD137)

Ejemplo: GV3-41BBL

EEELQIIQPEKLLLVT V GKT ATLHCTITSLFP V GPIQWFRGV GPGRVLIYN QKDGH FPRVTT VSDGTKRNNMDFS IRIS S ITPAD VGT YY C VKFRKGSPED VEFKS GPGTE MALGAKPSGGGGSGGGGSDPAGLLDLRQGMFAQLVAQNVLLIDGPLSWYSDP GLAG V S LTGGLS YKEDTKELV V AK AG V Y Y VFF QMELRR V V AGEGS GS V S LALH LMPLRSAAGAAALALTVDLPPASSEARNSAFGFQGRLLHLSAGQRLGVHLHTEA RARHAWQLTQGATVLGLFRVTPEIPA (SEQ ID NO: 37);

) Fusión a citocinas o citocinas atenuadas

Ejemplo: GV3-IL2

EEELQIIQPEKLLLVT V GKT ATLHCTITSLFP V GPIQWFRGV GPGRVLIYN QKDGH FPRVTT VSDGTKRNNMDFS IRIS S ITPAD VGT YY C VKFRKGSPED VEFKS GPGTE M ALGAKPS GGGGS GGGGS APTS S STKKTQLQLEHLLLDLQMILN GINNYKNPKL TRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINV IVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFCQSIISTLT (SEQ ID NO: 38); Ejemplo: GV3-IL2 (una citocina "atenuada" con mutaciones F42A/D20T)

EEELQIIQPEKLLLVT V GKT ATLHCTITSLFP V GPIQWFRGV GPGRVLIYN QKDGH

FPRVTT VSDGTKRNNMDFS IRIS SITPAD VGT YY C VKFRKGSPED VEFKS GPGTE

M ALGAKPS GGGGS GGGGS APTS S STKKTQLQLEHLLLTLQMILN GINNYKNPKL

TRMLT AKF YMPKKATELKHLQCLEEELKPLEE VLNLAQS KNFHLRPRDLIS NIN V

IVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFCQSUSTLT (SEQ ID NO: 39).

Ejemplo 2: Medición basada en resonancia de plasmón superficial de la afinidad de unión y la cinética de la variante GV3 de SIRP-gamma para CD47 humano

Usando el método de resonancia de plasmón superficial descrito anteriormente, se podría medir la afinidad de unión y la cinética de la variante GV3 de SIRP-gamma para CD47 humano. Por ejemplo, como se muestra en la Figura 1A, se utilizaron concentraciones variables de la variante SIRP-gamma GV3, incluyendo 100 pM, 316 pM, 1 nM, 3,16 nM, 10 nM y 100 nM, en reacciones de unión con una concentración conocida de CD47 humano biotinilado. Utilizando un modelo de unión Langmuir 1:1, la constante de disociación calculada Kd fue 92 pM. La semivida de disociación calculada T1/2 fue de aproximadamente 44 minutos. La figura 1B muestra una representación gráfica de un CD47 humano biotinilado unido a la variante GV3 de SIRP-gamma.

Ejemplo 3: Medición basada en resonancia de plasmón superficial de la afinidad de unión y la cinética de HAC-GV3, una proteína de fusión de la variante SIRP-gamma GV3 y una variante de PD-1 de alta afinidad HAC, para CD47 humano

Usando el método de resonancia de plasmón superficial descrito anteriormente, se podría medir la afinidad de unión y la cinética de HAC-GV3, una proteína de fusión de la variante SIRP-gamma GV3 y una variante de PD-1 de alta afinidad HAC, para CD47 humano. Por ejemplo, como se muestra en la Figura 2A, Se utilizaron concentraciones variables de la proteína de fusión HAC-GV3, incluyendo 100 pM, 316 pM, 1 nM, 3,16 nM, 10 nM y 100 nM, en reacciones de unión con una concentración conocida de CD47 humano biotinilado. Utilizando un modelo de unión Langmuir 1:1, la constante de disociación calculada Kd fue 160 pM. La semivida de disociación calculada T1/2 fue de aproximadamente 40 minutos. La figura 2B muestra una representación gráfica de un CD47 humano biotinilado unido a la proteína de fusión que comprende la variante GV3 y hAc de SIRP-gamma.

Ejemplo 4: Medición basada en resonancia de plasmón superficial de la afinidad de unión y la cinética de una variante de PD-1 HAC para PD-L1 humano

En otro ejemplo, se usó resonancia de plasmón superficial para medir la afinidad de unión y la cinética de la variante de PD-1 HAC para PD-L1 humano. Se usaron concentraciones variables de HAC, incluyendo 100 pM, 316 pM, 1 nM, 3,16 nM, 10 nM y 100 nM, en reacciones de unión con una concentración conocida de PD-L1 humano biotinilado. Utilizando un modelo de unión Langmuir 1:1, la constante de disociación calculada Kd fue 110 pM. La semivida de disociación calculada T1/2 fue de aproximadamente 42 minutos.

Ejemplo 5: Medición basada en resonancia de plasmón superficial de la afinidad de unión y la cinética de HAC-GV3, una fusión de la variante GV3 de SIRP-gamma con una variante de PD-1 HAC, para PD-L1 humano

Usando el método de resonancia de plasmón superficial descrito anteriormente, se podría medir la afinidad de unión y la cinética de HAC-GV3, una fusión de la variante GV3 de SIRP-gamma con una variante de PD-1 HAC, para PD-L1 humano. Por ejemplo, como se muestra en la Figura 3A, se añadieron concentraciones variables de la proteína de fusión HAC-GV3, incluyendo 100 pM, 316 pM, 1 nM, 3,16 nM, 10 nM y 100 nM, a reacciones de unión con una concentración conocida de PD-L1 humano biotinilado. Utilizando un modelo de unión Langmuir 1:1, la constante de disociación calculada Kd fue 134 pM. La semivida de disociación calculada T1/2 fue de aproximadamente 38 minutos. La figura 3B muestra una representación gráfica de un PD-L1 humano biotinilado unido a HAC-GV3.

Ejemplo 6: Medición basada en resonancia de plasmón superficial de la unión simultánea de CD47 humano y PD-L1 humano por HAC-GV3

En otro ejemplo de medición basada en resonancia de plasmón superficial, se midieron la afinidad de unión y la cinética de unión simultánea de CD47 humano y PD-L1 humano por HAC-GV3 añadiendo concentraciones variables de HGV3 o HAC-GV3 a una concentración conocida de CD47 humano biotinilado. Como se muestra en la FIG. 4A, en comparación con el GV3 humano solo, la curva de unión para la proteína de fusión HAC-GV3 mostró dos picos distintos: un primer pico para unirse a CD47 biotinilado y un segundo pico para unirse a PD-L1. La figura 4B muestra una representación gráfica de un CD47 humano biotinilado unido a la porción GV3 de la proteína de fusión HAC-GV3, en el que la porción HAC está unida a PD-L1.

Ejemplo 7: Medición basada en citometría de flujo del bloqueo de interacciones CD47/SIRP-alfa en la superficie de células CD47+ por GV3 y HAC-GV3

Usando el ensayo de bloqueo de CD47 basado en células descrito anteriormente, se combinaron 50 nM de tetrámeros SIRP-alfa biotinilados con concentraciones de titulación de GV3 o HAC-GV3 en presencia de las células CD47+. La figura 5 muestra la medición basada en citometría de flujo del bloqueo de interacciones CD47/SIRP-alfa en la superficie de células CD47+ GFP-luciferasa DLD1-Tg por GV3 y HAC-GV3. El porcentaje de la intensidad de fluorescencia media (% IFM) como lectura de la unión de SIRP-alfa se representa frente a la concentración logarítmica en M.

Ejemplo 8: Medición basada en citometría de flujo del bloqueo de interacciones CD47/SIRP-alfa en la superficie de células CD47+ PD-L1+ por GV3 y HAC-GV3

En otro ejemplo del ensayo de bloqueo de CD47 basado en células descrito anteriormente, se utilizó citometría de flujo para medir el bloqueo de las interacciones CD47/SIRP-alfa en la superficie de células CD47+ PD-L1+ GFP-luciferasa DLD1-Tg por GV3 y HAC-GV3. Como se muestra en la figura 6, se combinaron 50 nM de tetrámeros SIRP-alfa biotinilados con concentraciones de titulación de GV3 o HAC-GV3 en presencia de las células CD47+ PD-L1+. El porcentaje de la intensidad de fluorescencia media (% IFM) como lectura de la unión de SIRP-alfa se representa frente a la concentración logarítmica en M.

Ejemplo 9: Medición basada en citometría de flujo del bloqueo de las interacciones PD-1/PD-L1 en la superficie de las células PD-L1+ por HAC y HAC-GV3

En otro ejemplo de ensayo de bloqueo de CD47 basado en células, se utilizó citometría de flujo para medir el bloqueo de las interacciones PD-1/PD-L1 en la superficie de células de levadura PD-L1+ humanas por hAc y HAC-GV3. Como se muestra en la figura 7, se combinaron 100 nM de tetrámeros de PD-1 biotinilados con concentraciones de titulación de HAC o HAC-GV3 en presencia de células de levadura hPD-L1+. El porcentaje de intensidad de fluorescencia media (% IFM) como lectura de la unión de PD-1 se representa frente a la concentración logarítmica en M.

Ejemplo 10: Medición basada en citometría de flujo del bloqueo de interacciones PD-1/PD-L1 en la superficie de células C

- ediante HAC y HAC-GV3

En otro ejemplo de ensayo de bloqueo de CD47 basado en células, se utilizó citometría de flujo para medir el bloqueo de las interacciones PD-1/PD-L1 en la superficie de células CD47+ PD-L1+ GFP-luciferasa DLD1-Tg por hAc y HAC-GV3. Como se muestra en la figura 8, se combinaron 100 nM de tetrámeros de PD-1 biotinilados con concentraciones de titulación de HAC o HAC-GV3 en presencia de las células CD47+ PD-L1+. El porcentaje de intensidad de fluorescencia media (% IFM) como lectura de la unión de PD-1 se representa frente a la concentración logarítmica en M.

Ejemplo 11: La medición de la fagocitosis basada en FACS muestra que el microcuerpo GV3 y HAC-GV3 potencian la fagocitosis en una amplia gama de concentraciones de anticuerpos opsonizantes

Ejemplo 12: Ocupación y persistencia de HAC-GV3 y GV3

Los experimentos para determinar la ocupación y persistencia de HAC-GV3 y GV3 se resumen en la figura 10. Para probar la ocupación y persistencia de HAC-GV3 y GV3 NSG, se inyectaron ratones el día 0 con B16-F0 (por vía subcutánea), así como una mezcla de HL60 y HL60-Tg sin modificar (hPDL1, GFP) (por vía intravenosa). Los días 11, 12 y 13, a los ratones se les inyectó PBS, GV3 o HAC-GV3. Una hora o 24 horas después de la última inyección, se recogieron bazos o tumores de ratones sacrificados y las células se disociaron en suspensiones de células individuales en hielo sin el uso de digestión enzimática. Se usó FACS para analizar la unión del tetrámero SIRPA a esplenocitos de ratón, células tumorales sólidas de ratón (B16F0) o células tumorales humanas (HL60-Tg (hPDL1, GFP)).

La ocupación y persistencia de HAC-GV3 y GV3 se muestran en las figuras 11A-11D. Se demostró que HAC-GV3 tiene una mayor ocupación y persistencia en comparación con el control de GV3 y PBS en las células esplénicas totales a 1 hora y 24 horas (Figura 11A). Se observó que HAC-GV3 tenía una mayor ocupación y persistencia en comparación con el control de GV3 y PBS en células humanas aisladas del bazo a 1 hora y 24 horas (Figura 11B). Se demostró que HAC-GV3 tiene una mayor ocupación y persistencia en comparación con el control de GV3 y PBS en las células esplénicas totales a 1 hora y 24 horas (Figura 11C). Se demostró que HAC-GV3 tiene una mayor ocupación en comparación con el control de GV3 y PBS a 1 hora y 24 horas en células de melanoma B16-F0 aisladas de un tumor (Figura 11D).

Ejemplo 13: Ensayo clínico para probar el efecto de un polipéptido señuelo para el tratamiento del linfoma de células B

Este es un estudio prospectivo, abierto, controlado y aleatorizado para probar la seguridad y eficacia de un polipéptido señuelo para el tratamiento de pacientes con linfoma de células B en estadio IIIB o estadio IV. Para ser elegibles, los pacientes que entran en el ensayo habrán demostrado una enfermedad estable o una respuesta clínica después del tratamiento de primera línea (quimioterapia sola o quimioterapia y radioterapia) y tendrán un estado funcional ECOG de 0, 1 o 2. Después de un período de lavado de 3 semanas, los pacientes se estratificarán según el estado de la enfermedad y se asignarán aleatoriamente a un anticuerpo anti-CD20 (por ejemplo, rituximab) solo, o un anticuerpo anti-CD20 más polipéptido señuelo.

Se administrarán ocho tratamientos subcutáneos semanales con 10 mg/kg de un polipéptido señuelo en las semanas 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6 y 7. Todos los pacientes serán tratados adicionalmente con 375 mg/m2 de anti-CD20 en la semana 0 y 500 mg/m2 de anti-CD20 las semanas 1,2, 3, 4, 5, 6 y 7.

Las medidas de resultado primarias serán la documentación del perfil de seguridad del polipéptido señuelo y la comparación de la tasa de supervivencia de los pacientes en los dos brazos del ensayo. Las medidas de resultado secundarias serán medir la activación de la fagocitosis provocada por el polipéptido señuelo y evaluar la calidad de vida de los pacientes sometidos a inmunoterapia.

Ejemplo 14: Ensayo clínico para probar la dosis máxima tolerada y/o la dosis recomendada de polipéptido señuelo en pacientes con tumores sólidos avanzados

Este un estudio abierto, de fase I de aumento gradual de la dosis para evaluar la seguridad e inmunogenicidad de la vacunación a dosis repetidas con un polipéptido señuelo en pacientes con tumores sólidos en estadio 3 o 4 tratados previamente, incluyendo, aunque no de forma limitativa: cánceres de mama, de pulmón de células no microcíticas, de ovario, colorrectal, gástrico, de próstata, de células renales y de páncreas.

La Parte 1 evalúa los niveles de dosis crecientes del polipéptido señuelo administrados por vía subcutánea una vez cada dos semanas (Q2W) durante 8 semanas (para un total de 4 dosis) o una vez a la semana (QW) durante 8 semanas (para un total de 8 dosis), y utiliza un diseño de escalada de dosis 3 3 para identificar la dosis máxima tolerada (MTD) y/o la dosis recomendada (DR) para cada programa de dosificación, para una evaluación adicional en la Parte 2 del estudio. La parte 2 evalúa la seguridad, inmunogenicidad y actividad antitumoral potencial del polipéptido señuelo del Ejemplo 1 administrado durante 8 semanas en C2S y CW MTD/RD en cohortes de 15 pacientes cada una. Después del período de administración de 8 semanas, los pacientes son evaluados por seguridad, respuesta inmunitaria y respuesta tumoral a la semana 20.

La población de estudio incluye pacientes con tumores sólidos en estadio 3 o 4 tratados previamente.

Criterios de inclusión:

• 18-70 años de edad en el momento del consentimiento

• Esperanza de vida de al menos 6 meses, según la opinión del investigador

• Cáncer de mama, de pulmón de células no microcíticas, de ovario, colorrectal, gástrico, de próstata, de páncreas o de células renales u otro tipo de tumor confirmado histológicamente

• Evidencia de enfermedad persistente, recurrente o progresiva después de al menos un ciclo de terapia sistémica para enfermedad localmente avanzada o metastásica, incluyendo quimioterapia, terapia dirigida o inmunoterapia • Enfermedad en estadio clínico 3 o 4

• ECOG 0 o 1

• Parámetros de función hematológica, renal y hepática adecuados

Criterios de exclusión:

• Haber recibido tratamiento con cualquier quimioterapia sistémica, radiación o agente experimental dentro de las 4

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un polipéptido que comprende un polipéptido SIRP-gamma que comprende la secuencia EEELQX1IQPEKLLLVTVGKTATLHCTX2TSX3X4PX5GPX6X7WFRGX8GPGRX9LIYNX10X11X12GX13FPRVTTVSDX14X1 5KRNNMDFSIRISSITPADVGTYYCX16KFRKGX17PEX18VEFKSGPGTEMALGAKPS (SEQ ID NO: 2), en la que X1 es M, I, L o F; X2 es F, I o L; X3 es L, I, V, H, N o D; X4 es F, I, L o V; X5 es V, I, L, P, T o A; Xa es V o I; X7 es L o Q; X8 es V o A; X9 es E o V; X10 es Q, P, L, V, A o E; X11 es K o R; X12 es E, D, K, N, Q o H; X13 es H, P o R; X14 es L, I, V, P, T, A, R, S o G; X15 es T, I, N, F, S, Y, V, A o D; Xia es V o I; X17 es S, R, N, K, T, I o M; y X18 es N, K, D, E, H o Q.

2. El polipéptido de la reivindicación 1, en el que el polipéptido SIRP-gamma comprende una secuencia seleccionada de una de: SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21 y SEQ ID NO: 22.

3. El polipéptido de la reivindicación 1, en el que el polipéptido SIRP-gamma es al menos un 90 % idéntico a una secuencia de polipéptido SIRP-gamma de tipo salvaje y en el que el polipéptido SIRP-gamma se selecciona del grupo que consiste en: SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 23 y SEQ ID NO: 24.

4. El polipéptido de la reivindicación 1, en el que el polipéptido SIRP-gamma es una fusión de un polipéptido quimérico y en el que el polipéptido SIRP-gamma se fusiona con una secuencia polipeptídica que comprende un inhibidor del punto de control inmunitario, una molécula coestimuladora o una citocina o una citocina atenuada a través de una secuencia enlazadora.

5. El polipéptido de la reivindicación 4, en el que la secuencia enlazadora comprende GGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 29).

6. El polipéptido de la reivindicación 4, en el que el polipéptido SIRP-gamma está situado ya sea en el extremo N o en el extremo C de la secuencia polipeptídica que comprende el inhibidor del punto de control inmunitario, la molécula coestimuladora, la citocina o la citocina atenuada.

7. El polipéptido de la reivindicación 4, en el que el polipéptido inhibidor del punto de control inmunitario comprende una secuencia de un antagonista de PD-1 o PD-L1, un BTLA o un antagonista de CD160, o un antagonista de la fosfatidilserina, en donde el antagonista de fosfatidilserina se selecciona opcionalmente de MFGE8, TIM1, TIM3 o TIM4.

8. El polipéptido de la reivindicación 4, en el que el polipéptido de la molécula coestimuladora comprende una secuencia de un agonista de CD40, un agonista de 4-1BBL o de CD137.

9. El polipéptido de la reivindicación 4, en el que la citocina o la citocina atenuada son un polipéptido de citocina que comprende una secuencia de una IL2, en donde la IL2 comprende opcionalmente una secuencia polipeptídica que comprende las mutaciones D20T y F42A.

10. El polipéptido de una cualquiera de las reivindicaciones 4-9, en el que la fusión de un polipéptido quimérico comprende una secuencia seleccionada de:

SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38 o SEQ ID NO: 39.

11. El polipéptido de la reivindicación 1, en donde el polipéptido comprende además un anticuerpo opsonizante para permitir la fagocitosis o la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (CCDA) de la célula.

12. El polipéptido de la reivindicación 1, en donde el polipéptido bloquea la unión de CD47 a un ligando, en donde el ligando opcionalmente comprende SIRP-alfa, SIRP-gamma o trombospondina-1.

13. El polipéptido de la reivindicación 1, en el que el polipéptido SIRP-gamma es multimérico o monomérico.

14. El polipéptido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-13, para su uso en un método de tratamiento de cáncer, anemia, infección vírica, infección bacteriana, enfermedad autoinmunitaria, asma, alergia, rechazo de trasplante, aterosclerosis o fibrosis.

15. El polipéptido para el uso de la reivindicación 14, en el que el uso comprende modular la fagocitosis o la CCDA de una célula que expresa CD47.