ES2927234T3

ES2927234T3 - Cisteína proteasa

Info

Publication number: ES2927234T3
Application number: ES16707653T
Authority: ES
Inventors: Christian Kjellman; Sofia Jarnum; Emma Nordahl
Original assignee: Hansa Biopharma AB
Current assignee: Hansa Biopharma AB
Priority date: 2015-02-12
Filing date: 2016-02-12
Publication date: 2022-11-03
Anticipated expiration: 2036-02-12
Also published as: US11667905B2; KR20170116137A; US10696959B2; EA035130B1; AU2021266293A1; CA2976003A1; MX2017010390A; CN107532156A; LT3256580T; AU2016217800A1; CO2017009061A2; US20180023070A1; EA201791773A1; EP3256580A1; US20200283749A1; AU2016217800B2; GB201502306D0; US20230357741A1; PL3256580T3; KR102524613B1

Abstract

La presente invención se refiere a un polipéptido novedoso que presenta actividad de proteasa de cisteína IgG y usos in vivo y ex vivo del mismo. Los usos del polipéptido incluyen métodos para la prevención o el tratamiento de enfermedades y afecciones mediadas por IgG y métodos para el análisis de IgG. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Cisteína proteasa

Campo de la invención

La presente invención se refiere a un nuevo polipéptido que muestra actividad IgG cisteína proteasa, y sus usos in vivo y ex vivo. Los usos del polipéptido incluyen métodos para la prevención o el tratamiento de enfermedades y afecciones mediadas por IgG, y métodos para el análisis de IgG.

Antecedentes de la invención

IdeS (Enzima degradante de inmunoglobulina G de S. pyogenes) es una cisteína proteasa extracelular producida por el patógeno humano S. pyogenes. IdeS originariamente se aislaba de una cepa de Streptococcus grupo A de serotipo M1, pero ahora se ha identificado el gen ides en todas las cepas de Streptococcus grupo A probadas. IdeS tiene un extraordinariamente alto grado de especificidad de sustrato, siendo su único sustrato identificado IgG. IdeS cataliza una escisión proteolítica sencilla en la región bisagra inferior de las cadenas pesadas de todas las subclases de IgG humana. IdeS también cataliza una escisión equivalente de las cadenas pesadas de algunas subclases de IgG en diferentes animales. IdeS escinde de manera eficaz IgG en fragmentos Fc y F(ab')²por un mecanismo de dos fases. En la primera fase, se escinde una (primera) cadena pesada de IgG para generar una molécula de IgG escindida sencilla (scIgG) con una molécula de Fc unida no covalentemente. La molécula sclgG es de manera eficaz un producto intermedio que conserva la cadena pesada restante (segunda) de la molécula de IgG original. En la segunda fase del mecanismo esta segunda cadena pesada se escinde por IdeS par liberar un fragmento F(ab')²y un fragmento Fc homodimérico. Estos son los productos generalmente observados en condiciones fisiológicas. En condiciones reductoras el fragmento F(ab')²puede disociarse en dos fragmentos Fab y el Fc homodimérico puede disociarse en sus monómeros componentes.

ID de PDB: 2AU1 (https://www.rcsb.org) describe una estructura cristalina de una IdeS de S. pyogenes.

Sumario de la invención

Se ha demostrado que la capacidad de escisión de IgG de la IdeS tiene utilidad ex vivo, por ejemplo, en métodos para la producción de fragmentos Fab y Fc, que pueden usarse para el análisis de IgG. Véase, por ejemplo, los documentos WO2003051914 y WO2009033670. También se ha demostrado que IdeS tiene utilidad in vivo como agente terapéutico, puesto que es capa de la escisión in vivo de moléculas de IgG que median la enfermedad o que de otra manera son indeseables. Véase, por ejemplo, Los documentos WO2003051914, WO2006131347 y WO2013110946. IdeS puede usarse como una terapia para cualquier enfermedad o afección mediada completa o parcialmente por IgG. Muchas enfermedades autoinmunitarias están completa o parcialmente mediadas por IgG, como es el rechazo agudo de los órganos donados.

Sin embargo, IdeS es una proteína inmunogénica. Es decir, cuando IdeS se usa como agente terapéutico el sistema inmunitario del sujeto que recibe IdeS responderá a menudo a la misma. La reacción del sistema inmunitario a IdeS normalmente implicará la producción de anticuerpos específicos para IdeS. Estos anticuerpos pueden denominarse en el presente documento anticuerpos antifármaco (ADA) específicos para IdeS o "ADA específicos para IdeS". La respuesta inmunitaria a IdeS, en general, y la producción de ADA específicos para IdeS, en particular, pueden causar dos tipos relacionados de problemas. En primer lugar, puede reducirse la eficacia de IdeS, por ejemplo, debido a la unión a ADA, que potencialmente requiere mayor dosis o repetida para alcanzar el mismo efecto. Los ADA que tienen este efecto pueden denominarse ^{" a D a}neutralizantes". En segundo lugar, pueden haber complicaciones indeseadas o incluso dañinas, tales como una respuesta hiperinflamatoria desencadenada por complejos inmunitarios de ADA e IdeS. A mayor cantidad de ADA específicos para IdeS en un sujeto dado, mayor probabilidad de estos problemas. La presencia y la cantidad de moléculas de ADA específicos para IdeS en un paciente pueden determinarse por cualquier método adecuado, tal como una prueba CAP FEIA (ImmunoCAP) específica para agente o un ensayo de titulación realizados sobre una muestra de suero del paciente. Por encima de un umbral determinado por el médico, la cantidad de moléculas de ADA específicos para IdeS en el paciente puede excluir la administración de IdeS, o indicar que se requiere una mayor dosis de IdeS. Dicha dosis mayor puede a su vez dar como resultado una cantidad aumentada de moléculas de ADA específicos para IdeS en el paciente, excluyendo de este modo la administración adicional de IdeS.

IdeS es un factor de virulencia de S. pyogenes, que es responsable de infecciones comunes tipo tonsilitis y amigdalitis estreptocócica. Por consiguiente, la mayoría de los sujetos humanos han tenido IdeS en este contexto y es probable que tengan anticuerpos anti-IdeS en la corriente sanguínea. Los ADA específicos para IdeS habitualmente se detectan en muestras de suero de sujetos humanos aleatorios (probablemente debido a infecciones estreptocócicas anteriores), así como en preparaciones de IVIg (Inmunoglobulina intravenosa), que son preparaciones de IgG extraída del suero agrupado de miles de donantes. Incluso si un sujeto no posee ADA específicos para IdeS antes de una administración inicial de IdeS, es probable que se produzcan posteriormente dichas moléculas. Por tanto, para cualquier sujeto dado, es probable que los problemas asociados a la inmunogenicidad de IdeS presenten una barrera para el uso de IdeS como tratamiento. Estos problemas pueden requerir aumentar la dosis de IdeS y/o excluir el tratamiento con IdeS por completo, particularmente, si se requieren administraciones repetidas. Los enfoques existentes a los problemas de este tipo implican, por ejemplo, PEGilación de un agente terapéutico para reducir la inmunogenicidad o la coadministración del agente terapéutico con un agente inmunosupresor.

Los presentes inventores han adoptado un enfoque completamente diferente. Los inventores han identificado posiciones específicas dentro de la secuencia de IdeS que, cuando se modifican como se describe en el presente documento, conducen a nuevos polipéptidos para los cuales los problemas asociados a la inmunogenicidad se reducen en comparación con IdeS. Algunas modificaciones pueden aumentar la eficacia en la escisión por IgG del polipéptido de la invención en relación con IdeS, por lo que de este modo se reduce indirectamente la inmunogenicidad permitiendo el uso de una dosis o concentración inferior para alcanzar el mismo efecto. Como alternativa, o además, otras modificaciones pueden reducir directamente la inmunogenicidad reduciendo la capacidad de los anticuerpos específicos para IdeS para reconocer el polipéptido de la invención en relación con IdeS.

La secuencia completa de IdeS está a disposición del público como la secuencia de referencia de NCBI N.° WP_010922160.1 y se proporciona en el presente documento como SEQ ID NO: 1. Esta secuencia incluye una metionina N terminal seguida de una secuencia señal de secreción de 28 aminoácidos. La metionina N terminal y la secuencia señal (un total de 29 aminoácidos en el extremo N) normalmente se eliminan para formar la proteína IdeS madura, la secuencia que está a disposición del público como el n.° de acceso ADF13949.1 y se proporciona en el presente documento como SEQ ID NO: 2.

Salvo que se especifique lo contrario, todas las referencias a la numeración de las posiciones de los aminoácidos en los polipéptidos divulgados en el presente documento se basan en la numeración de las correspondientes posiciones en Se Q ID NO: 1, comenzando desde el extremo N. Por tanto, puesto que SEQ ID NO: 2 carece de la metionina N terminal y la secuencia señal de 28 aminoácidos de SEQ ID NO: 1, el residuo de ácido aspártico (D) en el extremo N de SEQ ID NO: 2 se denomina posición 30 ya que esta es la correspondiente posición en SEQ ID NO: 1. Al aplicar este esquema de numeración, el residuo más crítico para la actividad de la IgG cisteína proteasa de IdeS es la cisteína (C) en la posición 94 (65° residuo del extremo N de SEQ ID NO: 2). Otros residuos que son importantes para la actividad IgG cisteína proteasa son la lisina (K) en la posición 84, la histidina (H) en la posición 262 y el ácido aspártico (D) en cada una de las posiciones 284 y 286. Estos son los residuos 55°, 233er, 255° y 257° desde el extremo N de SEQ ID NO: 2, respectivamente.

De acuerdo con la presente invención, por tanto, se proporciona un polipéptido que tiene actividad IgG cisteína proteasa y que comprende una variante de la secuencia de SEQ ID NO: 2, dicha variante:

(a) es al menos un 50 % idéntica a SEQ ID NO: 2;

(b) tiene una cisteína (C) en la posición en dicha secuencia variante que corresponde a la posición 94 de SEQ ID NO: 1; y

(c) tiene, en las posiciones en dicha secuencia variante que corresponden a las posiciones 84, 262, 284 y 286 de SEQ ID NO: 1, una lisina (K), una histidina (H), un ácido aspártico (D) y un ácido aspártico (D), respectivamente;

en donde dicho polipéptido es al menos 1,5 veces más eficaz en la escisión de IgG que IdeS cuando se mide en el mismo ensayo y es menos inmunogénico que IdeS; en donde, además, dicha variante de SEQ ID NO: 2:

(1) tiene un aminoácido positivamente cargado en la posición en dicha variante que corresponde a la posición 130 de SEQ ID NO: 1, opcionalmente, en donde dicho aminoácido positivamente cargado es arginina (R) o lisina (K); y/o

(2) tiene un aminoácido positivamente cargado en la posición en dicha variante que corresponde a la posición 131 de SEQ ID NO: 1, opcionalmente, en donde dicho aminoácido positivamente cargado es arginina (R) o lisina (K); y/o

(3) no incluye la secuencia contigua NQTN; y/o

(4) ha eliminado en su totalidad los primeros veinte residuos en el extremo N de SEQ ID NO: 2 (que comprenden la secuencia contigua DSFSANQEIR YSEVTPYHVT; SEQ ID NO: 19).

El polipéptido de la invención puede ser más eficaz en la escisión de IgG1 que IgG2.

La invención también proporciona un polinucleótido, un vector de expresión o una célula hospedadora que codifica o expresa un polipéptido de la invención.

La invención también proporciona el polipéptido de la invención para su uso en un método para tratar o prevenir una enfermedad o afección mediada por anticuerpos IgG en un sujeto, comprendiendo el método administrar al sujeto una cantidad terapéutica o profilácticamente eficaz de un polipéptido de la invención. El método normalmente puede comprender administraciones múltiples de dicho polipéptido al sujeto.

La invención también proporciona un método para tratar, ex vivo, sangre extraída de un paciente, normalmente un paciente que padece de una enfermedad o afección mediada por anticuerpos IgG, dicho método comprende poner en contacto la sangre con un polipéptido de la invención.

La divulgación también proporciona un método para mejorar el beneficio a un sujeto de una terapia o agente terapéutico, comprendiendo el método (a) administrar al sujeto un polipéptido de la invención; y (b) posteriormente administrar dicha terapia o dicho agente terapéutico al sujeto; en donde:

- dicha terapia es un trasplante de órgano o dicho agente terapéutico es un anticuerpo, una terapia génica tal como un vector vírico, un reemplazo para un factor endógeno defectuoso tal como una enzima, un factor de crecimiento o factor de coagulación, o una terapia celular;

- la cantidad de dicho polipéptido administrado es suficiente para escindir substancialmente todas las moléculas de IgG presentes en el plasma del sujeto; y

- las etapas (a) y (b) se separan por un intervalo de tiempo que es suficiente para escindir substancialmente todas las moléculas de IgG presentes en el plasma del sujeto.

La invención también proporciona un método para generar fragmentos Fc, Fab o F(ab')²de IgG que comprende poner en contacto IgG con un polipéptido de la invención, ex vivo.

También se divulgan kits para llevar a cabo los métodos de acuerdo con la invención.

Breve descripción de las figuras

La Figura 1 muestra los resultados de un ensayo representativo para determinar la potencia (eficacia en la escisión de IgG) de polipéptidos de la invención en comparación con controles.

La Figura 2 muestra los resultados de un gel de SDS-PAGE representativa usado para visualizar los productos de escisión producidos por la incubación de IgG1 con polipéptidos de la invención o controles.

La Figura 3 muestra los resultados de un gel de SDS-PAGe representativa usado para visualizar los productos de escisión producidos por la incubación de IgG1 con polipéptidos adicionales de la invención o controles.

La Figura 4 muestra los resultados de un gel de SDS-PAGE representativa usado para visualizar los productos de escisión producidos por la incubación de IgG2 con polipéptidos de la invención o controles.

Las Figuras 5 y 6 muestran los resultados de ensayos de competición representativos para determinar el nivel de reconocimiento de polipéptidos de la invención por anticuerpos específicos para IdeS, en comparación con los controles.

La Figura 7 muestra curvas de titulación representativas para la escisión de IgG1 mediante diferentes polipéptidos de IgG cisteína proteasa.

La Figura 8 muestra curvas de titulación representativas para la escisión de IgG2 mediante diferentes polipéptidos de IgG cisteína proteasa.

La Figura 9 muestra los resultados de una SDS-PAGE representativa usada para visualizar los productos de escisión producidos por incubación de IgG con polipéptidos de la invención o controles.

La Figura 10 muestra los resultados de una SDS-PAGE representativa usada para visualizar los productos de escisión producidos por incubación de IgG con polipéptidos de la invención o controles.

La Figura 11 muestra los resultados de una SDS-PAGE representativa usada para visualizar los productos de escisión producidos por incubación de IVIg con polipéptidos de la invención o controles.

La Figura 12 muestra los resultados de una SDS-PAGE representativa usada para visualizar los productos de escisión producidos por incubación de IVIg con polipéptidos de la invención o controles.

Figura 13. Representación esquemática de la escisión de inmunoglobulinas por polipéptidos de la invención. La Figura 14 muestra los resultados de un % de competición representativo de sitios de unión a ADA con polipéptidos de la invención o controles.

La Figura 15 muestra los resultados de un % de competición representativo adicional de los sitios de unión a ADA con polipéptidos de la invención o controles.

La Figura 16 muestra los resultados de un ELISA de la eficacia representativo usado para determinar la eficacia de los polipéptidos de la invención en la escisión de IgG humana in vivo.

La Figura 17 muestra los resultados de una SDS-PAGE representativa usada para visualizar los productos de escisión de IgG producidos in vivo por los polipéptidos de la invención.

Breve descripción de las secuencias

SEQ ID NO: 1 es la secuencia completa de IdeS que incluye la metionina N terminal y la secuencia señal. También se divulga como la secuencia de referencia de NCBI N.° W p_010922160.1

SEQ ID NO: 2 es la secuencia madura de IdeS, que carece de la metionina N terminal y la secuencia señal. También se divulga como el n.° de acceso de Genbank ADF13949.1

SEQ ID NO: 3 a 16 son las secuencias de los polipéptidos ilustrativos de la invención

SEQ ID NO: 17 es la secuencia de un polipéptido de IdeS usado en el presente documento como control. Comprende la secuencia de SEQ ID NO: 2 con una metionina N terminal adicional y una etiqueta de histidina (referencia interna pCART124).

SEQ ID NO: 18 es la secuencia contigua NQTN, que corresponde a las posiciones 336-339 de SEQ ID NO: 1. SEQ ID NO: 19 es la secuencia contigua DSFS^aN^qEIR YSEVTPYHVT, que corresponde a las posiciones 30-49 de SEQ ID NO: 1.

SEQ ID NO: 20 a 34 son secuencias nucleotídicas que codifican los polipéptidos divulgados en el presente documento.

SEQ ID NO: 35 es la secuencia SFSANQEIRY SEVTPYHVT, que corresponde a las posiciones 31-49 de SEQ ID NO: 1.

SEQ ID NO: 36 es la secuencia DYQRNATEAY AKEVPHQIT, que corresponde a las posiciones 36-54 del polipéptido de IdeZ de la secuencia de referencia de NCBI N.° WP_014622780.1.

Se Q ID NO: 37 es la secuencia DDYQRNATEA YAKEVPHQIT, que puede estar presente en el extremo N de un polipéptido de la invención.

Descripción detallada de la invención

Debe entenderse que diferentes aplicaciones de los productos y métodos divulgados pueden adaptarse a las necesidades específicas de la técnica. También debe entenderse que la terminología usada en el presente documento tiene únicamente el fin de describir realizaciones particulares de la invención y no se pretende que sea limitante.

Además, como se usa en la presente memoria descriptiva y en las reivindicaciones adjuntas, las formas en singular "un", "una", "el" y "la" incluyen las referencias en plural salvo que el contenido indique claramente lo contrario. Por tanto, por ejemplo, la referencia a "un polipéptido" incluye "polipéptidos" y similares.

Un "polipéptido" se usa en el presente documento en su sentido más amplio para hacer referencia a un compuesto de dos o más subunidades de aminoácidos, análogos de aminoácidos u otros peptidomiméticos. El término "polipéptido" incluye por tanto secuencias de péptidos cortos y también polipéptidos y proteínas más largos. Como se usa en el presente documento, el término "aminoácido" se refiere a aminoácidos naturales y/o no naturales o sintéticos, incluyendo tanto los isómeros ópticos D o L como análogos de aminoácidos y peptidomiméticos.

Los términos "paciente" y "sujeto" se usan indistintamente y normalmente se refieren a un ser humano. Las referencias a IgG normalmente se refieren a IgG humana salvo que se especifique lo contrario.

Características funcionales del polipéptido

La presente invención se refiere a un nuevo polipéptido que tiene actividad IgG cisteína proteasa, en donde dicho polipéptido es más eficaz en la escisión de IgG que IdeS y/o es menos inmunogénico que IdeS. En el contexto de un control o una comparación en relación con un polipéptido de la invención, "IdeS" se refiere a un polipéptido que consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2. Como alternativa, o además, "IdeS" cuando se usa como control o una comparación puede referirse a un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 con un residuo de metionina (M) adicional en el extremo N y/o una etiqueta en el extremo C para ayudar con la expresión en y el aislamiento de sistemas de expresión bacterianos convencionales. Las etiquetas adecuadas incluyen una etiqueta de histidina que puede unirse directamente al extremo C de un polipéptido o unirse indirectamente por cualquier secuencia conectora adecuada, tal como 3, 4 o 5 residuos de glicina. La etiqueta de histidina normalmente consiste en seis residuos de histidina, aunque puede ser mayor que esta, normalmente hasta 7, 8, 9, 10 o 20 aminoácidos o menor, por ejemplo, 5, 4, 3, 2 o 1 aminoácidos. La secuencia de un polipéptido de IdeS ilustrativo usado en el presente documento es un control que se proporciona como SEQ ID NO: 14. Este polipéptido comprende la secuencia de SEQ ID NO: 2 con una metionina N terminal adicional y una etiqueta de histidina y puede denominarse en el presente documento pCART124.

La actividad IgG cisteína proteasa puede evaluarse mediante cualquier método adecuado, por ejemplo, incubando un polipéptido con una muestra que contiene IgG y determinando la presencia de los productos de escisión de IgG. La eficacia puede evaluarse en presencia o ausencia de un inhibidor, tal como un anticuerpo neutralizante. Sin embargo, la eficacia en el presente documento normalmente significará la eficacia evaluada en ausencia de dicho inhibidor salvo que se especifique lo contrario. Los métodos adecuados se describen en los Ejemplos. La eficacia de un polipéptido en la escisión de IgG puede denominarse en el presente documento como "la potencia" del polipéptido. La potencia de un polipéptido de la invención es normalmente al menos 1,5 veces, 2,0 veces, 2,5 veces, 3,0 veces, 4,0 veces, 4,5 veces, 5,0 veces, 6,0 veces, 7,0 veces o 7,5 veces mayor que la potencia de IdeS medida en el mismo ensayo. La potencia de un polipéptido de la invención es preferentemente al menos 4,5 veces, más preferentemente al menos 6,0 veces y lo más preferentemente al menos 7,5 veces mayor que la potencia de IdeS medida en el mismo ensayo. La potencia aumentada en relación con IdeS es una mejora deseable independientemente de los problemas asociados a la inmunogenicidad de IdeS. Sin embargo, dicha potencia aumentada normalmente también será capaz del uso de una dosis inferior de un polipéptido de la invención para el mismo efecto terapéutico que una dosis mayor de IdeS. La dosis inferior puede permitir también un mayor número de administraciones repetidas de un polipéptido de la invención en relación con IdeS. Esto es debido a que el uso de una dosis inferior reduce los problemas asociados a la inmunogenicidad de un agente terapéutico, debido a que es menos probable que el sistema inmunitario responda, o responderá menos vigorosamente, a un agente que está presente en una concentración inferior. Por lo tanto, un polipéptido de la invención puede ser tan inmunogénico como IdeS o incluso más inmunogénico que IdeS cuando está presente a una dosis equivalente, pero se reducen o evitan los problemas asociados a esta inmunogenicidad debido a que se requiere una dosis inferior para alcanzar el mismo efecto terapéutico. En una realización alternativa, un polipéptido de la invención puede tener potencia equivalente a IdeS siempre y cuando sea menos inmunogénico que IdeS cuando está presente a una dosis equivalente.

Los ensayos para evaluar la eficacia de un polipéptido en la escisión de IgG, es decir, ensayos para evaluar la potencia de un polipéptido, son bien conocidos en la técnica y puede usarse cualquier ensayo adecuado. Los ensayos adecuados incluyen un ensayo basado en ELISA, tal como el descrito en los Ejemplos. En dicho ensayo, los pocillos de una placa de ensayo normalmente se recubrirán con una diana anticuerpo, tal como albúmina de suero bovino (BSA). Las muestras del polipéptido a probar, a continuación, se añaden a los pocillos, seguido por muestras de anticuerpo específico a diana que es específico para BSA en este ejemplo. Se deja que el polipéptido y el anticuerpo interactúen en condiciones adecuadas para la actividad IgG cisteína proteasa. Después de un intervalo adecuado, se lavará la placa de ensayo y se añadirá un anticuerpo detector que se une específicamente al anticuerpo específico a diana en condiciones adecuadas para unirse al anticuerpo específico a diana. El anticuerpo detector se unirá a cualquier anticuerpo específico a diana que se ha unido a la diana en cada pocillo. Después del lavado, la cantidad de anticuerpo detector presente en un pocillo será proporcional a la cantidad de anticuerpo específico a diana unido a ese pocillo. El anticuerpo detector puede conjugarse directa o indirectamente a un marcador u otro sistema informador (tal como una enzima), de modo que pueda determinarse la cantidad de anticuerpo detector restante en cada pocillo. A mayor potencia del polipéptido probado que estaba en un pocillo, quedará menos anticuerpo específico a diana intacto y, por tanto, habrá menos anticuerpo detector. Normalmente, al menos un pocillo en una placa de ensayo dada incluirá IdeS en lugar de un polipéptido a probar, de modo que la potencia de los polipéptidos probados pueden compararse directamente con la potencia de IdeS. El polipéptido de la invención puede ser más eficaz en la escisión de IgG1 que IgG2.

Otros ensayos pueden determinar la potencia de un polipéptido probado visualizando y/o cuantificando directamente los fragmentos de IgG que resultan de la escisión de IgG mediante un polipéptido ensayado. También se describe un ensayo de este tipo en los Ejemplos. Dicho ensayo normalmente incubará una muestra de IgG con un polipéptido de prueba (o con IdeS como control) en distintas concentraciones en una serie de titulación. A continuación, los productos que resultan de la incubación en cada concentración se separan usando electroforesis en gel, por ejemplo, mediante SDS-PAGE. A continuación, la IgG completa y los fragmentos que resultan de la escisión de IgG se pueden identificar por tamaño y cuantificar por la intensidad de tinción con un colorante adecuado. A mayor cantidad de fragmentos de escisión, mayor potencia de un polipéptido ensayado a una concentración dada. Un polipéptido de la invención producirá normalmente cantidades detectables de fragmentos de escisión a una concentración inferior (un punto inferior en las series de titulación) que IdeS. Este tipo de ensayo también puede posibilitar la identificación de polipéptidos de prueba que son más eficaces en la escisión de la primera y la segunda cadena pesada de una molécula de IgG, ya que también se pueden determinar las cantidades de los diferentes fragmentos que resultan de cada acontecimiento de escisión. Este tipo de ensayo también puede adaptarse para determinar el alcance al que la presencia de ADA específicos para IdeS puede reducir la potencia de un polipéptido de la invención. En el ensayo adaptado, cuando se incuba una muestra de IgG con un polipéptido de prueba (o con IdeS como control), se incluye suero o una preparación de IVIg que contiene ADA específicos para IdeS con el medio de reacción. Preferentemente, la potencia de un polipéptido de la invención no está afectada por la presencia de ADA o se reduce menos por la presencia de ADA que la potencia de IdeS en el mismo ensayo. En otras palabras, preferentemente, el efecto neutralizante de ADA específicos para IdeS sobre el polipéptido de la invención es el mismo o inferior que el efecto neutralizante de ADA específicos para IdeS sobre IdeS, medido en el mismo ensayo.

Como se ha indicado anteriormente, un polipéptido de la invención puede ser tan inmunogénico como IdeS o incluso más inmunogénico que IdeS cuando está presente a una dosis equivalente, debido a que se reducen o evitan los problemas asociados a esta inmunogenicidad puesto que se requiere una dosis inferior del polipéptido de la invención para alcanzar el mismo efecto terapéutico. Sin embargo, normalmente un polipéptido de la invención no es más inmunogénico que IdeS y preferentemente es menos inmunogénico que IdeS. Es decir, un polipéptido de la invención puede dar como resultado la misma respuesta inmunitaria que IdeS o preferentemente una inferior cuando está presente a una dosis o concentración equivalente y medida en el mismo ensayo. La inmunogenicidad de un polipéptido de la invención normalmente es de no más del 90 %, no más del 85 %, no más del 80 %, no más del 70 %, no más del 60 % o no más del 50 % de la inmunogenicidad de IdeS medida en el mismo ensayo. Preferentemente, la inmunogenicidad de un polipéptido de la invención es de no más del 85 % de la inmunogenicidad de IdeS medida en el mismo ensayo. Más preferentemente, la inmunogenicidad de un polipéptido de la invención es de no más del 70 % de la inmunogenicidad de IdeS medida en el mismo ensayo.

Los ensayos para evaluar la inmunogenicidad de un polipéptido son bien conocidos en la técnica y se puede usar cualquier ensayo adecuado. Los ensayos preferidos para evaluar la inmunogenicidad de un polipéptido en relación con la inmunogenicidad de IdeS implica evaluar el alcance al que los ADA específicos para IdeS también se unen a un polipéptido de la invención. Se describen ensayos de este tipo en los Ejemplos.

Uno de dichos ensayos implica ensayar la competición entre IdeS y un polipéptido de prueba para unirse a ADA específicos para IdeS. Normalmente, los pocillos de una placa de ensayo se recubren con IdeS, seguido de la administración de una mezcla previamente incubada de una solución que contiene ADA específicos para IdeS, por ejemplo, una preparación de IVIg, y un polipéptido de prueba (o IdeS como control). La incubación previa tiene lugar en presencia de un inhibidor de actividad IgG cisteína proteasa, por ejemplo, ácido yodoacético (IHAc), y a alta concentración de sal de modo que solo se permite unión de alta afinidad entre proteína y ADA. La mezcla previamente incubada se deja interactuar con los pocilios recubiertos con IdeS. Cualquier ADA específico para IdeS no unido al péptido de prueba se unirá al IdeS sobre los pocillos. Después de un intervalo adecuado, se lavará la placa de ensayo y se añadirá un anticuerpo detector que se une específicamente a IgG en condiciones adecuadas para la unión. El anticuerpo detector se unirá a cualquier ADA que se haya unido a IdeS en cada pocillo. Después del lavado, la cantidad de anticuerpo detector presente en un pocillo será inversamente proporcional a la cantidad de ADA que se había unido al polipéptido de prueba. El anticuerpo detector puede conjugarse directa o indirectamente a un marcador u otro sistema informador (tal como una enzima), de modo que pueda determinarse la cantidad de anticuerpo detector restante en cada pocillo. Normalmente, al menos un pocillo en una placa de ensayo dada se probará con una mezcla previamente incubada de IVIg y IdeS en lugar de un polipéptido a probar, de modo que la unión de ADA a los polipéptidos probados pueden compararse directamente con la unión a IdeS.

Otro ensayo adecuado implica ensayar el alcance al cual una serie de titulación de diferentes concentraciones de ADA específicos para IdeS, por ejemplo, una preparación de IVIg, se une a un polipéptido de prueba en comparación con IdeS. Preferentemente, un polipéptido de la invención requerirá una mayor concentración de ADA para que la unión sea detectable, en relación con la concentración de ADA para que la unión a IdeS sea detectable. Dicho ensayo se describe en los Ejemplos. Dicho ensayo normalmente implica recubrir los pocillos de una placa de ensayo con polipéptido de prueba o IdeS, seguido de la incubación con cada pocillo con una concentración diferente de ADA específicos para IdeS de una serie de titulación. Las incubaciones se realizan en presencia de un inhibidor de la actividad de la IgG cisteína proteasa, por ejemplo, ácido yodoacético (IHAc), y a alta concentración de sal de modo que solo se permite unión de alta afinidad entre proteína y ^{A d a .}Después de un intervalo adecuado, la placa de ensayo se lavará la placa de ensayo y se añadirá un anticuerpo detector que se une específicamente a F(ab')²de IgG en condiciones adecuadas para la unión. El anticuerpo detector se unirá a cualquier ^{a D a}que se haya unido al polipéptido de prueba o IdeS en cada pocillo. Después del lavado, la cantidad de anticuerpo detector presente en un pocillo será directamente proporcional a la cantidad de ADA que se había unido al polipéptido de prueba o IdeS. El anticuerpo detector puede conjugarse directa o indirectamente a un marcador u otro sistema informador (tal como una enzima), de modo que pueda determinarse la cantidad de anticuerpo detector restante en cada pocillo. Al menos un pocillo de una placa de ensayo dada se incubará con tampón sin ADA como blanco para estabilizar un nivel umbral para la detección de la unión en los pocillos de ensayo.

Características estructurales del polipéptido

Esta sección expone las características estructurales de un polipéptido de la invención, que se aplica además a las características funcionales explicadas a grandes rasgos en la sección anterior.

El polipéptido de la invención normalmente tiene una longitud de al menos 100, 150, 200, 250, 260, 270, 280, 290 o 300 aminoácidos. El polipéptido de la invención normalmente no es mayor de una longitud de 400, 350, 340, 330, 320 o 310 aminoácidos. Se apreciará que cualquiera de los límites inferiores anteriormente enumerados se pueden combinar con cualquiera de los límites superiores anteriormente enumerados para proporcionar un intervalo para la longitud del polipéptido de la invención. Por ejemplo, el polipéptido puede tener una longitud de 100 a 400 aminoácidos o una longitud de 250 a 350 aminoácidos. El polipéptido tiene una longitud preferentemente de 290 y 320 aminoácidos, lo más preferentemente una longitud de 300 a 310 aminoácidos.

La estructura primaria (secuencia de aminoácidos) de un polipéptido de la invención se basa en la estructura primaria de IdeS, específicamente la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2. La secuencia de un polipéptido de la invención comprende una variante de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 que es al menos un 50 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2. La secuencia variante puede ser al menos un 60 %, al menos un 70 %, al menos un 80 %, al menos, un 85 %, preferentemente al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2. La variante puede ser idéntica a la secuencia de SEQ ID NO: 2 excepto la inclusión de una o más de las modificaciones específicas identificadas en el presente documento. La identidad relativa a la secuencia de SEQ ID NO: 2 se puede medir en una región de al menos 50, al menos 100, al menos 200, al menos 300 o más aminoácidos contiguos de la secuencia mostrada en SEQ ID NO: 2 o más preferentemente en la longitud completa de SEQ ID NO: 2.

La identidad de aminoácidos se puede calcular usando cualquier algoritmo adecuado. Por ejemplo, los algoritmos PILEUP y BLAST se pueden usar para calcular la identidad o alinear secuencias (tal como identificar secuencias equivalentes o correspondientes (normalmente en su configuración predeterminada), por ejemplo, como se describe en Altschul S. F. (1993) J. Mol. Evol. 36:290-300; Altschul, S, F et al (1990) J Mol Biol 215:403-10. El programa informático para realizar análisis BLAST está públicamente disponible a través del "National Center for Biotechnology Information" (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). Este algoritmo implica identificar primero un par de secuencias de alta puntuación (HSP) identificando palabras cortas de longitud W en la secuencia de consulta que coinciden o satisfacen alguna puntuación de umbral de valor positivo T cuando se alinean con una palabra de la misma longitud en una secuencia de base de datos. T se refiere al umbral de la puntuación de palabra vecina (Altschul et al., véase anteriormente). Estos aciertos de palabra vecina iniciales actúan como semillas para iniciar búsquedas para encontrar HSP que los contengan. Los aciertos de palabra se extienden en ambas direcciones a lo largo de cada secuencia hasta donde pueda aumentarse la puntuación de alineación acumulativa. Las extensiones de los aciertos de palabra en cada dirección se detienen cuando: la puntuación de alineación acumulativa queda fuera por la cantidad X de su valor máximo alcanzado; la puntuación acumulativa llega a cero o menos, debido a la acumulación de una o más alineaciones de residuos con puntuación negativa; o se alcanza el final de una de las secuencias. Los parámetros del algoritmo BLAST W, T y X determinan la sensibilidad y la velocidad de la alineación. El programa BLAST usa por defecto una longitud de palabra (W) de 11, la matriz de puntuación BLOSUM62 (véase Henikoff y Henikoff (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10915-10919) alineaciones (b ) de 50, previsión (E) de 10, M=5, N=4 y una comparación de ambas cadenas.

El algoritmo BLAST realiza un análisis estadístico de la similitud entre dos secuencias; véase, por ejemplo, Karlin y Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5873-5787. Una medida de la similitud proporcionada por el algoritmo BLAST es la probabilidad de suma más pequeña (P(N)), que proporciona una indicación de la probabilidad por la que se produciría una coincidencia entre dos secuencias polinucleotídicas o de aminoácidos por casualidad. Por ejemplo, una secuencia se considera similar a otra secuencia si la probabilidad de suma más pequeña en comparación de la primera secuencia con la segunda secuencia es menos de aproximadamente 1, preferentemente menos de aproximadamente 0,1, más preferentemente menos de aproximadamente 0,01 y lo más preferentemente menos de aproximadamente 0,001. Como alternativa, el paquete UWGCG proporciona el programa BESTFIT que puede usarse para calcular la identidad (por ejemplo, usado en su configuración predeterminada) (Devereux et al. (1984) Nucleic Acids Research 12, 387-395).

La secuencia de un polipéptido de la invención comprende una variante de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 en la que las modificaciones, tales como adiciones, deleciones o sustituciones de aminoácidos se realizan en relación con la secuencia de SEQ ID NO: 2. Salvo que se especifique lo contrario, preferentemente, las modificaciones son sustituciones de aminoácidos conservativas. Las sustituciones conservativas remplazan los aminoácidos por otros aminoácidos de estructura química similar, propiedades químicas similares o volumen de cadenas laterales similar. Los aminoácidos introducidos pueden tener polaridad, hidrofilicidad, hidrofobicidad, basicidad, acidez, neutralidad o carga similar a los aminoácidos que remplazan. Como alternativa, la sustitución conservativa puede introducir otro aminoácido que sea aromático o alifático en el lugar de un aminoácido aromático o alifático preexistente. Los cambios conservativos de aminoácidos son bien conocidos en la técnica y se pueden seleccionar de acuerdo con las propiedades de los 20 aminoácidos principales como se define en la Tabla a 1, a continuación. Cuando los aminoácidos tienen una polaridad similar, esto también se puede determinar por referencia a la escala de hidropatía para cadenas laterales de aminoácidos en la Tabla A2.

T l A1 - Pr i ími min i

Tabla A2 - Escala de hidropatía

Cadena lateral Hidropatía

Ile 4,5

Val 4,2

Leu 3,8

Phe 2,8

Cys 2,5

Met 1,9

Ala 1,8

Gly -0,4

Thr -0,7

Ser -0,8

Trp -0,9

Tyr -1,3

Pro -1,6

(continuación)

Cadena lateral Hidropatía

His -3,2

Glu -3,5

Gln -3,5

Asp -3,5

Asn -3,5

Lys -3,9

Arg -4,5

La secuencia de aminoácidos de un polipéptido de la invención comprende una variante de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2. Sin embargo, determinados residuos en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 preferentemente se conservan dentro de dicha secuencia variante. Por ejemplo, dicha secuencia variante normalmente conserva determinados residuos que se sabe que son requeridos para la actividad IgG cisteína proteasa. Por tanto, la cisteína en la posición 94 de SEQ ID NO: 1 debe conservarse (residuo 65° de SEQ ID NO: 2) en la secuencia de aminoácidos de un polipéptido de la invención. Opcionalmente, también se conservan la lisina en la posición 84, la histidina en la posición 262 y el ácido aspártico en cada una de las posiciones 284 y 286 de SEQ ID NO: 1. Estos son los residuos 55°, 233er, 255° y 257° de SEQ ID NO: 2, respectivamente. Por tanto, un polipéptido de la invención normalmente comprende una variante de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 que tiene una cisteína (C) en la posición en dicha secuencia variante que corresponde a la posición 94 de SEQ ID NO: 1; y tiene, en las posiciones en dicha secuencia variante que corresponden a las posiciones 84, 262, 284 y 286 de SEQ ID NO: 1, una lisina (K), una histidina (H), un ácido aspártico (D) y un ácido aspártico (D), respectivamente;

Comenzando con las anteriores limitaciones estructurales, los inventores identificaron posiciones específicas para la modificación para ajustar las propiedades funcionales de IdeS evaluando un modelo tridimensional de IdeS. Los inventores han identificado lo siguiente:

(1) El reemplazo de la asparagina (N) en la posición 130 de SEQ ID NO: 1 por un aminoácido positivamente cargado aumenta la potencia de un polipéptido que incorpora este cambio. Por tanto, un polipéptido de la invención puede comprender una variante de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 que tiene un aminoácido positivamente cargado en la posición en dicha secuencia variante que corresponde a la posición 130 de SEQ ID NO: 1. Los aminoácidos positivamente cargados comunes se identifican en la Tabla A1 anterior. El aminoácido positivamente cargado preferentemente es arginina (R) o lisina (K). Por consiguiente, esta modificación particular puede identificarse en el presente documento mediante el término "N130R/K".

(2) El reemplazo de la glicina (G) en la posición 131 de SEQ ID NO: 1 por un aminoácido positivamente cargado aumenta la potencia de un polipéptido que incorpora este cambio. Por tanto, un polipéptido de la invención puede comprender una variante de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 que tiene un aminoácido positivamente cargado en la posición en dicha secuencia variante que corresponde a la posición 131 de SEQ ID NO: 1. Los aminoácidos positivamente cargados comunes se identifican en la Tabla A1 anterior. El aminoácido positivamente cargado preferentemente es arginina (R) o lisina (K). Por consiguiente, esta modificación particular puede identificarse en el presente documento mediante el término "G131R/K".

(3) La eliminación de los últimos cuatro residuos en el extremo C de SEQ ID NO: 2 aumenta la potencia de un polipéptido que incorpora este cambio. Los últimos cuatro residuos en el extremo C de SEQ ID NO: 2 consiste en la secuencia contigua NQTN. Por tanto, un polipéptido de la invención puede comprender una variante de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 que no incluye la secuencia contigua NQTN. Es decir, los últimos cuatro residuos en el extremo C de SEQ ID NO: 2 pueden estar ausentes de dicha variante de SEQ ID NO: 2. Los últimos cuatro residuos de SEQ ID NO: 2 corresponden a las posiciones 336-339 de SEQ ID NO: 1. Por consiguiente, esta modificación particular puede identificarse en el presente documento mediante el término "N336_N339del".

(4) La eliminación o alteración de la secuencia de los primeros veinte residuos en el extremo N de SEQ ID NO: 2 puede aumentar la potencia de un polipéptido que incorpora este cambio y/o puede reducir la inmunogenicidad sin afectar negativamente a la potencia.

Los primeros veinte residuos en el extremo N de SEQ ID NO: 2 consisten en la secuencia contigua DSFSANQEIRYSEVTPYHVT (SEQ ID NO: 19). Por tanto, un polipéptido de la invención puede comprender una variante de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 que no incluye la secuencia contigua DSFSANQEIRYSEVTPYHVT.

A modo de ejemplo, dicha secuencia contigua de SEQ ID NO: 19 puede eliminarse en su totalidad. Es decir, los primeros veinte residuos en el extremo N de SEQ ID NO: 2 pueden estar ausentes de dicha variante de SEQ ID NO: 2. Los primeros veinte residuos de SEQ ID NO: 2 corresponden a las posiciones 30-49 de SEQ ID NO: 1. Por consiguiente, la deleción de esta secuencia contigua puede identificarse en el presente documento mediante el término "D30_T49del".

Como alternativa, un polipéptido de la invención puede comprender una variante de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 en la que la secuencia de los primeros veinte residuos en el extremo N de SEQ ID NO: 2 se altera reemplazando uno o más aminoácidos en dichos primeros veinte residuos. La secuencia alterada preferentemente ha reducido la inmunogenicidad en comparación con los primeros veinte aminoácidos de SEQ ID NO: 2. A modo de ejemplo, los aminoácidos en las posiciones 2 a 20 de SEQ ID NO: 2 (que corresponden a las posiciones 31-49 de SEQ ID NO: 1) pueden reemplazarse opcionalmente con la secuencia contigua DYQRNATEAY AKEVPHQIT (SEQ ID NO: 36). En otras palabras, los primeros veinte aminoácidos de un polipéptido de la invención pueden consistir en la secuencia DDYQRNATEA YAk Ev PHQIT (SEQ ID NO: 37) en lugar de la secuencia de SEQ ID NO: 19. La secuencia insertada SEQ ID NO: 36 se toma desde la región N terminal de IdeZ y corresponde a las posiciones 36-54 de la secuencia de Referencia de NCBI N.° WP_014622780.1 de IdeZ. Los sujetos humanos normalmente no expresan anticuerpos para IdeZ, y así un polipéptido que incluye esta secuencia es menos propenso a ADA. El reemplazo de SEQ ID NO: 35 por SEQ ID NO: 37 puede identificarse en el presente documento mediante el término "S31_T49replZ".

Por lo tanto, brevemente, un polipéptido de la invención comprende una variante de la secuencia de SEQ ID NO: 2, dicha variante:

(a) es al menos un 50 % idéntica a SEQ ID NO: 2;

en donde, dicha variante de SEQ ID NO: 2:

(3) no incluye la secuencia contigua NQTN; y/o

(4) no incluye la secuencia contigua DSFSANQEIR YSEVTPYHVT.

Dicha variante de SEQ ID NO: 2 puede incluir uno, dos, tres o las cuatro modificaciones (1) a (4) expuestas anteriormente. Dicha variante puede incluir cualquier combinación de dos o tres de las modificaciones (1) a (4) expuestas anteriormente. Una variante preferida incluye la modificación (3) y al menos una de las modificaciones (1) y (2). Otra variante preferida incluye las modificaciones (3) y (4) y al menos una de las modificaciones (1) y (2).

Los inventores también han determinado que otras determinadas modificaciones a la secuencia de SEQ ID NO: 2, que pueden aplicarse como alternativa, o además, a cualquier combinación de las modificaciones (1) a (4) descritas anteriormente, pueden aumentar la potencia de un polipéptido de la invención y/o pueden reducir el reconocimiento de un polipéptido de la invención por ADA específicos para IdeS. Por tanto, un polipéptido de la invención puede comprender una variante de la secuencia de SEQ ID NO: 2 en la que una sustitución se realiza en una o más de las posiciones correspondientes a las posiciones 115, 119, 139, 142, 198, 216, 226, 241, 245, 302, 316 y 333 de SEQ ID NO: 1. Dicha variante puede comprender una sustitución en todas estas posiciones, pero normalmente comprende una sustitución en dos, tres, cuatro, cinco, seis o siete de estas posiciones. Las sustituciones en estas posiciones normalmente reemplazan el aminoácido existente por otro aminoácido que tiene diferentes propiedades. Por ejemplo, una aminoácido no cargado puede reemplazarse por un aminoácido cargado, y viceversa. Las sustituciones preferidas en estas posiciones se exponen en la Tabla B de a continuación usando el código de una letra:

T l B

continuación

Cada una de las sustituciones en la tabla B puede denominarse en el presente documento usando un término obtenido combinando los números enteros en la primera, segunda y tercera columna para cada fila de izquierda a derecha. Por ejemplo, la sustitución en la primera fila puede denominarse en el presente documento "K115E", la sustitución en la segunda fila puede denominarse "E119R", etc. La modificación específica "D226N" pretende alterar un motivo de adhesión celular conocido en la secuencia de IdeS, es decir, la secuencia RGD contigua en las posiciones 224-226 de SEQ ID NO: 1.

La tabla C de a continuación resume las modificaciones realizadas para producir las secuencias de aminoácidos de determinados polipéptidos ilustrativos de la invención.

T l

A continuación, se reproduce totalmente la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 y 2, seguido por la secuencia de aminoácidos de cada uno de los polipéptidos ilustrativos de la invención descritos en la Tabla C.

SEQ ID NO:1

MRKRCYSTSAAVLAAVTLFVLSVDRGVIADSFSANQEIRYSEVTPYHVTSVWTKGVTPPANFTQGEDVFHAPYVA

NQGWYDITKTFNGKDDLLCGAATAGNMLHWWFDQNKDQIKRYLEEHPEKQKINFNGEQMFDVKEAIDTKNHQLDS

KLFEYFKEKAFPYLSTKHLGVFPDHVIDMFINGYRLSLTNHGPTPVKEGSKDPRGGIFDAVFTRGDQSKLLTSRH

DFKEKNLKEISDLIKKELTEGKALGLSHTYANVRINHVINLWGADFDSNGNLKAIYVTDSDSNASIGMKKYFVGV

NSAGKVAISAKEIKEDNIGAQVLGLFTLSTGQDSWNQTN

SEQ ID NO: 2

DSFSANQEIRYSEVTPYHVTSVWTKGVTPPANFTQGEDVFHAPYVANQGWYDITKTFNGKDDLLCGAATA

GNMLHWWFDQNKDQIKRYLEEHPEKQKINFNGEQMFDVKEAIDTKNHQLDSKLFEYFKEKAFPYLSTKHL

GVFPDHVIDMFINGYRLSLTNHGPTPVKEGSKDPRGGIFDAVFTRGDQSKLLTSRHDFKEKNLKEISDLI

KKELTEGKALGLSHTYANVRINHVTNLWGADFDSNGNLKAIYVTDSDSNASIGMKKYFVGVNSAGKVAIS

AKEIKEDNIGAQVLGLFTLSTGQDSWNQTN SEQ ID NO: 3 (pCART152)

DSFSANQEIRYSEVTPYHVTSVWTKGVTPPANFTQGEDVFHAPYVANQGWYDITKTFNGKDDLLCGAATAGNMLH WWFDQNKDQIKRYLEEHPEKQKINFRGEQMFDVKEAIDTKNHQLDSKLFEYFKEKAFPYLSTKHLGVFPDHVIDM FINGYRLSLTNHGPTPVKEGSKDPRGGIFDAVFTRGDQSKLLTSRHDFKEKNLKEISDLIKKELTEGKALGLSHT YANVRINHVINLWGADFDSNGNLKAIYVTDSDSNASIGMKKYFVGVNSAGKVAISAKEIKEDNIGAQVLGLFTLS TGQDSWNQTN

SEQ ID NO: 4 (pCART183)

DSFSANQEIRYSEVTPYHVTSVWTKGVTPPANFTQGEDVFHAPYVANQGWYDITKTFNGKDDLLCGAATAGNMLH WWFDQNKDQIKRYLEEHPEKQKINFKGEQMFDVKEAIDTKNHQLDSKLFEYFKEKAFPYLSTKHLGVFPDHVIDM FINGYRLSLTNHGPTPVKRGSKDPRGGIFDAVFTRGNQSKLLTSRHDFKEKNLKEISDLIKKELTEGKALGLSHT YANVRINHVINLWGADFDSNGNLKAIYVTDSDSNASIGMKKYFVGVNSAGKVAISAKEIKEDNIGAQVLGLFTLS TGQDSWNQTN

SEQ ID NO: 5 (pCART184)

DSFSANQEIRYSEVTPYHVTSVWTKGVTPPANFTQGEDVFHAPYVANQGWYDITKTFNGKDDLLCGAATAGNMLH WWFDQNKDQIKRYLEEHPEKQKINFRGEQMFDVKEAIDTKNHQLDSKLFEYFKEKAFPYLSTKHLGVFPDHVIDM FINGYRLSLTNHGPTPVKKGSKDPRGGIFDAVFTRGNQSKLLTSRHDFKEKNLKEISDLIKKELTEGKALGLSHT YANVRINHVINLWGADFDSNGNLKAIYVTDSDSNASIGMKKYFVGVNKAGKVAISAKEIKEDNIGAQVLGLFTLS TGQDSWNQTN

SEQ ID NO: 6 (pCART185)

DSFSANQEIRYSEVTPYHVTSVWTKGVTPPANFTQGEDVFHAPYVANQGWYDITKTFNGKDDLLCGAATAGNMLH WWFDQNKDQIKRYLREHPEKQKINFNGEQMFDVKEAIDTKNHQLDSKLFEYFKEKAFPYLSTKHLGVFPDHVIDM FINGYRLSLTNHGPTPVKEGSKDPRGGIFDAVFTRGNQSKLLTSRHDFKEKNLKEISDLIKKELDEGKALGLSHT YANVRINHVINLWGADFDSNGNLKAIYVTDSDSNASIGMKKYFVGVNSAGKVAISAKEIKEDNIGAQVLGLFTLS TGQDSWNQTN

SEQ ID NO: 7 (pCART186)

DSFSANQEIRYSEVTPYHVTSVWTKGVTPPANFTQGEDVFHAPYVANQGWYDITKTFNGKDDLLCGAATAGNMLH WWFDQNKDQIKRYLKEHPEKQKINFNGEQMFDVKEAIRTKNHQLDSKLFEYFKEKAFPYLSTKHLGVFPDHVIDM FINGYRLSLTNHGPTPVKEGSKDPRGGIFDAVFTRGNQSKLLTSRHDFKEKNLKEISDLIKKELEEGKALGLSHT YANVRINHVINLWGADFDSNGNLKAIYVTDSDSNASIGMKKYFVGVNKAGKVAISAKEIKEDNIGAQVLGLFTLS TGQDSWNQTN

SEQ ID NO: 8 (pCART187)

DSFSANQEIRYSEVTPYHVTSVWTKGVTPPANFTQGEDVFHAPYVANQGWYDITKTFNGKDDLLCGAATAGNMLH WWFDQNKDQIERYLEEHPEKQKINFNGEQMFDVKEAIDTKNHQLDSKLFEYFKEKAFPYLSTKHLGVFPDHVIDM FINGYRLSLTNHGPTPVKEGSKDPRGGIFDAVFTRGNQSKLLTSRHDFKEKNLKEISDLIKEELTKGKALGLSHT YANVRINHVINLWGADFDSNGNLKAIYVTDSDSNASIGMKKYFVGVNSAGKVAISAKEIKEKNIGAQVLGLFTLS TGQKSWNQTN

SEQ ID NO: 9 (pCART188)

DSFSANQEIRYSEVTPYHVTSVWTKGVTPPANFTQGEDVFHAPYVANQGWYDITKTFNGKDDLLCGAATAGNMLH WWFDQNKDQIKRYLKEHPEKQKINFRGEQMFDVKEAIRTKNHQLDSKLFEYFKEKAFPYLSTKHLGVFPDHVIDM FINGYRLSLTNHGPTPVKEGSKDPRGGIFDAVFTRGNQSKLLTSRHDFKEKNLKEISDLIKSELENGKALGLSHT YANVRINHVINLWGADFDSNGNLKAIYVTDSDSNASIGMKKYFVGVNKAGKVAISAKEIKEDNIGAQVLGLFTLS TGQDSWNQTN

SEQ ID NO: 10 (pCART189)

DSFSANQEIRYSEVTPYHVTSVWTKGVTPPANFTQGEDVFHAPYVANQGWYDITKTFNGKDDLLCGAATAGNMLH WWFDQNKDQIKRYLKEHPEKQKINFRGEQMFDVKEAIRTKNHQLDSKLFEYFKEKAFPYLSTKHLGVFPDHVIDM FINGYRLSLTNHGPTPVKKGSKDPRGGIFDAVFTRGNQSKLLTSRHDFKEKNLKEISDLIKKELEEGKALGLSHT YANVRINHVINLWGADFDSNGNLKAIYVTDSDSNASIGMKKYFVGVNSAGKVAISAKEIKEDNIGAQVLGLFTLS TGQDSWNQTN

SEQ ID NO: 11 (pCART190)

DSFSANQEIRYSEVTPYHVTSVWTKGVTPPANFTQGEDVFHAPYVANQGWYDITKTFNGKDDLLCGAATAGNMLH WWFDQNKDQIERYLEEHPEKQKINFRGEQMFDVKEAIDTKNHQLDSKLFEYFKEKAFPYLSTKHLGVFPDHVIDM FINGYRLSLTNHGPTPVKKGSKDPRGGIFDAVFTRGNQSKLLTSRHDFKEKNLKEISDLIKEELTKGKALGLSHT YANVRINHVINLWGADFDSNGNLKAIYVTDSDSNASIGMKKYFVGVNSAGKVAISAKEIKEDNIGAQVLGLFTLS TGQKSWNQTN

SEQ ID NO: 12 (pCART209)

DSFSANQEIRYSEVTPYHVTSVWTKGVTPPANFTQGEDVFHAPYVANQGWYDITKTFNGKDDLLCGAATAGNMLH WWFDQNKDQIKRYLEEHPEKQKINFNGEQMFDVKEAIDTKNHQLDSKLFEYFKEKAFPYLSTKHLGVFPDHVIDM FINGYRLSLTNHGPTPVKEGSKDPRGGIFDAVFTRGDQSKLLTSRHDFKEKNLKEISDLIKKELTEGKALGLSHT YANVRINHVINLWGAD FDSNGNLKAIYVT DSDSNASIGMKKYFVGVN SAGKVAISAKEIKEDNIGAQVLGLFTLS TGQDSW

SEQ ID NO: 13 (pCART125)

SVWTKGVTPPANFTQGEDVFHAPYVANQGWYDITKTFNGKDDLLCGAATAGNMLHWWFDQNKDQIKRYLEEHPEK QKINFNGEQMFDVKEAIDTKNHQLDSKLFEYFKEKAFPYLSTKHLGVFPDHVIDMFINGYRLSLTNHGPTPVKEG SKDPRGGIFDAVFTRGDQSKLLTSRHDFKEKNLKEISDLIKKELTEGKALGLSHTYANVRINHVINLWGADFDSN GNLKAIYVTDSDSNASIGMKKYFVGVN SAGKVAISAKEIKEDNIGAQVLGLFTLSTGQDSWNQTN

SEQ ID NO: 14 (pCART213)

SVWTKGVTPPANFTQGEDVFHAPYVANQGWYDITKTFNGKDDLLCGAATAGNMLHWWFDQNKDQIKRYLEEHPEK QKINFKGEQMFDVKEAIDTKNHQLDSKLFEYFKEKAFPYLSTKHLGVFPDHVIDMFINGYRLSLTNHGPTPVKEG SKDPRGGIFDAVFTRGNQSKLLTSRHDFKEKNLKEISDLIKKELTEGKALGLSHTYANVRINHVINLWGADFDSN GNLKAIYVTDS DSNASIGMKKYFVGVN SAGKVAISAKEIKEDNIGAQVLGLFTLSTGQDSWNQTN

SEQ ID NO: 15 (pCART214)

SVWTKGVTPPANFTQGEDVFHAPYVANQGWYDITKTFNGKDDLLCGAATAGNMLHWWFDQNKDQIERYLEEHPEK QKINFKGEQMFDVKKAIDTKNHQLDSKLFEYFKEKAFPYLSTKHLGVFPDHVIDMFINGYRLSLTNHGPTPVKEG SKDPRGGIFDAVFTRGNQSKLLTSRHDFKEKNLKEISDLIKEELTKGKALGLSHTYANVRINHVINLWGADFDSN GNLKAIYVTDSDSNASIGMKKYFVGVNSAGKVAISAKEIKEDNIGAQVLGLFTLSTGQKSWNQTN

SEQ ID NO: 16 (pCART228)

DDYQRNATEAYAKEVPHQITSVWTKGVTPPANFTQGEDVFHAPYVANQGWYDITKTFNGKDDLLCGAATAGNMLH WWFDQNKDQIERYLEEHPEKQKINFKGEQMFDVKKAIDTKNHQLDSKLFEYFKEKAFPYLSTKHLGVFPDHVIDM FINGYRLSLTNHGPTPVKEGSKDPRGGIFDAVFTRGNQSKLLTSRHDFKEKNLKEISDLIKEELTKGKALGLSHT YANVRINHVINLWGADFDSNGNLKAIYVTDSDSNASIGMKKYFVGVNSAGKVAISAKEIKEDNIGAQVLGLFTLS TGQKSWNQTNGGGHHHHHH

El polipéptido de la invención puede comprender, consistir esencialmente, o consistir en la secuencia de una cualquiera de las SEQ ID NO: 3 a 16. Cada una de las SEQ ID NO: 3 a 16 opcionalmente puede incluir una metionina adicional en el extremo N y/o una etiqueta de histidina en el extremo C. La etiqueta de histidina preferentemente consiste en seis residuos de histidina. La etiqueta de histidina preferentemente se une al extremo C mediante un conector de 3x residuos de glicina o 5x de glicina. Para SEQ ID NO: 13 la etiqueta de histidina preferentemente se une al extremo C mediante un conector de 5x residuos de glicina.

Producción de polipéptidos

Un polipéptido como se divulga en el presente documento puede producirse mediante cualquier medio adecuado. Por ejemplo, el polipéptido se puede sintetizar directamente usando técnicas convencionales conocidas en la técnica, tal como química en fase sólida de Fmoc, química en fase sólida de Boc o mediante síntesis peptídica en fase de solución. Como alternativa, se puede producir un polipéptido transformando una célula, normalmente una célula bacteriana, con una molécula de ácido nucleico o vector que codifica dicho polipéptido. La producción de polipéptidos mediante la expresión en células hospedadoras bacterianas se describe a continuación y se ilustra en los Ejemplos. La invención proporciona moléculas de ácido nucleico y vectores que codifican un polipéptido de la invención. La invención también proporciona una célula hospedadora que comprende dicho ácido nucleico o vector. Las moléculas polinucleotídicas ilustrativas que codifican los polipéptidos divulgados en el presente documento se proporcionan como SEQ ID NO: 20 a 34. Cada una de estas secuencias incluye en el extremo 5' un codón para la metionina N terminal (ATG) y, antes del codón de parada (TAA) en el extremo 3', codones para un conector 3x gly y una etiqueta de histidina 6x his, que puede excluirse opcionalmente.

Las expresiones "molécula de ácido nucleico" y "polinucleótido" se usan indistintamente en el presente documento y se refieren a una forma polimérica de nucleótidos de cualquier longitud, ya sean desoxirribonucleótidos o ribonucleótidos, o análogos de los mismos. Ejemplos no limitantes de polinucleótidos incluyen un gen, un fragmento de gen, ARN mensajero (ARNm), ADNc, polinucleótidos recombinantes, plásmidos, vectores, ADN aislado de cualquier secuencia, ARN aislado de cualquier secuencia, sondas de ácido nucleico y cebadores. Puede proporcionarse un polinucleótido de la invención en forma aislada o sustancialmente aislada. Por sustancialmente aislado/a, se entiende que puede haber un aislamiento sustancial, pero no total, del polipéptido de cualquier medio circundante. Los polinucleótidos se pueden mezclar con vehículos o diluyentes que no interferirán con el uso previsto y aún se considerarán sustancialmente aislados. Una secuencia de ácido nucleico que "codifica" un polipéptido seleccionado es una molécula de ácido nucleico que se transcribe (en el caso de ADN) y se traduce (en el caso de ARNm) en un polipéptido in vivo cuando se coloca bajo el control de secuencias reguladoras apropiadas, por ejemplo, en un vector de expresión. Los límites de la secuencia codificante se determinan mediante un codón de inicio en el extremo (amino) terminal 5' y un codón de parada de traducción en el extremo (carboxi) terminal 3'. Para los fines de la invención, dichas secuencias de ácido nucleico pueden incluir, pero sin limitación, ADNc de ARNm vírico, procariota o eucariota, secuencias genómicas de ADN o ARN vírico o procariota, e incluso secuencias de ADN sintéticas. Una secuencia de terminación de la transcripción se puede ubicar 3' de la secuencia codificante.

Los polinucleótidos pueden sintetizarse de acuerdo con métodos bien conocidos en la técnica, como se describe a modo de ejemplo en Sambrook et al (1989, Molecular Cloning - a laboratory manual; Cold Spring Harbor Press). Las moléculas de ácido nucleico de la presente invención se pueden proporcionar en forma de un casete de expresión que incluye secuencias de control unidas operativamente a la secuencia insertada, permitiendo así la expresión del polipéptido de la invención in vivo. Estos casetes de expresión, a su vez, se proporcionan normalmente dentro de vectores (por ejemplo, plásmidos o vectores víricos recombinantes). Dicho casete de expresión puede administrarse directamente a un sujeto hospedador. Como alternativa, un vector que comprende un polinucleótido de la invención puede administrarse a un sujeto hospedador. Preferentemente, el polinucleótido se prepara y/o administra usando un vector genético. Un vector adecuado puede ser cualquier vector que sea capaz de transportar una cantidad suficiente de información genética y permitir la expresión de un polipéptido de la invención.

Por tanto, la presente invención incluye vectores de expresión que comprenden tales secuencias de polinucleótidos. Dichos vectores de expresión se construyen de forma rutinaria en la técnica de la biología molecular y pueden implicar, por ejemplo, el uso de ADN plasmídico e iniciadores, promotores, potenciadores y otros elementos apropiados, tales como, por ejemplo, señales de poliadenilación que pueden ser necesarias y que se colocan en la orientación correcta, con el fin de permitir la expresión de un péptido de la invención. Otros vectores adecuados resultarán evidentes para los expertos en la materia. A modo de ejemplo adicional a este respecto, se hace referencia a Sambrook et al.

La invención también incluye células que se han modificado para expresar un polipéptido de la invención. Dichas células normalmente incluyen células procariotas tales como células bacterianas, por ejemplo, E. coli. Dichas células pueden cultivarse usando los métodos de rutina para producir un polipéptido de la invención.

Un polipéptido puede derivarse o modificarse para ayudar con su producción, aislamiento o purificación. Por ejemplo, donde un polipéptido de la invención se produce por expresión recombinante en una célula hospedadora bacteriana, la secuencia del polipéptido puede incluir un residuo de metionina adicional (M) en el extremo N para mejorar la expresión. Como ejemplo adicional, el polipéptido de la invención puede derivarse o modificarse mediante la adición de un ligando que es capaz de unirse directa y específicamente a un medio de separación. Como alternativa, el polipéptido puede derivarse o modificarse mediante la adición de un miembro de un par de unión y el modo de separación comprende un reactivo que se deriva o modifica por la adición de otro miembro de un par de unión. Se puede usar cualquier par de unión adecuado. En una realización preferida en donde el polipéptido para su uso en la invención se deriva o modifica por la adición de un miembro de un par de unión, el polipéptido está preferentemente etiquetado con histidina o etiquetado con biotina. Normalmente la secuencia codificante de aminoácidos de la etiqueta de histidina o biotina se incluye en el nivel génico y el polipéptido se expresa de manera recombinante en E. coli. La etiqueta de histidina o biotina normalmente está presente en cualquiera de los dos extremos del polipéptido, preferentemente en el extremo C. Puede unirse directamente al polipéptido o unirse indirectamente por cualquier secuencia conectora adecuada, tal como 3, 4 o 5 residuos de glicina. La etiqueta de histidina normalmente consiste en seis residuos de histidina, aunque puede ser mayor que esta, normalmente hasta 7, 8, 9, 10 o 20 aminoácidos o menor, por ejemplo, 5, 4, 3, 2 o 1 aminoácidos.

La secuencia de aminoácidos de un polipéptido puede modificarse para incluir aminoácidos que no se dan de manera natural, por ejemplo, para aumentar la estabilidad. Cuando los polipéptidos se producen por medio sintético, se pueden introducir dichos aminoácidos durante la producción. Los polipéptidos también se pueden modificar siguiendo o bien la producción sintética o recombinante. Los polipéptidos también pueden producirse usando aminoácidos D. En dichos casos los aminoácidos se unirán en secuencia inversa en la orientación C a N. Esto es lo convencional en la técnica para producir dichos polipéptidos.

En la técnica, se conocen un número de dichas modificaciones de cadena y pueden realizarse a las cadenas laterales de los polipéptidos, sujeto a los polipéptidos que conservan cualquier actividad requerida adicional o característica como se puede especificar en el presente documento. También se entenderá que los polipéptidos se pueden modificar químicamente, por ejemplo, modificar después de la traducción. Por ejemplo, se pueden someter a glucosilación, fosforilación o comprender residuos de aminoácidos modificados.

El polipéptido puede estar PEGilado. El polipéptido de la invención puede estar en una forma sustancialmente aislada. Se puede mezclar con vehículos o diluyentes (como los discutidos a continuación) que no interferirán con el uso previsto y aún se considerarán sustancialmente aislados. También puede estar en una forma sustancialmente purificada, en cuyo caso generalmente comprenderá al menos el 90 %, por ejemplo, al menos el 95 %, el 98 % o el 99 %, de la proteína en la preparación.

Composiciones y formulaciones que comprenden polipéptidos

En otro aspecto, la presente invención proporciona composiciones que comprenden un polipéptido de la invención. Por ejemplo, la invención proporciona una composición que comprende uno o más polipéptidos de la invención y al menos un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable. El vehículo o vehículos deben ser "aceptables" en el sentido de ser compatibles con los otros ingredientes de la composición y no perjudiciales a un sujeto al que se ha administrado la composición. Normalmente, los vehículos y la composición final, son estériles y sin pirógeno.

La formulación de una composición adecuada se puede llevar a cabo usando compuestos químicos y metodologías de formulación farmacéutica convencionales, todas ellas muy asequibles al experto en la materia. Por ejemplo, el agente se puede combinar con uno o más excipientes o vehículos farmacéuticamente aceptables. Sustancias auxiliares, tales como agentes humectantes o emulsionantes, sustancias tampón del pH, agentes reductores y similares, pueden estar presentes en el excipiente o vehículo. Los agentes reductores adecuados incluyen cisteína, tioglicerol, tioreducina, glutatión y similares. Los excipientes, vehículos y sustancias auxiliares son generalmente agentes farmacéuticos que no inducen una reacción inmunitaria en el individuo que recibe la composición, y que pueden administrarse sin producir excesiva toxicidad. Los excipientes farmacéuticamente aceptables incluyen, pero sin limitación, líquidos tales como agua, solución salina, polietilenglicol, ácido hialurónico, glicerol, tioglicerol y etanol. También se pueden incluir sales farmacéuticamente aceptables, por ejemplo, sales de ácidos minerales tales como clorhidratos, bromhidratos, fosfatos, sulfatos y similares; y las sales de ácidos orgánicos tales como acetatos, propionatos, malonatos, benzoatos y similares. Una profunda discusión de excipientes, vehículos y sustancias auxiliares farmacéuticamente aceptables en Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Pub. Co., N.J. 1991).

Tales composiciones se pueden preparar, envasar o comercializar en una forma adecuada para la administración en bolo o para la administración continua. Las composiciones inyectables se pueden preparar, envasar o comercializar en formas farmacéuticas unitarias, tal como en ampollas o en recipientes multidosis que contengan un conservante. Las composiciones incluyen, pero sin limitación, suspensiones, soluciones, emulsiones en vehículos oleosos o acuosos, pastas y formulaciones implantables de liberación sostenida o biodegradables. Dichas composiciones pueden comprender además uno o más ingredientes adicionales incluyendo, pero sin limitación, agentes de suspensión, estabilizantes y dispersantes. En un ejemplo de una composición para la administración parenteral, el principio activo se proporciona en forma seca (por ejemplo, un polvo o granulado) para la reconstitución con un vehículo adecuado (por ejemplo, agua estéril sin pirógeno) antes de la administración parenteral de la composición reconstituida. Las composiciones se pueden preparar, envasar o comercializar en forma de suspensión o solución acuosa u oleosa inyectable estéril. Esta suspensión o solución se puede formular de acuerdo con la técnica conocida, y puede comprender, además del principio activo, ingredientes adicionales, tales como agentes dispersantes, agentes humectantes o agentes de suspensión descritos en el presente documento. Tales formulaciones inyectables estériles se pueden preparar utilizando un diluyente o disolvente, no tóxico, por vía parenteral aceptable, tal como agua o 1,3-butanodiol, por ejemplo. Otros diluyentes y disolventes aceptables incluyen, pero sin limitación, solución de Ringer, solución isotónica de cloruro de sodio y aceites no volátiles tales como monoglicéridos o diglicéridos sintéticos.

Otras composiciones útiles que se pueden administrar por vía parenteral incluyen aquellas que comprenden el principio activo en forma microcristalina, en una preparación liposomal o como un componente de un sistema polimérico biodegradable. Las composiciones para la liberación sostenida o implantación pueden comprender materiales poliméricos o hidrófobos farmacéuticamente aceptables tales como una emulsión, una resina de intercambio iónico, un polímero poco soluble en pequeñas cantidades o una sal soluble en pequeñas cantidades. Las composiciones pueden ser adecuadas para la administración mediante cualquier vía apropiada entre las que se incluyen, por ejemplo, intradérmica, subcutánea, percutánea, intramuscular, intraarterial, intraperitoneal, intraarticular, intraósea u otras vías de administración adecuadas. Las composiciones preferidas son adecuadas para la administración por infusión intravenosa.

Métodos de uso de los polipéptidos

La invención proporciona el uso de polipéptidos de la invención en diferentes métodos. Por ejemplo, los presentes polipéptidos pueden proporcionar herramientas útiles para la biotecnología. Los polipéptidos pueden usarse para escisión ex vivo de IgG específica, en particular, IgG humana. En dicho método, el polipéptido puede incubarse con una muestra que contiene IgG en condiciones que permiten que se de la actividad de la cisteína proteasa específica. La escisión específica puede verificarse, y los productos de escisión aislarse usando cualquier método adecuado, tal como los descritos en los documentos WO2003051914 y WO2009033670. Por tanto, el método puede usarse, en particular, para generar fragmentos Fc y F(ab')². A continuación, pueden producirse fragmentos Fab llevándose a cabo una etapa de reducción (por ejemplo, en 2-mercaptoetanolamina o Cisteamina) en los fragmentos F(ab')²que resultan de la escisión de IgG con un polipéptido de la invención.

El método también puede usarse para detectar o analizar IgG en una muestra, o para eliminar IgG de una muestra. Un método para la detección de IgG en una muestra normalmente implica incubar el polipéptido con la muestra en condiciones que permiten la unión específica a IgG y la escisión. La presencia de IgG puede verificarse mediante la detección de los productos de escisión específica de IgG, que pueden analizarse posteriormente.

Los polipéptidos de acuerdo con la presente invención pueden también usarse en terapia o profilaxis. En aplicaciones terapéuticas, los polipéptidos o composiciones se administran a un sujeto que ya padece un trastorno o afección, en una cantidad suficiente para curar, aliviar o detener parcialmente la afección o uno o más de sus síntomas. Dicho tratamiento terapéutico puede dar como resultado una disminución de la gravedad de los síntomas de la enfermedad o un aumento de la frecuencia o duración de los períodos sin síntomas. Una cantidad adecuada para lograr esto se define como "cantidad terapéuticamente eficaz". En aplicaciones profilácticas, los polipéptidos o composiciones se administran a un sujeto que aún no presenta síntomas de un trastorno o afección, en una cantidad suficiente para prevenir o retrasar el desarrollo de los síntomas. Dicha cantidad se define como una "cantidad profilácticamente eficaz". El sujeto puede haber sido identificado como en riesgo de desarrollar la enfermedad o afección por cualquier medio adecuado. Por tanto, la invención también proporciona un polipéptido de la invención para su uso en el tratamiento del cuerpo humano o animal. En el presente documento, también se divulga un método para prevenir o tratar la enfermedad o afección en un sujeto, cuyo método comprende administrar un polipéptido de la invención al sujeto en una cantidad profiláctica o terapéuticamente eficaz. El polipéptido puede administrarse conjuntamente con un agente inmunosupresor. El polipéptido preferente se administra por infusión intravenosa, pero puede administrarse mediante cualquier vía adecuada incluyendo, por ejemplo, intradérmica, subcutánea, percutánea, intramuscular, intraarterial, intraperitoneal, intraarticular, intraósea u otras vías de administración adecuadas. La cantidad de dicho polipéptido que se administra puede tener un límite inferior de aproximadamente 0,01, 0,02, 0,03, 0,04, 0,05, 0,06, 0,07, 0,08, 0,09, 0,10, 0,11, 0,12, 0,13, 0,14, 0,15, 0,16, 0,17, 0,18, 0,19, 0,20, 0,21, 0,22, 0,23, 0,24, 0,25 mg/kg de PC. La cantidad de dicho polipéptido que se administra puede tener un límite superior de aproximadamente 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2,0 mg/kg de PC. Se entenderá que cualquiera de los límites superiores anteriormente mencionados se pueden combinar con cualquiera de los límites inferiores anteriores para proporcionar un intervalo para la dosis que se administra. Por ejemplo, la cantidad de dicho polipéptido que se administra puede estar entre aproximadamente 0,01 mg/kg de PC y 2 mg/kg de PC, entre 0,10 y 1 mg/kg de PC, y preferentemente entre 0,25 mg/kg de PC y 0,5 mg/kg de PC. El polipéptido puede administrarse en ocasiones múltiples al mismo sujeto, siempre que la cantidad de ADA en el suero del sujeto que es capaz de unirse al polipéptido no exceda un umbral determinado por el médico. La cantidad de ADA en el suero del sujeto que es capaz de unirse al polipéptido puede determinarse por cualquier método adecuado, tal como una prueba CAP FEIA (ImmunoCAP) específica a agente o un ensayo de titulación.

Los polipéptidos de la invención pueden ser particularmente útiles en el tratamiento o la prevención de una enfermedad o afección mediada por anticuerpos IgG patógenos. Por consiguiente, la invención proporciona un polipéptido de la invención para su uso en el tratamiento o prevención de una enfermedad o afección mediada por anticuerpos IgG patógenos. La divulgación también proporciona un método para tratar o prevenir una enfermedad o afección mediada por anticuerpos IgG patógenos que comprende administrar a un individuo un polipéptido de la invención. El método puede comprender administración repetida de dicho polipéptido. La invención también proporciona un polipéptido de la invención para su uso en la fabricación de un medicamento para el tratamiento o la prevención de una enfermedad o afección mediada por anticuerpos IgG patógenos.

Los anticuerpos patógenos normalmente pueden ser específicos para un antígeno al que se dirige en una enfermedad autoinmunitaria u otra afección mediada completamente o en parte por los anticuerpos. La Tabla D expone una lista de dichas enfermedades y los antígenos asociados. Un polipéptido de la invención puede usarse para tratar cualquiera de estas enfermedades o afecciones. El polipéptido es particularmente eficaz para el tratamiento o la prevención de la enfermedad autoinmunitaria que es mediada por completo o en parte por los anticuerpos IgG patógenos.

T l D

continuación

Un polipéptido de la invención puede usarse en un método para mejorar el beneficio a un sujeto de una terapia o un agente terapéutico. El método comprende dos etapas, que se denominan en el presente documento etapas (a) y (b).

La etapa (a) comprende administrar al sujeto un polipéptido de la invención. La cantidad del polipéptido administrado es preferentemente suficiente para escindir sustancialmente todas las moléculas de IgG presentes en el plasma del sujeto. La etapa (b) comprende posteriormente administrar al sujeto dicha terapia o agente terapéutico. Las etapas (a) y (b) se separaran por un intervalo de tiempo que es preferentemente suficiente para que tenga lugar la escisión de sustancialmente todas las moléculas de IgG presentes en el plasma del sujeto. Dicho intervalo normalmente puede ser de al menos 30 minutos y como mucho 21 días.

El agente terapéutico del cual se mejora el beneficio es normalmente un anticuerpo que se administra para el tratamiento de cáncer u otra enfermedad. El agente terapéutico puede ser IVIg. En el contexto de esta realización de la divulgación, la divulgación puede describirse como alternativa como que proporciona un método para el tratamiento de cáncer u otra enfermedad en un sujeto, comprendiendo el método (a) administrar al sujeto un polipéptido de la invención; y (b) administrar posteriormente al sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz de un anticuerpo que es un tratamiento para dicho cáncer o dicha otra enfermedad; en donde:

- las etapas (a) y (b) se separan por un intervalo de tiempo de al menos 2 horas y como mucho 21 días.

En otras palabras, la invención también proporciona el polipéptido para su uso en dicho método para el tratamiento de cáncer u otra enfermedad. La invención también proporciona el uso del agente en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de cáncer u otra enfermedad por dicho método. El cáncer puede ser leucemia linfoblástica aguda, leucemia mieloide aguda, carcinoma adrenocortical, cánceres relacionados con SIDA, linfoma relacionado con SIDA, cáncer de ano, cáncer de apéndice, astrocitoma, cáncer de cerebelo o cerebral de la infancia, carcinoma basocelular, cáncer del conducto biliar, extrahepático, cáncer de vejiga, cáncer óseo, osteosarcoma/histiocitoma fibroso maligno, glioma del tronco encefálico, cáncer cerebral, tumor cerebral, astrocitoma cerebeloso, tumor cerebral, astrocitoma cerebral/glioma maligno, tumor cerebral, ependimoma, tumor cerebral, meduloblastoma, tumor cerebral, tumores neuroectodérmicos primitivos supratentoriales, tumor cerebral, glioma de la vía óptica e hipotalámico, cáncer de mama, adenomas bronquiales/carcinoides, linfoma de Burkitt, tumor carcinoide, tumor carcinoide, gastrointestinal, carcinoma de sitio primario desconocido, linfoma del sistema nervioso central, astrocitoma cerebeloso, astrocitoma cerebral/glioma maligno, cáncer de cuello uterino, leucemia linfocítica crónica, leucemia mieloide crónica, trastornos mieloproliferativos crónicos, cáncer de colon, linfoma cutáneo de linfocitos T, tumor desmoplásico de células redondas pequeñas, cáncer de endometrio, ependimoma, cáncer de esófago, sarcoma de Ewing en la familia Ewing de tumores, tumor de células germinales extracraneales, infantil, tumor de las células germinales extragonadales, cáncer del conducto biliar extrahepático, cáncer ocular, melanoma intraocular, cáncer ocular, retinoblastoma, cáncer de vesícula biliar, cáncer gástrico (estómago), tumor carcinoide gastrointestinal, tumor del estroma gastrointestinal (GIST), tumor de células germinales: extracraneales, extragonadales, o de ovarios, tumor trofoblástico gestacional, glioma del tronco encefálico, glioma, astrocitoma cerebral infantil, glioma, vía óptica infantil e hipotalámico, carcinoide gástrico, tricoleucemia, cáncer de cabeza y cuello, cáncer cardíaco, cáncer hepatocelular (hígado), linfoma de Hodgkin, cáncer hipofaríngeo, glioma hipotalámico y de la vía óptica, melanoma intraocular, carcinoma de células de los islotes (páncreas), sarcoma de Kaposi, cáncer renal (cáncer de células renales), cáncer de laringe, leucemias, leucemia, linfoblástica aguda (también llamada leucemia linfocítica aguda), leucemia, linfocítica aguda (también llamada leucemia mielógena aguda), leucemia, linfocítica crónica (también llamada leucemia linfocítica crónica), leucemia, mielógena crónica (también llamada leucemia mieloide crónica), leucemia, tricoleucemia, cáncer de labio y de la cavidad oral, liposarcoma, cáncer de hígado (primario), cáncer de pulmón, cáncer de pulmón no microcítico, microcítico, linfomas, linfoma, relacionado con el SIDA, linfoma, Burkitt, linfoma, linfocito T cutáneo, linfoma, de Hodgkin, linfomas, no Hodgkin (una clasificación vieja de todos los linfomas excepto el de Hodgkin), linfoma, sistema nervioso central primario, macroglobulinemia, de Waldenstrom, histiocitoma fibroso maligno de hueso/osteosarcoma, meduloblastoma, melanoma, melanoma, intraocular (ojo), carcinoma de células de Merkel, mesotelioma, maligno adulto, mesotelioma, cáncer de cuello escamoso metastásico con tumor primario oculto, cáncer de boca, síndrome de neoplasia endocrina múltiple, mieloma múltiple/neoplasia de células plasmáticas, micosis fungoides, síndromes mielodisplásicos, enfermedades mielodisplásicas/mieloproliferativas, leucemia mielógena, crónica, leucemia mieloide, aguda de adulto, leucemia mieloide, aguda infantil, mieloma, múltiple (cáncer de la médula ósea), trastornos mieloproliferativos, cáncer de la cavidad nasal y los senos paranasales, carcinoma nasofaríngeo, neuroblastoma, linfoma no Hodgkin, cáncer de pulmón no microcítico, cáncer oral, cáncer orofaríngeo, osteosarcoma/histiocitoma fibroso maligno de hueso, cáncer de ovario, cáncer epitelial de ovario (tumor de estroma de epitelio superficial), tumor de células germinales de ovario, tumor ovárico de bajo potencial maligno, cáncer pancreático, cáncer pancreático, célula de los islotes, cáncer del seno paranasal y de la cavidad nasal, cáncer paratiroideo, cáncer de pene, cáncer faríngeo, feocromocitoma, astrocitoma pineal, germinoma pineal, pineoblastoma y tumores neuroectodérmicos primitivos supratentoriales, adenoma pituitario, neoplasia de células plasmáticas/mieloma múltiple, blastoma pleuropulmonar, linfoma primario del sistema nervioso central, cáncer de próstata, cáncer de recto, carcinoma de células renales (cáncer de riñón), pelvis renal y uréter, cáncer de células transicionales, retinoblastoma, rabdomiosarcoma, cáncer de las glándulas salivales, sarcoma, familia de tumores de Ewing, sarcoma de Kaposi, sarcoma, tejido blando, sarcoma, de útero, síndrome de Sezary, cáncer de piel (no melanoma), cáncer de piel (melanoma), carcinoma de piel, células de Merkel, cáncer microcítico de pulmón, cáncer del intestino delgado, sarcoma de tejidos blandos, carcinoma de células escamosas, cáncer escamoso de cuello con tumor primario oculto, metastásico, cáncer de estómago, tumor neuroectodérmico primitivo supratentorial, linfoma de linfocitos T, cutáneo -véase micosis fungoides y síndrome de Sézary, cáncer de testículos, cáncer de garganta, timoma, timoma y carcinoma tímico, cáncer de tiroides, cáncer de tiroides, cáncer de células transicionales de la pelvis renal y el uréter, tumor trofoblástico, uréter y pelvis renal, cáncer de células transicionales, cáncer de uretra, cáncer uterino, de endometrio, sarcoma uterino, cáncer de vagina, glioma de la vía óptica e hipotalámico, cáncer de vulva, macroglobulinemia de Waldenstrom y tumor de Wilms (cáncer de riñón).

El cáncer es, preferentemente, cáncer de próstata, cáncer de mama, cáncer de vejiga, cáncer de colon, cáncer de recto, cáncer pancreático, cáncer de ovario, cáncer de pulmón, cáncer de cuello uterino, cáncer de endometrio, cáncer de riñón (células renales), cáncer de esófago, cáncer de tiroides, cáncer de piel, linfoma, melanoma o leucemia.

El anticuerpo administrado en la etapa (b) es preferentemente específico para un antígeno tumoral asociado a uno o más de los anteriores tipos de cáncer. Las dianas de interés para un anticuerpo para su uso en el método incluyen CD2, CD3, CD19, CD20, CD22, CD25, CD30, CD32, CD33, CD40, CD52, CD54, CD56, CD64, CD70, CD74, CD79, CD80, CD86, CD105, CD138, CD174, CD205, CD227, CD326, CD340, MUC16, GPNMB, PSMA, Cripto, ED-B, TMEFF2, EphA2, EphB2, FAP, av integrina, mesotelina, EGFR, TAG-72, GD2, CA1X, 5T4, a4p7 integrina, Her2. Otras dianas son citocinas, tales como interleuquinas de IL-I a IL-13, factores a y p de necrosis tumoral, interferones a, p y Y, factor de crecimiento tumoral beta (TGF-p), factor estimulador de las colonias (CSF) y factor estimulador de las colonias de granulocitos y monocitos (GM-CSF). Véase Human Cytokines: Handbook for Basic & Clinical Research (Aggrawal et al. eds., Blackwell Scientific, Boston, MA 1991). Otras dianas son hormonas, enzimas y mensajeros intracelulares e intercelulares, tales como, adenil ciclasa, guanil ciclasa y fosfolipasa C. Otras dianas de interés son los antígenos de leucocitos, tales como CD20 y CD33. Los fármacos también pueden ser dianas de interés. Las moléculas diana pueden ser humanas, de mamíferos o bacterianas. Otras dianas son antígenos, tales como proteínas, glucoproteínas y carbohidratos de patógenos microbianos, tanto víricos como bacterianos y tumores. Otras dianas más se describen en el documento U.S. 4.366.241.

El anticuerpo puede unirse directa o indirectamente a una fracción citotóxica o a un marcador detectable. El anticuerpo se puede administrar a través de una o más vías de administración usando uno o más de una diversidad de métodos conocidos en la técnica. La vía y/o el modo de administración variarán dependiendo de los resultados deseados. Las vías de administración preferidas para los anticuerpos incluyen la administración intravenosa, intramuscular, intradérmica, intraperitoneal, subcutánea, espinal u otras vías de administración parenterales, por ejemplo, mediante inyección o infusión. La expresión "administración parenteral", tal como se usa en el presente documento, significa modos de administración diferentes de la administración entérica y tópica, generalmente por inyección. Como alternativa, un anticuerpo puede administrarse por una vía no parenteral, tal como una vía de administración tópica, epidérmica o mucosa. También se prefiere la administración local, incluyendo la infusión peritumoral, yuxtatumoral, intratumoral, intralesional, perilesional, intracavitaria, administración intravesicular e inhalación.

Un médico especialista experto puede determinar una dosificación adecuada de un anticuerpo de la invención. Los niveles reales de dosificación de un anticuerpo se pueden variar para obtener una cantidad del principio activo que sea eficaz para alcanzar la respuesta terapéutica deseada para un paciente, una composición y un modo de administración particulares, sin que sea tóxico para el paciente. El nivel de dosificación seleccionado dependerá de una variedad de factores farmacocinéticos que incluyen la actividad del anticuerpo particular empleado, de la vía de administración, el momento de la administración, la tasa de excreción del anticuerpo, la duración del tratamiento, otros fármacos, compuestos y/o materiales usados en combinación con las composiciones particulares empleadas, la edad, el sexo, el peso, la condición, la salud general y el historial médico previo del paciente que se está tratando y factores similares bien conocidos en las técnicas médicas.

Una dosis adecuada de un anticuerpo puede estar, por ejemplo, en el intervalo de aproximadamente 0,1 pg/kg a aproximadamente 100 mg/kg de peso corporal del paciente a tratar. Por ejemplo, una dosificación adecuada puede ser de aproximadamente 1 pg/kg a aproximadamente 10 mg/kg de peso corporal por día, o de aproximadamente 10 pg/kg a aproximadamente 5 mg/kg de peso corporal por día.

Las pautas posológicas pueden ajustarse para proporcionar la respuesta deseada óptima (por ejemplo, una respuesta terapéutica). Por ejemplo, pueden administrarse un bolo único, o la etapa (b) del método puede comprender varias dosis divididas administradas a lo largo del tiempo o la dosis puede reducirse o aumentarse proporcionalmente según se indique por las exigencias de la situación terapéutica, siempre que el intervalo requerido entre etapas (a) y (b) no exceda. Es especialmente ventajoso formular las composiciones parenterales en una forma farmacéutica unitaria para facilitar la administración y la uniformidad de la dosificación. La forma farmacéutica unitaria, como se usa en el presente documento, se refiere a unidades físicamente individuales adecuadas como dosis unitarias para los sujetos que han de tratarse; cada unidad contiene una cantidad predeterminada de compuesto activo calculada para producir el efecto terapéutico deseado en asociación con el vehículo farmacéutico necesario.

El anticuerpo de la etapa (b) puede administrarse en combinación con una quimioterapia o radioterapia. Además, el método puede comprender la administración de un anticuerpo anticanceroso adicional u otro agente terapéutico, que puede administrarse junto con el anticuerpo de la etapa (b) en una composición única o en composiciones separadas como parte de una terapia combinada. Por ejemplo, el anticuerpo de la etapa (b) puede administrarse antes, después o al mismo tiempo que el otro agente.

El anticuerpo puede ser abagovomab, abciximab, actoxumab, adalimumab, adecatumumab, afelimomab, afutuzumab, alacizumab pegol, ALD518, alemtuzumab, alirocumab, pentetato de altumomab, amatuximab, anatumomab mafenatox, anrukinzumab, apolizumab, arcitumomab, aselizumab, atinumab, atlizumab (= tocilizumab), atorolimumab, bapineuzumab, basiliximab, bavituximab, bectumomab, belimumab, benralizumab, bertilimumab, besilesomab, bevacizumab, bezlotoxumab, biciromab, bimagrumab, bivatuzumab mertansina, blinatumomab, blosozumab, brentuximab vedotina, briakinumab, brodalumab, canakinumab, cantuzumab mertansina, cantuzumab ravansina, caplacizumab, capromab pendetida, carlumab, catumaxomab, CC49, cedelizumab, certolizumab pegol, cetuximab, Ch.14.18, citatuzumab bogatox, cixutumumab, clazakizumab, clenoliximab, clivatuzumab tetraxetán, conatumumab, concizumab, crenezumab, CR6261, dacetuzumab, daclizumab, dalotuzumab, daratumumab, demcizumab, denosumab, detumomab, dorlimomab aritox, drozitumab, duligotumab, dupilumab, dusigitumab, ecromeximab, eculizumab, edobacomab, edrecolomab, efalizumab, efungumab, elotuzumab, elsilimomab, enavatuzumab, enlimomab pegol, enokizumab, enoticumab, ensituximab, epitumomab cituxetán, epratuzumab, erlizumab, ertumaxomab, etaracizumab, etrolizumab, evolocumab, exbivirumab, fanolesomab, faralimomab, farletuzumab, fasinumab, FBTA05, felvizumab, fezakinumab, ficlatuzumab, figitumumab, flanvotumab, fontolizumab, foralumab, foravirumab, fresolimumab, fulranumab, futuximab, galiximab, ganitumab, gantenerumab, gavilimomab, gemtuzumab ozogamicina, gevokizumab, girentuximab, glembatumumab vedotina, golimumab, gomiliximab, GS6624, ibalizumab, ibritumomab tiuxetano, icrucumab, igovomab, imciromab, imgatuzumab, inclacumab, indatuzimab ravtansina, infliximab, intetumumab, inolimomab, inotuzumab ozogamicina, ipilimumab, iratumumab, itolizumab, ixekizumab, keliximab, labetuzumab, lampalizumab, lebrikizumab, lemalesomab, lerdelimumab, lexatumumab, libivirumab, ligelizumab, lintuzumab, lirilumab, lodelcizumab, lorvotuzumab mertansina, lucatumumab, lumiliximab, mapatumumab, maslimomab, mavrilimumab, matuzumab, mepolizumab, metelimumab, milatuzumab, minretumomab, mitumomab, mogamulizumab, morolimumab, motavizumab, moxetumomab pasudotox, muromonab-CD3, nacolomab tafenatox, namilumab, naptumomab estafenatox, narnatumab, natalizumab, nebacumab, necitumumab, nerelimomab, nesvacumab, nimotuzumab, nivolumab, nofetumomab merpentano, obinutuzumab, ocaratuzumab, ocrelizumab, odulimomab, ofatumumab, olaratumab, olokizumab, omalizumab, onartuzumab, oportuzumab monatox, oregovomab, orticumab, otelixizumab, oxelumab, ozanezumab, ozoralizumab, pagibaximab, palivizumab, panitumumab, panobacumab, parsatuzumab, pascolizumab, pateclizumab, patritumab, pemtumomab, perakizumab, pertuzumab, pexelizumab, pidilizumab, pinatuzumab vedotina, pintumomab, placulumab, polatuzumab vedotina, ponezumab, priliximab, pritoxaximab, pritumumab, PRO 140, quilizumab, racotumomab, radretumab, rafivirumab, ramucirumab, ranibizumab, raxibacumab, regavirumab, reslizumab, rilotumumab, rituximab, robatumumab, roledumab, romosozumab, rontalizumab, rovelizumab, ruplizumab, samalizumab, sarilumab, satumomab pendetida, secukinumab, seribantumab, setoxaximab, sevirumab, sibrotuzumab, sifalimumab, siltuximab, simtuzumab, siplizumab, sirukumab, solanezumab, solitomab, sonepcizumab, sontuzumab, stamulumab, sulesomab, suvizumab, tabalumab, tacatuzumab tetraxetano, tadocizumab, talizumab, tanezumab, taplitumomab paptox, tefibazumab, telimomab aritox, tenatumomab, teneliximab, teplizumab, teprotumumab, TGN1412, ticilimumab (= tremelimumab), tildrakizumab, tigatuzumab, TNX-650, tocilizumab (=atlizumab), toralizumab, tositumomab, tralokinumab, trastuzumab, TRBS07, tregalizumab, tremelimumab, tucotuzumab celmoleucina, tuvirumab, ublituximab, urelumab, urtoxazumab, ustekinumab, vapaliximab, vatelizumab, vedolizumab, veltuzumab, vepalimomab, vesencumab, visilizumab, volociximab, vorsetuzumab mafodotina, votumumab, zalutumumab, zanolimumab, zatuximab, ziralimumab o zolimomab aritox.

Los anticuerpos preferidos incluyen natalizumab, vedolizumab, belimumab, atacicept, alefacept, otelixizumab, teplizumab, rituximab, ofatumumab, ocrelizumab, epratuzumab, alemtuzumab, abatacept, eculizamab, omalizumab, canakinumab, meplizumab, reslizumab, tocilizumab, ustekinumab, briakinumab, etanercept, inlfliximab, adalimumab, certolizumab pegol, golimumab, trastuzumab, gemtuzumab, ozogamicina, ibritumomab, tiuxetan, tostitumomab, cetuximab, bevacizumab, panitumumab, denosumab, ipilimumab, brentuximab y vedotina.

La terapia de la cual se mejora el beneficio es normalmente un trasplante de órgano. El órgano puede seleccionarse de riñón, hígado, corazón, páncreas, pulmón o intestino delgado. El sujeto a tratar preferentemente puede estar sensibilizado o sensibilizado altamente. Por "sensibilizado" se entiende que el sujeto ha desarrollado anticuerpos contra antígenos del complejo mayor de histocompatibilidad humano (MHC) (también denominado sistema de antígenos leucocitarios humanos (HLA)). Los anticuerpos anti-HLA se originan a partir de linfocitos B de manera alogénica sensibilizados y normalmente están presentes en pacientes que previamente se han sensibilizado por transfusión sanguínea, trasplante previo o embarazo (Jordan et al., 2003).

Si un receptor potencial del trasplante está sensibilizado o no puede determinarse por cualquier método adecuado. Por ejemplo, se puede usar una prueba de panel reactivo de anticuerpo (PRA) para determinar si un receptor está sensibilizado. Una puntuación de PRA >30 % normalmente se considera que el paciente está "en alto riesgo inmunológico" o "sensibilizado". Como alternativa, se puede realizar una prueba de compatibilidad cruzada, en la que una muestra de la sangre del donante potencial del trasplante se mezcla con la del receptor previsto. Una compatibilidad cruzada significa que el receptor tiene anticuerpos que reaccionan con la muestra donante, indicando que el receptor está sensibilizado y no se debería dar el trasplante. Las pruebas de compatibilidad cruzada normalmente se realiza como un examen final inmediatamente antes del trasplante.

La presencia de anticuerpos de alto título contra antígenos MHC del donante potencial (es decir, anticuerpos específicos de donante (DSA) es una contraindicación directa para el trasplante debido al riesgo de rechazo agudo mediado por anticuerpo. De forma abreviada, la sensibilización para los antígenos MHC del donante obstaculiza la identificación de un donante adecuado. Una prueba de compatibilidad cruzada es una barrera no ambigua para el trasplante. Puesto que aproximadamente un tercio de los pacientes que esperan para un trasplante de riñón están sensibilizados, con como mucho un 15 % que es altamente sensibilizado, esto conduce a una acumulación de pacientes que esperan un trasplante. En los Estados Unidos, el tiempo medio en la lista de espera para el trasplante renal en 2001-2002 era de 1.329 días para aquellos con una puntuación de panel reactivo de anticuerpo (PRA) de un 0-9 %, 1.920 días para aquellos con PRA de un 10-79 % y 3.649 días para aquellos con PRA de un 80 % o mayor (base de datos OPTN, 2011).

Una estrategia aceptada para superar la barrera de DSA es aplicar intercambio de plasma o inmunoadsorción, con frecuencia junto con, por ejemplo gama globulina intravenosa (IVIg) o rituximab, para bajar los niveles de DSA a un nivel donde puede considerarse el trasplante (Jordan et al., 2004; Montgomery et al., 2000; Vo et al., 2008a; Vo et al.

2008b). Sin embargo, el intercambio de plasma, la inmunoadsorción y los tratamientos con IVIg tienen la desventaja de ser poco eficaces y requerir un planeamiento riguroso puesto que implican tratamientos repetidos durante un periodo prolongado de tiempo. Cuando un órgano de un donante muerto llega a estar disponible se tiene que trasplantar en horas puesto que el tiempo de isquemia en frío prolongado es uno de los factores de riesgo más importantes para la función retrasada del injerto y la pérdida de aloinjertos en el trasplante renal (Ojo et al., 1997).

Por el contrario, el método de la presente divulgación permite la eliminación rápida, temporal y segura de DSA en un receptor potencial de trasplante. La administración del polipéptido de la invención justo antes del trasplante tiene la capacidad de desensibilizar de manera eficaz un paciente altamente sensibilizado, permitiendo de este modo el trasplante y evitando el rechazo agudo mediado por anticuerpo. Una dosis única del polipéptido antes del trasplante permitirá el trasplante de miles de pacientes con anticuerpos IgG específicos para el donante.

En el contexto de esta realización de la divulgación, el método puede describirse alternativamente como un método para el tratamiento de insuficiencia orgánica en un sujeto, comprendiendo el método (a) administrar al sujeto un polipéptido de la invención y (b) trasplantar posteriormente un reemplazo de órgano en el sujeto; en donde:

En otras palabras, esto puede describirse como un método para prevenir el rechazo de un órgano trasplantado en un sujeto, particularmente el rechazo agudo de trasplante mediado por anticuerpo, comprendiendo el método, al menos 2 horas y como mucho 21 días antes del trasplante del órgano, administrar al sujeto un polipéptido de la invención, en donde la cantidad de dicho polipéptido administrado es suficiente para escindir substancialmente todas las moléculas de IgG presentes en el plasma del sujeto. La invención también proporciona el uso del polipéptido de la invención en dicho método para tratar la insuficiencia orgánica o prevenir el rechazo de trasplante, particularmente, el rechazo agudo de trasplante mediado por anticuerpo. La invención también proporciona el uso del polipéptido de la invención en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de insuficiencia orgánica o para la prevención del rechazo de trasplante mediante dicho método. En esta realización, el método de la invención además puede comprender una etapa realizada en o inmediatamente antes del trasplante, cuya etapa comprende la supresión de la inducción de los linfocitos T y/o los linfocitos B en el paciente. Dicha supresión de la inducción normalmente puede comprender administrar un cantidad eficaz de un agente que mata o inhibe los linfocitos T y/o administrar una cantidad eficaz de un agente que mata o inhibe los linfocitos B. Los agentes que matan o inhiben los linfocitos T incluyen muromonab, basiliximab, daclizumab, un anticuerpo globulina antitimocítica (ATG) y una inmunoglobulina de linfocito, preparación de globulina antitimocítica (ATGAM). Se sabe que rituximab mata o inhibe los linfocitos B.

Ejemplos

Salvo que se indique lo contrario, los métodos usados son técnicas bioquímicas y moleculares convencionales. Ejemplos de libros de texto de metodología adecuados incluyen Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual (1989) y Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology (1995), John Wiley y Sons, Inc.

Ejemplo 1 - Diseño de polipéptidos, producción y purificación

Se analizó la molécula de IdeS madura y se identificaron las regiones adecuadas para la mutación. En algunos casos se usó una evaluación in silico para evaluar el resultado probable de una mutación. Habiendo decidido sobre la secuencia de cada polipéptido, se generó el ADNc que codifica cada polipéptido en GeneCust, Luxembourg o bien por mutación dirigida a sitio de una secuencia de inicio o síntesis que depende del número de mutaciones introducidas. El ADNc se secuenció y se transfirió al vector de expresión pET9a (Novagene) en el marco con una etiqueta 6x His C terminal, unida al extremo C por un conector corto de glicina (3x Gly). Se añadió metionina N terminal para mejorar la expresión bacteriana. Los plásmidos se transformaron (choque térmico) en E. coli BL21(DE3) (Stratagene) y se sembraron en placas de LB agarosa que contenían 30 pg/ml de kanamicina. Las colonias se recogieron y se iniciaron cultivos durante la noche (3 ml de medio LB) a 37 °C, 250 rpm. Al día siguiente se prepararon las reservas de glicerol y se inocularon 10 ml de medio TB suplementado con 30 pg/ml de kanamicina y antiespuma con cultivo durante la noche y se cultivaron hasta DO de 0,6-0,8 (37 °C, 300 rpm). En este momento, se añadió IPTG (1 mM) y se continuaron los cultivos durante 1 hora antes de la recogida de las bacterias por centrifugación. Los sedimentos se lavaron en PBS y se congelaron a -20 °C. Se usó un protocolo de congelación-descongelación para la lisis bacteriana (tres ciclos de congelación/descongelación en 1 ml de PBS cada uno) y las proteínas se purificaron usando columnas de centrifugado cargadas previamente Ni-NTA (Pierce). Después de la purificación las proteínas eluidas se activaron con DTT 10 mM antes del intercambio de tampón (3 volúmenes de PBS en dispositivos Millipore cfg MWCO 9K). La pureza y la estabilidad de cada proteína se evaluó usando electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato de sodio (SDS-PAGE) SDS-PAGE gel precast (Biorad) Mini-PROTEAN®TGX™ 12 % sin colorante.

La siguiente tabla resume los cambios realizados para cada polipéptido probado en relación con IdeS madura., sin incluir la metionina N terminal adicional y la etiqueta his. Por tanto, la secuencia de cada polipéptido usado en los experimentos descritos en el presente documento normalmente comprende la secuencia de la s Eq ID NO indicada en la tabla, más una metionina N terminal adicional y una etiqueta his unida al extremo C terminal por un conector de glicina corto.

Como control, se produjo una versión de IdeS usando la misma metodología que la que se ha descrito anteriormente. Esta versión de IdeS comprende la secuencia de SEQ ID NO: 2 más una metionina N terminal adicional y una etiqueta his unida al extremo C terminal por un conector de glicina corto. Esta versión de IdeS puede denominarse en el presente documento pCART124. La secuencia de pCART124 se proporciona a continuación:

MDSFSANQEIRYSEVTPYHVTSVWTKGVTPPANFTQGEDVFHAPYVANQGWYDITKTFNGKDDLLCGAATAGNML HWWFDQNKDQIKRYLEEHPEKQKINFNGEQMFDVKEAIDTKNHQLDSKLFEYFKEKAFPYLSTKHLGVFPDHVID MFINGYRLSLTNHGPTPVKEGSKDPRGGIFDAVFTRGDQSKLLTSRHDFKEKNLKEISDLIKKELTEGKALGLSH TYANVRINHVINLWGADFDSNGNLKAIYVTDSDSNASIGMKKYFVGVNSAGKVAISAKEIKEDNIGAQVLGLFTL STGQDSWNQTNGGGHHHHHH (SEQ ID NO: 17)

la IdeS que carece de etiqueta también se produjo independientemente para patrón de GMP usando purificación cromatográfica multietapa automatizada, para su uso como control adicional. Este polipéptido se denomina en el presente documento BX1001865.

La secuencia de ADNc usada para producir cada uno de los polipéptidos probados y pCART124 se proporcionan a continuación. Cada secuencia de ADNc incluye en el extremo 3' un codón para la metionina N terminal (a Tg ) y, antes del codón de parada (TAA) en el extremo 5', los codones para el conector de glicina y la etiqueta de histidina.

pCART124 (IdeS; SEQ ID NO: 20)

AT GGATAGTTTTTCTGC TAATCAAGAGAT TAGATAT TCGGAAGTAACAC CTTATCAC GTTACTTCCGTTTG GACC AAAGGAGTTACTCCTCCAGCAAACTTCACTCAAGGTGAAGATGTTTTTCACGCTCCTTATGTTGCTAACCAAGGA TGGTATGATATTACCAAAACATTCAATGGAAAAGACGATCTTCTTTGCGGGGCTGCCACAGCAGGGAATATGCTT CAC TGGTGGTTCGAT CAAAACAAAGAC CAAATTAAAC GTTATTTGGAAGAG CATCCAGAAAAG CAAAAAATAAAC TT CAATGGCGAACAGAT GTTTGAC GTAAAAGAAGC TATCGACACTAAAAAC CACCAG CTAGATAGTAAAT TATTT GAATATTTTAAAGAAAAAGCTTTCCCTTATCTATCTACTAAACACCTAGGAGTTTTCCCTGATCATGTAATTGAT ATGTTCATTAACGGCTACCGCCTTAGTCTAACTAACCACGGTCCAACGCCAGTAAAAGAAGGTAGTAAAGATCCC CGAGGTGGTATTTTTGACGCCGTATTTACAAGAGGTGATCAAAGTAAGCTATTGACAAGTCGTCATGATTTTAAA GAAAAAAAT CTCAAAGAAAT CAGT GATCTCATTAAGAAAGAGT TAAC CGAAGGCAAG GCTCTAGGCCTAT CACAC ACCTACGCTAACGTACGCATCAACCATGTTATAAACCTGTGGGGAGCTGACTTTGATTCTAACGGGAACCTTAAA GCTATTTATGTAACAGACTCTGATAGTAATGCATCTATTGGTATGAAGAAATACTTTGTTGGTGTTAATTCCGCT GGAAAAGTAG CTAT TTCTGCTAAAGAAATAAAAGAAGATAATATAG GTGCTCAAGTAC TAGGGTTAT TTACACTT TCAAC AGGGCAAGAT AGTTGGAAT CAGACCAATGGCGGTGGC CATCAT CACCATCAC CACTAA

pCART152 (SEQ ID NO: 21)

AT GGATAGTTTTTCTGC TAAT CAAGAGAT TAGATAT TCGGAAGTAACAC CTTAT CACGTTACTTCCGTTTG GACC AAAGGAGTTACTCCTCCAGCAAACTTCACTCAAGGTGAAGATGTTTTTCACGCTCCTTATGTTGCTAACCAAGGA TGGTATGATATTACCAAAACATTCAATGGAAAAGACGATCTTCTTTGCGGGGCTGCCACAGCAGGGAATATGCTT CACTGGTGGTTC GATCAAAAC AAAGAC CAAATTAAACGTTATT TGGAAGAG CAT CCAGAAAAGCAAAAAAT AAAC TTCCGTGGCGAACAGATGTTTGACGTAAAAGAAGCTATCGACACTAAAAACCACCAGCTAGATAGTAAATTATTT GAATAT TTTAAAGAAAAAG CTTTCCCT TATCTATCTAC TAAACAC CTAGGAGT TTTCCCT GATCATGTAAT TGAT ATGTTCATTAACGGCTACCGCCTTAGTCTAACTAACCACGGTCCAACGCCAGTAAAAGAAGGTAGTAAAGATCCC CGAGGTGGTATTTTTGACGCCGTATTTACAAGAGGTGATCAAAGTAAGCTATTGACAAGTCGTCATGATTTTAAA GAAAAAAAT CT CAAAGAAAT CAGTGATCTCATTAAGAAAGAGT TAAC CGAAG GCAAGGCTCTAGGCC TAT CACAC ACCTACGCTAACGTACGCATCAACCATGTTATAAACCTGTGGGGAGCTGACTTTGATTCTAACGGGAACCTTAAA GCTATTTATGTAACAGACTCTGATAGTAATGCATCTATTGGTATGAAGAAATACTTTGTTGGTGTTAATTCCGCT GGAAAAGT AG CTATTTCTGCTAAAGAAAT AAAAGAAGAT AATATAG GTGCTCAAGT ACTAG GGTTATT TACACTT TCAAC AGGGCAAGAT AGT TGGAATCAGAC CAATGGCGGTGGC CAT CATCACCAT CACCACTAA

pCART183 (SEQ ID NO: 22)

ATGGATAGTTTTTCTGCTAATCAAGAGATTAGATATTCGGAAGTAACACCTTATCACGTTACTTCCGTTTGGACC AAAGGAGTTACTCCTCCAGCAAACTTCACTCAAGGTGAAGATGTTTTTCACGCTCCTTATGTTGCTAACCAAGGA TGGTATGATATTACCAAAACATTCAATGGAAAAGACGATCTTCTTTGCGGGGCTGCCACAGCAGGGAATATGCTT CACTGGTGGTTC GATCAAAAC AAAGAC CAAATTAAAC GTTATTTG GAAGAGCAT CCAGAAAAGCAAAAAAT AAAC TTCAAAG GCGAACAGAT GTTTGACGTAAAAGAAG CTAT CGACACTAAAAACCAC CAGCTAGATAGT AAATTATT T GAATATT TTAAAGAAAAAG CTTTCCCT TAT CTAT CTACTAAACACCTAGGAGTTT TCCCTGATCAT GTAATTGAT ATGTTCATTAACGGCTACCGCCTTAGTCTAACTAACCACGGTCCAACGCCAGTAAAACGTGGTAGTAAAGATCCC CGAGGTGGTATTTTTGACGCCGTATTTACAAGAGGTAACCAAAGTAAGCTATTGACAAGTCGTCATGATTTTAAA GAAAAAAAT CTCAAAGAAAT CAGTGATCTCATTAAGAAAGAGT TAAC CGAAGGCAAG GCTCTAGGCC TATCACAC ACCTACGCTAACGTACGCATCAACCATGTTATAAACCTGTGGGGAGCTGACTTTGATTCTAACGGGAACCTTAAA GCTATTTATGTAACAGACTCTGATAGTAATGCATCTATTGGTATGAAGAAATACTTTGTTGGTGTTAATTCCGCT GGAAAAGTAG CTATTT CTGCTAAAGAAATAAAAGAAGATAATATAG GTGCTCAAGTAC TAGGGTTAT TTACACT T TCAACAG GGCAAGATAGT TGGAATCAGAC CAATGGCGGTGGC CAT CATCACCAT CACCACTAA

pCART184 (SEQ ID NO: 23)

AT GGATAGT TTTTCTGC TAATCAAGAGAT TAGATAT TCGGAAGTAACAC CTTAT CACGTTACTTCCGTTTG GAC C AAAGGAGTTACTCCTCCAGCAAACTTCACTCAAGGTGAAGATGTTTTTCACGCTCCTTATGTTGCTAACCAAGGA TGGTATGATATTACCAAAACATTCAATGGAAAAGACGATCTTCTTTGCGGGGCTGCCACAGCAGGGAATATGCTT CACTGGTGGTTC GATCAAAACAAAGAC CAAATTAAAC GTTATTT GGAAGAGCAT CCAGAAAAG CAAAAAATAAAC TTCCGTGGCGAACAGATGTTTGACGTAAAAGAAGCTATCGACACTAAAAACCACCAGCTAGATAGTAAATTATTT GAATATTTTAAAGAAAAAGCTTTCCCTTATCTATCTACTAAACACCTAGGAGTTTTCCCTGATCATGTAATTGAT ATGTTCATTAACGGCTACCGCCTTAGTCTAACTAACCACGGTCCAACGCCAGTAAAAAAAGGTAGTAAAGATCCC CGAGGTGGTATTTTTGACGCCGTATTTACAAGAGGTAACCAAAGTAAGCTATTGACAAGTCGTCATGATTTTAAA GAAAAAAAT CTCAAAGAAAT CAG TGATCTCAT TAAGAAAGAGT TAAC CGAAGGCAAG GCTCTAGGCC TAT CACAC ACCTACGCTAACGTACGCATCAACCATGTTATAAACCTGTGGGGAGCTGACTTTGATTCTAACGGGAACCTTAAA GCTATTTATGTAACAGACTCTGATAGTAATGCATCTATTGGTATGAAGAAATACTTTGTTGGTGTTAATAAAGCT GGAAAAGTAG CTATTT CTGCTAAAGAAATAAAAGAAGATAATATAG GT GCTCAAGTAC TAGGGT TATTTACAC TT TCAACAGG GCAAGATAGT TGGAAT CAGACCAAT GGCGGTGGC CATCAT CACCATCAC CACTAA

pCART185 (SEQ ID NO: 24)

ATGGATAGTTTTTCTGCTAATCAAGAGATTAGATATTCGGAAGTAACACCTTATCACGTTACTTCCGTTTGGACC AAAGGAGTTACTCCTCCAGCAAACTTCACTCAAGGTGAAGATGTTTTTCACGCTCCTTATGTTGCTAACCAAGGA TGGTATGATATTACCAAAACATTCAATGGAAAAGACGATCTTCTTTGCGGGGCTGCCACAGCAGGGAATATGCTT CACTGGTGGTTC GAT CAAAACAAAGAC CAAAT TAAACGTTAT TTGCGTGAG CATCCAGAAAAG CAAAAAATAAAC TTCAAT GGCGAACAGAT GTTTGAC GTAAAAGAAG CTATC GACACTAAAAAC CACCAG CTAGATAGTAAAT TATTT GAATATTTTAAAGAAAAAGCTTTCCCTTATCTATCTACTAAACACCTAGGAGTTTTCCCTGATCATGTAATTGAT ATGTTCATTAACGGCTACCGCCTTAGTCTAACTAACCACGGTCCAACGCCAGTAAAAGAAGGTAGTAAAGATCCC CGAGGTGGTATTTTTGACGCCGTATTTACAAGAGGTAACCAAAGTAAGCTATTGACAAGTCGTCATGATTTTAAA GAAAAAAAT CTCAAAGAAAT CAGTGATCTCATTAAGAAAGAGTTAGATGAAGGCAAGGCT CTAGGCCTAT CACAC ACCTACGCTAACGTACGCATCAACCATGTTATAAACCTGTGGGGAGCTGACTTTGATTCTAACGGGAACCTTAAA GCTATTTATGTAACAGACTCTGATAGTAATGCATCTATTGGTATGAAGAAATACTTTGTTGGTGTTAATTCCGCT GGAAAAGTAG CTAT TTCTGCTAAAGAAATAAAAGAAGATAATATAG GT GCTCAAGTAC TAGGGTTAT TTACACTT TCAACAG GGCAAGATAGT TGGAAT CAGACCAAT GGCGGTGGC CATCATCAC CATCAC CACTAA

pCART186 (SEQ ID NO: 25)

ATGGATAGTTTTTCTGCTAATCAAGAGATTAGATATTCGGAAGTAACACCTTATCACGTTACTTCCGTTTGGACC AAAGGAGTTACTCCTCCAGCAAACTTCACTCAAGGTGAAGATGTTTTTCACGCTCCTTATGTTGCTAACCAAGGA TGGTATGATATTACCAAAACATTCAATGGAAAAGACGATCTTCTTTGCGGGGCTGCCACAGCAGGGAATATGCTT CACTGGTGGTTC GATCAAAACAAAGAC CAAAT TAAACGTTAT TTGAAAGAG CATCCAGAAAAG CAAAAAATAAAC TTCAAT GGCGAAC AGATGTTT GACGTAAAAGAAG CTATC CGTACTAAAAAC CACCAG CTAGATAGTAAAT TATTT GAATATTTTAAAGAAAAAGCTTTCCCTTATCTATCTACTAAACACCTAGGAGTTTTCCCTGATCATGTAATTGAT ATGTTCATTAACGGCTACCGCCTTAGTCTAACTAACCACGGTCCAACGCCAGTAAAAGAAGGTAGTAAAGATCCC CGAGGTGGTATTTTTGACGCCGTATTTACAAGAGGTAACCAAAGTAAGCTATTGACAAGTCGTCATGATTTTAAA GAAAAAAAT CTCAAAGAAAT CAGTGATCT CATTAAGAAAGAGTTAGAAGAAGGCAAGGCT CTAGGCCTAT CACAC ACCTACGCTAACGTACGCATCAACCATGTTATAAACCTGTGGGGAGCTGACTTTGATTCTAACGGGAACCTTAAA GCTATTTATGTAACAGACTCTGATAGTAATGCATCTATTGGTATGAAGAAATACTTTGTTGGTGTTAATAAAGCT GGAAAAGTAG CTAT TTCTGCTAAAGAAATAAAAGAAGATAATATAG GT GCTCAAGTAC TAGGGTTAT TTACACTT TCAAC AGGGCAAGAT AGT TGGAATCAGAC CAATGGCGGTGGC CATCAT CACCATCAC CACTAA

pCART187 (SEQ ID NO: 26)

AT GGATAGT TTTTCTGCTAAT CAAGAGAT TAGATATTC GGAAGTAACAC CTTATCAC GTTACTTCCGTTTG GACC AAAGGAGTTACTCCTCCAGCAAACTTCACTCAAGGTGAAGATGTTTTTCACGCTCCTTATGTTGCTAACCAAGGA TGGTATGATATTACCAAAACATTCAATGGAAAAGACGATCTTCTTTGCGGGGCTGCCACAGCAGGGAATATGCTT CACTGGTGGTTC GATCAAAACAAAGAC CAAATTGAACGT TATTTGGAAGAG CATCCAGAAAAG CAAAAAATAAAC TTCAAT GGCGAACAGAT GTTTGACGTAAAAGAAG CTAT CGACACTAAAAACCACCAG CTAGATAGTAAAT TATTT GAATATTTTAAAGAAAAAGCTTTCCCTTATCTATCTACTAAACACCTAGGAGTTTTCCCTGATCATGTAATTGAT ATGTTCATTAACGGCTACCGCCTTAGTCTAACTAACCACGGTCCAACGCCAGTAAAAGAAGGTAGTAAAGATCCC CGAGGTGGTATTTTTGACGCCGTATTTACAAGAGGTAACCAAAGTAAGCTATTGACAAGTCGTCATGATTTTAAA GAAAAAAAT CTCAAAGAAAT CAGTGAT CTCATTAAGGAAGAGTTAACCAAAGGCAAGGCT CTAGGCCTAT CACAC ACCTACGCTAACGTACGCATCAACCATGTTATAAACCTGTGGGGAGCTGACTTTGATTCTAACGGGAACCTTAAA GCTATTTATGTAACAGACTCTGATAGTAATGCATCTATTGGTATGAAGAAATACTTTGTTGGTGTTAATTCCGCT GGAAAAGTAGCTATTTCTGCTAAAGAAATAAAAGAAAAAAATATAGGTGCTCAAGTACTAGGGTTATTTACACTT TCAACAGGG CAAAAAAGT TGGAATCAGAC CAATGGCGGTGGC CATCAT CACCATCAC CACTAA

pCART188 (SEQ ID NO: 27)

ATGGATAGTTTTTCTGCTAATCAAGAGATTAGATATTCGGAAGTAACACCTTATCACGTTACTTCCGTTTGGACC AAAGGAGTTACTCCTCCAGCAAACTTCACTCAAGGTGAAGATGTTTTTCACGCTCCTTATGTTGCTAACCAAGGA TGGTATGATATTACCAAAACATTCAATGGAAAAGACGATCTTCTTTGCGGGGCTGCCACAGCAGGGAATATGCTT CAC TGGTGGTTC GATCAAAACAAAGAC CAAATTAAAC GTTATTT GAAAGAG CATCCAGAAAAG CAAAAAATAAAC TTCCGTGGCGAACAGATGTTTGACGTAAAAGAAGCTATCCGTACTAAAAACCACCAGCTAGATAGTAAATTATTT GAATATTTTAAAGAAAAAGCTTTCCCTTATCTATCTACTAAACACCTAGGAGTTTTCCCTGATCATGTAATTGAT ATGTTCATTAACGGCTACCGCCTTAGTCTAACTAACCACGGTCCAACGCCAGTAAAAGAAGGTAGTAAAGATCCC CGAGGTGGTATTTTTGACGCCGTATTTACAAGAGGTAACCAAAGTAAGCTATTGACAAGTCGTCATGATTTTAAA GAAAAAAAT CT CAAAGAAAT CAGTGAT CTCATTAAGAGT GAGTTAGAAAAC GGCAAGGCTCTAGGCC TATCACAC

ACCTACGCTAACGTACGCATCAACCATGTTATAAACCTGTGGGGAGCTGACTTTGATTCTAACGGGAACCTTAAA GCTATTTATGTAACAGACTCTGATAGTAATGCATCTATTGGTATGAAGAAATACTTTGTTGGTGTTAATAAAGCT GGAAAAGTAGCTATTTCTGCTAAAGAAATAAAAGAAGATAATATAGGTGCTCAAGTACTAGGGTTATTTACACTT TCAACAG GGCAAGATAGT T GGAAT CAGACCAATGGCGGTGGC CAT CATCACCAT CACCAC TAA

pCART189 (SEQ ID NO: 28)

AT GGATAGTTTTTCTGC TAAT CAAGAGATTAGATATTC GGAAGTAACAC CTTAT CACGTTACTTCCGTTTG GACC AAAGGAGTTACTCCTCCAGCAAACTTCACTCAAGGTGAAGATGTTTTTCACGCTCCTTATGTTGCTAACCAAGGA TGGTATGATATTACCAAAACATTCAATGGAAAAGACGATCTTCTTTGCGGGGCTGCCACAGCAGGGAATATGCTT CACTGGTGGTTC GAT CAAAACAAAGAC CAAAT TAAACGT TATTTGAAAGAG CAT CCAGAAAAGCAAAAAATAAAC TTCCGTGGCGAACAGATGTTTGACGTAAAAGAAGCTATCCGTACTAAAAACCACCAGCTAGATAGTAAATTATTT GAATATTTTAAAGAAAAAGCTTTCCCTTATCTATCTACTAAACACCTAGGAGTTTTCCCTGATCATGTAATTGAT ATGTTCATTAACGGCTACCGCCTTAGTCTAACTAACCACGGTCCAACGCCAGTAAAAAAAGGTAGTAAAGATCCC CGAGGTGGTATTTTTGACGCCGTATTTACAAGAGGTAACCAAAGTAAGCTATTGACAAGTCGTCATGATTTTAAA GAAAAAAAT CTCAAAGAAAT CAGTGATCTCAT TAAGAAAGAGT TAGAAGAAG GCAAG GCTCTAGGCC TAT CACAC ACCTACGCTAACGTACGCATCAACCATGTTATAAACCTGTGGGGAGCTGACTTTGATTCTAACGGGAACCTTAAA GCTATTTATGTAACAGACTCTGATAGTAATGCATCTATTGGTATGAAGAAATACTTTGTTGGTGTTAATTCCGCT GGAAAAGTAGCTATTTCTGCTAAAGAAATAAAAGAAGATAATATAGGTGCTCAAGTACTAGGGTTATTTACACTT TCAACAGGGCAAGATAGTTGGAATCAGACCAAT GGCGGTGGCCAT CATCACCATCACCACTAA

pCART190 (SEQ ID NO: 29)

ATGGATAGT TTTTCTGC TAATCAAGAGAT TAGATAT TCGGAAGTAACAC CTTATCAC GTTACTTCCGTTTG GAC C AAAGGAGTTACTCCTCCAGCAAACTTCACTCAAGGTGAAGATGTTTTTCACGCTCCTTATGTTGCTAACCAAGGA TGGTATGATATTACCAAAACATTCAATGGAAAAGACGATCTTCTTTGCGGGGCTGCCACAGCAGGGAATATGCTT CACTGGTGGTTC GATCAAAACAAAGAC CAAATTGAAC GTTATTTG GAAGAGCATC CAGAAAAGCAAAAAATAAAC TTCCGTGGC GAACAGAT GTTTGACGTAAAAGAAG CTAT CGACACTAAAAAC CACCAG CTAGATAGTAAAT TATT T GAATATTTTAAAGAAAAAGCTTTCCCTTATCTATCTACTAAACACCTAGGAGTTTTCCCTGATCATGTAATTGAT ATGTTCATTAACGGCTACCGCCTTAGTCTAACTAACCACGGTCCAACGCCAGTAAAAAAAGGTAGTAAAGATCCC CGAGGTGGTATTTTTGACGCCGTATTTACAAGAGGTAACCAAAGTAAGCTATTGACAAGTCGTCATGATTTTAAA GAAAAAAATCTCAAAGAAATCAGTGATCTCATTAAGGAAGAGTTAACCAAAGGCAAGGCTCTAGGCCTATCACAC ACCTACGCTAACGTACGCATCAACCATGTTATAAACCTGTGGGGAGCTGACTTTGATTCTAACGGGAACCTTAAA GCTATTTATGTAACAGACTCTGATAGTAATGCATCTATTGGTATGAAGAAATACTTTGTTGGTGTTAATTCCGCT GGAAAAGTAG CTATTTC TGCTAAAGAAATAAAAGAAGATAATATAG GTGCTCAAGTAC TAGGGT TATTTACAC TT TCAACAGG GCAAAAAAGT TGGAATCAGAC CAATGGCGGTGGC CAT CATCACCATCAC CACTAA

pCART209 (SEQ ID NO: 30)

AT GGATAGTTTTTCTGC TAATCAAGAGAT TAGATAT TCGGAAGTAACAC CTTAT CACGTTACTTCCGTTTG GACC AAAGGAGTTACTCCTCCAGCAAACTTCACTCAAGGTGAAGATGTTTTTCACGCTCCTTATGTTGCTAACCAAGGA TGGTATGATATTACCAAAACATTCAATGGAAAAGACGATCTTCTTTGCGGGGCTGCCACAGCAGGGAATATGCTT CACTGGTGGTTC GATCAAAACAAAGAC CAAATTAAAC GTTAT TTGGAAGAGCAT CCAGAAAAG CAAAAAATAAAC TTCAAT GGCGAACAGAT GTTTGAC GTAAAAGAAG CTATCGACAC TAAAAACCAC CAGCTAGATAGTAAAT TAT TT GAATATTTTAAAGAAAAAGCTTTCCCTTATCTATCTACTAAACACCTAGGAGTTTTCCCTGATCATGTAATTGAT ATGTTCATTAACGGCTACCGCCTTAGTCTAACTAACCACGGTCCAACGCCAGTAAAAGAAGGTAGTAAAGATCCC CGAGGTGGTATTTTTGACGCCGTATTTACAAGAGGTGATCAAAGTAAGCTATTGACAAGTCGTCATGATTTTAAA GAAAAAAAT CTCAAAGAAAT CAGT GATCTCATTAAGAAAGAGT TAACCGAAG GCAAGGCTCTAGGCC TATCAC AC ACCTACGCTAACGTACGCATCAACCATGTTATAAACCTGTGGGGAGCTGACTTTGATTCTAACGGGAACCTTAAA GCTATTTATGTAACAGACTCTGATAGTAATGCATCTATTGGTATGAAGAAATACTTTGTTGGTGTTAATTCCGCT GGAAAAGTAGCTATTTCTGCTAAAGAAATAAAAGAAGATAATATAGGTGCTCAAGTACTAGGGTTATTTACACTT TCAAC AGGGCAAGAT AGTTGGGGTGGCGGCGGTGGC CATCAT CACCATCACCAC TAA

pCART125 (SEQ ID NO: 31)

ATGTCCGTTTGGACCAAAGGAGTTACTCCTCCAGCAAACTTCACTCAAGGTGAAGATGTTTTTCACGCTCCTTAT GTTGCTAACCAAGGATGGTATGATATTACCAAAACATTCAATGGAAAAGACGATCTTCTTTGCGGGGCTGCCACA GCAG GGAATAT GCTTCACTGGTGGTTC GATCAAAACAAAGAC CAAAT TAAAC GTTATTT GGAAGAGCAT CCAGAA AAG CAAAAAATAAAC TTCAAT GGCGAACAGAT GTTTGACGTAAAAGAAG CTAT CGACACTAAAAAC CACCAGCTA GATAGTAAATTATTTGAATATTTTAAAGAAAAAGCTTTCCCTTATCTATCTACTAAACACCTAGGAGTTTTCCCT GATCATGTAATTGATATGTTCATTAACGGCTACCGCCTTAGTCTAACTAACCACGGTCCAACGCCAGTAAAAGAA GGTAGTAAAGATCCCCGAGGTGGTATTTTTGACGCCGTATTTACAAGAGGTGATCAAAGTAAGCTATTGACAAGT CGT CATGATTT TAAAGAAAAAAAT CTCAAAGAAAT CAGTGATCTCATTAAGAAAGAGT TAAC CGAAG GCAAGGCT CTAGGCCTATCACACACCTACGCTAACGTACGCATCAACCATGTTATAAACCTGTGGGGAGCTGACTTTGATTCT AAC GGGAACCT TAAAGCTAT TTAT GTAACA GACTCTGATAGTAAT GCATCTATTGGTAT GAAGAAATAC TTTGTT

GGTGTTAATTCCGCTGGAAAAGTAGCTATTTCTGCTAAAGAAATAAAAGAAGATAATATAGGTGCTCAAGTACTA GGGT TATTTACAC TTTCAAC AGGGCAAGAT AGTTGGAAT CAGAC CAAT GGCGGTGGCCAT CATCACCAT CACCAC TAA

pCART213 (SEQ ID NO: 32)

ATGTCCGTTTGGACCAAAGGAGTTACTCCTCCAGCAAACTTCACTCAAGGTGAAGATGTTTTTCACGCTCCTTAT GTTGCTAACCAAGGATGGTATGATATTACCAAAACATTCAATGGAAAAGACGATCTTCTTTGCGGGGCTGCCACA GCAG GGAATATGCTTCAC TGGTGGTTCGAT CAAAACAAAGACCAAAT TAAACGTTAT TTGGAAGAGCATC CAGAA AAG CAAAAAATAAACT TCAAAGGCGAACAGAT GTTTGACGTAAAAGAAG CTATCGACAC TAAAAACCACCAG CTA GATAGTAAAT TATTTGAATAT TTTAAAGAAAAAG CTTTCCCTTAT CTATCTACTAAACAC CTAGGAGTTTT CCCT GATCATGTAATTGATATGTTCATTAACGGCTACCGCCTTAGTCTAACTAACCACGGTCCAACGCCAGTAAAAGAA GGTAGTAAAGATCCCCGAGGTGGTATTTTTGACGCCGTATTTACAAGAGGTAACCAAAGTAAGCTATTGACAAGT CGT CATGATTTTAAAGAAAAAAAT CTCAAAGAAAT CAGTGATCT CATTAAGAAAGAGT TAACCGAAGGCAAGGCT CTAGGCCTATCACACACCTACGCTAACGTACGCATCAACCATGTTATAAACCTGTGGGGAGCTGACTTTGATTCT AAC GGGAACCTTAAAG CTATTTATGTAACAGAC TCTGATAGTAAT GCATCTATTGGTAT GAAGAAATACTT TGTT GGTGTTAATTCCGCTGGAAAAGTAGCTATTTCTGCTAAAGAAATAAAAGAAGATAATATAGGTGCTCAAGTACTA GGGT TATTTACACTTT CAACAGGGCAAGATAGT TGGAATCAGAC CAATGGCGGTGGC CATCATCACCAT CACCAC TAA

pCART214 (SEQ ID NO: 33)

ATGTCCGTTTGGACCAAAGGAGTTACTCCTCCAGCAAACTTCACTCAAGGTGAAGATGTTTTTCACGCTCCTTAT

GTTGCTAACCAAGGATGGTATGATATTACCAAAACATTCAATGGAAAAGACGATCTTCTTTGCGGGGCTGCCACA

GCAGGGAATATGCTTCACTGGTGGTTCGATCAAAACAAAGACCAAATTGAACGTTATTTGGAAGAGCATCCAGAA

AAGCAAAAAATAAACTTCAAAGGCGAACAGATGTTTGACGTAAAAAAAGCTATCGACACTAAAAACCACCAGCTA

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GGTGTTAATTCCGCTGGAAAAGTAGCTATTTCTGCTAAAGAAATAAAAGAAGATAATATAGGTGCTCAAGTACTA

GGGTTATTTACACTTTCAACAGGGCAAAAAAGTTGGAATCAGACCAATGGCGGTGGCCATCATCACCATCACCAC

TAA

pCART228 (SEQ ID NO: 34)

ATGGACGATTACCAAAGGAATGCTACGGAAGCTTATGCCAAAGAAGTACCACATCAGATCACTTCCGTTTGGACC AAAGGAGTTACTCCTCCAGCAAACTTCACTCAAGGTGAAGATGTTTTTCACGCTCCTTATGTTGCTAACCAAGGA TGGTATGATATTACCAAAACATTCAATGGAAAAGACGATCTTCTTTGCGGGGCTGCCACAGCAGGGAATATGCTT CACTGGTGGTTCGATCAAAACAAAGACCAAATTGAACGTTATTTGGAAGAGCATCCAGAAAAGCAAAAAATAAAC TTCAAAGGCGAACAGATGTTTGACGTAAAAAAAGCTATCGACACTAAAAACCACCAGCTAGATAGTAAATTATTT GAATATTTTAAAGAAAAAGCTTTCCCTTATCTATCTACTAAACACCTAGGAGTTTTCCCTGATCATGTAATTGAT ATGTTCATTAACGGCTACCGCCTTAGTCTAACTAACCACGGTCCAACGCCAGTAAAAGAAGGTAGTAAAGATCCC CGAGGTGGTATTTTTGACGCCGTATTTACAAGAGGTAACCAAAGTAAGCTATTGACAAGTCGTCATGATTTTAAA GAAAAAAATCTCAAAGAAATCAGTGATCTCATTAAGGAAGAGTTAACCAAAGGCAAGGCTCTAGGCCTATCACAC ACCTACGCTAACGTACGCATCAACCATGTTATAAACCTGTGGGGAGCTGACTTTGATTCTAACGGGAACCTTAAA GCTATTTATGTAACAGACTCTGATAGTAATGCATCTATTGGTATGAAGAAATACTTTGTTGGTGTTAATTCCGCT GGAAAAGTAGCTATTTCTGCTAAAGAAATAAAAGAAGATAATATAGGTGCTCAAGTACTAGGGTTATTTACACTT TCAACAGGGCAAAAAAGTTGGAATCAGACCAATGGCGGTGGCCATCATCACCATCACCACTAA

Ejemplo 2 - Evaluación de la potencia (eficacia de escisión de IgG)

ELISA

La actividad enzimática se midió usando un ensayo de potencia basado en ELISA. El principio del ELISA era recubrir los pocillos de una placa de multititulación con una diana anticuerpo (BSA), a continuación, incubar diferentes concentraciones del polipéptido de la IgG cisteína proteasa (prueba o control) con anticuerpo anti-BSA en los pocillos, antes de detectar la cantidad de anticuerpo anti-BSA unido a los pocillos usando un anticuerpo detector. A mayor concentración de un polipéptido de IgG cisteína proteasa dado en un pocillo, menos polipéptido de anti-BSA intacto se unirá al pocillo, dando una señal inferior. De forma similar, un polipéptido de IgG cisteína proteasa más potente dará una señal inferior que un polipéptido de IgG cisteína proteasa menos potente cuando está presente en la misma concentración.

Se preparó la IdeS de referencia BX1001865 como una serie de titulación en etapas de dilución 1:2 de 320 nM hasta 0,16 nM para permitir la representación gráfica de una curva de calibración patrón para el ensayo. Los resultados alcanzados en el ensayo para las múltiples concentraciones conocidas de cada polipéptido probado se compararon frente a la sección lineal de la curva de calibración para determinar la concentración de IdeS de referencia que alcanzó la misma potencia. Dividiendo la concentración conocida de cada polipéptido por la concentración equivalente determinada de IdeS de referencia de la curva, se produjo una puntuación que es el factor de cambio en la potencia en relación con IdeS de referencia BX1001865. Por ejemplo, si el polipéptido de prueba 5 nM alcanza un resultado equivalente a IdeS de referencia 10 nM sobre la curva de calibración, el polipéptido de prueba tiene una potencia 2 veces mayor que IdeS de referencia BX1001865. Una puntuación media para el factor de cambio en la potencia en relación con la IdeS de referencia BX1001865 se calculó a partir de todas las puntuaciones alcanzadas en las diferentes concentraciones para cada polipéptido probado, siempre que caigan dentro de las sección lineal de la curva de calibración. A continuación, esta puntuación media se comparó con la puntuación media alcanzada para la IdeS de referencia pCART124, que se incluyó en cada placa para permitir la comparación entre las placas. La puntuación media para pCART124 se divide por la puntuación media para el polipéptido de prueba para producir una "razón de pCART124", que es de manera eficaz el factor de cambio en la potencia en relación con IdeS para cada polipéptido. A continuación, esta razón de pCART124 se podrá visualizar sobre un diagrama de barras.

Breve sumario del protocolo de laboratorio: Los pocillos de las placas de multititulación se recubrieron durante toda la noche con BSA ( l0 pg/ml), a continuación, se lavaron con PBS-T y se bloquearon durante 1 hora con gelatina de piel de pescado al 2 % en PBS. Se preparó el polipéptido de IdeS BX1001865 como una serie de titulación en etapas de dilución 1:2 en PBS con gelatina al 0,1 % desde 320 nM hasta 0,16 nM. A continuación, los polipéptidos de prueba y el control pCART124 se prepararon en cada una de 15, 7,5, 3,75 y 1,9 nM en PBS con gelatina al 0,1 %. Se añadió una muestra de 50 pl de polipéptido a cada pocillo con 50 pl de anti-BSA de conejo (ACRIS, N.° R1048P, 10 nM) como sustrato. Las placas se incubaron a temperatura ambiente durante 1 hora y, a continuación, se lavaron con PBS-T. Se añadió anticuerpo de cabra biotinilado específico anti-Fc de conejo (30.000x diluido) como un anticuerpo detector y se incubó durante 30 min. La placa se lavó y se añadió SA-Peroxidasa de rábano picante 40.000x diluida (HRP; Pierce) y se incubó durante 30 min. Las placas se lavaron y se desarrollaron usando TMB un componente como sustrato cromogénico para HRP durante 7 min, parado con H²SO⁴0,5 M. Se midió la absorbancia (DO) a A = 450 nm. Las puntuaciones medias para el factor de cambio en la potencia en relación con BX1001865 se determinaron para cada polipéptido prueba y para pCART124. A continuación, se calculó la "razón de pCART124" para cada polipéptido prueba como se ha expuesto anteriormente.

En la Figura 1 se muestran los resultados para la "razón de pCART124" para pCART152, 183, 184, 185, 186, 187, 189 y 190, junto con el resultado para pCART124. Todos los polipéptidos ilustrativos de la invención mostrados en el presente documento alcanzan una mejora de al menos 1,5 veces en potencia en relación con la IdeS control (pCART124). pCART152, 183, 184, 188, 189 y 190 todos alcanzan una potencia mucho mayor, incluso tan alta como una mejora de 8,0 veces sobre el control para pCART189. Cada uno de estos seis polipéptidos de prueba incluye la modificación N130R/K. El polipéptido pCART125 se probó por separado y se alcanzó la potencia comparable con la de IdeS (datos no mostrados).

Visualización de patrones de escisión de IgG

La eficacia de los diferentes polipéptidos de pCART se evaluó además visualizando en SDS-PAGE los productos de escisión mediante una serie de titulación de cada polipéptido en diferentes sustratos. Para probar la eficacia en el sustrato de IgG pura, se usó adalimumab (Humira) para IgG1 y denosumab (XGEVA) para IgG2. Para probar la eficacia en un ambiente fisiológico más complejo, algunos de los polipéptidos también se valoraron en IVIg (Octagam). Esto permite la evaluación del impacto de los anticuerpos anti-IdeS neutralizantes sobre la actividad polipeptídica. Los patrones de escisión para cada polipéptido se compararon con los patrones de escisión de IdeS (BX1001865 y pCART124) en el mismo sustrato. El protocolo fue el siguiente:

Para las pruebas de IgG pura, cada polipéptido de prueba o control se diluyó en una serie de titulación en etapas 1:3 desde 6,7 pg/ml hasta 0,04 ng/ml en ^pB^scon BSA al 0,05 % como proteína de soporte. Se transfirió 25 pl de cada concentración a placas de multititulación y la reacción de escisión se inició añadiendo 25 pl de Humira o XGEVA (2 mg/ml). Por tanto, cada concentración de inicio de polipéptido se diluye 1:2 en el pocillo, dando una serie de titulación desde 3,3 pg/ml hasta 0,02 ng/ml.

Para los ensayos de IVIg, cada polipéptido de prueba o control se diluyó en una serie de titulación en etapas 1:2 desde 30 pg/ml hasta 0,015 ng/ml en PBS con ^bS^aal 0,05 % como proteína de soporte. Se transfirió 25 pl de cada concentración a placas de multititulación y la reacción de escisión se inició añadiendo 25 pl de 10 mg/ml de IVIg. Por tanto, cada concentración de inicio de polipéptido se diluye 1:2 en el pocillo, dando una serie de titulación desde 15 pg/ml hasta 0,0075 ng/ml.

Las placas se incubaron a 37 °C durante 1,5 horas. Las muestras se mezclaron 1:4 en 2x tampón de carga SDS y se calentaron a 92 °C durante 5 min. Se cargaron 10 pl sobre un gel de poliacrilamida (gel precast Mini-PROTEAN®TGX™ de 4-20 % de 15 pocillos (Biorad) que se leyó de acuerdo con protocolos convencionales.

La Figura 2 muestra los patrones de escisión producidos con sustrato de IgG1 (adalimumab) para pCART183, 184, 185, 186, 187, 189 y 190 en comparación con IdeS (pCART124). Las concentraciones de polipéptido son de 3,33 pg/ml (carril 1) hasta 0,02 ng/ml (carril 12) en una serie de dilución en etapas 1:3. Se visualiza el adalimumab intacto (sin enzima) a la izquierda (carril C).

Las flechas a la derecha indican los diferentes productos de escisión de IgG. Flecha 1: IgG intacta; flecha 2: scIgG (IgG escindida sencilla - resulta de la escisión de la primera cadena pesada de IgG); flecha 3: fragmento F(ab')²(resulta de la escisión de la segunda cadena pesada de IgG). Se añadieron líneas verticales para facilitar la comparación en la escisión de la 1^'cadena pesada de IgG, en donde la IgG intacta se convierte en scIgG (entre el carril 6 y 7) y en la escisión de la 2 ' cadena pesada de IgG, en donde scIgG se convierte en fragmento F(ab')²(entre el carril 2 y 3).

pCART183, 184, 188, 189 y 190, en particular, todos muestran eficacia de escisión aumentada de la 2 ' cadena pesada dando como resultado banda de F(ab')²más intensa (flecha 3) y banda de scIgG menos intensa (flecha 2), en comparación con pCART124 en las mismas concentraciones. La diferencia se ve a partir de la concentración de 0,12 pg/ml (carril 4) pero es incluso más evidente a 0,37 pg/ml (carril 3). Por tanto, la figura 2 al completo muestra que un cambio a un aminoácido positivo en la posición 130 (N130R/K) aumenta la eficacia de la escisión de la 2 ' cadena pesada de IgG (pCART183, 184, 188, 189 y 190).

La figura 3 muestra los patrones de escisión producidos con sustrato de IgG1 para pCART152 y pCART209, en comparación con ambos controles de IdeS (pCART124 y BX1001865). Las concentraciones de enzima son desde 3.33 |jg/ml (carril 1) hasta 0,02 ng/ml (carril 12) en una serie de dilución en etapas 1:3. Las flechas a la derecha indican los diferentes productos de escisión de IgG. Flecha 1: IgG intacta; flecha 2: scIgG (IgG escindida sencilla - resulta de la escisión de la primera cadena pesada de IgG); flecha 3: fragmento F(ab')²(resulta de la escisión de la segunda cadena pesada de IgG); flecha 4: fragmento Fc; (*) indica la proteína vehículo (BSA) en el tampón de titulación. Se añadieron líneas verticales para facilitar la comparación en la escisión de la 1^'cadena pesada de IgG, en donde la IgG intacta se convierte en scIgG (entre el carril 6 y 7) y en la escisión de la 2 ' cadena pesada de IgG, en donde scIgG se convierte en fragmento F(ab')²(entre el carril 2 y 3).

pCART152 y pCART209 ambos muestran eficacia de escisión aumentada de la 2 ' cadena pesada que da como resultado una banda de F(ab')²más intensa (flecha 3) y menos scIgG restante (flecha 2), en comparación con pCART124 y BX1001865 (flecha 3 y 2) en la misma concentración. Esta diferencia se ve a partir de las concentraciones de 41 ng/ml (carril 5) pero es incluso más evidente a 0,12 jg/m l y 0,37 jg/m l (carril 4 y 3). Tanto pCART152 como pCART209 muestran eficacia de escisión de la 2 ' cadena pesada aproximadamente 3x IdeS original (BX1001865 y pCART124), es decir, 0,37 jg/m l de pCART152 y pCART209 (carril 3) produce un resultado similar a 1,11 jg/m l de BX100186 y pCART124 (carril 2).

pCART152 y pCART209 también muestran una eficacia mejorada en la escisión de la 1 ' cadena pesada de IgG, que da como resultado una banda de scIgG más intensa (flecha 2) y una banda de IgG menos intensa (flecha 1) en comparación con IdeS original (BX1001865 y pCART124) a la misma concentración. Para pCART152 esto puede verse a 1,5 ng/ml de enzima (carril 8) pero es incluso más evidente a 4,6 ng/ml (carril 7). pCART209 muestra una eficacia de escisión aumentada aproximadamente 3x IdeS original (BX1001865 y pCART124) también para la escisión de la primera cadena pesada, es decir, 4,6 ng/ml (carril 7) de pCART209 produce resultado similar a 14 ng/ml (carril 6) de BX1001865 y pCART124.

Por tanto, la figura 3 muestra que una única sustitución de aminoácidos en la posición 130 (N130K en pCART152) aumenta la eficacia de escisión de principalmente la 2 ' pero también hasta cierto alcance la 1' cadena pesada de IgG1, y que una deleción de la secuencia NQTN (pCART209) mejora la eficacia de escisión en 3 veces para tanto la 1' como la 2 ' cadena pesada de IgG1.

La figura 4 muestra los patrones de escisión producidos con sustrato de IgG2 para pCART152 y pCART209, en comparación con ambos controles de IdeS (pCART124 y BX1001865). Las concentraciones de enzima son desde 3.33 jg/m l (carril 1) hasta 0,02 ng/ml (carril 12) en una serie de dilución en etapas 1:3. Las flechas a la derecha indican los diferentes productos de escisión de IgG. Flecha 1: IgG intacta; flecha 2: scIgG (IgG escindida sencilla - resulta de la escisión de la primera cadena pesada de IgG); flecha 3: fragmento F(ab')²(resulta de la escisión de la segunda cadena pesada de IgG); flecha 4: fragmento Fc; (*) indica la proteína vehículo (BSA) en el tampón de titulación. Se añadieron líneas verticales para facilitar la comparación en la escisión de la 1^'cadena pesada de IgG, en donde la IgG intacta se convierte en scIgG (entre el carril 6 y 7) y en la escisión de la 2 ' cadena pesada de IgG, en donde scIgG se convierte en fragmento F(ab')²(entre el carril 2 y 3).

pCART152 y pCART209 ambos muestran eficacia de escisión aumentada de la 2 ' cadena pesada que da como resultado una banda de F(ab')²más intensa (flecha 3) y scIgG menos intensa (flecha 2), en comparación con pCART124 y BX1001865 (flecha 3 y 2) a las mismas concentraciones. Esta diferencia se ve a partir de las concentraciones de 0,37 jg/m l (carril 3) pero es incluso más evidente a 1,11 jg/m l (carril 2).

El resultado en el carril 6 (concentración de enzima 14 ng/ml) para pCART209 en comparación con BX1001865 y pCART124 muestra que pCART209 es también más eficaz en la escisión de la 1 ' cadena pesada de IgG. Esto da como resultado una banda de IgG intacta menos intensa (flecha 1) y una banda de scIgG más intensa (flecha 2) ya que la mayoría de la proteína se ha convertido en scIgG.

Por tanto, la figura 4 muestra que una única sustitución de aminoácidos en la posición 130 (N130K en pCART152) aumenta la eficacia de escisión de principalmente la 2 ' cadena pesada de IgG2, y que una deleción de la secuencia NQTN (pCART209) mejora la eficacia de escisión de tanto la 1 ' como la 2 ' cadena pesada de IgG2.

En general, se puede ver que los péptidos de prueba generalmente son más eficaces que IdeS en la escisión de IgG1 e IgG2. De acuerdo con los resultados de ELISA, pCART152, 183, 184, 188, 189 y 190 parecen ser particularmente más eficaces. La eficacia aumentada para estos polipéptidos parece relacionarse principalmente con la escisión de la segunda cadena pesada de IgG.

Se espera un cambio en un aminoácido positivo de G en la posición 131 para producir resultados similares a la sustitución de N130R/K. Las posiciones 130 y 131 están situadas en el bucle de una estructura horquilla beta que abarca las posiciones 126 a 136 de SEQ ID NO: 1. Basándose en los resultados obtenidos en el presente documento, se espera que los cambios a aminoácidos positivos en o una cualquiera o ambas posiciones 130 y 131 aumente la actividad IgG cisteína proteasa.

Ejemplo 3 - Evaluación de la inmunogenicidad

Ensayo de ADA competitivo

Este ensayo se basa en la competición entre un polipéptido de prueba e IdeS por la unión a anticuerpos anti-IdeS. Una incubación previa de la enzima de prueba e IVIg permitirá la unión de los anticuerpos anti-IdeS a la enzima pCART probada. A partir de entonces, la mezcla de IVIg-enzima se añade a una placa recubierta con IdeS y cualquier anticuerpo anti-IdeS no unido al polipéptido de prueba se unirá en su lugar a IdeS en la placa. Todas las incubaciones de unión se realizaron en presencia de ácido yodoacético (IHAc) 2 mM para inhibir la escisión de IgG y en alta sal de modo que solo se de la unión de alta afinidad. Después del lavado, se usa un fragmento F(ab')²de cabra biotinilado específico a anti-F(ab')²humano. El escaso reconocimiento del polipéptido de prueba por los anticuerpos anti-IdeS en IVIg dará como resultado alta unión de los anticuerpos anti-IdeS en IVIg a la placa, dando una señal alta. El buen reconocimiento del polipéptido de prueba por los anticuerpos anti-IdeS en IVIg dará el resultado opuesto. El protocolo detallado es el siguiente:

Se recubrió con IdeS de referencia (BX1001865) durante la noche sobre las placas de multititulación (5 pg/ml), a continuación, se lavó con PBS-T y se bloqueó durante 1 hora con BSA al 2 % en PBS suplementado con IHAc 2 mM y NaCl 1 M. Se preparó una placa de mezcla con diluciones seriadas del polipéptido de prueba y 20 pg/ml de IVIg en PBS suplementado con B^sA al 0,1 %, IHAc 2 mM y NaCl 1 M. Se incubó la placa de mezcla durante 1 hora a temperatura ambiente en un agitador. Después de la incubación, se descargó la solución de bloqueo de la placa recubierta con IdeS y se transfirieron 50 pl de cada muestra desde la placa de mezcla a los pocillos de la placa recubierta. Después de la incubación durante 1 hora a temperatura ambiente en un agitador, la placa se lavó con agua con PBS-T y un detector, se añadió fragmento F(ab')²de cabra biotinilado específico para anti-F(ab')²humano (20.000x diluido). Después de la incubación durante 30 minutos la placa se lavó y se añadió SA-HRP (Pierce) 40.000x diluida y se incubó durante 30 min. La placa se lavó y se desarrolló usando TMB un componente como sustrato cromogénico para HRP durante 7 min, parado con H²SO⁴0,5 M. Se midió la absorbancia (DO) a A = 450 nm. Los resultados se invirtieron (1/valor de DO) y se presentaron como una razón comparada con pCART124 (1/(polipéptido de prueba/pCART124)) para su visualización en diagramas de barras.

En la Figura 5 se muestran los resultados para pCART183, 184, 185, 186, 187, 189 y 190. Los resultados para pCART125 se muestran en la Figura 6. Todos los polipéptidos probados muestran alguna reducción en el reconocimiento del anticuerpo anti-IdeS en comparación con IdeS, normalmente al menos un 10 %. pCART185, 186 y 187, en particular, muestran mayor reducción en el reconocimiento, de alrededor de un 40 % en relación con IdeS. pCART125 muestra una reducción de alrededor de un 60 %.

Sumario

Todos los polipéptidos probados muestran aumentada potencia y/o reducida inmunogenicidad en relación con IdeS.

Ejemplo 4 - Evaluación de la potencia

ELISA de la potencia

Para abordar la capacidad de escisión de IgG1 e IgG2 humanas, se establecieron dos ensayos de la potencia basados en ELISA. Un ensayo que mide la escisión de IgG1 y la otra escisión de IgG2. Se calcularon los valores de CE50 (concentración efectiva media máxima) para los diferentes polipéptidos de IgG cisteína proteasa probados. El principio de los ensayos era recubrir los pocillos de una placa de multititulación con un fragmento F(ab)²dirigido contra los anticuerpos IgG humanos con especificidad por la región Fab. A continuación, las concentraciones tituladas del polipéptido de IgG cisteína proteasa (prueba o control) se incubaron juntas con anticuerpo IgG1 humano (Humira) o anticuerpo IgG2 humano (XGEVA) en los pocillos. La cantidad de IgG humana intacta o escindida sencilla (Humira o XGEVA) unida a los pocillos se midió usando un anticuerpo detector dirigido a IgG humana con especificidad contra la parte Fc del anticuerpo. A mayor concentración de un polipéptido de IgG cisteína proteasa dado en un pocillo, menos anticuerpo IgG humano intacto se unirá al pocillo, dando una señal inferior. De forma similar, un polipéptido de IgG cisteína proteasa más potente dará una señal inferior que un polipéptido de IgG cisteína proteasa menos potente cuando está presente en la misma concentración. Se prepararon las curvas de respuesta a la dosis de titulación para el control de IdeS (pCART124) y todos los polipéptidos de IgG cisteína proteasa probados, en tanto el ensayo de IgG1 (humira) como de IgG2 (XGEVA). Los valores de CE50 también se calcularon para cada variante probada, los cuales representan la concentración de un polipéptido en donde se observa un 50 % de su efecto máximo, en la segunda escisión de la molécula de IgG, es decir, la concentración en donde la mitad de la IgG se escinde completamente. Un valor inferior de CE50 representa una IgG cisteína proteasa más eficaz. La escisión de la primera cadena pesada de IgG, IgG a scIgG, no es visible en este ensayo debido a que la parte Fc de la IgG está aún presente y puede detectarse por el anticuerpo detector específi

Breve sumario del protocolo de laboratorio: Se recubrieron pocillos de las placas de multititulación durante la noche (+2-8 °C) con fragmento F(ab)²de cabra específico a anti-Fab humano (0,5 pg/ml) (Jackson N.° 109-006-097), a continuación, se lavó con PBS+0.05 % Tween 20 (PBS-T) y se bloqueó en gelatina de pescado al 0,45 % en solución salina tamponada con fosfato - Tween (PBS-T) (tampón de bloqueo) durante 45-120 min a temperatura ambiente. Se prepararon control de IdeS (pCART124) y los polipéptidos de IgG cisteína proteasa a probar como una serie de titulación en etapas de dilución 1:4 en tampón de bloqueo con una concentración de inicio de 80 pg/ml. Se añadieron volúmenes iguales (25 |jl) de IgG1 humana (Humira) a una concentración de 0,5 |jg/ml y las cantidades tituladas de polipéptidos de IgG cisteína proteasa a los pocillos y se incubaron 2 horas con agitación en un ambiente de temperatura controlada a 37 °C y, a continuación, se lavaron con PBS-T. Se mezcló anticuerpo de ratón biotinilado específico para anti-Fc de IgG humana (m-a-hIgG Bio II, Lote: C0013-ZC43C, Southern Biotech) (600 ng/ml) con Estrep-sulfo (200 ng/ml) y se añadió a las placas de multititulación. Las placas se sellaron con cinta de aluminio y se incubaron a 25 °C durante 1 hora con agitación. A continuación, las placas se lavaron en PBS-T y se añadieron 150 j l de 2x tampón T de lectura diluido (tampón de lectura MSD, N.° de Cat R92TC-2) a cada pocillo. Las placas se leyeron inmediatamente en un lector de placas, MDS (Meso Scale Discovery) QuickPlex SQ 120 Model 1300.

Los ensayos de eficacia visualizados en gel: El ensayo realizado como se describe en el Ejemplo 2 para la escisión de IgG1 (Humira), IgG2 (XGEVA) así como la escisión de un conjunto de IVIg de IgG humana (Octagam).

Resultados

ELISA de la potencia

Las curvas de respuesta a la dosis resultantes para las IgG cisteína proteasas en los ensayos de la potencia se muestran en la figura 7 (escisión de IgG1) y la figura 8 (escisión de IgG2). pCART125, 213 y 214 de los polipéptidos ilustrativos de la invención probados en el presente documento han aumentado la potencia con valores de CE50 disminuidos (tabla 1) en la escisión de ambas cadenas pesadas de IgG1 (figura 7) e IgG2 (figura 8) en comparación con el control de IdeS pCART124, con un factor de mejora en la potencia en el corte de IgG1 de 1,5 para pCART125, 2,2 para pCART214 y como mucho 3,0 para pCART213. Para la escisión de IgG2 (figura 8) el factor de mejora en comparación con pCART214 (IdeS) era de 1,6 para pCART125, 2,1 para pCART124 y 3,5 para pCART213.

Los ensayos de eficacia visualizados en gel

La escisión de IgG1 (figura 9A) e IgG2 (figura 9B) visualizada en el gel claramente muestra la escisión de la primera y segunda cadena pesada (las líneas verticales en las figuras marcan la escisión de la 1a y 2a cadena pesada por escisión de BX1001865 y pCART124). El * en las figuras ilustra el valor de CE50 aproximado, es decir, la concentración en donde un 50 % de la IgG se escinde de manera sencilla (scIgG) y un 50 % se escinde completamente (F(ab')²). Los datos de los geles se resumen en la tabla 2 (escisión de IgG1) y la tabla 3 (escisión de IgG2). La concentración de IgG cisteína proteasa necesaria para la escisión de la 1a cadena pesada de IgG1 (Humira) es de aproximadamente la misma para todos los polipéptidos probados, 1,5 ng/ml para BX1001865 y pCART124 (controles de IdeS), pCART125, 213 y 214 (figura 9A). Para la escisión de la 2a cadena pesada de IgG1 IdeS, pCART125 y 214 aproximadamente 120 ng/ml es necesario conseguir una banda dominante de F(ab')2 en los geles y aproximadamente una etapa de titulación menos, 40 ng/ml, para pCART213 (figura 9A). La escisión de IgG2 (XGEVA) visualizada en la figura 9B muestra que todos los polipéptidos probados, BX1001865, pCART124, 125, 213 y 214, demuestran aproximadamente la misma eficacia con 14 ng/ml necesarios para cortar la 1a cadena pesada y generar scIgG2 y aproximadamente 370 ng/ml para generar fragmentos F(ab')²(tabla 3). En otro conjunto de experimento de la eficacia se probó pCART228 contra Humira (IgG1) y XGEVA (IgG2) con BX1001865 y pCART124 como controles de IdeS (figura 10A y 10B, tabla 4). Es necesaria aproximadamente una etapa titulación de mayor concentración para los controles (BX1001865 y pCART124) en estos experimentos en comparación con la figura 9 y la tabla 3, se pueden observar pequeñas diferencias entre los experimentos debido al manejo de la muestra y la precisión en laboratorio en las diluciones de titulación de las muestras. Para conseguir una comparación fiable pCART228 debe compararse con la escisión de los controles de IdeS en el mismo experimento. Se ven patrones de escisión de IgG muy similares para pCART228 y los controles de IdeS en tanto la escisión de IgG1 como de IgG2 (figura 10A y B), pero con escisión más eficaz aproximadamente 3x (una etapa de titulación) de la 2a cadena pesada de IgG de IgG1 por pCART228 (figura 10A) con 120 ng/ml necesarios en comparación con 370 ng/ml para IdeS (tabla 4).

Los polipéptidos de IgG cisteína proteasa pCART125, 213 y 214 también se valoraron en el conjunto de IgG humana, IVIg (Octagam) con IdeS (BX1001865 y pCART124) como controles (figura 11). Todos los polipéptidos necesitaron 1,5 jg/m l para la escisión de la primera cadena pesada de IgG y aproximadamente 6 jg/m l para la segunda (figura 11 y tabla 5). La escisión de IVIg por pCART228 se analizó en un espectro de titulación más amplio con diluciones 1:2 de 30 jg/m l (figura 12) en comparación con las variantes probadas en la figura 11. La misma eficacia se ve para IdeS (BX1001865 y pCART124) y pCART228 (figura 12) con una concentración de 1,9 jg/m l para generar scIgG y 7,5 jg/m l para dar fragmentos F(ab')²(tabla 6) esto representa las mismas etapas de titulación que para pCART125, 213 y 214 (figura 11 y tabla 5).

Sumario de las figuras para el Ejemplo 4

Figura 7 Curvas de titulación para la escisión de IgG1 (Humira) mediante diferentes polipéptidos de IgG cisteína proteasa.

Figura 8 Curvas de titulación para la escisión de IgG2 (XGEVA) mediante diferentes polipéptidos de IgG cisteína proteasa.

Figura 9 Escisión de IgG analizada por SDS-PAGE usando cantidades de titulación (dilución 1:3 de 3.300 ng/ml) de pCART125, 213 y 214, con BX1001865 y pCART124 (IdeS original) como controles en el mismo experimento de escisión. A: escisión de humira (IgG1) y B: escisión de XGEVA (IgG2). Las líneas verticales marcan las concentraciones de IdeS (BX1001865 y pCART124) necesarias para dar la escisión de la 1a y 2a cadena pesada de IgG (en donde la cantidad del producto escindido domina sobre el producto no escindido). El * en las figuras representa el valor de CE50 aproximado en este experimento.

Figura 10 Escisión de IgG analizada por SDS-PAGE usando cantidades de titulación (dilución 1:3 de 3.300 ng/ml) de pCART228 con BX1001865 y pCART124 (IdeS original) como controles en el mismo experimento de escisión. A: escisión de humira (IgG1) y B: escisión de XGEVA (IgG2). Las líneas verticales marcan las concentraciones de IdeS (BX1001865 y pCART124) necesarias para dar la escisión de la 1a y 2a cadena pesada de IgG (en donde la cantidad del producto escindido domina sobre el producto no escindido).

Figura 11 Escisión de IVIg analizada por SDS-PAGE usando cantidades de titulación (dilución 1:2 de 6 pg/ml) de los polipéptidos de IgG cisteína proteasa probados e IdeS (BX1001865 y pCART124) como control en el mismo experimento de escisión.

Figura 12 Escisión de IVIg analizada por SDS-PAGE usando cantidades de titulación (dilución 1:2 de 30 pg/ml) de pCART228 con IdeS (BX1001865 y pCART124) como controles en el mismo experimento de escisión.

Figura 13. Representación esquemática de la escisión de inmunoglobulinas por polipéptidos de la invención. La escisión enzimática de la IgG se realiza en dos etapas. En primer lugar, se escinde una cadena pesada de IgG intacta y se genera IgG escindida sencilla. En segundo lugar, la siguiente cadena pesada de IgG se corta y se libera la parte Fc. La parte Fc está aún unida a la parte Fab en la molécula de scIgG y puesto que el anticuerpo detector en el ELISA de la potencia está reconociendo la parte Fc de la molécula de IgG el ensayo no diferirá entre IgG completa y sclgG.

Discusión y conclusión

Los valores de CE50 inferiores para pCART125, 213 y 214 en el ELISA de la potencia indican que estos polipéptidos tienen una potencia mejorada en la escisión de la 2a cadena pesada (de sclgG a F(ab')²) de tanto IgG1 como IgG2 en comparación con pCART124 (IdeS original). La visualización de la escisión de IgG en el gel muestra el corte de la 1a cadena pesada (de IgG a scIgG) que no es medible en el ELISA de la potencia usando un anticuerpo detector específico para Fc. La mayoría de las reacciones mediadas por Fc de IgG se pierden en una molécula escindida sencilla (datos no mostrados), que es central en una situación clínica en donde el principal foco está en incapacitar las moléculas de IgG patógenas. pCART228 es tan eficaz en tanto la escisión de IgG1 como IgG2 como IdeS original. Esto es importante cuando es necesario que una IgG cisteína proteasa del mismo tamaño molecular que IdeS tenga el reconocimiento inferior deseado de anticuerpos específicos para IdeS. IVIg es un conjunto de IgG humanas que contiene aproximadamente un 65-70 % de IgG1, un 35-30 % de IgG2 e IgG3/IgG4 compartiendo aproximadamente un 1 %. IVIg humana también contiene de manera natural anticuerpos anti-IdeS, de la exposición temprana del donante de IgG a S. pyogenes. Los anticuerpos anti-IdeS en IVIg humana son neutralizantes en la medida en que su unión a IdeS puede disminuir o demoler completamente la actividad IgG proteasa de IdeS. Los resultados de la escisión de IVIg muestran la escisión completa de todas las diferentes subclases de IgG, con una dominancia de IgG1 y IgG2 y con la presencia de anticuerpos anti-IdeS neutralizantes. Generalmente, todos los polipéptidos de IgG cisteína proteasa probados tienen inferior eficacia en la escisión de IgG2 en comparación con IgG1.

Tabla 1 CE50 (ng/ml) medida por el ELISA de la potencia y el factor de diferencia en la potencia en comparación con IdeS ori inal CART124.

Tabla 2 Datos para la escisión de IgG1 (Humira) mostrados en el gel (figura 9A). Concentración (ng/ml) de polipéptido necesaria para alcanzar la 1a y 2a escisión de IgG, en donde el producto escindido domina en cantidad sobre el no escindido. Valor de CE50 a roximado * en la fi ura 9A.

continuación

Tabla 3 Datos para la escisión de IgG2 (XGEVA) mostrados en el gel (figura 9B). Concentración (ng/ml) de polipéptido necesaria para alcanzar la 1a y 2a escisión de IgG, en donde el producto escindido domina en cantidad sobre el no escindido. Valor de CE50 a roximado * en la fi ura 9B.

Tabla 4. Datos para la escisión de IgG1 (Humira) e IgG2 (XGEVA) por pCART228 mostrados en el gel (figura 10). Concentración (ng/ml) de polipéptido necesaria para alcanzar la 1a y 2a escisión de IgG (en donde el producto escindido domina en cantidades sobre el no escindido .

Tabla 5. Datos para la escisión de IVIg por pCART125, 213 y 214 mostrados en el gel (figura 11). Concentración (ng/ml) de polipéptido necesaria para alcanzar la 1a y 2a escisión de IgG, en donde el producto escindido domina en cantidad sobre el no escindido.

Tabla 6. Datos para la escisión de IVIg por pCART228 mostrados en el gel (figura 12). Concentración (ng/ml) de polipéptido necesaria para alcanzar la escisión de la 1a y 2a cadena pesada de IgG, en donde el producto escindido domina en cantidad sobre el no escindido.

continuación

Ejemplo 5 - ELISA de ADA, un ELISA competitivo para los sitios de unión ADA-IdeS.

Los sitios de unión del anticuerpo antifármaco (ADA) contra IdeS se midieron para el polipéptido modificado de "ADA" de la invención (pCART125, 213 y 214) usando un ensayo basado en ELISA, Meso Scale Discovery (MSD). El principio del ELISA era recubrir los pocillos de una placa de multititulación con IdeS etiquetada con his original (pCART124). La mayoría de los humanos tienen anticuerpos contra IdeS en su suero debido a infecciones tempranas del grupo A de estreptococo. En este caso, se usaron dos conjuntos de suero humano clínicos diferentes como patrones para la detección de ADA. El primer conjunto es suero humano normal de 100 individuos, denominado conjunto de suero humano 1191807 y el segundo es un conjunto de suero de pacientes en el estudio de fase II 13-HMedIdeS-02, denominado conjunto-2 de Fase II. A estos pacientes se ha administrado IdeS una vez en un intervalo de dosis de 0,24-0,5 mg/kg de peso corporal y, de este modo, se ha inducido niveles (aproximadamente 50 veces) de ADA anti-IdeS en su suero.

El resumen de este ELISA de ADA competitivo es que IdeS (pCART124) se recubre en el fondo de una placa de microtitulación. Los conjuntos de suero humano se incuban previamente junto con los polipéptidos de la invención, para ser probados para el reconocimiento de ADA, o con el control positivo de IdeS (pCART 124) en una relación molar de 1:100 con exceso 100x de polipéptidos de la invención. La concentración de los dos diferentes conjuntos de suero usados para la incubación previa se estima a partir de la curva patrón para dar aproximadamente un 80 % de unión a IdeS original. Si los sitios de unión de ADA se han suprimido en los polipéptidos probados, estas variantes no pueden competir con la unión de ADA a la IdeS original en el fondo de los pocillos, es decir, una señal baja demuestra un fuerte parecido de ADA a IdeS original (pCART124) y una señal alta demuestra parecido débil de ADA a IdeS original.

La concentración de ambos patrones que alcanzan aproximadamente un 80 % de unión en la sección lineal de la curva patrón era de aproximadamente 200 ng de ADA (IdeS)/ml. En la incubación previa competitiva esta concentración de ambos patrones se usaron por separado y la concentración de los polipéptidos de la invención se usaron en una concentración de 100 veces la concentración de ADA, incluyendo la diferencia de peso molar entre un anticuerpo de 150 kDa e IdeS de aproximadamente 35 kDa, 4,2 veces, dando 100 veces 200 ng/ml que se divide por 4,2 que da aproximadamente 5 pg/ml de polipéptidos probados. El suero patrón que contenía 200 ng/ml de ADA e IdeS (pCART124) o polipéptidos de la invención se incubaron previamente juntos durante 1 hora a temperatura ambiente (TA). Como control para la unión máxima de ADA, la misma concentración de los patrones se incubaron previamente sin IdeS (pCART124) o polipéptidos probados y se usó como valor máximo de unión del 80 %. El nivel más inferior de la curva patrón, se usó como valor límite inferior para el intervalo del cálculo de la competición. A la puntuación media para los patrones incubados previamente con IdeS (pCART124) o los polipéptidos probados se restó el valor de unión patrón del 80 % dividido por el valor de unión patrón del 80 % al que se le ha restado los valores del límite inferior dando el % del valor de competición. Los polipéptidos probados con el % de competición más bajo significa que la mayoría de los epítopos de unión a ADA se han eliminado en comparación con la IdeS original (pCART124).

Breve sumario del protocolo de laboratorio: Se recubrieron los pocillos de placas de multititulación durante la noche con pCART124 (1 pg/ml), se lavaron 3 veces con PBS-T y se bloquearon durante 1 hora con gelatina de piel de pescado al 0,45 % y 2 mM del ácido yodoacético inhibidor (IHAc) de cisteína proteasa en PBS.

Se prepararon ambos patrones como series de titulación en etapas de dilución 1:3 en gelatina de piel de pescado al 0,45 % e IHAc 2 mM en PBS, de 5.000 ng de ADA (IdeS)/ml a 2,5 ng de ADA (IdeS)/ml para permitir la representación gráfica de una curva de calibración patrón para el ensayo, con mediciones en tanto la parte lineal como la parte máxima y mínima de la curva patrón. Al mismo tiempo que se bloquea la placa, se incubaron previamente juntos los patrones e IdeS (pCART124) o polipéptidos probados durante 1 hora a TA, es decir, las muestras en una etapa de competición, usando 200 ng/ml de AdA (patrones) y 5 pg/ml de IdeS (pCART124) o los polipéptidos a probar.

La placa recubierta con pCART124 se lavó 3 veces y se añadieron 50 pl de muestras previamente incubadas o 50 pl de patrón a cada pocillo de la placa de multititulación.

La placa se incubó a TA durante 2 horas y, a continuación, se lavó con PBS-T. Se añadió el fragmento-bio F(ab)²específico para a anti-F(ab) humano de cabra (Jackson N.° 109-066-097, 0,65 mg/ml), (1.000x diluido) como anticuerpo detector y Estreptavidina-Sulfo (MSD N.° de Cat.: R32AD-1 o R32AD-5) (2000x diluido) en tampón de bloqueo incubado durante 1 hora a TA en oscuridad. La placa se lavó 3 veces y se añadió tampón de lectura T (Tampón de lectura T MSD (4x)) 4x diluido y la placa se analizó en un lector de placa, MDS (Meso Scale Discovery) QuickPlex SQ 120 Model 1300 directamente.

Resultados y conclusión

Todos los polipéptidos de IgG cisteína proteasa probados, pCART125, 213 y 214 eran menos reconocidos por ADA específicos para IdeS en suero humano en comparación con IdeS original (pCART124). Algunos de los epítopos de reconocimiento de ADA se encuentran en la parte N-terminal de IdeS. Todos los polipéptidos de la invención se sometieron a deleción en el N terminal en comparación con IdeS y la única diferencia secuencial entre pCART125 e IdeS original es la deleción N-terminal.

El porcentaje (%) de bloqueo de los sitios de unión IdeS-ADA para pCART125, 213 y 214 se muestran en la figura 14 y 15 y la IdeS original pCART124 se usó como control positivo para el 100 % de parecido.

Ejemplo 6 - Evaluación de la eficacia in vivo en un modelo de ratón de Octagam (IVIg humana)

En el presente estudio, los ratones BALB/c se inyectaron por vía intraperitoneal (i.p.) con IVIg humana (Octagam). La concentración de IVIg humana se administró a una dosis de 900 mg/kg, para correlacionarse con la concentración plasmática de IgG humana (10 mg/ml). La IVIg humana se inyectó i.p. el día 0. Veinticuatro horas (día 1) después de la inyección de IVIg humana, PBS, controles de IdeS (BX1001865 y pCART124) o las cisteína proteasas a probar, pCART125, pCART213 y pCART214, se administraron por vía intravenosa (i.v.) a una dosis de 1 mg/kg. Dos horas después se extrajeron muestras de suero y se sacrificaron los ratones.

ELISA de la eficacia

El principio del ensayo era recubrir los pocillos de una placa de multititulación con un fragmento F(ab)²dirigido a los anticuerpos IgG humanos con especificidad para la región Fab. A continuación, se añadieron el suero de ratones tratados con IVIg y controles de IdeS (BX1001865 y pCART124) o el polipéptido de IgG cisteína proteasa probado. La cantidad de IgG humana intacta o escindida sencilla (IVIg) unida a los pocillos se midió usando un anticuerpo detector dirigido a IgG humana (IVIg) con especificidad contra la parte Fc del anticuerpo. A menor concentración detectada de anticuerpo IgG humano (IVIg) intacto se espera mayor eficacia del polipéptido de la IgG cisteína proteasa.

Breve sumario del protocolo de laboratorio: Los pocillos de una placa de multititulación se recubrieron durante la noche (+2-8 °C) con fragmento F(ab)²específico para anti-Fab humano de cabra (0,5 pg/ml) (Jackson N.° 109-006-097), a continuación, se lavó con PBS+0.05 % Tween 20 (PBS-T) y se bloqueó en BSA al 2 % en PBS-T (tampón de bloqueo) durante 45-120 min a TA (temperatura ambiente). Se usó el calibrador de proteína de suero humano (DAKO N.° X0908) como patrón y se añadió en un intervalo de 0,5-300 ng/ml. Las muestras de suero tomadas de ratones tratados con IVIg y diferentes polipéptidos de IgG cisteína proteasa se descongelaron y se diluyeron en tampón de bloqueo 100.000 veces antes de la adición a la placa de multititulación de ensayo. La placa se incubó 2 horas con agitación a TA y, a continuación, se lavó con PBS-T. Se mezcló anticuerpo de ratón biotinilado específico para anti-Fc de IgG humana (600 ng/ml) (Jackson N.° 109-066-098) con Estrep-sulfo (200 ng/ml) (MSD N.° R32AD-1) y se añadió a la placa de multititulación. La placa se selló con cinta de aluminio y se incubó a TA durante 1 hora con agitación. A continuación, la placa se lavó en PBS-T y se añadieron 150 pl de tampón T de lectura 2x diluido (MSD, N.°R92TC-2) a cada pocillo. La placa se analizó inmediatamente en un lector de placas, MDS (Meso Scale Discovery) QuickPlex SQ 120 Model 1300 directamente.

Eficacia visualizada en gel

10 pl de suero de ratones se diluyó en 1:10 en 90 pl de PBS. A partir de entonces, se mezclaron 10 pl de suero diluido con 30 pl de 4x tampón de carga de SDS-PAGE. Se usaron 5 pl de marcador de laboratorio de IgG para mostrar los diferentes fragmentos de IgG (IgG, scIgG y F(ab')2). Las muestras se calentaron a 92 °C durante 3 min (eppendorf compacto mezclador Thermo) y se centrifugaron brevemente antes de cargar 10 pl en 4-20 % Mini-Protean® TGX, gel TM Stainfree (N.° de cat 456-8096, Biorad). Los geles se corrieron a 200 V durante 40 min.

Resultados y conclusión

La escisión in vivo de IVIg humana (Octagam) por controles de IdeS (BX1001865 y pCART124) y pCART125, 213 y 214 se compararon estudiando el nivel de IgG humana en suero por ELISA de la eficacia y analizando la degradación de IgG por S^dS-PAGE. El tratamiento con los controles de IdeS (BX1001865 y pCART124) y las diferentes IgG cisteína proteasas pCART125, pCART213 y pCART214 en ratones mostró un claro efecto en la escisión de IgG humana in vivo (Tabla 7 y figura 16).

La escisión completa se muestra para los controles de IdeS (BX100186 y pCART 124), pCART125 y pCART213, sin bandas de sclgG visibles y bandas de F(ab')²significantes en los geles (figura 17). pCART214 mostró una eficacia inferior en este modelo de ratón con moléculas de sclgG presentes en el suero después de dos horas (* en la figura 17C). Sin embargo, no se pudo detectar IVIg intacta en el gel significando que la mayor barra para pCART214 en la figura 16 representa sclgG y no IgG intacta. Esto muestra que los polipéptidos de la invención escinden IgG en un modelo in vivo.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un polipéptido que tiene actividad IgG cisteína proteasa y que comprende una variante de la secuencia de SEQ ID NO: 2, dicha variante:

(a) es al menos un 50 % idéntica a SEQ ID NO: 2;

en donde dicho polipéptido es al menos 1,5 veces más eficaz en la escisión de IgG que IdeS cuando se mide en el mismo ensayo y es menos inmunogénico que IdeS; en donde, además, dicha variante de la secuencia de SEQ ID NO: 2:

(3) no incluye la secuencia contigua NQTN; y/o

2. Un polipéptido de acuerdo con la reivindicación 1, en donde dicha variante de la secuencia de SEQ ID NO: 2 es de al menos un 80 %, un 90 %, un 95 % o un 99 % idéntica a la SEQ ID NO: 2.

3. Un polipéptido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende o consiste en la secuencia de una cualquier de SEQ ID NO: 3 a 16, opcionalmente en donde dicha secuencia incluye una metionina adicional en el extremo N y/o una etiqueta de histidina en el extremo C.

4. Un polipéptido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde dicho polipéptido es de al menos 2,0 veces, 2,5 veces, 3,0 veces, 4,0 veces, 4,5 veces, 5,0 veces, 6,0 veces, 7,0 veces o 7,5 veces más eficaz que IdeS en la escisión de IgG, cuando se mide en el mismo ensayo.

5. Un polipéptido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores que es menos inmunogénico que IdeS, en donde preferentemente la inmunogenicidad de dicho polipéptido es no más del 85 % de la inmunogenicidad de IdeS medida en el mismo ensayo.

6. Un polinucleótido o vector de expresión que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores.

7. Una célula hospedadora que comprende el polinucleótido o vector de expresión de la reivindicación 6, que es preferentemente célula bacteriana, lo más preferible una célula de E. coli.

8. Una composición que comprende un polipéptido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 y al menos un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable.

9. Un polipéptido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 para su uso en el tratamiento de un cuerpo humano o animal.

10. Un polipéptido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 para su uso en un método para la prevención o el tratamiento de una enfermedad o afección en un sujeto, cuyo método comprende administrar al sujeto el polipéptido en una cantidad profiláctica o terapéuticamente eficaz.

11. Un polipéptido para su uso de acuerdo con la reivindicación 10, en donde dicha enfermedad o afección es una enfermedad o afección mediada por completo o en parte por anticuerpos de IgG patógenos, preferentemente en donde dicha enfermedad o afección es la enfermedad de Addison, glomerulonefritis anti-GBM, vasculitis asociada a anticuerpo citoplasmático antineutrófilo, encefalitis anti-NMDAR, síndrome de anticuerpos antifosfolípidos, APS catastrófico, enfermedades cutáneas ampollosas autoinmunitarias, pénfigo foliáceo, fogo selvagem, pénfigo vulgar, anemia hemolítica autoinmunitaria, hepatitis autoinmunitaria, neutropenia autoinmunitaria, Penfigoide ampolloso, enfermedad celíaca, urticaria crónica, bloqueo cardíaco congénito completo, diabetes de tipo 1A, epidermólisis ampollosa adquirida, crioglobulinemia mixta esencial, síndrome de Goodpasture, enfermedad de Graves, bocio, hipertiroidismo, exoftalmos infiltrativo, dermopatía infiltrativa, síndrome de Guillain-Barre, polineuropatía inflamatoria aguda desmielinizante, neuropatía axonal motora aguda, hemofilia - Deficiencia adquirida de FVIII, púrpura trombocitopénica idiopática, síndrome miasténico de Lambert-Eaton, enfermedad del tejido conectivo mixto, mieloma múltiple, miastenia gravis, crisis miasténica, miocarditis, miocardiopatía dilatada, neuromielitis óptica, cirrosis biliar primaria, esclerosis múltiple primaria progresiva, cardiopatía reumática, fiebre reumática, artritis reumatoide, enfermedad del suero, hipersensibilidad del complejo inmunitario (tipo III), síndrome de Sjogren, SLE, incluida nefritis lúpica, síndrome de la persona rígida, esclerosis sistémica, rechazo de trasplantes, púrpura trombocitopénica trombótica.

12. Un método ex vivo para la escisión de IgG, comprendiendo el método poner en contacto una muestra que contiene IgG con un polipéptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 en condiciones que permiten que se de actividad IgG cisteína proteasa.

13. Un método ex vivo de acuerdo con la reivindicación 12 que se realiza para generar fragmentos Fc y Fab y/o en donde la muestra es una muestra sanguínea tomada de un sujeto que padece una enfermedad o afección como se define en la reivindicación 11.