JP6961486B2 - システインプロテアーゼ - Google Patents
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Description
本発明は、IgGシステインプロテアーゼ活性を示す新規なポリペプチド、並びにそのインビボ及びエクスビボでの使用に関する。ポリペプチドの使用としては、IgGによって媒介される疾患及び状態を予防又は治療するための方法、及びIgGを解析するための方法が挙げられる。
IdeS(S.ピオゲネス(S.pyogenes)の免疫グロブリンG分解酵素(Immunoglobulin G−degrading enzyme of S. pyogenes))は、ヒトの病原体であるS.ピオゲネスによって産生される細胞外システインプロテアーゼである。IdeSは、最初に血清型M1のA群連鎖球菌株から単離されたが、今では、試験されたすべてのA群連鎖球菌株において、ides遺伝子が同定されている。IdeSは、程度の非常に高い基質特異性を有し、その、同定された唯一の基質がIgGである。IdeSは、ヒトIgGの全てのサブクラスの、重鎖下部のヒンジ領域において、タンパク質分解による1回切断を触媒する。IdeSは、これに相当する、様々な動物におけるIgGのいくつかのサブクラスの重鎖の切断も触媒する。IdeSは、2段階の機構を介して、IgGを、Fc及びF(ab’)2の断片に効率的に切断する。第1段階では、IgGの一方の(第1の)重鎖が切断されて、非共有的に結合したFc分子を有する、1回切断されたIgG(scIgG)分子が生成される。scIgG分子は、事実上、原型IgG分子の残りの(第2の)重鎖を保持する中間産物である。該メカニズムの第2段階においては、この第2の重鎖が、IdeSによって切断され、F(ab’)2断片及びホモダイマーのFc断片が遊離する。これらは、生理学的条件下で一般的に観察される産物である。還元条件下で、F(ab’)2断片は、2つのFab断片に解離する場合があり、ホモダイマーのFcは、その構成要素のモノマーに解離する場合がある。
IdeSのIgG切断能力は、例えば、IgG解析のために用いられ得る、Fab及びFcの断片を生成するための方法において、エクスビボでの有用性を有することが示されている。例えば、国際特許出願公開第2003051914号及び国際特許出願公開第2009033670号を参照。IdeSは、疾患を媒介するか、又はそうでなければ、望ましくない、IgG分子の、インビボでの切断が可能であるため、治療剤としての、インビボでの有用性も有することが示されている。例えば、国際特許出願公開第2003051914号、国際特許出願公開第2006131347号及び国際特許出願公開第2013110946号を参照。IdeSは、IgGによって全体的又は部分的に媒介される、任意の疾患又は状態に対する治療法として用いられ得る。多くの自己免疫疾患は、供与された臓器の急性拒絶反応のように、IgGが、全体的又は部分的に媒介する。
(a)配列番号2に対して少なくとも50%同一であり;
(b)前記変異体配列中の、配列番号1の94位に対応する位置にシステイン(C)を有し;及び場合により
(c)前記変異体配列中の、配列番号1の84位、262位、284位及び286位に対応する位置に、それぞれ、リジン(K)、ヒスチジン(H)、アスパラギン酸(D)及びアスパラギン酸(D)を有し;
前記ポリペプチドは、IgGの切断において、IdeSよりも有効であり、及び/又は、IdeSよりも免疫原性が低い。本発明のポリペプチドは、IgG2よりも、IgG1の切断においてより有効な場合がある。
好ましくは、配列番号2の前記変異体は:
(1)前記変異体中の、配列番号1の130位に対応する位置に、正に荷電したアミノ酸を有し、場合により、前記正に荷電したアミノ酸がアルギニン(R)又はリジン(K)であり;及び/又は
(2)前記変異体中の、配列番号1の131位に対応する位置に、正に荷電したアミノ酸を有し、場合により、前記正に荷電したアミノ酸がアルギニン(R)又はリジン(K)であり;及び/又は
(3)連続配列NQTNを含まず;及び/又は
(4)連続配列DSFSANQEIR YSEVTPYHVTを含まない。
− 前記治療が、臓器移植(若しくは前記治療剤が抗体)、ウイルスベクター等の遺伝子治療、欠損した、酵素、増殖因子若しくは凝固因子等の内因性因子についての置換、又は細胞治療であり;
− 投与される前記ポリペプチドの量は、被験体の血漿中に存在する実質的に全てのIgG分子を切断するのに十分であり;且つ
− 工程(a)及び(b)は、被験体の血漿中に存在する実質的にすべてのIgG分子を切断するのに十分な時間間隔で隔てられる、方法も提供する。
配列番号1は、N末端メチオニン及びシグナル配列を含むIdeSの全配列である。NCBI参照配列番号WP_010922160.1としても開示されている。
配列番号2は、N末端メチオニン及びシグナル配列を欠く、IdeSの成熟配列である。Genbank受入番号ADF13949.1としても開示されている。
配列番号3〜16は、本発明の例示的なポリペプチドの配列である
配列番号17は、本明細書でコントロールとして用いられるIdeSポリペプチドの配列である。追加のN末端メチオニン及びヒスチジンタグを伴う、配列番号2の配列(内部標準のpCART124)を含む。
配列番号18は、配列番号1の336位〜339位に対応する連続配列NQTNである。
配列番号19は、配列番号1の30位〜49位に対応する連続配列DSFSANQEIR YSEVTPYHVTである。
配列番号20〜34は、本明細書に開示されるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列である。
配列番号35は、配列番号1の31位〜49位に対応する配列SFSANQEIRY SEVTPYHVTである。
配列番号36は、IdeZポリペプチド(NCBI参照配列番号WP_014622780.1)の36位〜54位に対応する配列DYQRNATEAY AKEVPHQITである。
配列番号37は、本発明のポリペプチドのN末端に存在し得る配列DDYQRNATEA YAKEVPHQITである。
開示された生成物及び方法の異なる用途は、当該技術分野の特定のニーズに合わせて調整され得ることが理解されるべきである。本明細書で用いられる用語は、本発明の特定の実施形態を説明するためのみのものであり、限定することを意図するものではないことが理解されるべきである。
本発明は、IgGシステインプロテアーゼ活性を有する新規ポリペプチドに関し、前記ポリペプチドは、IgGの切断において、IdeSよりも有効であり、及び/又はIdeSよりも免疫原性が低い。本発明のポリペプチドに対するコントロール又は比較の関係において、「IdeS」は、配列番号2のアミノ酸配列からなるポリペプチドを指す。代替的に、又は追加的に、コントロール又は比較として用いられる場合、「IdeS」は、標準的な細菌発現系における発現及びそれからの単離を促進するために、付加的な、メチオニン(M)残基をN末端に、及び/又はタグをC末端に伴う、配列番号2のアミノ酸配列(the sequence the amino acid sequence of)を含むポリペプチドを指し得る。好適なタグとしては、ポリペプチドのC末端に直接連結され得るか、又は3つ、4つ又は5つのグリシン残基等の任意の好適なリンカー配列によって間接的に連結され得るヒスチジンタグが挙げられる。ヒスチジンタグは、典型的には6つのヒスチジン残基からなるが、これよりも長く、典型的には、最大7つ、8つ、9つ、10個又は20個のアミノ酸で、又はこれよりも短く、例えば5つ、4つ、3つ、2つ又は1つのアミノ酸であり得る。本明細書で用いられる例示的なIdeSポリペプチドの配列は、配列番号14として示されているコントロールである(is a control is provided as SEQ ID NO:14)。このポリペプチドは、追加のN末端メチオニン及びヒスチジンタグを有する配列番号2の配列を含み、本明細書ではpCART124と言われる場合がある。
本節は、前節で概説した機能的特徴に付加的に生かされる(apply in addition to)、本発明のポリペプチドの構造的特徴を示す。
(1)配列番号1の130位のアスパラギン(N)を、正に荷電したアミノ酸で置換することにより、この変化を組み込んだポリペプチドの効力が増強される。従って、本発明のポリペプチドは、配列番号1の130位に対応する前記変異体中の位置に、正に荷電したアミノ酸を有する、配列番号2のアミノ酸配列の変異体を含み得る。一般的な、正に荷電したアミノ酸が上記の表A1に同定されている。正に荷電したアミノ酸は、好ましくはアルギニン(R)又はリジン(K)である。従って、この特定の改変は、本明細書では用語「N130R/K」によって同定され得る。
(2)配列番号1の131位のグリシン(G)を、正に荷電したアミノ酸で置換することにより、この変化を組み込んだポリペプチドの効力が増強される。従って、本発明のポリペプチドは、配列番号1の131位に対応する前記変異体中の位置に正に荷電したアミノ酸を有する、配列番号2のアミノ酸配列の変異体を含み得る。一般的な、正に荷電したアミノ酸は、上記の表A1に同定されている。正に荷電したアミノ酸は、好ましくはアルギニン(R)又はリジン(K)である。従って、この特定の改変は、本明細書では用語「G131R/K」によって同定され得る。
(3)配列番号2のC末端の最後の4残基を欠失させることにより、この変化を組み込んだポリペプチドの効力が増強される。配列番号2のC末端の最後の4つの残基は、連続配列NQTNからなる。従って、本発明のポリペプチドは、連続配列NQTNを含まない、配列番号2のアミノ酸配列の変異体を含み得る。即ち、配列番号2のC末端の最後の4残基は、配列番号2の前記変異体には存在しなくてもよい。配列番号2の最後の4残基は、配列番号1の336位〜339位に対応する。従って、この特定の改変は、本明細書中で用語「N336_N339del」によって同定され得る。
(4)配列番号2のN末端の最初の20残基を欠失させる又は改変することは、効力に悪影響を及ぼすことなく、この変化を組み込むポリペプチドの効力を増強し得、及び/又は免疫原性を低下させ得る。配列番号2のN末端の最初の20残基は、連続配列DSFSANQEIRYSEVTPYHVT(配列番号19)からなる。従って、本発明のポリペプチドは、連続配列DSFSANQEIRYSEVTPYHVTを含まない、配列番号2のアミノ酸配列の変異体を含み得る。
一例として、配列番号19の前記連続配列は、その全体が欠失されていてもよい。すなわち、配列番号2のN末端の最初の20残基は、配列番号2の前記変異体には存在しなくてもよい。配列番号2の最初の20残基は、配列番号1の30位〜49位に対応する。従って、この連続した配列の欠失は、本明細書中で用語「D30_T49del」によって同定され得る。
或いは、本発明のポリペプチドは、配列番号2のN末端の最初の20残基の配列が、前記最初の20残基中の1以上のアミノ酸を置換することによって改変された、配列番号2のアミノ酸配列の変異体を含み得る。改変された配列は、好ましくは、配列番号2の最初の20個のアミノ酸と比較して免疫原性が減少する。一例として、配列番号2の2位〜20位のアミノ酸(配列番号1の31位〜49位に対応する)は、場合により、連続配列DYQRNATEAY AKEVPHQIT(配列番号36)で置換され得る。換言すれば、本発明のポリペプチドの最初の20個のアミノ酸は、配列番号19の配列の代わりに、配列DDYQRNATEA YAKEVPHQIT(配列番号37)からなり得る。挿入された配列である配列番号36は、IdeZのN末端領域からとられており、NCBI参照配列番号WP_014622780.1のIdeZの36位〜54位に対応する。ヒト被験体は、典型的には、IdeZに対する抗体を発現しないので、この配列を含むポリペプチドにはADAは作用しにくい。本明細書において、配列番号35の、配列番号37との置換は、用語「S31_T49replZ」によって同定され得る。
(a)配列番号2に対して少なくとも50%同一であり;
(b)前記変異体配列中の、配列番号1の94位に対応する位置にシステイン(C)を有し;及び場合により
(c)前記変異体配列中の、配列番号1の84位、262位、284位及び286位に対応する位置に、それぞれ、リジン(K)、ヒスチジン(H)、アスパラギン酸(D)及びアスパラギン酸(D)を有する;
好ましくは、配列番号2の前記変異体は:
(1)前記変異体中の、配列番号1の130位に対応する位置に、正に荷電したアミノ酸を有し、場合により、前記正に荷電したアミノ酸がアルギニン(R)又はリジン(K)であり;及び/又は
(2)前記変異体中の、配列番号1の131位に対応する位置に、正に荷電したアミノ酸を有し、場合により、前記正に荷電したアミノ酸がアルギニン(R)又はリジン(K)であり;及び/又は
(3)連続配列NQTNを含まず;及び/又は
(4)連続配列DSFSANQEIR YSEVTPYHVTを含まない。
本明細書に開示される通りのポリペプチドは、任意の好適な手段によって製造され得る。例えば、ポリペプチドは、Fmoc固相化学、Boc固相化学又は溶液相ペプチド合成等の、当該技術分野で公知の標準的技術を用いて直接的に合成され得る。或いは、ポリペプチドは、細胞、典型的には細菌細胞を、前記ポリペプチドをコードする核酸分子又はベクターで形質転換することによって製造され得る。細菌宿主細胞における発現によるポリペプチドの製造は、以下に記載され、実施例に例示される。本発明は、本発明のポリペプチドをコードする核酸分子及びベクターを提供する。本発明は、かかる核酸又はベクターを含む宿主細胞も提供する。本明細書に開示されるポリペプチドをコードする、例示的なポリヌクレオチド分子は、配列番号20〜34として示される。これらの配列の各々は、3’末端にN末端メチオニンのコドン(ATG)を含み、5’末端の終止コドン(TAA)の前に、3×グリシンのリンカー及び6×hisのヒスチジンタグのコドンを含み、それらは場合により除去され得る。
別の態様においては、本発明は、本発明のポリペプチドを含む組成物を提供する。例えば、本発明は、本発明の1以上のポリペプチド及び少なくとも1つの医薬的に許容可能な担体又は希釈剤を含む組成物を提供する。担体(複数可)は、組成物の他の成分と適合し、組成物が投与される被験体に有害ではないという意味で「許容可能」でなければならない。典型的には、担体及び最終組成物は、無菌で、発熱物質(pyrogen)フリーである。
本発明は、種々の方法における本発明のポリペプチドの使用を提供する。例えば、本発明のポリペプチドは、バイオテクノロジーに有用なツールを提供し得る。ポリペプチドは、IgG、特にヒトIgGの特異的なエクスビボ切断のために用いられ得る。かかる方法においては、ポリペプチドは、特異的システインプロテアーゼ活性を生じさせる条件下で、IgGを含有する試料とインキュベーションされ得る。国際公開第2003051914号及び国際公開第2009033670号に記載されたもの等の、任意の好適な方法を用いて、特定の切断が確認され得、切断産物が単離され得る。従って、該方法は、特に、Fc及びF(ab’)2の断片を生成するために用いられ得る。次いで、本発明のポリペプチドによるIgGの切断から生じるF(ab’)2断片に対する(例えば、2−メルカプトエタノールアミン又はシステアミンで)還元工程を実施することによって、Fab断片が製造され得る。
− 投与される前記ポリペプチドの量は、被験体の血漿中に存在する実質的に全てのIgG分子を切断するのに十分である;及び
− 工程(a)及び(b)は、少なくとも2時間、また多くとも21日の時間間隔で隔てられる
方法を提供するものとして記述され得る。
tuzumab)、シファリムマブ(Sifalimumab)、シルツキシマブ(Siltuximab)、シムツズマブ(Simtuzumab)、シプリズマブ(Siplizumab)、シルクマブ(Sirukumab)、ソラネズマブ(Solanezumab)、ソリトマブ(Solitomab)、ソネプシズマブ(Sonepcizumab)、ソンツズマブ(Sontuzumab)、スタムルマブ(Stamulumab)、スレソマブ(Sulesomab)、スビズマブ(Suvizumab)、タバルマブ(Tabalumab)、タカツズマブテトラキセタン(Tacatuzumab tetraxetan)、タドシズマブ(Tadocizumab)、タリズマブ(Talizumab)、タネズマブ(Tanezumab)、タプリツモマブパプトクス(Taplitumomab paptox)、テフィバズマブ(Tefibazumab)、テリモマブアリトクス(Telimomab aritox)、テナツモマブ(Tenatumomab)、テネリキシマブ(Teneliximab)、テプリズマブ(Teplizumab)、テプロツムマブ(Teprotumumab)、TGN1412、チシリムマブ(Ticilimumab)(=トレメリムマブ(tremelimumab))、チルドラキズマブ(Tildrakizumab)、チガツズマブ(Tigatuzumab)、TNX−650、トシリズマブ(Tocilizumab)(=アツリズマブ(atlizumab))、トラリズマブ(Toralizumab)、トシツモマブ(Tositumomab)、トラロキヌマブ(Tralokinumab)、トラスツズマブ(Trastuzumab)、TRBS07、トレガリズマブ(Tregalizumab)、トレメリムマブ(Tremelimumab)、ツコツズマブセルモロイキン(Tucotuzumab celmoleukin)、ツビルマブ(Tuvirumab)、ウブリツキシマブ(Ublituximab)、ウレルマブ(Urelumab)、ウルトキサズマブ(Urtoxazumab)、ウステキヌマブ(Ustekinumab)、バパリキシマブ(Vapaliximab)、バテリズマブ(Vatelizumab)、ベドリズマブ(Vedolizumab)、ベルツズマブ(Veltuzumab)、ベパリモマブ(Vepalimomab)、ベセンクマブ(Vesencumab)、ビシリズマブ(Visilizumab)、ボロシキシマブ(Volociximab)、ボルセツズマブマフォドチン(Vorsetuzumab mafodotin)、ボツムマブ(Votumumab)、ザルツムマブ(Zalutumumab)、ザノリムマブ(Zanolimumab)、ザツキシマブ(Zatuximab)、ジラリムマブ(Ziralimumab)、又はゾリモマブアリトクス(Zolimomab aritox)であり得る。
− 投与される前記ポリペプチドの量は、被験体の血漿中に存在する実質的に全てのIgG分子を切断するのに十分である;及び
− 工程(a)及び(b)は、少なくとも2時間、また多くとも21日の時間間隔で隔てられる、方法と記述され得る。
特に表示しない限り、用いた方法は、標準的な生化学及び分子生物学の技術である。好適な方法論の教科書の例としては、Sambrook et al.,Molecular Cloning,A Laboratory Manual(1989)及びAusubel et al.,Current Protocols in Molecular Biology(1995),John Wiley and Sons,Inc.が挙げられる。
成熟したIdeS分子を解析し、突然変異に好適な領域を同定した。いくつかの場合においては、インシリコ評価を用いて、突然変異で起こり得る結果を評価した。各ポリペプチドの配列を決定し、各ポリペプチドをコードするcDNAを、導入された突然変異の数に応じて、出発配列の部位特異的突然変異又は合成のいずれかによって、GeneCust,Luxembourgで生成した。cDNAを配列決定し、短いグリシンリンカー(3×Gly)によってC末端に連結したC末端6×Hisタグとインフレームで、pET9a発現ベクター(Novagene)に移した。細菌の発現を向上させるために、N末端メチオニンを付加した。E.コリBL21(DE3)(Stratagene)を、プラスミドで形質転換(熱ショック)して、30μg/mlのカナマイシンを含有するLBアガロースプレート上に播種した。単一のコロニーを拾い、一晩の培養(3mlのLB培地)を37℃、250rpmで開始した。翌日、グリセロールストックを調製し、30μg/mlのカナマイシン及び消泡剤を添加した10mlのTB培地に終夜培養液を植菌し、OD0.6〜0.8(37℃、300rpm)まで増殖させた。この時点で、IPTG(1mM)を加え、1時間培養を継続した後、遠心分離により細菌を回収した。ペレットをPBS中で洗浄し、−20℃で凍結させた。細菌溶解のための凍結融解プロトコルを用い(各1ml PBSにおいて3回の凍結/融解サイクル)、タンパク質を、Ni−NTAを予め充填したスピンカラム(Pierce)を用いて精製した。精製後、溶出したタンパク質を、緩衝液交換(MWCO 9K Millipore cfg装置中に3倍容量のPBS)前に、10mM DTTで活性化した。ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS−PAGE)無染色12%Mini−PROTEAN(登録商標)TGX(商標)プレキャストゲル(Biorad)SDS−PAGEを用いて、各タンパク質の純度及び安定性を評価した。
ELISA
ELISAベースの効力アッセイを用いて、酵素活性を測定した。ELISAの原理は、マルチタイタープレートのウェルを抗体標的(BSA)でコーティングし、次いで種々の濃度の(試験又はコントロールの)IgGシステインプロテアーゼポリペプチドを、ウェル中の抗BSA抗体とインキュベーションした後、検出抗体を用いて、ウェルに結合した抗BSA抗体の量を検出することである。ある特定の、ウェル中のIgGシステインプロテアーゼポリペプチドの濃度が高いほど、ウェルに結合する無傷の抗BSAポリペプチドはより少なく、もたらされるシグナルはより弱い。同様に、同じ濃度で存在する場合、より強力なIgGシステインプロテアーゼポリペプチドは、より効力が弱いIgGシステインプロテアーゼポリペプチドよりも、弱いシグナルをもたらす。
種々の基質中の、各ポリペプチドの滴定シリーズによって生成された切断産物を、SDS−PAGEで可視化することにより、種々のpCARTポリペプチドの有効性を更に評価した。純粋IgG基質中での有効性を試験するために、アダリムマブ(Humira)をIgG1用に用い、デノスマブ(XGEVA)をIgG2用に用いた。より複雑な生理学的環境中での有効性を試験するために、ポリペプチドをIVIg(Octagam)中(in in)でもいくつか滴定した。これにより、中和作用を有する抗IdeS抗体がポリペプチド活性に与える影響を評価できる。各ポリペプチドの切断パターンを、同一基質中のIdeS(BX1001865及びpCART124)の切断パターンと比較する。プロトコルは以下の通りである:
競合的ADAアッセイ
このアッセイは、抗IdeS抗体への結合についての、試験ポリペプチドとIdeSとの間の競合に基づいている。試験酵素とIVIgとのプレインキュベーションにより、試験したpCART酵素に対する抗IdeS抗体の結合が可能になる。その後、IdeSでコーティングしたプレートに、IVIg−酵素混合物を加え、試験ポリペプチドに結合していないすべての抗IdeS抗体を、プレート上のIdeSに、代わりに結合させる。結合のためのインキュベーションは、すべて、IgG切断を阻害するために、2mMヨード酢酸(IHAc)の存在下で、及び高塩濃度で行い、高親和性結合のみが生じるようにした。洗浄後、検出剤として、特異的なビオチン化抗ヒトF(ab’)2ヤギF(ab’)2断片を使用する。IVIg中の抗IdeS抗体による試験ポリペプチドの認識が乏しいと、IVIg中の抗IdeS抗体のプレートへの高結合をもたらし、強いシグナルをもたらす。IVIg中の抗IdeS抗体による試験ポリペプチドの良好な認識は、反対の結果をもたらす。詳細なプロトコルは以下の通りである。
試験したポリペプチドはすべて、IdeSと比較して、効力の増大及び/又は免疫原性の低下を示す。
効力ELISA
ヒトIgG1及びIgG2の切断能力を扱うために、2つのELISAベースの効力アッセイを用意した。一方のアッセイはIgG1の切断を、そして他方はIgG2の切断を測定する。試験した種々のIgGシステインプロテアーゼポリペプチドについて、EC50(半最大有効濃度)値を算出した。アッセイの原理は、Fab領域に対し特異性を有する、ヒトIgG抗体に対するF(ab)2断片で、マルチタイタープレートのウェルをコーティングすることであった。次いで、ウェル中で、ヒトIgG1抗体(Humira)又はヒトIgG2抗体(XGEVA)と共に、滴定濃度のIgGシステインプロテアーゼポリペプチド(試験又はコントロール)をインキュベーションした。ウェルに結合した無傷又は一回切断のヒトIgG(Humira又はXGEVA)の量を、抗体のFc部分に対する特異性を有する、ヒトIgGに対する検出抗体を用いて測定した。ある特定の、ウェル中のIgGシステインプロテアーゼポリペプチドの濃度が高いほど、ウェルに結合する無傷ヒトIgG抗体が少なく、より弱いシグナルがもたらされる。同様に、より強力なIgGシステインプロテアーゼポリペプチドは、同じ濃度で存在する場合、より効力が弱いIgGシステインプロテアーゼポリペプチドよりも弱いシグナルをもたらす。IgG1(humira)及びIgG2(XGEVA)アッセイの両方において、IdeSコントロール(pCART124)及び全ての試験したIgGシステインプロテアーゼポリペプチドについて、滴定用量応答曲線を作成した。IgG分子の第2の切断において、その最大効果の50%が観察されるポリペプチドの濃度、即ちIgGの半数が完全に切断されている濃度を表すEC50値も、試験した各変異体について算出した。EC50値がより低いと、より有効なIgGシステインプロテアーゼを表す。IgGのFc部分が依然として存在し、Fc特異的検出抗体によって検出し得るので、IgGからscIgGへの、第1のIgG重鎖の切断は、このアッセイにおいては明確でない(図13)。
効力ELISA
効力アッセイにおいて、試験したIgGシステインプロテアーゼについて得られた用量−応答曲線を図7(IgG1切断)及び図8(IgG2切断)に示す。本明細書で試験した、本発明の例示的なポリペプチドのpCART125、213、214は、IdeSコントロールのpCART124と比較して、EC50値を減少させて(表1)IgG1(図7)及びIgG2(図8)の、両方の重鎖を切断する効力を向上させ、pCART125については1.5、pCART214については2.2、及びpCART213については3.0の、切断における倍数的な効力向上であった。IgG2の切断(図8)に関しては、pCART124(IdeS)と比較して、pCART125については1.6、pCART214については2.1、及びpCART213については3.5の倍数的な向上であった。
ゲルで可視化した、IgG1(図9A)及びIgG2(図9B)の切断は、第1及び第2の重鎖切断を明確に示す(図中の縦線は、BX1001865及びpCART124の切断による第1及び第2のIgG重鎖切断を示す)。図中の*は、おおよそのEC50値、即ち、IgGの50%が1回切断(scIgG)され、50%が完全に切断(F(ab’)2)される濃度を示す。ゲルからのデータを表2(IgG1切断)及び表3(IgG2切断)にまとめる。IgG1(Humira)の第1の重鎖切断に必要なIgGシステインプロテアーゼの濃度は、BX1001865及びpCART124(IdeSコントロール)、pCART125,213及び214について1.5ng/mlで、試験したすべてのポリペプチドについて、ほぼ同じであった(図9A)。IgG1の第2の重鎖切断に関しては、IdeS、pCART125及び214は、ゲル上で支配的なF(ab’)2バンドを得るのに約120ng/ml必要であり、pCART213については、約1回滴定ステップが少ない40ng/mlである(図9A)。図9Bにおいて可視化したIgG2(XGEVA)切断により、試験したすべてのポリペプチド、BX1001865、pCART124、125、213及び214が、およそ同じ有効性を示し、第1のIgG重鎖を切断してscIgG2を生成するのに14ng/ml必要であり、及びF(ab’)2断片を生成するためには約370ng/mlであることが示される(表3)。
もう1式の有効性実験において、IdeSコントロールとしてBX1001865及びpCART124を用いて、Humira(IgG1)及びXGEVA(IgG2)に対してpCART228を試験した(図10A及び10B、表4)。これらの実験において、図9及び表3と比較して、コントロール(BX1001865及びpCART124)については、おおよそ1滴定ステップ高い濃度が必要であり、試料の取扱い及び試料の滴定希釈における実験室の精度に起因して、実験間の小さな差異が観察され得る。信頼できる比較を得るためには、pCART228を、同じ実験におけるIdeSコントロールの切断と比較しなければならない。IgG1及びIgG2の切断の両方において、非常に類似したIgG切断パターンが、pCART228及びIdeSコントロールについて見られる(図10A及びB)が、pCART228による、IgG1の第2のIgG重鎖切断に、120ng/ml必要であり、IdeSについての370ng/mlと比較して(表4)、およそ3倍(1滴定ステップ)効率的である(図10A)。
図7 種々のIgGシステインプロテアーゼポリペプチドによるIgG1(Humira)切断についての滴定曲線。
効力ELISAにおけるpCART125、213、及び214についてのより低いEC50値は、pCART124(原型IdeS)と比較して、これらのポリペプチドの、IgG1及びIgG2の両方の、第2の重鎖切断(scIgGからF(ab’)2へ)の効力が向上することを示す。ゲルでのIgG切断を可視化することにより、Fc特異的検出抗体を用いた効力ELISAにおいては測定できない、(IgGからscIgGへの)第1の重鎖の切断が示される。病原性IgG分子を不能化することが主な焦点である臨床状況において重要な、Fcにより媒介されるIgGの作用は、大抵、1回切断分子において無くなっている(データ示さず)。pCART228は、IgG1及びIgG2の切断の両方において、原型IdeSと同様に有効である。これは、IdeSと同じ分子サイズで、望ましい低さの、IdeS特異的抗体の認識を伴うIgGシステインプロテアーゼが必要な場合に重要である。IVIgは、おおよそ65〜70%のIgG1、35〜30%のIgG2及び約1%を占めるIgG3/IgG4を含有するヒトIgGのプールである。ヒトIVIgはまた、IgGドナーの、以前のS.ピオゲネスへの曝露に由来する抗IdeS抗体を自然に含有する。ヒトIVIg中の抗IdeS抗体は、それらのIdeSに対する結合が、IdeSのIgGプロテアーゼ活性を低下させ得るか又は完全に無くし得るという点で、中和作用がある。IVIg切断の結果は、抗IdeS中和抗体の存在により、(IgG1及びIgG2が優先されるが、)異なるIgGサブクラスすべてが、全般的に切断されることを示す。一般に、試験した全てのIgGシステインプロテアーゼポリペプチドは、IgG1と比較して、IgG2切断においてより有効性が低い。
ELISA,Meso Scale Discovery(MSD)ベースのアッセイを用いて、IdeSに対する抗薬物抗体(ADA)結合部位を、本発明の「ADA」改変ポリペプチド(pCART125、213及び214)について評価した。ELISAの原理は、原型のhisタグ付きIdeS(pCART124)で、マルチタイタープレートのウェルをコーティングすることであった。ほとんどのヒトは、以前のA群ストレプトコッカスの感染に起因して、血清中に、IdeSに対する抗体を有する。本明細書では、2つの異なるヒト臨床血清プールを、ADA検出についての基準として用いた。第1のプールは、ヒト血清プール1191807と呼ばれる、100個体からの正常なヒト血清であり、第2のプールは、第II相プール−2と呼ばれる、第II相研究13−HMedIdeS−02における患者由来の血清プールである。これらの患者には、IdeSが、0.24〜0.5mg/kg体重の用量範囲で、1回投与され、それにより血清中の抗IdeS ADAレベルをおおよそ50倍に誘導した。
試験したIgGシステインプロテアーゼポリペプチド、pCART125,213及び214は、全て、原型のIdeS(pCART124)と比較して、ヒト血清中のIdeS特異的ADAにより認識されにくい。ADA認識エピトープのいくつかは、IdeSのN末端部分に見出される。本発明のこれらのポリペプチドは全て、IdeSと比較してN末端が欠失しており、該N末端の欠失が、pCART125と原型のIdeSとの間の唯一の連続した相違である。
pCART125、213及び214についての、IdeS−ADA結合部位の遮断パーセンテージ(%)を図14及び図15に示す。原型IdeSのpCART124を100%類似のポジティブコントロールとして使用する。
本研究においては、BALB/cマウスに、ヒトIVIg(Octagam)を腹腔内(i.p.)注射した。ヒトIVIgの濃度は、ヒトIgG血漿濃度(10mg/ml)と関連性を持たせるように、900mg/kgの用量で投与した。
アッセイの原理は、Fab領域に対する特異性を有する、ヒトIgG抗体に対するF(ab’)2断片で、マルチタイタープレートのウェルをコーティングすることであった。次いで、IVIg並びにIdeSコントロール(BX1001865及びpCART124)又は試験したIgGシステインプロテアーゼポリペプチドで処置したマウス由来の血清を加えた。抗体のFc部分に対する特異性を有する、ヒトIgG(IVIg)に対する検出抗体を用いて、ウェルに結合した無傷又は1回切断のヒトIgG(IVIg)の量を測定した。無傷ヒトIgG抗体(IVIg)の検出濃度が低いほど、IgGシステインプロテアーゼポリペプチドがより有効であると予想される。
10μlのマウス血清を、90μlのPBSで1:10に希釈した。その後、10μlの希釈血清を30μlの4×SDS−PAGEローディング緩衝液と混合した。5μlの自製(in−house)IgGマーカーを用いて、種々のIgG断片(IgG、scIgG及びF(ab’)2)を示した。試料を、92℃で3分間加熱し(Thermo mixer compact,eppendorf)、短時間遠心してから、10μlを4〜20%Mini−Protean(登録商標)TGX、Stain−free(商標)ゲル(Cat.#456−8096、Biorad)にロードした。ゲルを、200Vで40分間泳動(run)した。
有効性ELISAにより、血清中のヒトIgGレベルを研究し、SDS−PAGEによるIgG分解を解析することにより、IdeSコントロール(BX1001865及びpCART124)及びpCART125、213及び214によるヒトIVIg(Octagam)のインビボ切断を比較した。
Claims (18)
- IgGシステインプロテアーゼ活性を有し、配列番号2の配列の変異体を含むポリペプチドであって、該変異体が:
(a)配列番号2に対して少なくとも90%同一であり;
(b)前記変異体配列中の、配列番号1の94位に対応する位置にシステイン(C)を有し;及び
(c)前記変異体配列中の、配列番号1の84位、262位、284位及び286位に対応する位置に、それぞれ、リジン(K)、ヒスチジン(H)、アスパラギン酸(D)及びアスパラギン酸(D)を有し;
前記ポリペプチドは、IgGの切断において、同じアッセイにおいて測定した場合IdeSよりも少なくとも1.5倍有効であり、且つ、IdeSよりも免疫原性が低く、更に配列番号2の配列の前記変異体が:
(1)前記変異体中の、配列番号1の130位に対応する位置に、正に荷電したアミノ酸を有し;及び/又は
(2)連続配列NQTNを含まず;及び/又は
(3)配列番号2のN末端における最初の20残基(連続配列DSFSANQEIR YSEVTPYHVT;配列番号19を含む)全体が欠失している、ポリペプチド。 - 配列番号2の配列の前記変異体が、前記変異体中の、配列番号1の130位に対応する位置に、正に荷電したアミノ酸を有し、前記正に荷電したアミノ酸がアルギニン(R)又はリジン(K)である、請求項1に記載のポリペプチド。
- 配列番号2の配列の前記変異体が、配列番号2に対して少なくとも95%又は99%同一である、請求項1又は2に記載のポリペプチド。
- 配列番号3〜16のいずれか1つの配列を含むか、又はそれからなる、請求項1〜3のいずれか1項に記載のポリペプチド。
- 前記配列が、メチオニンをN末端に、及び/又はヒスチジンタグをC末端に、更に含む、請求項1〜4のいずれか1項に記載のポリペプチド。
- 同じアッセイにおいて測定した場合、前記ポリペプチドが、IgGの切断において、IdeSよりも少なくとも2.0倍、2.5倍、3.0倍、4.0倍、4.5倍、5.0倍、6.0倍、7.0倍又は7.5倍更に有効である、請求項1〜5のいずれか1項に記載のポリペプチド。
- IdeSよりも免疫原性が低い、請求項1〜6のいずれか1項に記載のポリペプチド。
- 同じアッセイにおいて測定した場合、前記ポリペプチドの免疫原性が、IdeSの免疫原性の85%以下である、請求項7に記載のポリペプチド。
- 請求項1〜8のいずれか1項のポリペプチドをコードする核酸配列を含む、ポリヌクレオチド又は発現ベクター。
- 請求項9のポリヌクレオチド又は発現ベクターを含む宿主細胞。
- 細菌細胞である、請求項10に記載の宿主細胞。
- 細菌細胞がE.コリの細胞である、請求項11に記載の宿主細胞。
- 請求項1〜8のいずれか1項に記載のポリペプチド及び少なくとも1つの医薬的に許容可能な担体又は希釈剤を含む、組成物。
- 請求項1〜8のいずれか1項に記載のポリペプチドを有効成分として含む、医薬組成物。
- 被験体における疾患又は状態を予防又は治療するための方法において使用するための医薬製剤の製造における、請求項1〜8のいずれか1項に記載のポリペプチドの使用。
- 前記疾患又は状態が、病原性IgG抗体によって全体的又は部分的に媒介される疾患又は状態であり、好ましくは、前記疾患又は状態が、アジソン病、抗GBM糸球体腎炎、抗好中球細胞質抗体関連血管炎、抗NMDAR脳炎、抗リン脂質抗体症候群、劇症型APS、自己免疫性水疱性皮膚症、落葉状天疱瘡、ブラジル天疱瘡、尋常性天疱瘡、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性肝炎、自己免疫性好中球減少症、類天疱瘡、セリアック病、慢性蕁麻疹、完全先天性心ブロック、糖尿病1A型、後天性表皮水疱症、本態性混合型クリオグロブリン血症、グッドパスチャー症候群、グレーブス病、甲状腺腫、甲状腺機能亢進症、浸潤性眼球突出症、浸潤性皮膚症、ギラン・バレー症候群、急性炎症性脱髄性多発神経炎、急性運動性軸索型ニューロパチー、血友病−後天性第FVIII因子欠損症、特発性血小板減少性紫斑病、ランバート・イートン筋無力症症候群、混合性結合組織病、多発性骨髄腫、重症筋無力症、筋無力症クリーゼ、心筋炎、拡張型心筋症、視神経脊髄炎、原発性胆汁性肝硬変、一次進行型多発性硬化症、リウマチ性心疾患、リウマチ熱、関節リウマチ、血清病、免疫複合体過敏症(III型)、シェーグレン症候群、ループス腎炎を含むSLE、全身硬直性症候群、全身性硬化症、移植拒絶反応又は血栓性血小板減少性紫斑病である、請求項15に記載の使用。
- IgGを切断するためのエクスビボの方法であって、IgGシステインプロテアーゼ活性が生じることを可能にする条件下で、IgGを含有する試料と、請求項1〜8のいずれか1項に記載のポリペプチドとを接触させることを含む、方法。
- Fc及びFab断片を生成するために実施される、及び/又は、試料が、請求項16に定義された疾患又は状態に罹患している被験体から採取された血液試料である、請求項17に記載のエクスビボの方法。
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