JP2006520202A - ストレプトコッカス・ピオゲネス抗原 - Google Patents
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- C07K14/315—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Streptococcus (G), e.g. Enterococci
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Abstract
Description
(a)配列番号1、4-8、10-18、20、22、24-32、34-35、38-40、43-46、49-51、53-54、57-61、63、65-71、73、75-77、81-82、88、91-94および96-150から選ばれる核酸分子に対して少なくとも70%の配列同一性を有する核酸分子、
(b)(a)の核酸分子に相補的な核酸分子、
(c)(a)または(b)の核酸分子の少なくとも15の連続塩基を含む核酸分子、
(d)(a)、(b)または(c)の核酸分子にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でアニールする核酸分子、
(e)遺伝子コードの縮重を別として、(a)、(b)、(c)または(d)に定める核酸分子にハイブリダイズする核酸分子
よりなる群から選ばれた核酸配列を含む、高度免疫血清反応性の抗原またはその断片をコードする単離核酸分子を提供する。
(a)配列番号64から選ばれる核酸分子に対して少なくとも96%の配列同一性を有する核酸分子、
(b)(a)の核酸分子に相補的な核酸分子、
(c)(a)または(b)の核酸分子の少なくとも15の連続塩基を含む核酸分子、
(d)(a)、(b)または(c)の核酸分子にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でアニールする核酸分子、
(e)遺伝子コードの縮重を別として、(a)、(b)、(c)または(d)に定める核酸分子にハイブリダイズする核酸分子
よりなる群から選ばれた核酸配列を含む、高度免疫血清反応性の抗原またはその断片をコードする単離核酸分子を提供する。
(a)配列番号3、36、47-48、55、62、72、80、84、95から選ばれる核酸分子、
(b)(a)の核酸分子に相補的な核酸分子、
(c)遺伝子コードの縮重を別として、(a)、(b)、(c)または(d)に定める核酸分子にハイブリダイズする核酸分子
よりなる群から選ばれた核酸配列を含む単離核酸分子を提供する。
配列番号151の4-44, 57-65, 67-98, 101-107, 109-125, 131-144, 146-159, 168-173, 181-186, 191-200, 206-213, 229-245, 261-269, 288-301, 304-317, 323-328, 350-361, 374-384, 388-407, 416-425および1-114; 配列番号152の5-17, 49-64, 77-82, 87-98, 118-125, 127-140, 142-150, 153-159, 191-207, 212-218, 226-270, 274-287, 297-306, 325-331, 340-347, 352-369, 377-382, 390-395および29-226; 配列番号153の4-16, 20-26, 32-74, 76-87, 93-108, 116-141, 148-162, 165-180, 206-219, 221-228, 230-236, 239-245, 257-268, 313-328, 330-335, 353-359, 367-375, 394-403, 414-434, 437-444, 446-453, 456-464, 478-487, 526-535, 541-552, 568-575, 577-584, 589-598, 610-618, 624-643, 653-665, 667-681, 697-718, 730-748, 755-761, 773-794, 806-821, 823-831, 837-845, 862-877, 879-889, 896-919, 924-930, 935-940, 947-955, 959-964, 969-986, 991-1002, 1012-1036, 1047-1056, 1067-1073, 1079-1085, 1088-1111, 1130-1135, 1148-1164, 1166-1173, 1185-1192, 1244-1254および919-929; 配列番号154の5-44, 62-74, 78-83, 99-105, 107-113, 124-134, 161-174, 176-194, 203-211, 216-237, 241-247, 253-266, 272-299, 323-349, 353-360および145-305; 配列番号155の15-39, 52-61, 72-81, 92-97および71-81; 配列番号156の13-19, 21-31, 40-108, 115-122, 125-140, 158-180, 187-203, 210-223, 235-245および173-186; 配列番号157の5-12, 19-27, 29-39, 59-67, 71-78, 80-88, 92-104, 107-124, 129-142, 158-168, 185-191, 218-226, 230-243, 256-267, 272-277, 283-291, 307-325, 331-344, 346-352および316-331; 配列番号158の6-28, 43-53, 60-76, 93-103および21-99; 配列番号159の10-30, 120-126, 145-151, 159-169, 174-182, 191-196, 201-206, 214-220, 222-232, 254-272, 292-307, 313-323, 332-353, 361-369, 389-396, 401-415, 428-439, 465-481, 510-517, 560-568および9-26; 配列番号160の5-29, 39-45, 107-128および1-112; 配列番号161の4-38, 42-50, 54-60, 65-71, 91-102および21-56; 配列番号162の4-13, 19-25, 41-51, 54-62, 68-75, 79-89, 109-122, 130-136, 172-189, 192-198, 217-224, 262-268, 270-276, 281-298, 315-324, 333-342, 353-370, 376-391および23-39; 配列番号163の6-41, 49-58, 62-103, 117-124, 147-166, 173-194, 204-211, 221-229, 255-261, 269-284, 288-310, 319-325, 348-380, 383-389, 402-410, 424-443, 467-479, 496-517, 535-553, 555-565, 574-581, 583-591および474-489; 配列番号164の8-35, 52-57, 66-73, 81-88, 108-114, 125-131, 160-167, 174-180, 230-235, 237-249, 254-262, 278-285, 308-314, 321-326, 344-353, 358-372, 376-383, 393-411, 439-446, 453-464, 471-480, 485-492, 502-508, 523-529, 533-556, 558-563, 567-584, 589-597, 605-619, 625-645, 647-666, 671-678, 690-714, 721-728, 741-763, 766-773, 777-787, 792-802, 809-823, 849-864および37-241, 409-534, 582-604, 743-804; 配列番号165の4-17, 24-36, 38-44, 59-67, 72-90, 92-121, 126-149, 151-159, 161-175, 197-215, 217-227, 241-247, 257-264, 266-275, 277-284, 293-307, 315-321, 330-337, 345-350, 357-366, 385-416および202-337; 配列番号166の4-20, 22-46, 49-70, 80-89, 96-103, 105-119, 123-129, 153-160, 181-223, 227-233, 236-243, 248-255, 261-269, 274-279, 283-299, 305-313, 315-332, 339-344, 349-362, 365-373, 380-388, 391-397, 402-407および1-48; 配列番号167の18-37, 41-63, 100-106, 109-151, 153-167, 170-197, 199-207, 212-229, 232-253, 273-297および203-217; 配列番号168の20-26, 54-61, 80-88, 94-101, 113-119, 128-136, 138-144, 156-188, 193-201, 209-217, 221-229, 239-244, 251-257, 270-278, 281-290, 308-315, 319-332, 339-352, 370-381, 388-400, 411-417, 426-435, 468-482, 488-497, 499-506, 512-521および261-273; 配列番号169の6-12, 16-36, 50-56, 86-92, 115-125, 143-152, 163-172, 193-203, 235-244, 280-289, 302-315, 325-348, 370-379, 399-405, 411-417, 419-429, 441-449, 463-472, 482-490, 500-516, 536-543, 561-569, 587-594, 620-636, 647-653, 659-664, 677-685, 687-693, 713-719, 733-740, 746-754, 756-779, 792-799, 808-817, 822-828, 851-865, 902-908, 920-938, 946-952, 969-976, 988-1005, 1018-1027, 1045-1057, 1063-1069, 1071-1078, 1090-1099, 1101-1109, 1113-1127, 1130-1137, 1162-1174, 1211-1221, 1234-1242, 1261-1268, 1278-1284, 1312-1317, 1319-1326, 1345-1353, 1366-1378, 1382-1394, 1396-1413, 1415-1424, 1442-1457, 1467-1474, 1482-1490, 1492-1530, 1537-1549, 1559-1576, 1611-1616, 1624-1641および1-414, 443-614, 997-1392; 配列番号170の14-42, 70-75, 90-100, 158-181および1-164; 配列番号171の4-21, 30-36, 54-82, 89-97, 105-118, 138-147および126-207; 配列番号172の4-21, 31-66, 96-104, 106-113, 131-142および180-204; 配列番号173の5-23, 31-36, 38-55, 65-74, 79-88, 101-129, 131-154, 156-165, 183-194, 225-237, 245-261, 264-271, 279-284, 287-297, 313-319, 327-336, 343-363, 380-386および11-197, 204-219, 258-372; 配列番号174の4-20, 34-41, 71-86, 100-110, 113-124, 133-143, 150-158, 160-166, 175-182, 191-197, 213-223, 233-239, 259-278, 298-322および195-289; 配列番号175の4-10, 21-35, 44-52, 54-62, 67-73, 87-103, 106-135, 161-174, 177-192, 200-209, 216-223, 249-298, 304-312, 315-329および12-130; 配列番号176の10-27, 33-38, 48-55, 70-76, 96-107, 119-133, 141-147, 151-165, 183-190, 197-210, 228-236, 245-250, 266-272, 289-295, 297-306, 308-315, 323-352, 357-371, 381-390, 394-401, 404-415, 417-425, 427-462, 466-483, 485-496, 502-507, 520-529, 531-541, 553-570, 577-588, 591-596, 600-610, 619-632, 642-665, 671-692, 694-707および434-444; 配列番号177の6-14, 16-25, 36-46, 52-70, 83-111, 129-138, 140-149, 153-166, 169-181, 188-206, 212-220, 223-259, 261-269, 274-282, 286-293, 297-306, 313-319, 329-341, 343-359, 377-390, 409-415, 425-430および360-375; 配列番号178の4-26, 28-48, 54-62, 88-121, 147-162, 164-201, 203-237, 245-251および254-260; 配列番号179の12-21, 26-32, 66-72, 87-93, 98-112, 125-149, 179-203, 209-226, 233-242, 249-261, 266-271, 273-289, 293-318, 346-354, 360-371, 391-400および369-382; 配列番号180の11-38, 44-65, 70-87, 129-135, 140-163, 171-177, 225-232, 238-249, 258-266, 271-280, 284-291, 295-300, 329-337, 344-352, 405-412, 416-424, 426-434, 436-455, 462-475, 478-487および270-312; 配列番号181の5-17, 34-45, 59-69, 82-88, 117-129, 137-142, 158-165, 180-195, 201-206, 219-226, 241-260, 269-279, 292-305, 312-321, 341-347, 362-381, 396-410, 413-432, 434-445, 447-453, 482-487, 492-499, 507-516, 546-552, 556-565, 587-604および486-598; 配列番号182の4-15, 17-32, 40-47, 67-78, 90-98, 101-107, 111-136, 161-171, 184-198, 208-214, 234-245, 247-254, 272-279, 288-298, 303-310, 315-320, 327-333, 338-349, 364-374および378-396; 配列番号183の5-27, 33-49, 51-57, 74-81, 95-107, 130-137, 148-157, 173-184および75-235; 配列番号184の6-23, 47-53, 57-63, 75-82, 97-105, 113-122, 124-134, 142-153, 159-164, 169-179, 181-187, 192-208, 215-243, 247-257, 285-290, 303-310および30-51; 配列番号185の17-29, 44-52, 59-73, 77-83, 86-92, 97-110, 118-153, 156-166, 173-179, 192-209, 225-231, 234-240, 245-251, 260-268, 274-279, 297-306, 328-340, 353-360, 369-382, 384-397, 414-423, 431-436, 452-465, 492-498, 500-508, 516-552, 554-560, 568-574, 580-586, 609-617, 620-626, 641-647および208-219; 配列番号186の4-26, 32-45, 58-72, 111-119, 137-143, 146-159, 187-193, 221-231, 235-242, 250-273, 290-304, 311-321, 326-339, 341-347, 354-368, 397-403, 412-419, 426-432, 487-506, 580-592, 619-628, 663-685, 707-716, 743-751, 770-776, 787-792, 850-859, 866-873, 882-888, 922-931, 957-963, 975-981, 983-989, 1000-1008, 1023-1029, 1058-1064, 1089-1099, 1107-1114, 1139-1145, 1147-1156, 1217-1226, 1276-1281, 1329-1335, 1355-1366, 1382-1394, 1410-1416, 1418-1424, 1443-1451, 1461-1469, 1483-1489, 1491-1501, 1515-1522, 1538-1544, 1549-1561, 1587-1593, 1603-1613, 1625-1630, 1636-1641, 1684-1690, 1706-1723, 1765-1771, 1787-1804, 1850-1857, 1863-1894, 1897-1910, 1926-1935, 1937-1943, 1960-1983, 1991-2005, 2008-2014, 2018-2039および396-533, 1342-1502, 1672-1920; 配列番号187の4-25, 45-50, 53-65, 79-85, 87-92, 99-109, 126-137, 141-148, 156-183, 190-203, 212-217, 221-228, 235-242, 247-277, 287-293, 300-319, 321-330, 341-361, 378-389, 394-406, 437-449, 455-461, 472-478, 482-491, 507-522, 544-554, 576-582, 587-593, 611-621, 626-632, 649-661, 679-685, 696-704, 706-716, 726-736, 740-751, 759-766, 786-792, 797-802, 810-822, 824-832, 843-852, 863-869, 874-879, 882-905および1-113, 210-232, 250-423, 536-564; 配列番号188の4-16, 33-39, 43-49, 54-85, 107-123, 131-147, 157-169, 177-187, 198-209, 220-230, 238-248, 277-286, 293-301, 303-315, 319-379, 383-393, 402-414, 426-432, 439-449, 470-478, 483-497, 502-535, 552-566, 571-582, 596-601, 608-620, 631-643, 651-656, 663-678, 680-699, 705-717, 724-732, 738-748, 756-763, 766-772, 776-791, 796-810, 819-827, 829-841, 847-861, 866-871, 876-882, 887-894, 909-934, 941-947, 957-969, 986-994, 998-1028, 1033-1070, 1073-1080, 1090-1096, 1098-1132, 1134-1159, 1164-1172, 1174-1201および617-635;
配列番号189の7-25, 30-40, 42-64, 70-77, 85-118, 120-166, 169-199, 202-213, 222-244および190-203; 配列番号190の4-11, 15-53, 55-93, 95-113, 120-159, 164-200, 210-243, 250-258, 261-283, 298-319, 327-340, 356-366, 369-376, 380-386, 394-406, 409-421, 425-435, 442-454, 461-472, 480-490, 494-505, 507-514, 521-527, 533-544, 566-574および385-398; 配列番号191の5-36, 66-72, 120-127, 146-152, 159-168, 172-184, 205-210, 221-232, 234-243, 251-275, 295-305, 325-332, 367-373, 470-479, 482-487, 520-548, 592-600, 605-615, 627-642, 655-662, 664-698, 718-725, 734-763, 776-784, 798-809, 811-842, 845-852, 867-872, 879-888, 900-928, 933-940, 972-977, 982-1003および12-190, 276-283, 666-806; 配列番号192の4-38, 63-68, 100-114, 160-173, 183-192, 195-210, 212-219, 221-238, 240-256, 258-266, 274-290, 301-311, 313-319, 332-341, 357-363, 395-401, 405-410, 420-426, 435-450, 453-461, 468-475, 491-498, 510-518, 529-537, 545-552, 585-592, 602-611, 634-639, 650-664および30-80, 89-105, 111-151; 配列番号193の7-29, 31-39, 47-54, 63-74, 81-94, 97-117, 122-127, 146-157, 168-192, 195-204, 216-240, 251-259および195-203; 配列番号194の5-16, 28-34, 46-65, 79-94, 98-105, 107-113, 120-134, 147-158, 163-172, 180-186, 226-233, 237-251, 253-259, 275-285, 287-294, 302-308, 315-321, 334-344, 360-371, 399-412, 420-426および32-50; 配列番号195の8-20, 30-36, 71-79, 90-96, 106-117, 125-138, 141-147, 166-174および75-90; 配列番号196の4-13, 15-33, 43-52, 63-85, 98-114, 131-139, 146-174, 186-192, 198-206, 227-233および69-88; 配列番号197の4-22, 29-35, 59-68, 153-170, 213-219, 224-238, 240-246, 263-270, 285-292, 301-321, 327-346, 356-371, 389-405, 411-418, 421-427, 430-437, 450-467, 472-477, 482-487, 513-518, 531-538, 569-576, 606-614, 637-657, 662-667, 673-690, 743-753, 760-767, 770-777, 786-802および96-230, 361-491, 572-585; 配列番号198の4-12, 21-36, 48-55, 74-82, 121-127, 195-203, 207-228, 247-262, 269-278, 280-289および102-210; 配列番号199の13-20, 23-31, 38-44, 78-107, 110-118, 122-144, 151-164, 176-182, 190-198, 209-216, 219-243, 251-256, 289-304, 306-313および240-248; 配列番号200の5-26, 34-48, 57-77, 84-102, 116-132, 139-145, 150-162, 165-173, 176-187, 192-205, 216-221, 234-248, 250-260および182-198; 配列番号201の10-19, 26-44, 53-62, 69-87, 90-96, 121-127, 141-146, 148-158, 175-193, 204-259, 307-313, 334-348, 360-365, 370-401, 411-439, 441-450, 455-462, 467-472, 488-504および41-56; 配列番号202の5-21, 36-42, 96-116, 123-130, 138-144, 146-157, 184-201, 213-228, 252-259, 277-297, 308-313, 318-323, 327-333および202-217; 配列番号203の6-26, 33-51, 72-90, 97-131, 147-154, 164-171, 187-216, 231-236, 260-269, 275-283および1-127; 配列番号204の4-22, 24-38, 44-58, 72-88, 99-108, 110-117, 123-129, 131-137, 142-147, 167-178, 181-190, 206-214, 217-223, 271-282, 290-305, 320-327, 329-336, 343-352, 354-364, 396-402, 425-434, 451-456, 471-477, 485-491, 515-541, 544-583, 595-609, 611-626, 644-656, 660-681, 683-691, 695-718および297-458; 配列番号205の5-43, 92-102, 107-116, 120-130, 137-144, 155-163, 169-174, 193-213および24-135; 配列番号206の4-25, 61-69, 73-85, 88-95, 97-109, 111-130, 135-147, 150-157, 159-179, 182-201, 206-212, 224-248, 253-260, 287-295, 314-331, 338-344, 365-376, 396-405, 413-422, 424-430, 432-449, 478-485, 487-494, 503-517, 522-536, 544-560, 564-578, 585-590, 597-613, 615-623, 629-636, 640-649, 662-671, 713-721および176-330; 配列番号207の31-37, 41-52, 58-79, 82-105, 133-179, 184-193, 199-205, 209-226, 256-277, 281-295, 297-314, 322-328, 331-337, 359-367, 379-395, 403-409, 417-432, 442-447, 451-460, 466-472および46-62, 296-341; 配列番号208の23-29, 56-63, 67-74, 96-108, 122-132, 139-146, 152-159, 167-178, 189-196, 214-231, 247-265, 274-293, 301-309, 326-332, 356-363, 378-395, 406-412, 436-442, 445-451, 465-479, 487-501, 528-555, 567-581, 583-599, 610-617, 622-629, 638-662, 681-686, 694-700, 711-716および667-684; 配列番号209の20-51, 53-59, 109-115, 140-154, 185-191, 201-209, 212-218, 234-243, 253-263, 277-290, 303-313, 327-337, 342-349, 374-382, 394-410, 436-442, 464-477, 486-499, 521-530, 536-550, 560-566, 569-583, 652-672, 680-686, 698-704, 718-746, 758-770, 774-788, 802-827, 835-842, 861-869および258-416; 配列番号210の7-25, 39-45, 59-70, 92-108, 116-127, 161-168, 202-211, 217-227, 229-239, 254-262, 271-278, 291-300および278-295; 配列番号211の4-20, 27-33, 45-51, 53-62, 66-74, 81-88, 98-111, 124-130, 136-144, 156-179, 183-191および183-195; 配列番号212の12-24, 27-33, 43-49, 55-71, 77-85, 122-131, 168-177, 179-203, 209-214, 226-241および63-238; 配列番号213の4-19, 37-50, 120-126, 131-137, 139-162, 177-195, 200-209, 211-218, 233-256, 260-268, 271-283, 288-308および1-141; 配列番号214の11-17, 40-47, 57-63, 96-124, 141-162, 170-207, 223-235, 241-265, 271-277, 281-300, 312-318, 327-333, 373-379および231-368; 配列番号215の9-33, 41-48, 57-79, 97-103, 113-138, 146-157, 165-186, 195-201, 209-215, 223-229, 237-247, 277-286, 290-297, 328-342および247-260; 配列番号216の7-15, 39-45, 58-64, 79-84, 97-127, 130-141, 163-176, 195-203, 216-225, 235-247, 254-264, 271-279および64-72; 配列番号217の4-12, 26-42, 46-65, 73-80, 82-94, 116-125, 135-146, 167-173, 183-190, 232-271, 274-282, 300-306, 320-343, 351-362, 373-383, 385-391, 402-409, 414-426, 434-455, 460-466, 473-481, 485-503, 519-525, 533-542, 554-565, 599-624, 645-651, 675-693, 717-725, 751-758, 767-785, 792-797, 801-809, 819-825, 831-836, 859-869, 890-897および222-362, 756-896; 配列番号218の11-17, 22-28, 52-69, 73-83, 86-97, 123-148, 150-164, 166-177, 179-186, 188-199, 219-225, 229-243, 250-255および153-170; 配列番号219の4-61, 71-80, 83-90, 92-128, 133-153, 167-182, 184-192, 198-212および56-73; 配列番号220の4-19, 26-37, 45-52, 58-66, 71-77, 84-92, 94-101, 107-118, 120-133, 156-168, 170-179, 208-216, 228-238, 253-273, 280-296, 303-317, 326-334および298-312; 配列番号221の7-13, 27-35, 38-56, 85-108, 113-121, 123-160, 163-169, 172-183, 188-200, 206-211, 219-238, 247-254および141-157; 配列番号222の23-39, 45-73, 86-103, 107-115, 125-132, 137-146, 148-158, 160-168, 172-179, 185-192, 200-207, 210-224, 233-239, 246-255, 285-334, 338-352, 355-379, 383-389, 408-417, 423-429, 446-456, 460-473, 478-503, 522-540, 553-562, 568-577, 596-602, 620-636, 640-649, 655-663および433-440, 572-593; 配列番号223の4-42, 46-58, 64-76, 118-124, 130-137, 148-156, 164-169, 175-182, 187-194, 203-218, 220-227, 241-246, 254-259, 264-270, 275-289, 296-305, 309-314, 322-334, 342-354, 398-405, 419-426, 432-443, 462-475, 522-530, 552-567, 593-607, 618-634, 636-647, 653-658, 662-670, 681-695, 698-707, 709-720, 732-742, 767-792, 794-822, 828-842, 851-866, 881-890, 895-903, 928-934, 940-963, 978-986, 1003-1025, 1027-1043, 1058-1075, 1080-1087, 1095-1109, 1116-1122, 1133-1138, 1168-1174, 1179-1186, 1207-1214, 1248-1267および17-319, 417-563; 配列番号224の6-19, 23-33, 129-138, 140-150, 153-184, 190-198, 206-219, 235-245, 267-275, 284-289, 303-310, 322-328, 354-404, 407-413, 423-446, 453-462, 467-481, 491-500および46-187; 配列番号225の4-34, 39-57, 78-86, 106-116, 141-151, 156-162, 165-172, 213-237, 252-260, 262-268, 272-279, 296-307, 332-338, 397-403, 406-416, 431-446, 448-453, 464-470, 503-515, 519-525, 534-540, 551-563, 578-593, 646-668, 693-699, 703-719, 738-744, 748-759, 771-777, 807-813, 840-847, 870-876, 897-903, 910-925, 967-976, 979-992および21-244, 381-499, 818-959; 配列番号226の19-29, 65-75, 90-109, 111-137, 155-165, 169-175および118-136; 配列番号227の15-20, 30-36, 55-63, 73-79, 90-117, 120-127, 136-149, 166-188, 195-203, 211-223, 242-255, 264-269, 281-287, 325-330, 334-341, 348-366, 395-408, 423-429, 436-444, 452-465および147-155; 配列番号228の11-18, 21-53, 77-83, 91-98, 109-119, 142-163, 173-181, 193-208, 216-227, 238-255, 261-268, 274-286, 290-297, 308-315, 326-332, 352-359, 377-395, 399-406, 418-426, 428-438, 442-448, 458-465, 473-482, 488-499, 514-524, 543-553, 564-600, 623-632, 647-654, 660-669, 672-678, 710-723, 739-749, 787-793, 820-828, 838-860, 889-895, 901-907, 924-939, 956-962, 969-976, 991-999, 1012-1018, 1024-1029, 1035-1072, 1078-1091, 1142-1161および74-438; 配列番号229の4-31, 41-52, 58-63, 65-73, 83-88, 102-117, 123-130, 150-172, 177-195, 207-217, 222-235, 247-253, 295-305, 315-328, 335-342, 359-365, 389-394, 404-413および156-420; 配列番号230の4-42, 56-69, 98-108, 120-125, 210-216, 225-231, 276-285, 304-310, 313-318, 322-343および79-348; 配列番号231の12-21, 24-30, 42-50, 61-67, 69-85, 90-97, 110-143, 155-168および53-70; 配列番号232の4-26, 41-54, 71-78, 88-96, 116-127, 140-149, 151-158, 161-175, 190-196, 201-208, 220-226, 240-247, 266-281, 298-305, 308-318, 321-329, 344-353, 370-378, 384-405, 418-426, 429-442, 457-463, 494-505, 514-522および183-341; 配列番号233の4-27, 69-77, 79-101, 117-123, 126-142, 155-161, 171-186, 200-206, 213-231, 233-244, 258-263, 269-275, 315-331, 337-346, 349-372, 376-381, 401-410, 424-445, 447-455, 463-470, 478-484, 520-536, 546-555, 558-569, 580-597, 603-618, 628-638, 648-660, 668-683, 717-723, 765-771, 781-788, 792-806, 812-822および92-231, 618-757; 配列番号234の11-47, 63-75, 108-117, 119-128, 133-143, 171-185, 190-196, 226-232, 257-264, 278-283, 297-309, 332-338, 341-346, 351-358, 362-372および41-170; 配列番号235の6-26, 50-56, 83-89, 108-114, 123-131, 172-181, 194-200, 221-238, 241-259, 263-271, 284-292, 304-319, 321-335, 353-358, 384-391, 408-417, 424-430, 442-448, 459-466, 487-500, 514-528, 541-556, 572-578, 595-601, 605-613, 620-631, 634-648, 660-679, 686-693, 702-708, 716-725, 730-735, 749-755, 770-777, 805-811, 831-837, 843-851, 854-860, 863-869, 895-901, 904-914, 922-929, 933-938, 947-952, 956-963, 1000-1005, 1008-1014, 1021-1030, 1131-1137, 1154-1164, 1166-1174および20-487, 757-1153; 配列番号236の10-34, 67-78, 131-146, 160-175, 189-194, 201-214, 239-250, 265-271, 296-305および26-74, 91-100, 105-303; 配列番号237の9-15, 19-32, 109-122, 143-150, 171-180, 186-191, 209-217, 223-229, 260-273, 302-315, 340-346, 353-359, 377-383, 389-406, 420-426, 460-480および10-223, 231-251, 264-297, 312-336; 配列番号238の5-28, 76-81, 180-195, 203-209, 211-219, 227-234, 242-252, 271-282, 317-325, 350-356, 358-364, 394-400, 405-413, 417-424, 430-436, 443-449, 462-482, 488-498, 503-509, 525-537および22-344; 配列番号239の5-28, 42-54, 77-83, 86-93, 98-104, 120-127, 145-159, 166-176, 181-187, 189-197, 213-218, 230-237, 263-271, 285-291, 299-305, 326-346, 368-375, 390-395および1-151;
配列番号240の6-34, 48-55, 58-64, 84-101, 121-127, 143-149, 153-159, 163-170, 173-181, 216-225, 227-240, 248-254, 275-290, 349-364, 375-410, 412-418, 432-438, 445-451, 465-475, 488-496, 505-515, 558-564, 571-579, 585-595, 604-613, 626-643, 652-659, 677-686, 688-696, 702-709, 731-747, 777-795, 820-828, 836-842, 845-856, 863-868, 874-882, 900-909, 926-943, 961-976, 980-986, 992-998, 1022-1034, 1044-1074, 1085-1096, 1101-1112, 1117-1123, 1130-1147, 1181-1187, 1204-1211, 1213-1223, 1226-1239, 1242-1249, 1265-1271, 1273-1293, 1300-1308, 1361-1367, 1378-1384, 1395-1406, 1420-1428, 1439-1446, 1454-1460, 1477-1487, 1509-1520, 1526-1536, 1557-1574, 1585-1596, 1605-1617, 1621-1627, 1631-1637, 1648-1654, 1675-1689, 1692-1698, 1700-1706, 1712-1719, 1743-1756および91-263; 配列番号241の4-16, 75-90, 101-136, 138-144, 158-164, 171-177, 191-201, 214-222, 231-241, 284-290, 297-305, 311-321, 330-339, 352-369, 378-385, 403-412, 414-422, 428-435, 457-473, 503-521, 546-554, 562-568, 571-582, 589-594, 600-608, 626-635, 652-669, 687-702, 706-712, 718-724, 748-760, 770-775および261-272; 配列番号242の4-19, 30-41, 46-57, 62-68, 75-92, 126-132, 149-156, 158-168, 171-184, 187-194, 210-216, 218-238, 245-253, 306-312, 323-329, 340-351, 365-373, 384-391, 399-405, 422-432, 454-465, 471-481, 502-519, 530-541, 550-562, 566-572, 576-582, 593-599, 620-634, 637-643, 645-651, 657-664, 688-701および541-551; 配列番号243の6-11, 17-25, 53-58, 80-86, 91-99, 101-113, 123-131, 162-169, 181-188, 199-231, 245-252および84-254; 配列番号244の13-30, 71-120, 125-137, 139-145, 184-199および61-78; 配列番号245の9-30, 38-53, 63-70, 74-97, 103-150, 158-175, 183-217, 225-253, 260-268, 272-286, 290-341, 352-428, 434-450, 453-460, 469-478, 513-525, 527-534, 554-563, 586-600, 602-610, 624-640, 656-684, 707-729, 735-749, 757-763, 766-772, 779-788, 799-805, 807-815, 819-826, 831-855および568-580; 配列番号246の11-21, 29-38および5-17; 配列番号247の2-9; 配列番号248の4-10, 16-28および7-18, 26-34; 配列番号249の10-16および1-15; 配列番号250の4-11; 配列番号251の4-40, 42-51および37-53; 配列番号252の4-21および22-29; 配列番号253の2-11; 配列番号254の9-17, 32-44および1-22; 配列番号255の19-25, 27-32および15-34; 配列番号256の4-12, 15-22および11-33; 配列番号257の10-17, 24-30, 39-46, 51-70および51-61; 配列番号258の6-19; 配列番号259の6-11, 21-27, 31-54および11-29; 配列番号260の4-10, 13-45および11-35; 配列番号261の4-14, 23-32および11-35; 配列番号262の14-39, 45-51および15-29; 配列番号263の4-11, 14-28および4-17; 配列番号264の4-16および2-16; 配列番号265の4-10, 12-19, 39-50および6-22; 配列番号266の2-13; 配列番号267の4-11, 22-65および3-19; 配列番号268の17-23, 30-35, 39-46, 57-62および30-49; 配列番号269の4-19および14-22; 配列番号270の2-9; 配列番号271の7-18, 30-43および4-12; 配列番号272の4-30, 39-47および5-22; 配列番号273の6-15および14-29; 配列番号274の4-34および23-35; 配列番号275の4-36, 44-57, 65-72および14-27; 配列番号276の4-18および11-20; 配列番号277の5-19; 配列番号278の18-36および6-20; 配列番号279の4-10, 19-34, 41-84, 96-104および50-63; 配列番号280の4-9, 19-27および8-21; 配列番号281の4-16, 18-28および22-30; 配列番号282の4-15および21-35; 配列番号283の4-17および3-13; 配列番号284の4-12および4-18; 配列番号285の4-24, 31-36および29-45; 配列番号286の12-22, 34-49および21-32; 配列番号287の4-17および22-32; 配列番号288の4-16, 25-42および7-28; 配列番号289の4-10および7-20; 配列番号290の4-11, 16-36, 39-54および28-44; 配列番号291の5-20, 29-54および14-29; 配列番号292の24-33および10-22; 配列番号293の10-51, 54-61および43-64; 配列番号294の7-1および2-17; 配列番号295の11-20および6-20; 配列番号296の4-30, 34-41および19-28; 配列番号297の11-21; 配列番号298の4-16, 21-26および9-38; 配列番号299の4-12, 15-27, 30-42, 66-72および10-24; 配列番号300の8-17および11-20;および配列番号246の2-19; 配列番号247の1-12; 配列番号248の21-38; 配列番号254の2-22; 配列番号255の15-33; 配列番号256の11-32; 配列番号259の11-28; 配列番号260の10-27; 配列番号261の9-26; 配列番号263の4-16; 配列番号266の1-18; 配列番号273の12-29; 配列番号276の6-23; 配列番号277の1-21; 配列番号279の47-64; 配列番号285の28-45; 配列番号287の18-35; 配列番号291の14-31; 配列番号292の7-24; 配列番号299の8-25; 配列番号300の1-20; 配列番号151の18-33; 配列番号151の62-72; 配列番号152の118-131; 配列番号154の195-220; 配列番号154の215-240; 配列番号154の255-280, 配列番号155の72-81; 配列番号156の174-186; 配列番号157の317-331; 配列番号158の35-59; 配列番号158の54-84; 配列番号158の79-104; 配列番号159の33-58; 配列番号159の81-101; 配列番号159の136-150; 配列番号159の173-186; 配列番号159の231-251; 配列番号161の22-48; 配列番号162の24-39; 配列番号163の475-489; 配列番号164の38-56; 配列番号164の583-604; 配列番号165の202-223; 配列番号165の222-247; 配列番号165の242-267; 配列番号165の262-287; 配列番号165の282-307; 配列番号165の302-327; 配列番号166の25-48; 配列番号167の204-217; 配列番号168の259-276; 配列番号169の121-139; 配列番号169の260-267; 配列番号169の215-240; 配列番号170の115-140; 配列番号172の182-204; 配列番号173の144-153; 配列番号173の205-219; 配列番号174の196-206; 配列番号174の240-249; 配列番号174の272-287; 配列番号174の199-223; 配列番号174の218-237; 配列番号175の226-249; 配列番号175の287-306; 配列番号176の430-449; 配列番号177の361-375; 配列番号178の241-260; 配列番号181の483-502; 配列番号182の379-396; 配列番号184の31-51; 配列番号186の1436-1460; 配列番号186の1455-1474; 配列番号186の1469-1487; 配列番号187の215-229; 配列番号187の534-561; 配列番号187の59-84; 配列番号187の79-104; 配列番号188の618-635; 配列番号189の191-203; 配列番号190の386-398; 配列番号191の65-83; 配列番号192の90-105; 配列番号192の112-136; 配列番号193の290-209; 配列番号194の33-50; 配列番号195の76-90; 配列番号196の70-88; 配列番号197の418-442; 配列番号197の574-585; 配列番号198の87-104; 配列番号198の124-148; 配列番号198の141-152; 配列番号199の241-248; 配列番号200の183-198; 配列番号201の40-57; 配列番号202の202-217; 配列番号203の50-74; 配列番号203の69-93; 配列番号203の88-112; 配列番号203の107-127; 配列番号205の74-92; 配列番号206の207-232; 配列番号206の227-252; 配列番号206の247-272; 配列番号207の47-60; 配列番号207の297-305; 配列番号207の312-337; 配列番号208の667-384; 配列番号210の279-295; 配列番号211の179-198; 配列番号213の27-51; 配列番号213の46-70; 配列番号213の65-89; 配列番号213の84-108; 配列番号213の112-141; 配列番号215の248-260; 配列番号216の59-78; 配列番号218の154-170; 配列番号219の57-73; 配列番号220の297-314; 配列番号221の142-157; 配列番号222の428-447; 配列番号222の573-593; 配列番号223の523-544; 配列番号223の46-70; 配列番号223の65-89; 配列番号223の84-108; 配列番号223の122-151; 配列番号224の123-142; 配列番号225の903-921; 配列番号226の119-136; 配列番号227の142-161; 配列番号228の258-277; 配列番号228の272-300; 配列番号228の295-322; 配列番号229の311-343; 配列番号229の278-304; 配列番号230の131-150; 配列番号230の195-218; 配列番号231の53-70; 配列番号232の184-208; 配列番号232の222-246; 配列番号232の241-265; 配列番号232の260-284; 配列番号232の279-303; 配列番号232の317-341; 配列番号233の678-696; 配列番号235の88-114; 配列番号235の464-481; 配列番号236の153-172; 配列番号236の137-155, 166-184; 配列番号236の215-228; 配列番号237の37-51; 配列番号237の53-75; 配列番号237の232-251; 配列番号237の318-336; 配列番号238の305-315; 配列番号238の131-156; 配列番号241の258-275; 配列番号243の107-137; 配列番号243の138-162; 配列番号243の157-181; 配列番号243の195-227; 配列番号244の62-78; 配列番号245の567-584を含むペプチドよりなる群から選ばれた高度免疫血清反応性の抗原の断片を提供する。
・本発明により定められる高度免疫血清反応性の抗原またはその断片を非ヒト動物に投与することにより該動物において免疫応答を開始させ、
・該動物から抗体含有体液を取り出し、ついで
・該抗体含有体液をさらなる精製工程に供することにより該抗体を製造する。
・本発明により定められる高度免疫血清反応性の抗原またはその断片を非ヒト動物に投与することにより該動物において免疫応答を開始させ、
・該動物から脾臓または脾細胞を取り出し、
・該脾臓または脾細胞のハイブリドーマ細胞を産生させ、
・該高度免疫血清反応性の抗原またはその断片に特異的なハイブリドーマ細胞を選択およびクローニングし、
・該クローニングしたハイブリドーマ細胞の培養により抗体を産生させ、および任意にさらなる精製工程を行う。
(a)本発明による単離したまたは固定化した高度免疫血清反応性の抗原またはその断片を候補アンタゴニストと、該候補アンタゴニストの該高度免疫血清反応性の抗原またはその断片への結合に応答して検出可能なシグナルを提供することのできる成分の存在下、該候補アンタゴニストの該高度免疫血清反応性の抗原またはその断片への結合を可能にする条件下で接触させ、ついで
(b)該アンタゴニストの該高度免疫血清反応性の抗原またはその断片への結合に応答して生成されるシグナルの存在または不在を検出する。
(a)本発明による高度免疫血清反応性の抗原またはその高度免疫血断片を用意し、
(b)該高度免疫血清反応性の抗原またはその断片に対する相互作用パートナー、とりわけ本発明による抗体を用意し、
(c)該高度免疫血清反応性の抗原またはその断片を該相互作用パートナーと相互作用させて相互作用複合体を生成させ、
(d)候補アンタゴニストを用意し、
(e)該候補アンタゴニストと該相互作用複合体との間で競合反応を起こさせ、
(f)該候補アンタゴニストが該高度免疫血清反応性の抗原またはその断片と該相互作用パートナーとの相互作用活性を低減または抑制するか否かを決定する。
・ハイブリダイゼーションを、たとえば5xSSPE、5xデンハルト試薬、0.1%SDS、100g/mLの開裂DNA中、68℃で行う
・0.2xSSC、O.1%SDS中、42℃で中くらいのストリンジェンシーの洗浄を行う
・0.1xSSC、0.1%SDS中、68℃で高ストリンジェンシーの洗浄を行う
(1)咽頭炎および猩紅熱を引き起こすもの(たとえば、M血清型1, 3, 5, 6, 14, 18, 19, 24)
(2)膿皮症および連鎖球菌皮膚感染症を引き起こすもの(たとえば、M血清型2, 49, 57, 59, 60, 61)。
このことは、ワクチンとしてまたは一般に特定の疾患をターゲティングする医薬として使用するうえでの抗原の関連性を同定する基礎となりうる。
emm103/st2034 U74320 PNG, Bra, Egy, Mal,Nep, NZ, US M87 (66%)
emm104/st2034 AF056300 PNG, Egy, Mal,Nep, NZ, US M66 (72%)
emm105/st4529 AF060227 Mal, Nep, NZ, US M5 (45%)
emm106/st4532 AF077666 Mal, Egy, Iran, Nep M27G (71%)
emm107/st4264 AF163686 Mal, NZ M25 (52%)
emm108/st4547 AF052426 Mal, Bra, Egy, Ira, NZ M70 (84%)
emm109/st3018 AF077667 Mal, Egy, NZ M28 (74%)
emm110/st4935 U92492 Ind, Bul, NZ, Rus, US M13 (60%)
emm111/st4973 AF128960 Ind, Bra, Nep, US M80 (40%)
emm112/stCmuk16 AF091806 Thi, Bra, Rus, US M27L/77 (59%)
emm113/st2267 AF078068 NZ, Thai, Chi M13 (50%)
emm114/st2967 U50338 US, Can, Gam, NZ, PNG M73 (80%)
emm115/st2980 AF028712 US, Bra, Rus M36 (64%)
emm116/st2370 AF156180 US, Nep, NZ M52 (60%)
emm117/st436 AF058801 US M13 (59%)
emm118/st448 AF058802 US, Bra, Egy, Nep, NZ M49 (79%)
emm119/st3365 AF083874 US, Br, Nep M52 (59%)
emm120/st1135 AF296181 Egy M56 (78%)
emm121/st1161 AF296182 Egy M64 (64%)
emm122/st1432 AF222860 Egy, Rus, Nep M18 (40%)
emm123/st6949AF213451Arg, US, NZM80 (68%)
st1160/emm124AF149048 and AF018178 Egy, Mal, NZM2 (82%)
多くの場合、emm配列参照株はRebecca Lancefield博士のM型コレクションから直接得られたものである。そのような株はRCLと称する。
血清オパシティーファクター陽性(SOF+)株に対する抗血清が株特異的な仕方でOF活性を示すことは長い間知られてきた。それゆえ、少なくとも60の別個のsof(血清オパシティーファクター(serum opacity factor))遺伝子を表すsof遺伝子の500-2700塩基可変領域をGASオパシティーファクター陽性株(および興味深いことに、OF陰性emm12単離物とemm/M型12とに共通して見出されるホモログ)から分析した。sof遺伝子配列は、emm型内では通常よく保存されているものの、異なるGAS株の間では顕著に変異していることがわかった。それゆえ、重要な株としては、emm1, emm100, emm101, emm102, emm103, emm104, emm105, emm106, emm107, emm108, emm109, emm11, emm110, emm111, emm112, emm113, emm114, emm115, emm116, emm117, emm118, emm119, emm12, emm120, emm121, emm122, emm123, emm124, emm13L, emm14, emm15, emm17, emm18, emm19, emm2, emm22, emm23, emm24, emm25, emm26, emm27G, emm28, emm29, emm3, emm30, emm31, emm32, emm33, emm34, emm36, emm37, emm38, emm39, emm4, emm40, emm41, emm42, emm43, emm44, emm46, emm47, emm48, emm49, emm5, emm50, emm51, emm52, emm53, emm54, emm55, emm56, emm57, emm58, emm59, emm6, emm60, emm61 , emm62 , emm63, emm64, emm65, emm66, emm67, emm68, emm69, emm70, emm71, emm72, emm73, emm74, emm75, emm76, emm77, emm78, emm79, emm8, emm80, emm81 , emm82, emm83, emm84, emm85, emm86, emm87, emm88, emm89, emm9, emm90, emm91, emm92, emm93, emm94, emm95, emm96, emm97, emm98, emm99 ,st1389, st1731, st1759, st1815 , st1967, st1969, st1rp31, st11014, st2037, st204, st211, st213, st2147, st1207, st245, st2460, st2461, st2463, st2904, st2911, st2917, st2926, st2940, st369, st3757, st3765, st3850, st5282, st6735, st7700, st809, st833, st854, st980584, stck249, stck401, std432, std631, std633, stIL103, stIL62, stns292, stns554, sts104, stc1400, stc1741, stc36, stc3852, stc5344, stc5345, stc57, stc6979, stc74a, stc839, stg10, stg11, stg1389, stg166b, stg1750, stg2078, stg3390, stg4222, stg4545, stg480, stg4831, stg485, stg4974, stg5063, stg6, stg62647, stg643, stg652, stg653, stg663, stg840, stg93464, stg97, stL1376, stL1929およびstL2764が挙げられる。
配列番号188の4-16, 33-39, 43-49, 54-85, 107-123, 131-147, 157-169, 177-187, 198-209, 220-230, 238-248, 277-286, 293-301, 303-315, 319-379, 383-393, 402-414, 426-432, 439-449, 470-478, 483-497, 502-535, 552-566, 571-582, 596-601, 608-620, 631-643, 651-656, 663-678, 680-699, 705-717, 724-732, 738-748, 756-763, 766-772, 776-791, 796-810, 819-827, 829-841, 847-861, 866-871, 876-882, 887-894, 909-934, 941-947, 957-969, 986-994, 998-1028, 1033-1070, 1073-1080, 1090-1096, 1098-1132, 1134-1159, 1164-1172, 1174-1201および617-635; 配列番号189の7-25, 30-40, 42-64, 70-77, 85-118, 120-166, 169-199, 202-213, 222-244および190-203; 配列番号190の4-11, 15-53, 55-93, 95-113, 120-159, 164-200, 210-243, 250-258, 261-283, 298-319, 327-340, 356-366, 369-376, 380-386, 394-406, 409-421, 425-435, 442-454, 461-472, 480-490, 494-505, 507-514, 521-527, 533-544, 566-574および385-398; 配列番号191の5-36, 66-72, 120-127, 146-152, 159-168, 172-184, 205-210, 221-232, 234-243, 251-275, 295-305, 325-332, 367-373, 470-479, 482-487, 520-548, 592-600, 605-615, 627-642, 655-662, 664-698, 718-725, 734-763, 776-784, 798-809, 811-842, 845-852, 867-872, 879-888, 900-928, 933-940, 972-977, 982-1003および12-190, 276-283, 666-806; 配列番号192の4-38, 63-68, 100-114, 160-173, 183-192, 195-210, 212-219, 221-238, 240-256, 258-266, 274-290, 301-311, 313-319, 332-341, 357-363, 395-401, 405-410, 420-426, 435-450, 453-461, 468-475, 491-498, 510-518, 529-537, 545-552, 585-592, 602-611, 634-639, 650-664および30-80, 89-105, 111-151; 配列番号193の7-29, 31-39, 47-54, 63-74, 81-94, 97-117, 122-127, 146-157, 168-192, 195-204, 216-240, 251-259および195-203; 配列番号194の5-16, 28-34, 46-65, 79-94, 98-105, 107-113, 120-134, 147-158, 163-172, 180-186, 226-233, 237-251, 253-259, 275-285, 287-294, 302-308, 315-321, 334-344, 360-371, 399-412, 420-426および32-50; 配列番号195の8-20, 30-36, 71-79, 90-96, 106-117, 125-138, 141-147, 166-174および75-90; 配列番号196の4-13, 15-33, 43-52, 63-85, 98-114, 131-139, 146-174, 186-192, 198-206, 227-233および69-88; 配列番号197の4-22, 29-35, 59-68, 153-170, 213-219, 224-238, 240-246, 263-270, 285-292, 301-321, 327-346, 356-371, 389-405, 411-418, 421-427, 430-437, 450-467, 472-477, 482-487, 513-518, 531-538, 569-576, 606-614, 637-657, 662-667, 673-690, 743-753, 760-767, 770-777, 786-802および96-230, 361-491, 572-585; 配列番号198の4-12, 21-36, 48-55, 74-82, 121-127, 195-203, 207-228, 247-262, 269-278, 280-289および102-210; 配列番号199の13-20, 23-31, 38-44, 78-107, 110-118, 122-144, 151-164, 176-182, 190-198, 209-216, 219-243, 251-256, 289-304, 306-313および240-248; 配列番号200の5-26, 34-48, 57-77, 84-102, 116-132, 139-145, 150-162, 165-173, 176-187, 192-205, 216-221, 234-248, 250-260および182-198; 配列番号201の10-19, 26-44, 53-62, 69-87, 90-96, 121-127, 141-146, 148-158, 175-193, 204-259, 307-313, 334-348, 360-365, 370-401, 411-439, 441-450, 455-462, 467-472, 488-504および41-56; 配列番号202の5-21, 36-42, 96-116, 123-130, 138-144, 146-157, 184-201, 213-228, 252-259, 277-297, 308-313, 318-323, 327-333および202-217; 配列番号203の6-26, 33-51, 72-90, 97-131, 147-154, 164-171, 187-216, 231-236, 260-269, 275-283および1-127; 配列番号204の4-22, 24-38, 44-58, 72-88, 99-108, 110-117, 123-129, 131-137, 142-147, 167-178, 181-190, 206-214, 217-223, 271-282, 290-305, 320-327, 329-336, 343-352, 354-364, 396-402, 425-434, 451-456, 471-477, 485-491, 515-541, 544-583, 595-609, 611-626, 644-656, 660-681, 683-691, 695-718および297-458; 配列番号205の5-43, 92-102, 107-116, 120-130, 137-144, 155-163, 169-174, 193-213および24-135; 配列番号206の4-25, 61-69, 73-85, 88-95, 97-109, 111-130, 135-147, 150-157, 159-179, 182-201, 206-212, 224-248, 253-260, 287-295, 314-331, 338-344, 365-376, 396-405, 413-422, 424-430, 432-449, 478-485, 487-494, 503-517, 522-536, 544-560, 564-578, 585-590, 597-613, 615-623, 629-636, 640-649, 662-671, 713-721および176-330; 配列番号207の31-37, 41-52, 58-79, 82-105, 133-179, 184-193, 199-205, 209-226, 256-277, 281-295, 297-314, 322-328, 331-337, 359-367, 379-395, 403-409, 417-432, 442-447, 451-460, 466-472および46-62, 296-341; 配列番号208の23-29, 56-63, 67-74, 96-108, 122-132, 139-146, 152-159, 167-178, 189-196, 214-231, 247-265, 274-293, 301-309, 326-332, 356-363, 378-395, 406-412, 436-442, 445-451, 465-479, 487-501, 528-555, 567-581, 583-599, 610-617, 622-629, 638-662, 681-686, 694-700, 711-716および667-684; 配列番号209の20-51, 53-59, 109-115, 140-154, 185-191, 201-209, 212-218, 234-243, 253-263, 277-290, 303-313, 327-337, 342-349, 374-382, 394-410, 436-442, 464-477, 486-499, 521-530, 536-550, 560-566, 569-583, 652-672, 680-686, 698-704, 718-746, 758-770, 774-788, 802-827, 835-842, 861-869および258-416; 配列番号210の7-25, 39-45, 59-70, 92-108, 116-127, 161-168, 202-211, 217-227, 229-239, 254-262, 271-278, 291-300および278-295; 配列番号211の4-20, 27-33, 45-51, 53-62, 66-74, 81-88, 98-111, 124-130, 136-144, 156-179, 183-191および183-195; 配列番号212の12-24, 27-33, 43-49, 55-71, 77-85, 122-131, 168-177, 179-203, 209-214, 226-241および63-238; 配列番号213の4-19, 37-50, 120-126, 131-137, 139-162, 177-195, 200-209, 211-218, 233-256, 260-268, 271-283, 288-308および1-141; 配列番号214の11-17, 40-47, 57-63, 96-124, 141-162, 170-207, 223-235, 241-265, 271-277, 281-300, 312-318, 327-333, 373-379および231-368; 配列番号215の9-33, 41-48, 57-79, 97-103, 113-138, 146-157, 165-186, 195-201, 209-215, 223-229, 237-247, 277-286, 290-297, 328-342および247-260; 配列番号216の7-15, 39-45, 58-64, 79-84, 97-127, 130-141, 163-176, 195-203, 216-225, 235-247, 254-264, 271-279および64-72; 配列番号217の4-12, 26-42, 46-65, 73-80, 82-94, 116-125, 135-146, 167-173, 183-190, 232-271, 274-282, 300-306, 320-343, 351-362, 373-383, 385-391, 402-409, 414-426, 434-455, 460-466, 473-481, 485-503, 519-525, 533-542, 554-565, 599-624, 645-651, 675-693, 717-725, 751-758, 767-785, 792-797, 801-809, 819-825, 831-836, 859-869, 890-897および222-362, 756-896; 配列番号218の11-17, 22-28, 52-69, 73-83, 86-97, 123-148, 150-164, 166-177, 179-186, 188-199, 219-225, 229-243, 250-255および153-170; 配列番号219の4-61, 71-80, 83-90, 92-128, 133-153, 167-182, 184-192, 198-212および56-73; 配列番号220の4-19, 26-37, 45-52, 58-66, 71-77, 84-92, 94-101, 107-118, 120-133, 156-168, 170-179, 208-216, 228-238, 253-273, 280-296, 303-317, 326-334および298-312; 配列番号221の7-13, 27-35, 38-56, 85-108, 113-121, 123-160, 163-169, 172-183, 188-200, 206-211, 219-238, 247-254および141-157; 配列番号222の23-39, 45-73, 86-103, 107-115, 125-132, 137-146, 148-158, 160-168, 172-179, 185-192, 200-207, 210-224, 233-239, 246-255, 285-334, 338-352, 355-379, 383-389, 408-417, 423-429, 446-456, 460-473, 478-503, 522-540, 553-562, 568-577, 596-602, 620-636, 640-649, 655-663および433-440, 572-593; 配列番号223の4-42, 46-58, 64-76, 118-124, 130-137, 148-156, 164-169, 175-182, 187-194, 203-218, 220-227, 241-246, 254-259, 264-270, 275-289, 296-305, 309-314, 322-334, 342-354, 398-405, 419-426, 432-443, 462-475, 522-530, 552-567, 593-607, 618-634, 636-647, 653-658, 662-670, 681-695, 698-707, 709-720, 732-742, 767-792, 794-822, 828-842, 851-866, 881-890, 895-903, 928-934, 940-963, 978-986, 1003-1025, 1027-1043, 1058-1075, 1080-1087, 1095-1109, 1116-1122, 1133-1138, 1168-1174, 1179-1186, 1207-1214, 1248-1267および17-319, 417-563; 配列番号224の6-19, 23-33, 129-138, 140-150, 153-184, 190-198, 206-219, 235-245, 267-275, 284-289, 303-310, 322-328, 354-404, 407-413, 423-446, 453-462, 467-481, 491-500および46-187; 配列番号225の4-34, 39-57, 78-86, 106-116, 141-151, 156-162, 165-172, 213-237, 252-260, 262-268, 272-279, 296-307, 332-338, 397-403, 406-416, 431-446, 448-453, 464-470, 503-515, 519-525, 534-540, 551-563, 578-593, 646-668, 693-699, 703-719, 738-744, 748-759, 771-777, 807-813, 840-847, 870-876, 897-903, 910-925, 967-976, 979-992および21-244, 381-499, 818-959; 配列番号226の19-29, 65-75, 90-109, 111-137, 155-165, 169-175および118-136; 配列番号227の15-20, 30-36, 55-63, 73-79, 90-117, 120-127, 136-149, 166-188, 195-203, 211-223, 242-255, 264-269, 281-287, 325-330, 334-341, 348-366, 395-408, 423-429, 436-444, 452-465および147-155; 配列番号228の11-18, 21-53, 77-83, 91-98, 109-119, 142-163, 173-181, 193-208, 216-227, 238-255, 261-268, 274-286, 290-297, 308-315, 326-332, 352-359, 377-395, 399-406, 418-426, 428-438, 442-448, 458-465, 473-482, 488-499, 514-524, 543-553, 564-600, 623-632, 647-654, 660-669, 672-678, 710-723, 739-749, 787-793, 820-828, 838-860, 889-895, 901-907, 924-939, 956-962, 969-976, 991-999, 1012-1018, 1024-1029, 1035-1072, 1078-1091, 1142-1161および74-438; 配列番号229の4-31, 41-52, 58-63, 65-73, 83-88, 102-117, 123-130, 150-172, 177-195, 207-217, 222-235, 247-253, 295-305, 315-328, 335-342, 359-365, 389-394, 404-413および156-420; 配列番号230の4-42, 56-69, 98-108, 120-125, 210-216, 225-231, 276-285, 304-310, 313-318, 322-343および79-348; 配列番号231の12-21, 24-30, 42-50, 61-67, 69-85, 90-97, 110-143, 155-168および53-70; 配列番号232の4-26, 41-54, 71-78, 88-96, 116-127, 140-149, 151-158, 161-175, 190-196, 201-208, 220-226, 240-247, 266-281, 298-305, 308-318, 321-329, 344-353, 370-378, 384-405, 418-426, 429-442, 457-463, 494-505, 514-522および183-341; 配列番号233の4-27, 69-77, 79-101, 117-123, 126-142, 155-161, 171-186, 200-206, 213-231, 233-244, 258-263, 269-275, 315-331, 337-346, 349-372, 376-381, 401-410, 424-445, 447-455, 463-470, 478-484, 520-536, 546-555, 558-569, 580-597, 603-618, 628-638, 648-660, 668-683, 717-723, 765-771, 781-788, 792-806, 812-822および92-231, 618-757;
配列番号234の11-47, 63-75, 108-117, 119-128, 133-143, 171-185, 190-196, 226-232, 257-264, 278-283, 297-309, 332-338, 341-346, 351-358, 362-372および41-170; 配列番号235の6-26, 50-56, 83-89, 108-114, 123-131, 172-181, 194-200, 221-238, 241-259, 263-271, 284-292, 304-319, 321-335, 353-358, 384-391, 408-417, 424-430, 442-448, 459-466, 487-500, 514-528, 541-556, 572-578, 595-601, 605-613, 620-631, 634-648, 660-679, 686-693, 702-708, 716-725, 730-735, 749-755, 770-777, 805-811, 831-837, 843-851, 854-860, 863-869, 895-901, 904-914, 922-929, 933-938, 947-952, 956-963, 1000-1005, 1008-1014, 1021-1030, 1131-1137, 1154-1164, 1166-1174および20-487, 757-1153; 配列番号236の10-34, 67-78, 131-146, 160-175, 189-194, 201-214, 239-250, 265-271, 296-305および26-74, 91-100, 105-303; 配列番号237の9-15, 19-32, 109-122, 143-150, 171-180, 186-191, 209-217, 223-229, 260-273, 302-315, 340-346, 353-359, 377-383, 389-406, 420-426, 460-480および10-223, 231-251, 264-297, 312-336; 配列番号238の5-28, 76-81, 180-195, 203-209, 211-219, 227-234, 242-252, 271-282, 317-325, 350-356, 358-364, 394-400, 405-413, 417-424, 430-436, 443-449, 462-482, 488-498, 503-509, 525-537および22-344; 配列番号239の5-28, 42-54, 77-83, 86-93, 98-104, 120-127, 145-159, 166-176, 181-187, 189-197, 213-218, 230-237, 263-271, 285-291, 299-305, 326-346, 368-375, 390-395および1-151; 配列番号240の6-34, 48-55, 58-64, 84-101, 121-127, 143-149, 153-159, 163-170, 173-181, 216-225, 227-240, 248-254, 275-290, 349-364, 375-410, 412-418, 432-438, 445-451, 465-475, 488-496, 505-515, 558-564, 571-579, 585-595, 604-613, 626-643, 652-659, 677-686, 688-696, 702-709, 731-747, 777-795, 820-828, 836-842, 845-856, 863-868, 874-882, 900-909, 926-943, 961-976, 980-986, 992-998, 1022-1034, 1044-1074, 1085-1096, 1101-1112, 1117-1123, 1130-1147, 1181-1187, 1204-1211, 1213-1223, 1226-1239, 1242-1249, 1265-1271, 1273-1293, 1300-1308, 1361-1367, 1378-1384, 1395-1406, 1420-1428, 1439-1446, 1454-1460, 1477-1487, 1509-1520, 1526-1536, 1557-1574, 1585-1596, 1605-1617, 1621-1627, 1631-1637, 1648-1654, 1675-1689, 1692-1698, 1700-1706, 1712-1719, 1743-1756および91-263;
配列番号241の4-16, 75-90, 101-136, 138-144, 158-164, 171-177, 191-201, 214-222, 231-241, 284-290, 297-305, 311-321, 330-339, 352-369, 378-385, 403-412, 414-422, 428-435, 457-473, 503-521, 546-554, 562-568, 571-582, 589-594, 600-608, 626-635, 652-669, 687-702, 706-712, 718-724, 748-760, 770-775および261-272; 配列番号242の4-19, 30-41, 46-57, 62-68, 75-92, 126-132, 149-156, 158-168, 171-184, 187-194, 210-216, 218-238, 245-253, 306-312, 323-329, 340-351, 365-373, 384-391, 399-405, 422-432, 454-465, 471-481, 502-519, 530-541, 550-562, 566-572, 576-582, 593-599, 620-634, 637-643, 645-651, 657-664, 688-701および541-551; 配列番号243の6-11, 17-25, 53-58, 80-86, 91-99, 101-113, 123-131, 162-169, 181-188, 199-231, 245-252および84-254; 配列番号244の13-30, 71-120, 125-137, 139-145, 184-199および61-78; 配列番号245の9-30, 38-53, 63-70, 74-97, 103-150, 158-175, 183-217, 225-253, 260-268, 272-286, 290-341, 352-428, 434-450, 453-460, 469-478, 513-525, 527-534, 554-563, 586-600, 602-610, 624-640, 656-684, 707-729, 735-749, 757-763, 766-772, 779-788, 799-805, 807-815, 819-826, 831-855および568-580; 配列番号246の11-21, 29-38および5-17; 配列番号247の2-9; 配列番号248の4-10, 16-28および7-18, 26-34; 配列番号249の10-16および1-15; 配列番号250の4-11; 配列番号251の4-40, 42-51および37-53; 配列番号252の4-21および22-29; 配列番号253の2-11; 配列番号254の9-17, 32-44および1-22; 配列番号255の19-25, 27-32および15-34; 配列番号256の4-12, 15-22および11-33; 配列番号257の10-17, 24-30, 39-46, 51-70および51-61; 配列番号258の6-19; 配列番号259の6-11, 21-27, 31-54および11-29; 配列番号260の4-10, 13-45および11-35; 配列番号261の4-14, 23-32および11-35; 配列番号262の14-39, 45-51および15-29; 配列番号263の4-11, 14-28および4-17; 配列番号264の4-16および2-16; 配列番号265の4-10, 12-19, 39-50および6-22; 配列番号266の2-13; 配列番号267の4-11, 22-65および3-19; 配列番号268の17-23, 30-35, 39-46, 57-62および30-49; 配列番号269の4-19および14-22; 配列番号270の2-9; 配列番号271の7-18, 30-43および4-12; 配列番号272の4-30, 39-47および5-22; 配列番号273の6-15および14-29; 配列番号274の4-34および23-35; 配列番号275の4-36, 44-57, 65-72および14-27; 配列番号276の4-18および11-20; 配列番号277の5-19; 配列番号278の18-36および6-20; 配列番号279の4-10, 19-34, 41-84, 96-104および50-63; 配列番号280の4-9, 19-27および8-21; 配列番号281の4-16, 18-28および22-30; 配列番号282の4-15および21-35; 配列番号283の4-17および3-13; 配列番号284の4-12および4-18; 配列番号285の4-24, 31-36および29-45; 配列番号286の12-22, 34-49および21-32; 配列番号287の4-17および22-32; 配列番号288の4-16, 25-42および7-28; 配列番号289の4-10および7-20; 配列番号290の4-11, 16-36, 39-54および28-44; 配列番号291の5-20, 29-54および14-29; 配列番号292の24-33および10-22; 配列番号293の10-51, 54-61および43-64; 配列番号294の7-1および2-17; 配列番号295の11-20および6-20; 配列番号296の4-30, 34-41および19-28; 配列番号297の11-21; 配列番号298の4-16, 21-26および9-38; 配列番号299の4-12, 15-27, 30-42, 66-72および10-24; 配列番号300の8-17および11-20;および配列番号246の2-19; 配列番号247の1-12; 配列番号248の21-38; 配列番号254の2-22; 配列番号255の15-33; 配列番号256の11-32; 配列番号259の11-28; 配列番号260の10-27; 配列番号261の9-26; 配列番号263の4-16; 配列番号266の1-18; 配列番号273の12-29; 配列番号276の6-23; 配列番号277の1-21; 配列番号279の47-64; 配列番号285の28-45; 配列番号287の18-35; 配列番号291の14-31; 配列番号292の7-24; 配列番号299の8-25; 配列番号300の1-20; 配列番号151の18-33; 配列番号151の62-72; 配列番号152の118-131; 配列番号154の195-220; 配列番号154の215-240; 配列番号154の255-280, 配列番号155の72-81; 配列番号156の174-186; 配列番号157の317-331; 配列番号158の35-59; 配列番号158の54-84; 配列番号158の79-104; 配列番号159の33-58; 配列番号159の81-101; 配列番号159の136-150; 配列番号159の173-186; 配列番号159の231-251; 配列番号161の22-48; 配列番号162の24-39; 配列番号163の475-489; 配列番号164の38-56; 配列番号164の583-604; 配列番号165の202-223; 配列番号165の222-247; 配列番号165の242-267; 配列番号165の262-287; 配列番号165の282-307; 配列番号165の302-327; 配列番号166の25-48; 配列番号167の204-217; 配列番号168の259-276; 配列番号169の121-139; 配列番号169の260-267; 配列番号169の215-240; 配列番号170の115-140; 配列番号172の182-204; 配列番号173の144-153; 配列番号173の205-219; 配列番号174の196-206; 配列番号174の240-249; 配列番号174の272-287; 配列番号174の199-223; 配列番号174の218-237; 配列番号175の226-249; 配列番号175の287-306; 配列番号176の430-449; 配列番号177の361-375; 配列番号178の241-260; 配列番号181の483-502; 配列番号182の379-396; 配列番号184の31-51; 配列番号186の1436-1460; 配列番号186の1455-1474; 配列番号186の1469-1487; 配列番号187の215-229; 配列番号187の534-561; 配列番号187の59-84; 配列番号187の79-104; 配列番号188の618-635; 配列番号189の191-203; 配列番号190の386-398; 配列番号191の65-83; 配列番号192の90-105; 配列番号192の112-136; 配列番号193の290-209; 配列番号194の33-50; 配列番号195の76-90; 配列番号196の70-88; 配列番号197の418-442; 配列番号197の574-585; 配列番号198の87-104; 配列番号198の124-148; 配列番号198の141-152; 配列番号199の241-248; 配列番号200の183-198; 配列番号201の40-57; 配列番号202の202-217; 配列番号203の50-74; 配列番号203の69-93; 配列番号203の88-112; 配列番号203の107-127; 配列番号205の74-92; 配列番号206の207-232; 配列番号206の227-252; 配列番号206の247-272; 配列番号207の47-60; 配列番号207の297-305; 配列番号207の312-337; 配列番号208の667-384; 配列番号210の279-295; 配列番号211の179-198; 配列番号213の27-51; 配列番号213の46-70; 配列番号213の65-89; 配列番号213の84-108; 配列番号213の112-141; 配列番号215の248-260; 配列番号216の59-78; 配列番号218の154-170; 配列番号219の57-73; 配列番号220の297-314; 配列番号221の142-157; 配列番号222の428-447; 配列番号222の573-593; 配列番号223の523-544; 配列番号223の46-70; 配列番号223の65-89; 配列番号223の84-108; 配列番号223の122-151; 配列番号224の123-142; 配列番号225の903-921; 配列番号226の119-136; 配列番号227の142-161; 配列番号228の258-277; 配列番号228の272-300; 配列番号228の295-322; 配列番号229の311-343; 配列番号229の278-304; 配列番号230の131-150; 配列番号230の195-218; 配列番号231の53-70; 配列番号232の184-208; 配列番号232の222-246; 配列番号232の241-265; 配列番号232の260-284; 配列番号232の279-303; 配列番号232の317-341; 配列番号233の678-696; 配列番号235の88-114; 配列番号235の464-481; 配列番号236の153-172; 配列番号236の137-155, 166-184; 配列番号236の215-228; 配列番号237の37-51; 配列番号237の53-75; 配列番号237の232-251; 配列番号237の318-336; 配列番号238の305-315; 配列番号238の131-156; 配列番号241の258-275; 配列番号243の107-137; 配列番号243の138-162; 配列番号243の157-181; 配列番号243の195-227; 配列番号244の62-78; 配列番号245の567-584を含むペプチド、および該配列の少なくとも6、好ましくは8を超える、とりわけ10を超えるアミノ酸を含む断片よりなる群から選ばれる。これら断片はすべて、個々に、およびそれぞれ独立に、本発明の好ましく選択された側面を形成する。
http://www.bbcm.univ.trieste.it/~tossi/pag2.html
A、IC3−IgGを用いたlamBでのLSPy−70ライブラリー(1588)、B、IC3−IgAを用いたlamBでのLSPy−70ライブラリー(1539)、C、IC6−IgGを用いたlamBでのLSPy−70ライブラリー(1173)、D、P4−IgGを用いたlamBでのLSPy−70ライブラリー(1138)、E、P4−IgAを用いたlamBでのLSPy−70ライブラリー(981)、F、IC3−IgGを用いたbtuBでのLSPy−150ライブラリー(991)、G、IC6−IgGを用いたbtuBでのLSPy−150ライブラリー(1036)、H、P4−IgGを用いたbtuBでのLSPy−150ライブラリー(681)、I、IC3−IgGを用いたfhuAでのLSPy−400ライブラリー(559)、K、IC6−IgGを用いたfhuAでのLSPy−400ライブラリー(543)、L、P4−IgGを用いたfhuAでのLSPy−400ライブラリー(20)、*、5アミノ酸よりも長い抗原性配列の予測はプログラムANTIGENIC{Kolaskar, A.ら、1990}を用いて行った。
個々のヒト血清との選択したエピトープを表す個々の合成ペプチドの免疫反応性を示す。反応性の程度をパターン/グレーコードしてある(pattern/grey coded);白:−(<50U)、グレー:+(50〜119U)、斜線:++(120〜199U)、斜線で交差:+++(200〜1000U)および垂直に交差:++++(>1000U)。ELISA単位(U)は、OD545nmでの読み取りおよびバックグラウンドに対する補正後の希釈から計算した。スコア、すべての反応性の合計(すべての+の数の加算);P1〜P10血清は急性咽頭炎を罹患する患者からのものであり、N1〜N10血清は健康な成人からのものである。PおよびNは内部対照として用いる。
ペプチド名:SPO0012、ORF Spy0012と注釈;SPA0450、Spy0450の別の読み枠での潜在的な新規ORF;SPC0406、Spy0406の相補鎖での潜在的な新規ORF;SPN0001、非コード領域での潜在的な新規ORF。
図4Aに示す50のストレプトコッカス・ピオゲネス株を、関連抗原をコードする遺伝子に特異的なオリゴヌクレオチドを用いたPCRにより試験した。一つの選択したPCR断片のPCR断片を正しいDNA断片の増幅を確認するためにシークエンシングした。*、ストレプトコッカス・ピオゲネスSF370(M1)と比較した株M89でのアミノ酸置換の数。#、M89中に遺伝子が存在しなかったためにシークエンシングに用いた別の株。
組換え抗原を用いた免疫および病原性ストレプトコッカス・ピオゲネスAP1による攻撃は、実験手順の記載に従って行った。A、動物における免疫実験に使用した組換えタンパク質に含まれる各抗原のアミノ酸は、完全長タンパク質との関連で示してある。B、生存パーセントを防禦として表してあり、括弧内には負の対照(PBS免疫)の防禦のパーセント、ついで正の対照(Spy2018)の防禦のパーセントを記載してある。C、観察の終了時点ではすべてのマウスが死亡したがマウスが良好な生存を示したという事実によりSpy0269を選択した。このことは、14.6日目(Spy0269)、11.6日目(PBS)および19.3日目(Spy2018)に測定した平均生存時間によって反映されている。
抗原性タンパク質を、実験手順で列挙した6つの異なるストレプトコッカス・ピオゲネス株でのアミノ酸交換について分析した。残基の番号は完全長タンパク質中でのアミノ酸の位置を示す。Spy1666の場合は、ストレプトコッカス・ニューモニエTIGR(SP0334)中の同種遺伝子との比較による変化を列挙してある、なぜなら該遺伝子はストレプトコッカス・ピオゲネスとストレプトコッカス・ニューモニエとの間で高度に保存されているからである。A、ストレプトコッカス・ピオゲネスSF370からのタンパク質中のアミノ酸残基。B、ストレプトコッカス・ピオゲネスSF370と異なる場合に、他の5つのストレプトコッカス・ピオゲネス株からの分析した遺伝子のいずれか一つに存在するアミノ酸残基。C、触媒活性に関与するSpy0416の残基。これら残基の変化は酵素を不活性にすることが予想され、それゆえアラニン、セリン、トレオニンまたはグリシンと実験的に交換して酵素的に不活性な組換えタンパク質を生成した。
実施例1:ヒト血清からの抗体の調製
ヒト免疫系によって産生されヒト血清中に存在するA群連鎖球菌に対する抗体は、抗原性タンパク質のインビボでの発現およびその免疫原性を示している。これら分子は本明細書に記載のアプローチにおいて個体の抗原を同定するうえで必須であるが、該アプローチは特異的な抗連鎖球菌抗体と対応のストレプトコッカス・ピオゲネスペプチドまたはタンパク質との相互作用に基づくものである。関連する抗体レパートリーへのアクセスを得るため、ヒト血清を以下から回収した:
I.咽頭炎、創傷感染および菌血症などの急性ストレプトコッカス・ピオゲネス感染症を罹患する患者(ストレプトコッカス・ピオゲネスは医学的な微生物試験により病因であることが示された)
II.未感染の健康な成人、なぜならA群連鎖球菌感染は一般的であり、以前の連鎖球菌との遭遇による自然免疫の結果として抗体が存在するからである。
ペプチド合成
SyroII合成機(Multisyntech、ヴィッテン、ドイツ)を用いたRinkアミド樹脂(PepChem、チュービンゲン、ドイツ)上での標準F−moc化学を用い、ペプチドを小スケール(4mg樹脂;平行して288まで)で合成した。配列をアセンブリーした後、ペプチドをFmoc−イプシロン−アミノヘキサン酸(リンカーとして)およびビオチン(Sigma、セントルイス、ミズーリ;通常のアミノ酸と同様に活性化)を用いて伸長した。ペプチドを93%TFA、5%トリエチルシラン、および2%水を用いて樹脂から1時間かけて開裂した。ペプチドを真空乾燥し、アセトニトリル/水(1:1)から3回凍結乾燥した。正しい質量の存在はReflex III MALDI-TOF(Bruker、ブレーメン、ドイツ)での質量分析により確認した。これらペプチドをさらに精製することなく用いた。
血清の特徴付けのため:
ELISAプレート(Maxisorb, Millipore)を、コーティング緩衝液(0.1M炭酸ナトリウム、pH9.2)中に希釈した5〜10μg/mlの全タンパク質でコーティングした。血清の3つの希釈液(2,000×、10,000×、50,000×)をPBS−BSA中で調製した。
ビオチン標識ペプチドを、製造業者の指示に従ってストレプトアビジンELISAプレート(EXICON)に10μg/mlの濃度にてコーティングした。
全細菌溶解液および培養上澄み液試料をインビトロ増殖したストレプトコッカス・ピオゲネスSF370/M1から調製した。BioRad Mini-Protean 3 Cell電気泳動系を用いたSDS−PAGEにより10〜25μgの全タンパク質/レーンを分離し、タンパク質をニトロセルロース膜(ECL, Amersham Pharmacia)に移した。5%乳中で一夜ブロッキングした後、2,000×希釈の抗血清を加え、HRPO標識抗マウスIgGを検出に用いた。
全細菌溶解液:細菌を凍結−解凍サイクルを繰り返すことにより溶解した:凍結するまで(1分)ドライアイス/エタノール混合物上でインキュベート、ついで37℃で解凍(5分):3回繰り返す。この次に超音波処理および遠心分離(3,500rpm、15分、4℃)による上澄み液の回収を行った。
患者グループおよび非感染グループの両者から5つの血清を、スクリーニング手順に使用した血清プールに対する全体の抗連鎖球菌力価に基づいて選択した。大腸菌タンパク質に対する抗体は、熱不活化した血清を全菌体大腸菌細胞(DH5アルファ、pHIE11で形質転換、細菌表面ディスプレイに使用したのと同じ条件下で増殖)とともにインキュベートすることにより除去した。プールし枯渇させた血清からのIgGの高度に富んだ調製物を、プロテインGアフィニティークロマトグラフィーにより、製造業者の指示(UltraLink Immobilized Protein G, Pierce)に従って得た。IgA抗体もまた、ストレプトアビジン−アガロース(GIBCO BRL)上に固定化したビオチン標識抗ヒトIgA(Southern Biotech)を用いたアフィニティークロマトグラフィーにより精製した。枯渇および精製の効率を、SDS−PAGE、ウエスタンブロッティング、ELISAおよびタンパク質濃度測定によりチェックした。
実験手順
連鎖球菌ゲノムDNAの調製
50mlのTodd-Hewittブロス培地に凍結スタブ(stab)からのストレプトコッカス・ピオゲネスSF370/M細菌を接種し、通気および振盪しながら37℃で18時間増殖させた。ついで、培養液を回収し、1,600×gで15分間遠心分離にかけ、上澄み液を除去した。細菌ペレットをPBSで3回洗浄し、0.5mlのリゾチーム溶液(100mg/ml)に注意深く再浮遊させた。0.1mlの10mg/mlの熱処理リボヌクレアーゼAおよび20UのリボヌクレアーゼT1を加え、注意深く混合し、溶液を37℃で1時間インキュベートした。0.2mlの20%SDS溶液および0.1mlのプロテイナーゼK(10mg/ml)を加えた後、試験管を55℃で一夜インキュベートした。ついで、1/3容量の飽和NaClを加え、溶液を4℃で20分間インキュベートした。抽出物をミクロ遠心(13,000rpm)でペレット化し、上澄み液を新たな試験管に移した。この溶液をPhOH/CHCl3/IAA(25:24:1)およびCHCl3/IAA(24:1)で抽出した。0.6×容量のイソプロパノールを加えてDNAを室温で沈殿させ、滅菌パスツールピペットを用いて溶液から巻き取り、80%氷冷エタノールを入れた試験管に移した。沈殿を10−12,000×gで遠心分離してDNAを回収し、ついで空気乾燥し、ddH2Oに溶解した。
ゲノムDNA断片を機械的に切断して、カップ−ホーン(cup-horn)ソニケーター(BB5カップホーンを備えたBandelin Sonoplus UV 2200ソニケーター、100%出力で10秒パルス)を用いて150〜300bpのサイズの断片、または穏やかなデオキシリボヌクレアーゼI(Novagen)処理により50〜70bpのサイズの断片とした。超音波処理は、DNAを150〜300bpのサイズ範囲の断片に破壊したときに極めて密集した断片サイズ分布が生成することが観察された。しかしながら、超音波誘発による流体力学的剪断力へのDNAの十分な暴露にもかかわらず、その後の断片サイズの低減を効率的かつ再現可能に達成することはできなかった。それゆえ、50〜70bpのサイズの断片をNovagenのショットガン開裂キットを用いた穏やかなデオキシリボヌクレアーゼI処理により得た。このキットにより提供されるデオキシリボヌクレアーゼIの1:20希釈を調製し、MnCl2の存在下、60μl容量、20℃にて5分間消化を行って該酵素による二本鎖開裂を確実にした。反応を2μlの0.5M EDTAで停止させ、断片化効率を2%TAE−アガロースゲル上で評価した。この処理の結果、ゲノムDNAはほぼ50〜70bp断片に完全に断片化された。ついで、各100μMのdNTPの存在下、T4DNAポリメラーゼを用いて断片を平滑末端として末端の効率的な平滑化(flushing)を確実にした。断片はライゲーション反応に直ちに用いるか、またはその後の使用のために−20℃で凍結した。
ベクターpMAL4.31は、ベータ−ラクタマーゼ(bla)遺伝子をカナマイシン耐性遺伝子と交換してpASK−IBA骨格{Skerra, A.ら、1994}上に構築した。さらに、bla遺伝子をマルチプルクローニングサイトにクローニングした。成熟ベータ−ラクタマーゼをコードする配列の前にompAのリーダーペプチド配列を置いて細胞質膜をを経た効率的な分泌を可能とした。さらに、成熟ベータ−ラクタマーゼの最初の12のアミノ酸をコードする配列(スペーサー配列)がompAリーダーペプチド配列に続いており、リーダーペプチダーゼ開裂部位の直後の配列の融合が回避されたが、これはたとえば、この領域の正に荷電したアミノ酸のクラスターが細胞質膜を経た移動を低減ないし不能にさせるからである{Kajava, A.ら、2000}。SmaI制限部位はライブラリーの挿入のためである。上流のFseI部位および下流のNotI部位は選択した断片の回収に用いられ、SmaI部位にフランキングしている。これら3つの制限部位は、bla遺伝子が−1リーディングフレームで転写されNotI部位の15bp後ろで停止する結果となるような仕方で12アミノ酸のスペーサー配列をコードする配列の後ろに挿入される。+1bp挿入によってbla ORFは回復され、ベータ−ラクタマーゼタンパク質は産生され、その結果、アンピシリン耐性も獲得されるようになる。
ストレプトコッカス・ピオゲネスのゲノムDNA断片をベクターpMAL4.31のSmaI部位にライゲートした。組換えDNAをDH10Bエレクトロコンピテント大腸菌細胞(GIBCO BRL)にエレクトロポレーションし、形質転換体をカナマイシン(50μg/ml)およびアンピシリン(50μg/ml)を添加したLBアガーにプレーティングした。プレートを37℃で一夜インキュベートし、大スケールのDNA抽出のためにコロニーを選択した。代表的なプレートを貯蔵し、コロニーPCR分析および大スケールシークエンシング用のコロニーのために残しておいた。単純なPCRアッセイを用いて最初におおまかな断片サイズの分布並びに挿入効率を決定した。シークエンシングのデータから正確な断片サイズを評価し、挿入部位での連結の完全さ並びにフレーム選択の正確さ(3n+1則)を評価した。
ゲノムDNA断片をストレプトコッカス・ピオゲネスライブラリーを含むpMAL4.31ベクターから制限酵素FseIおよびNotIを用いて切り出した。ついで、断片の全集団を、FseIおよびNotIで消化しておいたプラスミドpMAL9.1(LamB)、pMAL10.1(BtuB)またはpHIE11(FluA)に移した。8bpのGCリッチ配列を認識するこれら2つの制限酵素を用い、pMAL4.31ベクターで選択したリーディングフレームが各プラットホームベクターで維持される。ついで、このプラスミドライブラリーをエレクトロポレーションにより大腸菌DH5α細胞に形質転換した。細胞を50μg/mlのカナマイシンを添加した大きなLBアガープレートにプレーティングし、37℃で一夜、単一コロニーが明確に視認できる密度に増殖させた。ついで、細胞をこれらプレートの表面から掻き落とし、新たなLB培地で洗浄し、ライブラリースクリーニングのために−80℃でアリコートに貯蔵した。
フレーム選択のためのライブラリー
pMAL4.31ベクターでそれぞれ約70bp、150bpおよび300bpのサイズの3つのライブラリー(LSPy70、LSPy150およびLSPy300)を生成した。各ライブラリーについて、約1μgのpMAL4.31プラスミドDNAおよび50ngのストレプトコッカス・ピオゲネスの断片化ゲノムDNAのライゲーションおよび引き続く形質転換により、フレーム選択後に4×105〜2×106クローンが得られた。ライブラリーのランダムさを評価するため、約600のランダムに選択したLSPy70のクローンをシークエンシングした。バイオインフォーマティクス分析は、これらクローンのうちごくわずかのみが1回を超えて存在することを示した。さらに、クローンの90%が16〜61bpのサイズ範囲に含まれ、平均サイズは34bpであることが示された(図2)。すべての配列が3n+1則に従い、すべてのクローンが正しくフレーム選択されていることが示された。
大腸菌の表面でのペプチドの提示には、フレーム選択ベクターpMAL4.31からのLPSyライブラリーからの挿入物をディスプレイプラスミドpMAL9.1(LamB)、pMAL10.1(BtuB)またはpHIE11(FluA)に移す必要があった。ゲノムDNA断片をFseIおよびNotI制限酵素により切り出し、5ngの挿入物を0.1μgのプラスミドDNAとライゲートし、引き続きDH5α細胞を形質転換すると2〜5×106クローンが得られた。これらクローンをLBプレートから掻き落とし、さらに増幅させることなく凍結させた。
実験手順
MACSスクリーニング
所定のライブラリーからの約2.5×108の細胞を、50μg/mlのカナマイシンを添加した5mlのLB培地で増殖させた。発現の誘発は1mM IPTGを30分間添加することにより行った。細胞を新たなLB培地で2回洗浄し、約2×107の細胞を100μlのLB培地に再浮遊させ、エッペンドルフ管に移した。
選択クローンを50μgのカナマイシンを添加した3mlのLB培地中、37℃にて一夜培養し、標準法を用いてプラスミドDNAを調製した。シークエンシングはMWG(ドイツ)にて、またはTIGR(米国)と協同で行った。
ビオチン化Igを用いたマグネチックアクチベーテッドセルソーティング(MACS)による細菌表面ディスプレイライブラリーのスクリーニング
pMAL9.1中のライブラリーLSPy70、pMAL10.1中のライブラリーLSPy150およびpHIE11中のライブラリーLSPy300を、患者血清または健康な個体からの血清からのビオチン化ヒトIgGおよびIgAのプールを用いてスクリーニングした(実施例1:ヒト血清からの抗体の調製を参照)。選択手順は実験手順の記載に従って行った。図3Aは、LSPy−70ライブラリーおよびP4−IgGを用いたスクリーニングの代表例を示す。MACSスクリーニングからの1回目の選択後のコロニーカウントから明らかなように、最終的に回収された細胞の合計数は3×107細胞から約5×104細胞に劇的に減少したのに対し、抗体を添加しなかった選択は約3×103細胞への減少を示した(図3A)。2回目の選択後でも、同様の数の細胞がP4−IgGで回収されたのに対し、ヒト血清からのIgGを添加しなかった場合には10未満の細胞しか回収されず、この選択がストレプトコッカス・ピオゲネス特異的な抗体に依存していることを明らかに示していた。スクリーニングの性能を評価するため、約50の選択クローンをランダムに取り、同じプールした血清を用いたウエスタンブロット分析に供した(図3B)。この分析により、選択クローンの70%が関連血清中に存在する抗体との反応性を示したのに対し、ストレプトコッカス・ピオゲネス特異的な挿入物を含まずLamBを発現する対照株は同血清と反応しないことが明らかとなった。一般に、反応性の割合は35〜75%の範囲にあることが観察された。コロニーPCR分析は、すべての選択クローンが予期したサイズの範囲の挿入物を含むことを示した。
約100人の患者および60人の健康な成人の血清が分析に含まれていた。選択クローンのバイオインフォーマティクス分析後、対応ペプチドをデザインし、合成した。28を超えるアミノ酸残基のエピトープの場合は重複ペプチドを製造した。すべてのペプチドをN末端ビオチンタグを付して合成し、ストレプトアビジンコーティングELISAプレート上でコーティング試薬として用いた。
PCRによるA群連鎖球菌抗原の遺伝子分布
理想的なワクチンは、当該ワクチンが向けられた標的生物のすべてまたは大部分の株に存在する抗原であろう。同定したストレプトコッカス・ピオゲネスの抗原をコードする遺伝子がストレプトコッカス・ピオゲネス株に普遍的に存在するものであるか否かを確立するため、目的遺伝子に対して特異的なプライマーを用いて一連の独立のストレプトコッカス・ピオゲネス単離物に対してPCRを行った。図4Aに示すように、患者に最も頻繁に存在するemm型をカバーするストレプトコッカス・ピオゲネス単離物を得た。プライマーとしてのオリゴヌクレオチドは、もしも可能なら同定したすべての免疫原性エピトープをカバーする約1,000bpの生成物をするよう同定したすべてのORFについてデザインした。すべてのストレプトコッカス・ピオゲネス株のゲノムDNAは、実施例2の記載と同様にして調製した。PCRは、Taqポリメラーゼ(1U)、200nMのdNTP、10ピコモルの各オリゴヌクレオチドおよびキットを製造業者(Invitrogen、オランダ)の指示に従って25μlの反応容量にて行った。標準として、条件を個々のプライマーペアに適合させる必要のない限り、30サイクル(1×:5分、95℃、30×:30秒、95℃、30秒、56℃、30秒、72℃、1×4分、72℃)行った。
免疫原性のタンパク質をコードする同定されたすべての遺伝子を、ストレプトコッカス・ピオゲネスの50の異なる株での存在についてPCRにより試験した(図4A)。一例として、図4Bは、示した50のすべての株とのSpy0269のPCR反応性を示す。明らかに見てとれるように、この遺伝子は分析したすべての株に存在している。株No.8(M89)からのPCR断片をシークエンシングしたところ、ストレプトコッカス・ピオゲネスM1株SF310と比較して917bpのうち2bpのみが異なり、その結果、これら2つの単離物は1アミノ酸の差異しかないことが示された。
マウスからの免疫血清の生成
ストレプトコッカス・ピオゲネスペプチドに融合したプラットホームタンパク質をコードするプラスミドを有する大腸菌クローンを、50μg/mlのカナマイシンを添加したLB培地中、37℃で増殖させた。一夜培養液を1:10に希釈し、OD600が0.5となるまで増殖させ、0.2mM IPTGで2時間誘発した。ペレット化した細菌菌体をPBS緩衝液に浮遊させ、氷上での超音波処理により破砕し、粗製の細胞抽出物を得た。OD600測定により、5×107細胞に対応するアリコートをNMRIマウスに静脈内注射し、ついで2週間後にブースター投与した。第二の注射の1週間後に血清を採取した。エピトープ特異的な抗体レベルをペプチドELISAにより測定した。
インビトロで増殖したストレプトコッカス・ピオゲネスSF370/M1による抗原の発現をイムノブロッティングにより試験した。異なる増殖培地および培養条件を試験して全溶解液および細菌培養上澄み液中の膠原の存在を検出した。予測した分子量および電気泳動移動度に対応する特異的なバンドが検出されたときに発現が確認されたとした。
フローサイトメトリー分析を以下のようにして行った。細菌を、イムノブロット分析により示される抗原の発現という結果となる培養条件下で増殖させた。細胞をハンクスの平衡塩類溶液(HBSS)で2回洗浄し、100μlのHBSS、0.5%BSAで細胞密度を約1×106CFUに調節した。50〜100倍に希釈した抗血清とともに4℃で30〜60分間インキュベートした後、未結合の抗体を過剰のHBSS、0.5%BSA中での遠心分離により洗浄して除いた。フルオレセイン(FITC)で標識したヤギ抗マウス二次抗体(F(ab')2フラグメント特異的)を細胞とともに4℃で30〜60分間インキュベートした。細胞を洗浄後、抗体を2%パラホルムアルデヒドで固定した。結合抗体をBecton Dickinson FACScanフローサイトメーターを用いて検出し、データをコンピュータープログラムCELLQuestでさらに分析した。対照血清には、マウスの免疫前血清、およびストレプトコッカス・ピオゲネスのゲノム挿入物を有しない遺伝子lamBまたはfluAをコードするプラスミドで形質転換しIPTG誘発した大腸菌から調製した溶解液で調製したマウスポリクローナル血清が含まれていた。
エピトープ特異的な免疫血清を、それがオプソニン食作用を誘発する活性についてFACSベースのアッセイで試験した。血清を熱不活化し、ついで抗大腸菌抗体を全菌体大腸菌(×3)とともにインキュベートすることにより除いた。107のAlexa 488標識したストレプトコッカス・ピオゲネス細胞を補体源として2〜10%免疫血清および2%ハムスター血清の存在下で前オプソニン処理し、ついで106の食細胞(RAW246.7またはP388.D1マウス単球細胞株)に加えた。細胞混合物を37℃で30分間インキュベートした。時間、IgG濃度および細菌の補体依存性の取り込みを、フルオレセンスアクチベーテッドセルソーターで測定した食細胞の平均蛍光強度の増大として記録した。
マウスマクロファージ細胞(RAW246.7またはP388.D1)および細菌をインキュベートし、60分後の生きた細菌の消失をコロニーカウンティングにより決定した。簡単に説明すると、細菌をハンクスの平衡塩類溶液(HBSS)で2回洗浄し、50μlのHBSSで細胞密度を約1×105CFUに調節した。細菌をマウス血清(25%まで)およびモルモット補体(5%まで)とともに100μlの合計容量にて4℃で60分間インキュベートした。前オプソニン処理した細菌をマクロファージ(マウス細胞株RAW246.7またはP388.D1;100μl当たり2×106細胞)と1:20の比で混合し、500rpmの回転シェーカー上、37℃でインキュベートした。各試料のアリコートを滅菌水で希釈し、室温で5分間インキュベートしてマクロファージを溶解させた。ついで、系列希釈をTodd-Hewitt Brothアガープレートにプレーティングした。プレートを37℃で一夜インキュベートし、コロニーをCountermatフラッシュコロニーカウンター(IUL Instruments)でカウントした。対照血清には、マウスの免疫前血清、およびストレプトコッカス・ピオゲネスのゲノム挿入物を有しない遺伝子lamBまたはfluAをコードするプラスミドで形質転換しIPTG誘発した大腸菌から調製した溶解液で調製したマウスポリクローナル血清が含まれていた。
インビトロ発現および細胞表面染色
抗原性タンパク質の発現を、ストレプトコッカス・ピオゲネスペプチドに融合したプラットホームタンパク質をコードするプラスミドを有する大腸菌クローンに対して産生させた血清を用いることによりストレプトコッカス・ピオゲネスSF370/M1でインビトロで分析した。この分析は、ポリペプチドの表面発現をFACS分析により評価するためにタンパク質がそもそも発現されるのか否かを決定する第一段階の工程であった。インビトロ条件下ではすべてのタンパク質が発現されるわけではないことは予想されたが、幾つかのタンパク質はウエスタンブロット分析により全細胞溶解液中で検出された(たとえば、Spy0012、Spy0112、Spy0416、Spy0437、Spy0872、Spy1032、Spy1315、Spy1798;データは示していない)。幾つかの抗原性タンパク質についての細胞表面接近可能性(accessibility)は、引き続きフローサイトメトリーに基づくアッセイにより示された。連鎖球菌を、免疫前血清、またはストレプトコッカス・ピオゲネス溶解液またはストレプトコッカス・ピオゲネスペプチドに融合したプラットホームタンパク質をコードするプラスミドを有する大腸菌クローンに対して産生させたポリクローナルマウス血清とともにインキュベートし、ついで蛍光標識した二次抗体で検出した。図5Aに示すように、ストレプトコッカス・ピオゲネス溶解液に対して産生した抗血清はストレプトコッカス・ピオゲネスSF370/M1細胞集団の蛍光にシフトを引き起こす。抗原Spy0012(図5B)、Spy1315およびSpy1798(図5C)のペプチドに対して産生したポリクローナル血清についてもストレプトコッカス・ピオゲネスSF370/M1細胞の同様の細胞表面染色が観察されたが、2つのピークの検出によって示されるように細菌の亜集団が染色されただけであった。この現象は、細菌の増殖の際の遺伝子産物の差異的な発現または他の表面分子によって引き起こされた抗体結合の部分的な抑制の結果である。
実験手順
抗原性タンパク質をコードする遺伝子のクローニング
目的とする遺伝子またはDNA断片を、遺伝子特異的なプライマーを用いたPCR増幅によりストレプトコッカス・ピオゲネスSF370のゲノムDNAから増幅した。遺伝子特異的な配列に加え、プライマーは各5'末端に増幅PCR産物のディレクショナルクローニングを助ける制限部位からなる付加的塩基を含んでいた。プライマーの遺伝子特異的な配列は長さが15〜24塩基の範囲であった。得られたPCR産物を適当な制限酵素で消化し、適当に消化したpET28b(+)ベクター(NOVAGEN)にクローニングした。組換えプラスミドの構築を確認した後、発現宿主としての大腸菌BL21 STARR細胞(INVITROGEN)を形質転換した。これら細胞を、pET28bプラスミドによってコードされる目的遺伝子を効率的に発現すべく最適化する。
組換えプラスミドを有する大腸菌BL21 STARR細胞を、50μg/mlのカナマイシンを添加したLB培地中、37℃で対数期まで増殖させた。OD600nmが0.8に達したら、培養液を1mM IPTGとともに37℃で3時間インキュベートした。細胞を遠心分離により回収し、凍結−解凍法の組合せにより溶解し、ついでNOVAGENからのBug-busterR試薬を用いて細胞を破砕した。溶解液を遠心分離により可溶(上澄み液)画分および不溶(ペレット)画分に分離した。
組換えタンパク質の局在に依存して、異なる精製戦略に従った。可溶画分中の該タンパク質は、細胞破砕後の細胞溶解液の上澄み液をNi−アガロースビーズ(Ni-NTA-AgaroseR、QIAGEN)に結合させることにより精製した。発現タンパク質のC末端、N末端または両末端のペンタヒスチジン(HIS)の存在により、該タンパク質はNi−アガロースに結合し、一方、他の混入タンパク質は緩衝液で洗浄することによりカラムから洗浄除去される。組換えタンパク質は適当な緩衝液中に100mMイミダゾールを含む溶液によって溶出させた。溶出液を濃縮し、Bradfordによりタンパク質濃度についてアッセイし、SDS−PAGEおよびウエスタンブロットにより分析した。不溶性画分中のタンパク質は、8M尿素を含む適当な緩衝液中にペレットを可溶化することにより精製した。この精製は、上記可溶性タンパク質について記載したのと同じ材料および手順を用いた変性条件下(8M尿素を含む緩衝液中)で行った。溶出液を濃縮および透析してすべての尿素を逐次的または段階的な仕方で除去した。最終タンパク質を濃縮し、SDS−PAGEにより分析し、Bradford法により測定した。予測された分子量および電気泳動移動度に対応する特異的なバンドが検出されたときに発現が確認されたとした。変性剤である尿素の除去による透析の際に沈殿したタンパク質については、不溶性の封入体を数回洗浄し、マウスの免疫に直接用いた。
組換えタンパク質の免疫原性を、NMRIマウスおよび感染因子としてストレプトコッカス・ピオゲネス株AP1を用いた実験動物モデルでアッセイした。7〜8週齢の10匹の雌NMRIマウスを50μg/投与の組換えタンパク質で2週間毎に合計3投与にて免疫した。最初の投与はフロイントの完全アジュバントをアジュバントとし、一方、残りの2回の投与はフロイントの不完全アジュバントをアジュバントとした。免疫の終了時に採血して抗体力価をチェックし、その後、致死量のストレプトコッカス・ピオゲネス(5×107病原性菌体)で静脈内(i.v.)攻撃した。攻撃後18〜21日間、マウスの生存をスコアリングした。
組換えタンパク質の発現および精製
組換えタンパク質発現のために選択した31のタンパク質のうち29のタンパク質が精製に十分なレベルで大腸菌中で産生させることができた。幾つかのタンパク質は可溶性のタンパク質として発現されたが(表4参照)、幾つかのタンパク質は透析の際に不溶性であるか(たとえば、Spy416B、Spy0872)または沈殿することがわかった。この透析はSpy0031、Spy0292、Spy720などの不溶性のタンパク質の可溶化後に変性剤の尿素を除去するために行ったものである。これらの場合、洗浄した封入体を直接マウスに注射して免疫した。一般に、アフィニティー精製は少なくとも85%の純度の組換えタンパク質調製物を生成した。
表4は、マウスで試験し、実験動物である程度の防禦を示した抗原を列挙したものである。動物における菌血症モデルでも試験したが記載の実験においていかなるレベルの防禦をも示さなかった組換えタンパク質は当該表に列挙していないが、Spy0012、Spy1063およびSpy1494などのタンパク質は含めてある。病原性細菌は血中に直接注射しているので、記載の菌血症モデルは侵入性疾患に対するワクチン候補の防禦価を評価するものである。そのようなA群連鎖球菌感染に対して防禦しうる抗体を誘起する組換えタンパク質は、A群連鎖球菌疾患に対するワクチンを開発するための価値ある候補であると考えられる。以前にストレプトコッカス・ピオゲネス攻撃に対して防禦を提供することが示された正の対照であるSpy2018(M1タンパク質)と比較して、18日または21日後に攻撃実験の終点(表4)を評価したときに幾つかの抗原は同程度の性能を示した(Spy0416、Spy1607またはSpy0292)。他のタンパク質は部分的な防禦効果しか示さなかったが(Spy0720、Spy0872)、他の抗原と組み合わせたときに非常に有効であることがわかる(図6)。
実験手順
PCR断片のシークエンシングおよびバイオインフォーマティクス分析
ストレプトコッカス・ピオゲネス株のPCR分析は実施例5に記載してある。PCR断片のシークエンシングは遺伝子の変動性の評価を提供し、その結果の要約を表3に列挙してある。5つのストレプトコッカス・ピオゲネス株(SF370:M1;MGAS8232:M18;SSI−1:M3;MGAS315:M3;Manfredo:M5)からのゲノム配列を入手できたことにより、抗原の変動性のさらなる評価が可能となった。すべての配列を、ストレプトコッカス・ピオゲネスSF370からの各抗原配列およびストレプトコッカス・ピオゲネスSF370からの抗原性タンパク質のものとは異なると同定されたアミノ酸残基を用いてアラインメントした。抗原性タンパク質の幾つかには挿入配列または欠失配列が検出されたが、この分析には含まれていない。
表5は、4つのストレプトコッカス・ピオゲネス株(MGAS8232:M18;SSI−1:M3;MGAS315:M3;Manfredo:M5)または増幅PCR断片のシークエンシングに用いた株(表3参照)の一つにおいて示された抗原の変わりうると同定されたすべての位置を示す。バイオインフォーマティクス分析は、抗原性タンパク質の幾つかのものは血清型M1、M3、M5、M18およびM89の6つの株のいずれにおいても単一のアミノ酸交換もなしに非常によく保存されていることを示している。この群に属するタンパク質としてはSpy0103およびSpy1536が挙げられるが、他の抗原性タンパク質における交換は、サイズ自体の差異から予期されるように小さなタンパク質よりも大きなタンパク質の方が多かった。種々の株を分析したが、単一の残基が他の株において1を超える他のアミノ酸に交換されることは殆ど観察されなかった。血清型、臨床所見または地理的位置が様々な一層多数の株における各遺伝子の配列のさらなる分析は、列挙したアミノ酸残基におけるまたはさらなる残基における可能な変化を確かに同定することであろう。
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Claims (37)
- (a)配列番号1、4-8、10-18、20、22、24-32、34-35、38-40、43-46、49-51、53-54、57-61、63、65-71、73、75-77、81-82、88、91-94および96-150から選ばれる核酸分子に対して少なくとも70%の配列同一性を有する核酸分子、
(b)(a)の核酸分子に相補的な核酸分子、
(c)(a)または(b)の核酸分子の少なくとも15の連続塩基を含む核酸分子、
(d)(a)、(b)または(c)の核酸分子にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でアニールする核酸分子、
(e)遺伝子コードの縮重を別として、(a)、(b)、(c)または(d)に定める核酸分子にハイブリダイズする核酸分子
よりなる群から選ばれた核酸配列を含む、高度免疫血清反応性の抗原またはその断片をコードする単離核酸分子。 - 配列の同一性が少なくとも80%、好ましくは少なくとも95%、とりわけ100%である、請求項1に記載の単離核酸分子。
- (a)配列番号64から選ばれる核酸分子に対して少なくとも96%の配列同一性を有する核酸分子、
(b)(a)の核酸分子に相補的な核酸分子、
(c)(a)または(b)の核酸分子の少なくとも15の連続塩基を含む核酸分子、
(d)(a)、(b)または(c)の核酸分子にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でアニールする核酸分子、
(e)遺伝子コードの縮重を別として、(a)、(b)、(c)または(d)に定める核酸分子にハイブリダイズする核酸分子
よりなる群から選ばれた核酸配列を含む、高度免疫血清反応性の抗原またはその断片をコードする単離核酸分子。 - (a)配列番号3、36、47-48、55、62、72、80、84、95から選ばれる核酸分子、
(b)(a)の核酸分子に相補的な核酸分子、
(c)遺伝子コードの縮重を別として、(a)、(b)、(c)または(d)に定める核酸分子にハイブリダイズする核酸分子
よりなる群から選ばれた核酸配列を含む単離核酸分子。 - 該核酸がDNAである、請求項1、2、3または4に記載の核酸分子。
- 該核酸がRNAである、請求項1、2、3、4または5に記載の核酸分子。
- 該核酸分子がゲノムDNA、とりわけストレプトコッカス・ピオゲネスのゲノムDNAから単離される、請求項1ないし5のいずれかに記載の単離核酸分子。
- 請求項1ないし7のいずれかに記載の核酸分子を含むベクター。
- 請求項1ないし7のいずれかに記載の核酸分子によってコードされる高度免疫グロブリン血清反応性の抗原またはその断片の組換え発現用に適合される、請求項8に記載のベクター。
- 請求項8または9に記載のベクターを含む宿主細胞。
- 請求項1、2、5、6または7のいずれかに記載の核酸分子によってコードされるアミノ酸配列を含む高度免疫血清に反応性の抗原およびその断片であって、該アミノ酸配列が、配列番号151、154-158、160-168、170、172、174-182、184-185、188-190、193-196、199-201、203-204、207-211、213、215-221、223、225-227、231-232、238、241-244および246-300よりなる群から選ばれることを特徴とする高度免疫血清に反応性の抗原およびその断片。
- 請求項3、5、6または7のいずれかに記載の核酸分子によってコードされるアミノ酸配列を含む高度免疫血清に反応性の抗原およびその断片であって、該アミノ酸配列が、配列番号214よりなる群から選ばれることを特徴とする高度免疫血清に反応性の抗原およびその断片。
- 請求項4、5、6または7のいずれかに記載の核酸分子によってコードされるアミノ酸配列を含む高度免疫血清に反応性の抗原およびその断片であって、該アミノ酸配列が、配列番号153、186、197-198、205、212、222、230、234、245よりなる群から選ばれることを特徴とする高度免疫血清に反応性の抗原およびその断片。
- 表2の縦列「予測される免疫原性アミノ酸」および「同定された免疫原性領域の位置」のアミノ酸配列を含むペプチド;表2の血清反応性エピトープ、とりわけアミノ酸:
配列番号151の4-44, 57-65, 67-98, 101-107, 109-125, 131-144, 146-159, 168-173, 181-186, 191-200, 206-213, 229-245, 261-269, 288-301, 304-317, 323-328, 350-361, 374-384, 388-407, 416-425および1-114; 配列番号152の5-17, 49-64, 77-82, 87-98, 118-125, 127-140, 142-150, 153-159, 191-207, 212-218, 226-270, 274-287, 297-306, 325-331, 340-347, 352-369, 377-382, 390-395および29-226; 配列番号153の4-16, 20-26, 32-74, 76-87, 93-108, 116-141, 148-162, 165-180, 206-219, 221-228, 230-236, 239-245, 257-268, 313-328, 330-335, 353-359, 367-375, 394-403, 414-434, 437-444, 446-453, 456-464, 478-487, 526-535, 541-552, 568-575, 577-584, 589-598, 610-618, 624-643, 653-665, 667-681, 697-718, 730-748, 755-761, 773-794, 806-821, 823-831, 837-845, 862-877, 879-889, 896-919, 924-930, 935-940, 947-955, 959-964, 969-986, 991-1002, 1012-1036, 1047-1056, 1067-1073, 1079-1085, 1088-1111, 1130-1135, 1148-1164, 1166-1173, 1185-1192, 1244-1254および919-929; 配列番号154の5-44, 62-74, 78-83, 99-105, 107-113, 124-134, 161-174, 176-194, 203-211, 216-237, 241-247, 253-266, 272-299, 323-349, 353-360および145-305; 配列番号155の15-39, 52-61, 72-81, 92-97および71-81; 配列番号156の13-19, 21-31, 40-108, 115-122, 125-140, 158-180, 187-203, 210-223, 235-245および173-186; 配列番号157の5-12, 19-27, 29-39, 59-67, 71-78, 80-88, 92-104, 107-124, 129-142, 158-168, 185-191, 218-226, 230-243, 256-267, 272-277, 283-291, 307-325, 331-344, 346-352および316-331; 配列番号158の6-28, 43-53, 60-76, 93-103および21-99; 配列番号159の10-30, 120-126, 145-151, 159-169, 174-182, 191-196, 201-206, 214-220, 222-232, 254-272, 292-307, 313-323, 332-353, 361-369, 389-396, 401-415, 428-439, 465-481, 510-517, 560-568および9-26; 配列番号160の5-29, 39-45, 107-128および1-112; 配列番号161の4-38, 42-50, 54-60, 65-71, 91-102および21-56; 配列番号162の4-13, 19-25, 41-51, 54-62, 68-75, 79-89, 109-122, 130-136, 172-189, 192-198, 217-224, 262-268, 270-276, 281-298, 315-324, 333-342, 353-370, 376-391および23-39; 配列番号163の6-41, 49-58, 62-103, 117-124, 147-166, 173-194, 204-211, 221-229, 255-261, 269-284, 288-310, 319-325, 348-380, 383-389, 402-410, 424-443, 467-479, 496-517, 535-553, 555-565, 574-581, 583-591および474-489; 配列番号164の8-35, 52-57, 66-73, 81-88, 108-114, 125-131, 160-167, 174-180, 230-235, 237-249, 254-262, 278-285, 308-314, 321-326, 344-353, 358-372, 376-383, 393-411, 439-446, 453-464, 471-480, 485-492, 502-508, 523-529, 533-556, 558-563, 567-584, 589-597, 605-619, 625-645, 647-666, 671-678, 690-714, 721-728, 741-763, 766-773, 777-787, 792-802, 809-823, 849-864および37-241, 409-534, 582-604, 743-804; 配列番号165の4-17, 24-36, 38-44, 59-67, 72-90, 92-121, 126-149, 151-159, 161-175, 197-215, 217-227, 241-247, 257-264, 266-275, 277-284, 293-307, 315-321, 330-337, 345-350, 357-366, 385-416および202-337; 配列番号166の4-20, 22-46, 49-70, 80-89, 96-103, 105-119, 123-129, 153-160, 181-223, 227-233, 236-243, 248-255, 261-269, 274-279, 283-299, 305-313, 315-332, 339-344, 349-362, 365-373, 380-388, 391-397, 402-407および1-48; 配列番号167の18-37, 41-63, 100-106, 109-151, 153-167, 170-197, 199-207, 212-229, 232-253, 273-297および203-217; 配列番号168の20-26, 54-61, 80-88, 94-101, 113-119, 128-136, 138-144, 156-188, 193-201, 209-217, 221-229, 239-244, 251-257, 270-278, 281-290, 308-315, 319-332, 339-352, 370-381, 388-400, 411-417, 426-435, 468-482, 488-497, 499-506, 512-521および261-273; 配列番号169の6-12, 16-36, 50-56, 86-92, 115-125, 143-152, 163-172, 193-203, 235-244, 280-289, 302-315, 325-348, 370-379, 399-405, 411-417, 419-429, 441-449, 463-472, 482-490, 500-516, 536-543, 561-569, 587-594, 620-636, 647-653, 659-664, 677-685, 687-693, 713-719, 733-740, 746-754, 756-779, 792-799, 808-817, 822-828, 851-865, 902-908, 920-938, 946-952, 969-976, 988-1005, 1018-1027, 1045-1057, 1063-1069, 1071-1078, 1090-1099, 1101-1109, 1113-1127, 1130-1137, 1162-1174, 1211-1221, 1234-1242, 1261-1268, 1278-1284, 1312-1317, 1319-1326, 1345-1353, 1366-1378, 1382-1394, 1396-1413, 1415-1424, 1442-1457, 1467-1474, 1482-1490, 1492-1530, 1537-1549, 1559-1576, 1611-1616, 1624-1641および1-414, 443-614, 997-1392; 配列番号170の14-42, 70-75, 90-100, 158-181および1-164; 配列番号171の4-21, 30-36, 54-82, 89-97, 105-118, 138-147および126-207; 配列番号172の4-21, 31-66, 96-104, 106-113, 131-142および180-204; 配列番号173の5-23, 31-36, 38-55, 65-74, 79-88, 101-129, 131-154, 156-165, 183-194, 225-237, 245-261, 264-271, 279-284, 287-297, 313-319, 327-336, 343-363, 380-386および11-197, 204-219, 258-372; 配列番号174の4-20, 34-41, 71-86, 100-110, 113-124, 133-143, 150-158, 160-166, 175-182, 191-197, 213-223, 233-239, 259-278, 298-322および195-289; 配列番号175の4-10, 21-35, 44-52, 54-62, 67-73, 87-103, 106-135, 161-174, 177-192, 200-209, 216-223, 249-298, 304-312, 315-329および12-130; 配列番号176の10-27, 33-38, 48-55, 70-76, 96-107, 119-133, 141-147, 151-165, 183-190, 197-210, 228-236, 245-250, 266-272, 289-295, 297-306, 308-315, 323-352, 357-371, 381-390, 394-401, 404-415, 417-425, 427-462, 466-483, 485-496, 502-507, 520-529, 531-541, 553-570, 577-588, 591-596, 600-610, 619-632, 642-665, 671-692, 694-707および434-444; 配列番号177の6-14, 16-25, 36-46, 52-70, 83-111, 129-138, 140-149, 153-166, 169-181, 188-206, 212-220, 223-259, 261-269, 274-282, 286-293, 297-306, 313-319, 329-341, 343-359, 377-390, 409-415, 425-430および360-375; 配列番号178の4-26, 28-48, 54-62, 88-121, 147-162, 164-201, 203-237, 245-251および254-260; 配列番号179の12-21, 26-32, 66-72, 87-93, 98-112, 125-149, 179-203, 209-226, 233-242, 249-261, 266-271, 273-289, 293-318, 346-354, 360-371, 391-400および369-382; 配列番号180の11-38, 44-65, 70-87, 129-135, 140-163, 171-177, 225-232, 238-249, 258-266, 271-280, 284-291, 295-300, 329-337, 344-352, 405-412, 416-424, 426-434, 436-455, 462-475, 478-487および270-312; 配列番号181の5-17, 34-45, 59-69, 82-88, 117-129, 137-142, 158-165, 180-195, 201-206, 219-226, 241-260, 269-279, 292-305, 312-321, 341-347, 362-381, 396-410, 413-432, 434-445, 447-453, 482-487, 492-499, 507-516, 546-552, 556-565, 587-604および486-598; 配列番号182の4-15, 17-32, 40-47, 67-78, 90-98, 101-107, 111-136, 161-171, 184-198, 208-214, 234-245, 247-254, 272-279, 288-298, 303-310, 315-320, 327-333, 338-349, 364-374および378-396; 配列番号183の5-27, 33-49, 51-57, 74-81, 95-107, 130-137, 148-157, 173-184および75-235; 配列番号184の6-23, 47-53, 57-63, 75-82, 97-105, 113-122, 124-134, 142-153, 159-164, 169-179, 181-187, 192-208, 215-243, 247-257, 285-290, 303-310および30-51; 配列番号185の17-29, 44-52, 59-73, 77-83, 86-92, 97-110, 118-153, 156-166, 173-179, 192-209, 225-231, 234-240, 245-251, 260-268, 274-279, 297-306, 328-340, 353-360, 369-382, 384-397, 414-423, 431-436, 452-465, 492-498, 500-508, 516-552, 554-560, 568-574, 580-586, 609-617, 620-626, 641-647および208-219; 配列番号186の4-26, 32-45, 58-72, 111-119, 137-143, 146-159, 187-193, 221-231, 235-242, 250-273, 290-304, 311-321, 326-339, 341-347, 354-368, 397-403, 412-419, 426-432, 487-506, 580-592, 619-628, 663-685, 707-716, 743-751, 770-776, 787-792, 850-859, 866-873, 882-888, 922-931, 957-963, 975-981, 983-989, 1000-1008, 1023-1029, 1058-1064, 1089-1099, 1107-1114, 1139-1145, 1147-1156, 1217-1226, 1276-1281, 1329-1335, 1355-1366, 1382-1394, 1410-1416, 1418-1424, 1443-1451, 1461-1469, 1483-1489, 1491-1501, 1515-1522, 1538-1544, 1549-1561, 1587-1593, 1603-1613, 1625-1630, 1636-1641, 1684-1690, 1706-1723, 1765-1771, 1787-1804, 1850-1857, 1863-1894, 1897-1910, 1926-1935, 1937-1943, 1960-1983, 1991-2005, 2008-2014, 2018-2039および396-533, 1342-1502, 1672-1920; 配列番号187の4-25, 45-50, 53-65, 79-85, 87-92, 99-109, 126-137, 141-148, 156-183, 190-203, 212-217, 221-228, 235-242, 247-277, 287-293, 300-319, 321-330, 341-361, 378-389, 394-406, 437-449, 455-461, 472-478, 482-491, 507-522, 544-554, 576-582, 587-593, 611-621, 626-632, 649-661, 679-685, 696-704, 706-716, 726-736, 740-751, 759-766, 786-792, 797-802, 810-822, 824-832, 843-852, 863-869, 874-879, 882-905および1-113, 210-232, 250-423, 536-564; 配列番号188の4-16, 33-39, 43-49, 54-85, 107-123, 131-147, 157-169, 177-187, 198-209, 220-230, 238-248, 277-286, 293-301, 303-315, 319-379, 383-393, 402-414, 426-432, 439-449, 470-478, 483-497, 502-535, 552-566, 571-582, 596-601, 608-620, 631-643, 651-656, 663-678, 680-699, 705-717, 724-732, 738-748, 756-763, 766-772, 776-791, 796-810, 819-827, 829-841, 847-861, 866-871, 876-882, 887-894, 909-934, 941-947, 957-969, 986-994, 998-1028, 1033-1070, 1073-1080, 1090-1096, 1098-1132, 1134-1159, 1164-1172, 1174-1201および617-635;
配列番号189の7-25, 30-40, 42-64, 70-77, 85-118, 120-166, 169-199, 202-213, 222-244および190-203; 配列番号190の4-11, 15-53, 55-93, 95-113, 120-159, 164-200, 210-243, 250-258, 261-283, 298-319, 327-340, 356-366, 369-376, 380-386, 394-406, 409-421, 425-435, 442-454, 461-472, 480-490, 494-505, 507-514, 521-527, 533-544, 566-574および385-398; 配列番号191の5-36, 66-72, 120-127, 146-152, 159-168, 172-184, 205-210, 221-232, 234-243, 251-275, 295-305, 325-332, 367-373, 470-479, 482-487, 520-548, 592-600, 605-615, 627-642, 655-662, 664-698, 718-725, 734-763, 776-784, 798-809, 811-842, 845-852, 867-872, 879-888, 900-928, 933-940, 972-977, 982-1003および12-190, 276-283, 666-806; 配列番号192の4-38, 63-68, 100-114, 160-173, 183-192, 195-210, 212-219, 221-238, 240-256, 258-266, 274-290, 301-311, 313-319, 332-341, 357-363, 395-401, 405-410, 420-426, 435-450, 453-461, 468-475, 491-498, 510-518, 529-537, 545-552, 585-592, 602-611, 634-639, 650-664および30-80, 89-105, 111-151; 配列番号193の7-29, 31-39, 47-54, 63-74, 81-94, 97-117, 122-127, 146-157, 168-192, 195-204, 216-240, 251-259および195-203; 配列番号194の5-16, 28-34, 46-65, 79-94, 98-105, 107-113, 120-134, 147-158, 163-172, 180-186, 226-233, 237-251, 253-259, 275-285, 287-294, 302-308, 315-321, 334-344, 360-371, 399-412, 420-426および32-50; 配列番号195の8-20, 30-36, 71-79, 90-96, 106-117, 125-138, 141-147, 166-174および75-90; 配列番号196の4-13, 15-33, 43-52, 63-85, 98-114, 131-139, 146-174, 186-192, 198-206, 227-233および69-88; 配列番号197の4-22, 29-35, 59-68, 153-170, 213-219, 224-238, 240-246, 263-270, 285-292, 301-321, 327-346, 356-371, 389-405, 411-418, 421-427, 430-437, 450-467, 472-477, 482-487, 513-518, 531-538, 569-576, 606-614, 637-657, 662-667, 673-690, 743-753, 760-767, 770-777, 786-802および96-230, 361-491, 572-585; 配列番号198の4-12, 21-36, 48-55, 74-82, 121-127, 195-203, 207-228, 247-262, 269-278, 280-289および102-210; 配列番号199の13-20, 23-31, 38-44, 78-107, 110-118, 122-144, 151-164, 176-182, 190-198, 209-216, 219-243, 251-256, 289-304, 306-313および240-248; 配列番号200の5-26, 34-48, 57-77, 84-102, 116-132, 139-145, 150-162, 165-173, 176-187, 192-205, 216-221, 234-248, 250-260および182-198; 配列番号201の10-19, 26-44, 53-62, 69-87, 90-96, 121-127, 141-146, 148-158, 175-193, 204-259, 307-313, 334-348, 360-365, 370-401, 411-439, 441-450, 455-462, 467-472, 488-504および41-56; 配列番号202の5-21, 36-42, 96-116, 123-130, 138-144, 146-157, 184-201, 213-228, 252-259, 277-297, 308-313, 318-323, 327-333および202-217; 配列番号203の6-26, 33-51, 72-90, 97-131, 147-154, 164-171, 187-216, 231-236, 260-269, 275-283および1-127; 配列番号204の4-22, 24-38, 44-58, 72-88, 99-108, 110-117, 123-129, 131-137, 142-147, 167-178, 181-190, 206-214, 217-223, 271-282, 290-305, 320-327, 329-336, 343-352, 354-364, 396-402, 425-434, 451-456, 471-477, 485-491, 515-541, 544-583, 595-609, 611-626, 644-656, 660-681, 683-691, 695-718および297-458; 配列番号205の5-43, 92-102, 107-116, 120-130, 137-144, 155-163, 169-174, 193-213および24-135; 配列番号206の4-25, 61-69, 73-85, 88-95, 97-109, 111-130, 135-147, 150-157, 159-179, 182-201, 206-212, 224-248, 253-260, 287-295, 314-331, 338-344, 365-376, 396-405, 413-422, 424-430, 432-449, 478-485, 487-494, 503-517, 522-536, 544-560, 564-578, 585-590, 597-613, 615-623, 629-636, 640-649, 662-671, 713-721および176-330; 配列番号207の31-37, 41-52, 58-79, 82-105, 133-179, 184-193, 199-205, 209-226, 256-277, 281-295, 297-314, 322-328, 331-337, 359-367, 379-395, 403-409, 417-432, 442-447, 451-460, 466-472および46-62, 296-341; 配列番号208の23-29, 56-63, 67-74, 96-108, 122-132, 139-146, 152-159, 167-178, 189-196, 214-231, 247-265, 274-293, 301-309, 326-332, 356-363, 378-395, 406-412, 436-442, 445-451, 465-479, 487-501, 528-555, 567-581, 583-599, 610-617, 622-629, 638-662, 681-686, 694-700, 711-716および667-684; 配列番号209の20-51, 53-59, 109-115, 140-154, 185-191, 201-209, 212-218, 234-243, 253-263, 277-290, 303-313, 327-337, 342-349, 374-382, 394-410, 436-442, 464-477, 486-499, 521-530, 536-550, 560-566, 569-583, 652-672, 680-686, 698-704, 718-746, 758-770, 774-788, 802-827, 835-842, 861-869および258-416; 配列番号210の7-25, 39-45, 59-70, 92-108, 116-127, 161-168, 202-211, 217-227, 229-239, 254-262, 271-278, 291-300および278-295; 配列番号211の4-20, 27-33, 45-51, 53-62, 66-74, 81-88, 98-111, 124-130, 136-144, 156-179, 183-191および183-195; 配列番号212の12-24, 27-33, 43-49, 55-71, 77-85, 122-131, 168-177, 179-203, 209-214, 226-241および63-238; 配列番号213の4-19, 37-50, 120-126, 131-137, 139-162, 177-195, 200-209, 211-218, 233-256, 260-268, 271-283, 288-308および1-141; 配列番号214の11-17, 40-47, 57-63, 96-124, 141-162, 170-207, 223-235, 241-265, 271-277, 281-300, 312-318, 327-333, 373-379および231-368; 配列番号215の9-33, 41-48, 57-79, 97-103, 113-138, 146-157, 165-186, 195-201, 209-215, 223-229, 237-247, 277-286, 290-297, 328-342および247-260; 配列番号216の7-15, 39-45, 58-64, 79-84, 97-127, 130-141, 163-176, 195-203, 216-225, 235-247, 254-264, 271-279および64-72; 配列番号217の4-12, 26-42, 46-65, 73-80, 82-94, 116-125, 135-146, 167-173, 183-190, 232-271, 274-282, 300-306, 320-343, 351-362, 373-383, 385-391, 402-409, 414-426, 434-455, 460-466, 473-481, 485-503, 519-525, 533-542, 554-565, 599-624, 645-651, 675-693, 717-725, 751-758, 767-785, 792-797, 801-809, 819-825, 831-836, 859-869, 890-897および222-362, 756-896; 配列番号218の11-17, 22-28, 52-69, 73-83, 86-97, 123-148, 150-164, 166-177, 179-186, 188-199, 219-225, 229-243, 250-255および153-170; 配列番号219の4-61, 71-80, 83-90, 92-128, 133-153, 167-182, 184-192, 198-212および56-73; 配列番号220の4-19, 26-37, 45-52, 58-66, 71-77, 84-92, 94-101, 107-118, 120-133, 156-168, 170-179, 208-216, 228-238, 253-273, 280-296, 303-317, 326-334および298-312; 配列番号221の7-13, 27-35, 38-56, 85-108, 113-121, 123-160, 163-169, 172-183, 188-200, 206-211, 219-238, 247-254および141-157; 配列番号222の23-39, 45-73, 86-103, 107-115, 125-132, 137-146, 148-158, 160-168, 172-179, 185-192, 200-207, 210-224, 233-239, 246-255, 285-334, 338-352, 355-379, 383-389, 408-417, 423-429, 446-456, 460-473, 478-503, 522-540, 553-562, 568-577, 596-602, 620-636, 640-649, 655-663および433-440, 572-593; 配列番号223の4-42, 46-58, 64-76, 118-124, 130-137, 148-156, 164-169, 175-182, 187-194, 203-218, 220-227, 241-246, 254-259, 264-270, 275-289, 296-305, 309-314, 322-334, 342-354, 398-405, 419-426, 432-443, 462-475, 522-530, 552-567, 593-607, 618-634, 636-647, 653-658, 662-670, 681-695, 698-707, 709-720, 732-742, 767-792, 794-822, 828-842, 851-866, 881-890, 895-903, 928-934, 940-963, 978-986, 1003-1025, 1027-1043, 1058-1075, 1080-1087, 1095-1109, 1116-1122, 1133-1138, 1168-1174, 1179-1186, 1207-1214, 1248-1267および17-319, 417-563; 配列番号224の6-19, 23-33, 129-138, 140-150, 153-184, 190-198, 206-219, 235-245, 267-275, 284-289, 303-310, 322-328, 354-404, 407-413, 423-446, 453-462, 467-481, 491-500および46-187; 配列番号225の4-34, 39-57, 78-86, 106-116, 141-151, 156-162, 165-172, 213-237, 252-260, 262-268, 272-279, 296-307, 332-338, 397-403, 406-416, 431-446, 448-453, 464-470, 503-515, 519-525, 534-540, 551-563, 578-593, 646-668, 693-699, 703-719, 738-744, 748-759, 771-777, 807-813, 840-847, 870-876, 897-903, 910-925, 967-976, 979-992および21-244, 381-499, 818-959; 配列番号226の19-29, 65-75, 90-109, 111-137, 155-165, 169-175および118-136; 配列番号227の15-20, 30-36, 55-63, 73-79, 90-117, 120-127, 136-149, 166-188, 195-203, 211-223, 242-255, 264-269, 281-287, 325-330, 334-341, 348-366, 395-408, 423-429, 436-444, 452-465および147-155; 配列番号228の11-18, 21-53, 77-83, 91-98, 109-119, 142-163, 173-181, 193-208, 216-227, 238-255, 261-268, 274-286, 290-297, 308-315, 326-332, 352-359, 377-395, 399-406, 418-426, 428-438, 442-448, 458-465, 473-482, 488-499, 514-524, 543-553, 564-600, 623-632, 647-654, 660-669, 672-678, 710-723, 739-749, 787-793, 820-828, 838-860, 889-895, 901-907, 924-939, 956-962, 969-976, 991-999, 1012-1018, 1024-1029, 1035-1072, 1078-1091, 1142-1161および74-438; 配列番号229の4-31, 41-52, 58-63, 65-73, 83-88, 102-117, 123-130, 150-172, 177-195, 207-217, 222-235, 247-253, 295-305, 315-328, 335-342, 359-365, 389-394, 404-413および156-420; 配列番号230の4-42, 56-69, 98-108, 120-125, 210-216, 225-231, 276-285, 304-310, 313-318, 322-343および79-348; 配列番号231の12-21, 24-30, 42-50, 61-67, 69-85, 90-97, 110-143, 155-168および53-70; 配列番号232の4-26, 41-54, 71-78, 88-96, 116-127, 140-149, 151-158, 161-175, 190-196, 201-208, 220-226, 240-247, 266-281, 298-305, 308-318, 321-329, 344-353, 370-378, 384-405, 418-426, 429-442, 457-463, 494-505, 514-522および183-341; 配列番号233の4-27, 69-77, 79-101, 117-123, 126-142, 155-161, 171-186, 200-206, 213-231, 233-244, 258-263, 269-275, 315-331, 337-346, 349-372, 376-381, 401-410, 424-445, 447-455, 463-470, 478-484, 520-536, 546-555, 558-569, 580-597, 603-618, 628-638, 648-660, 668-683, 717-723, 765-771, 781-788, 792-806, 812-822および92-231, 618-757; 配列番号234の11-47, 63-75, 108-117, 119-128, 133-143, 171-185, 190-196, 226-232, 257-264, 278-283, 297-309, 332-338, 341-346, 351-358, 362-372および41-170; 配列番号235の6-26, 50-56, 83-89, 108-114, 123-131, 172-181, 194-200, 221-238, 241-259, 263-271, 284-292, 304-319, 321-335, 353-358, 384-391, 408-417, 424-430, 442-448, 459-466, 487-500, 514-528, 541-556, 572-578, 595-601, 605-613, 620-631, 634-648, 660-679, 686-693, 702-708, 716-725, 730-735, 749-755, 770-777, 805-811, 831-837, 843-851, 854-860, 863-869, 895-901, 904-914, 922-929, 933-938, 947-952, 956-963, 1000-1005, 1008-1014, 1021-1030, 1131-1137, 1154-1164, 1166-1174および20-487, 757-1153; 配列番号236の10-34, 67-78, 131-146, 160-175, 189-194, 201-214, 239-250, 265-271, 296-305および26-74, 91-100, 105-303; 配列番号237の9-15, 19-32, 109-122, 143-150, 171-180, 186-191, 209-217, 223-229, 260-273, 302-315, 340-346, 353-359, 377-383, 389-406, 420-426, 460-480および10-223, 231-251, 264-297, 312-336; 配列番号238の5-28, 76-81, 180-195, 203-209, 211-219, 227-234, 242-252, 271-282, 317-325, 350-356, 358-364, 394-400, 405-413, 417-424, 430-436, 443-449, 462-482, 488-498, 503-509, 525-537および22-344; 配列番号239の5-28, 42-54, 77-83, 86-93, 98-104, 120-127, 145-159, 166-176, 181-187, 189-197, 213-218, 230-237, 263-271, 285-291, 299-305, 326-346, 368-375, 390-395および1-151;
配列番号240の6-34, 48-55, 58-64, 84-101, 121-127, 143-149, 153-159, 163-170, 173-181, 216-225, 227-240, 248-254, 275-290, 349-364, 375-410, 412-418, 432-438, 445-451, 465-475, 488-496, 505-515, 558-564, 571-579, 585-595, 604-613, 626-643, 652-659, 677-686, 688-696, 702-709, 731-747, 777-795, 820-828, 836-842, 845-856, 863-868, 874-882, 900-909, 926-943, 961-976, 980-986, 992-998, 1022-1034, 1044-1074, 1085-1096, 1101-1112, 1117-1123, 1130-1147, 1181-1187, 1204-1211, 1213-1223, 1226-1239, 1242-1249, 1265-1271, 1273-1293, 1300-1308, 1361-1367, 1378-1384, 1395-1406, 1420-1428, 1439-1446, 1454-1460, 1477-1487, 1509-1520, 1526-1536, 1557-1574, 1585-1596, 1605-1617, 1621-1627, 1631-1637, 1648-1654, 1675-1689, 1692-1698, 1700-1706, 1712-1719, 1743-1756および91-263; 配列番号241の4-16, 75-90, 101-136, 138-144, 158-164, 171-177, 191-201, 214-222, 231-241, 284-290, 297-305, 311-321, 330-339, 352-369, 378-385, 403-412, 414-422, 428-435, 457-473, 503-521, 546-554, 562-568, 571-582, 589-594, 600-608, 626-635, 652-669, 687-702, 706-712, 718-724, 748-760, 770-775および261-272; 配列番号242の4-19, 30-41, 46-57, 62-68, 75-92, 126-132, 149-156, 158-168, 171-184, 187-194, 210-216, 218-238, 245-253, 306-312, 323-329, 340-351, 365-373, 384-391, 399-405, 422-432, 454-465, 471-481, 502-519, 530-541, 550-562, 566-572, 576-582, 593-599, 620-634, 637-643, 645-651, 657-664, 688-701および541-551; 配列番号243の6-11, 17-25, 53-58, 80-86, 91-99, 101-113, 123-131, 162-169, 181-188, 199-231, 245-252および84-254; 配列番号244の13-30, 71-120, 125-137, 139-145, 184-199および61-78; 配列番号245の9-30, 38-53, 63-70, 74-97, 103-150, 158-175, 183-217, 225-253, 260-268, 272-286, 290-341, 352-428, 434-450, 453-460, 469-478, 513-525, 527-534, 554-563, 586-600, 602-610, 624-640, 656-684, 707-729, 735-749, 757-763, 766-772, 779-788, 799-805, 807-815, 819-826, 831-855および568-580; 配列番号246の11-21, 29-38および5-17; 配列番号247の2-9; 配列番号248の4-10, 16-28および7-18, 26-34; 配列番号249の10-16および1-15; 配列番号250の4-11; 配列番号251の4-40, 42-51および37-53; 配列番号252の4-21および22-29; 配列番号253の2-11; 配列番号254の9-17, 32-44および1-22; 配列番号255の19-25, 27-32および15-34; 配列番号256の4-12, 15-22および11-33; 配列番号257の10-17, 24-30, 39-46, 51-70および51-61; 配列番号258の6-19; 配列番号259の6-11, 21-27, 31-54および11-29; 配列番号260の4-10, 13-45および11-35; 配列番号261の4-14, 23-32および11-35; 配列番号262の14-39, 45-51および15-29; 配列番号263の4-11, 14-28および4-17; 配列番号264の4-16および2-16; 配列番号265の4-10, 12-19, 39-50および6-22; 配列番号266の2-13; 配列番号267の4-11, 22-65および3-19; 配列番号268の17-23, 30-35, 39-46, 57-62および30-49; 配列番号269の4-19および14-22; 配列番号270の2-9; 配列番号271の7-18, 30-43および4-12; 配列番号272の4-30, 39-47および5-22; 配列番号273の6-15および14-29; 配列番号274の4-34および23-35; 配列番号275の4-36, 44-57, 65-72および14-27; 配列番号276の4-18および11-20; 配列番号277の5-19; 配列番号278の18-36および6-20; 配列番号279の4-10, 19-34, 41-84, 96-104および50-63; 配列番号280の4-9, 19-27および8-21; 配列番号281の4-16, 18-28および22-30; 配列番号282の4-15および21-35; 配列番号283の4-17および3-13; 配列番号284の4-12および4-18; 配列番号285の4-24, 31-36および29-45; 配列番号286の12-22, 34-49および21-32; 配列番号287の4-17および22-32; 配列番号288の4-16, 25-42および7-28; 配列番号289の4-10および7-20; 配列番号290の4-11, 16-36, 39-54および28-44; 配列番号291の5-20, 29-54および14-29; 配列番号292の24-33および10-22; 配列番号293の10-51, 54-61および43-64; 配列番号294の7-1および2-17; 配列番号295の11-20および6-20; 配列番号296の4-30, 34-41および19-28; 配列番号297の11-21; 配列番号298の4-16, 21-26および9-38; 配列番号299の4-12, 15-27, 30-42, 66-72および10-24; 配列番号300の8-17および11-20;および配列番号246の2-19; 配列番号247の1-12; 配列番号248の21-38; 配列番号254の2-22; 配列番号255の15-33; 配列番号256の11-32; 配列番号259の11-28; 配列番号260の10-27; 配列番号261の9-26; 配列番号263の4-16; 配列番号266の1-18; 配列番号273の12-29; 配列番号276の6-23; 配列番号277の1-21; 配列番号279の47-64; 配列番号285の28-45; 配列番号287の18-35; 配列番号291の14-31; 配列番号292の7-24; 配列番号299の8-25; 配列番号300の1-20; 配列番号151の18-33; 配列番号151の62-72; 配列番号152の118-131; 配列番号154の195-220; 配列番号154の215-240; 配列番号154の255-280, 配列番号155の72-81; 配列番号156の174-186; 配列番号157の317-331; 配列番号158の35-59; 配列番号158の54-84; 配列番号158の79-104; 配列番号159の33-58; 配列番号159の81-101; 配列番号159の136-150; 配列番号159の173-186; 配列番号159の231-251; 配列番号161の22-48; 配列番号162の24-39; 配列番号163の475-489; 配列番号164の38-56; 配列番号164の583-604; 配列番号165の202-223; 配列番号165の222-247; 配列番号165の242-267; 配列番号165の262-287; 配列番号165の282-307; 配列番号165の302-327; 配列番号166の25-48; 配列番号167の204-217; 配列番号168の259-276; 配列番号169の121-139; 配列番号169の260-267; 配列番号169の215-240; 配列番号170の115-140; 配列番号172の182-204; 配列番号173の144-153; 配列番号173の205-219; 配列番号174の196-206; 配列番号174の240-249; 配列番号174の272-287; 配列番号174の199-223; 配列番号174の218-237; 配列番号175の226-249; 配列番号175の287-306; 配列番号176の430-449; 配列番号177の361-375; 配列番号178の241-260; 配列番号181の483-502; 配列番号182の379-396; 配列番号184の31-51; 配列番号186の1436-1460; 配列番号186の1455-1474; 配列番号186の1469-1487; 配列番号187の215-229; 配列番号187の534-561; 配列番号187の59-84; 配列番号187の79-104; 配列番号188の618-635; 配列番号189の191-203; 配列番号190の386-398; 配列番号191の65-83; 配列番号192の90-105; 配列番号192の112-136; 配列番号193の290-209; 配列番号194の33-50; 配列番号195の76-90; 配列番号196の70-88; 配列番号197の418-442; 配列番号197の574-585; 配列番号198の87-104; 配列番号198の124-148; 配列番号198の141-152; 配列番号199の241-248; 配列番号200の183-198; 配列番号201の40-57; 配列番号202の202-217; 配列番号203の50-74; 配列番号203の69-93; 配列番号203の88-112; 配列番号203の107-127; 配列番号205の74-92; 配列番号206の207-232; 配列番号206の227-252; 配列番号206の247-272; 配列番号207の47-60; 配列番号207の297-305; 配列番号207の312-337; 配列番号208の667-384; 配列番号210の279-295; 配列番号211の179-198; 配列番号213の27-51; 配列番号213の46-70; 配列番号213の65-89; 配列番号213の84-108; 配列番号213の112-141; 配列番号215の248-260; 配列番号216の59-78; 配列番号218の154-170; 配列番号219の57-73; 配列番号220の297-314; 配列番号221の142-157; 配列番号222の428-447; 配列番号222の573-593; 配列番号223の523-544; 配列番号223の46-70; 配列番号223の65-89; 配列番号223の84-108; 配列番号223の122-151; 配列番号224の123-142; 配列番号225の903-921; 配列番号226の119-136; 配列番号227の142-161; 配列番号228の258-277; 配列番号228の272-300; 配列番号228の295-322; 配列番号229の311-343; 配列番号229の278-304; 配列番号230の131-150; 配列番号230の195-218; 配列番号231の53-70; 配列番号232の184-208; 配列番号232の222-246; 配列番号232の241-265; 配列番号232の260-284; 配列番号232の279-303; 配列番号232の317-341; 配列番号233の678-696; 配列番号235の88-114; 配列番号235の464-481; 配列番号236の153-172; 配列番号236の137-155, 166-184; 配列番号236の215-228; 配列番号237の37-51; 配列番号237の53-75; 配列番号237の232-251; 配列番号237の318-336; 配列番号238の305-315; 配列番号238の131-156; 配列番号241の258-275; 配列番号243の107-137; 配列番号243の138-162; 配列番号243の157-181; 配列番号243の195-227; 配列番号244の62-7; 配列番号245の567-584を含むペプチドよりなる群から選ばれた高度免疫血清反応性の抗原の断片。 - 請求項1〜7のいずれかに記載の核酸分子を発現させることを含む、請求項11〜14のいずれかに記載のストレプトコッカス・ピオゲネスの高度免疫血清反応性の抗原またはその断片の製造方法。
- 請求項8または9に記載のベクターで適当な宿主細胞を形質転換またはトランスフェクションすることを含む、請求項11〜14のいずれかに記載のストレプトコッカス・ピオゲネスの高度免疫血清反応性の抗原またはその断片を発現する細胞の製造方法。
- 請求項11〜14のいずれかの高度免疫血清反応性の抗原またはその断片または請求項1〜7のいずれかに記載の核酸分子を含む医薬組成物、とりわけワクチン。
- さらに、ポリカチオン性ポリマー、とりわけポリカチオン性ペプチド、免疫促進デオキシヌクレオチド(ODN)、少なくとも2つのLysLeuLysモチーフを含むペプチド、神経刺激性の化合物、とりわけヒト成長ホルモン、ミョウバン、フロイントの完全または不完全アジュバントまたはこれらの組合せよりなる群から好ましくは選ばれる免疫促進物質をさらに含む、請求項17に記載の医薬組成物、とりわけワクチン。
- 医薬製剤の製造のための、とりわけストレプトコッカス・ピオゲネス感染に対するワクチンの製造のための、請求項1〜7のいずれかに記載の核酸分子または請求項11〜14のいずれかに記載の高度免疫血清反応性の抗原またはその断片の使用。
- 請求項11〜14のいずれかに記載の高度免疫血清反応性の抗原またはその断片の少なくとも選択された部分に結合する抗体、または少なくとも有効なその部分。
- モノクローナル抗体である、請求項20に記載の抗体。
- 抗体の有効な部分がFabフラグメントを含む、請求項20または21に記載の抗体。
- キメラ抗体である、請求項20〜22のいずれかに記載の抗体。
- ヒト化抗体である、請求項20〜23のいずれかに記載の抗体。
- 請求項20〜24のいずれかに記載の抗体を産生するハイブリドーマ細胞株。
- 以下の工程:
・請求項11〜14のいずれかに記載の高度免疫血清反応性の抗原またはその断片を非ヒト動物に投与することにより該動物において免疫応答を開始させ、
・該動物から抗体含有体液を取り出し、ついで
・該抗体含有体液をさらなる精製工程に供することにより該抗体を製造する
ことを特徴とする、請求項20に記載の抗体の製造方法。 - 以下の工程:
・請求項12〜15のいずれかに記載の高度免疫血清反応性の抗原またはその断片を非ヒト動物に投与することにより該動物において免疫応答を開始させ、
・該動物から脾臓または脾細胞を取り出し、
・該脾臓または脾細胞のハイブリドーマ細胞を産生させ、
・該高度免疫血清反応性の抗原またはその断片に特異的なハイブリドーマ細胞を選択およびクローニングし、
・該クローニングしたハイブリドーマ細胞の培養により抗体を産生させ、および任意にさらなる精製工程を行う
ことを特徴とする、請求項20に記載の抗体の製造方法。 - ストレプトコッカス・ピオゲネス感染の治療用医薬の製造のための、請求項20〜24のいずれかに記載の抗体の使用。
- 請求項11〜14のいずれかに記載の高度免疫血清反応性の抗原またはその断片に結合するアンタゴニスト。
- 請求項11〜14のいずれかに記載の高度免疫血清反応性の抗原またはその断片に結合しうるアンタゴニストの同定方法であって、以下の工程:
(a)請求項11〜14のいずれかに記載の単離したまたは固定化した高度免疫血清反応性の抗原またはその断片を候補アンタゴニストと、該候補アンタゴニストの該高度免疫血清反応性の抗原またはその断片への結合に応答して検出可能なシグナルを提供することのできる成分の存在下、該候補アンタゴニストの該高度免疫血清反応性の抗原またはその断片への結合を可能にする条件下で接触させ、ついで
(b)該アンタゴニストの該高度免疫血清反応性の抗原またはその断片への結合に応答して生成されるシグナルの存在または不在を検出する
ことを含む方法。 - 請求項11〜14のいずれかに記載の高度免疫血清反応性の抗原またはその断片のその相互作用パートナーへの相互作用活性を低減または抑制しうるアンタゴニストの同定方法であって、以下の工程:
(a)請求項11〜14のいずれかに記載の高度免疫血清反応性の抗原またはその高度免疫血断片を用意し、
(b)該高度免疫血清反応性の抗原またはその断片に対する相互作用パートナー、とりわけ請求項20〜24のいずれかに記載の抗体を用意し、
(c)該高度免疫血清反応性の抗原またはその断片を該相互作用パートナーと相互作用させて相互作用複合体を生成させ、
(d)候補アンタゴニストを用意し、
(e)該候補アンタゴニストと該相互作用複合体との間で競合反応を起こさせ、
(f)該候補アンタゴニストが該高度免疫血清反応性の抗原またはその断片と該相互作用パートナーとの相互作用活性を低減または抑制するか否かを決定する
ことを含む方法。 - 請求項11〜14のいずれかに記載の高度免疫血清反応性の抗原またはその断片の相互作用パートナーの単離および/または精製および/または同定のための、請求項11〜14のいずれかに記載の高度免疫血清反応性の抗原またはその断片の使用。
- 請求項11〜14のいずれかに記載の高度免疫血清反応性の抗原またはその断片の発現に関連する疾患をインビトロで診断する方法であって、請求項1〜7のいずれかに記載の高度免疫血清反応性の抗原および断片をコードする核酸配列の存在または請求項11〜14のいずれかに記載の高度免疫血清反応性の抗原またはその断片の存在を検出することを含む方法。
- 細菌感染、とりわけストレプトコッカス・ピオゲネス感染をインビトロで診断する方法であって、請求項1〜7のいずれかに記載の該高度免疫血清反応性の抗原および断片をコードする核酸配列の存在または請求項11〜14のいずれかに記載の高度免疫血清反応性の抗原またはその断片の存在を検出することを含む方法。
- 請求項11〜14のいずれかに記載の高度免疫血清反応性の抗原またはその断片へのペプチド結合を生成するための、請求項11〜14のいずれかに記載の高度免疫血清反応性の抗原またはその断片の使用であって、該ペプチドがアンチカリンであることを特徴とする使用。
- 機能性の核酸を製造するための、請求項11〜14のいずれかに記載の高度免疫血清反応性の抗原またはその断片の使用であって、該機能性核酸がアプタマーおよびシュピーゲルマーよりなる群から選ばれることを特徴とする使用。
- 機能性のリボ核酸分子を製造するための、請求項11〜14のいずれかに記載の核酸の使用であって、該機能性のリボ核酸が、リボザイム、アンチセンス核酸およびsiRNAよりなる群から選ばれることを特徴とする使用。
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