ES2330334T3

ES2330334T3 - Antigenos de streptococcus pyogenes.

Info

Publication number: ES2330334T3
Application number: ES04716233T
Authority: ES
Inventors: Andreas Meinke; Eszter Nagy; Birgit Winkler; Dieter Gelbmann
Original assignee: Intercell Austria AG
Current assignee: Valneva Austria GmbH
Priority date: 2003-03-04
Filing date: 2004-03-02
Publication date: 2009-12-09
Anticipated expiration: 2024-03-02
Also published as: WO2004078907A2; DE602004022923D1; CA2517518A1; DK1601770T3; EP2287311A1; EP2287313A1; US20130122047A1; EP2287312A1; HK1084977A1; CY1109683T1; SI1601770T1; EP1601770A2; PT1601770E; JP2006520202A; EP2287315A1; AU2009230772A1; EP2287314A1; US20060194751A1; EP2053125B1; US20100255034A1

Abstract

Una vacuna que comprende un fragmento antigénico del antígeno reactivo en suero hiperinmune de Sec. ID Nº 215, seleccionado del grupo constituido por péptidos que comprenden las secuencias de aminoácidos 31-345 ó 247- 260 de Sec. ID Nº 215 ó derivados que comprenden la secuencia de aminoácidos 37-345 de Sec. ID Nº 215 con 1 a 10 sustituciones, deleciones o adiciones de aminoácidos, en cualquier combinación.

Description

Antígenos de Streptococcus pyogenes.

La presente invención se refiere a moléculas de ácido nucleico aisladas, que codifican antígenos para Streptococcus pyogenes, que son adecuados para uso en la preparación de medicamentos farmacéuticos para la prevención y el tratamiento de las infecciones bacterianas causadas por Streptococcus pyogenes.

El Streptococcus pyogenes, también llamado estreptococo grupo A (GAS), es un importante patógeno bacteriano extracelular gram positivo e infecta comúnmente a los seres humanos. Los GAS colonizan la garganta o la piel y son responsables de una serie de infecciones supurativas y de secuelas no supurativas. Es principalmente una enfermedad de los niños y causa una diversidad de infecciones, incluidas la faringitis bacteriana, la escarlatina, el impétigo y la sepsis en los seres humanos. Décadas de estudios epidemiológicos han dado lugar al concepto de cepas características de la garganta y de la piel, donde ciertos serotipos con frecuencia están asociados con infecciones de la garganta o de la piel, respectivamente {Cunningham, M., 2000}. Se ha descubierto que los GAS son responsables del síndrome del choque tóxico estreptocócico asociado a la fascitis necrotizante que últimamente ha resurgido en los EEUU {Cone, L. y col., 1987; Stevens, D., 1992} y se ha descrito como la bacteria "comedora de carne" que invade la piel y los tejidos blandos dando como resultado la destrucción de los tejidos o de los miembros.

Pueden presentarse varias secuelas postestreptocócicas en los seres humanos posteriores a la infección, tales como la fiebre reumática aguda, la glomerulonefritis aguda y la artritis reactiva. De éstas, la fiebre reumática aguda y la enfermedad reumática cardiaca son las secuelas autoinmunes más graves y han dado lugar a incapacidad y muerte de niños en todo el mundo. S. pyogenes puede también causar enfermedades agudas graves tales como la escarlatina y la fascitis necrotizante y se ha asociado con el síndrome de Tourette, tics y trastornos del movimiento y de la atención.

Los estreptococos del grupo A son la causa bacteriana más común del dolor de garganta y la faringitis y explican al menos el 16% de todas las visitas de consulta en una práctica médica general, dependiente de la estación {Hope-Simpson, R., 1981}. Afecta principalmente a niños en edad escolar de entre 5 y 15 años de edad {Cunningham, M., 2000}. Todas las edades son susceptibles de propagar el organismo bajo condiciones de hacinamiento, por ejemplo en las escuelas. Los GAS no se consideran flora normal, aunque la portación faríngea de estreptococos del grupo A puede tener lugar sin síntomas clínicos.

Los estreptococos del grupo A pueden identificarse por el esquema de clasificación de Lancefield de tipificación serológica basado en sus hidratos de carbono o pueden clasificarse en serotipos de la proteína M en base a una proteína de superficie que puede extraerse hirviendo las bacterias con ácido clorhídrico. Esto ha dado lugar a la identificación de más de 80 serotipos, que pueden también tipificarse por medio de un enfoque molecular (genes emm). Ciertos serotipos de proteína M del S. pyogenes están asociados principalmente con la faringitis y la fiebre reumática, mientras que otros parece causar principalmente la piodermia y la glomerulonefritis aguda {Cunningham, M., 2000}.

También están implicados como causa de faringitis y ocasionalmente choque tóxico los estreptococos de los grupos C y G, que deben identificarse después del cultivo de garganta {Hope-Simpson, R., 1981; Bisno, A. y col., 1987}.

Actualmente, las infecciones estreptocócicas sólo pueden tratarse por medio de terapia con antibióticos. Sin embargo, el 25-30% de los tratados con antibióticos muestran enfermedad recurrente y/o emiten el organismo en las secreciones mucosas. En la actualidad no hay tratamiento preventivo (vacuna) disponible para evitar las infecciones estreptocócicas.

Por consiguiente, sigue existiendo la necesidad de un tratamiento eficaz para prevenir o aliviar las infecciones estreptocócicas. Una vacuna no sólo podría prevenir las infecciones por estreptococos, sino más específicamente podría prevenir o aliviar la colonización de los tejidos del huésped, reduciendo de este modo la incidencia de faringitis y de otras infecciones supurativas. La eliminación de las secuelas no supurativas, tales como la fiebre reumática, la glomerulonefritis aguda, la sepsis, el choque tóxico y la fascitis necrotizante, sería una consecuencia directa de reducir la incidencia de la infección aguda y la portación del organismo. Las vacunas capaces de demostrar protección cruzada contra otros estreptococos también serían útiles para prevenir o aliviar las infecciones causadas por todas las otras especies de estreptococos beta hemolíticos, a saber, los grupos A, B, C y G.

Una vacuna puede contener una completa diversidad de antígenos diferentes. Los ejemplos de antígenos son los organismos completos, atenuados o muertos, subfracciones de estos organismos/tejidos, proteínas, o, en su forma simple más simple, péptidos. Los antígenos pueden también ser reconocidos por el sistema inmune en la forma de proteínas o péptidos glicosilados y pueden también ser o contener polisacáridos o lípidos. Pueden usarse péptidos cortos ya que, por ejemplo, las células T citotóxicas (CTL) reconocen los antígenos en la forma de péptidos cortos, usualmente de 8-11 aminoácidos de longitud conjuntamente con el complejo principal de histocompatibilidad (MHC). Las células B pueden reconocer epítopos lineales tan cortos como 4-5 aminoácidos, así como estructuras tridimensionales (epítopos conformacionales). Para obtener respuestas inmunes sostenidas, específicas de antígeno, los adyuvantes necesitan disparar las cascadas inmunes que implican a todas las células del sistema inmune necesario. Principalmente, los adyuvantes actúan, pero no están restringidos en su modo de acción, en las denominadas células presentadoras de antígeno (APC). Usualmente estas células primero encuentran el(los) antígeno(s) y a continuación sigue la presentación del antígeno procesado o sin modificar a las células efectoras inmunes. También pueden estar implicados tipos de células intermedias. Solamente las células efectoras con la especificidad adecuada se activan en una respuesta inmune productiva. El adyuvante puede también retener localmente los antígenos y otros factores inyectados conjuntamente. Además, el adyuvante puede también actuar como quimiotáctico para otras células inmunes o puede actuar localmente y/o sistémicamente como agente estimulador para el sistema inmune.

Los enfoques para desarrollar una vacuna estreptocócica del grupo A se han centrado principalmente en la proteína M de la superficie celular del S. pyogenes {Bessen, D. y col., 1988; Bronze, M. y col., 1988}. Puesto que existen más de 80 diferentes serotipos M de S. pyogenes y continuamente surgen nuevos serotipos {Fischetti, V., 1989}, la inoculación con una cantidad limitada de proteína M específica de serotipo o péptidos derivados de la proteína M probablemente no será eficaz para proteger contra todos los otros serotipos M. Además, se ha mostrado que la proteína M contiene una secuencia de aminoácidos, que tiene reactividad inmunológicamente cruzada con el tejido cardiaco humano, que se cree que explica el daño de las válvulas cardiacas asociado con la fiebre reumática {Fenderson, P. y col., 1989}.

Hay otras proteínas bajo consideración para el desarrollo de vacunas, tales como las toxinas eritrogénicas, la exotoxina pirogénica estreptocócica A y la exotoxina pirogénica estreptocócica B {Lee, P. K., 1989}. La inmunidad para estas toxinas podría evitar posiblemente los síntomas mortales del choque tóxico estreptocócico, pero no podría evitar la colonización por los estreptococos del grupo A.

El documento WO 02/34771 A2 divulga un sondeo genómico de ácidos nucleicos y proteínas de los grupos A y B de Streptococcus.

Ferretti y col. (PNAS 98(8) (2001): 4658-4663) describen la secuencia genómica completa de una cepa M1 de Streptococcus pyogenes.

Smoot y col. (PNAS 99(7) (2002): 4668-4673) describen la secuencia del genoma del serotipo M18 de cepas del grupo A de Streptococcus.

Beres y col. (PNAS 99(15) (2002): 10078-10083) describen la secuencia del genoma de la cepa del serotipo M3 del Streptococcus grupo A.

El uso de las proteínas descritas anteriormente como antígenos para una vacuna potencial así como una serie de otros candidatos {Ji, Y. y col., 1997; Guzman, C. y col., 1999} resultó principalmente de una selección basada en la facilidad de identificación o en la posibilidad de disponibilidad. Existe una demanda para identificar los antígenos eficaces y relevantes para S. pyogenes.

Los autores de la presente invención han desarrollado un procedimiento para la identificación, el aislamiento y la producción de antígenos reactivos a sueros hiperinmunes de un patógeno específico, especialmente de Staphylococcus aureus y Staphylococcus epidermidis (documento WO 02/059148). Sin embargo, dadas las diferencias en la propiedad biológica, la función patógena y el antecedente genético, Streptococcus pyogenes puede distinguirse de las cepas de Staphylococcus. Es importante destacar que la selección de sueros para la identificación de antígenos de S. pyogenes es diferente de la utilizada para las selecciones de S. aureus. Se recogieron tres tipos principales de suero humano para ese objeto. Primero, se realizaron pruebas para identificar portadores de S. pyogenes en nasofaringe en adultos sanos de menos de 45 años de edad, de preferencia con niños pequeños en el hogar. Un gran porcentaje niños pequeños son portadores de S. pyogenes, y se los considera una fuente de exposición para los miembros de sus familias. En base a datos correlativos, es probable que los anticuerpos protectores (neutralizadores de la colonización) estén presentes en los individuos expuestos (niños con elevada tasa de portación en el hogar) que no son portadores de S. pyogenes. Para ser capaz de seleccionar las fuentes de suero relevantes, se realizó una serie de ensayos de ELISA que miden los niveles de anticuerpos IgG e IgA anti S. pyogenes con lisados bacterianos y proteínas del sobrenadante de los cultivos. Los sueros de los no portadores con valor elevado se incluyeron en la identificación de antígenos basada en el genoma. Este enfoque para la selección de sueros humanos es básicamente muy diferente de la utilizada para S. aureus, donde el estado de portador o no portador no puede asociarse con los niveles de anticuerpos.

En segundo lugar, las muestras de suero de pacientes con faringitis se caracterizaron y seleccionaron de la misma manera. El tercer grupo de muestras de suero obtenidas de individuos con secuelas postestreptocócicas - tales como fiebre reumática aguda y glomerulonefritis - se usó principalmente para el objeto de la validación. Este último grupo ayuda en la exclusión de los epítopos, que inducen altos niveles de anticuerpos en estos pacientes, puesto que la enfermedad postestreptocócica está asociada con anticuerpos inducidos por GAS y reactivos contra los tejidos humanos, tales como el músculo cardiaco, o están implicados en la formación de complejos inmunes perjudiciales en los glomérulos del riñón. Los genomas de las dos especies bacterianas S. pyogenes y S. aureus por sí mismos muestra una serie de diferencias importantes. El genoma de S. pyogenes contiene aproximadamente 1,85 Mb, mientras que S. aureus lleva 2,85 Mb. Tienen un contenido promedio de GC de 38,5 y 33%, respectivamente y aproximadamente del 30 al 45% de los genes codificados no se comparten entre los dos patógenos. Además, las dos especies bacterianas requieren diferentes condiciones de crecimiento y medio para la propagación. Mientras que S. pyogenes es un patógeno estrictamente humano, S. aureus puede encontrarse también infectando una variedad de animales de sangre caliente. A continuación se presenta una lista de las enfermedades más importantes, que pueden causar los dos patógenos. S. aureus causa principalmente infecciones hospitalarias, oportunistas: impétigo, foliculitis, abscesos, diviesos, laceraciones infectadas, endocarditis, meningitis, artritis séptica, neumonía, osteomielitis, el síndrome de la piel escaldada (SSS), el síndrome del choque tóxico. S. pyogenes causa principalmente infecciones adquiridas de la comunidad: dolor de garganta estreptocócico (fiebre, tonsilitis exudativa, faringitis), infecciones estreptocócicas de la piel, escarlatina, fiebre puerperal, septicemia, erisipelas, celulitis perianal, mastoiditis, otitis media, neumonía, peritonitis, infecciones de heridas, glomerulonefritis aguda, fiebre reumática aguda; síndrome análogo al choque tóxico, fascitis necrotizante.

El problema subyacente de la presente invención era proporcionar los medios para desarrollar medicamentos tales como vacunas contra la infección por S. pyogenes. Más particularmente, el problema era proporcionar una serie eficaz, relevante y completa de moléculas de ácido nucleico o de antígenos reactivos a sueros hiperinmunes de S. pyogenes que puedan usarse para la fabricación de dichos medicamentos.

Por consiguiente, la presente invención proporciona una vacuna que comprende un fragmento antigénico del antígeno reactivo en suero hiperinmune de Sec. ID Nº 215, seleccionado del grupo constituido por péptidos que comprenden las secuencias de aminoácidos 31-345 ó 247-260 de Sec. ID Nº 215 o derivados que comprenden la secuencia de aminoácidos 31-345 de Sec. ID Nº 215 con 1 a 10 sustituciones, deleciones o adiciones de aminoácidos, en cualquier combinación.

Según una forma de realización de preferencia de la presente invención, los péptidos comprenden los aminoácidos 31-345 ó 247-260 de Sec. ID Nº 215. Aún de más preferencia los péptidos están constituidos por una secuencia de aminoácidos 31-345 ó 247-260 de Sec. ID Nº 215. En formas de realización particularmente de preferencia los fragmentos están constituidos por los aminoácidos 31-345 ó 247-260 de Sec. ID Nº 215 y una secuencia líder o secretora, una secuencia utilizada para la purificación o una secuencia de proproteína.

Puede producirse un antígeno reactivo en suero hiperinmune de S. pyogenes o uno de sus fragmentos expresando una o más de las moléculas de ácido nucleico divulgadas en el presente documento en un sistema de expresión adecuado.

Además, se divulga un proceso para producir una célula, que expresa un antígeno reactivo en suero hiperinmune de S. pyogenes o uno de sus fragmentos que comprende transformar o transfectar una célula adecuada con el vector.

En una forma de realización de preferencia, la vacuna comprende además una sustancia inmunoestimuladora, de preferencia seleccionada del grupo constituido por polímeros policatiónicos, en especial péptidos policatiónicos, desoxinucleótidos (ODN) inmunoestimuladores, péptidos que contienen al menos dos motivos LysLeuLys, en especial KLKLSKLK, compuestos neuroactivos, en especial la hormona de crecimiento humana, alumbre, adyuvante completo o incompleto de Freund o sus combinaciones.

En una forma de realización de más preferencia, la sustancia inmunoestimuladora es una combinación de un polímero policatiónico y desoxinucleótidos inmunoestimuladores o de un péptido que contiene al menos dos motivos LysLeuLys y desoxinucleótidos inmunoestimuladores.

En una forma de realización aún de más preferencia, el polímero policatiónico es un péptido policatiónico, en especial poliarginina.

Según la presente invención, se proporciona el uso de una molécula de ácido nucleico que codifica un fragmento antigénico de la invención o el uso de un fragmento antigénico según la presente invención para la fabricación de una preparación farmacéutica, en especial para la fabricación de una vacuna contra la infección por S. pyogenes.

También se proporciona en el presente documento una vacuna que comprende un anticuerpo, o al menos una parte eficaz del mismo, que se une al menos a una parte selectiva del fragmento antigénico según la presente invención.

En una forma de realización de preferencia, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal.

En otra forma de realización de preferencia, la parte eficaz del anticuerpo comprende los fragmentos Fab.

En otra forma de realización de preferencia, el anticuerpo es un anticuerpo quimérico.

En aún otra forma de realización de preferencia, el anticuerpo es un anticuerpo humanizado.

También se divulga una línea celular de hibridoma, que produce un anticuerpo de la vacuna.

Además, está contemplado un procedimiento para producir un anticuerpo, caracterizado por las siguientes etapas:

\sqbullet: iniciar una respuesta inmune en un animal no humano administrando un antígeno reactivo en suero hiperinmune o uno de sus fragmentos a dicho animal,

\sqbullet: extraer un líquido corporal de dicho animal que contenga el anticuerpo, y

\sqbullet: producir el anticuerpo sometiendo dicho líquido corporal que contiene el anticuerpo a otras etapas de purificación.

\vskip1.000000\baselineskip

Por consiguiente, también se divulga un procedimiento para producir un anticuerpo según la presente invención, caracterizado por las siguientes etapas:

\sqbullet: iniciar una respuesta inmune en un animal no humano administrando un antígeno reactivo en suero hiperinmune o uno de sus fragmentos, según se definen en la presente invención, a dicho animal,

\sqbullet: extraer el bazo o células del bazo de dicho animal,

\sqbullet: producir células de hibridoma de dicho bazo o dichas células del bazo,

\sqbullet: seleccionar y clonar las células del hibridoma específicas para dichos antígenos reactivos en suero hiperinmune o uno de sus fragmentos,

\sqbullet: producir el anticuerpo por medio del cultivo de dichas células de hibridoma clonadas y opcionalmente otras etapas de purificación.

\vskip1.000000\baselineskip

Los anticuerpos proporcionados o producidos según los procedimientos anteriores pueden usarse para la preparación de un medicamento para tratar o prevenir las infecciones por S. pyogenes.

Se divulga un antagonista que se une a un antígeno reactivo en suero hiperinmune o un fragmento del mismo según la presente invención.

Uno de tales antagonistas capaces de unirse a un antígeno reactivo en suero hiperinmune o uno de sus fragmentos puede identificarse por medio de un procedimiento que comprende las siguientes etapas:

a): poner un antígeno reactivo en suero hiperinmune o uno de sus fragmentos inmovilizado o aislado en contacto con un antagonista candidato bajo condiciones que permitan la unión de dicho antagonista candidato a dicho antígeno o fragmento de antígeno reactivo en suero hiperinmune, en presencia de un componente capaz de proporcionar una señal detectable en respuesta a la unión del antagonista candidato a dicho antígeno reactivo en suero hiperinmune o su fragmento; y

b): detectar la presencia o ausencia de una señal generada en respuesta a la unión del antagonista al antígeno reactivo en suero hiperinmune o su fragmento.

\vskip1.000000\baselineskip

Un antagonista capaz de reducir o inhibir la actividad de interacción de un antígeno reactivo en suero hiperinmune o uno de sus fragmentos a su pareja de interacción puede identificarse por medio de un procedimiento que comprende las siguientes etapas:

a): proporcionar un antígeno reactivo en suero hiperinmune o un fragmento hiperinmune del mismo,

b): proporcionar una pareja de interacción para dicho antígeno reactivo en suero hiperinmune o uno de sus fragmentos, en especial un anticuerpo,

c): dejar que se produzca la interacción de dicho antígeno reactivo en suero hiperinmune o su fragmento con dicha pareja de interacción para formar un complejo de interacción,

d): proporcionar un antagonista candidato,

e): dejar que se produzca una reacción de competición entre el antagonista candidato y el complejo de interacción,

f): determinar si el antagonista candidato inhibe o reduce las actividades de interacción del antígeno reactivo en suero hiperinmune o su fragmento con la pareja de interacción.

\vskip1.000000\baselineskip

Los antígenos reactivos en suero hiperinmune o sus fragmentos pueden usarse para el aislamiento y/o la purificación y/o la identificación de una pareja de interacción de dicho antígeno reactivo en suero hiperinmune o su fragmento.

Es posible un proceso para diagnosticar in vitro una enfermedad relacionada con la expresión de un antígeno reactivo en suero hiperinmune o uno de sus fragmentos que comprende determinar la presencia de una secuencia de ácido nucleico que codifica dicho antígeno reactivo en suero hiperinmune y el fragmento o la presencia del antígeno reactivo en suero hiperinmune o su fragmento.

También se divulga un proceso para el diagnóstico in vitro de una infección bacteriana, en especial una infección por S. pyogenes, que comprende analizar la presencia de una secuencia de ácido nucleico que codifica dicho antígeno reactivo en suero hiperinmune y el fragmento o la presencia del antígeno reactivo en suero hiperinmune o su fragmento.

Además, la presente invención divulga el uso de un antígeno reactivo en suero hiperinmune o su fragmento para la generación de un péptido que se une a dicho antígeno reactivo en suero hiperinmune o fragmento del mismo, en el que el péptido es una anticalina.

La presente invención también contempla el uso de un antígeno reactivo en suero hiperinmune o fragmento del mismo para la fabricación de un ácido nucleico funcional, en el que el ácido nucleico funcional se selecciona del grupo constituido por aptámeros y spiegélmeros.

La molécula de ácido nucleico puede usarse también para la fabricación de un ácido ribonucleico funcional, en la que el ácido ribonucleico funcional se selecciona del grupo constituido por ribozimas, ácidos nucleicos antisentido y ARN interferentes pequeños (siRNA).

Está contemplada una serie completa, eficaz y relevante de moléculas de ácido nucleico aisladas y sus antígenos reactivos en suero hiperinmune codificados y sus fragmentos identificados de S. pyogenes usando una preparación de anticuerpos de combinaciones de múltiples plasmas humanos y bibliotecas de expresión de superficie derivadas del genoma de S. pyogenes. Por consiguiente, la presente invención satisface una muy sentida demanda de antígenos de S. pyogenes, vacunas, diagnósticos y productos útiles en procedimientos para preparar anticuerpos para identificar compuestos eficaces contra la infección por S. pyogenes.

Una vacuna eficaz debe estar compuesta por proteínas o polipéptidos, que sean expresados por todas las cepas y sean capaces de inducir abundantes anticuerpos, de elevada afinidad contra los componentes de la superficie celular de S. pyogenes. Los anticuerpos deben ser IgG1 y/o IgG3 para la opsonización, y cualquier subtipo de IgG e IgA para la neutralización de la acción de adhesión y de las toxinas. Una vacuna definida químicamente debe ser definitivamente superior comparada con una vacuna de células completas (atenuadas o muertas), ya que pueden eliminarse los componentes de S. pyogenes, que reaccionan de manera cruzada con los tejidos humanos o inhiben la opsonización {Whitnack, E. y col., 1985}, y pueden seleccionarse las proteínas individuales que inducen anticuerpos protectores y/o una respuesta inmune protectora.

El enfoque, que se ha utilizado para la presente invención, está basado en la interacción de las proteínas o péptidos del estreptococo grupo A con los anticuerpos presentes en el suero humano. Los anticuerpos producidos frente a S. pyogenes por el sistema inmune humano y presentes en el suero humano son indicativos de la expresión in vivo de las proteínas antigénicas y de su inmunogenicidad. Además, las proteínas antigénicas, según se identifican por las bibliotecas de expresión de presentación de superficie bacteriana usando combinaciones de sueros preseleccionados, se procesan en un segundo y un tercer ciclo de selección por medio de sueros generados o seleccionados de los individuos. Por consiguiente, la presente invención proporciona una serie eficaz, relevante y completa de antígenos de estreptococo grupo A como una composición farmacéutica, en especial una vacuna que previene la infección por S. pyogenes.

En el programa de identificación de antígenos para identificar una serie completa de antígenos según la presente invención, se seleccionan al menos dos bibliotecas de expresión de superficie bacteriana diferentes con varias combinaciones o fracciones de plasma u otros líquidos corporales que contienen anticuerpos combinados (combinaciones de anticuerpos). Las combinaciones de anticuerpos se obtienen de una colección de sueros, que se ha probado contra compuestos antigénicos de S. pyogenes, tales como extractos de células completas y proteínas de sobrenadantes de cultivos. De preferencia, se usan 2 colecciones de sueros diferentes: 1. Con un repertorio muy estable de anticuerpos: adultos normales, personas clínicamente sanas, quienes no son portadores y quienes superaron contactos previos o son actualmente portadores de S. pyogenes sin enfermedad aguda ni síntomas, 2. con anticuerpos inducidos de forma aguda por la presencia del organismo patógeno: pacientes con enfermedad aguda con diferentes manifestaciones (por ejemplo, faringitis, infección de heridas y bacteriemia por S. pyogenes). Los sueros deben reaccionar con múltiples antígenos específicos de estreptococos del grupo A para que se consideren hiperinmunes y, por consiguiente, relevantes en el procedimiento de selección aplicado para la presente invención. Los anticuerpos producidos contra los estreptococos por el sistema inmune humano y que están presentes en los sueros humanos son indicativos de la expresión in vivo de las proteínas antigénicas y su inmunogenicidad.

Las bibliotecas de expresión según se usan en la presente invención deben permitir la expresión de todos los antígenos potenciales, por ejemplo, derivados de todas las proteínas de superficie de S. pyogenes. Las bibliotecas de presentación de superficie bacteriana estarán representadas por una biblioteca recombinante de un huésped bacteriano que presenta una serie (total) de secuencias de péptidos expresadas de los estreptococos del grupo A en una serie de proteínas de membrana externa seleccionadas (LamB, BtuB, FhuA) en la membrana del huésped bacteriano {Georgiou, G., 1997; Etz, H. y col., 2001}. Una de las ventajas de usar bibliotecas de expresión recombinantes es que los antígenos reactivos en suero hiperinmune identificados pueden producirse inmediatamente por la expresión de secuencias codificadoras de los clones identificados y seleccionados que expresan los antígenos reactivos en suero hiperinmune sin necesidad de otras etapas de tecnología de ADN recombinante o de clonación.

La serie completa de antígenos identificados por medio del programa descrito según la presente invención se analiza además por medio de uno o más ciclos adicionales de selección. Por consiguiente, se usan preparaciones individuales de anticuerpos o anticuerpos generados contra péptidos seleccionados que se han identificado como inmunogénicos. Según una forma de realización de preferencia, las preparaciones de anticuerpos individuales para el segundo ciclo de selección se obtienen de pacientes que han sufrido una infección aguda con estreptococos del grupo A, en especial de pacientes que muestran un valor de anticuerpos por encima de cierto nivel mínimo, por ejemplo un valor de anticuerpos que es superior al percentil 80, de preferencia superior al percentil 90, especialmente superior al percentil 95 de los sueros humanos (pacientes o individuos sanos) probados. El uso de tales preparaciones de anticuerpos individuales de valor elevado en el segundo ciclo de selección permite una identificación muy selectiva de los antígenos reactivos en suero hiperinmune y sus fragmentos de S. pyogenes.

Siguiendo el procedimiento de selección de alto rendimiento, las proteínas antigénicas seleccionadas, expresadas como proteínas recombinantes o como productos traducidos in vitro, en caso que no puedan expresarse en sistemas de expresión procariotas, o los péptidos antigénicos identificados (producidos de manera sintética) se prueban en una segunda selección por una serie de ensayos de ELISA y transferencia Western para evaluar su inmunogenicidad con una gran colección de sueros humanos (sueros de > 100 no infectados, > 50 pacientes).

Es importante que las preparaciones de anticuerpos individuales (que puede ser también el suero seleccionado) permitan una identificación selectiva de los antígenos reactivos en suero hiperinmune de todos los candidatos prometedores del primer ciclo. Por consiguiente, deben usarse al menos 10 preparaciones de anticuerpos individuales (es decir, preparaciones de anticuerpos (por ejemplo sueros) de al menos 10 individuos diferentes que hayan sufrido una infección del patógeno elegido) para identificar estos antígenos en el segundo ciclo de selección. Por supuesto, es posible usar también menos de 10 preparaciones individuales, sin embargo, la selectividad de la etapa puede no ser óptima con un número bajo de preparaciones de anticuerpos individuales. Por otra parte, si un antígeno reactivo en suero hiperinmune dado (o uno de sus fragmentos antigénicos) es reconocido por al menos 10 preparaciones de anticuerpos individuales, de preferencia al menos 30, especialmente al menos 50 preparaciones de anticuerpos individuales, la identificación del antígeno reactivo en suero hiperinmune es también suficientemente selectiva para una identificación adecuada. La reactividad al suero hiperinmune puede probarse, por supuesto, con tantas preparaciones individuales como sea posible (por ejemplo, con más de 100 o incluso con más de 1.000).

Por consiguiente, la parte relevante de las preparaciones de anticuerpos reactivos en suero hiperinmune debe ser al menos 10, de más preferencia al menos 30, especialmente al menos 50 preparaciones de anticuerpos individuales. Como alternativa (o en combinación) los antígenos reactivos en suero hiperinmune pueden también identificarse de preferencia con al menos el 20%, de preferencia al menos el 30%, especialmente al menos el 40% de las preparaciones de anticuerpos individuales usadas en el segundo ciclo de selección.

Según una forma de realización de preferencia de la presente invención, los sueros a partir de los que se preparan las preparaciones de anticuerpos individuales para el segundo ciclo de selección (o que se usan como preparaciones de anticuerpos), se seleccionan por sus valores contra S. pyogenes (por ejemplo contra una preparación de este patógeno, tal como un lisado, componentes de la pared celular y proteínas recombinantes). De preferencia, algunos se seleccionan con un valor de IgA total superior a 4.000 U, especialmente superior a 6.000 U, y/o un valor de IgG superior a 10.000 U, especialmente superior a 12.000 U (U = unidades, calculadas a partir de la lectura de DO_{405 \ nm} en una dilución dada) cuando se usa el organismo completo (lisado total o células completas) como antígeno en el ELISA.

Los anticuerpos producidos contra estreptococos por el sistema inmune humano y presentes en sueros humanos son indicativos de la expresión in vivo de las proteínas antigénicas y de su inmunogenicidad. El reconocimiento de epítopos lineales por anticuerpos puede basarse en secuencias tan cortas como de 4-5 aminoácidos. Por supuesto, no significa necesariamente que estos péptidos cortos sean capaces de inducir el anticuerpo dado in vivo. Por esa razón, los epítopos, polipéptidos y proteínas definidos deben probarse además en animales (principalmente en ratones) para verificar su capacidad para inducir anticuerpos contra las proteínas seleccionadas in vivo.

Los antígenos de preferencia están localizados en la superficie celular o se secretan, y por consiguiente están accesibles de manera extracelular. Se espera que los anticuerpos contra proteínas de la pared celular sirvan para dos objetos: inhibir la adhesión y promover la fagocitosis. Los anticuerpos contra proteínas secretadas son ventajosos en la neutralización de sus funciones como toxina o componente de virulencia. Se sabe también que las bacterias se comunican unas con otras a través de proteínas secretadas. Los anticuerpos neutralizantes contra estas proteínas interrumpirán la comunicación cruzada promotora del crecimiento entre o dentro de las especies de estreptococos. Los análisis bioinformáticos (secuencias señal, señales de localización de pared celular, dominios transmembranarios) han demostrado ser muy útiles para evaluar la localización de superficie o la secreción. El enfoque experimental incluye el aislamiento de anticuerpos con los epítopos correspondientes y proteínas del suero humano, y la generación de sueros inmunes en ratones contra (poli)péptidos seleccionados por las selecciones de presentación de superficie bacteriana. Estos sueros se usan posteriormente en un tercer ciclo de selección como reactivos en los siguientes ensayos: tinción de superficie celular de estreptococos del grupo A cultivados bajo condiciones diferentes (FACS, microscopía), determinación de la capacidad de neutralización (toxina, adherencia) y promoción de la opsonización y fagocitosis (ensayo de fagocitosis in vitro).

Para este objeto, los clones de bacterias E. coli se inyectan directamente en los ratones y se recogen los sueros inmunes y se prueban en el ensayo relevante in vitro para anticuerpos opsónicos o neutralizantes funcionales. Como alternativa, los anticuerpos específicos pueden purificarse a partir de sueros humanos o de ratón usando péptidos o proteínas como sustrato.

La defensa del huésped contra S. pyogenes se basa principalmente en mecanismos inmunológicos congénitos. La inducción de anticuerpos de alta afinidad de tipo opsónico y neutralizante por medio de la vacunación ayuda al sistema inmune congénito a eliminar bacterias y toxinas. Esto hace que el procedimiento según la presente invención sea una herramienta óptima para la identificación de proteínas antigénicas de estreptococos del grupo A.

La piel y las membranas mucosas son barreras formidables contra la invasión por los estreptococos. Sin embargo, una vez que se genera una brecha en la piel o las membranas mucosas, la primera línea de defensa celular no adaptativa comienza su acción coordinada a través del complemento y de los fagocitos, especialmente los leucocitos polimorfonucleares (PMN). Estas células pueden considerarse como las piedras angulares en la eliminación de bacterias invasoras. Como los estreptococos del grupo A son principalmente patógenos extracelulares, la principal respuesta adaptativa contra los estreptococos proviene de la rama humoral del sistema inmune, y está mediada a través de tres mecanismos principales: promoción de la opsonización, neutralización de toxinas e inhibición de la adherencia. Se cree que la opsonización es especialmente importante, porque es un requisito para que se produzca una fagocitosis eficaz. Para la opsonización eficaz, la superficie microbiana tiene que estar recubierta con anticuerpos y los factores del complemento para el reconocimiento de los PMN a través de receptores para el fragmento Fc de la molécula de IgG o para C3b activado. Después de la opsonización, los estreptococos son fagocitados y mueren. Los anticuerpos unidos a los antígenos específicos en la superficie celular de las bacterias sirven como ligandos para la unión a los PMN y para promover la fagocitosis. Se espera que los mismos anticuerpos unidos a las adhesinas y a otras proteínas de la superficie celular neutralicen la adhesión y eviten la colonización. La selección de antígenos de la manera prevista por la presente invención es por consiguiente adecuada para identificar los que darán lugar a la protección contra la infección en un modelo animal o en seres humanos.

Según el procedimiento de identificación de antígenos usado en el presente documento, la presente invención puede proporcionar sorprendentemente una serie de ácidos nucleicos completos nuevos y antígenos reactivos en suero hiperinmune nuevos y sus fragmentos, de S. pyogenes, entre otras cosas, como se describe a continuación. La invención proporciona las secuencias de nucleótidos que codifican antígenos reactivos en suero hiperinmune cuyas secuencias se presentan en el listado de secuencias Sec. ID Nº 1-150 y las correspondientes secuencias de aminoácidos codificadas que representan los antígenos reactivos en suero hiperinmune se presentan en el listado de secuencias Sec. ID Nº 151-300.

Se divulga una molécula de ácido nucleico que exhibe el 70% de identidad a lo largo de su longitud total con una secuencia de nucleótidos presentada con las Sec. ID Nº 1, 4-8, 10-18, 20, 22, 24-32, 34-35, 38-40, 43-46, 49-51, 53-54, 57-61, 63, 65-71, 73, 75-77, 81-82, 88, 91-94 y 96-150. Los ácidos nucleicos pueden comprender una región que es al menos 80% o al menos 85% idéntica a lo largo de su longitud total a una molécula de ácido nucleico presentada con las Sec. ID Nº 1, 4-8, 10-18, 20, 22, 24-32, 34-35, 38-40, 43-46, 49-51, 53-54, 57-61, 63, 65-71, 73, 75-77, 81-82, 88, 91-94 y 96-150. En este aspecto, son posibles moléculas de ácido nucleico al menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, ó 96% idénticas a lo largo de la longitud total a la misma. Además, también son posibles las que tienen al menos 97%, las que tienen al menos 98% y al menos 99% ó 99,5% o con 100% de identidad. Además, están contemplados los ácidos nucleicos que codifican antígenos reactivos en suero hiperinmune o sus fragmentos (polipéptidos) que retienen sustancialmente la misma función o actividad biológica que el polipéptido maduro codificado por dichos ácidos nucleicos presentados en las Sec. ID Nº 1, 4-8,10-18, 20, 22, 24-32, 34-35, 38-40, 43-46, 49-51, 53-54, 57-61, 63, 65-71, 73, 75-77, 81-82, 88, 91-94 y 96-150.

La identidad, como se conoce en la técnica y se usa en el presente documento, es la relación entre dos o más secuencias de polipéptidos o dos o más secuencias de polinucleótidos, según se determina por medio de la comparación de las secuencias. En la técnica, identidad también significa el grado de relación de las secuencias entre secuencias de polipéptidos o polinucleótidos, como puede ser el caso, según se determina por la coincidencia entre las hebras de tales secuencias. La identidad puede calcularse fácilmente. Aunque existe una serie de procedimientos para medir la identidad entre dos secuencias de polipéptidos o polinucleótidos, el término es muy conocido por los expertos en la técnica (por ejemplo, Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987). Los procedimientos de preferencia para determinar la identidad están diseñados para dar las mayores coincidencias entre las secuencias probadas. Los procedimientos para determinar la identidad están codificados en programas informáticos. Los procedimientos de los programas informáticos de preferencia para determinar la identidad entre dos secuencias incluyen, pero no se limitan a, el paquete programas GCG {Devereux, J. y col., 1984}, BLASTP, BLASTN, y FASTA {Altschul, S. y col., 1990}.

Se divulgan moléculas de ácido nucleico que exhiben al menos el 96% de identidad con la secuencia de ácido nucleico presentada con la Sec. ID Nº 64.

Se divulgan moléculas de ácido nucleico que son idénticas a las secuencias de ácido nucleico presentadas con las Sec. ID Nº 3, 36, 47-48, 55, 62, 72, 80, 84, 95.

Las moléculas de ácido nucleico pueden ser también como segunda alternativa una molécula de ácido nucleico que es al menos esencialmente complementaria al ácido nucleico descrito como primera alternativa anteriormente. Según se usa en el presente documento, complementario significa que una hebra de ácido nucleico tiene sus bases apareadas a través del apareamiento de bases de Watson-Crick con una segunda hebra de ácido nucleico. Esencialmente complementaria según se usa en el presente documento significa que no se presenta el apareamiento de bases para todas las bases de las hebras respectivas sino que queda un cierto número o porcentaje de bases no apareadas o apareadas de manera errónea. El porcentaje de bases apareadas correctamente es de preferencia de al menos el 70%, de más preferencia del 80%, aún de más preferencia del 90% y de mayor preferencia cualquier porcentaje superior al 90%. Debe señalarse que un porcentaje del 70% de bases coincidentes se considera homología y la hibridación que tiene esta extensión de pares de bases coincidentes se considera rigurosa. Las condiciones de hibridación para este tipo de hibridación rigurosa pueden tomarse de Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley and Sons, Inc., 1987). Más particularmente, las condiciones de hibridación pueden ser las siguientes:

\sqbullet: Hibridación realizada por ejemplo en 5 x SSPE, 5 x reactivo de Denhardt, SDS al 0,1%, ADN fragmentado 100 g/ml a 68ºC

\sqbullet: Lavado de rigurosidad moderada en 0,2 x SSC, SDS al 0,1% a 42ºC

\sqbullet: Lavado de alta rigurosidad en 0,1 x SSC, SDS al 0,1% a 68ºC

\vskip1.000000\baselineskip

El ADN genómico con un contenido de GC del 50% tiene una T_{f} aproximada de 96ºC. Para el 1% de apareamiento erróneo, la T_{f} se reduce en aproximadamente 1ºC.

Además, cualquiera de las otras condiciones de hibridación que se describen en el presente documento también son en principio aplicables.

Por supuesto, todas las moléculas de las secuencias de ácidos nucleicos que codifican la misma molécula de polipéptido como las identificadas por la presente invención están abarcadas por cualquier divulgación de una secuencia codificadora dada, ya que la degeneración del código genético es directamente aplicable para determinar de manera fehaciente todas las moléculas de ácido nucleico posibles que codifican una molécula de polipéptido dada, aunque la cantidad de tales moléculas de ácido nucleico degeneradas puede ser elevada. Esto es aplicable también para fragmentos de un polipéptido dado, a condición de que los fragmentos codifiquen un polipéptido que sea adecuado para usar con respecto a la vacunación, por ejemplo como una vacuna activa o pasiva.

La molécula de ácido nucleico puede ser también como una tercera alternativa un ácido nucleico que comprenda una extensión de al menos 15 bases de la molécula de ácido nucleico según la primera y segunda alternativa de las moléculas de ácido nucleico según se resumió anteriormente. De preferencia, las bases forman una extensión contigua de bases. Sin embargo, la extensión puede estar constituida por dos o más restos que están separados por una serie de bases.

La molécula de ácido nucleico puede ser también como una cuarta alternativa una molécula de ácido nucleico que se aparea bajo condiciones de hibridación rigurosas con cualquiera de los ácidos nucleicos según las alternativas primera, segunda y tercera, resumidas anteriormente. Las condiciones de hibridación rigurosas son típicamente las descritas en el presente documento.

Finalmente, la molécula de ácido nucleico puede ser también como una quinta alternativa una molécula de ácido nucleico que, salvo por la redundancia código genético, hibridará con cualquiera de las moléculas de ácido nucleico según cualquier molécula de ácido nucleico según las alternativas primera, segunda, tercera y cuarta, resumidas anteriormente. Este tipo de molécula de ácido nucleico se refiere al hecho de que, de preferencia, los ácidos nucleicos codifican los antígenos reactivos en suero hiperinmune o sus fragmentos. Este tipo de molécula de ácido nucleico es particularmente útil en la detección de una molécula de ácido nucleico y por consiguiente en el diagnóstico de los microorganismos respectivos tales como S. pyogenes y de cualquier enfermedad o afección de la enfermedad donde esté implicado este tipo de microorganismo. De preferencia, la hibridación se presentará o tendrá lugar bajo condiciones rigurosas como se describió con respecto a la cuarta alternativa descrita anteriormente.

Molécula de ácido nucleico según se usa en el presente documento se refiere generalmente a cualquier molécula de ácido ribonucleico o molécula de ácido desoxirribonucleico, que pueden ser ARN o ADN sin modificar o ARN o ADN modificado. Por consiguiente, por ejemplo, molécula de ácido nucleico según se utiliza en el presente documento se refiere a, entre otros, al ADN de hebra única y de hebra doble, ADN que es una mezcla de ARN de hebra única y hebra doble, y ARN que es una mezcla de regiones de hebra única y regiones de hebra doble, moléculas híbridas que comprenden ADN y ARN que pueden ser de hebra única o, más típicamente, de hebra doble, o de hebra triple, o una mezcla de regiones de hebra única y hebra doble. Además, molécula de ácido nucleico según se utiliza en el presente documento se refiere a regiones de triple hebra que comprenden ARN o ADN o ambos, ARN y ADN. Las hebras en tales regiones pueden ser de la misma molécula o de moléculas diferentes. Las regiones pueden incluir todas las de una o más moléculas, pero más típicamente incluyen sólo una región de algunas de las moléculas. Una de las moléculas de una región de triple hélice frecuentemente es un oligonucleótido. Según se usa en el presente documento, el término molécula de ácido nucleico incluye los ADN o ARN según se describen anteriormente que contienen una o más bases modificadas. Por consiguiente, los ADN o ARN con estructuras centrales modificadas por estabilidad o por otras razones son "molécula de ácido nucleico" según lo previsto para el término en el presente documento. Además, Los ADN y ARN que comprenden bases inusuales, tales como la inosina, o bases modificadas, tales como bases tritiadas, para nombrar sólo dos ejemplos, son moléculas de ácido nucleico según se usa el término en el presente documento. Debe apreciarse que se ha realizado una gran diversidad de modificaciones al ADN y ARN que sirven para muchos objetos útiles conocidos por los expertos en la técnica. El término molécula de ácido nucleico según se utiliza en el presente documento abarca tales formas químicamente, enzimáticamente o metabólicamente modificadas de moléculas de ácido nucleico, así como las formas químicas de ADN y ARN características de virus y células, incluidas células simples y complejas, inter alia. El término molécula de ácido nucleico también abarca moléculas de ácido nucleico cortas con frecuencia denominadas oligonucleótido(s). "Polinucleótido" y "ácido nucleico" o "molécula de ácido nucleico" se usan con frecuencia de manera indistinta en el presente documento.

Las moléculas de ácido nucleico también abarcan numerosos fragmentos únicos, más largos y más cortos que las secuencias de las moléculas del ácido nucleico presentadas en el listado de secuencias de las regiones codificadoras de S. pyogenes, que pueden generarse por medio de procedimientos de clonación convencionales. Para ser único, un fragmento debe tener el tamaño suficiente para distinguirlo de otras secuencias de ácidos nucleicos conocidas, determinado más fácilmente comparando cualquier fragmento seleccionado de S. pyogenes con las secuencias de nucleótidos en las bases de datos computerizadas tales como GenBank.

Además, pueden realizarse modificaciones a las moléculas de ácido nucleico y de polipéptidos. Por ejemplo, pueden realizarse sustituciones de nucleótidos que no afecten el polipéptido codificado por el ácido nucleico, y por consiguiente está contemplada cualquier molécula de ácido nucleico que codifique un antígeno reactivo en suero hiperinmune o sus fragmentos.

Además, cualquiera de las moléculas de ácido nucleico que codifican antígenos reactivos en suero hiperinmune o sus fragmentos proporcionados por la presente invención pueden unirse de manera funcional, usando técnicas convencionales tales como las técnicas de clonación, a cualquier secuencia reguladora deseada, ya sea una secuencia reguladora de S. pyogenes o una secuencia reguladora heteróloga, una secuencia líder heteróloga, una secuencia marcadora heteróloga o una secuencia codificadora heteróloga para crear una proteína de fusión.

Las moléculas de ácido nucleico de la presente invención pueden estar en la forma de ARN, tal como ARNm o ARNc, o en la forma de ADN, incluidos, por ejemplo, el ADNc y al ADN genómico obtenido por clonación o producido por técnicas de síntesis química o por una combinación de las mismas. El ADN puede ser de triple hebra, doble hebra o de hebra única. El ADN de hebra única puede ser la hebra codificadora, conocida también como la hebra sentido, o puede ser la hebra no codificadora, también denominada hebra complementaria o antisentido.

La presente invención se refiere además a variantes de las moléculas de ácido nucleico descritas anteriormente en el presente documento que codifican fragmentos, análogos y derivados de los antígenos reactivos en suero hiperinmune y sus fragmentos que tienen una secuencia de aminoácidos deducida de S. pyogenes presentada en el listado de secuencias. Una variante de la molécula de ácido nucleico puede ser una variante que se presenta en la naturaleza tal como una variante alélica que se presenta en la naturaleza, o puede ser una variante que no se sabe que se presente en la naturaleza. Tales variantes de la molécula de ácido nucleico que no se presentan en la naturaleza pueden producirse por técnicas de mutagénesis, incluidas las aplicadas a moléculas de ácido nucleico, células y organismos.

Entre las variantes en este aspecto están las variantes que difieren de las moléculas de ácido nucleico mencionadas anteriormente por sustituciones, deleciones o adiciones del nucleótidos. Las sustituciones, deleciones o adiciones pueden implicar uno o más nucleótidos. Las variantes pueden alterarse en regiones codificadoras o no codificadoras o en ambas. Las alteraciones en las regiones codificadoras pueden producir sustituciones, deleciones o adiciones de aminoácidos conservadoras o no conservadoras. Resultan de preferencia las moléculas de ácido nucleico que codifican una variante, un análogo, un derivado o fragmento, o una variante, análogo o derivado de un fragmento, que tiene una secuencia de S. pyogenes según se presenta en el listado de secuencias, en las que están sustituidos, delecionados o añadidos, varios, unos pocos, 5 a 10, 1 a 5, 1 a 3, 2, 1 ó ningún aminoácido, en cualquier combinación. Entre éstas, resultan especialmente de preferencia las sustituciones, adiciones y deleciones silenciosas, que no alteran las propiedades y las actividades de los polipéptidos de S. pyogenes presentados en el listado de secuencias. También son especialmente de preferencia en este aspecto las sustituciones conservadoras.

Los péptidos y los fragmentos pueden incluir también epítopos modificados en los que de preferencia uno o dos de los aminoácidos de un epítopo dado están modificados o reemplazados según las reglas divulgadas en, por ejemplo {Tourdot, S. y col., 2000}, así como las secuencias de ácidos nucleicos que codifican tales epítopos modificados.

Está claro que también los epítopos derivados de los presentes epítopos por los intercambios de aminoácidos que mejoran, conservan o al menos no impiden significativamente la capacidad de activación de las células T de los epítopos están cubiertos por los epítopos según la presente invención. Por consiguiente los presentes epítopos también cubren los epítopos, que no contienen la secuencia original según se obtiene del S. pyogenes, pero provocan la misma respuesta o de preferencia una respuesta mejor de las células T. Estos epítopos se denominan "heteroclíticos"; necesitan tener una afinidad similar o de preferencia mayor para las moléculas del MHC/HLA, y necesitan la capacidad de estimular los receptores de las células T (TCR) dirigidos al epítopo original de una manera similar o, de preferencia, más potente.

Los epítopos heteroclíticos pueden obtenerse por medio de diseño racional, es decir considerando la contribución de residuos individuales para la unión al MHC/HLA como está descrito, por ejemplo por {Rammensee, H. y col., 1999}, combinado con un intercambio sistemático de residuos que potencialmente interactúan con los TCR y probando las secuencias resultantes con las células T dirigidas contra el epítopo original. Tal diseño es posible para un experto en la técnica sin mucha experimentación.

\newpage

Otra posibilidad incluye la selección de bibliotecas de péptidos con células T dirigidas contra el epítopo original. Un modo de preferencia es la exploración posicional de las bibliotecas de péptidos sintéticos. Tales aproximaciones se han descrito en detalle por ejemplo por {Hemmer, B. y col., 1999} y las referencias presentas en el mismo.

Como una alternativa a los epítopos representados por las presentes secuencias de aminoácidos o epítopos heteroclíticos derivados, pueden aplicarse también sustancias que imitan estos epítopos, por ejemplo los "peptidomiméticos" o "retro-inverso-péptidos".

Otro aspecto del diseño de epítopos mejorados es su formulación o modificación con sustancias que aumentan su capacidad para estimular las células T. Estas incluyen epítopos, lípidos o liposomas de células T ayudantes, o las modificaciones de preferencia como se describen en el documento WO 01/78767.

Otra manera de aumentar la capacidad de los epítopos para estimular las célula T es su formulación con sustancias inmunoestimuladoras, por ejemplo citocinas o quimiocinas como las interleucinas 2, 7, 12, 18, los interferones (IFN) clase I y II, especialmente el IFN-gamma, GM-CSF, TNF-alfa, flt3-ligando y otros.

Según se analiza además en el presente documento con respecto a los ensayos de moléculas de ácido nucleico, por ejemplo, las moléculas de ácido nucleico de la invención según se analizaron anteriormente, pueden utilizarse como una sonda de hibridación para ARN, ADNc y ADN genómico para aislar los ADNc de longitud total y los clones genómicos que codifican los polipéptidos de la presente invención y para aislar el ADNc y los clones genómicos de otros genes que tienen una similitud de secuencia alta con las moléculas de ácido nucleico de la presente invención. Tales sondas comprenderán por lo general al menos 15 bases. De preferencia, tales sondas tendrán al menos 20, al menos 25 o al menos 30 bases, y pueden tener al menos 50 bases. Las sondas particularmente de preferencia tendrán al menos 30 bases, y tendrán 50 bases o menos, por ejemplo 30, 35, 40, 45 ó 50 bases.

Por ejemplo, la región codificadora de una molécula de ácido nucleico puede aislarse seleccionando una biblioteca relevante usando la secuencia de ADN conocida para sintetizar una sonda de oligonucleótidos. A continuación se usa un oligonucleótido marcado que tiene una secuencia complementaria a la de un gen de la presente invención para seleccionar una biblioteca de ADNc, de ADN genómico o de ARNm para determinar con qué miembros de la biblioteca hibrida la sonda.

Las moléculas de ácido nucleico y los polipéptidos pueden usarse como reactivos y materiales para el desarrollo de tratamientos y diagnósticos para enfermedades, en particular enfermedades humanas, como se analiza más en el presente documento con relación a los ensayos de moléculas de ácido nucleico, inter alia.

Las moléculas de ácido nucleico que son oligonucleótidos pueden usarse en los procedimientos del presente documento según se describe, pero de preferencia para PCR, para determinar si los genes de S. pyogenes identificados en el presente documento están presentes en su totalidad o en parte o no están presentes, y/o transcriptos en el tejido infectado, tal como la sangre. Se reconoce que tales secuencias también tendrán utilidad en el diagnóstico de la etapa de la infección y del tipo de infección que ha realizado el patógeno. Para este y otros objetos pueden usarse las matrices que comprenden al menos uno de los ácidos nucleicos según se describen en el presente documento.

Las moléculas de ácido nucleico pueden usarse para la detección de moléculas de ácido nucleico y organismos o muestras que contienen estos ácidos nucleicos. De preferencia, tal detección es para diagnóstico, de más preferencia para el diagnóstico de una enfermedad relacionada o ligada a la presencia o abundancia de S. pyogenes.

Los eucariotas (en el presente documento también "individuo(s)"), particularmente mamíferos y especialmente seres humanos, infectados con S. pyogenes se pueden detectarse a nivel del ADN por una diversidad de técnicas. Pueden obtenerse candidatos de preferencia para distinguir un S. pyogenes de otros organismos.

Está contemplado un procedimiento para diagnosticar la enfermedad, que se presenta a partir de la infección con S. pyogenes, que comprende determinar a partir de una muestra aislada u obtenida de un individuo un nivel aumentado de expresión de una molécula de ácido nucleico que tiene la secuencia de una molécula de ácido nucleico presentada en el listado de secuencias. La expresión de las moléculas de ácido nucleico puede medirse usando cualquiera de los procedimientos conocidos en la técnica para cuantificar moléculas de ácido nucleico, tales como, por ejemplo, PCR, RT-PCR, protección de RNasa, transferencia Northern, otros procedimientos de hibridación y las matrices descritas en el presente documento.

Aislado, según se utiliza en el presente documento, significa separado "por la mano del hombre" de su estado natural; es decir, que, si se presenta en la naturaleza, se ha cambiado o se ha eliminado de su entorno original, o ambos. Por ejemplo, una molécula de ácido nucleico que se presenta en la naturaleza o un polipéptido presente en la naturaleza en un organismo vivo en su estado natural no está "aislado/a", pero la misma molécula de ácido nucleico o polipéptido separados de los materiales coexistentes de su estado natural está "aislada/o", según se utiliza el término en el presente documento. Como parte del aislamiento o después del mismo, tales moléculas de ácido nucleico pueden unirse a otras moléculas de ácido nucleico, tales como ADN, para la mutagénesis, para formar proteínas de fusión, y para la propagación o la expresión en un huésped, por ejemplo. Las moléculas de ácido nucleico aisladas, solas o unidas a otras moléculas de ácido nucleico tales como vectores, pueden introducirse en las células huésped, en cultivo o en organismos completos. Introducidos en las células huésped en cultivo o en organismos completos, tales ADN todavía pueden estar aislados, según se usa el término en el presente documento, porque no estarían en su forma o entorno presente en la naturaleza. De manera similar, las moléculas de ácido nucleico y los polipéptidos pueden presentarse en una composición, tales como las formulaciones de medios, las disoluciones para la introducción de moléculas de ácido nucleico o polipéptidos, por ejemplo, en las células, las composiciones o las disoluciones para las reacciones químicas o enzimáticas, por ejemplo, que no son composiciones que se presentan en la naturaleza y, en las mismas, siguen siendo moléculas de ácido nucleico o polipéptidos aislados/os dentro del significado de ese término según se utiliza en el presente documento.

Los ácidos nucleicos pueden sintetizarse químicamente. Como alternativa, los ácidos nucleicos pueden aislarse de S. pyogenes por medio de procedimientos conocidos por los expertos en la técnica.

También se divulga una serie completa de nuevos antígenos reactivos en suero hiperinmune y sus fragmentos usando el procedimiento de identificación de antígenos descrito en el presente documento. Se divulga un antígeno reactivo en suero hiperinmune que comprende una secuencia de aminoácidos codificada por una cualquiera de las moléculas de ácidos nucleicos descritas en el presente documento y sus fragmentos. Una serie nueva de antígenos reactivos en suero hiperinmune puede comprender secuencias de aminoácidos seleccionadas del grupo constituido por las secuencias de polipéptidos según se representan en Sec. ID Nº 151, 154-158, 160-168.170, 172, 174 -182, 184-185, 188-190, 193-196, 199-201, 203-204, 207-211, 213, 215-221, 223, 225-227, 231-232, 238, 241-244 y 246-300 y sus fragmentos. También se divulgan antígenos reactivos en suero hiperinmune que comprenden secuencias de aminoácidos seleccionadas del grupo constituido por las secuencias de polipéptidos según se representan en Sec. ID Nº 214 y sus fragmentos. Los antígenos reactivos en suero hiperinmune pueden comprender secuencias de aminoácidos seleccionadas del grupo constituido por las secuencias de polipéptidos según se representan en Sec. ID Nº 153, 186, 197-198, 205, 212, 222, 230, 234, 245 y sus fragmentos.

Los antígenos reactivos en suero hiperinmune y sus fragmentos según se divulgan incluyen cualquier serie de polipéptidos presentada en el listado de secuencias así como los polipéptidos que tienen al menos 70% de identidad con un polipéptido presentado en el listado de secuencias, de preferencia al menos 80% u 85% de identidad con un polipéptido presentado en el listado de secuencias, y de más preferencia al menos 90% de similitud (de más preferencia al menos 90% de identidad) con un polipéptido presentado en el listado de secuencias y aún de más preferencia al menos 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ó 99,5% de similitud (aún de más preferencia al menos 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ó 99,5% de identidad) con un polipéptido presentado en el listado de secuencias y también incluyen porciones de tales polipéptidos conteniendo tales porciones del polipéptido generalmente al menos 4 aminoácidos y de más preferencia al menos 8, aún de más preferencia al menos 30, aún de más preferencia al menos 50 aminoácidos, por ejemplo 4, 8, 10, 20, 30, 35, 40, 45 ó 50 aminoácidos.

La invención también se refiere a los fragmentos, análogos y derivados de estos antígenos reactivos en suero hiperinmune y sus fragmentos. Los términos "fragmento", "derivado" y "análogo" cuando se refieren a un antígeno cuya secuencia de aminoácidos se presenta en el listado de secuencias, significan un polipéptido que retiene esencialmente la misma función o actividad biológica que tal antígeno reactivo en suero hiperinmune y su fragmento.

El fragmento, derivado o análogo de un antígeno reactivo en suero hiperinmune puede ser 1) uno en el que están sustituidos uno o más de los residuos de aminoácidos con un residuo conservado o no conservado (de preferencia un residuo de aminoácido conservado) y tales residuos de aminoácidos sustituidos pueden o no ser uno codificado por el código genético, o 2) uno en el que uno o más de los residuos de aminoácidos incluyen un grupo sustituyente, o 3) uno en el que el antígeno reactivo en suero hiperinmune maduro o su fragmento está fusionado con otro compuesto, tal como un compuesto para aumentar la semivida del antígeno reactivo en suero hiperinmune y su fragmento (por ejemplo, polietilenglicol), o 4) uno en el que los aminoácidos adicionales están fusionados con el antígeno reactivo en suero hiperinmune maduro o su fragmento, tales como una secuencia líder o secretora o una secuencia que se utiliza para la purificación del antígeno reactivo en suero hiperinmune maduro o su fragmento o una secuencia de proproteína. Se considera que tales fragmentos, derivados y análogos están dentro del alcance de los expertos en la técnica a partir de las enseñanzas del presente documento.

La presente invención también divulga antígenos de diferentes aislamientos de S. pyogenes. Tales homólogos pueden aislarse fácilmente basándose en las secuencias de los ácidos nucleicos y de aminoácidos divulgadas en el presente documento. Hasta la fecha hay distinguidos más de 80 serotipos de proteína M y el tipificado se basa en la región variable en el extremo 5' del gen emm (véase por ejemplo Vitali y col., 2002). Por consiguiente, puede determinarse la presencia de cualquier antígeno para cada serotipo M. Además es posible determinar la variabilidad de un antígeno particular en los diversos serotipos M como se describe para el gen sic (Hoe y col., 2001). La influencia de los diferentes serotipos M en el tipo de enfermedad que causan está resumido en una reciente revisión (Cunningham, 2000). En particular, pueden distinguirse dos grupos de serotipos:

1): Los que causan faringitis y escarlatina (por ejemplo los tipos M 1, 3, 5, 6, 14, 18, 19, 24)

2): Los que causan piodermia e infecciones estreptocócicas de la piel (por ejemplo los tipos M 2, 49, 57, 59, 60, 61)

\newpage

Esto puede servir como base para identificar la relevancia de un antígeno para el uso como una vacuna o en general como un fármaco dirigido a una enfermedad específica.

La información por ejemplo de la página web de la CDC (http://www.cdc.gov/ncidod/biotech/strep/emmtypes.htm) ofrece un dendrograma que muestra la relación de diversos serotipos M. Otras referencias relevantes se encuentran en Vitali y col., Journal of Clinical Microbiology 40: 679-681. (2002) (procedimiento de tipificación molecular de emm), Enright y col., Infection and Immunity 69: 2416-2427. (2001) (procedimiento de tipificación molecular alternativo (MLST)), Hoe y col., The Journal of Infectious Diseases 183: 633-639. (2001) (ejemplo para la variación de un antígeno (sic) en muchos serotipos diferentes) y Cunningham, CLINICAL MICROBIOLOGY REVIEWS 13: 470-511. (2000) (revisión sobre la patogénesis del GAS).

Todos los tipos de emm se presentan en su totalidad y puede descargarse de la dirección anterior.

El dendrograma se construyó por el uso secuencial de la versión 10.1 del paquete de programas Wisconsin, Genetics Computes Group (GCG), los programas Pileup, Distances y Growtree de Madison. Básicamente, se usaron 22 residuos de secuencia señal más otros 83 residuos del extremo N terminal para las alineaciones que incluyeron las secuencias seleccionadas de las bases de datos. Las secuencias seleccionadas incluyen las denominaciones nuevas de emm 103-124 (descritas en la tabla a continuación) así como sus coincidencias de proteína M "clásicas" más próximas. Aunque este análisis está limitado porque los extremos C terminales están truncados arbitrariamente, este es un resultado típico ya que el dendrograma separa los grupos de secuencias de cepas M positivas para el factor de opacidad de las secuencias de cepas M negativas para el factor de opacidad. tipo de emm/denominación anterior - número de acceso de GenBank - países donde se aisló - coincidencia de secuencia de proteína M N terminal más cercana (% de identidad):

emm103/st2034 U74320 PNG, Bra, Egy, Mal, Nep, NZ, US M87 (66%)

emm104/st2034 AF056300 PNG, Egy, Mal, Nep, NZ, US M66 (72%)

emm105/st4529 AF060227 Mal, Nep, NZ, US M5 (45%)

emm106/st4532 AF077666 Mal, Egy, Iran, Nep M27G (71%)

emm107/st4264 AF163686 Mal, NZ M25 (52%)

emm108/st4547 AF052426 Mal, Bra, Egy, Ira, NZ M70 (84%) emm109/st3018 AF077667 Mal, Egy, NZ M28 (74%)

emm110/st4935 U92492 Ind, Bul, NZ, Rus, US M13 (60%)

emm111/st4973 AF128960 Ind, Bra, Nep, US M80 (40%)

emm112/stCmuk16 AF091806 Thi, Bra, Rus, US M27L/77 (59%) emm113/st2267 AF078068 NZ, Thai, Chi M13 (50%)

emm114/st2967 U50338 US, Can, Gam, NZ, PNG M73 (80%)

emm115/st2980 AF028712 US, Bra, Rus M36 (64%)

emm116/st2370 AF156180 US, Nep, NZ M52 (60%)

emm117/st436 AF058801 US M13 (59%)

emm118/st448 AF058802 US, Bra, Egy, Nep, NZ M49 (79%)

emm119/st3365 AF083874 US, Bra, Nep M52 (59%)

emm120/st1135 AF296181 Egy M56 (78%)

emm121/st1161 AF296182 Egy M64 (64%)

emm122/st1432 AF222860 Egy, Rus, Nep M18 (40%)

emm123/st6949 AF213451Arg, US, NZM80 (68%)

st1160/emm124 AF149048 and AF018178Egy, Mal, NZM2 (82%).

\newpage

Abreviaturas: Arg, Argentina; Bra, Brasil; Bul, Bulgaria; Cab, Canadá; Chi, Chile; Egy, Egipto; Gam, Gambia; Ind, India; Ira, Irán; Mal, Malasia; Nep, Nepal; NZ, Nueva Zelanda; PNG, Papua Nueva Guinea; Thi, Tailandia; Rus, Rusia; US, Estados Unidos.%: Coincidencia de la secuencia de proteína M madura más cercana a 50 residuos predichos del extremo N terminal maduro del tipo Lancefield caracterizado serológicamente.

Tipos de emm y tipos de secuencias:

En muchos casos las cepas de referencia de la secuencia de emm provinieron directamente de la colección de tipos M de la Dra. Rebecca Lancefield. Tales cepas se denominan RCL.

Las secuencias que comienzan con "emm" indican que los aislamientos representados por este tipo han sido analizados por varios laboratorios de referencia además de los laboratorios de estreptococos de la CDC. Cada uno de los "nuevos" tipos de emm, emm94 hasta emm124 están representados por múltiples aislamientos independientes recuperados de manifestaciones graves de la enfermedad, son no tipificables por la proteína M con todas las reservas de sueros de tipificación disponibles para los laboratorios internacionales de referencia del GAS, y demuestran propiedades antifagocíticas in vitro al multiplicarse en sangre humana normal. Las cepas con secuencias de emm que comienzan con "st" (tipo de secuencia) todavía no han sido validadas completamente por todos los laboratorios de referencia.

Genética del GAS:

Desde hace mucho tiempo se sabe que el antisuero contra las cepas positivas para el factor de la opacidad del suero (SOF+) inhibe la actividad del OF de una manera específica de cepa. Por consiguiente, se analizaron regiones variables de 500-2700 bases del gen sof (factor de opacidad del suero) que representan al menos 60 genes sof distintos de cepas de GAS positivas para el factor de opacidad (y curiosamente, un homólogo encontrado comúnmente en aislamientos de emm12 negativos para OF y en la cepa de referencia emm/tipo M 12). Se encontró que las secuencias del gen sof son también notablemente variables entre las diferentes cepas de GAS, aunque usualmente están bien conservadas dentro de un tipo de emm. Las cepas importantes incluyen por consiguiente emm1, emm100, emm101, emm102, emm103, emm104, emm105, emm106, emm107, emm108, emm109, emm11, emm11O, emm111, emm112, emm113, emm114, emm115, emm116, emm117, emm118, emm119, emm12, emm120, emm121, emm122, emm123, emm124, emm13L, emm14, emm15, emm17, emm18, emm19, emm2, emm22, emm23, emm24, emm25, emm26, emm27G, emm28, emm29, emm3, emm30, emm31, emm32, emm33, emm34, emm36, emm37, emm38, emm39, emm4, emm40, emm41, emm42, emm43, emm44, emm46, emm47, emm48, emm49, emm5, emm50, emm51, emm52, emm53, emm54, emm55, emm56, emm57, emm58, emm59, emm6, emm60, emm61, emm62, emm63, emm64, emm65, emm66, emm67, emm68, mm69, emm70, emm71, emm72, emm73, emm74, emm75, emm76, emm77, emm78, emm79, emm8, emm80, emm81, emm82, emm83, emm84, emm85, emm86, emm87, emm88, emm89, emm9, emm90, emm91, emm92, emm93, emm94, emm95, emm96, emm97, emm98, emm99, st1389, st1731, st1759, st1815, st1967, st1969, st1rp31, sti11014, st2037, st204, st211, st213, st2147, st1207, st245, st2460, st2461, st2463, st2904, st2911, st2917, st2926, st2940, st369, st3757, st3765, st3850, st5282, st6735, st7700, st809, st833, st854, st980584, stck249, stck401, std432, std631, std633, stIL103, stIL62, stns292, stns554, sts104, stc1400, stc1741, stc36, stc3852, stc5344, stc5345, stc57, stc6979, stc74a, stc839, stg10, stg11, stg1389, stg166b, stg1750, stg2078, stg3390, stg4222, stg4545, stg480, stg4831, stg485, stg4974, stg5063, stg6, stg62647, stg643, stg652, stg653, stg663, stg840, stg93464, stg97, stL1376, stL1929 y stL2764.

\vskip1.000000\baselineskip

Dentro de la divulgación en este aspecto están los antígenos reactivos en suero hiperinmune presentados en el listado de secuencias, las variantes, los análogos, los derivados y sus fragmentos, y las variantes, los análogos y los derivados de los fragmentos. Además, son factibles los polipéptidos de fusión que comprenden tales antígenos reactivos en suero hiperinmune, las variantes, los análogos, los derivados y sus fragmentos, y las variantes, los análogos y los derivados de los fragmentos. Tales polipéptidos y proteínas de fusión, así como las moléculas de ácido nucleico que los codifican, pueden generarse fácilmente usando las técnicas convencionales, incluidas las técnicas recombinantes convencionales para la producción y expresión de un ácido polinucleico recombinante que codifica una proteína de fusión.

Entre las variantes de preferencia están las que varían de una referencia por sustituciones conservadoras de aminoácidos.

Tales sustituciones son las que sustituyen un aminoácido dado en un polipéptido por otro aminoácido de características similares. Las sustituciones conservadoras que se observan típicamente son los reemplazos, uno por otro, entre los aminoácidos alifáticos Ala, Val, Leu e Ile; los intercambios de los residuos hidroxilo Ser y Thr, el intercambio de los residuos ácidos Asp y Glu, la sustitución entre los residuos amida Asn y Gln, el intercambio de los residuos básicos Lys y Arg y los reemplazos entre los residuos aromáticos Phe y Tyr.

Además particularmente de preferencia en este aspecto están las variantes, los análogos, los derivados y los fragmentos, y las variantes, los análogos y los derivados de los fragmentos, que tienen la secuencia de aminoácidos de cualquier polipéptido presentado en el listado de secuencias, en la que ningún residuo de aminoácido, varios, unos pocos, 5 a 10, 1 a 5, 1 a 3, 2 ó 1 están sustituidos, delecionados o añadidos, en cualquier combinación. Resultan especialmente de preferencia entre éstas las sustituciones, adiciones y deleciones silenciosas, que no alteran las propiedades y actividades del polipéptido de la presente invención. También son especialmente de preferencia en este aspecto las sustituciones conservadoras. Los polipéptidos más altamente de preferencia son los que tienen una secuencia de aminoácidos presentada en el listado de secuencias sin sustituciones. Las sustituciones de aminoácidos específicamente adecuadas son las que están contenidas en los homólogos para las secuencias divulgadas en el listado de secuencias según la presente solicitud. Un derivado de secuencia adecuado de un antígeno o de un epítopo según se divulga en el presente documento incluye por consiguiente una o más variaciones presentes en una o más cepas o serotipos de S. pyogenes (de preferencia 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ó 10 intercambios de aminoácidos basados en tales variaciones homólogas). Tales antígenos comprenden secuencias que pueden ser secuencias que se presentan en la naturaleza o secuencias artificiales creadas nuevas. Estas variantes de antígenos de preferencia se basan en tales variaciones de secuencias que se presentan en la naturaleza, por ejemplo formando una "secuencia maestra" para las regiones antigénicas de los polipéptidos según la presente invención. Los ejemplos adecuados para tales variaciones o intercambios homólogos se presentan en la tabla 5 en la sección de ejemplos. Por ejemplo, una secuencia dada de S. pyogenes puede modificarse incluyendo una o más de tales variaciones creando de esta manera una variante artificial (es decir, que no se presenta en la naturaleza) de este antígeno dado (que se presenta en la naturaleza) o la secuencia del epítopo.

Los antígenos reactivos en suero hiperinmune y sus fragmentos de la presente invención se proporcionan de preferencia en una forma aislada, y de preferencia se purifican hasta homogeneidad.

Son posibles los polipéptidos que comprenden fragmentos de los polipéptidos que tienen la secuencia de aminoácidos presentada en el listado de secuencias, y los fragmentos de variantes y los derivados de los polipéptidos presentados en el listado de secuencias. En este aspecto, un fragmento es un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que es enteramente la misma que parte, pero no toda la secuencia de aminoácidos del antígeno reactivo en suero hiperinmune mencionado anteriormente y su fragmento, y sus variantes o derivados, análogos y fragmentos. Tales fragmentos pueden ser "independientes", es decir, pueden no ser parte o pueden no estar fusionados a otros aminoácidos o polipéptidos, o pueden estar comprendidos dentro de un polipéptido más grande del que forman una parte o una región. También resultan de preferencia en este aspecto los fragmentos caracterizados por los atributos estructurales o funcionales del polipéptido de la presente invención, es decir los fragmentos que comprenden la hélice alfa y las regiones que forman la hélice alfa, la lámina beta y las regiones que forman la lámina beta, giros y las regiones que forman giros, enrollamientos y las regiones que forman enrollamientos, regiones hidrófilas, regiones hidrófobas, regiones alfa anfipáticas, regiones beta anfipáticas, regiones flexibles, regiones que forman la superficie, regiones de unión al sustrato y regiones de índice antigénico alto del polipéptido de la presente invención, y las combinaciones de tales fragmentos. Las regiones de preferencia son las que median las actividades de los antígenos reactivos en suero hiperinmune y sus fragmentos de la presente invención. Los más altamente de preferencia en este aspecto son los fragmentos que tienen una actividad química, biológica u otra actividad del antígeno reactivo en suero hiperinmune y sus fragmentos de la presente invención, incluidos los que tienen una actividad similar o una actividad mejorada, o con una actividad indeseable disminuida. Son particularmente de preferencia los fragmentos que comprenden receptores o dominios de enzimas que confieren una función esencial para la viabilidad del S. pyogenes o la capacidad para causar enfermedad en los seres humanos. Otros fragmentos de polipéptidos de preferencia son los que comprenden o contienen determinantes antigénicos o inmunogénicos en un animal, especialmente en un ser humano.

Un fragmento antigénico se define como un fragmento del antígeno identificado que es por sí mismo antigénico o puede convertirse en antigénico cuando se proporciona como un hapteno. Por consiguiente, también los antígenos o fragmentos antigénicos que muestran uno o (para fragmentos más largos) solamente unos pocos intercambios de aminoácidos están permitidos con la presente invención, a condición de que las capacidades antigénicas de tales fragmentos con los intercambios de aminoácidos no se deterioren gravemente en el(los) intercambio(s), es decir, que sean adecuados para provocar una respuesta inmune apropiada en un individuo vacunado con este antígeno y sean identificados por las preparaciones de anticuerpos del individuo a partir del suero del individuo.

Los ejemplos contemplados de fragmentos de un antígeno reactivo en suero hiperinmune se seleccionan del grupo constituido por las secuencias de aminoácidos de la columna "aa inmunogénicos predichos" y "localización de la región inmunogénica identificada" de la Tabla 1; los epítopos reactivos al suero de la Tabla 2, en especial los péptidos que comprenden los aminoácidos 4-44, 57-65, 67-98, 101-107, 109-125, 131-144, 146-159, 168-173, 181-186, 191-200, 206-213, 229-245, 261-269, 288-301, 304-317, 323-328, 350-361, 374-384, 388-407, 416-425 y 1-114 de Sec. ID Nº 151; 5-17, 49-64, 77-82, 87-98, 118-125, 127-140, 142-150, 153-159, 191-207, 212-218, 226-270, 274-287, 297-306, 325-331, 340-347, 352-369, 377-382, 390-395 y 29-226 de Sec. ID Nº 152; 4-16, 20-26, 32-74, 76-87, 93-108, 116-141, 148-162, 165-180, 206-219, 221-228, 230-236, 239-245, 257-268, 313-328, 330-335, 353-359, 367-375, 394-403, 414-434, 437-444, 446-453, 456-464, 478-487, 526-535, 541-552, 568-575, 577-584, 589-598, 610-618, 624-643, 653-665, 667-681, 697-718, 730-748, 755-761, 773-794, 806-821, 823-831, 837-845, 862-877, 879-889, 896-919, 924-930, 935-940, 947-955, 959-964, 969-986, 991-1002, 1012-1036, 1047-1056, 1067-1073, 1079-1085, 1088-1111, 1130-1135, 1148-1164, 1166-1173, 1185-1192, 1244-1254 y 919-929 de Sec. ID Nº 153; 5-44, 62-74, 78-83, 99-105, 107-113, 124-134, 161-174, 176-194, 203-211, 216-237, 241-247, 253-266, 272-299, 323-349, 353-360 y 145-305 de Sec. ID Nº 154; 15-39, 52-61, 72-81, 92-97 y 71-81 de Sec. ID Nº 155; 13-19, 21-31, 40-108, 115-122, 125-140, 158-180, 187-203, 210-223, 235-245 y 173-186 de Sec. ID Nº 156; 5-12, 19-27, 29-39, 59-67, 71-78, 80-88, 92-104, 107-124, 129-142, 158-168, 185-191, 218-226, 230-243, 256-267, 272-277, 283-291, 307-325, 331-344, 346-352 y 316-331 de Sec. ID Nº 157; 6-28, 43-53, 60-76, 93-103 y 21-99 de Sec. ID Nº 158; 10-30,120-126, 145-151, 159-169, 174-182, 191-196, 201-206, 214-220, 222-232, 254-272, 292-307, 313-323, 332-353, 361-369, 389-396, 401-415, 428-439, 465-481, 510-517, 560-568 y 9-264 de Sec. ID Nº 159; 5-29, 39-45, 107-128 y 1-112 de Sec. ID Nº 160; 4-38, 42-50, 54-60, 65-71, 91-102 y 21-56 de Sec. ID Nº 161; 4-13, 19-25, 41-51, 54-62, 68-75, 79-89, 109-122, 130-136, 172-189, 192-198, 217-224, 262-268, 270-276, 281-298, 315-324, 333-342, 353-370, 376-391 y 23-39 de Sec. ID Nº 162; 6-41, 49-58, 62-103, 117-124, 147-166, 173-194, 204-211, 221-229, 255-261, 269-284, 288-310, 319-325, 348-380, 383-389, 402-410, 424-443, 467-479, 496-517, 535-553, 555-565, 574-581, 583-591 y 474-489 de Sec. ID Nº 163; 8-35, 52-57, 66-73, 81-88, 108-114, 125-131, 160-167, 174-180, 230-235, 237-249, 254-262, 278-285, 308-314, 321-326, 344-353, 358-372, 376-383, 393-411, 439-446, 453-464, 471-480, 485-492, 502-508, 523-529, 533-556, 558-563, 567-584, 589-597, 605-619, 625-645, 647-666, 671-678, 690-714, 721-728, 741-763, 766-773, 777-787, 792-802, 809-823, 849-864 y 37-241, 409-534, 582-604, 743-804 de Sec. ID Nº 164; 4-17, 24-36, 38-44, 59-67, 72-90, 92-121, 126-149, 151-159, 161-175, 197-215, 217-227, 241-247, 257-264, 266-275, 277-284, 293-307, 315-321, 330-337, 345-350, 357-366, 385-416 y 202-337 de Sec. ID Nº 165; 4-20, 22-46, 49-70, 80-89, 96-103, 105-119, 123-129, 153-160, 181-223, 227-233, 236-243, 248-255, 261-269, 274-279, 283-299, 305-313, 315-332, 339-344, 349-362, 365-373, 380-388, 391-397, 402-407 y 1-48 de Sec. ID Nº 166; 18-37, 41-63, 100-106,109-151, 153-167, 170-197,199-207, 212-229, 232-253, 273-297 y 203-217 de Sec. ID Nº 167; 20-26, 54-61, 80-88, 94-101, 113-119, 128-136, 138-144, 156-188, 193-201, 209-217, 221-229, 239-244, 251-257, 270-278, 281-290, 308-315, 319-332, 339-352, 370-381, 388-400, 411-417, 426-435, 468-482, 488-497, 499-506, 512-521 y 261-273 de Sec. ID Nº 168; 6-12, 16-36, 50-56, 86-92, 115-125, 143-152, 163-172, 193-203, 235-244, 280-289, 302-315, 325-348, 370-379, 399-405, 411-417, 419-429, 441-449, 463-472, 482-490, 500-516, 536-543, 561-569, 587-594, 620-636, 647-653, 659-664, 677-685, 687-693, 713-719, 733-740, 746-754, 756-779, 792-799, 808-817, 822-828, 851-865, 902-908, 920-938, 946-952, 969-976, 988-1005, 1018-1027, 1045-1057, 1063-1069, 1071-1078, 1090-1099, 1101-1109, 1113-1127, 1130-1137, 1162-1174, 1211-1221, 1234-1242, 1261-1268, 1278-1284, 1312-1317, 1319-1326, 1345-1353, 1366-1378, 1382-1394, 1396-1413, 1415-1424, 1442-1457, 1467-1474, 1482-1490, 1492-1530, 1537-1549, 1559-1576, 1611-1616, 1624-1641 y 1-414, 443-614, 997-1392 de Sec. ID Nº 169; 14-42, 70-75, 90-100, 158-181 y 1-164 de Sec. ID Nº 170; 4-21, 30-36, 54-82, 89-97, 105-118, 138-147 y 126-207 de Sec. ID Nº 171; 4-21, 31-66, 96-104, 106-113, 131-142 y 180-204 de Sec. ID Nº 172; 5-23, 31-36, 38-55, 65-74, 79-88, 101-129, 131-154, 156-165, 183-194, 225-237, 245-261, 264-271, 279-284, 287-297, 313-319, 327-336, 343-363, 380-386 y 11-197, 204-219, 258-372 de Sec. ID Nº 173; 4-20, 34-41, 71-86, 100-110, 113-124, 133-143,150-158, 160-166, 175-182, 191-197, 213-223, 233-239, 259-278, 298-322 y 195-289 de Sec. ID Nº 174; 4-10, 21-35, 44-52, 54-62, 67-73, 87-103, 106-135, 161-174, 177-192, 200-209, 216-223, 249-298, 304-312, 315-329 y 12-130 de Sec. ID Nº 175; 10-27, 33-38, 48-55, 70-76, 96-107, 119-133, 141-147, 151-165, 183-190, 197-210, 228-236, 245-250, 266-272, 289-295, 297-306, 308-315, 323-352, 357-371, 381-390, 394-401, 404-415, 417-425, 427-462, 466-483, 485-496, 502-507, 520-529, 531-541, 553-570, 577-588, 591-596, 600-610, 619-632, 642-665, 671-692, 694-707 y 434-444 de Sec. ID Nº 176; 6-14, 16-25, 36-46, 52-70, 83-111, 129-138, 140-149, 153-166, 169-181, 188-206, 212-220, 223-259, 261-269, 274-282, 286-293, 297-306, 313-319, 329-341, 343-359, 377-390, 409-415, 425-430 y 360-375 de Sec. ID Nº 177; 4-26, 28-48, 54-62, 88-121, 147-162, 164-201, 203-237, 245-251 y 254-260 de Sec. ID Nº 178; 12-21, 26-32, 66-72, 87-93, 98-112, 125-149, 179-203, 209-226, 233-242, 249-261, 266-271, 273-289, 293-318, 346-354, 360-371, 391-400 y 369-382 de Sec. ID Nº 179; 11-38, 44-65, 70-87, 129-135, 140-163, 171-177, 225-232, 238-249, 258-266, 271-280, 284-291, 295-300, 329-337, 344-352, 405-412, 416-424, 426-434, 436-455, 462-475, 478-487 y 270-312 de Sec. ID Nº 180; 5-17, 34-45, 59-69, 82-88, 117-129, 137-142, 158-165, 180-195, 201-206, 219-226, 241-260, 269-279, 292-305, 312-321, 341-347, 362-381, 396-410, 413-432, 434-445, 447-453, 482-487, 492-499, 507-516, 546-552, 556-565, 587-604 y 486-598 de Sec. ID Nº 181; 4-15, 17-32, 40-47, 67-78, 90-98, 101-107, 111-136, 161-171, 184-198, 208-214, 234-245, 247-254, 272-279, 288-298, 303-310, 315-320, 327-333, 338-349, 364-374 y 378-396 de Sec. ID Nº 182; 5-27, 33-49, 51-57, 74-81, 95-107, 130-137, 148-157, 173-184 y 75-235 de Sec. ID Nº 183; 6-23, 47-53, 57-63, 75-82, 97-105, 113-122, 124-134, 142-153, 159-164, 169-179, 181-187, 192-208, 215-243, 247-257, 285-290, 303-310 y 30-51 de Sec. ID Nº 184; 17-29, 44-52, 59-73, 77-83, 86-92, 97-110, 118-153, 156-166, 173-179, 192-209, 225-231, 234-240, 245-251, 260-268, 274-279, 297-306, 328-340, 353-360, 369-382, 384-397, 414-423, 431-436, 452-465, 492-498, 500-508, 516-552, 554-560, 568-574, 580-586, 609-617, 620-626, 641-647 y 208-219 de Sec. ID Nº 185; 4-26, 32-45, 58-72,111-119,137-143, 146-159, 187-193, 221-231, 235-242, 250-273, 290-304, 311-321, 326-339, 341-347, 354-368, 397-403, 412-419, 426-432, 487-506, 580-592, 619-628, 663-685, 707-716, 743-751, 770-776, 787-792, 850-859, 866-873, 882-888, 922-931, 957-963, 975-981, 983-989, 1000-1008, 1023-1029, 1058-1064, 1089-1099, 1107-1114, 1139-1145, 1147-1156, 1217-1226, 1276-1281, 1329-1335, 1355-1366, 1382-1394, 1410-1416, 1418-1424, 1443-1451, 1461-1469, 1483-1489, 1491-1501, 1515-1522, 1538-1544, 1549-1561, 1587-1593, 1603-1613, 1625-1630, 1636-1641, 1684-1690, 1706-1723, 1765-1771, 1787-1804, 1850-1857, 1863-1894, 1897-1910, 1926-1935, 1937-1943, 1960-1983, 1991-2005, 2008-2014, 2018-2039 y 396-533, 1342-1502, 1672-1920 de Sec. ID Nº 186; 4-25, 45-50, 53-65, 79-85, 87-92, 99-109, 126-137, 141-148, 156-183, 190-203, 212-217, 221-228, 235-242, 247-277, 287-293, 300-319, 321-330, 341-361, 378-389, 394-406, 437-449, 455-461, 472-478, 482-491, 507-522, 544-554, 576-582, 587-593, 611-621, 626-632, 649-661, 679-685, 696-704, 706-716, 726-736, 740-751, 759-766, 786-792, 797-802, 810-822, 824-832, 843-852, 863-869, 874-879, 882-905 y 1-113, 210-232, 250-423, 536-564 de Sec. ID Nº 187; 4-16, 33-39, 43-49, 54-85, 107-123, 131-147, 157-169, 177-187, 198-209, 220-230, 238-248, 277-286, 293-301, 303-315, 319-379, 383-393, 402-414, 426-432, 439-449, 470-478, 483-497, 502-535, 552-566, 571-582, 596-601, 608-620, 631-643, 651-656, 663-678, 680-699, 705-717, 724-732, 738-748, 756-763, 766-772, 776-791, 796-810, 819-827, 829-841, 847-861, 866-871, 876-882, 887-894, 909-934, 941-947, 957-969, 986-994, 998-1028, 1033-1070, 1073-1080, 1090-1096, 1098-1132, 1134-1159, 1164-1172, 1174-1201 y 617-635 de Sec. ID Nº 188; 7-25, 30-40, 42-64, 70-77, 85-118, 120-166, 169-199, 202-213, 222-244 y 190-203 de Sec. ID Nº 189; 4-11, 15-53, 55-93, 95-113, 120-159, 164-200, 210-243, 250-258, 261-283, 298-319, 327-340, 356-366, 369-376, 380-386, 394-406, 409-421, 425-435, 442-454, 461-472, 480-490, 494-505, 507-514, 521-527, 533-544, 566-574 y 385-398 de Sec. ID Nº 190; 5-36, 66-72, 120-127, 146-152, 159-168, 172-184, 205-210, 221-232, 234-243, 251-275, 295-305, 325-332, 367-373, 470-479, 482-487, 520-548, 592-600, 605-615, 627-642, 655-662, 664-698, 718-725, 734-763, 776-784, 798-809, 811-842, 845-852, 867-872, 879-888, 900-928, 933-940, 972-977, 982-1003 y 12-190, 276-283, 666-806 de Sec. ID Nº 191; 4-38, 63-68, 100-114, 160-173, 183-192, 195-210, 212-219, 221-238, 240-256, 258-266, 274-290, 301-311, 313-319, 332-341, 357-363, 395-401, 405-410, 420-426, 435-450, 453-461, 468-475, 491-498, 510-518, 529-537, 545-552, 585-592, 602-611, 634-639, 650-664 y 30-80, 89-105, 111-151 de Sec. ID Nº 192; 7-29, 31-39, 47-54, 63-74, 81-94, 97-117, 122-127, 146-157, 168-192, 195-204, 216-240, 251-259 y 195-203 de Sec. ID Nº 193; 5-16, 28-34, 46-65, 79-94, 98-105, 107-113, 120-134, 147-158, 163-172, 180-186, 226-233, 237-251, 253-259, 275-285, 287-294, 302-308, 315-321, 334-344, 360-371, 399-412, 420-426 y 32-50 de Sec. ID Nº 194; 8-20, 30-36, 71-79, 90-96, 106-117, 125-138, 141-147, 166-174 y 75-90 de Sec. ID Nº 195; 4-13, 15-33, 43-52, 63-85, 98-114, 131-139, 146-174, 186-192, 198-206, 227-233 y 69-88 de Sec. ID Nº 196; 4-22, 29-35, 59-68, 153-170, 213-219, 224-238, 240-246, 263-270, 285-292, 301-321, 327-346, 356-371, 389-405, 411-418, 421-427, 430-437, 450-467, 472-477, 482-487, 513-518, 531-538, 569-576, 606-614, 637-657, 662-667, 673-690, 743-753, 760-767, 770-777, 786-802 y 96-230, 361-491, 572-585 de Sec. ID Nº 197; 4-12, 21-36, 48-55, 74-82, 121-127, 195-203, 207-228, 247-262, 269-278, 280-289 y 102-210 de Sec. ID Nº 198; 13-20, 23-31, 38-44, 78-107, 110-118, 122-144, 151-164, 176-182, 190-198, 209-216, 219-243, 251-256, 289-304, 306-313 y 240-248 de Sec. ID Nº 199; 5-26, 34-48, 57-77, 84-102, 116-132, 139-145, 150-162, 165-173, 176-187, 192-205, 216-221, 234-248, 250-260 y 182-198 de Sec. ID Nº 200; 10-19, 26-44, 53-62, 69-87, 90-96, 121-127, 141-146, 148-158, 175-193, 204-259, 307-313, 334-348, 360-365, 370-401, 411-439, 441-450, 455-462, 467-472, 488-504 y 41-56 de Sec. ID Nº 201; 5-21, 36-42, 96-116, 123-130, 138-144, 146-157, 184-201, 213-228, 252-259, 277-297, 308-313, 318-323, 327-333 y 202-217 de Sec. ID Nº 202; 6-26, 33-51, 72-90, 97-131, 147-154, 164-171, 187-216, 231-236, 260-269, 275-283 y 1-127 de Sec. ID Nº 203; 4-22, 24-38, 44-58, 72-88, 99-108, 110-117, 123-129, 131-137, 142-147, 167-178, 181-190, 206-214, 217-223, 271-282, 290-305, 320-327, 329-336, 343-352, 354-364, 396-402, 425-434, 451-456, 471-477, 485-491, 515-541, 544-583, 595-609, 611-626, 644-656, 660-681, 683-691, 695-718 y 297-458 de Sec. ID Nº 204; 5-43, 92-102, 107-116, 120-130, 137-144, 155-163, 169-174, 193-213 y 24-135 de Sec. ID Nº 205; 4-25, 61-69, 73-85, 88-95, 97-109, 111-130, 135-147, 150-157, 159-179, 182-201, 206-212, 224-248, 253-260, 287-295, 314-331, 338-344, 365-376, 396-405, 413-422, 424-430, 432-449, 478-485, 487-494, 503-517, 522-536, 544-560, 564-578, 585-590, 597-613, 615-623, 629-636, 640-649, 662-671, 713-721 y 176-330 de Sec. ID Nº 206; 31-37, 41-52, 58-79, 82-105, 133-179, 184-193, 199-205, 209-226, 256-277, 281-295, 297-314, 322-328, 331-337, 359-367, 379-395, 403-409, 417-432, 442-447, 451-460, 466-472 y 46-62, 296-341 de Sec. ID Nº 207; 23-29, 56-63, 67-74, 96-108, 122-132, 139-146, 152-159, 167-178, 189-196, 214-231, 247-265, 274-293, 301-309, 326-332, 356-363, 378-395, 406-412, 436-442, 445-451, 465-479, 487-501, 528-555, 567-581, 583-599, 610-617, 622-629, 638-662, 681-686, 694-700, 711-716 y 667-684 de Sec. ID Nº 208; 20-51, 53-59, 109-115, 140-154, 185-191, 201-209, 212-218, 234-243, 253-263, 277-290, 303-313, 327-337, 342-349, 374-382, 394-410, 436-442, 464-477, 486-499, 521-530, 536-550, 560-566, 569-583, 652-672, 680-686, 698-704, 718-746, 758-770, 774-788, 802-827, 835-842, 861-869 y 258-416 de Sec. ID Nº 209; 7-25, 39-45, 59-70, 92-108, 116-127, 161-168, 202-211, 217-227, 229-239, 254-262, 271-278, 291-300 y 278-295 de Sec. ID Nº 210; 4-20, 27-33, 45-51, 53-62, 66-74, 81-88, 98-111, 124-130, 136-144, 156-179, 183-191 y 183-195 de Sec. ID Nº 211; 12-24, 27-33, 43-49, 55-71, 77-85, 122-131, 168-177, 179-203, 209-214, 226-241 y 63-238 de Sec. ID Nº 212; 4-19, 37-50, 120-126, 131-137, 139-162, 177-195, 200-209, 211-218, 233-256, 260-268, 271-283, 288-308 y 1-141 de Sec. ID Nº 213; 11-17, 40-47, 57-63, 96-124, 141-162, 170-207, 223-235, 241-265, 271-277, 281-300, 312-318, 327-333, 373-379 y 231-368 de Sec. ID Nº 214; 9-33, 41-48, 57-79, 97-103, 113-138, 146-157, 165-186, 195-201, 209-215, 223-229, 237-247, 277-286, 290-297, 328-342 y 247-260 de Sec. ID Nº 215; 7-15, 39-45, 58-64, 79-84, 97-127, 130-141, 163-176, 195-203, 216-225, 235-247, 254-264, 271-279 y 64-72 de Sec. ID Nº 216; 4-12, 26-42, 46-65, 73-80, 82-94, 116-125, 135-146, 167-173, 183-190, 232-271, 274-282, 300-306, 320-343, 351-362, 373-383, 385-391, 402-409, 414-426, 434-455, 460-466, 473-481, 485-503, 519-525, 533-542, 554-565, 599-624, 645-651, 675-693, 717-725, 751-758, 767-785, 792-797, 801-809, 819-825, 831-836, 859-869, 890-897 y 222-362, 756-896 de Sec. ID Nº 217; 11-17, 22-28, 52-69, 73-83, 86-97, 123-148, 150-164, 166-177, 179-186, 188-199, 219-225, 229-243, 250-255 y 153-170 de Sec. ID Nº 218; 4-61, 71-80, 83-90, 92-128, 133-153, 167-182, 184-192, 198-212 y 56-73 de Sec. ID Nº 219; 4-19, 26-37, 45-52, 58-66, 71-77, 84-92, 94-101, 107-118, 120-133, 156-168, 170-179, 208-216, 228-238, 253-273, 280-296, 303-317, 326-334 y 298-312 de Sec. ID Nº 220; 7-13, 27-35, 38-56, 85-108, 113-121, 123-160, 163-169, 172-183, 188-200, 206-211, 219-238, 247-254 y 141-157 de Sec. ID Nº 221; 23-39, 45-73, 86-103, 107-115, 125-132, 137-146, 148-158, 160-168, 172-179, 185-192, 200-207, 210-224, 233-239, 246-255, 285-334, 338-352, 355-379, 383-389, 408-417, 423-429, 446-456, 460-473, 478-503, 522-540, 553-562, 568-577, 596-602, 620-636, 640-649, 655-663 y 433-440, 572-593 de Sec. ID Nº 222; 4-42, 46-58, 64-76, 118-124, 130-137, 148-156, 164-169, 175-182, 187-194, 203-218, 220-227, 241-246, 254-259, 264-270, 275-289, 296-305, 309-314, 322-334, 342-354, 398-405, 419-426, 432-443, 462-475, 522-530, 552-567, 593-607, 618-634, 636-647, 653-658, 662-670, 681-695, 698-707, 709-720, 732-742, 767-792, 794-822, 828-842, 851-866, 881-890, 895-903, 928-934, 940-963, 978-986, 1003-1025, 1027-1043, 1058-1075, 1080-1087, 1095-1109,1116-1122,1133-1138,1168-1174, 1179-1186,1207-1214,1248-1267 y 17-319, 417-563 de Sec. ID Nº 223; 6-19, 23-33, 129-138, 140-150, 153-184, 190-198, 206-219, 235-245, 267-275, 284-289, 303-310, 322-328, 354-404, 407-413, 423-446, 453-462, 467-481, 491-500 y 46-187 de Sec. ID Nº 224; 4-34, 39-57, 78-86, 106-116, 141-151, 156-162, 165-172, 213-237, 252-260, 262-268, 272-279, 296-307, 332-338, 397-403, 406-416, 431-446, 448-453, 464-470, 503-515, 519-525, 534-540, 551-563, 578-593, 646-668, 693-699, 703-719, 738-744, 748-759, 771-777, 807-813, 840-847, 870-876, 897-903, 910-925, 967-976, 979-992 y 21-244, 381-499, 818-959 de Sec. ID Nº 225; 19-29, 65-75, 90-109, 111-137, 155-165, 169-175 y 118-136 de Sec. ID Nº 226; 15-20, 30-36, 55-63, 73-79, 90-117, 120-127, 136-149, 166-188, 195-203, 211-223, 242-255, 264-269, 281-287, 325-330, 334-341, 348-366, 395-408, 423-429, 436-444, 452-465 y 147-155 de Sec. ID Nº 227; 11-18, 21-53, 77-83, 91-98, 109-119, 142-163, 173-181, 193-208, 216-227, 238-255, 261-268, 274-286, 290-297, 308-315, 326-332, 352-359, 377-395, 399-406, 418-426, 428-438, 442-448, 458-465, 473-482, 488-499, 514-524, 543-553, 564-600, 623-632, 647-654, 660-669, 672-678, 710-723, 739-749, 787-793, 820.-_828, 838-860, 889-895, 901-907, 924-939, 956-962, 969-976, 991-999,1012-1018, 1024-1029, 1035-1072, 1078-1091,1142-1161 y 74-438 de Sec. ID Nº 228; 4-31, 41-52, 58-63, 65-73, 83-88, 102-117, 123-130, 150-172, 177-195, 207-217, 222-235, 247-253, 295-305, 315-328, 335-342, 359-365, 389-394, 404-413 y 156-420 de Sec. ID Nº 229; 4-42, 56-69, 98-108,120-125, 210-216, 225-231, 276-285, 304-310, 313-318, 322-343 y 79-348 de Sec. ID Nº 230; 12-21, 24-30, 42-50, 61-67, 69-85, 90-97, 110-143, 155-168 y 53-70 de Sec. ID Nº 231; 4-26, 41-54, 71-78, 88-96, 116-127, 140-149, 151-158, 161-175, 190-196, 201-208, 220-226, 240-247, 266-281, 298-305, 308-318, 321-329, 344-353, 370-378, 384-405, 418-426, 429-442, 457-463, 494-505, 514-522 y 183-341 de Sec. ID Nº 232; 4-27, 69-77, 79-101, 117-123, 126-142, 155-161, 171-186, 200-206, 213-231, 233-244, 258-263, 269-275, 315-331, 337-346, 349-372, 376-381, 401-410, 424-445, 447-455, 463-470, 478-484, 520-536, 546-555, 558-569, 580-597, 603-618, 628-638, 648-660, 668-683, 717-723, 765-771, 781-788, 792-806, 812-822 y 92-231, 618-757 de Sec. ID Nº 233; 11-47, 63-75, 108-117, 119-128, 133-143, 171-185, 190-196, 226-232, 257-264, 278-283, 297-309, 332-338, 341-346, 351-358, 362-372 y 41-170 de Sec. ID Nº 234; 6-26, 50-56, 83-89, 108-114, 123-131, 172-181, 194-200, 221-238, 241-259, 263-271, 284-292, 304-319, 321-335, 353-358, 384-391, 408-417, 424-430, 442-448, 459-466, 487-500, 514-528, 541-556, 572-578, 595-601, 605-613, 620-631, 634-648, 660-679, 686-693, 702-708, 716-725, 730-735, 749-755, 770-777, 805-811, 831-837, 843-851, 854-860, 863-869, 895-901, 904-914, 922-929, 933-938, 947-952, 956-963, 1000-1005, 1008-1014, 1021-1030, 1131-1137, 1154-1164, 1166-1174 y 20-487, 757-1153 de Sec. ID Nº 235; 10-34, 67-78, 131-146, 160-175, 189-194, 201-214, 239-250, 265-271, 296-305 y 26-74, 91-100, 105-303 de Sec. ID Nº 236; 9-15, 19-32, 109-122, 143-150, 171-180, 186-191, 209-217, 223-229, 260-273, 302-315, 340-346, 353-359, 377-383, 389-406, 420-426, 460-480 y 10-223, 231-251, 264-297, 312-336 de Sec. ID Nº 237; 5-28, 76-81, 180-195, 203-209, 211-219, 227-234, 242-252, 271-282, 317-325, 350-356, 358-364, 394-400, 405-413, 417-424, 430-436, 443-449, 462-482, 488-498, 503-509, 525-537 y 22-344 de Sec. ID Nº 238; 5-28, 42-54, 77-83, 86-93, 98-104, 120-127, 145-159, 166-176, 181-187, 189-197, 213-218, 230-237, 263-271, 285-291, 299-305, 326-346, 368-375, 390-395 y 1-151 de Sec. ID Nº 239; 6-34, 48-55, 58-64, 84-101, 121-127,143-149,153-159, 163-170, 173-181, 216-225, 227-240, 248-254, 275-290, 349-364, 375-410, 412-418, 432-438, 445-451, 465-475, 488-496, 505-515, 558-564, 571-579, 585-595, 604-613, 626-643, 652-659, 677-686, 688-696, 702-709, 731-747, 777-795, 820-828, 836-842, 845-856, 863-868, 874-882,900-909,926-943,961-976,980-986,992-998,1022-1034, 1044-1074, 1085-1096, 1101-1112, 1117-1123, 1130-1147, 1181-1187, 1204-1211, 1213-1223, 1226-1239, 1242-1249, 1265-1271, 1273-1293, 1300-1308, 1361-1367, 1378-1384, 1395-1406, 1420-1428, 1439-1446, 1454-1460, 1477-1487, 1509-1520, 1526-1536, 1557-1574, 1585-1596, 1605-1617, 1621-1627, 1631-1637, 1648-1654, 1675-1689, 1692-1698, 1700-1706, 1712-1719, 1743-1756 y 91-263 de Sec. ID Nº 240; 4-16, 75-90, 101-136, 138-144,158-164,171-177,191-201, 214-222, 231-241, 284-290, 297-305, 311-321, 330-339, 352-369, 378-385, 403-412, 414-422, 428-435, 457-473, 503-521, 546-554, 562-568, 571-582, 589-594, 600-608, 626-635, 652-669, 687-702, 706-712, 718-724, 748-760, 770-775 y 261-272 de Sec. ID Nº 241; 4-19, 30-41, 46-57, 62-68, 75-92, 126-132, 149-156, 158-168, 171-184, 187-194, 210-216, 218-238, 245-253, 306-312, 323-329, 340-351, 365-373, 384-391, 399-405, 422-432, 454-465, 471-481, 502-519, 530-541, 550-562, 566-572, 576-582, 593-599, 620-634, 637-643, 645-651, 657-664, 688-701 y 541-551 de Sec. ID Nº 242; 6-11, 17-25, 53-58, 80-86, 91-99, 101-113, 123-131, 162-169, 181-188, 199-231, 245-252 y 84-254 de Sec. ID Nº 243; 13-30, 71-120, 125-137, 139-145, 184-199 y 61-78 de Sec. ID Nº 244; 9-30, 38-53, 63-70, 74-97, 103-150, 158-175, 183-217, 225-253, 260-268, 272-286, 290-341, 352-428, 434-450, 453-460, 469-478, 513-525, 527-534, 554-563, 586-600, 602-610, 624-640, 656-684, 707-729, 735-749, 757-763, 766-772, 779-788, 799-805, 807-815, 819-826, 831-855 y 568-580 de Sec. ID Nº 245; 11-21, 29-38 y 5-17 de Sec. ID Nº 246; 2-9 de Sec. ID Nº 247; 4-10, 16-28 y 7-18, 26-34 de Sec. ID Nº 248; 10-16 y 1-15 de Sec. ID Nº 249; 4-11 de Sec. ID Nº 250; 4-40, 42-51 y de Sec. ID Nº 251; 4-21 y 22-29 de Sec. ID Nº 252; 2-11 Sec. ID Nº 253; 9-17, 32-44 y 1-22 de Sec. ID Nº 254; 19-25, 27-32 y 15-34 de Sec. ID Nº 255; 4-12, 15-22 y 11-33 de Sec. ID Nº 256; 10-17, 24-30, 39-46, 51-70 y 51-61 de Sec. ID Nº 257; 6-19 de Sec. ID Nº 258; 6-11, 21-27, 31-54 y 11-29 de Sec. ID Nº 259; 4-10, 13-45 y 11-35 de Sec. ID Nº 260; 4-14, 23-32 y 11-35 de Sec. ID Nº 261; 14-39, 45-51 y 15-29 de Sec. ID Nº 262; 4-11, 14-28 y 4-17 de Sec. ID Nº 263; 4-16 y 2-16 de Sec. ID Nº 264; 4-10, 12-19, 39-50 y 6-22 de Sec. ID Nº 265; 2-13 de Sec. ID Nº 266; 4-11, 22-65 y 3-19 de Sec. ID Nº 267; 17-23, 30-35, 39-46, 57-62 y 30-49 de Sec. ID Nº 268; 4-19 y 14-22 de Sec. ID Nº 269; 2-9 de Sec. ID Nº 270; 7-18, 30-43 y 4-12 de Sec. ID Nº 271; 4-30, 39-47 y 5-22 de Sec. ID Nº 272; 6-15 y 14-29 de Sec. ID Nº 273; 4-34 y 23-35 de Sec. ID Nº 274; 4-36, 44-57, 65-72 y 14-27 de Sec. ID Nº 275; 4-18 y 11-20 de Sec. ID Nº 276; 5-19 de Sec. ID Nº 277; 18-36 y 6-20 de Sec. ID Nº 278; 4-10, 19-34, 41-84, 96-104 y 50-63 de Sec. ID Nº 279; 4-9, 19-27 y 8-21 de Sec. ID Nº 280; 4-16, 18-28 y 22-30 de Sec. ID Nº 281; 4-15 y 21-35 de Sec. ID Nº 282; 4-17 y 3-13 de Sec. ID Nº 283; 4-12 y 4-18 de Sec. ID Nº 284; 4-24, 31-36 y 29-45 de Sec. ID Nº 285;_12-22, 34-49 y 21-32 de Sec. ID Nº 286; 4-17 y 22-32 de Sec. ID Nº 287; 4-16, 25-42 y 7-28 de Sec. ID Nº 288; 4-10 y 7-20 de Sec. ID Nº 289; 4-11,16-36,39-54 y 28-44 de Sec. ID Nº 290; 5-20, 29-54 y 14-29 de Sec. ID Nº 291; 24-33 y 10-22 de Sec. ID Nº 292; 10-51, 54-61 y 43-64 de Sec. ID Nº 293; 7-13 y 2-17 de Sec. ID Nº 294; 11-20 y 6-20 de Sec. ID Nº 295; 4-30, 34-41 y 19-28 de Sec. ID Nº 296; 11-21 de Sec. ID Nº 297; 4-16, 21-26 y 9-38 de Sec. ID Nº 298; 4-12, 15-27, 30-42, 66-72 y 10-24 de Sec. ID Nº 299; 8-17 y 11-20 de Sec. ID Nº 300; y 2-19 de Sec. ID Nº246; 1-12 de Sec. ID Nº 247; 21-38 de Sec. ID Nº 248; 2-22 de Sec. ID Nº 254; 15-33 de Sec. ID Nº 255; 11-32 de Sec. ID Nº 256; 11-28 de Sec. ID Nº 259; 10-27 de Sec. ID Nº 260; 9-26 de Sec. ID Nº 261; 4-16 de Sec. ID Nº 263;_1-18 de Sec. ID Nº 266; 12-29 de Sec. ID Nº 273; 6-23 de Sec. ID Nº 276; 1-21 de Sec. ID Nº 277; 47-64 de Sec. ID Nº 279; 28-45 de Sec. ID Nº 285; 18-35 de Sec. ID Nº 287; 14-31 de Sec. ID Nº 291; 7-24 de Sec. ID Nº 292; 8-25 de Sec. ID Nº 299; 1-20 de Sec. ID Nº 300;_18-33 de Sec. ID Nº 151; 62-72 de Sec. ID Nº 151;_118-131 de Sec. ID Nº 152; 195-220 de Sec. ID Nº 154; 215-240 de Sec. ID Nº 154; 255-280 de Sec. ID Nº 154, 72-81 de Sec. ID Nº 155; 174-186 de Sec. ID Nº 156; 317-331 de Sec. ID Nº 157; 35-59 de Sec. ID Nº 158; 54-84 de Sec. ID Nº 158; 79-104 de Sec. ID Nº 158; 33-58 de Sec. ID Nº 159; 81-101 de Sec. ID Nº 159; 136-150 de Sec. ID Nº 159; 173-186 de Sec. ID Nº 159; 231-251 de Sec. ID Nº 159; 22-48 de Sec. ID Nº 161; 24-39 de Sec. ID Nº 162; 475-489 de Sec. ID Nº 163; 38-56 de Sec. ID Nº 164; 583-604 de Sec. ID Nº 164; 202-223 de Sec. ID Nº 165; 222-247 de Sec. ID Nº 165; 242-267 de Sec. ID Nº 165; 262-287 de Sec. ID Nº 165; 282-307 de Sec. ID Nº 165; 302-327 de Sec. ID Nº 165; 25-48 de Sec. ID Nº 166; 204-217 de Sec. ID Nº 167; 259-276 de Sec. ID Nº 168; 121-139 de Sec. ID Nº 169; 260-267 de Sec. ID Nº 169; 215-240 de Sec. ID Nº 169; 115-140 de Sec. ID Nº 170; 182-204 de Sec. ID Nº 172; 144-153 de Sec. ID Nº 173; 205-219 de Sec. ID Nº 173; 196-206 de Sec. ID Nº 174; 240-249 de Sec. ID Nº 174; 272-287 de Sec. ID Nº 174; 199-223 de Sec. ID Nº 174; 218-237 de Sec. ID Nº 174; 226-249 de Sec. ID Nº 175; 287-306 de Sec. ID Nº 175; 430-449 de Sec. ID Nº 176; 361-375 de Sec. ID Nº 177; 241-260 de Sec. ID Nº 178; 483-502 de Sec. ID Nº 181; 379-396 de Sec. ID Nº 182; 31-51 de Sec. ID Nº 184; 1436-1460 de Sec. ID Nº 186; 1455-1474 de Sec. ID Nº 186; 1469-1487 de Sec. ID Nº 186; 215-229 de Sec. ID Nº 187; 534-561 de Sec. ID Nº 187; 59-84 de Sec. ID Nº 187; 79-104 de Sec. ID Nº 187; 618-635 de Sec. ID Nº 188; 191-203 de Sec. ID Nº 189; 386-398 de Sec. ID Nº 190; 65-83 de Sec. ID Nº 191; 90-105 de Sec. ID Nº 192; 112-136 de Sec. ID Nº 192; 290-209 de Sec. ID Nº 193; 33-50 de Sec. ID Nº 194; 76-90 de Sec. ID Nº 195; 70-88 de Sec. ID Nº 196; 418-442 de Sec. ID Nº 197; 574-585 de Sec. ID Nº 197; 87-104 de Sec. ID Nº 198; 124-148 de Sec. ID Nº 198; 141-152 de Sec. ID Nº 198; 241-248 de Sec. ID Nº 199; 183-198 de Sec. ID Nº 200; 40-57 de Sec. ID Nº 201; 202-217 de Sec. ID Nº 202; 50-74 de Sec. ID Nº 203; 69-93 de Sec. ID Nº 203; 88-112 de Sec. ID Nº 203; 107-127 de Sec. ID Nº 203; 74-92 de Sec. ID Nº 205; 207-232 de Sec. ID Nº 206; 227-252 de Sec. ID Nº 206; 247-272 de Sec. ID Nº 206; 47-60 de Sec. ID Nº 207; 297-305 de Sec. ID Nº 207; 312-337 de Sec. ID Nº 207; 667-384 de Sec. ID Nº 208; 279-295 de Sec. ID Nº 210; 179-198 de Sec. ID Nº 211; 27-51 de Sec. ID Nº 213; 46-70 de Sec. ID Nº 213; 65-89 de Sec. ID Nº 213; 84-108 de Sec. ID Nº 213; 112-141 de Sec. ID Nº 213; 248-260 de Sec. ID Nº 215; 59-78 de Sec. ID Nº 216; 154-170 de Sec. ID Nº 218; 57-73 de Sec. ID Nº 219; 297-314 de Sec. ID Nº 220; 142-157 de Sec. ID Nº 221; 428-447 de Sec. ID Nº 222; 573-593 de Sec. ID Nº 222; 523-544 de Sec. ID Nº 223; 46-70 de Sec. ID Nº 223; 65-89 de Sec. ID Nº 223; 84-108 de Sec. ID Nº 223; 122-151 de Sec. ID Nº 223; 123-142 de Sec. ID Nº 224; 903-921 de Sec. ID Nº 225; 119-136 de Sec. ID Nº 226; 142-161 de Sec. ID Nº 227; 258-277 de Sec. ID Nº 228; 272-300 de Sec. ID Nº 228; 295-322 de Sec. ID Nº 228; 311-343 de Sec. ID Nº 229; 278-304 de Sec. ID Nº 229; 131-150 de Sec. ID Nº 230; 195-218 de Sec. ID Nº 230; 53-70 de Sec. ID Nº 231; 184-208 de Sec. ID Nº 232; 222-246 de Sec. ID Nº 232; 241-265 de Sec. ID Nº 232; 260-284 de Sec. ID Nº 232; 279-303 de Sec. ID Nº 232; 317-341 de Sec. ID Nº 232; 678-696 de Sec. ID Nº 233; 88-114 de Sec. ID Nº 235; 464-481 de Sec. ID Nº 235; 153-172 de Sec. ID Nº 236; 137-155, 166-184 de Sec. ID Nº 236; 215-228 de Sec. ID Nº 236; 37-51 de Sec. ID Nº 237; 53-75 de Sec. ID Nº 237; 232-251 de Sec. ID Nº 237; 318-336 de Sec. ID Nº 237; 305-315 de Sec. ID Nº 238; 131-156 de Sec. ID Nº 238; 258-275 de Sec. ID Nº 241; 107-137 de Sec. ID Nº 243; 138-162 de Sec. ID Nº 243; 157-181 de Sec. ID Nº 243; 195-227 de Sec. ID Nº 243; 62-78 de Sec. ID Nº 244; 567-584 de Sec. ID Nº 245, y los fragmentos que comprenden al menos 6, de preferencia más de 8, especialmente más de 10 aminoácidos de dichas secuencias.

\vskip1.000000\baselineskip

Todos los fragmentos lineales de un antígeno particular reactivos en suero hiperinmune pueden identificarse analizando la secuencia completa del antígeno proteico por una serie de péptidos solapados por 1 aminoácido con una longitud de al menos 10 aminoácidos. Posteriormente, pueden identificarse los epítopos no lineales por el análisis del antígeno proteico con sueros hiperinmunes usando la proteína de longitud total expresada o sus polipéptidos de dominios. Asumiendo que un dominio definido de una proteína es suficiente para formar la estructura tridimensional independiente de la proteína nativa, el análisis del respectivo polipéptido de dominio recombinante o producido sintéticamente con el suero hiperinmune permitirá la identificación de epítopos conformacionales dentro de los dominios individuales de proteínas de múltiples dominios. Para los antígenos en los que un dominio tiene epítopos lineales así como conformacionales, pueden usarse experimentos de competición con péptidos correspondientes a los epítopos lineales para confirmar la presencia de epítopos conformacionales.

Además, están contempladas las moléculas de ácido nucleico que codifican los fragmentos mencionados anteriormente, las moléculas de ácido nucleico que hibridan con moléculas de ácido nucleico que codifican los fragmentos, en particular las que hibridan bajo condiciones rigurosas, y las moléculas de ácido nucleico, tales como los cebadores de PCR, para amplificar moléculas de ácido nucleico que codifican los fragmentos. Al respecto, las moléculas de ácido nucleico de preferencia son las que corresponden a los fragmentos de preferencia, según se analizó anteriormente.

Se divulgan vectores que comprenden una molécula de ácido nucleico o moléculas de ácido nucleico, las células huésped que están manipuladas genéticamente con los vectores y la producción de antígenos reactivos en suero hiperinmune y sus fragmentos por técnicas recombinantes.

Puede usarse una gran diversidad de vectores de expresión para expresar un antígeno reactivo en suero hiperinmune o sus fragmentos. Por lo general, puede usarse cualquier vector adecuado para mantener, propagar o expresar los ácidos nucleicos para expresar un polipéptido en un huésped para la expresión en este aspecto. El vector puede ser, por ejemplo, un vector plasmídico, un vector de fago de hebra única o de doble hebra, un vector viral de ADN o ARN de hebra única o de doble hebra. Los plásmidos de partida divulgados en el presente documento están disponibles comercialmente, disponibles públicamente, o pueden construirse a partir de plásmidos disponibles por medio de la aplicación de rutina de procedimientos bien conocidos, publicados. Entre los vectores de preferencia, en ciertos aspectos, están aquellos para la expresión de moléculas de ácido nucleico y de antígenos reactivos en suero hiperinmune o sus fragmentos. Las construcciones de ácidos nucleicos en células huésped pueden usarse de una manera convencional para producir el producto genético codificado por la secuencia recombinante. Como alternativa, los antígenos reactivos en suero hiperinmune y sus fragmentos pueden producirse sintéticamente por medio de sintetizadores de péptidos convencionales. Las proteínas maduras pueden expresarse en células de mamífero, levaduras, bacterias, o en otras células bajo el control de promotores adecuados. También pueden utilizarse sistemas de traducción libres de células para producir tales proteínas usando ARN derivados de la construcción de ADN.

Las células huésped pueden manipularse genéticamente para incorporar moléculas de ácido nucleico y para expresar las moléculas de ácido nucleico de la presente invención. Los ejemplos representativos de huéspedes adecuados incluyen las células bacterianas, tales como células de estreptococos, estafilococos, E. coli, Streptomyces y Bacillus subtilis; células fúngicas, tales como células de levadura y células de Aspergillus; células de insectos tales como células de Drosophila S2 y de Spodoptera Sf9; células de animales tales como células CHO, COS, Hela, C127, 3T3, BHK, 293 y células del melanoma de Bowes; y células de plantas.

Se divulga un procedimiento para producir un antígeno de S. pyogenes reactivo en suero hiperinmune y uno de sus fragmentos que comprende expresar a partir de la célula huésped un antígeno reactivo en suero hiperinmune o uno de sus fragmentos codificado por las moléculas de ácido nucleico proporcionadas por la presente invención. También se contempla un procedimiento para producir una célula, que expresa un antígeno de S. pyogenes reactivo en suero hiperinmune o uno de sus fragmentos que comprende transformar o transfectar una célula huésped adecuada con el vector de manera tal que la célula transformada o transfectada exprese el polipéptido codificado por el ácido nucleico contenido en el vector.

El polipéptido puede expresarse en una forma modificada, tal como una proteína de fusión, y puede incluir no sólo señales de secreción sino también otras regiones funcionales heterólogas. Por consiguiente, por ejemplo, puede añadirse una región de aminoácidos adicionales, en particular aminoácidos cargados, a los extremos N o C terminales del polipéptido para mejorar la estabilidad y la persistencia en la célula huésped, durante la purificación o durante la manipulación y el almacenamiento posteriores. También, pueden añadirse regiones al polipéptido para facilitar la purificación. Tales regiones pueden eliminarse antes de la preparación final del polipéptido. La adición de restos de péptidos a los polipéptidos para engendrar la secreción o la excreción, para mejorar la estabilidad o para facilitar la purificación, entre otras, son técnicas familiares y de la rutina en la técnica. Una proteína de fusión de preferencia comprende una región heteróloga de inmunoglobulina que es útil para solubilizar o purificar los polipéptidos. Por ejemplo, el documento EP-A-O 464 533 (documento equivalente canadiense 2045869) divulga las proteínas de fusión que comprenden diversas porciones de la región constante de moléculas de inmunoglobina junto con otra proteína o parte de de la misma. En el descubrimiento de fármacos, por ejemplo, se han fusionado proteínas con las porciones Fc de anticuerpos con el objeto de realizar ensayos de selección de alto rendimiento para identificar antagonistas. Véase por ejemplo, {Bennett, D. y col., 1995} y {Johanson, K. y otros., 1995}.

El antígeno de S. pyogenes reactivo en suero hiperinmune o uno de sus fragmentos puede recuperarse y purificarse de cultivos de células recombinantes por medio de procedimientos bien conocidos, incluidos la precipitación con sulfato de amonio o etanol, la extracción ácida, la cromatografía de intercambio aniónico o catiónico, la cromatografía de fosfocelulosa, la cromatografía de interacción hidrófoba, la cromatografía de hidroxiapatita y la cromatografía con lectinas.

Los antígenos reactivos en suero hiperinmune y sus fragmentos según la presente invención pueden producirse por medio de síntesis química así como por medios biotecnológicos. Los últimos comprenden la transfección o la transformación de una célula huésped con un vector que contiene un ácido nucleico según la presente invención y el cultivo de la célula huésped transfectada o transformada bajo condiciones conocidas por los expertos en la técnica. El procedimiento de producción puede comprender también una etapa de purificación para purificar o aislar el polipéptido a producir.

Los antígenos reactivos en suero hiperinmune y sus fragmentos pueden usarse para la detección del organismo u organismos en una muestra que contiene estos organismos o sus polipéptidos derivados. De preferencia, tal detección es para diagnóstico, de más preferencia para el diagnóstico de una enfermedad, de mayor preferencia para el diagnóstico del una enfermedad relacionada o ligada a la presencia o a la abundancia de bacterias gram positivas, especialmente bacterias seleccionadas del grupo constituido por estreptococos, estafilococos y lactococos. De más preferencia, los microorganismos se seleccionan del grupo que comprende Streptococcus agalactiae, Streptococcus pneumoniae y Streptococcus mutans, en especial el microorganismo es Streptococcus pyogenes.

También están contemplados los ensayos de diagnóstico tales como los ensayos cuantitativos y de diagnóstico para detectar los niveles de antígenos reactivos en suero hiperinmune y sus fragmentos en células y tejidos, incluida la determinación de niveles normales y anormales. Por consiguiente, por ejemplo, puede utilizarse un ensayo de diagnóstico según la invención para detectar la sobreexpresión del polipéptido comparado con muestras de tejidos de control normales para detectar la presencia de una infección, por ejemplo, y para identificar el organismo infectante. Las técnicas de ensayo que pueden utilizarse para determinar los niveles de un polipéptido, en una muestra obtenida de un huésped son bien conocidas por los expertos en la técnica. Tales procedimientos de ensayo incluyen los radioinmunoensayos, los ensayos de unión competitiva, los análisis de transferencia Western y los ensayos ELISA. Entre estos, los ELISA son frecuentemente de preferencia. Un ensayo ELISA comprende inicialmente preparar un anticuerpo específico para el polipéptido, de preferencia un anticuerpo monoclonal. Además, generalmente se prepara un anticuerpo informador que se une al anticuerpo monoclonal. El anticuerpo informador está unido a un reactivo detectable tal como un reactivo radioactivo, fluorescente o enzimático, tal como la enzima peroxidasa del rábano picante.

Los antígenos reactivos en suero hiperinmune y sus fragmentos pueden usarse también con el objeto o con respecto a una matriz. Más particularmente, al menos uno de los antígenos reactivos en suero hiperinmune y sus fragmentos pueden inmovilizarse en un soporte. Dicho soporte comprende típicamente una diversidad de antígenos reactivos en suero hiperinmune y sus fragmentos en el que la diversidad pueda crearse usando uno o varios de los antígenos reactivos en suero hiperinmune y sus fragmentos y/o diferentes antígenos reactivos en suero hiperinmune y sus fragmentos. El aspecto característico de tal matriz así como de cualquier matriz en general es el hecho de que en una región o posición característica o predefinida en dicho soporte o una de sus superficies, está inmovilizado un polipéptido característico. Por esto, cualquier actividad en una posición o región característica de una matriz puede correlacionarse con un polipéptido específico. El número de diferentes antígenos reactivos en suero hiperinmune y sus fragmentos inmovilizados en un soporte puede variar desde tan pocos como 10 hasta varios miles de antígenos diferentes reactivos en suero hiperinmune y sus fragmentos. La densidad de antígenos reactivos en suero hiperinmune y sus fragmentos por cm^{2} es, en una forma de realización de preferencia, tan baja como 10 péptidos/polipéptidos por cm^{2} hasta al menos 400 diferentes péptidos/polipéptidos por cm^{2} y más particularmente al menos 1000 antígenos reactivos en suero hiperinmune diferentes y sus fragmentos por cm^{2}.

La fabricación de tales matrices es conocida por los expertos en la técnica y, por ejemplo, está descrita en la Patente de EEUU 5.744.309. La matriz comprende de preferencia un soporte sólido plano, poroso o no poroso que tiene al menos una primera superficie. Los antígenos reactivos en suero hiperinmune y sus fragmentos según se divulgan en el presente documento, se inmovilizan en dicha superficie. Los materiales de soporte de preferencia son, entre otros, vidrio o celulosa. También está dentro de la presente invención el uso de la matriz para cualquiera de las aplicaciones de diagnóstico descritas en el presente documento. Aparte de los antígenos reactivos en suero hiperinmune y sus fragmentos, también pueden usarse las moléculas de ácido nucleico para la generación de una matriz como se describió anteriormente. Esto se aplica también a una matriz hecha de anticuerpos, de preferencia anticuerpos monoclonales como, entre otros, los descritos en el presente documento.

También se divulga un anticuerpo dirigido a cualquiera de los antígenos reactivos en suero hiperinmune y sus fragmentos, a los derivados o a sus fragmentos. Están incluidos, por ejemplo, los anticuerpos monoclonales y policlonales, anticuerpos quiméricos, de cadena única y anticuerpos humanizados, así como los fragmentos Fab, o el producto de una biblioteca de expresión de Fab. El anticuerpo puede ser quimérico, es decir que diferentes partes del mismo provienen de diferentes especies o al menos las respectivas secuencias se toman de diferentes especies.

Los anticuerpos generados contra los antígenos reactivos en suero hiperinmune y sus fragmentos que corresponden a una secuencia pueden obtenerse por la inyección directa de los antígenos reactivos en suero hiperinmune y sus fragmentos en un animal o administrando los antígenos reactivos en suero hiperinmune y sus fragmentos a un animal, de preferencia un animal no humano. El anticuerpo obtenido de esa manera se unirá a continuación por sí mismo a los antígenos reactivos en suero hiperinmune y sus fragmentos. De esta manera, puede usarse incluso una secuencia que codifica solamente un fragmento de un antígeno reactivo en suero hiperinmune y sus fragmentos para generar los anticuerpos que se unen al antígeno nativo completo reactivo en suero hiperinmune y sus fragmentos. Tales anticuerpos pueden usarse a continuación para aislar los antígenos reactivos en suero hiperinmune y sus fragmentos de tejidos que expresan esos antígenos reactivos en suero hiperinmune y sus fragmentos.

Para la preparación de anticuerpos monoclonales, puede usarse cualquier técnica conocida en la técnica que proporcione los anticuerpos producidos por cultivos de líneas celulares continuas. (Como se describió originalmente en {Kohler, G. y col., 1975}.

Las técnicas descritas para la producción de anticuerpos de cadena única (Patente de EEUU Nº 4.946.778) pueden adaptarse para producir anticuerpos de cadena única contra los antígenos inmunogénicos reactivos en suero hiperinmune y sus fragmentos según esta invención. También, pueden usarse ratones transgénicos u otros organismos no humanos tales como otros mamíferos no humanos, para expresar anticuerpos humanizados contra los antígenos inmunogénicos reactivos en suero hiperinmune y sus fragmentos según esta invención.

Como alternativa, podría utilizarse la tecnología de presentación de fagos o la presentación ribosómica para seleccionar los genes de anticuerpos con actividades de unión hacia los antígenos reactivos en suero hiperinmune y sus fragmentos ya sea de repertorios de v-genes de linfocitos amplificados por PCR de seres humanos seleccionados por poseer los antígenos diana respectivos o de bibliotecas nuevas {McCafferty, J. y col., 1990}; {Marks, J. y col., 1992}. La afinidad de estos anticuerpos puede mejorarse también mezclando las cadenas {Clackson, T. y col., 1991}.

Si están presentes dos dominios de unión al antígeno, cada dominio puede estar dirigido contra un epítopo diferente - denominados anticuerpos "biespecíficos".

Los anticuerpos descritos anteriormente pueden utilizarse para aislar o para identificar los clones que expresan los antígenos reactivos en suero hiperinmune y sus fragmentos o para purificar los antígenos reactivos en suero hiperinmune y sus fragmentos por unión del anticuerpo a un soporte sólido para aislamiento y/o purificación por cromatografía de afinidad.

Por consiguiente, entre otros, los anticuerpos contra los antígenos reactivos en suero hiperinmune y sus fragmentos pueden utilizarse para inhibir y/o para tratar infecciones, particularmente las infecciones bacterianas y especialmente las infecciones que se presentan a partir del S. pyogenes.

Los antígenos reactivos en suero hiperinmune y sus fragmentos incluyen los derivados antigénicamente, epitópicamente o inmunológicamente equivalentes. El término "derivado antigénicamente equivalente" según se utiliza en el presente documento abarca un antígeno reactivo en suero hiperinmune y sus fragmentos o su equivalente que será reconocido específicamente por ciertos anticuerpos que, cuando se generan contra la proteína o el antígeno reactivo al suero hiperinmune y sus fragmentos, interfieren con la interacción entre el patógeno y el huésped mamífero. El término "derivado inmunológicamente equivalente" según se utiliza en el presente documento abarca un péptido o su equivalente que cuando se utiliza en una formulación adecuada para generar anticuerpos en un vertebrado, los anticuerpos actúan para interferir con la interacción entre el patógeno y el huésped mamífero.

Los antígenos reactivos en suero hiperinmune y sus fragmentos, tales como un derivado antigénicamente o inmunológicamente equivalente o una de sus proteínas de fusión pueden usarse como un antígeno para inmunizar un ratón u otro animal tal como una rata o un pollo. La proteína de fusión puede proporcionar estabilidad a los antígenos reactivos en suero hiperinmune y sus fragmentos. El antígeno puede asociarse, por ejemplo por conjugación, con una proteína vehículo inmunogénica, por ejemplo la albúmina sérica bovina (BSA) o la hemocianina de la lapa (KLH). Como alternativa, un péptido antigénico que comprende múltiples copias de la proteína o del antígeno reactivo en suero hiperinmune y sus fragmentos, o un antígeno reactivo en suero hiperinmune antigénicamente o inmunológicamente equivalente y sus fragmentos, pueden ser suficientemente antigénicos para mejorar la inmunogenicidad para evitar el uso de un vehículo.

De preferencia el anticuerpo o su derivado se modifica para hacerlo menos inmunogénico en el individuo. Por ejemplo, si el individuo es un ser humano el anticuerpo puede ser de más preferencia "humanizado", en el que la o las regiones que determinan la complementariedad del anticuerpo derivado del hibridoma se han trasplantado en un anticuerpo monoclonal humano, por ejemplo como está descrito en {Jones, P. y col., 1986} o {Tempest, P. y col., 1991}.

El uso de un polinucleótido de la invención en la inmunización genética utilizará de preferencia un procedimiento de administración adecuado tal como la inyección directa del ADN del plásmido en el músculo, la administración del ADN complejado con vehículos proteicos específicos, la coprecipitación del ADN con fosfato de calcio, el encapsulamiento del ADN en diversas formas de liposomas, el bombardeo de partículas {Tang, D. y col., 1992}, {Eisenbraun, M. y col., 1993} y la infección in vivo usando vectores retrovirales clonados {Seeger, C. y col., 1984}.

Se divulga un péptido que se une a cualquiera de los antígenos reactivos en suero hiperinmune y sus fragmentos según la presente invención, y un procedimiento para la fabricación de tales péptidos por el que el procedimiento se caracteriza por el uso de los antígenos reactivos al suero al hiperinmune y sus fragmentos y las etapas básicas son conocidas por el experto en la técnica.

Tales péptidos pueden generarse usando procedimientos según el estado de la técnica tales como la presentación de fagos o la presentación de ribosomas. En el caso de presentación de fagos, se genera básicamente una biblioteca de péptidos, en la forma de fagos, y este tipo de biblioteca se pone en contacto con la molécula diana, en el presente caso un antígeno reactivo en suero hiperinmune y sus fragmentos. Posteriormente se retiran los péptidos que se unen a la molécula diana, de preferencia como un complejo con la molécula diana, a partir de la reacción respectiva. Los expertos en la técnica saben que las características de unión, al menos hasta cierto punto, dependen de la configuración experimental utilizada en particular, tal como la concentración de sal y otras similares. Tras separar los péptidos unidos a la molécula diana con una afinidad más alta o una fuerza mayor, de los miembros no unidos de la biblioteca, y opcionalmente también tras eliminar la molécula diana del complejo de la molécula diana y el péptido, el o los péptidos respectivos pueden posteriormente caracterizarse. Antes de la caracterización se realiza opcionalmente una etapa de amplificación tal como, por ejemplo propagando los fagos que codifican los péptidos. La caracterización comprende de preferencia la secuenciación de los péptidos unidos a la diana. Básicamente, los péptidos no están limitados en sus longitudes, sin embargo, de preferencia se obtienen péptidos de preferencia que tienen longitudes desde aproximadamente 8 hasta 20 aminoácidos en los procedimientos respectivos. El tamaño de las bibliotecas puede ser de aproximadamente 10^{2} hasta 10^{18}, de preferencia de 10^{8} hasta 10^{15} péptidos diferentes, sin embargo, no está limitado a estos.

Una forma particular de antígenos reactivos en suero hiperinmune y sus fragmentos que se unen a la diana son las llamadas "anticalinas" que están descritas, entre otros, en la solicitud de patente Alemana DE 197 42 706 A1.

Están contemplados los ácidos nucleicos funcionales que interactúan con cualquiera de los antígenos reactivos en suero hiperinmune y sus fragmentos, y un procedimiento para la fabricación de tales ácidos nucleicos funcionales por el que el procedimiento se caracteriza por el uso de los antígenos reactivos en suero hiperinmune y sus fragmentos y las etapas básicas son conocidas por los expertos en la técnica. Los ácidos nucleicos funcionales son de preferencial los aptámeros y los spiegélmeros.

Los aptámeros son ácidos D-nucleicos que tienen hebra única o doble hebra y que interactúan específicamente con una molécula diana. La fabricación o la selección de aptámeros están descritas, por ejemplo, la patente Europea EP 0 533 838. Básicamente se realizan las siguientes etapas. Primero, se proporciona una mezcla de ácidos nucleicos, es decir aptámeros potenciales, por la que cada ácido nucleico comprende típicamente un segmento de varios, de preferencia al menos ocho nucleótidos posteriormente aleatorizados. Posteriormente se pone esta mezcla en contacto con la molécula diana por lo que el o los ácidos nucleicos se unen a la molécula diana, tal como basándose en la mayor afinidad hacia la diana o con una fuerza mayor a esta, comparado con la mezcla candidata. El o los ácidos nucleicos unidos se separan posteriormente del resto de la mezcla. Opcionalmente, el o los ácidos nucleicos obtenidos de esta manera se amplifican usando, por ejemplo la reacción en cadena de la polimerasa. Estas etapas pueden repetirse varias veces dando al final una mezcla que tiene una mayor relación de ácidos nucleicos que se unen específicamente a la diana a partir de la que se selecciona posteriormente de manera opcional el ácido nucleico de unión final. Estos ácidos nucleicos de unión específica se denominan aptámeros. Es obvio que en cualquier etapa del procedimiento para la generación o la identificación de los aptámeros pueden tomarse muestras de la mezcla de ácidos nucleicos individuales para determinar la secuencia de los mismos usando técnicas convencionales. Los aptámeros pueden estabilizarse tal como, por ejemplo, introduciendo grupos químicos definidos conocidos por los expertos en la técnica de generación de aptámeros. Tal modificación puede por ejemplo residir en la introducción de un grupo amino en la posición 2' del resto de azúcar de los nucleótidos. Los aptámeros se usan actualmente como agentes terapéuticos. Sin embargo, los aptámeros seleccionados o generados de esta manera pueden utilizarse para la validación de dianas y/o como sustancias líder para el desarrollo de medicamentos, de preferencia de los medicamentos basados en moléculas pequeñas. Esto se realiza actualmente por un ensayo de competición por el que la interacción específica entre la molécula diana y el aptámero se inhibe por medio de un fármaco candidato por el que tras reemplazar el aptámero del complejo de la diana y el aptámero, puede asumirse que el fármaco candidato respectivo permite una inhibición específica de la interacción entre la diana y el aptámero y, si la interacción es específica, dicho fármaco candidato será, al menos en principio, adecuado para bloquear la diana y disminuir de esta manera su disponibilidad o actividad biológica en un sistema respectivo que comprende tal diana. La molécula pequeña obtenida de esta manera puede someterse a continuación a otra derivatización y modificación para optimizar sus características físicas, químicas, biológicas y/o médicas tales como la toxicidad, la especificidad, la biodegradabilidad y la biodisponibilidad.

Los spiegélmeros y su generación o fabricación se basados en un principio similar. La fabricación de spiegélmeros se describe en la solicitud de patente internacional WO 98/08856. Los spiegélmeros son ácidos L-nucleicos, que significa que están compuestos de L-nucleótidos más que de D-nucleótidos como están los aptámeros. Los spiegélmeros se caracterizan por el hecho de tener una estabilidad muy alta en un sistema biológico y, comparable a los aptámeros, interactúan específicamente con la molécula diana contra la que están dirigidos. En el proceso de generación de spiegélmeros, se crea una población heterógona de ácidos D-nucleicos y esta población se pone en contacto con la antípoda óptica de la molécula diana, en el presente caso por ejemplo con el D-enantiómero del L-enantiómero que se presenta en la naturaleza de los antígenos reactivos en suero hiperinmune y sus fragmentos según la presente invención. Posteriormente, se separan los ácidos D-nucleicos que no interactúan con la antípoda óptica de la molécula diana. Pero los ácidos D-nucleicos que interactúan con la antípoda óptica de la molécula diana se separan, opcionalmente se determinan y/o se secuencian y posteriormente se sintetizan los ácidos L-nucleicos correspondientes basándose en la información de la secuencia de ácido nucleico obtenida de los ácidos D-nucleicos. Estos ácidos L-nucleicos que son idénticos en términos de secuencia a los ácidos D-nucleicos mencionados anteriormente que interactúan con la antípoda óptica de la molécula diana, tendrán interacción específicamente con la molécula diana que se presenta en la naturaleza más que con su antípoda óptica. De manera similar al procedimiento para la generación de aptámeros, es también posible repetir las diversas etapas varias veces y por consiguiente enriquecer los ácidos nucleicos que interactúan específicamente con la antípoda óptica de la molécula diana.

Están contemplados los ácidos nucleicos funcionales que interactúan con cualquiera de las moléculas de ácido nucleico descritas en el presente documento, y un procedimiento para la fabricación de tales ácidos nucleicos funcionales por el que el procedimiento está caracterizado por el uso de las moléculas de ácido nucleico y sus secuencias respectivas y las etapas básicas son conocidas por los expertos en la técnica. Los ácidos nucleicos funcionales son de preferencia ribozimas, oligonucleótidos antisentido y siARN.

Las ribozimas son ácidos nucleicos catalíticamente activos que están constituidos de preferencia por ARN que comprenden básicamente dos restos. El primer resto muestra una actividad catalítica mientras que el segundo resto es responsable de la interacción específica con el ácido nucleico diana, en el presente caso el ácido nucleico que codifica los antígenos reactivos en suero hiperinmune y sus fragmentos según la presente invención. Tras la interacción entre el ácido nucleico diana y el segundo resto de la ribozima, típicamente por hibridación y apareamiento de bases de Watson-Crick de las extensiones esencialmente complementarias de bases en las dos hebras en hibridación, el resto catalíticamente activo pueden activarse, que significa que cataliza, de manera intramolecular o intermolecular, el ácido nucleico diana en caso de que la actividad catalítica de la ribozima sea una actividad de fosfodiesterasa. Posteriormente, puede haber otra degradación del ácido nucleico diana que al final da lugar a la degradación del ácido nucleico diana así como de la proteína derivada de dicho ácido nucleico diana. Las ribozimas, su uso y los principios del diseño son conocidos por los expertos en la técnica y están descritos, por ejemplo en {Doherty, E. y col., 2001} y {Lewin, A. y col., 2001}.

La actividad y el diseño de los oligonucleótidos antisentido para la fabricación de un medicamento y como agente de diagnóstico, respectivamente, están basados en un modo de acción similar. Básicamente, los oligonucleótidos antisentido hibridan basándose en la complementariedad de las bases, con un ARN diana, de preferencia con un ARNm, activando de este modo la RNasa H. La RNasa H se activa por ADN acoplado a fosfodiéster y a fosforotioato. El ADN acoplado a fosfodiéster, sin embargo, se degradada rápidamente por las nucleasas celulares a excepción del ADN acoplado a fosforotioato. Estos derivados de ADN resistentes, que no se presentan en la naturaleza no inhiben la RNasa H tras la hibridación con el ARN. Es decir, los polinucleótidos antisentido son sólo eficaces como complejos híbridos de ADN ARN. Los ejemplos para este tipo de oligonucleótidos antisentido están descritos, entre otras, en las patentes de EEUU 5.849.902 y 5.989.912. Es decir, en base a la secuencia del ácido nucleico de la molécula diana que en el presente caso son las moléculas de ácido nucleico para los antígenos reactivos en suero hiperinmune y sus fragmentos, ya sea a partir de la proteína diana de la que en principio puede deducirse una secuencia de ácido nucleico respectiva, o conociendo la secuencia del ácido nucleico como tal, en particular el ARNm, pueden diseñarse los oligonucleótidos antisentido adecuados basándose en el principio de complementariedad de las bases.

\newpage

Resultan particularmente de preferencia los oligonucleótidos antisentido que tienen una extensión corta de ADN de fosforotioato (3 a 9 bases). Se requiere un mínimo de 3 bases de ADN para la activación de la RNasa H bacteriana y se requiere un mínimo de 5 bases para la activación de la RNasa H de mamífero. En estos oligonucleótidos quiméricos hay una región central que forma un sustrato para la RNasa H que está flanqueada por "brazos" de hibridación que comprenden los nucleótidos modificados que no forman los sustratos para la RNasa H. Los brazos de hibridación de los oligonucleótidos quiméricos pueden modificarse tal como por medio de 2'-O-metilo o 2'-flúor. Los enfoques alternativos utilizaron enlaces metilfosfonato o fosforamidato en dichos brazos. Otras formas de realización de oligonucleótidos antisentido útiles en la práctica de la presente invención son P-metoxioligonucleótidos, P-metoxioligodesoxirribonucleótidos parciales o P-metoxioligonucleótidos.

Son de importancia y de utilidad particular los oligonucleótidos antisentido como se describen más particularmente en las dos patentes de EEUU mencionadas anteriormente. Estos oligonucleótidos contienen nucleótidos unidos 5'\rightarrow3' que no se presentan en la naturaleza. En realidad los oligonucleótidos tienen dos tipos de nucleótidos: 2'-desoxifosforotioato, que activan la RNasa H, y nucleótidos modificados en 2', que no lo hacen. Los enlaces entre los nucleótidos modificados en 2' pueden ser fosfodiésteres, fosforotioato o P-etoxifosfodiéster. La activación de la RNasa H se lleva a cabo por una región activadora de RNasa H contigua, que contiene entre 3 y 5 nucleótidos 2'-desoxifosforotioato para activar la RNasa H bacteriano y entre 5 y 10 nucleótidos 2'-desoxifosforotioato para activar la RNasa eucariota y, particularmente, la RNasa H de mamífero. La protección de la degradación se consigue haciendo que las bases de los extremos 5' y 3 terminales sean altamente resistentes a las nucleasas y, opcionalmente, por la colocación de un grupo de bloqueo 3' terminal.

Más particularmente, el oligonucleótido antisentido comprende un extremos 5' y un extremo 3'; y desde 11 hasta 59 nucleótidos unidos 5'\rightarrow3' seleccionados independientemente del grupo constituido por nucleótidos fosfodiéster modificados en 2' y nucleótidos P-alquiloxifosfotriéster modificados en 2'; y en el que el nucleósido 5' terminal está unido a una región activadora de la RNasa H de entre de tres y diez desoxirribonucleótidos contiguos unidos por fosforotioato, y en el que el extremo 3' de dicho oligonucleótido se selecciona del grupo constituido por un desoxirribonucleótido invertido, una extensión contigua de uno a tres ribonucleótidos fosforotioato modificados en 2', un grupo biotina y un nucleótido P-alquiloxifosfotriéster.

También puede usarse un oligonucleótido antisentido en el que no es el nucleósido 5' terminal el que está unido a una región de activación de la RNasa H sino el nucleósido 3' terminal según se especificó anteriormente. También, el extremo 5' se selecciona del grupo particular más que el extremo 3' de dichos oligonucleótidos.

Los ácidos nucleicos así como los antígenos reactivos en suero hiperinmune y sus fragmentos pueden utilizarse como o para la fabricación de composiciones farmacéuticas, en especial vacunas. De preferencia tal composición farmacéutica, de preferencia vacuna es para la prevención o el tratamiento de las enfermedades causadas por, relacionadas o asociada con S. pyogenes. En otro aspecto la invención se refiere a un procedimiento para inducir una respuesta inmunológica en un individuo, en particular un mamífero, que comprende inocular el individuo con los antígenos reactivos en suero hiperinmune y sus fragmentos de la invención, o uno de sus fragmentos o variantes, adecuados para producir anticuerpos para proteger a dicho individuo de la infección, particularmente de la infección del Streptococcus y más particularmente de las infecciones por S. pyogenes.

Otro aspecto más de la invención se refiere a un procedimiento para inducir una respuesta inmunológica en un individuo que comprende administrar, a través de terapia génica o de otra manera, un ácido nucleico que codifica funcionalmente los antígenos reactivos en suero hiperinmune y sus fragmentos, o uno de sus fragmentos o variantes, para expresar los antígenos reactivos en suero hiperinmune y sus fragmentos, o uno de sus fragmentos o variantes in vivo para inducir una respuesta inmunológica para producir anticuerpos o una respuesta de células T mediada por células, ya sea células T productoras de citocinas o células T citotóxicas, para proteger a dicho individuo de la enfermedad, ya sea que esa enfermedad esté o no esté establecida dentro del individuo. Una manera de administrar el gen es haciéndolo penetrar en las células deseadas acelerándolo como un recubrimiento en partículas o de otra manera.

Otro aspecto de la invención se refiere a una composición inmunológica que, cuando se introduce en un huésped capaz de tener una respuesta inmunológica inducida dentro del mismo, induce una respuesta inmunológica en tal huésped, en la que la composición comprende el DNA recombinante que codifica y expresa un antígeno de los antígenos reactivos en suero hiperinmune y sus fragmentos de la presente invención. La respuesta inmunológica puede utilizarse de manera terapéutica o profiláctica y puede tener la forma de inmunidad por anticuerpos o de inmunidad celular tal como la que se presenta a partir de células T CD4+ o CTL.

Los antígenos reactivos en suero hiperinmune y sus fragmentos de la invención o uno de sus fragmentos pueden fusionarse con una coproteína que no pueda por sí misma producir anticuerpos, pero que es capaz de estabilizar a la primera proteína y de producir una proteína fusionada que tendrá propiedades inmunogénicas y protectoras. Esta proteína recombinante fusionada comprende además de preferencia una coproteína antigénica, tal como la glutatión-S-transferasa (GST) o la beta-galactosidasa, coproteínas relativamente grandes que solubilizan la proteína y facilitan la producción y la purificación de la misma. Además, la coproteína puede actuar como un adyuvante en el sentido de proporcionar una estimulación generalizada del sistema inmune. La coproteína puede unirse al extremo amino o al extremo carboxi terminal de la primera proteína.

\newpage

También, por medio de esta invención se proporcionan procedimientos que usan la molécula de ácido nucleico descrita o sus fragmentos particulares en tales experimentos genéticos de inmunización en modelos animales de infección con S. pyogenes. Tales fragmentos serán particularmente útiles para identificar los epítopos de proteínas capaces de provocar una respuesta inmune profiláctica o terapéutica. Este enfoque puede permitir la posterior preparación de anticuerpos monoclonales de valor particular a partir de los órganos requeridos del animal que resiste o aclara con éxito la infección para el desarrollo de agentes profilácticos o de tratamientos terapéuticos de la infección por S. pyogenes en los mamíferos, particularmente en los seres humanos.

Los antígenos reactivos en suero hiperinmune y sus fragmentos pueden usarse como un antígeno para la vacunación de un huésped para producir los anticuerpos específicos que protegen contra la invasión de bacterias, por ejemplo bloqueando la adherencia de las bacterias al tejido dañado. Los ejemplos de daños de tejidos incluyen las heridas en la piel o el tejido conectivo por ejemplo causadas por daños mecánicos, químicos o térmicos o por la implantación de dispositivos permanentes, o heridas en las membranas mucosas, tales como la boca, las glándulas mamarias, la uretra o la vagina.

La presente invención también incluye una formulación de vacuna que comprende la proteína recombinante inmunogénica junto con un vehículo adecuado. Puesto que la proteína puede degradarse en el estómago, se administra de preferencia por vía parenteral, incluyendo, por ejemplo, la administración subcutánea, intramuscular, intravenosa o intradérmica. Las formulaciones adecuadas para la administración parenteral incluyen las disoluciones estériles acuosas y no acuosas para inyección que pueden contener antioxidantes, tampones, bacteriostáticos y solutos que hacen a la formulación isotónica con el líquido corporal, de preferencia la sangre, del individuo; y suspensiones estériles acuosas y no acuosas que pueden incluir agentes de suspensión o agentes espesantes. Las formulaciones pueden presentarse en recipientes monodosis o de dosis múltiples, por ejemplo, ampollas selladas y viales, y pueden almacenarse en estado liofilizado que requiere solamente la adición del vehículo líquido estéril inmediatamente antes del uso. La formulación de vacuna puede también incluir sistemas adyuvantes para mejorar la inmunogenicidad de la formulación, tales como sistemas de aceite en agua y otros sistemas conocidos en la técnica. La dosificación dependerá de la actividad específica de la vacuna y puede determinarse fácilmente por medio de la experimentación rutinaria.

La presente invención divulga una composición farmacéutica que comprende tal antígeno reactivo en suero hiperinmune o uno de sus fragmentos según se proporciona en la presente invención para S. pyogenes. Tal composición farmacéutica puede comprender uno o más antígenos o sus fragmentos reactivos en suero hiperinmune contra S. pyogenes. Opcionalmente, tales antígenos o sus fragmentos reactivos en suero hiperinmune de S. pyogenes pueden también combinarse con antígenos contra otros patógenos en una composición farmacéutica de combinación. De preferencia, dicha composición farmacéutica es una vacuna para prevenir o tratar una infección causada por S. pyogenes y/u otros patógenos contra los que se han incluido los antígenos en la vacuna.

La presente invención divulga una composición farmacéutica que comprende una molécula de ácido nucleico que codifica un antígeno reactivo en suero hiperinmune o uno de sus fragmentos según se identificaron anteriormente para S. pyogenes. Tal composición farmacéutica puede comprender una o más moléculas de ácido nucleico que codifican los antígenos o sus fragmentos reactivos en suero hiperinmune contra S. pyogenes. Opcionalmente, tales moléculas de ácido nucleico de S. pyogenes que codifican los antígenos reactivos en suero hiperinmune o sus fragmentos pueden también combinarse con moléculas de ácido nucleico que codifican antígenos contra otros patógenos en una composición farmacéutica de combinación. De preferencia, dicha composición farmacéutica es una vacuna para prevenir o tratar una infección causada por S. pyogenes y/u otros patógenos contra los que se han incluido los antígenos en la vacuna.

La composición farmacéutica puede contener cualquier sustancia auxiliar adecuada, tales como sustancias tamponadoras, estabilizadores u otros componentes activos, especialmente los componentes conocidos relacionados con la composición farmacéutica y/o la producción de vacunas.

Un vehículo o excipiente de preferencia para los antígenos reactivos en suero hiperinmune, sus fragmentos o una de sus moléculas de ácido nucleico codificadoras según la presente invención es un compuesto inmunoestimulador para estimular más la respuesta inmune al antígeno reactivo en suero hiperinmune dado, su fragmento o su molécula de ácido nucleico codificadora. De preferencia, el compuesto inmunoestimulador en la preparación farmacéutica según la presente invención se selecciona del grupo de sustancias policatiónicas, en especial los péptidos policatiónicos, moléculas de ácidos nucleicos inmunoestimuladoras, de preferencia desoxinucleótidos inmunoestimuladores, alumbre, coadyuvantes completos de Freund, coadyuvantes incompletos de Freund, compuestos neuroactivos, en especial la hormona de crecimiento humana, o sus combinaciones.

También está dentro del ámbito de la presente invención que la composición farmacéutica, en especial la vacuna, comprenda aparte de los antígenos reactivos en suero hiperinmune, sus fragmentos y/o sus moléculas de ácido nucleico codificadoras según la presente invención, otros compuestos biológicamente o farmacéuticamente activos. De preferencia, la composición de vacuna comprende al menos un péptido policatiónico. El o los compuestos policatiónicos a usar según la presente invención puede ser cualquiera de los compuestos policatiónicos que muestre los efectos característicos según el documento WO 97/30721. Los compuestos policatiónicos de preferencia se seleccionan de polipéptidos básicos, policationes orgánicos, poliaminoácidos básicos o sus mezclas. Estos poliaminoácidos deben tener una longitud de cadena de al menos 4 residuos de aminoácidos (documento WO 97/30721). Son especialmente de preferencia las sustancias como la polilisina, poliarginina y los polipéptidos que contienen más del 20%, especialmente más del 50% de aminoácidos básicos en un intervalo de más de 8, especialmente más de 20, residuos de aminoácidos o sus mezclas. Otros policationes de preferencia y sus composiciones farmacéuticas se describen en el documento WO 97/30721 (por ejemplo polietilenimina) y en el documento WO 99/38528. De preferencia, estos polipéptidos contienen entre 20 y 500 residuos de aminoácidos, especialmente entre 30 y 200 residuos.

Estos compuestos policatiónicos pueden producirse químicamente o de manera recombinante o pueden obtenerse de fuentes naturales.

Los (poli)péptidos catiónicos pueden también ser antimicrobianos con propiedades como se resumen en {Ganz, T., 1999}. Estos (poli)péptidos pueden ser de origen procariota o animal o de plantas o pueden producirse químicamente o de manera recombinante (documento WO 02/13857). Los péptidos pueden también pertenecer a la clase de las defensinas (documento WO 02/13857). Las secuencias de tales péptidos pueden encontrarse, por ejemplo, en las bases de datos de secuencias de antimicrobianos en la siguiente dirección de internet: http: //www. bbcm. univ.trieste.it/\simtossi/
pag2.html.

Tales péptidos de defensa del huésped o defensivos son también una forma de preferencia del polímero policatiónico según la presente invención. Generalmente, se usa como polímero policatiónico un compuesto que permite como producto final la activación (o regulación por disminución) del sistema inmune adaptativo, de preferencia mediada por células presentadoras de antígeno (APC) (incluidas las células dendríticas).

Resultan especialmente de preferencia para uso como sustancias policatiónicas en la presente invención los péptidos antimicrobianos derivados de la catelicidina o sus derivados (solicitud de patente internacional WO 02/13857, en especial los péptidos antimicrobianos derivados de catelicidina de mamífero, de preferencia de ser humano, de bovino o del ratón.

Los compuestos policatiónicos derivados de fuentes naturales incluyen HIV-REV o HIV-TAT (péptidos catiónicos derivados, péptidos de antennapedia, quitosano u otros derivados de la quitina) u otros péptidos derivados de estos péptidos o proteínas por medio de producción bioquímica o recombinante. Otros compuestos policatiónicos de preferencia son la catelina o sustancias relacionadas o derivadas de la catelina. Por ejemplo, la catelina de ratón es un péptido que tiene la secuencia de aminoácidos NH2-RLAGLLRKGGEKIGEKLKKIGOKIKNFFQKLVPQPE-COOH. Las sustancias relacionadas o derivadas de la catelina contienen toda o partes de la secuencia de la catelina con al menos 15-20 residuos de aminoácidos. Las derivaciones pueden incluir la sustitución o la modificación de los aminoácidos naturales por aminoácidos que no están entre los 20 aminoácidos convencionales. Por otra parte, pueden introducirse otros residuos catiónicos en tales moléculas de catelina. Es de preferencia que estas moléculas de catelina estén combinadas con el antígeno. Sorprendentemente, estas moléculas de catelina han resultado ser también eficaces como adyuvante para un antígeno sin la adición de otros adyuvantes. Por consiguiente, es posible usar tales moléculas de catelina como adyuvantes eficaces en las formulaciones de vacunas con o sin otras sustancias inmunactivadoras.

Otra sustancia policatiónica de preferencia a utilizar según la presente invención es un péptido sintético que contiene al menos 2 motivos KLK separados por un conector de 3 a 7 aminoácidos hidrófobos (solicitud de patente internacional WO 02/32451).

La composición farmacéutica contemplada o las vacunas de la presente invención pueden comprender además ácido(s) nucleico(s) inmunostimulador(es). Los ácidos nucleicos inmunostimuladores son por ejemplo los ácidos nucleicos neutros o artificiales que contienen CpG, las extensiones cortas de ácidos nucleicos no derivados de vertebrados o en la forma de oligonucleótidos cortos (ODN) que contienen dinucleótidos de citosina-guanina (CpG) no metilados en un cierto contexto de bases (por ejemplo como se describe en el documento WO 96/02555). Como alternativa, también los ácidos nucleicos basados en la inosina y la citidina como por ejemplo se describen en el documento WO 01/93903, o los ácidos desoxinucleicos que contienen residuos desoxiinosina y/o desoxiuridina (descritos en los documentos WO 01/93905 y WO 02/95027) pueden usarse de preferencia como ácidos nucleicos inmunostimuladores para la presente invención. De preferencia, las mezclas de diferentes ácidos nucleicos inmunostimuladores pueden usarse según la presente invención.

También está dentro de la presente invención que cualquiera de los compuestos policatiónicos mencionados anteriormente esté combinado con cualquiera de los ácidos nucleicos inmunostimuladores como se mencionó anteriormente. De preferencia, tales combinaciones son según las descritas en los documentos WO 01/93905, WO 02/32451, WO 01/54720, WO 01/93903, WO 02/13857 y WO 02/95027 y en la solicitud de patente austríaca A 1924/2001.

Además o como alternativa tal composición de vacuna puede comprender aparte de los antígenos reactivos en suero hiperinmune y sus fragmentos, y sus moléculas de ácido nucleico codificadoras según la presente invención un compuesto neuroactivo. De preferencia, el compuesto neuroactivo es el factor de crecimiento humano como se describe, por ejemplo en el documento WO 01/24822. También de preferencia, el compuesto neuroactivo se combina con cualquiera de los compuestos policatiónicos y/o ácidos nucleicos inmunostimuladores según se mencionó anteriormente.

Está contemplada una composición farmacéutica. Tal composición farmacéutica es, por ejemplo, la vacuna de la invención descrita en el presente documento. Una composición farmacéutica es también una composición farmacéutica que comprende cualquiera de los siguientes compuestos o sus combinaciones: las moléculas de ácido nucleico según la presente invención, los antígenos reactivos en suero hiperinmune y sus fragmentos según la presente invención, el vector según la presente invención, las células según la presente invención, el anticuerpo según la presente invención, los ácidos nucleicos funcionales según la presente invención y los péptidos de unión tales como las anticalinas según la presente invención, cualquiera de los agonistas y antagonistas seleccionados según se describe en el presente documento. Con relación a los mismos, cualquiera de estos compuestos puede utilizarse en combinación con un vehículo o vehículos no estériles o estériles para uso con las células, los tejidos o los organismos, tales como un vehículo farmacéutico adecuado para la administración a un sujeto. Tales composiciones comprenden, por ejemplo, un aditivo del medio o una cantidad terapéuticamente eficaz de un antígeno reactivo en suero hiperinmune y sus fragmentos de la invención y un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable. Tales vehículos pueden incluir, pero no se limitan a, disolución salina, disolución salina tamponada, dextrosa, agua, glicerol, etanol y sus combinaciones. La formulación debe adaptarse al modo de administración.

Las composiciones farmacéuticas pueden administrarse de cualquier manera eficaz y conveniente, incluidas por ejemplo, la administración por vía tópica, oral, anal, vaginal, intravenosa, intraperitoneal, intramuscular, subcutánea, intranasal o intradérmica, entre otras.

En la terapia o como un profiláctico, el agente activo puede administrarse a un individuo como una composición inyectable, por ejemplo como una dispersión acuosa estéril, de preferencia isotónica.

Como alternativa, la composición puede formularse para la aplicación tópica, por ejemplo en la forma de pomadas, cremas, lociones, pomadas oculares, gotas oculares, gotas óticas, colutorios, vendajes y suturas impregnados y aerosoles, y puede contener los aditivos convencional adecuados, incluidos, por ejemplo, los conservantes, los disolventes para ayudar a la penetración del fármaco, y los emolientes en pomadas y cremas. Tales formulaciones tópicas pueden también contener vehículos convencionales compatibles, por ejemplo crema o bases de pomadas, y etanol o alcohol oleílico para las lociones. Tales vehículos pueden constituir desde aproximadamente el 1% hasta aproximadamente el 98% en peso de la formulación; más usualmente constituirán hasta aproximadamente el 80% en peso de la formulación.

Además de la terapia descrita anteriormente, las composiciones de esta invención pueden utilizarse generalmente como un agente de tratamiento de heridas para evitar la adhesión de bacterias a las proteínas de la matriz expuestas en el tejido de la herida y para el uso profiláctico en el tratamiento dental como una alternativa a, o conjuntamente con, la profilaxis con antibióticos.

Una composición de vacuna está convenientemente en forma inyectable. Los adyuvantes convencionales pueden usarse para aumentar la respuesta inmune. Una monodosis adecuada para la vacunación es de 0,05-5 \mug de antígeno/kg, y tal dosis se administra de preferencia 1-3 veces y con un intervalo de 1-3 semanas.

Con el intervalo de dosis indicado, no deberían observarse efectos toxicológicos adversos con los compuestos de la invención que imposibilitarían su administración a los individuos adecuados.

Además, se divulgan los envases y kits farmacéuticos y de diagnóstico que comprenden uno o más recipientes rellenos con uno o más de los componentes de las composiciones de la invención mencionadas anteriormente. El (los) componente(s) pueden estar presentes en una cantidad, dosificación, formulación o combinación útil. Asociado con
tal(es) recipiente(s) puede haber un aviso en la forma prescrita por una agencia gubernamental que regula la fabricación, el uso o la venta de productos farmacéuticos o biológicos, reflejando la aprobación por la agencia de la fabricación, el uso o la venta del producto para la administración a seres humanos.

Con respecto a la presente invención cualquier uso relacionado con enfermedad según se divulga en el presente documento tal como, por ejemplo, el uso de la composición farmacéutica o de la vacuna, es particularmente una enfermedad o una afección de enfermad que está causada por, ligada o asociada con los estreptococos, de más preferencia, S. pyogenes. Con respecto a esto, debe señalarse que S. pyogenes comprende varias cepas, incluidas las divulgadas en el presente documento. Una enfermedad relacionada, causada o asociada con la infección bacteriana a prevenir y/o tratar según la presente invención incluye entre otras la faringitis bacteriana, la escarlatina, el impétigo, la fiebre reumática, la fascitis necrotizante y la sepsis en los seres humanos.

Se divulga además un procedimiento de selección que usa cualquiera de los antígenos reactivos en suero hiperinmune o los ácidos nucleicos según la presente invención. Los procedimientos de selección como tales son conocidos por los expertos en la técnica y pueden diseñarse para seleccionar un agonista o un antagonista. De preferencia se selecciona un antagonista que en el presente caso inhibe o evita la unión de cualquier antígeno reactivo en suero hiperinmune y sus fragmentos según la presente invención a una pareja de interacción. Tal pareja de interacción puede ser una pareja de interacción que se presenta en la naturaleza o una pareja de interacción que no se presenta en la naturaleza.

Se divulga un procedimiento para seleccionar compuestos para identificar los que aumentan (agonista) o bloquean (antagonista) la función de los antígenos reactivos en suero hiperinmune y sus fragmentos o las moléculas de ácido nucleico de la presente invención, tales como su interacción con una molécula de unión. El procedimiento de selección puede implicar alto rendimiento.

Por ejemplo, para seleccionar agonistas o antagonistas, la pareja de interacción de la molécula de ácido nucleico y del ácido nucleico, respectivamente, según la presente invención, tal vez una mezcla de reacción sintética, un compartimiento celular, tal como una membrana, una envoltura celular o pared celular, o una preparación de cualquiera de los mismos, pueden prepararse a partir de una célula que expresa una molécula que se une a los antígenos reactivos en suero hiperinmune y sus fragmentos. La preparación se incuba con los antígenos reactivos en suero hiperinmune marcados y sus fragmentos en ausencia o en presencia de una molécula candidata que puede ser un agonista o un antagonista. La capacidad de la molécula candidata de unirse a la molécula de unión se refleja en la disminución de la unión del ligando marcado. Es más probable que las moléculas que se unen gratuitamente, es decir, sin inducir los efectos funcionales de los antígenos reactivos en suero hiperinmune y sus fragmentos, sean buenos antagonistas. Las moléculas que se unen bien y provocan los efectos funcionales que son los mismos o prácticamente los mismos con relación a los antígenos reactivos en suero hiperinmune y sus fragmentos son buenos agonistas.

Los efectos funcionales de los potenciales agonistas y antagonistas pueden medirse, por ejemplo, determinando la actividad de un sistema informador tras la interacción de la molécula candidata con una célula o una preparación celular adecuada, y comparando el efecto con el de los antígenos reactivos en suero hiperinmune y sus fragmentos o de las moléculas que provocan los mismos efectos que los antígenos reactivos en suero hiperinmune y sus fragmentos. Los sistemas informadores que pueden ser útiles al respecto incluyen, pero no se limitan a, sustratos colorimétricos marcados convertidos en el producto, un gen informador que es sensible a los cambios en la actividad funcional de los antígenos reactivos en suero hiperinmune y sus fragmentos, y los ensayos de unión conocidos en la técnica.

Otro ejemplo de un ensayo para antagonistas es un ensayo competitivo que combina los antígenos reactivos en suero hiperinmune y sus fragmentos y un antagonista potencial con las moléculas de unión unidas a membrana, moléculas de unión recombinantes, sustratos o ligandos naturales, o miméticos de sustratos o de ligandos, bajo condiciones adecuadas para un ensayo competitivo de inhibición. Los antígenos reactivos en suero hiperinmune y sus fragmentos pueden marcarse por ejemplo por medio de radioactividad o un compuesto colorimétrico, de tal manera que pueda determinarse exactamente la cantidad de moléculas de antígenos reactivos en suero hiperinmune y sus fragmentos, unidas a una molécula de unión o convertidas en un producto para evaluar la eficacia del antagonista potencial.

Los antagonistas potenciales incluyen moléculas orgánicas pequeñas, péptidos, polipéptidos y anticuerpos que se unen a un antígeno reactivo en suero hiperinmune y sus fragmentos de la invención y de ese modo inhiben o extinguen su actividad. Los antagonistas potenciales también pueden ser moléculas orgánicas pequeñas, un péptido, un polipéptido tal como una proteína estrechamente relacionada o un anticuerpo que se une a los mismos sitios en una molécula de unión sin inducir la actividad funcional de los antígenos reactivos en suero hiperinmune y sus fragmentos.

Los antagonistas potenciales incluyen una molécula pequeña que se une al sitio de unión de los antígenos reactivos en suero hiperinmune y sus fragmentos y lo ocupa evitando de este modo la unión a moléculas de unión celulares, de manera tal que se impide la actividad biológica normal. Los ejemplos de moléculas pequeñas incluyen, pero no se limitan a, moléculas orgánicas pequeñas, péptidos o moléculas análogas a péptidos. Otros antagonistas potenciales incluyen las moléculas antisentido.

Otros antagonistas potenciales incluyen las moléculas antisentido (véase {Okano, H. y col., 1991}; OLIGODEOXYNUCLEOTIDES AS ANTISENSE INHIBITORS OF GENE EXPRESSION; CRC Press, Boca Raton, FL (1988), para una descripción de estas moléculas).

Los antagonistas potenciales de preferencia incluyen los derivados de los antígenos reactivos en suero hiperinmune y sus fragmentos de la invención.

Según se utiliza en el presente documento la actividad de un antígeno reactivo en suero hiperinmune y sus fragmentos es su capacidad para unirse a cualquiera de sus parejas de interacción o el alcance de tal capacidad para unirse a su pareja de interacción o a cualquier pareja de interacción.

Es posible el uso de los antígenos reactivos en suero hiperinmune y sus fragmentos, las moléculas de ácido nucleico o los inhibidores para interferir con la interacción física inicial entre un patógeno y un huésped mamífero responsable de las secuelas de la infección. En particular las moléculas de la invención pueden utilizarse: i) en la prevención de la adhesión del S. pyogenes a las proteínas de la matriz extracelular de mamíferos en los dispositivos permanentes o a las proteínas de la matriz extracelular en heridas; ii) para bloquear la invasión de las células del mamífero mediada por proteínas, por ejemplo, iniciando la fosforilación de las tirosina cinasas de mamífero. {Rosenshine, I. y col., 1992} para bloquear la adhesión bacteriana entre las proteínas de la matriz extracelular de mamífero y las proteínas bacterianas que median el daño tisular; iv) para bloquear la progresión normal de la patogénesis en las infecciones iniciadas con excepción de las causadas por la implantación de dispositivos permanentes o por otras técnicas quirúrgicas.

Cada una de las secuencias de ADN codificadoras proporcionadas en el presente documento puede utilizarse en el descubrimiento y el desarrollo de compuestos antibacterianos. La proteína codificada tras la expresión puede utilizarse como diana para la selección de los fármacos antibacterianos. Además, las secuencias de ADN que codifican las regiones amino terminal de la proteína codificada o Shine-Delgarno u otras secuencias que facilitan la traducción del respectivo ARNm pueden utilizarse para construir secuencias antisentido para controlar la expresión de la secuencia codificadora de interés.

Los antagonistas y agonistas pueden utilizarse, por ejemplo, para inhibir las enfermedades que se presentan a partir de la infección con estreptococos, especialmente S. pyogenes, tales como la sepsis.

Está contemplado un dispositivo de afinidad, tal dispositivo de afinidad comprende al menos un material de soporte y cualquiera de los antígenos reactivos en suero hiperinmune y sus fragmentos que está unido al material de soporte. Debido a la especificidad de los antígenos reactivos en suero hiperinmune y sus fragmentos por sus células diana o moléculas diana o sus parejas de interacción, los antígenos reactivos en suero hiperinmune y sus fragmentos permiten una eliminación selectiva de su(s) pareja(s) de interacción de cualquier tipo de muestra aplicada al material de soporte a condición de que se cumplan las condiciones para la unión. La muestra puede ser una muestra biológica o médica, incluyendo, pero no limitado a, caldo de fermentación, residuo celular, preparación de células, preparación de tejidos, preparación de órganos, sangre, orina, linfa, licor y similares.

Los antígenos reactivos en suero hiperinmune y sus fragmentos pueden unirse a la matriz de una manera covalente o no covalente. El material de soporte adecuado es conocido por los expertos en la técnica y puede seleccionarse del grupo que comprende celulosa, silicio, vidrio, aluminio, perlas paramagnéticas, almidón y dextrano.

La presente invención se ilustra además por medio de las siguientes figuras, los ejemplos y el listado de secuencias de los que pueden tomarse otras características, formas de realización y ventajas. Debe entenderse que los presentes ejemplos se presentan sólo a manera de ilustración y no como limitación de la divulgación.

Con respecto a la presente invención

La Figura 1 muestra la caracterización del suero humano específico de S. pyogenes.

La Figura 2 muestra la caracterización de la biblioteca genómica de fragmentos pequeños, LSPy-70, de Streptococcus pyogenes SF370/M1.

La Figura 3 muestra la selección de células bacterianas por MACS usando IgG humanas biotiniladas.

La Figura 4 muestra un ejemplo para el estudio de distribución de genes con los antígenos identificados.

La Figura 5 muestra la tinción de superficie celular por citometría de flujo.

La Figura 6 muestra el valor protector de antígenos recombinantes identificados de S. pyogenes.

La Tabla 1 muestra el resumen de todas las selecciones realizadas con bibliotecas genómicas de S. pyogenes y suero humano.

La Tabla 2 muestra la serología de epítopos con suero humano.

La Tabla 3 muestra el resumen del análisis de distribución de genes para los antígenos identificados en cincuenta cepas de S. pyogenes.

La Tabla 4 resume la información sobre las proteínas antigénicas utilizadas para los experimentos de inmunización.

La Tabla 5 muestra la variabilidad de las proteínas antigénicas en seis cepas diferentes de S. pyogenes.

A continuación se describen con más detalle las figuras a las que puede hacerse referencia en la memoria descriptiva.

La Figura 1 muestra la caracterización del suero humano para S. pyogenes según se mide por medio de ELISA.

La Figura 2 muestra la distribución de tamaños de fragmentos de la biblioteca genómica de fragmentos pequeños de Streptococcus pyogenes SF370/M1, LSPy-70. Después de la secuenciación se fragmentaron 576 secuencias de clones seleccionados aleatoriamente para eliminar los residuos del vector y se graficó el número de clones con diversos tamaños de fragmentos genómicos. (B) Ilustración gráfica de la distribución de la misma serie de clones secuenciados aleatoriamente de LSPy-70 sobre el cromosoma de S. pyogenes. Los círculos azules indican secuencias coincidentes a ORFs anotados en orientación +/+. Los rectángulos rojos representan clones completamente coincidentes a las secuencias cromosómicas no codificadoras en orientación +/+. Los diamantes verdes ubican a todos los clones con secuencias complementarias o quiméricas. Las distancias numéricas en pares de bases están indicadas sobre cada genoma circular para la orientación. La división de diversas series de clones dentro de la biblioteca se presenta en números y porcentaje al pie de la figura.

La Figura 3A muestra la selección del separador MACS con IgG humanas biotiniladas. Se seleccionó la biblioteca LSPy-70 en pMAL9.1 con 10 \mug de (P4-IgG) de suero humano biotinilada en el primer ciclo y con 1 \mug en el segundo ciclo de selección. Como control negativo, no se añadió suero a las células de la biblioteca para la selección. La cantidad de células seleccionadas después del 1º y del 2º ciclo de elución se muestra para cada ciclo de selección. La Figura 3B muestra la reactividad de los clones específicos (1-52) aislados por presentación de superficie bacteriana según se analizó por medio del análisis de transferencia Western con el suero humano (P4-IgG) utilizado para la selección del MACS en una dilución de 1:3.000. Como un control de carga también se analizó la misma transferencia con anticuerpos dirigidos contra la proteína de plataforma LamB en una dilución de 1:5.000. LB, extracto de un clon que expresa LamB sin el inserto del péptido extraño.

La Figura 4A muestra los tipos de emm de S. pyogenes analizados para el estudio de distribución de genes. La Figura 4B muestra el análisis de PCR para la distribución de genes de los genes Spy0269 con los respectivos oligonucleótidos. El tamaño predicho de los fragmentos de PCR es de 1.000 pares de bases. 1-50, cepas de S. pyogenes según se presentan bajo A; N, sin adición de ADN genómico; P, ADN genómico de S. pyogenes SF310, que sirvió como molde para la construcción de la biblioteca.

Figura 5. Detección de la unión de anticuerpos específicos en la superficie celular de estreptococos grupo A por citometría de flujo. En la Figura 5A se incubó suero preinmune de ratón y suero policlonal generado contra el lisado S. pyogenes con la cepa SF370/M1 de S. pyogenes y se analizó por citometría de flujo. El control representa el nivel de unión no específica del anticuerpo secundario a la superficie de las células de S. pyogenes. Los histogramas en las figuras 5B y 5C indican la fluorescencia aumentada por la unión específica de los anticuerpos anti-Spy0012 (B) o anti Spy1315 y anti-Spy1798 (C) con respecto al suero de control contra las dos proteínas de plataforma LamB y FhuA, respectivamente.

Figura 6. Se inmunizaron ratones NMRI con 3 dosis consecutivas de proteína recombinante (50 \mug/dosis) separadas por dos semanas los días 0, 14 y 28. Como control negativo, se inmunizaron los ratones con PBS en presencia de adyuvante. La proteína M1 (Spy2018) sirvió como control positivo para el experimento de desafío. El desafío bacteriano se realizó con 5 x 10^{7} células de S. pyogenes AP1 i.v. y la supervivencia de los ratones se observó diariamente durante A) 18 días, B) 21 días y C) 19 días, respectivamente.

\vskip1.000000\baselineskip

Tabla 1: Proteínas inmunogénicas identificadas por presentación de superficie bacteriana.

A, biblioteca LSPy-70 en LamB con IC3-IgG (1588), B, biblioteca LSPy-70 en LamB con IC3-IgA (1539), C, biblioteca LSPy-70 en LamB con IC6-IgG (1173), D, biblioteca LSPy-70 en LamB con P4-IgG (1138), E, biblioteca LSPy-70 en LamB con P4-IgA (981), F, biblioteca LSPy-150 en btuB con IC3-IgG (991), G, biblioteca LSPy-150 en btuB con IC6-IgG (1036), H, biblioteca LSPy-150 en btuB con P4-IgG (681), I, biblioteca LSPy-400 en fhuA con IC3-IgG (559), K, biblioteca LSPy-400 en fhuA con IC6-IgG (543), L, biblioteca LSPy-400 en fhuA con P4-IgG (20), *, la predicción de las secuencias antigénicas de más 5 aminoácidos de longitud se realizó con el programa ANTIGENIC {Kolaskar, A. y col., 1990}.

\vskip1.000000\baselineskip

Tabla 2: Serología de epítopos con suero humano.

Se muestra la reactividad inmunológica de los péptidos sintéticos individuales que representan los epítopos seleccionados con los sueros humanos individuales. El grado de reactividad es patrón/codificado gris; blanco: - (< 50 U), gris: + (50-119 U), diagonal: ++ (120-199 U), cruzado diagonal: +++ (200-1000 U) y cruzado vertical: ++++ (> 1000U). Las unidades de ELISA (U) se calculan a partir de las lecturas de DO_{545 \ nm} y la dilución del suero después de la corrección del fondo. Puntuación, suma de todas las reactividades (adición de la cantidad de todos los +); los sueros P1 a P10 son de pacientes con faringitis aguda y los sueros N1 a N10 son de adultos sanos. P y N se utilizan como controles internos. Nombres de los péptidos: SP00012, ORF Spy0012 anotado; SPA0450, ORF potencial nuevo en el marco de lectura alternativo de Spy0450; SPC0406, ORF potencial nuevo en el complemento de Spy0406; SPN0001, ORF potencial nuevo en la región no codificadora.

\vskip1.000000\baselineskip

Tabla 3: Distribución de genes en las cepas de S. pyogenes .

Se probaron cincuenta cepas de S. pyogenes según se muestra en la Figura 4A por PCR con los oligonucleótidos específicos para los genes que codifican los antígenos relevantes. Se secuenció el fragmento de PCR de un fragmento de PCR seleccionado para confirmar la amplificación del fragmento de ADN correcto. *, número de sustituciones de aminoácidos en la cepa M89 con respecto a S. pyogenes SF370 (M1). #, cepa alternativa utilizada para la secuenciación, porque el gen no estaba presente en M89.

\vskip1.000000\baselineskip

Tabla 4: Proteínas recombinantes utilizadas para los experimentos de inmunización en ratones NMRI.

La inmunización con los antígenos recombinantes y el desafío con S. pyogenes AP1 patógeno se realizó como se describe en Procedimientos experimentales. A, Se administran los aminoácidos del antígeno respectivo contenido dentro de la proteína recombinante como se utiliza para los experimentos de inmunización en animales con relación a la proteína de longitud total. B, El porcentaje de supervivencia se representa como protección y los paréntesis describen el porcentaje de protección del control negativo (inmunizado con PBS) seguido por el porcentaje de protección del control positivo (Spy2018). C, Se seleccionó Spy0269 por el hecho de que los ratones mostraron mejor supervivencia aunque al final del período de observación todos los ratones murieron. Esto se refleja por medio del tiempo de supervivencia promedio medido en días: 14,6 (Spy0269), 11,6 (PBS) y 19,3 días (Spy2018).

\vskip1.000000\baselineskip

Tabla 5: Variación de las secuencias de las proteínas antigénicas de S. pyogenes .

Las proteínas antigénicas se analizaron para verificar los intercambios de aminoácidos en seis cepas diferentes de S. pyogenes como se presenta en Procedimientos experimentales. El número de los residuos indica la posición del aminoácido en la proteína de longitud total.

En el caso de Spy1666, se presentan los cambios en comparación con un gen homólogo en Streptococcus pneumoniae TIGR4 (SP0334), porque el gen está muy conservado en S. pyogenes así como en S. pneumoniae. A, residuos de aminoácidos en proteínas de S. pyogenes SF370. B, residuo(s) de aminoácidos, que pueden presentarse en cualquiera de los genes analizados de las otras cinco cepas de S. pyogenes, si son diferentes de S. pyogenes SF370. C, residuos de Spy0416 implicados en la actividad catalítica.

Los cambios en estos residuos se anticipan para hacer a la enzima inactiva y por consiguiente se intercambian de manera experimental con alanina, serina, treonina de glicina para producir una proteína recombinante enzimáticamente inactiva.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplos Ejemplo 1 Preparación de anticuerpos a partir del suero humano

Los anticuerpos producidos contra estreptococos del grupo A por el sistema inmune humano y presentes en los sueros humanos son indicativos de la expresión in vivo de las proteínas antigénicas y de su inmunogenicidad. Estas moléculas son esenciales para la identificación de antígenos individuales en el enfoque según se describe en la presente invención, que está basado en la interacción de los anticuerpos antiestreptocócicos específicos y los correspondientes péptidos o proteínas de S. pyogenes. Para acceder a los repertorios de anticuerpos relevantes, se recogieron sueros humanos de

I.: pacientes con infecciones agudas por S. pyogenes, tales como faringitis, infección de heridas y bacteriemia. (Se mostró que S. pyogenes era el agente causante por medio de pruebas microbiológicas médicas),

II.: adultos sanos no infectados, ya que las infecciones por estreptococos del grupo A son comunes, y los anticuerpos están presentes como consecuencia de la inmunización natural a partir de contactos previos con los estreptococos.

\vskip1.000000\baselineskip

Los sueros se caracterizaron para los anticuerpos anti S. pyogenes por una serie de ensayos de ELISA y de inmunotransferencia. Se usaron varios antígenos estreptocócicos para mostrar que los títulos medidos no eran un resultado de la suma de anticuerpos con reactividad cruzada. Con ese objeto se usaron dos preparaciones de antígenos diferentes: extracto de células completas o proteínas del sobrenadante del cultivo preparadas a partir de S. pyogenes SF370/M1 cultivado durante la noche (fase estacionaria) en medio de cultivo THB (caldo de Todd-Hewitt). Se determinaron los niveles de anticuerpos IgG e IgA. Se seleccionaron los sueros para otro análisis por inmunotransferencia basado en los valores de anticuerpos totales contra las dos preparaciones de antígenos.

Los valores se compararon en diluciones dadas donde la respuesta era lineal (Figura 1). Los sueros se clasificaron en base a la reactividad contra los múltiples componentes estreptocócicos, y los más altos se seleccionaron para otro análisis por inmunotransferencia. Este amplio enfoque de caracterización de anticuerpos ha dado lugar a la identificación inequívoca de sueros antiestreptocócicos hiperinmunes.

Recientemente se ha informado que no sólo los anticuerpos IgG del suero, sino también los IgA pueden ser reconocidos por los receptores de FcRIII de los PMN y pueden promover la opsonización {Phillips-Quagliata, J. y col., 2000; Shibuya, A. y col., 2000). El papel principal de los anticuerpos IgA es la neutralización, principalmente en la superficie de la mucosa. El nivel IgA del suero refleja la calidad, la cantidad y la especificidad de la IgA dimérica secretora. Por esa razón la muestra de suero no sólo se analizó para la IgG antiestreptocócica, sino también para los niveles de IgA. En los ensayos de ELISA se usaron reactivos secundarios altamente específicos para detectar anticuerpos del tipo de alta afinidad, tales como IgG e IgA, pero se evitó la IgM. La producción de anticuerpos IgM se produce durante la respuesta humoral adaptativa primaria, y da como resultado anticuerpos de baja afinidad, mientras que los anticuerpos IgG e IgA ya han experimentado la maduración de la afinidad, y son más valiosos para luchar o prevenir las enfermedades.

Procedimientos experimentales Síntesis de péptidos

Los péptidos se sintetizaron en pequeña escala (4 mg de resina; hasta 288 en paralelo) usando la química de F-moc convencional en una resina de amida Rink (PepChem, Tübingen, Alemania) usando un sintetizador SyroII (Multisyntech, Witten, Alemania). Después de organizar la secuencia, los péptidos se alargaron con Fmoc-ácido épsilon aminohexanoico (como conector) y biotina (Sigma, St. Louis, MO; activada como un aminoácido normal). Los péptidos se escindieron de la resina con TFA al 93%, trietilsilano al 5% y agua al 2% durante una hora. Los péptidos se secaron bajo vacío y se liofilizaron tres veces desde acetonitrilo/agua (1:1). La presencia de la masa correcta se verificó por espectrometría de masas en un Reflex III MALDI-TOF (Bruker, Bremen Alemania). Los péptidos se utilizaron sin otra purificación.

Ensayo de inmunoabsorción unido a enzimas (ELISA)

Para la caracterización del suero: Se recubrieron las placas de ELISA (Maxisorb, Millipore) con proteína total 5-10 \mug/ml diluida en el tampón de recubrimiento (carbonato de sodio 0,1M, pH 9,2). Se realizaron tres diluciones del suero (2.000X, 10.000X, 50.000X) en PBS-BSA.

Para la serología de los péptidos: Los péptidos marcados con biotina estaban recubriendo las placas de ELISA con estreptavidina (EXICON) en una concentración de 10 \mug/ml según las instrucciones del fabricante. Los sueros se probaron en dos diluciones, 200X y 1.000X.

Se usaron anticuerpos secundarios IgG antihumano o IgA antihumano altamente específicos conjugados con peroxidasa del rábano picante (HRP) según las recomendaciones del fabricante (dilución: 1.000x). Los complejos antígeno-anticuerpo se cuantificaron midiendo la conversión del sustrato (ABTS) al producto coloreado en base a las lecturas de DO_{405 \ nm} en un lector automatizado de ELISA (TECAN SUNRISE). Tras el recubrimiento manual, las placas de péptidos se procesaron y se analizaron por medio del robot de ELISA Gemini 160 (TECAN) con un lector incorporado (GENIOS, TECAN).

Inmunotransferencia

Se prepararon muestras del lisado bacteriano total y del sobrenadante del cultivo de S. pyogenes SF370/M1 cultivado in vitro. Se separaron 10 a 25 \mug de proteína total/carril por SDS-PAGE usando el sistema de electroforesis Mini-Protean 3 Cell de BioRad y se transfirieron las proteínas a una membrana de nitrocelulosa (ECL, Amersham Pharmacia). Tras bloquear durante la noche en leche al 5%, se añadieron los antisueros en una dilución 2.000x y se usó IgG anti ratón marcada con HRPO para la detección.

Preparación de extractos de antígenos bacterianos

Lisado bacteriano total: Las bacterias se lisaron por ciclos repetidos de congelación-descongelación: incubación en mezcla de hielo seco/etanol hasta la congelación (1 minuto), a continuación descongelación a 37ºC (5 minutos): repetido 3 veces. A continuación de esto se sometió a sonicación y se realizó la recogida del sobrenadante por centrifugación (3.500 rpm, 15 minutos, 4ºC).

Sobrenadante del cultivo: Tras eliminar las bacterias, se precipitó el sobrenadante de los cultivos bacterianos crecidos durante la noche con etanol helado (100%): 1 parte de sobrenadante/3 partes de etanol incubado durante la noche a -20ºC. El precipitado se recogió por centrifugación (2.600 g, durante 15 minutos) y se secó. Los sedimentos secos se disolvieron en PBS para ELISA, o en urea y tampón de muestra de SDS para la SDS-PAGE y la inmunotransferencia. La concentración de proteínas de las muestras se determinó por el ensayo de Bradford.

Purificación de los anticuerpos para la selección genómica. Se seleccionaron cinco sueros de los pacientes y del grupo no infectado en base a los valores antiestreptocócicos generales para generar una combinación de sueros utilizada en el procedimiento de selección. Los anticuerpos contra las proteínas de E. coli se eliminaron incubando el suero inactivado con calor con célula completas de E. coli (DH5alfa, transformado con pHIE11, cultivada bajo las mismas condiciones usadas para la presentación de superficie bacteriana). Se generaron preparaciones de IgG altamente enriquecidas de los sueros combinados, deplecionados por medio de cromatografía de afinidad de proteína G, según las instrucciones del fabricante (UltraLink Immobilized Protein G, Pierce). Los anticuerpos IgA se purificaron también por cromatografía de afinidad usando IgA antihumana marcada con biotina (Southern Biotech) inmovilizada en estreptavidina-agarosa (GIBCO BRL). La eficacia de la depleción y la purificación se controló por SDS-PAGE, transferencia Western, ELISA y mediciones de concentración de proteínas.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 2 Generación de bibliotecas de ADN genómico altamente aleatorizadas, de fragmentos pequeños, de marco seleccionado de Streptococcus pyogenes Procedimientos experimentales

Preparación de ADN genómico de estreptococos. Se inocularon 50 ml de medio de caldo de Todd-Hewitt con bacterias S. pyogenes SF370/M1 de un cultivo en profundidad congelado y se cultivó con aireación y agitación durante 18 horas a 37ºC. A continuación se recogió el cultivo, se centrifugó a 1.600x g durante 15 minutos y se retiró el sobrenadante. Se lavaron los sedimentos bacterianos 3 veces con PBS y se resuspendieron cuidadosamente en 0,5 ml de disolución de Lisozima (100 mg/ml). Se añadieron 0,1 ml de RNasa A 10 mg/ml tratada con calor y 20 U de RNasa T1, se mezcló cuidadosamente y la disolución se incubó durante 1 hora a 37ºC. Tras la adición de 0,2 ml de disolución de SDS al 20% y 0,1 ml de Proteinasa K (10 mg/ml) se incubó el tubo durante la noche a 55ºC. A continuación se añadió 1/3 del volumen de NaCl saturado y se incubó la disolución durante 20 minutos a 4ºC. Se sedimentó el extracto en una microcentrífuga (13.000 rpm) y se transfirió el sobrenadante a un tubo nuevo. La disolución se extrajo con PhOH/CHCl_{3}/IAA (25:24:1) y con CHCl_{3}/IAA (24:1). Se precipitó el ADN a temperatura ambiente añadiendo 0,6x el volumen de isopropanol, se transfirió desde la disolución con una pipeta Pasteur estéril a tubos que contenían etanol helado al 80%. Se recuperó el ADN centrifugando el precipitado a 10-12.000x g, a continuación se secó al aire y se disolvió en H_{2}Odd.

Preparación de fragmentos pequeños de ADN genómico. Los fragmentos de ADN genómico se cortaron mecánicamente en tamaños de fragmentos de tamaños en el intervalo entre 150 y 300 pb usando un sonicador con punta o "cup-horn" (sonicator UV 2200 Sonoplus de Bandelin equipado con punta BB5, pulsos de 10 segundos con una salida de potencia del 100%) o en fragmentos de tamaños entre 50 y 70 pb mediante el tratamiento suave con DNasa I (Novagen). Se observó que la sonicación dio como resultado una distribución de tamaños de los fragmentos mucho más estrecha cuando se rompió el ADN en fragmentos del intervalo de tamaños de 150-300 pb. Sin embargo, a pesar de la extensa exposición del ADN a la fuerza de corte hidromecánica inducida por ondas ultrasónicas, la posterior disminución en los tamaños de los fragmentos no pudo alcanzarse de manera eficaz y reproducible. Por consiguiente, se obtuvieron tamaños de fragmentos de 50 a 70 pb por medio del tratamiento suave con DNasa I usando un kit de escisión aleatoria de Novagen. Se preparó una dilución 1:20 de DNasa I con el kit proporcionado y se llevó a cabo la digestión en presencia de MnCl_{2} en un volumen de 60 \mul a 20ºC durante 5 minutos para asegurar la escisión de la doble hebra por medio de la enzima. Las reacciones se interrumpieron con 2 \mul de EDTA 0,5M y se evaluó la eficiencia de la fragmentación en un gel de TAE-agarosa al 2%. Este tratamiento dio como resultado la fragmentación total del ADN genómico en fragmentos de aproximadamente 50-70 pb. A continuación se generaron los extremos romos de los fragmentos dos veces usando Polimerasa de ADN T4 en presencia de 100 \muM de cada dNTP para asegurar el lavado eficaz de los extremos. Los fragmentos se usaron inmediatamente en reacciones de unión o se congelaron a -20ºC para su uso posterior.

Descripción de los vectores. El vector pMAL4.31 se construyó en una estructura central de pASK-IBA {Skerra, A., 1994} con el gen de beta-lactamasa (bla) intercambiado con el gen de la resistencia a la Kanamicina. Además se clonó el gen bla en el sitio de clonación múltiple. La secuencia que codifica la beta-lactamasa madura está precedida por la secuencia del péptido líder de ompA para permitir la secreción eficaz a través de la membrana citoplásmica. Además una secuencia que codifica los primeros 12 aminoácido (secuencia espaciadora) de la beta-lactamasa madura sigue a la secuencia del péptido líder de ompA para evitar la fusión de secuencias inmediatamente después del sitio de escisión de líder de la peptidasa, ya que por ejemplo los grupos de aminoácidos cargados positivamente en esta región disminuirían o impedirían la translocación a través de la membrana citoplásmica {Kajava, A. y col., 2000}. Un sitio de restricción de SmaI servirá para la inserción de la biblioteca. Un sitio de Fsel secuencia arriba y un sitio de Notl secuencia abajo, que se utilizaron para la recuperación del fragmento seleccionado, flanquean el sitio de Smal. Los tres sitios de restricción se insertan después de la secuencia que codifica la secuencia espaciadora de 12 aminoácidos de manera tal que el gen bla se transcribe en el marco de lectura -1 dando como resultado un codón de parada de 15 pb después del sitio de Notl. Una inserción de +1 pb restablece el ORF de bla de manera que la proteína beta-lactamasa se produce con una consiguiente obtención de la resistencia a la Ampicilina.

El vector pMAL9.1 se construyó clonando el gen lamB en el sitio de clonación múltiple de pEH1 {Hashemzadeh-Bonehi, L. y col., 1998}. Posteriormente, se insertó una secuencia en lamB después del aminoácido 154, que contenía los sitios de restricción de FseI, SmaI y NotI. El marco de lectura para esta inserción se construyó de manera tal que la transferencia de los fragmentos de ADN seleccionado del marco escindidos por medio de digestión con FseI y NotI del plásmido pMAL4.31 da un marco de lectura continuo de lamB y el inserto respectivo.

El vector pMAL10.1 se construyó clonando el gen btuB en el sitio de clonación múltiple de pEH1. Posteriormente, se insertó una secuencia en btuB después del aminoácido 236, que contenía los sitios de restricción de FseI, XbaI y NotI. El marco de lectura para esta inserción se eligió de manera tal que la transferencia de los fragmentos de ADN seleccionados del marco escindidos por la digestión con Fsel y Notl del plásmido pMAL4.31 da un marco de lectura continuo de btuB y el inserto respectivo.

El vector pHIE11 se construyó clonando el gen fhuA en el sitio de clonación múltiple de pEH1. A partir de entonces, se insertó una secuencia en fhuA después del aminoácido 405, que contenía los sitios de restricción de FseI, XbaI y NotI. El marco de lectura para esta inserción se eligió de manera tal que la transferencia de los fragmentos de ADN seleccionados del marco escindidos por la digestión con Fsel y Notl del plásmido pMAL4.31 da un marco de lectura continuo de fhuA y el inserto respectivo.

Clonación y evaluación de la biblioteca para la selección del marco. Se unieron fragmentos de ADN genómico de S. pyogenes en el sitio de SmaI del vector pMAL4.31. El ADN recombinante se electroporó en células de E. coli DH10B electrocompetentes (GIBCO BRL) y los transformantes se plaquearon en agar LB suplementado con Kanamicina (50 \mug/ml) y Ampicilina (50 \mug/ml). Las placas se incubaron durante la noche a 37ºC y se recogieron las colonias para la extracción de ADN a gran escala. Se almacenó una placa representativa y se conservó para recoger las colonias para el análisis por PCR de las colonias y la secuenciación a gran escala. Se usó un ensayo de PCR de colonias únicas para determinar inicialmente la distribución bruta de tamaño de los fragmentos así como la eficacia de la inserción. A partir de los datos de la secuenciación se evaluó el tamaño preciso de los fragmentos, la integridad de la unión en el sitio de inserción así como la exactitud de la selección del marco (regla 3n+1).

Clonación y evaluación de la biblioteca para la presentación de superficie bacteriana. Los fragmentos de ADN genómico se escindieron del vector pMAL4.31, que contenía la biblioteca de S. pyogenes con las enzimas de restricción FseI y NotI. A continuación se transfirió la población completa de fragmentos en los plásmidos pMAL9.1 (LamB), pMAL10.1 (BtuB) o pHIE11 (FhuA), que se habían digerido con FseI y NotI. Usando estas dos enzimas de restricción, que reconocen una secuencia rica en GC de 8 pb, el marco de lectura que se había seleccionado en el vector pMAL4.31 se mantiene en cada uno de los vectores de la plataforma. A continuación se transformó la biblioteca de plásmidos en células de E. coli DH5alfa por electroporación. Las células se plaquearon en placas grandes de agar LB suplementado con Kanamicina 50 \mug/ml y se cultivaron durante la noche a 37ºC a una densidad que da colonias únicas claramente visibles. A continuación se rasparon las células de la superficie de estas placas, se lavaron con medio LB fresco y se almacenaron en alícuotas a -80ºC para la selección de la biblioteca.

Resultados

Bibliotecas para la selección del marco. Se generaron tres bibliotecas (LSPy70, LSPy150 y LSPy300) en el vector de pMAL4.31 con tamaños de aproximadamente 70, 150 y 300 pb, respectivamente. Para cada biblioteca, la unión y posterior transformación de aproximadamente 1 \mug de ADN del plásmido pMAL4.31 y 50 ng de ADN genómico fragmentado de S. pyogenes dio 4 x 10^{5} a 2 x 10^{6} clones después de la selección del marco. Para evaluar la aleatoriedad de las bibliotecas, se secuenciaron aproximadamente 600 clones de LSPy70 elegidos aleatoriamente. El análisis bioinformático mostró que de estos clones sólo unos pocos estaban presentes más de una vez. Además, se mostró que el 90% de los clones entraban en el intervalo de tamaños entre 16 y 61 pb con un tamaño promedio de 34 pb (Figura 2). Todas las secuencias siguieron la regla 3n+1, mostrando que todos los marcos de los clones se seleccionaron adecuadamente.

Bibliotecas de presentación de superficie bacteriana. La presentación de péptidos en la superficie de E. coli requería la transferencia de los insertos de las bibliotecas de LSPy del vector de selección del marco pMAL4.31 a los plásmidos de presentación pMAL9.1 (LamB), pMAL10.1 (BtuB) o pHIE11 (FhuA). Los fragmentos de ADN genómico se escindieron por restricción con FseI y NotI y la unión de insertos de 5 ng con 0,1 \mug de ADN del plásmido y la posterior transformación en células DH5alfa dio como resultado 2-5 x 10^{6} clones. Los clones se rasparon de las placas de LB y se congelaron sin otra amplificación.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 3 Identificación de secuencias de péptidos altamente inmunogénicas de S. pyogenes usando bibliotecas genómicas presentadas de superficie bacteriana y suero humano Procedimientos experimentales

Selección por MACS. Se cultivaron aproximadamente 2,5 x 10^{8} células de una biblioteca dada en 5 ml de medio LB suplementado con Kanamicina 50 \mug/ml durante 2 horas a 37ºC. La expresión se indujo por la adición de IPTG 1 mM durante 30 minutos. Las células se lavaron dos veces con medio LB fresco y se resuspendieron aproximadamente 2 x 10^{7} células en 100 \mul de medio LB y se transfirieron a un tubo Eppendorf.

Se añadieron 10 \mug de IgG humanas, biotiniladas purificadas del suero a las células y la suspensión se incubó durante la noche a 4ºC con agitación suave. Se añadieron 900 \mul de medio LB, la suspensión se mezcló y se centrifugó posteriormente durante 10 minutos a 6.000 rpm a 4ºC (Para las selecciones de IgA, se usaron 10 \mug de IgA purificadas y éstas se capturaron con anticuerpos secundarios IgG antihumano biotinilado). Las células se lavaron una vez con 1 ml de LB y a continuación se resuspendieron en 100 \mul de medio LB. Se añadieron 10 \mul de microperlas de MACS acopladas a estreptavidina (Miltenyi Biotech, Alemania) y la incubación continuó durante 20 minutos a 4ºC. A partir de entonces se añadieron 900 \mul de medio LB y se cargó la suspensión celular microperlas de MACS en la columna de MS equilibrada (Miltenyi Biotech, Alemania) que se fijó al imán. (Las columnas de MS se equilibraron lavando una vez con 1 ml de EtOH al 70% y dos veces con 2 ml de medio LB).

\newpage

A continuación se lavó la columna tres veces con 3 ml de medio LB. Tras retirar el imán, se eluyeron las células lavando con 2 ml de medio LB. Tras lavar la columna con 3 ml de medio LB, se cargó el eluato de 2 ml por segunda vez en la misma columna y se repitieron los procesos de lavado y elución. El proceso de carga, lavado y elución se realizó por tercera vez, dando como resultado un eluato final de 2 ml.

A continuación se realizó un segundo ciclo de selección. Se recogieron las células del eluato final mediante centrifugación y se resuspendieron en 1 ml de medio LB suplementado con Kanamicina 50 \mug/ml. El cultivo se incubó a 37ºC durante 90 minutos y a continuación se indujo con IPTG 1 mM durante 30 minutos. Posteriormente se recogieron las células, se lavaron una vez con 1 ml de medio LB y se suspendieron en 10 \mul de medio LB. Puesto que el volumen se redujo, se añadió 1 \mug de IgG biotiniladas, humanas y la suspensión se incubó durante la noche a 4ºC con agitación suave. Todas las otras etapas fueron exactamente iguales al primer ciclo de selección. Las células seleccionadas tras dos ciclos de selección se plaquearon en placas de agar LB suplementado con Kanamicina 50 \mug/ml y se cultivaron durante la noche a 37ºC.

Evaluación de los clones seleccionados por secuenciación y análisis de transferencia Western. Los clones seleccionados se cultivaron durante la noche a 37ºC en 3 ml de medio LB suplementado con Kanamicina 50 \mug/ml para preparar el ADN de plásmido usando procedimientos convencionales. La secuenciación se realizó en MWG (Alemania) o en colaboración con TIGR (EEUU).

Para el análisis de transferencia Western se separaron aproximadamente 10 a 20 \mug de proteína celular total por SDS-PAGE al 10% y se transfirieron a la membrana HybondC (Amersham Pharmacia Biotech, Inglaterra). Las proteínas de fusión de LamB, BtuB o FhuA se detectaron usando suero humano como el anticuerpo primario en una dilución de aproximadamente 1:5.000 y anticuerpos IgG o IgA anti humano acoplados a HRP en una dilución de 1:5.000 como anticuerpos secundarios. La detección se realizó usando el kit de detección ECL (Amersham Pharmacia Biotech, Inglaterra). Como alternativa, se usaron anticuerpos anti FhuA de conejo o anti LamB de ratón como anticuerpos primarios en combinación con los anticuerpos secundarios respectivos acoplados a HRP para la detección de las proteínas de fusión.

Resultados

Selección de bibliotecas de presentación de superficie bacteriana por clasificación celular activada por magnetismo (MACS) usando Ig biotiniladas. Las bibliotecas LSPy70 en pMAL9.1, LSPy150 en pMAL10.1 y LSPy300 en pHIE11 se seleccionaron con combinaciones de IgG e IgA humanas, biotiniladas, de sueros de pacientes o sueros de individuos sanos (véase Ejemplo 1: Preparación de anticuerpos a partir de suero humano). El procedimiento de selección se realizó como se describió en Procedimientos experimentales. La Figura 3A muestra un ejemplo representativo de una selección con la biblioteca LSPy-70 y P4-IgG. Como puede observarse a partir del recuento de colonias después del primer ciclo de selección de la selección por MACS, el número total de células recuperadas al final se reduce drásticamente desde 3 x 10^{7} células hasta aproximadamente 5 x 10^{4} células, mientras que la selección sin anticuerpos adicionados mostró una reducción hasta aproximadamente 2 x 10^{3} células (Figura 3A). Tras el segundo ciclo, se recuperó una cantidad de células similar con P4-IgG, mientras que se recuperaron menos de 10 células cuando no se añadieron IgG de suero humano, mostrando claramente que la selección fue dependiente de los anticuerpos específicos de S. pyogenes. Para evaluar el rendimiento de la selección, se tomaron aleatoriamente aproximadamente 50 clones seleccionados y se sometieron al análisis de transferencia Western con el mismo suero, combinado (Figura 3B). Este análisis reveló que el 70% de los clones seleccionados mostraron reactividad con los anticuerpos presentes en el suero relevante mientras que la cepa de control que expresa LamB sin un inserto específico de S. pyogenes no reaccionó con el mismo suero. En general, se observó que la tasa de reactividad se mantuvo dentro del intervalo del 35 al 75%. El análisis por PCR de las colonias mostró que todos los clones seleccionados contenían un inserto en el intervalo de tamaños esperado.

La posterior secuenciación de un número mayor de clones tomados aleatoriamente (600 a 1200 por selección) dio lugar a la identificación del gen y de la correspondiente secuencia del péptido o proteína que se reconoció específicamente por el suero humano para la selección. La frecuencia con la que se selecciona un clon específico refleja al menos en parte la abundancia y/o afinidad de los anticuerpos específicos en el suero usado para selección y reconocimiento del epítopo presentado por este clon. Al respecto, es llamativo que los clones derivados de algunos ORF (por ejemplo Spy0433, Spy2025) se tomaron más de 80 veces, indicando su propiedad altamente inmunogénica. La Tabla 1 resume los datos obtenidos para las 15 selecciones realizadas. Todos los clones que se presentan en la Tabla 1 se han verificado por análisis de transferencia Western usando extractos de células completas de clones únicos para mostrar la reactividad indicada por la combinación de suero humano usada en la respectiva selección. Como puede observarse de la Tabla 1, regiones características de los ORF identificados se identifican como inmunogénicas, puesto que se presentan fragmentos de las proteínas de tamaños variables en la superficie por las proteínas de plataforma.

Vale la pena destacar además que la mayoría de los genes identificados por la selección por presentación de superficie bacteriana codifican proteínas que están unidas a la superficie de S. pyogenes y/o se secretan. Esto está de acuerdo con el papel esperado de las proteínas unidas o secretadas en la virulencia de S. pyogenes.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 4 Evaluación de la reactividad de las secuencias de péptidos altamente inmunogénicos con sueros humanos individuales

En el análisis se incluyeron aproximadamente sueros de 100 pacientes y de 60 adultos sanos. Tras el análisis bioinformático de los clones seleccionados, se diseñaron y se sintetizaron los péptidos correspondientes. En el caso de epítopos con más de 28 residuos de aminoácidos, se construyeron péptidos superpuestos. Todos los péptidos se sintetizaron con un marcador de biotina N-terminal y se usó como reactivo de recubrimiento en las placas de ELISA recubiertas con Estreptavidina.

El análisis se realizó en dos etapas. Primero, se seleccionaron los péptidos en base a su reactividad con los sueros individuales, que se incluyeron en las combinaciones de sueros (cinco sueros individuales) usados para las preparaciones de reactivos de selección de IgG e IgA para la presentación de superficie bacteriana. Los péptidos que no mostraron una reacción positiva no se incluyeron en otros estudios, más detallados. Segundo, se probó una gran cantidad de sueros individuales no preseleccionados de pacientes con faringitis aguda o con enfermedades postestreptocócicas o de adultos y niños sanos contra los péptidos que mostraban reactividad específica y elevada con los sueros de selección. Se midieron los niveles de anticuerpos por medio de ELISA y se compararon por la puntuación calculada para cada péptido en base a la cantidad de sueros positivos y la amplitud de la reactividad. En la tabla 2 se muestra un ejemplo para la reactividad de los sueros de 174 péptidos que representan epítopos de S. pyogenes de la selección genómica con 20 sueros humanos (que representan 4 combinaciones diferentes de cinco sueros) usados para la identificación de antígenos. Los péptidos varían desde altamente y ampliamente reactivos hasta débilmente positivos. Entre los más reactivos hay antígenos conocidos, algunos de ellos también son protectores en modelos de desafío en animales para portación nasofaríngea (por ejemplo, la peptidasa C5a y la proteína M).

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 5 Estudios de distribución de genes con proteínas altamente inmunogénicas identificadas de S. pyogenes

Distribución de genes de antígenos de estreptococos del grupo A por PCR. Un antígeno de vacuna ideal sería un antígeno que esté presente en todas, o en la gran mayoría de las cepas del organismo diana para el que está dirigida la vacuna. Para establecer si los genes que codifican los antígenos identificados de Streptococcus pyogenes se presentan de manera ubicua en cepas de S. pyogenes, se realizó la PCR en una serie de aislamientos de S. pyogenes independientes con cebadores específicos para el gen de interés. Los aislamientos de S. pyogenes se obtuvieron cubriendo los tipos de emm presentes con más frecuencia en los pacientes como se muestra en la Figura 4A. Se diseñaron secuencias de oligonucleótidos como cebadores para todos los ORF identificados dando productos de aproximadamente 1.000 pb, de ser posible cubriendo todos los epítopos inmunogénicos identificados. Se preparó el ADN genómico de todas las cepas de S. pyogenes según se describe en el Ejemplo 2. La PCR se llevó a cabo en un volumen de reacción de 25 \mul usando polimerasa Taq (1U), dNTP 200 nM, 10 pMol de cada oligonucleótido en el kit según las instrucciones del fabricante (Invitrogen, Holanda). Como patrón, se realizaron 30 ciclos (1 x: 5 minutos, 95ºC, 30x: 30 segundos, 95ºC, 30 segundos, 56ºC, 30 segundos, 72ºC, 1 x 4 minutos, 72ºC), a menos que tuvieran que adaptarse las condiciones para los pares de cebadores individuales.

Resultados

Todos los genes identificados que codifican proteínas inmunogénicas se probaron por PCR para verificar su presencia en 50 cepas diferentes de S. pyogenes (Figura 4A). Como un ejemplo, la figura 4B muestra la reacción de PCR para Spy0269 con todas las 50 cepas indicadas. Como resulta claramente visible, el gen está presente en todas las cepas analizadas. El fragmento de PCR de la cepa Nº 8 (M89) se secuenció y mostró que de 917 pb sólo 2 pb eran diferentes comparado con la cepa SF310 de S. pyogenes M1, dando como resultado sólo una diferencia de aminoácidos entre los dos aislamientos. De un total de 96 genes analizados, 70 estaban presentes en todas las cepas probadas, mientras que 22 genes estaban ausentes en más de 10 de las 50 cepas probadas (Tabla 3). Varios genes (Spy0433, Spy0681) mostraron variación en el tamaño y no estaban presentes en todos los aislamientos de cepas. Algunos genes mostraron variación en el tamaño, pero por otro lado estaban conservados en todas las cepas probadas (por ejemplo Spy1371). La secuenciación del fragmento generado por PCR de una cepa y la posterior comparación con la cepa M1 confirmó la amplificación del fragmento de ADN correcto y reveló un grado de divergencia de secuencia como se indicó en la Tabla 3. Es importante señalar que muchos de los antígenos identificados están bien conservados en todas las cepas en secuencia y tamaño y por consiguiente son nuevos candidatos de vacuna para prevenir infecciones por estreptococos del grupo A.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 6 Caracterización de sueros inmunes obtenidos de ratones inmunizados con proteínas/péptidos de S. pyogenes altamente inmunogénicos presentados en la superficie de E. coli Generación de sueros inmunes de ratones

Se cultivaron clones de E. coli que albergan plásmidos que codifican la proteína de plataforma fusionada a un péptido de S. pyogenes en medio LB suplementado con Kanamicina 50 \mug/ml a 37ºC. Los cultivos obtenidos durante la noche se diluyeron 1:10, se hicieron crecer hasta una DO_{600} de 0,5 y se indujeron con IPTG 0,2 mM durante 2 horas. Las células bacterianas sedimentadas se suspendieron en tampón PBS y se rompieron por medio de sonicación en hielo, generando un extracto celular bruto. Según la medición de DO_{600}, se inyectó una alícuota correspondiente a 5 x 10^{7} células en el ratón NMRI i.v., seguida por una estimulación después de 2 semanas. El suero se recogió 1 semana después de la segunda inyección. Los niveles de anticuerpos específicos de epítopo se midieron por medio de ELISA de péptidos.

Expresión de antígenos in vitro

La expresión de antígenos por medio del cultivo in vitro de S. pyogenes SF370/M1 se probó por medio de inmunotransferencia. Los diferentes medios de cultivo y las condiciones de cultivo se probaron para detectar la presencia de antígenos en los lisados totales y en los sobrenadantes de cultivos bacterianos. La expresión se consideró confirmada cuando se detectó una banda específica correspondiente a la movilidad electroforética esperada y al peso molecular predicho.

Tinción de la superficie celular

El análisis por citometría de flujo se llevó a cabo de la siguiente manera. Las bacterias se hicieron crecer bajo condiciones de cultivo, que dieron como resultado la expresión del antígeno como se muestra por el análisis de inmunotransferencia. Las células se lavaron dos veces en Disolución de Hanks Equilibrada (HBSS) y se ajustó la densidad celular hasta aproximadamente 1 X 10^{6} UFC en 100 \mul de HBSS, BSA al 0,5%. Tras incubar durante 30 a 60 minutos a 4ºC con antisueros diluidos 50 a 100 veces, los anticuerpos no unidos se eliminaron por medio de centrifugación en HBSS en exceso, BSA al 0,5%. Se incubó el anticuerpo secundario anti ratón de cabra (fragmento F(ab')_{2} específico) marcado con fluoresceína (FITC) con las células a 4ºC durante 30 a 60 minutos. Tras lavar las células, se fijaron los anticuerpos con paraformaldehído al 2%. Los anticuerpos unidos se detectaron usando un citómetro de flujo FACScan de Becton Dickinson y los datos se analizaron además con el programa informático CELLQuest. Los sueros de control incluyeron suero preinmune de ratón y suero policlonal de ratón generado con lisados preparados a partir de células de E. coli inducidas con IPTG transformadas con plásmidos que codifican los genes lamB o fhuA sin el inserto genómico de S. pyogenes.

Ensayo de opsonofagocitosis

Se probó la actividad de los sueros inmunes específicos de epítopo para inducir la opsonofagocitosis en un ensayo basado en FACS. Los sueros se inactivaron con calor y a continuación se eliminaron los anticuerpos anti E. coli por incubación con célula completa de E. coli (3x). Se preopsonizaron 10^{7} células de S. pyogenes marcadas con Alexa 488 en presencia de suero inmune al 2-10% y suero de hámster al 2% como fuente de complemento y a continuación se añadieron a 10^{6} células fagocíticas (líneas celulares monocíticas murinas RAW246.7 o P388.D1). Se incubó la mezcla celular durante 30 minutos a 37ºC. Se registró el tiempo, la concentración de IgG y la captación de bacterias dependiente del complemento como un aumento en la intensidad media de fluorescencia de las células fagocíticas medida con un clasificador de células activadas con fluorescencia.

Ensayo bactericida (muerte bacteriana)

Se incubaron células macrófagos murinos (RAW246.7 o P388.D1) y bacterias y se determinó la pérdida de bacterias viables tras 60 minutos por medio del recuento de colonias. En resumen, las bacterias se lavaron dos veces en Disolución Salina Equilibrada de Hanks (HBSS) y se ajustó la densidad celular hasta aproximadamente 1 X 10^{5} UFC en 50 \mul de HBSS. Las bacterias se incubaron con sueros de ratón (hasta el 25%) y complemento de cobaya (hasta el 5%) en un volumen total de 100 \mul durante 60 minutos a 4ºC. Las bacterias preopsonizadas se mezclaron con los macrófagos (línea celular murina RAW264.7 o P388.D1; 2 X 10^{6} células por 100 \mul) en una relación 1:20 y se incubaron a 37ºC en un agitador rotativo a 500 rpm. Se diluyó una alícuota de cada muestra en agua estéril y se incubó durante 5 minutos a temperatura ambiente para lisar los macrófagos. A continuación se plaquearon diluciones en serie sobre placas de agar con caldo de Todd-Hewitt. Las placas se incubaron durante la noche a 37ºC, y se hizo el recuento de colonias con el contador rápido de colonias Countermat (IUL Instruments). Los sueros de control incluyeron suero preinmune de ratón y suero policlonal de ratón generado con lisados preparados a partir de E. coli inducida con IPTG transformadas con plásmidos que albergan los genes lamB o flmA sin el inserto genómico de S. pyogenes.

\newpage

Resultados

Expresión in vitro y tinción de la superficie celular. La expresión de las proteínas antigénicas se analizó in vitro en S. pyogenes SF370/M1 usando los sueros generados contra los clones de E. coli que albergan plásmidos que codifican la proteína de plataforma fusionada al péptido de S. pyogenes. Este análisis sirvió como primera etapa para determinar si se expresa una proteína para evaluar la expresión superficial del polipéptido por medio del análisis FACS. Se anticipó que no todas las proteínas serían expresadas bajo la condiciones in vitro, pero se detectaron varias proteínas por medio de análisis de transferencia Western en los lisados celulares totales (por ejemplo Spy0012, Spy0112, Spy0416, Spy0437, Spy0872, Spy1032, Spy1315, Spy1798; datos no mostrados). Posteriormente se demostró por medio de un ensayo basado en citometría de flujo la accesibilidad de la superficie celular para diversas proteínas antigénicas. Se incubaron los estreptococos con sueros de ratón preinmunes y policlonales generados contra el lisado de S. pyogenes o clones de E. coli que albergan plásmidos que codifican la proteína de plataforma fusionada a un péptido de S. pyogenes, seguido por la detección con el anticuerpo secundario marcado fluorescente. Como se muestra en la Fig. 5A, los antisueros generados contra el lisado de S. pyogenes causan un cambio en la fluorescencia de la población celular de S. pyogenes SF370/Ml. Se observó una tinción de superficie celular similar de las células de S. pyogenes SF370/M1 con el suero policlonal generado contra péptidos del antígeno Spy0012 (Fig. 5B), Spy1315 y Spy1798 (Fig. 5C), aunque sólo se tiñó una subpoblación de bacterias, como lo indica la detección de dos picos. Este fenómeno puede ser un resultado de la expresión diferencial de los productos genéticos durante el crecimiento de la bacteria o de la inhibición parcial de la unión del anticuerpo causada por otras moléculas de superficie.

Estos experimentos confirmaron la predicción bioinformática de que estas proteínas se exportan por su secuencia del péptido señal y además mostraron que están ancladas en la superficie de la célula de S. pyogenes SF370/M1. También confirmaron que estas proteínas están disponibles para el reconocimiento por anticuerpos humanos y las transforman en candidatos valiosos para el desarrollo de una vacuna contra la enfermedad producida por estreptococos del grupo A.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 7 Respuestas inmunes protectoras contra la infección con estreptococos del grupo A tras la inmunización con antígenos recombinantes Procedimientos experimentales Clonación de genes que codifican proteínas antigénicas

Se amplificó el gen o el fragmento de ADN de interés a partir del ADN genómico de S. pyogenes SF370 por medio de amplificación por PCR usando cebadores específicos de genes. Aparte de la secuencia específica del gen, los cebadores contenían bases adicionales en el respectivo extremo 5' constituidas por sitios de restricción que ayudaron en la clonación direccional del producto de PCR amplificado. La secuencia del cebador específica del gen varió entre 15-24 bases de longitud. Los productos de PCR obtenidos se digirieron con las enzimas de restricción adecuadas y se clonaron en el vector pET28b(+) digerido adecuadamente (NOVAGEN). Tras confirmar la construcción del plásmido recombinante, se transformaron las células de E. coli BL21 STAR® (INVITROGEN) que sirvieron como huéspedes de expresión. Estas células están optimizadas para expresar de manera eficaz el gen de interés según está codificado por el plásmido de pET28b.

Expresión de antígenos en Escherichia coli

Se cultivaron las células de E. coli BL21 STAR® que albergan el plásmido recombinante en la fase logarítmica en medio LB suplementado con Kanamicina 50 \mug/ml a 37ºC. Una vez alcanzada una DO_{600 \ nm} de 0,8, se indujo el cultivo con IPTG 1 mM durante 3 horas a 37ºC. Las células se recogieron por centrifugación, se lisaron mediante una combinación del procedimiento de congelación/descongelación seguido por la rotura de las células con el reactivo Bug-buster® de NOVAGEN. El lisado se separó por medio de centrifugación en fracciones solubles (sobrenadante) e insolubles (sedimento).

Purificación de proteínas recombinantes de E. coli

Según la localización de la proteína, se siguieron diferentes estrategias de purificación. Las proteínas en la fracción soluble se purificaron por la unión del sobrenadante de los lisados celulares tras la rotura celular a perlas de Ni-Agarosa (Ni-NTA-Agarose®, QIAGEN). Por la presencia de la penta-Histidina (HIS) en el extremo C, N o en ambos extremos de la proteína expresada, la proteína se une al Ni-agarosa mientras que otras proteínas contaminantes se lavan y eliminan de la columna por medio de tampón de lavado. Las proteínas se eluyeron mediante una disolución que contenía imidazol 100 mM en el tampón adecuado. Se concentró el eluato, se analizó la concentración de proteína por el método de Bradford y se analizó por medio de SDS-PAGE y transferencia Western. Las proteínas en la fracción insoluble se purificaron por solubilización del sedimento en un tampón adecuado que contiene Urea 8 M. La purificación se realizó bajo condiciones de desnaturalización (en tampón que contiene Urea 8M) usando los mismos materiales y procedimientos que los mencionados anteriormente para las proteínas solubles. El eluato se concentró y se dializó para eliminar toda la urea de manera gradual o por etapas.

La disolución de proteínas final se concentró, se analizó por medio de SDS-PAGE y se midió por medio del método de Bradford.

La expresión se consideró confirmada cuando se detectó una banda específica correspondiente a la movilidad electroforética y al peso molecular predichos. Para las proteínas, que precipitaron durante la diálisis por la eliminación del reactivo de desnaturalización urea, los cuerpos de inclusión insolubles se lavaron varias veces y se usaron directamente para la inmunización de ratones.

Inmunización de ratones NMRI con proteínas recombinantes y desafío con S. pyogenes AP1

Se ensayó la inmunogenicidad de las proteínas en un modelo animal experimental usando ratones NMRI y la cepa AP1 de S. pyogenes como agente infeccioso. Se inmunizaron diez ratones NMRI hembra de 7-8 semanas de edad con 50 \mug/dosis de proteína recombinante cada 2 semanas para un total de 3 dosis. La dosis inicial se potenció con adyuvante Completo de Freund mientras que las dos dosis restantes se potenciaron con adyuvante Incompleto de Freund. Al final de la inmunización se extrajo sangre de los ratones para controlar el valor de anticuerpos y se desafiaron posteriormente por vía intravenosa (i.v.) con una dosis letal de S. pyogenes AP1 (5 x 10^{7} de bacterias patógenas). Se asignaron puntuaciones de supervivencia a los ratones durante 18 hasta 21 días posteriores al desafío.

Resultados Expresión y purificación de proteínas recombinantes

De las 31 proteínas seleccionadas para la expresión de la proteína recombinante, 29 proteínas pudieron producirse en E. coli hasta un nivel suficiente para la purificación. Mientras que algunas de las proteínas pudieron producirse como proteína soluble (véase Tabla 4), algunas proteínas resultaron insolubles (por ejemplo Spy416B, Spy0872) o precipitaron tras la diálisis, que tenía la finalidad de eliminar el reactivo de desnaturalización urea tras la solubilización de las proteínas insoluble tales como Spy0031, Spy0292, Spy720.

En estos casos los cuerpos de inclusión lavados se inyectaron directamente en los ratones para la inmunización. En general, la purificación por afinidad dio una preparación de proteína recombinante de al menos un 85% de pureza.

Respuestas inmunes tras la inmunización con proteínas recombinantes en ratones NMRI

La Tabla 4 presenta los antígenos que se probaron en ratones y mostraron algún grado de protección en animales experimentales. Las proteínas recombinantes, que se probaron también en el modelo de bacteriemia en animales, pero que no mostraron ningún nivel de protección en los experimentos descritos no se presentan en esta tabla; pero se incluyen las proteínas tales como Spy0012, Spy1063 y Spy1494. El modelo de bacteriemia descrito evalúa el valor protector de los candidatos de vacuna contra enfermedades invasivas ya que las bacterias patógenas se inyectan directamente en la sangre. Las proteínas recombinantes, que inducen anticuerpos capaces de proteger contra tal infección por estreptococo grupo A, se consideran candidatos valiosos para el desarrollo de una vacuna contra la enfermedad causada por estreptococo grupo A. En comparación con el control positivo Spy2018 (proteína M1), que se mostró previamente que proporciona protección contra el desafío con S. pyogenes, una serie de antígenos lograron un nivel similar cuando se alcanzó el punto final del experimento de desafío tras 18 ó 21 días (Tabla 4) (Spy0416, Spy1607 o Spy0292). Otras proteínas sólo mostraron un efecto protector parcial (Spy0720, Spy0872), pero pueden demostrar mucha eficacia cuando se combinan con otros antígenos (Fig. 6).

Sorprendentemente, la selección de antígenos había identificado epítopos inmunogénicos predominantemente en la primera mitad de las dos proteínas más grandes, Spy0416 y Spy1972. Por consiguiente se ha concluido que la región protectora también puede estar contenida en la parte N terminal de la proteína. En el caso de Spry0416, ambas partes del antígeno se produjeron como proteína recombinante (Spy0416A y Spy0416B; véase Tabla 4) y se probaron en experimentos animales. Los experimentos mostraron que sólo la primera mitad de la proteína Spy0416 (Tabla 4; Spy0416A) proporcionó protección en el modelo animal, mientras que la segunda mitad de la proteína (Spy0416B) no tuvo ningún efecto protector, definiendo claramente una región más pequeña dentro de la proteína como el candidato para vacuna. Para el antígeno Spy1972 sólo la primera mitad de la proteína de longitud total se produjo como proteína recombinante y se probó en el modelo animal.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 8 Variabilidad de los genes que codifican proteínas antigénicas en cepas de S. pyogenes de diversos serotipos Procedimientos experimentales Secuenciación de fragmentos de PCR y análisis bioinformático

El análisis de PCR de las cepas de S. pyogenes está descrito en el Ejemplo 5. La secuenciación de los fragmentos de PCR proporcionaron una estimación de la variabilidad del gen y el resumen de los resultados se presenta en la Tabla 3. La disponibilidad de las secuencias genómicas de cinco cepas de Streptococcus pyogenes (SF370: M1; MGAS8232: M18; SSI-1: M3; MGAS315: M3; Manfredo: M5) permitió una mejor evaluación de la variabilidad de los antígenos. Todas las secuencias se alinearon con la secuencia del antígeno respectivo de S. pyogenes SF370 y los residuos de aminoácidos identificados que difieren de aquellos en la proteína antigénica de S. pyogenes SF370. Se detectaron las secuencias insertadas o delecionadas en algunas de las proteínas antigénicas, pero no se incluyen en este análisis.

Resultados

La Tabla 5 muestra todas las posiciones que se identificaron como variables en los antígenos indicados en una de las cuatro cepas de S. pyogenes (MGAS8232: M18; SSI-1: M3; MGAS315: M3; Manfredo: M5) o la cepa usada para secuenciar el fragmento amplificado por PCR (véase Tabla 3). El análisis bioinformático muestra que algunas de las proteínas antigénicas están muy bien conservadas sin intercambio de ninguna de las seis cepas de los serotipos M1, M3, M5 y M18. Las proteínas pertenecientes a este grupo incluyen Spy0103 y Spy1536, mientras que los intercambios en la otra proteína antigénica son más numerosos en las proteínas más grandes que en las más pequeñas, como se espera a partir de la diferencia en tamaño por sí misma. Aunque se analizó una diversidad de cepas, prácticamente nunca se observó que hubiera cambiado un único residuo por más de un aminoácido diferente en las otras cepas. Otro análisis de las secuencias de los genes respectivos en una gran cantidad de cepas de serotipos, indicación clínica o localización geográfica variables identificará con certeza posibles cambios en los residuos de aminoácidos presentados o en otros residuos.

Sólo una de las proteínas antigénicas analizadas por alineación de las seis secuencias de genes mostró un grado considerable de variación en el tamaño (Spy1357: SF370 - 217 aminoácidos; MGAS8232 - 245 aa; SSI-1 - 329 aa; MGAS315 - 329 aa; Manfredo - 279 aa). Por consiguiente, es evidente que la mayoría de los antígenos evaluados están muy bien conservados en secuencia así como en tamaño y proporcionan candidatos prometedores para el desarrollo de vacunas.

Referencias

Altschul, S., y col. (1990). Journal of Molecular Biology 215: 403-410.

Bennett, D., y col. (1995). J Mol Recognit 8: 52-58.

Bessen, D., y col. (1988). Infect Immun 56: 2666-2672.

Bisno, A., y col. (1987). Infect Immun 55: 753-757.

Bronze, M., y col. (1988). J Immunol 141: 2767-2770.

Clackson, T., y col. (1991). Nature 352: 624-628.

Cone, L., y col. (1987). New Engl J Med 317: 146-149.

Cunningham, M. (2000). Clin Microbiol Rev 13: 470-511.

Devereux, J., y col. (1984). Nucleic acids research 12: 387-395.

Doherty, E., y col. (2001). Annu Rev Biophys Biomol Struct 30: 457-475.

Eisenbraun, M., y col. (1993). DNA Cell Biol 12: 791-797.

Enright M., y col. (2001) Inf. Immun. 69: 2416-2427

Etz, H., y col. (2001). Bacteriol 183: 6924-6935.

Fenderson, P., y col. (1989). J Immunol 142: 2475-2481.

Fischetti, V. (1989). Clin Microbiol Rev 2: 285-314.

Ganz, T. (1999). Science 286: 420-421.

Georgiou, G. (1997). Nature Biotechnology 15: 29-34.

Guzman, C., y col. (1999). J Infect Dis 179: 901-906.

Hashemzadeh-Bonehi, L., y col. (1998). Mol Microbiol 30: 676-678.

Heinje, von G, (1987) por ejemplo, Sequence Analysis in Molecular Biology, Academic Press

Hemmer, B., y col. (1999). Nat Med 5: 1375-1382.

Hoe N., y col. (2001) J. Inf. Dis. 183: 633-639

Hope-Simpson, R. (1981). J Hyg (Lond) 87: 109-129.

Ji, Y., y col. (1997). Infect Immun 65: 2080-2087.

Johanson, K., y col. (1995). J Biol Chem 270: 9459-9471.

Jones, P., y col. (1986). Nature 321: 522-525.

Kajava, A., y col. (2000). J Bacteriol 182: 2163-2169.

Kohler, G., y col. (1975). Nature 256: 495-497.

Kolaskar, A., y col. (1990). FEBS Lett 276: 172-174.

Lee, P. K. (1989). J Clin Microbiol 27: 1890-1892.

Lewin, A., y col. (2001). Trends Mol Med 7: 221-228.

Marks, J., y col. (1992). Biotechnology_(N Y) 10: 779-783.

McCafferty, J., y col. (1990). Nature 348: 552-554.

Okano, H., y col. (1991). J Neurochem 56: 560-567.

Oligodeoxynucleotides as Antisense Inhibitors of Gene Expression; CRC Press, Boca Ration, FL (1988) para una descripción de estas moléculas.

Phillips-Quagliata, J., y col. (2000). J Immunol 165: 2544-2555.

Rammensee, H., y col. (1999). Immunogenetics 50: 213-219.

Rosenshine, I., y col. (1992). Infect Immun 60: 2211-2217.

Seeger, C., y col. (1984). Proc Natl Acad Sci U S A 81: 5849-5852.

Shibuya, A., y col. (2000). Nature Immunology 1: 441-446.

Skerra, A. (1994). Gene 151: 131-135.

Stevens, D. (1992). Clin Infect Dis 14: 2-11.

Tang, D., y col. (1992). Nature 356: 152-154.

Tempest, P., y col. (1991). Biotechnology (N Y) 9: 266-271.

Tourdot, S., y col. (2000). Eur J Immunol 30: 3411-3421.

Whitnack, E., y col. (1985). J Exp Med 162: 1983-1997.

Wiley, J., y col. (1987) Current Protocols in Molecular Biology.

Vitali, L., y col. (2002) J. Clin. Microbiol 40: 679-681.

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

13

14

TABLA 2-1

15

16

TABLA 3 Distribución de genes en cepas de S. pyogenes

17

18

19

20

21

22

23

TABLA 4 Proteínas recombinantes usadas para experimentos de inmunización en ratones NMRI

24

TABLA 5 Variabilidad de los antígenos en cepas de S. pyogenes

25

26

27

28

29

30

31

32

33

34

SPy0012

\vskip1.000000\baselineskip

Sec. ID 1

\vskip1.000000\baselineskip

35

\vskip1.000000\baselineskip

SPy0019

\vskip1.000000\baselineskip

Sec. ID 2

\vskip1.000000\baselineskip

36

\newpage

SPy0025

\vskip1.000000\baselineskip

Sec. ID 3

\vskip1.000000\baselineskip

37

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

SPy0031

\vskip1.000000\baselineskip

Sec. ID 4

\vskip1.000000\baselineskip

38

\newpage

SPy0103

\vskip1.000000\baselineskip

Sec. ID 5

\vskip1.000000\baselineskip

39

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

SPy0112

\vskip1.000000\baselineskip

Sec. ID 6

\vskip1.000000\baselineskip

40

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

SPy0115

\vskip1.000000\baselineskip

Sec. ID 7

\vskip1.000000\baselineskip

41

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

SPy0166

\vskip1.000000\baselineskip

Sec. ID 8

\vskip1.000000\baselineskip

42

\newpage

SPy0167

\vskip1.000000\baselineskip

Sec. ID 9

43

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

SPy0168

\vskip1.000000\baselineskip

Sec. ID 10

44

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

SPy0171

\vskip1.000000\baselineskip

Sec. ID 11

\vskip1.000000\baselineskip

45

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

SPy0183

\vskip1.000000\baselineskip

Sec. ID 12

\vskip1.000000\baselineskip

46

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

SPy0230

\vskip1.000000\baselineskip

Sec. ID 13

\vskip1.000000\baselineskip

47

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

SPy0269

\vskip1.000000\baselineskip

Sec. ID 14

\vskip1.000000\baselineskip

48

\newpage

SPy0287

\vskip1.000000\baselineskip

Sec. ID 15

\vskip1.000000\baselineskip

49

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

SPy0292

\vskip1.000000\baselineskip

Sec. ID 16

\vskip1.000000\baselineskip

50

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

SPy0295

\vskip1.000000\baselineskip

Sec. ID 17

\vskip1.000000\baselineskip

51

\newpage

SPy0348

\vskip1.000000\baselineskip

Sec. ID 18

\vskip1.000000\baselineskip

52

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

SPy0416

\vskip1.000000\baselineskip

Sec. ID 19

53

530

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

SPy0430

\vskip1.000000\baselineskip

Sec. ID 20

54

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

SPy0433

\vskip1.000000\baselineskip

Sec. ID 21

55

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

SPy0437

\vskip1.000000\baselineskip

Sec. ID 22

56

\newpage

SPy0469

\vskip1.000000\baselineskip

Sec. ID 23

57

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

SPy0488

\vskip1.000000\baselineskip

Sec. ID 24

58

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

SPy0515

\vskip1.000000\baselineskip

Sec. ID 25

59

\newpage

SPy0580

\vskip1.000000\baselineskip

Sec. ID 26

60

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

SPy0621

\vskip1.000000\baselineskip

Sec. ID 27

61

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

SPy0630

\vskip1.000000\baselineskip

Sec. ID 28

62

\newpage

SPy0681

\vskip1.000000\baselineskip

Sec. ID 29

63

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

SPy0683

\vskip1.000000\baselineskip

Sec. ID 30

64

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

SPy0702

\vskip1.000000\baselineskip

Sec. ID 31

65

\newpage

SPy0710

\vskip1.000000\baselineskip

Sec. ID 32

66

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

SPy0711

\vskip1.000000\baselineskip

Sec. ID 33

67

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

SPy0720

\vskip1.000000\baselineskip

Sec. ID 34

68

\newpage

SPy0727

\vskip1.000000\baselineskip

Sec. ID 35

69

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

SPy0737

\vskip1.000000\baselineskip

Sec. ID 36

70

71

\newpage

SPy0747

\vskip1.000000\baselineskip

Sec. ID 37

72

\newpage

SPy0777

\vskip1.000000\baselineskip

Sec. ID 38

73

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

SPy0789

\vskip1.000000\baselineskip

Sec. ID 39

74

\newpage

SPy0839

\vskip1.000000\baselineskip

Sec. ID 40

75

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

SPy0843

\vskip1.000000\baselineskip

Sec. ID 41

76

\newpage

SPy0872

\vskip1.000000\baselineskip

Sec. ID 42

77

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

SPy0895

\vskip1.000000\baselineskip

Sec. ID 43

78

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

SPy0972

\vskip1.000000\baselineskip

Sec. ID 44

79

\newpage

SPy0981

\vskip1.000000\baselineskip

Sec. ID 45

80

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

SPy1008

\vskip1.000000\baselineskip

Sec. ID 46

81

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

SPy1032

\vskip1.000000\baselineskip

Sec. ID 47

82

\newpage

SPy1054

\vskip1.000000\baselineskip

Sec. ID 48

83

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

SPy1063

\vskip1.000000\baselineskip

Sec. ID 49

84

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

SPy1162

\vskip1.000000\baselineskip

Sec. ID 50

85

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

SPy1206

\vskip1.000000\baselineskip

Sec. ID 51

86

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

SPy1228

\vskip1.000000\baselineskip

Sec. ID 52

87

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

SPy1245

\vskip1.000000\baselineskip

Sec. ID 53

88

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

SPy1315

\vskip1.000000\baselineskip

Sec. ID 54

89

\newpage

SPy1357

\vskip1.000000\baselineskip

Sec. ID 55

90

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

SPy1361

\vskip1.000000\baselineskip

Sec. ID 56

91

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

SPy1371

\vskip1.000000\baselineskip

Sec. ID 57

92

\newpage

SPy1375

\vskip1.000000\baselineskip

Sec. ID 58

93

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

SPy1389

\vskip1.000000\baselineskip

Sec. ID 59

94

\newpage

SPy1390

\vskip1.000000\baselineskip

Sec. ID 60

95

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

SPy1422

\vskip1.000000\baselineskip

Sec. ID 61

96

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

SPy1436

\vskip1.000000\baselineskip

Sec. ID 62

97

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

SPy1494

\vskip1.000000\baselineskip

Sec. ID 63

98

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

SPy1523

\vskip1.000000\baselineskip

Sec. ID 64

99

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

SPy1536

\vskip1.000000\baselineskip

Sec. ID 65

100

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

SPy1564

\vskip1.000000\baselineskip

Sec. ID 66

101

\newpage

SPy1604

\vskip1.000000\baselineskip

Sec. ID 67

102

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

SPy1607

\vskip1.000000\baselineskip

Sec. ID 68

103

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

SPy1615

\vskip1.000000\baselineskip

Sec. ID 69

104

\newpage

SPy1666

\vskip1.000000\baselineskip

Sec. ID 70

105

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

SPy1727

\vskip1.000000\baselineskip

Sec. ID 71

106

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

SPy1785

\vskip1.000000\baselineskip

Sec. ID 72

107

\newpage

SPy1798

\vskip1.000000\baselineskip

Sec. ID 73

108

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

SPy1801

\vskip1.000000\baselineskip

Sec. ID 74

109

\newpage

SPy1813

\vskip1.000000\baselineskip

Sec. ID 75

110

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

SPy1821

\vskip1.000000\baselineskip

Sec. ID 76

111

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

SPy1916

\vskip1.000000\baselineskip

Sec. ID 77

112

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

SPy1972

\vskip1.000000\baselineskip

Sec. ID 78

113

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

SPy1979

\vskip1.000000\baselineskip

Sec. ID 79

114

\newpage

SPy1983

\vskip1.000000\baselineskip

Sec. ID 80

115

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

SPy1991

\vskip1.000000\baselineskip

Sec. ID 81

116

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

SPy2000

\vskip1.000000\baselineskip

Sec. ID 82

117

\newpage

SPy2006

\vskip1.000000\baselineskip

Sec. ID 83

118

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

SPy2009

\vskip1.000000\baselineskip

Sec. ID 84

119

\newpage

SPy2010

\vskip1.000000\baselineskip

Sec. ID 85

120

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

SPy2016

\vskip1.000000\baselineskip

Sec. ID 86

121

\newpage

SPy2018

\vskip1.000000\baselineskip

Sec. ID 87

122

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

SPy2025

\vskip1.000000\baselineskip

Sec. ID 88

123

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

SPy2039

\vskip1.000000\baselineskip

Sec. ID 89

124

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

SPy2043

\vskip1.000000\baselineskip

Sec. ID 90

125

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

SPy2059

\vskip1.000000\baselineskip

Sec. ID 91

126

\newpage

SPy2110

\vskip1.000000\baselineskip

Sec. ID 92

127

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

SPy2127

\vskip1.000000\baselineskip

Sec. ID 93

128

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

SPy2191

\vskip1.000000\baselineskip

Sec. ID 94

129

\newpage

SPy2211

\vskip1.000000\baselineskip

Sec. ID 95

130

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

ARF0450

\vskip1.000000\baselineskip

Sec. ID 96

131

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

ARF0569

\vskip1.000000\baselineskip

Sec. ID 97

\hskip1cm

1310

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

ARF0694

\vskip1.000000\baselineskip

Sec. ID 98

132

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

ARF0700

\vskip1.000000\baselineskip

Sec. ID 99

133

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

ARF1007

\vskip1.000000\baselineskip

Sec. ID 100

134

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

ARF1145

\vskip1.000000\baselineskip

Sec. ID 101

135

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

ARF1208

\vskip1.000000\baselineskip

Sec. ID 102

136

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

ARF1262

\vskip1.000000\baselineskip

Sec. ID 103

137

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

ARF1294

\vskip1.000000\baselineskip

Sec. ID 104

138

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

ARF1316

\vskip1.000000\baselineskip

Sec. ID 105

139

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

ARF1352

\vskip1.000000\baselineskip

Sec. ID 106

140

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

ARF1481

\vskip1.000000\baselineskip

Sec. ID 107

141

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

ARF1557

\vskip1.000000\baselineskip

Sec. ID 108

142

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

ARF1629

\vskip1.000000\baselineskip

Sec. ID 109

143

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

ARF1654

\vskip1.000000\baselineskip

Sec. ID 110

144

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

ARF2027

\vskip1.000000\baselineskip

Sec. ID 111

145

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

ARF2093

\vskip1.000000\baselineskip

Sec. ID 112

146

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

ARF2207

\vskip1.000000\baselineskip

Sec. ID 113

147

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

CRF0038

\vskip1.000000\baselineskip

Sec. ID 114

148

\newpage

CRF0122

\vskip1.000000\baselineskip

Sec. ID 115

149

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

CRF0406

\vskip1.000000\baselineskip

Sec. ID 116

150

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

CRF0416

\vskip1.000000\baselineskip

Sec. ID 117

151

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

CRF0507

\vskip1.000000\baselineskip

Sec. ID 118

152

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

CRF0549

\vskip1.000000\baselineskip

Sec. ID 119

153

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

CRF0569

\vskip1.000000\baselineskip

Sec. ID 120

154

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

CRF0628

\vskip1.000000\baselineskip

Sec. ID 121

155

\newpage

CRF0727

\vskip1.000000\baselineskip

Sec. ID 122

156

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

CRF0742

\vskip1.000000\baselineskip

Sec. ID 123

157

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

CRF0784

\vskip1.000000\baselineskip

Sec. ID 124

158

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

CRF0854

\vskip1.000000\baselineskip

Sec. ID 125

159

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

CRF0875

\vskip1.000000\baselineskip

Sec. ID 126

160

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

CRF0907

\vskip1.000000\baselineskip

Sec. ID 127

161

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

CRF0979

\vskip1.000000\baselineskip

Sec. ID 128

162

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

CRF1068

\vskip1.000000\baselineskip

Sec. ID 129

163

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

CRF1152

\vskip1.000000\baselineskip

Sec. ID 130

164

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

CRF1203

\vskip1.000000\baselineskip

Sec. ID 131

165

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

CRF1225

\vskip1.000000\baselineskip

Sec. ID 132

166

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

CRF1236

\vskip1.000000\baselineskip

Sec. ID 133

167

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

CRF1362

\vskip1.000000\baselineskip

Sec. ID 134

168

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

CRF1524

\vskip1.000000\baselineskip

Sec. ID 135

169

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

CRF1525

\vskip1.000000\baselineskip

Sec. ID 136

170

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

CRF1527

\vskip1.000000\baselineskip

Sec. ID 137

171

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

CRF1588

\vskip1.000000\baselineskip

Sec. ID 138

172

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

CRF1649

\vskip1.000000\baselineskip

Sec. ID 139

173

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

CRF1749

\vskip1.000000\baselineskip

Sec. ID 140

174

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

CRF1903

\vskip1.000000\baselineskip

Sec. ID 141

175

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

CRF1964

\vskip1.000000\baselineskip

Sec. ID 142

176

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

CRF2055

\vskip1.000000\baselineskip

Sec. ID 143

177

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

CRF2091

\vskip1.000000\baselineskip

Sec. ID 144

178

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

CRF2096

\vskip1.000000\baselineskip

Sec. ID 145

179

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

CRF2104

\vskip1.000000\baselineskip

Sec. ID 146

180

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

CRF2116

\vskip1.000000\baselineskip

Sec. ID 147

181

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

CRF2153

\vskip1.000000\baselineskip

Sec. ID 148

182

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

NRF0001

\vskip1.000000\baselineskip

Sec. ID 149

183

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

NRF0003

\vskip1.000000\baselineskip

Sec. ID 150

184

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

SPy0012

\vskip1.000000\baselineskip

Sec. ID 151

185

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

SPy0019

\vskip1.000000\baselineskip

Sec. ID 152

186

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

SPy0025

\vskip1.000000\baselineskip

Sec. ID 153

187

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

SPy0031

\vskip1.000000\baselineskip

Sec. ID 154

188

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

SPy0103

\vskip1.000000\baselineskip

Sec. ID 155

189

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

SPy0112

\vskip1.000000\baselineskip

Sec. ID 156

190

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

SPy0115

\vskip1.000000\baselineskip

Sec. ID 157

191

\newpage

SPy0166

\vskip1.000000\baselineskip

Sec. ID 158

192

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

SPy0167

\vskip1.000000\baselineskip

Sec. ID 159

193

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

SPy0168

\vskip1.000000\baselineskip

Sec. ID 160

194

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

SPy0171

\vskip1.000000\baselineskip

Sec. ID 161

195

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

SPy0183

\vskip1.000000\baselineskip

Sec. ID 162

196

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

SPy0230

\vskip1.000000\baselineskip

Sec. ID 163

197

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

SPy0269

\vskip1.000000\baselineskip

Sec. ID 164

198

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

SPy0287

\vskip1.000000\baselineskip

Sec. ID 165

199

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

SPy0292

\vskip1.000000\baselineskip

Sec. ID 166

200

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

SPy0295

\vskip1.000000\baselineskip

Sec. ID 167

201

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

SPy0348

\vskip1.000000\baselineskip

Sec. ID 168

202

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

SPy0416

\vskip1.000000\baselineskip

Sec. ID 169

203

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

SPy0430

\vskip1.000000\baselineskip

Sec. ID 170

204

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

SPy0433

\vskip1.000000\baselineskip

Sec. ID 171

205

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

SPy0437

\vskip1.000000\baselineskip

Sec. ID 172

206

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

SPy0469

\vskip1.000000\baselineskip

Sec. ID 173

207

\newpage

SPy0488

\vskip1.000000\baselineskip

Sec. ID 174

208

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

SPy0515

\vskip1.000000\baselineskip

Sec. ID 175

209

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

SPy0580

\vskip1.000000\baselineskip

Sec. ID 176

210

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

SPy0621

\vskip1.000000\baselineskip

Sec. ID 177

211

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

SPy0630

\vskip1.000000\baselineskip

Sec. ID 178

212

\newpage

SPy0681

\vskip1.000000\baselineskip

Sec. ID 179

213

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

SPy0683

\vskip1.000000\baselineskip

Sec. ID 180

214

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

SPy0702

\vskip1.000000\baselineskip

Sec. ID 181

215

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

SPy0710

\vskip1.000000\baselineskip

Sec. ID 182

216

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

SPy0711

\vskip1.000000\baselineskip

Sec. ID 183

217

\newpage

SPy0720

\vskip1.000000\baselineskip

Sec. ID 184

218

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

SPy0727

\vskip1.000000\baselineskip

Sec. ID 185

219

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

SPy0737

\vskip1.000000\baselineskip

Sec. ID 186

220

\newpage

SPy0747

\vskip1.000000\baselineskip

Sec. ID 187

221

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

SPy0777

\vskip1.000000\baselineskip

Sec. ID 188

222

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

SPy0789

\vskip1.000000\baselineskip

Sec. ID 189

223

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

SPy0839

\vskip1.000000\baselineskip

Sec. ID 190

224

\newpage

SPy0843

\vskip1.000000\baselineskip

Sec. ID 191

225

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

SPy0872

\vskip1.000000\baselineskip

Sec. ID 192

226

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

SPy0895

\vskip1.000000\baselineskip

Sec. ID 193

227

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

SPy0972

\vskip1.000000\baselineskip

Sec. ID 194

228

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

SPy0981

\vskip1.000000\baselineskip

Sec. ID 195

229

\newpage

SPy1008

\vskip1.000000\baselineskip

Sec. ID 196

230

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

SPy1032

\vskip1.000000\baselineskip

Sec. ID 197

231

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

SPy1054

\vskip1.000000\baselineskip

Sec. ID 198

232

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

SPy1063

\vskip1.000000\baselineskip

Sec. ID 199

233

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

SPy1162

\vskip1.000000\baselineskip

Sec. ID 200

234

\newpage

SPy1206

\vskip1.000000\baselineskip

Sec. ID 201

235

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

SPy1228

\vskip1.000000\baselineskip

Sec. ID 202

236

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

SPy1245

\vskip1.000000\baselineskip

Sec. ID 203

237

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

SPy1315

\vskip1.000000\baselineskip

Sec. ID 204

238

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

SPy1357

\vskip1.000000\baselineskip

Sec. ID 205

239

\newpage

SPy1361

\vskip1.000000\baselineskip

Sec. ID 206

240

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

SPy1371

\vskip1.000000\baselineskip

Sec. ID 207

241

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

SPy1375

\vskip1.000000\baselineskip

Sec. ID 208

242

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

SPy1389

\vskip1.000000\baselineskip

Sec. ID 209

243

\newpage

SPy1390

\vskip1.000000\baselineskip

Sec. ID 210

244

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

SPy1422

\vskip1.000000\baselineskip

Sec. ID 211

245

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

SPy1436

\vskip1.000000\baselineskip

Sec. ID 212

246

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

SPy1494

\vskip1.000000\baselineskip

Sec. ID 213

247

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

SPy1523

\vskip1.000000\baselineskip

Sec. ID 214

248

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

SPy1536

\vskip1.000000\baselineskip

Sec. ID 215

249

\newpage

SPy1564

\vskip1.000000\baselineskip

Sec. ID 216

250

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

SPy1604

\vskip1.000000\baselineskip

Sec. ID 217

251

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

SPy1607

\vskip1.000000\baselineskip

Sec. ID 218

252

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

SPy1615

\vskip1.000000\baselineskip

Sec. ID 219

253

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

SPy1666

\vskip1.000000\baselineskip

Sec. ID 220

254

\newpage

SPy1727

\vskip1.000000\baselineskip

Sec. ID 221

255

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

SPy1785

\vskip1.000000\baselineskip

Sec. ID 222

256

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

SPy1798

\vskip1.000000\baselineskip

Sec. ID 223

257

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

SPy1801

\vskip1.000000\baselineskip

Sec. ID 224

258

\newpage

SPy1813

\vskip1.000000\baselineskip

Sec. ID 225

259

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

SPy1821

\vskip1.000000\baselineskip

Sec. ID 226

260

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

Spry1916

\vskip1.000000\baselineskip

Sec. ID 227

261

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

SPy1972

\vskip1.000000\baselineskip

Sec. ID 228

262

\newpage

SPy1979

\vskip1.000000\baselineskip

Sec. ID 229

263

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

SPy1983

\vskip1.000000\baselineskip

Sec. ID 230

264

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

SPy1991

\vskip1.000000\baselineskip

Sec. ID 231

265

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

SPy2000

\vskip1.000000\baselineskip

Sec. ID 232

266

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

SPy2006

\vskip1.000000\baselineskip

Sec. ID 233

267

\newpage

SPy2009

\vskip1.000000\baselineskip

Sec. ID 234

268

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

SPy2010

\vskip1.000000\baselineskip

Sec. ID 235

269

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

SPy2016

\vskip1.000000\baselineskip

Sec. ID 236

270

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

SPy2018

\vskip1.000000\baselineskip

Sec. ID 237

271

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

SPy2025

\vskip1.000000\baselineskip

Sec. ID 238

272

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

SPy2039

\vskip1.000000\baselineskip

Sec. ID 239

273

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

SPy2043

\vskip1.000000\baselineskip

Sec. ID 240

274

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

SPy2059

\vskip1.000000\baselineskip

Sec. ID 241

275

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

SPy2110

\vskip1.000000\baselineskip

Sec. ID 242

276

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

SPy2127

\vskip1.000000\baselineskip

Sec. ID 243

277

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

SPy2191

\vskip1.000000\baselineskip

Sec. ID 244

278

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

SPy2211

\vskip1.000000\baselineskip

Sec. ID 245

279

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

ARF0450

\vskip1.000000\baselineskip

Sec. ID 246

280

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

ARF0569

\vskip1.000000\baselineskip

Sec. ID 247

\hskip0.3cm

281

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

ARF0694

\vskip1.000000\baselineskip

Sec. ID 248

282

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

ARF0700

\vskip1.000000\baselineskip

Sec. ID 249

283

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

ARF1007

\vskip1.000000\baselineskip

Sec. ID 250

284

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

ARF1145

\vskip1.000000\baselineskip

Sec. ID 251

285

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

ARF1208

\vskip1.000000\baselineskip

Sec. ID 252

286

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

ARF1262

\vskip1.000000\baselineskip

Sec. ID 253

\hskip0.3cm

287

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

ARF1294

\vskip1.000000\baselineskip

Sec. ID 254

288

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

ARF1316

\vskip1.000000\baselineskip

Sec. ID 255

\hskip0.3cm

289

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

ARF1352

\vskip1.000000\baselineskip

Sec. ID 256

\hskip0.3cm

290

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

ARF1481

\vskip1.000000\baselineskip

Sec. ID 257

\hskip0.3cm

291

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

ARF1557

\vskip1.000000\baselineskip

Sec. ID 258

\hskip0.3cm

292

\newpage

ARF1629

\vskip1.000000\baselineskip

Sec. ID 259

\hskip0.3cm

293

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

ARF1654

\vskip1.000000\baselineskip

Sec. ID 260

\hskip0.3cm

294

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

ARF2027

\vskip1.000000\baselineskip

Sec. ID 261

\hskip0.3cm

295

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

ARF2093

\vskip1.000000\baselineskip

Sec. ID 262

\hskip0.3cm

296

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

ARF2207

\vskip1.000000\baselineskip

Sec. ID 263

\hskip0.3cm

297

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

CRF0038

\vskip1.000000\baselineskip

Sec. ID 264

\hskip0.3cm

298

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

CRF0122

\vskip1.000000\baselineskip

Sec. ID 265

\hskip0.3cm

299

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

CRF0406

\vskip1.000000\baselineskip

Sec. ID 266

\hskip0.3cm

300

\newpage

CRF0416

\vskip1.000000\baselineskip

Sec. ID 267

\hskip0.3cm

301

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

CRF0507

\vskip1.000000\baselineskip

Sec. ID 268

\hskip0.3cm

302

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

CRF0549

\vskip1.000000\baselineskip

Sec. ID 269

\hskip0.3cm

303

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

CRF0569

\vskip1.000000\baselineskip

Sec. ID 270

\hskip0.3cm

304

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

CRF0628

\vskip1.000000\baselineskip

Sec. ID 271

\hskip0.3cm

305

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

CRF0727

\vskip1.000000\baselineskip

Sec. ID 272

\hskip0.3cm

306

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

CRF0742

\vskip1.000000\baselineskip

Sec. ID 273

\hskip0.3cm

307

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

CRF0784

\vskip1.000000\baselineskip

Sec. ID 274

\hskip0.3cm

308

\newpage

CRF0854

\vskip1.000000\baselineskip

Sec. ID 275

\hskip0.3cm

309

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

CRF0875

\vskip1.000000\baselineskip

Sec. ID 276

\hskip0.3cm

310

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

CRF0907

\vskip1.000000\baselineskip

Sec. ID 277

\hskip0.3cm

311

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

CRF0979

\vskip1.000000\baselineskip

Sec. ID 278

\hskip0.3cm

312

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

CRF1068

\vskip1.000000\baselineskip

Sec. ID 279

\hskip0.3cm

313

\hskip0.3cm

314

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

CRF1152

\vskip1.000000\baselineskip

Sec. ID 280

\hskip0.3cm

315

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

CRF1203

\vskip1.000000\baselineskip

Sec. ID 281

\hskip0.3cm

316

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

CRF1225

\vskip1.000000\baselineskip

Sec. ID 282

\hskip0.3cm

317

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

CRF1236

\vskip1.000000\baselineskip

Sec. ID 283

\hskip0.3cm

318

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

CRF1362

\vskip1.000000\baselineskip

Sec. ID 284

\hskip0.3cm

319

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

CRF1524

\vskip1.000000\baselineskip

Sec. ID 285

\hskip0.3cm

320

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

CRF1525

\vskip1.000000\baselineskip

Sec. ID 286

\hskip0.3cm

321

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

CRF1527

\vskip1.000000\baselineskip

Sec. ID 287

\hskip0.3cm

322

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

CRF1588

\vskip1.000000\baselineskip

Sec. ID 288

\hskip0.3cm

323

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

CRF1649

\vskip1.000000\baselineskip

Sec. ID 289

\hskip0.3cm

324

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

CRF1749

\vskip1.000000\baselineskip

Sec. ID 290

\hskip0.3cm

325

\newpage

CRF1903

\vskip1.000000\baselineskip

Sec. ID 291

\hskip0.3cm

326

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

CRF1964

\vskip1.000000\baselineskip

Sec. ID 292

\hskip0.3cm

327

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

CRF2055

\vskip1.000000\baselineskip

Sec. ID 293

\hskip0.3cm

328

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

CRF2091

\vskip1.000000\baselineskip

Sec. ID 294

\hskip0.3cm

329

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

CRF2096

\vskip1.000000\baselineskip

Sec. ID 295

\hskip0.3cm

330

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

CRF2104

\vskip1.000000\baselineskip

Sec. ID 296

\hskip0.3cm

331

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

CRF2116

\vskip1.000000\baselineskip

Sec. ID 297

\hskip0.3cm

332

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

CRF2153

\vskip1.000000\baselineskip

Sec. ID 298

\hskip0.3cm

333

\newpage

NRF0001

\vskip1.000000\baselineskip

Sec. ID 299

\hskip0.3cm

334

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

NRF0003

\vskip1.000000\baselineskip

Sec. ID 300

\hskip0.3cm

335

Claims

1. Una vacuna que comprende un fragmento antigénico del antígeno reactivo en suero hiperinmune de Sec. ID Nº 215, seleccionado del grupo constituido por péptidos que comprenden las secuencias de aminoácidos 31-345 ó 247-260 de Sec. ID Nº 215 ó derivados que comprenden la secuencia de aminoácidos 37-345 de Sec. ID Nº 215 con 1 a 10 sustituciones, deleciones o adiciones de aminoácidos, en cualquier combinación.

2. La vacuna según la reivindicación 1, caracterizada porque los péptidos comprenden los aminoácidos 31-345 ó 247-260 de Sec. ID Nº 215.

3. La vacuna según la reivindicación 1, caracterizada porque los péptidos están constituidos por una secuencia de aminoácidos 31-345 ó 247-260 de Sec. ID Nº 215.

4. La vacuna según la reivindicación 2, caracterizada porque los fragmentos están constituidos por los aminoácidos 31-345 ó 247-260 de Sec. ID Nº 215 y una secuencia líder o secretora, una secuencia utilizada para la purificación o una secuencia de proproteína.

5. La vacuna según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizada porque comprende además una sustancia inmunoestimuladora, de preferencia seleccionada del grupo que comprende polímeros policatiónicos, en especial péptidos policatiónicos, desoxinucleótidos (ODN) inmunoestimuladores, péptidos que contienen al menos dos motivos LysLeuLys, compuestos neuroactivos, en especial la hormona del crecimiento humana, alumbre, adyuvante completo o incompleto de Freund o sus combinaciones.

6. Uso de una molécula de ácido nucleico que codifica un fragmento antigénico según se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 o un fragmento antigénico según se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 para la fabricación de una preparación farmacéutica, en especial para la fabricación de una vacuna, contra la infección por S. pyogenes.

7. Una vacuna que comprende un anticuerpo, o al menos una parte eficaz del mismo, que se une al fragmento antigénico según se define en una cualquiera de las reivindicaciones 3 ó 4.

8. Una vacuna según la reivindicación 7, en la que el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal.

9. Una vacuna según la reivindicación 7 u 8, en la que dicha parte eficaz comprende los fragmentos Fab.

10. Una vacuna según una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 9, en la que el anticuerpo es un anticuerpo quimérico.

11. Una vacuna según una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 10, en la que el anticuerpo es un anticuerpo humanizado.

12. Uso de los anticuerpos según se definen en una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 11 para la preparación de un medicamento para tratar o prevenir las infecciones por S. pyogenes.