CN107043749A - 一种肿瘤浸润t淋巴细胞的分离诱导方法 - Google Patents

一种肿瘤浸润t淋巴细胞的分离诱导方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种肿瘤浸润T淋巴细胞的分离方法。本发明所提供的从实体肿瘤中分离诱导培养肿瘤浸润T淋巴细胞的方法，包括如下步骤：(1)将大小2～3mm3的肿瘤组织块加入含有分离诱导培养液的培养孔中进行培养；所述分离诱导培养液为仅含有IL‑7和IL‑15的RPMI‑1640完全培养基；(2)每3～4天进行一次半量换液；(3)2～3周后，去除所述肿瘤组织块，培养孔中的细胞即为肿瘤浸润T淋巴细胞。采用本发明方法分离得到的TIL纯度高且具有更强的肿瘤细胞杀伤活性。

Description

一种肿瘤浸润T淋巴细胞的分离诱导方法
技术领域
本发明属于生物医学领域，涉及一种肿瘤浸润T淋巴细胞的分离诱导方法。
背景技术
恶性肿瘤目前已经成为发达国家的主要死亡原因，发展中国家的次要死亡原因。对于肿瘤的治疗，目前主要的治疗手段包括传统的放射治疗、手术切除肿瘤、药物治疗以及新兴的肿瘤生物治疗。由于手术，放化疗在治疗中会给患者带来巨大的毒副作用，因此生物治疗凭借其显著疗效的优势成为第四种重要的肿瘤治疗模式。肿瘤生物治疗主要包括：过继细胞治疗、细胞因子治疗、肿瘤疫苗、靶向分子治疗等。目前关于过继细胞治疗的研究比较多，其中包括了肿瘤浸润T淋巴细胞(TIL)，而在这些TIL中，CD8+T细胞是最主要的效应细胞。
与标准的手术和化疗治疗方法不同的是，免疫治疗作为一种重要的治疗方法可通过打破机体对肿瘤的免疫耐受、提高机体免疫系统对肿瘤的免疫反应和增强免疫记忆来达到消除微残留肿瘤细胞和防止复发的目的。
TIL是一种非常有效的抗肿瘤的效应细胞。在体外，它们特异性的杀伤肿瘤细胞，并且在少量的IL-2存在的条件下，TIL就可以维持其体内高效的抗肿瘤效应，所以在肿瘤过继免疫治疗中，他们是继淋巴因子激活的杀伤细胞(LAK)细胞后的又一高效抗瘤效应细胞。近几年来TIL过继免疫治疗在动物肿瘤模型以及临床应用研究中取得了很好的疗效，因而在肿瘤过继免疫治疗中的作用受到重视。
利用特异性肿瘤局部浸润性CD8+T淋巴细胞治疗的关键是从肿瘤患者体内分离并鉴定肿瘤局部浸润的具有杀伤活性的淋巴细胞。传统的方法是通过将从肿瘤患者体内分离切除的肿瘤组织，经过体外与肿瘤细胞共培养，利用酶联免疫吸附试验检测体外淋巴细胞IFN-γ分泌，进而测定淋巴细胞的肿瘤杀伤活性。鉴于此种经典的分离鉴定TIL细胞肿瘤杀伤活性的方法需要从患者肿瘤组织分离并诱导培养出原代肿瘤细胞作为靶细胞，并经过体外TIL细胞与靶细胞的共培养(24h)，耗时较长；且从肿瘤组织分离培养原代肿瘤细胞以及肿瘤局部浸润性CD8+T淋巴细胞也颇具难度，所以，迫切需要建立高效、易行的方法分离、鉴定患者肿瘤浸润的杀伤性T淋巴细胞，以便应用于肿瘤的免疫治疗。
发明内容
本发明的目的是提供一种从实体肿瘤中分离诱导培养肿瘤浸润T淋巴细胞(TIL)的方法。
本发明所提供的从实体肿瘤中分离诱导培养肿瘤浸润T淋巴细胞的方法，具体可包括如下步骤：
(1)将大小2～3mm3的肿瘤组织块加入含有分离诱导培养液的培养孔中进行培养；
所述分离诱导培养液为仅含有IL-7和IL-15的RPMI-1640完全培养基。
(2)每3～4天进行一次半量换液(即将培养有所述肿瘤组织块的所述分离诱导培养液去除一半体积，并补充等体积的新鲜的所述分离诱导培养液)；
(3)2～3周(如2周)后，去除所述肿瘤组织块，培养孔中的细胞即为肿瘤浸润T淋巴细胞。
在本发明中，所述分离诱导培养液中IL-7的浓度可为2～5U/ml(具体如2U/ml)，IL-15的浓度具体为2～5U/ml(具体如2U/ml)。
步骤(1)中，加入到含有所述分离诱导培养液的培养孔中进行培养的所述大小2～3mm3的肿瘤组织块取自实体肿瘤不同部位，取材范围从肿瘤中心至肿瘤交界区域，距肿瘤边缘内1.5mm处。
步骤(1)中，是24孔培养板中每个培养孔中加入一个所述肿瘤组织块，用2mL所述分离诱导培养液进行培养。
步骤(1)中，所述培养具体为置于37℃、5％CO2孵箱中培养。
步骤(2)中，还可包括每日在倒置显微镜下观察每个培养孔中所述肿瘤组织块淋巴细胞的渗出和增殖情况的步骤。
步骤(3)中，2～3周后，每个培养孔中，密集的淋巴细胞基本上已经覆盖在所述肿瘤组织块周围的一部分平板上。
步骤(3)中，去除所述肿瘤组织块后还可包括如下步骤：待所述培养孔中的细胞长至汇合度100％时，测定每个培养孔中细胞的抑瘤活性，将所述抑瘤活性相对较强的孔中的细胞混合，即得肿瘤浸润T淋巴细胞。之后还可包括调整细胞密度为1×106/孔进行扩增培养的步骤。
其中，所述抑瘤活性体现为对靶细胞的杀伤活性；所述靶细胞为肿瘤细胞，具体为来源于所述肿瘤组织块中的肿瘤细胞。
本发明还保护一种用于从实体肿瘤中分离诱导培养肿瘤浸润T淋巴细胞的分离诱导培养液。
本发明所提供的用于从实体肿瘤中分离诱导培养肿瘤浸润T淋巴细胞的分离诱导培养液，具体为仅含有IL-7和IL-15的RPMI-1640完全培养基。
其中，所述分离诱导培养液中IL-7的浓度可为2～5U/ml(具体如2U/ml)，IL-15的浓度可为2～5U/ml(具体如2U/ml)。
所述分离诱导培养液在用于从实体肿瘤中分离诱导培养肿瘤浸润T淋巴细胞中的应用也属于本发明的保护范围。
本发明还保护一种用于从实体肿瘤中分离诱导培养肿瘤浸润T淋巴细胞的试剂盒。
本发明所提供的用于从实体肿瘤中分离诱导培养肿瘤浸润T淋巴细胞的试剂盒，含有所述分离诱导培养液以及记载有以上所述从实体肿瘤中分离诱导培养肿瘤浸润T淋巴细胞的方法的可读性载体。
在本发明中，所述IL-7可为人源IL-7，具体如rIL-7(Novoprotein公司产品，货号为GMP-CD47)；所述IL-15可为人源IL-15，具体如rIL-15(Novoprotein公司产品，货号为GMP-C016)。
在本发明中，所述肿瘤组织可为人体肿瘤组织，具体可为任何人体实体恶性肿瘤组织。所述恶性肿瘤如胃癌、食道癌、胰腺癌、鼻咽癌、膀胱癌、肾癌、结肠癌、甲状腺癌、乳腺癌、宫颈癌、卵巢癌、前列腺癌、膀胱癌、恶性胶质瘤、骨肉瘤、肝癌、肺癌等。
实验证明，采用本发明方法分离得到的TIL纯度高，具有较强的细胞增殖能力，且具有较强的肿瘤细胞杀伤活性。
附图说明
图1为本发明优化培养方法与常规培养方法所得TIL细胞扩增倍数检测结果。
图2为通过流式细胞术检测TIL表型鉴定结果。
图3为通过51Cr释放试验，测定TIL细胞对靶细胞的杀伤活性结果。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1、自体肿瘤细胞及TIL的分离
1、常规肿瘤组织TIL细胞培养
(1)将新鲜肿瘤组织(示例取自外科手术切除的新鲜肝癌组织，患者知情并同意)先后放置于含有青霉素-链霉素双抗(青霉素工作浓度为100U/ml；链霉素工作浓度为0.1mg/ml的PSB中浸泡3～5分钟，无菌棉拭子擦干，再使用含青霉素-链霉素双抗(青霉素工作浓度为100U/ml；链霉素工作浓度为0.1mg/ml)的PBS冲洗肿瘤组织3～5次，尽量洗尽血污、粘液。放置于无菌培养皿中，眼科剪剪去坏死及脂肪组织，留取肿瘤组织。
(2)于无菌培养皿中将肿瘤组织剪至约5mm3大小，分别放置于灭菌青霉素小瓶中，并加入少量RPMI-1640，保持组织湿润。用眼科剪将瓶中肿瘤组织尽量剪至组织体积小于1mm3，再将组织块分装于离心管中，每管约1ml。
(3)每管加入肿瘤组织块10倍体积量，即约10ml的0.1％II型胶原酶(Sigma公司产品，其货号为C6885，≥125CDU/mg)，将肿瘤组织块混匀，放置于4℃冰箱，消化过夜。次晨再加入0.02％透明质酸酶(Sigma公司产品，其货号为H3506，400-1000units/mg)、0.004％DNA酶I(Sigma公司产品，其货号为D5025，≥2000Kunitz units/mg)各5ml，37℃水浴消化4小时。吸管轻轻吹打，可见肿瘤组织己消化完全，细胞悬液呈肉色，稍粘稠。100目、200目筛网过滤，获得单细胞悬液。
(4)采用人淋巴细胞分离液(100％ncoll-Hypaque)、分步低速离心法、连续密度梯度离心法分离自体肿瘤细胞及TIL：离心管A中加入约3ml肿瘤组织单细胞悬液，再加入D-hanks液3ml，将细胞悬液稀释1倍，l000rpm离心20分钟，上清液移入离心管B中。沉淀细胞加入3ml D-hanks液重悬后，轻轻铺于装有1ml小牛血清的离心管C中，l000rpm离心20秒，沉淀细胞即为肿瘤细胞。可重复将沉淀细胞用D-hanks液重悬后，铺于小牛血清上并再次离心，以进一步提高肿瘤细胞纯度。收集离心管B、离心管C中上清液混合，取10ml轻轻铺于3ml100％人淋巴细胞分离液上，2000rpm离心20分钟，于人淋巴细胞分离液上层界面可见白色云雾状细胞层，即为TIL。收集上述白色云雾状细胞，使用RPMI-1640洗涤2次，2000rpin离心20分钟，获取TIL。
(5)将获取的TIL按1×106/mL的浓度悬浮于含10％人AB型血清和rIL-2(2 000IU/mL)的X-VIVO-15培养基内，接种于12孔板上，3mL/孔。置于37℃、5％CO2培养箱内培养，每3～5d换液一次。
(6)培养过程中每隔2～3d半量更换含同等浓度IL-2的新鲜培养基，培养14～21d后收获体外扩增的TIL。
2、本发明优化后肿瘤组织TIL细胞培养
(1)在肿瘤(来源同步骤1(1)中)不同部位取大小2～3mm3的组织块，取材范围包括肿瘤中心至肿瘤交界区域(距肿瘤边缘内1.5mm)。
(2)24孔板中加入2mL仅含终浓度为2U/ml的rIL-7(Novoprotein公司产品，货号为GMP-CD47)及终浓度为2U/ml的rIL-15(Novoprotein公司产品，货号为GMP-C016)的RPMI-1640完全培养基。每孔中放入1个肿瘤组织小块，之后将24孔板置于37℃、5％CO2孵箱中培养。
(3)隔日在倒置显微镜下观察每个培养孔中肿瘤组织块淋巴细胞的渗出和增殖情况，3～4日内需更换一半培养液(即用一半新鲜的含终浓度为2U/ml的rIL-7及终浓度为2U/ml的rIL-15的RPMI-1640完全培养基替换一半旧的培养液)。在培养2周后，密集的淋巴细胞覆盖在每个肿瘤组织块周围的一部分平板上。
(4)TIL培养2W后，去除每孔中的肿瘤组织。当孔中的细胞100％汇合时，分别检测每孔TIL的抑瘤活性(通过51Cr释放试验，测定TIL细胞对靶细胞的杀伤活性，制备的TIL细胞对靶细胞的特异性杀伤活性在效靶比为20:1时达到70％时，表明孔中TIL的抑瘤活性强，具体操作参见实施例2步骤3进行)，选取抑瘤活性强的孔中TIL将其混合，调整细胞密度为1×106/孔进行扩增培养。
(5)培养过程中每隔2～3d半量更换一半培养液(即用一半新鲜的含终浓度为2U/ml的rIL-7及终浓度为2U/ml的rIL-15的RPMI-1640完全培养基替换一半旧的培养液)，培养至21d后收获体外扩增的TIL。
实施例2、肿瘤组织特异性TIL细胞的鉴定
1、TIL细胞扩增倍数检测
检测方法如下：
分别收集第5d、7d、9d、11d、14d初分离和活化扩增(实施例1中常规培养的TIL细胞和本发明培养的TIL细胞)后的TIL细胞，细胞计数后进行TIL细胞扩增倍数的比较。
结果如图1所示，从图中可以看出经优化培养、扩增活化后TIL细胞扩增速度显著高于常规培养TIL细胞，提示优化TIL细胞具有较强的细胞增殖能力。
2、TIL细胞表型鉴定
流式细胞仪检测原理：利用各种单克隆抗体与淋巴细胞表面的抗原结合，再配合多色荧光染抖，即可以把各种不同功能的淋巴亚群区分开来，进而得出各细胞亚群所占的比例。
将实施例1获得的TIL细胞(常规培养以及优化培养)用PBS缓冲液洗涤后，用PBS缓冲液重悬，取两份50μl TIL细胞(约3×105细胞)分别加入2支流式管中，每管加入5μlPerCP标记的抗人CD3抗体(anti-CD3-PerCP，德国美天旎生物技术有限公司产品，其产品目录号为130-094-965)和5μl APC标记的抗人CD8抗体(anti-CD8-APC，美国BD公司，货号：555369)，充分混匀，4℃避光孵育30min，缓冲液洗涤后，悬浮细胞在500μl PBS缓冲液中，用流式细胞仪分别分析实施例1两种方法获得的TIL上CD3+CD8+T细胞的表达。
结果如图2所示，从图中可以看出，实施例1优化培养方法所得到TIL中CD3+CD8+T细胞比例为(95.06±9.05)％：常规方法所得TIL中CD3+CD8+T细胞比例为(36.95±5.56)％，二者比较差异具有显著意义(*P<0.05)。
3、通过51Cr释放试验，测定TIL细胞对靶细胞的杀伤活性
TIL(效应物)活性用标准的铬(51Cr)释放试验来衡量：
调整靶细胞(实施例1中分离培养的肿瘤细胞)2×106细胞/100μl放置在含有4％(体积分数)FCS的PBS中，用100μl51Cr(Perkin Elmer)标记并于37℃培养1h。标记好的靶细胞最后用含有2％(体积分数)小牛血清(Invitrogen)的1×Hank’s平衡盐溶液(Invitrogen)洗4次，于4℃1200-1500rpm离心8min，重新悬浮在15ml新鲜RPMI-1640培养基(GIBCO货号：31800-022:31800-022)中，至终浓度为2×105细胞/ml。
分别取100μl实施例1中两种方法获得的TIL细胞(初始浓度分别为3×106细胞/ml、1×106细胞/ml、3×105细胞/ml)，每个效应细胞的浓度设3个重复。在每个孔中含有不同稀释度的TIL 100μl，加入50μl靶细胞(2×105细胞/ml)，共形成4种效靶比(E/T)，即20:1、10:1、5:1和1:1。同时设自然释放孔(50μl靶细胞+0.1ml完全RPMI-1640培养液)和最大释放孔(50μl靶细胞+0.1ml 2％SDS)。各处理于37℃5％CO2条件下培养4h，900rpm离心5min，每孔取100μl上清液至51Cr计数管中计数(cpm值)。
根据下式计算细胞毒性：细胞毒性(％)＝[(实验孔cpm值-自然释放孔cpm值)/(最大释放cpm值-自然释放孔cpm值)]×100％
结果如图3所示，可见实施例1优化培养方法制备的TIL细胞对靶细胞的特异性杀伤活性在效靶比为20:1时达到70％，显著高于常规培养TIL细胞的杀伤活性。

Claims (10)

1.一种从实体肿瘤中分离诱导培养肿瘤浸润T淋巴细胞的方法，包括如下步骤：
(1)将大小2～3mm3的肿瘤组织块加入含有分离诱导培养液的培养孔中进行培养；
所述分离诱导培养液为仅含有IL-7和IL-15的RPMI-1640完全培养基；
(2)每3～4天进行一次半量换液；
(3)2～3周后，去除所述肿瘤组织块，培养孔中的细胞即为肿瘤浸润T淋巴细胞。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述分离诱导培养液中IL-7的浓度为2～5U/ml，IL-15的浓度为2～5U/ml。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：步骤(1)中，加入到含有所述分离诱导培养液的培养孔中进行培养的所述大小2～3mm3的肿瘤组织块取自实体肿瘤不同部位，取材范围从肿瘤中心至肿瘤交界区域，距肿瘤边缘内1.5mm处。
4.根据权利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于：步骤(1)中，是24孔培养板中每个培养孔中加入一个所述肿瘤组织块，用2mL所述分离诱导培养液进行培养。
5.根据权利要求1-4中任一所述的方法，其特征在于：步骤(3)中，去除所述肿瘤组织块后还包括如下步骤：待所述培养孔中的细胞长至汇合度100％时，测定每个培养孔中细胞的抑瘤活性，将所述抑瘤活性相对较强的孔中的细胞混合，即得肿瘤浸润T淋巴细胞。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述抑瘤活性体现为对靶细胞的杀伤活性；所述靶细胞为肿瘤细胞。
7.一种用于从实体肿瘤中分离诱导培养肿瘤浸润T淋巴细胞的分离诱导培养液，为仅含有IL-7和IL-15的RPMI-1640完全培养基。
8.根据权利要求7所述的分离诱导培养液，其特征在于：所述分离诱导培养液中IL-7的浓度为2～5U/ml，IL-15的浓度为2～5U/ml。
9.权利要求7或8所述的分离诱导培养液在用于从实体肿瘤中分离诱导培养肿瘤浸润T淋巴细胞中的应用。
10.一种用于从实体肿瘤中分离诱导培养肿瘤浸润T淋巴细胞的试剂盒，含有权利要求7或8所述的分离诱导培养液以及记载有权利要求1-6中任一所述方法的可读性载体。
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