JP2020527025A - 腫瘍細胞において免疫モジュレーターおよび抗がん治療剤を産生するようにプログラムされた微生物 - Google Patents

腫瘍細胞において免疫モジュレーターおよび抗がん治療剤を産生するようにプログラムされた微生物 Download PDF

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Abstract

細菌またはウイルスなどの遺伝的にプログラムされた微生物、その医薬組成物、ならびにがんをモジュレートおよび処置する方法が開示される。本開示は、腫瘍および腫瘍細胞を選択的に標的とする微生物であって、腫瘍部位で局所的に産生される１つまたは複数の免疫モジュレーター、例えば、免疫イニシエーター、あるいは１つもしくは複数の免疫イニシエーターおよび／または１つもしくは複数のサステナーの組合せを産生することができる微生物の組成物、方法、および使用を提供する。

Description

関連出願
本出願は、２０１７年７月１２日に出願された米国仮出願第６２／５３１，７８４号、２０１７年８月９日に出願された米国仮出願第６２／５４３，３２２号、２０１７年８月３０日に出願された米国仮出願第６２／５５２，３１９号、２０１７年１１月２９日に出願された米国仮出願第６２／５９２，３１７号、２０１７年１２月１８日に出願された米国仮出願第６２／６０７，２１０号、２０１８年１月５日に出願されたＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１８／０１２６９８、２０１８年２月９日に出願された米国仮出願第６２／６２８，７８６号、２０１８年３月１３日に出願された米国仮出願第６２／６４２，５３５号、２０１８年４月１３日に出願された米国仮出願第６２／６５７，４８７号、および２０１８年６月２２日に出願された米国仮出願第６２／６８８，８５２号に対する優先権を主張する。前述の出願のそれぞれの全内容は、参照によりそれらの全体が本明細書に明示的に組み込まれる。
配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩ形式で電子的に提出した配列表を含み、この配列表は、その全体がこれにより参照により本明細書に組み込まれる。２０１８年７月１０日に作成された前記ＡＳＣＩＩコピーは、１２６０４６−３１３２０＿ＳＬ．ｔｘｔという名であり、サイズは１，７８４，３１０バイトである。
現行のがん治療は、免疫療法、外科手術、化学療法、放射線療法、またはこれらの何らかの組合せの使用を用いるのが一般的である（アメリカがん協会（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｓｏｃｉｅｔｙ））。これらの薬物は、がん患者への大きな恩恵を示してきたが、多くのがんは、従来の治療法を使用して処置することが未だに困難である。現在、多くの従来のがん治療は、全身投与されるため健常組織に悪影響を及ぼし、結果として有意な副作用が生じることになる。例えば、多くのがん治療は、患者の抗腫瘍応答を後押しするために免疫系を活性化することに重点を置いている（Ｋｏｎｇら、２０１４年）。しかし、そのような治療にもかかわらず、腫瘍の周囲の微小環境は、依然として高免疫抑制性である。加えて、全身的な免疫調節の変更は、日和見自己免疫障害および免疫関連有害事象の発生を含む、免疫不全を誘発する。
がん細胞を特異的に標的とする細胞傷害薬を開発するために、過去数十年にわたって大きな努力が払われてきた。近年、腫瘍学におけるパラダイムがシフトし、がんの臨床的問題は、がん細胞の遺伝的異常の蓄積であるばかりでなく、免疫系によるこれらの異常細胞の寛容でもあると考えられている。その結果、最近の抗がん治療剤は、がん細胞ではなく免疫系を特異的に標的とするように設計されている。そのような治療法は、がん免疫寛容を回復させること、および有効な抗腫瘍免疫応答を刺激することを目標とする。例えば、現行の免疫療法は、パターン認識受容体（ＰＲＲ）アゴニストである免疫刺激性分子、または腫瘍微小環境に浸潤する様々な免疫細胞集団を標的とする免疫刺激性モノクローナル抗体を含む。しかし、それらの免疫標的設計にもかかわらず、これらの治療法は、あたかも免疫療法の全身投与（例えば、２〜３週間ごとの静脈内注入）に頼る従来の抗がん薬であるかのように、臨床開発されてきた。結果として、多くの現行の免疫療法は、高い投薬要求量に起因して毒性に悩まされ、そしてまた、望ましくない自己免疫応答または他の免疫関連有害事象をもたらすことが多い。
したがって、脈管形成不良の低酸素腫瘍領域を標的とすることができる、がん性細胞を特異的に標的とする一方で正常組織にはほとんど影響を及ぼさず、がん免疫寛容を回避することまたは回復させることを含めて免疫系を腫瘍と闘うように後押しする、有効ながん治療に対するまだ対処されていない要求がある。
本開示は、腫瘍および腫瘍細胞を選択的に標的とする微生物であって、腫瘍部位で局所的に産生される１つまたは複数の免疫モジュレーター、例えば、免疫イニシエーター、あるいは１つもしくは複数の免疫イニシエーターおよび／または１つもしくは複数のサステナーの組合せを産生することができる微生物の組成物、方法、および使用を提供する。ある特定の態様では、本開示は、１つまたは複数の免疫モジュレーター、例えば、免疫イニシエーターおよび／またはサステナーを産生するように操作されている、微生物を提供する。ある特定の態様では、操作された微生物は、細菌、例えば、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｎｏｖｙｉ ＮＴ、およびＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｕｔｙｒｉｃｕｍ ｍｉｙａｉｒｉ、ならびに本明細書で提供される他の例示的菌株であり、これらは、腫瘍微小環境に選択的にホーミングすることができる。したがって、ある特定の実施形態では、操作された微生物は、例えば、経口投与、静脈内注射、皮下注射、腫瘍内注射、または他の手段により、全身投与され、腫瘍部位に選択的にコロニー形成することができる。
一態様では、少なくとも１つの免疫イニシエーターを産生することができる、改変された微生物が、本明細書において開示される。一態様では、少なくとも１つの免疫サステナーを産生することができる、改変された微生物が、本明細書において開示される。一態様では、少なくとも１つの免疫イニシエーターおよび少なくとも１つの免疫サステナーを産生することができる、改変された微生物が、本明細書において開示される。
別の態様では、免疫イニシエーター、例えば、サイトカイン、ケモカイン、単鎖抗体、リガンド、代謝変換因子、Ｔ細胞共刺激受容体、Ｔ細胞共刺激受容体リガンド、操作化学療法、または溶解性ペプチドと、少なくとも１つの免疫サステナーを産生することができる第１の改変された微生物とを含む、組成物が、本明細書において開示される。さらに別の態様では、免疫サステナー、例えば、ケモカイン、サイトカイン、単鎖抗体、リガンド、代謝変換因子、Ｔ細胞共刺激受容体、またはＴ細胞共刺激受容体リガンドと、少なくとも１つの免疫イニシエーターを産生することができる第１の改変された微生物とを含む、組成物が、本明細書において開示される。別の態様では、少なくとも１つの免疫イニシエーターを産生することができる第１の改変された微生物と、少なくとも１つの免疫サステナーを産生することができる少なくとも第２の改変された微生物とを含む、組成物が、本明細書において開示される。
一実施形態では、免疫イニシエーターは、腫瘍溶解を増強すること、抗原提示細胞（ＡＰＣ）を活性化すること、ならびに／またはＴ細胞をプライミングおよび活性化することができる。別の実施形態では、免疫イニシエーターは、腫瘍溶解を増強することができる。別の実施形態では、免疫イニシエーターは、ＡＰＣを活性化することができる。さらに別の実施形態では、免疫イニシエーターは、Ｔ細胞をプライミングおよび活性化することができる。
一実施形態では、免疫イニシエーターは、少なくとも１つの遺伝子によってコードされる治療用分子である。一実施形態では、免疫イニシエーターは、少なくとも１つの遺伝子によってコードされる酵素によって産生される治療用分子である。一実施形態では、免疫イニシエーターは、少なくとも１つの遺伝子によってコードされる生合成経路または異化経路の少なくとも１つの酵素である。一実施形態では、免疫イニシエーターは、少なくとも１つの遺伝子によってコードされる生合成経路または異化経路の少なくとも１つの酵素によって産生される、少なくとも１つの治療用分子である。一実施形態では、免疫イニシエーターは、ＲＮＡ干渉、マイクロＲＮＡ応答もしくは阻害、ＴＬＲ応答、アンチセンス遺伝子調節、標的タンパク質結合、または遺伝子編集を媒介する、核酸分子である。
一実施形態では、免疫イニシエーターは、サイトカイン、ケモカイン、単鎖抗体、リガンド、代謝変換因子、Ｔ細胞共刺激受容体、Ｔ細胞共刺激受容体リガンド、操作化学療法、または溶解性ペプチドである。一実施形態では、免疫イニシエーターは、分泌されるペプチドまたは提示されるペプチドである。
一実施形態では、免疫イニシエーターは、ＳＴＩＮＧアゴニスト、アルギニン、５−ＦＵ、ＴＮＦα、ＩＦＮγ、ＩＦＮβ１、アゴニスト抗ＣＤ４０抗体、ＣＤ４０Ｌ、ＳＩＲＰα、ＧＭＣＳＦ、アゴニスト抗ＯＸＯ４０抗体、ＯＸＯ４０Ｌ、アゴニスト抗４−１ＢＢ抗体、４−１ＢＢＬ、アゴニスト抗ＧＩＴＲ抗体、ＧＩＴＲＬ、抗ＰＤ１抗体、抗ＰＤＬ１抗体、またはアズリンである。一実施形態では、免疫イニシエーターは、ＳＴＩＮＧアゴニストである。一実施形態では、免疫イニシエーターは、アルギニン生合成経路の少なくとも１つの酵素である。一実施形態では、免疫イニシエーターは、アルギニンである。一実施形態では、免疫イニシエーターは、５−ＦＵである。一実施形態では、免疫イニシエーターは、ＴＮＦαである。一実施形態では、免疫イニシエーターは、ＩＦＮγである。一実施形態では、免疫イニシエーターは、ＩＦＮβ１である。一実施形態では、免疫イニシエーターは、アゴニスト抗ＣＤ４０抗体である。一実施形態では、免疫イニシエーターは、ＳＩＲＰαである。一実施形態では、免疫イニシエーターは、ＣＤ４０Ｌである。一実施形態では、免疫イニシエーターは、ＧＭＣＳＦである。一実施形態では、免疫イニシエーターは、アゴニスト抗ＯＸＯ４０抗体である。別の実施形態では、免疫イニシエーターは、ＯＸＯ４０Ｌである。一実施形態では、免疫イニシエーターは、アゴニスト抗４−１ＢＢ抗体である。一実施形態では、免疫イニシエーターは、４−１ＢＢＬである。一実施形態では、免疫イニシエーターは、アゴニスト抗ＧＩＴＲ抗体である。別の実施形態では、免疫イニシエーターは、ＧＩＴＲＬである。一実施形態では、免疫イニシエーターは、抗ＰＤ１抗体である。一実施形態では、免疫イニシエーターは、抗ＰＤＬ１抗体である。一実施形態では、免疫イニシエーターは、アズリンである。
一実施形態では、免疫イニシエーターは、ＳＴＩＮＧアゴニストである。一実施形態では、ＳＴＩＮＧアゴニストは、ｃ−ジＡＭＰである。一実施形態では、ＳＴＩＮＧアゴニストは、ｃ−ＧＡＭＰである。一実施形態では、ＳＴＩＮＧアゴニストは、ｃ−ジＧＭＰである。
一実施形態では、改変された微生物は、免疫イニシエーターを産生する酵素をコードする少なくとも１つの遺伝子配列を含む。一実施形態では、免疫イニシエーターをコードする少なくとも１つの遺伝子配列は、ｄａｃＡ遺伝子配列である。一実施形態では、免疫イニシエーターをコードする少なくとも１つの遺伝子配列は、ｃＧＡＳ遺伝子配列である。一実施形態では、ｃＧＡＳ遺伝子配列は、ヒトｃＧＡＳ遺伝子配列である。一実施形態では、ｃＧＡＳ遺伝子配列は、ヒトｃＧＡＳ遺伝子配列、Ｖｅｒｍｉｎｅｐｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｅｉｓｅｎｉａｅ ｃＧＡＳ遺伝子配列、Ｋｉｎｇｅｌｌａ ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ ｃＧＡＳ遺伝子配列、およびＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｂａｃｉｌｌｉｆｏｒｍｉｓ ｃＧＡＳ遺伝子配列から選択される。
一実施形態では、免疫イニシエーターをコードする少なくとも１つの遺伝子配列は、改変された微生物の染色体に組み込まれている。一実施形態では、免疫イニシエーターをコードする少なくとも１つの遺伝子配列は、プラスミド上に存在する。一実施形態では、免疫イニシエーターをコードする少なくとも１つの遺伝子配列は、誘導性プロモーターに作動可能に連結されている。一実施形態では、誘導性プロモーターは、低酸素、嫌気、またはハイポキシック条件によって誘導される。
一実施形態では、免疫イニシエーターは、アルギニンである。別の実施形態では、免疫イニシエーターは、アルギニン生合成経路の少なくとも１つの酵素である。
一実施形態では、微生物は、アルギニン生合成経路の少なくとも１つの酵素をコードする少なくとも１つの遺伝子配列を含む。一実施形態では、アルギニン生合成経路の少なくとも１つの酵素をコードする少なくとも１つの遺伝子配列は、フィードバック耐性ａｒｇＡを含む。一実施形態では、アルギニン生合成経路の少なくとも１つの酵素をコードする少なくとも１つの遺伝子配列は、ａｒｇＡ、ａｒｇＢ、ａｒｇＣ、ａｒｇＤ、ａｒｇＥ、ａｒｇＦ、ａｒｇＧ、ａｒｇＨ、ａｒｇＩ、ａｒｇＪ、ｃａｒＡ、およびｃａｒＢからなる群から選択される。一実施形態では、微生物は、アルギニンリプレッサー遺伝子（ａｒｇＲ）の欠失または突然変異をさらに含む。一実施形態では、アルギニンの産生のための少なくとも１つの遺伝子配列は、改変された微生物の染色体に組み込まれている。一実施形態では、アルギニンの産生のための少なくとも１つの遺伝子配列は、プラスミド上に存在する。一実施形態では、アルギニンの産生のための少なくとも１つの遺伝子配列は、誘導性プロモーターに作動可能に連結されている。一実施形態では、誘導性プロモーターは、低酸素、嫌気、またはハイポキシック条件によって誘導される。
一実施形態では、免疫イニシエーターは、５−ＦＵである。
一実施形態では、微生物は、５−ＦＣを５−ＦＵに変換することができる酵素をコードする少なくとも１つの遺伝子配列を含む。一実施形態では、少なくとも１つの遺伝子配列は、ｃｏｄＡである。一実施形態では、少なくとも１つの遺伝子配列は、改変された微生物の染色体に組み込まれている。別の実施形態では、少なくとも１つの遺伝子配列は、プラスミド上に存在する。一実施形態では、免疫イニシエーターをコードする少なくとも１つの遺伝子配列は、誘導性プロモーターに作動可能に連結されている。一実施形態では、誘導性プロモーターは、ＦＮＲプロモーターである。
一実施形態では、免疫サステナーは、Ｔ細胞の移動および浸潤を増強すること、Ｔ細胞によるがん細胞の認識を増強すること、エフェクターＴ細胞応答を増強すること、および／または免疫抑制を克服することができる。一実施形態では、免疫サステナーは、Ｔ細胞の移動および浸潤を増強することができる。一実施形態では、免疫サステナーは、Ｔ細胞によるがん細胞の認識を増強することができる。一実施形態では、免疫サステナーは、エフェクターＴ細胞応答を増強することができる。一実施形態では、免疫サステナーは、免疫抑制を克服することができる。
一実施形態では、免疫サステナーは、少なくとも１つの遺伝子によってコードされる治療用分子である。一実施形態では、免疫サステナーは、少なくとも１つの遺伝子によってコードされる酵素によって産生される治療用分子である。一実施形態では、免疫サステナーは、少なくとも１つの遺伝子によってコードされる生合成または異化経路の少なくとも１つの酵素である。一実施形態では、免疫サステナーは、少なくとも１つの遺伝子によってコードされる生合成または異化経路の少なくとも１つの酵素によって産生される、少なくとも１つの治療用分子である。一実施形態では、免疫サステナーは、ＲＮＡ干渉、マイクロＲＮＡ応答もしくは阻害、ＴＬＲ応答、アンチセンス遺伝子調節、標的タンパク質結合、または遺伝子編集を媒介する、核酸分子である。
一実施形態では、免疫サステナーは、サイトカイン、ケモカイン、単鎖抗体、リガンド、代謝変換因子、Ｔ細胞共刺激受容体、Ｔ細胞共刺激受容体リガンド、または分泌もしくは提示されるペプチドである。
一実施形態では、免疫サステナーは、代謝変換因子、アルギニン、ＳＴＩＮＧアゴニスト、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０、抗ＰＤ１抗体、抗ＰＤＬ１抗体、抗ＣＴＬＡ４抗体、アゴニスト抗ＧＩＴＲ抗体もしくはＧＩＴＲＬ、アゴニスト抗ＯＸ４０抗体もしくはＯＸ４０Ｌ、アゴニスト抗４−１ＢＢ抗体もしくは４−１ＢＢＬ、ＩＬ−１５、ＩＬ−１５ ｓｕｓｈｉ、ＩＦＮγ、またはＩＬ−１２である。一実施形態では、免疫サステナーは、 分泌されるペプチドまたは提示されるペプチドである。
一実施形態では、免疫サステナーは、代謝変換因子である。一実施形態では、代謝変換因子は、キヌレニン消費経路の少なくとも１つの酵素である。別の実施形態では、代謝変換因子は、アデノシン消費経路の少なくとも１つの酵素である。別の実施形態では、代謝変換因子は、アルギニン生合成経路の少なくとも１つの酵素である。
一実施形態では、微生物は、キヌレニン消費経路の少なくとも１つの酵素をコードする少なくとも１つの遺伝子配列を含む。一実施形態では、キヌレニン消費経路の少なくとも１つの酵素をコードする少なくとも１つの遺伝子配列は、キヌレニナーゼ遺伝子配列である。一実施形態では、少なくとも１つの遺伝子配列は、ｋｙｎＵである。一実施形態では、少なくとも１つの遺伝子配列は、構成的プロモーターに作動可能に連結されている。一実施形態では、キヌレニン消費経路の少なくとも１つの酵素をコードする少なくとも１つの遺伝子配列は、微生物の染色体に組み込まれている。別の実施形態では、キヌレニン消費経路の少なくとも１つの酵素をコードする少なくとも１つの遺伝子配列は、プラスミド上に存在する。一実施形態では、微生物は、ｔｒｐＥの欠失または突然変異を含む。
一実施形態では、微生物は、アデノシン消費経路の少なくとも１つの酵素をコードする少なくとも１つの遺伝子配列を含む。一実施形態では、アデノシン消費経路の少なくとも１つの酵素をコードする少なくとも１つの遺伝子配列は、ａｄｄ、ｘａｐＡ、ｄｅｏＤ、ｘｄｈＡ、ｘｄｈＢ、およびｘｄｈＣから選択される。一実施形態では、アデノシン消費経路の少なくとも１つの酵素をコードする少なくとも１つの遺伝子配列は、低酸素、嫌気、またはハイポキシック条件によって誘導されるプロモーターに作動可能に連結されている。一実施形態では、アデノシン消費経路の少なくとも１つの酵素をコードする少なくとも１つの遺伝子配列は、微生物の染色体に組み込まれている。別の実施形態では、少なくとも１つの遺伝子配列は、プラスミド上に存在する。一実施形態では、改変された微生物は、微生物にアデノシンを移入するための酵素をコードする少なくとも１つの遺伝子配列を含む。一実施形態では、微生物にアデノシンを移入するための酵素をコードする少なくとも１つの遺伝子配列は、ｎｕｐＣまたはｎｕｐＧである。
一実施形態では、免疫サステナーは、アルギニンである。一実施形態では、微生物は、アルギニン生合成経路の少なくとも１つの酵素をコードする少なくとも１つの遺伝子配列を含む。一実施形態では、アルギニン生合成経路の少なくとも１つの酵素をコードする少なくとも１つの遺伝子配列は、フィードバック耐性ａｒｇＡを含む。一実施形態では、アルギニン生合成経路の少なくとも１つの酵素をコードする少なくとも１つの遺伝子配列は、ａｒｇＡ、ａｒｇＢ、ａｒｇＣ、ａｒｇＤ、ａｒｇＥ、ａｒｇＦ、ａｒｇＧ、ａｒｇＨ、ａｒｇＩ、ａｒｇＪ、ｃａｒＡ、およびｃａｒＢからなる群から選択される。一実施形態では、アルギニン生合成経路の少なくとも１つの酵素をコードする少なくとも１つの遺伝子配列は、低酸素、嫌気、またはハイポキシック条件によって誘導されるプロモーターに作動可能に連結されている。一実施形態では、アルギニン生合成経路の少なくとも１つの酵素をコードする少なくとも１つの遺伝子配列は、改変された微生物の染色体に組み込まれているか、またはプラスミド上に存在する。一実施形態では、微生物は、アルギニンリプレッサー遺伝子（ａｒｇＲ）の欠失または突然変異をさらに含む。
一実施形態では、免疫サステナーは、ＳＴＩＮＧアゴニストである。一実施形態では、ＳＴＩＮＧアゴニストは、ｃ−ジＡＭＰ、ｃ−ＧＡＭＰ、またはｃ−ジＧＭＰである。別の実施形態では、改変された微生物は、ＳＴＩＮＧアゴニストを産生する酵素をコードする少なくとも１つの遺伝子配列を含む。一実施形態では、免疫サステナーをコードする少なくとも１つの遺伝子配列は、ｄａｃＡ遺伝子配列である。一実施形態では、免疫サステナーをコードする少なくとも１つの遺伝子配列は、ｃＧＡＳ遺伝子配列である。一実施形態では、ｃＧＡＳ遺伝子配列は、ヒトｃＧＡＳ遺伝子配列、Ｖｅｒｍｉｎｅｐｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｅｉｓｅｎｉａｅ ｃＧＡＳ遺伝子配列、Ｋｉｎｇｅｌｌａ ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ ｃＧＡＳ遺伝子配列、およびＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｂａｃｉｌｌｉｆｏｒｍｉｓ ｃＧＡＳ遺伝子配列から選択される。
一実施形態では、免疫イニシエーターは、免疫サステナーと同じではない。一実施形態では、免疫イニシエーターは、免疫サステナーとは異なる。
一実施形態では、改変された微生物は、ＳＴＩＮＧアゴニストを産生することができる酵素をコードする少なくとも１つの遺伝子配列を含む。一実施形態では、ＳＴＩＮＧアゴニストをコードする少なくとも１つの遺伝子配列は、ｄａｃＡ遺伝子である。一実施形態では、ＳＴＩＮＧアゴニストをコードする少なくとも１つの遺伝子配列は、ｃＧＡＳ遺伝子である。一実施形態では、ＳＴＩＮＧアゴニストは、ｃ−ジＡＭＰである。一実施形態では、ＳＴＩＮＧアゴニストは、ｃ−ＧＡＭＰである。一実施形態では、ＳＴＩＮＧアゴニストは、ｃ−ジＧＭＰである。
一実施形態では、細菌は、細菌が腫瘍に存在する場合に補完されない遺伝子における栄養要求株である。一実施形態では、細菌が腫瘍に存在する場合に補完されない遺伝子は、ｄａｐＡ遺伝子である。一実施形態では、ｄａｐＡ遺伝子の発現は、１つまたは複数の免疫イニシエーターの発現を微調整する。一実施形態では、細菌は、細菌が腫瘍に存在する場合に補完される遺伝子における栄養要求株である。一実施形態では、細菌が腫瘍に存在する場合に補完される遺伝子は、ｔｈｙＡ遺伝子である。
一実施形態では、細菌は、内在性プロファージの突然変異または欠失をさらに含む。
一実施形態では、少なくとも１つの遺伝子配列は、誘導性プロモーターに作動可能に連結されている。一実施形態では、誘導性プロモーターは、低酸素または嫌気条件によって誘導される。一実施形態では、誘導性プロモーターは、腫瘍のハイポキシック環境によって誘導される。一実施形態では、プロモーターは、ＦＮＲプロモーターである。
一実施形態では、少なくとも１つの遺伝子配列は、細菌の染色体に組み込まれている。一実施形態では、少なくとも１つの遺伝子配列は、細菌のプラスミド上に位置する。
一実施形態では、細菌は、非病原性である。一実施形態では、細菌は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅである。
一態様では、エフェクター分子を産生することができる改変された微生物であって、エフェクター分子が、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０、ヒアルロニダーゼ、およびＳＩＲＰαからなる群から選択される、改変された微生物が、本明細書において開示される。
一実施形態では、改変された微生物は、ＣＸＣＬ９をコードする少なくとも１つの遺伝子配列を含む。一実施形態では、ＣＸＣＬ９をコードする少なくとも１つの遺伝子配列は、誘導性プロモーターに連結されている。
一実施形態では、改変された微生物は、ＣＸＣＬ１０をコードする少なくとも１つの遺伝子配列を含む。一実施形態では、ＣＸＣＬ１０をコードする少なくとも１つの遺伝子配列は、誘導性プロモーターに連結されている。
一実施形態では、改変された微生物は、ヒアルロニダーゼをコードする少なくとも１つの遺伝子配列を含む。一実施形態では、ヒアルロニダーゼをコードする少なくとも１つの遺伝子配列は、誘導性プロモーターに連結されている。
一実施形態では、改変された微生物は、ＳＩＲＰαをコードする少なくとも１つの遺伝子配列を含む。一実施形態では、ＳＩＲＰαをコードする少なくとも１つの遺伝子配列は、誘導性プロモーターに連結されている。
一実施形態では、エフェクター分子は、分泌される。別の実施形態では、エフェクター分子は、細胞表面に提示される。
一態様では、５−ＦＣを５−ＦＵに変換することができる改変された微生物が、本明細書において開示される。別の態様では、５−ＦＣを５−ＦＵに変換することができる改変された微生物であって、さらに、ＳＴＩＮＧアゴニストを産生することができる、改変された微生物が、本明細書において開示される。
一実施形態では、微生物は、５−ＦＣを５−ＦＵに変換することができる酵素をコードする少なくとも１つの遺伝子配列を含む。一実施形態では、少なくとも１つの遺伝子配列は、ｃｏｄＡである。一実施形態では、少なくとも１つの遺伝子配列は、ｃｏｄＡ：：ｕｐｐ融合体である。一実施形態では、少なくとも１つの遺伝子配列は、誘導性プロモーターまたは構成的プロモーターに作動可能に連結されている。一実施形態では、誘導性プロモーターは、ＦＮＲプロモーターである。一実施形態では、少なくとも１つの遺伝子配列は、微生物の染色体に組み込まれているか、またはプラスミド上に存在する。
一実施形態では、５−ＦＣを５−ＦＵに変換することができる微生物は、さらに、ＳＴＩＮＧアゴニストを産生することができる。一実施形態では、ＳＴＩＮＧアゴニストは、ｃ−ジＡＭＰ、ｃ−ＧＡＭＰ、またはｃ−ジＧＭＰである。一実施形態では、改変された微生物は、ＳＴＩＮＧアゴニストを産生する酵素をコードする少なくとも１つの遺伝子配列を含む。一実施形態では、ＳＴＩＮＧアゴニストを産生する酵素をコードする少なくとも１つの遺伝子配列は、ｄａｃＡ遺伝子配列である。一実施形態では、ＳＴＩＮＧアゴニストを産生する酵素をコードする少なくとも１つの遺伝子配列は、ｃＧＡＳ遺伝子配列である。一実施形態では、ｃＧＡＳ遺伝子配列は、ヒトｃＧＡＳ遺伝子配列である。一実施形態では、ＳＴＩＮＧアゴニストを産生する酵素をコードする少なくとも１つの遺伝子配列は、誘導性プロモーターに作動可能に連結されている。一実施形態では、誘導性プロモーターは、ＦＮＲプロモーターである。一実施形態では、ＳＴＩＮＧアゴニストを産生する酵素をコードする少なくとも１つの遺伝子配列は、微生物の染色体に組み込まれているか、またはプラスミド上に存在する。
別の態様では、二量体化ＩＬ−１２を分泌することができる改変された微生物であって、リンカー配列によってｐ４０ ＩＬ−１２サブユニット遺伝子配列に連結されたｐ３５ ＩＬ−１２サブユニット遺伝子配列を含む遺伝子配列と、分泌タグ配列とを含む、改変された微生物が、本明細書において開示される。一実施形態では、分泌タグ配列は、配列番号１２３５、１１４６〜１１５４、１１５６、および１１６８からなる群から選択される。一実施形態では、リンカー配列は、配列番号１１９４を含む。一実施形態では、ｐ３５ ＩＬ−１２サブユニット遺伝子配列は、配列番号１１９２を含み、ｐ４０ ＩＬ−１２サブユニット遺伝子配列は、配列番号１１９３を含む。一実施形態では、遺伝子配列は、配列番号１１６９〜１１７９からなる群から選択される配列を含む。一実施形態では、遺伝子配列は、誘導性プロモーターに作動可能に連結されている。一実施形態では、誘導性プロモーターは、ＦＮＲプロモーターである。一実施形態では、遺伝子配列は、微生物の染色体に組み込まれているか、またはプラスミド上に存在する。
別の態様では、ＩＬ−１５融合タンパク質を分泌することができる改変された微生物であって、ｓｕｓｈｉドメイン配列に融合されたＩＬ−１５遺伝子配列を含む配列を含む、改変された微生物が、本明細書において開示される。一実施形態では、配列は、配列番号１１９５〜１１９８からなる群から選択される。
一実施形態では、本明細書に開示される改変された微生物は、細菌である。一実施形態では、本明細書に開示される改変された微生物は、酵母である。一実施形態では、改変された微生物は、Ｅ．ｃｏｌｉ細菌である。一実施形態では、改変された微生物は、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅ細菌である。
一実施形態では、本明細書に開示される改変された微生物は、１つまたは複数の栄養要求体をもたらす遺伝子の少なくとも１つの突然変異または欠失を含む。一実施形態では、少なくとも１つの欠失または突然変異は、ｄａｐＡ遺伝子および／またはｔｈｙＡ遺伝子におけるものである。
一実施形態では、本明細書に開示される改変された微生物は、ファージ欠失を含む。
一態様では、免疫イニシエーターを産生することができる少なくとも第１の改変された微生物と、免疫サステナーを産生することができる少なくとも第２の改変された微生物とを含む、組成物が、本明細書において開示される。
一態様では、免疫サステナーと、免疫イニシエーターを産生することができる少なくとも１つの改変された微生物とを含む、組成物が、本明細書において開示される。一実施形態では、少なくとも１つの改変された微生物は、免疫イニシエーターおよび免疫サステナーの両方を産生することができる。別の実施形態では、少なくとも１つの改変された微生物は、免疫イニシエーターを産生することができ、少なくとも第２の改変された微生物は、免疫サステナーを産生することができる。さらに別の実施形態では、免疫サステナーは、組成物中の改変された微生物によって産生されない。
一態様では、免疫イニシエーターと、免疫サステナーを産生することができる少なくとも１つの改変された微生物とを含む、組成物が、本明細書において開示される。一実施形態では、少なくとも１つの改変された微生物は、免疫イニシエーターおよび免疫サステナーの両方を産生することができる。別の実施形態では、少なくとも１つの改変された微生物は、免疫サステナーを産生することができ、少なくとも第２の改変された微生物は、免疫イニシエーターを産生することができる。さらに別の実施形態では、免疫イニシエーターは、組成物中の改変された微生物によって産生されない。
一実施形態では、免疫イニシエーターは、アルギニン、ＴＮＦα、ＩＦＮγ、ＩＦＮβ１、ＧＭＣＳＦ、抗ＣＤ４０抗体、ＣＤ４０Ｌ、アゴニスト抗ＯＸ４０抗体、ＯＸＯ４０Ｌ、アゴニスト抗４１ＢＢ抗体、４１ＢＢＬ、アゴニスト抗ＧＩＴＲ抗体、ＧＩＴＲＬ、抗ＰＤ１抗体、抗ＰＤＬ１抗体、および／またはアズリンではない。一実施形態では、免疫イニシエーターは、アルギニンではない。一実施形態では、免疫イニシエーターは、ＴＮＦαではない。一実施形態では、免疫イニシエーターは、ＩＦＮγではない。一実施形態では、免疫イニシエーターは、ＩＦＮβ１ではない。一実施形態では、免疫イニシエーターは、抗ＣＤ４０抗体ではない。一実施形態では、免疫イニシエーターは、ＣＤ４０Ｌではない。一実施形態では、免疫イニシエーターは、ＧＭＣＳＦではない。一実施形態では、免疫イニシエーターは、アゴニスト抗ＯＸＯ４０抗体ではない。一実施形態では、免疫イニシエーターは、ＯＸＯ４０Ｌではない。一実施形態では、免疫イニシエーターは、アゴニスト抗４−１ＢＢ抗体ではない。一実施形態では、免疫イニシエーターは、４−１ＢＢＬではない。一実施形態では、免疫イニシエーターは、アゴニスト抗ＧＩＴＲ抗体ではない。一実施形態では、免疫イニシエーターは、ＧＩＴＲＬではない。一実施形態では、免疫イニシエーターは、抗ＰＤ１抗体ではない。一実施形態では、免疫イニシエーターは、抗ＰＤＬ１抗体ではない。一実施形態では、免疫イニシエーターは、アズリンではない。
一実施形態では、免疫サステナーは、キヌレニン消費経路の少なくとも１つの酵素でも、アデノシン消費経路の少なくとも１つの酵素でも、抗ＰＤ１抗体でも、抗ＰＤＬ１抗体でも、抗ＣＴＬＡ４抗体でも、ＩＬ−１５でも、ＩＬ−１５ ｓｕｓｈｉでも、ＩＦＮγでも、アゴニスト抗ＧＩＴＲ抗体でも、ＧＩＴＲＬでも、アゴニスト抗ＯＸ４０抗体でも、ＯＸ４０Ｌでも、アゴニスト抗４−１ＢＢ抗体でも、４−１ＢＢＬでも、ＩＬ−１２でもない。一実施形態では、免疫サステナーは、キヌレニン消費経路の少なくとも１つの酵素ではない。一実施形態では、免疫サステナーハ、アデノシン消費経路の少なくとも１つの酵素ではない。一実施形態では、免疫サステナーは、アルギニンではない。一実施形態では、免疫サステナーは、アルギニン生合成経路の少なくとも１つの酵素ではない。一実施形態では、免疫サステナーは、抗ＰＤ１抗体ではない。一実施形態では、免疫サステナーは、抗ＰＤＬ１抗体ではない。一実施形態では、免疫サステナーは、抗ＣＴＬＡ４抗体ではない。一実施形態では、免疫サステナーは、アゴニスト抗ＧＩＴＲ抗体ではない。一実施形態では、免疫サステナーは、ＧＩＴＲＬではない。一実施形態では、免疫サステナーは、ＩＬ−１５ではない。一実施形態では、免疫サステナーは、ＩＬ−１５ ｓｕｓｈｉではない。一実施形態では、免疫サステナーは、ＩＦＮγではない。一実施形態では、免疫サステナーは、アゴニスト抗ＯＸ４０抗体ではない。一実施形態では、免疫サステナーは、ＯＸ４０Ｌではない。一実施形態では、免疫サステナーは、アゴニスト抗４−１ＢＢ抗体ではない。一実施形態では、免疫サステナーは、４−１ＢＢＬではない。一実施形態では、免疫サステナーは、ＩＬ−１２ではない。
一態様では、本明細書に開示される改変された微生物と、薬学的に許容される担体とを含む、薬学的に許容される組成物が、本明細書において開示される。一態様では、本明細書に開示される組成物と、薬学的に許容される担体とを含む、薬学的に許容される組成物が、本明細書において開示される。一実施形態では、組成物は、腫瘍内注射用に製剤化される。別の実施形態では、薬学的に許容される組成物は、がんを有する対象の処置において使用するためのものである。別の実施形態では、薬学的に許容される組成物は、対象における免疫応答の誘導およびモジュレートに使用するためのものである。
一態様では、本明細書に開示される薬学的に許容される組成物と、その使用のための説明書とを含む、キットが、本明細書において開示される。
一態様では、対象におけるがんを処置する方法であって、本明細書に開示される薬学的に許容される組成物を対象に投与するステップを含み、それによって、対象におけるがんを処置する、方法が、本明細書において開示される。
一態様では、対象において免疫応答を誘導および維持する方法であって、本明細書に開示される薬学的に許容される組成物を対象に投与するステップを含み、それによって、対象において免疫応答を誘導および維持する、方法が、本明細書において開示される。
一態様では、対象において免疫応答を誘導および維持する方法であって、本明細書に記載される薬学的に許容される組成物を対象に投与するステップを含み、それによって、対象において免疫応答を誘導および維持する、方法が、本明細書において開示される。
別の態様では、腫瘍を有する対象においてアブスコパル効果を誘導する方法であって、本明細書に記載される薬学的に許容される組成物を対象に投与するステップを含み、それによって、対象においてアブスコパル効果を誘導する、方法が、本明細書において開示される。
一態様では、腫瘍を有する対象において免疫学的記憶を誘導する方法であって、本明細書に記載される薬学的に許容される組成物を対象に投与するステップを含み、それによって、対象において免疫学的記憶を誘導する、方法が、本明細書において開示される。
一態様では、対象において腫瘍の部分的な退縮を誘導する方法であって、本明細書に記載される薬学的に許容される組成物を対象に投与するステップを含み、それによって、対象において腫瘍の部分的な退縮を誘導する、方法が、本明細書において開示される。一実施形態では、部分的な退縮は、腫瘍のサイズの少なくとも約１０％、少なくとも約２５％、少なくとも約５０％、または少なくとも約７５％の減少である。
一態様では、対象において腫瘍の完全な退縮を誘導する方法であって、本明細書に記載される薬学的に許容される組成物を対象に投与するステップを含み、それによって、対象において腫瘍の完全な退縮を誘導する、方法が、本明細書において開示される。一実施形態では、腫瘍は、薬学的に許容される組成物の投与の後に、対象において検出可能ではない。
一態様では、対象におけるがんを処置する方法であって、第１の改変された微生物を対象に投与するステップであって、第１の改変された微生物が、免疫イニシエーターを産生することができる、ステップと、第２の改変された微生物を対象に投与するステップであって、第２の改変された微生物が、免疫サステナーを産生することができる、ステップと、を含み、それによって、対象におけるがんを処置する、方法が、本明細書において開示される。
一態様では、対象において免疫応答を誘導および維持する方法であって、第１の改変された微生物を対象に投与するステップであって、第１の改変された微生物が、免疫イニシエーターを産生することができる、ステップと、第２の改変された微生物を対象に投与するステップであって、第２の改変された微生物が、免疫サステナーを産生することができる、ステップと、を含み、それによって、対象において免疫応答を誘導および維持する、方法が、本明細書において開示される。
一実施形態では、投与するステップは、同時に行われる。一実施形態では、第１の改変された微生物を対象に投与するステップが、第２の改変された微生物を対象に投与するステップの前に生じる。一実施形態では、第２の改変された微生物を対象に投与するステップが、第１の改変された微生物を対象に投与するステップの前に生じる。
一態様では、対象におけるがんを処置する方法であって、第１の改変された微生物を対象に投与するステップであって、第１の改変された微生物が、免疫イニシエーターを産生することができる、ステップと、免疫サステナーを対象に投与するステップと、を含み、それによって、対象におけるがんを処置する、方法が、本明細書において開示される。
一態様では、対象において免疫応答を誘導および維持する方法であって、第１の改変された微生物を対象に投与するステップであって、第１の改変された微生物が、免疫イニシエーターを産生することができる、ステップと、免疫サステナーを対象に投与するステップと、を含み、それによって、対象において免疫応答を誘導および維持する、方法が、本明細書において開示される。
一実施形態では、投与するステップは、同時に行われる。一実施形態では、第１の改変された微生物を対象に投与するステップが、免疫サステナーを対象に投与するステップの前に生じる。別の実施形態では、免疫サステナーを対象に投与するステップが、第１の改変された微生物を対象に投与するステップの前に生じる。
一態様では、対象におけるがんを処置する方法であって、免疫イニシエーターを対象に投与するステップと、第１の改変された微生物を対象に投与するステップであって、第１の改変された微生物が、免疫サステナーを産生することができる、ステップと、を含み、それによって、対象におけるがんを処置する、方法が、本明細書において開示される。
一態様では、対象における免疫応答を誘導および維持する方法であって、免疫イニシエーターを対象に投与するステップと、第１の改変された微生物を対象に投与するステップであって、第１の改変された微生物が、免疫サステナーを産生することができる、ステップと、を含み、それによって、対象における免疫応答を誘導および維持する、方法が、本明細書において開示される。
一実施形態では、投与するステップは、同時に行われる。一実施形態では、第１の改変された微生物を対象に投与するステップが、免疫イニシエーターを対象に投与するステップの前に生じる。一実施形態では、免疫イニシエーターを対象に投与するステップが、第１の改変された微生物を対象に投与するステップの前に生じる。
一実施形態では、投与するステップは、腫瘍内注射である。
したがって、本開示は、１つまたは複数の免疫モジュレーターをコードする遺伝子配列を含む、１つまたは複数の改変された細菌を含む、組成物を提供する。一部の実施形態では、免疫モジュレーターは、免疫イニシエーターであり、これは、例えば、腫瘍溶解、樹状細胞もしくはマクロファージによる抗原提示、またはＴ細胞の活性化もしくはプライミングをモジュレート、例えば、促進し得る。そのような免疫イニシエーターの例としては、サイトカインもしくはケモカイン、例えば、ＴＮＦα、ＩＦＮ−ガンマ、およびＩＦＮ−ベータ１、単鎖抗体、例えば、抗ＣＤ４０抗体、または（３）リガンド、例えば、ＳＩＲＰαもしくはＣＤ４０Ｌ、代謝酵素（生合成または異化）、例えば、ＳＴＩＮＧアゴニスト産生酵素、または（５）細胞傷害性化学療法が挙げられる。免疫モジュレーター、例えば、免疫イニシエーターは、自然には遺伝子配列と会合していないプロモーターに作動可能に連結していてもよい。
一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、１つまたは複数のＳＴＩＮＧアゴニスト、例えば、ｃ−ジ−ＡＭＰ、３’３’−ｃＧＡＭＰ、および／またはｃ−２’３’−ｃＧＡＭＰを産生することができる。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ジアデニル酸シクラーゼ、例えば、Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓからの、例えば、ＤａｃＡをコードする遺伝子配列を含む。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、３’３’−ｃＧＡＭＰシンターゼをコードする遺伝子配列を含む。本開示において記載されている３’３’−ｃＧＡＭＰシンターゼの非限定的な例としては、Ｖｅｒｍｉｎｅｐｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｅｉｓｅｎｉａｅ（ＥＦ０１−２ Ｅａｒｔｈｗｏｒｍ ｓｙｍｂｉｏｎｔ）の３’３’−ｃＧＡＭＰシンターゼ、Ｋｉｎｇｅｌｌａ ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ（ＡＴＣＣ ３３３９４）由来の３’３’−ｃＧＡＭＰ シンターゼ、およびＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｂａｃｉｌｌｉｆｏｒｍｉｓ（ＡＴＣＣ ＢＡＡ−１２００）由来の３’３’−ｃＧＡＭＰシンターゼが挙げられる。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、２’３’−ｃＧＡＭＰシンターゼ、例えば、ヒトｃＧＡＳをコードする遺伝子配列を含む。
一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ＯＸ４０、ＧＩＴＲ、４１ＢＢを含むがこれらに限定されない、共刺激受容体のアゴニストをコードする遺伝子配列を含む。
一部の実施形態では、本開示の組成物は、操作化学療法をコードする遺伝子配列を含む、遺伝子操作された細菌を含む。操作化学療法の一例は、腫瘍の場合、５−ＦＣを５−ＦＵに変換することができる、操作された細菌によって提供され得る。
一部の実施形態では、組成物は、腫瘍浸潤もしくはＴ細胞応答をモジュレート、例えば、増強し得るか、または免疫抑制をモジュレート、例えば、軽減し得る、免疫サステナーを産生するための遺伝子配列を含む、１つまたは複数の遺伝子操作された微生物をさらに含む。そのようなサステナーは、サイトカインまたはケモカイン、単鎖抗体アンタゴニストペプチドまたはリガンド、および代謝酵素経路から選択され得る。
遺伝子操作された細菌によって産生され得る免疫維持サイトカインの例としては、ＩＬ−１５およびＣＸＣＬ１０が挙げられ、これらは、腫瘍微小環境に分泌され得る。単鎖抗体の非限定的な例としては、抗ＰＤ−１、抗ＰＤ−Ｌ１、または抗ＣＴＬＡ−４が挙げられ、これらは、腫瘍微小環境に分泌されるか、または微生物の細胞表面上に提示され得る。
一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、１つまたは複数の代謝変換のための回路網をコードする遺伝子配列を含む、すなわち、細菌は、自然には生合成または異化のいずれかであり得る、１つまたは複数の酵素に触媒される反応を行うことができる。したがって、一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、免疫開始および／もしくは免疫維持をモジュレート、例えば、促進するかもしくはそれに寄与する代謝物を産生することができるか、または免疫抑制をモジュレート、例えば、促進する代謝物を消費することができる。例えば、一部の実施形態では、組成物は、例えば、例としてＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓに由来するキヌレニナーゼを発現させることにより、免疫抑制性代謝物であるキヌレニンを消費することができる、遺伝子操作された細菌を含む。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、アデノシン異化経路および必要に応じてアデノシン輸送体をコードする遺伝子配列を含み、腫瘍微小環境内で、腫瘍成長を促進する代謝物であるアデノシンを破壊することができる。他の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、Ｔ細胞活性化およびプライミングの刺激因子であるアルギニンを産生することができる。一部の実施形態では、細菌は、腫瘍微小環境においてアンモニアを消費し、腫瘍成長を支持する窒素へのアクセスを低減することができる。
これらの組成物のいずれにおいても、免疫モジュレーター、例えば、免疫イニシエーターおよび／または免疫サステナーを産生するための遺伝子配列に作動可能に連結されるプロモーターは、誘導性プロモーターであり得る。一部の実施形態では、プロモーターは、低酸素または嫌気条件によって、例えば、腫瘍のハイポキシック環境によって、誘導される。本開示のそのような低酸素誘導性プロモーターの非限定的な例としては、ＦＮＲ誘導性プロモーター、ＡＮＲ誘導性プロモーター、およびＤＮＲ誘導性プロモーターが挙げられる。一部の実施形態では、免疫モジュレーター、例えば、免疫イニシエーターまたは免疫サステナーを産生するための遺伝子配列に作動可能に連結されるプロモーターは、通常は腫瘍内に存在しない化学インデューサーによって、直接的または間接的に誘導される。一部の実施形態では、プロモーターは、適切な成長容器における発酵の間に、ｉｎ ｖｉｔｒｏで誘導される。一部の実施形態では、化学インデューサーは、テトラサイクリン、ＩＰＴＧ、アラビノース、クメート（ｃｕｍａｔｅ）、およびサリチレートから選択される。
一部の実施形態では、組成物は、特定の代謝物の栄養要求株である細菌を含む、例えば、細菌は、微生物が腫瘍に存在する場合には補完されない遺伝子における栄養要求株である。一部の実施形態では、細菌は、ＤａｐＡ遺伝子における栄養要求株である。一部の実施形態では、組成物は、特定の代謝物の栄養要求株である細菌を含む、例えば、細菌は、微生物が腫瘍に存在する場合に補完される遺伝子における栄養要求株である。一部の実施形態では、細菌は、ＴｈｙＡ遺伝子における栄養要求株である。一部の実施形態では、細菌は、ＴｒｐＥ遺伝子における栄養要求株である。
一部の実施形態では、細菌は、グラム陽性細菌である。一部の実施形態では、細菌は、グラム陰性細菌である。一部の実施形態では、細菌は、偏性嫌気性細菌である。一部の実施形態では、細菌は、通性嫌気性細菌である。本開示において企図される細菌の非限定的な例としては、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｎｏｖｙｉ ＮＴ、およびＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｕｔｙｒｉｃｕｍ、およびＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍが挙げられる。一部の実施形態では、細菌は、Ｅ．ｃｏｌｉ ＮｉｓｓｌｅおよびＥ．ｃｏｌｉ Ｋ−１２から選択される。
一部の実施形態では、細菌は、抗生物質耐性遺伝子配列を含む。一部の実施形態では、免疫モジュレーターをコードする遺伝子配列のうちの１つまたは複数は、染色体上に存在する。一部の実施形態では、免疫モジュレーターをコードする遺伝子配列のうちの１つまたは複数は、プラスミド上に存在する。
加えて、１つまたは複数の免疫チェックポイント阻害剤、例えば、ＣＴＬＡ−４阻害剤、ＰＤ−１阻害剤、およびＰＤ−Ｌ１阻害剤をさらに含む、医薬組成物が、提供される。そのようなチェックポイント阻害剤は、遺伝子操作された細菌と組み合わせて、逐次的に、または同時に投与されてもよい。
加えて、共刺激受容体、例えば、ＯＸ４０、ＧＩＴＲ、および／または４１ＢＢに結合することができるリガンドまたはアゴニスト抗体などのアゴニスト分子を含むがこれらに限定されない、共刺激受容体、例えば、ＯＸ４０、ＧＩＴＲ、および／または４１ＢＢの１つまたは複数のアゴニストをさらに含む、医薬組成物が、提供される。そのようなアゴニスト分子は、遺伝子操作された細菌と組み合わせて、逐次的に、または同時に投与されてもよい。
これらの実施形態のいずれにおいても、操作された細菌の組合せは、外科手術、化学療法、標的療法、放射線療法、トモセラピー、免疫療法、がんワクチン、ホルモン療法、温熱療法、幹細胞移植（末梢血、骨髄、および臍帯血移植）、光線力学的療法、治療、ならびに血液製剤輸血および輸注、ならびに腫瘍溶解性ウイルスなどの、従来のがん治療と併用することができる。これらの実施形態のいずれにおいても、操作された細菌は、１つまたは複数の細胞毒または細胞溶解性ペプチドを産生することができる。これらの実施形態のいずれにおいても、操作された細菌は、がんまたは腫瘍ワクチンと併用することができる。
一実施形態では、少なくとも１つの免疫イニシエーターを含む改変された細菌であって、免疫イニシエーターが、インターフェロン遺伝子刺激因子（ＳＴＩＮＧ）アゴニストを産生することができる、改変された細菌が、本明細書において開示される。
図１は、抗原提示細胞におけるＳＴＩＮＧ経路を示す概略図を表す。
図２は、ＬＣ／ＭＳによって測定した場合のｉｎ ｖｉｔｒｏでの細胞外および細胞内環状ジＡＭＰ蓄積を示す棒グラフを表す（ＳＹＮ３５２７）。ｄａｃＡ発現構築物を含有しない対照株では環状ジＡＭＰ蓄積は測定されなかった。
図３は、ＳＹＮ３５２７の導入時の環状ジＡＭＰ産生を示す棒グラフを表す。
図４Ａおよび図４Ｂは、生きた細菌（図４Ａ）および熱殺菌した細菌（図４Ｂ）で処置したＲＡＷ ２６７．４細胞における相対的ＩＦＮｂ１ ｍＲＮＡ発現を表す。ＳＹＮ＝ストレプトマイシン抵抗性Ｎｉｓｓｌｅ。ＳＹＮ−ＳＴＩＮＧ＝ｐ１５−ｐｔｅｔ−ＤａｃＡ（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓからのもの）を含むＳＹＮ３５２７。
図５Ａおよび図５Ｂは、ＳＹＮ３５２７（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓからのテトラサイクリン誘導性ＤａｃＡを含む）による刺激の４時間後のＷＴまたはＴＬＲ４−／−マウス骨髄由来樹状細胞培養物におけるＩＮＦ−ｂ１産生（図５Ａ）またはＩＦＮ−ｂ１ ｍＲＮＡ発現（図５Ｂ）を示すグラフを表す。ＳＹＮ３５２７を、未誘導で放置した（「ＳＴＩＮＧ−ＵＮ」）か、または実験前にテトラサイクリンにより誘導した「ＳＴＩＮＧ−ＩＮ」。ＴＬＲ４−／−細胞は、ＬＰＳに応答することができない。非誘導細菌における低乃至は負のＩＦＮｂレベルは、ＩＦＮｂ誘導がＳＴＩＮＧアゴニストの発現に依存することを示す。同様のＩＦＮｂ誘導レベルがＷＴおよびＴＬＲ４−／−で観察された。これは、ＩＦＮｂのＳＴＩＮＧアゴニスト媒介誘導がＬＰＳ／ＴＬＲ４に依存しないことを実証する。図５Ｃおよび図５Ｄは、ＳＹＮ３５２７（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓからのテトラサイクリン誘導性ＤａｃＡを含む）による刺激の４時間後のＷＴまたはＴＬＲ４−／−マウス骨髄由来樹状細胞におけるＩＬ−６ ｍＲＮＡ発現（図５Ｃ）またはＣＤ８０ ｍＲＮＡ発現（図５Ｄ）を示すグラフを表す。ＳＹＮ３５２７を、未誘導で放置した（「ＳＴＩＮＧ−ＵＮ」）か、または実験前にテトラサイクリンにより誘導した「ＳＴＩＮＧ−ＩＮ」。ＴＬＲ４−／−細胞は、ＬＰＳに応答することができない。ＩＬ−６およびＣＤ８０レベルは、非誘導のものまたはＳＹＮ９４と比較して誘導ＳＹＮ３５２７への曝露時に同様であり、これは、ＬＰＳ／ＴＬＲ４シグナル伝達が、ＩＬ−６およびＣＤ８０上方調節をもたらすシグナルの大部分の原因となる可能性が高いことを示す。 同上。
図６Ａおよび図６Ｂは、ＲＡＷ ２６４．７細胞における様々な感染多重度（ＭＯＩ）でのＩＦＮ−ベータ１誘導に対するＳＴＩＮＧアゴニスト産生株の４時間（図６Ａ）ならびに４時間および４５分（図６Ｂ）の時点での活性のｉｎ ｖｉｔｒｏ分析の折れ線グラフを表し、ＳＹＮ３５２７（テトラサイクリン誘導性ｄａｃＡ構築物を含む）が、ＲＡＷ２６４．７細胞（不死化マウスマクロファージ細胞系）における用量依存的ＩＦＮ−ベータ１誘導を駆動することを実証する。簡単に説明すると、細菌（ＷＴ Ｎｉｓｓｌｅ（グラフ中に「ＳＹＮ」と標識されている）またはＳＹＮ３５２７（グラフ中に「ＳＹＮ−ＳＴＩＮＧ」と標識されており、Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓからのテトラサイクリン誘導性ＤａｃＡを含む）を様々な感染多重度（ＭＯＩ）で０．５×１０６個のＲＡＷ２６４．７細胞とともに共培養した。ＳＹＮ３５２７を、実験前に未誘導で放置したか、または示されているようにテトラサイクリンにより誘導した。共培養物を示されているように４時間または４５分間インキュベートし、タンパク質抽出物を分析した。
図７Ａは、ｉｎ ｖｉｖｏマウス試験の概要を示す概略図を表し、その結果を図７Ｂおよび図７Ｃに示す。図７Ｂは、Ｂ１６−Ｆ１０腫瘍を移植し、食塩水、ＳＹＮ９４（ストレプトマイシン抵抗性野生型Ｎｉｓｓｌｅ）、またはＳＹＮ３５２７（テトラサイクリン誘導性ｄａｃＡ構築物を含む）によって処置したマウスの平均腫瘍体積を示す折れ線グラフを表す。図７Ｃは、試験における個々のマウスの腫瘍体積を示す折れ線グラフを表す。図７Ｄは、９日目での腫瘍重量を示すグラフを表す。図７Ｅはフローサイトメトリーを介して測定した９日目での腫瘍流入領域リンパ節におけるＴ細胞総数を示すグラフを表す。図７Ｆは、ＣＤ４（従来の）およびＣＤ８ Ｔ細胞サブセット中の活性化（ＣＤ４４ ｈｉｇｈ）Ｔ細胞のパーセンテージを示すグラフを表し、図７Ｇは、フローサイトメトリーを介して測定した９日目での腫瘍流入領域リンパ節におけるＳＴＩＮＧ注射時のＴｒｅｇの活性化の欠如を示すグラフを表す。図７Ｈは、腫瘍コロニー形成を示すグラフを表す。Ｎ．Ｄ．＝検出されなかった。 同上。 同上。 同上。 同上。
図８Ａおよび図８Ｂは、食塩水またはストレプトマイシン抵抗性Ｎｉｓｓｌｅによって処置したマウスと比較した場合の、ｔｅｔ誘導性ＳＴＩＮＧアゴニスト産生株ＳＹＮ３５２７の投与および誘導の２日後（図８Ａ）または９日後（図８Ｂ）にＬｕｍｉｎｅｘ Ｂｅａｄアッセイによって測定したＢ１６腫瘍におけるＩＦＮ−ｂ１の濃度を示す棒グラフを表す。
図９Ａ、図９Ｂおよび図９Ｃは、ＳＹＮ−ＳＴＩＮＧで処置したＢ１６Ｆ１０腫瘍のサイトカイン動態分析を示す。Ｂ１６Ｆ１０腫瘍を本明細書に記載の通り処置し、処置開始後２および９日目に腫瘍のコホートを収集した。腫瘍をホモジナイズし、プロテアーゼ阻害剤で処置し、将来の分析のために凍結した。融解したホモジネートを、特別注文のＬｕｍｉｎｅｘサイトカインアレイを利用して分析した。図９Ａにおけるパネルは、ＳＹＮ−ＳＴＩＮＧ処置に応答して上方調節を示す自然免疫細胞応答を示すサイトカインを示す。図９Ｂおよび図９Ｃにおけるパネルは、細胞溶解性および活性化エフェクターＴ細胞に関連するサイトカインを示す。図９Ｄにおけるパネルは、細菌注射に応答して上方調節されたサイトカインを示す。コホート内の実験群を比較する多重Ｔ検定用に調整したホルム・シダック方法を使用して判定した統計的有意性。食塩水と比較した群；＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．００５。ＳＹＮ（ＷＴ）と比較した群；＃Ｐ＜０．０５。図９Ａは、食塩水またはストレプトマイシン抵抗性Ｎｉｓｓｌｅによって処置したマウスと比較した場合の、ｔｅｔ誘導性ＳＴＩＮＧアゴニスト産生株ＳＹＮ３５２７の投与および誘導の２日および９日後にＬｕｍｉｎｅｘ Ｂｅａｄアッセイによって測定したＢ１６腫瘍におけるＩＬ−６（左のパネル）、ＩＬ−１ベータ（中央のパネル）およびＭＣＰ−１（右のパネル）の濃度を示す棒グラフを表す。図９Ｂは、食塩水またはストレプトマイシン抵抗性Ｎｉｓｓｌｅによって処置したマウスと比較した場合のｔｅｔ誘導性ＳＴＩＮＧアゴニスト産生株ＳＹＮ３５２７の投与および誘導の２日および９日後にＬｕｍｉｎｅｘ Ｂｅａｄアッセイによって測定したＢ１６腫瘍におけるグランザイムＢ（左のパネル）、ＩＬ−２（中央のパネル）、およびＩＬ−１５（右のパネル）の濃度を示す棒グラフを表す。図９Ｃは、食塩水またはストレプトマイシン抵抗性Ｎｉｓｓｌｅによって処置したマウスと比較した場合のｔｅｔ誘導性ＳＴＩＮＧアゴニスト産生株ＳＹＮ３５２７の投与および誘導の２日および９日後にＬｕｍｉｎｅｘ Ｂｅａｄアッセイによって測定したＢ１６腫瘍におけるＩＦＮｇ（上のパネル）およびＩＬ−１２ｐ７０（下のパネル）の濃度を示す棒グラフを表す。図９Ｄは、食塩水またはストレプトマイシン抵抗性Ｎｉｓｓｌｅによって処置したマウスと比較した場合のｔｅｔ誘導性ＳＴＩＮＧアゴニスト産生株ＳＹＮ３５２７の投与および誘導の２日および９日後にＬｕｍｉｎｅｘ Ｂｅａｄアッセイによって測定したＢ１６腫瘍におけるＴＮＦ−ａ（上のパネル）およびＧＭ−ＣＳＦ（下のパネル）の濃度を示す棒グラフを表す。図９Ａ、図９Ｂおよび図９Ｃ中の各パネルにおける棒グラフは、図９Ａおよび図９Ｂと同じ順序、すなわち、食塩水（左）、ストレプトマイシン抵抗性野生型Ｎｉｓｓｌｅ（中央）そしてＳＹＮ３５２７（ＳＹＮ−ＳＴＩＮＧ、右）、で並べられている。 同上。 同上。 同上。
図１０Ａ、図１０Ｂおよび図１０Ｃは、樹状細胞（ＤＣ）およびマクロファージとの共培養後のＳＹＮ−ＳＴＩＮＧ（ＳＹＮ３５２７）活性のｉｎ ｖｉｔｒｏ分析を示すグラフを表す。簡単に説明すると、抗原提示細胞集団におけるＳＴＩＮＧ経路を活性化するＳＹＮ−ＳＴＩＮＧの能力を評価した。細菌（ＷＴ ＮｉｓｓｌｅまたはＳＹＮ３５２７（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓからテトラサイクリン誘導性ＤａｃＡを含む）を様々な感染多重度（ＭＯＩ）で０．５×１０６個のＲＡＷ２６４．７細胞（不死化マウスマクロファージ細胞系）またはマウス骨髄由来ＤＣとともに共培養した。ＳＹＮ３５２７を、未誘導で放置した（「ＳＴＩＮＧｕｎ」）か、または実験前にテトラサイクリンにより誘導した「ＳＴＩＮＧｉｎ」。共培養物を示されているように２または４時間インキュベートし、タンパク質抽出物を分析したか、またはｍＲＮＡを収集して定量的ＰＣＲによってＩＦＮβ１遺伝子誘導を測定した。図１０Ａおよび図１０Ｂは、刺激の４時間後（図１０Ａ）または刺激の２および４時間後（図１０Ｂ）のマウス骨髄由来樹状細胞におけるＩＦＮβ１（図１０Ａ）またはＩＦＮ−ｂ１ ｍＲＮＡ誘導（図１０Ｂ）を示すグラフを表す。図１０Ｃは、２時間の時点でのＲＡＷ ２６４．７細胞における平均ＩＦＮβ１遺伝子誘導（ｍＲＮＡレベル）を表す。６０℃で３０分間、熱殺菌した細菌を生じさせた。平均Ｃｔｒｌ＝対象ＰＢＳ；ＬＰＳ＝１００ｎｇ／ｍＬのリポ多糖。ＰＢＳ処置対照に対して正規化されたすべてのシグナル。 同上。
図１１は、３つの異なる用量（１×１０＾７、５×１０＾７および１×１０＾８）でのＳＴＩＮＧアゴニスト産生株の腫瘍体積に対する効果を経時的に示すｉｎ ｖｉｖｏ分析の折れ線グラフを表し、ＳＹＮ３５２７（テトラサイクリン誘導性Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ ｄａｃＡ構築物を含む）がＡ２０リンパ腫モデルにおいて用量依存的腫瘍制御を駆動することを実証する。
図１２Ａ、図１２Ｂ、図１２Ｃおよび図１２Ｄは、図１１に示す試験の各個々のマウスを示す折れ線グラフを表す。 同上。
図１３は、Ａ２０腫瘍モデルにおいてＳＹＮ３５２７（ＷＴ Ｔｅｔ−ＳＴＩＮＧ）により惹起された完全退縮が長期にわたる免疫学的記憶をもたらすことを示す折れ線グラフを表す。未処置対照とは対照的に、以前にＳＹＮ３５２７で処置され、完全退縮を示した動物では、２回目の移植が完全に拒絶された。グラフは、示されている実験群についての個々の腫瘍測定を示す。
図１４Ａは、ＳＴＩＮＧアゴニストの産生のための１つまたは複数の酵素をコードする遺伝子配列を発現し、キヌレニン消費酵素の発現のための１つまたは複数の遺伝子配列をさらに発現するように微生物が遺伝子操作される、本開示の非限定的な例の概略図を表す。ＳＴＩＮＧアゴニストの産生のためのそのような酵素の非限定的な例としては、例えばＬｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓからの、ｄａｃＡが挙げられる。そのようなキヌレニン消費酵素の非限定的な例としては、キヌレニナーゼ（例えば、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓからのキヌレニナーゼ）が挙げられる。より一般的には、免疫イニシエーター回路（ＳＴＩＮＧアゴニスト産生体または本明細書に記載の他のもの）を免疫サステナー回路（例えば、キヌレニン消費または本明細書に記載の他のもの）と組み合わせることができる。図１４Ｂは、免疫イニシエーター回路（ＳＴＩＮＧアゴニスト）および免疫サステナー回路（キヌレニン回路）を発現するように遺伝子操作されている微生物が、先ず高レベルの免疫刺激因子（例えばＬｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓからの、ＳＴＩＮＧアゴニスト産生酵素、例えばＤａｃＡ）を産生し、その後の時点で免疫サステナー（例えばＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓからの、キヌレニナーゼ）を産生する、本開示の一実施形態を示す、グラフの概略図を表す。一部の実施形態では、免疫イニシエーター（この場合は、ＳＴＩＮＧアゴニスト産生酵素、例えばｄａｃＡ）の発現は、インデューサーにより誘導される。一部の実施形態では、免疫サステナー（この場合はキヌレニナーゼ）は、インデューサーにより誘導される。一部の実施形態では、免疫イニシエーター（ＳＴＩＮＧアゴニスト産生酵素、例えばｄａｃＡ）と免疫サステナー（例えばキヌレニナーゼ）は両方とも、１つまたは複数のインデューサーにより誘導される。インデューサー＃１（例えば、免疫イニシエーターｄａｃＡ発現を誘導する）およびインデューサー＃２（例えば、免疫サステナーキヌレニナーゼ発現を誘導する）は、同じであることもあり、または異なることもある。インデューサー＃１およびインデューサー＃２を、逐次的にまたは同時に投与することができる。インデューサーの非限定的な例としては、ｉｎ ｖｉｖｏ条件、消化管もしくは腫瘍微小環境（低酸素、ある特定の栄養素など）の条件、ｉｎ ｖｉｔｒｏ成長条件、または化学的インデューサー（例えば、アラビノース、クミン酸塩およびサリチル酸塩、ＩＰＴＧもしくは本明細書に記載の他の化学的インデューサー）が挙げられる。他の実施形態では、免疫イニシエーター（ＳＴＩＮＧアゴニスト産生酵素、例えばｄａｃＡ）および免疫サステナー（例えばキヌレニナーゼ）は、本明細書に記載のものを含むがそれらに限定されない、構成的プロモーターにより駆動される。一部の実施形態では、免疫イニシエーター（ＳＴＩＮＧアゴニスト産生酵素、例えばｄａｃＡ）は、誘導性プロモーターにより駆動され、免疫サステナー（例えばキヌレニナーゼ）は、構成的プロモーターにより駆動される。一部の実施形態では、免疫イニシエーター（ＳＴＩＮＧアゴニスト産生酵素、例えばｄａｃＡ）は、構成的プロモーターにより駆動され、免疫サステナー（例えばキヌレニナーゼ）は、誘導性プロモーターにより駆動される。一部の実施形態では、両方の回路が、細菌染色体に組み込まれていることもある。一部の実施形態では、両方の回路が、プラスミド上に存在することもある。一部の実施形態では、両方の回路が、プラスミド上に存在することもある。一部の実施形態では、一方の回路は、細菌染色体に組み込まれていることがあり、もう一方の回路は、プラスミド上に存在することがある。
さらに別の実施形態では、ＳＴＩＮＧアゴニスト産生回路網、例えばｄａｃＡ、を発現する遺伝子操作された細菌の１つまたは複数の株、およびキヌレニン消費回路網（例えば、キヌレニナーゼ）を発現する遺伝子操作された細菌の１つまたは複数の別の株を、逐次的に投与することができ、例えば、ＳＴＩＮＧアゴニスト産生体（免疫刺激因子）をキヌレニン消費体（免疫サステナー）の前に投与することができる。より一般的には、免疫開始のための回路網を発現する細菌株を、免疫維持のための回路網を発現する別の細菌株とともに投与することができ、例えば、免疫イニシエーター株を免疫サステナー株の前に投与することができる。例えば、免疫開始のための回路網を発現する細菌株を、免疫維持のための回路網を発現する別の細菌株、例えば免疫イニシエーター株、の前に投与することができる。あるいは、免疫開始のための回路網を発現する細菌株を、免疫維持のための回路網を発現する別の細菌株、例えば免疫イニシエーター株、の後に投与することができる。さらに別の実施形態では、免疫開始のための回路網を発現する細菌株を、免疫維持のための回路網を発現する別の細菌株、例えば免疫イニシエーター株、と同時に投与することができる。
図１５は、本開示の遺伝子操作された細菌が、免疫不全の際に間質のものを補完することにより、広い抗腫瘍活性を達成するように腫瘍微小環境を変換することができる方法を示す、概略図を表す。
図１６は、抗腫瘍活性改善のための機序の組合せを示す概略図を表す。
図１７Ａおよび図１７Ｂは、ＳＴＩＮＧアゴニスト産生体ＳＮ３５２７、キヌレニン消費体ＳＹＮ２０２８、および組合せ株（ＳＴＩＮＧアゴニスト産生体＋キヌレニン消費体）ＳＹＮ３８３１の環状ジＡＭＰの産生（図１７Ａ）およびキヌレニンの消費（図１７Ｂ）を示す棒グラフを表す。
図１８Ａは、示されているような７２時間の期間にわたってのＣＴ２６腫瘍における栄養要求性突然変異体ΔＵｒａＡ、ΔＴｈｙＡおよびΔＤａｐＡの成長（腫瘍組織１グラムあたりのＣＦＵ）を示すグラフを表す。図１８Ｂおよび図１８Ｃは、示されているような７２時間にわたってのＢ１６Ｆ１０（図１８Ｂ）およびＥＬ４（図１８Ｃ）腫瘍における野生型Ｅ．ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅ（ＳＹＮ９４）と比較した栄養要求性突然変異体ΔＴｈｙＡ（ＳＹＮ１６０５）の成長（腫瘍組織１グラムあたりのＣＦＵ）を示すグラフを表す。 同上。
図１９Ａは、Ｂ１６Ｆ１０モデルにおける２つの異なる用量（１ｅ７および１ｅ８ ＣＦＵ）でのＳＹＮ４０２３（テトラサイクリン誘導性Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ ｄａｃＡ構築物およびΔＤａｐＡ突然変異を含む）の腫瘍成長（腫瘍体積中央値）に対する効果を食塩水対照と比較して経時的に示すｉｎ ｖｉｖｏ分析の折れ線グラフを表す。図１９Ｂ、図１９Ｃおよび図１９Ｄは、図１９Ａに示す試験の各個々のマウスを示す折れ線グラフを表す。 同上。
図２０Ａおよび図２０Ｂは、Ｂ１６Ｆ１０腫瘍を移植し、その後、１ｅ７ ＣＦＵ ＳＹＮ３５２７（ｄａｃＡ、投与の４時間後にテトラサイクリンで誘導）、１ｅ７ ＣＦＵ ＳＹＮ３５２７（ｄａｃＡ、未誘導で放置）、１ｅ８ ＣＦＵ ＳＹＮ４０２３（ｄａｃＡ、およびΔＤａｐＡ、誘導）、ＳＹＮ９４（未改変細菌）、または対照としての食塩水のいずれかによって処置したマウスの血液中の、示されているような様々な時点での、敗血症およびサイトカイン急増関連サイトカインＩＬ−１β（図２０Ａ）およびＴＮＦ−α（図２０Ｂ）の濃度を示すグラフを表す。ＬＰＳ処置を敗血症についての陽性対照として含めた。図２０Ｃおよび図２０Ｄは、示されているような様々な時点での腫瘍におけるＣ−ジＡＭＰ濃度（図２０Ｃ）またはＣＦＵ数（図２０Ｄ）を示すグラフを表す。 同上。
図２１Ａは、Ａ２０腫瘍モデルにおける腫瘍成長（腫瘍体積中央値）に対する食塩注射対照と比較したＳＹＮ４０２３（テトラサイクリン誘導性Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ ｄａｃＡ構築物およびΔＤａｐＡ突然変異を含む）の効果を示すｉｎ ｖｉｖｏ分析の折れ線グラフを表す。図２１Ｂおよび図２１Ｃは、図２１Ａに示す試験の各個々のマウスを示す折れ線グラフを表す。
図２２Ａは、Ｂ１６Ｆ１０モデルにおける、単独での、または免疫刺激因子（アゴニスト抗ＯＸ４０、抗４１ＢＢ、もしくは抗ＧＩＴＲ抗体）と組み合わせた、ＳＹＮ４０２３（テトラサイクリン誘導性Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ ｄａｃＡ構築物とΔＤａｐＡ突然変異とを含むＤＡＰ−ＳＴＩＮＧ）の腫瘍体積中央値に対する効果を、単独での対照または単剤（ＳＹＮ４０２３、抗ｏｘ４０、抗４１ＢＢもしくは抗ＧＩＴＲ抗体＋食塩水）と比較して経時的に示す、ｉｎ ｖｉｖｏ分析の折れ線グラフを表す。図２２Ｂ、図２２Ｃ、図２２Ｄ、図２２Ｅ、図２２Ｆ、図２２Ｇおよび図２２Ｈは、図２２Ａに示す試験の各個々のマウスを示す折れ線グラフを表す。 同上。 同上。
図２３Ａは、腫瘍内注射抗ＯＸ４０抗体と組み合わせたＳＹＮ４０２３（ｔｅｔ誘導性ｄａｃＡおよびデルタｄａｐＡを含む）がＡ２０腫瘍モデルにおいてアブスコパル効果を惹起することができることを示す折れ線グラフを表す。腫瘍体積平均中央値を各処置群について示す。処置／注射した腫瘍をグラフの右側に示し、その一方で、処置を施していない（未注射）腫瘍を左側に示す。図２３Ｂおよび図２３Ｃは、個々のマウス（図２３Ｂには未処置マウス、および図２３ＣにはＳＹＮ４０２３によって処置したマウス）の腫瘍体積を経時的に示す折れ線グラフを表す。図２３Ｄは、図２３Ａに示す試験期間にわたってのマウスの生存を示すグラフを表す。図２３Ｅは、試験期間にわたっての平均体重を示すグラフを表す。図２３Ｆは、以前にＳＹＮ４０２３で処置したマウス（図２３Ａ〜２３Ｅに示されている通りであり、少なくとも３０日間のモニタリング時に完全退縮を示した）の左脇腹にＡ２０腫瘍を移植し、右脇腹にＣＴ２６腫瘍を移植した再投与試験の結果を、同じ腫瘍を移植した未処置同齢マウスと比較して示す、折れ線グラフを表す。腫瘍体積平均中央値を各処置群について示す。図２３Ｇおよび図２３Ｈは、図２３Ｆに示す試験からの個々のマウス（図２３Ｇには未処置マウス、および図２３ＨにはＳＹＮ４０２３によって以前に処置したマウス）の腫瘍体積を経時的に示す折れ線グラフを表す。図２３Ｉは、アブスコパル効果および免疫学的記憶能力を問い合わせる２部構成の試験全体を示すグラフを表す（Ａ２０の再投与を表す）。グラフは、個々の実験群についての個々の腫瘍測定を示す。 同上。 同上。 同上。 同上。
図２４は、示されているように１および１６時間の時点でＢ１６腫瘍モデルにおいてインデューサーの存在または非存在下でＡＴＣ、アスピリン、クミン酸塩および低酸素（ＦＮＲ）誘導性プロモーターにより達成されたＧＦＰ発現レベルのｉｎ ｖｉｖｏ分析を示す棒グラフを表す。回収したすべての細菌（ＲＦＰ＋）のうちの誘導された細菌（ＧＦＰ＋）のパーセンテージ。
図２５は、図２４に記載の分析のＧＦＰ＋／ＲＦＰ＋細菌についての幾何平均蛍光強度（ＭＦＩ）によって測定した場合の遺伝子発現レベルを示す。
図２６Ａ、図２６Ｂ、図２６Ｃおよび図２６Ｄは、３つの異なる用量（１ｅ７（図２６Ｂ）、１ｅ８（図２６Ｃ）および１ｅ９（図２６Ｄ））でのＳＴＩＮＧアゴニスト産生株ＳＹＮ４４４９のＢ１６−Ｆ１０腫瘍体積に対する効果を経時的に示すｉｎ ｖｉｖｏ分析における個々のマウスの折れ線グラフを表し、１ｅ９の用量でのＳＹＮ４４４９の投与がＢ１６．Ｆ１０腫瘍モデルにおいてこの期間にわたって腫瘍成長の拒絶または制御をもたらすことを示す。図２６Ａは、食塩水対照で処置した個々のマウスの折れ線グラフを示す。 同上。
図２７Ａ、図２７Ｂおよび図２７Ｃは、３つの異なる用量（１ｅ６、１ｅ７および１ｅ８）でのＳＴＩＮＧアゴニスト産生株ＳＹＮ４４４９の腫瘍体積に対する効果を経時的に示すｉｎ ｖｉｖｏ分析における個々のマウスの折れ線グラフを表し、ＳＹＮ４４４９（プラスミドに基づくＦＮＲ−ｄａｃＡおよびデルタｄａｐＡを含む）がＡ２０リンパ腫モデルにおいて用量依存的腫瘍制御を駆動することを実証する。ＣＲ＝完全奏効。図２７Ｄは、食塩水対照で処置した個々のマウスの折れ線グラフを示す。 同上。
図２８Ａは、プラスミドにｄａｐＡ突然変異およびＦＮＲ−ｄａｃＡ（ΔＤＡＰ、１５Ａ−ｆｎｒ−ｄａｃＡ）を含むＳＹＮ４４４９をＳＹＮ９４（ストレプトマイシン抵抗性Ｎｉｓｓｌｅ）と比較して示す棒グラフであって、ＳＹＮ４４４９がｃ−ジＡＭＰを産生することを実証する棒グラフを表す。図２８Ｂおよび図２８Ｃは、ＳＹＮ４９１０（図２８Ｂ）およびＳＹＮ４９３９（図２８Ｃ）のｉｎ ｖｉｔｒｏでのｃ−ジＡＭＰ産生をＳＹＮ９４と比較して示す棒グラフを表す。図２８Ｄは、０、２および４時間の時点でのＳＹＮ２３０６、ＳＹＮ４９３９およびＳＹＮ９４についてのｉｎ ｖｉｔｒｏでのキヌレニン消費の比較を示す棒グラフを表す。ＳＹＮ４９１０は、ファージ欠失、ＤＡＰＡ栄養要求体、ＴｈｙＡ栄養要求体、およびＨＡ９／１０部位に組み込まれたＦＮＲ−ＤａｃＡ（ΔΦ、ΔＤＡＰ、ΔＴｈｙＡ、ＨＡ９／１０：：ｆｕｒ−ＤａｃＡ）を含む。ｃ−ジＡＭＰ産生とキヌレニン消費の組合せの株であるＳＹＮ４９３９は、染色体に組み込まれており構成的プロモーターの制御下にあるキヌレニナーゼと、ＴｒｐＥの欠失と、ファージ欠失と、ＤａｐＡ栄養要求体と、ＴｈｙＡ栄養要求体と、ＨＡ９／１０部位に組み込まれているＦＮＲ−ＤａｃＡ（ＰＳｙｎＪ２３１１９−ｐＫＹＮａｓｅ、ΔＴｒｐＥ、ΔΦ、ΔＤＡＰ、ΔＴｈｙＡ、ＨＡ９／１０：：ｆｎｒ−ＤａｃＡ）を含む。ＳＹＮ２３０６は、構成的に発現されたキヌレニナーゼ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）と、ＴｒｐＥの欠失（ＨＡ３／４：：ＰＳｙｎＪ２３１１９−ｐＫＹＮａｓｅデルタＴｒｐＥ）を含む。ＳＹＮ９４対照：ストレプトマイシン抵抗性Ｎｉｓｓｌｅ。 同上。
図２９Ａおよび図２９Ｂは、ＳＹＮ９４（ストレプトマイシン抵抗性Ｎｉｓｓｌｅ）とＳＹＮ４７３９（図２９Ａ）またはＳＹＮ４９３９（図２９Ｂ）によるｉｎ ｖｉｔｒｏでのｃ−ジＡＭＰ産生の比較を示す棒グラフを表す。図２９Ｃおよび図２９Ｄは、ＳＹＮ９４とＳＹＮ２０２８およびＳＹＮ４７３９（図２９Ｃ）またはＳＹＮ２３０６およびＳＹＮ４９３９（図２９Ｄ）による０、２および４時間の時点でｉｎ ｖｉｔｒｏでのキヌレニン消費の比較を示す棒グラフを表す。ＳＹＮ４７３９は、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓからの構成的に発現されたキヌレニナーゼ、ＴｒｐＥの欠失と、ＴｈｙＡ栄養要求体（ＨＡ３／４：：ＰＳｙｎＪ２３１１９−ｐＫＹＮａｓｅ、ΔＴｒｐＥ、ΔＴｈｙＡ、ＨＡ９／１０：：ｆｎｒ−ＤａｃＡ）を含む。ｃ−ジＡＭＰ産生とキヌレニン消費の組合せの株であるＳＹＮ４９３９は、染色体に組み込まれており、構成的プロモーターの制御下にあるキヌレニナーゼと、ＴｒｐＥの欠失と、ファージ欠失と、ＤＡＰＡ栄養要求体と、ＴｈｙＡ栄養要求体と、ＨＡ９／１０部位に組み込まれているＦＮＲ−ＤａｃＡ（ＰＳｙｎＪ２３１１９−ｐＫＹＮａｓｅ、ΔＴｒｐＥ、ΔΦ、ΔＤＡＰ、ΔＴｈｙＡ、ＨＡ９／１０：：ｆｎｒ−ＤａｃＡ）を含む。ＳＹＮ２０２８は、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅからの構成的プロモーターの制御下にあり染色体に組み込まれているキヌレニナーゼと、ＴｒｐＥの欠失（ＨＡ３／４：：ＰＳｙｎＪ２３１１９−ｐＫＹＮａｓｅデルタＴｒｐＥ）を含む。ＳＹＮ２３０６は、構成的に発現されたキヌレニナーゼ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）と、ＴｒｐＥの欠失（ＨＡ３／４：：ＰＳｙｎＪ２３１１９−ｐＫＹＮａｓｅデルタＴｒｐＥ）を含む。ＳＹＮ９４：ストレプトマイシン抵抗性Ｎｉｓｓｌｅ。 同上。
図３０および図３１は、０、２および４時間の時点でｉｎ ｖｉｔｒｏでのｃ−ジＡＭＰ産生およびｉｎ ｖｉｔｒｏでのキヌレニン消費についての、ＳＹＮ２３０６とＳＹＮ４７８９とＳＹＮ４９３９とＳＹＮ９４の間の比較を示す棒グラフを表す。ＳＹＮ２３０６は、構成的に発現されたキヌレニナーゼ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）と、ＴｒｐＥの欠失（ＨＡ３／４：：ＰＳｙｎＪ２３１１９−ｐＫＹＮａｓｅデルタＴｒｐＥ）を含む。ＳＹＮ９４：ストレプトマイシン抵抗性Ｎｉｓｓｌｅ。ＳＹＮ４７８９は、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓからの構成的に発現されたキヌレニナーゼと、ＴｒｐＥの欠失と、ＴｈｙＡ栄養要求体（ＨＡ３／４：：ＰＳｙｎＪ２３１１９−ｐＫＹＮａｓｅ、ΔＴｒｐＥ、ΔＴｈｙＡ、ＨＡ９／１０：：ｆｎｒ−ＤａｃＡ）を含む。ｃ−ジＡＭＰ産生とキヌレニン消費の組合せの株であるＳＹＮ４９３９は、染色体に組み込まれており、構成的プロモーターの制御下にあるキヌレニナーゼと、ＴｒｐＥの欠失と、ファージ欠失と、ＤＡＰＡ栄養要求体と、ＴｈｙＡ栄養要求体と、ＨＡ９／１０部位に組み込まれているＦＮＲ−ＤａｃＡ（ＰＳｙｎＪ２３１１９−ｐＫＹＮａｓｅ、ΔＴｒｐＥ、ΔΦ、ΔＤＡＰ、ΔＴｈｙＡ、ＨＡ９／１０：：ｆｎｒ−ＤａｃＡ）を含む。ＳＹＮ９４：ストレプトマイシン耐性Ｎｉｓｓｌｅ。 図３０および図３１は、０、２および４時間の時点でｉｎ ｖｉｔｒｏでのｃ−ジＡＭＰ産生およびｉｎ ｖｉｔｒｏでのキヌレニン消費についての、ＳＹＮ２３０６とＳＹＮ４７８９とＳＹＮ４９３９とＳＹＮ９４の間の比較を示す棒グラフを表す。ＳＹＮ２３０６は、構成的に発現されたキヌレニナーゼ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）と、ＴｒｐＥの欠失（ＨＡ３／４：：ＰＳｙｎＪ２３１１９−ｐＫＹＮａｓｅデルタＴｒｐＥ）を含む。ＳＹＮ９４：ストレプトマイシン抵抗性Ｎｉｓｓｌｅ。ＳＹＮ４７８９は、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓからの構成的に発現されたキヌレニナーゼと、ＴｒｐＥの欠失と、ＴｈｙＡ栄養要求体（ＨＡ３／４：：ＰＳｙｎＪ２３１１９−ｐＫＹＮａｓｅ、ΔＴｒｐＥ、ΔＴｈｙＡ、ＨＡ９／１０：：ｆｎｒ−ＤａｃＡ）を含む。ｃ−ジＡＭＰ産生とキヌレニン消費の組合せの株であるＳＹＮ４９３９は、染色体に組み込まれており、構成的プロモーターの制御下にあるキヌレニナーゼと、ＴｒｐＥの欠失と、ファージ欠失と、ＤＡＰＡ栄養要求体と、ＴｈｙＡ栄養要求体と、ＨＡ９／１０部位に組み込まれているＦＮＲ−ＤａｃＡ（ＰＳｙｎＪ２３１１９−ｐＫＹＮａｓｅ、ΔＴｒｐＥ、ΔΦ、ΔＤＡＰ、ΔＴｈｙＡ、ＨＡ９／１０：：ｆｎｒ−ＤａｃＡ）を含む。ＳＹＮ９４：ストレプトマイシン耐性Ｎｉｓｓｌｅ。
図３２は、ＲＡＷ ２６４．７細胞におけるＩＦＮ−ベータ１誘導に対する様々な感染多重度（ＭＯＩ）でのＳＴＩＮＧアゴニスト産生株ＳＹＮ４７３７の４時間の時点での活性のｉｎ ｖｉｔｒｏ分析の折れ線グラフを表し、ＳＹＮ４７３７（ファージ欠失と、ＤＡＰＡ栄養要求体と、ＨＡ９／１０部位に組み込まれているＦＮＲ−ＤａｃＡ（ΔΦ、ΔＤＡＰ、ＨＡ９／１０：：ｆｎｒ−ＤａｃＡ）を含む）がＲＡＷ ２６４．７細胞（不死化マウスマクロファージ細胞系）において用量依存的ＩＦＮ−ベータ１誘導を駆動することを実証する。簡単に説明すると、細菌（ＷＴ Ｎｉｓｓｌｅ（グラフ中に「ＳＹＮ」と標識されている））またはＳＹＮ４７３７を、４時間、嫌気的チャンバー内で前誘導してＳＴＩＮＧアゴニスト合成を誘導し、次いで、４時間、０．５×１０６個ＲＡＷ２６４．７細胞とともに様々な感染多重度（ＭＯＩ）で共培養し、ＲＡＷ２６４．７細胞上清中に存在するタンパク質を分析した。
図３３Ａおよび図３３Ｂは、ｃＧＡＳオルソログ（推定的ｃＧＡＭＰシンターゼ）を含む様々な株の、ｃ−ジＡＭＰおよび細菌ｃＧＡＭＰのｉｎ ｖｉｔｒｏでの産生を示すグラフを表す。 同上。
図３４Ａおよび図３４Ｂは、５−ＦＣを５−ＦＵに変換するＥ．ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅ株ＳＹＮ３５２９（Ｎｉｓｓｌｅ ｐ１５Ａ Ｐｔｅｔ−ＣｏｄＡ）およびＳＹＮ３６２０（Ｎｉｓｓｌｅ ｐ１５Ａ Ｐｔｅｔ−ＣｏｄＡ：：Ｕｐｐ融合体）の能力を示す棒グラフを表す。グラフは、２時間のアッセイ時間後の５−ＦＣレベル（図３４Ａ）および５−ＦＵレベル（図３４Ｂ）を示す。
図３５Ａは、ｉｎ ｖｉｖｏマウス試験の概要を示す概略図を表し、この試験の結果を図３５Ｂ、図３５Ｃ、図３５Ｄおよび図３５Ｅに示す。図３５Ｂは、Ｂ１６−Ｆ１０腫瘍を移植し、ＰＢＳ、ＳＹＮ３６２０（ｐＵＣ−Ｋａｎ−ｔｅｔ−ＣｏｄＡ：：Ｕｐｐ融合体を含む）またはＳＹＮ３５２９（ｐＵＣ−Ｋａｎ−ｔｅｔ−ＣｏｄＡ（シトシンデアミナーゼ）を含む）で処置したマウスの平均腫瘍体積を示す折れ線グラフを表す。図３５Ｃは、この試験における個々のマウスの腫瘍体積を示す折れ線グラフを表す。図３５Ｄは、６日目の腫瘍重量を示すグラフを表す。図３５Ｅは、質量分析によって測定した６日目の５−ＦＣの腫瘍内濃度を示すグラフを表す。 同上。 同上。
図３６Ａは、ｉｎ ｖｉｖｏマウス試験の概要を示す概略図を表し、その結果を図３６Ｂおよび３６Ｃに示す。図３６Ｂは、コロニー形成単位（ＣＦＵ）によって測定した腫瘍の細菌定着を示すグラフを表す。図３６Ｃは、フローサイトメトリーを介して測定した８日目のＣＴ２６腫瘍から単離した腫瘍内リンパ球の表記の免疫細胞集団における平均蛍光強度（ＭＦＩ）の中央値によって測定したＣＣＲ７（左）またはＣＤ４０（右）の相対的発現を示すグラフを表す。 同上。
図３７は、ＴＮＦα分泌体ＳＹＮ２３０４（ＰＡＬ：：Ｃｍ ｐ１５ａ ＴｅｔＲ Ｐｔｅｔ−ｐｈｏＡ ＴＮＦａ）、親対照ＳＹＮ１５５７、および組換えＩＬ−１５対照の上清によって処置した場合の、ＨｅＬａ細胞におけるＩカッパＢアルファの分解を示す細胞に基づくアッセイの結果を示すグラフを表す。
図３８Ａは、ｉｎ ｖｉｖｏマウス試験の概要を示す概略図を表し、この試験の結果を図３８Ｂ〜３８Ｄに示す。図３８Ｂは、コロニー形成単位（ＣＦＵ）により測定した場合の腫瘍の細菌コロニー形成を示すグラフを表す。図３８Ｃは、ＥＬＩＳＡにより測定した場合のＣＴ２６腫瘍におけるＴＮＦαの相対濃度を示すグラフを表す。図３８Ｄは、ＣＴ２６腫瘍を移植し、ＳＹＮ（ＤＯＭ突然変異体）またはＳＹＮ−ＴＮＦα（ＰＡＬ：：ＣＭ ｐ１５ａ ＴｅｔＲ Ｐｔｅｔ−ＰｈｏＡ−ＴＮＦαを含む）で処置したマウスの平均腫瘍体積を示す折れ線グラフを表す。 同上。
図３９Ａおよび図３９Ｂは、ＩＦＮガンマ分泌体ＳＹＮ３５４３（ＰＡＬ：：Ｃｍ ｐ１５ａ Ｐｔｅｔ−８７Ｋ ＰｈｏＡ−ｍＩＦＮｇ）、親対照ＳＹＮ１５５７、および組換えＩＬ−１５対照の上清によって処置した場合の、マウスＲＡＷ２６４．７細胞におけるＳＴＡＴ１リン酸化を示す細胞に基づくアッセイの結果を示すグラフを表す。
図４０Ａは、ｉｎ ｖｉｖｏマウス試験の概要を示す概略図を表し、この試験の結果を図４０Ｂおよび図４０Ｃに示す。図４０Ｂは、コロニー形成単位（ＣＦＵ）により測定した場合の腫瘍の細菌コロニー形成を示すグラフを表す。図４０Ｃは、ＥＬＩＳＡにより測定した場合のＣＴ２６腫瘍におけるＩＮＦγの相対濃度を示すグラフを表す。 同上。
図４１は、誘導（＋ＡＴＣ）条件および非誘導（−ＡＴＣ）条件下、酸素の存在下（＋Ｏ２）または非存在下（−Ｏ２）でのストレプトマイシン抵抗性Ｎｉｓｓｌｅ（ＳＹＮ−ＵＣＤ１０３）、ＳＹＮ−ＵＣＤ２０５、およびＳＹＮ−ＵＣＤ２０４によって産生されたｉｎ ｖｉｔｒｏアルギニンレベルの棒グラフを表す。ＳＹＮ−ＵＣＤ１０３は、対照のＮｉｓｓｌｅ構築物である。ＳＹＮ−ＵＣＤ２０５は、低コピー数プラスミドにおいてＦＮＲ誘導性プロモーターの制御下で発現されるΔＡｒｇＲおよびａｒｇＡｆｂｒを含む。ＳＹＮ−ＵＣＤ２０５は、低コピー数プラスミドにおいてテトラサイクリン誘導性プロモーターの制御下で発現されるΔＡｒｇＲおよびａｒｇＡｆｂｒを含む。ＳＹＮ−ＵＣＤ２０４は、低コピー数プラスミドにおいてテトラサイクリン誘導性プロモーターの制御下で発現されるΔＡｒｇＲおよびａｒｇＡｆｂｒを含む。
図４２Ａおよび図４２Ｂは、嫌気的誘導後の様々な時点での培地中のアンモニアレベルの棒グラフを表す。図４２Ａは、０、３０、６０、および１２０分の時点で測定したＳＹＮ−ＵＣＤ２０５、ＳＹＮ−ＵＣＤ２０６、およびＳＹＮ−ＵＣＤ３０１のアルギニン産生レベルの棒グラフを表す。図４２Ｂは、ＳＹＮ−ＵＣＤ２０４（ΔＡｒｇＲと、低コピー数プラスミド上のＰｆｎｒＳ−ＡｒｇＡｆｂｒと、野生型ＴｈｙＡとを含む）、ＳＹＮ−ＵＣＤ３０１、ＳＹＮ−ＵＣＤ３０２およびＳＹＮ−ＵＣＤ３０３（これらの３つ全てが、組み込まれたＦＮＲ−ＡｒｇＡｆｂｒ構築物を含み、ＳＹＮ−ＵＣＤ３０１は、ΔＡｒｇＲおよびｗｔＴｈｙＡを含み、ＳＹＮ−３０２およびＳＹＮ−ＵＣＤ３０３の両方は、ΔＡｒｇＲおよびΔＴｈｙＡを含み、それぞれ、クロラムフェニコール抵抗性またはカナマイシン抵抗性を有する）のアルギニン産生レベルの棒グラフを表す。結果は、ＦＮＲ ＡｒｇＡ ｆｂｒの染色体組み込みによって、同じ構築物を発現する低コピー数プラスミド株に関して認められるように類似のレベルのアルギニン産生が得られることを示している。 同上。
図４３は、ｍａｌＥＫ座でｆｎｒ誘導性プロモーターによって駆動されるＡｒｇＡｆｂｒの染色体挿入を有し、ΔＡｒｇＲおよびΔＴｈｙＡを有し、抗生物質抵抗性を有さない、操作された細菌株（ＳＹＮ−ＵＣＤ３０３）の、ｉｎ ｖｉｔｒｏ有効性（アンモニアからのアルギニン産生）を評価したことを示す、折れ線グラフを表す。ストレプトマイシン抵抗性Ｅ．ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅ（Ｎｉｓｓｌｅ）を参照として使用する。
図４４Ａは、４０Ａ、４０Ｂ、４０Ｃ、４４Ｅおよび４４Ｆに示す試験の投与スキーマを示すチャートを表す。図４４Ｂ、４４Ｃ、４４Ｄ、４４Ｅおよび４４Ｆは、化学療法剤シクロホスファミド（骨髄非破壊性化学療法、プレコンディショニング）およびアルギニン産生株（ＳＹＮ−ＵＣＤ３０４；組み込まれたＦＮＲ−ＡｒｇＡｆｂｒ構築物；ΔＡｒｇＲ、図４４Ｅ）、またはキヌレニン消費株（ＳＹＮ２０２８、図４４Ｆ）による組合せ処置の腫瘍体積に対する効果のｉｎ ｖｉｖｏ分析の各個々のマウスについての折れ線グラフを表す。組合せ処置の効果をビヒクル単独（図４４Ｂ）、シクロホスファミド単独（図４４Ｃ）、またはＳＹＮ９４（ストレプトマイシン抵抗性野生型Ｎｉｓｓｌｅ、図４４Ｄ）による処置と比較した。データは、シクロホスファミドと組み合わせたアルギニン産生株およびキヌレニン消費株の抗腫瘍活性を示唆する。本試験では、ＢＡＬＢ／ｃマウスにＣＴ２６腫瘍を移植し、シクロホスファミド（ＣＰ）を１００ｍｇ／ｋｇでＩＰ投与し、細菌１×１０ｅ７個（１００μｌ体積中）を腫瘍内に投与した。投与スキーマを図４４Ａに示す。 同上。
図４５Ａおよび図４５Ｂは、遊走細胞の数を、ＳＹＮ細菌上清中で様々な濃度で希釈したＳＹＮ−ＣＸＣＬ１０上清の添加後にフローサイトメトリーを介して測定するヒトＴ細胞トランスウェルアッセイの結果を表す。抗ＣＸＣＲ３を、１００％ＳＹＮ−ＣＸＣＬ１０上清を含有する対照ウェルに添加し、ＣＸＣＬ１０−ＣＸＣＲ３経路に関する遊走の特異性を確認した。図４５Ａは、遊走細胞の総数を表す。図４５Ｂは、サイトカインなしの対照と比較した遊走を表す。
図４６は、ＩＬ−１５分泌体ＳＹＮ３５２５（ＰＡＬ：：Ｃｍ ｐ１５ａ Ｐｔｅｔ−ＰｐｉＡ（ＥＣＯＬＩＮ＿１８６２０）−ＩＬ−１５−Ｓｕｓｈｉ）、親対照ＳＹＮ１５５７、および組換えＩＬ−１５対照の上清によって処置した場合のＣＤ３＋ＩＬ１５ＲＡアルファ＋Ｔ細胞におけるＳＴＡＴ５リン酸化を示す細胞に基づくアッセイの結果を示す折れ線グラフを表す。
図４７は、株ＳＹＮ１５６５（ＰｆｎｒＳ−ｎｕｐＣを含む）、ＳＹＮ１５８４（ＰｆｎｒＳ−ｎｕｐＣ；ＰｆｎｒＳ−ｘｄｈＡＢＣを含む）、ＳＹＮ１６５５（ＰｆｎｒＳ−ｎｕｐＣ；ＰｆｎｒＳ−ａｄｄ−ｘａｐＡ−ｄｅｏＤを含む）、およびＳＹＮ１６５６（ＰｆｎｒＳ−ｎｕｐＣ；ＰｆｎｒＳ−ｘｄｈＡＢＣ；ＰｆｎｒＳ−ａｄｄ−ｘａｐＡ−ｄｅｏＤを含む）が、グルコースが存在する場合であっても、ｉｎ ｖｉｔｒｏでアデノシンを分解できることを示す棒グラフを表す。
図４８は、ｉｎ ｖｉｖｏの腫瘍環境で予想されるアデノシンレベルに対応する１μＭアデノシンの存在下で、基質制限条件でのアデノシン分解を示す棒グラフを表す。結果は、低濃度の活性化ＳＹＮ１６５６（１ｅ６個細胞）（および同様に表示の他の株）が、定量限界より下でアデノシンを分解できることを示している。
図４９は、操作されたＥ．ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅ（ＳＹＮ１６５６）の単独または抗ＰＤ１との組合せによるアデノシン消費が腫瘍体積に及ぼす効果のｉｎ ｖｉｖｏ分析の折れ線グラフを表す。データは、単剤としての、およびＰＤ−１と組み合わせたアデノシン消費株の抗腫瘍活性を示唆する。
図５０Ａおよび図５０Ｂは、アデノシン消費株ＳＹＮ１６５６（ＳＹＮ−Ａｄｅ）と抗ＰＤ−１／抗ＣＴＬＡ４カクテルの組合せが多数の腫瘍拒絶を惹起することを示すグラフを表す。抗ＰＤ−１／抗ＣＴＬＡ４チェックポイント阻害と組み合わせたＳＹＮ１６５６の抗腫瘍活性を調査するために、Ｃ５７ＢＬ６マウスにＭＣ３８腫瘍を定着させた。腫瘍が６０〜８０ｍｍ３のサイズになったら、動物を、隔週で食塩水対照によって腫瘍内処置するか、抗ＰＤ−１および抗ＣＴＬＡ４抗体（それぞれ、１０および５ｍｇ／ｋｇ）のカクテルで腫瘍内処置するか、または未改変細菌（ＳＹＮ）もしくはＳＹＮ１６５６（ＳＹＮ−Ａｄｅ）と抗ＰＤ−１／抗ＣＴＬＡ４の組合せで腫瘍内処置し、腫瘍体積を週２回評価した。図５０Ａは、腫瘍体積中央値を表し、図５０Ｂは、＜２０００ｍｍ３を生存サロゲートとして使用して試験時に残存する動物のパーセンテージを経時的に表し、図５０Ｃ、図５０Ｄ、図５０Ｅおよび図５０Ｆは、各処置群からの個々の動物についての腫瘍体積を示すグラフを表す。 同上。
図５１は、７５μＭキヌレニンを補充したＭ９培地における、当初の株およびＡＬＥから進化させたキヌレニナーゼ発現株のキヌレニン消費速度を示す棒グラフを表す。株を以下のように標識する：ＳＹＮ１４０４：Ｔｒｐ：Ｅに欠失を含み、テトラサイクリン誘導性プロモーターの制御下でＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓからのキヌレニナーゼを発現する、中コピー数プラスミドを含むＥ．ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅ（ＮｉｓｓｌｅデルタＴｒｐＥ：：ＣｍＲ＋Ｐｔｅｔ−Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ＫＹＮＵ ｐ１５ａ ＫａｎＲ）；ＳＹＮ２０２７：Ｔｒｐ：Ｅに欠失を含み、ＨＡ３／４部位でゲノムに組み込まれた構成的プロモーター（内因性のｌｐｐプロモーター）の制御下でＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓからのキヌレニナーゼを発現するＥ．ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅ（ＨＡ３／４：：Ｐｌｐｐ−ｐＫＹＮａｓｅ ＫａｎＲ ＴｒｐＥ：：ＣｍＲ）；ＳＹＮ２０２８：Ｔｒｐ：Ｅに欠失を含み、ＨＡ３／４部位でゲノムに組み込まれた構成的プロモーター（合成Ｊ２３１１９プロモーター）の制御下でＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓからのキヌレニナーゼを発現するＥ．ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅ（ＨＡ３／４：：ＰＳｙｎＪ２３１１９−ｐＫＹＮａｓｅ ＫａｎＲ ＴｒｐＥ：：ＣｍＲ）；ＳＹＮ２０２７−Ｒ１：親ＳＹＮ２０２７株に由来し、ＡＬＥに起因する第１の進化株（Ｐｌｐｐ−ｐＫＹＮａｓｅ ＫａｎＲ ＴｒｐＥ：：ＣｍＲ進化株レプリケート１）。ＳＹＮ２０２７−Ｒ２：親ＳＹＮ２０２７株に由来し、ＡＬＥに起因する第２の進化株（Ｐｌｐｐ−ｐＫＹＮａｓｅ ＫａｎＲ ＴｒｐＥ：：ＣｍＲ進化株レプリケート２）。ＳＹＮ２０２８−Ｒ１：親ＳＹＮ２０２８株に由来し、ＡＬＥに起因する第１の進化株（ＨＡ３／４：：ＰＳｙｎＪ２３１１９−ｐＫＹＮａｓｅ ＫａｎＲ ＴｒｐＥ：：ＣｍＲ進化株レプリケート１）。ＳＹＮ２０２８−Ｒ２：親ＳＹＮ２０２８株に由来し、ＡＬＥに起因する第２の進化株（ＨＡ３／４：：ＰＳｙｎＪ２３１１９−ｐＫＹＮａｓｅ ＫａｎＲ ＴｒｐＥ：：ＣｍＲ進化株レプリケート１）。
図５２Ａおよび図５２Ｂは、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓからのキヌレニナーゼを産生する株による腫瘍内キヌレニン枯渇を示すドットプロットを表す。図５２Ａは、中コピー数プラスミドにおいて構成的に発現されたＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｅ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓキヌレニナーゼを有するキヌレニン消費株ＳＹＮ１７０４に関して観察された腫瘍内濃度を示すドットプロットを表す。図５２Ｂは、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｅ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓキヌレニナーゼの構成的に発現された染色体組み込みコピーを有するキヌレニン消費株ＳＹＮ２０２８に関して観察された腫瘍内濃度を示すドットプロットを表す。ＩＤＯインヒビターＩＮＣＢ０２４３６０を陽性対照として使用する。
図５３Ａおよび図５３Ｂは、ＣＴ２６腫瘍を移植して食塩水またはＳＹＮ１７０４のどちらかを投与したマウスにおいて測定された腫瘍内キヌレニン濃度（図５３Ａ）および血漿キヌレニン濃度（図５３Ｂ）を示すドットプロットを表す。キヌレニンの腫瘍内（Ｐ＜０．００１）および血漿中（Ｐ＜０．００５）濃度の有意な低減が、食塩水対照と比較してキヌレニン消費株ＳＹＮ１７０４に関して観察された。トリプトファンレベルは一定のままであった（データは示していない）。 同上。
図５４Ａ、図５４Ｂおよび図５４Ｃは、ＣＴ２６腫瘍内へのＫＹＮ消費株の単回投与が腫瘍中の腫瘍ＫＹＮレベル（図５４Ａ）および血漿中の腫瘍ＫＹＮレベル（図５４Ｂ）および腫瘍重量（図５４Ｃ）に及ぼす効果を示すグラフを表す。マウスに、ＳＹＮ９４またはＳＹＮ１７０４を１ｅ８ ＣＦＵ／ｍＬで腫瘍内投与を介して投与した。動物を犠牲にして採血し、表記の時間に組織を収集した。 同上。
図５５は、Ｅ．ｃｏｌｉ株ＳＹＮ３３６６およびＳＹＮ３３６７によって分泌されたマウスＣＤ４０Ｌ１（４７−２６０）およびＣＤ４０Ｌ２（１１２−２６０）がｍＣＤ４０抗体によって検出されることを示す細菌上清のウェスタンブロット解析を表す。
図５６は、ビヒクルまたは抗ＣＴＬＡ−４抗体単独と比較した、単独または抗ＣＴＬＡ４抗体と組み合わせた、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓキヌレニナーゼの構成的に発現された染色体に組み込まれたコピーを有するキヌレニン消費株ＳＹＮ２０２８によるキヌレニン消費が腫瘍体積に及ぼす効果のｉｎ ｖｉｖｏ分析の折れ線グラフを表す。データは、単剤としての、および抗ＣＴＬＡ４抗体と組み合わせたキヌレニン消費株の抗腫瘍活性を示唆し、ＳＹＮ２０２８が、ＣＴ２６においてαＣＴＬ−４媒介抗腫瘍活性を改善することを示唆している。本試験では、ＢＡＬＢ／ｃマウスにＣＴ２６腫瘍を移植し；抗ＣＴＬＡ４抗体を１００μｇ／マウスでＩＰ投与した；細菌１×１０ｅ７個を腫瘍内に投与した；細菌および抗体を全て隔週で投与した。
図５７Ａ、図５７Ｂ、図５７Ｃおよび図５７Ｄは、図５６に示す試験の各個々のマウスを示す折れ線グラフを表す。図５７Ｅは、対応するカプラン・マイヤープロットを表す。 同上。 同上。
図５８Ａ、図５８Ｂ、図５８Ｃ、図５８Ｄ、図５８Ｅは、抗ＣＴＬ−４および抗ＰＤ１抗体と組み合わせたＫｙｎ消費体ＳＹＮ２０２８がＭＣ３８腫瘍において抗腫瘍活性を改善したことを示す折れ線グラフを表す。図５８Ｂ、図５８Ｃ、図５８Ｄおよび図５８Ｅは、図５８Ａに示す試験の各個々のマウスを示す折れ線グラフを表す。抗ＣＴＬ−４および抗ＰＤ１抗体と組み合わせたＫｙｎ消費体ＳＹＮ２０２８は、ＭＣ３８腫瘍において、ビヒクル（図５８Ｂ）、抗ＣＴＬＡ４および抗ＰＤ１抗体単独（図５８Ｃ）、またはＳＹＮ９４（ストレプトマイシン抵抗性Ｅ．ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅ）＋抗ＣＴＬＡ４および抗ＰＤ１抗体（図５８Ｄ）と比較して改善された抗腫瘍活性を有する（図５８Ｅ）；すなわち、キヌレニン消費体には、抗ＣＴＬＡ−４／抗ＰＤ１抗体媒介抗腫瘍活性を改善する能力がある。図５８Ｆは、対応するカプラン・マイヤープロットを表す。 同上。 同上。
図５９Ａおよび図５９Ｂは、Ｂ１６Ｆ１０腫瘍モデルにおけるキヌレニン消費株ＳＹＮ２０２８（ＳＹＮ−Ｋｙｎ）の腫瘍コロニー形成およびｉｎ ｖｉｖｏ活性の分析を表す。約４０〜８０ｍｍ３の腫瘍サイズへの到達時に、マウスに１ｅ６ ＣＦＵの未改変（ＳＹＮ−ＷＴ）またはＳＹＮ２０２８（ＳＹＮ−Ｋｙｎ）を腫瘍内注射によって施した。注射の２４および７２時間後に、腫瘍をホモジナイズし、ＬＢ抗生物質選択プレートへのプレーティングによりコロニー形成単位（ＣＦＵ）を判定した（図５９Ａ）か、またはＬＣＭＳによりキヌレニンレベルを判定した（図５９Ｂ）。
図６０Ａおよび図６０Ｂは、ＳＹＮ１５６５（ＳＹＮ−Ａｄｅ）およびＳＹＮ２０２８（ＳＹＮ−Ｋｙｎ）が腫瘍内投与後に確固たる腫瘍コロニー形成を実証することを示すグラフを表す。アデノシン消費株ＳＹＮ１５６５またはキヌレニン消費株ＳＹＮ２０２８の腫瘍コロニー形成能力を評価するために、Ｂ１６．Ｆ１０腫瘍をＣ５７ＢＬ６マウスに定着させた。腫瘍が１００〜１５０ｍｍ３のサイズに達したら、ＳＹＮ１５６５、ＳＹＮ２０２８（１ｅ６個細胞／用量）または食塩水対照を単回注射として腫瘍内投与した。腫瘍組織１グラムあたりのコロニー形成単位（ＣＦＵ）を注射の７日後に計算した。結果を図６０Ａに示す。比較のために、１ｅ６個細胞／用量の単回注射の７日後の未改変Ｎｉｓｓｌｅ骨格（ＳＹＮ）について腫瘍組織１グラムあたりのＣＦＵを含めた（図６０Ｂ）。
図６１は、野生型Ｅ．ｃｏｌｉ（レーン１）および抗ＰＤ１ ｓｃＦｖを発現する株（レーン２）の総サイトゾル抽出物のウェスタンブロット解析を表す。
図６２は、ｔｅｔ誘導性抗ＰＤ１−ｓｃＦｖを発現する株からの抽出物と共にインキュベートしたＰＤ１発現ＥＬ４細胞のフローサイトメトリー分析のダイアグラムを表し、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて発現された抗ＰＤ１−ｓｃＦｖがマウスＥＬ４細胞上のＰＤ１に結合することを示す。
図６３は、抗ＰＤ１ ｓｃＦｖを分泌する様々な株の総サイトゾル抽出物のウェスタンブロット解析を表す。単一のバンドがレーン１〜６において３４ｋＤａ付近で検出され、それぞれＳＹＮ２７６７、ＳＹＮ２７６９、ＳＹＮ２７７１、ＳＹＮ２７７３、ＳＹＮ２７７５、およびＳＹＮ２７７７からの抽出物に対応した。
図６４は、ｔｅｔ誘導性抗ＰＤ１−ｓｃＦｖを分泌するＥ ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅ株からの抽出物と共にインキュベートしたＰＤ１発現ＥＬ４細胞のフローサイトメトリー分析のダイアグラムを表し、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅから分泌された抗ＰＤ１−ｓｃＦｖがマウスＥＬ４細胞上のＰＤ１に結合することを示す。
図６５は、ｔｅｔ誘導性抗ＰＤ１−ｓｃＦｖを分泌するＥ．ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅ株からの様々な量の抽出物（０、２、５、および１５μｌ）と共にインキュベートしたＰＤ１発現ＥＬ４細胞のフローサイトメトリー分析のダイアグラムを表し、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅから分泌された抗ＰＤ１−ｓｃＦｖがマウスＥＬ４細胞上のＰＤ１に用量依存的に結合することを示す。
図６６Ａおよび図６６Ｂは、ＥＬ４細胞のフローサイトメトリー分析のダイアグラムを表す。図６６Ｂは、ｔｅｔ誘導性抗ＰＤ１−ｓｃＦｖを分泌するＥ ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅ株からの抽出物を、様々な量の可溶性ＰＤＬ１（０、５、１０、および３０μｇ）と共にインキュベートする競合アッセイを表し、ＰＤＬ１が、マウスＥＬ４細胞上のＰＤ１に対してＥ．ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅから分泌された抗ＰＤ１−ｓｃＦｖの結合と用量依存的に競合することができることを示す。図６６Ｂは、ＩｇＧ対照を示す。
図６７は、ＳＹＮ２９９６（レーン１）、ＳＹＮ３１５９（レーン２）、ＳＹＮ３１６０（レーン３）、ＳＹＮ３０２１（レーン４）、ＳＹＮ３０２０（レーン５）、およびＳＹＮ３１６１（レーン６）からの細菌上清のウェスタンブロット解析を表し、ＷＴ ｍＳＩＲＰα、ｍＣＶ１ＳＩＲＰα、ｍＦＤ６ｘ２ＳＩＲＰα、ｍＣＶ１ＳＩＲＰα−ＩｇＧ４、ｍＦＤ６ＳＩＲＰα−ＩｇＧ４、および抗ｍＣＤ４７ ｓｃＦｖがそれぞれ、これらの株から分泌されることを示す。
図６８は、ＳＹＮ１５５７（１；ΔＰＡＬ親株）、ＳＹＮ２９９６（２；ｔｅｔ誘導性ｍＳＩＲＰαを発現する）、ＳＹＮ３０２１（３；ｔｅｔ誘導性抗ｍＣＤ４７ｓｃＦｖを発現する）、ＳＹＮ３１６１（４；ｔｅｔ誘導性ｍＣＶ１ＳＩＲＰα−ｈＩｇＧ融合体を発現する）からの上清と共にインキュベートしたＣＤ４７発現ＣＴ２６細胞のフローサイトメトリー分析のダイアグラムを表し、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて発現された分泌産物がマウスＣＴ２６細胞上のＣＤ４７に結合することができることを示す。
図６９は、ＳＹＮ１５５７（１；ΔＰＡＬ親株）、ＳＹＮ３０２０（２；ｔｅｔ誘導性ｍＦＤ６ＳＩＲＰα−ｈＩｇＧ融合体を発現する）、ＳＹＮ３１６０（３；ｔｅｔ誘導性ＦＤ１ｘ２ＳＩＲＰαを発現する）、ＳＹＮ３１５９（４；ｔｅｔ誘導性ｍＣＶ１ＳＩＲＰαを発現する）、ＳＹＮ３０２１（５；ｔｅｔ誘導性ｍＣＶ１ＳＩＲＰα−ｈＩｇＧ融合体を発現する）からの上清と共にインキュベートしたＣＤ４７発現ＣＴ２６細胞のフローサイトメトリー分析のダイアグラムを表し、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて発現された分泌産物がマウスＣＴ２６細胞上のＣＤ４７に結合することができることを示す。
図７０は、ＣＴ２６細胞のフローサイトメトリー分析のダイアグラムを表す。ｔｅｔ誘導性マウスＳＩＲＰαを分泌するＥ．ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅ株からの抽出物を組換えＳＩＲＰαと共にインキュベートする競合アッセイを実施し、組換えＳＩＲＰαがＣＴ２６細胞上のＣＤ４７に対してＥ．ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅから分泌されたＳＩＲＰαの結合と競合することができることを示す。
図７１は、ＣＴ２６細胞のフローサイトメトリー分析のダイアグラムを表す。ｔｅｔ誘導性マウスＳＩＲＰαを分泌するＥ．ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅ株からの抽出物を抗ＣＤ４７抗体と共にインキュベートする競合アッセイを実施し、抗体がＣＴ２６細胞上のＣＤ４７に対してＥ．ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅから分泌されたＳＩＲＰαの結合と競合することができることを示す。
図７２は、ＳＹＮ２９９７（レーン１）およびＳＹＮ２９９８（レーン２）からの細菌上清のウェスタンブロット解析を表し、マウスおよびヒトヒアルロニダーゼがそれぞれ、これらの株から分泌されることを示す。
図７３は、ＥＬＩＳＡアッセイにおけるヒアルロナン分解の測定としてのＳＹＮ１５５７（親株ΔＰＡＬ）、ＳＹＮ２９９７、およびＳＹＮ２９９８のヒアルロニダーゼ活性を示す棒グラフを表す。
図７４Ａは、テトラサイクリン誘導性ヒルヒアルロニダーゼを発現するＳＹＮ３３６９（レーン１）およびＳＹＮ１５５７（親株ΔＰＡＬ）（レーン２）からの細菌上清のウェスタンブロット解析を表し、ヒルヒアルロニダーゼがＳＹＮ３３６９から分泌されることを示す。Ｍ＝マーカー。図７４Ｂおよび図７４Ｃは、ＥＬＩＳＡアッセイにおけるヒアルロナン分解の測定としてのヒアルロニダーゼ活性を示す棒グラフを表す。図７４Ｂは、組換えヒアルロニダーゼによる陽性対照を示す。図７４Ｃは、ＳＹＮ１５５７（親株ΔＰＡＬ）、およびテトラサイクリン誘導性ヒルヒアルロニダーゼを発現するＳＹＮ３３６９のヒアルロニダーゼ活性を示す。 同上。
図７５は、Ｅ．ｃｏｌｉ １９１７ Ｎｉｓｓｌｅ染色体内の例示的な組み込み部位のマップを表す。これらの部位は、回路の構成要素が、本質的な遺伝子発現に干渉することなく、染色体に挿入されうる領域を示している。逆斜線（／）は、挿入が発散性または収束性に発現される遺伝子の間で起こることを示すために使用される。生合成遺伝子、例えばｔｈｙＡ内の挿入は、栄養要求株を作製するために有用でありうる。一部の実施形態では、個々の回路の構成要素を表記の部位の１つより多くに挿入する。一部の実施形態では、複数の異なる回路を表記の部位の１つより多くに挿入する。したがって、Ｅ．ｃｏｌｉ １９１７ Ｎｉｓｓｌｅ染色体の複数の部位に回路を挿入することによって、遺伝子操作された細菌は、複数の作用機序（ＭｏＡ）を可能にする回路を含みうる。
図７６は、腫瘍において１００μＬのＳＹＮ９４（ストレプトマイシン抵抗性Ｎｉｓｓｌｅ）またはＳＹＮ１５５７（Ｎｉｓｓｌｅ ΔＰＡＬ：：ＣｍＲ）（１ｅ７個細胞／用量）の腫瘍内（ＩＴ）投与後の様々な時点で検出された細菌のＣＦＵを示すグラフを表す。これらの時点で、血液中で検出された細菌はなかった。
図７７は、腫瘍（ＣＴ２６）において１ｅ７および１ｅ８個細胞／用量での１００μＬのＳＹＮ９４（ストレプトマイシン抵抗性Ｎｉｓｓｌｅ）の腫瘍内（ＩＴ）投与後の様々な時点で検出された細菌のＣＦＵを示すグラフを表す。腫瘍組織における細菌数は、両方の用量で同様であった。
図７８Ａおよび図７８Ｂは、腫瘍内１０７ ＣＦＵ／用量のＳＹＮ９４（ストレプトマイシン抵抗性Ｎｉｓｓｌｅ）投与または食塩水投与の４８時間後に、および未処置動物において、様々な組織で検出された細菌濃度（図７８Ａ）ならびに血清、腫瘍および肝臓中で測定されたＴＮＦａレベル（図７８Ｂ）を示すグラフを表す。細菌は、主として腫瘍内に存在し、試験した他の組織には非存在であった。測定されたＴＮＦａレベルは、血清、腫瘍および肝臓すべてにおいて、ＳＹＮ９４処置群と食塩水処置群と未処置群の間で同様であった。
図７９は、ＤａｃＡ（プラスミドに基づくＦＮＲ−ＤａｃＡ、ΔＤＡＰ）の発現を駆動するために低酸素プロモーター（ＦＮＲプロモーター）を使用する嫌気的誘導によって高レベルのｃ−ジＡＭＰ産生がｉｎ ｖｉｖｏで達成されることを示すグラフを表す。２ｅ５個のＢ１６細胞を移植し、移植後１４日目に、腫瘍が約２５０〜４００ｍｍ３に達したら、マウスを３つの実験群に分けた。群１にはＰＢＳを１回注射し（ｎ＝１）、群２（ｎ＝３）にはＳＹＮ７６６（ＤＡＰ−ＷＴ；１ｅ９個細胞）を注射した。群３（ｎ＝３）にはＳＹＮ４４４９（プラスミドに基づくＦＮＲ−ＤａｃＡ、ΔＤＡＰ；１ｅ９個細胞）を注射し、投与の２４時間後に、腫瘍を抽出し、ｃ−ジＡＭＰ産生をＬＣ−ＭＳ／ＭＳにより測定した。
図８０は、組み込まれたＤａｃＡの発現を駆動するために低酸素プロモーター（ＦＮＲプロモーター）を使用する嫌気的誘導によって高レベルのｃ−ジＡＭＰ産生がｉｎ ｖｉｖｏで達成されることを示すグラフを表す。２ｅ５個のＢ１６細胞を移植し、移植後１４日目に、腫瘍が約２５０〜４００ｍｍ３に達したら、マウスを２つの実験群に分けた。群１にはＰＢＳを１回注射し（ｎ＝３）、群２（ｎ＝３）にはＳＹＮ４９１０（ΔＴｈｙＡおよびΔＤａｐＡ栄養要求体ならびにファージ欠失をさらに含む、組み込まれているＤＡＰ−ＦＮＲ−ＳＴＩＮＧ；１ｅ９個細胞）を注射し、投与の２４時間後に、腫瘍を抽出し、ｃ−ジＡＭＰ産生をＬＣ−ＭＳ／ＭＳにより測定した。
図８１Ａ、図８１Ｂ、図８１Ｃおよび図８１Ｄは、Ｂ１６モデルにおけるＳＹＮ４９１０（ΔＴｈｙＡおよびΔＤａｐＡ栄養要求体ならびにファージ欠失をさらに含む、組み込まれているＤＡＰ−ＦＮＲ−ＳＴＩＮＧ）の有効性を示すグラフを表す。簡単に説明すると、Ｂ１６細胞を上記のように移植した。腫瘍が約１００ｍｍ＾３に達するまで、腫瘍成長をモニタリングした。０日目に、マウスを次のように腫瘍内投与の群（１群あたりＮ＝１０）に無作為化した：ＰＢＳ（群１、ビヒクル対照）、ＳＹＮ４７４０（ΔＴｈｙＡ、ΔＤａｐＡ、ΔΦ；群２、１ｅ９ ＣＦＵ）、ＳＹＮ４９１０（群３、１ｅ９ ＣＦＵ）。腫瘍サイズを測定し、０、２および５日目に細菌またはＰＢＳをマウスにＩ．Ｔ．注射した。腫瘍体積を週に２回記録した。結果は、ＳＹＮ４９１０の投与がＢ１６腫瘍リンパ腫モデルにおいて腫瘍制御および拒絶を駆動することを示す。 同上。
図８２は、ヒトサイクリックＧＡＭＰシンターゼ（ｈｃＧＡＳ）の発現による、ヒトサイクリックＧＡＭＰ（２’３’−ｃＧＡＭＰ）アナログの産生を示すグラフを表す。ｈｃＧＡＳの遺伝子回路は、ｐ１５ａ起点プラスミドと、Ｅ．ｃｏｌｉにおける発現のためにコドン最適化されたｈｃＧＡＳタンパク質のコード配列の発現を駆動するテトラサイクリン誘導性プロモーター（Ｐｔｅｔ）とを含む。示されている通り、次のような株を生成した：（１）プラスミド単独を含む株；（２）ｐ１５−ｐｔｅｔ−ｈｃＧＡＳとｄａｐＡ栄養要求性修飾とを含む株；（３）ｐ１５−ｐｔｅｔ−ｈｃＧＡＳとキヌレニン消費回路（構成的プロモーターの制御下にあり染色体に組み込まれているキヌレニナーゼ）とを含む株；（４）ｐ１５−ｐｔｅｔ−ｈｃＧＡＳと、構成的プロモーターの制御下にあり染色体に組み込まれているキヌレニナーゼと、低酸素誘導性ＦＮＲプロモーターの制御下にあるフィードバック耐性ＡｒｇＡを含むアルギニン産生回路と、内在性またはネイティブａｒｇＲ遺伝子の欠失とを含む株。２’３’−ｃＧＡＭＰアナログを産生するために、一晩培養物および対照株を、適切な抗生物質を含有するＬＢ中で成長させた。これらを、０．５％グルコースと適切な抗生物質とを含有するＭ９最少培地に逆希釈した。これらを２時間成長させた後、５００ｎｇ／ｍＬのアンヒドロテトラサイクリン（ＡＴＣ）で誘導入し、次いでその後、さらに２時間放置してインキュベートした。１ｍＬの培養物を除去し、８０００ｘｇで５分間、遠心分離し、上清を廃棄した。次いで、これらのペレットをＬＣ／ＭＳによる２’３’−ｃＧＡＭＰ ＳＴＩＮＧアゴニストの細胞内濃度の定量に使用した。
ある特定の腫瘍は、従来の治療法を使用して管理することが特に困難である。ハイポキシアは、がん性細胞が非常に低い酸素濃度で存在する固形腫瘍の特有の特徴である。ハイポキシアの領域は、多くの場合、壊死組織を包囲し、固形のがんがそれらの脈管構造より大きくなると発生する。血管供給が、腫瘍の代謝要求を満たすことができないと、腫瘍の微量環境は酸欠になる。腫瘍内の複数のエリアは、正常組織内の３〜１５％酸素と比較して＜１％酸素を含有し（ＶａｕｐｅｌおよびＨｏｃｋｅｌ、１９９５年）、無血管領域が腫瘍塊の２５〜７５％を占めることもある（Ｄａｎｇら、２００１年）。腫瘍のおおよそ９５％は、ある程度は低酸素である（Ｈｕａｎｇら、２００４年）。全身送達される抗がん剤は、腫瘍脈管構造
に頼って送達されるが、不良な脈管形成が、急速に分裂する細胞への酸素供給を妨げ、その結果、脈管形成不良の低酸素腫瘍領域における細胞増殖を標的とする治療に対するそれらの細胞の感受性が低くなる。放射線療法は、酸素が放射線誘導細胞死の必要エフェクターであるため、低酸素細胞を死滅させることができない。低酸素細胞には、放射線療法に対して、正常な酸素レベルを有する細胞の３倍までの抵抗性がある（Ｂｅｔｔｅｇｏｗｄａら、２００３年；Ｔｉｅｃｈｅｒ、１９９５年；Ｗａｃｈｓｂｅｒｇｅｒら、２００３年）。これらのすべての理由のため、切除不能な局所進行腫瘍は、従来の治療法を使用して管理することが特に困難である。
低酸素環境を標的とすることに関連する課題に加えて、がんを特異的に標的とし、破壊する治療法は、遺伝的変更と、ハイポキシアおよび壊死のエリアを有する不均質な塊をもたらす病態生理学的変化とを含む、正常組織と悪性組織との差を認識しなければならない。
本開示は、遺伝子操作された微生物、例えば、遺伝子操作された細菌、その医薬組成物、およびがんをモジュレートまたは処置するための方法に関する。ある特定の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、がん性細胞を標的とすることができる。ある特定の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、特に、低酸素腫瘍環境などの低酸素条件で、がん性細胞を標的とすることができる。ある特定の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、腫瘍細胞に局所送達される。ある特定の態様では、本明細書で開示される組成物および方法を使用して、１つもしくは複数の免疫モジュレーターをがん性細胞に送達すること、またはがん性細胞において１つもしくは複数の免疫モジュレーターを産生することができる。
本開示は、がんを処置するために免疫モジュレーターを局所的かつ腫瘍特異的に送達するための、組成物および治療方法に関する。ある特定の態様では、本開示は、がん性細胞を標的とすることができ、１つまたは複数のエフェクター分子、例えば、免疫モジュレーター、例えば、本明細書で提供されるエフェクター分子のいずれかを産生することができる、遺伝子操作された微生物に関する。ある特定の態様では、本開示は、がん性細胞を標的とすることができ、１つまたは複数のエフェクター分子、例えば、免疫モジュレーターを産生することができる、遺伝子操作された細菌に関する。ある特定の態様では、本開示は、がん性細胞、特に、腫瘍の低酸素領域におけるがん性細胞を標的とすることができ、酸素レベル誘導性プロモーターの制御下で１つまたは複数のエフェクター分子、例えば、免疫モジュレーターを産生することができる、遺伝子操作された細菌に関する。既存の従来の治療法とは対照的に、腫瘍の低酸素エリアは、嫌気性細菌の成長のための完璧なニッチを提供し、その使用は、周囲の脈管形成良好な酸素正常状態の組織を温存して、進行した局所腫瘍を正確に根絶する機会をもたらす。
具体的には、一部の実施形態では、遺伝子操作された微生物は、１つもしくは複数の免疫イニシエーターを産生することができる。一部の実施形態では、遺伝子操作された微生物は、１つもしくは複数の免疫イニシエーターと組み合わせて、１つもしくは複数の免疫サステナーを産生することができる。
一部の態様では、本開示は、１つまたは複数のエフェクター分子、例えば、免疫モジュレーター（例えば、免疫イニシエーターおよび／または免疫サステナー）を腫瘍細胞または腫瘍微小環境に送達することができる、遺伝子操作された微生物を提供する。一部の態様では、本開示は、全身的に、例えば本開示に記載の送達手段のいずれかによって、送達され、１つまたは複数のエフェクター分子、例えば、本明細書に記載の免疫イニシエーターおよび／または免疫サステナーを産生することができる、遺伝子操作された微生物に関する。一部の態様では、本開示は、局所的に、例えば局所腫瘍内投与によって、送達され、１つまたは複数のエフェクター分子、例えば、免疫イニシエーターおよび／または免疫サステナーを産生することができる、遺伝子操作された微生物に関する。一部の態様では、本明細書で開示される組成物および方法を使用して、１つまたは複数のエフェクター分子、例えば、免疫イニシエーターおよび／または免疫サステナーを腫瘍細胞に選択的に送達することによって、全身性細胞傷害性または全身性免疫不全、例えば、自己免疫事象または他の免疫関連有害事象の発生を低減させることができる。
本開示をより容易に理解することができるように、ある特定の用語が最初に定義される。これらの定義は、本開示の残部に照らし合わせて、また当業者により理解されるように、読まれたい。別段の定義がない限り、本明細書で使用されるすべての専門および科学用語は、当業者によって一般に理解されているのと同じ意味を有する。さらなる定義は、詳細な説明の至る所に示される。
がんに対する免疫の生成は、「がん−免疫サイクル」（ＣｈｅｎおよびＭｅｌｌｍａｎ、Ｏｎｃｏｌｏｇｙ Ｍｅｅｔｓ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ： Ｔｈｅ Ｃａｎｃｅｒ−Ｉｍｍｕｎｉｔｙ Ｃｙｃｌｅ； Ｉｍｍｕｎｉｔｙ、（２０１３年）、３９巻：１〜１０頁）と称されている潜在的に自己伝播性の周期的プロセスであり、これにより、Ｔ細胞応答の広範化および増幅がもたらされ得る。サイクルは、サイクル内の様々なステップにおいて免疫調節性フィードバック機序を引き起し、発達を停止させるかまたは免疫を制限し得る、阻害因子によって妨害される。
サイクルは、本質的に、抗がん免疫応答の開始が成功するために起こる必要のある一連のステップを含む。サイクルには、免疫応答が開始されるために起こる必要のあるステップと、免疫応答が維持される（すなわち、進行および拡大増殖することが可能となり、衰えない）ために、続いて起こる必要のある第２の一連の事象とが含まれる。これらのステップは、「がん−免疫サイクル」（ＣｈｅｎおよびＭｅｌｌｍａｎ、２０１３年）と称されており、本質的には、以下のものである。
１．腫瘍細胞内容物の放出（腫瘍溶解）および／または獲得：腫瘍細胞が破壊され、その内容物が流出し、結果としてネオ抗原の放出が起こり、それが、プロセシングのために抗原提示細胞（樹状細胞およびマクロファージによって取り込まれる。あるいは、抗原提示細胞が、能動的に、腫瘍細胞に直接食作用を行ってもよい。
２．抗原提示細胞（ＡＰＣ）（樹状細胞およびマクロファージ）の活性化：上記の第１のステップに加えて、次のステップには、抗原提示細胞の活性化およびそれに続く抗がんＴ細胞応答をもたらすために、瀕死の腫瘍細胞からのＤＡＭＰまたはＰＡＭＰの放出の結果として、炎症性サイトカインの放出または炎症性サイトカインの生成が含まれなければならない。抗原提示細胞の活性化は、腫瘍由来の抗原に対する末梢寛容を回避するために、極めて重要である。適正に活性化されると、抗原提示細胞は、その表面で以前に内部移行された抗原を、ＭＨＣＩおよびＭＨＣＩＩ分子の状況下で、適正な共刺激シグナル（ＣＤ８０／８６、サイトカインなど）とともに提示して、Ｔ細胞をプライミングおよび活性化する。
３．Ｔ細胞のプライミングおよび活性化：ＤＣおよびマクロファージによる抗原提示は、免疫系によって「外来」として認識される、がん特異的抗原に対するエフェクターＴ細胞応答のプライミングおよび活性化をもたらす。このステップは、エフェクターＴ細胞の数量および質、ならびに調節性Ｔ細胞の寄与を決定することにより、抗がん免疫応答の強度および範囲に極めて重要である。加えて、Ｔ細胞の適正なプライミングは、より優れたメモリーＴ細胞の形成および永続的な免疫をもたらし得る。
４．移動および浸潤：次に、活性化エフェクターＴ細胞は、腫瘍に移動し、腫瘍に浸潤しなければならない。
５．Ｔ細胞およびＴ細胞支持体によるがん細胞の認識、ならびにエフェクターＴ細胞応答の増強および拡大増殖：腫瘍部位に到達すると、Ｔ細胞は、それらのＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を介してがん細胞を認識し、それに結合することができ、ＴＣＲは、がん細胞上にＭＨＣ分子の状況で提示されているそれらの同種抗原に特異的に結合し、続いて、標的がん細胞を死滅させる。がん細胞の死滅により、腫瘍細胞の細胞溶解を通じて腫瘍関連抗原が放出され、サイクルが再度開始され、それによって、後続の回のサイクルにおける応答の量が増大する。ＭＨＣ−ＩまたはＭＨＣ−ＩＩのいずれかに制限されるＴ細胞による抗原認識は、さらなるエフェクター機能、例えば、ケモカインおよびエフェクターサイトカインの放出をもたらし、強固な抗腫瘍応答をさらに強化し得る。
６．免疫抑制の克服：最後に、がんに対する免疫応答におけるある特定の欠損を克服することおよび／またはがんの防御戦略を克服すること、すなわち、がんが免疫応答と戦う際に用いる弱点を克服することは、サイクルにおける別の極めて重要なステップとして解釈することができる。一部の事例では、Ｔ細胞のプライミングおよび活性化が生じたとしても、他の免疫抑制細胞サブセット、すなわち、調節性Ｔ細胞または骨髄系（ｍｙｌｏｉｄ）由来サプレッサー細胞が、腫瘍微小環境に対して能動的に動員および活性化される。他の事例では、Ｔ細胞は、適正に腫瘍にホーミングするための正しいシグナルを受容しない可能性があるか、または腫瘍に浸潤することから能動的に除外され得る。最後に、腫瘍微小環境には、サイクルの結果として産生されるエフェクター細胞を抑制または抑止することができる、ある特定の機序が存在している。そのような耐性機序には、通常、免疫寛容を媒介し、がん組織損傷を弱める、免疫チェックポイントと称されることも多い免疫阻害経路が組み入れられている（例えば、Ｐａｒｄｏｌｌ、（２０１２年）、Ｔｈｅ ｂｌｏｃｋａｄｅ ｏｆ ｉｍｍｕｎｅ ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔｓ ｉｎ ｃａｎｃｅｒ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ； Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｃａｎｃｅｒ、１２巻、２５２〜２６４頁を参照されたい）。
１つの重要な免疫チェックポイント受容体は、細胞傷害性Ｔリンパ球関連抗原４（ＣＴＬＡ４）であり、これは、Ｔ細胞活性化の振幅をダウンモジュレートする。一部の免疫チェックポイント受容体、例えば、プログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ１）は、組織内のＴ細胞エフェクター機能を制限する。ＰＤ１のリガンドを上方調節することによって、腫瘍細胞および抗原提示細胞は、腫瘍微小環境における抗腫瘍免疫応答を遮断する。いくつかは様々な種類の腫瘍細胞においては選択的に上方調節される、複数の追加の免疫チェックポイント受容体およびリガンドは、特に、抗腫瘍免疫応答の開始または活性化を増強するアプローチとの組合せにおいて、遮断の重要な標的である。
６つのステップのうちの１つまたは複数において、がん−免疫サイクルを経ての進行を促進および支持するための治療法が、開発されている。これらの治療法は、広義には、免疫応答の開始を促進する治療法および免疫応答を維持するのに役立つ治療法として、分類することができる。
本明細書で使用される場合、「免疫開始」または「免疫応答を開始すること」という用語は、免疫応答の生成および確立をもたらすステップを通じた前進を指す。例えば、これらのステップには、上述のがん免疫サイクルの最初の３つのステップ、すなわち、抗原獲得のプロセス（ステップ（１））、樹状細胞およびマクロファージの活性化（ステップ（２））、ならびに／またはＴ細胞のプライミングおよび活性化（ステップ（３））が含まれ得る。
本明細書で使用される場合、「免疫維持」または「免疫応答を維持すること」という用語は、免疫応答が、経時的に広範化および強化されるのを確実にし、免疫応答の減弱または抑制を予防するステップを通じた前進を指す。例えば、これらのステップには、記載されるサイクルのステップ４から６、すなわち、Ｔ細胞の移動および腫瘍浸潤、ＴＣＲを通じたがん細胞の認識、ならびに免疫抑制を克服すること、すなわち、調節性Ｔ細胞の枯渇または阻害、およびエフェクター応答の他の能動的な抑制の確立を予防することが含まれ得る。
したがって、一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、サイクル内のステップのうちの１つまたは複数をモジュレートすること、例えば、活性化すること、促進すること、支持することによって、がん免疫サイクルをモジュレート、例えば、前進させることができる。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、免疫応答の開始をモジュレート、例えば、強化するステップを、モジュレート、例えば、促進することができる。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、免疫応答の維持を増強するサイクル内のある特定のステップを、モジュレート、例えば、ブーストすることができる。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、免疫応答の開始をモジュレート、例えば、強化すること、および免疫応答の持続をモジュレート、例えば、増強することができる。
したがって、一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、免疫応答の開始をモジュレート、例えば、強化する、１つまたは複数のエフェクター分子、例えば、免疫モジュレーターを産生することができる。したがって、一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、免疫応答の維持をモジュレート、例えば、増強する、１つまたは複数のエフェクター分子、例えば、免疫モジュレーターを産生することができる。したがって、一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、免疫応答の開始をモジュレート、例えば、強化する、１つまたは複数のエフェクター分子、例えば、免疫モジュレーター、ならびに免疫応答の維持をモジュレート、例えば、増強する、１つまたは複数のエフェクター分子、例えば、免疫モジュレーターを産生することができる。
したがって、一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、免疫応答の開始をモジュレート、例えば、強化する、１つまたは複数のエフェクター分子、例えば、免疫モジュレーターをコードする遺伝子配列を含む。したがって、一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、免疫応答の維持をモジュレート、例えば、増強する、１つまたは複数のエフェクター分子、例えば、免疫モジュレーターをコードする遺伝子配列を含む。したがって、一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、免疫応答の開始をモジュレート、例えば、強化する、１つまたは複数のエフェクター分子、例えば、免疫モジュレーター、ならびに免疫応答の維持をモジュレート、例えば、増強する、１つまたは複数のエフェクター分子、例えば、免疫モジュレーターをコードする遺伝子配列を含む。
「エフェクター」、「エフェクター物質」、または「エフェクター分子」は、目的の１つまたは複数の分子、治療用物質、または薬物を指す。一実施形態では、「エフェクター」は、改変された微生物、例えば、細菌によって産生される。別の実施形態では、本明細書に記載される第１のエフェクターを産生することができる改変された微生物は、第２のエフェクター、例えば、改変された微生物によって産生されないが、第１のエフェクターを産生する改変された微生物の投与の前に、それと同時に、またはその後に投与される第２のエフェクターと組み合わせて、投与される。
そのようなエフェクターまたはエフェクター分子の非限定的な例は、「免疫モジュレーター」であり、本明細書に記載される免疫サステナーおよび／または免疫イニシエーターが含まれる。一部の実施形態では、改変された微生物は、２つまたはそれより多いエフェクター分子または免疫モジュレーターを産生することができる。一部の実施形態では、改変された微生物は、３、４、５、６、７、８、９、または１０個のエフェクター分子または免疫モジュレーターを産生することができる。一部の実施形態では、エフェクター分子または免疫モジュレーターは、がんのモジュレーションまたは処置に有用である治療用分子である。別の実施形態では、本明細書に記載される第１の免疫モジュレーターを産生することができる改変された微生物は、第２の免疫モジュレーター、例えば、改変された微生物によって産生されないが、第１の免疫モジュレーターを産生する改変された微生物の投与の前に、それと同時に、またはその後に投与される第２の免疫モジュレーターと組み合わせて、投与される。
一部の実施形態では、エフェクターまたは免疫モジュレーターは、少なくとも１つの遺伝子によってコードされる治療用分子である。他の実施形態では、エフェクターまたは免疫モジュレーターは、少なくとも１つの遺伝子によってコードされる酵素によって産生される治療用分子である。代替実施形態では、エフェクター分子または免疫モジュレーターは、少なくとも１つの遺伝子によってコードされる生化学的または生合成経路によって産生される治療用分子である。別の実施形態では、エフェクター分子または免疫モジュレーターは、少なくとも１つの遺伝子によってコードされる生化学的、生合成、または異化経路の少なくとも１つの酵素である。一部の実施形態では、エフェクター分子または免疫モジュレーターは、ＲＮＡ干渉、マイクロＲＮＡ応答もしくは阻害、ＴＬＲ応答、アンチセンス遺伝子調節、標的タンパク質結合（アプタマーまたはデコイオリゴ）、または遺伝子編集、例えば、ＣＲＩＳＰＲ干渉を媒介する核酸分子であり得る。他の種類のエフェクターおよび免疫モジュレーターは、本明細書に記載および列挙されている。
エフェクター分子および／または免疫モジュレーターの非限定的な例としては、免疫チェックポイント阻害剤（例えば、ＣＴＬＡ−４抗体、ＰＤ−１抗体、ＰＤＬ−１抗体）、細胞傷害剤（例えば、Ｃｌｙ Ａ、ＦＡＳＬ、ＴＲＡＩＬ、ＴＮＦα）、免疫刺激性サイトカインおよび共刺激分子（例えば、ＯＸ４０抗体またはＯＸ４０Ｌ、ＣＤ２８、ＩＣＯＳ、ＣＣＬ２１、ＩＬ−２、ＩＬ−１８、ＩＬ−１５、ＩＬ−１２、ＩＦＮ−ガンマ、ＩＬ−２１、ＴＮＦ、ＧＭ−ＣＳＦ）、抗原および抗体（例えば、腫瘍抗原、ネオ抗原、ＣｔｘＢ−ＰＳＡ融合タンパク質、ＣＰＶ−ＯｍｐＡ融合タンパク質、ＮＹ−ＥＳＯ−１腫瘍抗原、ＲＡＦ１、免疫サプレッサー分子に対する抗体、抗ＶＥＧＦ、抗ＣＸＲ４／ＣＸＣＬ１２、抗ＧＬＰ１、抗ＧＬＰ２、抗ガレクチン１、抗ガレクチン３、抗Ｔｉｅ２、抗ＣＤ４７、免疫チェックポイントに対する抗体、免疫抑制性サイトカインおよびケモカインに対する抗体）、ＤＮＡ転移ベクター（例えば、エンドスタチン、トロンボスポンジン−１、ＴＲＡＩＬ、ＳＭＡＣ、Ｓｔａｔ３、Ｂｃｌ２、ＦＬＴ３Ｌ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−１２、ＡＦＰ、ＶＥＧＦＲ２）、ならびに酵素（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ ＣＤ、ＨＳＶ−ＴＫ）、免疫刺激性代謝物およびそれらを産生する生合成経路の酵素（ＳＴＩＮＧアゴニスト、例えば、ｃ−ジＡＭＰ、３’３’−ｃＧＡＭＰ、および２’３’−ｃＧＡＭＰ、アルギニン、トリプトファン）が挙げられる。
エフェクターにはまた、免疫抑制性または腫瘍成長促進性代謝物、例えば、キヌレニン、アデノシン、およびアンモニアの異化をもたらす、酵素もしくは他のポリペプチド（例えば、輸送体または調節タンパク質）または他の改変（例えば、ある特定の内在性遺伝子、例えば、栄養要求体の不活性化）も含まれ得る。キヌレニン、アデノシン、およびアンモニアの消費回路の非限定的な例は、本明細書に記載されている。
免疫モジュレーターには、とりわけ、免疫イニシエーターおよび免疫サステナーが含まれる。
本明細書で使用される場合、「免疫イニシエーター」または「イニシエーター」という用語は、あるクラスのエフェクターまたは分子、例えば、免疫モジュレーター、または物質を指す。免疫イニシエーターは、（１）腫瘍細胞の細胞溶解（腫瘍溶解）、（２）ＡＰＣ（樹状細胞およびマクロファージ）の活性化、ならびに／または（３）Ｔ細胞のプライミングおよび活性化を含む、がん免疫サイクルの１つまたは複数のステップをモジュレート、例えば、強化または増強し得る。一実施形態では、免疫イニシエーターは、本明細書に記載される改変された微生物、例えば、細菌によって産生され得るか、または本開示の改変された微生物と組み合わせて投与され得る。例えば、本明細書に記載される第１の免疫イニシエーターまたは免疫サステナーを産生することができる改変された微生物は、第２の免疫イニシエーター、例えば、改変された微生物によって産生されないが、第１の免疫イニシエーターまたは免疫サステナーを産生する改変された微生物の投与の前に、それと同時に、またはその後に投与される第２の免疫イニシエーターと組み合わせて、投与される。このような免疫イニシエーターの非限定的な例は、本明細書にさらに詳細に記載されている。
一部の実施形態では、免疫イニシエーターは、少なくとも１つの遺伝子によってコードされる治療用分子である。このような治療用分子の非限定的な例は、本明細書に記載されており、サイトカイン、ケモカイン、単鎖抗体（アゴニストまたはアンタゴニスト）、リガンド（アゴニストまたはアンタゴニスト）、共刺激受容体／リガンドなどが挙げられるが、これらに限定されない。別の実施形態では、免疫イニシエーターは、少なくとも１つの遺伝子によってコードされる酵素によって産生される治療用分子である。このような酵素の非限定的な例は、本明細書に記載されており、ＳＴＩＮＧアゴニストを産生するＤａｃＡおよびｃＧＡＳが挙げられるが、これらに限定されない。別の実施形態では、免疫イニシエーターは、少なくとも１つの遺伝子によってコードされる生合成経路の少なくとも１つの酵素である。このような生合成経路の非限定的な例は、本明細書に記載されており、アルギニンの産生に関与する酵素が挙げられるが、これに限定されない。別の実施形態では、免疫イニシエーターは、少なくとも１つの遺伝子によってコードされる異化経路の少なくとも１つの酵素である。このような異化経路の非限定的な例は、本明細書に記載されており、有害な代謝物の異化に関与する酵素が挙げられるが、これに限定されない。別の実施形態では、免疫イニシエーターは、少なくとも１つの遺伝子によってコードされる生合成経路の少なくとも１つの酵素によって産生される少なくとも１つの分子である。別の実施形態では、免疫イニシエーターは、代謝変換によって産生される治療用分子である、すなわち、免疫イニシエーターは、代謝変換因子である。他の実施形態では、免疫イニシエーターは、ＲＮＡ干渉、マイクロＲＮＡ応答または阻害、ＴＬＲ応答、アンチセンス遺伝子調節、標的タンパク質結合（アプタマーまたはデコイオリゴ）、遺伝子編集、例えば、ＣＲＩＳＰＲ干渉を媒介する核酸分子であり得る。
「免疫イニシエーター」という用語はまた、内在性遺伝子の任意の改変、例えば、突然変異または欠失も指し得る。一部の実施形態では、細菌は、生化学的、生合成、または異化経路を発現するように操作されている。一部の実施形態では、細菌は、第２のメッセンジャー分子を産生するように操作されている。
広義には、微生物、例えば、細菌は、「免疫イニシエーター」を産生することができる場合、本明細書において、「免疫イニシエーター微生物」と称される場合がある。
特定の実施形態では、改変された微生物は、（１）腫瘍細胞の細胞溶解および／もしくは腫瘍抗原の取込みのステップ、（２）ＡＰＣの活性化のステップ、ならびに／または（３）Ｔ細胞のプライミングおよび活性化のステップのうちの１つまたは複数をモジュレート、例えば、強化する、１つまたは複数の免疫イニシエーターを産生することができる。一部の実施形態では、改変された微生物は、（１）腫瘍細胞の細胞溶解および／もしくは腫瘍抗原の取込みのステップ、（２）ＡＰＣの活性化のステップ、ならびに／または（３）Ｔ細胞のプライミングおよび活性化のステップのうちの１つまたは複数をモジュレート、例えば、強化する、１つまたは複数の免疫イニシエーターの産生のための遺伝子回路網を含む。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、（１）腫瘍溶解および／もしくは腫瘍抗原の取込みのステップ、（２）ＡＰＣの活性化のステップ、ならびに／または（３）Ｔ細胞のプライミングおよび活性化のステップのうちの１つまたは複数をモジュレート、例えば、強化する、１つまたは複数の免疫イニシエーターをコードする１つまたは複数の遺伝子を含む。任意の免疫イニシエーターを、がん免疫サイクルにおける同じかまたは異なるステップをモジュレートする１つまたは複数の追加の同じかまたは異なる免疫イニシエーターと組み合わせてもよい。
一実施形態では、改変された微生物は、腫瘍溶解または腫瘍抗原の取込み（ステップ（１））をモジュレートする、１つまたは複数の免疫イニシエーターを産生する。抗原獲得をモジュレートする免疫イニシエーターの非限定的な例は、本明細書に記載されており、当該技術分野で公知であり、溶解性ペプチド、ＣＤ４７遮断抗体、ＳＩＲＰ−アルファおよびバリアント、ＴＮＦα、ＩＦＮ−γ、ならびに５ＦＵが挙げられるが、これらに限定されない。一実施形態では、改変された微生物は、ＡＰＣの活性化（ステップ（２））をモジュレートする、１つまたは複数の免疫イニシエーターを産生する。ＡＰＣの活性化をモジュレートする免疫イニシエーターの非限定的な例は、本明細書に記載されており、当該技術分野で公知であり、Ｔｏｌｌ様受容体アゴニスト、ＳＴＩＮＧアゴニスト、ＣＤ４０Ｌ、およびＧＭ−ＣＳＦが挙げられるが、これらに限定されない。一実施形態では、改変された微生物は、Ｔ細胞のプライミングおよび活性化（ステップ（３））をモジュレート、例えば、増強する、１つまたは複数の免疫イニシエーターを産生する。Ｔ細胞のプライミングおよび活性化をモジュレート、例えば、増強する、免疫イニシエーターの非限定的な例は、本明細書に記載されており、当該技術分野で公知であり、抗ＯＸ４０抗体、ＯＸＯ４０Ｌ、抗４１ＢＢ抗体、４１ＢＢＬ、抗ＧＩＴＲ抗体、ＧＩＴＲＬ、抗ＣＤ２８抗体、抗ＣＴＬＡ４抗体、抗ＰＤ１抗体、抗ＰＤＬ１抗体、ＩＬ−１５、およびＩＬ−１２などが挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書で使用される場合、「免疫サステナー」または「サステナー」は、あるクラスのエフェクターもしくは分子、例えば、免疫モジュレーター、または物質を指す。免疫サステナーは、（４）移動及び浸潤、（５）Ｔ細胞およびＴ細胞支持体によるがん細胞の認識、ならびに／または（６）免疫抑制を克服する能力を含む、がん免疫サイクルの１つまたは複数のステップをモジュレート、例えば、ブーストまたは増強することができる。一実施形態では、免疫サステナーは、本明細書に記載される改変された微生物、例えば、細菌によって産生され得る。別の実施形態では、免疫サステナーは、本明細書に記載される改変された微生物と組み合わせて投与され得る。例えば、本明細書に記載される第１の免疫イニシエーターまたは免疫サステナーを産生することができる改変された微生物は、第２の免疫サステナー、例えば、改変された微生物によって産生されないが、第１の免疫イニシエーターまたは免疫サステナーを産生する改変された微生物の投与の前に、それと同時に、またはその後に投与される第２の免疫サステナーと組み合わせて、投与される。
一部の実施形態では、免疫サステナーは、少なくとも１つの遺伝子によってコードされる治療用分子である。このような治療用分子の非限定的な例は、本明細書に記載されており、サイトカイン、ケモカイン、単鎖抗体（アゴニストまたはアンタゴニスト）、リガンド（アゴニストまたはアンタゴニスト）などが挙げられる。別の実施形態では、免疫サステナーは、少なくとも１つの遺伝子によってコードされる酵素によって産生される治療用分子である。このような酵素の非限定的な例は、本明細書に記載されており、表８に記載されるものが挙げられるが、これらに限定されない。別の実施形態では、免疫サステナーは、少なくとも１つの遺伝子によってコードされる生合成経路または異化経路の少なくとも１つの酵素である。このような生合成経路の非限定的な例は、本明細書に記載されており、アルギニンの産生に関与する酵素が挙げられるが、これに限定されない。このような異化経路の非限定的な例は、本明細書に記載されており、キヌレニンの触媒作用に関与する酵素またはアデノシンの触媒作用に関与する酵素が挙げられるが、これらに限定されない。別の実施形態では、免疫サステナーは、少なくとも１つの遺伝子によってコードされる生合成、生化学的、または異化経路の少なくとも１つの酵素によって産生される少なくとも１つの分子である。別の実施形態では、免疫サステナーは、代謝変換によって産生される治療用分子である、すなわち、免疫イニシエーターは、代謝変換因子である。他の実施形態では、免疫サステナーは、ＲＮＡ干渉、マイクロＲＮＡ応答または阻害、ＴＬＲ応答、アンチセンス遺伝子調節、標的タンパク質結合（アプタマーまたはデコイオリゴ）、遺伝子編集、例えば、ＣＲＩＳＰＲ干渉を媒介する核酸分子であり得る。
特定の実施形態では、改変された微生物は、有害な代謝物、例えば、細胞分裂、増殖、がんの成長を促進する、および／または例えばがん免疫サイクルを経ての進行を防止することによって免疫系を抑制する代謝物を、破壊することができる。したがって、「免疫サステナー」という用語はまた、有害な分子の低減または排除も指し得る。そのような事例では、「免疫サステナー」という用語は、１つまたは複数の遺伝子によってコードされ得る、有害な代謝物を破壊する異化経路の１つまたは複数の酵素も指すために使用され得る。「免疫サステナー」という用語は、異化酵素をコードする回路網、異化酵素を産生するための回路網、または微生物によって発現される異化酵素を指し得る。
「免疫サステナー」という用語はまた、内在性遺伝子の任意の改変、例えば、突然変異または欠失も指し得る。一部の実施形態では、微生物は、生化学的、生合成、または異化経路を発現するように改変されている。一部の実施形態では、微生物は、第２のメッセンジャー分子を産生するように操作されている。
広義には、微生物、例えば、細菌は、「免疫サステナー」を産生することができる場合、「免疫サステナー微生物」と称される場合がある。
一部の実施形態では、改変された微生物は、（４）Ｔ細胞の移動および浸潤のステップ、（５）Ｔ細胞および／もしくはＴ細胞支持体によるがん細胞の認識のステップ、ならびに／または（６）免疫抑制を克服する能力のステップのうちの１つまたは複数をモジュレート、例えば、ブーストする、１つまたは複数の免疫サステナーを産生することができる。任意の免疫サステナーを、同じかまたは異なるステップをモジュレートする１つまたは複数の追加の免疫サステナーと組み合わせてもよい。一部の実施形態では、改変された微生物は、（４）Ｔ細胞の移動および浸潤のステップ、（５）Ｔ細胞および／もしくはＴ細胞支持体によるがん細胞の認識のステップ、ならびに／または（６）免疫抑制を克服する能力のステップのうちの１つまたは複数をモジュレート、例えば、ブーストする、１つまたは複数の免疫サステナーの産生のための遺伝子回路網を含む。一部の実施形態では、改変された微生物は、（４）Ｔ細胞の移動および浸潤のステップ、（５）Ｔ細胞および／もしくはＴ細胞支持体によるがん細胞の認識のステップ、ならびに／または（６）免疫抑制を克服する能力のステップのうちの１つまたは複数をモジュレート、例えば、ブーストする、１つまたは複数の免疫サステナーをコードする１つまたは複数の遺伝子を含む。
一実施形態では、改変された微生物は、Ｔ細胞の移動および浸潤（ステップ（４））をモジュレートする、１つまたは複数の免疫サステナーを産生する。Ｔ細胞の移動および浸潤をモジュレートする免疫サステナーの非限定的な例は、本明細書に記載されており、当該技術分野で公知であり、ケモカイン、例えば、ＣＸＣＬ９およびＣＸＣＬ１０、またはそのようなサイトカインの発現を誘導する上流の活性化因子が挙げられるが、これらに限定されない。一実施形態では、改変された微生物は、Ｔ細胞およびＴ細胞支持体によるがん細胞の認識（ステップ（５））をモジュレートする、１つまたは複数の免疫サステナーを産生する。Ｔ細胞およびＴ細胞支持体によるがん細胞の認識をモジュレートする免疫サステナーの非限定的な例は、本明細書に記載されており、当該技術分野で公知であり、抗ＰＤ１／ＰＤ−Ｌ１抗体（アンタゴニスト）、抗ＣＴＬＡ−４抗体（アンタゴニスト）、キヌレニン消費、アデノシン消費、抗ＯＸ４０抗体（アゴニスト）、抗４１ＢＢ抗体（アゴニスト）、および抗ＧＩＴＲ抗体（アゴニスト）が挙げられるが、これらに限定されない。一実施形態では、改変された微生物は、免疫抑制を克服する能力（ステップ（６））をモジュレート、例えば、増強する、１つまたは複数の免疫サステナーを産生する。免疫抑制を克服する能力をモジュレート、例えば、増強する免疫サステナーの非限定的な例は、本明細書に記載されており、当該技術分野で公知であり、ＩＬ−１５およびＩＬ−１２、ならびにそれらのバリアントが挙げられるが、これらに限定されない。
任意の１つまたは複数の免疫イニシエーターを、任意の１つまたは複数の免疫サステナーと組み合わせてもよい。したがって、一部の実施形態では、改変された微生物は、（１）腫瘍溶解のステップ、（２）ＡＰＣの活性化のステップ、ならびに／または（３）Ｔ細胞のプライミングおよび活性化のステップのうちの１つまたは複数をモジュレート、例えば、強化する、１つまたは複数の免疫イニシエーターを、（４）Ｔ細胞の移動および浸潤のステップ、（５）Ｔ細胞および／もしくはＴ細胞支持体によるがん細胞の認識のステップ、ならびに／または（６）免疫抑制を克服する能力のステップのうちの１つまたは複数をモジュレート、例えば、ブーストする、１つまたは複数の免疫サステナーと組み合わせて、産生することができる。
一部の実施形態では、ある特定の免疫モジュレーターは、がん免疫サイクルの複数の段階、例えば、免疫開始の１つもしくは複数の段階、または免疫維持の１つもしくは複数、または免疫開始の１つもしくは複数の段階および免疫維持の１つもしくは複数の段階で、作用する。
本明細書で使用される場合、「代謝変換」は、細胞、例えば、細菌細胞内における化学的形質変換を指し、これは、酵素に触媒される反応の結果である。酵素に触媒される反応は、自然には生合成または異化のいずれかであり得る。
本明細書で使用される場合、「代謝変換因子」という用語は、生合成または異化回路、すなわち、化学的形質変換を触媒する、すなわち、代謝物を消費、産生、または変換する、１つまたは複数の酵素をコードする遺伝子を含む回路を指す。一実施形態では、遺伝子は、非ネイティブ遺伝子である。別の実施形態では、遺伝子は、ネイティブ遺伝子によってコードされ得るが、回路は、１つもしくは複数の非ネイティブ遺伝子および／または１つもしくは複数の非ネイティブ栄養要求体を含むようにさらに改変される。一部の実施形態では、「代謝変換因子」という用語は、少なくとも１つの遺伝子によってコードされる生合成経路の少なくとも１つの酵素によって産生される、少なくとも１つの分子を指す。
「代謝変換因子」はまた、回路によってコードされる生合成または異化酵素、ならびに内在性遺伝子の任意の改変、例えば、突然変異または欠失を指す。「代謝変換因子」という用語はまた、異化酵素をコードする１つもしくは複数の遺伝子、および／または内在性遺伝子の改変を指す。例えば、代謝変換因子は、毒性もしくは免疫抑制性の代謝物を消費するか、または抗がん代謝物を産生するか、またはその両方であり得る。代謝変換因子の非限定的な例としては、キヌレニン消費物質、アデノシン消費物質、アルギニン産生物質、および／またはアンモニア消費物質、すなわち、キヌレニンもしくはアデノシンの消費またはアルギニンの産生、ならびに／またはアンモニアの消費のための酵素をコードする回路網が挙げられる。
広義には、微生物、例えば、細菌は、「代謝変換因子」を含むか、またはそれを産生することができる場合、本明細書において、「代謝変換因子微生物」または「代謝変換因子細菌」と称され得る。
本明細書で使用される場合、「部分的な退縮」という用語は、改変された微生物および／または免疫モジュレーターの、腫瘍を有する対象への投与の後の、腫瘍の成長の阻害、および／または腫瘍の、例えば、サイズにおける、退縮を指す。一実施形態では、「部分的な退縮」は、腫瘍の、例えば、サイズにおける、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、または少なくとも約９０％の退縮を指し得る。別の実施形態では、「部分的な退縮」は、腫瘍のサイズの、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、または少なくとも約９０％の減少を指し得る。一実施形態では、「部分的な退縮」は、腫瘍の、例えば、サイズにおける、退縮を指すが、腫瘍は、依然として、対象において検出可能である。
本明細書で使用される場合、「完全な退縮」という用語は、改変された微生物および／または免疫モジュレーターの、腫瘍を有する対象へ投与の後の、腫瘍の、例えば、サイズにおける、完全な退縮を指す。「完全な退縮」が生じた場合、腫瘍は、対象において検出不能である。
本明細書で使用される場合、「応答パーセント」という用語は、対象集団における、改変された微生物および／または免疫モジュレーターの投与の後に、本明細書に定義される部分的な退縮または完全な退縮のいずれかを示す対象のパーセンテージを指す。例えば、一実施形態では、対象集団における対象のうちの約５％、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、または約９５％が、部分奏功または完全奏功を示す。
本明細書で使用される場合、「安定疾患」という用語は、成長も収縮もしていないがんまたは腫瘍を指す。「安定疾患」はまた、新しい腫瘍が発生しておらず、がんまたは腫瘍が、例えば、転移によって、身体の任意の新しい領域またはエリアに、拡がっていない、疾患状態も指す。
「腫瘍内投与」は、腫瘍内部位への微生物送達についての任意のおよびすべての意味を含むように意図されており、腫瘍内注射手段に限定されない。操作された微生物の送達手段の例は、本明細書中で詳細に論じられている。
「がん」または「がん性」は、非調節細胞成長を特徴とする生理状態を指すために使用される。一部の実施形態では、がんは、腫瘍を指す。「腫瘍」は、任意の新生物細胞成長もしくは増殖または任意の前がん性もしくはがん性細胞もしくは組織を指すために使用される。腫瘍は、悪性であることもあり、または良性であることもある。がんの種類の例としては、副腎がん、副腎皮質癌、肛門がん、虫垂がん、胆管がん、膀胱がん、骨がん（例えば、ユーイング肉腫腫瘍、骨肉腫、悪性線維性組織球腫）、脳がん（例えば、星細胞腫、脳幹神経膠腫、頭蓋咽頭腫、脳室上衣腫）、気管支腫瘍、中枢神経系腫瘍、乳がん、キャッスルマン病、子宮頸がん、結腸がん、直腸がん、結腸直腸がん、子宮内膜がん、食道がん、眼がん、胆嚢がん、消化器がん、消化器カルチノイド腫瘍、消化器間質腫瘍、妊娠性絨毛性疾患、心臓がん、カポジ肉腫、腎がん、喉頭がん、下咽頭がん、白血病（例えば、急性リンパ性白血病、急性骨髄系白血病、慢性リンパ球性白血病、慢性骨髄性白血病）、肝がん、肺がん、リンパ腫（例えば、ＡＩＤＳ関連リンパ腫、バーキットリンパ腫、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、中枢神経系原発リンパ腫）、悪性中皮腫、多発性骨髄腫、骨髄異形成症候群、鼻腔がん、副鼻腔がん、上咽頭がん、神経芽腫、口腔がん、中咽頭がん、骨肉腫、卵巣がん、膵がん、陰茎がん、下垂体腫瘍、前立腺がん、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、ラブドイド腫瘍、唾液腺がん、肉腫、皮膚がん（例えば、基底細胞癌、黒色腫）、小腸がん、胃がん、奇形腫、精巣がん、のどのがん、胸腺がん、甲状腺がん、非通常型小児がん、尿道がん、子宮がん、子宮肉腫、膣がん、外陰がん、ワルデンストレーム高ガンマグロブリン血症、およびウィルムス腫瘍が挙げられるが、これらに限定されない。がん処置の副作用としては、日和見自己免疫障害、全身毒性、貧血、食欲減退、膀胱内膜の炎症、出血および内出血（血小板減少）、味覚または嗅覚の変化、便秘、下痢、口内乾燥、嚥下障害、浮腫、疲労、毛髪脱落（脱毛症）、感染、不妊、リンパ浮腫、口内炎、悪心、疼痛、末梢神経障害、う歯、尿路感染症、ならびに／または記憶および集中力に関する問題を挙げることができるが、これらに限定されない（米国国立がん研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ））。
本明細書で使用される場合、「アブスコパル」および「アブスコパル効果」は、腫瘍の局部的処置が、処置される腫瘍を収縮させるかまたはそれらに別様に影響を与えるばかりでなく、局部的処置の範囲外の他の腫瘍も収縮させるかまたはそれらにも別様に影響を与える効果を指す。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、アブスコパル効果を惹起することができる。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌の投与時にアブスコパル効果が観察されない。
アブスコパル効果が観察されるこれらの実施形態のいずれにおいても、投与部位に対して遠位である同じ種類の腫瘍における腫瘍成長のタイミングは、ナイーブ動物または対象における腫瘍成長（腫瘍体積）と比較して、同じ種類から少なくとも約０〜２日間、少なくとも約２〜４日間、少なくとも約４〜６日間、少なくとも約６〜８日間、少なくとも約８〜１０日間、少なくとも約１０〜１２日間、少なくとも約１２〜１４日間、少なくとも約１４〜１６日間、少なくとも約１６〜１８日間、少なくとも約１８〜２０日間、少なくとも約２０〜２５日間、少なくとも約２５〜３０日間、少なくとも約３０〜３５日間、遅延される。
アブスコパル効果が観察されるこれらの実施形態のいずれにおいても、同じ種類の遠位腫瘍における腫瘍体積で測定した場合の腫瘍成長のタイミングは、腫瘍再チャレンジでは、ナイーブ動物または対象における腫瘍成長（腫瘍体積）と比較して、少なくとも約０〜２週間、少なくとも約２〜４週間、少なくとも約４〜６週間、少なくとも約６〜８週間、少なくとも約８〜１０週間、少なくとも約１０〜１２週間、少なくとも約１２〜１４週間、少なくとも約１４〜１６週間、少なくとも約１６〜１８週間、少なくとも約１８〜２０週間、少なくとも約２０〜２５週間、少なくとも約２５〜３０週間、少なくとも約３０〜３５週間、少なくとも約３５〜４０週間、少なくとも約４０〜４５週間、少なくとも約４５〜５０週間、少なくとも約５０〜５５週間、少なくとも約５５〜６０週間、少なくとも約６０〜６５週間、少なくとも約６５〜７０週間、少なくとも約７０〜８０週間、少なくとも約８０〜９０週間、または少なくとも約９０〜１００、遅延される。
アブスコパル効果が観察されるこれらの実施形態のいずれにおいても、投与部位に対して遠位の同じ種類の腫瘍において腫瘍体積で測定した場合の腫瘍成長のタイミングは、腫瘍再チャレンジでは、ナイーブ動物または対象における腫瘍成長（腫瘍体積）と比較して、少なくとも約０〜２年間、少なくとも約２〜４年間、少なくとも約４〜６年間、少なくとも約６〜８年間、少なくとも約８〜１０年間、少なくとも約１０〜１２年間、少なくとも約１２〜１４年間、少なくとも約１４〜１６年間、少なくとも約１６〜１８年間、少なくとも約１８〜２０年間、少なくとも約２０〜２５年間、少なくとも約２５〜３０年間、少なくとも約３０〜３５年間、少なくとも約３５〜４０年間、少なくとも約４０〜４５年間、少なくとも約４５〜５０年間、少なくとも約５０〜５５年間、少なくとも約５５〜６０年間、少なくとも約６０〜６５年間、少なくとも約６５〜７０年間、少なくとも約７０〜８０年間、少なくとも約８０〜９０年間、または少なくとも約９０〜１００、遅延される。
さらに別の実施形態では、生存率は、腫瘍再チャレンジでは、ナイーブ対象における腫瘍成長（腫瘍体積）と比較して、少なくとも約１．０〜１．２倍、少なくとも約１．２〜１．４倍、少なくとも約１．４〜１．６倍、少なくとも約１．６〜１．８倍、少なくとも約１．８〜２倍、または少なくとも約２倍高くなる。さらに別の実施形態では、生存率は、腫瘍再チャレンジでは、ナイーブ対象における腫瘍成長（腫瘍体積）と比較して、少なくとも約２〜３倍、少なくとも約３〜４倍、少なくとも約４〜５倍、少なくとも約５〜６倍、少なくとも約６〜７倍、少なくとも約７〜８倍、少なくとも約８〜９倍、少なくとも約９〜１０倍、少なくとも約１０〜１５倍、少なくとも約１５〜２０倍、少なくとも約２０〜３０倍、少なくとも約３０〜４０倍、もしくは少なくとも約４０〜５０倍、少なくとも約５０〜１００倍、少なくとも約１００〜５００００倍、または少なくとも約５００〜１０００倍高い。この例では、「腫瘍再チャレンジ」には、がん進行のある特定の段階において、対象に生じ得る、転移形成も含まれ得る。
免疫学的記憶は、哺乳動物における免疫応答の重要な側面を表す。記憶応答は、がん細胞に対するワクチンの有効性の基礎を形成する。本明細書で使用される場合、「免疫記憶」または「免疫学的記憶」という用語は、長期生存抗原特異的リンパ球が、利用可能であり、特定の抗原への反復的な曝露により、応答を急速に開始することができる状態を指す。がん免疫療法における免疫学的記憶の重要性は、公知であり、メモリーＴ細胞の移動特性および長期継続的抗腫瘍能力は、悪性腫瘍の制御および転移または再発の予防に極めて重要な役割を果たす。免疫学的記憶は、Ｂリンパ球およびＴ細胞の両方に存在し、現在では、ＮＫ細胞、マクロファージ、および単球を含む、広範な種類の他の免疫細胞に存在すると考えられている。（例えば、Ｆａｒｂｅｒら、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ ｍｅｍｏｒｙ： ｌｅｓｓｏｎｓ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｐａｓｔ ａｎｄ ａ ｌｏｏｋ ｔｏ ｔｈｅ ｆｕｔｕｒｅ （Ｎａｔ． Ｒｅｖ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．、（２０１６年）、１６巻：１２４〜１２８頁を参照されたい）。メモリーＢ細胞は、長期間にわたり、抗体を産生することができる形質細胞である。メモリーＢ細胞は、既に、クローン拡大増殖および分化、ならびに親和性成熟を受けており、そのため、数倍急速に分裂し、はるかに高い親和性を有する抗体を産生することができる。メモリーＴ細胞は、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋の両方であり得る。これらのメモリーＴ細胞は、増殖するためにさらなる抗原刺激を必要とせず、したがって、ＭＨＣを介したシグナルを必要としない。
免疫学的記憶は、例えば、改変された微生物での処置により、完全な退縮を達成した後、動物モデルを再チャレンジすることによって、動物モデルにおいて測定することができる。動物に、次いで、がん細胞系からがん細胞を移植し、成長をモニターし、以前に腫瘍に曝露されていない同じ種類の年齢が一致するナイーブ動物と比較する。そのような腫瘍再チャレンジは、腫瘍細胞に対する全身的かつ長期的な免疫性を示すために使用され、将来的な再発または転移の形成に対抗する能力を表すことができる。そのような実験は、本明細書において、実施例にＡ２０腫瘍モデルを使用して記載されている。免疫学的記憶は、ナイーブ動物と比較して、再チャレンジした動物における腫瘍の再発を予防するか、または遅らせるであろう。細胞レベルでは、免疫学的記憶の形成は、腫瘍抗原特異的メモリーＴ細胞またはエフェクターメモリーＴ細胞の拡大増殖および／または存続性によって測定することができる。
一部の実施形態では、本明細書に記載される改変された微生物の投与時に、免疫学的記憶が、対象において達成される。一部の実施形態では、本明細書に記載される改変された微生物の投与時に、免疫学的記憶が、がん患者において達成される。
一部の実施形態では、本明細書に記載される改変された微生物の投与時に、完全奏功が、対象において達成される。一部の実施形態では、本明細書に記載される改変された微生物の投与時に、完全奏功が、がん患者において達成される。
一部の実施形態では、本明細書に記載される改変された微生物の投与時に、完全寛解が、対象において達成される。一部の実施形態では、本明細書に記載される改変された微生物を投与した後に、完全寛解が、がん患者において達成される。
一部の実施形態では、本明細書に記載される改変された微生物の投与時に、部分奏功が、対象において達成される。一部の実施形態では、本明細書に記載される改変された微生物の投与時に、部分奏功が、がん患者において達成される。
一部の実施形態では、本明細書に記載される改変された微生物の投与時に、安定疾患が、対象において達成される。一部の実施形態では、本明細書に記載される改変された微生物の投与時に、部分奏功が、がん患者において達成される。
一部の実施形態では、本明細書に記載される改変された微生物の投与時に、群内の対象のサブセットに、部分または完全奏功が達成される。一部の実施形態では、本明細書に記載される改変された微生物の投与時に、群内の患者のサブセットに、部分的または完全奏功が達成される。
免疫学的記憶が観察されるこれらの実施形態のいずれにおいても、腫瘍成長のタイミングは、腫瘍再チャレンジでは、ナイーブ動物または対象における腫瘍成長（腫瘍体積）と比較して、少なくとも約０〜２日間、少なくとも約２〜４日間、少なくとも約４〜６日間、少なくとも約６〜８日間、少なくとも約８〜１０日間、少なくとも約１０〜１２日間、少なくとも約１２〜１４日間、少なくとも約１４〜１６日間、少なくとも約１６〜１８日間、少なくとも約１８〜２０日間、少なくとも約２０〜２５日間、少なくとも約２５〜３０日間、少なくとも約３０〜３５日間、遅延される。
免疫学的記憶が観察されるこれらの実施形態のいずれにおいても、腫瘍体積で測定した場合の腫瘍成長のタイミングは、腫瘍再チャレンジでは、ナイーブ動物または対象における腫瘍成長（腫瘍体積）と比較して、少なくとも約０〜２週間、少なくとも約２〜４週間、少なくとも約４〜６週間、少なくとも約６〜８週間、少なくとも約８〜１０週間、少なくとも約１０〜１２週間、少なくとも約１２〜１４週間、少なくとも約１４〜１６週間、少なくとも約１６〜１８週間、少なくとも約１８〜２０週間、少なくとも約２０〜２５週間、少なくとも約２５〜３０週間、少なくとも約３０〜３５週間、少なくとも約３５〜４０週間、少なくとも約４０〜４５週間、少なくとも約４５〜５０週間、少なくとも約５０〜５５週間、少なくとも約５５〜６０週間、少なくとも約６０〜６５週間、少なくとも約６５〜７０週間、少なくとも約７０〜８０週間、少なくとも約８０〜９０週間、または少なくとも約９０〜１００、遅延される。
免疫学的記憶が観察されるこれらの実施形態のいずれにおいても、腫瘍体積で測定した場合の腫瘍成長のタイミングは、腫瘍再チャレンジでは、ナイーブ動物または対象における腫瘍成長（腫瘍体積）と比較して、少なくとも約０〜２年間、少なくとも約２〜４年間、少なくとも約４〜６年間、少なくとも約６〜８年間、少なくとも約８〜１０年間、少なくとも約１０〜１２年間、少なくとも約１２〜１４年間、少なくとも約１４〜１６年間、少なくとも約１６〜１８年間、少なくとも約１８〜２０年間、少なくとも約２０〜２５年間、少なくとも約２５〜３０年間、少なくとも約３０〜３５年間、少なくとも約３５〜４０年間、少なくとも約４０〜４５年間、少なくとも約４５〜５０年間、少なくとも約５０〜５５年間、少なくとも約５５〜６０年間、少なくとも約６０〜６５年間、少なくとも約６５〜７０年間、少なくとも約７０〜８０年間、少なくとも約８０〜９０年間、または少なくとも約９０〜１００、遅延される。
さらに別の実施形態では、生存率は、腫瘍再チャレンジでは、ナイーブ対象における腫瘍成長（腫瘍体積）と比較して、少なくとも約１．０〜１．２倍、少なくとも約１．２〜１．４倍、少なくとも約１．４〜１．６倍、少なくとも約１．６〜１．８倍、少なくとも約１．８〜２倍、または少なくとも約２倍高くなる。さらに別の実施形態では、生存率は、腫瘍再チャレンジでは、ナイーブ対象における腫瘍成長（腫瘍体積）と比較して、少なくとも約２〜３倍、少なくとも約３〜４倍、少なくとも約４〜５倍、少なくとも約５〜６倍、少なくとも約６〜７倍、少なくとも約７〜８倍、少なくとも約８〜９倍、少なくとも約９〜１０倍、少なくとも約１０〜１５倍、少なくとも約１５〜２０倍、少なくとも約２０〜３０倍、少なくとも約３０〜４０倍、もしくは少なくとも約４０〜５０倍、少なくとも約５０〜１００倍、少なくとも約１００〜５００００倍、または少なくとも約５００〜１０００倍高い。
本明細書で使用される場合、「熱い腫瘍」は、Ｔ細胞が炎症状態（ｉｎｆｌａｍｅｄ）にある、すなわち、腫瘍に浸潤しているＴ細胞の高存在量と関連する、腫瘍を指す。「冷たい腫瘍」は、腫瘍に浸潤しているエフェクターＴ細胞の非存在により特徴付けられ、さらに、免疫細胞は腫瘍に誘引されるが、腫瘍微小環境に浸潤することができない「免疫遮断（ｉｍｍｕｎｅ ｅｘｃｌｕｄｅｄ）」腫瘍、および免疫細胞の動員が全く生じない、「免疫無視（ｉｍｍｕｎｅ ｉｇｎｏｒｅｄ）」表現型にグループ化される（Ｖａｎ ｄｅｒ Ｗｏｕｄｅら、Ｍｉｇｒａｔｉｎｇ ｉｎｔｏ ｔｈｅ Ｔｕｍｏｒ： ａ Ｒｏａｄｍａｐ ｆｏｒ Ｔ Ｃｅｌｌｓ．Ｔｒｅｎｄｓ Ｃａｎｃｅｒ．、２０１７年１１月、３巻（１１号）：７９７〜８０８頁にさらに概説されている）。
「ハイポキシア」は、酸欠環境を生じさせる結果となる、生理的レベルと比較して低下した組織への酸素供給量を指すように使用される。「酸素正常状態」は、組織への生理的酸素供給レベルを指す。ハイポキシアは、固形腫瘍の顕著な特徴であり、不十分な灌流に起因する低酸素および壊死領域を特徴とする（Ｇｒｏｏｔら、２００７年）。
本明細書で使用する場合、「ペイロード」は、遺伝子操作された微生物、例えば、細菌またはウイルスにより産生される、目的の１つまたは複数の分子を指す。一部の実施形態では、ペイロードは、治療用ペイロード、例えば、エフェクター分子または免疫モジュレーター（例えば、免疫イニシエーターまたは免疫サステナー）である。一部の実施形態では、ペイロードは、調節分子、例えば、ＦＮＲなどの転写調節因子である。一部の実施形態では、ペイロードは、プロモーターまたはリプレッサーなどの、調節エレメントを含む。一部の実施形態では、ペイロードは、ＦＮＲＳからのものなどの誘導性プロモーターを含む。一部の実施形態では、ペイロードは、キルスイッチなどのリプレッサーエレメントを含む。一部の実施形態では、ペイロードは、遺伝子（１つもしくは複数）またはオペロンによりコードされている。代替実施形態では、ペイロードは、生合成または生化学的経路により産生され、生合成または生化学的経路は、必要に応じて微生物に内在性のものであってもよい。一部の実施形態では、遺伝子操作された微生物は、２またはそれより多いペイロードを含む。
本明細書で使用される場合、用語「低酸素」は、大気中に存在する酸素のレベル、量または濃度より少ない（例えば、＜２１％Ｏ２；＜１６０Ｔｏｒｒ Ｏ２））、酸素（Ｏ２）のレベル、量または濃度を指すように意図されている。したがって、用語「１つまたは複数の低酸素条件」または「低酸素環境」は、大気中に存在するより低いレベルの酸素を含有する条件または環境を指す。
一部の実施形態では、用語「低酸素」は、哺乳動物の消化管、例えば、内腔、胃、小腸、十二指腸、空腸、回腸、大腸、盲腸、結腸、遠位Ｓ状結腸、直腸および肛門管に見られる酸素（Ｏ２）のレベル、量または濃度を指すように意図されている。一部の実施形態では、用語「低酸素」は、０〜６０ｍｍＨｇ Ｏ２（０〜６０Ｔｏｒｒ Ｏ２）（例えば、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５，４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、および６０ｍｍＨｇ Ｏ２）であって、これらの任意のおよびすべての増分分数（例えば、０．２ｍｍＨｇ、０．５ｍｍＨｇ Ｏ２、０．７５ｍｍＨｇ Ｏ２、１．２５ｍｍＨｇ Ｏ２、２．１７５ｍｍＨｇ Ｏ２、３．４５ｍｍＨｇ Ｏ２、３．７５ｍｍＨｇ Ｏ２、４．５ｍｍＨｇ Ｏ２、６．８ｍｍＨｇ Ｏ２、１１．３５ｍｍＨｇ Ｏ２、４６．３ｍｍＨｇ Ｏ２、５８．７５ｍｍＨｇなど（これらの例示的分数は、説明を目的としてここに列挙されており、決して制限するようには意図されていない））を含む、Ｏ２のレベル、量または濃度を指すように意図されている。一部の実施形態では、「低酸素」は、約６０ｍｍＨｇ Ｏ２またはそれ未満（例えば、０〜約６０ｍｍＨｇ Ｏ２）を指す。用語「低酸素」は、０〜６０ｍｍＨｇ Ｏ２の間（両端の値を含む）、例えば、０〜５ｍｍＨｇ Ｏ２、＜１．５ｍｍＨｇ Ｏ２、６〜１０ｍｍＨｇ、＜８ｍｍＨｇ、４７〜６０ｍｍＨｇなどの、Ｏ２レベル、量または濃度の範囲を指すこともあり、この列挙された例示的範囲は、説明を目的としてここに列挙されおり、決して制限するようには意図されていない。例えば、Ａｌｂｅｎｂｅｒｇら、Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ、１４７巻（５号）：１０５５〜１０６３頁（２０１４年）；Ｂｅｒｇｏｆｓｋｙら、Ｊ Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．、４１巻（１１号）：１９７１〜１９８０頁（１９６２年）；Ｃｒｏｍｐｔｏｎら、Ｊ Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．、４３巻：４７３〜４７８頁（１９６５年）；Ｈｅら、ＰＮＡＳ （ＵＳＡ）、９６巻：４５８６〜４５９１頁（１９９９年）；ＭｃＫｅｏｗｎ， Ｂｒ． Ｊ． Ｒａｄｉｏｌ．、８７巻：２０１３０６７６頁（２０１４年）（ｄｏｉ： １０．１２５９／ｂｒｊ．２０１３０６７６）を参照されたく、これらの開示の各々は、様々な種の哺乳動物の消化管に見られる酸素レベルを論じており、これらの各々は、それら全体が参照により本明細書に組み込まれる。
一部の実施形態では、用語「低酸素」は、酸素が低下したレベルで、例えば、低酸素または無酸素レベルで存在する、消化管以外の哺乳動物の臓器または組織、例えば、尿生殖路、腫瘍組織などに見られる酸素（Ｏ２）のレベル、量または濃度を指すように意図されている。一部の実施形態では、「低酸素」は、部分好気、半好気、微好気、非好気、微有酸素、低酸素、無酸素および／または嫌気条件で存在する、酸素（Ｏ２）のレベル、量または濃度を指すように意図されている。例えば、表１は、様々な臓器および組織に存在する酸素量を要約するものである。一部の実施形態では、酸素（Ｏ２）のレベル、量または濃度は、溶存酸素（「ＤＯ」）の量として表され、これは、液体中に存在する遊離、非化合物酸素（Ｏ２）のレベルを指し、通常は、１リットル当たりのミリグラム（ｍｇ／Ｌ）、百万分率（ｐｐｍ；１ｍｇ／Ｌ＝１ｐｐｍ）、またはマイクロモル（μｍｏｌ）（１μｍｏｌ Ｏ２＝０．０２２３９１ｍｇ／Ｌ Ｏ２）で報告される。Ｆｏｎｄｒｉｅｓｔ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ， Ｉｎｃ．、「Ｄｉｓｓｏｌｖｅｄ Ｏｘｙｇｅｎ」、Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌｓ ｏｆ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔｓ、２０１３年１１月１９日、ｗｗｗ．ｆｏｎｄｒｉｅｓｔ．ｃｏｍ／ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ−ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔｓ／ｐａｒａｍｅｔｅｒｓ／ｗａｔｅｒ−ｑｕａｌｉｔｙ／ｄｉｓｓｏｌｖｅｄ− ｏｘｙｇｅｎ／＞。
一部の実施形態では、用語「低酸素」は、約６．０ｍｇ／Ｌ ＤＯまたはそれ未満、例えば、６．０ｍｇ／Ｌ、５．０ｍｇ／Ｌ、４．０ｍｇ／Ｌ、３．０ｍｇ／Ｌ、２．０ｍｇ／Ｌ、１．０ｍｇ／Ｌ、または０ｍｇ／Ｌ、ならびにこれらに関する任意の分数、例えば、３．２５ｍｇ／Ｌ、２．５ｍｇ／Ｌ、１．７５ｍｇ／Ｌ、１．５ｍｇ／Ｌ、１．２５ｍｇ／Ｌ、０．９ｍｇ／Ｌ、０．８ｍｇ／Ｌ、０．７ｍｇ／Ｌ、０．６ｍｇ／Ｌ、０．５ｍｇ／Ｌ、０．４ｍｇ／Ｌ、０．３ｍｇ／Ｌ、０．２ｍｇ／Ｌおよび０．１ｍｇ／Ｌ ＤＯである、酸素（Ｏ２）のレベル、量または濃度を指すように意図されており、例示的分数は、説明を目的としてここに列挙され、決して制限するようには意図されていない。液体または溶液中の酸素のレベルはまた、空気飽和度のパーセンテージとして報告されることもあり、または酸素飽和度のパーセンテージ（溶液中の溶存酸素（Ｏ２）の濃度の、ある特定の温度、圧力および塩分で、安定平衡下で、溶液に溶解するであろう酸素の最大量に対する比）として報告されることもある。酸素産生物質も消費物質も含まない、十分に曝気された溶液（例えば、混合および／または撹拌に供された溶液）は、１００％空気飽和されている。
一部の実施形態では、用語「低酸素」は、空気飽和度４０％またはそれ未満、例えば、空気飽和度４０％、３９％、３８％、３７％、３６％、３５％、３４％、３３％、３２％、３１％、３０％、２９％、２８％、２７％、２６％、２５％、２４％、２３％、２２％、２１％、２０％、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、および０％を、これらの任意のおよびすべての増分分数（例えば、３０．２５％、２２．７０％、１５．５％、７．７％、５．０％、２．８％、２．０％、１．６５％、１．０％、０．９％、０．８％、０．７５％、０．６８％、０．５％、０．４４％、０．３％、０．２５％、０．２％、０．１％、０．０８％、０．０７５％、０．０５８％、０．０４％、０．０３２％、０．０２５％、０．０１％など）、ならびに０〜４０％の間（両端の値を含む）の任意の空気飽和レベル範囲（例えば、０〜５％、０．０５〜０．１％、０．１〜０．２％、０．１〜０．５％、０．５〜２．０％、０〜１０％、５〜１０％、１０〜１５％、１５〜２０％、２０〜２５％、２５〜３０％など）を含めて、指すように意図されている。
ここに列挙された例示的分数および範囲は、説明を目的としたものであり、決して制限するようには意図されていない。一部の実施形態では、用語「低酸素」は、Ｏ２飽和度９％またはそれ未満、例えば、Ｏ２飽和度９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、０％を、これらの任意のおよびすべての増分分数（例えば、６．５％、５．０％、２．２％、１．７％、１．４％、０．９％、０．８％、０．７５％、０．６８％、０．５％、０．４４％、０．３％、０．２５％、０．２％、０．１％、０．０８％、０．０７５％、０．０５８％、０．０４％、０．０３２％、０．０２５％、０．０１％など）、および０〜９％の間（両端の値を含む）の任意のＯ２飽和レベルの範囲（例えば、０〜５％、０．０５〜０．１％、０．１〜０．２％、０．１〜０．５％、０．５〜２．０％、０〜８％、５〜７％、０．３〜４．２％Ｏ２など）を含めて、指すように意図されている。ここに列挙された例示的分数および範囲は、説明を目的としたものであり、決して制限するようには意図されていない。
本明細書で使用される場合、用語「遺伝子」または「遺伝子配列」は、ゲノム配列、ｃＤＮＡ配列、天然に存在する配列、人工配列、およびコドン最適化配列を含む、ポリペプチドまたはタンパク質を発現する任意の配列を指す。用語「遺伝子」または「遺伝子配列」は、内在性遺伝子の改変、例えば、欠失、突然変異、ならびにネイティブおよび非ネイティブ遺伝子の、それらが自然には通常は関連していないプロモーターの制御下での発現を、とりわけ含む。
本明細書で使用される場合、用語「遺伝子カセット」および「回路（ｃｉｒｃｕｉｔ）」または「回路（ｃｉｒｃｕｉｔｙ）」は、内在性遺伝子の改変、例えば、欠失、突然変異、ならびにネイティブおよび非ネイティブ遺伝子の、それらが自然には通常は関連していないプロモーターの制御下での発現を含む、ゲノム配列、ｃＤＮＡ配列、天然に存在する配列、人工配列、およびコドン最適化配列を含む、ポリペプチドまたはタンパク質を発現する任意の配列を、とりわけ指す。
抗体は、対応する抗原に非共有結合で、可逆的に、および特異的様式で結合することができる、免疫グロブリンファミリーのポリペプチド、または免疫グロブリンの断片を含むポリペプチドを一般的に指す。例示的抗体構造ユニットは、ジスルフィド結合によって接続された同一の２対のポリペプチド鎖であって、各対が１本の「軽」鎖（約２５ｋＤ）および１本の「重」鎖（約５０〜７０ｋＤ）を有するポリペプチド鎖で構成されている四量体を含む。
本明細書で使用される場合、用語「抗体」（単数）または「抗体」（複数）は、１つまたは複数の特定の結合特異性を有する、様々な抗体およびそれらの断片すべてを包含するように意図されている。したがって、用語「抗体」（単数）または「抗体」（複数）は、完全長抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、単鎖抗体（ＳｃＦｖ、ラクダ科動物）、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、これらの断片の多量体バージョン（例えば、Ｆ（ａｂ’）２）、単一ドメイン抗体（ｓｄＡＢ、ＶＨＨ断片）、重鎖抗体（ＨＣＡｂ）、ナノボディ、ダイアボディ、およびミニボディを含むように意図されている。抗体は、１つより多くの結合特異性を有することができ、例えば、二特異性でありうる。用語「抗体」はまた、いわゆる抗体模倣物、すなわち、抗原に特異的に結合することができるが抗体関連構造を有さないものを含むように意図されている。
「単鎖抗体」（単数）または「単鎖抗体」（複数）は、免疫グロブリンの重鎖と、免疫グロブリンの軽鎖と、必要に応じて、リンカーまたは結合、例えばジスルフィド結合とを含むペプチドを通常は指す。単鎖抗体は、旧来の抗体に見られる定常Ｆｃ領域を欠いている。一部の実施形態では、単鎖抗体は、天然に存在する単鎖抗体、例えば、ラクダ科動物抗体である。一部の実施形態では、単鎖抗体は、合成の、操作された、または修飾された単鎖抗体である。一部の実施形態では、単鎖抗体は、リンカーの付加および定常領域の除去にもかかわらず、元の免疫グロブリンと比較して実質的に同じ抗原特異性を保持することができる。一部の態様では、単鎖抗体は、例えば米国特許４，９４６，７７８号に記載されているような、アミノ酸数１０〜約２５の短いリンカーペプチドで、必要に応じて接続されている、免疫グロブリンの重鎖（ＶＨ）および軽鎖（ＶＬ）の可変領域の（いずれの定常領域も有さない）融合タンパク質を指す、「ｓｃＦｖ抗体」であってもよく、前記特許文献の内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。Ｆｖ断片は、抗体の結合部位を保持する最小の断片であって、一部の態様では結合部位が元の抗体の特異性を維持しうる、断片である。単鎖抗体の産生技術は、米国特許第４，９４６，７７８号に記載されている。
本明細書で使用される場合、用語「ポリペプチド」は、「ポリペプチド」（単数）はもちろん「ポリペプチド」（複数）も含み、アミド結合（すなわち、ペプチド結合）により直鎖状に連結されたアミノ酸単量体で構成されている分子を指す。用語「ポリペプチド」は、２またはそれより多いアミノ酸数の任意の鎖（単数）または鎖（複数）を指し、生成物の特定の長さを意味しない。したがって、「ペプチド」、「ジペプチド」、「トリペプチド」、「オリゴペプチド」、「タンパク質」、「アミノ酸鎖」、または２もしくはそれより多いアミノ酸数の鎖（単数）もしくは鎖（複数）を指すために使用される任意の他の用語は、「ポリペプチド」の定義の中に含まれ、用語「ポリペプチド」は、これらの用語のいずれかの代わりに、またはいずれかと同義で使用されうる。用語「ポリペプチド」は、グリコシル化、アセチル化、リン酸化、アミド化、誘導体化、タンパク質切断、または天然に存在しないアミノ酸による修飾を含むがこれらに限定されない、ポリペプチドの発現後修飾産物を指すようにも意図されている。一部の実施形態では、ポリペプチドは、本発明の遺伝子操作された細菌により産生される。本発明のポリペプチドは、約３もしくはそれより多い、５もしくはそれより多い、１０もしくはそれより多い、２０もしくはそれより多い、２５もしくはそれより多い、５０もしくはそれより多い、７５もしくはそれより多い、１００もしくはそれより多い、２００もしくはそれより多い、５００もしくはそれより多い、１，０００もしくはそれより多い、または２，０００もしくはそれより多いアミノ酸数のサイズのものであってもよい。
「単離された」ポリペプチドまたはその断片、バリアントもしくは誘導体は、その天然の環境にないポリペプチドを指す。特定の精製レベルは、要求されない。細菌または哺乳動物細胞を含むがこれらに限定されない宿主細胞において発現された、組換え産生ポリペプチドおよびタンパク質は、本発明の目的では単離されたと見なされ、任意の適切な技術により分離された、分画された、または部分的にもしくは実質的に精製されたネイティブまたは組換えポリペプチドも、単離されたとみなされる。組換えペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質は、組換えＤＮＡ技術により産生された、すなわち、ポリペプチドをコードする外因性組換えＤＮＡ発現構築物により形質転換された、微生物または哺乳動物の細胞から産生された、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質を指す。ほとんどの細菌培養において発現されるタンパク質またはペプチドには、通常はグリカンがないであろう。前述のポリペプチドの断片、誘導体、アナログまたはバリアント、およびそれらの組合せも、ポリペプチドとして含まれる。用語「断片」、「バリアント」、「誘導体」および「アナログ」は、元のペプチドのアミノ酸配列と十分に類似しているアミノ酸配列を有するポリペプチドを含み、対応する元のポリペプチドの少なくとも１つまたは複数の特性を保持する任意のポリペプチドを含む。本発明のポリペプチドの断片は、タンパク質分解断片はもちろん、欠失断片も含む。断片は、本明細書に記載の任意のポリペプチドに由来する特異的抗体または生物活性断片または免疫学的活性断片も含む。バリアントは、天然に存在することもあり、または天然に存在しないこともある。天然に存在しないバリアントは、当技術分野において公知の突然変異誘発法を使用して産生することができる。バリアントポリペプチドは、保存的または非保存的アミノ酸置換、欠失または付加を含みうる。
ポリペプチドは、融合タンパク質も含む。本明細書で使用される場合、用語「バリアント」は、元のペプチドの配列を含む、または元のペプチドと十分に類似している配列を含む、融合タンパク質を含む。本明細書で使用される場合、用語「融合タンパク質」は、２つまたはそれより多い異なるタンパク質のアミノ酸配列を含むキメラタンパク質を指す。典型的に、融合タンパク質は、周知のｉｎ ｖｉｔｒｏ組換え技術の結果として得られる。融合タンパク質は、融合タンパク質の成分である個々の元のタンパク質と、類似の構造機能を（必ずしも同程度にではないが）、および／または類似の調節機能を（必ずしも同程度にではないが）、および／または類似の生化学機能を（必ずしも同程度にではないが）および／または免疫学的活性を（必ずしも同程度にではないが）有しうる。「誘導体」は、２０の標準アミノ酸についての１つまたは複数の天然に存在するアミノ酸誘導体を含有するペプチドを含むが、これらに限定されない。２つのペプチド間の「類似性」は、１つのペプチドのアミノ酸配列をもう１つのペプチドの配列と比較することにより決定される。１つのペプチドのアミノ酸は、もう１つのペプチドの対応するアミノ酸と、それが同一のまたは保存的アミノ酸置換である場合、類似している。保存的置換は、Ｄａｙｈｏｆｆ， Ｍ． Ｏ．編、Ｔｈｅ Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ５、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ， Ｄ．Ｃ．（１９７８年）、およびＡｒｇｏｓ， ＥＭＢＯ Ｊ． ８巻（１９８９年）、７７９〜７８５頁に記載されているものを含む。例えば、次の群の１つに属するアミノ酸は、保存的変化または置換を示す：−Ａｌａ、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ；−Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｙｒ、Ｔｈｒ；−Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｐｈｅ；−Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ；−Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ｈｉｓ；および−Ａｓｐ、Ｇｌｕ。
これらの組合せ実施形態のいずれにおいても、遺伝子操作された細菌は、１つまたは複数の融合タンパク質をコードする遺伝子配列を含むことができる。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、安定化ポリペプチドと融合されているエフェクター、例えば、免疫モジュレーターをコードする遺伝子配列を含む。そのような安定化ポリペプチドは、当技術分野において公知であり、Ｆｃタンパク質を含む。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌によりコードされている融合タンパク質は、Ｆｃ融合タンパク質、例えば、ＩｇＧ Ｆｃ融合タンパク質またはＩｇＡ Ｆｃ融合タンパク質である。
一部の実施形態では、免疫モジュレーターは、ペプチドリンカーまたはペプチド結合によって安定化ポリペプチドと共有結合で融合されている。一部の実施形態では、安定化ポリペプチドは、免疫グロブリンＦｃポリペプチドを含む。一部の実施形態では、免疫グロブリンＦｃポリペプチドは、免疫グロブリン重鎖ＣＨ２定常領域の少なくとも一部分を含む。一部の実施形態では、免疫グロブリンＦｃポリペプチドは、免疫グロブリン重鎖ＣＨ３定常領域の少なくとも一部分を含む。一部の実施形態では、免疫グロブリンＦｃポリペプチドは、免疫グロブリン重鎖ＣＨ１定常領域の少なくとも一部分を含む。一部の実施形態では、免疫グロブリンＦｃポリペプチドは、免疫グロブリン可変ヒンジ領域の少なくとも一部分を含む。一部の実施形態では、免疫グロブリンＦｃポリペプチドは、免疫グロブリン可変ヒンジ領域、免疫グロブリン重鎖ＣＨ２定常領域および免疫グロブリン重鎖ＣＨ３定常領域の少なくとも一部分を含む。前記免疫グロブリンＦｃポリペプチドが、ヒトＩｇＧ Ｆｃポリペプチドである、請求項２〜６４のいずれか、および請求項１１２〜１２２のいずれかに記載の、遺伝子操作された細菌。一部の実施形態では、免疫グロブリンＦｃポリペプチドは、ヒトＩｇＧ４Ｆｃポリペプチドである。一部の実施形態では、リンカーは、グリシンリッチペプチドを含む。一部の実施形態では、グリシンリッチペプチドは、配列［ＧｌｙＧｌｙＧｌｙＧｌｙＳｅｒ］ｎ（配列中、ｎは、１、２、３、４、５または６である）を含む。一部の実施形態では、融合タンパク質は、ＳＩＲＰαＩｇＧ ＦＣ融合ポリペプチドを含む。一部の実施形態では、融合タンパク質は、ＳＩＲＰαＩｇＧ４ Ｆｃポリペプチドを含む。一部の実施形態では、グリシンリッチペプチドリンカーは、配列ＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳを含む。一部の実施形態では、ＳＩＲＰαのＮ末端は、ＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳを含むペプチドリンカーによってＩｇＧ４ ＦｃのＣ末端と共有結合で融合されている。
一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、多量体ポリペプチドの成分をコードする１つまたは複数の遺伝子配列を含む。一部の実施形態では、ポリペプチドは、二量体である。二量体タンパク質の非限定的な例としては、ＩＬ−１５（ヘテロ二量体）などの、サイトカインが挙げられる。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、１つまたは複数のポリペプチドをコードする１つまたは複数の遺伝子を含み、１つまたは複数のポリペプチドは、第１の単量体および第２の単量体を含む。一部の実施形態では、第１の単量体ポリペプチドは、ペプチドリンカーまたはペプチド結合によって第２の単量体ポリペプチドと共有結合で連結されている。一部の実施形態では、リンカーは、グリシンリッチペプチドを含む。一部の実施形態では、第１および第２の単量体は、同じポリペプチド配列を有する。一部の実施形態では、第１および第２の単量体は、各々が異なるポリペプチド配列を有する。一部の実施形態では、第１の単量体は、ＩＬ−１２ ｐ３５ポリペプチドであり、第２の単量体は、ＩＬ−１２ ｐ４０ポリペプチドである。一部の実施形態では、リンカーは、ＧＧＧＧＳＧＧＧＳを含む。
一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、配列番号１１１７の１つまたは複数と約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有するｈＩｇＧ４部分を含むｈＩＧｇ４融合タンパク質をコードする。別の実施形態では、ｈＩｇＧ４部分は、配列番号１１１７を含む。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌により発現されるポリペプチドのｈＩｇＧ４部分は、配列番号１１１７からなる。
一部の実施形態では、ｈＩＧｇ４融合タンパク質などの融合タンパク質をコードする核酸は、配列番号１１０３と少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９９％の同一性を有する配列を含む。一部の実施形態では、融合タンパク質をコードする核酸は、配列番号１１０３を含む。一部の実施形態では、ｈＩｇＧ４をコードする核酸部分は、配列番号１１０３からなる。
一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、配列番号１１２１の１つまたは複数と約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有するリンカー部分を含む融合タンパク質をコードする。別の実施形態では、リンカー部分は、配列番号１１２１を含む。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌により発現されるポリペプチドのリンカー部分は、配列番号１１２１からなる。
一部の実施形態では、免疫モジュレーターのエフェクター機能を、エフェクター機能を助長する別のポリペプチドとの融合によって向上させることができる。そのような融合の非限定的な例は、本明細書に記載のＩＬ−１５ＲアルファのＳｕｓｈｉドメインとのＩＬ−１５の融合である。したがって、一部の実施形態では、第１の単量体ポリペプチドは、ＩＬ−１５単量体であり、第２の単量体は、ＩＬ−１５Ｒアルファｓｕｓｈｉドメインポリペプチドである。
これらの実施形態のいずれか、およびすべての組合せ実施形態において、遺伝子操作された細菌は、本明細書に記載の１つまたは複数の分泌タグをコードする遺伝子配列を含む。これらの実施形態のいずれにおいても、遺伝子操作された細菌は、拡散性外膜表現型を可能にする、内在性膜会合タンパク質の１つまたは複数の突然変異を含む。適切な外膜突然変異は、本明細書に記載されている。
本明細書で使用される場合、用語「十分に類似している」は、第２のアミノ酸配列と比較して同一または同等のアミノ酸残基を、第１および第２のアミノ酸配列が共通の構造ドメインおよび／または共通の機能活性を有するために十分なまたは最小の数、含有する、第１のアミノ酸配列を意味する。例えば、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または少なくとも約１００％同一である共通の構造ドメインを含むアミノ酸配列は、十分に類似していると本明細書では定義される。好ましくは、バリアントは、本発明のペプチドのアミノ酸配列と十分に類似しているであろう。そのようなバリアントは、本発明のペプチドの機能活性を一般に保持する。バリアントは、１つまたは複数のアミノ酸欠失、付加および／または置換によってそれぞれネイティブおよびｗｔペプチドとはアミノ酸配列が異なるペプチドを含む。これらは、天然に存在するバリアントはもちろん、人工的に設計されたものでもありうる。
本明細書で使用される場合、用語「リンカー」、「リンカーペプチド」または「ペプチドリンカー」または「リンカー」は、２つのポリペプチド配列を接続するまたは連結させる、例えば、２つのポリペプチドドメインを連結させる、合成のまたは非ネイティブのまたは天然に存在しないアミノ酸配列を指す。本明細書で使用される場合、用語「合成（の）」は、天然に存在しないアミノ酸配列を指す。例示的リンカーは、本明細書に記載されている。さらなる例示的リンカーは、米国特許出願公開第２０１４００７９７０１号に提供されており、前記特許文献の内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。一部の実施形態では、リンカーは、グリシンリッチリンカーである。一部の実施形態では、リンカーは、（Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ）ｎである。一部の実施形態では、リンカーは、配列番号９７９を含む。
本明細書で使用される場合、用語「コドン最適化配列」は、例えば、コード配列から転写された転写物ＲＮＡ分子の発現宿主細胞もしくは生物における翻訳を向上させるように、またはコード配列の転写を向上するように、既存のコード配列から修飾された、または設計された、配列を指す。コドン最適化は、発現宿主生物のコドン選好に適合するようにコード配列のコドンを選択することを含むプロセスを含むが、これらに限定されない。
多くの生物は、成長ポリペプチド鎖における特定のアミノ酸の挿入をコードするための特定のコドンの使用にバイアスまたは選好を示す。コドン選好またはコドンバイアス（生物間のコドン使用頻度の差）は、遺伝コードの縮重により可能にされ、多くの生物間で十分に裏付けられている。コドンバイアスは、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の翻訳効率と相関することが多く、さらにはその翻訳効率は、とりわけ、翻訳されることになるコドンの特性、および特定の転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）分子の利用可能性に依存すると考えられている。細胞において選択されるｔＲＮＡの優位性は、一般に、ペプチド合成に最も多く使用されるコドンの現れである。したがって、遺伝子を、コドン最適化に基づいて所与の生物における最適な遺伝子発現に合わせることができる。
本明細書で使用される場合、用語「分泌系」または「分泌タンパク質」は、微生物の、例えば、細菌の細胞質から、免疫モジュレーターを分泌または排出することができるネイティブまたは非ネイティブ分泌機構を指す。グラム陰性菌の分泌系の非限定的な例としては、修飾ＩＩＩ型鞭毛、Ｉ型（例えば、溶血素分泌系）、ＩＩ型、ＩＶ型、Ｖ型、ＶＩ型およびＶＩＩ型分泌系、耐性−結節形成−分裂（ＲＮＤ）多剤排出ポンプ、様々な単一膜分泌系が挙げられる。分泌系の非限定的な例は、本明細書に記載される。
本明細書で使用される場合、用語「輸送体」は、例えば、細胞外環境から微生物に分子を移入するための機構、例えば、タンパク質（単数）またはタンパク質（複数）を指すように意図されている。
免疫系は、最も広くは、自然免疫と適応免疫という２つのカテゴリーに通常は分けられるが、これらの免疫に関連する免疫応答は、相互排他的ではない。「自然免疫」は、体内での外来作用因子または抗原の出現から直ちにまたは数時間以内に活性化される非特異的防御機構を指す。これらの機構は、物理的バリア、例えば皮膚、血液中の化学物質、ならびに体内の外来作用因子または細胞を攻撃する免疫系細胞、例えば樹状細胞（ＤＣ）、白血球、食細胞、マクロファージ、好中球およびナチュラルキラー細胞（ＮＫ）を含み、外来作用因子の存在に対して残りの免疫系を変更する。自然免疫応答中に、免疫学的抗原の提示と組み合わせてサイトカインおよびケモカインおよびが産生され、これにより適応免疫細胞を活性化し、完全に作動する免疫応答が開始化するように働く。「適応免疫」または「獲得免疫」は、抗原特異的免疫応答を指す。抗原は、先ず、抗原提示細胞（ＡＰＣ）によりプロセシングまたは提示されなければならない。抗原提示細胞またはアクセサリー細胞は、それらの表面に、直接、または主要組織適合複合体（ＭＨＣ）と複合体を形成している抗原を提示する、細胞である。マクロファージ、Ｂ細胞および樹状細胞をはじめとする、プロフェッショナル抗原提示細胞は、ＭＨＣ−ＩＩ制限様式で外来抗原のヘルパーＴ細胞への提示を専門に扱い、その一方で、他の細胞型は、細胞内で発生する抗原をＭＨＣ−Ｉ制限様式で細胞傷害性Ｔ細胞に提示することができる。抗原が提示され、認識されると、適応免疫系が、抗原を攻撃するように特異的に設計された免疫細胞の大群を活性化する。自然系同様、適応系は、液性免疫成分（Ｂリンパ球細胞）と細胞性免疫（Ｔリンパ球細胞）成分の両方を含む。Ｂ細胞が活性化されて抗体を分泌し、これらの抗体が、血流を通って移動し、外来抗原と結合する。ヘルパーＴ細胞（調節性Ｔ細胞、ＣＤ４＋細胞）および細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ、ＣＤ８＋細胞）は、それらのＴ細胞受容体が抗原結合ＭＨＣ分子と相互作用すると活性化される。サイトカインおよび共刺激分子は、Ｔ細胞成熟を助け、さらにはこれらの成熟細胞がサイトカインを産生し、これにより、応答を維持するさらなるＴ細胞の産生、プライミングおよび拡大増殖が可能になる。活性化されると、ヘルパーＴ細胞は、サイトカインを放出し、これらのサイトカインが、ＡＰＣ、マクロファージ、好中球および他のリンパ球を含む異なる免疫細胞型の活性を調節し、標的細胞を死滅させ、除去するように活性を方向付ける。ヘルパーＴ細胞はまた、免疫応答の維持も助ける細胞傷害性Ｔ細胞の活性化を支援する追加のシグナルを分泌する。活性化されると、ＣＴＬは、クローン選択され、その際に機能を獲得し、迅速に分裂して活性化されたエフェクター細胞の大群を産生し、将来の脅威に急速に応答する準備の整った長期にわたって生きるメモリーＴ細胞を形成する。次いで、活性化されたＣＴＬは、体中を移動して、特有のＭＨＣクラスＩおよび抗原を有する細胞を探索する。エフェクターＣＴＬは、標的細胞の細胞膜に孔を形成する細胞毒を放出して、アポトーシスを引き起こす。適応免疫は、特定の抗原に対するさらなる応答をより効率的にする「メモリー」も含む。感染が解消されると、ヘルパーＴ細胞および細胞傷害性Ｔ細胞は死滅し、食細胞により一掃されるが、これらの細胞の少数は、メモリー細胞として残存する。後になって同じ抗原に遭遇した場合、これらのメモリー細胞が迅速にエフェクター細胞に分化して、有効な応答を開始するのに必要な時間を短縮する。
「免疫チェックポイントインヒビター」または「免疫チェックポイント」は、１つもしくは複数の免疫チェックポイントタンパク質を完全にまたは部分的に低減させる、阻害する、そのようなタンパク質に干渉する、またはそのようなタンパク質をモジュレートする分子を指す。免疫チェックポイントタンパク質は、Ｔ細胞活性化または機能を調節し、当技術分野において公知である。非限定的な例としては、ＣＴＬＡ−４およびそのリガンドＣＤ８０およびＣＤ８６、ならびにＰＤ−１およびそのリガンドＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２が挙げられる。免疫チェックポイントタンパク質は、Ｔ細胞応答の共刺激性または阻害性相互作用に関与し、自己免疫寛容および生理的免疫応答を調節し、維持する。
「共刺激」分子または「共刺激因子」は、免疫応答または炎症応答を刺激するシグナルを増大させるまたは活性化する免疫モジュレーターである。
本明細書で使用される場合、がん性細胞を「阻害する」、遺伝子操作された微生物、例えば操作された細菌、または免疫モジュレーターは、同じ条件下で対照、例えば、未処置対照もしくは同じ亜型の未改変微生物と比較して少なくとも約１０％〜２０％、２０％〜２５％、２５％〜３０％、３０％〜４０％、４０％〜５０％、５０％〜６０％、６０％〜７０％、７０％〜７５％、７５％〜８０％、８０％〜８５％、８５％〜９０％、９０％〜９５％、９５％〜９９％、またはそれより大きく細胞増殖を低減させること、腫瘍成長を低減させること、および／または腫瘍体積を低減させることができる、細菌またはウイルスまたは分子を指す。
本明細書で使用される場合、免疫モジュレーター、例えば、サイトカイン、ケモカイン、免疫モジュレーション代謝物、または任意の他の免疫モジュレーション物質、因子もしくは分子などの、生体分子を「阻害する」、遺伝子操作された微生物、例えば操作された細菌、または免疫モジュレーターは、その生体分子、の生物活性、生物学的機能および／または数を、同じ条件下で、対照、例えば、未処置対照もしくは同じ亜型の未改変微生物と比較して低減させること、減少させること、または除去することができる、細菌またはウイルスまたは免疫モジュレーターを指す。
本明細書で使用される場合、例えば、サイトカイン、ケモカイン、免疫モジュレーション代謝物、または任意の他の免疫モジュレーション物質、因子もしくは分子などの、生体分子を「活性化する」または「刺激する」、遺伝子操作された微生物、例えば、操作された細菌、または免疫モジュレーターは、その生体分子の生物活性、生物学的機能および／または数を、同じ条件下で、対照、例えば、未処置対照もしくは同じ亜型の未改変微生物と比較して活性化すること、増大させること、増強すること、または促進することができる、細菌またはウイルスまたは抗がん分子を指す。
「腫瘍内投与のための細菌」は、それら自体をがん性細胞に方向付けることができる細菌を指す。腫瘍内投与のための細菌は、天然に、それら自体をがん性細胞、壊死組織および／または低酸素組織に方向付けることができる。一部の実施形態では、天然にそれら自体をがん性細胞、壊死組織および／または低酸素組織に方向付けることができない細菌は、それら自体をがん性細胞、壊死組織および／または低酸素組織に方向付けるように遺伝子操作される。腫瘍内投与のための細菌を、所望の生物学的特性を増強もしくは向上させるように、全身毒性を弱めるように、および／または臨床的安全性を確実にするように、さらに操作することができる。これらの種、株および／または亜型を弱毒化することができ、例えば、毒性遺伝子について欠失させることができる。一部の実施形態では、腫瘍内投与のための細菌は、低い感染能を有する。一部の実施形態では、腫瘍内投与のための細菌は、運動性である。一部の実施形態では、腫瘍内投与のための細菌は、標準的処置が届かない腫瘍に深く侵入することができる。一部の実施形態では、腫瘍内投与のための細菌は、悪性腫瘍の少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％にコロニー形成することができる。腫瘍内投与のための細菌の例としては、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｃａｕｌｏｂａｃｔｅｒ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、およびＶｉｂｒｉｏ、例えば、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｄｏｌｅｓｃｅｎｔｉｓ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｉｆｉｄｕｍ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｒｅｖｅ ＵＣＣ２００３、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｎｆａｎｔｉｓ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｕｔｙｒｉｃｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｕｔｙｒｉｃｕｍ Ｍ−５５、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｕｔｙｒｉｃｕｍ ｍｉｙａｉｒｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｃｏｃｈｌｅａｒｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｆｅｌｓｉｎｅｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｍｕｌｔｉｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｎｏｖｙｉ−ＮＴ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐａｒａｐｕｔｒｉｆｉｃｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐａｓｔｅｕｒｅａｎｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｃｔｉｎｏｖｏｒｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｒｏｓｅｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｐｏｒｏｇｅｎｅｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｅｒｔｉｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｅｔａｎｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｙｒｏｂｕｔｙｒｉｃｕｍ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＭＧ１６５５、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅ １９１７、Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｏｖｉｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｃｈｏｌｅｒａｅｓｕｉｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、およびＶｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａが挙げられるが、これらに限定されない（Ｃｒｏｎｉｎら、２０１２年；Ｆｏｒｂｅｓ、２００６年；ＪａｉｎおよびＦｏｒｂｅｓ、２００１年；Ｌｉｕら、２０１４年；Ｍｏｒｒｉｓｓｅｙら、２０１０年；Ｎｕｎｏら、２０１３年；Ｐａｔｙａｒら、２０１０年；Ｃｒｏｎｉｎら、Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ ２０１０年；１８巻：１３９７〜４０７頁）。一部の実施形態では、腫瘍内投与のための細菌は、非病原性細菌である。一部の実施形態では、腫瘍内投与は注射によりなされる。
「微生物」は、単一細胞から通常はなる顕微鏡的な、顕微鏡でも見えないほど微小なまたは超顕微鏡的なサイズの、生物または微小生物を指す。微生物の例としては、細菌、ウイルス、寄生虫、真菌、ある特定の藻類、原虫、および酵母が挙げられる。一部の態様では、ナイーブな状態から改変された微生物（「改変された微生物」）は、１つまたは複数のエフェクターまたは免疫モジュレーターを産生するように操作されている。ある特定の実施形態では、改変された微生物は、改変された細菌である。一部の実施形態では、改変された微生物は、遺伝子操作された細菌である。ある特定の実施形態では、改変された微生物は、改変された酵母である。他の実施形態では、改変された微生物は、遺伝子操作された酵母である。
本明細書で使用される場合、用語「組換え微生物」は、そのネイティブ状態から遺伝子改変された微生物、例えば、細菌、酵母もしくはウイルス細胞、または細菌、酵母もしくはウイルスを指す。したがって、「組換え細菌細胞」または「組換え細菌」は、そのネイティブ状態から遺伝子改変された、細菌細胞または細菌を指す。例えば、組換え細菌細胞は、それらのＤＮＡに導入された、ヌクレオチド挿入、ヌクレオチド欠失、ヌクレオチド再構成およびヌクレオチド修飾を有しうる。これらの遺伝子改変は、細菌のもしくは細菌細胞の染色体内に存在することもあり、または細菌もしくは細菌細胞におけるプラスミド上に存在することもある。本明細書で開示される組換え細菌細胞は、プラスミド上に外因性ヌクレオチド配列を含むこともある。あるいは、組換え細菌細胞は、それらの染色体に安定に組み込まれた外因性ヌクレオチド配列を含むこともある。
「プログラムされたまたは操作された微生物」は、特定の機能を遂行するようにそのネイティブ状態から遺伝子改変された微生物、例えば、細菌、酵母もしくはウイルス細胞、または細菌、酵母もしくはウイルスを指す。したがって、「プログラムされたもしくは操作された細菌細胞」または「プログラムされたもしくは操作された細菌」は、特定の機能を遂行するようにそのネイティブ状態から遺伝子改変された、細菌細胞または細菌を指す。ある特定の実施形態では、プログラムされたまたは操作された細菌細胞は、１つまたは複数のタンパク質、例えば、治療活性を有するまたは治療目的に役立つ１つまたは複数のタンパク質を発現するように改変されたものである。プログラムされたまたは操作された細菌細胞は、目的のタンパク質が発現されると成長を停止させるまたはそれ自体を破壊する能力を、さらに有しうる。
「非病原性細菌」は、宿主において疾患または有害な応答を引き起こすことができない細菌を指す。一部の実施形態では、非病原性細菌は、グラム陰性菌である。一部の実施形態では、非病原性細菌は、グラム陽性菌である。一部の実施形態では、非病原性細菌は、リポ多糖（ＬＰＳ）を含有しない。一部の実施形態では、非病原性細菌は、共生細菌である。非病原性細菌の例としては、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉａ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、およびＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属に属する、ある特定の株、例えば、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏａｇｕｌａｎｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｆｒａｇｉｌｉｓ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｔｈｅｔａｉｏｔａｏｍｉｃｒｏｎ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｉｆｉｄｕｍ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｎｆａｎｔｉｓ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌａｃｔｉｓ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｕｔｙｒｉｃｕｍ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｕｍ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｓｅｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｒａｃａｓｅｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｅｕｔｅｒｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｈａｍｎｏｓｕｓ、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ、およびＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｂｏｕｌａｒｄｉｉが挙げられるが、これらに限定されない（Ｓｏｎｎｅｎｂｏｒｎら、２００９年；Ｄｉｎｌｅｙｉｃｉら、２０１４年；米国特許第６，８３５，３７６号、米国特許第６，２０３，７９７号、米国特許第５，５８９，１６８号、米国特許第７，７３１，９７６号）。天然に病原性の細菌を遺伝子操作して、病原性の低下または除去をもたらすことができる。
「プロバイオティック」は、適切な量の微生物を含有する宿主生物に健康上の恩恵をもたらすことができる、生存している非病原性微生物、例えば、細菌を指すために使用される。一部の実施形態では、宿主生物は、哺乳動物である。一部の実施形態では、宿主生物は、ヒトである。一部の実施形態では、プロバイオティック細菌は、グラム陰性菌である。一部の実施形態では、プロバイオティック細菌は、グラム陽性菌である。非病原性細菌の一部の種、株および／または亜型は、現在プロバイオティック細菌として認知されている。プロバイオティック細菌の例としては、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉａ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ、およびＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属に属する、ある特定の株、例えば、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｉｆｉｄｕｍ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｕｍ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅ株、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｒａｃａｓｅｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ、およびＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｂｏｕｌａｒｄｉｉが挙げられるが、これらに限定されない（Ｄｉｎｌｅｙｉｃｉら、２０１４年；米国特許第５，５８９，１６８号；米国特許第６，２０３，７９７号；米国特許第６，８３５，３７６号）。プロバイオティックは、細菌のバリアントまたは突然変異株でありうる（Ａｒｔｈｕｒら、２０１２年；Ｃｕｅｖａｓ−Ｒａｍｏｓら、２０１０年；Ｏｌｉｅｒら、２０１２年；Ｎｏｕｇａｙｒｅｄｅら、２００６年）。非病原性細菌を、所望の生物学的特性、例えば、生存性を増強または向上させるように、遺伝子操作することができる。非病原性細菌を、プロバイオティック特性をもたらすように、遺伝子操作することができる。プロバイオティック細菌を、プロバイオティック特性を増強または向上させるように、遺伝子操作するか、またはプログラムすることができる。
本明細書で使用される場合、「腫瘍溶解性ウイルス」（ＯＶ）は、正常細胞を無傷のままにしながら、がん細胞を特異的に感染させ、溶解する能力を有する、ウイルスである。目的の腫瘍溶解性ウイルスは、これらに限定されないが、アデノウイルス、コクサッキー、レオウイルス、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、ワクシニア、鶏痘、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）、麻疹、およびパルボウイルスを含み、狂犬病、ウエストナイルウイルス、ニューカッスル病、およびそれらの遺伝子改変バージョンも含む。ＯＶの非限定的な例は、ＦＤＡによりがん治療剤として認可された最初の腫瘍溶解性ウイルスである、タリモジーン・ラハーパレプベック（Ｔ−ＶＥＣ）である。
「作動可能に連結した」は、核酸配列の発現を可能にする様式で、例えばｃｉｓで作用する様式で、調節領域配列に接合されている、核酸配列、例えば、ＳＴＩＮＧアゴニスト（例えば、ジアデニル酸シクラーゼまたはｃ−ジ−ＧＡＭＰシンターゼ）の産生に関する酵素をコードする遺伝子に当てはまる。調節領域は、目的の遺伝子の転写を指示することができる核酸であり、プロモーター配列、エンハンサー配列、応答エレメント、タンパク質認識部位、誘導性エレメント、プロモーター制御エレメント、タンパク質結合配列、５’および３’非翻訳領域、転写開始部位、終結配列、ポリアデニル化配列ならびにイントロンを含みうる。
「誘導性プロモーター」は、１つまたは複数の遺伝子に作動可能に連結した調節領域であって、遺伝子の発現が前記調節領域のインデューサーの存在下で増加される、調節領域を指す。
「外因性環境条件」は、本明細書に記載のプロモーターが誘導される設定または状況を指す。一部の実施形態では、外因性環境条件は、がん性細胞を含有する悪性成長、例えば、腫瘍に特異的である。句「外因性環境条件」は、無傷の（溶解されていない）操作された微生物の外部の、しかし腫瘍環境または宿主対象環境に内在性のまたはそれに固有の、環境条件を指すように意図されている。したがって、「外因性」および「内在性」は、哺乳動物体に内在性であるが、無傷の微生物細胞の外部にあるかまたはそのような細胞にとって外因性である、環境条件を指すために同義で使用される。一部の実施形態では、外因性環境条件は、低酸素、微好気または嫌気条件、例えば、低酸素および／または壊死組織である。一部の固形腫瘍は、低い細胞内および／または細胞外ｐＨを伴い、一部の実施形態では、外因性環境条件は、低ｐＨ環境である。一部の実施形態では、本開示の遺伝子操作された微生物は、ｐＨ依存性プロモーターを含む。一部の実施形態では、本開示の遺伝子操作された微生物は、酸素レベル依存性プロモーターを含む。一部の態様では、細菌は、酸素レベルを感知することができる転写因子を発達させてきた。異なるシグナル伝達経路を異なる酸素レベルにより誘発することができ、異なるシグナル伝達経路は、異なる動態で存在しうる。「酸素レベル依存性プロモーター」または「酸素レベル依存性調節領域」は、１つまたは複数の酸素レベル感知転写因子が結合することができる核酸配列であって、対応する転写因子の結合および／または活性化が、下流の遺伝子発現を活性化する、核酸配列を指す。
酸素レベル依存性転写因子の例としては、ＦＮＲ（フマル酸・硝酸レダクターゼ）、ＡＮＲおよびＤＮＲが挙げられるが、これらに限定されない。対応するＦＮＲ応答性プロモーター、ＡＮＲ（嫌気硝酸呼吸）応答性プロモーター、およびＤＮＲ（異化型硝酸呼吸調節因子）応答性プロモーターは、当技術分野において公知であり（例えば、Ｃａｓｔｉｇｌｉｏｎｅら、２００９年；Ｅｉｇｌｍｅｉｅｒら、１９８９年；Ｇａｌｉｍａｎｄら、１９９１年；Ｈａｓｅｇａｗａら、１９９８年；Ｈｏｅｒｅｎら、１９９３年；Ｓａｌｍｏｎら、２００３年を参照されたい）、非限定的な例は、表２に示される。
非限定的な例では、プロモーター（ＰｆｎｒＳ）は、低または無環境酸素条件下で高度に発現されることが公知であるＥ．ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅフマル酸・硝酸レダクターゼ遺伝子Ｓ（ｆｎｒＳ）から得られた（ＤｕｒａｎｄおよびＳｔｏｒｚ、２０１０年；Ｂｏｙｓｅｎら、２０１０年）。ＰｆｎｒＳプロモーターは、天然にＮｉｓｓｌｅに見られる包括的転写調節因子ＦＮＲにより嫌気条件下で活性化される。嫌気条件下で、ＦＮＲは、二量体を形成し、その制御下にある特定の遺伝子のプロモーター中の特定の配列と結合することによって、それらの遺伝子の発現を活性化する。しかし、好気条件下では、酸素がＦＮＲ二量体中の鉄−硫黄クラスターと反応し、それらを不活性形態に変換する。このように、ＰｆｎｒＳ誘導性プロモーターは、タンパク質またはＲＮＡの発現をモジュレートするために採用される。ＰｆｎｒＳは、本願では、ＦＮＲＳ、ｆｎｒｓ、ＦＮＲ、Ｐ−ＦＮＲＳプロモーター、およびプロモーターＰｆｎｒＳを示すための他のそのような関連する呼称と同義で使用される。
本明細書で使用される場合、「非ネイティブ」核酸配列は、微生物に通常は存在しない核酸配列、例えば、内在性配列の余剰コピー、あるいは異種配列、例えば、細菌もしくはウイルスの異なる種、株もしくは亜株からの配列、または同じ亜型の細菌もしくはウイルスからの非修飾配列と比較して修飾および／もしくは突然変異されている配列を指す。一部の実施形態では、非ネイティブ核酸配列は、合成の、天然に存在しない配列である（例えば、Ｐｕｒｃｅｌｌら、２０１３年を参照されたい）。非ネイティブ核酸配列は、調節領域、
プロモーター、遺伝子、および／または遺伝子カセット内の１つもしくは複数の遺伝子でありうる。一部の実施形態では、「非ネイティブ」は、自然には互いに同じ関係性で見いだされない２つまたはそれより多い核酸配列を指す。非ネイティブ核酸配列は、プラスミドまたは染色体上に存在しうる。一部の実施形態では、本開示の遺伝子操作された細菌は、ある遺伝子を有し、遺伝子は、前記遺伝子と自然には関連していない誘導性プロモーター、例えば、免疫モジュレーターをコードする遺伝子に作動可能に連結したＦＮＲ応答性プロモーター（または本明細書に記載の他のプロモーター）に直接または間接的に作動可能に連結している。
一実施形態では、エフェクターまたは免疫モジュレーターは、少なくとも１つの非ネイティブ遺伝子によってコードされる治療用分子である。一実施形態では、エフェクターまたは免疫モジュレーターは、少なくとも１つの非ネイティブ遺伝子によってコードされる酵素によって産生される治療用分子である。一実施形態では、エフェクターまたは免疫モジュレーターは、少なくとも１つの非ネイティブ遺伝子によってコードされる生合成経路の少なくとも１つの酵素である。別の実施形態では、エフェクターまたは免疫モジュレーターは、少なくとも１つの非ネイティブ遺伝子によってコードされる生合成経路の少なくとも１つの酵素によって産生される少なくとも１つの分子である。
一実施形態では、免疫イニシエーターは、少なくとも１つの非ネイティブ遺伝子によってコードされる治療用分子である。一実施形態では、免疫イニシエーターは、少なくとも１つの非ネイティブ遺伝子によってコードされる酵素によって産生される治療用分子である。一実施形態では、免疫イニシエーターは、少なくとも１つの非ネイティブ遺伝子によってコードされる生合成経路の少なくとも１つの酵素である。別の実施形態では、免疫イニシエーターは、少なくとも１つの非ネイティブ遺伝子によってコードされる生合成経路の少なくとも１つの酵素によって産生される少なくとも１つの分子である。
一実施形態では、免疫サステナーは、少なくとも１つの非ネイティブ遺伝子によってコードされる治療用分子である。一実施形態では、免疫サステナーは、少なくとも１つの非ネイティブ遺伝子によってコードされる酵素によって産生される治療用分子である。一実施形態では、免疫サステナーは、少なくとも１つの非ネイティブ遺伝子によってコードされる生合成経路の少なくとも１つの酵素である。別の実施形態では、免疫サステナーは、少なくとも１つの非ネイティブ遺伝子によってコードされる生合成経路の少なくとも１つの酵素によって産生される少なくとも１つの分子である。
「構成的プロモーター」は、その制御下にある、および／またはそれが作動可能に連結した、コード配列または遺伝子の連続転写を助長することができる、プロモーターを指す。構成的プロモーターおよびバリアントは、当技術分野において周知であり、構成的プロモーターの非限定的な例は、本明細書、および２０１７年１月１１日に出願され、ＷＯ２０１７／１２３６７５として公開された、国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０１３０７２に記載されており、その内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。一部の実施形態では、そのようなプロモーターは、ｉｎ ｖｉｔｒｏで、例えば、培養、拡大増殖および／または製造条件下で、活性である。一部の実施形態では、そのようなプロモーターは、ｉｎ ｖｉｖｏで、例えば、ｉｎ ｖｉｖｏ環境、例えば、消化管および／または腫瘍微小環境に見られる条件で、活性である。
本明細書で使用される場合、「安定に維持された」または「安定な」細菌またはウイルスは、非ネイティブ遺伝物質、例えば免疫モジュレーターを保有して、非ネイティブ遺伝物質が保持され、発現され、増やされるような、細菌またはウイルス宿主細胞を指すために使用される。安定な細菌またはウイルスは、ｉｎ ｖｉｔｒｏで、例えば培地中で、ならびに／またはｉｎ ｖｉｖｏで、例えば、低酸素および／もしくは壊死組織において、生存および／または成長することができる。例えば、安定な細菌またはウイルスは、免疫モジュレーターをコードする非ネイティブ遺伝物質を含む、遺伝子操作された細菌であって、非ネイティブ遺伝物質を保有するプラスミドまたは染色体が、細菌またはウイルスにおいて安定に維持されて、免疫モジュレーターを細菌またはウイルスにおいて発現することができ、細菌およびウイルスがｉｎ ｖｉｔｒｏおよび／またはｉｎ ｖｉｖｏで生存および／または成長することができるような、細菌でありうる。
本明細書で使用する場合、「モジュレートする」および「処置する」という用語ならびにそれらの同語源語は、がん、またはその少なくとも１つの認識できる症状の改善を指す。他の実施形態では、「モジュレートする」および「処置する」は、患者によって必ずしも認識されうるとは限らない、少なくとも１つの測定可能な物理的パラメーターの改善を指す。別の実施形態では、「モジュレートする」および「処置する」は、がんの進行を、身体的に（例えば、認識できる症状の安定化）、生理的に（例えば、物理的パラメーターの安定化）または両方により、阻害することを指す。別の実施形態では、「モジュレートする」および「処置する」は、がんの進行を緩徐化することまたは進行を好転させることを指す。本明細書で使用される場合、「予防する」およびその同語源語は、所与のがんの獲得の開始を遅らせること、またはその獲得リスクを低下させることを指す。
処置を必要とする者は、特定のがんを既に有する個体はもちろん、がんを有するリスクがある、または最終的にがんにかかる可能性がある個体を含みうる。処置の必要性は、例えば、がんの発症に関連する１つもしくは複数のリスク因子（例えば、アルコール使用、タバコ使用、肥満、紫外線への過度の曝露、高いエストロゲンレベル、家族歴、遺伝的感受性）の存在、がんの存在もしくは進行、または可能性としてがんを有する対象の処置に対する受容性によって評定される。がんは、ゲノム不安定性および罹患細胞内の高い突然変異率によって引き起こされる。がんの処置は、がんに関連する症状の除去、ならびに／または対象の腫瘍の成長および／もしくは体積のモジュレーションを包含し得、がんの根本原因、例えば、根底にある遺伝的素因の除去を必ずしも包含しない。
本明細書で使用される場合、用語「従来のがん処置」または「従来のがん治療（法）」は、ほとんどの医療専門家によって広く受入れられ、使用されている、処置または治療（法）を指す。それは、幅広く使用されていない代替または補完療法とは異なる。がんのための従来の処置の例としては、外科手術、化学療法、標的療法、放射線治療、トモセラピー、免疫療法、がんワクチン、ホルモン療法、温熱療法、幹細胞移植（末梢血、骨髄、および臍帯血移植）、光線力学的療法、治療、ならびに血液製剤輸血および輸注が挙げられる。
本明細書で使用される場合、「医薬組成物」は、生理学的に適切な担体および／または賦形剤のような他の成分を伴う本開示の遺伝子操作された微生物の調製物を指す。
同義で使用されうる句「生理学的に許容される担体」および「薬学的に許容される担体」は、生物を有意に刺激しない、かつ投与される細菌性またはウイルス性化合物の生物活性および生物学的特性を消失させない、担体または希釈剤を指す。アジュバントは、これらの句のもとに含まれる。
用語「賦形剤」は、活性成分の投与をさらに助長するために医薬組成物に添加される不活性物質を指す。例としては、重炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、様々な糖および様々な種類のデンプン、セルロース誘導体、ゼラチン、植物油、ポリエチレングリコール、ならびに界面活性剤（例えば、ポリソルベート２０を含む）が挙げられるが、これらに限定されない。
用語「治療有効用量」および「治療有効量」は、状態、例えばがんの予防、症状開始の遅延、または症状の改善をもたらす、化合物の量を指すために使用される。治療有効量は、例えば、がん性細胞に関連する障害の１つもしくは複数の症状の処置、予防、重症度低下、開始遅延、および／または発生リスク低下に十分でありうる。治療有効量、ならびに治療に有効な投与頻度は、当技術分野において公知の方法および下段で論じられる方法により決定することができる。
一部の実施形態では、「治療用分子」という用語は、状態、例えば、がんの予防、症状開始の遅延、または症状の改善をもたらす、分子または化合物を指す。一部の実施形態では、治療用分子は、とりわけ、例えば、サイトカイン、ケモカイン、単鎖抗体、リガンド、代謝変換因子、例えば、アルギニン、キヌレニン消費物質、もしくはアデノシン消費物質、Ｔ細胞共刺激受容体、Ｔ細胞共刺激受容体リガンド、操作化学療法、または溶解性ペプチドであり得る。
本明細書で使用される場合、冠詞「ａ」および「ａｎ」は、相反する明確な指示がない限り、「少なくとも１つ」を意味すると解されたい。
リスト内の要素間に使用される場合の句「および／または」は、（１）挙げられている単一の要素のみが存在すること、または（２）リストの１つより多い要素が存在することのいずれかを意味するように意図されている。例えば、「Ａ、Ｂ、および／またはＣ」は、選択が、Ａ単独、Ｂ単独、Ｃ単独、ＡとＢ、ＡとＣ、ＢとＣ、またはＡ、ＢおよびＣでありうることを示す。句「および／または」は、リスト中の要素「の少なくとも１つ」または「の１つもしくは複数」と同義で使用されうる。
細菌
一実施形態では、改変された微生物は、細菌、例えば、遺伝子操作された細菌であり得る。本開示の改変された微生物、または遺伝子操作された微生物、例えば、改変された細菌は、エフェクターおよび／または免疫モジュレーターを局所的にかつ腫瘍特異的に送達することができ、それによって、前記分子の全身投与に関連する全身性の細胞傷害性および／または免疫不全を低減させることができる。操作された細菌は、全身、経口、局所および／または腫瘍内投与することができる。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、がん性細胞、特に、腫瘍の低酸素領域のがん性細胞を標的とすることができ、エフェクター分子、例えば、本明細書で提供される免疫モジュレーター（例えば、免疫刺激因子または免疫サステナー）を産生することができる。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、低酸素条件、例えば腫瘍の低酸素環境、により活性化されるプロモーターの制御下でエフェクター、例えば 、免疫モジュレーターを発現する、細菌である。
一部の実施形態では、腫瘍を標的とする微生物は、天然にそれ自体をがん性細胞、壊死組織および／または低酸素組織に方向付けることができる、細菌である。例えば、腫瘍の細菌コロニー形成を、細菌のまたは宿主のいかなる特異的遺伝子改変もなく、達成することができる（Ｙｕら、２００８年）。一部の実施形態では、腫瘍を標的とする細菌は、天然にそれ自体をがん性細胞、壊死組織および／または低酸素組織に方向付けることができないが、それをするように遺伝子操作されている細菌である。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、血行性に拡散して標的腫瘍に達する。細菌感染は、腫瘍退縮と結び付けられており（Ｈａｌｌ、１９９８年；ＮａｕｔｓおよびＭｃＬａｒｅｎ、１９９０年）、ある特定の細菌種は、壊死性哺乳動物腫瘍に局在し、それらを溶解することが示されている（ＪａｉｎおよびＦｏｒｂｅｓ、２００１年）。腫瘍を標的とする細菌の非限定的な例は、表３に示される。
一部の実施形態では、目的の遺伝子が細菌内で発現され、これにより、免疫療法の有効性が増強される。最近の研究は、マウスにおいて、ある特定の種類の消化管微小生物の存在が、毒性副作用を増大させることなくがん免疫療法の抗腫瘍効果を増強することができることを示唆している（Ｍ．Ｖｅｔｉｚｏｕら、「Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ ｂｙ ＣＴＬＡ−４ ｂｌｏｃｋａｄｅ ｒｅｌｉｅｓ ｏｎ ｔｈｅ ｇｕｔ ｍｉｃｒｏｂｉｏｔａ」、Ｓｃｉｅｎｃｅ、ｄｏｉ：１０．１１２６／ａａｄ１３２９、２０１５年；Ａ．Ｓｉｖａｎら、「Ｃｏｍｍｅｎｓａｌ Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｒｏｍｏｔｅｓ ａｎｔｉｔｕｍｏｒ ｉｍｍｕｎｉｔｙ ａｎｄ ｆａｃｉｌｉｔａｔｅｓ ａｎｔｉ−ＰＤ−Ｌ１ ｅｆｆｉｃａｃｙ」、Ｓｃｉｅｎｃｅ、ｄｏｉ：０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ．ａａｃ４２５５、２０１５年）。これらのマウス研究で同定された消化管微生物種に人間でも同じ効果があるかどうかは、明らかでない。Ｖｅｔｉｚｏｕら（２０１５年）には、マウスにおいておよび患者においてＣＴＬＡ−４遮断の有効性と関連付けられた、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｔｈｅｔａｉｏｔａｏｍｉｃｒｏｎまたはＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｆｒａｇｉｌｉｓに特異的なＴ細胞応答が記載されている。Ｓｉｖａｎら（２０１５年）は、黒色腫のマウスモデルにおいて、抗腫瘍免疫にとっての、および（ＰＤ−１リガンド）有効性に対する抗ＰＤ−Ｌ１抗体にとっての、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍの重要性を説明している。一部の実施形態では、１つまたは複数の免疫モジュレーターを発現する細菌は、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓである。一部の実施形態では、１つまたは複数の免疫モジュレーターを発現する細菌は、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍである。一部の実施形態では、１つまたは複数の免疫モジュレーターを発現する細菌は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ Ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅである。一部の実施形態では、１つまたは複数の免疫モジュレーターを発現する細菌は、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｎｏｖｙｉ−ＮＴである。一部の実施形態では、１つまたは複数の免疫モジュレーターを発現する細菌は、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｕｔｙｒｉｃｕｍ ｍｉｙａｉｒｉである。
ある特定の実施形態では、改変された微生物または遺伝子操作された細菌は、偏性嫌気性細菌である。ある特定の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、通性嫌気性細菌である。ある特定の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、好気性細菌である。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、グラム陽性菌であり、ＬＰＳを欠く。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、グラム陰性菌である。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、グラム陽性かつ偏性嫌気性の細菌である。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、グラム陽性かつ通性嫌気性の細菌である。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、非病原性細菌である。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、共生細菌である。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、プロバイオティック細菌である。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、病原性を低下させるようにまたは除去するように改変または突然変異されている、天然に病原性の細菌である。例示的細菌としては、これらに限定されないが、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉａ、Ｃａｕｌｏｂａｃｔｅｒ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｖｉｂｒｉｏ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏａｇｕｌａｎｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｆｒａｇｉｌｉｓ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｔｈｅｔａｉｏｔａｏｍｉｃｒｏｎ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｄｏｌｅｓｃｅｎｔｉｓ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｉｆｉｄｕｍ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｒｅｖｅ ＵＣＣ２００３、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｎｆａｎｔｉｓ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌａｃｔｉｓ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｕｔｙｒｉｃｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｕｔｙｒｉｃｕｍ Ｍ−５５、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｕｔｙｒｉｃｕｍ ｍｉｙａｉｒｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｃｏｃｈｌｅａｒｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｆｅｌｓｉｎｅｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｍｕｌｔｉｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｎｏｖｙｉ−ＮＴ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐａｒａｐｕｔｒｉｆｉｃｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐａｓｔｅｕｒｅａｎｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｃｔｉｎｏｖｏｒｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｒｏｓｅｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｐｏｒｏｇｅｎｅｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｅｒｔｉｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｅｔａｎｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｙｒｏｂｕｔｙｒｉｃｕｍ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＭＧ１６５５、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅ １９１７、Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｏｖｉｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｃｈｏｌｅｒａｅｓｕｉｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａ、および表３に示されている細菌が挙げられる。ある特定の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｕｍ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｓｅｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｒａｃａｓｅｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｅｕｔｅｒｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｈａｍｎｏｓｕｓ、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ、およびＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｂｏｕｌａｒｄｉｉからなる群から選択される。ある特定の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｆｒａｇｉｌｉｓ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｔｈｅｔａｉｏｔａｏｍｉｃｒｏｎ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｉｆｉｄｕｍ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｎｆａｎｔｉｓ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌａｃｔｉｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｕｔｙｒｉｃｕｍ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｅｕｔｅｒｉ、およびＬａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓからなる群から選択される。一部の実施形態では、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓが、１つまたは複数の免疫モジュレーターの腫瘍特異的送達に使用される。静脈内注射されたＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｓｅｉは、腫瘍内に蓄積し、これが、一般に使用されるＮＯ供与体であるニトログリセリン（ＮＧ）により、おそらく乏血管性腫瘍への血流を増加させる上でのＮＯの役割に起因して増進されたことが以前に判明している（Ｆａｎｇら、２０１６年（Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．２０１６年；１４０９巻：９〜２３頁．Ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ ｏｆ Ｔｕｍｏｒ−Ｔａｒｇｅｔｅｄ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉａ ｗｉｔｈ Ｎｉｔｒｏｇｌｙｃｅｒｉｎ Ｉｎｖｏｌｖｉｎｇ Ａｕｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ＥＰＲ Ｅｆｆｅｃｔ）。
一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、偏性嫌気性菌である。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａであり、免疫モジュレーターを腫瘍特異的に送達することができる。Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａは、胞子を産生し、天然にコロニー形成することができ、低酸素腫瘍を溶解することができる場合もある、偏性嫌気性細菌である（Ｇｒｏｏｔら、２００７年）。実験的モデルにおいて、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａは、プロドラッグ変換酵素を送達するために、および放射線療法を増強させるために、使用されている（Ｇｒｏｏｔら、２００７年）。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｎｏｖｙｉ−ＮＴ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃｉｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｅｔａｎｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｏｎｃｏｌｙｔｉｃｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｐｏｒｏｇｅｎｅｓ、およびＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉからなる群から選択される（Ｌｉｕら、２０１４年）。一部の実施形態では、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍは、天然に非病原性である。例えば、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｏｎｃｏｌｙｔｉｃｕｍは、病原性であり、腫瘍細胞を溶解することができる。代替実施形態では、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍは、天然に病原性であるが、病原性を低下させるようにまたは除去するように改変される。例えば、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｎｏｖｙｉは、天然に病原性であり、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｎｏｖｙｉ−ＮＴは、致死性毒素を除去するように改変されている。Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｎｏｖｙｉ−ＮＴおよびＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｐｏｒｏｇｅｎｅｓは、がんを処置するために側鎖ＨＩＦ−１α抗体を送達するために使用されており、「優れた腫瘍コロニー形成性Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ株」である（Ｇｒｏｏｔら、２００７年）。
一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、通性嫌気性菌である。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、例えば、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍであり、免疫モジュレーターを腫瘍特異的に送達することができる。Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａは、通性嫌気性菌である、非胞子形成性グラム陰性菌である。一部の実施形態では、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａは、天然に病原性であるが、病原性を低下させるようにまたは除去するように改変される。例えば、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍは、病原性部位を除去するように改変される（弱毒化される）。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍであり、免疫モジュレーターを腫瘍特異的に送達することができる。Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍは、グラム陽性、分岐状嫌気性細菌である。一部の実施形態では、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍは、天然に非病原性である。代替実施形態では、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍは、天然に病原性であるが、病原性を低下させるようにまたは除去するように改変される。ＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍおよびＳａｌｍｏｎｅｌｌａは、腫瘍の低酸素で壊死の領域を優先的に標的とし、そこで複製することが示されている（Ｙｕら、２０１４年）。
一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、グラム陰性菌である。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、Ｅ．ｃｏｌｉである。例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅは、経口投与または静脈内投与のどちらかの後、ｉｎ ｖｉｖｏで腫瘍組織に優先的にコロニー形成することが示されている（Ｚｈａｎｇら、２０１２年およびＤａｎｉｎｏら、２０１５年）。Ｅ．ｃｏｌｉは、確固たる腫瘍特異的複製を示すことも示されている（Ｙｕら、２００８年）。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、「最もよく特徴付けられているプロバイオティクスの１つに進化した」Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ科のグラム陰性細菌である（Ｕｋｅｎａら、２００７年）、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅ １９１７株（Ｅ．ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅ）である。この株は、その完全な無害性（Ｓｃｈｕｌｔｚ、２００８年）を特徴とし、ＧＲＡＳ（一般的に安全と認められる）状態（Ｒｅｉｓｔｅｒら、２０１４年、この文献を強調しておく）を有する。
本発明の遺伝子操作された細菌は、例えば組織または血清中の防御因子により、破壊されうる（Ｓｏｎｎｅｎｂｏｒｎら、２００９年）。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、反復投与される。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、１回投与される。
ある特定の実施形態では、本明細書に記載のエフェクターおよび／または免疫モジュレーター（複数可）は、遺伝子操作された細菌の１つの種、株または亜型において発現される。代替実施形態では、エフェクターおよび／または免疫モジュレーターは、遺伝子操作された細菌の２つまたはそれより多い種、株および／または亜型において発現される。当業者には、本明細書で開示される遺伝子改変を、他の細菌の種、株および亜型のために改変し、それらに適応させることができることは理解されるであろう。
適切である細菌の他の例は、国際特許出願公開ＷＯ／２０１４／０４３５９３に記載されており、この内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。一部の実施形態では、そのような細菌は、１つまたは複数の病原性因子を弱毒化するように突然変異されている。
一部の実施形態では、本開示の遺伝子操作された細菌は、増殖し、腫瘍にコロニー形成する。一部の実施形態では、コロニー形成は、数日間、数週間、数カ月間、数年間、または無期限に、持続する。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、腫瘍において増殖せず、細菌の数は、注射後、検出できなくなるまで、急速に、例えば、注射後１週間も経たずに、低下する。
バクテリオファージ
一部の実施形態では、本開示の遺伝子操作された細菌は、その天然の状態に、１つまたは複数の溶原性、休眠、テンペレート、インタクト、欠損、潜在、またはサテライトファージまたはバクテリオシン／ファージ尾部、または遺伝子移入剤を含む。一部の実施形態では、プロファージまたはバクテリオファージは、目的の特定の細菌のすべての分離株に存在する。一部の実施形態では、細菌は、そのようなバクテリオファージの１つまたは複数を含む、親株の遺伝子操作された誘導体である。本明細書に記載される実施形態のいずれにおいても、細菌は、バクテリオファージの特性または挙動を変化させるプロファージまたはバクテリオファージのゲノム内に、１つまたは複数の改変または突然変異を含み得る。一部の実施形態では、改変または突然変異は、プロファージが、溶解性プロセスに入ることまたは溶解性プロセスを完了することを防止する。一部の実施形態では、改変または突然変異は、ファージが、同じかまたは異なる種類の他の細菌に感染するのを防止する。一部の実施形態では、改変または突然変異は、細菌宿主の適応度を変化させる。一部の実施形態では、改変または突然変異は、細菌宿主の適応度を変化させない。一部の実施形態では、改変または突然変異は、遺伝子操作された細菌の所望のエフェクター機能に対して、例えば、エフェクター分子、例えば、免疫モジュレーター、例えば、免疫刺激因子またはサステナーの発現のレベルに対して、影響を有する。一部の実施形態では、改変または突然変異は、所望の機能に対して、例えば、エフェクター分子の発現のレベルに対して、またはエフェクター分子の活性のレベルに対して、影響を有さない。
ファージゲノムのサイズは、多様であり、最も小さいものでＬｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃファージＬ５（２，４３５ｂｐ）、約１１．５ｋｂｐ（例えば、ＭｙｃｏｐｌａｓｍａファージＰ１）、約２１ｋｂｐ（例えば、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓファージｃ２）、および約３０ｋｂｐ（例えば、ＰａｓｔｅｕｒｅｌｌａファージＦ１０８）から、ほぼ５００ｋｂｐのＢａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍファージＧのゲノムまでの範囲である（ＨａｔｆｕｌｌおよびＨｅｎｄｒｉｘ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ Ｇｅｎｏｍｅｓ、Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｖｉｒｏｌ．、２０１１年１０月１日、１巻（４号）：２９８〜３０３頁、ならびにその中の参考文献）。ファージゲノムは、１０個よりも少ない遺伝子〜最大数百個の遺伝子をコードし得る。テンペレートファージまたはプロファージは、典型的に、細菌宿主の染色体に組み込まれるが、細菌プラスミドに組み込まれるファージのいくつかの例もまた、存在する（Ｌｉｔｔｌｅ、Ｌｏｙｓｏｇｅｎｙ， Ｐｒｏｐｈａｇｅ Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ， ａｎｄ Ｌｙｓｏｇｅｎｉｃ Ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ． Ｉｎ： Ｗａｌｄｏｒ ＭＫ、Ｆｒｉｅｄｍａｎ ＤＩ、Ａｄｈｙａ Ｓ編、Ｐｈａｇｅｓ Ｔｈｅｉｒ Ｒｏｌｅ ｉｎ Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ． Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ ＤＣ： ＡＳＭ Ｐｒｅｓｓ、２００５年、３７〜５４頁）。一部の事例では、ファージは、常に、細菌宿主の染色体内の同じ位置に位置しており、この位置は、各ファージに特異的である、すなわち、異なるファージは、異なる位置に位置する。他のファージは、多数の異なる場所に組み込まれ得る。
したがって、本開示の細菌は、長さが、少なくとも約１ｂｐ〜１０ｋｂ、少なくとも約１０ｋｂ〜２０ｋｂ、少なくとも約２０ｋｂ〜３０ｋｂ、少なくとも約３０ｋｂ〜４０ｋｂ、少なくとも約３０ｋｂ〜４０ｋｂ、少なくとも約４０ｋｂ〜５０ｋｂ、少なくとも約５０ｋｂ〜６０ｋｂ、少なくとも約６０ｋｂ〜７０ｋｂ、少なくとも約７０ｋｂ〜８０ｋｂ、少なくとも約８０ｋｂ〜９０ｋｂ、少なくとも約９０ｋｂ〜１００ｋｂ、少なくとも約１００ｋｂ〜１２０ｋｂ、少なくとも約１２０ｋｂ〜１４０ｋｂ、少なくとも約１４０ｋｂ〜１６０ｋｂ、少なくとも約１６０ｋｂ〜１８０ｋｂ、少なくとも約１８０ｋｂ〜２００ｋｂ、少なくとも約２００ｋｂ〜１８０ｋｂ、少なくとも約１６０ｋｂ〜２５０ｋｂ、少なくとも約２５０ｋｂ〜３００ｋｂ、少なくとも約３００ｋｂ〜３５０ｋｂ、少なくとも約３５０ｋｂ〜４００ｋｂ、少なくとも約４００ｋｂ〜５００ｋｂ、少なくとも約５００ｋｂ〜１０００ｋｂ変動し得る、１つまたは複数のファージゲノムを含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、長さが１０００ｋｂを超えるバクテリオファージゲノムを含む。
一部の実施形態では、本開示の細菌は、１つまたは複数のポリペプチドをコードする１つまたは複数の遺伝子を含む、１つまたは複数のファージゲノムを含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、少なくとも約１〜５個の遺伝子、少なくとも約５〜１０個の遺伝子、少なくとも約１０〜１５個の遺伝子、少なくとも約１５〜２０個の遺伝子、少なくとも約２０〜２５個の遺伝子、少なくとも約２５〜３０個の遺伝子、少なくとも約３０〜３５個の遺伝子、少なくとも約３５〜４０個の遺伝子、少なくとも約４０〜４５個の遺伝子、少なくとも約４５〜５０個の遺伝子、少なくとも約５０〜５５個の遺伝子、少なくとも約５５〜６０個の遺伝子、少なくとも約６０〜６５個の遺伝子、少なくとも約６５〜７０個の遺伝子、少なくとも約７０〜７５個の遺伝子、少なくとも約７５〜８０個の遺伝子、少なくとも約８０〜８５個の遺伝子、少なくとも約８５〜９０個の遺伝子、少なくとも約９０〜９５個の遺伝子、少なくとも約９５〜１００個の遺伝子、少なくとも約１００〜１１５個の遺伝子、少なくとも約１１５〜１２０個の遺伝子、少なくとも約１２０〜１２５個の遺伝子、少なくとも約１２５〜１３０個の遺伝子、少なくとも約１３０〜１３５個の遺伝子、少なくとも約１３５〜１４０個の遺伝子、少なくとも約１４０〜１４５個の遺伝子、少なくとも約１４５〜１５０個の遺伝子、少なくとも約１５０〜１６０個の遺伝子、少なくとも約１６０〜１７０個の遺伝子、少なくとも約１７０〜１８０個の遺伝子、少なくとも約１８０〜１９０個の遺伝子、少なくとも約１９０〜２００個の遺伝子、少なくとも約２００〜３００個の遺伝子を含む、バクテリオファージゲノムを含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、約３００個より多くの遺伝子を含む、バクテリオファージゲノムを含む。
一部の実施形態では、ファージは、特定の種では、常に、またはほぼ常に、細菌宿主の染色体内で、同じ場所または位置に位置する。一部の実施形態では、ファージは、特定の種では、宿主の染色体内で、異なる場所に組み込まれることが見出されている。一部の実施形態では、ファージは、プラスミド上に位置する。
一部の実施形態では、プロファージは、欠損プロファージまたは潜在プロファージであり得る。欠損プロファージは、もはや溶解性サイクルを受け得ない。潜在プロファージは、溶解性サイクルを受けることができないか、または溶解性サイクルを受けたことがない場合がある（Ｂｏｂａｙら、２０１４年）。一部の実施形態では、細菌は、１つまたは複数のサテライトファージゲノムを含む。サテライトファージは、それら自体の構造タンパク質遺伝子を有さない、その他の点では機能性のファージであり、他の特定のファージの構造タンパク質によるカプセル被包のために構成されるゲノムを有する（ＳｉｘおよびＫｌｕｇ Ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ Ｐ４： ａ ｓａｔｅｌｌｉｔｅ ｖｉｒｕｓ ｄｅｐｅｎｄｉｎｇ ｏｎ ａ ｈｅｌｐｅｒ ｓｕｃｈ ａｓ ｐｒｏｐｈａｇｅ Ｐ２、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、５１巻、２号、１９７３年２月、３２７〜３４４頁）。
一部の実施形態では、細菌は、１つまたは複数のテイロシン（ｔａｉｌｉｏｃｉｎ）を含む。グラム陽性およびグラム陰性の両方の多くの細菌は、付随するファージ頭部なしで機能性であるファージ尾部に似た様々な粒子を産生し（テイロシンと称される）、それらの多くは、バクテリオシン特性を有することが示されている（ＧｈｅｑｕｉｒｅおよびＭｏｔ、Ｔｈｅ Ｔａｉｌｏｃｉｎ Ｔａｌｅ： Ｐｅｅｌｉｎｇ ｏｆｆ Ｐｈａｇｅ； Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、２０１５年１０月、２３巻、１０号において概説されている）。ファージ尾部様バクテリオシンは、収縮性ファージ尾部様（Ｒ型）および非収縮性であるが可動性であるもの（Ｆ型）の２つの異なるファミリーに分類される。一部の実施形態では、細菌は、１つまたは複数の遺伝子移入剤を含む。遺伝子移入剤（ＧＴＡ）は、一部の細菌ゲノムによってコードされるファージ様エレメントである。ＧＴＡは、ファージに似ているが、典型的なファージを定義する特徴的な能力が欠如しており、宿主細胞のＤＮＡのランダムな断片をパッケージングし、次いで、それらを、同じ種の他の細菌へと横方向に移入する（Ｌａｎｇら、Ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ ａｇｅｎｔｓ： ｐｈａｇｅ−ｌｉｋｅ ｅｌｅｍｅｎｔｓ ｏｆ ｇｅｎｅｔｉｃ ｅｘｃｈａｎｇｅ、Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、２０１２年６月１１日、１０巻（７号）：４７２〜４８２頁において概説されている）。そこで、ＤＮＡが、常在する同種染色体領域を、相同組換えによって置き換え得る。しかし、これらの粒子は、粒子の大半が、ＧＴＡをコードする遺伝子を有していないため、ウイルスとして繁殖することはできない。一部の実施形態では、細菌は、１つまたは複数の繊維状ビリオンを含む。繊維状ビリオンは、ｄｓＤＮＡプロファージとして組み込まれる（Ｍａｒｖｉｎ ＤＡら、Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ ａｓｓｅｍｂｌｙ ｏｆ ｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓ ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅｓ、Ｐｒｏｇ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．、２０１４年４月、１１４巻（２号）：８０〜１２２頁において概説されている）。これらの実施形態のいずれにおいても、本明細書に記載される細菌は、それらの配列内に１つまたは複数の改変または突然変異を含み得る、欠損または潜在プロファージ、サテライトファージゲノム、テイロシン、遺伝子移入剤、繊維状ビリオンを含む。
プロファージは、実験またはコンピュータ計算のいずれかで、特定することができる。実験的アプローチは、宿主細菌を、ＵＶ光または他のＤＮＡ損傷条件に曝露することによって、ファージ粒子を放出するように誘導することを含む。しかし、一部の事例では、プロファージが誘導される条件は未知であり、したがって、プラークアッセイにおけるプラークの非存在は、必ずしも、プロファージの非存在を証明するものではない。加えて、このアプローチは、生存可能なファージの存在を示すことができるだけであり、欠損プロファージを明らかにするものではない。そのため、コンピュータ計算によるゲノム配列データからのプロファージの同定が、最も好ましい経路となっている。
２０１８年６月２１日に出願され、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、同時係属中の国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ１８／３８８４０は、Ｐｈａｓｔｅｒスコア付けによって決定される細菌ゲノムに含有されるいくつかの潜在的なバクテリオファージを含有する、プロバイオティック細菌の非限定的な例を提供している。Ｐｈａｓｔｅｒスコア付けは、ｐｈａｓｔｅｒ．ｃａおよびＺｈｏｕら（「ＰＨＡＳＴ： Ａ Ｆａｓｔ Ｐｈａｇｅ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ」、Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、（２０１１年）、３９巻（付録２）：Ｗ３４７〜Ｗ３５２頁）およびＡｒｎｄｔら（Ａｒｎｄｔら、（２０１６年）、ＰＨＡＳＴＥＲ： ａ ｂｅｔｔｅｒ， ｆａｓｔｅｒ ｖｅｒｓｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ＰＨＡＳＴ ｐｈａｇｅ ｓｅａｒｃｈ ｔｏｏｌ． Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、２０１６年５月３日）に詳細に記載されている。簡単に述べると、３つの方法を、異なる基準で適用して、提供された細菌ゲノム配列内のプロファージ領域を（インタクト、問題あり、または不完全として）スコア付けする。
本明細書に記載される実施形態のいずれにおいても、本明細書に記載される細菌は、既存のプロファージまたはバクテリオファージゲノム内の１つまたは複数の改変または突然変異を含み得る。一部の実施形態では、これらの改変は、プロファージの特性または挙動を変化させる。一部の実施形態では、改変または突然変異は、プロファージが、溶解性プロセスに入ることまたは溶解性プロセスを完了することを防止する。一部の実施形態では、改変または突然変異は、ファージが、同じかまたは異なる種類の他の細菌に感染するのを防止する。一部の実施形態では、改変または突然変異は、細菌宿主の適応度を変化させる。一部の実施形態では、改変または突然変異は、細菌宿主の適応度を変化させない。一部の実施形態では、改変または突然変異は、例えば、遺伝子操作された細菌の所望のエフェクター機能に対する影響を有する。一部の実施形態では、改変または突然変異は、例えば、遺伝子操作された細菌の所望のエフェクター機能に対する影響を有さない。
一部の実施形態では、改変または突然変異は、プロファージ溶解性プロセスの侵入または完了を、少なくとも約１〜２倍、少なくとも約２〜３倍、少なくとも約３〜４倍、少なくとも約４〜５倍、少なくとも約５〜１０倍、少なくとも約１０〜１００倍、少なくとも約１００〜１０００倍、低減させる。一部の実施形態では、改変または突然変異は、プロファージ溶解性プロセスの侵入または完了を完全に予防する。
一部の実施形態では、改変または突然変異は、プロファージ溶解性プロセスの侵入または完了を、少なくとも約１％〜１０％、少なくとも約１０％〜２０％、少なくとも約２０％〜３０％、少なくとも約３０％〜４０％、少なくとも約４０％〜５０％、少なくとも約５０％〜６０％、少なくとも約６０％〜７０％、少なくとも約７０％〜８０％、少なくとも約８０％〜９０％、または少なくとも約９０％〜１００％、低減させる。
一部の実施形態では、突然変異は、ファージゲノム配列内の１つまたは複数の欠失を含む。一部の実施形態では、突然変異は、ファージゲノム配列への１つまたは複数の挿入を含む。一部の実施形態では、抗生物質カセットが、ファージゲノム配列内の１つまたは複数の位置に挿入され得る。一部の実施形態では、突然変異は、ファージゲノム配列内の１つまたは複数の置換を含む。一部の実施形態では、突然変異は、ファージゲノム配列内の１つまたは複数の逆転を含む。一部の実施形態では、ファージゲノム内の改変は、１つまたは複数のファージゲノム遺伝子内の挿入、欠失、置換、または逆転のうちの２つまたはそれよりも多くの組合せである。本明細書に記載される実施形態のいずれにおいても、改変は、ファージゲノム内の１つまたは複数の遺伝子の１つまたは複数のフレームシフト突然変異をもたらし得る。
これらの実施形態のいずれにおいても、突然変異は、様々な機能のタンパク質、例えば、細胞溶解、例えば、プロテアーゼまたはリシン、毒素、抗生物質耐性、翻訳、構造（例えば、頭部、尾部、カラー、またはコーティングタンパク質）、バクテリオファージアセンブリ、組換え（例えば、インテグラーゼ、インベルターゼ、またはトランスポサーゼ）、または複製（例えば、プライマーゼ、ｔＲＮＡ関連タンパク質）、ファージ挿入、付加、パッケージング、またはターミナーゼをコードする１つまたは複数の遺伝子内に位置するか、またはそれを包含し得る。
一部の実施形態では、本明細書に記載される遺伝子操作された細菌は、操作されたＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ株Ｎｉｓｓｌｅ １９１７（Ｅ．ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅ）である。２０１８年６月２１日に出願され、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる同時係属中の国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ１８／３８８４０に記載されており、本明細書では実施例においてより詳細に記載されているように、慣例的な試験手順により、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅ １９１７（Ｅ．ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅ）および関連する操作された誘導体からのバクテリオファージ産生が同定されている。バクテリオファージの源を決定するために、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅおよび操作された誘導体のゲノムの共同研究によるバイオインフォマティクスアセスメントを行って、プロファージの形跡に関して株のゲノム配列を分析し、機能性ファージを産生する可能性について、任意の同定されたプロファージエレメントをアセスメントし、任意の機能性ファージエレメントを細菌ゲノム配列の中から同定された他の公知のファージと比較し、プロファージエレメントが他の配列決定されたＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ゲノムにおいて見出される頻度を評価した。アセスメントツールには、ファージ予測ソフトウェア（ＰＨＡＳＴおよびＰＨＡＳＴＥＲ）、ＳＰＡｄｅｓゲノムアセンブラーソフトウェア、変動性の低い配列を大きな参照ゲノムにマッピングするためのソフトウェア（ＢＷＡ ＭＥＭ）、ゲノム配列アライメントソフトウェア（ＭＵＭｍｅｒ）、およびＮａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ （ＮＣＢＩ）非冗長データベースが含まれた。アセスメント結果により、分析したＥ．ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅおよび操作された誘導体が、３つの候補プロファージエレメントを含有し、３つのうちの２つ（ファージ２およびファージ３）が、インタクトなファージゲノムの特徴であるほとんどの遺伝子特徴を含有することが示された。２つの他の可能性のあるファージエレメントもまた、同定された。注目すべきことに、操作された株は、親Ｅ．ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅにおいて同定されていない追加のファージエレメントを含有しておらず、これらの株によって産生されるプラーク形成単位は、これらの内在性ファージ（ファージ３）のうちの１つを起源とすることが示された。興味深いことに、ファージ３は、およそ６０００個の配列決定したＥ．ｃｏｌｉゲノムの集りの中で、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅに固有であるが、関連する配列は、短い相同性領域に限定されており、他の推定的プロファージエレメントは、少数のゲノムにおいて見出される。ファージ３は、誘導性であり、誘導されると細菌の細胞溶解をもたらすことが見出されたが、他のファージのいずれも、そう見出されなかった。
プロファージは、Ｅ．ｃｏｌｉ株で非常に一般的であり、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅは、配列決定したＥ．ｃｏｌｉゲノムの十分に特徴付けられたセットにおいて見出される平均数と比較して、比較的少数のプロファージ配列を含有する。そのため、操作された株におけるプロファージの存在は、この種の天然の状態の一部であり、分析した操作された株のプロファージ特徴は、前駆株Ｅ．ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅと一貫していた。
一部の実施形態では、本明細書に記載される細菌は、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノム内に、ファージ３の特性または挙動を変化させる１つまたは複数の改変または突然変異を含み得る。一部の実施形態では、改変または突然変異は、ファージ３が、溶解性プロセスに入ることまたは溶解性プロセスを完了することを防止する。一部の実施形態では、改変または突然変異は、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅファージ３が、同じかまたは異なる種類の他の細菌に感染するのを防止する。一部の実施形態では、改変または突然変異は、細菌宿主の適応度を改善する。一部の実施形態では、細菌宿主の有効な適応度がないことが、観察される。一部の実施形態では、改変または突然変異は、所望のエフェクター機能、例えば、免疫モジュレーターの発現に対する影響を有する。一部の実施形態では、所望のエフェクター機能、例えば、免疫モジュレーターの発現に対する影響は、観察されない。
一部の実施形態では、細菌の骨格（ｃｈａｓｓｉｓ）に導入される突然変異には、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノム配列内の１つまたは複数の欠失が含まれる。一部の実施形態では、突然変異には、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノム配列への１つまたは複数の挿入が含まれる。一部の実施形態では、抗生物質カセットが、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノム配列内の１つまたは複数の位置に挿入され得る。ファージ３内の突然変異は、同時係属中の米国仮出願第６２／５２３，２０２号および第６２／５５２，８２９号により詳細に記載されており、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
１つの特定の実施形態では、少なくとも約９０００〜１００００ｂｐのＥ．ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノムが、突然変異され、例えば、一例では、９６８７ｂｐのＥ．ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノムが、欠失される。
本明細書に記載される実施形態のいずれにおいても、改変は、ＥＣＯＬＩＮ＿０９９６５、ＥＣＯＬＩＮ＿０９９７０、ＥＣＯＬＩＮ＿０９９７５、ＥＣＯＬＩＮ＿０９９８０、ＥＣＯＬＩＮ＿０９９８５、ＥＣＯＬＩＮ＿０９９９０、ＥＣＯＬＩＮ＿０９９９５、ＥＣＯＬＩＮ＿１００００、ＥＣＯＬＩＮ＿１０００５、ＥＣＯＬＩＮ＿１００１０、ＥＣＯＬＩＮ＿１００１５、ＥＣＯＬＩＮ＿１００２０、ＥＣＯＬＩＮ＿１００２５、ＥＣＯＬＩＮ＿１００３０、ＥＣＯＬＩＮ＿１００３５、ＥＣＯＬＩＮ＿１００４０、ＥＣＯＬＩＮ＿１００４５、ＥＣＯＬＩＮ＿１００５０、ＥＣＯＬＩＮ＿１００５５、ＥＣＯＬＩＮ＿１００６５、ＥＣＯＬＩＮ＿１００７０、ＥＣＯＬＩＮ＿１００７５、ＥＣＯＬＩＮ＿１００８０、ＥＣＯＬＩＮ＿１００８５、ＥＣＯＬＩＮ＿１００９０、ＥＣＯＬＩＮ＿１００９５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１００、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１０５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１１０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１１５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１２０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１２５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１３０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１３５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１４０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１４５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１５０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１６０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１６５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１７０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１７５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１８０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１８５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１９０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１９５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２００、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２０５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２１０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２２０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２２５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２３０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２３５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２４０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２４５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２５０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２５５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２６０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２６５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２７０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２７５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２８０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２９０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２９５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０３００、ＥＣＯＬＩＮ＿１０３０５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０３１０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０３１５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０３２０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０３２５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０３３０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０３３５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０３４０およびＥＣＯＬＩＮ＿１０３４５から選択される１つまたは複数の遺伝子を包含し、そこに位置している。
一実施形態では、突然変異は、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１１０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１１５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１２０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１２５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１３０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１３５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１４０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１４５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１５０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１６０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１６５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１７０、およびＥＣＯＬＩＮ＿１０１７５のうちの１つまたは複数の完全または部分的な欠失である。一つの具体的な実施形態では、突然変異は、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１１０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１１５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１２０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１２５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１３０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１３５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１４０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１４５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１５０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１６０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１６５、およびＥＣＯＬＩＮ＿１０１７０、およびＥＣＯＬＩＮ＿１０１７５の完全または部分的な欠失である。一つの具体的な実施形態では、突然変異は、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１１０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１１５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１２０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１２５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１３０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１３５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１４０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１４５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１５０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１６０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１６５、およびＥＣＯＬＩＮ＿１０１７０の完全な欠失およびＥＣＯＬＩＮ＿１０１７５の完全な欠失である。一実施形態では、ファージゲノムの突然変異または欠失は、配列番号１２８５内の１つまたは複数の位置に位置している。一部の実施形態では、配列番号１４３２の少なくとも約０〜１％、１％〜１０％、１０％〜２０％、２０％〜３０％、３０％〜４０％、４０％〜５０％、５０％〜６０％、６０％〜７０％、７０％〜８０％、８０％〜９０％が、ファージゲノムから欠失されている。一部の実施形態では、配列番号１４３２の少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または少なくとも約１００％が、ファージゲノムから欠失されている。一部の実施形態では、配列番号１４３２の少なくとも約９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、または９０％が、ファージゲノムから欠失されている。一実施形態では、配列番号１４３２を含む配列は、ファージ３ゲノムから欠失されている。一実施形態では、配列番号１４３２の配列は、ファージ３ゲノムから欠失されている。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、配列番号１４３３を含む改変されたファージゲノム配列を含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、配列番号１４３３からなる改変されたファージゲノム配列を含む。
エフェクター分子
腫瘍溶解および自然免疫応答の活性化
ある特定の実施形態では、本開示のエフェクター分子または免疫モジュレーターは、自然抗腫瘍免疫応答を生成する。ある特定の実施形態では、本開示の免疫モジュレーターは、局所抗腫瘍免疫応答を生成する。一部の態様では、エフェクター分子または免疫モジュレーターは、遠位がん細胞に対する全身抗腫瘍免疫を活性化することができる。ある特定の実施形態では、免疫モジュレーターは、全身または適応抗腫瘍免疫応答を生成する。一部の実施形態では、免疫モジュレーターは、長期免疫学的記憶をもたらす。適切な免疫モジュレーター、例えば、免疫イニシエーターおよび／または免疫サステナーの例は、本明細書に記載されている。
一部の実施形態では、１つまたは複数の免疫モジュレーターは、本明細書に記載される改変された微生物によって産生され得る。他の実施形態では、１つまたは複数の免疫モジュレーターは、第２の免疫モジュレーターを産生することができる改変された微生物と組み合わせて、投与され得る。例えば、１つまたは複数の免疫イニシエーターは、１つまたは複数の免疫サステナーを産生することができる改変された微生物と組み合わせて、投与され得る。別の実施形態では、１つまたは複数の免疫サステナーは、１つまたは複数の免疫イニシエーターを産生することができる改変された微生物と組み合わせて、投与され得る。あるいは、１つまたは複数の第１の免疫イニシエーターは、１つまたは複数の第２の免疫イニシエーターを産生することができる改変された微生物と組み合わせて、投与され得る。あるいは、１つまたは複数の第１の免疫サステナーは、１つまたは複数の第２の免疫サステナーを産生することができる改変された微生物と組み合わせて、投与され得る。
腫瘍微小環境に見られる多くの免疫細胞は、パターン認識受容体（ＰＲＲ）を発現し、この受容体は、炎症誘発性シグナル伝達経路の活性化、食細胞応答（マクロファージ、好中球、および樹状細胞）の刺激、または分泌タンパク質としての微生物との結合により、自然免疫応答において重要な役割を果たす。ＰＲＲは、以下の２つのクラスの分子を認識する：微生物病原体に関連する、（ＰＡＭＰ）と、細胞損傷、死滅ストレスまたは組織傷害中に放出される細胞成分に関連する、損傷関連分子パターン（ＤＡＭＰ）という、２つの分子クラスを認識する。ＰＡＭＰは、各病原体に特有のものであり、病原体生存に必要な不可欠分子構造、例えば、細菌細胞壁分子（例えば、リポタンパク質）、ウイルスカプシドタンパク質、ならびにウイルスおよび細菌ＤＮＡである。ＰＲＲは、細菌、ウイルス、寄生虫、真菌および原虫を含む、様々な微生物病原体を特定することができる。ＰＲＲは、主として、自然免疫系の細胞、例えば、抗原提示マクロファージおよび樹状細胞によって発現されるが、他の細胞（免疫細胞と非免疫細胞の両方）によって発現されることもあり、細胞表面に局在して細胞外病原体を検出するか、またはエンドソームおよび細胞基質内に局在し、そこで細胞内に侵入するウイルスを検出する。
ＰＲＲの例としては、感染病原体を検出する細胞外ドメインを有する１型膜貫通受容体である、Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）が挙げられる。ＴＬＲ１、２、４および６は、細菌脂質を認識し、ＴＬＲ３、７および８は、ウイルスＲＮＡを認識し、ＴＬＲ９は、細菌ＤＮＡを認識し、ＴＬＲ５および１０は、細菌または寄生虫タンパク質を認識する。。ＰＲＲの他の例としては、Ｃ型レクチン受容体（ＣＬＲ）、例えば、Ｉ型マンノース受容体およびＩＩ型アシアロ糖タンパク質受容体、細胞質（細胞内）ＰＲＲ、ヌクレオチドオリゴマー化（ＮＯＤ）様受容体（ＮＬＲ）、例えば、ＮＯＤ１およびＮＯＤ２、レチノイン酸誘導性遺伝子Ｉ（ＲＩＧ−１）様受容体（ＲＬＲ）、例えば、ＲＩＧ−Ｉ、ＭＤＡ５およびＤＤＸ３、ならびに分泌ＰＲＲ、例えば、コレクチン、ペントラキシン、フィコリン、脂質トランスフェラーゼ、ペプチドグリカン認識タンパク質（ＰＧＲ）およびロイシンリッチリピート受容体（ＬＲＲ）が挙げられる。
ＰＲＲは、共刺激分子および炎症性サイトカイン、例えば、Ｉ型ＩＦＮ、ＩＬ−６、ＴＮＦおよびＩＬ−１２の産生を刺激する、ＮＦ−カッパＢ経路などの、シグナル伝達経路の活性化を開始し、この機序は、感染性病原体に対して開始される炎症および免疫応答の活性化の一因となる。そのような応答は、適応免疫応答に関与する腫瘍微小環境に存在する免疫細胞（例えば、抗原提示細胞（ＡＰＣ）、例えば、Ｂ細胞、ＤＣ、ＴＡＭ、および他の骨髄系由来サプレッサー細胞）の活性化を誘発する。最近の証拠は、ＰＡＭＰおよびＤＡＭＰにより活性化される免疫機序が、腫瘍細胞に対する免疫応答の活性化の一因にもなることを示す。（ＬｅＭｅｒｃｉｅｒら、Ｃａｎｃ Ｒｅｓ、７３巻：４６２９〜４０頁（２０１３年）；Ｋｉｍら、Ｂｌｏｏｄ、１１９巻：３５５〜６３頁（２０１２年））。
もう１つのＰＲＲサブファミリーは、ＲＩＧ−Ｉ様受容体（ＲＬＲ）であり、これは、ウイルス感染時の二本鎖ウイルスＲＮＡのセンサーであると考えられており、腫瘍内免疫刺激の標的とされうる。刺激されると、例えば、腫瘍溶解性ウイルスが腫瘍内に送達されると、ＲＬＲは、宿主細胞によるＩ型ＩＦＮの放出を誘発し、アポトーシスによるその死滅をもたらす。そのようなサイトカインおよび腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）は、抗腫瘍免疫応答の活性化ももたらす。ＲＬＲは、すべての腫瘍型において内因性発現されることを考えると、ＲＬＲは、普遍的な免疫原性促進性治療標的であり、腫瘍溶解性ウイルスの局所送達により生成される免疫応答に特に関連性がある。
一部の態様では、細菌の骨格そのものが、ＰＲＲ受容体、例えば、ＴＬＲまたはＲＩＧＩのうちの１つまたは複数を活性化し、自然免疫応答を刺激することができる。一部の態様では、ＰＲＲ、例えば、ＴＬＲまたはＲＩＧＩは、遺伝子操作された細菌によって産生される１つまたは複数の免疫モジュレーターによって活性化される。
溶解性ペプチド
本開示の細菌それら自体が、ＰＡＭＰおよびＤＡＭＰの存在に起因して腫瘍部位で細胞溶解をもたらすことになり、これにより、自然免疫応答が発動されることになり得る。加えて、一部の細菌は、腫瘍細胞を溶解する能力がある細胞溶解性の微生物であるという追加の特徴を有する。したがって、一部の実施形態では、操作された微生物は、天然またはネイティブ細胞溶解性ペプチドを産生する。一部の実施形態では、腫瘍部位に送達されると局所的に腫瘍微小環境内のがんまたは腫瘍細胞を溶解する能力がある１つまたは複数の細胞傷害性分子、例えば細胞溶解性ペプチドを産生するように、細菌をさらに操作することができる。細胞が溶解すると、腫瘍細胞は、適応免疫応答を促進するのに役立つ腫瘍関連抗原を放出する。ＰＡＭＰおよびＤＡＭＰの存在は、樹状細胞などの抗原提示細胞の成熟を促進し、これにより、抗原特異的ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞応答が活性化される。したがって、一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、１つまたは複数の細胞毒を産生することができる。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、１つまたは複数の溶解性ペプチド分子を産生することができる。遺伝子操作された細菌によって産生され得る例示的な溶解性ペプチドおよび細胞毒、ならびにそれらがどのようにして発現、誘導、および調節され得るかは、２０１７年１月１１日に出願され、ＷＯ２０１７／１２３６７５号として公開された、国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０１３０７２、ならびに２０１８年１月１日に出願されたＰＣＴ／ＵＳ２０１８／０１２６９８に記載されており、これらのそれぞれの内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
これらの実施形態のいずれにおいても、溶解性ペプチドをコードする遺伝子配列を含む遺伝子操作された細菌は、１つまたは複数のさらなるエフェクター分子、すなわち、治療用分子または代謝変換因子をコードする遺伝子配列をさらに含む。これらの実施形態のいずれにおいても、溶解性ペプチドをコードする回路は、同じかまたは異なる細菌株において、本明細書に記載される１つまたは複数の免疫イニシエーターまたは免疫サステナーをコードする回路と組み合わせることができる（組合せ回路または株の混合物）。免疫イニシエーターまたは免疫サステナーをコードする回路は、構成的または誘導性プロモーター、例えば、低酸素誘導性プロモーターまたは本明細書に記載される任意の他の構成的もしくは誘導性プロモーターの制御下にあり得る。これらの実施形態のいずれにおいても、溶解性ペプチドをコードする遺伝子配列は、同じかまたは異なる細菌株において、本明細書に記載される１つまたは複数のＳＴＩＮＧアゴニスト産生酵素をコードする遺伝子配列と組み合わせることができる（組合せ回路または株の混合物）。一部の実施形態では、溶解性ペプチドをコードする遺伝子配列と組み合わされる遺伝子配列は、ＤａｃＡをコードする。ＤａｃＡは、構成的または誘導性プロモーター、例えば、低酸素誘導性プロモーター、例えば、ＦＮＲ、または本明細書に記載される任意の他の構成的もしくは誘導性プロモーターの制御下にあり得る。一部の実施形態では、ｄａｃＡ遺伝子は、染色体に組み込まれている。一部の実施形態では、溶解性ペプチドをコードする遺伝子配列と組み合わされる遺伝子配列は、ｃＧＡＳをコードする。ｃＧＡＳは、構成的または誘導性プロモーター、例えば、低酸素誘導性プロモーター、例えば、ＦＮＲ、または本明細書に記載される任意の他の構成的もしくは誘導性プロモーターの制御下にあり得る。一部の実施形態では、ｃＧＡＳをコードする遺伝子は、染色体に組み込まれている。これらの組合せの実施形態のいずれにおいても、細菌は、栄養要求性の改変、例えば、ＤａｐＡ、ＴｈｙＡ、または両方の突然変異または欠失をさらに含み得る。これらの実施形態のいずれにおいても、細菌は、ファージの改変、例えば、本明細書に記載される内在性プロファージの突然変異または欠失をさらに含み得る。
抗原／ワクチン
腫瘍抗原、例えば、腫瘍特異的抗原、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）、および／またはネオ抗原を局所腫瘍環境に導入することにより、ネオ抗原に関連することが公知である目的の特定のがんまたは腫瘍細胞に対する免疫応答を生じさせることができる。本明細書で使用される場合、用語「腫瘍抗原」は、腫瘍特異的抗原、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）、およびネオ抗原を指すことを意図する。本明細書で使用される場合、腫瘍抗原は、「発癌ウイルス抗原」、腫瘍胎児抗原、組織分化抗原、およびがん精巣抗原も含む。操作された微生物は、ペプチド、例えば腫瘍抗原を微生物細胞壁に（例えば、微生物細胞表面に）アンカーすることができるように操作されていることもある。したがって、一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、１つまたは複数の腫瘍抗原を産生するように操作されている。本開示の細菌によって産生され得るそのような腫瘍抗原の非限定的な例は、例えば、２０１７年１月１１日に出願され、ＷＯ２０１７／１２３６７５として公開された国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０１３０７２、および２０１８年１月１日に出願されたＰＣＴ／ＵＳ２０１８／０１２６９８に記載されており、これらのそれぞれの内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるか、またはそうでなければ当該技術分野で公知である。
これらの実施形態のいずれにおいても、抗原をコードする遺伝子配列を含む遺伝子操作された細菌は、１つまたは複数のさらなるエフェクター分子、すなわち、治療用分子または代謝変換因子をコードする遺伝子配列をさらに含む。これらの実施形態のいずれにおいても、抗原をコードする回路は、同じかまたは異なる細菌株において、本明細書に記載される１つまたは複数の免疫イニシエーターまたは免疫サステナーをコードする回路と組み合わせることができる（組合せ回路または株の混合物）。免疫イニシエーターまたは免疫サステナーをコードする回路は、構成的または誘導性プロモーター、例えば、低酸素誘導性プロモーターまたは本明細書に記載される任意の他の構成的もしくは誘導性プロモーターの制御下にあり得る。これらの実施形態のいずれにおいても、抗原をコードする遺伝子配列は、同じかまたは異なる細菌株において、本明細書に記載される１つまたは複数のＳＴＩＮＧアゴニスト産生酵素をコードする遺伝子配列と組み合わせることができる（組合せ回路または株の混合物）。一部の実施形態では、抗原をコードする遺伝子配列と組み合わされる遺伝子配列は、ＤａｃＡをコードする。ＤａｃＡは、構成的または誘導性プロモーター、例えば、低酸素誘導性プロモーター、例えば、ＦＮＲ、または本明細書に記載される任意の他の構成的もしくは誘導性プロモーターの制御下にあり得る。一部の実施形態では、ｄａｃＡ遺伝子は、染色体に組み込まれている。一部の実施形態では、抗原をコードする遺伝子配列と組み合わされる遺伝子配列は、ｃＧＡＳをコードする。ｃＧＡＳは、構成的プまたは誘導性プロモーター、例えば、低酸素誘導性プロモーター、例えば、ＦＮＲ、または本明細書に記載される任意の他の構成的もしくは誘導性プロモーターの制御下にあり得る。一部の実施形態では、ｃＧＡＳをコードする遺伝子は、染色体に組み込まれている。これらの組合せの実施形態のいずれにおいても、細菌は、栄養要求性の改変、例えば、ＤａｐＡ、ＴｈｙＡ、または両方の突然変異または欠失をさらに含み得る。これらの実施形態のいずれにおいても、細菌は、ファージの改変、例えば、本明細書に記載される内在性プロファージの突然変異または欠失をさらに含み得る。
プロドラッグ
プロドラッグ療法は、反応性および細胞傷害性の低い形態の抗がん薬を提供する。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、プロドラッグをその活性形態に変換することができる。適切なプロドラッグ系の一例は、５−ＦＣ／５−ＦＵ系である。
細胞傷害性の放射線増感剤５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）は、消化器、乳、頭頸部および結腸直腸がんを含む、多くのがんの処置に使用される（Ｄｕｉｖｅｎｖｏｒｒｄｅｎら、２００６年、Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ５−ｆｌｕｏｒｏｕｒａｃｉｌ−ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌｓ ｔｏ ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ ｓｕｉｃｉｄｅ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ；Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ（２００６年）１４巻、５７〜６５頁）。しかし、毒性が、より高濃度でのその投与を制限する。腫瘍においてより高濃度をより低い毒性で達成するために、プロドラッグ系が開発された。シトシンデアミナーゼは、プロドラッグ５−フルオロシトシン（５−ＦＣ）を５−ＦＵに脱アミノ化する。５−ＦＣを比較的高濃度で導入することができ、それによって、腫瘍部位で生成される５−ＦＵは、全身投与することができる濃度より高濃度を安全に達成することができる。次いで、腫瘍部位で、５−ＦＵは、細胞酵素によって、強力なピリミジン代謝拮抗物質５−ＦｄＵＭＰ、５−ＦｄＵＴＰおよび５−ＦＵＴＰに形質転換される。これらの代謝物は、リボヌクレオチドをデオキシリボヌクレオチドに変換するチミジル酸シンテターゼを阻害する代謝遮断剤として作用し、その結果としてＤＮＡ合成を阻害する（Ｈｏｒａｎｉら２０１５年、Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｐｒｏｄｒｕｇｓ − Ｔｈｒｅｅ Ｄｅｃａｄｅｓ Ｏｆ Ｄｅｓｉｇｎ； ｗｊｐｐｓ；４巻、０７号、１７５１〜１７７９頁およびその中の参考文献）。
この系は、５−ＦＵを５−フルオロウリジン一リン酸に変換するＵＰＲＴ（哺乳動物オロチン酸ホスホリボシルトランスフェラーゼの作用と類似）を含めること、活性化へのその経路の第１のステップ、によって、さらに改善された（Ｔｉｒａｂｙら、１９９８年；Ｃｏｎｃｏｍｉｔａｎｔ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｅ．ｃｏｌｉ ｃｙｔｏｓｉｎｅ ｄｅａｍｉｎａｓｅ ａｎｄ ｕｒａｃｉｌ ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｂｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ ｉｍｐｒｏｖｅｓ ｔｈｅ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ ｏｆ ５−ｆｌｕｏｒｏｃｙｔｏｓｉｎｅ． ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｌｅｔｔ １９９８年；１７６巻：４１〜４９頁）。
一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、５−ＦＣを５ＦＵに変換することができる。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、腫瘍微小環境において、５−ＦＣを５ＦＵに変換することができる。一部の実施形態では、５−ＦＣは、全身投与される。一部の実施形態では、５−ＦＣは、経口、静脈内、または皮下投与される。一部の実施形態では、５−ＦＣは、腫瘍内注射によって投与される。遺伝子操作された細菌は、シトシンデアミナーゼ（ＥＣ ３．５．４．１）をコードする遺伝子配列を含む。
一部の実施形態では、シトシンデアミナーゼは、Ｅ．ｃｏｌｉからのものである。一部の実施形態では、シトシンデアミナーゼは、ｃｏｄＡである。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、酵母からのシトシンデアミナーゼを発現する。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ｃｏｄＡ−ｕｐｐ融合タンパク質を発現する。
遺伝子操作された細菌における異種発現に適したシトシンデアミナーゼの非限定的な例としては、以下のものが挙げられる：Ｐｈｏｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｅｉｏｇｎａｔｈｉ ｓｕｂｓｐ．ｍａｎｄａｐａｍｅｎｓｉｓ ｓｖｅｒｓ．１．１．（ＰＭＳＶ＿１３７８）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｍｅｎｄｏｃｉｎａ ＮＫ−０１（ＭＤＳ＿１５４８）、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ Ａ３（２）（ＳＣＯ４６３４）、Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ ｘｙｌｏｓｏｘｉｄａｎｓ ＡＸＸ−Ａ（ＡＸＸＡ＿１０７１５、ＡＸＸＡ＿１６２９２）、Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．ＳＸＣＣ−１（ＣＯＤＡ）、Ｇａｌｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｎａｔｉｓ ＵＭＮ１７９（ＵＭＮ１７９＿０００４９）、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｏｘｙｔｏｃａ ＫＣＴＣ １６８６（ＫＯＸ＿１４０５０、ＫＯＸ＿０４５５５）、Ｔａｙｌｏｒｅｌｌａ ａｓｉｎｉｇｅｎｉｔａｌｉｓ ＭＣＥ３（ＴＡＳＩ＿１３１０）、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｊｏｓｔｉｉ ＲＨＡ１（ＲＨＡ１＿ＲＯ００５９９、ＲＨＡ１＿ＲＯ００５９７）、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ａｅｒｏｇｅｎｅｓ ＫＣＴＣ ２１９０（ＥＡＥ＿１３２６５、ＥＡＥ＿０５１１５）、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ Ａｒｔｈｒｏｍｉｔｕｓ ｓｐ．ＳＦＢ−ｍｏｕｓｅ−Ｊａｐａｎ（ＳＦＢＭ＿１２４９）、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍ Ｐｏ８２（ＣＯＤＡ）、Ｓａｌｉｎｉｓｐｈａｅｒａ ｓｈａｂａｎｅｎｓｉｓ Ｅ１Ｌ３Ａ（ＳＳＰＳＨ＿０７０８６）、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｕｃｉｌａｇｉｎｏｓｕｓ ＫＮＰ４１４（ＫＮＰ４１４＿０３２３０、ＫＮＰ４１４＿０３２３３）、Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｊａｐｏｎｉｃｕｍ ＵＳＤＡ ６（ＢＪ６Ｔ＿６０１００、ＢＪ６Ｔ＿６００９０）、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ Ａｒｔｈｒｏｍｉｔｕｓ ｓｐ．ＳＦＢ−ｒａｔ−Ｙｉｔ（ＲＡＴＳＦＢ＿１０７９）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ Ｓ１６（ＰＰＳ＿２７４０）、Ｗｅｉｓｓｅｌｌａ ｋｏｒｅｅｎｓｉｓ ＫＡＣＣ １５５１０（ＷＫＫ＿０５０６０）、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｃｌｏａｃａｅ ＥｃＷＳＵ１（ＹＡＨＪ、ＣＯＤＡ）、Ｂｉｚｉｏｎｉａ ａｒｇｅｎｔｉｎｅｎｓｉｓ ＪＵＢ５９（ＢＺＡＲＧ＿２２１３）、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ Ｆ２（ＡＧＡＵ＿Ｌ１０１９５６）、Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ ＳＤ１（ＰＤＩ＿１２１６）、Ｓｕｌｆｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ ＴＰＹ（ＣＯＤＡ）、Ｖｉｂｒｉｏ ｔｕｂｉａｓｈｉｉ ＡＴＣＣ １９１０９（ＶＩＴＵ９１０９＿１３７４１）、Ｎｉｔｒｏｓｏｃｏｃｃｕｓ ｗａｔｓｏｎｉｉ Ｃ−１１３（ＮＷＡＴ＿２４７５）、Ｂｌａｔｔａｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．（Ｍａｓｔｏｔｅｒｍｅｓ ｄａｒｗｉｎｉｅｎｓｉｓ）ｓｔｒ．ＭＡＤＡＲ（ＣＯＤＡ）、Ｂｌａｔｔａｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．（Ｃｒｙｐｔｏｃｅｒｃｕｓ ｐｕｎｃｔｕｌａｔｕｓ）ｓｔｒ．Ｃｐｕ（ＣＯＤＡ）、Ｐｅｌａｇｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｈａｌｏｔｏｌｅｒａｎｓ Ｂ２（ＫＫＹ＿８５２、ＫＫＹ＿８５０）、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｓｐ．ＹＩ２３（ＢＹＩ２３＿Ａ０１８４１０、ＢＹＩ２３＿Ａ００８９６０）、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．ＣＣ９６０５（ＳＹＮＣＣ９６０５＿０８５４）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ Ｆ１１３（ＡＥＶ６１８９２．１）、Ｖｉｂｒｉｏ ｓｐ．ＥＪＹ３（ＶＥＪＹ３＿１６４９１）、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ ｅｌｏｎｇａｔｕｓ ＰＣＣ ７９４２（ＳＹＮＰＣＣ７９４２＿０５６８）、Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｓｐ．ＯＲＳ ２７８（ＢＲＡＤＯ１７８９、ＢＲＡＤＯ０８６２）、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ ｓｐ．ＰＣＣ ６８０３（ＣＯＤＡ）、Ｍｉｃｒｏｃｏｌｅｕｓ ｃｈｔｈｏｎｏｐｌａｓｔｅｓ ＰＣＣ ７４２０（ＭＣ７４２０＿２７４）、Ｐｒｏｃｈｌｏｒｏｃｏｃｃｕｓ ｍａｒｉｎｕｓ ｓｔｒ．ＡＳ９６０１（ＣＯＤＡ）、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｏ１５７：Ｈ７ ｓｔｒ．ＥＤＬ９３３（ＹＡＨＪ、ＣＯＤＡ）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ ＫＴ２４４０（ＣＯＤＡ）、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．ＷＨ ８１０９（ＳＨ８１０９＿１３７１）、Ｐｒｏｃｈｌｏｒｏｃｏｃｃｕｓ ｍａｒｉｎｕｓ ｓｕｂｓｐ．ｍａｒｉｎｕｓ ｓｔｒ．ＣＣＭＰ１３７５（ＳＳＮＡ）、Ｐｒｏｃｈｌｏｒｏｃｏｃｃｕｓ ｍａｒｉｎｕｓ ｓｔｒ．ＭＩＴ ９５１５（ＣＯＤＡ）、Ｐｒｏｃｈｌｏｒｏｃｏｃｃｕｓ ｍａｒｉｎｕｓ ｓｔｒ．ＭＩＴ ９３０１（ＣＯＤＡ）、Ｐｒｏｃｈｌｏｒｏｃｏｃｃｕｓ ｍａｒｉｎｕｓ ｓｔｒ．ＮＡＴＬ１Ａ（ＣＯＤＡ）、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ ｓｔｒ．Ｃ５８（ＡＴＵ４６９８）、Ｄｅｓｕｌｆｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ ＨＲＭ２（ＣＯＤＡ）、Ｃｙａｎｏｂｉｕｍ ｓｐ．ＰＣＣ ７００１（ＣＰＣＣ７００１＿２６０５）、Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｐｅｓｔｉｓ ＫＩＭ１０（ＣＯＤＡ）、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ ＡＴＣＣ １３１２４（ＣＯＤＡ）、Ｎｏｃａｒｄｉｏｉｄｅｓ ｓｐ．ＪＳ６１４（ＮＯＣＡ＿１４９５）、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｅｆｆｉｃｉｅｎｓ ＹＳ−３１４（ＣＯＤＡ）、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ ＡＴＣＣ １３０３２（ＣＧＬ００７６、ＣＯＤＡ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｎｔｈｒａｃｉｓ ｓｔｒ．Ａｍｅｓ（ＢＡＳ４３８９）、Ｄｉｃｋｅｙａ ｄａｄａｎｔｉｉ ３９３７（ＣＯＤＡ）、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＣＦＴ０７３（ＣＯＤＡ、ＹＡＨＪ）、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｓｍｉｕｍ ｅｒｙｔｈｒａｅｕｍ ＩＭＳ１０１（ＴＥＲＹ＿４５７０）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ Ｐｆ０−１（ＣＯＤＡ、ＰＦＬ０１＿３１４６）、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍ ＮＣＣ２７０５（ＣＯＤＡ）、Ｃａｒｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．１７−４（ＣＡＲ＿Ｃ０４６４０、ＡＴＺＣ）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ ＰＡＯ１（ＣＯＤＡ）、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｅｔａｎｉ Ｅ８８（ＣＴＣ＿０１８８３）、Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｐｅｓｔｉｓ ＣＯ９２（ＣＯＤＡ）、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｃｅｎｏｃｅｐａｃｉａ Ｊ２３１５（ＢＣＡＭ２７８０、ＣＯＤＡ）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ ＳＢＷ２５（ＣＯＤＡ）、Ｖｉｂｒｉｏ ｖｕｌｎｉｆｉｃｕｓ ＣＭＣＰ６（ＶＶ２＿０７８９）、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｂｏｎｇｏｒｉ ＮＣＴＣ １２４１９（ＣＯＤＡ）、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｃａ ｓｕｂｓｐ．ｅｎｔｅｒｉｃａ ｓｅｒｏｖａｒ Ｔｙｐｈｉ ｓｔｒ．ＣＴ１８（ＣＯＤＡ）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ Ｐｆ−５（ＣＯＤＡ）、Ｏｃｅａｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｉｈｅｙｅｎｓｉｓ ＨＴＥ８３１（ＯＢ１２６７）、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．ＲＳ９９１６（ＲＳ９９１６＿３２９０２）、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．ＲＳ９９１７（ＲＳ９９１７＿０２０６１）、Ｍａｎｎｈｅｉｍｉａ ｓｕｃｃｉｎｉｃｉｐｒｏｄｕｃｅｎｓ ＭＢＥＬ５５Ｅ（ＳＳＮＡ）、Ｖｉｂｒｉｏ ｐａｒａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ ＲＩＭＤ ２２１０６３３（ＶＰＡ１２４３）、Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｊａｐｏｎｉｃｕｍ ＵＳＤＡ １１０（ＢＬＬ３８４６、ＢＬＬ７２７６）、Ｍａｒｉｎｏｂａｃｔｅｒ ａｄｈａｅｒｅｎｓ ＨＰ１５（ＨＰ１５＿２７７２）、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ Ｖ５８３ ３ｓｅｑｓ ＥＦ＿１０６１、ＥＦ＿１０６２、ＥＦ＿０３９０）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ ＡＴＣＣ １４５７９（ＢＣ＿４５０３）、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．ＣＢ０１０１（ＳＣＢ０１＿０１０１００００１８７５）、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．ＣＢ０２０５（ＳＣＢ０２＿０１０１０００１３６２１）、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｍａｌｌｅｉ ＡＴＣＣ ２３３４４（ＣＯＤＡ）、Ｌａｂｒｅｎｚｉａ ａｌｅｘａｎｄｒｉｉ ＤＦＬ−１１（ＳＡＤＦＬ１１＿５０５０）、Ｍｙｘｏｃｏｃｃｕｓ ｘａｎｔｈｕｓ ＤＫ １６２２（ＭＸＡＮ＿５４２０）、Ｒｕｅｇｅｒｉａ ｐｏｍｅｒｏｙｉ ＤＳＳ−３（ＳＰＯ２８０６）、Ｇｌｏｅｏｂａｃｔｅｒ ｖｉｏｌａｃｅｕｓ ＰＣＣ ７４２１（ＧＬＬ２５２８）、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．Ｃ（ＳＳＮＧ＿０３２８７、ＳＳＮＧ＿０４１８６）、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｅｕｔｒｏｐｈａ ＪＭＰ１３４（ＲＥＵＴ＿Ｂ３９９３）、Ｍｏｏｒｅｌｌａ ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｉｃａ ＡＴＣＣ ３９０７３（ＭＯＴＨ＿０４６０）、Ｒｕｂｒｏｂａｃｔｅｒ ｘｙｌａｎｏｐｈｉｌｕｓ ＤＳＭ ９９４１（ＲＸＹＬ＿０２２４）、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｘｅｎｏｖｏｒａｎｓ ＬＢ４００（ＢＸＥ＿Ａ２１２０、ＢＸＥ＿Ａ１５３３）、Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｍｅｌｉｌｏｔｉ １０２１（Ｒ０２５９６）、Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｌｏｔｉ ＭＡＦＦ３０３０９９（ＭＬＲ５３６３、ＭＬＬ２０６１）、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍ ＧＭＩ１０００（ＣＯＤＡ）、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ ｅｌｏｎｇａｔｕｓ ＰＣＣ ６３０１（ＣＯＤＡ）、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｖｉｅｔｎａｍｉｅｎｓｉｓ Ｇ４（ＢＣＥＰ１８０８＿４８７４）、Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｒｕｂｒｕｍ ＡＴＣＣ １１１７０（ＲＲＵ＿Ａ２７８８）、Ｍａｒｉｎｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．ＥＬＢ１７（ＭＥＬＢ１７＿０６０９９）、Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｄｉａｚｏｔｒｏｐｈｉｃｕｓ ＰＡｌ ５（ＧＤＩＡ＿２５１８、ＧＤＩ３６３２）、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ ｓｕｂｓｐ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ ＭＧＨ ７８５７８（ＫＰＮ＿００６３２、ＣＯＤＡ）、Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ ｍｕｌｔｏｃｉｄａ ｓｕｂｓｐ．ｍｕｌｔｏｃｉｄａ ｓｔｒ．Ｐｍ７０（ＰＭ０５６５）、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ ２．４．１（ＲＳＰ＿０３４１）、Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ ｐｅｎｔｏｓａｃｅｕｓ ＡＴＣＣ ２５７４５（ＰＥＰＥ＿０２４１）、Ｐｓｅｕｄｏｇｕｌｂｅｎｋｉａｎｉａ ｆｅｒｒｏｏｘｉｄａｎｓ ２００２（ＦＵＲＡＤＲＡＦＴ＿０７３９）、Ｄｅｓｕｌｆｕｒｏｍｏｎａｓ ａｃｅｔｏｘｉｄａｎｓ ＤＳＭ ６８４（ＤＡＣＥ＿０６８４）、Ａｕｒａｎｔｉｍｏｎａｓ ｍａｎｇａｎｏｘｙｄａｎｓ ＳＩ８５−９Ａ１（ＳＩ８５９Ａ１＿０１９４７）、Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｓｐ．ＢＴＡｉ１（ＢＢＴＡ＿２１０５、ＢＢＴＡ＿７２０４）、Ｃｒｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｓａｋａｚａｋｉｉ ＡＴＣＣ ＢＡＡ−８９４（ＥＳＡ＿０３４０５）、Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ａｕｒｅｓｃｅｎｓ ＴＣ１（ＡＡＵＲ＿３８８９、ＡＡＵＲ＿０９２５）、Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．ＦＢ２４（ＡＲＴＨ＿３６００）、Ｊａｎｎａｓｃｈｉａ ｓｐ．ＣＣＳ１（ＪＡＮＮ＿１３０６）、Ｐｏｌａｒｏｍｏｎａｓ ｓｐ．ＪＳ６６６（ＢＰＲＯ＿１９６０）、Ｐｈｏｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｒｏｆｕｎｄｕｍ ＳＳ９（Ｙ３９４６）、Ｆｒａｎｋｉａ ｓｐ．ＥｕＩ１ｃ（ＦＲＡＥＵＩ１Ｃ＿４７２４、ＦＲＡＥＵＩ１Ｃ＿４６２５）、Ｔｈｅｒｍｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ ｒｏｓｅｕｍ ＤＳＭ ５１５９（ＴＲＤ＿１８４５）、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｖｉｔｉｓ Ｓ４（ＡＶＩ＿２１０１、ＡＶＩ＿２１０２）、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒａｄｉｏｂａｃｔｅｒ Ｋ８４ ５ｓｅｑｓ ＡＲＡＤ＿９０８５、ＡＲＡＤ＿９０８６、ＡＲＡＤ＿８０３３、ＡＲＡＤ＿３５１８、ＡＲＡＤ＿９８９３）、Ｖｉｂｒｉｏ ｆｉｓｃｈｅｒｉ ＥＳ１１４（ＣＯＤＡ）、Ｌｙｎｇｂｙａ ｓｐ．ＰＣＣ ８１０６（Ｌ８１０６＿１００８６）、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．ＢＬ１０７（Ｂ





Ｌ１０７＿１１０５６）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．ＮＲＲＬ Ｂ−１４９１１（Ｂ１４９１１＿０４０４４）、Ｒｏｓｅｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．ＭＥＤ１９３（ＭＥＤ１９３＿１７２２４）、Ｒｏｓｅｏｖａｒｉｕｓ ｓｐ．２１７（ＲＯＳ２１７＿１０９５７）、Ｐｅｌａｇｉｂａｃａ ｂｅｒｍｕｄｅｎｓｉｓ ＨＴＣＣ２６０１（Ｒ２６０１＿１６４８５、Ｒ２６０１＿００５３０）、Ｍａｒｉｎｏｍｏｎａｓ ｓｐ．ＭＥＤ１２１（ＭＥＤ１２１＿２３６２９）、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｋｅｉ ｓｕｂｓｐ．ｓａｋｅｉ ２３Ｋ（ＬＣＡ＿１２１２）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｗｅｉｈｅｎｓｔｅｐｈａｎｅｎｓｉｓ ＫＢＡＢ４（ＢＣＥＲＫＢＡＢ４＿４３３１）、Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐａｌｕｓｔｒｉｓ ＨａＡ２（ＲＰＢ＿２０８４）、Ａｌｉｉｖｉｂｒｉｏ ｓａｌｍｏｎｉｃｉｄａ ＬＦＩ１２３８（ＣＯＤＡ）、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．ＣＣ９９０２（ＳＹＮＣＣ９９０２＿１５３８）、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ｓｔｒ．Ｋ−１２ ｓｕｂｓｔｒ．Ｗ３１１０（ＣＯＤＡ、ＹＡＨＪ）、Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ ＰＤ１２２２（ＰＤＥＮ＿１０５７）、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．ＷＨ ７８０３（ＣＯＤＡ）、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．ＪＡ−３−３Ａｂ（ＣＹＡ＿１５６７、ＣＯＤＡ）、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．ＪＡ−２−３Ｂａ（２−１３）（ＣＹＢ＿１０６３、ＣＯＤＡ）、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｉｎｅｎｓ ＢＬ２（ＢＬＩＮＢ＿０１０２００００９４８５）、Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ ｖｉｎｅｌａｎｄｉｉ ＤＪ（ＣＯＤＡ）、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．ＪＤＲ−２ ６ｓｅｑｓ ＰＪＤＲ２＿６１３１、ＰＪＤＲ２＿６１３４、ＰＪＤＲ２＿３６１７、ＰＪＤＲ２＿３６２２、ＰＪＤＲ２＿３２５５、ＰＪＤＲ２＿３２５４）、Ｆｒａｎｋｉａ ａｌｎｉ ＡＣＮ１４ａ（ＦＲＡＡＬ４２５０）、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｒｅｖｅ ＵＣＣ２００３（ＣＯＤＡ）、Ｂｌａｔｔａｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．（Ｂｌａｔｔｅｌｌａ ｇｅｒｍａｎｉｃａ）ｓｔｒ．Ｂｇｅ（ＢＬＢＢＧＥ＿３５３）、アルファプロテオバクテリアＢＡＬ１９９（ＢＡＬ１９９＿０１６４４、ＢＡＬ１９９＿０９８６５）、Ｃａｒｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．ＡＴ７（ＣＡＴ７＿１０４９５、ＣＡＴ７＿０５８０６）、Ｎｉｔｒｏｓｏｍｏｎａｓ ｅｕｔｒｏｐｈａ Ｃ９１（ＮＥＵＴ＿１７２２）、Ｖｉｂｒｉｏ ｈａｒｖｅｙｉ ＡＴＣＣ ＢＡＡ−１１１６（ＶＩＢＨＡＲ＿０５３１９）、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ａｍｂｉｆａｒｉａ ＡＭＭＤ（ＢＡＭＢ＿３７４５、ＢＡＭＢ＿４９００）、Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓ １３０Ｚ（ＡＳＵＣ＿１１９０）、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ ＡＴＣＣ １７０２５（ＲＳＰＨ１７０２５＿０９５５）、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｅｕｔｅｒｉ １００−２３（ＬＲ０６６１）、Ａｃｉｄｉｐｈｉｌｉｕｍ ｃｒｙｐｔｕｍ ＪＦ−５（ＡＣＲＹ＿０８２８）、Ｈａｈｅｌｌａ ｃｈｅｊｕｅｎｓｉｓ ＫＣＴＣ ２３９６（ＨＣＨ＿０５１４７）、Ａｌｋａｌｉｐｈｉｌｕｓ ｏｒｅｍｌａｎｄｉｉ ＯｈＩＬＡｓ（ＣＬＯＳ＿１２１２、ＣＬＯＳ＿２４５７）、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｄｏｌｏｓａ ＡＵＯ１５８（ＢＤＡＧ＿０４０９４、ＢＤＡＧ＿０３２７３）、Ｒｏｓｅｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．ＡｚｗＫ−３ｂ（ＲＡＺＷＫ３Ｂ＿０８９０１）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ Ｆ１（ＰＰＵＴ＿２５２７）、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｈｙｔｏｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ ＩＳＤｇ（ＣＰＨＹ＿３６２２）、Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ ＮＢＲＣ １００５９９ ４ｓｅｑｓ ＢＢＲ４７＿１５８７０、ＢＢＲ４７＿１５６３０、ＢＢＲ４７＿１５６２０、ＢＢＲ４７＿１５６１０）、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ａｖｉｕｍ １９７Ｎ（ＣＯＤＡ）、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ５３６（ＣＯＤＡ、ＹＡＨＪ）、Ｐｏｌａｒｏｍｏｎａｓ ｎａｐｈｔｈａｌｅｎｉｖｏｒａｎｓ ＣＪ２（ＰＮＡＰ＿４００７）、Ｒａｍｌｉｂａｃｔｅｒ ｔａｔａｏｕｉｎｅｎｓｉｓ ＴＴＢ３１０（ＣＯＤＡ）、Ｊａｎｔｈｉｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．Ｍａｒｓｅｉｌｌｅ（ＣＯＤＡ）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｔｕｔｚｅｒｉ Ａ１５０１（ＣＯＤＡ）、Ａｅｒｏｍｏｎａｓ ｈｙｄｒｏｐｈｉｌａ ｓｕｂｓｐ．ｈｙｄｒｏｐｈｉｌａ ＡＴＣＣ ７９６６（ＣＯＤＡ）、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｅｕｔｒｏｐｈａ Ｈ１６（ＣＯＤＡ、ＳＳＮＡ）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｅｎｔｏｍｏｐｈｉｌａ Ｌ４８（ＰＳＥＥＮ３５９８）、Ｌａｂｒｅｎｚｉａ ａｇｇｒｅｇａｔａ ＩＡＭ １２６１４（ＳＩＡＭ６１４＿１６３７２、ＳＩＡＭ６１４＿２１０００）、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ ＡＴＣＣ ３６７（ＬＶＩＳ＿１９３２）、Ｓａｇｉｔｔｕｌａ ｓｔｅｌｌａｔａ Ｅ−３７（ＳＳＥ３７＿１８９５２）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．Ｂ１４９０５ ３ｓｅｑｓ ＢＢ１４９０５＿２０９４８、ＢＢ１４９０５＿１２０１０、ＢＢ１４９０５＿１２０１５）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ Ｗ６１９ ３ｓｅｑｓ ＰＰＵＴＷ６１９＿３２２８、ＰＰＵＴＷ６１９＿２２１０、ＰＰＵＴＷ６１９＿２１６２）、Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ ｍａｌｔｏｐｈｉｌｉａ Ｒ５５１−３（ＳＭＡＬ＿２３４８）、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｐｈｙｍａｔｕｍ ＳＴＭ８１５（ＢＰＨＹ＿１４７７）、Ｖｉｂｒｉｏｎａｌｅｓ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＳＷＡＴ−３（ＶＳＷＡＴ３＿２６５５６）、Ｒｏｓｅｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．ＧＡＩ１０１（ＲＧＡＩ１０１＿２５６８）、Ｖｉｂｒｉｏ ｓｈｉｌｏｎｉｉ ＡＫ１（ＶＳＡＫ１＿１７１０７）、Ｐｅｄｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．ＢＡＬ３９（ＰＢＡＬ３９＿００４１０）、Ｒｏｓｅｏｖａｒｉｕｓ ｓｐ．ＴＭ１０３５（ＲＴＭ１０３５＿１８２３０、ＲＴＭ１０３５＿１７９００）、Ｏｃｔａｄｅｃａｂａｃｔｅｒ ａｎｔａｒｃｔｉｃｕｓ ２３８（ＯＡ２３８＿４９７０）、Ｐｈａｅｏｂａｃｔｅｒ ｇａｌｌａｅｃｉｅｎｓｉｓ ＤＳＭ １７３９５（ＣＯＤＡ）、Ｏｃｅａｎｉｂｕｌｂｕｓ ｉｎｄｏｌｉｆｅｘ ＨＥＬ−４５（ＯＩＨＥＬ４５＿１４０６５、ＯＩＨＥＬ４５＿０１９２５）、Ｏｃｔａｄｅｃａｂａｃｔｅｒ ａｎｔａｒｃｔｉｃｕｓ ３０７（ＯＡ３０７＿７８）、Ｖｅｒｍｉｎｅｐｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｅｉｓｅｎｉａｅ ＥＦ０１−２（ＶＥＩＳ＿０４１６、ＶＥＩＳ＿４４３０）、Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ ｗｏｏｄｙｉ ＡＴＣＣ ５１９０８（ＳＷＯＯ＿１８５３）、Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｃａ ｓｕｂｓｐ．ｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｃａ ８０８１（ＣＯＤＡ）、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｍ Ｈ１０（ＣＣＥＬ＿０９０９）、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｍｕｌｔｉｖｏｒａｎｓ ＡＴＣＣ １７６１６（ＣＯＤＡ、ＢＭＵＬ＿４２８１）、Ｌｅｐｔｏｔｈｒｉｘ ｃｈｏｌｏｄｎｉｉ ＳＰ−６（ＬＣＨＯ＿０３１８）、Ａｃｉｄｏｖｏｒａｘ ｃｉｔｒｕｌｌｉ ＡＡＣ００−１（ＡＡＶＥ＿３２２１）、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｐｈｙｔｏｆｉｒｍａｎｓ ＰｓＪＮ（ＢＰＨＹＴ＿２５９８、ＢＰＨＹＴ＿２３８８）、Ｄｅｌｆｔｉａ ａｃｉｄｏｖｏｒａｎｓ ＳＰＨ−１（ＤＡＣＩ＿４９９５）、Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ ｐｅａｌｅａｎａ ＡＴＣＣ ７００３４５（ＳＰＥＡ＿２１８７）、Ｄｉｎｏｒｏｓｅｏｂａｃｔｅｒ ｓｈｉｂａｅ ＤＦＬ １２（ＣＯＤＡ）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｍｅｎｄｏｃｉｎａ ｙｍｐ（ＰＭＥＮ＿３８３４）、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｐｒｏｔｅａｍａｃｕｌａｎｓ ５６８（ＳＰＲＯ＿００９６、ＳＰＲＯ＿４５９４）、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．６３８（ＥＮＴ６３８＿３７９２、ＥＮＴ６３８＿３１４０）、Ｍａｒｉｎｏｍｏｎａｓ ｓｐ．ＭＷＹＬ１（ＭＭＷＹＬ１＿１５８３）、Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ ｅｒｙｔｈｒａｅａ ＮＲＲＬ ２３３８（ＳＥＲＹＮ２＿０１０１００００１２１７）、Ｘｅｎｏｒｈａｂｄｕｓ ｎｅｍａｔｏｐｈｉｌａ ＡＴＣＣ １９０６１（ＸＮＣ１＿２０９７）、Ｎｏｃａｒｄｉｏｉｄａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ Ｂｒｏａｄ−１（ＮＢＣＧ＿０２５５６）、Ｈｏｅｆｌｅａ ｐｈｏｔｏｔｒｏｐｈｉｃａ ＤＦＬ−４３（ＨＰＤＦＬ４３＿１６０４７）、Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．ＴＲＰ（ＰＡＴＲＰ＿０１０１００００８９５６）、Ｃｙａｎｏｔｈｅｃｅ ｓｐ．ＰＣＣ ８８０１（ＰＣＣ８８０１＿１９５２）、Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ ｓｅｄｉｍｉｎｉｓ ＨＡＷ−ＥＢ３（ＳＳＥＤ＿２８０３）、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．４−４６（Ｍ４４６＿３６０３、Ｍ４４６＿０９３３）、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒａｄｉｏｔｏｌｅｒａｎｓ ＪＣＭ ２８３１（ＭＲＡＤ２８３１＿４８２４）、Ａｚｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｃａｕｌｉｎｏｄａｎｓ ＯＲＳ ５７１（ＡＺＣ＿１９４５）、Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ ａｎｔｈｒｏｐｉ ＡＴＣＣ ４９１８８（ＯＡＮＴ＿３３１１）、Ｒｕｅｇｅｒｉａ ｓｐ．Ｒ１１（ＲＲ１１＿１６２１）、Ｃｙａｎｏｔｈｅｃｅ ｓｐ．ＡＴＣＣ ５１１４２（ＣＯＤＡ）、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｌａｖｕｌｉｇｅｒｕｓ ＡＴＣＣ ２７０６４（ＳＣＬＡＡ２＿０１０１０００２６６７１、ＳＣＬＡＶ＿５５３９）、Ｌｙｓｉｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐｈａｅｒｉｃｕｓ Ｃ３−４１（ＢＳＰＨ＿４２３１）、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ ＮＣＴＣ ２９１６（ＣＯＤＡ）、Ａｎａｅｒｏｔｒｕｎｃｕｓ ｃｏｌｉｈｏｍｉｎｉｓ ＤＳＭ １７２４１（ＡＮＡＣＯＬ＿０３９９８、ＡＮＡＣＯＬ＿０２２７９、ＡＮＡＣＯＬ＿０１３０９）、Ａｃｔｉｎｏｓｙｎｎｅｍａ ｍｉｒｕｍ ＤＳＭ ４３８２７（ＡＭＩＲ＿０５３８）、Ｓａｎｇｕｉｂａｃｔｅｒ ｋｅｄｄｉｅｉｉ ＤＳＭ １０５４２（ＳＫＥＤ＿２８０２０、ＳＫＥＤ＿１７２６０）、Ｓｔａｃｋｅｂｒａｎｄｔｉａ ｎａｓｓａｕｅｎｓｉｓ ＤＳＭ ４４７２８（ＳＮＡＳ＿１７０３）、Ｍｉｃｒｏｃｙｓｔｉｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ ＮＩＥＳ−８４３（ＭＡＥ＿０５３６０）、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ ＮＣＴＣ ８２３９（ＣＯＤＡ）、Ｋｉｔａｓａｔｏｓｐｏｒａ ｓｅｔａｅ ＫＭ−６０５４（ＫＳＥ＿３６３００、ＫＳＥ＿３６３２０）、Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｃｈｌｏｒｏｐｈｅｎｏｌｉｃｕｓ Ａ６（ＡＣＨＬ＿１０６１）、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｇｒｉｓｅｕｓ ｓｕｂｓｐ．ｇｒｉｓｅｕｓ ＮＢＲＣ １３３５０（ＳＧＲ＿６４５８）、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｐ．７＿２＿４３ＦＡＡ（ＣＳＢＧ＿０２０８７）、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｌｅｓ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ １＿７＿４７ＦＡＡ（ＣＢＦＧ＿００９０１）、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｌｂｕｓ Ｊ１０７４（ＳＳＨＧ＿０５６３３）、Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ ｈａｌｉｆａｘｅｎｓｉｓ ＨＡＷ−ＥＢ４（ＳＨＡＬ＿２１６０）、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｎｏｄｕｌａｎｓ ＯＲＳ ２０６０（ＭＮＯＤ＿３３４９）、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．Ｍｇ１（ＳＳＡＧ＿０５２７１）、Ｅｒｗｉｎｉａ ｔａｓｍａｎｉｅｎｓｉｓ Ｅｔ１／９９（ＣＯＤＡ）、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）（ＹＡＨＪ、ＣＯＤＡ、Ｂ２１＿００２９５、Ｂ２１＿００２８３）、Ｃｏｎｅｘｉｂａｃｔｅｒ ｗｏｅｓｅｉ ＤＳＭ １４６８４（ＣＷＯＥ＿５７００、ＣＷＯＥ＿５７０４、ＣＷＯＥ＿０３４４）、Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．３０＿２（ＣＳＡＧ＿０３０１３、ＣＳＡＧ＿０２６９１）、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａｌｅｓ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ １＿１＿４７（ＨＭＰＲＥＦ０１８９＿０１３１３）、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ９＿２＿５４ＦＡＡ（ＨＭＰＲＥＦ０８６４＿０３５６８





）、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｕｌｃｅｒａｎｓ ＡＴＣＣ ４９１８５（ＦＵＡＧ＿０２２２０）、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｖａｒｉｕｍ ＡＴＣＣ ２７７２５（ＦＶＡＧ＿００９０１）、Ｂｅｕｔｅｎｂｅｒｇｉａ ｃａｖｅｒｎａｅ ＤＳＭ １２３３３（ＢＣＡＶ＿１６８３、ＢＣＡＶ＿１４５１）、Ｐｒｏｖｉｄｅｎｃｉａ ｓｔｕａｒｔｉｉ ＡＴＣＣ ２５８２７（ＰＲＯＳＴＵ＿０４１８３）、Ｐｒｏｔｅｕｓ ｐｅｎｎｅｒｉ ＡＴＣＣ ３５１９８（ＰＲＯＰＥＮ＿０３６７２）、Ｓｔｒｅｐｔｏｓｐｏｒａｎｇｉｕｍ ｒｏｓｅｕｍ ＤＳＭ ４３０２１（ＳＲＯＳ＿３１８４、ＳＲＯＳ＿４８４７）、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．Ｙ４１２ＭＣ１０ ３ｓｅｑｓ ＧＹＭＣ１０＿２６９２、ＧＹＭＣ１０＿４７２７、ＧＹＭＣ１０＿３３９８）、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＡＴＣＣ ８７３９（ＹＡＨＪ、ＣＯＤＡ）、Ｋｔｅｄｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｒａｃｅｍｉｆｅｒ ＤＳＭ ４４９６３（ＫＲＡＣ＿３０３８）、Ｍａｒｉｎｏｍｏｎａｓ ｐｏｓｉｄｏｎｉｃａ ＩＶＩＡ−Ｐｏ−１８１（ＭＡＲ１８１＿２１８８）、Ｃｙａｎｏｔｈｅｃｅ ｓｐ．ＰＣＣ ７８２２（ＣＹＡＮ７８２２＿１８９８）、Ｅｄｗａｒｄｓｉｅｌｌａ ｔａｒｄａ ＥＩＢ２０２（ＣＯＤＡ）、Ｐｒｏｖｉｄｅｎｃｉａ ｒｕｓｔｉｇｉａｎｉｉ ＤＳＭ ４５４１（ＰＲＯＶＲＵＳＴ＿０５８６５）、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｃａｎｃｅｒｏｇｅｎｕｓ ＡＴＣＣ ３５３１６（ＥＮＴＣＡＮ＿０８３７６、ＥＮＴＣＡＮ＿０８６３１）、Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ ｙｏｕｎｇａｅ ＡＴＣＣ ２９２２０（ＣＩＴ２９２＿１０６７２、ＣＩＴ２９２＿０９６９７）、Ｃｉｔｒｅｉｃｅｌｌａ ｓｐ．ＳＥ４５（ＣＳＥ４５＿２９７０）、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ａｌｂｅｒｔｉｉ ＴＷ０７６２７（ＥＳＣＡＢ７６２７＿０３１７）、Ｏｌｉｇｏｔｒｏｐｈａ ｃａｒｂｏｘｉｄｏｖｏｒａｎｓ ＯＭ５（ＯＣＡＲ＿４６２７、ＣＯＤＡ）、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ｓｔｒ．Ｋ−１２ ｓｕｂｓｔｒ．ＭＧ１６５５（ＹＡＨＪ、ＣＯＤＡ）、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｕｃｈｎｅｒｉ ＮＲＲＬ Ｂ−３０９２９（ＬＢＵＣ＿２０３８）、Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ ｍａｘｉｍａ ＣＳ−３２８（ＡＭＡＸＤＲＡＦＴ＿２８９７）、Ｐａｎｔｏｅａ ｓｐ．ａＢ（ＰＡＮＡＢＤＲＡＦＴ＿０５６５、ＰＡＮＡＢＤＲＡＦＴ＿２９３８）、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｉｆｏｒｍｅ ＤＳＭ ３９８９（ＥＵＢＩＦＯＲ＿０１７７２）、Ｐｒｏｖｉｄｅｎｃｉａ ａｌｃａｌｉｆａｃｉｅｎｓ ＤＳＭ ３０１２０（ＰＲＯＶＡＬＣＡＬ＿０１１３１、ＰＲＯＶＡＬＣＡＬ＿０２８０４）、Ｐｒｏｖｉｄｅｎｃｉａ ｒｅｔｔｇｅｒｉ ＤＳＭ １１３１（ＰＲＯＶＲＥＴＴ＿０８７１４、ＰＲＯＶＲＥＴＴ＿０８１６９）、Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ ｍａｌｔｏｐｈｉｌｉａ Ｋ２７９ａ（ＡＴＺＣ２）、Ａｎａｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｏｌｙｔｉｃｕｓ ＡＴＣＣ ５１１７２（ＣＯＤＡ）、Ａｎａｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｔｅｔｒａｄｉｕｓ ＡＴＣＣ ３５０９８（ＨＭＰＲＥＦ００７７＿００９７）、Ｃｈｒｙｓｅｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｅｕｍ ＡＴＣＣ ３５９１０（ＤＡＮ２）、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｕｃｈｎｅｒｉ ＡＴＣＣ １１５７７（ＣＯＤＡ）、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｖａｇｉｎａｌｉｓ ＡＴＣＣ ４９５４０（ＣＯＤＡ）、Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｇｒａｙｉ ＤＳＭ ２０６０１（ＨＭＰＲＥＦ０５５６＿１０７５３、ＨＭＰＲＥＦ０５５６＿１０７５１、ＡＴＺＣ）、Ｄｅｓｕｌｆｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ ｂａｃｕｌａｔｕｍ ＤＳＭ ４０２８（ＤＢＡＣ＿２９３６）、Ａｎａｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｐｒｅｖｏｔｉｉ ＤＳＭ ２０５４８（ＡＰＲＥ＿１１１２）、Ｓｅｂａｌｄｅｌｌａ ｔｅｒｍｉｔｉｄｉｓ ＡＴＣＣ ３３３８６（ＳＴＥＲＭ＿０７８９）、Ｍｅｉｏｔｈｅｒｍｕｓ ｓｉｌｖａｎｕｓ ＤＳＭ ９９４６（ＭＥＳＩＬ＿２１０３）、Ｐｒｏｔｅｕｓ ｍｉｒａｂｉｌｉｓ ＨＩ４３２０（ＣＯＤＡ）、Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｏｐｐｏｒｔｕｎｉｓｔｕｍ ＷＳＭ２０７５（ＭＥＳＯＰ＿０１６２）、Ｖａｒｉｏｖｏｒａｘ ｐａｒａｄｏｘｕｓ Ｓ１１０（ＶＡＰＡＲ＿２６５４）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ ＱＭ Ｂ１５５１（ＢＭＱ＿０９８０）、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｓｅｕｄｏｃａｔｅｎｕｌａｔｕｍ ＤＳＭ ２０４３８＝ＪＣＭ １２００（ＢＩＦＰＳＥＵＤＯ＿０４３８２）、Ｆｅｒｒｉｍｏｎａｓ ｂａｌｅａｒｉｃａ ＤＳＭ 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ｓｐ．Ａｔ−９ｂ（ＰＡＴ９Ｂ＿３６７８、ＰＡＴ９Ｂ＿１０２９、ＰＡＴ９Ｂ＿０８５５）、Ｖａｒｉｏｖｏｒａｘ ｐａｒａｄｏｘｕｓ ＥＰＳ（ＶＡＲＰＡ＿３２５７、ＶＡＲＰＡ＿０９２０）、Ｐｒｏｃｈｌｏｒｏｃｏｃｃｕｓ ｍａｒｉｎｕｓ ｓｕｂｓｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ ｓｔｒ．ＣＣＭＰ１９８６（ＣＯＤＡ）、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．ＷＨ ７８０５（ＷＨ７８０５＿０５６７６）、Ｂｌａｔｔａｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．（Ｐｅｒｉｐｌａｎｅｔａ ａｍｅｒｉｃａｎａ）ｓｔｒ．ＢＰＬＡＮ（ＣＯＤＡ）、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｇｌｕｍａｅ ＢＧＲ１（ＢＧＬＵ＿１Ｇ１７９００）、Ａｚｏａｒｃｕｓ ｓｐ．ＢＨ７２（ＣＯＤＡ）、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｕｔｙｒｉｃｕｍ Ｅ４ ｓｔｒ．ＢｏＮＴ Ｅ ＢＬ５２６２（ＣＯＤＡ）、Ｅｒｗｉｎｉａ ｐｙｒｉｆｏｌｉａｅ Ｅｐ１／９６（ＣＯＤＡ）、Ｅｒｗｉｎｉａ ｂｉｌｌｉｎｇｉａｅ Ｅｂ６６１（ＥＢＣ＿３５４３０、ＣＯＤＡ、ＥＢＣ＿３２８５０、ＥＢＣ＿３２７８０）、Ｅｄｗａｒｄｓｉｅｌｌａ ｉｃｔａｌｕｒｉ ９３−１４６（ＮＴ０１ＥＩ＿３６１５）、Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ ｒｏｄｅｎｔｉｕｍ ＩＣＣ１６８（ＣＯＤＡ）、Ｓｔａｒｋｅｙａ ｎｏｖｅｌｌａ ＤＳＭ ５０６（ＳＮＯＶ＿３６１４、ＳＮＯＶ＿２３０４）、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｓｐ．ＣＣＧＥ１００１（ＢＣ１００１＿２３１１）、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｓｐ．ＣＣＧＥ１００２（ＢＣ１００２＿１９０８、ＢＣ１００２＿１６１０）、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｓｐ．ＣＣＧＥ１００３（ＢＣ１００３＿１１４７）、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ａｓｂｕｒｉａｅ ＬＦ７ａ（ＥＮＴＡＳ＿４０７４、ＥＮＴＡＳ＿３３７０）、Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｍ ＬＭＧ ３３０１（ＯＩＮＴ＿２０００３９５、ＯＩＮＴ＿２００１５４１）、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｌｅｎｔｏｃｅｌｌｕｍ ＤＳＭ ５４２７（ＣＬＯＬＥ＿１２９１）、Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ ａｅｓｐｏｅｅｎｓｉｓ Ａｓｐｏ−２（ＤＡＥＳ＿２１０１）、Ｇｏｒｄｏｎｉａ ｎｅｏｆｅｌｉｆａｅｃｉｓ ＮＲＲＬ Ｂ−５９３９５（ＳＣＮＵ＿１９６７７）、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．ＣＣ９３１１（ＳＹＮＣ＿０７４０）、Ｔｈｅｒｍａｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｍａｒｉａｎｅｎｓｉｓ ＤＳＭ １２８８５（ＴＭＡＲ＿１４７７）、Ｒｈｏｄｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ ｖａｎｎｉｅｌｉｉ ＡＴＣＣ １７１００（ＲＶＡＮ＿３３９５）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｌｌｕｌｏｓｉｌｙｔｉｃｕｓ ＤＳＭ ２５２２（ＢＣＥＬＬ＿１０９１、ＢＣＥＬＬ＿１２３４）、Ｃｙａｎｏｔｈｅｃｅ ｓｐ．ＰＣＣ ７４２４（ＰＣＣ７４２４＿０２３５）、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ３＿１＿５７ＦＡＡ＿ＣＴ１（ＨＭＰＲＥＦ０９９４＿０４４１９）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．２＿Ａ＿５７＿ＣＴ２（ＨＭＰＲＥＦ１０１３＿０４９０１、ＨＭＰＲＥＦ１０１３＿０４９０２、ＨＭＰＲＥＦ１０１３＿０１５３２、ＨＭＰＲＥＦ１０１３＿０４８８８）、Ａｆｉｐｉａ ｓｐ．１ＮＬＳ２（ＡＦＩＤＲＡＦＴ＿３０９２）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｌａｕｓｉｉ ＫＳＭ−Ｋ１６（ＡＢＣ４０３２）、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｏｄｏｒｉｆｅｒａ ＤＳＭ ４５８２（ＹＡＨＪ、ＣＯＤＡ）、Ｖｉｂｒｉｏ ａｌｇｉｎｏｌｙｔｉｃｕｓ ４０Ｂ（ＶＭＣ＿１９０８０）、Ｐｓｅｕｄｏｎｏｃａｒｄｉａ ｄｉｏｘａｎｉｖｏｒａｎｓ ＣＢ１１９０（ＰＳＥＤ＿５３８３）、Ｖｉｂｒｉｏ ｃｏｒａｌｌｉｉｌｙｔｉｃｕｓ ＡＴＣＣ ＢＡＡ−４５０（ＶＩＣ＿００２７０９）、Ｖｉｂｒｉｏ ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ ＣＩＰ １０２８９１＝ＡＴＣＣ ３３９３４（ＶＩＡ＿０００８５１）、Ｐｈｏｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄａｍｓｅｌａｅ ｓｕｂｓｐ．ｄａｍｓｅｌａｅ ＣＩＰ １０２７６１（ＶＤＡ＿０００７９９）、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｂｕｃｃａｌｉｓ ＡＴＣＣ ３５３１０（ＨＭＰＲＥＦ０６５０＿２３２９）、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｏｄｏｒｉｆｅｒａ ４Ｒｘ１３（ＳＯＤ＿Ｇ０１０５０、ＳＯＤ＿Ｈ００８１０）、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．ＷＨ ５７０１（ＷＨ５７０１＿１６１７３、ＷＨ５７０１＿０７３８６）、Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ ｐｌａｔｅｎｓｉｓ ＮＩＥＳ−３９（ＢＡＩ８９３５８．１）、Ｖｉｂｒｉｏ ｓｐ．Ｎ４１８（ＶＩＢＲＮ４１８＿０８８０７）、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｃｌｏａｃａｅ ＳＣＦ１（ＥＮＴＣＬ＿０３６２）、Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ ｃｌａｕｓｓｅｎｉｉ ＡＴＣＣ ＢＡＡ−３４４（ＣＯＤＡ）、Ｐａｎｔｏｅａ ａｎａｎａｔｉｓ ＬＭＧ ２０１０３（ＣＯＤＡ、ＹＡＨＪ）、Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＳＧ−６Ｃ（ＣＳＩＲＯ＿２００９）、Ｐａｎｔｏｅａ ｖａｇａｎｓ Ｃ９−１（ＣＯＤＡ、ＹＡＨＪ）、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ ＣＥＣＴ ５７１６（ＬＣ４０＿０５９７）、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｉｎｅｒｓ ＡＢ−１（ＬＩＮＥＡ＿０１０１０





０００６０４４）、Ｌｙｓｉｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｕｓｉｆｏｒｍｉｓ ＺＣ１（ＢＦＺＣ１＿０５１２３、ＢＦＺＣ１＿０５１１８）、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｖｏｒｔｅｘ Ｖ４５３（ＰＶＯＲ＿１６２０４、ＰＶＯＲ＿２５８６３）、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｃｌｏａｃａｅ ｓｕｂｓｐ．ｃｌｏａｃａｅ ＡＴＣＣ １３０４７（ＥＣＬ＿０４７４１、ＥＣＬ＿０３９９７）、Ｍａｒｉｎｏｍｏｎａｓ ｍｅｄｉｔｅｒｒａｎｅａ ＭＭＢ−１（ＭＡＲＭＥ＿０４９３）、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｃｌｏａｃａｅ ｓｕｂｓｐ．ｃｌｏａｃａｅ ＮＣＴＣ ９３９４（ＥＮＣ＿２９０９０、ＥＮＣ＿３４６４０）、Ｒａｈｎｅｌｌａ ｓｐ．Ｙ９６０２（ＲＡＨＡＱ＿４０６３、ＲＡＨＡＱ＿０２７８）、Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ ｐｉｅｃｈａｕｄｉｉ ＡＴＣＣ ４３５５３（ＨＭＰＲＥＦ０００４＿２３９７、ＡＴＺＣ、ＣＯＤＡ）、Ｓｕｔｔｅｒｅｌｌａ ｗａｄｓｗｏｒｔｈｅｎｓｉｓ ３＿１＿４５Ｂ（ＨＭＰＲＥＦ９４６４＿００５９５）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｕｌｖａ １２−Ｘ（ＰＳＥＦＵ＿１５６４）、Ｒａｈｎｅｌｌａ ａｑｕａｔｉｌｉｓ ＣＩＰ ７８．６５＝ＡＴＣＣ ３３０７１（ＡＥＸ５０２４３．１、ＡＥＸ５３９３３．１）、Ｐｒｏｃｈｌｏｒｏｃｏｃｃｕｓ ｍａｒｉｎｕｓ ｓｔｒ．ＭＩＴ ９３１２（ＰＭＴ９３１２＿１４００）、Ｐｒｏｃｈｌｏｒｏｃｏｃｃｕｓ ｍａｒｉｎｕｓ ｓｔｒ．ＭＩＴ ９３１３（ＣＯＤＡ）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ ＷＨ６（ＹＡＨＪ）、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉ ＤＳＭ １３５２８（ＣＬＪＵ＿Ｃ１９２３０）、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｂｉｎｇｃｈｅｎｇｇｅｎｓｉｓ ＢＣＷ−１（ＳＢＩ＿０６１５０）、Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ ｍｅｄｉｔｅｒｒａｎｅｉ Ｕ３２（ＡＭＥＤ＿１９９７）、Ｍｉｃｒｏｃｏｌｅｕｓ ｖａｇｉｎａｔｕｓ ＦＧＰ−２（ＭＩＣＶＡＤＲＡＦＴ＿２９８６、ＭＩＣＶＡＤＲＡＦＴ＿１２５３）、Ｋｅｔｏｇｕｌｏｎｉｇｅｎｉｕｍ ｖｕｌｇａｒｕｍ ＷＳＨ−００１（ＣＯＤＡＢ、ＫＶＵ＿１１４３）、Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ ｘｙｌｏｓｏｘｉｄａｎｓ Ａ８ （ＡＸＹＬ＿０１２２３、ＡＸＹＬ＿０５７３８、ＡＸＹＬ＿０１９８１、ＣＯＤＡ）、Ｐｅｄｏｂａｃｔｅｒ ｓａｌｔａｎｓ ＤＳＭ １２１４５（ＰＥＤＳＡ＿０１０６）、Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｃｉｃｅｒｉ ｂｉｏｖａｒ ｂｉｓｅｒｒｕｌａｅ ＷＳＭ１２７１（ＭＥＳＣＩ＿０１６３）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ ＧＢ−１（ＰＰＵＴＧＢ１＿２６５１、ＰＰＵＴＧＢ１＿３５９０）、Ｘａｎｔｈｏｂａｃｔｅｒ ａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｓ Ｐｙ２（ＸＡＵＴ＿４０５８）、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．ＷＨ ８１０２（ＣＯＤＡ）、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｖａｒｉａｂｉｌｅ ＤＳＭ ４４７０２（ＣＯＤＡ）、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．Ｈ１３−３（ＡＧＲＯＨ１３３＿０９５５１）、Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ ａｃｉｄｉｌａｃｔｉｃｉ ＤＳＭ ２０２８４（ＣＯＤＡ）、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ Ｔ３Ｔ１（ＰＡＲＡ＿１８２５０）、Ｗｅｅｋｓｅｌｌａ ｖｉｒｏｓａ ＤＳＭ １６９２２（ＷＥＥＶＩ＿１９９３）、Ａｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｕｒｉｎａｅ ＡＣＳ−１２０−Ｖ−Ｃｏｌ１０ａ（ＣＯＤＡ）、Ｔｈｅｒｍａｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｓｕｂｔｅｒｒａｎｅｕｓ ＤＳＭ １３９６５（ＴＨＥＳＵＤＲＡＦＴ＿１１６３）、Ａｅｒｏｍｏｎａｓ ｃａｖｉａｅ Ａｅ３９８（ＡＣＡＶＡ＿０１０１０００００６３６）、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｒｈｉｚｏｘｉｎｉｃａ ＨＫＩ ４５４（ＲＢＲＨ＿０３８０８）、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｃａ ｓｕｂｓｐ．ａｒｉｚｏｎａｅ ｓｅｒｏｖａｒ ｓｔｒ．ＲＳＫ２９８０（ＳＡＲＩ＿０４２９０）、Ｈｙｌｅｍｏｎｅｌｌａ ｇｒａｃｉｌｉｓ ＡＴＣＣ １９６２４（ＨＧＲ＿１１３２１）、Ａｇｇｒｅｇａｔｉｂａｃｔｅｒ ｓｅｇｎｉｓ ＡＴＣＣ ３３３９３（ＣＯＤＡ）、Ｒｏｓｅｏｖａｒｉｕｓ ｎｕｂｉｎｈｉｂｅｎｓ ＩＳＭ（ＩＳＭ＿１１２３０）、Ｐｌａｕｔｉａ ｓｔａｌｉ ｓｙｍｂｉｏｎｔ（ＰＳＴＡＳ＿０１０１０００１６１６１、ＰＳＴＡＳ＿０１０１０００１３５７４）、Ｐｅｐｔｏｎｉｐｈｉｌｕｓ ｈａｒｅｉ ＡＣＳ−１４６−Ｖ−Ｓｃｈ２ｂ（ＣＯＤＡ）、Ｐｓｅｕｄｏｖｉｂｒｉｏ ｓｐ．ＦＯ−ＢＥＧ１（ＰＳＥ＿０７６８）、Ｗｅｉｓｓｅｌｌａ ｃｉｂａｒｉａ ＫＡＣＣ １１８６２（ＷＣＩＢＫ１＿０１０１００００１５２９）、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．ＰＣＣ ７３３５（Ｓ７３３５＿２０５２、Ｓ７３３５＿１０９、Ｓ７３３５＿１７３１）、Ａｎａｅｒｏｌｉｎｅａ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ ＵＮＩ−１（ＡＮＴ＿０２９５０）、Ｐｒｏｃｈｌｏｒｏｃｏｃｃｕｓ ｍａｒｉｎｕｓ ｓｔｒ．ＭＩＴ ９２１１（ＣＯＤＡ）、Ｐｒｏｃｈｌｏｒｏｃｏｃｃｕｓ ｍａｒｉｎｕｓ ｓｔｒ．ＭＩＴ ９２１５（ＣＯＤＡ）、Ｆｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｒｕｃｔｏｓｕｓ ＫＣＴＣ ３５４４（ＦＦＲＵＫ３＿０１０１００００４８３４）、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆａｒｃｉｍｉｎｉｓ ＫＣＴＣ ３６８１（ＬＦＡＲＫ３＿０１０１００００１８４７）、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｒｕｃｔｉｖｏｒａｎｓ ＫＣＴＣ ３５４３（ＬＦＲＵＫ３＿０１０１００００２０７５）、Ｔｅｔｒａｇｅｎｏｃｏｃｃｕｓ ｈａｌｏｐｈｉｌｕｓ ＮＢＲＣ １２１７２（ＴＥＨ＿０５４３０、ＴＥＨ＿１４８５０、ＴＥＨ＿０２２２０）、Ｖｉｂｒｉｏ ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ ＬＭＧ ２０５４６（ＶＩＢＲ０５４６＿１４５４５）、Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ ｔａｉｗａｎｅｎｓｉｓ ＬＭＧ １９４２４（ＣＯＤＡ）、Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｅｓｔａｃｅｕｍ ＳｔＬＢ０３７（ＭＴＥＳ＿１２４７、ＭＴＥＳ＿３６００）、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｅｒｒａｅ ＨＰＬ−００３（ＨＰＬ００３＿２２０７０）、Ｒｕｂｒｉｖｉｖａｘ ｂｅｎｚｏａｔｉｌｙｔｉｃｕｓ ＪＡ２（ＲＢＸＪＡ２Ｔ＿０４７４３）、Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｕｍ ｇｉｌｖｕｍ ＳＬ００３Ｂ−２６Ａ１（ＳＬ００３Ｂ＿２４６１）、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｃａ ｓｕｂｓｐ．ｅｎｔｅｒｉｃａ ｓｅｒｏｖａｒ Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ ｓｔｒ．ＬＴ２（ＳＴＭ３３３４）、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｇｒｉｓｅｏａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ Ｍ０４５（ＳＧＭ＿３２１０）、Ａｅｒｏｍｏｎａｓ ｖｅｒｏｎｉｉ Ｂ５６５（Ｂ５６５＿３９８７）、Ｈａｌｏｍｏｎａｓ ｓｐ．ＴＤ０１（ＧＭＥ＿０８２０９）、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｇｌａｄｉｏｌｉ ＢＳＲ３（ＢＧＬＡ＿２Ｇ１３６６０）。
一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、腫瘍内投与され、５−ＦＣは、全身投与される。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌と５−ＦＣの両方が、全身投与される。
これらの実施形態のいずれにおいても、遺伝子操作された細菌は、同じ条件、例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏ条件下で、５−ＦＣから、同じ細菌亜型の未改変細菌より少なくとも約０％〜２％〜４％、４％〜６％、６％〜８％、８％〜１０％、１０％〜１２％、１２％〜１４％、１４％〜１６％、１６％〜１８％、１８％〜２０％、２０％〜２５％、２５％〜３０％、３０％〜３５％、３５％〜４０％、４０％〜４５％、４５％〜５０％、５０％〜５５％、５５％〜６０％、６０％〜６５％、６５％〜７０％〜８０％、８０％〜９０％、または９０％〜１００％多い５−ＦＵを産生する。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、５−ＦＣから、同じ細菌亜型の未改変細菌より少なくとも約１．０〜１．２倍、１．２〜１．４倍、１．４〜１．６倍、１．６〜１．８倍、１．８〜２倍、または２倍多い５−ＦＵを産生する。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件、例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏ条件下で、５−ＦＣから、同じ細菌亜型の未改変細菌より約３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、４０倍、または５０倍、１００倍、５００倍、または１０００倍多い５−ＦＵを産生する。
これらの実施形態のいずれにおいても、５−ＦＵを産生するように遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より０％〜２％〜４％、４％〜６％、６％〜８％、８％〜１０％、１０％〜１２％、１２％〜１４％、１４％〜１６％、１６％〜１８％、１８％〜２０％、２０％〜２５％、２５％〜３０％、３０％〜３５％、３５％〜４０％、４０％〜４５％、４５％〜５０％、５０％〜５５％、５５％〜６０％、６０％〜６５％、６５％〜７０％〜８０％、８０％〜９０％、または９０％〜１００％またはそれより大きく増加された量の５−ＦＣを消費する。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より１．０〜１．２倍、１．２〜１．４倍、１．４〜１．６倍、１．６〜１．８倍、１．８〜２倍、または２倍多い５−ＦＣを消費する。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より約３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、１００倍、５００倍、または１０００倍もしくはそれより大きく増加された量の５−ＦＣを産生する。
これらの実施形態のいずれにおいても、５−ＦＣから５−ＦＵへの変換のための回路をコードする遺伝子配列を含む遺伝子操作された細菌は、細胞増殖を、同じ条件下で、同じ亜型の未改変細菌と比較して、少なくとも約１０％〜２０％、２０％〜２５％、２５％〜３０％、３０％〜４０％、４０％〜５０％、５０％〜６０％、６０％〜７０％、７０％〜７５％、７５％〜８０％、８０％〜８５％、８５％〜９０％、９０％〜９５％、９５％〜９９％、またはそれより大きく低減させることができる。
これらの実施形態のいずれにおいても、５−ＦＣから５−ＦＵへの変換のための回路をコードする遺伝子配列を含む遺伝子操作された細菌は、腫瘍成長を、同じ条件下で、同じ亜型の未改変細菌と比較して、少なくとも約１０％〜２０％、２０％〜２５％、２５％〜３０％、３０％〜４０％、４０％〜５０％、５０％〜６０％、６０％〜７０％、７０％〜７５％、７５％〜８０％、８０％〜８５％、８５％〜９０％、９０％〜９５％、９５％〜９９％、またはそれより大きく低減させることができる。これらの実施形態のいずれにおいても、５−ＦＣから５−ＦＵへの変換のための回路をコードする遺伝子配列を含む遺伝子操作された細菌は、腫瘍サイズを、同じ条件下で、同じ亜型の未改変細菌と比較して、少なくとも約１０％〜２０％、２０％〜２５％、２５％〜３０％、３０％〜４０％、４０％〜５０％、５０％〜６０％、６０％〜７０％、７０％〜７５％、７５％〜８０％、８０％〜８５％、８５％〜９０％、９０％〜９５％、９５％〜９９％、またはそれより大きく低減させることができる。これらの変換実施形態のいずれにおいても、５−ＦＣから５−ＦＵへの変換のための回路をコードする遺伝子配列を含む遺伝子操作された細菌は、細胞体積を、同じ条件下で、同じ亜型の未改変細菌と比較して、少なくとも約１０％〜２０％、２０％〜２５％、２５％〜３０％、３０％〜４０％、４０％〜５０％、５０％〜６０％、６０％〜７０％、７０％〜７５％、７５％〜８０％、８０％〜８５％、８５％〜９０％、９０％〜９５％、９５％〜９９％、またはそれより大きく低減させることができる。これらの実施形態のいずれにおいても、５−ＦＣから５−ＦＵへの変換のための回路をコードする遺伝子配列を含む遺伝子操作された細菌は、細胞重量を、同じ条件下で、同じ亜型の未改変細菌と比較して、少なくとも約１０％〜２０％、２０％〜２５％、２５％〜３０％、３０％〜４０％、４０％〜５０％、５０％〜６０％、６０％〜７０％、７０％〜７５％、７５％〜８０％、８０％〜８５％、８５％〜９０％、９０％〜９５％、９５％〜９９％、またはそれより大きく低減させることができる。
一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ＣｏｄＡをコードする遺伝子配列を含む。一実施形態では、ＣｏｄＡ遺伝子は、配列番号１２１３と少なくとも約８０％の同一性を有する。別の実施形態では、ＣｏｄＡ遺伝子は、配列番号１２１３と少なくとも約８５％の同一性を有する。一実施形態では、ＣｏｄＡ遺伝子は、配列番号１２１３と少なくとも約９０％の同一性を有する。一実施形態では、ＣｏｄＡ遺伝子は、配列番号１２１３と少なくとも約９５％の同一性を有する。別の実施形態では、ＣｏｄＡ遺伝子は、配列番号１２１３と少なくとも約９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有する。したがって、一実施形態では、ＣｏｄＡ遺伝子は、配列番号１２１３と少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有する。別の実施形態では、ＣｏｄＡ遺伝子は、配列番号１２１３の配列を含む。さらに別の実施形態では、ＣｏｄＡ遺伝子は、配列番号１２１３の配列からなる。
一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、配列番号１２１６または配列番号１２１７と少なくとも約８０％の同一性を有するＣｏｄＡポリペプチドをコードする遺伝子配列を含む。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、配列番号１２１６または配列番号１２１７と少なくとも約９０％の同一性をほぼ有することがあるＣｏｄＡポリペプチドをコードする遺伝子配列を含む。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、配列番号１２１６または配列番号１２１７と少なくとも約９５％の同一性をほぼ有することがあるＣｏｄＡポリペプチドをコードする遺伝子配列を含む。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、配列番号１２１６もしくは配列番号１２１７と約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有するＣｏｄＡポリペプチドまたはその機能性断片をコードする遺伝子配列を含む。別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、配列番号１２１６または配列番号１２１７を含むＣｏｄＡポリペプチドをコードする遺伝子配列を含む。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌により発現されるポリペプチドは、配列番号１２１６または配列番号１２１７からなる。
一部の実施形態では、シトシンデアミナーゼは、例えば、安定性を増強するために、または５−ＦＵ産生を増大させるために、改変および／または突然変異される。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌および／または他の微生物は、誘導条件下で、例えば、免疫抑制および／または腫瘍微小環境に関連する条件下で、シトシンデアミナーゼを産生することができる。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌および／または他の微生物は、低酸素条件もしくは低酸素条件で、ある特定の分子もしくは代謝物の存在下で、がん、もしくはある特定の組織、免疫抑制、もしくは炎症に関連する分子もしくは代謝物の存在下で、または消化管、血行路もしくは腫瘍内に存在することもあり、しないこともある何らかの他の代謝物、例えばアラビノース、クメートおよびサリチレート、の存在下で、シトシンデアミナーゼを産生することができる。
一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、Ｅ．ｃｏｌｉからのシトシンデアミナーゼをコードする。一部の実施形態では、Ｅ．ｃｏｌｉからのシトシンデアミナーゼは、例えば、安定性を増強するために、または５−ＦＵ産生を増大させるために、改変および／または突然変異される。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌および／または他の微生物は、誘導条件下で、例えば、免疫抑制および／または腫瘍微小環境に関連する条件下で、シトシンデアミナーゼを産生することができる。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌および／または他の微生物は、低酸素条件もしくは低酸素条件で、ある特定の分子もしくは代謝物の存在下で、がん、もしくはある特定の組織、免疫抑制、もしくは炎症に関連する分子もしくは代謝物の存在下で、または消化管、血行路もしくは腫瘍内に存在することもあり、しないこともある何らかの他の代謝物、例えばアラビノース、クメートおよびサリチレートの存在下で、シトシンデアミナーゼを産生することができる。
一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌および／または微生物は、低酸素条件で、ならびに／あるいはがんの存在下で、ならびに／あるいは腫瘍微小環境、および／または腫瘍微小環境または組織特異的分子もしくは代謝物において、ならびに／あるいは炎症または免疫抑制に関連する分子または代謝物の存在下で、ならびに／あるいは消化管内または腫瘍に存在しうる代謝物の存在下で、ならびに／あるいはｉｎ ｖｉｖｏで存在することもあり、しないこともあり、ｉｎ ｖｉｔｒｏで、株培養、拡大増殖、産生および／もしくは製造中に存在することもある、代謝物、例えば、アラビノース、クメートおよびサリチレートおよび本明細書に記載の他のものの存在下で、Ｅ．ｃｏｌｉ由来のシトシンデアミナーゼの発現のための回路を含むが、これに限定されてない、記載の回路のいずれか１つまたは複数を発現することができる。一部の実施形態では、遺伝子配列は、そのような条件および／またはインデューサーにより誘導されうるプロモーターによって制御される。一部の実施形態では、遺伝子配列は、本明細書に記載の構成的プロモーターによって制御される。一部の実施形態では、遺伝子配列は、構成的プロモーターによって制御され、本明細書に記載の、ｉｎ ｖｉｖｏ条件および／またはｉｎ ｖｉｔｒｏ条件で、例えば、細菌および／または他の微生物の拡大増殖、産生および／または製造中に発現される。これらの実施形態のいずれにおいても、例えばＥ．ｃｏｌｉからの、シトシンデアミナーゼの発現のための回路網を含むがこれに限定されない、記載の回路のいずれか１つまたは複数は、１つもしくは複数のプラスミド（例えば、高コピー数もしくは低コピー数プラスミド）上に存在するか、または細菌および／もしくは他の微生物染色体内の１つもしくは複数の部位に組み込まれている。
これらの実施形態のいずれにおいても、シトシンデアミナーゼをコードする遺伝子配列を含む遺伝子操作された細菌は、１つまたは複数のさらなるエフェクター分子、すなわち、治療用分子または代謝変換因子をコードする遺伝子配列をさらに含む。これらの実施形態のいずれにおいても、シトシンデアミナーゼをコードする回路は、同じかまたは異なる細菌株において、本明細書に記載される１つまたは複数の免疫イニシエーターまたは免疫サステナーをコードする回路と組み合わせることができる（組合せ回路または株の混合物）。免疫イニシエーターまたは免疫サステナーをコードする回路は、構成的または誘導性プロモーター、例えば、低酸素誘導性プロモーターまたは本明細書に記載される任意の他の構成的もしくは誘導性プロモーターの制御下にあり得る。これらの実施形態のいずれにおいても、シトシンデアミナーゼをコードする遺伝子配列は、同じかまたは異なる細菌株において、本明細書に記載される１つまたは複数のＳＴＩＮＧアゴニスト産生酵素をコードする遺伝子配列と組み合わせることができる（組合せ回路または株の混合物）。一部の実施形態では、シトシンデアミナーゼをコードする遺伝子配列と組み合わされる遺伝子配列は、ＤａｃＡをコードする。ＤａｃＡは、構成的または誘導性プロモーター、例えば、低酸素誘導性プロモーター、例えば、ＦＮＲ、または本明細書に記載される任意の他の構成的もしくは誘導性プロモーターの制御下にあり得る。一部の実施形態では、ｄａｃＡ遺伝子は、染色体に組み込まれている。一部の実施形態では、シトシンデアミナーゼをコードする遺伝子配列と組み合わされる遺伝子配列は、ｃＧＡＳをコードする。ｃＧＡＳは、構成的または誘導性プロモーター、例えば、低酸素誘導性プロモーター、例えば、ＦＮＲ、または本明細書に記載される任意の他の構成的もしくは誘導性プロモーターの制御下にあり得る。一部の実施形態では、ｃＧＡＳをコードする遺伝子は、染色体に組み込まれている。これらの組合せの実施形態のいずれにおいても、細菌は、栄養要求性の改変、例えば、ＤａｐＡ、ＴｈｙＡ、または両方の突然変異または欠失をさらに含み得る。これらの実施形態のいずれにおいても、細菌は、ファージの改変、例えば、本明細書に記載される内在性プロファージの突然変異または欠失をさらに含み得る。
一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌および／または微生物は、記載の回路のいずれか１つまたは複数をさらに発現することができ、以下のものの１つまたは複数をさらに含む：（１）１つまたは複数の栄養要求体、例えば、当技術分野において公知の、および本明細書で提供される、任意の栄養要求体、例えばｔｈｙＡ栄養要求体、（２）１つまたは複数のキルスイッチ回路、例えば、本明細書に記載の、またはそうでなければ当技術分野において公知の、キルスイッチのいずれか、（３）１つまたは複数の抗生物質耐性回路、（４）生体分子または基質を移入するための１つまたは複数の輸送体、例えば、本明細書に記載の、またはそうでなければ当技術分野において公知の、輸送体のいずれか、（５）１つまたは複数の分泌回路、例えば、本明細書に記載の、でなければ当技術分野において公知の、分泌回路のいずれか、（６）１つまたは複数の表面提示回路、例えば、本明細書に記載の、でなければ当技術分野において公知の、表面提示回路のいずれか、（７）本明細書に記載の１つまたは複数の代謝物（例えば、キヌレニン、トリプトファン、アデノシン、アルギニン）の産生または分解のための１つまたは複数の回路、および（８）このような追加の回路の１つまたは複数の組合せ。これらの実施形態のいずれにおいても、遺伝子操作された細菌を単独で投与することができ、または抗ＣＴＬＡ４、抗体または抗ＰＤ１もしくは抗ＰＤＬ１抗体を含むがこれらに限定されない、本明細書に記載の１つもしくは複数の免疫チェックポイントインヒビターと組み合わせて投与することができる。
食作用回避の阻害−ＣＤ４７−ＳＩＲＰα経路
がんには、腫瘍進行を促進するために、プログラム細胞死およびプログラム細胞除去の一部として誘導された内因性の「私を食べて」シグナルの回避を可能にするように「私を食べないで」シグナルを上方調節する能力がある。
ＣＤ４７は、細胞遊走ならびにＴ細胞および樹状細胞活性化に関与する細胞表面分子である。加えて、ＣＤ４７は、チロシンホスファターゼ活性化および食作用性シナプスの膜直下集合部位でのミオシン蓄積の阻害につながる、食細胞上に発現されるシグナル調節タンパク質アルファ（ＳＩＲＰα）のライゲーションによって、食作用のインヒビターとして機能する。結果として、ＣＤ４７は、「私を食べないでシグナル」を伝達する。ＣＤ４７の喪失は、加齢および損傷細胞の恒常的食作用に至る。
腫瘍が食作用の回避によって自然免疫系を回避することを可能にする、ＣＤ４７発現レベル上昇が、複数のヒト腫瘍型で観察される。このプロセスは、腫瘍細胞上のＣＤ４７が食細胞上のＳＩＲＰαと結合すること、その結果、食作用の阻害および腫瘍生存を促進することによって起こる。
抗ＣＤ４７抗体は、多くの異なるヒトがんに対する前臨床活性を、ｉｎ ｖｉｔｒｏでも、マウス異種移植モデルにおいても明示している（Ｃｈａｏら、Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１２年４月；２４巻（２号）：２２５〜２３２頁．Ｔｈｅ ＣＤ４７−ＳＩＲＰα Ｐａｔｈｗａｙ ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｅ Ｅｖａｓｉｏｎ ａｎｄ Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、およびその中の参考文献）。ＣＤ４７に加えて、治療戦略としてＳＩＲＰαを標的とすることもでき、例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏで投与された抗ＳＩＲＰα抗体は、マクロファージによる腫瘍細胞の食作用を引き起こした（Ｃｈａｏら、２０１２年）。
第３の手法では、ヒトＳＩＲＰαの単一１４ｋＤａ ＣＤ４７結合ドメイン（膜貫通タンパク質を有さない可溶性形態）をヒトＣＤ４７に対する競合的アンタゴニストとして使用する、ＣＤ４７標的療法が、開発されている（Ｗｅｉｓｋｏｐｆら、Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ＳＩＲＰα ｖａｒｉａｎｔｓ ａｓ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ａｄｊｕｖａｎｔｓ ｔｏ ａｎｔｉ−ｃａｎｃｅｒ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ；Ｓｃｉｅｎｃｅ．２０１３年７月５日；３４１巻（６１４１号）：１０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ．１２３８８５６に記載の通りで
あり、この内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。野生型ＳＩＲＰαは、ＣＤ４７に対して比較的低い親和性を示したため、突然変異ＳＩＲＰαが酵母表面提示によるｉｎ ｖｉｔｒｏ進化によって生成され、それらは、ＣＤ４７の強力な結合剤およびアンタゴニストとして作用することが示された。これらのバリアントは、ＣＶ１（コンセンサスバリアント１）および高親和性バリアントＦＤ６、ならびにこれらのバリアントのＦｃ融合タンパク質を含む。親和性増加につながるアミノ酸変化は、ヒトＳＩＲＰαのｄ１ドメインに位置する。ＳＩＲＰαバリアントの非限定的な例は、ＷＯ／２０１３／１０９７５２にも記載されており、この内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
ある特定の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ＣＤ４７を阻害する、および／またはＳＩＲＰαを阻害する、および／またはＣＤ４７とマクロファージに発現されたＳＩＲＰαとの相互作用を阻害もしくは防止する、１つまたは複数の免疫モジュレーターを産生する。例えば、遺伝子操作された微生物は、ＣＤ４７に対する抗体および／またはＳＩＲＰαに対する抗体、例えば、ＣＤ４７に対する単鎖抗体および／またはＳＩＲＰαに対する単鎖抗体をコードしうる。別の非限定的な例では、遺伝子操作された微生物は、ＳＩＲＰαＣＤ４７結合ドメインを含む競合的アンタゴニストポリペプチドをコードしうる。そのような競合的アンタゴニストポリペプチドは、ＣＤ４７の競合的結合によって機能して、ＣＤ４７とマクロファージ上に発現されたＳＩＲＰαとの相互作用を防止することができる。一部の実施形態では、競合的アンタゴニストポリペプチドは、可溶性であり、例えば、微生物から分泌される。一部の実施形態では、競合的アンタゴニストポリペプチドは、微生物の表面に提示される。一部の実施形態では、競合的アンタゴニストポリペプチドをコードする遺伝子操作された微生物は、ＳＩＲＰαＣＤ４７結合ドメインの野生型形態をコードする。一部の実施形態では、競合的アンタゴニストポリペプチドをコードする遺伝子操作された微生物は、ＳＩＲＰαＣＤ４７結合ドメインの突然変異またはバリアント形態をコードする。一部の実施形態では、バリアント形態は、ＣＶ１ ＳＩＲＰαバリアントである。一部の実施形態では、バリアント形態は、ＦＤ６バリアントである。一部の実施形態では、ＳＩＲＰαバリアントは、Ｗｅｉｓｋｏｐｆら、および／または国際特許出願公開ＷＯ／２０１３／１０９７５２に記載のバリアントである。一部の実施形態では、競合的アンタゴニストポリペプチドをコードする遺伝子操作された微生物は、安定化ポリペプチドと融合されているＳＩＲＰαＣＤ４７結合ドメインまたはそのバリアントをコードする。一部の実施形態では、競合的アンタゴニストポリペプチドをコードする遺伝子操作された微生物は、安定化ポリペプチドと融合されているＳＩＲＰαＣＤ４７結合ドメインの野生型形態をコードする。非限定的な例では、野生型ＳＩＲＰαＣＤ４７結合ドメインポリペプチドと融合されている安定化ポリペプチドは、Ｆｃ部分である。一部の実施形態では、野生型ＳＩＲＰαＣＤ４７結合ドメインポリペプチドと融合されている安定化ポリペプチドは、ＩｇＧ Ｆｃ部分である。一部の実施形態では、野生型ＳＩＲＰαＣＤ４７結合ドメインポリペプチドと融合されている安定化ポリペプチドは、ＩｇＧ４ Ｆｃ部分である。一部の実施形態では、競合的アンタゴニストポリペプチドをコードする遺伝子操作された微生物は、安定化ポリペプチドと融合されているＳＩＲＰαＣＤ４７結合ドメインの突然変異またはバリアント形態をコードする。一部の実施形態では、安定化ポリペプチドと融合されているバリアント形態は、ＣＶ１ ＳＩＲＰαバリアントである。一部の実施形態では、安定化ポリペプチドと融合されているバリアント形態は、Ｆ６バリアントである。一部の実施形態では、安定化ポリペプチドと融合されているＳＩＲＰαバリアントは、Ｗｅｉｓｋｏｐｆら、および／または国際特許出願公開ＷＯ／２０１３／１０９７５２に記載のバリアントである。非限定的な例では、バリアントＳＩＲＰαＣＤ４７結合ドメインポリペプチドと融合されている安定化ポリペプチドは、Ｆｃ部分である。一部の実施形態では、バリアントＳＩＲＰαＣＤ４７結合ドメインポリペプチドと融合されている安定化ポリペプチドは、ＩｇＧ Ｆｃ部分である。一部の実施形態では、バリアントＳＩＲＰαＣＤ４７結合ドメインポリペプチドと融合されている安定化ポリペプチドは、ＩｇＧ４ Ｆｃ部分である。
一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、抗ＣＤ４７抗体および／または抗ＳＩＲＰα抗体、例えば単鎖抗体を発現する、細菌である。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、競合的アンタゴニストＳＩＲＰαＣＤ４７結合ドメイン（ＷＴ、またはＣＤ４７親和性を向上させるように突然変異されたもの）を発現する、細菌である。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、低酸素条件により活性化されるプロモーターの制御下で、抗ＣＤ４７抗体および／または抗ＳＩＲＰα抗体、例えば単鎖抗体を発現する、細菌である。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、低酸素条件により活性化されるプロモーターの制御下で、競合的アンタゴニストＳＩＲＰαＣＤ４７結合ドメイン（ＷＴ、またはＣＤ４７親和性が向上された突然変異バリアント）を発現する。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、低酸素条件によりまたは炎症性条件により活性化されるプロモーター、例えば、前記条件により活性化される、本明細書に記載のプロモーターのいずれかの制御下で、抗ＣＤ４７抗体および／または抗ＳＩＲＰα、例えば単鎖抗体を発現する。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、低酸素条件によりまたは炎症性条件により活性化されるプロモーター、例えば、前記条件により活性化される、本明細書に記載のプロモーターのいずれかの制御下で、競合的アンタゴニストＳＩＲＰαＣＤ４７結合ドメイン（ＷＴ、またはＣＤ４７親和性が向上された突然変異バリアント）を発現する。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、がん特異的プロモーター、組織特異的プロモーター、または構成的プロモーター、例えば、本明細書に記載のプロモーターのいずれかの制御下で、抗ＣＤ４７抗体および／または抗ＳＩＲＰα抗体、例えば単鎖抗体を発現する。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、がん特異的プロモーター、組織特異的プロモーター、または構成的プロモーター、例えば、本明細書に記載のプロモーターのいずれかの制御下の、競合的アンタゴニストＳＩＲＰαＣＤ４７結合ドメイン（ＷＴ、またはＣＤ４７親和性が向上された突然変異バリアント）をコードする１つまたは複数の遺伝子を含む。これらの実施形態のいずれにおいても、遺伝子操作された微生物は、Ｆｃ媒介機能、例えばＡＤＣＣ、ならびに／またはＭ−ＣＳＦおよび／もしくはＧＭ−ＣＳＦを刺激することができ、その結果、食作用阻害を遮断することになる、１つまたは複数の免疫モジュレーターを産生することもできる。
遺伝子操作された細菌および／または他の微生物は、ＣＤ４７−ＳＩＲＰα相互作用の阻害または防止のための、任意の適する抗ＣＤ４７抗体、抗ＳＩＲＰα抗体または競合的ＳＩＲＰαＣＤ４７結合ドメインポリペプチド（野生型、またはＣＤ４７結合親和性が向上された突然変異バリアント）をコードする、１つまたは複数の遺伝子を含むことができる。一部の実施形態では、抗体または競合的ポリペプチドは、例えば、安定性を増強させ、ＣＤ４７拮抗作用を増大させるために、改変および／または突然変異される。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌および／または他の微生物は、誘導条件下で、例えば、免疫抑制および／または腫瘍微小環境に関連する条件下で、抗体または競合的ポリペプチドを産生することができる。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌および／または他の微生物は、低酸素条件もしくは低酸素条件で、ある特定の分子もしくは代謝物の存在下で、がん、もしくはある特定の組織、免疫抑制、もしくは炎症に関連する分子もしくは代謝物の存在下で、または消化管、血行路もしくは腫瘍内に存在することもあり、しないこともある何らかの他の代謝物、例えばアラビノース、、クメートおよびサリチレートの存在下で、抗体または競合的ポリペプチドを産生することができる。
一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、Ｂ６Ｈ１２−抗ＣＤ４７−ｓｃＦｖをコードする抗ＣＤ４７遺伝子配列を含む。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、配列番号９９４と少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９９％相同であるポリペプチドをコードする。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、配列番号９９４を含むポリペプチドをコードする。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、配列番号９９４からなるポリペプチドをコードする。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、５Ｆ９−抗ＣＤ４７−ｓｃＦｖをコードする抗ＣＤ４７遺伝子配列を含む。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、配列番号９９６から選択される配列と少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９９％相同であるポリペプチドをコードする。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、配列番号９９６を含むポリペプチドをコードする。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、配列番号９９６からなるポリペプチドをコードする。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、５Ｆ９抗ｈＣＤ４７ｓｃＦｖ−Ｖ５−ＨＩＳをコードする抗ＣＤ４７遺伝子配列を含む。一部の実施形態では、抗ＣＤ４７ ｓｃＦｖ配列は、非コード領域とタグをコードする配列とを除く、配列番号９９３および配列番号９９５から選択される配列と、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９９％相同である。一部の実施形態では、遺伝子配列は、非コード領域とタグをコードする配列とを除く、配列番号９９３および配列番号９９５から選択される配列を含む。一部の実施形態では、遺伝子配列は、非コード領域とタグをコードする配列とを除く、配列番号９９３および配列番号９９５から選択される配列からなる。
一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、配列番号１１１８、配列番号１２３１、配列番号１１１９、配列番号１１２０から選択される配列と少なくとも約８０％の同一性を有するＳＩＲＰαポリペプチドをコードする遺伝子配列を含む。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、配列番号１１１８、配列番号１２３１、配列番号１１１９、配列番号１１２０から選択される配列と少なくとも約９０％の同一性を有するＳＩＲＰαポリペプチドをコードする遺伝子配列を含む。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、配列番号１１１８、配列番号１２３１、配列番号１１１９、配列番号１１２０から選択される配列と少なくとも約９５％の同一性を有するＳＩＲＰαポリペプチドをコードする遺伝子配列を含む。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、配列番号１１１８、配列番号１２３１、配列番号１１１９、配列番号１１２０から選択される配列またはその機能性断片と約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有するＳＩＲＰαポリペプチドをコードする遺伝子配列を含む。別の実施形態では、ＳＩＲＰαポリペプチドは、配列番号１１１８、配列番号１２３１、配列番号１１１９および配列番号１１２０から選択される配列を含む。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌により発現されるポリペプチドは、配列番号１１１８、配列番号１２３１、配列番号１１１９および配列番号１１２０から選択される配列からなる。
これらの実施形態のいずれにおいても、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より少なくとも約０％〜２％〜４％、４％〜６％、６％〜８％、８％〜１０％、１０％〜１２％、１２％〜１４％、１４％〜１６％、１６％〜１８％、１８％〜２０％、２０％〜２５％、２５％〜３０％、３０％〜３５％、３５％〜４０％、４０％〜４５％、４５％〜５０％、５０％〜５５％、５５％〜６０％、６０％〜６５％、６５％〜７０％〜８０％、８０％〜９０％、または９０％〜１００％多い、ＳＩＲＰα、ＳＩＲＰαバリアント（例えば、ＣＶ１もしくはＦＤ６バリアント）、またはＳＩＲＰα融合タンパク質（例えば、ＳＩＲＰα ＩｇＧ Ｆｃ融合タンパク質）を産生する。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より少なくとも約１．０〜１．２倍、１．２〜１．４倍、１．４〜１．６倍、１．６〜１．８倍、１．８〜２倍、または２倍多い、ＳＩＲＰα、ＳＩＲＰαバリアント（例えば、ＣＶ１もしくはＦＤ６バリアント）、またはＳＩＲＰα融合タンパク質（例えば、ＳＩＲＰα ＩｇＧ Ｆｃ融合タンパク質）を産生する。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、４０倍、または５０倍、１００倍、５００倍、または１０００倍多い、ＳＩＲＰα、ＳＩＲＰαバリアント（例えば、ＣＶ１もしくはＦＤ６バリアント）、またはＳＩＲＰα融合タンパク質（例えば、ＳＩＲＰα ＩｇＧ Ｆｃ融合タンパク質）を産生する。
これらの実施形態のいずれにおいても、ＳＩＲＰα、ＳＩＲＰαバリアント（例えば、ＣＶ１もしくはＦＤ６バリアント）、またはＳＩＲＰα融合タンパク質（例えば、ＳＩＲＰα ＩｇＧ Ｆｃ融合タンパク質）を産生するように遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より少なくとも約０％〜２％〜４％、４％〜６％、６％〜８％、８％〜１０％、１０％〜１２％、１２％〜１４％、１４％〜１６％、１６％〜１８％、１８％〜２０％、２０％〜２５％、２５％〜３０％、３０％〜３５％、３５％〜４０％、４０％〜４５％、４５％〜５０％、５０％〜５５％、５５％〜６０％、６０％〜６５％、６５％〜７０％〜８０％、８０％〜９０％、または９０％〜１００％多い、ＳＩＲＰα、ＳＩＲＰαバリアント（例えば、ＣＶ１もしくはＦＤ６バリアント）、またはＳＩＲＰα融合タンパク質（例えば、ＳＩＲＰα ＩｇＧ Ｆｃ融合タンパク質）を分泌する。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より少なくとも約１．０〜１．２倍、１．２〜１．４倍、１．４〜１．６倍、１．６〜１．８倍、１．８〜２倍、または２倍多い、ＳＩＲＰα、ＳＩＲＰαバリアント（例えば、ＣＶ１もしくはＦＤ６バリアント）、またはＳＩＲＰα融合タンパク質（例えば、ＳＩＲＰα ＩｇＧ Ｆｃ融合タンパク質）を分泌する。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、１００倍、５００倍、または１０００倍多い、ＳＩＲＰα、ＳＩＲＰαバリアント（例えば、ＣＶ１もしくはＦＤ６バリアント）、またはＳＩＲＰα融合タンパク質（例えば、ＳＩＲＰα ＩｇＧ Ｆｃ融合タンパク質）を分泌する。
一部の実施形態では、ＳＩＲＰα、ＳＩＲＰαバリアント（例えば、ＣＶ１もしくはＦＤ６バリアント）、またはＳＩＲＰα融合タンパク質（例えば、ＳＩＲＰα ＩｇＧ Ｆｃ融合タンパク質）を分泌するように遺伝子操作された細菌は、細胞増殖を、同じ条件下で、同じ亜型の未改変細菌と比較して、少なくとも約１０％〜２０％、２０％〜２５％、２５％〜３０％、３０％〜４０％、４０％〜５０％、５０％〜６０％、６０％〜７０％、７０％〜７５％、７５％〜８０％、８０％〜８５％、８５％〜９０％、９０％〜９５％、９５％〜９９％、またはそれより大きく低減させることができる。
一部の実施形態では、ＳＩＲＰα、ＳＩＲＰαバリアント（例えば、ＣＶ１もしくはＦＤ６バリアント）、またはＳＩＲＰα融合タンパク質（例えば、ＳＩＲＰα ＩｇＧ Ｆｃ融合タンパク質）を分泌するように遺伝子操作された細菌は、腫瘍成長を、同じ条件下で、同じ亜型の未改変細菌と比較して、少なくとも約１０％〜２０％、２０％〜２５％、２５％〜３０％、３０％〜４０％、４０％〜５０％、５０％〜６０％、６０％〜７０％、７０％〜７５％、７５％〜８０％、８０％〜８５％、８５％〜９０％、９０％〜９５％、９５％〜９９％、またはそれより大きく低減させることができる。
一部の実施形態では、ＳＩＲＰα、ＳＩＲＰαバリアント（例えば、ＣＶ１もしくはＦＤ６バリアント）、またはＳＩＲＰα融合タンパク質（例えば、ＳＩＲＰα ＩｇＧ Ｆｃ融合タンパク質）を分泌するように遺伝子操作された細菌は、腫瘍サイズを、同じ条件下で、同じ亜型の未改変細菌と比較して、少なくとも約１０％〜２０％、２０％〜２５％、２５％〜３０％、３０％〜４０％、４０％〜５０％、５０％〜６０％、６０％〜７０％、７０％〜７５％、７５％〜８０％、８０％〜８５％、８５％〜９０％、９０％〜９５％、９５％〜９９％、またはそれより大きく低減させることができる。
一部の実施形態では、ＳＩＲＰα、ＳＩＲＰαバリアント（例えば、ＣＶ１もしくはＦＤ６バリアント）、またはＳＩＲＰα融合タンパク質（例えば、ＳＩＲＰα ＩｇＧ Ｆｃ融合タンパク質）を分泌するように遺伝子操作された細菌は、腫瘍体積を、同じ条件下で、同じ亜型の未改変細菌と比較して、少なくとも約１０％〜２０％、２０％〜２５％、２５％〜３０％、３０％〜４０％、４０％〜５０％、５０％〜６０％、６０％〜７０％、７０％〜７５％、７５％〜８０％、８０％〜８５％、８５％〜９０％、９０％〜９５％、９５％〜９９％、またはそれより大きく低減させることができる。
一部の実施形態では、ＳＩＲＰα、ＳＩＲＰαバリアント（例えば、ＣＶ１もしくはＦＤ６バリアント）、またはＳＩＲＰα融合タンパク質（例えば、ＳＩＲＰα ＩｇＧ Ｆｃ融合タンパク質）を分泌するように遺伝子操作された細菌は、腫瘍重量を、同じ条件下で、同じ亜型の未改変細菌と比較して、少なくとも約１０％〜２０％、２０％〜２５％、２５％〜３０％、３０％〜４０％、４０％〜５０％、５０％〜６０％、６０％〜７０％、７０％〜７５％、７５％〜８０％、８０％〜８５％、８５％〜９０％、９０％〜９５％、９５％〜９９％、またはそれより大きく低減させることができる。一部の実施形態では、ＳＩＲＰα、ＳＩＲＰαバリアント（例えば、ＣＶ１もしくはＦＤ６バリアント）、またはＳＩＲＰα融合タンパク質（例えば、ＳＩＲＰα ＩｇＧ Ｆｃ融合タンパク質）を分泌するように遺伝子操作された細菌は、奏功率を、同じ条件下で、同じ亜型の未改変細菌と比較して、少なくとも約１０％〜２０％、２０％〜２５％、２５％〜３０％、３０％〜４０％、４０％〜５０％、５０％〜６０％、６０％〜７０％、７０％〜７５％、７５％〜８０％、８０％〜８５％、８５％〜９０％、９０％〜９５％、９５％〜９９％、またはそれより大きく上昇させることができる。
一部の実施形態では、ＳＩＲＰα、ＳＩＲＰαバリアント（例えば、ＣＶ１もしくはＦＤ６バリアント）、またはＳＩＲＰα融合タンパク質（例えば、ＳＩＲＰα ＩｇＧ Ｆｃ融合タンパク質）を分泌するように遺伝子操作された細菌は、腫瘍細胞の食作用を、同じ条件下で、同じ亜型の未改変細菌と比較して、少なくとも約１０％〜２０％、２０％〜２５％、２５％〜３０％、３０％〜４０％、４０％〜５０％、５０％〜６０％、６０％〜７０％、７０％〜７５％、７５％〜８０％、８０％〜８５％、８５％〜９０％、９０％〜９５％、９５％〜９９％、またはそれより大きく増加させることができる。
これらの実施形態のいずれにおいても、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より少なくとも約０％〜２％〜４％、４％〜６％、６％〜８％、８％〜１０％、１０％〜１２％、１２％〜１４％、１４％〜１６％、１６％〜１８％、１８％〜２０％、２０％〜２５％、２５％〜３０％、３０％〜３５％、３５％〜４０％、４０％〜４５％、４５％〜５０％、５０％〜５５％、５５％〜６０％、６０％〜６５％、６５％〜７０％〜８０％、８０％〜９０％、または９０％〜１００％多い抗ＣＤ４７ ｓｃＦｖを産生する。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より少なくとも約１．０〜１．２倍、１．２〜１．４倍、１．４〜１．６倍、１．６〜１．８倍、１．８〜２倍、または２倍多い抗ＣＤ４７ ｓｃＦｖを産生する。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、４０倍、または５０倍、１００倍、５００倍、または１０００倍多い抗ＣＤ４７ ｓｃＦｖを産生する。
これらの実施形態のいずれにおいても、抗ＣＤ４７ ｓｃＦｖを産生するように遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より少なくとも約０％〜２％〜４％、４％〜６％、６％〜８％、８％〜１０％、１０％〜１２％、１２％〜１４％、１４％〜１６％、１６％〜１８％、１８％〜２０％、２０％〜２５％、２５％〜３０％、３０％〜３５％、３５％〜４０％、４０％〜４５％、４５％〜５０％、５０％〜５５％、５５％〜６０％、６０％〜６５％、６５％〜７０％〜８０％、８０％〜９０％、または９０％〜１００％多い抗ＣＤ４７ ｓｃＦｖを分泌する。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より少なくとも約１．０〜１．２倍、１．２〜１．４倍、１．４〜１．６倍、１．６〜１．８倍、１．８〜２倍、または２倍多い抗ＣＤ４７ ｓｃＦｖを分泌する。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、１００倍、５００倍、または１０００倍多い抗ＣＤ４７ ｓｃＦｖを分泌する。
一部の実施形態では、抗ＣＤ４７ ｓｃＦｖを分泌するように遺伝子操作された細菌は、細胞増殖を、同じ条件下で、同じ亜型の未改変細菌と比較して少なくとも約１０％〜２０％、２０％〜２５％、２５％〜３０％、３０％〜４０％、４０％〜５０％、５０％〜６０％、６０％〜７０％、７０％〜７５％、７５％〜８０％、８０％〜８５％、８５％〜９０％、９０％〜９５％、９５％〜９９％、またはそれより大きく低減させることができる。
一部の実施形態では、抗ＣＤ４７ ｓｃＦｖを分泌するように遺伝子操作された細菌は、腫瘍成長を、同じ条件下で、同じ亜型の未改変細菌と比較して少なくとも約１０％〜２０％、２０％〜２５％、２５％〜３０％、３０％〜４０％、４０％〜５０％、５０％〜６０％、６０％〜７０％、７０％〜７５％、７５％〜８０％、８０％〜８５％、８５％〜９０％、９０％〜９５％、９５％〜９９％、またはそれより大きく低減させることができる。
一部の実施形態では、抗ＣＤ４７ ｓｃＦｖを分泌するように遺伝子操作された細菌は、腫瘍サイズを、同じ条件下で、同じ亜型の未改変細菌と比較して少なくとも約１０％〜２０％、２０％〜２５％、２５％〜３０％、３０％〜４０％、４０％〜５０％、５０％〜６０％、６０％〜７０％、７０％〜７５％、７５％〜８０％、８０％〜８５％、８５％〜９０％、９０％〜９５％、９５％〜９９％、またはそれより大きく低減させることができる。
一部の実施形態では、抗ＣＤ４７ ｓｃＦｖを分泌するように遺伝子操作された細菌は、腫瘍体積を、同じ条件下で、同じ亜型の未改変細菌と比較して少なくとも約１０％〜２０％、２０％〜２５％、２５％〜３０％、３０％〜４０％、４０％〜５０％、５０％〜６０％、６０％〜７０％、７０％〜７５％、７５％〜８０％、８０％〜８５％、８５％〜９０％、９０％〜９５％、９５％〜９９％、またはそれより大きく低減させることができる。
一部の実施形態では、抗ＣＤ４７ ｓｃＦｖを分泌するように遺伝子操作された細菌は、腫瘍重量を、同じ条件下で、同じ亜型の未改変細菌と比較して少なくとも約１０％〜２０％、２０％〜２５％、２５％〜３０％、３０％〜４０％、４０％〜５０％、５０％〜６０％、６０％〜７０％、７０％〜７５％、７５％〜８０％、８０％〜８５％、８５％〜９０％、９０％〜９５％、９５％〜９９％、またはそれより大きく低減させることができる。一部の実施形態では、抗ＣＤ４７ ｓｃＦｖを産生するように遺伝子操作された細菌は、奏功率を、同じ条件下で、同じ亜型の未改変細菌と比較して少なくとも約１０％〜２０％、２０％〜２５％、２５％〜３０％、３０％〜４０％、４０％〜５０％、５０％〜６０％、６０％〜７０％、７０％〜７５％、７５％〜８０％、８０％〜８５％、８５％〜９０％、９０％〜９５％、９５％〜９９％、またはそれより大きく上昇させることができる。
一部の実施形態では、抗ＣＤ４７ ｓｃＦｖを分泌するように遺伝子操作された細菌は、腫瘍細胞の食作用を、同じ条件下で、同じ亜型の未改変細菌と比較して少なくとも約１０％〜２０％、２０％〜２５％、２５％〜３０％、３０％〜４０％、４０％〜５０％、５０％〜６０％、６０％〜７０％、７０％〜７５％、７５％〜８０％、８０％〜８５％、８５％〜９０％、９０％〜９５％、９５％〜９９％、またはそれより大きく増大させることができる。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、腫瘍細胞の食作用を、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より少なくとも１．０〜１．２倍、１．２〜１．４倍、１．４〜１．６倍、１．６〜１．８倍、１．８〜２倍、または２倍大きく増大させる。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、腫瘍細胞の食作用を、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、１００倍、５００倍、または１０００倍大きく増大させる。
一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌および／または他の微生物は、低酸素条件で、ならびに／あるいはがんの、および／または腫瘍微小環境の、および／または腫瘍微小環境もしくは組織特異的分子もしくは代謝物の存在下で、ならびに／あるいは炎症、または免疫抑制に関連する分子または代謝物の存在下で、ならびに／あるいは消化管または腫瘍内に存在しうる代謝物の存在下で、ならびに／あるいはｉｎ ｖｉｖｏで存在することもあり、しないこともあり、ｉｎ ｖｉｔｒｏで株培養、拡大増殖、産生および／もしくは製造中に存在することもある、代謝物、例えば、アラビノース、クメートおよびサリチレートおよび本明細書に記載の他のものの存在下で、記載ＳＩＲＰαまたは抗ＣＤ４７の回路のいずれか１つまたは複数を発現することができる。一部の実施形態では、遺伝子配列は、そのような条件および／またはインデューサーにより誘導されうるプロモーターによって制御される。一部の実施形態では、遺伝子配列は、本明細書に記載の構成的プロモーターによって制御される。一部の実施形態では、遺伝子配列は、構成的プロモーターによって制御され、本明細書に記載の、ｉｎ ｖｉｖｏ条件および／またはｉｎ ｖｉｔｒｏ条件で、例えば、細菌および／または他の微生物の拡大増殖、産生および／または製造中に発現される。一部の実施形態では、遺伝子配列は、１つもしくは複数のプラスミド（例えば、高コピー数もしくは低コピー数プラスミド）上に存在するか、または細菌および／もしくは他の微生物染色体内の１つもしくは複数の部位に組み込まれている。
これらの実施形態のいずれにおいても、ＳＩＲＰαもしくはそのバリアントまたは抗ＣＤ４７ポリペプチドをコードする遺伝子配列を含む遺伝子操作された細菌は、１つまたは複数のさらなるエフェクター分子、すなわち、治療用分子または代謝変換因子をコードする遺伝子配列をさらに含む。これらの実施形態のいずれにおいても、ＳＩＲＰαもしくはそのバリアントまたは抗ＣＤ４７ポリペプチドをコードする回路は、同じかまたは異なる細菌株において、本明細書に記載される１つまたは複数の免疫イニシエーターまたは免疫サステナーをコードする回路と組み合わせることができる（組合せ回路または株の混合物）。免疫イニシエーターまたは免疫サステナーをコードする回路は、構成的または誘導性プロモーター、例えば、低酸素誘導性プロモーターまたは本明細書に記載される任意の他の構成的もしくは誘導性プロモーターの制御下にあり得る。
これらの実施形態のいずれにおいても、ＳＩＲＰαもしくはそのバリアントまたは抗ＣＤ４７ポリペプチドをコードする遺伝子配列は、同じかまたは異なる細菌株において、本明細書に記載される１つまたは複数のＳＴＩＮＧアゴニスト産生酵素をコードする遺伝子配列と組み合わせることができる（組合せ回路または株の混合物）。一部の実施形態では、ＳＩＲＰαもしくはそのバリアントまたは抗ＣＤ４７ポリペプチドをコードする遺伝子配列と組み合わされる遺伝子配列は、ＤａｃＡをコードする。ＤａｃＡは、構成的または誘導性プロモーター、例えば、低酸素誘導性プロモーター、例えば、ＦＮＲ、または本明細書に記載される任意の他の構成的もしくは誘導性プロモーターの制御下にあり得る。一部の実施形態では、ｄａｃＡ遺伝子は、染色体に組み込まれている。一部の実施形態では、ＳＩＲＰαもしくはそのバリアントまたは抗ＣＤ４７ポリペプチドをコードする遺伝子配列と組み合わされる遺伝子配列は、ｃＧＡＳをコードする。ｃＧＡＳは、構成的または誘導性プロモーター、例えば、低酸素誘導性プロモーター、例えば、ＦＮＲ、または本明細書に記載される任意の他の構成的もしくは誘導性プロモーターの制御下にあり得る。一部の実施形態では、ｃＧＡＳをコードする遺伝子は、染色体に組み込まれている。
これらの組合せの実施形態のいずれにおいても、細菌は、栄養要求性の改変、例えば、ＤａｐＡ、ＴｈｙＡ、または両方の突然変異または欠失をさらに含み得る。これらの実施形態のいずれにおいても、細菌は、ファージの改変、例えば、内在性プロファージの突然変異または欠失をさらに含み得る。
一部の実施形態では、記載の回路のうちのいずれか１つまたは複数は、１つもしくは複数のプラスミド（例えば、高コピー数または低コピー数プラスミド）上に存在するか、または細菌および／もしくは他の微生物の染色体内の１つもしくは複数の部位に組み込まれている。また、一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌および／または他の微生物は、記載の回路のいずれか１つまたは複数をさらに発現することができ、以下のものの１つまたは複数をさらに含む：（１）１つまたは複数の栄養要求体、例えば、当技術分野において公知の、および本明細書で提供される、任意の栄養要求体、例えばｔｈｙＡ栄養要求体、（２）１つまたは複数のキルスイッチ回路、例えば、本明細書に記載の、またはそうでなければ当技術分野において公知の、キルスイッチのいずれか、（３）１つまたは複数の抗生物質耐性回路、（４）生体分子または基質を移入するための１つまたは複数の輸送体、例えば、本明細書に記載の、またはそうでなければ当技術分野において公知の、輸送体のいずれか、（５）１つまたは複数の分泌回路、例えば、本明細書に記載の、でなければ当技術分野において公知の、分泌回路のいずれか、（６）１つまたは複数の表面提示回路、例えば、本明細書に記載の、でなければ当技術分野において公知の、表面提示回路のいずれか、（７）本明細書に記載される１つまたは複数の代謝物（例えば、キヌレニン、トリプトファン、アデノシン、アルギニン）の産生または分解のための１つまたは複数の回路、ならびに（８）このような追加の回路のうちの１つまたは複数の組合せ。これらの実施形態のいずれにおいても、遺伝子操作された細菌を単独で投与することができ、または抗ＣＴＬＡ４、抗ＰＤ１もしくは抗ＰＤ−Ｌ１抗体を含むがこれらに限定されない、本明細書に記載の１つもしくは複数の免疫チェックポイントインヒビターと組み合わせて投与することができる。
抗原提示細胞の活性化
ＳＴＩＮＧアゴニスト
インターフェロン遺伝子刺激因子（ＳＴＩＮＧ）タンパク質は、ＤＮＡウイルス、細菌、および腫瘍由来のＤＮＡに由来する細胞質性核酸によって誘発されるシグナル伝達の極めて重要なメディエーターであることが示されている。ＳＴＩＮＧが、Ｉ型インターフェロン産生を誘導する能力は、抗腫瘍応答の状況での研究に繋がり、結果として、ＳＴＩＮＧは、抗腫瘍免疫療法における強力な標的となる可能性があることが判明した。ＳＴＩＮＧ活性化によって引き起こされる抗腫瘍作用の大部分は、ＡＰＣによるＩＦＮ−βの産生およびこれらの細胞による抗原提示の改善、それによって腫瘍関連抗原に対するＣＤ８＋Ｔ細胞のプライミングを促進することに依存し得る。しかし、ＳＴＩＮＧタンパク質はまた、骨髄系由来サプレッサー細胞（ＭＤＳＣ）およびがん細胞そのものを含む、様々な種類の細胞にも広範に発現され、それらにおいては、経路の機能は依然として十分に特徴付けられていない（Ｓｏｋｏｌｏｗｓｋａ， Ｏ．およびＮｏｗｉｓ， Ｄ、ＳＴＩＮＧ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌｓ： Ｉｍｐｏｒｔａｎｔ ｏｒ Ｎｏｔ？； Ａｒｃｈｉｖｕｍ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉａｅ ｅｔ Ｔｈｅｒａｐｉａｅ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌｉｓ； Ａｒｃｈ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｔｈｅｒ． Ｅｘｐ．、（２０１８年）、６６巻：１２５頁）。
膜貫通タンパク質１７３（ＴＭＥＭ１７３）、インターフェロン調節因子３活性化メディエーター（ＭＩＴＡ）、ＭＰＹＳ、または小胞体インターフェロン刺激因子（ＥＲＩＳ）としても公知の、インターフェロン遺伝子刺激因子（ＳＴＩＮＧ）は、主としてマクロファージ、Ｔ細胞、樹状細胞、内皮細胞、ならびにある特定の線維芽細胞および上皮細胞に発現される、二量体タンパク質である。ＳＴＩＮＧは、自然免疫応答に重要な役割を果たす−ＳＴＩＮＧを欠くマウスは、様々な微小生物への曝露後に生存可能であるが、致死性感染に罹りやすい。ＳＴＩＮＧは、サイトゾルサイクリックジヌクレオチド（ＣＤＮ）、例えば、ｃＧＡＭＰおよび細菌の二次メッセンジャーｃ−ジ−ＧＭＰおよびｃ−ジ−ＡＭＰの形態の二次メッセンジャーのサイトゾル受容体として機能する。ＣＤＮによって刺激されると、ＳＴＩＮＧの構造変化が起こる。ＳＴＩＮＧは、ＥＲからゴルジ体へと移動し、そのカルボキシ末端は遊離される。これは、ＴＢＫ１（ＴＡＮＫ結合キナーゼ１）／ＩＲＦ３（インターフェロン調節因子３）、ＮＦ−κＢ、およびＳＴＡＴ６シグナル伝達経路を活性化をもたらし、そしてそれによってＩ型インターフェロンおよび炎症性サイトカイン応答を促進する。ＣＤＮは、正規のサイクリックジＧＭＰ（ｃ［Ｇ（３０−５０）ｐＧ（３０−５０）ｐ］）またはサイクリックジＡＭＰまたはサイクリックＧＡＭＰ（ｃＧＭＰ−ＡＭＰ）を含む（Ｂａｒｂｅｒ、ＳＴＩＮＧ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｃｙｔｏｓｏｌｉｃ ＤＮＡ ｓｅｎｓｉｎｇ ｐａｔｈｗａｙｓ； Ｔｒｅｎｄｓ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１４年２月：３５巻（２号）：８８〜９３頁）。
ＣＤＮは、外因性に（すなわち、細菌によって）産生されることもあり、および／または内因性に（すなわち、ｄｓＤＮＡへの曝露時に宿主酵素により宿主内で）産生されることもある。ＳＴＩＮＧは、様々な細菌性の二次メッセンジャー分子、サイクリックジグアニル酸一リン酸（ｃ−ジ−ＧＭＰ）およびサイクリックジアデニル酸一リン酸（ｃ−ジ−ＡＭＰ）を認識することができ、この認識によって、自然免疫シグナル伝達応答が誘発される（Ｍａら、Ｔｈｅ ｃＧＡＳ−ＳＴＩＮＧ Ｄｅｆｅｎｓｅ Ｐａｔｈｗａｙ ａｎｄ Ｉｔｓ Ｃｏｕｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｂｙ Ｖｉｒｕｓｅｓ ； Ｃｅｌｌ Ｈｏｓｔ ＆ Ｍｉｃｒｏｂｅ １９巻、２０１６年２月１０日）。加えて、サイクリックＧＭＰＡＭＰ（ｃＧＡＭＰ）はまた、ＳＴＩＮＧに結合し、ＩＲＦ３の不活性化およびβ−インターフェロン産生をもたらし得る。Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅによって産生される３’５’−３’５’ｃＧＡＭＰ（３’３’ｃＧＡＭＰ）および後生動物二次メッセンジャーサイクリック［Ｇ（２’，５’）ｐＡ（３’５’）］（２’３’ ｃＧＡＭＰ）のいずれも、ＳＴＩＮＧ経路を通じて自然免疫応答を活性化することができる（Ｙｉら、Ｓｉｎｇｌｅ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ ｏｆ Ｈｕｍａｎ ＳＴＩＮＧ Ｃａｎ Ａｆｆｅｃｔ Ｉｎｎａｔｅ Ｉｍｍｕｎｅ Ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｔｏ Ｃｙｃｌｉｃ Ｄｉｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ； ＰＬＯＳ Ｏｎｅ、（２０１３年）、８巻（１０号）ｅ７７８４６頁、その中の参考文献）。細菌および後生動物（例えば、ヒト）ｃ−ジ−ＧＡＭＰシンターゼ（ｃＧＡＳ）は、ＧＴＰおよびＡＴＰを利用して、ＳＴＩＮＧ活性化を行うことができるｃＧＡＭＰを生成する。２つの正規の３０〜５０ホスホジエステル連結を有する原核生物ＣＤＮとは対照的に、ヒトｃＧＡＳ産物は、特有の２０〜５０結合を含有し、その結果、２’，３’ｃＧＡＭＰとして表される混合連結型のサイクリックＧＭＰ−ＡＭＰ分子となる（Ｋｒａｎｚｕｓｃｈら、Ａｎｃｉｅｎｔ Ｏｒｉｇｉｎ ｏｆ ｃＧＡＳ−ＳＴＩＮＧ Ｒｅｖｅａｌｓ Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ２’，３’ｃＧＡＭＰ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ； Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ ５９巻、８９１〜９０３頁、２０１５年９月１７日、およびその中の参考文献に記載の通り）。細菌Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅは、ｃＧＡＳの構造ホモログであるＤｎｃＶと呼ばれる酵素をコードし、正規の３’−５’結合を有する関連二次メッセンジャー（３’，３’ｃＧＡＭＰ）を合成する。
インターフェロン遺伝子刺激因子（ＳＴＩＮＧ）経路の成分は、免疫系による腫瘍細胞の検出に重要な役割を果たす。前臨床研究では、サイクリックジヌクレオチド（ＣＤＮ）、天然に存在するまたは合理的に設計された合成誘導体は、攻撃的な抗腫瘍応答を促進することができる。例えば、ＳＴＩＮＧＶＡＸ形態の放射線照射ＧＭ−ＣＳＦ分泌全細胞ワクチンと合剤にされたとき、合成ＣＤＮは、抗腫瘍有効性を増大させ、ＰＤ−１遮断と組み合わせられたＳＴＩＮＧＶＡＸは、定着腫瘍の退縮を誘導した（Ｆｕら、ＳＴＩＮＧ ａｇｏｎｉｓｔ ｆｏｒｍｕｌａｔｅｄ ｃａｎｃｅｒ ｖａｃｃｉｎｅｓ ｃａｎ ｃｕｒｅ ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ ｔｕｍｏｒｓ ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ｔｏ ＰＤ−１ ｂｌｏｃｋａｄｅ； Ｓｃｉ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ．２０１５年４月１５日；７巻（２８３号）：２８３ｒａ５２）。別の例では、Ｓｍｉｔｈらは、ＳＴＩＮＧアゴニストが、養子移入されたリンパ
球によって認識されない腫瘍細胞を除去するように免疫応答を刺激することによってＣＡＲ Ｔ療法を増強することができること、およびそれによってＣＡＲ Ｔ細胞療法の有効性を向上させることができることを示す研究を行った（Ｓｍｉｔｈら、Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ ｃｏ−ｄｅｌｉｖｅｒｉｎｇ ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ Ｔ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ＳＴＩＮＧ ａｇｏｎｉｓｔｓ ｃａｎ ｅｌｉｍｉｎａｔｅ ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｏｕｓ ｔｕｍｏｒｓ；Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ．２０１７年６月１日：１２７巻（６号）：２１７６〜２１９１頁）。
一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、１つまたは複数のＳＴＩＮＧアゴニストを産生することができる、細菌である。本開示の遺伝子操作された細菌により産生されうるＳＴＩＮＧアゴニストの非限定的な例としては、３’３’ｃＧＡＭＰ、２’３’−ｃＧＡＭＰ、２’２’−ｃＧＡＭＰ、２’２’−ｃＧＡＭＰ ＶａｃｃｉＧｒａｄｅ（商標）（サイクリック［Ｇ（２’，５’）ｐＡ（２’，５’）ｐ］）、２’３’−ｃＧＡＭＰ、２’３’−ｃＧＡＭＰ ＶａｃｃｉＧｒａｄｅ（商標）（サイクリック［Ｇ（２’，５’）ｐＡ（３’，５’）ｐ］）、２’３’−ｃＧＡＭ（ＰＳ）２（Ｒｐ／Ｓｐ）、３’３’−ｃＧＡＭＰ、３’３’−ｃＧＡＭＰ ＶａｃｃｉＧｒａｄｅ（商標）（サイクリック［Ｇ（３’，５’）ｐＡ（３’，５’）ｐ］）、ｃ−ジＡＭＰ、ｃ−ジＡＭＰ ＶａｃｃｉＧｒａｄｅ（商標）（サイクリックジアデニル酸一リン酸Ｔｈ１／Ｔｈ２応答）、２’３’−ｃ−ジＡＭＰ、２’３’−ｃ−ジＡＭ（ＰＳ）２（Ｒｐ，Ｒｐ）（ｃ−ジＡＭＰのビスホスホロチオエートアナログ、Ｒｐ異性体）、２’３’−ｃ−ジＡＭ（ＰＳ）２（Ｒｐ，Ｒｐ）ＶａｃｃｉＧｒａｄｅ（商標）、ｃ−ジＧＭＰ、ｃ−ジＧＭＰ ＶａｃｃｉＧｒａｄｅ（商標）、２’３’−ｃ−ジＧＭＰ、およびｃ−ジＩＭＰが挙げられる。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、１つまたは複数のＳＴＩＮＧアゴニストの産生のための１つまたは複数の酵素をコードする遺伝子を含む、細菌である。サイクリックジＧＡＭＰシンターゼ（ｃｄｉ−ＧＡＭＰシンターゼまたはｃＧＡＳ）は、１つのＡＴＰおよび１つのＧＴＰからサイクリックジＧＡＭＰを産生する。一部の実施形態では、酵素は、ｃ−ジＧＡＭＰシンターゼ（ｃＧＡＳ）である。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、クラスＥＣ ２．７．７．８６の酵素の発現のための１つまたは複数の遺伝子配列を含む。一部の実施形態では、そのような酵素は、細菌酵素である。一部の実施形態では、酵素は、細菌ｃ−ジＧＭＰシンターゼである。一部の実施形態では、酵素は、細菌ｃ−ＧＡＭＰシンターゼ（ＧＭＰ−ＡＭＰシンターゼ）である。一部の実施形態では、細菌は、３’３’ｃ−ｄＧＡＭＰを産生することができる。
一部の実施形態では、細菌は、３’３’−ｃＧＡＭＰを産生することができる。本開示によると、遺伝子操作された細菌からの３’３’−ｃＧＡＭＰの産生に適切ないくつかの酵素が、同定されている。これらの酵素としては、Ｖｅｒｍｉｎｅｐｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｅｉｓｅｎｉａｅ（ＥＦ０１−２ Ｅａｒｔｈｗｏｒｍ ｓｙｍｂｉｏｎｔ）、Ｋｉｎｇｅｌｌａ ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ（ＡＴＣＣ ３３３９４）、およびＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｂａｃｉｌｌｉｆｏｒｍｉｓ（ＡＴＣＣ ＢＡＡ−１２００）に由来するＶｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅ ｃＧＡＳオルソログが挙げられる。したがって、一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅに由来するｃＧＡＳをコードする遺伝子配列を含む。したがって、一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、Ｖｅｒｍｉｎｅｐｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｅｉｓｅｎｉａｅ（ＥＦ０１−２ Ｅａｒｔｈｗｏｒｍ ｓｙｍｂｉｏｎｔ）、Ｋｉｎｇｅｌｌａ ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ（ＡＴＣＣ ３３３９４）、およびＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｂａｃｉｌｌｉｆｏｒｍｉｓ（ＡＴＣＣ ＢＡＡ−１２００）から選択される種に由来する１つまたは複数のＶｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅ ｃＧＡＳオルソログをコードする遺伝子配列を含む。一部の実施形態では、細菌は、ＤｎｃＶをコードする遺伝子配列を含む。一部の実施形態では、ＤｎｃＶは、Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅに由来する。一実施形態では、ＤｎｃＶオルソログは、Ｖｅｒｍｉｎｅｐｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｅｉｓｅｎｉａｅに由来する。一実施形態では、ＤｎｃＶオルソログは、Ｋｉｎｇｅｌｌａ ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓに由来する。一実施形態では、ＤｎｃＶオルソログは、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｂａｃｉｌｌｉｆｏｒｍｉｓに由来する。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、Ｅｎｈｙｄｒｏｂａｃｔｅｒ ａｅｒｏｓａｃｃｕｓ、Ｋｉｎｇｅｌｌａ ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｂａｃｉｌｌｉｆｏｒｍｉｓ、Ｐｈａｅｏｂａｃｔｅｒ ｇａｌｌａｅｃｉｅｎｓｉ、Ｃｉｔｒｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ ｓｐ．、Ｒｏｓｅｏｂａｃｔｅｒ ｌｉｔｏｒａｌｉｓ、Ｒｏｓｅｏｖａｒｉｕｓ ｓｐ．、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｏｐｕｌｉ、Ｅｒｙｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．、Ｅｒｙｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｌｉｔｏｒａｌｉｓ、Ｍｅｔｈｙｌｏｐｈａｇａ ｔｈｉｏｏｘｙｄａｎｓ、Ｍｅｔｈｙｌｏｐｈａｇａ ｔｈｉｏｏｘｙｄａｎｓ、Ｈｅｒｍｉｎｉｉｍｏｎａｓ ａｒｓｅｎｉｃｏｘｙｄａｎｓ、Ｖｅｒｍｉｎｅｐｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｅｉｓｅｎｉａｅ、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｔｕｎｄｒｉｐａｌｕｄｕｍ、Ｐｓｙｃｈｒｏｂａｃｔｅｒ ａｒｃｔｉｃｕｓ、Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅ、Ｖｉｂｒｉｏ ｓｐ、Ａｅｒｏｍｏｎａｓ ｓａｌｍｏｎｉｃｉｄａ、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｏｄｏｒｉｆｅｒａ、Ｖｅｒｍｉｎｅｐｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｅｉｓｅｎｉａｅ、およびＭｅｔｈｙｌｏｖｏｒｕｓ ｇｌｕｃｏｓｅｔｒｏｐｈｕｓから選択される種に由来するＤｎｃＶオルソログをコードする遺伝子配列を含む。
一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、２’３’−ｃＧＡＭＰを産生することができる。ヒトｃＧＡＳは、２’３’−ｃＧＡＭＰを産生することが公知である。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ヒトｃＧＡＳをコードする遺伝子配列を含む。
一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、腫瘍微小環境において、ｃ−ＧＡＭＰ（２’３’または３’３’）のレベルを増加させることができる。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、細胞内空間において、ｃ−ＧＡＭＰのレベルを増加させることができる。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、真核細胞の内部で、ｃ−ＧＡＭＰのレベルを増加させることができる。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、免疫細胞の内部で、ｃ−ＧＡＭＰ（２’３’または３’３’）のレベルを増加させることができる。一部の実施形態では、細胞は、食細胞である。一部の実施形態では、細胞は、マクロファージである。一部の実施形態では、細胞は、樹状細胞である。一部の実施形態では、細胞は、好中球である。一部の実施形態では、細胞は、ＭＤＳＣである。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、がん細胞の内部で、ｃ−ＧＡＭＰ（２’３’または３’３’）を増加させることができる。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、細菌細胞および／または成長培地において、ｉｎ ｖｉｔｒｏでｃ−ＧＡＭＰのレベルを増加させることができる。
一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅに由来する細菌ｃ−ジ−ＧＡＭＰシンターゼをコードする遺伝子配列を含む。一部の実施形態では、酵素は、ＤｎｃＶである。
一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、Ｖｅｒｍｉｎｅｐｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｅｉｓｅｎｉａｅに由来するｃ−ジ−ＡＭＰシンターゼをコードする遺伝子配列を含む。一実施形態では、細菌ｃ−ジ−ＧＡＭＰシンターゼは、Ｖｅｒｍｉｎｅｐｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｅｉｓｅｎｉａｅ（ＥＦ０１−２ Ｅａｒｔｈｗｏｒｍ ｓｙｍｂｉｏｎｔ）に由来するＤｃｎＶオルソログである。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、配列番号１２６２を含む１つまたは複数のポリペプチドまたはその機能性断片をコードするｃ−ジ−ＧＡＭＰシンターゼ遺伝子配列を含む。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、配列番号１２６２と少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９９％の同一性を有するポリペプチドまたはその機能性断片をコードする遺伝子配列を含む。一部の実施形態では、ポリペプチドは、配列番号１２６２と少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する。一部の特定の実施形態では、ポリペプチドは、配列番号１２６２を含む。他の特定の実施形態では、ポリペプチドは、配列番号１２６２からなる。ある特定の実施形態では、細菌ｃ−ジ−ＧＡＭＰシンターゼ遺伝子配列は、配列番号１２６５と少なくとも約８０％の同一性を有する。ある特定の実施形態では、遺伝子配列は、配列番号１２６５と少なくとも約９０％の同一性を有する。ある特定の実施形態では、遺伝子配列は、配列番号１２６５と少なくとも約９５％の同一性を有する。一部の実施形態では、遺伝子配列は、配列番号１２６５と少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する。一部の特定の実施形態では、遺伝子配列は、配列番号１２６５を含む。他の特定の実施形態では、遺伝子配列は、配列番号１２６５ならなる。
一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、Ｋｉｎｇｅｌｌａ ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ（ＡＴＣＣ ３３３９４）に由来するｃ−ジ−ＡＭＰシンターゼをコードする遺伝子配列を含む。一実施形態では、細菌ｃ−ジ−ＧＡＭＰシンターゼは、Ｋｉｎｇｅｌｌａ ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓに由来するＤｃｎＶオルソログである。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、配列番号１２６０を含む１つまたは複数のポリペプチドまたはその機能性断片をコードするｃ−ジ−ＧＡＭＰシンターゼ遺伝子配列を含む。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、配列番号１２６０と少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９９％の同一性を有するポリペプチドまたはその機能性断片をコードする遺伝子配列を含む。一部の実施形態では、ポリペプチドは、配列番号１２６０と少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する。一部の特定の実施形態では、ポリペプチドは、配列番号１２６０を含む。他の特定の実施形態では、ポリペプチドは、配列番号１２６０からなる。ある特定の実施形態では、細菌ｃ−ジ−ＧＡＭＰシンターゼ遺伝子配列は、配列番号１２６３と少なくとも約８０％の同一性を有する。ある特定の実施形態では、遺伝子配列は、配列番号１２６３と少なくとも約９０％の同一性を有する。ある特定の実施形態では、遺伝子配列は、配列番号１２６３と少なくとも約９５％の同一性を有する。一部の実施形態では、遺伝子配列は、配列番号１２６３と少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する。一部の特定の実施形態では、遺伝子配列は、配列番号１２６３を含む。他の特定の実施形態では、遺伝子配列は、配列番号１２６３ならなる。
一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｂａｃｉｌｌｉｆｏｒｍｉｓ（ＡＴＣＣ ＢＡＡ−１２００）に由来するｃ−ジ−ＡＭＰシンターゼをコードする遺伝子配列を含む。一実施形態では、細菌ｃ−ジ−ＧＡＭＰシンターゼは、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｂａｃｉｌｌｉｆｏｒｍｉｓに由来するＤｃｎＶオルソログである。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、配列番号１２６１を含む１つまたは複数のポリペプチドまたはその機能性断片をコードするｃ−ジ−ＧＡＭＰシンターゼ遺伝子配列を含む。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、配列番号１２６１と少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９９％の同一性であるポリペプチドまたはその機能性断片をコードする遺伝子配列を含む。一部の実施形態では、ポリペプチドは、配列番号１２６１と少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する。一部の特定の実施形態では、ポリペプチドは、配列番号１２６１を含む。他の特定の実施形態では、ポリペプチドは、配列番号１２６１からなる。ある特定の実施形態では、ｃ−ジ−ＧＡＭＰシンターゼ配列は、配列番号１２６４と少なくとも約８０％の同一性を有する。ある特定の実施形態では、遺伝子配列は、配列番号１２６４と少なくとも約９０％の同一性を有する。ある特定の実施形態では、遺伝子配列は、配列番号１２６４と少なくとも約９５％の同一性を有する。一部の実施形態では、遺伝子配列は、配列番号１２６４と少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する。一部の特定の実施形態では、遺伝子配列は、配列番号１２６４を含む。他の特定の実施形態では、遺伝子配列は、配列番号１２６４ならなる。
一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、哺乳動物ｃ−ジ−ＧＡＭＰ酵素をコードする遺伝子配列を含む。一部の実施形態では、ＳＴＩＮＧアゴニスト産生酵素は、ヒト酵素である。一部の実施形態では、遺伝子配列は、微生物宿主細胞における発現のためにコドン最適化される。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ヒトポリペプチドｃＧＡＳをコードする遺伝子配列を含む。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、配列番号１２５４を含む１つまたは複数のポリペプチドまたはその機能性断片をコードするフトｃＨＡＳ遺伝子配列を含む。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、配列番号１２５４と少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９９％の同一性であるポリペプチドまたはその機能性断片をコードする遺伝子配列を含む。一部の実施形態では、ポリペプチドは、配列番号１２５４と少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する。一部の特定の実施形態では、ポリペプチドは、配列番号１２５４を含む。他の特定の実施形態では、ポリペプチドは、配列番号１２５４からなる。ある特定の実施形態では、ヒトｃＧＡＳ遺伝子配列は、配列番号１２５５と少なくとも約８０％の同一性を有する。ある特定の実施形態では、遺伝子配列は、配列番号１２５５と少なくとも約９０％の同一性を有する。ある特定の実施形態では、遺伝子配列は、配列番号１２５５と少なくとも約９５％の同一性を有する。一部の実施形態では、遺伝子配列は、配列番号１２５５と少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する。一部の特定の実施形態では、遺伝子配列は、配列番号１２６４を含む。他の特定の実施形態では、遺伝子配列は、配列番号１２５５ならなる。
一部の実施形態では、細菌は、サイクリック−ジ−ＧＭＰを産生することができる。したがって、一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、１つまたは複数のジグアニル酸シクラーゼをコードする遺伝子配列を含む。
一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、腫瘍微小環境においてサイクリック−ジ−ＧＭＰのレベルを増加させることができる。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、細胞内空間において、サイクリック−ジ−ＧＭＰのレベルを増加させることができる。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、真核細胞の内部において、サイクリック−ジ−ＧＭＰのレベルを増加させることができる。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、免疫細胞の内部において、サイクリック−ジ−ＧＭＰのレベルを増加させることができる。一部の実施形態では、細胞は、食細胞である。一部の実施形態では、細胞は、マクロファージである。一部の実施形態では、細胞は、樹状細胞である。一部の実施形態では、細胞は、好中球である。一部の実施形態では、細胞は、ＭＤＳＣである。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、がん細胞の内部において、サイクリック−ジ−ＧＭＰのレベルを増加させることができる。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、細菌細胞および／または成長培地において、ｉｎ ｖｉｔｒｏでｃ−ＧＭＰのレベルを増加させることができる。
一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ｃ−ジＡＭＰを産生することができる。ジアデニル酸シクラーゼは、２つのＡＴＰ分子から１分子サイクリックジＡＭＰを産生する。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ジアデニル酸シクラーゼの発現のための１つまたは複数の遺伝子配列を含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、クラスＥＣ ２．７．７．８５の酵素の発現のための１つまたは複数の遺伝子配列を含む。一実施形態では、ジアデニル酸シクラーゼは、細菌ジアデニル酸シクラーゼである。一実施形態では、ジアデニル酸シクラーゼは、ＤａｃＡである。一実施形態では、ＤａｃＡは、Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓからのものである。
一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、配列番号１２５７を含む１つまたは複数のポリペプチドまたはその機能性断片をコードするＤａｃＡ遺伝子配列を含む。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、配列番号１２５７と少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９９％の同一性を有するポリペプチドまたはその機能性断片をコードする遺伝子配列を含む。一部の実施形態では、ポリペプチドは、配列番号１２５７と少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する。一部の特定の実施形態では、ポリペプチドは、配列番号１２５７を含む。他の特定の実施形態では、ポリペプチドは、配列番号１２５７からなる。ある特定の実施形態では、Ｄａｃ Ａ配列は、配列番号１２５８と少なくとも約８０％の同一性を有する。ある特定の実施形態では、遺伝子配列は、配列番号１２５８と少なくとも約９０％の同一性を有する。ある特定の実施形態では、遺伝子配列は、配列番号１２５８と少なくとも約９５％の同一性を有する。一部の実施形態では、遺伝子配列は、配列番号１２５８と少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する。一部の特定の実施形態では、遺伝子配列は、配列番号１２５８を含む。他の特定の実施形態では、遺伝子配列は、配列番号１２５８ならなる。
一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、低酸素条件下で誘導可能なプロモーター、例えば、本明細書に記載されるＦＮＲ誘導性プロモーターに作動可能に連結されている、ＤａｃＡ遺伝子配列を含む。ある特定の実施形態では、ＦＮＲ誘導性プロモーターに作動可能に連結されたＤａｃＡ遺伝子の配列は、配列番号１２８４と少なくとも約８０％の同一性を有する。ある特定の実施形態では、ＦＮＲ誘導性プロモーターに作動可能に連結されたＤａｃＡ遺伝子の配列は、配列番号１２５８と少なくとも約９０％の同一性を有する。ある特定の実施形態では、ＦＮＲ誘導性プロモーターに作動可能に連結されたＤａｃＡ遺伝子の配列は、配列番号１２５８と少なくとも約９５％の同一性を有する。一部の実施形態では、ＦＮＲ誘導性プロモーターに作動可能に連結されたＤａｃＡ遺伝子の配列は、配列番号１２５８と少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する。一部の特定の実施形態では、ＦＮＲ誘導性プロモーターに作動可能に連結されたＤａｃＡ遺伝子の配列は、配列番号１２５８を含む。他の特定の実施形態では、ＦＮＲ誘導性プロモーターに作動可能に連結されたＤａｃＡ遺伝子の配列は、配列番号１２５８からなる。
他の適切なジアデニル酸シクラーゼは、当技術分野において公知であり、ＥｇｇＮｏｇデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｅｇｇｎｏｇｄｂ．ｅｍｂｌ．ｄｅ）に含まれているものを含む。細菌により発現されうるジアデニル酸シクラーゼの非限定的な例としては、以下のものが挙げられる：Ｍｅｇａｓｐｈａｅｒａ ｓｐ．ＵＰＩＩ １３５−Ｅ（ＨＭＰＲＥＦ１０４０＿００２６）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｎｇｉｎｏｓｕｓ ＳＫ５２＝ＤＳＭ ２０５６３（ＨＭＰＲＥＦ９９６６＿０５５５）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｉｔｉｓ ｂｖ．２ ｓｔｒ．ＳＫ９５（ＨＭＰＲＥＦ９９６５＿１６７５）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｉｎｆａｎｔｉｓ ＳＫ１０７６（ＨＭＰＲＥＦ９９６７＿１５６８）、Ａｃｅｔｏｎｅｍａ ｌｏｎｇｕｍ ＤＳＭ ６５４０（ＡＬＯ＿０３３５６）、Ｓｐｏｒｏｓａｒｃｉｎａ ｎｅｗｙｏｒｋｅｎｓｉｓ ２６８１（ＨＭＰＲＥＦ９３７２＿２２７７）、Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ ｓｔｒ．Ｓｃｏｔｔ Ａ（ＢＮ４１８＿２５５１）、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ Ａｒｔｈｒｏｍｉｔｕｓ ｓｐ．ＳＦＢ−ｍｏｕｓｅ−Ｊａｐａｎ（ＳＦＢＭ＿１３５４）、Ｈａｌｏｐｌａｓｍａ ｃｏｎｔｒａｃｔｉｌｅ ＳＳＤ−１７Ｂ ２ ｓｅｑｓ ＨＬＰＣＯ＿０１７５０、ＨＬＰＣＯ＿０８８４９）、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｋｅｆｉｒａｎｏｆａｃｉｅｎｓ ＺＷ３（ＷＡＮＧ＿０９４１）、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ａｎａｔｉｓ １３４０（ＧＩＧ＿０３１４８）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｃｏｎｓｔｅｌｌａｔｕｓ ｓｕｂｓｐ．ｐｈａｒｙｎｇｉｓ ＳＫ１０６０＝ＣＣＵＧ ４６３７７（ＨＭＰＲＥＦ１０４２＿１１６８）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｉｎｆａｎｔｉｓ ＳＫ９７０（ＨＭＰＲＥＦ９９５４＿１６２８）、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｕｃｉｌａｇｉｎｏｓｕｓ ＫＮＰ４１４（ＹＢＢＰ）、Ｎｏｓｔｏｃ ｓｐ．ＰＣＣ ７１２０（ＡＬＬ２９９６）、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｃｏｌｕｍｂｉｎｕｍ ＳＦ７（ＭＣＳＦ７＿０１３２１）、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｕｍｉｎｉｓ ＳＰＭ０２１１（ＬＲＵ＿０１１９９）、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ Ａｒｔｈｒｏｍｉｔｕｓ ｓｐ．ＳＦＢ−ｒａｔ−Ｙｉｔ（ＲＡＴＳＦＢ＿１１８２）、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｐ．ＳＹ８５１９（ＣＸＩＶＡ＿０２１９０）、Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｌａｔｅｒｏｓｐｏｒｕｓ ＬＭＧ １５４４１（ＢＲＬＡ＿Ｃ０２２４０）、Ｗｅｉｓｓｅｌｌａ ｋｏｒｅｅｎｓｉｓ ＫＡＣＣ １５５１０（ＷＫＫ＿０１９５５）、Ｂｒａｃｈｙｓｐｉｒａ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ ＰＷＳ／Ａ（ＢＩＮＴ＿２２０４）、Ｂｉｚｉｏｎｉａ ａｒｇｅｎｔｉｎｅｎｓｉｓ ＪＵＢ５９（ＢＺＡＲＧ＿２６１７）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ ５７．Ｉ（ＳＳＡＬ＿０１３４８）、Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ ｓｕｂｓｐ．ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ Ｔｃ−４−１（ＴＣ４１＿３００１）、Ｓｕｌｆｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ ＴＰＹ（ＴＰＹ＿０８７５）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｓｅｕｄｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ ＩＳ７４９３（ＳＰＰＮ＿０７６６０）、Ｍｅｇａｓｐｈａｅｒａ ｅｌｓｄｅｎｉｉ ＤＳＭ ２０４６０（ＭＥＬＳ＿０８８３）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｉｎｆａｎｔａｒｉｕｓ ｓｕｂｓｐ．ｉｎｆａｎｔａｒｉｕｓ ＣＪ１８（ＳＩＮＦ＿１２６３）、Ｂｌａｔｔａｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．（Ｍａｓｔｏｔｅｒｍｅｓ ｄａｒｗｉｎｉｅｎｓｉｓ） ｓｔｒ．ＭＡＤＡＲ（ＭＡＤＡＲ＿５１１）、Ｂｌａｔｔａｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．（Ｃｒｙｐｔｏｃｅｒｃｕｓ ｐｕｎｃｔｕｌａｔｕｓ） ｓｔｒ．Ｃｐｕ（ＢＬＢＣＰＵ＿０９３）、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．ＣＣ９６０５（ＳＹＮＣＣ９６０５＿１６３０）、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｓｐ．ＣＣＢ＿ＵＳ３＿ＵＦ１（ＡＥＶ１７２２４．１）、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｈａｅｍｏｃａｎｉｓ ｓｔｒ．Ｉｌｌｉｎｏｉｓ（ＭＨＣ＿０４３５５）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍａｃｅｄｏｎｉｃｕｓ ＡＣＡ−ＤＣ １９８（ＹＢＢＰ）、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｈｙｏｒｈｉｎｉｓ ＧＤＬ−１（ＭＹＭ＿０４５７）、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ ｅｌｏｎｇａｔｕｓ ＰＣＣ ７９４２（ＳＹＮＰＣＣ７９４２＿０２６３）、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ ｓｐ．ＰＣＣ ６８０３（ＳＬＬ０５０５）、Ｃｈｌａｍｙｄｏｐｈｉｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ ＣＷＬ０２９（ＹＢＢＰ）、Ｍｉｃｒｏｃｏｌｅｕｓ ｃｈｔｈｏｎｏｐｌａｓｔｅｓ ＰＣＣ ７４２０（ＭＣ７４２０＿６８１８）、Ｐｅｒｓｅｐｈｏｎｅｌｌａ ｍａｒｉｎａ ＥＸ−Ｈ１（ＰＥＲＭＡ＿１６７６）、Ｄｅｓｕｌｆｉｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｈａｆｎｉｅｎｓｅ Ｙ５１（ＤＳＹ４４８９）、Ｐｒｏｃｈｌｏｒｏｃｏｃｃｕｓ ｍａｒｉｎｕｓ ｓｔｒ．ＡＳ９６０１（Ａ９６０１＿１１９７１）、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉａ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＢＢＦＬ７（ＢＢＦＬ７＿０２５５３）、Ｓｐｈａｅｒｏｃｈａｅｔａ ｇｌｏｂｕｓ ｓｔｒ．Ｂｕｄｄｙ（ＳＰＩＢＵＤＤＹ＿２２９３）、Ｓｐｈａｅｒｏｃｈａｅｔａ ｐｌｅｏｍｏｒｐｈａ ｓｔｒ．Ｇｒａｐｅｓ（ＳＰＩＧＲＡＰＥＳ＿２５０１）、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ ｓｕｂｓｐ．ａｕｒｅｕｓ Ｍｕ５０（ＳＡＶ２１６３）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｍ１ ＧＡＳ（ＳＰＹ＿１０３６）、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．ＷＨ ８１０９（ＳＨ８１０９＿２１９３）、Ｐｒｏｃｈｌｏｒｏｃｏｃｃｕｓ ｍａｒｉｎｕｓ ｓｕｂｓｐ．ｍａｒｉｎｕｓ ｓｔｒ．ＣＣＭＰ１３７５（ＰＲＯ＿１１０４）、Ｐｒｏｃｈｌｏｒｏｃｏｃｃｕｓ ｍａｒｉｎｕｓ ｓｔｒ．ＭＩＴ ９５１５（Ｐ９５１５＿１１８２１）、Ｐｒｏｃｈｌｏｒｏｃｏｃｃｕｓ ｍａｒｉｎｕｓ ｓｔｒ．ＭＩＴ ９３０１（Ｐ９３０１＿１１９８１）、Ｐｒｏｃｈｌｏｒｏｃｏｃｃｕｓ ｍａｒｉｎｕｓ ｓｔｒ．ＮＡＴＬ１Ａ（ＮＡＴＬ１＿１４８９１）、Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ ＥＧＤ−ｅ（ＬＭＯ２１２０）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ ＴＩＧＲ４ ２ ｓｅｑｓ ＳＰＮＥＴ＿０２０００３６８、ＳＰ＿１５６１）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ Ｒ６（ＳＰＲ１４１９）、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ ＲＰ６２Ａ（ＳＥＲＰ１７６４）、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ ＡＴＣＣ １２２２８（ＳＥ＿１７５４）、Ｄｅｓｕｌｆｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ ＨＲＭ２（ＨＲＭ２＿３２８８０）、Ｄｅｓｕｌｆｏｔａｌｅａ ｐｓｙｃｈｒｏｐｈｉｌａ ＬＳｖ５４（ＤＰ１６３９）、Ｃｙａｎｏｂｉｕｍ ｓｐ．ＰＣＣ ７００１（ＣＰＣＣ７００１＿１０２９）、Ｃｈｌａｍｙｄｏｐｈｉｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ ＴＷ−１８３（ＹＢＢＰ）、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｉｎｔｅｒｒｏｇａｎｓ ｓｅｒｏｖａｒ Ｌａｉ ｓｔｒ．５６６０１（ＬＡ＿３３０４）、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ ＡＴＣＣ １３１２４（ＣＰＦ＿２６６０）、Ｔｈｅｒｍｏｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ ｅｌｏｎｇａｔｕｓ ＢＰ−１（ＴＬＲ１７６２）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｎｔｈｒａｃｉｓ ｓｔｒ．Ａｍｅｓ（ＢＡ＿０１５５）、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍ ＡＴＣＣ ２７４０５（ＣＴＨＥ＿１１６６）、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ ｓｕｂｓｐ．ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ ＡＴＣＣ ８２９３（ＬＥＵＭ＿１５６８）、Ｏｅｎｏｃｏｃｃｕｓ ｏｅｎｉ ＰＳＵ−１（ＯＥＯＥ＿１６５６）、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｓｍｉｕｍ ｅｒｙｔｈｒａｅｕｍ ＩＭＳ１０１（ＴＥＲＹ＿２４３３）、Ｔａｎｎｅｒｅｌｌａ ｆｏｒｓｙｔｈｉａ ＡＴＣＣ ４３０３７（ＢＦＯ＿１３４７）、Ｓｕｌｆｕｒｉｈｙｄｒｏｇｅｎｉｂｉｕｍ ａｚｏｒｅｎｓｅ Ａｚ−Ｆｕ１（ＳＵＬＡＺ＿１６２６）、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ Ｋｏｒｉｂａｃｔｅｒ ｖｅｒｓａｔｉｌｉｓ Ｅｌｌｉｎ３４５（ＡＣＩＤ３４５＿０２７８）、Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ ａｌａｓｋｅｎｓｉｓ Ｇ２０（ＤＤＥ＿１５１５）、Ｃａｒｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．１７−４（ＹＢＢＰ）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ ＵＡ１５９（ＳＭＵ＿１４２８Ｃ）、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ａｇａｌａｃｔｉａｅ（ＭＡＧ３０６０）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅ ＮＥＭ３１６（ＧＢＳ０９０２）、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｅｔａｎｉ Ｅ８８（ＣＴＣ＿０２５４９）、Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｃｈａｍｐａｎｅｌｌｅｎｓｉｓ １８Ｐ１３（ＲＵＭ＿１４４７０）、Ｃｒｏｃｅｉｂａｃｔｅｒ ａｔｌａｎｔｉｃｕｓ ＨＴＣＣ２５５９（ＣＡ２５５９＿１３５１３）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｕｂｅｒｉｓ ０１４０Ｊ（ＳＵＢ１０９２）、Ｃｈｌａｍｙｄｏｐｈｉｌａ ａｂｏｒｔｕｓ Ｓ２６／３（ＣＡＢ６４２）、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ ＷＣＦＳ１（ＬＰ＿０８１８）、Ｏｃｅａｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｉｈｅｙｅｎｓｉｓ ＨＴＥ８３１（ＯＢ０２３０）、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．ＲＳ９９１６（ＲＳ９９１６＿３１３６７）、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．ＲＳ９９１７（ＲＳ９９１７＿００９６７）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ｓｕｂｓｐ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ ｓｔｒ．１６８（ＹＢＢＰ）、Ａｑｕｉｆｅｘ ａｅｏｌｉｃｕｓ ＶＦ５（ＡＱ＿１４６７）、Ｂｏｒｒｅｌｉａ ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ Ｂ３１（ＢＢ＿０００８）、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ Ｖ５８３（ＥＦ＿２１５７）、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｔｈｅｔａｉｏｔａｏｍｉｃｒｏｎ ＶＰＩ−５４８２（ＢＴ＿３６４７）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ ＡＴＣＣ １４５７９（ＢＣ＿０１８６）、Ｃｈｌａｍｙｄｏｐｈｉｌａ ｃａｖｉａｅ ＧＰＩＣ（ＣＣＡ＿００６７１）、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．ＣＢ０１０１（ＳＣＢ０１＿０１０１０００００９０２）、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．ＣＢ０２０５（ＳＣＢ０２＿０１０１０００１２６９２）、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ Ｓｏｌｉｂａｃｔｅｒ ｕｓｉｔａｔｕｓ Ｅｌｌｉｎ６０７６（ＡＣＩＤ＿１９０９）、Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｋａｕｓｔｏｐｈｉｌｕｓ ＨＴＡ４２６（ＧＫ０１５２）、Ｖｅｒｒｕｃｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ ｓｐｉｎｏｓｕｍ ＤＳＭ ４１３６（ＶＳＰＩＤ＿０１０１０００２２５３０）、Ａｎａｂａｅｎａ ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ ＡＴＣＣ ２９４１３（ＡＶＡ＿０９１３）、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ Ｗ８３（ＰＧ＿１５８８）、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｍｕｒｉｄａｒｕｍ Ｎｉｇｇ（ＴＣ＿０２８０）、Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｒａｄｉｏｄｕｒａｎｓ Ｒ１（ＤＲ＿０００７）、Ｇｅｏｂａｃｔｅｒ ｓｕｌｆｕｒｒｅｄｕｃｅｎｓ ＰＣＡ ２ ｓｅｑｓ ＧＳＵ１８０７、ＧＳＵ０８６８）、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ａｒｔｈｒｉｔｉｄｉｓ １５８Ｌ３−１（ＭＡＲＴＨ＿ＯＲＦ５２７）、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍ Ｇ３７（ＭＧ１０５）、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｄｅｎｔｉｃｏｌａ ＡＴＣＣ ３５４０５（ＴＤＥ＿１９０９）、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｐａｌｌｉｄｕｍ ｓｕｂｓｐ．ｐａｌｌｉｄｕｍ ｓｔｒ．Ｎｉｃｈｏｌｓ（ＴＰ＿０８２６）、酪酸産生菌ＳＳ３／４（ＣＫ３＿２３０５０）、Ｃａｒｂｏｘｙｄｏｔｈｅｒｍｕｓ ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｆｏｒｍａｎｓ Ｚ−２９０１（ＣＨＹ＿２０１５）、Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ａｌｂｕｓ ８（ＣＵＳ＿５３８６）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｉｔｉｓ ＮＣＴＣ １２２６１（ＳＭ１２２６１＿１１５１）、Ｇｌｏｅｏｂａｃｔｅｒ ｖｉｏｌａｃｅｕｓ ＰＣＣ ７４２１（ＧＬＬ０１０９）、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕ





ｓ ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ ＮＣＣ ５３３（ＬＪ＿０８９２）、Ｅｘｉｇｕｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｉｂｉｒｉｃｕｍ ２５５−１５（ＥＸＩＧ＿０１３８）、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ Ｊ（ＭＨＪ＿０４８５）、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｓｙｎｏｖｉａｅ ５３（ＭＳ５３＿０４９８）、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ＨＢ２７（ＴＴ＿Ｃ１６６０）、Ｏｎｉｏｎ ｙｅｌｌｏｗｓ ｐｈｙｔｏｐｌａｓｍａ ＯＹ−Ｍ（ＰＡＭ＿５８４）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ＬＭＧ １８３１１（ＯＳＳＧ）、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ Ｐｒｏｔｏｃｈｌａｍｙｄｉａ ａｍｏｅｂｏｐｈｉｌａ ＵＷＥ２５（ＰＣ１６３３）、Ｃｈｌａｍｙｄｏｐｈｉｌａ ｆｅｌｉｓ Ｆｅ／Ｃ−５６（ＣＦ０３４０）、Ｂｄｅｌｌｏｖｉｂｒｉｏ ｂａｃｔｅｒｉｏｖｏｒｕｓ ＨＤ１００（ＢＤ１９２９）、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｒｕｍｉｎｉｃｏｌａ ２３（ＰＲＵ＿２２６１）、Ｍｏｏｒｅｌｌａ ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｉｃａ ＡＴＣＣ ３９０７３（ＭＯＴＨ＿２２４８）、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｉｎｔｅｒｒｏｇａｎｓ ｓｅｒｏｖａｒ Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎｉ ｓｔｒ．Ｆｉｏｃｒｕｚ Ｌ１−１３０（ＬＩＣ＿１０８４４）、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｍｏｂｉｌｅ １６３Ｋ（ＭＭＯＢ４５５０）、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ ｅｌｏｎｇａｔｕｓ ＰＣＣ ６３０１（ＳＹＣ１２５０＿Ｃ）、Ｃｙｔｏｐｈａｇａ ｈｕｔｃｈｉｎｓｏｎｉｉ ＡＴＣＣ ３３４０６（ＣＨＵ＿３２２２）、Ｇｅｏｂａｃｔｅｒ ｍｅｔａｌｌｉｒｅｄｕｃｅｎｓ ＧＳ−１５ ２ ｓｅｑｓ ＧＭＥＴ＿１８８８、ＧＭＥＴ＿１１６８）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｈａｌｏｄｕｒａｎｓ Ｃ−１２５（ＢＨ０２６５）、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｆｒａｇｉｌｉｓ ＮＣＴＣ ９３４３（ＢＦ０３９７）、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ Ｄ／ＵＷ−３／ＣＸ（ＹＢＢＰ）、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ ＡＴＣＣ ８２４（ＣＡ＿Ｃ３０７９）、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ ６３０（ＣＤ０１１０）、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ ＮＣＦＭ（ＬＢＡ０７１４）、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ ｓｕｂｓｐ．ｌａｃｔｉｓ Ｉｌ１４０３（ＹＥＤＡ）、Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｉｎｎｏｃｕａ Ｃｌｉｐ１１２６２（ＬＩＮ２２２５）、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｐｅｎｅｔｒａｎｓ ＨＦ−２（ＭＹＰＥ２１２０）、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｐｕｌｍｏｎｉｓ ＵＡＢ ＣＴＩＰ（ＭＹＰＵ＿４０７０）、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ ＭＢ４（ＴＴＥ２２０９）、Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ ｐｅｎｔｏｓａｃｅｕｓ ＡＴＣＣ ２５７４５（ＰＥＰＥ＿０４７５）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ ＤＳＭ １３＝ＡＴＣＣ １４５８０ ２ ｓｅｑｓ ＹＢＢＰ、ＢＬ０２７０１）、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ ＪＣＳＣ１４３５（ＳＨ０８７７）、Ｄｅｓｕｌｆｕｒｏｍｏｎａｓ ａｃｅｔｏｘｉｄａｎｓ ＤＳＭ ６８４（ＤＡＣＥ＿０５４３）、Ｔｈｅｒｍｏｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ ｙｅｌｌｏｗｓｔｏｎｉｉ ＤＳＭ １１３４７（ＴＨＥＹＥ＿Ａ００４４）、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｂｏｖｉｓ ＰＧ４５（ＭＢＯＶＰＧ４５＿０３９４）、Ａｎａｅｒｏｍｙｘｏｂａｃｔｅｒ ｄｅｈａｌｏｇｅｎａｎｓ ２ＣＰ−Ｃ（ＡＤＥＨ＿１４９７）、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ ＮＣＩＭＢ ８０５２（ＣＢＥＩ＿０２００）、Ｂｏｒｒｅｌｉａ ｇａｒｉｎｉｉ ＰＢｉ（ＢＧ０００８）、Ｓｙｍｂｉｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｍ ＩＡＭ １４８６３（ＳＴＨ１９２）、Ａｌｋａｌｉｐｈｉｌｕｓ ｍｅｔａｌｌｉｒｅｄｉｇｅｎｓ ＱＹＭＦ（ＡＭＥＴ＿４３１３）、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ＨＢ８（ＴＴＨＡ０３２３）、Ｃｏｐｒｏｔｈｅｒｍｏｂａｃｔｅｒ ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃｕｓ ＤＳＭ ５２６５（ＣＯＰＲＯ５２６５＿１０８６）、Ｔｈｅｒｍｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ ｒｏｓｅｕｍ ＤＳＭ ５１５９（ＴＲＤ＿０６８８）、Ｓａｌｉｎｉｂａｃｔｅｒ ｒｕｂｅｒ ＤＳＭ １３８５５（ＳＲＵ＿１９４６）、Ｄｏｋｄｏｎｉａ ｄｏｎｇｈａｅｎｓｉｓ ＭＥＤ１３４（ＭＥＤ１３４＿０３３５４）、Ｐｏｌａｒｉｂａｃｔｅｒ ｉｒｇｅｎｓｉｉ ２３−Ｐ（ＰＩ２３Ｐ＿０１６３２）、Ｐｓｙｃｈｒｏｆｌｅｘｕｓ ｔｏｒｑｕｉｓ ＡＴＣＣ ７００７５５（Ｐ７００７５５＿０２２０２）、Ｒｏｂｉｇｉｎｉｔａｌｅａ ｂｉｆｏｒｍａｔａ ＨＴＣＣ２５０１（ＲＢ２５０１＿１０５９７）、Ｐｏｌａｒｉｂａｃｔｅｒ ｓｐ．ＭＥＤ１５２（ＭＥＤ１５２＿１１５１９）、Ｍａｒｉｂａｃｔｅｒ ｓｐ．ＨＴＣＣ２１７０（ＦＢ２１７０＿０１６５２）、Ｍｉｃｒｏｓｃｉｌｌａ ｍａｒｉｎａ ＡＴＣＣ ２３１３４（Ｍ２３１３４＿０７０２４）、Ｌｙｎｇｂｙａ ｓｐ．ＰＣＣ ８１０６（Ｌ８１０６＿１８９５１）、Ｎｏｄｕｌａｒｉａ ｓｐｕｍｉｇｅｎａ ＣＣＹ９４１４（Ｎ９４１４＿２３３９３）、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．ＢＬ１０７（ＢＬ１０７＿１１７８１）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．ＮＲＲＬ Ｂ−１４９１１（Ｂ１４９１１＿１９４８５）、Ｌｅｎｔｉｓｐｈａｅｒａ ａｒａｎｅｏｓａ ＨＴＣＣ２１５５（ＬＮＴＡＲ＿１８８００）、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｋｅｉ ｓｕｂｓｐ．ｓａｋｅｉ ２３Ｋ（ＬＣＡ＿１３５９）、Ｍａｒｉｐｒｏｆｕｎｄｕｓ ｆｅｒｒｏｏｘｙｄａｎｓ ＰＶ−１（ＳＰＶ１＿１３４１７）、Ｂｏｒｒｅｌｉａ ｈｅｒｍｓｉｉ ＤＡＨ（ＢＨ０００８）、Ｂｏｒｒｅｌｉａ ｔｕｒｉｃａｔａｅ ９１Ｅ１３５（ＢＴ０００８）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｗｅｉｈｅｎｓｔｅｐｈａｎｅｎｓｉｓ ＫＢＡＢ４（ＢＣＥＲＫＢＡＢ４＿０１４９）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｕｓ ＮＶＨ ３９１−９８（ＢＣＥＲ９８＿０１４８）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｕｍｉｌｕｓ ＳＡＦＲ−０３２（ＹＢＢＰ）、Ｇｅｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．ＦＲＣ−３２ ２ ｓｅｑｓ ＧＥＯＢ＿２３０９、ＧＥＯＢ＿３４２１）、Ｈｅｒｐｅｔｏｓｉｐｈｏｎ ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ ＤＳＭ ７８５（ＨＡＵＲ＿３４１６）、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．ＲＣＣ３０７（ＳＹＮＲＣＣ３０７＿０７９１）、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．ＣＣ９９０２（ＳＹＮＣＣ９９０２＿１３９２）、Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｇｅｏｔｈｅｒｍａｌｉｓ ＤＳＭ １１３００（ＤＧＥＯ＿０１３５）、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．ＰＣＣ ７００２（ＳＹＮＰＣＣ７００２＿Ａ００９８）、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．ＷＨ ７８０３（ＳＹＮＷＨ７８０３＿１５３２）、Ｐｅｄｏｓｐｈａｅｒａ ｐａｒｖｕｌａ Ｅｌｌｉｎ５１４（ＣＦＬＡＶ＿ＰＤ５５５２）、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．ＪＡ−３−３Ａｂ（ＣＹＡ＿２８９４）、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．ＪＡ−２−３Ｂａ（２−１３）（ＣＹＢ＿１６４５）、Ａｓｔｅｒ ｙｅｌｌｏｗｓ ｗｉｔｃｈｅｓ−ｂｒｏｏｍ ｐｈｙｔｏｐｌａｓｍａ ＡＹＷＢ（ＡＹＷＢ＿２４３）、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．ＪＤＲ−２（ＰＪＤＲ２＿５６３１）、Ｃｈｌｏｒｏｆｌｅｘｕｓ ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ Ｊ−１０−ｆｌ（ＣＡＵＲ＿１５７７）、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｇａｓｓｅｒｉ ＡＴＣＣ ３３３２３（ＬＧＡＳ＿１２８８）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ ＦＺＢ４２（ＹＢＢＰ）、Ｃｈｌｏｒｏｆｌｅｘｕｓ ａｇｇｒｅｇａｎｓ ＤＳＭ ９４８５（ＣＡＧＧ＿２３３７）、Ａｃａｒｙｏｃｈｌｏｒｉｓ ｍａｒｉｎａ ＭＢＩＣ１１０１７（ＡＭ１＿０４１３）、Ｂｌａｔｔａｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．（Ｂｌａｔｔｅｌｌａ ｇｅｒｍａｎｉｃａ） ｓｔｒ．Ｂｇｅ（ＢＬＢＢＧＥ＿１０１）、Ｓｉｍｋａｎｉａ ｎｅｇｅｖｅｎｓｉｓ Ｚ（ＹＢＢＰ）、Ｃｈｌａｍｙｄｏｐｈｉｌａ ｐｅｃｏｒｕｍ Ｅ５８（Ｇ５Ｓ＿１０４６）、Ｃｈｌａｍｙｄｏｐｈｉｌａ ｐｓｉｔｔａｃｉ ６ＢＣ ２ ｓｅｑｓ ＣＰＳＩＴ＿０７１４、Ｇ５Ｏ＿０７０７）、Ｃａｒｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．ＡＴ７（ＣＡＴ７＿０６５７３）、Ｆｉｎｅｇｏｌｄｉａ ｍａｇｎａ ＡＴＣＣ ２９３２８（ＦＭＧ＿１２２５）、Ｓｙｎｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ ｗｏｌｆｅｉ ｓｕｂｓｐ．ｗｏｌｆｅｉ ｓｔｒ．Ｇｏｅｔｔｉｎｇｅｎ（ＳＷＯＬ＿２１０３）、Ｓｙｎｔｒｏｐｈｏｂａｃｔｅｒ ｆｕｍａｒｏｘｉｄａｎｓ ＭＰＯＢ（ＳＦＵＭ＿３４５５）、Ｐｅｌｏｂａｃｔｅｒ ｃａｒｂｉｎｏｌｉｃｕｓ ＤＳＭ ２３８０（ＰＣＡＲ＿０９９９）、Ｐｅｌｏｂａｃｔｅｒ ｐｒｏｐｉｏｎｉｃｕｓ ＤＳＭ ２３７９ ２ ｓｅｑｓ ＰＰＲＯ＿２６４０、ＰＰＲＯ＿２２５４）、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｐｓｅｕｄｅｔｈａｎｏｌｉｃｕｓ ＡＴＣＣ ３３２２３（ＴＥＴＨ３９＿０４５７）、Ｖｉｃｔｉｖａｌｌｉｓ ｖａｄｅｎｓｉｓ ＡＴＣＣ ＢＡＡ−５４８（ＶＶＡＤ＿ＰＤ２４３７）、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｓａｐｒｏｐｈｙｔｉｃｕｓ ｓｕｂｓｐ．ｓａｐｒｏｐｈｙｔｉｃｕｓ ＡＴＣＣ １５３０５（ＳＳＰ０７２２）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏａｇｕｌａｎｓ ３６Ｄ１（ＢＣＯＡ＿１１０５）、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｈｏｍｉｎｉｓ ＡＴＣＣ ２３１１４（ＭＨＯ＿０５１０）、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｅｕｔｅｒｉ １００−２３（ＬＲＥＵ２３ＤＲＡＦＴ＿３４６３）、Ｄｅｓｕｌｆｏｔｏｍａｃｕｌｕｍ ｒｅｄｕｃｅｎｓ ＭＩ−１（ＤＲＥＤ＿０２９２）、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｃｉｔｒｅｕｍ ＫＭ２０（ＬＣＫ＿０１２９７）、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｏｌｙｍｙｘａ Ｅ６８１（ＰＰＥ＿０４２１７）、Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａ ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ ＡＴＣＣ ＢＡＡ−８３５（ＡＭＵＣ＿０４００）、Ａｌｋａｌｉｐｈｉｌｕｓ ｏｒｅｍｌａｎｄｉｉ ＯｈＩＬＡｓ（ＣＬＯＳ＿２４１７）、Ｇｅｏｂａｃｔｅｒ ｕｒａｎｉｉｒｅｄｕｃｅｎｓ Ｒｆ４ ２ ｓｅｑｓ ＧＵＲＡ＿１３６７、ＧＵＲＡ＿２７３２）、Ｃａｌｄｉｃｅｌｌｕｌｏｓｉｒｕｐｔｏｒ ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｓ ＤＳＭ ８９０３（ＣＳＡＣ＿１１８３）、Ｐｙｒａｍｉｄｏｂａｃｔｅｒ ｐｉｓｃｏｌｅｎｓ Ｗ５４５５（ＨＭＰＲＥＦ７２１５＿００７４）、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｂｏｒｇｐｅｔｅｒｓｅｎｉｉ ｓｅｒｏｖａｒ Ｈａｒｄｊｏ−ｂｏｖｉｓ Ｌ５５０（ＬＢＬ＿０９１３）、Ｒｏｓｅｉｆｌｅｘｕｓ ｓｐ．ＲＳ−１（ＲＯＳＥＲＳ＿１１４５）、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｈｙｔｏｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ ＩＳＤｇ（ＣＰＨＹ＿３５５１）、Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ ＮＢＲＣ １００５９９（ＢＢＲ４７＿０２６７０）、Ｅｘｉｇｕｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．ＡＴ１ｂ（ＥＡＴ１Ｂ＿１５９３）、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ ＵＣＣ１１８（ＬＳＬ＿１１４６）、Ｌａｗｓｏｎｉａ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ ＰＨＥ／ＭＮ１−００（ＬＩ０１９０）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｉｔｉｓ Ｂ６（ＳＭＩ＿１５５２）、Ｐｅｌｏｔｏｍａｃｕｌｕｍ ｔｈｅｒｍｏｐｒｏｐｉｏｎｉｃｕｍ ＳＩ（ＰＴＨ＿０５３６）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ Ｄ３９（ＳＰＤ＿１３９２）、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ Ｐｈｙｔｏｐｌａｓｍａ ｍａｌｉ（ＡＴＰ＿００３１２）、Ｇｅｍｍａｔｉｍｏｎａｓ ａｕｒａｎｔｉａｃａ Ｔ−２７（ＧＡＵ＿１３９４）、Ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｂａｃｕｌｕｍ ｓｐ．Ｙ０４ＡＡＳ１（ＨＹ０４ＡＡＳ１＿０００６）、Ｒｏｓｅｉｆｌｅｘｕｓ ｃａｓｔｅｎｈｏｌｚｉｉ ＤＳＭ １３９４１（ＲＣＡＳ＿３９８６）、Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｗｅｌｓｈｉｍｅｒｉ ｓｅｒｏｖａｒ ６ｂ ｓｔｒ．ＳＬＣＣ５３３４（ＬＷＥ２１３９）、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｎ





ｏｖｙｉ ＮＴ（ＮＴ０１ＣＸ＿１１６２）、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ ＡＴＣＣ ３６７（ＬＶＩＳ＿０６８４）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．Ｂ１４９０５（ＢＢ１４９０５＿０８６６８）、Ａｌｇｏｒｉｐｈａｇｕｓ ｓｐ．ＰＲ１（ＡＬＰＲ１＿１６０５９）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓａｎｇｕｉｎｉｓ ＳＫ３６（ＳＳＡ＿０８０２）、Ｂｏｒｒｅｌｉａ ａｆｚｅｌｉｉ ＰＫｏ ２ ｓｅｑｓ ＢＡＰＫＯ＿０００７、ＡＥＬ６９２４２．１）、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ ｓｕｂｓｐ．ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ ＡＴＣＣ １１８４２（ＬＤＢ０６５１）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｕｉｓ ０５ＺＹＨ３３（ＳＳＵ０５＿１４７０）、Ｋｏｒｄｉａ ａｌｇｉｃｉｄａ ＯＴ−１（ＫＡＯＴ１＿１０５２１）、Ｐｅｄｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．ＢＡＬ３９（ＰＢＡＬ３９＿０３９４４）、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉａｌｅｓ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＡＬＣ−１（ＦＢＡＬＣ１＿０４０７７）、Ｃｙａｎｏｔｈｅｃｅ ｓｐ．ＣＣＹ０１１０（ＣＹ０１１０＿３０６３３）、Ｐｌｅｓｉｏｃｙｓｔｉｓ ｐａｃｉｆｉｃａ ＳＩＲ−１（ＰＰＳＩＲ１＿１０１４０）、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｍ Ｈ１０（ＣＣＥＬ＿１２０１）、Ｃｙａｎｏｔｈｅｃｅ ｓｐ．ＰＣＣ ７４２５（ＣＹＡＮ７４２５＿４７０１）、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｃａｒｎｏｓｕｓ ｓｕｂｓｐ．ｃａｒｎｏｓｕｓ ＴＭ３００（ＳＣＡ＿１６６５）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｓｅｕｄｏｆｉｒｍｕｓ ＯＦ４（ＹＢＢＰ）、Ｌｅｅｕｗｅｎｈｏｅｋｉｅｌｌａ ｂｌａｎｄｅｎｓｉｓ ＭＥＤ２１７（ＭＥＤ２１７＿０４３５２）、Ｇｅｏｂａｃｔｅｒ ｌｏｖｌｅｙｉ ＳＺ ２ ｓｅｑｓ ＧＬＯＶ＿３０５５、ＧＬＯＶ＿２５２４）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｅｑｕｉ ｓｕｂｓｐ．ｚｏｏｅｐｉｄｅｍｉｃｕｓ（ＳＥＺ＿１２１３）、Ｔｈｅｒｍｏｓｉｎｕｓ ｃａｒｂｏｘｙｄｉｖｏｒａｎｓ Ｎｏｒ１（ＴＣＡＲＤＲＡＦＴ＿１０４５）、Ｇｅｏｂａｃｔｅｒ ｂｅｍｉｄｊｉｅｎｓｉｓ Ｂｅｍ（ＧＢＥＭ＿０８９５）、Ａｎａｅｒｏｍｙｘｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．Ｆｗ１０９−５（ＡＮＡＥ１０９＿２３３６）、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ ＤＰＣ ４５７１（ＬＨＶ＿０７５７）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．ｍ３−１３（ＢＭ３−１＿０１０１０００１０８５１）、Ｇｒａｍｅｌｌａ ｆｏｒｓｅｔｉｉ ＫＴ０８０３（ＧＦＯ＿０４２８）、Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｏｂｅｕｍ ＡＴＣＣ ２９１７４（ＲＵＭＯＢＥ＿０３５９７）、Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｔｏｒｑｕｅｓ ＡＴＣＣ ２７７５６（ＲＵＭＴＯＲ＿００８７０）、Ｄｏｒｅａ ｆｏｒｍｉｃｉｇｅｎｅｒａｎｓ ＡＴＣＣ ２７７５５（ＤＯＲＦＯＲ＿００２０４）、Ｄｏｒｅａ ｌｏｎｇｉｃａｔｅｎａ ＤＳＭ １３８１４（ＤＯＲＬＯＮ＿０１７４４）、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｖｅｎｔｒｉｏｓｕｍ ＡＴＣＣ ２７５６０（ＥＵＢＶＥＮ＿０１０８０）、Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ ｐｉｇｅｒ ＡＴＣＣ ２９０９８（ＤＥＳＰＩＧ＿０１５９２）、Ｐａｒｖｉｍｏｎａｓ ｍｉｃｒａ ＡＴＣＣ ３３２７０（ＰＥＰＭＩＣ＿０１３１２）、Ｐｓｅｕｄｏｆｌａｖｏｎｉｆｒａｃｔｏｒ ｃａｐｉｌｌｏｓｕｓ ＡＴＣＣ ２９７９９（ＢＡＣＣＡＰ＿０１９５０）、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｃｉｎｄｅｎｓ ＡＴＣＣ ３５７０４（ＣＬＯＳＣＩ＿０２３８９）、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｈａｌｌｉｉ ＤＳＭ ３３５３（ＥＵＢＨＡＬ＿０１２２８）、Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｇｎａｖｕｓ ＡＴＣＣ ２９１４９（ＲＵＭＧＮＡ＿０３５３７）、Ｓｕｂｄｏｌｉｇｒａｎｕｌｕｍ ｖａｒｉａｂｉｌｅ ＤＳＭ １５１７６（ＳＵＢＶＡＲ＿０５１７７）、Ｃｏｐｒｏｃｏｃｃｕｓ ｅｕｔａｃｔｕｓ ＡＴＣＣ ２７７５９（ＣＯＰＥＵＴ＿０１４９９）、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｏｖａｔｕｓ ＡＴＣＣ ８４８３（ＢＡＣＯＶＡ＿０３４８０）、Ｐａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｍｅｒｄａｅ ＡＴＣＣ ４３１８４（ＰＡＲＭＥＲ＿０３４３４）、Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ Ａ２−１６５（ＦＡＥＰＲＡＡ２１６５＿０１９５４）、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｐ．Ｌ２−５０（ＣＬＯＬ２５０＿００３４１）、Ａｎａｅｒｏｓｔｉｐｅｓ ｃａｃｃａｅ ＤＳＭ １４６６２（ＡＮＡＣＡＣ＿００２１９）、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｃａｃｃａｅ ＡＴＣＣ ４３１８５（ＢＡＣＣＡＣ＿０３２２５）、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｏｌｔｅａｅ ＡＴＣＣ ＢＡＡ−６１３（ＣＬＯＢＯＬ＿０４７５９）、Ｂｏｒｒｅｌｉａ ｄｕｔｔｏｎｉｉ Ｌｙ（ＢＤＵ＿１４）、Ｃｙａｎｏｔｈｅｃｅ ｓｐ．ＰＣＣ ８８０１（ＰＣＣ８８０１＿０１２７）、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ ｓｕｂｓｐ．ｃｒｅｍｏｒｉｓ ＭＧ１３６３（ＬＬＭＧ＿０４４８）、Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｅｒｍｏｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ ＮＧ８０−２（ＧＴＮＧ＿０１４９）、Ｅｐｕｌｏｐｉｓｃｉｕｍ ｓｐ．Ｎ．ｔ．ｍｏｒｐｈｏｔｙｐｅ Ｂ（ＥＰＵＬＯ＿０１０１００００３８３９）、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｇａｒｖｉｅａｅ Ｌｇ２（ＬＣＧＬ＿０３０４）、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｌｅｐｔｕｍ ＤＳＭ ７５３（ＣＬＯＬＥＰ＿０３０９７）、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｐｉｒｏｆｏｒｍｅ ＤＳＭ １５５２（ＣＬＯＳＰＩ＿０１６０８）、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｏｌｉｃｈｕｍ ＤＳＭ ３９９１（ＥＵＢＤＯＬ＿００１８８）、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｋｌｕｙｖｅｒｉ ＤＳＭ ５５５（ＣＫＬ＿０３１３）、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ ＡＴＣＣ ３３２７７（ＰＧＮ＿０５２３）、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｖｕｌｇａｔｕｓ ＡＴＣＣ ８４８２（ＢＶＵ＿０５１８）、Ｐａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｄｉｓｔａｓｏｎｉｓ ＡＴＣＣ ８５０３（ＢＤＩ＿３３６８）、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｈｏｍｉｎｉｓ ｓｕｂｓｐ．ｈｏｍｉｎｉｓ Ｃ８０（ＨＭＰＲＥＦ０７９８＿０１９６８）、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｃａｐｒａｅ Ｃ８７（ＨＭＰＲＥＦ０７８６＿０２３７３）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．Ｃ１５０（ＨＭＰＲＥＦ０８４８＿００４２３）、Ｓｕｌｆｕｒｉｈｙｄｒｏｇｅｎｉｂｉｕｍ ｓｐ．ＹＯ３ＡＯＰ１（ＳＹＯ３ＡＯＰ１＿０１１０）、Ｄｅｓｕｌｆａｔｉｂａｃｉｌｌｕｍ ａｌｋｅｎｉｖｏｒａｎｓ ＡＫ−０１（ＤＡＬＫ＿０３９７）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｅｌｅｎｉｔｉｒｅｄｕｃｅｎｓ ＭＬＳ１０（ＢＳＥＬ＿０３７２）、Ｃｙａｎｏｔｈｅｃｅ ｓｐ．ＡＴＣＣ ５１１４２（ＣＣＥ＿１３５０）、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｊｅｎｓｅｎｉｉ １１５３（ＬＢＪＧ＿０１６４５）、Ａｃｈｏｌｅｐｌａｓｍａ ｌａｉｄｌａｗｉｉ ＰＧ−８Ａ（ＡＣＬ＿１３６８）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏａｈｕｉｌｅｎｓｉｓ ｍ４−４（ＢＣＯＡＭ＿０１０１００００１１２０）、Ｇｅｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．Ｍ１８ ２ ｓｅｑｓ ＧＭ１８＿０７９２、ＧＭ１８＿２５１６）、Ｌｙｓｉｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐｈａｅｒｉｃｕｓ Ｃ３−４１（ＢＳＰＨ＿４５６８）、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ ＮＣＴＣ ２９１６（ＣＢＮ＿３５０６）、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ Ｃ ｓｔｒ．Ｅｋｌｕｎｄ（ＣＢＣ＿Ａ１５７５）、Ａｌｉｓｔｉｐｅｓ ｐｕｔｒｅｄｉｎｉｓ ＤＳＭ １７２１６（ＡＬＩＰＵＴ＿００１９０）、Ａｎａｅｒｏｆｕｓｔｉｓ ｓｔｅｒｃｏｒｉｈｏｍｉｎｉｓ ＤＳＭ １７２４４（ＡＮＡＳＴＥ＿０１５３９）、Ａｎａｅｒｏｔｒｕｎｃｕｓ ｃｏｌｉｈｏｍｉｎｉｓ ＤＳＭ １７２４１（ＡＮＡＣＯＬ＿０２７０６）、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂａｒｔｌｅｔｔｉｉ ＤＳＭ １６７９５（ＣＬＯＢＡＲ＿００７５９）、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｒａｍｏｓｕｍ ＤＳＭ １４０２（ＣＬＯＲＡＭ＿０１４８２）、Ｂｏｒｒｅｌｉａ ｖａｌａｉｓｉａｎａ ＶＳ１１６（ＢＶＡＶＳ１１６＿０００７）、Ｓｏｒａｎｇｉｕｍ ｃｅｌｌｕｌｏｓｕｍ Ｓｏ ｃｅ ５６（ＳＣＥ７６２３）、Ｍｉｃｒｏｃｙｓｔｉｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ ＮＩＥＳ−８４３（ＭＡＥ＿２５３９０）、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｓｔｅｒｃｏｒｉｓ ＡＴＣＣ ４３１８３（ＢＡＣＳＴＥ＿０２６３４）、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ Ａｍｏｅｂｏｐｈｉｌｕｓ ａｓｉａｔｉｃｕｓ ５ａ２（ＡＡＳＩ＿０６５２）、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｂｉｆｌｅｘａ ｓｅｒｏｖａｒ Ｐａｔｏｃ ｓｔｒａｉｎ Ｐａｔｏｃ １（Ｐａｒｉｓ）（ＬＥＰＢＩ＿Ｉ０７３５）、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｐ．７＿２＿４３ＦＡＡ（ＣＳＢＧ＿００１０１）、Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ ｓｐ．３＿１＿ｓｙｎ３（ＨＭＰＲＥＦ０３２６＿０２２５４）、Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．５＿１＿３９ＢＦＡＡ（ＲＳＡＧ＿０２１３５）、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｌｅｓ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ １＿７＿４７ＦＡＡ（ＣＢＦＧ＿００３４７）、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｆｒａｇｉｌｉｓ ３＿１＿１２（ＢＦＡＧ＿０２５７８）、Ｎａｔｒａｎａｅｒｏｂｉｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ＪＷ／ＮＭ−ＷＮ−ＬＦ（ＮＴＨＥＲ＿０２４０）、Ｍａｃｒｏｃｏｃｃｕｓ ｃａｓｅｏｌｙｔｉｃｕｓ ＪＣＳＣ５４０２（ＭＣＣＬ＿０３２１）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｇｏｒｄｏｎｉｉ ｓｔｒ．Ｃｈａｌｌｉｓ ｓｕｂｓｔｒ．ＣＨ１（ＳＧＯ＿０８８７）、Ｄｅｔｈｉｏｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ ｐｅｐｔｉｄｏｖｏｒａｎｓ ＤＳＭ １１００２（ＤＰＥＰ＿２０６２）、Ｃｏｐｒｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．２９＿１（ＨＭＰＲＥＦ９４８８＿０３４４８）、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｃｏｐｒｏｃｏｌａ ＤＳＭ １７１３６（ＢＡＣＣＯＰ＿０３６６５）、Ｃｏｐｒｏｃｏｃｃｕｓ ｃｏｍｅｓ ＡＴＣＣ ２７７５８（ＣＯＰＣＯＭ＿０２１７８）、Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．ＷＣＨ７０（ＧＷＣＨ７０＿０１５６）、非培養シロアリ第１群細菌系統型Ｒｓ−Ｄ１７（ＴＧＲＤ＿２０９）、Ｄｙａｄｏｂａｃｔｅｒ ｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ ＤＳＭ １８０５３（ＤＦＥＲ＿０２２４）、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｉｓ ＤＳＭ １７３９３（ＢＡＣＩＮＴ＿００７００）、Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔａｒｉｓ ＡＴＣＣ ２９１７６（ＲＵＭＬＡＣ＿０１２５７）、Ｂｌａｕｔｉａ ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｔｒｏｐｈｉｃａ ＤＳＭ １０５０７（ＲＵＭＨＹＤ＿０１２１８）、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ Ｄｅｓｕｌｆｏｒｕｄｉｓ ａｕｄａｘｖｉａｔｏｒ ＭＰ１０４Ｃ（ＤＡＵＤ＿１９３２）、Ｍａｒｖｉｎｂｒｙａｎｔｉａ ｆｏｒｍａｔｅｘｉｇｅｎｓ ＤＳＭ １４４６９（ＢＲＹＦＯＲ＿０７４１０）、Ｓｐｈａｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ＤＳＭ ２０７４５（ＳＴＨＥ＿１６０１）、Ｖｅｉｌｌｏｎｅｌｌａ ｐａｒｖｕｌａ ＤＳＭ ２００８（ＶＰＡＲ＿０２９２）、Ｍｅｔｈｙｌａｃｉｄｉｐｈｉｌｕｍ ｉｎｆｅｒｎｏｒｕｍ Ｖ４（ＭＩＮＦ＿１８９７）、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．Ｙ４１２ＭＣ１０（ＧＹＭＣ１０＿５７０１）、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｆｉｎｅｇｏｌｄｉｉ ＤＳＭ １７５６５（ＢＡＣＦＩＮ＿０７７３２）、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｅｇｇｅｒｔｈｉｉ ＤＳＭ ２０６９７（ＢＡＣＥＧＧ＿０３５６１）、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｐｅｃｔｉｎｏｐｈｉｌｕｓ ＡＴＣＣ ４３２４３（ＢＡＣＰＥＣ＿０２９３６）、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｐｌｅｂｅｉｕｓ ＤＳＭ １７１３５（ＢＡＣＰＬＥ＿００６９３）、Ｄｅｓｕｌｆｏｈａｌｏｂｉｕｍ ｒｅｔｂａｅｎｓｅ ＤＳＭ ５６９２（ＤＲＥＴ＿１７２５）、Ｄｅｓｕｌｆｏｔｏｍａｃｕｌｕｍ ａｃｅｔｏｘｉｄａｎｓ ＤＳＭ ７７１（ＤＴＯＸ＿０６０４）、Ｐｅｄｏｂａｃｔｅｒ ｈｅｐａｒｉｎｕｓ ＤＳＭ ２３６６（ＰＨＥＰ＿３６６４）、Ｃｈｉｔｉｎｏｐｈａｇａ ｐｉｎｅｎｓｉｓ ＤＳＭ ２５





８８（ＣＰＩＮ＿５４６６）、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉａ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＭＳ０２４−２Ａ（ＦＬＡＶ２ＡＤＲＡＦＴ＿００９０）、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉａ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＭＳ０２４−３Ｃ（ＦＬＡＶ３ＣＤＲＡＦＴ＿０８５１）、Ｍｏｏｒｅａ ｐｒｏｄｕｃｔａ ３Ｌ（ＬＹＮＧＢＭ３Ｌ＿１４４００）、Ａｎｏｘｙｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｌａｖｉｔｈｅｒｍｕｓ ＷＫ１（ＡＦＬＶ＿０１４９）、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ ＰＧ１８（ＭＢＩＯ＿０４７４）、Ｃｈｔｈｏｎｉｏｂａｃｔｅｒ ｆｌａｖｕｓ Ｅｌｌｉｎ４２８（ＣＦＥ４２８ＤＲＡＦＴ＿３０３１）、Ｃｙａｎｏｔｈｅｃｅ ｓｐ．ＰＣＣ ７８２２（ＣＹＡＮ７８２２＿１１５２）、Ｂｏｒｒｅｌｉａ ｓｐｉｅｌｍａｎｉｉ Ａ１４Ｓ（ＢＳＰＡ１４Ｓ＿０００９）、Ｈｅｌｉｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍｏｄｅｓｔｉｃａｌｄｕｍ Ｉｃｅ１（ＨＭ１＿１５２２）、Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ Ｙ５１ＭＣ２３（ＴＡＱＤＲＡＦＴ＿３９３８）、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｔｉｃｋｌａｎｄｉｉ ＤＳＭ ５１９（ＣＬＯＳＴ＿０４８４）、Ｔｅｐｉｄａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．Ｒｅ１（ＴＥＰＲＥ１＿０３２３）、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｈｉｒａｎｏｎｉｓ ＤＳＭ １３２７５（ＣＬＯＨＩＲ＿００００３）、Ｍｉｔｓｕｏｋｅｌｌａ ｍｕｌｔａｃｉｄａ ＤＳＭ ２０５４４（ＭＩＴＳＭＵＬ＿０３４７９）、Ｈａｌｉａｎｇｉｕｍ ｏｃｈｒａｃｅｕｍ ＤＳＭ １４３６５（ＨＯＣＨ＿３５５０）、Ｓｐｉｒｏｓｏｍａ ｌｉｎｇｕａｌｅ ＤＳＭ ７４（ＳＬＩＮ＿２６７３）、未同定の真正細菌ＳＣＢ４９（ＳＣＢ４９＿０３６７９）、Ａｃｅｔｉｖｉｂｒｉｏ ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｓ ＣＤ２（ＡＣＥＬＣ＿０２０１０００１３８４５）、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｕｃｈｎｅｒｉ ＮＲＲＬ Ｂ−３０９２９（ＬＢＵＣ＿１２９９）、Ｂｕｔｙｒｉｖｉｂｒｉｏ ｃｒｏｓｓｏｔｕｓ ＤＳＭ ２８７６（ＢＵＴＹＶＩＢ＿０２０５６）、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ Ａｚｏｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｐｓｅｕｄｏｔｒｉｃｈｏｎｙｍｐｈａｅ ｇｅｎｏｍｏｖａｒ．ＣＦＰ２（ＣＦＰＧ＿０６６）、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｃｒｏｃｏｄｙｌｉ ＭＰ１４５（ＭＣＲＯ＿０３８５）、Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ ｍａｘｉｍａ ＣＳ−３２８（ＡＭＡＸＤＲＡＦＴ＿４１８４）、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｅｌｉｇｅｎｓ ＡＴＣＣ ２７７５０（ＥＵＢＥＬＩ＿０１６２６）、Ｂｕｔｙｒｉｖｉｂｒｉｏ ｐｒｏｔｅｏｃｌａｓｔｉｃｕｓ Ｂ３１６（ＢＰＲ＿Ｉ２５８７）、Ｃｈｌｏｒｏｈｅｒｐｅｔｏｎ ｔｈａｌａｓｓｉｕｍ ＡＴＣＣ ３５１１０（ＣＴＨＡ＿１３４０）、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｉｆｏｒｍｅ ＤＳＭ ３９８９（ＥＵＢＩＦＯＲ＿０１７９４）、Ｒｈｏｄｏｔｈｅｒｍｕｓ ｍａｒｉｎｕｓ ＤＳＭ ４２５２（ＲＭＡＲ＿０１４６）、Ｂｏｒｒｅｌｉａ ｂｉｓｓｅｔｔｉｉ ＤＮ１２７（ＢＢＩＤＮ１２７＿０００８）、Ｃａｐｎｏｃｙｔｏｐｈａｇａ ｏｃｈｒａｃｅａ ＤＳＭ ７２７１（ＣＯＣＨ＿２１０７）、Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ ｓｕｂｓｐ．ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ ＤＳＭ ４４６（ＡＡＣＩ＿２６７２）、Ｃａｌｄｉｃｅｌｌｕｌｏｓｉｒｕｐｔｏｒ ｂｅｓｃｉｉ ＤＳＭ ６７２５（ＡＴＨＥ＿０３６１）、Ｄｅｎｉｔｒｏｖｉｂｒｉｏ ａｃｅｔｉｐｈｉｌｕｓ ＤＳＭ １２８０９（ＤＡＣＥＴ＿１２９８）、Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ ｄｅｓｕｌｆｕｒｉｃａｎｓ ｓｕｂｓｐ．ｄｅｓｕｌｆｕｒｉｃａｎｓ ｓｔｒ．ＡＴＣＣ ２７７７４（ＤＤＥＳ＿１７１５）、Ａｎａｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｏｌｙｔｉｃｕｓ ＡＴＣＣ ５１１７２（ＨＭＰＲＥＦ００７２＿１６４５）、Ａｎａｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｔｅｔｒａｄｉｕｓ ＡＴＣＣ ３５０９８（ＨＭＰＲＥＦ００７７＿０９０２）、Ｆｉｎｅｇｏｌｄｉａ ｍａｇｎａ ＡＴＣＣ ５３５１６（ＨＭＰＲＥＦ０３９１＿１０３７７）、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｎｔｒｉ ＤＳＭ １６０４１（ＹＢＢＰ）、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｕｃｈｎｅｒｉ ＡＴＣＣ １１５７７（ＨＭＰＲＥＦ０４９７＿２７５２）、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｕｌｔｕｎｅｎｓｉｓ ＤＳＭ １６０４７（ＨＭＰＲＥＦ０５４８＿０７４５）、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｖａｇｉｎａｌｉｓ ＡＴＣＣ ４９５４０（ＨＭＰＲＥＦ０５４９＿０７６６）、Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｇｒａｙｉ ＤＳＭ ２０６０１（ＨＭＰＲＥＦ０５５６＿１１６５２）、Ｓｐｈｉｎｇｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐｉｒｉｔｉｖｏｒｕｍ ＡＴＣＣ ３３８６１（ＨＭＰＲＥＦ０７６６＿１１７８７）、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ Ｍ２３８６４：Ｗ１（ＨＭＰＲＥＦ０７９３＿００９２）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｅｑｕｉｎｕｓ ＡＴＣＣ ９８１２（ＨＭＰＲＥＦ０８１９＿０８１２）、Ｄｅｓｕｌｆｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ ｂａｃｕｌａｔｕｍ ＤＳＭ ４０２８（ＤＢＡＣ＿０２５５）、Ｔｈｅｒｍａｎａｅｒｏｖｉｂｒｉｏ ａｃｉｄａｍｉｎｏｖｏｒａｎｓ ＤＳＭ ６５８９（ＴＡＣＩ＿０８３７）、Ｔｈｅｒｍｏｂａｃｕｌｕｍ ｔｅｒｒｅｎｕｍ ＡＴＣＣ ＢＡＡ−７９８（ＴＴＥＲ＿１８１７）、Ａｎａｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｐｒｅｖｏｔｉｉ ＤＳＭ ２０５４８（ＡＰＲＥ＿０３７０）、Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ ｓａｌｅｘｉｇｅｎｓ ＤＳＭ ２６３８（ＤＥＳＡＬ＿１７９５）、Ｂｒａｃｈｙｓｐｉｒａ ｍｕｒｄｏｃｈｉｉ ＤＳＭ １２５６３（ＢＭＵＲ＿２１８６）、Ｍｅｉｏｔｈｅｒｍｕｓ ｓｉｌｖａｎｕｓ ＤＳＭ ９９４６（ＭＥＳＩＬ＿０１６１）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ Ｒｏｃｋ４−１８（ＢＣＥＲＥ００２４＿１４１０）、Ｃｙｌｉｎｄｒｏｓｐｅｒｍｏｐｓｉｓ ｒａｃｉｂｏｒｓｋｉｉ ＣＳ−５０５（ＣＲＣ＿０１９２１）、Ｒａｐｈｉｄｉｏｐｓｉｓ ｂｒｏｏｋｉｉ Ｄ９（ＣＲＤ＿０１１８８）、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｃａｒｂｏｘｉｄｉｖｏｒａｎｓ Ｐ７ ２ ｓｅｑｓ ＣＬＣＡＲ＿００１６、ＣＣＡＲＢＤＲＡＦＴ＿４２６６）、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ Ｅ１ ｓｔｒ．ＢｏＮＴ Ｅ Ｂｅｌｕｇａ（ＣＬＯ＿３４９０）、Ｂｌａｕｔｉａ ｈａｎｓｅｎｉｉ ＤＳＭ ２０５８３（ＢＬＡＨＡＮ＿０７１５５）、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｃｏｐｒｉ ＤＳＭ １８２０５（ＰＲＥＶＣＯＰ＿０４８６７）、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｍｅｔｈｙｌｐｅｎｔｏｓｕｍ ＤＳＭ ５４７６（ＣＬＯＳＴＭＥＴＨ＿０００８４）、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｓｅｉ ＢＬ２３（ＬＣＡＢＬ＿１１８００）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ ＱＭ Ｂ１５５１（ＢＭＱ＿０１９５）、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｐｒｉｍｉｔｉａ ＺＡＳ−２（ＴＲＥＰＲ＿１９３６）、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ａｚｏｔｏｎｕｔｒｉｃｉｕｍ ＺＡＳ−９（ＴＲＥＡＺ＿０１４７）、Ｈｏｌｄｅｍａｎｉａ ｆｉｌｉｆｏｒｍｉｓ ＤＳＭ １２０４２（ＨＯＬＤＥＦＩＬＩ＿０３８１０）、Ｆｉｌｉｆａｃｔｏｒ ａｌｏｃｉｓ ＡＴＣＣ ３５８９６（ＨＭＰＲＥＦ０３８９＿００３６６）、Ｇｅｍｅｌｌａ ｈａｅｍｏｌｙｓａｎｓ ＡＴＣＣ １０３７９（ＧＥＭＨＡ０００１＿０９１２）、Ｓｅｌｅｎｏｍｏｎａｓ ｓｐｕｔｉｇｅｎａ ＡＴＣＣ ３５１８５（ＳＥＬＳＰ＿１６１０）、Ｖｅｉｌｌｏｎｅｌｌａ ｄｉｓｐａｒ ＡＴＣＣ １７７４８（ＶＥＩＤＩＳＯＬ＿０１８４５）、Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｄｅｓｅｒｔｉ ＶＣＤ１１５（ＤＥＩＤＥ＿１９７００）、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｃｏｐｒｏｐｈｉｌｕｓ ＤＳＭ １８２２８（ＢＡＣＣＯＰＲＯ＿００１５９）、Ｎｏｓｔｏｃ ａｚｏｌｌａｅ ０７０８（ＡＡＺＯ＿４７３５）、Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｒｉｃｈａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ５＿２＿５４ＦＡＡ（ＨＭＰＲＥＦ０８６３＿０２２７３）、Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ Ｄ１６（ＨＭＰＲＥＦ０８６６＿０１０６１）、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｂｉｖｉａ ＪＣＶＩＨＭＰ０１０（ＨＭＰＲＥＦ０６４８＿０３３８）、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｍｅｌａｎｉｎｏｇｅｎｉｃａ ＡＴＣＣ ２５８４５（ＨＭＰＲＥＦ０６５９＿Ａ６２１２）、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｅｎｄｏｄｏｎｔａｌｉｓ ＡＴＣＣ ３５４０６（ＰＯＲＥＮ０００１＿０２５１）、Ｃａｐｎｏｃｙｔｏｐｈａｇａ ｓｐｕｔｉｇｅｎａ ＡＴＣＣ ３３６１２（ＣＡＰＳＰ０００１＿０７２７）、Ｃａｐｎｏｃｙｔｏｐｈａｇａ ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ ＡＴＣＣ ３３６２４（ＣＡＰＧＩ０００１＿１９３６）、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｈｙｌｅｍｏｎａｅ ＤＳＭ １５０５３（ＣＬＯＨＹＬＥＭ＿０４６３１）、Ｔｈｅｒｍｏｓｅｄｉｍｉｎｉｂａｃｔｅｒ ｏｃｅａｎｉ ＤＳＭ １６６４６（ＴＯＣＥ＿１９７０）、Ｄｅｔｈｉｏｂａｃｔｅｒ ａｌｋａｌｉｐｈｉｌｕｓ ＡＨＴ １（ＤＥＡＬＤＲＡＦＴ＿０２３１）、Ｄｅｓｕｌｆｏｎａｔｒｏｎｏｓｐｉｒａ ｔｈｉｏｄｉｓｍｕｔａｎｓ ＡＳＯ３−１（ＤＴＨＩＯ＿ＰＤ２８０６）、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｐ．Ｄ５（ＨＭＰＲＥＦ０２４０＿０３７８０）、Ａｎａｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｈｙｄｒｏｇｅｎａｌｉｓ ＤＳＭ ７４５４（ＡＮＨＹＤＲＯ＿０１１４４）、Ｋｙｒｐｉｄｉａ ｔｕｓｃｉａｅ ＤＳＭ ２９１２（ＢＴＵＳ＿０１９６）、Ｇｅｍｅｌｌａ ｈａｅｍｏｌｙｓａｎｓ Ｍ３４１（ＨＭＰＲＥＦ０４２８＿０１４２９）、Ｇｅｍｅｌｌａ ｍｏｒｂｉｌｌｏｒｕｍ Ｍ４２４（ＨＭＰＲＥＦ０４３２＿０１３４６）、Ｇｅｍｅｌｌａ ｓａｎｇｕｉｎｉｓ Ｍ３２５（ＨＭＰＲＥＦ０４３３＿０１２２５）、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｏｒｉｓ Ｃ７３５（ＨＭＰＲＥＦ０６６５＿０１７４１）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．Ｍ１４３（ＨＭＰＲＥＦ０８５０＿００１０９）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．Ｍ３３４（ＨＭＰＲＥＦ０８５１＿０１６５２）、Ｂｉｌｏｐｈｉｌａ ｗａｄｓｗｏｒｔｈｉａ ３＿１＿６（ＨＭＰＲＥＦ０１７９＿００８９９）、Ｂｒａｃｈｙｓｐｉｒａ ｈｙｏｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ ＷＡ１（ＢＨＷＡ１＿０１１６７）、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ ＥＧ２（ＥＧＢＧ＿００８２０）、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｃａｓｓｅｌｉｆｌａｖｕｓ ＥＣ２０（ＥＣＢＧ＿００８２７）、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｕｍ Ｃ６８（ＥＦＸＧ＿０１６６５）、Ｓｙｎｔｒｏｐｈｕｓ ａｃｉｄｉｔｒｏｐｈｉｃｕｓ ＳＢ（ＳＹＮ＿０２７６２）、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｈａｍｎｏｓｕｓ ＧＧ ２ ｓｅｑｓ ＯＳＳＧ、ＬＲＨＭ＿０９３７）、Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｉｎｔｅｓｔｉｎｉ ＲｙＣ−ＭＲ９５（ＡＣＩＮ＿２０６９）、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｃｏｎｊｕｎｃｔｉｖａｅ ＨＲＣ／５８１（ＭＣＪ＿００２９４０）、Ｈａｌａｎａｅｒｏｂｉｕｍ ｐｒａｅｖａｌｅｎｓ ＤＳＭ ２２２８（ＨＰＲＡＥ＿１６４７）、Ａｍｉｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃｏｌｏｍｂｉｅｎｓｅ ＤＳＭ １２２６１（ＡＭＩＣＯ＿０７３７）、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｃｅｌｌｕｌｏｖｏｒａｎｓ ７４３Ｂ（ＣＬＯＣＥＬ＿３６７８）、Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ ｍａｇｎｅｔｉｃｕｓ ＲＳ−１（ＤＭＲ＿２５７２０）、Ｓｐｉｒｏｃｈａｅｔａ ｓｍａｒａｇｄｉｎａｅ ＤＳＭ １１２９３（ＳＰＩＲＳ＿１６４７）、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ ｏｒａｌ ｔａｘｏｎ ２７４ ｓｔｒ．Ｆ００５８（ＨＭＰＲＥＦ０１５６＿０１８２６）、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ ｏｒａｌ ｔａｘｏｎ １０７ ｓｔｒ．Ｆ０１６７（ＨＭＰＲＥＦ０４９１＿０１２３８）、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏｌｅｏｈｏｍｉｎｉｓ １０１−４−ＣＨＮ（ＨＭＰＲＥＦ０５０１＿０１０９４）、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｊｅｎｓｅｎｉｉ ２７−２−ＣＨＮ（ＨＭＰＲＥＦ０５２５＿００６１６）、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｂｕｃｃａｅ Ｄ１





７（ＨＭＰＲＥＦ０６４９＿０２０４３）、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｓｐ．ｏｒａｌ ｔａｘｏｎ ２９９ ｓｔｒ．Ｆ００３９（ＨＭＰＲＥＦ０６６９＿０１０４１）、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｓｐ．ｏｒａｌ ｔａｘｏｎ ３１７ ｓｔｒ．Ｆ０１０８（ＨＭＰＲＥＦ０６７０＿０２５５０）、Ｄｅｓｕｌｆｏｂｕｌｂｕｓ ｐｒｏｐｉｏｎｉｃｕｓ ＤＳＭ ２０３２ ２ ｓｅｑｓ ＤＥＳＰＲ＿２５０３、ＤＥＳＰＲ＿１０５３）、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍ ＤＳＭ ５７１（ＴＴＨＥ＿０４８４）、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｉｔａｌｉｃｕｓ Ａｂ９（ＴＨＩＴ＿１９２１）、Ｔｈｅｒｍｏｖｉｒｇａ ｌｉｅｎｉｉ ＤＳＭ １７２９１（ＴＬＩＥ＿０７５９）、Ａｍｉｎｏｍｏｎａｓ ｐａｕｃｉｖｏｒａｎｓ ＤＳＭ １２２６０（ＡＰＡＵ＿１２７４）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｉｔｉｓ ＳＫ３２１（ＳＭＳＫ３２１＿０１２７）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｉｔｉｓ ＳＫ５９７（ＳＭＳＫ５９７＿０４１７）、Ｒｏｓｅｂｕｒｉａ ｈｏｍｉｎｉｓ Ａ２−１８３（ＲＨＯＭ＿１２４０５）、Ｏｒｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｉｎｕｓ Ｆ０２６８（ＨＭＰＲＥＦ６１２３＿０８８７）、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｂｅｒｇｅｎｓｉｓ ＤＳＭ １７３６１（ＨＭＰＲＥＦ０６４５＿２７０１）、Ｓｅｌｅｎｏｍｏｎａｓ ｎｏｘｉａ ＡＴＣＣ ４３５４１（ＹＢＢＰ）、Ｗｅｉｓｓｅｌｌａ ｐａｒａｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ ＡＴＣＣ ３３３１３（ＨＭＰＲＥＦ０８７７＿００１１）、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｙｔｉｃｕｓ ＤＳＭ １１６６４（ＨＭＰＲＥＦ０４９３＿１０１７）、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｓｐ．Ｄ２０（ＨＭＰＲＥＦ０９６９＿０２０８７）、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐａｐｙｒｏｓｏｌｖｅｎｓ ＤＳＭ ２７８２（ＣＰＡＰ＿３９６８）、Ｄｅｓｕｌｆｕｒｉｖｉｂｒｉｏ ａｌｋａｌｉｐｈｉｌｕｓ ＡＨＴ２（ＤＡＡＨＴ２＿０４４５）、Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ ＤＳＭ ２０７３１（ＡＣＦＥＲ＿０６０１）、Ａｂｉｏｔｒｏｐｈｉａ ｄｅｆｅｃｔｉｖａ ＡＴＣＣ ４９１７６（ＧＣＷＵ０００１８２＿０００６３）、Ａｎａｅｒｏｂａｃｕｌｕｍ ｈｙｄｒｏｇｅｎｉｆｏｒｍａｎｓ ＡＴＣＣ ＢＡＡ−１８５０（ＨＭＰＲＥＦ１７０５＿０１１１５）、Ｃａｔｏｎｅｌｌａ ｍｏｒｂｉ ＡＴＣＣ ５１２７１（ＧＣＷＵ０００２８２＿００６２９）、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ Ｄ ｓｔｒ．１８７３（ＣＬＧ＿Ｂ１８５９）、Ｄｉａｌｉｓｔｅｒ ｉｎｖｉｓｕｓ ＤＳＭ １５４７０（ＧＣＷＵ０００３２１＿０１９０６）、Ｆｉｂｒｏｂａｃｔｅｒ ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓ ｓｕｂｓｐ．ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓ Ｓ８５ ２ ｓｅｑｓ ＦＳＵ＿００２８、ＦＩＳＵＣ＿２７７６）、Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ ｆｒｕｃｔｏｓｏｖｏｒａｎｓ ＪＪ（ＤＥＳＦＲＤＲＡＦＴ＿２８７９）、Ｐｅｐｔｏｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｔｏｍａｔｉｓ ＤＳＭ １７６７８（ＨＭＰＲＥＦ０６３４＿０７２７）、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｗａｒｎｅｒｉ Ｌ３７６０３（ＳＴＡＷＡ０００１＿００９４）、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｖｉｎｃｅｎｔｉｉ ＡＴＣＣ ３５５８０（ＴＲＥＶＩ０００１＿１２８９）、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｕｅｎｏｎｉｓ ６０−３（ＰＯＲＵＥ０００１＿０１９９）、Ｐｅｐｔｏｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｎａｅｒｏｂｉｕｓ ６５３−Ｌ（ＨＭＰＲＥＦ０６３１＿１２２８）、Ｐｅｐｔｏｎｉｐｈｉｌｕｓ ｌａｃｒｉｍａｌｉｓ ３１５−Ｂ（ＨＭＰＲＥＦ０６２８＿０７６２）、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ Ｐｈｙｔｏｐｌａｓｍａ ａｕｓｔｒａｌｉｅｎｓｅ（ＰＡ００９０）、Ｐｒｏｃｈｌｏｒｏｃｏｃｃｕｓ ｍａｒｉｎｕｓ ｓｕｂｓｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ ｓｔｒ．ＣＣＭＰ１９８６（ＰＭＭ１０９１）、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．ＷＨ ７８０５（ＷＨ７８０５＿０４４４１）、Ｂｌａｔｔａｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．（Ｐｅｒｉｐｌａｎｅｔａ ａｍｅｒｉｃａｎａ） ｓｔｒ．ＢＰＬＡＮ（ＢＰＬＡＮ＿５３４）、Ｃａｌｄｉｃｅｌｌｕｌｏｓｉｒｕｐｔｏｒ ｏｂｓｉｄｉａｎｓｉｓ ＯＢ４７（ＣＯＢ４７＿０３２５）、Ｏｒｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．ｏｒａｌ ｔａｘｏｎ ０７８ ｓｔｒ．Ｆ０２６２（ＧＣＷＵ０００３４１＿０１３６５）、Ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｂａｃｔｅｒ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ＴＫ−６ ２ ｓｅｑｓ ＡＤＯ４６０３４．１、ＨＴＨ＿１６６５）、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍ ＷＭ１（ＣＬＯＳＡ＿１２４８）、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｓｐ．ｏｒａｌ ｔａｘｏｎ ４７２ ｓｔｒ．Ｆ０２９５（ＨＭＰＲＥＦ６７４５＿１６１７）、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．ｏｒａｌ ｔａｘｏｎ ７８６ ｓｔｒ．Ｄ１４（ＰＯＴＧ＿０３８２２）、Ｒｏｓｅｂｕｒｉａ ｉｎｕｌｉｎｉｖｏｒａｎｓ ＤＳＭ １６８４１ ２ ｓｅｑｓ ＲＯＳＥＩＮＡ２１９４＿０２６１４、ＲＯＳＥＩＮＡ２１９４＿０２６１３）、Ｇｒａｎｕｌｉｃａｔｅｌｌａ ｅｌｅｇａｎｓ ＡＴＣＣ ７００６３３（ＨＭＰＲＥＦ０４４６＿０１３８１）、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｔａｎｎｅｒａｅ ＡＴＣＣ ５１２５９（ＧＣＷＵ０００３２５＿０２８４４）、Ｓｈｕｔｔｌｅｗｏｒｔｈｉａ ｓａｔｅｌｌｅｓ ＤＳＭ １４６００（ＧＣＷＵ０００３４２＿０１７２２）、Ｐｈａｓｃｏｌａｒｃｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｕｃｃｉｎａｔｕｔｅｎｓ ＹＩＴ １２０６７（ＨＭＰＲＥＦ９４４３＿０１５２２）、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｕｔｙｒｉｃｕｍ Ｅ４ ｓｔｒ．ＢｏＮＴ Ｅ ＢＬ５２６２（ＣＬＰ＿３９８０）、Ｃａｌｄｉｃｅｌｌｕｌｏｓｉｒｕｐｔｏｒ ｈｙｄｒｏｔｈｅｒｍａｌｉｓ １０８（ＣＡＬＨＹ＿２２８７）、Ｃａｌｄｉｃｅｌｌｕｌｏｓｉｒｕｐｔｏｒ ｋｒｉｓｔｊａｎｓｓｏｎｉｉ １７７Ｒ１Ｂ（ＣＡＬＫＲ＿０３１４）、Ｃａｌｄｉｃｅｌｌｕｌｏｓｉｒｕｐｔｏｒ ｏｗｅｎｓｅｎｓｉｓ ＯＬ（ＣＡＬＯＷ＿０２２８）、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃｅｌｌｕｌｏｓｏｌｖｅｎｓ ６（ＥＵＢＣＥＤＲＡＦＴ＿１１５０）、Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｅｒｍｏｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｉｕｓ Ｃ５６−ＹＳ９３（ＧＥＯＴＨ＿０１７５）、Ｔｈｅｒｍｉｎｃｏｌａ ｐｏｔｅｎｓ ＪＲ（ＴＨＥＲＪＲ＿０３７６）、Ｎｏｓｔｏｃ ｐｕｎｃｔｉｆｏｒｍｅ ＰＣＣ ７３１０２（ＮＰＵＮ＿Ｆ５９９０）、Ｇｒａｎｕｌｉｃａｔｅｌｌａ ａｄｉａｃｅｎｓ ＡＴＣＣ ４９１７５（ＹＢＢＰ）、Ｓｅｌｅｎｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｅｇｇｅｉ ＡＴＣＣ ４３５３１（ＨＭＰＲＥＦ０９０８＿１３６６）、Ｔｈｅｒｍｏｃｒｉｎｉｓ ａｌｂｕｓ ＤＳＭ １４４８４（ＴＨＡＬ＿０２３４）、Ｄｅｆｅｒｒｉｂａｃｔｅｒ ｄｅｓｕｌｆｕｒｉｃａｎｓ ＳＳＭ１（ＤＥＦＤＳ＿１０３１）、Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｆｌａｖｅｆａｃｉｅｎｓ ＦＤ−１（ＲＦＬＡＦ＿０１０１０００１２４４４）、Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ ｄｅｓｕｌｆｕｒｉｃａｎｓ ＮＤ１３２（ＤＮＤ１３２＿０８７７）、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｌｅｎｔｏｃｅｌｌｕｍ ＤＳＭ ５４２７（ＣＬＯＬＥ＿３３７０）、Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ ａｅｓｐｏｅｅｎｓｉｓ Ａｓｐｏ−２（ＤＡＥＳ＿１２５７）、Ｓｙｎｔｒｏｐｈｏｔｈｅｒｍｕｓ ｌｉｐｏｃａｌｉｄｕｓ ＤＳＭ １２６８０（ＳＬＩＰ＿２１３９）、Ｍａｒｉｖｉｒｇａ ｔｒａｃｔｕｏｓａ ＤＳＭ ４１２６（ＦＴＲＡＣ＿３７２０）、Ｄｅｓｕｌｆａｒｃｕｌｕｓ ｂａａｒｓｉｉ ＤＳＭ ２０７５（ＤＥＢＡ＿０７６４）、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．ＣＣ９３１１（ＳＹＮＣ＿１０３０）、Ｔｈｅｒｍａｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｍａｒｉａｎｅｎｓｉｓ ＤＳＭ １２８８５（ＴＭＡＲ＿０２３６）、Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ ｓｐ．ＦＷ１０１２Ｂ（ＤＦＷ１０１＿０４８０）、Ｊｏｎｑｕｅｔｅｌｌａ ａｎｔｈｒｏｐｉ Ｅ３＿３３ Ｅ１（ＧＣＷＵ０００２４６＿０１５２３）、Ｓｙｎｔｒｏｐｈｏｂｏｔｕｌｕｓ ｇｌｙｃｏｌｉｃｕｓ ＤＳＭ ８２７１（ＳＧＬＹ＿０４８３）、Ｔｈｅｒｍｏｖｉｂｒｉｏ ａｍｍｏｎｉｆｉｃａｎｓ ＨＢ−１（ＴＨＥＡＭ＿０８９２）、Ｔｒｕｅｐｅｒａ ｒａｄｉｏｖｉｃｔｒｉｘ ＤＳＭ １７０９３（ＴＲＡＤ＿１７０４）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｌｌｕｌｏｓｉｌｙｔｉｃｕｓ ＤＳＭ ２５２２（ＢＣＥＬＬ＿０１７０）、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｖｅｒｏｒａｌｉｓ Ｆ０３１９（ＨＭＰＲＥＦ０９７３＿０２９４７）、Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘ ｒｈｕｓｉｏｐａｔｈｉａｅ ｓｔｒ．Ｆｕｊｉｓａｗａ（ＥＲＨ＿０１１５）、Ｄｅｓｕｌｆｕｒｉｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｉｎｄｉｃｕｍ Ｓ５（ＳＥＬＩＮ＿２３２６）、Ｃｙａｎｏｔｈｅｃｅ ｓｐ．ＰＣＣ ７４２４（ＰＣＣ７４２４＿０８４３）、Ａｎａｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｖａｇｉｎａｌｉｓ ＡＴＣＣ ５１１７０（ＹＢＢＰ）、Ａｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｖｉｒｉｄａｎｓ ＡＴＣＣ １１５６３（ＹＢＢＰ）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｏｒａｌｉｓ ＡＴＣＣ ３５０３７ ２ ｓｅｑｓ ＨＭＰＲＥＦ８５７９＿１６８２、ＳＭＳＫ２３＿１１１５）、Ｚｕｎｏｎｇｗａｎｇｉａ ｐｒｏｆｕｎｄａ ＳＭ−Ａ８７（ＺＰＲ＿０９７８）、Ｈａｌａｎａｅｒｏｂｉｕｍ ｈｙｄｒｏｇｅｎｉｆｏｒｍａｎｓ（ＨＡＬＳＡ＿１８８２）、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｘｙｌａｎｉｓｏｌｖｅｎｓ ＸＢ１Ａ（ＢＸＹ＿２９６５０）、Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｔｏｒｑｕｅｓ Ｌ２−１４（ＲＴＯ＿１６４９０）、Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｏｂｅｕｍ Ａ２−１６２（ＣＫ５＿３３６００）、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒｅｃｔａｌｅ ＤＳＭ １７６２９（ＥＵＲ＿２４９１０）、Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ ＳＬ３／３（ＦＰＲ＿２７６３０）、Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．ＳＲ１／５（ＣＫ１＿３９３３０）、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ３＿１＿５７ＦＡＡ＿ＣＴ１（ＨＭＰＲＥＦ０９９４＿０１４９０）、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ９＿１＿４３ＢＦＡＡ（ＨＭＰＲＥＦ０９８７＿０１５９１）、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ １＿４＿５６ＦＡＡ（ＨＭＰＲＥＦ０９８８＿０１８０６）、Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｒｉｃｈａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ３＿１＿５３（ＨＭＰＲＥＦ０９８３＿０１３２８）、Ｅｔｈａｎｏｌｉｇｅｎｅｎｓ ｈａｒｂｉｎｅｎｓｅ ＹＵＡＮ−３（ＥＴＨＨＡ＿１６０５）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｄｙｓｇａｌａｃｔｉａｅ ｓｕｂｓｐ．ｄｙｓｇａｌａｃｔｉａｅ ＡＴＣＣ ２７９５７（ＳＤＤ２７９５７＿０６２１５）、Ｓｐｉｒｏｃｈａｅｔａ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ ＤＳＭ ６１９２（ＳＴＨＥＲＭ＿Ｃ１８３７０）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．２＿Ａ＿５７＿ＣＴ２（ＨＭＰＲＥＦ１０１３＿０５４４９）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｌａｕｓｉｉ ＫＳＭ−Ｋ１６（ＡＢＣ０２４１）、Ｔｈｅｒｍｏｄｅｓｕｌｆａｔａｔｏｒ ｉｎｄｉｃｕｓ ＤＳＭ １５２８６（ＴＨＥＩＮ＿００７６）、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｓａｌａｎｉｔｒｏｎｉｓ ＤＳＭ １８１７０（ＢＡＣＳＡ＿１４８６）、Ｏｃｅａｎｉｔｈｅｒｍｕｓ ｐｒｏｆｕｎｄｕｓ ＤＳＭ １４９７７（ＯＣＥＰＲ＿２１７８）、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｔｉｍｏｎｅｎｓｉｓ ＣＲＩＳ ５Ｃ−Ｂ１（ＨＭＰＲＥＦ９０１９＿２０２８）、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｂｕｃｃａｌｉｓ ＡＴＣＣ ３５３１０（ＨＭＰＲＥＦ０６５０＿０６７５）、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ａｍｎｉｉ ＣＲＩＳ ２１Ａ−Ａ（ＨＭＰＲＥＦ９０１８＿０３６５）、Ｂｕｌｌｅｉｄｉａ ｅｘｔｒｕｃｔａ Ｗ１２１９（ＨＭＰＲＥＦ９０１３＿００７８）、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｃｏｐｒｏｓｕｉｓ ＤＳＭ １８０１１（ＢＣＯＰ＿０５５８）、Ｐｒｅｖｏｔｅ





ｌｌａ ｍｕｌｔｉｓａｃｃｈａｒｉｖｏｒａｘ ＤＳＭ １７１２８（ＰＲＥＭＵ＿０８３９）、Ｃｅｌｌｕｌｏｐｈａｇａ ａｌｇｉｃｏｌａ ＤＳＭ １４２３７（ＣＥＬＡＬ＿０４８３）、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．ＷＨ ５７０１（ＷＨ５７０１＿１０３６０）、Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ ａｆｒｉｃａｎｕｓ ｓｔｒ．Ｗａｌｖｉｓ Ｂａｙ（ＤＥＳＡＦ＿３２８３）、Ｏｓｃｉｌｌｉｂａｃｔｅｒ ｖａｌｅｒｉｃｉｇｅｎｅｓ Ｓｊｍ１８−２０（ＯＢＶ＿２３３４０）、Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃｕｓ ＭＲＰ（ＤＥＩＰＲ＿０１３４）、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｈｅｌｃｏｇｅｎｅｓ Ｐ ３６−１０８（ＢＡＣＨＥ＿０３６６）、Ｐａｌｕｄｉｂａｃｔｅｒ ｐｒｏｐｉｏｎｉｃｉｇｅｎｅｓ ＷＢ４（ＰＡＬＰＲ＿１９２３）、Ｄｅｓｕｌｆｏｔｏｍａｃｕｌｕｍ ｎｉｇｒｉｆｉｃａｎｓ ＤＳＭ ５７４（ＤＥＳＮＩＤＲＡＦＴ＿２０９３）、Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ ｐｌａｔｅｎｓｉｓ ＮＩＥＳ−３９（ＢＡＩ８９４４２．１）、Ｍａｈｅｌｌａ ａｕｓｔｒａｌｉｅｎｓｉｓ ５０−１ ＢＯＮ（ＭＡＨＡＵ＿１８４６）、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｗｉｅｇｅｌｉｉ Ｒｔ８．Ｂ１（ＴＨＥＷＩ＿２１９１）、Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ａｌｂｕｓ ７（ＲＵＭＡＬ＿２３４５）、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｌｕｇｄｕｎｅｎｓｉｓ ＨＫＵ０９−０１（ＳＬＧＤ＿００８６２）、Ｍｅｇａｓｐｈａｅｒａ ｇｅｎｏｍｏｓｐ．ｔｙｐｅ＿１ ｓｔｒ．２８Ｌ（ＨＭＰＲＥＦ０８８９＿１０９９）、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｌｅｓ ｇｅｎｏｍｏｓｐ．ＢＶＡＢ３ ｓｔｒ．ＵＰＩＩ９−５（ＨＭＰＲＥＦ０８６８＿１４５３）、Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ ｃｌａｕｓｓｅｎｉｉ ＡＴＣＣ ＢＡＡ−３４４（ＰＥＣＬ＿５７１）、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｏｕｌｏｒｕｍ Ｆ０３９０（ＨＭＰＲＥＦ９４３１＿０１６７３）、Ｔｕｒｉｃｉｂａｃｔｅｒ ｓａｎｇｕｉｎｉｓ ＰＣ９０９（ＣＵＷ＿０３０５）、Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｓｅｅｌｉｇｅｒｉ ＦＳＬ Ｎ１−０６７（ＮＴ０３ＬＳ＿２４７３）、Ｓｏｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍｏｏｒｅｉ Ｆ０２０４（ＨＭＰＲＥＦ９４３０＿０１２４５）、Ｍｅｇａｓｐｈａｅｒａ ｍｉｃｒｏｎｕｃｉｆｏｒｍｉｓ Ｆ０３５９（ＨＭＰＲＥＦ９４２９＿００９２９）、Ｃａｐｎｏｃｙｔｏｐｈａｇａ ｓｐ．ｏｒａｌ ｔａｘｏｎ ３２９ ｓｔｒ．Ｆ００８７ ２ ｓｅｑｓ ＨＭＰＲＥＦ９０７４＿００８６７、ＨＭＰＲＥＦ９０７４＿０１０７８）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｎｇｉｎｏｓｕｓ Ｆ０２１１（ＨＭＰＲＥＦ０８１３＿００１５７）、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｓｕｉｓ ＫＩ３８０６（ＭＳＵＩ０４０４０）、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｇａｌｌｉｓｅｐｔｉｃｕｍ ｓｔｒ．Ｆ（ＭＧＦ＿２７７１）、Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｍａｒｉｃｏｐｅｎｓｉｓ ＤＳＭ ２１２１１（ＤＥＩＭＡ＿０６５１）、Ｏｄｏｒｉｂａｃｔｅｒ ｓｐｌａｎｃｈｎｉｃｕｓ ＤＳＭ ２０７１２（ＯＤＯＳＰ＿０２３９）、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ ＣＥＣＴ ５７１６（ＬＣ４０＿０２６５）、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｉｎｅｒｓ ＡＢ−１（ＬＩＮＥＡ＿０１０１００００６０８９）、ｃｙａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＵＣＹＮ−Ａ（ＵＣＹＮ＿０３１５０）、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｎｆｒａｎｃｉｓｃｅｎｓｉｓ ＴＭＷ １．１３０４（ＹＢＢＰ）、Ｍｕｃｉｌａｇｉｎｉｂａｃｔｅｒ ｐａｌｕｄｉｓ ＤＳＭ １８６０３（ＭＵＣＰＡ＿１２９６）、Ｌｙｓｉｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｕｓｉｆｏｒｍｉｓ ＺＣ１（ＢＦＺＣ１＿０３１４２）、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｖｏｒｔｅｘ Ｖ４５３（ＰＶＯＲ＿３０８７８）、Ｗａｄｄｌｉａ ｃｈｏｎｄｒｏｐｈｉｌａ ＷＳＵ ８６−１０４４（ＹＢＢＰ）、Ｆｌｅｘｉｓｔｉｐｅｓ ｓｉｎｕｓａｒａｂｉｃｉ ＤＳＭ ４９４７（ＦＬＥＸＳＩ＿０９７１）、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｕｒｄｌａｎｏｌｙｔｉｃｕｓ ＹＫ９（ＰＡＥＣＵＤＲＡＦＴ＿１８８８）、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｃｆ．ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍ Ｋ１０（ＣＬＳ＿０３２９０）、Ａｌｉｓｔｉｐｅｓ ｓｈａｈｉｉ ＷＡＬ ８３０１（ＡＬ１＿０２１９０）、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃｙｌｉｎｄｒｏｉｄｅｓ Ｔ２−８７（ＥＣ１＿００２３０）、Ｃｏｐｒｏｃｏｃｃｕｓ ｃａｔｕｓ ＧＤ／７（ＣＣ１＿３２４６０）、Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ Ｌ２−６（ＦＰ２＿０９９６０）、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｃｌａｒｉｆｌａｖｕｍ ＤＳＭ １９７３２（ＣＬＯＣＬ＿２９８３）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｔｒｏｐｈａｅｕｓ １９４２（ＢＡＴＲ１９４２＿１９５３０）、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ ＦＨ（ＭＰＮＥ＿０２７７）、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ２＿１＿４６ＦＡＡ（ＨＭＰＲＥＦ９４７７＿０００５８）、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｙｍｂｉｏｓｕｍ ＷＡＬ−１４１６３（ＨＭＰＲＥＦ９４７４＿０１２６７）、Ｄｙｓｇｏｎｏｍｏｎａｓ ｇａｄｅｉ ＡＴＣＣ ＢＡＡ−２８６（ＨＭＰＲＥＦ９４５５＿０２７６４）、Ｄｙｓｇｏｎｏｍｏｎａｓ ｍｏｓｓｉｉ ＤＳＭ ２２８３６（ＨＭＰＲＥＦ９４５６＿００４０１）、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｓｃｏｔｏｄｕｃｔｕｓ ＳＡ−０１（ＴＳＣ＿Ｃ２４３５０）、Ｓｐｈｉｎｇｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．２１（ＳＰＨ２１＿１２３３）、Ｓｐｉｒｏｃｈａｅｔａ ｃａｌｄａｒｉａ ＤＳＭ ７３３４（ＳＰＩＣＡ＿１２０１）、Ｐｒｏｃｈｌｏｒｏｃｏｃｃｕｓ ｍａｒｉｎｕｓ ｓｔｒ．ＭＩＴ ９３１２（ＰＭＴ９３１２＿１１０２）、Ｐｒｏｃｈｌｏｒｏｃｏｃｃｕｓ ｍａｒｉｎｕｓ ｓｔｒ．ＭＩＴ ９３１３（ＰＭＴ＿１０５８）、Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃｆ．ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ ＫＬＥ１２５５（ＨＭＰＲＥＦ９４３６＿００９４９）、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｒｉｓｐａｔｕｓ ＳＴ１（ＬＣＲＩＳ＿００７２１）、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉ ＤＳＭ １３５２８（ＣＬＪＵ＿Ｃ４０４７０）、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｂｒｙａｎｔｉｉ Ｂ１４（ＰＢＲ＿２３４５）、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｐｈａｇｅｄｅｎｉｓ Ｆ０４２１（ＨＭＰＲＥＦ９５５４＿０２０１２）、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｐ．ＢＮＬ１１００（ＣＬＯ１１００＿２８５１）、Ｍｉｃｒｏｃｏｌｅｕｓ ｖａｇｉｎａｔｕｓ ＦＧＰ−２（ＭＩＣＶＡＤＲＡＦＴ＿１３７７）、Ｂｒａｃｈｙｓｐｉｒａ ｐｉｌｏｓｉｃｏｌｉ ９５／１０００（ＢＰ９５１０００＿０６７１）、Ｓｐｉｒｏｃｈａｅｔａ ｃｏｃｃｏｉｄｅｓ ＤＳＭ １７３７４（ＳＰＩＣＯ＿１４５６）、Ｈａｌｉｓｃｏｍｅｎｏｂａｃｔｅｒ ｈｙｄｒｏｓｓｉｓ ＤＳＭ １１００（ＨＡＬＨＹ＿５７０３）、Ｄｅｓｕｌｆｏｔｏｍａｃｕｌｕｍ ｋｕｚｎｅｔｓｏｖｉｉ ＤＳＭ ６１１５（ＤＥＳＫＵ＿２８８３）、Ｒｕｎｅｌｌａ ｓｌｉｔｈｙｆｏｒｍｉｓ ＤＳＭ １９５９４（ＲＵＮＳＬ＿２８５９）、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｋｉｍｃｈｉｉ ＩＭＳＮＵ １１１５４（ＬＫＩ＿０８０８０）、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｇａｓｉｃｏｍｉｔａｔｕｍ ＬＭＧ １８８１１（ＯＳＳＧ）、Ｐｅｄｏｂａｃｔｅｒ ｓａｌｔａｎｓ ＤＳＭ １２１４５（ＰＥＤＳＡ＿３６８１）、Ｐａｒａｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｘｙｌａｎｉｐｈｉｌａ ＹＩＴ １１８４１（ＨＭＰＲＥＦ９４４２＿００８６３）、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｃｌａｒｕｓ ＹＩＴ １２０５６（ＨＭＰＲＥＦ９４４５＿０１６９１）、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｆｌｕｘｕｓ ＹＩＴ １２０５７（ＨＭＰＲＥＦ９４４６＿０３３０３）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｕｒｉｎａｌｉｓ ２２８５−９７（ＳＴＲＵＲ＿１３７６）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍａｃａｃａｅ ＮＣＴＣ １１５５８（ＳＴＲＭＡ＿０８６６）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｉｃｔａｌｕｒｉ ７０７−０５（ＳＴＲＩＣ＿０９９８）、Ｏｓｃｉｌｌｏｃｈｌｏｒｉｓ ｔｒｉｃｈｏｉｄｅｓ ＤＧ−６（ＯＳＣＴ＿２８２１）、Ｐａｒａｃｈｌａｍｙｄｉａ ａｃａｎｔｈａｍｏｅｂａｅ ＵＶ−７（ＹＢＢＰ）、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｄｅｎｔｉｃｏｌａ Ｆ０２８９（ＨＭＰＲＥＦ９１３７＿０３１６）、Ｐａｒｖｉｍｏｎａｓ ｓｐ．ｏｒａｌ ｔａｘｏｎ １１０ ｓｔｒ．Ｆ０１３９（ＨＭＰＲＥＦ９１２６＿０５３４）、Ｃａｌｄｉｔｅｒｒｉｖｉｂｒｉｏ ｎｉｔｒｏｒｅｄｕｃｅｎｓ ＤＳＭ １９６７２（ＣＡＬＮＩ＿１４４３）、Ｄｅｓｕｌｆｏｓｐｏｒｏｓｉｎｕｓ ｏｒｉｅｎｔｉｓ ＤＳＭ ７６５（ＤＥＳＯＲ＿０３６６）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｉｔｉｓ ｂｖ．２ ｓｔｒ．Ｆ０３９２（ＨＭＰＲＥＦ９１７８＿０６０２）、Ｔｈｅｒｍｏｄｅｓｕｌｆｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．ＯＰＢ４５（ＴＯＰＢ４５＿１３６６）、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．ＷＨ ８１０２（ＳＹＮＷ０９３５）、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｘｙｌａｎｏｌｙｔｉｃｕｍ ＬＸ−１１（ＴＨＥＸＹ＿０３８４）、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｈａｅｍｏｆｅｌｉｓ Ｏｈｉｏ２（ＭＨＦ＿１１９２）、Ｃａｐｎｏｃｙｔｏｐｈａｇａ ｃａｎｉｍｏｒｓｕｓ Ｃｃ５（ＣＣＡＮ＿１６６７０）、Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ ａｃｉｄｉｌａｃｔｉｃｉ ＤＳＭ ２０２８４（ＨＭＰＲＥＦ０６２３＿１６４７）、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｍａｒｓｈｉｉ ＤＳＭ １６９７３（ＨＭＰＲＥＦ０６５８＿１６００）、Ｐｅｐｔｏｎｉｐｈｉｌｕｓ ｄｕｅｒｄｅｎｉｉ ＡＴＣＣ ＢＡＡ−１６４０（ＨＭＰＲＥＦ９２２５＿１４９５）、Ｂａｃｔｅｒｉｏｖｏｒａｘ ｍａｒｉｎｕｓ ＳＪ（ＢＭＳ＿２１２６）、Ｓｅｌｅｎｏｍｏｎａｓ ｓｐ．ｏｒａｌ ｔａｘｏｎ １４９ ｓｔｒ．６７Ｈ２９ＢＰ（ＨＭＰＲＥＦ９１６６＿２１１７）、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｙｕｒｉｉ ｓｕｂｓｐ．ｍａｒｇａｒｅｔｉａｅ ＡＴＣＣ ４３７１５（ＨＭＰＲＥＦ０３７９＿１１７０）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｉｔｉｓ ＡＴＣＣ ６２４９（ＨＭＰＲＥＦ８５７１＿１４１４）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．ｏｒａｌ ｔａｘｏｎ ０７１ ｓｔｒ．７３Ｈ２５ＡＰ（ＨＭＰＲＥＦ９１８９＿０４１６）、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｄｉｓｉｅｎｓ ＦＢ０３５−０９ＡＮ（ＨＭＰＲＥＦ９２９６＿１１４８）、Ａｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｕｒｉｎａｅ ＡＣＳ−１２０−Ｖ−Ｃｏｌ１０ａ（ＨＭＰＲＥＦ９２４３＿００６１）、Ｖｅｉｌｌｏｎｅｌｌａ ａｔｙｐｉｃａ ＡＣＳ−０４９−Ｖ−Ｓｃｈ６（ＨＭＰＲＥＦ９３２１＿０２８２）、Ｃｅｌｌｕｌｏｐｈａｇａ ｌｙｔｉｃａ ＤＳＭ ７４８９（ＣＥＬＬＹ＿２３１９）、Ｔｈｅｒｍａｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｓｕｂｔｅｒｒａｎｅｕｓ ＤＳＭ １３９６５（ＴＨＥＳＵＤＲＡＦＴ＿０４１１）、Ｄｅｓｕｌｆｕｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏｌｉｔｈｏｔｒｏｐｈｕｍ ＤＳＭ １１６９９（ＤＥＳＴＥＲ＿０３９１）、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｓｕｃｃｉｎｉｆａｃｉｅｎｓ ＤＳＭ ２４８９（ＴＲＥＳＵ＿１１５２）、Ｍａｒｉｎｉｔｈｅｒｍｕｓ ｈｙｄｒｏｔｈｅｒｍａｌｉｓ ＤＳＭ １４８８４（ＭＡＲＫＹ＿１８６１）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｉｎｆａｎｔｉｓ ＳＫ１３０２（ＳＩＮ＿０８２４）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐａｒａｕｂｅｒｉｓ ＮＣＦＤ ２０２０（ＳＰＢ＿０８０８）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｏｒｃｉｎｕｓ ｓｔｒ．Ｊｅｌｉｎｋｏｖａ １７６（ＳＴＲＰＯ＿０１６４）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｃｒｉｃｅｔｉ ＨＳ−６（ＳＴＲＣＲ＿１１３３）、Ｃａｐｎｏｃｙｔｏｐｈａｇａ ｏｃｈｒａｃｅａ Ｆ０２８７（ＨＭＰＲＥＦ１９７７＿０７８６）、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｏｒａｌｉｓ ＡＴＣＣ ３３２６９（ＨＭＰＲＥＦ０６６３＿１０６７１）、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ａｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃａ ＤＳＭ ２０７０７（ＰＯＲＡＳ＿０６３





４）、Ａｎａｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｐｒｅｖｏｔｉｉ ＡＣＳ−０６５−Ｖ−Ｃｏｌ１３（ＨＭＰＲＥＦ９２９０＿０９６２）、Ｐｅｐｔｏｎｉｐｈｉｌｕｓ ｓｐ．ｏｒａｌ ｔａｘｏｎ ３７５ ｓｔｒ．Ｆ０４３６（ＨＭＰＲＥＦ９１３０＿１６１９）、Ｖｅｉｌｌｏｎｅｌｌａ ｓｐ．ｏｒａｌ ｔａｘｏｎ １５８ ｓｔｒ．Ｆ０４１２（ＨＭＰＲＥＦ９１９９＿０１８９）、Ｓｅｌｅｎｏｍｏｎａｓ ｓｐ．ｏｒａｌ ｔａｘｏｎ １３７ ｓｔｒ．Ｆ０４３０（ＨＭＰＲＥＦ９１６２＿２４５８）、Ｃｙｃｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍａｒｉｎｕｍ ＤＳＭ ７４５（ＣＹＣＭＡ＿２５２５）、Ｄｅｓｕｌｆｏｂａｃｃａ ａｃｅｔｏｘｉｄａｎｓ ＤＳＭ １１１０９（ＤＥＳＡＣ＿１４７５）、Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｉｖａｎｏｖｉｉ ｓｕｂｓｐ．ｉｖａｎｏｖｉｉ ＰＡＭ ５５（ＬＩＶ＿２１１１）、Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ ｖｕｌｇａｒｉｓ ｓｔｒ．Ｈｉｌｄｅｎｂｏｒｏｕｇｈ（ＤＶＵ＿１２８０）、Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ ｖｕｌｇａｒｉｓ ｓｔｒ．’Ｍｉｙａｚａｋｉ Ｆ’（ＤＶＭＦ＿００５７）、Ｍｕｒｉｃａｕｄａ ｒｕｅｓｔｒｉｎｇｅｎｓｉｓ ＤＳＭ １３２５８（ＭＵＲＲＵ＿０４７４）、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ａｒｇｅｎｔｉｎｕｍ ＫＣＴＣ ３７７３（ＬＡＲＧＫ３＿０１０１００００８３０６）、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｏｌｙｍｙｘａ ＳＣ２（ＰＰＳＣ２＿Ｃ４７２８）、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓａｂｕｒｒｅｕｍ ＤＳＭ ３９８６（ＨＭＰＲＥＦ０３８１＿２５１８）、Ｐｓｅｕｄｏｒａｍｉｂａｃｔｅｒ ａｌａｃｔｏｌｙｔｉｃｕｓ ＡＴＣＣ ２３２６３（ＨＭＰ０７２１＿０３１３）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐａｒａｓａｎｇｕｉｎｉｓ ＡＴＣＣ ９０３（ＨＭＰＲＥＦ８５７７＿０２３３）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓａｎｇｕｉｎｉｓ ＡＴＣＣ ４９２９６（ＨＭＰＲＥＦ８５７８＿１８２０）、Ｃａｐｎｏｃｙｔｏｐｈａｇａ ｓｐ．ｏｒａｌ ｔａｘｏｎ ３３８ ｓｔｒ．Ｆ０２３４（ＨＭＰＲＥＦ９０７１＿１３２５）、Ｃｅｎｔｉｐｅｄａ ｐｅｒｉｏｄｏｎｔｉｉ ＤＳＭ ２７７８（ＨＭＰＲＥＦ９０８１＿２３３２）、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｍｕｌｔｉｆｏｒｍｉｓ ＤＳＭ １６６０８（ＨＭＰＲＥＦ９１４１＿０３４６）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｅｒｏｒｉｓ ＡＴＣＣ ７００７８０（ＨＭＰＲＥＦ９１８０＿０４３４）、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｓａｌｉｖａｅ ＤＳＭ １５６０６（ＨＭＰＲＥＦ９４２０＿１４０２）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｓｔｒａｌｉｓ ＡＴＣＣ ７００６４１ ２ ｓｅｑｓ ＨＭＰＲＥＦ９９６１＿０９０６、ＨＭＰＲＥＦ９４２１＿１７２０）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｃｒｉｓｔａｔｕｓ ＡＴＣＣ ５１１００ ２ ｓｅｑｓ ＨＭＰＲＥＦ９４２２＿０７７６、ＨＭＰＲＥＦ９９６０＿０５３１）、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ ３０ＳＣ（ＬＡＣ３０ＳＣ＿０３５８５）、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｉｍｏｓｕｍ ＫＩＳＴ６１２（ＥＬＩ＿０７２６）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｄｏｗｎｅｉ Ｆ０４１５（ＨＭＰＲＥＦ９１７６＿１２０４）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．ｏｒａｌ ｔａｘｏｎ ０５６ ｓｔｒ．Ｆ０４１８（ＨＭＰＲＥＦ９１８２＿０３３０）、Ｏｒｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．ｏｒａｌ ｔａｘｏｎ １０８ ｓｔｒ．Ｆ０４２５（ＨＭＰＲＥＦ９１２４＿１２８９）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｖｅｓｔｉｂｕｌａｒｉｓ Ｆ０３９６（ＨＭＰＲＥＦ９１９２＿１５２１）、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｂｒｅｎｎａｂｏｒｅｎｓｅ ＤＳＭ １２１６８（ＴＲＥＢＲ＿１１６５）、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｆａｌｌａｘ ＫＣＴＣ ３５３７（ＬＦＡＬＫ３＿０１０１００００８６８９）、Ｅｒｅｍｏｃｏｃｃｕｓ ｃｏｌｅｏｃｏｌａ ＡＣＳ−１３９−Ｖ−Ｃｏｌ８（ＨＭＰＲＥＦ９２５７＿０２３３）、Ｐｅｐｔｏｎｉｐｈｉｌｕｓ ｈａｒｅｉ ＡＣＳ−１４６−Ｖ−Ｓｃｈ２ｂ（ＨＭＰＲＥＦ９２８６＿００４２）、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｐ．ＨＧＦ２（ＨＭＰＲＥＦ９４０６＿３６９２）、Ａｌｉｓｔｉｐｅｓ ｓｐ．ＨＧＢ５（ＨＭＰＲＥＦ９７２０＿２７８５）、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｄｅｎｔａｌｉｓ ＤＳＭ ３６８８（ＰＲＥＤＥ＿０１３２）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｓｅｕｄｏｐｏｒｃｉｎｕｓ ＳＰＩＮ ２００２６（ＨＭＰＲＥＦ９３２０＿０６４３）、Ｄｉａｌｉｓｔｅｒ ｍｉｃｒｏａｅｒｏｐｈｉｌｕｓ ＵＰＩＩ ３４５−Ｅ（ＨＭＰＲＥＦ９２２０＿００１８）、Ｗｅｉｓｓｅｌｌａ ｃｉｂａｒｉａ ＫＡＣＣ １１８６２（ＷＣＩＢＫ１＿０１０１００００１１７４）、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏｒｙｎｉｆｏｒｍｉｓ ｓｕｂｓｐ．ｃｏｒｙｎｉｆｏｒｍｉｓ ＫＣＴＣ ３１６７（ＬＣＯＲＣＫ３＿０１０１００００１９８２）、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．ＰＣＣ ７３３５（Ｓ７３３５＿３８６４）、Ｏｗｅｎｗｅｅｋｓｉａ ｈｏｎｇｋｏｎｇｅｎｓｉｓ ＤＳＭ １７３６８（ＯＷＥＨＯ＿３３４４）、Ａｎａｅｒｏｌｉｎｅａ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ ＵＮＩ−１（ＡＮＴ＿０９４７０）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｏｒａｌｉｓ Ｕｏ５（ＳＯＲ＿０６１９）、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｇｅｌｉｄｕｍ ＫＣＴＣ ３５２７（ＬＧＥＬＫ３＿０１０１００００６７４６）、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ ＢＫＴ０１５９２５（ＣＢＣ４＿０２７５）、Ｐｒｏｃｈｌｏｒｏｃｏｃｃｕｓ ｍａｒｉｎｕｓ ｓｔｒ．ＭＩＴ ９２１１（Ｐ９２１１＿１０９５１）、Ｐｒｏｃｈｌｏｒｏｃｏｃｃｕｓ ｍａｒｉｎｕｓ ｓｔｒ．ＭＩＴ ９２１５（Ｐ９２１５＿１２２７１）、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ ｓｕｂｓｐ．ａｕｒｅｕｓ ＮＣＴＣ ８３２５（ＳＡＯＵＨＳＣ＿０２４０７）、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ ｓｕｂｓｐ．ａｕｒｅｕｓ ＣＯＬ（ＳＡＣＯＬ２１５３）、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｎｉｍａｌｉｓ ＫＣＴＣ ３５０１（ＬＡＮＩＫ３＿０１０１０００００２９０）、Ｆｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｒｕｃｔｏｓｕｓ ＫＣＴＣ ３５４４（ＦＦＲＵＫ３＿０１０１００００６７５０）、Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｗｏｏｄｉｉ ＤＳＭ １０３０（ＡＷＯ＿Ｃ２８２００）、Ｐｌａｎｏｃｏｃｃｕｓ ｄｏｎｇｈａｅｎｓｉｓ ＭＰＡ１Ｕ２（ＧＰＤＭ＿１２１７７）、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆａｒｃｉｍｉｎｉｓ ＫＣＴＣ ３６８１（ＬＦＡＲＫ３＿０１０１００００９９１５）、Ｍｅｌｉｓｓｏｃｏｃｃｕｓ ｐｌｕｔｏｎｉｕｓ ＡＴＣＣ ３５３１１（ＭＰＴＰ＿０８３５）、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｒｕｃｔｉｖｏｒａｎｓ ＫＣＴＣ ３５４３（ＬＦＲＵＫ３＿０１０１００００２６５７）、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．ＨＧＦ７（ＨＭＰＲＥＦ９４１３＿５５６３）、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｏｒｉｓ Ｆ０４２３（ＨＭＰＲＥＦ９１０２＿１０８１）、Ｖｅｉｌｌｏｎｅｌｌａ ｓｐ．ｏｒａｌ ｔａｘｏｎ ７８０ ｓｔｒ．Ｆ０４２２（ＨＭＰＲＥＦ９２００＿１１１２）、Ｐａｒｖｉｍｏｎａｓ ｓｐ．ｏｒａｌ ｔａｘｏｎ ３９３ ｓｔｒ．Ｆ０４４０（ＨＭＰＲＥＦ９１２７＿１１７１）、Ｔｅｔｒａｇｅｎｏｃｏｃｃｕｓ ｈａｌｏｐｈｉｌｕｓ ＮＢＲＣ １２１７２（ＴＥＨ＿１３１００）、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ Ｃｈｌｏｒａｃｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｍ Ｂ（ＣＡＢＴＨＥＲ＿Ａ１２７７）、Ｏｒｎｉｔｈｉｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｃａｐｈａｒｃａｅ ＴＷ２５（ＯＴＷ２５＿０１０１０００２０３９３）、Ｌａｃｉｎｕｔｒｉｘ ｓｐ．５Ｈ−３−７−４（ＬＡＣＡＬ＿０３３７）、Ｋｒｏｋｉｎｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．４Ｈ−３−７−５（ＫＲＯＤＩ＿０１７７）、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｐｓｅｕｄｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｓ ＥＤ９９（ＳＰＳＥ＿０６５９）、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ ｓｕｂｓｐ．ａｕｒｅｕｓ ＭＳＨＲ１１３２（ＣＣＥ５９８２４．１）、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｅｒｒａｅ ＨＰＬ−００３（ＨＰＬ００３＿０３６６０）、Ｃａｌｄａｌｋａｌｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｅｒｍａｒｕｍ ＴＡ２．Ａ１（ＣＡＴＨＴＡ２＿０８８２）、Ｄｅｓｍｏｓｐｏｒａ ｓｐ．８４３７（ＨＭＰＲＥＦ９３７４＿２８９７）、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｎｉｇｒｅｓｃｅｎｓ ＡＴＣＣ ３３５６３（ＨＭＰＲＥＦ９４１９＿１４１５）、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｐａｌｌｅｎｓ ＡＴＣＣ ７００８２１（ＨＭＰＲＥＦ９１４４＿０１７５）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｉｎｆａｎｔｉｓ Ｘ（ＨＭＰＲＥＦ１１２４。
一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、腫瘍微小環境において、ｃ−ジ−ＡＭＰのレベルを増加させることができる。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、腫瘍の細胞内空間において、ｃ−ジＡＭＰのレベルを増加させることができる。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、真核細胞の内部において、ｃ−ジＡＭＰのレベルを増加させることができる。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、免疫細胞の内部において、ｃ−ジＡＭＰのレベルを増加させることができる。一部の実施形態では、細胞は、食細胞である。一部の実施形態では、細胞は、マクロファージである。一部の実施形態では、細胞は、樹状細胞である。一部の実施形態では、細胞は、好中球である。一部の実施形態では、細胞は、ＭＤＳＣである。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、がん細胞の内部において、ｃ−ＧＡＭＰ（２’３’ または３’３’）および／またはサイクリック−ジ−ＧＭＰのレベルを増加させることができる。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、細菌細胞および／または成長培地において、ｉｎ ｖｉｔｒｏでｃ−ジ−ＡＭＰのレベルを増加させることができる。
これらの実施形態のいずれにおいても、サイクリック−ジＡＭＰを産生するように遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より少なくとも約０％〜２％〜４％、４％〜６％、６％〜８％、８％〜１０％、１０％〜１２％、１２％〜１４％、１４％〜１６％、１６％〜１８％、１８％〜２０％、２０％〜２５％、２５％〜３０％、３０％〜３５％、３５％〜４０％、４０％〜４５％、４５％〜５０％、５０％〜５５％、５５％〜６０％、６０％〜６５％、６５％〜７０％〜８０％、８０％〜９０％、または９０％〜１００％多いサイクリックジＡＭＰを産生する。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より少なくとも約０〜１．０倍、１．０〜１．２倍、１．２〜１．４倍、１．４〜１．６倍、１．６〜１．８倍、１．８〜２倍、または２倍多いサイクリックジＡＭＰを産生する。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より約２〜３倍、３〜４倍、４〜５倍、５〜６倍、６〜７倍、７〜８倍、８〜９倍、９〜１０倍、１０〜１５倍、１５〜２０倍、２０〜３０倍、３０〜４０倍、または４０〜５０倍、５０〜１００倍、１００〜５００倍、または５００〜１０００倍またはそれより多いサイクリックジＡＭＰを産生する。
これらの実施形態のいずれにおいても、サイクリックジＡＭＰを産生するように遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より、少なくとも約０％〜２％〜４％、４％〜６％、６％〜８％、８％〜１０％、１０％〜１２％、１２％〜１４％、１４％〜１６％、１６％〜１８％、１８％〜２０％、２０％〜２５％、２５％〜３０％、３０％〜３５％、３５％〜４０％、４０％〜４５％、４５％〜５０％、５０％〜５５％、５５％〜６０％、６０％〜６５％、６５％〜７０％〜８０％、８０％〜９０％、または９０％〜１００％多いＡＴＰを消費する。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より少なくとも約０〜１．０倍、１．０〜１．２倍、１．２〜１．４倍、１．４〜１．６倍、１．６〜１．８倍、１．８〜２倍、または２倍多いＡＴＰを消費する。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より約２〜３倍、３〜４倍、４〜５倍、５〜６倍、６〜７倍、７〜８倍、８〜９倍、９〜１０倍、１０〜１５倍、１５〜２０倍、２０〜３０倍、３０〜４０倍、４０〜５０倍、５０〜１００倍、１００〜５００倍、または５００〜１０００倍またはそれより多いサイクリック−ジ−ＡＭＰを産生する。
これらの実施形態のいずれにおいても、サイクリック−ジＧＡＭＰを産生するように遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より少なくとも約０％〜２％〜４％、４％〜６％、６％〜８％、８％〜１０％、１０％〜１２％、１２％〜１４％、１４％〜１６％、１６％〜１８％、１８％〜２０％、２０％〜２５％、２５％〜３０％、３０％〜３５％、３５％〜４０％、４０％〜４５％、４５％〜５０％、５０％〜５５％、５５％〜６０％、６０％〜６５％、６５％〜７０％〜８０％、８０％〜９０％、または９０％〜１００％多いアルギニンを産生する。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より少なくとも約０〜１．０倍、１．０〜１．２倍、１．２〜１．４倍、１．４〜１．６倍、１．６〜１．８倍、１．８〜２倍、または２倍多いサイクリックジＧＡＭＰを産生する。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より約２〜３倍、３〜４倍、４〜５倍、５〜６倍、６〜７倍、７〜８倍、８〜９倍、９〜１０倍、１０〜１５倍、１５〜２０倍、２０〜３０倍、３０〜４０倍、または４０〜５０倍、５０〜１００倍、１００〜５００倍、または５００〜１０００倍またはそれより多いサイクリック−ジＧＡＭＰを産生する。
これらの実施形態のいずれにおいても、サイクリック−ジＧＡＭＰを産生するように遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より、少なくとも約０％〜２％〜４％、４％〜６％、６％〜８％、８％〜１０％、１０％〜１２％、１２％〜１４％、１４％〜１６％、１６％〜１８％、１８％〜２０％、２０％〜２５％、２５％〜３０％、３０％〜３５％、３５％〜４０％、４０％〜４５％、４５％〜５０％、５０％〜５５％、５５％〜６０％、６０％〜６５％、６５％〜７０％〜８０％、８０％〜９０％、または９０％〜１００％多いＡＴＰを消費する。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より少なくとも約０〜１．０倍、１．０〜１．２倍、１．２〜１．４倍、１．４〜１．６倍、１．６〜１．８倍、１．８〜２倍、または２倍多いＡＴＰおよび／またはＧＴＰを消費する。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より少なくとも約２〜３倍、３〜４倍、４〜５倍、５〜６倍、６〜７倍、７〜８倍、８〜９倍、９〜１０倍、１０〜１５倍、１５〜２０倍、２０〜３０倍、３０〜４０倍、または４０〜５０倍、５０〜１００倍、１００〜５００倍、または５００〜１０００倍またはそれよりＡＴＰおよび／またはＧＴＰを消費する。
これらの実施形態のいずれにおいても、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌と比較して、ＳＴＩＮＧアゴニスト産生速度を少なくとも約０％〜２％〜４％、４％〜６％、６％〜８％、８％〜１０％、１０％〜１２％、１２％〜１４％、１４％〜１６％、１６％〜１８％、１８％〜２０％、２０％〜２５％、２５％〜３０％、３０％〜３５％、３５％〜４０％、４０％〜４５％、４５％〜５０％、５０％〜５５％、５５％〜６０％、６０％〜６５％、６５％〜７０％〜８０％、８０％〜９０％、または９０％〜１００％上昇させる。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌と比較して、ＳＴＩＮＧアゴニスト産生速度を少なくとも約０〜１．０倍、１．０〜１．２倍、１．２〜１．４倍、１．４〜１．６倍、１．６〜１．８倍、１．８〜２倍、または２倍大きく上昇させる。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌と比較して、ＳＴＩＮＧアゴニスト産生速度を約３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、４０倍、または５０倍、１００倍、５００倍、または１０００倍上昇させる。
一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、４時間後、同じ細菌亜型の未改変細菌と比較して、ＳＴＩＮＧアゴニスト産生を少なくとも約８０％〜１００％増加させる。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、４時間後、同じ細菌亜型の未改変細菌と比較して、ＳＴＩＮＧアゴニスト産生を少なくとも約９０％〜１００％増加させる。１つの特定の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、４時間後、同じ細菌亜型の未改変細菌と比較して、ＳＴＩＮＧアゴニスト産生を約９５％〜１００％増加させる。１つの特定の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、４時間後、同じ細菌亜型の未改変細菌と比較して、ＳＴＩＮＧアゴニスト産生を少なくとも約９９％〜１００％増加させる。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、４時間後、ＳＴＩＮＧアゴニスト産生を少なくとも約１０〜５０倍増加させる。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、４時間後、ＳＴＩＮＧアゴニスト産生を少なくとも約５０〜１００倍増加させる。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、４時間後、ＳＴＩＮＧアゴニスト産生を少なくとも約１００〜５００倍増加させる。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、４時間後、ＳＴＩＮＧアゴニスト産生を少なくとも約５００〜１０００倍増加させる。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、４時間後、ＳＴＩＮＧアゴニスト産生を少なくとも約１０００〜５０００倍増加させる。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、４時間後、ＳＴＩＮＧアゴニスト産生を少なくとも約５０００〜１００００倍増加させる。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、４時間後、ＳＴＩＮＧアゴニスト産生を少なくとも約１００００〜１０００倍増加させる。
これらのＳＴＩＮＧアゴニスト産生実施形態のいずれにおいても、遺伝子操作された細菌は、腫瘍細胞増殖を（細胞培養中にｉｎ ｖｉｔｒｏで、および／またはｉｎ ｖｉｖｏで）、同じ条件下で、同じ亜型の未改変細菌と比較して、少なくとも約０〜１０％、１０％〜２０％、２０％〜２５％、２５％〜３０％、３０％〜４０％、４０％〜５０％、５０％〜６０％、６０％〜７０％、７０％〜７５％、７５％〜８０％、８０％〜８５％、８５％〜９０％、９０％〜９５％、９５％〜９９％、またはそれより大きく低減することができる。これらのＳＴＩＮＧアゴニスト産生実施形態のいずれにおいても、遺伝子操作された細菌は、腫瘍成長を（細胞培養中にｉｎ ｖｉｔｒｏで、および／またはｉｎ ｖｉｖｏで）、同じ条件下で、同じ亜型の未改変細菌と比較して、少なくとも約０〜１０％、１０％〜２０％、２０％〜２５％、２５％〜３０％、３０％〜４０％、４０％〜５０％、５０％〜６０％、６０％〜７０％、７０％〜７５％、７５％〜８０％、８０％〜８５％、８５％〜９０％、９０％〜９５％、９５％〜９９％、またはそれより大きく低減することができる。これらのＳＴＩＮＧアゴニスト産生実施形態のいずれにおいても、遺伝子操作された細菌は、腫瘍サイズを（細胞培養中にｉｎ ｖｉｔｒｏで、および／またはｉｎ ｖｉｖｏで）、同じ条件下で、同じ亜型の未改変細菌と比較して、少なくとも約０〜１０％、１０％〜２０％、２０％〜２５％、２５％〜３０％、３０％〜４０％、４０％〜５０％、５０％〜６０％、６０％〜７０％、７０％〜７５％、７５％〜８０％、８０％〜８５％、８５％〜９０％、９０％〜９５％、９５％〜９９％、またはそれより大きく低減することができる。これらのアゴニストＳＴＩＮＧアゴニスト産生実施形態のいずれにおいても、遺伝子操作された細菌は、腫瘍体積を（細胞培養中にｉｎ ｖｉｔｒｏで、および／またはｉｎ ｖｉｖｏで）、同じ条件下で、同じ亜型の未改変細菌と比較して、少なくとも約０〜１０％、１０％〜２０％、２０％〜２５％、２５％〜３０％、３０％〜４０％、４０％〜５０％、５０％〜６０％、６０％〜７０％、７０％〜７５％、７５％〜８０％、８０％〜８５％、８５％〜９０％、９０％〜９５％、９５％〜９９％、またはそれより大きく低減することができる。これらのＳＴＩＮＧアゴニスト産生実施形態のいずれにおいても、遺伝子操作された細菌は、腫瘍重量を（細胞培養中にｉｎ ｖｉｔｒｏで、および／またはｉｎ ｖｉｖｏで）、同じ条件下で、同じ亜型の未改変細菌と比較して、少なくとも約０〜１０％、１０％〜２０％、２０％〜２５％、２５％〜３０％、３０％〜４０％、４０％〜５０％、５０％〜６０％、６０％〜７０％、７０％〜７５％、７５％〜８０％、８０％〜８５％、８５％〜９０％、９０％〜９５％、９５％〜９９％、またはそれより大きく低減することができる。
一部の実施形態では、ｄａｃＡ（および／またはＳＴＩＮＧアゴニスト例えば、ｃＧＡＳの産生のための別の酵素）をコードする遺伝子配列を含む、遺伝子操作された細菌は、例えば細胞培養下の、マクロファージおよび／または樹状細胞中のＩＦＮ−β１ ｍＲＮＡまたはタンパク質レベルを上昇させることができる。一部の実施形態では、ＩＦＮ−β１ ｍＲＮＡまたはタンパク質は、投与される細菌の用量に依存して増加する。一部の実施形態では、ｄａｃＡ（および／またはＳＴＩＮＧアゴニスト、例えば、ｃＧＡＳの産生のための別の酵素）をコードする遺伝子配列を含む、遺伝子操作された細菌は、例えば腫瘍内の、マクロファージおよび／または樹状細胞中のＩＦＮ−β１ ｍＲＮＡまたはタンパク質レベルを上昇させることができる。一部の実施形態では、ＩＦＮ−ベータ１ ｍＲＮＡまたはタンパク質増加は、投与される細菌の投薬量に依存する。
一実施形態では、腫瘍内でのＩＦＮ−ベータ１ ｍＲＮＡまたはタンパク質産生は、同じ条件下、同じ亜型の未改変細菌の投与時に、例えば、細菌の初回注射後２日目に、観察されるＩＦＮ−ベータ１産生レベルと比較して、約２倍、約３倍、約４倍である。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、例えば刺激後４時間の時点で、骨髄由来樹状細胞において少なくとも約６，０００〜２５，０００、１５，０００〜２５，０００、６，０００〜８，０００、２０，０００〜２５，０００ｐｇ／ｍｌのＩＦＮ ｂ１ ｍＲＮＡの産生を誘導する。
一部の実施形態では、ｄａｃＡ（またはＳＴＩＮＧアゴニストの産生のための別の酵素）をコードする遺伝子配列を含む、遺伝子操作された細菌は、例えば刺激後２または４時間の時点で、骨髄由来樹状細胞におけるＩＦＮ−ｂ１産生を用量依存的に増加させることができる。
一部の実施形態では、ｄａｃＡ（またはＳＴＩＮＧアゴニストの産生のための別の酵素）をコードする遺伝子配列を含む、遺伝子操作された細菌は、例えば、細菌処置３回のレジメン後４または９日の時点で、同じ条件下で、同じ亜型の未改変細菌と比較して腫瘍体積を低減させることができる。非限定的な例では、腫瘍体積は、９日後、約０〜３０ｍｍ３である。
一部の実施形態では、２７日間またはそれより長い間、１、４、および１２日目に、または１週間に３回の腫瘍体積。一部の実施形態では、完全な腫瘍拒絶が観察される。
マウスのモデルにおける腫瘍体積を使用して、株の活性を特徴付けることができる。例えば、腫瘍体積は、Ａ２０ Ｂ細胞リンパ腫モデルまたは本明細書に記載されるかもしくは当該技術分野で公知の他のモデルなどの腫瘍モデルにおいて、２７日間またはそれより長い間、１、４、および１２日目、または１週間に３回、測定され得る。異なる用量を投与して、用量依存的応答を確立して示し、有効性および忍容性を確立することができる。腫瘍体積を、ＳＴＩＮＧアゴニスト株を投与した動物と、同じ条件下で、同じ亜型のＳＴＩＮＧ回路網を有さない株を投与した動物との間で比較してもよい。一部の実施形態では、腫瘍体積は、２７日間またはそれよりも長い間、１、４、および１２日目、または１週間に３回、測定され得る。一実施形態では、腫瘍体積は、ＳＴＩＮＧ産生株では、例えば、Ａ２０モデルにおいてアセスメントした場合、同じ条件下で、同じ亜型の未改変株と比較して、少なくとも約１〜２倍、２〜３倍、３〜４倍、４〜５倍、５〜６倍、６〜７倍、または７〜８倍低減される。一実施形態では、腫瘍体積は、５、８、または１２日目に、Ａ２０マウスモデルにおいて、同じ条件下で、ＳＴＩＮＧ産生株と、同じ亜型の未改変株との間で比較することができる。一実施形態では、腫瘍体積は、ＳＴＩＮＧ産生株を１０＾８ ＣＦＵで投与した場合、１２日後に、同じ条件下で、同じ亜型の未改変株と比較して、１２日目に、少なくとも約６倍低減される。一実施形態では、腫瘍体積は、ＳＴＩＮＧ産生株を１０＾７ ＣＦＵで投与した場合、１２日後に、同じ条件下で、同じ亜型の未改変株と比較して、１２日目に、少なくとも約２倍〜３倍低減される。一実施形態では、腫瘍体積は、ＳＴＩＮＧ産生株を１０＾７ ＣＦＵで投与した場合、１２日後に、同じ条件下で、同じ亜型の未改変株と比較して、１２日目に、少なくとも約３倍〜４倍低減される。
ＳＴＩＮＧアゴニスト産生株の株の活性は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで、ｃ−ジ−ＡＭＰ産生（細胞においてまたは培地において）の測定を行うことによって、定義することができる。ｃ−ジ−ＡＭＰ産生は、１、２、３、４、５、６時間、またはそれより長い期間にわたって、測定することができる。一例では、ｃ−ジ−ＡＭＰのレベルは、０、２、または４時間目に測定することができる。未改変Ｎｉｓｓｌｅは、そのような測定のベースラインとして使用することができる。ＳＴＩＮＧアゴニスト産生酵素が、化学インデューサーによって誘導されるプロモーターの制御下にある場合、インデューサーを添加する必要がある。ＳＴＩＮＧアゴニスト産生酵素が、外因性環境条件、例えば低酸素条件によって誘導されるプロモーターの制御下にある場合、細菌細胞は、これらの条件、例えば、低酸素条件下で、誘導される。追加のベースライン測定として、誘導可能であるＳＴＩＮＧアゴニスト産生株を、誘導しないまま残してもよい。インキュベーション時間の後に、ｃ−ジＡＭＰのレベルを、本明細書に記載されるように、ＬＣ−ＭＳによって測定してもよい。一部の実施形態では、誘導されたＳＴＩＮＧアゴニスト産生株は、１０＾９当たり少なくとも約０．０１ｍＭ〜１．４ｍＭの濃度で、ｃ−ジ−ＡＭＰを産生することができる。一部の実施形態では、誘導されたＳＴＩＮＧアゴニスト産生株は、例えば、２または４時間後に、１０＾９当たり、少なくとも約０．０１ｍＭ〜０．０２ｍＭ、０．０２ｍＭ〜０．０３ｍＭ、０．０３ｍＭ〜０．０４ｍＭ、０．０４ｍＭ〜０．０５ｍＭ、０．０５ｍＭ〜０．０６ｍＭ、０．０６ｍＭ〜０．０７ｍＭ、０．０７ｍＭ〜０．０８ｍＭ、０．０８ｍＭ〜０．０９ｍＭ、０．０９ｍＭ〜０．１０ｍＭ、０．１０ｍＭ〜０．１２ｍＭの濃度で、ｃ−ジ−ＡＭＰを産生することができる。一部の実施形態では、誘導されたＳＴＩＮＧアゴニスト産生株は、例えば、２または４時間後に、１０＾９当たり、少なくとも約０．１ｍＭ〜０．２ｍＭ、０．２ｍＭ〜０．３ｍＭ、０．３ｍＭ〜０．４ｍＭ、０．４ｍＭ〜０．５ｍＭ、０．５ｍＭ〜０．６ｍＭ、０．６ｍＭ〜０．７ｍＭ、０．７ｍＭ〜０．８ｍＭ、０．８ｍＭ〜０．９ｍＭ、０．９ｍＭ〜１ｍＭ、１ｍＭ〜１．２ｍＭ、１．２ｍＭ〜１．３ｍＭ、１．３ｍＭ〜１．４ｍＭの濃度で、ｃ−ジ−ＡＭＰを産生することができる。
ＳＴＩＮＧアゴニスト産生株の株の活性はまた、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの活性測定を使用して測定してもよい。ｉｎ ｖｉｔｒｏでの株の活性の測定の非限定的な例では、培養物でのＲＡＷ ２６４．７細胞（または他のマクロファージもしくは樹状細胞）におけるＩＦＮ−ベータ１誘導が、測定され得る。株の活性は、様々な時点において、様々な感染多重度（ＭＯＩ）で測定することができる。例えば、活性は、１、２、３、４、５、６時間、またはそれよりも遅くに、測定することができる。一例では、活性は、４５分または４時間目に測定され得る。未改変Ｎｉｓｓｌｅは、そのような測定のベースラインとして使用することができる。ＳＴＩＮＧアゴニスト産生酵素が、化学インデューサーによって誘導されるプロモーターの制御下にある場合、インデューサーを添加する必要がある。ＳＴＩＮＧアゴニスト産生酵素が、外因性環境条件、例えば低酸素条件によって誘導されるプロモーターの制御下にある場合、細菌細胞は、これらの条件、例えば、低酸素条件下で、誘導される。追加のベースライン測定として、誘導可能であるＳＴＩＮＧアゴニスト産生株を、誘導しないまま残してもよい。インキュベーション時間の後、ＩＦＮ−ベータのレベルを、タンパク質抽出物から測定することができるか、またはＲＮＡレベルを、例えば、ＰＣＴに基づく方法によって分析することができる。一部の実施形態では、誘導されたＳＴＩＮＧアゴニスト産生株は、ＩＦＮ−ｂレベルの用量依存的誘導を惹起し得る。一部の実施形態では、１０＾１〜１０＾２（感染多重度（ＭＯＩ）により、同じ条件下で、例えば、４時間後、同じ亜型の未改変Ｎｉｓｓｌｅ ｂａｓｅｌｉｎｅ株よりも、少なくとも約２０〜２５倍、２５〜３０倍、３０〜３５倍、３５〜４０倍、またはそれよりさらに高いＩＦＮ−ベータレベルを誘導することができる。一部の実施形態では、１０＾１〜１０＾２（感染多重度（ＭＯＩ）により、例えば、４時間後、少なくとも約１０，０００〜１２，０００、１２，０００〜１５，０００、１５，０００〜２０，０００、または２０，０００〜２５，０００ｐｇ／培地ｍｌのＩＦＮ−ベータを誘導することができる。
一部の実施形態では、１０＾１〜１０＾２（感染多重度（ＭＯＩ）により、同じ条件下で、例えば、４５分後、同じ亜型の野生型Ｎｉｓｓｌｅベースライン株よりも、少なくとも約１０〜１２倍、１２〜１５倍、１５〜２０倍、２０〜２５倍、またはそれよりさらに高いＩＦＮ−ベータレベルを誘導することができる。一部の実施形態では、１０＾１〜１０＾２（感染多重度（ＭＯＩ）により、例えば、４５分後、少なくとも約４，０００〜６，０００、６，０００〜８，０００、８，０００〜１０，０００、または１０，０００〜１２，０００ｐｇ／培地ｍｌのＩＦＮ−ベータを誘導することができる。
一部の実施形態では、ＳＴＩＮＧアゴニストを産生するように遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ亜型の未改変細菌と比較して、少なくとも約０〜１０％、１０％〜２０％、２０％〜２５％、２５％〜３０％、３０％〜４０％、４０％〜５０％、５０％〜６０％、６０％〜７０％、７０％〜７５％、７５％〜８０％、８０％〜８５％、８５％〜９０％、９０％〜９５％、９５％〜９９％１０％〜２０％、２０％〜２５％、２５％〜３０％、３０％〜４０％、４０％〜５０％、５０％〜６０％、６０％〜７０％、７０％〜７５％、７５％〜８０％、８０％〜８５％、８５％〜９０％、９０％〜９５％、９５％〜９９％、９８％、またはそれより多く、奏功率を増加させることができる。一部の実施形態では、ｄａｃＡをコードする遺伝子配列を含む遺伝子操作された細菌は、１００％奏功率を達成する。
一部の実施形態では、奏功率は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌で観察されるものに比べて、少なくとも約０〜１．０倍、１．０〜１．２倍、１．２〜１．４倍、１．４〜１．６倍、１．６〜１．８倍、１．８〜２倍、または２倍である。さらに別の実施形態では、奏功率は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌で観察されるものより約２〜３倍、３〜４倍、４〜５倍、５〜６倍、６〜７倍、７〜８倍、８〜９倍、９〜１０倍、１０〜１５倍、１５〜２０倍、２０〜３０倍、３０〜４０倍、もしくは４０〜５０倍、５０〜１００倍、１００〜５００倍、もしくは５００〜１０００倍、またはそれよりも高度である。
一部の実施形態では、ジアデニル酸シクラーゼ、例えば、ＤａｃＡ、ジ−ＧＡＭＰシンターゼ、および／または他のＳＴＩＮＧアゴニスト産生ポリペプチドをコードする遺伝子配列を含む、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ亜型の未改変細菌と比較して、少なくとも約０〜１０％、１０％〜２０％、２０％〜２５％、２５％〜３０％、３０％〜４０％、４０％〜５０％、５０％〜６０％、６０％〜７０％、７０％〜７５％、７５％〜８０％、８０％〜８５％、８５％〜９０％、９０％〜９５％、９５％〜９９％１０％〜２０％、２０％〜２５％、２５％〜３０％、３０％〜４０％、４０％〜５０％、５０％〜６０％、６０％〜７０％、７０％〜７５％、７５％〜８０％、８０％〜８５％、８５％〜９０％、９０％〜９５％、９５％〜９９％、９８％、またはそれより多くの腫瘍退縮を達成する。一部の実施形態では、腫瘍退縮は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌で観察されるものに比べて、少なくとも約０〜１．０倍、１．０〜１．２倍、１．２〜１．４倍、１．４〜１．６倍、１．６〜１．８倍、１．８〜２倍、または２倍である。さらに別の実施形態では、腫瘍退縮は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌で観察されるものより約２〜３倍、３〜４倍、４〜５倍、５〜６倍、６〜７倍、７〜８倍、８〜９倍、９〜１０倍、１０〜１５倍、１５〜２０倍、２０〜３０倍、３０〜４０倍、もしくは４０〜５０倍、５０〜１００倍、１００〜５００倍、もしくは５００〜１０００倍、またはそれよりも高度である。
一部の実施形態では、ジアデニル酸シクラーゼ、例えば、ＤａｃＡ、ジ−ＧＡＭＰシンターゼ、および／または他のＳＴＩＮＧアゴニスト産生ポリペプチドをコードする遺伝子配列を含む、遺伝子操作された細菌は、腫瘍流入領域リンパ節における総Ｔ細胞数を増加させる。一部の実施形態では、腫瘍流入領域リンパ節における総Ｔ細胞数の増加は、同じ条件下で、同じ亜型の未改変細菌と比較して、少なくとも約０〜１０％、１０％〜２０％、２０％〜２５％、２５％〜３０％、３０％〜４０％、４０％〜５０％、５０％〜６０％、６０％〜７０％、７０％〜７５％、７５％〜８０％、８０％〜８５％、８５％〜９０％、９０％〜９５％、９５％〜９９％１０％〜２０％、２０％〜２５％、２５％〜３０％、３０％〜４０％、４０％〜５０％、５０％〜６０％、６０％〜７０％、７０％〜７５％、７５％〜８０％、８０％〜８５％、８５％〜９０％、９０％〜９５％、９５％〜９９％、９８％であるか、またはそれよりも大きい。一部の実施形態では、総Ｔ細胞数の増加は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌で観察されるものに比べて、少なくとも約０〜１．０倍、１．０〜１．２倍、１．２〜１．４倍、１．４〜１．６倍、１．６〜１．８倍、１．８〜２倍、または２倍である。さらに別の実施形態では、総Ｔ細胞数の増加は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌で観察されるものより約２〜３倍、３〜４倍、４〜５倍、５〜６倍、６〜７倍、７〜８倍、８〜９倍、９〜１０倍、１０〜１５倍、１５〜２０倍、２０〜３０倍、３０〜４０倍、または４０〜５０倍、５０〜１００倍、１００〜５００倍、または５００〜１０００倍大きい。
一部の実施形態では、ジアデニル酸シクラーゼ、例えば、ＤａｃＡ、ジ−ＧＡＭＰシンターゼ、および／またはＳＴＩＮＧアゴニスト産生ポリペプチドをコードする遺伝子配列を含む、遺伝子操作された細菌は、腫瘍流入領域リンパ節における活性化エフェクターＣＤ４およびＣＤ８ Ｔ細胞のパーセンテージを増加させる。
一部の実施形態では、腫瘍流入領域リンパ節における活性化エフェクターＣＤ４およびＣＤ８ Ｔ細胞のパーセンテージは、同じ条件下で、同じ亜型の未改変細菌と比較して、少なくとも約０〜１０％、１０％〜２０％、２０％〜２５％、２５％〜３０％、３０％〜４０％、４０％〜５０％、５０％〜６０％、６０％〜７０％、７０％〜７５％、７５％〜８０％、８０％〜８５％、８５％〜９０％、９０％〜９５％、９５％〜９９％１０％〜２０％、２０％〜２５％、２５％〜３０％、３０％〜４０％、４０％〜５０％、５０％〜６０％、６０％〜７０％、７０％〜７５％、７５％〜８０％、８０％〜８５％、８５％〜９０％、９０％〜９５％、９５％〜９９％、９８％であるか、またはそれよりも高い。一部の実施形態では、活性化エフェクターＣＤ４およびＣＤ８ Ｔ細胞のパーセンテージは、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌で観察されるものに比べて、少なくとも約０〜１．０倍、１．０〜１．２倍、１．２〜１．４倍、１．４〜１．６倍、１．６〜１．８倍、１．８〜２倍、または２倍である。さらに別の実施形態では、活性化エフェクターＣＤ４およびＣＤ８ Ｔ細胞のパーセンテージは、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌で観察されるものより約２〜３倍、３〜４倍、４〜５倍、５〜６倍、６〜７倍、７〜８倍、８〜９倍、９〜１０倍、１０〜１５倍、１５〜２０倍、２０〜３０倍、３０〜４０倍、または４０〜５０倍、５０〜１００倍、１００〜５００倍、または５００〜１０００倍高い。一実施形態では、細菌にコードされた遺伝子は、ＤａｃＡであり、活性化エフェクターＣＤ４およびＣＤ８ Ｔ細胞のパーセンテージは、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌で観察されるものより２〜４倍高い。
一部の実施形態では、ジアデニル酸シクラーゼ、例えば、ＤａｃＡ、ジ−ＧＡＭＰシンターゼ、および／または他のＳＴＩＮＧアゴニスト産生ポリペプチドをコードする遺伝子配列を含む、遺伝子操作された細菌は、腫瘍内の先天的サイトカインの早期上昇、およびその後のエフェクターＴ細胞応答の上昇を達成する。
一部の実施形態では、腫瘍微小環境における、ｄａｃＡ（またはＳＴＩＮＧアゴニストの産生のための他の酵素）をコードする遺伝子配列を含む、遺伝子操作された細菌は、免疫学的抑制を克服することができ、強固な自然および適応抗腫瘍免疫応答を生成することになる。一部の実施形態では、ｄａｃＡをコードする遺伝子配列を含む遺伝子操作された細菌は、調節性Ｔ細胞の増殖または蓄積を阻害する。
一部の実施形態では、ｄａｃＡ、ｃＧＡＳ、および／またはＳＴＩＮＧアゴニストの産生のための他の酵素をコードする遺伝子配列を含む、遺伝子操作された細菌は、ＩＬ−６、ＩＬ−１ベータ、およびＭＣＰ−１を含むがこれらに限定されない、腫瘍内の先天的サイトカインの早期上昇を達成する。
一部の実施形態では、ＩＬ−６は、同じ条件下で、同じ亜型の未改変細菌と比較して、少なくとも約０〜１０％、１０％〜２０％、２０％〜２５％、２５％〜３０％、３０％〜４０％、４０％〜５０％、５０％〜６０％、６０％〜７０％、７０％〜７５％、７５％〜８０％、８０％〜８５％、８５％〜９０％、９０％〜９５％、９５％〜９９％１０％〜２０％、２０％〜２５％、２５％〜３０％、３０％〜４０％、４０％〜５０％、５０％〜６０％、６０％〜７０％、７０％〜７５％、７５％〜８０％、８０％〜８５％、８５％〜９０％、９０％〜９５％、９５％〜９９％、９８％、またはそれより多く、誘導される。一部の実施形態では、ＩＬ−６は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌で観察されるものより少なくとも約０〜１．０倍、１．０〜１．２倍、１．２〜１．４倍、１．４〜１．６倍、１．６〜１．８倍、１．８〜２倍、または２倍多く誘導される。さらに別の実施形態では、ＩＬ−６は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌で観察されるものより約２〜３倍、３〜４倍、４〜５倍、５〜６倍、６〜７倍、７〜８倍、８〜９倍、９〜１０倍、１０〜１５倍、１５〜２０倍、２０〜３０倍、３０〜４０倍、もしくは４０〜５０倍、５０〜１００倍、１００〜５００倍、もしくは５００〜１０００倍、またはそれより多く、誘導される。一実施形態では、細菌にコードされた遺伝子は、ｄａｃＡであり、誘導されるＩＬ−６のレベルは、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌で観察されるものより約２〜３倍高い。
一部の実施形態では、腫瘍内ＩＬ−１ｂのレベルは、同じ条件下で、同じ亜型の未改変細菌と比較して、少なくとも約０〜１０％、１０％〜２０％、２０％〜２５％、２５％〜３０％、３０％〜４０％、４０％〜５０％、５０％〜６０％、６０％〜７０％、７０％〜７５％、７５％〜８０％、８０％〜８５％、８５％〜９０％、９０％〜９５％、９５％〜９９％１０％〜２０％、２０％〜２５％、２５％〜３０％、３０％〜４０％、４０％〜５０％、５０％〜６０％、６０％〜７０％、７０％〜７５％、７５％〜８０％、８０％〜８５％、８５％〜９０％、９０％〜９５％、９５％〜９９％、９８％、またはそれより多く、上昇する。一部の実施形態では、ＩＬ−１ｂのレベルは、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌で観察されるものより少なくとも約０〜１．０倍、１．０〜１．２倍、１．２〜１．４倍、１．４〜１．６倍、１．６〜１．８倍、１．８〜２倍、または２倍またはそれより多く上昇する。さらに別の実施形態では、ＩＬ−１ｂのレベルは、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌で観察されるものより約２〜３倍、３〜４倍、４〜５倍、５〜６倍、６〜７倍、７〜８倍、８〜９倍、９〜１０倍、１０〜１５倍、１５〜２０倍、２０〜３０倍、３０〜４０倍、もしくは４０〜５０倍、５０〜１００倍、１００〜５００倍、もしくは５００〜１０００倍、またはそれより多く、上昇する。一実施形態では、細菌にコードされた遺伝子は、ジアデニル酸シクラーゼ、例えば、ＤａｃＡ、ジ−ＧＡＭＰシンターゼ、および／または他のＳＴＩＮＧアゴニスト産生ポリペプチドであり、ＩＬ−１ベータのレベルは、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌で観察されるものより約２倍、３倍、または４倍高い。
一部の実施形態では、腫瘍内ＭＣＰ１のレベルは、同じ条件下で、同じ亜型の未改変細菌と比較して、少なくとも約０〜１０％、１０％〜２０％、２０％〜２５％、２５％〜３０％、３０％〜４０％、４０％〜５０％、５０％〜６０％、６０％〜７０％、７０％〜７５％、７５％〜８０％、８０％〜８５％、８５％〜９０％、９０％〜９５％、９５％〜９９％１０％〜２０％、２０％〜２５％、２５％〜３０％、３０％〜４０％、４０％〜５０％、５０％〜６０％、６０％〜７０％、７０％〜７５％、７５％〜８０％、８０％〜８５％、８５％〜９０％、９０％〜９５％、９５％〜９９％、９８％、またはそれより多く、上昇する。一部の実施形態では、ＭＣＰ１のレベルは、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌で観察されるものより少なくとも約０〜１．０倍、１．０〜１．２倍、１．２〜１．４倍、１．４〜１．６倍、１．６〜１．８倍、１．８〜２倍、または２倍またはそれより多く上昇する。さらに別の実施形態では、ＭＣＰ１のレベルは、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌で観察されるものより約２〜３倍、３〜４倍、４〜５倍、５〜６倍、６〜７倍、７〜８倍、８〜９倍、９〜１０倍、１０〜１５倍、１５〜２０倍、２０〜３０倍、３０〜４０倍、もしくは４０〜５０倍、５０〜１００倍、１００〜５００倍、もしくは５００〜１０００倍、またはそれより多く、上昇する。一実施形態では、細菌にコードされた遺伝子は、ジアデニル酸シクラーゼ、例えば、ＤａｃＡ、ジ−ＧＡＭＰシンターゼ、および／または他のＳＴＩＮＧアゴニスト産生ポリペプチドであり、ＭＣＰ１のレベルは、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌で観察されるものより約２倍、３倍、または４倍高い。
一部の実施形態では、ジアデニル酸シクラーゼ、例えば、ｄａｃＡ、ジ−ＧＡＭＰシンターゼ、および／または他のＳＴＩＮＧアゴニスト産生ポリペプチドをコードする遺伝子配列を含む、遺伝子操作された細菌は、グランザイムＢ、ＩＬ−２、およびＩＬ−１５を含むがこれらに限定されない、エフェクターＴ細胞応答に対して関連性のある分子の活性化を達成する。
一部の実施形態では、腫瘍内グランザイムＢのレベルは、同じ条件下で、同じ亜型の未改変細菌と比較して、少なくとも約０〜１０％、１０％〜２０％、２０％〜２５％、２５％〜３０％、３０％〜４０％、４０％〜５０％、５０％〜６０％、６０％〜７０％、７０％〜７５％、７５％〜８０％、８０％〜８５％、８５％〜９０％、９０％〜９５％、９５％〜９９％１０％〜２０％、２０％〜２５％、２５％〜３０％、３０％〜４０％、４０％〜５０％、５０％〜６０％、６０％〜７０％、７０％〜７５％、７５％〜８０％、８０％〜８５％、８５％〜９０％、９０％〜９５％、９５％〜９９％、９８％、またはそれより多く、上昇する。一部の実施形態では、グランザイムＢのレベルは、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌で観察されるものより少なくとも約０〜１．０倍、１．０〜１．２倍、１．２〜１．４倍、１．４〜１．６倍、１．６〜１．８倍、１．８〜２倍、または２倍またはそれより多く上昇する。さらに別の実施形態では、グランザイムＢのレベルは、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌で観察されるものより約２〜３倍、３〜４倍、４〜５倍、５〜６倍、６〜７倍、７〜８倍、８〜９倍、９〜１０倍、１０〜１５倍、１５〜２０倍、２０〜３０倍、３０〜４０倍、もしくは４０〜５０倍、５０〜１００倍、１００〜５００倍、もしくは５００〜１０００倍、またはそれより多く、上昇する。一実施形態では、細菌にコードされた遺伝子は、ジアデニル酸シクラーゼ、例えば、ＤａｃＡ、ジ−ＧＡＭＰシンターゼ、および／または他のＳＴＩＮＧアゴニスト産生ポリペプチドであり、グランザイムＢのレベルは、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌で観察されるものより約２倍、３倍、または４倍高い。
一部の実施形態では、腫瘍内ＩＬ−２のレベルは、同じ条件下で、同じ亜型の未改変細菌と比較して、少なくとも約０〜１０％、１０％〜２０％、２０％〜２５％、２５％〜３０％、３０％〜４０％、４０％〜５０％、５０％〜６０％、６０％〜７０％、７０％〜７５％、７５％〜８０％、８０％〜８５％、８５％〜９０％、９０％〜９５％、９５％〜９９％１０％〜２０％、２０％〜２５％、２５％〜３０％、３０％〜４０％、４０％〜５０％、５０％〜６０％、６０％〜７０％、７０％〜７５％、７５％〜８０％、８０％〜８５％、８５％〜９０％、９０％〜９５％、９５％〜９９％、９８％、またはそれより多く、上昇する。一部の実施形態では、ＩＬ−２のレベルは、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌で観察されるものより少なくとも約０〜１．０倍、１．０〜１．２倍、１．２〜１．４倍、１．４〜１．６倍、１．６〜１．８倍、１．８〜２倍、または２倍またはそれより多く上昇する。さらに別の実施形態では、ＩＬ−２のレベルは、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌で観察されるものより約２〜３倍、３〜４倍、４〜５倍、５〜６倍、６〜７倍、７〜８倍、８〜９倍、９〜１０倍、１０〜１５倍、１５〜２０倍、２０〜３０倍、３０〜４０倍、もしくは４０〜５０倍、５０〜１００倍、１００〜５００倍、もしくは５００〜１０００倍、またはそれより多く、上昇する。一実施形態では、細菌にコードされた遺伝子は、ＤａｃＡであり、ＩＬ−２のレベルは、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌で観察されるものより約３倍、４倍、または５倍高い。
一部の実施形態では、腫瘍内ＩＬ−１５のレベルは、同じ条件下で、同じ亜型の未改変細菌と比較して、少なくとも約０〜１０％、１０％〜２０％、２０％〜２５％、２５％〜３０％、３０％〜４０％、４０％〜５０％、５０％〜６０％、６０％〜７０％、７０％〜７５％、７５％〜８０％、８０％〜８５％、８５％〜９０％、９０％〜９５％、９５％〜９９％１０％〜２０％、２０％〜２５％、２５％〜３０％、３０％〜４０％、４０％〜５０％、５０％〜６０％、６０％〜７０％、７０％〜７５％、７５％〜８０％、８０％〜８５％、８５％〜９０％、９０％〜９５％、９５％〜９９％、９８％、またはそれより多く、上昇する。一部の実施形態では、ＩＬ−１５のレベルは、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌で観察されるものより少なくとも約０〜１．０倍、１．０〜１．２倍、１．２〜１．４倍、１．４〜１．６倍、１．６〜１．８倍、１．８〜２倍、または２倍またはそれより多く上昇する。さらに別の実施形態では、ＩＬ−１５のレベルは、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌で観察されるものより約２〜３倍、３〜４倍、４〜５倍、５〜６倍、６〜７倍、７〜８倍、８〜９倍、９〜１０倍、１０〜１５倍、１５〜２０倍、２０〜３０倍、３０〜４０倍、もしくは４０〜５０倍、５０〜１００倍、１００〜５００倍、もしくは５００〜１０００倍、またはそれより多く、上昇する。一実施形態では、細菌にコードされた遺伝子は、ＤａｃＡであり、ＩＬ−１５のレベルは、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌で観察されるものより約２倍、３倍、倍、または５倍高い。
一部の実施形態では、腫瘍内ＩＦＮｇのレベルは、同じ条件下で、同じ亜型の未改変細菌と比較して、少なくとも約０〜１０％、１０％〜２０％、２０％〜２５％、２５％〜３０％、３０％〜４０％、４０％〜５０％、５０％〜６０％、６０％〜７０％、７０％〜７５％、７５％〜８０％、８０％〜８５％、８５％〜９０％、９０％〜９５％、９５％〜９９％１０％〜２０％、２０％〜２５％、２５％〜３０％、３０％〜４０％、４０％〜５０％、５０％〜６０％、６０％〜７０％、７０％〜７５％、７５％〜８０％、８０％〜８５％、８５％〜９０％、９０％〜９５％、９５％〜９９％、９８％、またはそれより多く、上昇する。一部の実施形態では、ＩＦＮｇのレベルは、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌で観察されるものより少なくとも約０〜１．０倍、１．０〜１．２倍、１．２〜１．４倍、１．４〜１．６倍、１．６〜１．８倍、１．８〜２倍、または２倍またはそれより多く上昇する。さらに別の実施形態では、ＩＦＮｇのレベルは、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌で観察されるものより約２〜３倍、３〜４倍、４〜５倍、５〜６倍、６〜７倍、７〜８倍、８〜９倍、９〜１０倍、１０〜１５倍、１５〜２０倍、２０〜３０倍、３０〜４０倍、もしくは４０〜５０倍、５０〜１００倍、１００〜５００倍、もしくは５００〜１０００倍、またはそれより多く、上昇する。一実施形態では、細菌にコードされた遺伝子は、ジアデニル酸シクラーゼ、例えば、ＤａｃＡ、ジ−ＧＡＭＰシンターゼ、および／または他のＳＴＩＮＧアゴニスト産生ポリペプチドであり、ＩＦＮｇのレベルは、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌で観察されるものより約２倍、３倍、または４倍高い。
一部の実施形態では、腫瘍内ＩＬ−１２のレベルは、同じ条件下で、同じ亜型の未改変細菌と比較して、少なくとも約０〜１０％、１０％〜２０％、２０％〜２５％、２５％〜３０％、３０％〜４０％、４０％〜５０％、５０％〜６０％、６０％〜７０％、７０％〜７５％、７５％〜８０％、８０％〜８５％、８５％〜９０％、９０％〜９５％、９５％〜９９％１０％〜２０％、２０％〜２５％、２５％〜３０％、３０％〜４０％、４０％〜５０％、５０％〜６０％、６０％〜７０％、７０％〜７５％、７５％〜８０％、８０％〜８５％、８５％〜９０％、９０％〜９５％、９５％〜９９％、９８％、またはそれより多く、上昇する。一部の実施形態では、ＩＬ−１２のレベルは、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌で観察されるものより少なくとも約０〜１．０倍、１．０〜１．２倍、１．２〜１．４倍、１．４〜１．６倍、１．６〜１．８倍、１．８〜２倍、または２倍またはそれより多く上昇する。さらに別の実施形態では、ＩＬ−１２のレベルは、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌で観察されるものより約２〜３倍、３〜４倍、４〜５倍、５〜６倍、６〜７倍、７〜８倍、８〜９倍、９〜１０倍、１０〜１５倍、１５〜２０倍、２０〜３０倍、３０〜４０倍、もしくは４０〜５０倍、５０〜１００倍、１００〜５００倍、もしくは５００〜１０００倍、またはそれより多く、上昇する。一実施形態では、細菌にコードされた遺伝子は、ジアデニル酸シクラーゼ、例えば、ＤａｃＡ、ジ−ＧＡＭＰシンターゼ、および／または他のＳＴＩＮＧアゴニスト産生ポリペプチドであり、ＩＬ−１２のレベルは、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌で観察されるものより約２倍、３倍、または４倍高い。
一部の実施形態では、腫瘍内ＴＮＦαのレベルは、同じ条件下で、同じ亜型の未改変細菌と比較して、少なくとも約０〜１０％、１０％〜２０％、２０％〜２５％、２５％〜３０％、３０％〜４０％、４０％〜５０％、５０％〜６０％、６０％〜７０％、７０％〜７５％、７５％〜８０％、８０％〜８５％、８５％〜９０％、９０％〜９５％、９５％〜９９％１０％〜２０％、２０％〜２５％、２５％〜３０％、３０％〜４０％、４０％〜５０％、５０％〜６０％、６０％〜７０％、７０％〜７５％、７５％〜８０％、８０％〜８５％、８５％〜９０％、９０％〜９５％、９５％〜９９％、９８％、またはそれより多く、上昇する。一部の実施形態では、ＴＮＦαのレベルは、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌で観察されるものより少なくとも約０〜１．０倍、１．０〜１．２倍、１．２〜１．４倍、１．４〜１．６倍、１．６〜１．８倍、１．８〜２倍、または２倍またはそれより多く上昇する。さらに別の実施形態では、ＴＮＦαのレベルは、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌で観察されるものより約２〜３倍、３〜４倍、４〜５倍、５〜６倍、６〜７倍、７〜８倍、８〜９倍、９〜１０倍、１０〜１５倍、１５〜２０倍、２０〜３０倍、３０〜４０倍、もしくは４０〜５０倍、５０〜１００倍、１００〜５００倍、もしくは５００〜１０００倍、またはそれより多く、上昇する。一実施形態では、細菌にコードされた遺伝子は、ジアデニル酸シクラーゼ、例えば、ＤａｃＡ、ジ−ＧＡＭＰシンターゼ、および／または他のＳＴＩＮＧアゴニスト産生ポリペプチドであり、ＴＮＦ−ａのレベルは、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌で観察されるものより少なくとも約２倍、３倍、または４倍高い。
一部の実施形態では、腫瘍におけるＧＭ−ＣＳＦのレベルは、同じ条件下で、同じ亜型の未改変細菌と比較して、少なくとも約０〜１０％、１０％〜２０％、２０％〜２５％、２５％〜３０％、３０％〜４０％、４０％〜５０％、５０％〜６０％、６０％〜７０％、７０％〜７５％、７５％〜８０％、８０％〜８５％、８５％〜９０％、９０％〜９５％、９５％〜９９％１０％〜２０％、２０％〜２５％、２５％〜３０％、３０％〜４０％、４０％〜５０％、５０％〜６０％、６０％〜７０％、７０％〜７５％、７５％〜８０％、８０％〜８５％、８５％〜９０％、９０％〜９５％、９５％〜９９％、９８％、またはそれより大きく上昇される。一部の実施形態では、ＧＭ−ＣＳＦのレベルは、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌で観察されるものより少なくとも約０〜１．０倍、１．０〜１．２倍、１．２〜１．４倍、１．４〜１．６倍、１．６〜１．８倍、１．８〜２倍、もしくは２倍、またはそれより大きく上昇される。さらに別の実施形態では、ＧＭ−ＣＳＦのレベルは、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌で観察されるものより約２〜３倍、３〜４倍、４〜５倍、５〜６倍、６〜７倍、７〜８倍、８〜９倍、９〜１０倍、１０〜１５倍、１５〜２０倍、２０〜３０倍、３０〜４０倍、もしくは４０〜５０倍、５０〜１００倍、１００〜５００倍、もしくは５００〜１０００倍、またはそれより大きく上昇される。一実施形態では、細菌にコードされた遺伝子は、ジアデニル酸シクラーゼ、例えば、ＤａｃＡ、ジ−ＧＡＭＰシンターゼ、および／または他のＳＴＩＮＧアゴニスト産生ポリペプチドであり、ＧＭ−ＣＳＦのレベルは、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌で観察されるものより少なくとも約２倍、３倍、または４倍高い。
一部の実施形態では、ジアデニル酸シクラーゼ、例えば、ＤａｃＡ、ジ−ＧＡＭＰシンターゼ、および／または他のＳＴＩＮＧアゴニスト産生ポリペプチドのうちの１つまたは複数をコードする遺伝子配列を含む、遺伝子操作された細菌の投与は、長期免疫学的記憶をもたらす。一部の実施形態では、ナイーブな年齢一致対照と比較して、少なくとも約０〜１０％、１０％〜２０％、２０％〜２５％、２５％〜３０％、３０％〜４０％、４０％〜５０％、５０％〜６０％、６０％〜７０％、７０％〜７５％、７５％〜８０％、８０％〜８５％、８５％〜９０％、９０％〜９５％、９５％〜９９％１０％〜２０％、２０％〜２５％、２５％〜３０％、３０％〜４０％、４０％〜５０％、５０％〜６０％、６０％〜７０％、７０％〜７５％、７５％〜８０％、８０％〜８５％、８５％〜９０％、９０％〜９５％、９５％〜９９％、９８％、またはそれよりも大きい、二次腫瘍チャレンジからの保護によって例証される、長期免疫学的記憶が、確立される。一部の実施形態では、ナイーブな年齢一致対照と比較して、少なくとも約０〜１．０倍、１．０〜１．２倍、１．２〜１．４倍、１．４〜１．６倍、１．６〜１．８倍、１．８〜２倍、もしくは２倍、またはそれよりも大きい、二次腫瘍チャレンジからの保護によって例証される、長期免疫学的記憶が、確立される。さらに別の実施形態では、ナイーブな年齢一致対照と比較して、少なくとも約２〜３倍、３〜４倍、４〜５倍、５〜６倍、６〜７倍、７〜８倍、８〜９倍、９〜１０倍、１０〜１５倍、１５〜２０倍、２０〜３０倍、３０〜４０倍、もしくは４０〜５０倍、５０〜１００倍、１００〜５００倍、もしくは５００〜１０００倍、またはそれよりも大きい、二次腫瘍チャレンジからの保護によって例証される、長期免疫学的記憶が、確立される。
一部の実施形態では、ｃ−ジＧＡＭＰシンターゼ、ジアデニル酸シクラーゼ、または他のＳＴＩＮＧアゴニスト産生ポリペプチドは、例えば、安定性を増強させるために、またはＳＴＩＮＧ作動作用を増大させるために、改変および／または突然変異される。一部の実施形態では、Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅまたはそのオルソログ（例えば、Ｖｅｒｍｉｎｅｐｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｅｉｓｅｎｉａｅ、Ｋｉｎｇｅｌｌａ ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ、および／またはＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｂａｃｉｌｌｉｆｏｒｍｉｓに由来する）に由来するｃ−ジ−ＧＡＭＰシンターゼは、またはヒトｃＧＡＳは、例えば、安定性を増強するために、またはＳＴＩＮＧ作動作用を増大させるために、改変および／または突然変異される。一部の実施形態では、Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ由来のジアデニル酸シクラーゼは、例えば、安定性を増強するために、またはＳＴＩＮＧ作動作用を増大させるために、改変および／または突然変異される。
一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌および／または他の微生物は、誘導条件下で、例えば、免疫抑制および／または腫瘍微小環境に関連する条件下で、１つまたは複数のジアデニル酸シクラーゼ、ｃ−ジ−ＧＡＭＰシンターゼおよび／または他のＳＴＩＮＧアゴニスト産生ポリペプチドを産生することができる。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌および／または他の微生物は、低酸素条件もしくはハイポキシック条件で、ある特定の分子もしくは代謝物の存在下で、がん、もしくはある特定の組織、免疫抑制、もしくは炎症に関連する分子もしくは代謝物の存在下で、または消化管、血行路、もしくは腫瘍内に存在することもあり、しないこともあり、ｉｎ ｖｉｔｒｏで、株培養、拡大増殖、産生、および／もしくは製造中に存在することもある、代謝物、例えば、アラビノース、クメート、およびサリチレートの存在下で、ジアデニル酸シクラーゼ、ｃ−ジ−ＧＡＭＰシンターゼおよび／または他のＳＴＩＮＧアゴニスト産生ポリペプチドを産生することができる。一部の実施形態では、１つまたは複数の遺伝子操作された細菌は、ジアデニル酸シクラーゼ、ｃ−ジ−ＧＡＭＰシンターゼ、および／または他のＳＴＩＮＧアゴニスト産生ポリペプチドをコードする遺伝子配列を含み、ここで、ジアデニル酸シクラーゼ、ｃ−ジ−ＧＡＭＰシンターゼ、および／または他のＳＴＩＮＧアゴニスト産生ポリペプチドは、腫瘍微小環境の外因性環境条件によって誘導可能なプロモーターに作動可能に連結されている。一部の実施形態では、腫瘍微小環境の外因性環境条件は、低酸素条件である。一部の実施形態では、１つまたは複数の遺伝子操作された細菌は、ジアデニル酸シクラーゼ、ｃ−ジ−ＧＡＭＰシンターゼ、および／または他のＳＴＩＮＧアゴニスト産生ポリペプチドをコードする遺伝子配列を含み、ここで、ジアデニル酸シクラーゼ、ｃ−ジ−ＧＡＭＰシンターゼ、および／または他のＳＴＩＮＧアゴニスト産生ポリペプチドは、本明細書に記載されるクメートまたはサリチレートによって誘導可能なプロモーターに作動可能に連結されている。一部の実施形態では、ジアデニル酸シクラーゼ、ｃ−ジ−ＧＡＭＰシンターゼ、および／または他のＳＴＩＮＧアゴニスト産生ポリペプチドをコードする遺伝子配列は、構成的プロモーターに作動可能に連結されている。一部の実施形態では、ジアデニル酸シクラーゼ、ｃ−ジ−ＧＡＭＰシンターゼ、および／または他のＳＴＩＮＧアゴニスト産生ポリペプチドをコードする遺伝子配列は、１つもしくは複数のプラスミド（例えば、高コピー数または低コピー数プラスミド）上に存在するか、または細菌および／もしくは他の微生物の染色体内の１つもしくは複数の部位に組み込まれている。
これらの実施形態のいずれにおいても、本明細書に記載されるＳＴＩＮＧアゴニスト産生株のいずれも、栄養要求性の改変を含み得る。これらの実施形態のいずれにおいても、ＳＴＩＮＧアゴニスト産生株は、ＤａｐＡの栄養要求性の改変、例えば、ＤａｐＡの欠失または突然変異を含み得る。これらの実施形態のいずれにおいても、ＳＴＩＮＧアゴニスト産生株は、ＴｈｙＡの栄養要求性の改変、例えば、ＴｈｙＡの欠失または突然変異をさらに含み得る。これらの実施形態のいずれにおいても、ＳＴＩＮＧアゴニスト産生株は、ＤａｐＡおよびＴｈｙＡ栄養要求体を含み得る。これらの実施形態のいずれにおいても、細菌は、内在性ファージの改変、例えば、内在性ファージの突然変異または欠失をさらに含み得る。非限定的な例では、細菌宿主は、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅであり、ファージの改変は、本明細書に記載のＮｉｓｓｌｅファージ３の改変を含む。一例では、ファージの改変は、１つまたは複数の遺伝子の欠失、例えば、１０ｋｂの欠失である。
１つまたは複数のジアデニル酸シクラーゼ、ｃ−ジ−ＧＡＭＰシンターゼ、または他のＳＴＩＮＧアゴニスト産生ポリペプチドをコードする遺伝子配列を含む、遺伝子操作された細菌について記載しているこれらの実施形態のいずれにおいても、遺伝子操作された細菌は、キヌレニナーゼ、例えば、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓに由来するキヌレニナーゼをコードし、（必要に応じて）ＴｒｐＥ遺伝子の改変、例えば、突然変異または欠失を有する、遺伝子配列をさらに含み得る。あるいは、１つまたは複数のジアデニル酸シクラーゼ、ｃ−ジ−ＧＡＭＰシンターゼ、または他のＳＴＩＮＧアゴニスト産生ポリペプチドをコードする遺伝子配列を含む、遺伝子操作された細菌は、キヌレニナーゼ、例えば、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓに由来するキヌレニナーゼをコードし、（必要に応じて）ＴｒｐＥ遺伝子の改変、例えば、突然変異または欠失を有する遺伝子配列を含む、遺伝子操作された細菌と組み合わせても、それとともに投与してもよい。
ある特定の実施形態では、１つまたは複数の遺伝子操作された細菌は、ジアデニル酸シクラーゼ、例えば、ＤａｃＡ、例えば、Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓに由来するものをコードする遺伝子配列を含み、ここで、ジアデニル酸シクラーゼ遺伝子は、外因性環境条件、例えば、腫瘍微小環境内の条件下で誘導可能なプロモーターに作動可能に連結されている。一実施形態では、ジアデニル酸シクラーゼ遺伝子は、低酸素条件下で誘導可能なプロモーター、例えば、ＦＮＲプロモーターに作動可能に連結されている。ある特定の実施形態では、１つまたは複数の遺伝子操作された細菌は、ジアデニル酸シクラーゼ、例えば、ｄａｃＡ、例えば、Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓに由来するものをコードする遺伝子配列を含み、ここで、ジアデニル酸シクラーゼは、本明細書に記載されるクメートまたはサリチレートによって誘導可能なプロモーターに作動可能に連結されている。ある特定の実施形態では、ジアデニル酸シクラーゼ遺伝子配列は、細菌の染色体に組み込まれている。適切な組込み部位は、本明細書に記載されている。非限定的な例では、ジアデニル酸シクラーゼ遺伝子は、ＨＡ９１０において組み込まれている。ある特定の実施形態では、ジアデニル酸シクラーゼをコードする遺伝子配列を含む細菌は、栄養要求性の改変をさらに含む。一部の実施形態では、改変、例えば、突然変異または欠失は、ｄａｐＡ遺伝子におけるものである。一部の実施形態では、改変、例えば、突然変異または欠失は、ｔｈｙＡ遺伝子におけるものである。一部の実施形態では、改変、例えば、突然変異または欠失は、ｄａｐＡおよびｔｈｙＡ遺伝子の両方におけるものである。これらの実施形態のいずれにおいても、細菌は、ファージの改変、例えば、内在性プロファージの突然変異または欠失をさらに含み得る。一例では、プロファージの改変は、１つまたは複数の遺伝子の欠失、例えば、１０ｋｂの欠失である。非限定的な例では、ジアデニル酸シクラーゼをコードする遺伝子配列を含む遺伝子操作された細菌は、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅに由来し、プロファージの改変は、本明細書に記載されるＮｉｓｓｌｅプロファージ３の欠失または突然変異を含む。
１つまたは複数のジアデニル酸シクラーゼをコードする遺伝子配列を含む遺伝子操作された細菌のある特定の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、キヌレニナーゼ、例えば、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓに由来するキヌレニナーゼをコードし、（必要に応じて）ＴｒｐＥ遺伝子の改変、例えば、突然変異または欠失を有する、遺伝子配列をさらに含み得る。あるいは、１つまたは複数のジアデニル酸シクラーゼをコードする遺伝子配列を含む、遺伝子操作された細菌は、キヌレニナーゼ、例えば、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓに由来するキヌレニナーゼをコードし、（必要に応じて）ＴｒｐＥ遺伝子の改変、例えば、突然変異または欠失を有する遺伝子配列を含む、遺伝子操作された細菌と組み合わせても、それとともに投与してもよい。
１つの特定の実施形態では、１つまたは複数の遺伝子操作された細菌は、ジアデニル酸シクラーゼ、例えば、ＤａｃＡ、例えば、Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓに由来するものをコードする遺伝子配列を含み、ここで、ジアデニル酸シクラーゼ遺伝子は、低酸素条件下で誘導可能なプロモーター、例えば、ＦＮＲプロモーターに作動可能に連結されている。ｄａｃＡ遺伝子配列は、例えば、組込み部位ＨＡ９１０において、細菌の染色体に組み込まれている。細菌は、栄養要求性の改変、例えば、ｄａｐＡもしくはｔｈｙＡ、または両方の遺伝子の突然変異または欠失をさらに含む。細菌は、内在性ファージの改変、例えば、内在性ファージの突然変異または欠失、例えば、１０ｋｂの欠失をさらに含み得る。１つの特定の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅに由来し、ファージの改変は、例えば、本明細書に記載されるように、Ｎｉｓｓｌｅファージ３の欠失または突然変異を含む。
別の特定の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、キヌレニナーゼ、例えば、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓに由来するキヌレニナーゼをコードし、（必要に応じて）ＴｒｐＥ遺伝子の改変、例えば、突然変異または欠失を有する、遺伝子配列をさらに含み得る。あるいは、遺伝子操作された細菌は、キヌレニナーゼ、例えば、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓに由来するキヌレニナーゼをコードし、（必要に応じて）ＴｒｐＥ遺伝子の改変、例えば、突然変異または欠失を有する遺伝子配列を含む、遺伝子操作された細菌と組み合わせても、それとともに投与してもよい。
ある特定の実施形態では、１つまたは複数の遺伝子操作された細菌は、ｃＧＡＭＰシンターゼ、例えば、ヒトｃＧＡＳをコードする遺伝子配列を含み、ここで、ｃＧＡＳ遺伝子は、外因性環境条件、例えば、腫瘍微小環境内の条件下で誘導可能なプロモーターに作動可能に連結されている。一実施形態では、ｃＧＡＳ遺伝子は、低酸素条件下で誘導可能なプロモーター、例えば、ＦＮＲプロモーターに作動可能に連結されている。ある特定の実施形態では、１つまたは複数の遺伝子操作された細菌は、ｃＧＡＳ、例えば、ヒトｃＧＡＳをコードする遺伝子配列を含み、ここで、ｃＧＡＳ遺伝子は、本明細書に記載されるクメートまたはサリチレートによって誘導可能なプロモーターに作動可能に連結されている。ある特定の実施形態では、ｃＧＡＳ遺伝子配列は、細菌の染色体に組み込まれている。適切な組込み部位は、本明細書に記載されており、当該技術分野で公知である。ある特定の実施形態では、ｃＧＡＳをコードする遺伝子配列を含む細菌は、栄養要求性の改変、例えば、ｄａｐＡもしくはｔｈｙＡ、または両方の遺伝子の突然変異または欠失をさらに含む。一部の実施形態では、改変、例えば、突然変異または欠失は、ｄａｐＡ遺伝子におけるものである。一部の実施形態では、改変、例えば、突然変異または欠失は、ｔｈｙＡ遺伝子におけるものである。一部の実施形態では、改変、例えば、突然変異または欠失は、ｄａｐＡおよびｔｈｙＡ遺伝子の両方におけるものである。これらの実施形態のいずれにおいても、細菌は、プロファージの改変、例えば、内在性プロファージの突然変異または欠失をさらに含み得る。一例では、プロファージの改変は、１つまたは複数の遺伝子の欠失、例えば、１０ｋｂの欠失である。非限定的な例では、ｃＧＡＳをコードする遺伝子配列を含む遺伝子操作された細菌は、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅに由来し、プロファージの改変は、本明細書に記載されるＮｉｓｓｌｅファージ３の欠失または突然変異を含む。
１つまたは複数のｃＧＡＳをコードする遺伝子配列を含む、遺伝子操作された細菌について記載しているこれらの実施形態のいずれにおいても、遺伝子操作された細菌は、キヌレニナーゼ、例えば、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓに由来するキヌレニナーゼをコードし、（必要に応じて）ＴｒｐＥ遺伝子の改変、例えば、突然変異または欠失を有する、遺伝子配列をさらに含み得る。あるいは、１つまたは複数のｃＧＡＳをコードする遺伝子配列を含む、遺伝子操作された細菌は、キヌレニナーゼ、例えば、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓに由来するキヌレニナーゼをコードし、（必要に応じて）ＴｒｐＥ遺伝子の改変、例えば、突然変異または欠失を有する遺伝子配列を含む、遺伝子操作された細菌と組み合わせても、それとともに投与してもよい。
一実施形態では、１つまたは複数の遺伝子操作された細菌は、ｃＧＡＳ、例えば、ヒトｃＧＡＳをコードする遺伝子配列を含み、ここで、ｃＧＡＳ遺伝子は、低酸素条件下で誘導可能なプロモーター、例えば、ＦＮＲプロモーターに作動可能に連結されている。ｃＧＡＳ遺伝子配列は、細菌の染色体に組み込まれている。細菌は、栄養要求性の改変、例えば、ｄａｐＡもしくはｔｈｙＡ、または両方の遺伝子の突然変異または欠失をさらに含む。細菌は、内在性ファージの改変、例えば、内在性ファージの突然変異または欠失、例えば、１０ｋｂの欠失をさらに含み得る。１つの特定の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅに由来し、ファージの改変は、例えば、本明細書に記載されるように、Ｎｉｓｓｌｅファージ３の欠失または突然変異を含む。
１つまたは複数のｃＧＡＳをコードする遺伝子配列を含む、遺伝子操作された細菌の別の特定の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、キヌレニナーゼ、例えば、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓに由来するキヌレニナーゼをコードし、（必要に応じて）ＴｒｐＥ遺伝子の改変、例えば、突然変異または欠失を有する、遺伝子配列をさらに含み得る。あるいは、１つまたは複数のｃＧＡＳをコードする遺伝子配列を含む、遺伝子操作された細菌は、キヌレニナーゼ、例えば、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓに由来するキヌレニナーゼをコードし、（必要に応じて）ＴｒｐＥ遺伝子の改変、例えば、突然変異または欠失を有する遺伝子配列を含む、遺伝子操作された細菌と組み合わせても、それとともに投与してもよい。
ある特定の実施形態では、１つまたは複数の遺伝子操作された細菌は、ジアデニル酸シクラーゼ、例えば、ＤａｃＡ、例えば、Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓに由来するもの、およびｃＧＡＭＰシンターゼ、例えば、ヒトｃＧＡＳをコードする遺伝子配列を含む。ある特定の実施形態では、ジアデニル酸シクラーゼ遺伝子および／またはｃＧＡＳ遺伝子は、外因性環境条件、例えば、腫瘍微小環境内の条件下で誘導可能なプロモーターに作動可能に連結されている。ある特定の実施形態では、ジアデニル酸シクラーゼ遺伝子および／またはｃＧＡＳ遺伝子は、クメートもしくはサリチレート、または別の化学インデューサーによって誘導可能なプロモーターに作動可能に連結されている。ある特定の実施形態では、ジアデニル酸シクラーゼ遺伝子および／またはｃＧＡＳ遺伝子は、構成的プロモーターに作動可能に連結されている。一実施形態では、ジアデニル酸シクラーゼ遺伝子および／またはｃＧＡＳ遺伝子は、低酸素条件下で誘導可能なプロモーター、例えば、ＦＮＲプロモーターに作動可能に連結されている。ある特定の実施形態では、１つまたは複数の遺伝子操作された細菌は、ジアデニル酸シクラーゼ遺伝子、例えば、ｄａｃＡ、例えば、Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓに由来するもの、およびｃＧＡＳ、例えば、ヒトｃＧＡＳをコードする遺伝子配列を含み、ここで、ジアデニル酸シクラーゼ遺伝子および／またはｃＧＡＳ遺伝子は、本明細書に記載されるクメートまたはサリチレートによって誘導可能なプロモーターに作動可能に連結されている。ある特定の実施形態では、ジアデニル酸シクラーゼおよびｃＧＡＳ遺伝子配列は、細菌の染色体に組み込まれている。適切な組込み部位は、本明細書に記載されており、当該技術分野で公知である。ある特定の実施形態では、ジアデニル酸シクラーゼおよびｃＧＡＳをコードする遺伝子配列を含む細菌は、ｄａｐＡもしくはｔｈｙＡ、または両方の遺伝子の突然変異または欠失をさらに含む。これらの実施形態のいずれにおいても、細菌は、プロファージの改変、例えば、内在性プロファージの突然変異または欠失をさらに含み得る。一例では、プロファージの改変は、１つまたは複数の遺伝子の欠失、例えば、１０ｋｂの欠失である。非限定的な例では、ジアデニル酸シクラーゼおよびｃＧＡＳをコードする遺伝子配列を含む遺伝子操作された細菌は、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅに由来し、プロファージの改変は、本明細書に記載されるＮｉｓｓｌｅファージ３の欠失または突然変異を含む。
１つまたは複数のジアデニル酸シクラーゼおよびｃＧＡＳ産生ポリペプチドをコードする遺伝子配列を含む、遺伝子操作された細菌について記載しているこれらの実施形態のいずれにおいても、遺伝子操作された細菌は、キヌレニナーゼ、例えば、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓに由来するキヌレニナーゼをコードし、（必要に応じて）ＴｒｐＥ遺伝子の改変、例えば、突然変異または欠失を有する、遺伝子配列をさらに含み得る。あるいは、１つまたは複数のジアデニル酸シクラーゼおよびｃＧＡＳポリペプチドをコードする遺伝子配列を含む、遺伝子操作された細菌は、キヌレニナーゼ、例えば、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓに由来するキヌレニナーゼをコードし、（必要に応じて）ＴｒｐＥ遺伝子の改変、例えば、突然変異または欠失を有する遺伝子配列を含む、遺伝子操作された細菌と組み合わせても、それとともに投与してもよい。
１つの特定の実施形態では、１つまたは複数の遺伝子操作された細菌は、ジアデニル酸シクラーゼ、例えば、ＤａｃＡ、例えば、Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓに由来するもの、およびｃＧＡＳ、例えば、ヒトｃＧＡＳをコードする遺伝子配列を含み、ここで、ジアデニル酸シクラーゼ遺伝子および／またはｃＧＡＳ遺伝子は、低酸素条件下で誘導可能なプロモーター、例えば、ＦＮＲプロモーターに作動可能に連結されている。ジアデニル酸シクラーゼ遺伝子およびｃＧＡＳ遺伝子配列は、細菌の染色体に組み込まれている。細菌は、栄養要求性の改変、例えば、ｄａｐＡもしくはｔｈｙＡ、または両方の遺伝子の突然変異または欠失をさらに含む。細菌は、内在性ファージの改変、例えば、内在性ファージの突然変異または欠失、例えば、１０ｋｂの欠失をさらに含み得る。１つの特定の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅに由来し、ファージの改変は、例えば、本明細書に記載されるように、Ｎｉｓｓｌｅファージ３の欠失または突然変異を含む。
１つまたは複数のジアデニル酸シクラーゼおよびｃＧＡＳポリペプチドをコードする遺伝子配列を含む、遺伝子操作された細菌の別の特定の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、キヌレニナーゼ、例えば、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓに由来するキヌレニナーゼをコードし、（必要に応じて）ＴｒｐＥ遺伝子の改変、例えば、突然変異または欠失を有する、遺伝子配列をさらに含み得る。あるいは、１つまたは複数のジアデニル酸シクラーゼおよびｃＧＡＳポリペプチドをコードする遺伝子配列を含む、遺伝子操作された細菌は、キヌレニナーゼ、例えば、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓに由来するキヌレニナーゼをコードし、（必要に応じて）ＴｒｐＥ遺伝子の改変、例えば、突然変異または欠失を有する遺伝子配列を含む、遺伝子操作された細菌と組み合わせても、それとともに投与してもよい。
これらの実施形態のいずれにおいても、１つまたは複数のＳＴＩＮＧアゴニストを産生するように遺伝子操作された１つまたは複数の細菌は、単独で、または抗ＣＴＬＡ４、抗ＰＤ１、もしくは抗ＰＤ−Ｌ１抗体を含むがこれらに限定されない、本明細書に記載される１つもしくは複数の免疫チェックポイント阻害剤と組み合わせて投与してもよい。一部の実施形態では、ＳＴＩＮＧアゴニストを産生する１つまたは複数の遺伝子操作された細菌は、チェックポイント阻害剤療法と組み合わせて投与した場合に、免疫学的記憶を誘起する。
これらの実施形態のいずれにおいても、ＳＴＩＮＧアゴニストを産生するように遺伝子操作された１つまたは複数の細菌は、抗ＣＴＬＡ４、抗ＰＤ１、または抗ＰＤ−Ｌ１抗体を含むがこれらに限定されない、本明細書に記載される１つまたは複数の免疫チェックポイント阻害剤を産生し、それらの表面上に分泌または提示するように、遺伝子操作されていてもよい。一部の実施形態では、ＳＴＩＮＧアゴニスト産生のための１つまたは複数の酵素をコードする遺伝子配列、および１つまたは複数の免疫チェックポイント阻害剤抗体、例えば、ｓｃＦｖ抗体をコードする遺伝子配列を含む、１つまたは複数の遺伝子操作された細菌は、腫瘍の再チャレンジ／再発の後に、免疫学的記憶を促進する。
これらの実施形態のいずれにおいても、１つまたは複数のＳＴＩＮＧアゴニストを産生するように遺伝子操作された１つまたは複数の細菌は、単独で、または抗ＯＸ４０、抗４１ＢＢ、もしくは抗ＧＩＴＲ抗体を含むがこれらに限定されない、本明細書に記載される１つもしくは複数の免疫刺激アゴニスト、例えば、アゴニスト抗体と組み合わせて投与してもよい。一部の実施形態では、ＳＴＩＮＧアゴニストを産生する１つまたは複数の遺伝子操作された細菌は、抗ＯＸ４０、抗４１ＢＢ、または抗ＧＩＴＲ抗体と組み合わせて投与した場合に、免疫学的記憶を誘起する。
これらの実施形態のいずれにおいても、ＳＴＩＮＧアゴニストを産生するように遺伝子操作された１つまたは複数の細菌は、抗ＯＸ４０、抗４１ＢＢ、または抗ＧＩＴＲ抗体を含むがこれらに限定されない、本明細書に記載される１つまたは複数の免疫刺激アゴニスト、例えば、アゴニスト抗体を産生し、それらの表面上に分泌または提示するように、遺伝子操作されていてもよい。一部の実施形態では、１つまたは複数のＳＴＩＮＧアゴニスト産生酵素をコードする遺伝子配列、および例えば、抗ＯＸ４０、抗４１ＢＢ、または抗ＧＩＴＲ抗体から選択される１つまたは複数の共刺激抗体をコードする遺伝子配列を含む、１つまたは複数の遺伝子操作された細菌は、免疫学的記憶を誘起する。
一実施形態では、ＳＴＩＮＧアゴニスト産生株の投与は、単独で投与するか、またはチェックポイント阻害剤療法および／もしくは共刺激抗体、例えば、抗ＯＸ４０、抗４１ＢＢ、もしくは抗ＧＩＴＲ抗体から選択されるものと組み合わせて投与した場合に、アブスコパル効果を惹起する。一実施形態では、ジアデニル酸シクラーゼ、例えば、ＤａｃＡ、例えば、Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓに由来するものをコードする１つまたは複数の遺伝子を含む、遺伝子操作された細菌の投与は、アブスコパル効果を惹起する。一実施形態では、アブスコパル効果は、２日目〜３日目の間に観察される。一実施形態では、ｃＧＡＳ、例えば、ヒトｃＧＡＳをコードする１つまたは複数の遺伝子を含む遺伝子操作された細菌の投与は、アブスコパル効果を惹起する。
また、一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌および／または他の微生物は、記載の回路のいずれか１つまたは複数をさらに発現することができ、以下のものの１つまたは複数をさらに含む：（１）１つまたは複数の栄養要求体、例えば、当技術分野において公知の、および本明細書で提供される、任意の栄養要求体、例えばｄａｐＡおよびｔｈｙＡ栄養要求体、（２）１つまたは複数のキルスイッチ回路、例えば、本明細書に記載の、またはそうでなければ当技術分野において公知の、キルスイッチのいずれか、（３）１つまたは複数の抗生物質耐性回路、（４）生体分子または基質を移入するための１つまたは複数の輸送体、例えば、本明細書に記載の、またはそうでなければ当技術分野において公知の、輸送体のいずれか、（５）１つまたは複数の分泌回路、例えば、本明細書に記載の、でなければ当技術分野において公知の、分泌回路のいずれか、（６）１つまたは複数の表面提示回路、例えば、本明細書に記載の、でなければ当技術分野において公知の、表面提示回路のいずれか、（７）本明細書に記載の１つまたは複数の代謝物（例えば、キヌレニン、トリプトファン、アデノシン、アルギニン）の産生または分解のための１つまたは複数の回路、（８）本明細書に記載される１つまたは複数の免疫イニシエーター（例えば、ＳＴＩＮＧアゴニスト、ＣＤ４０Ｌ、ＳＩＲＰα）、（９）本明細書に記載される１つまたは複数の免疫サステナー（例えば、ＩＬ−１５、ＩＬ−１２、ＣＸＣＬ１０）、ならびに（１０）そのような追加の回路のうちの１つまたは複数の組合せ。
ＣＤ４０
ＣＤ４０は、抗原提示細胞上に見られる共刺激タンパク質であり、それらの細胞の活性化に必要とされる。ヘルパーＴ細胞上のＣＤ１５４（ＣＤ４０Ｌ）のＣＤ４０との結合は、抗原提示細胞を活性化し、様々な下流免疫刺激効果を誘導する。一部の実施形態では、免疫モジュレーターは、ＣＤ４０のアゴニスト、例えば、アゴニスト抗ＣＤ４０抗体、アゴニスト抗ＣＤ４０抗体断片、ＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０Ｌ）ポリペプチド、およびＣＤ４０Ｌポリペプチド断片から選択されるアゴニストである。したがって、一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、アゴニスト抗ＣＤ４０抗体もしくはその断片、またはＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０Ｌ）ポリペプチドもしくはその断片をコードする配列を含む。
したがって、一部の実施形態では、操作された細菌は、アゴニスト抗ＣＤ４０抗体もしくはその断片、またはＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０Ｌ）ポリペプチドもしくはその断片を産生するように操作されている。一部の実施形態では、操作された細菌は、アゴニスト抗ＣＤ４０抗体もしくはその断片、またはＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０Ｌ）ポリペプチドもしくはその断片をコードするための配列を含む。一部の実施形態では、操作された細菌は、ＣＤ４０に対する抗体の１つまたは複数のコピーをコードする遺伝子配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ４０は、ヒトＣＤ４０である。一部の実施形態では、抗ＣＤ４０抗体は、ｓｃＦｖである。一部の実施形態では、抗ＣＤ４０抗体は、分泌される。一部の実施形態では、抗ＣＤ４０抗体は、細胞表面に提示される。これらの実施形態のいずれにおいても、アゴニスト抗ＣＤ４０抗体もしくはその断片、またはＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０Ｌ）ポリペプチドもしくはその断片をコードする遺伝子配列は、例えば本明細書に記載されるような分泌タグを、さらにコードする。
これらの実施形態のいずれにおいても、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より少なくとも約０％〜２％〜４％、４％〜６％、６％〜８％、８％〜１０％、１０％〜１２％、１２％〜１４％、１４％〜１６％、１６％〜１８％、１８％〜２０％、２０％〜２５％、２５％〜３０％、３０％〜３５％、３５％〜４０％、４０％〜４５％、４５％〜５０％、５０％〜５５％、５５％〜６０％、６０％〜６５％、６５％〜７０％〜８０％、８０％〜９０％、または９０％〜１００％多いＣＤ４０リガンドを産生する。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より少なくとも約１．０〜１．２倍、１．２〜１．４倍、１．４〜１．６倍、１．６〜１．８倍、１．８〜２倍、または２倍多いＣＤ４０リガンドを産生する。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、４０倍、または５０倍、１００倍、５００倍、または１０００倍多いＣＤ４０リガンドを産生する。
これらの実施形態のいずれにおいても、ＣＤ４０リガンドを産生するように遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より少なくとも約０％〜２％〜４％、４％〜６％、６％〜８％、８％〜１０％、１０％〜１２％、１２％〜１４％、１４％〜１６％、１６％〜１８％、１８％〜２０％、２０％〜２５％、２５％〜３０％、３０％〜３５％、３５％〜４０％、４０％〜４５％、４５％〜５０％、５０％〜５５％、５５％〜６０％、６０％〜６５％、６５％〜７０％〜８０％、８０％〜９０％、または９０％〜１００％多いＣＤ４０リガンドを分泌する。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より少なくとも約１．０〜１．２倍、１．２〜１．４倍、１．４〜１．６倍、１．６〜１．８倍、１．８〜２倍、または２倍多いＣＤ４０リガンドを分泌する。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、１００倍、５００倍、または１０００倍多いＣＤ４０リガンドを分泌する。
一部の実施形態では、ＣＤ４０リガンドを分泌するように遺伝子操作された細菌は、細胞増殖を、同じ条件下で、同じ亜型の未改変細菌と比較して、少なくとも約１０％〜２０％、２０％〜２５％、２５％〜３０％、３０％〜４０％、４０％〜５０％、５０％〜６０％、６０％〜７０％、７０％〜７５％、７５％〜８０％、８０％〜８５％、８５％〜９０％、９０％〜９５％、９５％〜９９％、またはそれより大きく低減させることができる。
一部の実施形態では、ＣＤ４０リガンドを分泌するように遺伝子操作された細菌は、腫瘍増殖を、同じ条件下で、同じ亜型の未改変細菌と比較して、少なくとも約１０％〜２０％、２０％〜２５％、２５％〜３０％、３０％〜４０％、４０％〜５０％、５０％〜６０％、６０％〜７０％、７０％〜７５％、７５％〜８０％、８０％〜８５％、８５％〜９０％、９０％〜９５％、９５％〜９９％、またはそれより大きく低減させることができる。一部の実施形態では、ＣＤ４０リガンドを分泌するように遺伝子操作された細菌は、腫瘍サイズを、同じ条件下で、同じ亜型の未改変細菌と比較して、少なくとも約１０％〜２０％、２０％〜２５％、２５％〜３０％、３０％〜４０％、４０％〜５０％、５０％〜６０％、６０％〜７０％、７０％〜７５％、７５％〜８０％、８０％〜８５％、８５％〜９０％、９０％〜９５％、９５％〜９９％、またはそれより大きく低減させることができる。一部の実施形態では、ＣＤ４０リガンドを分泌するように遺伝子操作された細菌は、腫瘍体積を、同じ条件下で、同じ亜型の未改変細菌と比較して、少なくとも約１０％〜２０％、２０％〜２５％、２５％〜３０％、３０％〜４０％、４０％〜５０％、５０％〜６０％、６０％〜７０％、７０％〜７５％、７５％〜８０％、８０％〜８５％、８５％〜９０％、９０％〜９５％、９５％〜９９％、またはそれより大きく低減させることができる。一部の実施形態では、ＣＤ４０リガンドを分泌するように遺伝子操作された細菌は、腫瘍重量を、同じ条件下で、同じ亜型の未改変細菌と比較して、少なくとも約１０％〜２０％、２０％〜２５％、２５％〜３０％、３０％〜４０％、４０％〜５０％、５０％〜６０％、６０％〜７０％、７０％〜７５％、７５％〜８０％、８０％〜８５％、８５％〜９０％、９０％〜９５％、９５％〜９９％、またはそれより大きく低減させることができる。一部の実施形態では、ＣＤ４０リガンドを分泌するように遺伝子操作された細菌は、奏効率を、同じ条件下で、同じ亜型の未改変細菌と比較して、少なくとも約１０％〜２０％、２０％〜２５％、２５％〜３０％、３０％〜４０％、４０％〜５０％、５０％〜６０％、６０％〜７０％、７０％〜７５％、７５％〜８０％、８０％〜８５％、８５％〜９０％、９０％〜９５％、９５％〜９９％、またはそれより大きく増大させることができる。一部の実施形態では、ＣＤ４０リガンドを産生するように遺伝子操作された細菌は、樹状細胞および／またはマクロファージにおいてＣＣＲ７発現を増加させることができる。
一部の実施形態では、ＣＣＲ７は、同じ条件下で、同じ亜型の未改変細菌と比較して、少なくとも約１０％〜２０％、２０％〜２５％、２５％〜３０％、３０％〜４０％、４０％〜５０％、５０％〜６０％、６０％〜７０％、７０％〜７５％、７５％〜８０％、８０％〜８５％、８５％〜９０％、９０％〜９５％、９５％〜９９％、９８％、またはそれより多く誘導される。一部の実施形態では、ＣＣＲ７は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌で観察されるものより約１．０〜１．２倍、１．２〜１．４倍、１．４〜１．６倍、１．６〜１．８倍、１．８〜２倍、または２倍多く誘導される。さらに別の実施形態では、ＣＣＲ７は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌で観察されるものより約３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、４０倍、または５０倍、１００倍、５００倍、または１０００倍もしくはそれより多く誘導される。一実施形態では、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌で観察されるものより２５％〜５５％、約３０〜４５％高い、マクロファージにおいて誘導されるＣＣＲ７のレベル。
一実施形態では、樹状細胞において誘導されるＣＣＲ７のレベルは、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌で観察されるものより約２倍高い。
一部の実施形態では、ＣＤ４０リガンドを産生するように遺伝子操作された細菌は、樹状細胞および／またはマクロファージ上でのＣＣＲ７発現を増加させることができる。
一部の実施形態では、ＣＤ４０は、同じ条件下で、同じ亜型の未改変細菌と比較して、少なくとも約１０％〜２０％、２０％〜２５％、２５％〜３０％、３０％〜４０％、４０％〜５０％、５０％〜６０％、６０％〜７０％、７０％〜７５％、７５％〜８０％、８０％〜８５％、８５％〜９０％、９０％〜９５％、９５％〜９９％、９８％、またはそれより多く誘導される。一部の実施形態では、ＣＤ４０は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌で観察されるものより約１．０〜１．２倍、１．２〜１．４倍、１．４〜１．６倍、１．６〜１．８倍、１．８〜２倍、または２倍多く誘導される。さらに別の実施形態では、ＣＤ４０は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌で観察されるものより約３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、４０倍、または５０倍、１００倍、５００倍、または１０００倍もしくはそれより多く誘導される。一実施形態では、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌で観察されるものより３０％〜５０％高い、マクロファージにおいて誘導されるＣＤ４０のレベル。
一実施形態では、樹状細胞において誘導されるＣＤ４０のレベルは、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌で観察されるものより約１０％高い。
したがって、一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、配列番号１０９３の１つまたは複数と約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有するＣＤ４０リガンドポリペプチドをコードする。別の実施形態では、ポリペプチドは、配列番号１０９３を含む。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌により発現されるポリペプチドは、配列番号１０９３からなる。
一部の実施形態では、遺伝子操作された微生物は、低酸素条件で、ならびに／あるいはがんおよび／または腫瘍微小環境、または組織特異的分子もしくは代謝物の存在下で、ならびに／あるいは炎症または免疫抑制に関連する分子または代謝物の存在下で、ならびに／あるいは消化管内に存在し得る代謝物の存在下で、ならびに／あるいはｉｎ ｖｉｖｏで存在することもあり、しないこともあり、ｉｎ ｖｉｔｒｏで、株培養、拡大増殖、産生、および／または製造中に存在することもある、代謝物、例えば、アラビノース、クメート、およびサリチレート、ならびに本明細書に記載されている他のものの存在下で、アゴニスト抗ＣＤ４０抗体もしくはその断片、またはＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０Ｌ）ポリペプチドもしくはその断片をコードする記載の回路のうちのいずれか１つまたは複数を発現することができる。一部の実施形態では、遺伝子配列は、そのような条件および／またはインデューサーにより誘導可能なプロモーターによって制御される。一部の実施形態では、遺伝子配列は、構成的プロモーターにより制御され、本明細書に記載の、ｉｎ ｖｉｖｏ条件および／またはｉｎ ｖｉｔｒｏ条件で、例えば、拡大増殖、産生および／または製造中に発現される。一部の実施形態では、記載の回路のいずれか１つまたは複数は、１つもしくは複数のプラスミド（例えば、高コピー数もしくは低コピー数プラスミド）上に存在するか、または微生物染色体内の１つもしくは複数の部位に組み込まれている。
これらの実施形態のいずれにおいても、アゴニスト抗ＣＤ４０抗体もしくはその断片、またはＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０Ｌ）ポリペプチドもしくはその断片をコードする遺伝子配列を含む、遺伝子操作された細菌は、１つまたは複数のさらなるエフェクター分子、すなわち、治療用分子または代謝変換因子をコードする遺伝子配列をさらに含む。これらの実施形態のいずれにおいても、アゴニスト抗ＣＤ４０抗体もしくはその断片、またはＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０Ｌ）ポリペプチドもしくはその断片をコードする回路は、同じかまたは異なる細菌株において、本明細書に記載される１つまたは複数の免疫イニシエーターまたは免疫サステナーをコードする回路と組み合わせることができる（組合せ回路または株の混合物）。免疫イニシエーターまたは免疫サステナーをコードする回路は、構成的または誘導性プロモーター、例えば、低酸素誘導性プロモーターまたは本明細書に記載される任意の他の構成的もしくは誘導性プロモーターの制御下にあり得る。
これらの実施形態のいずれにおいても、アゴニスト抗ＣＤ４０抗体もしくはその断片、またはＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０Ｌ）ポリペプチドもしくはその断片をコードする遺伝子配列は、同じかまたは異なる細菌株において、本明細書に記載される１つまたは複数のＳＴＩＮＧアゴニスト産生酵素をコードする遺伝子配列と組み合わせることができる（組合せ回路または株の混合物）。一部の実施形態では、アゴニスト抗ＣＤ４０抗体もしくはその断片、またはＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０Ｌ）ポリペプチドもしくはその断片をコードする遺伝子配列と組み合わされる遺伝子配列は、ＤａｃＡをコードする。ＤａｃＡは、構成的または誘導性プロモーター、例えば、低酸素誘導性プロモーター、例えば、ＦＮＲ、または本明細書に記載される任意の他の構成的もしくは誘導性プロモーターの制御下にあり得る。一部の実施形態では、ｄａｃＡ遺伝子は、染色体に組み込まれている。一部の実施形態では、アゴニスト抗ＣＤ４０抗体もしくはその断片、またはＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０Ｌ）ポリペプチドもしくはその断片をコードする遺伝子配列と組み合わされる遺伝子配列は、ｃＧＡＳをコードする。ｃＧＡＳは、構成的または誘導性プロモーター、例えば、低酸素誘導性プロモーター、例えば、ＦＮＲ、または本明細書に記載される任意の他の構成的もしくは誘導性プロモーターの制御下にあり得る。一部の実施形態では、ｃＧＡＳをコードする遺伝子は、染色体に組み込まれている。
これらの組合せの実施形態のいずれにおいても、細菌は、栄養要求性の改変、例えば、ＤａｐＡ、ＴｈｙＡ、または両方の突然変異または欠失をさらに含み得る。これらの実施形態のいずれにおいても、細菌は、ファージの改変、例えば、本明細書に記載される内在性プロファージの突然変異または欠失をさらに含み得る。
また、一部の実施形態では、遺伝子操作された微生物は、アゴニスト抗ＣＤ４０抗体もしくはその断片、またはＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０Ｌ）ポリペプチドもしくはその断片をコードする記載の回路のうちのいずれか１つまたは複数を発現することができ、以下のうちの１つまたは複数をさらに含む：（１）１つまたは複数の栄養要求体、例えば、当技術分野において公知の、本明細書に提供される、任意の栄養要求体、例えば、ｔｈｙＡ栄養要求体、（２）１つまたは複数のキルスイッチ回路、例えば、本明細書に記載されるか、またはそうでなければ当該技術分野において公知の、キルスイッチのうちのいずれか、（３）１つまたは複数の抗生物質耐性回路、（４）生体分子または基質を移入するための１つまたは複数の輸送体、例えば、本明細書に記載されるか、またはそうでなければ当該技術分野において公知の、輸送体のうちのいずれか、（５）１つまたは複数の分泌回路、例えば、本明細書に記載され、そうでなければ当該技術分野において公知の、分泌回路のうちのいずれか、（６）１つまたは複数の表面提示回路、例えば、本明細書に記載され、そうでなければ当該技術分野において公知の、表面提示回路のうちのいずれか、および（７）本明細書に記載される１つまたは複数の代謝物（例えば、キヌレニン、トリプトファン、アデノシン、アルギニン）の産生または分解のための１つまたは複数の回路、（８）このような追加の回路のうちの１つまたは複数の組合せ。これらの実施形態のいずれにおいても、遺伝子操作された細菌は、単独で、または抗ＣＴＬＡ４、抗ＰＤ１、もしくは抗ＰＤ−Ｌ１抗体を含むがこれらに限定されない、本明細書に記載される１つもしくは複数の免疫チェックポイント阻害剤と組み合わせて投与してもよい。
ＧＭＣＳＦ
コロニー刺激因子２（ＣＳＦ２）としても公知の、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）は、マクロファージ、Ｔ細胞、マスト細胞、ＮＫ細胞、内皮細胞および線維芽細胞により分泌される単量体糖タンパク質である。ＧＭ−ＣＳＦは、免疫系の発達を助長しかつ感染に対する防御を促進するサイトカインとして機能する、白血球成長因子である。例えば、ＧＭ−ＣＳＦは、顆粒球（好中球、好酸球および好塩基球）および単球を産生するように幹細胞を刺激し、単球は、血行路を出て組織に遊走し、するとすぐに成熟して、マクロファージおよび樹状細胞になる。ＧＭ−ＣＳＦは、免疫／炎症カスケードの一部であり、このカスケードは、少数のマクロファージの活性化がそれらの数の急速な増加につながるカスケードであり、このプロセスは、感染との戦いに極めて重要である。ＧＭ−ＣＳＦは、シグナル伝達兼転写活性化因子、ＳＴＡＴ５を介して、またはＳＴＡＴ３（マクロファージを活性化する）を介して、シグナル伝達する。
一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、樹状細胞活性化をモジュレートする免疫モジュレーターを産生することができる。一部の実施形態では、免疫モジュレーターは、ＧＭ−ＣＳＦである。したがって、一部の実施形態では、操作された細菌は、ＧＭ−ＣＳＦを産生するように操作されている。一部の実施形態では、操作された細菌は、ＧＭ−ＣＳＦをコードする配列を含む。一部の実施形態では、操作された細菌は、ＧＭ−ＣＳＦをコードするための配列、およびＧＭ−ＣＳＦの分泌のための分泌ペプチドをコードするための配列を含む。例示的な分泌タグおよび分泌方法は、本明細書に記載されている。
一部の実施形態では、遺伝子操作された微生物は、低酸素条件で、ならびに／あるいはがんの存在下で、および／または腫瘍微小環境、または組織特異的分子もしくは代謝物において、ならびに／あるいは炎症または免疫抑制に関連する分子または代謝物の存在下で、ならびに／あるいは消化管内に存在し得る代謝物の存在下で、ならびに／あるいはｉｎ ｖｉｖｏで存在することもあり、しないこともあり、ｉｎ ｖｉｔｒｏで、株培養、拡大増殖、産生、および／または製造中に存在することもある、代謝物、例えば、アラビノース、クメート、およびサリチレート、ならびに本明細書に記載される他のものの存在下で、記載のＧＭ−ＣＳＦ回路のうちのいずれか１つまたは複数を発現することができる。一部の実施形態では、そのようなインデューサーは、エフェクター遺伝子発現を誘導するために、ｉｎ ｖｉｖｏで投与され得る。一部の実施形態では、ＧＭ−ＣＳＦをコードする遺伝子配列は、そのような条件および／またはインデューサーにより誘導可能なプロモーターによって制御される。一部の実施形態では、ＧＭ−ＣＳＦをコードする遺伝子配列は、本明細書に記載される構成的プロモーターによって制御される。一部の実施形態では、遺伝子配列は、構成的プロモーターによって制御され、本明細書に記載の、ｉｎ ｖｉｖｏ条件および／またはｉｎ ｖｉｔｒｏ条件で、例えば、拡大増殖、産生、および／または製造中に発現される。一部の実施形態では、ＧＭ−ＣＳＦをコードする記載の遺伝子配列のうちのいずれか１つまたは複数は、１つもしくは複数のプラスミド（例えば、高コピー数または低コピー数プラスミド）上に存在するか、または微生物の染色体内の１つもしくは複数の部位に組み込まれている。
これらの実施形態のいずれにおいても、ＧＭ−ＣＳＦをコードする遺伝子配列を含む、遺伝子操作された細菌は、１つまたは複数のさらなるエフェクター分子、すなわち、治療用分子または代謝変換因子をコードする遺伝子配列をさらに含む。これらの実施形態のいずれにおいても、ＧＭ−ＣＳＦをコードする回路は、同じかまたは異なる細菌株において、本明細書に記載される１つまたは複数の免疫イニシエーターまたは免疫サステナーをコードする回路と組み合わせることができる（組合せ回路または株の混合物）。免疫イニシエーターまたは免疫サステナーをコードする回路は、構成的または誘導性プロモーター、例えば、低酸素誘導性プロモーターまたは本明細書に記載される任意の他の構成的もしくは誘導性プロモーターの制御下にあり得る。
これらの実施形態のいずれにおいても、ＧＭ−ＣＳＦをコードする遺伝子配列は、同じかまたは異なる細菌株において、本明細書に記載される１つまたは複数のＳＴＩＮＧアゴニスト産生酵素をコードする遺伝子配列と組み合わせることができる（組合せ回路または株の混合物）。一部の実施形態では、ＧＭ−ＣＳＦをコードする遺伝子配列と組み合わされる遺伝子配列は、ＤａｃＡをコードする。ＤａｃＡは、構成的または誘導性プロモーター、例えば、低酸素誘導性プロモーター、例えば、ＦＮＲ、または本明細書に記載される任意の他の構成的もしくは誘導性プロモーターの制御下にあり得る。一部の実施形態では、ｄａｃＡ遺伝子は、染色体に組み込まれている。一部の実施形態では、ＧＭ−ＣＳＦをコードする遺伝子配列と組み合わされる遺伝子配列は、ｃＧＡＳをコードする。ｃＧＡＳは、構成的または誘導性プロモーター、例えば、低酸素誘導性プロモーター、例えば、ＦＮＲ、または本明細書に記載される任意の他の構成的もしくは誘導性プロモーターの制御下にあり得る。一部の実施形態では、ｃＧＡＳをコードする遺伝子は、染色体に組み込まれている。
これらの組合せの実施形態のいずれにおいても、細菌は、栄養要求性の改変、例えば、ＤａｐＡ、ＴｈｙＡ、または両方の突然変異または欠失をさらに含み得る。これらの実施形態のいずれにおいても、細菌は、ファージの改変、例えば、本明細書に記載される内在性プロファージの突然変異または欠失をさらに含み得る。
一部の実施形態では、遺伝子操作された微生物は、ＧＭ−ＣＳＦをコードする記載の回路のうちのいずれか１つまたは複数を発現することができ、以下のうちの１つまたは複数をさらに含む：（１）１つまたは複数の栄養要求体、例えば、当該技術分野で公知であり、本明細書に提供される、任意の栄養要求体、例えば、ｔｈｙＡ栄養要求体、（２）１つまたは複数のキルスイッチ回路、例えば、本明細書に記載されるか、またはそうでなければ当該技術分野において公知の、キルスイッチのうちのいずれか、（３）１つまたは複数の抗生物質耐性回路、（４）生体分子または基質を移入するための１つまたは複数の輸送体、例えば、本明細書に記載されるか、またはそうでなければ当該技術分野において公知の、輸送体のうちのいずれか、（５）１つまたは複数の分泌回路、例えば、本明細書に記載され、そうでなければ当該技術分野において公知の、分泌回路のうちのいずれか、（６）１つまたは複数の表面提示回路、例えば、本明細書に記載され、そうでなければ当該技術分野において公知の、表面提示回路のうちのいずれか、および（７）本明細書に記載される１つまたは複数の代謝物（例えば、キヌレニン、トリプトファン、アデノシン、アルギニン）の産生または分解のための１つまたは複数の回路、（８）このような追加の回路のうちの１つまたは複数の組合せ。これらの実施形態のいずれにおいても、遺伝子操作された細菌は、単独で、または抗ＣＴＬＡ４、抗ＰＤ１、もしくは抗ＰＤ−Ｌ１抗体を含むがこれらに限定されない、本明細書に記載される１つもしくは複数の免疫チェックポイント阻害剤と組み合わせて投与してもよい。
エフェクター免疫細胞（免疫刺激因子）の活性化およびプライミング
Ｔ細胞活性化因子
サイトカインおよびサイトカイン受容体
ＣＤ４（表面抗原分類４）は、免疫細胞、例えば、細胞、単球、マクロファージおよび樹状細胞の表面に見られる糖タンパク質である。ＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞は、他の種類の免疫細胞にシグナルを送ることによって、Ｂ細胞の形質細胞およびメモリーＢ細胞への成熟、ならびに細胞傷害性Ｔ細胞およびマクロファージの活性化を含む、免疫学的プロセスにおいて、他の免疫細胞を支援するように働く、白血球である。ヘルパーＴ細胞は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）の表面に発現されるＭＨＣクラスＩＩ分子によってペプチド抗原とともに提示されると活性化される。活性化されると、ヘルパーＴ細胞は分裂し、活性免疫応答を調節または支援するサイトカインを分泌する。ヘルパーＴ細胞は、いくつかのサブタイプのうちの１つに分化することができ、そのようなサブタイプは、ＴＨ１、ＴＨ２、ＴＨ３、ＴＨ１７、ＴＨ９またはＴＦＨ細胞を含み、これらは、異なるサイトカインを分泌して、異なるタイプの免疫応答を助長する。
細胞傷害性Ｔ細胞（ＴＣ細胞、またはＣＴＬ）は、ウイルス感染細胞および腫瘍細胞を破壊し、移植拒絶反応にも関与する。これらの細胞は、それらの表面でＣＤ８糖タンパク質を発現することから、ＣＤ８＋Ｔ細胞としても公知である。細胞傷害性Ｔ細胞は、すべての有核細胞の表面に存在するＭＨＣクラスＩ分子と会合している抗原と結合することにより、それらの標的を認識する。
一部の実施形態では、遺伝子操作された微生物、例えば、遺伝子操作された細菌は、１つまたは複数のエフェクターＴ細胞、例えば、ＣＤ４＋細胞および／またはＣＤ８＋細胞をモジュレートする、１つまたは複数のエフェクター分子または免疫モジュレーターを産生することができる。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、１つまたは複数のエフェクターＴ細胞、例えば、ＣＤ４＋および／またはＣＤ８＋細胞の分化を活性化、刺激および／または誘導する、１つまたは複数のエフェクター分子を産生することができる。一部の実施形態では、免疫モジュレーターは、エフェクターＴ細胞、例えば、ＣＤ４＋および／またはＣＤ８＋細胞の分化を活性化、刺激および／または誘導する、サイトカインである。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ＩＬ−２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１２、ＩＬ−７、ＩＬ−２１、ＩＬ−１８、ＴＮＦ、およびＩＦＮ−ガンマから選択される１つまたは複数のサイトカインを産生する。本明細書で使用される場合、１つまたは複数のサイトカインの産生は、別のサイトカインまたは他の免疫モジュレーション分子に連結されたペプチドを介して融合されている、１つまたは複数のサイトカインを含む融合タンパク質を含む。例としては、ＩＬ−１２およびＩＬ−１５融合タンパク質が挙げられるが、これらに限定されない。一般に、本明細書に記載のすべてのアゴニストおよびアンタゴニストを、ペプチドリンカーを介して目的の別のポリペプチドと融合させて、それらの機能を向上させることまたは変更することができる。例えば、一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ＩＬ−２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１２、ＩＬ−７、ＩＬ−２１、ＩＬ−１８、ＴＮＦ、およびＩＦＮ−ガンマから選択される１つまたは複数のサイトカインをコードする配列を含む。一部の実施形態では、遺伝子操作された微生物は、１つまたは複数のサイトカイン融合タンパク質をコードする。そのような融合タンパク質の非限定的な例としては、抗体ポリペプチドに作動可能に連結した１つまたは複数のサイトカインポリペプチドであって、抗体が、腫瘍特異的抗原を認識することによってサイトカインを腫瘍と近接させる、サイトカインポリペプチドが挙げられる。
インターロイキン１２（ＩＬ−１２）は、その作用が自然免疫と適応免疫間の相互接続を生じさせる、サイトカインである。ＩＬ−１２は、活性化樹状細胞、単球、マクロファージおよび好中球はもちろん、他の細胞型も含む、多数の免疫細胞によって分泌される。ＩＬ−１２は、ｐ３５およびｐ４０サブユニットからなるヘテロ二量体タンパク質（ＩＬ−１２−ｐ７０；ＩＬ−１２−ｐ３５／ｐ４０）であり、ＩＬ−１２Ｒ−β１およびＩＬ−１２Ｒ−β２という２つのサブユニットで構成されている受容体と結合する。ＩＬ−１２受容体は、ＮＫ細胞、ＴおよびＢリンパ球を含む、多数の免疫細胞上に、構成的または誘導的に発現される。ＩＬ−１２が結合すると、受容体は、活性化され、ＪＡＫ／ＳＴＡＴ経路を介した下流のシグナル伝達が開始され、その結果として、ＩＬ−１２に対する細胞応答が生じる。ＩＬ−１２は、ＩＬ−１２作用の最も強力なメディエーターであるＩＦＮ−γのＮＫ細胞およびＴ細胞からの産生を増加させることによって作用する。加えて、ＩＬ−１２は、活性化ＮＫ細胞、ＣＤ８＋およびＣＤ４＋Ｔ細胞の成長および細胞傷害性を促進し、ＣＤ４＋Ｔｈ０細胞の分化をＴｈ１表現型にシフトさせる。さらに、ＩＬ−１２は、腫瘍細胞に対する抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、およびＩｇＧの誘導、およびＢ細胞からのＩｇＥ産生の抑制を増強する。加えて、ＩＬ−１２はまた、骨髄系由来サプレッサー細胞の再プログラミングに関与し、Ｔｈ１型免疫応答を指示し、ＭＨＣクラスＩ分子の発現の増加を助長する（例えば、Ｗａｌｄｍａｎｎら、Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｒｅｓ ２０１５年３月、３巻；２１９頁に概説されている）。
したがって、一部の実施形態では、操作された細菌は、ＩＬ−１２を産生するように操作されている。一部の実施形態では、操作された細菌は、ＩＬ−１２（すなわち、ｐ３５およびｐ４０サブユニット）をコードするための配列を含む。一部の実施形態では、操作された細菌は、例えば、強力なプロモーターに動作可能に連結した、および／またはＩＬ−１２遺伝子配列の１つより多くのコピーを含む、ＩＬ−１２を過剰発現するように、操作されている。一部の実施形態では、操作された細菌は、ＩＬ−１２の２つまたはそれより多いコピー、例えば、ＩＬ−１２遺伝子の２、３、４、５、６またはそれより多いコピーをコードする配列を含む。一部の実施形態では、操作された細菌は、ＩＬ−１２の産生を刺激する１つまたは複数の免疫モジュレーターを産生する。一部の実施形態では、操作された細菌は、ＩＬ−１２をコードするための配列、およびＩＬ−１２の分泌のための分泌ペプチドをコードするための配列を含む。
一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、２つのインターロイキン−１２単量体サブユニット（ＩＬ−１２Ａ（ｐ３５）およびＩＬ−１２Ｂ（ｐ４０））がリンカーにより共有結合で連結されている、遺伝子配列を含む。一部の実施形態では、リンカーは、セリングリシンリッチリンカーである。一実施形態では、遺伝子配列は、「ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号１２４７）」のアミノ酸数１５のリンカーが、強制二量体ヒトＩＬ−１２（ｄｉＩＬ−１２）融合タンパク質を産生するように、２つの単量体サブユニット（ＩＬ−１２Ａ（ｐ３５）およびＩＬ−１２Ｂ（ｐ４０））の間に挿入されている、構築物をコードする。一部の実施形態では、遺伝子配列は、発現のために、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉにおける発現のために、コドン最適化される。遺伝子操作された細菌が、２つのサブユニットが連結されているＩＬ−１２の発現のための遺伝子配列を含む、実施形態のいずれにおいても、遺伝子配列は、分泌タグをさらに含むことができる。分泌タグは、本明細書に記載のまたは当技術分野において公知の分泌タグのいずれかを含む。
一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、配列番号１１６９、配列番号１１７０、配列番号１１７１、配列番号１１７２、配列番号１１７３、配列番号１１７４、配列番号１１７５、配列番号１１７６、配列番号１１７７、配列番号１１７８、配列番号１１７９、配列番号１１９１、配列番号１１９２、配列番号１１９３、および配列番号１１９４から選択される配列と少なくとも約８０％の同一性を有する、ＩＬ−１２（ｐ４０）サブユニットに連結されたＩＬ−１２（ｐ３５）サブユニットをコードする遺伝子配列を含む。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、配列番号１１６９、配列番号１１７０、配列番号１１７１、配列番号１１７２、配列番号１１７３、配列番号１１７４、配列番号１１７５、配列番号１１７６、配列番号１１７７、配列番号１１７８、配列番号１１７９、配列番号１１９１、配列番号１１９２、配列番号１１９３、および配列番号１１９４から選択される配列と少なくとも約９０％の同一性をほぼ有することがある、ＩＬ−１２（ｐ４０）サブユニットに連結されたＩＬ−１２（ｐ３５）サブユニットをコードする遺伝子配列を含む。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、配列番号１１６９、配列番号１１７０、配列番号１１７１、配列番号１１７２、配列番号１１７３、配列番号１１７４、配列番号１１７５、配列番号１１７６、配列番号１１７７、配列番号１１７８、配列番号１１７９、配列番号１１９１、配列番号１１９２、配列番号１１９３、および配列番号１１９４から選択される配列と少なくとも約９５％の同一性をほぼ有することがある、ＩＬ−１２（ｐ４０）サブユニットに連結されたＩＬ−１２（ｐ３５）サブユニットをコードする遺伝子配列を含む。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、配列番号１１６９、配列番号１１７０、配列番号１１７１、配列番号１１７２、配列番号１１７３、配列番号１１７４、配列番号１１７５、配列番号１１７６、配列番号１１７７、配列番号１１７８、配列番号１１７９、配列番号１１９１、配列番号１１９２、配列番号１１９３、および配列番号１１９４から選択される配列またはその機能性断片と約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有する、ＩＬ−１２（ｐ４０）サブユニットに連結されたＩＬ−１２（ｐ３５）サブユニットをコードする遺伝子配列を含む。別の実施形態では、ＩＬ−１２（ｐ４０）サブユニットに連結されたＩＬ−１２（ｐ３５）サブユニットは、配列番号１１６９、配列番号１１７０、配列番号１１７１、配列番号１１７２、配列番号１１７３、配列番号１１７４、配列番号１１７５、配列番号１１７６、配列番号１１７７、配列番号１１７８、配列番号１１７９、配列番号１１９１、配列番号１１９２、配列番号１１９３、および配列番号１１９４から選択される配列を含む。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌により発現される、ＩＬ−１２（ｐ４０）サブユニットに連結されたＩＬ−１２（ｐ３５）サブユニットは、配列番号１１６９、配列番号１１７０、配列番号１１７１、配列番号１１７２、配列番号１１７３、配列番号１１７４、配列番号１１７５、配列番号１１７６、配列番号１１７７、配列番号１１７８、配列番号１１７９、配列番号１１９１、配列番号１１９２、配列番号１１９３、および配列番号１１９４から選択される配列からなる。遺伝子操作された細菌が、ＩＬ−１２（ｐ４０）サブユニットに連結されたＩＬ−１２（ｐ３５）サブユニットをコードする、これらの実施形態のいずれにおいても、Ｖ５、ＦＬＡＧまたはＨｉｓタグなどの、タグをコードする配列の１つまたは複数は、除去される。他の実施形態では、分泌タグは除去され、異なる分泌タグにより置換される。
これらの実施形態のいずれにおいても、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より少なくとも約０％〜２％〜４％、４％〜６％、６％〜８％、８％〜１０％、１０％〜１２％、１２％〜１４％、１４％〜１６％、１６％〜１８％、１８％〜２０％、２０％〜２５％、２５％〜３０％、３０％〜３５％、３５％〜４０％、４０％〜４５％、４５％〜５０％、５０％〜５５％、５５％〜６０％、６０％〜６５％、６５％〜７０％〜８０％、８０％〜９０％、または９０％〜１００％多いＩＬ−１２を産生する。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より少なくとも約１．０〜１．２倍、１．２〜１．４倍、１．４〜１．６倍、１．６〜１．８倍、１．８〜２倍、または２倍多いＩＬ−１２を産生する。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より少なくとも約３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、４０倍、または５０倍、１００倍、５００倍、または１０００倍多いＩＬ−１２を産生する。
これらの実施形態のいずれにおいても、遺伝子操作された細菌は、例えば４時間の誘導後、培地１ｍｌ当たり少なくとも約５〜１０、１０〜２０、２０〜３０、３０〜４０、４０〜５０、５０〜６０、６０〜７０、８０〜９０、９０〜１００、１００〜１５０、１５０〜２００、２００〜２５０、２５０〜３００、３００〜３５０、３５０〜４００ｐｇを産生する。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、例えば４時間の誘導後、培地１ｍｌ当たり少なくとも約１９５、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、３１０、３２０、３３０、３４０、３５０、３６０、３７０、３８０、３９０、４００、４１０、４２０、４３０、４４０、４５０、４６０、４７０、４８０、４９０または５００ｐｇを産生する。
これらの実施形態のいずれにおいても、ＩＬ−１２を産生するように遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より少なくとも約０％〜２％〜４％、４％〜６％、６％〜８％、８％〜１０％、１０％〜１２％、１２％〜１４％、１４％〜１６％、１６％〜１８％、１８％〜２０％、２０％〜２５％、２５％〜３０％、３０％〜３５％、３５％〜４０％、４０％〜４５％、４５％〜５０％、５０％〜５５％、５５％〜６０％、６０％〜６５％、６５％〜７０％〜８０％、８０％〜９０％、または９０％〜１００％多いＩＬ−１２を分泌する。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より少なくとも約１．０〜１．２倍、１．２〜１．４倍、１．４〜１．６倍、１．６〜１．８倍、１．８〜２倍、または２倍多いＩＬ−１２を分泌する。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より少なくとも約３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、４０倍、または５０倍、１００倍、５００倍、または１０００倍多いＩＬ−１２を分泌する。
一部の実施形態では、ＩＬ−１２を分泌するように遺伝子操作された細菌は、細胞増殖を、同じ条件下で、同じ亜型の未改変細菌と比較して、少なくとも約１０％〜２０％、２０％〜２５％、２５％〜３０％、３０％〜４０％、４０％〜５０％、５０％〜６０％、６０％〜７０％、７０％〜７５％、７５％〜８０％、８０％〜８５％、８５％〜９０％、９０％〜９５％、９５％〜９９％１０％〜２０％、２０％〜２５％、２５％〜３０％、３０％〜４０％、４０％〜５０％、５０％〜６０％、６０％〜７０％、７０％〜７５％、７５％〜８０％、８０％〜８５％、８５％〜９０％、９０％〜９５％、９５％〜９９％、またはそれより大きく低減することができる。
一部の実施形態では、ＩＬ−１２を分泌するように遺伝子操作された細菌は、腫瘍増殖を、同じ条件下で、同じ亜型の未改変細菌と比較して、少なくとも約１０％〜２０％、２０％〜２５％、２５％〜３０％、３０％〜４０％、４０％〜５０％、５０％〜６０％、６０％〜７０％、７０％〜７５％、７５％〜８０％、８０％〜８５％、８５％〜９０％、９０％〜９５％、９５％〜９９％１０％〜２０％、２０％〜２５％、２５％〜３０％、３０％〜４０％、４０％〜５０％、５０％〜６０％、６０％〜７０％、７０％〜７５％、７５％〜８０％、８０％〜８５％、８５％〜９０％、９０％〜９５％、９５％〜９９％、またはそれより大きく低減することができる。一部の実施形態では、ＩＬ−１２を分泌するように遺伝子操作された細菌は、腫瘍サイズを、同じ条件下で、同じ亜型の未改変細菌と比較して、少なくとも約１０％〜２０％、２０％〜２５％、２５％〜３０％、３０％〜４０％、４０％〜５０％、５０％〜６０％、６０％〜７０％、７０％〜７５％、７５％〜８０％、８０％〜８５％、８５％〜９０％、９０％〜９５％、９５％〜９９％、またはそれより大きく低減することができる。一部の実施形態では、ＩＬ−１２を分泌するように遺伝子操作された細菌は、腫瘍体積を、同じ条件下で、同じ亜型の未改変細菌と比較して、少なくとも約１０％〜２０％、２０％〜２５％、２５％〜３０％、３０％〜４０％、４０％〜５０％、５０％〜６０％、６０％〜７０％、７０％〜７５％、７５％〜８０％、８０％〜８５％、８５％〜９０％、９０％〜９５％、９５％〜９９％、またはそれより大きく低減することができる。一部の実施形態では、ＩＬ−１２を分泌するように遺伝子操作された細菌は、腫瘍重量を、同じ条件下で、同じ亜型の未改変細菌と比較して、少なくとも約１０％〜２０％、２０％〜２５％、２５％〜３０％、３０％〜４０％、４０％〜５０％、５０％〜６０％、６０％〜７０％、７０％〜７５％、７５％〜８０％、８０％〜８５％、８５％〜９０％、９０％〜９５％、９５％〜９９％、またはそれより大きく低減することができる。一部の実施形態では、ＩＬ−１２を分泌するように遺伝子操作された細菌は、奏効率を、同じ条件下で、同じ亜型の未改変細菌と比較して、少なくとも約１０％〜２０％、２０％〜２５％、２５％〜３０％、３０％〜４０％、４０％〜５０％、５０％〜６０％、６０％〜７０％、７０％〜７５％、７５％〜８０％、８０％〜８５％、８５％〜９０％、９０％〜９５％、９５％〜９９％、またはそれより大きく増大することができる。
ＩＬ−１５は、自然免疫系と適応免疫系両方の恒常性において多面的機能を示し、３つのサブユニットで構成されているヘテロ三量体受容体であるＩＬ−１５受容体と結合する。アルファサブユニットは、ＩＬ−１５に特異的であるが、ベータ（ＣＤ１２２）およびガンマ（ＣＤ１３２）サブユニットは、ＩＬ−２受容体と共有され、ＪＡＫ／ＳＴＡＴ経路を介して共同でシグナル伝達することができる。
ＩＬ−１５は、樹状細胞、単球およびマクロファージを含む、いくつかの細胞型により産生される。同じ細胞において産生されたＩＬ−１５ＲαおよびＩＬ−１５の同時発現は、ＩＬ−１５のＩＬ−１５Ｒαとの細胞内結合を可能にし、これは、その後、複合体として細胞表面にピストン輸送される。細胞表面にピストン輸送されると、次いで、これらの細胞のＩＬ−１５Ｒαは、ＩＬ−１５を発現しないＣＤ８ Ｔ細胞、ＮＫ細胞およびＮＫ−Ｔ細胞のＩＬ−１５Ｒβ−γｃに、ＩＬ−１５をトランス提示することができ、これにより、いわゆる免疫学的シナプスの形成が誘導される。マウスおよびヒトＩＬ−１５Ｒαは、両方とも、結合した膜中に存在し、およびまた可溶性形態で存在する。可溶性ＩＬ−１５Ｒα（ｓＩＬ−１５Ｒα）は、膜貫通受容体からタンパク質切断によって構成的に生成される。
ＩＬ−１５は、リンパ球発生、および自然免疫細胞の末梢維持、ならびにＴ細胞、特に、ナチュラルキラー（ＮＫ）およびＣＤ８＋Ｔ細胞集団の免疫学的記憶に、非常に重要である。ＩＬ−２とは対照的に、ＩＬ−１５は、Ｔｒｅｇの維持を促進せず、さらに、ＩＬ−１５は、ＩＬ−２により媒介される活性化誘導細胞死からエフェクターＴ細胞を保護することが示されている。
それ故に、ＩＬ−１５の送達は、長期にわたる抗腫瘍免疫のための有望な戦略と考えられる。組換えヒトＩＬ−１５のヒトで初めての臨床試験において、ＮＫ細胞１０倍拡大増殖、ならびにγδＴ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖の有意な増加が、処置時に観察された。加えて、サイトカイン−受容体融合複合体を含有するＩＬ−１５スーパーアゴニストが開発され、応答長を延長することが評価されている。これらは、Ｌ−１５ Ｎ７２Ｄスーパーアゴニスト／ＩＬ−１５ＲαＳｕｓｈｉ−Ｆｃ融合複合体（ＩＬ−１５ＳＡ／ＩＬ−１５ＲαＳｕ−Ｆｃ；ＡＬＴ−８０３）を含む（Ｋｉｍら、２０１６年 ＩＬ−１５ ｓｕｐｅｒａｇｏｎｉｓｔ／ＩＬ−１５ＲαＳｕｓｈｉ−Ｆｃ ｆｕｓｉｏｎ ｃｏｍｐｌｅｘ （ＩＬ−１５ＳＡ／ＩＬ− １５ＲαＳｕ−Ｆｃ； ＡＬＴ−８０３） ｍａｒｋｅｄｌｙ ｅｎｈａｎｃｅｓ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｓｕｂｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ ｏｆ ＮＫ ａｎｄ ｍｅｍｏｒｙ ＣＤ８＋ Ｔ ｃｅｌｌｓ，
ａｎｄ ｍｅｄｉａｔｅｓ ｐｏｔｅｎｔ ａｎｔｉ−ｔｕｍｏｒ ａｃｔｉｖｉｔｙ ａｇａｉｎｓｔ ｍｕｒｉｎｅ ｂｒｅａｓｔ ａｎｄ ｃｏｌｏｎ ｃａｒｃｉｎｏｍａｓ）。
したがって、一部の実施形態では、操作された細菌は、ＩＬ−１５を産生するように操作されている。一部の実施形態では、ＩＬ−１５は分泌される。
ＩＬ−１５の生物活性は、ＩＬ−１５を融合タンパク質ＩＬ−１５Ｒα−Ｆｃと前もって会合させることによって、または細胞会合ＩＬ−１５ＲαによるＩＬ−１５のトランス提示を模倣するためのＩＬ−１５Ｒαのｓｕｓｈｉドメインとの直接融合（ハイパーＩＬ−１５）によって、大きく向上される。単独で、またはＩＬ−１５Ｒαとの複合体として、いずれかで投与されたＩＬ−１５は、動物モデルにおいて強力な抗腫瘍活性を示す（Ｃｈｅｎｇら、Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ ｏｆ ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ ａｎｄ ａｕｔｏｃｈｔｈｏｎｏｕｓ ｌｉｖｅｒ ｃａｎｃｅｒ ｗｉｔｈ ＩＬ−１５／ＩＬ−１５Ｒα ｆｕｓｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ；Ｏｎｃｏｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．２０１４年；３巻（１１号）：ｅ９６３４０９頁、およびその中の参考文献）。
一部の実施形態では、操作された細菌は、ＩＬ−１５をコードする遺伝子配列を含む。一部の実施形態では、操作された細菌は、ＩＬ−１５Ｒａをコードするための配列を含む。一部の実施形態では、操作された細菌は、ＩＬ−１５をコードするための配列、およびＩＬ−１５Ｒａをコードするための配列を含む。一部の実施形態では、操作された細菌は、ＩＬ−１５およびＩＬ−１５Ｒａを含む融合ポリペプチドをコードするための配列を含む。一部の実施形態では、操作された細菌は、ＩＬ−１５をコードする配列、および分泌タグをコードする配列を含む。例示的な分泌タグは、当該技術分野で公知であり、本明細書に記載されている。
これらの実施形態のいずれにおいても、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より少なくとも約０％〜２％〜４％、４％〜６％、６％〜８％、８％〜１０％、１０％〜１２％、１２％〜１４％、１４％〜１６％、１６％〜１８％、１８％〜２０％、２０％〜２５％、２５％〜３０％、３０％〜３５％、３５％〜４０％、４０％〜４５％、４５％〜５０％、５０％〜５５％、５５％〜６０％、６０％〜６５％、６５％〜７０％〜８０％、８０％〜９０％、または９０％〜１００％多いＩＬ−１５またはＩＬ−１５／ＩＬ−１５Ｒα融合タンパク質を産生する。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より少なくとも約１．０〜１．２倍、１．２〜１．４倍、１．４〜１．６倍、１．６〜１．８倍、１．８〜２倍、または２倍多いＩＬ−１５またはＩＬ−１５／ＩＬ−１５Ｒα融合タンパク質を産生する。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より少なくとも約３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、４０倍、または５０倍、１００倍、５００倍、または１０００倍多いＩＬ−１５またはＩＬ−１５／ＩＬ−１５Ｒα融合タンパク質を産生する。
これらの実施形態のいずれにおいても、ＩＬ−１５またはＩＬ−１５／ＩＬ−１５Ｒα融合タンパク質を産生するように遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より少なくとも約０％〜２％〜４％、４％〜６％、６％〜８％、８％〜１０％、１０％〜１２％、１２％〜１４％、１４％〜１６％、１６％〜１８％、１８％〜２０％、２０％〜２５％、２５％〜３０％、３０％〜３５％、３５％〜４０％、４０％〜４５％、４５％〜５０％、５０％〜５５％、５５％〜６０％、６０％〜６５％、６５％〜７０％〜８０％、８０％〜９０％、または９０％〜１００％多いＩＬ−１５またはＩＬ−１５／ＩＬ−１５Ｒα融合タンパク質を分泌する。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より少なくとも約１．０〜１．２倍、１．２〜１．４倍、１．４〜１．６倍、１．６〜１．８倍、１．８〜２倍、または２倍多いＩＬ−１５またはＩＬ−１５／ＩＬ−１５Ｒα融合タンパク質を分泌する。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より少なくとも約３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、４０倍、または５０倍、１００倍、５００倍、または１０００倍多いＩＬ−１５またはＩＬ−１５／ＩＬ−１５Ｒα融合タンパク質を分泌する。
一部の実施形態では、ＩＬ−１５またはＩＬ−１５／ＩＬ−１５Ｒα融合タンパク質を分泌するように遺伝子操作された細菌は、細胞増殖を、同じ条件下で、同じ亜型の未改変細菌と比較して少なくとも約１０％〜２０％、２０％〜２５％、２５％〜３０％、３０％〜４０％、４０％〜５０％、５０％〜６０％、６０％〜７０％、７０％〜７５％、７５％〜８０％、８０％〜８５％、８５％〜９０％、９０％〜９５％、９５％〜９９％、またはそれより大きく低減させることができる。一部の実施形態では、ＩＬ−１５またはＩＬ−１５／ＩＬ−１５Ｒα融合タンパク質を分泌するように遺伝子操作された細菌は、腫瘍成長を、同じ条件下で、同じ亜型の未改変細菌と比較して少なくとも約１０％〜２０％、２０％〜２５％、２５％〜３０％、３０％〜４０％、４０％〜５０％、５０％〜６０％、６０％〜７０％、７０％〜７５％、７５％〜８０％、８０％〜８５％、８５％〜９０％、９０％〜９５％、９５％〜９９％、またはそれより大きく低減させることができる。一部の実施形態では、ＩＬ−１５またはＩＬ−１５／ＩＬ−１５Ｒα融合タンパク質を分泌するように遺伝子操作された細菌は、腫瘍サイズを、同じ条件下で、同じ亜型の未改変細菌と比較して少なくとも約１０％〜２０％、２０％〜２５％、２５％〜３０％、３０％〜４０％、４０％〜５０％、５０％〜６０％、６０％〜７０％、７０％〜７５％、７５％〜８０％、８０％〜８５％、８５％〜９０％、９０％〜９５％、９５％〜９９％、またはそれより大きく低減させることができる。一部の実施形態では、ＩＬ−１５またはＩＬ−１５／ＩＬ−１５Ｒα融合タンパク質を産生するように遺伝子操作された細菌は、腫瘍体積を、同じ条件下で、同じ亜型の未改変細菌と比較して少なくとも約１０％〜２０％、２０％〜２５％、２５％〜３０％、３０％〜４０％、４０％〜５０％、５０％〜６０％、６０％〜７０％、７０％〜７５％、７５％〜８０％、８０％〜８５％、８５％〜９０％、９０％〜９５％、９５％〜９９％、またはそれより大きく低減させることができる。一部の実施形態では、ＩＬ−１５またはＩＬ−１５／ＩＬ−１５Ｒα融合タンパク質を産生するように遺伝子操作された細菌は、腫瘍重量を、同じ条件下で、同じ亜型の未改変細菌と比較して少なくとも約１０％〜２０％、２０％〜２５％、２５％〜３０％、３０％〜４０％、４０％〜５０％、５０％〜６０％、６０％〜７０％、７０％〜７５％、７５％〜８０％、８０％〜８５％、８５％〜９０％、９０％〜９５％、９５％〜９９％、またはそれより大きく低減させることができる。一部の実施形態では、ＩＬ−１５またはＩＬ−１５／ＩＬ−１５Ｒα融合タンパク質を産生するように遺伝子操作された細菌は、奏功率を、同じ条件下で、同じ亜型の未改変細菌と比較して少なくとも約１０％〜２０％、２０％〜２５％、２５％〜３０％、３０％〜４０％、４０％〜５０％、５０％〜６０％、６０％〜７０％、７０％〜７５％、７５％〜８０％、８０％〜８５％、８５％〜９０％、９０％〜９５％、９５％〜９９％、またはそれより大きく上昇させることができる。
一部の実施形態では、ＩＬ−１５またはＩＬ−１５／ＩＬ−１５Ｒα融合タンパク質を産生するように遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ亜型の未改変細菌と比較して少なくとも約１０％〜２０％、２０％〜２５％、２５％〜３０％、３０％〜４０％、４０％〜５０％、５０％〜６０％、６０％〜７０％、７０％〜７５％、７５％〜８０％、８０％〜８５％、８５％〜９０％、９０％〜９５％、９５％〜９９％、またはそれより大きく、ＮＫ細胞の拡大増殖を促進することができる。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より少なくとも１．０〜１．２倍、１．２〜１．４倍、１．４〜１．６倍、１．６〜１．８倍、１．８〜２倍、または２倍高度に、ＮＫ細胞の拡大増殖を促進する。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の細菌より少なくとも３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、１００倍、５００倍、または１０００倍高度に、ＮＫ細胞の拡大増殖を促進する。
一部の実施形態では、ＩＬ−１５またはＩＬ−１５／ＩＬ−１５Ｒα融合タンパク質を産生するように遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ亜型の未改変細菌と比較して少なくとも約１０％〜２０％、２０％〜２５％、２５％〜３０％、３０％〜４０％、４０％〜５０％、５０％〜６０％、６０％〜７０％、７０％〜７５％、７５％〜８０％、８０％〜８５％、８５％〜９０％、９０％〜９５％、９５％〜９９％、またはそれより高度に、γδＴ細胞および／またはＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖を増加させることができる。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より少なくとも１．０〜１．２倍、１．２〜１．４倍、１．４〜１．６倍、１．６〜１．８倍、１．８〜２倍、または２倍高度に、γδＴ細胞および／またはＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖を増加させる。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より少なくとも３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、１００倍、５００倍、または１０００倍高度に、γδＴ細胞および／またはＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖を増加させる。
一部の実施形態では、ＩＬ−１５またはＩＬ−１５／ＩＬ−１５Ｒα融合タンパク質を産生するように遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ亜型の未改変細菌と比較して少なくとも約１０％〜２０％、２０％〜２５％、２５％〜３０％、３０％〜４０％、４０％〜５０％、５０％〜６０％、６０％〜７０％、７０％〜７５％、７５％〜８０％、８０％〜８５％、８５％〜９０％、９０％〜９５％、９５％〜９９％、またはそれより大きい親和性によりＩＬ−１５またはＩＬ−１５／ＩＬ−１５Ｒα融合タンパク質受容体と結合することができる。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より少なくとも１．０〜１．２倍、１．２〜１．４倍、１．４〜１．６倍、１．６〜１．８倍、１．８〜２倍、または２倍大きい親和性でＩＬ−１５またはＩＬ−１５／ＩＬ−１５Ｒα融合タンパク質受容体と結合する。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より少なくとも３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、１００倍、５００倍、または１０００倍もしくはそれより大きい親和性で、ＩＬ−１５またはＩＬ−１５／ＩＬ−１５Ｒα融合タンパク質受容体と結合することができる。
一部の実施形態では、分泌のためのＩＬ−１５をコードする１つまたは複数の遺伝子を含む遺伝子操作された細菌は、例えばＣＤ３＋ＩＬ１５ＲＡアルファ＋Ｔ細胞において、ＳＴＡＴ５リン酸化を誘導することができる。一部の実施形態では、ＩＬ−１５またはＩＬ−１５／ＩＬ−１５Ｒα融合タンパク質を産生するように遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ亜型の未改変細菌と比較して少なくとも約１０％〜２０％、２０％〜２５％、２５％〜３０％、３０％〜４０％、４０％〜５０％、５０％〜６０％、６０％〜７０％、７０％〜７５％、７５％〜８０％、８０％〜８５％、８５％〜９０％、９０％〜９５％、９５％〜９９％、またはそれよりもっと高レベルにＳＴＡＴ５リン酸化を誘導することができる。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より少なくとも１．０〜１．２倍、１．２〜１．４倍、１．４〜１．６倍、１．６〜１．８倍、１．８〜２倍、または２倍もしくはそれよりもっと高レベルにＳＴＡＴ５リン酸化を誘導する。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より少なくとも３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、１００倍、５００倍、または１０００倍もしくはそれよりもっと高レベルにＳＴＡＴ５リン酸化を誘導する。一実施形態では、ＩＬ−１５分泌株は、同じ条件下で、同じ量で、ｒｈＩＬ１５のものに匹敵するＳＴＡＴ５リン酸化を誘導する。
一部の実施形態では、分泌のためのＩＬ−１５をコードする１つまたは複数の遺伝子を含む遺伝子操作された細菌は、例えばＣＤ３＋ＩＬ１５ＲＡアルファ＋Ｔ細胞において、ＳＴＡＴ３リン酸化を誘導することができる。一部の実施形態では、分泌のためのＩＬ−１５をコードする１つまたは複数の遺伝子を含む遺伝子操作された細菌は、例えばＣＤ３＋ＩＬ１５ＲＡアルファ＋Ｔ細胞において、ＳＴＡＴ３リン酸化を誘導することができる。一部の実施形態では、ＩＬ−１５またはＩＬ−１５／ＩＬ−１５Ｒα融合タンパク質を産生するように遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ亜型の未改変細菌と比較して少なくとも約１０％〜２０％、２０％〜２５％、２５％〜３０％、３０％〜４０％、４０％〜５０％、５０％〜６０％、６０％〜７０％、７０％〜７５％、７５％〜８０％、８０％〜８５％、８５％〜９０％、９０％〜９５％、９５％〜９９％、またはそれよりもっと高レベルにＳＴＡＴ３リン酸化を誘導することができる。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より少なくとも１．０〜１．２倍、１．２〜１．４倍、１．４〜１．６倍、１．６〜１．８倍、１．８〜２倍、または２倍もしくはそれよりもっと高レベルにＳＴＡＴ３リン酸化を誘導する。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より少なくとも３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、１００倍、５００倍、または１０００倍もしくはもっと高レベルにＳＴＡＴ３リン酸化を誘導する。一実施形態では、ＩＬ−１５分泌株は、同じ条件下で、同じ量で、ｒｈＩＬ１５のものに匹敵するＳＴＡＴ３リン酸化を誘導する。
一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、配列番号１１３３、配列番号１１３４、配列番号１１３５、配列番号１１３６から選択される配列と少なくとも約８０％の同一性を有する１つまたは複数のＩＬ−１５、ＩＬ−Ｒアルファ、リンカー、およびＩＬ−１５−ＩＬ１５Ｒアルファ融合ポリペプチドをコードする遺伝子配列を含む。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、配列番号１１３３、配列番号１１３４、配列番号１１３５、配列番号１１３６から選択される配列と少なくとも約９０％の同一性を有する１つまたは複数のＩＬ−１５、ＩＬ−Ｒアルファ、リンカー、およびＩＬ−１５−ＩＬ１５Ｒアルファ融合ポリペプチドをコードする遺伝子配列を含む。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、配列番号１１３３、配列番号１１３４、配列番号１１３５、配列番号１１３６から選択される配列と少なくとも約９０％の同一性を有する１つまたは複数のＩＬ−１５、ＩＬ−Ｒアルファ、リンカー、およびＩＬ−１５−ＩＬ１５Ｒアルファ融合ポリペプチドをコードする遺伝子配列を含む。
一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、配列番号１１３３、配列番号１１３４、配列番号１１３５、配列番号１１３６から選択される１つもしくは複数のポリペプチドまたはその機能性断片と少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９９％同一性を有するポリペプチドをコードする遺伝子配列を含む。他の特定の実施形態では、ポリペプチドは、配列番号１１３３、配列番号１１３４、配列番号１１３５、配列番号１１３６から選択される１つまたは複数のポリペプチドからなる。
一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ＩＬ−１５、ＩＬ−Ｒアルファ、リンカー、およびＩＬ−１５−ＩＬ１５Ｒアルファ融合タンパク質またはその断片もしくは機能性バリアントをコードする遺伝子配列を含む。一実施形態では、ＩＬ−１５またはＩＬ−１５融合タンパク質をコードする遺伝子配列は、配列番号１３３８、配列番号１３３９、配列番号１３４０、配列番号１３４１、配列番号１３４２、配列番号１３４３、配列番号１３４４から選択される配列と少なくとも約９０％の同一性を有する。一実施形態では、ＩＬ−１５またはＩＬ−１５融合タンパク質をコードする遺伝子配列は、配列番号１３３８、配列番号１３３９、配列番号１３４０、配列番号１３４１、配列番号１３４２、配列番号１３４３、配列番号１３４４から選択される配列と少なくとも約８０％の同一性を有する。一実施形態では、ＩＬ−１５またはＩＬ−１５融合タンパク質をコードする遺伝子配列は、配列番号１３３８、配列番号１３３９、配列番号１３４０、配列番号１３４１、配列番号１３４２、配列番号１３４３、配列番号１３４４から選択される配列と少なくとも約９５％の同一性を有する。ある特定の実施形態では、ＩＬ−１５、ＩＬ−Ｒアルファ、リンカー、およびＩＬ−１５−ＩＬ１５Ｒアルファ融合タンパク質配列は、配列番号１３３８、配列番号１３３９、配列番号１３４０、配列番号１３４１、配列番号１３４２、配列番号１３４３、配列番号１３４４から選択される１つもしくは複数のポリヌクレオチドまたはその機能性断片と少なくとも約８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有する。一部の特定の実施形態では、遺伝子配列は、配列番号１３３８、配列番号１３３９、配列番号１３４０、配列番号１３４１、配列番号１３４２、配列番号１３４３、配列番号１３４４から選択される１つまたは複数のポリヌクレオチドを含む。他の特定の実施形態では、遺伝子配列は、配列番号１３３８、配列番号１３３９、配列番号１３４０、配列番号１３４１、配列番号１３４２、配列番号１３４３、配列番号１３４４から選択される１つまたは複数のポリヌクレオチドからなる。
一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ＩＬ−１５もしくはＩＬ−１５融合タンパク質、またはその断片もしくは機能性バリアントをコードする、遺伝子配列を含む。一実施形態では、ＩＬ−１５またはＩＬ−１５融合タンパク質をコードする遺伝子配列は、配列番号１３４５、配列番号１２００、配列番号１２０１、配列番号１２０２、配列番号１２０３、配列番号１２０４、および配列番号１１９９から選択される配列と少なくとも約８０％の同一性を有する。別の実施形態では、ＩＬ−１５またはＩＬ−１５融合タンパク質をコードする遺伝子配列は、配列番号１３４５、配列番号１２００、配列番号１２０１、配列番号１２０２、配列番号１２０３、配列番号１２０４、および配列番号１１９９から選択される配列と少なくとも約８５％の同一性を有する。一実施形態では、ＩＬ−１５またはＩＬ−１５融合タンパク質をコードする遺伝子配列は、配列番号１３４５、配列番号１２００、配列番号１２０１、配列番号１２０２、配列番号１２０３、配列番号１２０４、および配列番号１１９９から選択される配列と少なくとも約９０％の同一性を有する。一実施形態では、遺伝子配列ＩＬ−１５またはＩＬ−１５融合タンパク質は、配列番号１３４５、配列番号１２００、配列番号１２０１、配列番号１２０２、配列番号１２０３、配列番号１２０４、および配列番号１１９９から選択される配列と少なくとも約９５％の同一性を有する。別の実施形態では、ＩＬ−１５またはＩＬ−１５融合タンパク質をコードする遺伝子配列は、配列番号１３４５、配列番号１２００、配列番号１２０１、配列番号１２０２、配列番号１２０３、配列番号１２０４、および配列番号１１９９から選択される配列と少なくとも約９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有する。したがって、一実施形態では、ＩＬ−１５またはＩＬ−１５融合タンパク質をコードする遺伝子配列は、配列番号１３４５、配列番号１２００、配列番号１２０１、配列番号１２０２、配列番号１２０３、配列番号１２０４、および配列番号１１９９から選択される配列と少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有する。別の実施形態では、ＩＬ−１５またはＩＬ−１５融合タンパク質をコードする遺伝子配列は、配列番号１３４５、配列番号１２００、配列番号１２０１、配列番号１２０２、配列番号１２０３、配列番号１２０４、および配列番号１１９９から選択される配列を含む。さらに別の実施形態では、ＩＬ−１５またはＩＬ−１５融合タンパク質をコードする遺伝子配列は、配列番号１３４５、配列番号１２００、配列番号１２０１、配列番号１２０２、配列番号１２０３、配列番号１２０４、および配列番号１１９９から選択される配列からなる。これらの実施形態のいずれにおいても、遺伝子操作された細菌は、ＩＬ−１５またはＩＬ−１５融合タンパク質をコードし、タグをコードする配列の１つまたは複数の配列は、除去される。
一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、配列番号１１９５、配列番号１１９６、配列番号１１９７、および配列番号１１９８から選択される配列と少なくとも約８０％の同一性を有する本明細書に記載のＩＬ−１５またはＩＬ−１５融合タンパク質をコードする遺伝子配列を含む。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、配列番号１１９５、配列番号１１９６、配列番号１１９７、および配列番号１１９８から選択される配列と少なくとも約９０％の同一性をほぼ有することがあるＩＬ−１５またはＩＬ−１５融合タンパク質をコードする遺伝子配列を含む。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、配列番号１１９５、配列番号１１９６、配列番号１１９７、および配列番号１１９８から選択される配列と少なくとも約９５％の同一性をほぼ有することがあるＩＬ−１５またはＩＬ−１５融合タンパク質をコードする遺伝子配列を含む。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、配列番号１１９５、配列番号１１９６、配列番号１１９７、および配列番号１１９８から選択される配列またはその機能性断片と約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有するＩＬ−１５またはＩＬ−１５融合タンパク質をコードする遺伝子配列を含む。別の実施形態では、ＩＬ−１５またはＩＬ−１５融合タンパク質は、配列番号１１９５、配列番号１１９６、配列番号１１９７および配列番号１１９８から選択される配列を含む。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌により発現されるＩＬ−１５またはＩＬ−１５融合タンパク質は、配列番号１１９５、配列番号１１９６、配列番号１１９７および配列番号１１９８から選択される配列からなる。遺伝子操作された細菌がＩＬ−１５またはＩＬ−１５融合タンパク質をコードする、これらの実施形態のいずれにおいても、分泌タグを除去してもよく、異なる分泌タグで置換してもよい。
インターフェロンガンマ（ＩＦＮγまたはＩＩ型インターフェロン）は、ウイルス、一部の細菌および原虫感染に対する自然または適応免疫に、非常に重要なサイトカインである。ＩＦＮγは、マクロファージを活性化し、クラスＩＩ主要組織適合複合体（ＭＨＣ）分子発現を誘導する。ＩＦＮγは、ウイルス複製を阻害することができ、免疫系において免疫刺激および免疫モジュレーション効果を有する。ＩＦＮγは、主として、ナチュラルキラー（ＮＫ）およびナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞により自然免疫応答の一部として、ならびにＣＤ４ Ｔｈ１およびＣＤ８細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）エフェクターＴ細胞により産生される。抗原特異的免疫が発生すると、ＩＦＮγは、ヘルパーＴ細胞（特に、Ｔｈ１細胞）、細胞傷害性Ｔ細胞（ＴＣ細胞）およびＮＫ細胞のみによって分泌される。ＩＦＮγは、非常に多くの免疫刺激効果を有し、免疫系においていくつかの異なる役割を果たし、そのような役割には、ＮＫ細胞活性の促進、マクロファージの抗原提示およびリソソーム活性の増大、誘導性一酸化窒素シンターゼｉＮＯＳの活性化、活性化血漿Ｂ細胞からのある特定のＩｇＧの産生、細胞免疫につながるＴｈ１分化の促進が含まれる。ＩＦＮγはまた、正常細胞に、抗原提示細胞上でのクラスＩ ＭＨＣ分子はもちろんクラスＩＩ ＭＨＣの発現を増加させ、白血球遊走に関連する接着および結合を促進し、マクロファージの、それらが細胞内生物を死滅させる点でより強力になるような、活性化による肉芽腫形成に関与する。
これらの実施形態のいずれにおいても、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より少なくとも約０％〜２％〜４％、４％〜６％、６％〜８％、８％〜１０％、１０％〜１２％、１２％〜１４％、１４％〜１６％、１６％〜１８％、１８％〜２０％、２０％〜２５％、２５％〜３０％、３０％〜３５％、３５％〜４０％、４０％〜４５％、４５％〜５０％、５０％〜５５％、５５％〜６０％、６０％〜６５％、６５％〜７０％〜８０％、８０％〜９０％、または９０％〜１００％多いＩＦＮ−ガンマを産生する。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より少なくとも約１．０〜１．２倍、１．２〜１．４倍、１．４〜１．６倍、１．６〜１．８倍、１．８〜２倍、または２倍多いＩＦＮ−ガンマを産生する。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、４０倍、または５０倍、１００倍、５００倍、または１０００倍多いＩＦＮ−ガンマを産生する。
これらの実施形態のいずれにおいても、ＩＦＮ−ガンマを産生するように遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より少なくとも約０％〜２％〜４％、４％〜６％、６％〜８％、８％〜１０％、１０％〜１２％、１２％〜１４％、１４％〜１６％、１６％〜１８％、１８％〜２０％、２０％〜２５％、２５％〜３０％、３０％〜３５％、３５％〜４０％、４０％〜４５％、４５％〜５０％、５０％〜５５％、５５％〜６０％、６０％〜６５％、６５％〜７０％〜８０％、８０％〜９０％、または９０％〜１００％多いＩＦＮ−ガンマを分泌する。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より少なくとも約１．０〜１．２倍、１．２〜１．４倍、１．４〜１．６倍、１．６〜１．８倍、１．８〜２倍、または２倍多いＩＦＮ−ガンマを分泌する。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、４０倍、または５０倍、１００倍、５００倍、または１０００倍多いＩＦＮ−ガンマを分泌する。
一部の実施形態では、ＩＦＮ−ガンマを分泌するように遺伝子操作された細菌は、細胞増殖を、同じ条件下で、同じ亜型の未改変細菌と比較して少なくとも約１０％〜２０％、２０％〜２５％、２５％〜３０％、３０％〜４０％、４０％〜５０％、５０％〜６０％、６０％〜７０％、７０％〜７５％、７５％〜８０％、８０％〜８５％、８５％〜９０％、９０％〜９５％、９５％〜９９％、またはそれより大きく低減させることができる。
一部の実施形態では、ＩＦＮ−ガンマをコードする１つまたは複数の遺伝子を含む遺伝子操作された細菌は、マクロファージ細胞系においてＳＴＡＴ１リン酸化を誘導する。これらの実施形態のいずれにおいても、ＩＦＮ−ガンマを産生するように遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より０％〜２％〜４％、４％〜６％、６％〜８％、８％〜１０％、１０％〜１２％、１２％〜１４％、１４％〜１６％、１６％〜１８％、１８％〜２０％、２０％〜２５％、２５％〜３０％、３０％〜３５％、３５％〜４０％、４０％〜４５％、４５％〜５０％、５０％〜５５％、５５％〜６０％、６０％〜６５％、６５％〜７０％〜８０％、８０％〜９０％、または９０％〜１００％もしくはそれより高レベルにＳＴＡＴ１リン酸化を誘導する。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より１．０〜１．２倍、１．２〜１．４倍、１．４〜１．６倍、１．６〜１．８倍、１．８〜２倍、または２倍もしくはそれより高レベルにＳＴＡＴ１リン酸化を誘導する。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、４０倍、または５０倍、１００倍、５００倍、または１０００倍もしくはそれより高いレベルにＳＴＡＴ１リン酸化を誘導する。
１つの特定の実施形態では、細菌は、腫瘍におけるＩＦＮガンマ産生を、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌と比較して腫瘍１グラム当たり０．１、０．２、０．３ｎｇ増加させることができる。１つの特定の実施形態では、細菌は、ＩＦＮガンマ産生を、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌と比較して約５、１０または１５倍増加させることができる。
一部の実施形態では、ＩＦＮガンマを分泌するように遺伝子操作された細菌は、腫瘍成長を、同じ条件下で、同じ亜型の未改変細菌と比較して少なくとも約１０％〜２０％、２０％〜２５％、２５％〜３０％、３０％〜４０％、４０％〜５０％、５０％〜６０％、６０％〜７０％、７０％〜７５％、７５％〜８０％、８０％〜８５％、８５％〜９０％、９０％〜９５％、９５％〜９９％、またはそれより大きく低減させることができる。
一部の実施形態では、ＩＦＮガンマを分泌するように遺伝子操作された細菌は、腫瘍サイズを、同じ条件下で、同じ亜型の未改変細菌と比較して少なくとも約１０％〜２０％、２０％〜２５％、２５％〜３０％、３０％〜４０％、４０％〜５０％、５０％〜６０％、６０％〜７０％、７０％〜７５％、７５％〜８０％、８０％〜８５％、８５％〜９０％、９０％〜９５％、９５％〜９９％、またはそれより大きく低減させることができる。一部の実施形態では、ＩＦＮガンマを産生するように遺伝子操作された細菌は、腫瘍体積を、同じ条件下で、同じ亜型の未改変細菌と比較して少なくとも約１０％〜２０％、２０％〜２５％、２５％〜３０％、３０％〜４０％、４０％〜５０％、５０％〜６０％、６０％〜７０％、７０％〜７５％、７５％〜８０％、８０％〜８５％、８５％〜９０％、９０％〜９５％、９５％〜９９％、またはそれより大きく低減させることができる。一部の実施形態では、ＩＦＮガンマを産生するように遺伝子操作された細菌は、腫瘍重量を、同じ条件下で、同じ亜型の未改変細菌と比較して少なくとも約１０％〜２０％、２０％〜２５％、２５％〜３０％、３０％〜４０％、４０％〜５０％、５０％〜６０％、６０％〜７０％、７０％〜７５％、７５％〜８０％、８０％〜８５％、８５％〜９０％、９０％〜９５％、９５％〜９９％、またはそれより大きく低減させることができる。一部の実施形態では、ＩＦＮガンマを産生するように遺伝子操作された細菌は、奏功率を、同じ条件下で、同じ亜型の未改変細菌と比較して少なくとも約１０％〜２０％、２０％〜２５％、２５％〜３０％、３０％〜４０％、４０％〜５０％、５０％〜６０％、６０％〜７０％、７０％〜７５％、７５％〜８０％、８０％〜８５％、８５％〜９０％、９０％〜９５％、９５％〜９９％、またはそれより大きく上昇させることができる。
インターロイキン−１８（ＩＬ−１８、これは、インターフェロン−ガンマ誘導因子としても公知である）は、ＩＬ−１スーパーファミリーに属する炎症性サイトカインであり、マクロファージおよび他の細胞により産生される。ＩＬ−１８は、インターロイキン−１８受容体と結合し、ＩＬ−１２と一緒に、ＩＬ−１８は、リポ多糖（ＬＰＳ）のような微生物産物による感染後に細胞媒介免疫を誘導する。ＩＬ−１８で刺激されると、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞およびある特定の１型ヘルパーＴ細胞は、マクロファージおよび他の免疫細胞の活性化に関与するインターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）またはＩＩ型インターフェロンを放出する。ＩＬ−１８はまた、重篤な炎症反応を誘導しうる。
したがって、一部の実施形態では、操作された細菌は、ＩＬ−１８を産生するように操作されている。一部の実施形態では、操作された細菌は、ＩＬ−１８をコードするための配列を含む。一部の実施形態では、操作された細菌は、例えば、強力なプロモーターに動作可能に連結した、および／またはＩＬ−１８遺伝子配列の１つより多くのコピーを含む、ＩＬ−１８を過剰発現するように、操作されている。一部の実施形態では、操作された細菌は、ＩＬ−１８遺伝子の２つまたはそれより多いコピー、例えば、ＩＬ−１８遺伝子の２、３、４、５、６またはそれより多いコピーをコードする配列を含む。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、低酸素条件により活性化されるプロモーターの制御下で、ＩＬ−１８を発現する、および／または分泌ペプチドを発現する。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、低酸素条件により活性化されるプロモーターの制御下で、ＩＬ−１８を発現する、および／または分泌ペプチドを発現する、細菌である。ある特定の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、低酸素条件によりまたは炎症性条件により活性化されるプロモーター、例えば、前記条件により活性化される、本明細書に記載のプロモーターのいずれかの制御下で、ＩＬ−１８および／または分泌ペプチドを発現する。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、がん特異的プロモーター、組織特異的プロモーター、または構成的プロモーター、例えば、本明細書に記載のプロモーターのいずれかの制御下で、ＩＬ−１８を発現する、および／または分泌ペプチドを発現する。
インターロイキン−２（ＩＬ−２）は、白血球（ｗｈｉｔｅ ｂｌｏｏｄ ｃｅｌｌ）（白血球（ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ）、多くの場合、リンパ球）の活性を調節するサイトカインである。ＩＬ−２は、微生物感染に対する、および外来のもの（「非自己」）と「自己」とを区別する際の、身体の自然応答の一部である。ＩＬ−２は、リンパ球により発現されるＩＬ−２受容体と結合することによってその効果を媒介する。ＩＬ−２は、サイトカインファミリーのメンバーであり、このファミリーは、ＩＬ−４、ＩＬ−７、ＩＬ−９、ＩＬ−１５およびＩＬ−２１も含む。ＩＬ−２は、アルファ、ベータおよびガンマサブユニットからなる複合体であるＩＬ−２受容体を介してシグナルを伝達する。ガンマサブユニットは、このサイトカイン受容体ファミリーのすべてのメンバーによって共有される。ＩＬ−２は、Ｔ細胞のエフェクターＴ細胞への分化を促進し、最初のＴ細胞が抗原により刺激されたときにメモリーＴ細胞への分化を促進する。抗原選択Ｔ細胞クローンの数および機能の拡大に依存する、Ｔ細胞の免疫学的記憶の発生におけるその役割によって、ＩＬ−２はまた、細胞媒介免疫において肝要な役割を果たす。ＩＬ−２は、食品医薬局（ＦＤＡ）によって、および欧州数カ国で、がん（悪性黒色腫、腎細胞がん）の処置に認可されている。ＩＬ−２は、黒色腫転移を処置するためにも使用され、高い完全奏功率を有する。
したがって、一部の実施形態では、操作された細菌は、ＩＬ−２を産生するように操作されている。一部の実施形態では、操作された細菌は、ＩＬ−２をコードするための配列を含む。一部の実施形態では、操作された細菌は、ＩＬ−２、例えば、強力なプロモーターに動作可能に連結したＩＬ−２、および／またはＩＬ−２遺伝子配列の１つより多くのコピーを含むＩＬ−２を過剰発現するように、操作されている。一部の実施形態では、操作された細菌は、ＩＬ−２遺伝子の２つまたはそれより多いコピー、例えば、ＩＬ−２遺伝子の２、３、４、５、６またはそれより多いコピーをコードする配列を含む。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、低酸素条件により活性化されるプロモーターの制御下で、ＩＬ−２を発現する、および／または分泌ペプチドを発現する。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、低酸素条件により活性化されるプロモーターの制御下で、ＩＬ−２を発現する、および／または分泌ペプチドを発現する、細菌である。ある特定の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、低酸素条件によりまたは炎症性条件により活性化されるプロモーター、例えば、前記条件により活性化される、本明細書に記載のプロモーターのいずれかの制御下で、ＩＬ−２および／または分泌ペプチドを発現する。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、がん特異的プロモーター、組織特異的プロモーター、または構成的プロモーター、例えば、本明細書に記載のプロモーターのいずれかの制御下で、ＩＬ−２を発現する、および／または分泌ペプチドを発現する。
インターロイキン−２１は、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞および細胞傷害性Ｔ細胞を含む、免疫系のある特定の細胞に対して強力な調節効果があるサイトカインである。ＩＬ−２１は、そのこれらの細胞における細胞分裂／増殖を誘導する。ＩＬ−２１は、活性化ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞に発現されるが、ほとんどの他の組織には発現されない。加えて、ＩＬ−２１発現は、ヘルパーＴ細胞のＴｈ２およびＴｈ１７サブセットでは上方調節される。ＩＬ−２１は、これらの細胞の機能を調節するＮＫ Ｔ細胞にも発現される。ＩＬ−２１と結合したとき、ＩＬ−２１受容体は、その標的遺伝子を活性化するためにＪａｋ１とＪａｋ３とＳＴＡＴ３ホモ二量体とを利用する、Ｊａｋ／ＳＴＡＴ経路を介して作用する。ＩＬ−２１は、ＩＬ−２産生能力がある特有のＣＤ２８＋ＣＤ１２７ｈｉ ＣＤ４５ＲＯ＋表現型を有するメモリー型ＣＴＬの集団の濃縮によってヒトＴ細胞の分化プログラミングをモジュレートすることが示されている。ＩＬ−２１には、永続的腫瘍免疫を獲得するための、ＣＤ８＋細胞応答の継続および増加による抗腫瘍効果もある。ＩＬ−２１は、転移性黒色腫（ＭＭ）および腎細胞癌（ＲＣＣ）患者における第１相臨床試験に認可されている。
したがって、一部の実施形態では、操作された細菌は、ＩＬ−２１を産生するように操作されている。一部の実施形態では、操作された細菌は、ＩＬ−２１をコードする配列を含む。一部の実施形態では、操作された細菌は、例えば、強力なプロモーターに動作可能に連結した、および／またはＩＬ−２１遺伝子配列の１つより多くのコピーを含む、ＩＬ−２１を過剰発現するように、操作されている。一部の実施形態では、操作された細菌は、ＩＬ−２１の２つまたはそれより多いコピー、例えば、ＩＬ−２１遺伝子の２、３、４、５、６またはそれより多いコピーをコードする配列を含む。一部の実施形態では、操作された細菌は、ＩＬ−２１の産生を刺激する１つまたは複数の免疫モジュレーターを産生する。一部の実施形態では、操作された細菌は、ＩＬ−２１をコードするための配列、およびＩｌ−２１の分泌のための分泌ペプチドをコードするための配列を含む。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、低酸素条件により活性化されるプロモーターの制御下で、ＩＬ−２１を発現する、および／または分泌ペプチドを発現する。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、低酸素条件により活性化されるプロモーターの制御下で、Ｉｌ−２１を発現する、および／または分泌ペプチドを発現する、細菌である。ある特定の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、低酸素条件によりまたは炎症性条件により活性化されるプロモーター、例えば、前記条件により活性化される、本明細書に記載のプロモーターのいずれかの制御下で、ＩＬ−２１および／または分泌ペプチドを発現する。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、がん特異的プロモーター、組織特異的プロモーター、または構成的プロモーター、例えば、本明細書に記載のプロモーターのいずれかの制御下で、ＩＬ−２１を発現する、および／または分泌ペプチドを発現する。
腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）（カケクチンまたはＴＮＦアルファとしても公知）は、ある特定の腫瘍細胞系の細胞溶解を引き起こすことができ、ある特定の条件下で細胞増殖を刺激し、細胞分化を誘導することができる、サイトカインである。ＴＮＦは、全身性炎症に関与し、急性相反応を構成するサイトカインの１つである。ＴＮＦは、主として活性化マクロファージによって産生されるが、多くの他の細胞型、例えば、ＣＤ４＋リンパ球、ＮＫ細胞、好中球、マスト細胞、好酸球およびニューロンによって産生されうる。ＴＮＦの主な役割は、免疫細胞の調節にある。
ＴＮＦは、ＴＮＦＲ１（ＴＮＦ受容体１型；ＣＤ１２０ａ；ｐ５５／６０）およびＴＮＦＲ２（ＴＮＦ受容体２型；ＣＤ１２０ｂ；ｐ７５／８０）という、２つの受容体に結合することができる。ＴＮＦＲ１は、ほとんどの組織で発現され、ＴＮＦの膜結合形態と可溶性三量体形態の両方によって完全に活性化されうるが、ＴＮＦＲ２は、免疫系の細胞にしか見られず、ＴＮＦホモ三量体の膜結合形態に応答する。その受容体と結合すると、ＴＮＦは、ＮＦ−κＢおよびＭＡＰＫ経路を活性化することができ、これらの経路は、非常に多くのタンパク質の転写を媒介し、ならびに炎症応答に関与する経路を含む、細胞分化および増殖に関与するいくつかの経路を媒介する。ＴＮＦは、細胞アポトーシスを誘導する経路も調節する。
一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、樹状細胞活性化をモジュレートする免疫モジュレーターを産生することができる。一部の実施形態では、免疫モジュレーターは、ＴＮＦである。したがって、一部の実施形態では、操作された細菌は、ＴＮＦを産生するように操作されている。一部の実施形態では、ＴＮＦは、本明細書に記載されるように、細菌から分泌される。一部の実施形態では、操作された細菌は、ＴＮＦをコードする配列を含む。
これらの実施形態のいずれにおいても、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より少なくとも約０％〜２％〜４％、４％〜６％、６％〜８％、８％〜１０％、１０％〜１２％、１２％〜１４％、１４％〜１６％、１６％〜１８％、１８％〜２０％、２０％〜２５％、２５％〜３０％、３０％〜３５％、３５％〜４０％、４０％〜４５％、４５％〜５０％、５０％〜５５％、５５％〜６０％、６０％〜６５％、６５％〜７０％〜８０％、８０％〜９０％、または９０％〜１００％多いＴＮＦを産生する。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より少なくとも約１．０〜１．２倍、１．２〜１．４倍、１．４〜１．６倍、１．６〜１．８倍、１．８〜２倍、または２倍多いＴＮＦを産生する。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、４０倍、または５０倍、１００倍、５００倍、または１０００倍多いＴＮＦを産生する。
これらの実施形態のいずれにおいても、ＴＮＦを産生するように遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より、少なくとも約０％〜２％〜４％、４％〜６％、６％〜８％、８％〜１０％、１０％〜１２％、１２％〜１４％、１４％〜１６％、１６％〜１８％、１８％〜２０％、２０％〜２５％、２５％〜３０％、３０％〜３５％、３５％〜４０％、４０％〜４５％、４５％〜５０％、５０％〜５５％、５５％〜６０％、６０％〜６５％、６５％〜７０％〜８０％、８０％〜９０％、または９０％〜１００％多いＴＮＦを分泌する。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より少なくとも約１．０〜１．２倍、１．２〜１．４倍、１．４〜１．６倍、１．６〜１．８倍、１．８〜２倍、または２倍多いＴＮＦを分泌する。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、４０倍、または５０倍、１００倍、５００倍、または１０００倍多いＴＮＦを分泌する。
一部の実施形態では、ＴＮＦを分泌するように遺伝子操作された細菌は、細胞増殖を、同じ条件下で、同じ亜型の未改変細菌と比較して少なくとも約１０％〜２０％、２０％〜２５％、２５％〜３０％、３０％〜４０％、４０％〜５０％、５０％〜６０％、６０％〜７０％、７０％〜７５％、７５％〜８０％、８０％〜８５％、８５％〜９０％、９０％〜９５％、９５％〜９９％、またはそれより大きく低減させることができる。一部の実施形態では、ＴＮＦを分泌するように遺伝子操作された細菌は、腫瘍成長を、同じ条件下で、同じ亜型の未改変細菌と比較して少なくとも約１０％〜２０％、２０％〜２５％、２５％〜３０％、３０％〜４０％、４０％〜５０％、５０％〜６０％、６０％〜７０％、７０％〜７５％、７５％〜８０％、８０％〜８５％、８５％〜９０％、９０％〜９５％、９５％〜９９％、またはそれより大きく低減させることができる。一部の実施形態では、ＴＮＦを分泌するように遺伝子操作された細菌は、腫瘍サイズを、同じ条件下で、同じ亜型の未改変細菌と比較して少なくとも約１０％〜２０％、２０％〜２５％、２５％〜３０％、３０％〜４０％、４０％〜５０％、５０％〜６０％、６０％〜７０％、７０％〜７５％、７５％〜８０％、８０％〜８５％、８５％〜９０％、９０％〜９５％、９５％〜９９％、またはそれより大きく低減させることができる。一部の実施形態では、ＴＮＦを産生するように遺伝子操作された細菌は、腫瘍体積を、同じ条件下で、同じ亜型の未改変細菌と比較して少なくとも約１０％〜２０％、２０％〜２５％、２５％〜３０％、３０％〜４０％、４０％〜５０％、５０％〜６０％、６０％〜７０％、７０％〜７５％、７５％〜８０％、８０％〜８５％、８５％〜９０％、９０％〜９５％、９５％〜９９％、またはそれより大きく低減させることができる。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、例えば２用量処置レジメンの７日目に、腫瘍体積を約４０〜６０％、約４５〜５５％、低減させることができる。一実施形態では、腫瘍体積は、同じ条件下で、同じ亜型の未改変細胞の投与時の約６００ｍｍ３と比較して、ＴＮＦを発現する細菌の投与時には約３００ｍｍ３である。一部の実施形態では、ＴＮＦを産生するように遺伝子操作された細菌は、腫瘍重量を、同じ条件下で、同じ亜型の未改変細菌と比較して少なくとも約１０％〜２０％、２０％〜２５％、２５％〜３０％、３０％〜４０％、４０％〜５０％、５０％〜６０％、６０％〜７０％、７０％〜７５％、７５％〜８０％、８０％〜８５％、８５％〜９０％、９０％〜９５％、９５％〜９９％、またはそれより大きく低減させることができる。一部の実施形態では、ＴＮＦを産生するように遺伝子操作された細菌は、奏功率を、同じ条件下で、同じ亜型の未改変細菌と比較して少なくとも約１０％〜２０％、２０％〜２５％、２５％〜３０％、３０％〜４０％、４０％〜５０％、５０％〜６０％、６０％〜７０％、７０％〜７５％、７５％〜８０％、８０％〜８５％、８５％〜９０％、９０％〜９５％、９５％〜９９％、またはそれより大きく上昇させることができる。
一部の実施形態では、ＴＮＦを産生するように遺伝子操作された細菌は、樹状細胞および／またはマクロファージ上でのＣＣＲ７発現を増加させることができる。
一部の実施形態では、分泌のためのＴＮＦαをコードする１つまたは複数の遺伝子を含む遺伝子操作された細菌は、例えばＴＮＦ受容体を有する細胞において、ＮＦカッパＢ経路を活性化することができる。一部の実施形態では、ＴＮＦαをコードする１つまたは複数の遺伝子を含む遺伝子操作された細菌は、ＩカッパＢアルファ分解を誘導することができる。一部の実施形態では、操作された細菌から分泌される分泌ＴＮＦαレベルは、同じ条件下で、同濃度の組換えＴＮＦαとほぼ同程度に、ＩカッパＢアルファ分解を引き起こす。
一部の実施形態では、遺伝子操作された微生物は、低酸素条件で、ならびに／あるいはがんおよび／または腫瘍微小環境、または組織特異的分子もしくは代謝物の存在下で、ならびに／あるいは炎症または免疫抑制に関連する分子または代謝物の存在下で、ならびに／あるいは消化管内に存在しうる代謝物の存在下で、ならびに／あるいはｉｎ ｖｉｖｏで存在することもあり、しないこともあり、ならびにｉｎ ｖｉｔｒｏで株培養、拡大増殖、産生および／または製造中に存在することもある、代謝物、例えば、アラビノース、クメートおよびサリチレートおよび本明細書に記載の他のものの存在下で、記載のＩＬ−２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１２、ＩＬ−７、ＩＬ−２１、ＩＬ−１８、ＴＮＦおよびＩＦＮガンマ回路のいずれか１つまたは複数を発現することができる。一部の実施形態では、遺伝子配列は、そのような条件および／またはインデューサーにより誘導されうるプロモーターによって制御される。一部の実施形態では、遺伝子配列は、本明細書に記載の構成的プロモーターによって制御される。一部の実施形態では、そのようなインデューサーは、エフェクター遺伝子発現を誘導するために、ｉｎ ｖｉｖｏで投与され得る。一部の実施形態では、ＩＬ−２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１２、ＩＬ−７、ＩＬ−２１、ＩＬ−１８、ＴＮＦ、およびＩＦＮ−ガンマをコードする遺伝子配列は、そのような条件および／またはインデューサーにより誘導可能なプロモーターによって制御される。一部の実施形態では、ＩＬ−２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１２、ＩＬ−７、ＩＬ−２１、ＩＬ−１８、ＴＮＦ、およびＩＦＮ−ガンマをコードする遺伝子配列は、本明細書に記載される構成的プロモーターによって制御される。一部の実施形態では、遺伝子配列は、構成的プロモーターにより制御され、本明細書に記載の、ｉｎ ｖｉｖｏ条件および／またはｉｎ ｖｉｔｒｏ条件で、例えば、拡大増殖、産生および／または製造中に発現される。一部の実施形態では、ＩＬ−２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１２、ＩＬ−７、ＩＬ−２１、ＩＬ−１８、ＴＮＦ、および／またはＩＦＮ−ガンマをコードする記載の遺伝子配列のうちのいずれか１つまたは複数は、１つもしくは複数のプラスミド（例えば、高コピー数または低コピー数プラスミド）上に存在するか、または微生物の染色体内の１つもしくは複数の部位に組み込まれている。
これらの実施形態のいずれにおいても、ＩＬ−２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１２、ＩＬ−７、ＩＬ−２１、ＩＬ−１８、ＴＮＦ、および／またはＩＦＮ−ガンマをコードする遺伝子配列を含む、遺伝子操作された細菌は、１つまたは複数のさらなるエフェクター分子、すなわち、治療用分子または代謝変換因子をコードする遺伝子配列をさらに含む。これらの実施形態のいずれにおいても、ＩＬ−２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１２、ＩＬ−７、ＩＬ−２１、ＩＬ−１８、ＴＮＦ、および／またはＩＦＮ−ガンマをコードする回路は、同じかまたは異なる細菌株において、本明細書に記載される１つまたは複数の免疫イニシエーターまたは免疫サステナーをコードする回路と組み合わせることができる（組合せ回路または株の混合物）。免疫イニシエーターまたは免疫サステナーをコードする回路は、構成的または誘導性プロモーター、例えば、低酸素誘導性プロモーターまたは本明細書に記載される任意の他の構成的もしくは誘導性プロモーターの制御下にあり得る。
これらの実施形態のいずれにおいても、ＩＬ−２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１２、ＩＬ−７、ＩＬ−２１、ＩＬ−１８、ＴＮＦ、および／またはＩＦＮ−ガンマをコードする遺伝子配列は、同じかまたは異なる細菌株において、本明細書に記載される１つまたは複数のＳＴＩＮＧアゴニスト産生酵素をコードする遺伝子配列と組み合わせることができる（組合せ回路または株の混合物）。一部の実施形態では、ＩＬ−２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１２、ＩＬ−７、ＩＬ−２１、ＩＬ−１８、ＴＮＦ、および／またはＩＦＮ−ガンマをコードする遺伝子配列と組み合わされる遺伝子配列は、ＤａｃＡをコードする。ＤａｃＡは、構成的または誘導性プロモーター、例えば、低酸素誘導性プロモーター、例えば、ＦＮＲ、または本明細書に記載される任意の他の構成的もしくは誘導性プロモーターの制御下にあり得る。一部の実施形態では、ｄａｃＡ遺伝子は、染色体に組み込まれている。一部の実施形態では、ＩＬ−２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１２、ＩＬ−７、ＩＬ−２１、ＩＬ−１８、ＴＮＦ、および／またはＩＦＮ−ガンマをコードする遺伝子配列と組み合わされる遺伝子配列は、ｃＧＡＳを含む。ｃＧＡＳは、構成的または誘導性プロモーター、例えば、低酸素誘導性プロモーター、例えば、ＦＮＲ、または本明細書に記載される任意の他の構成的もしくは誘導性プロモーターの制御下にあり得る。一部の実施形態では、ｃＧＡＳをコードする遺伝子は、染色体に組み込まれている。
これらの組合せの実施形態のいずれにおいても、細菌は、栄養要求性の改変、例えば、ＤａｐＡ、ＴｈｙＡ、または両方の突然変異または欠失をさらに含み得る。これらの実施形態のいずれにおいても、細菌は、ファージの改変、例えば、本明細書に記載される内在性プロファージの突然変異または欠失をさらに含み得る。
また、一部の実施形態では、遺伝子操作された微生物は、ＩＬ−２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１２、ＩＬ−７、ＩＬ−２１、ＩＬ−１８、ＴＮＦおよびＩＦＮガンマをコードする記載の回路のいずれか１つまたは複数をさらに発現することができ、以下のものの１つまたは複数をさらに含む：（１）１つまたは複数の栄養要求体、例えば、当技術分野において公知の、および本明細書で提供される、任意の栄養要求体、例えばｔｈｙＡ栄養要求体、（２）１つまたは複数のキルスイッチ回路、例えば、本明細書に記載の、またはそうでなければ当技術分野において公知の、キルスイッチのいずれか、（３）１つまたは複数の抗生物質耐性回路、（４）生体分子または基質を移入するための１つまたは複数の輸送体、例えば、本明細書に記載の、またはそうでなければ当技術分野において公知の、輸送体のいずれか、（５）１つまたは複数の分泌回路、例えば、本明細書に記載の、でなければ当技術分野において公知の、分泌回路のいずれか、（６）１つまたは複数の表面提示回路、例えば、本明細書に記載の、でなければ当技術分野において公知の、表面提示回路のいずれか、および（７）本明細書に記載の１つまたは複数の代謝物（例えば、キヌレニン、トリプトファン、アデノシン、アルギニン）の産生または分解のための１つまたは複数の回路、（８）このような追加の回路の１つまたは複数の組合せ。これらの実施形態のいずれにおいても、遺伝子操作された細菌を単独で投与することができ、または抗ＣＴＬＡ４、抗ＰＤ１もしくは抗ＰＤ−Ｌ１抗体を含むがこれらに限定されない、本明細書に記載の１つもしくは複数の免疫チェックポイントインヒビターと組み合わせて投与することができる。
共刺激分子
グルココルチコイドに誘導される腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）関連受容体（ＧＩＴＲ、ＴＮＦＲ１８）は、Ｉ型膜貫通タンパク質であり、ＴＮＦＲスーパーファミリーのメンバーである１。ＧＩＴＲは、主として、ＣＤ２５＋ ＣＤ４＋調節性Ｔ（Ｔｒｅｇ）細胞に高いレベルで発現されるが、従来的なＣＤ２５− ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞においても低いレベルで構成的に発現され、活性化後には急速に上方調節される。アゴニスト抗ＧＩＴＲモノクローナル抗体（ｍＡｂ、ＤＴＡ−１）２，６，７またはＧＩＴＲＬトランスフェクタントおよび可溶性ＧＩＴＲＬ５，８，９を使用したｉｎ ｖｉｔｒｏでの研究により、ＧＩＴＲ−ＧＩＴＲＬ経路が、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋エフェクターＴ細胞（ならびに対抗するエフェクター機能にもかかわらず、Ｔｒｅｇ細胞）の活性化をもたらす、正の共刺激シグナルを誘導することが示された（Ｐｉａｏら、（２００９年）、Ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ ｏｆ Ｔ−ｃｅｌｌ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ａｎｔｉ−ｔｕｍｏｕｒ ｉｍｍｕｎｉｔｙ ｖｉａ ｔｈｅ ｅｃｔｏｐｉｃａｌｌｙ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｇｌｕｃｏｃｏｒｔｉｃｏｉｄ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｔｕｍｏｕｒ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｒｅｌａｔｅｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｌｉｇａｎｄ （ＧＩＴＲＬ） ｏｎ ｔｕｍｏｕｒｓ； Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、１２７巻、４８９〜４９９頁、およびその中の参考文献）。一部の実施形態では、エフェクターまたは免疫モジュレーターは、ＧＩＴＲのアゴニスト、例えば、アゴニスト抗ＧＩＴＲ抗体、アゴニスト抗ＧＩＴＲ抗体断片、ＧＩＴＲリガンドポリペプチド（ＧＩＴＲＬ）、およびＧＩＴＲＬポリペプチド断片から選択されるアゴニストである。したがって、一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、アゴニスト抗ＧＩＴＲ抗体もしくはその断片、またはＧＩＴＲリガンドポリペプチドもしくはその断片をコードする配列を含む。したがって、一部の実施形態では、操作された細菌は、アゴニスト抗ＧＩＴＲ抗体もしくはその断片、またはＧＩＴＲリガンドポリペプチドもしくはその断片を産生するように操作されている。一部の実施形態では、操作された細菌は、アゴニスト抗ＧＩＴＲ抗体もしくはその断片、またはＧＩＴＲリガンドポリペプチドもしくはその断片をコードするための配列を含む。一部の実施形態では、操作された細菌は、アゴニスト抗ＧＩＴＲ抗体もしくはその断片、またはＧＩＴＲリガンドポリペプチドもしくはその断片をコードするための配列と、前記抗体およびポリペプチドの分泌のための分泌ペプチドをコードするための配列とを含む。分泌タグおよび適切な分泌機序の非限定的な例は、本明細書に記載されている。一部の実施形態では、抗体またはリガンドは、表面上に提示される。細菌表面提示のための適切な技術は、本明細書に記載されている。
ＧＩＴＲは、活性化Ｔ細胞において、Ｔ細胞増殖およびＴ細胞生存を促進するように機能するため、ＧＩＴＲ作動作用は、有益なことに、Ｔ細胞応答を開始することができる第２のモダリティ（免疫イニシエーター）と組み合わせることができ、これには、自然免疫刺激因子、例えば、本明細書に記載されるＳＴＩＮＧアゴニストを発現する遺伝子操作された細菌が含まれるがこれに限定されない。
したがって、１つの非限定的な例では、１つまたは複数の遺伝子操作された細菌は、例えば、本明細書に記載されるように、アゴニスト抗ＧＩＴＲ抗体と組み合わせて、ＳＴＩＮＧアゴニストの産生のための１つまたは複数の酵素を発現する。別の非限定的な例では、１つまたは複数の遺伝子操作された細菌は、例えば、本明細書に記載されるように、ＳＴＩＮＧアゴニストの産生のための１つまたは複数の酵素を発現し、本明細書に記載されるように、アゴニスト抗ＧＩＴＲ抗体と組み合わせて投与される。
ＣＤ１３７または４−１ＢＢは、ＴＮＦスーパーファミリーに属する２型膜貫通糖タンパク質であって、活性化Ｔリンパ球（例えば、ＣＤ８＋およびＣＤ４＋細胞）上に発現され、活性化Ｔリンパ球に対する共刺激活性を有する、２型膜貫通糖タンパク質である。ＣＤ１３７または４−１ＢＢは、Ｔ細胞増殖、ＩＬ−２分泌生存および細胞溶解活性を増強することが示されている。一部の実施形態では、免疫モジュレーターは、ＣＤ１３７（４−１ＢＢ）のアゴニスト、例えば、アゴニスト抗ＣＤ１３７抗体もしくはその断片、またはＣＤ１３７リガンドポリペプチドもしくはその断片から選択されるアゴニストである。したがって、一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、アゴニスト抗ＣＤ１３７抗体もしくはその断片、またはＣＤ１３７リガンドポリペプチドもしくはその断片をコードする配列を含む。したがって、一部の実施形態では、操作された細菌は、アゴニスト抗ＣＤ１３７抗体もしくはその断片、またはＣＤ１３７リガンドポリペプチドもしくはその断片を産生するように操作されている。一部の実施形態では、操作された細菌は、アゴニスト抗ＣＤ１３７抗体もしくはその断片、またはＣＤ１３７リガンドポリペプチドもしくはその断片をコードするための配列を含む。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、アゴニスト抗ＣＤ１３７抗体もしくはその断片、またはＣＤ１３７リガンドポリペプチドもしくはその断片を発現する、および／または分泌ペプチドを発現する。適切な分泌タグおよび適切な分泌機序の非限定的な例は、本明細書に記載されている。一部の実施形態では、抗体またはリガンドは、表面上に提示される。細菌表面提示のための適切な技術は、本明細書に記載されている。
ＣＤ１３７（４−１ＢＢ）は、活性化されたマウスおよびヒトＣＤ８＋およびＣＤ４＋Ｔ細胞に発現される７。これは、ＴＮＦＲファミリーのメンバーであり、共刺激および抗アポトーシス機能を媒介し、Ｔ細胞増殖およびＴ細胞生存を促進する１０，１１。ＣＤ１３７は、Ｔ細胞刺激に応じて、刺激後１２時間〜最大５日間、上方調節されることが報告されている（Ｗｏｌｆｌら、Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＣＤ１３７ ｐｅｒｍｉｔｓ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ， ｉｓｏｌａｔｉｏｎ， ａｎｄ ｅｘｐａｎｓｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｆｕｌｌ ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ ｏｆ ＣＤ８ Ｔ ｃｅｌｌｓ ｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ ｔｏ ａｎｔｉｇｅｎ ｗｉｔｈｏｕｔ ｒｅｑｕｉｒｉｎｇ ｋｎｏｗｌｅｄｇｅ ｏｆ ｅｐｉｔｏｐｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｉｅｓ； ＢＬＯＯＤ、２００７年７月１日、１１０巻、１号、およびその中の参考文献）。したがって、ＣＤ１３７（４−１ＢＢ）作動作用は、有益なことに、Ｔ細胞応答を開始することができる第２のモダリティ（免疫イニシエーター）と組み合わせることができ、これには、自然免疫刺激因子（免疫イニシエーター）を発現する遺伝子操作された細菌が含まれるがこれに限定されない。自然免疫刺激因子（免疫イニシエーター）を発現する例示的な細菌は、本明細書に記載されている。
したがって、１つの非限定的な例では、１つまたは複数の遺伝子操作された細菌は、例えば、本明細書に記載されるように、アゴニスト抗４１ＢＢ（ＣＤ１３７）抗体と組み合わせて、ＳＴＩＮＧアゴニストの産生のための１つまたは複数の酵素を発現する。別の非限定的な例では、１つまたは複数の遺伝子操作された細菌は、例えば、本明細書に記載されるように、ＳＴＩＮＧアゴニストの産生のための１つまたは複数の酵素を発現し、本明細書に記載されるように、アゴニスト抗４１ＢＢ（ＣＤ１３７）抗体と組み合わせて投与される。
ＯＸ４０、またはＣＤ１３４は、Ｔ細胞の生存を保つこと、およびその後にサイトカイン産生を増加させることに関与する、Ｔ細胞受容体である。ＯＸ４０は、生存を増強するその能力に起因して、免疫応答および記憶応答の維持に極めて重要な役割がある。ＯＸ４０はまた、Ｔｈ１媒介反応およびＴｈ２媒介反応の両方において、有意な役割を果たす。一部の実施形態では、免疫モジュレーターは、ＯＸ４０のアゴニスト、例えば、アゴニスト抗ＯＸ４０抗体もしくはその断片、またはＯＸ４０リガンド（ＯＸ４０Ｌ）もしくはその断片から選択されるアゴニストである。したがって、一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、アゴニスト抗ＯＸ４０抗体もしくはその断片、またはＯＸ４０リガンドもしくはその断片をコードする配列を含む。したがって、一部の実施形態では、操作された細菌は、アゴニスト抗ＯＸ４０抗体もしくはその断片、またはＯＸ４０リガンドもしくはその断片を産生するように操作されている。一部の実施形態では、操作された細菌は、アゴニスト抗ＯＸ４０抗体もしくはその断片、またはＯＸ４０リガンドもしくはその断片をコードするための配列を含む。一部の実施形態では、操作された細菌は、アゴニスト抗ＯＸ４０抗体もしくはその断片、またはＯＸ４０リガンドもしくはその断片をコードするための配列と、前記抗体およびポリペプチドの分泌のための分泌ペプチドをコードするための配列とを含む。適切な分泌タグおよび適切な分泌機序の非限定的な例は、本明細書に記載されている。一部の実施形態では、抗体またはリガンドは、表面上に提示される。細菌表面提示のための適切な技術は、本明細書に記載されている。
近年では、Ｔｏｌｌ様受容体９（ＴＬＲ９）リガンドである非メチル化ＣＧ富化オリゴデオキシヌクレオチド（ＣｐＧ）と、抗ＯＸ４０抗体との組合せを、腫瘍の１つの部位に局所的に注射することにより、局所的にＴ細胞免疫応答が相乗的に誘発され、これが、次いで、身体全体にわたり、遠位部位のがんを攻撃することが見出されている（Ｓａｇｉｖ−Ｂａｒｆｉら、Ｅｒａｄｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓ ｍａｌｉｇｎａｎｃｙ ｂｙ ｌｏｃａｌ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ ； Ｓｃｉ． Ｔｒａｎｓｌ． Ｍｅｄ．、１０巻、ｅａａｎ４４８８、（２０１８年））。非メチル化ＣＧ富化オリゴデオキシヌクレオチド（ＣｐＧ）は、自然免疫系の構成成分であるＴＬＲ９を活性化する。したがって、免疫系の他の活性化機序は、自然免疫刺激因子（免疫イニシエーター）を発現する遺伝子操作された細菌を含むがこれに限定されない、アゴニストＯＸ４０抗体と組み合わせて、同様の結果をもたらすことができる。自然免疫刺激因子（免疫イニシエーター）を発現する例示的な細菌は、本明細書に記載されている。
したがって、１つの非限定的な例では、１つまたは複数の遺伝子操作された細菌は、例えば、本明細書に記載されるように、アゴニストＯＸ４０抗体と組み合わせて、ＳＴＩＮＧアゴニストの産生のための１つまたは複数の酵素を発現する。別の非限定的な例では、１つまたは複数の遺伝子操作された細菌は、例えば、本明細書に記載されるように、ＳＴＩＮＧアゴニストの産生のための１つまたは複数の酵素を発現し、本明細書に記載されるように、ＯＸ４０抗体と組み合わせて投与される。
ＣＤ２８は、Ｔ細胞活性化および生存に必要な共刺激シグナルを提供する、Ｔ細胞に発現されるタンパク質の１つである。一部の実施形態では、免疫モジュレーターは、ＣＤ２８のアゴニスト、例えば、アゴニスト抗ＣＤ２８抗体、アゴニスト抗ＣＤ２８抗体断片、ＣＤ８０（Ｂ７．１）ポリペプチドまたはそのポリペプチド断片、およびＣＤ８６（Ｂ７．２）ポリペプチドまたはそのポリペプチド断片から選択されるアゴニストである。したがって、一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、アゴニスト抗ＣＤ２８抗体もしくはその断片、またはＣＤ８０ポリペプチドもしくはその断片、またはＣＤ８６ポリペプチドもしくはその断片をコードする配列を含む。一部の実施形態では、操作された細菌は、アゴニスト抗ＣＤ２８抗体もしくはその断片、またはＣＤ８０ポリペプチドもしくはその断片、またはＣＤ８６ポリペプチドもしくはその断片を産生するように操作されている。一部の実施形態では、操作された細菌は、アゴニスト抗ＣＤ２８抗体もしくはその断片、またはＣＤ８０ポリペプチドもしくはその断片、またはＣＤ８６ポリペプチドもしくはその断片をコードするための配列を含む。一部の実施形態では、操作された細菌は、アゴニスト抗ＣＤ２８抗体もしくはその断片、またはＣＤ８０ポリペプチドもしくはその断片、またはＣＤ８６ポリペプチドもしくはその断片をコードするための配列と、前記抗体およびポリペプチドの分泌のための分泌ペプチドをコードするための配列とを含む。適切な分泌タグおよび適切な分泌機序の非限定的な例は、本明細書に記載されている。一部の実施形態では、抗体またはリガンドは、表面上に提示される。細菌表面提示のための適切な技術は、本明細書に記載されている。
ＩＣＯＳは、ＣＤ２８に構造的におよび機能的に関連する誘導性Ｔ細胞共刺激因子である。一部の実施形態では、免疫モジュレーターは、ＩＣＯＳのアゴニスト、例えば、アゴニスト抗ＩＣＯＳ抗体もしくはその断片、またはＩＣＯＳリガンドポリペプチドもしくはその断片から選択されるアゴニストである。したがって、一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、アゴニスト抗ＩＣＯＳ抗体もしくはその断片、またはＩＣＯＳリガンドポリペプチドもしくはその断片をコードする配列を含む。したがって、一部の実施形態では、操作された細菌は、アゴニスト抗ＩＣＯＳ抗体もしくはその断片、またはＩＣＯＳリガンドポリペプチドもしくはその断片を産生するように操作されている。一部の実施形態では、操作された細菌は、アゴニスト抗ＩＣＯＳ抗体もしくはその断片、またはＩＣＯＳリガンドポリペプチドもしくはその断片をコードするための配列を含む。一部の実施形態では、操作された細菌は、アゴニスト抗ＩＣＯＳ抗体もしくはその断片、またはＩＣＯＳリガンドポリペプチドもしくはその断片をコードするための配列と、前記抗体およびポリペプチドの分泌のための分泌ペプチドをコードするための配列とを含む。適切な分泌タグおよび適切な分泌機序の非限定的な例は、本明細書に記載されている。一部の実施形態では、抗体またはリガンドは、表面上に提示される。細菌表面提示のための適切な技術は、本明細書に記載されている。
ＣＤ２２６は、ナチュラルキラー細胞、血小板、単球、およびＴ細胞のサブセット（例えば、ＣＤ８＋およびＣＤ４＋細胞）の表面に発現される糖タンパク質であって、そのリガンド、ＣＤ１１２およびＣＤ１５５を有する他の細胞との細胞接着を媒介する糖タンパク質である。数ある中でも特に、ＣＤ２２６は、免疫シナプス形成に関与し、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞活性化を誘発する。一部の実施形態では、免疫モジュレーターは、ＣＤ２２６のアゴニスト、例えば、アゴニスト抗ＣＤ２２６抗体またはその断片、ＣＤ１１２ポリペプチドまたはその断片、ＣＤ１５５ポリペプチドまたはその断片から選択されるアゴニストである。したがって、一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、アゴニスト抗ＣＤ２２６抗体またはその断片、ＣＤ１１２ポリペプチドまたはその断片、ＣＤ１５５ポリペプチドまたはその断片から選択されるアゴニストをコードする配列を含む。したがって、一部の実施形態では、操作された細菌は、アゴニスト抗ＣＤ２２６抗体またはその断片、ＣＤ１１２ポリペプチドまたはその断片、ＣＤ１５５またはその断片から選択されるアゴニストを産生するように操作されている。一部の実施形態では、操作された細菌は、アゴニスト抗ＣＤ２２６抗体もしくはその断片、ＣＤ１１２もしくはＣＤ１５５ポリペプチドもしくはその断片から選択されるアゴニストをコードするための配列を含む。一部の実施形態では、操作された細菌は、アゴニスト抗ＣＤ２２６抗体もしくはその断片、ＣＤ１１２もしくはＣＤ１５５ポリペプチドもしくはその断片から選択されるアゴニストをコードするための配列と、前記抗体およびポリペプチドの分泌のための分泌ペプチドをコードするための配列とを含む。適切な分泌タグおよび適切な分泌機序の非限定的な例は、本明細書に記載されている。一部の実施形態では、抗体またはリガンドは、表面上に提示される。細菌表面提示のための適切な技術は、本明細書に記載されている。
これらの実施形態のいずれにおいても、アゴニスト抗体は、ヒト抗体であっても、ヒト化抗体であってもよく、異なるアイソタイプ、例えば、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４を含むこともある。また、抗体は、ＦｃＲ結合、ＦｃＲｎ結合、補体機能、グリコシル化、Ｃ１ｑ結合などの、エフェクター機能；補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）；Ｆｃ受容体結合；抗体依存性細胞介在性細胞傷害（ＡＤＣＣ）；食作用；細胞表面受容体（例えば、Ｂ細胞受容体；ＢＣＲ）の下方調節を増大または減少させるように改変されている定常領域を含むこともある。これらの実施形態のいずれにおいても、抗体は、単鎖抗体であってもよく、または単鎖抗体断片であってもよい。
一部の実施形態では、遺伝子操作された微生物は、低酸素条件で、ならびに／あるいはがんの存在下で、および／または腫瘍微小環境、または組織特異的分子もしくは代謝物において、ならびに／あるいは炎症または免疫抑制に関連する分子または代謝物の存在下で、ならびに／あるいは消化管内に存在し得る代謝物の存在下で、ならびに／あるいはｉｎ ｖｉｖｏで存在することもあり、しないこともあり、ｉｎ ｖｉｔｒｏで、株培養、拡大増殖、産生、および／または製造中に存在することもある、代謝物、例えば、アラビノース、クメート、およびサリチレート、ならびに本明細書に記載される他のものの存在下で、記載されるアゴニスト抗ＧＩＴＲ抗体／ＧＩＴＲリガンド、抗ＣＤ１３７／ＣＤ１３７リガンド、抗ＯＸ４０抗体／ＯＸ４０リガンド、抗ＣＤ２８抗体／ＣＤ８０もしくはＣＤ８６ポリペプチド、抗ＩＣＯＳ抗体／ＩＣＯＳリガンド、抗ＣＤ２２６抗体／ＣＤ１１２、および／またはＣＤ１５５回路のうちのいずれか１つまたは複数を発現することができる。一部の実施形態では、そのようなインデューサーは、エフェクター遺伝子発現を誘導するために、ｉｎ ｖｉｖｏで投与され得る。一部の実施形態では、アゴニスト抗ＧＩＴＲ抗体／ＧＩＴＲリガンド、抗ＣＤ１３７／ＣＤ１３７リガンド、抗ＯＸ４０抗体／ＯＸ４０リガンド、抗ＣＤ２８抗体／ＣＤ８０もしくはＣＤ８６ポリペプチド、抗ＩＣＯＳ抗体／ＩＣＯＳリガンド、抗ＣＤ２２６抗体／ＣＤ１１２、および／またはＣＤ１５５ポリペプチドをコードする遺伝子配列は、そのような条件および／またはインデューサーにより誘導可能なプロモーターによって制御される。一部の実施形態では、アゴニスト抗ＧＩＴＲ抗体／ＧＩＴＲリガンド、抗ＣＤ１３７／ＣＤ１３７リガンド、抗ＯＸ４０抗体／ＯＸ４０リガンド、抗ＣＤ２８抗体／ＣＤ８０もしくはＣＤ８６ポリペプチド、抗ＩＣＯＳ抗体／ＩＣＯＳリガンド、抗ＣＤ２２６抗体／ＣＤ１１２、および／またはＣＤ１５５ポリペプチドをコードする遺伝子配列は、本明細書に記載されるように、構成的プロモーターによって制御される。一部の実施形態では、遺伝子配列は、構成的プロモーターによって制御され、本明細書に記載の、ｉｎ ｖｉｖｏ条件および／またはｉｎ ｖｉｔｒｏ条件で、例えば、拡大増殖、産生、および／または製造中に発現される。一部の実施形態では、アゴニスト抗ＧＩＴＲ抗体／ＧＩＴＲリガンド、抗ＣＤ１３７／ＣＤ１３７リガンド、抗ＯＸ４０抗体／ＯＸ４０リガンド、抗ＣＤ２８抗体／ＣＤ８０もしくはＣＤ８６ポリペプチド、抗ＩＣＯＳ抗体／ＩＣＯＳリガンド、抗ＣＤ２２６抗体／ＣＤ１１２、および／またはＣＤ１５５ポリペプチドをコードする記載の遺伝子配列のうちのいずれか１つまたは複数は、１つもしくは複数のプラスミド（例えば、高コピー数または低コピー数プラスミド）上に存在するか、または微生物の染色体内の１つまたは複数の部位に組み込まれている。
これらの実施形態のいずれにおいても、アゴニスト抗ＧＩＴＲ抗体／ＧＩＴＲリガンド、抗ＣＤ１３７／ＣＤ１３７リガンド、抗ＯＸ４０抗体／ＯＸ４０リガンド、抗ＣＤ２８抗体／ＣＤ８０もしくはＣＤ８６ポリペプチド、抗ＩＣＯＳ抗体／ＩＣＯＳリガンド、抗ＣＤ２２６抗体／ＣＤ１１２、および／またはＣＤ１５５ポリペプチドをコードする遺伝子配列を含む遺伝子操作された細菌は、１つまたは複数のさらなるエフェクター分子、すなわち、治療用分子または代謝変換因子をコードする遺伝子配列をさらに含む。これらの実施形態のいずれにおいても、アゴニスト抗ＧＩＴＲ抗体／ＧＩＴＲリガンド、抗ＣＤ１３７／ＣＤ１３７リガンド、抗ＯＸ４０抗体／ＯＸ４０リガンド、抗ＣＤ２８抗体／ＣＤ８０もしくはＣＤ８６ポリペプチド、抗ＩＣＯＳ抗体／ＩＣＯＳリガンド、抗ＣＤ２２６抗体／ＣＤ１１２、および／またはＣＤ１５５ポリペプチドをコードする回路は、同じかまたは異なる細菌株において、本明細書に記載される１つまたは複数の免疫イニシエーターまたは免疫サステナーをコードする回路と組み合わせることができる（組合せ回路または株の混合物）。免疫イニシエーターまたは免疫サステナーをコードする回路は、構成的または誘導性プロモーター、例えば、低酸素誘導性プロモーターまたは本明細書に記載される任意の他の構成的もしくは誘導性プロモーターの制御下にあり得る。
これらの実施形態のいずれにおいても、アゴニスト抗ＧＩＴＲ抗体／ＧＩＴＲリガンド、抗ＣＤ１３７／ＣＤ１３７リガンド、抗ＯＸ４０抗体／ＯＸ４０リガンド、抗ＣＤ２８抗体／ＣＤ８０もしくはＣＤ８６ポリペプチド、抗ＩＣＯＳ抗体／ＩＣＯＳリガンド、抗ＣＤ２２６抗体／ＣＤ１１２、および／またはＣＤ１５５ポリペプチドをコードする遺伝子配列は、同じかまたは異なる細菌株において、本明細書に記載される１つまたは複数のＳＴＩＮＧアゴニスト産生酵素をコードする遺伝子配列と組み合わせることができる（組合せ回路または株の混合物）。一部の実施形態では、アゴニスト抗ＧＩＴＲ抗体／ＧＩＴＲリガンド、抗ＣＤ１３７／ＣＤ１３７リガンド、抗ＯＸ４０抗体／ＯＸ４０リガンド、抗ＣＤ２８抗体／ＣＤ８０もしくはＣＤ８６ポリペプチド、抗ＩＣＯＳ抗体／ＩＣＯＳリガンド、抗ＣＤ２２６抗体／ＣＤ１１２、および／またはＣＤ１５５ポリペプチドをコードする遺伝子配列と組み合わされる遺伝子配列は、ＤａｃＡをコードする。ＤａｃＡは、構成的または誘導性プロモーター、例えば、低酸素誘導性プロモーター、例えば、ＦＮＲ、または本明細書に記載される任意の他の構成的もしくは誘導性プロモーターの制御下にあり得る。一部の実施形態では、ｄａｃＡ遺伝子は、染色体に組み込まれている。一部の実施形態では、アゴニスト抗ＧＩＴＲ抗体／ＧＩＴＲリガンド、抗ＣＤ１３７／ＣＤ１３７リガンド、抗ＯＸ４０抗体／ＯＸ４０リガンド、抗ＣＤ２８抗体／ＣＤ８０もしくはＣＤ８６ポリペプチド、抗ＩＣＯＳ抗体／ＩＣＯＳリガンド、抗ＣＤ２２６抗体／ＣＤ１１２、および／またはＣＤ１５５ポリペプチドをコードする遺伝子配列と組み合わされる遺伝子配列は、ｃＧＡＳをコードする。ｃＧＡＳは、構成的または誘導性プロモーター、例えば、低酸素誘導性プロモーター、例えば、ＦＮＲ、または本明細書に記載される任意の他の構成的もしくは誘導性プロモーターの制御下にあり得る。一部の実施形態では、ｃＧＡＳをコードする遺伝子は、染色体に組み込まれている。
これらの組合せの実施形態のいずれにおいても、細菌は、栄養要求性の改変、例えば、ＤａｐＡ、ＴｈｙＡ、または両方の突然変異または欠失をさらに含み得る。これらの実施形態のいずれにおいても、細菌は、ファージの改変、例えば、本明細書に記載される内在性プロファージの突然変異または欠失をさらに含み得る。
また、一部の実施形態では、遺伝子操作された微生物は、アゴニスト抗ＧＩＴＲ抗体／ＧＩＴＲリガンド、抗ＣＤ１３７／ＣＤ１３７リガンド、抗ＯＸ４０抗体／ＯＸ４０リガンド、抗ＣＤ２８抗体／ＣＤ８０もしくはＣＤ８６ポリペプチド、抗ＩＣＯＳ抗体／ＩＣＯＳリガンド、抗ＣＤ２２６抗体／ＣＤ１１２、および／またはＣＤ１５５ポリペプチドをコードする記載の回路のうちのいずれか１つまたは複数を発現することができ、以下のうちの１つまたは複数をさらに含む：（１）１つまたは複数の栄養要求体、例えば、当技術分野において公知の、本明細書に提供される、任意の栄養要求体、例えば、ｔｈｙＡ栄養要求体、（２）１つまたは複数のキルスイッチ回路、例えば、本明細書に記載されるか、またはそうでなければ当該技術分野において公知の、キルスイッチのうちのいずれか、（３）１つまたは複数の抗生物質耐性回路、（４）生体分子または基質を移入するための１つまたは複数の輸送体、例えば、本明細書に記載されるか、またはそうでなければ当該技術分野において公知の、輸送体のうちのいずれか、（５）１つまたは複数の分泌回路、例えば、本明細書に記載され、そうでなければ当該技術分野において公知の、分泌回路のうちのいずれか、（６）１つまたは複数の表面提示回路、例えば、本明細書に記載され、そうでなければ当該技術分野において公知の、表面提示回路のうちのいずれか、および（７）本明細書に記載される１つまたは複数の代謝物（例えば、キヌレニン、トリプトファン、アデノシン、アルギニン）の産生または分解のための１つまたは複数の回路、（８）このような追加の回路のうちの１つまたは複数の組合せ。これらの実施形態のいずれにおいても、遺伝子操作された細菌は、単独で、または抗ＣＴＬＡ４、抗ＰＤ１、もしくは抗ＰＤ−Ｌ１抗体を含むがこれらに限定されない、本明細書に記載される１つもしくは複数の免疫チェックポイント阻害剤と組み合わせて投与してもよい。
局所免疫抑制の除去（逆転）
腫瘍細胞は、抗原提示または樹状細胞の成熟に干渉するシグナルを生成し、それらの前駆体を代わりに免疫抑制細胞型に成熟させることによって、破壊を免れることが多い。したがって、腫瘍部位での免疫抑制の開始、促進、および／または維持に関与する免疫モジュレーション分子の活性を防止または阻害する１つまたは複数の免疫モジュレーターの、単独での、または１つもしくは複数の他の免疫モジュレーターとの組合せでの、局所送達は、治療利益をもたらす。
免疫チェックポイント阻害剤
一部の実施形態では、免疫モジュレーターは、免疫サプレッサー分子のインヒビター、例えば、免疫チェックポイント分子のインヒビターである。阻害される免疫チェックポイント分子は、いずれの公知のまたは後に発見される免疫チェックポイント分子または他の免疫サプレッサー分子であってもよい。一部の実施形態では、阻害される免疫チェックポイント分子、または他の免疫サプレッサー分子は、ＣＴＬＡ−４、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＴＩＧＩＴ、ＶＩＳＴＡ、ＬＡＧ−３、ＴＩＭ１、ＴＩＭ３、ＣＥＡＣＡＭ１、ＬＡＩＲ−１、ＨＶＥＭ、ＢＴＬＡ、ＣＤ１６０、ＣＤ２００、ＣＤ２００Ｒ、ＣＤ３９、ＣＤ７３、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、ＩＤＯ、ＴＤＯ、ＫＩＲ、およびＡ２ａＲから選択される。ある特定の態様では、本開示は、免疫チェックポイントまたは他の免疫サプレッサー分子を阻害する１つまたは複数の免疫モジュレーターを産生するように操作されている、操作された微生物、例えば、操作された細菌を提供する。一部の実施形態では、遺伝子操作された微生物は、がん性細胞増殖、腫瘍成長、および／または腫瘍体積を低減させることができる。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、がんまたは腫瘍細胞を標的とするように操作されている、細菌である。一部の実施形態では、遺伝子操作された微生物は、低酸素条件、例えば、腫瘍の低酸素環境により活性化されるプロモーターの制御下で免疫チェックポイントインヒビターまたは別の免疫サプレッサー分子のインヒビターを発現する細菌である。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ハイポキシック条件によりまたは炎症性条件により活性化されるプロモーター、例えば、前記条件により活性化される、本明細書に記載されるプロモーターのうちのいずれかの制御下で、１つまたは複数の免疫チェックポイント阻害剤を発現する。
一部の実施形態では、本開示の遺伝子操作された微生物は、ＣＴＬＡ−４阻害剤、例えば、ＣＴＬＡ−４に対する抗体をコードする遺伝子を含む、遺伝子操作された細菌である。これらの実施形態のいずれにおいても、抗ＣＴＬＡ−４抗体は、単鎖抗ＣＴＬＡ−４抗体であり得る。一部の実施形態では、本開示の遺伝子操作された微生物は、ＰＤ−１阻害剤、例えば、ＰＤ−１またはＰＤ−Ｌ１に対する抗体をコードする遺伝子を含む、遺伝子操作された細菌である。これらの実施形態のいずれにおいても、抗ＰＤ−１またはＰＤ−Ｌ１抗体は、単鎖抗ＰＤ−１抗体であり得る。一部の実施形態では、本開示の遺伝子操作された微生物は、ＣＴＬＡ−４、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＴＩＧＩＴ、ＶＩＳＴＡ、ＬＡＧ−３、ＴＩＭ１、ＴＩＭ３、ＣＥＡＣＡＭ１、ＬＡＩＲ−１、ＨＶＥＭ、ＢＴＬＡ、ＣＤ１６０、ＣＤ２００、ＣＤ２００Ｒ、ＣＤ３９、ＣＤ７３、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、ＩＤＯ、ＴＤＯ、ＫＩＲ、およびＡ２ａＲ阻害剤から選択される阻害剤、例えば、列挙された免疫チェックポイントまたは他のサプレッサー分子のうちのいずれかに対する抗体をコードする遺伝子を含む、操作された細菌である。そのようなチェックポイント阻害剤分子の例は、例えば、２０１７年１月１１日に出願され、ＷＯ２０１７／１２３６７５として公開された、国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０１３０７２、および２０１８年１月１日に出願されたＰＣＴ／ＵＳ２０１８／０１２６９８に記載されており、これらのそれぞれの内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。これらの実施形態のいずれにおいても、抗体は、単鎖抗体であってもよい。一部の実施形態では、チェックポイントインヒビターまたは別の免疫サプレッサー分子のインヒビターを発現する、操作された細菌は、局所的に、例えば、腫瘍内注射によって、投与される。
一部の実施形態では、本開示は、ＣＴＬＡ−４インヒビターを発現する、遺伝子操作された微生物、例えば、操作された細菌を提供する。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、低酸素条件、例えば、腫瘍の低酸素環境により活性化されるプロモーターの制御下で、ＣＴＬＡ−４インヒビターを発現する。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、抗ＣＴＬＡ−４抗体、例えば、単鎖抗体を発現する。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、抗ＣＴＬＡ−４抗体、例えば、単鎖抗体を発現する、細菌である。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、低酸素条件により活性化されるプロモーターの制御下で、抗ＣＴＬＡ−４抗体、例えば、単鎖抗体を発現する。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、低酸素条件により活性化されるプロモーターの制御下で、抗ＣＴＬＡ−４抗体、例えば、単鎖抗体を発現する、細菌である。
一部の実施形態では、遺伝子操作された微生物は、ＰＤ−１阻害剤を発現する、細菌である。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、低酸素条件、例えば、腫瘍の低酸素環境により活性化されるプロモーターの制御下で、ＰＤ−１インヒビターを発現する。一部の実施形態では、遺伝子操作された微生物は、低酸素条件、例えば、腫瘍のハイポキシック環境により活性化されるプロモーターの制御下で、ＰＤ−１阻害剤を発現する、細菌である。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、抗ＰＤ−１抗体、例えば、単鎖抗体を発現する。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、抗ＰＤ−１抗体、例えば、単鎖抗体を発現する、細菌である。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、低酸素条件により活性化されるプロモーターの制御下で、抗ＰＤ−１抗体、例えば、単鎖抗体を発現する。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、低酸素条件により活性化されるプロモーターの制御下で、抗ＰＤ−１抗体、例えば、単鎖抗体を発現する、細菌である。
一部の実施形態では、ｓｃＦｖ構築物、例えばＰＤ１−ｓｃＦｖをコードする核酸は、配列番号９７５、配列番号９７６、配列番号９７７、配列番号９７８、配列番号９７９、および／または配列番号９８０から選択される配列と少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９９％の同一性を有する配列を含む。一部の実施形態では、ｓｃＦｖ構築物、例えばＰＤ１−ｓｃＦｖ、をコードする核酸は、配列番号９７５、配列番号９７６、配列番号９７７、配列番号９７８、配列番号９７９、および／または配列番号９８０から選択される配列を含む。一部の実施形態では、ｓｃＦｖ構築物、例えばＰＤ１−ｓｃＦｖ、をコードする核酸は、配列番号９７５、配列番号９７６、配列番号９７７、配列番号９７８、配列番号９７９、および／または配列番号９８０から選択される配列からなる。
一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ＰＤ−Ｌ１阻害剤を発現する。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、抗ＰＤ−Ｌ１抗体、例えば、単鎖抗体を発現する。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、抗ＰＤ−Ｌ１抗体、例えば、単鎖抗体を発現する、細菌である。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、低酸素条件により活性化されるプロモーターの制御下で、抗ＰＤ−Ｌ１抗体、例えば、単鎖抗体を発現する、細菌である。
一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ＰＤ−Ｌ２阻害剤を発現する、細菌である。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、抗ＰＤ−Ｌ２抗体、例えば、単鎖抗体を発現する、細菌である。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、抗ＰＤ−Ｌ２抗体、例えば、単鎖抗体を発現する、細菌である。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、低酸素条件により活性化されるプロモーターの制御下で、抗ＰＤ−Ｌ２抗体、例えば、単鎖抗体を発現する、細菌である。
単鎖抗ＣＴＬＡ−４抗体の構築における使用のための例示的重鎖および軽鎖アミノ酸配列が示され、本明細書に記載されている（例えば、配列番号７６１、配列番号７６２、配列番号７６３、配列番号７６４）。
単鎖抗ＰＤ−１抗体の構築における使用のための例示的な重鎖および軽鎖アミノ酸配列としては、配列番号１、配列番号２、配列番号３、および／または配列番号４が挙げられる。
一部の実施形態では、配列は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、および／または配列番号４の配列と少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９９％相同である。単鎖抗体の構築のための他の例示的な重鎖および軽鎖アミノ酸配列としては、配列番号５〜４６が挙げられる。
一部の実施形態では、単鎖抗体は、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４ 配列番号４５、または配列番号４６の配列と少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９９％相同である。
一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、および／または配列番号４のＤＮＡ配列と少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９９％相同であるポリペプチドをコードする核酸配列を含む。
一部の実施形態では、遺伝子操作された微生物は、低酸素条件で、ならびに／あるいはがんの存在下で、および／または腫瘍微小環境、または組織特異的分子もしくは代謝物において、ならびに／あるいは炎症または免疫抑制に関連する分子または代謝物の存在下で、ならびに／あるいは消化管内に存在し得る代謝物の存在下で、ならびに／あるいはｉｎ ｖｉｖｏで存在することもあり、しないこともあり、ｉｎ ｖｉｔｒｏで、株培養、拡大増殖、産生、および／または製造中に存在することもある、代謝物、例えば、アラビノース、クメート、およびサリチレート、ならびに本明細書に記載される他のものの存在下で、記載のＣＴＬＡ−４、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＴＩＧＩＴ、ＶＩＳＴＡ、ＬＡＧ−３、ＴＩＭ１、ＴＩＭ３、ＣＥＡＣＡＭ１、ＬＡＩＲ−１、ＨＶＥＭ、ＢＴＬＡ、ＣＤ１６０、ＣＤ２００、ＣＤ２００Ｒ、ＣＤ３９、ＣＤ７３、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、ＩＤＯ、ＴＤＯ、ＫＩＲ、およびＡ２ａＲ回路のうちのいずれか１つまたは複数を発現することができる。一部の実施形態では、そのようなインデューサーは、エフェクター遺伝子発現を誘導するために、ｉｎ ｖｉｖｏで投与され得る。一部の実施形態では、ＣＴＬＡ−４、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＴＩＧＩＴ、ＶＩＳＴＡ、ＬＡＧ−３、ＴＩＭ１、ＴＩＭ３、ＣＥＡＣＡＭ１、ＬＡＩＲ−１、ＨＶＥＭ、ＢＴＬＡ、ＣＤ１６０、ＣＤ２００、ＣＤ２００Ｒ、ＣＤ３９、ＣＤ７３、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、ＩＤＯ、ＴＤＯ、ＫＩＲ、およびＡ２ａＲをコードする遺伝子配列は、そのような条件および／またはインデューサーにより誘導可能なプロモーターによって制御される。一部の実施形態では、ＣＴＬＡ−４、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＴＩＧＩＴ、ＶＩＳＴＡ、ＬＡＧ−３、ＴＩＭ１、ＴＩＭ３、ＣＥＡＣＡＭ１、ＬＡＩＲ−１、ＨＶＥＭ、ＢＴＬＡ、ＣＤ１６０、ＣＤ２００、ＣＤ２００Ｒ、ＣＤ３９、ＣＤ７３、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、ＩＤＯ、ＴＤＯ、ＫＩＲ、およびＡ２ａＲをコードする遺伝子配列は、本明細書に記載される構成的プロモーターによって制御される。一部の実施形態では、遺伝子配列は、構成的プロモーターにより制御され、本明細書に記載の、ｉｎ ｖｉｖｏ条件および／またはｉｎ ｖｉｔｒｏ条件で、例えば、拡大増殖、産生および／または製造中に発現される。一部の実施形態では、ＣＴＬＡ−４、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＴＩＧＩＴ、ＶＩＳＴＡ、ＬＡＧ−３、ＴＩＭ１、ＴＩＭ３、ＣＥＡＣＡＭ１、ＬＡＩＲ−１、ＨＶＥＭ、ＢＴＬＡ、ＣＤ１６０、ＣＤ２００、ＣＤ２００Ｒ、ＣＤ３９、ＣＤ７３、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、ＩＤＯ、ＴＤＯ、ＫＩＲ、およびＡ２ａＲをコードする記載の遺伝子配列のうちのいずれか１つまたは複数は、１つもしくは複数のプラスミド（例えば、高コピー数または低コピー数プラスミド）上に存在するか、または微生物の染色体内の１つもしくは複数の部位に組み込まれている。
これらの実施形態のいずれにおいても、ＣＴＬＡ−４、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＴＩＧＩＴ、ＶＩＳＴＡ、ＬＡＧ−３、ＴＩＭ１、ＴＩＭ３、ＣＥＡＣＡＭ１、ＬＡＩＲ−１、ＨＶＥＭ、ＢＴＬＡ、ＣＤ１６０、ＣＤ２００、ＣＤ２００Ｒ、ＣＤ３９、ＣＤ７３、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、ＩＤＯ、ＴＤＯ、ＫＩＲ、およびＡ２ａＲをコードする遺伝子配列を含む、遺伝子操作された細菌は、１つまたは複数のさらなるエフェクター分子、すなわち、治療用分子または代謝変換因子をコードする遺伝子配列をさらに含む。これらの実施形態のいずれにおいても、ＣＴＬＡ−４、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＴＩＧＩＴ、ＶＩＳＴＡ、ＬＡＧ−３、ＴＩＭ１、ＴＩＭ３、ＣＥＡＣＡＭ１、ＬＡＩＲ−１、ＨＶＥＭ、ＢＴＬＡ、ＣＤ１６０、ＣＤ２００、ＣＤ２００Ｒ、ＣＤ３９、ＣＤ７３、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、ＩＤＯ、ＴＤＯ、ＫＩＲ、およびＡ２ａＲをコードする回路は、同じかまたは異なる細菌株において、本明細書に記載される１つまたは複数の免疫イニシエーターまたは免疫サステナーをコードする回路と組み合わせることができる（組合せ回路または株の混合物）。免疫イニシエーターまたは免疫サステナーをコードする回路は、構成的または誘導性プロモーター、例えば、低酸素誘導性プロモーターまたは本明細書に記載される任意の他の構成的もしくは誘導性プロモーターの制御下にあり得る。
これらの実施形態のいずれにおいても、ＣＴＬＡ−４、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＴＩＧＩＴ、ＶＩＳＴＡ、ＬＡＧ−３、ＴＩＭ１、ＴＩＭ３、ＣＥＡＣＡＭ１、ＬＡＩＲ−１、ＨＶＥＭ、ＢＴＬＡ、ＣＤ１６０、ＣＤ２００、ＣＤ２００Ｒ、ＣＤ３９、ＣＤ７３、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、ＩＤＯ、ＴＤＯ、ＫＩＲ、およびＡ２ａＲをコードする遺伝子配列は、同じかまたは異なる細菌株において、本明細書に記載される１つまたは複数のＳＴＩＮＧアゴニスト産生酵素をコードする遺伝子配列と組み合わせることができる（組合せ回路または株の混合物）。一部の実施形態では、ＣＴＬＡ−４、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＴＩＧＩＴ、ＶＩＳＴＡ、ＬＡＧ−３、ＴＩＭ１、ＴＩＭ３、ＣＥＡＣＡＭ１、ＬＡＩＲ−１、ＨＶＥＭ、ＢＴＬＡ、ＣＤ１６０、ＣＤ２００、ＣＤ２００Ｒ、ＣＤ３９、ＣＤ７３、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、ＩＤＯ、ＴＤＯ、ＫＩＲ、およびＡ２ａＲをコードする遺伝子配列と組み合わされる遺伝子配列は、ＤａｃＡをコードする。ＤａｃＡは、構成的または誘導性プロモーター、例えば、低酸素誘導性プロモーター、例えば、ＦＮＲ、または本明細書に記載される任意の他の構成的もしくは誘導性プロモーターの制御下にあり得る。一部の実施形態では、ｄａｃＡ遺伝子は、染色体に組み込まれている。一部の実施形態では、ＣＴＬＡ−４、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＴＩＧＩＴ、ＶＩＳＴＡ、ＬＡＧ−３、ＴＩＭ１、ＴＩＭ３、ＣＥＡＣＡＭ１、ＬＡＩＲ−１、ＨＶＥＭ、ＢＴＬＡ、ＣＤ１６０、ＣＤ２００、ＣＤ２００Ｒ、ＣＤ３９、ＣＤ７３、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、ＩＤＯ、ＴＤＯ、ＫＩＲ、およびＡ２ａＲをコードする遺伝子配列と組み合わされる遺伝子配列は、ｃＧＡＳをコードする。ｃＧＡＳは、構成的または誘導性プロモーター、例えば、低酸素誘導性プロモーター、例えば、ＦＮＲ、または本明細書に記載される任意の他の構成的もしくは誘導性プロモーターの制御下にあり得る。一部の実施形態では、ｃＧＡＳをコードする遺伝子は、染色体に組み込まれている。
これらの組合せの実施形態のいずれにおいても、細菌は、栄養要求性の改変、例えば、ＤａｐＡ、ＴｈｙＡ、または両方の突然変異または欠失をさらに含み得る。これらの実施形態のいずれにおいても、細菌は、ファージの改変、例えば、本明細書に記載される内在性プロファージの突然変異または欠失をさらに含み得る。
また、一部の実施形態では、遺伝子操作された微生物は、ＣＴＬＡ−４、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＴＩＧＩＴ、ＶＩＳＴＡ、ＬＡＧ−３、ＴＩＭ１、ＴＩＭ３、ＣＥＡＣＡＭ１、ＬＡＩＲ−１、ＨＶＥＭ、ＢＴＬＡ、ＣＤ１６０、ＣＤ２００、ＣＤ２００Ｒ、ＣＤ３９、ＣＤ７３、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、ＩＤＯ、ＴＤＯ、ＫＩＲ、およびＡ２ａＲをコードする記載の回路のうちのいずれか１つまたは複数を発現することができ、以下のうちの１つまたは複数をさらに含む：（１）１つまたは複数の栄養要求体、例えば、当技術分野において公知の、本明細書に提供される、任意の栄養要求体、例えば、ｔｈｙＡ栄養要求体、（２）１つまたは複数のキルスイッチ回路、例えば、本明細書に記載されるか、またはそうでなければ当該技術分野において公知の、キルスイッチのうちのいずれか、（３）１つまたは複数の抗生物質耐性回路、（４）生体分子または基質を移入するための１つまたは複数の輸送体、例えば、本明細書に記載されるか、またはそうでなければ当該技術分野において公知の、輸送体のうちのいずれか、（５）１つまたは複数の分泌回路、例えば、本明細書に記載され、そうでなければ当該技術分野において公知の、分泌回路のうちのいずれか、（６）１つまたは複数の表面提示回路、例えば、本明細書に記載され、そうでなければ当該技術分野において公知の、表面提示回路のうちのいずれか、および（７）本明細書に記載される１つまたは複数の代謝物（例えば、キヌレニン、トリプトファン、アデノシン、アルギニン）の産生または分解のための１つまたは複数の回路、（８）このような追加の回路のうちの１つまたは複数の組合せ。これらの実施形態のいずれにおいても、遺伝子操作された細菌は、単独で、または抗ＣＴＬＡ４、抗ＰＤ１、もしくは抗ＰＤ−Ｌ１抗体を含むがこれらに限定されない、本明細書に記載される１つもしくは複数の免疫チェックポイント阻害剤と組み合わせて投与してもよい。
免疫代謝および代謝変換因子
トリプトファンおよびキヌレニン
調節性Ｔ細胞、またはＴｒｅｇは、過剰な免疫反応を防止すること、自己抗原に対する寛容を維持すること、および自己免疫を消失させることによって免疫系をモジュレートする、Ｔ細胞の亜集団である。Ｔｒｅｇは、他の細胞の免疫応答を抑制し、例えば、侵入してくる生物の排除に成功した後、免疫応答を停止させる。これらの細胞は、エフェクターＴ細胞の誘導および増殖を一般に抑制または下方調節する。ＣＤ４、ＣＤ２５、およびＦｏｘｐ３（ＣＤ４＋ＣＤ２５＋調節性Ｔ細胞）を発現するものを含む、調節性Ｔ細胞の種々の亜集団がある。Ｔｒｅｇは、エフェクターＴ細胞応答を減弱させるのに肝要であり、したがって、有効な抗腫瘍応答の主な障害の１つに相当し、抗腫瘍応答の誘導または強化に頼る現行の治療の失敗を意味する。したがって、ある特定の実施形態では、本開示の遺伝子操作された細菌は、Ｔｒｅｇを枯渇させる、および／またはＴｒｅｇ活性化を阻害もしくは遮断する、１つまたは複数の免疫モジュレーターを産生する。
トリプトファン（ＴＲＰ）からキヌレニン（ＫＹＮ）への代謝経路は、自然および適応免疫の肝要な調節因子として確立されている。インドールアミン−２，３−ジオキシゲナーゼ１（ＩＤＯ１）およびＴＲＰ−２，３−ジオキシゲナーゼ２（ＴＤＯ）による必須アミノ酸であるトリプトファンの分解、ならびに結果として生じるアリール炭化水素受容体（ＡＨＲ）を活性化するトリプトファン代謝物、例えば、キヌレニンの産生はいずれも、多くの種類のがんにおいて、免疫抑制性微小環境を維持する中心経路である。例えば、ＡＨＲとのキヌレニンの結合は、調節性Ｔ細胞表現型（Ｔｒｅｇ）に有利に働くナイーブＣＤ４＋ヘルパーＴ（Ｔｈ）細胞の分化の再プログラミングをもたらし、その一方で、インターロイキン−１７（ＩＬ−１７）産生Ｔｈ（Ｔｈ１７）細胞への分化の抑制をもたらす。アリール水素受容体の活性化は、樹状細胞に対する免疫寛容性表現型の促進ももたらす。
一部の実施形態では、本開示の遺伝子操作された微生物、例えば、遺伝子操作された細菌は、トリプトファンを産生する、および／またはキヌレニンを分解することによって、Ｔｒｅｇを枯渇させることまたはＴｒｅｇの活性化を阻害もしくは遮断することができる。一部の実施形態では、本開示の遺伝子操作された微生物は、トリプトファンを産生する、および／またはキヌレニンを分解することによって、ＣＤ８＋：Ｔｒｅｇの比を増大させることができる（例えば、ＴｒｅｇよりＣＤ８＋の産生に有利に働く）。
トリプトファンを増加させること
一部の実施形態では、本開示の遺伝子操作された微生物は、トリプトファンを産生することができる。一部の実施形態では、トリプトファンを産生する、遺伝子操作された細菌および／または他の微生物は、トリプトファン生合成経路の１つまたは複数の酵素をコードする１つまたは複数の遺伝子配列を含む。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓまたはＥ．ｃｏｌｉ．に由来するｔｒｐＥ、ｔｒｐＤ、ｔｒｐＣ、ｔｒｐＦ、ｔｒｐＢ、およびｔｒｐＡ遺伝子をコードする配列を含み、必要に応じて、トリプトファン前駆体であるコリスマイト（ｃｈｏｒｉｓｍｉｔｅ）を産生する遺伝子配列、例えば、ａｒｏＧ、ａｒｏＦ、ａｒｏＨ、ａｒｏＢ、ａｒｏＤ、ａｒｏＥ、ａｒｏＫ、およびＡｒｏＣをコードする配列、ならびに必要に応じて野生型またはフィードバック耐性のいずれかのＳｅｒＡ遺伝子を含む。必要に応じて、ＡｒｏＧおよびＴｒｐＥは、フィードバック耐性バージョンで置き換えられる。これらの実施形態のいずれにおいても、トリプトファンリプレッサー（ｔｒｐＲ）を、必要に応じて、そのリプレッサー機能を低下させるかまたは消去するように、欠失、突然変異、または改変してもよい。これらの実施形態のいずれにおいても、ｔｎａＡ遺伝子（Ｔｒｐをインドールに変換するトリプトファナーゼをコードする）が、必要に応じて、欠失していてもよい。そのようなチェックポイント阻害剤分子の例は、例えば、２０１７年１月１１日に出願され、ＷＯ２０１７／１２３６７５として公開された国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０１３０７２、および２０１８年１月１日に出願されたＰＣＴ／ＵＳ２０１８／０１２６９８に記載されており、これらのそれぞれの内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、低酸素条件で、ならびに／あるいはがんの、および／または腫瘍微小環境の、および／または腫瘍微小環境もしくは組織特異的分子もしくは代謝物の存在下で、ならびに／あるいは炎症または免疫抑制に関連する分子または代謝物の存在下で、ならびに／あるいは腫瘍もしくは消化管内に存在し得る代謝物の存在下で、ならびに／あるいはｉｎ ｖｉｖｏで存在することもあり、しないこともあり、ｉｎ ｖｉｔｒｏで、株培養、拡大増殖、産生、および／または製造中に存在することもある、代謝物、例えば、アラビノース、クメート、およびサリチレート、ならびに本明細書に記載される他のものの存在下で、記載の回路のうちのいずれか１つまたは複数を発現することができる。一部の実施形態では、そのようなインデューサーは、エフェクター遺伝子発現を誘導するために、ｉｎ ｖｉｖｏで投与され得る。一部の実施形態では、遺伝子配列は、そのような条件および／またはインデューサーにより誘導可能なプロモーターによって制御される。一部の実施形態では、遺伝子配列は、本明細書に記載される構成的プロモーターによって制御される。一部の実施形態では、遺伝子配列は、構成的プロモーターによって制御され、本明細書に記載の、ｉｎ ｖｉｖｏ条件および／またはｉｎ ｖｉｔｒｏ条件で、例えば、細菌の拡大増殖、産生、および／または製造中に発現される。
一部の実施形態では、記載の回路のうちのいずれか１つまたは複数は、１つもしくは複数のプラスミド（例えば、高コピー数または低コピー数プラスミド）上に存在するか、または細菌の染色体内の１つもしくは複数の部位に組み込まれている。また、一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌および／または他の微生物は、記載の回路のうちのいずれか１つまたは複数をさらに発現することができ、以下のうちの１つまたは複数をさらに含む：（１）本明細書に記載される、ＳＴＩＮＧアゴニストの産生のための１つまたは複数の酵素を含むがこれらに限定されない、１つまたは複数のイニシエーター回路、（２）本明細書に記載される１つまたは複数のサステナー回路、（３）１つまたは複数の栄養要求体、例えば、当該技術分野において公知の、本明細書に提供される、任意の栄養要求体、例えば、ｔｈｙＡ栄養要求体、（２）本明細書に記載されるか、またはそうでなければ当該技術分野において公知の、１つまたは複数のキルスイッチ回路、（３）１つまたは複数の抗生物質耐性回路、（４）本明細書に記載されるか、またはそうでなければ当該技術分野において公知の、生体分子または基質を移入するための１つまたは複数の輸送体、（５）本明細書に記載され、そうでなければ当該技術分野において公知の、１つまたは複数の分泌回路、（６）本明細書に記載され、そうでなければ当該技術分野において公知の、１つまたは複数の表面提示回路、（７）本明細書に記載される１つまたは複数の代謝物の産生または分解のための１つまたは複数の回路（代謝変換因子）（例えば、キヌレニン、トリプトファン、アデノシン、アルギニン）、および（８）このような追加の回路のうちの１つまたは複数の組合せ。これらの実施形態のいずれにおいても、遺伝子操作された細菌を単独で投与することができ、または抗ＣＴＬＡ４抗体、抗ＰＤ１および／もしくは抗ＰＤＬ１抗体を含むがこれらに限定されない、本明細書に記載の１つもしくは複数の免疫チェックポイントインヒビターと組み合わせて投与することができる。
キヌレニンを減少させること
一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌および／または他の微生物は、キヌレニンを代謝または分解するため、および細胞外環境におけるキヌレニンレベルを低減させるための機序を含む。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌および／または他の微生物は、キヌレニナーゼをコードする遺伝子配列を含む。
一実施形態では、遺伝子操作された微生物は、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓからのキヌレニナーゼの発現のための遺伝子配列をコードし、このキヌレニナーゼは、キヌレニンをＡＡ（アントラニル酸（Ａｎｔｈｒａｎｉｌｌｉｃ ａｃｉｄ））に変換し、その後、このＡＡは、Ｅ．ｃｏｌｉ ｔｒｐオペロンの酵素によってトリプトファンに変換されうる。必要に応じて、ｔｒｐＥ遺伝子を、それがキヌレニンからのトリプトファンの生成に必要とされない場合には、欠失させてもよい。したがって、一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ｔｒｐＤ、ｔｒｐＣ、ｔｒｐＡ、ならびにｔｒｐＤおよびキヌレニナーゼをコードする、１つまたは複数の遺伝子または遺伝子カセットを含むことができる。この欠失は、内在性コリスメート経路によるトリプトファンの産生を妨げることもあり、キヌレニナーゼによるキヌレニンからのトリプトファンの産生を増加させることもある。
代替実施形態では、ｔｒｐＥ遺伝子は、キヌレニンおよびコリスメートの両方を基質として使用することによりトリプトファン産生を最大にするために、欠失されない。本発明の一実施形態では、この回路を含む遺伝子操作された細菌および／または他の微生物は、がんにおける免疫回避を低減させるのに有用であり得る。
一部の実施形態では、微生物は、細胞外環境、例えば腫瘍環境、からのキヌレニンの取込みのための輸送体をコードする。Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍにおいてｃｈｒとｔｒｐオペロンの間に位置するＡｒｏＴ、ならびにＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉのｔｒｐ座位付近の類似の遺伝子、ａｒｏＲおよびａｒｏＳは、芳香族アミノ酸の輸送に関与することが判明した。ＡｒｏＰは、芳香族アミノ酸（フェニルアラニン、チロシン、およびトリプトファン）の細胞質膜を横断する輸送に関与する透過酵素である。そのような輸送体／透過酵素の発現は、遺伝子操作された微生物におけるキヌレニン移入に有用でありうる。
本開示の遺伝子操作された細菌によりコードされるキヌレニナーゼをコードする例示的な遺伝子としては、ある特定の実施形態では、配列番号６５〜６７が挙げられる。
一実施形態では、遺伝子操作された細菌によりコードされ、発現される１つまたは複数のポリペプチドおよび／またはポリヌクレオチドは、配列番号６５から配列番号６７までの１つまたは複数と少なくとも約８０％の同一性を有する。一実施形態では、遺伝子操作された細菌によりコードされ、発現される１つまたは複数のポリペプチドおよび／またはポリヌクレオチドは、配列番号６５から配列番号６７までの１つまたは複数と少なくとも約８５％の同一性を有する。一実施形態では、遺伝子操作された細菌によりコードされ、発現される１つまたは複数のポリペプチドおよび／またはポリヌクレオチドは、配列番号６５から配列番号６７までの１つまたは複数と少なくとも約９０％の同一性を有する。一実施形態では、遺伝子操作された細菌によりコードされ、発現される１つまたは複数のポリペプチドおよび／またはポリヌクレオチドは、配列番号６５から配列番号６７までの１つまたは複数と少なくとも約９５％の同一性を有する。一実施形態では、遺伝子操作された細菌によりコードされ、発現される１つまたは複数のポリペプチドおよび／またはポリヌクレオチドは、配列番号６５から配列番号６７までの１つまたは複数と少なくとも約９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する。したがって、一実施形態では、遺伝子操作された細菌により発現される１つまたは複数のポリペプチドおよび／またはポリヌクレオチドは、配列番号６５から配列番号６７までの１つまたは複数と少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する。別の実施形態では、遺伝子操作された細菌によりコードされ、発現される１つまたは複数のポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチドは、配列番号６５から配列番号６７までの１つまたは複数の配列を含む。別の実施形態では、遺伝子操作された細菌によりコードされ、発現される１つまたは複数のポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチドは、配列番号６５から配列番号６７までの１つまたは複数の配列からなる。
例示的なコドン最適化キヌレニナーゼカセット配列は、配列番号６８、８６５、６９、８６６、７０、８６７を含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌によりコードされ、発現される１つまたは複数のポリヌクレオチドは、配列番号６８から配列番号７０および配列番号８６５から配列番号８６８までの１つまたは複数と少なくとも約８０％の同一性を有する。一実施形態では、遺伝子操作された細菌によりコードされ、発現される１つまたは複数のポリヌクレオチドは、配列番号６８から配列番号７０および配列番号８６５から配列番号８６８までの１つまたは複数と少なくとも約８５％の同一性を有する。一実施形態では、遺伝子操作された細菌によりコードされ、発現される１つまたは複数のポリヌクレオチドは、配列番号６８から配列番号７０および配列番号８６５から配列番号８６８までの１つまたは複数と少なくとも約９０％の同一性を有する。一実施形態では、遺伝子操作された細菌によりコードされ、発現される１つまたは複数のポリヌクレオチドは、配列番号６８から配列番号７０および配列番号８６５から配列番号８６８までの１つまたは複数と少なくとも約９５％の同一性を有する。一実施形態では、遺伝子操作された細菌によりコードされ、発現される１つまたは複数のポリヌクレオチドは、配列番号６８から配列番号７０および配列番号８６５から配列番号８６８までの１つまたは複数と少なくとも約９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する。したがって、一実施形態では、遺伝子操作された細菌により発現される１つまたは複数のポリヌクレオチドは、配列番号６８から配列番号７０および配列番号８６５から配列番号８６８までの１つまたは複数と少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する。別の実施形態では、遺伝子操作された細菌によりコードされ、発現される１つまたは複数のポリヌクレオチドは、配列番号６８から配列番号７０および配列番号８６５から配列番号８６８までの１つまたは複数の配列を含む。別の実施形態では、遺伝子操作された細菌によりコードされ、発現される１つまたは複数のポリヌクレオチドは、配列番号６８から配列番号７０および配列番号８６５から配列番号８６８までの１つまたは複数の配列からなる。
一部の実施形態では、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓキヌレニナーゼの発現のための構築物は、配列番号１１６、配列番号８８８、配列番号８８９、配列番号８９０、配列番号８９１、配列番号８９２、および／または配列番号８９３から選択される配列と少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９９％相同である。一部の実施形態では、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓキヌレニナーゼの発現のための構築物は、配列番号１１６、配列番号８８８、配列番号８８９、配列番号８９０、配列番号８９１、配列番号８９２、および／または配列番号８９３から選択される配列を含む。一部の実施形態では、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓキヌレニナーゼの発現のための構築物は、配列番号１１６、配列番号８８８、配列番号８８９、配列番号８９０、配列番号８９１、配列番号８９２、および／または配列番号８９３から選択される配列からなる。他の適切なキヌレニナーゼは、米国特許出願公開第２０１７００５６４４９号に記載されており、前記特許文献の内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
これらの実施形態のいずれにおいても、キヌレニンを消費するように、および必要に応じて、トリプトファンを産生するように、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より０％〜２％〜４％、４％〜６％、６％〜８％、８％〜１０％、１０％〜１２％、１２％〜１４％、１４％〜１６％、１６％〜１８％、１８％〜２０％、２０％〜２５％、２５％〜３０％、３０％〜３５％、３５％〜４０％、４０％〜４５％、４５％〜５０％、５０％〜５５％、５５％〜６０％、６０％〜６５％、６５％〜７０％〜８０％、８０％〜９０％、または９０％〜１００％多いキヌレニンを消費する。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より１．０〜１．２倍、１．２〜１．４倍、１．４〜１．６倍、１．６〜１．８倍、１．８〜２倍、または２倍多いキヌレニンを消費する。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より約３倍、４倍、約３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、１００倍、５００倍、または１０００倍多いキヌレニンを消費する。
これらの実施形態のいずれにおいても、キヌレニンを消費するように、および必要に応じて、トリプトファンを産生するように、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より少なくとも約０％〜２％〜４％、４％〜６％、６％〜８％、８％〜１０％、１０％〜１２％、１２％〜１４％、１４％〜１６％、１６％〜１８％、１８％〜２０％、２０％〜２５％、２５％〜３０％、３０％〜３５％、３５％〜４０％、４０％〜４５％、４５％〜５０％、５０％〜５５％、５５％〜６０％、６０％〜６５％、６５％〜７０％〜８０％、８０％〜９０％、または９０％〜１００％多いトリプトファンを産生する。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より少なくとも約１．０〜１．２倍、１．２〜１．４倍、１．４〜１．６倍、１．６〜１．８倍、１．８〜２倍、または２倍多いトリプトファンを産生する。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より約３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、４０倍、または５０倍、１００倍、５００倍、または１０００倍多いトリプトファンを産生する。
これらの実施形態のいずれにおいても、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌と比較して、キヌレニン消費速度を０％〜２％〜４％、４％〜６％、６％〜８％、８％〜１０％、１０％〜１２％、１２％〜１４％、１４％〜１６％、１６％〜１８％、１８％〜２０％、２０％〜２５％、２５％〜３０％、３０％〜３５％、３５％〜４０％、４０％〜４５％、４５％〜５０％、５０％〜５５％、５５％〜６０％、６０％〜６５％、６５％〜７０％〜８０％、８０％〜９０％、または９０％〜１００％上昇させる。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌と比較して、キヌレニン消費速度を１．０〜１．２倍、１．２〜１．４倍、１．４〜１．６倍、１．６〜１．８倍、１．８〜２倍、または２倍大きく上昇させる。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌と比較して、キヌレニン消費速度を約３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、４０倍、または５０倍、１００倍、５００倍、または１０００倍上昇させる。
一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、４時間後、同じ細菌亜型の未改変細菌と比較して、キヌレニン消費を約８０％〜１００％増加させる。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、４時間後、同じ細菌亜型の未改変細菌と比較して、キヌレニン消費を約９０％〜１００％増加させる。１つの特定の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、４時間後、同じ細菌亜型の未改変細菌と比較して、キヌレニン消費を約９５％〜１００％増加させる。１つの特定の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、４時間後、同じ細菌亜型の未改変細菌と比較して、キヌレニン消費を約９９％〜１００％増加させる。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、４時間後、キヌレニン消費を約１０〜５０倍増加させる。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、４時間後、キヌレニン消費を約５０〜１００倍増加させる。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、４時間後、キヌレニン消費を約１００〜５００倍増加させる。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、４時間後、キヌレニン消費を約５００〜１０００倍増加させる。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、４時間後、キヌレニン消費を約１０００〜５０００倍増加させる。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、４時間後、キヌレニン消費を約５０００〜１００００倍増加させる。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、４時間後、キヌレニン消費を約１００００〜１０００倍増加させる。
これらの実施形態のいずれにおいても、遺伝子操作された細菌は、例えば、腫瘍において、細胞増殖を、同じ条件下で、同じ亜型の未改変細菌と比較して、少なくとも約１０％〜２０％、２０％〜２５％、２５％〜３０％、３０％〜４０％、４０％〜５０％、５０％〜６０％、６０％〜７０％、７０％〜７５％、７５％〜８０％、８０％〜８５％、８５％〜９０％、９０％〜９５％、９５％〜９９％、またはそれより大きく低減することができる。これらの実施形態のいずれにおいても、遺伝子操作された細菌は、例えば、腫瘍において、腫瘍増殖を、同じ条件下で、同じ亜型の未改変細菌と比較して、少なくとも約１０％〜２０％、２０％〜２５％、２５％〜３０％、３０％〜４０％、４０％〜５０％、５０％〜６０％、６０％〜７０％、７０％〜７５％、７５％〜８０％、８０％〜８５％、８５％〜９０％、９０％〜９５％、９５％〜９９％、またはそれより大きく低減することができる。これらの実施形態のいずれにおいても、遺伝子操作された細菌は、例えば、腫瘍において、腫瘍サイズを、同じ条件下で、同じ亜型の未改変細菌と比較して、少なくとも約１０％〜２０％、２０％〜２５％、２５％〜３０％、３０％〜４０％、４０％〜５０％、５０％〜６０％、６０％〜７０％、７０％〜７５％、７５％〜８０％、８０％〜８５％、８５％〜９０％、９０％〜９５％、９５％〜９９％、またはそれより大きく低減することができる。これらの実施形態のいずれにおいても、遺伝子操作された細菌は、例えば、腫瘍において、腫瘍体積を、同じ条件下で、同じ亜型の未改変細菌と比較して、少なくとも約１０％〜２０％、２０％〜２５％、２５％〜３０％、３０％〜４０％、４０％〜５０％、５０％〜６０％、６０％〜７０％、７０％〜７５％、７５％〜８０％、８０％〜８５％、８５％〜９０％、９０％〜９５％、９５％〜９９％、またはそれより大きく低減することができる。これらの実施形態のいずれにおいても、遺伝子操作された細菌は、例えば、腫瘍において、腫瘍重量を、同じ条件下で、同じ亜型の未改変細菌と比較して、少なくとも約１０％〜２０％、２０％〜２５％、２５％〜３０％、３０％〜４０％、４０％〜５０％、５０％〜６０％、６０％〜７０％、７０％〜７５％、７５％〜８０％、８０％〜８５％、８５％〜９０％、９０％〜９５％、９５％〜９９％、またはそれより大きく低減することができる。
一部の実施形態では、キヌレニナーゼは、本明細書に記載される分泌系を使用して、細胞外環境、例えば、腫瘍微小環境に分泌される。
一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌および／または他の微生物は、キヌレニンを代謝または分解するための機構であって、一部の実施形態では、トリプトファンの産生増加ももたらす機構を含む。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、細胞外環境におけるＴＲＰ：ＫＹＮ比またはＫＹＮ：ＴＲＰ比をモジュレートする。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ＴＲＰ：ＫＹＮ比またはＫＹＮ：ＴＲＰ比を増大させる。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ＴＲＰ：ＫＹＮ比またはＫＹＮ：ＴＲＰ比を低減させる。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、酵素キヌレニナーゼをコードする配列を、さらに、本明細書に記載されるトリプトファン産生回路のうちのいずれかを含む。
遺伝子操作された細菌および／または他の微生物は、キヌレニナーゼを産生するために任意の適切な遺伝子を含むことができる。一部の実施形態では、キヌレニナーゼを産生するための遺伝子は、例えば、安定性を増強させ、キヌレニナーゼ産生を増加させるように、改変および／または突然変異される。一部の実施形態では、操作された細菌および／または他の微生物はまた、キヌレニンの取込みまたは移入が増強されており、例えば、キヌレニンの細菌および／または他の微生物細胞への取込みを増加させるための輸送体または他の機構を含む。
一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌および／または他の微生物は、誘導条件下で、例えば、免疫抑制および／または腫瘍微小環境に関連する条件下で、キヌレニナーゼを産生することができる。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌および／または他の微生物は、低酸素条件で、がん、もしくはある特定の組織、免疫抑制、もしくは炎症と関連するある特定の分子または代謝物の存在下で、あるいはｉｎ ｖｉｖｏで、例えば、腫瘍微小環境に存在することもあり、しないこともあり、ｉｎ ｖｉｔｒｏで、株培養、拡大増殖、産生、および／または製造中に存在することもある、何らかの他の代謝物、例えば、アラビノース、クメート、およびサリチレートの存在下で、キヌレニナーゼを産生することができる。
一部の実施形態では、遺伝子配列は、そのような条件および／またはインデューサーにより誘導されうるプロモーターによって制御される。一部の実施形態では、遺伝子配列は、本明細書に記載の構成的プロモーターによって制御される。一部の実施形態では、遺伝子配列は、構成的プロモーターにより制御され、本明細書に記載の、ｉｎ ｖｉｖｏ条件および／またはｉｎ ｖｉｔｒｏ条件で、例えば、細菌および／もしくは他の微生物の拡大増殖、産生および／または製造中に発現される。一部の実施形態では、記載の回路のうちのいずれか１つまたは複数は、１つもしくは複数のプラスミド（例えば、高コピー数または低コピー数プラスミド）上に存在するか、または細菌の染色体内の１つもしくは複数の部位に組み込まれている。
これらの実施形態のいずれにおいても、キヌレニナーゼ、例えば、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓに由来するものをコードする遺伝子配列を含む、遺伝子操作された細菌は、１つまたは複数のさらなるエフェクター分子、すなわち、治療用分子または代謝変換因子をコードする遺伝子配列をさらに含む。これらの実施形態のいずれにおいても、キヌレニナーゼ、例えば、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓに由来するものをコードする回路は、同じかまたは異なる細菌株において、本明細書に記載される１つまたは複数の免疫イニシエーターまたは免疫サステナーをコードする回路と組み合わせることができる（組合せ回路または株の混合物）。免疫イニシエーターまたは免疫サステナーをコードする回路は、構成的または誘導性プロモーター、例えば、低酸素誘導性プロモーターまたは本明細書に記載される任意の他の構成的もしくは誘導性プロモーターの制御下にあり得る。
これらの実施形態のいずれにおいても、キヌレニナーゼ、例えば、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓに由来するものをコードする遺伝子配列は、同じかまたは異なる細菌株において、本明細書に記載される１つまたは複数のＳＴＩＮＧアゴニスト産生酵素をコードする遺伝子配列と組み合わせることができる（組合せ回路または株の混合物）。一部の実施形態では、キヌレニナーゼ、例えば、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓに由来するものをコードする遺伝子配列と組み合わされる遺伝子配列は、ＤａｃＡをコードする。ＤａｃＡは、構成的または誘導性プロモーター、例えば、低酸素誘導性プロモーター、例えば、ＦＮＲ、または本明細書に記載される任意の他の構成的もしくは誘導性プロモーターの制御下にあり得る。一部の実施形態では、ｄａｃＡ遺伝子は、染色体に組み込まれている。一部の実施形態では、キヌレニナーゼ、例えば、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓに由来するものをコードする遺伝子配列と組み合わされる遺伝子配列は、ｃＧＡＳをコードする。ｃＧＡＳは、構成的または誘導性プロモーター、例えば、低酸素誘導性プロモーター、例えば、ＦＮＲ、または本明細書に記載される任意の他の構成的もしくは誘導性プロモーターの制御下にあり得る。一部の実施形態では、ｃＧＡＳをコードする遺伝子は、染色体に組み込まれている。これらの組合せの実施形態のいずれにおいても、細菌は、栄養要求性の改変、例えば、ＤａｐＡ、ＴｈｙＡ、または両方の突然変異または欠失をさらに含み得る。これらの実施形態のいずれにおいても、細菌は、ファージの改変、例えば、本明細書に記載される内在性プロファージの突然変異または欠失をさらに含み得る。必要に応じて、細菌株は、本明細書に記載されるトリプトファン産生回路網をさらに含み得る。
また、一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌および／または他の微生物は、記載の回路のうちのいずれか１つまたは複数をさらに発現することができ、以下のうちの１つまたは複数をさらに含む：（１）本明細書に記載される、ＳＴＩＮＧアゴニストの産生のための１つまたは複数の酵素を含むがこれらに限定されない、１つまたは複数のイニシエーター回路、（２）本明細書に記載される１つまたは複数のサステナー回路、（３）１つまたは複数の栄養要求体、例えば、当該技術分野において公知の、本明細書に提供される、任意の栄養要求体、例えば、ｔｈｙＡ栄養要求体、（２）本明細書に記載されるか、またはそうでなければ当該技術分野において公知の、１つまたは複数のキルスイッチ回路、（３）１つまたは複数の抗生物質耐性回路、（４）本明細書に記載されるか、そうでなければ当該技術分野において公知の、生体分子または基質を移入するための１つまたは複数の輸送体、（５）本明細書に記載され、そうでなければ当該技術分野において公知の、１つまたは複数の分泌回路、（６）本明細書に記載され、そうでなければ当該技術分野において公知の、１つまたは複数の表面提示回路、および（７）本明細書に記載される１つまたは複数の代謝物の産生または分解のための１つまたは複数の回路（代謝変換因子）（例えば、キヌレニン、トリプトファン、アデノシン、アルギニン）、および（８）このような追加の回路のうちの１つまたは複数の組合せ。これらの実施形態のいずれにおいても、遺伝子操作された細菌は、単独で、または抗ＣＴＬＡ４抗体、抗ＰＤ１、および／もしくは抗ＰＤＬ１抗体を含むがこれらに限定されない、本明細書に記載される１つもしくは複数の免疫チェックポイント阻害剤と組み合わせて投与してもよい。
適応実験室進化（ＡＬＥ）
本明細書に記載されるＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ（ｋｙｎＵ）に由来するキヌレニナーゼ（ＫＹＮａｓｅ）を導入することによって、ＫＹＮを効率的に移入し、それをＴＲＰに変換するように、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅを操作することができる。
Ｅ．ｃｏｌｉは、そのＴＲＰ生合成経路においてアントラニレートを天然に利用する。簡単に述べると、ＴｒｐＥ（ＴｒｐＤとの複合体でのＴｒｐＥ）酵素は、コリスメートをアントラニレートに変換する。次いで、ＴｒｐＤ、ＴｒｐＣ、ＴｒｐＡおよびＴｒｐＢは、インドールとセリンが縮合してトリプトファンを形成することで終わる、５ステップ反応を触媒する。ラムダ−ＲＥＤリコンビニアリングによってＴｒｐＥ酵素を置換することにより、その後のＮｉｓｓｌｅ株（ΔｔｒｐＥ：：Ｃｍ）は、ＴＲＰまたはアントラニレートの補給のない最少培地では成長することができない栄養要求株である。あるいは、ΔｔｒｐＥ：：Ｃｍにおけるキヌレニナーゼの発現（ＫＹＮａｓｅ−ｔｒｐＥ）によって、ＫＹＮを供給することによりこの栄養要求体をレスキューすることができる。
本明細書に記載されるように、ＫＹＮａｓｅ−ｔｒｐＥ中のＫＹＮの成長制限性を活用し、適応実験室進化を用いて、ＫＹＮを益々効率的に利用することができる株を進化させた。
それらの培養の容易さ、短い世代時間、非常に高い集団密度および小さいゲノムのため、微小生物を簡易タイムスケールで固有の表現型に進化させることができる。適応実験室進化（ＡＬＥ）は、好ましい表現型を有する株を進化させるために選択圧下で微小生物を継代させる方法である。適応実験室進化は、は、２０１７年１月１１日に出願され、ＷＯ２０１７／１２３６７５として公開された、国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０１３０７２に記載されており、その内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
先ず、ＫＹＮ濃度の下限を確立し、漸減ＫＹＮ濃度で継代させることにより突然変異体を進化させた。これは、ＫＹＮ移入を増加させることができる突然変異体を選択することができるが、細菌細胞は、遊離している外因性ＴＲＰを利用するほうを依然として選ぶ。腫瘍環境において、ＫＹＮを枯渇させ、局所ＴＲＰ濃度を上昇させることにより、二重治療機能を得ることができる。したがって、ＴＲＰよりＫＹＮのほうを選ぶ株を進化させるために、ＴＲＰの毒性アナログ−５−フルオローＬ−トリプトファン（ＴｏｘＴＲＰ）−をＡＬＥ実験に組み込むことができる。次いで、結果として得られた最高性能の株を全ゲノム配列解析に供して、寄与する突然変異を逆重畳積分する。ラムダ−ＲＥＤを行って、ＴｒｐＥを再導入し、Ｔｒｐ調節（ｔｒｐＲ、ｔｙｒＲ転写アテニュエーター）を不活性化して、ＴｒｐＡＢＣＤＥ発現を上方調節し、コリスメート産生を増加させることができる。結果として得られる株は、今や外部ＴＲＰに対して非感受性であり、ＫＹＮを効率的にＴＲＰに変換し、そしてまた、今やＴＲＰを過剰産生する。
プリン作動性の系−ＡＴＰ／アデノシン代謝
がん免疫療法の成功に対する重要な障害は、腫瘍が、抗炎症性サイトカインの産生、調節性免疫サブセットの動員、および免疫抑制性代謝物の産生を含む、免疫回避を容易にするいくつかの機序を用いることである。１つのそのような免疫抑制経路は、ＣＤ７３による、強力な免疫抑制分子である細胞外アデノシンの産生である。損傷したまたは瀕死の細胞および細菌により放出される、免疫刺激性細胞外ＡＴＰは、免疫食細胞の動員を促進し、ＮＬＲＰ３インフラマソームの共活性化因子であるＰ２Ｘ７Ｒを活性化し、これにより、その後、ＩＬ−１βおよびＩＬ−１８などの炎症性サイトカインの産生が誘発される。細胞外ＡＴＰのＡＤＰ、ＡＭＰ、およびアデノシンへの異化は、ＡＴＰをＡＭＰに加水分解するＣＤ３９（エクトヌクレオシド三リン酸ジホスホヒドロラーゼ１、Ｅ−ＮＴＰＤａｓｅ１）、およびＡＭＰを脱リン酸化してアデノシンにするＣＤ７３（エクト−５’ヌクレオチダーゼ、Ｅｃｔｏ５’ＮＴａｓｅ）によって制御される。したがって、ＣＤ３９およびＣＤ７３は、協調して作用して、炎症性ＡＴＰを免疫抑制性アデノシンに変換する。その免疫調節性の役割に加えて、エクトヌクレオチダーゼ経路は、がん細胞成長、分化、浸潤、遊走、転移および腫瘍血管新生のモジュレーションに直接寄与する。
一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、腫瘍微小環境から過剰なアデノシンを除去するための手段を含む。多くの細菌は、合成のサルベージ経路によりヌクレオチドおよびデオキシヌクレオチドの合成環境から低濃度のヌクレオチドを捕捉する。加えて、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉでは、ヌクレオチドが、成長のための唯一の窒素および炭素源として使用されうる（Ｎｅｕｈａｒｄ Ｊ， Ｎｙｇａａｒｄ Ｐ． Ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ ｏｆ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ， ｐｕｒｉｎｅｓ ａｎｄ ｐｙｒｉｍｉｄｉｎｅｓ． Ｉｎ： Ｎｅｉｄｈａｒｄｔ ＦＣ、Ｉｎｇｒａｈａｍ ＪＬ、Ｌｏｗ ＫＢ、Ｍａｇａｓａｎｉｋ Ｂ、Ｓｃｈａｅｃｈｔｅｒ Ｍ、Ｕｍｂａｒｇｅｒ ＨＥ編． Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ａｎｄ Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ： Ｃｅｌｌｕｌａｒ ａｎｄ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ． Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ ＤＣ： ＡＳＭ Ｐｒｅｓｓ；１９８７年、４４５〜４７３頁）。濃縮型ヌクレオシド輸送体（ＣＮＴ）ファミリーと、ヌクレオシド：Ｈ＋共輸送体（ＮＨＳ）ファミリーという、２つの進化的に無関係のカチオン連結輸送体ファミリーが、ヌクレオシド取込みに関与する（例えば、Ｃａｂｒｉｔａら、Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． ８０巻、２００２年．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ ａｎｄ ｎｕｃｌｅｏｂａｓｅ ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎ ｅｕｋａｒｙｏｔｅｓ ａｎｄ ｐｒｏｋａｒｙｏｔｅｓを参照されたく、この内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。ＮｕｐＣおよびＮｕｐＧは、Ｅ．ｃｏｌｉにおける輸送体ファミリーメンバーである。ｎｕｐＣ遺伝子とｎｕｐＧ遺伝子の両方が欠失している突然変異体は、単一炭素源としてヌクレオシドを用いて成長することができない。これら両方の輸送体は、プロトンに連結しているが、それらの選択性に差がある。ＮｕｐＣは、Ｈ＋／ヌクレオチド共輸送体ファミリーのヌクレオチド輸送体である。ＮｕｐＣピリミジンヌクレオシド−Ｈ＋輸送体は、ヌクレオシド、特にピリミジンの共輸送（すなわち、Ｈ＋結合基質取込み）を媒介する。このファミリーの２つの公知メンバーは、グラム陽性およびグラム陰性菌で見られる。ＮｕｐＧは、広範なヌクレオシドおよびデオキシヌクレオシドを輸送することができ、対照的に、ＮｕｐＣは、グアノシンもデオキシグアノシンも輸送することができない。Ｅ．ｃｏｌｉ由来のＮｕｐＧのホモログは、ヒト消化管病原体、例えば、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、歯周病に関連する生物、例えば、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓおよびＰｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ、ならびにＥｒｗｉｎｉａ属の植物病原体を含む、広範な真性細菌に見られる（Ｖａｚｉｒｉら、Ｍｏｌ Ｍｅｍｂｒ Ｂｉｏｌ．、２０１３年３月；３０巻（１〜２号）：１１４〜１２８頁；Ｕｓｅ ｏｆ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｍｏｄｅｌｌｉｎｇ ｔｏ ｐｒｏｂｅ ｔｈｅ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ ｔｈｅ ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ ＮｕｐＧに記載の通りであり、この内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。ＣＮＴスーパーファミリーに由来する推定的細菌輸送体およびＮｕｐＧ／ＸａｐＢファミリーに由来する輸送体としては、以下の表５および表６に列挙されているものが挙げられる。加えて、ｃｏｄＢ（ＧｅｎＢａｎｋ Ｐ２５５２５、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）が、ウラシル／アラントイン輸送体ファミリーと称する酵母輸送体ファミリーとの相同性に基づいて同定された（Ｃａｂｒｉｔａら、上掲）。
一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、操作された細菌に腫瘍微小環境からアデノシンを移入するための手段を含む。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、操作された細菌または操作されたウイルスに腫瘍微小環境からアデノシンを移入するための手段を含む。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ヌクレオシド輸送体をコードするための配列を含む。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、アデノシン輸送体をコードするための配列を含む。ある特定の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、Ｅ．ｃｏｌｉヌクレオシド透過酵素ｎｕｐＧまたはｎｕｐＣをコードするための配列を含む。これらの実施形態のいずれにおいても、遺伝子操作された細菌は、腫瘍内投与のための細菌である。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、低酸素条件により活性化されるプロモーターの制御下の、ヌクレオシド輸送体またはアデノシン輸送体をコードするための配列、例えば、ｎｕｐＧまたはｎｕｐＣ輸送体配列を含む。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、低酸素条件によりまたは炎症性条件により活性化されるプロモーター、例えば、前記条件により活性化される、本明細書に記載のプロモーターのいずれかの制御下の、ヌクレオシド輸送体またはアデノシン輸送体をコードするための配列、例えば、ｎｕｐＧまたはｎｕｐＣ輸送体配列を含む。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、がん特異的プロモーター、組織特異的プロモーター、または構成的プロモーター、例えば、本明細書に記載のプロモーターのいずれかの制御下の、ヌクレオシド輸送体またはアデノシン輸送体をコードするための配列、例えば、ｎｕｐＧまたはｎｕｐＣ輸送体配列を含む。
一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、アデノシンを代謝または分解するための手段を含む。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、アデノシンを尿酸に変換することができる１つまたは複数の酵素をコードする１つまたは複数の遺伝子配列を含む（図１、図２および図３を参照されたい）。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、Ｅ．ｃｏｌｉからのａｄｄ、ｘａｐＡ、ｄｅｏＤ、ｘｄｈＡ、ｘｄｈＢ、およびｘｄｈＣ遺伝子をコードする配列を含む。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、Ｅ．ｃｏｌｉからのａｄｄ、ｘａｐＡ、ｄｅｏＤ、ｘｄｈＡ、ｘｄｈＢ、およびｘｄｈＣ遺伝子をコードする配列を含み、ヌクレオシドまたはアデノシン輸送体をコードする配列を含む。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、Ｅ．ｃｏｌｉからのａｄｄ、ｘａｐＡ、ｄｅｏＤ、ｘｄｈＡ、ｘｄｈＢ、およびｘｄｈＣ遺伝子をコードする配列を含み、ｎｕｐＧまたはｎｕｐＣをコードする配列を含む。例示的な操作された細菌は、図２に示されている。
アデノシン分解回路に有用な例示的な配列としては、配列番号７１〜７７が挙げられる。
一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、配列番号７１、配列番号７２、配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５、配列番号７６および／もしくは配列番号７７から選択される１つもしくは複数のポリヌクレオチド配列またはその機能性断片と少なくとも約８０％の同一性を有する、アデノシン分解酵素またはアデノシン輸送体をコードする核酸配列を含む。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、配列番号７１、配列番号７２、配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５、配列番号７６および／もしくは配列番号７７から選択される１つもしくは複数のポリヌクレオチド配列またはその機能性断片と少なくとも約９０％の同一性を有する、アデノシン分解酵素またはアデノシン輸送体をコードする核酸配列を含む。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、配列番号７１、配列番号７２、配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５、配列番号７６および／もしくは配列番号７７から選択される１つもしくは複数のポリヌクレオチド配列またはその機能性断片と少なくとも約９５％の同一性を有する、アデノシン分解酵素またはアデノシン輸送体をコードする核酸配列を含む。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、配列番号７１、配列番号７２、配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５、配列番号７６、および／または配列番号７７から選択される１つまたは複数のポリヌクレオチド配列と少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９９％相同である、アデノシン分解酵素またはアデノシン輸送体をコードする核酸配列を含む。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、配列番号７１、配列番号７２、配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５、配列番号７６および／または配列番号７７から選択される１つまたは複数のポリヌクレオチド配列を含む、アデノシン分解酵素またはアデノシン輸送体をコードする核酸配列を含む。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、配列番号７１、配列番号７２、配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５、配列番号７６および／または配列番号７７から選択される１つまたは複数のポリヌクレオチド配列からなる、アデノシン分解酵素またはアデノシン輸送体をコードする核酸配列を含む。
一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、遺伝コードの冗長性がなければ、配列番号７１、配列番号７２、配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５、配列番号７６、および／または配列番号７７から選択される配列と同じタンパク質をコードする、アデノシン分解酵素またはアデノシン輸送体をコードする核酸配列を含む。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、遺伝コードの冗長性がなければ、配列番号７１、配列番号７２、配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５、配列番号７６、および／もしくは配列番号７７から選択される配列によりコードされるポリペプチドまたはその機能性断片に対して少なくとも約８０％である、ポリペプチドをコードする、アデノシン分解酵素またはアデノシン輸送体をコードする核酸を含む。
一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、遺伝コードの冗長性がなければ、配列番号７１、配列番号７２、配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５、配列番号７６、および／もしくは配列番号７７から選択される配列によりコードされるポリペプチドまたはその機能性断片と少なくとも約９０％相同であるポリペプチドをコードする、アデノシン分解酵素またはアデノシン輸送体をコードする核酸を含む。
一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、遺伝コードの冗長性がなければ、配列番号７１、配列番号７２、配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５、配列番号７６および／もしくは配列番号７７から選択される配列またはその機能性断片によりコードされているポリペプチドと少なくとも約９５％相同であるポリペプチドをコードする、アデノシン分解酵素またはアデノシン輸送体をコードする核酸を含む。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、遺伝コードの冗長性がなければ、配列番号７１、配列番号７２、配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５、配列番号７６および／または配列番号７７から選択される配列によりコードされているポリペプチドと少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９９％相同であるポリペプチドをコードする、アデノシン分解酵素またはアデノシン輸送体をコードする核酸を含む。
１つの特定の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、染色体のＨＡ１／２（ａｇａＩ／ｒｓｍＩ）領域に組み込まれたＰｆｎｒＳ−ｎｕｐＣ、染色体のＨＡ９／１０（ｅｘｏ／ｃｅａ）領域に組み込まれたＰｆｎｒＳ−ｘｄｈＡＢＣ、および染色体のｍａｌＥ／Ｋ領域に組み込まれたＰｆｎｒＳ−ａｄｄ−ｘａｐＡ−ｄｅｏＤを含む。
一部の実施形態では、構築物は、ＰｆｎｒＳ（配列番号８５６）、ＰｆｎｒＳ−ｎｕｐＣ（配列番号８５７）、ＰｆｎｒＳ−ｘｄｈＡＢＣ（配列番号８５８）、ｘｄｈＡＢＣ（配列番号８５９）、ＰｆｎｒＳ−ａｄｄ−ｘａｐＡ−ｄｅｏＤ（配列番号８６０）、およびａｄｄ−ｘａｐＡ−ｄｅｏＤ（配列番号８６１）を含む。
一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、配列番号８５６、配列番号８５７、配列番号８５８、配列番号８５９、配列番号８６０、および／もしくは配列番号８６１から選択されるポリヌクレオチド配列またはそのバリアントもしくは機能性断片と少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９９％相同である構築物を消費するアデノシンをコードする核酸配列を含む。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、配列番号８５６、配列番号８５７、配列番号８５８、配列番号８５９、配列番号８６０、および／または配列番号８６１から選択される１つまたは複数のポリヌクレオチド配列を含む構築物を消費するアデノシンをコードする核酸配列を含む。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、配列番号８５６、配列番号８５７、配列番号８５８、配列番号８５９、配列番号８６０、および／または配列番号８６１から選択される１つまたは複数のポリヌクレオチド配列からなる構築物を消費するアデノシンをコードする核酸配列を含む。
一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ＮｕｐＣをコードする核酸配列を含む。一実施形態では、核酸配列は、配列番号７８と少なくとも約８０％の同一性を有するＮｕｐＣポリペプチドをコードする。一実施形態では、核酸配列は、配列番号７８と少なくとも約９０％の同一性を有するＮｕｐＣポリペプチドをコードする。別の実施形態では、核酸配列は、配列番号７８と少なくとも約９５％の同一性を有するＮｕｐＣポリペプチドをコードする。したがって、一実施形態では、核酸配列は、配列番号７８と少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有するＮｕｐＣポリペプチドをコードする。別の実施形態では、核酸配列は、配列番号７８をコードする配列を含むＮｕｐＣポリペプチドをコードする。さらに別の実施形態では、核酸配列は、配列番号７８からなるＮｕｐＣポリペプチドをコードする。
一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ＸｄｈＡをコードする核酸配列を含む。一実施形態では、核酸配列は、配列番号７９と少なくとも約８０％の同一性を有するＸｄｈＡポリペプチドをコードする。一実施形態では、核酸配列は、配列番号７９と少なくとも約９０％の同一性を有するＸｄｈＡポリペプチドをコードする。別の実施形態では、核酸配列は、配列番号７９と少なくとも約９５％の同一性を有するＸｄｈＡポリペプチドをコードする。したがって、一実施形態では、核酸配列は、配列番号７９と少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有するＸｄｈＡポリペプチドをコードする。別の実施形態では、核酸配列は、配列番号７９をコードする配列を含むＸｄｈＡポリペプチドをコードする。さらに別の実施形態では、核酸配列は、配列番号７９をコードする配列からなるＸｄｈＡポリペプチドをコードする。
一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ＸｄｈＢをコードする核酸配列を含む。一実施形態では、核酸配列は、配列番号８０と少なくとも約８０％の同一性を有するＸｄｈＢポリペプチドをコードする。一実施形態では、核酸配列は、配列番号８０と少なくとも約９０％の同一性を有するＸｄｈＢポリペプチドをコードする。別の実施形態では、核酸配列は、配列番号８０と少なくとも約９５％の同一性を有するＸｄｈＢポリペプチドをコードする。したがって、一実施形態では、核酸配列は、配列番号８０と少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有するＸｄｈＢポリペプチドをコードする。別の実施形態では、核酸配列は、配列番号８０をコードする配列を含むＸｄｈＢポリペプチドをコードする。さらに別の実施形態では、核酸配列は、配列番号８０をコードする配列からなるＸｄｈＢポリペプチドをコードする。
一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ＸｄｈＣをコードする核酸配列を含む。一実施形態では、核酸配列は、配列番号８１と少なくとも約８０％の同一性を有するＸｄｈＣポリペプチドをコードする。一実施形態では、核酸配列は、配列番号８１と少なくとも約９０％の同一性を有するＸｄｈＣポリペプチドをコードする。別の実施形態では、核酸配列は、配列番号８１と少なくとも約９５％の同一性を有するＸｄｈＣポリペプチドをコードする。したがって、一実施形態では、核酸配列は、配列番号８１と少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有するＸｄｈＣポリペプチドをコードする。別の実施形態では、核酸配列は、配列番号８１をコードする配列を含むＸｄｈＣポリペプチドをコードする。さらに別の実施形態では、核酸配列は、配列番号８１をコードする配列からなるＸｄｈＣポリペプチドをコードする。
一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、Ａｄｄをコードする核酸配列を含む。一実施形態では、核酸配列は、配列番号８２と少なくとも約８０％の同一性を有するＡｄｄポリペプチドをコードする。一実施形態では、核酸配列は、配列番号８２と少なくとも約９０％の同一性を有するＡｄｄポリペプチドをコードする。別の実施形態では、核酸配列は、配列番号８２と少なくとも約９５％の同一性を有するＡｄｄポリペプチドをコードする。したがって、一実施形態では、核酸配列は、配列番号８２と少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有するＡｄｄポリペプチドをコードする。別の実施形態では、核酸配列は、配列番号８２をコードする配列を含むＡｄｄポリペプチドをコードする。さらに別の実施形態では、核酸配列は、配列番号８２をコードする配列からなるＡｄｄポリペプチドをコードする。
一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ＸａｐＡをコードする核酸配列を含む。一実施形態では、核酸配列は、配列番号８３と少なくとも約８０％の同一性を有するＸａｐＡポリペプチドをコードする。一実施形態では、核酸配列は、配列番号８３と少なくとも約９０％の同一性を有するＸａｐＡポリペプチドをコードする。別の実施形態では、核酸配列は、配列番号８３と少なくとも約９５％の同一性を有するＸａｐＡポリペプチドをコードする。したがって、一実施形態では、核酸配列は、配列番号８３と少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有するＸａｐＡポリペプチドをコードする。別の実施形態では、核酸配列は、配列番号８３をコードする配列を含むＸａｐＡポリペプチドをコードする。さらに別の実施形態では、核酸配列は、配列番号８３をコードする配列からなるＸａｐＡポリペプチドをコードする。
一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ＤｅｏＤをコードする核酸配列を含む。一実施形態では、核酸配列は、配列番号８４と少なくとも約８０％の同一性を有するＤｅｏＤポリペプチドをコードする。一実施形態では、核酸配列は、配列番号８４と少なくとも約９０％の同一性を有するＤｅｏＤポリペプチドをコードする。別の実施形態では、核酸配列は、配列番号８４と少なくとも約９５％の同一性を有するＤｅｏＤポリペプチドをコードする。したがって、一実施形態では、核酸配列は、配列番号８４と少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有するＤｅｏＤポリペプチドをコードする。別の実施形態では、核酸配列は、配列番号８４をコードする配列を含むＤｅｏＤポリペプチドをコードする。さらに別の実施形態では、核酸配列は、配列番号８４をコードする配列からなるＤｅｏＤポリペプチドをコードする。
これらの実施形態のいずれにおいても、アデノシンを消費するように遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より、０％〜２％〜４％、４％〜６％、６％〜８％、８％〜１０％、１０％〜１２％、１２％〜１４％、１４％〜１６％、１６％〜１８％、１８％〜２０％、２０％〜２５％、２５％〜３０％、３０％〜３５％、３５％〜４０％、４０％〜４５％、４５％〜５０％、５０％〜５５％、５５％〜６０％、６０％〜６５％、６５％〜７０％〜８０％、８０％〜９０％、または９０％〜１００％多いアデノシンを消費する。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より１．０〜１．２倍、１．２〜１．４倍、１．４〜１．６倍、１．６〜１．８倍、１．８〜２倍、または２倍多いアデノシンを消費する。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より約３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、１００倍、５００倍、または１０００倍多いアデノシンを消費する。
これらの実施形態のいずれにおいても、アデノシンを消費するように遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より、少なくとも約０％〜２％〜４％、４％〜６％、６％〜８％、８％〜１０％、１０％〜１２％、１２％〜１４％、１４％〜１６％、１６％〜１８％、１８％〜２０％、２０％〜２５％、２５％〜３０％、３０％〜３５％、３５％〜４０％、４０％〜４５％、４５％〜５０％、５０％〜５５％、５５％〜６０％、６０％〜６５％、６５％〜７０％〜８０％、８０％〜９０％、または９０％〜１００％多い尿酸を産生する。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より少なくとも約１．０〜１．２倍、１．２〜１．４倍、１．４〜１．６倍、１．６〜１．８倍、１．８〜２倍、または２倍多い尿酸を産生する。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より約３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、４０倍、または５０倍、１００倍、５００倍、または１０００倍多い尿酸を産生する。
これらの実施形態のいずれにおいても、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌と比較して、アデノシン分解速度を０％〜２％〜４％、４％〜６％、６％〜８％、８％〜１０％、１０％〜１２％、１２％〜１４％、１４％〜１６％、１６％〜１８％、１８％〜２０％、２０％〜２５％、２５％〜３０％、３０％〜３５％、３５％〜４０％、４０％〜４５％、４５％〜５０％、５０％〜５５％、５５％〜６０％、６０％〜６５％、６５％〜７０％〜８０％、８０％〜９０％、または９０％〜１００％上昇させる。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌と比較して、アデノシン分解速度を１．０〜１．２倍、１．２〜１．４倍、１．４〜１．６倍、１．６〜１．８倍、１．８〜２倍、または２倍大きく上昇させる。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌と比較して、分解速度を約３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、４０倍、または５０倍、１００倍、５００倍、または１０００倍、上昇させる。
一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、低酸素条件下で誘導されたとき、約１．８〜１０ｕｍｏｌ／ｈｒ／１０９細胞のアデノシン分解速度を有する。１つの特定の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、約５〜９ｕｍｏｌ／ｈｒ／１０９細胞のアデノシン分解速度を有する。１つの特定の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、約６〜８ｕｍｏｌ／ｈｒ／１０９細胞のアデノシン分解速度を有する。
一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、すなわち、低酸素条件下で誘導されたとき、１時間後、同じ細菌亜型の未改変細菌と比較して、アデノシン分解を約５０％〜７０％増加させる。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、すなわち、低酸素条件下で誘導されたとき、１時間後、同じ細菌亜型の未改変細菌と比較して、アデノシン分解を約５５％〜６５％増加させる。１つの特定の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、すなわち、低酸素条件下で誘導されたとき、１時間後、同じ細菌亜型の未改変細菌と比較して、アデノシン分解を約５５％〜６０％増加させる。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、低酸素条件下で誘導されたとき、１時間後、アデノシン分解を約１．５〜３倍増加させる。１つの特定の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、低酸素条件下で誘導されたとき、１時間後、アデノシン分解を約２〜２．５倍増加させる。
一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、すなわち、低酸素条件下で誘導されたとき、２時間後、同じ細菌亜型の未改変細菌と比較して、アデノシン分解を約８５％〜１００％増加させる。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、すなわち、低酸素条件下で誘導されたとき、２時間後、同じ細菌亜型の未改変細菌と比較して、アデノシン分解を約９５％〜１００％増加させる。１つの特定の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、すなわち、低酸素条件下で誘導されたとき、２時間後、同じ細菌亜型の未改変細菌と比較して、アデノシン分解を約９７％〜９９％増加させる。
さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、低酸素条件下で誘導されたとき、２時間後、アデノシン分解を約４０〜５０倍増加させる。１つの特定の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、低酸素条件下で誘導されたとき、２時間後、アデノシン分解を約４４〜４８倍増加させる。
一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、すなわち、低酸素条件下で誘導されたとき、３時間後、同じ細菌亜型の未改変細菌と比較して、アデノシン分解を約９５％〜１００％増加させる。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、すなわち、低酸素条件下で誘導されたとき、３時間後、同じ細菌亜型の未改変細菌と比較して、アデノシン分解を約９８％〜１００％増加させる。１つの特定の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、すなわち、低酸素条件下で誘導されたとき、３時間後、同じ細菌亜型の未改変細菌と比較して、アデノシン分解を約９９％〜９９％増加させる。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、低酸素条件下で誘導されたとき、３時間後、アデノシン分解を約１００〜１０００倍増加させる。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、低酸素条件下で誘導されたとき、３時間後、アデノシン分解を約１０００〜１００００倍増加させる。
一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、すなわち、低酸素条件下で誘導されたとき、４時間後、同じ細菌亜型の未改変細菌と比較して、アデノシン分解を約９５％〜１００％増加させる。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、すなわち、低酸素条件下で誘導されたとき、４時間後、同じ細菌亜型の未改変細菌と比較して、アデノシン分解を約９８％〜１００％増加させる。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、すなわち、低酸素条件下で誘導されたとき、４時間後、同じ細菌亜型の未改変細菌と比較して、アデノシン分解を約９９％〜９９％増加させる。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、低酸素条件下で誘導されたとき、４時間後、アデノシン分解を約１００〜１０００倍増加させる。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、低酸素条件下で誘導されたとき、４時間後、アデノシン分解を約１０００〜１００００倍増加させる。
これらの実施形態のいずれにおいても、遺伝子操作された細菌は、細胞増殖を、同じ条件下で、同じ亜型の未改変細菌と比較して、少なくとも約１０％〜２０％、２０％〜２５％、２５％〜３０％、３０％〜４０％、４０％〜５０％、５０％〜６０％、６０％〜７０％、７０％〜７５％、７５％〜８０％、８０％〜８５％、８５％〜９０％、９０％〜９５％、９５％〜９９％、またはそれより大きく低減させることができる。これらの実施形態のいずれにおいても、遺伝子操作された細菌は、腫瘍成長を、同じ条件下で、同じ亜型の未改変細菌と比較して、少なくとも約１０％〜２０％、２０％〜２５％、２５％〜３０％、３０％〜４０％、４０％〜５０％、５０％〜６０％、６０％〜７０％、７０％〜７５％、７５％〜８０％、８０％〜８５％、８５％〜９０％、９０％〜９５％、９５％〜９９％、またはそれより大きく低減させることができる。これらの実施形態のいずれにおいても、遺伝子操作された細菌は、腫瘍サイズを、同じ条件下で、同じ亜型の未改変細菌と比較して、少なくとも約１０％〜２０％、２０％〜２５％、２５％〜３０％、３０％〜４０％、４０％〜５０％、５０％〜６０％、６０％〜７０％、７０％〜７５％、７５％〜８０％、８０％〜８５％、８５％〜９０％、９０％〜９５％、９５％〜９９％、またはそれより大きく低減させることができる。これらの実施形態のいずれにおいても、遺伝子操作された細菌は、腫瘍体積を、同じ条件下で、同じ亜型の未改変細菌と比較して、少なくとも約１０％〜２０％、２０％〜２５％、２５％〜３０％、３０％〜４０％、４０％〜５０％、５０％〜６０％、６０％〜７０％、７０％〜７５％、７５％〜８０％、８０％〜８５％、８５％〜９０％、９０％〜９５％、９５％〜９９％、またはそれより大きく低減させることができる。これらの実施形態のいずれにおいても、遺伝子操作された細菌は、腫瘍重量を、同じ条件下で、同じ亜型の未改変細菌と比較して、少なくとも約１０％〜２０％、２０％〜２５％、２５％〜３０％、３０％〜４０％、４０％〜５０％、５０％〜６０％、６０％〜７０％、７０％〜７５％、７５％〜８０％、８０％〜８５％、８５％〜９０％、９０％〜９５％、９５％〜９９％、またはそれより大きく低減させることができる。
一部の実施形態では、遺伝子操作された微生物は、低酸素条件で、ならびに／あるいはがんの、および／または腫瘍微小環境の、または組織特異的分子もしくは代謝物の存在下で、ならびに／あるいは炎症または免疫抑制に関連する分子または代謝物の存在下で、ならびに／あるいは消化管内に存在し得る代謝物の存在下で、ならびに／あるいはｉｎ ｖｉｖｏで存在することもあり、しないこともあり、ｉｎ ｖｉｔｒｏで、株培養、拡大増殖、産生、および／または製造中に存在することもある、代謝物、例えば、アラビノース、クメート、およびサリチレート、ならびに本明細書に記載される他のものの存在下で、アデノシンの分解のための記載の回路のうちのいずれか１つまたは複数を発現することができる。一部の実施形態では、そのようなインデューサーは、エフェクター遺伝子発現を誘導するために、ｉｎ ｖｉｖｏで投与され得る。一部の実施形態では、アデノシンの分解のための回路網をコードする遺伝子配列は、そのような条件および／またはインデューサーにより誘導可能なプロモーターによって制御される。一部の実施形態では、遺伝子配列は、本明細書に記載の構成的プロモーターによって制御される。一部の実施形態では、遺伝子配列は、構成的プロモーターによって制御され、本明細書に記載の、ｉｎ ｖｉｖｏ条件および／またはｉｎ ｖｉｔｒｏ条件で、例えば、拡大増殖、産生、および／または製造中に発現される。一部の実施形態では、記載されるアデノシン分解回路のうちのいずれか１つまたは複数は、１つもしくは複数のプラスミド（例えば、高コピー数または低コピー数プラスミド）上に存在するか、または微生物の染色体内の１つもしくは複数の部位に組み込まれている。
これらの実施形態のいずれにおいても、本明細書に記載されるアデノシン異化経路およびアデノシン輸送体をコードする遺伝子配列を含む、遺伝子操作された細菌は、１つまたは複数のさらなるエフェクター分子、すなわち、治療用分子または代謝変換因子をコードする遺伝子配列をさらに含む。これらの実施形態のいずれにおいても、アデノシン異化経路およびアデノシン輸送体をコードする回路は、同じかまたは異なる細菌株において、本明細書に記載される１つまたは複数の免疫イニシエーターまたは免疫サステナーをコードする回路と組み合わせることができる（組合せ回路または株の混合物）。免疫イニシエーターまたは免疫サステナーをコードする回路は、構成的または誘導性プロモーター、例えば、低酸素誘導性プロモーターまたは本明細書に記載される任意の他の構成的もしくは誘導性プロモーターの制御下にあり得る。
これらの実施形態のいずれにおいても、アデノシン異化経路およびアデノシン輸送体をコードする遺伝子配列は、同じかまたは異なる細菌株において、本明細書に記載される１つまたは複数のＳＴＩＮＧアゴニスト産生酵素をコードする遺伝子配列と組み合わせることができる（組合せ回路または株の混合物）。一部の実施形態では、アデノシン異化経路およびアデノシン輸送体をコードする遺伝子配列と組み合わされる遺伝子配列は、ＤａｃＡをコードする。ＤａｃＡは、構成的または誘導性プロモーター、例えば、低酸素誘導性プロモーター、例えば、ＦＮＲ、または本明細書に記載される任意の他の構成的もしくは誘導性プロモーターの制御下にあり得る。一部の実施形態では、ｄａｃＡ遺伝子は、染色体に組み込まれている。一部の実施形態では、アデノシン異化経路およびアデノシン輸送体をコードする遺伝子配列と組み合わされる遺伝子配列は、ｃＧＡＳをコードする。ｃＧＡＳは、構成的または誘導性プロモーター、例えば、低酸素誘導性プロモーター、例えば、ＦＮＲ、または本明細書に記載される任意の他の構成的もしくは誘導性プロモーターの制御下にあり得る。一部の実施形態では、ｃＧＡＳをコードする遺伝子は、染色体に組み込まれている。これらの組合せの実施形態のいずれにおいても、細菌は、栄養要求性の改変、例えば、ＤａｐＡ、ＴｈｙＡ、または両方の突然変異または欠失をさらに含み得る。これらの実施形態のいずれにおいても、細菌は、ファージの改変、例えば、本明細書に記載される内在性プロファージの突然変異または欠失をさらに含み得る。
また、一部の実施形態では、遺伝子操作された微生物は、記載の回路のうちのいずれか１つまたは複数を発現することができ、以下のうちの１つまたは複数をさらに含む：（１）１つまたは複数の栄養要求体、例えば、当該技術分野において公知の、本明細書に提供される、任意の栄養要求体、例えば、ｔｈｙＡ栄養要求体、（２）１つまたは複数のキルスイッチ回路、例えば、本明細書に記載の、またはそうでなければ当技術分野において公知の、キルスイッチのいずれか、（３）１つまたは複数の抗生物質耐性回路、（４）生体分子または基質を移入するための１つまたは複数の輸送体、例えば、本明細書に記載の、またはそうでなければ当技術分野において公知の、輸送体のいずれか、（５）１つまたは複数の分泌回路、例えば、本明細書に記載の、でなければ当技術分野において公知の、分泌回路のいずれか、（６）１つまたは複数の表面提示回路、例えば、本明細書に記載の、でなければ当技術分野において公知の、表面提示回路のいずれか、および（７）本明細書に記載の１つまたは複数の代謝物（例えば、キヌレニン、トリプトファン、アデノシン、アルギニン）の産生または分解のための１つまたは複数の回路、（８）このような追加の回路の１つまたは複数の組合せ。これらの実施形態のいずれにおいても、遺伝子操作された細菌を単独で投与することができ、または抗ＣＴＬＡ４、抗ＰＤ１もしくは抗ＰＤ−Ｌ１抗体を含むがこれらに限定されない、本明細書に記載の１つもしくは複数の免疫チェックポイントインヒビターと組み合わせて投与することができる。
一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、腫瘍微小環境におけるＡＴＰレベルを、例えば、微生物からのＡＴＰの産生および分泌を増加させることにより、上昇させる手段を含む。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、腫瘍微小環境におけるアデノシンレベルを（例えば、アデノシンの取込みを増加させることにより、アデノシンを代謝および／または分解することにより）低下させるための、腫瘍微小環境におけるＡＴＰレベルを上昇させるための、および／または腫瘍微小環境におけるＡＴＰのアデノシンへの変換を妨げるもしくは遮断するための、１つまたは複数の手段を含む。これらの実施形態のいずれにおいても、遺伝子操作された細菌は、腫瘍内投与のための細菌である。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、低酸素条件により、低酸素条件により、または炎症性条件により活性化されるプロモーター、例えば、前記条件により活性化される、本明細書に記載のプロモーターのいずれかの制御下の、アデノシンを代謝するための１つまたは複数の遺伝子を含む。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、がん特異的プロモーター、組織特異的プロモーター、または構成的プロモーター、例えば、本明細書に記載のプロモーターのいずれかの制御下で、アデノシンを代謝するための１つまたは複数の遺伝子を発現する。
アルギニン／アルギナーゼＩ代謝
Ｌ−アルギニン（Ｌ−Ａｒｇ）は、免疫応答を含む、いくつかの生物システムにおいて中心的役割を果たす非必須アミノ酸である。Ｌ−アルギニンは、アルギナーゼＩ、アルギナーゼＩＩ、および誘導性一酸化窒素シンターゼにより代謝される。アルギナーゼ１は、Ｌ−アルギニンを尿素およびＬ−オルニチンに加水分解し、Ｌ−オルニチンは、悪性腫瘍において急速な細胞周期進行に必要とされるポリアミンの産生のための主要な基質である。腫瘍浸潤骨髄由来サプレッサー細胞（ＭＤＳＣ）の特徴的な亜集団で、腫瘍細胞自体ではないものは、腫瘍微小環境においてそれらにＬ−アルギニン（Ｌ−Ａｒｇ）を急速に組み込ませ、細胞外Ｌ−Ａｒｇを枯渇させる、高レベルのアルギナーゼＩおよびカチオン性アミノ酸輸送体２Ｂを産生することが示されている。これらの細胞は、Ｔ細胞受容体発現および抗原特異的Ｔ細胞応答の強力な阻害剤ならびに調節性Ｔ細胞の強力なインデューサーである。さらに、Ｌａｎｚａｖｅｃｃｈｉａおよび同僚による近年の研究により、活性化Ｔ細胞もまた、Ｌ−アルギニンを大量に消費し、それを急速に下流の代謝物へと変換し、これによって、活性化後の細胞内アルギニンレベルの著しい減少がもたらされることが示されている。これらの研究において、外因性Ｌ−アルギニンをＴ細胞培養培地に添加することにより、Ｔ細胞における遊離Ｌ−アルギニンの細胞内レベルが増加し、さらに、Ｌ−アルギニンレベルの増加は、生体エネルギーおよび生存の増加から、ｉｎ ｖｉｖｏ抗腫瘍活性までに及ぶ、Ｔ細胞の活性化、分化、および機能に多面的な効果を引き起こした（Ｇｅｉｇｅｒら、（２０１６年）、Ｌ−Ａｒｇｉｎｉｎｅ Ｍｏｄｕｌａｔｅｓ Ｔ Ｃｅｌｌ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ａｎｄ Ｅｎｈａｎｃｅｓ Ｓｕｒｖｉｖａｌ ａｎｄ Ａｎｔｉ−ｔｕｍｏｒ Ａｃｔｉｖｉｔｙ； Ｃｅｌｌ、１６７巻、８２９〜８４２頁、この内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。したがって、アルギニンを産生および分泌するように操作された細菌は、Ｔ細胞によるアルギニンの取込みを促進し、Ｔ細胞活性化の増強およびより長期の持続をもたらすことが可能であり得る。したがって、一部の実施形態では、本開示の遺伝子操作された細菌は、アルギニンを産生することができる。
近年の発見により、腫瘍微小環境が、ヒト身体のいずれの他の臓器とも異なる、固有な種類のアンモニア代謝を有することが示唆されている（Ｓｐｉｎｅｌｌｉら、Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ｒｅｃｙｃｌｉｎｇ ｏｆ ａｍｍｏｎｉａ ｖｉａ ｇｌｕｔａｍａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ ｓｕｐｐｏｒｔｓ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ ｂｉｏｍａｓｓ； Ｓｃｉｅｎｃｅ １０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ．ａａｍ９３０５、（２０１７年））。腫瘍は脈管形成不良であるため、腫瘍微小環境に蓄積するアンモニアは、老廃物ではなく、むしろ、独自に、腫瘍がこのアンモニアを重要な窒素源として代謝経路に再吸収して、急速に増殖しているがん細胞におけるアミノ酸合成に対する高い需要を支持することを可能にしている。加えて、Ｅｎｇら（Ｅｎｇら、Ａｍｍｏｎｉａ Ｄｅｒｉｖｅｄ ｆｒｏｍ Ｇｌｕｔａｍｉｎｏｌｙｓｉｓ Ｉｓ ａ Ｄｉｆｆｕｓｉｂｌｅ Ｒｅｇｕｌａｔｏｒ ｏｆ Ａｕｔｏｐｈａｇｙ； Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、（２０１０年）；３巻（１１８号）ｒａ３１）は、グルタミノリシス中に遊離したアンモニアが、オートファジーを刺激し、これにより、巨大分子を再利用して、急速に増殖している細胞において生存に必要とされる代謝前駆体にすることとで、細胞の適応度が促進されることを見出した。著者らは、グルタミノリシスに関与する腫瘍細胞からのアンモニアの遊離により、オートファジーを促進するシグナルが提供され、これにより、腫瘍の様々な領域にある細胞が、内部生成されたまたは環境的ストレスから保護されると提案している。
したがって、遺伝子操作された細菌によるアンモニアの消費は、がん代謝またはがん細胞におけるオートファジーの促進に対するアンモニアの利用可能性を低減させ得る。本明細書に記載される本開示は、過剰なアンモニアを低減させること、ならびにアンモニアおよび／または窒素を、代替的な副産物へと変換することができる、遺伝子操作された細菌をさらに提供する。ある特定の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、腫瘍微小環境において、過剰なアンモニアを低減させ、アンモニアおよび／または窒素を代替的な副産物へと変換する。ある特定の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、腫瘍内の過剰な窒素を、腫瘍に対する窒素の利用可能性を低減する分子、例えば、アルギニン、シトルリン、メチオニン、ヒスチジン、リシン、アスパラギン、グルタミン、またはトリプトファンに組み込むことによって、過剰なアンモニアを低減させる。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、腫瘍内の過剰な窒素を、腫瘍の成長を阻害するか、またはＴ細胞の活性化を促進する、アルギニンを含むがこれに限定されない分子に組み込むことによって、過剰なアンモニアを低減させる。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、アンモニアを消費し、アルギニンを産生することができる。
本明細書において以下に記載され、２０１６年０５月２５日に出願されたＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０３４２００、および２０１６年０５月２５日に出願され、ＵＳ２０１６０３３３３２６として公開された米国出願第１５／１６４，８２８号、ならびに２０１５年１２月０４日に出願されたＰＣＴ／ＵＳ２０１５／０６４１４０、ならびに２０１５年１２月０４日に出願された米国特許第９，４８７，７６４号により詳細に記載されている、アルギニン産生回路において、アンモニアは、細菌（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅ）によって取り込まれ、グルタメートに変換され、グルタメートが、続いて、アルギニンへと代謝される。アルギニンは、次いで、最終的には細菌細胞から排出される。このため、この回路は、アンモニアの消費に好適であり、腫瘍におけるがん細胞に対するアンモニアの利用可能性を低減させると同時に、アルギニンを産生し、アルギニンが、Ｔ細胞活性化を促進し、免疫抑制を予防する。
一部の実施形態では、Ｌ−アルギニンを産生する、および／またはアンモニアを消費する、遺伝子操作された細菌は、Ｌ−アルギニン生合成経路の１つまたは複数の酵素をコードする１つまたは複数の遺伝子配列を含む。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、アンモニアをグルタメートに組み込み、グルタメートをアルギニンに変換することができる、１つまたは複数の酵素をコードする１つまたは複数の遺伝子配列を含む。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、アルギニンオペロンを含む。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、Ｅ．ｃｏｌｉのアルギニンオペロンを含む。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、別の細菌のアルギニンオペロンを含む。これらの実施形態のいずれにおいても、アルギニンリプレッサー（ＡｒｇＲ）は、必要に応じて、そのリプレッサー機能を低下させるかまたは消去するように、欠失、突然変異、または改変され得る。
「アルギニンオペロン」、「アルギニン生合成オペロン」、および「ａｒｇオペロン」は、少なくとも１つのプロモーターと少なくとも１つのＡＲＧボックスとを含む共有調節領域の制御下にあるアルギニン生合成酵素をコードする遺伝子のうちの１つまたは複数についての一群を指すために、同義で使用される。一部の実施形態では、１つまたは複数の遺伝子は、同時転写および／または同時翻訳される。
「突然変異型アルギニンレギュロン」または「突然変異アルギニンレギュロン」は、突然変異型アルギニンレギュロンが、同じ条件下で、同じ細菌亜型由来の未改変レギュロンより多くのアルギニンおよび／または中間副産物を産生するように、アルギニン生合成経路におけるグルタメートからアルギニンへの変換に関与する酵素をコードするオペロンのそれぞれに対するアルギニンにより媒介される抑止を低減させるまたは除去する１つまたは複数の核酸突然変異を含む、アルギニンレギュロンを指すために使用される。
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ（Ｅ．ｃｏｌｉ）などの細菌において、アルギニン生合成経路は、２０１６年５月２５日に出願されたＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０３４２００、および２０１６年５月２５日に出願され、ＵＳ２０１６０３３３３２６として公開された、米国出願第１５／１６４，８２８号、ならびに２０１５年１２月４日に出願された国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１５／０６４１４０号、ならびに２０１５年１２月４日に出願された米国特許第９，４８７，７６４号に記載されており、これらのそれぞれの内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、８ステップの酵素的プロセスでグルタメートをアルギニンに変換することができる。これらの酵素をコードする遺伝子のすべては、アルギニンにより、各遺伝子の調節領域と結合して転写を阻害する複合体を形成することになるＡｒｇＲとのその相互作用によって、抑止される。Ｎ−アセチルグルタミン酸シンテターゼは、タンパク質レベルでアルギニンのみによる、アロステリックフィードバック阻害も受ける。
一部の操作された細菌または操作されたウイルスにおいて、アルギニンレギュロンは、Ｎ−アセチルグルタミン酸シンテターゼをコードするａｒｇＡ、Ｎ−アセチルグルタミン酸キナーゼをコードするａｒｇＢ、Ｎ−アセチルグルタミルリン酸レダクターゼをコードするａｒｇＣ、アセチルオルニチンアミノトランスフェラーゼをコードするａｒｇＤ、Ｎ−アセチルオルニチナーゼをコードするａｒｇＥ、アルギニノコハク酸シンターゼをコードするａｒｇＧ、アルギニノコハク酸リアーゼをコードするａｒｇＨ、オルニチントランスカルバミラーゼを各々が独立してコードするａｒｇＦおよびａｒｇＩの一方もしくは両方、カルバモイルリン酸シンターゼの小さいサブユニットをコードするｃａｒＡ、カルバモイルリン酸シンターゼの大きいサブユニットをコードするｃａｒＢ、これらのオペロン、これらのオペレーター、これらのプロモーター、これらのＡＲＧボックス、および／またはこれらの調節領域を含むが、それらに限定されない。一部の実施形態では、アルギニンレギュロンは、オルニチンアセチルトランスフェラーゼを（Ｎ−アセチルグルタミン酸シンテターゼおよび／もしくはＮ−アセチルオルニチナーゼに加えて、またはその代わりに）コードするａｒｇＪ、そのオペロン、そのオペレーター、そのプロモーター、そのＡＲＧボックス、および／またはその調節領域を含む。
一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、アルギニン生合成経路を含み、アルギニンを産生する、および／またはアンモニアを消費することができる。より具体的な態様では、遺伝子操作された細菌は、アルギニン生合成酵素をコードする１つまたは複数のオペロンが、同じ条件下で同じ亜型の未改変細菌より多くのアルギニンを産生するように抑止解除されている、突然変異型アルギニンレギュロンを含む。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、アルギニンを過剰産生する。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、アンモニアを消費する。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、アルギニンを過剰産生し、アンモニアを消費する。
各オペロンは、前記オペロンにおけるアルギニン生合成遺伝子の抑止および発現を制御する、少なくとも１つのプロモーターおよび少なくとも１つのＡＲＧボックスを含む、調節領域によって調節される。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌または遺伝子操作された細菌は、アルギニン生合成経路におけるグルタメートからアルギニンへの変換に関与する酵素をコードするオペロンの１つまたは複数に対するアルギニンにより媒介される抑止を低減または除去する１つまたは複数の核酸突然変異を含むアルギニンレギュロンを含む。アルギニンにより媒介される抑止の低減または除去は、ＡｒｇＲリプレッサー結合を（例えば、アルギニンリプレッサーを突然変異もしくは欠失させることにより、またはアルギニン生合成酵素をコードするオペロンの各々についての少なくとも１つＡＲＧボックスを突然変異させることにより）、および／またはＮ−アセチルグルタミン酸シンテターゼとのアルギニンの結合を（例えば、アルギニンフィードバック耐性Ｎ−アセチルグルタミン酸シンターゼ突然変異体、例えば、ａｒｇＡｆｂｒ、を産生するようにＮ−アセチルグルタミン酸シンテターゼを突然変異させることにより）低減または除去することによって果たすことができる。
一部の実施形態では、アルギニンにより媒介される抑止の低減または除去は、ＡｒｇＲリプレッサー結合を低減させるもしくは除去することにより、例えば、アルギニン生合成酵素をコードするオペロンのうちの１つもしくは複数について、少なくとも１つのＡＲＧボックスを突然変異させることにより、またはアルギニンリプレッサーを突然変異もしくは欠失させることにより、および／またはＮ−アセチルグルタミン酸シンテターゼとのアルギニン結合を低減させるもしくは除去することにより（例えば、アルギニンフィードバック耐性Ｎ−アセチルグルタミン酸シンターゼ突然変異体、例えばａｒｇＡｆｂｒを産生するようにＮ−アセチルグルタミン酸シンテターゼを突然変異させることにより）、達成され得る。
「ＡｒｇＲ」または「アルギニンリプレッサー」は、アルギニンレギュロン内のアルギニン生合成遺伝子の転写を調節することによりアルギニン生合成を抑制することができるタンパク質を指すために使用される。「いずれかの機能性ＡｒｇＲを欠く」細菌、および「ＡｒｇＲ欠失細菌」は、各アルギニンリプレッサーが、同じ条件下で同じ亜型の細菌からの未改変アルギニンリプレッサーと比較して有意な活性低減または除去を有する、細菌を指すために使用される。ＡＲＧボックスは、コンセンサス配列を含む核酸配列を指し、これは、ａｒｇＲ、ａｒｇＡ、ａｒｇＢ、ａｒｇＣ、ａｒｇＤ、ａｒｇＥ、ａｒｇＦ、ａｒｇＧ、ａｒｇＨ、ａｒｇＩ、ａｒｇＪ、ｃａｒＡ、および／またはｃａｒＢの調節領域のうちの１つまたは複数に高頻度で存在することが公知である。
一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、アルギニン生合成酵素Ｎ−アセチルグルタミン酸キナーゼ、Ｎ−アセチルグルタミルリン酸レダクターゼ、アセチルオルニチンアミノトランスフェラーゼ、Ｎ−アセチルオルニチナーゼ、オルニチントランスカルバミラーゼ、アルギニノコハク酸シンターゼ、アルギニノコハク酸リアーゼ、およびカルバモイルリン酸シンターゼをコードするオペロンの１つまたは複数についての少なくとも１つのＡＲＧボックスに、アルギニンレギュロンが抑制解除され、アルギニンおよび／または中間副産物、例えばシトルリン、の生合成が増進されるような１つまたは複数の核酸突然変異を含む、突然変異型アルギニンレギュロンをさらに含む。そのような遺伝子操作された細菌、突然変異型Ａｒｇボックス、および例示的な突然変異型アルギニンレギュロンは、２０１６年５月２５日に出願されたＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０３４２００および２０１６年５月２５日に出願され、ＵＳ２０１６０３３３３２６として公開された米国出願第１５／１６４，８２８号、ならびに２０１５年１２月４日に出願されたＰＣＴ／ＵＳ２０１５／０６４１４０、ならびに２０１５年１２月４日に出願された米国特許第９，４８７，７６４号に記載されており、これらのそれぞれの内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、機能性ＡｒｇＲリプレッサーが欠如しており、したがって、アルギニン生合成オペロンのそれぞれに対するＡｒｇＲリプレッサーにより媒介される転写抑止が低減または除去される。機能性ＡｒｇＲリプレッサーが欠如している本開示の遺伝子操作された細菌は、２０１６年０５月２５日に出願されたＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０３４２００および２０１６年５月２５日に出願され、ＵＳ２０１６０３３３３２６として公開された米国出願第１５／１６４，８２８号、ならびに２０１５年１２月４日に出願されたＰＣＴ／ＵＳ２０１５／０６４１４０、ならびに２０１５年１２月４日に出願された米国特許第９，４８７，７６４号に記載されており、これらのそれぞれの内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。一部の実施形態では、操作された細菌は、アルギニンリプレッサー機能が低下されるかまたは不活性になるような、１つまたは複数の核酸突然変異を含む、突然変異型アルギニンリプレッサーを含む。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、アルギニンリプレッサーを有さず（例えば、アルギニンリプレッサー遺伝子が欠失されており）、その結果、レギュロンが抑止解除され、アルギニンおよび／または中間副産物の生合成が増強され、かつ／またはアンモニア消費が増大されることになる。アルギニンリプレッサー活性が低減または除去されている細菌は、細菌ａｒｇＲ遺伝子を改変することによって、またはａｒｇＲ遺伝子の転写を改変することによって、生成することができる。一部の実施形態では、対応する野生型細菌に通常は存在する機能性ａｒｇＲ遺伝子の各コピーが、独立して、１つもしくは複数のヌクレオチドの欠失、挿入、もしくは置換によって欠失されているかもしくは不活性になっているか、または欠失されている。
一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、アルギニンフィードバック耐性Ｎ−アセチルグルタミン酸シンターゼ突然変異体、例えば、ａｒｇＡｆｂｒを含む（例えば、Ｅｃｋｈａｒｄｔら、１９７５年；Ｒａｊａｇｏｐａｌら、１９９８年を参照されたい）。ａｒｇＡｆｂｒを含む本開示による遺伝子操作された細菌は、２０１６年５月２５日に出願されたＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０３４２００および２０１５年５月２５日に出願され、ＵＳ２０１６０３３３３２６として公開された米国出願第１５／１６４，８２８号、ならびに２０１５年１２月４日に出願されたＰＣＴ／ＵＳ２０１５／０６４１４０号、ならびに２０１５年１２月４日に出願された米国特許第９，４８７，７６４号に記載されており、これらのそれぞれの内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、アルギニンフィードバック耐性ＡｒｇＡを含む突然変異型アルギニンレギュロンを含み、アルギニンフィードバック耐性ＡｒｇＡが発現されると、同じ条件下で同じ亜型の未改変細菌より多くのアルギニンおよび／または中間副産物を産生することができる。フィードバック耐性ａｒｇＡ遺伝子は、プラスミド上に、または染色体、例えば、１つもしくは複数の組込み部位における１つもしくは複数のコピーに、存在し得る。複数の別個のフィードバック耐性Ｎ−アセチルグルタミン酸シンテターゼタンパク質が、当該技術分野で公知であり、遺伝子操作された細菌において、組み合わせることができる。一部の実施形態では、ａｒｇＡｆｂｒ遺伝子は、構成的プロモーターの制御下で発現される。一部の実施形態では、ａｒｇＡｆｂｒ遺伝子は、腫瘍微小環境によって誘導されるプロモーターの制御下で発現される。一部の実施形態では、ａｒｇＡｆｂｒ遺伝子は、低酸素条件下で誘導されるプロモーター、例えば、ＦＮＲプロモーターの制御下で発現される。
例示的ａｒｇＡｆｂｒ配列の核酸配列は、配列番号１０２で示される。例示的ａｒｇＡｆｂｒ配列のポリペプチド配列は、配列番号１０３で示される。
一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、配列番号１０２の核酸配列またはその機能性断片を含む。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、遺伝コードの冗長性がなければ配列番号１０２と同じポリペプチドまたはその機能性断片をコードする、核酸配列を含む。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、配列番号１０２のＤＮＡ配列もしくはその機能性断片と少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、もしくは少なくとも約９９％相同である核酸配列、または遺伝コードの冗長性がなければ配列番号１０２と同じポリペプチドもしくはその機能性断片をコードする核酸配列を含む。
一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、配列番号１０３のポリペプチド配列またはその機能性断片をコードする。一部の実施形態では、ポリペプチド配列をコードする遺伝子操作された細菌は、配列番号１０３またはその機能性断片と比較して１つもしくは複数の保存的アミノ酸置換を含有するポリペプチドをコードする。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、配列番号１０３のＤＮＡ配列またはその機能性断片と少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９９％相同であるポリペプチド配列をコードする。
一部の実施形態では、Ｎ−アセチルグルタミン酸シンテターゼのアルギニンフィードバック阻害は、遺伝子操作された細菌では、アルギニンフィードバック耐性Ｎ−アセチルグルタミン酸シンテターゼが活性であるとき、同じ条件下で、同じ亜型の細菌由来の野生型Ｎ−アセチルグルタミン酸シンテターゼと比較して、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％低減される。
一部の実施形態では、突然変異型または欠失アルギニンリプレッサーを含む、遺伝子改変された細菌は、アルギニンフィードバック耐性Ｎ−アセチルグルタミン酸シンターゼ突然変異体、例えば、ａｒｇＡｆｂｒをさらに含む。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ＡｒｇＡのフィードバック耐性形態を含み、あらゆる機能性アルギニンリプレッサーが欠如しており、アルギニンを産生することができる。一部の実施形態では、ａｒｇＲ遺伝子は、遺伝子操作された細菌において欠失している。一部の実施形態では、ａｒｇＲ遺伝子は、ＡｒｇＲ機能を不活性化するために突然変異される。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ａｒｇＡｆｂｒおよび欠失ＡｒｇＲを含む。一部の実施形態では、欠失ＡｒｇＲおよび／または欠失ａｒｇＧは、細菌ゲノムから欠失されるものであり、ａｒｇＡｆｂｒは、プラスミド内に存在する。一部の実施形態では、欠失ＡｒｇＲは、細菌ゲノムから欠失されるものであり、ａｒｇＡｆｂｒは、染色体に組み込まれている。
これらの実施形態のいずれにおいても、アルギニンを産生する、および／またはアンモニアを消費するように遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より少なくとも約０％〜２％〜４％、４％〜６％、６％〜８％、８％〜１０％、１０％〜１２％、１２％〜１４％、１４％〜１６％、１６％〜１８％、１８％〜２０％、２０％〜２５％、２５％〜３０％、３０％〜３５％、３５％〜４０％、４０％〜４５％、４５％〜５０％、５０％〜５５％、５５％〜６０％、６０％〜６５％、６５％〜７０％〜８０％、８０％〜９０％、または９０％〜１００％多いアルギニンを産生する。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より少なくとも約１．０〜１．２倍、１．２〜１．４倍、１．４〜１．６倍、１．６〜１．８倍、１．８〜２倍、または２倍多いアルギニンを産生する。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より約３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、４０倍、または５０倍、１００倍、５００倍、または１０００倍多いアルギニンを産生する。
これらの実施形態のいずれにおいても、アルギニンを産生する、および／またはアンモニアを消費するように遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より０％〜２％〜４％、４％〜６％、６％〜８％、８％〜１０％、１０％〜１２％、１２％〜１４％、１４％〜１６％、１６％〜１８％、１８％〜２０％、２０％〜２５％、２５％〜３０％、３０％〜３５％、３５％〜４０％、４０％〜４５％、４５％〜５０％、５０％〜５５％、５５％〜６０％、６０％〜６５％、６５％〜７０％〜８０％、８０％〜９０％、または９０％〜１００％多いグルタミン酸を消費する。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より１．０〜１．２倍、１．２〜１．４倍、１．４〜１．６倍、１．６〜１．８倍、１．８〜２倍、または２倍多いグルタミン酸を消費する。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より約３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、１００倍、５００倍、または１０００倍多いグルタミン酸を消費する。
これらの実施形態のいずれにおいても、アルギニンを産生する、および／またはアンモニアを消費するように遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より０％〜２％〜４％、４％〜６％、６％〜８％、８％〜１０％、１０％〜１２％、１２％〜１４％、１４％〜１６％、１６％〜１８％、１８％〜２０％、２０％〜２５％、２５％〜３０％、３０％〜３５％、３５％〜４０％、４０％〜４５％、４５％〜５０％、５０％〜５５％、５５％〜６０％、６０％〜６５％、６５％〜７０％〜８０％、８０％〜９０％、または９０％〜１００％多いアンモニアを消費する。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より１．０〜１．２倍、１．２〜１．４倍、１．４〜１．６倍、１．６〜１．８倍、１．８〜２倍、または２倍多いアンモニアを消費する。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より約３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、１００倍、５００倍、または１０００倍多いアンモニアを消費する。
これらの実施形態のいずれにおいても、遺伝子操作された細菌は、細胞増殖を、同じ条件下で、同じ亜型の未改変細菌と比較して、少なくとも約１０％〜２０％、２０％〜２５％、２５％〜３０％、３０％〜４０％、４０％〜５０％、５０％〜６０％、６０％〜７０％、７０％〜７５％、７５％〜８０％、８０％〜８５％、８５％〜９０％、９０％〜９５％、９５％〜９９％、またはそれより大きく低減させることができる。これらの実施形態のいずれにおいても、遺伝子操作された細菌は、腫瘍成長を、同じ条件下で、同じ亜型の未改変細菌と比較して、少なくとも約１０％〜２０％、２０％〜２５％、２５％〜３０％、３０％〜４０％、４０％〜５０％、５０％〜６０％、６０％〜７０％、７０％〜７５％、７５％〜８０％、８０％〜８５％、８５％〜９０％、９０％〜９５％、９５％〜９９％、またはそれより大きく低減させることができる。これらの実施形態のいずれにおいても、遺伝子操作された細菌は、腫瘍サイズを、同じ条件下で、同じ亜型の未改変細菌と比較して、少なくとも約１０％〜２０％、２０％〜２５％、２５％〜３０％、３０％〜４０％、４０％〜５０％、５０％〜６０％、６０％〜７０％、７０％〜７５％、７５％〜８０％、８０％〜８５％、８５％〜９０％、９０％〜９５％、９５％〜９９％、またはそれより大きく低減させることができる。これらの実施形態のいずれにおいても、遺伝子操作された細菌は、腫瘍体積を、同じ条件下で、同じ亜型の未改変細菌と比較して、少なくとも約１０％〜２０％、２０％〜２５％、２５％〜３０％、３０％〜４０％、４０％〜５０％、５０％〜６０％、６０％〜７０％、７０％〜７５％、７５％〜８０％、８０％〜８５％、８５％〜９０％、９０％〜９５％、９５％〜９９％、またはそれより大きく低減させることができる。これらの実施形態のいずれにおいても、遺伝子操作された細菌は、腫瘍重量を、同じ条件下で、同じ亜型の未改変細菌と比較して、少なくとも約１０％〜２０％、２０％〜２５％、２５％〜３０％、３０％〜４０％、４０％〜５０％、５０％〜６０％、６０％〜７０％、７０％〜７５％、７５％〜８０％、８０％〜８５％、８５％〜９０％、９０％〜９５％、９５％〜９９％、またはそれより大きく低減させることができる。
アルギニン産生株およびアンモニア消費株は、米国特許出願公開第２０１６０３３３３２６号として発行された、２０１６年５月２５日出願のＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０３４２００および２０１６年５月２５日出願の１５／１６４，８２８、ならびに２０１５年１２月４日出願のＰＣＴ／ＵＳ２０１５／０６４１４０、ならびに２０１５年１２月４日出願の米国特許第９，４８７，７６４号にも記載されており、これらの各々についての内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
一部の実施形態では、アルギニンの産生およびまたはアンモニアの消費のための遺伝子操作された微生物は、低酸素条件下で、ならびに／あるいはがんの、および／または腫瘍微小環境もしくは組織特異的分子もしくは代謝物の存在下で、ならびに／あるいは炎症または免疫抑制に関連する分子または代謝物の存在下で、記載の回路のうちのいずれか１つまたは複数を発現することができる。
一部の実施形態では、アルギニンの産生およびまたはアンモニアの消費のための記載の回路のうちのいずれか１つまたは複数は、１つもしくは複数のプラスミド（例えば、高コピー数または低コピー数プラスミド）上に存在するか、または微生物の染色体内の１つもしくは複数の部位に組み込まれている。また、一部の実施形態では、遺伝子操作された微生物は、記載の回路のいずれか１つまたは複数をさらに発現することができ、以下のものの１つまたは複数をさらに含む：（１）１つまたは複数の栄養要求体、例えば、当技術分野において公知の、および本明細書で提供される、任意の栄養要求体、例えばｔｈｙＡ栄養要求体、（２）１つまたは複数のキルスイッチ回路、例えば、本明細書に記載の、またはそうでなければ当技術分野において公知の、キルスイッチのいずれか、（３）１つまたは複数の抗生物質耐性回路、（４）生体分子または基質を移入するための１つまたは複数の輸送体、例えば、本明細書に記載の、またはそうでなければ当技術分野において公知の、輸送体のいずれか、（５）１つまたは複数の分泌回路、例えば、本明細書に記載の、でなければ当技術分野において公知の、分泌回路のいずれか、（６）１つまたは複数の表面提示回路、例えば、本明細書に記載の、でなければ当技術分野において公知の、表面提示回路のいずれか、および（７）本明細書に記載の１つまたは複数の代謝物（例えば、キヌレニン、トリプトファン、アデノシン、アルギニン）の産生または分解のための１つまたは複数の回路、（８）このような追加の回路の１つまたは複数の組合せ。これらの実施形態のいずれにおいても、遺伝子操作された細菌を単独で投与することができ、または抗ＣＴＬＡ４、抗ＰＤ１もしくは抗ＰＤ−Ｌ１抗体を含むがこれらに限定されない、本明細書に記載の１つもしくは複数の免疫チェックポイントインヒビターと組み合わせて投与することができる。
これらの実施形態のいずれにおいても、アルギニン産生および／またはアンモニア消費の回路網をコードする遺伝子配列を含む、遺伝子操作された細菌は、１つまたは複数のさらなるエフェクター分子、すなわち、治療用分子または代謝変換因子をコードする遺伝子配列をさらに含む。これらの実施形態のいずれにおいても、アルギニン産生および／またはアンモニア消費の回路網をコードする回路は、同じかまたは異なる細菌株において、本明細書に記載される１つまたは複数の免疫イニシエーターまたは免疫サステナーをコードする回路と組み合わせることができる（組合せ回路または株の混合物）。免疫イニシエーターまたは免疫サステナーをコードする回路は、構成的または誘導性プロモーター、例えば、低酸素誘導性プロモーターまたは本明細書に記載される任意の他の構成的もしくは誘導性プロモーターの制御下にあり得る。
これらの実施形態のいずれにおいても、アルギニン産生および／またはアンモニア消費の回路網をコードする遺伝子配列は、同じかまたは異なる細菌株において、本明細書に記載される１つまたは複数のＳＴＩＮＧアゴニスト産生酵素をコードする遺伝子配列と組み合わせることができる（組合せ回路または株の混合物）。一部の実施形態では、アルギニン産生および／またはアンモニア消費の回路網をコードする遺伝子配列と組み合わされる遺伝子配列は、ＤａｃＡをコードする。ＤａｃＡは、構成的または誘導性プロモーター、例えば、低酸素誘導性プロモーター、例えば、ＦＮＲ、または本明細書に記載される任意の他の構成的もしくは誘導性プロモーターの制御下にあり得る。一部の実施形態では、ｄａｃＡ遺伝子は、染色体に組み込まれている。一部の実施形態では、アルギニン産生および／またはアンモニア消費の回路網をコードする遺伝子配列と組み合わされる遺伝子配列は、ｃＧＡＳをコードする。ｃＧＡＳは、構成的または誘導性プロモーター、例えば、低酸素誘導性プロモーター、例えば、ＦＮＲ、または本明細書に記載される任意の他の構成的もしくは誘導性プロモーターの制御下にあり得る。一部の実施形態では、ｃＧＡＳをコードする遺伝子は、染色体に組み込まれている。
これらの組合せの実施形態のいずれにおいても、細菌は、栄養要求性の改変、例えば、ＤａｐＡ、ＴｈｙＡ、または両方の突然変異または欠失をさらに含み得る。これらの実施形態のいずれにおいても、細菌は、ファージの改変、例えば、本明細書に記載される内在性プロファージの突然変異または欠失をさらに含み得る。
Ｔｈ１／ＣＤ８誘引性（ａｔｔａｃｔｉｎｇ）ケモカイン
ケモカインは、免疫細胞、例えば、免疫応答を活性化するもの、およびがん細胞アポトーシスを誘導するもの、の誘引および動員に非常に重要である。ケモカインの標的細胞は、ケモカインが結合して機能を媒介する、対応する受容体を発現する。それ故、ＣＣおよびＣＸＣケモカインの受容体は、それぞれ、ＣＣＲおよびＣＸＣＲと呼ばれる。ＣＣケモカインは、ＣＣケモカイン受容体と結合し、ＣＸＣケモカインは、ＣＸＣケモカイン受容体と結合する。ほとんどの受容体は、通常は１つより多くのケモカインと結合し、ほとんどのケモカインは、通常は１つより多くの受容体と結合する。
ケモカインインターフェロン−γ誘導性タンパク質１０ｋＤａ（ＣＸＣＬ１０）は、ＣＸＣＲ３受容体と結合してその生物学的効果を発揮する、ＣＸＣケモカインファミリーのメンバーである。ＣＸＣＬ１０は、走化性、アポトーシスの誘導、細胞成長の調節、および血管新生抑制効果の媒介に関与する。ＣＸＣＬ１０は、感染性疾患、慢性炎症、免疫不全、腫瘍発達、転移および播種を含む、様々なヒト疾患に関連する。より重要なこととして、ＣＸＣＬ１０は、疾患重症度を媒介する主要生物学的マーカーとして同定されており、様々な疾患の予後指標として利用されうる。この概説では、本発明者らは、がんの発病機序におけるＣＸＣＬ１０の新たな役割を解明する現行の研究に重点を置いている。疾患開始および進行におけるＣＸＣＬ１０の役割を理解することにより、関連ヒト悪性腫瘍についての可能性のあるバイオマーカーおよび治療標的としてＣＸＣＬ１０を開発するための基礎を得ることができる。
ＣＸＣＬ１０およびＣＸＣＬ９は、主として、活性化Ｔリンパ球（Ｔｈ１）、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、炎症性樹状細胞、マクロファージおよびＢ細胞上に発現される、７回膜貫通型Ｇタンパク質共役受容体である受容体、ＣＸＣＲ３を、各々が特異的に活性化する。インターフェロン誘導血管新生抑制性ＣＸＣケモカインおよびインターフェロン誘導性Ｔ細胞化学誘引物質（Ｉ−ＴＡＣ／ＣＸＣＬ１１）も、ＣＸＣＲ３を活性化する。これらのＣＸＣケモカインは、優先的にＴｈ１リンパ球上に発現される。
免疫により媒介される組織特異的破壊は、Ｔｈ１分極、関連ケモカイン（ＣＸＣＲ３およびＣＣＲ５リガンド、例えば、ＣＸＣＬ１０およびＣＸＣＬ９）、および細胞傷害性機序の活性化に関連する遺伝子と、関連付けられている。他の研究により、がん、例えば、早期乳がん、結腸直腸、肺、肝細胞、卵巣および黒色腫における長い無病生存および全生存期間は、１型ヘルパーＴ（Ｔｈ１）細胞関連因子、例えば、ＩＦＮ−ガンマ、シグナル伝達兼転写活性化因子１（ＳＴＡ１）、ＩＬ−１２、ＩＦＮ調節因子１、転写因子Ｔ−ｂｅｔ、免疫エフェクターまたは細胞傷害性因子（グランザイム）、パーフォリン、およびグラニュライシン、ＣＸＣＲ３およびＣＣＲ６リガンドケモカイン（ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０、およびＣＣＬ５）、他のケモカイン（ＣＸＣＬ１およびＣＣＬ２）、ならびに接着分子（ＭＡＤＣＡＭ１、ＩＣＡＭ１、ＶＣＡＭ１）の活性化に、一貫して関連することが示されている。化学誘引および接着は、腫瘍内免疫細胞の密度の決定に非常に重要な役割を果たすことが示されている。他の研究により、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０およびＣＸＣＬ１１の上方調節は、処置応答性（特に、養子移入療法に応答性のもの）を予示することが示されている。さらに他の研究により、リンパ球による腫瘍浸潤を駆動するケモカインは、肝細胞癌を有する患者の生存期間を予示することが示されている。
がん進行が、がん細胞固有の因子と微小環境の因子の両方により調節されることは、今では認知されている。ヘルパーＴ１（Ｔｈ１）および／または細胞傷害性Ｔ細胞の存在が、いくつかのがんにおいて再燃リスク低減と相関すること、ならびに炎症誘発性腫瘍微小環境が、肝細胞癌を有する患者のコホートにおいて生存期間延長と相関することは、実証されている。ＣＸＣＬ１０、ＣＣＬ５、およびＣＣＬ２発現は、Ｔｈ１、ＣＤ８＋Ｔ細胞、およびナチュラルキラー細胞による腫瘍浸潤と相関することが示されている。データは、ＣＸＣＬ１０、ＣＣＬ５、およびＣＣＬ２が、Ｔｈ１、ＣＤ８＋Ｔ細胞、およびＮＫ細胞を腫瘍微小環境に誘引する主ケモカインであることを示す。また、ＣＸＣＬ１０およびＴＬＲ３（ＣＸＣＬ１０、ＣＣＬ５、およびＣＣＬ２を誘導する）発現は、がん細胞アポトーシスと相関する。
インターフェロンガンマ誘導タンパク質１０（ＩＰ−１０）または低分子誘導性サイトカインＢ１０としても公知のＣ−Ｘ−Ｃモチーフケモカイン１０（ＣＸＣＬ１０）は、ヒトにおいてＣＸＣＬ１０遺伝子にコードされている８．７ｋＤａタンパク質である。ＣＸＣＬ１０は、単球、内皮細胞および線維芽細胞を含むいくつかの細胞型によりＩＦＮ−γに応答して分泌されるＣＸＣケモカインファミリーに属する低分子サイトカインである。ＣＸＣＬ１０は、単球／マクロファージ、Ｔ細胞、ＮＫ細胞および樹状細胞の化学誘引、内皮細胞へのＴ細胞接着の促進、抗腫瘍活性、ならびに骨髄コロニー形成および血管新生の阻害を含む、いくつかの役割を果たす。このケモカインは、その効果を、細胞表面ケモカイン受容体ＣＸＣＲ３と結合することによって惹起する。
炎症誘発性条件下で、ＣＸＣＬ１０は、白血球、活性化好中球、好酸球、単球、上皮細胞、内皮細胞、間質細胞（線維芽細胞）およびケラチノサイトなどの、様々な細胞から、ＩＦＮ−γに応答して分泌される。インターフェロン応答のこの極めて重要な調節因子は、活性化Ｔｈ１リンパ球を優先的に炎症のエリアに誘引し、その発現は、Ｔｈ１免疫応答と関連する。ＣＸＣＬ１０は、単球、Ｔ細胞およびＮＫ細胞の化学誘引物質でもある。（Ｃｈｅｗら、Ｇｕｔ、２０１２年、６１巻：４２７〜４３８頁）。さらに他の研究により、免疫
防御シグネチャー遺伝子、例えば、Ｔｈ１型ケモカインＣＸＣＬ１０およびＣＸＣＬ９は、がんにおいて後成的にサイレンシングされうることが示されている。（Ｐｅｎｇら、Ｎａｔｕｒｅ、２０１５年、ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎａｔｕｒｅ １５５２０）。
ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド９（ＣＸＣＬ９）は、ガンマインターフェロンにより誘導されるモノカイン（ＭＩＧ）としても公知であるＣＸＣケモカインファミリーに属する低分子サイトカインである。ＣＸＣＬ９は、ＩＦＮ−γにより誘導されるＴ細胞化学誘引物質（Ｔｈ１／ＣＤ８誘引性ケモカイン）である。ＣＸＣＬ９は、ＣＸＣＬ１０およびＣＸＣＬ１１という２つの他のＣＸＣケモカインに密接に関連している。ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０およびＣＸＣＬ１１はすべて、それらの走化性機能を、ケモカイン受容体ＣＸＣＲ３と相互作用することによって惹起する。
一部の実施形態では、操作された細菌は、Ｔｈ１／ＣＤ８誘引性（ａｔｔａｃｔｉｎｇ）ケモカインである１つまたは複数のケモカインをコードする遺伝子配列を含む。一部の実施形態では、操作された細菌は、ＣＸＣＲ３リガンドケモカインである１つまたは複数のケモカインをコードする遺伝子配列を含む。一部の実施形態では、操作された細菌は、ＣＣＲ５リガンドケモカインである１つまたは複数のケモカインをコードする遺伝子配列を含む。一部の実施形態では、操作された細菌は、ＣＸＣＬ１０の１つまたは複数のコピーをコードする遺伝子配列を含む。
これらの実施形態のいずれにおいても、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より少なくとも約０％〜２％〜４％、４％〜６％、６％〜８％、８％〜１０％、１０％〜１２％、１２％〜１４％、１４％〜１６％、１６％〜１８％、１８％〜２０％、２０％〜２５％、２５％〜３０％、３０％〜３５％、３５％〜４０％、４０％〜４５％、４５％〜５０％、５０％〜５５％、５５％〜６０％、６０％〜６５％、６５％〜７０％〜８０％、８０％〜９０％、または９０％〜１００％多いＣＸＣＬ１０を産生する。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より少なくとも約１．０〜１．２倍、１．２〜１．４倍、１．４〜１．６倍、１．６〜１．８倍、１．８〜２倍、または２倍多いＣＸＣＬ１０を産生する。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より少なくとも約３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、４０倍、または５０倍、１００倍、５００倍、または１０００倍多いＣＸＣＬ１０を産生する。
これらの実施形態のいずれにおいても、ＣＸＣＬ１０を産生するように遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より少なくとも約０％〜２％〜４％、４％〜６％、６％〜８％、８％〜１０％、１０％〜１２％、１２％〜１４％、１４％〜１６％、１６％〜１８％、１８％〜２０％、２０％〜２５％、２５％〜３０％、３０％〜３５％、３５％〜４０％、４０％〜４５％、４５％〜５０％、５０％〜５５％、５５％〜６０％、６０％〜６５％、６５％〜７０％〜８０％、８０％〜９０％、または９０％〜１００％多いＣＸＣＬ１０を分泌する。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より少なくとも約１．０〜１．２倍、１．２〜１．４倍、１．４〜１．６倍、１．６〜１．８倍、１．８〜２倍、または２倍多いＣＸＣＬ１０を分泌する。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より少なくとも約３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、４０倍、または５０倍、１００倍、５００倍、または１０００倍多いＣＸＣＬ１０を分泌する。
一部の実施形態では、ＣＸＣＬ１０を分泌するように遺伝子操作された細菌は、細胞増殖を、同じ条件下で、同じ亜型の未改変細菌と比較して、少なくとも約１０％〜２０％、２０％〜２５％、２５％〜３０％、３０％〜４０％、４０％〜５０％、５０％〜６０％、６０％〜７０％、７０％〜７５％、７５％〜８０％、８０％〜８５％、８５％〜９０％、９０％〜９５％、９５％〜９９％、またはそれより大きく低減させることができる。一部の実施形態では、ＣＸＣＬ１０を分泌するように遺伝子操作された細菌は、腫瘍成長を、同じ条件下で、同じ亜型の未改変細菌と比較して、少なくとも約１０％〜２０％、２０％〜２５％、２５％〜３０％、３０％〜４０％、４０％〜５０％、５０％〜６０％、６０％〜７０％、７０％〜７５％、７５％〜８０％、８０％〜８５％、８５％〜９０％、９０％〜９５％、９５％〜９９％、またはそれより大きく低減させることができる。一部の実施形態では、ＣＸＣＬ１０を分泌するように遺伝子操作された細菌は、腫瘍サイズを、同じ条件下で、同じ亜型の未改変細菌と比較して、少なくとも約１０％〜２０％、２０％〜２５％、２５％〜３０％、３０％〜４０％、４０％〜５０％、５０％〜６０％、６０％〜７０％、７０％〜７５％、７５％〜８０％、８０％〜８５％、８５％〜９０％、９０％〜９５％、９５％〜９９％、またはそれより大きく低減させることができる。一部の実施形態では、ＣＸＣＬ１０を産生するように遺伝子操作された細菌は、腫瘍体積を、同じ条件下で、同じ亜型の未改変細菌と比較して、少なくとも約１０％〜２０％、２０％〜２５％、２５％〜３０％、３０％〜４０％、４０％〜５０％、５０％〜６０％、６０％〜７０％、７０％〜７５％、７５％〜８０％、８０％〜８５％、８５％〜９０％、９０％〜９５％、９５％〜９９％、またはそれより大きく低減させることができる。一部の実施形態では、ＣＸＣＬ１０を産生するように遺伝子操作された細菌は、腫瘍重量を、同じ条件下で、同じ亜型の未改変細菌と比較して、少なくとも約１０％〜２０％、２０％〜２５％、２５％〜３０％、３０％〜４０％、４０％〜５０％、５０％〜６０％、６０％〜７０％、７０％〜７５％、７５％〜８０％、８０％〜８５％、８５％〜９０％、９０％〜９５％、９５％〜９９％、またはそれより大きく低減させることができる。一部の実施形態では、ＣＸＣＬ１０を産生するように遺伝子操作された細菌は、奏功率を、同じ条件下で、同じ亜型の未改変細菌と比較して、少なくとも約１０％〜２０％、２０％〜２５％、２５％〜３０％、３０％〜４０％、４０％〜５０％、５０％〜６０％、６０％〜７０％、７０％〜７５％、７５％〜８０％、８０％〜８５％、８５％〜９０％、９０％〜９５％、９５％〜９９％、またはそれより大きく上昇させることができる。
一部の実施形態では、ＣＸＣＬ１０を産生するように遺伝子操作された細菌は、活性化Ｔｈ１リンパ球を、同じ条件下で、同じ亜型の未改変細菌と比較して、少なくとも約１０％〜２０％、２０％〜２５％、２５％〜３０％、３０％〜４０％、４０％〜５０％、５０％〜６０％、６０％〜７０％、７０％〜７５％、７５％〜８０％、８０％〜８５％、８５％〜９０％、９０％〜９５％、９５％〜９９％、またはそれより高度に誘引することができる。一部の実施形態では、ＣＸＣＬ１０に対して遺伝子操作された細菌は、活性化Ｔｈ１リンパ球を、同じ条件下で、同じ亜型の未改変細菌と比較して、少なくとも約１０％〜２０％、２０％〜２５％、２５％〜３０％、３０％〜４０％、４０％〜５０％、５０％〜６０％、６０％〜７０％、７０％〜７５％、７５％〜８０％、８０％〜８５％、８５％〜９０％、９０％〜９５％、９５％〜９９％、またはそれより高度に誘引することができる。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より少なくとも約１．０〜１．２倍、１．２〜１．４倍、１．４〜１．６倍、１．６〜１．８倍、１．８〜２倍、または２倍高度に、活性化Ｔｈ１リンパ球を誘引する。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より約３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、１００倍、５００倍、または１０００倍高度に、活性化Ｔｈ１リンパ球を誘引する。
一部の実施形態では、ＣＸＣＬ１０を産生するように遺伝子操作された細菌は、Ｔ細胞の走化性を、同じ条件下で、同じ亜型の未改変細菌と比較して、少なくとも約１０％〜２０％、２０％〜２５％、２５％〜３０％、３０％〜４０％、４０％〜５０％、５０％〜６０％、６０％〜７０％、７０％〜７５％、７５％〜８０％、８０％〜８５％、８５％〜９０％、９０％〜９５％、９５％〜９９％、またはそれより高度に促進することができる。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より少なくとも約１．０〜１．２倍、１．２〜１．４倍、１．４〜１．６倍、１．６〜１．８倍、１．８〜２倍、または２倍高度に、Ｔ細胞の走化性を促進する。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より約３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、１００倍、５００倍、または１０００倍高度に、Ｔ細胞の走化性を促進する。
一部の実施形態では、ＣＸＣＬ１０を産生するように遺伝子操作された細菌は、ＮＫ細胞の走化性を、同じ条件下で、同じ亜型の未改変細菌と比較して、少なくとも約１０％〜２０％、２０％〜２５％、２５％〜３０％、３０％〜４０％、４０％〜５０％、５０％〜６０％、６０％〜７０％、７０％〜７５％、７５％〜８０％、８０％〜８５％、８５％〜９０％、９０％〜９５％、９５％〜９９％、またはそれより高度に促進することができる。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より少なくとも約１．０〜１．２倍、１．２〜１．４倍、１．４〜１．６倍、１．６〜１．８倍、１．８〜２倍、または２倍高度に、ＮＫ細胞の走化性を促進する。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より少なくとも約３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、１００倍、５００倍、または１０００倍高度に、ＮＫ細胞の走化性を促進する。
一部の実施形態では、ＣＸＣＬ１０を産生するように遺伝子操作された細菌は、ＣＸＣＲ３に、同じ条件下で、同じ亜型の未改変細菌と比較して、少なくとも約１０％〜２０％、２０％〜２５％、２５％〜３０％、３０％〜４０％、４０％〜５０％、５０％〜６０％、６０％〜７０％、７０％〜７５％、７５％〜８０％、８０％〜８５％、８５％〜９０％、９０％〜９５％、９５％〜９９％、またはそれより高い親和性で結合することができる。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より少なくとも約１．０〜１．２倍、１．２〜１．４倍、１．４〜１．６倍、１．６〜１．８倍、１．８〜２倍、または２倍大きい親和性でＣＸＣＲ３と結合する。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より少なくとも約３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、１００倍、５００倍、または１０００倍高度に、Ｔ細胞の走化性を促進することができる。
一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ＣＸＣＬ１０ポリペプチドまたはその断片もしくは機能性バリアントをコードする、遺伝子配列を含む。一実施形態では、ＣＸＣＬ１０ポリペプチドをコードする遺伝子配列は、配列番号１２０７または配列番号１２０８から選択される配列と少なくとも約８０％の同一性を有する。別の実施形態では、ＣＸＣＬ１０ポリペプチドをコードする遺伝子配列は、配列番号１２０７または配列番号１２０８から選択される配列と少なくとも約８５％の同一性を有する。一実施形態では、ＣＸＣＬ１０ポリペプチドをコードする遺伝子配列は、配列番号１２０７または配列番号１２０８から選択される配列と少なくとも約９０％の同一性を有する。一実施形態では、遺伝子配列ＣＸＣＬ１０ポリペプチドは、配列番号１２０７または配列番号１２０８から選択される配列と少なくとも約９５％の同一性を有する。別の実施形態では、ＣＸＣＬ１０ポリペプチドをコードする遺伝子配列は、配列番号１２０７または配列番号１２０８から選択される配列と少なくとも約９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有する。したがって、一実施形態では、ＣＸＣＬ１０ポリペプチドをコードする遺伝子配列は、配列番号１２０７または配列番号１２０８から選択される配列と少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有する。別の実施形態では、ＣＸＣＬ１０ポリペプチドをコードする遺伝子配列は、配列番号１２０７または配列番号１２０８から選択される配列を含む。さらに別の実施形態では、ＣＸＣＬ１０ポリペプチドをコードする遺伝子配列は、配列番号１２０７または配列番号１２０８から選択される配列からなる。遺伝子操作された細菌がＣＸＣＬ１０をコードする、これらの実施形態のいずれにおいても、分泌タグをコードする配列の１つまたは複数を除去してもよく、異なるタグで置換してもよい。
一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、配列番号１２０５または配列番号１２０６から選択される配列と少なくとも約８０％の同一性を有するＣＸＣＬ１０ポリペプチドをコードする遺伝子配列を含む。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、配列番号１２０５または配列番号１２０６から選択される配列と少なくとも約９０％の同一性をほぼ有することがあるＣＸＣＬ１０ポリペプチドをコードする遺伝子配列を含む。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、配列番号１２０５または配列番号１２０６から選択される配列と少なくとも約９５％の同一性をほぼ有することがあるＣＸＣＬ１０ポリペプチドをコードする遺伝子配列を含む。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、配列番号１２０５もしくは配列番号１２０６から選択される配列と約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有するＣＸＣＬ１０ポリペプチドまたはその機能性断片をコードする遺伝子配列を含む。別の実施形態では、ＣＸＣＬ１０ポリペプチドは、配列番号１２０５または配列番号１２０６から選択される配列を含む。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌により発現されるＣＸＣＬ１０ポリペプチドは、配列番号１２０５または配列番号１２０６から選択される配列からなる。遺伝子操作された細菌がＣＸＣＬ１０ポリペプチドをコードする、これらの実施形態のいずれにおいても、分泌タグを除去してもよく、異なる分泌タグで置換してもよい。
一部の実施形態では、遺伝子操作された微生物は、低酸素条件で、ならびに／あるいはがんの存在下で、ならびに／あるいは腫瘍微小環境、または組織特異的分子もしくは代謝物において、ならびに／あるいは炎症または免疫抑制に関連する分子または代謝物の存在下で、ならびに／あるいは消化管内に存在し得る代謝物の存在下で、ならびに／あるいはｉｎ ｖｉｖｏで存在することもあり、しないこともあり、ｉｎ ｖｉｔｒｏで、株培養、拡大増殖、産生、および／または製造中に存在することもある、代謝物、例えば、アラビノース、クメート、およびサリチレート、ならびに本明細書に記載される他のものの存在下で、記載のＣＸＣＬ１０回路のうちのいずれか１つまたは複数を発現することができる。一部の実施形態では、そのようなインデューサーは、エフェクター遺伝子発現を誘導するために、ｉｎ ｖｉｖｏで投与され得る。一部の実施形態では、ＣＸＣＬ１０をコードする遺伝子配列は、そのような条件および／またはインデューサーにより誘導可能なプロモーターによって制御される。一部の実施形態では、ＣＸＣＬ１０をコードする遺伝子配列は、本明細書に記載の構成的プロモーターによって制御される。一部の実施形態では、遺伝子配列は、構成的プロモーターによって制御され、本明細書に記載の、ｉｎ ｖｉｖｏ条件および／またはｉｎ ｖｉｔｒｏ条件で、例えば、拡大増殖、産生および／または製造中に発現される。
一部の実施形態では、ＣＸＣＬ１０は、分泌される。一部の実施形態では、ＣＸＣＬ１０をコードする遺伝子配列を含む遺伝子操作された細菌は、ＰｈｏＡ、ＯｍｐＦ、ｃｖａＣ、ＴｏｒＡ、ＦｄｎＧ、ＤｍｓＡおよびＰｅｌＢから選択される分泌タグを含む。一部の実施形態では、分泌タグは、ＰｈｏＡである。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ｌｐｐ、ｎｌＰ、ｔｏｌＡおよびＰＡＬから選択される外膜タンパク質の１つまたは複数の欠失をさらに含む。一部の実施形態では、欠失または突然変異した外膜タンパク質は、ＰＡＬである。一部の実施形態では、ＣＸＣＬ１０の産生のための遺伝子配列を含む遺伝子操作された細菌は、ＩＬ−１５をコードする遺伝子配列をさらに含む。一部の実施形態では、ＩＬ−１５は、分泌される。一部の実施形態では、ＩＬ−１５をコードする遺伝子配列は、ＰｈｏＡ、ＯｍｐＦ、ｃｖａＣ、ＴｏｒＡ、ＦｄｎＧ、ＤｍｓＡおよびＰｅｌＢから選択される分泌タグを含む。一部の実施形態では、分泌タグは、ＰｈｏＡである。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ｌｐｐ、ｎｌＰ、ｔｏｌＡおよびＰＡＬから選択される外膜タンパク質の１つまたは複数の欠失をさらに含む。一部の実施形態では、欠失または突然変異した外膜タンパク質は、ＰＡＬである。
一部の実施形態では、ＣＸＣＬ１０をコードする記載の遺伝子配列のいずれか１つまたは複数は、１つもしくは複数のプラスミド（例えば、高コピー数もしくは低コピー数プラスミド）上に存在するか、または微生物染色体内の１つもしくは複数の部位に組み込まれている。また、一部の実施形態では、遺伝子操作された微生物は、記載の回路のいずれか１つまたは複数をさらに発現することができ、以下のものの１つまたは複数をさらに含む：（１）１つまたは複数の栄養要求体、例えば、当技術分野において公知の、および本明細書で提供される、任意の栄養要求体、例えばｔｈｙＡ栄養要求体、（２）１つまたは複数のキルスイッチ回路、例えば、本明細書に記載の、またはそうでなければ当技術分野において公知の、キルスイッチのいずれか、（３）１つまたは複数の抗生物質耐性回路、（４）生体分子または基質を移入するための１つまたは複数の輸送体、例えば、本明細書に記載の、またはそうでなければ当技術分野において公知の、輸送体のいずれか、（５）１つまたは複数の分泌回路、例えば、本明細書に記載の、でなければ当技術分野において公知の、分泌回路のいずれか、（６）１つまたは複数の表面提示回路、例えば、本明細書に記載の、でなければ当技術分野において公知の、表面提示回路のいずれか、および（７）本明細書に記載の１つまたは複数の代謝物（例えば、キヌレニン、トリプトファン、アデノシン、アルギニン）の産生または分解のための１つまたは複数の回路、（８）このような追加の回路の１つまたは複数の組合せ。これらの実施形態のいずれにおいても、遺伝子操作された細菌を単独で投与することができ、または抗ＣＴＬＡ４、抗ＰＤ１もしくは抗ＰＤ−Ｌ１抗体を含むがこれらに限定されない、本明細書に記載の１つもしくは複数の免疫チェックポイントインヒビターと組み合わせて投与することができる。
これらの実施形態のいずれにおいても、ＣＸＣＬ１０をコードする遺伝子配列を含む、遺伝子操作された細菌は、１つまたは複数のさらなるエフェクター分子、すなわち、治療用分子または代謝変換因子をコードする遺伝子配列をさらに含む。これらの実施形態のいずれにおいても、ＣＸＣＬ１０をコードする回路は、同じかまたは異なる細菌株において、本明細書に記載される１つまたは複数の免疫イニシエーターまたは免疫サステナーをコードする回路と組み合わせることができる（組合せ回路または株の混合物）。免疫イニシエーターまたは免疫サステナーをコードする回路は、構成的または誘導性プロモーター、例えば、低酸素誘導性プロモーターまたは本明細書に記載される任意の他の構成的もしくは誘導性プロモーターの制御下にあり得る。
これらの実施形態のいずれにおいても、ＣＸＣＬ１０をコードする遺伝子配列は、同じかまたは異なる細菌株において、本明細書に記載される１つまたは複数のＳＴＩＮＧアゴニスト産生酵素をコードする遺伝子配列と組み合わせることができる（組合せ回路または株の混合物）。一部の実施形態では、ＣＸＣＬ１０をコードする遺伝子配列と組み合わされる遺伝子配列は、ＤａｃＡをコードする。ＤａｃＡは、構成的または誘導性プロモーター、例えば、低酸素誘導性プロモーター、例えば、ＦＮＲ、または本明細書に記載される任意の他の構成的もしくは誘導性プロモーターの制御下にあり得る。一部の実施形態では、ｄａｃＡ遺伝子は、染色体に組み込まれている。一部の実施形態では、ＣＸＣＬ１０をコードする遺伝子配列と組み合わされる遺伝子配列は、ｃＧＡＳをコードする。ｃＧＡＳは、構成的または誘導性プロモーター、例えば、低酸素誘導性プロモーター、例えば、ＦＮＲ、または本明細書に記載される任意の他の構成的もしくは誘導性プロモーターの制御下にあり得る。一部の実施形態では、ｃＧＡＳをコードする遺伝子は、染色体に組み込まれている。
これらの組合せの実施形態のいずれにおいても、細菌は、栄養要求性の改変、例えば、ＤａｐＡ、ＴｈｙＡ、または両方の突然変異または欠失をさらに含み得る。これらの実施形態のいずれにおいても、細菌は、ファージの改変、例えば、本明細書に記載される内在性プロファージの突然変異または欠失をさらに含み得る。
これらの実施形態のいずれにおいても、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より少なくとも約０％〜２％〜４％、４％〜６％、６％〜８％、８％〜１０％、１０％〜１２％、１２％〜１４％、１４％〜１６％、１６％〜１８％、１８％〜２０％、２０％〜２５％、２５％〜３０％、３０％〜３５％、３５％〜４０％、４０％〜４５％、４５％〜５０％、５０％〜５５％、５５％〜６０％、６０％〜６５％、６５％〜７０％〜８０％、８０％〜９０％、または９０％〜１００％多いＣＸＣＬ９を産生する。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より少なくとも約１．０〜１．２倍、１．２〜１．４倍、１．４〜１．６倍、１．６〜１．８倍、１．８〜２倍、または２倍多いＣＸＣＬ９を産生する。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より少なくとも約３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、４０倍、または５０倍、１００倍、５００倍、または１０００倍多いＣＸＣＬ９を産生する。
これらの実施形態のいずれにおいても、ＣＸＣＬ９を産生するように遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より少なくとも約０％〜２％〜４％、４％〜６％、６％〜８％、８％〜１０％、１０％〜１２％、１２％〜１４％、１４％〜１６％、１６％〜１８％、１８％〜２０％、２０％〜２５％、２５％〜３０％、３０％〜３５％、３５％〜４０％、４０％〜４５％、４５％〜５０％、５０％〜５５％、５５％〜６０％、６０％〜６５％、６５％〜７０％〜８０％、８０％〜９０％、または９０％〜１００％多いＣＸＣＬ９を分泌する。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より少なくとも約１．０〜１．２倍、１．２〜１．４倍、１．４〜１．６倍、１．６〜１．８倍、１．８〜２倍、または２倍多いＣＸＣＬ９を分泌する。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より少なくとも約３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、４０倍、または５０倍、１００倍、５００倍、または１０００倍多いＣＸＣＬ９を分泌する。
一部の実施形態では、少なくとも約ＣＸＣＬ９を分泌するように遺伝子操作された細菌は、細胞増殖を、同じ条件下で、同じ亜型の未改変細菌と比較して、少なくとも約１０％〜２０％、２０％〜２５％、２５％〜３０％、３０％〜４０％、４０％〜５０％、５０％〜６０％、６０％〜７０％、７０％〜７５％、７５％〜８０％、８０％〜８５％、８５％〜９０％、９０％〜９５％、９５％〜９９％、またはそれより大きく低減させることができる。一部の実施形態では、少なくとも約ＣＸＣＬ９を分泌するように遺伝子操作された細菌は、腫瘍増殖を、同じ条件下で、同じ亜型の未改変細菌と比較して、少なくとも約１０％〜２０％、２０％〜２５％、２５％〜３０％、３０％〜４０％、４０％〜５０％、５０％〜６０％、６０％〜７０％、７０％〜７５％、７５％〜８０％、８０％〜８５％、８５％〜９０％、９０％〜９５％、９５％〜９９％、またはそれより大きく低減させることができる。一部の実施形態では、少なくとも約ＣＸＣＬ９を分泌するように遺伝子操作された細菌は、腫瘍サイズを、同じ条件下で、同じ亜型の未改変細菌と比較して、少なくとも約１０％〜２０％、２０％〜２５％、２５％〜３０％、３０％〜４０％、４０％〜５０％、５０％〜６０％、６０％〜７０％、７０％〜７５％、７５％〜８０％、８０％〜８５％、８５％〜９０％、９０％〜９５％、９５％〜９９％、またはそれより大きく低減させることができる。一部の実施形態では、少なくとも約ＣＸＣＬ９を分泌するように遺伝子操作された細菌は、腫瘍体積を、同じ条件下で、同じ亜型の未改変細菌と比較して、少なくとも約１０％〜２０％、２０％〜２５％、２５％〜３０％、３０％〜４０％、４０％〜５０％、５０％〜６０％、６０％〜７０％、７０％〜７５％、７５％〜８０％、８０％〜８５％、８５％〜９０％、９０％〜９５％、９５％〜９９％、またはそれより大きく低減させることができる。一部の実施形態では、少なくとも約ＣＸＣＬ９を分泌するように遺伝子操作された細菌は、腫瘍重量を、同じ条件下で、同じ亜型の未改変細菌と比較して、少なくとも約１０％〜２０％、２０％〜２５％、２５％〜３０％、３０％〜４０％、４０％〜５０％、５０％〜６０％、６０％〜７０％、７０％〜７５％、７５％〜８０％、８０％〜８５％、８５％〜９０％、９０％〜９５％、９５％〜９９％、またはそれより大きく低減させることができる。一部の実施形態では、少なくとも約ＣＸＣＬ９を分泌するように遺伝子操作された細菌は、細胞増殖奏効率を、同じ条件下で、同じ亜型の未改変細菌と比較して、少なくとも約１０％〜２０％、２０％〜２５％、２５％〜３０％、３０％〜４０％、４０％〜５０％、５０％〜６０％、６０％〜７０％、７０％〜７５％、７５％〜８０％、８０％〜８５％、８５％〜９０％、９０％〜９５％、９５％〜９９％、またはそれより大きく増加させることができる。
一部の実施形態では、ＣＸＣＬ９を産生するように遺伝子操作された細菌は、活性化Ｔｈ１リンパ球を、同じ条件下で、同じ亜型の未改変細菌と比較して、少なくとも約１０％〜２０％、２０％〜２５％、２５％〜３０％、３０％〜４０％、４０％〜５０％、５０％〜６０％、６０％〜７０％、７０％〜７５％、７５％〜８０％、８０％〜８５％、８５％〜９０％、９０％〜９５％、９５％〜９９％、またはそれより高度に誘引することができる。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より少なくとも約１．０〜１．２倍、１．２〜１．４倍、１．４〜１．６倍、１．６〜１．８倍、１．８〜２倍、または２倍高度に、活性化Ｔｈ１リンパ球を誘引する。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より少なくとも約３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、１００倍、５００倍、または１０００倍高度に、活性化Ｔｈ１リンパ球を誘引する。
一部の実施形態では、ＣＸＣＬ９を産生するように遺伝子操作された細菌は、Ｔ細胞の走化性を、同じ条件下で、同じ亜型の未改変細菌と比較して、少なくとも約１０％〜２０％、２０％〜２５％、２５％〜３０％、３０％〜４０％、４０％〜５０％、５０％〜６０％、６０％〜７０％、７０％〜７５％、７５％〜８０％、８０％〜８５％、８５％〜９０％、９０％〜９５％、９５％〜９９％、またはそれより大きく促進することができる。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より少なくとも約１．０〜１．２倍、１．２〜１．４倍、１．４〜１．６倍、１．６〜１．８倍、１．８〜２倍、または２倍高度に、Ｔ細胞の走化性を促進する。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より少なくとも約３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、１００倍、５００倍、または１０００倍高度に、Ｔ細胞の走化性を促進する。
一部の実施形態では、ＣＸＣＬ９を産生するように遺伝子操作された細菌は、ＮＫ細胞の走化性を、同じ条件下で、同じ亜型の未改変細菌と比較して、少なくとも約１０％〜２０％、２０％〜２５％、２５％〜３０％、３０％〜４０％、４０％〜５０％、５０％〜６０％、６０％〜７０％、７０％〜７５％、７５％〜８０％、８０％〜８５％、８５％〜９０％、９０％〜９５％、９５％〜９９％、またはそれより大きく促進することができる。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より少なくとも約１．０〜１．２倍、１．２〜１．４倍、１．４〜１．６倍、１．６〜１．８倍、１．８〜２倍、または２倍高度に、ＮＫ細胞の走化性を促進する。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、１００倍、５００倍、または１０００倍高度に、ＮＫ細胞の走化性を促進する。
一部の実施形態では、ＣＸＣＬ９を産生するように遺伝子操作された細菌は、ＣＸＣＲ３に、同じ条件下で、同じ亜型の未改変細菌と比較して、少なくとも約１０％〜２０％、２０％〜２５％、２５％〜３０％、３０％〜４０％、４０％〜５０％、５０％〜６０％、６０％〜７０％、７０％〜７５％、７５％〜８０％、８０％〜８５％、８５％〜９０％、９０％〜９５％、９５％〜９９％、またはそれより高い親和性で結合することができる。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より少なくとも１．０〜１．２倍、１．２〜１．４倍、１．４〜１．６倍、１．６〜１．８倍、１．８〜２倍、または２倍大きい親和性でＣＸＣＲ３と結合する。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より少なくとも約３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、１００倍、５００倍、または１０００倍大きい親和性で、ＣＸＣＲ３と結合することができる。
一部の実施形態では、遺伝子操作された微生物は、低酸素条件で、ならびに／あるいはがんの存在下で、ならびに／あるいは腫瘍微小環境、または組織特異的分子もしくは代謝物において、ならびに／あるいは炎症または免疫抑制に関連する分子または代謝物の存在下で、ならびに／あるいは消化管内に存在し得る代謝物の存在下で、ならびに／あるいはｉｎ ｖｉｖｏで存在することもあり、しないこともあり、ｉｎ ｖｉｔｒｏで、株培養、拡大増殖、産生、および／または製造中に存在することもある、代謝物、例えば、アラビノース、クメート、およびサリチレート、ならびに本明細書に記載される他のものの存在下で、記載のＣＸＣＬ９回路のうちのいずれか１つまたは複数を発現することができる。一部の実施形態では、そのようなインデューサーは、エフェクター遺伝子発現を誘導するために、ｉｎ ｖｉｖｏで投与され得る。一部の実施形態では、ＣＸＣＬ９をコードする遺伝子配列は、そのような条件および／またはインデューサーにより誘導可能なプロモーターによって制御される。一部の実施形態では、ＣＸＣＬ９をコードする遺伝子配列は、本明細書に記載の構成的プロモーターによって制御される。一部の実施形態では、遺伝子配列は、構成的プロモーターによって制御され、本明細書に記載の、ｉｎ ｖｉｖｏ条件および／またはｉｎ ｖｉｔｒｏ条件で、例えば、拡大増殖、産生および／または製造中に発現される。
一部の実施形態では、ＣＸＣＬ９をコードする記載の遺伝子配列のいずれか１つまたは複数は、１つもしくは複数のプラスミド（例えば、高コピー数もしくは低コピー数プラスミド）上に存在するか、または微生物染色体内の１つもしくは複数の部位に組み込まれている。また、一部の実施形態では、遺伝子操作された微生物は、記載の回路のいずれか１つまたは複数をさらに発現することができ、以下のものの１つまたは複数をさらに含む：（１）１つまたは複数の栄養要求体、例えば、当技術分野において公知の、および本明細書で提供される、任意の栄養要求体、例えばｔｈｙＡ栄養要求体、（２）１つまたは複数のキルスイッチ回路、例えば、本明細書に記載の、またはそうでなければ当技術分野において公知の、キルスイッチのいずれか、（３）１つまたは複数の抗生物質耐性回路、（４）生体分子または基質を移入するための１つまたは複数の輸送体、例えば、本明細書に記載の、またはそうでなければ当技術分野において公知の、輸送体のいずれか、（５）１つまたは複数の分泌回路、例えば、本明細書に記載の、でなければ当技術分野において公知の、分泌回路のいずれか、（６）１つまたは複数の表面提示回路、例えば、本明細書に記載の、でなければ当技術分野において公知の、表面提示回路のいずれか、および（７）本明細書に記載の１つまたは複数の代謝物（例えば、キヌレニン、トリプトファン、アデノシン、アルギニン）の産生または分解のための１つまたは複数の回路、（８）このような追加の回路の１つまたは複数の組合せ。これらの実施形態のいずれにおいても、遺伝子操作された細菌を単独で投与することができ、または抗ＣＴＬＡ４、抗ＰＤ１もしくは抗ＰＤ−Ｌ１抗体を含むがこれらに限定されない、本明細書に記載の１つもしくは複数の免疫チェックポイントインヒビターと組み合わせて投与することができる。
これらの実施形態のいずれにおいても、ＣＸＣＬ９をコードする遺伝子配列を含む、遺伝子操作された細菌は、１つまたは複数のさらなるエフェクター分子、すなわち、治療用分子または代謝変換因子をコードする遺伝子配列をさらに含む。これらの実施形態のいずれにおいても、ＣＸＣＬ９をコードする回路は、同じかまたは異なる細菌株において、本明細書に記載される１つまたは複数の免疫イニシエーターまたは免疫サステナーをコードする回路と組み合わせることができる（組合せ回路または株の混合物）。免疫イニシエーターまたは免疫サステナーをコードする回路は、構成的または誘導性プロモーター、例えば、低酸素誘導性プロモーターまたは本明細書に記載される任意の他の構成的もしくは誘導性プロモーターの制御下にあり得る。これらの実施形態のいずれにおいても、ＣＸＣＬ９をコードする遺伝子配列は、同じかまたは異なる細菌株において、本明細書に記載される１つまたは複数のＳＴＩＮＧアゴニスト産生酵素をコードする遺伝子配列と組み合わせることができる（組合せ回路または株の混合物）。一部の実施形態では、ＣＸＣＬ９をコードする遺伝子配列と組み合わされる遺伝子配列は、ＤａｃＡをコードする。ＤａｃＡは、構成的または誘導性プロモーター、例えば、低酸素誘導性プロモーター、例えば、ＦＮＲ、または本明細書に記載される任意の他の構成的もしくは誘導性プロモーターの制御下にあり得る。一部の実施形態では、ｄａｃＡ遺伝子は、染色体に組み込まれている。一部の実施形態では、ＣＸＣＬ９をコードする遺伝子配列と組み合わされる遺伝子配列は、ｃＧＡＳをコードする。ｃＧＡＳは、構成的または誘導性プロモーター、例えば、低酸素誘導性プロモーター、例えば、ＦＮＲ、または本明細書に記載される任意の他の構成的もしくは誘導性プロモーターの制御下にあり得る。一部の実施形態では、ｃＧＡＳをコードする遺伝子は、染色体に組み込まれている。これらの組合せの実施形態のいずれにおいても、細菌は、栄養要求性の改変、例えば、ＤａｐＡ、ＴｈｙＡ、または両方の突然変異または欠失をさらに含み得る。これらの実施形態のいずれにおいても、細菌は、ファージの改変、例えば、本明細書に記載される内在性プロファージの突然変異または欠失をさらに含み得る。
間質モジュレーション
細胞外基質（ＥＣＭ）成分の蓄積は、腫瘍および間質組織の正常な構造を変形させ、これが血管およびリンパ管の異常な形状の原因となる。腫瘍の治療抵抗性に寄与しうる１つの要因は、血管を有意に圧迫するＥＣＭの剛性であり、この圧迫の結果として（拡散および対流に対する制約に起因して）灌流が低減されることになり、この低減により、最終的に腫瘍細胞への治療薬の送達が妨げられる。間質における血管圧迫を低減させて薬物送達を支援する１つの戦略は、一部の間質腫瘍環境における豊富なヒアルロナンまたはヒアルロン酸（ＨＡ）を有する高密度の複雑なＥＣＭ中に埋め込まれた線維芽細胞、免疫細胞、および内皮細胞からなるＥＣＭ足場の酵素的破壊である。ＨＡは、その高いコロイド浸透圧に起因して水を保持する、反復Ｎ−アセチルグルコサミンおよびグルクロン酸ユニットで構成されている大きな直鎖状グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）であるＨＡは、腫瘍間質形成および維持における役割を果たすと考えられる。ヒアルロニダーゼ（ＰＥＧＰＨ２０；ｒＨｕＰＨ２０）による酵素的ＨＡ分解は、マウス膵管腺癌（ＰＤＡ）腫瘍において間質液圧を低下させ、血管開存性、薬物送達および生存が同時に観察されることが示されている（Ｐｒｏｖｅｎｚａｎｏら、Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ、２０１２年、２１巻：４１８〜４２９頁；Ｔｈｏｍｐｓｏｎら、Ｍｏｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒ、２０１０年、９巻：３０５２〜６４頁）。ＰＥＧＰＨ２０は、伸長ポリマーを切断して置換ユニットにすることによって、ＨＡと結合している水を遊離させると考えられている。捕捉された水の放出は、２０〜３０ｍｍＨｇの範囲に間質液圧を低下させ、これにより、潰れた細動脈および毛細血管の開放が可能になる（Ｐｒｏｖｅｎｚａｎｏら）。
一部の実施形態では、操作された細菌は、間質をモジュレートする１つまたは複数の分子をコードする遺伝子配列を含む。一部の実施形態では、操作された細菌は、ヒアルロナンまたはヒアルロン酸（ＨＡ）を分解する酵素の１つまたは複数のコピーをコードする遺伝子配列を含む。一部の実施形態では、操作された細菌は、ヒアルロニダーゼの１つまたは複数のコピーをコードする遺伝子配列を含む。
これらの実施形態のいずれにおいても、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より少なくとも約０％〜２％〜４％、４％〜６％、６％〜８％、８％〜１０％、１０％〜１２％、１２％〜１４％、１４％〜１６％、１６％〜１８％、１８％〜２０％、２０％〜２５％、２５％〜３０％、３０％〜３５％、３５％〜４０％、４０％〜４５％、４５％〜５０％、５０％〜５５％、５５％〜６０％、６０％〜６５％、６５％〜７０％〜８０％、８０％〜９０％、または９０％〜１００％多いヒアルロニダーゼを産生する。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より少なくとも約１．０〜１．２倍、１．２〜１．４倍、１．４〜１．６倍、１．６〜１．８倍、１．８〜２倍、または２倍多いヒアルロニダーゼを産生する。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、４０倍、または５０倍、１００倍、５００倍、または１０００倍多いヒアルロニダーゼを産生する。
これらの実施形態のいずれにおいても、ヒアルロニダーゼを産生するように遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より０％〜２％〜４％、４％〜６％、６％〜８％、８％〜１０％、１０％〜１２％、１２％〜１４％、１４％〜１６％、１６％〜１８％、１８％〜２０％、２０％〜２５％、２５％〜３０％、３０％〜３５％、３５％〜４０％、４０％〜４５％、４５％〜５０％、５０％〜５５％、５５％〜６０％、６０％〜６５％、６５％〜７０％〜８０％、８０％〜９０％、または９０％〜１００％多いヒアルロナンを分解する。
さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より１．０〜１．２倍、１．２〜１．４倍、１．４〜１．６倍、１．６〜１．８倍、１．８〜２倍、または２倍多いヒアルロナンを分解する。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、４０倍、または５０倍、１００倍、５００倍、または１０００倍多いヒアルロナンを分解する。一実施形態では、分泌のためのヒアルロニダーゼをコードする１つまたは複数の遺伝子を含む、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ濃度の組換えヒアルロニダーゼとほぼ同程度にヒアルロナンを分解することができる。
一部の実施形態では、ヒアルロニダーゼを分泌するように遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ亜型の未改変細菌と比較して、細胞増殖を、少なくとも約１０％〜２０％、２０％〜２５％、２５％〜３０％、３０％〜４０％、４０％〜５０％、５０％〜６０％、６０％〜７０％、７０％〜７５％、７５％〜８０％、８０％〜８５％、８５％〜９０％、９０％〜９５％、９５％〜９９％またはそれよりも多く低下させることができる。一部の実施形態では、ヒアルロニダーゼを分泌するように遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ亜型の未改変細菌と比較して、腫瘍増殖を、少なくとも約１０％〜２０％、２０％〜２５％、２５％〜３０％、３０％〜４０％、４０％〜５０％、５０％〜６０％、６０％〜７０％、７０％〜７５％、７５％〜８０％、８０％〜８５％、８５％〜９０％、９０％〜９５％、９５％〜９９％またはそれよりも多く低下させることができる。一部の実施形態では、ヒアルロニダーゼを分泌するように遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ亜型の未改変細菌と比較して、腫瘍サイズを、少なくとも約１０％〜２０％、２０％〜２５％、２５％〜３０％、３０％〜４０％、４０％〜５０％、５０％〜６０％、６０％〜７０％、７０％〜７５％、７５％〜８０％、８０％〜８５％、８５％〜９０％、９０％〜９５％、９５％〜９９％またはそれよりも多く低下させることができる。一部の実施形態では、ヒアルロニダーゼを分泌するように遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ亜型の未改変細菌と比較して、腫瘍体積を、少なくとも約１０％〜２０％、２０％〜２５％、２５％〜３０％、３０％〜４０％、４０％〜５０％、５０％〜６０％、６０％〜７０％、７０％〜７５％、７５％〜８０％、８０％〜８５％、８５％〜９０％、９０％〜９５％、９５％〜９９％またはそれよりも多く低下させることができる。一部の実施形態では、ヒアルロニダーゼを分泌するように遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ亜型の未改変細菌と比較して、腫瘍重量を、少なくとも約１０％〜２０％、２０％〜２５％、２５％〜３０％、３０％〜４０％、４０％〜５０％、５０％〜６０％、６０％〜７０％、７０％〜７５％、７５％〜８０％、８０％〜８５％、８５％〜９０％、９０％〜９５％、９５％〜９９％またはそれよりも多く低下させることができる。一部の実施形態では、ヒアルロニダーゼを分泌するように遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ亜型の未改変細菌と比較して、奏効率を、少なくとも約１０％〜２０％、２０％〜２５％、２５％〜３０％、３０％〜４０％、４０％〜５０％、５０％〜６０％、６０％〜７０％、７０％〜７５％、７５％〜８０％、８０％〜８５％、８５％〜９０％、９０％〜９５％、９５％〜９９％またはそれよりも多く増加させることができる。
一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、配列番号１１２７、配列番号１１２８、配列番号１１２９、配列番号１１３０、配列番号１１３１から選択される１つもしくは複数のポリペプチドまたはその機能性断片をコードするヒアルロニダーゼ遺伝子配列を含む。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、配列番号１１２７、配列番号１１２８、配列番号１１２９、配列番号１１３０、配列番号１１３１から選択される１つもしくは複数のポリペプチドまたはその機能性断片と少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９９％の同一性を有するポリペプチドをコードする遺伝子配列を含む。一部の特定の実施形態では、ポリペプチドは、配列番号１１２７、配列番号１１２８、配列番号１１２９、配列番号１１３０、配列番号１１３１から選択される１つまたは複数のポリペプチドを含む。他の特定の実施形態では、ポリペプチドは、配列番号１１２７、配列番号１１２８、配列番号１１２９、配列番号１１３０、配列番号１１３１から選択される１つまたは複数のポリペプチドからなる。ある特定の実施形態では、ヒアルロニダーゼ配列は、配列番号１１２２、配列番号１１２３、配列番号１２２４、配列番号１２２５、配列番号１２２６から選択される１つもしくは複数のポリヌクレオチドまたはその機能性断片と少なくとも約８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有する。一部の特定の実施形態では、遺伝子配列は、配列番号１１２７、配列番号１１２８、配列番号１１２９、配列番号１１３０、配列番号１１３１から選択される１つまたは複数の配列を含む。他の特定の実施形態では、遺伝子配列は、配列番号１１２７、配列番号１１２８、配列番号１１２９、配列番号１１３０、配列番号１１３１から選択される１つまたは複数のポリヌクレオチドからなる。
一部の実施形態では、操作された細菌は、ヒトヒアルロニダーゼの１つまたは複数のコピーをコードする遺伝子配列を含む。一部の実施形態では、ヒアルロニダーゼは、ヒルヒアルロニダーゼである。これらの実施形態のいずれにおいても、ヒアルロニダーゼを含む遺伝子配列は、ＰｈｏＡ、ＯｍｐＦ、ｃｖａＣ、ＴｏｒＡ、ＦｄｎＧ、ＤｍｓＡおよびＰｅｌＢから選択される分泌タグをさらにコードする。一部の実施形態では、分泌タグは、ヒアルロニダーゼポリペプチド配列のＮ末端に、かつヒアルロニダーゼコード配列の５’末端にある。一部の実施形態では、分泌タグは、ヒアルロニダーゼポリペプチド配列のＣ末端に、かつヒアルロニダーゼコード配列の３’末端にある。一実施形態では、分泌タグは、ＰｈｏＡである。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、分泌のためのヒアルロニダーゼをコードする。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、細菌細胞表面への提示のためのヒアルロニダーゼをコードする。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ｌｐｐ、ｎｌＰ、ｔｏｌＡおよびＰＡＬから選択される外膜タンパク質の１つまたは複数の欠失をさらに含む。一部の実施形態では、欠失または突然変異した外膜タンパク質は、ＰＡＬである。
一部の実施形態では、遺伝子操作された微生物は、低酸素条件で、ならびに／あるいはがんの、および／または腫瘍微小環境の、または組織特異的分子もしくは代謝物の存在下で、ならびに／あるいは炎症または免疫抑制に関連する分子または代謝物の存在下で、ならびに／あるいは消化管内に存在しうる代謝物の存在下で、ならびに／あるいはｉｎ ｖｉｖｏで存在することもあり、しないこともあり、ｉｎ ｖｉｔｒｏで、株培養、拡大増殖、産生および／または製造中に存在することもある、代謝物、例えば、アラビノース、クメート（ｃｕｍａｔｅ）およびサリチレート（ｓａｌｉｃｙｌａｔｅ）および本明細書に記載の他のものの存在下で、記載の間質モジュレーション回路または遺伝子配列、例えば、ヒアルロニダーゼ回路のうちいずれか１つまたは複数を発現することができる。一部の実施形態では、そのようなインデューサーをｉｎ ｖｉｖｏで投与して、エフェクター遺伝子発現を誘導することができる。一部の実施形態では、間質モジュレーション回路、例えば、ヒアルロニダーゼ回路をコードする遺伝子配列は、ｉｎ ｖｉｖｏおよび／またはｉｎ ｖｉｔｒｏでそのような条件および／またはインデューサーにより誘導されうるプロモーターによって制御される。一部の実施形態では、遺伝子配列は、本明細書に記載の構成的プロモーターによって制御される。一部の実施形態では、遺伝子配列は、構成的プロモーターによって制御され、本明細書に記載の、ｉｎ ｖｉｖｏ条件および／またはｉｎ ｖｉｔｒｏ条件で、例えば、拡大増殖、産生および／または製造中に発現される。一部の実施形態では、記載の間質モジュレーション遺伝子配列、例えば、ヒアルロニダーゼ遺伝子配列のうちいずれか１つまたは複数は、１つもしくは複数のプラスミド（例えば、高コピー数または低コピー数プラスミド）上に存在するか、または微生物染色体内の１つもしくは複数の部位に組み込まれている。
これらの実施形態のいずれにおいても、間質モジュレーションエフェクター、例えば、ヒアルロニダーゼをコードする遺伝子配列（複数可）を含む遺伝子操作された細菌は、１つまたは複数のさらに別のエフェクター分子、すなわち、治療分子または代謝変換因子をコードする遺伝子配列をさらに含む。これらの実施形態のいずれにおいても、間質モジュレーションエフェクター、例えば、ヒアルロニダーゼをコードする回路は、同じまたは異なる細菌株（組合せ回路または株の混合物）において、本明細書に記載される１つまたは複数の免疫イニシエーターまたは免疫サステナーをコードする回路と組み合わせることができる。免疫イニシエーターまたは免疫サステナーをコードする回路は、構成的または誘導性プロモーター、例えば、低酸素誘導性プロモーターまたは本明細書に記載される他のいずれかの構成的または誘導性プロモーターの制御下に置くことができる。
これらの実施形態のいずれにおいても、間質モジュレーションエフェクター、例えば、ヒアルロニダーゼをコードする遺伝子配列（複数可）は、同じまたは異なる細菌株（組合せ回路または株の混合物）において、本明細書に記載される１つまたは複数のＳＴＩＮＧアゴニスト産生酵素をコードする遺伝子配列（複数可）と組み合わせることができる。一部の実施形態では、間質モジュレーションエフェクター、例えば、ヒアルロニダーゼをコードする遺伝子配列（複数可）と組み合わされる遺伝子配列は、ＤａｃＡをコードする。ＤａｃＡは、構成的または誘導性プロモーター、例えば、ＦＮＲ等の低酸素誘導性プロモーターまたは本明細書に記載される他のいずれかの構成的または誘導性プロモーターの制御下に置くことができる。一部の実施形態では、ｄａｃＡ遺伝子は、染色体に組み込まれている。一部の実施形態では、間質モジュレーションエフェクター、例えば、ヒアルロニダーゼをコードする遺伝子配列（複数可）と組み合わされる遺伝子配列は、ｃＧＡＳをコードする。ｃＧＡＳは、構成的または誘導性プロモーター、例えば、ＦＮＲ等の低酸素誘導性プロモーターまたは本明細書に記載される他のいずれかの構成的または誘導性プロモーターの制御下に置くことができる。一部の実施形態では、ｃＧＡＳをコードする遺伝子は、染色体に組み込まれている。
これらの組合せ実施形態のいずれにおいても、細菌は、ＤａｐＡ、ＴｈｙＡまたはその両方に、栄養要求性改変、例えば、突然変異または欠失をさらに含むことができる。これらの実施形態のいずれにおいても、細菌は、本明細書に記載される内在性プロファージに、ファージ改変、例えば、突然変異または欠失をさらに含むことができる。
また、一部の実施形態では、遺伝子操作された微生物は、記載の間質モジュレーション回路のいずれか１つまたは複数、例えば、ヒアルロニダーゼ回路をさらに発現することができ、以下のものの１つまたは複数をさらに含む：（１）１つまたは複数の栄養要求体、例えば、当技術分野において公知の、および本明細書で提供される、任意の栄養要求体、例えばｔｈｙＡ栄養要求体、（２）１つまたは複数のキルスイッチ回路、例えば、本明細書に記載の、またはそうでなければ当技術分野において公知の、キルスイッチのいずれか、（３）１つまたは複数の抗生物質耐性回路、（４）生体分子または基質を移入するための１つまたは複数の輸送体、例えば、本明細書に記載の、またはそうでなければ当技術分野において公知の、輸送体のいずれか、（５）１つまたは複数の分泌回路、例えば、本明細書に記載の、でなければ当技術分野において公知の、分泌回路のいずれか、（６）１つまたは複数の表面提示回路、例えば、本明細書に記載の、でなければ当技術分野において公知の、表面提示回路のいずれか、および（７）本明細書に記載の１つまたは複数の代謝物（例えば、キヌレニン、トリプトファン、アデノシン、アルギニン）の産生または分解のための１つまたは複数の回路、（８）このような追加の回路の１つまたは複数の組合せ。これらの実施形態のいずれにおいても、遺伝子操作された細菌を単独で投与することができ、または抗ＣＴＬＡ４、抗ＰＤ１もしくは抗ＰＤ−Ｌ１抗体を含むがこれらに限定されない、本明細書に記載の１つもしくは複数の免疫チェックポイントインヒビターと組み合わせて投与することができる。
他の免疫モジュレーター
他の免疫モジュレーターは、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、０１／１１／２０１７に出願され、ＷＯ２０１７／１２３６７５として公開された国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０１３０７２に記載されている、治療核酸（ＲＮＡおよびＤＮＡ）、例えば、ＲＮＡｉ分子（ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｄｓＲＮＡ等）、ｍＲＮＡ、アンチセンス分子、アプタマーおよびＣＲＩＳＰＥＲ／Ｃａｓ９分子を含む。よって、一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、例えば、ＲＮＡｉ分子（ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｄｓＲＮＡ）、ｍＲＮＡ、アンチセンス分子、アプタマーおよびＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９分子から選択される核酸分子を含む、ＲＮＡまたはＤＮＡ免疫モジュレーターである１つまたは複数の免疫モジュレーターを産生するための配列（複数可）を含む。そのような分子は、本明細書で後述する参考文献において例証および考察されている。
これらの実施形態のいずれにおいても、これらの回路は、同じまたは異なる細菌株（組合せ回路または株の混合物）において、１つまたは複数の免疫イニシエーター（例えば、本明細書に記載されるＳＴＩＮＧアゴニスト）の産生のための回路と組み合わせることができる。
免疫イニシエーターおよび免疫サステナーの組合せ
一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌により発現される回路網は、複数の機構を兼備するように選択される。例えば、腫瘍微小環境において複数の直交免疫モジュレーション経路を活性化することにより、免疫学的に冷たい腫瘍は、免疫学的に熱い腫瘍に形質転換される。免疫応答の異なる成分に対して影響を与える複数のエフェクターを選択することができる。遺伝子操作された細菌によって発現されるエフェクターによって標的化されうる、異なる免疫応答構成成分は、免疫開始および免疫増大およびＴ細胞拡大増殖（免疫持続）を含む。
一部の実施形態では、少なくとも第１の免疫モジュレーター、例えば、免疫イニシエーターまたは免疫サステナーを産生する第１の改変された微生物は、少なくとも第２の免疫モジュレーター、例えば、免疫イニシエーターまたは免疫サステナーを産生する第２の改変された微生物と組み合わせて、例えば、その前に、それと同時に、またはその後に投与することができる。他の実施形態では、１つまたは複数の免疫モジュレーターは、第２の免疫モジュレーター（複数可）を産生することができる改変された微生物と組み合わせて、例えば、その前に、それと同時に、またはその後に投与することができる。例えば、１つまたは複数の免疫イニシエーターは、１つまたは複数の免疫サステナーを産生することができる改変された微生物と組み合わせて、例えば、その前に、それと同時に、またはその後に投与することができる。別の実施形態では、１つまたは複数の免疫サステナーは、１つまたは複数の免疫イニシエーターを産生することができる改変された微生物と組み合わせて、例えば、その前に、それと同時に、またはその後に投与することができる。あるいは、１つまたは複数の第１の免疫イニシエーターは、１つまたは複数の第２の免疫イニシエーターを産生することができる改変された微生物と組み合わせて、例えば、その前に、それと同時に、またはその後に投与することができる。あるいは、１つまたは複数の第１の免疫サステナーは、１つまたは複数の第２の免疫サステナーを産生することができる改変された微生物と組み合わせて、例えば、その前に、それと同時に、またはその後に投与することができる。一部の実施形態では、免疫イニシエーターおよび／または免疫サステナーは、間質モジュレーター、例えば、ヒアルロニダーゼとさらに組み合わせることができる。
一部の実施形態では、１つまたは複数の微生物は、１つまたは複数の免疫調節エフェクターまたは２つもしくはそれよりも多いこれらのエフェクターの組合せをコードする遺伝子配列（複数可）を発現するように遺伝子操作される。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、１つもしくは複数の免疫調節エフェクターまたは２つもしくはそれよりも多いこれらのエフェクターの組合せをコードする回路網を含む。あるいは、本開示は、異なるまたは別々の遺伝子操作された細菌の組合せ（例えば、２つまたはそれよりも多く）を含む組成物であって、各細菌が、１つまたは複数の免疫調節エフェクターをコードする、組成物を提供する。そのような別個のまたは異なる細菌株は、同時発生的にまたは逐次に投与することができる。
一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、免疫開始（例えば、活性化およびプライミングを含む）および免疫持続（例えば、免疫増大またはＴ細胞拡大増殖を含む）をモジュレートすることができる回路網を含む。したがって、一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、１つまたは複数の免疫イニシエーターおよび１つまたは複数の免疫サステナーをコードする回路網または遺伝子配列を含む。
あるいは、本開示は、異なる遺伝子操作された細菌の組合せ（例えば、２つまたはそれよりも多く）を含む組成物であって、各細菌が、１つもしくは複数の免疫イニシエーターおよび／または１つもしくは複数の免疫サステナーをコードする、組成物を提供する。そのような別個のまたは異なる細菌株は、同時発生的にまたは逐次に投与することができる。
本明細書に記載される遺伝子配列（複数可）、回路、エフェクター、免疫モジュレーター、免疫イニシエーターまたは免疫サステナーの各組合せは、１つの細菌株における組合せ回路網として、あるいは組合せの１つまたは複数の遺伝子配列、回路、エフェクター、免疫モジュレーター、免疫イニシエーターまたは免疫サステナーをそれぞれ発現する２つまたはそれよりも多い異なるまたは別々の細菌株において提供することができる。例えば、免疫イニシエーターの産生のための回路網および免疫サステナーの産生のための遺伝子回路網を含む１つまたは複数の遺伝子操作された細菌は、両方の回路を含む１つの株、または回路の少なくとも１つをそれぞれ含む２つもしくはそれよりも多い株において提供することができる。
微生物が、免疫イニシエーター回路および免疫サステナー回路を発現するように遺伝子操作された、本開示の一部の実施形態では、微生物は、先ず、より高いレベルの免疫刺激因子を、より後の時点では、免疫サステナーを産生する。ある特定の実施形態では、１つまたは複数の遺伝子配列は、当技術分野で公知のまたは本明細書に記載される誘導性プロモーターの制御下に置かれる。例えば、そのような誘導性プロモーターは、ＦＮＲプロモーター等、低酸素条件下で誘導されうる。一部の実施形態では、１つまたは複数の遺伝子配列は、本明細書に記載される通り、炎症性条件下で（例えば、ＲＮＳ、ＲＯＳ）誘導される直接的にまたは間接的に誘導性のプロモーターに作動可能に連結される。他の実施形態では、プロモーターは、ある特定の分子または代謝物の存在下で、例えば、腫瘍微小環境および／または免疫抑制に関連する分子または代謝物の存在下で誘導される。一部の実施形態では、プロモーターは、ある特定の組織型において誘導される。一部の実施形態では、プロモーターは、ある特定の消化管特異的または腫瘍特異的分子または代謝物の存在下で誘導される。一部の実施形態では、プロモーターは、アラビノース、クメートおよびサリチレートまたは当技術分野で公知のもしくは本明細書に記載される別の化学的もしくは栄養的インデューサー等、消化管または腫瘍内に存在することもあり、しないこともある他の何らかの代謝物の存在下で誘導される。ある特定の実施形態では、１つまたは複数のカセットは、本明細書に記載されるまたは当技術分野で公知の構成的プロモーターの制御下にあり、例えばその発現を、異なる強さのリボソーム結合部位を使用して微調整することができる。そのような微生物は、必要に応じて、栄養要求性改変、例えば、アミノ酸またはヌクレオチド代謝における栄養要求性改変も含む。改変されうる遺伝子の非限定的な例は、ＴｈｙＡおよびＤａｐＡまたはその両方（ΔＤａｐＡもしくはΔＴｈｙＡまたはその両方）である。
一部の実施形態では、免疫イニシエーターの発現は、化学的インデューサーによって誘導されるプロモーターの制御下に置かれる。一部の実施形態では、免疫サステナーは、化学的インデューサーによって誘導されるプロモーターの制御下に置かれる。一部の実施形態では、免疫イニシエーターおよび免疫サステナーの両方は、化学的インデューサーによって誘導されるプロモーターの制御下に置かれる。インデューサー（免疫刺激因子発現を誘導）および第２のインデューサー（免疫サステナー発現を誘導）は、同じまたは異なるインデューサーとなることができる。第１のインデューサーおよび第２のインデューサーは、逐次にまたは同時発生的に投与することができる。一部の実施形態では、免疫サステナーおよび／または免疫イニシエーターは、ｉｎ ｖｉｖｏ条件下で、例えば、消化管もしくは腫瘍微小環境の条件（例えば、低酸素、ある特定の栄養素等）によって、細胞培養もしくはｉｎ ｖｉｔｒｏ成長の際の条件によって、またはｉｎ ｖｉｔｒｏもしくはｉｎ ｖｉｖｏで用いることができる化学的インデューサー（例えば、アラビノース、クメートおよびサリチレート、ＩＰＴＧまたは本明細書に記載される他の化学的インデューサー）によって誘導されうる。
一部の実施形態では、免疫イニシエーターは、誘導性プロモーターによって制御される、またはこれに直接的にもしくは間接的に連結され、免疫サステナーは、構成的プロモーターによって制御される、またはこれに直接的にもしくは間接的に連結される。一部の実施形態では、免疫イニシエーターは、構成的プロモーターによって制御される、またはこれに直接的にもしくは間接的に連結され、免疫サステナーは、誘導性プロモーターによって制御される、またはこれに直接的にもしくは間接的に連結される。
一部の実施形態では、両方の回路が、細菌染色体中に組み込まれていてよい。一部の実施形態では、両方の回路が、プラスミド上に存在していてよい。一部の実施形態では、両方の回路が、プラスミド上に存在していてよい。一部の実施形態では、一方の回路が、細菌染色体中に組み込まれていてよく、別の回路が、プラスミド上に存在していてよい。
別の実施形態では、免疫開始のための回路網を発現する細菌株は、免疫持続のための回路網を発現する別々の細菌株と併せて投与することができる。例えば、免疫イニシエーター回路網を発現する遺伝子操作された細菌の１つまたは複数の株、および免疫サステナー回路網を発現する遺伝子操作された細菌の１つまたは複数の別々の株は、逐次に投与することができる、例えば、免疫刺激因子は、免疫サステナーの前に投与することができる。別の例では、免疫イニシエーター株は、免疫サステナー株の後に投与することができる。さらに別の例では、免疫イニシエーター株は、免疫サステナー株と同時発生的に投与することができる。
投与の順序またはタイミング（同時発生的または逐次）に関係なく、操作された株は、投与後逐次にまたは同時発生的に、免疫サステナーのための回路網を発現することができる、すなわち、発現のタイミングおよびレベルは、プロモーターおよびリボソーム結合部位を含むがこれらに限定されない、本明細書に記載される１つまたは複数の機構を使用して調整される。
より具体的な例では、ＳＴＩＮＧアゴニストの産生のための酵素をコードする遺伝子配列（複数可）、およびキヌレニンの消費のための酵素をコードする遺伝子配列（複数可）を含む１つまたは複数の遺伝子操作された細菌は、両方の回路を含む１つの株において、または回路の少なくとも１つをそれぞれ含む、２つもしくはそれよりも多い株において提供することができる。投与の非限定的な例では、免疫イニシエーター産生株が１番目に投与され、次いで免疫サステナー産生株が２番目に投与される。投与のより具体的な非限定的な例では、ＳＴＩＮＧアゴニスト産生株が１番目に投与され、次いでキヌレニン消費株が２番目に投与される。
免疫イニシエーターおよびサステナーの非限定的な例は、表７および表８に記載されている。
一部の組合せ実施形態では、表７の１つまたは複数のエフェクターは、表８の１つまたは複数のエフェクターと組み合わせることができる。
免疫応答の異なる構成成分に影響を有する複数のエフェクターを選択することができる。１つまたは複数の遺伝子操作された細菌によって発現されるエフェクターによって標的化されうる異なる免疫応答構成成分は、腫瘍退縮、ＡＰＣの免疫活性化、ならびにＴ細胞の活性化およびプライミング（「免疫イニシエーター」）、搬送および浸潤、免疫増大、Ｔ細胞拡大増殖（「免疫サステナー」）を含む。一部の組合せ実施形態では、「免疫イニシエーター」は、「免疫サステナー」と組み合わせられる。一部の実施形態では、免疫イニシエーターおよび／または免疫サステナーを、さらに、間質モジュレーター、例えば、ヒアルロニダーゼと組み合わせることができる。一部の実施形態では、免疫イニシエーターおよび免疫サステナーおよび必要に応じて間質モジュレーターをコードする遺伝子を含む２つまたはそれより多い異なる細菌を、組み合わせ、同時にまたは逐次的に投与することができる。
一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、免疫応答を開始するエフェクターまたは免疫モジュレーター、すなわち、免疫イニシエーターを産生することができる。本明細書に記載される免疫活性化およびプライミングを標的化するためのそのようなエフェクターの非限定的な例は、可溶性ＳＩＲＰα、抗ＣＤ４７抗体および抗ＣＤ４０抗体、ＣＤ４０−リガンド、ＴＮＦα、ＩＦＮ−ガンマ、５−ＦＣから５−ＦＵへの変換、およびＳＴＩＮＧアゴニストを含む。本明細書に記載される免疫増大を標的化するためのエフェクターの非限定的な例は、キヌレニン分解、アデノシン分解、アルギニン産生、ＣＸＣＬ１０、ＩＬ−１５、ＩＬ−１２分泌、および例えば、抗ＰＤ−１分泌またはディスプレイによる、チェックポイント阻害を含む。本明細書に記載されるＴ細胞拡大増殖を標的化するためのエフェクターの非限定的な例は、抗ＰＤ−１および抗ＰＤ−Ｌ１抗体、抗ＣＴＬＡ−４抗体、およびＩＬ−１５を含む。
一実施形態では、免疫イニシエーターは、免疫サステナーと同じではない。非限定的な一例として、免疫イニシエーターがＩＦＮ−ガンマである場合、免疫サステナーはＩＦＮ−ガンマではない。一実施形態では、免疫イニシエーターは、免疫サステナーとは異なる。非限定的な一例として、免疫イニシエーターがＩＦＮ−ガンマである場合、免疫サステナーはＩＦＮ−ガンマではない。
一組合せ実施形態では、遺伝子操作された細菌は、１つまたは複数の免疫サステナーの産生のための１つまたは複数の遺伝子配列と組み合わせた、１つまたは複数の免疫イニシエーターの産生のための遺伝子配列を含む。代替実施形態では、本開示は、異なる遺伝子操作された細菌の組合せ（例えば、２つまたはそれよりも多く）を含む組成物を提供する。そのような一組成物実施形態では、１つまたは複数の免疫イニシエーターの産生のための遺伝子配列を含む１つまたは複数の遺伝子操作された細菌は、１つまたは複数の免疫サステナーの産生のための遺伝子配列を含む１つまたは複数の遺伝子操作された細菌と組み合わせることができる。あるいは、組成物における各細菌は、免疫サステナー（複数可）および免疫イニシエーター（複数可）の両方を有することができる。
これらの組合せおよび／または組成物実施形態のいずれにおいても、１つの免疫イニシエーターは、ケモカインまたはサイトカインとなることができる。一部の免疫サステナーおよび免疫イニシエーター組合せおよび／または組成物実施形態では、１つの免疫イニシエーターは、ケモカインまたはサイトカインであり、１つの免疫サステナーは、一本鎖抗体である。一部の免疫サステナーおよび免疫イニシエーター組合せおよび／または組成物実施形態では、１つの免疫イニシエーターは、ケモカインまたはサイトカインであり、１つの免疫サステナーは、受容体リガンドである。一部の実施形態では、１つの免疫イニシエーターは、ケモカインまたはサイトカインであり、１つの免疫サステナーは、受容体リガンドである。一部の実施形態では、１つの免疫イニシエーターは、ケモカインまたはサイトカインであり、１つの免疫サステナーは、ケモカインまたはサイトカインである。一部の実施形態では、１つの免疫イニシエーターは、ケモカインまたはサイトカインであり、１つの免疫サステナーは、ケモカインまたはサイトカインである。一部の実施形態では、１つの免疫イニシエーターは、ケモカインまたはサイトカインであり、１つの免疫サステナーは、代謝的変換である。代謝的変換は、アルギニン産生、アデノシン消費、および／またはキヌレニン消費でありうる。一部の実施形態では、ケモカインまたはサイトカインイニシエーターは、ＴＮＦα、ＩＦＮ−ガンマおよびＩＦＮ−ベータ１から選択される。これらの実施形態のいずれにおいても、免疫サステナーまたはオーグメンターは、抗ＰＤ−１単鎖抗体、抗ＣＴＬＡ４単鎖抗体、ＩＬ−１５、ＣＸＣＬ１０または代謝的変換から選択することができる。代謝的変換は、アルギニン産生、アデノシン消費、および／またはキヌレニン消費でありうる。
これらの組合せおよび／または組成物実施形態のいずれにおいても、１つの免疫イニシエーターは、単鎖抗体でありうる。一部の免疫サステナーおよび免疫イニシエーター組合せおよび／または組成物実施形態では、１つの免疫イニシエーターは、単鎖抗体であり、１つの免疫サステナーは、単鎖抗体である。一部の実施形態では、１つの免疫イニシエーターは、単鎖抗体であり、１つの免疫サステナーは、受容体リガンドである。一部の実施形態では、１つの免疫イニシエーターは、単鎖抗体であり、１つの免疫サステナーは、受容体リガンドである。一部の実施形態では、１つの免疫イニシエーターは、単鎖抗体であり、１つの免疫サステナーは、ケモカインまたはサイトカインである。一部の実施形態では、１つの免疫イニシエーターは、単鎖抗体であり、１つの免疫サステナーは、代謝的変換である。代謝的変換は、アルギニン産生、アデノシン消費、および／またはキヌレニン消費でありうる。これらの実施形態のいずれにおいても、免疫サステナーまたはオーグメンターは、抗ＰＤ−１単鎖抗体、抗ＣＴＬＡ４単鎖抗体、ＩＬ−１５、ＣＸＣＬ１０または代謝的変換から選択することができる。代謝的変換は、アルギニン産生、アデノシン消費、および／またはキヌレニン消費でありうる。
これらの組合せおよび／または組成物実施形態のいずれにおいても、１つの免疫イニシエーターは、受容体リガンドでありうる。一部の免疫サステナーおよび免疫イニシエーター組合せおよび／または組成物実施形態では、１つの免疫イニシエーターは、受容体リガンドであり、１つの免疫サステナーは、単鎖抗体である。一部の実施形態では、１つの免疫イニシエーターは、受容体リガンドであり、１つの免疫サステナーは、受容体リガンドである。一部の実施形態では、１つの免疫イニシエーターは、受容体リガンドであり、１つの免疫サステナーは、受容体リガンドである。一部の実施形態では、１つの免疫イニシエーターは、受容体リガンドであり、１つの免疫サステナーは、ケモカインまたはサイトカインである。一部の実施形態では、１つの免疫イニシエーターは、受容体リガンドであり、１つの免疫サステナーは、代謝的変換である。代謝的変換は、アルギニン産生、アデノシン消費、および／またはキヌレニン消費でありうる。１つの免疫イニシエーターが受容体リガンドである、一部の実施形態では、免疫イニシエーターは、ＣＤ４０Ｌである。これらの実施形態のいずれにおいても、免疫サステナーまたはオーグメンターは、抗ＰＤ−１単鎖抗体、抗ＣＴＬＡ４単鎖抗体、ＩＬ−１５、ＣＸＣＬ１０または代謝的変換から選択することができる。代謝的変換は、アルギニン産生、アデノシン消費、および／またはキヌレニン消費でありうる。一部の実施形態では、受容体リガンドは、ＳＩＲＰα、またはその断片、バリアントもしくは融合タンパク質である。これらの実施形態のいずれにおいても、免疫サステナーまたはオーグメンターは、抗ＰＤ−１単鎖抗体、抗ＣＴＬＡ４単鎖抗体、ＩＬ−１５、ＣＸＣＬ１０または代謝的変換から選択することができる。代謝的変換は、アルギニン産生、アデノシン消費、および／またはキヌレニン消費でありうる。
これらの組合せおよび／または組成物実施形態のいずれにおいても、１つの免疫イニシエーターは、代謝的変換因子でありうる。一部の免疫サステナーおよび免疫イニシエーター組合せおよび／または組成物実施形態では、１つの免疫イニシエーターは、代謝的変換であり、１つの免疫サステナーは、単鎖抗体である。一部の実施形態では、１つの免疫イニシエーターは、代謝的変換であり、１つの免疫サステナーは、受容体リガンドである。一部の実施形態では、１つの免疫イニシエーターは、代謝的変換であり、１つの免疫サステナーは、受容体リガンドである。一部の実施形態では、１つの免疫イニシエーターは、代謝的変換であり、１つの免疫サステナーは、ケモカインまたはサイトカインである。一部の実施形態では、１つの免疫イニシエーターは、代謝的変換であり、１つの免疫サステナーは、例えばキヌレニン消費物質、トリプトファン産生物質、アルギニン産生物質およびアデノシン消費物質から選択される、代謝的変換である。一部の実施形態では、イニシエーター代謝性変換は、ＳＴＩＮＧアゴニスト生産者、例えば、ジアデニル酸（ｄｉａｄｅｎｙｌａｔｅ）シクラーゼ、例えば、ＤａｃＡである。これらの実施形態のいずれにおいても、免疫サステナーまたはオーグメンターは、抗ＰＤ−１単鎖抗体、抗ＣＴＬＡ４単鎖抗体、ＩＬ−１５、ＣＸＣＬ１０または代謝的変換から選択することができる。代謝的変換は、アルギニン産生、アデノシン消費、および／またはキヌレニン消費でありうる。
これらの組合せおよび／または組成物実施形態のいずれにおいても、１つの免疫イニシエーターは、遺伝子操作免疫療法（ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ）でありうる。一部の免疫サステナーおよび免疫イニシエーター組合せおよび／または組成物実施形態では、１つの免疫イニシエーターは、遺伝子操作化学療法（ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ）であり、１つの免疫サステナーは、単鎖抗体である。一部の実施形態では、１つの免疫イニシエーターは、遺伝子操作化学療法であり、１つの免疫サステナーは、受容体リガンドである。一部の実施形態では、１つの免疫イニシエーターは、遺伝子操作化学療法であり、１つの免疫サステナーは、受容体リガンドである。一部の実施形態では、１つの免疫イニシエーターは、遺伝子操作化学療法であり、１つの免疫サステナーは、ケモカインまたはサイトカインである。一部の実施形態では、１つの免疫イニシエーターは、遺伝子操作化学療法であり、１つの免疫サステナーは、代謝的変換である。代謝的変換は、アルギニン産生、アデノシン消費、および／またはキヌレニン消費でありうる。一部の実施形態では、イニシエーター遺伝子操作化学療法は、例えば、ｃｏｄＡまたはそのバリアントもしくは融合タンパク質による、５ＦＣから５ＦＵへの変換である。これらの実施形態のいずれにおいても、免疫サステナーまたはオーグメンターは、抗ＰＤ−１単鎖抗体、抗ＣＴＬＡ４単鎖抗体、ＩＬ−１５、ＣＸＣＬ１０または代謝的変換から選択することができる。代謝的変換は、アルギニン産生、アデノシン消費、および／またはキヌレニン消費でありうる。
これらの組合せおよび／または組成物実施形態のいずれにおいても、１つの免疫サステナーは、単鎖抗体でありうる。一部の免疫サステナーおよび免疫イニシエーター組合せおよび／または組成物実施形態では、１つの免疫サステナーは、単鎖抗体であり、免疫イニシエーターは、サイトカインまたはケモカインである。一部の実施形態では、１つの免疫サステナーは、単鎖抗体であり、免疫イニシエーターは、受容体リガンドである。一部の実施形態では、１つの免疫サステナーは、単鎖抗体であり、免疫イニシエーターは、単鎖抗体である。一部の実施形態では、１つの免疫サステナーは、単鎖抗体であり、免疫イニシエーターは、代謝的変換である。一部の実施形態では、１つの免疫サステナーは、単鎖抗体であり、免疫イニシエーターは、遺伝子操作化学療法である。一部の免疫サステナーおよび免疫イニシエーター組合せおよび／または組成物実施形態では、免疫サステナーは、抗ＰＤ−１抗体である。一部の免疫サステナーおよび免疫イニシエーター組合せおよび／または組成物実施形態では、免疫サステナーは、抗ＣＴＬＡ４抗体である。これらの実施形態のいずれにおいても、免疫イニシエーターは、ＴＮＦα、ＩＦＮ−ガンマ、ＩＦＮ−ベータ１、ＳＩＲＰα、ＣＤ４０Ｌ、ＳＴＩＮＧアゴニスト、および５ＦＣ−＞５ＦＵから選択することができる。
これらの組合せおよび／または組成物実施形態のいずれにおいても、１つの免疫サステナーは、受容体リガンドでありうる。一部の免疫サステナーおよび免疫イニシエーター組合せおよび／または組成物実施形態では、１つの免疫サステナーは、受容体リガンドであり、免疫イニシエーターは、サイトカインまたはケモカインである。一部の実施形態では、１つの免疫サステナーは、受容体リガンドであり、免疫イニシエーターは、受容体リガンドである。一部の実施形態では、１つの免疫サステナーは、受容体リガンドであり、免疫イニシエーターは、単鎖抗体である。一部の実施形態では、１つの免疫サステナーは、受容体リガンドであり、免疫イニシエーターは、代謝的変換である。一部の実施形態では、１つの免疫サステナーは、受容体リガンドであり、免疫イニシエーターは、遺伝子操作化学療法である。一部の免疫サステナーおよび免疫イニシエーター組合せおよび／または組成物実施形態では、免疫サステナーは、ＰＤ１もしくはＰＤＬ１もしくはＣＴＬＡ４、またはそれらの断片、バリアントもしくは融合タンパク質である。これらの実施形態のいずれにおいても、免疫イニシエーターは、ＴＮＦα、ＩＦＮ−ガンマ、ＩＦＮ−ベータ１、ＳＩＲＰα、ＣＤ４０Ｌ、ＳＴＩＮＧアゴニスト、および５ＦＣ−＞５ＦＵから選択することができる。
これらの組合せおよび／または組成物実施形態のいずれにおいても、１つの免疫サステナーは、サイトカインまたはケモカインでありうる。一部の免疫サステナーおよび免疫イニシエーター組合せおよび／または組成物実施形態では、１つの免疫サステナーは、サイトカインまたはケモカインであり、免疫イニシエーターは、サイトカインまたはケモカインである。一部の実施形態では、１つの免疫サステナーは、サイトカインまたはケモカインであり、免疫イニシエーターは、受容体リガンドである。一部の実施形態では、１つの免疫サステナーは、サイトカインまたはケモカインであり、免疫イニシエーターは、単鎖抗体である。一部の実施形態では、１つの免疫サステナーは、サイトカインまたはケモカインであり、免疫イニシエーターは、代謝的変換である。一部の実施形態では、１つの免疫サステナーは、サイトカインまたはケモカインであり、免疫イニシエーターは、遺伝子操作化学療法である。一部の免疫サステナーおよび免疫イニシエーター組合せおよび／または組成物実施形態では、免疫サステナーは、ＩＬ−１５またはその断片、バリアントもしくは融合タンパク質である。一部の免疫サステナーおよび免疫イニシエーター組合せおよび／または組成物実施形態では、免疫サステナーは、ＣＸＣＬ１０またはその断片、バリアントもしくは融合タンパク質である。これらの実施形態のいずれにおいても、免疫イニシエーターは、ＴＮＦα、ＩＦＮ−ガンマ、ＩＦＮ−ベータ１、ＳＩＲＰα、ＣＤ４０Ｌ、ＳＴＩＮＧアゴニスト、および５ＦＣ−＞５ＦＵから選択することができる。
これらの組合せおよび／または組成物実施形態のいずれにおいても、１つの免疫サステナーは、代謝的変換でありうる。一部の免疫サステナーおよび免疫イニシエーター組合せおよび／または組成物実施形態では、１つの免疫サステナーは、代謝的変換であり、免疫イニシエーターは、サイトカインまたはケモカインである。一部の実施形態では、１つの免疫サステナーは、代謝的変換であり、免疫イニシエーターは、受容体リガンドである。一部の実施形態では、１つの免疫サステナーは、代謝的変換であり、免疫イニシエーターは、単鎖抗体である。一部の実施形態では、１つの免疫サステナーは、代謝的変換であり、免疫イニシエーターは、代謝的変換である。一部の実施形態では、１つの免疫サステナーは、代謝的変換であり、免疫イニシエーターは、遺伝子操作化学療法である。一部の免疫サステナーおよび免疫イニシエーター組合せおよび／または組成物実施形態では、免疫サステナーは、キヌレニン消費である。一部の免疫サステナーおよび免疫イニシエーター組合せおよび／または組成物実施形態では、免疫サステナーは、アルギニン産生である。一部の免疫サステナーおよび免疫イニシエーター組合せおよび／または組成物実施形態では、免疫サステナーは、アデノシン消費である。これらの実施形態のいずれにおいても、免疫イニシエーターは、ＴＮＦα、ＩＦＮ−ガンマ、ＩＦＮ−ベータ１、ＳＩＲＰα、ＣＤ４０Ｌ、ＳＴＩＮＧアゴニスト、および５ＦＣ−＞５ＦＵから選択することができる。
これらの組合せ実施形態のいずれにおいても、遺伝子操作された細菌は、キヌレニンの消費（および必要に応じて、トリプトファンの産生）のための酵素をコードする遺伝子配列と、免疫イニシエーターの産生のための遺伝子配列とを含むことができる。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、キヌレニナーゼをコードする遺伝子配列と、免疫イニシエーターの産生のための遺伝子配列とを含む。一部の実施形態では、キヌレニナーゼと組み合わせた免疫イニシエーターは、ケモカインまたはサイトカインである。一部の実施形態では、キヌレニナーゼと組み合わせた免疫イニシエーターは、一本鎖抗体である。一部の実施形態では、キヌレニナーゼと組み合わせた免疫イニシエーターは、受容体リガンドである。一部の実施形態では、キヌレニナーゼと組み合わせた免疫イニシエーターは、代謝性変換、例えば、ＳＴＩＮＧアゴニスト生産者、例えば、ジアデニル酸シクラーゼ、例えば、ｄａｃＡである。一部の実施形態では、キヌレニナーゼと組み合わせられる免疫イニシエーターは、遺伝子操作化学療法、例えば、５ＦＣの５ＦＵへの変換のためのｃｏｄＡである。一部の実施形態では、免疫イニシエーターは、ＴＮＦα、ＩＦＮ−ガンマ、ＩＦＮ−ベータ１、ＳＩＲＰα、ＣＤ４０Ｌ、ＳＴＩＮＧアゴニスト、および５ＦＣ−＞５ＦＵから選択される。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、キヌレニナーゼをコードする遺伝子配列と、ＴＮＦαをコードする遺伝子配列とを含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、キヌレニナーゼをコードする遺伝子配列と、ＩＦＮ−ガンマをコードする遺伝子配列とを含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、キヌレニナーゼをコードする遺伝子配列と、ＩＦＮ−ベータ１をコードする遺伝子配列とを含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、キヌレニナーゼをコードする遺伝子配列と、本明細書に記載のＳＩＲＰαまたはそのバリアントをコードする遺伝子配列とを含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、キヌレニナーゼをコードする遺伝子配列と、ＣＤ４０Ｌをコードする遺伝子配列とを含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、キヌレニナーゼをコードする遺伝子配列と、ＳＴＩＮＧアゴニストの産生のための酵素、例えばサイクリック−ジＡＭＰの産生のためのｄａｃＡ、をコードする遺伝子配列とを含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、キヌレニナーゼをコードする遺伝子配列と、５ＦＣの５ＦＵへの変換のための酵素、例えばｃｏｄＡまたはそのバリアントもしくは融合タンパク質、をコードする遺伝子配列とを含む。これらのキヌレニン消費および免疫イニシエーター組合せおよび／または組成物実施形態のいずれにおいても、ｔｒｐＥを欠失させることができる。
これらの組合せ実施形態のいずれにおいても、遺伝子操作された細菌は、ＳＴＩＮＧアゴニストの産生のための酵素をコードする遺伝子配列と、免疫サステナーの産生のための遺伝子配列とを含むことができる。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、例えば、ジアデニレートシクラーゼ、例えばｄａｃＡをコードする遺伝子配列と、免疫サステナーの産生のための遺伝子配列とを含む。一部の実施形態では、ｄａｃＡと組み合わせられる免疫サステナーは、ケモカインまたはサイトカインである。一部の実施形態では、ｄａｃＡと組み合わせられる免疫サステナーは、単鎖抗体である。一部の実施形態では、ジアデニレートシクラーゼ、例えばｄａｃＡ、と組み合わせられる免疫サステナーは、受容体リガンドである。一部の実施形態では、ジアデニレートシクラーゼ、例えばｄａｃＡ、と組み合わせられる免疫サステナーは、代謝的変換、例えば、アルギニン産生物質、キヌレニン消費物質および／またはアデノシン消費物質である。一部の実施形態では、免疫サステナーは、抗ＰＤ−１抗体、抗ＣＴＬＡ４抗体、抗ＰＤ−Ｌ１抗体、ＩＬ−１５、ＣＸＣＬ１０、アルギニン産生物質、アデノシン消費物質、およびキヌレニン消費物質から選択される。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ｄａｃＡをコードする遺伝子配列と、抗ＰＤ−１抗体をコードする遺伝子配列とを含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ジアデニレートシクラーゼ、例えばｄａｃＡ、をコードする遺伝子配列と、抗ＣＴＬＡ４抗体をコードする遺伝子配列とを含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ｄａｃＡをコードする遺伝子配列と、ＩＬ−１５をコードする遺伝子配列とを含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ジアデニレートシクラーゼ、例えばｄａｃＡ、をコードする遺伝子配列と、ＣＸＣＬ１０をコードする遺伝子配列とを含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ジアデニレートシクラーゼ、例えばｄａｃＡ、をコードする遺伝子配列と、例えば本明細書に記載の、アルギニンの産生のための回路網をコードする遺伝子配列とを含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ジアデニレートシクラーゼ、例えばｄａｃＡ、をコードする遺伝子配列と、キヌレニンの消費のための酵素、例えば、キヌレニナーゼ、例えばＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓからのキヌレニナーゼ、をコードする遺伝子配列とを含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ジアデニレートシクラーゼ、例えばｄａｃＡ、をコードする遺伝子配列と、本明細書に記載の、消費アデノシンのための酵素をコードする遺伝子配列とを含む。一実施形態では、アデノシン分解経路酵素をコードする遺伝子配列は、ｘｄｈＡ、ｘｄｈＢ、ｘｄｈＣ、ａｄｄ、ｘａｐＡ、ｄｅｏＤおよびｎｕｐＣから選択される１つまたは複数の遺伝子を含む。一実施形態では、アデノシン分解経路をコードする遺伝子配列は、ｘｄｈＡ、ｘｄｈＢ、ｘｄｈＣ、ａｄｄ、ｘａｐＡ、ｄｅｏＤおよびｎｕｐＣを含む。一実施形態では、ｄａｃＡは、Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓからのものである。
これらの組成物実施形態のいずれにおいても、キヌレニンの消費（および必要に応じて、トリプトファンの産生）のための酵素をコードする遺伝子配列を含む１つまたは複数の異なる遺伝子操作された細菌は、免疫イニシエーターの産生のための遺伝子配列を含む１つまたは複数の異なる遺伝子操作された細菌と組み合わせることができる。一部の実施形態では、キヌレニナーゼをコードする遺伝子配列を含む組成物の１つまたは複数の異なる遺伝子操作された細菌は、免疫イニシエーターの産生のための遺伝子配列を含む１つまたは複数の異なる遺伝子操作された細菌と組み合わされる。一部の実施形態では、キヌレニナーゼと組み合わせられる免疫イニシエーターは、ケモカインまたはサイトカインである。一部の実施形態では、キヌレニナーゼと組み合わせられる免疫イニシエーターは、単鎖抗体である。一部の実施形態では、キヌレニナーゼと組み合わせられる免疫イニシエーターは、受容体リガンドである。一部の実施形態では、キヌレニナーゼと組み合わせられる免疫イニシエーターは、代謝的変換、例えば、ＳＴＩＮＧアゴニスト産生物質、例えば、デアデニレートシクラーゼ、例えばｄａｃＡである。一部の実施形態では、キヌレニナーゼと組み合わせられる免疫イニシエーターは、遺伝子操作化学療法、例えば、５ＦＣの５ＦＵへの変換のためのｃｏｄＡである。一部の実施形態では、免疫イニシエーターは、ＴＮＦα、ＩＦＮ−ガンマ、ＩＦＮ−ベータ１、ＳＩＲＰα、ＣＤ４０Ｌ、ＳＴＩＮＧアゴニストおよび５ＦＣ−＞５ＦＵから選択される。一実施形態では、１つまたは複数の異なる遺伝子操作された細菌は、キヌレニナーゼをコードする遺伝子配列およびＴＮＦαをコードする遺伝子配列を含む。一実施形態では、キヌレニナーゼをコードする遺伝子配列を含む組成物の１つまたは複数の異なる遺伝子操作された細菌は、ＩＦＮ−ガンマをコードする遺伝子配列を含む１つまたは複数の異なる遺伝子操作された細菌と組み合わされる。一実施形態では、キヌレニナーゼをコードする遺伝子配列を含む組成物の１つまたは複数の異なる遺伝子操作された細菌は、ＩＦＮ−ベータ１をコードする遺伝子配列を含む１つまたは複数の異なる遺伝子操作された細菌と組み合わせられる。一実施形態では、キヌレニナーゼをコードする遺伝子配列を含む組成物の１つまたは複数の異なる遺伝子操作された細菌は、本明細書に記載のＳＩＲＰαまたはそのバリアントをコードする遺伝子配列を含む１つまたは複数の異なる遺伝子操作された細菌と組み合わせられる。一実施形態では、キヌレニナーゼをコードする遺伝子配列を含む組成物の１つまたは複数の異なる遺伝子操作された細菌は、ＣＤ４０Ｌをコードする遺伝子配列を含む１つまたは複数の異なる遺伝子操作された細菌と組み合わせられる。一実施形態では、キヌレニナーゼをコードする遺伝子配列を含む組成物の１つまたは複数の異なる遺伝子操作された細菌は、ＳＴＩＮＧアゴニストの産生のための酵素、例えばサイクリック−ジＡＭＰの産生のためのｄａｃＡ、をコードする遺伝子配列を含む１つまたは複数の異なる遺伝子操作された細菌と組み合わせられる。一実施形態では、キヌレニナーゼをコードする遺伝子配列を含む組成物の１つまたは複数の異なる遺伝子操作された細菌は、５ＦＣの５ＦＵへの変換のための酵素、例えばｃｏｄＡまたはそのバリアントもしくは融合タンパク質、をコードする遺伝子配列を含む１つまたは複数の異なる遺伝子操作された細菌と組み合わせられる。これらのキヌレニン消費および免疫イニシエーター組合せおよび／または組成物実施形態のいずれにおいても、ｔｒｐＥを欠失させることができる。
これらの組成物実施形態のいずれにおいても、ＳＴＩＮＧアゴニストの産生のための酵素をコードする遺伝子配列を含むことができる、１つまたは複数の異なる遺伝子操作された細菌を、免疫サステナーの産生のための遺伝子配列を含む１つまたは複数の異なる遺伝子操作された細菌と、組み合わせることができる。一部の実施形態では、ジアデニル酸シクラーゼ、例えば、ｄａｃＡをコードする遺伝子配列を含む組成物の１つまたは複数の異なる遺伝子操作された細菌は、免疫サステナーの産生のための遺伝子配列を含む１つまたは複数の異なる遺伝子操作された細菌と組み合わされる。一部の実施形態では、ジアデニル酸シクラーゼ、例えば、ｄａｃＡと組み合わされる免疫サステナーは、ケモカインまたはサイトカインである。一部の実施形態では、ｄａｃＡと組み合わされる免疫サステナーは、一本鎖抗体である。一部の実施形態では、ジアデニル酸シクラーゼ、例えば、ｄａｃＡと組み合わされる免疫サステナーは、受容体リガンドである。一部の実施形態では、ジアデニル酸シクラーゼ、例えば、ｄａｃＡと組み合わされる免疫サステナーは、代謝性変換、例えば、アルギニン生産者、キヌレニン消費者および／またはアデノシン消費者である。一部の実施形態では、免疫サステナーは、抗ＰＤ−１抗体、抗ＣＴＬＡ４抗体、ＩＬ−１５、ＣＸＣＬ１０、アルギニン生産者、アデノシン消費者およびキヌレニン消費者から選択される。一実施形態では、ジアデニル酸シクラーゼ、例えば、ｄａｃＡをコードする遺伝子配列を含む組成物の１つまたは複数の異なる遺伝子操作された細菌は、抗ＰＤ−１抗体をコードする遺伝子配列を含む１つまたは複数の異なる遺伝子操作された細菌と組み合わされる。一実施形態では、ジアデニル酸シクラーゼ、例えば、ｄａｃＡをコードする遺伝子配列を含む組成物の１つまたは複数の異なる遺伝子操作された細菌は、抗ＣＴＬＡ４抗体をコードする遺伝子配列を含む１つまたは複数の異なる遺伝子操作された細菌と組み合わされる。一実施形態では、ジアデニル酸シクラーゼ、例えば、ｄａｃＡをコードする遺伝子配列を含む組成物の１つまたは複数の異なる遺伝子操作された細菌は、ＩＬ−１５をコードする遺伝子配列を含む１つまたは複数の異なる遺伝子操作された細菌と組み合わされる。一実施形態では、ジアデニル酸シクラーゼ、例えば、ｄａｃＡをコードする遺伝子配列を含む組成物の１つまたは複数の異なる遺伝子操作された細菌は、ＣＸＣＬ１０をコードする遺伝子配列を含む１つまたは複数の異なる遺伝子操作された細菌と組み合わされる。一実施形態では、ジアデニル酸シクラーゼ、例えば、ｄａｃＡをコードする遺伝子配列を含む組成物の１つまたは複数の異なる遺伝子操作された細菌は、例えば、本明細書に記載される通り、アルギニンの産生のための回路網をコードする遺伝子配列を含む１つまたは複数の異なる遺伝子操作された細菌と組み合わされる。一実施形態では、ジアデニル酸シクラーゼ、例えば、ｄａｃＡをコードする遺伝子配列を含む組成物の１つまたは複数の異なる遺伝子操作された細菌は、キヌレニンの消費のための酵素、例えば、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ由来の、例えば、キヌレニナーゼをコードする遺伝子配列を含む１つまたは複数の異なる遺伝子操作された細菌と組み合わされる。
一実施形態では、ｄａｃＡをコードする遺伝子配列を含む組成物の１つまたは複数の異なる遺伝子操作された細菌は、本明細書に記載の消費アデノシンのための酵素をコードする遺伝子配列を含む１つまたは複数の異なる遺伝子操作された細菌と組み合わせられる。一実施形態では、アデノシン分解経路酵素をコードする遺伝子配列は、ｘｄｈＡ、ｘｄｈＢ、ｘｄｈＣ、ａｄｄ、ｘａｐＡ、ｄｅｏＤおよびｎｕｐＣから選択される１つまたは複数の遺伝子を含む。一実施形態では、アデノシン分解経路をコードする遺伝子配列は、ｘｄｈＡ、ｘｄｈＢ、ｘｄｈＣ、ａｄｄ、ｘａｐＡ、ｄｅｏＤおよびｎｕｐＣを含む。一実施形態では、ｄａｃＡは、Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓからのものである。
いずれか１つまたは複数の免疫イニシエーターは、がん免疫サイクルにおいて、いずれか１つまたは複数の免疫サステナーと組み合わせることができる。したがって、一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、がん免疫サイクル（１）腫瘍退縮、（２）ＡＰＣの活性化ならびに／または（３）Ｔ細胞のプライミングおよび活性化のステップのうち１つまたは複数をモジュレート、例えば、強化する１つまたは複数の免疫イニシエーターを、（４）Ｔ細胞搬送および浸潤、（５）Ｔ細胞によるがん細胞の認識および／もしくはＴ細胞支持ならびに／または（６）免疫抑制を克服する能力のステップのうち１つまたは複数をモジュレート、例えば、ブーストする１つまたは複数の免疫サステナーと組み合わせて産生することができる。ステップ（１）、（２）および（ａｎ）（３）をモジュレートする免疫イニシエーターの非限定的な例は、本明細書に提供される。ステップ（４）、（５）および（ａｎ）（６）をモジュレートする免疫サステナーの非限定的な例は、本明細書に提供される。したがって、これらの例示的な免疫モジュレーターのいずれが、本明細書に記載される１つまたは複数のがん免疫サイクルステップをモジュレートすることができる免疫イニシエーター／免疫サステナー組合せの一部となってもよい。したがって、免疫イニシエーター（複数可）／免疫サステナー（複数可）の組合せをコードする遺伝子配列を含む遺伝子操作された細菌は、例えば、次に示すがん免疫サイクルステップの組合せをモジュレートすることができる：ステップ（１）、ステップ（２）、ステップ（３）、ステップ（４）、ステップ（５）、ステップ（６）；ステップ（１）、ステップ（２）、ステップ（３）、ステップ（４）、ステップ（５）；ステップ（１）、ステップ（２）、ステップ（３）、ステップ（４）、ステップ（６）；ステップ（１）、ステップ（２）、ステップ（３）、ステップ（５）、ステップ（６）；ステップ（１）、ステップ（２）、ステップ（３）、ステップ（４）；ステップ（１）、ステップ（２）、ステップ（３）、ステップ（５）；ステップ（１）、ステップ（２）、ステップ（３）、ステップ（６）；ステップ（１）、ステップ（２）、ステップ（４）、ステップ（５）、ステップ（６）；ステップ（１）、ステップ（２）、ステップ（４）、ステップ（５）；ステップ（１）、ステップ（２）、ステップ（４）、ステップ（６）；ステップ（１）、ステップ（２）、ステップ（５）、ステップ（６）；ステップ（１）、ステップ（２）、ステップ（４）；ステップ（１）、ステップ（２）、ステップ（５）；ステップ（１）、ステップ（２）、ステップ（６）；ステップ（１）、ステップ（３）、ステップ（４）、ステップ（５）、ステップ（６）；ステップ（１）、ステップ（３）、ステップ（４）、ステップ（５）；ステップ（１）、ステップ（３）、ステップ（４）、ステップ（６）；ステップ（１）、ステップ（３）、ステップ（５）、ステップ（６）；ステップ（１）、ステップ（３）、ステップ（４）；ステップ（１）、ステップ（３）、ステップ（５）；ステップ（１）、ステップ（３）、ステップ（６）；ステップ（２）、ステップ（３）、ステップ（４）、ステップ（５）、ステップ（６）；ステップ（２）、ステップ（３）、ステップ（４）、ステップ（５）；ステップ（２）、ステップ（３）、ステップ（４）、ステップ（６）；ステップ（２）、ステップ（３）、ステップ（５）、ステップ（６）；ステップ（２）、ステップ（３）、ステップ（４）；ステップ（２）、ステップ（３）、ステップ（５）；ステップ（２）、ステップ（３）、ステップ（６）；ステップ（１）、ステップ（４）、ステップ（５）、ステップ（６）；ステップ（１）、ステップ（４）、ステップ（５）；ステップ（１）、ステップ（４）、ステップ（６）；ステップ（１）、ステップ（５）、ステップ（６）；ステップ（１）、ステップ（４）；ステップ（１）、ステップ（５）；ステップ（１）、ステップ（６）；ステップ（２）、ステップ（４）、ステップ（５）、ステップ（６）；ステップ（２）、ステップ（４）、ステップ（５）；ステップ（２）、ステップ（４）、ステップ（６）；ステップ（２）、ステップ（５）、ステップ（６）；ステップ（２）、ステップ（４）；ステップ（２）、ステップ（５）；ステップ（２）、ステップ（６）；ステップ（３）、ステップ（４）、ステップ（５）、ステップ（６）；ステップ（３）、ステップ（４）、ステップ（５）；ステップ（３）、ステップ（４）、ステップ（６）；ステップ（３）、ステップ（５）、ステップ（６）；ステップ（３）、ステップ（４）；ステップ（３）、ステップ（５）；ステップ（３）、ステップ（６）。
一部の実施形態では、本発明の遺伝子操作された細菌は、低酸素条件下で、免疫イニシエーターおよび／または免疫サステナーを産生し、同じ条件下で、同じ亜型の未改変細菌と比較して、細胞増殖、腫瘍成長および／または腫瘍体積を、少なくとも約１０％〜２０％、２０％〜２５％、２５％〜３０％、３０％〜４０％、４０％〜５０％、５０％〜６０％、６０％〜７０％、７０％〜７５％、７５％〜８０％、８０％〜８５％、８５％〜９０％、９０％〜９５％、９５％〜９９％またはそれよりも多く低下させることができる。
一部の実施形態では、本発明の遺伝子操作された細菌は、構成的プロモーターの制御下で、免疫イニシエーターおよび／または免疫サステナーを産生し、同じ条件下で、同じ亜型の未改変細菌と比較して、細胞増殖、腫瘍成長および／または腫瘍体積を、少なくとも約１０％〜２０％、２０％〜２５％、２５％〜３０％、３０％〜４０％、４０％〜５０％、５０％〜６０％、６０％〜７０％、７０％〜７５％、７５％〜８０％、８０％〜８５％、８５％〜９０％、９０％〜９５％、９５％〜９９％またはそれよりも多く低下させることができる。
免疫イニシエーターまたは免疫サステナーをコードする回路は、構成的または誘導性プロモーター、例えば、低酸素誘導性プロモーターまたは本明細書に記載される他のいずれかの構成的または誘導性プロモーターの制御下に置くことができる。これらの実施形態のいずれにおいても、免疫イニシエーターまたは免疫サステナーをコードする遺伝子配列（複数可）は、同じまたは異なる細菌株（組合せ回路または株の混合物）において、本明細書に記載される１つまたは複数のＳＴＩＮＧアゴニスト産生酵素をコードする遺伝子配列（複数可）と組み合わせることができる。一部の実施形態では、免疫イニシエーターまたは免疫サステナーをコードする遺伝子配列（複数可）と組み合わされる遺伝子配列は、ＤａｃＡをコードする。ＤａｃＡは、構成的または誘導性プロモーター、例えば、ＦＮＲ等の低酸素誘導性プロモーターまたは本明細書に記載される他のいずれかの構成的または誘導性プロモーターの制御下に置くことができる。一部の実施形態では、ｄａｃＡ遺伝子は、染色体に組み込まれている。一部の実施形態では、免疫イニシエーターまたは免疫サステナーをコードする遺伝子配列（複数可）と組み合わされる遺伝子配列は、ｃＧＡＳをコードする。ｃＧＡＳは、構成的または誘導性プロモーター、例えば、ＦＮＲ等の低酸素誘導性プロモーターまたは本明細書に記載される他のいずれかの構成的または誘導性プロモーターの制御下に置くことができる。一部の実施形態では、ｃＧＡＳをコードする遺伝子は、染色体に組み込まれている。これらの組合せ実施形態のいずれにおいても、細菌は、ＤａｐＡ、ＴｈｙＡまたはその両方に、栄養要求性改変、例えば、突然変異または欠失をさらに含むことができる。これらの実施形態のいずれにおいても、細菌は、本明細書に記載される内在性プロファージに、ファージ改変、例えば、突然変異または欠失をさらに含むことができる。
これらの実施形態およびあらゆる組合せ実施形態のいずれにおいても、操作された細菌は、外科手術、化学療法、標的化療法、放射線療法、トモセラピー、免疫療法、がんワクチン、ホルモン療法、温熱療法、幹細胞移植（末梢血、骨髄および臍帯血移植）、光線力学的療法、腫瘍退縮ウイルス療法、ならびに血液製剤供与および輸血等、従来のがん治療と併せて使用することができる。免疫モジュレーターを産生するためのこれらの実施形態のいずれにおいても、１つまたは複数の操作された細菌は、チェックポイント阻害剤、Ｆｃ媒介性ＡＤＣＣ、ＢｉＴＥ、ＴＣＲ、養子細胞療法（ＴＩＬ、ＣＡＲ、ＮＫ／ＮＫＴ等）、ならびに本明細書に記載されるおよびそれ以外に当技術分野で公知の他の免疫療法のいずれか等、がんの処置に使用される他の従来の免疫療法と併せて使用することができる。これらの実施形態のいずれにおいても、操作された細菌は、がんまたは腫瘍ワクチンと併せて使用することができる。
免疫イニシエーターおよび免疫イニシエーターの組合せ
一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ステップ（１）、（２）および／または（３）のうち１つまたは複数をモジュレート、例えば、強化する２つまたはそれよりも多いイニシエーターを産生することができる。あるいは、本開示は、異なる遺伝子操作された細菌の組合せ（例えば、２つまたはそれよりも多く）を含む組成物であって、各細菌が、１つまたは複数の免疫イニシエーターをコードする、組成物を提供する。さらに別の実施形態では、本開示は、免疫イニシエーターを産生することができる改変された微生物と組み合わせて、例えば、その前に、それと同時に、またはその後に免疫イニシエーターを投与することを提供する。そのような別個のまたは異なる組合せおよび／または細菌株は、同時発生的にまたは逐次に投与することができる。投与の順序またはタイミング（同時発生的または逐次）に関係なく、操作された株は、投与後逐次にまたは同時発生的に、免疫サステナーのための回路網を発現することができる、すなわち、発現のタイミングおよびレベルは、プロモーターおよびリボソーム結合部位を含むがこれらに限定されない、本明細書に記載される１つまたは複数の機構を使用して調整される。
微生物が、２つまたはそれよりも多い免疫イニシエーター回路を発現するように遺伝子操作された、本開示の一部の実施形態では、微生物は、先ず、より高いレベルの第１の免疫刺激因子を、より後の時点では、第２の免疫イニシエーターを産生する。微生物が、２つまたはそれよりも多い免疫イニシエーター回路を発現するように遺伝子操作された、本開示の一部の実施形態では、微生物は、第１の免疫刺激因子および第２の免疫イニシエーターを同時発生的に産生する。ある特定の実施形態では、１つまたは複数の遺伝子配列は、当技術分野で公知のまたは本明細書に記載される誘導性プロモーターの制御下に置かれる。例えば、そのような誘導性プロモーターは、ＦＮＲプロモーター等、低酸素条件下で誘導されうる。一部の実施形態では、免疫イニシエーターをコードする１つまたは複数の遺伝子配列は、本明細書に記載される通り、炎症性条件下で（例えば、ＲＮＳ、ＲＯＳ）誘導される直接的にまたは間接的に誘導性のプロモーターに作動可能に連結される。他の実施形態では、プロモーターは、ある特定の分子または代謝物の存在下で、例えば、腫瘍微小環境および／または免疫抑制に関連する分子または代謝物の存在下で誘導される。一部の実施形態では、プロモーターは、ある特定の組織型において誘導される。一部の実施形態では、プロモーターは、ある特定の消化管特異的または腫瘍特異的分子または代謝物の存在下で誘導される。一部の実施形態では、プロモーターは、アラビノース、クメートおよびサリチレートまたは当技術分野で公知のもしくは本明細書に記載される別の化学的もしくは栄養的インデューサー等、消化管または腫瘍内に存在することもあり、しないこともある他の何らかの代謝物の存在下で誘導される。ある特定の実施形態では、２つまたはそれよりも多い免疫イニシエーター回路は、本明細書に記載されるまたは当技術分野で公知の構成的プロモーターの制御下に置かれる、例えば、その発現は、異なる強度のリボソーム結合部位を使用して微調整することができる。そのような微生物は、必要に応じて、栄養要求性改変、例えば、アミノ酸またはヌクレオチド代謝における栄養要求性改変も含む。非限定的な例は、ΔＤａｐＡもしくはΔＴｈｙＡまたはその両方を含む。
２つまたはそれよりも多い免疫イニシエーターの発現を制御するプロモーターは、同じであっても異なっていてもよく、同じ化学的もしくは環境的インデューサーまたは異なる化学的もしくは環境的インデューサーによって誘導することができる。第１のインデューサーおよび第２のインデューサーは、逐次にまたは同時発生的に投与することができる。一部の実施形態では、一方のイニシエーターが、低酸素プロモーターの制御下に置かれる。一部の実施形態では、両方のイニシエーターが、低酸素プロモーターの制御下に置かれる。一部の実施形態では、一方のイニシエーターが、構成的プロモーターの制御下に置かれる。一部の実施形態では、両方のイニシエーターが、構成的プロモーターの制御下に置かれる。
一部の実施形態では、両方の回路が、細菌染色体中に組み込まれていてよい。一部の実施形態では、両方の回路が、プラスミド上に存在していてよい。一部の実施形態では、両方の回路が、プラスミド上に存在していてよい。一部の実施形態では、一方の回路が、細菌染色体中に組み込まれていてよく、別の回路が、プラスミド上に存在していてよい。
いずれかの免疫イニシエーターを、がん免疫サイクルにおける同じまたは異なるステップをモジュレートする１つまたは複数の追加的な同じまたは異なる免疫イニシエーター（複数可）と組み合わせることができる。
一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、（１）腫瘍細胞の溶解、（２）ＡＰＣの活性化ならびに／または（３）Ｔ細胞のプライミングおよび活性化のステップのうち１つまたは複数をモジュレート、例えば、強化する１つまたは複数の免疫イニシエーターを産生することができる。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ステップ（１）、（２）および／または（３）のうち１つまたは複数をモジュレート、例えば、強化する２つまたはそれよりも多いイニシエーターを産生することができる。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、がん免疫サイクルの同じステップをモジュレート、例えば、強化する２つまたはそれよりも多い免疫イニシエーターを産生する。一例では、遺伝子操作された細菌は、腫瘍退縮（ステップ（１））をモジュレートする２つまたはそれよりも多い免疫イニシエーターを産生する。一例では、遺伝子操作された細菌は、ＡＰＣの活性化（ステップ（２））をモジュレートする２つまたはそれよりも多い免疫イニシエーターを産生する。一例では、遺伝子操作された細菌は、Ｔ細胞のプライミングおよび活性化（ステップ（３））をモジュレート、例えば、増強する２つまたはそれよりも多い免疫イニシエーターを産生する。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じステップをモジュレート、例えば、強化する２つまたはそれよりも多い免疫イニシエーターを産生する。非限定的な例では、遺伝子操作された細菌は、腫瘍退縮（ステップ（１））をモジュレート、例えば、強化する１つまたは複数の免疫イニシエーター、およびＡＰＣの活性化（ステップ（２））をモジュレート、例えば、強化する１つまたは複数の免疫イニシエーターを産生する。別の非限定的な例では、遺伝子操作された細菌は、腫瘍退縮（ステップ（１））をモジュレート、例えば、強化する１つまたは複数の免疫イニシエーター、ならびにＴ細胞のプライミングおよび活性化（ステップ（３））をモジュレート、例えば、強化する１つまたは複数の免疫イニシエーターを産生する。別の非限定的な例では、遺伝子操作された細菌は、ＡＰＣの活性化（ステップ（２））をモジュレート、例えば、強化する１つまたは複数の免疫イニシエーター、ならびにＴ細胞のプライミングおよび活性化（ステップ（３））をモジュレート、例えば、強化する１つまたは複数の免疫イニシエーターを産生する。さらに別の非限定的な例では、遺伝子操作された細菌は、ステップ（１）腫瘍退縮をモジュレート、例えば、強化する１つまたは複数の免疫イニシエーター、ＡＰＣの活性化（ステップ（２））をモジュレート、例えば、強化する１つまたは複数の免疫イニシエーター、ならびにＴ細胞のプライミングおよび活性化（ステップ（３））をモジュレート、例えば、強化する１つまたは複数の免疫イニシエーターを産生する。
一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、（１）腫瘍退縮、（２）ＡＰＣの活性化ならびに／または（３）Ｔ細胞のプライミングおよび活性化のステップのうち１つまたは複数をモジュレート、例えば、強化する１つまたは複数の免疫イニシエーターの産生のための遺伝子回路網を含む。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、（１）腫瘍退縮、（２）ＡＰＣの活性化ならびに／または（３）Ｔ細胞のプライミングおよび活性化のステップのうち１つまたは複数をモジュレート、例えば、強化する１つまたは複数の免疫イニシエーターをコードする１つまたは複数の遺伝子を含む。いずれかの免疫イニシエーターを、同じまたは異なるステップをモジュレートする別の免疫イニシエーターと組み合わせることができる。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、（１）腫瘍退縮、（２）ＡＰＣの活性化ならびに／または（３）Ｔ細胞のプライミングおよび活性化のステップのうち１つまたは複数をモジュレート、例えば、強化する２つまたはそれよりも多いイニシエーターをコードする遺伝子配列（複数可）を含む。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じステップをモジュレート、例えば、強化する２つまたはそれよりも多い免疫イニシエーターをコードする遺伝子配列（複数可）を含む。一例では、遺伝子操作された細菌は、（１）腫瘍細胞の溶解（腫瘍退縮）のステップをモジュレートする２つまたはそれよりも多い免疫イニシエーターをコードする遺伝子配列（複数可）を含む。一例では、遺伝子操作された細菌は、ＡＰＣの活性化（ステップ（２））をモジュレートする２つまたはそれよりも多い免疫イニシエーターをコードする遺伝子配列（複数可）を含む。一例では、遺伝子操作された細菌は、Ｔ細胞のプライミングおよび活性化（ステップ（３））をモジュレートする２つまたはそれよりも多い免疫イニシエーターをコードする遺伝子配列（複数可）を含む。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じステップをモジュレート、例えば、強化する２つまたはそれよりも多い免疫イニシエーターをコードする遺伝子配列（複数可）を含む。非限定的な例では、遺伝子操作された細菌は、腫瘍退縮（ステップ（１））をモジュレート、例えば、強化する１つまたは複数の免疫イニシエーター、およびＡＰＣの活性化（ステップ（２））をモジュレート、例えば、強化する１つまたは複数の免疫イニシエーターをコードする遺伝子配列（複数可）を含む。別の非限定的な例では、遺伝子操作された細菌は、腫瘍退縮（ステップ（１））をモジュレート、例えば、強化する１つまたは複数の免疫イニシエーター、ならびにＴ細胞のプライミングおよび活性化（ステップ（３））をモジュレート、例えば、強化する１つまたは複数の免疫イニシエーターをコードする遺伝子配列（複数可）を含む。別の非限定的な例では、遺伝子操作された細菌は、ＡＰＣの活性化（ステップ（２））をモジュレート、例えば、強化する１つまたは複数の免疫イニシエーター、ならびにＴ細胞のプライミングおよび活性化（ステップ（３））をモジュレート、例えば、強化する１つまたは複数の免疫イニシエーターをコードする遺伝子配列（複数可）を含む。さらに別の非限定的な例では、遺伝子操作された細菌は、腫瘍退縮（ステップ（１））をモジュレート、例えば、強化する１つまたは複数の免疫イニシエーター、ＡＰＣの活性化（ステップ（２））をモジュレート、例えば、強化する１つまたは複数の免疫イニシエーター、ならびにＴ細胞のプライミングおよび活性化（ステップ（３））をモジュレート、例えば、強化する１つまたは複数の免疫イニシエーターをコードする遺伝子配列（複数可）を含む。
一部の実施形態では、本発明の遺伝子操作された細菌は、低酸素条件下で、２つまたはそれよりも多い免疫イニシエーターを産生し、同じ条件下で、同じ亜型の未改変細菌と比較して、細胞増殖、腫瘍成長および／または腫瘍体積を、少なくとも約１０％〜２０％、２０％〜２５％、２５％〜３０％、３０％〜４０％、４０％〜５０％、５０％〜６０％、６０％〜７０％、７０％〜７５％、７５％〜８０％、８０％〜８５％、８５％〜９０％、９０％〜９５％、９５％〜９９％またはそれよりも多く低下させることができる。
一部の実施形態では、本発明の遺伝子操作された細菌は、構成的プロモーターの制御下で、２つまたはそれよりも多い免疫イニシエーターを産生し、同じ条件下で、同じ亜型の未改変細菌と比較して、細胞増殖、腫瘍成長および／または腫瘍体積を、少なくとも約１０％〜２０％、２０％〜２５％、２５％〜３０％、３０％〜４０％、４０％〜５０％、５０％〜６０％、６０％〜７０％、７０％〜７５％、７５％〜８０％、８０％〜８５％、８５％〜９０％、９０％〜９５％、９５％〜９９％またはそれよりも多く低下させることができる。
これらの実施形態およびあらゆる組合せ実施形態のいずれにおいても、操作された細菌は、外科手術、化学療法、標的化療法、放射線療法、トモセラピー、免疫療法、がんワクチン、ホルモン療法、温熱療法、幹細胞移植（末梢血、骨髄および臍帯血移植）、光線力学的療法、腫瘍退縮ウイルス療法、ならびに血液製剤供与および輸血等、従来のがん治療と併せて使用することができる。
免疫イニシエーターをコードする回路は、構成的または誘導性プロモーター、例えば、低酸素誘導性プロモーターまたは本明細書に記載される他のいずれかの構成的または誘導性プロモーターの制御下に置くことができる。
これらの実施形態のいずれにおいても、免疫イニシエーターをコードする遺伝子配列（複数可）は、同じまたは異なる細菌株（組合せ回路または株の混合物）において、本明細書に記載される１つまたは複数のＳＴＩＮＧアゴニスト産生酵素をコードする遺伝子配列（複数可）と組み合わせることができる。一部の実施形態では、免疫イニシエーターをコードする遺伝子配列（複数可）と組み合わされる遺伝子配列は、ＤａｃＡをコードする。ＤａｃＡは、構成的または誘導性プロモーター、例えば、ＦＮＲ等の低酸素誘導性プロモーターまたは本明細書に記載される他のいずれかの構成的または誘導性プロモーターの制御下に置くことができる。一部の実施形態では、ｄａｃＡ遺伝子は、染色体に組み込まれている。一部の実施形態では、免疫イニシエーターをコードする遺伝子配列（複数可）と組み合わされる遺伝子配列は、ｃＧＡＳをコードする。ｃＧＡＳは、構成的または誘導性プロモーター、例えば、ＦＮＲ等の低酸素誘導性プロモーターまたは本明細書に記載される他のいずれかの構成的または誘導性プロモーターの制御下に置くことができる。一部の実施形態では、ｃＧＡＳをコードする遺伝子は、染色体に組み込まれている。
これらの組合せ実施形態のいずれにおいても、細菌は、ＤａｐＡ、ＴｈｙＡまたはその両方に、栄養要求性改変、例えば、突然変異または欠失をさらに含むことができる。これらの実施形態のいずれにおいても、細菌は、本明細書に記載される内在性プロファージに、ファージ改変、例えば、突然変異または欠失をさらに含むことができる。
免疫モジュレーターを産生するためのこれらの実施形態のいずれにおいても、１つまたは複数の操作された細菌は、チェックポイント阻害剤、Ｆｃ媒介性ＡＤＣＣ、ＢｉＴＥ、ＴＣＲ、養子細胞療法（ＴＩＬ、ＣＡＲ、ＮＫ／ＮＫＴ等）、ならびに本明細書に記載されるおよびそれ以外に当技術分野で公知の他の免疫療法のいずれか等、がんの処置に使用される他の従来の免疫療法と併せて使用することができる。これらの実施形態のいずれにおいても、操作された細菌は、がんまたは腫瘍ワクチンと併せて使用することができる。
免疫サステナーおよび免疫サステナーの組合せ
一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ステップ（１）、（２）および／または（３）のうち１つまたは複数をモジュレート、例えば、強化する２つまたはそれよりも多いサステナーを産生することができる。あるいは、本開示は、異なる遺伝子操作された細菌の組合せ（例えば、２つまたはそれよりも多く）を含む組成物であって、各細菌が、１つまたは複数の免疫サステナーをコードする、組成物を提供する。さらに別の実施形態では、本開示は、免疫サステナーを産生することができる改変された微生物と組み合わせて、例えば、その前に、それと同時に、またはその後に免疫サステナーを投与することを提供する。そのような別個のまたは異なる組合せまたは細菌株は、同時発生的にまたは逐次に投与することができる。投与の順序またはタイミング（同時発生的または逐次）に関係なく、操作された株は、投与後逐次にまたは同時発生的に、免疫サステナーのための回路網を発現することができる、すなわち、発現のタイミングおよびレベルは、プロモーターおよびリボソーム結合部位を含むがこれらに限定されない、本明細書に記載される１つまたは複数の機構を使用して調整される。
微生物が、２つまたはそれよりも多い免疫サステナー回路を発現するように遺伝子操作された、本開示の一部の実施形態では、微生物は、先ず、より高いレベルの第１の免疫刺激因子を、より後の時点では、第２の免疫サステナーを産生する。微生物が、２つまたはそれよりも多い免疫サステナー回路を発現するように遺伝子操作された、本開示の一部の実施形態では、微生物は、第１の免疫刺激因子および第２の免疫サステナーを同時発生的に産生する。ある特定の実施形態では、１つまたは複数の遺伝子配列は、当技術分野で公知のまたは本明細書に記載される誘導性プロモーターの制御下に置かれる。例えば、そのような誘導性プロモーターは、ＦＮＲプロモーター等、低酸素条件下で誘導されうる。一部の実施形態では、免疫サステナーをコードする１つまたは複数の遺伝子配列は、本明細書に記載される通り、炎症性条件下で（例えば、ＲＮＳ、ＲＯＳ）誘導される直接的にまたは間接的に誘導性のプロモーターに作動可能に連結される。他の実施形態では、プロモーターは、ある特定の分子または代謝物の存在下で、例えば、腫瘍微小環境および／または免疫抑制に関連する分子または代謝物の存在下で誘導される。一部の実施形態では、プロモーターは、ある特定の組織型において誘導される。一部の実施形態では、プロモーターは、ある特定の消化管特異的または腫瘍特異的分子または代謝物の存在下で誘導される。一部の実施形態では、プロモーターは、アラビノース、クメートおよびサリチレートまたは当技術分野で公知のもしくは本明細書に記載される別の化学的もしくは栄養的インデューサー等、消化管または腫瘍内に存在することもあり、しないこともある他の何らかの代謝物の存在下で誘導される。ある特定の実施形態では、２つまたはそれよりも多い免疫サステナー回路は、本明細書に記載されるまたは当技術分野で公知の構成的プロモーターの制御下に置かれ、例えば、その発現は、異なる強度のリボソーム結合部位を使用して微調整することができる。そのような微生物は、必要に応じて、栄養要求性改変、例えば、ΔＤａｐＡもしくはΔＴｈｙＡまたはその両方等、アミノ酸またはヌクレオチド代謝における栄養要求性改変も含む。
２つまたはそれよりも多い免疫サステナーの発現を制御するプロモーターは、同じであっても異なっていてもよく、同じ化学的もしくは環境的インデューサーまたは異なる化学的もしくは環境的インデューサーによって誘導することができる。第１のインデューサーおよび第２のインデューサーは、逐次にまたは同時発生的に投与することができる。一部の実施形態では、一方のサステナーが、低酸素プロモーターの制御下に置かれる。一部の実施形態では、両方のサステナーが、低酸素プロモーターの制御下に置かれる。一部の実施形態では、一方のサステナーが、構成的プロモーターの制御下に置かれる。一部の実施形態では、両方のサステナーが、構成的プロモーターの制御下に置かれる。
一部の実施形態では、両方の回路が、細菌染色体中に組み込まれていてよい。一部の実施形態では、両方の回路が、プラスミド上に存在していてよい。一部の実施形態では、両方の回路が、プラスミド上に存在していてよい。一部の実施形態では、一方の回路が、細菌染色体中に組み込まれていてよく、別の回路が、プラスミド上に存在していてよい。
一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、（４）Ｔ細胞搬送および浸潤、（５）Ｔ細胞によるがん細胞の認識および／もしくはＴ細胞支持ならびに／または（６）免疫抑制を克服する能力のステップのうち１つまたは複数をモジュレート、例えば、ブーストする１つまたは複数の免疫サステナーを産生することができる。いずれかの免疫サステナーを、同じまたは異なるステップをモジュレートする別の免疫サステナーと組み合わせることができる。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ステップ（４）、（５）および／または（６）のうち１つまたは複数をモジュレート、例えば、ブーストする２つまたはそれよりも多いサステナーを産生することができる。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じステップをモジュレート、例えば、ブーストする２つまたはそれよりも多い免疫サステナーを産生することができる。一例では、遺伝子操作された細菌は、Ｔ細胞搬送および浸潤（ステップ（４））をモジュレートする２つまたはそれよりも多い免疫サステナーを産生する。一例では、遺伝子操作された細菌は、（５）Ｔ細胞によるがん細胞の認識および／またはＴ細胞支持のステップをモジュレートする２つまたはそれよりも多い免疫サステナーを産生する。一例では、遺伝子操作された細菌は、免疫抑制を克服する能力（ステップ（６））をモジュレート、例えば、増強する２つまたはそれよりも多い免疫サステナーを産生する。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じステップをモジュレート、例えば、ブーストする２つまたはそれよりも多い免疫サステナーを産生する。非限定的な例では、遺伝子操作された細菌は、Ｔ細胞搬送および浸潤（ステップ（４））をモジュレート、例えば、ブーストする１つまたは複数の免疫サステナー、ならびにＴ細胞によるがん細胞の認識および／またはＴ細胞支持（ステップ（５））をモジュレート、例えば、ブーストする１つまたは複数の免疫サステナーを産生する。別の非限定的な例では、遺伝子操作された細菌は、Ｔ細胞搬送および浸潤（ステップ（４））をモジュレート、例えば、ブーストする１つまたは複数の免疫サステナー、ならびに免疫抑制を克服する能力（ステップ（６））をモジュレート、例えば、ブーストする１つまたは複数の免疫サステナーを産生する。別の非限定的な例では、遺伝子操作された細菌は、Ｔ細胞によるがん細胞の認識および／またはＴ細胞支持（ステップ（５））をモジュレート、例えば、ブーストする１つまたは複数の免疫サステナー、ならびに免疫抑制を克服する能力（ステップ（６））をモジュレート、例えば、ブーストする１つまたは複数の免疫サステナーを産生する。さらに別の非限定的な例では、遺伝子操作された細菌は、（４）Ｔ細胞搬送および浸潤のステップをモジュレート、例えば、ブーストする１つまたは複数の免疫サステナー、Ｔ細胞によるがん細胞の認識および／またはＴ細胞支持（ステップ（５））をモジュレート、例えば、ブーストする１つまたは複数の免疫サステナー、ならびに免疫抑制を克服する能力（ステップ（６））をモジュレート、例えば、ブーストする１つまたは複数の免疫サステナーを産生する。
一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、（４）Ｔ細胞搬送および浸潤、（５）Ｔ細胞によるがん細胞の認識および／もしくはＴ細胞支持ならびに／または（６）免疫抑制を克服する能力のステップのうち１つまたは複数をモジュレート、例えば、ブーストする１つまたは複数の免疫サステナーの産生のための遺伝子回路網を含む。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、（４）Ｔ細胞搬送および浸潤、（５）Ｔ細胞によるがん細胞の認識および／もしくはＴ細胞支持ならびに／または（６）免疫抑制を克服する能力のステップのうち１つまたは複数をモジュレート、例えば、ブーストする１つまたは複数の免疫サステナーをコードする１つまたは複数の遺伝子を含む。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、（４）Ｔ細胞搬送および浸潤、（５）Ｔ細胞によるがん細胞の認識および／もしくはＴ細胞支持、ならびに／または（６）免疫抑制を克服する能力のステップのうち１つまたは複数をモジュレート、例えば、ブーストする２つまたはそれよりも多いサステナーをコードする遺伝子配列（複数可）を含む。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じステップをモジュレート、例えば、ブーストする２つまたはそれよりも多い免疫サステナーをコードする遺伝子配列（複数可）を含む。一例では、遺伝子操作された細菌は、Ｔ細胞搬送および浸潤（ステップ（４））をモジュレートする２つまたはそれよりも多い免疫サステナーをコードする遺伝子配列（複数可）を含む。一例では、遺伝子操作された細菌は、Ｔ細胞によるがん細胞の認識および／またはＴ細胞支持（ステップ（５））をモジュレートする２つまたはそれよりも多い免疫サステナーをコードする遺伝子配列（複数可）を含む。一例では、遺伝子操作された細菌は、免疫抑制を克服する能力（ステップ（６））をモジュレートする２つまたはそれよりも多い免疫サステナーをコードする遺伝子配列（複数可）を含む。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じステップをモジュレート、例えば、ブーストする２つまたはそれよりも多い免疫サステナーをコードする遺伝子配列（複数可）を含む。非限定的な例では、遺伝子操作された細菌は、Ｔ細胞搬送および浸潤（ステップ（４））をモジュレート、例えば、ブーストする１つまたは複数の免疫サステナー、ならびにＴ細胞によるがん細胞の認識および／またはＴ細胞支持（ステップ（５））をモジュレート、例えば、ブーストする１つまたは複数の免疫サステナーをコードする遺伝子配列（複数可）を含む。別の非限定的な例では、遺伝子操作された細菌は、Ｔ細胞搬送および浸潤（ステップ（４））をモジュレート、例えば、ブーストする１つまたは複数の免疫サステナー、ならびに免疫抑制を克服する能力（ステップ（６））をモジュレート、例えば、ブーストする１つまたは複数の免疫サステナーをコードする遺伝子配列（複数可）を含む。別の非限定的な例では、遺伝子操作された細菌は、Ｔ細胞によるがん細胞の認識および／またはＴ細胞支持（ステップ（５））をモジュレート、例えば、ブーストする１つまたは複数の免疫サステナー、ならびに免疫抑制を克服する能力（ステップ（６））をモジュレート、例えば、ブーストする１つまたは複数の免疫サステナーをコードする遺伝子配列（複数可）を含む。さらに別の非限定的な例では、遺伝子操作された細菌は、Ｔ細胞搬送および浸潤（ステップ（４））をモジュレート、例えば、ブーストする１つまたは複数の免疫サステナー、Ｔ細胞によるがん細胞の認識および／またはＴ細胞支持（ステップ（５））をモジュレート、例えば、ブーストする１つまたは複数の免疫サステナー、ならびに免疫抑制を克服する能力（ステップ（６））をモジュレート、例えば、ブーストする１つまたは複数の免疫サステナーをコードする遺伝子配列（複数可）を含む。
一部の実施形態では、本発明の遺伝子操作された細菌は、低酸素条件下で、２つまたはそれよりも多い免疫サステナーを産生し、同じ条件下で、同じ亜型の未改変細菌と比較して、細胞増殖、腫瘍成長および／または腫瘍体積を、少なくとも約１０％〜２０％、２０％〜２５％、２５％〜３０％、３０％〜４０％、４０％〜５０％、５０％〜６０％、６０％〜７０％、７０％〜７５％、７５％〜８０％、８０％〜８５％、８５％〜９０％、９０％〜９５％、９５％〜９９％またはそれよりも多く低下させることができる。
一部の実施形態では、本発明の遺伝子操作された細菌は、構成的プロモーターの制御下で、２つまたはそれよりも多い免疫サステナーを産生し、同じ条件下で、同じ亜型の未改変細菌と比較して、細胞増殖、腫瘍成長および／または腫瘍体積を、少なくとも約１０％〜２０％、２０％〜２５％、２５％〜３０％、３０％〜４０％、４０％〜５０％、５０％〜６０％、６０％〜７０％、７０％〜７５％、７５％〜８０％、８０％〜８５％、８５％〜９０％、９０％〜９５％、９５％〜９９％またはそれよりも多く低下させることができる。
免疫サステナーをコードする回路は、構成的または誘導性プロモーター、例えば、低酸素誘導性プロモーターまたは本明細書に記載される他のいずれかの構成的または誘導性プロモーターの制御下に置くことができる。
これらの実施形態のいずれにおいても、免疫サステナーをコードする遺伝子配列（複数可）は、同じまたは異なる細菌株（組合せ回路または株の混合物）において、本明細書に記載される１つまたは複数のＳＴＩＮＧアゴニスト産生酵素をコードする遺伝子配列（複数可）と組み合わせることができる。一部の実施形態では、免疫サステナーをコードする遺伝子配列（複数可）と組み合わされる遺伝子配列は、ＤａｃＡをコードする。ＤａｃＡは、構成的または誘導性プロモーター、例えば、ＦＮＲ等の低酸素誘導性プロモーターまたは本明細書に記載される他のいずれかの構成的または誘導性プロモーターの制御下に置くことができる。一部の実施形態では、ｄａｃＡ遺伝子は、染色体に組み込まれている。一部の実施形態では、免疫サステナーをコードする遺伝子配列（複数可）と組み合わされる遺伝子配列は、ｃＧＡＳをコードする。ｃＧＡＳは、構成的または誘導性プロモーター、例えば、ＦＮＲ等の低酸素誘導性プロモーターまたは本明細書に記載される他のいずれかの構成的または誘導性プロモーターの制御下に置くことができる。一部の実施形態では、ｃＧＡＳをコードする遺伝子は、染色体に組み込まれている。
これらの組合せ実施形態のいずれにおいても、細菌は、ＤａｐＡ、ＴｈｙＡまたはその両方に、栄養要求性改変、例えば、突然変異または欠失をさらに含むことができる。これらの実施形態のいずれにおいても、細菌は、本明細書に記載される内在性プロファージに、ファージ改変、例えば、突然変異または欠失をさらに含むことができる。
これらの実施形態およびあらゆる組合せ実施形態のいずれにおいても、操作された細菌は、外科手術、化学療法、標的化療法、放射線療法、トモセラピー、免疫療法、がんワクチン、ホルモン療法、温熱療法、幹細胞移植（末梢血、骨髄および臍帯血移植）、光線力学的療法、腫瘍退縮ウイルス療法、ならびに血液製剤供与および輸血等、従来のがん治療と併せて使用することができる。免疫モジュレーターを産生するためのこれらの実施形態のいずれにおいても、１つまたは複数の操作された細菌は、チェックポイント阻害剤、Ｆｃ媒介性ＡＤＣＣ、ＢｉＴＥ、ＴＣＲ、養子細胞療法（ＴＩＬ、ＣＡＲ、ＮＫ／ＮＫＴ等）、ならびに本明細書に記載されるおよびそれ以外に当技術分野で公知の他の免疫療法のいずれか等、がんの処置に使用される他の従来の免疫療法と併せて使用することができる。これらの実施形態のいずれにおいても、操作された細菌は、がんまたは腫瘍ワクチンと併せて使用することができる。
ＳＴＩＮＧアゴニスト組合せ
ＳＴＩＮＧアゴニストおよびキヌレニン消費
一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、キヌレニンの消費のための酵素をコードする１つまたは複数の遺伝子と組み合わせて、ＳＴＩＮＧアゴニストの産生のための酵素をコードする１つまたは複数の遺伝子を含む。一実施形態では、産生されるＳＴＩＮＧアゴニストは、ｃ−ジＡＭＰである。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、キヌレニナーゼをコードする遺伝子配列と組み合わせて、ジアデニル酸シクラーゼをコードする遺伝子配列を含む。一実施形態では、ジアデニル酸シクラーゼは、Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓからのものである。一実施形態では、キヌレニナーゼは、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓからのものである。１つの特定の実施形態では、ジアデニル酸シクラーゼは、Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓからのものであり、キヌレニナーゼは、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓからのものである。一実施形態では、産生されるＳＴＩＮＧアゴニストは、サイクリック−ジＧＡＭＰである。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、キヌレニナーゼをコードする遺伝子配列と組み合わせて、ｃ−ジＧＡＭＰシンターゼをコードする遺伝子配列を含む。一実施形態では、ｃ−ジＧＡＭＰシンターゼは、Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅからのものである。一部の実施形態では、ｃＧＡＳはヒトｃＧＡＳである。一実施形態では、キヌレニナーゼは、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓからのものである。特異的な一実施形態では、ｃ−ジ−ＧＡＭＰシンターゼは、ヒトｃＧＡＳであり、キヌレニナーゼは、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓに由来する。特異的な一実施形態では、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ由来のキヌレニナーゼは、染色体に組み込まれ、構成的プロモーターの制御下に置かれる。
一部の実施形態では、本開示の微生物は、ＳＴＩＮＧアゴニストの産生のための１つまたは複数の酵素をコードする遺伝子配列（複数可）、およびその上、キヌレニン消費酵素の発現のための１つまたは複数の遺伝子配列を発現するように遺伝子操作されている。ＳＴＩＮＧアゴニストの産生のためのそのような酵素の非限定的な例は、例えば、Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ由来のＤａｃＡを含む。そのようなキヌレニン消費酵素の非限定的な例は、キヌレニナーゼ（例えば、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ由来のキヌレニナーゼ）を含む。より一般には、免疫イニシエーター回路（ＳＴＩＮＧアゴニスト生産者または本明細書に記載の他のもの）は、免疫サステナー回路（例えば、キヌレニン消費または本明細書に記載の他のもの）と組み合わせることができる。
微生物が、ＳＴＩＮＧアゴニストおよびキヌレニン消費回路を発現するように遺伝子操作された、本開示の一部の実施形態では、微生物は、先ず、より高レベルのＳＴＩＮＧアゴニスト産生酵素、例えば、Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ由来の例えば、ＤａｃＡを産生し、より後の時点では、例えば、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ由来のキヌレニナーゼを産生する。一部の実施形態では、ＳＴＩＮＧアゴニスト産生酵素、例えば、ｄａｃＡの発現は、インデューサーによって誘導される。一部の実施形態では、キヌレニナーゼは、インデューサーによって誘導される。一部の実施形態では、ＳＴＩＮＧアゴニスト産生酵素、例えば、ｄａｃＡおよびキヌレニナーゼは、１つまたは複数のインデューサーによって誘導される。第１のインデューサー（例えば、ｄａｃＡ発現を誘導）および第２のインデューサー（例えば、キヌレニナーゼ発現を誘導）は、同じまたは異なるインデューサーとなることができる。第１および第２のインデューサーは、逐次にまたは同時発生的に投与することができる。インデューサーの非限定的な例は、消化管もしくは腫瘍微小環境の条件（例えば、低酸素、ある特定の栄養素等）、細胞培養中のある特定のｉｎ ｖｉｔｒｏ条件、またはｉｎ ｖｉｔｒｏもしくはｉｎ ｖｉｖｏで添加されうる化学的インデューサー（例えば、アラビノース、クメートおよびサリチレート、ＩＰＴＧまたは本明細書に記載される他の化学的インデューサー）を含む。他の実施形態では、ＳＴＩＮＧアゴニスト産生酵素、例えば、ｄａｃＡおよびキヌレニナーゼの両方は、本明細書に記載されるものを含むがこれらに限定されない構成的プロモーターによって制御される、またはこれに直接的にもしくは間接的に連結される。一部の実施形態では、ＳＴＩＮＧアゴニスト産生酵素、例えば、ｄａｃＡは、誘導性プロモーターによって制御される、またはこれに直接的にもしくは間接的に連結され、キヌレニナーゼは、構成的プロモーターによって制御される、またはこれに直接的にもしくは間接的に連結される。一部の実施形態では、ＳＴＩＮＧアゴニスト産生酵素、例えば、ｄａｃＡは、構成的プロモーターによって制御される、またはこれに直接的にもしくは間接的に連結され、キヌレニナーゼは、誘導性プロモーターによって制御される、またはこれに直接的にもしくは間接的に連結される。一部の実施形態では、両方の回路が、細菌染色体中に組み込まれていてよい。一部の実施形態では、両方の回路が、プラスミド上に存在していてよい。一部の実施形態では、両方の回路が、プラスミド上に存在していてよい。一部の実施形態では、一方の回路が、細菌染色体中に組み込まれていてよく、別の回路が、プラスミド上に存在していてよい。
さらに別の実施形態では、ＳＴＩＮＧアゴニスト産生回路網、例えば、ｄａｃＡを発現する遺伝子操作された細菌の１つまたは複数の株、およびキヌレニン消費回路網（例えば、キヌレニナーゼ）を発現する遺伝子操作された細菌の１つまたは複数の別々の株は、逐次に投与することができる、例えば、ＳＴＩＮＧアゴニスト生産者は、キヌレニン消費者の前に投与することができる。他の実施形態では、ＳＴＩＮＧアゴニスト生産者は、キヌレニン消費者の後に投与することができる。さらに別の実施形態では、ＳＴＩＮＧアゴニスト生産者は、キヌレニン消費者と同時発生的に投与することができる。
代替実施形態では、本開示は、各細菌が異なる免疫モジュレーターをコードする、異なる遺伝子操作された細菌の組合せ（例えば、２つまたはそれより多く）を含む、組成物を提供する。一実施形態では、組成物は、ＳＴＩＮＧアゴニストの産生のための酵素をコードする１つまたは複数の遺伝子を含む遺伝子操作された細菌と、キヌレニンの消費のための酵素をコードする１つまたは複数の遺伝子を含む遺伝子操作された細菌とを含む。一実施形態では、産生されるＳＴＩＮＧアゴニストは、ｃ−ジＡＭＰである。一実施形態では、組成物は、ジアデニル酸シクラーゼをコードする遺伝子配列を含む遺伝子操作された細菌と、キヌレニナーゼをコードする遺伝子配列を含む遺伝子操作された細菌とを含む。一実施形態では、ジアデニル酸シクラーゼは、Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓからのものである。一実施形態では、キヌレニナーゼは、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓからのものである。１つの特定の実施形態では、ジアデニル酸シクラーゼは、Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓからのものであり、キヌレニナーゼは、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓからのものである。一実施形態では、産生されるＳＴＩＮＧアゴニストは、サイクリック−ジＧＡＭＰである。一実施形態では、組成物は、ｃ−ジＧＡＭＰシンターゼをコードする遺伝子配列を含む遺伝子操作された細菌と、キヌレニナーゼをコードする遺伝子配列を含む遺伝子操作された細菌とを含む。一実施形態では、ｃ−ジＧＡＭＰシンターゼは、Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅからのものである。特異的な一実施形態では、ｃ−ジ−ＧＡＭＰシンターゼは、Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅに由来し、キヌレニナーゼは、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓに由来する。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ヒトｃＧＡＳの産生のための配列を含む。一実施形態では、キヌレニナーゼは、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓに由来する。特異的な一実施形態では、ｃ−ジ−ＧＡＭＰシンターゼは、ヒトｃＧＡＳであり、キヌレニナーゼは、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓに由来する。特異的な一実施形態では、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ由来のキヌレニナーゼは、染色体に組み込まれ、構成的プロモーターの制御下に置かれる。
これらのＳＴＩＮＧアゴニスト産生およびキヌレニン消費実施形態のいずれにおいても、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より少なくとも約０％〜２％〜４％、４％〜６％、６％〜８％、８％〜１０％、１０％〜１２％、１２％〜１４％、１４％〜１６％、１６％〜１８％、１８％〜２０％、２０％〜２５％、２５％〜３０％、３０％〜３５％、３５％〜４０％、４０％〜４５％、４５％〜５０％、５０％〜５５％、５５％〜６０％、６０％〜６５％、６５％〜７０％〜８０％、８０％〜９０％、または９０％〜１００％多いＳＴＩＮＧアゴニスト、例えば、サイクリック−ジＡＭＰを産生する。
これらのＳＴＩＮＧアゴニスト産生およびキヌレニン消費実施形態のいずれにおいても、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より０％〜２％〜４％、４％〜６％、６％〜８％、８％〜１０％、１０％〜１２％、１２％〜１４％、１４％〜１６％、１６％〜１８％、１８％〜２０％、２０％〜２５％、２５％〜３０％、３０％〜３５％、３５％〜４０％、４０％〜４５％、４５％〜５０％、５０％〜５５％、５５％〜６０％、６０％〜６５％、６５％〜７０％〜８０％、８０％〜９０％、または９０％〜１００％多いキヌレニンを消費する。
さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より少なくとも約１．０〜１．２倍、１．２〜１．４倍、１．４〜１．６倍、１．６〜１．８倍、１．８〜２倍、または２倍多いＳＴＩＮＧアゴニスト、例えば、サイクリック−ジＡＭＰを産生する。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より約３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、４０倍、または５０倍、１００倍、５００倍、または１０００倍多いＳＴＩＮＧアゴニスト、例えば、サイクリック−ジＡＭＰを産生する。
さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より１．０〜１．２倍、１．２〜１．４倍、１．４〜１．６倍、１．６〜１．８倍、１．８〜２倍、または２倍多いキヌレニンを消費する。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より約３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、４０倍、または５０倍、１００倍、５００倍、または１０００倍多いキヌレニンを消費する。
これらのＳＴＩＮＧアゴニスト産生およびキヌレニン消費実施形態のいずれにおいても、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より０％〜２％〜４％、４％〜６％、６％〜８％、８％〜１０％、１０％〜１２％、１２％〜１４％、１４％〜１６％、１６％〜１８％、１８％〜２０％、２０％〜２５％、２５％〜３０％、３０％〜３５％、３５％〜４０％、４０％〜４５％、４５％〜５０％、５０％〜５５％、５５％〜６０％、６０％〜６５％、６５％〜７０％〜８０％、８０％〜９０％、または９０％〜１００％多いＡＴＰを消費する。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より１．０〜１．２倍、１．２〜１．４倍、１．４〜１．６倍、１．６〜１．８倍、１．８〜２倍、または２倍多いＡＴＰを消費する。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より約３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、１００倍、５００倍、または１０００倍多いＡＴＰを消費する。
非限定的な例では、血液中のキヌレニンレベルの低減は、キヌレニナーゼ発現株活性に関する指標として測定することができる。
これらのＳＴＩＮＧアゴニスト産生およびキヌレニン消費実施形態のいずれにおいても、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より少なくとも約０％〜２％〜４％、４％〜６％、６％〜８％、８％〜１０％、１０％〜１２％、１２％〜１４％、１４％〜１６％、１６％〜１８％、１８％〜２０％、２０％〜２５％、２５％〜３０％、３０％〜３５％、３５％〜４０％、４０％〜４５％、４５％〜５０％、５０％〜５５％、５５％〜６０％、６０％〜６５％、６５％〜７０％〜８０％、８０％〜９０％、または９０％〜１００％多いトリプトファンを産生する。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より少なくとも約１．０〜１．２倍、１．２〜１．４倍、１．４〜１．６倍、１．６〜１．８倍、１．８〜２倍、または２倍多いトリプトファンを産生する。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より約３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、１００倍、５００倍、または１０００倍多いトリプトファンを産生する。
これらの実施形態のいずれにおいても、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌と比較して、キヌレニン消費速度を０％〜２％〜４％、４％〜６％、６％〜８％、８％〜１０％、１０％〜１２％、１２％〜１４％、１４％〜１６％、１６％〜１８％、１８％〜２０％、２０％〜２５％、２５％〜３０％、３０％〜３５％、３５％〜４０％、４０％〜４５％、４５％〜５０％、５０％〜５５％、５５％〜６０％、６０％〜６５％、６５％〜７０％〜８０％、８０％〜９０％、または９０％〜１００％上昇させる。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌と比較して、キヌレニン消費速度を１．０〜１．２倍、１．２〜１．４倍、１．４〜１．６倍、１．６〜１．８倍、１．８〜２倍、または２倍大きく上昇させる。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌と比較して、キヌレニン消費速度を約３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、４０倍、または５０倍、１００倍、５００倍、または１０００倍上昇させる。
一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、４時間後、同じ細菌亜型の未改変細菌と比較して、キヌレニン消費を約８０％〜１００％増加させる。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、４時間後、同じ細菌亜型の未改変細菌と比較して、キヌレニン消費を約９０％〜１００％増加させる。１つの特定の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、４時間後、同じ細菌亜型の未改変細菌と比較して、キヌレニン消費を約９５％〜１００％増加させる。１つの特定の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、４時間後、同じ細菌亜型の未改変細菌と比較して、キヌレニン消費を約９９％〜１００％増加させる。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、キヌレニン消費を、４時間後、約１０〜５０倍増加させる。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、キヌレニン消費を、４時間後、約５０〜１００倍増加させる。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、キヌレニン消費を、４時間後、約１００〜５００倍増加させる。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、キヌレニン消費を、４時間後、約５００〜１０００倍増加させる。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、キヌレニン消費を、４時間後、約１０００〜５０００倍増加させる。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、キヌレニン消費を、４時間後、約５０００〜１００００倍増加させる。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、キヌレニン消費を、４時間後、約１００００〜１０００倍増加させる。
これらの実施形態のいずれにおいても、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌と比較して、ＳＴＩＮＧアゴニスト産生速度を０％〜２％〜４％、４％〜６％、６％〜８％、８％〜１０％、１０％〜１２％、１２％〜１４％、１４％〜１６％、１６％〜１８％、１８％〜２０％、２０％〜２５％、２５％〜３０％、３０％〜３５％、３５％〜４０％、４０％〜４５％、４５％〜５０％、５０％〜５５％、５５％〜６０％、６０％〜６５％、６５％〜７０％〜８０％、８０％〜９０％、または９０％〜１００％上昇させる。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌と比較して、ＳＴＩＮＧアゴニスト産生速度を１．０〜１．２倍、１．２〜１．４倍、１．４〜１．６倍、１．６〜１．８倍、１．８〜２倍、または２倍大きく上昇させる。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌と比較して、ＳＴＩＮＧアゴニスト産生速度を約３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、４０倍、または５０倍、１００倍、５００倍、または１０００倍上昇させる。
一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、４時間後、同じ細菌亜型の未改変細菌と比較して、ＳＴＩＮＧアゴニスト産生を約８０％〜１００％増加させる。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、４時間後、同じ細菌亜型の未改変細菌と比較して、ＳＴＩＮＧアゴニスト産生を約９０％〜１００％増加させる。１つの特定の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、４時間後、同じ細菌亜型の未改変細菌と比較して、ＳＴＩＮＧアゴニスト産生を約９５％〜１００％増加させる。１つの特定の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、４時間後、同じ細菌亜型の未改変細菌と比較して、ＳＴＩＮＧアゴニスト産生を約９９％〜１００％増加させる。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、４時間後、ＳＴＩＮＧアゴニスト産生を約１０〜５０倍増加させる。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、４時間後、ＳＴＩＮＧアゴニスト産生を約５０〜１００倍増加させる。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、４時間後、ＳＴＩＮＧアゴニスト産生を約１００〜５００倍増加させる。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、４時間後、ＳＴＩＮＧアゴニスト産生を約５００〜１０００倍増加させる。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、４時間後、ＳＴＩＮＧアゴニスト産生を約１０００〜５０００倍増加させる。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、４時間後、ＳＴＩＮＧアゴニスト産生を約５０００〜１００００倍増加させる。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、４時間後、ＳＴＩＮＧアゴニスト産生を約１００００〜１０００倍増加させる。
これらのＳＴＩＮＧアゴニスト産生およびキヌレニン消費実施形態のいずれにおいても、遺伝子操作された細菌は、細胞増殖を、同じ条件下で、同じ亜型の未改変細菌と比較して少なくとも約１０％〜２０％、２０％〜２５％、２５％〜３０％、３０％〜４０％、４０％〜５０％、５０％〜６０％、６０％〜７０％、７０％〜７５％、７５％〜８０％、８０％〜８５％、８５％〜９０％、９０％〜９５％、９５％〜９９％、またはそれより大きく低減させることができる。これらのＳＴＩＮＧアゴニスト産生およびキヌレニン消費実施形態のいずれにおいても、遺伝子操作された細菌は、腫瘍成長を、同じ条件下で、同じ亜型の未改変細菌と比較して少なくとも約１０％〜２０％、２０％〜２５％、２５％〜３０％、３０％〜４０％、４０％〜５０％、５０％〜６０％、６０％〜７０％、７０％〜７５％、７５％〜８０％、８０％〜８５％、８５％〜９０％、９０％〜９５％、９５％〜９９％、またはそれより大きく低減させることができる。これらのＳＴＩＮＧアゴニスト産生およびキヌレニン消費実施形態のいずれにおいても、遺伝子操作された細菌は、腫瘍サイズを、同じ条件下で、同じ亜型の未改変細菌と比較して少なくとも約１０％〜２０％、２０％〜２５％、２５％〜３０％、３０％〜４０％、４０％〜５０％、５０％〜６０％、６０％〜７０％、７０％〜７５％、７５％〜８０％、８０％〜８５％、８５％〜９０％、９０％〜９５％、９５％〜９９％、またはそれより大きく低減させることができる。これらのＳＴＩＮＧアゴニスト産生およびキヌレニン消費実施形態のいずれにおいても、遺伝子操作された細菌は、腫瘍体積を、同じ条件下で、同じ亜型の未改変細菌と比較して少なくとも約１０％〜２０％、２０％〜２５％、２５％〜３０％、３０％〜４０％、４０％〜５０％、５０％〜６０％、６０％〜７０％、７０％〜７５％、７５％〜８０％、８０％〜８５％、８５％〜９０％、９０％〜９５％、９５％〜９９％、またはそれより大きく低減させることができる。これらのＳＴＩＮＧアゴニスト産生およびキヌレニン消費実施形態のいずれにおいても、遺伝子操作された細菌は、腫瘍重量を、同じ条件下で、同じ亜型の未改変細菌と比較して少なくとも約１０％〜２０％、２０％〜２５％、２５％〜３０％、３０％〜４０％、４０％〜５０％、５０％〜６０％、６０％〜７０％、７０％〜７５％、７５％〜８０％、８０％〜８５％、８５％〜９０％、９０％〜９５％、９５％〜９９％、またはそれより大きく低減させることができる。
一部のＳＴＩＮＧアゴニスト産生およびキヌレニン消費実施形態では、遺伝子操作された微生物は、低酸素条件で、ならびに／あるいはがんの、および／または腫瘍微小環境の、または組織特異的分子もしくは代謝物の存在下で、ならびに／あるいは炎症または免疫抑制に関連する分子または代謝物の存在下で、ならびに／あるいは消化管内に存在しうる代謝物の存在下で、ならびに／あるいはｉｎ ｖｉｖｏで存在することもあり、しないこともあり、ｉｎ ｖｉｔｒｏで、株培養、拡大増殖、産生および／または製造中に存在することもある、代謝物、例えば、アラビノース、クメートおよびサリチレートおよび本明細書に記載の他のものの存在下で、アデノシンおよびキヌレニンの分解のための記載の回路のうちいずれか１つまたは複数を発現することができる。一部の実施形態では、そのようなインデューサーをｉｎ ｖｉｖｏで投与して、エフェクター遺伝子発現を誘導することができる。一部の実施形態では、ＳＴＩＮＧアゴニスト産生およびキヌレニンの分解のための回路網をコードする遺伝子配列（複数可）は、そのような条件および／またはインデューサーによって誘導性のプロモーターによって制御される。一部の実施形態では、遺伝子配列（複数可）は、本明細書に記載される構成的プロモーターによって制御される。一部の実施形態では、遺伝子配列は、構成的プロモーターにより制御され、本明細書に記載の、ｉｎ ｖｉｖｏ条件および／またはｉｎ ｖｉｔｒｏ条件で、例えば、拡大増殖、産生および／または製造中に発現される。
これらのＳＴＩＮＧアゴニスト産生およびキヌレニン消費実施形態のいずれにおいても、記載されたＳＴＩＮＧアゴニスト産生回路およびキヌレニン消費回路のいずれか１つまたは複数は、１つもしくは複数のプラスミド（例えば、高コピー数または低コピー数プラスミド）上に存在するか、または微生物染色体内の１つもしくは複数の部位に組み込まれている。また、一部の実施形態では、遺伝子操作された微生物は、記載の回路のうちいずれか１つまたは複数をさらに発現することができ、次のうち１つまたは複数をさらに含む：（１）当技術分野で公知かつ本明細書に提供されるいずれかの栄養要求体、例えば、ｔｈｙＡおよび／またはｄａｐＡ栄養要求体等、１つまたは複数の栄養要求体、（２）本明細書に記載されるまたはそれ以外に当技術分野で公知のキルスイッチのいずれか等、１つまたは複数のキルスイッチ回路、（３）１つまたは複数の抗生物質抵抗性回路、（４）本明細書に記載されるまたはそれ以外に当技術分野で公知の輸送体のいずれか等、生物学的分子または基質を移入するための１つまたは複数の輸送体、（５）本明細書に記載されるおよびそれ以外に当技術分野で公知の分泌回路のいずれか等、１つまたは複数の分泌回路、（６）本明細書に記載されるおよびそれ以外に当技術分野で公知の表面ディスプレイ回路のいずれか等、１つまたは複数の表面ディスプレイ回路、ならびに（７）本明細書に記載される１つまたは複数の代謝物（例えば、キヌレニン、トリプトファン、アデノシン、アルギニン）の産生または分解のための１つまたは複数の回路、（８）そのような追加的な回路のうち１つまたは複数の組合せ。
これらの実施形態のいずれにおいても、ＳＴＩＮＧアゴニストを産生し、キヌレニンを消費するように遺伝子操作された１つまたは複数の細菌は、単独で、または抗ＣＴＬＡ４、抗ＰＤ１もしくは抗ＰＤ−Ｌ１抗体を含むがこれらに限定されない、本明細書に記載される１つもしくは複数の免疫チェックポイント阻害剤と組み合わせて投与することができる。これらの実施形態のいずれにおいても、ＳＴＩＮＧアゴニストを産生し、キヌレニンを消費するように遺伝子操作された１つまたは複数の細菌は、抗ＣＴＬＡ４、抗ＰＤ１または抗ＰＤ−Ｌ１抗体を含むがこれらに限定されない、本明細書に記載される１つまたは複数の免疫チェックポイント阻害剤を産生および分泌またはその表面にディスプレイするように遺伝子操作されうる。
これらの実施形態のいずれにおいても、ＳＴＩＮＧアゴニストを産生し、キヌレニンを消費するように遺伝子操作された１つまたは複数の細菌は、単独で、または本明細書に記載される１つもしくは複数の免疫刺激性アゴニスト、例えば、抗ＯＸ４０、抗４１ＢＢもしくは抗ＧＩＴＲ抗体を含むがこれらに限定されない、アゴニスト抗体と組み合わせて投与することができる。これらの実施形態のいずれにおいても、ＳＴＩＮＧアゴニストを産生し、キヌレニンを消費するように遺伝子操作された１つまたは複数の細菌は、本明細書に記載される１つまたは複数の免疫刺激性アゴニスト、例えば、抗ＯＸ４０、抗４１ＢＢまたは抗ＧＩＴＲ抗体を含むがこれらに限定されない、アゴニスト抗体を産生および分泌またはその表面にディスプレイするように遺伝子操作されうる。
ある特定の実施形態では、１つまたは複数のＳＴＩＮＧアゴニストおよび例えば、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ由来の１つまたは複数のキヌレニナーゼの産生のための記載の回路のうちいずれか１つまたは複数を発現する１つまたは複数の遺伝子操作された細菌は、抗ＣＴＬＡ４、抗ＰＤ１または抗ＰＤ−Ｌ１抗体を含むがこれらに限定されない、本明細書に記載される１つまたは複数の免疫チェックポイント阻害剤を産生および分泌またはその表面にディスプレイするように遺伝子操作されうる。一実施形態では、１つまたは複数の遺伝子操作された細菌は、例えば、Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ由来のＤａｃＡをコードする遺伝子配列（複数可）を含み、ＤａｃＡは、低酸素条件下で誘導性のプロモーター、例えば、ＦＮＲプロモーターに作動可能に連結されている。ｄａｃＡをコードする遺伝子配列を含む細菌は、ｄａｐＡに突然変異または欠失を含む。１つまたは複数の遺伝子操作された細菌は、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ由来のキヌレニナーゼをコードする遺伝子配列をさらに含み、キヌレニナーゼをコードする遺伝子配列を含む細菌は、ＴｒｐＥに突然変異または欠失をさらに含む。ある特定の実施形態では、ｄａｃＡおよびキヌレニナーゼ配列は、細菌染色体中に組み込まれる。特異的な一実施形態では、１つまたは複数の遺伝子操作された細菌は、ＴｈｙＡに突然変異（複数可）または欠失（複数可）をさらに含むことができる。特異的な一実施形態では、チェックポイント阻害剤は、ＰＤ−１である。特異的な一実施形態では、チェックポイント阻害剤は、ＰＤ−Ｌ１である。特異的な一実施形態では、チェックポイント阻害剤は、ＣＴＬＡ−４である。
一実施形態では、ｄａｃＡ回路網（例えば、Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ由来の、例えば、低酸素プロモーターの制御下に置かれ、染色体に組み込まれる）、キヌレニナーゼ回路網（例えば、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ由来の、例えば、構成的プロモーターの制御下に置かれ、染色体に組み込まれる）および栄養要求性突然変異（ＴｒｐＥ、ｄａｐＡおよびＴｈｙＡにおける突然変異または欠失）、およびチェックポイント阻害剤分泌またはディスプレイ回路網（例えば、構成的プロモーターまたは誘導性プロモーターの制御下に置かれ、染色体に組み込まれる）は、１つの細菌において組み合わされる。代替実施形態では、細菌組成物は、ｄａｃＡ（例えば、Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ由来の、例えば、低酸素プロモーターの制御下に置かれ、染色体に組み込まれる）をコードする遺伝子配列を含み、ＤａｐＡにおける突然変異または欠失、およびＴｈｙＡにおける必要に応じた突然変異または欠失をさらに含む第１の細菌、ならびにキヌレニナーゼ回路網（例えば、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ由来の、例えば、構成的プロモーターの制御下に置かれ、染色体に組み込まれる）をコードする遺伝子配列、ＴｒｐＥにおける突然変異または欠失、および必要に応じて、ＴｈｙＡにおける突然変異または欠失を含む第２の細菌を含む。組成物は、チェックポイント阻害剤を分泌またはディスプレイするように操作された第３の細菌をさらに含む。あるいは、第１または第２の細菌は、チェックポイント阻害剤を分泌またはディスプレイするように操作される。
遺伝子操作された細菌が、１つまたは複数のＳＴＩＮＧアゴニストの産生のための回路網をコードする、これらの組合せ実施形態のいずれにおいても、細菌は、ＤａｐＡ、ＴｈｙＡまたはその両方に、栄養要求性改変、例えば、突然変異または欠失をさらに含むことができる。遺伝子操作された細菌が、１つまたは複数のＳＴＩＮＧアゴニストの産生のための回路網をコードする、これらの実施形態のいずれにおいても、細菌は、本明細書に記載される内在性プロファージに、ファージ改変、例えば、突然変異または欠失をさらに含むことができる。
ＳＴＩＮＧアゴニストおよびアデノシン消費
一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、アデノシンの消費のための酵素をコードする１つまたは複数の遺伝子と組み合わせて、ＳＴＩＮＧアゴニストの産生のための酵素をコードする１つまたは複数の遺伝子を含む。一実施形態では、産生されるＳＴＩＮＧアゴニストは、ｃ−ジＡＭＰである。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、アデノシン分解経路をコードする遺伝子配列と組み合わせて、ジアデニル酸シクラーゼをコードする遺伝子配列を含む。一実施形態では、ジアデニル酸シクラーゼは、Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓからのものである。一実施形態では、アデノシン分解経路酵素をコードする遺伝子配列は、ｘｄｈＡ、ｘｄｈＢ、ｘｄｈＣ、ａｄｄ、ｘａｐＡ、ｄｅｏＤおよびｎｕｐＣから選択される１つまたは複数の遺伝子を含む。一実施形態では、アデノシン分解経路をコードする遺伝子配列は、ｘｄｈＡ、ｘｄｈＢ、ｘｄｈＣ、ａｄｄ、ｘａｐＡ、ｄｅｏＤおよびｎｕｐＣを含む。一実施形態では、アデノシン経路酵素は、Ｅ ｃｏｌｉからのものである。１つの特定の実施形態では、ジアデニル酸シクラーゼは、Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓからのものであり、アデノシン分解経路をコードする遺伝子配列は、例えばＥ．ｃｏｌｉからの、ｘｄｈＡ、ｘｄｈＢ、ｘｄｈＣ、ａｄｄ、ｘａｐＡ、ｄｅｏＤおよびｎｕｐＣを含む。１つの特定の実施形態では、アデノシン経路酵素は、染色体に組み込まれており、低酸素プロモーター、例えばＦＮＲ、の制御下にある。
一実施形態では、産生されるＳＴＩＮＧアゴニストは、サイクリック−ジＧＡＭＰである。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、アデノシン分解経路をコードする遺伝子配列と組み合わせて、ｃ−ジＧＡＭＰシンターゼをコードする遺伝子配列を含む。一実施形態では、ｃ−ジＧＡＭＰシンターゼは、Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅからのものである。一実施形態では、ｃ−ジ−ＧＡＭＰシンターゼは、ヒトｃＧＡＳである。一実施形態では、アデノシン分解経路酵素をコードする遺伝子配列は、ｘｄｈＡ、ｘｄｈＢ、ｘｄｈＣ、ａｄｄ、ｘａｐＡ、ｄｅｏＤおよびｎｕｐＣから選択される１つまたは複数の遺伝子を含む。一実施形態では、アデノシン分解経路をコードする遺伝子配列は、ｘｄｈＡ、ｘｄｈＢ、ｘｄｈＣ、ａｄｄ、ｘａｐＡ、ｄｅｏＤおよびｎｕｐＣを含む。一実施形態では、アデノシン経路酵素は、Ｅ ｃｏｌｉからのものである。１つの特定の実施形態では、ｃ−ジＧＡＭＰシンターゼは、Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅからのものであり、アデノシン分解経路をコードする遺伝子配列は、例えばＥ．ｃｏｌｉからの、ｘｄｈＡ、ｘｄｈＢ、ｘｄｈＣ、ａｄｄ、ｘａｐＡ、ｄｅｏＤおよびｎｕｐＣを含む。１つの特定の実施形態では、ｃ−ジ−ＧＡＭＰシンターゼは、ヒトｃＧＡＳからのものであり、アデノシン分解経路をコードする遺伝子配列は、例えば、ｅ．ｃｏｌｉからのｘｄｈＡ、ｘｄｈＢ、ｘｄｈＣ、ａｄｄ、ｘａｐＡ、ｄｅｏＤ、およびｎｕｐＣを含む。１つの特定の実施形態では、アデノシン分解経路をコードする遺伝子は、染色体に組み込まれており、低酸素プロモーター、例えばＦＮＲ、の制御下にある。
代替実施形態では、本開示は、各細菌が異なる免疫モジュレーターをコードする、異なる遺伝子操作された細菌の組合せ（例えば、２つまたはそれより多く）を含む、組成物を提供する。したがって、一実施形態では、組成物は、ＳＴＩＮＧアゴニストの産生のための酵素をコードする１つまたは複数の遺伝子を含む遺伝子操作された細菌を含み、これと組み合わせて、アデノシンの消費のための酵素をコードする１つまたは複数の遺伝子を含む遺伝子操作された細菌を含む。一実施形態では、産生されるＳＴＩＮＧアゴニストは、ｃ−ジＡＭＰである。一実施形態では、組成物は、アデノシン分解経路をコードする遺伝子配列を含む遺伝子操作された細菌と組み合わせて、ジアデニル酸シクラーゼをコードする遺伝子配列を含む遺伝子操作された細菌を含む。一実施形態では、ジアデニル酸シクラーゼは、Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓからのものである。一実施形態では、アデノシン分解経路酵素をコードする遺伝子配列は、ｘｄｈＡ、ｘｄｈＢ、ｘｄｈＣ、ａｄｄ、ｘａｐＡ、ｄｅｏＤおよびｎｕｐＣから選択される１つまたは複数の遺伝子を含む。一実施形態では、アデノシン分解経路をコードする遺伝子配列は、ｘｄｈＡ、ｘｄｈＢ、ｘｄｈＣ、ａｄｄ、ｘａｐＡ、ｄｅｏＤおよびｎｕｐＣを含む。一実施形態では、アデノシン経路酵素は、Ｅ ｃｏｌｉからのものである。１つの特定の実施形態では、ジアデニル酸シクラーゼは、Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓからのものであり、アデノシン分解経路をコードする遺伝子配列は、例えばＥ．ｃｏｌｉからの、ｘｄｈＡ、ｘｄｈＢ、ｘｄｈＣ、ａｄｄ、ｘａｐＡ、ｄｅｏＤおよびｎｕｐＣを含む。１つの特定の実施形態では、アデノシン経路酵素は、染色体に組み込まれており、低酸素プロモーター、例えばＦＮＲ、の制御下にある。
一実施形態では、産生されるＳＴＩＮＧアゴニストは、サイクリック−ジＧＡＭＰである。一実施形態では、組成物は、アデノシン分解経路をコードする遺伝子配列を含む遺伝子操作された細菌と組み合わせて、ｃ−ジＧＡＭＰシンターゼをコードする遺伝子配列を含む遺伝子操作された細菌を含む。一実施形態では、ｃ−ジＧＡＭＰシンターゼは、Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅからのものである。一実施形態では、ｃ−ジ−ＧＡＭＰシンターゼはヒトｃＧＡＳである。
一実施形態では、アデノシン分解経路酵素をコードする遺伝子配列は、ｘｄｈＡ、ｘｄｈＢ、ｘｄｈＣ、ａｄｄ、ｘａｐＡ、ｄｅｏＤおよびｎｕｐＣから選択される１つまたは複数の遺伝子を含む。一実施形態では、アデノシン分解経路をコードする遺伝子配列は、ｘｄｈＡ、ｘｄｈＢ、ｘｄｈＣ、ａｄｄ、ｘａｐＡ、ｄｅｏＤおよびｎｕｐＣを含む。一実施形態では、アデノシン経路酵素は、Ｅ ｃｏｌｉからのものである。１つの特定の実施形態では、ｃ−ジＧＡＭＰシンターゼは、Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅからのものであり、アデノシン分解経路をコードする遺伝子配列は、例えばＥ．ｃｏｌｉからの、ｘｄｈＡ、ｘｄｈＢ、ｘｄｈＣ、ａｄｄ、ｘａｐＡ、ｄｅｏＤおよびｎｕｐＣを含む。１つの特定の実施形態では、ｃ−ジ−ＧＡＭＰシンターゼは、ヒトｃＧＡＳであり、アデノシン分解経路をコードする遺伝子配列は、例えば、ｅ．ｃｏｌｉからのｘｄｈＡ，ｘｄｈＢ、ｘｄｈＣ、ａｄｄ、ｘａｐＡ、ｄｅｏＤ、およびｎｕｐＣを含む。１つの特定の実施形態では、アデノシン分解経路をコードする遺伝子は、染色体に組み込まれており、低酸素プロモーター、例えばＦＮＲ、の制御下にある。
これらのＳＴＩＮＧアゴニスト産生およびアデノシン消費実施形態のいずれにおいても、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より少なくとも約０％〜２％、２％〜４％、４％〜６％、６％〜８％、８％〜１０％、１０％〜１２％、１２％〜１４％、１４％〜１６％、１６％〜１８％、１８％〜２０％、２０％〜２５％、２５％〜３０％、３０％〜３５％、３５％〜４０％、４０％〜４５％、４５％〜５０％、５０％〜５５％、５５％〜６０％、６０％〜６５％、６５％〜７０％〜８０％、８０％〜９０％、または９０％〜１００％多いＳＴＩＮＧアゴニスト、例えば、サイクリック−ジＡＭＰを産生する。
これらのＳＴＩＮＧアゴニスト産生およびアデノシン消費実施形態のいずれにおいても、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より０％〜２％、２％〜４％、４％〜６％、６％〜８％、８％〜１０％、１０％〜１２％、１２％〜１４％、１４％〜１６％、１６％〜１８％、１８％〜２０％、２０％〜２５％、２５％〜３０％、３０％〜３５％、３５％〜４０％、４０％〜４５％、４５％〜５０％、５０％〜５５％、５５％〜６０％、６０％〜６５％、６５％〜７０％〜８０％、８０％〜９０％、または９０％〜１００％多いアデノシンを消費する。
さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より少なくとも約１．０〜１．２倍、１．２〜１．４倍、１．４〜１．６倍、１．６〜１．８倍、１．８〜２倍、または２倍多いＳＴＩＮＧアゴニスト、例えば、サイクリック−ジＡＭＰを産生する。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より約３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、４０倍、または５０倍、１００倍、５００倍、または１０００倍多いＳＴＩＮＧアゴニスト、例えば、サイクリック−ジＡＭＰを産生する。
さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より１．０〜１．２倍、１．２〜１．４倍、１．４〜１．６倍、１．６〜１．８倍、１．８〜２倍、または２倍多いアデノシンを消費する。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より約３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、４０倍、または５０倍、１００倍、５００倍、または１０００倍多いアデノシンを消費する。
これらのＳＴＩＮＧアゴニスト産生およびアデノシン消費実施形態のいずれにおいても、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より０％〜２％、２％〜４％、４％〜６％、６％〜８％、８％〜１０％、１０％〜１２％、１２％〜１４％、１４％〜１６％、１６％〜１８％、１８％〜２０％、２０％〜２５％、２５％〜３０％、３０％〜３５％、３５％〜４０％、４０％〜４５％、４５％〜５０％、５０％〜５５％、５５％〜６０％、６０％〜６５％、６５％〜７０％〜８０％、８０％〜９０％、または９０％〜１００％多いＡＴＰを消費する。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より１．０〜１．２倍、１．２〜１．４倍、１．４〜１．６倍、１．６〜１．８倍、１．８〜２倍、または２倍多いアデノシンを消費する。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より約３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、１００倍、５００倍、または１０００倍多いＡＴＰを消費する。
これらのＳＴＩＮＧアゴニスト産生およびアデノシン消費実施形態のいずれにおいても、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より少なくとも約０％〜２％、２％〜４％、４％〜６％、６％〜８％、８％〜１０％、１０％〜１２％、１２％〜１４％、１４％〜１６％、１６％〜１８％、１８％〜２０％、２０％〜２５％、２５％〜３０％、３０％〜３５％、３５％〜４０％、４０％〜４５％、４５％〜５０％、５０％〜５５％、５５％〜６０％、６０％〜６５％、６５％〜７０％〜８０％、８０％〜９０％、または９０％〜１００％多い尿酸を産生する。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より少なくとも約１．０〜１．２倍、１．２〜１．４倍、１．４〜１．６倍、１．６〜１．８倍、１．８〜２倍、または２倍多い尿酸を産生する。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より約３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、１００倍、５００倍、または１０００倍多い尿酸を産生する。
これらのＳＴＩＮＧアゴニスト産生およびアデノシン消費実施形態のいずれにおいても、遺伝子操作された細菌は、細胞増殖を、同じ条件下で、同じ亜型の未改変細菌と比較して少なくとも約１０％〜２０％、２０％〜２５％、２５％〜３０％、３０％〜４０％、４０％〜５０％、５０％〜６０％、６０％〜７０％、７０％〜７５％、７５％〜８０％、８０％〜８５％、８５％〜９０％、９０％〜９５％、９５％〜９９％、またはそれより大きく低減させることができる。これらのＳＴＩＮＧアゴニスト産生およびアデノシン消費実施形態のいずれにおいても、遺伝子操作された細菌は、腫瘍成長を、同じ条件下で、同じ亜型の未改変細菌と比較して少なくとも約１０％〜２０％、２０％〜２５％、２５％〜３０％、３０％〜４０％、４０％〜５０％、５０％〜６０％、６０％〜７０％、７０％〜７５％、７５％〜８０％、８０％〜８５％、８５％〜９０％、９０％〜９５％、９５％〜９９％、またはそれより大きく低減させることができる。これらのＳＴＩＮＧアゴニスト産生およびアデノシン消費実施形態のいずれにおいても、遺伝子操作された細菌は、腫瘍サイズを、同じ条件下で、同じ亜型の未改変細菌と比較して少なくとも約１０％〜２０％、２０％〜２５％、２５％〜３０％、３０％〜４０％、４０％〜５０％、５０％〜６０％、６０％〜７０％、７０％〜７５％、７５％〜８０％、８０％〜８５％、８５％〜９０％、９０％〜９５％、９５％〜９９％、またはそれより大きく低減させることができる。これらのＳＴＩＮＧアゴニスト産生およびアデノシン消費実施形態のいずれにおいても、遺伝子操作された細菌は、腫瘍体積を、同じ条件下で、同じ亜型の未改変細菌と比較して少なくとも約１０％〜２０％、２０％〜２５％、２５％〜３０％、３０％〜４０％、４０％〜５０％、５０％〜６０％、６０％〜７０％、７０％〜７５％、７５％〜８０％、８０％〜８５％、８５％〜９０％、９０％〜９５％、９５％〜９９％、またはそれより大きく低減させることができる。これらのＳＴＩＮＧアゴニスト産生およびアデノシン消費実施形態のいずれにおいても、遺伝子操作された細菌は、腫瘍重量を、同じ条件下で、同じ亜型の未改変細菌と比較して少なくとも約１０％〜２０％、２０％〜２５％、２５％〜３０％、３０％〜４０％、４０％〜５０％、５０％〜６０％、６０％〜７０％、７０％〜７５％、７５％〜８０％、８０％〜８５％、８５％〜９０％、９０％〜９５％、９５％〜９９％、またはそれより大きく低減させることができる。
一部のＳＴＩＮＧアゴニスト産生およびアデノシン消費実施形態では、遺伝子操作された微生物は、低酸素条件で、ならびに／あるいはがんの、および／または腫瘍微小環境の、または組織特異的分子もしくは代謝物の存在下で、ならびに／あるいは炎症または免疫抑制に関連する分子または代謝物の存在下で、ならびに／あるいは消化管内に存在しうる代謝物の存在下で、ならびに／あるいはｉｎ ｖｉｖｏで存在することもあり、しないこともあり、ｉｎ ｖｉｔｒｏで、株培養、拡大増殖、産生および／または製造中に存在することもある、代謝物、例えば、アラビノース、クメートおよびサリチレートおよび本明細書に記載の他のものの存在下で、ＳＴＩＮＧアゴニスト産生およびアデノシンの分解のための記載の回路のうちいずれか１つまたは複数を発現することができる。一部の実施形態では、そのようなインデューサーをｉｎ ｖｉｖｏで投与して、エフェクター遺伝子発現を誘導することができる。一部の実施形態では、ＳＴＩＮＧアゴニスト産生およびアデノシンの分解のための回路網をコードする遺伝子配列（複数可）は、そのような条件および／またはインデューサーによって誘導性のプロモーターによって制御される。一部の実施形態では、遺伝子配列（複数可）は、本明細書に記載される構成的プロモーターによって制御される。一部の実施形態では、遺伝子配列（複数可）は、構成的プロモーターによって制御され、本明細書に記載される通り、ｉｎ ｖｉｖｏ条件および／またはｉｎ ｖｉｔｒｏ条件において、例えば、拡大増殖、産生および／または製造中に発現される。
これらのＳＴＩＮＧアゴニスト産生およびアデノシン消費実施形態のいずれにおいても、記載のＳＴＩＮＧアゴニスト産生回路およびアデノシン消費回路のうちいずれか１つまたは複数は、１つもしくは複数のプラスミド（例えば、高コピー数または低コピー数プラスミド）上に存在するか、または微生物染色体内の１つもしくは複数の部位に組み込まれている。また、一部の実施形態では、遺伝子操作された微生物は、記載の回路のうちいずれか１つまたは複数をさらに発現することができ、次のうち１つまたは複数をさらに含む：（１）当技術分野で公知かつ本明細書に提供されるいずれかの栄養要求体、例えば、ｔｈｙＡおよび／またはｄａｐＡ栄養要求体等、１つまたは複数の栄養要求体、（２）本明細書に記載されるまたはそれ以外に当技術分野で公知のキルスイッチのいずれか等、１つまたは複数のキルスイッチ回路、（３）１つまたは複数の抗生物質抵抗性回路、（４）本明細書に記載されるまたはそれ以外に当技術分野で公知の輸送体のいずれか等、生物学的分子または基質を移入するための１つまたは複数の輸送体、（５）本明細書に記載されるおよびそれ以外に当技術分野で公知の分泌回路のいずれか等、１つまたは複数の分泌回路、（６）本明細書に記載されるおよびそれ以外に当技術分野で公知の表面ディスプレイ回路のいずれか等、１つまたは複数の表面ディスプレイ回路、ならびに（７）本明細書に記載される１つまたは複数の代謝物（例えば、アデノシン、トリプトファン、アデノシン、アルギニン）の産生または分解のための１つまたは複数の回路、（８）そのような追加的な回路のうち１つまたは複数の組合せ。
これらの実施形態のいずれにおいても、ＳＴＩＮＧアゴニストを産生し、アデノシンを消費するように遺伝子操作された１つまたは複数の細菌は、単独で、または抗ＣＴＬＡ４、抗ＰＤ１もしくは抗ＰＤ−Ｌ１抗体を含むがこれらに限定されない、本明細書に記載される１つもしくは複数の免疫チェックポイント阻害剤と組み合わせて投与することができる。これらの実施形態のいずれにおいても、ＳＴＩＮＧアゴニストを産生し、アデノシンを消費するように遺伝子操作された１つまたは複数の細菌は、抗ＣＴＬＡ４、抗ＰＤ１または抗ＰＤ−Ｌ１抗体を含むがこれらに限定されない、本明細書に記載される１つまたは複数の免疫チェックポイント阻害剤を産生および分泌またはその表面にディスプレイするように遺伝子操作されうる。
これらの実施形態のいずれにおいても、ＳＴＩＮＧアゴニストを産生し、アデノシンを消費するように遺伝子操作された１つまたは複数の細菌は、単独で、または本明細書に記載される１つもしくは複数の免疫刺激性アゴニスト、例えば、抗ＯＸ４０、抗４１ＢＢもしくは抗ＧＩＴＲ抗体を含むがこれらに限定されない、アゴニスト抗体と組み合わせて投与することができる。これらの実施形態のいずれにおいても、ＳＴＩＮＧアゴニストを産生し、アデノシンを消費するように遺伝子操作された１つまたは複数の細菌は、本明細書に記載される１つまたは複数の免疫刺激性アゴニスト、例えば、抗ＯＸ４０、抗４１ＢＢまたは抗ＧＩＴＲ抗体を含むがこれらに限定されない、アゴニスト抗体を産生および分泌またはその表面にディスプレイするように遺伝子操作されうる。
ＳＴＩＮＧアゴニストおよびアルギニン産生／アンモニア消費
一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、アルギニンの産生および／またはアンモニアの消費のための酵素をコードする１つまたは複数の遺伝子と組み合わせて、ＳＴＩＮＧアゴニストの産生のための酵素をコードする１つまたは複数の遺伝子を含む。一実施形態では、産生されるＳＴＩＮＧアゴニストは、ｃ−ジＡＭＰである。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、アルギニン産生および／またはアンモニアの消費経路をコードする遺伝子配列と組み合わせて、ジアデニル酸シクラーゼをコードする遺伝子配列を含む。一実施形態では、ジアデニル酸シクラーゼは、Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓからのものである。一実施形態では、アルギニン産生および／またはアンモニアの消費回路をコードする遺伝子配列は、フィードバック耐性ＡｒｇＡ（ＡｒｇＡｆｂｒ）を含み、内在性アルギニンオペロンリプレッサーＡｒｇＲの欠失を含む。一実施形態では、ＡｒｇＡｆｂｒは、Ｅ ｃｏｌｉからのものである。１つの特定の実施形態では、ＡｒｇＡｆｂｒは、染色体に組み込まれており、低酸素プロモーター、例えばＦＮＲの制御下にある。
代替実施形態では、本開示は、各細菌が異なる免疫モジュレーターをコードする、異なる遺伝子操作された細菌の組合せ（例えば、２つまたはそれより多く）を含む、組成物を提供する。したがって、一実施形態では、組成物は、アルギニンの産生のための酵素をコードする１つまたは複数の遺伝子を含む遺伝子操作された細菌と組み合わせて、ＳＴＩＮＧアゴニストの産生のための酵素をコードする１つまたは複数の遺伝子を含む遺伝子操作された細菌を含む。一実施形態では、産生されるＳＴＩＮＧアゴニストは、ｃ−ジＡＭＰである。一実施形態では、組成物は、アルギニン産生経路をコードする遺伝子配列を含む遺伝子操作された細菌と組み合わせて、ジアデニル酸シクラーゼをコードする遺伝子配列を含む遺伝子操作された細菌を含む。一実施形態では、ジアデニル酸シクラーゼは、Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓからのものである。一実施形態では、アルギニン産生回路をコードする遺伝子配列は、フィードバック耐性ＡｒｇＡ（ＡｒｇＡｆｂｒ）を含み、内在性アルギニンオペロンリプレッサーＡｒｇＲの欠失を含む。一実施形態では、ＡｒｇＡｆｂｒは、Ｅ ｃｏｌｉからのものである。１つの特定の実施形態では、ＡｒｇＡｆｂｒは、染色体に組み込まれており、低酸素プロモーター、例えばＦＮＲの制御下にある。
これらのＳＴＩＮＧアゴニスト産生およびアルギニン産生および／またはアンモニアの消費実施形態のいずれにおいても、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より少なくとも約０％〜２％〜４％、４％〜６％、６％〜８％、８％〜１０％、１０％〜１２％、１２％〜１４％、１４％〜１６％、１６％〜１８％、１８％〜２０％、２０％〜２５％、２５％〜３０％、３０％〜３５％、３５％〜４０％、４０％〜４５％、４５％〜５０％、５０％〜５５％、５５％〜６０％、６０％〜６５％、６５％〜７０％〜８０％、８０％〜９０％、または９０％〜１００％多いＳＴＩＮＧアゴニスト、例えば、サイクリック−ジＡＭＰを産生する。
これらのＳＴＩＮＧアゴニスト産生およびアルギニン産生および／またはアンモニアの消費実施形態のいずれにおいても、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より少なくとも約０％〜２％、２％〜４％、４％〜６％、６％〜８％、８％〜１０％、１０％〜１２％、１２％〜１４％、１４％〜１６％、１６％〜１８％、１８％〜２０％、２０％〜２５％、２５％〜３０％、３０％〜３５％、３５％〜４０％、４０％〜４５％、４５％〜５０％、５０％〜５５％、５５％〜６０％、６０％〜６５％、６５％〜７０％〜８０％、８０％〜９０％、または９０％〜１００％多いアルギニンを産生する。
さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より少なくとも約１．０〜１．２倍、１．２〜１．４倍、１．４〜１．６倍、１．６〜１．８倍、１．８〜２倍、または２倍多いＳＴＩＮＧアゴニスト、例えば、サイクリック−ジＡＭＰを産生する。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より約３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、４０倍、または５０倍、１００倍、５００倍、または１０００倍多いＳＴＩＮＧアゴニスト、例えば、サイクリック−ジＡＭＰを産生する。
さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より少なくとも約１．０〜１．２倍、１．２〜１．４倍、１．４〜１．６倍、１．６〜１．８倍、１．８〜２倍、または２倍多いアルギニンを産生する。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より約３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、４０倍、または５０倍、１００倍、５００倍、または１０００倍多いアルギニンを産生する。
これらのＳＴＩＮＧアゴニスト産生およびアルギニン産生および／またはアンモニアの消費実施形態のいずれにおいても、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より０％〜２％、２％〜４％、４％〜６％、６％〜８％、８％〜１０％、１０％〜１２％、１２％〜１４％、１４％〜１６％、１６％〜１８％、１８％〜２０％、２０％〜２５％、２５％〜３０％、３０％〜３５％、３５％〜４０％、４０％〜４５％、４５％〜５０％、５０％〜５５％、５５％〜６０％、６０％〜６５％、６５％〜７０％〜８０％、８０％〜９０％、または９０％〜１００％多いＡＴＰを消費する。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より１．０〜１．２倍、１．２〜１．４倍、１．４〜１．６倍、１．６〜１．８倍、１．８〜２倍、または２倍多いアルギニンを消費する。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より約３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、１００倍、５００倍、または１０００倍多いグルタメートを消費する。
これらのＳＴＩＮＧアゴニスト産生ならびにアルギニン産生および／またはアンモニア消費実施形態のいずれにおいても、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より０％〜２％、２％〜４％、４％〜６％、６％〜８％、８％〜１０％、１０％〜１２％、１２％〜１４％、１４％〜１６％、１６％〜１８％、１８％〜２０％、２０％〜２５％、２５％〜３０％、３０％〜３５％、３５％〜４０％、４０％〜４５％、４５％〜５０％、５０％〜５５％、５５％〜６０％、６０％〜６５％、６５％〜７０％〜８０％、８０％〜９０％、または９０％〜１００％多いグルタメートを消費する。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より１．０〜１．２倍、１．２〜１．４倍、１．４〜１．６倍、１．６〜１．８倍、１．８〜２倍、または２倍多いグルタメートを消費する。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より約３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、１００倍、５００倍、または１０００倍多いグルタメートを消費する。
これらのＳＴＩＮＧアゴニスト産生ならびにアルギニン産生および／またはアンモニア消費実施形態のいずれにおいても、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より０％〜２％、２％〜４％、４％〜６％、６％〜８％、８％〜１０％、１０％〜１２％、１２％〜１４％、１４％〜１６％、１６％〜１８％、１８％〜２０％、２０％〜２５％、２５％〜３０％、３０％〜３５％、３５％〜４０％、４０％〜４５％、４５％〜５０％、５０％〜５５％、５５％〜６０％、６０％〜６５％、６５％〜７０％〜８０％、８０％〜９０％、または９０％〜１００％多いアンモニアを消費する。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より１．０〜１．２倍、１．２〜１．４倍、１．４〜１．６倍、１．６〜１．８倍、１．８〜２倍、または２倍多いアンモニアを消費する。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より約３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、１００倍、５００倍または１０００倍多いアンモニアを消費する。
これらのＳＴＩＮＧアゴニスト産生ならびにアルギニン産生および／またはアンモニア消費実施形態のいずれにおいても、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ亜型の未改変細菌と比較して、細胞増殖を、少なくとも約１０％〜２０％、２０％〜２５％、２５％〜３０％、３０％〜４０％、４０％〜５０％、５０％〜６０％、６０％〜７０％、７０％〜７５％、７５％〜８０％、８０％〜８５％、８５％〜９０％、９０％〜９５％、９５％〜９９％またはそれよりも多く低下させることができる。これらのＳＴＩＮＧアゴニスト産生ならびにアルギニン産生および／またはアンモニア消費実施形態のいずれにおいても、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ亜型の未改変細菌と比較して、腫瘍増殖を、少なくとも約１０％〜２０％、２０％〜２５％、２５％〜３０％、３０％〜４０％、４０％〜５０％、５０％〜６０％、６０％〜７０％、７０％〜７５％、７５％〜８０％、８０％〜８５％、８５％〜９０％、９０％〜９５％、９５％〜９９％またはそれよりも多く低下させることができる。これらのＳＴＩＮＧアゴニスト産生ならびにアルギニン産生および／またはアンモニア消費実施形態のいずれにおいても、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ亜型の未改変細菌と比較して、腫瘍サイズを、少なくとも約１０％〜２０％、２０％〜２５％、２５％〜３０％、３０％〜４０％、４０％〜５０％、５０％〜６０％、６０％〜７０％、７０％〜７５％、７５％〜８０％、８０％〜８５％、８５％〜９０％、９０％〜９５％、９５％〜９９％またはそれよりも多く低下させることができる。これらのＳＴＩＮＧアゴニスト産生ならびにアルギニン産生および／またはアンモニア消費実施形態のいずれにおいても、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ亜型の未改変細菌と比較して、腫瘍体積を、少なくとも約１０％〜２０％、２０％〜２５％、２５％〜３０％、３０％〜４０％、４０％〜５０％、５０％〜６０％、６０％〜７０％、７０％〜７５％、７５％〜８０％、８０％〜８５％、８５％〜９０％、９０％〜９５％、９５％〜９９％またはそれよりも多く低下させることができる。これらのＳＴＩＮＧアゴニスト産生ならびにアルギニン産生および／またはアンモニア消費実施形態のいずれにおいても、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ亜型の未改変細菌と比較して、腫瘍重量を、少なくとも約１０％〜２０％、２０％〜２５％、２５％〜３０％、３０％〜４０％、４０％〜５０％、５０％〜６０％、６０％〜７０％、７０％〜７５％、７５％〜８０％、８０％〜８５％、８５％〜９０％、９０％〜９５％、９５％〜９９％またはそれよりも多く低下させることができる。
一部のＳＴＩＮＧアゴニスト産生およびアルギニン産生／アンモニア消費実施形態では、遺伝子操作された微生物は、低酸素条件で、ならびに／あるいはがんの、および／または腫瘍微小環境の、または組織特異的分子もしくは代謝物の存在下で、ならびに／あるいは炎症または免疫抑制に関連する分子または代謝物の存在下で、ならびに／あるいは消化管内に存在しうる代謝物の存在下で、ならびに／あるいはｉｎ ｖｉｖｏで存在することもあり、しないこともあり、ｉｎ ｖｉｔｒｏで、株培養、拡大増殖、産生および／または製造中に存在することもある、代謝物、例えば、アラビノース、クメートおよびサリチレートおよび本明細書に記載の他のものの存在下で、ＳＴＩＮＧアゴニスト産生およびアルギニン産生／アンモニア消費のための記載の回路のうちいずれか１つまたは複数を発現することができる。一部の実施形態では、そのようなインデューサーをｉｎ ｖｉｖｏで投与して、エフェクター遺伝子発現を誘導することができる。一部の実施形態では、ＳＴＩＮＧアゴニスト産生およびアルギニン産生／アンモニア消費のための回路網をコードする遺伝子配列（複数可）は、そのような条件および／またはインデューサーによって誘導性のプロモーターによって制御される。一部の実施形態では、遺伝子配列は、構成的プロモーターにより制御され、本明細書に記載の、ｉｎ ｖｉｖｏ条件および／またはｉｎ ｖｉｔｒｏ条件で、例えば、細菌の拡大増殖、産生および／または製造中に発現される。
これらのＳＴＩＮＧアゴニスト産生およびアルギニン産生／アンモニア消費実施形態のいずれにおいても、記載のＳＴＩＮＧアゴニスト産生回路およびアルギニン産生／アンモニア消費回路のうちいずれか１つまたは複数は、１つもしくは複数のプラスミド（例えば、高コピー数または低コピー数プラスミド）上に存在するか、または微生物染色体内の１つもしくは複数の部位に組み込まれている。また、一部の実施形態では、遺伝子操作された微生物は、記載の回路のうちいずれか１つまたは複数をさらに発現することができ、次のうち１つまたは複数をさらに含む：（１）当技術分野で公知かつ本明細書に提供されるいずれかの栄養要求体、例えば、ｔｈｙＡおよび／またはｄａｐＡ栄養要求体等、１つまたは複数の栄養要求体、（２）本明細書に記載されるまたはそれ以外に当技術分野で公知のキルスイッチのいずれか等、１つまたは複数のキルスイッチ回路、（３）１つまたは複数の抗生物質抵抗性回路、（４）本明細書に記載されるまたはそれ以外に当技術分野で公知の輸送体のいずれか等、生物学的分子または基質を移入するための１つまたは複数の輸送体、（５）本明細書に記載されるおよびそれ以外に当技術分野で公知の分泌回路のいずれか等、１つまたは複数の分泌回路、（６）本明細書に記載されるおよびそれ以外に当技術分野で公知の表面ディスプレイ回路のいずれか等、１つまたは複数の表面ディスプレイ回路、ならびに（７）本明細書に記載される１つまたは複数の代謝物の産生または分解（例えば、アルギニン産生／アンモニア、トリプトファン、アルギニン産生／アンモニア、アルギニンおよびキヌレニン）のための１つまたは複数の回路、（８）そのような追加的な回路のうち１つまたは複数の組合せ。
これらの実施形態のいずれにおいても、ＳＴＩＮＧアゴニストを産生し、アルギニンを産生および／またはアンモニアを消費するように遺伝子操作された１つまたは複数の細菌は、単独で、または抗ＣＴＬＡ４、抗ＰＤ１もしくは抗ＰＤ−Ｌ１抗体を含むがこれらに限定されない、本明細書に記載される１つもしくは複数の免疫チェックポイント阻害剤と組み合わせて投与することができる。これらの実施形態のいずれにおいても、ＳＴＩＮＧアゴニストを産生し、アルギニンを産生および／またはアンモニアを消費するように遺伝子操作された１つまたは複数の細菌は、抗ＣＴＬＡ４、抗ＰＤ１または抗ＰＤ−Ｌ１抗体を含むがこれらに限定されない、本明細書に記載される１つまたは複数の免疫チェックポイント阻害剤を産生および分泌またはその表面にディスプレイするように遺伝子操作されうる。
これらの実施形態のいずれにおいても、ＳＴＩＮＧアゴニストを産生し、アルギニンを産生および／またはアンモニアを消費するように遺伝子操作された１つまたは複数の細菌は、単独で、または本明細書に記載される１つもしくは複数の免疫刺激性アゴニスト、例えば、抗ＯＸ４０、抗４１ＢＢもしくは抗ＧＩＴＲ抗体を含むがこれらに限定されない、アゴニスト抗体と組み合わせて投与することができる。これらの実施形態のいずれにおいても、ＳＴＩＮＧアゴニストを産生し、アルギニンを産生および／またはアンモニアを消費するように遺伝子操作された１つまたは複数の細菌は、本明細書に記載される１つまたは複数の免疫刺激性アゴニスト、例えば、抗ＯＸ４０、抗４１ＢＢまたは抗ＧＩＴＲ抗体を含むがこれらに限定されない、アゴニスト抗体を産生および分泌またはその表面にディスプレイするように遺伝子操作されうる。
ある特定の実施形態では、１つまたは複数のＳＴＩＮＧアゴニストおよび例えば、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ由来の１つまたは複数のキヌレニナーゼの産生のための記載の回路のうちいずれか１つまたは複数を発現する１つまたは複数の遺伝子操作された細菌は、チェックポイント阻害剤、例えば、抗ＰＤ−１、抗ＰＤ−Ｌ１または抗ＣＴＬＡ−４の分泌またはディスプレイのための回路網をさらに含む。一実施形態では、１つまたは複数の遺伝子操作された細菌は、例えば、Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ由来のＤａｃＡをコードする遺伝子配列（複数可）を含み、ＤａｃＡは、低酸素条件下で誘導性のプロモーター、例えば、ＦＮＲプロモーターに作動可能に連結されている。ｄａｃＡをコードする遺伝子配列を含む細菌は、ｄａｐＡに突然変異または欠失を含む。１つまたは複数の遺伝子操作された細菌は、フィードバック抵抗性ＡｒｇＡをコードする遺伝子配列をさらに含み、フィードバック抵抗性ＡｒｇＡをコードする遺伝子配列を含む細菌は、ＡｒｇＲに突然変異または欠失をさらに含む。ある特定の実施形態では、ｄａｃＡおよびフィードバック抵抗性ＡｒｇＡ配列は、細菌染色体中に組み込まれる。特異的な一実施形態では、１つまたは複数の遺伝子操作された細菌は、ＴｈｙＡに突然変異（複数可）または欠失（複数可）をさらに含むことができる。特異的な一実施形態では、チェックポイント阻害剤は、ＰＤ−１である。特異的な一実施形態では、チェックポイント阻害剤は、ＰＤ−Ｌ１である。特異的な一実施形態では、チェックポイント阻害剤は、ＣＴＬＡ−４である。チェックポイント阻害剤は、構成的または誘導性プロモーターの制御下に置くことができる。
一実施形態では、ｄａｃＡ回路網（例えば、Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ由来の、例えば、低酸素プロモーターの制御下に置かれ、染色体に組み込まれる）、アルギニン産生／アンモニア消費回路網（例えば、ＡｒｇＡｆｂｒを含む、例えば、低酸素誘導性プロモーターの制御下に置かれ、染色体に組み込まれ、ΔＡｒｇＲである）、チェックポイント阻害剤、例えば、抗ＰＤ−１、抗ＰＤ−Ｌ１または抗ＣＴＬＡ−４の分泌またはディスプレイのための回路網、および栄養要求性突然変異（ｄａｐＡおよびＴｈｙＡにおける突然変異または欠失）は、１つの細菌において組み合わされる。代替実施形態では、細菌組成物は、ｄａｃＡ（例えば、Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ由来の、例えば、低酸素プロモーターの制御下に置かれ、染色体に組み込まれる）をコードする遺伝子配列を含み、ＤａｐＡにおける突然変異または欠失、およびＴｈｙＡにおける必要に応じた突然変異または欠失をさらに含む第１の細菌、ならびにアルギニン産生／アンモニア消費回路網（例えば、ＡｒｇＡｆｂｒを含む、例えば、低酸素誘導性プロモーターの制御下に置かれ、染色体に組み込まれ、ΔＡｒｇＲである）をコードする遺伝子配列、および必要に応じてＴｈｙＡにおける突然変異または欠失を含む第２の細菌を含む。組成物は、チェックポイント阻害剤を分泌またはディスプレイするように操作された第３の細菌をさらに含む。あるいは、第１または第２の細菌は、チェックポイント阻害剤を分泌またはディスプレイするように操作される。
ＳＴＩＮＧアゴニストおよびチェックポイント阻害剤
一部の実施形態では、１つまたは複数の遺伝子操作された細菌は、１つまたは複数のチェックポイント阻害剤、例えば、抗ＰＤ−１、抗ＰＤＬ−１および／または抗ＣＴＬＡ４抗体をコードする１つまたは複数の遺伝子と組み合わせて、ＳＴＩＮＧアゴニスト（複数可）の産生のための酵素をコードする１つまたは複数の遺伝子を含む。一部の実施形態では、抗体は、細菌から分泌される。一部の実施形態では、抗体は、細菌の表面にディスプレイされる。一実施形態では、産生されるＳＴＩＮＧアゴニストは、ｃ−ジ−ＡＭＰである。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、１つまたは複数のチェックポイント阻害剤、例えば、抗ＰＤ−１、抗ＰＤＬ−１および／または抗ＣＴＬＡ４抗体をコードする遺伝子配列と組み合わせて、ジアデニル酸シクラーゼをコードする遺伝子配列を含む。一部の実施形態では、１つまたは複数の遺伝子操作された細菌は、チェックポイント阻害剤の分泌を改善するための、ＤＯＭ（拡散性外膜）突然変異、例えば、ΔＰＡＬをさらに含む。一実施形態では、ジアデニル酸シクラーゼは、Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓに由来する。一実施形態では、チェックポイント阻害剤は、ＰＤ−１である。一実施形態では、チェックポイント阻害剤は、ＰＤ−Ｌ１である。一実施形態では、チェックポイント阻害剤は、ＣＴＬＡ−４である。特異的な一実施形態では、チェックポイント阻害遺伝子回路網は、染色体に組み込まれ、低酸素プロモーター、例えば、ＦＮＲの制御下に置かれる。
代替実施形態では、本開示は、異なる遺伝子操作された細菌の組合せ（例えば、２つまたはそれよりも多く）を含む組成物であって、各細菌が、異なる免疫モジュレーターをコードする、組成物を提供する。したがって、一実施形態では、組成物は、１つまたは複数のチェックポイント阻害剤、例えば、抗ＰＤ−１、抗ＰＤＬ−１および／または抗ＣＴＬＡ４抗体をコードする１つまたは複数の遺伝子を含む遺伝子操作された細菌と組み合わせて、ＳＴＩＮＧアゴニスト（複数可）の産生のための酵素をコードする１つまたは複数の遺伝子を含む遺伝子操作された細菌を含む。一実施形態では、産生されるＳＴＩＮＧアゴニストは、ｃ−ジ−ＡＭＰである。一実施形態では、組成物は、１つまたは複数のチェックポイント阻害剤、例えば、抗ＰＤ−１、抗ＰＤＬ−１および／または抗ＣＴＬＡ４抗体をコードする遺伝子配列を含む遺伝子操作された細菌と組み合わせて、ジアデニル酸シクラーゼをコードする遺伝子配列を含む遺伝子操作された細菌を含む。一部の実施形態では、チェックポイント阻害剤をコードする遺伝子操作された細菌は、チェックポイント阻害剤の分泌を改善するための、ＤＯＭ（拡散性外膜）突然変異、例えば、ΔＰＡＬをさらに含む。一実施形態では、ジアデニル酸シクラーゼは、Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓに由来する。一実施形態では、チェックポイント阻害剤は、ＰＤ−１である。一実施形態では、チェックポイント阻害剤は、ＰＤ−Ｌ１である。一実施形態では、チェックポイント阻害剤は、ＣＴＬＡ−４である。特異的な一実施形態では、チェックポイント阻害遺伝子回路網は、染色体に組み込まれ、低酸素プロモーター、例えば、ＦＮＲの制御下に置かれる。
これらのＳＴＩＮＧアゴニストおよびチェックポイント阻害剤産生実施形態のいずれにおいても、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より少なくとも約０％〜２％〜４％、４％〜６％、６％〜８％、８％〜１０％、１０％〜１２％、１２％〜１４％、１４％〜１６％、１６％〜１８％、１８％〜２０％、２０％〜２５％、２５％〜３０％、３０％〜３５％、３５％〜４０％、４０％〜４５％、４５％〜５０％、５０％〜５５％、５５％〜６０％、６０％〜６５％、６５％〜７０％〜８０％、８０％〜９０％、または９０％〜１００％多いＳＴＩＮＧアゴニスト、例えば、サイクリック−ジ−ＡＭＰを産生する。
さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より少なくとも約１．０〜１．２倍、１．２〜１．４倍、１．４〜１．６倍、１．６〜１．８倍、１．８〜２倍、または２倍多いＳＴＩＮＧアゴニスト、例えば、サイクリック−ジＡＭＰを産生する。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より約３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、４０倍、または５０倍、１００倍、５００倍、または１０００倍多いＳＴＩＮＧアゴニスト、例えば、サイクリック−ジＡＭＰを産生する。
これらのＳＴＩＮＧアゴニストおよびチェックポイント阻害剤産生実施形態のいずれにおいても、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より０％〜２％、２％〜４％、４％〜６％、６％〜８％、８％〜１０％、１０％〜１２％、１２％〜１４％、１４％〜１６％、１６％〜１８％、１８％〜２０％、２０％〜２５％、２５％〜３０％、３０％〜３５％、３５％〜４０％、４０％〜４５％、４５％〜５０％、５０％〜５５％、５５％〜６０％、６０％〜６５％、６５％〜７０％〜８０％、８０％〜９０％、または９０％〜１００％多いＡＴＰを消費する。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より１．０〜１．２倍、１．２〜１．４倍、１．４〜１．６倍、１．６〜１．８倍、１．８〜２倍、または２倍多いアルギニンを消費する。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より約３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、１００倍、５００倍または１０００倍多いグルタメートを消費する。
これらのＳＴＩＮＧアゴニストおよびチェックポイント阻害剤産生実施形態のいずれにおいても、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ亜型の未改変細菌と比較して、細胞増殖を、少なくとも約１０％〜２０％、２０％〜２５％、２５％〜３０％、３０％〜４０％、４０％〜５０％、５０％〜６０％、６０％〜７０％、７０％〜７５％、７５％〜８０％、８０％〜８５％、８５％〜９０％、９０％〜９５％、９５％〜９９％またはそれよりも多く低下させることができる。これらのＳＴＩＮＧアゴニストおよびチェックポイント阻害剤産生実施形態のいずれにおいても、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ亜型の未改変細菌と比較して、腫瘍増殖を、少なくとも約１０％〜２０％、２０％〜２５％、２５％〜３０％、３０％〜４０％、４０％〜５０％、５０％〜６０％、６０％〜７０％、７０％〜７５％、７５％〜８０％、８０％〜８５％、８５％〜９０％、９０％〜９５％、９５％〜９９％またはそれよりも多く低下させることができる。これらのＳＴＩＮＧアゴニストおよびチェックポイント阻害剤産生実施形態のいずれにおいても、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ亜型の未改変細菌と比較して、腫瘍サイズを、少なくとも約１０％〜２０％、２０％〜２５％、２５％〜３０％、３０％〜４０％、４０％〜５０％、５０％〜６０％、６０％〜７０％、７０％〜７５％、７５％〜８０％、８０％〜８５％、８５％〜９０％、９０％〜９５％、９５％〜９９％またはそれよりも多く低下させることができる。これらのＳＴＩＮＧアゴニストおよびチェックポイント阻害剤産生実施形態のいずれにおいても、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ亜型の未改変細菌と比較して、腫瘍体積を、少なくとも約１０％〜２０％、２０％〜２５％、２５％〜３０％、３０％〜４０％、４０％〜５０％、５０％〜６０％、６０％〜７０％、７０％〜７５％、７５％〜８０％、８０％〜８５％、８５％〜９０％、９０％〜９５％、９５％〜９９％またはそれよりも多く低下させることができる。これらのＳＴＩＮＧアゴニストおよびチェックポイント阻害剤産生実施形態のいずれにおいても、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ亜型の未改変細菌と比較して、腫瘍重量を、少なくとも約１０％〜２０％、２０％〜２５％、２５％〜３０％、３０％〜４０％、４０％〜５０％、５０％〜６０％、６０％〜７０％、７０％〜７５％、７５％〜８０％、８０％〜８５％、８５％〜９０％、９０％〜９５％、９５％〜９９％またはそれよりも多く低下させることができる。
これらのＳＴＩＮＧアゴニストおよびチェックポイント阻害剤産生実施形態のいずれにおいても、遺伝子操作された微生物は、低酸素条件で、ならびに／あるいはがんの、および／または腫瘍微小環境の、または組織特異的分子もしくは代謝物の存在下で、ならびに／あるいは炎症または免疫抑制に関連する分子または代謝物の存在下で、ならびに／あるいは消化管内に存在しうる代謝物の存在下で、ならびに／あるいはｉｎ ｖｉｖｏで存在することもあり、しないこともあり、ｉｎ ｖｉｔｒｏで、株培養、拡大増殖、産生および／または製造中に存在することもある、代謝物、例えば、アラビノース、クメートおよびサリチレートおよび本明細書に記載の他のものの存在下で、ＳＴＩＮＧアゴニスト産生ならびにチェックポイント阻害剤産生、例えば、抗ＰＤ−１、抗ＰＤ−Ｌ１および／または抗ＣＴＬＡ−４産生のための記載の回路のうちいずれか１つまたは複数を発現することができる。一部の実施形態では、そのようなインデューサーをｉｎ ｖｉｖｏで投与して、エフェクター遺伝子発現を誘導することができる。一部の実施形態では、ＳＴＩＮＧアゴニスト産生ならびにチェックポイント阻害剤産生、例えば、抗ＰＤ−１、抗ＰＤ−Ｌ１および／または抗ＣＴＬＡ−４産生のための回路網をコードする遺伝子配列（複数可）は、そのような条件および／またはインデューサーによって誘導性のプロモーターによって制御される。一部の実施形態では、遺伝子配列（複数可）は、本明細書に記載される構成的プロモーターによって制御される。一部の実施形態では、遺伝子配列（複数可）は、構成的プロモーターによって制御され、本明細書に記載される通り、ｉｎ ｖｉｖｏ条件および／またはｉｎ ｖｉｔｒｏ条件において、例えば、拡大増殖、産生および／または製造中に発現される。
これらのＳＴＩＮＧアゴニスト産生ならびにチェックポイント阻害剤産生、例えば、抗ＰＤ−１、抗ＰＤ−Ｌ１および／または抗ＣＴＬＡ−４産生実施形態のいずれにおいても、記載のＳＴＩＮＧアゴニスト産生回路およびチェックポイント阻害剤産生回路のうちいずれか１つまたは複数は、１つもしくは複数のプラスミド（例えば、高コピー数または低コピー数プラスミド）上に存在するか、または微生物染色体内の１つもしくは複数の部位に組み込まれている。また、一部の実施形態では、遺伝子操作された微生物は、記載の回路のうちいずれか１つまたは複数をさらに発現することができ、次のうち１つまたは複数をさらに含む：（１）当技術分野で公知かつ本明細書に提供されるいずれかの栄養要求体、例えば、ｔｈｙＡおよび／またはｄａｐＡ栄養要求体等、１つまたは複数の栄養要求体、（２）本明細書に記載されるまたはそれ以外に当技術分野で公知のキルスイッチのいずれか等、１つまたは複数のキルスイッチ回路、（３）１つまたは複数の抗生物質抵抗性回路、（４）本明細書に記載されるまたはそれ以外に当技術分野で公知の輸送体のいずれか等、生物学的分子または基質を移入するための１つまたは複数の輸送体、（５）本明細書に記載されるおよびそれ以外に当技術分野で公知の分泌回路のいずれか等、１つまたは複数の分泌回路、（６）本明細書に記載されるおよびそれ以外に当技術分野で公知の表面ディスプレイ回路のいずれか等、１つまたは複数の表面ディスプレイ回路、ならびに（７）本明細書に記載される１つまたは複数の代謝物の産生または分解（例えば、アルギニン産生／アンモニア、トリプトファン、アルギニン産生／アンモニア、アルギニンおよびキヌレニン）のための１つまたは複数の回路、（８）そのような追加的な回路のうち１つまたは複数の組合せ。
これらの実施形態のいずれにおいても、ＳＴＩＮＧアゴニストを産生し、チェックポイント阻害剤産生回路を含むように遺伝子操作された１つまたは複数の細菌は、単独で、または抗ＣＴＬＡ４、抗ＰＤ１もしくは抗ＰＤ−Ｌ１抗体を含むがこれらに限定されない、本明細書に記載される１つもしくは複数の免疫チェックポイント阻害剤と組み合わせて投与することができる。これらの実施形態のいずれにおいても、ＳＴＩＮＧアゴニストを産生し、チェックポイント阻害剤産生回路を含むように遺伝子操作された１つまたは複数の細菌は、抗ＣＴＬＡ４、抗ＰＤ１または抗ＰＤ−Ｌ１抗体を含むがこれらに限定されない、本明細書に記載される１つまたは複数の免疫チェックポイント阻害剤を産生および分泌またはその表面にディスプレイするように遺伝子操作されうる。
これらの実施形態のいずれにおいても、ＳＴＩＮＧアゴニストを産生し、チェックポイント阻害剤産生回路を含むように遺伝子操作された１つまたは複数の細菌は、単独で、または本明細書に記載される１つもしくは複数の免疫刺激性アゴニスト、例えば、抗ＯＸ４０、抗４１ＢＢもしくは抗ＧＩＴＲ抗体を含むがこれらに限定されない、アゴニスト抗体と組み合わせて投与することができる。これらの実施形態のいずれにおいても、ＳＴＩＮＧアゴニストを産生し、チェックポイント阻害剤産生回路を含むように遺伝子操作された１つまたは複数の細菌は、本明細書に記載される１つまたは複数の免疫刺激性アゴニスト、例えば、抗ＯＸ４０、抗４１ＢＢまたは抗ＧＩＴＲ抗体を含むがこれらに限定されない、アゴニスト抗体を産生および分泌またはその表面にディスプレイするように遺伝子操作されうる。
ＳＴＩＮＧアゴニストおよび免疫刺激性アゴニスト
一部の実施形態では、１つまたは複数の遺伝子操作された細菌は、１つまたは複数の免疫刺激因子アゴニスト、例えば、抗ＯＸ４０、抗４１ＢＢおよび／または抗ＧＩＴＲ抗体をコードする１つまたは複数の遺伝子と組み合わせて、ＳＴＩＮＧアゴニスト（複数可）の産生のための酵素をコードする１つまたは複数の遺伝子を含む。一部の実施形態では、抗体は、細菌から分泌される。一部の実施形態では、抗体は、細菌の表面にディスプレイされる。一実施形態では、産生されるＳＴＩＮＧアゴニストは、ｃ−ジ−ＡＭＰである。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、１つまたは複数の免疫刺激因子アゴニスト、例えば、抗ＯＸ４０、抗４１ＢＢおよび／または抗ＧＩＴＲ抗体をコードする遺伝子配列と組み合わせて、ジアデニル酸シクラーゼをコードする遺伝子配列を含む。一部の実施形態では、１つまたは複数の遺伝子操作された細菌は、免疫刺激因子アゴニストの分泌を改善するための、ＤＯＭ（拡散性外膜）突然変異、例えば、ΔＰＡＬをさらに含む。一実施形態では、ジアデニル酸シクラーゼは、Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓに由来する。一実施形態では、免疫刺激因子アゴニストは、ＯＸ４０である。一実施形態では、免疫刺激因子アゴニストは、４１ＢＢである。一実施形態では、免疫刺激因子アゴニストは、ＧＩＴＲである。特異的な一実施形態では、チェックポイント阻害遺伝子回路網は、染色体に組み込まれ、低酸素プロモーター、例えば、ＦＮＲの制御下に置かれる。
代替実施形態では、本開示は、異なる遺伝子操作された細菌の組合せ（例えば、２つまたはそれよりも多く）を含む組成物であって、各細菌が、異なる免疫モジュレーターをコードする、組成物を提供する。したがって、一実施形態では、組成物は、１つまたは複数の免疫刺激因子アゴニスト、例えば、抗ＯＸ４０、抗４１ＢＢおよび／または抗ＧＩＴＲ抗体をコードする１つまたは複数の遺伝子を含む遺伝子操作された細菌と組み合わせて、ＳＴＩＮＧアゴニスト（複数可）の産生のための酵素をコードする１つまたは複数の遺伝子を含む遺伝子操作された細菌を含む。一実施形態では、産生されるＳＴＩＮＧアゴニストは、ｃ−ジ−ＡＭＰである。一実施形態では、組成物は、１つまたは複数の免疫刺激因子アゴニスト、例えば、抗ＯＸ４０、抗４１ＢＢおよび／または抗ＧＩＴＲ抗体をコードする遺伝子配列を含む遺伝子操作された細菌と組み合わせて、ジアデニル酸シクラーゼをコードする遺伝子配列を含む遺伝子操作された細菌を含む。一部の実施形態では、免疫刺激因子アゴニストをコードする遺伝子操作された細菌は、免疫刺激因子アゴニストの分泌を改善するための、ＤＯＭ（拡散性外膜）突然変異、例えば、ΔＰＡＬをさらに含む。一実施形態では、ジアデニル酸シクラーゼは、Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓに由来する。一実施形態では、免疫刺激因子アゴニストは、ＯＸ４０である。一実施形態では、免疫刺激因子アゴニストは、４１ＢＢである。一実施形態では、免疫刺激因子アゴニストは、ＧＩＴＲである。特異的な一実施形態では、チェックポイント阻害遺伝子回路網は、染色体に組み込まれ、低酸素プロモーター、例えば、ＦＮＲの制御下に置かれる。
これらのＳＴＩＮＧアゴニストおよび免疫刺激因子アゴニスト産生実施形態のいずれにおいても、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より少なくとも約０％〜２％〜４％、４％〜６％、６％〜８％、８％〜１０％、１０％〜１２％、１２％〜１４％、１４％〜１６％、１６％〜１８％、１８％〜２０％、２０％〜２５％、２５％〜３０％、３０％〜３５％、３５％〜４０％、４０％〜４５％、４５％〜５０％、５０％〜５５％、５５％〜６０％、６０％〜６５％、６５％〜７０％〜８０％、８０％〜９０％、または９０％〜１００％多いＳＴＩＮＧアゴニスト、例えば、サイクリック−ジ−ＡＭＰを産生する。
さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より少なくとも約１．０〜１．２倍、１．２〜１．４倍、１．４〜１．６倍、１．６〜１．８倍、１．８〜２倍、または２倍多いＳＴＩＮＧアゴニスト、例えば、サイクリック−ジ−ＡＭＰを産生する。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より約３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、４０倍、または５０倍、１００倍、５００倍、または１０００倍多いＳＴＩＮＧアゴニスト、例えば、サイクリック−ジ−ＡＭＰを産生する。
これらのＳＴＩＮＧアゴニストおよび免疫刺激因子アゴニスト産生実施形態のいずれにおいても、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より０％〜２％、２％〜４％、４％〜６％、６％〜８％、８％〜１０％、１０％〜１２％、１２％〜１４％、１４％〜１６％、１６％〜１８％、１８％〜２０％、２０％〜２５％、２５％〜３０％、３０％〜３５％、３５％〜４０％、４０％〜４５％、４５％〜５０％、５０％〜５５％、５５％〜６０％、６０％〜６５％、６５％〜７０％〜８０％、８０％〜９０％、または９０％〜１００％多いＡＴＰを消費する。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より１．０〜１．２倍、１．２〜１．４倍、１．４〜１．６倍、１．６〜１．８倍、１．８〜２倍、または２倍多いアルギニンを消費する。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より約３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、１００倍、５００倍、または１０００倍多いグルタメートを消費する。
これらのＳＴＩＮＧアゴニストおよび免疫刺激因子アゴニスト産生実施形態のいずれにおいても、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ亜型の未改変細菌と比較して、細胞増殖を、少なくとも約１０％〜２０％、２０％〜２５％、２５％〜３０％、３０％〜４０％、４０％〜５０％、５０％〜６０％、６０％〜７０％、７０％〜７５％、７５％〜８０％、８０％〜８５％、８５％〜９０％、９０％〜９５％、９５％〜９９％またはそれよりも多く低下させることができる。これらのＳＴＩＮＧアゴニストおよび免疫刺激因子アゴニスト産生実施形態のいずれにおいても、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ亜型の未改変細菌と比較して、腫瘍増殖を、少なくとも約１０％〜２０％、２０％〜２５％、２５％〜３０％、３０％〜４０％、４０％〜５０％、５０％〜６０％、６０％〜７０％、７０％〜７５％、７５％〜８０％、８０％〜８５％、８５％〜９０％、９０％〜９５％、９５％〜９９％またはそれよりも多く低下させることができる。これらのＳＴＩＮＧアゴニストおよび免疫刺激因子アゴニスト産生実施形態のいずれにおいても、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ亜型の未改変細菌と比較して、腫瘍サイズ増殖を、少なくとも約１０％〜２０％、２０％〜２５％、２５％〜３０％、３０％〜４０％、４０％〜５０％、５０％〜６０％、６０％〜７０％、７０％〜７５％、７５％〜８０％、８０％〜８５％、８５％〜９０％、９０％〜９５％、９５％〜９９％またはそれよりも多く低下させることができる。これらのＳＴＩＮＧアゴニストおよび免疫刺激因子アゴニスト産生実施形態のいずれにおいても、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ亜型の未改変細菌と比較して、腫瘍体積を、少なくとも約１０％〜２０％、２０％〜２５％、２５％〜３０％、３０％〜４０％、４０％〜５０％、５０％〜６０％、６０％〜７０％、７０％〜７５％、７５％〜８０％、８０％〜８５％、８５％〜９０％、９０％〜９５％、９５％〜９９％またはそれよりも多く低下させることができる。これらのＳＴＩＮＧアゴニストおよび免疫刺激因子アゴニスト産生実施形態のいずれにおいても、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ亜型の未改変細菌と比較して、腫瘍重量を、少なくとも約１０％〜２０％、２０％〜２５％、２５％〜３０％、３０％〜４０％、４０％〜５０％、５０％〜６０％、６０％〜７０％、７０％〜７５％、７５％〜８０％、８０％〜８５％、８５％〜９０％、９０％〜９５％、９５％〜９９％またはそれよりも多く低下させることができる。
これらのＳＴＩＮＧアゴニストおよび免疫刺激因子アゴニスト産生実施形態のいずれにおいても、遺伝子操作された微生物は、低酸素条件で、ならびに／あるいはがんの、および／または腫瘍微小環境の、または組織特異的分子もしくは代謝物の存在下で、ならびに／あるいは炎症または免疫抑制に関連する分子または代謝物の存在下で、ならびに／あるいは消化管内に存在しうる代謝物の存在下で、ならびに／あるいはｉｎ ｖｉｖｏで存在することもあり、しないこともあり、ｉｎ ｖｉｔｒｏで、株培養、拡大増殖、産生および／または製造中に存在することもある、代謝物、例えば、アラビノース、クメートおよびサリチレートおよび本明細書に記載の他のものの存在下で、ＳＴＩＮＧアゴニスト産生ならびに免疫刺激因子アゴニスト産生、例えば、抗ＯＸ４０、抗４１ＢＢおよび／または抗ＧＩＴＲ産生のための記載の回路のうちいずれか１つまたは複数を発現することができる。一部の実施形態では、そのようなインデューサーをｉｎ ｖｉｖｏで投与して、エフェクター遺伝子発現を誘導することができる。一部の実施形態では、ＳＴＩＮＧアゴニスト産生ならびに免疫刺激因子アゴニスト産生、例えば、抗ＯＸ４０、抗４１ＢＢおよび／または抗ＧＩＴＲ産生のための回路網をコードする遺伝子配列（複数可）は、そのような条件および／またはインデューサーによって誘導性のプロモーターによって制御される。一部の実施形態では、遺伝子配列は、本明細書に記載の構成的プロモーターによって制御される。一部の実施形態では、遺伝子配列は、構成的プロモーターによって制御され、本明細書に記載の、ｉｎ ｖｉｖｏ条件および／またはｉｎ ｖｉｔｒｏ条件で、例えば、拡大増殖、産生および／または製造中に発現される。
これらのＳＴＩＮＧアゴニスト産生ならびに免疫刺激因子アゴニスト産生、例えば、抗ＯＸ４０、抗４１ＢＢおよび／または抗ＧＩＴＲ産生実施形態のいずれにおいても、記載のＳＴＩＮＧアゴニスト産生回路および免疫刺激因子アゴニスト産生回路のうちいずれか１つまたは複数は、１つもしくは複数のプラスミド（例えば、高コピー数または低コピー数プラスミド）上に存在するか、または微生物染色体内の１つもしくは複数の部位に組み込まれている。また、一部の実施形態では、遺伝子操作された微生物は、記載の回路のうちいずれか１つまたは複数をさらに発現することができ、次のうち１つまたは複数をさらに含む：（１）当技術分野で公知かつ本明細書に提供されるいずれかの栄養要求体、例えば、ｔｈｙＡおよび／またはｄａｐＡ栄養要求体等、１つまたは複数の栄養要求体、（２）本明細書に記載されるまたはそれ以外に当技術分野で公知のキルスイッチのいずれか等、１つまたは複数のキルスイッチ回路、（３）１つまたは複数の抗生物質抵抗性回路、（４）本明細書に記載されるまたはそれ以外に当技術分野で公知の輸送体のいずれか等、生物学的分子または基質を移入するための１つまたは複数の輸送体、（５）本明細書に記載されるおよびそれ以外に当技術分野で公知の分泌回路のいずれか等、１つまたは複数の分泌回路、（６）本明細書に記載されるおよびそれ以外に当技術分野で公知の表面ディスプレイ回路のいずれか等、１つまたは複数の表面ディスプレイ回路、ならびに（７）本明細書に記載される１つまたは複数の代謝物の産生または分解（例えば、アルギニン産生／アンモニア、トリプトファン、アルギニン産生／アンモニア、アルギニンおよびキヌレニン）のための１つまたは複数の回路、（８）そのような追加的な回路のうち１つまたは複数の組合せ。
これらの実施形態のいずれにおいても、ＳＴＩＮＧアゴニストを産生し、免疫刺激因子アゴニスト産生回路を含むように遺伝子操作された１つまたは複数の細菌は、単独で、または抗ＣＴＬＡ−４、抗ＰＤ−１もしくは抗ＰＤ−Ｌ１抗体を含むがこれらに限定されない、本明細書に記載される１つもしくは複数の免疫刺激因子アゴニストと組み合わせて投与することができる。これらの実施形態のいずれにおいても、ＳＴＩＮＧアゴニストを産生し、免疫刺激因子アゴニスト産生回路を含むように遺伝子操作された１つまたは複数の細菌は、抗ＣＴＬＡ−４、抗ＰＤ−１または抗ＰＤ−Ｌ１抗体を含むがこれらに限定されない、本明細書に記載される１つまたは複数の免疫刺激因子アゴニストを産生および分泌またはその表面にディスプレイするように遺伝子操作されうる。
これらの実施形態のいずれにおいても、ＳＴＩＮＧアゴニストを産生し、免疫刺激因子アゴニスト産生回路を含むように遺伝子操作された１つまたは複数の細菌は、単独で、または本明細書に記載される１つもしくは複数の免疫刺激性アゴニスト、例えば、抗ＯＸ４０、抗４１ＢＢもしくは抗ＧＩＴＲ抗体を含むがこれらに限定されない、アゴニスト抗体と組み合わせて投与することができる。これらの実施形態のいずれにおいても、ＳＴＩＮＧアゴニストを産生し、免疫刺激因子アゴニスト産生回路を含むように遺伝子操作された１つまたは複数の細菌は、本明細書に記載される１つまたは複数の免疫刺激性アゴニスト、例えば、抗ＯＸ４０、抗４１ＢＢまたは抗ＧＩＴＲ抗体を含むがこれらに限定されない、アゴニスト抗体を産生および分泌またはその表面にディスプレイするように遺伝子操作されうる。
５−ＦＣから５−ＦＵへの組合せ
一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、キヌレニンの消費のための酵素をコードする１つまたは複数の遺伝子と組み合わせて、５−ＦＣの５−ＦＵへの変換のための酵素をコードする１つまたは複数の遺伝子を含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、キヌレニナーゼをコードする遺伝子配列と組み合わせて、シトシンデアミナーゼをコードする遺伝子配列を含む。一実施形態では、シトシンデアミナーゼは、Ｅ．ｃｏｌｉからのものである。一実施形態では、シトシンデアミナーゼは、酵母からのものである。一実施形態では、キヌレニナーゼは、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓからのものである。１つの特定の実施形態では、シトシンデアミナーゼは、Ｅ．ｃｏｌｉからのものであり、キヌレニナーゼは、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓからのものである。一実施形態では、キヌレニナーゼは、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓからのものである。１つの特定の実施形態では、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ
ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓからのキヌレニナーゼは、染色体に組み込まれており、構成的プロモーターの制御下にある。
代替実施形態では、本開示は、各細菌が異なる免疫モジュレーターをコードする、異なる遺伝子操作された細菌の組合せ（例えば、２つまたはそれより多く）を含む、組成物を提供する。したがって、一実施形態では、組成物は、キヌレニンの消費のための酵素をコードする１つまたは複数の遺伝子を含む遺伝子操作された細菌と組み合わせて、５−ＦＣの５−ＦＵへの変換のための酵素をコードする１つまたは複数の遺伝子を含む遺伝子操作された細菌を含む。一実施形態では、組成物は、キヌレニナーゼをコードする遺伝子配列を含む遺伝子操作された細菌と組み合わせて、シトシンデアミナーゼをコードする遺伝子配列を含む遺伝子操作された細菌を含む。一実施形態では、シトシンデアミナーゼは、Ｅ．ｃｏｌｉからのものである。一実施形態では、シトシンデアミナーゼは、酵母からのものである。一実施形態では、キヌレニナーゼは、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓからのものである。１つの特定の実施形態では、シトシンデアミナーゼは、Ｅ．ｃｏｌｉからのものであり、キヌレニナーゼは、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓからのものである。一実施形態では、キヌレニナーゼは、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓからのものである。１つの特定の実施形態では、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓからのキヌレニナーゼは、染色体に組み込まれており、構成的プロモーターの制御下にある。
これらの５−ＦＣから５−ＦＵへの変換およびキヌレニン消費実施形態のいずれにおいても、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より少なくとも約０％〜２％〜４％、４％〜６％、６％〜８％、８％〜１０％、１０％〜１２％、１２％〜１４％、１４％〜１６％、１６％〜１８％、１８％〜２０％、２０％〜２５％、２５％〜３０％、３０％〜３５％、３５％〜４０％、４０％〜４５％、４５％〜５０％、５０％〜５５％、５５％〜６０％、６０％〜６５％、６５％〜７０％〜８０％、８０％〜９０％、または９０％〜１００％多いＳＴＩＮＧアゴニスト、例えば、サイクリック−ジ−ＡＭＰを産生する。
これらの５−ＦＣから５−ＦＵへの変換およびキヌレニン消費実施形態のいずれにおいても、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より０％〜２％〜４％、４％〜６％、６％〜８％、８％〜１０％、１０％〜１２％、１２％〜１４％、１４％〜１６％、１６％〜１８％、１８％〜２０％、２０％〜２５％、２５％〜３０％、３０％〜３５％、３５％〜４０％、４０％〜４５％、４５％〜５０％、５０％〜５５％、５５％〜６０％、６０％〜６５％、６５％〜７０％〜８０％、８０％〜９０％、または９０％〜１００％多いキヌレニンを消費する。
さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より１．０〜１．２倍、１．２〜１．４倍、１．４〜１．６倍、１．６〜１．８倍、１．８〜２倍、または２倍多い５−ＦＣを５−ＦＵへと変換する。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より約３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、４０倍、または５０倍、１００倍、５００倍、または１０００倍多い５−ＦＵを産生する。
さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より１．０〜１．２倍、１．２〜１．４倍、１．４〜１．６倍、１．６〜１．８倍、１．８〜２倍、または２倍多いキヌレニンを消費する。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より約３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、４０倍、または５０倍、１００倍、５００倍、または１０００倍多いキヌレニンを消費する。
これらの５−ＦＣから５−ＦＵへの変換およびキヌレニン消費実施形態のいずれにおいても、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より０％〜２％〜４％、４％〜６％、６％〜８％、８％〜１０％、１０％〜１２％、１２％〜１４％、１４％〜１６％、１６％〜１８％、１８％〜２０％、２０％〜２５％、２５％〜３０％、３０％〜３５％、３５％〜４０％、４０％〜４５％、４５％〜５０％、５０％〜５５％、５５％〜６０％、６０％〜６５％、６５％〜７０％〜８０％、８０％〜９０％、または９０％〜１００％多い５−ＦＣを消費する。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より１．０〜１．２倍、１．２〜１．４倍、１．４〜１．６倍、１．６〜１．８倍、１．８〜２倍、または２倍多い５−ＦＣを消費する。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より約３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、１００倍、５００倍または１０００倍多い５−ＦＣを消費する。
これらの５−ＦＣから５−ＦＵへの変換およびキヌレニン消費実施形態のいずれにおいても、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より少なくとも約０％〜２％〜４％、４％〜６％、６％〜８％、８％〜１０％、１０％〜１２％、１２％〜１４％、１４％〜１６％、１６％〜１８％、１８％〜２０％、２０％〜２５％、２５％〜３０％、３０％〜３５％、３５％〜４０％、４０％〜４５％、４５％〜５０％、５０％〜５５％、５５％〜６０％、６０％〜６５％、６５％〜７０％〜８０％、８０％〜９０％、または９０％〜１００％多いトリプトファンを産生する。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より少なくとも約１．０〜１．２倍、１．２〜１．４倍、１．４〜１．６倍、１．６〜１．８倍、１．８〜２倍、または２倍多いトリプトファンを産生する。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より約３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、１００倍、５００倍または１０００倍多いトリプトファンを産生する。
これらの５−ＦＣから５−ＦＵへの変換およびキヌレニン消費実施形態のいずれにおいても、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ亜型の未改変細菌と比較して、細胞増殖を、少なくとも約１０％〜２０％、２０％〜２５％、２５％〜３０％、３０％〜４０％、４０％〜５０％、５０％〜６０％、６０％〜７０％、７０％〜７５％、７５％〜８０％、８０％〜８５％、８５％〜９０％、９０％〜９５％、９５％〜９９％またはそれよりも多く低下させることができる。これらの５−ＦＣから５−ＦＵへの変換およびキヌレニン消費実施形態のいずれにおいても、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ亜型の未改変細菌と比較して、腫瘍増殖を、少なくとも約１０％〜２０％、２０％〜２５％、２５％〜３０％、３０％〜４０％、４０％〜５０％、５０％〜６０％、６０％〜７０％、７０％〜７５％、７５％〜８０％、８０％〜８５％、８５％〜９０％、９０％〜９５％、９５％〜９９％またはそれよりも多く低下させることができる。これらの５−ＦＣから５−ＦＵへの変換およびキヌレニン消費実施形態のいずれにおいても、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ亜型の未改変細菌と比較して、腫瘍サイズを、少なくとも約１０％〜２０％、２０％〜２５％、２５％〜３０％、３０％〜４０％、４０％〜５０％、５０％〜６０％、６０％〜７０％、７０％〜７５％、７５％〜８０％、８０％〜８５％、８５％〜９０％、９０％〜９５％、９５％〜９９％またはそれよりも多く低下させることができる。これらの５−ＦＣから５−ＦＵへの変換およびキヌレニン消費実施形態のいずれにおいても、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ亜型の未改変細菌と比較して、腫瘍体積を、少なくとも約１０％〜２０％、２０％〜２５％、２５％〜３０％、３０％〜４０％、４０％〜５０％、５０％〜６０％、６０％〜７０％、７０％〜７５％、７５％〜８０％、８０％〜８５％、８５％〜９０％、９０％〜９５％、９５％〜９９％またはそれよりも多く低下させることができる。これらの５−ＦＣから５−ＦＵへの変換およびキヌレニン消費実施形態のいずれにおいても、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ亜型の未改変細菌と比較して、腫瘍重量を、少なくとも約１０％〜２０％、２０％〜２５％、２５％〜３０％、３０％〜４０％、４０％〜５０％、５０％〜６０％、６０％〜７０％、７０％〜７５％、７５％〜８０％、８０％〜８５％、８５％〜９０％、９０％〜９５％、９５％〜９９％またはそれよりも多く低下させることができる。
一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、アデノシンの消費のための酵素をコードする１つまたは複数の遺伝子と組み合わせて、５−ＦＣの５−ＦＵへの変換のための酵素をコードする１つまたは複数の遺伝子を含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、アデノシン分解経路をコードする遺伝子配列と組み合わせて、シトシンデアミナーゼをコードする遺伝子配列を含む。一実施形態では、シトシンデアミナーゼは、Ｅ．ｃｏｌｉからのものである。一実施形態では、シトシンデアミナーゼは、酵母からのものである。一実施形態では、アデノシン分解経路酵素をコードする遺伝子配列は、ｘｄｈＡ、ｘｄｈＢ、ｘｄｈＣ、ａｄｄ、ｘａｐＡ、ｄｅｏＤおよびｎｕｐＣから選択される１つまたは複数の遺伝子を含む。一実施形態では、アデノシン分解経路をコードする遺伝子配列は、ｘｄｈＡ、ｘｄｈＢ、ｘｄｈＣ、ａｄｄ、ｘａｐＡ、ｄｅｏＤおよびｎｕｐＣを含む。一実施形態では、アデノシン経路酵素は、Ｅ ｃｏｌｉからのものである。１つの特定の実施形態では、シトシンデアミナーゼは、Ｅ．ｃｏｌｉからのものであり、アデノシン分解経路をコードする遺伝子配列は、例えばＥ．ｃｏｌｉからの、ｘｄｈＡ、ｘｄｈＢ、ｘｄｈＣ、ａｄｄ、ｘａｐＡ、ｄｅｏＤおよびｎｕｐＣを含む。１つの特定の実施形態では、アデノシン経路酵素は、染色体に組み込まれており、低酸素プロモーター、例えばＦＮＲ、の制御下にある。
代替実施形態では、本開示は、各細菌が異なる免疫モジュレーターをコードする、異なる遺伝子操作された細菌の組合せ（例えば、２つまたはそれより多く）を含む、組成物を提供する。したがって、一実施形態では、組成物は、アデノシンの消費のための酵素をコードする１つまたは複数の遺伝子と組み合わせて、５−ＦＣの５−ＦＵへの変換のための酵素をコードする１つまたは複数の遺伝子を含む、遺伝子操作された細菌を含む。一実施形態では、組成物は、アデノシン分解経路をコードする遺伝子配列を含む遺伝子操作された細菌と組み合わせて、シトシンデアミナーゼをコードする遺伝子配列を含む遺伝子操作された細菌を含む。一実施形態では、シトシンデアミナーゼは、Ｅ．ｃｏｌｉからのものである。一実施形態では、シトシンデアミナーゼは、酵母からのものである。一実施形態では、アデノシン分解経路酵素をコードする遺伝子配列は、ｘｄｈＡ、ｘｄｈＢ、ｘｄｈＣ、ａｄｄ、ｘａｐＡ、ｄｅｏＤおよびｎｕｐＣから選択される１つまたは複数の遺伝子を含む。一実施形態では、アデノシン分解経路をコードする遺伝子配列は、ｘｄｈＡ、ｘｄｈＢ、ｘｄｈＣ、ａｄｄ、ｘａｐＡ、ｄｅｏＤおよびｎｕｐＣを含む。一実施形態では、アデノシン経路酵素は、Ｅ ｃｏｌｉからのものである。１つの特定の実施形態では、シトシンデアミナーゼは、Ｅ．ｃｏｌｉからのものであり、アデノシン分解経路をコードする遺伝子配列は、例えばＥ．ｃｏｌｉからの、ｘｄｈＡ、ｘｄｈＢ、ｘｄｈＣ、ａｄｄ、ｘａｐＡ、ｄｅｏＤおよびｎｕｐＣを含む。１つの特定の実施形態では、アデノシン経路酵素は、染色体に組み込まれており、低酸素プロモーター、例えばＦＮＲ、の制御下にある。
これらの５−ＦＣから５−ＦＵへの変換およびアデノシン消費実施形態のいずれにおいても、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より少なくとも約０％〜２％、２％〜４％、４％〜６％、６％〜８％、８％〜１０％、１０％〜１２％、１２％〜１４％、１４％〜１６％、１６％〜１８％、１８％〜２０％、２０％〜２５％、２５％〜３０％、３０％〜３５％、３５％〜４０％、４０％〜４５％、４５％〜５０％、５０％〜５５％、５５％〜６０％、６０％〜６５％、６５％〜７０％〜８０％、８０％〜９０％、または９０％〜１００％多いＳＴＩＮＧアゴニスト、例えば、サイクリック−ジ−ＡＭＰを産生する。
これらの５−ＦＣから５−ＦＵへの変換およびアデノシン消費実施形態のいずれにおいても、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より０％〜２％、２％〜４％、４％〜６％、６％〜８％、８％〜１０％、１０％〜１２％、１２％〜１４％、１４％〜１６％、１６％〜１８％、１８％〜２０％、２０％〜２５％、２５％〜３０％、３０％〜３５％、３５％〜４０％、４０％〜４５％、４５％〜５０％、５０％〜５５％、５５％〜６０％、６０％〜６５％、６５％〜７０％〜８０％、８０％〜９０％、または９０％〜１００％多いアデノシンを消費する。
さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より少なくとも約１．０〜１．２倍、１．２〜１．４倍、１．４〜１．６倍、１．６〜１．８倍、１．８〜２倍、または２倍多い５−ＦＵを産生する。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より約３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、４０倍、または５０倍、１００倍、５００倍、または１０００倍多い５−ＦＵを産生する。
さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より１．０〜１．２倍、１．２〜１．４倍、１．４〜１．６倍、１．６〜１．８倍、１．８〜２倍、または２倍多いアデノシンを消費する。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より約３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、４０倍、または５０倍、１００倍、５００倍、または１０００倍多いアデノシンを消費する。
これらの５−ＦＣから５−ＦＵへの変換およびアデノシン消費実施形態のいずれにおいても、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より０％〜２％〜４％、４％〜６％、６％〜８％、８％〜１０％、１０％〜１２％、１２％〜１４％、１４％〜１６％、１６％〜１８％、１８％〜２０％、２０％〜２５％、２５％〜３０％、３０％〜３５％、３５％〜４０％、４０％〜４５％、４５％〜５０％、５０％〜５５％、５５％〜６０％、６０％〜６５％、６５％〜７０％〜８０％、８０％〜９０％、または９０％〜１００％多い５−ＦＣを消費する。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より１．０〜１．２倍、１．２〜１．４倍、１．４〜１．６倍、１．６〜１．８倍、１．８〜２倍、または２倍多いアデノシンを消費する。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より約３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、１００倍、５００倍または１０００倍多い５−ＦＣを消費する。
これらの５−ＦＣから５−ＦＵへの変換およびアデノシン消費実施形態のいずれにおいても、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より少なくとも約０％〜２％〜４％、４％〜６％、６％〜８％、８％〜１０％、１０％〜１２％、１２％〜１４％、１４％〜１６％、１６％〜１８％、１８％〜２０％、２０％〜２５％、２５％〜３０％、３０％〜３５％、３５％〜４０％、４０％〜４５％、４５％〜５０％、５０％〜５５％、５５％〜６０％、６０％〜６５％、６５％〜７０％〜８０％、８０％〜９０％、または９０％〜１００％多いウレート（ｕｒａｔｅ）を産生する。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より少なくとも約１．０〜１．２倍、１．２〜１．４倍、１．４〜１．６倍、１．６〜１．８倍、１．８〜２倍、または２倍多いウレートを産生する。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より約３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、１００倍、５００倍または１０００倍多いウレートを産生する。
これらの５−ＦＣから５−ＦＵへの変換およびアデノシン消費実施形態のいずれにおいても、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ亜型の未改変細菌と比較して、細胞増殖を、少なくとも約１０％〜２０％、２０％〜２５％、２５％〜３０％、３０％〜４０％、４０％〜５０％、５０％〜６０％、６０％〜７０％、７０％〜７５％、７５％〜８０％、８０％〜８５％、８５％〜９０％、９０％〜９５％、９５％〜９９％またはそれよりも多く低下させることができる。これらのＳＴＩＮＧアゴニスト産生およびアデノシン消費実施形態のいずれにおいても、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ亜型の未改変細菌と比較して、腫瘍増殖を、少なくとも約１０％〜２０％、２０％〜２５％、２５％〜３０％、３０％〜４０％、４０％〜５０％、５０％〜６０％、６０％〜７０％、７０％〜７５％、７５％〜８０％、８０％〜８５％、８５％〜９０％、９０％〜９５％、９５％〜９９％またはそれよりも多く低下させることができる。これらの５−ＦＣから５−ＦＵへの変換およびアデノシン消費実施形態のいずれにおいても、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ亜型の未改変細菌と比較して、腫瘍サイズを、少なくとも約１０％〜２０％、２０％〜２５％、２５％〜３０％、３０％〜４０％、４０％〜５０％、５０％〜６０％、６０％〜７０％、７０％〜７５％、７５％〜８０％、８０％〜８５％、８５％〜９０％、９０％〜９５％、９５％〜９９％またはそれよりも多く低下させることができる。これらの５−ＦＣから５−ＦＵへの変換およびアデノシン消費実施形態のいずれにおいても、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ亜型の未改変細菌と比較して、腫瘍体積を、少なくとも約１０％〜２０％、２０％〜２５％、２５％〜３０％、３０％〜４０％、４０％〜５０％、５０％〜６０％、６０％〜７０％、７０％〜７５％、７５％〜８０％、８０％〜８５％、８５％〜９０％、９０％〜９５％、９５％〜９９％またはそれよりも多く低下させることができる。これらの５−ＦＣから５−ＦＵへの変換およびアデノシン消費実施形態のいずれにおいても、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ亜型の未改変細菌と比較して、腫瘍重量を、少なくとも約１０％〜２０％、２０％〜２５％、２５％〜３０％、３０％〜４０％、４０％〜５０％、５０％〜６０％、６０％〜７０％、７０％〜７５％、７５％〜８０％、８０％〜８５％、８５％〜９０％、９０％〜９５％、９５％〜９９％またはそれよりも多く低下させることができる。
一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、アルギニンの産生のための酵素をコードする１つまたは複数の遺伝子と組み合わせて、５−ＦＵの産生のための酵素をコードする１つまたは複数の遺伝子を含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、アルギニン産生経路をコードする遺伝子配列と組み合わせて、シトシンデアミナーゼをコードする遺伝子配列を含む。一実施形態では、シトシンデアミナーゼは、Ｅ．ｃｏｌｉからのものである。一実施形態では、シトシンデアミナーゼは、酵母からのものである。一実施形態では、アルギニン産生回路をコードする遺伝子配列は、フィードバック耐性ＡｒｇＡ（ＡｒｇＡｆｂｒ）を含み、内在性アルギニンオペロンリプレッサーＡｒｇＲの欠失を含む。一実施形態では、ＡｒｇＡｆｂｒは、Ｅ ｃｏｌｉからのものである。特異的な一実施形態では、ＡｒｇＡｆｂｒは、染色体に組み込まれ、低酸素プロモーター、例えば、ＦＮＲの制御下に置かれる。
代替実施形態では、本開示は、各細菌が異なる免疫モジュレーターをコードする、異なる遺伝子操作された細菌の組合せ（例えば、２つまたはそれより多く）を含む、組成物を提供する。したがって、一実施形態では、組成物は、アルギニンの産生のための酵素をコードする１つまたは複数の遺伝子を含む遺伝子操作された細菌と組み合わせて、５−ＦＵの産生のための酵素をコードする１つまたは複数の遺伝子を含む遺伝子操作された細菌を含む。一実施形態では、組成物は、アルギニン産生経路をコードする遺伝子配列を含む遺伝子操作された細菌と組み合わせて、シトシンデアミナーゼをコードする遺伝子配列を含む遺伝子操作された細菌を含む。一実施形態では、シトシンデアミナーゼは、Ｅ．ｃｏｌｉからのものである。一実施形態では、シトシンデアミナーゼは、酵母からのものである。一実施形態では、アルギニン産生回路をコードする遺伝子配列は、フィードバック耐性ＡｒｇＡ（ＡｒｇＡｆｂｒ）を含み、内在性アルギニンオペロンリプレッサーＡｒｇＲの欠失を含む。一実施形態では、ＡｒｇＡｆｂｒは、Ｅ ｃｏｌｉからのものである。特異的な一実施形態では、ＡｒｇＡｆｂｒは、染色体に組み込まれ、低酸素プロモーター、例えば、ＦＮＲの制御下に置かれる。
これらの５−ＦＣから５−ＦＵへの変換およびアルギニン産生実施形態のいずれにおいても、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より少なくとも約０％〜２％〜４％、４％〜６％、６％〜８％、８％〜１０％、１０％〜１２％、１２％〜１４％、１４％〜１６％、１６％〜１８％、１８％〜２０％、２０％〜２５％、２５％〜３０％、３０％〜３５％、３５％〜４０％、４０％〜４５％、４５％〜５０％、５０％〜５５％、５５％〜６０％、６０％〜６５％、６５％〜７０％〜８０％、８０％〜９０％、または９０％〜１００％多い５−ＦＵを産生する。
５−ＦＣから５−ＦＵへの変換およびアルギニン産生実施形態のいずれにおいても、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より少なくとも約０％〜２％、２％〜４％、４％〜６％、６％〜８％、８％〜１０％、１０％〜１２％、１２％〜１４％、１４％〜１６％、１６％〜１８％、１８％〜２０％、２０％〜２５％、２５％〜３０％、３０％〜３５％、３５％〜４０％、４０％〜４５％、４５％〜５０％、５０％〜５５％、５５％〜６０％、６０％〜６５％、６５％〜７０％〜８０％、８０％〜９０％、または９０％〜１００％多いアルギニンを産生する。
さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より少なくとも約１．０〜１．２倍、１．２〜１．４倍、１．４〜１．６倍、１．６〜１．８倍、１．８〜２倍、または２倍多い５−ＦＵを産生する。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より約３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、４０倍、または５０倍、１００倍、５００倍、または１０００倍多い５−ＦＵを産生する。
さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より少なくとも約１．０〜１．２倍、１．２〜１．４倍、１．４〜１．６倍、１．６〜１．８倍、１．８〜２倍、または２倍多いアルギニンを産生する。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より約３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、４０倍、または５０倍、１００倍、５００倍、または１０００倍多いアルギニンを産生する。
これらの５−ＦＣから５−ＦＵへの変換およびアルギニン産生実施形態のいずれにおいても、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より０％〜２％、２％〜４％、４％〜６％、６％〜８％、８％〜１０％、１０％〜１２％、１２％〜１４％、１４％〜１６％、１６％〜１８％、１８％〜２０％、２０％〜２５％、２５％〜３０％、３０％〜３５％、３５％〜４０％、４０％〜４５％、４５％〜５０％、５０％〜５５％、５５％〜６０％、６０％〜６５％、６５％〜７０％〜８０％、８０％〜９０％、または９０％〜１００％多い５−ＦＣを消費する。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より１．０〜１．２倍、１．２〜１．４倍、１．４〜１．６倍、１．６〜１．８倍、１．８〜２倍、または２倍多い５−ＦＣを消費する。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より約３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、１００倍、５００倍、または１０００倍多い５ＦＣを消費する。
これらの５−ＦＣから５−ＦＵへの変換およびアルギニン産生実施形態のいずれにおいても、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より０％〜２％、２％〜４％、４％〜６％、６％〜８％、８％〜１０％、１０％〜１２％、１２％〜１４％、１４％〜１６％、１６％〜１８％、１８％〜２０％、２０％〜２５％、２５％〜３０％、３０％〜３５％、３５％〜４０％、４０％〜４５％、４５％〜５０％、５０％〜５５％、５５％〜６０％、６０％〜６５％、６５％〜７０％〜８０％、８０％〜９０％、または９０％〜１００％多いグルタメートを消費する。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より１．０〜１．２倍、１．２〜１．４倍、１．４〜１．６倍、１．６〜１．８倍、１．８〜２倍、または２倍多いグルタメートを消費する。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より約３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、１００倍、５００倍、または１０００倍多いグルタメートを消費する。
これらの５−ＦＣから５−ＦＵへの変換およびアルギニン産生実施形態のいずれにおいても、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ亜型の未改変細菌と比較して、細胞増殖を、少なくとも約１０％〜２０％、２０％〜２５％、２５％〜３０％、３０％〜４０％、４０％〜５０％、５０％〜６０％、６０％〜７０％、７０％〜７５％、７５％〜８０％、８０％〜８５％、８５％〜９０％、９０％〜９５％、９５％〜９９％またはそれよりも多く低下させることができる。これらの５−ＦＣから５−ＦＵへの変換およびアルギニン産生実施形態のいずれにおいても、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ亜型の未改変細菌と比較して、腫瘍増殖を、少なくとも約１０％〜２０％、２０％〜２５％、２５％〜３０％、３０％〜４０％、４０％〜５０％、５０％〜６０％、６０％〜７０％、７０％〜７５％、７５％〜８０％、８０％〜８５％、８５％〜９０％、９０％〜９５％、９５％〜９９％またはそれよりも多く低下させることができる。これらの５−ＦＣから５−ＦＵへの変換およびアルギニン産生実施形態のいずれにおいても、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ亜型の未改変細菌と比較して、腫瘍サイズを、少なくとも約１０％〜２０％、２０％〜２５％、２５％〜３０％、３０％〜４０％、４０％〜５０％、５０％〜６０％、６０％〜７０％、７０％〜７５％、７５％〜８０％、８０％〜８５％、８５％〜９０％、９０％〜９５％、９５％〜９９％またはそれよりも多く低下させることができる。これらの５−ＦＣから５−ＦＵへの変換およびアルギニン産生実施形態のいずれにおいても、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ亜型の未改変細菌と比較して、腫瘍体積を、少なくとも約１０％〜２０％、２０％〜２５％、２５％〜３０％、３０％〜４０％、４０％〜５０％、５０％〜６０％、６０％〜７０％、７０％〜７５％、７５％〜８０％、８０％〜８５％、８５％〜９０％、９０％〜９５％、９５％〜９９％またはそれよりも多く低下させることができる。これらの５−ＦＣから５−ＦＵへの変換およびアルギニン産生実施形態のいずれにおいても、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ亜型の未改変細菌と比較して、腫瘍重量を、少なくとも約１０％〜２０％、２０％〜２５％、２５％〜３０％、３０％〜４０％、４０％〜５０％、５０％〜６０％、６０％〜７０％、７０％〜７５％、７５％〜８０％、８０％〜８５％、８５％〜９０％、９０％〜９５％、９５％〜９９％またはそれよりも多く低下させることができる。
免疫活性化およびプライミングを免疫増強と組み合わせるこれらの実施形態のいずれにおいても、免疫活性化およびプライミングを標的化するためのエフェクターをコードする遺伝子配列、ならびに免疫増強のためのエフェクターをコードする遺伝子配列を、１つまたは複数の直接または間接誘導性プロモーターに作動可能に連結させることができる。一部の実施形態では、２つまたはそれより多い遺伝子配列は、外因性環境条件下で、例えば、消化管内に見られる条件、腫瘍微小環境または他の組織特異的条件下で誘導される直接または間接誘導性プロモーターに作動可能に連結している。一部の実施形態では、２つまたはそれより多い遺伝子配列は、消化管内に見られる代謝物、腫瘍微小環境または他の特異的条件によって誘導される直接または間接誘導性プロモーターに作動可能に連結している。一部の実施形態では、２つまたはそれより多い遺伝子配列は、低酸素または嫌気条件下で誘導される直接または間接誘導性プロモーターに作動可能に連結している。一部の実施形態では、２つまたはそれより多い遺伝子配列は、本明細書に記載の炎症性条件（例えば、ＲＮＳ、ＲＯＳ）下で誘導される直接または間接誘導性プロモーターに作動可能に連結している。一部の実施形態では、２つまたはそれより多い遺伝子配列は、本明細書に記載の、例えば腫瘍内に見られるような、免疫抑制性条件下で誘導される直接または間接誘導性プロモーターに作動可能に連結している。一部の実施形態では、２つまたはそれより多い遺伝子配列は、ｉｎ ｖｉｖｏ条件下で存在することもあり、しないこともあり、およびｉｎ ｖｉｔｒｏ条件（例えば、株培養、拡大増殖、製造）中に存在することもある、化学的または栄養学的インデューサー、例えば、テトラサイクリンもしくはアラビノース、クメートおよびサリチレート、または本明細書に記載の他のものへの曝露によって誘導される直接または間接誘導性プロモーターに連結されている。一部の実施形態では、２つまたはそれより多いペイロードは、すべてが構成的プロモーターに連結されている。適切な構成的プロモーターは、本明細書に記載されている。一部の実施形態では、２つまたはそれより多い遺伝子配列は、同じプロモーター配列に作動可能に連結している。一部の実施形態では、２つまたはそれより多い遺伝子配列は、２つまたはそれより多い異なるプロモーター配列に作動可能に連結しており、プロモーター配列は、すべてが構成的（同じもしくは異なる構成的プロモーター）であることもあり、すべてが誘導性（同じもしくは異なるインデューサーによって誘導可能）であることもあり、または構成的プロモーターと誘導性プロモーターの混合物であることもある。
上記免疫活性化および免疫増強組合せ実施形態のいずれにおいても、１つまたは複数の免疫活性化および免疫増強エフェクターを産生するための遺伝子配列は、細菌の染色体上に存在しうる。上記組合せ実施形態のいずれにおいても、１つまたは複数の免疫活性化および免疫増強エフェクターを産生するための遺伝子配列は、細菌のプラスミド上に存在しうる。上記組合せ実施形態のいずれにおいても、１つまたは複数の免疫活性化および免疫増強エフェクターを産生するための遺伝子配列は、細菌のプラスミド上にも染色体上にも存在しうる。上記組合せ実施形態のいずれにおいても、細菌は、細胞生存および／または成長に必要な遺伝子の欠失または突然変異を含む栄養要求株でありえ、例えば、遺伝子は、ｔｈｙＡ、ｄａｐＤおよびｄａｐＡから選択される。上記組合せ実施形態のいずれにおいても、遺伝子操作された細菌は、キルスイッチを含むことができる。
一部の免疫イニシエーターおよびサステナー組合せおよび／または組成物において、遺伝子操作された微生物は、低酸素条件で、ならびに／あるいはがんおよび／または腫瘍微小環境、または組織特異的分子もしくは代謝物の存在下で、ならびに／あるいは炎症または免疫抑制に関連する分子または代謝物の存在下で、ならびに／あるいは消化管内に存在しうる代謝物の存在下で、ならびに／あるいはｉｎ ｖｉｖｏで存在することもあり、しないこともあり、ならびにｉｎ ｖｉｔｒｏで株培養、拡大増殖、産生および／または製造中に存在することもある、代謝物、例えば、アラビノース、クメートおよびサリチレートおよび本明細書に記載の他のものの存在下で、記載の免疫イニシエーター回路および免疫サステナー回路のいずれか１つまたは複数を発現することができる。一部の実施形態では、そのようなインデューサーをｉｎ ｖｉｖｏで投与して、エフェクター遺伝子発現を誘導することができる。一部の免疫イニシエーターおよびサステナー組合せおよび／または組成物において、免疫イニシエーターおよび免疫サステナーの回路網をコードする遺伝子配列は、そのような条件および／またはインデューサーにより誘導されうるプロモーターによって制御される。一部の実施形態では、遺伝子配列は、本明細書に記載の構成的プロモーターによって制御される。一部の実施形態では、遺伝子配列は、構成的プロモーターにより制御され、本明細書に記載の、ｉｎ ｖｉｖｏ条件および／またはｉｎ ｖｉｔｒｏ条件で、例えば、拡大増殖、産生および／または製造中に発現される。
これらの免疫イニシエーターおよびサステナー組合せおよび／または組成物のいずれにおいても、免疫イニシエーター回路および免疫サステナー回路のいずれか１つまたは複数は、１つもしくは複数のプラスミド（例えば、高コピー数もしくは低コピー数プラスミド）上に存在するか、または微生物染色体内の１つもしくは複数の部位に組み込まれている。また、一部の実施形態では、遺伝子操作された微生物は、記載の回路のいずれか１つまたは複数をさらに発現することができ、以下のものの１つまたは複数をさらに含む：（１）１つまたは複数の栄養要求体、例えば、当技術分野において公知の、および本明細書で提供される、任意の栄養要求体、例えばｔｈｙＡおよび／またはｄｐａＡ栄養要求体、（２）１つまたは複数のキルスイッチ回路、例えば、本明細書に記載の、またはそうでなければ当技術分野において公知の、キルスイッチのいずれか、（３）１つまたは複数の抗生物質耐性回路、（４）生体分子または基質を移入するための１つまたは複数の輸送体、例えば、本明細書に記載の、またはそうでなければ当技術分野において公知の、輸送体のいずれか、（５）１つまたは複数の分泌回路、例えば、本明細書に記載の、でなければ当技術分野において公知の、分泌回路のいずれか、（６）１つまたは複数の表面提示回路、例えば、本明細書に記載の、でなければ当技術分野において公知の、表面提示回路のいずれか、および（７）本明細書に記載の１つまたは複数の代謝物（例えば、キヌレニン、トリプトファン、アデノシン、アルギニン）の産生または分解のための１つまたは複数の回路、（８）このような追加の回路の１つまたは複数の組合せ。これらの実施形態のいずれにおいても、アデノシンおよびキヌレニンを消費するように遺伝子操作された細菌を単独で投与することができ、または抗ＣＴＬＡ４、抗ＰＤ１もしくは抗ＰＤ−Ｌ１抗体を含むがこれらに限定されない、本明細書に記載の１つもしくは複数の免疫チェックポイントインヒビターと組み合わせて投与することができる。
微生物が、１つまたは複数の免疫イニシエーター回路および免疫サステナー回路を発現するように遺伝子操作された、これらの実施形態のいずれにおいても、微生物は、先ず、より高いレベルの免疫刺激因子を産生し、後に、免疫サステナーを産生することができる。これらの免疫イニシエーター／サステナー実施形態のいずれにおいても、免疫イニシエーターの発現は、インデューサーによって誘導されうる。これらの免疫イニシエーター／サステナー実施形態のいずれにおいても、免疫サステナーは、インデューサーによって誘導されうる。これらの免疫イニシエーター／サステナー実施形態のいずれにおいても、免疫イニシエーターおよび免疫サステナーの両方は、１つまたは複数のインデューサーによって誘導されうる。第１のインデューサー（免疫刺激因子発現を誘導）および第２のインデューサー（免疫サステナー発現を誘導）は、同じまたは異なるインデューサーとなることができる。これらの免疫イニシエーター／サステナー実施形態のいずれにおいても、第１のインデューサーおよび第２のインデューサーは、逐次にまたは同時発生的に投与することができる。インデューサーの非限定的な例は、ｉｎ ｖｉｖｏ条件、例えば、消化管もしくは腫瘍微小環境の条件（例えば、低酸素、ある特定の栄養素等）、細胞培養もしくはｉｎ ｖｉｔｒｏ成長の際の条件、またはｉｎ ｖｉｔｒｏもしくはｉｎ ｖｉｖｏで用いることができる化学的インデューサー（例えば、アラビノース、クメートおよびサリチレート、ＩＰＴＧまたは本明細書に記載される他の化学的インデューサー）を含む。これらの免疫イニシエーター／サステナー実施形態のいずれにおいても、免疫イニシエーターおよび免疫サステナーの両方は、本明細書に記載されるものを含むがこれらに限定されない、構成的プロモーターによって制御されうる、またはこれに直接的にもしくは間接的に連結されうる。これらの免疫イニシエーター／サステナー実施形態のいずれにおいても、免疫イニシエーターは、誘導性プロモーターによって制御されうる、またはこれに直接的にもしくは間接的に連結されうる、かつ免疫サステナーは、構成的プロモーターによって制御されうる、またはこれに直接的にもしくは間接的に連結されうる。これらの免疫イニシエーター／サステナー実施形態のいずれにおいても、免疫イニシエーターは、構成的プロモーターによって制御されうる、またはこれに直接的にもしくは間接的に連結されうる、かつ免疫サステナーは、誘導性プロモーターによって制御されうる、またはこれに直接的にもしくは間接的に連結されうる。
これらの免疫イニシエーター／サステナー実施形態のいずれにおいても、免疫開始のための回路網を発現する細菌株は、免疫持続のための回路網を発現する別々の細菌株と併せて投与することができる。例えば、免疫イニシエーター回路網を発現する遺伝子操作された細菌の１つまたは複数の株、および免疫サステナー回路網を発現する遺伝子操作された細菌の１つまたは複数の別々の株は、逐次に投与することができ、例えば、免疫刺激因子は、免疫サステナーの前に投与することができる。別の例では、免疫イニシエーター株は、免疫サステナー株の後に投与することができる。さらに別の例では、免疫イニシエーター株は、免疫サステナー株と同時発生的に投与することができる。
これらの免疫イニシエーター／サステナー実施形態のいずれにおいても、投与の順序またはタイミング（同時発生的または逐次）に関係なく、操作された株は、投与後逐次にまたは同時発生的に、免疫サステナーのための回路網を発現することができる、すなわち、発現のタイミングおよびレベルは、プロモーターおよびリボソーム結合部位を含むがこれらに限定されない、本明細書に記載される１つまたは複数の機構を使用して調整される。
代謝回路の組合せ
アデノシンおよびキヌレニン消費
一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、１つまたは複数の代謝物を産生および／または消費する回路網を含む。あるいは、本開示は、各細菌が１つまたは複数の代謝基質の産生および／または消費のための１つまたは複数の酵素をコードする、異なる遺伝子操作された細菌の組合せ（例えば、２つまたはそれより多く）を含む、組成物を提供する。そのような別個のまたは異なる菌株を同時にまたは逐次的に投与することができる。そのような基質の非限定的な例は、キヌレニン、トリプトファン、アデノシンおよびアルギニンを含む。
本明細書に記載される回路、エフェクターまたは免疫モジュレーターの各組合せは、１つの細菌株における組合せ回路網として、あるいは、組合せの１つまたは複数の回路をそれぞれ発現する２つまたはそれよりも多い異なるまたは別々の細菌株において提供することができる。例えば、キヌレニンの消費のための回路網およびアルギニンの産生のための遺伝子回路網を含む１つまたは複数の遺伝子操作された細菌は、両方の回路を含む１つの株において、または回路のうち少なくとも１つをそれぞれ含む２つもしくはそれよりも多い株において提供することができる。
一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、アデノシンの分解およびキヌレニンの消費のための回路網を含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、アデノシン分解経路と組み合わせてキヌレニナーゼをコードする遺伝子配列を含む。一実施形態では、キヌレニナーゼは、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓからのものである。１つの特定の実施形態では、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓからのキヌレニナーゼは、染色体に組み込まれており、構成的プロモーターの制御下にある。一実施形態では、アデノシン分解経路酵素をコードする遺伝子配列は、ｘｄｈＡ、ｘｄｈＢ、ｘｄｈＣ、ａｄｄ、ｘａｐＡ、ｄｅｏＤおよびｎｕｐＣから選択される１つまたは複数の遺伝子を含む。一実施形態では、アデノシン分解経路をコードする遺伝子配列は、ｘｄｈＡ、ｘｄｈＢ、ｘｄｈＣ、ａｄｄ、ｘａｐＡ、ｄｅｏＤおよびｎｕｐＣを含む。一実施形態では、アデノシン経路酵素は、Ｅ ｃｏｌｉからのものである。１つの特定の実施形態では、キヌレニナーゼは、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓからのものであり、アデノシン分解経路をコードする遺伝子配列は、例えばＥ．ｃｏｌｉからの、ｘｄｈＡ、ｘｄｈＢ、ｘｄｈＣ、ａｄｄ、ｘａｐＡ、ｄｅｏＤおよびｎｕｐＣを含む。１つの特定の実施形態では、アデノシン経路酵素は、染色体に組み込まれており、低酸素プロモーター、例えばＦＮＲ、の制御下にある。これらの実施形態のいずれにおいても、ＴｒｐＥを欠失させることができる。
代替実施形態では、本開示は、各細菌が異なる免疫モジュレーターをコードする、異なる遺伝子操作された細菌の組合せ（例えば、２つまたはそれより多く）を含む、組成物を提供する。したがって、一部の実施形態では、組成物は、アデノシンの分解のための回路網を含む遺伝子操作された細菌、および遺伝子操作された細菌、キヌレニンの消費を含む。一実施形態では、組成物は、アデノシン分解経路をコードする遺伝子配列を含む遺伝子操作された細菌と組み合わせて、キヌレニナーゼをコードする遺伝子配列を含む遺伝子操作された細菌を含む。これらの実施形態のいずれにおいても、ＴｒｐＥを欠失させることができる。
一実施形態では、キヌレニナーゼは、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓからのものである。１つの特定の実施形態では、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓからのキヌレニナーゼは、染色体に組み込まれており、構成的プロモーターの制御下にある。一実施形態では、アデノシン分解経路酵素をコードする遺伝子配列は、ｘｄｈＡ、ｘｄｈＢ、ｘｄｈＣ、ａｄｄ、ｘａｐＡ、ｄｅｏＤおよびｎｕｐＣから選択される１つまたは複数の遺伝子を含む。一実施形態では、アデノシン分解経路をコードする遺伝子配列は、ｘｄｈＡ、ｘｄｈＢ、ｘｄｈＣ、ａｄｄ、ｘａｐＡ、ｄｅｏＤおよびｎｕｐＣを含む。一実施形態では、アデノシン経路酵素は、Ｅ ｃｏｌｉからのものである。１つの特定の実施形態では、キヌレニナーゼは、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓからのものであり、アデノシン分解経路をコードする遺伝子配列は、例えばＥ．ｃｏｌｉからの、ｘｄｈＡ、ｘｄｈＢ、ｘｄｈＣ、ａｄｄ、ｘａｐＡ、ｄｅｏＤおよびｎｕｐＣを含む。１つの特定の実施形態では、アデノシン経路酵素は、染色体に組み込まれており、低酸素プロモーター、例えばＦＮＲ、の制御下にある。これらの実施形態のいずれにおいても、ＴｒｐＥを欠失させることができる。
これらのアデノシンおよびキヌレニン消費実施形態のいずれにおいても、アデノシンおよびキヌレニンを消費するように遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より０％〜２％〜４％、４％〜６％、６％〜８％、８％〜１０％、１０％〜１２％、１２％〜１４％、１４％〜１６％、１６％〜１８％、１８％〜２０％、２０％〜２５％、２５％〜３０％、３０％〜３５％、３５％〜４０％、４０％〜４５％、４５％〜５０％、５０％〜５５％、５５％〜６０％、６０％〜６５％、６５％〜７０％〜８０％、８０％〜９０％、または９０％〜１００％多いアデノシンを消費する。さらに別の実施形態では、アデノシンおよびキヌレニンを消費するように遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より１．０〜１．２倍、１．２〜１．４倍、１．４〜１．６倍、１．６〜１．８倍、１．８〜２倍、または２倍多いアデノシンを消費する。さらに別の実施形態では、アデノシンおよびキヌレニンを消費するように遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より約３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、１００倍、５００倍、または１０００倍多いアデノシンを消費する。
これらのアデノシンおよびキヌレニン消費実施形態のいずれにおいても、アデノシンおよびキヌレニンを消費するように遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より少なくとも約０％〜２％〜４％、４％〜６％、６％〜８％、８％〜１０％、１０％〜１２％、１２％〜１４％、１４％〜１６％、１６％〜１８％、１８％〜２０％、２０％〜２５％、２５％〜３０％、３０％〜３５％、３５％〜４０％、４０％〜４５％、４５％〜５０％、５０％〜５５％、５５％〜６０％、６０％〜６５％、６５％〜７０％〜８０％、８０％〜９０％、または９０％〜１００％多い尿酸を産生する。さらに別の実施形態では、アデノシンおよびキヌレニンを消費するように遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より少なくとも約１．０〜１．２倍、１．２〜１．４倍、１．４〜１．６倍、１．６〜１．８倍、１．８〜２倍、または２倍多い尿酸を産生する。さらに別の実施形態では、アデノシンおよびキヌレニンを消費するように遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より約３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、４０倍、または５０倍、１００倍、５００倍、または１０００倍多い尿酸を産生する。
これらのアデノシンおよびキヌレニン消費実施形態のいずれにおいても、アデノシンおよびキヌレニンを消費するように遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌と比較して、アデノシン分解速度を０％〜２％〜４％、４％〜６％、６％〜８％、８％〜１０％、１０％〜１２％、１２％〜１４％、１４％〜１６％、１６％〜１８％、１８％〜２０％、２０％〜２５％、２５％〜３０％、３０％〜３５％、３５％〜４０％、４０％〜４５％、４５％〜５０％、５０％〜５５％、５５％〜６０％、６０％〜６５％、６５％〜７０％〜８０％、８０％〜９０％、または９０％〜１００％上昇させる。さらに別の実施形態では、アデノシンおよびキヌレニンを消費するように遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌と比較して、アデノシン分解速度を１．０〜１．２倍、１．２〜１．４倍、１．４〜１．６倍、１．６〜１．８倍、１．８〜２倍、または２倍大きく上昇させる。さらに別の実施形態では、アデノシンおよびキヌレニンを消費するように遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌と比較して、分解速度を約３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、４０倍、または５０倍、１００倍、５００倍、または１０００倍上昇させる。
これらのアデノシンおよびキヌレニン消費実施形態のいずれにおいても、アデノシンおよびキヌレニンを消費するように遺伝子操作された細菌は、低酸素条件下で誘導されたとき、約１．８〜１０ｕｍｏｌ／ｈｒ／１０９細胞のアデノシン分解速度を有しうる。１つの特定の実施形態では、アデノシンおよびキヌレニンを消費するように遺伝子操作された細菌は、約５〜９ｕｍｏｌ／ｈｒ／１０９細胞のアデノシン分解速度を有する。１つの特定の実施形態では、アデノシンおよびキヌレニンを消費するように遺伝子操作された細菌は、約６〜８ｕｍｏｌ／ｈｒ／１０９細胞のアデノシン分解速度を有する。
これらのアデノシンおよびキヌレニン消費実施形態のいずれにおいても、アデノシンおよびキヌレニンを消費するように遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、すなわち、低酸素条件下で誘導されたとき、１時間後、同じ細菌亜型の未改変細菌と比較して、アデノシン分解を約５０％〜７０％増加させることができる。一実施形態では、アデノシンおよびキヌレニンを消費するように遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、すなわち、低酸素条件下で誘導されたとき、１時間後、同じ細菌亜型の未改変細菌と比較して、アデノシン分解を約５５％〜６５％増加させる。１つの特定の実施形態では、アデノシンおよびキヌレニンを消費するように遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、すなわち、低酸素条件下で誘導されたとき、１時間後、同じ細菌亜型の未改変細菌と比較して、アデノシン分解を約５５％〜６０％増加させる。さらに別の実施形態では、アデノシンおよびキヌレニンを消費するように遺伝子操作された細菌は、低酸素条件下で誘導されたとき、１時間後、アデノシン分解を約１．５〜３倍増加させる。１つの特定の実施形態では、アデノシンおよびキヌレニンを消費するように遺伝子操作された細菌は、低酸素条件下で誘導されたとき、１時間後、アデノシン分解を約２〜２．５倍増加させる。
１つのアデノシンおよびキヌレニン消費実施形態では、細菌は、同じ条件下で、すなわち、低酸素条件下で誘導されたとき、２時間後、同じ細菌亜型の未改変細菌と比較して、アデノシン分解を約８５％〜１００％増加させる。一実施形態では、アデノシンおよびキヌレニンを消費するように遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、すなわち、低酸素条件下で誘導されたとき、２時間後、同じ細菌亜型の未改変細菌と比較して、アデノシン分解を約９５％〜１００％増加させる。１つの特定の実施形態では、アデノシンおよびキヌレニンを消費するように遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、すなわち、低酸素条件下で誘導されたとき、２時間後、同じ細菌亜型の未改変細菌と比較して、アデノシン分解を約９７％〜９９％増加させる。
１つのアデノシンおよびキヌレニン消費実施形態では、アデノシンおよびキヌレニンを消費するように遺伝子操作された細菌は、低酸素条件下で誘導されたとき、２時間後、アデノシン分解を約４０〜５０倍増加させることができる。１つの特定の実施形態では、アデノシンおよびキヌレニンを消費するように遺伝子操作された細菌は、低酸素条件下で誘導されたとき、２時間後、アデノシン分解を約４４〜４８倍増加させる。
１つのアデノシンおよびキヌレニン消費実施形態では、アデノシンおよびキヌレニンを消費するように遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、すなわち、低酸素条件下で誘導されたとき、３時間後、同じ細菌亜型の未改変細菌と比較して、アデノシン分解を約９５％〜１００％増加させる。一実施形態では、アデノシンおよびキヌレニンを消費するように遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、すなわち、低酸素条件下で誘導されたとき、３時間後、同じ細菌亜型の未改変細菌と比較して、アデノシン分解を約９８％〜１００％増加させる。１つの特定の実施形態では、アデノシンおよびキヌレニンを消費するように遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、すなわち、低酸素条件下で誘導されたとき、３時間後、同じ細菌亜型の未改変細菌と比較して、アデノシン分解を約９９％〜９９％増加させる。さらに別の実施形態では、アデノシンおよびキヌレニンを消費するように遺伝子操作された細菌は、低酸素条件下で誘導されたとき、３時間後、アデノシン分解を約１００〜１０００倍増加させる。さらに別の実施形態では、アデノシンおよびキヌレニンを消費するように遺伝子操作された細菌は、低酸素条件下で誘導されたとき、３時間後、アデノシン分解を約１０００〜１００００倍増加させる。
１つのアデノシンおよびキヌレニン消費実施形態では、アデノシンおよびキヌレニンを消費するように遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、すなわち、低酸素条件下で誘導されたとき、４時間後、同じ細菌亜型の未改変細菌と比較して、アデノシン分解を約９５％〜１００％増加させる。一実施形態では、アデノシンおよびキヌレニンを消費するように遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、すなわち、低酸素条件下で誘導されたとき、４時間後、同じ細菌亜型の未改変細菌と比較して、アデノシン分解を約９８％〜１００％増加させる。一実施形態では、アデノシンおよびキヌレニンを消費するように遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、すなわち、低酸素条件下で誘導されたとき、４時間後、同じ細菌亜型の未改変細菌と比較して、アデノシン分解を約９９％〜９９％増加させる。さらに別の実施形態では、アデノシンおよびキヌレニンを消費するように遺伝子操作された細菌は、低酸素条件下で誘導されたとき、４時間後、アデノシン分解を約１００〜１０００倍増加させる。さらに別の実施形態では、アデノシンおよびキヌレニンを消費するように遺伝子操作された細菌は、低酸素条件下で誘導されたとき、４時間後、アデノシン分解を約１０００〜１００００倍増加させる。
これらのアデノシンおよびキヌレニン消費実施形態のいずれにおいても、細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より０％〜２％〜４％、４％〜６％、６％〜８％、８％〜１０％、１０％〜１２％、１２％〜１４％、１４％〜１６％、１６％〜１８％、１８％〜２０％、２０％〜２５％、２５％〜３０％、３０％〜３５％、３５％〜４０％、４０％〜４５％、４５％〜５０％、５０％〜５５％、５５％〜６０％、６０％〜６５％、６５％〜７０％〜８０％、８０％〜９０％、または９０％〜１００％多いキヌレニンを消費する。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より１．０〜１．２倍、１．２〜１．４倍、１．４〜１．６倍、１．６〜１．８倍、１．８〜２倍、または２倍多いキヌレニンを消費する。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より約３倍、４倍、約３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、１００倍、５００倍、または１０００倍多いキヌレニンを消費する。
これらのアデノシンおよびキヌレニン消費実施形態のいずれにおいても、キヌレニンを消費するように、および必要に応じて、トリプトファンを産生するように、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より少なくとも約０％〜２％〜４％、４％〜６％、６％〜８％、８％〜１０％、１０％〜１２％、１２％〜１４％、１４％〜１６％、１６％〜１８％、１８％〜２０％、２０％〜２５％、２５％〜３０％、３０％〜３５％、３５％〜４０％、４０％〜４５％、４５％〜５０％、５０％〜５５％、５５％〜６０％、６０％〜６５％、６５％〜７０％〜８０％、８０％〜９０％、または９０％〜１００％多いトリプトファンを産生する。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より少なくとも約１．０〜１．２倍、１．２〜１．４倍、１．４〜１．６倍、１．６〜１．８倍、１．８〜２倍、または２倍多いトリプトファンを産生する。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より約３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、４０倍、または５０倍、１００倍、５００倍、または１０００倍多いトリプトファンを産生する。
これらのアデノシンおよびキヌレニン消費実施形態のいずれにおいても、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌と比較して、キヌレニン消費速度を０％〜２％〜４％、４％〜６％、６％〜８％、８％〜１０％、１０％〜１２％、１２％〜１４％、１４％〜１６％、１６％〜１８％、１８％〜２０％、２０％〜２５％、２５％〜３０％、３０％〜３５％、３５％〜４０％、４０％〜４５％、４５％〜５０％、５０％〜５５％、５５％〜６０％、６０％〜６５％、６５％〜７０％〜８０％、８０％〜９０％、または９０％〜１００％上昇させる。さらに別のアデノシンおよびキヌレニン消費実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌と比較して、キヌレニン消費速度を１．０〜１．２倍、１．２〜１．４倍、１．４〜１．６倍、１．６〜１．８倍、１．８〜２倍、または２倍大きく上昇させる。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌と比較して、キヌレニン消費速度を約３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、４０倍、または５０倍、１００倍、５００倍、または１０００倍上昇させる。
１つのアデノシンおよびキヌレニン消費実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、４時間後、同じ細菌亜型の未改変細菌と比較して、キヌレニン消費を約８０％〜１００％増加させる。１つのアデノシンおよびキヌレニン消費実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、４時間後、同じ細菌亜型の未改変細菌と比較して、キヌレニン消費を約９０％〜１００％増加させる。１つの特定のアデノシンおよびキヌレニン消費実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、４時間後、同じ細菌亜型の未改変細菌と比較して、キヌレニン消費を約９５％〜１００％増加させる。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、４時間後、同じ細菌亜型の未改変細菌と比較して、キヌレニン消費を約９９％〜１００％増加させる。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、キヌレニン消費を、４時間後、約１０〜５０倍増加させる。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、キヌレニン消費を、４時間後、約５０〜１００倍増加させる。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、キヌレニン消費を、４時間後、約１００〜５００倍増加させる。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、キヌレニン消費を、４時間後、約５００〜１０００倍増加させる。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、キヌレニン消費を、４時間後、約１０００〜５０００倍増加させる。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、キヌレニン消費を、４時間後、約５０００〜１００００倍増加させる。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、キヌレニン消費を、４時間後、約１００００〜１０００倍増加させる。
これらのアデノシンおよびキヌレニン消費実施形態のいずれにおいても、遺伝子操作された細菌は、細胞増殖を、同じ条件下で、同じ亜型の未改変細菌と比較して少なくとも約
１０％〜２０％、２０％〜２５％、２５％〜３０％、３０％〜４０％、４０％〜５０％、５０％〜６０％、６０％〜７０％、７０％〜７５％、７５％〜８０％、８０％〜８５％、８５％〜９０％、９０％〜９５％、９５％〜９９％、またはそれより大きく低減させることができる。これらのアデノシンおよびキヌレニン消費実施形態のいずれにおいても、遺伝子操作された細菌は、腫瘍成長を、同じ条件下で、同じ亜型の未改変細菌と比較して少なくとも約
１０％〜２０％、２０％〜２５％、２５％〜３０％、３０％〜４０％、４０％〜５０％、５０％〜６０％、６０％〜７０％、７０％〜７５％、７５％〜８０％、８０％〜８５％、８５％〜９０％、９０％〜９５％、９５％〜９９％、またはそれより大きく低減させることができる。これらのアデノシンおよびキヌレニン消費実施形態のいずれにおいても、遺伝子操作された細菌は、腫瘍サイズを、同じ条件下で、同じ亜型の未改変細菌と比較して少なくとも約
１０％〜２０％、２０％〜２５％、２５％〜３０％、３０％〜４０％、４０％〜５０％、５０％〜６０％、６０％〜７０％、７０％〜７５％、７５％〜８０％、８０％〜８５％、８５％〜９０％、９０％〜９５％、９５％〜９９％、またはそれより大きく低減させることができる。これらのアデノシンおよびキヌレニン消費実施形態のいずれにおいても、遺伝子操作された細菌は、腫瘍体積を、同じ条件下で、同じ亜型の未改変細菌と比較して少なくとも約
１０％〜２０％、２０％〜２５％、２５％〜３０％、３０％〜４０％、４０％〜５０％、５０％〜６０％、６０％〜７０％、７０％〜７５％、７５％〜８０％、８０％〜８５％、８５％〜９０％、９０％〜９５％、９５％〜９９％、またはそれより大きく低減させることができる。これらのアデノシンおよびキヌレニン消費実施形態のいずれにおいても、遺伝子操作された細菌は、腫瘍重量を、同じ条件下で、同じ亜型の未改変細菌と比較して少なくとも約
１０％〜２０％、２０％〜２５％、２５％〜３０％、３０％〜４０％、４０％〜５０％、５０％〜６０％、６０％〜７０％、７０％〜７５％、７５％〜８０％、８０％〜８５％、８５％〜９０％、９０％〜９５％、９５％〜９９％、またはそれより大きく低減させることができる。
一部のアデノシンおよびキヌレニン消費実施形態では、遺伝子操作された微生物は、低酸素条件で、ならびに／あるいはがんおよび／または腫瘍微小環境、または組織特異的分子もしくは代謝物の存在下で、ならびに／あるいは炎症または免疫抑制に関連する分子または代謝物の存在下で、ならびに／あるいは消化管内に存在しうる代謝物の存在下で、ならびに／あるいはｉｎ ｖｉｖｏで存在することもあり、しないこともあり、ならびにｉｎ ｖｉｔｒｏで株培養、拡大増殖、産生および／または製造中に存在することもある、代謝物、例えば、アラビノース、クメートおよびサリチレートおよび本明細書に記載の他のものの存在下で、アデノシンおよびキヌレニンの分解のための記載の回路のいずれか１つまたは複数を発現することができる。一部の実施形態では、このようなインデューサーはｉｎ ｖｉｖｏで投与され得、エフェクター遺伝子発現を誘導する。一部の実施形態では、アデノシンおよび／またはキヌレニンの分解のための回路網をコードする遺伝子配列は、そのような条件および／またはインデューサーにより誘導されうるプロモーターによって制御される。一部の実施形態では、遺伝子配列は、本明細書に記載の構成的プロモーターによって制御される。一部の実施形態では、遺伝子配列は、構成的プロモーターにより制御され、本明細書に記載の、ｉｎ ｖｉｖｏ条件および／またはｉｎ ｖｉｔｒｏ条件で、例えば、拡大増殖、産生および／または製造中に発現される。
これらのアデノシンおよびキヌレニン消費実施形態のいずれにおいても、記載のアデノシン分解回路およびキヌレニン消費回路のいずれか１つまたは複数は、１つもしくは複数のプラスミド（例えば、高コピー数もしくは低コピー数プラスミド）上に存在するか、または微生物染色体内の１つもしくは複数の部位に組み込まれている。また、一部の実施形態では、遺伝子操作された微生物は、記載の回路のいずれか１つまたは複数をさらに発現することができ、以下のものの１つまたは複数をさらに含む：（１）１つまたは複数の栄養要求体、例えば、当技術分野において公知の、および本明細書で提供される、任意の栄養要求体、例えばｔｈｙＡおよび／またはｄｐａＡ栄養要求体、（２）１つまたは複数のキルスイッチ回路、例えば、本明細書に記載の、またはそうでなければ当技術分野において公知の、キルスイッチのいずれか、（３）１つまたは複数の抗生物質耐性回路、（４）生体分子または基質を移入するための１つまたは複数の輸送体、例えば、本明細書に記載の、またはそうでなければ当技術分野において公知の、輸送体のいずれか、（５）１つまたは複数の分泌回路、例えば、本明細書に記載の、でなければ当技術分野において公知の、分泌回路のいずれか、（６）１つまたは複数の表面提示回路、例えば、本明細書に記載の、でなければ当技術分野において公知の、表面提示回路のいずれか、および（７）本明細書に記載の１つまたは複数の代謝物（例えば、キヌレニン、トリプトファン、アデノシン、アルギニン）の産生または分解のための１つまたは複数の回路、（８）このような追加の回路の１つまたは複数の組合せ。
これらの実施形態のいずれにおいても、アデノシンおよびキヌレニンを消費するように遺伝子操作された１つまたは複数の細菌は、単独で、または抗ＣＴＬＡ４、抗ＰＤ１もしくは抗ＰＤ−Ｌ１抗体を含むがこれらに限定されない、本明細書に記載される１つもしくは複数の免疫チェックポイント阻害剤と組み合わせて投与することができる。これらの実施形態のいずれにおいても、アデノシンおよびキヌレニンを消費するように遺伝子操作された１つまたは複数の細菌は、抗ＣＴＬＡ４、抗ＰＤ１または抗ＰＤ−Ｌ１抗体を含むがこれらに限定されない、本明細書に記載される１つまたは複数の免疫チェックポイント阻害剤を産生および分泌またはその表面にディスプレイするように遺伝子操作されうる。
これらの実施形態のいずれにおいても、アデノシンおよびキヌレニンを消費するように遺伝子操作された１つまたは複数の細菌は、単独で、または本明細書に記載される１つもしくは複数の免疫刺激性アゴニスト、例えば、抗ＯＸ４０、抗４１ＢＢもしくは抗ＧＩＴＲ抗体を含むがこれらに限定されない、アゴニスト抗体と組み合わせて投与することができる。これらの実施形態のいずれにおいても、アデノシンおよびキヌレニンを消費するように遺伝子操作された１つまたは複数の細菌は、本明細書に記載される１つまたは複数の免疫刺激性アゴニスト、例えば、抗ＯＸ４０、抗４１ＢＢまたは抗ＧＩＴＲ抗体を含むがこれらに限定されない、アゴニスト抗体を産生および分泌またはその表面にディスプレイするように遺伝子操作されうる。
アデノシン消費およびアルギニン産生
一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、アデノシンの分解およびアルギニンの産生および／またはアンモニアの消費のための回路網を含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、アデノシン分解経路と組み合わせてアルギニン産生および／またはアンモニア消費回路をコードする遺伝子配列を含む。一実施形態では、アルギニン産生および／またはアンモニア消費回路をコードする遺伝子配列は、フィードバック耐性ＡｒｇＡ（ＡｒｇＡｆｂｒ）を含み、内在性アルギニンオペロンリプレッサーＡｒｇＲの欠失を含む。一実施形態では、ＡｒｇＡｆｂｒは、Ｅ ｃｏｌｉからのものである。１つの特定の実施形態では、ＡｒｇＡｆｂｒは、染色体に組み込まれており、低酸素プロモーター、例えばＦＮＲの制御下にある。
一実施形態では、アデノシン分解経路酵素をコードする遺伝子配列は、ｘｄｈＡ、ｘｄｈＢ、ｘｄｈＣ、ａｄｄ、ｘａｐＡ、ｄｅｏＤおよびｎｕｐＣから選択される１つまたは複数の遺伝子を含む。一実施形態では、アデノシン分解経路をコードする遺伝子配列は、ｘｄｈＡ、ｘｄｈＢ、ｘｄｈＣ、ａｄｄ、ｘａｐＡ、ｄｅｏＤおよびｎｕｐＣを含む。一実施形態では、アデノシン経路酵素は、Ｅ ｃｏｌｉからのものである。１つの特定の実施形態では、フィードバック耐性ＡｒｇＡ（ＡｒｇＡｆｂｒ）は、Ｅ．ｃｏｌｉからのものであり、アデノシン分解経路をコードする遺伝子配列は、例えばＥ．ｃｏｌｉからの、ｘｄｈＡ、ｘｄｈＢ、ｘｄｈＣ、ａｄｄ、ｘａｐＡ、ｄｅｏＤおよびｎｕｐＣを含む。１つの特定の実施形態では、アデノシン経路酵素は、染色体に組み込まれており、低酸素プロモーター、例えばＦＮＲ、の制御下にある。
代替実施形態では、本開示は、各細菌が異なる免疫モジュレーターをコードする、異なる遺伝子操作された細菌の組合せ（例えば、２つまたはそれより多く）を含む、組成物を提供する。したがって、一部の実施形態では、組成物は、アデノシンの分解のための回路網を含む遺伝子操作された細菌と、アルギニンの産生および／またはアンモニアの消費のための配列を含む遺伝子操作された細菌とを含む。一実施形態では、組成物は、アデノシン分解経路をコードする遺伝子配列を含む遺伝子操作された細菌と組み合わせて、フィードバック耐性ＡｒｇＡ（ＡｒｇＡｆｂｒ）をコードする遺伝子配列を含み、内在性アルギニンオペロンリプレッサーＡｒｇＲの欠失を含む、遺伝子操作された細菌を含む。
１つの組成物実施形態では、ＡｒｇＡｆｂｒは、Ｅ ｃｏｌｉからのものである。１つの特定の実施形態では、ＡｒｇＡｆｂｒは、染色体に組み込まれており、低酸素プロモーター、例えばＦＮＲ、の制御下にある。１つの組成物実施形態では、アデノシン分解経路酵素をコードする遺伝子配列は、ｘｄｈＡ、ｘｄｈＢ、ｘｄｈＣ、ａｄｄ、ｘａｐＡ、ｄｅｏＤおよびｎｕｐＣから選択される１つまたは複数の遺伝子を含む。一実施形態では、アデノシン分解経路をコードする遺伝子配列は、ｘｄｈＡ、ｘｄｈＢ、ｘｄｈＣ、ａｄｄ、ｘａｐＡ、ｄｅｏＤおよびｎｕｐＣを含む。一実施形態では、アデノシン経路酵素は、Ｅ ｃｏｌｉからのものである。１つの特定の実施形態では、ジアデニル酸シクラーゼは、Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓからのものであり、アデノシン分解経路をコードする遺伝子配列は、例えばＥ．ｃｏｌｉからの、ｘｄｈＡ、ｘｄｈＢ、ｘｄｈＣ、ａｄｄ、ｘａｐＡ、ｄｅｏＤおよびｎｕｐＣを含む。１つの特定の実施形態では、アデノシン経路酵素は、染色体に組み込まれており、低酸素プロモーター、例えばＦＮＲ、の制御下にある。
これらのアデノシン消費およびアルギニン産生および／またはアンモニア消費実施形態のいずれにおいても、細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より０％〜２％〜４％、４％〜６％、６％〜８％、８％〜１０％、１０％〜１２％、１２％〜１４％、１４％〜１６％、１６％〜１８％、１８％〜２０％、２０％〜２５％、２５％〜３０％、３０％〜３５％、３５％〜４０％、４０％〜４５％、４５％〜５０％、５０％〜５５％、５５％〜６０％、６０％〜６５％、６５％〜７０％〜８０％、８０％〜９０％、または９０％〜１００％多いアデノシンを消費する。さらに別の実施形態では、細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より１．０〜１．２倍、１．２〜１．４倍、１．４〜１．６倍、１．６〜１．８倍、１．８〜２倍、または２倍多いアデノシンを消費する。さらに別の実施形態では、細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より約３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、１００倍、５００倍、または１０００倍多いアデノシンを消費する。
これらのアデノシン消費およびアルギニン産生実施形態のいずれにおいても、細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より少なくとも約０％〜２％〜４％、４％〜６％、６％〜８％、８％〜１０％、１０％〜１２％、１２％〜１４％、１４％〜１６％、１６％〜１８％、１８％〜２０％、２０％〜２５％、２５％〜３０％、３０％〜３５％、３５％〜４０％、４０％〜４５％、４５％〜５０％、５０％〜５５％、５５％〜６０％、６０％〜６５％、６５％〜７０％〜８０％、８０％〜９０％、または９０％〜１００％多い尿酸を産生する。さらに別の実施形態では、細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より少なくとも約１．０〜１．２倍、１．２〜１．４倍、１．４〜１．６倍、１．６〜１．８倍、１．８〜２倍、または２倍多い尿酸を産生する。さらに別の実施形態では、細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より約３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、４０倍、または５０倍、１００倍、５００倍、または１０００倍多い尿酸を産生する。
これらのアデノシン消費およびアルギニン産生および／またはアンモニア消費実施形態のいずれにおいても、細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌と比較して、アデノシン分解速度を０％〜２％〜４％、４％〜６％、６％〜８％、８％〜１０％、１０％〜１２％、１２％〜１４％、１４％〜１６％、１６％〜１８％、１８％〜２０％、２０％〜２５％、２５％〜３０％、３０％〜３５％、３５％〜４０％、４０％〜４５％、４５％〜５０％、５０％〜５５％、５５％〜６０％、６０％〜６５％、６５％〜７０％〜８０％、８０％〜９０％、または９０％〜１００％上昇させる。さらに別の実施形態では、細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌と比較して、アデノシン分解速度を１．０〜１．２倍、１．２〜１．４倍、１．４〜１．６倍、１．６〜１．８倍、１．８〜２倍、または２倍大きく上昇させる。さらに別の実施形態では、細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌と比較して、分解速度を約３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、４０倍、または５０倍、１００倍、５００倍、または１０００倍上昇させる。
これらのアデノシン消費およびアルギニン産生および／またはアンモニア消費実施形態のいずれにおいても、細菌は、低酸素条件下で誘導されたとき、約１．８〜１０ｕｍｏｌ／ｈｒ／１０９細胞のアデノシン分解速度を有しうる。１つの特定の実施形態では、細菌は、約５〜９ｕｍｏｌ／ｈｒ／１０９細胞のアデノシン分解速度を有する。１つの特定の実施形態では、細菌は、約６〜８ｕｍｏｌ／ｈｒ／１０９細胞のアデノシン分解速度を有する。
これらのアデノシン消費ならびにアルギニン産生および／またはアンモニア消費実施形態のいずれにおいても、細菌は、同じ条件下での、同じ細菌亜型の未改変細菌と比べて、すなわち、低酸素条件下で誘導された場合、１時間後に、アデノシン分解を約５０％〜７０％増加させることができる。一実施形態では、細菌は、同じ条件下での、同じ細菌亜型の未改変細菌と比べて、すなわち、低酸素条件下で誘導された場合、１時間後に、アデノシン分解を約５５％〜６５％増加させる。特異的な一実施形態では、細菌は、同じ条件下での、同じ細菌亜型の未改変細菌と比べて、すなわち、低酸素条件下で誘導された場合、１時間後に、アデノシン分解を約５５％〜６０％増加させる。さらに別の実施形態では、細菌は、低酸素条件下で誘導された場合、１時間後に、アデノシン分解を約１．５〜３倍増加させる。特異的な一実施形態では、細菌は、低酸素条件下で誘導された場合、１時間後に、アデノシン分解を約２〜２．５倍増加させる。
アデノシン消費ならびにアルギニン産生および／またはアンモニア消費の一実施形態では、細菌は、同じ条件下での、同じ細菌亜型の未改変細菌と比べて、すなわち、低酸素条件下で誘導された場合、２時間後に、アデノシン分解を約８５％〜１００％増加させる。一実施形態では、細菌は、同じ条件下での、同じ細菌亜型の未改変細菌と比べて、すなわち、低酸素条件下で誘導された場合、２時間後に、アデノシン分解を約９５％〜１００％増加させる。特異的な一実施形態では、細菌は、同じ条件下での、同じ細菌亜型の未改変細菌と比べて、すなわち、低酸素条件下で誘導された場合、２時間後に、アデノシン分解を約９７％〜９９％増加させる。
アデノシン消費ならびにアルギニン産生および／またはアンモニア消費の一実施形態では、細菌は、低酸素条件下で誘導された場合、２時間後に、アデノシン分解を約４０〜５０倍増加させることができる。特異的な一実施形態では、細菌は、低酸素条件下で誘導された場合、２時間後に、アデノシン分解を約４４〜４８倍増加させる。
アデノシン消費ならびにアルギニン産生および／またはアンモニア消費の一実施形態では、細菌は、同じ条件下での、同じ細菌亜型の未改変細菌と比べて、すなわち、低酸素条件下で誘導された場合、３時間後に、アデノシン分解を約９５％〜１００％増加させる。一実施形態では、細菌は、同じ条件下での、同じ細菌亜型の未改変細菌と比べて、すなわち、低酸素条件下で誘導された場合、３時間後に、アデノシン分解を約９８％〜１００％増加させる。特異的な一実施形態では、細菌は、同じ条件下での、同じ細菌亜型の未改変細菌と比べて、すなわち、低酸素条件下で誘導された場合、３時間後に、アデノシン分解を約９９％〜９９％増加させる。さらに別の実施形態では、細菌は、低酸素条件下で誘導された場合、３時間後に、アデノシン分解を約１００〜１０００倍増加させる。さらに別の実施形態では、細菌は、低酸素条件下で誘導された場合、３時間後に、アデノシン分解を約１０００〜１００００倍増加させる。
アデノシン消費ならびにアルギニン産生および／またはアンモニア消費の一実施形態では、細菌は、同じ条件下での、同じ細菌亜型の未改変細菌と比べて、すなわち、低酸素条件下で誘導された場合、４時間後に、アデノシン分解を約９５％〜１００％増加させる。一実施形態では、細菌は、同じ条件下での、同じ細菌亜型の未改変細菌と比べて、すなわち、低酸素条件下で誘導された場合、４時間後に、アデノシン分解を約９８％〜１００％増加させる。一実施形態では、細菌は、同じ条件下での、同じ細菌亜型の未改変細菌と比べて、すなわち、低酸素条件下で誘導された場合、４時間後に、アデノシン分解を約９９％〜９９％増加させる。さらに別の実施形態では、細菌は、低酸素条件下で誘導された場合、４時間後に、アデノシン分解を約１００〜１０００倍増加させる。さらに別の実施形態では、細菌は、低酸素条件下で誘導された場合、４時間後に、アデノシン分解を約１０００〜１００００倍増加させる。
いずれのアデノシン消費およびアルギニン産生および／またはアンモニア消費実施形態においても、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より少なくとも約０％〜２％、２％〜４％、４％〜６％、６％〜８％、８％〜１０％、１０％〜１２％、１２％〜１４％、１４％〜１６％、１６％〜１８％、１８％〜２０％、２０％〜２５％、２５％〜３０％、３０％〜３５％、３５％〜４０％、４０％〜４５％、４５％〜５０％、５０％〜５５％、５５％〜６０％、６０％〜６５％、６５％〜７０％〜８０％、８０％〜９０％、または９０％〜１００％多いアルギニンを産生する。
さらに別のアデノシン消費およびアルギニン産生および／またはアンモニア消費実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より少なくとも約１．０〜１．２倍、１．２〜１．４倍、１．４〜１．６倍、１．６〜１．８倍、１．８〜２倍、または２倍多いアルギニンを産生する。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より約３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、４０倍、または５０倍、１００倍、５００倍、または１０００倍多いアルギニンを産生する。
これらのアデノシン消費ならびにアルギニン産生および／またはアンモニア消費実施形態のいずれにおいても、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より０％〜２％、２％〜４％、４％〜６％、６％〜８％、８％〜１０％、１０％〜１２％、１２％〜１４％、１４％〜１６％、１６％〜１８％、１８％〜２０％、２０％〜２５％、２５％〜３０％、３０％〜３５％、３５％〜４０％、４０％〜４５％、４５％〜５０％、５０％〜５５％、５５％〜６０％、６０％〜６５％、６５％〜７０％〜８０％、８０％〜９０％、または９０％〜１００％多いグルタメートを消費する。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より１．０〜１．２倍、１．２〜１．４倍、１．４〜１．６倍、１．６〜１．８倍、１．８〜２倍、または２倍多いグルタメートを消費する。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より約３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、１００倍、５００倍、または１０００倍多いグルタメートを消費する。
これらのアデノシン消費ならびにアルギニン産生および／またはアンモニア消費実施形態のいずれにおいても、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より０％〜２％、２％〜４％、４％〜６％、６％〜８％、８％〜１０％、１０％〜１２％、１２％〜１４％、１４％〜１６％、１６％〜１８％、１８％〜２０％、２０％〜２５％、２５％〜３０％、３０％〜３５％、３５％〜４０％、４０％〜４５％、４５％〜５０％、５０％〜５５％、５５％〜６０％、６０％〜６５％、６５％〜７０％〜８０％、８０％〜９０％、または９０％〜１００％多いアンモニアを消費する。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より１．０〜１．２倍、１．２〜１．４倍、１．４〜１．６倍、１．６〜１．８倍、１．８〜２倍、または２倍多いアンモニアを消費する。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より約３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、１００倍、５００倍または１０００倍多いアンモニアを消費する。
これらのアデノシン消費ならびにアルギニン産生および／またはアンモニア消費実施形態のいずれにおいても、細菌は、同じ条件下で、同じ亜型の未改変細菌と比較して、細胞増殖を、少なくとも約１０％〜２０％、２０％〜２５％、２５％〜３０％、３０％〜４０％、４０％〜５０％、５０％〜６０％、６０％〜７０％、７０％〜７５％、７５％〜８０％、８０％〜８５％、８５％〜９０％、９０％〜９５％、９５％〜９９％またはそれよりも多く低下させることができる。これらのアデノシン消費ならびにアルギニン産生および／またはアンモニア消費実施形態のいずれにおいても、細菌は、同じ条件下で、同じ亜型の未改変細菌と比較して、腫瘍増殖を、少なくとも約１０％〜２０％、２０％〜２５％、２５％〜３０％、３０％〜４０％、４０％〜５０％、５０％〜６０％、６０％〜７０％、７０％〜７５％、７５％〜８０％、８０％〜８５％、８５％〜９０％、９０％〜９５％、９５％〜９９％またはそれよりも多く低下させることができる。これらのアデノシン消費ならびにアルギニン産生および／またはアンモニア消費実施形態のいずれにおいても、細菌は、同じ条件下で、同じ亜型の未改変細菌と比較して、腫瘍サイズを、少なくとも約１０％〜２０％、２０％〜２５％、２５％〜３０％、３０％〜４０％、４０％〜５０％、５０％〜６０％、６０％〜７０％、７０％〜７５％、７５％〜８０％、８０％〜８５％、８５％〜９０％、９０％〜９５％、９５％〜９９％またはそれよりも多く低下させることができる。これらのアデノシン消費ならびにアルギニン産生および／またはアンモニア消費実施形態のいずれにおいても、細菌は、同じ条件下で、同じ亜型の未改変細菌と比較して、腫瘍体積を、少なくとも約１０％〜２０％、２０％〜２５％、２５％〜３０％、３０％〜４０％、４０％〜５０％、５０％〜６０％、６０％〜７０％、７０％〜７５％、７５％〜８０％、８０％〜８５％、８５％〜９０％、９０％〜９５％、９５％〜９９％またはそれよりも多く低下させることができる。これらのアデノシン消費ならびにアルギニン産生および／またはアンモニア消費実施形態のいずれにおいても、細菌は、同じ条件下で、同じ亜型の未改変細菌と比較して、腫瘍重量を、少なくとも約１０％〜２０％、２０％〜２５％、２５％〜３０％、３０％〜４０％、４０％〜５０％、５０％〜６０％、６０％〜７０％、７０％〜７５％、７５％〜８０％、８０％〜８５％、８５％〜９０％、９０％〜９５％、９５％〜９９％またはそれよりも多く低下させることができる。
一部のアデノシン消費ならびにアルギニン産生および／またはアンモニア消費実施形態では、遺伝子操作された微生物は、低酸素条件で、ならびに／あるいはがんの、および／または腫瘍微小環境の、または組織特異的分子もしくは代謝物の存在下で、ならびに／あるいは炎症または免疫抑制に関連する分子または代謝物の存在下で、ならびに／あるいは消化管内に存在しうる代謝物の存在下で、ならびに／あるいはｉｎ ｖｉｖｏで存在することもあり、しないこともあり、ｉｎ ｖｉｔｒｏで、株培養、拡大増殖、産生および／または製造中に存在することもある、代謝物、例えば、アラビノース、クメートおよびサリチレートおよび本明細書に記載の他のものの存在下で、アデノシンの分解およびアルギニンの産生のための記載の回路のうちいずれか１つまたは複数を発現することができる。一部の実施形態では、そのようなインデューサーをｉｎ ｖｉｖｏで投与して、エフェクター遺伝子発現を誘導することができる。一部の実施形態では、アデノシンの分解およびアルギニンの産生のための回路網をコードする遺伝子配列は、そのような条件および／またはインデューサーにより誘導されうるプロモーターによって制御される。一部の実施形態では、遺伝子配列は、本明細書に記載の構成的プロモーターによって制御される。一部の実施形態では、遺伝子配列は、構成的プロモーターによって制御され、本明細書に記載の、ｉｎ ｖｉｖｏ条件および／またはｉｎ ｖｉｔｒｏ条件で、例えば、拡大増殖、産生および／または製造中に発現される。
これらのアデノシン消費ならびにアルギニン産生および／またはアンモニア消費実施形態のいずれにおいても、記載のアデノシン分解回路およびアルギニン産生回路のいずれか１つまたは複数は、１つもしくは複数のプラスミド（例えば、高コピー数もしくは低コピー数プラスミド）上に存在するか、または微生物染色体内の１つもしくは複数の部位に組み込まれている。また、一部の実施形態では、遺伝子操作された微生物は、記載の回路のいずれか１つまたは複数をさらに発現することができ、以下のものの１つまたは複数をさらに含む：（１）１つまたは複数の栄養要求体、例えば、当技術分野において公知の、および本明細書で提供される、任意の栄養要求体、ｔｈｙＡおよび／またはｄａｐＡ栄養要求体、（２）本明細書に記載されるまたはそれ以外に当技術分野で公知のキルスイッチのいずれか等、１つまたは複数のキルスイッチ回路、（３）１つまたは複数の抗生物質抵抗性回路、（４）本明細書に記載されるまたはそれ以外に当技術分野で公知の輸送体のいずれか等、生物学的分子または基質を移入するための１つまたは複数の輸送体、（５）本明細書に記載されるおよびそれ以外に当技術分野で公知の分泌回路のいずれか等、１つまたは複数の分泌回路、（６）本明細書に記載されるおよびそれ以外に当技術分野で公知の表面ディスプレイ回路のいずれか等、１つまたは複数の表面ディスプレイ回路、ならびに（７）本明細書に記載される１つまたは複数の代謝物（例えば、キヌレニン、トリプトファン、アデノシン、アルギニン）の産生または分解のための１つまたは複数の回路、（８）そのような追加的な回路のうち１つまたは複数の組合せ。
これらの実施形態のいずれにおいても、アデノシンを消費し、アルギニンを産生および／またはアンモニアを消費するように遺伝子操作された細菌は、単独で、または抗ＣＴＬＡ４、抗ＰＤ１もしくは抗ＰＤ−Ｌ１抗体を含むがこれらに限定されない、本明細書に記載される１つもしくは複数の免疫チェックポイント阻害剤と組み合わせて投与することができる。これらの実施形態のいずれにおいても、アデノシンを消費し、アルギニンを産生および／またはアンモニアを消費するように遺伝子操作された１つまたは複数の細菌は、抗ＣＴＬＡ４、抗ＰＤ１または抗ＰＤ−Ｌ１抗体を含むがこれらに限定されない、本明細書に記載される１つまたは複数の免疫チェックポイント阻害剤を産生および分泌またはその表面にディスプレイするように遺伝子操作されうる。
これらの実施形態のいずれにおいても、アデノシンを消費し、アルギニンを産生および／またはアンモニアを消費するように遺伝子操作された１つまたは複数の細菌は、単独で、または本明細書に記載される１つもしくは複数の免疫刺激性アゴニスト、例えば、抗ＯＸ４０、抗４１ＢＢもしくは抗ＧＩＴＲ抗体を含むがこれらに限定されない、アゴニスト抗体と組み合わせて投与することができる。これらの実施形態のいずれにおいても、アデノシンを消費し、アルギニンを産生および／またはアンモニアを消費するように遺伝子操作された１つまたは複数の細菌は、本明細書に記載される１つまたは複数の免疫刺激性アゴニスト、例えば、抗ＯＸ４０、抗４１ＢＢまたは抗ＧＩＴＲ抗体を含むがこれらに限定されない、アゴニスト抗体を産生および分泌またはその表面にディスプレイするように遺伝子操作されうる。
キヌレニン消費およびアルギニン産生
一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、キヌレニンの消費ならびにアルギニンの産生および／またはアンモニアの消費のための回路網を含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、キヌレニン消費（および必要に応じてトリプトファン産生）経路と組み合わせて、アルギニン産生および／またはアンモニア消費回路をコードする遺伝子配列を含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、アルギニン産生経路と組み合わせて、キヌレニナーゼをコードする遺伝子配列を含む。一実施形態では、キヌレニナーゼは、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓに由来する。特異的な一実施形態では、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ由来のキヌレニナーゼは、染色体に組み込まれ、構成的プロモーターの制御下に置かれる。一実施形態では、アルギニン産生および／またはアンモニア消費回路をコードする遺伝子配列は、フィードバック抵抗性ＡｒｇＡ（ＡｒｇＡｆｂｒ）、および内在性アルギニンオペロンリプレッサーＡｒｇＲにおける欠失を含む。一実施形態では、ＡｒｇＡｆｂｒは、Ｅ．ｃｏｌｉに由来する。１つの特定の実施形態では、ＡｒｇＡｆｂｒは、染色体に組み込まれており、低酸素プロモーター、例えばＦＮＲ、の制御下にある。これらの実施形態のいずれにおいても、ＴｒｐＥを欠失させることができる。
代替実施形態では、本開示は、各細菌が異なる免疫モジュレーターをコードする、異なる遺伝子操作された細菌の組合せ（例えば、２つまたはそれより多く）を含む、組成物を提供する。したがって、一部の実施形態では、組成物は、キヌレニンの消費のための回路網を含む遺伝子操作された細菌、ならびにアルギニンの産生および／またはアンモニアの消費のための回路網を含む遺伝子操作された細菌を含む。一実施形態では、組成物は、キヌレニン消費（および必要に応じてトリプトファン産生）経路をコードする遺伝子配列を含む遺伝子操作された細菌と組み合わせて、アルギニン産生回路をコードする遺伝子配列を含む遺伝子操作された細菌を含む。一実施形態では、組成物は、アルギニン産生経路をコードする遺伝子配列を含む遺伝子操作された細菌と組み合わせて、キヌレニナーゼをコードする遺伝子配列を含む遺伝子操作された細菌を含む。一実施形態では、キヌレニナーゼは、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓに由来する。特異的な一実施形態では、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ由来のキヌレニナーゼは、染色体に組み込まれ、構成的プロモーターの制御下に置かれる。一実施形態では、アルギニン産生および／またはアンモニア消費回路をコードする遺伝子配列は、フィードバック抵抗性ＡｒｇＡ（ＡｒｇＡｆｂｒ）、および内在性アルギニンオペロンリプレッサーＡｒｇＲにおける欠失を含む。一実施形態では、ＡｒｇＡｆｂｒは、Ｅ．ｃｏｌｉに由来する。特異的な一実施形態では、ＡｒｇＡｆｂｒは、染色体に組み込まれ、低酸素プロモーター、例えば、ＦＮＲの制御下に置かれる。これらの実施形態のいずれにおいても、ＴｒｐＥは、欠失されうる。
これらのキヌレニン消費ならびにアルギニン産生および／またはアンモニア消費実施形態のいずれにおいても、細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より０％〜２％〜４％、４％〜６％、６％〜８％、８％〜１０％、１０％〜１２％、１２％〜１４％、１４％〜１６％、１６％〜１８％、１８％〜２０％、２０％〜２５％、２５％〜３０％、３０％〜３５％、３５％〜４０％、４０％〜４５％、４５％〜５０％、５０％〜５５％、５５％〜６０％、６０％〜６５％、６５％〜７０％〜８０％、８０％〜９０％、または９０％〜１００％多いキヌレニンを消費する。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より１．０〜１．２倍、１．２〜１．４倍、１．４〜１．６倍、１．６〜１．８倍、１．８〜２倍、または２倍多いキヌレニンを消費する。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より約３倍、４倍、約３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、１００倍、５００倍または１０００倍多いキヌレニンを消費する。
これらのキヌレニン消費ならびにアルギニン産生および／またはアンモニア消費実施形態のいずれにおいても、キヌレニンを消費し、必要に応じてトリプトファンを産生するように遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より少なくとも約０％〜２％〜４％、４％〜６％、６％〜８％、８％〜１０％、１０％〜１２％、１２％〜１４％、１４％〜１６％、１６％〜１８％、１８％〜２０％、２０％〜２５％、２５％〜３０％、３０％〜３５％、３５％〜４０％、４０％〜４５％、４５％〜５０％、５０％〜５５％、５５％〜６０％、６０％〜６５％、６５％〜７０％〜８０％、８０％〜９０％、または９０％〜１００％多いトリプトファンを産生する。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より少なくとも約１．０〜１．２倍、１．２〜１．４倍、１．４〜１．６倍、１．６〜１．８倍、１．８〜２倍、または２倍多いトリプトファンを産生する。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より約３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、４０倍、または５０倍、１００倍、５００倍、または１０００倍多いトリプトファンを産生する。
これらのキヌレニン消費ならびにアルギニン産生および／またはアンモニア消費実施形態のいずれにおいても、遺伝子操作された細菌は、キヌレニン消費率を、同じ条件下での、同じ細菌亜型の未改変細菌と比べて、０％〜２％〜４％、４％〜６％、６％〜８％、８％〜１０％、１０％〜１２％、１２％〜１４％、１４％〜１６％、１６％〜１８％、１８％〜２０％、２０％〜２５％、２５％〜３０％、３０％〜３５％、３５％〜４０％、４０％〜４５％、４５％〜５０％、５０％〜５５％、５５％〜６０％、６０％〜６５％、６５％〜７０％〜８０％、８０％〜９０％、または９０％〜１００％増加させる。さらに別のキヌレニン消費およびアルギニン産生実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下での、同じ細菌亜型の未改変細菌と比べて、キヌレニン消費率を、１．０〜１．２倍、１．２〜１．４倍、１．４〜１．６倍、１．６〜１．８倍、１．８〜２倍、または２倍多く増加させる。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下での、同じ細菌亜型の未改変細菌と比べて、キヌレニン消費率を、約３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、４０倍、または５０倍、１００倍、５００倍、または１０００倍増加させる。
キヌレニン消費ならびにアルギニン産生および／またはアンモニア消費の一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、４時間後に、同じ条件下での、同じ細菌亜型の未改変細菌と比べて、キヌレニン消費を約８０％〜１００％増加させる。キヌレニン消費ならびにアルギニン産生および／またはアンモニア消費の一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、４時間後に、同じ条件下での、同じ細菌亜型の未改変細菌と比べて、キヌレニン消費を約９０％〜１００％増加させる。キヌレニン消費ならびにアルギニン産生および／またはアンモニア消費の特異的な一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、４時間後、同じ細菌亜型の未改変細菌と比較して、キヌレニン消費を約９５％〜１００％増加させる。１つの特定の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、４時間後、同じ細菌亜型の未改変細菌と比較して、キヌレニン消費を約９９％〜１００％増加させる。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、キヌレニン消費を、４時間後、約１０〜５０倍増加させる。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、キヌレニン消費を、４時間後、約５０〜１００倍増加させる。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、キヌレニン消費を、４時間後、約１００〜５００倍増加させる。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、キヌレニン消費を、４時間後、約５００〜１０００倍増加させる。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、キヌレニン消費を、４時間後、約１０００〜５０００倍増加させる。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、キヌレニン消費を、４時間後、約５０００〜１００００倍増加させる。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、キヌレニン消費を、４時間後、約１００００〜１０００倍増加させる。
いずれのキヌレニン消費ならびにアルギニン産生および／またはアンモニア消費実施形態においても、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より少なくとも約０％〜２％、２％〜４％、４％〜６％、６％〜８％、８％〜１０％、１０％〜１２％、１２％〜１４％、１４％〜１６％、１６％〜１８％、１８％〜２０％、２０％〜２５％、２５％〜３０％、３０％〜３５％、３５％〜４０％、４０％〜４５％、４５％〜５０％、５０％〜５５％、５５％〜６０％、６０％〜６５％、６５％〜７０％〜８０％、８０％〜９０％、または９０％〜１００％多いアルギニンを産生する。
さらに別のキヌレニン消費ならびにアルギニン産生および／またはアンモニア消費実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より少なくとも約１．０〜１．２倍、１．２〜１．４倍、１．４〜１．６倍、１．６〜１．８倍、１．８〜２倍、または２倍多いアルギニンを産生する。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より約３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、４０倍、または５０倍、１００倍、５００倍、または１０００倍多いアルギニンを産生する。
これらのキヌレニン消費ならびにアルギニン産生および／またはアンモニア消費実施形態のいずれにおいても、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より０％〜２％、２％〜４％、４％〜６％、６％〜８％、８％〜１０％、１０％〜１２％、１２％〜１４％、１４％〜１６％、１６％〜１８％、１８％〜２０％、２０％〜２５％、２５％〜３０％、３０％〜３５％、３５％〜４０％、４０％〜４５％、４５％〜５０％、５０％〜５５％、５５％〜６０％、６０％〜６５％、６５％〜７０％〜８０％、８０％〜９０％、または９０％〜１００％多いグルタメートを消費する。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より１．０〜１．２倍、１．２〜１．４倍、１．４〜１．６倍、１．６〜１．８倍、１．８〜２倍、または２倍多いグルタメートを消費する。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より約３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、１００倍、５００倍または１０００倍多いグルタメートを消費する。
これらのキヌレニン消費ならびにアルギニン産生および／またはアンモニア消費実施形態のいずれにおいても、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より０％〜２％、２％〜４％、４％〜６％、６％〜８％、８％〜１０％、１０％〜１２％、１２％〜１４％、１４％〜１６％、１６％〜１８％、１８％〜２０％、２０％〜２５％、２５％〜３０％、３０％〜３５％、３５％〜４０％、４０％〜４５％、４５％〜５０％、５０％〜５５％、５５％〜６０％、６０％〜６５％、６５％〜７０％〜８０％、８０％〜９０％、または９０％〜１００％多いアンモニアを消費する。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より１．０〜１．２倍、１．２〜１．４倍、１．４〜１．６倍、１．６〜１．８倍、１．８〜２倍、または２倍多いアンモニアを消費する。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より約３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、１００倍、５００倍または１０００倍多いアンモニアを消費する。
これらのキヌレニン消費ならびにアルギニン産生および／またはアンモニア消費実施形態のいずれにおいても、細菌は、同じ条件下で、同じ亜型の未改変細菌と比較して、細胞増殖を、少なくとも約１０％〜２０％、２０％〜２５％、２５％〜３０％、３０％〜４０％、４０％〜５０％、５０％〜６０％、６０％〜７０％、７０％〜７５％、７５％〜８０％、８０％〜８５％、８５％〜９０％、９０％〜９５％、９５％〜９９％またはそれよりも多く低下させることができる。これらのキヌレニン消費ならびにアルギニン産生および／またはアンモニア消費実施形態のいずれにおいても、細菌は、同じ条件下で、同じ亜型の未改変細菌と比較して、腫瘍増殖を、少なくとも約１０％〜２０％、２０％〜２５％、２５％〜３０％、３０％〜４０％、４０％〜５０％、５０％〜６０％、６０％〜７０％、７０％〜７５％、７５％〜８０％、８０％〜８５％、８５％〜９０％、９０％〜９５％、９５％〜９９％またはそれよりも多く低下させることができる。これらのキヌレニン消費ならびにアルギニン産生および／またはアンモニア消費実施形態のいずれにおいても、細菌は、同じ条件下で、同じ亜型の未改変細菌と比較して、腫瘍サイズを、少なくとも約１０％〜２０％、２０％〜２５％、２５％〜３０％、３０％〜４０％、４０％〜５０％、５０％〜６０％、６０％〜７０％、７０％〜７５％、７５％〜８０％、８０％〜８５％、８５％〜９０％、９０％〜９５％、９５％〜９９％またはそれよりも多く低下させることができる。これらのキヌレニン消費ならびにアルギニン産生および／またはアンモニア消費実施形態のいずれにおいても、細菌は、同じ条件下で、同じ亜型の未改変細菌と比較して、腫瘍体積を、少なくとも約１０％〜２０％、２０％〜２５％、２５％〜３０％、３０％〜４０％、４０％〜５０％、５０％〜６０％、６０％〜７０％、７０％〜７５％、７５％〜８０％、８０％〜８５％、８５％〜９０％、９０％〜９５％、９５％〜９９％またはそれよりも多く低下させることができる。これらのキヌレニン消費ならびにアルギニン産生および／またはアンモニア消費実施形態のいずれにおいても、細菌は、同じ条件下で、同じ亜型の未改変細菌と比較して、腫瘍重量を、少なくとも約１０％〜２０％、２０％〜２５％、２５％〜３０％、３０％〜４０％、４０％〜５０％、５０％〜６０％、６０％〜７０％、７０％〜７５％、７５％〜８０％、８０％〜８５％、８５％〜９０％、９０％〜９５％、９５％〜９９％またはそれよりも多く低下させることができる。
一部のキヌレニン消費ならびにアルギニン産生および／またはアンモニア消費実施形態では、遺伝子操作された微生物は、低酸素条件で、ならびに／あるいはがんおよび／または腫瘍微小環境、または組織特異的分子もしくは代謝物の存在下で、ならびに／あるいは炎症または免疫抑制に関連する分子または代謝物の存在下で、ならびに／あるいは消化管内に存在しうる代謝物の存在下で、ならびに／あるいはｉｎ ｖｉｖｏで存在することもあり、しないこともあり、ならびにｉｎ ｖｉｔｒｏで株培養、拡大増殖、産生および／または製造中に存在することもある、代謝物、例えば、アラビノース、クメートおよびサリチレートおよび本明細書に記載の他のものの存在下で、キヌレニン消費およびアルギニン産生のための記載の回路のいずれか１つまたは複数を発現することができる。一部の実施形態では、そのようなインデューサーをｉｎ ｖｉｖｏで投与して、エフェクター遺伝子発現を誘導することができる。一部の実施形態では、遺伝子配列は、本明細書に記載の構成的プロモーターによって制御される。一部の実施形態では、遺伝子配列は、構成的プロモーターにより制御され、本明細書に記載の、ｉｎ ｖｉｖｏ条件および／またはｉｎ ｖｉｔｒｏ条件で、例えば、拡大増殖、産生および／または製造中に発現される。これらのキヌレニン消費ならびにアルギニン産生および／またはアンモニア消費実施形態のいずれにおいても、記載のアデノシン分解回路およびキヌレニン消費回路のうちいずれか１つまたは複数は、１つもしくは複数のプラスミド（例えば、高コピー数または低コピー数プラスミド）上に存在するか、または微生物染色体内の１つもしくは複数の部位に組み込まれている。
また、一部の実施形態では、遺伝子操作された微生物は、記載の回路のいずれか１つまたは複数をさらに発現することができ、以下のものの１つまたは複数をさらに含む：（１）１つまたは複数の栄養要求体、例えば、当技術分野において公知の、および本明細書で提供される、任意の栄養要求体、例えばｔｈｙＡおよび／またはｄａｐＡ栄養要求体、（２）１つまたは複数のキルスイッチ回路、例えば、本明細書に記載の、またはそうでなければ当技術分野において公知の、キルスイッチのいずれか、（３）１つまたは複数の抗生物質耐性回路、（４）生体分子または基質を移入するための１つまたは複数の輸送体、例えば、本明細書に記載の、またはそうでなければ当技術分野において公知の、輸送体のいずれか、（５）１つまたは複数の分泌回路、例えば、本明細書に記載の、でなければ当技術分野において公知の、分泌回路のいずれか、（６）１つまたは複数の表面提示回路、例えば、本明細書に記載の、でなければ当技術分野において公知の、表面提示回路のいずれか、および（７）本明細書に記載の１つまたは複数の代謝物（例えば、キヌレニン、トリプトファン、アデノシン、アルギニン）の産生または分解のための１つまたは複数の回路、（８）このような追加の回路の１つまたは複数の組合せ。これらの実施形態のいずれにおいても、アデノシンおよびキヌレニンを消費するように遺伝子操作された細菌を単独で投与することができ、または抗ＣＴＬＡ４、抗ＰＤ１もしくは抗ＰＤ−Ｌ１抗体を含むがこれらに限定されない、本明細書に記載の１つもしくは複数の免疫チェックポイントインヒビターと組み合わせて投与することができる。
これらの実施形態のいずれにおいても、キヌレニンを消費し、アルギニンを産生および／またはアンモニアを消費するように遺伝子操作された細菌は、単独で、または抗ＣＴＬＡ４、抗ＰＤ１もしくは抗ＰＤ−Ｌ１抗体を含むがこれらに限定されない、本明細書に記載される１つもしくは複数の免疫チェックポイント阻害剤と組み合わせて投与することができる。これらの実施形態のいずれにおいても、キヌレニンを消費し、アルギニンを産生および／またはアンモニアを消費するように遺伝子操作された１つまたは複数の細菌は、抗ＣＴＬＡ４、抗ＰＤ１または抗ＰＤ−Ｌ１抗体を含むがこれらに限定されない、本明細書に記載される１つまたは複数の免疫チェックポイント阻害剤を産生および分泌またはその表面にディスプレイするように遺伝子操作されうる。
これらの実施形態のいずれにおいても、キヌレニンを消費し、アルギニンを産生および／またはアンモニアを消費するように遺伝子操作された１つまたは複数の細菌は、単独で、または本明細書に記載される１つもしくは複数の免疫刺激性アゴニスト、例えば、抗ＯＸ４０、抗４１ＢＢもしくは抗ＧＩＴＲ抗体を含むがこれらに限定されない、アゴニスト抗体と組み合わせて投与することができる。これらの実施形態のいずれにおいても、キヌレニンを消費し、アルギニンを産生および／またはアンモニアを消費するように遺伝子操作された１つまたは複数の細菌は、本明細書に記載される１つまたは複数の免疫刺激性アゴニスト、例えば、抗ＯＸ４０、抗４１ＢＢまたは抗ＧＩＴＲ抗体を含むがこれらに限定されない、アゴニスト抗体を産生および分泌またはその表面にディスプレイするように遺伝子操作されうる。
これらの代謝変換因子組合せ回路実施形態（すなわち、ＡＤ＋Ｋｙｎ、ＡＤ＋Ａｒｇ／ＮＨ４＋、Ｋｙｎ＋Ａｒｇ）のいずれにおいても、代謝変換因子組合せをコードする遺伝子配列（複数可）を含む遺伝子操作された細菌は、１つまたは複数のさらに別のエフェクター分子、すなわち、治療分子または代謝変換因子をコードする遺伝子配列（複数可）をさらに含む。これらの実施形態のいずれにおいても、代謝変換因子組合せをコードする回路は、同じまたは異なる細菌株（組合せ回路または株の混合物）において、本明細書に記載される１つまたは複数の免疫イニシエーターまたは免疫サステナーをコードする回路と組み合わせることができる。免疫イニシエーターまたは免疫サステナーをコードする回路は、構成的または誘導性プロモーター、例えば、低酸素誘導性プロモーターまたは本明細書に記載される他のいずれかの構成的または誘導性プロモーターの制御下に置くことができる。これらの実施形態のいずれにおいても、代謝変換因子組合せをコードする遺伝子配列（複数可）は、同じまたは異なる細菌株（組合せ回路または株の混合物）において、本明細書に記載される１つまたは複数のＳＴＩＮＧアゴニスト産生酵素をコードする遺伝子配列（複数可）と組み合わせることができる。一部の実施形態では、代謝変換因子組合せをコードする遺伝子配列（複数可）と組み合わされる遺伝子配列は、ＤａｃＡをコードする。ＤａｃＡは、構成的または誘導性プロモーター、例えば、ＦＮＲ等の低酸素誘導性プロモーターまたは本明細書に記載される他のいずれかの構成的または誘導性プロモーターの制御下に置くことができる。一部の実施形態では、ｄａｃＡ遺伝子は、染色体に組み込まれている。一部の実施形態では、代謝変換因子組合せをコードする遺伝子配列（複数可）と組み合わされる遺伝子配列は、ｃＧＡＳをコードする。ｃＧＡＳは、構成的または誘導性プロモーター、例えば、ＦＮＲ等の低酸素誘導性プロモーターまたは本明細書に記載される他のいずれかの構成的または誘導性プロモーターの制御下に置くことができる。一部の実施形態では、ｃＧＡＳをコードする遺伝子は、染色体に組み込まれている。
これらの代謝変換因子組合せ実施形態（すなわち、ＡＤ＋Ｋｙｎ、ＡＤ＋Ａｒｇ／ＮＨ４＋、Ｋｙｎ＋Ａｒｇ）のいずれにおいても、細菌は、ＤａｐＡ、ＴｈｙＡまたはその両方に、栄養要求性改変、例えば、突然変異または欠失をさらに含むことができる。これらの実施形態のいずれにおいても、細菌は、本明細書に記載される内在性プロファージに、ファージ改変、例えば、突然変異または欠失をさらに含むことができる。
エフェクターおよび免疫モジュレーターの発現の調節
一部の実施形態では、細菌細胞は、ペイロードをコードする遺伝子を有する、安定に維持されたプラスミドまたは染色体を含み、したがって、ペイロードを宿主細胞において発現させることができ、宿主細胞は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで、例えば培地中で、および／またはｉｎ ｖｉｖｏで、例えば消化管内で、もしくは腫瘍微小環境において、生存および／または成長することができる。一部の実施形態では、細菌細胞は、２つまたはそれより多い別個のペイロードまたはオペロン、例えば、２つまたはそれより多いペイロード遺伝子を含む。一部の実施形態では、細菌細胞は、３つまたはそれより多い別個の輸送体またはオペロン、例えば、３つまたはそれより多いペイロード遺伝子を含む。一部の実施形態では、細菌細胞は、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれより多い別個のペイロードまたはオペロン、例えば、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれより多いペイロード遺伝子を含む。
本明細書において、用語「ペイロード（単数）」、「目的のポリペプチド（単数）」または「目的のポリペプチド（複数）」、「目的のタンパク質（単数）」、「目的のタンパク質（複数）」、「ペイロード（複数）」、「エフェクター分子」、「エフェクター」は、本明細書に記載の１つもしくは複数のエフェクター分子、および／またはそのようなエフェクター分子の産生に必要な１つもしくは複数の酵素もしくは酵素としてのポリペプチド機能を指す。ペイロードの非限定的な例としては、ＩＬ−１２、ＩＬ−２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８、ＩＬ−７、ＩＬ−２１、ＣＤ４０アゴニスト、ＣＤ４０アゴニスト、ＣＤ２２６アゴニスト、ＣＤ１３７アゴニスト、ＩＣＯＳアゴニスト、ＯＸＯ４０アゴニスト、ＧＭ−ＣＳＦ、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ９、これに限定されないがチェックポイントインヒビター（例えば、ＰＤ１、ＰＤＬ１、ＣＴＬＡ４、抗ＬＡＧ３、抗ＴＩＭ３および本明細書に記載の他のもの）を含む抗体、例えばｓｃＦｖ、キヌレニナーゼ、トリプトファンおよび／またはアルギニン産生酵素、アデノシン分解酵素が挙げられる。
本明細書で使用される場合、用語「目的のポリペプチド（単数）」または「目的のポリペプチド（複数）」、「目的のタンパク質（単数）」、「目的のタンパク質（複数）」、「ペイロード（単数）」、「ペイロード（複数）」は、本明細書に記載のトリプトファン合成酵素、キヌレニン分解酵素、アデノシン分解酵素、アルギニン産生酵素および他の代謝経路酵素のいずれか単数またはいずれか複数をさらに含む。本明細書で使用される場合、用語「目的の遺伝子」または「目的の遺伝子配列」は、本明細書に記載の１つまたは複数の免疫モジュレーターをコードする遺伝子および／もしくは（ａｎ／ｏｒ）遺伝子配列およびもしくは遺伝子カセットのいずれか単数またはいずれか複数を含む。
一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じペイロード遺伝子の複数のコピーを含む。一部の実施形態では、ペイロードをコードする遺伝子は、プラスミド上に存在し、直接または間接誘導性プロモーターに作動可能に連結している。一部の実施形態では、ペイロードをコードする遺伝子は、プラスミド上に存在し、構成的プロモーターに作動可能に連結している。一部の実施形態では、ペイロードをコードする遺伝子は、プラスミド上に存在し、低酸素または嫌気条件下で誘導されるプロモーターに作動可能に連結している。一部の実施形態では、ペイロードをコードする遺伝子は、プラスミド上に存在し、テトラサイクリンもしくはアラビノース、クメートおよびサリチレートまたは本明細書に記載の別の化学もしくは栄養インデューサーへの曝露により誘導されるプロモーターに作動可能に連結している。
一部の実施形態では、ペイロードをコードする遺伝子は、染色体上に存在し、直接または間接誘導性プロモーターに作動可能に連結している。一部の実施形態では、ペイロードをコードする遺伝子は、染色体上に存在し、構成的プロモーターに作動可能に連結している。一部の実施形態では、ペイロードをコードする遺伝子は、染色体内に存在し、低酸素または嫌気条件下で誘導されるプロモーターに作動可能に連結している。一部の実施形態では、ペイロードをコードする遺伝子は、染色体上に存在し、テトラサイクリンもしくはアラビノース、クメートおよびサリチレートまたは本明細書に記載の別の化学もしくは栄養インデューサーへの曝露により誘導されるプロモーターに作動可能に連結している。
一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、２つまたはそれより多いペイロードを含み、ペイロードのすべてが染色体上に存在する。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、２つまたはそれより多いペイロードを含み、ペイロードのすべてが１つまたは複数の同じまたは異なるプラスミド上に存在する。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、２つまたはそれより多いペイロードを含み、ペイロードの一部は、染色体上に存在し、ペイロードの一部は、１つまたは複数の同じまたは異なるプラスミド上に存在する。
上記実施形態のいずれにおいても、エフェクターまたは免疫モジュレーター組合せを産生するための１つまたは複数のペイロードは、１つまたは複数の直接または間接誘導性プロモーターに作動可能に連結している。一部の実施形態では、１つまたは複数のペイロードは、外因性環境条件下で、例えば、消化管内に見られる条件、腫瘍微小環境または他の特異的条件下で、誘導される直接または間接誘導性プロモーターに、作動可能に連結している。一部の実施形態では、１つまたは複数のペイロードは、消化管内に見られる代謝物、腫瘍微小環境または他の組織特異的条件によって誘導される直接または間接誘導性プロモーターに、作動可能に連結している。一部の実施形態では、１つまたは複数のペイロードは、低酸素または嫌気条件下で誘導される直接または間接誘導性プロモーターに作動可能に連結している。一部の実施形態では、１つまたは複数のペイロードは、本明細書に記載の炎症性条件（例えば、ＲＮＳ、ＲＯＳ）下で誘導される直接または間接誘導性プロモーターに作動可能に連結している。一部の実施形態では、１つまたは複数のペイロードは、本明細書に記載の、例えば腫瘍内に見られるような、免疫抑制性条件下で誘導される直接または間接誘導性プロモーターに作動可能に連結している。一部の実施形態では、２つまたはそれより多い遺伝子配列は、ｉｎ ｖｉｖｏ条件下で存在することもあり、しないこともあり、ならびにｉｎ ｖｉｔｒｏ条件（例えば、株培養、拡大増殖、製造）中に存在することもある、化学または栄養インデューサー、例えば、テトラサイクリンもしくはアラビノース、クメートおよびサリチレートまたは本明細書に記載の他のものへの曝露によって誘導される直接または間接誘導性プロモーターに連結されている。一部の実施形態では、２つまたはそれより多いペイロードは、すべてが構成的プロモーターに連結されている。
一部の実施形態では、プロモーターは、本明細書に記載のｉｎ ｖｉｖｏ条件、例えば消化管のもとで誘導される。一部の実施形態では、プロモーターは、本明細書に記載のｉｎ ｖｉｔｒｏ条件、例えば、様々な細胞培養および／または製造条件下で誘導される。一部の実施形態では、プロモーターは、本明細書に記載のｉｎ ｖｉｖｏ条件、例えば消化管のもとで、ならびに本明細書に記載のｉｎ ｖｉｔｒｏ条件、例えば、様々な細胞培養ならびに／または細胞産生および／もしくは製造条件下で誘導される。
一部の実施形態では、ペイロードをコードする遺伝子に作動可能に連結したプロモーターは、外因性環境条件（例えば、ｉｎ ｖｉｖｏおよび／またはｉｎ ｖｉｔｒｏおよび／または産生／製造条件）により、直接誘導される。一部の実施形態では、ペイロードをコードする遺伝子に作動可能に連結したプロモーターは、外因性環境条件（例えば、ｉｎ ｖｉｖｏおよび／またはｉｎ ｖｉｔｒｏおよび／または産生／製造条件）により、間接的に誘導される。
一部の実施形態では、プロモーターは、哺乳動物の消化管に特異的な外因性環境条件により、直接または間接的に誘導される。一部の実施形態では、プロモーターは、腫瘍および／または哺乳動物の小腸の低酸素環境に特異的な外因性環境条件により、直接または間接的に誘導される。一部の実施形態では、プロモーターは、腫瘍の低酸素環境および／または哺乳動物消化管の環境などの、低酸素または嫌気条件により、直接または間接的に誘導される。一部の実施形態では、プロモーターは、腫瘍、哺乳動物の特定の組織または消化管に特異的である分子または代謝物により、直接または間接的に誘導される。一部の実施形態では、プロモーターは、細菌細胞と併用投与される分子により、直接または間接的に誘導される。
ＦＮＲ依存性調節
本発明の遺伝子操作された細菌は、免疫モジュレーターを産生するための遺伝子または遺伝子カセットを含み、遺伝子または遺伝子カセットは、外因性環境条件により制御される直接または間接誘導性プロモーターに、作動可能に連結している。一部の実施形態では、誘導性プロモーターは、酸素レベル依存性プロモーターであり、免疫モジュレーターは、低酸素、微好気または嫌気条件で発現される。例えば、低酸素条件では、酸素レベル依存性プロモーターは、対応する酸素レベル感知転写因子により活性化され、それによって、免疫モジュレーターの産生が駆動される。
細菌は、酸素レベルを感知することができる転写因子を発達させてきた。異なるシグナル伝達経路を異なる酸素レベルにより誘発することができ、異なるシグナル伝達経路は、異なる動態で存在しうる。酸素レベル依存性プロモーターは、１つまたは複数の酸素レベル感知転写因子が結合することができる核酸配列であって、対応する転写因子の結合および／または活性化が下流の遺伝子発現を活性化する、核酸配列である。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ペイロードを産生するための遺伝子または遺伝子カセットであって、酸素レベル依存性プロモーターの制御下にある遺伝子または遺伝子カセットを含む。より特異的な態様では、遺伝子操作された細菌は、低酸素または嫌気環境下、例えば、腫瘍の低酸素環境および／または哺乳動物消化管の環境下で活性化される酸素レベル依存性プロモーターの制御下の、ペイロードを産生するための遺伝子または遺伝子カセットを含む。
ある特定の実施形態では、細菌細胞は、フマル酸および硝酸レダクターゼ調節因子（ＦＮＲ）応答性プロモーターに作動可能に連結された、ペイロードをコードする遺伝子を含む。ある特定の実施形態では、細菌細胞は、フマル酸・硝酸レダクターゼ調節因子（ＦＮＲ）応答性プロモーターの制御下で発現されるペイロードをコードする遺伝子を含む。Ｅ．ｃｏｌｉにおいて、ＦＮＲは、好気性代謝から嫌気性代謝への切り替えを制御する主転写アクチベーターである（Ｕｎｄｅｎら、１９９７年）。嫌気状態で、ＦＮＲは、二量体化して活性ＤＮＡ結合タンパク質になり、このタンパク質が、嫌気成長への適応に関与する何百もの遺伝子を活性化する。好気状態では、ＦＮＲは、酸素により二量体化が妨げられ、不活性である。ＦＮＲ応答性プロモーターは、配列番号５６３〜５７９のＦＮＲ応答性プロモーターを含むが、これらに限定されない。下線付き配列は、予測されるリボソーム結合部位であり、太字の配列は、クローニングに使用される制限部位である。
ＦＮＲプロモーター配列は、当技術分野において公知であり、任意の適するＦＮＲプロモーター配列を本発明の遺伝子操作された細菌において使用することができる。任意の適するＦＮＲプロモーターを任意の適するペイロードと組み合わせることができる。
本明細書で使用される場合、用語「ペイロード」は、本明細書に記載される免疫イニシエーターおよび免疫サステナーを含むがこれらに限定されない、１つまたは複数のエフェクター分子、例えば、免疫モジュレーターを指す。
ＦＮＲプロモーター配列の非限定的な例は、配列番号５６３〜５７９で提供される。一部の実施形態では、本開示の遺伝子操作された細菌は、配列番号５６３、配列番号５６４、配列番号５６５、配列番号５６６、配列番号５６７、配列番号５６８、配列番号５６９、ｎｉｒＢ１プロモーター（配列番号５７０）、ｎｉｒＢ２プロモーター（配列番号５７１）、ｎｉｒＢ３プロモーター（配列番号５７２）、ｙｄｆＺプロモーター（配列番号５７３）、強力なリボソーム結合部位に融合されたｎｉｒＢプロモーター（配列番号５７４）、強力なリボソーム結合部位に融合されたｙｄｆＺプロモーター（配列番号５７５）、ｆｎｒＳ、嫌気誘導型低分子ＲＮＡ遺伝子（ｆｎｒＳ１プロモーター配列番号５７６またはｆｎｒＳ２プロモーター配列番号５７７）、ｃｒｐ結合部位に融合されたｎｉｒＢプロモーター（配列番号５７８）、およびｃｒｐ結合部位に融合されたｆｎｒＳ（配列番号５７９）を含む、低酸素誘導性、例えば、ＦＮＲ調節プロモーターに作動可能に連結した、ペイロード、例えば、エフェクターまたは免疫モジュレーターを含む。一部の実施形態では、ＦＮＲ応答性プロモーターは、配列番号５６３〜５７９から選択される配列と少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９９％相同である。別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、配列番号５６３〜５７９から選択される配列を含むＦＮＲ応答性プロモーターを含む遺伝子配列を含む。さらに別の実施形態では、ＦＮＲ応答性プロモーターは、配列番号５６３〜５７９をから選択される配列からなる。．一部の実施形態では、本開示の遺伝子操作された細菌は、配列番号１２８１または配列番号１２８２から選択される配列に対して少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％または少なくとも約９９％相同であるＦＮＲ応答性プロモーターに作動可能に連結された、エフェクター分子、例えば、免疫イニシエーターまたは免疫刺激因子をコードする遺伝子を含む。別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、配列番号１２８１または配列番号１２８２から選択される配列を含むＦＮＲ応答性プロモーターに作動可能に連結されたエフェクター分子を含む。さらに別の実施形態では、ＦＮＲ応答性プロモーターは、配列番号１２８１または配列番号１２８２から選択される配列からなる。
一部の実施形態では、複数の異なるＦＮＲ核酸配列が遺伝子操作された細菌に挿入される。代替実施形態では、遺伝子操作された細菌は、代替酸素レベル依存性プロモーター、例えば、ＤＮＲ（Ｔｒｕｎｋら、２０１０年）またはＡＮＲ（Ｒａｙら、１９９７年）の制御下で発現されるペイロードをコードする遺伝子を含む。これらの実施形態では、ペイロード遺伝子の発現は、消化管内などの、低酸素または嫌気環境で特に活性化される。一部の実施形態では、遺伝子発現は、当技術分野において公知の方法により、例えば、リボソーム結合部位を最適化することおよび／またはｍＲＮＡ安定性を増大させることにより、さらに最適化される。一実施形態では、哺乳動物消化管は、ヒト哺乳動物消化管である。
別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、アルギニンデイミナーゼおよび硝酸還元転写調節因子の嫌気的調節（ＡＮＲ）の制御下で発現される免疫モジュレーターを産生するための遺伝子または遺伝子カセットを含む。Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａにおいて、ＡＮＲは、「酸素制限条件または嫌気条件下で誘導されうる生理的機能の発現に必要である」（Ｗｉｎｔｅｌｅｒら、１９９６年；Ｓａｗｅｒｓ １９９１年）。Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ ＡＮＲは、Ｅ．ｃｏｌｉ ＦＮＲと相同であり、「コンセンサスＦＮＲ部位（ＴＴＧＡＴ−−−−ＡＴＣＡＡ）は、ＡＮＲおよびＦＮＲによって効率的に認識された」（Ｗｉｎｔｅｌｅｒら、１９９６年）。ＦＮＲと同様に、嫌気状態では、ＡＮＲは、嫌気成長への適応に関与する非常に多くの遺伝子を活性化する。好気状態では、ＡＮＲは不活性である。Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｙｒｉｎｇａｅ、およびＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｍｅｎｄｏｃｉｎａは、すべて、ＡＮＲの機能的アナログを有する（Ｚｉｍｍｅｒｍａｎｎら、１９９１年）。ＡＮＲにより調節されるプロモーター、例えば、ａｒｃＤＡＢＣオペロンのプロモーターは、当技術分野において公知である（例えば、Ｈａｓｅｇａｗａら、１９９８年を参照されたい）。
他の実施形態では、ペイロードを産生するための１つまたは複数の遺伝子配列は、転写アクチベーター、例えばＣＲＰ、の結合部位に融合された酸素レベル依存性プロモーターの制御下で発現される。ＣＲＰ（サイクリックＡＭＰ受容体タンパク質またはカタボライト活性化タンパク質またはＣＡＰ）は、グルコースなどの急速に代謝可能な炭水化物が存在するときに、あまり好ましくない炭素源の取込み、代謝および同化の原因となる遺伝子を抑止することにより、細菌において主要な調節的役割を果たす（Ｗｕら、２０１５年）。グルコースに対するこの選好性は、グルコース抑止、ならびにカーボンカタボライト抑止と名付けられた（Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒ、２００８年；ＧｏｒｋｅおよびＳｔｕｌｋｅ、２００８年）。一部の実施形態では、免疫モジュレーターを産生するための遺伝子または遺伝子カセットは、ＣＲＰ結合部位に融合された酸素レベル依存性プロモーターにより制御される。一部の実施形態では、ペイロードの１つまたは複数の遺伝子配列は、ＣＲＰ結合部位に融合されたＦＮＲプロモーターにより制御される。これらの実施形態では、サイクリックＡＭＰは、環境にグルコースが存在しない場合、ＣＲＰと結合する。この結合によって、ＣＲＰの立体構造変化が生じ、ＣＲＰはその結合部位と密接に結合することが可能になる。その場合、ＣＲＰ結合は、ＲＮＡポリメラーゼを直接タンパク質間相互作用によってＦＮＲプロモーターに動員することにより、遺伝子または遺伝子カセットの転写を活性化する。グルコースの存在下では、サイクリックＡＭＰは、ＣＲＰと結合せず、ペイロードを産生するための遺伝子または遺伝子カセットの転写は、抑止される。一部の実施形態では、転写アクチベーターの結合部位に融合された酸素レベル依存性プロモーター（例えば、ＦＮＲプロモーター）は、例えばｉｎ ｖｉｔｒｏで成長培地にグルコースを添加することにより、十分な量のグルコースが存在する場合に、ペイロードを産生するための遺伝子または遺伝子カセットが嫌気条件下で確実に発現されないようにするために使用される。
一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、細菌の異なる種、株または亜株からの酸素レベル依存性プロモーターを含む。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、細菌の異なる種、株または亜株からの酸素レベル感知転写因子、例えば、ＦＮＲ、ＡＮＲまたはＤＮＲを含む。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、細菌の異なる種、株または亜株からの酸素レベル感知転写因子および対応するプロモーターを含む。異種酸素レベル依存性転写調節因子および／またはプロモーターは、低酸素または嫌気環境で、前記プロモーターに作動可能に連結した遺伝子、例えばペイロードを産生するための１つまたは複数の遺伝子配列、の転写を、同じ条件下で細菌のネイティブ遺伝子およびプロモーターと比較して増加させる。ある特定の実施形態では、非ネイティブ酸素レベル依存性転写調節因子は、Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅに由来するＦＮＲタンパク質である（例えば、Ｉｓａｂｅｌｌａら、２０１１年を参照されたい）。一部の実施形態では、対応する野生型転写調節因子は、無傷の状態で保たれ、野生型活性を保持する。代替実施形態では、対応する野生型転写調節因子は、野生型活性を低減または消失させるために欠失または突然変異される。
一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、野生型酸素レベル依存性転写調節因子、例えば、ＦＮＲ、ＡＮＲまたはＤＮＲと、同じ亜型の細菌からの野生型プロモーターと比較して突然変異されている対応するプロモーターとを含む。突然変異プロモーターは、野生型転写調節因子との結合を増進させ、低酸素または嫌気環境で、前記プロモーターに作動可能に連結した遺伝子、例えばペイロードをコードする遺伝子、の転写を、同じ条件下で、野生型プロモーターと比較して増加させる。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、野生型酸素レベル依存性プロモーター、例えば、ＦＮＲ、ＡＮＲまたはＤＮＲプロモーターと、同じ亜型の細菌に由来する野生型転写調節因子と比較して突然変異されている対応する転写調節因子とを含む。突然変異転写調節因子は、野生型プロモーターとの結合を増進させ、低酸素または嫌気環境で、前記プロモーターに作動可能に連結した遺伝子、例えばペイロードをコードする遺伝子、の転写を、同じ条件下で、野生型転写調節因子と比較して増加させる。ある特定の実施形態では、突然変異型酸素レベル依存性転写調節因子は、二量体化を増進させかつＦＮＲ活性を増強するアミノ酸置換を含む、ＦＮＲタンパク質である（例えば、Ｍｏｏｒｅら、２００６年を参照されたい）。一部の実施形態で
は、酸素レベル感知転写調節因子と対応するプロモーターの両方が、低酸素条件で、ペイロードの発現を、同じ亜型の細菌からの野生型配列と比較して増加させるために、突然変異される。
一部の実施形態では、細菌細胞は、酸素レベル感知転写調節因子をコードする内因性遺伝子、例えばＦＮＲ遺伝子、の複数のコピーを含む。一部の実施形態では、酸素レベル感知転写調節因子をコードする遺伝子は、プラスミド上に存在する。一部の実施形態では、酸素レベル感知転写調節因子をコードする遺伝子、およびペイロードをコードする遺伝子は、異なるプラスミド上に存在する。一部の実施形態では、酸素レベル感知転写調節因子をコードする遺伝子、およびペイロードをコードする遺伝子は、同じプラスミド上に存在する。
一部の実施形態では、酸素レベル感知転写調節因子をコードする遺伝子は、染色体上に存在する。一部の実施形態では、酸素レベル感知転写調節因子をコードする遺伝子、およびペイロードをコードする遺伝子は、異なる染色体上に存在する。一部の実施形態では、酸素レベル感知転写調節因子をコードする遺伝子、およびペイロードをコードする遺伝子は、同じ染色体上に存在する。一部の事例では、発現安定性を増強するために誘導性プロモーターの制御下で酸素レベル感知転写調節因子を発現させるほうが有利でありうる。一部の実施形態では、転写調節因子の発現は、ペイロードをコードする遺伝子の発現を制御するプロモーターとは異なるプロモーターにより制御される。一部の実施形態では、転写調節因子の発現は、ペイロードの発現を制御する同じプロモーターにより制御される。一部の実施形態では、転写調節因子およびペイロードは、プロモーター領域から分岐転写される。
ＲＮＳ依存性調節
一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は炎症性条件により活性化されるプロモーターの制御下でペイロードを発現する。一実施形態では、ペイロードを産生するための遺伝子は、炎症性環境で活性化される炎症依存性プロモーター、例えば活性窒素種またはＲＮＳプロモーター、の制御下で発現される。例えば、活性窒素種によって誘導性の、適したＲＮＳ誘導性プロモーターは、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、０１／１１／２０１７に出願され、ＷＯ２０１７／１２３６７５として公開された国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０１３０７２に記載されている。
ＲＮＳを感知する転写因子およびその対応するＲＮＳ応答性遺伝子、プロモーター、および／または調節領域の例は、表９に示すものを含むがこれらに限定されない。
ＲＯＳ依存性調節
一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、細胞損傷の条件によって活性化されるプロモーターの制御下でペイロードを発現する。一実施形態では、ペイロードを産生するための遺伝子は、細胞または組織損傷が存在する環境において活性化される細胞損傷依存性プロモーター、例えば、活性酸素種またはＲＯＳプロモーターの制御下で発現される。一部の実施形態では、本発明の遺伝子操作された細菌は、少なくとも１つの活性酸素種を感知することができる転写因子によって直接的にまたは間接的に制御される調整可能な調節領域を含む。例えば、活性酸素種によって誘導性の、適したＲＯＳ誘導性プロモーターは、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、０１／１１／２０１７に出願され、ＷＯ２０１７／１２３６７５として公開された国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０１３０７２に記載されている。
ＲＯＳを感知する転写因子およびその対応するＲＯＳ応答性遺伝子、プロモーター、および／または調節領域の例は、表１０に示すものを含むがこれらに限定されない。
他のプロモーター
一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、環境、例えば、腫瘍微小環境、特定の組織、または哺乳動物消化管において、特定の分子または代謝物に応答性である誘導性プロモーターの制御下で発現される免疫モジュレーターを産生するための遺伝子または遺伝子カセットを含む。哺乳動物消化管内に、健常および／もしくは疾患状態の際に、または腫瘍微小環境に見られる任意の分子または代謝物を、ペイロード発現を誘導するために使用することができる。
代替実施形態では、免疫モジュレーターを産生するための遺伝子または遺伝子カセットは、環境、例えば、腫瘍微小環境、特定の組織、または哺乳動物消化管に存在しない栄養または化学インデューサーに作動可能に連結している。一部の実施形態では、栄養または化学インデューサーは、遺伝子操作された細菌の前に、それと同時に、またはそれと逐次的に投与される。
他の誘導性プロモーター
一部の実施形態では、本明細書に記載の目的のポリペプチドをコードする１つまたは複数の遺伝子配列は、プラスミド上に存在し、１つまたは複数の栄養および／もしくは化学インデューサーならびに／または代謝物により直接または間接的に誘導されうるプロモーターに作動可能に連結している。一部の実施形態では、細菌細胞は、１つまたは複数の栄養および／もしくは化学インデューサーならびに／または代謝物により誘導される免疫モジュレーターをコードする遺伝子を有する安定に維持されたプラスミドまたは染色体を含み、したがって、免疫モジュレーターを宿主細胞において発現させることができ、宿主細胞は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで、例えば培養条件下で、および／またはｉｎ ｖｉｖｏで、例えば消化管内もしくは腫瘍微小環境内で、生存および／または成長することができる。
一部の実施形態では、１つまたは複数の免疫モジュレーターおよび／または他の目的のポリペプチドの発現は、ｉｎ ｖｉｖｏで、１つまたは複数のアラビノース、クメートおよびサリチレート誘導性プロモーターによって直接的にまたは間接的に駆動される。一部の実施形態では、プロモーターは、本発明の遺伝子操作された細菌と同時投与される化学的および／または栄養的インデューサーおよび／または代謝物によって直接的にまたは間接的に誘導される。一部の実施形態では、インデューサーは、腫瘍への細菌注射前の規定された時点に腹腔内投与される。一部の実施形態では、インデューサーは、腫瘍への細菌注射後の規定された時点に腹腔内投与される。一部の実施形態では、インデューサーは、腫瘍への細菌注射と同時発生的に腹腔内投与される。一部の実施形態では、インデューサーは、腫瘍への細菌注射前の規定された時点に静脈内投与される。一部の実施形態では、インデューサーは、腫瘍への細菌注射後の規定された時点に静脈内投与される。一部の実施形態では、インデューサーは、腫瘍への細菌注射と同時発生的に静脈内投与される。一部の実施形態では、インデューサーは、腫瘍への細菌注射前の規定された時点に皮下投与される。一部の実施形態では、インデューサーは、腫瘍への細菌注射後の規定された時点に皮下投与される。一部の実施形態では、インデューサーは、腫瘍への細菌注射と同時発生的に皮下投与される。
一部の実施形態では、インデューサーは、腫瘍への細菌注射前の規定された時点に腫瘍内投与される。一部の実施形態では、インデューサーは、腫瘍への細菌注射後の規定された時点に腫瘍内投与される。一部の実施形態では、インデューサーは、腫瘍への細菌注射と同時発生的に腫瘍内投与される。一部の実施形態では、インデューサーは、腫瘍への細菌注射前の規定された時点に腹腔内投与される。一部の実施形態では、インデューサーは、腫瘍への細菌注射後の規定された時点に腹腔内投与される。一部の実施形態では、インデューサーは、静脈内細菌投与と同時発生的に腹腔内投与される。一部の実施形態では、インデューサーは、腫瘍への細菌注射前の規定された時点に静脈内投与される。一部の実施形態では、インデューサーは、腫瘍への細菌注射後の規定された時点に静脈内投与される。一部の実施形態では、インデューサーは、静脈内細菌投与と同時発生的に静脈内投与される。一部の実施形態では、インデューサーは、腫瘍への細菌注射前の規定された時点に皮下投与される。一部の実施形態では、インデューサーは、腫瘍への細菌注射後の規定された時点に皮下投与される。一部の実施形態では、インデューサーは、静脈内細菌投与と同時発生的に皮下投与される。一部の実施形態では、インデューサーは、腫瘍への細菌注射前の規定された時点に腫瘍内投与される。一部の実施形態では、インデューサーは、腫瘍への細菌注射後の規定された時点に腫瘍内投与される。一部の実施形態では、インデューサーは、静脈内細菌投与と同時発生的に腫瘍内投与される。
一部の実施形態では、目的の１つまたは複数の免疫モジュレーターおよび／または他のポリペプチドの発現は、ｉｎ ｖｉｖｏでの投与の前の株のｉｎ ｖｉｔｒｏでの成長、調製または製造中に化学および／もしくは栄養インデューサーならびに／または代謝物により誘導される１つまたは複数のプロモーターによって直接または間接的に駆動される。一部の実施形態では、化学および／もしくは栄養インデューサーならびに／または代謝物により誘導されるプロモーターは、例えば、細胞成長、細胞拡大増殖、発酵、回収、精製、製剤化および／または製造中に使用される、例えば、フラスコ、発酵槽または他の適切な培養容器において成長させられる、培養中に誘導される。一部の実施形態では、プロモーターは、投与の前に、発現を誘導するためにならびに細菌に目的の免疫モジュレーターおよび／または他のポリペプチドを前負荷するために細菌培養に添加される分子により直接または間接的に誘導される。一部の実施形態では、化学および／もしくは栄養インデューサーならびに／または代謝物により誘導される培養は、好気的に成長させられる。一部の実施形態では、化学および／もしくは栄養インデューサーならびに／または代謝物により誘導される培養は、嫌気的に成長させられる。
一実施形態では、エフェクターまたは免疫モジュレーターをコードする遺伝子は、サリチレートまたはその誘導体によって誘導されるプロモーターに作動可能に連結される。１００年間を超える臨床使用の後に、サリチレートは、依然として、世界中で最も広範に使用されている「店頭販売の（ｏｖｅｒ−ｔｈｅ−ｃｏｕｎｔｅｒ）」薬物の１つであり続け、未だに、それによって新薬が評価される標準鎮痛剤／解熱剤／抗炎症剤として認識されている（Ｃｌｉｓｓｏｌｄ；Ｓａｌｉｃｙｌａｔｅ ａｎｄ ｒｅｌａｔｅｄ ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ ｏｆ ｓａｌｉｃｙｌｉｃ ａｃｉｄ；Ｄｒｕｇｓ．１９８６年；３２巻、追補４号：８〜２６頁）。非限定的な例では、免疫モジュレーターは、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａから本来適応されたサリチレートＰＳａｌ／ＮａｈＲバイオセンサー回路（パート：ＢＢａ＿Ｊ６１０５１）の一部として、プロモーターＰＳａｌに作動可能に連結される。ｎａｈＲ遺伝子は、インデューサーサリチレートに応答してｎａｈおよびｓａｌプロモーターに結合して転写を活性化する３４ｋＤａタンパク質をコードする、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａの８３ｋｂナフタレン分解プラスミドＮＡＨ７から取り出された（Ｄｕｎｎ， Ｎ． Ｗ．およびＩ． Ｃ． Ｇｕｎｓａｌｕｓ（１９７３年）Ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｂｌｅ ｐｌａｓｍｉｄ ｅｎｃｏｄｉｎｇ ｅａｒｌｙ ｅｎｚｙｍｅｓ ｏｆ ｎａｐｈｔｈａｌｅｎｅ ｏｘｉｄａｔｉｏｎ ｉｎ Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ．、Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１１４巻：９７４〜９７９頁）。この系において、ＮａｈＲは、構成的プロモーター（Ｐｃ）によって構成的に発現され、目的のタンパク質、例えば、免疫モジュレーターの発現は、インデューサー（例えば、サリチレート）の存在下でＮａｈＲによって正に調節される。よって、一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、サリチレート誘導性プロモーター（例えば、ＰＳａｌ）に作動可能に連結された、免疫モジュレーターをコードする遺伝子配列を含む。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、プロモーターに作動可能に連結された、ＮａｈＲをコードする遺伝子配列（複数可）をさらに含む。一部の実施形態では、ＮａｈＲは、本明細書に記載されるまたは当技術分野で公知の構成的プロモーターの制御下に置かれる。一部の実施形態では、ＮａｈＲは、本明細書に記載されるまたは当技術分野で公知の誘導性プロモーターの制御下に置かれる。本明細書に記載される一部の実施形態では、Ｂｉｏｂｒｉｃｋ ＢＢａ＿Ｊ６１０５１（構成的プロモーターおよびＰＳａｌプロモーターによって駆動されるＮａｈＲをコードする遺伝子を含有する）は、ｄａｃＡに先行してクローニングされた。
一部の実施形態では、目的の１つまたは複数の免疫モジュレータータンパク質、例えば１つまたは複数の治療用ポリペプチド、の発現は、１つまたは複数のサリチレート誘導性プロモーターにより直接または間接的に駆動される。
一部の実施形態では、サリチレート誘導性プロモーターは、目的の１つまたは複数のタンパク質のｉｎ ｖｉｖｏでの発現に有用であり、またはそのような発現中に誘導される。一部の実施形態では、目的の１つまたは複数の免疫モジュレーターの発現は、ｉｎ ｖｉｖｏで１つまたは複数のサリチレート誘導性プロモーターにより直接または間接的に駆動される。一部の実施形態では、プロモーターは、本発明の遺伝子操作された細菌と併用投与される分子、例えばサリチレート、により直接または間接的に誘導される。
一部の実施形態では、サリチレートは、腫瘍への細菌注射前の規定された時点に腹腔内投与される。一部の実施形態では、サリチレートは、腫瘍への細菌注射後の規定された時点に腹腔内投与される。一部の実施形態では、サリチレートは、腫瘍への細菌注射と同時発生的に腹腔内投与される。一部の実施形態では、サリチレートは、腫瘍への細菌注射前の規定された時点に静脈内投与される。一部の実施形態では、サリチレートは、腫瘍への細菌注射後の規定された時点に静脈内投与される。一部の実施形態では、サリチレートは、腫瘍への細菌注射と同時発生的に静脈内投与される。一部の実施形態では、サリチレートは、腫瘍への細菌注射前の規定された時点に皮下投与される。一部の実施形態では、サリチレートは、腫瘍への細菌注射後の規定された時点に皮下投与される。一部の実施形態では、サリチレートは、腫瘍への細菌注射と同時発生的に皮下投与される。
一部の実施形態では、サリチレートは、腫瘍への細菌注射前の規定された時点に腫瘍内投与される。一部の実施形態では、サリチレートは、腫瘍への細菌注射後の規定された時点に腫瘍内投与される。一部の実施形態では、サリチレートは、腫瘍への細菌注射と同時発生的に腫瘍内投与される。一部の実施形態では、サリチレートは、腫瘍への細菌注射前の規定された時点に腹腔内投与される。一部の実施形態では、サリチレートは、腫瘍への細菌注射後の規定された時点に腹腔内投与される。一部の実施形態では、サリチレートは、静脈内細菌投与と同時発生的に腹腔内投与される。一部の実施形態では、サリチレートは、腫瘍への細菌注射前の規定された時点に静脈内投与される。一部の実施形態では、サリチレートは、腫瘍への細菌注射後の規定された時点に静脈内投与される。一部の実施形態では、サリチレートは、静脈内細菌投与と同時発生的に静脈内投与される。一部の実施形態では、サリチレートは、腫瘍への細菌注射前の規定された時点に皮下投与される。一部の実施形態では、サリチレートは、腫瘍への細菌注射後の規定された時点に皮下投与される。一部の実施形態では、サリチレートは、静脈内細菌投与と同時発生的に皮下投与される。一部の実施形態では、サリチレートは、腫瘍への細菌注射前の規定された時点に腫瘍内投与される。一部の実施形態では、サリチレートは、腫瘍への細菌注射後の規定された時点に腫瘍内投与される。一部の実施形態では、サリチレートは、静脈内細菌投与と同時発生的に腫瘍内投与される。
一部の実施形態では、１つまたは複数の目的のタンパク質の発現は、ｉｎ ｖｉｖｏ投与に先立つ株のｉｎ ｖｉｔｒｏ成長、調製または製造において、１つまたは複数のサリチレート誘導性プロモーターによって直接的にまたは間接的に駆動される。一部の実施形態では、サリチレート誘導性プロモーターは、培養中に、例えば、フラスコ、発酵槽または他の適切な培養容器内での育成下で誘導され、例えば、細胞成長、細胞拡大増殖、発酵、回収、精製、製剤化および／または製造中に使用される。一部の実施形態では、プロモーターは、細菌培養物に添加されて発現を誘導し、投与に先立ち細菌にペイロードを前負荷する分子、例えば、サリチレートによって直接的にまたは間接的に誘導される。一部の実施形態では、サリチレートによって誘導される培養物は、好気的に育成される。一部の実施形態では、サリチレートによって誘導される培養物は、嫌気的に育成される。
一部の実施形態では、サリチレート誘導性プロモーターは、低コピー数プラスミドまたは高コピー数プラスミドまたは本明細書に記載のバイオセーフティシステムプラスミドからの目的の１つまたは複数のタンパク質の発現を駆動する。一部の実施形態では、サリチレート誘導性プロモーターは、細菌染色体に組み込まれている構築物からの目的の１つまたは複数のタンパク質の発現を駆動する。例示的な挿入部位は、本明細書に記載されている。
一部の実施形態では、１つまたは複数の目的のタンパク質は、ネイティブサリチレート誘導性プロモーターに連結され、これによって駆動される。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、配列番号１２７３または配列番号１２７４と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％，９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する１つまたは複数の遺伝子配列を含む。
一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、配列番号１２７３または配列番号１２７４を含む遺伝子配列を含む。別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、配列番号１２７３または配列番号１２７４からなる遺伝子配列を含む。
一部の実施形態では、サリチレート誘導性構築物は、一部の実施形態では、構成的または誘導性プロモーターから多岐にわたり転写される、ＮａｈＲをコードする遺伝子をさらに含む。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、配列番号１２７８と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一性を有する１つまたは複数の遺伝子配列を含む。別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、配列番号１２７８を含む遺伝子配列を含む。別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、配列番号１２７８からなる遺伝子配列を含む。
一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、配列番号１２８０によりコードされているポリペプチドと少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％，９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有するポリペプチドをコードする１つまたは複数の遺伝子配列を含む。別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、配列番号１２８０を含むポリペプチドをコードする遺伝子配列を含む。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌により発現されるポリペプチドは、配列番号１２８０からなる。
一実施形態では、免疫モジュレーターをコードする遺伝子は、クメートまたはその誘導体によって誘導されるプロモーターに作動可能に連結される。適した誘導体は、当技術分野で公知であり、例えば、米国特許第７７４５５９２号に記載されている。クメート誘導の利点は、クメートが、無毒性、水溶性かつ安価であることを含む。ネイティブＰ．ｐｕｔｉｄａ Ｆ１においてクメート調節性発現が機能する基礎的機構、およびＥ．ｃｏｌｉを含むがこれらに限定されない他の細菌クラスにこれが適用される仕方は、以前に記載された（例えば、Ｃｈｏｉら、Ｎｏｖｅｌ， Ｖｅｒｓａｔｉｌｅ， ａｎｄ Ｔｉｇｈｔｌｙ Ｒｅｇｕｌａｔｅｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｓｔｒａｉｎｓ；Ａｐｐｌ． Ｅｎｖｉｒｏｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ２０１０年８月、７６巻、１５号、５０５８〜５０６６頁を参照）。基本的に、クメート回路またはスイッチは、４つの構成成分を含む：強いプロモーター、リプレッサー結合ＤＮＡ配列またはオペレーター、ｃｙｍＲの発現、リプレッサー、およびインデューサーとしてのクメート。インデューサーの添加は、クメートおよびＣｙｍＲの間の複合体の形成を引き起こし、そのＤＮＡ結合部位からのリプレッサーの除去をもたらし、目的の遺伝子の発現を可能にする。構成的プロモーターおよびｃｙｍＲ応答性プロモーターによって駆動されるｃｙｍＲ遺伝子を含む構築物は、ＤａｃＡ遺伝子の前にクローニングされて、ＤａｃＡのクメート誘導性発現を可能にし、これは、本明細書の他の箇所に記載されている。
一実施形態では、１つまたは複数の目的の免疫モジュレータータンパク質、例えば、１つまたは複数の治療ポリペプチドの発現は、クメートまたはその誘導体によって誘導性の１つまたは複数のプロモーターによって直接的にまたは間接的に駆動される。
一部の実施形態では、クメート誘導性プロモーターは、１つまたは複数の目的のタンパク質のｉｎ ｖｉｖｏ発現に有用であるまたはその際に誘導される。一部の実施形態では、１つまたは複数の目的の免疫モジュレータータンパク質の発現は、ｉｎ ｖｉｖｏで１つまたは複数のクメート誘導性プロモーターによって直接的にまたは間接的に駆動される。一部の実施形態では、プロモーターは、本発明の遺伝子操作された細菌と同時投与される分子、例えば、クメートによって直接的にまたは間接的に誘導される。
一部の実施形態では、クメートは、腫瘍への細菌注射前の規定された時点に腹腔内投与される。一部の実施形態では、クメートは、腫瘍への細菌注射後の規定された時点に腹腔内投与される。一部の実施形態では、クメートは、腫瘍への細菌注射と同時発生的に腹腔内投与される。一部の実施形態では、クメートは、腫瘍への細菌注射前の規定された時点に静脈内投与される。一部の実施形態では、クメートは、腫瘍への細菌注射後の規定された時点に静脈内投与される。一部の実施形態では、クメートは、腫瘍への細菌注射と同時発生的に静脈内投与される。一部の実施形態では、クメートは、腫瘍への細菌注射前の規定された時点に皮下投与される。一部の実施形態では、クメートは、腫瘍への細菌注射後の規定された時点に皮下投与される。一部の実施形態では、クメートは、腫瘍への細菌注射と同時発生的に皮下投与される。
一部の実施形態では、クメートは、腫瘍への細菌注射前の規定された時点に腫瘍内投与される。一部の実施形態では、クメートは、腫瘍への細菌注射後の規定された時点に腫瘍内投与される。一部の実施形態では、クメートは、腫瘍への細菌注射と同時発生的に腫瘍内投与される。一部の実施形態では、クメートは、腫瘍への細菌注射前の規定された時点に腹腔内投与される。一部の実施形態では、クメートは、腫瘍への細菌注射後の規定された時点に腹腔内投与される。一部の実施形態では、クメートは、静脈内細菌投与と同時発生的に腹腔内投与される。一部の実施形態では、クメートは、腫瘍への細菌注射前の規定された時点に静脈内投与される。一部の実施形態では、クメートは、腫瘍への細菌注射後の規定された時点に静脈内投与される。一部の実施形態では、クメートは、静脈内細菌投与と同時発生的に静脈内投与される。一部の実施形態では、クメートは、腫瘍への細菌注射前の規定された時点に皮下投与される。一部の実施形態では、クメートは、腫瘍への細菌注射後の規定された時点に皮下投与される。一部の実施形態では、クメートは、静脈内細菌投与と同時発生的に皮下投与される。一部の実施形態では、クメートは、腫瘍への細菌注射前の規定された時点に腫瘍内投与される。一部の実施形態では、クメートは、腫瘍への細菌注射後の規定された時点に腫瘍内投与される。一部の実施形態では、クメートは、静脈内細菌投与と同時発生的に腫瘍内投与される。
一部の実施形態では、目的の１つまたは複数のタンパク質の発現は、ｉｎ ｖｉｖｏでの投与の前の株のｉｎ ｖｉｔｒｏでの成長、調製または製造中に１つまたは複数のクメート誘導性プロモーターにより直接または間接的に駆動される。一部の実施形態では、テトラサイクリン誘導性プロモーターは、例えば、細胞成長、細胞拡大増殖、発酵、回収、精製、製剤化および／または製造中に使用される、例えば、フラスコ、発酵槽または他の適切な培養容器において成長させられる、培養中に誘導される。一部の実施形態では、プロモーターは、投与の前に、発現を誘導するためにおよび細菌にペイロードを前負荷するために細菌培養に添加される分子、例えばクメート、により直接または間接的に誘導される。一部の実施形態では、クメートにより誘導される培養は、好気的に成長させられる。一部の実施形態では、クメートにより誘導される培養は、嫌気的に成長させられる。
一部の実施形態では、クメート誘導性プロモーターは、低コピー数プラスミドまたは高コピー数プラスミドまたは本明細書に記載のバイオセーフティシステムプラスミドからの目的の１つまたは複数のタンパク質の発現を駆動する。一部の実施形態では、クメート誘導性プロモーターは、細菌染色体に組み込まれている構築物から目的の１つまたは複数のタンパク質の発現を駆動する。例示的な挿入部位は、本明細書に記載されている。
一部の実施形態では、１つまたは複数の目的のタンパク質は、ネイティブクメート誘導性プロモーターに作動可能に連結される。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、配列番号１２７０または配列番号１２７１と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一性を有する１つまたは複数の遺伝子配列を含む。
一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、配列番号１２７０または配列番号１２７１を含む遺伝子配列を含む。別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、配列番号１２７０または配列番号１２７１からなる遺伝子配列を含む。
一部の実施形態では、クメート誘導性構築物は、一部の実施形態では、構成的または誘導性プロモーターから多岐にわたり転写される、ＣｙｍＲをコードする遺伝子をさらに含む。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、配列番号１２６８と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一性を有する１つまたは複数の遺伝子配列を含む。別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、配列番号１２６８を含む遺伝子配列を含む。別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、配列番号１２６８からなる遺伝子配列を含む。
一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、配列番号１２６９によってコードされるポリペプチドと少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一性を有するポリペプチドをコードする１つまたは複数の遺伝子配列を含む。別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、配列番号１２６９を含むポリペプチドをコードする遺伝子配列を含む。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌によって発現されるポリペプチドは、配列番号１２６９からなる。
本開示において企図される他の誘導性プロモーターは、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、０１／１１／２０１７に出願され、ＷＯ２０１７／１２３６７５として公開された国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０１３０７２に記載されている。そのようなプロモーターは、アラビノース誘導性、ラムノース誘導性およびＩＰＴＧ誘導性プロモーター、テトラサイクリン誘導性プロモーター、温度誘導性プロモーター、ならびにＰＳＳＢプロモーターを含む。これらのプロモーターは、互いと、または低酸素誘導性プロモーター等の他の誘導性プロモーターもしくは構成的プロモーターと組み合わせて使用して、例えば、１つの細菌において、または２つ以上の細菌株の組成物において、異なるエフェクターの発現を微調整することができる。
構成的プロモーター
一部の実施形態では、ペイロードをコードする遺伝子は、プラスミド上に存在し、構成的プロモーターに作動可能に連結している。一部の実施形態では、ペイロードをコードする遺伝子は、染色体上に存在し、構成的プロモーターに作動可能に連結している。
一部の実施形態では、構成的プロモーターは、本明細書に記載のｉｎ ｖｉｖｏ条件下で、例えば消化管のもとで、および／または腫瘍微小環境の条件下で、活性である。一部の実施形態では、プロモーターは、本明細書に記載のｉｎ ｖｉｔｒｏ条件下で、例えば、様々な細胞培養および／または細胞製造条件下で、活性である。一部の実施形態では、構成的プロモーターは、本明細書に記載のｉｎ ｖｉｖｏ条件下で、例えば、消化管のもとで、および／または腫瘍微小環境の条件下で、ならびに本明細書に記載のｉｎ ｖｉｔｒｏ条件下で、例えば、様々な細胞培養ならびに／または細胞産生および／もしくは製造条件下で、活性である。
一部の実施形態では、ペイロードをコードする遺伝子に作動可能に連結している構成的プロモーターは、様々な外因性環境条件（例えば、ｉｎ ｖｉｖｏおよび／またはｉｎ ｖｉｔｒｏおよび／または産生／製造条件）で、活性である。
一部の実施形態では、構成的プロモーターは、哺乳動物の消化管に特異的な外因性環境条件、および／または腫瘍微小環境条件で、活性である。一部の実施形態では、構成的プロモーターは、哺乳動物の小腸に特異的な外因性環境条件において活性である。一部の実施形態では、構成的プロモーターは、低酸素または嫌気条件、例えば、哺乳動物の消化管の環境、および／または腫瘍微小環境条件で、活性である。一部の実施形態では、構成的プロモーターは、哺乳動物の消化管および／または腫瘍微小環境条件に特異的である分子または代謝物の存在下で活性である。一部の実施形態では、構成的プロモーターは、細菌細胞と併用投与される分子により直接または間接的に誘導される。一部の実施形態では、構成的プロモーターは、分子もしくは代謝物、またはｉｎ ｖｉｔｒｏでの培養中に存在する他の条件、細胞産生および／または製造条件の存在下で、活性である。
細菌の構成的プロモーターは、当技術分野で公知であり、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、０１／１１／２０１７に出願され、ＷＯ２０１７／１２３６７５として公開された国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０１３０７２に記載されている。例は、配列番号５９８〜７３９において本明細書に含まれており、サブセットは、表１１に示されている。
一部の実施形態では、プロモーターは、Ｐｌｐｐまたはその誘導体である。一部の実施形態では、プロモーターは、配列番号７４０からの配列を含む。一部の実施形態では、構成的プロモーターは、配列番号７４０の配列と少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９９％相同である。一部の実施形態では、プロモーターは、ＰａｐＦＡＢ４６またはその誘導体である。一部の実施形態では、プロモーターは、配列番号７４１からの配列を含む。一部の実施形態では、構成的プロモーターは、配列番号７４１の配列と少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９９％相同である。一部の実施形態では、プロモーターは、ＰＪ２３１０１＋ＵＰエレメントまたはその誘導体である。一部の実施形態では、プロモーターは、配列番号７４２からの配列を含む。一部の実施形態では、構成的プロモーターは、配列番号７４２の配列と少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９９％相同である。一部の実施形態では、プロモーターは、ＰＪ２３１０７＋ＵＰエレメントまたはその誘導体である。一部の実施形態では、プロモーターは、配列番号７４３からの配列を含む。一部の実施形態では、構成的プロモーターは、配列番号７４３の配列と少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９９％相同である。一部の実施形態では、プロモーターは、ＰＳＹＮ２３１１９またはその誘導体である。一部の実施形態では、プロモーターは、配列番号７４４からの配列を含む。一部の実施形態では、構成的プロモーターは、配列番号７４４の配列と少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９９％相同である。
ペイロードに連結されうる追加的なプロモーターは、ａｐＦＡＢ１２４（ｔｃｇａｃａｔｔｔａｔｃｃｃｔｔｇｃｇｇｃｇａａｔａｃｔｔａｃａｇｃｃａｔａｇｃａａ（配列番号１４４３））；ａｐｆａｂ３３８（ＧＧＣＧＣＧＣＣＴＴＧＡＣＡＡＴＴＡＡＴＣＡＴＣＣＧＧＣＴＣＣＴＡＧＧＡＴＧＴＧＴＧＧＡＧＧＧＡＣ（配列番号１４４４））、ａｐＦＡＢ６６（ＧＧＣＧＣＧＣＣＴＴＧＡＣＡＴＣＡＧＧＡＡＡＡＴＴＴＴＴＣＴＧＴＡＴＡＡＴＡＧＡＴＴＣＡＴＣＴＣＡＡ（配列番号１４４５））およびａｐＦＡＢ５４（ＧＧＣＧＣＧＣＣＴＴＧＡＣＡＴＡＡＡＧＴＣＴＡＡＣＣＴＡＴＡＧＧＡＴＡＣＴＴＡＣＡＧＣＣＡＴＡＣＡＡＧ（配列番号１４４６））を含む。一部の実施形態では、プロモーターは、ａｐＦＡＢ１２４またはその誘導体である。一部の実施形態では、プロモーターは、ａｐＦＡＢ１２４の配列を含む。一部の実施形態では、構成的プロモーターは、ａｐＦＡＢ１２４の配列に対して少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％または少なくとも約９９％相同である。一部の実施形態では、プロモーターは、ａｐＦＡＢ３３８またはその誘導体である。一部の実施形態では、プロモーターは、ａｐＦＡＢ３３８の配列を含む。一部の実施形態では、構成的プロモーターは、ａｐＦＡＢ３３８の配列に対して少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％または少なくとも約９９％相同である。一部の実施形態では、プロモーターは、ａｐＦＡＢ６６またはその誘導体である。一部の実施形態では、プロモーターは、ａｐＦＡＢ６６の配列を含む。一部の実施形態では、構成的プロモーターは、ａｐＦＡＢ６６の配列に対して少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％または少なくとも約９９％相同である。一部の実施形態では、プロモーターは、ａｐＦＡＢ５４またはその誘導体である。一部の実施形態では、プロモーターは、ａｐＦＡＢ５４の配列を含む。一部の実施形態では、構成的プロモーターは、ａｐＦＡＢ５４の配列に対して少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％または少なくとも約９９％相同である。
リボソーム結合部位
一部の実施形態では、リボソーム結合部位は、付加、交換または置換される。少数のリボソーム結合部位を試験することにより、発現レベルを微調整して所望のレベルにすることができる。一部の実施形態では、原核生物発現に適しており、所望の発現レベルを達成するために使用することができるＲＢＳが、選択される。ＲＢＳの非限定的な例は、標準生物学的パーツ・レジストリ（Ｒｅｇｉｓｔｒｙ ｏｆ ｓｔａｎｄａｒｄ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｐａｒｔｓ）に収載されており、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、０１／１１／２０１７に出願され、ＷＯ２０１７／１２３６７５として公開された国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０１３０７２に記載されている。適した例は、配列番号１０１８〜１０５０および８６９〜８７１、８７３〜８７７、８８０〜８８７に示されている。
株培養におけるペイロードの誘導
培養におけるペイロードの誘導は、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、０１／１１／２０１７に出願され、ＷＯ２０１７／１２３６７５として公開された国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０１３０７２に記載されている。
一部の実施形態では、投与の前に目的のペイロードもしくはタンパク質発現および／またはペイロード活性を前誘導するのが望ましい。そのような目的のペイロードまたはタンパク質は、分泌を目的としたエフェクターであってもよく、またはエフェクターを産生するように代謝反応を触媒する酵素であってもよい。他の実施形態では、目的のタンパク質は、有害な代謝物を異化する酵素である。そのような状況では、株に目的の活性ペイロードまたはタンパク質が前負荷される。そのような事例では、本発明の遺伝子操作された細菌は、ｉｎ ｖｉｖｏでの投与の前の細胞成長、拡大増殖、精製、発酵および／または製造中の細菌培養に関して規定される条件下で、目的の１つまたは複数のタンパク質を発現する。そのような培養条件は、例えば、細胞成長、細胞拡大増殖、発酵、回収、精製、製剤化および／または製造中に使用される、フラスコ、発酵槽または他の適切な培養容器で、規定されうる。本明細書で使用される場合、用語「細菌培養」または「細菌細胞培養」または「培養」は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで、細胞成長、細胞拡大増殖、回収、精製、発酵および／または製造を含む、いくつかの産生プロセス中に維持または成長させられる、細菌細胞または微生物を指す。本明細書で使用される場合、用語「発酵」は、被定義条件下での細菌の成長、拡大増殖および維持を指す。発酵は、嫌気または低酸素または酸素負荷条件を含む多数の細胞培養条件下で、インデューサー、栄養素の存在下で、被定義温度などで、行われうる。
培養条件は、高い細胞密度（高バイオマス）収率を維持しながら細胞の最適な活性および生存率を達成するように選択される。酸素レベル（例えば、低酸素、微好気性、好気性）、培地の温度、ならびに栄養素および／または種々の成長培地、培地に供給される化学および／または栄養インデューサーならびに他の成分を含む、多数の細胞培養条件および運転パラメーターが、最適な活性、高い収率および高い生存率を達成するためにモニターされ、調整される。
一部の実施形態では、目的の１つまたは複数のタンパク質は、株がｉｎ ｖｉｖｏでの投与のために成長させられている間に、直接または間接的に誘導される。理論に縛られることは望まないが、前誘導は、例えば、消化管又は腫瘍において、ｉｎ ｖｉｖｏでの活性を高めることができる。特に消化管区画での細菌滞留時間が比較的短い場合、細菌は、十分なｉｎ ｖｉｖｏ誘導能力に達することなく小腸を通過することもある。対照的に、株が前誘導されており、かつ株に前負荷されていた場合、株は、既に十分に活性であり、これによって、細菌が腸に到達したとき、より迅速に、より大きい活性が可能になる。それ故、株が最適な活性でない通過時間が「浪費され」ない。細菌は、腸を通って移動し続けるので、ｉｎ ｖｉｖｏでの誘導は、消化管の環境条件下（例えば、低酸素、または消化管代謝物の存在下）で起こる。同様に、他の細菌の、本明細書に記載される通りの、全身性投与または腫瘍内注射は、細菌が腫瘍に達すると、より大きい活性をより急速に可能にすることができる。腫瘍に入ると、例えば、腫瘍微小環境の条件下で、ｉｎ ｖｉｖｏ誘導が起こる。
一実施形態では、１つまたは複数のペイロードの発現は、細胞成長、細胞拡大増殖、発酵、回収、精製、製剤化および／または製造中に誘導される。一実施形態では、目的の、いくつかの異なるタンパク質の発現は、細胞成長、細胞拡大増殖、発酵、回収、精製、製剤化および／または製造中に誘導される。
一部の実施形態では、株は、ｉｎ ｖｉｖｏでの投与の前の株成長中にいかなる前誘導プロトコールもなく、投与される。
嫌気誘導
一部の実施形態では、細胞は、培養中に嫌気または低酸素条件下で誘導される。そのような事例では、細胞は、ある特定の密度、例えば１×１０８〜１×１０１１の範囲の密度、を示す、ある特定のＯＤ、例えば０．１〜１０の範囲内のＯＤに達し、そして指数関数的成長に達し終えるまで（例えば、１．５〜３時間）成長させられ、次いで、おおよそ３〜５時間にわたって嫌気または低酸素条件に切り替えられる。一部の実施形態では、株は、例えば、ＦＮＲプロモーター活性を誘導し、１つまたは複数のＦＮＲプロモーターの制御下で１つまたは複数のペイロードおよび／または輸送体の発現を駆動するために、嫌気または低酸素条件下で誘導される。
一実施形態では、１つまたは複数のペイロードの発現は、１つまたは複数のＦＮＲプロモーターの制御下にあり、細胞成長、細胞拡大増殖、発酵、回収、精製、製剤化および／または製造中に、嫌気または低酸素条件下で誘導される。一実施形態では、目的のいくつかの異なるタンパク質の発現は、１つまたは複数のＦＮＲプロモーターの制御下にあり、細胞成長、細胞拡大増殖、発酵、回収、精製、製剤化および／または製造中に、嫌気または低酸素条件下で誘導される。
理論に縛られることは望まないが、ＦＮＲプロモーターの制御下の１つまたは複数のペイロードを含む株は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで、嫌気または低酸素培養条件下での、ならびにｉｎ ｖｉｖｏで、消化管に見られる低酸素条件および／または腫瘍微小環境の条件下で、これらのプロモーターからのペイロードの発現を可能にしうる。
一部の実施形態では、アラビノース、クメートおよびサリチレートＩＰＴＧ、ラムノース、テトラサイクリンならびに／または他の化学および／もしくは栄養インデューサーにより誘導されうる、目的のペイロードに連結されたプロモーターを、嫌気または低酸素条件下、化学および／または栄養インデューサーの存在下で、誘導することができる。詳細には、株は、遺伝子配列の一部がＦＮＲプロモーターの制御下にあり、他の遺伝子配列が、化学および／または栄養インデューサーにより誘導されるプロモーターの制御下にある、遺伝子配列の組合せを含むことができる。一部の実施形態では、株は、１つまたは複数のＦＮＲプロモーターの制御下の１つまたは複数のペイロード遺伝子配列と、本明細書に記載の１つまたは複数の構成的プロモーターの制御下の１つまたは複数のペイロード遺伝子配列とを含むことができる。好気誘導
一部の実施形態では、好気条件下で株を調製すること、株に前負荷すること、および株を前誘導することが望ましい。これは、より効率的な成長および生存率を可能にし、場合によっては、毒性代謝物の蓄積を低減させる。そのような事例では、細胞は、ある特定の密度、例えば１×１０８〜１×１０１１の範囲の密度、を示す、ある特定のＯＤ、例えば０．１〜１０の範囲内のＯＤに達し、そして指数関数的成長に達し終えるまで（例えば、１．５〜３時間）成長させられ、次いで、インデューサーの添加によって、または他の手段、例えば、許容温度へのシフトによって、おおよそ３〜５時間にわたって誘導される。
一部の実施形態では、アラビノース、クメートおよびサリチレート、ＩＰＴＧ、ラムノース、テトラサイクリン、ならびに／または本明細書に記載のもしくは当技術分野において公知の他の化学および／もしくは栄養インデューサーにより誘導されうるプロモーターを、好気条件下で、化学および／または栄養インデューサーの存在下で、細胞成長、細胞拡大増殖、発酵、回収、精製、製剤化および／または製造中に誘導することができる。一実施形態では、１つまたは複数のペイロードの発現は、化学および／または栄養インデューサーにより調節される１つまたは複数のプロモーターの制御下にあり、好気条件下で、細胞成長、細胞拡大増殖、発酵、回収、精製、製剤化および／または製造中に誘導される。
一部の実施形態では、遺伝子操作された株は、好気培養条件下で誘導される遺伝子配列を含む。一部の実施形態では、これらの株は、ｉｎ ｖｉｖｏで消化管内および／または腫瘍微小環境条件での活性化のためのＦＮＲ誘導性遺伝子配列をさらに含む。一部の実施形態では、これらの株は、ｉｎ ｖｉｖｏで消化管内および／または腫瘍微小環境条件での活性化のためのＦＮＲ誘導性遺伝子配列をさらに備えていない。
微好気誘導
一部の実施形態では、生存率、成長および活性は、微好気条件下で菌株を前誘導することにより最適化される。一部の実施形態では、微好気条件は、特に、１つまたは複数のペイロードの発現が、嫌気性および／または低酸素プロモーター、例えばＦＮＲプロモーター、により駆動される場合、最適な成長、活性および生存率の条件と、誘導のための最適な条件との「バランスを取る」のに最もよく適している。そのような事例では、細胞は、例えば、ある特定の密度、例えば１×１０８〜１×１０１１の範囲の密度、を示す、ある特定のＯＤ、例えば０．１〜１０の範囲内のＯＤに達し、そして指数関数的成長に達し終えるまで成長させられ（例えば、１．５〜３時間）、次いで、インデューサーの添加によって、または他の手段、例えば、許容温度へのシフトによって、おおよそ３〜５時間にわたって誘導される。
一実施形態では、１つまたは複数のペイロードの発現は、１つまたは複数のＦＮＲプロモーターの制御下にあり、微好気条件下で、細胞成長、細胞拡大増殖、発酵、回収、精製、製剤化および／または製造中に誘導される。
理論に縛られることは望まないが、ＦＮＲプロモーターの制御下の１つまたは複数のペイロードを含む株は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで、微好気培養条件下で、ならびにｉｎ ｖｉｖｏで、消化管に見られる低酸素条件および／または腫瘍微小環境の条件下で、これらのプロモーターからのペイロードの発現を可能にしうる。
一部の実施形態では、アラビノース、クメートおよびサリチレート、ＩＰＴＧ、ラムノース、テトラサイクリンならびに／または他の化学および／もしくは栄養インデューサーにより誘導されうるプロモーターを、微好気条件下で、化学および／または栄養インデューサーの存在下で、誘導することができる。詳細には、株は、遺伝子配列の一部がＦＮＲプロモーターの制御下にあり、他の遺伝子配列が化学および／または栄養インデューサーにより誘導されるプロモーターの制御下にある、遺伝子配列の組合せを含むことができる。一部の実施形態では、株は、１つまたは複数のＦＮＲプロモーターの制御下の１つまたは複数のペイロード遺伝子配列と、本明細書に記載の１つまたは複数の構成的プロモーターの制御下の１つまたは複数のペイロード遺伝子配列とを含むことができる。
一実施形態では、１つまたは複数のペイロードの発現は、化学および／または栄養インデューサーにより調節される１つまたは複数のプロモーターの制御下にあり、微好気条件下で、細胞成長、細胞拡大増殖、発酵、回収、精製、製剤化および／または製造中に誘導される。
フェージング、パルシングおよび／またはサイクリングを使用する株の誘導
一部の実施形態では、ｉｎ ｖｉｖｏでの投与の前に、株を効率的に誘導し、成長させるために、細胞成長、拡大増殖、回収、精製、発酵および／または製造中にサイクリング、フェージングまたはパルシング技術が利用される。この方法は、特に、成長、細胞健康状態または生存率が誘導条件下で悪影響を受ける場合、最適な成長、活性、細胞健康状態、および生存率の条件と、誘導のための最適な条件との「バランスを取る」ために使用される。そのような事例では、細胞は、第１のフェーズまたはサイクルで、ある特定の密度、例えば１×１０８〜１×１０１１の範囲の密度、を示す、ある特定のＯＤ、例えば０．１〜１０の範囲内のＯＤに達し終えるまで成長させられ（例えば、１．５〜３時間）、次いで、インデューサーの添加によって、または他の手段、例えば、許容温度へのシフト（プロモーターが温度調節型である場合）、または酸素レベルの変化（例えば、ＦＮＲプロモーターにより駆動される構築物の誘導の場合、酸素レベルの低減）によって、おおよそ３〜５時間にわたって誘導される。第２のフェーズまたはサイクルでは、条件は、最適な成長、細胞健康状態および生存率を支持する当初の条件に戻される。あるいは、化学および／または栄養インデューサーが使用される場合には、第２のフェーズまたはサイクルで、インデューサーの第２の用量を培養にスパイクすることができる。
一部の実施形態では、２サイクルの最適条件および誘導条件が利用される（すなわち、成長、誘導、回収および成長、誘導）。一部の実施形態では、３サイクルの最適条件および誘導条件が利用される。一部の実施形態では、４サイクルまたはそれより多いサイクルの最適条件および誘導条件が利用される。非限定的な例では、そのようなサイクリングおよび／またはフェージングは、嫌気および／または低酸素条件下での誘導（例えば、ＦＮＲプロモーターの誘導）に使用される。一実施形態では、細胞は、最適な密度に成長させられ、次いで、嫌気および／または低酸素条件下で誘導される。成長および／または生存率が、ストレスの多い誘導条件のために悪影響を受ける前に、細胞は、酸素負荷条件に戻されて回復させられ、その後、２回目の誘導嫌気および／または低酸素条件に戻される。一部の実施形態では、これらのサイクルが必要に応じて繰り返される。
一部の実施形態では、成長中の培養に、１回、化学および／または栄養インデューサーがスパイクされる。一部の実施形態では、成長中の培養に、２回、化学および／または栄養インデューサーがスパイクされる。一部の実施形態では、成長中の培養に、３回またはそれより多い回数、化学および／または栄養インデューサーがスパイクされる。非限定的な例では、細胞は、先ず、最適成長条件下で、ある特定の密度まで、例えば、細胞が１×１０８〜１×１０１１の範囲の密度になるまで、０．１〜１０に達するように１．５〜３時間、成長させられる。次いで、化学インデューサー、例えば、アラビノースまたはＩＰＴＧが、培養に添加される。３〜５時間後、追加のインデューサー用量が、誘導の再開始のために添加される。スパイキングを必要に応じて繰り返すことができる。
一部の実施形態では、フェージング（ｐｈａｓｉｎｇ）またはサイクリングまたはパルシングまたはスパイキング技法を使用することにより、細胞成長、細胞拡大増殖、発酵、回収、精製、製剤化および／または製造において誘導されたペイロード（複数可）は、異なる誘導性プロモーター、例えば、２つの異なる化学的インデューサーの制御下に置かれる。他の実施形態では、ペイロードは、低酸素条件または微好気的条件下で誘導され、第２のペイロードは、化学的インデューサーによって誘導される。
核酸
一部の実施形態では、本開示は、１つまたは複数の免疫イニシエーターおよび／または免疫サステナーを産生するための新規核酸を提供する。一部の実施形態では、核酸は、１つまたは複数の免疫イニシエーターおよび／または免疫サステナーポリペプチドをコードする。よって、一部の実施形態では、核酸は、１つまたは複数の免疫イニシエーターおよび／または免疫サステナーポリペプチドをコードする遺伝子配列（複数可）を含む。
一部の実施形態では、本開示は、１つまたは複数のＳＴＩＮＧアゴニストを産生するための新規核酸を提供する。一部の実施形態では、核酸は、１つまたは複数のＳＴＩＮＧアゴニスト産生ポリペプチドをコードする。よって、一部の実施形態では、核酸は、１つまたは複数のＳＴＩＮＧアゴニスト産生ポリペプチドをコードする遺伝子配列（複数可）を含む。
一部の実施形態では、本開示は、ｃ−ジ−ＡＭＰを産生するための新規核酸を提供する。一部の実施形態では、核酸は、１つまたは複数のｃ−ジＡＭＰ産生ポリペプチドをコードする。よって、一部の実施形態では、核酸は、１つまたは複数のサイクリックジアデニル酸シクラーゼポリペプチドをコードする遺伝子配列（複数可）を含む。一部の実施形態では、核酸は、ＤａｃＡポリペプチドをコードする遺伝子配列を含む。ある特定の実施形態では、ＤａｃＡポリペプチドは、配列番号１２５７と少なくとも約８０％同一性を有する。ある特定の実施形態では、ＤａｃＡポリペプチドは、配列番号１２５７と少なくとも約９０％同一性を有する。ある特定の実施形態では、ＤａｃＡポリペプチドは、配列番号１２５７と少なくとも約９５％同一性を有する。一部の実施形態では、ＤａｃＡポリペプチドは、配列番号１２５７と少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一性を有する。一部の特異的な実施形態では、ＤａｃＡポリペプチドは、配列番号１２５７を含む。他の特異的な実施形態では、ＤａｃＡポリペプチドは、配列番号１２５７からなる。一部の実施形態では、核酸は、ｄａｃＡ遺伝子配列を含む。ある特定の実施形態では、ｄａｃＡ遺伝子配列を含む核酸は、配列番号１２５８と少なくとも約８０％同一性を有する。ある特定の実施形態では、ｄａｃＡ遺伝子配列を含む核酸は、配列番号１２５８と少なくとも約９０％同一性を有する。ある特定の実施形態では、ｄａｃＡ遺伝子配列を含む核酸は、配列番号１２５８と少なくとも約９５％同一性を有する。一部の実施形態では、ｄａｃＡ遺伝子配列を含む核酸は、配列番号１２５８と少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一性を有する。一部の特異的な実施形態では、ｄａｃＡ遺伝子配列を含む核酸は、配列番号１２５８を含む。他の特異的な実施形態では、ｄａｃＡ遺伝子配列を含む核酸は、配列番号１２５８からなる。
ある特定の実施形態では、ｄａｃＡ遺伝子配列を含む核酸は、低酸素誘導性プロモーターに作動可能に連結される。ある特定の実施形態では、ｄａｃＡ遺伝子配列を含む核酸は、低酸素誘導性プロモーターに作動可能に連結され、配列番号１２８４と少なくとも約８０％同一性を有する。ある特定の実施形態では、低酸素誘導性プロモーターに作動可能に連結されたｄａｃＡ遺伝子配列を含む核酸は、配列番号１２８４と少なくとも約９０％同一性を有する。ある特定の実施形態では、低酸素誘導性プロモーターに作動可能に連結されたｄａｃＡ遺伝子配列を含む核酸は、配列番号１２８４と少なくとも約９５％同一性を有する。一部の実施形態では、低酸素誘導性プロモーターに作動可能に連結されたｄａｃＡ遺伝子配列を含む核酸は、配列番号１２８４と少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一性を有する。一部の特異的な実施形態では、低酸素誘導性プロモーターに作動可能に連結されたｄａｃＡ遺伝子配列を含む核酸は、配列番号１２８４を含む。他の特異的な実施形態では、低酸素誘導性プロモーターに作動可能に連結されたｄａｃＡ遺伝子配列を含む核酸は、配列番号１２８４からなる。
一部の実施形態では、本開示は、ｃ−ＧＡＭＰを産生するための新規核酸を提供する。一部の実施形態では、核酸は、１つまたは複数のｃ−ＧＡＭＰ産生ポリペプチドをコードする。よって、一部の実施形態では、核酸は、１つまたは複数のサイクリックｃ−ＧＡＭＰシンターゼ（ｃＧＡＳ）ポリペプチドをコードする遺伝子配列（複数可）を含む。一部の実施形態では、核酸は、ＧＡＭＰシンターゼポリペプチドをコードする遺伝子配列を含む。一部の実施形態では、核酸は、ヒトＧＡＭＰシンターゼポリペプチドをコードする遺伝子配列を含む。一部の実施形態では、核酸は、Ｖｅｒｍｉｎｅｐｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｅｉｓｅｎｉａｅ由来のＧＡＭＰシンターゼポリペプチドをコードする遺伝子配列を含む。一部の実施形態では、核酸は、Ｋｉｎｇｅｌｌａ ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ由来のＧＡＭＰシンターゼポリペプチド（ＡＴＣＣ ３３３９４）をコードする遺伝子配列を含む。一部の実施形態では、核酸は、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｂａｃｉｌｌｉｆｏｒｍｉｓ由来のＧＡＭＰシンターゼポリペプチド（ＡＴＣＣ ＢＡＡ−１２００）をコードする遺伝子配列を含む。ある特定の実施形態では、ｃＧＡＳポリペプチドは、配列番号１２５４、１２６０、１２６１および１２６２から選択される配列と少なくとも約８０％同一性を有する。ある特定の実施形態では、ｃＧＡＳポリペプチドは、配列番号１２５４、１２６０、１２６１および１２６２から選択される配列と少なくとも約９０％同一性を有する。ある特定の実施形態では、ｃＧＡＳポリペプチドは、配列番号１２５４、１２６０、１２６１および１２６２から選択される配列と少なくとも約９５％同一性を有する。一部の実施形態では、ｃＧＡＳポリペプチドは、配列番号１２５４、１２６０、１２６１および１２６２から選択される配列と少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一性を有する。一部の特異的な実施形態では、ｃＧＡＳポリペプチドは、配列番号１２５４、１２６０、１２６１および１２６２から選択される配列を含む。他の特異的な実施形態では、ｃＧＡＳポリペプチドは、配列番号１２５４、１２６０、１２６１および１２６２から選択される配列からなる。一部の実施形態では、核酸は、ｃＧＡＳ遺伝子配列を含む。ある特定の実施形態では、ｃＧＡＳ遺伝子配列を含む核酸は、配列番号１２５５、１２６３、１２６４および１２６５から選択される配列と少なくとも約８０％同一性を有する。ある特定の実施形態では、ｃＧＡＳ遺伝子配列を含む核酸は、配列番号１２５５、１２６３、１２６４および１２６５から選択される配列と少なくとも約９０％同一性を有する。ある特定の実施形態では、ｃＧＡＳ遺伝子配列を含む核酸は、配列番号１２５５、１２６３、１２６４および１２６５から選択される配列と少なくとも約９５％同一性を有する。一部の実施形態では、ｃＧＡＳ遺伝子配列を含む核酸は、配列番号１２５５、１２６３、１２６４および１２６５から選択される配列と少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一性を有する。一部の特異的な実施形態では、ｃＧＡＳ遺伝子配列を含む核酸は、配列番号１２５５、１２６３、１２６４および１２６５から選択される配列を含む。他の特異的な実施形態では、ｃＧＡＳ遺伝子配列を含む核酸は、配列番号１２５５、１２６３、１２６４および１２６５から選択される配列からなる。
一部の実施形態では、本開示は、キヌレニンを枯渇させるための新規核酸を提供する。一部の実施形態では、核酸は、１つまたは複数のキヌレニン枯渇酵素をコードする遺伝子配列を含む。本明細書に記載の核酸実施形態の１つでは、キヌレニン異化酵素をコードする核酸配列は、ｋｙｎＵ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）を含む。したがって、一実施形態では、ｋｙｎＵ遺伝子を含む核酸配列は、配列番号６８と少なくとも約８０％の同一性を有する。一実施形態では、ｋｙｎＵ遺伝子を含む核酸配列は、配列番号６８と少なくとも約９０％の同一性を有する。別の実施形態では、ｋｙｎＵ遺伝子を含む核酸配列は、配列番号６８と少なくとも約９５％の同一性を有する。したがって、一実施形態では、ｋｙｎＵ遺伝子を含む核酸配列は、配列番号６８と少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有する。別の実施形態では、ｋｙｎＵ遺伝子を含む核酸配列は、配列番号６８を含む。さらに別の実施形態では、ｋｙｎＵ遺伝子を含む核酸配列は、配列番号６８からなる。
本明細書に記載の核酸実施形態の１つでは、キヌレニン分解酵素は、キヌレニナーゼ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｅ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）を含む。一実施形態では、核酸配列は、配列番号６５と少なくとも約８０％の同一性を有するポリペプチドをコードする。一実施形態では、核酸配列は、配列番号６５と少なくとも約９０％の同一性を有するポリペプチドをコードする。別の実施形態では、核酸配列は、配列番号６５と少なくとも約９５％の同一性を有するポリペプチドをコードする。したがって、一実施形態では、核酸配列は、配列番号６５と少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有するポリペプチドをコードする。別の実施形態では、核酸配列は、配列番号６５をコードする配列を含むポリペプチドをコードする。さらに別の実施形態では、核酸配列は、配列番号６５をコードする配列からなるポリペプチドをコードする。
一部の実施形態では、本開示は、キヌレニンを消費するための新規核酸を提供する。一部の実施形態では、核酸は、１つまたは複数のキヌレニン消費ポリペプチドをコードする。よって、一部の実施形態では、核酸は、１つまたは複数のキヌレニン消費ポリペプチドをコードする遺伝子配列（複数可）を含む。
一部の実施形態では、本開示は、キヌレニンを消費するための新規核酸を提供する。一部の実施形態では、核酸は、１つまたは複数のキヌレニン消費ポリペプチドをコードする。よって、一部の実施形態では、核酸は、１つまたは複数のキヌレニナーゼポリペプチドをコードする遺伝子配列（複数可）を含む。一部の実施形態では、核酸は、例えば、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓに由来するキヌレニナーゼポリペプチドをコードする遺伝子配列を含む。ある特定の実施形態では、キヌレニナーゼポリペプチドは、配列番号６５と少なくとも約８０％同一性を有する。ある特定の実施形態では、キヌレニナーゼポリペプチドは、配列番号６５と少なくとも約９０％同一性を有する。ある特定の実施形態では、キヌレニナーゼポリペプチドは、配列番号６５と少なくとも約９５％同一性を有する。一部の実施形態では、キヌレニナーゼポリペプチドは、配列番号６５と少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一性を有する。一部の特異的な実施形態では、キヌレニナーゼポリペプチドは、配列番号６５を含む。他の特異的な実施形態では、キヌレニナーゼポリペプチドは、配列番号６５からなる。一部の実施形態では、核酸は、ｋｙｎ遺伝子配列を含む。ある特定の実施形態では、ｋｙｎ遺伝子配列を含む核酸は、配列番号６８と少なくとも約８０％同一性を有する。ある特定の実施形態では、ｋｙｎ遺伝子配列を含む核酸は、配列番号６８と少なくとも約９０％同一性を有する。ある特定の実施形態では、ｋｙｎ遺伝子配列を含む核酸は、配列番号６８と少なくとも約９５％同一性を有する。一部の実施形態では、ｋｙｎ遺伝子配列を含む核酸は、配列番号６８と少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一性を有する。一部の特異的な実施形態では、ｋｙｎ遺伝子配列を含む核酸は、配列番号６８を含む。他の特異的な実施形態では、ｋｙｎ遺伝子配列を含む核酸は、配列番号６８からなる。一部の実施形態では、核酸は、ｋｙｎ遺伝子配列を含む。ある特定の実施形態では、ｋｙｎ遺伝子配列を含む核酸は、配列番号１２８３と少なくとも約８０％同一性を有する。ある特定の実施形態では、ｋｙｎ遺伝子配列を含む核酸は、配列番号１２８３と少なくとも約９０％同一性を有する。ある特定の実施形態では、ｋｙｎ遺伝子配列を含む核酸は、配列番号１２８３と少なくとも約９５％同一性を有する。一部の実施形態では、ｋｙｎ遺伝子配列を含む核酸は、配列番号１２８３と少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一性を有する。一部の特異的な実施形態では、ｋｙｎ遺伝子配列を含む核酸は、配列番号１２８３を含む。他の特異的な実施形態では、ｋｙｎ遺伝子配列を含む核酸は、配列番号１２８３からなる。
ある特定の実施形態では、ｋｙｎ遺伝子配列を含む核酸は、本明細書に記載される構成的プロモーター、例えば、ＰＳＹＮ２３１１９に作動可能に連結される。ある特定の実施形態では、ｋｙｎ遺伝子配列を含む核酸は、低酸素誘導性プロモーターに作動可能に連結され、配列番号８９０と少なくとも約８０％同一性を有する。ある特定の実施形態では、低酸素誘導性プロモーターに作動可能に連結されたｋｙｎ遺伝子配列を含む核酸は、配列番号８９０と少なくとも約９０％同一性を有する。ある特定の実施形態では、低酸素誘導性プロモーターに作動可能に連結されたｋｙｎ遺伝子配列を含む核酸は、配列番号８９０と少なくとも約９５％同一性を有する。一部の実施形態では、低酸素誘導性プロモーターに作動可能に連結されたｋｙｎ遺伝子配列を含む核酸は、配列番号８９０と少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一性を有する。一部の特異的な実施形態では、低酸素誘導性プロモーターに作動可能に連結されたｋｙｎ遺伝子配列を含む核酸は、配列番号８９０を含む。他の特異的な実施形態では、低酸素誘導性プロモーターに作動可能に連結されたｋｙｎ遺伝子配列を含む核酸は、配列番号８９０からなる。
追加的な適した核酸配列は、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、０１／１１／２０１７に出願され、ＷＯ２０１７／１２３６７５として公開された国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０１３０７２に記載されている。
上に記載される核酸実施形態のいずれにおいても、エフェクター、例えば、免疫モジュレーター、例えば、免疫イニシエーターおよび／または免疫サステナーを産生するための１つまたは複数の核酸配列は、１つまたは複数の直接的にまたは間接的に誘導性のプロモーターに作動可能に連結される。一部の実施形態では、１つまたは複数の核酸配列は、外因性環境条件下で、例えば、消化管内に見られる条件、腫瘍微小環境または他の組織特異的条件下で誘導される直接または間接誘導性プロモーターに作動可能に連結している。一部の実施形態では、１つまたは複数の核酸配列は、消化管内に見られる代謝物、腫瘍微小環境または他の特異的条件によって誘導される直接または間接誘導性プロモーターに、作動可能に連結している。一部の実施形態では、１つまたは複数の核酸配列は、低酸素または嫌気条件下で誘導される直接または間接誘導性プロモーターに作動可能に連結している。一部の実施形態では、１つまたは複数の核酸配列は、本明細書に記載の炎症性条件（例えば、ＲＮＳ、ＲＯＳ）下で誘導される直接または間接誘導性プロモーターに作動可能に連結している。一部の実施形態では、１つまたは複数の核酸配列は、本明細書に記載の、例えば腫瘍内に見られるような、免疫抑制性条件下で誘導される直接または間接誘導性プロモーターに作動可能に連結している。一部の実施形態では、１つまたはそれより多い遺伝子配列は、ｉｎ ｖｉｖｏ条件下で存在することもあり、しないこともあり、ならびにｉｎ ｖｉｔｒｏ条件（例えば、株培養、拡大増殖、製造）中に存在することもある、化学または栄養インデューサー、例えば、テトラサイクリンもしくはアラビノース、クメートおよびサリチレート、または本明細書に記載の他のものへの曝露によって誘導される直接または間接誘導性プロモーターに連結されている。一部の実施形態では、１つまたは複数のペイロードは、本明細書、およびその内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、０１／１１／２０１７に出願され、ＷＯ２０１７／１２３６７５として公開された国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０１３０７２に記載される、構成的プロモーターに連結される。一部の実施形態では、１つまたはそれより多い遺伝子配列は、同じプロモーター配列に作動可能に連結している。一部の実施形態では、２つまたはそれより多い遺伝配列は、２つまたはそれより多い異なるプロモーター配列に作動可能に連結しており、プロモーター配列は、すべてが構成的（同じもしくは異なる構成的プロモーター）であることもあり、すべてが誘導性（同じもしくは異なるインデューサーによって誘導可能）であることもあり、または構成的プロモーターと誘導性プロモーターの混合物であることもある。
一実施形態では、１つまたは複数の免疫モジュレーターをコードする１つまたは複数の核酸配列は、細菌細胞におけるプラスミド上に位置する。別の実施形態では、１つまたは複数の免疫モジュレーターをコードする１つまたは複数の核酸配列は、細菌細胞の染色体中に位置する。これらの核酸実施形態のいずれにおいても、１つまたは複数の免疫モジュレーターをコードするそのような１つまたは複数の核酸配列は、本明細書に記載される他の免疫モジュレーターをコードする他のいずれかの核酸と組み合わせることができる。
これらの実施形態のいずれにおいても、上記および本明細書の他の箇所に記載されるエフェクター分子、例えば、免疫モジュレーター、例えば、免疫サステナーまたは免疫モジュレーターをコードする核酸配列（複数可）は、１つまたは複数のさらに別のエフェクター分子、すなわち、治療分子または代謝変換因子をコードする核酸配列（複数可）と組み合わせることができる（同じまたは別々の核酸分子上に）。免疫イニシエーターまたは免疫サステナーをコードする核酸配列は、構成的または誘導性プロモーター、例えば、低酸素誘導性プロモーターまたは本明細書に記載される他のいずれかの構成的または誘導性プロモーターの制御下に置くことができる。
これらの実施形態のいずれにおいても、上記に記載されるエフェクター分子のうち１つまたは複数をコードする核酸配列（複数可）は、本明細書に記載される１つまたは複数のＳＴＩＮＧアゴニスト産生酵素をコードする核酸配列（複数可）と組み合わせることができる（同じまたは別々の核酸分子上に）。一部の実施形態では、エフェクター分子をコードする核酸配列（複数可）と組み合わされる核酸配列（複数可）は、ＤａｃＡをコードする。ＤａｃＡは、構成的または誘導性プロモーター、例えば、ＦＮＲ等の低酸素誘導性プロモーターまたは本明細書に記載される他のいずれかの構成的または誘導性プロモーターの制御下に置くことができる。一部の実施形態では、エフェクター分子をコードする遺伝子配列（複数可）と組み合わされる核酸配列（複数可）は、ｃＧＡＳをコードする。ｃＧＡＳは、構成的または誘導性プロモーター、例えば、ＦＮＲ等の低酸素誘導性プロモーターまたは本明細書に記載される他のいずれかの構成的または誘導性プロモーターの制御下に置くことができる。
これらの組合せ実施形態のいずれにおいても、核酸配列（複数可）は、ＤａｐＡ、ＴｈｙＡまたはその両方に、栄養要求性改変、例えば、突然変異または欠失を有する核酸配列（複数可）を含む。これらの実施形態のいずれにおいても、核酸配列（複数可）は、本明細書に記載される内在性プロファージに、ファージ改変、例えば、突然変異または欠失を含む核酸配列を含む。
分泌
遺伝子操作された微生物が、その微生物から分泌されるように意図されたタンパク質、ポリペプチド、ペプチド、または他の免疫調節、ＤＮＡ、ＲＮＡ、小分子もしくは他の分子を産生する、本明細書に記載の実施形態のいずれにおいても、操作された微生物は、分泌機構と、分泌系をコードする対応する遺伝子配列とを含むことができる。
一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、細胞外環境で細菌細胞質から免疫モジュレーターを分泌することができる、ネイティブ分泌機構または非ネイティブ分泌機構をさらに含む。多くの細菌は、細菌細胞エンベロープを横断して基質を輸送するための洗練された分泌系を発達させてきた。小分子、タンパク質およびＤＮＡなどの基質を、細胞外空間もしくは周辺質（例えば、消化管内腔または他の空間）に放出すること、標的細胞に注入すること、または細菌の膜と会合させることができる。
グラム陰性細菌において、分泌機構は、内膜および外膜の一方または両方にまたがることができる。タンパク質、例えば治療用ポリペプチド、を細胞外空間に移行させるために、ポリペプチドを、先ず、細胞内で翻訳し、内膜を横断して移動できるようにし、最終的には外膜を横断して移動できるようにしなければならない。多くのエフェクタータンパク質（例えば、治療用ポリペプチド）−特に、真核生物由来のもの−は、三次および四次構造を安定させるためにジスルフィド結合を含有する。これらの結合は、周辺質シャペロンのおかげで酸化性周辺質区画において正しく形成することができるが、外膜を横断してポリペプチドを移行させるために、ジスルフィド結合を還元し、タンパク質を再びアンフォールディングしなければならない。
グラム陰性およびグラム陽性細菌からの異種ポリペプチド、例えば、エフェクター分子の分泌に適した分泌系は、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、０１／１１／２０１７に出願され、ＷＯ２０１７／１２３６７５として公開された国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０１３０７２に記載されている。そのような分泌系は、二重膜貫通（Ｄｏｕｂｌｅ ｍｅｍｂｒａｎｅ−ｓｐａｎｎｉｎｇ）分泌系を含み、Ｉ型分泌系（Ｔ１ＳＳ）、ＩＩ型分泌系（Ｔ２ＳＳ）、ＩＩＩ型分泌系（Ｔ３ＳＳ）、ＩＶ型分泌系（Ｔ４ＳＳ）、ＶＩ型分泌系（Ｔ６ＳＳ）、および多剤排出ポンプの抵抗性結節形成区画（ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ−ｎｏｄｕｌａｔｉｏｎ−ｄｉｖｉｓｉｏｎ）（ＲＮＤ）ファミリー、およびＶＩＩ型分泌系（Ｔ７ＳＳ）を含むがこれらに限定されない。あるいは、ヘモリジンに基づく分泌系、Ｖ型オートトランスポーター分泌系、伝統的もしくは改変型ＩＩＩ型またはＩＩＩ型様分泌系（Ｔ３ＳＳ）、鞭毛ＩＩＩ型分泌経路を使用することができる。一部の実施形態では、非ネイティブ１回（ｓｉｎｇｌｅ）膜貫通分泌系、例えば、ＴａｔもしくはＴａｔ様系またはＳｅｃもしくはＳｅｃ様系を使用することができる。本明細書およびＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０１３０７２に記載される分泌系のいずれかを本開示に従って用いて、目的のポリペプチドを分泌させてもよい。
グラム陰性菌において正確にフォールディングされたタンパク質を分泌する１つの方法−特に、ジスルフィド結合を必要とするもの−は、還元性環境周辺質を不安定化性外膜とともに標的化することである。この方法で、タンパク質を、酸化性環境に移動できるようにし、正確にフォールディングさせる。組織化された細胞外分泌系とは対照的に、タンパク質は、その後、正しくフォールディングされた形態で膜漏出によって細胞膜周辺腔から抜け出すことができる。したがって、これらの「漏出性の」グラム陰性突然変異体は、生物活性の、正確にジスルフィド結合したポリペプチドを分泌することができる。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、「漏出性の」または不安定化された外膜（ＤＯＭ）を有する。漏出性を誘導するための細菌外膜の不安定化は、例えばｌｐｐ、ｏｍｐＣ、ｏｍｐＡ、ｏｍｐＦ、ｔｏｌＡ、ｔｏｌＢおよびｐａｌを含む、硬いペプチドグリカン骨格への外膜の繋留に関与する遺伝子を欠失させることによって、またはそのような遺伝子の突然変異を誘発することによって、遂行することができる。Ｌｐｐは、細胞１個当たり約５００，０００コピーで存在する、細菌細胞内に最も大量に存在するポリペプチドであり、ペプチドグリカンへの細菌細胞壁の主要「ステープル」として機能する。ＴｏｌＡ−ＰＡＬおよびＯｍｐＡ複合体は、Ｌｐｐと同様に機能し、漏出性表現型を生じさせるための他の欠失標的である。加えて、漏出性表現型は、周辺質プロテアーゼが不活性化されたときに観察されている。周辺質にはタンパク質が非常に密集しており、それ故、周辺質は、タンパク質代謝回転を助長するためのいくつかの周辺質タンパク質をコードする。ｄｅｇＳ、ｄｅｇＰまたはｎｌｐＩなどの周辺質プロテアーゼの除去は、周辺質タンパク質の過剰な蓄積を促進することにより漏出性表現型を誘導することができる。プロテアーゼの突然変異もまた、これらのプロテアーゼによる標的化分解を防止することにより、エフェクターポリペプチドを失わないようにすることができる。
さらに、これらの突然変異の組合せは、細胞生存率を大きく犠牲にすることなく、細胞の漏出性表現型を相乗的に増強することができる。したがって、一部の実施形態では、操作された細菌は、１つまたは複数の欠失または突然変異した膜遺伝子を有する。一部の実施形態では、操作された細菌は、欠失または突然変異したｌｐｐ遺伝子を有する。一部の実施形態では、操作された細菌は、ｏｍｐＡ、ｏｍｐＡ、およびｏｍｐＦ遺伝子から選択される、１つまたは複数の欠失または突然変異した遺伝子を有する。一部の実施形態では、操作された細菌は、ｔｏｌＡ、ｔｏｌＢおよびｐａｌ遺伝子から選択される、１つまたは複数の欠失または突然変異した遺伝子を有する。一部の実施形態では、操作された細菌は、１つまたは複数の欠失または突然変異した周辺質プロテアーゼ遺伝子を有する。一部の実施形態では、操作された細菌は、ｄｅｇＳ、ｄｅｇＰおよびｎｌｐｌから選択される、１つまたは複数の欠失または突然変異した周辺質プロテアーゼ遺伝子を有する。一部の実施形態では、操作された細菌は、ｌｐｐ、ｏｍｐＡ、ｏｍｐＦ、ｔｏｌＡ、ｔｏｌＢ、ｐａｌ、ｄｅｇＳ、ｄｅｇＰおよびｎｌｐｌ遺伝子から選択される、１つまたは複数の欠失または突然変異した遺伝子を有する。
細胞生存率に対する障害を最小にするために、例えばｌｐｐ、ｏｍｐＡ、ｏｍｐＦ、ｔｏｌＡ、ｔｏｌＢ、ｐａｌ、ｄｅｇＳ、ｄｅｇＰおよびｎｌｐｌから選択される、１つまたは複数の膜または周辺質プロテアーゼ遺伝子を、誘導性プロモーターの制御下に置くことにより、漏出性表現型を誘導可能にすることができる。例えば、ｌｐｐまたは他の細胞壁安定性タンパク質または周辺質プロテアーゼの発現を、治療用ポリペプチドを送達する（分泌する）必要がある状態の際に、抑止することができる。例えば、標的膜または周辺質プロテアーゼ遺伝子の転写または翻訳を低減させる、転写リプレッサータンパク質または設計されたアンチセンスＲＮＡを、誘導条件下で発現させることができる。逆に言うと、ある特定のペプチドの過剰発現、例えば、コリシン、またはＴｏｌＡの第３のトポロジカルドメインの過剰発現は、不安定化された表現型をもたらすことができ、治療用ポリペプチドを送達する（分泌する）必要がある状態の際にペプチド過剰発現を誘導することができる。これらの種類の戦略は、バイオマス産生から脆弱な漏出性表現型を分離することになる。したがって、一部の実施形態では、操作された細菌は、誘導性プロモーターの制御下の１つまたは複数の膜および／または周辺質プロテアーゼ遺伝子を有する。
１つまたは複数の目的のタンパク質または治療タンパク質が、微生物から分泌または搬出される一部の実施形態では、操作された微生物は、分泌タグを含む遺伝子配列（複数可）を含む。一部の実施形態では、１つまたは複数の目的のタンパク質または治療タンパク質は、１つまたは複数の目的のタンパク質または治療タンパク質を特異的な分泌系に方向付けるための、ＲＮＡまたはペプチド起源のいずれかの「分泌タグ」を含む。分泌タグは、ｓｅｃまたはｔａｔ系に由来することができる。
一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、免疫モジュレーター、例えば、サイトカイン、抗体（例えば、ｓｃＦｖ）、代謝酵素、例えばキヌレニナーゼ、および本明細書に記載の他のもの、の分泌のための、本明細書に記載のネイティブまたは非ネイティブ分泌系を含む。
一部の実施形態では、分泌タグは、ＰｈｏＡ、ＯｍｐＦ、ｃｖａＣ、ＴｏｒＡ、ｆｄｎＧ、ｄｍｓＡ、ＰｅｌＢ、ＨｌｙＡ分泌シグナル、およびＨｌｙＡ分泌シグナルから選択される。一部の実施形態では、分泌タグは、ＰｈｏＡ分泌シグナルである。一部の実施形態では、分泌タグは、配列番号７４５または配列番号７４６から選択される配列を含む。一部の実施形態では、分泌タグは、ＯｍｐＦ分泌シグナルである。一部の実施形態では、分泌タグは、ＯｍｐＦ分泌シグナルである。一部の実施形態において、分泌タグは、配列番号７４７を含む。一部の実施形態では、分泌タグは、ｃｖａＣ分泌シグナルである。一部の実施形態において、分泌タグは、配列番号７４８を含む。一部の実施形態では、分泌タグは、ｔｏｒＡ分泌シグナルである。一部の実施形態において、分泌タグは、配列番号７４９を含む。一部の実施形態では、分泌タグは、ｆｄｎＧ分泌シグナルである。一部の実施形態において、分泌タグは、配列番号７５０を含む。一部の実施形態では、分泌タグは、ｄｍｓＡ分泌シグナルである。一部の実施形態において、分泌タグは、配列番号７５１を含む。一部の実施形態では、分泌タグは、ＰｅｌＢ分泌シグナルである。一部の実施形態において、分泌タグは、配列番号７５２を含む。一部の実施形態では、分泌タグは、ＨｌｙＡ分泌シグナルである。一部の実施形態では、分泌タグは、配列番号７５３および配列番号７５４から選択される配列を含む。
一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、アドヘシン（ＥＣＯＬＩＮ＿１９８８０）、ＤｓｂＡ（ＥＣＯＬＩＮ＿２１５２５）、ＧｌｔＩ（ＥＣＯＬＩＮ＿０３４３０）、ＧｓｐＤ（ＥＣＯＬＩＮ＿１６４９５）、ＨｄｅＢ（ＥＣＯＬＩＮ＿１９４１０）、ＭａｌＥ（ＥＣＯＬＩＮ＿２２５４０）、ＯｐｐＡ（ＥＣＯＬＩＮ＿０７２９５）、ＰｅｌＢ、ＰｈｏＡ（ＥＣＯＬＩＮ＿０２２５５）、ＰｐｉＡ（ＥＣＯＬＩＮ＿１８６２０）、ＴｏｌＢ、ｔｏｒｔ、ＯｍｐＡ、ＰｅｌＢ、ＤｓｂＡ ｍｇｌＢおよびｌａｍＢ分泌タグから選択される分泌タグを含むポリペプチドをコードする。分泌タグの例示的配列は、配列番号１２２２、配列番号１２２３、配列番号１２２４、配列番号１２２５、配列番号１２２６、配列番号１２２７、配列番号１２２８、配列番号１２２９、配列番号１２３０、配列番号１１４１、配列番号１１４２、配列番号１１４３、配列番号１１４４、配列番号１１４５、配列番号１２５３、配列番号１１５７、配列番号１１５８、配列番号１１５９、配列番号１１６０、配列番号１１６１、配列番号１１６２、配列番号１１６３、配列番号１１６４、配列番号１１６５、配列番号１１６６、および配列番号１１６７に示される。
一部の実施形態では、分泌タグは、配列番号１２１８、配列番号１２１９、配列番号１１８１、配列番号１２２０、配列番号１２２１、配列番号１１８０、配列番号１１８４、配列番号１１８６、配列番号１１９０、配列番号１１８２、配列番号１１３５、配列番号１１８３、配列番号１１８８、配列番号１１８７、配列番号７４７、配列番号１１８５、および配列番号１１８９から選択される。
いずれかの分泌タグまたは分泌系を、分泌が意図される本明細書に記載されるいずれかの免疫モジュレーターと組み合わせることができる。一部の実施形態では、分泌系は、ｌｐｐ、ｎｌＰ、ｔｏｌＡ、ＰＡＬを含むがこれらに限定されない、漏出性または拡散性外膜表現型（ＤＯＭ）をもたらす１つまたは複数のゲノム突然変異と組み合わせて使用される。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌によって分泌される治療タンパク質は、プロテアーゼ、例えば、腸プロテアーゼに対する抵抗性を増加させるように改変される。
一部の実施形態では、目的の治療ポリペプチド、例えば、免疫モジュレーター、例えば、本明細書に記載される免疫イニシエーターおよび／または免疫サステナーは、拡散性外膜（ＤＯＭ）系を経て分泌される。一部の実施形態では、目的の治療用ポリペプチドは、Ｎ末端Ｓｅｃ依存性分泌シグナルと融合されている。そのようなＮ末端Ｓｅｃ依存性分泌シグナルの非限定的な例としては、ＰｈｏＡ、ＯｍｐＦ、ＯｍｐＡ、およびｃｖａＣが挙げられる。代替実施形態では、目的の治療用ポリペプチドは、Ｔａｔ依存性分泌シグナルと融合されている。例示的なＴａｔ依存性タグとしては、ＴｏｒＡ、ＦｄｎＧ、およびＤｍｓＡが挙げられる。
ある特定の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、外膜および／または周辺質タンパク質の１つまたは複数における欠失または突然変異を有する。１つまたは複数が欠失または突然変異されうる、そのようなタンパク質の非限定的な例としては、ｌｐｐ、ｐａｌ、ｔｏｌＡおよび／またはｎｌｐＩが挙げられる。一部の実施形態では、ｌｐｐが、欠失または突然変異される。一部の実施形態では、ｐａｌが、欠失または突然変異される。一部の実施形態では、ｔｏｌＡが、欠失または突然変異される。他の実施形態では、ｎｌｐＩが、欠失または突然変異される。さらに他の実施形態では、ある特定の周辺質プロテアーゼは、例えば、周辺質におけるポリペプチドの安定性を増大させるために、欠失または突然変異される。そのようなプロテアーゼの非限定的な例としては、ｄｅｇＰおよびｏｍｐＴが挙げられる。一部の実施形態では、ｄｅｇＰが、欠失または突然変異される。一部の実施形態では、ｏｍｐＴが、欠失または突然変異される。一部の実施形態では、ｄｅｇＰおよびｏｍｐＴが、欠失または突然変異される。
表面ディスプレイ
一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌および／または微生物は、細菌および／または微生物の表面にアンカーまたは提示される免疫モジュレーターをコードする１種もしくは複数の遺伝子および／または遺伝子カセットをコードする。細菌および／または微生物に提示またはアンカーされる免疫モジュレーターの例は、本明細書に記載されている免疫モジュレーターのいずれかであり、抗体、例えば、ｓｃＦｖ断片、および腫瘍特異的抗原またはネオ抗原が挙げられるがこれらに限定されない。非限定的な例では、細菌細胞表面にアンカーまたは提示される抗体またはｓｃＦｖ断片は、ＣＬＴＬＡ４、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１が挙げられるがこれらに限定されない、本明細書に記載されているチェックポイントインヒビターに対する。
グラム陰性およびグラム陽性細菌の表面における異種ポリペプチド、例えば、エフェクター分子の表面ディスプレイに適した系は、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、０１／１１／２０１７に出願され、ＷＯ２０１７／１２３６７５として公開された国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０１３０７２に記載されている。
一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、インベイシン提示タグを含む治療用ポリペプチドをコードする遺伝子配列を含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、配列番号９９０を含むポリペプチドをコードする遺伝子配列を含む。
一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ＬｐｐＯｍｐＡ提示タグを含む治療用ポリペプチドをコードする遺伝子配列を含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、配列番号９９１を含むポリペプチドをコードする遺伝子配列を含む。
一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、インチミンＮ提示タグを含む治療用ポリペプチドをコードする遺伝子配列を含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、配列番号９９２を含むポリペプチドをコードする遺伝子配列を含む。
一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、配列番号９９０、配列番号９９１および配列番号９９２から選択される配列と少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％または少なくとも約９９％相同である提示アンカーを含む。別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、配列番号９９０、配列番号９９１および配列番号９９２から選択される配列を含む提示アンカーをコードする遺伝子配列を含む。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌によって発現される提示アンカーは、配列番号９９０、配列番号９９１および配列番号９９２から選択される配列からなる。
一部の実施形態では、１つまたは複数のＳｃＦｖが、単独で、または他の目的の治療用ポリペプチドと組み合わせて、細菌細胞表面に提示される。
一部の実施形態では、細胞表面提示戦略または回路は、１個の細菌において分泌戦略または回路と組み合わされる。一部の実施形態では、同じポリペプチドが、提示かつ分泌される。一部の実施形態では、第１のポリペプチドが提示され、第２のポリペプチドが分泌される。一部の実施形態では、提示戦略または回路戦略は、酵素の細胞内産生および結果として、その基質の細胞内異化作用の回路と組み合わされる。一部の実施形態では、提示戦略または提示回路は、腸障壁エンハンサー分子および／または抗炎症性エフェクター分子の細胞内産生の回路と組み合わされる。
一部の実施形態では、表面提示されるポリペプチドまたは融合タンパク質の発現は、誘導性プロモーターによって駆動される。一部の実施形態では、誘導性プロモーターは、酸素レベル依存性プロモーター（例えば、ＦＮＲ誘導性プロモーター）である。一部の実施形態では、誘導性プロモーターは、腸特異的および／または腫瘍特異的によって誘導されるプロモーター、または炎症もしくは炎症性応答によって誘導されるプロモーター（ＲＮＳ、ＲＯＳプロモーター）、または腸に天然に存在していても存在していなくてもよい（例えば、外因的に添加され得る）代謝物、例えば、アラビノース、クメートおよびサリチレートによって誘導されるプロモーターである。代替実施形態では、表面提示されるポリペプチドまたはポリペプチド融合タンパク質の発現は、構成的プロモーターによって駆動される。
一部の実施形態では、表面提示されるポリペプチドまたは融合タンパク質の発現は、プラスミドに基づく。一部の実施形態では、表面提示のための抗体またはｓｃＦｖ断片をコードする遺伝子配列は、染色体に挿入される。
必須遺伝子、栄養要求株、キルスイッチ（Ｋｉｌｌ Ｓｗｉｔｃｈ）および宿主−プラスミド依存性
本明細書で使用される場合、用語「必須遺伝子」は、細胞成長および／または生存に必要な遺伝子を指す。細菌必須遺伝子は、当業者にとって周知であり、遺伝子の定方向欠失および／またはランダム突然変異誘発ならびにスクリーニングによって同定することができる（例えば、これらそれぞれの内容全体が明確に参照により本明細書に組み込まれる、ＺｈａｎｇおよびＬｉｎ、２００９年、ＤＥＧ ５．０、ａ ｄａｔａｂａｓｅ ｏｆ ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ｇｅｎｅｓ ｉｎ ｂｏｔｈ ｐｒｏｋａｒｙｏｔｅｓ ａｎｄ ｅｕｋａｒｙｏｔｅｓ、Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、３７巻：Ｄ４５５〜Ｄ４５８頁ならびにＧｅｒｄｅｓら、Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ｇｅｎｅｓ ｏｎ ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ｍａｐｓ、Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、１７巻（５号）：４４８〜４５６頁を参照）。
「必須遺伝子」は、生物が生きる状況および環境に依存することができる。例えば、必須遺伝子の突然変異、その修飾、またはその切除は、栄養要求株となる本開示の組換え細菌をもたらし得る。栄養要求性修飾は、生存または成長に必須な、外因的に添加される栄養素の非存在下では、細菌が、当該必須栄養素の産生に必要な遺伝子を欠くせいで、死滅するように意図される。
栄養要求性修飾は、生存または成長に必須な、外因的に添加される栄養素の非存在下では、細菌が、当該必須栄養素の産生に必要な遺伝子を欠くせいで、死滅するように意図される。一部の実施形態では、本明細書に記載されている遺伝子操作された細菌のいずれかは、細胞生存および／または成長に要求される遺伝子における欠失または突然変異も含む。一実施形態では、必須遺伝子は、ＤＮＡ合成遺伝子、例えば、ｔｈｙＡである。別の実施形態では、必須遺伝子は、細菌細胞壁合成遺伝子、例えば、ｄａｐＡである。さらに別の実施形態では、必須遺伝子は、アミノ酸遺伝子、例えば、ｓｅｒＡまたはｍｅｔＡである。対応する野生型遺伝子産物が細菌において産生されないのであれば、ｃｙｓＥ、ｇｌｎＡ、ｉｌｖＤ、ｌｅｕＢ、ｌｙｓＡ、ｓｅｒＡ、ｍｅｔＡ、ｇｌｙＡ、ｈｉｓＢ、ｉｌｖＡ、ｐｈｅＡ、ｐｒｏＡ、ｔｈｒＣ、ｔｒｐＣ、ｔｙｒＡ、ｔｈｙＡ、ｕｒａＡ、ｄａｐＡ、ｄａｐＢ、ｄａｐＤ、ｄａｐＥ、ｄａｐＦ、ｆｌｈＤ、ｍｅｔＢ、ｍｅｔＣ、ｐｒｏＡＢおよびｔｈｉ１が挙げられるがこれらに限定されない、細胞生存および／または成長に要求されるいかなる遺伝子を標的としてもよい。栄養要求性株を産生するために破壊または欠失され得る例示的な細菌遺伝子は、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、２０１７年１月１１日に出願され、ＷＯ２０１７／１２３６７５として公開された、国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０１３０７２に記載されている。そのようなものとして、オリゴヌクレオチド合成、アミノ酸合成および細胞壁合成に要求される遺伝子が挙げられるがこれらに限定されない。表１２は、栄養要求性株を産生するために破壊または欠失されうる例示的な細菌遺伝子を収載する。これらは、オリゴヌクレオチド合成、アミノ酸合成および細胞壁合成に要求される遺伝子を含むがこれらに限定されない。
栄養要求性突然変異は、天然の生態系における遺伝子操作された細菌の意図されない増殖の防止に生物学的封じ込め戦略が要求されうる場合に有用である。上に記載されるまたは当技術分野で公知の必須遺伝子、例えば、ＤＮＡ合成遺伝子、アミノ酸合成遺伝子、または細胞壁の合成のための遺伝子におけるいずれかの栄養要求性突然変異が、この目的に有用となりうる。したがって、一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、例えば、天然の環境における細菌の成長および増殖を防止するために、１つまたは複数の栄養要求性遺伝子に改変、例えば、突然変異（複数可）または欠失（複数可）を含む。一部の実施形態では、改変は、非コード領域に位置することができる。一部の実施形態では、改変は、転写または翻訳の減弱をもたらす。一部の実施形態では、改変、例えば、突然変異または欠失は、必須遺伝子の転写低下もしくは転写なしまたは翻訳低下もしくは翻訳なしをもたらす。一部の実施形態では、改変、例えば、突然変異または欠失は、必須遺伝子の非機能的バージョンの転写および／または翻訳をもたらす。一部の実施形態では、改変、例えば、突然変異または欠失は、必須遺伝子のトランケートされた転写または翻訳をもたらし、トランケートされたポリペプチドをもたらす。一部の実施形態では、改変、例えば、突然変異は、遺伝子のコード領域内に位置する。
天然の生態系において成長することができないが、ある特定の栄養要求性突然変異は、細菌が投与された哺乳動物宿主における、例えば、腫瘍環境において、成長および増殖を可能にすることができる。例えば、栄養要求性突然変異によって非機能的にされる必須経路は、腫瘍微小環境内で宿主による代謝物の産生によって補完されうる。結果として、宿主に投与された細菌は、環境から代謝物を取り入れることができ、腫瘍において増殖およびコロニー形成することができる。よって、一部の実施形態では、栄養要求性遺伝子は、代謝物の産生のための必須遺伝子であり、この代謝物は、ｉｎ ｖｉｖｏで、例えば、腫瘍状況において哺乳動物宿主によっても産生される。一部の実施形態では、宿主腫瘍による代謝物産生は、細菌による代謝物の取込みを可能にすることができ、腫瘍内での細菌の生存および／または増殖を許す。一部の実施形態では、そのような栄養要求性突然変異を含む細菌は、栄養要求性突然変異を保有しない同じ亜型の細菌と同じ程度まで、腫瘍において増殖およびコロニー形成することができる。
一部の実施形態では、細菌は、腫瘍微小環境においてコロニー形成および増殖することができる。一部の実施形態では、腫瘍コロニー形成細菌は、１つまたは複数の栄養要求性突然変異を含む。一部の実施形態では、腫瘍コロニー形成細菌は、１つまたは複数の栄養要求性改変または突然変異を含まない。非限定的な例では、対象に本来注射された数よりも多い数の細菌が、２４時間および７２時間後に検出される。一部の実施形態では、注射２４時間後に検出されるＣＦＵは、投与時よりも、少なくとも約１〜２ｌｏｇ多い。一部の実施形態では、注射２４時間後に検出されるＣＦＵは、投与時よりも、少なくとも約２〜３ｌｏｇ多い。一部の実施形態では、注射２４時間後に検出されるＣＦＵは、投与時よりも、少なくとも約３〜４ｌｏｇ多い。一部の実施形態では、注射２４時間後に検出されるＣＦＵは、投与時よりも、少なくとも約４〜５ｌｏｇ多い。一部の実施形態では、注射２４時間後に検出されるＣＦＵは、投与時よりも、少なくとも約５〜６ｌｏｇ多い。一部の実施形態では、注射７２時間後に検出されるＣＦＵは、投与時よりも、少なくとも約１〜２ｌｏｇ多い。一部の実施形態では、注射７２時間後に検出されるＣＦＵは、投与時よりも、少なくとも約２〜３ｌｏｇ多い。一部の実施形態では、注射７２時間後に検出されるＣＦＵは、投与時よりも、少なくとも約３〜４ｌｏｇ多い。一部の実施形態では、注射７２時間後に検出されるＣＦＵは、投与時よりも、少なくとも約４〜５ｌｏｇ多い。一部の実施形態では、注射７２時間後に検出されるＣＦＵは、投与時よりも、少なくとも約５〜６ｌｏｇ多い。一部の実施形態では、ＣＦＵは、注射から少なくとも１週間後、少なくとも２週間後またはそれよりも後、少なくとも１カ月後、少なくとも２カ月後またはそれよりも後等、より後の時点で測定することができる。
腫瘍での増殖およびコロニー形成を可能にするそのような栄養要求性遺伝子の非限定的な例は、本明細書に示す通り、ｔｈｙＡおよびｕｒａＡである。したがって、一部の実施形態では、本開示の遺伝子操作された細菌は、ｔｈｙＡ遺伝子に栄養要求性改変、例えば、突然変異または欠失を含むことができる。一部の実施形態では、本開示の遺伝子操作された細菌は、ｕｒａＡ遺伝子に栄養要求性改変、例えば、突然変異または欠失を含むことができる。一部の実施形態では、本開示の遺伝子操作された細菌は、ｔｈｙＡ遺伝子およびｕｒａＡ遺伝子に栄養要求性改変、例えば、突然変異または欠失を含むことができる。
あるいは、栄養要求性遺伝子は、宿主が腫瘍内で産生することができない代謝物の産生のための必須遺伝子である、すなわち、栄養要求性突然変異は、腫瘍微小環境内で宿主による代謝物の産生によって補完されない。結果として、この突然変異は、腫瘍で成長およびコロニー形成する細菌の能力に影響を与えることができ、細菌計数は、時間と共に減少する。この種の栄養要求性突然変異は、例えば、腫瘍内での、免疫モジュレーターのｉｎ ｖｉｖｏ活性または免疫モジュレーターの活性の持続時間のモジュレーションに有用となることができる。免疫モジュレーター放出のレベルおよびタイミングを微調整するこの方法の例は、ｄａｐＡにおける栄養要求性改変、例えば、突然変異を使用して本明細書に記載される。ジアミノピメリン酸（Ｄａｐ）は、例えば、グラム陰性細菌の、ある特定の細菌細胞壁の特徴的な構成成分である。ジアミノピメリン酸がないと、細菌は、プロテオグリカンを形成することができず、そのような訳で、成長することができない。ＤａｐＡは、哺乳動物細胞によって産生されず、したがって、ＤａｐＡの代替供給源は、腫瘍において提供されない。そのような訳で、ｄａｐＡ栄養要求体は、腫瘍における細菌の存在のタイミングおよび程度ならびに／または免疫モジュレーター発現および産生のレベルおよびタイミングをモジュレートおよび微調整するための特に有用な戦略を示すことができる。したがって、一部の実施形態では、本開示の遺伝子操作された細菌は、宿主が腫瘍内で産生することができない代謝物の産生のための必須遺伝子に突然変異を含む。一部の実施形態では、栄養要求性突然変異は、当技術分野で公知のもしくは本明細書に記載される細菌細胞壁の産生および維持に必須の遺伝子に存する、または細菌に特有であり、哺乳動物細胞には存在しない別の構造に必須の遺伝子における突然変異である。一部の実施形態では、そのような栄養要求性突然変異を含む細菌は、栄養要求性突然変異を保有しない同じ亜型の細菌よりも実質的に少ない程度に、腫瘍で増殖およびコロニー形成することができる。細菌成長（およびエフェクターレベルの程度）の制御は、本明細書に記載される代謝物または化学的誘導性プロモーターを含むがこれらに限定されない、他の調節戦略とさらに組み合わせることができる。
非限定的な例では、対象に本来注射された数よりも少ない数の細菌が、２４時間および７２時間後に検出される。一部の実施形態では、注射２４時間後に検出されるＣＦＵは、投与時よりも、少なくとも約１〜２ｌｏｇ少ない。一部の実施形態では、注射２４時間後に検出されるＣＦＵは、投与時よりも、少なくとも約２〜３ｌｏｇ少ない。一部の実施形態では、注射２４時間後に検出されるＣＦＵは、投与時よりも、少なくとも約３〜４ｌｏｇ少ない。一部の実施形態では、注射２４時間後に検出されるＣＦＵは、投与時よりも、少なくとも約４〜５ｌｏｇ少ない。一部の実施形態では、注射２４時間後に検出されるＣＦＵは、投与時よりも、少なくとも約５〜６ｌｏｇ少ない。一部の実施形態では、注射７２時間後に検出されるＣＦＵは、投与時よりも、少なくとも約１〜２ｌｏｇ少ない。一部の実施形態では、注射７２時間後に検出されるＣＦＵは、投与時よりも、少なくとも約２〜３ｌｏｇ少ない。一部の実施形態では、注射７２時間後に検出されるＣＦＵは、投与時よりも、少なくとも約３〜４ｌｏｇ少ない。一部の実施形態では、注射７２時間後に検出されるＣＦＵは、投与時よりも、少なくとも約４〜５ｌｏｇ少ない。一部の実施形態では、注射７２時間後に検出されるＣＦＵは、投与時よりも、少なくとも約５〜６ｌｏｇ少ない。一部の実施形態では、ＣＦＵは、注射から少なくとも１週間後、少なくとも２週間後またはそれよりも後、少なくとも１カ月後、少なくとも２カ月後またはそれよりも後等、より後の時点で測定することができる。
一部の実施形態では、本開示の遺伝子操作された細菌は、ｄａｐＡに栄養要求性改変、例えば、突然変異を含む。本明細書に記載される非限定的な例は、ｃ−ジ−ＡＭＰ産生のためにｄａｃＡをコードする遺伝子配列を含む遺伝子操作された細菌である。ＳＴＩＮＧアゴニストの産生は、ｄａｐＡ栄養要求体の導入により時間的に調節または制限することができる。一部の実施形態では、ｄａｐＡ栄養要求体は、調整可能なＳＴＩＮＧアゴニスト産生のための手段を提供する。
栄養要求性改変を使用して、様々な用途のためのエフェクター分子を産生する突然変異体細菌に関してスクリーニングすることもできる。一例では、栄養要求体は、細菌株のスモールスケールおよびラージスケール産生におけるバッチの純度または「無菌性」のモニタリングに有用である。この場合、栄養要求体は、潜在的な夾雑物から操作された細菌を区別するための手段を示す。非限定的な例では、生きているバイオ治療薬の製造プロセスにおいて（すなわち、ラージスケール）、栄養要求体は、薬物物質の純度または「無菌性」を実証するための有用なツールとなることができる。培養物の純度を決定するためのこの方法は、この目的のために実験株において使用されることが多いが、生きている治療薬製品の開発の際に除去されることがある、抗生物質抵抗性遺伝子の非存在下で特に有用である。
ｔｒｐＥは、本明細書に記載される別の栄養要求性（ａｕｘｔｒｏｐｈｉｃ）突然変異である。この突然変異を保有する細菌は、トリプトファンを産生することができない。ｔｒｐＥ突然変異を有する本明細書に記載される遺伝子操作された細菌は、キヌレニナーゼをさらに含む。キヌレニナーゼは、細菌に、キヌレニンをトリプトファン前駆体アントラニル酸塩へと変換させ、したがって、細菌は、キヌレニンが存在すれば、トリプトファンの非存在下で成長することができる。
一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、１つの必須遺伝子に栄養要求性突然変異（複数可）を含む。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、２つの必須遺伝子に栄養要求性突然変異（複数可）を含む（二重栄養要求体）。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、３つまたはそれよりも多い必須遺伝子に栄養要求性突然変異（複数可）を含む。
一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ｄａｐＡおよびｔｈｙＡに栄養要求性突然変異（複数可）を含む。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ｄａｐＡおよびｕｒａＡに栄養要求性突然変異（複数可）を含む。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ｔｈｙＡおよびｕｒａＡに栄養要求性突然変異（複数可）を含む。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ｄａｐＡ、ｔｈｙＡおよびｕｒａＡに栄養要求性突然変異（複数可）を含む。
一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ｔｒｐＥに栄養要求性突然変異（複数可）を含む。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ｔｒｐＥおよびｔｈｙＡに栄養要求性突然変異（複数可）を含む。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ｔｒｐＥおよびｄａｐＡに栄養要求性突然変異（複数可）を含む。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ｔｒｐＥおよびｕｒａＡに栄養要求性突然変異（複数可）を含む。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ｔｒｐＥ、ｄａｐＡおよびｔｈｙＡに栄養要求性突然変異（複数可）を含む。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ｔｒｐＥ、ｄａｐＡおよびｕｒａＡに栄養要求性突然変異（複数可）を含む。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ｔｒｐＥ、ｔｈｙＡおよびｕｒａＡに栄養要求性突然変異（複数可）を含む。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ｔｒｐＥ、ｄａｐＡ、ｔｈｙＡおよびｕｒａＡに栄養要求性突然変異（複数可）を含む。
別の非限定的な例では、条件付き栄養要求株を生成することができる。ｄａｐＡまたはｔｈｙＡの染色体コピーがノックアウトされる。ｔｈｙＡまたはｄａｐＡの別のコピーが、例えば、低酸素プロモーターの制御下で導入される。嫌気的条件下で、ｄａｐＡまたはｔｈｙＡ（場合によっては）が発現され、株は、ｄａｐまたはチミジンの非存在下で成長することができる。好気的条件下で、ｄａｐＡまたはｔｈｙＡ発現は打ち切られ、株は、ｄａｐまたはチミジンの非存在下で成長することができない。そのような戦略を用いて、嫌気的条件、例えば、消化管または腫瘍微小環境の条件下での細菌の生存を可能にするが、好気的条件下での生存を防止することもできる。
一部の実施形態では、本開示の遺伝子操作された細菌は、合成リガンド依存性必須遺伝子（ＳＬｉＤＥ）細菌細胞である。ＳＬｉＤＥ細菌細胞は、特定のリガンドの存在下でのみ成長する、１つまたは複数の必須遺伝子における突然変異を有する合成栄養要求株である（その内容全体が明確に参照により本明細書に組み込まれる、ＬｏｐｅｚおよびＡｎｄｅｒｓｏｎ「Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ａｕｘｏｔｒｏｐｈｓ ｗｉｔｈ Ｌｉｇａｎｄ−Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｇｅｎｅｓ ｆｏｒ ａ ＢＬ２１ （ＤＥ３ Ｂｉｏｓａｆｅｔｙ Ｓｔｒａｉｎ」ＡＣＳ Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｂｉｏｌｏｇｙ（２０１５年）ＤＯＩ：１０．１０２１／ａｃｓｓｙｎｂｉｏ．５ｂ０００８５を参照）。ＳＬｉＤＥ細菌細胞は、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、０１／１１／２０１７に出願され、ＷＯ２０１７／１２３６７５として公開された国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０１３０７２に記載されている。
一部の実施形態では、本発明の遺伝子操作された細菌は、キルスイッチも含む。適したキルスイッチは、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、２０１６年６月２４日に出願され、ＷＯ２０１６／２１０３７３として公開された、国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／３９４２７に記載されている。キルスイッチは、外部刺激に応答して、操作された微生物を能動的に死滅させるように意図される。生存のための必須栄養素を欠くせいで細菌が死滅する栄養要求性突然変異とは対照的に、キルスイッチは、細胞死を引き起こす微生物内における毒性分子の産生を誘導する、環境中における特定の因子によって引き金を引かれる。一部の実施形態では、本発明の遺伝子操作された細菌は、宿主−プラスミド相互依存性を作るように修飾されたプラスミドも含む。ある特定の実施形態では、相互に依存性の宿主−プラスミドプラットフォームは、Ｗｒｉｇｈｔら、２０１５年に記載されている通りである。上述および他の系およびプラットフォームは、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、０１／１１／２０１７に出願され、ＷＯ２０１７／１２３６７５として公開された国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０１３０７２に記載されている。
遺伝的調節性回路
一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、本明細書に記載されている構築物を発現するための、多層状遺伝的調節性回路を含む。適した多層状遺伝的調節性回路は、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、２０１６年６月２４日に出願され、ＷＯ２０１６／２１０３７８として公開された、国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／３９４３４に記載されている。遺伝的調節性回路は、免疫モジュレーターを産生するまたは栄養要求株をレスキューする突然変異体細菌のスクリーニングに有用である。ある特定の実施形態では、本発明は、１つまたは複数の目的の遺伝子を産生する遺伝子操作された細菌を選択するための方法を提供する。
医薬組成物および製剤
本発明の遺伝子操作された微生物を含む医薬組成物を使用して、がんを処置、管理、寛解および／または予防することができる。１つもしくは複数の遺伝子操作された細菌を単独で、または予防剤、治療剤および／または薬学的に許容される担体と組み合わせて含む本発明の医薬組成物が提供される。
ある特定の実施形態では、医薬組成物は、本明細書に記載されている遺伝子改変、例えば、１つまたは複数のエフェクター、例えば、免疫モジュレーターをコードする１つまたは複数の遺伝子を含むように操作された、１つの種、株またはサブタイプの細菌を含む。代替実施形態では、医薬組成物は、本明細書に記載されている遺伝子改変、例えば、１つまたは複数のエフェクター、例えば、免疫モジュレーターをコードする１つまたは複数の遺伝子を含むようにそれぞれ操作された、２つまたはそれより多い種、株および／またはサブタイプの細菌を含む。
一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、胞子として全身性または腫瘍内に投与される。非限定的な例として、遺伝子操作された細菌は、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａ株であり、投与は、腫瘍内の低酸素／壊死エリアの選択的コロニー形成をもたらす。一部の実施形態では、胞子は、固形腫瘍に存在する低酸素／壊死領域において排他的に発芽し、他のいかなる身体箇所においても発芽しない。
本発明の医薬組成物は、医薬品使用のための組成物への活性成分の加工を容易にする、賦形剤および補助物を含む１つまたは複数の生理学的に許容される担体を使用して、従来様式で製剤化することができる。医薬組成物を製剤化する方法は、当該技術分野で公知である（例えば、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．、Ｅａｓｔｏｎ、ＰＡを参照）。一部の実施形態では、医薬組成物は、打錠、凍結乾燥、直接圧縮、従来混合、溶解、造粒、水簸、乳化、カプセル被包、封入または噴霧乾燥に付されて、腸溶的にコーティングされていてもコーティングされていなくてもよい、錠剤、粒状（ｇｒａｎｕｌａｔｅ）、ナノ粒子、ナノカプセル剤、マイクロカプセル剤、マイクロ錠剤、ペレット剤または散剤を形成する。適切な製剤は、投与経路に依存する。
遺伝子操作された微生物は、いずれか適した剤形（例えば、経口投与のための液剤、カプセル剤、サシェ剤、硬カプセル剤、軟カプセル剤、錠剤、腸溶コーティングされた錠剤、懸濁剤、散剤、粒剤またはマトリックス持続放出形成）で、いずれか適した種類の投与（例えば、経口、局所、注射用、静脈内、皮下、腫瘍内、腫瘍周囲、即時放出、パルス放出、遅延放出または持続放出）のために、医薬組成物へと製剤化することができる。遺伝子操作された細菌に適した投薬の量は、約１０４〜１０１２個細菌の範囲であり得る。組成物は、毎日、毎週または毎月１回またはそれより多く投与することができる。組成物は、食事の前、その最中またはその後に投与することができる。一実施形態では、医薬組成物は、対象が食事をとる前に投与される。一実施形態では、医薬組成物は、食事と同時に投与される。一実施形態では、医薬組成物は、対象が食事をとった後に投与される。
遺伝子操作された細菌は、１つまたは複数の薬学的に許容される担体、増粘剤、希釈剤、緩衝剤、緩衝用薬剤、表面活性剤、中性またはカチオン性脂質、脂質複合体、リポソーム、浸透エンハンサー、担体化合物、および他の薬学的に許容される担体または薬剤を含む医薬組成物へと製剤化することができる。例えば、医薬組成物として、炭酸水素カルシウム、炭酸水素ナトリウム、リン酸カルシウム、様々な糖およびデンプンの種類、セルロース誘導体、ゼラチン、植物油、ポリエチレングリコール、ならびに例えば、ポリソルベート２０を含む界面活性物質の添加を挙げることができるがこれらに限定されない。一部の実施形態では、本発明の遺伝子操作された細菌は、炭酸水素ナトリウムの溶液、例えば、炭酸水素ナトリウムの１モル濃度溶液中に製剤化することができる（例えば胃など、酸性の細胞環境を緩衝するために）。遺伝子操作された細菌は、中性または塩形態として投与および製剤化することができる。薬学的に許容される塩は、塩酸、リン酸、酢酸、シュウ酸、酒石酸などに由来する塩など、アニオンにより形成される塩、および水酸化ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、第二鉄、イソプロピルアミン、トリエチルアミン、２−エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカインなどに由来する塩など、カチオンにより形成される塩を含む。
遺伝子操作された微生物は、例えば、注入または注射によって、静脈内投与することができる。その代わりに、遺伝子操作された微生物は、腫瘍内および／または腫瘍周囲に投与することができる。他の実施形態では、遺伝子操作された微生物は、動脈内、筋肉内または腹腔内投与することができる。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、腫瘍の約２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％またはそれより大きくコロニー形成する。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、腫瘍被膜、コラーゲンおよび／または間質の浸透を増強するために腫瘍中隔（ｓｅｐｔａｅ）を破壊するために、ペグ化形態のｒＨｕＰＨ２０（ＰＥＧＰＨ２０）または他の薬剤と同時投与される。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、免疫モジュレーターと共に、線維性組織を分解する１つまたは複数の酵素を産生することができる。
本開示の遺伝子操作された微生物は、標的腫瘍内に直接的に置かれた細菌またはウイルスをもたらす腫瘍内注射により投与することができる。操作された細菌またはウイルスの腫瘍内注射は、強力な局在化された炎症性応答と共に、腫瘍細胞に対する適応免疫応答を誘発することができる。細菌またはウイルスは、１ｍｌシリンジ内に引き抜かれる前に、溶液に懸濁される。一部の実施形態では、腫瘍は、１８ゲージ多叉針（ｍｕｌｔｉｐｒｏｎｇｅｄ ｎｅｅｄｌｅ）（Ｑｕａｄｒａ−Ｆｕｓｅ、Ｒｅｘ Ｍｅｄｉｃａｌ）を用いて注射される。注射部位は、無菌的に準備される。利用できるのであれば、超音波またはＣＴを使用して、注射のための腫瘍の壊死性領域を同定することができる。壊死性領域が同定されない場合、注射は、腫瘍の中心に方向付けることができる。針を予め定義された領域に１回挿入し、一定の圧力で分注する。注射針をゆっくり除去し、注射部位を滅菌する。
固形腫瘍への本発明の遺伝子操作された細菌またはウイルスの直接腫瘍内注射は、静脈内投与と比較して有利となり得る。静脈内注射方法を使用すると、ごく僅かな割合の細菌が、標的腫瘍に達することができる。例えば、４Ｔ１腫瘍を有するマウスの尾静脈へのＥ．ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅ注射後に、大部分の細菌（＞９９％）は動物から迅速に排除され、ごく僅かなパーセンテージの投与細菌が腫瘍にコロニー形成する（Ｓｔｒｉｔｚｋｅｒら、２００７年）。特に、マウスと比較して相対的に大きい血液体積および相対的に小さい腫瘍を有する大型動物およびヒト患者において、腫瘍内注射が特に有益となり得る。腫瘍への直接的な注射は、より高濃度の治療剤の送達を可能にし、全身性投与に起因し得る毒性を回避する。加えて、細菌の腫瘍内注射は、腫瘍内に頑強かつ局在化された免疫応答を誘導する。
場所、腫瘍型および腫瘍サイズに応じて、皮膚、皮下および経皮注射、治療的超音波内視鏡検査、または気管支内腫瘍内送達が挙げられるがこれらに限定されない、異なる投与技法を使用することができる。腫瘍内投与手順に先立ち、患者の局所麻酔薬ならびに標準心、圧力および酸素モニタリング、または全身麻酔と組み合わせた鎮静が行われる。
一部の腫瘍に対して、最小侵襲的な投与方法である経皮注射を用いることができる。超音波、コンピュータ断層撮影（ＣＴ）または蛍光透視法をガイダンスとして使用して、針を導入および位置決めすることができる。経皮腫瘍内注射は、例えば、Ｌｅｎｃｉｏｎｉら、２０１０年において肝細胞癌について記載されている。皮膚、皮下および結節性腫瘍の腫瘍内注射は、例えば、後期黒色腫についてＷＯ／２０１４／０３６４１２（Ａｍｇｅｎ）において記載されている。
単一の挿入ポイントまたは複数の挿入ポイントを経皮注射プロトコールにおいて使用することができる。単一の挿入ポイントを使用すると、針の放射状リーチが及ぶ限りにおいて、溶液を複数のトラックに沿って経皮注射することができる。他の実施形態では、腫瘍が、針の放射状リーチより大きい場合、複数の注射ポイントを使用することができる。総用量が注射および分散されるまで必要な頻度で、針を抜き出さずに引き戻して向け直すことができる。滅菌性を維持するために、注射毎に別々の針が使用される。針のサイズおよび長さは、腫瘍の型およびサイズに応じて変動する。
一部の実施形態では、腫瘍は、１８ゲージ多叉針（Ｑｕａｄｒａ−Ｆｕｓｅ、Ｒｅｘ Ｍｅｄｉｃａｌ）を用いて経皮注射される。デバイスは、１８ゲージ穿刺針、２０ｃｍの長さからなる。針は、４個の末端側孔およびコネクタと延長チューブクランプをそれぞれ備える格納式３叉を有する。叉は、針の外側壁から展開される。針は、腫瘍の中心へと経皮導入し、腫瘍の最深縁に位置決めすることができる。叉は、腫瘍の縁へと展開される。叉は、最大の長さで展開され、次いで、規定の間隔で格納される。必要に応じて、１回または複数の回転−注射−回転手技を行うことができ、その際、叉が格納され、針が６０度回転し、続いて、叉の反復展開および追加的な注射がなされる。
治療的超音波内視鏡検査（ＥＵＳ）は、ある特定の他の腫瘍へのアクセスを得る際に固有の解剖学的制約を克服するために用いられる（Ｓｈｉｒｌｅｙら、２０１３年）。ＥＵＳガイドされた細針注射（ＥＵＳ−ＦＮＩ）は、頭頸部、食道、膵、肝および副腎腫瘤の処置のための抗腫瘍療法の使用に成功した（Ｖｅｒｎａら、２００８年）。ＥＵＳ−ＦＮＩは、膵がん注射のために広範に使用された。細針注射は、曲線エコー（ｅｃｈｏ）内視鏡の使用を要求する。食道に注意深く挿管され、エコー内視鏡が、胃および十二指腸へと通過し、そこで膵検査が行われ、標的腫瘍が同定される。最も大きい平面が測定され、腫瘍体積を推定し、注射体積を計算する。適切な体積がシリンジ内に引かれる。準備の整った２２ゲージ細針吸引（ＦＮＡ）針が、エコー内視鏡のワーキングチャネルへと通過する。超音波ガイダンス下で、針は、腫瘍へと通過する。腫瘍のサイズに応じて、投与は、腫瘍をセクションへと分け、次いで体積の対応する画分を各セクションへと注射することにより行うことができる。ドプラ技術によるインストールされた内視鏡超音波プロセッサの使用は、腫瘍への針通過に干渉し得る動脈または静脈構造がないことを保証する（Ｓｈｉｒｌｅｙら、２０１３年）。一部の実施形態では、ＥＵＳ−ＦＮＩのための「複数注射用針」（ＭＩＮ）を使用して、ストレート型の針と比較して、腫瘍への注射分布を改善することができる（Ｏｈａｒａら、２０１３年）。
非小細胞肺がんなど、肺がんのための腫瘍内投与は、Ｃｅｌｉｋｏｇｌｕら、２００８年に記載されている通り、気管支内腫瘍内送達方法により達成することができる。気管支鏡検査（経鼻または経口）は、処置されるべき病変を可視化するために遂行される。腫瘍体積は、気管支表面にわたる目に見える長さ−幅高さ測定値から視覚的に推定することができる。次に、気管支鏡のワーキングチャネルを通して針デバイスが導入される。プラスチックカテーテルに取り付けられた金属性の針からなる針カテーテルは、前進の際にワーキングチャネルへの針による損傷を防止するためにシース内に配置される。針のサイズおよび長さは変動し、腫瘍の腫瘍型およびサイズにより決定される。プラスチック製の針は、金属針より硬くなく、ワーキングチャネルにおけるより鋭角な屈曲の辺りを通過し得るため理想的である。針が病変内に挿入され、本発明の遺伝子操作された細菌が注射される。腫瘍塊が完全に灌流されるまで、針は、いくつかの挿入ポイントに反復的に挿入される。各注射後に、針は、腫瘍から完全に引き抜かれ、次いで、別の場所に埋伏される。気管支鏡注射セッションの終わりに、処置に起因するいずれかの壊死性デブリの除去は、機械的解剖、または灌注および吸引を伴う他のアブレーション技法を使用して除去することができる。
一部の実施形態では、標的腫瘍に免疫モジュレーターを送達することができる遺伝子操作された細菌またはウイルスは、経皮注射、ＥＵＳ−ＦＮＩまたは気管支内腫瘍内送達方法が挙げられるがこれらに限定されない方法を使用して腫瘍へと直接的に投与される。一部の事例では、腹腔鏡または外科的切開技法など、他の技法が、標的腫瘍のアクセスに使用されるが、これらの技法は、はるかにより侵襲的であり、はるかにより重い病的状態およびより長い入院をもたらす。
一部の実施形態では、細菌、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅまたは胞子、例えば、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｎｏｖｙｉ ＮＴは、全身性または腫瘍内注射のために滅菌リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）に溶解される。
注射されるべき用量は、腫瘍の型およびサイズに由来する。薬物または本発明の遺伝子操作された細菌もしくはウイルスの用量は典型的に、全身性静脈内投与のための用量より低い、例えば、数桁低い。
各病変へと注射される体積は、腫瘍のサイズに基づく。腫瘍体積を得るために、最も大きい平面の測定を遂行することができる。次に、推定される腫瘍体積は、総体積のパーセンテージとして注射体積の決定を通知することができる。例えば、総腫瘍体積のおよそ２０〜４０％の注射体積を使用することができる。
例えば、ＷＯ／２０１４／０３６４１２に例えば記載されているように、その最も大きい寸法が５ｃｍより大きい腫瘍に対して、最大４ｍｌを注射することができる。その最も大きい寸法が２．５〜５ｃｍの間の腫瘍に対して、最大２ｍｌを注射することができる。その最も大きい寸法が２．５〜５ｃｍの間の腫瘍に対して、最大２ｍｌを注射することができる。その最も大きい寸法が１．５〜２．５ｃｍの間の腫瘍に対して、最大１ｍｌを注射することができる。その最も大きい寸法が０．５〜１．５ｃｍの間の腫瘍に対して、最大０．５ｍｌを注射することができる。その最も大きい寸法が０．５に等しいまたはそれより小さい腫瘍に対して、最大０．１ｍｌを注射することができる。その代わりに、超音波スキャンを使用して、周囲の組織へと漏出することなく腫瘍によって取り込まれ得る注射体積を決定することができる。
一部の実施形態では、処置レジメンは、１回または複数の腫瘍内投与を含むであろう。一部の実施形態では、処置レジメンは、初回用量と、それに続く少なくとも１回のその後の用量を含むであろう。１回または複数回の用量は、２つまたはそれより多いサイクルで逐次投与することができる。
例えば、第１の用量は、１日目に投与することができ、第２の用量は、１、２、３、４、５、６日または１、２、３もしくは４週間後に、またはより長い間隔の後に投与することができる。追加的な用量は、１、２、３、４、５、６日後にまたは１、２、３もしくは４週間後に、またはより長い間隔の後に投与することができる。一部の実施形態では、第１およびその後の投与は、同じ投薬量を有する。他の実施形態では、異なる用量が投与される。一部の実施形態では、１日に２回以上の用量が投与される、例えば、１日に２、３回またはそれより多い用量を投与することができる。
記載されている投与経路および投薬量は、単なるガイドとして意図される。最適な投与経路および投薬量は、当業者であれば直ちに決定することができる。投薬量は、様々なパラメーターに従って、特に、腫瘍の場所、腫瘍のサイズ、処置されるべき患者の年齢、体重および状態、ならびに投与の経路および方法に従って決定することができる。
一実施形態では、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ胞子は、全身性に送達される。別の実施形態では、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ胞子は、腫瘍内注射により送達される。一実施形態では、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅは、腫瘍内注射により送達される。他の実施形態では、例えば、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｄａｎｉｎｏら、２０１５年またはＳｔｒｉｔｚｋｅｒら、２００７年におけるマウスモデルにおいて記載されている通り、腫瘍に向かうことが公知のＥ ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅは、静脈内注射によりまたは経口で投与される。毒性を低減させるＥ．ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅ突然変異として、Ｓｔｒｉｔｚｋｅｒら、２０１０年（Ｓｔｒｉｔｚｋｅｒら、Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ Ｂｕｇｓ １巻：２号、１３９〜１４５頁；Ｍｙｒｉｓｔｙｌａｔｉｏｎ ｎｅｇａｔｉｖｅ ｍｓｂＢ−ｍｕｔａｎｔｓ ｏｆ ｐｒｏｂｉｏｔｉｃ Ｅ． ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅ １９１７ ｒｅｔａｉｎ ｔｕｍｏｒ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｃｏｌｏｎｉｚａｔｉｏｎ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｂｕｔ ｓｈｏｗ ｌｅｓｓ ｓｉｄｅ ｅｆｆｅｃｔｓ ｉｎ ｉｍｍｕｎｏｃｏｍｐｅｔｅｎｔ ｍｉｃｅ）に記載されている通り、非ミリストイル化ＬＰＳおよび低下されたエンドトキシン活性をもたらすｍｓｂＢ突然変異体が挙げられるがこれに限定されない。
静脈内注射のため、細菌の好ましい用量は、最大数の細菌が腫瘍に見出され、最低量が他の組織に見出される用量である。マウスにおいて、Ｓｔｒｉｔｚｋｅｒら（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ２９７巻（２００７年）１５１〜１６２頁；Ｔｕｍｏｒ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｃｏｌｏｎｉｚａｔｉｏｎ， ｔｉｓｓｕｅ ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ， ａｎｄ ｇｅｎｅ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｂｙ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅ １９１７ ｉｎ ｌｉｖｅ ｍｉｃｅ）は、腫瘍コロニー形成成功に必要とされる細菌の最低数が、２ｅ４ＣＦＵであり、この場合、マウスの半分が、腫瘍コロニー形成を示したことを見出した。２ｅ５および２ｅ６ＣＦＵの注射は、全腫瘍のコロニー形成をもたらし、腫瘍における細菌の数が増加した。しかし、より高濃度では、細菌計数が、肝臓および脾臓において検出可能になった。
一部の実施形態では、本開示の微生物は、経口投与することができる。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、肝臓がんまたは肝臓転移の予防、処置または管理において有用となり得る。例えば、Ｄａｎｉｎｏらは、経口投与されたＥ．ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅが、肝臓転移のマウスモデルにおける胃腸管にわたることにより、肝臓転移にコロニー形成することができることを示した（その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｄａｎｉｎｏら、Ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ ｐｒｏｂｉｏｔｉｃｓ ｆｏｒ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｃａｎｃｅｒ ｉｎ ｕｒｉｎｅ． Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、７巻（２８９号）：１〜１０頁）。
一実施形態では、遺伝子操作された微生物は、腫瘍内注射によって送達される。一実施形態では、遺伝子操作された微生物は、胸膜内送達される。一実施形態では、遺伝子操作された微生物は、皮下送達される。一実施形態では、遺伝子操作された微生物は、静脈内送達される。一実施形態では、遺伝子操作された微生物は、胸膜内送達される。
一部の実施形態では、本発明の遺伝子操作された微生物は、複数の注射を要求するレジメンに従って腫瘍内投与することができる。一部の実施形態では、同じ細菌株が、各腫瘍内注射において投与される。一部の実施形態では、第１の株が先ず注射され、第２の株がより後の時点で注射される。例えば、免疫イニシエーター、例えば、ＳＴＩＮＧアゴニストを産生することができる株は、別の免疫イニシエーター、例えば、共刺激性分子、例えば、アゴニスト抗ＯＸ４０、４１ＢＢまたはＧＩＴＲを産生することができる株と同時発生的にまたは逐次に投与することができる。この２つの免疫イニシエーターの追加的な注射を、同時発生的または逐次のいずれかで、続いて行うことができる。別の例では、免疫イニシエーター、例えば、ＳＴＩＮＧアゴニストを産生することができる株を先ず投与することができ、免疫サステナーを産生すること、例えば、キヌレニン消費または抗ＰＤ−１／抗ＰＤ−Ｌ１分泌または抗ＰＤ−１／抗ＰＤ−Ｌ１表面ディスプレイができる株を２番目に投与することができる。ＳＴＩＮＧアゴニスト産生株および／または抗ＰＤ−１／抗ＰＤ−Ｌ１産生株の追加的な注射を続いて行うことができる。これらの例のいずれにおいても、必要に応じて、腫瘍内注射と同時発生的に腫瘍生検を採取することができる。必要に応じて、抗生物質を使用して、第２の株の注射前に腫瘍から第１の株を排除することができる。あるいは、コロニー形成を限定するｄａｐＡ遺伝子における栄養要求性改変、例えば、突然変異を第１の株に取り込むことができ、これにより、第２の株の注射に先立ち第１の株の細菌を排除することができる。
本発明の操作された細菌またはウイルスが腫瘍内送達される腫瘍型は、Ｂ、ＴおよびＮＫ細胞リンパ腫、結腸および直腸がん、転移性黒色腫を含む黒色腫、菌状息肉症、メルケル癌、肝細胞癌および結腸直腸がんに続発する肝臓転移を含む肝臓がん、膵がん、乳がん、濾胞性リンパ腫、前立腺がん、不応性肝臓がん、ならびにメルケル細胞癌が挙げられるがこれらに限定されない、局所的に進行性および転移性の腫瘍を含む。
一部の実施形態では、腫瘍内注射の一部として、腫瘍細胞溶解が起こる。結果として、腫瘍抗原が露出されて、抗腫瘍応答を誘発する。この露出は、細菌によって発現されるエフェクターと協調して、抗腫瘍効果を増強することができる。一部の実施形態では、腫瘍内注射の一部として、腫瘍細胞溶解は起こらない。
本明細書に開示されている遺伝子操作された微生物は、局所的に投与することができ、軟膏剤、クリーム剤、経皮パッチ剤、ローション剤、ゲル剤、シャンプー剤、スプレー剤、エアロゾル剤、液剤、エマルション剤の形態または当業者に周知の他の形態で製剤化することができる。例えば、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．、Ｅａｓｔｏｎ， ＰＡ．を参照されたい。ある実施形態では、スプレー用ではない局所剤形のため、局所的適用と適合性の担体または１つもしくは複数の賦形剤を含み、水より大きい動的粘性を有する、粘稠性から半固体または固体形態が用いられる。適した製剤として、滅菌され得る、または様々な特性、例えば、浸透圧に影響を与えるために補助剤（例えば、保存料、安定剤、湿潤剤、緩衝剤または塩）と混合され得る、液剤、懸濁剤、エマルション剤、クリーム剤、軟膏剤、散剤、リニメント剤、膏薬等が挙げられるがこれらに限定されない。他の適した局所剤形は、固体または液体不活性担体と組み合わせた活性成分が、加圧された揮発性物質（例えば、フロン等のガス状噴霧剤）との混合物においてまたはスクイーズボトルにおいて包装された、スプレー用エアロゾル調製物を含む。保湿剤または保水剤が、医薬組成物および剤形に添加されてもよい。このような追加的な成分の例は、当該技術分野で周知である。一実施形態では、本発明の組換え細菌を含む医薬組成物は、衛生製品として製剤化することができる。例えば、衛生製品は、抗細菌製剤、または発酵ブロス等の発酵製品であってもよい。衛生製品は、例えば、シャンプー、コンディショナー、クリーム、ペースト、ローションおよびリップクリームであってもよい。
本明細書に開示されている遺伝子操作された微生物は、経口投与することができ、錠剤、丸剤、ドラジェ剤、カプセル剤、液剤、ゲル剤、シロップ剤、スラリー、懸濁剤などとして製剤化することができる。経口使用のための薬理学的組成物は、固体賦形剤を使用し、必要に応じて、得られた混合物を粉砕し、所望に応じて適した補助物を添加した後に顆粒の混合物を加工して作製して、錠剤またはドラジェコアを得ることができる。適した賦形剤として、ラクトース、スクロース、マンニトールまたはソルビトールを含む糖などのフィラー；トウモロコシデンプン、コムギデンプン、イネデンプン、ジャガイモデンプン、ゼラチン、トラガントガム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチル−セルロース、ナトリウムカルボメチルセルロースなどのセルロース組成物；および／またはポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）もしくはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等の生理学的に許容されるポリマーが挙げられるがこれらに限定されない。架橋ポリビニルピロリドン、寒天、アルギン酸またはアルギン酸ナトリウムなどのその塩等の崩壊剤が添加されてもよい。
錠剤またはカプセル剤は、結合剤（例えば、アルファ化トウモロコシデンプン、ポリビニルピロリドン、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ポリエチレングリコール、スクロース、グルコース、ソルビトール、デンプン、ガム、カオリンおよびトラガント）；フィラー（例えば、ラクトース、微結晶性セルロースまたはリン酸水素カルシウム）；滑沢剤（例えば、カルシウム、アルミニウム、亜鉛、ステアリン酸、ポリエチレングリコール、ラウリル硫酸ナトリウム、デンプン、安息香酸ナトリウム、Ｌ−ロイシン、ステアリン酸マグネシウム、タルクまたはシリカ）；崩壊物質（例えば、デンプン、ジャガイモデンプン、デンプングリコール酸ナトリウム、糖、セルロース誘導体、シリカ粉末）；または湿潤剤（例えば、ラウリル硫酸ナトリウム）などの薬学的に許容される賦形剤を用いて、従来手段によって調製することができる。錠剤は、当該技術分野で周知の方法によってコーティングすることができる。コーティング殻が存在することができ、一般的な膜として、ポリラクチド、ポリグリコール酸、ポリ酸無水物、他の生分解性ポリマー、アルギン酸塩−ポリリシン−アルギン酸塩（ＡＰＡ）、アルギン酸塩−ポリメチレン−ｃｏ−グアニジン−アルギン酸塩（Ａ−ＰＭＣＧ−Ａ）、ヒドロキシ（ｈｙｄｒｏｙ）メチルアクリレート−メチルメタクリレート（ＨＥＭＡ−ＭＭＡ）、多層状ＨＥＭＡ−ＭＭＡ−ＭＡＡ、ポリアクリロニトリル塩化ビニル（ＰＡＮ−ＰＶＣ）、アクリロニトリル／メタリルスルホン酸ナトリウム（ＡＮ−６９）、ポリエチレングリコール／ポリペンタメチルシクロペンタシロキサン／ポリジメチルシロキサン（ＰＥＧ／ＰＤ５／ＰＤＭＳ）、ポリＮ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド（ＰＤＭＡＡｍ）、ケイ質カプセル被包、セルロースサルフェート／アルギン酸ナトリウム／ポリメチレン−ｃｏ−グアニジン（ＣＳ／Ａ／ＰＭＣＧ）、セルロースアセテートフタレート、アルギン酸カルシウム、ｋ−カラゲナン−ローカストビーンガムゲルビーズ、ジェラン−キサンタンビーズ、ポリ（ラクチド−ｃｏ−グリコリド）、カラゲナン、デンプンポリ酸無水物、デンプンポリメタクリレート、ポリアミノ酸、および腸溶コーティングポリマーが挙げられるがこれらに限定されない。
一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、腸または腸の特定の領域、例えば、大腸への放出のために腸溶的にコーティングされる。胃から結腸までの典型的なｐＨプロファイルは、約１〜４（胃）、５．５〜６（十二指腸）、７．３〜８．０（回腸）および５．５〜６．５（結腸）である。一部の疾患では、ｐＨプロファイルは修飾され得る。一部の実施形態では、コーティングは、放出部位を指定するために、特異的ｐＨ環境において分解される。一部の実施形態では、少なくとも２つのコーティングが使用される。一部の実施形態では、外側コーティングおよび内側コーティングは、異なるｐＨレベルで分解される。
一部の実施形態では、１つまたは複数のコーティング層（例えば、外側、内側および／または（ｏ）中間コーティング層）において、腸溶コーティング材料を使用することがで
きる。腸溶コーティングされたポリマーは、低ｐＨでは非イオン化を維持し、したがって、不溶性を維持する。しかし、胃腸管においてｐＨが増加するにつれて、酸性官能基は、イオン化が可能になり、ポリマーは膨張する、または腸液に可溶性になる。
腸溶コーティングに使用される材料は、セルロースアセテートフタレート（ＣＡＰ）、ポリ（メタクリル酸−ｃｏ−メチルメタクリレート）、セルロースアセテートトリメリテート（ＣＡＴ）、ポリ（ビニルアセテートフタレート）（ＰＶＡＰ）およびヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート（ＨＰＭＣＰ）、脂肪酸、ワックス、Ｓｈｅｌｌａｃ（アロイリット酸（ａｌｅｕｒｔｉｃ ａｃｉｄ）のエステル）、プラスチックおよび植物繊維を含む。その上、ゼイン、アクア−ゼイン（アルコールを含有しない水性ゼイン製剤）、アミロースデンプンおよびデンプン誘導体、ならびにデキストリン（例えば、マルトデキストリン）も使用される。他の公知の腸溶コーティングは、エチルセルロース、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、アミロースアセテートフタレート、セルロースアセテートフタレート、ヒドロキシルプロピルメチルセルロースフタレート、エチルアクリレートおよびメチルメタクリレートを含む。
コーティングポリマーは、フタレート誘導体、ＣＡＴ、ＨＰＭＣＡＳ、ポリアクリル酸誘導体、アクリル酸および少なくとも１種のアクリル酸エステルを含むコポリマー、Ｅｕｄｒａｇｉｔ（商標）Ｓ（ポリ（メタクリル酸、メチルメタクリレート）１：２）；Ｅｕｄｒａｇｉｔ Ｌ１００（商標）Ｓ（ポリ（メタクリル酸、メチルメタクリレート）１：１）；Ｅｕｄｒａｇｉｔ Ｌ３０Ｄ（商標）（ポリ（メタクリル酸、エチルアクリレート）１：１）；および（Ｅｕｄｒａｇｉｔ Ｌ１００−５５）（ポリ（メタクリル酸、エチルアクリレート）１：１）（Ｅｕｄｒａｇｉｔ（商標）Ｌは、メタクリル酸およびメタクリル酸メチルエステルから合成されるアニオン性ポリマーである）、アクリル酸およびアクリル酸エステルコポリマーとブレンドされたポリメチルメタクリレート、アルギン酸、アルギン酸アンモニア、アルギン酸ナトリウム、アルギン酸カリウム、アルギン酸マグネシウムもしくはアルギン酸カルシウム、ビニルアセテートコポリマー、ポリビニルアセテート３０Ｄ（水における３０％分散）、ポリ（ジメチルアミノエチルアクリレート）を含む中性メタクリル酸エステル（“Ｅｕｄｒａｇｉｔ Ｅ（商標））、メチルメタクリレートおよびエチルアクリレートとトリメチルアンモニオエチルメタクリレートクロライドのコポリマー、メチルメタクリレートおよびエチルアクリレートのコポリマー、ゼイン、ｓｈｅｌｌａｃ、ガムもしくは多糖、またはそれらの組合せのうち１つまたは複数を含むこともできる。
コーティング層は、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）、ヒドロキシプロピルエチルセルロース（ＨＰＥＣ）、ヒドロキシプロピルセルロース（ＨＰＣ）、ヒドロキシプロピルエチルセルロース（ＨＰＥＣ）、ヒドロキシメチルプロピルセルロース（ＨＭＰＣ）、エチルヒドロキシエチルセルロース（ＥＨＥＣ）（エツロース）、ヒドロキシエチルメチルセルロース（ＨＥＭＣ）、ヒドロキシメチルエチルセルロース（ＨＭＥＣ）、プロピルヒドロキシエチルセルロース（ＰＨＥＣ）、メチルヒドロキシエチルセルロース（ＭＨＥＣ）、疎水性に修飾されたヒドロキシエチルセルロース（ＮＥＸＴＯＮ）、カルボキシメチルヒドロキシエチルセルロース（ＣＭＨＥＣ）、メチルセルロース、エチルセルロース、水溶性ビニルアセテートコポリマー、ガム、アルギン酸、およびアルギン酸アンモニア、アルギン酸ナトリウム、アルギン酸カリウムなどのアルギン酸など等の多糖、炭水化物の酸フタレート、アミロースアセテートフタレート、セルロースアセテートフタレート（ＣＡＰ）、セルロースエステルフタレート、セルロースエーテルフタレート、ヒドロキシプロピルセルロースフタレート（ＨＰＣＰ）、ヒドロキシプロピルエチルセルロースフタレート（ＨＰＥＣＰ）、ヒドロキシプロピル（ｐｒｏｐｌｙ）メチルセルロースフタレート（ＨＰＭＣＰ）、ヒドロキシプロピルメチルセルロースアセテートサクシネート（ＨＰＭＣＡＳ）を含有するポリマーを含むこともできる。
一部の実施形態では、遺伝子操作された微生物は、腸または腸の特定の領域、例えば、大腸への放出のために腸溶的にコーティングされる。胃から結腸までの典型的なｐＨプロファイルは、約１〜４（胃）、５．５〜６（十二指腸）、７．３〜８．０（回腸）および５．５〜６．５（結腸）である。一部の疾患では、ｐＨプロファイルは修飾され得る。一部の実施形態では、コーティングは、放出部位を指定するために、特異的ｐＨ環境において分解される。一部の実施形態では、少なくとも２つのコーティングが使用される。一部の実施形態では、外側コーティングおよび内側コーティングは、異なるｐＨレベルで分解される。
経口投与のための液体調製物は、液剤、シロップ剤、懸濁剤、または使用前の水もしくは他の適したビヒクルによる構成のための乾燥製品の形態をとることができる。このような液体調製物は、懸濁剤（例えば、ソルビトールシロップ、セルロース誘導体または水添食用脂肪）；乳化剤（例えば、レシチンまたはアカシア）；非水性ビヒクル（例えば、アーモンド油、油性エステル、エチルアルコールまたは分画された植物油）；および保存料（例えば、メチルもしくはプロピル−ｐ−ヒドロキシベンゾエートまたはソルビン酸）などの薬学的に許容される薬剤を用いて、従来手段によって調製することができる。調製物は、適宜、緩衝剤の塩、調味剤、着色剤および甘味剤を含有することもできる。経口投与のための調製物は、本明細書に記載されている遺伝子操作された微生物の緩徐放出、制御放出または持続放出のために適切に製剤化することができる。
一実施形態では、本開示の遺伝子操作された微生物は、小児対象への投与に適した組成物において製剤化することができる。当該技術分野で周知の通り、子供は、異なる胃排出速度、ｐＨ、胃腸管透過性などを含む多くの側面において成人とは異なる（Ｉｖａｎｏｖｓｋａら
、Ｐｅｄｉａｔｒｉｃｓ、１３４巻（２号）：３６１〜３７２頁、２０１４年）。さらに、投与経路および味覚特質など、小児製剤の認容性および嗜好性は、許容される小児服薬遵守の達成に重要である。よって、一実施形態では、小児対象への投与に適した組成物は、嚥下し易いもしくは溶解可能な剤形、または香味料、甘味料もしくは味覚遮断物が添加された組成物など、より口当たりが良い組成物を含むことができる。一実施形態では、小児対象への投与に適した組成物は、成人への投与に適する場合もある。
一実施形態では、小児対象への投与に適した組成物は、液剤、シロッ剤プ、懸濁剤、エリキシル剤、懸濁剤もしくは液剤としての再構成のための散剤、分散性／発泡性錠剤、咀嚼錠剤、グミキャンディ、ロリポップ、フリーザーポップ（ｆｒｅｅｚｅｒ ｐｏｐ）、トローチ剤、チューインガム、経口の細長い条片（ｔｈｉｎ ｓｔｒｉｐ）、経口で崩壊する錠剤、サシェ剤、軟ゼラチンカプセル剤、振りかけ用（ｓｐｒｉｎｋｌｅ）経口散剤、または粒剤を含むことができる。一実施形態では、組成物は、キャンディに弾性、所望の腰の強い稠度およびより長い有効期間を与えるゼラチン基剤から作られた、グミキャンディである。一部の実施形態では、グミキャンディは、甘味料または香味料を含むこともできる。
一実施形態では、小児対象への投与に適した組成物は、香味料を含むことができる。本明細書で使用される場合、「香味料」は、製剤に別個の味覚および芳香をもたらす物質（液体または固体）である。香味料は、製剤の嗜好の改善にも役立つ。香味料として、ストロベリー、バニラ、レモン、グレープ、バブルガムおよびチェリーが挙げられるがこれらに限定されない。
ある特定の実施形態では、遺伝子操作された微生物は、例えば、不活性希釈剤または同化可能な食用担体と共に経口投与することができる。化合物は、硬もしくは軟殻ゼラチンカプセルに封入する、錠剤中に圧縮する、または対象の食事に直接的に組み込むこともできる。経口治療投与のため、化合物は、賦形剤と共に組み込み、経口摂取可能な錠剤、バッカル錠剤、トローチ剤、カプセル剤、エリキシル剤、懸濁剤、シロップ剤、ウエハその他の形態で使用することができる。非経口的投与以外によって化合物を投与するために、その不活性化を防止するための材料で化合物をコーティングする、または化合物をそれと同時投与することが必要となり得る。
別の実施形態では、本発明の組換え細菌を含む医薬組成物は、食べられる製品、例えば、食品であってもよい。一実施形態では、食品は、ミルク、濃縮乳、発酵乳（ヨーグルト、酸乳、フローズンヨーグルト、乳酸菌発酵飲料）、粉乳、アイスクリーム、クリームチーズ、ドライチーズ、豆乳、発酵豆乳、野菜−フルーツジュース、フルーツジュース、スポーツドリンク、菓子類、キャンディ、乳児食（乳児用ケーキなど）、栄養性食品、動物飼料または栄養補助食品である。一実施形態では、食品は、発酵乳製品など、発酵食である。一実施形態では、発酵乳製品は、ヨーグルトである。別の実施形態では、発酵乳製品は、チーズ、ミルク、クリーム、アイスクリーム、ミルクセーキまたはケフィアである。別の実施形態では、本発明の組換え細菌は、プロバイオティクスとして機能することが意図される他の生きた細菌細胞を含有する調製物において組み合わされる。別の実施形態では、食品は、飲料である。一実施形態では、飲料は、フルーツジュースに基づく飲料または植物もしくはハーブ抽出物を含有する飲料である。別の実施形態では、食品は、ゼリーまたはプディングである。本発明の組換え細菌の投与に適した他の食品は、当該技術分野で周知である。例えば、これらそれぞれの内容全体が明確に参照により本明細書に組み込まれる、Ｕ．Ｓ．２０１５／０３５９８９４およびＵＳ２０１５／０２３８５４５を参照されたい。さらに別の実施形態では、本発明の医薬組成物は、パン、ヨーグルトまたはチーズなどの食品の中へと注射される、その上にスプレーされる、またはその上に振りかけられる。
一部の実施形態では、組成物は、腸溶的にコーティングされているまたはコーティングされていない、ナノ粒子、ナノカプセル剤、マイクロカプセル剤またはマイクロ錠剤による、小腸内（ｉｎｔｒａｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ）投与、空腸内（ｉｎｔｒａｊｅｊｕｎａｌ）投与、十二指腸内投与、回腸内（ｉｎｔｒａｉｌｅａｌ）投与、胃シャント投与または結腸内投与のために製剤化される。医薬組成物は、例えば、カカオバターまたは他のグリセリドなどの従来坐薬基剤を使用して、坐薬または停留浣腸などの直腸組成物において製剤化することもできる。組成物は、油性または水性ビヒクルにおける懸濁剤、液剤またはエマルション剤となることができ、懸濁化剤、安定化剤および／または分散剤を含有することができる。
本明細書に記載されている遺伝子操作された微生物は、鼻腔内投与することができ、エアロゾル形態、スプレー、ミスト、または液滴の形態で製剤化することができ、適した噴霧剤（例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素または他の適したガス）の使用による、加圧パックまたはネブライザーからのエアロゾルスプレー提示の形態で簡便に送達することができる。加圧エアロゾル投薬量単位は、計量した量を送達するバルブの設置により決定することができる。インヘラーまたは吸入器における使用のためのカプセルおよびカートリッジ（例えば、ゼラチン製）は、化合物、およびラクトースまたはデンプンなどの適した粉末基剤の粉末混合物を含有して製剤化することができる。
遺伝子操作された微生物は、デポー調製物として投与および製剤化することができる。このような長時間作用性製剤は、植え込みによって、または静脈内注射、皮下注射、局所注射、直接注射もしくは注入を含む注射によって投与することができる。例えば、組成物は、適したポリマーもしくは疎水性材料（例えば、許容される油中のエマルションとして）またはイオン交換樹脂により、または難溶性誘導体（例えば、難溶性塩として）として製剤化することができる。
一部の実施形態では、単一の剤形における薬学的に許容される組成物が本明細書に開示されている。単一の剤形は、液体または固体形態のものとなることができる。単一の剤形は、修飾することなく患者に直接的に投与することができる、または投与に先立ち希釈もしくは再構成することができる。ある特定の実施形態では、単一の剤形は、ボーラス形態で、例えば、単一の注射で、複数の錠剤、カプセル剤、丸剤などを含む経口用量を含む単一の経口用量で投与することができる。代替実施形態では、単一の剤形は、例えば、注入によって、ある期間にわたって投与することができる。
医薬組成物の単一の剤形は、腸溶的にコーティングされていてもコーティングされていなくてもよい、錠剤、粒状、ナノ粒子、ナノカプセル剤、マイクロカプセル剤、マイクロ錠剤、ペレット剤または散剤など、より小さいアリコート、単一用量容器、単一用量液体形態または単一用量固体形態へと、医薬組成物を分割することにより調製することができる。固体形態における単一用量は、患者への投与に先立ち液体、典型的には滅菌水または生理食塩水溶液を添加することにより再構成することができる。
他の実施形態では、組成物は、制御放出または持続放出システムにおいて送達することができる。一実施形態では、ポンプを使用して、制御または持続放出を達成することができる。別の実施形態では、ポリマー材料を使用して、本開示の治療法の制御または持続放出を達成することができる（例えば、米国特許第５，９８９，４６３号を参照）。持続放出製剤において使用されるポリマーの例として、ポリ（２−ヒドロキシエチルメタクリレート）、ポリ（メチルメタクリレート）、ポリ（アクリル酸）、ポリ（エチレン−ｃｏ−ビニルアセテート）、ポリ（メタクリル酸）、ポリグリコリド（ＰＬＧ）、ポリ酸無水物、ポリ（Ｎ−ビニルピロリドン）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリアクリルアミド、ポリ（エチレングリコール）、ポリラクチド（ＰＬＡ）、ポリ（ラクチド−ｃｏ−グリコリド）（ＰＬＧＡ）およびポリオルトエステルが挙げられるがこれらに限定されない。持続放出製剤において使用されるポリマーは、不活性で、浸出可能な（ｌｅａｃｈａｂｌｅ）不純物を含まず、貯蔵下で安定し、滅菌され、生分解性となることができる。一部の実施形態では、制御または持続放出システムは、予防または治療標的に近接して配置することができ、よって、全身性用量の僅かな一部分のみを要求する。当業者に公知のいかなる適した技法を使用してもよい。
投薬量レジメンは、治療応答をもたらすように調整することができる。投薬は、疾患の重症度および応答性、投与経路、処置の時間的経過（数日間〜数カ月間〜数年間）、ならびに疾患寛解までの時間を含むいくつかの因子に依存し得る。例えば、単一のボーラスを一度に投与することができる、いくつかの分割用量を所定の期間にわたって投与することができる、または治療状況によって示される通りに用量を低減もしくは増加させることができる。投薬量の仕様は、活性化合物の特有の特徴および達成されるべき特定の治療効果によって指示される。投薬量の値は、軽減されるべき状態の種類および重症度と共に変動し得る。いずれか特定の対象に対して、個々の必要および処置担当の臨床医の専門的判断に従って、特異的な投薬量レジメンを経時的に調整することができる。本明細書に提供される化合物の毒性および治療有効性は、細胞培養または動物モデルにおいて標準医薬品手順によって決定することができる。例えば、ＬＤ５０、ＥＤ５０、ＥＣ５０およびＩＣ５０を決定することができ、毒性および治療効果の間の用量比（ＬＤ５０／ＥＤ５０）を治療指数として計算することができる。毒性副作用を示す組成物は、潜在的損傷を最小化して副作用を低減させるための慎重な修飾により使用することができる。投薬は、細胞培養アッセイおよび動物モデルから初期に推定することができる。ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏアッセイならびに動物研究から得られるデータは、ヒトにおける使用のためのある範囲の投薬量の製剤化において使用することができる。
成分は、例えば、活性薬剤の含量を示すアンプルまたはサシェなど、密閉シールされた容器における乾燥した凍結乾燥粉末または水を含まない濃縮物として、別々に、または単位剤形において一緒に混合して供給される。投与機序が、注射によるものである場合、投与に先立ち成分を混合することができるように、注射用滅菌水または生理食塩水のアンプルを提供することができる。
医薬組成物は、薬剤の含量を示すアンプルまたはサシェなど、密閉シールされた容器内に包装することができる。一実施形態では、医薬組成物の１つまたは複数は、密閉シールされた容器内に乾燥し滅菌された凍結乾燥粉末または水を含まない濃縮物として供給され、対象への投与に適切な濃度に再構成（例えば、水または生理食塩水で）され得る。ある実施形態では、予防もしくは治療剤または医薬組成物の１つまたは複数は、２℃〜８℃の間で貯蔵され、再構成後１時間以内、３時間以内、５時間以内、６時間以内、１２時間以内、２４時間以内、４８時間以内、７２時間以内または１週間以内に投与される、密閉シールされた容器内に乾燥した滅菌凍結乾燥粉末として供給される。凍結乾燥剤形のために凍結保護物質、主に０〜１０％スクロース（最適には０．５〜１．０％）が含まれていてよい。他の適した凍結保護物質は、トレハロースおよびラクトースを含む。他の適した増量剤は、グリシンおよびアルギニンを含み、そのいずれかは、０〜０．０５％の濃度で含まれ得、ポリソルベート−８０（最適には、０．００５〜０．０１％の濃度で含まれる）も含まれ得る。追加的な界面活性物質として、ポリソルベート２０およびＢＲＩＪ界面活性物質が挙げられるがこれらに限定されない。医薬組成物は、注射用溶液として調製することができ、吸収または分散の増加に使用される薬剤、例えば、ヒアルロニダーゼなど、アジュバントとして有用な薬剤をさらに含むことができる。
一部の実施形態では、遺伝子操作された微生物およびその組成物は、静脈内投与、腫瘍内投与または腫瘍周囲投与のために製剤化される。遺伝子操作された微生物は、デポー調製物として製剤化することができる。このような長時間作用性製剤は、植え込みまたは注射によって投与することができる。例えば、組成物は、適したポリマーもしくは疎水性材料（例えば、許容される油中のエマルションとして）またはイオン交換樹脂により、または難溶性誘導体（例えば、難溶性塩として）として製剤化することができる。
一部の実施形態では、遺伝子操作されたＯＶは、効率的送達および宿主抗ウイルス免疫応答の克服の必要を考慮に入れて、送達のために調製される。抗ウイルス応答を逃れるためのアプローチは、処置レジメンの一部としての異なるウイルス血清型の投与（血清型スイッチング）、抗体認識からウイルスをマスクするためのポリマーコーティングなどの製剤、および送達ビヒクルとしての細胞の使用を含む。
別の実施形態では、組成物は、制御放出または持続放出システムにおいて送達することができる。一実施形態では、ポンプを使用して、制御または持続放出を達成することができる。別の実施形態では、ポリマー材料を使用して、本開示の治療法の制御または持続放出を達成することができる（例えば、米国特許第５，９８９，４６３号を参照）。持続放出製剤において使用されるポリマーの例として、ポリ（２−ヒドロキシエチルメタクリレート）、ポリ（メチルメタクリレート）、ポリ（アクリル酸）、ポリ（エチレン−ｃｏ−ビニルアセテート）、ポリ（メタクリル酸）、ポリグリコリド（ＰＬＧ）、ポリ酸無水物、ポリ（Ｎ−ビニルピロリドン）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリアクリルアミド、ポリ（エチレングリコール）、ポリラクチド（ＰＬＡ）、ポリ（ラクチド−ｃｏ−グリコリド）（ＰＬＧＡ）およびポリオルトエステルが挙げられるがこれらに限定されない。持続放出製剤において使用されるポリマーは、不活性で、浸出可能な不純物を含まず、貯蔵下で安定し、滅菌され、生分解性となることができる。一部の実施形態では、制御または持続放出システムは、予防または治療標的に近接して配置することができ、よって、全身性用量の僅かな一部分のみを要求する。当業者に公知のいかなる適した技法を使用してもよい。
本発明の遺伝子操作された細菌は、中性または塩形態として投与および製剤化することができる。薬学的に許容される塩は、塩酸、リン酸、酢酸、シュウ酸、酒石酸などに由来する塩など、アニオンにより形成される塩、および水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カルシウム、水酸化第二鉄、イソプロピルアミン、トリエチルアミン、２−エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカインなどに由来する塩など、カチオンにより形成される塩を含む。
処置方法
本発明の別の態様は、がんを処置する方法を提供する。一部の実施形態では、本発明は、がんに関連する１つまたは複数の症状を低減、寛解または排除するための方法を提供する。一部の実施形態では、前記がんが、副腎がん、副腎皮質癌、肛門がん、虫垂がん、胆管がん、膀胱がん、骨がん（例えば、ユーイング肉腫腫瘍、骨肉腫、悪性線維性組織球腫）、脳がん（例えば、星細胞腫、脳幹神経膠腫、頭蓋咽頭腫、脳室上衣腫）、気管支腫瘍、中枢神経系腫瘍、乳がん、キャッスルマン病、子宮頸がん、結腸がん、直腸がん、結腸直腸がん、子宮内膜がん、食道がん、眼がん、胆嚢がん、消化器がん、消化器カルチノイド腫瘍、消化器間質腫瘍、妊娠性絨毛性疾患、心臓がん、カポジ肉腫、腎がん、喉頭がん、下咽頭がん、白血病（例えば、急性リンパ性白血病、急性骨髄系白血病、慢性リンパ球性白血病、慢性骨髄性白血病）、肝がん、肺がん、リンパ腫（例えば、ＡＩＤＳ関連リンパ腫、バーキットリンパ腫、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、中枢神経系原発リンパ腫）、悪性中皮腫、多発性骨髄腫、骨髄異形成症候群、鼻腔がん、副鼻腔がん、上咽頭がん、神経芽腫、口腔がん、中咽頭がん、骨肉腫、卵巣がん、膵がん、陰茎がん、下垂体腫瘍、前立腺がん、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、ラブドイド腫瘍、唾液腺がん、肉腫、皮膚がん（例えば、基底細胞癌、黒色腫）、小腸がん、胃がん、奇形腫、精巣がん、のどのがん、胸腺がん、甲状腺がん、非通常型小児がん、尿道がん、子宮がん、子宮肉腫、膣がん、外陰がん、ワルデンストレーム高ガンマグロブリン血症、およびウィルムス腫瘍から選択される。一部の実施形態では、それらに関連する症状として、貧血、食欲不振、膀胱裏層の刺激作用、出血および内出血（血小板減少症）、味覚もしくは嗅覚の変化、便秘、下痢、口渇、嚥下障害、浮腫、疲労、毛髪脱落（脱毛症）、感染症、不妊症、リンパ浮腫、口内炎、悪心、疼痛、末梢神経障害、う歯、尿路感染症、および／または記憶および集中に関する問題が挙げられるがこれらに限定されない。
本方法は、本明細書に記載されている細菌の少なくとも１つの遺伝子操作された種、株またはサブタイプにより医薬組成物を調製するステップと、この医薬組成物を対象に治療有効量で投与するステップとを含むことができる。遺伝子操作された微生物は、組織もしくは供給を担う血管へと局所に、例えば、腫瘍内もしくは腫瘍周囲に、または全身性に、例えば、注入もしくは注射により静脈内に投与することができる。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、静脈内、腫瘍内、動脈内、筋肉内、腹腔内、経口または局所的に投与される。一部の実施形態では、遺伝子操作された微生物は、静脈内に、すなわち、全身性に投与される。
ある特定の実施形態では、対象への医薬組成物の投与は、対象における細胞増殖、腫瘍成長および／または腫瘍体積を低減させる。一部の実施形態では、本開示の方法は、細胞増殖、腫瘍成長および／または腫瘍体積を、無処置または対照の対象におけるレベルと比較して、少なくとも約１０％〜２０％、２０％〜２５％、２５％〜３０％、３０％〜４０％、４０％〜５０％、５０％〜６０％、６０％〜７０％、７０％〜７５％、７５％〜８０％、８０％〜８５％、８５％〜９０％、９０％〜９５％、９５％〜９９％またはそれより大きく低減させることができる。一部の実施形態では、低減は、医薬組成物の投与前および後に、対象における細胞増殖、腫瘍成長および／または腫瘍体積を比較することにより測定される。一部の実施形態では、対象におけるがんを処置または寛解する方法は、がんの１つまたは複数の症状を、少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％またはそれより大きく改善させる。
医薬組成物の投与の前、その最中およびその後に、血液、血清、血漿、尿、腹水、および／または組織もしくは臓器由来の生検などの生体試料において、対象におけるがん性細胞および／またはバイオマーカーを測定することができる。一部の実施形態では、方法は、対象における腫瘍体積を検出不能なサイズまで、または処置に先立つ対象の腫瘍体積の約１％、２％、５％、１０％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％もしくは９０％未満まで低下させるために、本発明の組成物の投与を含むことができる。他の実施形態では、方法は、対象における細胞増殖速度または腫瘍成長速度を検出不能な速度まで、または処置に先立つ速度の約１％、２％、５％、１０％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％もしくは９０％未満まで低下させるために、本発明の組成物の投与を含むことができる。
免疫に基づく免疫モジュレーターを発現する遺伝子操作された微生物に対して、応答パターンは、伝統的細胞傷害性療法に対するものとは異なる場合がある。例えば、免疫に基づく治療法で処置された腫瘍は、これが退縮する前に拡大し得る、および／または新たな病変が出現し得る（Ａｇａｒｗａｌａら、２０１５年）。腫瘍サイズ増加は、腫瘍組織には通常存在しないリンパ球およびマクロファージによる重度の浸潤が原因となり得る。その上、応答時間は、標準療法、例えば、細胞傷害性療法に関連する応答時間より遅くなる場合がある。一部の実施形態では、免疫モジュレーターの送達は、腫瘍の体積および／またはサイズを一時的に増加させるが、対象の腫瘍の成長をモジュレートするおよび／またはがんの症状を寛解することができる。
遺伝子操作された細菌は、例えば、投与の数時間または数日後に、組織もしくは血清における防御因子によって（Ｓｏｎｎｅｎｂｏｒｎら、２００９年）、またはキルスイッチの活性化によって破壊され得る。よって、免疫モジュレーターを産生するための遺伝子または遺伝子カセットを含む医薬組成物は、治療有効用量および頻度で再投与することができる。代替実施形態では、遺伝子操作された細菌は、投与後数時間または数日以内に破壊されず、腫瘍において繁殖し、腫瘍にコロニー形成することができる。
医薬組成物は、単独で、または１つもしくは複数のさらなる治療剤、例えば、本明細書に記載されており、当該技術分野で公知の、例えば、化学療法薬もしくはチェックポイントインヒビターと組み合わせて投与することができる。１つまたは複数のさらなる治療剤の選択における重要な考慮は、薬剤が、本発明の遺伝子操作された細菌と適合性となるべきであり、例えば、薬剤が、細菌を死滅させてはならないことである。一部の研究では、抗がん免疫療法、例えば、ＣＴＬＡ−４またはＰＤ−１インヒビターの有効性は、マイクロバイオームにおける特定の細菌株の存在を要求する（Ｉｌｄａら、２０１３年；Ｖｅｔｉｚｏｕら、２０１５年；Ｓｉｖａｎら、２０１５年）。一部の実施形態では、細菌を含む医薬組成物は、チェックポイントインヒビターまたは化学療法剤の効果を増大させ、例えば、全身性に投与される化学療法または免疫療法剤の用量の低下を可能にする。一部の実施形態では、医薬組成物は、１種もしくは複数の共生またはプロバイオティクス細菌、例えば、ＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍまたはＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓと共に投与される。
ある特定の実施形態では、医薬組成物は、第１の免疫イニシエーターをコードする少なくとも１つの遺伝子を含む第１の遺伝子操作された細菌を対象に投与し、第２の免疫イニシエーターをコードする少なくとも１つの遺伝子を含む第２の遺伝子操作された細菌を対象に投与することにより、がんを処置するために対象に投与することができる。一部の実施形態では、投与ステップは、同時的に行われる。一部の実施形態では、対象への第１の遺伝子操作された細菌の投与は、対象への第２の遺伝子操作された細菌の投与の前に起こる。一部の実施形態では、対象への第２の遺伝子操作された細菌の投与は、対象への第１の遺伝子操作された細菌の投与の前に起こる。一部の実施形態では、第１の遺伝子操作された細菌の第２の遺伝子操作された細菌に対する比は、５：１、４：１、３：１、２：１、１：１、１：２、１：３、１：４または１：５である。一部の実施形態では、第２の遺伝子操作された細菌の第１の遺伝子操作された細菌に対する比は、５：１、４：１、３：１、２：１、１：１、１：２、１：３、１：４または１：５である。
化学療法剤
一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、１つまたは複数の化学療法剤による投薬と逐次に、それと同時にまたはその後に投与される。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、Ｔｒａｂｅｃｔｅｄｉｎ（登録商標）、Ｂｅｌｏｔｅｃａｎ（登録商標）、Ｃｉｓｐｌａｔｉｎ（登録商標）、Ｃａｒｂｏｐｌａｔｉｎ（登録商標）、Ｂｅｖａｃｉｚｕｍａｂ（登録商標）、Ｐａｚｏｐａｎｉｂ（登録商標）、５−フルオロウラシル、Ｃａｐｅｃｉｔａｂｉｎｅ（登録商標）、Ｉｒｉｎｏｔｅｃａｎ（登録商標）およびＯｘａｌｉｐｌａｔｉｎ（登録商標）から選択される１つまたは複数の化学療法剤による投薬と逐次に、それと同時にまたはその後に投与される。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ゲムシタビン（ジェムザール）による投薬と逐次に、それと同時にまたはその後に投与される。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、シクロホスファミドによる投薬と逐次に、それと同時にまたはその後に投与される。これらの実施形態のいずれかでは、１つまたは複数の細菌は、全身性にまたは経口にまたは腫瘍内に投与される。
一部の実施形態では、代謝物の産生または消費のための酵素をコードする遺伝子配列を含む、本明細書に記載されている１つまたは複数の操作された細菌、例えば、キヌレニンもしくはアデノシン消費者、アンモニア消費者、アルギニン生産者および／またはＳＴＩＮＧアゴニスト生産者は、１つまたは複数の化学療法剤による投薬と逐次に、それと同時にまたはその後に投与される。一部の実施形態では、化学療法剤は、全身性に投与され、細菌は、腫瘍内に投与される。一部の実施形態では、化学療法剤および細菌は、全身性に投与される。一部の実施形態では、代謝変換因子をコードする遺伝子配列を含む、本明細書に記載されている１つまたは複数の操作された細菌、例えば、キヌレニン消費者、アデノシン消費者、アルギニン生産者、アンモニア消費者および／またはＳＴＩＮＧアゴニスト生産者および／またはアンモニア消費者は、化学療法剤による投薬と逐次に、それと同時にまたはその後に投与される。一実施形態では、化学療法剤は、シクロホスファミドである。
一部の実施形態では、アデノシンの分解のための記載されている回路のうちいずれか１つまたは複数を発現する遺伝子操作された１つまたは複数の細菌は、化学療法剤投薬と逐次に、それと同時にまたはその後に投与される。一実施形態では、化学療法剤は、シクロホスファミドである。一部の実施形態では、キヌレニンの消費のための記載されている回路のうちいずれか１つまたは複数を発現する遺伝子操作された細菌は、化学療法剤による投薬と逐次に、それと同時にまたはその後に投与される。一実施形態では、化学療法剤は、シクロホスファミドである。一部の実施形態では、アルギニンの産生のための記載されている回路のうちいずれか１つまたは複数を発現する遺伝子操作された細菌は、化学療法剤による投薬と逐次に、それと同時にまたはその後に投与される。一部の実施形態では、消費および／またはアルギニン産生のための記載の回路のうちいずれか１つまたは複数を発現する遺伝子操作された細菌は、化学療法剤による投薬と逐次に、同時に、またはその後に投与される。一実施形態では、化学療法剤は、シクロホスファミドである。
一部の実施形態では、１つまたは複数の操作された細菌、例えば、アデノシン消費者、キヌレニン消費者、アンモニア消費者、アルギニン生産者は、同時投与された化学療法剤（例えば、シクロホスファミド、または本明細書に記載されているもしくは当該技術分野で公知の別の薬剤）の抗腫瘍活性（例えば、腫瘍増殖、サイズ、体積、重量）を、例えば、同じ条件下での化学療法単独と比較して、または同じ条件下での同じサブタイプの無修飾細菌と比較して、１０％〜２０％、２０％〜２５％、２５％〜３０％、３０％〜４０％、４０％〜５０％、５０％〜６０％、６０％〜７０％、７０％〜７５％、７５％〜８０％、８０％〜８５％、８５％〜９０％、９０％〜９５％、９５％〜９９％またはそれより大きく改善することができる。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌、例えば、アデノシン消費者、キヌレニン消費者、アルギニン生産者は、同時投与された化学療法剤（例えば、シクロホスファミド、または本明細書に記載されているもしくは当該技術分野で公知の別の薬剤）の抗腫瘍活性（例えば、腫瘍増殖、サイズ、体積、重量）を、例えば、同じ条件下での化学療法単独と比較して、または同じ条件下での同じサブタイプの無修飾細菌と比較して、１．０〜１．２倍、１．２〜１．４倍、１．４〜１．６倍、１．６〜１．８倍、１．８〜２倍もしくは２倍にまたはそれより大きく改善することができる。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌、例えば、アデノシン消費者、キヌレニン消費者、アルギニン生産者は、同時投与された化学療法剤（例えば、シクロホスファミド、または本明細書に記載されているもしくは当該技術分野で公知の別の薬剤）の抗腫瘍活性（例えば、腫瘍増殖、サイズ、体積、重量）を、例えば、同じ条件下での化学療法単独と比較して、または同じ条件下での同じサブタイプの無修飾細菌と比較して、約３倍、４倍、約３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、１００倍、５００倍もしくは１０００倍にまたはそれより大きく改善することができる。
一部の実施形態では、免疫活性化およびプライミングのためのエフェクターの産生のための遺伝子配列を含む、本明細書に記載されている１つまたは複数の操作された細菌は、化学療法剤による投薬と逐次に、それと同時にまたはその後に投与される。一部の実施形態では、化学療法剤は、全身性に投与され、細菌は、腫瘍内に投与される。一部の実施形態では、化学療法剤および細菌は、全身性に投与される。
一部の実施形態では、化学療法剤と共に投与される遺伝子操作された細菌は、１つまたは複数のＳＴＩＮＧアゴニストの産生のための１つまたは複数の酵素をコードする遺伝子配列（複数可）を含む。一部の実施形態では、ジアデニル酸シクラーゼおよび／またはヒトもしくは細菌ｃＧＡＳ等の他のＳＴＩＮＧアゴニスト産生酵素をコードする遺伝子配列（複数可）を含む、本明細書に記載される１つまたは複数の操作された細菌は、化学療法剤による投薬と逐次に、同時に、またはその後に投与される。一実施形態では、化学療法剤は、シクロホスファミドである。
一部の実施形態では、ジアデニル酸シクラーゼまたはＳＴＩＮＧアゴニストの生成のための他の酵素を発現する遺伝子操作された細菌は、同時投与された化学療法剤（例えば、シクロホスファミド）の抗腫瘍活性（例えば、腫瘍増殖、サイズ、体積、重量）を、例えば、同じ条件下での化学療法単独と比較して、または同じ条件下での同じサブタイプの無修飾細菌と比較して、１０％〜２０％、２０％〜２５％、２５％〜３０％、３０％〜４０％、４０％〜５０％、５０％〜６０％、６０％〜７０％、７０％〜７５％、７５％〜８０％、８０％〜８５％、８５％〜９０％、９０％〜９５％、９５％〜９９％またはそれより大きく改善することができる。一部の実施形態では、ジアデニル酸シクラーゼ、ｃＧＡＳおよび／またはＳＴＩＮＧアゴニストの生成のための他の酵素を発現する遺伝子操作された細菌は、同時投与された化学療法剤（例えば、シクロホスファミド、または本明細書に記載されているもしくは当該技術分野で公知の別の薬剤）の抗腫瘍活性（例えば、腫瘍増殖、サイズ、体積、重量）を、例えば、同じ条件下での化学療法単独と比較して、または同じ条件下での同じサブタイプの無修飾細菌と比較して、１．０〜１．２倍、１．２〜１．４倍、１．４〜１．６倍、１．６〜１．８倍、１．８〜２倍もしくは２倍にまたはそれより大きく改善することができる。一部の実施形態では、ジアデニル酸シクラーゼまたはＳＴＩＮＧアゴニストの生成のための他の酵素を発現する遺伝子操作された細菌は、同時投与された化学療法剤（例えば、シクロホスファミド、または本明細書に記載されているもしくは当該技術分野で公知の別の薬剤）の抗腫瘍活性（例えば、腫瘍増殖、サイズ、体積、重量）を、例えば、同じ条件下での化学療法単独と比較して、または同じ条件下での同じサブタイプの無修飾細菌と比較して、約３倍、４倍、約３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、１００倍、５００倍もしくは１０００倍にまたはそれより大きく改善することができる。
一部の実施形態では、５−ＦＣから５−ＦＵへの変換のための記載されているシトシンデアミナーゼのうちいずれか１つまたは複数を発現する遺伝子操作された細菌は、化学療法剤投薬と逐次に、それと同時にまたはその後に投与される。一実施形態では、化学療法剤は、シクロホスファミドである。
一部の実施形態では、化学療法剤と共に投与される遺伝子操作された細菌は、５−ＦＣから５−ＦＵへの変換のための１つまたは複数の酵素をコードする遺伝子配列（複数可）を含む。一部の実施形態では、５−ＦＣから５−ＦＵへの変換のためのシトシンデアミナーゼを発現する遺伝子操作された細菌は、同時投与された化学療法剤（例えば、シクロホスファミド）の抗腫瘍活性（例えば、腫瘍増殖、サイズ、体積、重量）を、例えば、同じ条件下での化学療法単独と比較して、または同じ条件下での同じサブタイプの無修飾細菌と比較して、１０％〜２０％、２０％〜２５％、２５％〜３０％、３０％〜４０％、４０％〜５０％、５０％〜６０％、６０％〜７０％、７０％〜７５％、７５％〜８０％、８０％〜８５％、８５％〜９０％、９０％〜９５％、９５％〜９９％またはそれより大きく改善することができる。
一部の実施形態では、５−ＦＣから５−ＦＵへの変換のためのシトシンデアミナーゼを発現する遺伝子操作された細菌は、同時投与された化学療法剤（例えば、シクロホスファミド、または本明細書に記載されているもしくは当該技術分野で公知の別の薬剤）の抗腫瘍活性（例えば、腫瘍増殖、サイズ、体積、重量）を、例えば、同じ条件下での化学療法単独と比較して、または同じ条件下での同じサブタイプの無修飾細菌と比較して、１．０〜１．２倍、１．２〜１．４倍、１．４〜１．６倍、１．６〜１．８倍、１．８〜２倍もしくは２倍にまたはそれより大きく改善することができる。一部の実施形態では、５−ＦＣから５−ＦＵへの変換のためのシトシンデアミナーゼを発現する遺伝子操作された細菌は、同時投与された化学療法剤（例えば、シクロホスファミド、または本明細書に記載されているもしくは当該技術分野で公知の別の薬剤）の抗腫瘍活性（例えば、腫瘍増殖、サイズ、体積、重量）を、例えば、同じ条件下での化学療法単独と比較して、または同じ条件下での同じサブタイプの無修飾細菌と比較して、約３倍、４倍、約３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、１００倍、５００倍もしくは１０００倍にまたはそれより大きく改善することができる。
一部の実施形態では、アデノシンの分解、キヌレニン消費、アンモニア消費および／またはアルギニン産生のための１つまたは複数の酵素をコードする遺伝子配列（複数可）と組み合わせてＳＴＩＮＧアゴニストの産生のための酵素をコードする遺伝子配列（複数可）を含む、本明細書に記載される１つまたは複数の操作された細菌は、本明細書に記載される１つまたは複数の化学療法試薬による投薬と逐次に、同時に、またはその後に投与される。これらの実施形態のいずれかでは、１つまたは複数の化学療法試薬は、全身性にまたは経口的にまたは腫瘍内に投与される。これらの実施形態のいずれかでは、１つまたは複数の細菌は、全身性にまたは経口的にまたは腫瘍内に投与される。
遺伝子操作された１つまたは複数の細菌が化学療法剤と組み合わされる、一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同時投与された化学療法剤（例えば、シクロホスファミド）の抗腫瘍活性（例えば、腫瘍増殖、サイズ、体積、重量）を、例えば、同じ条件下での化学療法単独と比較して、または同じ条件下での同じサブタイプの無修飾細菌と比較して、１０％〜２０％、２０％〜２５％、２５％〜３０％、３０％〜４０％、４０％〜５０％、５０％〜６０％、６０％〜７０％、７０％〜７５％、７５％〜８０％、８０％〜８５％、８５％〜９０％、９０％〜９５％、９５％〜９９％またはそれより大きく改善することができる。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同時投与された化学療法剤（例えば、シクロホスファミド、または本明細書に記載されているもしくは当該技術分野で公知の別の薬剤）の抗腫瘍活性（例えば、腫瘍増殖、サイズ、体積、重量）を、例えば、同じ条件下での化学療法単独と比較して、または同じ条件下での同じサブタイプの無修飾細菌と比較して、１．０〜１．２倍、１．２〜１．４倍、１．４〜１．６倍、１．６〜１．８倍、１．８〜２倍もしくは２倍にまたはそれより大きく改善することができる。一部の実施形態では、遺伝子操作された１つまたは複数の細菌は、同時投与された化学療法剤（例えば、シクロホスファミド、または本明細書に記載されているもしくは当該技術分野で公知の別の薬剤）の抗腫瘍活性（例えば、腫瘍増殖、サイズ、体積、重量）を、例えば、同じ条件下での化学療法単独と比較して、または同じ条件下での同じサブタイプの無修飾細菌と比較して、約３倍、４倍、約３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、１００倍、５００倍もしくは１０００倍にまたはそれより大きく改善することができる。
一部の実施形態では、本明細書に記載されている１つまたは複数のアデノシン分解酵素をコードする遺伝子配列を含む、１つまたは複数の遺伝子操作された細菌は、ゲムシタビンによる投薬と逐次に、それと同時にまたはその後に投与される。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌によってコードされるアデノシン消費のための酵素は、ａｄｄ、ｘａｐＡ、ｄｅｏＤ、ｘｄｈＡ、ｘｄｈＢおよびｘｄｈＣおよびｎｕｐＣのうち１つまたは複数を含む。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌によってコードされるアデノシン消費のための酵素は、ａｄｄ、ｘａｐＡ、ｄｅｏＤ、ｘｄｈＡ、ｘｄｈＢおよびｘｄｈＣおよびｎｕｐＧのうち１つまたは複数を含む。一部の実施形態では、表面提示または分泌のための抗ＣＤ４０抗体をコードする遺伝子配列を含む、本明細書に記載されている１つまたは複数の操作された細菌は、ゲムシタビンによる投薬と逐次に、それと同時にまたはその後に投与される。一部の実施形態では、分泌のためまたは表面提示のためのヒアルロニダーゼをコードする遺伝子配列を含む、本明細書に記載されている１つまたは複数の操作された細菌は、ゲムシタビンによる投薬と逐次に、それと同時にまたはその後に投与される。これらの実施形態のいずれかでは、１つまたは複数の細菌は、全身性にまたは経口的にまたは腫瘍内に投与される。
遺伝子操作された細菌がゲムシタビンと組み合わされる、一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同時投与された化学療法剤（例えば、シクロホスファミド）の抗腫瘍活性（例えば、腫瘍増殖、サイズ、体積、重量）を、例えば、同じ条件下での化学療法単独と比較して、または同じ条件下での同じサブタイプの無修飾細菌と比較して、
１０％〜２０％、２０％〜２５％、２５％〜３０％、３０％〜４０％、４０％〜５０％、５０％〜６０％、６０％〜７０％、７０％〜７５％、７５％〜８０％、８０％〜８５％、８５％〜９０％、９０％〜９５％、９５％〜９９％またはそれより大きく改善することができる。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同時投与された化学療法剤（例えば、シクロホスファミドまたは本明細書に記載されるもしくは当技術分野で公知の別の薬剤）の抗腫瘍活性（例えば、腫瘍増殖、サイズ、体積、重量）を、同じ条件下で化学療法単独と比較して、または同じ条件下で同じ亜型の未改変細菌と比較して、例えば、１．０〜１．２倍、１．２〜１．４倍、１．４〜１．６倍、１．６〜１．８倍、１．８〜２倍、または２倍多くまたはそれよりも多く改善することができる。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同時投与された化学療法剤（例えば、シクロホスファミド、または本明細書に記載されているもしくは当該技術分野で公知の別の薬剤）の抗腫瘍活性（例えば、腫瘍増殖、サイズ、体積、重量）を、例えば、同じ条件下での化学療法単独と比較して、または同じ条件下での同じサブタイプの無修飾細菌と比較して、約３倍、４倍、約３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、１００倍、５００倍もしくは１０００倍にまたはそれより大きく改善することができる。
チェックポイント阻害
ある特定の実施形態では、１つまたは複数の遺伝子操作された細菌は、１つまたは複数のチェックポイント阻害剤、免疫刺激性抗体（阻害性またはアゴニスト性）または当技術分野で公知のもしくは本明細書に記載される他のアゴニストによる投薬と逐次に、同時に、またはその後に投与される。ある特定の実施形態では、１つまたは複数の遺伝子操作された細菌は、１つのチェックポイント阻害剤、免疫刺激性抗体（阻害性またはアゴニスト性）または当技術分野で公知のもしくは本明細書に記載される他のアゴニストによる投薬と逐次に、同時に、またはその後に投与される。ある特定の実施形態では、１つまたは複数の遺伝子操作された細菌は、２つのチェックポイント阻害剤、免疫刺激性抗体（阻害性またはアゴニスト性）または当技術分野で公知のもしくは本明細書に記載される他のアゴニストによる投薬と逐次に、同時に、またはその後に投与される。
免疫チェックポイントインヒビターの非限定的な例として、ＣＴＬＡ−４抗体（イピリムマブおよびトレメリムマブ（ＣＰ６７５２０６）が挙げられるがこれらに限定されない）、抗４−１ＢＢ（ＣＤ１３７、ＴＮＦＲＳＦ９）抗体（ＰＦ−０５０８２５６６およびウレルマブが挙げられるがこれらに限定されない）、抗ＯＸ４０抗体（Ｐｒｏｖｉｄｅｎｃｅ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ）が挙げられるがこれに限定されない抗ＣＤ１３４（ＯＸ４０）抗体、抗ＰＤ−１抗体（ニボルマブ、ピディリズマブ、ペムブロリズマブ（ＭＫ−３４７５／ＳＣＨ９００４７５）、ランブロリズマブ、ＲＥＧＮ２８１０、ＰＤ−１（Ａｇｅｎｕｓ）が挙げられるがこれらに限定されない）、抗ＰＤ−Ｌ１抗体（デュルバルマブ（ＭＥＤＩ４７３６）、アベルマブ（ＭＳＢ００１０７１８Ｃ）およびアテゾリズマブ（ＭＰＤＬ３２８０Ａ、ＲＧ７４４６、ＲＯ５５４１２６７）が挙げられるがこれらに限定されない）、および抗ＫＩＲ抗体（リリルマブが挙げられるがこれに限定されない）、ＬＡＧ３抗体（ＢＭＳ−９８６０１６が挙げられるがこれに限定されない）、抗ＣＣＲ４抗体（モガムリズマブが挙げられるがこれに限定されない）、抗ＣＤ２７抗体（バルリルマブが挙げられるがこれらに限定されない）、抗ＣＸＣＲ４抗体（ウロクプルマブが挙げられるがこれに限定されない）が挙げられる。一部の実施形態では、少なくとも１種の細菌細胞は、抗ホスファチジルセリン抗体（バビツクスマブが挙げられるがこれに限定されない）による投薬と逐次に、それと同時にまたはその後に投与される。
一部の実施形態では、少なくとも１種の細菌細胞は、ＴＬＲ９抗体（ＭＧＮ１７０３が挙げられるがこれに限定されない）、ＰＤ−１抗体（ＳＨＲ−１２１０（Ｉｎｃｙｔｅ／Ｊｉａｎｇｓｕ Ｈｅｎｇｒｕｉ）が挙げられるがこれに限定されない）、抗ＯＸ４０抗体（ＯＸ４０（Ａｇｅｎｕｓ）が挙げられるがこれに限定されない）、抗Ｔｉｍ３抗体（抗Ｔｉｍ３（Ａｇｅｎｕｓ／ＩＮｃｙｔｅ）が挙げられるがこれに限定されない）、抗Ｌａｇ３抗体（抗Ｌａｇ３（Ａｇｅｎｕｓ／ＩＮｃｙｔｅ）が挙げられるがこれに限定されない）、抗Ｂ７Ｈ３抗体（エノブリツズマブ（ＭＧＡ−２７１）、ＷＯ２００９１０１６１１に記載されている抗ＣＴ−０１１（ｈＢＡＴ、ｈＢＡＴ１）が挙げられるがこれらに限定されない）、抗ＰＤＬ−２抗体（ＡＭＰ−２２４（ＷＯ２０１００２７８２７およびＷＯ２０１１０６６３４２に記載）が挙げられるがこれに限定されない）、抗ＣＤ４０抗体（ＣＰ−８７０、８９３が挙げられるがこれに限定されない）、抗ＣＤ４０抗体（ＣＰ−８７０、８９３が挙げられるがこれに限定されない）から選択される１つまたは複数の抗体による投薬と逐次に、それと同時にまたはその後に投与される。
一部の実施形態では、代謝物の産生または消費のための酵素をコードする遺伝子配列を含む、本明細書に記載されている１つまたは複数の操作された細菌、例えば、キヌレニン消費者、アデノシン消費者、アルギニン生産者、アンモニア消費者および／またはＳＴＩＮＧアゴニスト生産者は、１つまたは複数のチェックポイントインヒビターによる投薬と逐次に、それと同時にまたはその後に投与される。一部の実施形態では、チェックポイントインヒビターは、全身投与され、細菌は、腫瘍内に投与される。一部の実施形態では、チェックポイントインヒビターおよび細菌は、全身投与される。一部の実施形態では、代謝変換因子をコードする遺伝子配列を含む、本明細書に記載されている１つまたは複数の操作された細菌、例えば、キヌレニン消費者、アデノシン消費者、アルギニン生産者および／またはアンモニア消費者および／またはＳＴＩＮＧアゴニスト生産者は、抗ＰＤ１抗体による投薬と逐次に、それと同時にまたはその後に投与される。一部の実施形態では、代謝変換因子をコードする遺伝子配列を含む、本明細書に記載されている１つまたは複数の操作された細菌、例えば、キヌレニン消費者、アデノシン消費者、アルギニン生産者、アンモニア消費者および／またはＳＴＩＮＧアゴニスト生産者は、抗ＣＴＬＡ−４抗体による投薬と逐次に、それと同時にまたはその後に投与される。一部の実施形態では、アデノシンの分解のための記載の回路のうちいずれか１つまたは複数を発現する遺伝子操作された細菌は、抗ＰＤ−Ｌ１抗体による投薬と逐次に、同時に、またはその後に投与される。
一部の実施形態では、代謝変換因子をコードする遺伝子配列を含む遺伝子操作された細菌、例えば、キヌレニン消費者もしくはアデノシン消費者、アルギニン生産者、アンモニア消費者および／またはＳＴＩＮＧアゴニスト生産者は、抗ＣＴＬＡ４抗体および抗ＰＤ−１抗体による投薬と逐次に、それと同時にまたはその後に投与される。一部の実施形態では、アデノシンの分解のための記載されている回路のうちいずれか１つまたは複数を発現する遺伝子操作された細菌は、抗ＰＤ−Ｌ１抗体および抗ＣＴＬＡ４抗体による投薬と逐次に、それと同時にまたはその後に投与される。
一部の実施形態では、アデノシンの分解のための記載されている回路のうちいずれか１つまたは複数を発現する遺伝子操作された細菌は、例えば、抗ＰＤ−１、抗ＰＤ−Ｌ１および抗ＣＴＬＡ−４が挙げられるがこれらに限定されない、本明細書に記載されている当該技術分野で公知のチェックポイントインヒビターによる投薬と逐次に、それと同時にまたはその後に投与される。一部の実施形態では、アデノシンの分解のための記載の回路のうちいずれか１つまたは複数を発現する遺伝子操作された細菌は、抗ＰＤ１抗体による投薬と逐次に、同時に、またはその後に投与される。一部の実施形態では、アデノシンの分解のための記載の回路のうちいずれか１つまたは複数を発現する遺伝子操作された細菌は、抗ＰＤ−Ｌ１抗体による投薬と逐次に、同時に、またはその後に投与される。一部の実施形態では、アデノシンの分解のための記載の回路のうちいずれか１つまたは複数を発現する遺伝子操作された細菌は、抗ＣＴＬＡ４抗体による投薬と逐次に、同時に、またはその後に投与される。一部の実施形態では、アデノシンの分解のための記載の回路のうちいずれか１つまたは複数を発現する遺伝子操作された細菌は、抗ＣＴＬＡ４抗体および抗ＰＤ１抗体および／またはＰＤ−Ｌ１抗体による投薬と逐次に、同時に、またはその後に投与される。
一部の実施形態では、キヌレニンの消費のための記載の回路のうちいずれか１つまたは複数を発現する遺伝子操作された細菌は、例えば、抗ＰＤ−１、抗ＰＤ−Ｌ１および抗ＣＴＬＡ−４を含むがこれらに限定されない、本明細書に記載され、当技術分野で公知のチェックポイント阻害剤による投薬と逐次に、同時に、またはその後に投与される。一部の実施形態では、キヌレニンの消費のための記載の回路のうちいずれか１つまたは複数を発現する遺伝子操作された細菌は、抗ＣＴＬＡ４抗体による投薬と逐次に、同時に、またはその後に投与される。一部の実施形態では、キヌレニンの消費のための記載の回路のうちいずれか１つまたは複数を発現する遺伝子操作された細菌は、抗ＰＤ１抗体による投薬と逐次に、同時に、またはその後に投与される。一部の実施形態では、キヌレニンの消費のための記載されている回路のうちいずれか１つまたは複数を発現する遺伝子操作された細菌は、抗ＰＤ−Ｌ１抗体による投薬と逐次に、それと同時にまたはその後に投与される。一部の実施形態では、キヌレニンの消費のための記載されている回路のうちいずれか１つまたは複数を発現する遺伝子操作された細菌は、抗ＣＴＬＡ４抗体ならびに抗ＰＤ１抗体および／または抗ＰＤ−Ｌ１抗体による投薬と逐次に、それと同時にまたはその後に投与される。
一部の実施形態では、アルギニンの産生および／またはアンモニアの消費のための記載されている回路のうちいずれか１つまたは複数を発現する遺伝子操作された細菌は、例えば、抗ＰＤ−１、抗ＰＤ−Ｌ１および抗ＣＴＬＡ−４が挙げられるがこれらに限定されない、本明細書に記載されている当該技術分野で公知のチェックポイントインヒビターによる投薬と逐次に、それと同時にまたはその後に投与される。一部の実施形態では、アルギニンの産生および／またはアンモニアの消費のための記載されている回路のうちいずれか１つまたは複数を発現する遺伝子操作された細菌は、抗ＣＴＬＡ４抗体による投薬と逐次に、それと同時にまたはその後に投与される。一部の実施形態では、アルギニンの産生および／またはアンモニアの消費のための記載されている回路のうちいずれか１つまたは複数を発現する遺伝子操作された細菌は、抗ＰＤ１抗体による投薬と逐次に、それと同時にまたはその後に投与される。一部の実施形態では、アルギニンの産生および／またはアンモニアの消費のための記載の回路のうちいずれか１つまたは複数を発現する遺伝子操作された細菌は、抗ＰＤ−１Ｌ抗体による投薬と逐次に、同時に、またはその後に投与される。一部の実施形態では、アルギニンの産生および／またはアンモニアの消費のための記載の回路のうちいずれか１つまたは複数を発現する遺伝子操作された細菌は、抗ＣＴＬＡ４抗体および抗ＰＤ１抗体による投薬と逐次に、同時に、またはその後に投与される。
一部の実施形態では、１つまたは複数のＳＴＩＮＧアゴニストの産生のための記載の回路のうちいずれか１つまたは複数を発現する遺伝子操作された細菌は、例えば、抗ＰＤ−１、抗ＰＤ−Ｌ１および抗ＣＴＬＡ−４を含むがこれらに限定されない、本明細書に記載され、当技術分野で公知のチェックポイント阻害剤による投薬と逐次に、同時に、またはその後に投与される。一部の実施形態では、１つまたは複数のＳＴＩＮＧアゴニストの産生のための記載の回路のうちいずれか１つまたは複数を発現する遺伝子操作された細菌は、抗ＣＴＬＡ４抗体による投薬と逐次に、同時に、またはその後に投与される。一部の実施形態では、１つまたは複数のＳＴＩＮＧアゴニストの産生のための記載の回路のうちいずれか１つまたは複数を発現する遺伝子操作された細菌は、抗ＰＤ１抗体による投薬と逐次に、同時に、またはその後に投与される。一部の実施形態では、１つまたは複数のＳＴＩＮＧアゴニストの産生のための記載の回路のうちいずれか１つまたは複数を発現する遺伝子操作された細菌は、抗ＰＤ−Ｌ１抗体による投薬と逐次に、同時に、またはその後に投与される。一部の実施形態では、１つまたは複数のＳＴＩＮＧアゴニストの産生のための記載の回路のうちいずれか１つまたは複数を発現する遺伝子操作された細菌は、抗ＣＴＬＡ−４抗体および抗ＰＤ−１抗体および／または抗ＰＤ−Ｌ１抗体による投薬と逐次に、同時に、またはその後に投与される。
一部の実施形態では、１つまたは複数のＳＴＩＮＧアゴニストの産生のための記載の回路、および１つまたは複数の代謝性変換回路のうちいずれか１つまたは複数を発現する１つまたは複数の遺伝子操作された細菌は、例えば、抗ＰＤ−１、抗ＰＤ−Ｌ１および抗ＣＴＬＡ−４を含むがこれらに限定されない、本明細書に記載され、当技術分野で公知のチェックポイント阻害剤による投薬と逐次に、同時に、またはその後に投与される。一部の実施形態では、１つまたは複数のＳＴＩＮＧアゴニストの産生のための記載の回路、および１つまたは複数の代謝性変換回路のうちいずれか１つまたは複数を発現する１つまたは複数の遺伝子操作された細菌は、抗ＣＴＬＡ−４抗体による投薬と逐次に、同時に、またはその後に投与される。一部の実施形態では、１つまたは複数のＳＴＩＮＧアゴニストの産生のための記載の回路、および１つまたは複数の代謝性変換回路のうちいずれか１つまたは複数を発現する１つまたは複数の遺伝子操作された細菌は、抗ＰＤ−１抗体による投薬と逐次に、同時に、またはその後に投与される。一部の実施形態では、１つまたは複数のＳＴＩＮＧアゴニストの産生のための記載の回路、および１つまたは複数の代謝性変換回路のうちいずれか１つまたは複数を発現する１つまたは複数の遺伝子操作された細菌は、抗ＰＤ−Ｌ１抗体による投薬と逐次に、同時に、またはその後に投与される。一部の実施形態では、１つまたは複数のＳＴＩＮＧアゴニストの産生のための記載の回路、および１つまたは複数の代謝性変換回路のうちいずれか１つまたは複数を発現する遺伝子操作された細菌は、抗ＣＴＬＡ−４抗体および抗ＰＤ−１抗体および／または抗ＰＤ−Ｌ１抗体による投薬と逐次に、同時に、またはその後に投与される。これらの実施形態のいずれにおいても、遺伝子操作された細菌は、１つまたは複数の必須遺伝子に、突然変異（複数可）または欠失（複数可）をさらに含むことができる。これらの実施形態のいずれにおいても、細菌は、ｄａｐＡに１つまたは複数の栄養要求性改変、例えば、突然変異または欠失を含むことができる。これらの実施形態のいずれにおいても、細菌は、ｔｈｙＡに１つまたは複数の栄養要求性改変、例えば、突然変異または欠失を含むことができる。これらの実施形態のいずれにおいても、細菌は、本明細書に記載される内在性プロファージに、ファージ改変、例えば、突然変異または欠失をさらに含むことができる。
一部の実施形態では、１つまたは複数のＳＴＩＮＧアゴニストおよび例えば、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ由来の１つまたは複数のキヌレニナーゼの産生のための記載の回路のうちいずれか１つまたは複数を発現する１つまたは複数の遺伝子操作された細菌は、例えば、抗ＰＤ−１、抗ＰＤ−Ｌ１および抗ＣＴＬＡ−４を含むがこれらに限定されない、本明細書に記載され、当技術分野で公知のチェックポイント阻害剤による投薬と逐次に、同時に、またはその後に投与される。一部の実施形態では、１つまたは複数のＳＴＩＮＧアゴニストおよび例えば、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ由来の１つまたは複数のキヌレニナーゼの産生のための記載の回路のうちいずれか１つまたは複数を発現する１つまたは複数の遺伝子操作された細菌は、抗ＣＴＬＡ−４抗体による投薬と逐次に、同時に、またはその後に投与される。一部の実施形態では、１つまたは複数のＳＴＩＮＧアゴニストおよび例えば、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ由来の１つまたは複数のキヌレニナーゼの産生のための記載の回路のうちいずれか１つまたは複数を発現する１つまたは複数の遺伝子操作された細菌は、抗ＰＤ−１抗体による投薬と逐次に、同時に、またはその後に投与される。一部の実施形態では、１つまたは複数のＳＴＩＮＧアゴニストおよび例えば、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ由来の１つまたは複数のキヌレニナーゼの産生のための記載の回路のうちいずれか１つまたは複数を発現する１つまたは複数の遺伝子操作された細菌は、抗ＰＤ−Ｌ１抗体による投薬と逐次に、同時に、またはその後に投与される。
一部の実施形態では、１つまたは複数のＳＴＩＮＧアゴニストおよび例えば、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ由来の１つまたは複数のキヌレニナーゼの産生のための記載の回路のうちいずれか１つまたは複数を発現する遺伝子操作された細菌は、抗ＣＴＬＡ−４抗体および抗ＰＤ−１抗体および／または抗ＰＤ−Ｌ１抗体による投薬と逐次に、同時に、またはその後に投与される。一部の実施形態では、ＳＴＩＮＧアゴニストは、ｃ−ジＡＭＰである。一部の実施形態では、ＳＴＩＮＧアゴニスト産生酵素は、例えば、Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ由来のＤａｃＡである。ある特定の実施形態では、ｄａｃＡは、低酸素条件下で誘導性のプロモーター、例えば、ＦＮＲプロモーターに作動可能に連結されている。一部の実施形態では、キヌレニナーゼは、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓに由来し、キヌレニナーゼをコードする遺伝子配列を含む細菌は、ｔｒｐＥに突然変異または欠失をさらに含む。一部の実施形態では、キヌレニナーゼは、構成的プロモーターに作動可能に連結される。これらの実施形態のいずれにおいても、遺伝子操作された細菌は、１つまたは複数の必須遺伝子に、突然変異（複数可）または欠失（複数可）をさらに含むことができる。これらの実施形態のいずれにおいても、細菌は、ｄａｐＡに１つまたは複数の栄養要求性改変、例えば、突然変異または欠失を含むことができる。これらの実施形態のいずれにおいても、細菌は、ｔｒｐＥに１つまたは複数の栄養要求性改変、例えば、突然変異または欠失を含むことができる。これらの実施形態のいずれにおいても、細菌は、ｔｈｙＡに１つまたは複数の栄養要求性改変、例えば、突然変異または欠失を含むことができる。これらの実施形態のいずれにおいても、細菌は、本明細書に記載される内在性プロファージに、ファージ改変、例えば、突然変異または欠失をさらに含むことができる。
ある特定の実施形態では、１つまたは複数のＳＴＩＮＧアゴニストおよび例えば、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ由来の１つまたは複数のキヌレニナーゼの産生のための記載の回路のうちいずれか１つまたは複数を発現する１つまたは複数の遺伝子操作された細菌は、抗ＰＤ−１、抗ＰＤ−Ｌ１または抗ＣＴＬＡ−４による投薬と逐次に、同時に、またはその後に投与される。一実施形態では、１つまたは複数の遺伝子操作された細菌は、例えば、Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ由来のＤａｃＡをコードする遺伝子配列（複数可）を含み、ＤａｃＡは、低酸素条件下で誘導性のプロモーター、例えば、ＦＮＲプロモーターに作動可能に連結されている。ｄａｃＡをコードする遺伝子配列を含む細菌は、ｄａｐＡに突然変異または欠失を含む。１つまたは複数の遺伝子操作された細菌は、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ由来のキヌレニナーゼをコードする遺伝子配列をさらに含み、キヌレニナーゼをコードする遺伝子配列を含む細菌は、ｔｒｐＥに突然変異または欠失をさらに含む。ある特定の実施形態では、ｄａｃＡおよびキヌレニナーゼ配列は、細菌染色体中に組み込まれる。特異的な一実施形態では、１つまたは複数の遺伝子操作された細菌は、ｔｈｙＡに突然変異（複数可）または欠失（複数可）をさらに含むことができる。特異的な一実施形態では、細菌は、本明細書に記載される内在性プロファージに、ファージ改変、例えば、突然変異または欠失をさらに含むことができる。
特異的な一実施形態では、チェックポイント阻害剤は、ＰＤ−１である。特異的な一実施形態では、チェックポイント阻害剤は、ＰＤ−Ｌ１である。特異的な一実施形態では、チェックポイント阻害剤は、ＣＴＬＡ−４である。
一実施形態では、ｄａｃＡ回路網（例えば、Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ由来の、例えば、低酸素プロモーターの制御下に置かれ、染色体に組み込まれる）、キヌレニナーゼ回路網（例えば、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ由来の、例えば、構成的プロモーターの制御下に置かれ、染色体に組み込まれる）および栄養要求性突然変異（ｔｒｐＥ、ｄａｐＡおよびｔｈｙＡにおける突然変異または欠失）は、１つの細菌において組み合わされる。代替実施形態では、細菌組成物は、ｄａｃＡ（例えば、Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ由来の、例えば、低酸素プロモーターの制御下に置かれ、染色体に組み込まれる）をコードする遺伝子配列を含み、ｄａｐＡにおける突然変異または欠失、およびｔｈｙＡにおける必要に応じた突然変異または欠失をさらに含む第１の細菌、ならびにキヌレニナーゼ回路網（例えば、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ由来の、例えば、構成的プロモーターの制御下に置かれ、染色体に組み込まれる）をコードする遺伝子配列、ｔｒｐＥにおける突然変異または欠失、および必要に応じてｔｈｙＡにおける突然変異または欠失を含む第２の細菌を含む。これらの実施形態のいずれにおいても、細菌は、本明細書に記載される内在性プロファージに、ファージ改変、例えば、突然変異または欠失をさらに含むことができる。
一部の実施形態では、本明細書に記載される１つまたは複数のＳＴＩＮＧアゴニストおよび１つまたは複数のアデノシン消費酵素の産生のための記載の回路のうちいずれか１つまたは複数を発現する１つまたは複数の遺伝子操作された細菌は、例えば、抗ＰＤ−１、抗ＰＤ−Ｌ１および抗ＣＴＬＡ−４を含むがこれらに限定されない、本明細書に記載され、当技術分野で公知のチェックポイント阻害剤による投薬と逐次に、同時に、またはその後に投与される。一部の実施形態では、本明細書に記載される１つまたは複数のＳＴＩＮＧアゴニストおよび１つまたは複数のアデノシン消費酵素の産生のための記載の回路のうちいずれか１つまたは複数を発現する１つまたは複数の遺伝子操作された細菌は、抗ＣＴＬＡ−４抗体による投薬と逐次に、同時に、またはその後に投与される。一部の実施形態では、本明細書に記載される１つまたは複数のＳＴＩＮＧアゴニストおよび１つまたは複数のアデノシン消費酵素の産生のための記載の回路のうちいずれか１つまたは複数を発現する１つまたは複数の遺伝子操作された細菌は、抗ＰＤ−１抗体による投薬と逐次に、同時に、またはその後に投与される。一部の実施形態では、本明細書に記載される１つまたは複数のＳＴＩＮＧアゴニストおよび１つまたは複数のアデノシン消費酵素の産生のための記載の回路のうちいずれか１つまたは複数を発現する１つまたは複数の遺伝子操作された細菌は、抗ＰＤ−Ｌ１抗体による投薬と逐次に、同時に、またはその後に投与される。一部の実施形態では、本明細書に記載される１つまたは複数のＳＴＩＮＧアゴニストおよび１つまたは複数のアデノシン消費酵素の産生のための記載の回路のうちいずれか１つまたは複数を発現する遺伝子操作された細菌は、抗ＣＴＬＡ−４抗体および抗ＰＤ−１抗体および／または抗ＰＤ−Ｌ１抗体による投薬と逐次に、同時に、またはその後に投与される。これらの実施形態のいずれにおいても、遺伝子操作された細菌は、１つまたは複数の必須遺伝子に、突然変異（複数可）または欠失（複数可）をさらに含むことができる。これらの実施形態のいずれにおいても、細菌は、ｄａｐＡに１つまたは複数の栄養要求性改変、例えば、突然変異または欠失を含むことができる。これらの実施形態のいずれにおいても、細菌は、ｔｒｐＥに１つまたは複数の栄養要求性改変、例えば、突然変異または欠失を含むことができる。これらの実施形態のいずれにおいても、細菌は、ｔｈｙＡに１つまたは複数の栄養要求性改変、例えば、突然変異または欠失を含むことができる。これらの実施形態のいずれにおいても、細菌は、本明細書に記載される内在性プロファージに、ファージ改変、例えば、突然変異または欠失をさらに含むことができる。
一部の実施形態では、本明細書に記載される１つまたは複数のＳＴＩＮＧアゴニストの産生のための記載の回路ならびに１つまたは複数のアルギニン産生および／またはアンモニア消費回路のうちいずれか１つまたは複数を含む１つまたは複数の遺伝子操作された細菌は、例えば、抗ＰＤ−１、抗ＰＤ−Ｌ１および抗ＣＴＬＡ−４を含むがこれらに限定されない、本明細書に記載され、当技術分野で公知のチェックポイント阻害剤による投薬と逐次に、同時に、またはその後に投与される。一部の実施形態では、本明細書に記載される１つまたは複数のＳＴＩＮＧアゴニストの産生のための記載の回路ならびに１つまたは複数のアルギニン産生および／またはアンモニア消費回路のうちいずれか１つまたは複数を含む遺伝子操作された細菌は、抗ＣＴＬＡ−４抗体による投薬と逐次に、同時に、またはその後に投与される。一部の実施形態では、本明細書に記載される１つまたは複数のＳＴＩＮＧアゴニストの産生のための記載の回路ならびに１つまたは複数のアルギニン産生および／またはアンモニア消費回路のうちいずれか１つまたは複数を含む遺伝子操作された細菌は、抗ＰＤ−１抗体による投薬と逐次に、同時に、またはその後に投与される。一部の実施形態では、本明細書に記載される１つまたは複数のＳＴＩＮＧアゴニストの産生のための記載の回路ならびに１つまたは複数のアルギニン産生および／またはアンモニア消費回路のうちいずれか１つまたは複数を含む遺伝子操作された細菌は、抗ＰＤ−Ｌ１抗体による投薬と逐次に、同時に、またはその後に投与される。一部の実施形態では、本明細書に記載される１つまたは複数のＳＴＩＮＧアゴニストの産生のための記載の回路ならびに１つまたは複数のアルギニン産生および／またはアンモニア消費回路のうちいずれか１つまたは複数を含む遺伝子操作された細菌は、抗ＣＴＬＡ−４抗体および抗ＰＤ−１抗体および／または抗ＰＤ−Ｌ１抗体による投薬と逐次に、同時に、またはその後に投与される。これらの実施形態のいずれにおいても、遺伝子操作された細菌は、１つまたは複数の必須遺伝子に、突然変異（複数可）または欠失（複数可）をさらに含むことができる。これらの実施形態のいずれにおいても、細菌は、ｄａｐＡに１つまたは複数の栄養要求性改変、例えば、突然変異または欠失を含むことができる。これらの実施形態のいずれにおいても、細菌は、ｔｒｐＥに１つまたは複数の栄養要求性改変、例えば、突然変異または欠失を含むことができる。これらの実施形態のいずれにおいても、細菌は、ｔｈｙＡに１つまたは複数の栄養要求性改変、例えば、突然変異または欠失を含むことができる。これらの実施形態のいずれにおいても、細菌は、本明細書に記載される内在性プロファージに、ファージ改変、例えば、突然変異または欠失をさらに含むことができる。
一部の実施形態では、１つまたは複数のＳＴＩＮＧアゴニストの産生のための記載の回路および１つまたは複数のアルギニン産生／アンモニア消費回路のうちいずれか１つまたは複数を発現する遺伝子操作された細菌は、抗ＣＴＬＡ−４抗体および抗ＰＤ−１抗体および／または抗ＰＤ−Ｌ１抗体による投薬と逐次に、同時に、またはその後に投与される。一部の実施形態では、ＳＴＩＮＧアゴニストは、ｃ−ジＡＭＰである。一部の実施形態では、ＳＴＩＮＧアゴニスト産生酵素は、例えば、Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ由来のＤａｃＡである。ある特定の実施形態では、ｄａｃＡは、低酸素条件下で誘導性のプロモーター、例えば、ＦＮＲプロモーターに作動可能に連結されている。一部の実施形態では、アルギニン産生／アンモニア消費回路は、フィードバック抵抗性ＡｒｇＡを含み、フィードバック抵抗性ＡｒｇＡをコードする遺伝子配列を含む細菌は、ＡｒｇＲに突然変異または欠失をさらに有する。一部の実施形態では、フィードバック抵抗性ＡｒｇＡは、低酸素条件下で誘導性のプロモーターに作動可能に連結される。これらの実施形態のいずれにおいても、遺伝子操作された細菌は、１つまたは複数の必須遺伝子に、突然変異（複数可）または欠失（複数可）をさらに含むことができる。これらの実施形態のいずれにおいても、細菌は、ｄａｐＡに１つまたは複数の栄養要求性改変、例えば、突然変異または欠失を含むことができる。これらの実施形態のいずれにおいても、細菌は、ｔｈｙＡに１つまたは複数の栄養要求性改変、例えば、突然変異または欠失を含むことができる。
ある特定の実施形態では、１つまたは複数のＳＴＩＮＧアゴニストおよび例えば、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ由来の１つまたは複数のキヌレニナーゼの産生のための記載の回路のうちいずれか１つまたは複数を発現する１つまたは複数の遺伝子操作された細菌は、抗ＰＤ−１、抗ＰＤ−Ｌ１または抗ＣＴＬＡ−４による投薬と逐次に、同時に、またはその後に投与される。一実施形態では、１つまたは複数の遺伝子操作された細菌は、例えば、Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ由来のＤａｃＡをコードする遺伝子配列（複数可）を含み、ＤａｃＡは、低酸素条件下で誘導性のプロモーター、例えば、ＦＮＲプロモーターに作動可能に連結されている。ｄａｃＡをコードする遺伝子配列を含む細菌は、ｄａｐＡに突然変異または欠失を含む。１つまたは複数の遺伝子操作された細菌は、フィードバック抵抗性ＡｒｇＡをコードする遺伝子配列をさらに含み、フィードバック抵抗性ＡｒｇＡをコードする遺伝子配列を含む細菌は、ＡｒｇＲに突然変異または欠失をさらに含む。ある特定の実施形態では、ｄａｃＡおよびフィードバック抵抗性ＡｒｇＡ配列は、細菌染色体中に組み込まれる。特異的な一実施形態では、１つまたは複数の遺伝子操作された細菌は、ｔｈｙＡに突然変異（複数可）または欠失（複数可）をさらに含むことができる。特異的な一実施形態では、チェックポイント阻害剤は、ＰＤ−１である。特異的な一実施形態では、チェックポイント阻害剤は、ＰＤ−Ｌ１である。特異的な一実施形態では、チェックポイント阻害剤は、ＣＴＬＡ−４である。
一実施形態では、ｄａｃＡ回路網（例えば、Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ由来の、例えば、低酸素プロモーターの制御下に置かれ、染色体に組み込まれる）、アルギニン産生／アンモニア消費回路網（例えば、ＡｒｇＡｆｂｒを含む、例えば、低酸素誘導性プロモーターの制御下に置かれ、染色体に組み込まれ、ΔＡｒｇＲである）および栄養要求性突然変異（ｄａｐＡおよびｔｈｙＡにおける突然変異または欠失）は、１つの細菌において組み合わされる。代替実施形態では、細菌組成物は、ｄａｃＡ（例えば、Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ由来の、例えば、低酸素プロモーターの制御下に置かれ、染色体に組み込まれる）をコードする遺伝子配列を含み、ｄａｐＡにおける突然変異または欠失、およびｔｈｙＡにおける必要に応じた突然変異または欠失をさらに含む第１の細菌、ならびにアルギニン産生／アンモニア消費回路網（例えば、ＡｒｇＡｆｂｒを含む、例えば、低酸素誘導性プロモーターの制御下に置かれ、染色体に組み込まれ、ΔＡｒｇＲである）をコードする遺伝子配列、および必要に応じてｔｈｙＡにおける突然変異または欠失を含む第２の細菌を含む。
一部の実施形態では、１つまたは複数の遺伝子操作された細菌、例えば、アデノシン消費者、キヌレニン消費者、アンモニア消費者、アルギニン生産者および／またはＳＴＩＮＧアゴニスト生産者は、同時投与されたチェックポイント阻害剤（例えば、抗ＰＤ−１、抗ＰＤ−Ｌ１および／または抗ＣＴＬＡ−４）の抗腫瘍活性（例えば、腫瘍増殖、サイズ、体積、重量）を、同じ条件下でチェックポイント阻害剤療法単独と比較して、または同じ条件下で同じ亜型の未改変細菌と比較して、例えば、１０％〜２０％、２０％〜２５％、２５％〜３０％、３０％〜４０％、４０％〜５０％、５０％〜６０％、６０％〜７０％、７０％〜７５％、７５％〜８０％、８０％〜８５％、８５％〜９０％、９０％〜９５％、９５％〜９９％またはそれよりも多く改善することができる。一部の実施形態では、１つまたは複数の遺伝子操作された細菌、例えば、アデノシン消費者、キヌレニン消費者、アンモニア消費者、アルギニン生産者および／またはＳＴＩＮＧアゴニスト生産者は、同時投与されたチェックポイント阻害剤（例えば、抗ＰＤ−１、抗ＰＤ−Ｌ１および／または抗ＣＴＬＡ−４）の抗腫瘍活性（例えば、腫瘍増殖、サイズ、体積、重量）を、同じ条件下で化学療法単独と比較して、または同じ条件下で同じ亜型の未改変細菌と比較して、例えば、１．０〜１．２倍、１．２〜１．４倍、１．４〜１．６倍、１．６〜１．８倍、１．８〜２倍、または２倍多くまたはそれよりも多く改善することができる。一部の実施形態では、１つまたは複数の遺伝子操作された細菌、例えば、アデノシン消費者、キヌレニン消費者、アンモニア消費者、アルギニン生産者および／またはＳＴＩＮＧアゴニスト生産者は、同時投与されたチェックポイントインヒビター（例えば、抗ＰＤ−１、抗ＰＤ−Ｌ１および／またはＣＴＬＡ−４）の抗腫瘍活性（例えば、腫瘍増殖、サイズ、体積、重量）を、例えば、同じ条件下での化学療法単独と比較して、または同じ条件下での同じサブタイプの無修飾細菌と比較して、約３倍、４倍、約３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、１００倍、５００倍もしくは１０００倍にまたはそれより大きく改善することができる。
一部の実施形態では、アデノシンを消費するように遺伝子操作された細菌は、同時投与されたチェックポイント阻害剤（例えば、ＰＤ−１および／またはＣＴＬＡ−４）の抗腫瘍活性（例えば、腫瘍増殖、サイズ、体積、重量）を、同じ条件下でチェックポイント阻害剤療法単独と比較して、または同じ条件下で同じ亜型の未改変細菌と比較して、例えば、１０％〜２０％、２０％〜２５％、２５％〜３０％、３０％〜４０％、４０％〜５０％、５０％〜６０％、６０％〜７０％、７０％〜７５％、７５％〜８０％、８０％〜８５％、８５％〜９０％、９０％〜９５％、９５％〜９９％またはそれよりも多く改善することができる。一部の実施形態では、アデノシンを消費するように遺伝子操作された細菌は、同時投与されたチェックポイント阻害剤（例えば、抗ＰＤ−１、抗ＰＤ−Ｌ１および／または抗ＣＴＬＡ−４）の抗腫瘍活性（例えば、腫瘍増殖、サイズ、体積、重量）を、同じ条件下で化学療法単独と比較して、または同じ条件下で同じ亜型の未改変細菌と比較して、例えば、１．０〜１．２倍、１．２〜１．４倍、１．４〜１．６倍、１．６〜１．８倍、１．８〜２倍、または２倍多くまたはそれよりも多く改善することができる。一部の実施形態では、アデノシンを消費するように遺伝子操作された細菌は、同時投与されたチェックポイント阻害剤（例えば、抗ＰＤ−１、抗ＰＤ−Ｌ１および／または抗ＣＴＬＡ−４）の抗腫瘍活性（例えば、腫瘍増殖、サイズ、体積、重量）を、同じ条件下で化学療法単独と比較して、または同じ条件下で同じ亜型の未改変細菌と比較して、例えば、約３倍、４倍、約３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、１００倍、５００倍または１０００倍多くまたはそれよりも多く改善することができる。
一部の実施形態では、キヌレニンを消費するように遺伝子操作された細菌は、同時投与されたチェックポイント阻害剤（例えば、抗ＰＤ−１、抗ＰＤ−Ｌ１および／または抗ＣＴＬＡ−４）の抗腫瘍活性（例えば、腫瘍増殖、サイズ、体積、重量）を、同じ条件下でチェックポイント阻害剤療法単独と比較して、または同じ条件下で同じ亜型の未改変細菌と比較して、例えば、１０％〜２０％、２０％〜２５％、２５％〜３０％、３０％〜４０％、４０％〜５０％、５０％〜６０％、６０％〜７０％、７０％〜７５％、７５％〜８０％、８０％〜８５％、８５％〜９０％、９０％〜９５％、９５％〜９９％またはそれよりも多く改善することができる。一部の実施形態では、キヌレニンを消費するように遺伝子操作された細菌は、同時投与されたチェックポイント阻害剤（例えば、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１および／またはＣＴＬＡ−４）の抗腫瘍活性（例えば、腫瘍増殖、サイズ、体積、重量）を、同じ条件下で化学療法単独と比較して、または同じ条件下で同じ亜型の未改変細菌と比較して、例えば、１．０〜１．２倍、１．２〜１．４倍、１．４〜１．６倍、１．６〜１．８倍、１．８〜２倍、または２倍多くまたはそれよりも多く改善することができる。一部の実施形態では、キヌレニンを消費するように遺伝子操作された細菌は、同時投与されたチェックポイント阻害剤（例えば、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１および／またはＣＴＬＡ−４）の抗腫瘍活性（例えば、腫瘍増殖、サイズ、体積、重量）を、同じ条件下で化学療法単独と比較して、または同じ条件下で同じ亜型の未改変細菌と比較して、例えば、約３倍、４倍、約３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、１００倍、５００倍または１０００倍多くまたはそれよりも多く改善することができる。
一部の実施形態では、アルギニンを産生するおよび／またはアンモニアを消費するように遺伝子操作された細菌は、同時投与されたチェックポイント阻害剤（例えば、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１および／またはＣＴＬＡ−４）の抗腫瘍活性（例えば、腫瘍増殖、サイズ、体積、重量）を、同じ条件下でチェックポイント阻害剤療法単独と比較して、または同じ条件下で同じ亜型の未改変細菌と比較して、例えば、１０％〜２０％、２０％〜２５％、２５％〜３０％、３０％〜４０％、４０％〜５０％、５０％〜６０％、６０％〜７０％、７０％〜７５％、７５％〜８０％、８０％〜８５％、８５％〜９０％、９０％〜９５％、９５％〜９９％またはそれよりも多く改善することができる。一部の実施形態では、アルギニンを産生するおよび／またはアンモニアを消費するように遺伝子操作された細菌は、同時投与されたチェックポイント阻害剤（例えば、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１および／またはＣＴＬＡ−４）の抗腫瘍活性（例えば、腫瘍増殖、サイズ、体積、重量）を、同じ条件下で化学療法単独と比較して、または同じ条件下で同じ亜型の未改変細菌と比較して、例えば、１．０〜１．２倍、１．２〜１．４倍、１．４〜１．６倍、１．６〜１．８倍、１．８〜２倍、または２倍多くまたはそれよりも多く改善することができる。一部の実施形態では、アルギニンを産生するおよび／またはアンモニアを消費するように遺伝子操作された細菌は、同時投与されたチェックポイント阻害剤（例えば、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１および／またはＣＴＬＡ−４）の抗腫瘍活性（例えば、腫瘍増殖、サイズ、体積、重量）を、同じ条件下で化学療法単独と比較して、または同じ条件下で同じ亜型の未改変細菌と比較して、例えば、約３倍、４倍、約３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、１００倍、５００倍または１０００倍多くまたはそれよりも多く改善することができる。
一部の実施形態では、ＳＴＩＮＧアゴニスト（複数可）を産生するように遺伝子操作された細菌は、同時投与されたチェックポイント阻害剤（例えば、抗ＰＤ−１、抗ＰＤ−Ｌ１および／または抗ＣＴＬＡ−４）の抗腫瘍活性（例えば、腫瘍増殖、サイズ、体積、重量）を、同じ条件下でチェックポイント阻害剤療法単独と比較して、または同じ条件下で同じ亜型の未改変細菌と比較して、例えば、１０％〜２０％、２０％〜２５％、２５％〜３０％、３０％〜４０％、４０％〜５０％、５０％〜６０％、６０％〜７０％、７０％〜７５％、７５％〜８０％、８０％〜８５％、８５％〜９０％、９０％〜９５％、９５％〜９９％またはそれよりも多く改善することができる。一部の実施形態では、ＳＴＩＮＧアゴニスト（複数可）を産生するように遺伝子操作された細菌は、同時投与されたチェックポイント阻害剤（例えば、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１および／またはＣＴＬＡ−４）の抗腫瘍活性（例えば、腫瘍増殖、サイズ、体積、重量）を、同じ条件下で化学療法単独と比較して、または同じ条件下で同じ亜型の未改変細菌と比較して、例えば、１．０〜１．２倍、１．２〜１．４倍、１．４〜１．６倍、１．６〜１．８倍、１．８〜２倍、または２倍多くまたはそれよりも多く改善することができる。一部の実施形態では、ＳＴＩＮＧアゴニスト（複数可）を産生するように遺伝子操作された細菌は、同時投与されたチェックポイント阻害剤（例えば、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１および／またはＣＴＬＡ−４）の抗腫瘍活性（例えば、腫瘍増殖、サイズ、体積、重量）を、同じ条件下で化学療法単独と比較して、または同じ条件下で同じ亜型の未改変細菌と比較して、例えば、約３倍、４倍、約３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、１００倍、５００倍または１０００倍多くまたはそれよりも多く改善することができる。
共刺激性分子
ある特定の実施形態では、１つまたは複数の遺伝子操作された細菌は、アゴニスト抗体を含むがこれらに限定されない、１つまたは複数のアゴニスト免疫刺激性分子またはアゴニストによる投薬と逐次に、同時に、またはその後に投与される。
一部の実施形態では、少なくとも１つの細菌細胞は、抗ＯＸ４０抗体（ＩＮＣＡＧＮ０１９４９（Ａｇｅｎｕｓ）；ＢＭＳ ９８６１７８（Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ）、ＭＥＤＩ０５６２（Ｍｅｄｉｍｍｕｎｅ）、ＧＳＫ３１７４９９８（ＧＳＫ）、ＰＦ−０４５１８６００（Ｐｆｉｚｅｒ）を含むがこれらに限定されない）、抗４１ＢＢ／ＣＤ１３７（ＰＦ−０５０８２５６６（Ｐｆｉｚｅｒ）、ウレルマブ（ＢＭＳ−６６３５１３；Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ）を含むがこれらに限定されない）および抗ＧＩＴＲ（ＴＲＸ５１８（Ｌｅａｐ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）、ＭＫ−４１６６（Ｍｅｒｃｋ）、ＭＫ−１２４８（Ｍｅｒｃｋ）、ＡＭＧ ２２８（Ａｍｇｅｎ）、ＢＭＳ−９８６１５６（ＢＭＳ）、ＩＮＣＡＧＮ０１８７６（Ｉｎｃｙｔｅ／Ａｇｅｎｕｓ）、ＭＥＤＩ１８７３（ＡＺ）、ＧＷＮ３２３（ＮＶＳ）を含むがこれらに限定されない）から選択される１つまたは複数の抗体による投薬と逐次に、同時に、またはその後に投与される。一部の実施形態では、代謝物の産生または消費のための酵素をコードする遺伝子配列（複数可）を含む、本明細書に記載される１つまたは複数の操作された細菌、例えば、キヌレニン消費者、アデノシン消費者、アルギニン生産者、アンモニア消費者および／またはＳＴＩＮＧアゴニスト生産者は、抗ＯＸ４０抗体、抗４１ＢＢおよび／または抗ＧＩＴＲから選択されるアゴニスト抗体による投薬と逐次に、同時に、またはその後に投与される。一部の実施形態では、アゴニスト抗体、例えば、抗ＯＸ４０抗体、抗４１ＢＢおよび／または抗ＧＩＴＲは、全身性投与され、細菌は、腫瘍内投与される。一部の実施形態では、アゴニスト抗体、例えば、抗ＯＸ４０抗体、抗４１ＢＢおよび／または抗ＧＩＴＲ、ならびに細菌は、全身性投与される。一部の実施形態では、代謝変換因子をコードする遺伝子配列（複数可）を含む、本明細書に記載される１つまたは複数の操作された細菌、例えば、キヌレニン消費者、アデノシン消費者、アルギニン生産者および／もしくはアンモニア消費者ならびに／またはＳＴＩＮＧアゴニスト生産者は、抗ＯＸ４０抗体による投薬と逐次に、同時に、またはその後に投与される。一部の実施形態では、代謝変換因子をコードする遺伝子配列（複数可）を含む、本明細書に記載される１つまたは複数の操作された細菌、例えば、キヌレニン消費者、アデノシン消費者、アルギニン生産者、アンモニア消費者および／またはＳＴＩＮＧアゴニスト生産者は、抗４１ＢＢ抗体による投薬と逐次に、同時に、またはその後に投与される。一部の実施形態では、アデノシンの分解のための記載の回路のうちいずれか１つまたは複数を発現する遺伝子操作された細菌は、抗ＧＩＴＲ抗体による投薬と逐次に、同時に、またはその後に投与される。
一部の実施形態では、アデノシンの分解のための記載の回路のうちいずれか１つまたは複数を発現する遺伝子操作された細菌は、アゴニスト免疫刺激性分子、例えば、アゴニスト抗体、例えば、抗ＯＸ４０抗体、抗４１ＢＢ抗体および／または抗ＧＩＴＲ抗体による投薬と逐次に、同時に、またはその後に投与される。一部の実施形態では、アデノシンの分解のための記載の回路のうちいずれか１つまたは複数を発現する遺伝子操作された細菌は、抗Ｏｘ４０抗体による投薬と逐次に、同時に、またはその後に投与される。一部の実施形態では、アデノシンの分解のための記載の回路のうちいずれか１つまたは複数を発現する遺伝子操作された細菌は、抗４１ＢＢ抗体による投薬と逐次に、同時に、またはその後に投与される。一部の実施形態では、アデノシンの分解のための記載の回路のうちいずれか１つまたは複数を発現する遺伝子操作された細菌は、抗ＧＩＴＲ抗体による投薬と逐次に、同時に、またはその後に投与される。一部の実施形態では、アデノシンの分解のための記載の回路のうちいずれか１つまたは複数を発現する遺伝子操作された細菌は、抗ＧＩＴＲ抗体および抗ＯＸ４０抗体および／または抗４１ＢＢ抗体による投薬と逐次に、同時に、またはその後に投与される。
一部の実施形態では、キヌレニンの消費のための記載の回路のうちいずれか１つまたは複数を発現する遺伝子操作された細菌は、アゴニスト免疫刺激性分子、例えば、アゴニスト抗体、例えば、抗ＯＸ４０抗体、抗４１ＢＢ抗体および／または抗ＧＩＴＲ抗体による投薬と逐次に、同時に、またはその後に投与される。一部の実施形態では、キヌレニンの消費のための記載の回路のうちいずれか１つまたは複数を発現する遺伝子操作された細菌は、抗ＧＩＴＲ抗体による投薬と逐次に、同時に、またはその後に投与される。一部の実施形態では、キヌレニンの消費のための記載の回路のうちいずれか１つまたは複数を発現する遺伝子操作された細菌は、抗ＯＸ４０抗体による投薬と逐次に、同時に、またはその後に投与される。一部の実施形態では、キヌレニンの消費のための記載の回路のうちいずれか１つまたは複数を発現する遺伝子操作された細菌は、抗４１ＢＢ抗体による投薬と逐次に、同時に、またはその後に投与される。一部の実施形態では、キヌレニンの消費のための記載の回路のうちいずれか１つまたは複数を発現する遺伝子操作された細菌は、抗ＧＩＴＲ抗体および抗ＯＸ４０抗体および／または抗４１ＢＢ抗体による投薬と逐次に、同時に、またはその後に投与される。
一部の実施形態では、アルギニンの産生および／またはアンモニアの消費のための記載の回路のうちいずれか１つまたは複数を発現する遺伝子操作された細菌は、アゴニスト免疫刺激性分子、例えば、アゴニスト抗体、例えば、抗ＯＸ４０抗体、抗４１ＢＢ抗体および／または抗ＧＩＴＲ抗体による投薬と逐次に、同時に、またはその後に投与される。一部の実施形態では、アルギニンの産生および／またはアンモニアの消費のための記載の回路のうちいずれか１つまたは複数を発現する遺伝子操作された細菌は、抗ＧＩＴＲ抗体による投薬と逐次に、同時に、またはその後に投与される。一部の実施形態では、アルギニンの産生および／またはアンモニアの消費のための記載の回路のうちいずれか１つまたは複数を発現する遺伝子操作された細菌は、抗ＯＸ４０抗体による投薬と逐次に、同時に、またはその後に投与される。一部の実施形態では、アルギニンの産生および／またはアンモニアの消費のための記載の回路のうちいずれか１つまたは複数を発現する遺伝子操作された細菌は、抗ＯＸ４０Ｌ抗体による投薬と逐次に、同時に、またはその後に投与される。一部の実施形態では、アルギニンの産生および／またはアンモニアの消費のための記載の回路のうちいずれか１つまたは複数を発現する遺伝子操作された細菌は、抗ＧＩＴＲ抗体および抗ＯＸ４０抗体による投薬と逐次に、同時に、またはその後に投与される。
一部の実施形態では、１つまたは複数のＳＴＩＮＧアゴニストの産生のための記載の回路のうちいずれか１つまたは複数を発現する遺伝子操作された細菌は、アゴニスト免疫刺激性分子、例えば、アゴニスト抗体、例えば、抗ＯＸ４０抗体、抗４１ＢＢ抗体および／または抗ＧＩＴＲ抗体による投薬と逐次に、同時に、またはその後に投与される。一部の実施形態では、１つまたは複数のＳＴＩＮＧアゴニストの産生のための記載の回路のうちいずれか１つまたは複数を発現する遺伝子操作された細菌は、抗ＧＩＴＲ抗体による投薬と逐次に、同時に、またはその後に投与される。一部の実施形態では、１つまたは複数のＳＴＩＮＧアゴニストの産生のための記載の回路のうちいずれか１つまたは複数を発現する遺伝子操作された細菌は、抗ＯＸ４０抗体による投薬と逐次に、同時に、またはその後に投与される。一部の実施形態では、１つまたは複数のＳＴＩＮＧアゴニストの産生のための記載の回路のうちいずれか１つまたは複数を発現する遺伝子操作された細菌は、抗４１ＢＢ抗体による投薬と逐次に、同時に、またはその後に投与される。一部の実施形態では、１つまたは複数のＳＴＩＮＧアゴニストの産生のための記載の回路のうちいずれか１つまたは複数を発現する遺伝子操作された細菌は、抗ＧＩＴＲ抗体および抗ＯＸ４０抗体および／または抗４１ＢＢ抗体による投薬と逐次に、同時に、またはその後に投与される。これらの実施形態のいずれにおいても、遺伝子操作された細菌は、１つまたは複数の必須遺伝子に、突然変異（複数可）または欠失（複数可）をさらに含むことができる。これらの実施形態のいずれにおいても、細菌は、ｄａｐＡに１つまたは複数の栄養要求性改変、例えば、突然変異または欠失を含むことができる。これらの実施形態のいずれにおいても、細菌は、ｔｈｙＡに１つまたは複数の栄養要求性改変、例えば、突然変異または欠失を含むことができる。これらの実施形態のいずれにおいても、細菌は、本明細書に記載される内在性プロファージに、ファージ改変、例えば、突然変異または欠失をさらに含むことができる。
一部の実施形態では、１つまたは複数のＳＴＩＮＧアゴニストの産生のための記載の回路、および１つまたは複数の代謝性変換回路のうちいずれか１つまたは複数を発現する１つまたは複数の遺伝子操作された細菌は、例えば、抗ＯＸ４０、抗４１ＢＢおよび抗ＧＩＴＲを含むがこれらに限定されない、本明細書に記載され、当技術分野で公知の、アゴニスト抗体または他の免疫刺激性アゴニストによる投薬と逐次に、同時に、またはその後に投与される。一部の実施形態では、１つまたは複数のＳＴＩＮＧアゴニストの産生のための記載の回路、および１つまたは複数の代謝性変換回路のうちいずれか１つまたは複数を発現する１つまたは複数の遺伝子操作された細菌は、抗ＧＩＴＲ抗体による投薬と逐次に、同時に、またはその後に投与される。一部の実施形態では、１つまたは複数のＳＴＩＮＧアゴニストの産生のための記載の回路、および１つまたは複数の代謝性変換回路のうちいずれか１つまたは複数を発現する１つまたは複数の遺伝子操作された細菌は、抗ＯＸ４０抗体による投薬と逐次に、同時に、またはその後に投与される。一部の実施形態では、１つまたは複数のＳＴＩＮＧアゴニストの産生のための記載の回路、および１つまたは複数の代謝性変換回路のうちいずれか１つまたは複数を発現する１つまたは複数の遺伝子操作された細菌は、抗４１ＢＢ抗体による投薬と逐次に、同時に、またはその後に投与される。一部の実施形態では、１つまたは複数のＳＴＩＮＧアゴニストの産生のための記載の回路、および１つまたは複数の代謝性変換回路のうちいずれか１つまたは複数を発現する遺伝子操作された細菌は、抗ＧＩＴＲ抗体および抗ＯＸ４０抗体および／または抗４１ＢＢ抗体による投薬と逐次に、同時に、またはその後に投与される。これらの実施形態のいずれにおいても、遺伝子操作された細菌は、１つまたは複数の必須遺伝子に、突然変異（複数可）または欠失（複数可）をさらに含むことができる。これらの実施形態のいずれにおいても、細菌は、ｄａｐＡに１つまたは複数の栄養要求性改変、例えば、突然変異または欠失を含むことができる。これらの実施形態のいずれにおいても、細菌は、ｔｈｙＡに１つまたは複数の栄養要求性改変、例えば、突然変異または欠失を含むことができる。これらの実施形態のいずれにおいても、細菌は、本明細書に記載される内在性プロファージに、ファージ改変、例えば、突然変異または欠失をさらに含むことができる。
一部の実施形態では、１つまたは複数のＳＴＩＮＧアゴニストおよび例えば、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ由来の１つまたは複数のキヌレニナーゼの産生のための記載の回路のうちいずれか１つまたは複数を発現する１つまたは複数の遺伝子操作された細菌は、例えば、抗ＯＸ４０、抗４１ＢＢおよび抗ＧＩＴＲを含むがこれらに限定されない、本明細書に記載され、当技術分野で公知の、アゴニスト抗体または他の免疫刺激性アゴニストによる投薬と逐次に、同時に、またはその後に投与される。一部の実施形態では、１つまたは複数のＳＴＩＮＧアゴニストおよび例えば、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ由来の１つまたは複数のキヌレニナーゼの産生のための記載の回路のうちいずれか１つまたは複数を発現する１つまたは複数の遺伝子操作された細菌は、抗ＧＩＴＲ抗体による投薬と逐次に、同時に、またはその後に投与される。一部の実施形態では、１つまたは複数のＳＴＩＮＧアゴニストおよび例えば、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ由来の１つまたは複数のキヌレニナーゼの産生のための記載の回路のうちいずれか１つまたは複数を発現する１つまたは複数の遺伝子操作された細菌は、抗ＯＸ４０抗体による投薬と逐次に、同時に、またはその後に投与される。一部の実施形態では、１つまたは複数のＳＴＩＮＧアゴニストおよび例えば、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ由来の１つまたは複数のキヌレニナーゼの産生のための記載の回路のうちいずれか１つまたは複数を発現する１つまたは複数の遺伝子操作された細菌は、抗４１ＢＢ抗体による投薬と逐次に、同時に、またはその後に投与される。一部の実施形態では、１つまたは複数のＳＴＩＮＧアゴニストおよび例えば、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ由来の１つまたは複数のキヌレニナーゼの産生のための記載の回路のうちいずれか１つまたは複数を発現する遺伝子操作された細菌は、抗ＧＩＴＲ抗体および抗ＯＸ４０抗体および／または抗４１ＢＢ抗体による投薬と逐次に、同時に、またはその後に投与される。これらの実施形態のいずれにおいても、遺伝子操作された細菌は、１つまたは複数の必須遺伝子に、突然変異（複数可）または欠失（複数可）をさらに含むことができる。これらの実施形態のいずれにおいても、細菌は、ｄａｐＡに１つまたは複数の栄養要求性改変、例えば、突然変異または欠失を含むことができる。これらの実施形態のいずれにおいても、細菌は、ｔｒｐＥに１つまたは複数の栄養要求性改変、例えば、突然変異または欠失を含むことができる。これらの実施形態のいずれにおいても、細菌は、ｔｈｙＡに１つまたは複数の栄養要求性改変、例えば、突然変異または欠失を含むことができる。これらの実施形態のいずれにおいても、細菌は、本明細書に記載される内在性プロファージに、ファージ改変、例えば、突然変異または欠失をさらに含むことができる。
一部の実施形態では、本明細書に記載される１つまたは複数のＳＴＩＮＧアゴニストおよび１つまたは複数のアデノシン消費酵素の産生のための記載の回路のうちいずれか１つまたは複数を発現する１つまたは複数の遺伝子操作された細菌は、例えば、抗ＯＸ４０、抗４１ＢＢおよび抗ＧＩＴＲを含むがこれらに限定されない、本明細書に記載され、当技術分野で公知の、アゴニスト抗体または他の免疫刺激性アゴニストによる投薬と逐次に、同時に、またはその後に投与される。一部の実施形態では、本明細書に記載される１つまたは複数のＳＴＩＮＧアゴニストおよび１つまたは複数のアデノシン消費酵素の産生のための記載の回路のうちいずれか１つまたは複数を発現する１つまたは複数の遺伝子操作された細菌は、抗ＧＩＴＲ抗体による投薬と逐次に、同時に、またはその後に投与される。一部の実施形態では、本明細書に記載される１つまたは複数のＳＴＩＮＧアゴニストおよび１つまたは複数のアデノシン消費酵素の産生のための記載の回路のうちいずれか１つまたは複数を発現する１つまたは複数の遺伝子操作された細菌は、抗ＯＸ４０抗体による投薬と逐次に、同時に、またはその後に投与される。一部の実施形態では、本明細書に記載される１つまたは複数のＳＴＩＮＧアゴニストおよび１つまたは複数のアデノシン消費酵素の産生のための記載の回路のうちいずれか１つまたは複数を発現する１つまたは複数の遺伝子操作された細菌は、抗４１ＢＢ抗体による投薬と逐次に、同時に、またはその後に投与される。一部の実施形態では、本明細書に記載される１つまたは複数のＳＴＩＮＧアゴニストおよび１つまたは複数のアデノシン消費酵素の産生のための記載の回路のうちいずれか１つまたは複数を発現する遺伝子操作された細菌は、抗ＧＩＴＲ抗体および抗ＯＸ４０抗体および／または抗４１ＢＢ抗体による投薬と逐次に、同時に、またはその後に投与される。これらの実施形態のいずれにおいても、遺伝子操作された細菌は、１つまたは複数の必須遺伝子に、突然変異（複数可）または欠失（複数可）をさらに含むことができる。これらの実施形態のいずれにおいても、細菌は、ｄａｐＡに１つまたは複数の栄養要求性改変、例えば、突然変異または欠失を含むことができる。これらの実施形態のいずれにおいても、細菌は、ｔｒｐＥに１つまたは複数の栄養要求性改変、例えば、突然変異または欠失を含むことができる。これらの実施形態のいずれにおいても、細菌は、ｔｈｙＡに１つまたは複数の栄養要求性改変、例えば、突然変異または欠失を含むことができる。これらの実施形態のいずれにおいても、細菌は、本明細書に記載される内在性プロファージに、ファージ改変、例えば、突然変異または欠失をさらに含むことができる。
一部の実施形態では、本明細書に記載される１つまたは複数のＳＴＩＮＧアゴニストの産生のための記載の回路ならびに１つまたは複数のアルギニン産生および／またはアンモニア消費回路のうちいずれか１つまたは複数を含む１つまたは複数の遺伝子操作された細菌は、例えば、抗ＯＸ４０、抗４１ＢＢおよび抗ＧＩＴＲを含むがこれらに限定されない、本明細書に記載され、当技術分野で公知の、アゴニスト抗体または他の免疫刺激性アゴニストによる投薬と逐次に、同時に、またはその後に投与される。一部の実施形態では、本明細書に記載される１つまたは複数のＳＴＩＮＧアゴニストの産生のための記載の回路ならびに１つまたは複数のアルギニン産生および／またはアンモニア消費回路のうちいずれか１つまたは複数を含む遺伝子操作された細菌は、抗ＧＩＴＲ抗体による投薬と逐次に、同時に、またはその後に投与される。一部の実施形態では、本明細書に記載される１つまたは複数のＳＴＩＮＧアゴニストの産生のための記載の回路ならびに１つまたは複数のアルギニン産生および／またはアンモニア消費回路のうちいずれか１つまたは複数を含む遺伝子操作された細菌は、抗ＯＸ４０抗体による投薬と逐次に、同時に、またはその後に投与される。一部の実施形態では、本明細書に記載される１つまたは複数のＳＴＩＮＧアゴニストの産生のための記載の回路ならびに１つまたは複数のアルギニン産生および／またはアンモニア消費回路のうちいずれか１つまたは複数を含む遺伝子操作された細菌は、抗４１ＢＢ抗体による投薬と逐次に、同時に、またはその後に投与される。一部の実施形態では、本明細書に記載される１つまたは複数のＳＴＩＮＧアゴニストの産生のための記載の回路ならびに１つまたは複数のアルギニン産生および／またはアンモニア消費回路のうちいずれか１つまたは複数を含む遺伝子操作された細菌は、抗ＧＩＴＲ抗体および抗ＯＸ４０抗体および／または抗４１ＢＢ抗体による投薬と逐次に、同時に、またはその後に投与される。これらの実施形態のいずれにおいても、遺伝子操作された細菌は、１つまたは複数の必須遺伝子に、突然変異（複数可）または欠失（複数可）をさらに含むことができる。これらの実施形態のいずれにおいても、細菌は、ｄａｐＡに１つまたは複数の栄養要求性改変、例えば、突然変異または欠失を含むことができる。これらの実施形態のいずれにおいても、細菌は、ｔｒｐＥに１つまたは複数の栄養要求性改変、例えば、突然変異または欠失を含むことができる。これらの実施形態のいずれにおいても、細菌は、ｔｈｙＡに１つまたは複数の栄養要求性改変、例えば、突然変異または欠失を含むことができる。これらの実施形態のいずれにおいても、細菌は、本明細書に記載される内在性プロファージに、ファージ改変、例えば、突然変異または欠失をさらに含むことができる。
一部の実施形態では、１つまたは複数の遺伝子操作された細菌、例えば、アデノシン消費者、キヌレニン消費者、アンモニア消費者、アルギニン生産者および／またはＳＴＩＮＧアゴニスト生産者は、同時投与されたアゴニスト抗体または他の免疫刺激性アゴニスト（例えば、抗ＯＸ４０、抗４１ＢＢおよび／または抗ＧＩＴＲ）の抗腫瘍活性（例えば、腫瘍増殖、サイズ、体積、重量）を、同じ条件下でアゴニスト抗体療法単独と比較して、または同じ条件下で同じ亜型の未改変細菌と比較して、例えば、１０％〜２０％、２０％〜２５％、２５％〜３０％、３０％〜４０％、４０％〜５０％、５０％〜６０％、６０％〜７０％、７０％〜７５％、７５％〜８０％、８０％〜８５％、８５％〜９０％、９０％〜９５％、９５％〜９９％またはそれよりも多く改善することができる。一部の実施形態では、１つまたは複数の遺伝子操作された細菌、例えば、アデノシン消費者、キヌレニン消費者、アンモニア消費者、アルギニン生産者および／またはＳＴＩＮＧアゴニスト生産者は、同時投与されたアゴニスト抗体または他の免疫刺激性アゴニスト（例えば、抗ＯＸ４０、抗４１ＢＢおよび／または抗ＧＩＴＲ）の抗腫瘍活性（例えば、腫瘍増殖、サイズ、体積、重量）を、同じ条件下で化学療法単独と比較して、または同じ条件下で同じ亜型の未改変細菌と比較して、例えば、１．０〜１．２倍、１．２〜１．４倍、１．４〜１．６倍、１．６〜１．８倍、１．８〜２倍、または２倍多くまたはそれよりも多く改善することができる。一部の実施形態では、１つまたは複数の遺伝子操作された細菌、例えば、アデノシン消費者、キヌレニン消費者、アンモニア消費者、アルギニン生産者および／またはＳＴＩＮＧアゴニスト生産者は、同時投与されたアゴニスト抗体または他の免疫刺激性アゴニスト（例えば、抗ＯＸ４０、抗４１ＢＢおよび／または抗ＧＩＴＲ）の抗腫瘍活性（例えば、腫瘍増殖、サイズ、体積、重量）を、同じ条件下で化学療法単独と比較して、または同じ条件下で同じ亜型の未改変細菌と比較して、例えば、約３倍、４倍、約３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、１００倍、５００倍または１０００倍多くまたはそれよりも多く改善することができる。
一部の実施形態では、アデノシンを消費するように遺伝子操作された細菌は、同時投与されたアゴニスト抗体または他の免疫刺激性アゴニスト（例えば、ＯＸ４０および／またはＧＩＴＲ）の抗腫瘍活性（例えば、腫瘍増殖、サイズ、体積、重量）を、同じ条件下でアゴニスト抗体療法単独と比較して、または同じ条件下で同じ亜型の未改変細菌と比較して、例えば、１０％〜２０％、２０％〜２５％、２５％〜３０％、３０％〜４０％、４０％〜５０％、５０％〜６０％、６０％〜７０％、７０％〜７５％、７５％〜８０％、８０％〜８５％、８５％〜９０％、９０％〜９５％、９５％〜９９％またはそれよりも多く改善することができる。一部の実施形態では、アデノシンを消費するように遺伝子操作された細菌は、同時投与されたアゴニスト抗体または他の免疫刺激性アゴニスト（例えば、抗ＯＸ４０、抗４１ＢＢおよび／または抗ＧＩＴＲ）の抗腫瘍活性（例えば、腫瘍増殖、サイズ、体積、重量）を、同じ条件下で化学療法単独と比較して、または同じ条件下で同じ亜型の未改変細菌と比較して、例えば、１．０〜１．２倍、１．２〜１．４倍、１．４〜１．６倍、１．６〜１．８倍、１．８〜２倍、または２倍多くまたはそれよりも多く改善することができる。一部の実施形態では、アデノシンを消費するように遺伝子操作された細菌は、同時投与されたアゴニスト抗体または他の免疫刺激性アゴニスト（例えば、抗ＯＸ４０、抗４１ＢＢおよび／または抗ＧＩＴＲ）の抗腫瘍活性（例えば、腫瘍増殖、サイズ、体積、重量）を、同じ条件下で化学療法単独と比較して、または同じ条件下で同じ亜型の未改変細菌と比較して、例えば、約３倍、４倍、約３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、１００倍、５００倍または１０００倍多くまたはそれよりも多く改善することができる。
一部の実施形態では、キヌレニンを消費するように遺伝子操作された細菌は、同時投与されたアゴニスト抗体または他の免疫刺激性アゴニスト（例えば、抗ＯＸ４０、抗４１ＢＢおよび／または抗ＧＩＴＲ）の抗腫瘍活性（例えば、腫瘍増殖、サイズ、体積、重量）を、同じ条件下でアゴニスト抗体療法単独と比較して、または同じ条件下で同じ亜型の未改変細菌と比較して、例えば、１０％〜２０％、２０％〜２５％、２５％〜３０％、３０％〜４０％、４０％〜５０％、５０％〜６０％、６０％〜７０％、７０％〜７５％、７５％〜８０％、８０％〜８５％、８５％〜９０％、９０％〜９５％、９５％〜９９％またはそれよりも多く改善することができる。一部の実施形態では、キヌレニンを消費するように遺伝子操作された細菌は、同時投与されたアゴニスト抗体または他の免疫刺激性アゴニスト（例えば、抗ＯＸ４０、抗４１ＢＢおよび／または抗ＧＩＴＲ）の抗腫瘍活性（例えば、腫瘍増殖、サイズ、体積、重量）を、同じ条件下で化学療法単独と比較して、または同じ条件下で同じ亜型の未改変細菌と比較して、例えば、１．０〜１．２倍、１．２〜１．４倍、１．４〜１．６倍、１．６〜１．８倍、１．８〜２倍、または２倍多くまたはそれよりも多く改善することができる。一部の実施形態では、キヌレニンを消費するように遺伝子操作された細菌は、同時投与されたアゴニスト抗体または他の免疫刺激性アゴニスト（例えば、抗ＯＸ４０、抗４１ＢＢおよび／または抗ＧＩＴＲ）の抗腫瘍活性（例えば、腫瘍増殖、サイズ、体積、重量）を、同じ条件下で化学療法単独と比較して、または同じ条件下で同じ亜型の未改変細菌と比較して、例えば、約３倍、４倍、約３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、１００倍、５００倍または１０００倍多くまたはそれよりも多く改善することができる。
一部の実施形態では、アルギニンを産生するおよび／またはアンモニアを消費するように遺伝子操作された細菌は、同時投与されたアゴニスト抗体または他の免疫刺激性アゴニスト（例えば、抗ＯＸ４０、抗４１ＢＢおよび／または抗ＧＩＴＲ）の抗腫瘍活性（例えば、腫瘍増殖、サイズ、体積、重量）を、同じ条件下でアゴニスト抗体療法単独と比較して、または同じ条件下で同じ亜型の未改変細菌と比較して、例えば、１０％〜２０％、２０％〜２５％、２５％〜３０％、３０％〜４０％、４０％〜５０％、５０％〜６０％、６０％〜７０％、７０％〜７５％、７５％〜８０％、８０％〜８５％、８５％〜９０％、９０％〜９５％、９５％〜９９％またはそれよりも多く改善することができる。一部の実施形態では、アルギニンを産生するおよび／またはアンモニアを消費するように遺伝子操作された細菌は、同時投与されたアゴニスト抗体または他の免疫刺激性アゴニスト（例えば、抗ＯＸ４０、抗４１ＢＢおよび／または抗ＧＩＴＲ）の抗腫瘍活性（例えば、腫瘍増殖、サイズ、体積、重量）を、同じ条件下で化学療法単独と比較して、または同じ条件下で同じ亜型の未改変細菌と比較して、例えば、１．０〜１．２倍、１．２〜１．４倍、１．４〜１．６倍、１．６〜１．８倍、１．８〜２倍、または２倍多くまたはそれよりも多く改善することができる。一部の実施形態では、アルギニンを産生するおよび／またはアンモニアを消費するように遺伝子操作された細菌は、同時投与されたアゴニスト抗体または他の免疫刺激性アゴニスト（例えば、抗ＯＸ４０、抗４１ＢＢおよび／または抗ＧＩＴＲ）の抗腫瘍活性（例えば、腫瘍増殖、サイズ、体積、重量）を、同じ条件下で化学療法単独と比較して、または同じ条件下で同じ亜型の未改変細菌と比較して、例えば、約３倍、４倍、約３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、１００倍、５００倍または１０００倍多くまたはそれよりも多く改善することができる。
一部の実施形態では、ＳＴＩＮＧアゴニスト（複数可）を産生するように遺伝子操作された細菌は、同時投与されたアゴニスト抗体または他の免疫刺激性アゴニスト（例えば、抗ＯＸ４０、抗４１ＢＢおよび／または抗ＧＩＴＲ）の抗腫瘍活性（例えば、腫瘍増殖、サイズ、体積、重量）を、同じ条件下でアゴニスト抗体療法単独と比較して、または同じ条件下で同じ亜型の未改変細菌と比較して、例えば、１０％〜２０％、２０％〜２５％、２５％〜３０％、３０％〜４０％、４０％〜５０％、５０％〜６０％、６０％〜７０％、７０％〜７５％、７５％〜８０％、８０％〜８５％、８５％〜９０％、９０％〜９５％、９５％〜９９％またはそれよりも多く改善することができる。一部の実施形態では、ＳＴＩＮＧアゴニスト（複数可）を産生するように遺伝子操作された細菌は、同時投与されたアゴニスト抗体または他の免疫刺激性アゴニスト（例えば、抗ＯＸ４０、抗４１ＢＢおよび／または抗ＧＩＴＲ）の抗腫瘍活性（例えば、腫瘍増殖、サイズ、体積、重量）を、同じ条件下で化学療法単独と比較して、または同じ条件下で同じ亜型の未改変細菌と比較して、例えば、１．０〜１．２倍、１．２〜１．４倍、１．４〜１．６倍、１．６〜１．８倍、１．８〜２倍、または２倍多くまたはそれよりも多く改善することができる。一部の実施形態では、ＳＴＩＮＧアゴニスト（複数可）を産生するように遺伝子操作された細菌は、同時投与されたアゴニスト抗体または他の免疫刺激性アゴニスト（例えば、抗ＯＸ４０、抗４１ＢＢおよび／または抗ＧＩＴＲ）の抗腫瘍活性（例えば、腫瘍増殖、サイズ、体積、重量）を、同じ条件下で化学療法単独と比較して、または同じ条件下で同じ亜型の未改変細菌と比較して、例えば、約３倍、４倍、約３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、１００倍、５００倍または１０００倍多くまたはそれよりも多く改善することができる。
一部の実施形態では、遺伝子操作された微生物は、他の処置モダリティまたは他のモダリティの組合せを含むレジメンの一部として投与することができる。そのようなモダリティまたは薬剤の非限定的な例は、従来の治療法（例えば、放射線療法、化学療法）、他の免疫療法、幹細胞療法および標的化療法（例えば、ＢＲＡＦまたは血管内皮増殖因子インヒビター；抗体または化合物）、本明細書に記載されている細菌、ならびに腫瘍溶解性ウイルスである。治療法は、Ｆｃ媒介性ＡＤＣＣ療法、細胞傷害性Ｔ細胞を腫瘍細胞に連結する二特異性可溶性ｓｃＦｖ（例えば、ＢｉＴＥ）、およびエフェクター機能を有する可溶性ＴＣＲを使用した治療法を含む抗体−免疫係合関連も含む。免疫療法は、ワクチン（例えば、ウイルス抗原、腫瘍関連抗原、ネオ抗原またはそれらの組合せ）、チェックポイントインヒビター、サイトカイン療法、養子細胞療法（ＡＣＴ）を含む。ＡＣＴとして、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）療法、ネイティブまたは操作されたＴＣＲまたはＣＡＲ−Ｔ療法、ナチュラルキラー細胞療法、および樹状細胞ワクチン、または他の抗原提示細胞の他のワクチンが挙げられるがこれらに限定されない。標的化療法は、抗体および化合物を含み、例えば、血管新生抑制戦略およびＢＲＡＦ阻害を含む。
細菌ＤＮＡの免疫賦活活性は、非メチル化ＣｐＧモチーフを発現する合成オリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）によって模倣される。Ｂｏｄｅら、Ｅｘｐｅｒｔ Ｒｅｖ Ｖａｃｃｉｎｅｓ．、２０１１年４月；１０巻（４号）：４９９〜５１１頁、ＣｐＧ ＤＮＡ ａｓ ａ ｖａｃｃｉｎｅ ａｄｊｕｖａｎｔ。ワクチンアジュバントとして使用されると、ＣｐＧ ＯＤＮは、プロフェッショナル抗原提示細胞の機能を改善し、液性および細胞性ワクチン特異的免疫応答の生成をブーストする。一部の実施形態では、ＣｐＧは、本発明の遺伝子操作された細菌と組み合わせて投与することができる。
一実施形態では、遺伝子操作された微生物は、腫瘍細胞溶解物と組み合わせて投与される。
医薬組成物の投薬量および投与の頻度は、症状の重症度およびがんの進行に基づき選択することができる。適切な治療有効用量および投与の頻度は、処置担当の臨床医によって選択することができる。
Ｉｎ Ｖｉｖｏでの処置
改変された微生物は、ｉｎ ｖｉｖｏで、例えば、動物モデルにおいて評価することができる。がんに関連する疾患または状態のいずれか適した動物モデルを使用することができる、例えば、腫瘍同系または異種移植マウスモデル（例えば、Ｙｕら、２０１５年を参照）。遺伝子操作された細菌は、全身性にまたは局所的に、例えば、経口投与（経管栄養）により、静脈内もしくは皮下注射によりまたは腫瘍内注射により動物に投与することができ、例えば、腫瘍体積を測定することにより、処置有効性を決定することができる。
動物モデルの非限定的な例として、Ｄａｎｇら、２００１年、Ｈｅａｐら、２０１４年およびＤａｎｉｎｏら、２０１５年に記載されているマウスモデルが挙げられる。
前臨床マウスモデルは、いずれの免疫療法および併用免疫療法が、種々のがんにおいて最適な治療指数（最大の抗腫瘍有効性および最小の免疫関連有害事象（ｉｒＡＥ））を生成するかを決定する。
マウス組織部位への様々なヒトがん細胞型に由来する培養細胞または患者の腫瘍塊の移植は、がんマウスモデル（異種移植モデリング）の生成に広く使用されてきた。異種移植モデリングにおいて、ヒト腫瘍または細胞系は、移植片拒絶を回避するために免疫低下宿主動物（例えば、ヌードまたはＳＣＩＤマウス）へと皮下または同所性のいずれかで植え込まれる。本来のヒト腫瘍微小環境は、このようなモデルにおいて再現されないため、免疫モジュレーターを標的とする抗がん剤の活性は、これらのモデルにおいて正確に測定されない可能性があり、インタクトな免疫系を有するマウスモデルをより望ましいものとする。
したがって、同系免疫適格性宿主におけるマウスがん細胞の移植（同種移植）が使用されて、所与のマウス系統（ｓｔｒａｉｎ）と同じ遺伝的背景に由来する腫瘍組織を有するマウスモデルを生成する。同系モデルにおいて、宿主免疫系は正常であり、このことは、腫瘍の微小環境の実際の生活状況をより密接に表すことができる。腫瘍細胞またはがん細胞系は、同系免疫適格性宿主動物（例えば、マウス）へと皮下または同所性のいずれかで移植される。免疫チェックポイントベンチマーク評価のための同系マウスモデルにおいて使用することができる代表的なマウス腫瘍細胞系として、ＷＯ２０１７／１２３６７５として出版され、その内容の全体が本明細書に参照として援用される２０１７年１月１１日に出願された国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０１３０７２に収載されている細胞系が挙げられるがこれらに限定されない。ある特定の細胞系に由来する腫瘍に関して、オボアルブミンを添加して、免疫応答をさらに刺激し、これにより、応答ベースラインレベルを増加させることができる。同系マウスモデルにおいて使用することができるマウス系統の例として、Ｃ５７ＢＬ／６、ＦＶＢ／Ｎ、Ｂａｌｂ／ｃ、Ｃ３Ｈ、ＨｅＪ、Ｃ３Ｈ／ＨｅＪ、ＮＯＤ／ＳｈｉＬＴ、Ａ／Ｊ、１２９Ｓ１／ＳｖｌｍＪ、ＮＯＤを含む細胞系に依存する。その上、いくつかのさらに遺伝子操作されたマウス系統は、分子および組織学的レベルの両方でヒト腫瘍発生を擬態することが報告された。これらの遺伝子操作されたマウスモデルも、本分野に優れたツールを提供し、その上、これらのモデルにおいて開発された侵襲的腫瘍に由来するがん細胞系も、同系腫瘍モデルのための細胞系の良好な資源である。遺伝子操作された系統の例は、ＷＯ２０１７／１２３６７５として出版され、その内容の全体が本明細書に参照として援用される２０１７年１月１１日に出願された国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０１３０７２に提示される。
多くの場合、潜在的治療分子は、ヒト免疫モジュレーターと相互作用し、ヒト免疫系を刺激し、そのマウス対応物を検出せず、その逆もまた同じである。治療分子の研究において、このことを考慮に入れる必要がある。さらに最近では、免疫不全マウスがヒト免疫系により再構成された、マウスとヒト免疫系との間の差に関する問題の克服に役立ち、ヒト免疫のｉｎ ｖｉｖｏ研究を可能にした、「ヒト化」マウスモデルが開発された。ＩＬ２受容体ヌルおよび重症の組み合わせた免疫欠乏性突然変異（ｓｃｉｄ）を組み合わせる、重症の免疫不全なマウス（ＮＯＤ−ｓｃｉｄ ＩＬ２Ｒｇヌルマウス）は、成熟Ｔ細胞、Ｂ細胞または機能的ＮＫ細胞を欠き、サイトカインシグナル伝達を欠乏する。このようなマウスは、ヒト造血幹細胞および末梢血単核細胞を生着することができる。ＣＤ３４＋造血幹細胞（ｈｕ−ＣＤ３４）が免疫欠乏性マウスに注射され、長期研究において非常に良好なＴ細胞成熟および機能を含むヒト免疫細胞集団の多系列生着をもたらす。このモデルは、１２カ月間の研究スパンを有し、機能的ヒト免疫系が、宿主に対するドナー細胞免疫反応性なしで、Ｔ細胞依存性炎症性応答を示す。患者由来異種移植は、これらのモデルにおいて直ちに移植することができ、ｉｎ ｖｉｖｏ設定において研究される免疫モジュレーション剤の効果は、ヒト腫瘍微小環境をさらに反映する（免疫および非免疫細胞に基づく両方で）（Ｂａｉａら、２０１５年）。
ヒト化マウスモデルにおける使用のための目的のヒト細胞系として、ＨＣＴ−１１６およびＨＴ−２９結腸がん細胞系が挙げられるがこれらに限定されない。
ラットＦ９８神経膠腫モデル、および自然発症イヌ腫瘍の有用性は、これらそれぞれの内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｒｏｂｅｒｔｓら、２０１４年に記載されてい
る。ルシフェラーゼを発現するように操作されたＦ９８ラット神経膠腫細胞の移植によって生成される局所に侵襲的な腫瘍に、Ｃ．ｎｏｖｙｉ−ＮＴ胞子を腫瘍内注射したところ、発芽およびルシフェラーゼ活性急落をもたらした。Ｃ．ｎｏｖｙｉ−ＮＴ発芽は、この細菌の栄養型の出現によって実証された。これらの研究において、Ｃ．ｎｏｖｙｉ−ＮＴは、近隣細胞を温存しつつ、腫瘍へと正確に向かう。
例えば、イヌ軟部組織肉腫は、多くの品種において一般的であり、特に、遺伝的変更および突然変異のスペクトルの観点から、ヒトにおけるものと同様の臨床的、病理組織学的および遺伝的特色を有する（Ｒｏｂｅｒｔｓら、２０１４年；Ｓｔａｅｄｔｋｅら、２０１５年）。Ｒｏｂｅｒｔｓらは、イヌにおける研究を遂行し、それによると、Ｃ．ｎｏｖｙｉ−ＮＴ胞子は、１〜４処置サイクルにおいて、自然発症で起こる固形腫瘍に腫瘍内注射され（１×１０８個のＣ．ｎｏｖｙｉ−ＮＴ胞子）、９０日間追跡した。強力な炎症性応答が観察されており、腫瘍内注射が自然免疫応答を開始したことを示す。
一部の実施形態では、本発明の遺伝子操作された微生物は、本明細書に記載されているモデルのいずれかへと全身性に、例えば、経口、皮下、静脈内または腫瘍内に投与されて、抗腫瘍有効性およびいずれかの処置関連の有害副作用をアセスメントする。
配列
一部の実施形態では、ある特定の前駆体配列は、細菌分泌シグナル配列を含むがこれに限定されない、１つまたは複数の細菌配列で置換される。一部の実施形態では、サイトカインをコードするポリヌクレオチド配列は、細菌発現のためにコドン最適化される。一部の実施形態では、ある特定の前駆体配列は、哺乳動物分泌シグナル配列を含むがこれに限定されない、１つまたは複数の哺乳動物配列で置換される。一部の実施形態では、サイトカインをコードするポリ
一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、免疫モジュレーションサイトカインをコードする遺伝子配列を含む。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ｈＩＬ−１２の発現のための１つまたは複数の遺伝子配列を含む。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、配列番号１０５３のポリペプチドをコードする１つまたは複数の遺伝子配列を含む。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、配列番号１０５４のポリペプチドをコードする１つまたは複数の遺伝子配列を含む。
一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ｈＩＬ−１５の発現のための１つまたは複数の遺伝子配列を含む。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、配列番号１０５７のポリペプチドをコードする１つまたは複数の遺伝子配列を含む。
一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ＧＭＣＳＦの発現のための１つまたは複数の遺伝子配列を含む。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、配列番号１０５８のポリペプチドをコードする１つまたは複数の遺伝子配列を含む。
一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ＴＮＦα、例えば、細胞外部分の発現のための１つまたは複数の遺伝子配列を含む。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、配列番号１０５９のポリペプチドをコードする１つまたは複数の遺伝子配列を含む。
一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ＩＦＮ−ガンマの発現のための１つまたは複数の遺伝子配列を含む。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、配列番号１０６０のポリペプチドをコードする１つまたは複数の遺伝子配列を含む。
一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ＣＸＣＬ１０の発現のための１つまたは複数の遺伝子配列を含む。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、配列番号１０６１のポリペプチドをコードする１つまたは複数の遺伝子配列を含む。
一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ＣＸＣＬ９の発現のための１つまたは複数の遺伝子配列を含む。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、配列番号１０６２のポリペプチドをコードする１つまたは複数の遺伝子配列を含む。
一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、配列番号１０５３、配列番号１０５４、配列番号１０５５、配列番号１０５６、配列番号１０５７、配列番号１０５８、配列番号１０５９、配列番号１０６０、配列番号１０６１および配列番号１０６２に対して少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％または少なくとも約９９％相同であるポリペプチドをコードする核酸配列を含む。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、配列番号１０５３、配列番号１０５４、配列番号１０５５、配列番号１０５６、配列番号１０５７、配列番号１０５８、配列番号１０５９、配列番号１０６０、配列番号１０６１および配列番号１０６２から選択される配列を含むポリペプチドをコードする核酸配列を含む。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、配列番号１０５３、配列番号１０５４、配列番号１０５５、配列番号１０５６、配列番号１０５７、配列番号１０５８、配列番号１０５９、配列番号１０６０、配列番号１０６１および配列番号１０６２から選択される配列からなるポリペプチドをコードする核酸配列を含む。
一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、遺伝暗号の冗長性を別にすれば、配列番号１０６３と同じポリペプチドをコードする遺伝子配列を含む。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、配列番号１０６３を含む。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、遺伝暗号の冗長性を別にすれば、配列番号１０６４と同じポリペプチドをコードする遺伝子配列を含む。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、遺伝子配列、配列番号１０６４を含む。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、遺伝暗号の冗長性を別にすれば、配列番号１０６７と同じポリペプチドをコードする遺伝子配列を含む。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、配列番号１０６７を含む。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、遺伝暗号の冗長性を別にすれば、配列番号１０６８と同じポリペプチドをコードする遺伝子配列を含む。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、配列番号１０６８を含む。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、遺伝暗号の冗長性を別にすれば、配列番号１０６９と同じポリペプチドをコードする遺伝子配列を含む。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、配列番号１０６９を含む。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、遺伝子配列を含む。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、遺伝暗号の冗長性を別にすれば、配列番号１０７０と同じポリペプチドをコードする遺伝子配列を含む。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、配列番号１０７０を含む。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、遺伝暗号の冗長性を別にすれば、配列番号１０７１と同じポリペプチドをコードする遺伝子配列を含む。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、配列番号１０７１を含む。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、配列番号１０６３、配列番号１０６４、配列番号１０６７、配列番号１０６８、配列番号１０６９、配列番号１０７０および／または配列番号１０７１のＤＮＡ配列に対して少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％または少なくとも約９９％相同である核酸配列を含む。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、配列番号１０６３、配列番号１０６４、配列番号１０６７、配列番号１０６８、配列番号１０６９、配列番号１０７０および／または配列番号１０７１から選択される配列を含む核酸配列を含む。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、配列番号１０６３、配列番号１０６４、配列番号１０６７、配列番号１０６８、配列番号１０６９、配列番号１０７０および／または配列番号１０７１から選択される配列からなる核酸配列を含む。
一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、配列番号８９４、配列番号８９５、配列番号８９６、配列番号８９７、配列番号８９８、配列番号８９９、配列番号９００、配列番号９０１、配列番号９０２、配列番号９０３、配列番号９０４、配列番号９０５、配列番号９０６、配列番号９０７、配列番号９０８、配列番号９０９、配列番号９１０、配列番号９１１、配列番号９１２、および／または配列番号９１３のＤＮＡ配列に対して少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％または少なくとも約９９％相同である核酸配列を含む。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、配列番号８９４、配列番号８９５、配列番号８９６、配列番号８９７、配列番号８９８、配列番号８９９、配列番号９００、配列番号９０１、配列番号９０２、配列番号９０３、配列番号９０４、配列番号９０５、配列番号９０６、配列番号９０７、配列番号９０８、配列番号９０９、配列番号９１０、配列番号９１１、配列番号９１２、および／または配列番号９１３から選択されるＤＮＡ配列を含む核酸配列を含む。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、配列番号８９４、配列番号８９５、配列番号８９６、配列番号８９７、配列番号８９８、配列番号８９９、配列番号９００、配列番号９０１、配列番号９０２、配列番号９０３、配列番号９０４、配列番号９０５、配列番号９０６、配列番号９０７、配列番号９０８、配列番号９０９、配列番号９１０、配列番号９１１、配列番号９１２、および／または配列番号９１３から選択されるＤＮＡ配列からなる核酸配列を含む。
一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、配列番号９１４、配列番号９１５、配列番号９１６、配列番号９１７、配列番号９１８および配列番号９１９のＤＮＡ配列に対して少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％または少なくとも約９９％相同である核酸配列を含む。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、配列番号９１４、配列番号９１５、配列番号９１６、配列番号９１７、配列番号９１８および配列番号９１９から選択されるＤＮＡ配列を含む核酸配列を含む。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、配列番号９１４、配列番号９１５、配列番号９１６、配列番号９１７、配列番号９１８および配列番号９１９から選択されるＤＮＡ配列からなる核酸配列を含む。
一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、Ｎ末端ＯｍｐＦ分泌タグを有するヒトＩＬ−１２ａ構築物をコードする遺伝子配列、例えば、配列番号９２０を含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、Ｎ末端ＰｈｏＡ分泌タグを有するヒトＩＬ−１２ａ構築物をコードする遺伝子配列、例えば、配列番号９２１を含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、Ｎ末端ＴｏｒＡ分泌タグを有するヒトＩＬ−１２ａ構築物をコードする遺伝子配列、例えば、配列番号９２２を含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、Ｎ末端ＯｍｐＦ分泌タグを有するヒトＩＬ−１２ｂ構築物をコードする遺伝子配列、例えば、配列番号９２３を含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、Ｎ末端ＰｈｏＡ分泌タグを有するヒトＩＬ−１２ｂ構築物をコードする遺伝子配列、例えば、配列番号９２４を含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、Ｎ末端ＴｏｒＡ分泌タグを有するヒトＩＬ−１２構築物をコードする遺伝子配列、例えば、配列番号９２５を含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、Ｎ末端ＯｍｐＦ分泌タグを有するヒトＧＭＣＳＦ構築物をコードする遺伝子配列、例えば、配列番号９３２を含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、Ｎ末端ＰｈｏＡ分泌タグを有するヒトＧＭＣＳＦ構築物をコードする遺伝子配列、例えば、配列番号９３３を含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、Ｎ末端ＴｏｒＡ分泌タグを有するヒトＧＭＣＳＦ構築物をコードする遺伝子配列、例えば、配列番号９３４を含む。
一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、Ｎ末端ＯｍｐＦ分泌タグを有するヒトＩＬ−１５構築物をコードする遺伝子配列、例えば、配列番号９３５を含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、Ｎ末端ＰｈｏＡ分泌タグを有するヒトＩＬ−１５構築物をコードする遺伝子配列、例えば、配列番号９３６を含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、Ｎ末端ＴｏｒＡ分泌タグを有するヒトＩＬ−１５構築物をコードする遺伝子配列、例えば、配列番号９３７を含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、Ｎ末端ＯｍｐＦ分泌タグを有するヒトＴＮＦアルファ構築物をコードする遺伝子配列、例えば、配列番号９３８を含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、Ｎ末端ＰｈｏＡ分泌タグを有するヒトＴＮＦａ構築物をコードする遺伝子配列、例えば、配列番号９３９を含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、Ｎ末端ＴｏｒＡ分泌タグを有するヒトＴＮＦａ構築物をコードする遺伝子配列、例えば、配列番号９４０を含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、Ｎ末端ＯｍｐＦ分泌タグを有するヒトＩＦＮｇ構築物をコードする遺伝子配列、例えば、配列番号９４１を含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、Ｎ末端ＰｈｏＡ分泌タグを有するヒトＩＦＮｇ構築物をコードする遺伝子配列、例えば、配列番号９４２を含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、Ｎ末端ＴｏｒＡ分泌タグを有するヒトＩＦＮガンマ構築物をコードする遺伝子配列、例えば、配列番号９４３を含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、Ｎ末端ＯｍｐＦ分泌を有するヒトＣＸＣＬ９構築物をコードする遺伝子配列、例えば、配列番号１０７５を含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、Ｎ末端ＰｈｏＡ分泌タグを有するヒトＣＸＣＬ９構築物をコードする遺伝子配列、例えば、配列番号１０７６を含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、Ｎ末端ＴｏｒＡ分泌タグを有するヒトＣＸＣＬ９構築物をコードする遺伝子配列、例えば、配列番号１０７７を含む。
一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、配列番号９２０〜９４３もしくは１０７２〜１０７８から選択されるポリペプチド配列またはそれらの機能的な断片もしくはバリアントに対して少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％または少なくとも約９９％相同であるポリペプチドをコードする遺伝子配列を含む。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、配列番号９２０〜９４３または１０７２〜１０７８から選択されるポリペプチド配列に対して少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％または少なくとも約９９％相同であるポリペプチドをコードする遺伝子配列を含む。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、配列番号９２０〜９４３または１０７２〜１０７８から選択される配列を含むポリペプチドをコードする遺伝子配列を含む。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、配列番号９２０〜９４３または１０７２〜１０７８から選択される配列からなるポリペプチドをコードする遺伝子配列を含む。
一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、配列番号９５３〜９６０および配列番号１０８１〜１０８４から選択される１つまたは複数の核酸配列を含む。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、配列番号９５３〜９６０および配列番号１０８１〜１０８４から選択される１つまたは複数のＤＮＡ配列に対して少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％または少なくとも約９９％相同である核酸配列を含む。
一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ヒトＩＬ−１２ａおよびヒトＩＬ−１２ｂの両方を含む構築物を含む遺伝子配列を含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、配列番号９６５のｐｈｏＡ−ｈＩＬ１２ｂ−ｐｈｏＡ−ｈＩＬ１２ａ部分または配列番号９６６のｐｈｏＡ−ｍＩＬ１２ｂ−ｐｈｏＡ−ｍＩＬ１２ａ部分を含む遺伝子配列を含む。
一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ｐｈｏＡ−ＩＬ１５を含む構築物を含む遺伝子配列を含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、配列番号９６７のｐｈｏＡ−ＩＬ１５部分を含む遺伝子配列を含む。
一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ｐｈｏＡ−ＧＭＣＳＦを含む構築物を含む遺伝子配列を含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、配列番号９６８のｐｈｏＡ−ＧＭＣＳＦ部分を含む遺伝子配列を含む。
一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ｐｈｏＡ−ＴＮＦαを含む構築物を含む遺伝子配列を含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、配列番号９６９のｐｈｏＡ−ＴＮＦα部分を含む遺伝子配列を含む。
一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ｐｈｏＡ−ＩＦＮガンマを含む構築物を含む遺伝子配列を含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、配列番号９７０のｐｈｏＡ−ＩＦＮガンマ部分を含む遺伝子配列を含む。
一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、非コード領域を除外して、配列番号９６５、配列番号９６６、配列番号９６７、配列番号９６８、配列番号９６９、配列番号９７０から選択されるＤＮＡ配列に対して少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％または少なくとも約９９％相同である核酸配列を含む。
以下の実施例は、本開示の例示的な実施形態を提供する。当業者は、本開示の精神または範囲を変化させることなく行ってもよい多数の改変および変形形態を認識するであろう。そのような改変および変形形態は、本開示の範囲内に包含される。実施例は、本開示をいかなるようにも制限しない。
本明細書に提供する本開示は、以下の実施例に記載される配列番号のいずれかの配列と少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９９％相同性を有する配列を提供する。
（実施例１）
免疫モジュレーター
一本鎖抗ＣＴＬＡ−４抗体の構築に使用するための例示的な核酸配列は、例えば実施例１において、その内容のその全体が参照により本明細書に組み込まれる、ＷＯ２０１７／１２３６７５として公開された、２０１７年１月１１日に提出された国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０１３０７２に記載されている。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、そのＤＮＡ配列と少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、もしくは少なくとも約９９％相同である核酸配列、または配列番号７６５、配列番号７６６、配列番号７６７、配列番号７６８、配列番号７６９、配列番号７７０、配列番号７７１、配列番号７７２、配列番号７７３、配列番号７７４、配列番号７７５、および／または配列番号７７６と少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、もしくは少なくとも約９９％相同であるポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を含む核酸配列を含む。別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、配列番号７６５、配列番号７６６、配列番号７６７、配列番号７６８、配列番号７６９、配列番号７７０、配列番号７７１、配列番号７７２、配列番号７７３、配列番号７７４、配列番号７７５、および／または配列番号７７６から選択される配列を含むポリペプチドをコードする遺伝子配列を含む。なお別の実施形態では、遺伝子操作された細菌によって発現されるポリペプチドは、配列番号７６５、配列番号７６６、配列番号７６７、配列番号７６８、配列番号７６９、配列番号７７０、配列番号７７１、配列番号７７２、配列番号７７３、配列番号７７４、配列番号７７５、および／または配列番号７７６から選択される配列からなる。
一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、そのＤＮＡ配列と少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、もしくは少なくとも約９９％相同である核酸配列、または配列番号７７７、配列番号７７８、配列番号７７９、配列番号７８０、配列番号７８１、配列番号７８２、配列番号７８３、配列番号７８４、配列番号７８５、配列番号７８６、配列番号７８７、および／または配列番号７８８と少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、もしくは少なくとも約９９％相同であるポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を含む核酸配列を含む。別の実施形態では、遺伝子配列は、配列番号７７７、配列番号７７８、配列番号７７９、配列番号７８０、配列番号７８１、配列番号７８２、配列番号７８３、配列番号７８４、配列番号７８５、配列番号７８６、配列番号７８７、および／または配列番号７８８から選択される配列を含む。別の実施形態では、遺伝子配列は、配列番号７７７、配列番号７７８、配列番号７７９、配列番号７８０、配列番号７８１、配列番号７８２、配列番号７８３、配列番号７８４、配列番号７８５、配列番号７８６、配列番号７８７、および／または配列番号７８８から選択される配列からなる。
（実施例２）
Ｅ．ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅの腫瘍薬物動態
腫瘍薬物動態をアッセイし、その内容の全体が参照により本明細書に、例えば実施例５８〜６１に組み込まれる、ＷＯ２０１７／１２３６７５として公開された、２０１７年１月１１日に提出された国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０１３０７２に記載されるように決定した。Ｎｉｓｓｌｅ（１ｅ７および１ｅ８個細胞／用量）の腫瘍薬物動態を、ＣＴ２６腫瘍モデルを使用して７日にわたって決定した。腫瘍組織中の細菌数は、両方の用量で類似であった。血液中ではいずれの時点においても細菌は検出されなかった。
ストレプトマイシン抵抗性ＮｉｓｓｌｅおよびＮｉｓｓｌｅ ＤＯＭ変異体（ＮｉｓｓｌｅΔＰＡＬ：：ＣｍＲ）の腫瘍薬物動態を、ＣＴ２６腫瘍モデルにおいて比較した。腫瘍組織中の細菌数は両方の株において類似であった。血液中に細菌は検出されなかった。これらの結果は、野生型およびＤＯＭ変異体Ｎｉｓｓｌｅの両方が腫瘍環境において生存することができることを示している。
ストレプトマイシン抵抗性Ｎｉｓｓｌｅの腫瘍内投与に対するｉｎ ｖｉｖｏでのサイトカイン応答を、ＣＴ２６腫瘍モデルを使用して１ｅ６（群１）または１ｅ７個細胞／用量（群２）のいずれかでアセスメントした。表記の用量でマウスＣＴ−２４モデルにおいてＳＹＮ９４腫瘍内投与後の時間経過において、レベルを血清中および腫瘍中で測定した。結果は、サイトカイン応答が腫瘍において高用量で誘発されたが血清中では誘発されなかったことを示す。低用量は、実質的なサイトカイン応答を誘発しない。
様々な組織における腫瘍ＰＫ、細菌レベル、およびこれらの組織におけるサイトカインレベルを、ＩＴ投与（１ｅ７個細胞／用量）の４８時間後にアセスメントした。参照により本明細書に組み込まれる国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０１３０７２に認められるように、細菌は、腫瘍に主に存在し、試験した他の組織には存在しなかった。測定したＴＮＦαレベルは、ＳＹＮ９４、食塩水処置およびナイーブ群の間で全ての血清、腫瘍、および肝臓において類似であった。ＴＮＦαレベルは、Ｎｉｓｓｌｅを、ＩＶを介して１ｅ８で投与した場合に１．５時間で測定されたＴＮＦαレベルと比較して無視できる程度である。しかし、ＩＶ投与によっても、ＴＮＦαレベルは４時間で検出不能レベルへと低下した。類似の低レベルのＴＮＦαが、ＳＹＮ９４の１ｅ６ ＩＶ用量で検出される。
（実施例３Ａ）
代謝物のＬＣ−ＭＳ／ＭＳ定量
細菌上清および腫瘍組織中のアデノシン、キヌレニン、トリプトファン、およびアルギニンの定量化を、その内容の全体が参照により本明細書に組み込まれる、ＷＯ２０１７／１２３６７５として公開された、２０１７年１月１１日に提出された国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０１３０７２に記載されるＬＣ−ＭＳ／ＭＳによって実施した。
（実施例３Ｂ）
染色体挿入を使用する細菌株の操作
Ｅ．ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅゲノムに構築物を組み込む方法は、参照により本明細書に組み込まれる国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０１３０７２に記載される。
（実施例４）
アデノシン分解株の生成
アデノシン分解経路における３つのオペロンの概略図を図４７および４８に示す。アデノシン消費株を生成するために、オペロンの各々１つ（またはｎｕｐＣの場合には単一の遺伝子）をＰｆｎｒＳプロモーターの制御下でＫＩＫＯベクターにクローニングした。ノックインＰＣＲ産物をＫＩＫＯベクターから作製し、アレル交換を行ってこれらのオペロンをＥ．ｃｏｌｉゲノムに組み込んだ。アレル交換は、本明細書に記載されるラムダｒｅｄリコンビナーゼ系を使用することにより容易となった。複数の株の組合せを生成し、表１３は、生成し、アデノシン分解アッセイにおいて比較した株を要約する。表１４は、構築物の各々に関して使用した組み込み部位を要約する。
（実施例５）
Ｉｎ ｖｉｔｒｏでのアデノシン分解の測定
Ｉｎ ｖｉｔｒｏアデノシン消費
グルコースは、Ｅ．ｃｏｌｉの好ましい炭素源である。しかし、Ｅ．ｃｏｌｉはまた、グルコースの非存在下では唯一の炭素源としてアデノシンも使用することができる。新たに生成された株がアデノシンを分解する能力をアセスメントするために、および好ましい炭素源であるグルコースの存在下であってもそのようにできるか否かをアセスメントするために。
これを達成するために、野生型対照を含む各株の一晩培養物を、ＬＢ中、２５０ｒｐｍで振とうさせながら３７Ｃで成長させた。培養物を１：１００（１２５ｍＬバッフル付きフラスコ中に１００ｍＬ）に逆希釈（ｂａｃｋ ｄｉｌｕｔｉｏｎ）し、初期対数期まで１．５時間成長させた。培養物が初期対数期に達すると、培養物を、嫌気的雰囲気（８５％Ｎ２、１０％ＣＯ２、５％Ｈ２）を供給するＣｏｙ嫌気的チャンバーに移動させた。培養物を嫌気的に４時間インキュベートし、操作されたアデノシン分解経路遺伝子を誘導させた。
培養物を嫌気的チャンバーから取り出し、アデノシン分解活性に関して試験した。これを達成するために、約１ｅ８個の活性化細菌細胞を１．５ｍＬ微量遠心管において遠心沈降させ、アデノシンアッセイ緩衝液（１０ｍＭアデノシンを含み、グルコースを含まないかまたは０．５％グルコースを含む１×Ｍ９最少培地（スライドを参照されたい））に再懸濁させた。管を３７℃で５時間静置してインキュベートし、上清試料を５時間の間、毎時間回収した。上清試料を、アデノシン濃度の決定のためにＬＣ−ＭＳを介して分析した。
結果を図３に示し、操作された全ての株が、野生型対照株より速い速度でアデノシンを分解（上清試料中にそれが存在しないことによって決定する）できることを示す。全ての株は、Ｅ．ｃｏｌｉの好ましい炭素源であるグルコースが存在するか否かにかかわらず、アデノシンを分解することができた。
基質制限条件下でのＩｎ ｖｉｔｒｏ活性
これまでの試験では、基質は無限であった、すなわち株はＶｍａｘで機能することができた。そのような基質濃度は、ｉｎ ｖｉｖｏで予想される濃度の大過剰量であった。次に、操作された細菌のアデノシン分解能を、より制限的な基質濃度（ｉｎ ｖｉｖｏでの腫瘍中のアデノシン濃度により一貫する）およびより低用量（敗血症を引き起こしていないマウスにおいてＩＶまたはＩＴ投与することができる用量とより一貫する）でアセスメントした。
各株の一晩培養物をＬＢ中、２５０ｒｐｍで振とうさせながら３７Ｃで成長させた。培養物を１：１００（１２５ｍＬバッフル付きフラスコ中に１０ｍＬ）に逆希釈し、初期対数期まで１．５時間成長させた。培養物が初期対数期に達すると、培養物を、嫌気的雰囲気（８５％Ｎ２、１０％ＣＯ２、５％Ｈ２）を供給するＣｏｙ嫌気的チャンバーに移動させた。培養物を嫌気的に４時間インキュベートし、操作されたアデノシン分解経路遺伝子を誘導させた。
活性化細胞をｃｅｌｌｏｍｅｔｅｒにおいて定量し、ＰＢＳ中で５ｅ８ ｃｆｕ／ｍＬに希釈した。この懸濁液（５ｅ６個の細菌を含む）１０μＬを、Ｍ９最少培地、０．５％グルコース、および１００μＭアデノシンで構成されるアデノシンアッセイ緩衝液１ｍＬ中に再懸濁させた。細胞を、３７Ｃで静置してインキュベートした。上清試料を５時間の間、毎時間除去して、アデノシン分解速度を決定した。上清試料を、アデノシン濃度の決定のためにＬＣ−ＭＳを介して分析した。報告された分解速度は、試料採取の０から５時間の間の最大線形速度である（極めて低い基質（アデノシン）分解では速度は線形ではない場合があることから、これは後の時点を含まなくてもよい）。
結果を図５および６に示し、操作された株は全て、対照株ＳＹＮ０１の速度より速い速度でアデノシンを分解することができた（上清試料中にそれが存在しないことによって決定）ことを示している。ＳＹＮ１６５６は、アデノシン分解経路を含む３つ全ての組み込みを含む最も高度に操作された株であり、アデノシンを最高速度で分解することができ、アデノシンレベルは３時間で検出不能レベルとなった。
線形速度を表１５に示す。
（実施例６）
Ｉｎ ｖｉｖｏでのアデノシン消費株の効果
アデノシン消費株ＳＹＮ１６５６（ＰｆｎｒＳ−ｎｕｐＣ；ＰｆｎｒＳ−ｘｄｈＡＢＣ；ＰｆｎｒＳ−ａｄｄ−ｘａｐＡ−ｄｅｏＤを含む）のｉｎ ｖｉｖｏでの効果を、単独および抗ＰＤ１との組合せにおいてアセスメントした。
ＡＴＣＣから得たＣＴ２６細胞を提供されたガイドラインに従って培養した。ＰＢＳ中のおよそ１ｅ６個細胞／マウスを各動物（ＢａｌｂＣ／Ｊ（雌性、８週齢））の右脇腹に皮下移植し、腫瘍の成長をおよそ１０日間モニタリングした。腫瘍が約１００〜１５０ｍｍ３に達すると、動物を投与のための群に無作為化した。
細胞を調製するために、ストレプトマイシン抵抗性Ｎｉｓｓｌｅ（ＳＹＮ０９４）を、ＬＢブロス中で６００ｎｍでの吸光度（Ａ６００ｎｍ）が０．４（２×１０８コロニー形成単位（ＣＦＵ）／ｍＬに対応する）となるまで成長させ、ＰＢＳ中で２回洗浄した。懸濁液をＰＢＳまたは食塩水中で希釈し、１００μＬを、腫瘍を有するマウスの腫瘍内に適切な用量で注射することができる。ＳＹＮ１６５６を調製するために、細胞をＬＢ（２Ｌ）中で１：１００に希釈し、好気的に１．５時間成長させた後、嫌気的チャンバーに４時間移動させた。投与前に、細胞を２００倍濃縮し、凍結した（ＰＢＳ中に１５％グリセロール、２ｇ／Ｌグルコース）。
ＣＴ２６移植のおよそ１０日後、１日目に細菌をＰＢＳ ０．１ｍｌに懸濁させて、マウスを秤量し、測定し、以下のような処置群に無作為化した：群１、食塩水注射（１００μｌ）（ｎ＝１４）；群２、ＳＹＮ９４ ＩＴ １０ｅ７（ｎ＝１４）；群３、ＳＹＮ１６５６ ＩＴ １０ｅ７（ｎ＝１４）；群４、ＳＹＮ１６５６ ＩＴ １０ｅ７＋ａＰＤ−１（ＢｉｏＸｃｅｌｌ）、１０ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．（ｎ＝１４）；群５、ａＰＤ−１（ＢｉｏＸｃｅｌｌ）、１０ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ（ｎ＝９）。
１日目および４日目に、動物にその群分けに従って食塩水または株を腫瘍内に（ＩＴ）単独で、または抗ＰＤ１（Ｉ．Ｐ）と組み合わせて投与した。血漿をさらなる分析のために収集した。図４９は、１、４、および７日目のマウスの腫瘍体積を示す。結果は、腫瘍体積が、食塩水処置対照と比較して７日目に３つ全ての処置群（ＳＹＮ１６５６、抗ＰＤ１、およびＳＹＮ１６５６＋抗ＰＤ１）において減少することを示している；腫瘍サイズは、ＳＹＮ１６５６および抗ＰＤ１処置群において最小であり、次いでＳＹＮ１６５６単独および抗ＰＤ１単独であり、２つの処置の間に相乗効果が存在しうることを示しており、単剤としてのおよびａＰＤ−１との組合せにおけるアデノシン消費株の抗腫瘍活性を示唆している。腫瘍体積は、ＳＹＮ１６５６および抗ＰＤ１によって処置した動物では食塩水単独より有意に低かった（ｐ＝０．０１）。ＳＹＮ１６５６および抗ＰＤ１によって処置した動物の腫瘍体積もまた、抗ＰＤ１単独によって処置した動物より有意に低かった。
他の試験では、動物がおよそ２０００ｍｍ３の腫瘍サイズに達するまで、本試験を、１０、１５、および１８日目での投与および分析を含めるように延長した。
（実施例７）
適応実験室進化（ＡＬＥ）
先ず、ｔｒｐＥノックアウトを含む株であって、構成的プロモーターにより駆動されるＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ ＫＹＮアーゼの発現のための構築物を組み込んだ株を、ＷＯ２０１７／１２３６７５として公開された、２０１７年１月１１日に出願された国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０１３０７２、および２０１８年１月５日に出願された国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１８／０１２６９８（これらの参考特許文献の内容は、それら全体が参照により組み込まれる）に記載されているように生成した。ＫＹＮアーゼ構築物をＨＡ３／４部位に組み込み、２つの異なるプロモーターを使用した；内因性のｌｐｐ遺伝子のプロモーターを親株ＳＹＮ２０２７（ＨＡ３／４：：Ｐｌｐｐ−ｐＫＹＮａｓｅ ＫａｎＲ ＴｒｐＥ：：ＣｍＲ）に使用し、合成ｐＳｙｎＪ２３１１９を親株ＳＹＮ２０２８（ＨＡ３／４：：ＰＳｙｎＪ２３１１９−ｐＫＹＮａｓｅ ＫａｎＲ ＴｒｐＥ：：ＣｍＲ）に使用した。株を進化させ、その株がＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ ＫＹＮアーゼの染色体組み込みバージョンを含むことになるように、これらの株を生成した。これらの株をチェッカーボードアッセイ（例えば、ＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０１３０７２に記載される）において、それらのプラスミドに基づくＰｔｅｔ相対物と類似のＡＬＥパラメータを有することを確証した。ＡＬＥ実験に使用するためのキヌレニン（ＫＹＮ）およびＴｏｘＴｒｐ濃度の下限を、ＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０１３０７２に記載されるチェッカーボードアッセイを使用して確立し、下限濃度は、中コピー数プラスミドからのｔｅｔ誘導性ＫＹＮアーゼを発現する株に関して観察された濃度に対応した。
親株ＳＹＮ２０２７およびＳＹＮ２０２８に由来する変異体を、以下のように、ＫＹＮの漸減濃度および異なる３つのＴｏｘＴｒｐ濃度で継代することによって進化させた。
ＡＬＥ親株を、プレートにおいてグルコースおよびＬ−キヌレニンを補充したＭ９最少培地（Ｍ９＋ＫＹＮ）中で培養した。各親からの単一コロニーを選択し、滅菌リン酸緩衝食塩水溶液２０μＬに再懸濁させた。次に、このコロニーを使用してＭ９＋ＫＹＮの２つの培養物に接種し、後期対数期へと成長させ、６００ｎｍでの吸光度を決定した。次に、これらの培養物を、Ｍ９＋ＫＹＮＵ １ｍＬを有する９６ウェル深型プレートの３つの行で１０３に希釈した。３つの列の各１つは、異なるＴｏｘＴｒｐ濃度（２倍増加）を有し、各行は、漸減濃度のＫＹＮ（２分の１づつ）を有した。１２時間ごとに、培養物のＯＤ６００がほぼ０．１となるまで成長したウェルからの３０μＬを使用してプレートを逆希釈した。このプロセスを５日間繰り返した後、ＴｏｘＴｒｐ濃度は、選択圧を維持するために倍加させた。２週間後、増殖速度の増加は検出されず、培養物をＭ９＋ＫＹＮに播種した。培養は全て３７℃、３５０ＲＰＭで振とうさせながら実施した。個々のコロニーを、Ｍ９＋ＫＹＮ＋ＴｏｘＴｒｐ培地中で選択およびスクリーニングして、増加した成長速度表現型を確認した。
各親株（ＳＹＮ２０２０７−Ｒ１、ＳＹＮ２０２７−Ｒ２、ＳＹＮ２０２８−Ｒ１、およびＳＹＮ２０２８−Ｒ２）の２つのレプリケートを選択し、キヌレニン産生に関してアッセイした。
簡単に説明すると、一晩培養物をＬＢ ４００ｍＬ中で１：１００に希釈し、４時間成長させた。次に、培養物２ｍＬを遠心沈降させ、Ｍ９緩衝液２ｍＬに再懸濁させた。培養物のＯＤ６００を測定した（ＰＢＳ中で１／１００希釈）。ＯＤ約０．８（約１Ｅ８）の開始細胞数を目標とする３ｍｌアッセイのために必要な細胞培養物の量を遠心沈降させた。細胞ペレットを、培養管中でアッセイ体積（３ｍｌ）のＭ９＋０．５％グルコース＋７５μＭ ＫＹＮ中に再懸濁させた。各時点（ｔ＝０、２、および３時間）で２２０μｌを３連で円錐形の９６ＷＰに採取し、４μｌを各時点でｃｆｕ測定のために除去した。各時点で、試料を円錐底の９６ＷＰ中、３０００ｇで５分間遠心沈降させ、各ウェルからの２００μｌを透明な平底９６ＷＰに移した。キヌレニンの検量線およびブランク試料を、同じプレートで調製した。次に、３０％トリクロロ酢酸（体積／体積）４０ｕｌを各ウェルに添加し、ピペットを上下させることによって混合した。プレートをアルミニウムホイルで密閉し、６０Ｃで１５分間インキュベートした。プレートを４Ｃ、１１５００ｒｐｍで１５分間遠心沈降させ、各ウェルから１２５μｌをアリコートにし、別の９６ＷＰにおいて氷酢酸中の２％エールリッヒ試薬１２５μｌと混合した。試料を、ピペットを上下させることによって混合し、ＯＤ４８０での吸光度を測定した。成長速度を、親株ＳＹＮ２０２７およびＳＹＮ２０２８、ならびに対応する進化株に関して図５１に示す。
（実施例８）
キヌレニン消費株はＣＴ２６マウス腫瘍モデルにおいて腫瘍性キヌレニンレベルを減少させる
Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓからのキヌレニナーゼを含む遺伝子操作された細菌がｉｎ ｖｉｖｏの腫瘍環境でキヌレニンを消費する能力をアセスメントした。ＳＹＮ１７０４、すなわちＴｒｐ：Ｅに欠失を含み、構成的プロモーターの制御下でＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓからのキヌレニナーゼを発現する中コピー数プラスミドを含むＥ．ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅ株（ＮｉｓｓｌｅΔＴｒｐＥ：：ＣｍＲ＋Ｐｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅ−Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ＫＹＮＵ ＫａｎＲ）を第１の試験（試験１）に使用した。
第２の試験（試験２）では、ＳＹＮ２０２８、すなわちＴｒｐ：Ｅに欠失を含み、構成的プロモーターの制御下でＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓからのキヌレニナーゼを発現する組み込まれた構築物を含むＥ．ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅ株（Ｎｉｓｓｌｅ ＨＡ３／４：：ＰＳｙｎＪ２３１１９−ｐＫＹＮａｓｅ ＫａｎＲ ＴｒｐＥ：：ＣｍＲ）の活性をアセスメントした。
両方の試験において、ＡＴＣＣから得たＣＴ２６細胞を、提供されたガイドラインに従って培養した。ＰＢＳ中のおよそ１ｅ６個細胞／マウスを各動物（ＢａｌｂＣ／Ｊ（雌性、８週齢））の右脇腹に皮下移植し、腫瘍の成長をおよそ１０日間モニタリングした。腫瘍が約１００〜１５０ｍｍ３に達すると、動物を投与のための群に無作為化した。
腫瘍内注射の場合、細菌を、６００ｎｍでの吸光度（Ａ６００ ｎｍ）が０．４（２×１０８コロニー形成単位（ＣＦＵ）／ｍＬに対応する）に達するまでＬＢブロス中で成長させ、ＰＢＳ中で２回洗浄した。１００マイクロＬを、腫瘍を有するマウスの腫瘍内に適切な用量で注射することができるように、懸濁液をＰＢＳまたは食塩水中で希釈した。
試験１：ＣＴ２６移植の約１０日後、細菌をＰＢＳ ０．１ｍｌに懸濁させて、マウスに以下のように１００μｌを腫瘍内に注射した（５ｅ６個細胞／マウス）：群１−ビヒクル対照（ｎ＝８）、群２−ＳＹＮ９４（ｎ＝８）、および群３−ＳＹＮ１７０４（ｎ＝８）。２日目から試験終了まで、動物に、ビヒクル対照または細菌５ｅ６個細胞／マウスの１００μｌを隔週で腫瘍内に投与した。動物の体重を測定し、腫瘍体積を週に２回測定した。腫瘍が約２０００ｍｍ３に達すると動物を安楽死させ、キヌレニン濃度を、本明細書に記載されるようにＬＣ／ＭＳによって測定した。結果を図５２Ａに示す。腫瘍内濃度の有意な低減が、キヌレニン消費株ＳＹＮ１７０４および野生型Ｅ．ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅに関して観察された。腫瘍内キヌレニンレベルは、野生型Ｎｉｓｓｌｅと比較してＳＹＮ１７０４において低減されたが、その差は、１つの外れ値のために有意性に達しなかった。
試験２：ＣＴ２６移植のおよそ１０日後、細菌を、食塩水０．１ｍｌに懸濁させて、マウスの腫瘍内に細菌懸濁液（１ｅ８個細胞／マウス）を以下のように注射した：群１−ビヒクル対照（ｎ＝１０）、群２−ＳＹＮ９４（ｎ＝１０）、群３−ＳＹＮ２０２８（ｎ＝１０）。群５（ｎ＝１０）には、対照としてＩＮＣＢ０２４３６０（ＩＤＯインヒビター）を、１日２回強制経口投与した。２日目から試験終了まで、動物にビヒクル対照または細菌１ｅ８個細胞／マウス１００μｌを隔週で腫瘍内に投与した。動物の体重を測定し、腫瘍体積を週に２回測定した。群５には、対照としてＩＮＣＢ０２４３６０を試験終了まで１日２回強制経口投与した。腫瘍が約２０００ｍｍ３に達すると動物を安楽死させた。腫瘍の断片を、予め重量を測定したビードバスター（ｂｅａｄ−ｂｕｓｔｅｒ）管に入れ、分析のために氷中で保存した。キヌレニン濃度を本明細書に記載されるようにＬＣ／ＭＳによって測定した。結果を図５２Ｂに示す。腫瘍内濃度の有意な低減が、野生型Ｎｉｓｓｌｅまたは野生型対照と比較してキヌレニン消費株ＳＹＮ２０２８に関して観察された。ＳＹＮ２０２８において観察された腫瘍内キヌレニンレベルは、ＩＤＯインヒビターＩＮＣＢ０２４３６０に関して観察されたレベルと類似であった。
（実施例９）
染色体挿入およびプラスミドを有する操作された細菌株のｉｎ ｖｉｔｒｏ有効性の比較
ｍａｌＥＫ座でｆｎｒ誘導性プロモーターによって駆動されるＡｒｇＡｆｂｒの染色体挿入を有する操作された細菌株と、ｆｎｒ誘導性プロモーターによって駆動されるＡｒｇＡｆｂｒを含む低コピー数プラスミドを有する株との間のｉｎ ｖｉｔｒｏ有効性を比較するために、培地中のアルギニンレベルを嫌気的誘導後の様々な時点で測定した。さらに、チミジンに関する栄養要求性が、アルギニン産生効率に対して影響を及ぼしうるか否かをアセスメントするために、ＴｈｙＡ欠失を有するまたは有しない、低コピー数プラスミドにおいてｆｎｒ−ＡｒｇＡｆｂｒを含むか、または染色体に組み込まれた、操作された細菌株のアルギニン産生を比較した。
一晩培養物をＬＢ中で１：１００に希釈し、振とう（２５０ｒｐｍ）させながら３７℃で成長させた。１．５時間成長させた後、細菌培養物を以下のように誘導した：（１）ＦＮＲ誘導性ａｒｇＡｆｂｒを含む細菌を、３７℃のＣｏｙ嫌気的チャンバー（９０％Ｎ２、５％ＣＯ２、５％Ｈ２、および２０ｍＭ硝酸塩を供給する）中での嫌気的条件で、ＬＢ中３７℃で４時間誘導した；（２）テトラサイクリン誘導性ａｒｇＡｆｂｒを含む細菌を、アンヒドロテトラサイクリン（１００ｎｇ／ｍＬ）によって誘導した。誘導後、細菌をインキュベータから取り出し、最高速度で５分間遠心沈降させた。細胞をＭ９グルコース１ｍＬに再懸濁させ、ＯＤ６００を測定した。ＯＤ６００が０．６〜０．８の間になるまで細胞を希釈した。Ｍ９グルコース培地中に再懸濁させた細胞を、３７Ｃで振とうさせながら好気的に成長させた。細胞懸濁液１００μＬを採取し、時間＝０でのＯＤ６００を測定する。１００μＬアリコートを、質量分析（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）のために丸底９６ウェルプレートにおいて−２０℃で凍結した。その後の各時点（例えば、３０、６０、および１２０分）で、細胞懸濁液１００μＬを除去し、ＯＤ６００を測定した；１００μＬアリコートを、質量分析のために丸底９６ウェルプレートにおいて−２０Ｃで凍結した。試料を、アルギニン濃度に関して分析した。各時点で、質量分析によって決定した正規化濃度対ＯＤ６００を使用して、単位時間あたり細胞あたりのアルギニン産生速度を決定した。ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ法の要約を上記に提供する。
３０、６０、および１２０分間の誘導後のアルギニン産生を、（１）Ｓｙｎ−ＵＣＤ３０１（ＳＹＮ−ＵＣＤ３０４；ｍａｌＥＫ座で染色体に組み込まれたＦＮＲ誘導性プロモーターの制御下で発現されたΔＡｒｇＲおよびａｒｇＡｆｂｒを含む）、（２）ＳＹＮ−ＵＣＤ２０５（低コピー数プラスミドにおいてＦＮＲ誘導プロモーターの制御下で発現されたΔＡｒｇＲおよびａｒｇＡｆｂｒを含む）、および（３）ＳＹＮ−ＵＣＤ２０６（低コピー数プラスミドにおいてＦＮＲ誘導プロモーターの制御下で発現されたΔＡｒｇＲおよびΔＴｈｙＡおよびａｒｇＡｆｂｒを含む）の間で比較した。ＳＹＮ−ＵＣＤ１０３を対照Ｎｉｓｓｌｅ構築物として使用し、結果を示す。
本明細書において、０、３０、６０、および１２０分で測定したＳＹＮ−ＵＣＤ２０５、ＳＹＮ−ＵＣＤ２０６、およびＳＹＮ−ＵＣＤ３０１のアルギニン産生レベルを示す。アルギニン産生は、３つ全ての株の間で同等であり、最大のアルギニン産生は、ＳＹＮ−ＵＣＤ３０１に関して１２０分で得られ、このことはＦＮＲ ＡｒｇＡ ｆｂｒの染色体組み込みによって、同じ構築物を発現する低コピー数プラスミド株について認められるものと類似のレベルのアルギニン産生が得られ、アルギニン産生速度をさらにわずかに増加させうることを示している。ＳＹＮ−ＵＣＤ２０６は、ＳＹＮ−ＵＣＤ２０５およびＳＹＮ−ＵＣＤ−３０１（６０分でより低いアルギニンレベル）と比較して減弱されたアルギニン産生を示したが、１２０分では同等のアルギニン産生レベルに達し、ΔＴｈｙＡがアルギニン産生に対してわずかに減弱作用を有しうることを示している。ＳＹＮ−ＵＣＤ１０３対照ではアルギニン産生は検出されなかった。
次に、試料を上記のように調製し、誘導後１２０分でのアルギニン産生を、（１）ＳＹＮ−ＵＣＤ２０４（低コピー数プラスミドにおいてテトラサイクリン誘導性プロモーターの制御下で発現されたΔＡｒｇＲおよびａｒｇＡｆｂｒを含む）、および（２）ＳＹＮ−ＵＣＤ３０１（ｍａｌＥＫ座で染色体に組み込まれたＦＮＲ誘導性プロモーターの制御下で発現されたΔＡｒｇＲ、ＣｍＲ、およびａｒｇＡｆｂｒを含む）、（３）ＳＹＮ−ＵＣＤ３０２（ｍａｌＥＫ座で染色体に組み込まれたＦＮＲ誘導性プロモーターの制御下で発現されたΔＡｒｇＲ、ΔＴｈｙＡ、ＣｍＲ（クロラムフェニコール抵抗性）およびａｒｇＡｆｂｒを含む）、および（４）ＳＹＮ−ＵＣＤ３０３（ｍａｌＥＫ座で染色体に組み込まれたＦＮＲ誘導性プロモーターの制御下で発現されたΔＡｒｇＲ、ΔＴｈｙＡ、ＫａｎＲ（カナマイシン抵抗性）およびａｒｇＡｆｂｒを含む）の間で比較した。
ΔＡｒｇＲおよびΔＴｈｙＡを含むＳＹＮ−ＵＣＤ１０６を、対照のＮｉｓｓｌｅ構築物として使用した。結果を図４２Ｂに示す。図４２Ｂにおいて認められるように、アルギニン産生は、０．７〜０．９μｍｏｌ／１×１０９個細胞の間まで上昇し、アルギニン産生が、プラスミドにおいてＡｒｇＡｆｂｒを有する株およびＡｒｇＡｆｂｒの組み込まれたコピーを有する株において類似のレベルであることを示している。
（実施例１０）
染色体挿入およびプラスミドを有する操作された細菌株のｉｎ ｖｉｔｒｏ有効性の比較
ｍａｌＥＫ座でｆｎｒ誘導性プロモーターによって駆動されるＡｒｇＡｆｂｒの染色体挿入を有し、ΔＡｒｇＲおよびＴｈｙＡ欠失を有し、抗生物質耐性を有しない操作された細菌株におけるｉｎ ｖｉｔｒｏ有効性（アンモニアからのアルギニン産生）をアセスメントした（ＳＹＮ−ＵＣＤ３０３）。
一晩培養物をＬＢ中で１：１００に希釈し、振とう（２５０ｒｐｍ）させながら３７℃で成長させた。１．５時間成長させた後、細菌培養物を、３７℃のＣｏｙ嫌気的チャンバー（９０％Ｎ２、５％ＣＯ２、５％Ｈ２、および２０ｍＭ硝酸塩を供給する）中での嫌気的条件で、ＬＢ中３７℃で４時間誘導した。誘導後、細菌をインキュベータから取り出し、最高速度で５分間遠心沈降させた。細胞をＭ９グルコース１ｍＬに再懸濁させ、ＯＤ６００を測定した。ＯＤ６００が０．６〜０．８の間になるまで細胞を希釈した。Ｍ９グルコース培地中に再懸濁させた細胞を、３７Ｃで振とうさせながら好気的に成長させた。細胞懸濁液１００μＬを除去し、時間＝０でのＯＤ６００を測定した。１００μＬアリコートを、質量分析（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）のために丸底９６ウェルプレートにおいて−２０℃で凍結した。その後の各時点（例えば、２０、４０、６０、８０、１００、および１２０分）で、細胞懸濁液１００μＬを除去し、ＯＤ６００を測定した；１００μＬアリコートを、質量分析のために丸底９６ウェルプレートにおいて−２０Ｃで凍結した。試料を、アルギニン濃度に関して分析した。各時点で、質量分析によって決定した正規化濃度対ＯＤ６００を使用して、単位時間あたり細胞あたりのアルギニン産生速度を決定した。ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ法の要約を本明細書に提供する。結果を図４３に示す。
（実施例１１）
サイトカイン分泌のための構築物および細菌の生成
免疫モジュレーションポリペプチド、例えばサイトカイン、例えばｈＩＬ−１２、ｍＩＬ−１２、ｈＩＬ−１５、ＧＭＣＳＦ、ＴＮＦα、ＩＦＮ−ガンマ、ＣＸＣＬ９、およびＣＸＣＬ１０を分泌することができる株を産生するために、異なる分泌戦略を用いるいくつかの構築物を設計した。様々なサイトカイン構築物を合成し、Ｅ．ｃｏｌｉの形質転換のためにベクターｐＢＲ３２２にクローニングした。一部の実施形態では、エフェクター分子をコードする構築物をゲノムに組み込む。一部の実施形態では、エフェクター分子をコードする構築物は、プラスミド、例えば中コピー数プラスミドに存在する。
（実施例１２）
ＭＣ３８モデルにおける抗ＰＤ−１および抗ＣＴＬＡ−４の全身投与と組み合わせたキヌレニン消費株の活性
キヌレニン消費株ＳＹＮ２０２８が、抗ＣＴＬＡ４と抗ＰＤ−１との組合せの抗腫瘍応答を増強する能力を、Ｃ５７ＢＬ／６−ＭＣ３８同系腫瘍モデルにおいてアセスメントした。
試験において使用する細胞を産生するために、一晩培養物を使用して、抗生物質と共にＬＢ培地５００ｍＬに接種した。株を、培養物が、対数期終期（ＯＤ６００＝０．８〜１．０）に達するまで振とうさせながら３７Ｃでインキュベートした。収集するために、細胞を５０００ｒｐｍで２０分間遠心沈降させ、培地を吸引し、細胞をＰＢＳによって洗浄し、１５％グリセロールおよびＰＢＳ中に再懸濁させ、アリコートにして−８０Ｃで凍結した。細胞は、連続プレーティング（ｐｌａｔｉｎｇ）によって濃度を試験した。
表１６における試験デザインに従って、マウスにＭＣ３８腫瘍を移植し、マウスにキヌレニン消費細菌を腫瘍内注射し、抗ＣＴＬＡ−４および抗ＰＤ−１抗体を腹腔内に注射した。ＭＣ３８細胞（１×１０５個／マウス／１００μＬ）を−９日目に各動物の右脇腹にＳＣ移植した。腫瘍の成長をモニタリングした；腫瘍が１日目に約５０〜８０ｍｍ３に達すると、マウスを表１６に示す処置群に無作為化した。
２回の測定の間を１〜２日空けて週に３回、腫瘍体積および体重を記録した。
図５８Ａ、５８Ｂ、５８Ｃ、および５８Ｅの結果は、キヌレニン消費株が、ＭＣ３８モデルにおいて抗ＣＴＬＡ−４／抗ＰＤ−１抗体媒介抗腫瘍活性を改善する能力を有することを示す。具体的には、抗ＰＤ−１／抗ＣＴＬＡ−４群では、マウスの２５％が処置に応答した；抗ＰＤ−１／抗ＣＴＬＡ−４＋ＳＹＮ９４群では同じ応答率が観察された。抗ＰＤ−１／抗ＣＴＬＡ−４＋ＳＹＮ２０２８群では、マウスの７１％が応答した。
（実施例１３）
骨髄非破壊性化学療法と組み合わせたアルギニン産生体およびキヌレニン消費体の活性
アルギニン産生体（ＳＹＮ８２８）およびキヌレニン消費体（ＳＹＮ２０２８）の活性を、ＣＴ２６腫瘍モデルにおいてシクロホスファミド処置と組み合わせてアセスメントした。
試験のための細胞を産生するために、一晩培養物を使用して、抗生物質と共にＬＢ培地５００ｍＬに接種した。株を、培養物が、対数期終期（ＯＤ６００＝０．８〜１．０）に達するまで振とうさせながら３７Ｃでインキュベートした。収集するために、細胞を５０００ｒｐｍで２０分間遠心沈降させ、培地を吸引し、細胞をＰＢＳによって洗浄し、１５％グリセロールおよびＰＢＳ中に再懸濁させ、アリコートにして−８０Ｃで凍結した。細胞は、連続プレーティング（ｐｌａｔｉｎｇ）によって濃度を試験した。
以下および図４４Ａに記載のタイムラインに従って、マウスにＣＴ２６腫瘍を移植し、マウスにアルギニン産生細菌（ＳＹＮ８２８）およびキヌレニン消費細菌（ＳＹＮ２０２８）ならびに対照を、１００ｍｇ／ｋｇシクロホスファミド（ＣＰ）と組み合わせて腫瘍内に注射した。
簡単に説明すると、ＣＴ２６細胞（ＰＢＳ中に１ｅ６個細胞／マウス）を−９日目に各動物の右脇腹にＳＣ移植した。腫瘍の成長を、腫瘍が約５０〜８０ｍｍ３に達するまでモニタリングした。０日目に、マウスを１００ｍｇ／ｋｇ（１００μＬ／マウス）シクロホスファミドのＩ．Ｐ．によって前処置し、群に無作為化した。処置の１日目に、マウスにＳＹＮ９４（ＷＴ、１ｅ８ ＣＦＵ／ｍＬ）（Ｉ．Ｔ．）、ＳＹＮ２０２８（Ｋｙｎ、１ｅ８ ＣＦＵ／ｍＬ）、またはＳＹＮ８２５（Ａｒｇ、１ｅ８ ＣＦＵ／ｍＬ）（Ｉ．Ｔ．）のいずれかの１００μＬを投与した。４、８、１１、および１５日目に動物の体重を測定し、腫瘍を測定し、マウスに適切な処置／群を投与した。個々のマウスの腫瘍体積を、図４４Ｂ、４４Ｃ、４４Ｄ、４４Ｅ、および４４Ｆに示し、シクロホスファミドと組み合わせたキヌレニン消費株およびアルギニン産生株の抗腫瘍活性をシクロホスファミド単独と比較して示す。
（実施例１４）
ＬＣ−ＭＳ／ＭＳによる細菌細胞ペレットおよび腫瘍組織ホモジネートにおける環状ジＡＭＰの定量
試料の調製
標準物質を生成するために、１０ｍｇ／ｍＬ環状ジＡＭＰを１．５ｍＬ微量遠心管において調製し、２５０、１００、２０、４、０．８、０．１６、０．０３２μｇ／ｍＬ溶液を水中で調製した。ＱＣ溶液は、２００、２０、および２μｇ／ｍＬレベルで調製した。
試料調製：Ｉｎ ｖｉｔｒｏ試料に関して、細菌ペレットを、２：１ アセトニトリル：水１００μＬを添加することによって抽出し、ボルテックスし、遠心分離した。上清２０μＬを新しい９６ウェルプレートに移し、０．１％ギ酸１８０μＬを添加することによって１０倍希釈した。Ｉｎ ｖｉｖｏ試料の場合、組織ホモジネートは、２：１ アセトニトリル：水９０μＬを腫瘍ホモジネート１０μＬに添加することによって抽出した。試料をボルテックスし、遠心分離した。上清２０μＬを新しい９６ウェルプレートに移し、０．１％ギ酸１８０μＬを添加することによって１０倍希釈した。プレートをＣｌｅａｒＡＳｅａｌシートによって熱密封し、十分に混合した。
ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ法
検体を、Ｔｈｅｒｍｏ ＴＳＱ Ｑｕａｎｔｕｍ Ｍａｘトリプル四重極質量分析計を使用してタンデム質量分析にカップリングした液体クロマトグラフィー（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）によって測定した。表１７〜表１９は、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ法の要約を提供する。
データ解析のために、ＳＲＭクロマトグラムを組み込み、標準物質のピーク面積を濃度に対してプロットした。線形の曲線をフィットさせ、未知物質の濃度を、そのピーク面積および検量線の式の勾配切片を使用して計算した。
（実施例１５）
Ｅ．ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅ細胞表面上の抗ｍＰＤ１−ｓｃＦｖの提示
Ｎｉｓｓｌｅ細胞表面上に抗ｍＰＤ１−ｓｃＦｖを提示することができる遺伝子操作された細菌を生成するために、表２０に示すように本明細書に記載される方法に従って構築物を生成した。配列は、配列番号９８７〜９８９である。提示アンカーポリペプチドは配列番号９９０〜９９２を含む。
一部の実施形態では、提示アンカーは、配列番号９９０、配列番号９９１、および／または配列番号９９２の配列と少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９９％相同である。
ｔｅｔ誘導性ｐｔｅｔ−ＬｐｐＯｍｐＡ−抗ＰＤ１−ｓｃＦｖを含むプラスミドに基づく構築物を含むＥ．ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅを、ＬＢ培地中で一晩成長させた。培養物をＬＢ中で１：１００に希釈し、振とう（２００ｒｐｍ）させながら吸光度が０．８となるまで成長させ、その時点で培養物を室温に冷却し、無水テトラサイクリン（ａｎｈｙｄｒｏｕｓ ｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎｅ）（ＡＴＣ）を培養物に１００ｎｇ／ｍＬの濃度で培養物に添加し、ｐｔｅｔ−ＬｐｐＯｍｐＡ−Ｊ４３−ｓｃＦｖの発現を１８時間誘導した。
一本鎖抗体が遺伝子操作されたＥ．ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅの表面上に提示されるか否か、およびＰＤ１に機能的に結合するか否かを決定するために、全細胞ＥＬＩＳＡアッセイを実施した。細胞１０９個を、２％ＢＳＡを含むＰＢＳを使用して室温で１時間遮断し、ビオチン化−ｍＰＤ１を添加し、室温で１時間インキュベートした。その後、細胞をＰＢＳＴ（ＰＢＳ／０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０）によって３回洗浄し、ブロッキング溶液中のストレプトアビジンコンジュゲートＨＲＰと共に４０分間インキュベートした。インキュベーション後、ウェルをＰＢＳＴによって３回洗浄し、ＰＢＳ中に再懸濁させた後、３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）基質キットを使用し、製造元の説明書（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）に従って染色した。ビオチン化ＩｇＧおよび無添加のＰＢＳを陰性対照としてｍＰＤ１の代わりに使用した。細胞を遠心分離によって除去し、上清を収集した。上清のシグナル強度を、ＥＬＩＳＡリーダーを使用して４５０ｎｍで測定した。結果（データは利用できない）は、Ｊ４３−ｓｃＦｖ（抗ｍＰＤ１）が、遺伝子操作された細菌の表面上に提示され、ｍＰＤ１に結合することができることを示している（表２１）。
（実施例１６）
Ｅ．ｃｏｌｉにおけるα−ＰＤ１−ｓｃＦｖ発現
機能的ｓｃＦｖをＥ ｃｏｌｉにおいて発現させることができるか否かを決定するために、抗ＰＤ１−ｓｃＦｖ断片を、マウスＰＤ−１と反応するＪ４３モノクローナル抗体に基づいて生成した。
マウスモノクローナル抗体Ｊ４３配列を、特許ＥＰ第１４４５２６４Ａ１から得た。次に、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）を設計した。ｔｅｔプロモーター、リボソーム結合部位、設計したＪ４３−ｓｃＦｖ、Ｃ末端Ｖ５タグおよびＣ末端ヘキサヒスチジンタグ（配列番号１２５２）を含む断片を、ＩＤＴＤＮＡにより合成した。構築物を、ｐＣＲ（商標）−Ｂｌｕｎｔ ＩＩ−ＴＯＰＯ（登録商標）ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングし、本明細書に記載されるようにＥ．ｃｏｌｉ ＤＨ５αに形質転換し、プラスミドｐＵＣ−ｐｔｅｔ−Ｊ４３ｓｃＦｖ−Ｖ５−ＨＩＳ（配列番号９７６〜９８０）を生成した。
ｔｅｔ誘導性Ｊ４３−抗ＰＤ１−ｓｃＦｖ−Ｖ５を含むＥ．ｃｏｌｉまたは野生型対照をＬＢ培地中で一晩成長させた。培養物をＬＢ中で１：４０に希釈し、振とう（２５０ｒｐｍ）させながら吸光度が０．８となるまで成長させ、その時点で無水テトラサイクリン（ＡＴＣ）を培養物に１００ｎｇ／ｍＬの濃度で添加し、Ｊ４３−抗ＰＤ１−ｓｃＦｖ−Ｖ５の発現を誘導した。同量のテトラサイクリンを野生型対照培養物に添加した。４時間誘導後、細菌をペレットにし、ＰＢＳ中で洗浄して収集し、超音波緩衝液（ＰＢＳ）２ｍＬに再懸濁させ、氷上で超音波によって溶解した。不溶性のデブリを、１２，０００ｒｐｍ、４℃で１５分間、２回遠心沈降させた。
タンパク質濃度をＢＣＡタンパク質アッセイによって決定し、野生型およびＰｔｅｔ−Ｊ４３−抗ＰＤ１−ｓｃＦＶ−Ｖ５を含む株から単離した抽出物をウェスタンブロットによって分析した。タンパク質をＰＶＤＦ膜に転写し、Ｊ４３−抗ＰＤ１−ｓｃＦｖを、ＨＲＰコンジュゲート抗Ｖ５抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）によって検出した。レーン２（Ｊ４３−抗ＰＤ１−ｓｃＦｖ−Ｖ５株からの抽出物）において単一のバンドが２７ｋＤａで検出された。レーン１（野生型抽出物）ではバンドは検出されなかった。
Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＨ５αから精製した一本鎖抗体が標的タンパク質ＰＤ１に機能的に結合するか否かを決定するために、ＥＬＩＳＡアッセイを実施した。プレートに、２μｇ／ｍＬ ＰＤ１（Ｒｎｄｓｙｓｔｅｍｓ）を１００μＬ／ウェル、４℃で一晩吸収させた。ウェルを、ＰＢＳ／０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０中の２％ＢＳＡによって室温で２時間遮断した。３回洗浄後、ウェルを細菌抽出物（Ｊ４３−ｓｃＦｖ−Ｖ５または野生型陰性対照）と共に室温で１時間インキュベートした。ウェルをＰＢＳＴ（ＰＢＳ／０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０）によって４回洗浄し、ブロッキング溶液中のＨＲＰコンジュゲート抗Ｖ５抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）と共に４０分間インキュベートした。インキュベーション後、ウェルをＰＢＳＴによって４回洗浄した後、３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）を使用して染色した。シグナル強度を、ＥＬＩＳＡリーダーを使用して４５０ｎｍで測定した。結果を表２２に示し、遺伝子操作された細菌によって発現された抗体がＰＤ１に特異的に結合することができることを示している。
次に、組換えＪ４３−抗ｓｃＦｖ−Ｖ５を、Ｃ末端ポリヒスチジンタグを回収するｐＥＴ２２ｂベクターを使用して発現させ、固定した金属イオンアフィニティクロマトグラフィーを使用して精製した。タンパク質濃度を２８０ｎｍでの吸光度によって決定し、純度をクーマシーゲルによって確認した（データは示していない）。
Ｅ．ｃｏｌｉにおいて発現された抗ＰＤ１−ｓｃＦｖが、マウスＥＬ４細胞上の表面ＰＤ１に結合するか否かを決定するために、ＥＬ４細胞を使用してフローサイトメトリー分析を実施した。ＥＬ４は、その細胞表面上にＰＤ１を発現するマウスリンパ腫細胞系である。
ＥＬ４細胞を、１０％ＦＢＳを含むダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）において成長させた。細胞を遠心沈降させ、上清を吸引し、ペレットをＤ−ＰＢＳ １ｍｌに再懸濁させ、冷却したアッセイ管に移し（１×１０６個細胞）、０．５％ＢＳＡを含むＤ−ＰＢＳ中で２〜３回洗浄した。細胞を、０．５％ＢＳＡを含むＰＢＳに再懸濁させ、これに精製ｓｃＦｖ−Ｖ５および抗Ｖ５−ＦＩＴＣ抗体を添加し、室温で１時間インキュベートした。陰性対照はｓｃＦｖ−Ｖ５を除外した。細胞をＰＢＳ ０．５ｍｌに再懸濁させ、フローサイトメーターにおいて分析した。結果を図６２に示す。ＥＬ４単独およびＥＬ４＋二次抗体のみの試料と比較して、精製抗ＰＤ１−ｓｃＦｖ−Ｖ５および抗Ｖ５−ＦＩＴＣの両方が存在した場合に限り、集団のシフトが観察される（異なる２つのバッチを示す）。
（実施例１７）
抗ｍＰＤ１−ｓｃＦｖの分泌
抗ｍＰＤ１−ｓｃＦｖの分泌のために本明細書に記載される方法に従って生成した株を表２４に示す。
ｔｅｔ誘導性Ｊ４３−抗ｓｃＦｖ−Ｖ５をＰｈｏＡ、ＯｍｐＦ、もしくはＰｅｌＢ分泌タグと共に含むプラスミドに基づく構築物（配列番号９８１〜９８６を参照）を含むＥ．ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅまたは野生型対照をＬＢ培地中で一晩成長させた。培養物をＬＢ中で１：１００に希釈し、振とう（２００ｒｐｍ）させながら吸光度が０．８となるまで成長させ、その時点で培養物を室温に冷却し、無水テトラサイクリン（ＡＴＣ）を培養物に１００ｎｇ／ｍＬの濃度で添加し、ＰｈｏＡ−、ＯｍｐＦ−、またはＰｅｌＢ−Ｊ４３−抗ｓｃＦｖ−Ｖ５の発現を誘導した。野生型Ｎｉｓｓｌｅ培養物にはテトラサイクリンを添加しなかった。室温で１８時間誘導後、細菌をペレットにし、上清を収集して氷上に置いた。
培地および細胞溶解物中のタンパク質濃度をＢＣＡタンパク質アッセイによって決定し、野生型およびＰｔｅｔ−Ｊ４３−抗ｓｃＦｖ−Ｖ５を含む株から単離した抽出物および培地をウェスタンブロットによって解析した。タンパク質をＰＶＤＦ膜に転写し、Ｊ４３−抗ｓｃＦｖを、ＨＲＰコンジュゲート抗Ｖ５抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）によって検出した。結果を図６３に示す。レーン１〜６においてＳＹＮ２７６７、ＳＹＮ２７６９、ＳＹＮ２７７１、ＳＹＮ２７７３、ＳＹＮ２７７５、およびＳＹＮ２７７７からの抽出物にそれぞれ対応する単一のバンドが３４ｋＤａ付近に検出された。
Ｅ．ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅにおける分泌されたＪ４３−抗ｓｃＦｖが、マウス細胞上のＰＤ１に結合するか否かを決定するために、フローサイトメトリー分析を、ＥＬ４細胞を使用して実施した。ＥＬ４は、その細胞表面上にＰＤ１を発現するマウスリンパ腫細胞系である。
ＥＬ４細胞を、１０％ＦＢＳおよび１％ペニシリン−ストレプトマイシンを含むダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で成長させた。細胞を遠心沈降させ、上清を吸引し、ペレットをＤ−ＰＢＳ １ｍｌ中に再懸濁させ、冷アッセイ管（１×１０６個）に移し、Ｄ−ＰＢＳ中で３回洗浄した。細胞を、０．５％ＢＳＡを含むＤ−ＰＢＳ中に再懸濁させ、これに精製ｓｃＦｖ−Ｖ５および抗Ｖ５−ＦＩＴＣ抗体を添加し、室温で１時間インキュベートした。陰性対照は、分泌されたＪ４３−ｓｃＦｖ−Ｖ５を除外した。次いで細胞をＰＢＳ ０．５ｍｌ中に再懸濁させ、フローサイトメーターで分析した。結果を（図６４）に示す。ＥＬ４単独およびＥＬ４＋二次抗体のみによる試料と比較して、分泌された抗ＰＤ１−ｓｃＦｖ−Ｖ５（一次抗体）および抗Ｖ５−ＦＩＴＣ（二次抗体）の両方が存在する場合に限って集団シフトが観察された。類似の試験を、分泌されたｓｃＦｖの異なる量（０、２、５、および１５μＬ）について実施し、ＥＬ４細胞の用量依存的染色を観察した（図６５）。
次に、ＰＤＬ１が、遺伝子操作された細菌によって分泌された抗ＰＤ１−ｓｃＦｖのマウスＰＤ１に対する結合を阻害するか否かを決定するために競合アッセイを実施した。ＥＬ４細胞を成長させ、フローサイトメトリープロトコールを、分泌された抗ＰＤ１−ｓｃＦｖ−Ｖ５のインキュベーションの間にＰＤＬ１を様々な濃度（０、５、１０、および３０μｇ／ｍＬ）で添加したことを除き、本質的に上記の通りに実施した。ラット−ＩｇＧを、分泌されたｓｃＦｖの陰性対照として使用した。結果を図６６Ａおよび図６６Ｂに示す。ＰＤＬ１は、分泌された抗ｍＰＤ１−ｓｃＦｖの、ＥＬ４細胞表面上のｍＰＤ１に対する結合に対して用量依存的に競合した。ラット−ＩｇＧタンパク質の陰性対照は、類似の用量依存的な結合競合を示さなかった。
（実施例１８）
サイトカイン分泌（ＩＬ−１５）
操作された細菌によって発現されたｈＩＬ−１５が分泌されるか否かを決定するために、ｈＩＬ−１５分泌構築物／株を含む操作された株からの細菌上清中のｈＩＬ−１５濃度を測定した。株は、Ｌｐｐ（ｌｐｐ：：Ｃｍ）、ｎｌｐＩ（ｎｌｐＩ：：Ｃｍ）、ｔｏｌＡ（ｔｏｌＡ：：Ｃｍ）、またはＰＡＬ（ＰＡＬ：：Ｃｍ）のいずれかの欠失を含む。全ての株は、ＰｈｏＡ分泌タグと共にｈＩＬ−１５を発現するプラスミドをさらに含む。
Ｅ．ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅ株をＬＢ培地中で一晩成長させた。培養物をＬＢ中で１：２００に希釈し、振とう（２００ｒｐｍ）させながら２時間成長させた。培養物を、吸光度が０．５となるまで希釈し、その時点で無水テトラサイクリン（ＡＴＣ）を培養物に１００ｎｇ／ｍＬの濃度で添加して、ｈＩＬ−１５の発現を誘導した。１２時間誘導後、細胞を遠心沈降させ、上清を収集した。無細胞培地を生成するために、清澄な上清を、０．２２ミクロンフィルターを通してさらに濾過し、いかなる残留細菌も除去し、氷上に置いた。さらに、細胞内組換えタンパク質産生を検出するために、ペレットにした細菌を洗浄し、プロテアーゼインヒビターおよびＲｅａｄｙ−Ｌｙｓｅリゾチーム溶液（Ｅｐｉｃｅｎｔｅｒ）を含むＢｕｇＢｕｓｔｅｒ（商標）（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）中に再懸濁させ、当初の培養条件と比較して１０倍濃縮された溶解物を得た。室温で１０分間インキュベーション後、不溶性のデブリを１２，０００ｒｃｆ、４℃で２０分間遠心沈降させた後、さらに処理するまで氷上に置いた。
無細胞培地および細菌細胞抽出物中のｈＩＬ−１５の濃度を、ｈＩＬ−１５ ＥＬＩＳＡ（ＲｎＤ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）によって製造元の説明書に従って測定した。試料を全て３連で実施し、検量線を使用して分泌されたｈＩＬ−１５レベルを計算した。検量線は、組換えｈＩＬ−１５を使用して生成した。野生型ＮｉｓｓｌｅをＥＬＩＳＡに陰性対照として含め、シグナルは観察されなかった。表２４は、それぞれの上清中で測定したｈＩＬ−１５のレベルを要約する。データは、ｈＩＬ−１５が、異なる細菌株から様々なレベルで分泌されることを示している。
（実施例１９）
サイトカイン分泌（ＧＭＣＳＦ）
操作された細菌によって発現されるｈＧＭＣＳＦが分泌されるか否かを決定するために、ｈＧＭＣＳＦ分泌構築物／株を含む操作された株からの細菌上清中のｈＧＭＣＳＦの濃度を測定した。株は、Ｌｐｐ（ｌｐｐ：：Ｃｍ）、ｎｌｐＩ（ｎｌｐＩ：：Ｃｍ）、ｔｏｌＡ（ｔｏｌＡ：：Ｃｍ）、またはＰＡＬ（ＰＡＬ：：Ｃｍ）のいずれかの欠失を含む。株は全て、ＰｈｏＡ分泌タグと共にｈＧＭＣＳＦを発現するプラスミドをさらに含む。
Ｅ．ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅ株を、ＩＬ−１５に関する上記の実施例に記載したとおりに成長、誘導および処理した。
無細胞培地中および細菌細胞抽出物中のｈＧＭＣＳＦの濃度を、ｈＧＭＣＳＦ ＥＬＩＳＡ（ＲｎＤ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）によって、製造元の説明書に従って測定した。全ての試料を３連で実行し、検量線を使用して分泌されたｈＧＭＣＳＦレベルを計算した。検量線は組換えｈＧＭＣＳＦを使用して生成した。野生型ＮｉｓｓｌｅをＥＬＩＳＡに陰性対照として含め、シグナルは観察されなかった。表２５は、それぞれの上清中で測定されたｈＧＭＣＳＦのレベルを要約する。データは、ｈＧＭＣＳＦが、異なる細菌株から様々なレベルで分泌されることを示している。
（実施例２０）
サイトカインの分泌（ＴＮＦａ）
操作された細菌によって発現されたｈＴＮＦａが分泌されるか否かを決定するために、ｈＴＮＦａ分泌構築物／株を含む操作された株からの細菌上清中のｈＴＮＦａの濃度を測定した。株は、Ｌｐｐ（ｌｐｐ：：Ｃｍ）、ｎｌｐＩ（ｎｌｐＩ：：Ｃｍ）、ｔｏｌＡ（ｔｏｌＡ：：Ｃｍ）、またはＰＡＬ（ＰＡＬ：：Ｃｍ）のいずれかの欠失を含む。全ての株は、ＰｈｏＡ分泌タグと共にｈＴＮＦａを発現するプラスミドをさらに含む。
Ｅ．ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅ株を、ＩＬ−１５に関する上記の実施例に記載したとおりに成長、誘導および処理した。
無細胞培地中および細菌細胞抽出物中のｈＴＮＦａの濃度を、ｈＴＮＦａ ＥＬＩＳＡ（ＲｎＤ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）によって、製造元の説明書に従って測定した。全ての試料を３連で実行し、検量線を使用して分泌されたｈＴＮＦａレベルを計算した。検量線は組換えｈＴＮＦａを使用して生成した。野生型ＮｉｓｓｌｅをＥＬＩＳＡに陰性対照として含め、シグナルは観察されなかった。表２６は、それぞれの上清中で測定されたｈＴＮＦａのレベルを要約する。データは、ｈＴＮＦａが、異なる細菌株から様々なレベルで分泌されることを示している。
（実施例２１）
分泌されたＴＮＦαの機能的アッセイ
次に、遺伝子操作された細菌から分泌されたＴＮＦαが機能的であることを証明するために試験を実施した。ＴＮＦα媒介ＮＦ−カッパＢ活性化に基づいて細胞に基づくアッセイを用いた。ＴＮＦαのその受容体に対する結合により、ＩＫＫによるＩｋＢアルファのリン酸化および分解をもたらす。ＴＮＦαの生物活性を、フローサイトメトリーを介してＩｋＢ分解の定量によって決定することができる。
簡単に説明すると、ＨｅＬａ細胞を、ＳＹＮ２３０４（ＰＡＬ：：Ｃｍ ｐ１５ａ ＴｅｔＲ Ｐｔｅｔ−ｐｈｏＡ ＴＮＦａを含む）に由来するＴＮＦａ分泌上清によって１０分間処置した。次に、細胞をパラホルムアルデヒドに基づく緩衝液中で固定した後、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００中で透過性にした。ＩｋＢａ分解のモジュレーションをフローサイトメトリーによって決定し、結果を図３７に示す。
図３７に認められるように、ＳＹＮ２３０４はｒｈＴＮＦａの生物活性に近づく生物活性を示し、ＳＹＮ１５５７処置によって、細菌上清のオフターゲット成分からの交絡因子（すなわち、ＬＰＳ）を示さない、測定可能なシグナルはもたらさなかった。
（実施例２２）
サイトカイン分泌（ｈＩＦＮｇ）
操作された細菌によって発現されるｈＩＦＮｇが分泌されるか否かを決定するために、ｈＩＦＮａ分泌構築物／株を含む操作された株からの細菌上清中のｈＩＦＮｇの濃度を測定した。株は、Ｌｐｐ（ｌｐｐ：：Ｃｍ）、ｎｌｐＩ（ｎｌｐＩ：：Ｃｍ）、ｔｏｌＡ（ｔｏｌＡ：：Ｃｍ）、またはＰＡＬ（ＰＡＬ：：Ｃｍ）のいずれかの欠失を含む。全ての株は、ＰｈｏＡ分泌タグと共にｈＩＦＮｇを発現するプラスミドをさらに含む。
Ｅ．ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅ株を、ＩＬ−１５に関する上記の実施例に記載したとおりに成長、誘導および処理した。
無細胞培地中および細菌細胞抽出物中のｈＩＦＮｇの濃度を、ｈＩＦＮｇ ＥＬＩＳＡ（ＲｎＤ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）によって、製造元の説明書に従って測定した。全ての試料を３連で実行し、検量線を使用して分泌されたｈＩＦＮｇレベルを計算した。検量線は組換えｈＩＦＮｇを使用して生成した。野生型ＮｉｓｓｌｅをＥＬＩＳＡに陰性対照として含め、シグナルは観察されなかった。表２７は、それぞれの上清中で測定されたｈＩＦＮｇのレベルを要約する。データは、ｈＩＦＮｇが、異なる細菌株から様々なレベルで分泌されることを示している。
表２８は、各サイトカインに関して得られた分泌レベルの要約を提供し、観察された分泌レベルの差のいくつかを説明しうるサイトカインのいくつかの構造特徴を記載する。
（実施例２３）
Ｅ．ｃｏｌｉにおける抗ＣＤ４７ ｓｃＦｖの発現
機能的な抗ＣＤ４７−ｓｃＦｖを、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて発現させることができるか否かを決定するために、抗ＣＤ４７−ｓｃＦｖ断片を、ヒトＣＤ４７と反応するＢ６Ｈ１２および５Ｆ９モノクローナル抗体に基づいて生成した。
モノクローナル抗体Ｂ６Ｈ１２および５Ｆ９（抗ヒトＣＤ４７）配列を、公開された特許（ＵＳ２０１３０１４２７８６Ａ１）から得た。次に、ヒトＣＤ４７を標的とする一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）を設計した。ｔｅｔプロモーター、リボソーム結合部位、設計された抗ｈＣＤ４７−ｓｃＦｖ、Ｃ末端Ｖ５タグ、およびＣ末端ヘキサヒスチジンタグ（配列番号１２５２）を含む断片を、ＩＤＴＤＮＡが合成した。構築物をｐＣＲ（商標）−Ｂｌｕｎｔ ＩＩ−ＴＯＰＯ（登録商標）ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングし、本明細書に記載されるようにＥ．ｃｏｌｉ ＤＨ５αに形質転換し、プラスミドｐＵＣ−ｐｔｅｔ−Ｂ６Ｈ１２抗ｈＣＤ４７ｓｃＦｖ−Ｖ５−ＨＩＳ（配列番号９９３）およびｐＵＣ−ｐｔｅｔ−５Ｆ９抗ｈＣＤ４７ｓｃＦｖ−Ｖ５−ＨＩＳ（配列番号９９４）を生成した。
ｐＵＣ−ｐｔｅｔ−Ｂ６Ｈ１２抗ｈＣＤ４７ｓｃＦｖ−Ｖ５−ＨＩＳまたはｐＵＣ−ｐｔｅｔ−５Ｆ９抗ｈＣＤ４７ｓｃＦｖ−Ｖ５−ＨＩＳを含むＥ．ｃｏｌｉ ＤＨ５αを、ＬＢ培地中で一晩成長させた。培養物をＬＢ中で１：１００に希釈し、振とう（２００ｒｐｍ）させながら、吸光度が０．８となるまで成長させ、その時点で培養物を室温まで冷却し、無水テトラサイクリン（ＡＴＣ）を培養物に１００ｎｇ／ｍＬの濃度で添加して、ｐｔｅｔ−ｓｃＦｖの発現を１８時間誘導した後、細菌をペレットにし、ＰＢＳ中で洗浄して回収し、ＰＢＳ緩衝液 ２ｍＬ中に再懸濁させて、氷上で超音波によって溶解した。不溶性のデブリを１２，０００ｒｐｍ、４℃で１５分間、２回遠心沈降させる。
Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＨ５αにおいて発現された抗ＣＤ４７一本鎖抗体が、標的タンパク質に機能的に結合するか否かを決定するために、ＥＬＩＳＡアッセイを実施した。プレートに、２μｇ／ｍＬ標的タンパク質（ヒトＣＤ４７、マウスＣＤ４７、ＩｇＧ、およびＰＢＳ、Ｒｎｄｓｙｓｔｅｍｓから）を１００μＬ／ウェル、４℃で一晩吸収させた。ウェルをＰＢＳ／０．１％ Ｔｗｅｅｎ−２０中の２％ＢＳＡによって室温で２時間遮断した。３回洗浄後、ウェルを細菌抽出物と共に室温で１時間インキュベートした。ウェルをＰＢＳＴ（ＰＢＳ／０．１％ Ｔｗｅｅｎ−２０）によって４回洗浄し、ＨＲＰコンジュゲート抗Ｖ５抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）と共にブロッキング溶液中で４０分間インキュベートした。インキュベーション後、ウェルをＰＢＳＴによって４回洗浄した後、３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）を使用して染色した。シグナル強度を、ＥＬＩＳＡリーダーを使用して４５０ｎｍで測定した。結果を表２９に示し、遺伝子操作された細菌によって発現された抗ＣＤ４７−ｓｃＦｖが、ヒトＣＤ４７に特異的に結合することができることを示している。
（実施例２４）
キヌレニン消費株はＣＴ２６マウス腫瘍モデルにおいて腫瘍性キヌレニンレベルを減少させる
Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓからのキヌレニナーゼを含む遺伝子操作された細菌がｉｎ ｖｉｖｏの腫瘍環境でキヌレニンを消費する能力をアセスメントした。Ｔｒｐ：Ｅに欠失を含み、構成的プロモーターの制御下でＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ
ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓからのキヌレニナーゼを発現する中コピー数プラスミドを含むＳＹＮ１７０４、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅ株（ＮｉｓｓｌｅデルタＴｒｐＥ：：ＣｍＲ＋Ｐｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅ−Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ＫＹＮＵ ＫａｎＲ）を使用した。
両方の試験において、ＡＴＣＣから得たＣＴ２６細胞を、提供されたガイドラインに従って培養した。ＰＢＳ中のおよそ１ｅ６個細胞／マウスを各動物（ＢａｌｂＣ／Ｊ（雌性、８週齢））の右脇腹に皮下移植し、腫瘍の成長をおよそ１０日間モニタリングした。腫瘍が約１００〜１５０ｍｍ３に達すると、動物を投与のための群に無作為化した。
腫瘍内注射のために、細菌を、ＬＢブロス中で６００ｎｍでの吸光度（Ａ６００ｎｍ）が０．４（２×１０８コロニー形成単位（ＣＦＵ）／ｍＬに対応する）となるまで成長させ、ＰＢＳ中で２回洗浄した。懸濁液をＰＢＳまたは食塩水で希釈して、１００μＬを、腫瘍を有するマウスに適切な用量で腫瘍内注射することができる。
ＣＴ２６移植の約１０日後、細菌をＰＢＳ ０．１ｍＬ中に懸濁させ、マウスに１００μＬを以下のように腫瘍内注射した（１ｅ７個細胞／マウス）：群１−食塩水対照（ｎ＝７）、群２−ＳＹＮ１７０４（ｎ＝７）。動物に、それらの群分けに従って食塩水または株のいずれかを隔週（ＢＩＷ）で腫瘍内に投与した。動物の体重を測定し、腫瘍体積を週に２回測定した。腫瘍が約２０００ｍｍ３に達すると動物を安楽死させた。血漿および腫瘍組織を収集し、キヌレニンおよびトリプトファン濃度を本明細書に記載のようにＬＣ／ＭＳによって測定した。結果を図４２Ａおよび４２Ｂに示す。キヌレニンの腫瘍内（Ｐ＜０．００１）および血漿中（Ｐ＜０．００５）濃度の有意な低減が、キヌレニン消費株ＳＹＮ１７０４について観察された。トリプトファンレベルは一定のままであった（データは示していない）。
（実施例２５）
ＣＴ２６腫瘍モデルにおけるＳＹＮ９４およびＳＹＮ１７０４による動態試験
ＣＴ２６腫瘍におけるＫＹＮ消費株の１回投与が腫瘍ＫＹＮレベルおよび腫瘍重量に及ぼす効果をアセスメントした。ＣＲＬからの８週齢の雌性Ｂａｌｂ／Ｃマウス（１８〜２５ｇ）を、施設に少なくとも３日間順化させた。動物に通常の食餌および水を与えた。
−８日目に、ＣＴ２６細胞（ＰＢＳ中に約１ｅ６個細胞／マウス）を各動物の右脇腹にＳＣ移植した。腫瘍の成長を、腫瘍が約１００〜１５０ｍｍ３に達するまで１週間モニタリングした。次いで、動物を秤量し、測定し、表３０に従って処置群に無作為化した（１日目）。動物に、腫瘍内投与を介してＳＹＮ９４またはＳＹＮ１７０４を適切な濃度で投与した。腫瘍内注射のために、ＳＹＮ９４細胞を３．０×１０ｅ１１ ＣＦＵ／ｍＬ保存液から１×１０ｅ８ ＣＦＵ／ｍＬの濃度に希釈し、ＳＹＮ１７０４細胞を保存液から１×１０ｅ８ ＣＦＵ／ｍＬの濃度に希釈した。
動物を腫瘍の成長に関連する異常または過剰な疼痛の兆候に関して投与後毎日観察した。動物を１日目（Ｔ＝０群；群１）、２日目（Ｔ＝２４時間；群２および５）、４日目（Ｔ＝７２時間；群３および６）、および８日目（Ｔ＝１６８時間；群４および７）に犠牲にした。
各群に関して全血を適切なエンドポイントで心採血により収集した。得ることができる最大の血液をＬｉＨｅｐ管（ＢＤ）に収集した。試料を氷上で維持した後、遠心分離機で遠心沈降させた（２０００ｇ、４Ｃで１０分間）。次に、血漿を１．５ｍＬ Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ管に移し、後に分析するまで−８０Ｃで保存した。腫瘍試料を２つの部分に分割し、第１の部分を、再度秤量したビードバスター管において適切なエンドポイントで収集した。管中の組織の秤量後、さらなる分析のために−８０Ｃで保存した。腫瘍の他の部分を切片作製および分析のために１０％ホルマリン中で固定した。採血からの血漿試料をＬＣＭＳによって分析し、細胞に基づくアッセイを使用してサイトカイン分析を実施した。腫瘍試料を、キヌレニンレベルに関してＬＣＭＳによって分析した。結果を図５４Ａ〜５４Ｃに示す。
（実施例２６）
マウスＣＤ４０Ｌの分泌
ＣＤ４０Ｌを分泌することができる遺伝子操作された細菌を生成するために、表８９に示されるｍＣＤ４０Ｌ１（４７−２６０）およびｍＣＤ４０Ｌ２（１２２−２６０）構築物を、本明細書に記載される方法に従って生成した。ｍＣＤ４０Ｌ１（４７−２６０）およびｍＣＤ４０Ｌ２（１２２−２６０）はそれぞれ、完全長のｍＣＤ４０Ｌの細胞外部分およびｍＣＤ４Ｌの可溶性型に対応する。
ｐｔｅｔ−ＰｈｏＡ−ＣＤ４０Ｌ１（４７−２６０）（ＳＹＮ３３６６）およびｔｅｔ−ＰｈｏＡ−ＣＤ４０Ｌ２（１１２−２６０）（ＳＹＮ３３６７）を含むプラスミドに基づくｔｅｔ誘導性構築物を含むＥ．ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅならびに親対照株ＳＹＮ１５５７を、ＬＢ培地中で一晩成長させた。培養物をＬＢ中で１：１００に希釈し、振とう（２００ｒｐｍ）させながら吸光度が０．８となるまで成長させ、その時点で培養物を室温に冷却し、無水テトラサイクリン（ＡＴＣ）を１００ｎｇ／ｍＬの濃度で培養物に添加し、ｍＣＤ４０Ｌ１およびｍＣＤ４０Ｌ２の発現を誘導した。
１８時間誘導後、細胞を遠心沈降させ、上清を収集した。無細胞培地を生成するために、清澄な上清を、０．２２ミクロンフィルターを通してさらに濾過し、いかなる残留細菌も除去し、氷上に置いた。
次に、上清をウェスタンブロットによって解析した。上清２５μＬからのタンパク質を、ＰＶＤＦ膜に転写し、ｍＣＤ４０−Ｌ１およびｍＣＤ４０Ｌ−２を、ＨＲＰコンジュゲート抗Ｖ５抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）によって検出した。結果を図５５に示す。ｍＣＤ４０Ｌ１およびｍＣＤ４０Ｌ２に関してそれぞれ、３２ｋＤａおよび２４ｋＤａ付近に単一のバンドが検出された。
清澄な上清中の捕捉された遺伝子操作されたＥ．ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅによって分泌されたｍＣＤ４０Ｌが、ｍＣＤ４０に機能的に結合することができるか否か、および／または抗ｍＣＤ４０Ｌ抗体によって検出されるか否かを決定するために、プレートをｍＣＤ４０または抗ｍＣＤ４０Ｌ抗体によってコーティングすることによってＥＬＩＳＡアッセイを実施した。結果を表３２に示し、遺伝子操作された細菌によって分泌されたｍＣＤ４０Ｌ１（４７−２６０）およびｍＣＤ４０Ｌ２（１１２−２６０）が、ｍＣＤ４０に結合することができることを示している。
（実施例２７）
ＳＩＲＰαおよびバリアントならびに抗ＣＤ４７ ｓｃＦｖの分泌
抗ＳＩＲＰＡを分泌することができる遺伝子操作された細菌を生成するために、表３３に示される構築物を本明細書に記載される方法に従って生成した。配列番号１０９４〜１１０４および配列番号１１０５〜１１２１を含む配列を示す。
Ｅ．ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅ株ＳＹＮ１５５７、ＳＹＮ２９９６、ＳＹＮ３１５９、ＳＹＮ３１６０、ＳＹＮ３０２１、ＳＹＮ３０２０、およびＳＹＮ３１６１をＬＢ培地中で一晩成長させた。培養物をＬＢ中で１：１００に希釈し、振とう（２００ｒｐｍ）させながら吸光度が０．８となるまで成長させ、その時点で培養物を室温に冷却し、無水テトラサイクリン（ＡＴＣ）を１００ｎｇ／ｍＬの濃度で培養物に添加し、ＳＩＲＰα、もしくはＳＩＲＰαバリアント、またはＣＤ４７ ｓｃＦｖの発現を誘導した。
１８時間誘導後、細胞を遠心沈降させ、上清を収集した。無細胞培地を生成するために、清澄な上清を、０．２２ミクロンフィルターを通してさらに濾過し、いかなる残留細菌も除去し、氷上に置いた。
次に、上清をウェスタンブロットによって解析した。上清２５μＬ中のタンパク質をＰＶＤＦ膜に転写し、ＳＩＲＰαおよびＳＩＲＰαバリアントならびに抗ＣＤ４７ ｓｃＦｖを、抗Ｖ５−ＨＲＰ抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）を使用して検出した。結果を図６７に示す。ＷＴ ｍＳＩＲＰαに関して４６ｋＤａ、ＣＶ１ＳＩＲＰαに関して２０ｋＤａ、ＦＤ６ｘ２ ＳＩＲＰαに関して３３ｋＤａ、ＦＤ６ＳＩＲＰα−ＩｇＧ４に関して４２ｋＤａ、ＣＶ１ＳＩＲＰα−ＩｇＧ４に関して４２ｋＤａ、および抗ＣＤ４７ ｓｃＦｖに関して３０ｋＤａ付近に、それぞれ単一のバンドが検出された。
遺伝子操作されたＥ．ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅによって分泌された野生型ＳＩＲＰα、ＳＩＲＰαバリアント、および抗ＣＤ４７−ｓｃＦｖが、ＣＤ４７に機能的に結合することができるか否か、ならびに／または抗ＳＩＲＰα抗体によって検出されるか否かを決定するために、プレートを対応する抗体またはリガンドによってコーティングすることによってＥＬＩＳＡアッセイを実施した。結果を表３４に示し、遺伝子操作された細菌によって分泌されたｍＳＩＲＰαおよび抗ｍＣＤ４７ｓｃＦｖの両方がｍＣＤ４７に結合することができることを示している。
Ｅ．ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅから分泌されたＳＩＲＰα、ＳＩＲＰαバリアント、および抗ＣＤ４７ ｓｃＦｖが、マウス細胞上のＣＤ４７に結合するか否かを決定するために、ＣＴ２６細胞を使用してフローサイトメトリー分析を実施した。ＣＴ２６は、その細胞表面上にＣＤ４７を発現するマウス結腸癌細胞系である。
ＣＴ２６細胞を、１０％ＦＢＳおよび１％ペニシリン−ストレプトマイシンを含むダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）において成長させた。細胞を遠心沈降させ、上清を吸引し、ペレットをＤ−ＰＢＳ １ｍＬ中に再懸濁させ、冷却したアッセイ管に移し（１×１０６個細胞）、Ｄ−ＰＢＳ中で３回洗浄した。細胞を、０．５％ＢＳＡを含むＤ−ＰＢＳ中に再懸濁させ、これに上清１０μＬ（１０倍濃縮）を添加し、４Ｃで１時間インキュベートした。ＳＹＮ１５５７からの上清をベースライン陰性対照として使用した。次に細胞をＰＢＳ ０．５ｍｌ中に再懸濁させ、適当な濃度に希釈し、フローサイトメーターにおいて分析した。結果を（図６８および図６９）に示す。ベースラインと比較して、分泌されたＳＩＲＰα、ＳＩＲＰαバリアント、および抗ＣＤ４７ ｓｃＦｖを含む試料では集団のシフトが観察され、ＣＶ１ＳＩＲＰα−ＩｇＧ４を発現するＳＹＮ３０２１については最大のシフトが観察される。
次に、競合アッセイを実施して、遺伝子操作された細菌によって分泌されたマウスＳＩＲＰαが、ＣＴ２６細胞上のマウスＣＤ４７に対する組換えｍＳＩＲＰαまたは抗ＣＤ４７抗体の結合と競合できるか否かを決定した。ＣＴ２６細胞を成長させ、組換えＳＩＲＰα（Ｒｎｄｓｙｓｔｅｍｓ）または抗ＣＤ４７抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）を、分泌されたＦＤ６ｘ２ｓｉｒｐαまたはＦＤ６ｓｉｒｐαｈＩｇＧ４のインキュベーションの間に添加したことを除き、本質的に上記の通りにフローサイトメトリープロトコールを実施した。図７０および図７１はそれぞれ、組換えＳＩＲＰαおよび抗ＣＤ４７抗体との競合の結果を示す。組換えＳＩＲＰαおよび抗ＣＤ４７抗体はいずれも、ＣＴ２６細胞上のＣＤ４７に対する結合に関して分泌されたＳＩＲＰαと競合することができた。
（実施例２８）
ヒアルロニダーゼの分泌
ヒアルロニダーゼを分泌することができる遺伝子操作された細菌を生成するために、構築物を、本明細書に記載される方法に従って生成した（ＳＹＮ２９９８：ＮｉｓｓｌｅΔＰＡＬ：：ＣｍＲ；ｐ１５Ａ−ｐｔｅｔ−ＲＢＳ−ＰｈｏＡ−−ＦＬＡＧ−ヒトヒアルロニダーゼ−Ｖ５− Ｈｉｓ ｔａｇｓ；ＳＹＮ２９９７：ＮｉｓｓｌｅΔＰＡＬ：：ＣｍＲ；ｐ１５Ａ−ｐｔｅｔ−ＲＢＳ−ＰｈｏＡ−ＦＬＡＧ−ヒトヒアルロニダーゼ−Ｖ５−Ｈｉｓ；ＳＹＮ３３６９：ＮｉｓｓｌｅΔＰＡＬ：：ＣｍＲ；ｐ１５Ａ−ｐｔｅｔ−ＲＢＳ−ＰｈｏＡ−ＦＬＡＧ−ｌｅｅｃｈヒルヒアルロニダーゼ−Ｖ５−Ｈｉｓ）。
Ｅ．ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅ株ＳＹＮ１５５７、ＳＹＮ２９９７（マウスヒアルロニダーゼを分泌する）、ＳＹＮ２９９８（ヒトヒアルロニダーゼを分泌する）およびＳＹＮ３３６９（ｌｅｅｃｈヒルヒアルロニダーゼを分泌する）を、ＬＢ培地中で一晩成長させた。培養物をＬＢ中で１：１００に希釈し、振とう（２００ｒｐｍ）させながら吸光度が０．８となるまで成長させ、その時点で培養物を室温に冷却し、無水テトラサイクリン（ＡＴＣ）を１００ｎｇ／ｍＬの濃度で培養物に添加し、ヒアルロニダーゼの発現を誘導した。
１８時間誘導後、細胞を遠心沈降させ、上清を収集した。無細胞培地を生成するために、澄明な上清を、０．２２ミクロンフィルターを通してさらに濾過し、いかなる残留細菌も除去し、氷上に置いた。
次に、上清をウェスタンブロットによって解析した。上清２５μＬ中のタンパク質をＰＶＤＦ膜に転写し、抗Ｖ５−ＨＲＰ抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）を使用してヒアルロニダーゼを検出した。結果を図７２に示す。分泌されたマウスおよびヒトヒアルロニダーゼの両方に関して５０ｋＤａ付近、ならびにｌｅｅｃｈヒルヒアルロニダーゼに関して５７ｋＤａ付近で単一のバンドを検出した。
遺伝子操作されたＥ．ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅによって分泌されたヒアルロニダーゼが活性であるか否かを決定するために、ビオチン化ヒアルロネートコーティングプレートを使用して、製造元の説明書に従って、ヒアルロナンの切断能に関するヒアルロニダーゼ活性アッセイを実施した。簡単に説明すると、ヒアルロニダーゼはポリマーを切断し、それによってプレート上のビオチンが失われ、次いで、これをストレプトアビジン−ＨＰＲおよび基質によって検出することができる。結果を図７４Ａ〜７４Ｂに示し、遺伝子操作された細菌によって分泌されるヒアルロニダーゼが、ヒアルロナンを分解することができることを示している。親株ＳＹＮ１５５７を陰性対照として使用した。分泌されたｌｅｅｃｈヒルヒアルロニダーゼに関して得られた結果を図７４Ａ〜７４Ｂに示す。
（実施例２９）
操作されたＩＬ−１５産生Ｅ．ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅ株
株の構築および生化学分析：
生物活性インターロイキン１５（ＩＬ−１５）を分泌することができる操作されたＥ．ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅ株を生成するために、ＩＬ−１５が、Ｓｕｓｈｉドメインとして公知の機能的受容体の形成にとって必要なＩＬ−１５Ｒαの最小の領域に融合されている融合タンパク質を構築した。ＩＬ−１５およびＩＬ−１５Ｒαは、機能的複合体を形成し、これはトランスプレゼンテーションと呼ばれるプロセスにおいて、ＩＬ−２Ｒβおよびγｃを発現する隣接するリンパ球の細胞のシグナル伝達、活性化および増殖を刺激する（例えば、Ｏｃｈｏａら、Ｈｉｇｈ−ｄｅｎｓｉｔｙ ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎｓ ｄｅｌｉｖｅｒｉｎｇ ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１５；Ｏｎｃｏｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、２０１３年４月１日；２巻（４号）：ｅ２３４１０頁を参照されたい）。ＩＬ−１５の生物活性は、２つの異なる改変：ＩＬ−１５のアミノ酸７２位でのアスパラギンからアスパラギン酸への置換（Ｚｈｕ Ｘ、Ｍａｒｃｕｓ ＷＤ、Ｘｕ Ｗ， Ｌｅｅ ＨＩ、Ｈａｎ Ｋ、Ｅｇａｎ ＪＯ、 Ｙｏｖａｎｄｉｃｈ ＪＬ、Ｒｈｏｄｅ ＰＲ、Ｗｏｎｇ ＨＣ． Ｎｏｖｅｌ ｈｕｍａｎ ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１５ ａｇｏｎｉｓｔｓ． Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２００９年；１８３巻：３５９８〜３６０７頁）および／または細胞会合ＩＬ−１５ＲαによるＩＬ−１５のトランスプレゼンテーションの模倣によるＩＬ−１５Ｒαのｓｕｓｈｉドメインとの直接融合（Ｍｏｒｔｉｅｒら、Ｓｏｌｕｂｌｅ ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１５ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ａｌｐｈａ（ＩＬ−１５Ｒ ａｌｐｈａ）−ｓｕｓｈｉ ａｓ ａ ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ａｎｄ ｐｏｔｅｎｔ ａｇｏｎｉｓｔ ｏｆ ＩＬ−１５ ａｃｔｉｏｎ ｔｈｒｏｕｇｈ ＩＬ−１５Ｒ ｂｅｔａｇａｍｍａ． Ｈｙｐｅｒａｇｏｎｉｓｔ ＩＬ−１５ ｘ ＩＬ−１５Ｒ ａｌｐｈａ ｆｕｓｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎｓ． Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２００６年；２８１巻：１６１２〜９頁）によって大きく改善される。
改変された組換えＩＬ−１５−Ｓｕｓｈｉ融合タンパク質を産生するために、Ｎ７２Ｄ変異を有するＩＬ−１５単量体を、２０アミノ酸リンカーによって連結されたｓｕｓｈｉドメインのＣ末端（７８アミノ酸）に融合した。ＩＬ−１５Ｒ ｓｕｓｈｉドメインのＮ末端に、タグの検出、精製、および除去を促進するために、ＦＬＡＧ−タグおよび第Ｘａ因子切断部位を含めた。ペリプラズムへの移行を促進するために、ＩＬ１５融合タンパク質を１０種のメンバーのプラスミドライブラリにクローニングした。分泌された融合タンパク質のコード配列をＥ．ｃｏｌｉでの発現に関してコドン最適化し、ＩＤＴ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓに二本鎖ＤＮＡ断片として注文した。ＤＮＡを受領した後、標準的なクローニング手順を使用して、これを消化し、１０種のメンバーのプラスミドライブラリにライゲートした。プラスミドライブラリの各メンバーは、低コピー数プラスミド骨格、ならびに多様な最適化リボソーム結合部位および分泌タグの発現を駆動するＰｔｅｔプロモーターを含む。ＩＬ−１５融合体を分泌タグのＣ末端にクローニングした後、プラスミドをＳＹＮ１５５７（ΔＰＡＬ、拡散性外膜（ＤＯＭ）表現型）に形質転換し、ＩＬ−１５−Ｓｕｓｈｉ分泌株ＳＹＮ３５１６−ＳＹＮ３５２５を作製した。構築物配列の非制限的な例には、配列番号１１３２〜１１３７および配列番号１１３８〜１１４４が挙げられる。表３５は、ＩＬ−１５−Ｓｕｓｈｉ株の説明を提供する。表３６は、ＷＴ ＩＬ−１５を使用して生成した株の一覧を提供する。
ＳＹＮ３５２５によるＩＬ−１５の産生およびｉｎ ｖｉｔｒｏ定量
ＩＬ−１５の産生をアッセイするため、および／または生物活性を定量するために、培養物を成長させ、誘導し、上清を回収し、ＥＬＩＳＡによって定量化した。アッセイ日の前に、陰性対照株（ＳＹＮ１５５７）およびＩＬ−１５−ｓｕｓｈｉドメイン産生株（ＳＹＮ３５１６−ＳＹＮ３５２５）の両方をＬＢ寒天プレート上に播き、適切な抗生物質と共に３７℃で成長させた。２ＹＴブロスの２ｍＬ開始培養物に、成長させる誘導培養物５０ｍＬ毎に単一のコロニーを接種し、３７℃で２時間成長させ、８０００×ｇで１０分間遠心沈降させ、細胞を、アンヒドロテトラサイクリン（ａＴｃ）インデューサー（１００ｎｇ／ｍＬ）を有する当初の体積の２ＹＴ培地中に再懸濁させた。これらの培養物を３０℃に置き、４時間振とうさせ、ＩＬ−１５−ｓｕｓｈｉ融合タンパク質産生を誘導した。次に、培養物をインキュベータから取り出し、２０，０００×ｇで１０分間遠心分離し、全ての細胞をペレットにして、上清を、０．２２μｍフィルターの中に通過させて、滅菌した上清を生じた。これらの上清を細胞に基づくアッセイにおいて使用した。
プラスミドライブラリによるＩＬ−１５融合体の産生を評価するために、ＳＹＮ１５５７およびＩＬ−１５産生ライブラリの培養物を誘導し、２連で収集した。これらの上清を連続希釈し、ＩＬ−１５ ＥＬＩＳＡキット（ヒトＩＬ−１５ Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ ＥＬＩＳＡキット−Ｄ１５００、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）を使用して定量化した。表３７に示した分泌ライブラリのスクリーニングからのデータは、リーダーペプチドとしてＥ．ｃｏｌｉからのＰｐｉＡ分泌シグナルを含むＳＹＮ３５２５から最大の産生を示した。ＳＹＮ１５５７上清は、ＥＬＩＳＡにおいて交叉反応性を示さなかった（データは示していない）。
ＳＹＮ３５２５からのＩＬ−１５産生をさらに評価するために、株を成長させて、バッフル付きフラスコにおいて最大の収率を生成するように誘導した。ＳＹＮ３５２５の濾過した上清から、ＳＹＮ１５５７およびＳＹＮ３５２５の試料を３連で希釈し、ＥＬＩＳＡキット（ヒトＩＬ−１５ Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ ＥＬＩＳＡキット−Ｄ１５００、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）において実行した。これらの分析の結果を表３８に示す。結果は、最大の誘導条件下で、ＳＹＮ３５２５上清がＩＬ−１５ ＥＬＩＳＡアッセイにおいて正に反応した材料の７３３〜７９５ｎｇ／ｍＬの間を含むことを示した。これに対し、ＳＹＮ１５５７上清は、検出可能なレベルを有しなかった（示していない）。
比較のために、ＷＴ ＩＬ−１５を発現する構築物からの分泌を表３９に示す。
（実施例３０）
細菌によって分泌されたＩＬ−１５の機能的アッセイ
次に、機能的アッセイを実施してＳＹＮ３５２５から分泌されたＩＬ−１５が機能的であることを証明した。ＳＴＡＴ３およびＳＴＡＴ５は、リガンドが結合するとＩＬ−１５Ｒアルファによってリン酸化されることが示されている。
Ｔ細胞を、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ ｕｎｔｏｕｃｈｅｄ ｐａｎ−Ｔ細胞キット（収率＝約５ｅ７個細胞／調製物）を介してヒトロイコフェレーシスから精製した。ＩＬ１５Ｒａ発現を、フィトヘマグルチニンＰ（ＰＨＡ）による４８時間の軽度の刺激によって誘導した。活性化Ｔ細胞を、ＩＬ１５発現細菌ＳＹＮ３５２５からの上清によって１５分間処置した。処置した細胞をパラホルムアルデヒドに基づく溶液中で固定した後、９０％メタノール中で厳しい透過処理を行った。ホスホ−ＳＴＡＴ５のモジュレーションを、ＩＬ１５Ｒ＋ＣＤ３＋細胞におけるマルチカラーフローサイトメトリーによって定量化した。結果を図４６に示し、ＳＹＮ３５２５由来ＩＬ１５が、ｒｈＩＬ１５のそれと同等の生物活性を呈することを示す。２つの個々の細菌調製物からの上清の間で一貫した結果が観察された。
（実施例３１）
分泌のための二量体化ＩＬ−１２の構築
株の操作：生物活性インターロイキン１２（ＩＬ−１２）ヘテロ二量体を分泌することができる、操作されたＥ．ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅ株を生成するために、２つのインターロイキン−１２単量体サブユニット（ＩＬ−１２Ａ（ｐ３５）およびＩＬ−１２Ｂ（ｐ４０））がリンカーによって共有結合により連結されている構築物を生成した。
Ｅ．ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅから産生された組換えヒトＩＬ−１２タンパク質の二量体化を促進するために、１５アミノ酸のリンカー「ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ」（配列番号１２４７）を２つの単量体サブユニット（ＩＬ−１２Ａ（ｐ３５）およびＩＬ−１２Ｂ（ｐ４０）の間に挿入し、強制的な二量体ヒトＩＬ−１２（ジＩＬ−１２）融合タンパク質を産生し、配列をコドン最適化した。
ペリプラズムへの移行を促進するために、分泌タグをジＩＬ−１２融合タンパク質のＮ末端に付加した。誘導性Ｐｔｅｔプロモーター、リボソーム結合部位、ジＩＬ−１２コード配列、および他の必要なリンカーのエレメントを含むＤＮＡ配列を、ＩＤＴ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓが合成し、その後高コピー数プラスミドベクターにクローニングした。プラスミドを、ＳＹＮ１５５５、ＳＹＮ１５５６、ＳＹＮ１５５７、またはＳＹＮ１６２５（ｎｌｐｌ、ｔｏｌＡ、ＰＡＬ、またはｌｐｐ欠失をそれぞれ含み、拡散性膜表現型を作製する）に形質転換し、二量体化ヒトＩＬ−１２（ジＩＬ−１２）分泌株を作製した。
Ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイのためのＳＹＮ３４６６からＳＹＮ３５０５によるジＩＬ−１２の産生：
ＩＬ−１２の産生に関してアッセイするためおよび／または生物活性を定量化するために、培養物を成長させて誘導し、その後上清を収集し、シェーカープレートを使用して以下のようにＥＬＩＳＡを介して定量化した。陰性対照株（ＳＹＮ１５５５、ＳＹＮ１５５６、ＳＹＮ１５５７、またはＳＹＮ１６２５）およびジＩＬ−１２産生株（ＳＹＮ３４６６からＳＹＮ３５０５）の両方をＬＢ寒天プレート上に播き、それぞれ、クロラムフェニコールまたはクロラムフェニコールとカルベニシリンと共に３７℃で成長させた。一晩成長させた後、個々のコロニーを採取して、成長させる将来のシェーカープレートにおいて２ＹＴブロスの４ｍＬ開始培養物に接種するために使用した。開始培養物には、寒天プレートで使用した同じ抗生物質を接種した。開始培養物が飽和に達すると、培養物を、適切な抗生物質を含む２ＹＴを含む新しいシェーカープレートに１：２５に逆希釈した。この開始培養物を、ＯＤ６００＝約０．８〜１となるまで３７℃で２時間成長させた。次に培養物を、ａＴｃインデューサー（１００マイクロｇ／ｍＬ）を添加することによって誘導した。これらの誘導した培養物を、振とうさせながら３０℃で４時間インキュベートし、ＩＬ−１２産生を促進した。
産生期が終了した後、培養物のシェーカープレートをインキュベータから取り出し、２００００×ｇで１０分間遠心分離し、全ての細胞をペレットにした。上清をＥＬＩＳＡ分析のために維持した。
ＥＬＩＳＡによる上清中のジＩＬ−１２の定量：
上清中のジＩＬ−１２の量を評価するために、試料を、Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓのヒトＩＬ−１２ ｐ７０ Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ ＥＬＩＳＡキットを使用してアッセイした。これらの分析の結果を、表４２に示す。結果は、上清が、ＩＬ−１２ ＥＬＩＳＡアッセイにおいて正に反応する材料の１７から３０９ｐｇ／ｍＬの間を含むことを示した。これに対し、ＳＹＮ１５５７上清は、検出不能レベルを有した。
（実施例３２）
操作されたＩＬ−１５産生Ｅ．ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅ株
株の操作
生物活性インターロイキン１５（ＩＬ−１５）を分泌することができる操作されたＥ．ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅ株を生成するために、Ｓｕｓｈｉドメインとして公知の、機能的受容体の形成にとって必要なＩＬ−１５Ｒαの最小領域に、ＩＬ−１５を融合させる融合タンパク質を構築した。ＩＬ−１５およびＩＬ−１５Ｒαは、機能的複合体を形成し、これはトランスプレゼンテーションと呼ばれるプロセスにおいて、ＩＬ−２Ｒβおよびγｃを発現する隣接するリンパ球の細胞のシグナリング、活性化、および増殖を刺激する（例えば、Ｏｃｈｏａら、Ｈｉｇｈ−ｄｅｎｓｉｔｙ ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎｓ ｄｅｌｉｖｅｒｉｎｇ ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１５；Ｏｎｃｏｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．２０１３年４月１日；２巻（４号）：ｅ２３４１０頁を参照されたい）。ＩＬ−１５の生物活性は、細胞会合ＩＬ−１５ＲαによるＩＬ−１５のトランスプレゼンテーションを模倣することによって、ＩＬ−１５Ｒαのｓｕｓｈｉドメインとの直接融合によって大きく改善する（Ｍｏｒｔｉｅｒら、Ｓｏｌｕｂｌｅ ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１５ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ａｌｐｈａ （ＩＬ−１５Ｒ ａｌｐｈａ） −ｓｕｓｈｉ ａｓ ａ ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ａｎｄ ｐｏｔｅｎｔ ａｇｏｎｉｓｔ ｏｆ ＩＬ−１５ ａｃｔｉｏｎ ｔｈｒｏｕｇｈ ＩＬ−１５Ｒ ｂｅｔａｇａｍｍａ． Ｈｙｐｅｒａｇｏｎｉｓｔ ＩＬ−１５ ｘ ＩＬ−１５Ｒ ａｌｐｈａ ｆｕｓｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎｓ． Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ、２００６年；２８１巻：１６１２〜９頁）。
組換えＩＬ−１５−Ｓｕｓｈｉ融合タンパク質を産生するために、ＩＬ−１５単量体を２０アミノ酸リンカーによって連結されたｓｕｓｈｉドメインのＣ末端に融合させた。ペリプラズムへの移行を促進するために、１９４１０、ｔｏｒｔ、またはｐｅｌＢ分泌タグをＩＬ−１５−Ｓｕｓｈｉ融合タンパク質のＮ末端に添加した。Ｐｔｅｔプロモーター、ＲＢＳ、ＩＬ−１５−Ｓｕｓｈｉのコード配列、および他の必要なリンカーを含むＤＮＡ配列は、ＩＤＴ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓが合成し、その後、ｔｅｔ誘導性プロモーターの制御下でＩＤＴ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓが提供する高コピー数プラスミドベクターにクローニングした。プラスミドをＳＹＮ１５５７（ΔＰＡＬ、拡散可能な外膜（ＤＯＭ）表現型）またはＳＹＮ９４（ＰＡＬ欠失なしのＥ．ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅ株）に形質転換し、ＩＬ−１５−Ｓｕｓｈｉ分泌株ＳＹＮ３４５８からＳＹＮ３４６３を作製した。表４３および表４４は、構築物配列の多数の非制限的な例を記載する。
Ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイのためのＳＹＮ３４５８からＳＹＮ３４６３によるＩＬ−１５の産生：
ＩＬ−１５の産生に関してアッセイするためおよび／または生物活性を定量化するために、培養物を成長させて誘導し、上清を収集してＥＬＩＳＡによって定量化した。アッセイ日の前に、陰性対照株（ＳＹＮ１５５７）およびＩＬ−１５−ｓｕｓｈｉドメイン産生株ＳＹＮ３４５８からＳＹＮ３４６３の両方を、ＬＢ寒天プレート上に播き、適切な抗生物質と共に３７℃で成長させた。２ＹＴブロスの２ｍＬ開始培養物に、成長させる誘導した培養物５０ｍＬ毎に単一のコロニーを接種し、３７℃で２時間成長させ、８０００×ｇで１０分間遠心沈降させ、細胞をアンヒドロテトラサイクリン（ａＴｃ）インデューサー（１００μｇ／ｍＬ）を有する当初の体積の２ＹＴ培地に再懸濁した。これらの培養物を３０℃置き、４時間振とうさせ、ＩＬ−１５−ｓｕｓｈｉ融合タンパク質の産生を誘導した。次に、培養物をインキュベータから取り出して、２０，０００×ｇで１０分間遠心分離し、全ての細胞をペレットにして、上清を、０．２２μｍフィルターを通して濾過し、滅菌した上清を生じた。これらの上清を細胞に基づくアッセイにおいて使用した。
ＥＬＩＳＡによるＳＹＮ３４５８からＳＹＮ３４６３の上清中のＩＬ−１５の定量化：
濾過した上清中のＩＬ−１５の産生を評価するために、ＳＹＮ１５５７およびＳＹＮ３４５８からＳＹＮ３４６３の試料を３連で希釈し、ヒトＩＬ−１５ Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ ＥＬＩＳＡキット（Ｒａ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）において実行した。これらの分析の結果を表４５に示す。結果は、ＳＹＮ３４５８からＳＹＮ３４６３の上清が、ＩＬ−１５ ＥＬＩＳＡアッセイにおいて正に反応する材料の４〜２７５ｎｇ／ｍＬの間を含むことを示した。これに対し、ＳＹＮ９４およびＳＹＮ１５５７上清は、検出不能レベルを有した（示していない）。
（実施例３３）
ＣＸＣＬ１０の分泌
組換えＣＸＣＬ１０ケモカインを産生するために、合成構築物を考案した（データは提供していない）。ＣＸＣＬ１０タンパク質の分泌型／可溶性型を、Ｅ．ｃｏｌｉにおける発現に関してコドン最適化し、ＩＤＴ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓに二本鎖ＤＮＡ断片として注文した。ペリプラズムへの移行を促進するために、ＣＸＣＬ１０可溶性タンパク質を、１０種のメンバーのプラスミドライブラリにクローニングした。ＤＮＡを受領後、標準的なクローニング手順を使用して、これを消化し、１０種のメンバーのプラスミドライブラリにライゲートした。プラスミドライブラリの各メンバーは、低コピー数プラスミド骨格、および様々な最適化リボソーム結合部位の発現を駆動するＰｔｅｔプロモーター、および分泌タグを含む。ＣＸＣＬ１０を分泌タグのＣ末端にクローニングした後、プラスミドをＳＹＮ１５５７（ΔＰＡＬ、拡散性外膜（ＤＯＭ）表現型）に形質転換し、ＣＸＣＬ１０分泌株、ＳＹＮ３４０４およびＳＹＮ３４０６〜ＳＹＮ３４１４を作製した。構築物の配列は、配列番号１２０５、配列番号１２０６、配列番号１２０８、および配列番号１２０９を含む。
ＣＸＣＬ１０の産生に関してアッセイするためおよび／または生物活性を定量化するために、培養物を成長させて誘導し、上清を収集してＥＬＩＳＡによって定量化した。アッセイ日の前に、陰性対照株（ＳＹＮ１５５７）およびＣＸＣＬ１０産生株（ＳＹＮ３４０４〜ＳＹＮ３４１４）の両方を、ＬＢ寒天プレート上に播き、適切な抗生物質と共に３７℃で成長させた。２ＹＴブロスの２ｍＬ開始培養物に、成長させる誘導した培養物５０ｍＬ毎に単一のコロニーを接種し、３７℃で２時間成長させ、８０００×ｇで１０分間遠心沈降させ、細胞をアンヒドロテトラサイクリン（ａＴｃ）インデューサー（１００ｎｇ／ｍＬ）を有する当初の体積の２ＹＴ培地に再懸濁した。これらの培養物を３０℃に置き、４時間振とうさせ、ＣＸＣＬ１０タンパク質の産生を誘導した。次に、培養物をインキュベータから取り出して、２０，０００×ｇで１０分間遠心分離して、全ての細胞をペレットにして、上清を、０．２２μｍフィルターの中に通過させて、滅菌した上清を生じた。これらの上清を細胞に基づくアッセイにおいて使用した。
プラスミドライブラリによるＣＸＣＬ１０の産生を評価するために、ＳＹＮ１５５７およびＣＸＣＬ１０産生ライブラリの培養物を誘導し、２連で収集した。これらの上清を連続希釈し、ＣＸＣＬ１０ ＥＬＩＳＡキット（ヒトＣＸＣＬ１０／ＩＰ−１０ Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ ＥＬＩＳＡキット−ＤＩＰ１００，Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）を使用して定量化した。表４７に示す本発明者らの分泌ライブラリのスクリーニングからのデータは、リーダーペプチドとしてＥ．ｃｏｌｉからのＰｈｏＡ分泌シグナルを含むＳＹＮ３４１３から最大の産生を示す。ＳＹＮ１５５７の上清は、ＥＬＩＳＡにおいて交叉反応性を示さなかった（データは示していない）。
ＳＹＮ３４１３からのＣＸＣＬ１０の産生をさらに評価するために、株をバッフル付きフラスコ中で最大収率を生成するように成長させて誘導した。ＳＹＮ３４１３の濾過した上清から、ＳＹＮ１５５７およびＳＹＮ３４１３の試料を３連で希釈し、ＥＬＩＳＡキット（ヒトＣＸＣＬ１０／ＩＰ−１０ Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ ＥＬＩＳＡキット−ＤＩＰ１００、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）において実行した。これらの分析の結果を表１１２に示す。結果は、最大の誘導条件では、ＳＹＮ３４１３上清が、ＣＸＣＬ１０ ＥＬＩＳＡアッセイにおいて正に反応する材料の１９９〜２３２ｎｇ／ｍＬの間を含むことを示した。これに対し、ＳＹＮ１５５７上清は検出可能なレベルを有しなかった（示していない）。
ＣＸＣＬ１０の機能的アッセイ
上記の株のいずれかから分泌されたＣＸＣＬ１０が、機能的であるか否かを決定するために、走化性アッセイを、本質的にＭｉｋｕｃｋｉら（その内容の全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｍｉｋｕｃｋｉら、Ｎｏｎ−ｒｅｄｕｎｄａｎｔ Ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔ ｆｏｒ ＣＸＣＲ３ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ
ｄｕｒｉｎｇ Ｔｕｍｏｒｉｃｉｄａｌ Ｔ Ｃｅｌｌ Ｔｒａｆｆｉｃｋｉｎｇ ａｃｒｏｓｓ Ｔｕｍｏｒ Ｖａｓｃｕｌａｒ Ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔｓ；Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ．２０１５年；６巻：７４５８頁）に記載されているとおりに実施する。
簡単に説明すると、ｃｅｌｌ ｔｒａｃｅ標識ナイーブ（または拡大増殖した）ヒトＣＤ８＋Ｔ細胞を、ＰＴＸまたは抗ＣＸＣＬ１０の存在下または非存在下で、上部にＴ細胞（５×１０５個細胞）を有し、下部にｒＣＸＣＬ１０／上清を有する２４ウェルトランスウェルプレート（５μＭ孔）に移す。−＞細胞を３時間インキュベートし、遊走した細胞をフローサイトメトリーによって計数する。あるいは、ホスホＡＫＴを、フローサイトメトリー、ウェスタンブロット、またはＥＬＩＳＡによって測定する。
（実施例３４）
ＳＴＩＮＧアゴニスト産生株の生成
ＳＴＩＮＧアゴニスト株を生成するために、ＤａｃＡ（ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ環状ジＡＭＰシンターゼ）を、Ｐｔｅｔプロモーターの制御下でｐ１５にクローニングし、表５０に記載される株を生成した。構築物の配列を要約する。
（実施例３５）
Ｉｎ ｖｉｔｒｏ ＳＴＩＮＧアゴニスト産生
新たに生成した株がｃ−ジ−ＡＭＰを産生する能力を、最初にｉｎ ｖｉｔｒｏでアセスメントした。
Ｅ．ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅ株ＳＹＮ３５２７（ＤａｃＡ構築物を含む）および対照株をＬＢ培地中で一晩成長させた。培養物を、０．５％グルコース（重量／体積）を補充したＭ９最少培地中で１：２５に希釈し、振とう（３５０ｒｐｍ）させながら３７℃で２時間成長させた。培養物を吸光度が０．５となるように希釈し、その時点で無水テトラサイクリン（ＡＴＣ）を培養物に１００ｎｇ／ｍＬの濃度で添加し、ＤａｃＡの発現を誘導した。４時間誘導後、試料を、環状ジヌクレオチド産生のＬＣ／ＭＳ分析のために採取した。試料を５０００ＲＰＭで２０分間遠心分離し、細胞分画と細胞外分画とを分離した。次に細胞ペレットを使用して、細胞内環状ジ−ＡＭＰを決定し、培地上清を使用して、環状ジ−ＡＭＰの細胞外蓄積を決定した。濃度を、ＬＣ／ＭＳを介して決定した。
結果を図２に示し、操作された株が、ｃ−ジ−ＡＭＰを細胞内で産生することができること、および程度は低いものの細胞外でも産生することができることを示している。野生型対照では、環状ジ−ＡＭＰは、細胞内または細胞外分画のいずれにも見出されなかった（データは示していない）。
図３は、本質的に上記の通りに行った後続試験を表す。
（実施例３６）
細菌産生ＳＴＩＮＧアゴニストは免疫応答を誘導する
細菌産生ＳＴＩＮＧアゴニストまたは細菌の骨格そのものが免疫応答の誘導の原因であるかどうかを決定するために、生きたおよび熱殺菌したＳＹＮ３５２７（テトラサイクリン誘導性プロモーターの制御下にあるプラスミドに基づくＤａｃＡ（ｐ１５−ｐｔｅｔ−ＤａｃＡ）を含む）をＲＡＷ ２６７．４マウスマクロファージ細胞系の上清に添加し、ＩＦＮ−ベータ１ ｍＲＮＡのレベルを測定した。
図４に示すように、ＩＦＮｂ１ ｍＲＮＡ発現は、ｃ−ジ−ＡＭＰ分泌株によって用量依存的に増加するが、熱殺菌した場合には増加しない。
（実施例３７）
ＳＴＩＮＧアゴニスト産生株のｉｎ ｖｉｖｏでの活性
ＳＴＩＮＧアゴニスト産生株ＳＹＮ３５２７（プラスミドに基づく、Ｌｉｓｔｅｒｉａ
ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ由来のテトラサイクリン誘導性ｐ１５ａ Ｐｔｅｔ−ＤａｃＡを含むＥ ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅ）の忍容性、定着、および活性を決定するために、腫瘍体積、重量、およびＴ細胞応答を、Ｂ１６腫瘍モデルにおいてアセスメントした。
試験のための細胞を産生するため、一晩培養物を使用して、抗生物質を含むＬＢ培地５００ｍＬに接種した。株を、培養物が対数期の終期に達するまで（ＯＤ６００＝０．８〜１．０）、振とうさせながら３７Ｃでインキュベートした。収集するために、細胞を５０００ｒｐｍで２０分間遠心沈降させ、培地を吸引し、細胞をＰＢＳによって洗浄し、１５％グリセロールおよびＰＢＳ中に再懸濁させ、アリコートにして、−８０Ｃで凍結した。細胞は、連続プレーティングによって濃度を試験した。
マウスにＢ１６腫瘍を移植し、以下に記載のタイムラインおよび図７Ａに従ってマウスに細菌産生ＳＴＩＮＧアゴニストおよび対照を腫瘍内注射した。様々な時点で採取した試料を、腫瘍１グラムあたりのＣＦＵ数、サイトカイン分析（ＩＦＮ−ベータおよびＴ細胞パネル）、および腫瘍流入領域リンパ節（ＴＤＬＮ）のフローサイトメトリー分析のために処理した。
簡単に説明すると、Ｂ１６細胞を−９日目に各動物の右脇腹にＳＣ（ＰＢＳ中に２×１０ｅ５個細胞／マウス）移植した。−３日目に腫瘍の成長をモニタリングした；腫瘍が１日目に約５０〜８０ｍｍ３に達すると、マウスを、以下のような腫瘍内投与のための群（１群あたりＮ＝１５／マウス５匹／時点）に無作為化した：食塩水（対照、群１）、ＳＹＮ９４（ストレプトマイシン抵抗性Ｎｉｓｓｌｅ、群２、１×１０ｅ７）、およびＳＹＮ３５２７（ＳＴＩＮＧアゴニスト、群３、１×１０ｅ７）。動物に、群に基づいて適切な細菌または食塩水（注射のための対照）を投与した。４時間後、マウスを、１０μｇ ＡＴＣ（アンヒドロテトラサイクリン）の腹腔内注射により処置した。２日目に、各処置群からのマウス５匹を、ＡＴＣ投与の２４時間後に１群あたりマウス５匹犠牲にし（群１〜４）、試料を分析のために処理した。４日目に、マウスの体重を測定し、腫瘍体積を測定し、マウスに適切な処置／群を投与した。４時間後、マウスに１０μｇ ＡＴＣを注射した。５日目に、マウス５匹／群をＡＴＣ投与の２４時間後に犠牲にした。８日目に残りのマウスの腫瘍を秤量し、測定し、マウスに適切な処置／群を投与した。９日目にマウス５匹／群を、ＡＴＣ投与の２４時間後に犠牲にした。
１、４、および９日目での腫瘍体積を図７Ｂに示し、個々のマウスに関して図７Ｃに示し、ＳＹＮ３５２７の投与によって、この期間にわたって腫瘍成長の拒絶または制御が起こったことを示している（９日目でのＳＹＮ３５２７に関してｐ＜０．０２対食塩水対照）。ＳＴＩＮＧアゴニスト産生細菌の投与後９日目での図７Ｄに示す腫瘍重量は、食塩水対照処置と比較して有意な腫瘍の退縮を示す（ｐ＜０．０２）。腫瘍流入領域リンパ節からのリンパ球のフローサイトメトリー分析は、細胞を単細胞懸濁液に入れ、以下の抗体によって染色することによって実施した：抗ＣＤ４−ＡＰＣ、ＴＣＲ−ベータ−ＰＥＣｙ７、ＣＤ８−アルファ−ＢＶ７８５、ＣＤ２５−ＢＶ６５０、およびＦｏｘＰ３−ＰＥ（全て、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄから）。腫瘍の退縮は、フローサイトメトリー分析によって測定すると、腫瘍流入領域リンパ節（ＴＤＬＮ）におけるＴ細胞総数の増加と相関し（ＳＹＮ３５２７に関してｐ＜０．０３対食塩水対照）、このことは腫瘍特異的Ｔ細胞の活性化および拡大増殖を示しうる（図７Ｅ）。
Ｂ１６Ｆ１０腫瘍のＳＹＮ−ＳＴＩＮＧ処置後の腫瘍コロニー形成および細菌成長を評価するために、Ｂ１６Ｆ１０腫瘍を、本質的に上記の通り処置した。処置開始後９日目に腫瘍をホモジナイズした。ホモジネートを連続希釈し、ＬＢ寒天プレート上に播種して、腫瘍内の組織１グラムあたりの生菌数（またはコロニー形成単位）を計算した。確実に細菌がＳＴＩＮＧ回路の発現を失わないようにするために適切な抗生物質を含有する寒天プレート上に、ＳＹＮ−ＳＴＩＮＧ試料を播種した。結果を図７Ｈに示す。
サイトカイン分析に関して、Ｌｕｍｉｎｅｘアッセイを、製造元の説明書に従って実施した。細菌産生ＳＴＩＮＧアゴニストによる生得の免疫系の活性化を決定するために、ＩＮＦ−ベータ１、ＩＬ−６、ＩＬ−１ベータ、およびＭＣＰ−１（Ｃｃｌ２））のレベルをアセスメントし、２日目および９日目の結果を、図８Ａおよび図８Ｂに示す。結果は、ＳＹＮ３５２７によって産生されたＳＴＩＮＧアゴニストが、２日目で腫瘍中のＩＦＮ−ベータ産生を有意に増加することができること（Ｐ＜０．００８対対照またはＳＹＮ９４）、ならびに２日目で食塩水およびＮｉｓｓｌｅ単独と比較してＩＬ−６（ｐ＜０．００６対対照）、ＴＮＦα（＊＊ ｐ＜０．００２対対照、＊ ｐ＜０．０１対ＳＹＮ９４）およびＭＣＰ−１誘導によって示されるように、一般的な生得の免疫応答を誘導することができるが、９日目では誘導できないことを示している。２日目での腫瘍内の生得の応答は、Ｔ細胞関連サイトカインであるグランザイムＢ（ｐ＜０．００６対対照；ｐ＜０．０３対ＳＹＮ９４）、ＩＬ−２（ｐ＜０．０３対対照）、およびＩＬ−１５（ｐ＜０．０５対対照またはＳＹＮ９４）の産生によって示されるように、９日目でＴ細胞関連応答に切り替えられた（図８Ｂ）。図９は、サイトカインが細菌注射（すなわち、ＷＴおよびＳＹＮ−ＳＴＩＮＧ両方）により上方調節されたことを示す。
（実施例３８）
ＭＣ３８腫瘍モデルにおける抗ＰＤ−１および抗ＣＴＬＡ−４の全身投与と組み合わせたアデノシン消費株の活性
アデノシン消費株ＳＹＮ１６５６が、抗ＣＴＬＡ４と抗ＰＤ−１の組合せの抗腫瘍応答を増強する能力を、Ｃ５７ＢＬ／６−ＭＣ３８同系腫瘍モデルにおいてアセスメントした。
試験において使用する細胞を産生するために、一晩培養物を使用して、抗生物質と共にＬＢ培地５００ｍＬに接種した。株を、培養物が、対数期終期（ＯＤ６００＝０．８〜１．０）に達するまで振とうさせながら３７Ｃでインキュベートした。収集するために、細胞を５０００ｒｐｍで２０分間遠心沈降させ、培地を吸引し、細胞をＰＢＳによって洗浄し、１５％グリセロールおよびＰＢＳ中に再懸濁させ、アリコートにして−８０Ｃで凍結した。細胞は、連続プレーティング（ｐｌａｔｉｎｇ）によって濃度を試験した。
表５４における試験デザインに従って、マウスにＭＣ３８腫瘍を移植し、マウスにアデノシン消費細菌を腫瘍内に注射し、抗ＣＴＬＡ−４および抗ＰＤ−１抗体を腹腔内に注射した。ＭＣ３８細胞を、−９日目に各動物の右脇腹にＳＣ（１×１０５個／マウス／１００μＬ）移植した。腫瘍の成長をモニタリングした；１日目に腫瘍が約５０〜８０ｍｍ３に達すると、マウスを表５０に示す処置群に無作為化した。
腫瘍体積および体重を２回の測定の間に１〜２日の間隔を空けて週に３回記録した。
結果は、アデノシン消費株が、ＭＣ３８モデルにおいて抗ＣＴＬＡ−４／抗ＰＤ−１抗体媒介性抗腫瘍活性を改善する能力を有することを示している。具体的には、抗ＰＤ−１／抗ＣＴＬＡ−４群では、完全な応答を示した１２匹中１匹を含むマウス１２匹中５匹が処置に応答した。抗ＰＤ−１／抗ＣＴＬＡ−４＋ＳＹＮ１６５６群では、同数（１２匹中５匹）が応答したが、５匹の応答体のうち少なくとも４匹は完全な応答体であった。
（実施例３９）
５−ＦＣを５−ＦＵに変換するための株の生成
５−ＦＵは、その全身毒性によって制限される一般的な化学療法剤である。しかし、５−ＦＣは、かなり良好に忍容される。ｃｏｄＡ（シトシンデアミナーゼ）、またはｃｏｄＡ（シトシンデアミナーゼ）とｕｐｐ（ウラシルホスホリボシルトランスフェラーゼ）の融合体を使用すると、５−ＦＣを、関連する副作用を最小限にしながら、腫瘍において活性薬型の５Ｆ−ＵＭＰに変換することができる。
５−ＦＵ産生株を生成するために、ｃｏｄＡ（シトシンデアミナーゼ）またはｃｏｄＡ（シトシンデアミナーゼ）とｕｐｐ（ウラシルホスホリボシルトランスフェラーゼ）の融合体を、Ｐｔｅｔプロモーターの制御下でｐ１５ベクターにクローニングし、表５１に記載される株を生成した。
（実施例４０）５−ＦＣの５−ＦＵへのｉｎ ｖｉｔｒｏでの変換
新たに生成した株が５−ＦＣを５−ＦＵに変換する能力を、最初にｉｎ ｖｉｔｒｏでアセスメントした。
上記のＥ．ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅ株ＳＹＮ３５２９、ＳＹＮ３６２０、およびＳＹＮ９４対照（ストレプトマイシン抵抗性を有する野生型Ｎｉｓｓｌｅ）をＬＢ培地中で一晩成長させた。培養物を、０．５％グルコース（重量／体積）を補充したＭ９最少培地中で１：５０に希釈し、振とう（３５０ｒｐｍ）させながら３７℃で２時間成長させ、その時点で無水テトラサイクリン（ＡＴＣ）を培養物に１００ｎｇ／ｍＬの濃度で添加し、ＣｏｄＡまたはＣｏｄＡ−Ｕｐｐ融合体の発現を誘導した。２時間誘導後、培養物を遠心沈降させ、培地を吸引し、細胞ペレットをＭ９＋０．５％グルコース（重量／体積）＋ＡＴＣ（１００ｎｇ／ｍｌ）＋１０ｍＭ ５−フルオロシトシン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（登録商標））に再懸濁させた。次いで、これらの培養物を３７℃のインキュベータに戻し、振とうさせながらさらに２時間インキュベートし、その時点で試料を、５−ＦＵ産生のＬＣ／ＭＳ分析のために除去した。試料を５０００ＲＰＭで２０分間遠心分離して、細胞分画と細胞外分画とを分離した。次に細胞ペレットを使用して、細胞内５−ＦＣおよび５−ＦＵを決定し、培地上清を使用して、５−ＦＵの細胞外蓄積または５−ＦＣの消費を決定した。
結果を、図３４Ａおよび図３４Ｂに示し、操作された株が、野生型対照株より速い速度で５−ＦＣを分解することができ（図３４Ａ）、５−ＦＵを産生することができる（図３４Ｂ）ことを示している。５−ＦＵＭＰに関して利用可能な標準物質がないために、本発明者らは、ＳＹＮ３６２０からの５−ＦＵＭＰの蓄積を測定することができなかった。
（実施例４１）
ＣＴ２６腫瘍モデルにおける５Ｆ−Ｃから５−ＦＵへの変換体のｉｎ ｖｉｖｏ活性
５−ＦＣから５−ＦＵへの変換株ＳＹＮ３５２９（ｐＵＣ−Ｋａｎ−ｔｅｔ−ＣｏｄＡ（シトシンデアミナーゼ）を含む）およびＳＹＮ３６２０（ｐＵＣ−Ｋａｎ−ｔｅｔ−ＣｏｄＡ：：Ｕｐｐ融合体を含む）のｉｎ ｖｉｖｏ活性および有効性を決定するために、腫瘍体積をＣＴ２６腫瘍モデルにおいてアセスメントし、ＰＢＳ対照と比較した。
試験のための細胞を産生するために、一晩培養物を使用して、抗生物質を含むＬＢ培地５００ｍＬに接種した。株を、培養物が対数期の終期に達するまで（ＯＤ６００＝０．８〜１．０）、振とうさせながら３７Ｃでインキュベートした。収集するために、細胞を５０００ｒｐｍで２０分間遠心沈降させ、培地を吸引し、細胞をＰＢＳで洗浄し、１５％グリセロールおよびＰＢＳ中に再懸濁させ、アリコートにして、−８０Ｃで凍結した。細胞を連続プレーティングにより濃度試験した。
以下および図３５Ａに記載されるタイムラインに従って、マウスにＣＴ２６腫瘍を移植し、５−ＦＣを５−ＦＵに変換することができる細菌産生酵素またはビヒクル対照を腫瘍内に注射し、５−ＦＣを投与した。腫瘍体積を様々な時点で測定し、実験終了時に腫瘍を秤量し、処理して、株の生物活性の測定として５−ＦＣの相対的消費を評価した。
簡単に説明すると、ＣＴ２６細胞を−１５日目に各動物の右脇腹にＳＣ（ＰＢＳ中で１×１０６個細胞／マウス）移植した。腫瘍の成長を、腫瘍が約１５０〜４５０ｍｍ３に達するまでモニタリングした。０日目に、マウスを以下のように腫瘍内投与の群（１群あたりＮ＝５）に無作為化した：ＰＢＳ（群１、ビヒクル対照）、ＳＹＮ３５２９（群２、１×１０７ＣＦＵ）、ＳＹＮ３６２０（群３、１×１０７ＣＦＵ）。腫瘍サイズを測定し、０、２、および５日目にＡＴＣ（１μｇ Ｉ．Ｐ．）投与の４時間後に、マウスに細菌またはＰＢＳをＩ．Ｔ．注射した。３日目に開始して、５−ＦＣ（５００ｍｇ／ｋｇ）をＩＰ注射によって毎日投与した。マウスを６日目に最終分析のために犠牲にした。
０、２、および５日目での平均腫瘍体積を図３５Ｂに示し、個々のマウスに関して図３５Ｃに示し、５−ＦＣと共にＳＹＮ３５２９またはＳＹＮ３５６０のいずれかを投与することにより、ＰＢＳ対照と比較してこの期間にわたって腫瘍成長の鈍化が起こることを示している。図３５Ｄに示す、細菌投与の６日後で５−ＦＣ投与の３日後の腫瘍重量は、ＰＢＳ対照処置と比較して腫瘍質量の低減を示す。腫瘍ホモジネートの質量分析により、ＰＢＳ対照と比較して細菌定着腫瘍では５−ＦＣレベルが低減することが証明され、５−ＦＣがその活性型５−ＦＵへとその場で変換されたことを示唆している（図３５Ｅ）。
（実施例４２）
キヌレニン消費体とＳＴＩＮＧアゴニスト産生体の組合せの生成および株の活性のｉｎ ｖｉｔｒｏ測定
キヌレニンを消費してＳＴＩＮＧアゴニストを産生する株を生成するために、ＳＹＮ２０２８（Ｎｉｓｓｌｅ ＨＡ３／４：：ＰＳｙｎＪ２３１１９−ｐＫｙｎａｓｅ ＴｒｐＥ：：ＣｍＲを含む）を、ＳＹＮ３５２７において既に使用された構築物（Ｐｔｅｔプロモーターの制御下でｐ１５ベクターにクローニングされたＤａｃＡ）によって形質転換し、表５２に記載される株を生成した。
次に、新たに生成された株がキヌレニンを消費してＳＴＩＮＧアゴニストを産生する能力をｉｎ ｖｉｔｒｏでアセスメントした。Ｅ．ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅ株ＳＹＮ０９４（野生型対照）、ＳＹＮ２０２８（ＫＹＮ）、ＳＹＮ３５２７（ＳＴＩＮＧ）、およびＳＹＮ３８３１（ＫＹＮ＋ＳＴＩＮＧ）を、適切な抗生物質を含むＬＢ培地中で一晩成長させた。培養物を、０．５％グルコース（重量／体積）および適切な抗生物質を補充したＭ９最少培地またはＬＢおよび抗生物質中で１：２５に希釈し、振とう（３５０ｒｐｍ）させながら３７℃で２時間成長させた。
環状ジ−ＡＭＰ産生の測定のために、Ｍ９培地中での培養物を同じＭ９補充培地によって吸光度（６００ｎｍ）が０．５となるまで希釈し、その時点で無水テトラサイクリン（ＡＴＣ）を１００ｎｇ／ｍＬの濃度で培養物に添加し、ＤａｃＡの発現を誘導した。細胞をさらに４時間誘導して、環状ジ−ＡＭＰを蓄積させた。
試料を、環状ジヌクレオチド産生のＬＣ／ＭＳ分析のために除去した。試料を１００００×ｇで５分間遠心分離し、細胞分画と細胞外分画とを分離した。次に、細胞ペレットを使用して、細胞内環状ジ−ＡＭＰを決定した。濃度を、ＬＣ／ＭＳを介して決定した。
キヌレニン消費を定量化するために、ＬＢ培養物を遠心沈降させて、１００μＭ Ｌ−キヌレニン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（登録商標））を含むＬＢ中に、吸光度（６００ｎｍ）が１．０となるように再懸濁させた。次いで、これらの培養物を３７℃に置き、４時間振とうさせ、キヌレニンを消費させた。キヌレニン消費の測定に関して、試料を各培養物から除去し、１００００×ｇで５分間遠心沈降させ、細胞分画と細胞外分画とを分離した。培地上清を除去し、ＬＣ／ＭＳ分析を介してキヌレニンの消費を決定するために使用した。
図１７Ａに示す結果は、操作された株ＳＹＮ３８３１が、ＳＹＮ３５２７と類似の環状ジ−ＡＭＰを産生することができることを示し、そのキヌレニン消費親株ＳＹＮ２０２８は、環状ジ−ＡＭＰを産生することができなかった。図１７Ｂの結果は、新たな組合せ株ＳＹＮ３８３１もまた、その親株ＳＹＮ２０２８と同様にキヌレニンを消費する能力を保持したことを示している。まとめると、これらの結果は、ｉｎ ｖｉｔｒｏの組合せ株ＳＹＮ３８３１は、ＳＴＩＮＧアゴニストである環状ジ−ＡＭＰを産生する能力と共にＡＨＲアゴニストであるキヌレニンを消費する能力の両方を保有することを支持する。
（実施例４３）
分泌されたＩＦＮ−ガンマの機能的アッセイ
次に、遺伝子操作された細菌から分泌されたＩＦＮ−ガンマが機能的であることを証明する試験を実施した。細胞に基づくアッセイを、ＩＦＮガンマがその受容体に結合した場合のＳＴＡＴ１のリン酸化の増加に基づいて用いた。ＩＦＮ−ガンマの生物活性は、フローサイトメトリーを介するＳＴＡＴ１リン酸化の定量によって決定することができる。
次に、遺伝子操作された細菌から分泌されたＩＦＮ−ガンマが機能的であることを証明する試験を実施した。細胞に基づくアッセイを、ＩＦＮガンマがその受容体に結合した場合のＳＴＡＴ１のリン酸化の増加に基づいて用いた。ＩＦＮ−ガンマの生物活性は、フローサイトメトリーを介してＳＴＡＴ１リン酸化の定量によって決定することができる。
簡単に説明すると、マウスＲＡＷ２６４．７細胞を、マウスＩＦＮｇ発現細菌（ＰＡＬ：：Ｃｍ ｐ１５ａ Ｐｔｅｔ−８７Ｋ ＰｈｏＡ−ｍＩＦＮｇを含むＳＹＮ３５４３）からの上清によって１５分間処置した。処置した細胞をパラホルムアルデヒドに基づく溶液中で固定した後、９０％メタノール中で厳しい透過処理を行った。ホスホ−ＳＴＡＴ１のモジュレーションをフローサイトメトリーによって定量化し、結果を図３９Ａおよび３９Ｂに示す。
図３９Ａおよび図３９Ｂは、２つの独立したアッセイにおけるＳＹＮ３５４３の生物活性を示す。
（実施例４４）
ＣＤ４０Ｌ分泌株ＳＹＮ３３６７のｉｎ ｖｉｖｏでの活性
ＣＤ４０Ｌ分泌株ＳＹＮ３３６７（ＰＡＬ：：Ｃｍ ｐＵＣ−ｔｅｔ−ＰｈｏＡ−ｍＣＤ４０Ｌ １１２−２６０を含む；本実施例および図３６においてＳＹＮ−ＣＤ４０Ｌと呼ぶ）のｉｎ ｖｉｖｏ活性を決定するために、腫瘍内抗原提示細胞（ＡＰＣ）の活性化を、フローサイトメトリーによってアセスメントし、ＣＴ２６腫瘍モデルにおいてＳＹＮ１５５７（ＤＯＭ変異体；本実施例および図３６においてＳＹＮと呼ぶ）、または組換えマウスＣＤ４０Ｌ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）のいずれかによる処置と比較した。
試験のための細菌細胞を産生するために、一晩培養物を使用して、抗生物質と共にＬＢ培地５００ｍＬに接種した。株を、培養物が、対数期終期（ＯＤ６００＝０．８〜１．０）に達するまで振とうさせながら３７Ｃでインキュベートした。収集するために、細胞を５０００ｒｐｍで２０分間遠心沈降させ、培地を吸引し、細胞をＰＢＳによって洗浄し、１５％グリセロールおよびＰＢＳ中に再懸濁させ、アリコートにして−８０Ｃで凍結した。細胞は、連続プレーティング（ｐｌａｔｉｎｇ）によって濃度を試験した。
簡単に説明すると、ＣＴ２６細胞を各動物の右脇腹にＳＣ（ＰＢＳ中で１×１０６個細胞／マウス）移植した。腫瘍の成長をモニタリングした；腫瘍が約８０〜１００ｍｍ３に達すると、マウスを以下の腫瘍内投与の群（１群あたりＮ＝６）に無作為化した：ＳＹＮ１５５７（漏出表現型ＤＯＭ変異体、群１、１×１０７個）、ＳＹＮ３３６７（ｍＣＤ４０Ｌ分泌体、群２、１×１０７個）、および組換えｍＣＤ４０Ｌ（１μｇ；群３）。０日目に、マウスに細菌をＩ．Ｔ．注射した。１、４、および７日目に全ての群にＡＴＣ １μｇを、ＩＰ注射により注射した（３回のパルス）。１、４、および７日目に、群３を組換えＣＤ４０Ｌ １μｇのＩ．Ｔ．注射により処置した。８日目に、全てのマウスを犠牲にし、マウス３匹を、腫瘍内ＡＰＣの活性化をフローサイトメトリーによって分析するために利用し、マウス３匹を、ＣＦＵプレーティングを介して細菌定着を測定するために利用した。
３つの代表的な腫瘍をホモジナイズし、腫瘍ホモジネートを連続希釈し、コロニー形成単位濃度を測定するために適切な抗生物質を含むＬＢ寒天プレート上に播種した。図３６Ｂに示されるように、ＳＹＮ−ＣＤ４０Ｌは、ＳＹＮと類似の程度に腫瘍に定着し、最大１×１０８ＣＦＵ／グラム腫瘍に達した。３つの代表的な腫瘍からの腫瘍内ＡＰＣのフローサイトメトリー分析を、腫瘍をＤＮアーゼとリベラーゼＴＬ（Ｓｉｇｍａ）の混合物中、３７℃で３０分間消化し、細胞を単細胞懸濁液に入れ、以下の抗体によって染色することによって実施した：抗ＭＨＣＩＩ（ＩＡ／ＩＥ）、ＣＤ４５．２、ＣＤ４０、Ｇｒ１、ＣＤ１９７（ＣＣＲ７）、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ（全てＢｉｏｌｅｇｅｎｄから）。ＣＴ２６腫瘍をＳＹＮ−ＣＤ４０Ｌによって処置すると、腫瘍内樹状細胞においてより高レベルのＣＣＲ７発現が得られ（ＳＹＮ−ＣＤ４０Ｌに関してｐ＜０．０４対ＳＹＮ対照）、マクロファージにおいても同様に高い発現傾向が見られた（図３６Ｃ）。さらに、ＣＤ４０に関するより高い発現傾向は、腫瘍中の樹状細胞とマクロファージの両方について観察された。これらの結果は、ＳＹＮ−ＣＤ４０Ｌによる処置によって、腫瘍内の重要なＡＰＣサブセットの活性化の増加が起こることを示唆している。
（実施例４５）
ＣＴ２６腫瘍におけるｈＴＮＦαの活性
ｈＴＮＦａ発現株ＳＹＮ２３０４（ＰＡＬ：：ＣＭ ｐ１５ａ ＴｅｔＲ Ｐｔｅｔ−ＰｈｏＡ−ＴＮＦαを含む；本実施例および図３８においてＳＹＮ−ＴＮＦαと呼ぶ）のｉｎ ｖｉｖｏ活性を決定するために、ＣＴ２６腫瘍において腫瘍体積をアセスメントし、ＳＹＮ１５５７（ＤＯＭ変異体；本実施例および図３８においてＳＹＮと呼ぶ）と比較した。
試験のための細菌細胞を産生するために、一晩培養物を使用して、抗生物質と共にＬＢ培地５００ｍＬに接種した。株を、培養物が、対数期終期（ＯＤ６００＝０．８〜１．０）に達するまで振とうさせながら３７Ｃでインキュベートした。収集するために、細胞を５０００ｒｐｍで２０分間遠心沈降させ、培地を吸引し、細胞をＰＢＳによって洗浄し、１５％グリセロールおよびＰＢＳ中に再懸濁させ、アリコートにして−８０Ｃで凍結した。細胞は、連続プレーティング（ｐｌａｔｉｎｇ）によって濃度を試験した。
簡単に説明すると、ＣＴ２６細胞を、各動物の右脇腹にＳＣ（ＰＢＳ中で１×１０６個細胞／マウス）移植した。腫瘍の成長をモニタリングした；腫瘍が約５０〜８０ｍｍ３に達すると、マウスを以下の腫瘍内投与の群（１群あたりＮ＝５）に無作為化した：ＳＹＮ（漏出表現型ＤＯＭ変異体、群１、１×１０７個）およびＳＹＮ−ＴＮＦα（ＴＮＦα分泌体、群２、１×１０７個）。０および４日目に、マウスに細菌をＩ．Ｔ．注射した。１および４日目に両方の群にＡＴＣ １μｇを、ＩＰ注射により投与した（２回のパルス）。腫瘍サイズを週に２回測定した。腫瘍をホモジナイズし、腫瘍ホモジネートを連続希釈し、コロニー形成単位濃度を測定するために適切な抗生物質を含むＬＢ寒天プレート上に播種した。図３８Ｂに示すように、ＳＹＮ−ＴＮＦαは、ＳＹＮと類似の程度に腫瘍に定着し、１ｘ１０８ＣＦＵ／グラム腫瘍にまで達した。ｈＴＮＦαの腫瘍内発現は、ｈＴＮＦα ＥＬＩＳＡ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）によって測定した場合にＳＹＮ−ＴＮＦα処置ＣＴ２６腫瘍に限って検出された（図３８Ｃ）。図３８Ｄに示す結果は、ＳＹＮによる処置（Ｐ＜０．０２）と比較するとＳＹＮ−ＴＮＦαによって処置したＣＴ２６腫瘍では最初の細菌投与の７日後で、腫瘍の成長の有意な低減を示す。まとめると、これらの結果は、ＳＹＮ−ＴＮＦαが、ＣＴ２６腫瘍において定着および持続することができ、そこでそれらがｈＴＮＦαの検出可能なレベルを発現し、それによって腫瘍の成長の有意な低減をもたらすことを証明する。
（実施例４６）
ｍＩＦＮガンマ分泌株ＳＹＮ３３６７のｉｎ ｖｉｖｏでの活性
ＩＦＮガンマ発現株ＳＹＮ３３６７（ＰＡＬ：：Ｃｍ ｐ１５ａ Ｐｔｅｔ−８７Ｋ ＰｈｏＡ−ｍＩＦＮｇを含む；本明細書においてＳＹＮ−ＩＦＮγと呼ぶ）のｉｎ ｖｉｖｏ動力学を決定するために、ＣＴ２６腫瘍を処置し、ＳＹＮ１５５７（ＤＯＭ変異体；本明細書においてＳＹＮと呼ぶ）処置腫瘍と比較した。
試験のための細菌細胞を産生するため、一晩培養物を使用して、抗生物質を含むＬＢ培地５００ｍＬに接種した。株を、培養物が、対数期の終期に達するまで（ＯＤ６００＝０．８〜１．０）、振とうさせながら３７Ｃでインキュベートした。収集するために、細胞を５０００ｒｐｍで２０分間遠心沈降させ、培地を吸引し、細胞をＰＢＳによって洗浄し、１５％グリセロールおよびＰＢＳ中に再懸濁させ、アリコートにして、−８０Ｃで凍結した。細胞は、連続プレーティングによって濃度を試験した。
簡単に説明すると、ＣＴ２６細胞を、各動物の右脇腹にＳＣ（ＰＢＳ中で１×１０６個細胞／マウス）移植した。腫瘍の成長をモニタリングした；腫瘍が約５０〜８０ｍｍ３に達すると、マウスを以下の腫瘍内投与の群（１群あたりＮ＝６）に無作為化した：ＳＹＮ（漏出表現型ＤＯＭ変異体、群１、１×１０７個）およびＳＹＮ−ＩＦＮγ（ＩＦＮガンマ分泌体、群２、１×１０７個）。０日目および３日目に、マウスに適切な細菌株を投与した。１、４および７ ４日目に、全てのマウスにＡＴＣ １μｇを、Ｉ．Ｐ．で注射した（３回のパルス）。８日目に全てのマウスを犠牲にし、マウス３匹を、ＣＦＵプレーティングを介して腫瘍内細菌定着を測定するために利用し、マウス３匹をＥＬＩＳＡによって腫瘍内ＩＦＮγ産生を分析するために利用した。腫瘍をホモジナイズし、腫瘍ホモジネートを連続希釈し、コロニー形成単位濃度を測定するために適切な抗生物質を含むＬＢ寒天プレート上に播種した。図ＸＢに示すように、ＳＹＮ−ＩＦＮγは、ＳＹＮと類似の程度に腫瘍に定着し、１ｘ１０８ＣＦＵ／グラム腫瘍にまで達した。ＩＦＮγの腫瘍内発現は、マウスＩＦＮγ ＥＬＩＳＡ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）によって測定した場合にＳＹＮ−ＩＦＮγ処置ＣＴ２６腫瘍に限って検出された（図４０Ｃ）。まとめると、これらの結果は、ＳＹＮ−ＩＦＮγが、ＣＴ２６腫瘍において定着および持続することができ、そこでそれらがＡＴＣによる誘導後にＩＦＮγの検出可能なレベルを発現することを証明する。
（実施例４７）
分泌されたＣＸＣＬ１０の機能的アッセイ
上記の株のいずれかから分泌されたヒトＣＸＣＬ１０が機能的であるか否かを決定するために、走化性アッセイを、本質的にＭｉｋｕｃｋｉら（その内容の全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｍｉｋｕｃｋｉら、Ｎｏｎ−ｒｅｄｕｎｄａｎｔ Ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔ ｆｏｒ ＣＸＣＲ３ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｄｕｒｉｎｇ Ｔｕｍｏｒｉｃｉｄａｌ Ｔ Ｃｅｌｌ Ｔｒａｆｆｉｃｋｉｎｇ ａｃｒｏｓｓ Ｔｕｍｏｒ Ｖａｓｃｕｌａｒ Ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔｓ；Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ．２０１５年；６巻：７４５８頁）に記載されているとおりに実施した。このアッセイにおいて、ヒトＣＤ８＋Ｔ細胞（抗ＣＤ３／ＣＤ２８による拡大増殖の８日後）をＣｅｌｌ ｔｒａｃｅバイオレットによって標識し、抗ｈＣＸＣＲ３の存在下または非存在下で、上部にＴ細胞を有し、下部に細菌上清を有する２４ウェルトランスウェルプレート（５μＭ孔）に移した。細胞を３時間インキュベートし、ウェルの底から回収した遊走細胞をフローサイトメトリーによって計数した。
細菌上清を調製するために、株（ＳＹＮ１５５７対照株およびＳＹＮ２９４２（ＰＡＬ：：Ｃｍ Ｐｔｅｔ−８７Ｋ ＰｈｏＡを含む（ＥＣＯＬＩＮ＿０２２５５）））を融解して一晩成長させ、次いで、テトラサイクリンを３時間添加することによってｈＣＸＣＬ１０を発現するように誘導した。上清を滅菌した後、以下に記されるように使用した。Ｔ細胞を調製するために、予め単離した初代ヒトＣＤ８ Ｔ細胞（ＡｌｌＣｅｌｌｓ）を計数し、収集し、刺激後およそ８日目に抗ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズと共にＴ細胞培地に再懸濁させた。ウェルの下部に０．５ｍｌおよび上部に０．１ｍｌの空隙を有し、５μＭ孔径の２４ウェルトランスウェルプレートをアッセイのために使用した。ウェルの下部の細菌上清を調製するために、ＳＹＮ２９４２からの上清を、ＳＹＮ１５５７対照細菌から得た上清中で希釈し、１００％、３３％、１１％、３．７％、および０％ＳＹＮ２９４２を含む混合物を生成した。ウェルの上部を調製するために、Ｔ細胞１００μＬを上部ウェル（およそ２．５×１０個細胞を含む）に添加した。抗ＣＸＣＲ３（マウスＩｇＧ１；クローンＧ０２５Ｈ７）を対照ウェルに最終濃度１μｇ／ｍＬで添加した。プレートを３７Ｃのインキュベータ内に３時間入れた後分析した。分析のために、各下部のウェルの内容物を９６ウェルプレートの２つのウェルに移した。プレートを遠心沈降させ、２つのウェルを合わせて、ＰＢＳ中に再懸濁させ、ＭＡＣＳＱｕａｎｔフローサイトメーターにおいて分析し、遊走した細胞数を定量化した。初代ヒトＴ細胞は、ＳＹＮ２９４２上清に向かって用量依存的に移動し、これはＣＸＣＬ１０の受容体ＣＸＣＲ３の遮断によって消失した。このデータ（示していない）は、ＳＹＮ２９４２によって産生されたｈＣＸＣＬ１０が生物学的に活性であり、初代Ｔ細胞の移動をｉｎ ｖｉｔｒｏで誘発するために十分な濃度で豊富に存在することを示唆している。
（実施例４８）
Ｂａｌｂ／ｃ−Ａ２０腫瘍モデルにおけるＳＹＮ３５２７処置の有効性の評価
ｃ−Ａ２０腫瘍モデル（Ａ２０ Ｂ細胞リンパ腫）における、３つの異なる用量での、およびＰＢＳ対照と比較した、経時的なＳＹＮ３５２７（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓからのプラスミドに基づくｔｅｔ誘導性ｄａｃＡを含む）のｉｎ ｖｉｖｏ活性および有効性の判定。
試験のための細胞を産生するために、一晩培養物を使用して、抗生物質と共にＬＢ培地５００ｍＬに接種した。株を、培養物が、対数期終期（ＯＤ６００＝０．８〜１．０）に達するまで振とうさせながら３７Ｃでインキュベートした。収集するために、細胞を５０００ｒｐｍで２０分間遠心沈降させ、培地を吸引し、細胞をＰＢＳによって洗浄し、１５％グリセロールおよびＰＢＳ中に再懸濁させ、アリコートにして−８０Ｃで凍結した。細胞は、連続プレーティング（ｐｌａｔｉｎｇ）によって濃度を試験した。
雌Ｂａｌｂ／ｃマウス６週齢にＡ２０腫瘍を移植し、ｃ−ジＡＭＰを産生することができる細菌産生酵素の３つの異なる用量を腫瘍内注射した。腫瘍体積を様々な時点で測定し、実験終了時に腫瘍を秤量し、処理した。
簡単に説明すると、−１５日目に各動物の右脇腹にＡ−２０細胞（ＰＢＳ中の２×１０ ５／マウス／１００μＬ）をＳＣ移植した。腫瘍が約１００ｍｍ３に達するまで、腫瘍成長をモニタリングした。０日目に、マウスを次のような腫瘍内投与の群（１群あたりＮ＝８）に無作為化した：ＰＢＳ（群１、ビヒクル対照）、ＳＹＮ３５２７（群２、１×１０＾７ ＣＦＵ）、ＳＹＮ３５２７（群３、５×１０＾７ ＣＦＵ）、およびＳＹＮ３５２７（群４、５×１０＾８ ＣＦＵ）。腫瘍サイズを測定し、０、２および５日目に細菌またはＰＢＳをマウスにＩ．Ｔ．注射し、その後、４時間後にＡＴＣ（１μｇ Ｉ．Ｐ．）を注射した。
動物に、群に基づいた適切な細菌または食塩水（注射のための対照）を０、３および７日目に投与した。細菌を投与した４時間後、マウスを１０μｇのＡＴＣ（アンヒドロテトラサイクリン）で腹腔内注射によって処置した。２回の測定の間を１〜２日空けて週に３回、腫瘍体積および体重を記録した。
１、４および１２日目の腫瘍体積を図１１に示し、個々のマウスにおける２７日までの間の腫瘍体積を図１２Ａ（食塩水対照）、図１２Ｂ（１×１０＾７ ＣＦＵ）、図１２Ｃ（５×１０＾７ ＣＦＵ）および図１２Ｄ（５×１０＾８ ＣＦＵ）に示す。結果は、ＳＹＮ３５２７の投与がＡ２０リンパ腫モデルにおいて用量依存的腫瘍制御を駆動することを示す。
（実施例４９）
ＳＴＩＮＧイニシエーターとＫｙｎサステナーを組み合わせること：ａＰＤ１チェックポイント阻害剤での有効性の改善
次に、免疫イニシエーター／サステナー対の組合せを、単独でまたはチェックポイント阻害剤療法と組み合わせて試験した。サステナーキヌレニン消費株ＳＹＮ２０２８（構成的プロモーターの制御下にある組み込まれたキヌレニナーゼと、ΔＴｒｐＥとを含む）と組み合わせたイニシエーターＳＴＩＮＧ産生株ＳＹＮ３５２７（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓからの、プラスミドに基づく、テトラサイクリン誘導性ｐ１５ａ Ｐｔｅｔ−ＤａｃＡを含む、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅ）の有効性を判定するために、免疫学的に「冷たい」腫瘍モデルと見なされるＢ１６Ｆ１０腫瘍モデルにおいて、腫瘍体積、生存および体重をモニタリングした。チェックポイント阻害がイニシエーター／サステナーペアの有効性をさらに改善するかどうかをアセスメントするために、全身投与される抗ＰＤ１抗体の追加についての効果もアセスメントした。マウスを２用量のＳＴＩＮＧアゴニスト産生株（イニシエーター）で処置し、その後、抗ＰＤ１、キヌレニン消費株または組合せのいずれか（サステナー）で処置した。
試験のための細胞（ＳＹＮ３５２７およびＳＹＮ２０２８）を産生するために、一晩培養物を使用して、抗生物質を含むＬＢ培地５００ｍＬに接種した。株を、培養物が対数期の終期に達するまで（ＯＤ６００＝０．８〜１．０）、振とうさせながら３７Ｃでインキュベートした。収集するために、細胞を５０００ｒｐｍで２０分間遠心沈降させ、培地を吸引し、細胞をＰＢＳで洗浄し、１５％グリセロールおよびＰＢＳ中に再懸濁させ、アリコートにして、−８０Ｃで凍結した。細胞を連続プレーティングにより濃度試験した。
マウスにＢ１６Ｆ１０腫瘍を移植し、下記のタイムラインに従ってマウスにＳＴＩＮＧアゴニストを産生する細菌を、続いて、キヌレニンを消費する細菌を腫瘍内注射した。簡単に説明すると、−９日目に各動物の右脇腹にＢ１６Ｆ１０細胞（ＰＢＳ中の２ｅ５個細胞／マウス）をＳＣ移植した。−３日目に腫瘍成長をモニタリングし、０日目、腫瘍が約５０〜８０ｍｍ３に達したら、マウスを次のような腫瘍内投与の実験群（１群あたりＮ＝１０）に無作為化した：群１：食塩水＋アイソタイプ対照；群２：食塩水＋抗ＰＤ１抗体；群３：ＳＹＮ３５２７［１ｅ７］＋アイソタイプ対照；群４：ＳＹＮ３５２７［１ｅ７］＋抗ＰＤ１抗体；群５：ＳＹＮ３５２７［１ｅ７］−＞ＳＹＮ３５２７：ＳＹＮ２０２８［１ｅ７］−＞ＳＹＮ２０２８［１ｅ７］＋アイソタイプ対照；群６：ＳＹＮ３５２７［１ｅ７］−＞ＳＹＮ３５２７：ＳＹＮ２０２８［１ｅ７］−＞ＳＹＮ２０２８［１ｅ７］＋抗ＰＤ１抗体；群７：ＳＹＮ３５２７［１ｅ６］−＞ＳＹＮ３５２７［１ｅ７］＋アイソタイプ対照；群８：ＳＹＮ３５２７［１ｅ６］−＞ＳＹＮ３５２７［１ｅ７］＋抗ＰＤ１抗体。アイソタイプ対照および抗ＰＤ１抗体を注射１回あたり２００μｇで投与した。１日目、５日目および８日目に群に基づいて適切な細菌を動物に投与した。各細菌投与の４時間後、マウスを１０μｇのＡＴＣ（アンヒドロテトラサイクリン）で腹腔内注射によって処置した。完全な応答体については細菌投与を停止した。表５３は、処置タイムラインの要約を提供する。結果を表５４に示す。
処置に対して完全または部分奏効を明示した腫瘍を有するマウスについては投与を中止し、５０日間、持続的奏効についてマウスをモニタリングした。この期間中に再燃した腫瘍はなかった。
次に、ＣＲを示した動物に初回腫瘍移植とは反対側の脇腹への腫瘍再移植によって再投与して、ＳＹＮ３５２７での処置が免疫学的記憶を付与できるかどうかをアセスメントした。簡単に説明すると、Ｂ１６Ｆ１０細胞を７１日目に群３〜８からの１１匹の完全な応答体に再移植し、未処置動物（ｎ＝６）と比較した。結果を図１２に示す。この結果は、初回ＳＹＮ３５２７処置に対するＣＲを以前に経験したマウスについて、未処置マウスと比較して腫瘍成長の有意な遅延を実証し、これは、免疫学的記憶の形成を含意する。
（実施例５０）
安全性および生物学的封じ込め戦略のアセスメント：腫瘍における栄養要求性突然変異体の増殖
栄養要求性突然変異株の腫瘍における増殖能力をアセスメントした。３種の栄養要求性株を生成した：ＳＹＮ１１９３（ΔＵｒａＡ：：ＣＭ）、ＳＹＮ１５３４またはＳＹＮ１６０５（ΔＴｈｙＡ：：ＣＭ）、ＳＹＮ７６６（ΔＤａｐＡ：：ＣＭ）。
栄養要求性株の増殖を、先ず、ＣＴ２６モデルにおいてアセスメントした。ＣＴ２６細胞（ＰＢＳ中の約１ｅ６個細胞／マウス）を各動物（ＢａｌｂＣ／Ｊ（雌、８週齢））の右脇腹に皮下移植し、腫瘍成長をおおよそ１０日間にわたってモニタリングした。腫瘍が約１００〜１５０ｍｍ３に達したら、動物を投与の群に無作為化した。
腫瘍内注射のために、チミジン（３ｍＭ）とジアミノピメリン酸（１００μｇ／ｍＬのＤＡＰ）またはウラシルを必要に応じて含有するＬＢブロス中で細菌を６００ｎｍでの吸光度（Ａ６００ｎｍ）０．４（２ｅ８コロニー形成単位（ＣＦＵ）／ｍＬに相当する）に達するまで成長させ、ＰＢＳで２回洗浄した。４０μＬを適切な用量で担腫瘍マウスに腫瘍内注射することができるように、ＰＢＳまたは食塩水で懸濁液を希釈した。
細菌をＰＢＳに懸濁させ、次のように４０μＬをマウスに腫瘍内注射（１ｅ６個細胞／マウス）した：群１−ＳＹＮ９４（ｎ＝６）、群２−ＳＹＮ１１９３（ｎ＝６）、群３−ＳＹＮ１５３４（ｎ＝６）、および群２−ＳＹＮ７６６（ｎ＝６）。腫瘍組織を２４および７２時間の時点で収集した。腫瘍組織ホモジネートを連続希釈し、ＬＢ寒天プレート（抗生物質とチミジン、ジアミノピメリン酸またはウラシルとを含有する）上に播種して、腫瘍内の組織１グラムあたりの生菌数（またはコロニー形成単位）を計算した。図１８Ａにおける結果は、ΔＴｈｙＡおよびΔＵｒａＡ突然変異を含む株が、未改変Ｅ．ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅ株と同様に、腫瘍においてコロニー形成することおよび増殖することができることを示す。ピリミジン経路の突然変異は、ピリミジン源の非存在下で細菌の成長を防止するが、結果は、コロニー形成および成長を可能にするために十分なレベルのこれらの栄養素が腫瘍内に存在することを示す。しかるが故に、これらの栄養要求性突然変異は、成長およびコロニー形成特性に悪影響を及ぼさずにピリミジンの非存在下で成長を防止することにより、および腫瘍内での拡張、エフェクター産生または有効性により、生物学的封じ込め戦略に有用である。
対照的に、ΔＤａｐＡ突然変異を含有する株は増殖せず、最初に注射したものより少ない細菌数が２４時間および７２時間後に検出される。ジアミノピメリン酸（Ｄａｐ）は、細菌によって作製されるが、哺乳動物宿主によって作製されないアミノ酸である。これは、ある特定の細菌の細胞壁、例えばグラム陰性菌の細胞壁、に特有の成分である。ジアミノピメリン酸がなければ、細菌は、プロテオグリカンを形成することができず、しかるが故に、成長することができない。しかるが故に、ＤａｐＡ栄養要求性は、細菌成長および腫瘍のコロニー形成に影響を与えることができ、ある期間にわたって腫瘍内の細菌の存在度ならびに／またはエフェクター発現および産生レベルを経時的にモジュレートする、タイミングを微調整する、ために特に有用な戦略をもたらしうる。
Ｂ１６Ｆ１０およびＥＬ４細胞においてＴｈｙＡ栄養要求性株を用いて、図１８Ｂおよび図１８Ｃに示す、後続試験を行った。ＴｈｙＡ栄養要求性株は、ＣＴ２６モデルにおいて未改変株に対して観察された成長パターンを再現して、７２時間の期間にわたってＷＴ株と同様の速度で増殖することができた。
（実施例５１）
骨格改変による時間的な用量のモジュレーション：ＤＡＰ−ＳＴＩＮＧ株で治療域を改善する可能性
ｉｎ ｖｉｖｏでのエフェクター産生のレベルおよびタイミングを制御するための様々な方法であって、各々を個々にまたは（より厳密な制御を可能にするために）組み合わせて使用することができる方法をアセスメントした。誘導性プロモーター（テトラサイクリン、クミン酸塩、サリチル酸塩またはハイポキシア／嫌気生活誘導性）を使用してエフェクター分子産生のレベルおよびタイミングを制御または微調整することができることをアセスメントするための試験を行った。それを下で説明する。
加えて、遺伝子操作された細菌の存在量を制御することによってエフェクター分子産生のレベルおよびタイミングを調節することができることをアセスメントした。前の実施例で説明したように、有利なことに、ＤａｐＡ栄養要求性株は腫瘍で成長して腫瘍にコロニーを形成することができないことが判明した。したがって、ＤａｐＡ栄養要求体は、細菌負荷量および用量に対してならびに拡張エフェクターペイロード送達および存在量により時間的制御を獲得する手段をもたらすことができるだろう。
ＳＴＩＮＧ産生に対するＤａｐＡの効果を試験するために、ＳＴＩＮＧ産生体ＳＹＮ４０２３（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓからの、プラスミドに基づく、テトラサイクリン誘導性ｐ１５ａ Ｐｔｅｔ−ＤａｃＡと、ΔＤａｐＡとを含む、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅ）を生成した。次に、腫瘍の細菌成長またはコロニー形成とエフェクター産生とをモジュレートする能力を試験した。
ＤＡＰ−ＳＴＩＮＧ株ＳＹＮ４０２３（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓからのｐ１５ａ Ｐｔｅｔ−ＤａｃＡとΔＤａｐＡとを含むＥ．ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅ）を含む処置の有効性を判定するために、Ｂ１６Ｆ１０腫瘍モデルにおいて腫瘍体積および体重をモニタリングした。
試験のための細胞を産生するために、一晩培養物を使用して、抗生物質を含むＬＢ培地５００ｍＬに接種した。株を、培養物が対数期の終期に達するまで（ＯＤ６００＝０．８〜１．０）、振とうさせながら３７Ｃでインキュベートした。収集するために、細胞を５０００ｒｐｍで２０分間遠心沈降させ、培地を吸引し、細胞をＰＢＳで洗浄し、１５％グリセロールおよびＰＢＳ中に再懸濁させ、アリコートにして、−８０Ｃで凍結した。細胞を連続プレーティングにより濃度試験した。
マウスにＢ１６Ｆ１０腫瘍を移植し、下記のタイムラインに従ってマウスにＳＴＩＮＧアゴニストを産生する細菌を腫瘍内注射した。簡単に説明すると、−９日目に各動物の右脇腹にＢ１６Ｆ１０細胞（ＰＢＳ中の２ｅ５個細胞／マウス）をＳＣ移植した。−３日目に腫瘍成長をモニタリングし、０日目、腫瘍が約５０〜８０ｍｍ３に達したら、マウスを次のような腫瘍内投与の群（１群あたりＮ＝１０）に無作為化した：食塩水（対照、群１）、ＳＹＮ４０２３（ＤＡＰ−ＳＴＩＮＧ、群２、１ｅ７ ＣＦＵ）およびＳＹＮ４０２３（ＤＡＰ−ＳＴＩＮＧ、群３、１ｅ８ ＣＦＵ）。動物に、群に基づいた適切な細菌または食塩水（注射のための対照）を１、５および８日目に投与した。細菌投与の４時間前に、マウスを１０μｇのＡＴＣ（アンヒドロテトラサイクリン）で腹腔内注射によって処置した。完全な応答体については細菌投与を停止した。
５、８および１２日目の腫瘍体積を図１９Ａに示す。個々のマウスについての腫瘍体積を図１９Ｂ、図１９Ｃおよび図１９Ｄに示す。結果は、１ｅ８の用量でのＳＹＮ４０２３の投与がこの期間にわたって腫瘍成長の拒絶または制御をもたらすことを示す。
加えて、これらの結果は、ＤａｐＡ栄養要求性の導入による細菌成長の制限が株の有効性を低下させないことを示す。
（実施例５２）
サイトカイン放出症候群の除外
サイトカイン放出症候群（ＣＲＳ）は、一部の疾患または感染症の合併症として生じる、ならびにまた、一部のモノクローナル抗体薬のおよびＣＡＲ−Ｔ療法などの養子Ｔ細胞療法の有害効果である、全身性炎症反応症候群の一形態である。サイトカイン放出症候群は、免疫療法の過程で、免疫細胞から血液中へのサイトカインの大量の急速な放出により引き起こされる。同様に、全身性細菌感染症は、敗血症として公知の過程でサイトカインの急速な放出をもたらしうる。腫瘍内細菌処置が、マウスの血液中のＣＲＳまたは敗血症に関連するサイトカインレベル上昇をもたらさないことを保証するために、ＳＴＩＮＧアゴニスト産生細菌および対応する未改変対照での腫瘍の処置時に血液中のサイトカインレベルを測定した。
Ｂ１６Ｆ１０腫瘍を本明細書の他の箇所で説明するように移植してモニタリングし、０時点で、マウスを次のように無作為化し、群に応じてマウスにＩ．Ｔ．注射した：食塩水、１ｅ７ ＣＦＵでのＳＹＮ３５２７（ＳＴＩＮＧ、誘導）、１ｅ７ ＣＦＵでのＳＹＮ３５２７（ＳＴＩＮＧ、未誘導）、１ｅ８ ＣＦＵでのＳＹＮ４０２３（ＳＴＩＮＧ ＤＡＰ、誘導）または１ｅ７ ＣＦＵでのＳＹＮ９４（未改変細菌）（１群あたりｎ＝１２）。ＬＰＳ誘導敗血症対照（１００μＬ ＰＢＳ中の５００μｇ）をこの試験に含め、静脈内投与した。各細菌投与の４時間後、マウスを１０μｇのＡＴＣ（アンヒドロテトラサイクリン）で腹腔内注射によって処置した（誘導）か、またはＰＢＳビヒクル対照で処置した（未誘導）。マウスを１、５および２４時間の時点で（各時点に４匹）犠牲にした。特別注文のＬｕｍｉｎｅｘキットを製造業者の使用説明書に従って使用して、血液中のＴＮＦαおよびＩＬ−１βレベルを定量した。結果を図２０に示す。この結果は、サイトカインレベルが敗血症対照において観察されたものをはるかに下回ることを示す。これらのデータは、敗血症性ショックおよびサイトカイン急増が担腫瘍マウスにおいてＳＹＮ３５２７の処置後にもＳＹＮ４０２３の処置後にも起こらないことを示唆する。
腫瘍ホモジネート（１時間、５時間、２４時間）を液体クロマトグラフィー質量分析によってＳＴＩＮＧアゴニストｃ−ジＡＭＰの産生について分析し、ＬＢプレート上へのプレーティングによってＣＦＵを測定した。図２０Ｃは、ｃ−ジＡＭＰ測定を示し、ｃ−ジＡＭＰがｉｎ ｖｉｖｏで（ＡＴＣで誘導したとき）ＳＹＮ３５２７およびＳＹＮ４０２３の両方により生成されることを確証する。図２０Ｄは、ＣＦＵ数を示し、ＳＹＮ３５２７が未改変ＳＹＮ９４と同様の程度に腫瘍においてコロニー形成し、成長する一方で、ΔＤａｐＡ株であるＳＹＮ４０２３が測定した期間（２４時間）にわたって細菌数低減を示すことを実証する。注目すべきことに、すべての血液試料は、細菌成長に対して陰性であった。注目すべきことに、分析した細菌株のいずれでの処置後にも血流へのサイトカインの放出が起こらない。全体的に見れば、これらの結果は、Ｂ１６Ｆ１０腫瘍の腫瘍内処置およびＳＴＩＮＧアゴニストの発現が安全であり、敗血症に関連するサイトカインの全身性の増加も、サイトカイン急増に関連するサイトカインの全身性増加も引き起こさないことを示す。
（実施例５３）
ＳＴＩＮＧ多型性：複数の対立遺伝子に対処するための追加のアゴニスト産生株の構築
複数の対立遺伝子がヒトＳＴＩＮＧ（ｈＳＴＩＮＧ）について記載されている。異なるＳＴＩＮＧアゴニストは、異なる特異性でこれらの対立遺伝子を活性化する（例えば、Ｙｉら、Ｓｉｎｇｌｅ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ ｏｆ Ｈｕｍａｎ ＳＴＩＮＧ Ｃａｎ Ａｆｆｅｃｔ Ｉｎｎａｔｅ Ｉｍｍｕｎｅ Ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｔｏ Ｃｙｃｌｉｃ Ｄｉｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ； ＰＬＯＳ Ｏｎｅ ２０１３年１０月｜８巻｜１０号｜ｅ７７８４６を参照されたく、この参考文献の内容はその全体が参照により本明細書に組み込まれる）。ＳＴＩＮＧは、細菌からの環状ジヌクレオチド、および／または内在性サイクリックＧＡＭＰを感知する。ｃ−ジＡＭＰの産生に加えて、ＳＹＮ３５２７について本明細書中で示すように、追加のまたは代替のアゴニストの産生は、追加の対立遺伝子の刺激を増強するために使用することができる可能性があり、操作された株の有効性をモジュレートするためのより大きな自由度を提供することができるだろう。
推定的ｃＧＡＭＰシンターゼ（２１種のタンパク質）の系統発生学的ライブラリーを、公知のｃＧＡＭＰシンターゼ（ｃＧＡＳ）ＤｎｃＶとの相同性に基づいて同定した。ＳＴＩＮＧアゴニスト株を生成するために、ｃＧＡＳオルソログをＰｔｅｔプロモーターの制御下のｐ１５にクローニングした。次いで、ｃＧＡＳオルソログをスクリーニングして、ｉｎ ｖｉｔｒｏでｃＧＡＭＰを産生することができる代替酵素を同定した。
簡単に説明すると、ｃＧＡＳオルソログの１つをコードする異種構築物を含むＥ．ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅ株、および対照株を、ＬＢ培地中で一晩成長させた。培養物を、０．５％グルコース（ｗ／ｖ）を補充したＭ９最少培地で１：１０希釈し、振とう（３５０ｒｐｍ）しながら３７℃で２時間成長させた。培養物を１．０の光学密度に希釈し、このとき、無水テトラサイクリン（ＡＴＣ）を１００ｎｇ／ｍＬの濃度で培養物に添加してｃＧＡＳの発現を誘導した。誘導の４時間後、環状ジヌクレオチド産生のＬＣ／ＭＳ分析のために試料を除去した。試料を２０分間、５０００ＲＰＭで遠心分離して、細胞画分と細胞外画分を分離した。次いで、細胞ペレットを使用して、細胞内３’，３’ｃＧＡＭＰを決定した。ＬＣ／ＭＳによって濃度を決定した。
結果を図３３Ａおよび図３３Ｂに示す。前に示したように、ＳＹＮ３５２７は、高レベルのｃｄＡＭＰを産生する。試験した他の株では有意な産生が観察されなかった。しかし、ｃＧＡＭＰのいくつかの有意な産生体（ＳＹＮ４２５１、ＳＹＮ４２４０、ＳＹＮ４２４１）を同定した。ＳＹＮ４２５１は、Ｖｅｒｍｉｎｅｐｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｅｉｓｅｎｉａｅ（ＥＦ０１−２ ミミズ共生生物）からのオルソログを発現し、ＳＹＮ４２４０は、Ｋｉｎｇｅｌｌａ ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓからのオルソログ（ＡＴＣＣ ３３３９４）を発現し、ＳＹＮ４２４１は、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｂａｃｉｌｌｉｆｏｒｍｉｓからのオルソログ（ＡＴＣＣ ＢＡＡ−１２００）を発現する。配列を表５５に記載する。
（実施例５４）
Ａ２０腫瘍モデルについてのＳＹＮ４０２３処置の抗腫瘍有効性
ＳＹＮ４０２３（ｐｔｅｔ−ＤａｃＡおよびΔＤａｐＡ）の抗腫瘍活性をＡ２０腫瘍モデルにおいてアセスメントした。
試験のための細胞を産生するために、一晩培養物を使用して、抗生物質を含むＬＢ培地５００ｍＬに接種した。株を、培養物が対数期の終期に達するまで（ＯＤ６００＝０．８〜１．０）、振とうさせながら３７Ｃでインキュベートした。収集するために、細胞を５０００ｒｐｍで２０分間遠心沈降させ、培地を吸引し、細胞をＰＢＳで洗浄し、１５％グリセロールおよびＰＢＳ中に再懸濁させ、アリコートにして、−８０Ｃで凍結した。細胞を連続プレーティングにより濃度試験した。
−１４日目にマウスの各々の右脇腹にＡ２０腫瘍（ＰＢＳ中の１ｅ６個細胞／マウス）をＳＣ移植した。−３日目に腫瘍成長をモニタリングし、腫瘍が約４０〜８０ｍｍ３に達したら、マウス（０日目）を表５６に示すような腫瘍内投与の実験群（１群あたりＮ＝１２）に無作為化した。
１日目および４日目にＳＹＮ４０２３細菌または食塩水を動物にＩ．Ｔ．投与した。各細菌投与の４時間前に、マウスを１０μｇのＡＴＣ（アンヒドロテトラサイクリン）で腹腔内注射によって前処置した。腫瘍体積を測定し、動物の健康状態を、３回／週、アセスメントした。結果を図２１に示す。この結果は、ＳＹＮ４０２３でのＡ２０腫瘍の処置が腫瘍制御および拒絶をもたらすことを示す。これらのデータは、ＳＹＮ４０２３処置が、Ａ２０腫瘍モデルにおいて２用量のみで効果があることを実証する。
（実施例５５）
ＤＡＰ栄養要求株ＳＴＩＮＧアゴニスト産生株での免疫刺激因子有効性の増強
ＯＸ４０、４１ＢＢおよびＧＩＴＲによる免疫刺激を誘発するアゴニスト抗体は、細胞傷害性ＣＤ８＋およびヘルパーＣＤ４＋Ｔ細胞の拡大増殖および増殖によって抗腫瘍免疫を促進することが示されており（Ｓａｎｍａｍｅｄ， Ｍ． Ｆ．ら（２０１５年）．「Ａｇｏｎｉｓｔｓ ｏｆ Ｃｏ−ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ａｇａｉｎｓｔ ＣＤ１３７， ＯＸ４０， ＧＩＴＲ， ＣＤ２７， ＣＤ２８， ａｎｄ ＩＣＯＳ．」Ｓｅｍｉｎ Ｏｎｃｏｌ ４２巻（４号）：６４０〜６５５頁、この参考文献の内容はその全体が参照により本明細書に組み込まれる）、したがって、本発明者らは、これらの処置と本発明者らのＳＴＩＮＧアゴニスト産生細菌株との組み合わせた有効性を評価しようとした。
ＳＹＮ４０２３（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓからの、プラスミドに基づく、テトラサイクリン誘導性ｐ１５ａ Ｐｔｅｔ−ＤａｃＡと、ΔＤａｐＡとを含む、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅ）が、ａＯＸ４０、ａ４１ＢＢおよびａＧＩＴＲの有効性を増強することができるかどうかを判定するために、腫瘍成長をＢ１６Ｆ１０腫瘍モデルにおいてモニタリングした。
試験のための細胞を産生するために、一晩培養物を使用して、抗生物質を含むＬＢ培地５００ｍＬに接種した。株を、培養物が対数期の終期に達するまで（ＯＤ６００＝０．８〜１．０）、振とうさせながら３７Ｃでインキュベートした。収集するために、細胞を５０００ｒｐｍで２０分間遠心沈降させ、培地を吸引し、細胞をＰＢＳで洗浄し、１５％グリセロールおよびＰＢＳ中に再懸濁させ、アリコートにして、−８０Ｃで凍結した。細胞を連続プレーティングにより濃度試験した。
−９日目にマウスの各々の右脇腹にＢ１６Ｆ１０腫瘍（ＰＢＳ中の２ｅ５個細胞／マウス）をＳＣ移植した。−３日目に腫瘍成長をモニタリングし、腫瘍が約４０〜８０に達したら、マウス（０日目）を表５７に示すような腫瘍内投与の実験群（１群あたりＮ＝１０）に無作為化した。
動物に試験期間にわたって週２回、ＳＹＮ４０２３細菌をＩ．Ｔ．投与し、適切な抗体をＩ．Ｐ．投与した。抗体処置（Ｉ．Ｐ．）は、次の通りであった：抗ＯＸ−４０（１用量あたり１００μｇでの抗ＯＸ−４０）、抗ＧＩＴＲ（１用量あたり３５０μｇでのＤＴＡ−１）、およびα４−１ＢＢ（１用量あたり３５０μｇでのＬＯＢ１２．３）。各細菌投与の４時間前に、マウスを１０μｇのＡＴＣ（アンヒドロテトラサイクリン）で腹腔内注射によって処置した。完全な応答体については細菌投与を停止した。腫瘍成長を、図２２Ａ（体積中央値）ならびに図２２Ｂ、図２２Ｃ、図２２Ｄ、図２２Ｅ、図２２Ｆ、図２２Ｇおよび図２２Ｈ（個々のマウス）に示すように、３、６、９および１３日目に測定した。結果は、ＳＹＮ４０２３と様々なアゴニスト抗体の併用投与がアゴニスト抗体単独と比較して腫瘍成長および腫瘍拒絶の優れた制御をもたらすことを示す。これらのデータおよび上記データは、ＳＴＩＮＧアゴニスト産生が免疫チェックポイント療法と免疫アゴニスト療法の両方の有効性を改善することができることを実証する。
（実施例５６）
Ｂ１６Ｆ１０腫瘍モデルにおけるｉｎ ｖｉｖｏプロモーター試験
免疫学的ペイロード送達に対する制御手段として、いくつかの誘導性プロモーター系の機能および有用性を評価した。低酸素誘導性ＦＮＲ、クミン酸塩誘導性およびサリチル酸塩誘導性プロモーターの活性をｉｎ ｖｉｖｏで腫瘍微小環境においてアセスメントした。
誘導後の腫瘍内の様々な誘導性プロモーターの発現を評価するために、試験する様々なプロモーターにより駆動されるＧＦＰ受容体構築物を生成した。構成的プロモーターにより駆動されるＲＦＰを使用して、腫瘍内の細菌細胞を同定し、単離した。
本明細書に記載するようにＢ１６Ｆ１０に移植し（２ｅ５で移植し）、投与前に約１００ｍｍ３の腫瘍サイズに到達させた。試験１日目に、表５８に収載するように、マウスを群（１群あたりマウス８匹；１時点あたりマウス４匹）に無作為化し、誘導性ＧＦＰ株をマウスに注射した。インデューサーを細菌注射の４８時間後（３日目）にＩ．Ｐ．投与した。
インデューサー注射の１および１６時間後（３日目および４日目）に、腫瘍を４０μＭセルストレーナーで破砕し、７００ｇで５分間遠心した。上清を新たな管に移し、４，０００ｒｐｍで１０分間遠心した。ペレットを５００μＬのＰＢＳ中に再懸濁させ、２００μＬをフローサイトメトリー分析のために９６ウェルペレットに移した。結果を図２４および図２５に示す。図２４は、ＧＦＰ陽性である（すなわち、プロモーターが活性である）、ＲＦＰ陽性（細菌細胞、無腫瘍細胞）のパーセンテージを示す。３つのプロモーターが活性である細菌細胞のパーセンテージが、１時間の時点と１６時間の時点で同じであることに注目されたい。図２５は、全遺伝子発現レベルを測定する、平均蛍光強度（ＭＦＩ）を表す。１６時間の時点でより高い発現レベルを示すｔｅｔ誘導性構築物を除いて、これらの発現レベルもまた、２つの時点にわたって同じままである。考え合わせると、これらの結果は、試験した３つすべてのプロモーターが、免疫学的ペイロードのプロキシであるレポーター遺伝子発現を腫瘍においてｉｎ ｖｉｖｏで駆動することができることを示す。
（実施例５７）
ＷＴ ＳＴＩＮＧ株の投与は長期免疫学的記憶をもたらす
ＳＹＮ３５２７（ＷＴ Ｔｅｔ−ＳＴＩＮＧ）により惹起される完全退縮が長期にわたる免疫学的記憶をもたらすことことができることを、Ａ２０腫瘍モデルにおいてアセスメントした。
ＳＹＮ３５２７用量応答試験（実施例５２、図６５）でＳＹＮ３５２７処置により完全退縮が認められた動物（ｎ＝４）を使用し、未処置同齢マウスと比較した。
−１４日目に未処置対照マウスの各々の右脇腹にＡ２０腫瘍（ＰＢＳ中の２ｅ５個細胞／マウス）をＳＣ移植した。以前にＳＹＮ３５２７によって処置した（そして完全退縮を示している）マウスの、最初の腫瘍とは反対側の脇腹である左脇腹に、最初の処置後６０日目にＡ２０腫瘍（ＰＢＳ中の２ｅ５個細胞／マウス）をＳＣ移植した。
腫瘍体積および体重を週に３回測定し、動物の健康状態を週に３回アセスメントした。結果を図１３に示す。この結果は、ＷＴ ＳＴＩＮＧ株の投与が長期免疫学的記憶をもたらすことを示す。未処置対照とは対照的に、以前にＳＹＮ３５２７で処置した動物では腫瘍の再発が観察されなかった。これは、持続的記憶応答を示す。
（実施例５８）
プロモーター試験（ＦＮＲ、クミン酸塩誘導性およびサリチル酸塩誘導性プロモーターの比較）
ＦＮＲ、クミン酸塩誘導性およびサリチル酸塩誘導性プロモーターを、ｉｎ ｖｉｔｒｏで調節可能かつ効果的なエフェクター発現レベルを可能にするそれらの能力についてアセスメントした。
利用したサリチル酸センサー回路ＰＳａｌ／ＮａｈＲバイオセンサー回路（パート：ＢＢａ＿Ｊ６１０５１）を最初はＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａから適応させた。ｎａｈおよびｓａｌプロモーターと結合して、インデューサーサリチル酸塩に応答して転写を活性化する３４ｋＤａタンパク質をコードする、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａの８３ｋｂナフタレン分解プラスミドＮＡＨ７（Ｄｕｎｎ， Ｎ． Ｗ．、およびＩ． Ｃ． Ｇｕｎｓａｌｕｓ．（１９７３年）Ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｂｌｅ ｐｌａｓｍｉｄ ｅｎｃｏｄｉｎｇ ｅａｒｌｙ ｅｎｚｙｍｅｓ ｏｆ ｎａｐｈｔｈａｌｅｎｅ ｏｘｉｄａｔｉｏｎ ｉｎ Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ． Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． １１４巻：９７４〜９７９頁）からｎａｈＲ遺伝子を取り出した。ＮａｈＲは、構成的プロモーター（Ｐｃ）により構成的に発現され、目的のタンパク質の発現は、インデューサーの存在下でＮａｈＲにより正に調節される。ここでは、Ｂｉｏｂｒｉｃｋ ＢＢａ＿Ｊ６１０５１（構成的プロモーターおよびＰＳａｌプロモーターにより駆動されるＮａｈＲをコードする遺伝子を含有する）を、骨格ｐ１５内のｄａｃＡの前にクローニングした。
クミン酸塩により調節される発現が、ネイティブＰ．ｐｕｔｉｄａ Ｆ１において機能する基本的機序、およびそれをＥ．ｃｏｌｉに適用する方法は、以前に記載されている（例えば、Ｃｈｏｉら、Ｎｏｖｅｌ， Ｖｅｒｓａｔｉｌｅ， ａｎｄ Ｔｉｇｈｔｌｙ Ｒｅｇｕｌａｔｅｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｓｔｒａｉｎｓ； Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２０１０年８月７６巻１５号５０５８〜５０６６頁を参照されたい）。本質的に、クミン酸回路またはスイッチは、次の４つの構成要素を含む：強力プロモーター、リプレッサー結合ＤＮＡ配列またはオペレーター、ｃｙｍＲの発現、リプレッサー、およびインデューサーとしてのクミン酸塩。インデューサー変化の付加は、クミン酸塩とＣｙｍＲとの複合体の形成を引き起こし、結果としてリプレッサーがそのＤＮＡ結合部位から除去されることになり、それによって目的の遺伝子の発現が可能になる。ここでは、構成的プロモーターおよびｃｙｍＲ応答性プロモーターにより駆動されるｃｙｍＲ遺伝子を含む構築物を、クミン酸塩誘導性発現を可能にするために、ｐ１５内のＤａｃＡ遺伝子の前にクローニングした。
ｉｎ ｖｉｔｒｏでＤａｃＡの発現を駆動するおよびｃ−ジＡＭＰの産生を可能にするこれらのプロモーターの能力をアセスメントした。ＦＮＲ、クミン酸塩誘導性およびサリチル酸塩誘導性プロモーターを含有する断片を、ｄａｃＡ構築物を含有するｐ１５にクローニングした。株を下記の表６０に示すように表した。
（実施例５９）
ＴｈｙＡ栄養要求体（ΔｔｈｙＡ）の生成
栄養要求性突然変異は、生存または成長に必須の外部から加えられる栄養素の非存在下で細菌を死滅させる。これらの細菌には、その必須栄養素を産生するために必要な遺伝子がないからである。遺伝子操作された株に栄養要求性修飾を加えることで遺伝子操作された細菌を生成するために、オリゴヌクレオチド合成に必須の遺伝子であるｔｈｙＡを欠失させる。Ｅ．ｃｏｌｉ ＮｉｓｓｌｅにおけるｔｈｙＡ遺伝子の欠失は、チミジンが補充されない限りＬＢプレート上でコロニーを形成することができない株を生じさせる。次のような３ラウンドのＰＣＲを使用して、ｔｈｙＡ：：ｃａｍ ＰＣＲ断片を増幅する。第１のＰＣＲラウンドについては、鋳型としての１ｎｇのｐＫＤ３と、２５μｌの２×ｐｈｕｓｉｏｎと、０．２μＬのプライマーＳＲ３６およびＳＲ３８と、０、０．２、０．４または０．６μｌのいずれかのＤＭＳＯとを含有する４×５０μｌのＰＣＲ反応物を、ヌクレアーゼフリー水で５０μｌの体積にし、以下のサイクル条件下で増幅させる：
ステップ１：３０秒間、９８ｃ
ステップ２：１０秒間、９８ｃ
ステップ３：１５秒間、５５ｃ
ステップ４：２０秒間、７２ｃ
ステップ２〜４を３０サイクル繰り返す
ステップ５：５分間、７２ｃ
その後、５μｌの各ＰＣＲ反応物をアガロースゲル上で泳動させて、適切なサイズのＰＣＲ産物を確認する。ＺｙｍｏｃｌｅａｎゲルＤＮＡ回収キットを製造業者の使用説明書に従って使用して、残りのＰＣＲ反応物からＰＣＲ産物を精製し、３０μｌのヌクレアーゼフリー水で溶出する。
第２のＰＣＲラウンドについては、０．２μｌのプライマーＳＲ３３およびＳＲ３４を用いたことを除いて上記の通りの４×５０μｌのＰＣＲ反応物において、ラウンド１からの１μｌの精製ＰＣＲ産物を鋳型として使用する。サイクル条件は、第１のＰＣＲ反応について上で述べたのと同じである。ＰＣＲ産物を、上記の通り、アガロースゲル上で泳動させて増幅を検証し、精製し、３０μｌで溶出する。
第３のＰＣＲラウンドについては、プライマーＳＲ４３およびＳＲ４４を用いたことを除いて上記の通りの４×５０μｌのＰＣＲ反応物において、ラウンド２からの１μｌの精製ＰＣＲ産物を鋳型として使用する。サイクル条件は、ラウンド１および２について記載したのと同じである。上記の通り、増幅を検証し、ＰＣＲ産物を精製し、溶出する。分光光度計を使用して、濃度および純度を測定する。ｔｈｙＡの上流と相同の９２ｂｐと、ｆｒｔ部位と隣接しているクロラムフェニコールカセットと、ｔｈｙＡ遺伝子の下流と相同の９８ｂｐとを含有する、得られた直鎖ＤＮＡ断片を、リコンビニアリングのために成長させたｐＫＤ４６を含有するＥ．ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅ １９１７株に形質転換させる。電子穿孔後、３ｍＭのチミジンを含有する１ｍｌのＳＯＣ培地を添加し、細胞を振とうさせながら２時間、３７Ｃで放置して回復させる。次いで、細胞を１０，０００ｘｇで１分間ペレット化し、上清を廃棄し、３ｍＭのチミジンを含有する１００μｌのＬＢに細胞ペレットを再懸濁させ、３ｍＭのｔｈｙと２０μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールとを含有するＬＢ寒天プレートに塗る。細胞を３７Ｃで一晩インキュベートする。ＬＢプレート上に出現したコロニーを再画線する。＋ｃａｍ ２０μｇ／ｍｌ＋または−ｔｈｙ ３ｍＭ。（ｔｈｙＡ栄養要求株は、ｔｈｙ ３ｍＭを補充した培地中でのみ成長することになる）。
次に、抗生物質耐性をｐＣＰ２０形質転換で除去する。ｐＣＰ２０は、酵母Ｆｌｐリコンビナーゼ遺伝子、ＦＬＰ、クロラムフェニコールおよびアンピシリン耐性遺伝子、ならびに温度感受性複製を有する。選択抗生物質を含有するＬＢ培地中、３７℃で、ＯＤ６００＝０．４〜０．６まで、細菌を成長させる。１ｍＬの細胞を次のように洗浄する：細胞を１６，０００ｘｇで１分間、ペレット化する。上清を廃棄し、ペレットを１ｍＬの氷冷１０％グリセロールに再懸濁させる。このステップを３回繰り返す。最終ペレットを７０μｌの氷冷１０％グリセロールに再懸濁させる。次に、細胞に１ｎｇのｐＣＰ２０プラスミドＤＮＡを電子穿孔し、３ｍＭのチミジンを補充した１ｍＬのＳＯＣを直ちにキュベットに添加する。細胞を再懸濁させ、培養管に移し、３０℃で１時間、成長させる。次いで、細胞を１０，０００ｘｇで１分間ペレット化し、上清を廃棄し、３ｍＭのチミジンを含有する１００μｌのＬＢに細胞ペレットを再懸濁させ、３ｍＭのｔｈｙと１００μｇ／ｍｌのカルベニシリンとを含有するＬＢ寒天プレートに塗り、３０℃で１６〜２４時間、成長させる。次に、形質転換体を、４２℃で、非選択的に（抗生物質なし）、コロニー精製する。
コロニー精製形質転換体を試験するために、ピペット先端部を用いてコロニーを４２℃プレートから採取し、１０μＬのＬＢに再懸濁させる。３μＬの細胞懸濁液を次の３枚１セットのプレートにピペットで移す：Ｃａｍ、（３７℃；宿主株のゲノム中のＣａｍＲ遺伝子の存在／非存在について試験する）、Ａｍｐ、（３０℃、ｐＣＰ２０プラスミドからのＡｍｐＲの存在／非存在について試験する）、およびＬＢのみ（クロラムフェニコールカセットおよびｐＣＰ２０プラスミドを喪失した望ましい細胞）、３７℃。ＣａｍプレートでもＡｍｐプレートでも成長がない場合にはコロニーを消滅したと見なし、採取し、ＬＢプレートに再画線して単一コロニーを得、一晩、３７℃で成長させる。
その後、５μｌの各ＰＣＲ反応物をアガロースゲル上で泳動させて、適切なサイズのＰＣＲ産物を確認する。ＺｙｍｏｃｌｅａｎゲルＤＮＡ回収キットを製造業者の使用説明書に従って使用して、残りのＰＣＲ反応物からＰＣＲ産物を精製し、３０μｌのヌクレアーゼフリー水で溶出する。
第２のＰＣＲラウンドについては、０．２μｌのプライマーＳＲ３３およびＳＲ３４を用いたことを除いて上記の通りの４×５０μｌのＰＣＲ反応物において、ラウンド１からの１μｌの精製ＰＣＲ産物を鋳型として使用する。サイクル条件は、第１のＰＣＲ反応について上で述べたのと同じである。ＰＣＲ産物を、上記の通り、アガロースゲル上で泳動させて増幅を検証し、精製し、３０μｌで溶出する。
第３のＰＣＲラウンドについては、プライマーＳＲ４３およびＳＲ４４を用いたことを除いて上記の通りの４×５０μｌのＰＣＲ反応物において、ラウンド２からの１μｌの精製ＰＣＲ産物を鋳型として使用する。サイクル条件は、ラウンド１および２について記載したのと同じである。上記の通り、増幅を検証し、ＰＣＲ産物を精製し、溶出する。分光光度計を使用して、濃度および純度を測定する。ｔｈｙＡの上流と相同の９２ｂｐと、ｆｒｔ部位と隣接しているクロラムフェニコールカセットと、ｔｈｙＡ遺伝子の下流と相同の９８ｂｐとを含有する、得られた直鎖ＤＮＡ断片を、リコンビニアリングのために成長させたｐＫＤ４６を含有するＥ．ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅ １９１７株に形質転換させる。電子穿孔後、３ｍＭのチミジンを含有する１ｍｌのＳＯＣ培地を添加し、細胞を振とうさせながら２時間、３７Ｃで放置して回復させる。次いで、細胞を１０，０００ｘｇで１分間ペレット化し、上清を廃棄し、３ｍＭのチミジンを含有する１００μｌのＬＢに細胞ペレットを再懸濁させ、３ｍＭのｔｈｙと２０μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールとを含有するＬＢ寒天プレートに塗る。細胞を３７Ｃで一晩インキュベートする。ＬＢプレート上に出現したコロニーを再画線する。＋ｃａｍ ２０μｇ／ｍｌ＋または−ｔｈｙ ３ｍＭ。（ｔｈｙＡ栄養要求株は、ｔｈｙ ３ｍＭを補充した培地中でのみ成長することになる）。
次に、抗生物質耐性をｐＣＰ２０形質転換で除去する。ｐＣＰ２０は、酵母Ｆｌｐリコンビナーゼ遺伝子、ＦＬＰ、クロラムフェニコールおよびアンピシリン耐性遺伝子、ならびに温度感受性複製を有する。選択抗生物質を含有するＬＢ培地中、３７℃で、ＯＤ６００＝０．４〜０．６まで、細菌を成長させる。１ｍＬの細胞を次のように洗浄する：細胞を１６，０００ｘｇで１分間、ペレット化する。上清を廃棄し、ペレットを１ｍＬの氷冷１０％グリセロールに再懸濁させる。このステップを３回繰り返す。最終ペレットを７０μｌの氷冷１０％グリセロールに再懸濁させる。次に、細胞に１ｎｇのｐＣＰ２０プラスミドＤＮＡを電子穿孔し、３ｍＭのチミジンを補充した１ｍＬのＳＯＣを直ちにキュベットに添加する。細胞を再懸濁させ、培養管に移し、３０℃で１時間、成長させる。次いで、細胞を１０，０００ｘｇで１分間ペレット化し、上清を廃棄し、３ｍＭのチミジンを含有する１００μｌのＬＢに細胞ペレットを再懸濁させ、３ｍＭのｔｈｙと１００μｇ／ｍｌのカルベニシリンとを含有するＬＢ寒天プレートに塗り、３０℃で１６〜２４時間、成長させる。次に、形質転換体を、４２℃で、非選択的に（抗生物質なし）、コロニー精製する。
コロニー精製形質転換体を試験するために、ピペット先端部を用いてコロニーを４２℃プレートから採取し、１０μＬのＬＢに再懸濁させる。３μＬの細胞懸濁液を次の３枚１セットのプレートにピペットで移す：Ｃａｍ、（３７℃；宿主株のゲノム中のＣａｍＲ遺伝子の存在／非存在について試験する）、Ａｍｐ、（３０℃、ｐＣＰ２０プラスミドからのＡｍｐＲの存在／非存在について試験する）、およびＬＢのみ（クロラムフェニコールカセットおよびｐＣＰ２０プラスミドを喪失した望ましい細胞）、３７℃。ＣａｍプレートでもＡｍｐプレートでも成長がない場合にはコロニーを消滅したと見なし、採取し、ＬＢプレートに再画線して単一コロニーを得、一晩、３７℃で成長させる。
他の実施形態では、同様の方法を使用して、ｄａｐＡを含むがこれに限定されない他の栄養要求体を作出する。
（実施例６０）
ＤＡＰＡ栄養要求株ＳＴＩＮＧ株の生成
ｉｎ ｖｉｖｏおよびその環境での成長を制御するために、細菌成長に必須である４−ヒドロキシ−テトラヒドロピコリン酸シンターゼをコードするｄａｐＡ遺伝子を欠失させることによって親Ｅ．ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅ骨格を栄養要求性株になるように操作した。この欠失は、細菌をジアミノピメリン酸（ＤＡＰ）合成不能することによって、細菌細胞壁の適正な形成を、その株にＤＡＰが外部から補充されない限り、防止する。
ｄａｐＡ欠失（ΔｄａｐＡ）を生じさせるために、ネステッドプライマーを使用して２ラウンドのＰＣＲを行った。第１のＰＣＲラウンドについては、ｐＫＤ３を鋳型ＤＮＡとして使用した。ＥｃＮ染色体内のｄａｐＡ遺伝子座に隣接する相同性と、ｆｒｔ部位と隣接しているクロラムフェニコール耐性遺伝子とを含有するｄｓＤＮＡ断片を生成するためのプライマーを設計した。第２のＰＣＲラウンドで使用したプライマーは、第１のラウンドのＰＣＲ産物を鋳型ＤＮＡとして利用した。これらのプライマーは、リコンビニアリングのためのより長いＥｃＮ相同長を提供するためにｄａｐＡとの追加の相同性を含有した。結果として生じるｄａｐＡノックアウト断片は、その５’および３’末端に、それぞれ、６８塩基対および７０塩基対のＥｃＮ相同性を含んだ。ｐＫＤ４６を含有する株を電子穿孔によりｄａｐＡノックアウト断片で形質転換した。クロラムフェニコール（３０μｇ／ｍＬ）とジアミノピメリン酸塩（１００μｇ／ｍＬ）とを含有するＬＢ寒天でコロニーを選択し、適正な組換え事象をＰＣＲにより検証した。ｐＫＤ４６を３７Ｃでの継代により株から消滅させた。
このＤＡＰ栄養要求株骨格を使用して、ＳＴＩＮＧアゴニスト産生株ＳＹＮ４０２３などの、エフェクターの産生のための遺伝子配列を発現する細菌を生成した。
（実施例６１）
全身性抗腫瘍免疫：ＤＡＰ−ＳＴＩＮＧはアゴニスト抗ＯＸ４０抗体との組合せでアブスコパル効果を惹起し、長期免疫学的記憶をもたらす
Ｔ細胞活性化を促進する正の共刺激受容体としては、ＣＤ２８、ＣＤ１３７（４−１ＢＢとしても公知）、およびＯＸ４０（ＣＤ１３４または腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）スーパーファミリーメンバー４としても公知）が挙げられる。最近、アゴニストＯＸ４０抗体と組み合わせた（例えば、Ｔｏｌｌ様受容体による）自然免疫刺激は、Ｔ細胞依存性（ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞依存性）アブスコパル効果および免疫学的記憶を促進することができることが示された（Ｓａｇｉｖ−Ｂａｒｆｉら、Ｉｎ Ｓｉｔｕ Ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ａ ＴＬＲ９ Ａｇｏｎｉｓｔ ａｎｄ Ａｎｔｉ−ＯＸ４０ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｌｅａｄｓ ｔｏ Ｔｕｍｏｒ Ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ Ｉｎｄｕｃｅｓ Ａｂｓｃｏｐａｌ Ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ｉｎ Ｍｕｒｉｎｅ Ｌｙｍｐｈｏｍａ； Ｂｌｏｏｄ ２０１６年１２８巻：１８４７頁；Ｓａｇｉｖ−Ｂａｒｆｉら、Ｅｒａｄｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓ ｍａｌｉｇｎａｎｃｙ ｂｙ ｌｏｃａｌ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、２０１８年）。抗ＯＸ４０抗体との組合せでアブスコパル効果を誘導するＳＹＮ４０２３（プラスミドに基づくテトラサイクリン誘導性ＤａｃＡと、ｄａｐＡ栄養要求性突然変異とを含む）の能力をＡ２０腫瘍モデルにおいてアセスメントした。
試験のための細胞を産生するために、一晩培養物を使用して、抗生物質を含むＬＢ培地５００ｍＬに接種した。株を、培養物が対数期の終期に達するまで（ＯＤ６００＝０．８〜１．０）、振とうさせながら３７Ｃでインキュベートした。収集するために、細胞を５０００ｒｐｍで２０分間遠心沈降させ、培地を吸引し、細胞をＰＢＳで洗浄し、１５％グリセロールおよびＰＢＳ中に再懸濁させ、アリコートにして、−８０Ｃで凍結した。細胞を連続プレーティングにより濃度試験した。
−１４日目に、Ａ２０腫瘍（５０：５０ マトリゲルマトリゲル：ＰＢＳ）をマウスの各々の右脇腹に２ｅ５個細胞／マウス、および左脇腹に１ｅ５個細胞／マウス、ＳＣ移植した。−３日目に腫瘍成長をモニタリングし、腫瘍が約８０〜１００ｍｍ３に達したら、マウス（０日目）を表６１に示すような腫瘍内投与の実験群（１群あたりＮ＝１０）に無作為化した。
動物に、０、３および７日目に３用量のＳＹＮ４０２３細菌Ｉ．Ｔ．およびＯＸ４０抗体Ｉ．Ｔ．投与を施した。投与の４時間後にマウスに１０μｇのＡＴＣ（アンヒドロテトラサイクリン）を腹腔内注射によって投与した。完全な応答体については細菌投与を停止した。両方の脇腹における腫瘍体積を測定し、動物の健康状態を、３回／週、アセスメントした。結果を図２３Ａ〜図２３Ｃに示す。この結果は、ＳＹＮ４０２３でのＡ２０腫瘍の処置がａＯＸ４０との組合せでアブスコパル効果を惹起することを示す。体重に対する有意な効果は観察されなかった（図２３Ｅ）。腫瘍負荷に起因して除去する必要がなく、試験時に維持することができた動物の生存、すなわち時間の長さを、図２３Ｄに示す。
次に、上記試験においてＳＹＮ４０２３により惹起された完全退縮が長期にわたる免疫学的記憶をもたらすかどうかを試験するために、Ａ２０およびＣＴ２６腫瘍を用いて再投与を行った。ＳＹＮ４０２３処置により完全退縮が認められた動物を使用し、未処置同齢マウスと比較した。
簡単に説明すると、４匹の１４週齢未処置Ｂａｌｂ／ｃ雌の左脇腹に、５０％マトリゲル中の２×１０５個Ａ２０細胞を、右脇腹に５０％マトリゲル中の１×１０５個ＣＴ２６細胞を接種した。上記の試験の第１部により腫瘍寛解が認められたマウス（ｎ＝１１）に、同じ方法で接種した。マウスを、腫瘍体積、体重および健康状態観察のために、週に２〜３回モニタリングした。
結果を図２３Ｆ〜Ｈおよび図２３Ｉに表す。この結果は、ＳＹＮ４０２３株の投与が、Ａ２０再投与に対して完全に防御する長期免疫学的記憶をもたらすことを示す。図２３Ｆは、各処置群についての腫瘍体積平均中央値を表し、図２３Ｇおよび図２３Ｈは、個々のマウスの腫瘍体積を経時的に示す折れ線グラフを表す。図２３Ｉは、アブスコパル効果および免疫学的記憶能力を問い合わせる２部構成の試験全体を表す（Ａ２０の再投与を表す）。Ａ２０再投与試験アームでは、未処置対照とは対照的に、以前にＳＹＮ４０２３で処置した動物では腫瘍の再発が観察されなかった。これは、持続的記憶応答を示す。ＣＴ２６再投与試験アームでは、ＳＹＮ４０２３株の投与は、ＣＴ２６腫瘍成長からある程度保護した。以前にＳＹＮ４０２３で処置し、ＣＴ２６を投与した動物１１匹中９匹が腫瘍再成長から保護された。
（実施例６２）
Ｂ１６．Ｆ１０腫瘍モデルにおけるＳＹＮ４４４９（ＤＡＰ−ＦＮＲ ＳＴＩＮＧ）の用量依存的抗腫瘍活性
ＦＮＲプロモーターの制御下にあるｄａｃＡを発現するプラスミドに基づく構築物を含む、本明細書中の他の箇所で説明したように構築したＤａｐ栄養要求性株（ＳＹＮ４４４９；ΔＤＡＰ、ｐ１５Ａ−ｆｎｒ−ｄａｃＡ）を、Ｂ１６．Ｆ１０黒色腫腫瘍モデルにおいて様々な用量でアセスメントした。
試験のための細胞を産生するために、一晩培養物を使用して、抗生物質を含むＬＢ培地５００ｍＬに接種した。株を、培養物が対数期の終期に達するまで（ＯＤ６００＝０．８〜１．０）、振とうさせながら３７Ｃでインキュベートした。収集するために、細胞を５０００ｒｐｍで２０分間遠心沈降させ、培地を吸引し、細胞をＰＢＳで洗浄し、１５％グリセロールおよびＰＢＳ中に再懸濁させ、アリコートにして、−８０Ｃで凍結した。細胞を連続プレーティングにより濃度試験した。
マウスにＢ１６腫瘍を移植し、ＳＴＩＮＧアゴニストを産生する細菌を様々な用量で、および対照を、マウスに腫瘍内注射した。
簡単に説明すると、−９日目に各動物の右脇腹にＢ１６細胞（ＰＢＳ中の２×１０ｅ５個細胞／マウス）をＳＣ移植した。−３日目に腫瘍成長をモニタリングし、１日目、腫瘍が約５０〜８０ｍｍ３に達したら、マウスを次のような腫瘍内投与の群（１群あたりＮ＝９）に無作為化した：群１−ＰＢＳ（対照）；群２−ＳＹＮ４４４９、１ｅ７ ＣＦＵ；群３−ＳＹＮ４４４９、１ｅ８ ＣＦＵ；および群４−ＳＹＮ４４４９、１ｅ９ ＣＦＵ。動物に、群に基づいた適切な細菌またはＰＢＳ（注射のための対照に）を１および４日目に投与した。完全な応答体については細菌投与を停止した。
４、７、１０、１２および１５日目の腫瘍体積を個々のマウスについて図２６Ａ〜図２６Ｄに示す。結果は、ＳＹＮ４４４９の投与がＢ１６−Ｆ１０腫瘍成長および腫瘍拒絶に対して用量依存的影響を及ぼすことを示す。１ｅ９の用量（図２６Ｄ）でのこの処置は、最大の拒絶パーセンテージ、およびこの期間にわたって腫瘍成長の有意な制御をもたらす。
（実施例６３）
Ａ２０腫瘍モデルにおけるＳＹＮ４４４９用量応答
Ａ２０腫瘍モデル（Ｂ細胞リンパ腫モデル）における、３つの異なる用量での、およびＰＢＳ対照と比較した、経時的なＳＹＮ４４４９（ＦＮＲ−ｄａｃＡ、デルタｄａｐＡ（ΔＤＡＰ、ｐ１５Ａ−ｆｎｒ−ｄａｃＡ）を含む）のｉｎ ｖｉｖｏ活性および有効性の判定。
試験のための細胞を産生するために、一晩培養物を使用して、抗生物質を含むＬＢ培地５００ｍＬに接種した。株を、培養物が対数期の終期に達するまで（ＯＤ６００＝０．８〜１．０）、振とうさせながら３７Ｃでインキュベートした。収集するために、細胞を５０００ｒｐｍで２０分間遠心沈降させ、培地を吸引し、細胞をＰＢＳで洗浄し、１５％グリセロールおよびＰＢＳ中に再懸濁させ、アリコートにして、−８０Ｃで凍結した。細胞を連続プレーティングにより濃度試験した。
雌Ｂａｌｂ／ｃマウス６週齢にＡ２０腫瘍を移植し、ｃ−ジＡＭＰを産生することができる細菌産生酵素の３種の異なる用量を腫瘍内注射した。腫瘍体積を様々な時点で測定した。
簡単に説明すると、−１５日目に各動物の右脇腹にＡ２０細胞（ＰＢＳ中の２×１０ ５／マウス／１００μＬ）をＳＣ移植した。腫瘍が約６０〜８０ｍｍ３に達するまで、腫瘍成長をモニタリングした。０日目に、マウスを次のような腫瘍内投与の群（１群あたりＮ＝１０）に無作為化した：ＰＢＳ（群１，ビヒクル対照）、ＳＹＮ４４４９（群２、１ｅ６ ＣＦＵ）、ＳＹＮ４４４９（群３、１ｅ７ ＣＦＵ）、およびＳＹＮ４４４９（群４、１ｅ８ ＣＦＵ）。動物に、群に基づいた適切な細菌またはＰＢＳ（注射のための対照に）を０、３および７日目に投与した。２回の測定の間を１〜２日空けて週に３回、３０日間、腫瘍体積および体重を記録した。結果を図２７Ａ〜図２７Ｄに示す。この結果は、１ｅ６（図２７Ａ）、１ｅ７（図２７Ｂ）および１ｅ８ ＣＦＵ（図２７Ｃ）でのＳＹＮ４４４９が、それぞれ、１０匹中５匹の完全奏功、１０匹中６匹の完全奏効、および１０匹中６匹の完全奏効をもたらしたことで、ＳＹ４４４９の投与がＡ２０リンパ腫モデルにおいて用量依存的腫瘍制御を駆動することを示す。
（実施例６４）
低酸素プロモーターの制御下でのＳＴＩＮＧアゴニスト産生株の構築および活性
例えば腫瘍微小環境に存在するような、低酸素条件下で誘導されるＳＴＩＮＧアゴニスト産生株を生成するために、Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓからのｄａｃＡをＦＮＲ誘導性プロモーターの制御下で低コピー数プラスミドにクローニングし、ＤａｐＡの欠失をさらに含むＮｉｓｓｌｅ株に形質転換して、ＳＹＮ４４４９（ΔＤＡＰ、１５Ａ−ｆｎｒ−ｄａｃＡ）を生成した。
ＳＹＮ４４４９のｉｎ ｖｉｔｒｏ活性を測定するために、ＳＹＮ４４４９および野生型対照の一晩培養物を、２５０ｒｐｍで振とうさせながら２ＹＴ（ジアミノピメリン酸を補充したもの）中、３７Ｃで成長させた。培養物を１：１００（１２５ｍＬバッフル付きフラスコ中に１０ｍＬ）に逆希釈し、初期対数期まで２〜３時間成長させた。培養物が初期対数期に達したら、培養物を、嫌気的雰囲気（８５％Ｎ２、１０％ＣＯ２、５％Ｈ２）を供給するＣｏｙ嫌気的チャンバーに移動させた。培養物を、嫌気的に３〜４時間インキュベートして、または管の中で一晩、３７Ｃ、２５０ｒｐｍで振とうさせて、ｄａｃＡを誘導させた。次に、試料を５分間、１００００Ｘｇで遠心分離して、細胞画分と細胞外画分を分離した。次いで、細胞ペレットを使用して、細胞内環状ジＡＭＰを判定した。濃度は、本明細書に記載の通りＬＣ／ＭＳによって決定した。結果を図２８Ａに示す。この結果は、ＳＹＮ４４４９が、ｉｎ ｖｉｔｒｏでＦＮＲプロモーターの制御下でｃ−ジＡＭＰを産生することができることを示す。
（実施例６５）
低酸素プロモーターの制御下での様々なＳＴＩＮＧアゴニスト産生株の構築
次に、ＦＮＲ−ＤａｃＡおよび／またはヒトｃＧＡＳの組み込まれたコピーを含む株を構築した。例を表６３に収載する。ｄａｐＡおよび／またはＴｈｙＡ栄養要求性を有する株を構築し、ｄａｃＡおよびキヌレニン消費回路両方を有する株を設計し、一部の事例では、本明細書に記載するおよび当技術分野で公知である方法を使用して、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅプロファージ３を破壊した。
表６３中の株を生成するために、本明細書に記載するおよび当技術分野で公知である方法を、様々な配列に使用した。例えば、ＤａｐＡノックアウト、ＨＡ９１０−ＦＮＲ−ｄａｃＡノックイン、そしてその後、ｔｈｙＡノックアウトを加えることにより、ファージ３ノックアウトを除いて野生型であるＮｉｓｓｌｅ株からＳＹＮ４９１０を構築した。別の例では、ｔｈｙＡノックアウト、ＨＡ９１０−ＦＮＲ−ｄａｃＡノックイン、ｄａｐノックアウト、およびファージノックアウトを加えることにより、ＳＹＮ２３０６（構成的プロモーターの制御下にある組み込まれたキヌレニナーゼを含む株）からＳＹＮ４９３９を構築した。
Ａ．ＤａｃＡの染色体組み込み
ＦＮＲプロモーターの制御下にある染色体に組み込まれているＤａｃＡを含む株を生成するために、Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓからのｄａｃＡをＦＮＲプロモーター（配列番号１２８１）の制御下にあるＫＩＫＯベクターにクローニングした。ノックインＰＣＲ産物をＫＩＫＯベクターから作製し、対立遺伝子交換を行って、これらのオペロンをＥ．ｃｏｌｉ ＮｉｓｓｌｅゲノムのＨＡ９１０部位に組み込んだ。本明細書におよび２０１７年１月１１日に出願されたＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０１３０７２（この内容はその全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載のラムダｒｅｄリコンビナーゼ系の使用によって対立遺伝子交換を容易にした。ラムダｒｅｄ系は、ＤａｔｓｅｎｋｏおよびＷａｎｎｅｒ（Ｏｎｅ−ｓｔｅｐ ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ ｇｅｎｅｓ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ−１２ ｕｓｉｎｇ ＰＣＲ ｐｒｏｄｕｃｔｓ； ＰＮＡＳ ２０００年６月６日．９７巻（１２号）６６４０〜６６４５頁）に記載されており、その修飾形態および適応形態も、当技術分野において記載されている。
Ｂ．ファージ３ノックアウトの生成
生物情報学的手法は、活性ファージを含有すると推定されるゲノムの３領域を同定するのに役立つ（２０１８年６月２１日に出願された国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ１８／３８８４０に記載されている通り（この参考特許文献の内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる））。社内開発ＰＣＲ方法を使用して、活性ファージがＥ．ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅゲノムの塩基２，０３５，８６７〜２，０７９，１７７の間のゲノム座に由来することを証明した。
ファージを不活性化するために、ラムダｒｅｄリコンビニアリングを使用して、９，６８７塩基対欠失を生じさせた。先ず、プラスミドｐＫＤ３からフリッパーゼ認識部位（ＦＲＴ）と隣接しているクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）遺伝子を増幅するためのプライマーを設計し、合成した。Ｎｉｓｓｌｅに導入すると、このカセットは、抗生物質クロラムフェニコールに対する耐性をもたらす。加えて、これらのプライマーは、ファージ座内に抗生物質カセットを方向付けるゲノムと相同性の６０塩基対を含有する。ファージ３ ＫＯ ＦＷＤおよびファージ３ ＫＯ ＲＥＶプライマーを使用して１１７８塩基対直鎖ＤＮＡ断片をＰＣＲ増幅し、これをＰＣＲ精製した。得られたＤＮＡ鋳型をリコンビニアリングに使用した。
ファージの欠失の用意をするために、先ず、ラムダｒｅｄ系を、当技術分野で公知の電子穿孔によるＥ．ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅ宿主株（野生型、または操作された成分をさらに含む）へのラムダｒｅｄ遺伝子を含むｐＫＤ４６プラスミドの形質転換により導入した。細胞を選択培地プレートに塗り広げ、一晩、３０℃でインキュベートした。次に、リコンビニアリング構築物を、電子穿孔により、ｐＫＤ４６を含むＥ．ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅ株に形質転換した。形質転換細胞を、３５μｇ／ｍＬのクロラムフェニコールを含有するＬＢプレートに塗り広げ、一晩インキュベートした。突然変異の存在をコロニーＰＣＲにより検証した。ＣＡＴ遺伝子がゲノムに挿入された（それによってファージが欠失し、不活性化された）場合にのみ、ＰＣＲ産物が形成する。
抗生物質耐性遺伝子をプラスミドｐＣＰ２０で除去した。プラスミドｐＣＰ２０は、ＦＲＴ部位を組み換えることによってＣＡＴ遺伝子を除去するフリッパーゼリコンビナーゼを発現する、温度感受性プラスミドである。ファージ配列が欠失された株を、抗生物質を含有するＬＢ培地中、３７℃で、０．４〜０．６のＯＤ６００に達するまで成長させ、次いで、電子穿孔を使用してｐＣＰ２０で形質転換した。２００μｌの細胞をカルベニシリンプレートに塗り、２００μＬの細胞をクロラムフェニコールプレートに塗り、両方を３７℃で一晩成長させた。カルベニシリンプレートは、ｐＣＰ２０を有する細胞を含有する。クロラムフェニコールプレートによって、電子穿孔で生き残った細胞数の指標が得られる。カルベニシリンプレートからの形質転換体を非選択的に４３℃で精製し、一晩放置して成長させた。
精製された形質転換体をカルベニシリンおよびクロラムフェニコールに対する感度について試験した。コロニーの成長がクロラムフェニコールプレートでもカルベニシリンプレートでも観察されなかった場合には、ＣＡＴ遺伝子とｐＣＰ２０プラスミドの両方が失われており、コロニーをさらなる分析のために保存した。保存したコロニーをＬＢプレート上に再画線して単一コロニーを得、一晩、３７℃で成長させた。ファージ配列の欠失を、ゲノムのファージ座領域の配列解析により、および溶菌斑形成の非存在の表現型検証により（２０１８年６月２１に出願された国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ１８／３８８４０（この内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）（に記載されているように）に記載のプロトコールに本質的に従って）、確認した。
ファージＫＯなどのノックアウトの代替実施方法は、ＦＲＴの代わりにｌｏｘＰ認識部位を使用し、ｐＣＰ２０の代わりにｐＣＲＥプラスミドを使用する方法である。この場合、先ず、プラスミドｐＫＤ４−ｌｏｘＰ（配列番号１４４２）からフリッパーゼ認識部位（ｌｏｘＰ）と隣接しているアミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ（ＮｅｏＲ／ＫａｎＲ）遺伝子を増幅するためのプライマーを設計し、合成した。Ｎｉｓｓｌｅに導入すると、このカセットは、抗生物質カナマイシンに対する耐性をもたらす。加えて、これらのプライマーは、ファージ座内に抗生物質カセットを方向付けるゲノムと相同性の６０塩基対を含有する。プライマーを使用して１１７８塩基対直鎖ＤＮＡ断片をＰＣＲ増幅し、これをＰＣＲ精製した。得られたＤＮＡ鋳型をリコンビニアリングに使用した。
ファージの欠失の用意をするために、先ず、ラムダｒｅｄ系を、当技術分野で公知の電子穿孔によるＥ．ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅ宿主株（野生型、または操作された成分をさらに含む）へのラムダｒｅｄ遺伝子を含むｐＫＤ４６プラスミドの形質転換により導入した。細胞を選択培地プレートに塗り広げ、一晩、３０℃でインキュベートした。次に、リコンビニアリング構築物を、電子穿孔により、ｐＫＤ４６を含むＥ．ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅ株に形質転換した。形質転換細胞を、５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含有するＬＢプレートに塗り広げ、一晩インキュベートした。突然変異の存在をコロニーＰＣＲにより検証した。ＣＡＴ遺伝子がゲノムに挿入された（それによってファージが欠失し、不活性化された）場合にのみ、ＰＣＲ産物が形成する。
抗生物質耐性遺伝子をプラスミドｐＫＤ４−ｌｏｘＰで除去した。プラスミドｐＫＤ４−ｌｏｘＰは、ｌｏｘＰ部位を組み換えることによってＮｅｏＲ／ＫａｎＲ遺伝子を除去するフリッパーゼリコンビナーゼを発現する温度感受性プラスミドである、ＦＲＴ部位がｌｏｘＰ部位により置換されている、変性ｐＫＤ４である。ファージ配列が欠失された株を、抗生物質を含有するＬＢ培地中、３７℃で、０．４〜０．６のＯＤ６００に達するまで成長させ、次いで、電子穿孔を使用してｌｏｇｉｃ１２５３で形質転換した。２００μｌの細胞をカルベニシリンプレートに塗り、２００μＬの細胞をカナマイシンプレートに塗り、両方を３７℃で一晩成長させた。カルベニシリンプレートは、ｐＫＤ４−ｌｏｘＰを有する細胞を含有する。カナマイシンプレートによって、電子穿孔で生き残った細胞数の指標が得られる。カルベニシリンプレートからの形質転換体を非選択的に４３℃で精製し、一晩放置して成長させた。
精製された形質転換体をカルベニシリンおよびカナマイシンに対する感度について試験した。コロニーの成長がカナマイシンプレートでもカルベニシリンプレートでも観察されなかった場合には、ＮｅｏＲ／ＫａｎＲ遺伝子とｐＫＤ４−ｌｏｘＰプラスミドの両方が失われており、コロニーをさらなる分析のために保存した。保存したコロニーをＬＢプレート上に再画線して単一コロニーを得、一晩、３７℃で成長させた。ファージ欠失部位に隣接するプライマー（ＧＴＧＡＴＴＡＡＧＴＡＣＧＴＧＡＡＡＴＣＧＡＣＴＧＡＡＣ（配列番号１４３６）およびＣＴＣＴＧＴＣＧＧＣＡＡＣＡＴＧＡＧＧＡ（配列番号１４３７））を使用する、予想された６４０ｂｐ断片のＰＣＲ増幅により、ファージ配列の欠失を確認した。
表６４は、欠失により不活性化されたファージ３遺伝子を収載する。
Ｃ．ＴｈｙＡ栄養要求株（ΔｔｈｙＡ）ＳＴＩＮＧアゴニスト産生株の生成
Ｅ．ｃｏｌｉ ＮｉｓｓｌｅにおけるｔｈｙＡ遺伝子の突然変異は、チミジンが補充されない限りＬＢプレート上でコロニーを形成することができない株を生じさせる。ネステッドプライマーでの３ラウンドのＰＣＲを使用して、ｔｈｙＡ：：ｃａｍ ＰＣＲ断片を増幅した。第１のＰＣＲラウンドについては、ｐＫＤ３を鋳型として使用した。ＰＣＲ産物を残りのＰＣＲ反応物から精製し、第２のＰＣＲ反応で鋳型として使用した。この場合もやはり、得られたＰＣＲ産物を精製し、第３のＰＣＲランドで鋳型として使用した。ｔｈｙＡの上流と相同の９２ｂｐと、ｆｒｔ部位と隣接しているクロラムフェニコールカセットと、ｔｈｙＡ遺伝子の下流と相同の９８ｂｐとを含有する、得られた直鎖ＤＮＡ断片を、リコンビニアリングのために成長させたｐＫＤ４６を含有するＥ．ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅ １９１７株に、電子穿孔を使用して形質転換させた。クロラムフェニコール（３０μｇ／ｍＬ）とチミジン（３ｍＭ）とを含有するＬＢ寒天でコロニーを選択し、適正な組換え事象をＰＣＲにより検証した。ｐＫＤ４６を３７Ｃでの継代により株から消滅させた。
次に、抗生物質耐性をｐＣＰ２０形質転換で除去し、細胞を３ｍＭのチミジンと１００μｇ／ｍｌのカルベニシリンとを含有するＬＢ寒天プレートに塗り、３０℃で１６〜２４時間成長させた。次に、形質転換体を、４２℃で、非選択的に（抗生物質なし）、コロニー精製した。コロニー精製形質転換体を試験するために、Ｃａｍ、ＡｍｐおよびＬＢのみのプレート上にコロニーを播種し、Ｃａｍプレート上でもＡｍｐプレート上でも成長がなかった場合にはコロニーを消滅したと見なした。抗生物質カセットの非存在をＰＣＲにより確認した。
Ｄ．ＤＡＰＡ栄養要求株ＳＴＩＮＧ株の生成
ｄａｐＡ欠失（ΔｄａｐＡ）を生じさせるために、ネステッドプライマーを使用して２ラウンドのＰＣＲを行った。第１のＰＣＲラウンドについては、ｐＫＤ３を鋳型ＤＮＡとして使用した。ＥｃＮ染色体内のｄａｐＡ遺伝子座に隣接する相同性と、ｆｒｔ部位と隣接しているクロラムフェニコール耐性遺伝子とを含有するｄｓＤＮＡ断片を生成するためのプライマーを設計した。第２のＰＣＲラウンドで使用したプライマーは、第１のラウンドのＰＣＲ産物を鋳型ＤＮＡとして利用した。これらのプライマーは、リコンビニアリングのためのより長いＥｃＮ相同長を提供するためにｄａｐＡとの追加の相同性を含有した。結果として生じるｄａｐＡノックアウト断片は、その５’および３’末端に、それぞれ、６８塩基対および７０塩基対のＥｃＮ相同性を含んだ。ｐＫＤ４６を含有する株を電子穿孔によりｄａｐＡノックアウト断片で形質転換した。クロラムフェニコール（３０μｇ／ｍＬ）とジアミノピメリン酸塩（１００μｇ／ｍＬ）とを含有するＬＢ寒天でコロニーを選択し、適正な組換え事象をＰＣＲにより検証した。ｐＫＤ４６を３７Ｃでの継代により株から消滅させた。
（実施例６６）
低酸素プロモーターの制御下での様々なＳＴＩＮＧアゴニスト産生株の構築および活性
二重栄養要求性とファージノックアウトとを含む株の試験
ＦＮＲ−ＤａｃＡを含み、かつ二重栄養要求性とファージノックアウトとを含む株である、ＳＹＮ４９１０（ΔΦ、ΔＤＡＰ、ΔＴｈｙＡ、ＨＡ９／１０：：ｆｎｒ−ＤａｃＡ）および組合せ株ＳＹＮ４９３９（Ｎｉｓｓｌｅ、ΔΦ、ΔＤＡＰ、ΔＴｈｙＡ、ＨＡ９／１０：：ｆｎｒ−ＤａｃＡ、ＰＳｙｎＪ２３１１９−ｐＫＹＮａｓｅ、ΔＴｒｐＥ）を、本明細書に記載の方法に従って構築した。
ＳＹＮ４９１０およびＳＹＮ４９３９のｉｎ ｖｉｔｒｏ活性を測定、比較するために、Ｎｉｓｓｌｅ対照（ＳＹＮ９４、ストレプトマイシン耐性Ｎｉｓｓｌｅ）を含む各株の一晩培養物を、２５０ｒｐｍで振とうさせながらＬＢ中、３７Ｃで成長させた。培養物を１：１００（１２５ｍＬバッフル付きフラスコ中に１０ｍＬ）に逆希釈し、初期対数期まで２〜３時間成長させた。培養物が初期対数期に達したら、培養物を、嫌気的雰囲気（８５％Ｎ２、１０％ＣＯ２、５％Ｈ２）を供給するＣｏｙ嫌気的チャンバーに移動させた。培養物を、嫌気的に３〜４時間インキュベートして、または管の中で一晩、３７Ｃ、２５０ｒｐｍで振とうさせて、ｄａｃＡ遺伝子を誘導させた。
次に、環状ジヌクレオチド産生のＬＣ／ＭＳ分析のために培養物を除去した。試料を５分間、１００００ｘｇで遠心分離して、細胞画分と細胞外画分を分離した。次いで、細胞ペレットを使用して、細胞内環状ジＡＭＰを判定した。濃度は、本明細書に記載の通りＬＣ／ＭＳによって決定した。
キヌレニン消費を定量するために、ＬＢ一晩培養物ＳＹＮ４９１０およびＳＹＮ４９３９＋キヌレニン消費株ＳＹＮ２３０６（ＨＡ３／４：：ＰＳｙｎＪ２３１１９−ｐＫＹＮａｓｅデルタＴｒｐＥを含む）およびＮｉｓｓｌｅ対照（ＳＹＮ９４）を、０．５％グルコース（ｗ／ｖ）および適切な抗生物質を補充したまたはＬＢおよび抗生物質を補充したＭ９最少培地で１：２５希釈し、振とう（２５０ｒｐｍ）しながら３７℃で５〜６時間成長させた。細胞を遠心沈降させ、２００μＭのＬ−キヌレニン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（登録商標））を補充したＬＢ培地に再懸濁させて１．０の光学密度（６００ｎｍ）にした。次いで、これらの培養物を３７℃で振とうさせながら３〜４時間インキュベートして、キヌレニンを消費させた。キヌレニン消費測定のために、試料を各培養物から除去し、５分間、１００００ｘｇで遠心して、細胞画分と細胞外画分を分離した。培地上清を除去し、使用して、ＬＣ／ＭＳ分析によってキヌレニンの消費を判定した。
図２８Ｂおよび図２８Ｃに示す結果は、ＳＹＮ４９１０とＳＹＮ４９３９の両方が環状ジＡＭＰを産生することができたことを示す。図２８Ｄの結果は、組合せ株ＳＹＮ４９３９もまたその親ＳＹＮ２３０６と同様にキヌレニンを消費する能力を保持したことを示す。考え合わせると、これらの結果は、ファージノックアウトと二重栄養要求性とを含むこれらの株がｉｎ ｖｉｔｒｏ環状ジＡＭＰ産生能力を維持すること、および組合せ株ＳＹＮ４９３９が環状ジＡＭＰ産生とキヌレニン消費両方の能力を有することを示す。
株活性に対するファージノックアウトおよびｄａｐＡ栄養要求性の効果の試験
株活性に対するファージノックアウトおよびｄａｐＡ栄養要求性の効果を試験するために、ファージノックアウトおよびｄａｐＡノックアウトを有するおよび有さない株である、ＳＹＮ４７３９（Ｎｉｓｓｌｅ ＨＡ３／４：：ＰＳｙｎＪ２３１１９−ｐＫＹＮａｓｅ、ΔＴｒｐＥ、ΔＴｈｙＡ、ＨＡ９／１０：：ｆｎｒ−ＤａｃＡ）およびＳＹＮ４９３９（Ｎｉｓｓｌｅ、ΔΦ、ΔＤＡＰ、ΔＴｈｙＡ、ＨＡ９／１０：：ｆｎｒ−ＤａｃＡ、ＰＳｙｎＪ２３１１９−ｐＫＹＮａｓｅ、ΔＴｒｐＥ）を対照比較した。本質的には上記の通り株を成長させ、ｃ−ジＡＭＰ産生およびキヌレニン消費についてアセスメントした。
両方の株についての環状ジＡＭＰ産生を図２９Ａおよび図２９Ｂに示す。キヌレニン消費体単一回路株ＳＹＮ２０２８およびＳＹＮ２３０６と比較してキヌレニン産生を図２９Ｃおよび図２９Ｄに示す。図３０および図３１で同様の結果が見られる。ＳＹＮ４７８７は、本質的に、ＳＹＮ４７３９（Ｎｉｓｓｌｅ ΔＴｈｙＡ、ＨＡ９／１０：：ｆｎｒ−ＤａｃＡ、ＨＡ３／４：：ＰＳｙｎＪ２３１１９−ｐＫＹＮａｓｅ、ΔＴｒｐＥ）と同じ回路を含むが、いずれの抗生物質マーカーも含まない（ＳＹＮ４７３９はカナマイシン耐性を有する）。考え合わせると、これらの結果は、ファージおよびｄａｐＡノックアウトがｉｎ ｖｉｔｒｏで株の活性に影響を与えないことを示す。
（実施例６７）
ファージ試験プロトコール：マイトマイシンＣ誘導データ分析を使用するＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉからの細菌ウイルスの溶菌斑アッセイ
マイトマイシンＣファージ誘導手順（Ｓｉｎｓｈｅｉｍｅｒ ＲＬ． Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ Ｘ１７４． Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． １９５９年；１巻：３７〜４２頁ならびにＣｌｏｗｅｓ， ＲＣおよびＨａｙｅｓ， Ｗ． Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ ｉｎ ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｇｅｎｅｔｉｃｓ． Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、ＮＹ． １９６８年に記載されているような、マイトマイシンＣ誘導を使用するＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ（Ｅ．ｃｏｌｉ）からの細菌ウイルスの溶菌斑アッセイである、方法ＳＴＭ−Ｖ−７０８（前記参考文献の各々についての内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる））を使用してファージの産生について細胞系を分析した。簡単に説明すると、試料（細胞拡大増殖を支持するためにチミジン補充培地を適宜用いる）および対照細胞を一晩成長させた。試料の一部分、陽性対照（Ｅ．ｃｏｌｉ、ＥＭＧ２：Ｋ（ラムダ）、ＡＴＣＣ ２３７１６、または同等のもの）および陰性対照（Ｅ．ｃｏｌｉ、ＡＴＣＣ １３７０６、または同等のもの）を除去し、遠心分離し、各上清をバクテリオファージの存在について溶菌斑アッセイで検査した。２μｇ／ｍＬの最終濃度でマイトマイシンＣを、残りの試料、陽性および陰性細菌培養物に添加した。次いで、培養物を３７±２℃にし、陽性対照で溶解が起こるまで３００〜４００ＲＰＭで振とうした（〜４．５時間）。各培養物をクロロホルムで処置し、遠心分離し、上清の０．１ｍＬアリコートをバクテリオファージの存在について検査した。これを遂行するために、上清をファージ感受性Ｅ．ｃｏｌｉ株ＡＴＣＣ １３７０６と混合し、０．７％アガロース溶液と混合し、溶原性ブロス（ＬＢ）寒天の上に菌叢として播種した。陽性対照に溶菌斑が存在し、陰性対照に溶菌斑が存在しなかった場合、試験を有効と見なした。
（実施例６８）
ＳＹＮ４７３７により産生されたｃ−ジＡＭＰについての機能アッセイ
次に、機能アッセイを行って、ＳＹＮ４７３７（デルタファージ、デルタＤａｐ、ＨＡ９／１０：：ＦＮＲ−ｄａｃＡ）の活性をさらに確認した。抗原提示細胞集団においてＳＴＩＮＧ経路を活性化するＳＹＮ４７３７の能力をアセスメントした。細菌（ＷＴ ＮｉｓｓｌｅまたはＳＹＮ４７３７）を様々な感染多重度（ＭＯＩ）で０．５×１０６個ＲＡＷ ２６４．７細胞（不死化マウスマクロファージ細胞系）とともに共培養した。ＳＹＮ４７３７を２５０ｒｐｍで振とうさせながら３７Ｃで１時間インキュベートし、実験前に４〜５時間、嫌気的チャンバーで誘導した。共培養物を、述べたように４時間インキュベートし、タンパク質抽出物をＩＦＮβ１産生について分析した。図３２は、ＷＴ ＮｉｓｓｌｅではなくＳＹＮ４７３７が、ＭＯＩ依存的にＩＦＮβ１産生を誘導することができることを示す。

Claims (94)

  1. 少なくとも１つの免疫イニシエーターおよび少なくとも１つの免疫サステナーを産生することができる、改変された微生物。
  2. 前記免疫イニシエーターが、腫瘍溶解を増強すること、抗原提示細胞（ＡＰＣ）を活性化すること、ならびに／またはＴ細胞をプライミングおよび活性化することができる、請求項１に記載の改変された微生物。
  3. 前記免疫イニシエーターが、少なくとも１つの遺伝子によってコードされる治療用分子、少なくとも１つの遺伝子によってコードされる酵素によって産生される治療用分子、少なくとも１つの遺伝子によってコードされる生合成もしくは異化経路の少なくとも１つの酵素、少なくとも１つの遺伝子によってコードされる生合成もしくは異化経路の少なくとも１つの酵素によって産生される少なくとも１つの治療用分子、またはＲＮＡ干渉、マイクロＲＮＡ応答もしくは阻害、ＴＬＲ応答、アンチセンス遺伝子調節、標的タンパク質結合、もしくは遺伝子編集を媒介する核酸分子である、請求項１または請求項２に記載の改変された微生物。
  4. 前記免疫イニシエーターが、サイトカイン、ケモカイン、単鎖抗体、リガンド、代謝変換因子、Ｔ細胞共刺激受容体、Ｔ細胞共刺激受容体リガンド、操作化学療法、または溶解性ペプチドである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の改変された微生物。
  5. 前記免疫イニシエーターが、ＳＴＩＮＧアゴニスト、アルギニン、５−ＦＵ、ＴＮＦα、ＩＦＮγ、ＩＦＮβ１、アゴニスト抗ＣＤ４０抗体、ＣＤ４０Ｌ、ＳＩＲＰα、ＧＭＣＳＦ、アゴニスト抗ＯＸＯ４０抗体、ＯＸＯ４０Ｌ、アゴニスト抗４−１ＢＢ抗体、４−１ＢＢＬ、アゴニスト抗ＧＩＴＲ抗体、ＧＩＴＲＬ、抗ＰＤ１抗体、抗ＰＤＬ１抗体、またはアズリンである、請求項１〜４のいずれか一項に記載の改変された微生物。
  6. 前記免疫イニシエーターが、ＳＴＩＮＧアゴニストである、請求項５に記載の改変された微生物。
  7. 前記ＳＴＩＮＧアゴニストが、ｃ−ジＡＭＰ、ｃ−ＧＡＭＰ、またはｃ−ジＧＭＰである、請求項６に記載の改変された微生物。
  8. 前記免疫イニシエーターを産生する酵素をコードする少なくとも１つの遺伝子配列を含む、請求項５〜７のいずれか一項に記載の改変された微生物。
  9. 前記免疫イニシエーターをコードする前記少なくとも１つの遺伝子配列が、ｄａｃＡ遺伝子配列である、請求項８に記載の改変された微生物。
  10. 前記免疫イニシエーターをコードする前記少なくとも１つの遺伝子配列が、ｃＧＡＳ遺伝子配列である、請求項８に記載の改変された微生物。
  11. 前記ｃＧＡＳ遺伝子配列が、ヒトｃＧＡＳ遺伝子配列、Ｖｅｒｍｉｎｅｐｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｅｉｓｅｎｉａｅ ｃＧＡＳ遺伝子配列、Ｋｉｎｇｅｌｌａ ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ ｃＧＡＳ遺伝子配列、およびＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｂａｃｉｌｌｉｆｏｒｍｉｓ ｃＧＡＳ遺伝子配列から選択される、請求項１０に記載の改変された微生物。
  12. 前記免疫イニシエーターをコードする前記少なくとも１つの遺伝子配列が、前記改変された微生物の染色体に組み込まれているか、またはプラスミド上に存在する、請求項８〜１１のいずれか一項に記載の改変された微生物。
  13. 前記免疫イニシエーターをコードする前記少なくとも１つの遺伝子配列が、誘導性プロモーターに作動可能に連結されている、請求項８〜１１のいずれか一項に記載の改変された微生物。
  14. 前記誘導性プロモーターが、低酸素、嫌気、またはハイポキシック条件によって誘導される、請求項１３に記載の改変された微生物。
  15. 前記免疫イニシエーターが、アルギニンである、請求項５に記載の改変された微生物。
  16. アルギニン生合成経路の少なくとも１つの酵素をコードする少なくとも１つの遺伝子配列を含む、請求項１５に記載の改変された微生物。
  17. 前記アルギニン生合成経路の前記少なくとも１つの酵素をコードする前記少なくとも１つの遺伝子配列が、フィードバック耐性ａｒｇＡを含む、請求項１５に記載の改変された微生物。
  18. 前記アルギニン生合成経路の前記少なくとも１つの酵素をコードする前記少なくとも１つの遺伝子配列が、ａｒｇＡ、ａｒｇＢ、ａｒｇＣ、ａｒｇＤ、ａｒｇＥ、ａｒｇＦ、ａｒｇＧ、ａｒｇＨ、ａｒｇＩ、ａｒｇＪ、ｃａｒＡ、およびｃａｒＢからなる群から選択される、請求項１６に記載の改変された微生物。
  19. アルギニンリプレッサー遺伝子（ａｒｇＲ）の欠失または突然変異をさらに含む、請求項１７または請求項１８に記載の改変された微生物。
  20. アルギニンの産生のための前記少なくとも１つの遺伝子配列が、前記改変された微生物の染色体に組み込まれているか、またはプラスミド上に存在する、請求項１６〜１９のいずれか一項に記載の改変された微生物。
  21. 前記アルギニンの産生のための前記少なくとも１つの遺伝子配列が、誘導性プロモーターに作動可能に連結されている、請求項１６〜２０のいずれか一項に記載の改変された微生物。
  22. 前記誘導性プロモーターが、低酸素、嫌気、またはハイポキシック条件によって誘導される、請求項２１に記載の改変された微生物。
  23. 前記免疫イニシエーターが、５−ＦＵである、請求項５に記載の改変された微生物。
  24. ５−ＦＣを５−ＦＵに変換することができる酵素をコードする少なくとも１つの遺伝子配列を含む、請求項２３に記載の改変された微生物。
  25. 前記少なくとも１つの遺伝子配列が、ｃｏｄＡである、請求項２４に記載の改変された微生物。
  26. 前記少なくとも１つの遺伝子配列が、前記改変された微生物の染色体に組み込まれているか、またはプラスミド上に存在する、請求項２４または請求項２５に記載の改変された微生物。
  27. 前記免疫イニシエーターをコードする前記少なくとも１つの遺伝子配列が、誘導性プロモーターに作動可能に連結されている、請求項２４〜２６のいずれか一項に記載の改変された微生物。
  28. 前記誘導性プロモーターが、低酸素、嫌気、またはハイポキシック条件によって誘導される、請求項２７に記載の改変された微生物。
  29. 前記免疫サステナーが、Ｔ細胞の移動および浸潤を増強すること、Ｔ細胞によるがん細胞の認識を増強すること、エフェクターＴ細胞応答を増強すること、および／または免疫抑制を克服することができる、請求項１に記載の改変された微生物。
  30. 前記免疫サステナーが、少なくとも１つの遺伝子によってコードされる治療用分子、少なくとも１つの遺伝子によってコードされる酵素によって産生される治療用分子、少なくとも１つの遺伝子によってコードされる生合成もしくは異化経路の少なくとも１つの酵素、少なくとも１つの遺伝子によってコードされる生合成もしくは異化経路の少なくとも１つの酵素によって産生される少なくとも１つの治療用分子、またはＲＮＡ干渉、マイクロＲＮＡ応答もしくは阻害、ＴＬＲ応答、アンチセンス遺伝子調節、標的タンパク質結合、もしくは遺伝子編集を媒介する核酸分子である、請求項１または請求項２９に記載の改変された微生物。
  31. 前記免疫サステナーが、サイトカイン、ケモカイン、単鎖抗体、リガンド、代謝変換因子、Ｔ細胞共刺激受容体、またはＴ細胞共刺激受容体リガンドである、請求項１、２９、または３０のいずれか一項に記載の改変された微生物。
  32. 前記免疫サステナーが、代謝変換因子、アルギニン、ＳＴＩＮＧアゴニスト、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０、抗ＰＤ１抗体、抗ＰＤＬ１抗体、抗ＣＴＬＡ４抗体、アゴニスト抗ＧＩＴＲ抗体もしくはＧＩＴＲＬ、アゴニスト抗ＯＸ４０抗体もしくはＯＸ４０Ｌ、アゴニスト抗４−１ＢＢ抗体もしくは４−１ＢＢＬ、ＩＬ−１５、ＩＬ−１５ ｓｕｓｈｉ、ＩＦＮγ、またはＩＬ−１２である、請求項１または２９〜３１のいずれか一項に記載の改変された微生物。
  33. 前記免疫サステナーが、代謝変換因子である、請求項３２に記載の改変された微生物。
  34. 前記代謝変換因子が、キヌレニン消費経路の少なくとも１つの酵素またはアデノシン消費経路の少なくとも１つの酵素である、請求項３３に記載の改変された微生物。
  35. 前記キヌレニン消費経路の前記少なくとも１つの酵素をコードする少なくとも１つの遺伝子配列を含む、請求項３３または請求項３４に記載の改変された微生物。
  36. 前記キヌレニン消費経路の前記少なくとも１つの酵素をコードする前記少なくとも１つの遺伝子配列が、キヌレニナーゼ遺伝子配列である、請求項３５に記載の改変された微生物。
  37. 前記少なくとも１つの遺伝子配列が、ｋｙｎＵである、請求項３６に記載の改変された微生物。
  38. 前記少なくとも１つの遺伝子配列が、構成的プロモーターに作動可能に連結されている、請求項３７に記載の改変された微生物。
  39. 前記キヌレニン消費経路の前記少なくとも１つの酵素をコードする前記少なくとも１つの遺伝子配列が、前記微生物の染色体に組み込まれているか、またはプラスミド上に存在する、請求項３５〜３８のいずれか一項に記載の改変された微生物。
  40. ｔｒｐＥの欠失または突然変異を含む、請求項３５〜３９のいずれか一項に記載の改変された微生物。
  41. アデノシン消費経路の少なくとも１つの酵素をコードする少なくとも１つの遺伝子配列を含む、請求項３２または請求項３３に記載の改変された微生物。
  42. 前記アデノシン消費経路の前記少なくとも１つの酵素をコードする前記少なくとも１つの遺伝子配列が、ａｄｄ、ｘａｐＡ、ｄｅｏＤ、ｘｄｈＡ、ｘｄｈＢ、およびｘｄｈＣから選択される、請求項４１に記載の改変された微生物。
  43. 前記アデノシン消費経路の前記少なくとも１つの酵素をコードする前記少なくとも１つの遺伝子配列が、低酸素、嫌気、またはハイポキシック条件によって誘導されるプロモーターに作動可能に連結されている、請求項４２に記載の改変された微生物。
  44. 前記アデノシン消費経路の前記少なくとも１つの酵素をコードする前記少なくとも１つの遺伝子配列が、前記微生物の染色体に組み込まれているか、またはプラスミド上に存在する、請求項４１〜４３のいずれか一項に記載の改変された微生物。
  45. 前記微生物にアデノシンを移入するための酵素をコードする少なくとも１つの遺伝子配列を含む、請求項４１〜４４のいずれか一項に記載の改変された微生物。
  46. 前記微生物にアデノシンを移入するための前記酵素をコードする前記少なくとも１つの遺伝子配列が、ｎｕｐＣまたはｎｕｐＧである、請求項４５に記載の改変された微生物。
  47. 免疫サステナーが、アルギニンである、請求項３２または請求項３３に記載の改変された微生物。
  48. アルギニン生合成経路の少なくとも１つの酵素をコードする少なくとも１つの遺伝子配列を含む、請求項４７に記載の改変された微生物。
  49. 前記アルギニン生合成経路の前記少なくとも１つの酵素が、フィードバック耐性ａｒｇＡを含む、請求項４８に記載の改変された微生物。
  50. 前記アルギニン生合成経路の前記少なくとも１つの酵素をコードする前記少なくとも１つの遺伝子配列が、ａｒｇＡ、ａｒｇＢ、ａｒｇＣ、ａｒｇＤ、ａｒｇＥ、ａｒｇＦ、ａｒｇＧ、ａｒｇＨ、ａｒｇＩ、ａｒｇＪ、ｃａｒＡ、およびｃａｒＢからなる群から選択される、請求項４８または請求項４９に記載の改変された微生物。
  51. 前記アルギニン生合成経路の前記少なくとも１つの酵素をコードする前記少なくとも１つの遺伝子配列が、低酸素、嫌気、またはハイポキシック条件によって誘導されるプロモーターに作動可能に連結されている、請求項４８〜５０のいずれか一項に記載の改変された微生物。
  52. 前記アルギニン生合成経路の前記少なくとも１つの酵素をコードする前記少なくとも１つの遺伝子配列が、前記改変された微生物の染色体に組み込まれているか、またはプラスミド上に存在する、請求項４８〜５１のいずれか一項に記載の改変された微生物。
  53. アルギニンリプレッサー遺伝子（ａｒｇＲ）の欠失または突然変異をさらに含む、請求項４７〜５２のいずれか一項に記載の改変された微生物。
  54. 前記免疫サステナーが、ＳＴＩＮＧアゴニストである、請求項３２または請求項３３に記載の改変された微生物。
  55. 前記ＳＴＩＮＧアゴニストが、ｃ−ジＡＭＰ、ｃ−ＧＡＭＰ、またはｃ−ジＧＭＰである、請求項５４に記載の改変された微生物。
  56. 前記ＳＴＩＮＧアゴニストを産生する酵素をコードする少なくとも１つの遺伝子配列を含む、請求項５４〜５５のいずれか一項に記載の改変された微生物。
  57. 前記免疫サステナーをコードする前記少なくとも１つの遺伝子配列が、ｄａｃＡ遺伝子配列である、請求項５６に記載の改変された微生物。
  58. 前記免疫サステナーをコードする前記少なくとも１つの遺伝子配列が、ｃＧＡＳ遺伝子配列である、請求項５６に記載の改変された微生物。
  59. 前記ｃＧＡＳ遺伝子配列が、ヒトｃＧＡＳ遺伝子配列、Ｖｅｒｍｉｎｅｐｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｅｉｓｅｎｉａｅ ｃＧＡＳ遺伝子配列、Ｋｉｎｇｅｌｌａ ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ ｃＧＡＳ遺伝子配列、およびＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｂａｃｉｌｌｉｆｏｒｍｉｓ ｃＧＡＳ遺伝子配列から選択される、請求項５８に記載の改変された微生物。
  60. 細菌または酵母である、先行する請求項のいずれか一項に記載の改変された微生物。
  61. Ｅ． ｃｏｌｉ細菌である、先行する請求項のいずれか一項に記載の改変された微生物。
  62. Ｅ． ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅ細菌である、先行する請求項のいずれか一項に記載の改変された微生物。
  63. １つまたは複数の栄養要求体をもたらす遺伝子において少なくとも１つの突然変異または欠失を含む、先行する請求項のいずれか一項に記載の改変された微生物。
  64. 前記少なくとも１つの欠失または突然変異が、ｄａｐＡ遺伝子および／またはｔｈｙＡ遺伝子におけるものである、請求項６３に記載の改変された微生物。
  65. ファージ欠失を含む、先行する請求項のいずれか一項に記載の改変された微生物。
  66. 免疫イニシエーターを産生することができる少なくとも１つの改変された微生物と、免疫サステナーとを含む、組成物。
  67. 前記少なくとも１つの改変された微生物が、前記免疫イニシエーターおよび前記免疫サステナーを産生することができる、請求項６６に記載の組成物。
  68. 前記少なくとも１つの改変された微生物が、前記免疫イニシエーターを産生することができ、少なくとも第２の改変された微生物が、前記免疫サステナーを産生することができる、請求項６６に記載の組成物。
  69. 前記免疫サステナーが、前記組成物中の改変された微生物によって産生されない、請求項６６に記載の組成物。
  70. 免疫サステナーを産生することができる少なくとも１つの改変された微生物と、免疫イニシエーターとを含む、組成物。
  71. 前記少なくとも１つの改変された微生物が、前記免疫イニシエーターおよび前記免疫サステナーを産生することができる、請求項７０に記載の組成物。
  72. 前記少なくとも１つの改変された微生物が、前記免疫サステナーを産生することができ、少なくとも第２の改変された微生物が、前記免疫イニシエーターを産生することができる、請求項７０に記載の組成物。
  73. 前記免疫イニシエーターが、前記組成物中の改変された微生物によって産生されない、請求項７０に記載の組成物。
  74. 請求項１〜６５のいずれか一項に記載の改変された微生物または請求項６６〜７３のいずれか一項に記載の組成物と、薬学的に許容される担体とを含む、薬学的に許容される組成物。
  75. 腫瘍内投与のために製剤化される、請求項７４に記載の薬学的に許容される組成物。
  76. 請求項７４または請求項７５に記載の薬学的に許容される組成物と、その使用のための説明書とを含む、キット。
  77. 対象におけるがんを処置する方法であって、請求項７４または請求項７５に記載の薬学的に許容される組成物を前記対象に投与するステップを含み、それによって、前記対象におけるがんを処置する、方法。
  78. 対象において免疫応答を誘導および維持する方法であって、請求項７４または請求項７５に記載の薬学的に許容される組成物を前記対象に投与するステップを含み、それによって、前記対象において前記免疫応答を誘導および維持する、方法。
  79. 腫瘍を有する対象においてアブスコパル効果を誘導する方法であって、請求項７４または請求項７５に記載の薬学的に許容される組成物を前記対象に投与するステップを含み、それによって、前記対象において前記アブスコパル効果を誘導する、方法。
  80. 腫瘍を有する対象において免疫学的記憶を誘導する方法であって、請求項７４または請求項７５に記載の薬学的に許容される組成物を前記対象に投与するステップを含み、それによって、前記対象において前記免疫学的記憶を誘導する、方法。
  81. 対象において腫瘍の部分的な退縮を誘導する方法であって、請求項７４または請求項７５に記載の薬学的に許容される組成物を前記対象に投与するステップを含み、それによって、前記対象において前記腫瘍の前記部分的な退縮を誘導する、方法。
  82. 前記部分的な退縮が、前記腫瘍のサイズの少なくとも約１０％、少なくとも約２５％、少なくとも約５０％、または少なくとも約７５％の減少である、請求項８１に記載の方法。
  83. 対象において腫瘍の完全な退縮を誘導する方法であって、請求項７４または請求項７５に記載の薬学的に許容される組成物を前記対象に投与するステップを含み、それによって、前記対象において前記腫瘍の前記完全な退縮を誘導する、方法。
  84. 前記腫瘍が、前記薬学的に許容される組成物の投与後に、前記対象において検出可能ではない、請求項８３に記載の方法。
  85. 対象におけるがんを処置する方法であって、
    第１の改変された微生物を前記対象に投与するステップであって、前記第１の改変された微生物が、免疫イニシエーターを産生することができる、ステップと、
    第２の改変された微生物を前記対象に投与するステップであって、前記第２の改変された微生物が、免疫サステナーを産生することができる、ステップと、を含み、
    それによって、前記対象におけるがんを処置する、方法。
  86. 対象において免疫応答を誘導および維持する方法であって、
    第１の改変された微生物を前記対象に投与するステップであって、前記第１の改変された微生物が、免疫イニシエーターを産生することができる、ステップと、
    第２の改変された微生物を前記対象に投与するステップであって、前記第２の改変された微生物が、免疫サステナーを産生することができる、ステップと、を含み、
    それによって、前記対象において前記免疫応答を誘導および維持する、方法。
  87. 前記投与するステップが、同時に行われるか、前記第１の改変された微生物を前記対象に投与するステップが、前記第２の改変された微生物を前記対象に投与するステップの前に生じるか、または前記第２の改変された微生物を前記対象に投与するステップが、前記第１の改変された微生物を前記対象に投与するステップの前に生じる、請求項８５または請求項８６に記載の方法。
  88. 対象におけるがんを処置する方法であって、
    第１の改変された微生物を前記対象に投与するステップであって、前記第１の改変された微生物が、免疫イニシエーターを産生することができる、ステップと、
    免疫サステナーを前記対象に投与するステップと、を含み、
    それによって、前記対象におけるがんを処置する、方法。
  89. 対象において免疫応答を誘導および維持する方法であって、
    第１の改変された微生物を前記対象に投与するステップであって、前記第１の改変された微生物が、免疫イニシエーターを産生することができる、ステップと、
    免疫サステナーを前記対象に投与するステップと、を含み、
    それによって、前記対象において前記免疫応答を誘導および維持する、方法。
  90. 前記投与するステップが、同時に行われるか、前記第１の改変された微生物を前記対象に投与するステップが、前記免疫サステナーを前記対象に投与するステップの前に生じるか、または前記免疫サステナーを前記対象に投与するステップが、前記第１の改変された微生物を前記対象に投与するステップの前に生じる、請求項８８または請求項８９に記載の方法。
  91. 対象におけるがんを処置する方法であって、
    免疫イニシエーターを前記対象に投与するステップと、
    第１の改変された微生物を前記対象に投与するステップであって、前記第１の改変された微生物が、免疫サステナーを産生することができる、ステップと、を含み、
    それによって、前記対象におけるがんを処置する、方法。
  92. 対象において免疫応答を誘導および維持する方法であって、
    免疫イニシエーターを前記対象に投与するステップと、
    第１の改変された微生物を前記対象に投与するステップであって、前記第１の改変された微生物が、免疫サステナーを産生することができる、ステップと、を含み、
    それによって、前記対象において前記免疫応答を誘導および維持する、方法。
  93. 前記投与するステップが、同時に行われるか、前記第１の改変された微生物を前記対象に投与する前記ステップが前記免疫イニシエーターを前記対象に投与する前記ステップの前に生じるか、または前記免疫イニシエーターを前記対象に投与する前記ステップが、前記第１の改変された微生物を前記対象に投与する前記ステップの前に生じる、請求項９１または請求項９２に記載の方法。
  94. 前記投与するステップが、腫瘍内注射である、請求項７７〜９３のいずれか一項に記載の方法。
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