JP2005516917A - 細胞外アデノシン阻害剤およびアデノシン受容体阻害剤を用いて免疫応答および炎症を増強するための方法 - Google Patents

細胞外アデノシン阻害剤およびアデノシン受容体阻害剤を用いて免疫応答および炎症を増強するための方法 Download PDF

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Abstract

抗原に対する免疫応答を増加させる方法が本明細書に提供される。本方法には、細胞外アデノシンを阻害するかまたはアデノシン受容体を阻害する薬剤を投与する段階が含まれる。ワクチンの効果を高める方法および腫瘍抗原または免疫細胞媒介性の腫瘍破壊に対する免疫応答を増加させる方法も開示される。

Description

関連出願の相互参照
本出願は、2001年12月12日付で出願した米国特許仮出願第60/340,772号および2001年12月19日付で出願した米国特許仮出願第60/342,585号に対する優先権を主張するものであり、両者とも参照としてその全体が本明細書に組み入れられる。
分野
本出願は、免疫応答および炎症を増強するため、ならびに幾つかの例ではNF-kB活性を調節するための、アデノシン受容体アンタゴニストおよび細胞外アデノシンの形成を減少させるかまたは細胞外アデノシンを分解する薬剤のような、細胞外アデノシン阻害剤および/またはアデノシン受容体阻害剤の使用に関する。
背景
炎症反応は、体内から有害物質を排除する補助となるが、炎症は同様に、健常組織に害を及ぼす可能性がある非特異反応でもある。感染、アレルゲン、自己免疫刺激、ならびに移植組織、有害化学物質、および毒素に対する免疫応答、虚血/再潅流、低酸素状態、物理的外傷、ならびに熱傷のほか腫瘍の増殖を含む、炎症反応を起こす可能性がある広範な病原性の傷害が存在する。炎症は通常、病原因子の除去または希釈をもたらす局所的な作用であり、結果として傷害物質および傷害組織の隔離をもたらす。炎症に関与する細胞には、白血球(即ち、免疫系細胞--好中球、好酸球、リンパ球、単球、好塩基球、マクロファージ、B細胞、樹状細胞、顆粒球、および肥満細胞)、血管内皮細胞、血管平滑筋細胞、繊維芽細胞、および筋細胞が含まれる。
アデノシンは、鎮静作用の誘導、血管拡張、心拍数および心筋収縮能の抑制、血小板凝集能の阻害、糖新生の刺激、ならびに脂肪分解の阻害を含む多様な生理作用を調節する(Stiles、Trends Pharmacol. Sci. 7:486, 1986; Williams、Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 27:315, 1987; Ramkumarら、Prog. Drug. Res. 32:195, 1988を参照されたい)。さらに、アデノシン受容体サブタイプを非選択的に活性化するアデノシンおよび幾つかのアデノシン類似体は、好中球による炎症性酸化産物の産生を減少させる(Cronsteinら、Ann. N.Y. Acad. Sci. 451:291, 1985; Robertsら、Biochem. J., 227:669, 1985; Schrierら、J. Immunol. 137:3284, 1986; Cronsteinら、Clinical Immunol. Immunopath. 42:76, 1987)。
生化学的および薬理学的基準に基づき、アデノシン受容体は4つのサブタイプ、A2a、A2b、A1、およびA3に識別されている。A1およびA3はアデニレートシクラーゼを阻害し、A2aおよびA2bはアデニレートシクラーゼを刺激する(Stiles、ibid; Williams, ibid; 受容体A3に関しては米国特許第5,441,883号も参照されたい)。リガンド結合特性、糖鎖形成、および調節のような、これらのアデノシン受容体の生化学的および薬理学的特性に関しては実質的に進展している。アデニレートシクラーゼに対するその作用に加えて、アデノシンは、カリウムチャネルを開口させ、カルシウムチャネルを介して代謝速度を減少させ、かつ受容体媒介性の機構を介してホスホイノチシド代謝を阻害するかまたは刺激する(FredholmおよびDunwiddie、Trends Pharmacol. Sci. 9:130, 1988; Sebastiaoら、Br. J. Pharmacol. 100:55, 1990; Stiles, Clin. Res. 38:10, 1990; およびNakahataら、J. Neurochem. 57:963, 1991)。アデノシン受容体A1、A2、およびA3をコードするcDNAがクローニングされている(Libertら、Science 244:569, 1989; Maenhaetら、Biochem. Biophys. Res. Commun.173:1169, 1990; Libertら、EMBO J. 10:1677, 1991; Mahanら、Molecular Pharmacol. 40:1, 1991; Reppertら、Molec. Endo. 5:1037〜1048, 1991; 米国特許第5,441,883)。アデノシン受容体の分子クローニングにより、これらがGタンパク質結合型受容体のスーパーファミリーに属することが明らかとなった。
概要
アデノシン受容体は、種々の疾患の発病の間、免疫応答を制限することができ、これによって正常組織を免疫による過剰な傷害から防御できる、生理学的「停止」(終結機構)として機能することにより、インビボにおける炎症の抑制で重複のない役割を果たしていることが本明細書に開示される。A2a、A2b、およびA3のようなアデノシン受容体は、炎症の間に免疫応答を抑制し、組織を免疫による傷害から防御していることが示されている。アデノシン受容体を介したシグナル伝達の阻害を、免疫応答を増強および延長するのに利用することができる。
免疫応答を増加させるための方法が本明細書に提供される。1つの例として、本方法は、腫瘍、例えば癌の損傷のような、望ましいかつ標的化された組織の傷害を増加させる。細胞外アデノシンの生成を促す1つまたは複数の過程およびアデノシン受容体を介したアデノシンによるシグナル伝達を阻害する方法が本明細書に開示される。例えば、免疫応答の増強、局部組織の炎症、および標的化組織の破壊は、アデノシンを生成する局部組織の低酸素状態を阻害するかもしくは減少させることにより; 蓄積された細胞外アデノシンを分解する(または不活性化させる)ことにより; 免疫細胞でのアデノシン受容体発現を抑制するかもしくは減少させることにより; および/またはアデノシン受容体を介したアデノシンリガンドによるシグナル伝達を阻害する/遮断することにより達成される。本明細書に開示される結果により、さまざまな疾患(例えば、癌および敗血症)を患っている被検体に、「低酸素状態→アデノシンの蓄積→免疫細胞に対するアデノシン受容体による免疫抑制性のシグナル伝達」経路を破壊する物質をインビボ投与することで、腫瘍のインビボ治療または免疫感作の向上を引き起こすことができることが証明される。
1つの例として、本方法には、1つまたは複数の細胞外アデノシン阻害剤および/またはアデノシン受容体阻害剤、例えばアデノシン受容体アンタゴニストを投与する段階が含まれる。ワクチンの効果を高めるため、ワクチンと共に1つまたは複数のアデノシン受容体阻害剤および/または細胞外アデノシン阻害剤を投与することができる。1つの例として、免疫応答/炎症を増加させるため、1つもしくは複数のアデノシン受容体阻害剤または細胞外アデノシン阻害剤を投与する。別の例として、腫瘍破壊のためような、標的組織の傷害を達成するための方法が提供される。
配列表
添付の配列表に記載の核酸配列は、ヌクレオチド塩基に対する標準的な文字略号を用いて示されている。各核酸配列の片側鎖のみ示されているが、相補鎖は、表示鎖に対する任意の言及により包含されるものと理解される。
配列番号:1は、CpGオリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列を示す。
いくつかの特定の態様の詳細な説明
略語
Adora1 アデノシン受容体A1
Adora2a アデノシン受容体A2a
Adora2b アデノシン受容体A2b
Adora3 アデノシン受容体A3
ADA アデノシンデアミナーゼ、アデノシン分解酵素
ADA-PEG インビボ半減期を延ばすためにポリエチレングリコール修飾したADA
ADA SCID アデノシンデアミナーゼ欠損重症複合免疫不全症
ALT アラニン・アミノトランスフェラーゼ。肝酵素
cAMP 環状アデノシン一リン酸
CGS CGS21680
Con A: コンカナバリンA
FK フォルスコリン
H-E ヘマトキシリンおよびエオシン
IL-12p40 インターロイキン-12p40
IL-1β インターロイキン-1β
IL-6 インターロイキン-6
Iso イソプロテレノール
LPS リポポリサッカライド、細菌外毒素
PEA 緑膿菌(Pseudomonas)外毒素A
PGE2 プロスタグランジンE2
TNF-α 腫瘍壊死因子α
用語
用語および方法の以下の説明は、本開示をよりよく説明し、本開示の実践における当業者への手引きために提供される。本明細書および特許請求の範囲のなかで使用される際、単数形「一つの(a)」または「一つの(an)」または「その(the)」には、文脈により他に明記されていなければ複数対象が含まれる。例えば、「アデノシン受容体アンタゴニスト(an adenosine receptor antagonist)」に対する言及には、複数のそのようなアンタゴニストが含まれ、かつ「アデノシン受容体(the adenosine receptor)」に対する言及には、1つまたは複数の、受容体および当業者に周知のその等価物などに対する言及が含まれる。同様に、単語「または」は、文脈により他に明記されていなければ「および」を含むと意図される。
他に説明がない限り、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、本開示に関係する当業者により共通して理解される用語と同じ意味を有する。分子生物学における共通用語の定義は、Benjamin Lewin、Genes V, Oxford University Press出版, 1994(ISBN 0-19-854287-9); Kendrewら(編)、The Encyclopedia of Molecular Biology, Blackwell Science社出版, 1994(ISBN 0-632-02182-9); およびRobert A. Meyers(編)、Molecular Biology and Biotechnology: a Comprehensive Desk Reference, VCH Publishers社出版, 1995(ISBN 1-56081-569-8)において見出すことができる。本明細書に記載のものに類似のまたは同等の方法および材料を、本開示を実践するうえでまたは試験するうえで使用することができるが、適当な方法および材料を以下に説明する。材料、方法、および例は、単なる例示に過ぎず限定することを意図するものではない。
アデノシン: 糖であるリボースに連結された、含窒素塩基であるアデニンを含むリボヌクレオチド。
アデノシン受容体: 少なくとも4つのサブタイプのアデノシン受容体(Adora1、Adora2a、Adora2b、およびAdora3(それぞれ、A1、A2a、A2b、およびA3とも呼ばれる))がクローニングされている。アデノシン受容体には、アデノシン受容体の断片のほか、天然ペプチドとアデノシン受容体の生物学的活性の全部または一部を保持する変異体の両方が含まれる。アデノシン受容体は、Gタンパク質結合型受容体(GPCR)スーパーファミリーの一員であり、かつアデニリルシクラーゼ活性の刺激または阻害を調節し、それ故に環状AMP濃度を調節すると考えられる。アデノシン受容体アンタゴニストメチルキサンチン(例えば、お茶、コーヒー、およびココアの中に存在するカフェイン、およびテオフィリン)のcAMP濃度に対する作用が知られている。
受容体A1は、アデニリルシクラーゼ活性の阻害に関与している。しかし、イオンチャンネル、およびホスホリパーゼCに(Gタンパク質を介して)結合するという証拠も存在する。神経系においては、アデノシン受容体A1は、伝達物質の放出阻害およびニューロン活動の低下を調節する。この受容体を心臓で遮断すると、強いコーヒーを大量に飲んだ後に(カフェインおよびテオフィリンが原因となって)認められる、速くて、強い「拍動」が起こる。1つの例として、A1はGenBankアクセッション番号L22214として示される。
A2aはもっぱら、アデニリルシクラーゼ活性の刺激と結び付けられる。CNSにおけるその分布は非常に離散的であるが、尾状核および被殻、ならびに側坐核および嗅結節には多量に局在している。末梢では、A2a受容体は血小板に存在し、抗凝集的である。1つの態様として、A2aはGenBankアクセッション番号AH003248として示され、そしてA2bはGenBankアクセッション番号NM000676として示される。受容体A2aおよびA2bは、類似の細胞効果を引き起こすが、組織分布およびその活性化に必要とされる細胞外アデノシンの量に対する要求性は異なる。受容体A2bは、受容体A2aよりも高い濃度のアデノシンにより活性化されるように思われる(Linden, Ann. Rev Pharmacol. Toxicol. 41:775〜87, 2001)。
A3は、アデニリルシクラーゼ活性の阻害と結び付けられる。1つの例として、A3はGenBankアクセッション番号AH003597として示される。
アデノシン受容体阻害剤: アデノシン受容体の活性を低下させる任意の作用物質または組成物。例えば、そのような阻害剤は、その阻害剤がない場合のアデノシン受容体の活性と比較して、アデノシン受容体の活性を低下させてもよい。例には、以下に限定されることはないが、薬理学的アンタゴニスト、遺伝子治療薬、リボザイム、アンチセンス・オリゴヌクレオチド、またはアデノシン受容体をコードするmRNAに選択的に結合する他の触媒性核酸が含まれる。
アジュバント: 他の作用物質(例えば化合物または抗原エピトープ)の免疫刺激特性の1つまたは複数を増強するかまたは増大させる任意の物質。アジュバントは、免疫反応を細胞レベルでまたは体液レベルで増大させるか、刺激するか、活性化するか、増強するか、または調節する。
例えば、アジュバントをワクチンに添加すると、被検体の細胞のような、細胞の免疫応答を高められる。アジュバントは、免疫応答を引き起こすのに必要とされるワクチンが少なくなるように使用することができる。アジュバントの非限定的な具体例の1つは、フロイントアジュバントであり、これは免疫原、乳化剤およびマイコバクテリアを含む油中水乳剤である。古典的な作用物質(フロイントアジュバント、BCG、コリネバクテリウム・パルヴム(Corynebacterium parvum))は、細菌性抗原を含む。いくつかのアジュバントは内在性である(例えば、ヒスタミン、インターフェロン、輸送因子、タフトシン、インターロイキン-1、およびインターロイキン-12)。アジュバントの作用機序は、非特異的であって、多種多様な抗原に対する免疫応答の増大をもたらすか、または抗原特異的、即ち、限られた群の抗原に対する限定された種類の免疫応答に影響を及ぼす可能性がある。多くの生物応答修飾物質の治療有効性は、それらの抗原特異的な免疫アジュバント活性に関連している。
作用物質: 任意のポリペプチド、化合物、小分子、有機化合物、塩、ポリヌクレオチド、ペプチド模擬体、または関心対象の他の分子。
アゴニスト: 天然に存在する1つまたは複数の作用物質により、通常、刺激される受容体に親和性を有しかつその受容体の生理作用を刺激し、それにより生化学的応答を誘発する作用物質。1つの例として、アゴニストのうちのある分子(A)が、受容体分子(R)に可逆的に結合して活性なアゴニスト-受容体複合体(AR)を形成し、この複合体が、アゴニストが結合したままで薬理学的応答を引き起こす。
アンタゴニスト: 生物応答を誘導することなく受容体に結合する薬物のような、他のものの作用を無効にする傾向がある作用物質。1つの例として、アンタゴニストは、受容体A2a、A2b、またはA3のような、アデノシン受容体に対するアンタゴニストの化合物である。アデノシン受容体アンタゴニストの具体例には、以下に限定されることはないが: ZM241385; MRS1220; 1,7,メチルキサンチン(カフェイン); テオフィリン; テオブロミン; SCH 58261 [7-(2-フェニルエチル)-5-アミノ-2-(2-フリル)-ピラゾロ-[4,3-e]-1,2,4-トリアゾロ[1,5-c]ピリミジン] (Schering-Plough Research Institute, Milan, Italy); KW-6002 [(E)-1,3-ジエチル-8-(3,4-ジメトキシスチリル)-7-メチル-3,7-ジヒドロ-1H-プリン-2,6-ジオン] (Kyowa Hakko Kogyo社, Shizuoka, Japan); およびADA-PEGが含まれる。アンタゴニストの非限定的な具体例は、米国特許第5,565,566号; 米国特許第5,545,627号, 米国特許第5,981,524号; 米国特許第5,861,405号; 米国特許第6,066,642号; 米国特許第6,326,390号; 米国特許第5,670,501号; 米国特許第6,117,998号; 米国特許第6,232,297号; 米国特許第5,786,360号; 米国特許第5,424,297号; 米国特許第6,313,131号; 米国特許第5,504,090号; および米国特許第6,322,771号に報告されている。別の例として、アデノシン受容体アンタゴニストは、アンチセンス・オリゴヌクレオチド、リボザイム、またはアデノシン受容体をコードするmRNAに選択的に結合する他の触媒性核酸である。
動物: 生命のある多細胞脊椎動物、例えば、哺乳類および鳥類を含む部類。哺乳類という用語には、ヒトおよびヒト以外の哺乳類の両者が含まれる。同様に、「被検体」という用語には、ヒトおよび家畜被検体の両者が含まれる。
抗体: 免疫グロブリン分子および免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な部分、即ち、特異的に抗原と結合する(抗原と免疫反応する)抗原結合部位を含む分子。天然に存在する抗体(例えば、IgG)には、4本のポリペプチド鎖、つまりジスルフィド結合により相互に連結した2本の重(H)鎖と2本の軽(L)鎖が含まれる。しかし、抗体の抗原結合機能は、天然に存在する抗体の断片により行うことができる。従って、これらの抗原結合断片も「抗体」という用語により指定される。
抗体という用語の中に包含される結合断片の例には、(i) VL、VH、CL、およびCH1ドメインからなるFab断片; (ii) VHおよびCH1ドメインからなるFd断片; (iii) 抗体の単一アームのVLおよびVHドメインからなるFv断片; (iv) VHドメインからなるdAb断片(Wardら、Nature 341:544〜6, 1989); (v) 単離された相補性決定領域(CDR); ならびに(vi) F(ab')2断片、つまりヒンジ(蝶つがい)部でジスルフィド架橋により連結された2個のFab断片を含む二価断片、が含まれる。さらに、Fv断片の2つのドメインは別々の遺伝子によりコード化されるが、組換え法により、2つのドメインが1本のタンパク質鎖(1本鎖Fv (scFv)として知られる; Birdら、Science 242:423〜6, 1988; およびHustonら、Proc. Natl. Acad. Sci. 85:5879〜83, 1988)として構成されることを可能とする、合成リンカーを作製することができる。そのような1本鎖抗体も含まれる。
1つの例として、抗体は、その標的抗原を架橋結合できるもの、例えば、F( ab')2断片のような二価断片である。または、それ自体はその標的抗原を架橋結合しない抗体断片(例えば、Fab断片)を、抗体断片を架橋結合する働きをする第二抗体と結合させて使用することができ、これによって標的抗原を架橋結合することができる。従来の方法を用いて抗体を断片化することができ、その断片を、完全な抗体に対して説明されているのと同じ方法で、有用性を目的としてスクリーニングすることができる。抗体はさらに、標的抗原を特異的に結合する二重特異性分子およびキメラ分子を含むように意図される。
「特異的に結合する」とは、個々の抗体がT細胞の表面分子のような抗原と特異的に免疫反応する能力を指す。この結合は、抗体分子とT細胞の表面分子の抗原決定基との間の偶発的ではない結合反応である。所望の抗原特異性は通常、抗体がT細胞の表面分子および関連性のない抗原と差別的に結合する能力の基準点から決定され、これにより、特に2つの抗原が特異なエピトープを有する場合、2つの異なる抗原を区別する。特定のエピトープに特異的に結合する抗体は、「特異抗体」と呼ばれる。
抗原: 被検体に注入されるかまたは吸収される組成物を含め、抗体産生または被検体のT細胞応答を刺激するような、特異的な免疫応答を誘導する標的となることができる化合物、組成物、または物質。抗原は、異種免疫原によって誘導されるものを含め、特異的な体液性または細胞性の免疫の産物と反応する。「抗原」という用語には、関連する抗原エピトープの全てが含まれる。
アンチセンス、センス、およびアンチジーン: 二本鎖DNA(dsDNA)は2本の鎖、即ちプラス鎖と呼ばれる5'から 3'方向の鎖、およびマイナス鎖と呼ばれる3'から5'方向の鎖(逆相補鎖)を有する。RNAポリメラーゼは、核酸を5'から 3'方向に付加するので、DNAのマイナス鎖は、転写の間、RNAに対する鋳型としての役割を果たす。従って、形成されるRNAは、マイナス鎖に相補的でありかつプラス鎖と同一である配列を有する(Tの代わりにUに置換されていることを除いて)。アンチセンス分子はRNAまたはDNAのプラス鎖のどちらかに特異的にハイブリダイズ可能なまたは特異的に相補的な分子である。センス分子はDNAのマイナス鎖に特異的にハイブリダイズ可能なまたは特異的に相補的な分子である。アンチジーン分子は、標的dsDNAに指向するアンチセンスまたはセンス分子である。
アンチセンス・オリゴヌクレオチド: 少なくとも約10、12、15、20、30、または50ヌクレオチドのような、少なくとも約8ヌクレオチドの配列であって、その配列は、形質転換ベクターのプロモーター配列に対して逆向きに配置された遺伝子配列(例えばcDNAもしくは遺伝子配列の全部もしくは一部、またはその逆相補鎖)に由来する。
1つの例として、配列はアデノシン受容体の配列である(例えば、GenBankアクセッション番号L22214、AH003248、NM000676、およびAH003597)。アデノシン受容体配列の逆相補鎖を利用してアデノシン受容体の遺伝子座からのタンパク質発現を抑制する場合、アデノシンもしくはアデノシン受容体の遺伝子座のセンス鎖またはcDNAをアンチセンス構築物に挿入する。形質転換細胞におけるアデノシン受容体タンパク質の発現の減少は、アデノシン受容体cDNAコード配列の逆相補鎖、アデノシン受容体cDNAもしくは遺伝子配列、またはその隣接領域を含むアデノシン受容体の遺伝子座、例えばアデノシン受容体A1、A2a、A2b、またはA3遺伝子座に基づいたアンチセンス・オリゴヌクレオチドを細胞に導入することにより得ることができる。
導入される配列は、完全長ヒトアデノシン受容体のcDNAもしくは遺伝子またはその逆相補鎖である必要はなく、かつ形質転換される細胞種で見つかった対応配列に厳密に相同である必要はない。しかし、一般に、導入される配列の長さが短い場合、効果的なアンチセンス抑制のためには、天然のアデノシンまたはアデノシン受容体遺伝子座の配列に対する相同性の度合いがより高い必要がある。ベクターに導入されるアンチセンス配列は、長さを少なくとも30ヌクレオチドとすることができ、かつ、より一層のアンチセンス抑制は通常、配列が100ヌクレオチドより長い場合のように、アンチセンス配列の長さが増すにつれて観察されるものと思われる。アデノシン受容体遺伝子自体を抑制する場合、アンチセンス構築物の転写により、細胞の内在性アデノシン受容体遺伝子から転写されるmRNA分子の逆相補鎖であるRNA分子が産生される。アデノシン受容体遺伝子座の反対側の鎖由来のタンパク質発現を抑制する場合、アンチセンス構築物の転写により、内在性のアデノシンまたはアデノシン受容体遺伝子から転写されるmRNA分子と同一であるRNA分子が産生され、そのアンチセンス構築物は、隣接領域中の配列よりもむしろアデノシン受容体遺伝子内の配列から産生されたと推測される。アデノシン受容体遺伝子座の逆相補鎖である配列を標的とするように作製されたアンチセンス分子は、アデノシン受容体cDNAをコードしていない、遺伝子座の鎖由来のタンパク質またはペプチドの異常な発現を抑制するのに役立つと思われる。
自己免疫疾患: 免疫系が内在性抗原に対する免疫応答(例えば、B細胞またはT細胞応答)を引き起こし、その結果的として組織への傷害が生じる疾患。
親和力: 抗原および抗体のような、2つの作用物質または分子間の相互作用の総体的な強さ。親和力は、親和性と相互作用の結合価の両方に依存する。従って、多価抗原に対して、10箇所の抗原結合部位を有する五量体IgM抗体の親和力は、同一抗原に対する二量体IgG分子の親和力よりもかなり大きい可能性がある。
B細胞またはBリンパ球: リンパ球の2つの主要な種類のうちの1つ。B細胞受容体と呼ばれることもあるBリンパ球上の抗原受容体は、細胞表面の免疫グロブリンである。抗原により活性化されると、B細胞はこの受容体と同じ抗原に特異的な抗体分子を産生する細胞に分化する。
結合または安定な結合: 十分な量のオリゴヌクレオチドがその標的核酸と塩基対を形成するかまたはハイブリダイズしてその結合の検出を可能とする場合、オリゴヌクレオチドは標的核酸に結合するかまたは安定的に結合する。標的:オリゴヌクレオチド複合体の物理的または機能的特性のどちらかによって結合を検出することができる。標的とオリゴヌクレオチドとの間の結合は、機能的および物理的結合試験の両方を含む、当業者に周知の任意の手順により検出することができる。結合が遺伝子の発現、DNA複製、転写、翻訳等のような生合成過程に対する観測可能な影響を及ぼすかどうか決定することで、結合を機能的に検出することができる。
DNAまたはRNAの相補鎖の結合を検出する物理的方法には、DNase Iまたは化学的フットプリンティング、ゲルシフトおよび親和性切断アッセイ、ノーザンブロッティング、ドットブロッティング、ならびに光吸収検出法のような方法が含まれる。例えば、広く利用されている方法の1つには、オリゴヌクレオチド(または類似体)および標的核酸を含有する溶液の光吸収の変化を、温度をゆっくりと上げながら220〜300 nmで観測する工程が含まれる。オリゴヌクレオチドまたは類似体がその標的に結合した場合、オリゴヌクレオチド(または類似体)および標的が相互に解離する、または融解する特性温度で吸光度が増加する。
オリゴマーとその標的核酸との間の結合は、オリゴマーの50%がその標的から融解する温度(Tm)によって特徴付けられることが多い。融解温度(Tm)が高いとは、融解温度(Tm)が低い複合体に比べて、強いまたは安定な複合体であることを意味する。
生物学的試料: 適当な生物学的試料には、被検体の細胞から得られる、ゲノムDNA、RNA(mRNAを含む)、および/またはタンパク質を含む試料が含まれる。例としては、以下に限定されることはないが、末梢血、尿、精液、唾液、組織生検、外科手術による試料、羊水穿刺による試料、血清のような血液の派生物および分画、ならびに生検材料が含まれる。
癌: 分化の喪失、増殖速度の増加、周辺組織への浸潤を伴う特有の脱分化を起こした、かつ転移可能な悪性新生物。
cDNA(相補的DNA): 内部の、非コード部分(イントロン)がないDNAおよび転写を決定する調節配列の断片。cDNAは、細胞から抽出したメッセンジャーRNAから逆転写によって実験室で合成される。
相補性および相補性の割合: 分子は相補的な核酸と鎖が相互にワトソン-クリック、フーグスティン、または逆フーグスティンの塩基対を形成することによって結合する(ハイブリダイズする)時に、安定な二量体または三量体を形成する。安定的な結合は、オリゴヌクレオチドが所要の条件下で標的核酸配列に検出可能に結合したままである場合に起こる。
相補性とは、1つの核酸鎖の塩基が第2の核酸鎖の塩基と塩基対を形成する度合いである。相補性は従来、割合、即ち、2本の鎖の間でまたは2本の鎖の特定領域もしくはドメイン内で塩基対を形成するヌクレオチドの割合により説明される。例えば、15ヌクレオチドのオリゴヌクレオチドのうちの10個のヌクレオチドが、DNA分子の標的化領域と塩基対を形成する場合、そのオリゴヌクレオチドは、標的化したDNA領域に対して66.67%の相補性を有すると言われる。
本開示において、「十分な相補性」という用語は、検出可能な結合を形成するのに、および抗原結合の場合には遺伝子産物(例えばアデノシン受容体)の発現を妨害するのに十分な数の塩基対がオリゴヌクレオチドと標的配列との間に存在することを意味する。形成された塩基対の割合により表現するかまたは測定する場合、この目標を満たす相補性の割合は最低約50%の相補性から最高(100%)の相補性までに及び得る。一般に、十分な相補性は、少なくとも約50%、例えば少なくとも75%、90%、95%、98%、または実に100%の相補性である。
当業者が所望の条件下で使用するのに適したオリゴヌクレオチドを設計することを可能とする結合条件を樹立する際に関係がある、定性的かつ定量的な検討事項の詳細な取り扱いについては、Beltzら、Methods Enzymol 100:266〜285, 1983、およびSambrookら(編)、Molecular Cloning : A Laboratory Manual,第2版, 第1〜3巻, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989により提供される。
含む(Comprises): 「含む(including)」を意味する用語。例えば、「AまたはBを含む(comprising)」とは、他に明記されていなければ、AもしくはBを含む(including)、またはAおよびBの両方を含むことを意味する。
サイトカイン: 細胞により作られるタンパク質であって、リンパ球のような、他の細胞の挙動に影響を及ぼす。1つの例として、サイトカインはケモカイン、つまり細胞輸送に影響を及ぼす分子である。
DNA: デオキシリボ核酸。DNAは、大部分の生物(ウイルスのなかには、リボ核酸(RNA)からなる遺伝子を有するものもある)の遺伝物質を含む長鎖高分子化合物である。DNA高分子化合物の繰り返し単位は、4つの異なるヌクレオチドであり、ヌクレオチドはそれぞれ、4つの塩基(アデニン、グアニン、シトシン、およびチミン)のうちの1つがリン酸基の付いたデオキシリボース糖に結合されるように含んでいる。ヌクレオチドのトリプレット(コドンとも呼ばれる)が、ポリペプチドの各アミノ酸をコードする。コドンという用語は、DNA配列が転写されるmRNAの3つのヌクレオチドの対応(および相補的)配列に対しても使用される。
欠失: DNA配列の除去であり、両側の領域は互いに連結している。
分化: 細胞が生物学的機能を実行するためにさらに特化される過程。分化は、悪性形質転換を起こした細胞により完全にまたは部分的に失われる特性である。
エピトープ: 抗原決定基。これらは、抗原性である、即ち特異的な免疫応答を誘導する、分子の特定の化学基またはペプチド配列である。抗体は、特定の抗原エピトープに結合する。
コードする: ポリヌクレオチドは、その天然の状態でまたは当業者に周知の方法により操作される場合に、これがポリペプチドもしくはその断片に対するmRNAおよび/またはポリペプチドもしくはその断片を産生するように転写および/または翻訳されるならば、ポリペプチドを「コードする」と言われる。アンチセンス鎖はそのような核酸の相補体であり、コード配列はそれから推定することができる。
ハイブリダイゼーション: オリゴヌクレオチドおよびその類似体は、相補的塩基との間で、ワトソン-クリック、フーグスティン、または逆フーグスティンの水素結合を含む水素結合によりハイブリダイズする。一般に、核酸は、ピリミジン(シトシン(C)、ウラシル(U)、およびチミン(T))かまたはプリン(アデニン(A)およびグアニン(G))のどちらかの含窒素塩基からなる。これらの含窒素塩基はピリミジンとプリンとの間で水素結合を形成し、かつピリミジンのプリンとの結合は「塩基対合」と呼ばれる。より具体的には、アデニンはチミンまたはウラシルと水素結合し、グアニンはシトシンと水素結合する。「相補的(な)」とは、2つの別個の核酸配列またはその同じ核酸配列の2つの別個の領域の間で起こる塩基対合を指す。例えば、治療的に有効なオリゴヌクレオチドは、アデノシン受容体をコードするmRNA、またはアデノシン受容体をコードするdsDNAに相補的とすることができる。
「特異的にハイブリダイズ可能な」および「特異的に相補的(な)」とは、安定的かつ特異的な結合がオリゴヌクレオチド(またはその類似体)とDNAまたはRNA標的との間で起こるような十分な程度の相補性を示す用語である。オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体は、特異的にハイブリダイズ可能であるため、その標的配列に100%相補的である必要はない。オリゴヌクレオチドまたは類似体は、標的DNAまたはRNA分子に対するオリゴヌクレオチドまたは類似体の結合が標的DNAまたはRNAの正常機能を阻害する場合に、特異的にハイブリダイズ可能であり、かつ特異的な結合が望まれる条件下で、例えばインビボ試験またはインビボ系の場合の生理学的条件下で、非標的配列に対するオリゴヌクレオチドまたは類似体の非特異的な結合を回避するのに十分な程度の相補性がある。そのような結合は、特異的ハイブリダイゼーションと呼ばれる。
好ましい程度のストリンジェンシーをもたらすハイブリダイゼーション条件は、選択のハイブリダイゼーション法の性質およびハイブリダイズする核酸配列の組成と長さに応じて変化するものと思われる。余分な時間もストリンジェンシーに影響を及ぼすと思われるが、一般に、ハイブリダイゼーションの温度およびハイブリダイゼーション緩衝液のイオン強度(特に、Na+濃度)により、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーが決定されるものと思われる。好ましい程度のストリンジェンシーを得るのに必要なハイブリダイゼーション条件に関する計算は、Sambrookら(編)、Molecular Cloning : A Laboratory Manual,第2版, 第1〜3巻, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989, 第9章および第11章により論じられている。
本開示を目的として、「ストリンジェントな条件」には、ハイブリダイゼーション分子と標的配列との間に存在する不適合が25%未満である場合にのみハイブリダイゼーションが起こるような条件が包含される。より厳密に定義する場合、「ストリンジェントな条件」は、特定の水準のストリンジェンシーに分けることができる。従って、本明細書では、「適度なストリンジェンシー」の条件とは、これより低い条件下では25%を越える配列不適合を有する分子がハイブリダイズしないような条件であり; 「中間のストリンジェンシー」の条件とは、これより低い条件下では15%を越える不適合を有する分子がハイブリダイズしないような条件であり；かつ「高いストリンジェンシー」の条件とは、これより低い条件下では10%を越える不適合を有する配列がハイブリダイズしないような条件である。「非常に高いストリンジェンシー」の条件とは、この下では6%を越える不適合を有する配列はハイブリダイズしないような条件である。
過敏症: 再暴露されると症候性反応を引き起こす無毒抗原に対する免疫反応は、過敏性反応と呼ばれる。これらは繰り返し起こる場合、過敏性症候群を引き起こす可能性がある。抗原に対する反応性増大のこの状態が過敏症と呼ばれる。過敏性反応は、機構により分類される: I型過敏性反応には、肥満細胞のIgE抗体刺激が含まれる; II型過敏性反応には、細胞表面または細胞間質抗原に対するIgG抗体が含まれる; III型過敏性反応には、抗原:抗体複合体が含まれる; およびIV型過敏性反応は、T細胞媒介性である。
免疫細胞: 炎症誘発性サイトカインを産生する細胞のような、ならびに組織傷害および/または疾患の病因に関与する細胞のような、宿主防御機構に関与する任意の細胞。例としては、以下に限定されることはないが、T細胞、B細胞、ナチュラルキラー細胞、好中球、肥満細胞、マクロファージ、抗原提示細胞、好塩基球、および好酸球が含まれる。
免疫応答: 免疫性の変化、例えば、刺激物質に対する、B細胞またはT細胞のような免疫系細胞の応答。1つの例として、応答は特定の抗原に特異的である(「抗原特異的な応答」)。1つの例として、免疫応答はTh1、Th2、またはTh3応答のようなT細胞応答である。具体例として、免疫応答の増大または増強は、被検体がウイルス感染または腫瘍のような疾患を撃退する能力の増加である。
免疫グロブリン: 血漿およびその他の体液中に見られるタンパク質の種類であって、抗体活性を示しかつ他の分子と高い特異性で結合する; 構造および生物学的活性に基づいて5つのクラス(IgM、IgG、IgA、IgD、およびIgE)に分類される。免疫グロブリンおよびそのある種の変異体が知られており、かつ多くのものが組換え細胞の培養で調製されている(例えば、米国特許第4,745,055号; 米国特許第4,444,487号; 国際公開公報第88/03565号; 欧州特許第256,654号; 欧州特許第120,694号; 欧州特許第125,023号; Faoulknerら、Nature 298:286, 1982; Morrison, J. Immunol. 123:793, 1979; Morrisonら、Ann Rev. Immunol 2:239, 1984を参照されたい)。
天然型(天然に存在する)免疫グロブリンは、4本のポリペプチド鎖で構成されている。「重」鎖または「H」鎖と呼ばれ、50〜75キロダルトンの重さがある長鎖が2本、および「軽」鎖または「L」鎖と呼ばれ、25キロダルトンの重さがある短鎖が2本存在する。それらはジスルフィド結合により相互に連結され、「Y」型分子を形成する。重鎖および軽鎖のそれぞれが可変領域および定常領域に分けられる。Fc領域には重鎖および軽鎖の定常領域が含まれるが、可変領域は含まれない。
細胞外アデノシン阻害剤: 細胞外アデノシンの活性および量を減少させる任意の物質または組成物。例としては、以下に限定されることはないが、細胞外アデノシンを分解する物質、細胞外アデノシンを不活化させる物質、および/または細胞外アデノシンの蓄積もしくは形成を減少させるかもしくは抑制する物質が含まれる。具体例としては、以下に限定されることはないが、アデノシンデアミナーゼ、アデノシンキナーゼ、およびアデノシンキナーゼ・エンハンサーのような酵素; 酸化; 低酸素-虚血の程度を軽減する酸化還元電位変化剤; ならびに選択的に結合して内在型アデノシンがアデノシン受容体を介してシグナルを伝達する能力を減少させるかまたはなくすその他の触媒剤が含まれる。その他の例には、アデノシン受容体がある細胞の負の選択およびアデノシン受容体がない細胞の割合の濃縮をもたらす細胞培養条件が含まれる。
炎症: 組織への傷害が起こる際、その傷害に対する体内反応は通常炎症である。この傷害は、外傷、血液供給の不足、出血、自己免疫による攻撃、移植された外来組織、または感染が原因となり得る。体内によるこの全身反応には、免疫系の多くの成分(例えばIL-1およびTNF)の放出、傷害部位への細胞の誘引、体液の放出による組織の腫脹、および他の過程が含まれる。
傷害に対する組織反応である炎症は、急性期および慢性期と呼ばれる2つの局面に分けられる。急性期には、炎症は、血流量および血管透過性の増加、水腫、ならびに白血球および炎症メディエーター(例えばサイトカイン)の蓄積を特徴とする。亜急性/慢性期には、炎症は、組織傷害部位に存在する病因に対する特異的な体液性または細胞性の免疫応答の進行を特徴とする。急性および慢性の両方の炎症過程の間、種々の可溶性因子が、細胞接着分子の発現増加および化学誘引を介して白血球の動員に関与している。これらの可溶性メディエーターの多くは、常在細胞(例えば繊維芽細胞、内皮細胞、組織マクロファージ、および肥満細胞)および新たに動員された炎症細胞(例えば単球、リンパ球、好中球、および好酸球)の両方の活性化を調節している。
単離された: 「単離された」生物学的要素(例えば核酸またはタンパク質)は実質的に、その要素がもともと存在している生物細胞中の他の生物学的要素、例えば、他の染色体および染色体外のDNAおよびRNAならびにタンパク質から分離されているか、それらとは別に産生されているか、またはそれらから分けて精製されている。従って「単離された」核酸およびタンパク質には標準的な精製方法により精製された核酸およびタンパク質が含まれる。この用語にはまた、宿主細胞において組換え発現により調製された核酸およびタンパク質ならびに化学的に合成された核酸も包含される。
白血球: 生体を感染性微生物および外来物質に対して防衛する際に関与する血液中の細胞であり、「白血球(white cells)」とも呼ばれる。白血球は骨髄で産生される。主要な5種類の白血球細胞が存在しており、主要な2群、多形核白血球(好中球、好酸球、好塩基球)および単核白血球(単球およびリンパ球)にさらに分割される。感染がある場合、白血球の産生は増加する。
リンパ球: 体内の免疫防御に関与する白血球の一種。主要な2種類のリンパ球、B細胞およびT細胞が存在する。
哺乳類: この用語には、ヒトおよびヒト以外の哺乳類の両者が含まれる。同様に、「被検体」という用語には、ヒトおよび家畜被検体の両者が含まれる。
モノクローナル抗体: Bリンパ球の単一クローンにより産生される抗体。モノクローナル抗体は、当業者に周知の方法により、例えば、ミエローマ細胞を免疫脾臓細胞と融合して得られる抗体産生雑種細胞を作製することにより産生される。
ナチュラルキラー(NK)細胞: これらは大きな、通常は顆粒状の、非T(non-T)型、非B(non-B)型リンパ球であり、ある種の腫瘍細胞を殺傷する。NK細胞は、ウイルスおよびその他の細胞内病原体に対する先天性免疫のほかに、抗体依存性細胞媒介性細胞障害(ADCC)においてもまた重要である。
新生物: 制御不能かつ進行性の過剰な細胞分裂の結果生じる異常な組織塊であり、腫瘍とも呼ばれる。新生物は良性(浸潤性でもなく癌性でもない)または悪性(侵襲性)である。
核酸: 一本鎖型または二本鎖型のデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチド高分子化合物であり、他に限定されなければ天然に存在するヌクレオチドと類似の方法で核酸にハイブリダイズする、天然型ヌクレオチドの周知の類似体を含む。
オリゴヌクレオチド: 長さが約200ヌクレオチド塩基までの直鎖状ポリヌクレオチド配列であり、例えば少なくとも6ヌクレオチド、例えば少なくとも15、25、50、75、100、またはちょうど200ヌクレオチド長の(DNAまたはRNAのような)ポリヌクレオチド。
機能的に連結される: 第1の核酸配列が第2の核酸配列と機能的に関連するように配置される場合、第1の核酸配列は第2の核酸配列と機能的に連結されている。例えば、プロモーターがコード配列の転写または発現に影響を及ぼすならば、プロモーターはコード配列と機能的に連結されている。一般に、機能的に連結されたDNA配列は連続的であり、かつ2つのタンパク質のコード領域を連結する必要がある場合、読み枠は同一である。
薬剤: 被検体または細胞に適当に投与される場合に、所望の治療的または予防的効果を誘導できる化合物または化学組成物。「インキュベートする」とういう語句には、薬剤が細胞と相互作用するのに十分な時間が含まれる。「接触する」という語句には、固体状または液状の薬剤を細胞とインキュベートする工程が含まれる。
薬学的に許容される担体: 本開示で有用な、薬学的に許容される担体は、従来通りである。Remington's Pharmaceutical Sciences, by E. W. Martin, Mack Publishing社, Easton, PA, 15th Edition(1975)には、アデノシン受容体阻害剤および/または細胞外アデノシン阻害剤の薬剤送達に適した組成物および剤形が報告されている。
一般に、担体の種類は使用される個別の投与方法に依存するものと思われる。例えば、非経口剤形には通常、媒体として水、生理食塩水、平衡塩類溶液、水性デキストロース、グリセロールなどのような薬学的または生理学的に許容される流体を含む注入可能な流体が含まれる。固体組成物の場合(例えば、粉剤、丸剤、錠剤、またはカプセル剤)、従来の無毒性固体担体には、例えば、医薬等級のマンニトール、乳糖、澱粉、またはステアリン酸マグネシウムが含まれる。生物学的に中性の担体に加えて、投与される薬学的組成物は、湿潤剤または乳化剤、保存剤、およびpH緩衝剤など、例えば酢酸ナトリウムまたはソルビタン・モノラウレートのような、無毒性補助物質を少量含むことができる。
ポリヌクレオチド: 長さが100ヌクレオチド塩基よりも長い配列を含む、直鎖状ヌクレオチド配列。
ポリペプチド: 長さまたは翻訳後修飾(例えば、糖鎖付加またはリン酸化)に関わりなく、アミノ酸の任意鎖。
疾患の予防または治療: 疾患を「予防する」とは、例えば、ある疾患に対する素因を有する人において、疾患の完全な進行を阻害するかまたは低下させることを指す。周知の素因を有する人の例は、家族に糖尿病歴のある人、または対象が狼瘡または関節リウマチのような病気にかかりやすくする要因にさらされていた人である。「治療する」とは、疾患または病的状態の徴候または症状を、その進行開始後に改善する治療的介入を指す。
プローブおよびプライマー: 核酸プローブおよびプライマーは、核酸配列に基づいて容易に調製することができる。プローブには、検出可能な標識またはレポーター分子に付着した単離核酸が含まれる。典型的な標識には、放射性同位体、酵素基質、補因子、リガンド、化学発光物質または蛍光物質、ハプテン、および酵素が含まれる。標識化する方法および種々の目的に適した標識を選択する際の手引きは、例えば、Sambrookら(In Molecular Cloning: A Laboratory Manual, CSHL, New York, 1989)およびAusubelら(In Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publ. Assoc. and Wiley-Intersciences, 1992)のなかで論じられている。
プライマーは、長さが少なくとも10ヌクレオチド、例えば、長さが少なくとも約12、15、17、20、または25ヌクレオチドのDNAオリゴヌクレオチドのような、短い核酸分子である。プライマーと標的DNA鎖との間でハイブリッドを形成させるため、核酸ハイブリダイゼーション法によってプライマーを相補的な標的DNA鎖にアニールさせることができ、次いでDNAポリメラーゼ酵素により、標的DNA鎖に沿ってプライマーを伸長させることができる。例えば、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)法または当技術分野において周知の他の核酸増幅法によって核酸配列を増幅させるのに、プライマー対を使用することができる。
プローブおよびプライマーを調製するおよび使用するための方法は、例えば、Sambrookら(In Molecular Cloning: A Laboratory Manual, CSHL, New York, 1989)、Ausubelら(In Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publ. Assoc. and Wiley-Intersciences, 1998)、およびInnisら(PCR Protocols, A Guide to Methods and Applications, Academic Press社, San Diego, CA, 1990)に報告されている。PCRプライマー対は、例えば、Primer(Version 0.5,(著作権) 1991, Whitehead Institute for Biomedical Research, Cambridge, MA)のようなその目的を意図したコンピュータ・プログラムを用いることにより、周知の配列から得ることができる。当業者であれば、特定のプローブまたはプライマーの特異性は、その長さとともに増加することを理解するものと思われる。従って、例えば、アデノシン受容体をコードするヌクレオチドのなかの30の連続ヌクレオチドからなるプライマーは、アデノシン受容体をコードする他の核酸のような標的配列に、僅か15ヌクレオチドからなる対応プライマーよりも高い特異性でアニールすると思われる。このように、高い特異性を得るため、関心対象のヌクレオチド配列のなかの少なくとも17、20、23、25、30、35、40、45、50、またはそれ以上の連続ヌクレオチドを含むプローブおよびプライマーを選択することができる。
精製された: 精製されたという用語は、絶対的な純度を必要とするのではなく、むしろ相対用語として意図される。従って、例えば、精製されたペプチドまたは核酸調製物は、ペプチドまたは核酸が細胞内のその自然環境に存在するそのペプチドまたは核酸よりも濃縮されているような調製物である。例えば、調製物は、タンパク質または核酸が調製物のペプチドまたは核酸の全含有量の少なくとも50%、例えば少なくとも70%に相当するように精製される。
受容体: 特異物質の選択的結合および結合に付随して起こる特異的な生理学的効果を特徴とする、細胞質のまたは細胞表面上の分子構造体であり、例えば、ペプチドホルモン、神経伝達物質、免疫グロブリン、小分子に対する細胞表面受容体、およびステロイドホルモンに対する細胞質受容体である。アデノシン受容体は、アデノシンに対する細胞表面受容体であり、以下に限定されることはないが、受容体A2およびA3が含まれる。
組換え体: 組換え核酸は、天然には存在しない配列を有するかまたは別の方法で分離された2つの配列断片を人工的に組合せて作製される配列を有するものである。この人工的な組合せは多くの場合、化学合成により、またはより一般的には単離された核酸断片の人為的操作により、例えば遺伝子工学技術により達成される。同様に、組換えタンパク質は、組換え核酸分子によりコード化されるものである。
リボザイム: 特異性の高いエンドリボヌクレアーゼ活性を有する合成RNA分子。リボザイムの作製および使用については、Cechの米国特許第4,987,071号およびHaselhoffの米国特許第5,543,508号に開示されている。アンチセンスRNAに結合する内在性mRNA分子を切断し、これが次いで内在性遺伝子の発現のアンチセンス阻害を増強するように、アンチセンスRNA中の含有リボザイム配列を使用してRNA切断活性をアンチセンスRNAに与えることができる。
特異的な結合物質: 特定の標的にのみ実質的に結合する物質。従って、抗体または抗体断片特異的な結合物質は、特定の抗体もしくは抗体断片、またはタンパク質、例えば融合タンパク質中の抗体領域にのみ実質的に結合する。本明細書で使用される場合、「アデノシン受容体特異的な結合物質」という用語には、抗アデノシン受容体抗体(およびその機能的な抗体断片)ならびにアデノシン受容体にのみ実質的に結合するその他の物質(例えば潜在的な治療薬)が含まれる。
抗体は、HarlowおよびLane(Antibodies, A Laboratory Manual, CSHL, New York, 1988)を含む、多くの教科書に記載されている標準的な分子法を用いて産生することができる。特定の物質が標的のタンパク質またはペプチドにのみ実質的に結合することの決定を、決まりきった手順に使用するかまたは適合させることによって容易に行うことができる。適当なインビトロ試験の1つは、ウエスタンブロッティング法を利用している(HarlowおよびLane, Antibodies, A Laboratory Manual, CSHL, New York, 1988)。
抗体の短い断片はまた、特異的な結合物質としての機能を果たすこともできる。例えば、アデノシン受容体に結合するFAb、Fv、および1本鎖Fv (SCFv)は、アデノシン受容体特異的な結合物質である。
被検体: 生命のある多細胞脊椎動物、ヒトおよびヒト以外の哺乳類の両者を含む部類。
T細胞: 免疫応答に関与する白血球細胞。T細胞には、以下に限定されることはないが、CD4+ T細胞およびCD8+ T細胞が含まれる。CD4+ Tリンパ球は、その表面に「分化クラスター4」(CD4)として知られるマーカーを持つ免疫細胞である。ヘルパーT細胞としても知られるこれらの細胞は、抗体反応およびキラーT細胞反応を含む、免疫反応を統合する補助となる。CD8+ T細胞は、「分化クラスター8」(CD8)マーカーを持つ。1つの態様として、CD8 T細胞は、細胞傷害性Tリンパ球である。別の例として、CD8細胞は、サプレッサーT細胞である。
標的配列: 治療的に有効なオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体とのハイブリダイゼーションの際、アデノシン受容体の遺伝子発現のような遺伝子発現の阻害をもたらすssDNA、dsDNA、またはRNAの部分。アンチセンスまたはセンス分子はどちらもdsDNAの標的化部分の発現を阻害すると思われるので、dsDNAのある部分を標的化するのにそれらを使用することができる。アンチセンス分子はプラス鎖に結合することができ、センス分子はマイナス鎖に結合することができる。従って、標的配列はssDNA、dsDNA、およびRNAとすることができる。
治療的有効量: 治療を受けている被検体において所望の効果を挙げるのに十分な物質または組成物の量。例えば、これは、免疫細胞の活性を増加させるおよび/または被検体の免疫応答を増強するのに必要な量とすることができる。1つの例として、これは、ウイルスの、真菌の、もしくは細菌の複製を阻害することができるか、またはウイルスの、真菌の、もしくは細菌の感染の表だった兆候をある程度まで変えることができる量である。別の例として、これはさらなる腫瘍増殖を減少させることができるかまたは予防することができる量である。被検体に投与される場合、インビトロで、ウイルス複製を阻害するかまたは腫瘍細胞を減少させることが示されている標的組織濃度(例えば、リンパ球中における)に達する用量が一般に使用されている。
治療的有効量: 疾患の進行を防ぐ、または疾患の退行を引き起こすのに十分な用量であり、例えば腫瘍の容積または大きさを減少させるのに十分な用量。別の例として、それは、痛みまたは腫脹のような、疾患により引き起こされる症状を取り除くことができる量である。
治療的に有効なアデノシン受容体オリゴヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチド類似体: 1つまたは複数のアデノシン受容体の発現を阻害するかまたは低下させるその能力を特徴とする。下記のように、治療有効性には完全な阻害は必ずしも必要とされない。治療的に有効なオリゴヌクレオチドは、1つまたは複数のアデノシン受容体の発現を阻害するかまたは低下させるその能力を特徴とする。阻害とは、オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体の非存在下におけるアデノシン受容体の産生と比較した場合に認められる、アデノシン受容体の発現の低下である。例えば、オリゴヌクレオチドはアデノシン受容体の発現を、少なくとも15%、30%、40%、50%、60%、もしくは70%、またはそれ以上まで阻害することができる可能性があり、そして依然として治療的に有効であると考えられる。
治療的に有効なオリゴヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチド類似体はさらに、アデノシン受容体をコードする核酸配列に十分に相補的であることを特徴とする。本明細書では、十分に相補的とは、治療的に有効なオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体がアデノシン受容体の発現を特異的に妨害することができ、かつアデノシン受容体以外の遺伝子の発現を有意に変化させないことを意味する。
形質導入されたおよび形質転換された: ウイルスまたはベクターは、これらが核酸を細胞中に移送する場合に細胞に「形質導入する」。その核酸の細胞ゲノムへの組込みにより、またはエピソーム複製によって、そのDNAが細胞によって安定的に複製される場合、細胞は細胞中に形質導入された核酸によって「形質転換される」。本明細書で使用される場合、形質転換という用語には、ウイルス・ベクターによるトランスフェクション、プラスミド・ベクターによる形質転換、ならびにエレクトロポレーション、リポフェクション、およびパーティクルガン加速による裸のDNAの導入を含む、このような細胞に核酸分子を導入できると思われる方法の全てが包含される。
治療: ウイルスの感染のような初感染の予防的阻止、および未治療疾患の過程の自然経過を変えるための治療的介入の両方を指す。
腫瘍: 制御不能かつ進行性の過剰な細胞分裂の結果生じる異常な組織塊であり、新生物とも呼ばれる。腫瘍は良性(浸潤性でもなく癌性でもない)または悪性(侵襲性)である。
ワクチン: 病原体に対する適応免疫を誘導するために被検体に投与される、病原体の死菌形態もしくは弱毒化(非病原性)形態、または病原体から単離された抗原。
ベクター: 宿主細胞中に導入されるような核酸分子であり、これにより形質転換された宿主細胞を作り出す。ベクターは、複製起点のような、宿主細胞中でベクターが複製するのを可能とする核酸配列を含むことができる。ベクターはまた、1つまたは複数の選択マーカー遺伝子および当技術分野において周知の他の遺伝要素を含むこともできる。「ベクター」という用語には、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ワクシニア、およびレトロウイルス・ベクターのような、ウイルス・ベクターが含まれる。
炎症の停止機構
アデノシン受容体は、インビボにおける炎症の生理学的「停止」機構であり、例えば、細胞外アデノシンおよびアデノシン受容体(例えばA2a、A2b、およびA3)は炎症に影響を及ぼしかつそれにより免疫応答を変化させるための薬理的および遺伝的標的であることが本明細書に開示される。本明細書に開示される、細胞外アデノシン阻害剤(例えば、細胞外アデノシンの形成を抑制する、細胞外アデノシンを分解する、不活化させる、および/または減少させる物質)、および/またはアデノシン受容体阻害剤(例えば、アデノシン受容体アンタゴニスト)の使用による、細胞外アデノシンまたはアデノシン受容体の阻害または減少は、マクロファージ、好中球、顆粒球、樹状細胞、T細胞-および/またはB細胞-媒介性反応のような、免疫反応を引き起こす際に役立つ。さらに、細胞外アデノシン阻害剤およびアデノシン受容体阻害剤は、急性または慢性炎症を促進する際に役立つ。Gsタンパク質媒介性細胞内経路の阻害剤およびアデノシン受容体が引き起こすGiタンパク質媒介性細胞内経路の阻害剤もまた、急性および慢性炎症を増大させるのに使用することができる。
アデノシン受容体阻害剤、細胞内cAMP依存的経路の阻害剤、および細胞外アデノシン阻害剤
本明細書に開示されるのは、1つまたは複数の細胞外アデノシン阻害剤またはアデノシン受容体阻害剤、例えばアデノシン受容体アンタゴニストに免疫細胞を接触させるかまたはそれらを被検体に投与することによる、免疫応答または炎症を増加させるための方法および標的組織の傷害のための方法である。図16に概略を示す。
細胞外アデノシンを阻害する物質には、アデノシンがアデノシン受容体を介してシグナルを伝達する能力を無効にするようにアデノシンの構造を改変する物質のような、細胞外アデノシンを非機能的にさせる(またはその機能を低下させる)物質が含まれる。これは例えば、酵素(例えば、アデノシンデアミナーゼ)、またはアデノシンに選択的に結合しかつこれを破壊し、結果として内在的に形成されたアデノシンがアデノシン受容体を介してシグナルを伝達しかつ炎症を止める能力を取り除くかまたは有意に低下させる他の触媒分子とすることができる。細胞外アデノシンを分解する物質の1つは、ADA SCID患者の治療で使用されてきたADA-PEG(ポリエチレングリコール修飾ADA)である(Hershfield, Hum Mutat. 5:107, 1995)。別の例として、細胞外アデノシンを阻害する物質には、細胞外アデノシンの形成を抑制するかもしくは減少させる物質、および/または細胞外アデノシンの蓄積を抑制するかもしくは減少させる物質が含まれる。
アデノシン受容体阻害剤にはアデノシン受容体アンタゴニストが含まれる。アンタゴニストは、生物応答を誘導することなく細胞受容体に結合する薬物のような、他のものの作用を無効にする傾向がある任意の物質である。1つの例として、アンタゴニストは、受容体A2a、A2b、またはA3のような、アデノシン受容体に対するアンタゴニストの化合物である。別の例として、アンタゴニストは、アデノシン受容体に結合するがG1タンパク質依存的な細胞内経路を引き起こさないペプチドまたはペプチド模倣物である。適当なアンタゴニストは、米国特許第5,565,566号; 米国特許第5,545,627号, 米国特許第5,981,524号; 米国特許第5,861,405号; 米国特許第6,066,642号; 米国特許第6,326,390号; 米国特許第5,670,501号; 米国特許第6,117,998号; 米国特許第6,232,297号; 米国特許第5,786,360号; 米国特許第5,424,297号; 米国特許第6,313,131号, 米国特許第5,504,090号;および米国特許第6,322,771号に報告されている。
別の例として、アンタゴニストはアデノシン受容体をコードするmRNAに特異的に結合するアンチセンス分子または触媒性核酸分子(例えば、リボザイム)である。非限定的な具体例として、アンチセンス分子または触媒性核酸分子は、A2a、A2b、またはA3に結合する。さらなる例として、アンチセンス分子または触媒性核酸はアデノシン受容体の下流の生化学的経路を標的とする。例えば、アンチセンス分子または触媒性核酸は、Gsタンパク質またはGiタンパク質に依存的な細胞内経路に関与する酵素を阻害することができる。
宿主細胞中のアデノシン受容体タンパク質の発現は、細胞に、アデノシン受容体の遺伝子座、例えばアデノシン受容体A1、A2a、A2b、またはA3遺伝子座(例えば、それぞれGenBankアクセッション番号L22214、AH003248、NM000676、およびAH003597)に基づく、アンチセンス構築物または他の遺伝子配列標的化物質を導入することにより減少させることができる。アンチセンス構築物には、アデノシン受容体cDNAコード配列の逆相補鎖、アデノシン受容体cDNAもしくは遺伝子配列、またはその隣接領域が含まれる。アンチセンス抑制の場合、アデノシン受容体の遺伝子座由来のヌクレオチド配列(例えば、アデノシン受容体のcDNAもしくは遺伝子の全部もしくは一部またはその逆相補鎖)を、ベクターのプロモーター配列に対して逆向きに配置する。次いで、ベクターを関心対象の細胞に導入する。報告されている配列の逆相補鎖を利用してアデノシン受容体の遺伝子座からのタンパク質の発現を抑制する場合、開示されているアデノシンもしくはアデノシン受容体の遺伝子座のセンス鎖またはcDNAをアンチセンス構築物に挿入する。理論に縛られるわけではないが、アンチセンスRNA分子は内在性mRNA分子に結合し、それによって内在性mRNAの翻訳を阻害すると考えられる。
アデノシン受容体遺伝子の抑制の場合、アンチセンス構築物の転写によって、細胞の内在性アデノシン受容体遺伝子から転写されるmRNA分子の逆相補鎖であるRNA分子が産生される。導入される配列は、完全長ヒトアデノシン受容体のcDNAもしくは遺伝子またはその逆相補鎖である必要はなく、かつ形質転換される細胞種で見つかった対応配列に厳密に相同的である必要はない。しかし、一般に、導入される配列の長さが短い場合、効果的なアンチセンス抑制のためには、天然のアデノシンまたはアデノシン受容体遺伝子座の配列に対する相同性の度合いがより高い必要がある。1つの例として、ベクターに導入されるアンチセンス配列は、長さが少なくとも10、例えば少なくとも30ヌクレオチドである。アンチセンス抑制の向上は通常、アンチセンス配列の長さが増すにつれて認められる。より短いポリヌクレオチド(オリゴヌクレオチド)は、合成的およびインビボで都合良く作製することができる。具体的な態様として、オリゴヌクレオチドは、少なくとも10ヌクレオチド、少なくとも15ヌクレオチド、少なくとも30ヌクレオチド、少なくとも100ヌクレオチド、または少なくとも200ヌクレオチドである。
アデノシン受容体のような標的RNA分子の翻訳を阻害するため、アンチセンス分子は標的RNAと接触するのに十分な時間細胞中に存在するのが理想的である。しかし、細胞はポリヌクレオチド(例えば、アンチセンス分子)を分解する酵素および他の成分を含んでいる。アンチセンス分子は、細胞中で分解されないように操作することができる。これは例えば、アンチセンス分子の各塩基を連結している天然ホスホジエステル結合を修飾型結合に置換することにより行うことができる。これらの修飾型結合は、例えば、ホスホロチオエート、メチルホスホネート、ホスホジチオエート、またはホスホセレネート(phosphoselenate)とすることができる。さらに、単一アンチセンス分子は、さまざまな組合せで複数の置換を含むことができる。
アンチセンス分子はまた、異なる糖分子を含むように設計することができる。例えば分子は、塩基に連結された、糖のリボース、デオキシリボース、またはその混合物を含むことができる。塩基は、標的RNAに相補的に結合する分子能をもたらす。相補的な結合は、一方の分子の塩基がもう一方の分子(の塩基)と水素結合を形成する場合に起こる。通常、塩基アデニン(A)はチミジン(T)およびウラシル(U)に相補的であり、一方、シトシン(C)はグアニン(G) に相補的である。従って、アンチセンス分子の配列ATCGは、標的RNAのTAGCに結合する。さらに、アンチセンス分子は、有効であるために、標的RNAに100%相補的である必要はない。
オリゴヌクレオチドは、DNAもしくはRNA、またはキメラ混合物もしくはキメラ誘導体もしくはその修飾型、1本鎖もしくは2本鎖とすることができる。オリゴヌクレオチドは、塩基部分で、糖部分で、またはリン酸骨格で修飾することができ、かつペプチドのような他の付加基、または細胞膜(例えば、Letsingerら、PNAS USA 86:6553〜6, 1989; Lemaitreら、PNAS USA 84:648〜52, 1987; 国際公開公報第88/09810号を参照されたい)もしくは血液脳関門(例えば、国際公開公報第89/10134号を参照されたい)の通過輸送を促進する物質、ハイブリダイゼーションによる切断物質(hybridization triggered cleavage agent) (例えば、Krolら、BioTechniques 6:958〜76, 1988を参照されたい)または挿入剤(例えば、Zon, Pharm. Res. 5:539〜49, 1988を参照されたい)を含むことができる。
具体例として、アデノシン受容体アンチセンス・ポリヌクレオチドは例えば1本鎖DNAとして提供される。そのようなポリヌクレオチドは、受容体A1、A2a、A2b、またはA3をコードする配列に対してアンチセンスな配列を含むことができる。オリゴヌクレオチドは、その構造の任意の位置で、当技術分野において一般に知られている置換基を用いて修飾することができる。例えば、修飾塩基部分は、5-フルオロウラシル、5-ブロモウラシル、5-クロロウラシル、5-ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、アセチルシトシン、5-(カルボキシヒドロキシルメチル)ウラシル、5-カルボキシメチルアミノメチル-2-チオウリジン、5-カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、β-D-ガラクトシルクオシン、イノシン、N-6-イソペンテニルアデニン、1-メチルグアニン、1-メチルイノシン、2,2-ジメチルグアニン、2-メチルアデニン、2-メチルグアニン、3-メチルシトシン、5-メチルシトシン、N6-アデニン、7-メチルグアニン、5-メチルアミノメチルウラシル、メトキシアミノメチル-2-チオウラシル、β-D-マンノシルクオシン、5'-メトキシカルボキシメチルウラシル、5-メトキシウラシル、2-メチルチオ-N6-イソペンテニルアデニン、ウラシル-5-オキシ酢酸、シュードウラシル、クオシン、2-チオシトシン、5-メチル-2-チオウラシル、2-チオウラシル、4-チオウラシル、5-メチルウラシル、ウラシル-5-オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル-S-オキシ酢酸、5-メチル-2-チオウラシル、3-(3-アミノ-3-N-2-カルボキシプロピル)ウラシル、および2,6-ジアミノプリンとすることができる。
別の例として、ポリヌクレオチドには、少なくとも1つの修飾された糖成分、例えばアラビノース、2-フルオロアラビノース、キシロース、およびヘキソース、または修飾されたリン酸骨格成分、例えばホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホルアミドチオエート、ホスホルアミデート、ホスホルジアミデート、メチルホスホネート、アルキルホスホトリエステル、もしくはホルムアセタール、またはその類似体が含まれる。
アンチセンス・ポリヌクレオチドを他の分子、例えばペプチド、ハイブリダイゼーションによる架橋物質(hybridization triggered cross-linking agent)、輸送物質、またはハイブリダイゼーションによる切断物質に結合することができる。腫瘍細胞による分子の取り込みを増強させる標的化部分を含めることもできる。標的化部分は、腫瘍細胞の表面に存在する分子を認識する抗体またはその断片のような、特異的結合分子とすることができる。
また、内在性アデノシン受容体の遺伝子座からの発現の抑制は、リボザイムのような触媒性核酸を用いて行うことができる。リボザイムは、特異性の高いエンドリボヌクレアーゼ活性を有する合成RNA分子である。リボザイムの作製および使用については、Cechの米国特許第4,987,071号およびHaselhoffの米国特許第5,543,508号に開示されている。リボザイムを合成して、細胞もしくは被検体に投与することができるか、または発現ベクター(このベクターから、リボザイムが標的細胞中で合成される)にコード化することができる(国際公開公報第9523225号、およびBeigelmanら、Nucl. Acids Res. 23:4434〜42, 1995にあるように)。触媒活性を有するオリゴヌクレオチドの例は、国際公開公報第9506764号、国際公開公報第9011364号、およびSarverら(Science 247:1222〜5, 1990)に報告されている。アンチセンスRNAに結合する内在性mRNA分子を切断し、これが次いで内在性遺伝子の発現のアンチセンス阻害を増強するように、アンチセンスRNA中の含有リボザイム配列を使用してRNA切断活性をアンチセンスRNAに与えることができる。
さらに、内在性アデノシン受容体の活性を遮断するために、アデノシン受容体の優性阻害突然変異型を使用することができる。この例として、アデノシン受容体の優性阻害突然変異型をコードする核酸を、プロモーターに機能的に連結させることができる。非限定的な具体例の1つとして、プロモーターは誘導プロモーターである。次に、優性阻害型アデノシン受容体をコードする核酸およびプロモーターを含むベクターを細胞に導入する。
別の例において、局部組織における細胞外アデノシンの蓄積は、アデノシンデアミナーゼ(ADA)製剤を用いて阻害される。これは例えば、アデノシンデアミナーゼ酵素もしくはリボザイム、またはアデノシンに選択的に結合し、かつこれを破壊し、結果として内在的に形成されたアデノシンがアデノシン受容体を介してシグナルを伝達しかつ炎症を止める能力を取り除くかまたは有意に低下させる他の触媒分子とすることができる。
核転写因子のモジュレーターを含む、炎症性分子の合成および/または分泌の調節に関与している酵素およびタンパク質の特異的阻害剤を使用することにより、アデノシン受容体によって誘発される細胞内シグナル伝達カスケードの伝播にも影響を及ぼすことができる。
さまざまな状況(以下を参照されたい)において炎症または免疫応答を増大させる/増強するために、アデノシン受容体発現の抑制またはGsタンパク質もしくはGiタンパク質に依存的な細胞内経路、またはcAMPに依存的な細胞内経路の発現も使用される。
免疫応答の増大
アデノシン受容体阻害剤および/または細胞外アデノシン阻害剤を用いて、天然の、細胞外アデノシン依存的な、内在性の抗炎症過程をインビボで遮断することにより、炎症性応答を増強するおよび延ばすための方法が本明細書に開示される。1つの例として、アデノシン受容体は、受容体A2a、A2b、またはA3である。
免疫細胞の活性を増加させるための方法も本明細書で開示される。免疫細胞には、以下に限定されることはないが、白血球(即ち、好中球、好酸球、リンパ球、単球、好塩基球、マクロファージ、B細胞、T細胞、樹上細胞、および肥満細胞)、ならびに他の種類の炎症誘発性サイトカイン産生細胞が含まれる。別の例として、免疫細胞はマクロファージである。さらに別の例として、免疫細胞は抗原提示樹状細胞である。さらなる態様として、免疫細胞はナチュラルキラー細胞である。さらなる例として、免疫細胞は顆粒球である。免疫細胞の活性は、インビボまたはインビトロで増加させることができる。1つの例として、この方法には、「古典的免疫細胞」とは見なされないものを含め、炎症誘発性サイトカイン/分子を産生する任意の他の細胞にアデノシン受容体を標的化する段階が含まれる。
従って、非限定的な具体例の1つとして、細胞はB細胞であり、かつ免疫グロブリン(例えば、IgGまたはIgM)の分泌が増加する。別の非限定的な具体例として、細胞はT細胞でありかつサイトカイン(例えば、IL-2またはIL-4)分泌活性が増加する。同様に、別の態様として、細胞はヘルパーT細胞かまたは細胞傷害性T細胞のどちらかであり、かつヘルパーT細胞の機能かまたは細胞傷害性T細胞の機能のどちらかが増加する。理論に縛られるわけではないが、細胞傷害性T細胞の活性は、致死的打撃を与えるFasリガンド分子の長時間発現によりまたはインビボの標的組織への免疫細胞の輸送向上により増加する。理論に縛られるわけではないが、ヘルパーT細胞の活性は、サイトカイン分泌の持続により増強される。
本方法には、免疫細胞をアデノシン受容体アンタゴニスト、または細胞外アデノシン阻害剤のようなアデノシン受容体阻害剤と接触させる段階、およびこれにより免疫細胞の活性を増加させる段階が含まれる。免疫細胞は、急性免疫応答または慢性免疫応答に関与し得る。
当業者であれば、免疫細胞の活性増加を同定する際に有用な方法を容易に同定することができる。例えば、サイトカインの分泌は、ELISA法もしくはPCRに基づくアッセイ法により、または生物学的アッセイ法で測定することができる。1つの例として、活性の増加は対照と比較して測定される。適当な対照には、アデノシンアンタゴニストと接触されていない免疫細胞または基準値が含まれる。
被検体の免疫応答を増強するための方法が本明細書に開示される。本方法には、免疫応答を増強するために、被検体にアデノシン受容体阻害剤および/または細胞外アデノシン阻害剤の治療的有効量を投与する段階が含まれる。1つの例として、免疫応答は、マクロファージ/単球またはB細胞応答である。別の例として、免疫応答はT細胞応答である。
T細胞媒介性免疫応答を向上させるための方法が本明細書に提供される。本方法には、被検体に対する、アデノシン受容体阻害剤および/または細胞外アデノシン阻害剤の投与が含まれる。1つの態様として、被検体は、免疫不全ウイルス(例えば、HIV-1またはHIV-2)に感染した被検体のような、免疫反応が抑制された被検体である。アデノシン受容体阻害剤および/または細胞外アデノシン阻害剤を投与すると、結果的に所望の免疫応答が増加するおよび/または関心対象のサイトカインの分泌が持続する。別の例として、被検体は、細菌性病原体、ウイルス性病原体、または真菌性病原体のような病原体に感染している。被検体における病原体の破壊を促進するために、アデノシン受容体阻害剤および/または細胞外アデノシン阻害剤を投与する。1つの例として、被検体は、免疫反応が抑制されている。免疫不全疾患、免疫抑制治療法、急性および/または慢性感染、ならびに老化と関連した免疫不全(例えば、1つもしくは複数の種類の免疫細胞の不全、または1つもしくは複数の免疫学的因子の不全)を、本明細書に記載の方法を用いて治療することができる。免疫抑制の状態および疾患の一般的概要は、Harrisons 「Principles of Internal Medicine」, 第14版, McGraw-Hill, 1998のなかで、とりわけ86章(Principles of Cancer Therapy)、307章(Primary Immune Deficiency Diseases)、および308章(Human Immunodeficiency Virus Diseases)のなかで見つけることができる。
多く治療法では、免疫系が弱められる可能性がある。例えば、コルチコステロイドでは、細胞媒介性免疫が抑制される可能性がある。癌治療法(例えば、化学療法および放射線療法)と関連した主な毒性は、免疫系および血液系の維持に関与する造血性細胞のような増殖性細胞の破壊である。同様に、骨髄移植法(この治療法では、免疫細胞を取り除いた後で移植細胞に置き換える)では、免疫抑制および免疫系の枯渇が必要とされる。退縮した免疫細胞を刺激することによってこれらの症状のうちの一部を治療するために、ある種の周知の免疫賦活剤(例えば、エリスロポエチンおよびコロニー刺激因子、例えばG-CSF、これは「Neupogen」(米国特許第5,536,495号)という名称で市販されていることもある)が以前から使用されてきた。本開示による免疫賦活性の化合物および混合物を、骨髄移植、化学療法、および/または放射線療法を受けた患者を含め、治療法または医原的に誘発された免疫抑制に苦しんでいる患者の免疫系を刺激するために使用することができる。
免疫系が低下するかまたは抑制されるその他の症状が公知である。例えば、アデノシン受容体アンタゴニストでの治療による免疫系の活性化(T細胞産生の刺激を介した)はまた、免疫機能が多くの場合に低下している老齢の被検体においても有益な可能性がある。同様に、免疫応答が異常であるかまたは好ましくないその他の症状が知られている。これらの症状のうちのいずれかもまた、本明細書に開示の方法または記載の組成物の適用により恩恵が受けられるものと思われる。一般に、本開示の方法または組成物のうちの1つを用いた治療の必要性は、試験被検体の免疫状態を調べ、この免疫状態を対照的なまたは平均的な免疫状態(仮想的「健常」被検体)と比較することにより決定することができる。例えば、免疫機能を評価するために、骨髄生検または末梢血白血球を試料とすることができる。免疫機能の低下の同定には、白血球減少症、例えば好中球減少症もしくはリンパ球減少症、または白血球機能の低下の証拠が含まれる。試験被検体に、正常を下回る、末梢血白血球数における減少のような（例えば正常より25%下回る減少）、免疫状態の減少がある場合、本開示の免疫賦活法は免疫抑制状態を改善するための治療法と見なされるべきである。
また、被検体にアデノシン受容体阻害剤および/または細胞外アデノシン阻害剤を投与することにより、被検体のNF-kB活性を増強するのに使用できる方法も開示される。NF-kB活性の増強によりIL-12p40およびTNF-αのような、炎症誘発性サイトカインの転写が促進され、これにより免疫応答が高められる。
ワクチン
アジュバント活性を与えることにより、抗原に対する免疫応答を高めるための方法が提供される。抗原に対する免疫応答を高めるために、アジュバントとして機能する、細胞外アデノシン阻害剤、アデノシン受容体阻害剤、細胞内cAMP依存的経路阻害剤、および/または細胞内Giタンパク質依存的経路阻害剤と共に抗原を投与する。
1つの例として、ワクチンに対する免疫応答を延ばすための方法が提供される。この方法には、アデノシン受容体アンタゴニストのようなワクチンと共にアデノシン受容体阻害剤を投与することが含まれる。
従って、アジュバント組成物として、アデノシン受容体アンタゴニストのようなアデノシン受容体阻害剤の使用が本明細書に開示される。従って、特定抗原に対する免疫応答の刺激のための方法も本開示の範囲内である。本開示によるアジュバントおよびアジュバントを含有するワクチン組成物が効果的に投与される宿主動物には、ヒトおよびヒト以外の哺乳類が含まれる。
通常、抗原は本開示のアジュバント化合物との混合物として使用される。例えば、(i)少なくとも1つの治療的に有効な抗原またはワクチン; および(ii)少なくとも1つのアデノシン受容体アンタゴニストまたはアデノシン分解剤(例えば、ADA-PEG)を含む治療用アジュバント組成物が本明細書に開示される。
このような治療用組成物は例えば、(A)生きている、加熱死した、または化学的に弱毒化されたウイルス、細菌、マイコプラズマ、菌類、および原虫; (B) (A)の断片、抽出物、サブユニット、代謝産物、および組換え構築物; (C) 哺乳類のタンパク質および糖タンパク質の断片、サブユニット、代謝産物、および組換え構築物; (D) 腫瘍特異抗原; ならびに(E) 核酸ワクチンのような少なくとも1つの抗原物質を含むことができる。
従って、治療用組成物は、任意の適当な抗原またはワクチン成分をアデノシン受容体アンタゴニストと組合せて、例えば、病原生物および非病原生物、ウイルス、ならびに真菌由来の抗原のような抗原物質を本開示のアジュバント化合物と組合せて利用することができる。
さらなる例として、このような治療用組成物は、天然痘、黄熱病、ジステンパー、コレラ、鶏痘、猩紅熱、ジフテリア、破傷風、百日咳、インフルエンザ、狂犬病、おたふく風邪、はしか、口蹄病、および小児麻痺のような病状および症状に対して薬理学的に活性なタンパク質、ペプチド、抗原、およびワクチンを適当に含むことができる。(i)抗原、ならびに(ii)少なくとも1つのアデノシン受容体阻害剤または/および細胞外アデノシン阻害剤を含む、結果的に得られるワクチン製剤には、製剤がそれでワクチン接種された宿主動物、胚、または卵子(下記を参照されたい)に投与される場合、免疫応答を誘導するのに効果的な量の抗原およびアジュバント化合物がそれぞれ含まれる。
腫瘍治療
腫瘍免疫におけるリンパ系細胞の重要性が繰り返し示されてきた。腫瘍に対する細胞媒介性宿主応答には、細胞媒介性免疫と関連した細胞機構が新たに形質転換された腫瘍細胞を腫瘍関連抗原(正常細胞には見られない腫瘍細胞関連抗原)を認識した後に破壊する、免疫監視機構の概念が含まれる。これは、同一でないドナーからの移植組織の拒絶過程に類似している。ヒトにおいて、患者の末梢血リンパ球の懸濁液および腫瘍細胞の懸濁液を混合することによって、腫瘍結節の増殖がインビボで阻害されたことから、腫瘍に対する細胞媒介性反応が示唆される。インビトロでの研究から、ある種の新生物を有する患者から得たリンパ系細胞は、その対応するヒト腫瘍培養細胞に対して細胞傷害性を示すことが明らかとされた。これらの細胞傷害性細胞(一般的にT細胞である)は、神経芽細胞腫、悪性黒色腫、肉腫、ならびに結腸癌、乳癌、子宮頚癌、子宮内膜癌、卵巣癌、精巣癌、鼻咽頭癌、および腎臓癌で発見されている。化学的発癌物質またはウイルスにより誘導されたさまざまな動物腫瘍と反応させて、インビトロで腫瘍細胞と反応する液性抗体も作製されている。インビトロ・ハイブリドーマ技術により、さまざまな動物およびヒトの新生物に対するモノクローナル抗腫瘍抗体の検出および作製が可能である。抗体によるインビボでの腫瘍増殖の抑制は、白血病およびリンパ腫の両方で証明可能であった。
腫瘍破壊(例えば腫瘍の大きさまたは容積を減少させること)を向上させるため、腫瘍浸潤リンパ球を含む免疫細胞の炎症作用を増加させる、およびいくつかの態様では、抗腫瘍活性を有する他の免疫細胞の動員をさらに促進させるための方法が本明細書に提供される。先天性の抗癌免疫応答および腫瘍細胞表面の腫瘍関連抗原を認識する免疫細胞による癌の適応免疫療法の両方を向上させるための方法が提供される。1つの例として、腫瘍細胞に対して親和性(向性)を有する第1の物質を被検体に投与する。腫瘍に対する免疫応答を促進させるため、アデノシン受容体阻害剤(例えばアデノシン受容体アンタゴニスト)および/または細胞外アデノシン阻害剤である第2の物質を被検体に投与する。理論に縛られるわけではないが、第1の物質は、腫瘍細胞またはその局所環境に対する向性により、腫瘍中に選択的に蓄積する。第1の物質は、腫瘍細胞に対するその物質自体の細胞毒性により、一部の低い割合の腫瘍細胞の死を誘発する。
1つの例として、第1の物質は腫瘍細胞の細胞死を引き起こす。さらなる例として、第1の物質は化学療法薬である。さらに別の態様として、第1の物質は腫瘍細胞に対する免疫応答を起こす。1つの例として、第2の物質は、受容体がアデノシンに結合しないように、またはアデノシン受容体により誘発される生化学的経路を活性化しないように、アデノシン受容体を突然変異させるために使用される遺伝子標的化物質である。アデノシン受容体の補完的な不活性化または遺伝学的もしくは薬理学的手法を用いて細胞外アデノシンを減少させることに加えて、第1の物質により標的化組織(例えば腫瘍)に低レベルの炎症を誘発することにより、組織(例えば腫瘍)の破壊が引き起こされることが本明細書に示される。
1つの例として、第1の物質は、腫瘍特異抗原とのその選択的相互作用により腫瘍に蓄積する免疫毒素である。腫瘍破壊は完全ではないものの、これらの試薬は腫瘍細胞の直接破壊を引き起こす。理論に縛られるわけではないが、一部の腫瘍細胞の死が腫瘍内に炎症性の環境を引き起こし、腫瘍浸潤性免疫細胞(マクロファージおよびT細胞)を活性化する。次いで、この抗腫瘍活性を早期的に終結させると思われる先天性の阻害経路が、アデノシン受容体阻害剤(例えばアデノシン受容体アンタゴニスト)または細胞外アデノシン阻害剤(例えば細胞外アデノシン分解剤または細胞外アデノシン妨害剤)により遮断されると考えられる。従って、アデノシン受容体阻害剤および/または細胞外アデノシン阻害剤を投与することで、腫瘍細胞死が加速される。
別の例として、第1の化合物は、インビボで抗腫瘍過程を惹起する。免疫細胞を活性化する二価性試薬を、腫瘍特異抗原に結合する抗体とT細胞またはマクロファージ活性化リガンド(例えば、それぞれ抗T細胞受容体mAbまたはT細胞様受容体リガンド)に結合させる。理論に縛られるわけではないが、第1の物質は、腫瘍特異抗原とのその選択的相互作用により腫瘍に蓄積する。第1の物質はまた腫瘍浸潤性免疫細胞を活性化させ、腫瘍細胞を破壊する。この免疫細胞の活性化および腫瘍細胞の死が腫瘍内に炎症性の環境を引き起こし、加えて腫瘍浸潤性免疫細胞(例えばマクロファージおよびT細胞)を活性化する。第2の物質は腫瘍細胞死を加速させる、アデノシン受容体阻害剤(例えばアデノシン受容体アンタゴニスト)または細胞外アデノシン阻害剤である。
別の態様として、インビボで抗腫瘍過程を惹起する第1の物質は、腫瘍抗原に特異的なT細胞群であり、単独で、またはT細胞の抗腫瘍活性を増強する他のリガンド(例えばCTLA-4リガンド; Kuhnsら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:12711, 2001)と組み合わされるか、またはCD25+調節性T細胞の除去と組み合わされる。これらの2つの免疫調節機構のうちのどちらかを取り除くことで、抗腫瘍CTL活性が向上する(Sutmullerら, J. Exp. Med. 94:823〜32, 2001)。理論に縛られるわけではないが、この免疫細胞の活性化および腫瘍細胞の死が腫瘍内に炎症性の環境を引き起こし、腫瘍浸潤性免疫細胞(マクロファージおよびT細胞)を活性化する。この例では、第2の物質はアデノシン受容体アンタゴニストまたはアデノシン分解剤ではない。その代わりとして、アデノシン受容体の喪失(または減少)をもたらす条件下で、抗腫瘍免疫細胞を調製する過程がそれにあたり、これにより腫瘍細胞を腫瘍関連アデノシンによって生存できないようにする。この過程は、細胞培養で内在性アデノシンの形成を増加させるための低酸素インキュベーターのようなさらなる条件またはアデノシン受容体を発現する免疫細胞の拡張を抑制するかもしくは減少させるような選択的マイナス圧を与えるためのアデノシン類似体の添加を含むことができる。
さらなる態様として、第1の物質は、腫瘍と正常組織の環境との間の相違(例えば、増殖速度、酸化還元電位、もしくは酸素分圧(低酸素状態)の相違またはその他の化学的相違)によって腫瘍に蓄積する細胞傷害性化合物である。理論に縛られるわけではないが、この化合物が腫瘍細胞死を引き起こして腫瘍内に炎症性の環境を引き起こし、さらに腫瘍浸潤性免疫細胞(マクロファージおよびT細胞)を活性化する。第2の物質は、アデノシンによって抗腫瘍細胞の不活性化を抑制するかまたは減少させることによって腫瘍細胞死を加速する、アデノシン受容体阻害剤(例えばアデノシン受容体アンタゴニスト)または細胞外アデノシン阻害剤である。
さらに別の態様として、第1の物質は腫瘍細胞に蓄積する化合物であり、かつこの化合物は腫瘍細胞の増殖亢進によって細胞傷害性となる。理論に縛られるわけではないが、この化合物が腫瘍細胞死を引き起こし、腫瘍内に炎症性の環境を引き起こす。腫瘍浸潤性免疫細胞(マクロファージおよびT細胞)が活性化される。第2の物質は、腫瘍細胞死を加速させるアデノシン受容体阻害剤(例えばアデノシン受容体アンタゴニスト)または細胞外アデノシン阻害剤(例えば細胞外アデノシン分解剤)である。
薬学的組成物および投与
少なくとも1つのアデノシン受容体阻害剤、例えばアデノシン受容体アンタゴニスト、および/または少なくとも1つの細胞外アデノシン阻害剤を含む薬学的組成物は、選択された具体的な投与方法に応じて、適当な液体または固体担体と共に製剤化することができる。本開示で有用な、薬学的に許容される担体および賦形剤は従来通りである。例えば、非経口製剤には通常、水、生理食塩水、他の平衡塩類溶液、水性デキストロース、グリセロールなどのような薬学的または生理学的に許容される液体媒体である注入可能な流体が含まれる。含有される賦形剤は、例えば、ヒト血清アルブミンまたは血漿製剤のような他のタンパク質である。望ましいならば、投与される薬学的組成物はまた、湿潤剤または乳化剤、保存剤、およびpH緩衝剤など、例えば酢酸ナトリウムまたはソルビタン・モノラウレートのような、無毒性補助物質を少量含むこともできる。
その他の医用薬剤、例えばその他の免疫賦活剤もまた含むことができる。免疫賦活剤には、以下に限定されることはないが、例えばIFA、COX-2阻害剤、IL-12、サポニン(例えばQS-23)、およびN-アセチル-システインが含まれる。
薬学的組成物の剤形は、選択された投与方法により決定されるものと思われる。例えば、注入可能な流体の他に、局所用製剤および経口製剤を使用することができる。局所用製剤には、点眼液、軟膏、スプレー剤などが含まれる。経口製剤は、液体(例えば、シロップ剤、液剤、懸濁剤)、または固体(例えば、粉剤、丸剤、錠剤、またはカプセル剤)とすることができる。固体組成物の場合、従来の無毒性固体担体には、例えば、医薬等級のマンニトール、乳糖、澱粉、またはステアリン酸マグネシウムが含まれる。当業者には、このような剤形を調製する実際の方法は周知であるか、または明らかであると思われる。
本開示のいくつかの態様においてアデノシン受容体アンタゴニストを含む薬学的組成物は、正確な用量を個別投与するのに適した、単位用量で製剤化されるものと思われる。例えば、可能な単位用量の1つとして、アデノシン受容体アゴニストまたはアンタゴニストの約1 mg〜約1 gを含むことができる。投与される活性化合物の量は、治療を受けている被検体、苦痛の重さ、および投与方法に依存するものと思われ、かつ処方を行う臨床医の判断に最も良く委ねられる。これらの制限内で、投与される製剤は活性化合物の量を、治療を受けている被検体で所望の効果を達成するのに効果的な量だけ含むものと思われる。
本開示の化合物はヒトまたはその他の動物細胞に投与することができ、ヒトまたはその他の動物細胞に対して、その化合物はさまざまな方法で、例えば局所的に、経口的に、経静脈的に、筋肉注射で、腹腔内で、鼻腔内に、経皮的に、内皮的に、髄腔内で、および皮下で有効である。投与の具体的な方法および投与計画は、主治医により、症例の詳細(例えば、被検体、疾患、関与する病状、および治療が予防的であるかどうか)を考慮に入れつつ選択されるものと思われる。治療には、数日から数ヶ月、またはさらに数年に渡る、化合物の１日単回投与または1日複数回投与が含まれる。
アデノシン受容体阻害剤および/または細胞外アデノシン阻害剤の治療的有効量は、被検体の免疫系を刺激するのに必要なアデノシン受容体アンタゴニストの量とすることができる。アデノシン受容体アンタゴニストにより引き起こすことができる特異的な免疫賦活効果およびアデノシン受容体アゴニストにより引き起こすことができる特異的な免疫賦活効果を、本明細書に記載する。いくつかの態様において、アデノシン受容体アンタゴニストの免疫賦活的な量は、実質的な細胞傷害効果を引き起こすことなく(例えば、試料中の10%を超える細胞を殺傷することなく)免疫応答(例えば、本明細書に記載の刺激応答のいずれか)を刺激するのに十分な量である。
アデノシン受容体阻害剤および/または細胞外アデノシン阻害剤の有効量を、一連の治療の間、例えば毎日、単回投与で、または複数回投与で投与することができる。しかし、アデノシン受容体阻害剤および/または細胞外アデノシン阻害剤の有効量は、適用される特定のアゴニストまたはアンタゴニスト、治療を受けている被検体、苦痛の重さおよび種類、ならびに治療薬の投与方法に依存するものと思われる。例えば、アデノシン受容体阻害剤および/または細胞外アデノシン阻害剤の治療的有効量は、体重1 Kg当たり約0.1 mgから体重1 Kg当たり約1 gまで変化する可能性がある。
開示された化合物の部位特異的な投与を、例えば前癌状態の部位、新生物を取り除いた組織部位、または新生物が発生しやすいことが疑われる領域にアデノシン受容体アンタゴニストを投与することによって利用することできる。
本開示にはまた、アデノシン受容体阻害剤および/または細胞外アデノシン阻害剤を、免疫関連の障害、症状、または疾患の治療において有用な他の物質の1つまたは複数と組み合わせることが含まれる。例えば、本開示の化合物を、有効量の他の免疫抑制剤、免疫賦活剤、抗癌剤、抗炎症薬、抗感染症薬、および/またはワクチンと組み合わせて投与することができる。「組み合わせて投与」または「同時投与」という用語は、活性物質の同時投与および逐次投与の両方を指す。1つの例として、配列番号:1をアデノシン受容体阻害剤および/または細胞外アデノシン阻害剤と同時投与する。別の例として、配列番号:1をアデノシン受容体阻害剤および/または細胞外アデノシン阻害剤の投与前にまたは投与後に投与する。
本開示の化合物と組み合わせて使用できる物質の例は、AS-101(Wyeth-Ayerst Labs.社)、ブロピリミン(Upjohn社)、γ-インターフェロン(Genentech社)、GM-CSF(Genetics Institute社)、IL-2(Cetus or Hoffman-LaRoche社)、ヒト免疫グロブリン(Cutter Biological社)、IMREG(Imreg社, New Orleans, Louisianaより)、SK&F106528(Genentech社)、TNF(Genentech社)、アザチオプリン、シクロホスファミド、クロラムブシル、およびメトトレキサートである。被検体が増殖抑制療法または他の細胞傷害性療法を受けた後の(またはその間の)、本開示の免疫賦活組成物を用いた被検体の治療法が示される。増殖抑制化合物の例には、以下が含まれる: イフォサミド、シスプラチン、メトトレキサート、サイトキサン、プロカリジン(procarizine)、エトポシド、BCNU、ビンクリスチン、ビンブラスチン、シクロホスファミド、ゲンシタビン、5-フルオロウラシル、パクリタキセル、およびドキソルビシン。
いくつかの例において、被検体に細胞傷害性治療を施し、その後、一定期間(通常、数日から数週間の範囲)、治療により免疫抑制効果がもたらされているかどうかを決定するために監視を行う。そのような監視には、白血球減少症もしくは汎血球減少症に対する抹消血の監視、および/またはT細胞機能の監視が含まれる。免疫抑制を示す被検体が、開示された開示内容の治療法を用いる治療の候補であると思われる。
アデノシン受容体アンタゴニストをスクリーニングするための方法
免疫系の細胞を用いて、アデノシン受容体アンタゴニストの作用をスクリーニングするための方法もまた開示される。本方法には、活性化された免疫細胞を化合物と接触させる段階、および免疫細胞の活性を測定する段階が含まれる。活性の増加または免疫細胞の活性化の持続により、化合物がインビボの環境で効果的であるアデノシン受容体アンタゴニストであることが示唆される。このような方法はまた、免疫抑制剤および免疫賦活剤をスクリーニングするためにも使用することができ、ここで、活性の増加または免疫細胞の活性化の持続により化合物が免疫賦活剤であることが示唆され、かつ活性の減少または免疫細胞の活性化時間の減少により化合物が免疫抑制剤であることが示唆される。
他の用法のなかで、受容体アンタゴニストの機能の機能試験によっては、治療的使用に効果的な受容体アンタゴニストまたは受容体アゴニストのそれぞれの投薬量の最適化が可能となる。これらの試験はまた、周知のアデノシン受容体アンタゴニストのほかに新たに同定されたアデノシン受容体アンタゴニストまたは推定上のアデノシン受容体アンタゴニストを、免疫抑制または免疫賦活生物活性について試験するために使用することができる。候補物質は、その後の選別および試験のために、本明細書に記載の1つまたは複数の試験法によって最初にスクリーニングすることができる。
アデノシン受容体アンタゴニストの免疫賦活活性は、アデノシン受容体アンタゴニストが、免疫細胞の、免疫系の、および/またはより一般的には被検体における、免疫応答を増強させる能力である。より具体的には、アデノシン受容体アンタゴニストに関連する免疫賦活には、アデノシン受容体アンタゴニストが2 μg/ml未満の用量でインビトロ系に適用される場合、より好ましくは1 μg/ml未満(例えば、約0.1 μg/ml〜僅か0.003 μg/ml以下)の場合に見られるような効果が含まれる。インビトロ系では、これらの効果は、20 gのマウスでは約1 μg〜約5 μg、または体重1 kg当たり約50〜約250 μgの適用量で見られる。関連する特異的な免疫賦活効果には、T細胞産生の刺激、インターロイキン産生(例えば、マクロファージによるIL-1および/またはIL-12の産生)の刺激、ならびにナチュラルキラー細胞および/またはマクロファージの活性化が含まれる。
アデノシン受容体阻害剤によって免疫賦活を試験するための方法には、本明細書に開示される方法、例えば、1つまたは複数の免疫細胞種の活性化もしくは増殖、またはインターロイキン産生(例えばIL-1またはIL-12)の増加(または減少)の直接的な測定が含まれる。免疫賦活による二次効果はまた、本明細書に記載されているように、例えば、腫瘍形成、腫瘍の相対的増殖速度、もしくは腫瘍転移を試験することにより、またはウイルス感染もしくは他の感染に対する、試験化合物で処置した生物の耐性により測定することができる。
実施例1
受容体A2aの活性化はコンカナバリンA誘発性肝臓障害をインビボで減少させる
本実施例は、選択的A2aアゴニストによる受容体A2aの薬理学的活性化によって、炎症性肝臓損傷モデルで肝臓傷害が抑制されることを証明するために利用した方法について説明するものである。
マウスにおけるコンカナバリンA(Con-A)誘発性肝臓障害は、T細胞、マクロファージ、ならびに炎症誘発性サイトカインであるTNF-α、IL-4、およびIFN-γにより調節され、かつウイルス性肝炎および自己免疫性肝炎の、十分に説明されたインビボ炎症モデルに相当する。B6野生型マウス5匹に20 mg/kgのConA(IV型, Sigma, St. Louis, MO)滅菌PBS溶液を単独で静脈内注射(i.v.)、またはConA処置の直前にCGS21680(2 mg/kg)、イソプロテレノール(100 mg/kg, Sigma, St. Louis, MO)、もしくはプロスタグランジンE2(PGE2, 5 mg/kg, Sigma, St. Louis, MO)を腹腔内(i.p.)に同時注射した。肝臓の障害および炎症の程度は、Con-A注射から1.5時間、4時間、および8時間後に、肝酵素アラニン・アミノトランスフェラーゼ(ALT)およびTNF-αの血清濃度を測定することにより定量化した。TNF-αは、ELISAキット(R＆D systems社, Minneapolis, MN)を用い、製造元の指示に従って測定した。血清ALT活性は、比色測定キットを用いて測定した(Sigma社, St. Louis, MO)。本明細書に開示されているデータは、平均値±標準誤差として表されている。群間の相違は、スチューデントt検定を用いて評価した。
図1Aに示されるように、cAMPを上昇させるGs共役型受容体のいくつかの薬理学的活性化により、肝臓障害が抑制されたかまたは減少した。同様に、A2aの活性化により、Con-Aによる炎症性TNF-αのインビボ蓄積が阻害された。A2aアゴニストのCGS21680はまた、ELISAキット(R＆D systems社, Minneapolis, MN)を用いて測定されたように、活性化されたマクロファージおよびT細胞により、IL-12およびIFN-γの分泌をインビトロで阻害した(図1B)。従って、受容体A2aまたは他のGsタンパク質共役型受容体の薬理学的活性化により、インビボにおいてCon-Aによる肝臓障害および炎症性TNF-αの蓄積が抑制されるかまたは減少する。
実施例2
インビトロにおける、マウス肝臓単核細胞のcAMP濃度に対するA2aアゴニストおよびアンタゴニストの効果
本実施例は、受容体A2aのシグナル伝達(cAMPの蓄積)がA2aR-/-マウス由来の肝臓単核細胞およびマクロファージにおいては減少するかまたは取り除かれてさえしまうが、A2aR+/+同腹子由来の細胞ではそうならないことを証明するために利用した、方法について説明するものである。
結果の再現性をより良くするために、同腹子または同齢の野生型マウス(A2aR+/+)およびホモ接合型の受容体A2a遺伝子欠損マウス(A2aR-/-)を全ての実験で使用した。C57BL/6系の受容体A2a欠損マウスについては、以前に報告されている(Chenら、J. Neuroscience 19:9192〜9200, 1999; Apasovら、Br. J. Pharmacol. 131:43〜50, 2000; およびArmstrongら、Biochem. J. 354:123〜130, 2001)。マウス受容体A2aの遺伝子型は、サザンブロット解析により決定した(Chenら、J. Neuroscience 19:9192〜200, 1999)。
細胞の刺激およびcAMP濃度の測定は、以前に報告されているように行った(Apasovら、Br. J. Pharmacol. 131:43〜50, 2000、参照として本明細書に組み入れられる)。手短に言えば、肝臓単核細胞は、パーコール(Amersham Pharmacia Biotech社, Uppsala, Sweden)を用いて、肝臓実質細胞および細胞残屑から単離した。その結果得られた肝臓単核細胞(1×105細胞/200 μl)を、10 μM CGS21680、1 μM ZM241385 (Tocris社, Ballwin, MO)、100 μMイソプロテレノール、50 μMフォルスコリン、または1 μM PGE2の存在下、37℃で30分間インキュベートした。cAMP濃度は、cAMP酵素免疫測定キット(Amersham Pharmacia Biotech社, Buckinghamshire, England, UK)を用い、製造元の指示に従って測定した。
図2Aに示されるように、A2aRアンタゴニストのZM241385は、A2aR+/+マウスの肝臓由来の単核細胞におけるAGORA2aアゴニスト(CGS21680)によるcAMP増加を阻害した。対照的に、A2aRアゴニストのCGS21680は、A2aR-/-マウスの肝臓由来の単核細胞のcAMPを増加させなかった(図2B)。A2aR-/-マウス由来細胞は、他のGsタンパク質共役型受容体のリガンドに対するcAMP応答を維持していた(図2D)。従って、受容体A2aはアゴニストにより活性化されると、炎症を抑制する可能性がある。このように、A2a欠損マウスでは、cAMPを上昇させる受容体に欠損がある。結果として、これらのマウスは、炎症における受容体A2aの役割をインビボで立証するのに使用することができる。
実施例3
受容体A2a欠損マウスにおける炎症誘発性サイトカインの蓄積および肝臓障害
本実施例は、機能的な受容体A2aが存在しない場合、Con-Aの投与に応答して炎症の増加および組織障害の悪化が引き起こされることを証明するのに利用した、方法について説明するものである。
A2a+/+マウス(n=5)および受容体A2a遺伝子欠損(A2a-/-)マウス(n=5)を使用した。マウスに最適以下の用量(12.5 mg/kg)のCon-A(図3A、挿入図を参照されたい)を静脈内注射し、その後、ALTおよびサイトカインの血清濃度を、実施例1に記載されているように、1時間、6時間、8時間、24時間、および48時間で測定した(サイトカインは、ELISAキット(R＆D systems社)を用い、製造元の指示に従って測定した)。
図3Aに示されるように、Con-A処置の後、A2a+/+マウスに比べてA2a-/-マウスにおいて、血清ALT濃度の大幅な増加が観察された。最適以下の用量の炎症刺激物質Con-A(図3Aの挿入図を参照されたい)でさえ、48時間以内にA2aR-/-マウス5匹のうちの2匹を殺傷したが、A2aR+/+対照では全てが生存していた。低用量のCon-A(A2aR+/+対照マウスでは、肝臓障害をごく僅かしかまたは全く起こさなかった)でも、A2aR-/-マウスでは、TdTアポトーシス試験ならびにヘマトキシリンおよびエオシン(H-E)染色を用いて死んだ細胞および白血球の蓄積が明らかにされたように、広範囲に及ぶ炎症および肝臓障害を引き起こすのに十分であった。
A2aR+/+マウス(n=5)およびA2aR-/-マウス(n=5)の肝臓障害に対するTNF-αの影響を、マウスにD-ガラクトサミン(Sigma社, St. Louis, MO)およびTNF-α(PharMingen社, San Diego, CA)を組み合わせて注射することにより比較した。マウス組換え型TNF-α(4〜15 μg/kg)を静脈内注射する30分前に、D-ガラクトサミン(700 mg/kg)を腹腔内注射した。6時間後、マウスを屠殺し、実施例1に記載されているように、血清ATL濃度を測定することで肝臓障害を評価した。図3Bに示されるように、受容体A2aが欠損しても、TNF-αによるインビボ損傷に対する肝細胞の感受性に影響はなかった。従って、TNF-αがインビボでA2aR-/-マウスおよびA2aR+/+マウスのどちらにおいても肝細胞を直接的に破壊するうえで等しく効果的であった(図3B)ことから、A2aR+/+マウスとA2aR-/-マウスとの間の相違は、TNF-αに対するA2aR-/-の肝細胞の感受性増加によっては説明されなかった。さらに、A2aR-/-マウスの血清中では、A2aR+/+マウスでTNF-α濃度が低いかまたは検出不可能であったのに比べて、炎症性TNF-αの過剰なかつ長期に及ぶ蓄積が認められた(図3B)。IL-4濃度は、A2aR-/-マウスとA2aR+/+マウスとの間で相違がなかったが、A2aR-/-マウスでは、IFN-γも高濃度でかつ長期間存在していた。A2aR+/+野生型マウスの受容体A2aを受容体A2アンタゴニストZM241385により不活化させると、同様にしてA2aR-/-マウスでの炎症性組織障害を増加させた(図4)。
要約すれば、cAMPの誘因となる他のGs共役型受容体は、Con-Aに対するA2aR-/-マウスの感受性増加により証明されるように、A2aR-/-マウスの免疫細胞の受容体A2aの欠損を感知できるほどに補ってはいない。遺伝学的に不活化されたアデノシン受容体を有するマウスは、機能的なアデノシン受容体が全くない。A2aR-/-マウスは、十分に機能的なその他の受容体(例えば、プロスタグランジンまたはβ-アドレナリン作用性受容体)を有しており、これらは免疫応答の天然のダウンレギュレータとして機能している可能性がある。これらのデータから、受容体A2a遺伝子欠損マウスは、受容体A2aをインビボにおける免疫応答の重複のないダウンレギュレータと関連付けるのに利用できることが証明される。これらのデータからまた、これらのマウスにおけるcAMPの蓄積をもたらすシグナル伝達経路は機能的であって、このことから、人為的変異がA2aR遺伝子欠損マウスに存在する可能性が完全に排除されることが証明される。
実施例4
受容体A2aのインビボにおける不活化による肝臓障害の悪化
本実施例により、炎症性肝臓障害および全身性炎症の他のモデルにおいて、アデノシン受容体A2を、組織保護特性を証明するのに利用した方法が提供される。これらの結果から、標的組織の損傷をインビボで達成することができることが証明され、例えば、標的組織が腫瘍である場合、第1の物質または薬物は、特異的免疫細胞(例えばT細胞またはNK-T細胞)、毒素(例えばPEA)、または細胞傷害性物質(例えば四塩化炭素)である。
B6マウス(n=5)にCon-A 12.5 mg/kgを単独でまたはA2aRアンタゴニストZM241385(2 mg/kg)と組み合わせて注射した。緑膿菌(Pseudomonas)外毒素A(PEA, 100 μg/kg静脈内注射、Sigma社, St. Louis, MO)をまた、以下のように肝臓障害を誘発させるのに使用した。マウスにPEAを単独(n=6)で、またはPEA注射前およびPEA注射から12時間後のZM241385(n=7)の腹腔内注射と組み合わせて注射した。四塩化炭素(CCl4)による肝毒性は、A2aR+/+マウス(n=7)およびA2aR-/-マウス(n=7)にオリーブ油に溶解したCCl4(0.5 ml/kg, Sigma社)を腹腔内注射することによって決定した。
注射後、実施例1に記載されているように、血清ATL(これは肝臓障害の程度を示す)を測定した。さらに、組織学的評価ならびに組織障害およびアポトーシス細胞(核DNAの1本鎖切断のインサイチュー染色によるアポトーシス細胞の検出)の解析を行った。
図4Aに示されるように、アデノシン受容体アンタゴニストを用いて、受容体A2aをインビボで薬学的に不活化させると、Con-Aにより誘導される肝臓障害が悪化する。A2aR+/+マウスにおけるアンタゴニストZM241385によるアデノシン受容体A2の不活化により、T細胞およびTNF-α依存的なPEAによる急性肝毒性が悪化した(図4B)。化学的(CCl4)に誘発された急性肝毒性の間、A2aR-/-マウスで肝臓障害の増加も認められた(図4C)。
従って、炎症誘発性サイトカインの蓄積の増加および持続ならびに肝臓障害の悪化が、野生型マウスに比べて、受容体A2a欠損マウスにおいて起こる。これらのデータから、アデノシン受容体、例えば受容体A2aはインビボで、免疫応答/炎症の生理学的ダウンレギュレータとして機能しており、かつ過剰な組織傷害の防御役として機能していることが証明される。受容体A2aが遺伝学的に不活化されると、ごく僅かな、最適以下の用量の炎症刺激物に対し、はるかに強力で長い免疫応答が引き起こされる。これは組織損傷および動物死から明らかである(受容体A2aを発現している正常な野生型同腹子では、実質的に組織損傷は検出されずかつ高いレベルの炎症誘発性サイトカインが検出されたのはごく短期間であった)。A2aRアンタゴニストが投与されずに、炎症性刺激物のCon-Aが同じ用量だけ与えられた正常な野生型同腹子では、実質的に組織損傷は検出されなかった。
要約すれば、これらの結果から、2つの作用物質を用いて免疫抑制「ブレーキ」を切り離すことによって、標的組織(本実施例では、肝臓であったが、その他の腫瘍を標的としてもよい)を縮小させるかまたは破壊することができることが証明される。第1の物質は、標的組織特異的である; 例えば、腫瘍に対して親和性を有する細胞傷害性細胞、これはT細胞依存的組織損傷を増加させることができる; 例えば、腫瘍に対して親和性を有する抗毒素(図4B)、これは抗毒素依存的標的組織損傷を引き起こすことができる; および例えば、腫瘍に対して親和性を有する有毒化学物質(図4C)、これは化学療法依存的標的組織損傷を引き起こすことができる。この物質は、観測できないかまたは弱い炎症を起こす。第2の物質は、低酸素状態、細胞外アデノシン、および/またはアデノシン受容体の存在を不活化させるかまたは減少させる。第2の物質は、標的組織破壊の強さを促進させかつその持続期間を延ばす。
実施例5
内毒素処理された受容体A2a欠損マウスにおける炎症誘発性サイトカインの蓄積および組織障害の増加
本実施例は、皮下および静脈内に細菌内毒素(LPS)を注射後のインビボ敗血ショックモデルを用いて、炎症誘発性サイトカインの蓄積および組織障害を抑制する際のアデノシン受容体A2aの役割を証明するためにさらに利用した方法について説明するものである。
リポポリサッカライド(LPS, 大腸菌0111:B4; 3 mg/kg, Sigma社)をA2aR-/-(n=11) マウスおよびA2aR+/+(n=10)マウスに静脈内注射した。LPS注射後96〜120時間、生存率を監視した。統計学的解析により、アデノシン受容体がないマウスの死亡率は高くかつ速くなることが確認された。図5に示されるように、A2a-/-マウスは全て48〜72時間までに死亡したが、A2a+/+マウスの生存率は、120時間かまたは96時間で10〜20%であった。
A2aR-/-雄マウスおよび同齢のA2aR+/+マウスの内毒素ショックを、LPSを3または5 mg/kg静脈内注射することより誘発した。続いて、注射から1時間および16時間後に、血液試料を眼窩後採血により得た。マウスの別の群では、Levyら(Nat. Immunol. 2:612, 2001)に報告されているように、本質的には滅菌空気を用いて調製された、背部空気嚢中にLPSを注入した(100 μg/kg)。LPS注入後の各時点における血清サイトカイン濃度を、以下のように、R＆D systems社から入手したELISAキットを以下の製造元の指示通りに用いて決定した: TNF-αおよびIL-6の濃度は1時間の時点で測定し、かつIL-12p40およびIL-1βの濃度は3時間の時点で測定した。図6A〜6Dに示されるように、A2aR-/-マウスではアデノシン受容体A2aがないために、野生型マウスに比べて、空気嚢中にLPSを注入(感染性創傷モデル)後に、炎症誘発性サイトカインの濃度が劇的に増加する。
従って、アデノシン受容体を欠いたマウス(遺伝子不活化により)は死ぬのが早く(図5)、かつ細菌内毒素に反応して高い濃度の細胞傷害性TNF-α(図6A)を有するように、アデノシン受容体A2aは、敗血性ショックによる死を防いでいる。これらの結果から、アデノシン受容体A2aは、生来のかつ重複のない、炎症性組織障害の「ブレーキ」であることが証明される。
実施例6
免疫細胞活性化後のA2aR-/-マウスにおける炎症誘発性サイトカインのmRNAの蓄積増加
変異型マウス(A2aR-/-)または野生型マウスに20 nmol CpGオリゴヌクレオチド(
Figure 2005516917
星印はホスホロチオエートを意味する。配列番号:1)を静脈内注射した。このToll受容体を活性化するCpG DNA製剤は免疫系を刺激する。1時間後、mRNAを脾細胞から抽出し、市販の鋳型を用いた(mCK-2bおよびmCK-3b, Pharmingen社, San Diego, CA)RNaseプロテクション・アッセイ法を利用して、サイトカイン遺伝子の発現について分析した。
図7に示されるように、アデノシン受容体がない場合、NF-kBにより転写されるサイトカインmRNA(例えば、TNF-αおよびIL-12p40)は劇的に増加する。従って、アデノシン受容体A2aは、CpGによる免疫細胞のインビボ活性化の間、IL-12(これはT細胞応答に重要である)を含む炎症誘発性サイトカインmRNAの蓄積を抑制するのに関与している。これは、アデノシン受容体を標的とした不活化を、免疫応答を増強するのに利用できるというさらなる証拠を与えるものである。サイトカインのIL-12は、T細胞依存的免疫応答を促進する際に重要であることから、これらのデータにより、免疫細胞の「アデノシンの蓄積→アデノシン→アデノシン受容体→シグナル伝達」経路を遺伝学的に標的化することで免疫応答を増強することが可能であり、これを、ワクチンを向上させるための免疫促進物質として利用することができることを証明するものである。
実施例7
アデノシン受容体アンタゴニストによる、CpGにより活性化された免疫細胞の炎症誘発性サイトカイン発現のインビボにおける増加
本実施例は、NF-kB活性ならびにTNFおよびIL-12p40のような炎症誘発性サイトカインの発現に関するアデノシン受容体アンタゴニストの役割を決定するために利用した方法について説明するものである。
C57BL/6マウスを、配列番号:1の投与15分前にZM241385(10 mg/kgを腹腔内に)で前処理し、実施例6に記載の方法を用いて、脾臓中のサイトカインmRNAの発現をCpG単独で処理したマウスと比較した。
図7に示されるように、アデノシン受容体変異型マウス(アデノシン受容体が遺伝学的に不活化される)では、NF-kB調節性の炎症誘発性サイトカイン(TNFα、IL-12p40)のmRNA発現がさらに高くなっていた。同様に、図8Aおよび8Bに示されるように、NF-kB調節性の炎症誘発性サイトカインの高い発現がZM241385処理マウス(アデノシン受容体が薬理学的に不活化される)で認められた。従って、アデノシン受容体アンタゴニストの投与を利用して、増強したかまたは増加したNF-kB活性により、CpGによる活性化後に炎症誘発性サイトカインの転写を増加させるかまたは促進させることができる。
実施例8
IKKによって媒介されるIkBのリン酸化を阻害することによる、アデノシン受容体によるNF-kBの核移行およびサイトカインmRNAの転写の減少
NF-kBの核移行(これはサイトカインの発現に必要である)に必要な、IKKによって媒介されるリン酸化に関するアデノシン受容体の役割をさらに証明するために、以下の方法を用いた。
実施例6に記載されているように、免疫細胞を活性化するため、変異型マウス(A2aR-/-)および野生型マウスにCpGを静脈内注射した。注射から1時間後、標準的な方法を用いて、腹腔マクロファージから核抽出物を単離した。NF-kBのマクロファージの核内への移行の程度を決定するために、核抽出物を、特異的DNA配列に対する結合のための電気泳動移動度シフトアッセイ(EMSA)のなかで、日常的なEMSA法に従って比較した。
図9に示されるように、CpGによって誘導されるNF-kBの核内への移行は、アデノシン受容体A2aがないと増加する。このことから、受容体A2aは、NF-kBの核内への移行を負に調節し、これによりその活性をインビボにおいて負に調節していることが証明される。
IkBのリン酸化の役割を決定するため、C57BL/6マウスに、アデノシン受容体アゴニストCGS21680(2 mg/kg)の存在下または非存在下で、5nM CpG(配列番号:1)を静脈内注射した。20分後、上述のようにマクロファージを単離し、IkBを認識する抗体およびIkBのリン酸化型(IkB-P)を識別できる抗体を用いて、ウエスタンブロット解析にかけた。図11Aに示されるように、CpGで免疫刺激後、IkBのリン酸化は、アデノシン受容体アゴニストCGS21680が存在する場合には減少するかまたは阻害される。図11Bに示されるように、対照パネルに並べた試料は、ウエスタンブロットで示されるような、同程度の量のIkBを有していた。
従って、NF-kB活性は、アデノシン受容体により、IKKによるIkBのリン酸化が阻害される(または減少する)結果として調節される。IkBがリン酸化されないと、NF-kBは核内に移行することができず、従ってNF-kBはIL-12p40およびTNF-αのような炎症誘発性サイトカインのmRNA発現を誘導することができない。アデノシン受容体A2aによって媒介されるシグナル伝達の阻害による転写因子NF-kBの核移行の増進は、IKKによるIkBリン酸化のcAMPによって誘導される阻害の抑制により説明される。
図11に要約されているように、活性なアデノシン受容体、例えばA2aが存在すると、IKKによって媒介されるIkBのリン酸化、およびNF-kBの核移行が遮断され、これにより炎症誘発性サイトカインのmRNA発現が阻害されるかまたは減少することによって炎症が減少するかまたは阻害される。
実施例9
アデノシン受容体アンタゴニストによる腫瘍増殖の減少
存在するアデノシンを低下させることにより、腫瘍の自己防衛機構を無効化することが可能かどうか決定するため、以下の方法を用いた。腫瘍は低酸素状態にあり、かつ低酸素状態は、脳、心臓中の、および固形腫瘍中のアデノシンの蓄積を促すので、アデノシンは、抗腫瘍免疫細胞(例えばTキラー細胞)が腫瘍と接触することを阻害するかまたは抑制し、従って、腫瘍が抗腫瘍細胞による影響を受けることを抑制している可能性がある。例えば、アデノシンが存在すると、CTLのケモカイン受容体のシグナル伝達を阻害するかもしくは減少させる(これにより腫瘍に対する親和性の減少および/または走化性の減少もしくは阻害が引き起こされる可能性がある); CTLの運動性を阻害するかもしくは減少させる; CTLによる炎症誘発性サイトカインの産生を阻害するかもしくは減少させる; CTL/腫瘍複合体の形成を阻害するかもしくは減少させる; FasL/顆粒の開口分泌を阻害するかもしくは減少させる; および/またはCTLによる致死性の攻撃を阻害するかもしくは減少させる可能性がある。結果として、アデノシンが遮断されるかまたは減少されれば、抗腫瘍細胞は、腫瘍を減少させる際にさらに効果的となる可能性がある。
第0日に、BALB/cマウスにCMS4腫瘍細胞(メチルコラントレン誘発性肉腫、2.5×105細胞)を静脈内接種して、肺腫瘍の形成を誘発させた。10日後、抗原特異的Tキラー細胞(CTL細胞)(5×105または1×106細胞)をマウスに、ZM241385(10 mg/kg/日)の腹腔内注射有りまたは無しで静脈内注射した、またはCTL細胞表面の受容体A2を不活化させるため、比較的非選択性のA2aおよびA2b受容体アンタゴニストの1,3,7-トリメチルキサンチン(カフェイン, 0.1(%)w/v)を飲水により投与したが、これは、腫瘍が、これらの受容体を介してTキラー細胞にシグナルを伝達し、それによりTキラー細胞が腫瘍細胞に致死性の「攻撃」を加えることを阻止するためである。その後、第17日、第18日、および第24日にマウスを屠殺し、その肺を目視検査によって転移巣の数と大きさについて評価することで、肺腫瘍について調べた。
図12A〜12Cに示されるように、アデノシン受容体アンタゴニスト、例えばZM241385またはカフェインを投与すると、肺中の転移結節数の減少からも明らかなように、癌腫瘍の免疫療法が大幅に向上する。対照的に、CTL細胞単独では、同様の効率的で腫瘍転移を減少させることができなかった。
免疫原性がない腫瘍、例えば、乳房腫瘍で同じような結果が得られることを証明するため、以下の方法を用いた。第0日に、BALB/cマウスに、免疫原性がない4T1乳房腫瘍細胞(アメリカンタイプカルチャーコレクション, Manassas, VA, カタログ番号CRL-2539) 1×105個を皮下接種して、乳房腫瘍の形成を誘発させた。4T1細胞は、BALB/cマウスに注入されると、その原発腫瘍がその元の位置で増殖している間に、肺、肝臓、リンパ節、および脳に転移できる高転移性腫瘍を自発的に生み出す。腫瘍接種から7日後、マウスにZM241385(10 mg/kg)またはカフェイン(20 mg/kg)を毎日、腹腔内注射した。その後、腫瘍の直径および腫瘍の容積の時間依存的な変化を算出した。
図13に示されるように、アデノシン受容体アンタゴニストは、免疫原性がない4T1乳房腫瘍細胞の皮下増殖を減速させることから、腫瘍を有する被検体にアデノシン受容体アンタゴニストを投与することで、被検体の1つまたは複数の腫瘍の数および/または大きさを減少させることができることが示唆される。これらの結果からまた、アデノシン受容体アンタゴニストは、血管形成を阻害することにより、腫瘍増殖を低下させることが示唆される。
実施例10
アデノシン受容体アンタゴニストによる、腫瘍の大きさの減少
本実施例は、抗腫瘍ワクチン接種を向上させるのに利用した、アデノシン受容体アンタゴニストを同時投与する方法について説明するものである。
第0日に、BALB/cマウス(免疫不全ヌードマウス; または免疫応答性C57BL/6マウス)に、B16黒色腫細胞(アメリカンタイプカルチャーコレクション, Manassas, VA)、またはB16-H2-Kdを形質導入した腫瘍細胞(細胞の免疫原性を高める)を皮下接種して、黒色腫形成を誘発させた。アデノシン受容体アンタゴニストによる処置は、腫瘍細胞の注入から28日後(その時点では、腫瘍は直径7〜9 mmに達していた)に開始した。
図14に示されるように、毎日、ZM241385(0.2 mg/マウス)およびカフェイン(0.4 mg/マウス)を用いて腹腔内処置すると、腫瘍(増殖)遅延を引き起こし、これは処置から3〜7日後に顕著になった。腫瘍増殖の遅延は、免疫応答性C57BL/6マウスで大きく、免疫不全ヌードマウスではそれより小さかった。しかし、腫瘍が大きさを増すにつれ、アンタゴニストはどちらも、免疫不全動物においてさえ腫瘍増殖を減速させた。このことから、腫瘍を有する被検体にアデノシン受容体アンタゴニストを投与することで、被検体の1つまたは複数の腫瘍の数および/または大きさを減少させることができることが示唆される。さらに、アデノシン受容体アンタゴニストは、抗腫瘍免疫と血管形成の抑制または減少のどちらも向上させると思われる。
実施例11
アデノシン受容体アンタゴニストによる、皮下および腹腔内ワクチン接種に対する免疫応答の改善
本実施例は、アデノシン受容体アンタゴニスト、例えばA2aおよびA3アンタゴニストを同時投与することによりワクチンに対する免疫応答を高めることができるかどうか、およびワクチンが異なる輸送経路により輸送される場合効果は変化するのかどうかを決定するために利用した方法について説明するものである。
モデル抗原のTNP-KLH(100 μg, Sigma社)をアデノシン受容体アンタゴニスト(約1 mg/kgのテオフィリン(A2aアンタゴニスト)、ZM241385(A2aアンタゴニスト)、またはMRS1220(A3アンタゴニスト、Sigma社))と共に腹腔内注射するかまたはA2aR+/+マウスの足蹠内に皮下注射した。注射のための抗原は以下のように調製した。DNP-KLH(1.0 mg/ml, Biosearch Technologies社 カタログ番号T-5060-5)は、PBS中で調製した(例えば、精製DNP-KLH 4.0 mgをPBSに溶解させ、次いで体積を4.0 mlまで上昇させた)。完全フロイントアジュバント(2.0 ml, CFA; Sigma F-5881)を4℃でTNP-KLH溶液2.0 mlとボルテックスにかけて混合した。CFA/KLH混合物を19ゲージの注射針を付けた3 mlのガラスシリンジ内に引き込んだ。このシリンジを両口ロッキング・ハブ・コネクタ(double-ended locking hub connector)またはプラスチック製の三方活栓に取り付けた。空の2mlのガラスシリンジを他端に取り付け、混合物を一端から他端へ押し出して繰り返し往復させた。混合物が白色かつ均質となったら、コネクタまたは活栓を取り外し、25ゲージの注射針を取り付け、乳濁液を100 mlビーカーに入れた冷水50 mlの液面に一滴入れることによって検査した。液滴は、凝集するはずであるが; もしそうでなければ、混合を繰り返した。各マウスに200 μl(100 μg)を腹腔内注射した。
TNP-KLHおよびテオフィリン注射から7日、14日、および21日後に、血液試料を眼窩後採血により得た。抗TNP特異的IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3、およびIgM抗体の血清濃度を、ELISAキット(Sigma社)を用い、製造元の指示に従って測定した。
抗TNP特異的IgG1抗体の血清濃度は7日の時点で、対照に比べて、TNP-KLHおよびZM241385またはMRS1220を同時に注射したマウスでは顕著に増加していた。IgG2も第7日で増加していた。従って、アデノシン受容体アンタゴニストをワクチンと共に投与すると、アデノシン受容体アンタゴニストによって内在性の抗炎症経路が遮断されることで、ワクチン接種に対する免疫応答が高まる(抗原特異的な免疫グロブリンIgG1の高力価から明らかなように)。
同様に、抗TNP特異的IgG1抗体の血清濃度は7日の時点で、対照に比べて、TNP-KLHおよびテオフィリンを腹腔内(図15)にまたは皮下に同時注射したマウスでは顕著に増加していた。従って、ワクチン接種が腹腔内または皮下である場合、アデノシン受容体アンタゴニストをワクチンと共に同時投与することで、ワクチンに対する免疫応答が増強される。アンタゴニストを用いて、アデノシン受容体、例えばA2aおよびA3を薬理学的に不活性化させると、高力価の抗原特異的な免疫グロブリンIgG1が生じるが、このようなアンタゴニストはワクチンと共に投与する。
実施例12
抗癌剤併用した、アデノシン受容体アンタゴニストの投与
本実施例は、被検体の癌の治療を助長するのに利用できる、1つまたは複数のアデノシン受容体アンタゴニストを、単独で、または抗癌剤と組み合わせて用いる方法について説明するものである。この手順は、このような治療法の実例として役立つものであって、限定するものではない。当業者であれば、この手順を被検体の要求に合わせるように、かつ使用する物質に対して最適化されるように変更することができる。被検体は、それ以前に化学療法、放射線療法、または遺伝子治療法を受けていてもよいが、その必要はない。好ましくは、患者は、十分な骨髄機能(末梢顆粒球の絶対数が2,000個/mm3を越えかつ末梢血小板の絶対数が100,000個/mm3と定義される)を示す。
アデノシン受容体アンタゴニストは、必要に応じて、標準的な、周知の無毒性の生理学的に許容される担体、アジュバント、および媒介物を含有する、用量単位の剤形で経口的にまたは非経口的に投与される。本明細書において、非経口という用語には、皮下注射、静脈内注射、筋肉内注射、動脈内注射、または注入技術が含まれる。アデノシン受容体アンタゴニストは、使用するアンタゴニストに応じて、約0.1 mg/kg〜約1 g/kgの用量で投与することができる。例えば、アデノシン受容体アンタゴニストは、少なくとも0.5 mg/kg体重、例えば3〜10 mg/kgの用量で被検体に投与することができる。アデノシン受容体アンタゴニストは、他の抗癌剤の前、抗癌剤の後、または抗癌剤と同時に、患者に送達することができる。
通常の治療単位には、7〜21日間に渡って送達される約6回の服用が含まれる。または、治療単位には、7〜21日間に渡って送達される毎日の服用が含まれる。臨床医による選択に応じて、投薬計画を3週間毎に6回の服用でまたはより高い頻度(1日1回、1日2回、1日4回など)もしくはより低い頻度(月1回、2ヶ月に1回、3ヶ月に1回など)の基準で継続することができる。勿論、これらは単に治療の例示的な回数に過ぎず、当業者であれば、多くの他の回数の治療単位が可能であることを容易に認識するものと思われる。アデノシン受容体アンタゴニストを、多くの従来の化学療法計画のいずれかと組み合わせることができる。
アデノシン受容体アンタゴニストの局所送達は、臨床疾患に対抗するための治療的有効量を送達するのに効果的な方法である。同様に、化学療法薬を特定の病変部位に向けることができる。あるいは、どちらか一方のまたは両方の薬剤を全身送達するのが適当である可能性がある。
臨床的な効果は、許容可能な測定法により規定することができる。例えば、完全寛解は、少なくとも1ヶ月間、測定可能な全疾患の消失により規定することができる。部分寛解は、20%またはそれ以上の、例えば50%またはそれ以上の、例えば75%またはそれ以上の、評価可能な全腫瘍結節の角化物直径の合計の減少または少なくとも1ヶ月、増大を示す腫瘍部位がないことにより規定することができる。同様に、混合型の寛解は、1部位または複数部位の悪化を伴いつつ、測定可能な全病巣の角化物直径が20%またはそれ以上、例えば50%またはそれ以上まで減少していることにより規定することができる。
勿論、上述の治療計画は、本明細書に開示されている情報を入手して治療計画を最適化することができると思われる当業者により変更され得る。
実施例13
アデノシン受容体アンタゴニストのアジュバントとしての利用
本実施例は、被検体にアデノシン受容体アンタゴニストをワクチンと組み合わせて投与することにより、1つまたは複数のアデノシン受容体アンタゴニストをアジュバントとして利用するための方法について説明するものである。この手順は、このような方法の実例として役立てることを意図するものであって、限定するものではない。当業者であれば、この手順を被検体の要求に合わせるように、および使用する特定のアンタゴニストおよびワクチンに対して最適化されるように変更することができるであろう。
アデノシン受容体アンタゴニストは、必要に応じて、標準的な、周知の無毒性の生理学的に許容される担体、アジュバント、および媒介物を含有する、用量単位の剤形で経口的、局所的、または非経口的に投与される。アデノシン受容体アンタゴニストは、使用するアンタゴニストに応じて、約0.1 mg/kg〜約1 g/kgの用量で投与することができる。アデノシン受容体アンタゴニストは、ワクチンの前、ワクチンの後、またはワクチンと同時に患者に送達することができる。
ワクチン接種の通常治療単位には単回投与が含まれる。選択的に、この治療単位を12週間毎にまたはより高い頻度(月1回、週1回など)もしくはより低い頻度(年2回、年1回、3年毎、10年毎など)の基準で繰り返すことができる。勿論、これらは単にワクチン接種の例示的な回数に過ぎず、当業者であれば、多くの他の回数の治療単位が可能であることを容易に認識するものと思われる。アデノシン受容体アンタゴニストを、多くの従来のワクチン接種のいずれかと組み合わせることができる。
臨床的な効果は許容可能な測定法により規定することができる。例えば、TNF-α、IFN-γ、IL-4、IL-6、IL-1β、およびIL-12p40の血中濃度または血清試料中濃度を、市販されているELISAキットを用い、製造元の指示に従って決定することができる。あるいは、血中または血清試料中の抗ワクチン抗体を、ELISAキットを用いて測定することができる。
勿論、上述の治療計画は、当業者により変更され得る。本発明者らの開示の原理を適用できる多くの可能な態様をかんがみ、例示した態様は単なる開示の実例に過ぎないと認識されるべきであって、本開示範囲の限定と解釈されるべきではない。むしろ、開示範囲は、以下の特許請求の範囲により定義される。従って、本発明者らはこれらの特許請求の範囲および精神のなかに入るもの全てを本発明者らの発明として主張する。
（図１Ａ）薬理学的に活性化されたcAMP上昇性受容体またはcAMPの増加は、インビボにおいて炎症を遮断できることを示す棒グラフである。処置マウスと未処置マウスとの間の相違は、星印により示されるように(＊P<0.05)、統計学的に有意である。
（図１Ｂ）薬理学的に活性化されたcAMP上昇性受容体A2aは、インビボにおいて炎症を遮断できることを示す棒グラフである。処置マウスと未処置マウスとの間の相違は、星印により示されるように(＊P<0.05)、統計学的に有意である。
（図２Ａおよび図２Ｂ）CGS21680のみ、またはCGS21680およびZM241385を用いて処理した(A)野生型(A2aR+/+)マウスまたは(B)A2aR欠損(A2aR-/-)マウス由来のリンパ系細胞のcAMP濃度を示す棒グラフである。
（図２Ｃおよび図２Ｄ）FK、イソプロテレノール、またはPGE2で処理した(C)野生型(A2aR+/+)または(D)A2aR欠損(A2aR-/-)のリンパ系細胞のcAMP濃度を示す棒グラフである。処置マウスと未処置マウスとの間の相違は、星印により示されるように(＊P<0.05)、統計学的に有意である。
（図３Ａおよび図３Ｂ）各時点でのA2aR+/+およびA2aR-/-マウスにおける(A)ALTまたは(B)TNF-αの血清濃度を示すドットプロットである。
（図４Ａ）異なる組合せの炎症刺激物質、コンカナバリンA(Con-A)および受容体A2アンタゴニストZM241385を用いて処置したマウスの血清ATL濃度を示す棒グラフである。＊A2aR+/+マウスに対してP<0.05。
（図４Ｂおよび図４Ｃ）(B) 緑膿菌(Pseudomonas)外毒素Aまたは(C) 四塩化炭素を注射したマウスの血清ATL濃度を示す散布図である。
（図５）受容体A2aは敗血性ショックによる死を防ぐことを示す生存グラフである。＊P<0.05。
（図６Ａ〜図６Ｄ）外毒素ショックにさらした、A2aR+/+野生型マウスと比較したA2aR-/-マウスの表示サイトカインの血清濃度を示す散布図である。＊P<0.05。
（図７）受容体A2aが不活性化されたマウスにおいて、炎症性刺激物質で処置後、炎症の増加を(炎症誘発性サイトカインmRNA発現により)証明するリボヌクレアーゼ・プロテクションアッセイ(RPA)の結果を示すデジタル画像である。
（図８Ａおよび図８Ｂ）受容体A2aが薬理学的に不活性化されたマウスにおいて、炎症性刺激物質で処置後、炎症の増加を(炎症誘発性サイトカインmRNA発現により)証明するリボヌクレアーゼ・プロテクションアッセイ(RPA)の結果を示すデジタル画像である。
（図９）受容体A2aは核内へのNF-kBの移行を負に調節することにより、インビボにおいて、NF-kBの活性を負に調節することを証明する、マクロファージの核抽出物の電気泳動移動度シフトアッセイの結果を示すデジタル画像である。
（図１０Ａおよび図１０Ｂ）アデノシン受容体は、IKKキナーゼによるIκ-Bのリン酸化を阻害することによりNF-kBの移行を負に調節することを示すウエスタンブロット法のデジタル画像である。
（図１１）免疫細胞活性化後の細胞内事象ならびにアデノシン受容体A2aおよびcAMPによって媒介されるNF-kB活性の阻害を示す概略図である。
（図１２Ａ〜図１２Ｃ）アデノシン受容体アンタゴニストは、転移結節の数を減少させることによって癌腫瘍の免疫療法を向上させることを示すドットプロットである。
（図１３および図１４）アデノシン受容体アンタゴニストは、腫瘍の大きさ/容積を減少させることによって癌治療を向上させることを示すグラフである。
（図１５）TNP-KLHのみ(CFA)またはアデノシン受容体アンタゴニストテオフィリン(CFA＋アンタゴニスト)を皮下注射したマウスのIgG1濃度を示す散布図であり、免疫混合物中のテオフィリンによる抗体産生の向上を証明している。
（図１６）内在性の抗炎症過程を阻害するかまたは減少させることによって炎症応答を増強するおよび/または延長させるのに使用できる方法の概略である。

Claims (54)

  1. アデノシン受容体阻害剤および/または細胞外アデノシン阻害剤の治療的有効量を被検体に投与し、それにより免疫応答を増強する段階を含む、被検体の免疫応答を増強するための方法。
  2. 免疫応答を増強する段階に、被検体において免疫細胞の活性を増加させる段階が含まれる、請求項1記載の方法。
  3. 被検体が新生物を有し、免疫応答を増強する段階がその被検体において新生物細胞の容積の減少および/または新生物細胞の数の減少をもたらす、請求項1記載の方法。
  4. アデノシン受容体阻害剤がアデノシン受容体アンタゴニストである、請求項1記載の方法。
  5. アデノシン受容体アンタゴニストが、アデノシン受容体A2a、A2b、またはA3アンタゴニストである、請求項4記載の方法。
  6. アデノシン受容体アンタゴニストが、ZM241385、MRS1220、1,7,メチルキサンチン(カフェイン)、テオフィリン、テオブロミン、SCH5826、KW-6002、またはADA-PEGである、請求項4記載の方法。
  7. アデノシン受容体アンタゴニストが、リボザイム、アンチセンス・オリゴヌクレオチド、またはアデノシン受容体をコードするmRNAに選択的に結合する触媒性核酸である、請求項4記載の方法。
  8. 細胞外アデノシン阻害剤が、内在性アデノシンキナーゼの活性を増加させる薬剤または内在性アデノシンデアミナーゼの活性を増加させる薬剤であり、これにより細胞外アデノシンを減少させ、細胞外アデノシンを減少させることで被検体における免疫応答を増強する、請求項1記載の方法。
  9. 細胞外アデノシン阻害剤が、酸化剤、酸化還元電位変化剤、アデノシン蓄積減少剤、アデノシンデアミナーゼ、アデノシンキナーゼ、またはアデノシンキナーゼ・エンハンサーである、請求項1記載の方法。
  10. 免疫細胞が1つまたは複数の炎症誘発性サイトカインを産生する細胞である、請求項2記載の方法。
  11. 免疫細胞が、マクロファージ、顆粒球、単球、好中球、樹状細胞、T細胞、B細胞、またはナチュラルキラー細胞である、請求項2記載の方法。
  12. 免疫細胞がB細胞である方法であって、その活性が抗体産生である、請求項11記載の方法。
  13. 免疫細胞がT細胞であり、その活性が腫瘍浸潤リンパ球(TIL)の効果の増加である、請求項11記載の方法。
  14. 免疫細胞が、マクロファージ、顆粒球、単球、または樹状細胞である方法であって、その活性が炎症誘発性サイトカインの産生である、請求項11記載の方法。
  15. 炎症関連性局部組織の低酸素状態、および/または炎症性局部組織環境における分子の酸化還元状態を減少させる薬剤を被検体に投与する段階をさらに含む、請求項1記載の方法。
  16. 免疫細胞の活性が炎症の増加をもたらす、請求項2記載の方法。
  17. 免疫応答が、マクロファージの、単球の、好中球の、顆粒球の、樹状細胞の、T細胞の、B細胞の、またはナチュラルキラー細胞の応答である、請求項1記載の方法。
  18. 免疫応答が炎症誘発性サイトカインの応答である、請求項1記載の方法。
  19. 炎症誘発性サイトカインの応答がIL-12p40および/またはTNF-α mRNAの発現の増加である、請求項18記載の方法。
  20. 被検体にワクチンを投与する段階をさらに含む方法であって、アデノシン受容体を阻害する段階および/または細胞外アデノシンを阻害する段階がワクチンにより刺激される免疫応答を増強する、請求項1記載の方法。
  21. ワクチンが抗原性ポリペプチドまたはその抗原性エピトープを含む、請求項20記載の方法。
  22. ワクチンがウイルス性ワクチンである、請求項20記載の方法。
  23. ウイルス性ワクチンが、生ワクチン、弱毒化ワクチン、または加熱死菌ワクチンである、請求項22記載の方法。
  24. ワクチンがTキラー細胞を含む、請求項20記載の方法。
  25. Tキラー細胞が被検体においてウイルス感染細胞の量を減少させることができる、請求項22記載の方法。
  26. 被検体が、ウイルス、細菌、または真菌を含む病原体に感染している、請求項1記載の方法。
  27. 被検体が免疫無防備状態である、請求項1記載の方法。
  28. 被検体が免疫不全ウイルスに感染している、請求項27記載の方法。
  29. 免疫不全ウイルスがHIV-1またはHIV-2である、請求項28記載の方法。
  30. 被検体が免疫抑制療法を受けている、請求項27記載の方法。
  31. 新生物が直径が2 mmより大きな腫瘍であり、かつその腫瘍が局部低酸素領域を有する、請求項2記載の方法。
  32. 新生物が、肺の、乳房の、皮膚の、または肝臓の腫瘍である、請求項31記載の方法。
  33. 抗新生物薬の治療的有効量を被検体に投与する段階をさらに含む、請求項3記載の方法。
  34. 抗新生物薬が新生物細胞を選択的に標的とする、請求項33記載の方法。
  35. 抗新生物薬が細胞死を促進するタンパク質をコードする核酸である、請求項34記載の方法。
  36. 抗新生物薬が、アルキル化剤、葉酸アンタゴニスト、プリンアンタゴニスト、ピリミジンアンタゴニスト、紡錘体毒、ポドフィロトキシン、抗生物質、ニトロソ尿素、無機イオン、生物応答修飾物質、酵素、またはホルモンである、請求項36記載の方法。
  37. 新生物の損傷を増加させるため、被検体にまず放射線または放射性同位体を投与する、請求項3記載の方法。
  38. 細胞傷害性Tリンパ球(CTL)またはリンホカイン活性化キラー(LAK)細胞を被検体に投与する段階をさらに含む、請求項1記載の方法。
  39. 以下の段階を含む、アデノシン受容体アンタゴニストをスクリーニングするための方法:
    免疫細胞を薬剤と接触させる段階; および
    薬剤なしの対照と比較した、免疫細胞の増加した活性についてアッセイする段階であって、免疫細胞の増加した活性が、薬剤がアデノシン受容体アンタゴニストであることを示す段階。
  40. 免疫細胞が1つまたは複数の炎症誘発性サイトカインを産生する細胞である、請求項39記載の方法。
  41. 免疫細胞が、マクロファージ、顆粒球、単球、好中球、樹状細胞、T細胞、B細胞、またはナチュラルキラー細胞である、請求項39記載の方法。
  42. 増加した活性には増加した環状AMP、増加したサイトカイン、増加したアポトーシス細胞死、および/または形態学的変化が含まれる、請求項39記載の方法。
  43. アデノシン受容体A2aの数を減少させる培養条件下で免疫細胞をインキュベートする段階を含む、腫瘍の防御に抵抗性の免疫細胞または抗ウイルス性の免疫細胞を調製する方法であって、
    培養条件には、アデノシン受容体アンタゴニストまたはアデノシンデアミナーゼ活性阻害剤とのインキュベーションにより、その培養条件におけるアデノシンの量を増加させることが含まれる方法。
  44. 免疫細胞はCTLまたはLAK細胞である、請求項43記載の方法。
  45. 請求項43記載の方法を用いて作製された腫瘍の防御に抵抗性の免疫細胞を被検体に投与し、これにより被検体において腫瘍の容積を減少させる段階および/または腫瘍細胞の数を減少させる段階を含む、被検体において腫瘍の容積を減少させるおよび/または腫瘍細胞の数を減少させる方法。
  46. 請求項43記載の方法を用いて作製された抗ウイルス性免疫細胞を被検体に投与し、これにより被検体におけるウイルスに対する免疫応答を増強する段階を含む、被検体においてウイルスに対する免疫応答を増強する方法。
  47. 被検体にアデノシン受容体阻害剤、および/または細胞外アデノシン阻害剤の治療的有効量を投与し、これにより腫瘍の血液供給を遮断する段階を含む、被検体において腫瘍の血液供給を遮断するための方法。
  48. 腫瘍の血液供給の遮断が被検体において腫瘍の容積の減少および/または腫瘍細胞の数の減少をもたらす、請求項47記載の方法。
  49. 被検体にアデノシン受容体阻害剤、および/または細胞外アデノシン阻害剤の治療的有効量を投与し、これにより被検体におけるNF-kB活性を増強する段階を含む、被検体においてNF-kB活性を増強する方法。
  50. 低酸素状態を減少させる薬剤の治療的有効量を被検体に投与し、これにより免疫応答を増強させる段階を含む、被検体において免疫応答を増強させるための方法。
  51. 低酸素状態を減少させる薬剤が酸化剤であり、かつ免疫応答が被検体において腫瘍の容積を減少させるか、または被検体におけるウイルスに対する免疫応答を増強する、請求項50記載の方法。
  52. 免疫細胞をアデノシン受容体アンタゴニストと接触させる段階を含む、免疫細胞におけるIL-12p40の発現を増加させるための方法。
  53. 免疫細胞を配列番号:1と接触させる段階をさらに含む、請求項52記載の方法。
  54. 配列番号:1と共にアデノシン受容体アンタゴニストを同時投与する段階を含む、配列番号:1の1つまたは複数の免疫増強特性を増加させるための方法。
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