CN116670269A - 工程化微生物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及工程化微生物，其中所述工程化微生物包含治疗性分子和修饰的pks岛。

Description

工程化微生物
背景技术
环调节蛋白(Cyclomodulins)是能够干扰真核细胞周期的微生物毒素。Fais2018。大肠杆菌素(Colibactin)是一种环调节蛋白，其通过pks基因组岛编码的酶合成。同上。pks基因组岛在肠杆菌科(Enterobacteriaceae)中是“高度保守的”。同上。在大肠杆菌(Escherichia coli)中，54千碱基的pks基因组岛含有19种基因，即clbA到clbS，并编码各种酶，所述酶已被描述为“负责大肠杆菌素合成的组装线”。同上。用于大肠杆菌素合成的pks基因组岛组装线包括三种聚酮合酶(ClbC、ClbI、ClbO)、三种非核糖体肽合酶(ClbH、ClbJ、ClbN)、两种杂合的非核糖体肽/聚酮合酶(ClbB、ClbK)，以及九种辅助、裁剪和编辑蛋白。聚酮合酶、非核糖体肽合酶和杂合酶“通常以大型复合体(mega-complexes)的形式组织成一条组装线，其中合成化合物从一个酶促模块转移至下一个酶促模块。”同上。大肠杆菌素经历前药激活机制，所述机制掺入N末端结构基序，其在生物合成的最终阶段被去除。
pks基因组岛存在于各种微生物中，诸如肠杆菌科成员，例如埃希氏菌属(Escherichia)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、肠杆菌属(Enterobacter)和柠檬酸杆菌属(Citrobacter)。同上。含有pks基因组岛的诸如大肠杆菌的微生物已在肠道微生物群中被鉴定为共生细菌并且处于疾病状态。同上。已有报道称，诸如大肠杆菌的产生大肠杆菌素的微生物在结直肠癌中数量过多。同上。产生大肠杆菌素的微生物能够诱导染色体不稳定、细胞周期停滞、DNA损伤、上皮细胞衰老和/或免疫细胞凋亡。同上。然而，另外已有报道称，产生大肠杆菌素的微生物表现出抗炎、抗生素和止痛作用。同上。在一些模型中，功能性pks基因组岛对于益生菌微生物诸如大肠杆菌Nissle(一种以其无害性和GRAS(通常被认为是安全的)状态为特征的菌株)发挥抗炎作用非常重要。同上，Schultz 2008，Reister 2014。在产生大肠杆菌素的微生物中，大肠杆菌素的产生可有助于促进细菌的生长和维持。
微生物，包括工程化微生物，可具有治疗用途。早在1917年，例如，大肠杆菌Nissle就被包装成药用胶囊(称为Mutaflor)，以用于治疗肠道病状。Ukena 2007。这些微生物可能受到大肠杆菌素的“多重效应”(包括潜在有益和潜在有害效应)的影响。Rais 2018。因此，对有效微生物(包括工程化微生物)存在显著未满足的需要，在所述微生物中，大肠杆菌素的一种或多种潜在有害效应被降低，同时微生物的一种或多种潜在有益效应得以保持。
发明内容
本公开提供了一种包含修饰的pks岛的工程化微生物(例如工程化细菌)，以及其组合物和制剂。在一些实施方案中，本公开提供了用于治疗患有疾病或病症的受试者的方法，其通过施用包含修饰的pks岛的工程化微生物(例如工程化细菌)来实现，以及所述工程化微生物的组合物和制剂。在一些实施方案中，包含修饰的pks岛的工程化微生物(例如工程化细菌)还包含一种或多种用于产生治疗性分子的基因。在一些实施方案中，治疗性分子能够减少受试者体内的一种或多种有害分子，例如有害苯丙氨酸、有害氨、有害草酸盐、有害甲硫氨酸或有害亮氨酸。在一些实施方案中，包含修饰的pks岛的工程化微生物(例如工程化细菌)还包含一种或多种用于产生苯丙氨酸代谢酶(PME)的基因；或包含一种或多种用于产生草酸分解代谢酶的基因；或包含一种或多种编码修饰的精氨酸生物合成途径(例如缺失的精氨酸阻遏物、修饰的精氨酸阻遏物结合位点和/或精氨酸反馈抗性N-乙酰谷氨酸合酶突变)的基因；或包含一种或多种用于产生抗癌分子(例如脱腺苷酸环化酶基因或能够产生干扰素基因刺激物激动剂的酶)的基因；或包含草酸代谢酶，例如乙酰辅酶A:草酸辅酶A转移酶。在一些实施方案中，包含修饰的pks岛的微生物能够减轻受试者的高苯丙氨酸血症和/或治疗与高苯丙氨酸血症相关的疾病或病症，例如苯丙酮尿症(PKU)；或能够减少受试者体内的草酸盐和/或治疗与高草酸尿症(HOX)相关的疾病或病症；或能够减少受试者体内的过量氨和/或治疗与高氨血症相关的疾病或病症，例如尿素循环障碍(UCD)；或能够产生抗癌分子，例如脱腺苷酸环化酶或能够产生干扰素基因刺激物(STING)激动剂的酶，和/或治疗癌症。
在一些实施方案中，包含修饰的pks岛的工程化微生物(例如工程化细菌)还包含一种或多种用于产生苯丙氨酸代谢酶(PME)的基因；或包含一种或多种用于产生甲硫氨酸分解代谢酶(例如甲硫氨酸γ裂解酶(MGL)或甲硫氨酸脱羧酶(MDC))的基因；或包含一种或多种用于产生草酸代谢酶(例如scaaE3、frc和oxdC)的基因；或包含一种或多种用于产生尿酸分解代谢酶的基因；或包含一种或多种用于产生亮氨酸分解代谢酶(例如脱羧酶)的基因；或包含一种或多种用于产生用于产生乳酸盐的酶的基因。在一些实施方案中，包含修饰的pks岛的微生物能够降低受试者的甲硫氨酸水平和或能够治疗与氨基酸代谢相关的疾病，诸如同型半胱氨酸尿症、癌症和代谢综合征/疾病；或能够降低受试者的尿酸水平和/或能够治疗与尿酸相关的疾病，诸如高尿酸血症或痛风；或能够降低受试者的亮氨酸水平和/或能够治疗受试者的与支链氨基酸的异常分解代谢相关的代谢病症，诸如异戊酸血症、丙酸血症、甲基丙二酸血症、槭糖尿病(MSUD)和糖尿病酮症酸中毒以及其他病症；或能够提高受试者的水平和/或能够治疗与肠道炎症相关的疾病，包括但不限于溃疡性结肠炎和克罗恩病(Crohn’sdisease)。
在一些实施方案中，包含修饰的pks岛的工程化微生物(例如工程化细菌)还包含一种或多种用于产生甲硫氨酸分解代谢酶(例如甲硫氨酸γ裂解酶(MGL)或甲硫氨酸脱羧酶(MDC))的基因和一种或多种用于产生甲硫氨酸转运蛋白(例如metP)的基因。在一些实施方案中，包含修饰的pks岛的工程化微生物(例如工程化细菌)还包含一种或多种用于产生草酸代谢酶(例如scaaE3、frc和oxdC)的基因和用于产生草酸盐转运蛋白(例如oxlT)的基因。
在一些实施方案中，与包含天然或未修饰的pks岛的对照微生物相比，包含修饰的pks岛的工程化微生物(例如工程化细菌)产生较少的大肠杆菌素。在一些实施方案中，与包含天然或未修饰的pks岛的对照微生物相比，工程化微生物(例如工程化细菌)具有较小的遗传毒性。本文还提供了检测一种或多种大肠杆菌素前体和一种或多种代谢物的方法。在一些实施方案中，大肠杆菌素前体或代谢物的测量结果代表了大肠杆菌素的水平。在一些实施方案中，所述方法检测N-肉豆蔻酰-D-天冬酰胺。
在一些实施方案中，例如与微生物的一种或多种天然clb基因相比，工程化微生物(例如工程化细菌)在pks岛中的一种或多种clb基因中包含修饰，例如部分或完全缺失。在一些实施方案中，例如与微生物的一种或多种天然clb基因和一个或多个可操作地连接的启动子相比，工程化微生物(例如工程化细菌)在clbA、clbB、clbC、clbD、clbE、clbF、clbG、clbH、clbI、clbJ、clbK、clbL、clbM、clbN、clbO、clbP、clbQ、clbR和clbS或一个或多个其可操作地连接的启动子中的一个或多个中包含修饰，例如部分或完全缺失。在一些实施方案中，例如与微生物的一种或多种天然clb基因和一个或多个可操作地连接的启动子相比，工程化微生物(例如工程化细菌)在clbA、clbB、clbC、clbD、clbE、clbF、clbG、clbH、clbI、clbJ、clbK、clbL、clbM、clbN、clbO、clbP、clbQ和clbR或一个或多个其可操作地连接的启动子中的一个或多个中包含修饰，例如部分或完全缺失。在一些实施方案中，例如与微生物的一种或多种天然clb基因和一个或多个可操作地连接的启动子相比，工程化微生物(例如工程化细菌)在clbA、clbB、clbC、clbD、clbE、clbF、clbG、clbH、clbI、clbJ、clbK、clbL、clbM、clbN、clbO、clbP、clbQ和clbR或一个或多个其可操作地连接的启动子中的每一个中包含修饰，例如部分或完全缺失。在一些实施方案中，与包含一种或多种天然clb基因和一个或多个可操作地连接的启动子的微生物相比，工程化微生物(例如工程化细菌)在clbA、clbB、clbC、clbD、clbE、clbF、clbG、clbH、clbI、clbJ、clbK、clbL、clbM、clbN、clbO、clbP、clbQ和clbR以及一个或多个其可操作地连接的启动子中的每一个中包含部分缺失，并且产生较少的大肠杆菌素。在一些实施方案中，与包含一种或多种天然clb基因和一个或多个可操作地连接的启动子的微生物相比，工程化微生物(例如遗传工程化细菌)在clbA、clbB、clbC、clbD、clbE、clbF、clbG、clbH、clbI、clbJ、clbK、clbL、clbM、clbN、clbO、clbP、clbQ和clbR以及一个或多个其可操作地连接的启动子中的每一个中包含完全缺失，并且产生较少的大肠杆菌素。在一些实施方案中，微生物保留天然或未修饰的clbS基因，任选地具有可操作地连接的启动子的部分或完全缺失。
在另一方面，本公开提供了一种药物组合物，其包含如本文所提供的工程化微生物。
在另一方面，本公开提供了一种减少有害分子的方法，其包括向有需要的受试者施用如本文所提供的药物组合物。
在另一方面，本公开提供了一种减少有害分子的方法，其包括向有需要的受试者施用如本文所提供的药物组合物。
在另一方面，本公开提供了一种减少草酸盐的方法，其包括向有需要的受试者施用如本文所提供的药物组合物，其中治疗性分子是草酸代谢酶。
在另一方面，本公开提供了一种治疗HOX的方法，其包括向有需要的受试者施用如本文所提供的药物组合物，其中治疗性分子是草酸代谢酶。
在另一方面，本公开提供了一种减少苯丙氨酸的方法，其包括向有需要的受试者施用如本文所提供的药物组合物，其中治疗性分子是苯丙氨酸代谢酶。
在另一方面，本公开提供了一种治疗高苯丙氨酸血症的方法，其包括向有需要的受试者施用如本文所提供的药物组合物，其中治疗性分子是苯丙氨酸代谢酶。
在另一方面，本公开提供了一种治疗PKU的方法，其包括向有需要的受试者施用如本文所提供的药物组合物，其中治疗性分子是苯丙氨酸代谢酶。
在另一方面，本公开提供了一种降低甲硫氨酸水平的方法，其包括向有需要的受试者施用如本文所提供的药物组合物，其中治疗性分子是甲硫氨酸代谢酶。
在另一方面，本公开提供了一种治疗同型半胱氨酸尿症的方法，其包括向有需要的受试者施用如本文所提供的药物组合物，其中治疗性分子是甲硫氨酸代谢酶。
在另一方面，本公开提供了一种评估pks岛活性的方法，其包括使用LC-MS/MS检测N-肉豆蔻酰-D-天冬酰胺。
附图说明
图1A和图1B示出Δpks菌株在小鼠中的示例性药代动力学特征。Δpks大肠杆菌Nissle(EcN)菌株在clbA-clbR基因和可操作地连接的启动子的clb序列中包含缺失，其中clbS基因序列未修饰(完整)但其可操作地连接的启动子缺失。
图2示出Δpks菌株(缺失的clbA-clbR基因和启动子序列、完整的clbS基因序列与缺失的可操作地连接的启动子)在非人灵长类动物中的示例性药代动力学特征。
图3A和B示出示例性pks岛的示意图。图3A示出完整的pks岛。图3B示出示例性缺失。缺失通过虚线界定。
图4示出pks岛的示例性clb核苷酸序列。在一个实施方案中，工程化细菌在所有这些clb序列中均包含缺失，clbS序列除外。
图5示出pks岛的示例性clb氨基酸序列。在一个实施方案中，工程化细菌在所有这些clb序列中均包含缺失，clbS序列除外。
图6示出示例性Δpks菌株的体外生长和竞争速率(缺失的clbA-clbR基因和启动子序列、完整的clbS基因序列与缺失的可操作地连接的启动子；此处称为Δclb(该图中的Δclb是指缺失产生大肠杆菌素所需的所有基因)。
图7描绘了示出具有完整的clb序列的亲本菌株SYNB1618和SYNB1934以及具有Δpks缺失的SYNB1618和SYNB1934衍生菌株的细菌上清液中的体外TCA产生的平均速率的条形图。SYN8260和SYN8261是衍生自亲本克隆SYNB1618并具有Δpks的克隆。SYN8256是衍生自亲本克隆SYNB1934并具有Δpks的克隆。
图8描绘了示出来自具有完整的clb序列的亲本菌株SYNB1618和SYNB1934以及具有Δpks缺失的SYNB1618和SYNB1618衍生菌株的过夜培养物和摇瓶培养物的上清液中存在的大肠杆菌素前体水平的图。
图9A-C描绘了示出在施用SYNB1934和具有Δpks的SYNB1934衍生菌株(SYNB1934v1，本文也称为SYN8256)后，NHP中的苯丙氨酸(Phe)(9A)和反式肉桂酸(TCA)(9B)的血浆水平的时间过程以及给药后6小时的尿马尿酸盐(HA)(9C)的图。
图10示出用于减轻高苯丙氨酸血症并治疗以高苯丙氨酸血症为特征的病症的示例性的遗传工程化细菌SYNB1618。
图11示出用于减轻高苯丙氨酸血症并治疗以高苯丙氨酸血症为特征的病症的示例性的遗传工程化细菌SYNB1934。
具体实施方式
本公开尤其涉及工程化微生物(例如工程化细菌)，与合适的对照，例如相同菌株和/或亚型的未修饰细菌中的天然pks岛相比，其包含修饰的pks岛，以及任选的一种或多种用于产生期望治疗性分子的基因；以及所述工程化微生物的组合物、制剂和使用方法。
为了能够更容易地理解本公开，首先定义某些术语。应当根据本公开的其余部分并如本领域普通技术人员所理解的那样来解读这些定义。除非另有定义，否则本文所使用的所有技术和科学术语具有与本领域普通技术人员通常所理解的含义相同的含义。附加定义如整个具体实施方式中所阐述。
如本文所用，“pks基因组岛”和“pks岛”用于指微生物(例如细菌)中的基因组区域，其包含编码能够合成大肠杆菌素的蛋白质的序列。pks岛含有clb序列，例如clb基因和相关的调控元件，例如可操作地连接的启动子。在大肠杆菌中，54千碱基的pks基因组岛包含19种基因，即clbA到clbS，并编码三种聚酮合酶(ClbC、ClbI、ClbO)、三种非核糖体肽合酶(ClbH、ClbJ、ClbN)、两种杂合的非核糖体肽/聚酮合酶(ClbB、ClbK)，以及九种辅助、裁剪和编辑蛋白。由示例性pks岛编码的示例性蛋白质在表1中示出。参见Fais 2018，其内容据此以引用方式并入。在一些实施方案中，pks岛是指包含以下基因和可操作地连接的启动子的54-kb基因组区域：clbA、clbB、clbC、clbD、clbE、clbF、clbG、clbH、clbI、clbJ、clbK、clbL、clbM、clbN、clbO、clbP、clbQ、clbR或clbS。pks岛存在于各种微生物中，诸如肠杆菌科成员，例如埃希氏菌属、克雷伯氏菌属、肠杆菌属和柠檬酸杆菌属。同上。pks岛在肠杆菌科中是“高度保守的”。同上。
示例性clb核苷酸序列在图4中提供。示例性clb氨基酸序列在图5中提供。
表1
大肠杆菌素是一种环调节蛋白，其为能够干扰真核细胞周期的微生物毒素。Fais2018。诸如大肠杆菌的产生大肠杆菌素的微生物物已在肠道微生物群中被鉴定为共生细菌并且处于疾病状态，例如结直肠癌。同上。产生大肠杆菌素的微生物能够诱导染色体不稳定、细胞周期停滞、DNA损伤、上皮细胞衰老和/或免疫细胞凋亡。同上。然而，产生大肠杆菌素的微生物还能够表现出抗炎、抗生素和止痛作用。同上。
如本文所用，修饰的pks岛是指例如clb基因和/或调控元件的clb序列中的变化，其不同于合适对照的pks岛，例如相同菌株和/或亚型的未修饰细菌中的天然pks岛。例如，工程化细菌在pks岛中包含合成的clbS基因或合成的clbS启动子，并且不同于合适对照的pks岛(例如，相同菌株和/或亚型的未修饰细菌中的天然pks岛)中的相应clbS基因或启动子序列。
如本文所用，pks岛中的部分或完全缺失是指clb序列，例如基因和/或调控元件，其与合适对照的pks岛(例如，相同菌株和/或亚型的未修饰细菌中的天然pks岛)中的相应clb序列相比至少部分被去除。pks岛中的部分或完全缺失可称为“敲除”或“德尔塔”(Δ)pks岛。天然pks岛中的clb序列，例如clb基因和/或调控元件，可缺失至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％。在一些实施方案中，天然pks岛中的clb序列，例如clb基因和/或调控元件，可以是100％缺失的。例如，与合适对照的pks岛(例如，相同菌株和/或亚型的未修饰细菌中的天然pks岛)中的clbA基因序列相比，工程化细菌在pks岛中包含clbA基因的100％缺失。或者，例如，与合适对照的pks岛(例如，相同菌株和/或亚型的未修饰细菌中的天然pks岛)中的clbA启动子序列相比，工程化细菌在pks岛中包含clbA启动子的50％缺失。
如本文所用，术语“N-肉豆蔻酰-D-天冬酰胺”是指在大肠杆菌素合成期间由pks岛产生的小分子。在一些实施方案中，ClbN使用天冬酰胺生成N-肉豆蔻酰-D-天冬酰胺，其被ClbB接受。在一些实施方案中，本文还提供了一种或多种代谢物。在一些实施方案中，pks岛的活性和/或大肠杆菌素的水平可通过测量N-肉豆蔻酰-D-天冬酰胺的水平来评估。
如本文所用，“治疗性”分子，例如蛋白质，是指能够在受试者中产生治疗效果的分子。例如，诸如IL-10的治疗性分子可以能够减轻受试者的炎症。在一些实施方案中，治疗性分子能够减少受试者体内的一种或多种有害分子，例如，苯丙氨酸代谢酶能够代谢患有PKU的受试者体内的过量和/或有害的苯丙氨酸。在一些实施方案中，治疗性分子能够减少受试者体内的一种或多种有害分子，例如，草酸代谢酶能够分解代谢患有HOX的受试者体内的过量和/或有害的草酸盐。在一些实施方案中，有害分子是甲硫氨酸，并且治疗性分子是甲硫氨酸分解代谢酶，其能够分解代谢例如患有同型半胱氨酸尿症的受试者体内的过量和/或有害的甲硫氨酸。在一些实施方案中，有害分子是尿酸，并且治疗性分子是尿酸降解酶，其能够降解例如患有高尿酸血症或痛风的受试者体内的过量和/或有害的尿酸。在一些实施方案中，有害分子是亮氨酸，并且治疗性分子是亮氨酸代谢酶，例如亮氨酸脱羧酶，其能够分解代谢例如患有异戊酸血症、丙酸血症、甲基丙二酸血症、槭糖尿病(MSUD)和糖尿病酮症酸中毒以及其他氨基酸代谢病症的受试者体内的过量和/或有害的亮氨酸。在一些实施方案中，治疗性分子能够提高受试者的有益代谢物水平。在一个实施方案中，治疗性分子是用于产生乳酸盐的酶，例如用于治疗炎症性病症。在一些实施方案中，本文公开的工程化微生物(例如工程化细菌)表达一种或多种治疗性分子。在一些实施方案中，本文公开的工程化微生物(例如遗传工程化细菌)在施用于受试者之前表达一种或多种治疗性分子。在一些实施方案中，本文公开的工程化微生物(例如遗传工程化细菌)在施用于受试者之后表达一种或多种治疗性分子，例如一种或多种用于产生治疗性分子的基因在施用于受试者后被诱导。
如本文所用，“活性”是指细胞或组合物(例如，细菌或细菌组合物)的期望参数，例如，分子的输出。在一些实施方案中，“治疗活性”是指由细胞产生期望的治疗性分子，例如，如在细胞模型、动物模型或人患者中在体外或体内测量的。在一些实施方案中，活性是指来自细胞的期望治疗性分子的量或功能。在一些实施方案中，活性是指产生一种或多种期望治疗性分子的速率。在一些实施方案中，活性是指一种或多种有害化合物，例如细胞外部的有害化合物被代谢或减少的速率，例如，如通过有害化合物或中间体的水平所测量的。
“苯丙氨酸”和“Phe”用于指具有式C6H5CH2CH(NH2)COOH的氨基酸。苯丙氨酸是酪氨酸、多巴胺、去甲肾上腺素和肾上腺素的前体。L-苯丙氨酸是一种必需氨基酸，并且是主要存在于膳食蛋白质中的苯丙氨酸形式；发现立体异构体D-苯丙氨酸在膳食蛋白质中的量较低；DL-苯丙氨酸是两种形式的组合。苯丙氨酸可指L-苯丙氨酸、D-苯丙氨酸和DL-苯丙氨酸中的一种或多种。
苯丙氨酸代谢酶”或“PME”用于指能够降解苯丙氨酸的酶。本领域已知的任何苯丙氨酸代谢酶都可由工程化微生物、遗传工程化细菌编码。PME包括但不限于苯丙氨酸羟化酶(PAH)、苯丙氨酸解氨酶(PAL)、氨基转移酶、L-氨基酸脱氨酶(LAAD)和苯丙氨酸脱氢酶、谷氨酸-草酰乙酸转氨酶1(GOT1)、谷氨酸-草酰乙酸转氨酶2(GOT2)、多巴羧化酶(DDC)或酪氨酸转氨酶(TAT)。
苯丙氨酸羟化酶(“PAH”)将苯丙氨酸转化为酪氨酸。PAH利用称为四氢生物蝶呤(BH4)的辅因子将苯丙氨酸转化为酪氨酸。
苯丙氨酸解氨酶”和“PAL”用于指将苯丙氨酸转化或加工成反式肉桂酸和氨的苯丙氨酸代谢酶(PME)。反式肉桂酸毒性低并且在哺乳动物中被肝酶转化为马尿酸，马尿酸分泌在尿液中。PAL可取代酶PAH来代谢过量的苯丙氨酸。PAL酶活性不需要THB辅因子活性。在一些实施方案中，PAL由源自原核物种的PAL基因编码。在替代性实施方案中，PAL由源自真核物种的PAL基因编码。在一些实施方案中，PAL由源自细菌物种的PAL基因编码，所述细菌物种包括但不限于木糖氧化无色杆菌(Achromobacter xylosoxidans)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、发光光杆状菌(Photorhabdus luminescens)、多变鱼腥藻(Anabaena variabilis)和根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)。在一些实施方案中，PAL由源自多变鱼腥藻的PAL基因编码，并且在本文中称为“PAL1”(Moffitt等人，2007)。在一些实施方案中，PAL由源自发光光杆状菌的PAL基因编码，并且在本文中称为“PAL3”(Williams等人，2005)。在一些实施方案中，PAL由源自酵母物种，例如圆红冬孢酵母(Rhodosporidium toruloides)的PAL基因编码(Gilbert等人，1985)。在一些实施方案中，PAL由源自植物物种，例如拟南芥(Arabidopsis thaliana)的PAL基因编码(Wanner等人，1995)。可使用PAL或其功能片段的任何合适的核苷酸和氨基酸序列。
“L-氨基酸脱氨酶”和“LAAD”用于指催化L-氨基酸的立体特异性氧化脱氨作用以产生它们各自的酮酸、氨和过氧化氢的酶。例如，LAAD催化苯丙氨酸转化为苯丙酮酸盐。多种LAAD酶是本领域已知的，其中许多酶来源于细菌，诸如变形杆菌属(Proteus)、普罗维登西亚菌属(Providencia)和摩根氏菌属(Morganella)，或来源于毒液。LAAD的特征在于苯丙氨酸降解反应速率快(Hou等人，Appl Microbiol Technol.2015年10月；99(20):8391-402；“Production of phenylpyruvic acid from L-phenylalanine using an L-amino aciddeaminase from Proteus mirabilis:comparison of enzymatic and whole-cellbiotransformation approaches”)。大多数真核和原核L-氨基酸脱氨酶是细胞外的；然而，变形杆菌属物种LAAD定位于质膜(内膜)，向外面向周质间隙，酶促活性驻留在其中。由于这种定位的结果，变形杆菌LAAD介导的苯丙氨酸降解不需要苯丙氨酸通过内膜转运到细胞质中。苯丙氨酸很容易通过外膜被吸收到周质中，而不需要转运蛋白，因此消除了对改善底物可用性的转运蛋白的需要。
在一些实施方案中，工程化微生物(例如工程化细菌)包含源自细菌物种的LAAD基因，所述细菌物种包括但不限于变形杆菌属、普罗维登西亚菌属和摩根氏菌属细菌。在一些实施方案中，细菌物种是奇异变形杆菌(Proteus mirabilis)。在一些实施方案中，细菌物种是普通变形杆菌(Proteus vulgaris)。在一些实施方案中，由工程化微生物(例如工程化细菌)编码的LAAD定位于质膜，面向周质间隙，并且其中催化活性出现在周质间隙中。
如本文所用，“GOT1”、“GOT2”和“TAT”将苯丙氨酸转化为苯丙酮酸盐。
如本文所用，“DDC”将苯丙氨酸转化为苯乙胺。
如本文所用，术语“转运蛋白”意在指用于将分子(例如，氨基酸、毒素、代谢物、底物等)从细胞外环境输入微生物中的机制，例如一种或多种蛋白质。例如，诸如PheP的苯丙氨酸转运蛋白将苯丙氨酸输入微生物中。
“苯丙氨酸转运蛋白”用于指能够将苯丙氨酸转运到细菌细胞中的膜转运蛋白(参见例如，Pi等人，1991)。在大肠杆菌中，pheP基因编码负责苯丙氨酸转运的高亲和力苯丙氨酸特异性通透酶(Pi等人，1998)。在一些实施方案中，苯丙氨酸转运蛋白由源自细菌物种的pheP基因编码，所述细菌物种包括但不限于醋酸钙不动杆菌(Acinetobactercalcoaceticus)、肠道沙门氏菌(Salmonella enterica)和大肠杆菌。其他苯丙氨酸转运蛋白包括由aroP基因编码的Ageneral氨基酸通透酶，其以高亲和力转运包括苯丙氨酸在内的三种芳香族氨基酸，并且被认为与PheP一起负责大部分的苯丙氨酸输入。此外，低水平的苯丙氨酸转运活性已被追踪到LIV-I/LS系统的活性，所述LIV-I/LS系统是由两种周质结合蛋白LIV结合蛋白(LIV-I系统)和LS结合蛋白(LS系统)以及膜组分LivHMGF组成的支链氨基酸转运蛋白。在一些实施方案中，苯丙氨酸转运蛋白由源自细菌物种的aroP基因编码。在一些实施方案中，苯丙氨酸转运蛋白由源自细菌物种的LIV结合蛋白和LS结合蛋白以及LivHMGF基因编码。在一些实施方案中，工程化微生物(例如工程化细菌)包含选自pheP、aroP和LIV-I/LS系统的多于一种类型的苯丙氨酸转运蛋白。
“苯丙氨酸代谢物”是指由于苯丙氨酸降解产生的代谢物。代谢物可由苯丙氨酸直接产生，由使用苯丙氨酸作为底物的酶产生，或由代谢途径下游的作用于苯丙氨酸代谢物底物的不同酶间接产生。在一些实施方案中，苯丙氨酸代谢物由编码PME的工程化微生物(例如工程化细菌)产生。
PME和苯丙氨酸转运蛋白，以及此类酶和转运蛋白的代表性实例的核苷酸和氨基酸序列，以及示例性启动子提供于WO2016183531A1和WO2017087580A1中，其内容据此通过引用整体并入。任何合适的酶和/或苯丙氨酸转运蛋白可用于本公开的工程化微生物(例如工程化细菌)。在一个实施方案中，一种或多种PME(例如PAL和/或LAAD)和/或Phe转运蛋白(例如，PheP)和/或转录调控因子(例如FNRS24Y)的表达由一种或多种温度调节型启动子驱动。
“高氨血症”、“高氨血症性”或“过量氨”用于指增加的体内氨浓度。高氨血症是由解毒能力下降和/或氨产生增加引起的。解毒能力下降可能是由尿素循环障碍(UCD)引起的，诸如精氨基琥珀酸尿症(argininosuccinic aciduria)、精氨酸酶缺乏症(arginasedeficiency)、氨基甲酰磷酸合成酶缺乏症、瓜氨酸血症、N-乙酰谷氨酸合成酶缺乏症和鸟氨酸转氨甲酰酶缺乏症；或由肝脏旁路，例如开放的肝管引起；和/或由谷氨酰胺合成酶的缺陷引起。参见，例如，Hoffman等人，2013；等人，2013。氨产生增加可能是由感染、药物、神经性膀胱功能障碍和肠道细菌过度生长引起的。参见，例如，/>等人，2013。氨产生增加也可与肿瘤微环境相关。参见，例如，Spinelli等人，2017。与高氨血症相关的其他病症和病状包括但不限于肝脏病症，诸如肝性脑病、急性肝衰竭或慢性肝衰竭；有机酸病症；异戊酸尿症；3-甲基巴豆酰甘氨酸尿症；甲基丙二酸血症；丙酸尿症；脂肪酸氧化缺陷；肉碱循环缺陷；肉碱缺乏症；β-氧化缺乏症；赖氨酸尿蛋白不耐受；吡咯啉-5-羧酸合成酶缺乏症；丙酮酸羧化酶缺乏症；鸟氨酸转氨酶缺乏症；碳酸酐酶缺乏症；高胰岛素血症-高氨血症综合征；线粒体病症；丙戊酸疗法；天冬酰胺酶疗法；全胃肠外营养；使用含甘氨酸的溶液进行的膀胱镜检查；肺/骨髓移植后；门体分流术；尿路感染；输尿管扩张；多发性骨髓瘤；以及化疗。参见，例如，Hoffman等人，2013；/>等人，2013；Pham等人，2013；Lazier等人，2014。在健康受试者中，血浆氨浓度通常小于约50μmol/L。参见，例如，Leonard，2006。在一些实施方案中，高氨血症的诊断信号是至少约50μmol/L、至少约80μmol/L、至少约150μmol/L、至少约180μmol/L或至少约200μmol/L的血浆氨浓度。参见，例如，Leonard，2006；Hoffman等人，2013；/>等人，2013。改变精氨酸生物合成，例如在工程化微生物(例如工程化细菌)中，以减轻高氨血症的方法是本领域已知的，所述方法例如通过使精氨酸阻遏物缺失、修饰精氨酸阻遏物结合位点，和/或使用精氨酸反馈抗性N-乙酰谷氨酸合酶来实现。参见，例如，WO2016200614，其内容据此通过引用并入。
“抗癌分子”是指一种或多种感兴趣的治疗性物质或药物，其将由工程化微生物(例如工程化细菌)产生，能够减少和/或抑制细胞生长或复制。在一些实施方案中，抗癌分子是可用于调节或治疗癌症的治疗性分子。在一些实施方案中，抗癌分子是由基因编码的治疗性分子。在替代性实施方案中，抗癌分子是通过生物化学或生物合成途径产生的治疗性分子，其中生物合成或生物化学途径可任选地对于微生物是内源的。在一些实施方案中，遗传工程化微生物能够产生两种或更多种抗癌分子。抗癌分子的非限制性实例包括免疫检查点抑制剂(例如，CTLA-4抗体、PD-1抗体、PDL-1抗体)、细胞毒性剂(例如，Cly A、FASL、TRAIL、TNF-α)、免疫刺激细胞因子和共刺激分子(例如，OX40、CD28、ICOS、CCL21、IL-2、IL-18、IL-15、IL-12、IFN-γ、IL-21、TNF、GM-CSF)、抗原和抗体(例如，肿瘤抗原、新抗原(neoantigen)、CtxB-PSA融合蛋白、CPV-OmpA融合蛋白、NY-ESO-1肿瘤抗原、RAF1、针对免疫抑制分子的抗体、抗VEGF、抗CXR4/CXCL12、抗GLP1、抗GLP2、抗半乳糖凝集素1、抗半乳糖凝集素3、抗Tie2、抗CD47、针对免疫检查点的抗体、针对免疫抑制性细胞因子和趋化因子的抗体)、DNA转移载体(例如，内皮抑素、血小板反应蛋白-1、TRAIL、SMAC、Stat3、Bcl2、FLT3L、GM-CSF、IL-12、AFP、VEGFR2)以及酶(例如，大肠杆菌CD、HSV-TK)。在一些实施方案中，抗癌分子包括介导RNA干扰、微RNA反应或抑制、TLR反应、反义基因调控、靶蛋白结合(适配体或诱饵寡核苷酸)、基因编辑诸如CRISPR干扰的核酸分子。在一些实施方案中，细菌或病毒可以用作载体以将DNA转移到哺乳动物细胞中，例如通过细菌感染。参见，例如，Bernardes等人，2013。能够产生抗癌分子，例如脱腺苷酸环化酶基因(例如，来自单核细胞增生性李斯特菌(Listeria monocytogenes)的dacA)或能够产生干扰素基因刺激物(STING)激动剂的酶的工程化微生物(例如工程化细菌)在本领域中是已知的。参见，例如，WO2018129404，其内容据此通过引用并入。
如本文所用的术语“草酸盐”是指式C2O4 2-的二价阴离子。草酸盐是草酸的共轭碱。如本文所用的术语“草酸”是指具有化学式H2C2O4的二元羧酸。
在一个实施方案中，“其中草酸盐有害的病症”是涉及草酸盐和/或草酸或直接位于上游的分子(诸如乙醛酸盐)的水平异常(例如增加)的疾病或病症。在一个实施方案中，其中草酸盐有害的病症是在受试者中观察到高草酸尿症的病症或疾病。在一个实施方案中，其中草酸盐有害的病症是指导致每日尿草酸盐排泄超过每24小时40mg的任何一种或多种病状、病症、疾病、倾向和/或遗传突变。在一个实施方案中，其中草酸盐有害的病症是选自由以下组成的组的病症或疾病：PHI、PHII、PHII、继发性高草酸尿症、肠高草酸尿症、细菌过度生长综合征、克罗恩病、炎症性肠病、肾移植后高草酸尿症、因肥胖进行空肠回肠旁路术后的高草酸尿症、胃溃疡手术后的高草酸尿症、慢性肠系膜缺血、胃旁路术、囊性纤维化、短肠综合征、胆/胰腺疾病(例如，慢性胰腺炎)。
如本文所用，术语“草酸分解代谢酶”或“草酸代谢酶”是指任何能够代谢草酸盐或能够减少草酸盐积聚或可以减轻、改善或预防一种或多种草酸盐有害的疾病或疾病症状的酶。草酸酶的实例包括但不限于甲酰辅酶A:草酸辅酶A转移酶(也称为甲酰辅酶A转移酶)(例如来自产甲酸草酸杆菌(O.formigenes)的Frc)、草酰辅酶A合成酶(也称为草酸辅酶A连接酶)(例如来自酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的酿酒酵母酰基活化酶3(ScAAE3))、草酰辅酶A脱羧酶(例如来自产甲酸草酸杆菌的Oxc(本文也称为oxdC或草酸脱羧酶))、乙酰辅酶A:草酸辅酶A转移酶(ACOCT)(例如，来自大肠杆菌的YfdE)以及分解代谢草酸、草酰辅酶A或其任何其他代谢物的任何其他酶。分解代谢酶还包括丙氨酸乙醛酸转氨酶(AGT，由AGXT基因编码，例如人形式)、乙醛酸/羟基丙酮酸还原酶(GRHPR；具有乙醛酸还原酶(GR)、羟基丙酮酸还原酶(HPR)和D-甘油酸脱氢酶(DGDH)活性的酶，例如人形式)、以及4-羟基2-酮戊二酸醛缩酶(由HOGA1基因编码，例如在人中，并且其将4-羟基2-酮戊二酸盐分解为丙酮酸盐和乙醛酸盐)。这些蛋白质的功能缺陷导致草酸盐或其相应的α-酮酸在细胞和组织中积聚。本公开的草酸分解代谢酶包括野生型或修饰的草酸代谢酶两者，并且可以使用重组和合成方法产生或从天然来源纯化。草酸代谢酶包括全长多肽及其功能片段、以及其同系物和变体。草酸代谢酶包括已经由野生型序列修饰的多肽，包括例如具有一个或多个氨基酸缺失、插入和/或取代的多肽，并且可包括例如融合多肽和具有另外序列的多肽，所述另外序列例如调控肽序列、接头肽序列和其他肽序列。
如本文所用，术语“分解代谢”是指草酸盐的细胞摄取、和/或草酸盐降解成其相应的草酰辅酶A、和/或草酰辅酶A甲酸盐和二氧化碳的降解。在一个实施方案中，草酸盐的细胞摄取发生在肾脏中。在一个实施方案中，细胞摄取发生在肝脏中。在一个实施方案中，草酸盐的细胞摄取发生在肠道中。在一个实施方案中，草酸盐的细胞摄取发生在胃中。在一个实施方案中，细胞摄取由SLC26转运蛋白介导(参见Robijn等人(2011)。在一个实施方案中，细胞摄取由转运蛋白SLC26A1介导。在一个实施方案中，细胞摄取由转运蛋白SLC26A6介导。在一个实施方案中，草酸盐的细胞摄取由细胞旁转运系统介导。在一个实施方案中，草酸盐的细胞摄取由跨细胞转运系统介导。
如本文所用，术语“甲硫氨酸分解代谢酶”是指参与甲硫氨酸分解代谢的酶。具体地，当甲硫氨酸分解代谢酶在重组细菌细胞中表达时，与相同条件下的相同细菌亚型的未修饰细菌相比，所述细菌细胞在分解代谢酶表达时将更多的甲硫氨酸水解成3-甲基硫代丙胺。在一些实施方案中，还可在重组细菌中表达或修饰甲硫氨酸转运蛋白以增强甲硫氨酸向细胞中的输入，从而增加甲硫氨酸分解代谢酶对甲硫氨酸的分解代谢。在其他实施方案中，可在重组细菌中敲除甲硫氨酸输出蛋白，以减少甲硫氨酸的输出和/或增加甲硫氨酸的细胞质浓度。在一些实施方案中，遗传工程化的细菌细胞包含编码甲硫氨酸脱羧酶(MDC)基因序列的基因序列。在一些实施方案中，细菌细胞包含减少甲硫氨酸从细菌细胞的输出的遗传修饰，例如内源甲硫氨酸外排泵诸如yjeH的敲除。在一些实施方案中，细菌细胞还包含甲硫氨酸输入蛋白，诸如metNIQ。此类重组或遗传工程化细菌的非限制性实例公开于2021年2月12日提交的国际专利申请PC T/US2021/017775和2016年5月13日提交的国际专利申请PCT/US2016/032565中，其中的每一个的内容均通过引用整体并入本文。
所述专利的内容通过引用整体并入本文。
如本文所用，术语“尿酸降解酶(uric acid degrading enzyme或uric aciddegradation enzyme)”是指能够加工、分解和/或降解尿酸的酶。在一个实施方案中，尿酸降解酶是指将尿酸加工、分解和/或降解成例如羟基异尿酸盐和/或尿囊素。在其他实施方案中，“尿酸降解酶”可指在上游起作用以降解尿酸前体从而降低下游尿酸水平的酶。例如，在一个实施方案中，尿酸降解酶降解鸟苷。在另一个实施方案中，尿酸降解酶降解腺苷。此类重组或遗传工程化细菌的非限制性实例公开于2021年2月25日提交的国际专利申请PCT/US2021/019625中，其内容通过引用整体并入本文。
如本文所用，术语“亮氨酸分解代谢酶(leucine catabolism enzyme)”或“亮氨酸分解代谢酶(leucine catabolism enzyme)”或“分解代谢酶”或“亮氨酸代谢酶”是指能够代谢亮氨酸和/或能够减少积聚的亮氨酸，和/或可以减轻、改善或预防一种或多种与亮氨酸分解代谢相关的疾病或疾病症状的任何酶。亮氨酸分解代谢酶的实例包括但不限于亮氨酸脱羧酶(LCD)。在一个实施方案中，LDC酶是E.C.4.1.1.14。此类重组或遗传工程化细菌的非限制性实例公开于2021年3月17日提交的国际专利申请PCT/US2021/022676中，其内容通过引用整体并入本文。
“可操作地连接”是指核酸序列，例如编码治疗性分子的基因，以允许核酸序列表达的方式连接到调控区序列，例如顺式作用。调控区是可以指导感兴趣基因的转录的核酸，并且可包含启动子序列、增强子序列、应答元件、蛋白质识别位点、诱导型元件、启动子控制元件、蛋白质结合序列、5'和3'非翻译区、转录起始位点、终止序列、聚腺苷酸化序列和内含子。
如本文所用的“启动子”是指能够控制编码序列或基因表达的核苷酸序列。启动子通常位于它们所调控的序列的5’。启动子可以全部来源于天然基因，或由来源于自然界中存在的启动子的不同元件构成，和/或包含合成的核苷酸区段。本领域技术人员将容易地确定，不同的启动子可响应于特定的刺激(例如以细胞或组织特异性的方式)、响应于不同的环境或生理条件或响应于特定的化合物来调控编码序列或基因的表达。原核启动子通常被分为两类：诱导型和组成型。“组成型启动子”是指允许在其控制下的编码序列或基因连续转录的启动子。
“诱导型启动子”是指与一种或多种基因可操作地连接的调控区，其中在所述调控区的诱导物的存在下一种或多种基因的表达增加。
在一些实施方案中，工程化微生物(例如工程化细菌)包含一种或多种其表达受温度敏感性机制控制的基因。温度调节剂是有利的，因为无需使用外部化学物质或专门的培养基就能进行强转录控制(参见例如，Nemani等人，Magnetic nanoparticle hyperthermiainduced cytosine deaminase expression in microencapsulated E.coli for enzyme-prodrug therapy；J Biotechnol.2015年6月10日；203:32–40，以及其中的参考文献)。使用突变体cI857阻遏物和pL和/或pR噬菌体λ启动子进行的温度调节蛋白表达可用于工程化重组细菌菌株。感兴趣的基因克隆在λ启动子下游并且可以通过噬菌体λ的突变不耐热cI857阻遏物有效地调控。在低于37℃的温度下，cI857与pR启动子的oL或oR区域结合，并阻断通过RNA聚合酶进行的转录。在更高的温度下，功能性cI857二聚体不稳定，消除与oL或oR DNA序列的结合，并且启动mRNA转录。
“氧水平依赖性启动子”或“氧水平依赖性调控区”是指一种或多种氧水平感知转录因子能够结合的核酸序列，其中相应转录因子的结合和/或激活会激活下游基因表达。
氧水平依赖性转录因子的实例包括但不限于FNR、ANR和DNR。相应FNR响应性启动子、ANR响应性启动子和DNR响应性启动子是本领域已知的(参见例如，WO2017087580；Castiglione等人，2009；Eiglmeier等人，1989；Galimand等人，1991；Hasegawa等人，1998；Hoeren等人，1993；Salmon等人，2003)。在一些实施方案中，FNR响应性启动子是衍生自已知在低或无环境氧的条件下高度表达的大肠杆菌Nissle延胡索酸和硝酸还原酶基因S(fnrS)的PfnrS(Durand和Storz，2010；Boysen等人，2010)。
如本文所用，“非天然”核酸序列是指通常不存在于细菌中的核酸序列，例如内源序列的额外拷贝或异源序列，诸如来自细菌的不同物种、品系或亚系的序列、或与来自相同亚型的细菌的未修饰序列相比被修饰和/或突变的序列。在一些实施方案中，非天然核酸序列是合成的、非天然存在的序列。参见，例如，Purcell等人，2013，Towards a whole-cellmodeling approach for synthetic biology。非天然核酸序列可以是调控区、启动子、基因和/或基因盒中的一种或多种基因。在一些实施方案中，“非天然的”是指在自然界中彼此不存在于相同关系中的两个或更多个核酸序列。在一些实施方案中，工程化微生物(例如工程化细菌)被工程化以包含相同调控区、启动子、基因和/或基因盒的多个拷贝，以便增加拷贝数或包含执行多种不同功能的基因盒的多种不同组分。在一些实施方案中，本发明的工程化微生物(例如工程化细菌)包含编码苯丙氨酸代谢酶的基因，所述基因可操作地连接至在自然界中与所述基因不相关的诱导型启动子，例如可操作地连接至编码PAL的基因的FNR启动子或可操作地连接至LAAD的ParaBAD启动子。
“肠道”是指负责食物转移和消化、营养吸收和废物排泄的器官、腺体、道和系统。在人中，肠道包括胃肠(GI)道，其开始于嘴并终止于肛门，并且另外还包括食道、胃、小肠和大肠。肠道还包括附属器官和腺体，诸如脾、肝、胆囊和胰腺。上胃肠道包括食道、胃和小肠的十二指肠。下胃肠道包括小肠的剩余部分(即，空肠和回肠)以及大肠的全部(即，盲肠、结肠、直肠和肛管)。可以在整个肠道(例如，在胃肠道中，并且特别是在小肠中)中发现细菌。在一些实施方案中，工程化微生物(例如工程化细菌)在肠道中具有活性(例如，表达一种或多种异源基因)。在一些实施方案中，工程化微生物(例如工程化细菌)在大肠中具有活性(例如，表达一种或多种异源基因)。在一些实施方案中，工程化微生物(例如工程化细菌)在小肠中具有活性(例如，表达一种或多种异源基因)。在一些实施方案中，工程化微生物(例如工程化细菌)在小肠和大肠中具有活性。
如本文所用，术语“基因”或“基因序列”意在指遗传序列，例如核酸序列。基因、基因序列或遗传序列意在包括完整基因序列或部分基因序列。基因、基因序列或遗传序列意在包括编码蛋白质或多肽的序列，并且还意在包括不编码蛋白质或多肽的遗传序列，例如调控序列、前导序列、信号序列或其他非蛋白质编码序列。
“微生物”是指通常由单细胞组成的微观、亚微观或超微观大小的生物体或微生物。微生物的实例包括细菌、酵母、病毒、寄生虫、真菌、某些藻类和原生动物。在一些方面，微生物被工程化(“工程化微生物”)以产生一种或多种感兴趣的治疗性分子或蛋白质。在某些方面，微生物被工程化为从其环境(例如，肠道)中吸收和分解代谢某些代谢物或其他化合物。在某些方面，微生物被工程化以合成某些有益代谢物或其他化合物(合成的或天然存在的)并将它们释放到其环境中。在某些实施方案中，工程化微生物是工程化细菌。在某些实施方案中，工程化微生物是工程化病毒。
“工程化”或“遗传工程化”微生物是指已从其天然状态经过遗传修饰的微生物，例如细菌。因此，“工程化”或“遗传工程化”细菌是指已从其天然状态经过遗传修饰的细菌，例如以执行特定功能，例如以代谢代谢物，例如苯丙氨酸、草酸盐、甲硫氨酸或亮氨酸。在某些实施方案中，工程化微生物(例如细菌)被修饰以表达一种或多种分子，例如治疗性分子，例如具有治疗活性或用于治疗目的的治疗性蛋白质。一旦一种或多种感兴趣的蛋白质已经被表达，工程化微生物(例如细菌)还可具有停止生长或自身毁灭的能力。
“非致病性”是指不能在宿主体内引起疾病或有害反应的微生物，例如细菌。在一些实施方案中，非致病性细菌是革兰氏阴性菌。在一些实施方案中，非致病性细菌是革兰氏阳性菌。在一些实施方案中，非致病性细菌是共生细菌，其存在于肠道的固有微生物群中。非致病性细菌的实例包括但不限于芽孢杆菌属(Bacillus)、拟杆菌属(Bacteroides)、双歧杆菌属(Bifidobacterium)、短杆菌属(Brevibacter ia)、梭菌属(Clostridium)、肠球菌属(Enterococcus)、埃希氏菌属(Esc herichia)、乳杆菌属(Lactobacillus)、乳球菌属(Lactococcus)、酵母属(Saccharomyces)和葡萄球菌属(Staphylococcus)，例如凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、脆弱拟杆菌(Bacteroides fragilis)、枯草拟杆菌(Bacteroides subtilis)、多形拟杆菌(Bac teroidesthetaiotaomicron)、两歧双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum)、婴儿双歧杆菌(Bifidobacterium infantis)、乳双歧杆菌(Bifidobacteriumlactis)、长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)、丁酸梭菌(Clostridiu m butyricum)、屎肠球菌(Enterococcus faecium)、大肠杆菌、嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)、保加利亚乳杆菌(Lactobacillus bulga ricus)、干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)、约氏乳杆菌(Lactobacillus johnsonii)、副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)、植物乳杆菌(Lacto bacillus plantarum)、罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)、鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)、乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)和鲍氏酵母菌(Saccharomyces boulardii)(Sonnenborn等人，2009；Dinley ici等人，2014；美国专利号6,835,376；美国专利号6,203,797；美国专利号5,589,168；美国专利号7,731,976)。可对天然致病性细菌进行遗传工程化以降低或消除致病性。
“益生菌”用于指可以赋予含有适当量微生物的宿主生物体健康益处的活的非致病性微生物，例如细菌。在一些实施方案中，宿主生物体是哺乳动物。在一些实施方案中，宿主生物体是人。非致病性细菌的一些物种、菌株和/或亚型目前被认为是益生菌。益生菌的实例包括但不限于双歧杆菌属、埃希氏菌属、乳杆菌属和酵母属，例如两歧双歧杆菌、屎肠球菌、大肠杆菌、大肠杆菌Nissle菌株、嗜酸乳杆菌、保加利亚乳杆菌、副干酪乳杆菌、植物乳杆菌和鲍氏酵母菌(Dinleyici等人，2014；美国专利号5,589,168；美国专利号6,203,797；美国专利号6,835,376)。益生菌可以是细菌的变体或突变菌株(Arthur等人，2012；Cuevas-Ramos等人，2010；Olier等人，2012；Nougayrede等人，2006)。可对非致病性细菌进行遗传工程化以增强或改善期望的生物特性，例如生存能力。可对非致病性细菌进行遗传工程化以提供益生菌特性。可对益生菌进行遗传工程化以增强或改善益生菌特性。
如本文所用，“异源”基因或“异源序列”是指通常在自然界中在给定细胞中不存在的核苷酸序列。如本文所用，异源序列涵盖外源引入给定细胞中的核酸序列，并且可以是天然序列(在细胞中天然存在或表达)或非天然序列(在细胞中非天然存在或表达)，并且可以是天然或野生型序列或变体、非天然或合成的序列。“异源基因”包括已以不同于相应的天然基因的形式引入宿主细胞中的天然基因或其片段。例如，异源基因可包括作为嵌合基因一部分的天然编码序列，以包括重新引入宿主细胞中的非天然调控区。异源基因也可包括引入非天然宿主细胞中的天然基因或其片段。因此，异源基因对于受体细胞可以是外源的或天然的；在给定细胞中天然存在但表达非天然量的核酸和/或其编码的多肽的核酸序列；和/或在自然界中彼此不存在于相同关系中的两个或更多个核酸序列。如本文所用，术语“内源基因”是指在生物体基因组中在其天然位置中的天然基因。如本文所用，术语“转基因”是指已经被引入宿主生物体(例如宿主细菌细胞)基因组中的基因。
如本文所用，术语“治疗”和“调节”及其同源词是指疾病、病症和/或病状或其至少一种可辨别症状的改善。在另一个实施方案中，“治疗”和“调节”是指至少一个可测量的物理参数(不一定可由患者辨别)的改善。在另一个实施方案中，“治疗”和“调节”是指在物理上(例如，可辨别症状的稳定)、在生理上(例如，物理参数的稳定)或两者抑制疾病、病症和/或病状的进展。在另一个实施方案中，“治疗”和“调节”是指减缓疾病、病症和/或病状的进展或逆转其进展。如本文所用，“预防”及其同源词是指延迟给定疾病、病症和/或病状或与此类疾病、病症和/或病状相关的症状的发作或降低获得给定疾病、病症和/或病状或与此类疾病、病症和/或病状相关的症状的风险。
需要治疗者可包括已经患有特定医学疾病的个体，以及有患上疾病的风险或最终可能患上疾病的个体。例如，通过与发展疾病相关的一种或多种风险因素的存在、疾病的存在或进展，或患有疾病的受试者对治疗的可能接受性来评估治疗的需要。例如，原发性高苯丙氨酸血症，例如PKU，是由先天性基因突变引起的，目前尚无已知的治愈方法，并且高苯丙氨酸血症也可继发于其他病状，例如肝病。治疗可包括减少或消除一种或多种疾病特征，例如原发性高苯丙氨酸血症中的过量苯丙氨酸，并且不必须包括消除潜在疾病。
如本文所用，“药物组合物”是指本发明的工程化微生物(例如，工程化细菌)与其他组分诸如生理上合适的载剂和/或赋形剂的制剂。
可互换使用的短语“生理上可接受的载剂”和“药学上可接受的载剂”是指不对生物体造成显著刺激并且不消除所施用的细菌化合物的生物活性和特性的载剂或稀释剂。佐剂包括在这些短语中。
术语“赋形剂”是指添加到药物组合物中以进一步促进活性成分施用的惰性物质。实例包括但不限于碳酸氢钙、磷酸钙、各种糖和各种类型的淀粉、纤维素衍生物、明胶、植物油、聚乙二醇和表面活性剂(包括例如聚山梨醇酯20)。
术语“治疗有效剂量”和“治疗有效量”用于指引起病状(例如高苯丙氨酸血症)的预防、症状发作延迟或症状改善的化合物的量。治疗有效量可例如足以治疗、预防与过量苯丙氨酸水平相关的疾病或病状的一种或多种症状、减轻其严重性、延迟其发作和/或降低其发生风险。治疗有效量以及治疗有效的施用频率可以通过本领域已知的方法来确定，并且在下面进行论述。
如本文所用，术语“多肽”包括“一种多肽”以及“多种多肽”，并且是指由通过酰胺键(即肽键)线性连接的氨基酸单体构成的分子。术语“多肽”是指两个或更多个氨基酸的任何一条或多条链，而不是指产物的特定长度。因此，“肽”、“二肽”、“三肽”、“寡肽”、“蛋白质”、“氨基酸链”或用于指两个或更多个氨基酸的一条链或多条链的任何其他术语都包括在“多肽”的定义中，并且术语“多肽”可代替这些术语中的任一个使用，或与其互换使用。术语“二肽”是指两个连接的氨基酸的肽。术语“三肽”是指三个连接的氨基酸的肽。术语“多肽”也旨在指多肽的表达后修饰的产物，所述表达后修饰包括但不限于糖基化、乙酰化、磷酸化、酰胺化、衍生化、蛋白水解切割或通过非天然存在的氨基酸进行的修饰。多肽可来源于天然生物来源或通过重组技术产生。在其他实施方案中，多肽由本发明的工程化微生物，例如遗传工程化细菌或病毒产生。本发明的多肽可具有约3个或更多个、5个或更多个、10个或更多个、20个或更多个、25个或更多个、50个或更多个、75个或更多个、100个或更多个、200个或更多个、500个或更多个、1,000个或更多个，或2,000个或更多个氨基酸的大小。多肽可具有确定的三维结构，尽管它们不一定具有这种结构。具有确定的三维结构的多肽被称为折叠的，并且不具有确定的三维结构而是可以采用大量不同构象的多肽被称为未折叠的。术语“肽”或“多肽”可以指与蛋白质或蛋白质的一部分对应的氨基酸序列，或者可以指与非蛋白质序列对应的氨基酸序列，例如选自调控肽序列、前导肽序列、信号肽序列、接头肽序列和其他肽序列的序列。
如本文所用，术语“足够相似”意指第一氨基酸序列相对于第二氨基酸序列含有足够或最小数量的相同或等同的氨基酸残基，使得第一氨基酸序列和第二氨基酸序列具有共同的结构性结构域和/或共同的功能活性。例如，包含为至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或至少约100％相同的共同结构性结构域的氨基酸序列在本文中被定义为足够相似。优选地，变体将与本发明的肽的氨基酸序列足够相似。此类变体通常保留了本发明肽的功能活性。变体包括分别通过一个或多个氨基酸缺失、添加和/或取代而与天然和野生型肽在氨基酸序列上不同的肽。这些可以是天然存在的变体，也可以是人工设计的变体。
如本文所用的冠词“一个/一种”应被理解为意指“至少一个/至少一种”，除非有明确相反的指示。
短语“和/或”在列表中的要素之间使用时，旨在表示(1)仅存在单个列出的要素，或者(2)存在列表中的多于一个要素。例如，“A、B和/或C”表示选择可以是单独的A；单独的B；单独的C；A和B；A和C；B和C；或A、B和C。短语“和/或”可与列表中的“至少一个”或“一个或多个”要素互换使用。
术语“约”在列表前使用时，修饰列表中的每个成员。术语“约”或“大约”是指由本领域普通技术人员确定的特定值的可接受误差，这部分地取决于该值是如何测量或确定的。
数值范围将限定范围的数量包括在内。考虑到有效数字和与测量相关的误差，测量值和可测量值被理解为近似值。此外，“包含(comprise、comprises、comprising)”、“含有(contain、contains、containing)”、“包括(include、includes和including)”的使用不旨在为限制性的。应该理解，上述一般描述和详细描述均仅为示例性和解释性的并且不限制本教导。
本文引用的参考文献以引用方式整体并入。
包含修饰的PKS岛的工程化微生物
在一些实施方案中，本公开提供了一种包含修饰的pks岛的工程化微生物(例如工程化细菌)，以及其组合物和制剂。在一些实施方案中，本公开提供了一种工程化微生物(例如工程化细菌)，其包含修饰的pks岛并且还包含一种或多种编码治疗性分子的基因或基因盒；以及所述微生物的组合物和制剂。
在一些实施方案中，工程化微生物(例如工程化细菌)包含修饰的pks岛。在一些实施方案中，与合适的对照，例如相同菌株和/或亚型的未修饰细菌中的天然pks岛相比，工程化微生物(例如工程化细菌)包含修饰的clb序列，所述clb序列选自clbA、clbB、clbC、clbD、clbE、clbF、clbG、clbH、clbI、clbJ、clbK、clbL、clbM、clbN、clbO、clbP、clbQ、clbR和clbS基因序列和/或可操作地连接的启动子序列中的一个或多个。在一些实施方案中，与对照相比，修饰的clb序列是插入、取代和/或缺失。
在一些实施方案中，与合适的对照相比，工程化微生物(例如工程化细菌)在clbA、clbB、clbC、clbD、clbE、clbF、clbG、clbH、clbI、clbJ、clbK、clbL、clbM、clbN、clbO、clbP、clbQ和clbR基因序列中的一个或多个中包含修饰。
在一些实施方案中，与合适的对照相比，工程化微生物(例如工程化细菌)在可操作地连接至clbA、clbB、clbC、clbD、clbE、clbF、clbG、clbH、clbI、clbJ、clbK、clbL、clbM、clbN、clbO、clbP、clbQ和clbR基因的启动子序列中的一个或多个中包含修饰。
在一些实施方案中，与合适的对照相比，工程化微生物(例如工程化细菌)在clbA、clbB、clbC、clbD、clbE、clbF、clbG、clbH、clbI、clbJ、clbK、clbL、clbM、clbN、clbO、clbP、clbQ和clbR基因序列中的每一个中包含修饰。
在一些实施方案中，与合适的对照相比，工程化微生物(例如工程化细菌)在可操作地连接至clbA、clbB、clbC、clbD、clbE、clbF、clbG、clbH、clbI、clbJ、clbK、clbL、clbM、clbN、clbO、clbP、clbQ、clbR和clbS基因的启动子序列中的每一个中包含修饰。
在一些实施方案中，与合适的对照相比，工程化微生物(例如工程化细菌)在clbA、clbB、clbC、clbD、clbE、clbF、clbG、clbH、clbI、clbJ、clbK、clbL、clbM、clbN、clbO、clbP、clbQ、clbR和clbS基因序列中的一个或多个中包含修饰。
在一些实施方案中，与合适的对照相比，工程化微生物(例如工程化细菌)在可操作地连接至clbA、clbB、clbC、clbD、clbE、clbF、clbG、clbH、clbI、clbJ、clbK、clbL、clbM、clbN、clbO、clbP、clbQ、clbR和clbS基因的启动子序列中的一个或多个中包含修饰。
在一些实施方案中，与合适的对照相比，工程化微生物(例如工程化细菌)在clbA、clbB、clbC、clbD、clbE、clbF、clbG、clbH、clbI、clbJ、clbK、clbL、clbM、clbN、clbO、clbP、clbQ、clbR和clbS基因序列中的每一个中包含修饰。
在一些实施方案中，与合适的对照相比，工程化微生物(例如工程化细菌)在可操作地连接至clbA、clbB、clbC、clbD、clbE、clbF、clbG、clbH、clbI、clbJ、clbK、clbL、clbM、clbN、clbO、clbP、clbQ、clbR和clbS基因的启动子序列中的每一个中包含修饰。
在一些实施方案中，与合适的对照相比，工程化微生物(例如工程化细菌)包含未修饰的clbS基因序列、clbA、clbB、clbC、clbD、clbE、clbF、clbG、clbH、clbI、clbJ、clbK、clbL、clbM、clbN、clbO、clbP、clbQ和clbR基因序列中的每一个中的修饰，以及clbS启动子序列中的修饰。
在一些实施方案中，工程化微生物(例如工程化细菌)在pks岛中包含完全或部分缺失，例如clb序列(例如，clb基因或启动子序列)中的完全或缺失。在一些实施方案中，与合适的对照，例如相同菌株和/或亚型的未修饰细菌中的天然pks岛相比，工程化微生物(例如工程化细菌)在选自clbA、clbB、clbC、clbD、clbE、clbF、clbG、clbH、clbI、clbJ、clbK、clbL、clbM、clbN、clbO、clbP、clbQ、clbR和clbS基因序列和/或可操作地连接的启动子序列中的一个或多个的clb序列中包含完全或部分缺失。在一些实施方案中，与对照，例如相同菌株和/或亚型的未修饰细菌中的天然pks岛中的相应clb序列相比，clb序列(例如clb基因或启动子序列)可缺失至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％。在一些实施方案中，与对照，例如相同菌株和/或亚型的未修饰细菌中的天然pks岛中的相应clb序列相比，clb序列(例如，clb基因或启动子序列)可以是100％缺失的
在一些实施方案中，与合适的对照相比，工程化微生物(例如工程化细菌)在clbA、clbB、clbC、clbD、clbE、clbF、clbG、clbH、clbI、clbJ、clbK、clbL、clbM、clbN、clbO、clbP、clbQ和clbR基因序列中的一个或多个中包含部分或完全缺失。
在一些实施方案中，与合适的对照相比，工程化微生物(例如工程化细菌)在可操作地连接至clbA、clbB、clbC、clbD、clbE、clbF、clbG、clbH、clbI、clbJ、clbK、clbL、clbM、clbN、clbO、clbP、clbQ和clbR基因的启动子序列中的一个或多个中包含部分或完全缺失。
在一些实施方案中，与合适的对照相比，工程化微生物(例如工程化细菌)在clbA、clbB、clbC、clbD、clbE、clbF、clbG、clbH、clbI、clbJ、clbK、clbL、clbM、clbN、clbO、clbP、clbQ和clbR基因序列中的每一个中包含部分或完全缺失。
在一些实施方案中，与合适的对照相比，工程化微生物(例如工程化细菌)在可操作地连接至clbA、clbB、clbC、clbD、clbE、clbF、clbG、clbH、clbI、clbJ、clbK、clbL、clbM、clbN、clbO、clbP、clbQ、clbR和clbS基因的启动子序列中的每一个中包含部分或完全缺失。
在一些实施方案中，与合适的对照相比，工程化微生物(例如工程化细菌)在clbA、clbB、clbC、clbD、clbE、clbF、clbG、clbH、clbI、clbJ、clbK、clbL、clbM、clbN、clbO、clbP、clbQ、clbR和clbS基因序列中的一个或多个中包含部分或完全缺失。
在一些实施方案中，与合适的对照相比，工程化微生物(例如工程化细菌)在可操作地连接至clbA、clbB、clbC、clbD、clbE、clbF、clbG、clbH、clbI、clbJ、clbK、clbL、clbM、clbN、clbO、clbP、clbQ、clbR和clbS基因的启动子序列中的一个或多个中包含部分或完全缺失。
在一些实施方案中，与合适的对照相比，工程化微生物(例如工程化细菌)在clbA、clbB、clbC、clbD、clbE、clbF、clbG、clbH、clbI、clbJ、clbK、clbL、clbM、clbN、clbO、clbP、clbQ、clbR和clbS基因序列中的每一个中包含部分或完全缺失。
在一些实施方案中，与合适的对照相比，工程化微生物(例如工程化细菌)在可操作地连接至clbA、clbB、clbC、clbD、clbE、clbF、clbG、clbH、clbI、clbJ、clbK、clbL、clbM、clbN、clbO、clbP、clbQ、clbR和clbS基因的启动子序列中的每一个中包含部分或完全缺失。
在一些实施方案中，与合适的对照相比，工程化微生物(例如工程化细菌)包含未修饰的clbS基因序列、clbA、clbB、clbC、clbD、clbE、clbF、clbG、clbH、clbI、clbJ、clbK、clbL、clbM、clbN、clbO、clbP、clbQ和clbR基因序列中的每一个中的部分或完全缺失，以及clbS启动子序列中的部分或完全缺失
在一些实施方案中，与合适的对照，例如包含天然pks岛的相同菌株和/或亚型的未修饰细菌中的天然pks岛相比，包含修饰的pks岛的工程化微生物(例如工程化细菌)表达较少的大肠杆菌素。在一些实施方案中，与对照相比，包含修饰的pks岛的工程化微生物(例如工程化细菌)表达较少的大肠杆菌素。在一些实施方案中，与对照相比，包含修饰的pks岛的工程化微生物(例如工程化细菌)表达较少的N-肉豆蔻酰-D-天冬酰胺。在一些实施方案中，与对照相比，包含修饰的pks岛的工程化微生物(例如工程化细菌)表现出降低的辅助蛋白活性。在一些实施方案中，与对照相比，包含修饰的pks岛的工程化微生物(例如工程化细菌)表现出降低的磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶活性。在一些实施方案中，与对照相比，包含修饰的pks岛的工程化微生物(例如工程化细菌)表现出降低的聚酮合酶活性。在一些实施方案中，与对照相比，包含修饰的pks岛的工程化微生物(例如工程化细菌)表现出降低的非核糖体肽合酶活性。在一些实施方案中，与对照相比，包含修饰的pks岛的工程化微生物(例如工程化细菌)表现出降低的杂合非核糖体肽/聚酮合酶活性。在一些实施方案中，与对照相比，包含修饰的pks岛的工程化微生物(例如工程化细菌)表现出降低的羟酰辅酶A脱氢酶活性。在一些实施方案中，与对照相比，包含修饰的pks岛的工程化微生物(例如工程化细菌)表现出降低的酰基载体蛋白活性。在一些实施方案中，与对照相比，包含修饰的pks岛的工程化微生物(例如工程化细菌)表现出降低的αβ脱氢酶活性。在一些实施方案中，与对照相比，包含修饰的pks岛的工程化微生物(例如工程化细菌)表现出降低的酰基转移酶活性。在一些实施方案中，与对照相比，包含修饰的pks岛的工程化微生物(例如工程化细菌)表现出降低的酰胺酶活性。在一些实施方案中，与对照相比，包含修饰的pks岛的工程化微生物(例如工程化细菌)表现出降低的MATE转运蛋白活性。在一些实施方案中，与对照相比，包含修饰的pks岛的工程化微生物(例如工程化细菌)表现出降低的fmtA肽酶活性。在一些实施方案中，与对照相比，包含修饰的pks岛的工程化微生物(例如工程化细菌)表现出降低的硫酯酶活性。在一些实施方案中，与对照相比，包含修饰的pks岛的工程化微生物(例如工程化细菌)表现出前大肠杆菌素跨细胞质膜转运减少。在一些实施方案中，与对照相比，包含修饰的pks岛的工程化微生物(例如工程化细菌)表现出前大肠杆菌素跨周质转运减少。在一些实施方案中，与对照相比，包含修饰的pks岛的工程化微生物(例如工程化细菌)表现出前大肠杆菌素到大肠杆菌素的裂解减少。
在一些实施方案中，与包含未修饰的pks岛的相应对照相比，包含修饰的pks岛的工程化微生物(例如工程化细菌)例如在生长和竞争测定中表现出类似的生长速率。在一些实施方案中，与包含未修饰的pks岛的相应对照相比，包含修饰的pks岛的工程化微生物(例如工程化细菌)例如在竞争生长后表现出类似的活力。在一些实施方案中，与包含未修饰的pks岛的相应对照相比，包含修饰的pks岛的工程化微生物(例如工程化细菌)表现出类似的表达治疗性分子的能力。在一些实施方案中，与包含未修饰的pks岛的相应对照相比，包含修饰的pks岛的工程化细菌具有最小的适应性成本。
在一些实施方案中，工程化微生物(例如工程化细菌)还包含一种或多种用于产生期望的治疗性分子的基因。还可包含修饰的pks岛的包含一种或多种用于产生期望的治疗性分子的基因的工程化微生物(例如工程化细菌)描述于WO2016090343、WO2016200614、WO2017139697、WO2016183531、WO2017087580、WO2016141108、WO2017074566、WO2017136792、WO2017136795、WO2018129404、WO2019014391、WO2016210384、WO2017123418、WO2017123676、WO2016183531、WO2018237198、WO2016201380、US20170216370和WO2017040719中，其内容据此以引用方式并入。
在一些实施方案中，一种或多种基因可操作地连接至诱导型启动子。在一些实施方案中，治疗性分子能够在受试者中产生治疗效果。例如，诸如IL-10的治疗性分子可以能够减轻受试者的炎症。在一些实施方案中，治疗性分子是抗癌分子。在一些实施方案中，治疗性分子是能够产生STING激动剂的酶。在一些实施方案中，治疗性分子是脱腺苷酸环化酶，例如dacA。在一些实施方案中，治疗性分子能够减少受试者体内的一种或多种有害分子，例如，苯丙氨酸代谢酶能够代谢患有PKU的受试者体内过量和有害的苯丙氨酸，或者草酸代谢酶能够分解代谢患有HOX的受试者体内过量和有害的草酸盐。在一些实施方案中，工程化微生物(例如工程化细菌)包含一种或多种编码修饰的精氨酸生物合成途径(例如，缺失的精氨酸阻遏物、修饰的精氨酸阻遏物结合位点和/或精氨酸反馈抗性N-乙酰谷氨酸合酶突变)的基因并且能够减少例如患有UCD的受试者或患有癌症的受试者体内的有害氨。在一些实施方案中，治疗性分子与另一分子联合作用以产生治疗效果，例如，苯丙氨酸转运蛋白与苯丙氨酸代谢酶联合作用以减少患有PKU的受试者体内的有害苯丙氨酸。在一些实施方案中，本文公开的工程化微生物(例如工程化细菌)表达一种或多种治疗性分子。在一些实施方案中，本文公开的工程化微生物(例如工程化细菌)在施用于受试者之前表达一种或多种治疗性分子。在一些实施方案中，本文公开的工程化微生物(例如工程化细菌)在施用于受试者之后表达一种或多种治疗性分子，例如一种或多种用于产生治疗性分子的基因在施用于受试者后被诱导。
在一些实施方案中，工程化微生物(例如工程化细菌)包含如本文所述的修饰的pks岛和一种或多种编码治疗性分子的基因和/或基因盒。在一些实施方案中，工程化微生物(例如工程化细菌)包含如本文所述的修饰的pks岛和一种或多种编码至少一种苯丙氨酸代谢酶的基因和/或基因盒。在一些实施方案中，工程化微生物(例如工程化细菌)包含如本文所述的修饰的pks岛和一种或多种编码至少一种草酸代谢酶的基因和/或基因盒。
在一些实施方案中，工程化微生物(例如工程化细菌)包含修饰的pks岛和编码PAH的基因。在一些实施方案中，工程化微生物(例如工程化细菌)包含编码PAH的基因，其中PAH基因可操作地连接至诱导型启动子。在一些实施方案中，微生物(例如细菌)包含非天然PAH基因。在一些实施方案中，微生物(例如细菌)包含天然PAH基因的另外拷贝。在一些实施方案中，启动子在自然界中与PAH基因不相关。在一些实施方案中，启动子是本文公开的任何一种或多种启动子。在一些实施方案中，表达PAH的工程化微生物(例如工程化细菌)将苯丙氨酸转化为酪氨酸。
在一些实施方案中，工程化微生物(例如工程化细菌)包含修饰的pks岛和编码PAL的基因。在一些实施方案中，工程化微生物(例如工程化细菌)包含编码PAL的基因，其中PAL基因可操作地连接至诱导型启动子。在一些实施方案中，微生物(例如细菌)包含非天然PAL基因。在一些实施方案中，微生物(例如细菌)包含天然PAL基因的另外拷贝。在一些实施方案中，启动子在自然界中与PAL基因不相关。在一些实施方案中，启动子是本文公开的任何一种或多种启动子。在一些实施方案中，表达PAL的工程化微生物(例如工程化细菌)将苯丙氨酸转化为反式肉桂酸盐和氨。
在一些实施方案中，工程化微生物(例如工程化细菌)包含修饰的pks岛和编码LAAD的基因。在一些实施方案中，LAAD基因可操作地连接至诱导型启动子。在一些实施方案中，微生物(例如细菌)包含非天然LAAD基因。在一些实施方案中，微生物(例如细菌)包含天然LAAD基因的另外拷贝。在一些实施方案中，启动子在自然界中与LAAD基因不相关。在一些实施方案中，表达LAAD的工程化微生物(例如工程化细菌)将苯丙氨酸转化为苯丙酮酸。
在一些实施方案中，工程化微生物(例如工程化细菌)包含修饰的pks岛和编码苯丙氨酸转运蛋白(例如PheP)的基因。在一些实施方案中，PheP基因可操作地连接至诱导型启动子。在一些实施方案中，工程化微生物(例如工程化细菌)包含编码非天然苯丙氨酸转运蛋白基因的基因，例如天然苯丙氨酸转运蛋白的另外拷贝。在一些实施方案中，微生物(例如细菌)包含天然PheP基因的另外拷贝。在一些实施方案中，启动子在自然界中与PheP基因不相关。在一些实施方案中，表达PheP的工程化微生物(例如工程化细菌)将苯丙氨酸转运到细菌细胞中。
在一些实施方案中，单一启动子控制一种或多种编码PME和苯丙氨酸转运蛋白的基因的表达。在一些实施方案中，相同启动子的不同拷贝控制PME和苯丙氨酸转运蛋白的表达。在一些实施方案中，不同的启动子控制PME和苯丙氨酸转运蛋白的表达。在一些实施方案中，控制PME表达的启动子不同于控制苯丙氨酸转运蛋白表达的一种或多种启动子。在一些实施方案中，与一种或多种编码PME的基因和一种或多种编码苯丙氨酸转运蛋白的基因可操作地连接的一种或多种启动子由在哺乳动物肠道中发现的外源环境条件诱导。在一些实施方案中，与一种或多种编码PME的基因和一种或多种编码苯丙氨酸转运蛋白的基因可操作地连接的一种或多种启动子在低氧或厌氧条件下被诱导，例如FNR响应性启动子、ANR响应性启动子和DNR响应性启动子。在一些实施方案中，与一种或多种编码PME的基因和一种或多种编码苯丙氨酸转运蛋白的基因可操作地连接的一种或多种启动子是温度调节型启动子。在一些实施方案中，与一种或多种编码PME的基因和一种或多种编码苯丙氨酸转运蛋白的基因可操作地连接的一种或多种启动子由阿拉伯糖、IPTG、四环素或鼠李糖诱导。在一些实施方案中，一种或多种编码PME(例如PAL和/或LAAD)的基因可操作地连接至选自以下的启动子：在低氧或厌氧条件下被诱导的启动子、温度调节型启动子以及由阿拉伯糖、IPTG、四环素或鼠李糖诱导的启动子。在一些实施方案中，温度调节型启动子能够在37℃与42℃之间的温度下被诱导。在一些实施方案中，温度调节型启动子是λCI诱导型启动子。在一些实施方案中，遗传工程化细菌还包含一种或多种编码温度敏感性CI阻遏物突变体的基因，在一些实施方案中，其为CI857。
在一些实施方案中，工程化微生物(例如工程化细菌)包含修饰的pks岛和编码GOT1的基因。在一些实施方案中，工程化微生物(例如工程化细菌)包含编码GOT1的基因，其中GOT1基因可操作地连接至诱导型启动子。在一些实施方案中，微生物(例如细菌)包含非天然GOT1基因。在一些实施方案中，微生物(例如细菌)包含天然GOT1基因的另外拷贝。在一些实施方案中，启动子在自然界中与GOT1基因不相关。在一些实施方案中，启动子是本文公开的任何一种或多种启动子。在一些实施方案中，表达GOT1的工程化微生物(例如工程化细菌)将苯丙氨酸转化为苯丙酮酸盐。
在一些实施方案中，工程化微生物(例如工程化细菌)包含修饰的pks岛和编码GOT2的基因。在一些实施方案中，工程化微生物(例如工程化细菌)包含编码GOT2的基因，其中GOT2基因可操作地连接至诱导型启动子。在一些实施方案中，微生物(例如细菌)包含非天然GOT2基因。在一些实施方案中，微生物(例如细菌)包含天然GOT2基因的另外拷贝。在一些实施方案中，启动子在自然界中与GOT2基因不相关。在一些实施方案中，启动子是本文公开的任何一种或多种启动子。在一些实施方案中，表达GOT2的工程化微生物(例如工程化细菌)将苯丙氨酸转化为苯丙酮酸盐。
在一些实施方案中，工程化微生物(例如工程化细菌)包含修饰的pks岛和编码TAT的基因。在一些实施方案中，工程化微生物(例如工程化细菌)包含编码TAT的基因，其中TAT基因可操作地连接至诱导型启动子。在一些实施方案中，微生物(例如细菌)包含非天然TAT基因。在一些实施方案中，微生物(例如细菌)包含天然TAT基因的另外拷贝。在一些实施方案中，启动子在自然界中与TAT基因不相关。在一些实施方案中，启动子是本文公开的任何一种或多种启动子。在一些实施方案中，表达TAT的工程化微生物(例如工程化细菌)将苯丙氨酸转化为苯丙酮酸盐。
在一些实施方案中，工程化微生物(例如工程化细菌)包含修饰的pks岛和编码DDC的基因。在一些实施方案中，工程化微生物(例如工程化细菌)包含编码DDC的基因，其中DDC基因可操作地连接至诱导型启动子。在一些实施方案中，微生物(例如细菌)包含非天然DDC基因。在一些实施方案中，微生物(例如细菌)包含天然DDC基因的另外拷贝。在一些实施方案中，启动子在自然界中与DDC基因不相关。在一些实施方案中，启动子是本文公开的任何一种或多种启动子。在一些实施方案中，表达DDC的工程化微生物(例如工程化细菌)将苯丙氨酸转化为苯基乙胺。
在一些实施方案中，工程化微生物(例如工程化细菌)包含修饰的pks岛和一种或多种编码至少一种草酸分解代谢酶的基因和/或基因盒。在一些实施方案中，工程化细菌包含一种或多种编码至少一种草酸分解代谢酶的基因和/或基因盒，并且能够将草酸盐转化为草酰辅酶A。在一些实施方案中，工程化细菌包含一种或多种编码至少一种草酸分解代谢酶的基因和/或基因盒，并且能够将草酰辅酶A转化为甲酸盐和二氧化碳。在一些实施方案中，工程化细菌包含一种或多种编码至少一种草酸分解代谢酶的基因和/或基因盒，并且能够将草酸盐转化为草酰辅酶A，并将草酰辅酶A转化为甲酸盐和二氧化碳。在一些实施方案中，本公开的工程化细菌包含一种或多种编码一种或多种草酸分解代谢酶的基因和或基因盒，所述草酸分解代谢酶将草酸盐和甲酰辅酶A转化为草酰辅酶A和甲酸盐。在一些实施方案中，本公开的工程化细菌包含一种或多种编码一种或多种草酸分解代谢酶的基因和/或基因盒，所述草酸分解代谢酶将草酸盐和乙酰辅酶A转化为草酰辅酶A和乙酸盐。在一些实施方案中，本公开的工程化细菌包含一种或多种编码一种或多种草酸分解代谢酶的基因和/或基因盒，所述草酸分解代谢酶将草酸盐和辅酶A转化为草酰辅酶A(例如，通过将一个ATP转化为AMP加二磷酸盐)。在一些实施方案中，本公开的工程化细菌包含一种或多种编码一种或多种草酸分解代谢酶的基因和/或基因盒，所述草酸分解代谢酶将草酰辅酶A转化为二氧化碳和甲酰辅酶A。在一些实施方案中，工程化细菌由于草酸盐分解代谢而产生甲酸盐。在一些实施方案中，工程化细菌由于草酸盐分解代谢而产生甲酸盐和二氧化碳。在一些实施方案中，工程化细菌由于草酸盐分解代谢而产生乙酸盐。在一些实施方案中，工程化细菌由于草酸盐分解代谢而产生乙酸盐和二氧化碳。在一些实施方案中，工程化细菌由于草酸盐分解代谢而产生甲酸盐、乙酸盐和二氧化碳。
在一些实施方案中，工程化细菌包含如本文所公开的修饰的pks岛和一种或多种编码至少一种草酸分解代谢酶的基因和/或基因盒，并且能够将草酸盐转化为草酰辅酶A。在一些实施方案中，工程化细菌包含如本文所公开的修饰的pks岛和一种或多种编码至少一种草酸分解代谢酶的基因和/或基因盒，并且能够将草酰辅酶A转化为甲酸盐和二氧化碳。在一些实施方案中，工程化细菌包含如本文所公开的修饰的pks岛和一种或多种编码至少一种草酸分解代谢酶的基因和/或基因盒，并且能够将盐酸盐转化为草酰辅酶A并将草酰辅酶A转化为甲酸盐和二氧化碳。在一些实施方案中，工程化细菌包含如本文所公开的修饰的pks岛和一种或多种编码至少一种草酸分解代谢酶的基因和/或基因盒，所述草酸分解代谢酶将草酸盐和甲酰辅酶A转化为草酰辅酶A和甲酸盐。在一些实施方案中，工程化细菌包含如本文所公开的修饰的pks岛和一种或多种编码至少一种草酸分解代谢酶的基因和/或基因盒，所述草酸分解代谢酶将草酸盐和乙酰辅酶A转化为草酰辅酶A和乙酸盐。在一些实施方案中，工程化细菌包含如本文所公开的修饰的pks岛和一种或多种编码至少一种草酸分解代谢酶的基因和/或基因盒，所述草酸分解代谢酶将草酸盐和辅酶A转化为草酰辅酶A(例如，通过将一个ATP转化为AMP加二磷酸盐)。在一些实施方案中，工程化细菌包含如本文所公开的修饰的pks岛和一种或多种编码至少一种草酸分解代谢酶的基因和/或基因盒，所述草酸分解代谢酶将草酰辅酶A转化为二氧化碳和甲酰辅酶A。在一些实施方案中，包含如本文所公开的修饰的pks岛的工程化细菌由于草酸盐分解代谢而产生甲酸盐。在一些实施方案中，包含如本文所公开的修饰的pks岛的工程化细菌由于草酸盐分解代谢而产生甲酸盐和二氧化碳。在一些实施方案中，包含如本文所公开的修饰的pks岛的工程化细菌由于草酸盐分解代谢而产生乙酸盐。在一些实施方案中，包含如本文所公开的修饰的pks岛的工程化细菌由于草酸盐分解代谢而产生乙酸盐和二氧化碳。在一些实施方案中，包含如本文所公开的修饰的pks岛的工程化细菌由于草酸盐分解代谢而产生甲酸盐、乙酸盐和二氧化碳。
在一些实施方案中，一种或多种草酸分解代谢酶增加细胞中草酸盐和/或草酰辅酶A分解代谢的速率。在一些实施方案中，一种或多种草酸分解代谢酶降低细胞中草酸盐的水平。在一些实施方案中，一种或多种草酸分解代谢酶降低细胞中草酰辅酶A的水平。在一些实施方案中，一种或多种草酸分解代谢酶降低细胞中草酸的水平。
在一些实施方案中，一种或多种草酸分解代谢酶增加细胞中草酸盐和/或草酰辅酶A分解代谢的速率。在一些实施方案中，一种或多种草酸分解代谢酶降低细胞中草酸盐的水平。在一些实施方案中，一种或多种草酸分解代谢酶降低细胞中草酰辅酶A的水平。在一些实施方案中，一种或多种草酸分解代谢酶降低细胞中草酸的水平。
在一些实施方案中，与细胞中其相应的草酸盐水平相比，一种或多种草酸分解代谢酶增加细胞中草酰辅酶A的水平。在一些实施方案中，与细胞中其相应的草酰辅酶A的水平相比，一种或多种草酸分解代谢酶增加细胞中甲酸盐和二氧化碳的水平。在一些实施方案中，与细胞中草酸盐的水平相比，一种或多种草酸分解代谢酶降低草酸盐和/或草酰辅酶A的水平。
参与草酸盐的分解代谢的酶可在本发明的细菌中表达或修饰，以增强草酸盐的分解代谢。具体地说，与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比，当至少一种草酸分解代谢酶在本发明的工程化细菌细胞中表达时，当分解代谢酶表达时，工程化细菌细胞将更多的草酸盐转化为草酰辅酶A，或者将更多的草酰辅酶A转化为甲酸盐和二氧化碳。因此，包含编码草酸分解代谢酶的异源基因的遗传工程化细菌可以分解代谢草酸盐和/或草酰辅酶A以治疗草酸盐有害的病症，诸如PHI、PHII、PHIII以及继发性高草酸尿症、肠高草酸尿症和特发性高草酸尿症。
在一个实施方案中，本发明的细菌细胞包含至少一种编码至少一种草酸分解代谢酶的异源基因。在一个实施方案中，本发明的细菌细胞包含至少一种编码草酸盐输入蛋白的异源基因和至少一种编码至少一种草酸分解代谢酶的异源基因。在一个实施方案中，本发明的细菌细胞包含至少一种编码甲酸盐输出蛋白的异源基因和至少一种编码至少一种草酸分解代谢酶的异源基因。在一个实施方案中，本发明的细菌细胞包含至少一种编码草酸盐:甲酸盐反向转运蛋白的异源基因和至少一种编码至少一种草酸分解代谢酶的异源基因。
草酸分解代谢酶是本领域已知的。在一些实施方案中，草酸分解代谢酶由至少一种编码来源于细菌物种的至少一种草酸分解代谢酶的基因编码。在一些实施方案中，草酸分解代谢酶由编码来源于非细菌物种的草酸分解代谢酶的基因编码。在一些实施方案中，草酸分解代谢酶由来源于真核物种(例如酵母物种或植物物种)的基因编码。在一个实施方案中，草酸分解代谢酶由来源于人的基因编码。在一个实施方案中，编码一种或多种草酸分解代谢酶的一个或多个基因序列来源于包括但不限于以下的属或物种的生物体：双歧杆菌属、博德特菌属(Bordetella)、慢生根瘤菌属(Bradyrhizobium)、伯克霍尔德氏菌属(Burkholderia)、梭菌属、肠球菌属、埃希氏菌属、真细菌属(Eubacterium)、乳杆菌属、磁螺菌属(Magnetospirillium)、分枝杆菌属、脉孢菌属(Neurospora)、草酸杆菌属(Oxalobacter)(例如，产甲酸草酸杆菌)、罗尔斯通氏菌属(Ralstonia)、红假单胞菌属(Rhod opseudomonas)、志贺氏菌属(Shigella)、热原体属(Thermoplasma)和需氧去氮菌(Thauera)，例如，动物双歧杆菌(Bifidobacterium animali s)、两岐双岐杆菌、婴儿双岐杆菌、乳双歧杆菌、长双歧杆菌、支气管炎博德特菌(Bordatella bronchiseptica)、副百日咳博德特菌(Bor datella parapertussis)、真菌伯克霍尔德菌(Burkholderiafungorum)、异种伯克霍尔德菌(Burkholderia xenovorans)、大豆慢生根瘤菌(Bradyrhizobium japonicum)、丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)、艰难梭菌(Clostridium difficile)、闪烁梭菌(Clostridium scindens)、产孢梭菌(Clostridiumsporogenes)、破伤风梭菌(Clostridium tentani)、粪肠球菌、大肠杆菌、迟缓真杆菌(Eubacterium lentum)、嗜酸乳杆菌、保加利亚乳杆菌、干酪乳杆菌、加氏乳杆菌(Lactobacillus gasse ri)、植物乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、乳酸乳球菌、向磁磁螺菌(Magnetospirillium magentotaticum)、鸟分枝杆菌(Mycobacterium avium)、胞内分枝杆菌(Mycobacterium intracellulare)、堪萨斯分枝杆菌(Mycoba cterium kansasii)、麻风分枝杆菌(Mycobacterium leprae)、耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis)、结核分枝杆菌(Mycobacterium tube rculosis)、溃疡分枝杆菌(Mycobacterium ulcerans)、粗糙脉孢菌(Neu rospora crassa)、产甲酸草酸杆菌、雷氏普罗威登斯菌(Providencia rettgeri)、迟缓真杆菌(Eubacterium lentum)、富养产碱菌(Ralstonia eutropha)、耐金属罗尔斯通菌(Ralstonia metallidurans)、沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonas palustris)、弗氏志贺氏菌(Shigella flexneri)、火山热原体(Thermoplasma volcanium)和芳香族需氧去氮菌(Thauer a aromatica)。
如本文所用，术语“序列同一性百分比(％)”或“同一性百分比(％)”，也包括“同源性”，被定义为在比对序列并引入缺口(如果必要的话)以达到最大序列同一性百分比并且不考虑任何保守取代作为序列同一性一部分之后候选序列中的氨基酸残基或核苷酸与参考序列中的氨基酸残基或核苷酸相同的百分比。用于比较的序列的最佳比对(除了手动以外)可以通过以下手段来产生：Smith和Waterman，1981，Ads App.Math.2，482的局部同源算法、Neddleman和Wunsch，1970，J.Mol.Biol.48，443的局部同源算法、Pearson和Lipman，1988，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85，2444的相似性搜索方法，或使用这些算法的计算机程序(威斯康星遗传学软件包(Genetics Computer Group，575Science Drive，Madison，Wis.)中的GAP、BESTFIT、FASTA、BLAST P、BLAST N和TFASTA)。在一个实施方案中，基因或蛋白质与本文所公开的基因或蛋白质至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同。
在一些实施方案中，诱变编码草酸分解代谢酶的基因；选择表现出活性增加的突变体；并且将诱变的编码草酸分解代谢酶的基因分离并插入细菌细胞中。在一个实施方案中，可以筛选和选择允许细菌在草酸盐作为唯一碳源上生长的自发突变体。包含本文所述修饰的基因可存在于质粒或染色体上。表2中列出本公开的草酸分解代谢酶的非限制性实例。
表2.草酸分解代谢酶多核苷酸序列
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在一个实施方案中，编码一种或多种草酸分解代谢酶的一个或多个基因序列包括甲酰辅酶A:草酸辅酶A转移酶序列。在一个实施方案中，甲酰辅酶A:草酸辅酶A转移酶是frc，例如来自产甲酸草酸杆菌。因此，在一个实施方案中，frc基因与SEQ ID NO:1的整个序列具有至少约80％的同一性。因此，在一个实施方案中，frc基因与SEQ ID NO:1的整个序列具有至少约90％的同一性。因此，在一个实施方案中，frc基因与SEQ ID NO:1的整个序列具有至少约95％的同一性。因此，在一个实施方案中，frc基因与SEQ ID NO:1的整个序列具有至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。在另一个实施方案中，frc基因包含SEQ ID NO:1的序列。在另一个实施方案中，frc基因由SEQ ID NO:1的序列组成。
在一个实施方案中，编码一种或多种草酸分解代谢酶的一个或多个基因序列包括草酰辅酶A脱羧酶序列。在一个实施方案中，草酰辅酶A脱羧酶是oxc，例如来自产甲酸草酸杆菌。因此，在一个实施方案中，oxc基因与SEQ ID NO:2的整个序列具有至少约80％的同一性。因此，在一个实施方案中，oxc基因与SEQ ID NO:2的整个序列具有至少约90％的同一性。因此，在一个实施方案中，oxc基因与SEQ ID NO:2的整个序列具有至少约95％的同一性。因此，在一个实施方案中，oxc基因与SEQ ID NO:2的整个序列具有至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。在另一个实施方案中，oxc基因包含SEQ ID NO:2的序列。在另一个实施方案中，oxc基因由SEQID NO:2的序列组成。在另一个实施方案中，oxc基因由SEQ ID NO:2的序列组成。
在一个实施方案中，至少一种编码至少一种草酸分解代谢酶的基因包含草酸辅酶A连接酶序列。在一个实施方案中，草酸辅酶A连接酶是来自酿酒酵母的ScAAE3。因此，在一个实施方案中，ScAAE3基因与SEQ ID NO:3的整个序列具有至少约80％的同一性。因此，在一个实施方案中，ScAAE3基因与SEQ ID NO:3的整个序列具有至少约90％的同一性。因此，在一个实施方案中，ScAAE3基因与SEQ ID NO:3的整个序列具有至少约95％的同一性。因此，在一个实施方案中，ScAAE3基因与SEQ ID NO:3的整个序列具有至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。在另一个实施方案中，ScAAE3基因包含SEQ ID NO:3的序列。在另一个实施方案中，ScAAE3基因由SEQ ID NO:3的序列组成。
在一个实施方案中，至少一种编码至少一种草酸分解代谢酶的基因包含乙酰辅酶A:草酸辅酶A转移酶序列。在一个实施方案中，乙酰辅酶A:草酸辅酶A转移酶是来自大肠杆菌、来自酿酒酵母的YfdE。因此，在一个实施方案中，YfdE基因与SEQ ID NO:4的整个序列具有至少约80％的同一性。因此，在一个实施方案中，YfdE基因与SEQ ID NO:4的整个序列具有至少约90％的同一性。因此，在一个实施方案中，YfdE基因与SEQ ID NO:4的整个序列具有至少约95％的同一性。因此，在一个实施方案中，YfdE基因与SEQ ID NO:4的整个序列具有至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。在另一个实施方案中，YfdE基因包含SEQ ID NO:4的序列。在另一个实施方案中，YfdE基因由SEQ ID NO:4的序列组成。
表3·草酸分解代谢酶的多肽序列
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在一个实施方案中，由一种或多种草酸盐分解代谢盒编码并由遗传工程化细菌表达的一种或多种多肽包括甲酰辅酶A转移酶，例如来自产甲酸草酸杆菌的frc。在一个实施方案中，多肽与SEQ IDNO:5具有至少约80％的同一性。在另一个实施方案中，由一种或多种草酸盐分解代谢基因或基因盒编码并由遗传工程化细菌表达的一种或多种多肽与SEQ IDNO:5具有至少约85％的同一性。在一个实施方案中，由一种或多种草酸盐分解代谢基因或基因盒编码并由遗传工程化细菌表达的一种或多种多肽与SEQ ID NO:5具有至少约90％的同一性。在一个实施方案中，由一种或多种草酸盐分解代谢基因或基因盒编码并由遗传工程化细菌表达的一种或多种多肽与SEQ ID NO:5具有至少约95％的同一性。在另一个实施方案中，由一种或多种草酸盐分解代谢基因或基因盒编码并由遗传工程化细菌表达的一种或多种多肽与SEQ ID NO:5具有至少约96％、97％、98％或99％的同一性。因此，在一个实施方案中，由一种或多种草酸盐分解代谢基因或基因盒编码并由遗传工程化细菌表达的一种或多种多肽与SEQ ID NO:5具有至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。在另一个实施方案中，由一种或多种草酸盐分解代谢基因或基因盒编码并由遗传工程化细菌表达的一种或多种多肽包含SEQ ID NO:5的序列。在另一个实施方案中，由一种或多种草酸盐分解代谢基因或基因盒编码并由遗传工程化细菌表达的一种或多种多肽由SEQ ID NO:5的序列组成。
在一个实施方案中，由一种或多种草酸盐分解代谢盒编码并由工程化细菌表达的一种或多种多肽包括草酰辅酶A脱羧酶，例如来自产甲酸草酸杆菌的oxc。在一个实施方案中，多肽与SEQ ID NO:6具有至少约80％的同一性。在另一个实施方案中，由一种或多种草酸盐分解代谢基因或基因盒编码并由工程化细菌表达的一种或多种多肽与SEQ ID NO:6具有至少约85％的同一性。在一个实施方案中，由一种或多种草酸盐分解代谢基因或基因盒编码并由工程化细菌表达的一种或多种多肽与SEQ ID NO:6具有至少约90％的同一性。在一个实施方案中，由一种或多种草酸盐分解代谢基因或基因盒编码并由工程化细菌表达的一种或多种多肽与SEQ ID NO:6具有至少约95％的同一性。在另一个实施方案中，由一种或多种草酸盐分解代谢基因或基因盒编码并由工程化细菌表达的一种或多种多肽与SEQ IDNO:6具有至少约96％、97％、98％或99％的同一性。因此，在一个实施方案中，由一种或多种草酸盐分解代谢基因或基因盒编码并由遗传工程化细菌表达的一种或多种多肽与SEQ IDNO:6具有至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。在另一个实施方案中，由一种或多种草酸盐分解代谢基因或基因盒编码并由工程化细菌表达的一种或多种多肽包含SEQID NO:6的序列。在另一个实施方案中，由一种或多种草酸盐分解代谢基因或基因盒编码并由遗传工程化细菌表达的一种或多种多肽由SEQ ID NO:6的序列组成。
在一个实施方案中，由一种或多种草酸盐分解代谢基因或基因盒编码并由工程化细菌表达的一种或多种多肽包括草酸辅酶A连接酶，例如来自酿酒酵母的ScAAE3。在一个实施方案中，多肽与SEQ ID NO:7具有至少约80％的同一性。在另一个实施方案中，由一种或多种草酸盐分解代谢基因或基因盒编码并由工程化细菌表达的一种或多种多肽与SEQ IDNO:7具有至少约85％的同一性。在一个实施方案中，由一种或多种草酸盐分解代谢基因或基因盒编码并由工程化细菌表达的一种或多种多肽与SEQ ID NO:7具有至少约90％的同一性。在一个实施方案中，由一种或多种草酸盐分解代谢基因或基因盒编码并由工程化细菌表达的一种或多种多肽与SEQ ID NO:7具有至少约95％的同一性。在另一个实施方案中，由一种或多种草酸盐分解代谢基因或基因盒编码并由工程化细菌表达的一种或多种多肽与SEQ ID NO:7具有至少约96％、97％、98％或99％的同一性。因此，在一个实施方案中，由一种或多种草酸盐分解代谢基因或基因盒编码并由工程化细菌表达的一种或多种多肽与SEQID NO:7具有至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。在另一个实施方案中，由一种或多种草酸盐分解代谢基因或基因盒编码并由工程化细菌表达的一种或多种多肽包含SEQID NO:7的序列。在另一个实施方案中，由一种或多种草酸盐分解代谢盒编码并由遗传工程化细菌表达的一种或多种多肽由SEQ ID NO:7的序列组成。
在一个实施方案中，由一种或多种草酸盐分解代谢盒编码并由工程化细菌表达的一种或多种多肽包括乙酰辅酶A:草酸辅酶A转移酶，例如来自大肠杆菌的YfdE。在一个实施方案中，多肽与SEQ ID NO:8具有至少约80％的同一性。在另一个实施方案中，由一种或多种草酸盐分解代谢基因或基因盒编码并由工程化细菌表达的一种或多种多肽与SEQ IDNO:8具有至少约85％的同一性。在一个实施方案中，由一种或多种草酸盐分解代谢基因或基因盒编码并由工程化细菌表达的一种或多种多肽与SEQ ID NO:8具有至少约90％的同一性。在一个实施方案中，由一种或多种草酸盐分解代谢基因或基因盒编码并由工程化细菌表达的一种或多种多肽与SEQ ID NO:8具有至少约95％的同一性。在另一个实施方案中，由一种或多种草酸盐分解代谢基因或基因盒编码并由工程化细菌表达的一种或多种多肽与SEQ ID NO:8具有至少约96％、97％、98％或99％的同一性。因此，在一个实施方案中，由一种或多种草酸盐分解代谢基因或基因盒编码并由遗传工程化细菌表达的一种或多种多肽与SEQ ID NO:8具有至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。在另一个实施方案中，由一种或多种草酸盐分解代谢基因或基因盒编码并由工程化细菌表达的一种或多种多肽包含SEQ ID NO:8的序列。在另一个实施方案中，由一种或多种草酸盐分解代谢基因或基因盒编码并由工程化细菌表达的一种或多种多肽由SEQ ID NO:8的序列组成。
在一个实施方案中，由一种或多种草酸盐分解代谢基因或基因盒编码并由遗传工程化细菌表达的一种或多种多肽包括甲酰辅酶A转移酶，例如来自大肠杆菌的yfdW。在一个实施方案中，多肽与SEQ IDNO:9具有至少约80％的同一性。在另一个实施方案中，由一种或多种草酸盐分解代谢基因或基因盒编码并由工程化细菌表达的一种或多种多肽与SEQ IDNO:9具有至少约85％的同一性。在一个实施方案中，由一种或多种草酸盐分解代谢基因或基因盒编码并由工程化细菌表达的一种或多种多肽与SEQ ID NO:9具有至少约90％的同一性。在一个实施方案中，由一种或多种草酸盐分解代谢基因或基因盒编码并由工程化细菌表达的一种或多种多肽与SEQ ID NO:9具有至少约95％的同一性。在另一个实施方案中，由一种或多种草酸盐分解代谢基因或基因盒编码并由工程化细菌表达的一种或多种多肽与SEQ ID NO:9具有至少约96％、97％、98％或99％的同一性。因此，在一个实施方案中，由一种或多种草酸盐分解代谢基因或基因盒编码并由工程化细菌表达的一种或多种多肽与SEQID NO:9具有至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。在另一个实施方案中，由一种或多种草酸盐分解代谢基因或基因盒编码并由工程化细菌表达的一种或多种多肽包含SEQID NO:9的序列。在另一个实施方案中，由一种或多种草酸盐分解代谢基因或基因盒编码并由工程化细菌表达的一种或多种多肽由SEQ ID NO:9的序列组成。
在一个实施方案中，由一种或多种草酸盐分解代谢基因或基因盒编码并由工程化细菌表达的一种或多种多肽包括草酰辅酶A脱羧酶，例如来自大肠杆菌的yfdU。在一个实施方案中，多肽与SEQ ID NO:10具有至少约80％的同一性。在另一个实施方案中，由一种或多种草酸盐分解代谢基因或基因盒编码并由工程化细菌表达的一种或多种多肽与SEQ IDNO:10具有至少约85％的同一性。在一个实施方案中，由一种或多种草酸盐分解代谢基因或基因盒编码并由工程化细菌表达的一种或多种多肽与SEQ ID NO:10具有至少约90％的同一性。在一个实施方案中，由一种或多种草酸盐分解代谢基因或基因盒编码并由工程化细菌表达的一种或多种多肽与SEQ ID NO:10具有至少约95％的同一性。在另一个实施方案中，由一种或多种草酸盐分解代谢基因或基因盒编码并由工程化细菌表达的一种或多种多肽与SEQ ID NO:10具有至少约96％、97％、98％或99％的同一性。因此，在一个实施方案中，由一种或多种草酸盐分解代谢基因或基因盒编码并由工程化细菌表达的一种或多种多肽与SEQ ID NO:10具有至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。在另一个实施方案中，由一种或多种草酸盐分解代谢基因或基因盒编码并由工程化细菌表达的一种或多种多肽包含SEQ ID NO:10的序列。在另一个实施方案中，由一种或多种草酸盐分解代谢基因或基因盒编码并由工程化细菌表达的一种或多种多肽由SEQ ID NO:10的序列组成。
在一些实施方案中，包含修饰的pks岛的工程化微生物(例如遗传工程化细菌)是非致病性细菌。在一些实施方案中，工程化微生物(例如遗传工程化细菌)是共生细菌。在一些实施方案中，遗传工程化细菌是益生菌。在一些实施方案中，遗传工程化细菌是被修饰或突变以降低或消除致病性的天然致病性细菌。在一些实施方案中，非致病性细菌是革兰氏阴性菌。在一些实施方案中，非致病性细菌是革兰氏阳性菌。示例性细菌包括但不限于拟杆菌属、双歧杆菌属、梭菌属、埃希氏菌属、乳杆菌属和乳球菌属。在一些实施方案中，遗传工程化细菌是大肠杆菌菌株Nissle 1917(大肠杆菌Nissle)，其为已进化成最佳表征的益生菌之一的肠杆菌科革兰氏阴性菌(Ukena等人，2007)。该菌株的特征在于完全无害(Schultz，2008)，并具有GRAS(通常被认为是安全的)状态(Reister等人，2014，着重强调)。
未修饰的大肠杆菌Nissle或遗传工程化细菌可例如被肠道或血清中的防御因子(Sonnenborn等人，2009)或通过在施用后数小时或数天激活杀伤开关(kill switch)而被破坏。因此，该组合物可需要继续施用。在一些实施方案中，为人受试者计算停留时间。
在一些实施方案中，治疗性分子，例如PAL，可在低拷贝质粒、高拷贝质粒或染色体上表达，例如在大肠杆菌Nissle中的一个或多个以下插入位点：malE/K、insB/I、araC/BAD、lacZ、agaI/rsmI、thyA和malP/T。插入位点可处于基因组中的任何位置，例如，在存活和/或生长所需的基因中，诸如thyA(以产生营养缺陷型)；在基因组的活性区域，诸如基因组复制位点附近；和/或在不同的启动子之间，以降低意外转录的风险，诸如在阿拉伯糖操纵子的AraB与AraC之间。在一些实施方案中，多于一个拷贝，例如两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或更多个拷贝的治疗性分子，例如PAL，在一个或多个整合位点处整合到工程化微生物(例如遗传工程化细菌)中的细菌染色体中。在一些实施方案中，工程化微生物(例如遗传工程化细菌)包含一种或多种编码苯丙氨酸代谢酶(PME)的基因；一种或多种用于产生抗癌分子(例如脱腺苷酸环化酶基因(例如，dacA)或能够产生STING激动剂的酶)的基因；以及一种或多种编码修饰的精氨酸生物合成途径(例如缺失的精氨酸阻遏物、修饰的精氨酸阻遏物结合位点和/或精氨酸反馈抗性N-乙酰谷氨酸合酶突变以用于产生精氨酸)的基因。在一些实施方案中，工程化微生物(例如遗传工程化细菌)包含编码PME的基因，其中PME基因可操作地连接至诱导型启动子。在一些实施方案中，微生物(例如细菌)包含非天然PME基因。在一些实施方案中，微生物(例如细菌)包含天然PME基因的另外拷贝。在一些实施方案中，启动子在自然界中与PME基因不相关。
在一些实施方案中，工程化微生物(例如遗传工程化细菌)是一种或多种必需基因的营养缺陷型。例如，必需基因的突变、修饰或切除可导致工程化微生物(例如，遗传工程化细菌)变成营养缺陷型。营养缺陷型修饰旨在导致细菌在没有外源添加的生存或生长所必需的营养素的情况下死亡，因为它们缺乏产生所述必需营养素所必需的一种或多种基因。在一些实施方案中，本文所述的任何工程化微生物(例如，遗传工程化细菌)还在细胞存活和/或生长所必需的基因中包含缺失或突变。
示例性的营养缺陷型提供于WO2016090343、WO2016200614、WO2017139697、WO2016183531、WO2017087580、WO2016141108、WO2017074566、WO2017136792、WO2017136795、WO2018129404、WO2019014391、WO2016210384、WO2017123418、WO2017123676、WO2016183531、WO2018237198、WO2016201380、US20170216370和WO2017040719中，所述专利的内容据此以引用方式整体并入。在一个实施方案中，必需基因是DNA合成基因，例如thyA。胸腺嘧啶是细菌细胞生长所必需的核酸；没有它时，细菌会经历细胞死亡。thyA基因编码胸苷酸合成酶，其为通过将dUMP转化为dT MP来催化胸腺嘧啶合成中的第一步的酶(Sat等人，2003)。在一些实施方案中，微生物(例如，细菌细胞)是thyA营养缺陷型，其中thyA基因被缺失和/或被不相关的基因替代。thyA营养缺陷型仅在存在足够量的胸腺嘧啶时(例如，通过在体外将胸腺嘧啶添加到生长培养基中，或者在体内人类肠道中天然存在高水平胸腺嘧啶的情况下)才能够生长。在一些实施方案中，微生物(例如，细菌细胞)是当细菌存在于哺乳动物肠道中时得到补充的基因的营养缺陷型。在没有足够量的胸腺嘧啶时，thyA营养缺陷型就会死亡。在一些实施方案中，将营养缺陷型修饰用于确保细菌细胞在不存在营养缺陷型基因产物的情况下(例如，在肠道外部)不能存活。
在另一个实施方案中，工程化微生物(例如遗传工程化细菌)是细胞壁合成基因例如dapA中的营养缺陷型。二氨基庚二酸(DAP)是在赖氨酸生物合成途径中合成的氨基酸，并且是细菌细胞壁生长所必需的(Meadow等人，1959；Clarkson等人，1971)。在一些实施方案中，本文所述的任何工程化微生物(例如，遗传工程化细菌)都是dapD营养缺陷型，其中dapD被缺失和/或被不相关的基因替代。dapD营养缺陷型仅在存在足够量的DAP时(例如，通过在体外将DAP添加到生长培养基中，或者在体内人类肠道中天然存在高水平DAP的情况下)才能够生长。在没有足够量的DAP时，dapD营养缺陷型就会死亡。在一些实施方案中，将营养缺陷型修饰用于确保微生物(例如细菌细胞)在不存在营养缺陷型基因产物的情况下(例如，在肠道外部)不能存活。
在一些实施方案中，工程化微生物(例如遗传工程化细菌)包含编码苯丙氨酸解氨酶(PAL)的基因，例如编码来自发光光杆状菌(Photorhabdus luminescens)的PAL的基因，例如stlA。Williams等人，2005。在一些实施方案中，PAL基因(例如stlA基因)可操作地连接至诱导型启动子。在一些实施方案中，PAL基因(例如stlA基因)可操作地连接至可在低氧条件下诱导的启动子，例如PfnrS启动子。在一些实施方案中，PAL基因(例如stlA基因)可操作地连接至可由异丙基β-d-1-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导的启动子，例如Ptac启动子。在一些实施方案中，工程化微生物(例如遗传工程化细菌)包含编码苯丙氨酸转运蛋白的基因，例如编码来自大肠杆菌的苯丙氨酸转运蛋白的基因，例如pheP。在一些实施方案中，苯丙氨酸转运蛋白基因(例如pheP基因)可操作地连接至诱导型启动子。在一些实施方案中，苯丙氨酸转运蛋白基因(例如pheP基因)可操作地连接至可在低氧条件下诱导的启动子，例如PfnrS启动子。在一些实施方案中，工程化微生物(例如遗传工程化细菌)包含编码L-氨基酸脱氨酶(LAAD)的基因，例如pma。在一些实施方案中，LAAD基因可操作地连接至诱导型启动子。在一些实施方案中，LAAD基因可操作地连接至可由阿拉伯糖诱导的启动子，例如PBAD启动子。在一些实施方案中，工程化微生物(例如遗传工程化细菌)包含多个拷贝的编码PAL、苯丙氨酸转运蛋白和/或LAAD的基因。在一些实施方案中，编码PAL、苯丙氨酸转运蛋白和/或LAAD的基因是染色体整合的。
在一些实施方案中，遗传工程化细菌是SYNB1618并且包含三个拷贝的stlA，每个拷贝可操作地连接至PfnrS启动子；两个拷贝的stlA，每个拷贝可操作地连接至Ptac启动子；两个拷贝的pheP，每个拷贝可操作地连接至PfnrS启动子；以及一个拷贝的pma，其可操作地连接至PBAD启动子。参见，例如，Isabella等人，Development of a synthetic livebacterial therapeutic for the human metabolic disease phenylketonuria，NatureBiotechnology(2018)，其通过引用整体并入本文。
在一些实施方案中，工程化微生物(例如遗传工程化细菌)包含编码多肽的PAL基因，与野生型发光光杆状菌PAL例如mPAL1相比，所述多肽具有修饰S92G、H133M、I167K、L432I和V470A。参见，例如，PCT/US2021/023003，其以引用方式整体并入本文。
mPAL1：
MKAKDVQPTIIINKNGLISLEDIYDIAIKQKKVEISTEITELLTHGREKLEEKLNSGEVIYGINTGFGGNANLVVPFEKIAEHQQNLLTFLGAGTGDYMSKPCIKASQFTMLLSVCKGWSATRPIVAQAIVDMINHDIVPLVPRYGSVGASGDLIPLSYIARALCGKGKVYYMGAEIDAAEAIKRAGLTPLSLKAKEGLALINGTRVMSGISAITVIKLEKLFKASISAIALAVEALLASHEHYDARIQQVKNHPGQNAVASALRNLLAGSTQVNLLSGVKEQANKACRHQEITQLNDTLQEVYSIRCAPQVLGIVPESLATARKILEREVISANDNPLIDPENGDVLHGGNFMGQYVARTMDALKLDIALIANHLHAIVALMMDNRFSRGLPNSLSPTPGMYQGFKGVQLSQTALVAAIRHDCAASGIHTIATEQYNQDIVSLGLHAAQDVLEMEQKLRNIVSMTILVACQAIHLRGNISEIAPETAKFYHAVREISSPLITDRALDEDIIRIADAIINDQLPLPEIMLEE
在一些实施方案中，mPAL1基因可操作地连接至诱导型启动子。在一些实施方案中，mPAL1基因可操作地连接至可由异丙基β-d-1-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导的启动子，例如Ptac启动子。在一些实施方案中，工程化微生物(例如遗传工程化细菌)包含编码苯丙氨酸转运蛋白的基因，例如编码来自大肠杆菌的苯丙氨酸转运蛋白的基因，例如pheP。在一些实施方案中，苯丙氨酸转运蛋白基因(例如pheP基因)可操作地连接至诱导型启动子。在一些实施方案中，苯丙氨酸转运蛋白基因(例如pheP基因)可操作地连接至可由异丙基β-d-1-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导的启动子，例如Ptac启动子。在一些实施方案中，工程化微生物(例如遗传工程化细菌)包含编码L-氨基酸脱氨酶(LAAD)的基因，例如pma。在一些实施方案中，LAAD基因可操作地连接至诱导型启动子。在一些实施方案中，LAAD基因可操作地连接至可由阿拉伯糖诱导的启动子，例如PBAD启动子。在一些实施方案中，工程化微生物(例如遗传工程化细菌)包含多个拷贝的编码mPAL1、苯丙氨酸转运蛋白和/或LAAD的基因。在一些实施方案中，编码mPAL1、苯丙氨酸转运蛋白和/或LAAD的基因是染色体整合的。
在一些实施方案中，工程化微生物(例如遗传工程化细菌)包含编码甲硫氨酸γ裂解酶(MGL)、MetNIQ和/或甲硫氨酸脱羧酶(MDC)的基因，分别例如编码来自扩展短杆菌(Brevibacterium aurantiacum)、弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacter freundii)、牙龈卟啉单胞菌(Porphyromo nas gingivalis)或牙龈卟啉单胞菌的MGL的基因；编码来自大肠杆菌的MetNIQ的基因；和/或编码来自链霉菌属(Streptomyces)物种590的MDC的基因。在一些实施方案中，MGL基因可操作地连接至诱导型启动子。在一些实施方案中，MGL基因可操作地连接至可在低氧条件下诱导的启动子，例如PfnrS启动子。在一些实施方案中，MGL基因可操作地连接至可由异丙基β-d-1-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导的启动子，例如Ptac启动子。
在一些实施方案中，metNIQ基因可操作地连接至诱导型启动子。在一些实施方案中，metNIQ基因可操作地连接至可在低氧条件下诱导的启动子，例如PfnrS启动子。在一些实施方案中，metNIQ基因可操作地连接至可由异丙基β-d-1-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导的启动子，例如Ptac启动子。
在一些实施方案中，MDC基因可操作地连接至诱导型启动子。在一些实施方案中，MDC基因可操作地连接至可在低氧条件下诱导的启动子，例如PfnrS启动子。在一些实施方案中，MDC基因可操作地连接至可由异丙基β-d-1-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导的启动子，例如Ptac启动子。
在一些实施方案中，工程化微生物(例如遗传工程化细菌)包含编码甲硫氨酸转运蛋白的基因，例如编码来自枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的甲硫氨酸转运蛋白的基因，例如metP基因。在一些实施方案中，甲硫氨酸转运蛋白基因(例如metP基因)可操作地连接至诱导型启动子。在一些实施方案中，甲硫氨酸转运蛋白基因(例如metP基因)可操作地连接至可在低氧条件下诱导的启动子，例如PfnrS启动子。
在一些实施方案中，工程化微生物(例如遗传工程化细菌)包含多个拷贝的编码MGL、MetNIQ、MDC和/或MetP的基因。在一些实施方案中，工程化微生物(例如遗传工程化细菌)包含位于质粒上的编码MGL、MetNIQ、MDC和/或MetP的基因。在一些实施方案中，将编码MGL、MetNIQ、MDC和/或MetP的基因整合到细菌染色体中。
在一些实施方案中，遗传工程化细菌是SYN7349并且包含各自可操作地连接至Ptet启动子的编码MDC的基因和编码MetNIQ的基因，以及yjeH基因的缺失。参见，例如，PCT/US2021/017775，其以引用方式整体并入本文。
在一些实施方案中，工程化微生物(例如遗传工程化细菌)包含编码一种或多种草酸分解代谢酶(例如，草酸辅酶A连接酶(例如，来自酿酒酵母的ScAAE3)、草酰辅酶A脱羧酶(Oxc，例如来自产甲酸草酸杆菌)和甲酰辅酶A转移酶(例如，Frc，例如来自产甲酸草酸杆菌))的基因。在一些实施方案中，scaaE3基因可操作地连接至诱导型启动子。在一些实施方案中，scaaE3基因可操作地连接至可在低氧条件下诱导的启动子，例如PfnrS启动子。在一些实施方案中，scaaE3基因可操作地连接至可由异丙基β-d-1-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导的启动子，例如Ptac启动子。
在一些实施方案中，oxc基因可操作地连接至诱导型启动子。在一些实施方案中，oxc基因可操作地连接至可在低氧条件下诱导的启动子，例如PfnrS启动子。在一些实施方案中，oxc基因可操作地连接至可由异丙基β-d-1-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导的启动子，例如Ptac启动子。
在一些实施方案中，frc基因可操作地连接至诱导型启动子。在一些实施方案中，frc基因可操作地连接至可在低氧条件下诱导的启动子，例如PfnrS启动子。在一些实施方案中，frc基因可操作地连接至可由异丙基β-d-1-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导的启动子，例如Ptac启动子。
在一些实施方案中，工程化微生物(例如遗传工程化细菌)包含编码草酸盐转运蛋白的基因，例如编码来自产甲酸草酸杆菌的甲硫氨酸转运蛋白的基因，例如oxlT基因。在一些实施方案中，草酸盐转运蛋白基因(例如oxlT基因)可操作地连接至诱导型启动子。在一些实施方案中，草酸盐转运蛋白基因(例如oxlT基因)可操作地连接至可在低氧条件下诱导的启动子，例如PfnrS启动子。
在一些实施方案中，工程化微生物(例如遗传工程化细菌)包含多个拷贝的编码scaaE3、frc、oxc和/或oxlT的基因。在一些实施方案中，工程化微生物(例如遗传工程化细菌)包含位于质粒上的编码scaaE3、frc、oxc和/或oxlT的基因。在一些实施方案中，将编码scaaE3、frc、oxc和/或oxlT的基因整合到细菌染色体中。
在一些实施方案中，遗传工程化细菌是SYN7169或SYNB8802，并且包含各自可操作地连接至FNR启动子的编码scaaE3、oxc、frc的基因和编码oxlT的基因，以及噬菌体3的缺失。参见，例如，PCT/US2021/013401，其以引用方式整体并入本文。
药物组合物
在一些实施方案中，本公开提供了药物组合物，其包含含有修饰的pks岛的工程化微生物，例如工程化细菌。在一些实施方案中，本公开提供了药物组合物，其包含工程化微生物(例如工程化细菌)，所述工程化微生物包含修饰的pks岛和一种或多种用于产生治疗性分子的基因或基因盒。在一些实施方案中，药物组合物可用于治疗、管理、改善和/或预防疾病或病症，例如癌症；或与过量苯丙氨酸相关的疾病，例如PKU；或与高氨血症相关的疾病，例如UCD；或与过量草酸盐相关的疾病，例如HOX，或与本文所述的其他有害分子相关的疾病。
提供了药物组合物，其包含单独的或与预防剂、治疗剂和/或药学上可接受的载剂组合的一种或多种工程化微生物(例如工程化细菌)。在某些实施方案中，药物组合物包含一种微生物(例如细菌)物种、菌株或亚型，其被工程化以包含本文所述的遗传修饰，例如pks岛修饰。在替代性实施方案中，药物组合物包含两种或更多种微生物(例如细菌)物种、菌株和/或亚型，它们各自被工程化以包含本文所述的遗传修饰，例如pks岛修饰。
在一些实施方案中，药物组合物包含工程化微生物(例如工程化细菌)，与合适的对照，例如相同菌株和/或亚型的未修饰细菌中的天然pks岛相比，所述工程化微生物包含修饰的clb序列，所述clb序列选自clbA、clbB、clbC、clbD、clbE、clbF、clbG、clbH、clbI、clbJ、clbK、clbL、clbM、clbN、clbO、clbP、clbQ、clbR和clbS基因序列和/或可操作地连接的启动子序列中的一个或多个。在一些实施方案中，与对照相比，修饰的clb序列是插入、取代和/或缺失。
在一些实施方案中，药物组合物包含工程化微生物(例如工程化细菌)，与合适的对照相比，所述工程化微生物在clbA、clbB、clbC、clbD、clbE、clbF、clbG、clbH、clbI、clbJ、clbK、clbL、clbM、clbN、clbO、clbP、clbQ和clbR基因序列中的一个或多个中包含修饰。
在一些实施方案中，药物组合物包含工程化微生物(例如工程化细菌)，与合适的对照相比，所述工程化微生物在可操作地连接至clbA、clbB、clbC、clbD、clbE、clbF、clbG、clbH、clbI、clbJ、clbK、clbL、clbM、clbN、clbO、clbP、clbQ和clbR基因的启动子序列中的一个或多个中包含修饰。
在一些实施方案中，药物组合物包含工程化微生物(例如工程化细菌)，与合适的对照相比，所述工程化微生物在clbA、clbB、clbC、clbD、clbE、clbF、clbG、clbH、clbI、clbJ、clbK、clbL、clbM、clbN、clbO、clbP、clbQ和clbR基因序列中的每一个中包含修饰。
在一些实施方案中，药物组合物包含工程化微生物(例如工程化细菌)，与合适的对照相比，所述工程化微生物在可操作地连接至clbA、clbB、clbC、clbD、clbE、clbF、clbG、clbH、clbI、clbJ、clbK、clbL、clbM、clbN、clbO、clbP、clbQ、clbR和clbS基因的启动子序列中的每一个中包含修饰。
在一些实施方案中，药物组合物包含工程化微生物(例如工程化细菌)，与合适的对照相比，所述工程化微生物在clbA、clbB、clbC、clbD、clbE、clbF、clbG、clbH、clbI、clbJ、clbK、clbL、clbM、clbN、clbO、clbP、clbQ、clbR和clbS基因序列中的一个或多个中包含修饰。
在一些实施方案中，药物组合物包含工程化微生物(例如工程化细菌)，与合适的对照相比，所述工程化微生物在可操作地连接至clbA、clbB、clbC、clbD、clbE、clbF、clbG、clbH、clbI、clbJ、clbK、clbL、clbM、clbN、clbO、clbP、clbQ、clbR和clbS基因的启动子序列中的一个或多个中包含修饰。
在一些实施方案中，药物组合物包含工程化微生物(例如工程化细菌)，与合适的对照相比，所述工程化微生物在clbA、clbB、clbC、clbD、clbE、clbF、clbG、clbH、clbI、clbJ、clbK、clbL、clbM、clbN、clbO、clbP、clbQ、clbR和clbS基因序列中的每一个中包含修饰。
在一些实施方案中，药物组合物包含工程化微生物(例如工程化细菌)，与合适的对照相比，所述工程化微生物在可操作地连接至clbA、clbB、clbC、clbD、clbE、clbF、clbG、clbH、clbI、clbJ、clbK、clbL、clbM、clbN、clbO、clbP、clbQ、clbR和clbS基因的启动子序列中的每一个中包含修饰。
在一些实施方案中，药物组合物包含工程化微生物(例如工程化细菌)，与合适的对照相比，所述工程化微生物包含未修饰的clbS基因序列、clbA、clbB、clbC、clbD、clbE、clbF、clbG、clbH、clbI、clbJ、clbK、clbL、clbM、clbN、clbO、clbP、clbQ和clbR基因序列中的每一个中的修饰，以及clbS启动子序列中的修饰。
在一些实施方案中，药物组合物包含工程化微生物(例如工程化细菌)，其在pks岛中包含完全或部分缺失，例如clb序列(例如，clb基因或启动子序列)中的完全或缺失。在一些实施方案中，药物组合物包含工程化微生物(例如工程化细菌)，与合适的对照，例如相同菌株和/或亚型的未修饰细菌中的天然pks岛相比，所述工程化微生物在clb序列中包含完全或部分缺失，所述clb序列选自clbA、clbB、clbC、clbD、clbE、clbF、clbG、clbH、clbI、clbJ、clbK、clbL、clbM、clbN、clbO、clbP、clbQ、clbR和clbS基因序列和/或可操作地连接的启动子序列中的一个或多个。在一些实施方案中，与对照，例如相同菌株和/或亚型的未修饰细菌中的天然pks岛中的相应clb序列相比，clb序列(例如clb基因或启动子序列)可缺失至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％。在一些实施方案中，与对照，例如相同菌株和/或亚型的未修饰细菌中的天然pks岛中的相应clb序列相比，clb序列(例如，clb基因或启动子序列)可以是100％缺失的
在一些实施方案中，药物组合物包含工程化微生物(例如工程化细菌)，与合适的对照相比，所述工程化微生物在clbA、clbB、clbC、clbD、clbE、clbF、clbG、clbH、clbI、clbJ、clbK、clbL、clbM、clbN、clbO、clbP、clbQ和clbR基因序列中的一个或多个中包含部分或完全缺失。
在一些实施方案中，药物组合物包含工程化微生物(例如工程化细菌)，与合适的对照相比，所述工程化微生物在可操作地连接至clbA、clbB、clbC、clbD、clbE、clbF、clbG、clbH、clbI、clbJ、clbK、clbL、clbM、clbN、clbO、clbP、clbQ和clbR基因的启动子序列中的一个或多个中包含部分或完全缺失。
在一些实施方案中，药物组合物包含工程化微生物(例如工程化细菌)，与合适的对照相比，所述工程化微生物在clbA、clbB、clbC、clbD、clbE、clbF、clbG、clbH、clbI、clbJ、clbK、clbL、clbM、clbN、clbO、clbP、clbQ和clbR基因序列中的每一个中包含部分或完全缺失。
在一些实施方案中，药物组合物包含工程化微生物(例如工程化细菌)，与合适的对照相比，所述工程化微生物在可操作地连接至clbA、clbB、clbC、clbD、clbE、clbF、clbG、clbH、clbI、clbJ、clbK、clbL、clbM、clbN、clbO、clbP、clbQ、clbR和clbS基因的启动子序列中的每一个中包含部分或完全缺失。
在一些实施方案中，药物组合物包含工程化微生物(例如工程化细菌)，与合适的对照相比，所述工程化微生物在clbA、clbB、clbC、clbD、clbE、clbF、clbG、clbH、clbI、clbJ、clbK、clbL、clbM、clbN、clbO、clbP、clbQ、clbR和clbS基因序列中的一个或多个中包含部分或完全缺失。
在一些实施方案中，药物组合物包含工程化微生物(例如工程化细菌)，与合适的对照相比，所述工程化微生物在可操作地连接至clbA、clbB、clbC、clbD、clbE、clbF、clbG、clbH、clbI、clbJ、clbK、clbL、clbM、clbN、clbO、clbP、clbQ、clbR和clbS基因的启动子序列中的一个或多个中包含部分或完全缺失。
在一些实施方案中，药物组合物包含工程化微生物(例如工程化细菌)，与合适的对照相比，所述工程化微生物在clbA、clbB、clbC、clbD、clbE、clbF、clbG、clbH、clbI、clbJ、clbK、clbL、clbM、clbN、clbO、clbP、clbQ、clbR和clbS基因序列中的每一个中包含部分或完全缺失。
在一些实施方案中，药物组合物包含工程化微生物(例如工程化细菌)，与合适的对照相比，所述工程化微生物在可操作地连接至clbA、clbB、clbC、clbD、clbE、clbF、clbG、clbH、clbI、clbJ、clbK、clbL、clbM、clbN、clbO、clbP、clbQ、clbR和clbS基因的启动子序列中的每一个中包含部分或完全缺失。
在一些实施方案中，药物组合物包含工程化微生物(例如工程化细菌)，与合适的对照相比，所述工程化微生物包含未修饰的clbS基因序列、clbA、clbB、clbC、clbD、clbE、clbF、clbG、clbH、clbI、clbJ、clbK、clbL、clbM、clbN、clbO、clbP、clbQ和clbR基因序列中的每一个中的部分或完全缺失，以及clbS启动子序列中的部分或完全缺失
在一些实施方案中，药物组合物包含工程化微生物(例如工程化细菌)，与合适的对照，例如包含天然pks岛的相同菌株和/或亚型的未修饰细菌相比，所述工程化微生物包含修饰的pks岛并且表达较少的大肠杆菌素。在一些实施方案中，药物组合物包含工程化微生物(例如工程化细菌)，与对照相比，所述工程化微生物包含修饰的pks岛并且表达较少的N-肉豆蔻酰-D-天冬酰胺。在一些实施方案中，药物组合物包含工程化微生物(例如工程化细菌)，与对照相比，所述工程化微生物包含修饰的pks岛并且表现出降低的辅助蛋白活性。在一些实施方案中，药物组合物包含工程化微生物(例如工程化细菌)，与对照相比，所述工程化微生物包含修饰的pks岛并且表现出降低的磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶活性。在一些实施方案中，药物组合物包含工程化微生物(例如工程化细菌)，与对照相比，所述工程化微生物包含修饰的pks岛并且表现出降低的聚酮合酶活性。在一些实施方案中，药物组合物包含工程化微生物(例如工程化细菌)，与对照相比，所述工程化微生物包含修饰的pks岛并且表现出降低的非核糖体肽合酶活性。在一些实施方案中，药物组合物包含工程化微生物(例如工程化细菌)，与对照相比，所述工程化微生物包含修饰的pks岛并且表现出降低的杂合非核糖体肽/聚酮合酶活性。在一些实施方案中，药物组合物包含工程化微生物(例如工程化细菌)，与对照相比，所述工程化微生物包含修饰的pks岛并且表现出降低的羟酰辅酶A脱氢酶活性。在一些实施方案中，药物组合物包含工程化微生物(例如工程化细菌)，与对照相比，所述工程化微生物包含修饰的pks岛和降低的酰基载体蛋白活性。在一些实施方案中，药物组合物包含工程化微生物(例如工程化细菌)，与对照相比，所述工程化微生物包含修饰的pks岛和降低的αβ脱氢酶活性。在一些实施方案中，药物组合物包含工程化微生物(例如工程化细菌)，与对照相比，所述工程化微生物包含修饰的pks岛并且表现出降低的酰基转移酶活性。在一些实施方案中，药物组合物包含工程化微生物(例如工程化细菌)，与对照相比，所述工程化微生物包含修饰的pks岛并且表现出降低的酰胺酶活性。在一些实施方案中，药物组合物包含工程化微生物(例如工程化细菌)，与对照相比，所述工程化微生物包含修饰的pks岛并且表现出降低的MATE转运蛋白活性。在一些实施方案中，药物组合物包含工程化微生物(例如工程化细菌)，与对照相比，所述工程化微生物包含修饰的pks岛并且表现出降低的fmtA肽酶活性。在一些实施方案中，药物组合物包含工程化微生物(例如工程化细菌)，与对照相比，所述工程化微生物包含修饰的pks岛并且表现出降低的硫酯酶活性。在一些实施方案中，药物组合物包含工程化微生物(例如工程化细菌)，与对照相比，所述工程化微生物包含修饰的pks岛并且表现出前大肠杆菌素跨细胞质膜转运减少。在一些实施方案中，药物组合物包含工程化微生物(例如工程化细菌)，与对照相比，所述工程化微生物包含修饰的pks岛并且表现出前大肠杆菌素跨周质转运减少。在一些实施方案中，药物组合物包含工程化微生物(例如工程化细菌)，与对照相比，所述工程化微生物包含修饰的pks岛并且表现出前大肠杆菌素到大肠杆菌素的裂解减少。
在一些实施方案中，药物组合物包含工程化微生物(例如工程化细菌)，所述工程化微生物包含修饰的pks岛并且还包含一种或多种用于产生如本文所述的期望的治疗性分子的基因。在一些实施方案中，一种或多种用于产生期望的治疗性分子的基因可操作地连接至启动子，例如诱导型启动子，如本文所述。
在一些实施方案中，药物组合物包含工程化微生物(例如工程化细菌)，所述工程化微生物包含修饰的pks岛并且还包含一种或多种用于产生至少一种苯丙氨酸代谢酶(例如，PAL和/或LAAD)的基因或基因盒，如本文所述。
在一些实施方案中，药物组合物包含工程化微生物(例如工程化细菌)，所述工程化微生物包含修饰的pks岛并且还包含一种或多种编码GOT1、GOT2、TAT和/或DDC的基因。
在一些实施方案中，药物组合物包含工程化微生物(例如工程化细菌)，所述工程化微生物包含修饰的pks岛并且还包含一种或多种编码修饰的精氨酸生物合成途径(例如，缺失的精氨酸阻遏物、修饰的精氨酸阻遏物结合位点和/或精氨酸反馈抗性N-乙酰谷氨酸合酶突变)的基因或基因盒。
在一些实施方案中，药物组合物包含工程化微生物(例如工程化细菌)，所述工程化微生物包含修饰的pks岛并且还包含一种或多种用于产生抗癌分子(例如，脱腺苷酸环化酶基因或能够产生干扰素基因刺激物激动剂的酶)的基因或基因盒。
在一些实施方案中(例如，其中微生物(例如细菌)被遗传工程化以包含PME)，活性可通过苯丙氨酸到TCA的转化率来测量，例如在体外或体内，例如尿HA。在一些实施方案中(例如，其中微生物(例如细菌)被遗传工程化以包含PME)，活性可通过苯丙氨酸到PPA的转化率来测量，例如在体外或体内。在一些实施方案中(例如，其中微生物(例如细菌)被遗传工程化以包含修饰的精氨酸生物合成途径，例如缺失的精氨酸阻遏物、修饰的精氨酸阻遏物结合位点和/或精氨酸反馈抗性N-乙酰谷氨酸合酶突变)，活性可通过测定氨、精氨酸或瓜氨酸的水平来测量，例如，在体外或体内。在一些实施方案中(例如，其中微生物(例如细菌)被遗传工程化以包含抗癌分子，例如dacA)，活性可通过测定环状二核苷酸(例如环状二-AMP)的水平来测量，例如，在体外或体内。
在一些实施方案中，药物组合物包含工程化微生物(例如工程化细菌)，所述工程化微生物包含修饰的pks岛并且还包含一种或多种用于产生至少一种草酸代谢酶的基因或基因盒，如本文所述。
在一些实施方案中，药物组合物包含工程化微生物，所述工程化微生物包含修饰的pks岛并且还包含一种或多种编码至少一种草酸分解代谢酶的基因和/或基因盒，并且能够将草酸盐转化为草酰辅酶A。在一些实施方案中，药物组合物包含工程化微生物，所述工程化微生物包含修饰的pks岛并且还包含一种或多种编码至少一种草酸分解代谢酶的基因和/或基因盒，并且能够将草酰辅酶A转化为甲酸盐和二氧化碳。在一些实施方案中，药物组合物包含工程化微生物，所述工程化微生物包含修饰的pks岛并且还包含一种或多种编码至少一种草酸分解代谢酶的基因和/或基因盒，并且能够将草酸盐转化为草酰辅酶A并将草酰辅酶A转化为甲酸盐和二氧化碳。在一些实施方案中，药物组合物包含工程化微生物，所述工程化微生物包含修饰的pks岛并且还包含一种或多种编码一种或多种草酸分解代谢酶的基因和或基因盒，所述草酸分解代谢酶将草酸盐和甲酰辅酶A转化为草酰辅酶A和甲酸盐。在一些实施方案中，药物组合物包含工程化微生物，所述工程化微生物包含修饰的pks岛并且还包含一种或多种编码一种或多种草酸分解代谢酶的基因和/或基因盒，所述草酸分解代谢酶将草酸盐和乙酰辅酶A转化为草酰辅酶A和乙酸盐。在一些实施方案中，药物组合物包含工程化微生物，所述工程化微生物包含修饰的pks岛并且还包含一种或多种编码一种或多种草酸分解代谢酶的基因和/或基因盒，所述草酸分解代谢酶将草酸盐和辅酶A转化为草酰辅酶A(例如，通过将一个ATP转化为AMP加二磷酸盐)。在一些实施方案中，药物组合物包含工程化微生物，所述工程化微生物包含修饰的pks岛并且还包含一种或多种编码一种或多种草酸分解代谢酶的基因和/或基因盒，所述草酸分解代谢酶将草酰辅酶A转化为二氧化碳和甲酰辅酶A。在一些实施方案中，药物组合物包含工程化微生物，所述工程化微生物包含修饰的pks岛并且由于草酸盐分解代谢而进一步产生甲酸盐。在一些实施方案中，工程化细菌包含修饰的pks岛并且由于草酸盐分解代谢而进一步产生甲酸盐和二氧化碳。在一些实施方案中，药物组合物包含工程化微生物，所述工程化微生物包含修饰的pks岛并且由于草酸盐分解代谢而进一步产生乙酸盐。在一些实施方案中，药物组合物包含工程化微生物，所述工程化微生物包含修饰的pks岛并且由于草酸盐分解代谢而进一步产生乙酸盐和二氧化碳。在一些实施方案中，药物组合物包含工程化微生物，所述工程化微生物包含修饰的pks岛并且由于草酸盐分解代谢而进一步产生甲酸盐、乙酸盐和二氧化碳。
在一些实施方案中，药物组合物包含工程化微生物(例如工程化细菌)，所述工程化微生物包含如本文所公开的修饰的pks岛和一种或多种编码至少一种草酸分解代谢酶的基因和/或基因盒，并且能够将草酰辅酶A转化为甲酸盐和二氧化碳。在一些实施方案中，药物组合物包含工程化微生物(例如工程化细菌)，所述工程化微生物包含如本文所公开的修饰的pks岛和一种或多种编码至少一种草酸分解代谢酶的基因和/或基因盒，并且能够将草酸盐转化为草酰辅酶A并将草酰辅酶A转化为甲酸盐和二氧化碳。在一些实施方案中，药物组合物包含工程化微生物(例如工程化细菌)，所述工程化微生物包含如本文所公开的修饰的pks岛和一种或多种编码至少一种草酸分解代谢酶的基因和/或基因盒，所述草酸分解代谢酶将草酸盐和甲酰辅酶A转化为草酰辅酶A和甲酸盐。在一些实施方案中，药物组合物包含工程化微生物(例如工程化细菌)，所述工程化微生物包含如本文所公开的修饰的pks岛和一种或多种编码至少一种草酸分解代谢酶的基因和/或基因盒，所述草酸分解代谢酶将草酸盐和乙酰辅酶A转化为草酰辅酶A和乙酸盐。在一些实施方案中，药物组合物包含工程化微生物(例如工程化细菌)，所述工程化微生物包含如本文所公开的修饰的pks岛和一种或多种编码至少一种草酸分解代谢酶的基因和/或基因盒，所述草酸分解代谢酶将草酸盐和辅酶A转化为草酰辅酶A(例如，通过将一个ATP转化为AMP加二磷酸盐)。在一些实施方案中，药物组合物包含工程化微生物(例如工程化细菌)，所述工程化微生物包含如本文所公开的修饰的pks岛和一种或多种编码至少一种草酸分解代谢酶的基因和/或基因盒，所述草酸分解代谢酶将草酰辅酶A转化为二氧化碳和甲酰辅酶A。在一些实施方案中，包含如本文所公开的修饰的pks岛的工程化细菌由于草酸盐分解代谢而产生甲酸盐。在一些实施方案中，药物组合物包含工程化微生物(例如工程化细菌)，所述工程化微生物包含如本文所公开的修饰的pks岛，由于草酸盐分解代谢而产生甲酸盐和二氧化碳。在一些实施方案中，药物组合物包含工程化微生物(例如工程化细菌)，所述工程化微生物包含如本文所公开的修饰的pks岛，由于草酸盐分解代谢而产生乙酸盐。在一些实施方案中，药物组合物包含工程化微生物(例如工程化细菌)，所述工程化微生物包含如本文所公开的修饰的pks岛，由于草酸盐分解代谢而产生乙酸盐和二氧化碳。在一些实施方案中，药物组合物包含工程化微生物(例如工程化细菌)，所述工程化微生物包含如本文所公开的修饰的pks岛，由于草酸盐分解代谢而产生甲酸盐、乙酸盐和二氧化碳。
在一些实施方案中，药物组合物包含工程化微生物(例如工程化细菌)，所述工程化微生物包含修饰的pks岛和一种或多种增加细胞中的草酸盐和/或草酰辅酶A分解代谢速率的草酸分解代谢酶。在一些实施方案中，药物组合物包含工程化微生物(例如工程化细菌)，所述工程化微生物包含修饰的pks岛和一种或多种降低细胞中的草酸盐水平的草酸分解代谢酶。在一些实施方案中，药物组合物包含工程化微生物(例如工程化细菌)，所述工程化微生物包含修饰的pks岛和一种或多种降低细胞中的草酰辅酶A水平的草酸分解代谢酶。在一些实施方案中，药物组合物包含工程化微生物(例如工程化细菌)，所述工程化微生物包含修饰的pks岛和一种或多种降低细胞中的草酸水平的草酸分解代谢酶。
在一些实施方案中，药物组合物包含工程化微生物(例如遗传工程化细菌)，所述工程化微生物包含如本文所公开的修饰的pks岛和一种或多种降低细胞中的草酸盐水平的草酸分解代谢酶。在一些实施方案中，药物组合物包含工程化微生物(例如遗传工程化细菌)，所述工程化微生物包含如本文所公开的修饰的pks岛和一种或多种降低细胞中的草酰辅酶A水平的草酸分解代谢酶。在一些实施方案中，药物组合物包含工程化微生物(例如遗传工程化细菌)，所述工程化微生物包含如本文所公开的修饰的pks岛和一种或多种降低细胞中的草酸水平的草酸分解代谢酶。
在一些实施方案中，药物组合物包含工程化微生物(例如遗传工程化细菌)，所述工程化微生物包含如本文所公开的修饰的pks岛和一种或多种草酸分解代谢酶，与细胞中的其相应草酸盐的水平相比，所述草酸分解代谢酶增加细胞中的草酰辅酶A水平。在一些实施方案中，药物组合物包含工程化微生物(例如遗传工程化细菌)，所述工程化微生物包含如本文所公开的修饰的pks岛和一种或多种草酸分解代谢酶，与细胞中的其相应草酰辅酶A的水平相比，所述草酸分解代谢酶增加细胞中的甲酸盐和二氧化碳水平。在一些实施方案中，药物组合物包含工程化微生物(例如遗传工程化细菌)，所述工程化微生物包含如本文所公开的修饰的pks岛和一种或多种草酸分解代谢酶，与细胞中的草酸盐水平相比，所述草酸分解代谢酶降低草酸盐和/或草酰辅酶A的水平。在一些实施方案中，药物组合物包含工程化微生物(例如工程化细菌)，所述工程化微生物包含修饰的pks岛和至少一种编码草酸盐的输入蛋白的异源基因和至少一种编码至少一种草酸分解代谢酶的异源基因。在一些实施方案中，药物组合物包含工程化微生物(例如工程化细菌)，所述工程化微生物包含至少一种编码甲酸盐的输出蛋白的异源基因和至少一种编码至少一种草酸分解代谢酶的异源基因。在一些实施方案中，药物组合物包含工程化微生物(例如工程化细菌)，所述工程化微生物包含至少一种编码草酸盐:甲酸盐反向转运蛋白的异源基因和至少一种编码至少一种草酸分解代谢酶的异源基因。在一些实施方案中，药物组合物包含工程化微生物(例如遗传工程化细菌)，所述工程化微生物包含如本文所公开的修饰的pks岛、包含至少一种编码至少一种草酸分解代谢酶的异源基因。在一些实施方案中，药物组合物包含工程化微生物(例如遗传工程化细菌)，所述工程化微生物包含如本文所公开的修饰的pks岛、包含至少一种编码草酸盐的输入蛋白的异源基因和至少一种编码至少一种草酸分解代谢酶的异源基因。在一些实施方案中，药物组合物包含工程化微生物(例如遗传工程化细菌)，所述工程化微生物包含如本文所公开的修饰的pks岛、包含至少一种编码甲酸盐的输出蛋白的异源基因和至少一种编码至少一种草酸分解代谢酶的异源基因。在一些实施方案中，药物组合物包含工程化微生物(例如遗传工程化细菌)，所述工程化微生物包含如本文所公开的修饰的pks岛、包含至少一种编码草酸盐:甲酸盐反向转运蛋白的异源基因和至少一种编码至少一种草酸分解代谢酶的异源基因。
在一些实施方案中，药物组合物包含工程化微生物(例如工程化细菌)，所述工程化微生物包含编码一种或多种草酸分解代谢酶的一个或多个基因序列，所述基因序列包括甲酰辅酶A:草酸辅酶A转移酶序列。在一些实施方案中，药物组合物包含工程化微生物(例如工程化细菌)，所述工程化微生物包含甲酰辅酶A:草酸辅酶A转移酶frc，例如来自产甲酸草酸杆菌。在一些实施方案中，药物组合物包含工程化微生物(例如工程化细菌)，所述工程化微生物包含与SEQ ID NO:1的整个序列具有至少约80％同一性的frc基因。在一些实施方案中，药物组合物包含工程化微生物(例如工程化细菌)，所述工程化微生物包含与SEQ IDNO:1的整个序列具有至少约90％同一性的frc基因。在一些实施方案中，药物组合物包含工程化微生物(例如工程化细菌)，所述工程化微生物包含与SEQ ID NO:1的整个序列具有至少约95％同一性的frc基因。在一些实施方案中，药物组合物包含工程化微生物(例如工程化细菌)，所述工程化微生物包含与SEQ ID NO:1的整个序列具有至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的frc基因。在一些实施方案中，药物组合物包含工程化微生物(例如工程化细菌)，所述工程化微生物包含含有SEQ ID NO:1的序列的frc基因。在一些实施方案中，药物组合物包含工程化微生物(例如工程化细菌)，所述工程化微生物包含由SEQ ID NO:1的序列组成的frc基因。
在一些实施方案中，药物组合物包含工程化微生物(例如遗传工程化细菌)，所述工程化微生物包含如本文所公开的修饰的pks岛并且还包含编码一种或多种草酸分解代谢酶的一个或多个基因序列，所述基因序列包括甲酰辅酶A:草酸辅酶A转移酶序列。在一些实施方案中，药物组合物包含工程化微生物(例如遗传工程化细菌)，所述工程化微生物包含如本文所公开的修饰的pks岛，并且还包含甲酰辅酶A:草酸辅酶A转移酶frc，例如来自产甲酸草酸杆菌。在一些实施方案中，药物组合物包含工程化微生物(例如遗传工程化细菌)，所述工程化微生物包含如本文所公开的修饰的pks岛，并且还包含与SEQ ID NO:1的整个序列具有至少约80％同一性的frc基因。在一些实施方案中，药物组合物包含工程化微生物(例如遗传工程化细菌)，所述工程化微生物包含如本文所公开的修饰的pks岛，并且还包含与SEQ ID NO:1的整个序列具有至少约90％同一性的frc基因。在一些实施方案中，药物组合物包含工程化微生物(例如遗传工程化细菌)，所述工程化微生物包含如本文所公开的修饰的pks岛，并且还包含与SEQ ID NO:1的整个序列具有至少约95％同一性的frc基因。在一些实施方案中，药物组合物包含工程化微生物(例如遗传工程化细菌)，所述工程化微生物包含如本文所公开的修饰的pks岛，并且还包含与SEQ ID NO:1的整个序列具有至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的frc基因。在一些实施方案中，药物组合物包含工程化微生物(例如遗传工程化细菌)，所述工程化微生物包含如本文所公开的修饰的pks岛，并且还包含含有SEQ ID NO:1的序列的frc基因。在一些实施方案中，药物组合物包含工程化微生物(例如遗传工程化细菌)，所述工程化微生物包含如本文所公开的修饰的pks岛，并且还包含由SEQ ID NO:1的序列组成的frc基因。
在一些实施方案中，药物组合物包含工程化微生物(例如工程化细菌)，所述工程化微生物包含编码一种或多种草酸分解代谢酶的一个或多个基因序列，所述基因序列包括草酰辅酶A脱羧酶序列。在一些实施方案中，药物组合物包含工程化微生物(例如工程化细菌)，所述工程化微生物包含为例如来自产甲酸草酸杆菌的oxc的草酰辅酶A脱羧酶。在一些实施方案中，药物组合物包含工程化微生物(例如工程化细菌)，所述工程化微生物包含与SEQ ID NO:2的整个序列具有至少约80％同一性的oxc基因。在一些实施方案中，药物组合物包含工程化微生物(例如工程化细菌)，所述工程化微生物还包含与SEQ ID NO:2的整个序列具有至少约90％同一性的oxc基因。在一些实施方案中，药物组合物包含工程化微生物(例如工程化细菌)，所述工程化微生物包含与SEQ ID NO:2的整个序列具有至少约95％同一性的oxc基因。在一些实施方案中，药物组合物包含工程化微生物(例如工程化细菌)，所述工程化微生物包含与SEQ ID NO:2的整个序列具有至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的oxc基因。在一些实施方案中，药物组合物包含工程化微生物(例如工程化细菌)，所述工程化微生物包含含有SEQID NO:2的序列的oxc基因。在一些实施方案中，药物组合物包含工程化微生物(例如工程化细菌)，所述工程化微生物包含由SEQ ID NO:2的序列组成的oxc基因。在一些实施方案中，药物组合物包含工程化微生物(例如工程化细菌)，所述工程化微生物包含由SEQ ID NO:2的序列组成的oxc基因。
在一些实施方案中，药物组合物包含工程化微生物(例如遗传工程化细菌)，所述工程化微生物包含修饰的pks岛并且还包含编码一种或多种草酸分解代谢酶的一个或多个基因序列，所述基因序列包括草酰辅酶A脱羧酶序列。在一些实施方案中，药物组合物包含工程化微生物(例如遗传工程化细菌)，所述工程化微生物包含如本文所公开的修饰的pks岛，并且还包含为例如来自产甲酸草酸杆菌的oxc的草酰辅酶A脱羧酶。在一些实施方案中，药物组合物包含工程化微生物(例如遗传工程化细菌)，所述工程化微生物包含如本文所公开的修饰的pks岛并且还包含与SEQ ID NO:2的整个序列具有至少约80％同一性的oxc基因。在一些实施方案中，药物组合物包含工程化微生物(例如遗传工程化细菌)，所述工程化微生物包含如本文所公开的修饰的pks岛并且还包含与SEQ ID NO:2的整个序列具有至少约90％同一性的oxc基因。在一些实施方案中，药物组合物包含工程化微生物(例如遗传工程化细菌)，所述工程化微生物包含如本文所公开的修饰的pks岛并且还包含与SEQ ID NO:2的整个序列具有至少约95％同一性的oxc基因。在一些实施方案中，药物组合物包含工程化微生物(例如遗传工程化细菌)，所述工程化微生物包含如本文所公开的修饰的pks岛并且还包含与SEQ ID NO:2的整个序列具有至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的oxc基因。在一些实施方案中，药物组合物包含工程化微生物(例如遗传工程化细菌)，所述工程化微生物包含如本文所公开的修饰的pks岛并且还包含含有SEQ ID NO:2的序列的oxc基因。在一些实施方案中，药物组合物包含工程化微生物(例如遗传工程化细菌)，所述工程化微生物包含如本文所公开的修饰的pks岛并且还包含由SEQ ID NO:2的序列组成的oxc基因。在一些实施方案中，药物组合物包含工程化微生物(例如遗传工程化细菌)，所述工程化微生物包含如本文所公开的修饰的pks岛并且还包含由SEQ ID NO:2的序列组成的oxc基因。
在一些实施方案中，药物组合物包含工程化微生物(例如工程化细菌)，所述工程化微生物包含至少一种编码至少一种草酸分解代谢酶的基因，所述基因包含草酸辅酶A连接酶序列。在一些实施方案中，药物组合物包含工程化微生物(例如工程化细菌)，所述工程化微生物包含为来自酿酒酵母的ScAAE3的草酸辅酶A连接酶。在一些实施方案中，药物组合物包含工程化微生物(例如工程化细菌)，所述工程化微生物包含与SEQ ID NO:3的整个序列具有至少约80％同一性的ScAAE3基因。在一些实施方案中，药物组合物包含工程化微生物(例如工程化细菌)，所述工程化微生物包含与SEQ ID NO:3的整个序列具有至少约90％同一性的ScAAE3基因。在一些实施方案中，药物组合物包含工程化微生物(例如工程化细菌)，所述工程化微生物包含与SEQ ID NO:3的整个序列具有至少约95％同一性的ScAAE3基因。在一些实施方案中，药物组合物包含工程化微生物(例如工程化细菌)，所述工程化微生物包含与SEQ ID NO:3的整个序列具有至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的ScAAE3基因。在一些实施方案中，药物组合物包含工程化微生物(例如工程化细菌)，所述工程化微生物还包含含有SEQ IDNO:3的序列的ScAAE3基因。在一些实施方案中，药物组合物包含工程化微生物(例如工程化细菌)，所述工程化微生物包含由SEQ ID NO:3的序列组成的ScAAE3基因。
在一些实施方案中，药物组合物包含工程化微生物(例如遗传工程化细菌)，所述工程化微生物包含如本文所公开的修饰的pks岛，并且还包含至少一种编码至少一种草酸分解代谢酶的基因，所述基因包含草酸辅酶A连接酶序列。在一些实施方案中，药物组合物包含工程化微生物(例如遗传工程化细菌)，所述工程化微生物包含如本文所公开的修饰的pks岛，并且还包含为来自酿酒酵母的ScAAE3的草酸辅酶A连接酶。在一些实施方案中，药物组合物包含工程化微生物(例如遗传工程化细菌)，所述工程化微生物包含如本文所公开的修饰的pks岛并且还包含与SEQ ID NO:3的整个序列具有至少约80％同一性的ScAAE3基因。在一些实施方案中，药物组合物包含工程化微生物(例如遗传工程化细菌)，所述工程化微生物包含如本文所公开的修饰的pks岛并且还包含与SEQ ID NO:3的整个序列具有至少约90％同一性的ScAAE3基因。在一些实施方案中，药物组合物包含工程化微生物(例如遗传工程化细菌)，所述工程化微生物包含如本文所公开的修饰的pks岛并且还包含与SEQ ID NO:3的整个序列具有至少约95％同一性的ScAAE3基因。在一些实施方案中，药物组合物包含工程化微生物(例如遗传工程化细菌)，所述工程化微生物包含如本文所公开的修饰的pks岛并且还包含与SEQ ID NO:3的整个序列具有至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的ScAAE3基因。在一些实施方案中，药物组合物包含工程化微生物(例如遗传工程化细菌)，所述工程化微生物包含如本文所公开的修饰的pks岛并且还包含含有SEQ ID NO:3的序列的ScAAE3基因。在一些实施方案中，药物组合物包含工程化微生物(例如遗传工程化细菌)，所述工程化微生物包含如本文所公开的修饰的pks岛并且还包含由SEQ ID NO:3的序列组成的ScAAE3基因。
在一些实施方案中，药物组合物包含工程化微生物(例如工程化细菌)，所述工程化微生物包含至少一种编码至少一种草酸分解代谢酶的基因，所述基因包含乙酰辅酶A:草酸辅酶A转移酶序列。在一些实施方案中，药物组合物包含工程化微生物(例如工程化细菌)，所述工程化微生物包含来自大肠杆菌、来自酿酒酵母的乙酰辅酶A:草酸辅酶A转移酶YfdE。在一些实施方案中，药物组合物包含工程化微生物(例如工程化细菌)，所述工程化微生物包含与SEQ ID NO:4的整个序列具有至少约80％同一性的YfdE基因。在一些实施方案中，药物组合物包含工程化微生物(例如工程化细菌)，所述工程化微生物包含与SEQ IDNO:4的整个序列具有至少约90％同一性的YfdE基因。在一些实施方案中，药物组合物包含工程化微生物(例如工程化细菌)，所述工程化微生物包含与SEQ ID NO:4的整个序列具有至少约95％同一性的YfdE基因。在一些实施方案中，药物组合物包含工程化微生物(例如工程化细菌)，所述工程化微生物包含与SEQ ID NO:4的整个序列具有至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的YfdE基因。在一些实施方案中，药物组合物包含工程化微生物(例如工程化细菌)，所述工程化微生物包含含有SEQ ID NO:4的序列的YfdE基因。在一些实施方案中，药物组合物包含工程化微生物(例如工程化细菌)，所述工程化微生物包含由SEQ ID NO:4的序列组成的YfdE基因。
在一些实施方案中，药物组合物包含工程化微生物(例如遗传工程化细菌)，所述工程化微生物包含如本文所公开的修饰的pks岛，并且还包含至少一种编码草酸分解代谢酶的基因，所述基因包含乙酰辅酶A:草酸辅酶A转移酶序列。在一些实施方案中，药物组合物包含工程化微生物(例如遗传工程化细菌)，所述工程化微生物包含如本文所公开的修饰的pks岛，并且还包含为来自大肠杆菌、来自酿酒酵母的YfdE的乙酰辅酶A:草酸辅酶A转移酶。在一些实施方案中，药物组合物包含工程化微生物(例如遗传工程化细菌)，所述工程化微生物包含如本文所公开的修饰的pks岛并且还包含与SEQ ID NO:4的整个序列具有至少约80％同一性的YfdE基因。在一些实施方案中，药物组合物包含工程化微生物(例如遗传工程化细菌)，所述工程化微生物包含如本文所公开的修饰的pks岛并且还包含与SEQ ID NO:4的整个序列具有至少约90％同一性的YfdE基因。在一些实施方案中，药物组合物包含工程化微生物(例如遗传工程化细菌)，所述工程化微生物包含如本文所公开的修饰的pks岛并且还包含与SEQ ID NO:4的整个序列具有至少约95％同一性的YfdE基因。在一些实施方案中，药物组合物包含工程化微生物(例如遗传工程化细菌)，所述工程化微生物包含如本文所公开的修饰的pks岛并且还包含与SEQ ID NO:4的整个序列具有至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的YfdE基因。在一些实施方案中，药物组合物包含工程化微生物(例如遗传工程化细菌)，所述工程化微生物包含如本文所公开的修饰的pks岛并且还包含含有SEQ ID NO:4的序列的YfdE基因。在一些实施方案中，药物组合物包含工程化微生物(例如遗传工程化细菌)，所述工程化微生物包含如本文所公开的修饰的pks岛并且还包含由SEQ ID NO:4的序列组成的YfdE基因。
在一些实施方案中，药物组合物包含工程化微生物(例如工程化细菌)，所述工程化微生物包含由一种或多种草酸盐分解代谢盒编码并由遗传工程化细菌表达的一种或多种多肽，所述多肽包括甲酰辅酶A转移酶，例如来自产甲酸草酸杆菌的frc。在一些实施方案中，药物组合物包含工程化微生物(例如工程化细菌)，所述工程化微生物包含一种或多种多肽，所述多肽与SEQ ID NO:5具有至少约80％的同一性。在一些实施方案中，药物组合物包含工程化微生物(例如工程化细菌)，所述工程化微生物包含一种或多种多肽，所述多肽由一种或多种草酸盐分解代谢基因或基因盒编码并由遗传工程化细菌表达，与SEQ ID NO:5具有至少约85％的同一性。在一些实施方案中，药物组合物包含工程化微生物(例如工程化细菌)，所述工程化微生物包含一种或多种多肽，所述多肽由一种或多种草酸盐分解代谢基因或基因盒编码并由遗传工程化细菌表达，与SEQ ID NO:5具有至少约90％的同一性。在一些实施方案中，药物组合物包含工程化微生物(例如工程化细菌)，所述工程化微生物包含一种或多种多肽，所述多肽由一种或多种草酸盐分解代谢基因或基因盒编码并由遗传工程化细菌表达，与SEQ ID NO:5具有至少约95％的同一性。在一些实施方案中，药物组合物包含工程化微生物(例如工程化细菌)，所述工程化微生物包含一种或多种多肽，所述多肽由一种或多种草酸盐分解代谢基因或基因盒编码并由遗传工程化细菌表达，与SEQ ID NO:5具有至少约96％、97％、98％或99％的同一性。在一些实施方案中，药物组合物包含工程化微生物(例如工程化细菌)，所述工程化微生物包含一种或多种多肽，所述多肽由一种或多种草酸盐分解代谢基因或基因盒编码并由遗传工程化细菌表达，与SEQ ID NO:5具有至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。在一些实施方案中，药物组合物包含工程化微生物(例如工程化细菌)，所述工程化微生物包含一种或多种多肽，所述多肽由一种或多种草酸盐分解代谢基因或基因盒编码并由遗传工程化细菌表达，包含SEQ ID NO:5的序列。在一些实施方案中，药物组合物包含工程化微生物(例如工程化细菌)，所述工程化微生物包含一种或多种多肽，所述多肽由一种或多种草酸盐分解代谢基因或基因盒编码并由遗传工程化细菌表达，由SEQ ID NO:5的序列组成。
在一些实施方案中，药物组合物包含工程化微生物(例如工程化细菌)，所述工程化微生物包含如本文所公开的修饰的pks岛，并且还包含由一种或多种草酸盐分解代谢盒编码并由遗传工程化细菌表达的一种或多种多肽，所述多肽包括甲酰辅酶A转移酶，例如来自产甲酸草酸杆菌的frc。在一些实施方案中，药物组合物包含工程化微生物(例如工程化细菌)，所述工程化微生物包含如本文所公开的修饰的pks岛，并且还包含一种或多种多肽，所述多肽与SEQ ID NO:5具有至少约80％的同一性。在一些实施方案中，药物组合物包含工程化微生物(例如工程化细菌)，所述工程化微生物包含如本文所公开的修饰的pks岛，包含由一种或多种草酸盐分解代谢基因或基因盒编码并由遗传工程化细菌表达的一种或多种多肽，所述多肽与SEQ ID NO:5具有至少约85％的同一性。在一些实施方案中，药物组合物包含工程化微生物(例如工程化细菌)，所述工程化微生物包含如本文所公开的修饰的pks岛，并且还包含由一种或多种草酸盐分解代谢基因或基因盒编码并由遗传工程化细菌表达的一种或多种多肽，所述多肽与SEQ ID NO:5具有至少约90％的同一性。在一些实施方案中，药物组合物包含工程化微生物(例如工程化细菌)，所述工程化微生物包含如本文所公开的修饰的pks岛，并且还包含由一种或多种草酸盐分解代谢基因或基因盒编码并由遗传工程化细菌表达的一种或多种多肽，所述多肽与SEQ ID NO:5具有至少约95％的同一性。在一些实施方案中，药物组合物包含工程化微生物(例如工程化细菌)，所述工程化微生物包含如本文所公开的修饰的pks岛，并且还包含由一种或多种草酸盐分解代谢基因或基因盒编码并由遗传工程化细菌表达的一种或多种多肽，所述多肽与SEQ ID NO:5具有至少约96％、97％、98％或99％的同一性。在一些实施方案中，药物组合物包含工程化微生物(例如工程化细菌)，所述工程化微生物包含如本文所公开的修饰的pks岛，并且还包含由一种或多种草酸盐分解代谢基因或基因盒编码并由遗传工程化细菌表达的一种或多种多肽，所述多肽与SEQ ID NO:5具有至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。在一些实施方案中，药物组合物包含工程化微生物(例如工程化细菌)，所述工程化微生物包含如本文所公开的修饰的pks岛，并且还包含由一种或多种草酸盐分解代谢基因或基因盒编码并由遗传工程化细菌表达的一种或多种多肽，所述多肽包含SEQ ID NO:5的序列。在一些实施方案中，药物组合物包含工程化微生物(例如工程化细菌)，所述工程化微生物包含如本文所公开的修饰的pks岛，并且还包含由一种或多种草酸盐分解代谢基因或基因盒编码并由遗传工程化细菌表达的一种或多种多肽，所述多肽由SEQ ID NO:5的序列组成。
在一些实施方案中，药物组合物包含工程化微生物(例如工程化细菌)，所述工程化微生物包含由一种或多种草酸盐分解代谢盒编码并由工程化细菌表达的一种或多种多肽，所述多肽包括草酰辅酶A脱羧酶，例如来自产甲酸草酸杆菌的oxc。在一些实施方案中，药物组合物包含工程化微生物(例如工程化细菌)，所述工程化微生物包含一种或多种多肽，所述多肽与SEQ ID NO:6具有至少约80％的同一性。在一些实施方案中，药物组合物包含工程化微生物(例如工程化细菌)，所述工程化微生物包含一种或多种多肽，所述多肽具有由一种或多种草酸盐分解代谢基因或基因盒编码并由工程化细菌表达的一种或多种多肽，所述多肽与SEQ ID NO:6具有至少约85％的同一性。在一些实施方案中，药物组合物包含工程化微生物(例如工程化细菌)，所述工程化微生物包含一种或多种多肽，所述多肽具有由一种或多种草酸盐分解代谢基因或基因盒编码并由工程化细菌表达的一种或多种多肽，所述多肽与SEQ ID NO:6具有至少约90％的同一性。在一些实施方案中，药物组合物包含工程化微生物(例如工程化细菌)，所述工程化微生物包含一种或多种多肽，所述多肽具有由一种或多种草酸盐分解代谢基因或基因盒编码并由工程化细菌表达的一种或多种多肽，所述多肽与SEQ ID NO:6具有至少约95％的同一性。在一些实施方案中，药物组合物包含工程化微生物(例如工程化细菌)，所述工程化微生物包含一种或多种多肽，所述多肽具有由一种或多种草酸盐分解代谢基因或基因盒编码并由工程化细菌表达的一种或多种多肽，所述多肽与SEQ ID NO:6具有至少约96％、97％、98％或99％的同一性。在一些实施方案中，药物组合物包含工程化微生物(例如工程化细菌)，所述工程化微生物包含一种或多种多肽，所述多肽具有由一种或多种草酸盐分解代谢基因或基因盒编码并由遗传工程化细菌表达的一种或多种多肽，所述多肽与SEQ ID NO:6具有至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。在一些实施方案中，药物组合物包含工程化微生物(例如工程化细菌)，所述工程化微生物包含一种或多种多肽，所述多肽具有由一种或多种草酸盐分解代谢基因或基因盒编码并由工程化细菌表达的一种或多种多肽，所述多肽包含SEQ ID NO:6的序列。在一些实施方案中，药物组合物包含工程化微生物(例如遗传工程化细菌)，所述工程化微生物包含一种或多种多肽，所述多肽具有由一种或多种草酸盐分解代谢基因或基因盒编码并由遗传工程化细菌表达的一种或多种多肽，所述多肽由SEQ ID NO:6的序列组成。
在一些实施方案中，药物组合物包含工程化微生物(例如遗传工程化细菌)，所述工程化微生物包含如本文所公开的修饰的pks岛，并且还包含由一种或多种草酸盐分解代谢盒编码并由工程化细菌表达的一种或多种多肽，所述多肽包括草酰辅酶A脱羧酶，例如来自产甲酸草酸杆菌的oxc。在一些实施方案中，药物组合物包含工程化微生物(例如遗传工程化细菌)，所述工程化微生物包含如本文所公开的修饰的pks岛，并且还包含一种或多种多肽，所述多肽与SEQ ID NO:6具有至少约80％的同一性。在一些实施方案中，药物组合物包含工程化微生物(例如遗传工程化细菌)，所述工程化微生物包含如本文所公开的修饰的pks岛，并且还包含一种或多种多肽，所述多肽具有由一种或多种草酸盐分解代谢基因或基因盒编码并由工程化细菌表达的一种或多种多肽，所述多肽与SEQ ID NO:6具有至少约85％的同一性。在一些实施方案中，药物组合物包含工程化微生物(例如遗传工程化细菌)，所述工程化微生物包含如本文所公开的修饰的pks岛，并且还包含一种或多种多肽，所述多肽具有由一种或多种草酸盐分解代谢基因或基因盒编码并由工程化细菌表达的一种或多种多肽，所述多肽与SEQ ID NO:6具有至少约90％的同一性。在一些实施方案中，药物组合物包含工程化微生物(例如遗传工程化细菌)，所述工程化微生物包含如本文所公开的修饰的pks岛，并且还包含一种或多种多肽，所述多肽具有由一种或多种草酸盐分解代谢基因或基因盒编码并由工程化细菌表达的一种或多种多肽，所述多肽与SEQ ID NO:6具有至少约95％的同一性。在一些实施方案中，药物组合物包含工程化微生物(例如遗传工程化细菌)，所述工程化微生物包含如本文所公开的修饰的pks岛，并且还包含一种或多种多肽，所述多肽具有由一种或多种草酸盐分解代谢基因或基因盒编码并由工程化细菌表达的一种或多种多肽，所述多肽与SEQ ID NO:6具有至少约96％、97％、98％或99％的同一性。在一些实施方案中，药物组合物包含工程化微生物(例如遗传工程化细菌)，所述工程化微生物包含如本文所公开的修饰的pks岛，并且还包含一种或多种多肽，所述多肽具有由一种或多种草酸盐分解代谢基因或基因盒编码并由遗传工程化细菌表达的一种或多种多肽，所述多肽与SEQ ID NO:6具有至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。在一些实施方案中，药物组合物包含工程化微生物(例如遗传工程化细菌)，所述工程化微生物包含如本文所公开的修饰的pks岛，并且还包含一种或多种多肽，所述多肽具有由一种或多种草酸盐分解代谢基因或基因盒编码并由工程化细菌表达的一种或多种多肽，所述多肽包含SEQ ID NO:6的序列。在一些实施方案中，药物组合物包含工程化微生物(例如遗传工程化细菌)，所述工程化微生物包含如本文所公开的修饰的pks岛，并且还包含一种或多种多肽，所述多肽具有由一种或多种草酸盐分解代谢基因或基因盒编码并由遗传工程化细菌表达的一种或多种多肽，所述多肽由SEQ ID NO:6的序列组成。
在一些实施方案中，药物组合物包含工程化微生物(例如工程化细菌)，所述工程化微生物包含由一种或多种草酸盐分解代谢基因或基因盒编码并由工程化细菌表达的一种或多种多肽，所述多肽包括草酸辅酶A连接酶，例如来自酿酒酵母的ScAAE3。在一些实施方案中，药物组合物包含工程化微生物(例如工程化细菌)，所述工程化微生物包含一种或多种多肽，所述多肽与SEQ ID NO:7具有至少约80％的同一性。在一些实施方案中，药物组合物包含工程化微生物(例如工程化细菌)，所述工程化微生物包含一种或多种多肽，所述多肽具有由一种或多种草酸盐分解代谢基因或基因盒编码并由工程化细菌表达的一种或多种多肽，所述多肽与SEQ ID NO:7具有至少约85％的同一性。在一些实施方案中，药物组合物包含工程化微生物(例如工程化细菌)，所述工程化微生物包含一种或多种多肽，所述多肽具有由一种或多种草酸盐分解代谢基因或基因盒编码并由工程化细菌表达的一种或多种多肽，所述多肽与SEQ ID NO:7具有至少约90％的同一性。在一些实施方案中，药物组合物包含工程化微生物(例如工程化细菌)，所述工程化微生物包含一种或多种多肽，所述多肽具有由一种或多种草酸盐分解代谢基因或基因盒编码并由工程化细菌表达的一种或多种多肽，所述多肽与SEQ ID NO:7具有至少约95％的同一性。在一些实施方案中，药物组合物包含工程化微生物(例如工程化细菌)，所述工程化微生物包含一种或多种多肽，所述多肽具有由一种或多种草酸盐分解代谢基因或基因盒编码并由工程化细菌表达的一种或多种多肽，所述多肽与SEQ ID NO:7具有至少约96％、97％、98％或99％的同一性。在一些实施方案中，药物组合物包含工程化微生物(例如工程化细菌)，所述工程化微生物包含一种或多种多肽，所述多肽具有由一种或多种草酸盐分解代谢基因或基因盒编码并由工程化细菌表达的一种或多种多肽，所述多肽与SEQ ID NO:7具有至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。在一些实施方案中，药物组合物包含工程化微生物(例如工程化细菌)，所述工程化微生物包含一种或多种多肽，所述多肽具有由一种或多种草酸盐分解代谢基因或基因盒编码并由工程化细菌表达的一种或多种多肽，所述多肽包含SEQ ID NO:7的序列。在一些实施方案中，药物组合物包含工程化微生物(例如工程化细菌)，所述工程化微生物包含一种或多种多肽，所述多肽具有由一种或多种草酸盐分解代谢盒编码并由遗传工程化细菌表达的一种或多种多肽，所述多肽由SEQ ID NO:7的序列组成。
在一些实施方案中，药物组合物包含工程化微生物(例如遗传工程化细菌)，所述工程化微生物包含如本文所公开的修饰的pks岛，并且还包含由一种或多种草酸盐分解代谢基因或基因盒编码并由工程化细菌表达的一种或多种多肽，所述多肽包括草酸辅酶A连接酶，例如来自酿酒酵母的ScAAE3。在一些实施方案中，药物组合物包含工程化微生物(例如遗传工程化细菌)，所述工程化微生物包含如本文所公开的修饰的pks岛，并且还包含一种或多种多肽，所述多肽与SEQ ID NO:7具有至少约80％的同一性。在一些实施方案中，药物组合物包含工程化微生物(例如遗传工程化细菌)，所述工程化微生物包含如本文所公开的修饰的pks岛，并且还包含由一种或多种草酸盐分解代谢基因或基因盒编码并由工程化细菌表达的一种或多种多肽，所述多肽与SEQ ID NO:7具有至少约85％的同一性。在一些实施方案中，药物组合物包含工程化微生物(例如遗传工程化细菌)，所述工程化微生物包含如本文所公开的修饰的pks岛，并且还包含由一种或多种草酸盐分解代谢基因或基因盒编码并由工程化细菌表达的一种或多种多肽，所述多肽与SEQ ID NO:7具有至少约90％的同一性。在一些实施方案中，药物组合物包含工程化微生物(例如遗传工程化细菌)，所述工程化微生物包含如本文所公开的修饰的pks岛，并且还包含由一种或多种草酸盐分解代谢基因或基因盒编码并由工程化细菌表达的一种或多种多肽，所述多肽与SEQ ID NO:7具有至少约95％的同一性。在一些实施方案中，药物组合物包含工程化微生物(例如遗传工程化细菌)，所述工程化微生物包含如本文所公开的修饰的pks岛，并且还包含由一种或多种草酸盐分解代谢基因或基因盒编码并由工程化细菌表达的一种或多种多肽，所述多肽与SEQ IDNO:7具有至少约96％、97％、98％或99％的同一性。在一些实施方案中，药物组合物包含工程化微生物(例如遗传工程化细菌)，所述工程化微生物包含如本文所公开的修饰的pks岛，并且还包含由一种或多种草酸盐分解代谢基因或基因盒编码并由工程化细菌表达的一种或多种多肽，所述多肽与SEQ ID NO:7具有至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。在一些实施方案中，药物组合物包含工程化微生物(例如遗传工程化细菌)，所述工程化微生物包含如本文所公开的修饰的pks岛，并且还包含由一种或多种草酸盐分解代谢基因或基因盒编码并由工程化细菌表达的一种或多种多肽，所述多肽包含SEQ ID NO:7的序列。在一些实施方案中，药物组合物包含工程化微生物(例如遗传工程化细菌)，所述工程化微生物包含如本文所公开的修饰的pks岛，并且还包含由一种或多种草酸盐分解代谢盒编码并由遗传工程化细菌表达的一种或多种多肽，所述多肽由SEQ ID NO:7的序列组成。
在一些实施方案中，药物组合物包含工程化微生物(例如工程化细菌)，所述工程化微生物包含由一种或多种草酸盐分解代谢盒编码并由工程化细菌表达的一种或多种多肽，所述多肽包括乙酰辅酶A:草酸辅酶A转移酶，例如来自大肠杆菌的YfdE。在一些实施方案中，药物组合物包含工程化微生物(例如工程化细菌)，所述工程化微生物包含一种或多种多肽，所述多肽与SEQ ID NO:8具有至少约80％的同一性。在一些实施方案中，药物组合物包含工程化微生物(例如工程化细菌)，所述工程化微生物包含由一种或多种草酸盐分解代谢基因或基因盒编码并由工程化细菌表达的一种或多种多肽，所述多肽与SEQ ID NO:8具有至少约85％的同一性。在一些实施方案中，药物组合物包含工程化微生物(例如工程化细菌)，所述工程化微生物包含由一种或多种草酸盐分解代谢基因或基因盒编码并由工程化细菌表达的一种或多种多肽，所述多肽与SEQ ID NO:8具有至少约90％的同一性。在一些实施方案中，药物组合物包含工程化微生物(例如工程化细菌)，所述工程化微生物包含由一种或多种草酸盐分解代谢基因或基因盒编码并由工程化细菌表达的一种或多种多肽，所述多肽与SEQ ID NO:8具有至少约95％的同一性。在一些实施方案中，药物组合物包含工程化微生物(例如工程化细菌)，所述工程化微生物包含由一种或多种草酸盐分解代谢基因或基因盒编码并由工程化细菌表达的一种或多种多肽，所述多肽与SEQ ID NO:8具有至少约96％、97％、98％或99％的同一性。在一些实施方案中，药物组合物包含工程化微生物(例如工程化细菌)，所述工程化微生物包含由一种或多种草酸盐分解代谢基因或基因盒编码并由遗传工程化细菌表达的一种或多种多肽，所述多肽与SEQ ID NO:8具有至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。在一些实施方案中，药物组合物包含工程化微生物(例如工程化细菌)，所述工程化微生物包含由一种或多种草酸盐分解代谢基因或基因盒编码并由工程化细菌表达的一种或多种多肽，所述多肽包含SEQ ID NO:8的序列。在一些实施方案中，药物组合物包含工程化微生物(例如工程化细菌)，所述工程化微生物包含由一种或多种草酸盐分解代谢基因或基因盒编码并由工程化细菌表达的一种或多种多肽，所述多肽由SEQ ID NO:8的序列组成。
在一些实施方案中，药物组合物包含工程化微生物(例如遗传工程化细菌)，所述工程化微生物包含如本文所公开的修饰的pks岛，并且还包含由一种或多种草酸盐分解代谢盒编码并由工程化细菌表达的一种或多种多肽，所述多肽包括乙酰辅酶A:草酸辅酶A转移酶，例如来自大肠杆菌的YfdE。在一些实施方案中，药物组合物包含工程化微生物(例如遗传工程化细菌)，所述工程化微生物包含如本文所公开的修饰的pks岛，并且还包含一种或多种多肽，所述多肽与SEQ ID NO:8具有至少约80％的同一性。在一些实施方案中，药物组合物包含工程化微生物(例如遗传工程化细菌)，所述工程化微生物包含如本文所公开的修饰的pks岛，并且还包含由一种或多种草酸盐分解代谢基因或基因盒编码并由工程化细菌表达的一种或多种多肽，所述多肽与SEQ ID NO:8具有至少约85％的同一性。在一些实施方案中，药物组合物包含工程化微生物(例如遗传工程化细菌)，所述工程化微生物包含如本文所公开的修饰的pks岛，并且还包含由一种或多种草酸盐分解代谢基因或基因盒编码并由工程化细菌表达的一种或多种多肽，所述多肽与SEQ ID NO:8具有至少约90％的同一性。在一些实施方案中，药物组合物包含工程化微生物(例如遗传工程化细菌)，所述工程化微生物包含如本文所公开的修饰的pks岛，并且还包含由一种或多种草酸盐分解代谢基因或基因盒编码并由工程化细菌表达的一种或多种多肽，所述多肽与SEQ ID NO:8具有至少约95％的同一性。在一些实施方案中，药物组合物包含工程化微生物(例如遗传工程化细菌)，所述工程化微生物包含如本文所公开的修饰的pks岛，并且还包含由一种或多种草酸盐分解代谢基因或基因盒编码并由工程化细菌表达的一种或多种多肽，所述多肽与SEQ IDNO:8具有至少约96％、97％、98％或99％的同一性。在一些实施方案中，药物组合物包含工程化微生物(例如遗传工程化细菌)，所述工程化微生物包含如本文所公开的修饰的pks岛，并且还包含由一种或多种草酸盐分解代谢基因或基因盒编码并由遗传工程化细菌表达的一种或多种多肽，所述多肽与SEQ ID NO:8具有至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。在一些实施方案中，药物组合物包含工程化微生物(例如遗传工程化细菌)，所述工程化微生物包含如本文所公开的修饰的pks岛，并且还包含由一种或多种草酸盐分解代谢基因或基因盒编码并由工程化细菌表达的一种或多种多肽，所述多肽包含SEQ ID NO:8的序列。在一些实施方案中，药物组合物包含工程化微生物(例如遗传工程化细菌)，所述工程化微生物包含如本文所公开的修饰的pks岛，并且还包含由一种或多种草酸盐分解代谢基因或基因盒编码并由工程化细菌表达的一种或多种多肽，所述多肽由SEQ ID NO:8的序列组成。
在一些实施方案中，药物组合物包含工程化微生物(例如工程化细菌)，所述工程化微生物包含由一种或多种草酸盐分解代谢基因或基因盒编码并由遗传工程化细菌表达的一种或多种多肽，所述多肽包括甲酰辅酶A转移酶，例如来自大肠杆菌的yfdW。在一些实施方案中，药物组合物包含工程化微生物(例如工程化细菌)，所述工程化微生物包含一种或多种多肽，所述多肽与SEQ ID NO:9具有至少约80％的同一性。在一些实施方案中，药物组合物包含工程化微生物(例如工程化细菌)，所述工程化微生物包含由一种或多种草酸盐分解代谢基因或基因盒编码并由工程化细菌表达的一种或多种多肽，所述多肽与SEQ IDNO:9具有至少约85％的同一性。在一些实施方案中，药物组合物包含工程化微生物(例如工程化细菌)，所述工程化微生物包含由一种或多种草酸盐分解代谢基因或基因盒编码并由工程化细菌表达的一种或多种多肽，所述多肽与SEQ ID NO:9具有至少约90％的同一性。在一些实施方案中，药物组合物包含工程化微生物(例如工程化细菌)，所述工程化微生物包含由一种或多种草酸盐分解代谢基因或基因盒编码并由工程化细菌表达的一种或多种多肽，所述多肽与SEQ ID NO:9具有至少约95％的同一性。在一些实施方案中，药物组合物包含工程化微生物(例如工程化细菌)，所述工程化微生物包含由一种或多种草酸盐分解代谢基因或基因盒编码并由工程化细菌表达的一种或多种多肽，所述多肽与SEQ ID NO:9具有至少约96％、97％、98％或99％的同一性。在一些实施方案中，药物组合物包含工程化微生物(例如工程化细菌)，所述工程化微生物包含由一种或多种草酸盐分解代谢基因或基因盒编码并由工程化细菌表达的一种或多种多肽，所述多肽与SEQ ID NO:9具有至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。在一些实施方案中，药物组合物包含工程化微生物(例如工程化细菌)，所述工程化微生物包含由一种或多种草酸盐分解代谢基因或基因盒编码并由工程化细菌表达的一种或多种多肽，所述多肽包含SEQ ID NO:9的序列。在一些实施方案中，药物组合物包含工程化微生物(例如工程化细菌)，所述工程化微生物包含由一种或多种草酸盐分解代谢基因或基因盒编码并由工程化细菌表达的一种或多种多肽，所述多肽由SEQ ID NO:9的序列组成。
在一些实施方案中，药物组合物包含工程化微生物(例如遗传工程化细菌)，所述工程化微生物包含如本文所公开的修饰的pks岛，包含由一种或多种草酸盐分解代谢基因或基因盒编码并由遗传工程化细菌表达的一种或多种多肽，所述多肽包括甲酰辅酶A转移酶，例如来自大肠杆菌的yfdW。在一些实施方案中，药物组合物包含工程化微生物(例如遗传工程化细菌)，所述工程化微生物包含如本文所公开的修饰的pks岛，并且还包含一种或多种多肽，所述多肽与SEQ ID NO:9具有至少约80％的同一性。在一些实施方案中，药物组合物包含工程化微生物(例如遗传工程化细菌)，所述工程化微生物包含如本文所公开的修饰的pks岛，并且还包含由一种或多种草酸盐分解代谢基因或基因盒编码并由工程化细菌表达的一种或多种多肽，所述多肽与SEQ ID NO:9具有至少约85％的同一性。在一些实施方案中，药物组合物包含工程化微生物(例如遗传工程化细菌)，所述工程化微生物包含如本文所公开的修饰的pks岛，并且还包含由一种或多种草酸盐分解代谢基因或基因盒编码并由工程化细菌表达的一种或多种多肽，所述多肽与SEQ ID NO:9具有至少约90％的同一性。在一些实施方案中，药物组合物包含工程化微生物(例如遗传工程化细菌)，所述工程化微生物包含如本文所公开的修饰的pks岛，并且还包含由一种或多种草酸盐分解代谢基因或基因盒编码并由工程化细菌表达的一种或多种多肽，所述多肽与SEQ ID NO:9具有至少约95％的同一性。在一些实施方案中，药物组合物包含工程化微生物(例如遗传工程化细菌)，所述工程化微生物包含如本文所公开的修饰的pks岛，并且还包含由一种或多种草酸盐分解代谢基因或基因盒编码并由工程化细菌表达的一种或多种多肽，所述多肽与SEQ ID NO:9具有至少约96％、97％、98％或99％的同一性。在一些实施方案中，药物组合物包含工程化微生物(例如遗传工程化细菌)，所述工程化微生物包含如本文所公开的修饰的pks岛，并且还包含由一种或多种草酸盐分解代谢基因或基因盒编码并由工程化细菌表达的一种或多种多肽，所述多肽与SEQ ID NO:9具有至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。在一些实施方案中，药物组合物包含工程化微生物(例如遗传工程化细菌)，所述工程化微生物包含如本文所公开的修饰的pks岛，并且还包含由一种或多种草酸盐分解代谢基因或基因盒编码并由工程化细菌表达的一种或多种多肽，所述多肽包含SEQ ID NO:9的序列。在一些实施方案中，药物组合物包含工程化微生物(例如遗传工程化细菌)，所述工程化微生物包含如本文所公开的修饰的pks岛，并且还包含由一种或多种草酸盐分解代谢基因或基因盒编码并由工程化细菌表达的一种或多种多肽，所述多肽由SEQ ID NO:9的序列组成。
在一些实施方案中，药物组合物包含工程化微生物(例如工程化细菌)，所述工程化微生物包含由一种或多种草酸盐分解代谢基因或基因盒编码并由工程化细菌表达的一种或多种多肽，所述多肽包括草酰辅酶A脱羧酶，例如来自大肠杆菌的yfdU。在一些实施方案中，药物组合物包含工程化微生物(例如工程化细菌)，所述工程化微生物包含一种或多种多肽，所述多肽与SEQ ID NO:10具有至少约80％的同一性。在另一个实施方案中，由一种或多种草酸盐分解代谢基因或基因盒编码并由工程化细菌表达的一种或多种多肽与SEQID NO:10具有至少约85％的同一性。在一些实施方案中，药物组合物包含工程化微生物(例如工程化细菌)，所述工程化微生物包含由一种或多种草酸盐分解代谢基因或基因盒编码并由工程化细菌表达的一种或多种多肽，所述多肽与SEQ ID NO:10具有至少约90％的同一性。在一些实施方案中，药物组合物包含工程化微生物(例如工程化细菌)，所述工程化微生物包含由一种或多种草酸盐分解代谢基因或基因盒编码并由工程化细菌表达的一种或多种多肽，所述多肽与SEQ ID NO:10具有至少约95％的同一性。在一些实施方案中，药物组合物包含工程化微生物(例如工程化细菌)，所述工程化微生物包含由一种或多种草酸盐分解代谢基因或基因盒编码并由工程化细菌表达的一种或多种多肽，所述多肽与SEQ ID NO:10具有至少约96％、97％、98％或99％的同一性。在一些实施方案中，药物组合物包含工程化微生物(例如工程化细菌)，所述工程化微生物包含由一种或多种草酸盐分解代谢基因或基因盒编码并由工程化细菌表达的一种或多种多肽，所述多肽与SEQ ID NO:10具有至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。在一些实施方案中，药物组合物包含工程化微生物(例如工程化细菌)，所述工程化微生物包含由一种或多种草酸盐分解代谢基因或基因盒编码并由工程化细菌表达的一种或多种多肽，所述多肽包含SEQ ID NO:10的序列。在一些实施方案中，药物组合物包含工程化微生物(例如工程化细菌)，所述工程化微生物包含由一种或多种草酸盐分解代谢基因或基因盒编码并由工程化细菌表达的一种或多种多肽，所述多肽由SEQ ID NO:10的序列组成。
在一些实施方案中，药物组合物包含工程化微生物(例如遗传工程化细菌)，所述工程化微生物包含如本文所公开的修饰的pks岛，并且还包含由一种或多种草酸盐分解代谢基因或基因盒编码并由工程化细菌表达的一种或多种多肽，所述多肽包括草酰辅酶A脱羧酶，例如来自大肠杆菌的yfdU。在一些实施方案中，药物组合物包含工程化微生物(例如遗传工程化细菌)，所述工程化微生物包含如本文所公开的修饰的pks岛，并且还包含一种或多种多肽，所述多肽与SEQ ID NO:10具有至少约80％的同一性。在一些实施方案中，药物组合物包含工程化微生物(例如遗传工程化细菌)，所述工程化微生物包含如本文所公开的修饰的pks岛，并且还包含由一种或多种草酸盐分解代谢基因或基因盒编码并由工程化细菌表达的一种或多种多肽，所述多肽与SEQ ID NO:10具有至少约85％的同一性。在一些实施方案中，药物组合物包含工程化微生物(例如遗传工程化细菌)，所述工程化微生物包含如本文所公开的修饰的pks岛，并且还包含由一种或多种草酸盐分解代谢基因或基因盒编码并由工程化细菌表达的一种或多种多肽，所述多肽与SEQ ID NO:10具有至少约90％的同一性。在一些实施方案中，药物组合物包含工程化微生物(例如遗传工程化细菌)，所述工程化微生物包含如本文所公开的修饰的pks岛，并且还包含由一种或多种草酸盐分解代谢基因或基因盒编码并由工程化细菌表达的一种或多种多肽，所述多肽与SEQ ID NO:10具有至少约95％的同一性。在一些实施方案中，药物组合物包含工程化微生物(例如遗传工程化细菌)，所述工程化微生物包含如本文所公开的修饰的pks岛，并且还包含由一种或多种草酸盐分解代谢基因或基因盒编码并由工程化细菌表达的一种或多种多肽，所述多肽与SEQIDNO:10具有至少约96％、97％、98％或99％的同一性。在一些实施方案中，药物组合物包含工程化微生物(例如遗传工程化细菌)，所述工程化微生物包含如本文所公开的修饰的pks岛，并且还包含由一种或多种草酸盐分解代谢基因或基因盒编码并由工程化细菌表达的一种或多种多肽，所述多肽与SEQ ID NO:10具有至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。在一些实施方案中，药物组合物包含工程化微生物(例如遗传工程化细菌)，所述工程化微生物包含如本文所公开的修饰的pks岛，并且还包含由一种或多种草酸盐分解代谢基因或基因盒编码并由工程化细菌表达的一种或多种多肽，所述多肽包含SEQ ID NO:10的序列。在一些实施方案中，药物组合物包含工程化微生物(例如遗传工程化细菌)，所述工程化微生物包含如本文所公开的修饰的pks岛，并且还包含由一种或多种草酸盐分解代谢基因或基因盒编码并由工程化细菌表达的一种或多种多肽，所述多肽由SEQ ID NO:10的序列组成。
本文所述的药物组合物可使用一种或多种生理上可接受的载剂以常规方式配制，所述生理上可接受的载剂包括赋形剂和助剂，它们有助于将活性成分加工成用于药物用途的组合物。配制药物组合物的方法是本领域已知的(参见例如，“Remington'sPharmaceutical Sciences,”Mack Publishing Co.，Easton，Pa.)。在一些实施方案中，对药物组合物进行压片、冻干、直接压缩、常规混合、溶解、造粒、磨细、乳化、包封、包埋或喷雾干燥，以形成片剂、颗粒剂、纳米颗粒、纳米胶囊、微胶囊、微型片剂、丹剂或粉剂，它们可以是肠溶包衣的或未包衣的。适当的制剂取决于施用途径。
本文所述的工程化微生物(例如工程化细菌)可被配制为呈任何合适剂型(例如，用于口服施用的液体、胶囊、小药囊、硬胶囊、软胶囊、片剂、肠溶包衣片剂、悬浮粉剂、颗粒剂或基质缓释制剂)和用于任何合适施用类型(例如，口服、局部、注射、立即释放、脉冲释放、延迟释放或持续释放)的药物组合物。
工程化微生物(例如工程化细菌)可被配制成药物组合物，所述药物组合物包含一种或多种药学上可接受的载剂、增稠剂、稀释剂、缓冲液、缓冲剂、表面活性剂、中性或阳离子脂质、脂质复合物、脂质体、渗透促进剂、载剂化合物和其他药学上可接受的载剂或剂。例如，药物组合物可以包括但不限于添加碳酸氢钙、碳酸氢钠、磷酸钙、各种糖和各种类型的淀粉、纤维素衍生物、明胶、植物油、聚乙二醇和表面活性剂(包括例如聚山梨醇酯20)。在一些实施方案中，本发明的工程化微生物(例如工程化细菌)可配制在碳酸氢钠溶液(例如，1摩尔碳酸氢钠溶液)中(例如，以缓冲酸性细胞环境，诸如胃)。在一些实施方案中，工程化微生物包含苯丙氨酸代谢酶，诸如苯丙氨酸解氨酶，并被配制在碳酸氢钠或碳酸氢钙的溶液中，任选地与PPI一起，以缓冲酸性环境(例如，小于pH 1、小于pH 2、小于pH 3、小于pH 4、小于pH 5、小于pH 6，或小于pH 7)和/或降低环境的酸度(例如，导致pH大于5、pH大于6、pH大于7、pH大于8、pH大于9，或pH大于10)，例如，以调节受试者肠道的酸度或酸性环境。在一些实施方案中，工程化微生物包含苯丙氨酸代谢酶诸如苯丙氨酸解氨酶，被配制在碳酸氢钠或碳酸氢钙的溶液中，并进一步与止吐药一起施用(例如，之前、同时、之后)。止吐药的实例包括但不限于异丙嗪、氯苯甲嗪、羟嗪、氟哌利多(droperidol)、甲氧氯普胺、昂丹司琼(ondansetron)、多拉司琼(dolasetron)、马罗匹坦(maropitant)、吩噻嗪(phenotyhiazines)、法莫替丁(famotidine)、雷尼替丁(ranitidine)、奥美拉唑(omeprazole)、泮托拉唑(pantoprazole)、米索前列醇质子泵抑制剂、组胺-2受体拮抗剂、血清素(5-HT3)拮抗剂、抗组胺药、丁酰苯或胃肠动力剂。可将工程化微生物(例如工程化细菌)以中性或盐的形式施用和配制。药学上可接受的盐包括与阴离子形成的盐，诸如衍生自盐酸、磷酸、乙酸、草酸、酒石酸等的那些盐，以及与阳离子形成的盐，诸如衍生自钠、钾、铵、钙、氢氧化铁、异丙胺、三乙胺、2-乙氨基乙醇、组氨酸、普鲁卡因等的那些盐。
本文公开的药物组合物可局部施用并配制成软膏、乳膏、透皮贴剂、洗剂、凝胶、香波、喷雾剂、气雾剂、溶液、乳液的形式或本领域技术人员熟知的其他形式。参见，例如，“Remington'sPharmaceutical Sciences,”Mack Publishing Co.，Easton，Pa.。在一个实施方案中，对于不可喷雾的局部剂型，采用包含载剂或与局部应用相容的一种或多种赋形剂并具有大于水的动态粘度的粘性至半固体或固体形式。合适的制剂包括但不限于溶液、混悬液、乳液、乳膏、软膏、粉剂、搽剂、油膏等，它们可以被灭菌或与辅助剂(例如，防腐剂、稳定剂、湿润剂、缓冲剂或盐)混合以用于影响各种特性(例如渗透压)。其他合适的局部剂型包括可喷雾的气溶胶制剂，其中与固体或液体惰性载剂组合的活性成分被包装在与加压挥发物(例如，气体推进剂，诸如氟利昂)的混合物中或在挤压瓶中。也可以将保湿剂或湿润剂添加到药物组合物和剂型中。此类附加成分的实例是本领域熟知的。在一个实施方案中，包含本发明重组细菌的药物组合物可以被配制成卫生产品。例如，卫生产品可以是抗细菌制剂或发酵产品(诸如发酵液)。卫生产品可以是例如香波、调理剂、乳膏、糊剂、洗剂和润唇膏。
可将本文公开的药物组合物口服施用并且配制成片剂、丸剂、糖衣丸、胶囊、液体、凝胶、糖浆、浆液、混悬液等。可以使用固体赋形剂制备用于口服使用的药物组合物，任选地研磨所得混合物并加工颗粒混合物，之后如果需要则添加合适的助剂以获得片剂或糖衣丸芯。合适的赋形剂包括但不限于填充剂，诸如糖，包括乳糖、蔗糖、甘露醇或山梨醇；纤维素组合物，诸如玉米淀粉、小麦淀粉、大米淀粉、马铃薯淀粉、明胶、黄蓍胶、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羧甲基纤维素钠；和/或生理上可接受的聚合物，诸如聚乙烯吡咯烷酮(PVP)或聚乙二醇(PEG)。也可以添加崩解剂，诸如交联聚乙烯吡咯烷酮、琼脂、海藻酸或其盐诸如海藻酸钠。
片剂或胶囊可以通过常规手段与以下物质一起制备：药学上可接受的赋形剂，诸如粘合剂(例如，预凝胶化玉米淀粉、聚乙烯吡咯烷酮、羟丙基甲基纤维素、羧甲基纤维素、聚乙二醇、蔗糖、葡萄糖、山梨醇、淀粉、树胶、高岭土和黄蓍胶)；填充剂(例如，乳糖、微晶纤维素或磷酸氢钙)；润滑剂(例如，钙、铝、锌、硬脂酸、聚乙二醇、十二烷基硫酸钠、淀粉、苯甲酸钠、L-亮氨酸、硬脂酸镁、滑石或二氧化硅)；崩解剂(例如，淀粉、马铃薯淀粉、淀粉羟乙酸钠、糖、纤维素衍生物、二氧化硅粉末)；或湿润剂(例如，十二烷基硫酸钠)。可以通过本领域熟知的方法对片剂进行包衣。可以存在包衣壳，并且常见的膜包括但不限于聚交酯、聚乙醇酸、聚酸酐、其他可生物降解的聚合物、海藻酸盐-聚赖氨酸-海藻酸盐(APA)、海藻酸盐-聚甲烯-共-胍-海藻酸盐(A-PMCG-A)、羟甲基丙烯酸酯-甲基丙烯酸甲酯(HEMA-MMA)、多层HEMA-MMA-MAA、聚丙烯腈-氯乙烯(PAN-PVC)、丙烯腈/甲代烯丙基磺酸钠(AN-69)、聚乙二醇/聚五甲基环五硅氧烷/聚二甲基硅氧烷(PEG/PD5/PDMS)、聚N,N-二甲基丙烯酰胺(PDMAAm)、含硅胶囊、硫酸纤维素/海藻酸钠/聚甲烯-共-胍(CS/A/PMCG)、醋酸邻苯二甲酸纤维素、海藻酸钙、k-角叉菜胶-刺槐豆胶凝胶珠、胶凝糖-黄原胶珠、聚(丙交酯-共-乙交酯)、角叉菜胶、淀粉聚酸酐、淀粉聚甲基丙烯酸酯、聚氨基酸和肠溶包衣聚合物。
在一些实施方案中，将工程化微生物(例如工程化细菌)进行肠溶包衣以释放到肠道或肠道的特定区域(例如大肠)中。从胃到结肠的典型pH范围为约1-4(胃)、5.5-6(十二指肠)、7.3-8.0(回肠)和5.5-6.5(结肠)。在一些疾病中，pH范围可改变。在一些实施方案中，包衣在特定的pH环境中降解，以便指定释放的部位。在一些实施方案中，使用至少两层包衣。在一些实施方案中，外部包衣和内部包衣在不同的pH水平下降解。
用于口服施用的液体制剂可以采取溶液、糖浆、混悬液或用于在使用前用水或其他合适的媒介物复原的干燥产品的形式。此类液体制剂可通过常规方式用药学上可接受的剂制备，所述药学上可接受的剂诸如悬浮剂(例如，山梨醇糖浆、纤维素衍生物或氢化可食用脂肪)；乳化剂(例如，卵磷脂或阿拉伯胶)；非水性媒介物(例如，扁桃仁油、油酯、乙醇或分馏植物油)；以及防腐剂(例如，对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯或山梨酸)。制剂还可包含适当的缓冲盐、调味剂、着色剂和甜味剂。用于口服施用的制剂可适当地配制以用于缓慢释放、受控释放或持续释放本文所述的工程化微生物(例如工程化细菌)。
在一个实施方案中，可将工程化微生物(例如工程化细菌)配制成适合于向儿科受试者施用的组合物。如本领域熟知的，儿童在许多方面不同于成人，包括不同的胃排空率、pH、胃肠渗透性等(Ivanovska等人，2014)。此外，儿科制剂接受性和偏好(诸如施用途径和味道属性)对于实现可接受的儿科依从性是至关重要的。因此，在一个实施方案中，适合于向儿科受试者施用的组合物可包括易于吞咽或可溶解的剂型，或更可口的组合物，诸如添加了调味剂、甜味剂或味觉阻断剂的组合物。在一个实施方案中，适合于向儿科受试者施用的组合物也可以适合于向成人施用。
在一个实施方案中，适合于向儿科受试者施用的组合物可包括溶液、糖浆、混悬液、酏剂、重构为混悬液或溶液的粉剂、可分散/泡腾片、咀嚼片、橡皮糖、棒棒糖、冰棒、锭剂、口香糖、口腔薄带、口腔崩解片、小药囊、软明胶胶囊、喷洒口服粉剂或颗粒剂。在一个实施方案中，组合物是橡皮糖，其由明胶基料制成，赋予糖果弹性、期望的耐嚼稠度和更长的保存期。在一些实施方案中，橡皮糖还可包含甜味剂或调味剂。
在一个实施方案中，适合于向儿科受试者施用的组合物可包括调味剂。如本文所用，“调味剂”是为制剂提供独特味道和香味的物质(液体或固体)。调味剂也有助于改善制剂的适口性。调味剂包括但不限于草莓、香草、柠檬、葡萄、泡泡糖和樱桃。
在某些实施方案中，工程化微生物(例如工程化细菌)可例如与惰性稀释剂或可同化的可食用载剂一起口服施用。化合物还可被包封在硬或软壳明胶胶囊中，压制成片剂，或直接掺入受试者的饮食中。对于口服治疗性施用，可将化合物与赋形剂混合，并以可摄取片剂、口含片、锭剂、胶囊、酏剂、混悬液、糖浆、晶片等形式使用。为了通过除肠胃外施用以外的方式施用化合物，可能需要用防止其失活的材料对化合物进行包衣，或者将化合物与防止其失活的材料共同施用。
在另一个实施方案中，包含本发明重组细菌的药物组合物可以是可食用产品，例如食品。在一个实施方案中，食品是奶、浓缩奶、发酵奶(酸奶、酸乳、冷冻酸奶、乳酸菌发酵饮料)、奶粉、冰淇淋、奶油干酪、干干酪、豆浆、发酵豆浆、蔬果汁、果汁、运动饮料、糕饼、糖果、婴儿食品(诸如婴儿蛋糕)、营养食品、动物饲料或膳食补充剂。在一个实施方案中，食品是发酵食品，诸如发酵乳制品。在一个实施方案中，发酵乳制品是酸奶。在另一个实施方案中，发酵乳制品是奶酪、奶、奶油、冰淇淋、奶昔或酸乳酒。在另一个实施方案中，将本发明的重组细菌组合在含有旨在用作益生菌的其他活细菌细胞的制剂中。在另一个实施方案中，食品是饮料。在一个实施方案中，饮料是基于果汁的饮料或含有植物或草药提取物的饮料。在另一个实施方案中，食品是果冻或布丁。适合于施用本发明的重组细菌的其他食品是本领域熟知的。参见例如US 2015/0359894和US 2015/0238545，其各自的全部内容以引用的方式明确并入本文。在另一个实施方案中，将本发明的药物组合物注射到食品中、喷雾到或喷洒到食品上，所述食品诸如面包、酸奶或奶酪。
在一些实施方案中，组合物被配制用于肠内施用、空肠内施用、十二指肠内施用、回肠内施用、胃分流施用或结肠内施用，通过肠溶包衣或未包衣的纳米颗粒、纳米胶囊、微胶囊或微型片剂施用。也可以将药物组合物配制成直肠组合物，诸如栓剂或保留灌肠剂，使用例如常规栓剂基质，诸如可可脂或其他甘油酯。组合物可以是在油性或水性媒介物中的混悬液、溶液或乳液，并且可以含有悬浮剂、稳定剂和/或分散剂。
药物组合物可鼻内施用，配制成气溶胶形式、喷雾、薄雾或滴剂形式，并且使用合适的推进剂(例如，二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或其他合适的气体)从加压包装或喷雾器中以气溶胶喷雾的形式方便地递送。可以通过提供阀门递送计量的量来确定加压气溶胶剂量单位。可以将用于吸入器或吹入器的胶囊和药筒(例如，明胶的)配制成含有化合物和合适的粉末基质(诸如乳糖或淀粉)的粉末混合物。
可将工程化微生物(例如工程化细菌)以贮库制剂的形式施用和配制。此类长效制剂可通过植入或通过注射施用，包括静脉内注射、皮下注射、局部注射、直接注射或输注。例如，可用合适的聚合物或疏水材料(例如，作为可接受的油中的乳液)或离子交换树脂或作为微溶衍生物(例如，作为微溶盐)来配制组合物。
在一些实施方案中，本文公开了单一剂型的药学上可接受的组合物。单一剂型可以是液体或固体形式。单一剂型可以不经改变直接施用于患者，或者可以在施用之前稀释或重构。在某些实施方案中，可以将单一剂型以推注形式施用，例如，单次注射、单次口服剂量，包括含有多个片剂、胶囊、丸剂等的口服剂量。在替代性实施方案中，单一剂型可以在一段时间内施用，例如通过输注。
药物组合物的单一剂型可以通过将药物组合物分成较小的等份、单剂量容器、单剂量液体形式或单剂量固体形式(诸如片剂、颗粒剂、纳米颗粒、纳米胶囊、微胶囊、微型片剂、丹剂或粉剂，它们可以是肠溶包衣的或未包衣的)来制备。固体形式的单剂量可以在向患者施用之前通过添加液体(通常是无菌水或盐水溶液)来重构。
在其他实施方案中，组合物可以在受控释放或持续释放系统中递送。在一个实施方案中，可使用泵来实现受控释放或持续释放。在另一个实施方案中，聚合材料可以用于实现本公开的疗法的受控或持续释放(参见例如美国专利号5,989,463)。用于持续释放制剂的聚合物的实例包括但不限于聚(2-羟乙基甲基丙烯酸酯)、聚(甲基丙烯酸甲酯)、聚(丙烯酸)、聚(乙烯-共-醋酸乙烯酯)、聚(甲基丙烯酸)、聚乙交酯(PLG)、聚酸酐、聚(N-乙烯基吡咯烷酮)、聚(乙烯醇)、聚丙烯酰胺、聚(乙二醇)、聚丙交酯(PLA)、聚(丙交酯-共-乙交酯)(PLGA)和聚原酸酯。用于持续释放制剂的聚合物可以是惰性的、不含可浸出杂质、储存稳定、无菌和可生物降解的。在一些实施方案中，可将受控或持续释放系统置于预防或治疗靶标附近，因此仅需要全身剂量的一部分。可使用本领域技术人员已知的任何合适的技术。
可调整剂量方案以提供治疗反应。剂量可取决于几个因素，包括疾病的严重程度和响应性、施用途径、疗程(几天到几个月到几年)和疾病改善的时间。例如，可一次施用单次推注，可在预先确定的时间段内施用几个分开的剂量，或者可根据治疗情况所指示减少或增加剂量。剂量规格由活性化合物的独特特征和要实现的特定治疗效果决定。剂量值可随着待缓解的病状的类型和严重程度而变化。对于任何特定受试者，可根据个人需要和治疗临床医生的专业判断随时间调整具体的剂量方案。本文提供的化合物的毒性和治疗功效可以通过细胞培养或动物模型中的标准药学程序来确定。例如，可确定LD50、ED50、EC50和IC50，并且可将毒性与治疗效果之间的剂量比(LD50/ED50)计算为治疗指数。可使用表现出毒副作用的组合物，并仔细修改以使潜在的损害最小化，从而减少副作用。最初可从细胞培养测定和动物模型来估计剂量。从体外和体内测定以及动物研究中获得的数据可以用于配制用于人的剂量范围。
成分以单位剂型(例如，作为在指示活性剂的量的密封容器诸如安瓿或小药囊中的冻干粉末或无水浓缩物)分开或混合在一起提供。如果施用方式是通过注射，可以提供一安瓿无菌注射用水或盐水，以便可在施用之前将成分混合。
可将药物组合物包装在密封容器中，诸如指示剂的量的安瓿或小药囊。在一个实施方案中，一种或多种药物组合物作为密封容器中的干燥无菌冻干粉末或无水浓缩物提供，并且可以被重构(例如，用水或盐水)至适当的浓度，以用于向受试者施用。在一个实施方案中，一种或多种预防剂或治疗剂或药物组合物作为在密封容器中的干燥无菌冻干粉末提供，储存在2℃与8℃之间并在重构后1小时内、3小时内、5小时内、6小时内、12小时内、24小时内、48小时内、72小时内或一周内施用。冻干剂型中可以包含冷冻保护剂，主要是海藻糖。其他合适的冷冻保护剂包括其他二糖(例如，蔗糖或乳糖)、氨基酸和聚合物。
用途和治疗方法
在一些实施方案中，本公开提供了用于治疗患有疾病或病症的受试者的方法，其中所述方法包括施用包含修饰的pks岛的工程化微生物(例如工程化细菌)。在一些实施方案中，本公开提供了用于治疗患有疾病或病症的受试者的方法，其中所述方法包括施用包含修饰的pks岛和一种或多种编码治疗性分子的基因或基因盒的工程化微生物(例如工程化细菌)。
在一些实施方案中，工程化微生物(例如工程化细菌)包含如本文所公开的修饰的pks岛并且还包含一种或多种用于产生抗癌分子(例如，脱腺苷酸环化酶基因或能够产生干扰素基因刺激物激动剂的酶)的基因或基因盒；或包含一种或多种编码修饰的精氨酸生物合成途径(例如，缺失的精氨酸阻遏物、修饰的精氨酸阻遏物结合位点和/或精氨酸反馈抗性N-乙酰谷氨酸合酶突变)的基因或基因盒；或包含一种或多种用于产生苯丙氨酸代谢酶的基因或基因盒；或包含一种或多种用于产生草酸代谢酶的基因或基因盒。
在一些实施方案中，本公开提供了用于减轻高苯丙氨酸血症或治疗与高苯丙氨酸血症相关的疾病的方法，其通过向受试者施用药物组合物来实现，所述药物组合物包含含有修饰的pks岛和苯丙氨酸代谢酶的工程化微生物(例如工程化细菌)。在一些实施方案中，本公开提供了用于减轻高苯丙氨酸血症或治疗与高苯丙氨酸血症相关的疾病的方法，其通过施用药物组合物来实现，所述药物组合物包含含有修饰的pks岛和苯丙氨酸代谢酶的工程化微生物(例如工程化细菌)。在一些实施方案中，本公开提供了用于减轻高苯丙氨酸血症或治疗与高苯丙氨酸血症相关的疾病的方法，其通过施用药物组合物来实现，所述药物组合物包含含有修饰的pks岛和苯丙氨酸转运蛋白的工程化微生物(例如工程化细菌)。在一些实施方案中，与高苯丙氨酸血症相关的疾病选自苯丙酮尿症、经典或典型苯丙酮尿症、非典型苯丙酮尿症、永久性轻度高苯丙氨酸血症、非苯丙酮尿症高苯丙氨酸血症、苯丙氨酸羟化酶缺乏症、辅因子缺乏症、二氢蝶啶还原酶缺乏症、四氢蝶呤合酶缺乏症、塞加瓦氏病和肝病。
在一些实施方案中，治疗方法包括施用包含编码至少一种PME(例如，PAL和/或LAAD)的基因的工程化细菌，其中PME基因可操作地连接至诱导型启动子。在一些实施方案中，治疗方法包括施用包含非天然PME基因(例如天然PME基因的另外拷贝)的工程化细菌。在一些实施方案中，启动子在自然界中与PME基因不相关。在一些实施方案中，治疗方法包括施用还包含苯丙氨酸转运蛋白(例如PheP)的工程化细菌。在一些实施方案中，治疗方法包括施用包含非天然苯丙氨酸转运蛋白基因(例如，天然苯丙氨酸转运蛋白基因的另外拷贝)的工程化细菌。在一些实施方案中，启动子在自然界中与苯丙氨酸转运蛋白基因不相关。在一些实施方案中，启动子是温度调节型启动子或在低氧或厌氧条件下诱导的启动子。在一些实施方案中，诱导型启动子在施用于受试者之前被诱导。在一些实施方案中，诱导型启动子在施用于受试者之后被诱导。在一些实施方案中，通过本文公开的方法制备的细菌是一种或多种必需基因例如thyA或dapA的营养缺陷型
在一些实施方案中，本公开提供了一种治疗炎症性肠病(IBD)、自身免疫性病症、腹泻病、相关疾病和受益于肠道炎症减轻和/或肠道屏障功能增强的其他疾病的方法，其通过向受试者施用药物组合物来实现，所述药物组合物包含工程化微生物(例如工程化细菌)，所述工程化微生物包含修饰的pks岛和一种或多种编码抗炎和/或肠道屏障功能增强分子的基因或基因盒。在一些实施方案中，腹泻病选自由以下组成的组：急性水样腹泻例如霍乱、急性血性腹泻例如痢疾和迁延性腹泻。在一些实施方案中，IBD或相关疾病选自由以下组成的组：克罗恩病、溃疡性结肠炎、胶原性结肠炎、淋巴细胞性结肠炎、改道性结肠炎、白塞病(Behcet’s disease)、中间型结肠炎、短肠综合征、溃疡性直肠炎、直肠乙状结肠炎、左侧结肠炎、全结肠炎和暴发性结肠炎。在一些实施方案中，疾病或病状是选自由以下组成的组的自身免疫性病症：急性播散性脑脊髓炎(ADEM)、急性坏死性出血性白质脑炎、艾迪生病(Addison’s disease)、无丙种球蛋白血症、斑秃、淀粉样变性、强直性脊柱炎、抗GBM/抗TBM肾炎、抗磷脂综合征(APS)、自身免疫性血管性水肿、自身免疫性再生障碍性贫血、自身免疫性自主神经失调、自身免疫性溶血性贫血、自身免疫性肝炎、自身免疫性高脂血症、自身免疫性免疫缺陷、自身免疫性内耳病(AIED)、自身免疫性心肌炎、自身免疫性卵巢炎、自身免疫性胰腺炎、自身免疫性视网膜病变、自身免疫性血小板减少性紫癜(ATP)、自身免疫性甲状腺疾病、自身免疫性荨麻疹、轴突和神经元神经病(axonal&neuronalneuropathies)、巴洛病(Balo disease)、白塞病、大疱性类天疱疮、心肌病、卡斯特莱曼病(Castleman disease)、乳糜泻、南美锥虫病、慢性炎症性脱髓鞘性多发性神经病(CIDP)、慢性复发性多灶性骨髓炎(CRMO)、查格-施特劳斯综合征(Churg-Strauss syndrome)、瘢痕性类天疱疮/良性黏膜类天疱疮、克罗恩病、柯根综合征(Cogan’s syndrome)、冷凝集素病、先天性心脏传导阻滞、柯萨奇心肌炎(Coxsackie myocarditis)、CREST病、原发性混合性冷球蛋白血症、脱髓鞘性神经病、疱疹样皮炎、皮肌炎、德维克病(Devic’s disease)(视神经脊髓炎)、盘状狼疮、德雷斯勒综合征(Dressler’s syndrome)、子宫内膜异位、嗜酸细胞性食管炎、嗜酸细胞性筋膜炎、结节性红斑、实验性变态反应性脑脊髓炎、伊文氏综合征(Evanssyndrome)、纤维化肺泡炎、巨细胞动脉炎(颞动脉炎)、巨细胞心肌炎、肾小球性肾炎、古德帕斯丘综合征(Goodpasture’ssyndrome)、肉芽肿性多血管炎(GPA)、格雷夫斯病(Graves’disease)、格林-巴利综合征(Guillain-Barre syndrome)、桥本氏脑炎(Hashimoto’sencephalitis)、桥本氏甲状腺炎、溶血性贫血、亨-舍二氏紫癜(Henoch-Schonleinpurpura)、妊娠疱疹、低丙球蛋白血症、特发性血小板减少性紫癜(ITP)、IgA肾病、IgG4相关硬化性疾病、免疫调节脂蛋白、包涵体肌炎、间质性膀胱炎、幼年型关节炎、幼年特发性关节炎、幼年型肌炎、川崎综合征(Kawasaki syndrome)、兰伯特-伊顿综合征(Lambert-Eatonsyndrome)、白细胞破碎性血管炎、扁平苔藓、硬化性苔藓、木样结膜炎、线状IgA病(LAD)、狼疮(系统性红斑狼疮)、慢性莱姆病、梅尼埃病(Meniere’s disease)、显微镜下多血管炎、混合性结缔组织病(MCTD)、莫伦氏溃疡(Mooren’sulcer)、穆-哈二氏病(Mucha-Habermanndisease)、多发性硬化症、重症肌无力、肌炎、发作性睡病、视神经脊髓炎(德维克氏)、中性粒细胞减少症、眼瘢痕性类天疱疮、视神经炎、回纹型风湿症(palindromic rheumatism)、PANDAS(与链球菌相关的小儿自身免疫性神经精神病症)、副肿瘤性小脑变性、阵发性睡眠性血红蛋白尿症(PNH)、帕-罗二氏综合征(Parry Romberg syndrome)、帕森奇-特纳综合征(Parsonnage-Turner syndrome)、睫状体平坦部炎(周边葡萄膜炎)、天疱疮、周围神经病变、静脉周围性脑脊髓炎、恶性贫血、POEMS综合征、结节性多动脉炎、I型、II型和III型自身免疫性多腺体综合征、风湿性多肌痛、多肌炎、心肌梗死后综合征、心包切开术后综合征、孕酮性皮炎、原发性胆汁性肝硬化、原发性硬化性胆管炎、牛皮癣、银屑病关节炎、特发性肺纤维化、坏疽性脓皮病、纯红细胞再生障碍、雷诺现象(Raynaud’s phenomenon)、反应性关节炎、反射交感性营养不良(reflex sympathetic dystrophy)、瑞特氏综合征(Reiter’ssyndrome)、复发性多软骨炎、不宁腿综合征、腹膜后纤维化、风湿热、类风湿性关节炎、结节病、施密特综合征(Schmidt syndrome)、巩膜炎、硬皮病、舍格伦综合征(Sjogren’ssyndrome)、精子和睾丸自身免疫、僵人综合征、亚急性细菌性心内膜炎(SBE)、苏萨克氏综合征(Susac’s syndrome)、交感性眼炎、大动脉炎(Takayasu’s arteritis)、颞动脉炎/巨细胞动脉炎、血小板减少性紫癜(TTP)、托-亨二氏综合征(Tolosa-Hunt syndrome)、横贯性脊髓炎、1型糖尿病、哮喘、溃疡性结肠炎、未分化结缔组织病(UCTD)、葡萄膜炎、血管炎、水泡性皮肤病、白癜风和韦格纳肉芽肿病(Wegener’sgranulomatosis)。在一些实施方案中，本发明提供了用于减少、改善或消除与这些疾病相关的一种或多种症状的方法，所述疾病包括但不限于腹泻、血便、口疮、肛周疾病、腹痛、腹部绞痛、发烧、疲劳、体重减轻、缺铁、贫血、食欲不振、体重减轻、厌食、生长迟缓、青春期发育迟缓以及皮肤、眼睛、关节、肝脏和胆管炎症。在一些实施方案中，本发明提供了用于减轻肠道炎症和/或增强肠道屏障功能，从而改善或预防全身性自身免疫性病症(例如哮喘)的方法(Arrieta等人，2015)。
在一些实施方案中，本公开提供了用于治疗与高氨血症相关的疾病或病症的方法，其通过施用工程化微生物(例如工程化细菌)来实现，所述工程化微生物包含修饰的pks岛并且还包含修饰的精氨酸生物合成途径，例如缺失的精氨酸阻遏物、修饰的精氨酸阻遏物结合位点和/或精氨酸反馈抗性N-乙酰谷氨酸合酶突变。在一些实施方案中，病症是尿素循环障碍诸如精氨基琥珀酸尿症、精氨酸酶缺乏症、氨基甲酰磷酸合成酶缺乏症、瓜氨酸血症、N-乙酰谷氨酸合成酶缺乏症以及鸟氨酸、转氨甲酰酶缺乏症。在替代性实施方案中，病症是肝脏病症，诸如肝性脑病、急性肝衰竭或慢性肝衰竭；有机酸病症；异戊酸尿症；3-甲基巴豆酰甘氨酸尿症；甲基丙二酸血症；丙酸尿症；脂肪酸氧化缺陷；肉碱循环缺陷；肉碱缺乏症；β-氧化缺乏症；赖氨酸尿蛋白不耐受；吡咯啉-5-羧酸合成酶缺乏症；丙酮酸羧化酶缺乏症；鸟氨酸转氨酶缺乏症；碳酸酐酶缺乏症；高胰岛素血症-高氨血症综合征；线粒体病症；丙戊酸疗法；天冬酰胺酶疗法；全胃肠外营养；使用含甘氨酸的溶液进行的膀胱镜检查；肺/骨髓移植后；门体分流术；尿路感染；输尿管扩张；多发性骨髓瘤；化疗；感染；神经性膀胱功能障碍；或肠道细菌过度生长。在一些实施方案中，高氨血症与亨廷顿病(Huntington’sdisease)相关。在一些实施方案中，一种或多种与其相关的症状包括但不限于癫痫发作、共济失调、中风样病变、昏迷、精神错乱、视力丧失、急性脑病、脑水肿以及呕吐、呼吸性碱中毒和体温过低。在一些实施方案中，病症是癌症，例如，其中癌症的肿瘤微环境与增加的氨相关。
在一些实施方案中，本公开提供了通过施用工程化微生物(例如工程化细菌)来治疗癌症的方法，所述工程化微生物包含修饰的pks岛和至少一种用于产生抗癌分子(例如，dacA或能够产生STING激动剂的酶)的基因。在一些实施方案中，癌症选自肾上腺癌、肾上腺皮质癌、肛门癌、阑尾癌、胆管癌、膀胱癌、骨癌(例如，尤文肉瘤肿瘤、骨肉瘤、恶性纤维性组织细胞瘤)、脑癌(例如，星形细胞瘤、脑干胶质瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤)、支气管肿瘤、中枢神经系统肿瘤、乳腺癌、卡斯特莱曼病、宫颈癌、结肠癌、直肠癌、结直肠癌、子宫内膜癌、食道癌、眼癌、胆囊癌、胃肠癌、胃肠道类癌瘤、胃肠道间质瘤、妊娠滋养细胞疾病、心脏癌、卡波西肉瘤、肾癌、喉癌、下咽癌、白血病(例如，急性成淋巴细胞性白血病、急性骨髓性白血病、慢性淋巴细胞性白血病、慢性髓细胞性白血病)、肝癌、肺癌、淋巴瘤(例如，AIDS相关淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、皮肤T细胞淋巴瘤、霍金淋巴瘤、非霍金淋巴瘤、原发性中枢神经系统淋巴瘤)、恶性间皮瘤、多发性骨髓瘤、骨髓增生异常综合征、鼻腔癌、鼻窦癌、鼻咽癌、成神经细胞瘤、口腔癌、口咽癌、骨肉瘤、卵巢癌、胰腺癌、阴茎癌、垂体瘤、前列腺癌、视网膜母细胞瘤、横纹肌肉瘤、横纹肌样瘤、唾液腺癌、肉瘤、皮肤癌(例如，基底细胞癌、黑色素瘤)、小肠癌、胃癌、畸胎瘤、睾丸癌、咽喉癌、胸腺癌、甲状腺癌、罕见的儿童癌症、尿道癌、子宫癌、子宫肉瘤、阴道癌、外阴癌、华氏巨球蛋白血症(macrogloblulinemia)和肾母细胞瘤。
在一些实施方案中，本公开提供了用于降低与HOX相关的草酸盐和/或草酸水平的方法，其通过施用工程化微生物(例如工程化细菌)来实现，所述工程化微生物包含修饰的pks岛和一种或多种编码草酸代谢酶或草酸分解代谢酶的基因或基因盒。所述方法可包括制备具有至少一种本文所述的遗传工程化细菌物种、菌株或亚型的药物组合物，并且将药物组合物以治疗有效量施用于受试者。在一些实施方案中，治疗与草酸盐升高相关的疾病或病症的方法包括向有需要的受试者施用包含编码一种或多种草酸分解代谢酶的一个或多个基因序列的工程化细菌或其药物组合物。在一些实施方案中，治疗与草酸盐升高相关的疾病或病症的方法包括向有需要的受试者施用包含编码一种或多种草酸盐转运蛋白的一个或多个基因序列的工程化细菌或其药物组合物。在一些实施方案中，治疗与草酸盐升高相关的疾病或病症的方法包括向有需要的受试者施用包含编码一种或多种甲酸盐输入蛋白的一个或多个基因序列的工程化细菌或其药物组合物。在一些实施方案中，治疗与草酸盐升高相关的疾病或病症的方法包括向有需要的受试者施用包含编码一种或多种草酸盐:甲酸盐反向转运蛋白的一个或多个基因序列的工程化细菌或其药物组合物。在一些实施方案中，治疗与草酸盐升高相关的疾病或病症的方法包括向有需要的受试者施用工程化细菌，所述工程化细菌包含编码一种或多种草酸分解代谢酶的一个或多个基因序列和编码以下中的一种或多种的一个或多个基因序列：(i)一种或多种草酸盐转运蛋白；(ii)一种或多种甲酸盐输出蛋白；(iii)一种或多种草酸盐:甲酸盐反向转运蛋白；以及(iv)它们的组合或它们的药物组合物。在一些实施方案中，将本文公开的细菌细胞口服施用，例如在液体混悬液中。在一些实施方案中，本文公开的细菌细胞在凝胶帽中冻干并口服施用。在一些实施方案中，本文公开的细菌细胞通过饲管或胃分流管施用。在一些实施方案中，本文公开的细菌细胞通过直肠(例如通过灌肠)施用。在一些实施方案中，遗传工程化细菌局部、肠内、空肠内、十二指肠内、回肠内和/或结肠内施用。
在一些实施方案中，本公开提供了用于降低受试者的草酸盐和/或草酸水平或治疗与高草酸尿症相关的疾病的方法，其通过施用本文公开的药物组合物，例如，包含编码草酸分解代谢酶的基因的遗传工程化细菌来实现。在一些实施方案中，本公开提供了用于降低受试者的草酸盐和/或草酸水平或治疗与高草酸尿症相关的疾病的方法，其通过施用本文公开的药物组合物，例如，包含草酸分解代谢酶和修饰的pks岛的遗传工程化细菌来实现。所述方法可包括降低受试者的草酸盐水平，所述方法包括向受试者施用包含工程化微生物的药物组合物，从而降低受试者的草酸盐水平，所述工程化微生物包含编码一种或多种草酸分解代谢酶的一个或多个基因序列，所述基因序列可操作地连接至在自然界中与草酸分解代谢酶基因不相关的直接或间接第一诱导型启动子。所述方法可包括降低受试者的草酸盐水平，所述方法包括向受试者施用包含工程化微生物的药物组合物，从而降低受试者的草酸盐水平，所述工程化微生物包含如本文所公开的修饰的pks岛和编码一种或多种草酸分解代谢酶的一个或多个基因序列，所述基因序列可操作地连接至在自然界中与草酸分解代谢酶基因不相关的直接或间接第一诱导型启动子。
在一些实施方案中，所述方法包括施用如本文所述的药物组合物，以将受试者的草酸盐和/或草酸水平降低至正常水平。在另一个实施方案中，施用本文所述的药物组合物以将受试者的草酸盐和/或草酸水平降低至正常水平以下。在另一个实施方案中，施用本文所述的药物组合物以将受试者的每日尿草酸盐排泄降低至每24小时少于40mg。
在一些实施方案中，所述方法包括施用如本文所述的药物组合物，以将受试者的急性草酸盐水平降低至约25mg/天、约30mg/天、约40mg/天、约50mg/天、约60mg/天、约70mg/天、约80mg/天、约90mg/天或约100mg/天。在一个实施方案中，所述方法将受试者的慢性草酸盐水平降低至约25mg/天、约30mg/天、约40mg/天、约50mg/天、约60mg/天、约70mg/天、约80mg/天、约90mg/天或约100mg/天。
在某些实施方案中，所述方法包括施用如本文所述的药物组合物，以降低受试者的草酸盐和/或草酸水平。在一些实施方案中，本公开的方法将受试者的草酸盐和/或草酸水平降低至少约10％、20％、25％、30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或更多。在另一个实施方案中，本发明的方法将受试者的草酸盐和/或草酸水平降低至少2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍或10倍。在另一个实施方案中，本发明的方法将受试者的每日尿草酸盐排泄降低至每24小时少于40mg。在一些实施方案中，通过比较施用药物组合物之前和之后受试者的草酸盐和/或草酸水平来测量降低。在一个实施方案中，受试者肠道中的草酸盐和/或草酸水平降低。在一个实施方案中，受试者尿液中的草酸盐和/或草酸水平降低。在另一个实施方案中，受试者血液中的草酸盐和/或草酸水平降低。在另一个实施方案中，受试者血浆中的草酸盐和/或草酸水平降低。在另一个实施方案中，受试者粪便中的草酸盐和/或草酸水平降低。在另一个实施方案中，受试者脑中的草酸盐和/或草酸水平降低。
在一个实施方案中，施用本文所述的药物组合物以将受试者的草酸盐降低至正常水平。
在一些实施方案中，治疗草酸盐有害的病症(例如高草酸尿症)的方法允许病状或病症的一种或多种症状改善至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或更多。在一些实施方案中，治疗草酸盐有害的病症(例如高草酸尿症)的方法允许病状或病症的一种或多种症状改善至少约2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍或10倍。
在施用药物组合物之前、期间和之后，可在生物样品中测量受试者的草酸盐和/或草酸水平，所述生物样品诸如血液、血清、血浆、尿液、腹膜液、脑脊液、粪便、肠粘膜碎屑、从组织收集的样品和/或从以下中的一种或多种的内容物收集的样品：胃、肾、肝、十二指肠、空肠、回肠、盲肠、结肠、直肠和肛管。在一些实施方案中，所述方法可包括施用本文公开的组合物以降低草酸盐和/或草酸的水平。在一些实施方案中，所述方法可包括施用本发明的组合物，以将受试者的草酸盐和/或草酸降低至不可检测的水平。在一些实施方案中，所述方法可包括施用本发明的组合物以将草酸盐和/或草酸浓度降低至不可检测的水平，或降低至治疗前受试者的草酸盐和/或草酸水平的少于约1％、2％、5％、10％、20％、25％、30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％或95％。
在一些实施方案中，所述方法包括施用药物组合物，所述药物组合物包含如本文所公开的工程化微生物(例如工程化细菌)。与相同条件下的相同亚型的未修饰细菌相比，工程化微生物在外源环境条件下(诸如哺乳动物肠道的低氧环境)产生草酸分解代谢酶，以将尿液、血液或血浆中的草酸盐和/或草酸水平降低至少约1.5倍、至少约2倍、至少约3倍、至少约4倍、至少约5倍、至少约6倍、至少约7倍、至少约8倍、至少约9倍、至少约10倍、至少约15倍、至少约20倍、至少约30倍、至少约40倍或至少约50倍。
在一些实施方案中，所述方法包括施用本文公开的药物组合物，以将草酸盐的血浆水平降低至小于4mg/dL。在一个实施方案中，本文公开的药物组合物将草酸盐的血浆水平降低至小于3.9mg/dL。在一个实施方案中，本文公开的药物组合物将草酸盐的血浆水平降低至小于3.8mg/dL、3.7mg/dL、3.6mg/dL、3.5mg/dL、3.4mg/dL、3.3mg/dL、3.2mg/dL、3.1mg/dL、3.0mg/dL、2.9mg/dL、2.8mg/dL、2.7mg/dL、2.6mg/dL、2.5mg/dL、2.0mg/dL、1.75mg/dL、1.5mg/dL、1.0mg/dL或0.5mg/dL。
在一个实施方案中，在施用本文公开的药物组合物之前，受试者的血浆水平为至少4mg/dL草酸盐。在另一个实施方案中，在施用本文公开的药物组合物之前，受试者的血浆水平为至少4.1mg/dL、4.2mg/dL、4.3mg/dL、4.4mg/dL、4.5mg/dL、4.75mg/dL、5.0mg/dL、5.5mg/dL、6mg/dL、7mg/dL、8mg/dL、9mg/dL或10mg/dL。
在一些实施方案中，本文公开的方法还包括将在施用本文公开的药物组合物之后的受试者血浆样品中的草酸盐和/或草酸水平与在施用本文公开的药物组合物之前的受试者血浆样品进行比较。在一个实施方案中，施用本文公开的药物组合物之后的受试者血浆样品中的草酸盐和/或草酸水平的降低表明血浆草酸盐和/或草酸水平降低，从而治疗了受试者中的草酸盐和/或草酸有害的病症。在一个实施方案中，与施用药物组合物之前的血浆样品中的草酸盐和/或草酸水平相比，施用药物组合物之后的样品中的血浆草酸盐和/或草酸水平降低至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％。在另一个实施方案中，与施用药物组合物之前的血浆样品中的草酸盐和/或草酸水平相比，施用药物组合物之后的血浆样品中的血浆草酸盐和/或草酸水平降低至少2倍、3倍、4倍或5倍。
在一些实施方案中，本文公开的方法还包括将施用本文公开的药物组合物之后的受试者尿液样品中的草酸盐和/或草酸水平与施用本文公开的药物组合物之前的受试者尿液样品进行比较。在一个实施方案中，施用本文公开的药物组合物之后的受试者尿液样品中的草酸盐和/或草酸水平的降低表明尿液草酸盐和/或草酸水平降低，从而治疗了受试者的其中草酸盐和/或草酸有害的病症。在一个实施方案中，与施用药物组合物之前的尿液样品中的草酸盐和/或草酸水平相比，施用药物组合物之后的样品中的尿液草酸盐和/或草酸水平降低至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％。在另一个实施方案中，与施用药物组合物之前的尿液样品中的草酸盐和/或草酸水平相比，施用药物组合物之后的尿液样品中的尿液草酸盐和/或草酸水平降低至少2倍、3倍、4倍或5倍。
在一些实施方案中，治疗方法包括施用包含修饰的pks岛和任选的如本文所公开的治疗性分子的工程化微生物(例如工程化细菌)、其组合物或制剂，其中组合物或制剂包含在pH范围为6-8的生物缓冲液中的1-20％海藻糖、1-10％海藻糖、5-15％海藻糖、7-13％海藻糖、9-11％海藻糖或约10％海藻糖，其中生物缓冲液可以是PIPES、MOPS、HEPES和/或Tris缓冲液。在一些实施方案中，组合物或制剂包含1-400mM Tris缓冲液。在一些实施方案中，组合物或制剂包含1-300mM Tris缓冲液。在一些实施方案中，组合物或制剂包含1-200mM Tris缓冲液。在一些实施方案中，组合物或制剂包含1-100mM Tris缓冲液。在一些实施方案中，组合物或制剂包含1-50mM Tris缓冲液。在一些实施方案中，组合物或制剂包含1-10mM Tris缓冲液。在一些实施方案中，药物组合物包含冻干细菌。在一些实施方案中，冻干细菌的水含量百分比为大约1-10％。在一些实施方案中，水含量百分比为大约3-8％。在一些实施方案中，水含量百分比为大约3-6％。在一些实施方案中，水含量百分比为大约3-5％。在一些实施方案中，水含量百分比为大约3％、大约4％或大约5％。
示例性的疾病、病症和治疗方法提供于WO2016090343、WO2016200614、WO2017139697、WO2016183531、WO2017087580、WO 2016141108、WO2017074566、WO2017136792、WO2017136795、WO2018129404、WO2019014391、WO2016210384、WO2017123418、WO2017123676、WO2016183531、WO2018237198、WO2016201380、US20170216370和WO2017040719中，所述专利的内容据此以引用方式整体并入
本公开还提供了评估大肠杆菌素产生和pks岛活性的方法，例如通过测量一种或多种大肠杆菌素前体或代谢物。在一些实施方案中，评估大肠杆菌素水平的方法包括检测N-肉豆蔻酰-D-天冬酰胺。在一些实施方案中，N-肉豆蔻酰-D-天冬酰胺使用质谱法(例如，定量LC-MS/MS)检测。
实施例
实施例1
Δpks菌株在小鼠中的药代动力学特征
通过使clbA-R基因和可操作地连接的启动子的clb序列缺失来产生Δpks大肠杆菌Nissle(EcN)菌株；clbS基因序列是未修饰的(完整的)，但其可操作地连接的启动子是缺失的(图3B)。如先前所述，使用λ红(lambda red)方法产生构建体。参见，例如，PCT/US2016/032562，其内容以引用方式整体并入本文。在初始健康小鼠和用链霉素预处理的小鼠中研究了Δpks菌株的药代动力学特征，链霉素是一种氨基糖苷类抗生素，与细菌30S核糖体亚基结合并损害蛋白质合成，从而消除小鼠胃肠道常驻菌群的存活和生长。
在菌株给药前一天，用尾部标志标记和鉴定雌性野生型C57BL/6j小鼠，并基于体重分成实验组(表A)。链霉素水(Strep-water)是通过将5g链霉素溶解在1L反渗透(RO)水中制备的，并在饮用瓶中随意提供给组2的小鼠。接下来的一天，小鼠的亚组接受1e+10个EcN细胞(WT、Δpks或两者的组合)或媒介物的管饲(PO剂量)(表A)。
表A.小鼠研究设计
然后将小鼠放入干净的笼子中以避免排泄物交叉污染。通过将动物保持在预先称重的Bead Beater收集管上，在不同的时间点(给药后1、3、6、24、48、72小时)通过自由捕获来新鲜收集粪便丸粒。然后在收集的一个小时之内，通过在500μl的PBS中利用FastPrep 24以4m/s的速度匀浆10秒对丸粒进行处理以用于CFU铺板。将匀浆液的10微升的8个1比10连续稀释液一式三份地按行铺板(row-plated)在含有对每种菌株具有选择性的抗生素的LB琼脂的培养皿上。具体地，分别根据粪便样品是获自WT EcN、Δpks EcN，还是媒介物和组合WT+Δpks EcN组中的小鼠，将所述粪便样品铺板在Strep-300、Kan-100或Strep-300和Kan-100平板上。将平板在37℃下孵育过夜，以允许抗生素抗性细胞的克隆生长。第二天对CFU进行计数，并将其针对先前收集的粪便丸粒的重量(g)归一化。在初始健康小鼠(组1)中，非工程化(WT)和Δpks EcN细胞在给药后72hr完成粪便转变和排泄，如在72小时收集时间点时不存在CFU所表明的(图1A)。此外，Δpks和WT EcN细胞表现出的活力相当，如通过在来自早期时间点的粪便样品中获取的CFU的数量所测量的(图1A)。在根除常驻肠细菌的小鼠(组2)中，其中WT和Δpks菌株共同给药，非工程化细胞与Δpks细胞的CFU恢复在所有时间点都无法区分，表明对于Δpks EcN而言，在活力上未观察到竞争劣势(图1B)。
实施例2
Δpks菌株在非人灵长类动物(NHP)中的药代动力学特征。
将实施例1中描述的Δpks EcN菌株(缺失的clbA-clbR基因和启动子序列、完整的clbS基因序列与缺失的可操作地连接的启动子)施用于非人灵长类动物。上述Δpks菌株的药代动力学特征是在托管在查尔斯河实验室(Charles River Laboratories)的我们的非初始雄性食蟹猴(Cynomolgus Macaque)群体中研究的。体重不超过5Kg的六只猴子接受后续管饲的碳酸氢钠(5mL)、总量为1e+12个(10mL)的相等数量的WT EcN和Δpks EcN细胞的组合，以及用以冲洗注射器中的残余物的水。
在每次粪便收集之前3小时清洁并更换尿液和粪便盘。每个时间点的粪便收集发生在3小时的时间段内，以便动物有时间排便。收集时间点为：给药后6小时(T3-6)、24小时(T21-24)、48小时(T45-48)、72小时(T69-72)、96小时(T93-96)以及120小时(T117-120)。对粪便样品进行称重、包装在冰中并立即运送到Synlogic。将样品在含有1ml PBS的BeadBeater中用FastPrep 24以4m/s的速度匀浆40秒，并根据上述方法(在小鼠中的药代动力学)铺板。在37℃下过夜孵育后对CFU进行计数。跨时间点未观察到CFU恢复的显著差异，并且到第5天，在铺板以选择性地支持各单一菌株生长的粪便匀浆中未获取到CFU(图2)。因此，我们得出结论，非工程化(WT)和Δpks EcN具有相似的排泄和活力特征。
实施例3
表达苯丙氨酸解氨酶的Δpks菌株的体外活性特征
Δpks EcN菌株(缺失的clbA-clbR基因和启动子序列、完整的clbS基因序列与缺失的可操作地连接的启动子)描述于实施例1中并且还包含编码苯丙氨酸解氨酶(PAL)的基因序列，例如，来自发光光杆状菌的野生型PAL(stlA)或本文所述的突变体PAL(mPAL1)。示例性PAL酶还描述于2016年5月13日提交的PCT/US2016/032562中，其内容以引用方式整体并入本文。PAL对苯丙氨酸的降解导致产生马尿酸。测量马尿酸盐的产生水平以评估Δpks对菌株活性的影响。SYNB1618和SYNB1618是具有完整clb序列的亲本菌株。SYN8260和SYN8261是衍生自亲本克隆SYNB1618并具有Δpks的克隆。SYN8256是衍生自亲本克隆SYNB1934并具有Δpkspks的克隆。
为了测量活化细胞的PAL活性，将冷冻细胞等分试样解冻并稀释1000X，以测量600nm吸光度下的细胞密度(OD)。使用生成的OD值，将细胞在M9缓冲液中稀释至10OD。对于该测定，将细胞在测定缓冲液(含40mM苯丙氨酸的M9)中进一步稀释至1OD，最终体积为1mL，并在96深孔板中在37℃下不振荡地孵育2小时。在0、30、60、90和120分钟时，将150μL样品收集于v底96孔板中，并以4000rpm离心2分钟。将上清液的等分试样(100μL)转移到透明的平底96孔板中，以用于在290nm吸光度下进行TCA测量。使用synergy neo微板读数器测量600和290nm处的吸光度。
在测定缓冲液中制备TCA标准品，浓度如下：0.625、0.313、0.156、0.078、0.039、0.02和0.01mM。使用每个浓度在290nm处的吸光度值生成标准曲线，并使用该标准曲线将吸光度值转换为测定过程中产生的mM TCA。TCA产生速率使用针对0、30、60、90和120分钟时间点中的每一个计算的TCA量计算，并通过每小时1E9个细胞/mL(假设1OD＝1E9个细胞)归一化。最终TCA产生值报告为μmol/hr/1E9个细胞。结果在图7中示出，并且表明大肠杆菌素敲除菌株与其亲本菌株相比未表现出TCA产生的损失。
实施例4
大肠杆菌素的体外产生
为了证实Δpks缺失消除了大肠杆菌素的产生，评估了具有Δpks缺失的菌株产生大肠杆菌素的能力。大肠杆菌素是挥发性的并且不可直接检测。进行评估大肠杆菌素水平的替代测定，其中测量了大肠杆菌素前体的水平。大肠杆菌素前体被ClbP代谢为比率为1:2的大肠杆菌素和N-肉豆蔻酰-D-天冬酰胺，并且通过LC-MS/MS在细菌上清液中测量N-肉豆蔻酰-D-天冬酰胺。
简单来说，使用Thermo Vanquish UHPLC-Altis TSQ MS系统，通过LC-MS/MS对细菌上清液中的N-肉豆蔻酰-D-天冬酰胺进行量化。在80％乙腈中制备浓度为0.032至20μg/mL的标准品。用乙腈将样品萃取至80％。使用0.1％甲酸(A)和含0.1％甲酸的乙腈(B)在0.4mL/min和40℃下，将两微升注入Thermo Hypersil Gold 5μM C18，2.1x 100mm柱中。使用经2分钟从30％到98％ B的梯度分离分析物，然后进行洗涤和平衡步骤。通过串联质谱法检测化合物，其中使用N-肉豆蔻酰-D-天冬酰胺特定碰撞诱导的质量转变在电喷雾负离子模式下监测选定反应：343/211、343/326、343/133。343/211离子对的峰面积用于根据标准校准曲线计算未知浓度。结果在图8中示出，证明大肠杆菌素前体的产生在SYNB1618Δclb和SYNB1934Δclb菌株中被消除。
实施例5
Δpks菌株在施用于非人灵长类动物后的活性
本研究的目标是评估口服施用于非人灵长类动物后的药代动力学。实验设计在表4中示出。
表4.实验设计
治疗的施用
在第1天通过管饲法将测试制品施用于适当的动物。使用附接至塑料注射器的一次性导管，通过管饲法施用剂量制剂。给药后，将管饲管用5mL动物饮用水冲洗到动物的胃中。每组都用干净的管饲管给药。给药的第一天指定为第1天。动物在给药的前一天(第-1天)禁食过夜。蛋白胨以3.05克提供，并且之所以被选择是因为它模拟人的低蛋白饮食，并且允许检测进食后血液中的Phe和尿液中的Phe代谢物。向NHP给药10e11个细菌。在第1天向所有动物分配D5-Phe(20mg/mL)。对所有动物执行生活程序(in-life procedure)、观察和测量，包括适用的替代方案。在最后一次血液收集后恢复饮食。
样品收集和处理
在第1天给药前0hr和给药后30min、1hr、2hr、4hr和6hr通过静脉穿刺从适当的外周静脉收集血液以用于生物分析。收集后，将样品转移到适当的实验室以进行处理并储存在-80℃。根据下表收集样品。在第1天，在给药之前，插入干净的收集盘以帮助在室温下进行尿液收集。在给药后6小时结束时，测量并记录尿液总量。收集尿液样品并立即在干冰上冷冻。目标体积为1mL并且抗凝剂为肝素(钠)。将样品置于碎的湿冰上直到离心。按照标准程序将样品离心。分离所得的血浆，分两等份转移并立即在干冰上冷冻并储存于-80℃下。
通过LC-MS/MS量化NHP血浆或尿液中的Phe、d5-phe、TCA、d5-TCA、HA、d5-HA、肌酐
使用Thermo Ultimate 3000UHPLC-TSQ Quantum MS系统，通过LC-MS/MS对NHP血浆中的苯丙氨酸、d5-苯丙氨酸、反式肉桂酸和d5-反式肉桂酸以及NHP尿液中的马尿酸、d5-马尿酸和肌酐在非人灵长类动物尿液中进行量化。在水中制备0.16至250μg/mL的标准品溶液。将纯净血浆、40倍稀释尿液和在水中的标准品在含有1ug/mL13C915N-苯丙氨酸和d5-肌酐作为内标的乙腈中，用50mM的2-肼基喹啉、二硫二吡啶和三苯基膦中的每一种衍生化，并在60℃下孵育一小时。衍生化后，将20μL的标准品和样品用180μL 0.1％甲酸/乙腈(140:40)稀释。使用0.1％甲酸(A)和含0.1％甲酸的乙腈以0.5mL/min将10微升注入PhenomenexLuna 5um C18(2)100A，100x 2mm柱上，在初始10％ B保持0.5分钟后使用经1.5分钟从10％到97％B的梯度，然后进行洗涤和平衡步骤。通过串联质谱法检测化合物，其中使用以下离子对在电喷雾正离子模式下监测选定反应：苯丙氨酸307/186、d5-苯丙氨酸312/186、反式肉桂酸290/131、d5-反式肉桂酸295/136、马尿酸321/160、d5-马尿酸326/160、13C9 15N-苯丙氨酸317/187、肌酐114/44、d5-肌酐119/49。对色谱图进行积分，并使用分析物/内标峰面积比计算未知浓度。
实施例6
包含用于降解草酸盐的基因表达系统的Δpks菌株的体外活性特征
将实施例1中描述的Δpks EcN菌株(缺失的clbA-clbR基因和启动子序列、完整的clbS基因序列与缺失的可操作地连接的启动子)工程化为进一步包含用于降解草酸盐的表达系统，如提交于2016年8月31日的PCT/US2016/049781中所述，其内容通过引用整体并入本文，以评估Δpks对菌株的草酸盐消耗能力的影响。
使菌株在摇瓶中生长，并且随后在厌氧室中激活，接着浓缩并在基于甘油的配制缓冲液(PBS+25％甘油)中冷冻于≤–65℃下。在含有10mM草酸盐的测定培养基中，将活化细胞重悬至OD600＝5并且在37℃下静态孵育。在30和60min时取出上清液样品，以确定草酸盐的浓度。通过液相色谱-串联质谱法(LC-MS/MS)确定浓度。
使用Thermo Vanquish UHPLC-Altis TSQ MS系统，通过LC-MS/MS对细菌上清液中的草酸盐进行量化。在水中制备0.8至1000μg/mL的标准品。样品和标准品用包括1μg/mL13C2-草酸盐作为内标的10mM乙酸铵稀释十倍。使用10mM乙酸铵(A)和甲醇(B)在0.4mL/min和50℃下将十微升注入Waters Acquity HSS T31.8um100A 2.1x 100mm柱上。在初始100％A保持0.5分钟后，使用经1.5分钟从0到95％ B的梯度分离分析物，然后进行洗涤和平衡步骤。通过串联质谱法检测化合物，其中使用以下离子对在电喷雾负离子模式下监测选定反应：草酸盐89/61、13C2-草酸盐91/62。对色谱图进行积分，并使用草酸盐/13C2-草酸盐(分析物/内标)峰面积比计算未知浓度。
实施例7
能够分解代谢草酸盐的Δpks菌株在施用于非人灵长类动物后的药效动力学
将Δpks EcN菌株(例如，如实施例1中所述，其被工程化以进一步包含用于降解草酸盐的表达系统，如实施例6中所述)的体内活性与包含用于降解草酸盐的表达系统但不是Δpks缺失的菌株相比较。
进行体内活性单剂量交叉研究，以评估菌株在急性高草酸尿症的非人灵长类动物模型中代谢胃肠道和饮食衍生的草酸盐和13C2-草酸盐的能力。与媒介物对照相比，无论是否存在pks缺失，草酸盐和13C2-草酸盐的尿排出率(Urinary recovery)均显著降低，表明这两种菌株都能够消耗患有急性高草酸尿症的非人灵长类动物体内的草酸盐。结果在图5和表6中示出。
表5.与媒介物对照相比的尿液草酸盘的变化百分比
表6.与媒介物对照相比的尿液13 C2-草酸盐的变化百分比
示例性序列
>扩展短杆菌_MGL–SEQ ID NO:101
ATGACGAGCCTTCACCCCGAAACTTTAATGGTGCACGGGGGTATGAAGGGATTGACAGAGGCGGGTGTTCACGTCCCGGCGATCGACCTGTCGACAACGAATCCTGTTAATGACGTAGCGACAGGGGGTGATTCTTACGAATGGCTTGCAACGGGTCACACGTTGAAGGATGGTGATTCTGCTGTTTACCAGCGTTTATGGCAGCCCGGTGTAGCTCGTTTCGAGACGGCTCTGGCTGGGCTGGAGCACGCGGAGGAGGCTGTAGCTTTCGCCACGGGTATGGCCGCCATGACCGCGGCCTTATTGGCAGCAGTATCAGCTGGCACGCCTCATATCGTCGCAGTCCGCCCATTATACGGCGGTTCAGACCATCTTTTAGAGACTGGTTTACTGGGGACAACTGTCACGTGGGCGAAAGAAGCTGACATCGCCAGTGCAATCCAAGACGATACAGGGTTAGTGATCGTGGAGACGCCAGCCAATCCTAGTCTTGATCTGGTAGACCTGGATTCTGTCGTGTCAGCGGCAGGGAACGTCCCTGTCCTTGTAGATAATACGTTTTGTACTCCTGTCCTTCAGCAACCTATCTCGCACGGCGCCGCACTTGTATTACATTCGGCAACAAAGTATTTAGGGGGGCATGGGGACGCCATGGGCGGGATCATCGCGACTAATGCTGATTGGGCTATGCGCCTGCGTCAGGTCCGTGCGATCACTGGTGCATTACTGCATCCGATGGGCGCGTACTTGTTACACCGCGGTTTGCGTACTCTGGCTGTTCGCATGCGTGCCGCTCAGACAACTGCTGGTGAGCTTGCTGAGCGCTTAGACGCTCATCCCGCTATTTCAGTTGTGCACTACCCAGGATTGAAGGGGCAAGATCCTCGTGGATTGTTAGGCCGTCAGATGAGTGGAGGTGGGGCAATGATTGCTATGGAGCTGGCAGGGGGATTCGATGCGGCACGCTCCTTTGTTGAGCATTGTAACTTGGTCGTGCATGCCGTATCACTTGGGGGAGCAGACACATTAATTCAACATCCGGCAAGTTTGACACACCGCCCGGTCGCAGCAACCGCCAAGCCTGGTGATGGTTTGATCCGCTTGAGCGTGGGGCTTGAGCACGTTGACGACTTGGCCGATGACTTGATCGCTGCTTTGGACGCCTCTCGCGCTGCTGCATGA
>弗氏柠檬酸杆菌_MGL–SEQ ID NO:102
ATGTCTGATTGTCGTGCCTACGGCTTTAACACACAGATCGTCCACGCCGGACAACAACCGGACCCAAGCACTGGTGCATTGTCGACGCCAATCTTTCAGACTTCTACTTTCGTTTTCGATTCGGCAGAACAGGGGGCCGCACGTTTCGCGTTGGAGGAACCGGGATACATCTATACGCGCTTGGGCAATCCAACTACTGATGCGCTTGAAAAGAAACTTGCAGTGCTGGAACGTGGGGACGCGGCGTTAGCCACAGCGAGCGGCATCTCCGCTATTACCACAAGTCTTCTTACTCTTTGCCAGCAAGGGGACCATATCGTATCAGCTAGTGCAATCTACGGTTGCACTCACGCATTCTTAAGTCATTCGCTTCCTAAATTTGGCATTAACGTTTCATTCGTCGACGCAGCGAAGCCCGAAGAAATCCGCGCCGCCATGCGTCCAGAGACAAAAGTGGTATATATCGAGACGCCCGCGAACCCTACTTTATCCTTAGTGGATATTGAGACTGTTGCTGGAATCGCGCACCAGCAAGGAGCCTTGTTAGTCGTGGACAACACTTTTATGTCTCCGTATTGTCAACAACCATTACTGCTGGGTGCTGACATCGTGGTCCATAGTGTTACCAAGTACATTAACGGGCATGGGGATGTTATTGGCGGTGTCATCGTAGGTAAACAGGAGTTCATCGACCAAGCACGCTTTGTGGGATTAAAGGACATTACGGGCGGATGCATGAGCCCCTTTAATGCATGGCTGACACTTCGCGGGGTAAAGACGTTAGGGATCCGTATGGAGCGTCATTGCGAAAACGCATTGAAAATCGCGCGTTTTCTTGAGGGCCATCCTGCTATTACACGTGTCTATTATCCTGGATTGCCGTCACACCCCCAATACGAACTTGGGAAGCGCCAAATGTCGCTTCCTGGGGGAATCATTTCGTTTGAAATTGCTGGTGGCCTTGAAGCAGGTCGCCGTATGATTAACAGCGTGGAGTTATGTTTGCTGGCAGTTAGCTTAGGTGATACGGAGACGTTGATTCAGCATCCGGCGAGCATGACACATTCCCCTGTTGCTCCCGAGGAGCGTCTGAAGGCTGGCATCACTGATGGACTGATCCGTTTGTCCGTCGGCCTTGAAGATCCGGAAGACATCATTAACGACCTGGAGCACGCCATTCGCAAGGCAACGTTTtaa
>牙龈卟啉单胞菌_MGL–SEQ ID NO:103
ATGAAGAAAGAGGACTTAATGCGTTCGGGGTTCGCAACTCGTGCTATTCATGGTGGAGCCATCGAAAATGCTTTTGGGTGCCTGGCCACCCCCATCTACCAAACTTCAACGTTTGTTTTCGATACGGCTGAACAGGGTGGACGTCGCTTTGCGGGTGAAGAAGATGGGTACATTTACACTCGCTTAGGAAACCCGAACTGTACCCAGGTTGAGGAGAAGCTGGCGATGTTAGAAGGAGGGGAAGCAGCGGCCTCCGCAAGTAGTGGTATCGGAGCGATCTCTTCAGCTATCTGGGTGTGCGTCAAGGCGGGAGATCATATTGTAGCGGGAAAAACTTTGTACGGTTGCACGTTTGCGTTCTTGACCCACGGACTTTCTCGCTATGGAGTTGAGGTCACCTTGGTGGACACGCGCCATCCAGAAGAGGTTGAGGCCGCTATTCGTCCAAACACTAAGTTGGTCTATTTGGAAACTCCCGCAAACCCTAACATGTACCTTACTGATATCAAAGCTGTGTGTGATATCGCGCACAAGCATGAGGGTGTTCGCGTCATGGTGGATAATACCTACTGTACACCTTACATCTGTCGCCCACTGGAGTTAGGTGCTGATATTGTTGTCCATTCCGCCACAAAATATCTGAACGGACATGGAGATGTTATCGCTGGGTTTGTAGTAGGGAAAGAGGATTACATCAAGGAGGTCAAATTGGTTGGTGTTAAGGACTTGACAGGAGCCAATATGTCACCCTTCGACGCATACCTTATTAGTCGTGGTATGAAGACGTTACAAATCCGTATGGAACAACATTGCCGTAACGCACAAACAGTTGCTGAGTTTCTGGAGAAGCATCCTGCGGTTGAGGCGGTGTACTTCCCGGGCTTGCCTTCATTCCCGCAATATGAGTTGGCCAAGAAGCAGATGGCACTTCCGGGAGCGATGATTGCGTTTGAAGTTAAGGGAGGCTGCGAAGCCGGTAAGAAACTTATGAACAATCTTCATCTGTGTTCCTTAGCCGTCTCCTTAGGCGATACCGAGACTTTAATCCAACACCCGGCCTCAATGACGCACTCGCCCTATACGCCCGAGGAACGCGCCGCAAGCGACATCTCGGAGGGGCTTGTACGCCTTTCTGTTGGATTGGAAAATGTTGAGGATATTATCGCGGACCTGAAGCATGGCCTGGATAGTCTTATCtaa
>链霉菌属物种590_MDC–SEQ ID NO:
104ATGTCCCCGACGGCGTTTCCAGCGGCCGAAACAGCTAC TGCCCCTGCAACTGCCGTCGATCCTGGGCCAGAACTGGACGGCGGAGATTTCGCCCTTCCAGAGGGCGGGCTGGATGACGATCGTCGCTTACGTGCATTGGACGCAGTTGACGAGTATTTGACCCGCAAGCGCAAGCATTTGGTTGGGTACCAAGCTACCCAGGATATGCAGGGAACGGCCTTGGATTTAGCCCGTTTCATGCCCAACAACATCAACAACCTGGGAGATCCTTTCCAGTCGGGTGGGTATAAACCAAATACGAAAGTCGTTGAGCGTGCCGTACTGGACTACTATGCAAAATTGTGGCACGCAGAACGTCCACACGACCCAGCTGACCCAGAAAGCTACTGGGGTTACATGTTATCGATGGGCTCAACTGAGGGCAACATGTACGCCCTGTGGAATGCACGTGACTACCTGTCGGGTAAGGCTTTGATTCAGCCTCCCACGGCACCATTTGACGCTGTTCGCTACGTGAAGGCTGACCCCGATCGCCGCAATCCTAACGCACACCACCCAGTCGCATTCTACTCGGAGGATACCCACTATTCTTTTGCTAAAGCCGTTGCGGTGCTGGGTGTCGAAACTTTCCACGCTGTGGGTCTGGAGAAATACGCTGACGAGTGCCCCTTGGTGGATCCAGTAACCGGCCTTCGTACCTGGCCGACCGAAGTTCCATCGCGCCCGGGGCCGTCGGGTTTAAGCTGGGACGGCCCTGGTGAGATTGATGTTGATGCGCTTGCAGTACTGGTCGAGTTCTTCGCAGCGAAGGGTCACCCCGTCTTCGTCAACCTTAACTTGGGGTCTACATTTAAAGGAGCACATGATGACGTACGTGCGGTATGTGAACGCTTATTACCAATCTTCGAGCGCCATGGCTTAGTACAACGTGAAGTTGTATATGGGAGCTGTCCCCAAACCGGCCGCCCTTTAGTGGATGTACGTCGCGGATTTTGGATCCACGTAGATGGGGCACTTGGGGCGGGGTATGCCCCTTTTCTGCGTCTTGCCGCCGAAGACCCGGAAGGTTATGGTTGGACCCCTGAGGCAGAATTACCTGAGTTCGACTTCGGCTTACGTTTGCCGACGGCGGGGCATGGAGAAGTTGATATGGTTAGCAGCATCGCCATGAGTGGACATAAGTGGGCAGGCGCGCCGTGGCCATGCGGCATCTATATGACGAAAGTGAAATATCAGATTAGTCCACCGTCACAGCCCGATTATATTGGTGCTCCTGACACAACATTTGCCGGTTCCCGTAACGGCTTTTCGCCGTTAATTTTGTGGGATCATTTATCGCGCTACTCGTACCGCGACCAGGTAGAGCGCATCCGCGAAGCACAGGAGCTTGCAGCATATTTGGAACGCCGCCTTACCGCTATGGAGCGCGAGCTGGGAGTGGAACTTTGGCCAGCCCGCACACCGGGTGCTGTAACCGTACGTTTTCGCAAACCCTCTGCTGAGCTGGTTGCGAAGTGGTCCTTGTCGTCGCAGGATGTTTTAATGGTGCCGGGTGATGAAACTACGCGTCGTAGTTACGTTCATGTGTTCGTGATGCCTTCTGTTGATCGTGCAAAGTTAGATGCGTTGCTGGCAGAATTGGCCGAAGATCCCGTCATCTTGGGTGCGCCTtaa
来自EcN的ABC转运蛋白–MetNIQ
>MetN–SEQ ID NO:105
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>MetI–SEQ ID NO:
106Atgtctgagccgatgatgtggctgctggttcgtggcgtatgggaaacgctggcaatgacct tcgtatccggtttttttggctttgtgattggtctgccggttggcgttctgctttatgtcacgcgtccggggcaaattattgctaacgcgaagttgtatcgtaccatttctgcgattgtgaacattttccgttccatcccgttcattatcttgctggtatggatgattccgtttacccgcgttattgtcggtacatcgattggattgcaggcagcgattgttccgttaaccgttggtgcagcaccgtttattgcccgtatggtcgagaacgctctgctggagatcccaaccgggttaattgaagcttcccgcgcaatgggggccacgccaatgcagatcgtccgtaaagtgctgttaccggaagcgttgccgggtctggtgaatgcggcaactatcaccctgattaccctggttggttattccgcgatgggtggtgcagtcggtgccggtggtttaggtcagattggctatcagtatggctacatcggctacaacgcgacggtgatgaatacggtactggtattgctggtcattctggtttatttaattcagttcgcaggcgaccgcatcgtccgggctgtcactcgcaagtaa
>MetQ–SEQ ID NO:107
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>扩展短杆菌_MGL–SEQ ID NO:108
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>弗氏柠檬酸杆菌_MGL–SEQ ID NO:
109MSDCRAYGFNTQIVHAGQQPDPSTGALSTPIFQTSTFVFDSAEQGAARFALEEPGYIYTRLGNPTTDALEKKLAVLERGDAALATASGISAITTSLLTLCQQGDHIVSASAIYGCTHAFLSHSLPKFGINVSFVDAAKPEEIRAAMRPETKVVYIETPANPTLSLVDIETVAGIAHQQGALLVVDNTFMSPYCQQPLLLGADIVVHSVTKYINGHGDVIGGVIVGKQEFIDQARFVGLKDITGGCMSPFNAWLTLRGVKTLGIRMERHCENALKIARFLEGHPAITRVYYPGLPSHPQYELGKRQMSLPGGIISFEIAGGLEAGRRMINSVELCLLAVSLGDTETLIQHPASMTHSPVAPEERLKAGITDGLIRLSVGLEDPEDIINDLEHAIRKATF*
>牙龈卟啉单胞菌_MGL–SEQ ID NO:110
MKKEDLMRSGFATRAIHGGAIENAFGCLATPIYQTSTFVFDTAEQGGRRFAGEEDGYIYTRLGNPNCTQVEEKLAMLEGGEAAASASSGIGAISSAIWVCVKAGDHIVAGKTLYGCTFAFLTHGLSRYGVEVTLVDTRHPEEVEAAIRPNTKLVYLETPANPNMYLTDIKAVCDIAHKHEGVRVMVDNTYCTPYICRPLELGADIVVHSATKYLNGHGDVIAGFVVGKEDYIKEVKLVGVKDLTGANMSPFDAYLISRGMKTLQIRMEQHCRNAQTVAEFLEKHPAVEAVYFPGLPSFPQYELAKKQMALPGAMIAFEVKGGCEAGKKLMNNLHLCSLAVSLGDTETLIQHPASMTHSPYTPEERAASDISEGLVRLSVGLENVEDIIADLKHGLDSLI*
>链霉菌属物种590_MDC–SEQ ID NO:111
MSPTAFPAAETATAPATAVDPGPELDGGDFALPEGGLDDDRRLRALDAVDEYLTRKRKHLVGYQATQDMQGTALDLARFMPNNINNLGDPFQSGGYKPNTKVVERAVLDYYAKLWHAERPHDPADPESYWGYMLSMGSTEGNMYALWNARDYLSGKALIQPPTAPFDAVRYVKADPDRRNPNAHHPVAFYSEDTHYSFAKAVAVLGVETFHAVGLEKYADECPLVDPVTGLRTWPTEVPSRPGPSGLSWDGPGEIDVDALAVLVEFFAAKGHPVFVNLNLGSTFKGAHDDVRAVCERLLPIFERHGLVQREVVYGSCPQTGRPLVDVRRGFWIHVDGALGAGYAPFLRLAAEDPEGYGWTPEAELPEFDFGLRLPTAGHGEVDMVSSIAMSGHKWAGAPWPCGIYMTKVKYQISPPSQPDYIGAPDTTFAGSRNGFSPLILWDHLSRYSYRDQVERIREAQELAAYLERRLTAMERELGVELWPARTPGAVTVRFRKPSAELVAKWSLSSQDVLMVPGDETTRRSYVHVFVMPSVDRAKLDALLAELAEDPVILGAP*
来自EcN的ABC转运蛋白–MetNIQ
>MetN–SEQ ID NO:
112MIKLSNITKVFHQGTRTIQALNNVSLHVPAGQIYGVIGAS GAGKSTLIRCVNLLERPTEGSVLVDGQELTTLSESELTKARRQIGMIFQHFNLLSSRTVFGNVALPLELDNTPKDEIKRRVTELLSLVGLGDKHDSYPSNLSGGQKQRVAIARALASNPKVLLCDEATSALDPATTRSILELLKDINRRLGLTILLITHEMDVVKRICDCVAVISNGELIEQDTVSEVFSHPKTPLAQKFIQSTLHLDIPEDYQERLQAEPFTDCVPMLRLEFTGQSVDAPLLSETARRFNVNNNIISAQMDYAGGVKFGIMLTEMHGTQQDTQAAIAWLQEHHVKVEVLGYV*
>MetI–SEQ ID NO:
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>MetQ–SEQ ID NO:
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>yjeH–SEQ ID NO:
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>弗氏柠檬酸杆菌_WT_MGL–SEQ ID NO:116
atgtctgactgtcgtgcttacggattcaatacccagatcgttcatgcgggccaacaacccgacccttccactggcgcgctcagtacgcctattttccagacgtcaaccttcgtttttgacagtgccgaacagggcgccgcccgctttgcgcttgaagaacccggctacatctatacgcgccttggaaaccccaccaccgacgcgctggagaaaaagctggctgtgctggaaagaggcgatgccgcgctggcaactgcatccggtatttcagccatcaccacctcgttgctgaccctttgccagcagggcgaccatatcgtttccgccagtgccatttacggctgcactcacgcttttctgtcacacagcctgccgaagttcggcattaacgtcagcttcgtcgacgccgccaagccggaagaaatccgcgcggccatgcgcccggaaaccaaagtggtgtatatcgaaacaccagcaaacccaacgctctcgctggttgatattgaaacggtcgccgggatcgcccatcagcaaggcgcattgctggtcgtggataacacctttatgtcaccctactgccagcaacctctgctgttaggtgccgacatcgtggtgcacagcgtgaccaagtacatcaacggccacggggacgtgattggcggtgtgattgttggcaagcaggaatttatcgaccaggcacgattcgtcgggctgaaagatatcaccggcggctgcatgagtccgttcaacgcctggctgacgctgcgcggcgtgaaaacgctgggcatccgaatggagcgccattgtgaaaacgcgttaaaaattgcccgcttcctggaagggcatccggccattacccgcgtgtattaccctggcttgccttcacatccgcagtatgagctgggtaaacgtcagatgagcctgccgggaggaattatcagcttcgaaatcgccggcggcctcgaggctggcagacggatgatcaattctgtagaattgtgcctcctcgcggtcagtctcggtgacaccgaaaccctcattcagcacccagcgtctatgacacattcgcccgttgcgccagaggaacggcttaaagcaggtattaccgacggacttatccgtctttctgttggtcttgaagatccagaagatattattaacgaccttgaacacgccatcagaaaggcaacattctga
>牙龈卟啉单胞菌_WT_MGL–SEQ ID NO:117
Atgaaaaaagaagaccttatgcgtagtggctttgccacacgtgccatccatggaggcgctatcgagaacgccttcggctgcttagccactcccatctaccaaacatcgactttcgtttttgacactgccgaacagggaggccgccgctttgccggagaggaagacggatacatctatacccgtctgggcaaccccaactgcacccaagtggaagagaaactggccatgctcgagggcggagaagccgccgcatcggcctcatccggtatcggagccatcagctctgccatctgggtatgcgtgaaggccggcgaccatatcgtagccggcaagacgctctacggctgcaccttcgccttcctcacccacggactgagccgctacggtgtggaagtcaccctcgtggatacccgccatccggaagaggtggaggctgccattcgcccgaatacgaagctcgtctatctggagactccggccaaccccaatatgtacctgaccgacatcaaggcagtctgcgacatcgctcataagcacgaaggcgtacgcgtcatggtggacaatacctactgcacgccctatatctgccgtccgctggagctgggtgccgacatcgtggtacacagcgcgaccaagtacctgaacggacatggcgacgtcatcgccggattcgtcgttggtaaagaggactacatcaaggaggtgaagctcgtcggcgtcaaggacctcacgggggccaatatgagtccgttcgatgcttatctgatcagccgcggcatgaagacgctgcagatacgtatggagcagcactgccgcaatgctcagaccgtagccgaattcctcgaaaagcatccggccgtagaagcagtttatttccccggacttccgagcttcccccaatacgaattggccaagaagcagatggcactgcccggagccatgatcgccttcgaagtgaagggcggttgcgaagccggtaagaagctgatgaacaacctgcacctctgctccctcgccgtgagcttgggcgatacggaaaccctcatccagcatccggccagcatgacccactcgccctacacacccgaagagcgtgctgccagcgacatatccgaaggactggtacgcctgtccgtgggtctggagaacgtggaggacatcatcgccgacctcaaacacggtctggacagcctgatctaa
>扩展短杆菌_WT_MGL–SEQ ID NO:118
atgacctcactgcacccagaaacgctcatggtccacggcggaatgaaaggcctcaccgaggcaggagtccacgtaccggccatcgacctctcgaccaccaacccagtcaacgatgtcgccaccggcggtgactcctacgaatggctcgccaccggccatacgctcaaggacggcgactcggccgtctaccagcgcctctggcagcccggtgtcgcacgcttcgagaccgcgctggccgggctcgaacacgctgaggaagcagtcgccttcgccacgggcatggccgcaatgactgccgcacttctcgcggccgtcagcgcaggaacaccccacatcgtcgcagtgcgtcccctctatggcggaagcgaccacctcctcgaaaccggactgctggggacaacagtcacatgggcaaaggaagccgacatcgcctcggcgatccaagatgacaccggactcgtcattgtcgagaccccggcaaaccccagcctggaccttgttgatctcgacagtgtcgtctcagccgccggcaacgtgcctgtgctggtggacaacacattctgcacacctgttctccagcagcccatctcccacggagcggccctcgtactgcacagcgcgacaaaatacctcggcggtcatggcgatgccatgggcggcatcatcgccaccaacgccgactgggcgatgcgcctgcgacaggtccgagccatcacaggagccctgctccaccccatgggcgcgtatctccttcatcggggcttgcgcactctggccgtgcgcatgcgcgcggctcagaccaccgccggtgagctcgctgagcgcctggacgcgcaccctgccatctccgtcgtccactacccgggactgaaaggccaggacccacgcggactgctcggacgccaaatgtccggtggtggtgcgatgatcgcgatggagctcgccggtggattcgacgccgcccgcagcttcgtcgaacactgcaacctcgtcgtccacgcggtgtccctgggcggcgctgacactctcatccagcatccggcgtcactgactcacaggccagttgcggccacggcgaagcccggcgatggtctcatccgactctctgtgggactcgaacacgtcgatgacctggcagacgatctcatcgctgccctcgacgcgagtcgggccgctgcctga
>链霉菌属物种590_WT_MetDC–SEQ ID NO:119
atgagcccgaccgccttccccgccgccgagaccgcgaccgcgcccgcgaccgccgtcgatcccggtccggagctggacggcggtgacttcgccctccccgagggcggcctggacgacgaccggcggctgcgcgcgctcgacgccgtggacgagtacctgacccgcaagcgcaagcacctggtcggctaccaggccacccaggacatgcagggcaccgcactggacctcgcccggttcatgccgaacaacatcaacaacctcggcgacccgttccagagcggcggatacaagcccaacaccaaggtcgtcgagcgggccgtgctcgactactacgcgaagctctggcacgccgagcgcccgcacgacccggccgacccggagtcgtactggggctacatgctgtccatgggctcgaccgagggcaacatgtacgccctctggaacgccagggactacctgagcggcaaggcgctgatccagccgccgaccgcccccttcgacgcggtgcgctacgtcaaggccgaccccgaccgacggaacccgaacgcccaccacccggtggccttctactccgaggacacccactactccttcgccaaggccgtggccgtcctcggcgtggagaccttccacgccgtcggcctggagaagtacgccgacgagtgcccgctggtcgacccggtgaccgggctgcgcacctggcccaccgaggtgccctcccgcccgggtccgtccggcctgtcctgggacggccccggcgagatagacgtcgacgccctcgccgtactcgtcgagttcttcgccgccaagggtcacccggtcttcgtcaacctcaacctcggcagcaccttcaagggcgcccacgacgacgtccgcgccgtctgcgagcgcttgctgccgatcttcgagcggcacgggctcgtccagcgcgaggtggtctacggcagctgcccgcagaccggccggccgctggtggacgtgcgccgcggcttctggatccacgtggacggcgcgctcggcgccggctacgcgccgttcctgcggctggccgccgaggacccggaagggtacggctggacgcccgaggcggagctgcccgagttcgacttcggcctgcggctgcccaccgccgggcacggcgaggtggacatggtctcctcgatcgcgatgagcggccacaagtgggccggcgcgccgtggccgtgcggcatctacatgaccaaggtgaagtaccagatctcgccgccgtcccagccggactacatcggcgccccggacaccaccttcgccggctcccgcaacggcttctccccgctgatcctctgggaccacctgtcccggtactcctaccgggaccaggtggagcggatccgcgaggcccaggagctggccgcctacctggagcggcggctgaccgccatggagcgcgaactcggcgtcgagctctggccggcccgtaccccgggcgccgtcaccgtacggttccgcaagccgagcgccgagctggtggccaagtggtcgctgtcctcccaggacgtgctgatggtcccgggcgacgagaccacccggcgcagctacgtgcacgtcttcgtgatgccctcggtcgaccgggccaagctggacgcgctgctcgccgaactcgccgaggacccggtgatcctgggcgcaccgtag
OxlT编码区(来自产甲酸草酸杆菌的草酸盐:甲酸盐反向转运蛋白)-SEQ ID NO:120
ATGAATAATCCACAAACAGGACAATCAACAGGCCTCTTGGGCAATCGTTGGTTCTACTTGGTATTAGCAGTTTTGCTGATGTGTATGATCTCGGGTGTCCAATATTCCTGGACACTGTACGCTAACCCGGTTAAAGACAACCTTGGCGTTTCTTTGGCTGCGGTTCAGACGGCTTTCACACTCTCTCAGGTCATTCAAGCTGGTTCTCAGCCTGGTGGTGGTTACTTCGTTGATAAATTCGGTCCAAGAATTCCATTGATGTTCGGTGGTGCGATGGTTCTCGCTGGCTGGACCTTCATGGGTATGGTTGACAGTGTTCCTGCTCTGTATGCTCTTTATACTCTGGCCGGTGCAGGTGTTGGTATCGTTTACGGTATCGCGATGAACACGGCTAACAGATGGTTCCCGGACAAACGCGGTCTGGCTTCCGGTTTCACCGCTGCCGGTTACGGTCTGGGTGTTCTGCCGTTCCTGCCACTGATCAGCTCCGTTCTGAAAGTTGAAGGTGTTGGCGCAGCATTCATGTACACCGGTTTGATCATGGGTATCCTGATTATCCTGATCGCTTTCGTTATCCGTTTCCCTGGCCAGCAAGGCGCCAAAAAACAAATCGTTGTTACCGACAAGGATTTCAATTCTGGCGAAATGCTGAGAACACCACAATTCTGGGTTCTGTGGACCGCATTCTTTTCCGTTAACTTTGGTGGTTTGCTGCTGGTTGCCAACAGCGTCCCTTACGGTCGCAGCCTCGGTCTTGCCGCAGGTGTGCTGACGATCGGTGTTTCGATCCAGAACCTGTTCAATGGTGGTTGCCGTCCTTTCTGGGGTTTCGTTTCCGATAAAATCGGCCGTTACAAAACCATGTCCGTCGTTTTCGGTATCAATGCTGTTGTTCTCGCACTTTTCCCGACGATTGCTGCCTTGGGCGATGTAGCCTTTATCGCCATGTTGGCAATCGCATTCTTCACATGGGGTGGTAGCTACGCTCTGTTCCCATCGACCAACAGCGATATTTTCGGTACGGCATACTCTGCCAGAAACTATGGTTTCTTCTGGGCTGCAAAAGCAACTGCCTCGATCTTCGGTGGTGGTCTGGGTGCTGCAATTGCAACCAACTTCGGATGGAATACCGCTTTCCTGATTACTGCGATTACTTCTTTCATCGCATTTGCTCTGGCTACCTTCGTTATTCCAAGAATGGGCCGTCCAGTCAAGAAAATGGTCAAATTGTCTCCAGAAGAAAAAGCTGTACATTAA
OxlT(来自产甲酸草酸杆菌的草酸盐:甲酸盐反向转运蛋白)-SEQ ID NO:121
MNNPQTGQSTGLLGNRWFYLVLAVLLMCMISGVQYSWTLYANPVKDNLGVSLAAVQTAFTLSQVIQAGSQPGGGYFVDKFGPRIPLMFGGAMVLAGWTFMGMVDSVPALYALYTLAGAGVGIVYGIAMNTANRWFPDKRGLASGFTAAGYGLGVLPFLPLISSVLKVEGVGAAFMYTGLIMGILIILIAFVIRFPGQQGAKKQIVVTDKDFNSGEMLRTPQFWVLWTAFFSVNFGGLLLVANSVPYGRSLGLAAGVLTIGVSIQNLFNGGCRPFWGFVSDKIGRYKTMSVVFGINAVVLALFPTIAALGDVAFIAMLAIAFFTWGGSYALFPSTNSDIFGTAYSARNYGFFWAAKATASIFGGGLGAAIATNFGWNTAFLITAITSFIAFALATFVIPRMGRPVKKMVKLSPEEKAVH*
frc(来自产甲酸草酸杆菌的甲酰辅酶A转移酶)–SEQ ID NO:122
ATGACTAAACCATTAGATGGAATTAATGTGCTTGACTTTACCCACGTCCAGGCAGGTCCTGCCTGTACACAGATGATGGGTTTCTTGGGCGCAAACGTCATCAAGATTGAAAGACGTGGTTCCGGAGATATGACTCGTGGATGGCTGCAGGACAAACCAAATGTTGATTCCCTGTATTTCACGATGTTCAACTGTAACAAACGTTCGATTGAACTGGACATGAAAACCCCGGAAGGCAAAGAGCTTCTGGAACAGATGATCAAGAAAGCCGACGTCATGGTCGAAAACTTCGGACCAGGCGCACTGGACCGTATGGGCTTTACTTGGGAATACATTCAGGAACTGAATCCACGCGTCATTCTGGCTTCCGTTAAAGGCTATGCAGAAGGCCACGCCAACGAACACCTGAAAGTTTATGAAAACGTTGCACAGTGTTCCGGCGGTGCTGCAGCTACCACCGGTTTCTGGGATGGTCCTCCAACCGTTTCCGGCGCTGCTCTGGGTGACTCCAACTCCGGTATGCACCTGATGATCGGTATTCTGGCCGCTCTGGAAATGCGTCACAAAACCGGCCGTGGTCAGAAAGTTGCCGTCGCTATGCAGGACGCTGTTCTGAATCTGGTTCGTATCAAACTGCGTGACCAGCAACGTCTGGAAAGAACCGGCATTCTGGCTGAATACCCACAGGCTCAGCCTAACTTTGCCTTCGACAGAGACGGTAACCCACTGTCCTTCGACAACATCACTTCCGTTCCACGTGGTGGTAACGCAGGTGGCGGCGGCCAGCCAGGCTGGATGCTGAAATGTAAAGGTTGGGAAACCGATGCGGACTCCTACGTTTACTTCACCATCGCTGCAAACATGTGGCCACAGATCTGCGACATGATCGACAAGCCAGAATGGAAAGACGACCCAGCCTACAACACATTCGAAGGTCGTGTTGACAAGCTGATGGACATCTTCTCCTTCATCGAAACCAAGTTCGCTGACAAGGACAAATTCGAAGTTACCGAATGGGCTGCCCAGTACGGCATTCCTTGCGGTCCGGTCATGTCCATGAAAGAACTGGCTCACGATCCTTCCCTGCAGAAAGTTGGTACCGTCGTTGAAGTTGTCGACGAAATTCGTGGTAACCACCTGACCGTTGGCGCACCGTTCAAATTCTCCGGATTCCAGCCGGAAATTACCCGTGCTCCGCTGTTGGGCGAACATACCGACGAAGTTCTGAAAGAACTGGGTCTTGACGATGCCAAGATCAAGGAACTGCATGCAAAACAGGTAGTTTGA
Frc(来自产甲酸草酸杆菌的甲酰辅酶A转移酶)-SEQ ID NO:123
MTKPLDGINVLDFTHVQAGPACTQMMGFLGANVIKIERRGSGDMTRGWLQDKPNVDSLYFTMFNCNKRSIELDMKTPEGKELLEQMIKKADVMVENFGPGALDRMGFTWEYIQELNPRVILASVKGYAEGHANEHLKVYENVAQCSGGAAATTGFWDGPPTVSGAALGDSNSGMHLMIGILAALEMRHKTGRGQKVAVAMQDAVLNLVRIKLRDQQRLERTGILAEYPQAQPNFAFDRDGNPLSFDNITSVPRGGNAGGGGQPGWMLKCKGWETDADSYVYFTIAANMWPQICDMIDKPEWKDDPAYNTFEGRVDKLMDIFSFIETKFADKDKFEVTEWAAQYGIPCGPVMSMKELAHDPSLQKVGTVVEVVDEIRGNHLTVGAPFKFSGFQPEITRAPLLGEHTDEVLKELGLDDAKIKELHAKQVV*
oxc(来自产甲酸草酸杆菌的草酰辅酶A脱羧酶)，也称为oxdc(草酸脱羧酶)–SEQID NO:124
ATGAGTAACGACGACAATGTAGAGTTGACTGATGGCTTTCATGTTTTGATCGATGCCCTGAAAATGAATGACATCGATACCATGTATGGTGTTGTCGGCATTCCTATCACGAACCTGGCTCGTATGTGGCAAGATGACGGTCAGCGTTTTTACAGCTTCCGTCACGAACAACACGCAGGTTATGCAGCTTCTATCGCCGGTTACATCGAAGGAAAACCTGGCGTTTGCTTGACCGTTTCCGCCCCTGGCTTCCTGAACGGCGTGACTTCCCTGGCTCATGCAACCACCAACTGCTTCCCAATGATCCTGTTGAGCGGTTCCAGTGAACGTGAAATCGTCGATTTGCAACAGGGCGATTACGAAGAAATGGATCAGATGAATGTTGCACGTCCACACTGCAAAGCTTCTTTCCGTATCAACAGCATCAAAGACATTCCAATCGGTATCGCTCGTGCAGTTCGCACCGCTGTATCCGGACGTCCAGGTGGTGTTTACGTTGACTTGCCAGCAAAACTGTTCGGTCAGACCATTTCTGTAGAAGAAGCTAACAAACTGCTCTTCAAACCAATCGATCCAGCTCCGGCACAGATTCCTGCTGAAGACGCTATCGCTCGCGCTGCTGACCTGATCAAGAACGCCAAACGTCCAGTTATCATGCTGGGTAAAGGCGCTGCATACGCACAATGCGACGACGAAATCCGCGCACTGGTTGAAGAAACCGGCATCCCATTCCTGCCAATGGGTATGGCTAAAGGCCTGCTGCCTGACAACCATCCACAATCCGCTGCTGCAACCCGTGCTTTCGCACTGGCACAGTGTGACGTTTGCGTACTGATCGGCGCTCGTCTGAACTGGCTGATGCAGCACGGTAAAGGCAAAACCTGGGGCGACGAACTGAAGAAATACGTTCAGATCGACATCCAGGCTAACGAAATGGACAGCAACCAGCCTATCGCTGCACCAGTTGTTGGTGACATCAAGTCCGCCGTTTCCCTGCTCCGCAAAGCACTGAAAGGCGCTCCAAAAGCTGACGCTGAATGGACCGGCGCTCTGAAAGCCAAAGTTGACGGCAACAAAGCCAAACTGGCTGGCAAGATGACTGCCGAAACCCCATCCGGAATGATGAACTACTCCAATTCCCTGGGCGTTGTTCGTGACTTCATGCTGGCAAATCCGGATATTTCCCTGGTTAACGAAGGCGCTAATGCACTCGACAACACTCGTATGATTGTTGACATGCTGAAACCACGCAAACGTCTTGACTCCGGTACCTGGGGTGTTATGGGTATTGGTATGGGCTACTGCGTTGCTGCAGCTGCTGTTACCGGCAAACCGGTTATCGCTGTTGAAGGCGATAGCGCATTCGGTTTCTCCGGTATGGAACTGGAAACCATCTGCCGTTACAACCTGCCAGTTACCGTTATCATCATGAACAATGGTGGTATCTATAAAGGTAACGAAGCAGATCCACAACCAGGCGTTATCTCCTGTACCCGTCTGACCCGTGGTCGTTACGACATGATGATGGAAGCATTTGGCGGTAAAGGTTATGTTGCCAATACTCCAGCAGAACTGAAAGCTGCTCTGGAAGAAGCTGTTGCTTCCGGCAAACCATGCCTGATCAACGCGATGATCGATCCAGACGCTGGTGTCGAATCTGGCCGTATCAAGAGCCTGAACGTTGTAAGTAAAGTTGGCAAGAAATAA
Oxc(来自产甲酸草酸杆菌的草酰辅酶A脱羧酶)-SEQ ID NO:125
MSNDDNVELTDGFHVLIDALKMNDIDTMYGVVGIPITNLARMWQDDGQRFYSFRHEQHAGYAASIAGYIEGKPGVCLTVSAPGFLNGVTSLAHATTNCFPMILLSGSSEREIVDLQQGDYEEMDQMNVARPHCKASFRINSIKDIPIGIARAVRTAVSGRPGGVYVDLPAKLFGQTISVEEANKLLFKPIDPAPAQIPAEDAIARAADLIKNAKRPVIMLGKGAAYAQCDDEIRALVEETGIPFLPMGMAKGLLPDNHPQSAAATRAFALAQCDVCVLIGARLNWLMQHGKGKTWGDELKKYVQIDIQANEMDSNQPIAAPVVGDIKSAVSLLRKALKGAPKADAEWTGALKAKVDGNKAKLAGKMTAETPSGMMNYSNSLGVVRDFMLANPDISLVNEGANALDNTRMIVDMLKPRKRLDSGTWGVMGIGMGYCVAAAAVTGKPVIAVEGDSAFGFSGMELETICRYNLPVTVIIMNNGGIYKGNEADPQPGVISCTRLTRGRYDMMMEAFGGKGYVANTPAELKAALEEAVASGKPCLINAMIDPDAGVESGRIKSLNVVSKVGKK*
ScAAE3(来自酿酒酵母的草酸辅酶A连接酶)–SEQ ID NO:126
ATGACCAGTGCAGCTACGGTGACCGCGAGCTTTAATGACACTTTTTCTGTGAGCGATAATGTCGCGGTAATCGTACCGGAAACCGATACGCAGGTCACCTACCGTGATCTTTCCCACATGGTAGGACACTTTCAAACAATGTTCACGAACCCGAATAGTCCTCTGTACGGGGCGGTCTTTCGTCAAGACACGGTAGCGATTAGCATGCGTAACGGCCTTGAATTTATTGTGGCTTTCCTTGGAGCCACGATGGATGCGAAAATTGGTGCGCCACTGAATCCCAATTATAAAGAGAAGGAGTTTAATTTTTACCTGAATGACTTAAAGTCCAAAGCCATCTGCGTGCCGAAAGGCACCACCAAACTGCAAAGTTCAGAAATTCTTAAGAGTGCGTCCACGTTCGGGTGCTTTATTGTGGAACTGGCGTTTGACGCCACCCGTTTTCGTGTTGAATATGACATTTACTCCCCGGAGGACAATTATAAACGTGTGATCTACCGCAGCCTTAACAATGCTAAGTTTGTCAACACAAACCCTGTCAAGTTCCCGGGTTTCGCCCGCAGCTCGGATGTTGCACTTATTTTGCATACCTCAGGCACCACTAGTACCCCAAAGACCGTACCCCTCTTGCATCTGAATATTGTCCGTTCAACCCTGAATATCGCCAACACTTACAAACTTACCCCGCTGGATCGCTCCTATGTTGTAATGCCGCTGTTTCATGTACATGGATTAATCGGCGTCTTACTGAGTACGTTCCGCACCCAGGGCAGTGTAGTCGTCCCGGACGGCTTTCATCCGAAGCTCTTCTGGGATCAGTTTGTTAAATATAACTGCAATTGGTTTAGTTGCGTCCCAACGATCTCTATGATTATGTTGAATATGCCCAAACCGAATCCGTTTCCGCACATTCGCTTTATCCGCTCATGTAGCAGCGCGCTGGCGCCAGCAACGTTTCACAAGCTGGAAAAAGAATTTAATGCCCCAGTTCTGGAAGCGTACGCGATGACAGAAGCATCTCATCAGATGACCAGTAACAATCTGCCTCCCGGTAAACGTAAACCGGGGACCGTGGGCCAACCTCAAGGTGTAACCGTAGTAATCCTGGATGACAACGATAACGTTCTGCCGCCCGGCAAAGTTGGCGAGGTGTCGATCCGTGGGGAGAACGTCACCCTGGGCTACGCTAATAACCCGAAAGCTAACAAAGAAAACTTCACTAAACGTGAAAACTATTTCCGTACCGGGGATCAGGGCTACTTCGACCCGGAGGGCTTTCTCGTGCTGACCGGCCGCATTAAAGAATTGATCAATCGCGGTGGTGAAAAAATTAGTCCTATTGAACTGGACGGAATCATGCTCTCGCATCCTAAAATCGACGAGGCGGTGGCGTTCGGCGTTCCAGATGATATGTATGGCCAAGTCGTTCAGGCGGCAATCGTGTTGAAAAAGGGGGAAAAGATGACCTATGAAGAATTAGTGAATTTCCTGAAAAAGCATTTAGCAAGCTTTAAAATCCCAACCAAAGTCTACTTTGTGGATAAGCTGCCTAAAACGGCCACCGGGAAGATTCAACGTCGCGTAATCGCCGAAACCTTCGCGAAATCTAGTCGCAACAAAAGCAAACTTtaa
ScAAE3(来自酿酒酵母的草酸辅酶A连接酶)–SEQ ID NO:127
MTSAATVTASFNDTFSVSDNVAVIVPETDTQVTYRDLSHMVGHFQTMFTNPNSPLYGAVFRQDTVAISMRNGLEFIVAFLGATMDAKIGAPLNPNYKEKEFNFYLNDLKSKAICVPKGTTKLQSSEILKSASTFGCFIVELAFDATRFRVEYDIYSPEDNYKRVIYRSLNNAKFVNTNPVKFPGFARSSDVALILHTSGTTSTPKTVPLLHLNIVRSTLNIANTYKLTPLDRSYVVMPLFHVHGLIGVLLSTFRTQGSVVVPDGFHPKLFWDQFVKYNCNWFSCVPTISMIMLNMPKPNPFPHIRFIRSCSSALAPATFHKLEKEFNAPVLEAYAMTEASHQMTSNNLPPGKRKPGTVGQPQGVTVVILDDNDNVLPPGKVGEVSIRGENVTLGYANNPKANKENFTKRENYFRTGDQGYFDPEGFLVLTGRIKELINRGGEKISPIELDGIMLSHPKIDEAVAFGVPDDMYGQVVQAAIVLKKGEKMTYEELVNFLKKHLASFKIPTKVYFVDKLPKTATGKIQRRVIAETFAKSSRNKSKL*
yfdE(来自大肠杆菌的乙酰辅酶A:草酸辅酶A转移酶)–SEQ ID NO:128
atgACAAATAATGAAAGCAAAGGGCCGTTTGAAGGCTTATTAGTTATCGATATGACACATGTCCTTAATGGACCTTTCGGAACTCAACTTCTTTGTAATATGGGCGCAAGGGTAATTAAAGTTGAGCCGCCGGGTCATGGTGATGATACCCGCACATTTGGTCCCTATGTGGATGGACAGTCACTCTATTACAGTTTTATTAATCATGGCAAAGAGAGTGTGGTTCTTGATTTAAAGAATGATCACGATAAAAGTATATTTATAAATATGCTCAAACAAGCTGATGTATTAGCTGAGAATTTTCGCCCAGGTACAATGGAAAAACTGGGGTTTTCATGGGAAACGCTTCAAGAAATCAACCCGCGCCTCATATATGCTTCATCGTCAGGTTTCGGACATACCGGTCCGCTAAAAGATGCTCCTGCCTACGATACCATCATTCAGGCAATGAGCGGGATAATGATGGAAACAGGATATCCTGATGCTCCGCCAGTGCGCGTTGGTACATCTCTTGCGGATCTATGCGGCGGTGTCTATTTATTCAGCGGAATAGTGAGTGCACTTTATGGCCGCGAAAAGAGCCAGAGAGGGGCGCATGTCGATATAGCGATGTTTGATGCCACGCTGAGTTTTCTGGAGCATGGTCTGATGGCATATATCGCAACTGGGAAGTCACCACAACGTCTGGGAAATCGCCATCCCTACATGGCACCTTTTGATGTTTTCAATACTCAGGATAAGCCGATTACGATTTGTTGTGGTAATGACAAGCTTTTTTCTGCGTTATGCCAGGCACTGGAGCTTACGGAACTGGTTAATGATCCCCGATTTAGCAGCAATATTTTACGCGTACAAAACCAGGCTATTCTTAAACAATATATTGAGCGGACGTTAAAAACGCAGGCAGCTGAAGTTTGGTTAGCCAGAATACATGAAGTTGGTGTACCCGTCGCGCCGTTATTAAGTGTGGCTGAGGCCATTAAATTGCCACAAACTCAGGCGAGAAATATGTTGATTGAAGCCGGGGGAATAATGATGCCGGGTAATCCGATAAAAATCAGCGGCTGCGCGGACCCGCATGTTATGCCGGGAGCGGCAACGCTCGACCAGCATGGGGAACAAATTCGCCAGGAGTTCTCATCAtaa
yfdE(来自大肠杆菌的乙酰辅酶A:草酸辅酶A转移酶)–SEQ ID NO:129
MTNNESKGPFEGLLVIDMTHVLNGPFGTQLLCNMGARVIKVEPPGHGDDTRTFGPYVDGQSLYYSFINHGKESVVLDLKNDHDKSIFINMLKQADVLAENFRPGTMEKLGFSWETLQEINPRLIYASSSGFGHTGPLKDAPAYDTIIQAMSGIMMETGYPDAPPVRVGTSLADLCGGVYLFSGIVSALYGREKSQRGAHVDIAMFDATLSFLEHGLMAYIATGKSPQRLGNRHPYMAPFDVFNTQDKPITICCGNDKLFSALCQALELTELVNDPRFSSNILRVQNQAILKQYIERTLKTQAAEVWLARIHEVGVPVAPLLSVAEAIKLPQTQARNMLIEAGGIMMPGNPIKISGCADPHVMPGAATLDQHGEQIRQEFSS*
yfdW(来自大肠杆菌的甲酰辅酶A转移酶)–SEQ ID NO:130
SYYHHHHHHLESTSLYKKAGLMSTPLQGIKVLDFTGVQSGPSCTQMLAWFGADVIKIERPGVGDVTRHQLRDIPDIDALYFTMLNSNKRSIELNTKTAEGKEVMEKLIREADILVENFHPGAIDHMGFTWEHIQEINPRLIFGSIKGFDECSPYVNVKAYENVAQAAGGAASTTGFWDGPPLVSAAALGDSNTGMHLLIGLLAALLHREKTGRGQRVTMSMQDAVLNLCRVKLRDQQRLDKLGYLEEYPQYPNGTFGDAVPRGGNAGGGGQPGWILKCKGWETDPNAYIYFTIQEQNWENTCKAIGKPEWITDPAYSTAHARQPHIFDIFAEIEKYTVTIDKHEAVAYLTQFDIPCAPVLSMKEISLDPSLRQSGSVVEVEQPLRGKYLTVGCPMKFSAFTPDIKAAPLLGEHTAAVLQELGYSDDEIAAMKQNHAI
yfdU(来自大肠杆菌的草酰辅酶A脱羧酶)–SEQ ID NO:131
MSDQLQMTDGMHIIVEALKQNNIDTIYGVVGIPVTDMARHAQAEGIRYIGFRHEQSAGYAAAASGFLTQKPGICLTVSAPGFLNGLTALANATVNGFPMIMISGSSDRAIVDLQQGDYEELDQMNAAKPYAKAAFRVNQPQDLGIALARAIRVSVSGRPGGVYLDLPANVLAATMEKDEALTTIVKVENPSPALLPCPKSVTSAISLLAKAERPLIILGKGAAYSQADEQLREFIESAQIPFLPMSMAKGILEDTHPLSAAAARSFALANADVVMLVGARLNWLLAHGKKGWAADTQFIQLDIEPQEIDSNRPIAVPVVGDIASSMQGMLAELKQNTFTTPLVWRDILNIHKQQNAQKMHEKLSTDTQPLNYFNALSAVRDVLRENQDIYLVNEGANTLDNARNIIDMYKPRRRLDCGTWGVMGIGMGYAIGASVTSGSPVVAIEGDSAFGFSGMEIETICRYNLPVTIVIFNNGGIYRGDGVDLSGAGAPSPTDLLHHARYDKLMDAFRGVGYNVTTTDELRHALTTGIQSRKPTIINVVIDPAAGTESGHITKLNPKQVAGN
甲硫氨酸输入系统通透酶蛋白MetP(枯草芽孢杆菌)–SEQ ID NO:132
atgtttgagaagtattttccaaatgttgacttgaccgagttatggaatgccacatatgaaactctgtatatgacattgatttccttactgtttgccttcgtaatcggcgtcatcctgggattgctgttattcttaacatctaaggggtctctttggcaaaataaagcagtaaattccgttatcgcagccgttgtcaacatctttcgttcaattcccttccttattttaatcatcctgcttcttggtttcactaaattcttagtgggaacaattttgggaccaaatgcggctcttcccgcgttagtcatcggtagtgctcccttttatgctcgtctggtcgaaatcgcacttcgtgaagtggacaaaggagtgattgaggcggcgaaatcgatgggggctaagacgagcactattatttttaaggttcttatccccgagtccatgcccgcgctgatttccggaattacagtgactgcgattgcattgatcgggtcaaccgccatcgcaggagctattggttctggtggattgggaaacttagcatacgttgaaggctatcaatcgaataatgcggatgtgaccttcgtggccacagttttcatcctgattattgttttcatcattcagatcattggtgaccttattaccaacatcatcgataaacgc

Claims (36)

1.一种工程化微生物，与包含未修饰的pks岛的相应微生物相比，其包含一种或多种编码治疗性分子的基因或基因盒和修饰的pks岛。
2.一种包含修饰的pks岛的工程化微生物，其中与包含未修饰的pks岛的相应微生物相比，所述修饰的pks岛包含修饰的clb序列，所述clb序列选自clbA、clbB、clbC、clbD、clbE、clbF、clbG、clbH、clbI、clbJ、clbK、clbL、clbM、clbN、clbO、clbP、clbQ、clbR或clbS基因或可操作地连接的启动子序列。
3.如权利要求2所述的工程化微生物，其中与包含未修饰的pks岛的相应微生物相比，所述修饰的pks岛包含修饰的clb序列，所述clb序列选自clbA、clbB、clbC、clbD、clbE、clbF、clbG、clbH、clbI、clbJ、clbK、clbL、clbM、clbN、clbO、clbP、clbQ、clbR或clbS基因序列。
4.如权利要求2或3所述的工程化微生物，其中与包含未修饰的pks岛的相应微生物相比，所述修饰的pks岛包含修饰的clb序列，所述clb序列选自clbA、clbB、clbC、clbD、clbE、clbF、clbG、clbH、clbI、clbJ、clbK、clbL、clbM、clbN、clbO、clbP、clbQ、clbR或clbS启动子序列。
5.如权利要求2-4中任一项所述的工程化微生物，其中与包含未修饰的pks岛的相应微生物相比，所述修饰的pks岛包含修饰的clb序列，所述clb序列选自clbA、clbB、clbC、clbD、clbE、clbF、clbG、clbH、clbI、clbJ、clbK、clbL、clbM、clbN、clbO、clbP、clbQ或clbR基因序列。
6.如权利要求2-4中任一项所述的工程化微生物，其中与包含未修饰的pks岛的相应微生物相比，所述修饰的pks岛包含修饰的clb序列，所述clb序列选自clbA、clbB、clbC、clbD、clbE、clbF、clbG、clbH、clbI、clbJ、clbK、clbL、clbM、clbN、clbO、clbP、clbQ或clbR启动子序列。
7.如权利要求1-6中任一项所述的工程化微生物，其中与包含未修饰的pks岛的相应微生物相比，所述修饰的pks岛在clb序列中包含缺失。
8.如权利要求7所述的工程化微生物，其中与包含未修饰的pks岛的相应微生物相比，所述clb序列中的所述缺失是部分缺失。
9.如权利要求7所述的工程化微生物，其中与包含未修饰的pks岛的相应微生物相比，所述clb序列中的所述缺失是完全缺失。
10.如权利要求1-9中任一项所述的工程化微生物，其中与包含未修饰的pks岛的相应微生物相比，所述修饰的pks岛在clb基因序列中包含缺失。
11.如权利要求1-10中任一项所述的工程化微生物，其中与包含未修饰的pks岛的相应微生物相比，所述修饰的pks岛在clb启动子序列中包含缺失。
12.如权利要求1-11中任一项所述的工程化微生物，其中与包含未修饰的pks岛的相应微生物相比，所述修饰的pks岛包含所述clbA、clbB、clbC、clbD、clbE、clbF、clbG、clbH、clbI、clbJ、clbK、clbL、clbM、clbN、clbO、clbP、clbQ和clbR基因序列的完全或部分缺失。
13.如权利要求1-12中任一项所述的工程化微生物，其中与包含未修饰的pks岛的相应微生物相比，所述修饰的pks岛包含完整或未修饰的clbS基因序列。
14.如权利要求1-13中任一项所述的工程化微生物，其中与包含未修饰的pks岛的相应微生物相比，所述修饰的pks岛包含可操作地连接至clbS的所述启动子的完全或部分缺失。
15.如权利要求2-14中任一项所述的工程化微生物，其还包含用于产生治疗性分子的基因或基因盒。
16.如权利要求1-15中任一项所述的工程化微生物，其中所述治疗性分子是苯丙氨酸代谢酶。
17.如权利要求1-15中任一项所述的工程化微生物，其中所述治疗性分子是草酸代谢酶。
18.如权利要求1-17中任一项所述的工程化微生物，其中所述治疗性分子能够减少有害分子。
19.如权利要求1-18中任一项所述的工程化微生物，其中所述工程化微生物是工程化细菌。
20.如权利要求1-19中任一项所述的工程化微生物，其中所述工程化微生物是工程化埃希氏菌属。
21.如权利要求1-20中任一项所述的工程化微生物，其中所述工程化微生物是工程化大肠杆菌。
22.如权利要求1-21中任一项所述的工程化微生物，其中所述工程化微生物是工程化大肠杆菌Nissle。
23.如权利要求1-22中任一项所述的工程化微生物，其中与包含未修饰的pks岛的相应微生物相比，所述工程化微生物产生较少的大肠杆菌素。
24.如权利要求1-23中任一项所述的工程化微生物，其中与包含未修饰的pks岛的相应微生物相比，所述工程化微生物产生较少的大肠杆菌素前体或代谢物。
25.如权利要求1-24中任一项所述的工程化微生物，其中与包含未修饰的pks岛的相应微生物相比，所述工程化微生物产生较少的N-肉豆蔻酰-D-天冬酰胺。
26.一种药物组合物，其包含如权利要求1-25中任一项所述的工程化微生物。
27.一种治疗方法，其包括向有需要的受试者施用如权利要求26所述的药物组合物。
28.一种减少有害分子的方法，其包括向有需要的受试者施用如权利要求26所述的药物组合物。
29.一种减少草酸盐的方法，其包括向有需要的受试者施用如权利要求26所述的药物组合物，其中所述治疗性分子是草酸代谢酶。
30.一种治疗HOX的方法，其包括向有需要的受试者施用如权利要求26所述的药物组合物，其中所述治疗性分子是草酸代谢酶。
31.一种减少苯丙氨酸的方法，其包括向有需要的受试者施用如权利要求26所述的药物组合物，其中所述治疗性分子是苯丙氨酸代谢酶。
32.一种治疗高苯丙氨酸血症的方法，其包括向有需要的受试者施用如权利要求26所述的药物组合物，其中所述治疗性分子是苯丙氨酸代谢酶。
33.一种治疗PKU的方法，其包括向有需要的受试者施用如权利要求26所述的药物组合物，其中所述治疗性分子是苯丙氨酸代谢酶。
34.一种降低甲硫氨酸水平的方法，其包括向有需要的受试者施用如权利要求26所述的药物组合物，其中所述治疗性分子是甲硫氨酸代谢酶。
35.一种治疗同型半胱氨酸尿症的方法，其包括向有需要的受试者施用如权利要求26所述的药物组合物，其中所述治疗性分子是甲硫氨酸代谢酶。
36.一种评估pks岛活性的方法，其包括使用LC-MS/MS检测N-肉豆蔻酰-D-天冬酰胺。
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