CN116948962A - 一种肿瘤引流淋巴结来源的肿瘤特异t细胞，及其分离扩增和应用 - Google Patents
一种肿瘤引流淋巴结来源的肿瘤特异t细胞，及其分离扩增和应用 Download PDFInfo
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- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2509/00—Methods for the dissociation of cells, e.g. specific use of enzymes
- C12N2509/10—Mechanical dissociation
Abstract
本发明属于生物工程和生物治疗领域，公开了一种肿瘤引流淋巴结来源的肿瘤特异T细胞，及其分离扩增和应用。相比于现有的肿瘤免疫细胞，本发明的肿瘤引流淋巴结来源淋巴细胞(LNL)具有其独特的优势：处于免疫耗竭状态的淋巴细胞更少，可获得的淋巴细胞数量更多，靶向抗原更广谱，肿瘤特异性的T细胞比例更高。在体外细胞杀伤试验和小鼠体内杀瘤试验中，LNL均具有明显的杀瘤效果。
Description
技术领域
本发明涉及一种肿瘤引流淋巴结来源的肿瘤特异T细胞，及其分离扩增和应用，尤其涉及circFam53b多肽在制备反应性T细胞与非反应性T细胞中的应用，属于生物工程和生物治疗领域。
背景技术
过继性细胞免疫治疗(Adoptive Cell Transfer Therapy,ACT)，是指从肿瘤患者体内分离免疫活性细胞，在体外进行扩增和功能鉴定，然后向患者回输，从而达到直接杀伤肿瘤或激发机体的免疫应答杀伤肿瘤细胞的目的。与传统的治疗方法相比，过继性细胞免疫治疗具有安全性高、治疗精准、疗效持久等特点。近10年来，随着免疫细胞、基因编辑等基础理论与技术手段的不断发展，过继性细胞免疫治疗成为继手术、放疗和化疗之后的第四种肿瘤治疗手段，为大量恶性肿瘤治疗带来了新的希望。
过继性免疫细胞治疗用到的免疫细胞按是否经基因工程改造可分为两大类：未经改造的主要包括肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)、细胞毒性T淋巴细胞(CTL)、细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK)等；经基因工程改造的主要包括嵌合抗原受体T细胞(CAR-T)、T细胞受体T细胞(TCR-T)、嵌合抗原受体自然杀伤细胞(CAR-NK)等。
未经改造的免疫细胞制备过程相对简单，成本较低，但临床效果欠佳。制备过程大致包括：①组织或体液分离提取活性细胞；②细胞体外诱导、扩增培养；③细胞收集、检测；④细胞回输治疗。基因工程改造的免疫细胞显示出较好的临床治疗效果，但制备过程繁琐，技术要求高，成本高昂，难以惠及大多数肿瘤患者。制备过程大致包括：①筛选肿瘤特异性抗原，以及对该抗原具有高度特异性的基因序列；②从患者体内分离出免疫细胞；③构建包含抗原高度特异性基因序列的病毒载体；④病毒转染免疫细胞；⑤细胞体外培养、扩增；⑥细胞收集、检测；⑦细胞回输治疗。
当前，未经改造的过继性细胞免疫治疗的T细胞主要来自外周血、肿瘤组织、腹水。外周血来源的T细胞中，肿瘤特异性T细胞含量极少，且大部分T细胞属于终末期效应T细胞，寿命较短。肿瘤组织和腹水来源的T细胞有部分识别肿瘤的能力，但由于处于肿瘤微环境中，T细胞抗肿瘤能力受到抑制，且大多处于耗竭状态。因此，如何从患者体内获取数量更多、活性更强的肿瘤特异性T细胞，以期获得更好的治疗效果，是临床亟需解决的问题。
发明内容
针对上述技术问题，本发明一方面提供了一种制备肿瘤引流淋巴结来源的肿瘤特异T细胞的方法，其包括如下步骤：
1、引流淋巴结免疫细胞(PreLNL)的制备；
2、circFam53b多肽特异性T细胞的筛选；
3、引流淋巴结来源的淋巴细胞(LNL细胞)的激活和扩增；
4、LNL细胞的收集，并验证circFam53b反应性T细胞与非反应性T细胞的肿瘤杀伤能力。
发明人发现，由于引流淋巴结是从癌症患者获得的淋巴组织，其中包含需要分离的特异性T细胞，在从引流淋巴结中分离T细胞时，需要先用消化酶等对引流淋巴结进行消化，从组织中释放出T细胞，再用特异性抗原来识别特异性T细胞。
因此，根据本发明的优选实施方案中，在步骤1中，包括在从引流淋巴结中分离T细胞时，先对引流淋巴结进行消化的步骤，以及将消化后的细胞及组织沉淀置于培养箱(例如37℃)中培养的步骤。
更优选地，在步骤1中，包括将消化后的细胞及组织沉淀置于37℃、5％CO2培养箱中培养一段时间，优选24-48小时。
根据多批次实验数据对比，本发明将消化后的细胞及组织沉淀置于37℃、5％CO2培养箱培养24hr后，再进行70μm滤网过滤、Ficoll分离等步骤，获取的引流淋巴结来源PreLNL数量明显多于消化后直接分离得到的PreLNL。
在本发明优选的实施方案中，在步骤1中还包括组织及外周血的获取、自体血清分离、和肿瘤组织冻存的步骤。
在本发明优选的实施方案中，在步骤1之后，在步骤2之前，还包括引流淋巴结免疫细胞(PreLNL)的冻存和复苏的步骤。
在本发明优选的实施方案中，冻存引流淋巴结免疫细胞(PreLNL)的细胞冻存液为含10％DMSO、40％AIM-V和50％自体血清的细胞冻存液。
在本发明优选的实施方案中，在引流淋巴结免疫细胞(PreLNL)复苏的过程中，向细胞悬液中加入1mg/mL的I型DNA酶，37℃、5％CO2培养箱中温浴10min。
在本发明优选的实施方案中，在步骤2中还包括树突状细胞(DC细胞)的制备。
在本发明优选的实施方案中，在步骤3中，采用流式分选出circFam53b反应性T细胞与非反应性T细胞，并分开培养。
在本发明优选的实施方案中，在步骤3中，采用含5％AB血清、2.5％Supergrow、1000U/mL rhIL-2、20ng/mL rhIL7、20ng/mL rhIL15、2ng/mL rhIL21的AIM-V培养体系扩增LNL细胞。
本发明另一方面提供了根据本发明所述的方法制备的肿瘤特异T细胞。
本发明另一方面提供了circFam53b多肽在制备肿瘤特异T细胞中的应用，其中circFam53b多肽序列优选为ALFRLTNRA，核苷酸序列为：GCCCTCTTCAGATTGACCAACCGAGCA。
本发明再一方面提供了本发明所述的肿瘤特异T细胞在制备治疗癌症的药物中的应用，其中药物优选为细胞制剂，癌症优选为乳腺癌、口腔癌、甲状腺癌、肺癌、胃癌、大肠癌、肝癌、胰腺癌、卵巢癌。
有益效果
与现有技术相比，本发明提供的LNL细胞制剂，由于细胞来源于引流淋巴结，改进了细胞获取和培养的方法，并且是流式筛选后分开培养，最终混合应用。优点主要包括以下方面：
1、本发明采用引流淋巴结作为T细胞来源，相比外周血、肿瘤组织、腹水等来源的T细胞，肿瘤引流淋巴结来源淋巴细胞(LNL)有其独特的优势，例如：处于免疫耗竭状态的淋巴细胞更少，可获得的淋巴细胞数量更多，靶向抗原更广谱，肿瘤特异性的T细胞比例更高。
2、本发明将消化后的细胞及组织沉淀置于37℃、5％CO2培养箱培养24hr后，再进行70μm滤网过滤、Ficoll分离等步骤，获取的引流淋巴结来源PreLNL数量明显多于消化后直接分离得到的PreLNL。
3、本发明采用含10％DMSO+40％AIM-V+50％自体血清的细胞冻存液来冻存PBMC及PreLNL细胞，减少了采用动物源性血清带来外源风险的可能。
4、本发明在细胞复苏过程中，向细胞悬液常规加入1mg/mL的I型DNA酶，37℃、5％CO2培养箱温浴10min，可去除死细胞释放的DNA，避免DNA缠绕导致活细胞聚团。
5、本发明采用流式分选出circFam53b反应性T细胞与非反应性T细胞，并分开培养，最终共同回输，在circFam53b阳性乳腺癌PDX小鼠模型中，显示出更强的肿瘤抑制效果。
6、本发明采用含5％AB血清+2.5％Supergrow+1000U/mL rhIL-2+20ng/mL rhIL7+20ng/mL rhIL15+2ng/mL rhIL21的AIM-V培养体系扩增LNL细胞，可使LNL中有更高比例的中央记忆型T细胞(TCM)，细胞增殖能力、活力更强，输注后体内存活时间更长。
7、本发明中未筛选的LNL细胞制剂或circFam53b反应性T细胞+非反应性T细胞组成的混合LNL细胞制剂，可用于包括但不限于：乳腺癌、口腔癌、甲状腺癌、肺癌、胃癌、大肠癌、肝癌、胰腺癌、卵巢癌等的临床治疗。
附图说明
图1是消化后直接分离的PreLNL与本发明消化后再培养24hr分离的PreLNL对比图；
A：消化后直接分离的PreLNL；
B：本发明消化后再培养24hr分离的PreLNL。
图2是分选前后，circFam53b反应性T细胞纯度对比图；
A：PreLNL；
B：筛选前circFam53b多肽+DC+PreLNL；
C：筛选后circFam53b多肽反应性T细胞。
图3是小鼠体内肿瘤杀伤实验结果和CD3+T细胞浸润图；
A：对照组；
B：未筛选LNL组；
C：circFam53特异LNL+非特异性LNL组；
D：对照组；
E：未筛选LNL组；
F：circFam53特异LNL+非特异性LNL组。
具体实施方式
为了更好的说明本方法的目的和优点，结合附图及具体实施例对本发明具体实施内容做进一步详细说明。
对比例(现有技术方案具体实施过程示例)
对比例1
手术获取引流淋巴结后，胶原酶+DNA酶消化30-60min，获得引流淋巴结T细胞。将人工合成肿瘤抗原多肽与引流淋巴结T细胞共培养1-2天，流式分选CD4+、CD25-辅助T细胞和CD8+杀伤性T细胞亚群。CD4+、CD25-辅助T细胞采用CD3/CD28磁珠+20ng/mL rhIL7+胎牛血清激活，CD8+杀伤性T细胞采用50ng/mL anti-CD3+20ng/mL rhIL7+5ng/mL rhIL15+胎牛血清激活。每3天半量换液，培养9天后收集两组细胞，分别按1:100的比例加入辐照的外周血单个核细胞，同时加入终浓度0.5μg/mL的人工合成肿瘤抗原多肽，继续培养12天，收获T细胞。
对比例2
通过淋巴细胞分离液分离出乳腺癌患者外周血中的PBMC。磁珠分选得到CD8+T细胞，重悬于含10％v/v AB血清的DMEM完全培养基中，加入20ng/mL IL-2，置于37℃、CO2培养箱中扩增培养6天。CD8-T细胞重悬于纯DMEM培养基中，贴壁2hr，轻摇弃去悬浮细胞，获得贴壁的单核细胞。向单核细胞中加入含10％v/v AB血清+50ng/mL GM-CSF+20ng/mL IL-4的DMEM完全培养基，每3天更换细胞因子，37℃、CO2培养箱中培养6天，得到DC细胞。将DC细胞和培养后的CD8+T细胞按照1:1的比例在24孔板中共培养并加入circFam53b所编码的抗原表位多肽(浓度为20μg/mL，每孔添加100μL)，共同培养3周。培养结束后收集细胞，进行细胞活率检测及计数。用CD8和定制的MHC I类circFam53b五聚体进行流式分选，得到CD8+、circFam53b五聚体阳性的T细胞。
实施例1：引流淋巴结免疫细胞(PreLNL)制备及冻存
1、组织及外周血获取
乳腺癌患者，术中切取肿瘤0.5～1g、腋窝引流淋巴结0.5～1g分别放入含100U/mL青霉素+100μg/mL链霉素的组织运输液中，抽取抗凝外周血5mL、非抗凝外周血5mL。
2、自体血清分离
将5mL非抗凝外周血置于室温2hr，待血清析出，3000rpm离心10min，吸取上层血清，转移至15mL离心管，56℃水浴灭活30min，即得自体血清。
3、肿瘤组织冻存
将肿瘤组织切至每块0.2g左右大小，一块用于Western Blot检测circFam53b蛋白表达情况，其余转移至15mL离心管，加5mL含100U/mL青霉素+100μg/mL链霉素的生理盐水洗涤2次，将肿瘤组织块转移至5mL冻存管，加入3mL纯AIM-V培养基，转移至液氮冻存。
4、引流淋巴结免疫细胞(PreLNL)制备及冻存
在50mL离心管中，将腋窝引流淋巴结剪碎，加入适量含1.5mg/mL的I型胶原酶+1.5mg/mL的III型胶原酶+0.1mg/mL的I型DNA酶组成的混合消化酶，37℃消化30min。将组织消化混合液转移至15mL离心管，加入8mL生理盐水，混合均匀，5000rpm离心10min，弃去上清。
用5mL含5％AB血清+2.5％Supergrow+2000U/mL rhIL-2的AIM-V培养基重悬细胞及组织沉淀，转移至T25培养瓶，置于37℃、5％CO2培养箱培养24hr。收集细胞及组织混合液，转移至50mL离心管，加入35mL生理盐水，混合均匀，于70μm滤网过滤，收集滤液。加入终浓度为0.1mg/mL的I型DNA酶，37℃温浴10min后，3000rpm离心10min，弃去上清。
用3mL生理盐水重悬细胞沉淀，置于5mL Ficoll分离液上层，1500rpm离心20min，取白膜层细胞转移至新的15mL离心管，加入10mL生理盐水，混合均匀，取200uL测定细胞浓度及活率，其余细胞悬液1500rpm离心5min，获得细胞沉淀，即得PreLNL。
配置含10％DMSO+40％AIM-V+50％自体血清的细胞冻存液。将冻存液、冻存管及冻存盒4℃预冷。根据细胞计数结果，按照1～2×107个/mL浓度，重悬PreLNL，加至1.5mL冻存管，放入冻存盒，-80℃冻存24hr后转移至液氮罐长期保存，待需要时复苏。
根据多批次实验数据对比，本发明将消化后的细胞及组织沉淀置于37℃、5％CO2培养箱培养24hr后，再进行70μm滤网过滤、Ficoll分离等步骤，获取的引流淋巴结来源PreLNL数量明显多于消化后直接分离得到的PreLNL，具体见附图1。
实施例2：circFam53b多肽特异性T细胞筛选
1、DC细胞制备
将5mL外周血，加至5mL Ficoll分离液上层，1500rpm离心20min。取白膜层细胞转移至新的15mL离心管，加入10mL生理盐水，混合均匀，2000rpm离心5min，即获得外周血单个核细胞(PBMC)沉淀。加入10mL生理盐水，混合均匀，取200uL测定细胞浓度及活率，其余细胞悬液1500rpm离心5min。配置含10％DMSO+40％AIM-V+50％自体血清的细胞冻存液。将冻存液、冻存管及冻存盒4℃预冷。根据细胞计数结果，按照1×107个/mL浓度，重悬PBMC，加至1.5mL冻存管，放入冻存盒，-80℃冻存24hr后转移至液氮罐长期保存，待需要时复苏。
复苏细胞时，离心机提前预冷至4℃，在15mL离心管中装入4℃纯AIM-V培养基10mL。从液氮取出PBMC冻存管，置于37℃水浴锅，待冻存管中还有绿豆大小冰块时，将冻存管转移至生物安全柜，加入1mL纯AIM-V培养基，冻存液完全溶解后，将细胞悬液转移至含有4℃纯AIM-V培养基的15mL离心管。轻轻摇匀，4℃离心机1500rpm离心5min后，弃去上清。加入2mL常温纯AIM-V培养基重悬PBMC，取100μL细胞悬液测细胞活率及计数。向剩余细胞悬液中加入1mg/mL的I型DNA酶200μL，混合均匀，置于37℃、5％CO2培养箱温浴10min后，1500rpm离心5min，弃去上清。
根据细胞计数结果，用常温纯AIM-V培养基调整细胞密度至2×106个/mL，接种至T25培养瓶，置于37℃、5％CO2培养箱2hr，以使单核细胞贴壁。取出T25培养瓶，轻摇瓶底至淋巴细胞飘起，吸去悬浮细胞及培养基。加入含1000U/mL GM-CSF+500U/mL rhIL-4+2.5％Supergrow的AIM-V培养基(DC I液)5mL，置于37℃、5％CO2培养箱中培养，诱导单核细胞向DC细胞分化。第3天，半量换液，吸去一半旧培养基，补加2.5mL DC I液。
第5天，用DC I液配置终浓度为20μg/mL的circFam53b多肽溶液，半量换液，吸去一半旧培养基，补加2.5mL circFam53b多肽溶液。其中采用的circFam53b多肽，其所编码的多肽抗原表位氨基酸序列为ALFRLTNRA，可以激活抗肿瘤免疫，杀伤肿瘤细胞，以下同。
第6天，配置含20ng/mL rhTNF-α+20ng/mL rhIL-1β+2000U/mL rhIL-6+2mg/mLPGE2+2.5％Supergrow的AIM-V培养基(DC II液)，半量换液，吸去一半旧培养基，补加2.5mLDC II液。
第8天，收集DC上清至15mL离心管，1500rpm离心5min，弃去上清，加入2.5mL含5％AB血清+2.5％Supergrow+1000U/mL rhIL-2+20ng/mL rhIL7+20ng/mL rhIL15+2ng/mLrhIL21的AIM-V培养基重悬细胞沉淀，重新加入至DC细胞瓶。即收获负载circFam53b多肽的成熟DC细胞。
2、circFam53b多肽特异性T细胞筛选
采用PCR、Western检测患者肿瘤组织中circFam53b的表达情况。针对circFam53b阳性患者进行circFam53b多肽特异性T细胞筛选。
离心机提前预冷至4℃，在15mL离心管中装入4℃纯AIM-V培养基10mL。从液氮取出PreLNL冻存管，置于37℃水浴锅，待冻存管中还有绿豆大小冰块时，将冻存管转移至生物安全柜，加入1mL纯AIM-V培养基，冻存液完全溶解后，将细胞悬液转移至含有4℃纯AIM-V培养基的15mL离心管。轻轻摇匀，4℃离心机1500rpm离心5min后，弃去上清。加入2mL常温纯AIM-V培养基重悬PreLNL，取100μL细胞悬液测细胞活率及计数。向剩余细胞悬液中加入1mg/mL的I型DNA酶200μL，混合均匀，置于37℃、5％CO2培养箱温浴10min后，1500rpm离心5min，弃去上清。
针对circFam53b阳性患者，根据细胞计数结果，用含5％AB血清+2.5％Supergrow+1000U/mL rhIL-2+20ng/mL rhIL7+20ng/mL rhIL15+2ng/mL rhIL21的AIM-V培养基重悬PreLNL细胞，调整细胞密度至2×106个/mL，接种至T25培养瓶，置于37℃、5％CO2培养箱培养2天。
用2.5mL含5％AB血清+2.5％Supergrow+1000U/mL rhIL-2+20ng/mL rhIL7+20ng/mL rhIL15+2ng/mL rhIL21的AIM-V培养基重悬PreLNL细胞，按细胞比10:1的比例，将PreLNL细胞加入T25DC瓶，置于37℃、5％CO2培养箱中与DC细胞共培养。根据细胞增殖情况，选择半量换液或扩瓶。
PreLNL细胞转移至15mL离心管，1500rpm离心5min，弃去上清。用2.5mL含5％AB血清+2.5％Supergrow+1000U/mL rhIL-2+20ng/mL rhIL7+20ng/mL rhIL15+2ng/mL rhIL21的AIM-V培养基重悬PreLNL细胞，按细胞比例10:1的比例，将PreLNL细胞加入T25 DC瓶，置于37℃、5％CO2培养箱中与DC细胞共培养。根据细胞增殖情况，选择半量换液或扩瓶。共培养第7天后，收集细胞悬液，采用circFam53b五聚体进行流式分选circFam53b反应性T细胞与非反应性T细胞。将分选得到的circFam53b反应性T细胞与非反应性T细胞，各吸取100μL细胞悬液测细胞活率及计数，剩余细胞悬液分别转入15mL离心管，1500rpm离心5min，弃去上清。
经分选后，circFam53b反应性T细胞纯度达到98.26，具体见附图2C。
实施例3：激活和扩增LNL细胞，并验证circFam53b反应性T细胞与非反应性T细胞的肿瘤杀伤能力
配置含5％AB血清+2.5％Supergrow+1000U/mL rhIFNγ的AIM-V培养基，分别调整circFam53b反应性T细胞与非反应性T细胞浓度至2×106个/mL。根据细胞数量，分别接种至24孔板或12孔或T25瓶，置于37℃、5％CO2培养箱培养24hr后半量换液。加入等量的含5％AB血清+2.5％Supergrow+60ng/mL OKT CD3单抗+2000U/mL rhIL-2+40ng/mL rhIL7+40ng/mLrhIL15+4ng/mL rhIL21的AIM-V培养基，置于37℃、5％CO2培养箱培养3天。根据细胞增殖情况，每2-3天扩瓶培养，补加等量含5％AB血清+2.5％Supergrow+2000U/mL rhIL-2+40ng/mLrhIL7+40ng/mL rhIL15+4ng/mL rhIL21的AIM-V培养基。
体外培养2-3周后，收集circFam53b反应性T细胞与非反应性T细胞，细胞数量可达5-20×109。检测细胞活率及计数；流式检测CD3、CD4、CD8、CD45RO、CD62L、CD95、circFam53b五聚体等细胞标志物。
取circFam53b阳性乳腺癌患者的新鲜肿瘤组织，移植至NCG小鼠体内，构建circFam53b阳性乳腺癌PDX模型。小鼠分为：对照组(注射生理盐水)、未筛选LNL组(不经circFam53b多肽筛选，直接培养的PreLNL)、circFam53b特异LNL+非特异性LNL组(circFam53b多肽筛选后，分别培养circFam53b反应性T细胞与非反应性T细胞，最终按1:1混合)。小鼠体内肿瘤杀伤实验结果表明：circFam53b特异LNL+非特异性LNL组相比未筛选LNL组，具有更强的抑制肿瘤生长能力，具体见附图3B、3C)。小鼠肿瘤免疫组化实验结果表明：circFam53b特异LNL+非特异性LNL组相比未筛选LNL组，具有更多CD3+T细胞浸润，具体见附图3E、3F)。
以上所述为本发明的较佳实施例而已，本发明不应该局限于该实施例和附图所公开的内容。凡是不脱离本发明所公开的精神下完成的等效或修改，都落入本发明保护的范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 中山大学孙逸仙纪念医院
<120> 一种肿瘤引流淋巴结来源的肿瘤特异T细胞，及其分离扩增和应用
<130> 20220411
<160> 2
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 1
Ala Leu Phe Arg Leu Thr Asn Arg Ala
1 5
<210> 2
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 2
gccctcttca gattgaccaa ccgagca 27
Claims (10)
1.一种制备肿瘤引流淋巴结来源的肿瘤特异T细胞的方法，其包括如下步骤：
(1)引流淋巴结免疫细胞(PreLNL)的制备；
(2)circFam53b多肽特异性T细胞的筛选；
(3)引流淋巴结来源淋巴细胞(LNL细胞)的激活和扩增，
(4)LNL细胞的收集，并验证circFam53b反应性T细胞与非反应性T细胞的肿瘤杀伤能力；
其中，在步骤(1)中，包括将消化后的细胞及组织沉淀置于37℃、5％CO2培养箱中培养24hr。
2.根据权利要求1所述的方法，其中在步骤(1)中还包括组织及外周血的获取、自体血清分离、和肿瘤组织冻存的步骤；在步骤(2)中还包括树突状细胞(DC细胞)的制备。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中在步骤(1)之后，在步骤(2)之前，还包括引流淋巴结免疫细胞(PreLNL)的冻存和复苏的步骤。
4.根据权利要求3所述的方法，其中细胞冻存液为含10％DMSO、40％AIM-V和50％自体血清的细胞冻存液。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中在细胞复苏的过程中，向细胞悬液中加入1mg/mL的I型DNA酶，37℃、5％CO2培养箱中温浴10min。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其中在步骤(3)中，采用流式分选出circFam53b反应性T细胞与非反应性T细胞，并分开培养。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的方法，其中在步骤(3)中，采用含5％AB血清、2.5％Supergrow、1000U/mL rhIL-2、20ng/mL rhIL7、20ng/mL rhIL15、2ng/mL rhIL21的AIM-V培养体系扩增LNL细胞。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的方法制备的肿瘤特异T细胞。
9.circFam53b多肽在制备肿瘤特异T细胞中的应用，其中circFam53b多肽序列优选为ALFRLTNRA，核苷酸序列为：GCCCTCTTCAGATTGACCAACCGAGCA。
10.权利要求8所述的肿瘤特异T细胞在制备治疗癌症的药物中的应用，其中药物优选为细胞制剂，癌症优选为乳腺癌、口腔癌、甲状腺癌、肺癌、胃癌、大肠癌、肝癌、胰腺癌、卵巢癌。
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