CN108192865A

CN108192865A - Nk细胞体外扩增方法及用于该方法的试剂盒

Info

Publication number: CN108192865A
Application number: CN201711467912.XA
Authority: CN
Inventors: 姜丽君; 毕薇薇; 李超; 邢亚丽
Original assignee: JILIN TUO HUA BIO-TECHNOLOGY Co Ltd
Current assignee: JILIN TUO HUA BIO-TECHNOLOGY Co Ltd
Priority date: 2017-12-29
Filing date: 2017-12-29
Publication date: 2018-06-22
Anticipated expiration: 2037-12-29
Also published as: CN108192865B

Abstract

本发明提供了一种NK细胞体外扩增方法及用于该方法的试剂盒。根据本发明的方法对从脐带血或外周血分离出的单个核细胞进行体外诱导扩增后所获得的NK细胞，经流式检测CD3^‑CD16⁺CD56⁺细胞比例高达90％以上，且培养更符合临床级制备要求，在体内外均显现出良好的杀伤活性。另一方面，本发明提供了用于诱导分化NK细胞的HER‑抗体和α‑甘露聚糖肽以及用于扩增NK细胞的兔抗人胸腺细胞免疫球蛋白、IL‑15和IL‑2在制备用于体外获得高纯度的NK细胞的试剂盒中的用途。

Description

NK细胞体外扩增方法及用于该方法的试剂盒

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种高纯度的临床级NK细胞体外扩增方法及试剂盒。

背景技术

细胞治疗是继手术、放疗和化疗之后的又一种肿瘤治疗方法，它一般作为手术、放化疗的辅助手段，延长患者的寿命，清除体内手术后残余的肿瘤细胞。NK细胞是一类无主要组织相容性复合物(MHC)限制性、能直接杀伤靶细胞的特殊淋巴细胞群体，被认为是肿瘤免疫治疗的重要效应细胞，它不仅与抗肿瘤、抗病毒感染和免疫调节有关，而且在某些情况下参与超敏反应和自身免疫性疾病的发生。外周血中的NK细胞数量非常有限，所以限制了NK细胞的临床应用。当今获得临床级NK细胞的方法是体外培养，即分离患者外周血的单个核细胞进行诱导和扩增，使其增加数百甚至数千倍并且细胞毒性得到很大的提高，再把NK细胞回输到患者的体内，但是常规的NK细胞的制备方法并不理想，目前国内体外培养NK细胞方法主要有以下几种方法：一种是采用滋养层细胞扩增NK细胞方法，即将单个核细胞与肿瘤细胞株(如K562细胞株)混合培养诱导扩增NK细胞。此方法虽然可以大大增强NK细胞杀瘤性和增殖率，但在培养过程中引入了肿瘤细胞，虽经过致死剂量的γ射线照射，如果发生存活的滋养层细胞随细胞一起进入人体会存在安全隐患。另一种方法采用免疫磁珠法，这种方法分离出的细胞虽然纯度较高，但大大增加了研究成本，而且因为缺乏成熟的分选后体外培养工艺，所以很难在体外扩增，无法满足临床回输所需的细胞数量。因此，国内目前的NK细胞培养试剂盒或NK细胞培养方法在细胞数量、细胞纯度和杀瘤性上不能满足临床和科研需要。

发明内容

为了解决现有技术中NK细胞纯度不够、扩增倍数不高、扩增方法成本高且比较麻烦以及安全性不够的问题，本发明提供一种体外诱导扩增单个核细胞以获得高纯度的NK细胞的方法，所述方法包括以下步骤：

1)用终浓度0.01-10μg/ml的HER-2抗体在4℃下包被培养瓶；

2)获得分离的单个核细胞；

3)用干细胞生长培养基将上述步骤2)中获得的分离的单个核细胞调整至1×10⁶至2×10⁶个/ml的密度，并加入到步骤1)的HER-2抗体包被的培养瓶中，向培养瓶中加入终浓度为1-100μg/ml的α-甘露聚糖肽；在适合细胞生长的条件下培养；

4)培养3-5天后，向步骤3)获得的培养物中加入干细胞生长培养基，并加入兔抗人胸腺细胞免疫球蛋白至终浓度10-2000ng/ml，在适合细胞生长的条件下继续培养；

5)继续培养3-5天后，向步骤4)获得的培养物中加入含有终浓度2-200ng/ml的IL-15和终浓度100-10000IU/ml的IL-2的X-VIVO-15无血清培养基，并加入5％灭活血浆，在适合细胞生长的条件下继续培养；

6)继续培养3-5天后，向步骤5)获得的培养物中加入含有终浓度2-200ng/ml的IL-15和终浓度100-10000IU/ml的IL-2的X-VIVO-15无血清培养基，在适合细胞生长的条件下继续培养；

7)重复步骤6)1-10次，优选地，重复步骤6)2-7次，更优选地，重复步骤6)3-5次，更优选地，重复步骤6)4次，获得高纯度的NK细胞。

根据上述本发明的方法，其中步骤3)为NK细胞的诱导步骤，步骤4)至步骤7)为NK细胞的扩增步骤。

进一步地，根据上述本发明的方法，其中步骤2)中的单个核细胞分离自哺乳动物的外周血或脐带血；优选地，所述哺乳动物是非人哺乳动物；进一步优选地，所述哺乳动物是人。

进一步地，根据上述本发明的方法，其中步骤3)中的HER-2抗体的终浓度为0.01-10μg/ml、优选0.02-9μg/ml、优选0.03-8μg/ml、优选0.04-7μg/ml、优选0.05-6μg/ml、优选0.06-6μg/ml、优选0.07-4μg/ml、优选0.08-3μg/ml、优选0.09-2μg/ml、优选0.1-1μg/ml、优选0.2μg/ml、优选0.3μg/ml、优选0.4μg/ml、优选0.5μg/ml、优选0.6μg/ml、优选0.7μg/ml、优选0.8μg/ml、优选0.9μg/ml。

进一步地，根据上述本发明的方法，其中步骤3)中的α-甘露聚糖肽的终浓度为1-100μg/ml、优选2-90μg/ml、优选3-80μg/ml、优选4-70μg/ml、优选5-60μg/ml、优选6-50μg/ml、优选7-40μg/ml、优选8-30μg/ml、优选9-20μg/ml、优选10μg/ml。

进一步地，根据上述本发明的方法，其中步骤4)中的兔抗人胸腺细胞免疫球蛋白终浓度10-2000ng/ml、优选20-1900ng/ml、优选30-1800ng/ml、优选40-1700ng/ml、优选50-1600ng/ml、优选60-1500ng/ml、优选70-1400ng/ml、优选80-1300ng/ml、优选90-1200ng/ml、优选10-1000ng/ml、优选100ng/ml、优选150ng/ml、优选200ng/ml、优选250ng/ml、优选300ng/ml、优选350ng/ml、优选400ng/ml、优选450ng/ml、优选500ng/ml、优选550ng/ml、优选600ng/ml、优选650ng/ml、优选700ng/ml、优选750ng/ml、优选800ng/ml、优选850ng/ml、优选900ng/ml。

进一步地，根据上述本发明的方法，其中步骤4)-7)中的IL-15终浓度为2-200ng/ml、优选3-190ng/ml、优选4-180ng/ml、优选5-170ng/ml、优选6-160ng/ml、优选7-150ng/ml、优选8-140ng/ml、优选9-130ng/ml、优选10-120ng/ml、优选15ng/ml、优选20ng/ml、优选25ng/ml、优选30ng/ml、优选35ng/ml、优选40ng/ml、优选45ng/ml、优选50ng/ml、优选55ng/ml、优选60ng/ml、优选65ng/ml、优选70ng/ml、优选75ng/ml、优选80ng/ml、优选85ng/ml、优选90ng/ml、优选100ng/ml。

进一步地，根据上述本发明的方法，其中步骤4)-7)中的IL-2终浓度100-10000IU/ml、优选200-9000IU/ml、优选300-8000IU/ml、优选400-7000IU/ml、优选500-6000IU/ml、优选600-5000IU/ml、优选700-4000IU/ml、优选800-3000IU/ml、优选900-2000IU/ml、优选1000IU/ml。

本发明的方法与现有技术的其他方法相比的有益效果是：作为NK细胞诱导试剂的(多抗)α-甘露聚糖肽和扩增试剂兔抗人胸腺细胞免疫球蛋白(即复宁)为临床用药，相对与实验级试剂更安全、更符合GMP要求。

其中兔抗人胸腺细胞免疫球蛋白(即复宁)是一种临床上用于预防和治疗肾移植排斥反应的免疫抑制药物，可以选择性地扩增生物治疗中免疫效应性细胞CD16⁺CD56⁺细胞，上调NK细胞活化/抑制受体的表达，促进其分化成熟和体外抗肿瘤活性的提高；多抗主要成分为α-甘露聚糖肽，甘露聚糖肽通过激活MR(甘露糖受体)和MBL(甘露聚糖肽结合凝集素)两条途径，改善和增加机体的免疫功能和应激能力。研究证实，本品可提升外周血白细胞、激活吞噬细胞、NK细胞、T、B细胞亚群，诱生干扰素、白细胞介素及肿瘤坏死因子；此两种药物合用可以大大增加NK细胞的数量，与白介素类细胞因子共同刺激培养免疫细胞具有数量大，纯度高、细胞毒性强等特点，从而能够满足临床的需要。同时与免疫磁珠分选法相比较培养成本大大降低，与饲养层细胞刺激法相比较风险大大降低，技术操作简单易行。所用本发明从临床实际应用可行性出发，对刺激剂种类、细胞因子组合、制备成本、细胞毒活性等进行了综合衡量，以期为实现NK细胞在临床过继免疫治疗中的大规模应用。

因而，另一方面，本发明提供了用于诱导分化NK细胞的HER-抗体和α-甘露聚糖肽以及用于扩增NK细胞的兔抗人胸腺细胞免疫球蛋白、IL-15和IL-2在制备用于体外获得高纯度的NK细胞的试剂盒中的用途。

另一方面，本发明提供了用于体外获得高纯度的NK细胞的试剂盒，其包含：用于诱导分化NK细胞的HER-抗体和α-甘露聚糖肽以及用于扩增NK细胞的兔抗人胸腺细胞免疫球蛋白、IL-15和IL-2。

本发明的NK细胞体外扩增试剂盒经测定其培养的细胞纯度高达90％以上，杀瘤性高达85％以上，增殖率达到1000倍：在其平行试验中，NK细胞在细胞比例、杀瘤性、增殖率指标上比较稳定，所以此发明方法不仅可以用在试剂盒研究而且能够满足临床需求，是目前为止NK细胞体外培养最优方法。

因而，另一方面，本发明提供了根据上述本发明的方法获得的高纯度的NK细胞在用于制备治疗肿瘤的药物中的用途。

本发明的用于制备自体NK细胞的试剂盒使用简单、方便，适合外周血、脐带血、单采血等多种标本，在NK细胞制备领域可以得到广泛的应用。

附图说明

图1A至图1B是采用本发明的方法培养细胞的镜检图，其中图1A为第7天100倍下镜检图；图1B为第14天100倍下镜检图；

图2A至图2C是采用本发明的方法培养NK细胞第7天、第14天、第21天的流式表型图，其中CD3-CD16+CD56+细胞群(Q1区)为NK细胞。

具体实施方式

以下结合附图，通过实施例进一步说明本发明，但不作为对本发明的限制。以下提供了本发明实施方式中所使用的具体材料及其来源。但是，应当理解的是，这些仅仅是示例性的，并不意图限制本发明，与如下试剂和仪器的类型、型号、品质、性质或功能相同或相似的材料均可以用于实施本发明。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1：体外扩增脐带血标本中的NK细胞

1、将作为NK细胞诱导分化抗体的HER-2抗体1.5μg(同立海源，货号：TL-503)融化，加入15ml生理盐水中充分混匀，加入到175cm²底面积细胞培养瓶中，并使液体充分在瓶底分散，4℃冰箱平放过夜。

2、无菌采集健康产妇脐带血50ml(经患者同意采自中国医科大学四平医院妇产科)；

3、将采集的血样转至50ml离心管(康宁，货号：430828)，室温下用Thermo 4KR离心机调至800g转速，离心分离10min；

4、吸取上层血浆于培养时备用；按0.9％生理盐水：剩余血液＝1：1的比例稀释血液，取2支50ml离心管中分别加入15ml TBD人外周血淋巴细胞分离液(天津灏洋生物制品科技有限责任公司，货号：LTS1077006)，缓慢的按稀释血：淋巴细胞分离液＝2:1加在淋巴细胞分离液之上；

5、将加好稀释血的离心管进行密度梯度离心，室温下将Thermo4KR离心机调至800g升1降1离心20min，离心后分层由上至下分别为血浆、淋巴细胞分离液、红细胞；

6、吸取上层血浆至50ml离心管中，56℃水浴灭活10min，离心取上清留用；

7、离心完毕后吸取脐血单个核细胞，用大于单个核细胞10倍体积的0.9％生理盐水充分混匀、洗涤，450g离心10min，弃上清，重复三次后，进行细胞计数。取出冰箱4℃内预先用HER-2抗体包被的培养瓶，吸弃包被液，用20ml生理盐水清洗瓶底后备用。用CellGro干细胞生长培养基(德国Cell Genix公司，货号：20802-0500)清洗离心管，调整细胞密度为1-2×106个/ml(最优为1.5×106个/ml)，加入到包被并清洗的培养瓶内，并加入终浓度为10μg/ml的α-甘露聚糖肽(成都利尔药业，国药准字H20003633)，确保培养基终体积为40ml-50ml左右，放入37℃、5％CO2培养箱中培养细胞。培养开始时记为培养第0天。

8、培养第3天，如细胞增殖情况较好，培养液变黄，加入CellGro干细胞生长培养基(德国Cell Genix公司，货号：20802-0500)50ml，并加入10μg兔抗人胸腺细胞免疫球蛋白(法国赛达公司，货号：S20090067)终浓度100ng/ml继续诱导培养。

9、扩增培养基的配置：每瓶1000ml的X-VIVO-15无血清培养基(美国LONZA公司，货号04-418Q)，加入20μg IL-15(北京同立海源公司，货号：TL-202)终浓度为20ng/ml，再加入100万IU的IL-2，终浓度为1000IU/ml。

10、培养第6天，进行NK细胞培养基体积的扩增：转袋补加步骤9中配置的扩增培养基200ml，并加入5％患者自体灭活血浆，放入培养箱中继续培养。

11、以后每3天补一次步骤9中配置的扩增培养基400ml，直至第14-21天收获全部NK细胞。

实施例2：细胞扩增后细胞量、扩增倍数及活率

总细胞扩增倍数：将上述实施例中培养的第7、14、21天获得的细胞用台盼蓝染色后再用血细胞计数器进行计数，将当前的总细胞除以培养前的单个核细胞总数，数值即为细胞的扩增倍数，细胞活率(％)＝未染色的细胞数/观察的细胞总数×100。结果参见表1和图1A和图1B，图1A为培养第7天倒置显微镜下图片，可以看到细胞透亮、状态佳，增殖球散在，细胞呈不规则长地瓜型；图1B为培养第14天倒置显微镜下图片，较7天细胞密度明显变大，增殖球减少。

表1：扩增前后细胞数量、扩增倍数、活率对照表

实施例3：流式细胞仪检测细胞扩增前后CD3^-CD16⁺CD56⁺NK细胞比例

流式细胞术检测方法：取实施例1中培养第7天、14天、21天后所获得的细胞样本5×10⁵细胞/管，PBS洗涤2次。分别加入流式检测抗体进行双标记流式表型检测：FITC标记的鼠抗人CD3抗体(BioLegend，货号300306)和APC标记的鼠抗人CD16抗体(BioLegend，货号304610)、CD56抗体(BioLegend，货号304610)；室温下孵育20min，PBS洗涤2次，细胞通过流式细胞仪进行分析。

结果如图2A至图2C所示，经过14天的诱导培养CD3^-CD16⁺CD56⁺NK细胞(Q1区)第7天的约18.4％(图2A)升高至约87.8％(图2B)，培养21天后流式检测CD3^-CD16⁺CD56⁺NK细胞(Q1区)升至96.8％(图2C)。

实施例4：细胞杀伤活性检测

取对数生长期的K562细胞株(购于上海艾研生物科技有限公司)作为靶细胞，并调整细胞密度为8×10⁵个/ml，每孔取50μl铺于96孔培养板中。取本发明实施例1中获得的第14天和第21天的NK细胞调整密度为8×10⁵个/ml、4×10⁶个/ml、8×10⁶个/ml、1.6×10⁷个/ml，加入96孔培养板中，每孔50μl，使效靶比分别为1:1、5:1、10:1、20:1，每组设三个复孔。接种方式如下：

空白组(a值)：X-VIVO-15(100μl)

(b值)：NK细胞(50μl)+X-VIVO-15(50μl)

对照组(c值)：k562(50μl)+X-VIVO-15(50μl)

实验组(d值)：k562(50μl)+NK细胞(50μl)

将接种好的细胞，置于37℃，5％CO₂条件下共培养24小时后，每孔加10μl CCK-8试剂，摇匀，37℃，5％CO₂条件下继续培养3小时，酶标仪波长450nm测定吸光度。按下式计算杀伤活性：杀瘤效率＝[1-(d值-b值-a值)/(c值-a值)]×100％。结果显示本发明制备的NK细胞对肿瘤K562细胞株具有较高的杀伤活性，在10:1、20:1的效靶比下第14天杀伤率即可达到100％；在5:1的效靶比下第14天杀伤率可达到85％以上，第21天杀伤率可达到97％；在1:1的效靶比下第14天和21天的杀伤率均低于40％，但第21天的杀伤率显著高于第14天(如表2所示)。

表2：本发明制备NK细胞对肿瘤K562细胞的杀伤活性

Claims

1.一种体外诱导扩增单个核细胞以获得高纯度的NK细胞的方法，所述方法包括以下步骤：

1)用终浓度0.01-10μg/ml的HER-2抗体在4℃下包被培养瓶；

2)获得分离的单个核细胞；

7)重复步骤6)1-10次，获得高纯度的NK细胞。

2.根据权利要求1所述的体外诱导扩增单个核细胞以获得高纯度的NK细胞的方法，其中步骤2)中的单个核细胞分离自哺乳动物的外周血或脐带血。

3.根据权利要求2所述的体外诱导扩增单个核细胞以获得高纯度的NK细胞的方法，其中所述哺乳动物是非人哺乳动物。

4.根据权利要求2所述的体外诱导扩增单个核细胞以获得高纯度的NK细胞的方法，其中所述哺乳动物是人。

5.根据权利要求1-4中任一项所述的体外诱导扩增单个核细胞以获得高纯度的NK细胞的方法，其中步骤1)中的HER-2抗体的终浓度为0.1μg/ml，步骤3)中的α-甘露聚糖肽的终浓度为10μg/ml，步骤4)中的兔抗人胸腺细胞免疫球蛋白终浓度为100ng/ml，步骤4)-7)中的IL-15终浓度为20ng/ml以及步骤4)-7)中的IL-2终浓度为1000IU/ml。

6.根据权利要求5所述的体外诱导扩增单个核细胞以获得高纯度的NK细胞的方法，其中在步骤7)中重复步骤6)3、4或5次。

7.用于诱导分化NK细胞的HER-抗体和α-甘露聚糖肽以及用于扩增NK细胞的兔抗人胸腺细胞免疫球蛋白、IL-15和IL-2在制备用于权利要求1-6中任一项所述的方法中的试剂盒中的用途。

8.一种用于权利要求1-6中任一项所述的方法中的试剂盒，其包含：用于诱导分化NK细胞的HER-抗体和α-甘露聚糖肽以及用于扩增NK细胞的兔抗人胸腺细胞免疫球蛋白、IL-15和IL-2。

9.根据权利要求8所述的试剂盒，所述试剂盒进一步包含干细胞培养基和X-VIVO-15无血清培养基。

10.根据权利要求1-6中任一项所述的方法获得的高纯度的NK细胞在制备用于治疗肿瘤的药物中的用途。