CN117844748A - 肿瘤抗原特异性记忆性cd8 t细胞的鉴定、体外扩增及应用方法 - Google Patents
肿瘤抗原特异性记忆性cd8 t细胞的鉴定、体外扩增及应用方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN117844748A CN117844748A CN202211211371.5A CN202211211371A CN117844748A CN 117844748 A CN117844748 A CN 117844748A CN 202211211371 A CN202211211371 A CN 202211211371A CN 117844748 A CN117844748 A CN 117844748A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- cells
- cell
- tumor
- tim3
- cd62l
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 title claims abstract description 98
- 239000000427 antigen Substances 0.000 title claims abstract description 49
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 title claims abstract description 49
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 title claims abstract description 49
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 title claims abstract description 12
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 10
- 230000003321 amplification Effects 0.000 title abstract description 6
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 title abstract description 6
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 131
- 210000001165 lymph node Anatomy 0.000 claims abstract description 45
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 claims description 44
- 102100040678 Programmed cell death protein 1 Human genes 0.000 claims description 37
- 101710089372 Programmed cell death protein 1 Proteins 0.000 claims description 22
- 101001018097 Homo sapiens L-selectin Proteins 0.000 claims description 21
- 102100033467 L-selectin Human genes 0.000 claims description 21
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 claims description 20
- 102100034458 Hepatitis A virus cellular receptor 2 Human genes 0.000 claims description 19
- 102100036301 C-C chemokine receptor type 7 Human genes 0.000 claims description 17
- 101000716065 Homo sapiens C-C chemokine receptor type 7 Proteins 0.000 claims description 17
- 101001055145 Homo sapiens Interleukin-2 receptor subunit beta Proteins 0.000 claims description 17
- 101001043809 Homo sapiens Interleukin-7 receptor subunit alpha Proteins 0.000 claims description 17
- 102100026879 Interleukin-2 receptor subunit beta Human genes 0.000 claims description 17
- 102100021593 Interleukin-7 receptor subunit alpha Human genes 0.000 claims description 17
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 claims description 16
- 102100029722 Ectonucleoside triphosphate diphosphohydrolase 1 Human genes 0.000 claims description 15
- 101001012447 Homo sapiens Ectonucleoside triphosphate diphosphohydrolase 1 Proteins 0.000 claims description 15
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 claims description 15
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 claims description 15
- 108010074708 B7-H1 Antigen Proteins 0.000 claims description 14
- 101001137987 Homo sapiens Lymphocyte activation gene 3 protein Proteins 0.000 claims description 14
- 102000017578 LAG3 Human genes 0.000 claims description 14
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 claims description 14
- 230000004614 tumor growth Effects 0.000 claims description 14
- 101150046249 Havcr2 gene Proteins 0.000 claims description 13
- 206010033128 Ovarian cancer Diseases 0.000 claims description 9
- 206010061535 Ovarian neoplasm Diseases 0.000 claims description 9
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 claims description 9
- 108091008042 inhibitory receptors Proteins 0.000 claims description 8
- 102100032912 CD44 antigen Human genes 0.000 claims description 7
- 108010020382 Hepatocyte Nuclear Factor 1-alpha Proteins 0.000 claims description 7
- 101000868273 Homo sapiens CD44 antigen Proteins 0.000 claims description 7
- 101001068133 Homo sapiens Hepatitis A virus cellular receptor 2 Proteins 0.000 claims description 6
- 201000001441 melanoma Diseases 0.000 claims description 6
- 210000003071 memory t lymphocyte Anatomy 0.000 claims description 6
- 230000004044 response Effects 0.000 claims description 6
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 claims description 5
- 239000003550 marker Substances 0.000 claims description 5
- 238000000926 separation method Methods 0.000 claims description 4
- 230000002459 sustained effect Effects 0.000 claims description 4
- 102000000588 Interleukin-2 Human genes 0.000 claims description 3
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 claims description 3
- 102000000704 Interleukin-7 Human genes 0.000 claims description 3
- 108010002586 Interleukin-7 Proteins 0.000 claims description 3
- 239000011324 bead Substances 0.000 claims description 3
- 238000009172 cell transfer therapy Methods 0.000 claims description 3
- 101100510617 Caenorhabditis elegans sel-8 gene Proteins 0.000 claims description 2
- 241000282412 Homo Species 0.000 claims description 2
- 102000003812 Interleukin-15 Human genes 0.000 claims description 2
- 108090000172 Interleukin-15 Proteins 0.000 claims description 2
- 229940100994 interleukin-7 Drugs 0.000 claims description 2
- 102000008096 B7-H1 Antigen Human genes 0.000 claims 3
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims 2
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims 1
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 15
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 10
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 9
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 9
- 238000009169 immunotherapy Methods 0.000 description 7
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 6
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 6
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 5
- 230000008595 infiltration Effects 0.000 description 5
- 238000001764 infiltration Methods 0.000 description 5
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 5
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 5
- 102100024216 Programmed cell death 1 ligand 1 Human genes 0.000 description 4
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 4
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 4
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 4
- 102000029816 Collagenase Human genes 0.000 description 3
- 108060005980 Collagenase Proteins 0.000 description 3
- 108091008874 T cell receptors Proteins 0.000 description 3
- 102000016266 T-Cell Antigen Receptors Human genes 0.000 description 3
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 description 3
- 229960002424 collagenase Drugs 0.000 description 3
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 3
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 3
- 239000004519 grease Substances 0.000 description 3
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 3
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 3
- 210000003171 tumor-infiltrating lymphocyte Anatomy 0.000 description 3
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 2
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 2
- 102000037982 Immune checkpoint proteins Human genes 0.000 description 2
- 108091008036 Immune checkpoint proteins Proteins 0.000 description 2
- 239000004677 Nylon Substances 0.000 description 2
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 description 2
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 description 2
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 2
- 210000001015 abdomen Anatomy 0.000 description 2
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 2
- 230000005975 antitumor immune response Effects 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 2
- YRQNKMKHABXEJZ-UVQQGXFZSA-N chembl176323 Chemical compound C1C[C@]2(C)[C@@]3(C)CC(N=C4C[C@]5(C)CCC6[C@]7(C)CC[C@@H]([C@]7(CC[C@]6(C)[C@@]5(C)CC4=N4)C)CCCCCCCC)=C4C[C@]3(C)CCC2[C@]2(C)CC[C@H](CCCCCCCC)[C@]21C YRQNKMKHABXEJZ-UVQQGXFZSA-N 0.000 description 2
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 210000003162 effector t lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 230000001973 epigenetic effect Effects 0.000 description 2
- 230000006870 function Effects 0.000 description 2
- 238000000227 grinding Methods 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 2
- 230000037451 immune surveillance Effects 0.000 description 2
- 238000013394 immunophenotyping Methods 0.000 description 2
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 2
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 2
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 2
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 2
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 2
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 2
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 2
- 229920001778 nylon Polymers 0.000 description 2
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 238000010008 shearing Methods 0.000 description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 2
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 2
- 230000002195 synergetic effect Effects 0.000 description 2
- 230000005751 tumor progression Effects 0.000 description 2
- 238000010200 validation analysis Methods 0.000 description 2
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 2
- -1 2b4 Proteins 0.000 description 1
- GOZMBJCYMQQACI-UHFFFAOYSA-N 6,7-dimethyl-3-[[methyl-[2-[methyl-[[1-[3-(trifluoromethyl)phenyl]indol-3-yl]methyl]amino]ethyl]amino]methyl]chromen-4-one;dihydrochloride Chemical compound Cl.Cl.C=1OC2=CC(C)=C(C)C=C2C(=O)C=1CN(C)CCN(C)CC(C1=CC=CC=C11)=CN1C1=CC=CC(C(F)(F)F)=C1 GOZMBJCYMQQACI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101000840545 Bacillus thuringiensis L-isoleucine-4-hydroxylase Proteins 0.000 description 1
- 102100036008 CD48 antigen Human genes 0.000 description 1
- 208000005623 Carcinogenesis Diseases 0.000 description 1
- 206010059866 Drug resistance Diseases 0.000 description 1
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 1
- 235000009161 Espostoa lanata Nutrition 0.000 description 1
- 240000001624 Espostoa lanata Species 0.000 description 1
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010001498 Galectin 1 Proteins 0.000 description 1
- 102100021736 Galectin-1 Human genes 0.000 description 1
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 description 1
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 description 1
- 102100022057 Hepatocyte nuclear factor 1-alpha Human genes 0.000 description 1
- 101000716130 Homo sapiens CD48 antigen Proteins 0.000 description 1
- 101001037256 Homo sapiens Indoleamine 2,3-dioxygenase 1 Proteins 0.000 description 1
- 101000914514 Homo sapiens T-cell-specific surface glycoprotein CD28 Proteins 0.000 description 1
- 101000648265 Homo sapiens Thymocyte selection-associated high mobility group box protein TOX Proteins 0.000 description 1
- 102100040061 Indoleamine 2,3-dioxygenase 1 Human genes 0.000 description 1
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 description 1
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 1
- 102000003814 Interleukin-10 Human genes 0.000 description 1
- 108090000174 Interleukin-10 Proteins 0.000 description 1
- 102000015696 Interleukins Human genes 0.000 description 1
- 108010063738 Interleukins Proteins 0.000 description 1
- 208000008839 Kidney Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- 229930182816 L-glutamine Natural products 0.000 description 1
- 206010024641 Listeriosis Diseases 0.000 description 1
- 101100445364 Mus musculus Eomes gene Proteins 0.000 description 1
- 206010038389 Renal cancer Diseases 0.000 description 1
- 239000006146 Roswell Park Memorial Institute medium Substances 0.000 description 1
- 101001037255 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) Indoleamine 2,3-dioxygenase Proteins 0.000 description 1
- 102100027213 T-cell-specific surface glycoprotein CD28 Human genes 0.000 description 1
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 1
- 101100445365 Xenopus laevis eomes gene Proteins 0.000 description 1
- 210000003815 abdominal wall Anatomy 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 230000005809 anti-tumor immunity Effects 0.000 description 1
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 1
- 230000002146 bilateral effect Effects 0.000 description 1
- 238000001815 biotherapy Methods 0.000 description 1
- 210000004204 blood vessel Anatomy 0.000 description 1
- 238000007664 blowing Methods 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 230000036952 cancer formation Effects 0.000 description 1
- 231100000504 carcinogenesis Toxicity 0.000 description 1
- 230000024245 cell differentiation Effects 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 230000022534 cell killing Effects 0.000 description 1
- 239000002771 cell marker Substances 0.000 description 1
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 238000002512 chemotherapy Methods 0.000 description 1
- 210000002808 connective tissue Anatomy 0.000 description 1
- 208000035250 cutaneous malignant susceptibility to 1 melanoma Diseases 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 238000000432 density-gradient centrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 238000004043 dyeing Methods 0.000 description 1
- 230000017188 evasion or tolerance of host immune response Effects 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 229960000556 fingolimod Drugs 0.000 description 1
- KKGQTZUTZRNORY-UHFFFAOYSA-N fingolimod Chemical compound CCCCCCCCC1=CC=C(CCC(N)(CO)CO)C=C1 KKGQTZUTZRNORY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000001943 fluorescence-activated cell sorting Methods 0.000 description 1
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 230000005746 immune checkpoint blockade Effects 0.000 description 1
- 238000011502 immune monitoring Methods 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 230000001506 immunosuppresive effect Effects 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 238000011221 initial treatment Methods 0.000 description 1
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 description 1
- 229940047122 interleukins Drugs 0.000 description 1
- 201000010982 kidney cancer Diseases 0.000 description 1
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 239000003147 molecular marker Substances 0.000 description 1
- 208000002154 non-small cell lung carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 1
- 230000032361 posttranscriptional gene silencing Effects 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 230000005180 public health Effects 0.000 description 1
- 230000007115 recruitment Effects 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000008844 regulatory mechanism Effects 0.000 description 1
- 238000002271 resection Methods 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 1
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 1
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 1
- 229910001220 stainless steel Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010935 stainless steel Substances 0.000 description 1
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 1
- 208000029729 tumor suppressor gene on chromosome 11 Diseases 0.000 description 1
- 239000012224 working solution Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
- C12N5/0636—T lymphocytes
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
- A61K35/14—Blood; Artificial blood
- A61K35/17—Lymphocytes; B-cells; T-cells; Natural killer cells; Interferon-activated or cytokine-activated lymphocytes
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2509/00—Methods for the dissociation of cells, e.g. specific use of enzymes
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Virology (AREA)
- Developmental Biology & Embryology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Mycology (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本申请提供了一种实体肿瘤引流淋巴结抗原特异性记忆性CD8T细胞的鉴定、体外扩增及应用方法。
Description
技术领域
本发明属于免疫应答和肿瘤生物治疗领域，尤其涉及一种新型的实体肿瘤引流淋巴结抗原特异性记忆性CD8 T细胞的鉴定、体外扩增及应用方法。
背景技术
恶性肿瘤是严重危害我国公众健康的重大疾病，据国家癌症中心发布的统计数据，我国仅2015年一年新增癌症病例就高达392.9万，死亡病例233.8万，二者均高居世界第一。机体的免疫系统可以主动识别肿瘤抗原，发挥免疫监视功能，在早期清除发生癌变的细胞。但是，在特定情形下，肿瘤细胞可以通过多种免疫逃逸策略逃脱机体的免疫监视，形成原发性肿瘤，并建立抑制性肿瘤微环境，抑制抗肿瘤免疫应答，促进肿瘤生长与进展。
激活的肿瘤抗原特异性的CD8 T细胞所介导的抗肿瘤免疫应答是机体对抗肿瘤发生发展的主要途径。CD8 T通过其T细胞受体(TCR)识别表达于肿瘤细胞表面的肿瘤抗原肽-MHC I类分子复合物，特异性地杀伤肿瘤细胞，从而在机体的抗肿瘤免疫中扮演关键作用。但是，一旦肿瘤细胞通过免疫编辑(Immunoediting)突破免疫监视，会快速增殖，形成肿瘤组织，并建立抑制性免疫微环境。在此情形下，肿瘤组织内的肿瘤抗原及免疫抑制性分子(PD-L1,CD48，Galectin-1,IDO及IL-10等)通过TCR及共抑制信号途径，持续刺激肿瘤特异性的CD8 T细胞，最终使之分化为终末耗竭的CD8 T细胞(Exhausted T cell,TEX)。与耗竭T细胞相对应的概念是效应T细胞(effector T cells,Teff)及记忆性T细胞(memory Tcells,Tmem)。效应性T细胞具备较强的效应功能，可以分泌功能性细胞因子(IFN-γ,TNF-α等)，并且通过穿孔素-颗粒酶(perforin-granzyme)途径直接杀伤病毒感染的靶细胞或癌变细胞。而记忆性T细胞则可以长久维持，再次识别病毒或者肿瘤抗原时，能快速增值，迅速、高效地清除病毒感染或癌变细胞。与之相反的是，耗竭的CD8 T细胞渐进式丧失细胞因子分泌功能、靶细胞杀伤功能、易于凋亡，并失去分化为记忆细胞的潜力。基于这些特性，耗竭的CD8 T细胞在群体水平失去控制肿瘤生长及进展的能力。因此，在细胞及分子水平，深入研究肿瘤环境下CD8 T细胞耗竭机制可能为逆转耗竭、提升肿瘤免疫治疗提供新的思路，具有重要的理论意义及临床价值。
目前针对CD8 T细胞耗竭的免疫策略主要是阻断抑制性受体相关信号通路，以PD-1/PD-L1阻断抗体为代表的免疫检查点阻断疗法在恶性黑色素瘤、非小细胞肺癌及肾癌的治疗中取得了较好的效果，中位疗效持续时间约为传统化疗的2-3倍，然而患者反应率最高不超过30％。此外，临床研究发现在初始阶段响应的病人在后期会出现耐药抵抗或复发，只有极少数病人(<5％)可被临床治愈。
目前，领域内大多数的观点认为，肿瘤组织浸润的耗竭前体细胞(progenitorexhausted T cell,TPEX)是响应PD-1免疫检查点治疗的关键细胞亚群。但是，这一细胞亚群在浸润的肿瘤特异性CD8 T细胞所占比例较低，其增殖潜力有限，很难解释PD-1免疫检查点阻断疗法显著的抗肿瘤效应。并且，研究表明，肿瘤组织浸润的耗竭CD8 T细胞各亚群呈现相对固化的表观遗传及转录状态,PD-1免疫检查点阻断很难改变已经固化的表观遗传特性。进一步提升PD-1免疫检查点阻断疗法的响应率及持续效应是肿瘤免疫治疗领域目前面临的重大挑战。未来取得突破的关键之一可能在于厘清、鉴定响应PD-1免疫治疗的新的关键CD8 T细胞亚群，并阐明其响应的分子调控机制。
发明内容
本发明提供了一种新型的实体肿瘤引流淋巴结(Tumor draining lymph nodes,TdLN)内抗原特异性记忆性CD8 T细胞及其鉴定、扩增和应用。本发明利用流式细胞分选及分析技术，鉴定了新型的富集于小鼠肿瘤引流淋巴结内的具有记忆细胞特征的、非耗竭的肿瘤特异性CD8 T细胞。此独特的细胞亚群高表达记忆T细胞表面分子CD62L、CD127、CD122、CCR7，不表达抑制性受体Tim3、LAG3、CD39，2B4，使其区别于肿瘤内浸润的耗竭前体细胞及其它耗竭细胞亚群；表达CD44(源自人的细胞为CD45RA-CD45RO+)而区分于初始CD8 T细胞；高表达转录因子TCF-1而区分于效应CD8 T细胞；表达低水平PD-1而区分于经典的记忆性CD8 T细胞。这一新型细胞亚群对持续补充及维持肿瘤组织内浸润(Tumorinfiltrating T cells,TILs)的耗竭CD8 T细胞各亚群至关重要。更重要的是，这一细胞亚群是持续响应肿瘤PD-1/PD-L1免疫检查点阻断疗法的关键细胞亚群。
在一个方面，本发明提供了一种源自肿瘤引流淋巴结的抗原特异性记忆性CD8 T细胞(下文称为“本发明的细胞”或“本发明的CD8T细胞”或“本发明的新型细胞群体”)，其特征在于，是具有以下标志物组合的细胞：活化的CD62L+PD1Low/dimTim3-CD8+T细胞。
在一个优选实施方案中，本发明的细胞是：
对于小鼠肿瘤来源：
CD44+CD62L+CD127+CD122+CCR7+PD1Low/dimTim3-CD39-LAG3-CD8+T细胞；
对于人肿瘤来源：
CD3+CD4-CD45RA-CD45RO+CD62L+CD127+CD122+CCR7+PD1Low/dim Tim3-CD39-LAG3-CD8+T细胞。
在一个方面，本发明的新型细胞群体的特征在于，高表达CD122，CD62L，CD127，CCR7，缺失表达2B4,LAG3,Tim3，CD39，表达较低水平的抑制性受体PD-1，优选地，本发明的新型细胞群体高表达转录因子TCF-1并且能够持续响应PD-1/PD-L1免疫检查点阻断疗法。
在另一个方面，本发明提供了分离自肿瘤引流淋巴结的抗原特异性记忆性CD8 T细胞在抗肿瘤中的应用。在一个具体实施方案中，本发明提供了所述T细胞在用于抑制肿瘤生长的过继细胞转移疗法中的用途，即将富集的或增殖的自身的或非自身的所述T细胞注射/回输至患者体内。在一个优选的实施方案中，所述肿瘤选自黑色素瘤和和卵巢癌。在一个具体实施方案中，所述T细胞与PD-1/PD-L1免疫检查点阻断疗法共同施用，优选地，所述PD-1/PD-L1免疫检查点阻断疗法是抗PD-L1或PD-1抗体。
在又一个方面，本发明提供了从肿瘤引流淋巴结分离本发明所述的T细胞的方法，包括下列步骤：
a.从小鼠或人实体肿瘤引流淋巴结获取单细胞悬液；
b.从上述单细胞悬液分选活化的CD62L+PD1Low/dimTim3-CD8+T细胞，
优选地，对于小鼠，从所述单细胞悬液分选
CD44+CD62L+CD127+CD122+CCR7+PD1Low/dimTim3-CD39-LAG3-CD8+T细胞；
对于人，从所述单细胞悬液分选
CD3+CD4-CD45RA-CD45RO+CD62L+CD127+CD122+CCR7+PD1Low/dim Tim3-CD39-LAG3-CD8+T细胞；
优选地，所述T细胞通过流式细胞术或磁珠分选获得；和
c.在含有CD3/28抗体，低剂量白介素2、白介素7和15的T细胞培养基中进行体外扩增培养。
本发明的目的通过下述关键技术方案实现：
(1)利用流式细胞分析技术，结合小鼠肿瘤模型及人卵巢癌样本鉴定肿瘤引流淋巴结内抗原特异性非耗竭的记忆性CD8 T细胞的免疫表型；
(2)利用流式细胞分选技术分选出肿瘤引流淋巴结内高表达记忆细胞相关分子、低表达PD-1的非耗竭活化CD8 T细胞亚群，通过优化的T细胞体外(in-vitro)培养条件，进一步扩增该细胞数量，为后续治疗做准备；
(3)通过单独回输该群细胞或联合PD-1/PD-L1免疫检查点阻断疗法治疗小鼠肿瘤。
使用本发明所述的方法能够精确、有效地获得肿瘤引流淋巴结抗原特异性记忆性CD8 T细胞(Tumor specific memory CD8 T cell,TTSM)。与本领域公认的耗竭前体细胞及肿瘤组织浸润淋巴细胞(TILs)相比，该群细胞具有抗原非依赖性的稳态增殖能力，并在再次接触相同肿瘤抗原时具有强大的快速增殖潜能。且肿瘤中浸润的各耗竭CD8 T细胞亚群(耗竭前体细胞及终末耗竭细胞)依赖于该群细胞的补充，过继转移这一群细胞可以抑制肿瘤生长。此外，与耗竭前体细胞相比，该群细胞是真正响应PD-1/PD-L1免疫检查点阻断疗法的关键细胞亚群，并且与PD-1/PD-L1免疫检查点阻断疗法展示出显著的协同效应。该发明有效提高肿瘤免疫治疗的效力，为本领域相关研究提供了新的方向和启发。
附图说明
图1显示了小鼠皮下移植瘤模型的建立及流式细胞分析策略。
图2显示了肿瘤引流淋巴结抗原特异性记忆性CD8 T细胞免疫表型分析。
图3显示了肿瘤引流淋巴结抗原特异性记忆性CD8 T细胞记忆表型验证。
图4肿瘤引流淋巴结抗原特异性记忆性CD8 T细胞有效控制肿瘤生长。
图5：肿瘤引流淋巴结抗原特异性记忆性CD8 T细胞在免疫检查点阻断疗法中的重要作用并与PD-L1免疫治疗显示出协同效应。
图6：人卵巢癌引流淋巴结中存在抗原特异性记忆性CD8 T细胞。
具体实施方式
下面将结合实施例对本申请的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将理解，下列实施例仅用于说明本申请，而不是对本申请的范围的限定。根据优选实施方案的下列详细描述，本申请的各种目的和有利方面对于本领域技术人员来说将变得明显。
实施例1：用于分离小鼠肿瘤引流淋巴结内抗原特异性记忆性CD8 T细胞的移植瘤模型的建立
1、肿瘤细胞系准备：本实施例利用小鼠黑色素瘤细胞系B16.F10建立小鼠皮下移植瘤模型，该细胞系使用含有10％胎牛血清(Fetal bovine serum,FBS)、1％青-链霉素和2mM L-谷氨酰胺的DMEM培养基进行传代与体外培养。
2、肿瘤细胞接种：待小鼠黑色素瘤细胞B16融合密度达到80％-90％左右时，消化细胞，计数后用1XPBS缓冲液调整肿瘤细胞悬液的浓度至5×106细胞/mL，用1mL BD胰岛素针吸取0.1mL肿瘤细胞悬液；一手抓持小鼠耳朵与背部之间的皮肤，充分暴露小鼠的腹部，用75％酒精棉球清洁皮肤；另一只手持注射器，水平进针(与小鼠腹部平面夹角约0-15°)刺入小鼠腹股沟部位皮肤，回抽负压则将肿瘤细胞悬液打入皮下，形成一个小皮丘，注射完毕后快速平行出针，防止细胞悬液流出。
3、细胞注射8-10天后观察肿瘤生长情况，通常在8天左右可见肿瘤长至黄豆大小，之后每两天用游标卡尺测量并记录肿瘤大小(肿瘤体积计算公式为：肿瘤体积＝1/2长x宽2，单位：mm3)。根据具体实验要求确定观察终点(图1A)。从伦理学角度考虑，当肿瘤体积达2000mm3时即判定小鼠死亡。
实施例2：肿瘤引流淋巴结抗原特异性记忆性CD8 T细胞的分离获取及免疫表型鉴定
1、将小鼠处死后小心分离出腹股沟皮下淋巴结，通常定位于下腹壁三支皮下浅表血管相交处；以载玻片磨砂区域小心研磨淋巴结，随后用含有10％胎牛血清的RPMI-1640培养基冲洗研磨区域，反复若干次后收集细胞混悬液，于4℃离心6分钟，离心力设置为400g。离心后再以无菌PBS重悬，轻轻将细胞沉淀吹打几次，再次离心后以一定体积上述培养基重悬，制成单细胞悬液后备用；
2、优选的：同时，分离皮下肿瘤组织，充分研磨后以密度梯度离心法分离肿瘤组织浸润的淋巴细胞作为对照。分离液Percoll密度梯度为：上层44％，下层67％，于室温离心30分钟，离心机转速为550g；
3、肿瘤抗原特异性的CD8 T细胞免疫表型分析
3.1将从肿瘤淋巴结分离的细胞计录细胞总数，再用荧光抗体染色。流式细胞染色步骤参考文献：转录因子TCF-1在病毒特异性T细胞免疫应答中的作用及机制研究.黄启钊.2018.博士毕业论文(已公开)。在本实施例中，我们用Live/Dead(L/D)染料区分死细胞，进行流式细胞分析，以CD3、CD8和CD44标记经抗原活化的细胞。根据其在总细胞的频率和总细胞数量，确定抗原特异性的CD8 T细胞的数量(图1B)；
3.2检测细胞表面分子的表达，包括PD-1,2B4,LAG3,Tim3等抑制性受体；CD122，CD62L，CD127、CCR7等记忆相关分子及其他相关细胞表面分子，上述表面分子均可以使用流式细胞仪进行定量分析；
3.3检测核内转录因子，主要包括TCF-1，TOX，Eomes等T细胞分化相关重要转录因子。
从结果可知，肿瘤引流淋巴结中存在一群高表达CD122，CD62L，CD127、CCR7等记忆相关分子，缺失表达2B4,LAG3,Tim3，CD39等抑制性受体的抗原特异性CD8 T细胞；同时，该群细胞高表达记忆细胞相关转录因子TCF-1(GFP指代)(见图2)，提示该群细胞具有记忆细胞特征。
实施例3：肿瘤引流淋巴结抗原特异性记忆性CD8 T细胞的表型验证
1、流式细胞技术分选目的细胞亚群：从实施例2中确定肿瘤引流淋巴结抗原特异性记忆性CD8 T细胞高表达记忆T细胞相关标志分子，低表达耗竭细胞相关标志分子PD-1，缺失表达2B4,LAG3,Tim3、CD39等抑制性受体。因此，我们将引流淋巴结抗原特异性记忆性CD8T细胞定义为CD44+CD62L+CD127+CD122+CCR7+PD1Low/dimTim3-CD39-LAG3-CD8+T细胞，利用该分子标志从小鼠肿瘤引流淋巴结内分选出目的细胞亚群。
2、验证目的细胞亚群的记忆特性：将分选得到的目的细胞亚群及急性感染模型中的经典记忆细胞标记细胞增殖染料(Cell trace Violet)以相同数量混合后回输至受体小鼠，分别在不同时间点取受体鼠脾脏，观察两种来源细胞的长期维持能力及稳态增殖能力(图3C-E)；另外，将相同数量两种来源的细胞混合之后输入/>受体小鼠，再次给与相同抗原刺激，观察肿瘤引流淋巴结及急性病毒感染中分别形成的记忆细胞在遇到相同抗原时细胞应答能力有何区别(图3A、B)。结果表明，引流淋巴结抗原特异性记忆细胞与经典记忆细胞类似，能够不依赖于抗原进行稳态增殖(self-renew)，并长期存活(图3C-E)；遇到相同抗原再次刺激时比肿瘤组织浸润的抗原特异性细胞具有更好的扩增能力(图3A、B)及效应功能，从而更好地控制表达相同抗原的李斯特菌感染(图3F、G)。
实施例4：肿瘤引流淋巴结抗原特异性记忆性CD8 T细胞体外扩增与应用
1、体外扩增目的细胞亚群：将实施例2中分离得到的CD44+CD62L+CD127+CD122+CCR7+PD1Low/dimTim3-CD39-LAG3-CD8+T细胞进行体外培养，培养基为含有10％胎牛血清(FBS)的RPMI1640培养基，同时加入0.5μg/ml CD28抗体，1-5ng/ml白介素2和20ng/ml白介素7及15(IL2/IL7/IL15)。分选目的细胞后计数，按照24孔板每个孔1X106个细胞铺入事先包被有2-5μg/ml CD3抗体的培养板内，培养2-3天后观察细胞扩增情况，扩增良好时可见大量克隆集落形成，之后将细胞转移至不含CD3/28抗体的12孔板内，如此方法连续培养7-10天，计数后用于下一步实验；
2、肿瘤引流淋巴结抗原特异性记忆性CD8 T细胞能有效控制肿瘤生长：在验证肿瘤引流淋巴结该群细胞的治疗效果时(B16模型)，我们选取肿瘤组织浸润的抗原特异性CD8+T细胞(tumor infiltrating lymphocytes,TIL)作为对照，在肿瘤接种第8-10天时分别给荷瘤小鼠回输2X105个目的细胞，之后记录肿瘤生长曲线和荷瘤小鼠存活情况(图4A)，如图4所示，与传统的肿瘤组织浸润耗竭T细胞(TME-TEX)相比，本发明的淋巴结来源的记忆细胞能够更加有效的控制肿瘤生长，延长荷瘤小鼠存活时间。
此外，我们在小鼠荷瘤第8天时将小鼠双侧引流淋巴结切除，之后回输淋巴结抗原特异性记忆细胞，分别在接种肿瘤第10、13/16天给与PD-L1阻断抗体(BioXCell公司，Cat#BE0101)或对照试剂(IgG)，同时给细胞回输联合anti-PD-L1阻断抗体治疗组以FTY710处理(图5A)。结果显示，淋巴结切除后anti-PD-L1阻断抗体失去控制肿瘤作用，回输补充该群细胞后，能有效回复该阻断抗体的抗肿瘤效果；若使用淋巴细胞迁移抑制剂FTY-720阻断该群细胞从淋巴结向外周的迁移，anti-PD-L1阻断抗体亦失去控制肿瘤作用(图5B，C)。以上结果进一步提示定位于肿瘤引流淋巴结的抗原特异性记忆细胞在肿瘤免疫治疗中的重要作用。
实施例5：卵巢癌患者肿瘤引流淋巴结抗原特异性记忆性CD8 T细胞的分离获取及免疫表型鉴定
1、卵巢癌患者筛选：本实施例选取2例适合手术切除的卵巢癌初治患者。术前与患者签订知情同意书并报伦理委员会审批通过。
2、肿瘤标本处理：
(1)手术取出肿瘤组织后小心剔除表面附着的结缔组织，剪成1cm X 1cm大小的组织块，用眼科剪充分剪碎，放入15ml离心管内，而后每管肿瘤组织加入适量体积(5-8ml)的I型胶原酶(Collagenase I)溶液，于37℃摇床消化45min-1h，胶原酶用RPMI-1640培养基溶解，工作浓度为1mg/ml。
(2)消化完成后每管加入等体积的含2％FBS的RPMI-1640培养基(R2)，充分颠倒混匀以终止胶原酶反应。在70μm尼龙滤网上，用注射器塑料尾端研磨即可(也可用300-400目不锈钢滤网替代)。
(3)细胞悬液离心(2000rpm，10min，室温)弃上清，每管以8ml 44％Percoll溶液(体积比，用RPMI稀释)重悬，之后插入毛细加样针(巴氏管)，缓缓加入4ml 67％Percoll溶液，静置一段时间，可见液体分为红白两层，轻柔的取出毛细玻璃针，离心，室温，550g，30min，升速降速调为零(若条件允许，以上液体最好加入15ml圆底摇菌管或离心管内进行分层离心)。
(4)离心完成后取出流式管，注意取出的过程要动作轻柔，以免破坏分层。此时可见液体分为三层，中间层为白色云絮状，即为淋巴细胞层，首先用1ml移液枪小心吸弃最上层棕黄色油脂，之后用1ml枪一边旋转一边缓慢吸取，加到事先加有3-5ml R2的15ml离心管内，充分混匀后，离心(2000rpm，10min，4℃)重悬，计数。
(5)离心后弃上清，以一定体积含10％FBS的RPMI-1640培养基(R10)重悬待用。
(6)淋巴结若较小，直接在70μm尼龙滤网上研磨，若较大，则剪碎后，再研磨，计数，冻存即可。若肿瘤细胞转移至淋巴结，剪碎之后也需要I型胶原酶消化。
3、流式细胞技术检测肿瘤抗原特异性CD8 T细胞免疫表型
(1)将2所得细胞计数后按0.5～1x106细胞对应50微升染色缓冲液；配置流式染色工作液FACS buffer：PBS+2％FBS+0.01％NaN3
(2)按实施例2.3所述方法进行荧光抗体标记，不同的是，对于人的样本，以CD45RA-CD45RO+标记经抗原活化的记忆细胞(对应小鼠的CD44)。
(3)从结果可知，抗原特异性记忆CD8 T细胞也存在于卵巢癌肿瘤引流淋巴结中。类似的，高表达CD122，CD62L，CD127、CCR7等记忆相关分子，缺失表达2B4,LAG3,Tim3，CD39等抑制性受体的抗原特异性CD8 T细胞；同时，该群细胞高表达记忆细胞相关转录因子TCF-1(图6)。以上结果进一步证实CD3+CD4-CD45RA-CD45RO+CD62L+CD127+CD122+CCR7+PD1Low/dimTim3-CD39-LAG3-CD8+T的存在，为肿瘤临床免疫治疗提供新的理论依据。
Claims (10)
1.一种源自肿瘤引流淋巴结的抗原特异性记忆性T细胞，其特征在于，是具有以下标志物组合的细胞：
活化的CD62L+PD1Low/dimTim3-CD8+T细胞。
2.根据权利要求1所述T细胞，其特征在于，是具有以下标志物组合的T细胞：
对于小鼠肿瘤来源：CD44+CD62L+CD127+CD122+CCR7+PD1Low/dimTim3-CD39-LAG3-CD8+T细胞；
对于人肿瘤来源：CD3+CD4-CD45RA-CD45RO+CD62L+CD127+CD122+CCR7+PD1Low/dimTim3-CD39-LAG3-CD8+T细胞。
3.根据权利要求1或2所述的T细胞，其中所述T细胞通过流式细胞术或磁珠分选获得。
4.根据权利要求1-3任一项所述的T细胞，其特征在于，高表达CD122，CD62L，CD127，CCR7，缺失表达2B4,LAG3,Tim3，CD39，表达较低水平的抑制性受体PD-1，并且高表达转录因子TCF-1。
5.根据权利要求1-4任一项所述的T细胞，其特征在于，能够持续响应PD-1/PD-L1免疫检查点阻断疗法。
6.权利要求1-5中任一项定义的T细胞在制备用于抑制肿瘤生长的药物中的用途，优选地，所述T细胞通过过继细胞转移疗法而抑制肿瘤生长；优选地，所述肿瘤选自黑色素瘤和卵巢癌。
7.权利要求1-5中任一项定义的T细胞与PD-1/PD-L1免疫检查点阻断疗法的组合在制备用于抑制肿瘤生长的药物中的用途，优选地，所述T细胞通过过继细胞转移疗法而抑制肿瘤生长；优选地，所述肿瘤选自黑色素瘤和卵巢癌。
8.根据权利要求7所述的用途，其中所述PD-1/PD-L1免疫检查点阻断疗法是抗PD-L1抗体或抗PD-1抗体。
9.一种药物组合物，其包含权利要求1-5中任一项定义的T细胞和药学上可接受的载体。
10.一种分离抗原特异性记忆性CD8+T细胞的方法，包括下列步骤：
a.从小鼠或人实体肿瘤引流淋巴结获取单细胞悬液；
b.从上述单细胞悬液分选活化的CD62L+PD1Low/dimTim3-CD8+T细胞，
优选地，对于小鼠，从所述单细胞悬液分选CD44+CD62L+CD127+CD122+CCR7+PD1Low/ dimTim3-CD39-LAG3-CD8+T细胞；对于人，从所述单细胞悬液分选CD3+CD4-CD45RA-CD45RO+CD62L+CD127+CD122+CCR7+PD1Low/dimTim3-CD39-LAG3-CD8+T细胞；
优选地，所述T细胞通过流式细胞术或磁珠分选获得；和
c.在含有CD3/28抗体，低剂量白介素2、白介素7和15的T细胞培养基中进行体外扩增培养。
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202211211371.5A CN117844748A (zh) | 2022-09-30 | 2022-09-30 | 肿瘤抗原特异性记忆性cd8 t细胞的鉴定、体外扩增及应用方法 |
| PCT/CN2023/121922 WO2024067673A1 (zh) | 2022-09-30 | 2023-09-27 | 肿瘤抗原特异性记忆性cd8 t细胞的鉴定、体外扩增及应用方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202211211371.5A CN117844748A (zh) | 2022-09-30 | 2022-09-30 | 肿瘤抗原特异性记忆性cd8 t细胞的鉴定、体外扩增及应用方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN117844748A true CN117844748A (zh) | 2024-04-09 |
Family
ID=90476384
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202211211371.5A Pending CN117844748A (zh) | 2022-09-30 | 2022-09-30 | 肿瘤抗原特异性记忆性cd8 t细胞的鉴定、体外扩增及应用方法 |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN117844748A (zh) |
| WO (1) | WO2024067673A1 (zh) |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP7505761B2 (ja) * | 2017-12-15 | 2024-06-25 | ザ ボード オブ トラスティーズ オブ ザ レランド スタンフォード ジュニア ユニバーシティー | Ｔ細胞疲弊を阻害するための組成物および方法 |
| US11548947B2 (en) * | 2018-06-21 | 2023-01-10 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Bispecific anti-PSMA X anti-CD28 antibodies and uses thereof |
| CN114908049A (zh) * | 2021-02-10 | 2022-08-16 | 江苏集萃医学免疫技术研究所有限公司 | Hdac6抑制剂在选择性诱导t细胞扩增中的用途 |
| CN116103233A (zh) * | 2022-10-06 | 2023-05-12 | 中国人民解放军陆军军医大学 | 肿瘤引流淋巴结抗原反应性cd8+t细胞的鉴定方法 |
-
2022
- 2022-09-30 CN CN202211211371.5A patent/CN117844748A/zh active Pending
-
2023
- 2023-09-27 WO PCT/CN2023/121922 patent/WO2024067673A1/zh unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO2024067673A1 (zh) | 2024-04-04 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Lai et al. | Human ovarian cancer stem-like cells can be efficiently killed by γδ T lymphocytes | |
| CN103756963A (zh) | 一种体外扩增nk细胞的方法 | |
| Wu et al. | Human effector T cells derived from central memory cells rather than CD8+ T cells modified by tumor-specific TCR gene transfer possess superior traits for adoptive immunotherapy | |
| JP6073417B2 (ja) | 自然殺害細胞増殖方法、及び自然殺害細胞増殖用の組成物 | |
| CN105176927A (zh) | 一种细胞毒性增强的高效靶向杀伤nk/cik细胞的制备方法 | |
| CN111918963A (zh) | 表达趋化因子受体和细胞粘附分子的cd3阴性细胞群体及其用途和制备方法 | |
| EP3786288A1 (en) | Method for expanding human dc cell, and human dc cell resource library | |
| CN112251406A (zh) | 一种nk细胞活化阶段的外泌体分选方法 | |
| Rodriguez et al. | Identification and characterization of tertiary lymphoid structures in murine melanoma | |
| CN109536444B (zh) | 一种适用于恶性实体瘤肿瘤浸润t淋巴细胞的分离诱导方法 | |
| CN115094034A (zh) | 一种人nkt细胞系及其应用 | |
| CN113684180A (zh) | 一种提高骨髓瘤杀伤活性的nk细胞制备方法 | |
| CA3169995A1 (en) | Pharmaceutical composition and method for inducing an immune response | |
| CN110747167B (zh) | 一种半合子bak细胞的制备方法及其应用 | |
| CN108486055B (zh) | 培养基及其在中央记忆型t淋巴细胞培养中的应用 | |
| CN109136284B (zh) | 一种afft2细胞 | |
| CN113613723A (zh) | 包含nk细胞的细胞群体的制造方法 | |
| CN117844748A (zh) | 肿瘤抗原特异性记忆性cd8 t细胞的鉴定、体外扩增及应用方法 | |
| Russell et al. | USC-HN2, a new model cell line for recurrent oral cavity squamous cell carcinoma with immunosuppressive characteristics | |
| CN116103233A (zh) | 肿瘤引流淋巴结抗原反应性cd8+t细胞的鉴定方法 | |
| CN110628717B (zh) | 一种浸润性t细胞的培养方法 | |
| CN111172110B (zh) | 一种脐带血cik细胞的培养方法 | |
| CN115678845A (zh) | 肿瘤特异性ctl细胞的培养方法及细胞治疗产品 | |
| Sacks et al. | A multicellular tumor spheroid model of cellular immunity against head and neck cancer | |
| TWI669400B (zh) | 用於體外擴增自然殺手細胞及自然殺手ｔ細胞之無血清細胞培養液 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination |