CN116103233A - 肿瘤引流淋巴结抗原反应性cd8+t细胞的鉴定方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种T细胞表面的组合标志物及优化的筛选流程，利用该标志物可以高效分选肿瘤及引流结中包含有抗原反应性CD8⁺T细胞的候选细胞群，进一步分析所筛选到的T细胞的TCR基因，发现和分离并表征了一系列新的克隆性的TCR基因及其序列，通过检测表达这些TCR的T细胞能否识别HCC肿瘤细胞抗原，判断其对肿瘤抗原的特异性。可以应用于过继细胞疗法的细胞药物中。

Description

肿瘤引流淋巴结抗原反应性CD8+T细胞的鉴定方法

技术领域

本发明属于免疫应答和肿瘤生物治疗技术领域，涉及实体肿瘤引流淋巴结中抗原反应性记忆CD8⁺T细胞表面的组合标志物，还涉及利用该组合标志物对CD8⁺T细胞分选和鉴定。

背景技术

恶性肿瘤是严重危害公众健康的重大疾病。机体的免疫系统可以主动识别肿瘤抗原，发挥免疫监视功能，在早期清除发生癌变的细胞。但是，在特定情形下，肿瘤细胞可以通过多种免疫逃逸策略逃脱机体的免疫监视，形成原发性肿瘤，并建立抑制性肿瘤微环境，抑制抗肿瘤免疫应答，促进肿瘤生长与进展。肿瘤抗原特异性的CD8 T细胞所介导的抗肿瘤免疫应答是机体对抗肿瘤发生发展，清除癌变细胞的主要途径。初始(Naive)CD8 T通过其T细胞受体(TCR)识别表达于肿瘤细胞表面的肿瘤抗原肽-MHC I类分子复合物而活化，进一步分化为效应细胞特异性地杀伤肿瘤细胞，从而在机体的抗肿瘤免疫中扮演关键作用。

在过去的十年中，基于免疫检查点抑制剂和过继细胞转移(ACT)疗法的发展已经彻底改变了癌症治疗。使用自体肿瘤组织浸润淋巴细胞(TIL)的过继细胞转移(ACT)免疫治疗可以介导患有转移性黑色素瘤和特定上皮癌患者的肿瘤持久消退。但肿瘤免疫治疗的疗效仅限于一小部分患者和癌症类型。肿瘤免疫微环境的异质性和个体肿瘤内肿瘤浸润淋巴细胞(TILs)的表型特征差异也造成了患者对免疫治疗反应的不同应答效果。先前的研究表明，TILs不仅包括肿瘤特异性抗原(TSA)-特异性T细胞，还包括识别与肿瘤无关的抗原表位(如病毒特异性抗原)的旁观者T细胞，而TSA反应性T细胞频率非常低(0.01％-0.001％)。并且，大部分TSA反应性T细胞都是终末分化的耗竭细胞，其功能及增殖潜力有限，大大限制了检查点阻断和ACT的治疗效果。为此，研究者发现，通过将肿瘤特异性T细胞受体(TCR)转移到自体外周血淋巴细胞(PBL)中来重塑T细胞特异性，可以为ACT提供了一种更有潜力的细胞来源。因此，一种从癌症患者中快速鉴定和验证TSA反应性T细胞及其TCR的方法在发展这种癌症治疗方法方面是非常具有价值的。

然而，由于TIL细胞的异质性组成，没有可靠的标记物可以特异性鉴定TSA反应性T细胞的全部构成。目前鉴定的方法一方面是使用肿瘤抗原肽pMHC多聚体染色，但目前公认的肿瘤抗原肽pMHC多聚体非常有限，能鉴定出TSA反应性T细胞类型很少；另一方面是对肿瘤细胞进行全外显子组测序(WES)以发现非同义突变，然后通过In silico预测合成相应的表位多肽，与TIL标本共培养后，通过酶联免疫吸收点(ELISpot)测定干扰素-γ，及流式细胞分析T细胞激活标记(4-1BB等)，筛选肿瘤反应性淋巴细胞。这种方法被证实能够在黑色素瘤患者和上皮性癌症患者中识别TSA及TSA反应TCRs。但由于现有的计算工具不能完全准确地预测T细胞的反应性，因此大部分已确定的TSA候选基因并不是免疫原性的，且这中方法依赖深度测序和机器学习，需要花费大量的时间和精力；同时现有方法在筛选时是在肿瘤组织中无倾向性筛选，使得肿瘤抗原特异性T细胞筛选得率低(1％)。

此外，肿瘤引流淋巴结是肿瘤免疫应答的重要场所，研究发现切除引流淋巴结后，肿瘤疫苗及检查点阻断疗法效果明显下降，提示引流淋巴结内TSA反应性T细胞对肿瘤免疫治疗有重要作用。目前对肿瘤引流淋巴结内TSA反应性T细胞的研究非常有限，缺乏精确高效鉴定的方法，大大限制了其临床运用。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种鉴定实体肿瘤及引流淋巴结内抗原反应性CD8⁺T细胞技术策略及使用方法。本发明主要目的是利用流式细胞技术、高通量测序技术及慢病毒介导的基因修饰技术，在人原发性肝细胞肝癌样本鉴定出新型的富集于肿瘤引流淋巴结内的肿瘤特异性CD8⁺T细胞。

为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：

1、分选候选肿瘤抗原反应性CD8⁺T细胞表面的组合标志物，所述组合标志物为：

L/D-CD45RA-CD8⁺CD39⁺PD1⁺；或L/D-CD45RA^-CD8⁺CCR7⁺PD1^Low/dim。

进一步，分选候选肿瘤抗原反应性CD8⁺T细胞表面的组合标志物中，L/D^-CD45RA^-CD8⁺CD39⁺PD1⁺用于分选肿瘤组织的T细胞，L/D^-CD45RA^-CD8⁺CCR7⁺PD1^Low/dim用于分选肿瘤引流淋巴结的抗原特异性CD8⁺T细胞。

进一步，所述分选候选肿瘤抗原反应性CD8⁺T细胞表面的组合标志物中，所述肿瘤为人肝细胞肝癌。

进一步，所述分选候选肿瘤抗原反应性CD8⁺T细胞表面的组合标志物中，所述组合标志物为：

L/D-CD45RA^-CD8⁺CD39⁺PD1⁺CD3⁺CD4^-CD45RO⁺；或

L/D^-CD45RA^-CD8⁺CCR7⁺PD1^Low/dimCD3⁺CD4-CD45RO⁺CD122⁺CD62L⁺CD127⁺2B4-LAG3-

Tim3-CD39-。

2、上述方案中所述组合标志物用流式细胞技术或磁珠分选技术分选得到的肿瘤抗原反应性CD8⁺T细胞。

进一步，所述CD8⁺T细胞来源于肿瘤引流淋巴结，表面有高表达CD122，CD62L，CD127和CCR7分子，缺失表达CD4，CD45RA，2B4,LAG3,Tim3和CD39分子，表达较低水平的抑制性受体PD-1。

3、一种抗原反应性CD8⁺T细胞确定克隆扩增TCR，验证其抗原特异性并构建TCR-T的方法，克隆扩增TCR同时被来源于肿瘤和引流淋巴结的上述抗原反应性CD8⁺T细胞所共有，且至少在任意一种组织扩增两次以上；同时联合慢病毒表达载体和酶联免疫斑点试验证实其抗原特异性。

进一步，确定克隆扩增TCR，验证其抗原特异性并构建TCR-T的方法中，所述TCR由α和β链，其中α链由SEQ ID NO:4-9所示的核苷酸编码而成，且所述β链由SEQ ID NO:10-15所示的核苷酸编码而成。

4、抗原特异性记忆性CD8⁺T细胞在制备过继性细胞免疫治疗药物中的应用。

5、利用抗原反应性CD8⁺T细胞确定克隆扩增TCR，并构建的TCR-T细胞在制备过继性细胞免疫治疗药物中的应用。

本发明的有益效果在于：利用提供一组T细胞表面的标志物组合，可以高效、精准的分选和鉴定肿瘤组织及其引流结中具有抗原特异性的CD8⁺T细胞亚群，在肿瘤免疫治疗中有重要潜力。且筛选得率高于现有方法，进一步分析所筛选到的T细胞的TCR基因，发现和分离并表征了一系列新的克隆性的TCR基因及其序列，表达这些TCR的T细胞具有特异性识别HCC肿瘤细胞抗原，并杀死肿瘤细胞的活性。与对照组相比，超过80％的表达嵌合TCR CD8T细胞能够显著产生IFN-γ，提示该细胞的肿瘤抗原特异性，可以应用于过继细胞疗法的细胞药物中。

附图说明

为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图进行说明：

图1为HCC患者中TdLN衍生的肿瘤反应性记忆CD8⁺T细胞的鉴定和表征。

图2为根据肝细胞癌患者肿瘤及引流淋巴结中T细胞特征基因对细胞类群进行定义。

图3为对所选TCR能特异性识别肿瘤抗原的验证策略和验证结果。

图4为ELISpot验证TCR抗原特异性结果。

具体实施方式

下面将结合附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1

肝癌肿瘤组织及引流淋巴结淋巴细胞获取

1、肝癌患者筛选：本实施例选取6例适合手术切除的肝细胞肝癌初治患者，所有患者无乙肝感染病史。术前与患者签订知情同意书并报伦理委员会审批通过。

2、肿瘤标本处理：

(1)手术取出肿瘤组织后小心剔除表面附着的结缔组织，剪成1cm X 1cm大小的组织块，用眼科剪充分剪碎，放入15ml离心管内，而后每管肿瘤组织加入适量体积(5-8ml)的I型胶原酶(Collagenase I)溶液，于37℃摇床消化45min-1h，胶原酶用RPMI-1640培养基溶解，工作浓度为1mg/ml。

(2)消化完成后每管加入等体积的含2％FBS的RPMI-1640培养基(R2)，充分颠倒混匀以终止胶原酶反应。在70μm尼龙滤网上，用注射器塑料尾端研磨即可(也可用300-400目不锈钢滤网替代)。研磨后，取一部分混合细胞，每一冻存管存5×10^6/ml全细胞(以后作为肿瘤靶细胞)，冻存在10％ DMSO，90％血清的冻存液，先-80℃过夜，在转入液氮罐。将剩下的细胞以一定体积预冷的PBS溶液重悬，轻柔吹打混匀后制成单细胞悬液待用；

(3)细胞悬液离心(2000rpm，10min，室温)弃上清，每管以8ml 44％ Percoll溶液(体积比，用RPMI稀释)重悬，之后插入毛细加样针(巴氏管)，缓缓加入4ml 67％Percoll溶液，静置一段时间，可见液体分为红白两层，轻柔的取出毛细玻璃针，离心，室温，550g，30min，升速降速调为零(若条件允许，以上液体最好加入15ml圆底摇菌管或离心管内进行分层离心)。

(4)离心完成后取出流式管，注意取出的过程要动作轻柔，以免破坏分层。此时可见液体分为三层，中间层为白色云絮状，即为淋巴细胞层，首先用1ml移液枪小心吸弃最上层棕黄色油脂，之后用1ml枪一边旋转一边缓慢吸取，加到预先加有3-5ml R2的15ml离心管内，充分混匀后，离心(2000rpm，10min，4℃)重悬，计数。

(5)离心后弃上清，以一定体积含10％FBS的RPMI-1640培养基(R10)重悬待用。

(6)取对应的肿瘤引流淋巴结(TdLNs)中淋巴细胞，淋巴结若较小，直接在70μm尼龙滤网上研磨，若较大，则剪碎后，再研磨，计数，冻存即可。若肿瘤细胞转移至淋巴结，剪碎之后也需要I型胶原酶消化，其余方式同前所述。

实施例2

流式细胞技术分选目标亚群

1、荧光抗体标记：

(1)将实施例1所得细胞计数后按0.5x10⁶～1x10⁶细胞对应50μl染色工作液；配置流式染色工作液FACS buffer：PBS+2％FBS+0.01％NaN₃；

(2)CCR7染色：先在37℃用CCR7-PERCP流式染色抗体(1:200)孵育30分钟，随后以8ml预冷的PBS吹打洗涤细胞，于4℃，500g，离心5分钟；重复洗涤三次后置于冰上待下一步染色。

(3)其他表面抗体染色：配置抗体工作液，包括Live/Dead(L/D)-APC/Cy7(1:400)、CD45RA-PB(1:200)、PD1-PE(1:100)、CD8-PE-Cy7(1:300)和CD39-FITC(1:200)，其余抗体均按1:200用FACS稀释。将抗体按比例加入FACS buffer中，涡旋振荡器混匀后低温离心3min，13000转。将抗体工作液加入离心好的细胞中，用移液枪上下混匀，避免产生气泡，用锡箔纸包好避光，冰上放置半小时；各抗体浓度可以根据实验优选浓度条件，找到最为合适的稀释比例。

(4)之后以8ml预冷的PBS吹打洗涤细胞，于4℃，500g，离心5分钟；重复洗涤三次后置于冰上待用。

流式细胞染色步骤参考文献：转录因子TCF-1在病毒特异性T细胞免疫应答中的作用及机制研究.黄启钊.2018.博士毕业论文。

2、流式分选目标细胞亚群：

流式抗体标记后的样本用PBS+10％ FBS重悬至4x10^6cells/ml，运用流式细胞分选仪进行特定细胞群的分选。由于从肿瘤组织中获得的细胞数量减少，且活细胞比率低，因此分别将两名或三名患者的肿瘤和淋巴结淋巴细胞混合用于细胞分类。在本实施例中，基于前期研究数据，我们用Live/Dead(L/D)染料区分死细胞，进行流式细胞分析，以CD3、CD8和CD45RA，标记经历过抗原活化的细胞，以L/D-CD45RA^-CD8⁺CD39⁺PD1⁺界定肿瘤组织浸润的活化的肿瘤抗原反应性CD8 T细胞(非必须的还可以包括：CD3⁺CD4^-CD45RO⁺)，以L/D^-CD45RA-CD8⁺CCR7⁺PD1^Low/dim界定引流淋巴结内活化的肿瘤抗原反应性记忆性CD8 T细胞(非必须的还可以包括：CD3⁺CD4-CD45RO⁺CD122⁺CD62L⁺CD127⁺2B4-LAG3-Tim3-CD39-)。

分选的细胞收集到装有5ml RPMI1640+10％FBS的15ml离心管中。本实施例中，采用6例肝细胞癌患者的肿瘤和淋巴结进行分选，从TdLNs中约能采集到7500至6.3x10^5个细胞，从肿瘤(TME)样本中约能收集到3600至5.8x10^5个目标细胞。

实施例3单细胞测序及数据分析

1、单细胞文库制备及测序：使用10x Genomics公司Chromium Single Cell 5′Library&Gel Bead Kit v.2生成5'单细胞RNA序列和免疫分析文库。具体操作参见试剂盒说明书。用Illumina Novaseq对所有文库进行测序，每个表达文库和TCR文库分别获得58000reads/cell和24000reads/cell。

2、数据分析及CD8 T细胞表型分析：使用10X Genomics Cell Ranger Suite(v3.1.0)对测序数据进行数据比对和去重，得到每个样品中各细胞的基因表达矩阵和TCR序列。利用Seurat R包对数据进行标准化，取前2000个高变异基因，合并每个样品的高变异基因得到高变异基因集。合并所有样品的基因表达矩阵，去除矩阵中的线粒体基因。根据高变异基因集对合并的基因表达矩阵进行PCA主成分分析。利用Harmony去除批次效应，将得到的结果进行UMAP降维、聚类和可视化。利用Seurat鉴定每个T细胞类群的差异表达基因，根据不同T细胞特征基因对细胞类群进行定义，如附图1所示，HCC患者中TdLN衍生的肿瘤反应性记忆CD8⁺T细胞的鉴定和表征，其中，与图1中A直方图相关，显示从每个scRNA-seq实验获得的TdLN和TME衍生的推定肿瘤反应性CD8⁺T细胞的数量肝细胞癌(HCC)患者(B1-B6，表1所示)。图1中(B)来自6名HCC患者的肿瘤反应性CD8⁺T细胞(n＝40,847)被投影到UMAP分析中，显示出九个显着集群。在UMAP投影中分析的每个样本的细胞数在A中显示。每个点表示一个单独的单元格，每个点颜色代表一个带注释的簇；T_CM-like，中枢记忆样T细胞；T_EM-like，效应记忆样T细胞；T_RM-like，组织驻留记忆样T细胞；T_PEX，祖细胞耗尽的T细胞；T_EX，耗尽的T细胞。图1中C为B的UMAP图中所示的代表性基因的单细胞转录水平。转录水平采用颜色编码：灰色，未表示；蓝色，表达。图1中D为UMAP图分别显示TdLN和TME衍生的肿瘤反应性CD8⁺T细胞，与B中的UMAP图相关。图1中(E)条形图显示每个簇中细胞的百分比作为每个样本位置的总细胞的一部分，与B中的UMAP图相关。图1中(F)直方图显示每个患者样本中具有来自TdLN和TME的已识别TCR的细胞数量。图1中(G)的UMAP图显示TdLN和TME衍生的肿瘤反应性CD8⁺T细胞分别与克隆型频率重叠。

表1HCC患者信息

实施例4克隆扩增的T细胞受体筛选

1、克隆扩增TCR筛选：根据分析TCR测序结果，显示带有不同TCR的CD8 T细胞在肿瘤和引流淋巴结扩增程度是有差异的，测序结果比对后，将具有相同TCR序列、同时在引流淋巴结和肿瘤组织扩增至少两次以上的T细胞定义为克隆扩增T细胞。

2、克隆扩增T细胞转录组特征：我们分别从TdLN和TME中分别收集到了1165和2211个克隆扩增CD8⁺T细胞，包含209个克隆TCR。将这些克隆扩增的CD8⁺T细胞与其匹配的scRNA序列数据整合，以进行无监督聚类，识别差异表达基因，根据不同T细胞特征基因对细胞类群进行定义，图2显示了肝细胞癌患者肿瘤及引流淋巴结中具有共同TCR序列，且进行过扩增(出现2次及以上)的CD8 TCR克隆，如图2所示，其中A条形图显示来自HCC患者的配对TdLN和TME衍生的肿瘤反应性CD8⁺T细胞之间共享的TCR克隆数量，与图1中A的UMAP图相关。此绘图包括代表TME中至少两个克隆的共享克隆型。每个患者的共享克隆型数列在图的底部。部分共享克隆型的配对TCR序列列于表2(一共筛选出209个)。(B)点图表示图1中A所有簇中选定的标记基因子集的相对平均活性。点颜色代表相对于所有簇的平均基因表达水平，点大小对应于每个簇中检测到指示基因活性的细胞百分比，与图1中A相关。图2中C是TCR转导(GFP⁺)CD8⁺T细胞(左)中小鼠b链表达(表明选定TCR克隆的表达)的代表性FACS图；图2中D是TCR转导中4-1BB的表达模式(GFP⁺)CD8⁺T细胞(右)如图1中G所示。

表2部分CD8⁺T细胞TCRα和TCRβ链的CDR3序列和克隆计数

实施例5克隆扩增T细胞肿瘤抗原特异性验证

1、构建实施例4中筛选到的TCR慢病毒表达载体：在实施例4找到的克隆扩增T细胞中，按扩增倍数排序，选出扩增频率前10-20的TCR进行下一步分析；在本实施例中我们选取6个TCR克隆，构建TCR慢病毒表达载体(详细的TRA和TRB序列见表3)。根据文献报道(Draperet al.,2015；Jin et al.,2018)，首先分别将来源于人的TCRα或TCRβ链可变区(V区)编码与来源于小鼠的TCR C区(C区)编码序列并在一起，以减少TCR表达产物组装错配，并增强过表达TCR的稳定性。进一步，将人鼠嵌合的TCRα链、TCRβ链通过P2A序列连接，通过同源重组的方式构建至带有绿色荧光蛋白标记的慢病毒表达载体(pHR_PGK，Addgene)上，测序验证序列准确性后待用；

表3TCR序列

2、过表达嵌合TCR：通过慢病毒载体系统，将构建的TCR表达在患者外周血PBMC细胞上。首先将上述表达载体与慢病毒包装系统转染按如下比例混合：pHR_PGK(5μg/well)，pMD2.G(3μg/well)，psPAX2(5μg/well)。之后利用Lipo3000(Life公司)转染至HEK-293T细胞(10cm培养皿)中，转染72小时后收集病毒上清液，通过盐浓缩法进一步提高病毒滴度。具体步骤参考Robert F Siliciano教授文献报道(Nature Protocol，2014)，此处不再赘述。转染当日利用ImmunoCultTM Human CD3/CD28 T Cell Activator试剂盒活化患者PBMC细胞，具体步骤参考说明书(Stemcell#10991)活化72小时后进行流式细胞染色，若细胞高表达CD25、CD69，提示活化良好。将100μl浓缩病毒上清加入单个细胞培养孔，利用离心法进行慢病毒转导(参考Robert F Siliciano教授文献报道)，之后每孔加入含有2-5ng/ml IL-2的ImmunoCultTM-XF T Cell Expansion Medium培养基(Stemcell)，轻柔吹打混匀后放入二氧化碳培养箱。利用小鼠TCRβ链抗体(Biolegend，109208)验证嵌合TCR表达效果，48小时后观察GFP情况，结果如图3所示，所选的表达克隆扩增TCR的CD8 T细胞的构建及验证策略(A)和转染效率GFP验证结果(B)，结果显示利用慢病毒表达载体能高效率的将目标载体表达在CD8 T细胞。

3、酶联免疫斑点实验：本实施例中，我们采用ELISpot实验快速有效的验证TCR抗原特异性。首先将2×10⁴TCR转导的T细胞按照3倍梯度稀释，然后与Toll-like receptor激动剂Poly(I:C)(25μg/ml，InvivoGen)处理48小时的自体肿瘤细胞按比例混合(T细胞-肿瘤细胞为2:1)，在预包被干扰素γ(IFN-γ)的96孔ELISpot板(Mabtech)中共培养。孵育20h后，从ELISpot培养皿中提取细胞，利用流式细胞技术检测4-1BB的表达，同时按说明书行ELISpot实验，检测IFN-γ表达。结果提示，与对照组相比，超过80％的表达嵌合TCR CD8T细胞在与对应的肿瘤细胞共培养后能显著活化，表现为上调4-1BB的表达(图4中A,B)，活化的细胞能够显著产生IFN-γ(图4中C，D)，提示该细胞的肿瘤抗原特异性。

按照本发明提供的表面标记分选出细胞，里面包含了肿瘤特异性T细胞；通过进一步对这些细胞进行单细胞测序，筛选出具有相同TCR序列、同时在引流淋巴结和肿瘤组织扩增至少两次以上的T细胞克隆；最后将筛选出的TCR通过实施例5精准验证，结果显示，肿瘤抗原特异性的TCR阳性率在80％左右。与传统无倾向性的筛选相比，我们两轮筛选后检出率增高，更加高效，并且进一步用实施例5进行验证，保证其精确性。

最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。

Claims (10)

1.分选候选肿瘤抗原反应性CD8⁺T细胞表面的组合标志物，其特征在于，所述组合标志物为：

L/D-CD45RA-CD8⁺CD39⁺PD1⁺；或L/D-CD45RA-CD8⁺CCR7⁺PD1^Low/dim。

2.根据权利要求1所述分选候选肿瘤抗原反应性CD8⁺T细胞表面的组合标志物，其特征在于，L/D-CD45RA-CD8⁺CD39⁺PD1⁺用于分选肿瘤组织的T细胞，L/D-CD45RA-CD8⁺CCR7⁺PD1^{Low /dim}用于分选肿瘤引流淋巴结的T细胞。

3.根据权利要求1所述分选候选肿瘤抗原反应性CD8⁺T细胞表面的组合标志物，其特征在于，所述组合标志物为：

L/D-CD45RA^-CD8⁺CD39⁺PD1⁺CD3⁺CD4-CD45RO⁺；或

L/D^-CD45RA-CD8⁺CCR7⁺PD1^Low/dimCD3⁺CD4-CD45RO⁺CD122⁺CD62L⁺CD127⁺2B4-LAG3^-Tim3^-CD39-。

4.根据权利要求1-3任一项所述分选肿瘤抗原反应性CD8⁺T细胞表面的组合标志物，其特征在于，所述肿瘤为人肝细胞肝癌。

5.由权利要求1-3任一项所述组合标志物用流式细胞技术或磁珠分选技术分选得到的肿瘤抗原反应性CD8⁺T细胞。

6.根据权利要求5所述候选肿瘤抗原反应性CD8⁺T细胞，其特征在于，所述CD8⁺T细胞来源于肿瘤引流淋巴结，表面有高表达CD122，CD62L，CD127和CCR7分子，缺失表达CD4，CD45RA，2B4,LAG3,Tim3和CD39分子，表达较低水平的抑制性受体PD-1。

7.一种利用权利要求4或5所述候选抗原反应性CD8⁺T细胞确定克隆扩增TCR，验证其抗原特异性并构建TCR-T的方法，其特征在于，克隆扩增TCR同时被来源于肿瘤和引流淋巴结的上述抗原反应性CD8⁺T细胞所共有，且至少在任意一种组织扩增两次以上；同时联合慢病毒表达载体和酶联免疫斑点试验证实其抗原特异性。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述TCR由α和β链，其中α链由SEQ ID NO:4-9所示的核苷酸编码而成，且所述β链由SEQ ID NO:10-15所示的核苷酸编码而成。

9.权利要求4或5所述的抗原特异性记忆性CD8⁺T细胞在制备过继性细胞免疫治疗药物中的应用。

10.利用权利要求7所述方法构建的TCR-T细胞在制备过继性细胞免疫治疗药物中的应用。

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