CN115232854A - 一种源细胞的筛选方法、源细胞、细胞库及产品 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种源细胞的筛选方法，将源细胞与免疫细胞共培养，其中，通过共培养后免疫细胞亚群调节能力筛选源细胞。还公开了由该方法筛选的源细胞、细胞库及制成的产品。所述源细胞为干细胞，通过本发明的方法筛选的源细胞，可以针对具体受者的疾病或病症选择相适应的源细胞进行治疗，因而相对于传统的方法，能够提高科学性、有效性。

Description

一种源细胞的筛选方法、源细胞、细胞库及产品
技术领域
本发明属于生物医药与细胞治疗领域，具体涉及干细胞的筛选方法、干细胞及其产品。
背景技术
MSCss具有的多向分化潜能、低免疫原性、免疫调节等特性，使其成为多种疾病细胞治疗的首选对象。作为理想细胞药物，MSCss还具有取材容易、对机体损伤小、扩增能力强、较快适应机体等方面的特点。同时，大量的临床数据和报道出MSCss在临床方面的应用，尤其是在宿主移植排斥反应、强直性脊柱炎、类风湿关节炎、系统性红斑狼疮等免疫相关性疾病的治疗方面。
传统的筛选方法难以针对具体的个体，筛选出个性化治疗的源细胞。因此，有必要设计更加科学的方法，筛选方便治疗不同类型的免疫功能相关性疾病的源细胞。
发明内容
本发明提供了一种源细胞的筛选方法、由该方法筛选出的源细胞、构建的细胞库及制成的产品，可以解决现有技术中的不足。
本发明的技术方案如下：
一种源细胞的筛选方法，将源细胞与免疫细胞共培养，其中，通过共培养后免疫细胞亚群调节能力筛选源细胞。具体的，所述源细胞为干细胞，通过本方法筛选的源细胞，可以针对具体受者的疾病或病症选择相适应的源细胞进行治疗，因而相对于传统的方法，能够提高科学性、有效性。
在一些实施例中，根据对免疫细胞亚群细胞产生促进或抑制效果筛选源细胞；或，根据对促进或抑制免疫细胞亚群能力的不同筛选源细胞。因此可以筛选具有免疫促进效果的源细胞，用于治疗炎症相关的疾病，或者筛选具有免疫抑制效果的源细胞，以治疗自身免疫性疾病。
在一些实施例中，所述免疫细胞亚群为Th1、Th17或T-reg细胞中的至少一种，或者其组合。
在一些实施例中，筛选对Th1或Th17呈现抑制作用，或筛选对T-reg细胞呈现促进作用的源细胞。
在一些实施例中，所述免疫细胞包括但不限于外周血单个核细胞、白细胞、淋巴细胞或T细胞。
在一些实施例中，所述共培养的方式为源细胞与免疫细胞以直接接触的方式共培养，所述的直接接触共培养方式是指免疫细胞与源细胞在一个合适容器以直接接触的方法共培养一段时间。
在一些实施例中，所述共培养的方式为使用transwell共培养的方式。transwell共培养指的是：利用聚四氟乙烯(PTFE)膜等材料将PBMC与MSCs进行分开，细胞无法直接接触，只能利用旁分泌方式分泌因子进行细胞间信息交流。
在一些实施例中，所述的方法包括：利用PBMC与间充质干细胞直接接触共培养的方式，筛选出抑制Th1或Th17细胞能力强的源性间充质干细胞，或筛选出促进T-reg细胞能力强的源性间充质干细胞。
具体的，筛选对Th1细胞的抑制率大于40％的源细胞，或筛选对Th17的抑制率大于40％的源细胞，或筛选对T-reg细胞的增殖促进倍数大于1的源细胞的源细胞。依据此标准筛选后的源性间充质干细胞在免疫相关性疾病治疗中会产生较好的治疗效果，可以有效的促进抑炎性细胞亚群和抑炎性因子的分泌从而抑制炎症反应以及炎症因子的分泌。
在一些实施例中，所述源细胞包括且不限于P0、P1、P2、P3…Pn代种子细胞或主库细胞的源性细胞；培养容器包括且不限于96孔板、48孔板、24孔板、12孔板、6孔板、T25培养瓶。
在一个示例性实施方案，其中所述的方法包括：
(a)取P3代源性MSCs接种至6孔板，培养过夜贴壁后弃上清，加入PBMC细胞共培养72h；
(b)利用流式细胞检测对比PBMC组和MSCs组中的Treg细胞占比；
(c)记录数据至数据库，根据需求使用相应细胞库中源性MSCs，以提高医疗或科研有效性。
在一些实施例中，培养时间不少于24小时；干细胞与免疫细胞共培养的比例为1：1～400。
在一些实施例中，共培养时还包括加入免疫细胞激活剂。
在一些实施例中，所述源细胞为：脐带干细胞、脐带血干细胞、骨髓干细胞、脂肪干细胞、肌肉干细胞、沃顿胶干细胞、神经干细胞、皮肤干细胞、羊膜干细胞、绒毛膜干细胞、蜕膜干细胞或胎盘干细胞中的至少一种。
本发明还提供了一种采用如上任一所述筛选方法得到的源细胞。
本发明还提供了一种采用如上任一所述筛选方法得到的源细胞或上述的源细胞制成的产品。如用于治疗疾病或病症的药用制剂，或者以美容为目的的化妆品。
本发明还提供了一种采用如上任一所述筛选方法得到的源细胞所构建的细胞库。
与现有技术相比，本发明的有益效果如下：
本发明所述的方法提供一种有效的筛选手段，基于免疫细胞与源细胞直接或间接共培养后，针对一种或多种免疫细胞亚群的占比筛选调节能力强的源细胞，为细胞受体筛选出优质的源细胞，将治疗或科研的有效性提升至最大，节约成本，提高效率，富有广泛的应用前景。
当然，实施本发明的任一产品并不一定需要同时达到以上所述的所有优点。
附图说明
图1是本发明实施例2中脐带来源的MSCs表面标志物检测结果示意图；
图2A是本发明实施例3中MSCs成脂分化能力示意图；
图2B是本发明实施例3中MSCs成骨分化能力示意图；
图2C是本发明实施例3中MSCs成软骨分化能力示意图；
图3A是本发明实施例5中不同供者PBMC中Th1亚群细胞占比(流式图)，其中，(1)指Donor A，(2)指Donor B，(3)指Donor C；
图3B是本发明实施例5中不同供者PBMC与MSCs共培养后Th1亚群细胞占比(流式图)，其中，(1)指Donor A，(2)指Donor B，(3)指Donor C；
图3C是本发明实施例5中不同MSCs对不同供者PBMC中Th1亚群细胞增殖抑制率(分布图)；
图4A是本发明实施例6中不同供者PBMC中Th17亚群细胞占比(流式图)，其中，(1)指Donor A，(2)指Donor B，(3)指Donor C；
图4B是本发明实施例6中不同供者PBMC与MSCs共培养后Th17亚群细胞占比(流式图)，其中，(1)指Donor A，(2)指Donor B，(3)指Donor C；
图4C是本发明实施例6中不同MSCs对不同供者PBMC中Th17亚群细胞增殖抑制率(分布图)；
图5A是本发明实施例7中DonorAPBMC中T-reg亚群细胞占比(流式图)，其中，(1)指T-reg中CD4阳性检测，(2)指T-reg中CD25、Foxp3阳性检测；
图5B是本发明实施例7中Donor B PBMC中T-reg亚群细胞占比(流式图)，其中，(1)指T-reg中CD4阳性检测，(2)指T-reg中CD25、Foxp3阳性检测；
图5C是本发明实施例7中Donor C PBMC中T-reg亚群细胞占比(流式图)，其中，(1)指T-reg中CD4阳性检测，(2)指T-reg中CD25、Foxp3阳性检测；
图5D是本发明实施例7中Donor A的PBMC与MSCs共培养后T-reg亚群细胞占比(流式图)，其中，(1)指T-reg中CD4阳性检测，(2)指T-reg中CD25、Foxp3阳性检测；
图5E是本发明实施例7中Donor B的PBMC与MSCs共培养后T-reg亚群细胞占比(流式图)，其中，(1)指T-reg中CD4阳性检测，(2)指T-reg中CD25、Foxp3阳性检测；
图5F是本发明实施例7中Donor C的PBMC与MSCs共培养后T-reg亚群细胞占比(流式图)，其中，(1)指T-reg中CD4阳性检测，(2)指T-reg中CD25、Foxp3阳性检测；
图5G是本发明实施例7中不同MSCs对不同供者PBMC中T-reg亚群细胞增殖促进倍数(分布图)；
图6A是本发明实施例7中不同MSCs对不同供者PBMC中Th1亚群细胞抑制率检测结果；
图6B是本发明实施例7中不同MSCs对不同供者PBMC中Th17亚群细胞抑制率检测结果；
图6C是本发明实施例7中不同MSCs对不同供者PBMC中T-reg亚群细胞促进倍数检测结果。
具体实施方式
本发明提供一种基于免疫细胞亚群调节能力筛选源细胞，建立细胞库和数据库并提升有效性的方法。
MSCs免疫功能调节主要表现在：可与机体内几乎所有的免疫细胞相互作用并调节其功能，用于改善局部病损组织的微环境、抑制过激的炎症反应或调控异常免疫反应。
MSCs与T淋巴细胞作用机制主要通过细胞-细胞直接接触和分泌多种可溶性细胞因子介导，如转化生长因子-β、肝细胞生长因子、IFN-γ、前列腺素、NO等，参与介导抑制体内外T淋巴细胞的活化和增殖。
MSCs可以参与调控不同CD4+T淋巴细胞亚群，MSCs可有效抑制促炎性淋巴细胞亚群Th1和Th17的增殖和相应细胞因子分泌，促进Th1细胞分化为Th2细胞，促进Th17细胞分化为T-reg细胞。
Th1细胞主要通过分泌炎性因子诱导巨噬细胞、NK细胞、B细胞、CD8+毒性细胞的活化来促进细胞介导的炎症反应，在类风湿性关节炎(RA)、1型糖尿病、莱姆病、多发性硬化(MS)、慢性甲状腺炎中，Th1及Th1细胞因子占优势，与激活细胞免疫有关。
通常认为Th1及其分泌的细胞因子具有促炎功能；Th2及其分泌的细胞因子具有抑炎功能，在宿主移植排斥反应中，Th1细胞比例会上升，Th2细胞比例会下降，MSCs可以促进Th1细胞分化为Th2细胞，可以帮助恢复机体免疫平衡状态。
Th17细胞大部分效应能力来自于IL-17和GM-CSF，IL-17与TNF-α一起通过黏附因子、促炎细胞因子(IL-6、GM-CSF、G-CSF等)、趋化因子、前列腺素E2和基质金属蛋白酶的表达促进炎症反应。
T-reg细胞是一种特殊的免疫调节T细胞亚群，在机体免疫应答的负调节及自身免疫耐受中发挥着重要调节作用。
通过对比不同供者MSCs对Th1、Th17和Treg细胞表现出不同的抑制能力建立相应的数据库，鉴于此数据库进行MSCs供者细胞筛选，方便治疗不同类型的免疫功能缺陷性疾病。
根据本发明一个示例性实施方案，所述的免疫细胞的来源包括但不限于人、鼠、兔和猴。
根据本发明一个示例性实施方案，所述的筛选机制指免疫细胞与源细胞以直接或间接接触的方式共培养后，对免疫细胞亚群细胞产生促进或抑制效果，针对促进或抑制免疫细胞亚群能力的不同筛选源细胞。
根据本发明一个示例性实施方案，所述的源细胞指种子细胞或者主细胞库中的细胞，包括且不限于各类干细胞。
根据本发明一个示例性实施方案，所述细胞库为多种源细胞的集合，包括且不限于使用冻存管或冻存袋等储存于液氮的形式。
根据本发明一个示例性实施方案，所述的数据库多种源细胞各类数据统计的集合，其各种数据包括且不限于物理、化学和生物相关特性的数据，记录形式包括且不限于纸质的或电脑的方式。
根据本发明一个示例性实施方案，所述的有效性指包括且不限于用于治疗相关疾病的有效性或用于科研效果的有效性。
根据本发明一个示例性实施方案，所述的直接接触共培养方式是指免疫细胞与源细胞在一个合适容器以直接接触的方法共培养一段时间。
根据本发明一个示例性实施方案，所述的间接接触共培养方式包括但不限于使用transwell共培养的方式。
根据本发明一个示例性实施方案，所述的免疫细胞亚群检测方式包括但不限于流式检测。
根据本发明一个示例性实施方案，所述的间充质干细胞源包括而不限于：脐带、脐带血、骨髓、脂肪、肌肉、沃顿胶、神经、皮肤、羊膜、绒毛膜、蜕膜和胎盘。
根据本发明一个示例性实施方案，所述的源细胞包括且不限于P0、P1、P2、P3…Pn代种子细胞或主库细胞等源性细胞。
根据本发明一个示例性实施方案，所述的T-reg检测方法包括且不限于流式检测。
根据本发明一个示例性实施方案，所述的方法包括：利用PBMC与MSCss直接接触共培养的方式，筛选出抑制Th17细胞能力强的源性间充质干细胞。
根据本发明一个示例性实施方案，其中所述的方法包括：
(a)取P3代源性MSCs接种至6孔板，培养过夜贴壁后弃上清，加入PBMC细胞和激活剂共培养72h；
(b)利用流式细胞检测对比PBMC组和MSCs组中的T-reg细胞占比；
(c)记录数据至数据库，根据需求使用相应细胞库中源性MSCs，以提高医疗或科研有效性。
根据本发明一个示例性实施方案，所述的免疫细胞包括但不限于PBMC，淋巴细胞和T细胞。
根据本发明一个示例性实施方案，所述的免疫细胞亚群包括但不限于Th1、和Th17细胞。
根据本发明一个示例性实施方案，所述的间充质干细胞源包括而不限于：脐带、脐带血、骨髓、脂肪、肌肉、沃顿胶、神经、皮肤、羊膜、绒毛膜、蜕膜和胎盘。
根据本发明一个示例性实施方案，所述的源细胞包括且不限于P0、P1、P2、P3…Pn代种子细胞或主库细胞等源性细胞。
根据本发明一个示例性实施方案，所述的MSCs与PBMC共培养的比例包括但不限于1：1、1：5、1：10…1：400。
根据本发明一个示例性实施方案，所述的T-reg检测方法包括且不限于流式检测。
根据本发明一个示例性实施方案，所述的激活剂包括但不限于PHA和CD3/CD28等有活化PBMC能力的试剂。
公式：增殖抑制率＝(1-PBMC+PHA+MSC组/PBMC+PHA组)*100％计算增殖抑制率数值；
增殖倍数＝PBMC+PHA+MSC组/PBMC+PHA组-1。
PBMC+PHA+MSCs组：PBMC与MSCs在PHA刺激下共培养后流式检测出的细胞占比；
PBMC+PHA组：PBMC在PHA刺激下共培养后流式检测出的细胞占比。
在本文中，由「一数值至另一数值」表示的范围，是一种避免在说明书中一一列举该范围中的所有数值的概要性表示方式。因此，某一特定数值范围的记载，涵盖该数值范围内的任意数值以及由该数值范围内的任意数值界定出的较小数值范围，如同在说明书中明文写出该任意数值和该较小数值范围一样。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应该理解，这些实施例仅用于说明本发明，而不用于限定本发明的保护范围。在实际应用中本领域技术人员根据本发明做出的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。
实施例1：脐带间充质干细胞的获取
(1)在生物安全柜内，将脐带放置于10cm细胞培养皿中，第一遍用生理盐水润洗，第二遍用75％酒精润洗，第三遍再用生理盐水润洗，用手术剪剪成2cm左右的小段，用有齿镊将脐带小段外层的表皮剥净，撕开华通氏胶，先剔除2根动脉，再剔除1根静脉，用生理盐水洗净血液，再用手术刀将华通氏胶组织部分切成大约2-3mm大小的组织块。
(2)按64个组织块/T75培养瓶的规格将组织块均匀散布，将培养瓶放入37℃，5％CO2培养箱烘干90min，达到放置时间，操作台内配制10％FBS完全培养基，缓慢添加15ml至T75培养瓶。
(3)原代分离7天后，更换新的10％FBS完全培养基，将培养液全部慢慢吸出，弃置，在T75培养瓶中加入15ml 10％FBS完全培养基，换液后的T75培养瓶放于37℃、5％CO2培养箱进行培养，之后每2-5天观察一次，最后一次换液时，将培养基和组织块一并小心倒出。
(4)添加生理盐水洗涤后，加入4ml胰酶消化细胞，加入同胰酶等体积10％FBS完全培养基，并轻轻吹打2次以上至细胞无团块，将细胞悬液用70μm筛网过滤至50ml离心管，1800rpm、5min离心，弃上清，添加10％FBS完全培养液进行接种，继续培养。
(5)细胞长满后，消化，按照2×106个/ml密度进行细胞冻存。
实施例2：脐带间充质干细胞表面标志物检测
从细胞库中取出13个样本脐带间充质干细胞，放入37℃水浴锅进行快速复融后添加10ml预热PBS进行洗涤；进行细胞计数后按照1.75×105个/ml密度接种至T175培养瓶，添加40ml 10％FBS完全培养液进行培养；细胞长满后，进行消化后取3×106个细胞进行MSCs表面标志物检测，检测指标包括：CD14、CD19、CD31、CD34、CD45、CD73、CD90、CD105、HLA-DR。
检测结果如图1所示，通过对所有样本表面抗原分析，结果显示出所有样本满足细胞干性表达的需求，即满足CD73、CD90、CD105全阳性标准，CD14、CD19、CD31、CD34、CD45、HLA-DR全阴性标准。
实施例3：脐带间充质干细胞成脂、成骨、成软骨三系分化检测
(1)取实施例2中细胞进行接种，接种至六孔板内，接种密度为8×104个/ml，接种体积为3ml，培养2天后吸弃原培养液，按照3ml/孔添加人脐带间质干细胞成脂诱导分化培养基；2-3天更换人脐带间质干细胞成脂诱导分化培养基，培养至20天左右；成脂诱导分化结束后，吸弃六孔板中的间质干细胞成脂诱导分化培养基，用PBS冲洗1-2次，每孔添加2mL4％中性甲醛溶液，固定30min，吸弃中性甲醛溶液，用PBS冲洗2次；每孔中加入1ml油红O抗体工作液，染色30min，吸弃油红O染液，用60％异丙醇冲洗2次，用PBS冲洗1次，每孔添加1mlPBS，结果如图2A所示。
(2)取实施例2中细胞进行接种，接种至六孔板内，接种密度为4×104个/ml，接种体积为3ml，培养2天后吸弃原培养液，按照3ml/孔添加人脐带间质干细胞成骨诱导分化培养基；2-3天更换人脐带间质干细胞成骨诱导分化培养基，培养至20天左右；成骨诱导分化结束后，吸弃六孔板中的成骨诱导分化完全培养基，用PBS冲洗1-2次，每孔加入2mL 4％中性甲醛溶液，固定30min，吸弃中性甲醛溶液，用PBS冲洗2次，每孔中加入1ml茜素红染液，染色3-5min，吸弃茜素红染液，用PBS冲洗2-3次，每孔添加1ml PBS，结果如图2B所示。
(3)取实施例2中13个样本MSCs，将5×105细胞转移到15ml离心管中，1000rpm，5min离心，弃上清，加入0.5ml人脐带间质干细胞成软骨诱导分化完全培养基，重悬细胞，室温下1000rpm，5min离心，弃上清，用0.5ml人脐带间质干细胞成软骨诱导分化完全培养基重悬细胞，室温下1000rpm，5min离心，拧松离心管管盖，以便于气体交换，将其放置于37℃，5％CO2的培养箱中培养；(此步骤不需要吸掉上清并重悬细胞，且24h之内不要摇动离心管)；当细胞团出现聚拢现象时(一般为24h或48h后，实际视细胞生长情况而定)，轻弹离心管底部使软骨球脱离管底悬浮在液体中；自接种开始计算，每隔1-2天更换成软骨诱导分化培养液，14天之后，对软骨球进行固定、包埋、切片、抗体染色；采用HE染色法进行成软骨能力检测，结果如图2C所示。
通过对13个源细胞样本进行成脂、成骨、成软骨三系分化检测，所有样本均具有三系分化的潜能，鉴定为脐带间充质干细胞，所有样本初步满足入库标准。
在此基础上进行PBMC与MSCs体外共培养实验，检测MSCs对PBMC中Th1、Th17、T-reg细胞调节能力，筛选出抑制Th1、Th17细胞能力强的源性间充质干细胞，筛选出促进T-reg细胞能力强的源性间充质干细胞。
实施例4：PBMC细胞制备
取3个志愿者全血进行PBMC分离，先离心(1000rpm，10min)去除血浆，添加等比例的生理盐水，混匀；将血液稀释液添加至预先添加的ficoll液中，离心(2000rpm，20min)后吸取白膜层细胞；将细胞用生理盐水洗涤两遍，离心(1500rpm，6min)后按照1×107/ml进行细胞冻存，分别标记为Donor A、Donor B、Donor C。
实施例5：MSCs对PBMC在活化条件下对Th1细胞亚群影响
取实施例2中选取的13个供者脐带间充质干细胞进行接种，接种至六孔板内，接种密度为8×104个/ml，接种体积为3ml；贴壁24小时后，吸弃上清液。
取实施例4中3种(DonorA、Donor B、Donor C)冻存的PBMC复苏后，接种至吸弃上清液的含有贴壁MSCs六孔板内，接种密度为8×105个/ml，接种体积为3ml；设置一组不添加MSCs的单独PBMC组作为阳性对照。按照20ng/ml添加PHA激活剂，添加后放入37℃培养箱进行细胞培养，培养3天后进行检测。
每组样本添加激活抑制剂，将细胞破膜后，刺激细胞活化促进IFN-γ分泌至胞内；添加固定破膜剂后6小时，吸取细胞后过滤，离心(1500rpm，6min)；细胞沉淀用生理盐水清洗一遍后，添加CD4抗体进行表面染色；孵育30min，样本进行洗涤一遍，添加固定破膜剂；孵育50min，用破膜洗液洗涤，添加IFN-γ抗体进行胞内染色；孵育30min，用破膜洗液洗涤，进行流式检测。
不同供者PBMC活化刺激培养后Th1细胞占比存在差异性，结果如图3A(1)、(2)、(3)所示，Donor A、Donor B、Donor C中Th1细胞占比依次是2.60％、2.91％、2.02％。
MSCs与PBMC共培养后，对不同供者PBMC中Th1细胞抑制能力表现不同的差异性，结果如图3B(1)、(2)、(3)所示，Donor A、Donor B、Donor C的PBMC与MSCs共培养后Th1细胞占比依次是1.40％、1.10％、0.79％。
图中所有(1)使用的PBMC为Donor A；图中所有(2)使用的PBMC为Donor B；图中所有(3)使用的PBMC为Donor C；
基于差异性的区别，计算MSCs对PBMC中Th1细胞亚群的增殖抑制率，结果如图3C所示，Th1细胞为是由初始T细胞分化而成的促炎细胞，能分泌IFN-γ等促炎因子，导致炎症的发生。MSCs免疫调节功能可直观的体现在抑制Th1细胞的增殖或促进Th1细胞分化为Th2细胞。根据不同供者MSCs对Th1细胞调节能力差异性筛选出对增殖抑制率大于40％的供者MSCs，建立子细胞库。
实施例6：MSCs对PBMC在活化条件下对Th17细胞亚群影响
取实施例5中添加PHA激活剂的PBMC组、PBMC与MSCs共培养组；每组样本添加激活抑制剂，将细胞破膜后，刺激细胞活化促进IL-17A分泌至胞内；添加固定破膜剂后6小时，吸取细胞后过滤，离心(1500rpm，6min)；沉淀用生理盐水清洗一遍后，添加CD4抗体进行表面染色；孵育30min，样本进行洗涤一遍，添加固定破膜剂；孵育50min，用破膜洗液洗涤，添加IL-17A抗体抗体进行胞内染色；孵育30min，用破膜洗液洗涤，进行流式检测。
不同供者PBMC活化刺激培养后Th17细胞占比存在差异性，结果如图4A(1)、(2)、(3)所示，Donor A、Donor B、Donor C中Th17细胞占比依次是0.50％、0.31％、0.40％。
MSCs与PBMC共培养后，对不同供者PBMC中Th17细胞抑制能力表现不同的差异性，结果如图4B(1)、(2)、(3)所示，Donor A、Donor B、Donor C的PBMC与MSCs共培养后Th17细胞占比依次是0.15％、0.10％、0.06％。图中所有(1)使用的PBMC为Donor A；图中所有(2)使用的PBMC为Donor B；图中所有(3)使用的PBMC为Donor C；
基于差异性的区别，计算MSCs对PBMC中Th17细胞亚群的增殖抑制率，结果如图4C所示。Th17细胞是一类分泌IL-17A的促炎性CD4+细胞，其功能异常活化与自身免疫疾病相关，MSCs能抑制Th17细胞的增殖和诱导Th17细胞转化为T-reg细胞，抑制自身免疫疾病的发生。根据不同供者MSCs对Th17细胞调节能力差异性筛选出对增殖抑制率大于40％的供者MSCs，建立子细胞库。
实施例7：MSCs对PBMC在静息条件下对T-reg细胞亚群影响
PHA激活剂可以促进T细胞大量活化，刺激细胞表达CD25、CD69信号通路，促进T-reg细胞表达量提高，存在PBMC吞噬MSCs现象，进而无法产生免疫调控作用。
取实施例2中选取的13个供者脐带间充质干细胞进行接种，接种至六孔板内，接种密度为8×104个/ml，接种体积为3ml；贴壁24小时后，吸弃上清液；
取实施例4中3种冻存的PBMC复苏后，接种至吸弃上清液的含有贴壁MSCs六孔板内，接种密度为8×105个/ml，接种体积为3ml，记为donorA、donor B、donor C；设置一组不添加MSCs的单独PBMC组作为阳性对照，放入37℃培养箱进行细胞培养，培养3天后进行检测；
每组样本吸取过滤后，离心(1500rpm，6min)，细胞沉淀用生理盐水清洗一遍后，添加CD4、CD25抗体进行表面染色；孵育30min，样本进行洗涤一遍，添加固定破膜剂；孵育50min，用破膜洗液洗涤，添加Foxp3抗体进行胞内染色；孵育30min，用破膜洗液洗涤，进行流式检测。
不同供者PBMC体外培养后T-reg细胞占比存在差异性，结果如图5A(1)(2)、5B(1)(2)、5C(1)(2)所示，Donor A、Donor B、Donor C的PBMC体外培养后T-reg细胞占比依次为0.44％、0.77％、0.47％。MSCs与PBMC共培养后，对不同供者PBMC中T-reg细胞抑制能力表现不同的差异性，结果如图5D(1)(2)、5E(1)(2)、5F(1)(2)所示，Donor A、Donor B、Donor C的PBMC与MSCs共培养后T-reg细胞占比依次是1.16％、1.38％、1.19％。图中所有(1)指T-reg中CD4阳性检测；图中所有(2)指T-reg中CD25、Foxp3阳性检测；图中A、D指PBMC供者为DonorA、图中B、E指PBMC供者为Donor B图中C、F指PBMC供者为Donor C；
基于差异性的区别，计算MSCs对PBMC中T-reg细胞亚群的增殖促进率，结果如图5G所示。T-reg细胞是一类表型为CD4+CD25+Foxp3+的免疫抑制细胞，MSCs促进T-reg细胞的分化和增殖是MSC免疫抑制功能的关键因素之一。根据不同供者MSCs对T-reg细胞调节能力差异性筛选出增殖促进倍数大于1的供者MSCs，建立子细胞库。
通过对不同供者MSCs与PBMC体外共培养，检测MSCs对PBMC中Th1、Th17、T-reg细胞亚群的调节能力，不同供者MSCs对PBMC中Th1、Th17、T-reg细胞亚群的调节能力具有差异，结果如图6A、6B、6C所示。。筛选出抑制Th1、Th17细胞能力强的源性间充质干细胞，筛选出促进T-reg细胞能力强的源性间充质干细胞。
以上公开的仅为本发明优选实施例，优选实施例并没有详尽叙述所有的细节，应该理解，这些实施例仅用于说明本发明，而不用于限定本发明的保护范围，本发明仅受权利要求书及其全部范围和等效物的限制。
本说明书选取并具体描述这些实施例，是为了更好地解释本发明的原理和实际应用，从而使所属领域技术人员能很好地利用本发明。在本发明及上述实施例的教导下，本领域技术人员很容易预见到，本发明所列举或例举的各原料或其等同替换物、各加工方法或其等同替换物都能实现本发明，以及各原料和加工方法的参数上下限取值、区间值都能实现本发明，在此不一一列举实施例。

Claims (14)

1.一种源细胞的筛选方法，其特征在于，将源细胞与免疫细胞共培养，其中，通过共培养后对免疫细胞亚群调节能力筛选源细胞。
2.根据权利要求1所述的筛选方法，其特征在于，根据对免疫细胞亚群细胞产生促进或抑制效果筛选源细胞；或，根据对促进或抑制免疫细胞亚群能力的不同筛选源细胞。
3.根据权利要求1所述的筛选方法，其特征在于，所述免疫细胞亚群为Th1、Th17或T-reg细胞中的至少一种。
4.根据权利要求1所述的筛选方法，其特征在于，筛选对Th1或Th17呈现抑制作用，或筛选对T-reg细胞呈现促进作用的源细胞。
5.根据权利要求1所述的筛选方法，其特征在于，所述免疫细胞包括但不限于外周血单个核细胞、白细胞、淋巴细胞或T细胞。
6.根据权利要求1所述的筛选方法，其特征在于，所述共培养的方式为源细胞与免疫细胞以直接接触的方式共培养，或所述共培养的方式为使用transwell共培养的方式。
7.根据权利要求1所述的筛选方法，其特征在于，所述的方法包括：利用PBMC与间充质干细胞直接接触共培养的方式，筛选出抑制Th1、Th17细胞能力强的源性间充质干细胞，或筛选出促进T-reg细胞能力强的源性间充质干细胞。
8.根据权利要求1所述的筛选方法，其特征在于，所述源细胞包括且不限于P0、P1、P2、P3…Pn代种子细胞或主库细胞的源性细胞。
9.根据权利要求1所述的筛选方法，其特征在于，培养时间不少于24小时；干细胞与免疫细胞共培养的比例为1：1～400。
10.根据权利要求1所述的筛选方法，其特征在于，共培养时还包括加入免疫细胞激活剂。
11.根据权利要求1所述的筛选方法，其特征在于，所述源细胞为：脐带干细胞、脐带血干细胞、骨髓干细胞、脂肪干细胞、肌肉干细胞、沃顿胶干细胞、神经干细胞、皮肤干细胞、羊膜干细胞、绒毛膜干细胞、蜕膜干细胞或胎盘干细胞中的至少一种。
12.一种采用权利要求1-11任一所述筛选方法得到的源细胞。
13.一种采用权利要求1-11任一所述筛选方法得到的源细胞所构建的细胞库。
14.一种采用权利要求1-11任一所述筛选方法得到的源细胞制成的产品。
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