CN110559316A

CN110559316A - 一种细胞组合物在癌细胞kals-1上的应用

Info

Publication number: CN110559316A
Application number: CN201910408513.9A
Authority: CN
Inventors: 邢永梅; 邓蒙蒙; 程箫; 刘丹; 吴疆; 王保如
Original assignee: Anhui Ruida Health Industry Co Ltd
Current assignee: Anhui Ruida Health Industry Co Ltd
Priority date: 2019-05-16
Filing date: 2019-05-16
Publication date: 2019-12-13

Abstract

本发明公开了一种细胞组合物在癌细胞KALS‑1上的应用，具体涉及γδT细胞和NK细胞组合物在KALS‑1上的应用。通过共培养诱导扩增方法获得γδT和NK细胞组合物，混合γδT和NK细胞毒性/活性强，对KALS‑1的作用强，几乎可以100％杀伤KALS‑1，为KALS‑1型癌症及疾病提供治疗方案；简化了在临床中治疗过程，简化了治疗手段，也降低了治疗成本。

Description

一种细胞组合物在癌细胞KALS-1上的应用

技术领域：

本发明涉及生物技术领域，具体涉及免疫细胞在疾病上的应用，更具体涉及细胞组合物在癌细胞KALS-1上的应用。

背景技术：

γδT细胞是一种既能杀伤癌细胞，肿瘤干细胞，又能识别癌抗原的免疫细胞。

γδT细胞是执行固有免疫功能的T细胞，其TCR由γ和δ链组成。此类T细胞主要分布于肠道呼吸道以及泌尿生殖道等黏膜和皮下组织，在外周血中只占CD3+T细胞的 0.5％-1％。其TCR缺乏多样性，可直接识别某些完整的多肽抗原。γδT细胞所识别的抗原种类有限:①HSP；②感染细胞表面CD1分子提成的脂类抗原；③某些病毒蛋白或表达于感染细胞表面的病毒蛋白；④细菌裂解产物中的磷酸化抗原。

γδT细胞是一种既能杀伤癌细胞，肿瘤干细胞，又能识别癌抗原的免疫细胞，它的杀伤性较强，但肿瘤干细胞杀伤不如NK细胞。因此，它主要用于杀伤癌细胞与协助DC细胞识别发现癌细胞抗原，然后将这些抗原进行杀伤或是传递给其他细胞。同时，γδT细胞主要分布于皮肤和黏膜组织上，因此对于黏膜方面的癌症治疗效果突出，比如消化道、呼吸道、生殖系统方面的癌症效果显著。

γδT细胞主要在胸腺中发育成熟，通过V(D)J基因重组产生γδT细胞受体(TCR)。通过特异性的基因重排，从一个共同淋巴细胞前体(commonlymphoidprecursor,CLP)分化为表达αβ受体和γδ受体的T细胞系。γδT细胞不易受抗原加工和呈递缺失的影响，因此γδT细胞具有很高的临床肿瘤免疫治疗潜在应用价值。γδT细胞在肿瘤免疫监视和抗肿瘤免疫反应中发挥重要作用。

γδT细胞作用还体现在：

①γδT细胞能够与多种免疫细胞发生作用，参加抗肿瘤免疫应答。

②γδT细胞能够在肿瘤发生的早期阶段迅速引起有效的抗肿瘤免疫应答。

③γδT细胞在抗肿瘤免疫过程中具有重要的保护作用。

④γδT能够利用细胞毒效应杀伤肿瘤细胞，防止肿瘤的发生发展。

⑤γδT细胞能够分泌相关因子，这些因子能够放大肿瘤信号。

⑥γδT细胞能分泌穿孔素，诱导肿瘤细胞凋亡。

由于γδT细胞在外周血中的含量极低，大大限制了γδT细胞作为过继免疫细胞在临床上的应用。目前从外周血单个核细胞扩增γδT细胞，扩增倍数低，细胞纯度及细胞量不高。扩增出的γδT细胞很难满足临床需求，即使通过优化各种诱导条件及扩增方法扩增出的单一γδT细胞在相应的免疫性疾病和肿瘤疾病上有所应用，但是应用后并未达到人们理想中的效果。

细胞免疫治疗是目前最具有前景的肿瘤治疗方式之一，通过体外扩增或改造后回输到病人体内达到杀伤肿瘤细胞的目的或者通过活化机体免疫系统，增强肿瘤患者自身免疫功能从而抵抗肿瘤或其他疾病。目前，NK细胞免疫治疗受到越来越多的重视。NK细胞占人外周血淋巴细胞的5-15％，一般定义其表型为CD3-CD56+，NK细胞又可以进一步细分为两个主要的亚群：具有免疫调节功能的CD56highCD16-细胞和具有细胞毒活性的CD56dimCD16+细胞。NK细胞在抗病毒感染和抗肿瘤的早期免疫反应中发挥着重要的免疫监视功能，NK细胞不需要识别肿瘤特异性抗原，便可直接、快速的发挥细胞毒活性。特别重要的是NK细胞能够有效地清除机体内的肿瘤干细胞样细胞，抑制肿瘤的生长和转移。

在现有的研究中，大多采用单一的免疫细胞或杀伤性细胞进行细胞治疗或者在临床治疗中采用联合治疗的方式，在现有技术中，采用联合治疗需要花费更高的费用，为病患带来更多经济压力。

因此解决上述现有的临床现象是急需的。

发明内容

针对上述所述问题，本发明提出了一种细胞组合物在神经胶质瘤细胞KALS-1上的应用，具体涉及γδT细胞和NK细胞组合物，该组合物在神经胶质瘤KALS-1上的应用。

所述细胞组合物包括：γδT细胞和NK细胞。

所述γδT细胞和NK细胞比例为1：0.5-10。

上述细胞混合物在癌细胞KALS-1上的应用。

上述γδT-NK细胞组合物获得方法：

1：γδT细胞的获得；

2：NK细胞的获得；

3：γδT细胞和NK细胞混合细胞物诱导扩增共培养；

4：15-20天γδT细胞和NK细胞混合细胞的获得。

其中所述γδT细胞的获得包括如下步骤：

(1)单个核细胞的制备：分离单个核细胞，用含体积百分比50％-100％的含10vt％FBS或自体血清的RMPI1640和0％-50％X-vivo15的混合培养基重悬细胞，接种在培养瓶或培养袋中培养；

(2)γδT细胞的诱导：加入含浓度为1-100μM的唑来膦酸和500～2000U/mLIL-2 的混合培养基体外刺激4天后加入含有10～500ng/mLanti-humanCD3Ab、10～500ng/mL anti-humanCD28Ab、10～200ng/mLIL-15、10～200ng/mLIL-21、500～3000U/mLIL-2 的混合培养基进行半量换液，置于37℃、5％CO₂培养箱中培养；

(3)培养2～3天，待γδT细胞生长状态良好待后续使用。

优选的，唑来膦酸浓度为5μM、anti-humanCD3Ab浓度为50ng/mL、anti-humanCD28Ab 浓度为50ng/mL、IL-15浓度为50ng/mL、IL-21浓度为50ng/mL、IL-2浓度为1000U/mL。

优选的，单个核细胞来源于外周血、脐带血、骨髓或诱导性多能干细胞(iPSC)。

在一个实施方案中也可以使用其他磷酸抗原代替唑来膦酸，包括异戊烯焦磷酸酯(IPP),(E)-4-羟基-3-甲基-丁-2-烯基焦磷酸酯(HMB-PP),焦磷酸乙酯(EPP)，焦磷酸法呢酯(FPP),二甲基烯丙基磷酸酯(DMAP),二甲基烯丙基焦磷酸酯(DMAPP),乙基-腺苷三磷酸酯(EPPPA)，牦牛儿焦磷酸酯(GPP),牦牛儿牦牛儿焦磷酸酯(GGPP),异戊烯-腺苷焦磷酸酯(IPPPA),磷酸一乙酯(MEP),焦磷酸一乙酯(MEPP)等含有氮的双磷酸酯。

优选的，在一个实施案例中混合培养基中含10vt％FBS或自体血清的RMPI1640的比例为50vt％，X-vivo15培养基的比例为50vt％。

其中NK细胞的获得包括如下步骤：

(1)分离单个核细胞；

(2)通过免疫分选去除单个核细胞中的CD³⁺T淋巴细胞；

(3)加入NK细胞培养用无血清细胞培养基及终浓度为10-500ng/mlIL-15、 10-500ng/mlIL-12、10-500ng/mlIL-21、10-500ng/mlIL-18和500-1500U/mlIL-2接种在细胞培养瓶体外培养2-5天后全换液，待细胞生长状态良好。

上述所述单个核细胞是通过肝素抗凝无菌一次性采血管静脉穿刺采集外周血后，通过 Ficoll密度梯度离心获得或者通过单采机采集的单个核细胞；或者来自于脐带血、骨髓和 iPSCs诱导分化得到的单个核细胞。

所述免疫分选去除单个核细胞中的CD³⁺T淋巴细胞可采用免疫磁珠、膜泡免疫分选和流式细胞仪免疫分选等方法。

所述去除CD3+T淋巴细胞后的单个核细胞的接种浓度为0.1-2×10⁶cells/ml，优选为1×10⁶cells/ml。

所述细胞因子组合中所用白介素-15的浓度优选为120-350ng/ml。

所述细胞因子组合中所用白介素-12的浓度优选为100-300ng/ml。

所述细胞因子组合中所用白介素-21的浓度优选为100-380ng/ml。

所述细胞因子组合中所用白介素-18的浓度优选为100-300ng/ml。

所述细胞因子组合中所用白介素-2的浓度优选为1000-1500U/ml。

所述NK细胞全换液天数优选为第4天，细胞浓度优选为1×10⁶cells/ml。

所述NK细胞换液为通过补加含NK细胞扩增所需细胞因子的NK细胞无血清培养调整 NK细胞浓度至1×10⁶cells/ml。

γδT细胞和NK细胞混合细胞物共培养包括如下步骤：

(1)取上述生长状态良好的γδT细胞适量，并放置于培养瓶中；

(2)取上述生长状态良好的NK细胞适量，并放置于步骤1γδT细胞培养瓶中；

(3)向培养瓶中加入自体血清的RMPI1640和X-vivo15培养基1-2天；RMPI1640和X-vivo15的比例为1：0.5-5；

(4)2-3天向细胞培养瓶中加入100-300ng/mlIL-15、100-300ng/mlIL-12、 100-200ng/mlIL-21、50-200ng/mlIL-18和500-1500U/mlIL-2的混合培养基进行半量换液，置于37℃、5％CO₂培养箱中培养；

(5)培养第5天-第18天，每天观察细胞生长状态，补加含细胞因子的自体血清的RMPI 1640和X-vivo15培养基，维持细胞浓度1×10⁶cells/ml，置于饱和湿度、37℃、5.0％CO₂培养箱继续培养，至达到所需细胞数量时收获细胞。期间，如果细胞体积超过240ml，则分瓶培养或转入细胞培养袋中传代培养，14-18天收获混合细胞培养物。

所述γδT细胞接种量为0.1-2×10⁶cells/ml，NK细胞接种量为0.1-1×10⁶ cells/ml。

共培养诱导扩增的方法，先通过刺激诱导单个核细胞扩增为γδT细胞，同时通过采集外周血分离筛选并刺激诱导扩增出NK细胞，后通过γδT细胞与NK细胞共同诱导活化培养，同时利用多种扩增因子组合共同刺激诱导扩增γδT细胞与NK细胞，获得γδT 细胞与NK细胞共培养混合细胞，具有数量大、扩增倍数高、细胞毒性强等特点，具有非常好的临床应用价值。

本发明所用原料和试剂除有特殊说明外，均市售可得。

由于采用上述的技术方案，本发明的有益效果是：(1)本发明提供了一种γδT-NK细胞共培养细胞组合物在KALS-1上的应用，混合γδT-NK细胞毒性/活性强，对KALS-1的作用强，几乎可以100％杀伤KALS-1，为KALS-1型癌症及疾病提供治疗方案；(2)共培养诱导扩增方法操作简单，且可获得大量扩增的γδT细胞和NK细胞；(3)且在刺激因子缺少的情况下，培养过程细胞可相互促进刺激生长，缩短了培养时间同时获得大量满足临床需求的医用细胞量，γδT细胞和 NK细胞大量扩增；(4)共培养模式获得的细胞组合物，简化了在临床中多次使用单独的细胞进行免疫治疗，减少成本，简化治疗过程。

附图说明：

图1为扩增培养γδT细胞生长曲线及扩增倍数；

图2为扩增培养NK细胞生长曲线及扩增倍数；

图3为扩增培养γδT细胞和NK细胞生长曲线及扩增倍数；

图4为γδT细胞、NK细胞、γδT细胞和NK细胞组合细胞物对KALS-1细胞的杀伤活性检测；

图5为γδT细胞和NK细胞混合细胞物对癌细胞KALS-1移植瘤的生长抑制作用。

具体实施方式：

下面结合具体的实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。应理解，所描述的实施例是本发明一部分实施例，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

为了使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。

实施例1γδT细胞的获得

γδT细胞的获得从外周血中分离单个核细胞(PBMCs)并扩增γδT细胞：

(1)使用前30分钟开启生物安全柜；

(2)使用前从冰箱中取出D-PBS，室温放置30分钟；

(3)将30ml外周血液样品(肝素抗凝)转移到两个无菌50ml离心管，每管15ml，然后向每管加入22.5ml无菌D-PBS，反复颠倒离心管，充分混匀；

(4)另取两个50ml无菌离心管，分别加入15mlFicoll-PaquePlus溶液，然后分别缓慢的加入24ml步骤3中稀释后的血液(由步骤3中两个无菌管中吸取)，形成分层，20℃，400×g,离心30分钟；

(5)将步骤4中的两个50ml离心管放入生物安全柜，然后使用10ml吸管吸掉15ml血清层，装入一个新的无菌50ml离心管中，56℃灭活30分钟待用(用于配制混合培养基)；

(6)吸取每一个50ml离心管中的白细胞层(PBMCs)，转入一个新的50ml无菌离心管；

(7)向步骤6装有PBMCs细胞悬液的离心管中加入其3倍体积的无菌PBS，并用无菌移液管混匀，20℃，400×g，离心10分钟；

(8)弃上清，加入50ml无菌PBS，缓慢重悬PBMC；

(9)20℃，400×g，离心10分钟；

(10)加入5ml50vt％含步骤5自体血清的RMPI1640+50vt％X-vivo15的混合培养基，混匀，取10μl用于计数；

(11)由步骤10中取一半量的外周血单个核细胞(PBMCs),加入一定体积含有唑来膦酸的混合培养基调整细胞浓度至1×10⁶cells/ml；另一半量的PBMCs加入含有唑来膦酸的 RPMI1640培养基，调整细胞浓度至1×10⁶cells/ml；

(12)使用T-175培养瓶培养细胞；

(13)将细胞培养瓶放置于5％CO₂、37℃细胞培养箱中进行细胞培养；

(14)在第4天时，将所有细胞转入50ml无菌离心管中(20℃，400×g,离心5分钟)，更换扩增培养基；取一半量含有所需扩增因子(anti-humanCD3Ab,anti-humanCD28Ab,IL-15，IL-21，和IL-2)组合物的混合培养基加入空的细胞培养瓶中，离心后的细胞培养基上清转移到50ml无菌离心管中，取一半量细胞培养基上清重悬细胞，分别将重悬后的细胞放入此步细胞培养瓶中，5％CO₂、37℃继续培养；

(15)在第6、8、10、12、14、16和18天更换扩增培养基。

在培养第0、4、6、8、10、12、14、16、18和20天统计接种细胞数和扩增培养的细胞数，制作细胞生长曲线，如图1所示，接种3000万细胞，扩增20天，细胞总数可达约 260亿，完全满足临床应用需要。统计第0天、第8天、第14天和第20天，计算γδT细胞扩增倍数，如图1所示。

实施例2NK细胞的获得

1、单核细胞的分离

1.1在生物安全柜正常工作状态下，50ml无菌离心管分别加入Ficoll-PaquePlus淋巴细胞分离液；

1.2将患者外周全血与DPBS按比例均匀稀释后缓慢注入于离心管中淋巴细胞分离液液面上层；

1.3 20℃，400×g，离心30分钟；

1.4使用无菌吸管吸取分离管中的血浆层，将血浆放入50ml无菌离心管中，56℃水浴30分钟灭活，800g×离心10分钟，将上层血浆转移至新的50ml无菌离心管中；

1.5吸取分离所得的单个核细胞层(PBMCs)装于50ml无菌离心管中；

1.6加入DPBS，混匀，20℃，400×g，离心10分钟，洗涤1次；

1.7弃上清液，再用DPBS将1.6步所有细胞重悬至一个50ml无菌离心管中，混匀，取20μl细胞悬液置于1.5mlEP管中计数。

2、NK细胞体外扩增-CD³⁺T细胞去除

2.1根据步骤1.7的计数结果，取出5×10⁵细胞置于1.5mlEP管中，用于分选前表型检测，剩余细胞20℃，400×g，离心10分钟，再洗涤1次，弃上清液，用含0.5％人血白蛋白及1mMEDTA的DPBS(0.5％HSA，1mMEDTA，DPBS)将细胞浓度调整至1×10⁸cells/ml，转移至5ml无菌流式管中，按150μl/ml样品加入EasysepTMHumanCD3Positive SelectionKitII中的HumanCD3PositiveSelectionCocktailII，混匀，室温放置 3min；

2.2将EasysepTMHumanCD3PositiveSelectionKitII中的RapidSphereTM50100 混匀，按90μl/ml样品加至步骤2.1的流式管中，混匀，室温放置3min；

2.3用含0.5％HSA，1mMEDTA，DPBS将步骤2.2中5ml无菌流式管中的细胞悬液的体积补齐至2.5ml，轻轻混匀；

2.4将上述5ml无菌流式管置于磁铁中室温静置3min，拿起磁铁，将细胞倒于15ml无菌离心管中，取20μl细胞悬液置于1.5mlEP管中计数。

3、NK细胞体外扩增-NK细胞培养

3.1根据2.4步计数结果，取出5×10⁵细胞置于1.5mlEP管中，用于分选后表型检测，剩余细胞悬液用L500培养基将剩余细胞体积补至14ml，混匀，20℃，400×g，离心5min；

3.2弃上清，20℃，400×g，离心5min；

3.3吸弃上清，用含10％自体血清的SuperCultureTML500(L500)培养基将细胞浓度调整至1×10⁶cells/ml，加入IL-2使其终浓度为1500IU/ml，另加入细胞因子(IL-15、Il-12、IL-21和IL-18终浓度均为200ng/ml)，混匀。

3.4将细胞置于37℃、饱和湿度、5.0％CO2培养箱中培养。

3.5培养第4天，将细胞吹匀，取20μl细胞悬液置于1.5mlEP管中，用于计数。剩余细胞转至50ml无菌离心管中，20℃，400×g，离心5min；

3.6弃上清，用新鲜配制的含10％自体血清的L500培养基重悬细胞，并调整细胞浓度至1×10⁶cells/ml，同时加入IL-2使其终浓度为1500U/ml和另加入细胞因子(IL-15、Il-12、IL-21和IL-18终浓度均为200ng/ml)，混匀。

3.7将上述细胞置于37℃、饱和湿度、5.0％CO₂培养箱中继续培养。

3.8培养第5天-第21天，每天观察细胞生长状态，补加含细胞因子的L500培养基(如有足够血浆，可继续维持10％自体血浆含量)，维持细胞浓度1×10⁶cells/ml，置于饱和湿度、37℃、5.0％CO₂培养箱继续培养，至达到所需细胞数量时收获细胞。期间，如果细胞体积超过240ml，则分瓶培养或转入细胞培养袋中传代培养。

在培养第0、4、6、8、10、12、14、16、18、20和22天统计接种细胞数和扩增培养的细胞数，制作细胞生长曲线，如图2所示，接种1560万细胞，扩增21天，细胞总数可达约420亿，完全满足临床应用需要。统计第0天、第6天、第14天和第22天，计算NK细胞扩增倍数，可见采用本发明方法可以获得大量的NK细胞，结果参见图2。

实施例3γδT细胞和NK细胞混合细胞物共培养

(1)取实施例1中培养3-10天生长状态良好的γδT细胞1-3ml，并放置于培养瓶中；

(2)取实施例2中培养3-10天生长状态良好的NK细胞1-3ml，并放置于步骤1γδT细胞培养瓶中；

(3)向培养瓶中加入自体血清的RMPI1640和X-vivo15培养基1-2天；RMPI1640和X-vivo15的比例为1：1；

(4)第2-3天向细胞培养瓶中加入100ng/mlIL-15、100ng/mlIL-12、100ng/mlIL-21、 80ng/mlIL-18和500U/mlIL-2的混合培养基进行半量换液，置于37℃、5％CO₂培养箱中培养；

(5)培养第5天-第16天，每天观察细胞生长状态，补加含细胞因子的自体血清的RMPI 1640和X-vivo15培养基，维持细胞浓度1×10⁶cells/ml，置于饱和湿度、37℃、5.0％CO²培养箱继续培养，至达到所需细胞数量时收获细胞。期间，如果细胞体积超过240ml，则分瓶培养或转入细胞培养袋中传代培养，17-18天收获混合细胞培养物。

在培养第0、4、6、8、10、12、14和16天统计接种细胞数和扩增培养的细胞数，制作细胞生长曲线，如图3所示，NK细胞接种1500万细胞，γδT接种2000万细胞,扩增16天，细胞总数可达约1100亿；总细胞数目完全满足临床应用需要。如图3所示，统计第0天、第8天、第12天和第16天，计算γδT细胞和NK细胞扩增倍数。

实施例4γδT细胞和NK细胞混合细胞物对癌细胞KALS-1的杀伤活性

使用5μM的CFSE对KALS-1细胞染色，将NK细胞或γδT细胞或γδT细胞和NK细胞混合细胞物或PBS与KALS-1细胞按照20:1的比例，37℃孵育4h后，加入1μg/ml的 PI染料，CFSE+PI双阳性的细胞为死亡细胞，如图4所示，在4h、8h后γδT细胞和NK 细胞混合细胞物能显著地增强对癌细胞的杀伤活性，几乎100％的杀伤SK-BR-3细胞。

且有上述实施例可以得出，γδT细胞与NK细胞分离后在混合培养，两种细胞可以相互促进增殖生长，且细胞生长周期有所缩短，且在刺激因子缺少的情况下，γδT细胞和NK细胞大量扩增，且混合细胞毒性/活性强。

实施例5γδT细胞和NK细胞混合细胞物对癌细胞KALS-1移植瘤的生长抑制作用

将5×10⁶个KALS-1细胞接种在BALB/cnude小鼠有后肢上，待肿瘤长到100mm³时，将小鼠分为四组(每组10只)，分别通过尾静脉注射PBS、NK细胞、γδT细胞、γδT细胞和NK细胞混合细胞物，每周注射一次，共注射四次，观测肿瘤生长情况，如图5所示， γδT细胞和NK细胞混合细胞物能显著增强对KALS-1细胞移植瘤的生长的抑制。

以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。

Claims

1.一种细胞组合物在癌细胞KALS-1上的应用，其特征在于：γδT细胞和NK细胞组合物在癌细胞KALS-1上的应用。

2.根据权利要求1所述细胞组合物在癌细胞KALS-1上的应用，其特征在于：γδT细胞和NK细胞比例为1：0.5-10。

3.根据权利要求2所述细胞组合物在癌细胞KALS-1上的应用，其特征在于：γδT细胞和NK细胞制备方法如下：

(1)γδT细胞的获得；

(2)NK细胞的获得；

(3)γδT细胞和NK细胞混合细胞物诱导扩增共培养；

(4)15-20天γδT细胞和NK细胞混合细胞的获得。

4.根据权利要求3所述细胞组合物在癌细胞KALS-1上的应用，其特征在于：γδT细胞的获得方法为：

(1)单个核细胞的制备：分离单个核细胞，用含体积百分比50％-100％的含10vt％FBS或自体血清的RMPI 1640和0％-50％X-vivo15的混合培养基重悬细胞，接种在培养瓶或培养袋中培养；

(2)γδT细胞的诱导：加入含浓度为1-100μM的唑来膦酸和500～2000U/mL IL-2的混合培养基体外刺激4天后加入含有10～500ng/mL anti-human CD3Ab、10～500ng/mL anti-human CD28Ab、10～200ng/mL IL-15、10～200ng/mL IL-21、500～3000U/mL IL-2的混合培养基进行半量换液，置于37℃、5％CO₂培养箱中培养；

(3)培养2～3天，待γδT细胞生长状态良好待后续使用。

5.根据权利要求3所述细胞组合物在癌细胞KALS-1上的应用，其特征在于：NK细胞的获得包括如下步骤：

(1)分离单个核细胞；

(2)通过免疫分选去除单个核细胞中的CD³⁺T淋巴细胞；

(3)加入NK细胞培养用无血清细胞培养基及终浓度为10-500ng/ml IL-15、10-500ng/ml IL-12、10-500ng/ml IL-21、10-500ng/ml IL-18和500-1500U/ml IL-2接种在细胞培养瓶体外培养2-5天后全换液，待细胞生长状态良好。

6.根据权利要求3所述细胞组合物在癌细胞KALS-1上的应用，其特征在于：γδT细胞和NK细胞混合细胞物共培养包括如下步骤：

(1)取单独培养中生长状态良好的γδT细胞适量，并放置于培养瓶中；

(2)取单独培养中生长状态良好的NK细胞适量，并放置于上述步骤(1)γδT细胞培养瓶中；

(3)向培养瓶中加入自体血清的RMPI 1640和X-vivo15培养基1-2天；

(4)2-3天向细胞培养瓶中加入100-300ng/ml IL-15、100-300ng/ml IL-12、100-200ng/ml IL-21、50-200ng/ml IL-18和500-1500U/ml IL-2的混合培养基进行半量换液，置于37℃、5％CO₂培养箱中培养；

(5)培养第5天-第18天，每天观察细胞生长状态，补加含细胞因子的自体血清的RMPI1640和X-vivo15培养基，维持细胞浓度1×10⁶cells/ml，置于饱和湿度、37℃、5.0％CO₂培养箱继续培养，至达到所需细胞数量时收获细胞；如果细胞体积超过240ml，则分瓶培养或转入细胞培养袋中传代培养，14-18天收获混合细胞培养物。

7.根据权利要求4-6任一项所述细胞组合物在癌细胞KALS-1上的应用，其特征在于：RMPI 1640和X-vivo15的比例为1：0.5-5。