KR100281177B1 - 세포의 선택, 분리 및 융합방법 - Google Patents

세포의 선택, 분리 및 융합방법 Download PDF

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로버트 제프리 이쉬크로프트
푸셀 피티와이. 리미티드
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Abstract

디일렉트로포레시스를 이용하여 다른 유형의 세포들을 분리하는 방법; 상보적인 리간드를 포함하는 전극과의 접촉상태로 리간드 함유세포들을 디일렉트로포레시스에 의해 끌어당김으로써 세포들을 전기화학적 선택하는 방법; 및 세포들 또는 세포와 벡터를 그것들이 융합할 수 있도록 병치상태로 조작하는데 디일렉트로포레시스를 이용하여 개별적으로 분리된 세포를 다른 세포 또는 벡터와 융합시키는 방법이 기술되었다.

Description

[발명의 명칭]
세포의 선택, 분리 및 융합방법
[도면의 간단한 설명]
본 발명의 바람직한 면은 하기에서 첨부된 도면과 관련하여 기술될 것이다.
제1도는 세포(10)의 단순모델인데, 비교적 높은 전도성과 유전율의 균일한 내부(11)가 반대 특성의 박막(12)에 의하여 둘러싸여 있다.
제2도는 세포의 단순모델에 대한 주파수의 함수로서 힘(force) 곡선의 주파수-의존 성분의 전형적인 실례인데, 모델 세포 자체가 낮은 전도성의 수용액중에서 현탁되어 있다.
제3도는 표적화된 항원(14)의 피복된 전극(13)의 도식적 표현이며, 이 전극은 화학적으로 선택적인 전극의 한 실례이다.
제4도는 표면에서 표적항원을 발현하고, 전극에 비특이적으로 부착된 세포(16)의 피복된 전극(15)의 도식적 표현이다.
제5도는 여기서 기술한 전기화학적 선택방법을 이용하여 여러 개의 정상 항체분비 세포(17)가 부착된 제3도의 전극(13)의 도식적 표현이다.
제6도는 많은 분비(대개는 항체분비) 세포(18)가 부착된 제4도의 전극(15)의 도식적 표현이다.
제7도는 여러 개의 불멸인 파트너 세포(21)가 부착된 추가의 전극(19)의 도식적 표현이다.
제8도는 제5도의 전극(13)위의 세포(17)와 제7도의 전극(19)위의 세포(21)가 하나가 각각의 필수형태인 두 융합될 세포의 견고한 위치관계를 획득하도록 가깝게 병치된 것을 도식적으로 나타낸 것이다.
제9도는 2종 세포융합이 일어나서 하나의 융합체 세포(22)를 생성한 후의 제7도의 전극(19)의 도식적 표현이다.
제10도는 본 발명의 한 구체예에 따른 방법을 수행하기 위한 반응기 셀(reactor cell)의 평면도이다.
제11도는 제10도의 반응기 셀의 수직단면도이다.
제12도는 제10도의 반응기 셀에서 사용하기 위한 추가 전극(31)의 도식적인 측입면도이다.
제13도는 본 발명에 따른 방법을 수행하기 위한 대체 융합 챔버(fusion chamber)의 도식적인 평면도이다.
제14도는 제13도의 도식적인 평면도의 수직입면도이다.
제15도는 고정, 융합 및 전이 전극의 3차원적인 배열의 등측 도식적 표현이다.
제16도는 제13도의 융합 챔버속에 양의 압력을 적용시킴으로써 분비세포를 도입시키는 “이동(displacement)”피펫을 나타내는 도식적인 수직입면도이다.
제17도는 제13도의 융합챔버로부터 미부착된 세포를 빼내는 “이동”피펫을 나타내는 도식적인 수직입면도이다.
제18도는 제13도의 융합 챔버속에 형광 파트너 세포를 도입시키는 “이동”피펫을 나타내는 도식적인 수직입면도이다.
제19도는 제18도에서 보여지는 이동 피펫으로 도입된 세포들의 집단으로부터 파트너 세포를 골라내기 위해서 전기장을 이용하는 것을 나타내는데 도식적인 수직입면도로서 보여진다.
제20도 내지 제24도는 세포 전이 공정을 나타내는 평면도의 일련의 확대된 도식적 도해인데, 이 공정에 의해 단일의 파트너 세포가 정상 분비 세포에 부착되어 세포융합에 바람직한 배열로 하나의 융합할 세포쌍을 형성하게 된다.
제25도는 융합할 준비가 된 하나의 세포쌍의 도식적 도해이다.
제26도는 푸사겐성(fusagenic) 펄스 전기장의 부여전에, 적용된 장에 의하여 만들어진 밀착(appression) 및 신장(elongation)을 나타낸다.
제27도는 융합후 제13도의 융합 챔버의 고정 전극에 부착된 여러 개의 세포쌍의 도식적 도해이며, 융합되지 않은 파트너 세포(44)를 끌어내는 이동 피펫이 보여진다.
제28도는 하나의 융합할 세포쌍을 나타내는 도식적 도해인데, 이것은 각 필수 유형의 하나의 선택된 세포를 포함하고, 두 전극사이에서 용액중에 위치하고, 그러나 그것들중 어느 것에도 접촉하지는 않고, 두 전극을 지나는 푸사겐성 펄스 전기장의 부여전에 적용된 장에 의하여 만들어진 밀착 및 신장상태하에 있다.
제29도 내지 제31도는 여러 번의 세포분열을 겪은 배양한 융합체 세포에 적용되는 전기화학적 선택과정의 도식적 도해이다; 항체를 합성하고 발현하는 세포들은 융합전에 정상 분비세포의 전기화학적 선택에 대해서 기술한 것처럼 항원-피복된 전극과 또다른 전극을 이용함으로써 항체를 발현하지 않는 세포들로부터 분리할 수 있다.
제29도는 선택적 전극으로의 세포들의 인력(attraction)을 나타낸다.
제30도는 어떤 세포들의 화학적 부착을 허용하는 전기력에 의한 부착을 나타낸다.
제31도는 전극으로부터의 결합되지 않은 세포들의 척력(repulsion)을 나타낸다.
[발명의 상세한 설명]
[발명의 분야]
본 발명은 일정한 생-합성된 표적분자(리간드)를 발현하는 또는 지니는 하나 이상의 세포를 선택적으로 회수하는 방법; 다른 유형의 세포들을 분리하는 방법에 관한 것이며, 독립적으로 그러나 부수적으로, 두가지의 그런 개별세포들 또는 세포와 벡터를 융합시켜서 하나의 단일 “융합체 세포(fusate cell)”를 형성하는 방법에 관한 것이다. 융합방법은 특히 하이브리도마 즉, 모노클로날 항체를 생성하는 포유동물의 하이브리드 세포의 제조에 적용할 수 있고, 다른 포유동물의 세포 및 식물세포 구조체에 적용할 수 있다.
[선행기술]
하이브리도마는 항체 분비 정상세포 예컨대 B 림프구 세포를 실제 대부분 비-항체 분비인자(secretor)인 불멸세포 대개 골수종 세포주와 융합시켜서 만들어지는 이원(binary) 하이브리드 세포이다. 분비세포는 면역화된 동물에서 다양한 수단에 의해 얻어질 수 있고, 종양주는 배양물에서 생장한다. 융합의 효과 및 목적은 많은 수의 다른 불멸 하이브리드 세포들을 생성하는 것으로 그 세포들 각각은 면역화에서 사용된 항원의 한 에피토프에 특이적인 모노클로날 항체 따위의 일정한 생합성되는 표적분자를 생성하고 분비하는 성질과 그 것들에 대한 유전자를 보유한다. 가장 흔한 하이브리도마 제조방법이 두가지 유형의 세포의 직접적인 벌크 융합을 포함하지만, 불멸화된 항체 분비세포는 형질전환 바이러스 입자의 존재하에서 인간 B 세포를 융합시키는 것과 같이 보다 색다르고 위험한 방법에 의하여 생성되었다; 마우스 세포에 대해서 개발된 방법을 인간세포의 경우에 직접 적용하는 것이 대개 효과가 없었기 때문에 이러한 방법이 발달되었다. 그러한 불멸화된 세포도 또한 하이브리도마라고 불리는데, 정상세포-골수종 세포 하이브리도마와는 같지않게 이런 형질변환세포의 정확한 병인학(病因學)이 알려지지 않았기 때문에 용도는 미결이다.
현재의 하이브리도마 제조방법은 일련의 별개의 단계들을 포함한다 (세부화된 방법은 마우스에 대해 사용되는 것이다) :
ⅰ) 추구하는 항체에 대한 항원에 미리 면역화된 동물로부터의 B 림프구 세포의 추출(종종 비장정제술에 의함). 수집후에는 전체 세포 계수에서 B-림프구의 상대비율을 증가시키기 위해 어떤 농축방법이 이용될 수 있다.
ⅱ) 림프구를 골수종 세포 따위의 적당한 불멸 세포주와 혼합하고 혼합물에서 세포사이의 융합은 다음에 의하여 촉진된다:
a) 화학적 수단-예컨대 폴리에틸렌 글리콜(PEG)의 첨가
b) 푸사겐성 바이러스(fusagenic virus), 또는
c) 강력한 전기장에 짧은 노출
때로는 이것들의 조합이 사용된다.
전기장에서의 짧은 노출은 일렉트로포레이션(electroporation) 및 전기융합(electrofusion)으로 이끈다. 이러한 형상은 예컨대 미국특허 제4,441,972호 및 제4,832,814호에서 기술되었다.
ⅲ) 생존하고 융합된 세포들의 선택 및 배양. 융합과정은 골수종-골수종, 림프구-림프구 및 골수종-림프구 파트너의 단일 및 다수의 융합으로부터 생기는 융합세포들(융합체 ; Fusate)을 생성한다.
하나의 적합한 불멸 융합 파트너 세포를 선택한다면, 골수종-골수종 융합체는 특별한 성장배지, 전형적으로는 이러한 융합체가 생존할 수 없는 히포크산틴, 아미노프테린 및 티미딘(“HAT”)으로 보충된 정상배지에서 배양시킴으로써 제거될 수 있다.
정상 림프구-정상 림프구 융합체는 생존하며 고작해야 단지 한정된 수의 세포분열만을 겪는다.
골수종-림프구 융합체중 일부는 연장된 배양후에도 생존가능하게 남을 수 있다; 이것이 하이브리도마이다. 그러나 그것들이 반드시 일정한 생합성되는 표적분자를 제조하는 것은 아니라는 점에서 반드시 관심있는 하이브리도마일 수는 없다.
ⅳ) 생존하는 하이브리도마를 스크리닝하여 항체생성 특히 관심있는 원래의 항원에 특이적인 항체의 생성을 확인한다. 오래 걸리고 어려울 수 있는 이러한 과정이 요구되는 항체를 생성하는 “클로날” 융합체를 나타낸다면, 이 세포를 배양하여 생장시켜서 “모노클로날 항체”를 다량으로 제조할 수 있다.
ⅴ) 하이브리도마의 유전적 안정성이 연장된 기간동안 배양 및 재-클로닝에 의해 시험되어야 한다.
B 세포를 하이브리도마로서 불멸화하는데 이용되는 방법론은 임상적으로 또는 상업적으로 관심있는 어떤 기능(예컨대 T-세포 효과인자 기능 또는 식세포 활성)을 수행하거나, 또는 어떤 일정한 생-합성되는 표적분자(예컨대, 인간 및 마우스 인터루킨)를 분비하는 세포주로서 다른 별개의 정상 세포유형을 불멸화하는데 또한 이용되었다.
원하는 산물을 분비하는 세포를 제조하는 현재의 방법들은 결함과 한계를 가진다(여기서는 하이브리도마의 경우에 대해서 예증됨), 특히:
ⅰ) 1억개의 비장세포와 1000만개의 골수종 세포의 전형적인 PEG-매개 융합에서는, 융합세포의 수득량이 1000 이하일 것이며, 이중에서 4 또는 5개의 클로닝 세포(그러나 흔하게는 전혀없다)가 원하는 특이성을 갖는 항체를 만든다. 이것은 한번에 5-10 융합조작을 행하는 습관을 만들어서 적합한 하이브리도마를 발견하려면 어렵게 연속 처리하게 만든다. 세포를 매우 짧은 시간동안 강력한 전기장에 노출시킴으로써 융합 가능성을 개선할 수 있다; 이 방법은 “일렉트로포레이션”으로 알려져 있다. 예컨대 본 명세서 말단에 있는 참고문헌 5를 참조. 그러나 현탁액중의 세포에 대한 융합 가능성은 예컨대 1.5 x 10-5으로 낮았다. 미국특허 제4,832,814호 참조.
전기장 노출전에 현탁액에서 원하는 유형의 세포쌍 (즉, 골수종과 B 세포)의 결합 및 접근케 하는 화학약재를 사용함으로써 더 높은 성공률이 얻어졌다. 이 방법은 광범위하게 이용되지 못했는데, 그것은 아마도 그것의 복잡성, 오염되기 쉬움 또는 낮은 효율 때문일 것이다. 이것은 세포 표면상에서 낮은 비율로 나타나는 분자가 면역화 및 융합에서 관심있는 항원인 경우에 특히 명확하다.
ⅱ) 세포사이의 융합과정이 무차별적이다. 융합에 대한 세포의 선택의 결핍은 두 단계의 세포 내역에서 일어난다:
a) 비-하이브리드 융합
이 과정의 무차별성은 하기의 것들을 생성한다:
림프구-림프구 융합체
골수종-골수종 융합체
림프구-골수종 융합체: 이것이 유일한 하이브리드 융합체이고 유일하게 가치있는 융합체이다.
b) 비-선택적 하이브리드 융합
생성되는 림프구-골수종 융합체는 무차별적으로 생성된다.
관심있는 항체를 생성하는 림프구만의 골수종 세포와 융합되도록 하는 선택기작이 없다. 그러한 하이브리도마는 수주일후 이종의 세포 융합 혼합물의 성장후에 분리되어야만 한다.
iii) 현재의 방법은 5가지의 분리된 융합후 선택방법을 필요로 하는데, 이것은 오염 또는 선택방법의 실패로 인한 하이브리도마의 유실의 위험을 수반한다: HAT 선택(7일동안의 공급 배양을 포함한다), 항체 분비인자의 분리, 클로닝, 특이적인 항체에 대한 검사 및 최종 클로닝. HAT 선택은 골수종 세포주가 HAT-민감성이면 효과적이고 이것은 현재의 방법들에서 융합 파트너 세포의 선택을 크게 제한한다. 이것은 전통적인 방법들에 의한 인간 하이브리도마의 개발에 있어 주요한 장애인 것으로 판명되었다. 이전에 언급한 전기융합 방법은 실제로 3가지 현상을 포함한다. 이것중 첫번째는 세포가 비-균일 고주파 전기장에 노출되었을 때 세포들의 운동을 기술하는 디일렉트로포레시스(dielectrophoresis) 현상이다. 이 현상은 Poh ℓ의 모노그래프에서 상세히 기술되었다(참고문헌 1). 비균일 전기장은 비균일장을 만들기 위해 예컨대 원통형 와이어의 형태를 취한 전극에 고주파 시그날을 적용시킴으로써 대개 생성되며 Poh ℓ의 연구(참고문헌 1 및 미국특허 제4,441,972호)는 세포가 전기장이 전선전극에 대해 가장 강력한 부위를 향하여 즉 그러한 전극의 표면을 향하여 끌어당겨지는 것을 나타냈다. Poh ℓ은 또한 세포의 디일렉트로포레시스는 낮은 전기 전도성의 용액중에 세포를 현탁시킴으로써 강하게 촉진된다는 것을 나타냈다. 고주파 전류가 다수(수백만)의 세포 현탁액을 포함하는 용액을 통과할 때, 각 세포주위의 공간은 전기장이 비균일이고 세포표면에 접근함에 따라 증가하는 부위가 된다. Poh ℓ(참고문헌 1) 및 Zimmermann(참고문헌 5)이 나타낸 것처럼, 이것은 세포들이 펄 체인(pearl chain)으로서 대개 나타내는 선형사슬로 그것들 스스로 정렬하게 만든다. 전기융합에 포함된 두번째 현상은 세포막의 전기적 분해현상이다. 이 과정은 크지만 매우 짧은 전류의 펄스가 세포의 현탁액을 지날 때(Sale 및 Hamilton (참고문헌 6), Zimmermann 등(미국특허 제4,081,340호)) 또는 단일세포에서 (Coster 및 Zimmermann(참고문헌 2, 3 및 4)) 일어난다. 그러한 세포막의 전기적 분해는 또한 투과성을 증가시키는데 이것은 세포막의 “일렉트로포레이션”으로 나타내며, sale 및 Hamilton(참고문헌 6), Sepersu 등(참고문헌 7), Zimmermann 등(미국특허 제4,081,340호)에서 기술되었다. 세번째 현상은 세포가 먼저 불균질적인 전기장에서 선형사슬로 정렬되고 그 다음에 전기적 분해를 겪게 될 때 일어날 수 있는 세포 융합에 관한 것으로, Neumann 등 (참고문헌 8), Zimmermann 등(참고문헌 9), Poh ℓ(미국특허 제4,476,004호), Root (미국특허 제4,832,814호), Hoffman(미국특허 제4,561,961호), Marshall(미국특허 제4,906,576호)에서 기술되었다. 디일렉트로포레시스에 의해 “펄 체인”으로 정렬된 세포는 세포의 현탁액으로부터 임의의 방법으로 끌어당겨지고 사슬의 집합 전체에 걸쳐서 대개 예상할 수 없는 방식으로 많은 “펄 체인”에서 인접한 세포들 사이에서 다수의 융합이 일어난다. 본 발명의 장치 및 방법은 특별한 특성을 갖는 하나의 세포(또는 벡터)(예컨대 분비 B 림프구) 및 다른 특성을 갖는 다른 세포(또는 벡터)(예컨대 골수종세포)를 선택적으로 조작하고, 이 두 세포를 단일의 세포쌍으로, 모으고, 이러한 단일의 세포쌍(다른 것은 없음)을 융합하는 방법을 제공함으로써 전기융합의 선행기술을 개선하였다.
[발명의 개시]
본 발명은 첫번째 면에서는 일정한 리간드를 발현하거나 제공하는 세포, 벡터, 입자 또는 분자를 선택적 회수하는 방법에 있는데, 이것은 일정한 리간드에 상보적인 리간드 또는 리간드들을 표적의 표면에 부착시키는 단계, 세포, 벡터, 입자 또는 분자중 일부가 일정 리간드를 발현하거나 제공하는 전기적 전도성 액체중의 세포, 벡터, 입자 또는 분자의 용액 또는 현탁액 속에 표적을 도입하는 단계, 적당한 주파수, 강도 및 불균등성의 교류전기장(alternating electric field)을 현탁액 또는 용액에서 한쌍의 전극사이에서 확립시킴으로써 일정 리간드를 발현하거나 제공하는 세포, 벡터, 입자 또는 분자중 적어도 일부를 표적과 접촉하도록 이동시키고 상보적인 리간드 또는 리간드들과 결합시키는 세포, 벡터, 입자 또는 다른 세포, 벡터, 입자 또는 분자중 적어도 일부로부터의 표적에 결합한 세포, 벡터, 입자 또는 분자를 분리시키는 단계들로 이루어진다. 이 방법을 하기에서는 “전기화학적 선택”으로 명명한다.
디일렉트로포레시스의 현상을 이용하여 낮은 전도성 매체를 통해서 세포, 벡터, 입자 또는 분자를 이동시키고, 그것들이 그것의 경로, 예컨대 때때로 표적위의 상보적 리간드에 부착할 기회를 가지는 오픈 메시(mesh)중에 위치한 표적에 접촉되고, 그리하여 그것에 결합되거나 그렇지 않으면 표적을 지나 통과되고 또는 추가로 표적을 통과하게 되도록 할 수 있다.
본 발명의 바람직한 구체예에서는 표적은 사실상 상보적인 리간드 또는 리간드들로 적당히 피복된 전극중 하나이다. 전기장의 주파수, 강도 및 불균등성의 어떤 범위 이상에서는 세포가 전극으로부터 밀려날 수 있고 이 효과는 세포 유형에 좌우되기 때문에, 표적상에 세포 혼합물의 부분집합을 선택적으로 유지시키고 다른 세포들의 집합을 표적으로부터 밀려나게 하는 것이 가능하다.
첫번째 전극위로 세포를 먼저 끌어당기는 과정은 어떤 경우에는 정상(steady) 전기장의 적용에 의하여 도움을 받을 수 있고, 세포를 부착시키는데 사용되는 교류(AC) 전기장은 원하는 세포들이 피복된 전극으로 끌어당겨지는 그러한 주파수이어야 하고, 세포에 대한 힘이 연속적으로 그러나 단조롭지 않게 주파수와 함께 변화하고 세포유형에 좌우되기 때문에 선택적으로 세포들이 특별한 전극을 향하여 흘러가게 하는 것이 가능하다. 본 발명은 융합과정을 촉진하기 위해서 부착된 세포들을 회전 또는 변형에 의하여 조작할 수 있는 가능성을 포함한다.
두번째 면에서 본 발명은 전기적 전도성 액체중에서 적어도 두가지 다른 유형의 요소의 세포, 벡터, 입자 또는 분자의 현탁액 또는 용액에서 세포, 벡터, 입자 또는 분자를 분리하는 방법에 있는데, 이것은 액중의 두 전극사이에서 일정한 주파수, 강도 및 불균등성의 교류 전기장을 확립시켜서 선택적으로 한 유형의 세포, 벡터, 입자 또는 분자를 전극을 향하여 액체를 통과이동시키고 동시에 또는 순차적으로 또다른 유형의 세포, 벡터, 입자 또는 분자를 전극으로부터 떨어지도록 액체를 통과이동시키는 단계, 전극을 향하여 이동한 세포, 벡터, 입자 또는 분자를 전극으로부터 떨어지도록 이동한 것들로부터 분리하는 단계로 이루어진다.
본 발명의 이러한 면에서 교류는 한 유형의 세포들의 일부 또는 전부가 전극중 적어도 하나와 접촉하고 남아있는 세포들은 전극들로부터 제거될 때까지 유지될 것이다.
세번째 면에서 본 발명은 선택된 제1세포를 선택된 제2세포 또는 벡터와 융합시켜서 단일의 융합체 세포를 형성하는 방법에 있는데, 이것은 선택된 제1세포를 분리하고, 선택된 제1세포를 제2세포 또는 벡터와 병치상태로 가져가고, 병치상태의 세포들 또는 세포와 벡터를 적당한 주파수, 강도 및 불균등성의 교류전기장에 의하여 유지하고, 세포들 또는 세포와 벡터가 융합되게 하는 단계들로 이루어진다.
융합되는 세포는 원핵 또는 진핵세포일 수 있다. 본 발명의 바람직한 구체예에서는 그것들이 포유류 세포이고 보다 중요하게는 그것들중 적어도 하나가 인간세포일 수 있다. 본 발명에 따른 방법은 또한 플라스미드 따위의 벡터, 또는 유용한 DNA나 RNA를 포함하는 인공적인 구조체, 리포솜 소낭 또는 변형 원핵체 또는 진핵체를 세포 속에 도입하는데 이용할 수 있다. 여기서 사용되는 용어 “벡터”는 천연적으로 존재하거나 제조된, 세포막을 통한 DNA나 RNA의 이동을 가능하게 하는 DNA 혹은 RNA의 어떤 운반체를 의미하는 것으로 사용된다.
본 발명의 세번째 면에 따른 방법은 특히 원하는 분자 종(species)을 암호화하는 유전자를 발현하는 세포와 불멸세포의 융합에 적용가능하다. 원하는 분자종은 항체일 수 있지만, 그것은 또한 효소, 성장인자, 괴사인자 또는 어떤 다른 생-합성되는 리간드 또는 생체-분자 일 수 있다. 본 발명은 또한 다른 용도를 가질 수 있다. 두 배(emoryonic) 세포를 융합시켜서 배수체(polyploid) 융합체를 생성할 수 있고, 또한 정상이거나 그렇지 않은 두 반수체(haploid) 세포를 사용하여 새로운 이배체 융합체를 생성할 수 있다.
다른 구체예들에서 첫번째 면에 다른 방법은 많은 조직 배양 응용물에서 단지 한 세포를 포함하는 적은수의 세포들의 선택 및 조작을 요구하는 방법들에 특히 유용하다. 그것은 또한 적당한 전극 기하도형적 배열(geometries)로 및/또는 세포혼합물의 동종 하위군으로의 분리기(separator)로서 그자체 전극이 아닌 선택적 표적을 사용함으로써, 그러한 구체예들에서 이용할 수 있다.
바람직한 구체예에서 본 발명은 선행기술과 연관된 문제점들 각각을 극복한다. 본 발명의 방법은 살아있는 세포와 세포 같은 벡터의 선택, 병렬 및 융합을 가능하게 한다. 본 발명의 바람직한 구체예에 따른 방법은 다음을 제공한다:
ⅰ) 항원 특이적인 모노클로날 항체분자를 분비하는, 또는 (항체 분비인자가 아닌 다른 세포 하이브리드 유형에 대한) 선택과정에서 이용되는 (생체) 화학물질에 특이적인 생합성되는 분자를 분비하는 그런 세포들의 융합을 위한 또는 다른 목적 예컨대 특정 세포 농축을 위한 선택.
ⅱ) 특정 항원-또는 다른 표적분자에 결합하는 세포와 선택된 융합 파트너(골수종 세포 또는 다른 불멸세포)의 90% 이상 효율적이고, 각 세포 쌍 간에, 특이적인 이원 융합.
ⅲ) 가능한 분비 또는 합성능력을 갖는 불멸의 이원 하이브리드를 생성하기 위하여 HAT 같은 영양소 감수성에 대한 어떤 요구없이 정상의 생성 및/또는 분비세포에 대한 융합 파트너로서 어떤 원하는 세포주로부터 한 세포를 이용할 기회.
ⅳ) 선택단계로서 본 발명의 첫번째 면을 이용하여 현재의 융합후 배양과정을 대체함으로써 달성되는, 특정 생체산물의 안정한 분비인자의 융합후 선택. 선행기술 제조방법에서 단계들중 일부가 제거된다.
이 신규한 방법은 모노클로날 항체 및 다른 분비성 세포산물의 응용에서 새롭고 독특한 기회를 제공하는 많은 파생결과를 갖는다. 이 신규한 방법은 또한 인간의 모노클로날 항체 및 인간기원의 다른 분비성 세포산물의 생성을 가능하게 한다.
[발명을 수행하는 최선의 방식]
본 발명을 하기의 과정에 의하여 기술한다.
[1. 분비세포의 세포 선택 방법]
융합에 사용하기 위한 세포 선택 방법의 바람직한 구체예는 둘 또는 그 이상의 전극 사이에서 발달된 다양한 파형, 강도 및 주파수의 직류 및 교류전기장에 의해 발생되는 힘을 이용하는데, 전극들중 하나 또는 그이상은 중성의 화학물질로 피복되거나 아무것도 없이 드러낸 것일 수 있고, 그것들중 다른 것은 표적세포에 부착할 수 있는 항원 또는 다른 표적분자(리간드)로 피복되어, 융합과정에 사용되도록 하나이상의 그런 세포들의 부착을 확실하게 한다. 전기력의 강도와 방향은 주파수에 좌우되기 때문에, 이러한 전기장의 주파수와 그래디언트(gradient)경사도를 조정하여 원하는 세포의 최적 선택을 달성할 수 있다. 다양한 세포와 벡터유형에 대해서 주파수와 힘의 세부변이는 세부막과 내부구조 및 그것의 조직에 좌우된다. 이 구체예는 또한 전기력과 전기기계적 매니퓰레이터(manipulator)를 이용하여 부착된 세포를 융합부위로 전이시키고 거기서 파트너와 함께 그것들을 융합 준비 상태로 배열시킨다.
제1도에서 보여지는 것처럼 막(11)에 의해 둘러싸인 세포(10)는 수성매체(12)중에 현탁된다. 세포의 내부는 비교적 높은 전도성과 유전율을 가지며 세포막(11)은 반대의 특성을 가진다. 수용액은 낮은 전도성을 갖는다. 제2도는 교류전기장의 주파수가 세포(10)에 적용될 때 세포에 대한 디일렉트로포레시스 힘(dielectrophoretic force)이 변화하는 방식을 나타내며, 힘은 전기장 강도의 제곱의 기울기(∇ E2) 및 도면에서 보여지는 함수 f(α)의 적(積)에 직접 비례한다 실제 살아있는 세포에서 불균질적인 장에서 힘의 세부 변이는 그것의 세부 막과 내부구조 및 조직에 의해 변경된다. 이것은 세포유형마다 다르다. 이 곡선은 하기의 변수들에 대한 AC 전기장 주파수의 함수로서 상대 디일렉트로포레시스 힘을 나타낸다.
막의 유전율(permittivity)(εm) = 10ε0
세포질의 유전율(εc) = 60ε0
외부배지의 유전율(εs) = 80ε0
세포질의 전도율(conductivity)(σc) = 1.0 S.m-1
외부배지의 전도율(σ0) = 0.001 S.m-1
세포막의 두께(δ) = 10㎚
세포의 반경(R) = 10㎛
여기서 ε0는 자유공간의 유전율 = 8.85 x 1012F.m-1이고, 디일렉트로포레시스 힘은 F = 2πεsR3(∇ E2) f(α)에 의해 주어지고, 여기서 (∇ E2)은 전기장 강도의 제곱의 기울기, f(α)는 도면에서 보여지는 함수이다.
한쌍의 전극 사이의 전기장은 그 전극들에 교류전류(AC) 시그날의 적용에 의해 확립될 수 있다. 전극의 표면에서의 장, 또는 그것들 사이의 어떤 지점에서의 장은 전극의 기하학적 구조(예컨대 직경) 및 그것의 위치(예컨대 분리)로부터 계산될 수 있다. 또한, 용액을 가로질러 나타날 적용된 AC 시그날 부분 및 전극-용액 경계면에서 형성되는 전기적 이중층을 가로질러 나타나는 부분을 결정하는 것이 필요하다. 용액자체를 가로질러 나타나는 전체적용 전위의 부분은 AC 전위의 주파수, 용액의 이온조성 및 전극의 특성에 좌우된다. 주파수에 따른 변이는 전극-용액 시스템의 “임피던스 분산”(impedance dispersion)으로 알려진 과정에 기인한다. 단지 용액을 가로질러 나타나는 전기장의 부분만의 용액에서 세포나 벡터의 디일렉트로포레시스 운동에 이바지한다는 것을 주목해야 한다. 그러나 이중층을 가로질러 나타나는 전위의 부분은 전극-용액 경계면에서의 분자결합과정에 이바지한다.
선택방법의 다른 구체예는 전극들의 일부 또는 전부에서 이용되는 어떤 피복물도 필요로 하지 않는데, 그것은 이전의 통상적인 선택방법, 예컨대 형광 활성화 세포 선별(FACS)은 적절한 전극에 도입된 다음 부착된 세포 또는 벡터의 전부 또는 대부분이 원하는 생합성되는 표적분자를 생성하도록 이용될 수 있기 때문이다. 이것은 특히 표적세포가 생합성 일정 리간드를 합성하지만 표면에 나타내지는 않는 경우에 적용되는데, 이것은 B-세포족에서 마지막으로 분화된 항체 생성 세포인 플라즈마 세포에서 일어날 수 있다.
예컨대 성공적인 융합후 일정기간 뒤에 배양시에 성장하는 원하는 하이브리드 세포의 선택에 이용하기 위한 세포 선택방법의 바람직한 구체예는 선택 사이클의 다른 단계들에서 전기화학적 선택방법을 이용한다; 이것은 본 명세서의 실시예에서 예시되며, 제29도, 제30도, 제31도에서 도식적으로 보여진다. [(a) 세포 선택]
일정 리간드에 상보적인 리간드가 적어도 하나의 전극상에 제공되는 것이 전기화학적 선택과정에서 바람직하지만, 리간드 포함 표적과 접촉상태로 세포가 이동하는 것이 교류전기장에 의하여 유도될 수 있다면 상보적인 리간드 분자가 그위에 부착되는 평면의 다공성 중합체와 같이 다른 표적위에 리간드를 제공하는 것도 또한 가능하다. 그러한 비-전극 표적은 큰 체적 및/또는 큰 수의 미분화된 세포들로부터 일정 리간드를 발현하는 세포를 미리 농축시키는데 유용할 수 있다.
원하는 항체를 발현하는 세포들이 온건한 삼투성(tonicity)과 성질의 수용액 또는 비-수용액 중에서 전극에 선택적으로 부착된다. 전극은 대개는 원통형의 와이어 전극이지만 반드시 그렇지는 않다.
대개는 세포 현탁액을 낮은 전도성을 갖는 수성배지, 예컨대 소르비톨 또는 글루코스 또는 다른 당의 등장 용액중에서 사용하는 것이 효과가 있다. 두가지 주요 특징의 이유는 하기와 같다: 수성인 것은 적절히 이용될 때 세포 생존성을 양호하게 유지하기 때문이고 낮은 전도성은 교류가 배지를 통과할 때 세포가 겪는 전기력을 최대화하기 때문이다.
이 공정들은 매우 적은 수의 세포와 매우 적은 체적의 용액을 요구하며 광학현미경 단계에서 완전히 수행될 수 있다; 전체 공정이 현미경하에서 관찰될 수 있다.
[ⅰ) 세포-선택적인 전극의 제조]
전극은 분비세포가 그것에 대한 항체를 생성하는 항원으로 피복되거나, 또는 세포가 그것에 대해 관심있는 일정 생합성 표적분자를 만드는 다른 리간드 즉 일정 리간드로 피복된다.
여기서 말하는 ‘항원’은 사실상 그 자체가 관심있는 항원을 발현한다고 알려졌지만, 그것에 대한 항원분자가 분리되지 않은 또는 정제된 형태로 쉽게 혹은 전혀 얻어질 수 없는 세포 전체일 수도 있다. ‘항원’이 관심있는 항원을 발현하는 전체 세포이면, 전극이 먼저 그런 세포들로 피복된다. 후자는 다음 섹션에서 기술되는 몇가지 방법으로 이루어질 수 있다.
항원으로 전극을 피복하는 것은 제3도에서 보여지는 것처럼 적당한 농도의 항원을 포함하는 용액중에 전극을 침지시킴으로써 수행된다. 피복공정은 가능하게는 변화되는 극성의 그리고 가능하게는 변화된 시간 간격의 교류전기장 및/또는 정상 전기장의 적용에 의하여 촉진될 수 있다. 예컨대 피복 사이클의 어떤 단계에서 펄스화될 수 있다. 따라서 최적 주파수, 장 세기, 및 장 글레디언트의 AC 전기장 및 정상 DC 전기장의 조합을 사용함으로써, 정상 장의 극성을 변화시킴으로써 전극상에 다른, 바람직한 방향들로 항원 또는 다른 리간드를 부착시키는 것이 가능하다.
[ⅱ) 항원 발현 세포를 병합(incorporating)하는 선택적 전극]
‘항원’이 그 자체가 순수한 형태로 또는 그것의 천연구조로 얻어질 수 없으면 [예컨대 단백질이 정제과정에 의해 변성될 때], 그것이 세포 표면상에 항원분자를 발현하는 세포상에 나타날 때를 제외하고는, 전극을 세포 현탁액중에 침지시키고 전극과 멀리 떨어질 중성의 전극사이에 적당한 주파수(대개 고주파)의 교류전기장을 적용시켜서 선택적 전극을 이러한 세포들로 피복시킬 수 있다. 그다음 세포들을 전기적 선택 즉 전극까지 하나 이상의 세포들을 끌어당기는데 디일렉트로포레시스 힘을 이용하여 전극에 부착시킬 수 있다. 또한 표적세포를 선택적으로 부착시키는 공정을 어떤 경우에는 정상 전기장의 적용에 의해 도움을 받을 수 있다. 일단 ‘항원’ 세포가 전극표면을 피복하면 그것들을 짧은 (마이크로초) 전기적 펄스의 적용에 의해 더 영구히 부착될 수 있다. 그런 펄스는 정확한 강도와 지속 시간이면 세포 표면 위의 분자들이 전극에 부착되게 할 것이다. 가장 적합한 펄스 강도 및 지속 시간의 선택은 세포 종에 좌우된다. 그렇게 부착되면 이 세포들은 교류 전기장 또는 정상 전가장이 제거될 때 조차도 전극 위에 남아있게 될 것이다. 그러나 세포가 그렇게 단단히 부착되는 것은 원리적으로 이 방법에 대한 필수적인 필요조건은 아니다.
[ⅲ) 다른 종에서 추출된 항체를 병합하는 선택적 전극]
어떤 경우에는 상기의 섹션(ⅱ)에서 기술한 것처럼 전극을 피복시키는데 항원발현세포를 이용하는 것이 바람직할 수도 있지만, 단지 그러한 특별한 세포들만으로 구성되는 현탁액은 용이하게 생성될 수 없다. 많은 그런 항원들에 대해서, 다른 동물종의 하이브리도마로부터 추출된 모노클로날항체, 또는 그 항원에 대한 폴리클로날 항체, 또는 어느 유형의 항체의 분자단편이 이미 이용가능할 수 있다. 이 경우에는 전극이 먼저 관심있는 세포에 의해 발현된 항원에 대한 (그런 세포와 다른 세포의 혼합물만이 이용가능함에도 불구하고) 그 종이 항체, 또는 그것의 분자 단편으로 피복되어야 한다. 이러한 전극의 항체로의 피복은 상기의 섹션 (ⅰ)에서 이전에 기술된 대로 수행된다. 그 다음에 항체 피복된 전극을 이용하여 관심있는 항원을 발현하는 세포들을 선택하고, 전극 그 자체를 그런 세포들로 피복시킨다. 이 과정은 다음 섹션에서 기술되며 여기서는 전극을 항원을 발현하는 세포들로 피복시키는 것을 말한다. 그런데 다음 섹션은 그런 “선택적” 전극이 그 항원에 대한 항체를 분비하는 세포들로 추가로 피복될 수 있는 방법을 기술한다.
[ⅳ) 전극 또는 다른 표적의 예비(pre)-피복]
어떤 경우에는 전극 또는 다른 표적을 단량체 또는 중합체 물질의 얇은 피복으로 먼저 피복시키는 것이 필요할 수 있는데, 이러한 물질에는 폴리아미드 단백질 A, 아비딘 또는 강하게 그러나 반드시 선택적이지 않게 흡수하는 표면을 제공하는 다른 물질 등이 있다. 전극 또는 다른 표적 자체는 전도성 유기물질, 예컨대 요오드 도프처리한 폴리아세틸렌, 또는 폴리피롤 등으로부터 제조될 수 있다.
[b) 전극의 정상 분비 세포로의 피복]
선택적 전극의 피복후에 남아있는 결합되지 않은 세포성 또는 분자성 시약 (분자, 세포, 벡터 또는 다른 시약들)은 어떤 적당한 수단에 의해, 통상 새로운 용액으로의 플러싱(flushing)에 의해 챔버로부터 제거된다. 이전에 선택적 전극에 적용된 분자성 또는 세포성 피복물은 그 전극 위에 고정되어 남아있어서 관심있는 세포들의 부착을 확실하게 할 준비가 되어 있다.
그 다음엔 관심있는 분비세포를 포함하는, 그러나 반드시 유일하게 이 세포들로 구성되지 는 않은 세포 현탁액을 전극 챔버속에 도입시킨다. 이 세포 혼합물은 관심있는 생합성 분자의 생산자인 정상세포를 포함하는데, 이것은 그 세포주의 불멸파트너 세포와 또는 적당한 벡터와 융합되게 된다. 전형적으로는 그것들은 말초의 혈액 또는 다른 적당하고 이용가능한 기관(편도선, 비장 등)에서 새로 추출된 림프세포들이며, 종종 선택적 표적 및 디일렉트로포레시스를 이용하여 및/또는 혈액학의 표준 세포 준비방법을 이용함으로써 또는 세포선별, 통상적으로 형광 활성화 세포선별(Fluorescence Activated Cell Sorting)에 의하여 부분적으로 농축될 것이다. 일부 응용에서는 그것들은 처리 또는 미처리, 정상 또는 그렇지 않은 배양세포일 수 있다.
상기에서 지적한 바와 같이, 전기화학적 선택에 의하면 화학적으로 선택적인 전극위에 세포 혼합물의 부분집합을 선택적으로 끌어당겨서 부착시킨다음 유지하는 것이 가능한데, 이것은 제29도, 제30도, 제31도에 나타냈다. 먼저 첫번째 전극위로 세포를 끌어당기는 과정은 어떤 경우에는 정상 전기장의 적용에 의하여 도움을 받을 수 있고, 세포들을 모으는데 사용된 AC 전기장은 원하는 세포가 피복된 전극으로 이끌리고 그것을 향해 흘러가게 될 그런 주파수일 필요가 있다. 이 전기장은 또한 서로서로 밀접하게 근접한 세포를 융합으로 이끌지 않고 세포들의 전기적 분해로 이끌지 않도록 충분히 낮은 강도이어야 한다. 그것은 화학적으로 선택적인 전극 위에 현탁 세포들을 약하게 힘을 주어 세포 표면상의 단백질 분자들의 변성을 일으키지 않고 국부적인 특정 화학적 결합(따라서 선택)이 일어나게 해야 하며, 그렇지 않으면 세포들을 비-특이적인 방법으로 전극에 결합되게 할 수 있다. 척력 방식의 전기적 선택의 적합한 사용후에는, 피복된 전극 위의 피복물에 상보적인, 따라서 전극에 충분히 강하게 결합되는 정확한 항체를 분비하는 세포들만이 부착된 채로 남게될 것이다.
적용되는 전기장의 적절한 변화는 항체-항원 결합과정에 반대되는 전기력을 적용시킴으로써 높은 친화성 항체를 발현하는 세포들만을 선택적으로 유지시키도록 한다; 이 반대의 전기력의 강도는 정상 전기장의 강도 및 방향을 조정함으로써 및/또는 AC 전기장의 주파수와 강도를 변화시킴으로써 조정될 수 있다.
다른 구체예에서는 선택적 전극이 다공성이고 전기적으로 전도성인 물질로 구성되고, 전극의 한쪽에 흡입을 시도함으로써 세포들을 전극으로 끌어당긴다. 그다음 원하지 않는 세포의 제거는 백-플러싱에 의해 또는 상기에서 언급한 방법들에 의하여 이루어질 수 있다.
[2. 불멸 세포 융합 파트너의 선택]
현탁액중에 남아있는 분비세포들은 수용액으로 약하게 플러싱시켜서, 또는 상기에서 기술한 다른 방법들에 의하여 제거된다.
하이브리도마 생성의 경우에는, 불멸(예컨대 골수종) 세포가 동일한 챔버속에 또는 인접한 챔버속에 도입되는데, 어떤 구체예에서 인접한 챔버는 세포가 현탁된 수용액으로 채워진 채널을 통해서 첫번째 챔버와 통해 있을 수 있다. 그것들은 또다른 피복되지 않거나 (비-선택적인) 피복된 화학적으로 선택적인 전극에 부착되도록 만들어질 수 있는데, 이 전극은 이 전극과 챔버의 다른 전극사이에 적용된 교류 전기장 및/또는 정상 전기장의 적용에 의하여 이 파트너 세포에 특이하게 결합한다. 적당한 전극 기하구조의 선택에 의하여, 적용된 전기장의 강도, 파형 및 장 세기의 적절한 조절에 의하여, 그리고 챔버속으로 도입된 불멸 세포의 수를 조절함에 의하여 이 전극에 부착되는 세포수를 원하는 수(단일세포를 포함)로 제한하는 것이 가능하다(제7도 참조).
불멸세포가 부착되는 전극은 세포가 상기에서 기술한 대로 부착되기전에 항원 또는 불멸 파트너 세포에 특이적인 다른 리간드 결합분자를 포함하는 중합체, 단백질 또는 기타물질로 먼저 피복될 수 있지만 반드시 그렇지는 않다. 이것은 항원이 장전된 선택적 전극위의 정상세포가 또한 피복된 전극에 부착되기 때문에 그런 예비-피복물이 더 대칭적인 전기장 분포를 제공할 수 있어서 어떤 경우에는 유용하다. 그러나 불멸세포에 대해 이용되는 전극을 예비-피복시키는 것이 항상 필수적인 것으로는 밝혀지지 않았다. 어떤 경우에는 두 전극에서 전기장 강도 글레디언트의 비대칭성을 신중히 만들어내는 것이 유용할 수 있다. 이것은 어떤 구체예에서는 전극을 유전체 물질층으로 피복시킴으로써 및/또는 다른 곡률이나 다른 기하학적 차이를 갖는 전극을 사용함으로써 이루어질 수 있다. 이 특징은 특히 하기에서 기술되는 세포 전이(thansfer)과정에서 유용할 수 있다.
[3. 최적 푸사겐성(fusagenic) 상태를 위한 선택된 세포쌍의 밀착(appression)]
원하는 하이브리드 세포를 생성하는데 있어서 결정적인 단계는 두개의 선택된 융합할 세포를 단일 세포쌍으로 모으는 것이다. 이것은 세가지 바람직한 방법중 하나로 이루어질 수 있다. 첫번째에는, 파트너 세포를 포함하는 전극이 마이크로매니퓰레이터 속에 보유되고, 이것은 전기장에 의해 유지되는 세포 또는 세포들을 세포 선택적 전극에 부착된 분비세포와 접촉상태로 가져갈 수 있도록 하여 선택된 분비세포를 선택된 불멸 파트너 세포와 직접적으로 쌍 접촉(병치)상태로 가져가게 한다(제8도 참조).
융합할 세포쌍을 모으는 두번째 방법에서는, (제20도 내지 제24도 참조) 파트너 세포가 마이크로매니퓰레이터 속에 또한 보유되는 전이전극(transfer electrode)에 의해 이동되고, 기계적 조작 및 전기장의 강도 및/또는 주파수의 변화(일시적인 또는 그렇지 않은)의 조합에 의하여, 이 전극으로부터 분비세포(그 자체가 선택적 전극에 부착됨) 위로 전이되는데, 이것은 이 전극위의 세포, 또는 이 전극위의 다른 세포에 비-선택적으로 부착된 세포가 그 자체가 떨어지고 선택적 전극에서 유지되는 분비세포까지 그리고 분비세포위로 전기장의 영향하에서 이동하게 한다. 이 두번째 방법을 여기서는 “세포 전이 공정”으로서 나타낸다. 세포 전이공정에서는 분비 및 융합 파트너 세포의 역할을 반대로 하는 것이 가능하다.
융합할 세포쌍을 모으는 세번째 방법에서는, 각 필수유형이 미리 선택된 세포들이 융합 챔버속으로 단일하게 그리고 별도로 도입되는데, 반드시 이러한 도입에서 전극을 사용하는 것은 아니다.
그리고 나서, 예컨대 하기의 실시예 4의 방법에서와 같이, 전기장의 제곱의 기울기에 좌우되는 힘의 적용에 의하여 세포쌍을 병치상태로 가져간다. 그 다음엔 이 세포쌍이 완전히 또는 부분적으로 고정화되어 어느쪽 전극에도 부착되지 않고 융합이 되도록 하는 것이 실용적이다.
다양한 구체예가 세포쌍을 병치시키고 적당한 융합을 달성하는데 실행가능하지만, 제26도에서 기술한 대로 압축하에 그리고 신장하에 세포를 동시에 유지하도록 적당한 강도, 주파수, 파형, 글레디언트 및 지속시간의 AC 전기장을 이용하는 것이 필요하며, 다음 섹션에서 기술한 방법으로 양호한 융합을 이루기 위해서는 반드시 그렇지는 않지만 그 접촉을 융합시까지 그리고 융합시를 포함하여 유지하는 것이 필요하다.
[4. 선택된 세포쌍의 융합]
일단 선택된 분비세포의 그것의 불멸 융합 파트너가 단단한 접촉상태에 있게 되면, 짧은 (마이크로초 내지 밀리초) 펄스화된 전기장의 적용에 의해 세포가 융합될 수 있는데(전기적 융합), 전기적 펄스는 각각 분비세포 및 불멸세포를 포함하는 전극 사이에서 적용된다(제8도). 다른 구체예에서는, 펄스(들)가 세포 전이 공정(제20도 내지 제24도)을 이용하여 부착된 파트너 세포가 전이되어 선택된 정상세포위에 놓여진 전극과 또다른 멀리 떨어진 “융합” 전극사이에 적용될 수 있는데, 이 전극들중 어느 하나 또는 둘다 융합할 세포쌍과 접촉되거나 (제25도 및 제26도) 또는 접촉되지 않는다(제28도). 한편 푸사겐성 화학물질(예컨대 PEG) 또는 바이러스 매개물(예컨대 엡스타인-바르 바이러스)이 예컨대 마이크로피펫을 통해서 챔버속으로 국부적으로 도입될 수 있고(화학적 융합을 달성), 또는 전기장과 푸사겐성 작용제의 조합(전기화학적 융합)을 이용할 수 있다. 융합펄스 또는 펄스들이 부여된 후에는, AC 전기장을 융합이전의 값에서 유지하거나 유지하지 않을 수 있지만, 장의 일부 유지가 때로는 융합을 촉진시키는데 유용하다는 것이 발견되었다. 단단한 밀착의 단순유지는 어떤 경우에는 일시적인 장 펄스의 적용없이도 세포융합에 필요한 세포막의 전기적 분해를 일으키는데 그 자체로서도 충분할 수 있으며, 이것은 다른 구체예로서 취급된다. 필요한 전기적 펄스의 최적 지속시간 및 강도는 두 세포종(세포크기를 포함), 수용액의 이온세기 및 조성, 용액의 삼투도, 온도 및 기타 생리적 변수들에 좌우된다. 그러나 결과적인 융합체 하이브리드 세포의 이후의 용해없이 세포쌍에 대해 90% 이상의 융합 확률을 용이하게 달성하는 것이 가능하다.
[5. 융합체의 조작]
기술한 융합들로부터 융합체 세포(들)를 제거하는 몇가지의 표준방법이 있다. 세포는 마이크로피펫을 이용하여 및/또는 이동가능 전극(마이크로매니택레이터에 부착)을 조작함으로써 제거될 수 있다. 후자의 경우에는 이 전극과 용액중의 멀리떨어진 중성의 전극사이에 약한 교류전기장을 적용함으로써 융합체 세포가 전극위에서 유지될 수 있다 (제9도). 그다음 이 융합체 세포는 융합 챔버 속에 만들어진 ‘마이크로웰’ 속에 ‘침전’될 수 있고, 또는 배양 웰로의 이후의 제거를 위해 수층내에서 또다른 지점으로 이동될 수 있다.
“융합체”는 또한 표준성장배지 및/또는 증가된 산도의 용액에의 노출에 의해 전극으로부터 분리될 수도 있다. 그다음 융합체는 챔버로부터 분출되어 배양을 위해 수집되거나 또는 어떤 다른 적합한 수단에 의해 배양 웰에 운반될 수 있다.
더이상의 변형에서는, 융합된 하이브리드 세포들은 전극에 여전히 부착되어 있거나 또는 전극으로부터 탈착되어 융합 챔버에 남아있을 수 있고 적합한 배양배지로 융합챔버내의 용액을 바꿈으로써 인시튜 배양될 수 있다.
또다른 구체예에서, 정상배지에의 노출은, 예를들면, 컴퓨터 제어하에, 그리고 아마도 탈착을 실행하기 위해 전기장의 도움으로 손으로 다루거나 컴퓨터 제어에 의해 간단히 조절될 수 있는 부피된 미세부피의 배지를 끌어내기 위해 사용될 수 있는 그러한 형상과 디자인의 이동(displacement) 피펫(예를들면 제18도 또는 제27도에 나타낸 것과 같은 것)의 배치와 조합될 수 있고 또는 조합되지 않을 수도 있는데, 그로인해 융합체 세포도 또한 그것이 U자로 굽은 트랩 또는 기타 보유수단을 통과하기에 충분한 이동 피펫으로 끌어내어질 수 있다. 예를들면 제27도 참조. 그후 피펫과 세포를 같이 챔버밖으로 공기중으로 끌어낼 수 있고 세포를 테라사키- 또는 기타 배양접시에 보관할 수가 있다.
[6. 하이브리드의 단기 생장]
융합에 있어서, 개개 융합체 세포를 각각, 아마도 성장인자 또는 공급자 세포가 보충된 적합한 배지를 함유하는 별도의 웰에 놓는다. 5회의 분할 사이클후, 본 발명자의 실시는 한계 희석법 또는 본 발명자의 이동피펫을 통한 단일세포-분배를 사용하여, 사전에 면역 글로불린 G(또는 면역 글로불린 M, A, E, D, 이러한 분자들이 특정 하이브리도마에서 요구되는 경우)로 세척된 새로운 웰 및 신선한 배지로 단일세포들로서의 25 내지 30 자손을 재클로닝한 것이었고, 따라서 본 발명자는 각 새로운 웰에서 후속 생장에 의한 표적 항체/아이소타입 생성의 초기 검출을 달성할 수 있다. 이것은 본 발명자로 하여금 유용한 클론을 선별하고 관계없는 것들은 폐기하도록 허용하여 안정하고 성공적인 클론을 찾기위한 시간을 최소화하며 처리공정의 부피를 줄여준다.
그다음 높은 생산성을 가진 웰들을 상기한 방법에 의해 전기화학적 선별을 시켜서, 요구 사항에 따라 높은 친화성 항체를 생성할 수 있거나(예를들면 제29도, 제30도 및 제31도 참조), 또는 자체를 팽창시키거나, 또는 핵형의 안정성(별도 측정함)에 따라 상기와 같이 그리고/또는 항체 생성 데이타에 의해 표시된 대로 재클로닝시킨 이들 세포들을 분리할 수도 있다.
[7. 융합체의 유전학적 안정성]
융합체의 유전학적 안정성 및 관련 생체분자 생성은 예를들면, ELISA법 또는 플로우시토메트리(Flow Cytometry) 분석과 같은 모노클로날 (또는 다른 분비) 생성물을 위한 표준분석(assay) 기술을 사용함으로써 연장된 기간에 걸쳐 세포배양의 통상적 기술에 의해 입증될 수 있다. 일단 세포가 충분한 수에 이르면 핵형화 그리고 또한 플로우 시토메트리에 의한 표면 면역글로불린 분석이 수행될 수 있다.
또다르게는 또는 추가로, 새로운 하이브리도마 (또는 다른 하이브리드)에 의해 생성된 항체의 친화성 및 선택성이 평가될 수 있고 상기한 전기화학적 선별기술을 사용하여 개개의 하이브리드가 선별될 수 있다 (제29도, 제30도 및 제31도 참조). 이 방법에서, 예를들면, 항원에 대한 매우 강한 친화성을 나타내는 하이브리드를 다른 항원으로부터 선별할 수 있고 상기한 바와 같은 챔버로부터 따로따로 제거할 수 있다. 재배양후 이 과정은 필요에 따라 반복될 수 있다. 이 재선별과정은 물론 다른 파트너 세포와의 재융합을 수반하지도 않으며 하이브리도마 개발의 현재의 의례적인 방법들에서 요구되는 대부분의 과정들을 수반하지도 않는다.
[8. 트리오마(triomas), 쿼드로마(quadromas) 및 고급 분비자들의 생성]
상기한 선별 및 융합공정은 다른 항원들에 대한 항체들을 분비하는 두개의 하이브리도마 세포의 선별 및 융합에 쉽게 연장될 수 있다(quadromas). 이런식으로 이중 특이성(bispecific) 항체를 분비하는 하이브리도마를 발생시키는 것이 가능할 것이다. 하이브리도마 세포의 분비 B 세포와의 융합(triomas)은 마찬가지의 결과를 달성시킬 것이다.
이러한 항체는 진단학 및 치료법에 넓은 이용분야를 가질 것이며 어떤 진단학적 이용분야에서는 이미 사용되고 있다.
또한 상기한 기술에 의해 두개의 동일한 하이브리도마를 융합하는 것도 가능하다. 이것은 첫번 하이브리도마의 안정한 이원 융합체 클론, 그다음 그것들의 이중-하이브리도마 자손 등의 반복융합에 의해 모노클로날 항체의 고급분비자를 생성하여 따라서 단일 하이브리드 세포내에 유전자의 다수 복사체를 포함시키기 위해 사용될 수 있다. 본 발명자는 이미 이러한 이중-하이브리도마 창조 프로그램을 수행하였다; 이하 섹션의 실시예 참조.
[9. 다른 유형의 하이브리드와 현존하는 구조체의 증폭]
본 발명은 또한 어떤 유형의 진핵세포도 어떤 정의된 세포 또는 벡터 파트너와도 융합시켜, 구체적으로 말하면 반드시 분비되는 분자는 아니나, 인터루킨, 성장인자, 혈액생성물 등과 같은 천연생성물을 예를들어서 글리코실화된 형태로 생성할 수 있는 진핵세포 하이브리드를 달성함으로써 세포주의 제조를 가능케 한다.
본 발명은 또한 진핵세포 유전자에 대한 박테리아 비히클로 할 때 발견되는 현 제조상의 문제를 피하는 박테리아 세포의 포유동물 세포와의 융합을 허용한다. 하이브리도마에 의해 기술된 유전자 증폭의 라운드들을 또한 이들 세포에 적용하여 고급 분비자들을 얻을 수 있는데, 본 발명자는 유전자 증폭의 라운드 수에의 한계는 아직 알지 못하고 있다.
유전자 증폭의 특히 효과적인 영역은 포유동물 또는 식물세포(진핵세포)를 사람 에리트로포이에틴 유전자와 트랜스펙션시킨 것과 같은 다른 유전자와 트랜스펙션된 것이다(종종 벡터를 거치는데 이것은 그들의 DNA를 그들 숙주세포의 염색체에 통합시킨다). 본 발명자 기술의 독특한 능력으로 수행된 이들 진핵세포 트랜스펙트 구조체의 자가융합의 연속라운드들은 이들 통상 매우 고가의 생성물의 의례적 제조에 사용되는 현 구조체에 비하여 과생산성인 세포주를 수득하기 쉽다.
[10. 본 신규한 방법의 이점]
본 신규한 방법은 적어도 바람직한 구체예에서 다음의 구체적인 이점들을 갖는다.
ⅰ) 그것은 매우 적은 수의 세포만을 요한다. 즉, 수많은 원하는 하이브리드 세포를 얻기위해 10개의 세포가 사용될 수 있으며(현재의 기술에 의해서는 백만개가 요구되는 것과 비교됨), 따라서 공여자의, 예를 들어서 말초혈액으로부터 특정 분비세포들을 얻을 수도 있다. 이것은 현재 달성불가능한 매우 다양한 사람 하이드리도마 및 기타 분비성 사람 하이브리드 세포를 제조할 수 있는 가능성을 열어준다.
ⅱ) 사람세포 및 기타종(예를들면 마우스)의 하이브리도마는 종종 더 신속한 배양 또는 사람-사람 하이브리드 보다 더 튼튼한 하이브리드와 같은 이점들을 제공한다.
ⅲ) 새로운 조작 사이클은 종래의 전개 사이클 보다 더 짧다. 즉, 많은 기르고(farming) 클로닝시키는 단계들이 없어지는데 이것은 세포들이 시작부터 클론으로서 성장될 수 있고 융합 5일내에 상징액을 분석할 수 있으며 HAT 선별이 불필요하기 때문이다.
ⅳ) 가장 높은 친화성 및 특이성의 항체들을 원한다면, 융합의 시기에 선별할 수 있고 그러면 융합후 곧바로 분석을 시작할 수 있다.
ⅴ) 그것은 HAT 선별이 필요하지 않기 때문에, 불멸의 융합 파트너의 선택은 아무런 현재 방법의 현 영양소 감수성 제한을 갖지 않는다.
ⅵ) 그것은 하이브리도마 자체의 계속적인 자기융합으로부터, 어떤 특정한 분비된항체 또는 다른 천연생성물의 “고급(high) 분비자”인 새로운 세포주들을 생성할 수 있다. 이것은 하이브리드 세포당 항체의 더 높은 생성을 허용한다.
ⅶ) 그것은 트리오마 및 쿼드로마를 만들어 모노클로날 이중특이성 항체를 생성할 수 있다. 이러한 항체는 진단 키트를 만들 것이며 항체를 토대로한 다른 진단키트들을 더 싸고 간단하게 만들게 할 것이다. 하나의 특이성은 항체를 기질 또는 작용제(플루오로크롬, 독소, 핵종, 등)에 부착시키기 위해 사용되는 한편, 이중 특이성중의 제2의 특이성은 마커(marker) 발현에 의해 표적 “생산자”세포로 향하게 될 수 있다.
ⅷ) 사람 세포 표면항원, 예를들면, “사람 림프구 항원”, HLA 항원에 대한 모노클로날항체에 대해, 그 항원만에 대한 항체를 만들고 다른 세포 표면항원에 대한 항체는 만들지 않는 분비세포의 사람 말초혈액 (특정 HLA 항원에 과-면역된 사람의 말초혈액)으로부터의 선별과정은 이 방법으로 간단해진다.
[실시예]
본 발명자는 이제 일련의 실시예를 제공하는데 여기서 본 발명자는 본 발명자의 능력과 가능한 상업적 이용분야를 예시하는 분비된 생성물을 스스로 생성하는 새로운 하이브리도마 및 세포 하이브리드를 만드는 본 발명자의 방법의 갖가지 구체예들을 사용하였다.
[실시예 1]
[키홀 림펫 헤모시아닌(keyhole limpet hemocyanin), KLH, 항원에 대한 항체를 만드는 마우스 하이브리도마]
키홀 림펫 헤모시아닌(KLH)에 대한 항체를 분비하는 마우스 세포 하이브리도마를 생성하기 위해 본 발명 방법이 어떻게 사용되었는지의 구체적 실시예를 이하에 기술한다.
바다 연체동물인 키홀 림펫으로부터의 헤모시아닌은 많은 면역학적 연구에서 모델항원으로서 사용되어 왔다. 이것은 정제된 형태로 쉽게 구입할 수 있다.
여기 기술된 장 강도, 파형 및 주파수 용액의 화학적 조성, 노출시간 및 모든 다른 변수들에 대한 상세한 것들은 이 특정 하이브리도마의 제조에 효과적인 것으로 발견되었다.
[1. 방법]
항 KLH 하이브리도마의 제조는 다섯가지 공정으로 나눌 수 있다.
ⅰ) 마우스 비장세포의 준비.
ⅱ) 고정된 전극을 KLH 단백질로 피복.
ⅲ) 전기화학/선별 기술을 사용하여 항-KLH 항체를 분비하는 정상 B 림프구의 선별.
ⅳ) 단일 융합자 쌍들을 형성하기 위한 마우스 골수종 세포주, SP2로부터 파트너 세포들의 처리.
ⅴ) 세포의 선별된 쌍들의 융합.
이들 공정을 이제 상세히 기술하기로 한다.
[2. B 림프구의 제조]
성숙한 마우스(Balb/c 균주)를 등장식염수 밀리리터당 0.1 밀리그램 헤모시아닌을 함유하는 용액 400 마이크로리터로 면역시켰다. 복강내로 단백질의 주사에 의해 면역시켰다. 초기면역 10일후 마우스를 KLH의 ‘부스터’ 주사를 받게 하였다. 마우스의 면역시스템은 주사에 반응하였고 면역된 이들 마우스의 혈청에 항체가 존재하였다. 이것은 면역된 마우스의 꼬리로부터 취한 혈액에 대한 표준 ELISA 시험에 의해 나타났다.
ELISA 시험에서, 단백질에 대한 항체의 존재는 두 단계에서 나타났다. 먼저 플라스틱판에 작은 함몰부 또는 웰의 기부 및 벽을 항원 단백질로 피복하였다. 그다음 시험용액을 웰의 일부에 넣었다. 다른 웰에 면역시키지 않은 마우스로부터의 대조표준용액을 넣었다. 만일 시험용액이 항원에 대한 항체를 함유한다면 항체분자가 웰의 벽에 결합되는 한편, 대조 표준항체는 단지 미소한, 비특이적 결합만이 있었다.
둘째로, 결합된 항체는 그다음에 마우스 면역글로불린에 대한 효소결합된 양(sheep) 폴리클로날 항체를 함유하는 용액에의 노출에 의해 나타났다. 항체에 부착된 효소는 무색기질을 착색된 것으로 전환시켰다. 색변화는 양성 결합 결과를 가리켰다.
정확하고 조절된 결과를 보증하기 위해 면역된 마우스와 대조 표준 마우스(즉, 면역시키지 안은 마우스)로부터 비장을 제거하여 전체 방법을 증명하였다. 비장은 적혈구(적혈세포) 및 다른 세포 형태들 뿐만 아니라 B 및 T 림프구의 혼합물을 함유한다. 표준 염화암모늄 용해기술을 사용하여 90%의 적혈구를 제거하였다. 남아있는 세포 현탁액은 B와 T 림프구를 함유하였다. 전극 선별 공정은 이 세포현탁액에서 수행되었다(이하 섹션 3 참조).
면역시키지 않은(대조표준) 마우스로부터의 비장세포를 사용하여 선별과정의 효율을 증명하였다.
[3. 선별 및 융합 챔버]
이 특정 실시예에 사용된 챔버의 개략도를 제10도 및 제11도에 나타내었다. 이 특정 챔버는 플렉시-유리(“Perspex”) 블록을 기계가공한 두개의 웰(23 및 24)로 구성된다. 두개의 웰을 분리하는 플렉시 유리도 또한 채널(25)에서 오목하게 되어 있다. 웰을 용액으로 완전히 채울 때, 이 오목한 채널을 통해 웰간에 유체가 소통하였다. 웰을 최대용량의 80%를 채울 때 유체부피는 서로 분리되었다.
챔버는 각각 2 밀리미터 직경의 두개의 작은 폴리스티렌 튜브(26 및 27)로 구성되어 있는데 하나(26)는 유체가 챔버로 주입(펌핑)되도록 허용하며 다른 것(27)은 챔버로부터 유체의 제거를 허용하였다.
고정전극(28)이 챔버의 기저부에 나란히 장착되어 있다. 그것은 두 웰과 그것들을 분리하는 벽(29)을 통해 뻗어있다. 사용된 와이어는 니켈합금 와이어로 되어 있고 128 마이크로미터의 직경을 가졌다. 그것은 웰의 바닥으로부터 대략 0.30 밀리미터에서 장착되어 있다.
제2의 전극(31)은 “L” 형상으로 굽혀진 작은 길이의 같은 니켈합금 와이어로 구성되어 있다(제12도). 이 전극은 수력에 의해 구동되는 마이크로매니택레이터에 부착되어 챔버의 두 웰중 어느 한 곳에서 이동시켜 어떤 ㅟ치에도 위치시킬 수 있도록 되어 있다.
제3의 전극(19)(제7도)은 작은 길이의 니켈합금 와이어로 만들어지고 반경이 대략 250 마이크로미터인 확대된 구형 팁을 가졌다. 제3의 전극(19)도 또한 마이크로매니택레이터에 부착되어 있고 두 웰의 어느 한곳에 위치시킬 수 있다.
전체 챔버를 현미경 아래 장착시켰다.
[4. 세포 선택적 전극의 준비]
고정된 니켈합금 와이어 전극을 KLH 단백질로 피복하여 그것을 항-KLH 항체를 분비하는 B 림프구 세포에 대해 선택적으로 만들었다. 여기서 단계들은 다음과 같았다:
ⅰ) 융합챔버 및 전극을 70% 알코올/물 용액으로 반복 세척함으로써 소독하였다.
ⅱ) 이동성 전극(31)을 “L” 형태로된 전극(31)의 단부가 고정된 와이어 전극(28)에 평행하고 그로부터 1 밀리미터 분리되어 있도록 마이크로매니택레이터를 사용하여 웰(24)에 놓았다.
ⅲ) 소르비톨 용액 1 밀리미터중의 KLH 단백질 0.2 밀리그램으로 구성되는 KLH 단백질 용액을 웰(24)에 놓았다. 소르비톨 용액은 pH = 8의 산도에서 150 밀리몰 소르비톨을 함유하였다. 산도는 수산화나트륨 및/또는 염산의 첨가에 의해 조절하였다.
ⅳ) 이 특정 실시예에 대해서는, 고정전극(28)과 이동성 전극(31)간에 DC 전압을 인가하였다(제10도). 고정전극(28)은 이동성 전극(31)에 관하여 양의 전극이었다. 인가된 전압은 전극간의 중간쯤의 용액에서의 전기장이 미터당 2,000 볼트가 되도록 조절되었다. 전극간의 장 강도는 균일하지 않으나, 장 방정식과 전극의 직경 및 전극간의 알려진 분리거리를 사용하여 쉽게 계산될 수 있다. 고정 전극상에 단백질 피복의 퇴적을 (현미경하에) 관찰하기에 충분히 길게 전위차를 인가하였다. 이것은 대략 12분을 요하였다. 역 극성을 사용할 때 항원은 고정 전극에 들러붙지 않았다.
ⅴ) 전기전위차를 끄고 챔버를 살균한 150 밀리몰 소르비톨 용액(산도 pH = 8)으로 5회 서서히 플러싱시켜 미결합된 KLH 단백질을 제거하였다. 작은 폴리스티렌 튜브(26)를 통해 소르비톨 용액을 더 주입하고 폴리스티렌 튜브(27)를 통해 용액을 제거함으로써 플러싱을 달성시켰다. 마지막으로 챔버를 pH 6.5에서의 150밀리몰 소르비톨의 살균한 세척용액으로 플러싱시켰다.
[5. B 세포의 선별]
KLH-피복된 고정전극(28)을 KLH 단백질에 대한 항체를 분비하는 B 림프구로 피복하였다.
이것은 다음과 같이 달성되었다:
ⅰ) 상기 섹션 2에서 기술된 것과 같이 제조된 림프구 세포의 현탁액을 150 밀리몰의 농도 및 pH 6.5의 산도의 소르비톨을 함유하는 용액으로 2회 세척하였다. 세척은 세포를 원심분리기에서 회전시키고 원심분리관 바닥의 세포의 밀집된 펠릿을 신선한 소르비톨 용액에 재현탁시킴으로써 달성하였다.
ⅱ) 세포의 농도가 밀리리터당 대략 백만개 세포된 림프구 현탁액의 샘플이 제조되었다.
ⅲ) 웰(24)에 리간드 피복된 고정 전극(28)을 함유하는 융합 챔버내의 웰에 세척된 림프구의 현탁액을 채웠다.
ⅳ) 2.00 메가헤르츠의 주파수에서 교류의 사인파 전류를 피복된 전극과 이동성 전극(31)간에 통과시켰고 주파수는 B 세포를 전극으로부터 반발시키는 것이 아니라 전극을 향하여 끌리는 것이 발견되었다. 이동성 전극(31)은 고정 전극에 평행하게 옆으로 약 0.2㎜ 떨어져서 약 0.5㎜의 깊이에서 용액에 놓여졌다. 이때 웰내의 세포들은 그것들의 항원피복된 전극(28)과의 전기화학적/선별을 용이하게 하기 위해 수회 재현탁시켰다. 전류의 수준을 전극 사이 중간쯤의 교류전기장이 미터당 대략 6,000 볼트가 되도록 조절되었다. 전류는 5분간 켠다음 5분간 껐다. 전기장은 바뀌어서 약하게 부착된 (비특이적으로 결합된) 세포를 항원 피복된 전극으로부터 반발시켰으며, 이것은 장의 주파수를 1㎑로 바꿈으로써 달성되었고 전극사이 중간지점에서의 진폭은 30초간 유지된 값인 미터당 500 볼트로 조절되었다. 사이클을 반복하였다. 그다음 현탁액을 10분간 가라앉혀 두었다.
ⅴ) 이 단계에서, 시험 마우스로부터의 어떤 세포들은 피복된 전극(28)에 부착되어 남아있었다. 대조표준 공정에서는 림프구를 면역시키지 않은 마우스로부터 추출했을 때 전극에 매우 적은 세포들이 부착되었다.
ⅵ) 그다음 챔버를 pH = 6.5의 산도로 150 밀리몰 소르비톨을 함유하는 용액으로 플러싱시켰다. 플러싱을 분당 3 밀리리터의 속도로 수행하였다. 이 과정은 피복된 전극(28)에 초기에 부착하는 일부 림프구들의 제거를 일으켰다. 나머지 세포들은 항원(KLH 단백질)에 대한 항체를 분비하는 B 림프구이었다. 증명단계는 이하 참조. 대략 5 밀리리터의 플러싱 용액의 부피가 보통 웰로부터 대부분의 미부착된 세포를 제거하기 충분하며, 세포들이 정상이고 처음 2주의 세포배양의 동안에 분열없이 보통 죽기때문에 완전한 제거가 필수적은 아니다.
ⅶ) 면역시키지 않은 마우스로부터의 림프구로한 대조 표준실험에서는 플러싱 후 세포들이 피복된 전극에 부착되어 남아있지 않았다.
[6. 선별과정의 증명]
여기 기술된 과정은 선별과정의 증명을 허용하나 하이브리도마의 일상적 제조에는 요구되지 않았다. 상기 섹션 5에 기술된 과정의 끝에서 피복된 전극(28)에 부착되어 남아있었던 세포가 실제로 KLH 단백질에 대한 항체를 발현하는 B 림프구이었는지를 점검하기 위해 다음의 과정을 사용하였다.
ⅰ) 150 밀리몰 소르비톨 용액, pH = 7.5 중의 밀리리터당 3 밀리그램의 KLH 단백질을 함유하는 용액소량을 융합 챔버내 웰(24)에 첨가하였다. 이것은 20℃의 실온에서 30분간 그자리에 두었다.
ⅱ) 그다음 용액을 pH = 7.5의 산도에서 150 밀리몰 소르비톨 용액으로 플러싱에 의해 서서히 세척하여 약 300 마이크로리터의 용액부피를 남겼다.
ⅲ) 플루오레세인 콘주게이트된 염소 항 마우스 면역글로불린 폴리클로날 항체(Silenus-AMD, Hawthorne, Victoria, Australia) 용액 30 마이크로리터를 웰에 첨가하고 서서히 혼합한 다음 실온에서 30분간 배양하였다.
ⅳ) 챔버를 다시 상기와 같이 pH = 7.5의 산도에서 150 밀리몰 소르비톨 용액으로 서서히 플러싱하였다.
ⅴ) 챔버를 자외선광을 조사시키고 현미경하에 형광을 점검하였다.
결과-피복된 전극에 부착하는 세포의 95% 이상이 형광을 나타내었다. 즉, 95% 이상의 이들 세포가 KLH 단백질에 대한 항체를 발현하고 있었다.
면역시키지 않은 마우스를 사용하는 대조 표준실험에서는 플러싱 후 피복된 전극에 부착되어 남아있는 세포는 없었다(섹션 5에 기술된 것과 같음).
[7. 골수종 세포(SP2)의 처리]
KLH 단백질에 대한 항체를 분비하는 선별된 B 림프구와 SP2 골수종 세포간의 전기적, 이원 융합을 실행하기 위해, 단일 SP2 세포를, 앞서 기술된 기술을 사용하여 분리하고 상기 단계 5(ⅵ)에 기술된 것과 같이 웰(24)에 남아있는 하나의 단일 선별된 B 세포와 양호한 막 접촉하도록 가져왔다.
이렇게 하기 위하여, 니켈합금 와이어(직경 128 마이크로미터)로 만든 이동성의 확대된 팁의 전극(19), 마이크로매니퓰레이터, 디일렉트로포레시스를 요하였다. 단일 SP2 세포를 집어내어 B 림프구와 융합을 유발시키기 위한 프로토콜은 다음과 같다:
ⅰ) pH 6.5에서 150 밀리몰 소르비톨의 용액중의 SP2 세포 현탁액을 제조하였고, 밀리리터당 대략 10,000개 세포를 함유하였다.
ⅱ) 웰(24)을 상기 단계 5(ⅵ)에 기술된 바와 같이 pH 6.5에서 밀리몰 소르비톨을 함유하는 용액으로 채웠다.
ⅲ) 웰(23)을 비우고 건조시켰다.
ⅳ) 웰(23)의 3분의 2를 SP2 세포 현탁액(단계 ⅰ)로부터)으로 채웠다.
현탁액을 10분간 가라앉혀두어 모든 SP2 세포가 웰의 바닥에 가라않게 두었다. 그다음 웰을 150 밀리몰 소르비톨 용액으로 서서히 채워 (SP2 세포를 휘젓지 않으므로 채널(25)을 통해 웰(24)로 우연한 이동을 방지하도록 함) 두 웰(23 및 24)내의 소르비톨 용액이 채널(25)을 통해 연결되도록 하여 채널(25)도 이제 또한 소르비톨 용액으로 채워지도록 하였다. 그러나 SP2 세포는 웰(23)에만 존재하고 단지 약간의 세포가 웰의 바닥에 놓여 있었다.
ⅴ) 이동성 전극(19)을 마이크로매니퓰레이터를 사용하여 웰(23)로 보내었다.
ⅵ) 이 이동성 전극(19)과 고정전극(28)은 사인파 전기파형 발생기로 연결되었다. 전극도 또한 전기 펄스 발생기에 평행하게 연결되었다. 사인파 발생기는 1.8 메가헤르츠의 주파수와 3 볼트의 진폭으로 고정시켰는데 이것은 대략 6,400 볼트/m의 전극간 중도의 장 강도를 제공하였고 이것은 SP2 세포를 끌었다. 이것은 전극팁 근처의 불균일한 전기장에서 디일렉트로포레시스에 의해 SP2 세포의 이동성 전극(19)의 구형팁으로 향한 선호적 이동 및 부착을 일으키기에 적당하였다(제7도). 이 경우에 부착은 분비세포의 선별에서 상기 사용된 것과 같이 화학 결합이 아니라 부분적으로 전기적인 선별이었다. 이 경우에 여기서 일어나는 어떤 부착은 약하고 화학적으로 비특이적이어서 일단 장이 적당히 변경되면 세포가 전극에서 떨어지게 되거나 또는 온화한 교반에 의해(장을 차단함) 쉽게 제거될 수 있거나, 또는 전극으로부터 몰아낼 수 있을 정도이었다(주파수를 1 킬로헤르츠로 이동시킴).
ⅶ) 하나 또는 두세개의 SP2 세포들이 이동성 전극(19)에 부착된 후 그 전극은 채널(23)을 통해 웰(24)로 서서히 이동하여 언제든지 전극이 웰(23 및 24)을 연결하는 채널을 채우는 소르비톨 용액에 확실하게 잠겨있도록 한다. 전극의 이동은 전극이 부착된 수력 마이크로매니퓰레이터에 의해 실행되었다.
ⅷ) 전극의 팁에 부착된 SP2 세포는 다음에 웰(24)내 고정전극에 부착된 선별된 B 림프구세포중 하나로부터 대략 5 마이크로미터 떨어져서 그것을 향해 있도록 조작하였다.
[8. 선별된 세포의 융합]
선별된 정상의, 분비 B 림프구와 이제 쌍을 이룬 융합자인 파트너 SP2 세포의 융합을 실행하기 위해 다음 과정이 사용되었다.
ⅰ) 이동성 전극(19)과 고정된 선별전극(28)간의 전기장을 미터당 50,000 볼트의 값으로 증가시켰다. 이것은 두 세포를 한번에 신장을 일으키고 전극에 견고히 부착되게 하였다. 신장은 세포의 단단한 접촉을 가져왔다. 이것은 양호한 세포막 접촉을 확실히 하기 위해 행해졌다. 전기장의 주파수는 1.8 메가헤르츠에서 유지시켰다.
ⅱ) 이제 두세개의 사각 전기펄스를 초당 2 펄스의 속도로 인가하였고, 각 펄스는 지속시간이 100 마이크로초이었다. 펄스 진폭은 전극 분리가 50마이크로미터(이 단일 융합자쌍에서의 세포의 유형에 적합함), 장 강도가 약 65,000 내지 70,000 볼트/미터이었을 때 3 내지 4 볼트로 설정되었다. 이 단계에서 단일쌍의 세포가 융합하여 단일 융합체 세포를 형성하였으나, 형태는 하나의 정상 단일세포 보다는 융합된 쌍으로 있음을 나타내었다.
ⅲ) 융합직후 높은 주파수의 AC 전기장을 껐다. 융합체 세포는 고정 전극(28)에 결합되어 남아있었다.
ⅳ) 이동성 전극(19)은 마이크로매니퓰레이터를 사용하여 웰(23)로 되이동시켰고 이 섹션에서 기술된 단계 7 내지 8을 반복하여 이원 융합을 더 실행하였다.
ⅴ) 두 세 융합체를 얻은후, 융합배지를 제거하고 융합 챔버에 설치된 플러싱 시스템(튜브 26 및 27)을 사용하여 배양배지를 바꾸었다.
ⅵ) 웰(24)내 “융합체”를 가진 챔버를 그다음 며칠간 CO2조절된 배양기에 이동시켰다. 이 단계에서 챔버는 세포가 융합 챔버로부터 제거되어 표준 96 웰 배양 용기의 작은 웰들에 발라지기에 충분한 세포들을 함유하였다. 이원 융합체의 분열은 대부분 90% 이상의 경우에서 48시간내에 일어났다. 그후 세포들을 이하섹션의 본문에서 기술된 과정에 따라 처리하였다.
요약하면, 세포의 원래 융합후 대략 3주의 기간후 클론성 하이브리드가 분리되고 성장되었다.
[실시예 2]
[간염 B 표면항원에 대한 사람-사람 하이브리도마]
[1. 방법]
간염 B 표면항원에 대한 사람-사람 하이브리도마의 제조는 다섯 공정들로 나눌 수 있다.
ⅰ) 사람 말초 혈액세포의 준비 및 사전 농축.
ⅱ) 간연 B 표면항원을 가진 고정된 전극을 화학적으로 선택적으로 만들기 위해 피복하기.
ⅲ) 주로 고정된, 선별 전극을 사용하여 전기화학적 선별에 의한 항-간염 B 표면 항원 항체를 발현하는 B 림프구의 선별.
ⅳ) 이동 전극상의 전기선별을 사용하여 사람 파트너 세포, K562의 처리.
ⅴ) 대표적인 수의 하이브리드 융합체를 얻기위해 수회반복된 선택된 쌍들의 세포의 융합.
이들 공정들을 이제 상세히 기술할 것이다.
[2. 사람 말초 혈액세포의 준비 및 사전 농축]
10밀리리터의 사람 말초혈액 샘플을 간염 B 표면항원에 대한 면역글로불린 G의 생성을 위해 음성(대조표준) 및 양성(시험)인 것으로 사전에 나타난 환자들로부터 끌어내었다. 스미스 클라인 비이캄(Smith Kline Beecham, Dandenong, Victoria, Australia)에 의해 시판 공급된 재조합 백신으로 최근에 부스트시킨 양성 환자들로부터 샘플을 취하였다. 각 샘플은 B-세포 계통은 아닌 거의 모든 세포들이 제거되도록 처리한 다음 말기 단계 분비 B-세포, 플라즈마 블라스트 및 플라즈마 세포에 대한 나머지를 농축시켰다. 따라서, 각 실시예에서, 전체 혈액을 퍼콜(Percoll; Pharmacia Limited, West Melbourne, Victoria, Australia)상에서 분리시킨 다음 플라스틱 부착에 의해 단세포를 고갈시켰다. 결과된 세포들을 각 단계에서 2회씩 OKT3 항체(pan-T- 세포항체, Ortho Diagnostics, Ryde, NSW, Australia로부터 구입)로, 그다음 B1(pan-B-세포 항체, Coulter Corporation, Brookvale, NSW, Australia로부터 구입)으로 그다음 NKH1(null, 예를들면 Natural Killer, 세포에 대한 마커; Coulter로부터 구입)으로 패닝(panning)시켰다. 최종적으로 앞의 패닝단계의 마지막으로부터 미부착된 세포를 하이브리도마 세포주, CRL 8022,(미국특허 No. 4,364,935; 세포주는 American Type Culture Collection, Rockville, MD, USA로부터 얻어졌다)의 상징액으로부터 얻어지고 플라즈마 세포의 전형이며, 활성화된 T-세포 및 미성숙 B-세포 서브세트에도 존재하는 클러스터 오브 데지그네이션 38, “CD38”, 항체를 사용하여 패닝시켰다. 원하지 않은 세포, 즉, 접시에 부착되지 않은 것들을 제거하기 위해 규정 식염수 용액으로 수회 세척에 이어서, 부착된 세포를 먼저 환자 자신의 혈청 1 밀리리터중의 10 마이크로리터의 과량의 CD38의 항체와 배양(37℃에서 30분)에 의해 탈착시킨 다음 느슨한 세포들을 수집함으로써 접시로부터 회수하였다. 수회 세척으로부터의 세포를 모으고 농축시키고 세척하였다. 그것들을 정상배지 더하기 10% 소태아 혈청, FCS에 재현탁시키고, 약 40,000개 세포를 회수하였다. 이와 같이 블라스트로 풍부하게된 이들 세포를 제13도, 제14도 및 제15도에 기술된 전극 시스템을 사용하는 전기화학적 선별과정을 받게하였는 바, 전극들의 표면에서 간염 B 표면 항원에 대한 항체를 발현한 세포들을 선별하였다. 이것은 이하 섹션 5에서 기술된다.
[3. 선별 및 융합 챔버]
오스트레일리아, 시드니, 메도스 회사로부터 구입하여 본 목적에 맞도록 변형시킨 8-웰 플레이트(32), “Nunc”의 웰(35)을 이용하여 세포선택과 세포융합을 행하였다. 웰과 전극의 변형 및 형태는 제13, 14, 15도에 나타나 있다. 간략하게 말하면 플레이트(32)의 벽(33)에서 플라스틱 조각을 떼어내고, 니켈합금 선으로 만든 직경 128 마이크로미터의 고정 전극(34)을 웰(35)의 벽(33)의 작은 구멍을 통하여 웰(35)의 바닥가까이에 바닥과 나란히 넣어서 전극(34)을 웰(35)들을 가로질러, 처음에는 4개의 웰을 다음에는 다른 4개의 웰에 돌려 장치한 후, 전극(34)이 통과한 구멍들을 실리콘 고무 접착제로 봉하였다; 웰(35)에서 고정전극은 유리 슬라이드 바닥(32)에서 보통 500 마이크로미터 떨어져 있다. 플레이트(32)를 현미경에 놓고(제시안하였음) 한방향 조절기의 한 끝에 부착하여 웰이 하나씩 시야에 들어올 수 있도록 하였다. 삼중 피펫 “트리 피펫”을 정밀조작하여 챔버안에 넣거나 챔버위에서 조작할 수 있도록, 삼중 피펫 “트리 피펫”을 삼중축 마이크로매니택레이터에 장치하였다; 이렇게 하여 현미경을 보면서, 세포의 현탁용 및 세척용 용액을 주입하거나 없애는 기능, 웰(35)을 세척하는 기능, 웰에서 사용한 용액을 교환하는 기능을 수행하는 융합/선별챔버에서 적당한 위치로 트리 피펫을 조절할 수 있다. 피펫(40)(제16도 참조) “이동 피펫”은 따로 또다른 삼중축 마이크로매니퓰레이터(45)에 장착하였다; 이것은 약간의 세포를 웰(35)로 넣거나, 꺼내거나, 웰(35)에서 옮기는데 사용하였다. 바람직한 세포농도 및 압력조건하에서, 바람직한 세포수인 둘 또는 다섯 개의 세포를 포함하는 양을 쉽게 웰에 넣거나 제거할 수 있었다.
[4. 세포-선택용 전극의 제조]
오스트레일리아 아보트사(오스트레일리아, 뉴사우스웨일즈, 커넬)에서 구입한 B형 간염의 표면항원을 사용하여 전극을 피복하였다. 수산화나트륨 및/또는 염산을 사용하여 산도를 pH 8.0으로 조절한 소르비톨 150㎖에 10배 희석하여 사용하였다. 직경이 128 마이크로미터인 니켈합금선 고정 전극(34)을 B형 간염의 표면항원으로 피복하여 B형 간염의 표면항원에 대한 항체를 분비하는 B 림프구를 선택할 수 있도록 하였다.
아래와 같은 단계에 의한다:
ⅰ) 트리 피펫으로 챔버와 내용물을 70% 알코올/물로 반복세척하여 융합챔버 즉 웰(35)과 전극들을 멸균하였다.
ⅱ) 마이크로매니퓰레이터(37)를 사용하여 활성웰(35) (웰중에서 세포쌍을 융합시키는데 사용되는 웰로서 본 실험이 행해지는 웰)에 융합 전극(36)을 넣어 전극(36)의 가장 가까운 끝이 선택용 고정 전극(34)과 1㎜ 떨어져서 평행하도록 하고, pH 8.0의 150 밀리몰 소르비톨 약 1㎖씩을 사용하여 5번씩 씻어낸 후 제거한다.
ⅲ) 항원 0.5㎖을 고정 전극이 화학적으로 선택할 수 있도록 된 활성 웰에 넣었다.
ⅳ) 본 특정 실시예에서는, 고정 전극(34)과 이동가능한 융합전극(36) 사이에 DC 및 AC 둘다를 사용할 수 있다. 적용된 DC 전위의 극성은, 융합전극(36)에 비하여 고정전극(34)이 양성이었다. 적용된 전압은, 전극 사이의 전기장의 미터당 4000 볼트가 되도록 조절하였다. 적용된 AC 전위는, 1.7 메가헤르츠의 주파수를 가졌고 2,000 볼트/미터의 AC 전기장 세기를 가졌다. 전극 사이의 전기장 세기는, 전위, 전극 분리정도 및 전극의 직경에 의해 계산될 수 있다. 전위차는 고정 전극(34)에서 일어나는 화학적 피복 침착을 현미경으로 관찰할 수 있을 만큼 긴 시간, 이 경우 약 10분정도 계속되며 2분이 더 지나면 전기장의 극성이 반전된다. 또 다른 웰(35)에서도 선택용 고정 전극(34)에 비슷한 피복이 일어나며 DC 전기장의 극성은 1분과 10분에서 각각 반전되었다. 이와 같이 다른 방식의 세포선택과 세포융합이 성공적으로 일어났다.
ⅴ) 스위치를 꺼서 전위차를 없애고, 트리-피펫을 사용하여 소르비톨 용액으로 챔버를 5번 씻어 결합하지 않은 B형 간염 표면항원을 제거하였다. 챔버를 비운후 pH 6.5의 150 밀리몰 소르비톨을 다시 가하여 선택용 분비세포를 전기화학적으로 받아들일 수 있는 준비상태로 하였다.
[5. B 세포의 선택]
B형 간염의 표면항원에 대한 항체를 분비하는 B-세포 블라스토이드 세포(43)가 풍부한 세포로 전극(34)을 피복하였다. 아래와 같이 행한다:
ⅰ) 상기 섹션 2에서 기술한 바에 따라 제조한 림프구 현탁액을 산도 pH6.5 150밀리몰 농도의 소르비톨을 함유하는 용액으로 2번 세척한 후 ㎖당 세포 약 1,000,000개의 농도를 다시 현탁시켰다.
ⅱ) 분비세포(43)를 50㎕씩 나누어 화학적 선택용 고정전극(34)을 갖고 있는 활성 웰(35)에 가하였다.
ⅲ) 세포(43)를 주사하기전에 교류를 30초간 흘렸다; 교류는 2 메가헤르츠의 주파수를 가졌으며, 선택용 고정 전극(34)과 융합 전극(36) 사이를 통과하였다. 전위는 선택용 고정전극(34)의 표면 전기장이 전극과 주어진 전위에서 계산하여 미터당 약 8000 볼트가 되도록 조정하였다. 2분간 전류를 통과시킨 후, 5초간 전기장을 주파수 1㎑, 미터당 1000 볼트로 변화시켜 선택용 고정 전극(34)에 약하게 부착한 (비특이적으로 결합한) 세포들을 반발시켰다. 상기와 같이 2분간 끌어당기고 5초간 반발시키는 것을 4번 더 반복하였다. 그리고 나서 현탁액을 10분간 조용히 방치하였다.
ⅴ) 이 과정에서 세포(43)의 일부는 피복된 전극에 흡착된 상태로 남아있고 흡착되지 않은 세포는 회수하여 재사용하였다. 즉 흡착되지 않거나 단지 느슨하게 흡착된 세포는 선택용전류에 사용된 소르비톨 용액과 유사한 용액으로 바꾸어주고 부드럽게 씻어주는 방식으로 회수하여 재사용하였다. 느슨하게 흡착한 세포는 선택용 전기의 반발력 (전극표면의 전기장 세기 1000 볼트/미터 및 1000 헤르츠)을 이용하여 제거하였다. 세포(43)를 소르비톨 용액 약 1㎖로 2번 씻은 후 파트너 K562 세포(44)를 선택, 받아들일 수 있도록 챔버준비를 하였다. 선택용 고정 전극(34)에 부착된 채로 남아있는 세포(43)는 항원에 대한 항체를 분비하는 것으로 생각되었다.
[6. 파트너 세포(K562)의 조작]
B형 간염에 대한 항체를 분비하는 림프구 세포(43)와 K562 파트너 세포(44) 사이의 전기적 융합을 효과적으로 행하기 위해서는, 전에 기술한 기술을 사용하여 분리시킨 항체분비 림프구 세포(43)중의 한 세포와 한 개의 K562 세포(44)의 막접촉이 좋아야 한다. 이러한 목적으로, 전이 전극(38)은 직경 128 마이크로미터의 원통형축(41)에 부착된 직경 250 마이크로미터의 구(39)로 이루어져 있다. 전극은 미국 캘리포니아주에 있는 캘리포니아 파인 전선주식회사에서 만든 니켈합금으로 만들었다.
전이전극은 3중축으로 만들어진 마이크로매니퓰레이터(42)에 장착되어 있다. 세포 전이조작은 다음 과정들을 포함하고 있다.
ⅰ) 100 밀리몰 소르비톨을 함유하는 용액중에 K562 세포(44)를 현탁시켜 밀리리터당 약 10,000 세포가 함유되도록 하였다.
ⅱ) 전이 전극(38)은 마이크로조작기(42)를 사용하여 활성웰(35)에 넣었다.
ⅲ) 고정 전극(34)과 전이 전극(38)을 펄스 발생기에 연결하였다. 선택용 고정 전극(34) 및 원통형 융합 전극(36)을 펄스 발생기에 연결하였다. 펄스 발생기를 2 메가헤르츠, 1 볼트로 조절하여 K562 세포(44)를 전이 전극의 끝으로 움직여 전이 전극에 흡착시켰다(전이 전극 끝부분의 비균일 전기장에서 전기영동에 의하여). 이 과정은 제20도에 나타나 있다. 전극을 움직여 또 다른 K562 세포(44)로부터 150 마이크로미터 안으로 들어가면, 전극의 기계적 운동과 전기장 세기의 조절에 의해 두번째 K562 세포가 유인되어 이미 전이 전극위에 붙어있는 첫번째 K562 세포위에 붙었다; 이러한 과정이 제20도에서 제22도에 나타나 있다.
ⅳ) 전이 전극(38)에 흡착된 첫번째 파트너 세포 K562 위에 두번째 K562 세포를 흡착시킨 후, 전이 전극(38)을 부드럽게 움직여, 두번째 K562 세포가 선택용 고정 전극(34)에 흡착된 정상 분비세포인 림프구에서 약 100 마이크로미터되도록 하였다. 전극의 이동은 전극(38)이 부착된 수압 마이크로매니퓰레이터(42)에 의하여 촉진되었다. 전이 전극(38)은 초당 약 20 마이크로미터의 속도로 림프구에 접근 및 이탈을 하였고, AC 신호는 다음과 같이 연속적으로 변하였다: 주파수는 1000 헤르츠로 감소시켰고, 0.5 볼트의 전위를 적용시켰다; 이 경우 두번째 K562 세포(44)가 전이 전극(38)에 있는 첫번째 K562 세포(44)에서 떨어졌다; 다음 주파수를 450 킬로헤르츠 진폭을 3 볼트로 변화시키면 첫번째 K562 세포(44)를 갖고 있는 전이 전극(38)이 선택용 전극(34)에서 멀어졌다. 이동안 유리 K562 세포(44)가 전기장의 활동영역으로 급히 들어가서, 제23도 및 제24도에서 볼 수 있는 바와 같이 이미 선택되어 선택용 고정 전극(34)에 부착되어 있는 정상 분비세포(43)에 붙었다.
[7. 선택된 세포의 융합]
선택된 림프구(43)와 K562 세포(44)의 전기적 융합을 효율적으로 행하기 위해 아래와 같이 실험하였다.
ⅰ) 구모양의 전이 전극(38)을 고정 전극(34)에서 서서히 멀리하고, 융합 전극(36)을 융합시킬 세포쌍이 부착된 고정전극(34)에 가까이 평행으로 하였다. 상황은 제25도에서 보는 바와같다.
ⅱ) 융합 전극(36) 및 고정 전극(34) 사이의 전기장을 미터당 50,000 볼트로 증가시켰다. 이리하면 고정 전극(34)에 강하게 흡착된 분비세포와 K562 세포가 빠르게 길어졌다. 이렇게 세포가 신장되면 세포(43)와 세포(44)의 접촉력이 커지면서 세포막 접촉이 좋아졌다. 전기장의 주파수는 2 메가헤르츠를 유지하였다.
ⅲ) 전극(34 및 36)에 2초 간격으로 100 마이크로초 동안 전기력 펄스를 주었다. 펄스 세기는 전극분리가 50 마이크로미터 (두 세포 타입에 적당)일 때 8 및 9 볼트 사이로 맞추었다. 보통 1번 또는 2번의 펄스로 융합이 일어났다.
ⅳ) 융합후에 즉시 높은 주파수의 AC 전기장을 껐다. 융합된 세포쌍은 (융합체) 고정 전극(34)에 남아있었다.
ⅴ) 마이크로매니퓰레이터(37)를 사용하여 융합 전극(36)을 멀리한 후에, 전이 전극(38)을 가까이 한 후 과정(6과 7)을 반복하였다; 많은 경우에 융합과정을 한번만 수행하여 웰(35)에 하나의 융합체만 존재하도록 하는 것이 바람직하였다.
ⅵ) 하나 또는 수개의 융합체를 얻으면, 융합배지를 제거하고, 트리피펫 세척방법을 사용하여 배양배지를 넣어주었다; 새로운 웰에서 전 과정을 반복하여 모든 웰에 융합체를 만들었다.
ⅶ) 융합체를 갖고 있는 8웰 플레이트를 CO탯 배양기로 옮겨 수일간 배양하였다. 그리고 융합챔버의 세포들을 표준 96 웰 배양기의 웰로 옮겼다. 이틀간 배양한 후 각 웰의 세포들을 대량 배양기에서 배양하였다.
[실시예 3]
[MUD50 항원에 대한 마우스-마우스-이중하이브리도마]
MUD50 마우스-마우스 하이브리도마에서 클론한 세포 한쌍을 융합하여 이원융합체 세포를 만들어 배양하였다. 클론하여, 얻어진 핵형을 나타내며 본래의 모노클로날 항체를 분비하는 하이브리도마 세포주 7개를 얻었다. 이러한 세포주들을 세포 측정기로 예비 스크리닝하여 보면 몇몇 자손 세포주들은 모 하이브리도마 세포주보다 훨씬 큰 속도로 항체를 분비하였다. 이러한 자손 세포주들중 하나인 MUD50B를 효소결합 면역분석법인 ELISA법으로 생산성을 정량분석하여 본 결과, MUD50B는 모세포주의 세포당 평균 분비속도가 70% 높은 세포당 평균 분비속도(전체 항체의 평균 분비속도)를 갖고 있었다. 이 과정에서 사용된 단계들은 대부분 전술한 두 실시예에서 상세히 기술되었다. 따라서 다음에는 개략적으로 설명하였다.
[1. 방법]
이중-하이브리도마를 만드는데는 4가지의 주요과정이 있다.
ⅰ) 이원융합체 세포를 생산하여 배양하였다.
ⅱ) 항체 생산능이 증가된 잘 자란 웰을 스크리닝하였다.
ⅲ) 생산능이 증가된 클론을 대량 생산하였다.
ⅳ) 적당한 특이성을 갖는 전체 항체를 계속적으로 다량 생산하는 것을 스크리닝하였다.
[2. 세포와 세포쌍 융합방법]
본래의 하이브리도마 MUD50은 오스트레일리아, 뉴사우스웨일즈, 맥커리 대학의 KL villiams 교수로부터 선물받았다. 변형균 Dictyostelium discoideum의 막을 가지고 면역 시킨 Balb/c 마우스의 비장과 HAT-과민성 마우스 골수종 세포주 NS1을 PEG-유도 융합시켜 MUD50을 얻었다. 이 하이브리도마는 변형균의 성장시 단세포 단계가 아닌 다세포 단계에서 나타나는 그 개체의 세포들의 해드영역에서 발현되는 막 단백질의 에피토프중 하나에 대한 면역글로불린 G3이소타입 항체를 분비하였다.
이 세포에 대하여, 뉴사우스웨일즈, 랜드윅, 프린스 어브 웰일즈 병원의 Lam Poh Tang 박사의 도움으로 핵형을 조사하였고, NS1 세포를 대조군으로 하여, MUD50(동일 배양산물)에 대한 형광성 항마우스 염소 폴리클로날 항체의 상대적 평균 결합강도를 세포 측정기로 측정하는 방법과, 두가지의 다른 농도의 배양 상징액에서의 항체농도를 측정하는 방법으로 항체 생산능을 측정하였다.
최대농도 ㎖당 백만개로 자란 세포들을 융합하기 하루전에 하나당 셋으로 나누었다. 생장의 로그기에 약 10만개씩을 수확하여, 원심분리하여 농축하고, ㎖당 약 백만개의 농도가 되도록 하여 새로운 배지에 옮겨 융합준비를 하였다. 10% FCS를 가한 정상배지 RPMI1640(오스트레일리아, 빅토리아, 멜보른, 시토시스템스) 500 마이크로리터에 상기 세포 10 마이크로리터를 넣고, 8웰 플레이트의 Nunc 웰중 한 웰에 가하여, 융합시 나머지 웰로 약간의 세포를 정시에 전이시키는 때에 필요한 (제13, 14, 15도 및 섹션 3 실시예 2 참조) 보존용 웰로 사용하였다. 두번째 웰은 150 밀리몰 소르비톨 용액 1㎖로 채웠으며 pH 조절을 하지 않아 전도성을 최소화하였고, 이동 피펫(섹션 3 끝부분의 실시예 2에서 기술)으로 보존용 단계에서 MUD50의 세척조로 사용되었다; 현미경을 보면서, 이동 피펫으로 세척용 웰에서 5개의 세포를 취하여 나머지 6개의 웰중 첫번째 웰에 옮겨넣고 한번의 융합을 일으켰다. 나머지 융합용 웰에서 융합을 일으킨 후, 3회 융합을 끝내고, 트리피펫을 사용하여 세척용 웰에서 소르비톨을 제거한 후, 트리피펫을 사용하여 세포와 신선한 소르비톨 용액을 다시 가하였다.
[3. 이원 세포 융합]
8-웰 플레이트중 나머지 6 웰에서 한번씩 행하였다. 세 전극(제15도 참조)의 어느것도 화학적으로 피복할 필요는 없었다. 도리어 일반적인 화학물질을 피복하면 융합체의 융합후 생존율이 감소되었다. 파트너 세포를 카르복시 플루오레세인 디아세테이트 (오스트레일리아, 뉴사우스웨일즈, 시드니, 시그나 케미칼스-융합시작 15분전에 일반 생리식염수 20 마이크로리터에 1 마이크로리터를 보존용 웰에 가함)로 미리 처리하면, 형광현미경을 사용하여, (제16도 참조) 이동 피펫으로 각 융합챔버로 도입된 MUD50 세포의 수를 두 세포가 융합되기전에 육안으로 셀 수 있었다; 이러한 특징은 후에 융합되지 않은 생존 세포를 웰에서 제거하는데 도움이 되었다. 융합 챔버/웰에서, 고정전극과 융합 전극 사이의 전기장을 약 20,000v/m로 하고, 웰에는 5개의 세포를 도입하고, 1.95 메가헤르츠를 가하면, 단지 2개의 MUD50 세포만이 서로서로 떨어져서 융합전극을 마주보는 안쪽면에 부착하였다. 전이전극을 사용하여 (제19도 내지 제22도 참조), 제3세포와 제4세포를 선택하여 전이조작을 하여(제23도 및 24도 참조) 제4세포를 고정 전극에 부착된 2 세포중 한 세포위로 침착시켜 MUD50 융합쌍을 만들었다. 이동성 융합전극을 섹션 7 실시예2에서 기술한 융합에 적당한 위치(제25도)로 가져오고 고정전극과 융합전극 사이의 전기장을 50,000 볼트/미터로 하면 세포는 자동적으로 길어져서 단단하게 눌려졌다. 강도 100,000 v/m의 DC 펄스를 100 마이크로초동안 적용하면 세포는 융합되었다; 펄스를 준후 30 내지 60초동안 현미경으로 관찰하여 초기 펄스에 대한 융합쌍의 반응정도에 따라 보통 한번 또는 3번의 펄스를 사용하였다. 일단 융합이 일어나면, 제2세포(여전이 고정전극에 부착되어 있는 세포)는 때때로 남아있는 제5세포와 융합하기도 하였다. 어떠한 경우이든지, 이동 피펫으로 남아있는 살아있는 단일세포를 융합 챔버에서 제거하는데 (제27도 참조), 웰 한면에 침착하지 않고 부유하는 세포는 녹색 내부 형광을 이용하여 세어서 제거하기도 하였다. 트리-피펫을 사용하여 즉시 일반배지 [RPMI 1640 + FCS 10%, 항생제 페니실린/스트렙토마이신 0.1㎎/㎖ (오스트레일리아, 뉴사우스웨일즈, 캐슬힐, 시토시스템즈 P/L)]로 희석시켜주고, 웰에 소르비톨의 흔적만이 남을 때까지 웰에 존재하는 소르비톨을 제거하였다.
나머지 6개의 웰에 하나 또는 2개의 융합체가 포함되면, 8 웰 플레이트를 덮어서 CO2배양기로 옮겼다. 모두 10개의 플레이트가 완성되면 내용물을 배양하였다. 융합에 사용한 세포와 동일 배지에서 취한 MUD50 세포주의 세포를 함유하는 플레이트를 같이 배양하였다. 이 세포들은 이원세포 융합체의 분열(성장) 속도, 항체 생산능이 비교에 대조군으로 사용되었다.
[4. 성장(outgrowth)과 스크리닝]
웰을 이틀 간격으로 모니터하여 세포수가 약 1000개에 도달하면 ELISA로 항체 생산 능력을 정량분석하였다. 웰의 상징액을 항-마우스 양(sheep) IgG 항체를 사용하여 분석하여 자동측정기로 읽었다. 모세포주보다 상당히 높은 항체 생산능을 나타내는 (가장 밀도가 큰 대조 플레이트보다 0.3 단위가 큰) 20개의 웰중에서 성장속도가 큰 10개를 선택하여 라이트 체인(light chain) 생산능을 분석하여 (horse radish 퍼옥시다제에 커플링된 항 마우스 항 카파 라이트 체인양 항체, 오스트레일리아, 빅토리아, 파크빌, CSL에서), 7개의 양성 반응 웰을 선택하여 대량배양에 들어갔다. 플루오레세인-접합 항마우스 IgG 항체와 피코에리트린-접합 항-카파 항체로 이중 표식한 각 세포주 세포의 상대 형광강도를 세포측정기로 측정하는 방법을 사용하여 항체 생산능의 안정성을 매주일 측정 비교하였다; 배지부피를 매일 조절하여 5 x 105세포/㎖의 농도를 유지하면 측정하기에 용이하였다. 한달을 관찰한 결과 세포주중 넷은 상대 형광도가 일정하게 유지되었고, 나머지들은 라이트 체인 형광이 감소하였다. 4주일을 더 모니터링하여, 가장 생산성이 큰 세포주 MUD50B을 선택하여 전반적인 특성화 작업을 행하고 보관하였다.
[5. 모세포주와 자세포주의 비교]
상기 세포주의 염색체 형태는 조사해본 결과 모델번호 84 염색체를 가졌으며, 모세포주 MUD50 보다 4개의 염색체를 더 가졌다. 두가지 다른 배양방법으로 두개의 세포주의 평균 세포성 항체 생산율을 측정하였고, 또한 절대적 및 상대적 방법 즉 ELISA 정량분석 및 세포 측정기를 사용하여 두 세포주에서의 항체생산율을 조사하였다. 두가지 측정방법에 의하면, 항체생산율은 자세포주는 모세포주보다 약 70%(85 및 65)더 컸다.
[실시예 4]
[전기선택적으로 피융합쌍을 융합하여 얻은 하이브리도마]
두개의 세포를 선택하여 두개의 피융합 세포에 필요한 기하학적 형태를 만들어준 후 고정 전극이나 융합 전극에 접촉하지 않으면서 융합되는 예이다.
정상분비세포가 B형 간염의 표면항원에 양성인 항체를 생산하는 인간의 말초 혈액세포인 경우에서의, 쌍형성, 뒤이은 밀착, 길이가 늘어나는 것 및 융합과정을 상세히 기술하였다.
[1. 세포]
원하지 않는 교차반응성 세포들을 섹션2 실시예 2에서 기술한 방법에 의해 제거한 후 OKT10 마우스 항체를 사용하여 인간의 말초 혈액중 림포블라스토이드 세포를 풍부하게 하는 방법에 의해 융합에 사용되는 정상 인간 혈액세포를 제조하고, 융합 파트너 세포주 SP2는 성장기중 로그기의 세포 배양액에서 얻었다.
[2. 융합 챔버]
융합 챔버는 8웰 플레이트중 한 웰로서 섹션3 실시예 2에서 기술한 방법으로 준비하였다.
[3. B 세포의 선택]
B형 간염 표면항원에 대한 항체를 가지고 있는 세포를 선택할 수 있도록 상기 기술한 방법으로 블라스트를 풍부하게 한 약 40,000개의 혈액세포를 패닝시켰다. 바닥이 평평한 린브로(Linbro) EIA 96 웰 플레이트를 사용하여, 오스트레일리아 뉴사우스웨일즈 커넬의 오스트레일리아 아보트사에서 구입한 항원을 생리식염수로 pH 9로 맞추어 혈액세포와 밤새 배양한 후, 생리식염수 ㎖당 1㎎의 소혈청 알부민으로 블로킹시켰다. 세포의 선택은 2개의 웰에서 행하여지는데, 각 웰에 20,000 세포를 가하고 37℃에서 1시간동안 배양한 후 배지로 두번 부드럽게 세척하고, 항원용액 50 마이크로리터를 가하여 부착된 세포를 덮어 방출이 용이하게 하였다. 30분 후에 웰을 신선한 배지로 채우고, 세포가 바닥에 떨어지면 다시 교환하였다.
[4. 파트너 세포의 제조]
섹션 2 실시예 3에서 전술한 바와 유사한 방법으로 SP2 세포를 제조하였다. 8 웰 플레이트중 한 Nunc 웰 파트너 세포의 보존용 웰로 명명된 한 웰에 정상배지 0.5㎖을 넣고 여기에 로그기의 SP2 세포 200개를 넣었다. 두번째 웰은 융합 바로전 세척을 위하여 소르비톨 용액(pH 7.5)으로 채웠다. 이동 피펫을 사용하여 SP2 세포의 약간을 세척용 웰에 옮긴후 5분후에 이들중 한개를 융합 챔버로 옮겼다.
[5. 선택된 정상세포의 쌍짓기의 융합을 위한 준비과정]
정상세포 약 200개를 선택하여 린브로 플레이트의 두 웰에 재현탁시킨후, 200 정도의 파트너 세포의 보존용 웰과 파트너 세포의 세척용 웰을 갖고있는 8 웰 플레이트의 세번째 웰로 전부 이전시켰다. 마지막으로, 선택조작전에 정상세포의 세척용 웰로 사용할 수 있도록 4번째 웰을 소르비톨 용액으로 채웠다.
[6. 선택세포의 단지 하나의 쌍 형성]
5분전에 이동 피펫을 사용하여 파트너 세포의 세척용 웰중에 있는 약간의 SP2 세포로부터 단 한개의 SP2 세포를 집어내어 고정 전극과 이동 전극 사이에 주파수 2.00 메가헤르츠, 20,000 볼트/m 강도의 AC 전기장을 갖도록 미리 장치되어진 융합용 웰에 넣었다. 세포가 웰바닥으로 떨어지면서, 고정 전극으로 유인되었다. 세척용 웰에 5분전에 넣어준 정상 분비세포 한개를 잡아내어 융합챔버로 옮겨주면 정상세포는 디일렉트로포레시스 힘에 의해 두 전극중 하나로 서서히 끌려갔다. 정상세포가 전극에 유인되지 않고 웰 바닥에 떨어지거나 두 전극 사이의 공간 바깥으로 나가면, 이동성 융합 전극을 아래로 움직여 정상세포 흡인력을 증가시켜 정상세포가 융합 전극으로 움직여오도록 하였다. 그리고나서 융합 전극을 고정 전극과 같은 깊이로 다시 들어올려 두 전극 사이가 약 300 마이크로미터되도록 분리시키면 두 개 내외의 세포가 나란히되어 밀착이 일어났다(제28도 참조). 전기장 강도를 약 500 v/m, 주파수를 1000 헤르츠로 줄이면 두 세포들은 각각의 전극에서 떨어져 전극사이 공간으로 나왔다. 직경의 5 내지 10배 사이의 거리안에 세포가 들어왔을 때 전기장 주파수를 2.0 메가헤르츠로 강도를 20,000 v/m로 바꾸어 주면 세포들이 나란히 붙었다. 때때로 세포쌍이 전극에 가까이 왔다 멀어졌다 하거나, 세포쌍이 전극 한 부분에 붙어움직이지 않거나 하기도 하였다. 상기와 같이 세포가 부유하면 전기장을 끄고 2개의 세포가 웰 바닥에 떨어지도록 한 후 융합 전극을 웰바닥까지 낮추고 전기장을 다시 켰다. 세포들은 항상 쌍을 형성하며, 전의 70,000 내지 80,000 v/m 보다 약간 높은 전기장 강도에서도 웰바닥에 머물러 있었다. 세포쌍은 한 전극을 향해 이동하였다. 그러나 바닥에 접촉하여 생긴 마찰에 의해 방해를 받는 이유에서인지 매우 천천히 움직여 전극에 접촉하기전에 항상 융합이 일어났다.
이 세포들은 늘어나서 나란히 접촉한 후(제28도 참조), 섹션 3 실시예 3에서 기술한 바와 유사한 방법으로 전기적 펄스에 의해 융합되었다. 다음 조작은 전에 기술한 바와 같은 방법으로 하였다.
넓게 기술된 본 발명의 정신 또는 범위로부터 벗어나지 않고 상기에서 기술한 본 발명에 대해 수많은 변경 및 수정이 행해질 수 있다는 것을 당업자들은 인식할 수 있을 것이다.

Claims (24)

  1. 일정한 리간드를 발현하거나 제공하는 세포, 벡터, 입자 또는 분자를 선택적으로 회수하는 방법에 있어서, 이 방법이 표적의 표면에 일정 리간드에 상보적인 리간드 또는 리간드들을 부착시키는 단계, 세포, 벡터, 입자 또는 분자들중 일부가 일정 리간드를 발현하거나 제공하는 전기적으로 전도성있는 액체중의 세포, 벡터, 입자 또는 분자들의 현탁액 또는 용액속으로 상기 표적을 도입시키는 단계; 적당한 주파수, 강도 및 불균등성의 교류전기장을 현탁액 또는 용액에서 한쌍의 전극사이에 확립시킴으로써 상기 일정 리간드를 발현하거나 제공하는 세포, 벡터, 입자 또는 분자들중 적어도 일부를 상기 표적과 접촉하도록 이동시키고 상보적인 리간드 또는 리간드들과 결합시키는 단계; 및 상기 표적에 결합된 세포, 벡터, 입자 또는 분자들을 현탁액의 다른 세포, 벡터, 입자 또는 분자들중 적어도 일부로부터 분리시키는 단계로 이루어지는 것을 특징으로 하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상보적인 리간드 또는 리간드들이 그 자체가 표적을 구성하는 전극들 중 하나에 부착되는 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제1항에 있어서, 세포, 벡터, 입자 또는 분자들이 표적위의 리간드 또는 리간드들에 결합된 후에 전기장의 주파수 및/또는 강도 및/또는 불균등성을 변화시켜서 그 결합된 세포, 벡터, 입자 또는 분자들중 적어도 일부가 표적으로부터 떨어져 이동되게 하는 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제1항에 있어서, 진동, 교반 또는 다른 기계적 수단을 이용하여 그 결합된 세포, 벡터, 입자 또는 분자들중 적어도 일부를 표적으로부터 분리시키는 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제1항에 있어서, 표적에 결합된 세포, 벡터, 입자 또는 분자들과 현탁액 또는 용액내의 다른 세포, 벡터, 입자 또는 분자들은 결합되지 않은 세포, 벡터, 입자 또는 분자들을 표적으로부터 물리적으로 플러싱시켜서 떨어지게 함으로써 또는 결합되지 않은 세포, 벡터, 입자 또는 분자들의 주변으로부터 그 표적을 제거시킴으로써 분리시키는 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제1항에 있어서, 전극들 사이에서 세포, 벡터, 입자 또는 분자들의 현탁액 또는 용액에 적용된 교류전기장 뿐만 아니라 그안의 세포, 벡터, 입자 또는 분자들에 정상 전기장이 동시에 적용되는 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제1항에 있어서, 표적에 부착된 리간드가 세포 또는 벡터의 일부분이 아닌 화학적 리간드인 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제1항에 있어서, 표적에 부착된 리간드가 세포 또는 벡터의 일부분인 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제1항에 있어서, 이 방법이 세포들의 분리에 사용되는 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 제2항에 있어서, 상보적인 리간드 또는 리간드들이 리간드를 포함하는 용액 또는 현탁액에서 전극과 또다른 전극사이에 적당한 전기장의 적용에 의하여 유도되는 리간드 또는 리간드들의 전극과의 비-특이적인 결합에 의하여 상보적인 리간드 또는 리간드들이 전극에 부착되는 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 제10항에 있어서, 전기장은 리간드들이 다양한 적합한 방향으로 다른 전극위에 침착될 수 있도록 선택된 조합의 교류 전기장과 정상 전기장인 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 전기적으로 전도성있는 액체중의 적어도 두가지 다른 유형의 세포, 벡터, 입자 또는 분자들의 현탁액 또는 용액에서 세포, 벡터, 입자 또는 분자들을 분리하는 방법에 있어서, 이 방법은 액체중의 두 전극사이에 주파수, 강도 및 불균등성의 교류 전기장을 확립시켜 한 유형의 세포, 벡터, 입자 또는 분자들 상기 교류 전기장에 의해 유도된 디일렉트로포레시스 힘에 기인하여, 선택적으로 전극들을 향하여 액체를 통해서 이동하게 하고 동시에 또는 순차적으로 또다른 유형의 세포, 벡터, 입자 또는 분자들을 상기 교류 전기장에 의해 유도된 디일렉트로포레시스 힘에 기인하여, 전극들로부터 떨어져서 액체를 통해 이동하게 하는 단계, 및 전극들을 향하여 이동한 세포, 벡터, 입자 또는 분자들을 전극들로부터 떨어져서 이동한 것들로부터 분리시키는 단계로 이루어지는 것을 특징으로 하는 방법.
  13. 제12항에 있어서, 한 유형의 세포, 벡터, 입자 또는 분자들중 일부 또는 전부가 전극들중 적어도 하나와 접촉되고 그다음 남아있는 세포, 벡터, 입자 또는 분자가 전극 또는 전극들과 접촉한 것들로부터 분리될 때까지 교류 전기장을 유지시키는 것을 특징으로 하는 방법.
  14. 제13항에 있어서, 전극들중 적어도 하나의 표면이 한 유형의 세포, 벡터, 입자 또는 분자들이 특이적으로 결합할 리간드 또는 리간드들을 지니는 것을 특징으로 하는 방법.
  15. 제13항에 있어서, 교류 전기장이 한 유형의 세포, 벡터, 입자 또는 분자들이 전극들을 향하여 액체를 통해서 이동되게 하고 동시에 다른 유형의 세포, 벡터, 입자 또는 분자들이 전극들로부터 떨어져서 이동되게 하는 것을 특징으로 하는 방법.
  16. 제13항에 있어서, 이 방법이 적어도 두 유형의 세포들의 분리에 적용되는 것을 특징으로 하는 방법.
  17. 선택된 제1세포를 선택된 제2세포와 융합시켜서 단일의 융합체 세포를 형성하는 방법에 있어서, (ⅰ) 적어도 하나의 제1세포를 적당한 주파수, 강도 및 불균형성의 교류 전류가 사이에 존재하는 한 쌍의 전극중 제1전극에 물리적 또는 화학적으로 결합시켜 각각의 제1세포가 전극중 하나에 직접적으로 접촉하게 하고, 상기 물리적 또는 화학적 결합이 달성되어 다수의 융합체 세포가 형성될 때 전극들중 상기 하나에 존재하는 세포들이 단지 단일층으로 존재하게 하는 단계; (ⅱ) 단일 제2세포를 제1세포 또는 제1세포들중 하나에 충분히 근접하게 물리적으로 조작하여서 제2세포가 전극들 사이의 교류 전류에 의해 유도되는 상기 제1세포의 국소 디일렉트로포레시스 장에 의해 상기 제1세포와 병치상태로 있게 하는 단계; (ⅲ) 제1 및 제2세포들을 융합하게 하는 단계로 이루어지는 것을 특징으로 하는 방법.
  18. 제17항에 있어서, 제1세포 및 제2세포중 하나가 벡터로 대치되는 것을 특징으로 하는 방법.
  19. 제17항에 있어서, 상기 단일 제2세포를 전극쌍 중 제2전극에 물리적 또는 화학적으로 결합시키고 나서 전극들 중 하나의 물리적 조작에 의해 상기 제1세포와 병치상태로 가져가는 것을 특징으로 하는 방법.
  20. 제19항에 있어서, 제1 및 제2세포들을 그것들이 융합되기 전에 전극들중 적어도 하나로부터 방출시키는 것을 특징으로 하는 방법.
  21. 제20항에 있어서, 제1 및 제2세포들을 그것들이 융합되고 전에 전극 둘다로부터 방출시키는 것을 특징으로 하는 방법.
  22. 제17항에 있어서, 병치된 세포들을 강력한 전기장의 적용, 푸사겐성 화학물질 바이러스 매개 및 이것들의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 푸사겐성 작용제에 의하여 융합시키는 것을 특징으로 하는 방법.
  23. 제19항에 있어서, 상기 제2세포를 제2전극에 부착시키고, 다른 하나의 제2세포를 제2전극에 이미 부착된 제2세포에 부착시키고, 교류 전기장을 변화시켜서 이 다른 제2세포가 제1세포에 가까이 근접하고 있는 제2전극으로부터 방출되게 하여 다른 제2세포가 제2전극으로부터 분리되고, 제2전극을 다른 제2세포와 근접하지 못하게 하고 다시 교류 전기장을 변화시켜서 다른 제2세포가 제1세포와의 병치상태로 이동되게 하는 것을 특징으로 하는 방법.
  24. 제23항에 있어서, 전기장을 변화시켜서 제2전극위의 다른 제2세포가 반드시 제2전극을 물러나게 하지는 않으면서 제1전극위의 제1세포를 향하여 제2전극위의 제2세포로부터 밀려나게하고, 그리고 나서 다른 제2세포가 두 전극사이의 위치에 도달했을 때 전기장을 변화시켜서 다른 제2세포가 제1세포와의 병치상태로 이동되게 하는 것을 특징으로 하는 방법.
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