JP2023134615A - 二本鎖オリゴヌクレオチド、二本鎖オリゴヌクレオチドを含む組成物および複合体ならびに調製方法と使用 - Google Patents

二本鎖オリゴヌクレオチド、二本鎖オリゴヌクレオチドを含む組成物および複合体ならびに調製方法と使用 Download PDF

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カオ、シャン
Shan Gao
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Abstract

【課題】新規な二本鎖オリゴヌクレオチド、当該オリゴヌクレオチドを含む薬物組成物、複合体及びその薬物の調製における使用を提供する。【解決手段】センス鎖とアンチセンス鎖を含む二本鎖オリゴヌクレオチドであって、前記センス鎖及びアンチセンス鎖の各ヌクレオチドがいずれも修飾ヌクレオチドである。【選択図】図１５

Description

本開示は、二本鎖オリゴヌクレオチド、二本鎖オリゴヌクレオチドを含む組成物および
複合体ならびに調製方法と使用に関する。
二本鎖オリゴヌクレオチドは、薬物の活性成分として周知である。低分子核酸薬物の開
発では、送達系は、キー技術の一つである。
そのうち、肝細胞に対する標的複合送達技術である低分子核酸送達系がある。
いくつかの実施形態において、本開示は、二本鎖オリゴヌクレオチドを提供する。前記
二本鎖オリゴヌクレオチドは、センス鎖とアンチセンス鎖を含み、前記センス鎖及びアン
チセンス鎖の各ヌクレオチドがいずれも修飾ヌクレオチドであり、前記センス鎖がヌクレ
オチド配列１を含み、前記アンチセンス鎖がヌクレオチド配列２を含み、前記ヌクレオチ
ド配列１と前記ヌクレオチド配列２の長さがいずれも１９ヌクレオチドであり、前記ヌク
レオチド配列１と前記ヌクレオチド配列２とが、少なくとも一部で逆相補的に二本鎖領域
を形成し、前記ヌクレオチド配列２が、第１のヌクレオチド配列断片と少なくとも一部で
逆相補的であり、前記第１のヌクレオチド配列断片が標的ｍＲＮＡにおけるヌクレオチド
配列断片であり、５’末端から３’末端に向かって、前記ヌクレオチド配列１の第７、８
、９位のヌクレオチドがフルオロ修飾ヌクレオチドであり、前記ヌクレオチド配列１の他
の位置の各ヌクレオチドが独立して非フルオロ修飾ヌクレオチドの１つであり、前記ヌク
レオチド配列２の５’末端の１番目のヌクレオチドがアンチセンス鎖の５’末端の１番目
のヌクレオチドであり、前記ヌクレオチド配列２の第２、６、１４、１６位のヌクレオチ
ドがフルオロ修飾ヌクレオチドであり、前記ヌクレオチド配列２の他の位置の各ヌクレオ
チドが独立して非フルオロ修飾ヌクレオチドの１つである。
いくつかの実施形態において、本開示は、本開示の二本鎖オリゴヌクレオチドを含む薬
物組成物をさらに提供する。当該薬物組成物は、本開示の二本鎖オリゴヌクレオチド及び
薬学的に許容可能な担体を含む。
いくつかの実施形態において、本開示は、本開示の二本鎖オリゴヌクレオチドを含む複
合体をさらに提供する。当該複合体は、本開示の二本鎖オリゴヌクレオチド及び当該二本
鎖オリゴヌクレオチドに複合して結合されるリガンドを含む。
いくつかの実施形態において、本開示は、本開示の二本鎖オリゴヌクレオチド、薬物組
成物又は複合体の、肝細胞における特定の遺伝子の発現による病理学的状態又は疾患の治
療及び／又は予防のための薬物の調製における使用を提供する。
いくつかの実施形態において、本開示は、肝細胞における特定の遺伝子の発現による病
理学的状態又は疾患の治療方法であって、当該疾患に罹患している被験体に本開示の二本
鎖オリゴヌクレオチド、薬物組成物又は複合体を投与することを含む方法を提供する。
いくつかの実施形態において、本開示は、本開示の二本鎖オリゴヌクレオチド、薬物組
成物又は複合体を肝細胞と接触させることを含む、前記肝細胞における特定の遺伝子の発
現の抑制方法を提供する。
いくつかの実施形態において、本開示は、本開示の二本鎖オリゴヌクレオチド、薬物組
成物又は複合体を含むキットを提供する。
本発明の他の特徴と利点については、後述する発明を実施するための形態部分において
詳しく説明する。
［引用による組み込み］
本明細書で言及される全ての出版物、特許及び特許出願は、各々の出版物、特許及び特
許出願が特別にかつ個別に引用により本明細書に組み込まれるのと同じ程度に、引用によ
り本明細書に組み込まれる。
ｓｉＲＮＡ複合体の体外トリトソームにおける安定性試験の半定量的結果を示す。 ｓｉＲＮＡ複合体の体外でのヒト血漿における安定性試験の半定量的結果を示す。 ｓｉＲＮＡ複合体の体外でのサル血漿における安定性試験の半定量的結果を示す。 １０ｍｇ／ｋｇの用量で、ラット血漿における複合体Ａ１（図７）、１０ｍｇ／ｋｇの用量で、ラットの肝臓と腎臓における複合体Ａ１（図８）、５０ｍｇ／ｋｇの用量で、ラット血漿における複合体Ａ１（図９）、５０ｍｇ／ｋｇの用量で、ラットの肝臓と腎臓における複合体Ａ１（図１０）のＰＫ／ＴＫ血漿濃度又は組織濃度の経時的代謝曲線を示す。 それぞれ４４ＢｒｉＨＢＶモデルにおいて本開示の複合体によるＨＢＶ ｍＲＮＡに対する抑制作用を示す。 それぞれＡＡＶ－ＨＢＶモデルにおいて本開示の複合体による血清ＨＢｓＡｇ及びＨＢＶ ＤＮＡに対する経時的な抑制作用を示す。 Ｍ－Ｔｇモデルにおいて本開示の複合体による血清ＨＢｓＡｇに対する経時的な抑制作用を示す。 それぞれ１．２８ｃｏｐｙのＨＢＶ－Ｔｇモデルにおいて本開示の複合体による血清ＨＢｓＡｇ及びＨＢＶ ＤＮＡに対する経時的な抑制作用を示す。 それぞれ異なる濃度の複合体Ａ１によるＧＳＣＭ、ＧＳＳＭ、ＰＳＣＭ及びＰＳＳＭの発現に対する抑制効果を示す。 それぞれ本開示の複合体による体外での標的ｍＲＮＡとオフターゲットｍＲＮＡに対する抑制作用を示す。 それぞれ本開示の複合体の体外での安定性試験結果を示す。 本開示の複合体による体内でのＨＢＶ ｍＲＮＡに対する抑制作用を示す。 本開示の複合体による異なるＨＢＶトランスジェニックマウス血清におけるＨＢｓＡｇ及びＨＢＶ ＤＮＡの発現に対する経時的な抑制作用を示す。 本開示の複合体の体外での安定性試験結果を示す。 本開示の複合体による体外での標的ｍＲＮＡ及びオフターゲットｍＲＮＡに対する抑制効果を示す。 ４４ＢｒｉＨＢＶモデルにおいて本開示の複合体による体内でのｍＲＮＡに対する抑制効果を示す。 本開示の複合体によるマウスにおけるＨＢｓＡｇの発現に対する経時的な抑制作用を示す。 本開示の複合体による体内でのＭ－ＴｇモデルマウスにおけるｍＲＮＡに対する抑制作用を示す。 本開示の複合体の体外での安定性試験結果を示す。 本開示の複合体による体外での標的ｍＲＮＡとオフターゲットｍＲＮＡに対する抑制作用を示す。 本開示の複合体による体内でＨＢＶ ｍＲＮＡに対する抑制作用を示す。 本開示の複合体によるＨＢＶトランスジェニックマウス血清におけるＨＢｓＡｇの発現に対する経時的な抑制作用を示す。 Ｍ－Ｔｇモデルマウスにおける本開示の複合体によるＨＢＶ ｍＲＮＡに対する抑制作用を示す。 比較ｓｉＲＮＡ３による体外での標的ｍＲＮＡとオフターゲットｍＲＮＡに対する抑制作用を示す。 本開示のｓｉＲＮＡ Ｅ１による体外での標的ｍＲＮＡとオフターゲットｍＲＮＡに対する抑制作用を示す。 それぞれ本開示のｓｉＲＮＡとｓｉＲＮＡ複合体による体外でのＡＮＧＰＴＬ３ ｍＲＮＡに対する抑制作用を示す。 それぞれ本開示の複合体の体外での安定性実験結果を示す。 本開示の複合体による脂質（血中脂質）に対する抑制率を示し、血清における総コレステロール（ＣＨＯ）及びトリグリセリド（ＴＧ）で表す。 本開示の複合体による体内でＡＮＧＰＴＬ３ ｍＲＮＡ発現に対する抑制率を示す。 それぞれ本開示の複合体による脂質に対する抑制率を示し、血清総コレステロール（ＣＨＯ）及びトリグリセリド（ＴＧ）で表す。 本開示の複合体による脂質に対する経時的な抑制率を示し、血清総コレステロール（ＣＨＯ）及びトリグリセリド（ＴＧ）で表す。 本開示の複合体によるＡＮＧＰＴＬ３ ｍＲＮＡ発現に対する抑制率を示す。 本開示の複合体による脂質に対する経時的な抑制率を示し、血清総コレステロール（ＣＨＯ）及びトリグリセリド（ＴＧ）で表す。 本開示の複合体による脂質に対する経時的な抑制率を示し、血清総コレステロール（ＣＨＯ）及びトリグリセリド（ＴＧ）で表す。 本開示の複合体による脂質に対する経時的な抑制率を示し、血清総コレステロール（ＣＨＯ）及びトリグリセリド（ＴＧ）で表す。 本開示の複合体によるＡＮＧＰＴＬ３ ｍＲＮＡ発現に対する抑制率を示す。 本開示の複合体による体外でＡＰＯＣ３発現に対する抑制率を示す。 １４日目に、本開示の複合体による肝組織におけるＡＰＯＣ３の発現の抑制率を示す。 本開示の複合体による脂質に対する経時的な抑制率を示し、血清総コレステロール（ＣＨＯ）及びトリグリセリド（ＴＧ）で表す。 本開示の複合体による脂質に対する経時的な抑制率を示し、血清総コレステロール（ＣＨＯ）及びトリグリセリド（ＴＧ）で表す。 異なる用量の本開示の複合体による脂質に対する経時的な抑制率を示し、血清総コレステロール（ＣＨＯ）及びトリグリセリド（ＴＧ）で表す。 本開示の複合体の体外での安定性試験結果を示す。 異なる用量の本開示の複合体による血清表面抗原、血清ｅ抗原及びＨＢＶ ＤＮＡに対する経時的な抑制率を示す。
以下に本開示の発明を実施するための形態を詳しく説明する。また、ここで説明される
発明を実施するための形態は、本開示を説明又は解釈するためのものに過ぎず、本開示を
制限するためのものではないと理解すべきである。
（定義）
文脈において、特に説明がない限り、大文字Ｃ、Ｇ、Ｕ、Ａは、ヌクレオチドの塩基配
列を表し、小文字ｍは、当該文字ｍの左側に隣接する１つのヌクレオチドが２’－メトキ
シ修飾ヌクレオチドであることを表し、小文字ｆは、当該文字ｆの左側に隣接する１つの
ヌクレオチドが２’－フルオロ修飾ヌクレオチドであることを表し、小文字ｓは、当該文
字ｓの左右に隣接する２個のヌクレオチド間がチオリン酸エステル基により結合されてい
ることを表し、Ｐ１は、当該Ｐ１の右側に隣接する１つのヌクレオチドが５’－リン酸ヌ
クレオチド又は５’－リン酸アナログ修飾ヌクレオチドであることを表し、特に、ビニル
リン酸エステル修飾ヌクレオチド（以下の実施例においてＶＰで表される）、５’－リン
酸ヌクレオチド（以下の実施例においてＰで表される）又は５’－チオリン酸エステル修
飾ヌクレオチド（以下の実施例においてＰｓで表される）を指す。
本明細書の文脈において、「相補」又は「逆相補」という用語は、互換的に使用されて
もよく、当業者に周知の意味、即ち、二本鎖核酸分子において、一方の鎖の塩基と他方の
鎖上の塩基とが相補的に対合するという意味を有する。ＤＮＡにおいて、プリン塩基であ
るアデニン（Ａ）は、常にピリミジン塩基であるチミン（Ｔ）（又は、ＲＮＡにおいてウ
ラシル（Ｕ）である）と対合し、プリン塩基であるグアニン（Ｇ）は、常にピリミジン塩
基であるシトシン（Ｃ）と対合する。各塩基対は、いずれも１つのプリンと１つのピリミ
ジンを含む。一方の鎖上のアデニンが常に他方の鎖上のチミン（又はウラシル）と対合す
るとともに、グアニンが常にシトシンと対合する場合、両方の鎖同士が相補的であり、ま
たその相補鎖の配列から鎖の配列を推知できると考えられる。これに応じて、「ミスマッ
チ」は、本分野では、二本鎖核酸において、対応する位置での塩基が相補的に対合して存
在しないことを意味する。
文脈において、特に説明がない限り、「基本的に逆相補的である」とは、関連する２つ
のヌクレオチド配列間に３つ以下の塩基ミスマッチが存在することを指し、「実質的に逆
相補的である」とは、２つのヌクレオチド配列間に１つ以下の塩基ミスマッチが存在する
ことを指し、「完全に相補的である」とは、２つのヌクレオチド配列間に塩基ミスマッチ
が存在しないことを指す。
文脈において、一方のヌクレオチド配列と他方のヌクレオチド配列に「ヌクレオチド差
異」が存在するとは、前者が後者に比べて、同じ位置のヌクレオチドの塩基種類が変化し
たことを指し、例えば、後者において１つのヌクレオチド塩基がＡであるとき、前者の同
じ位置での、対応するヌクレオチド塩基がＵ、Ｃ、Ｇ又はＴである場合に、当該位置で２
つのヌクレオチド配列間にヌクレオチド差異が存在すると認められている。いくつかの実
施形態において、元の位置のヌクレオチドの代わりに無塩基ヌクレオチド又はヌクレオチ
ドアナログを用いる場合、当該位置でヌクレオチド差異が生じたとも考えられる。
文脈において、特に本開示の二本鎖オリゴヌクレオチド、薬物組成物及び／又はオリゴ
ヌクレオチド複合体の調製方法を説明する際に、特に説明がない限り、前記ヌクレオシド
モノマー（ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ ｍｏｎｏｍｅｒ）とは、調製する二本鎖オリゴヌクレ
オチド、薬物組成物及び／又はオリゴヌクレオチド複合体におけるヌクレオチドの種類と
順序に応じてホスホルアミダイト固相合成に用いられる修飾又は未修飾のヌクレオシドモ
ノマー（ｕｎｍｏｄｉｆｉｅｄ ｏｒ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ＲＮＡ ｐｈｏｓｐｈｏｒａ
ｍｉｄｉｔｅｓ。ＲＮＡ ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅｓをＮｕｃｌｅｏｓｉｄｅ
ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅｓということもある）を指す。ホスホルアミダイト固相
合成は、当業者に公知のＲＮＡ合成に用いられる方法である。本開示に用いられるヌクレ
オシドモノマーは、いずれも市販品として購入可能である。
本明細書で用いられる場合、２つのアルファベット文字間又は記号間のものでないダッ
シュ（「－」）は、置換基の結合点の位置を示すために用いられている。例えば、－Ｃ１
－Ｃ１０アルキル－ＮＨ２は、Ｃ１－Ｃ１０アルキル基により結合する。
本明細書で用いられる場合、「任意の」又は「任意に」とは、続いて記載する事象又は
状況が発生してもよく、発生しなくてもよいこと、並びに前記記載が事象又は状況が発生
した場合と発生しない場合を含むことを指す。例えば、「任意に置換されたアルキル」は
、以下の文章で定義される「アルキル」及び「置換アルキル」を含む。１又は複数の置換
基を含む任意の基に関して、これらの基が、立体的に非現実的な、合成上実行不可能な及
び／又は本質的に不安定な、いかなる置換又は置換パターンも導入することは意図されな
いと、当業者に理解される。
本明細書で用いられる場合、「アルキル」とは、特定の数の炭素原子を有する直鎖と分
岐鎖を指し、前記特定の数は、通常１～２０個の炭素原子、例えば、１～１０個の炭素原
子、１～８個又は１～６個の炭素原子である。例えば、Ｃ１－Ｃ６アルキルは、１～６個
の炭素原子の直鎖と分岐鎖アルキルを含む。特定の数の炭素を有するアルキル残基を命名
する場合、当該数の炭素を有する全ての分岐鎖及び直鎖形式を含むことを意図する。した
がって、例えば、「ブチル」は、ｎ－ブチル、ｓｅｃ－ブチル、イソブチル及びｔｅｒｔ
－ブチルを含むことを意味し、「プロピル」は、ｎ－プロピル及びイソプロピルを含む。
アルキレンは、アルキルのサブセットであり、アルキルと同じであるが２つの結合点を有
する残基を指す。
本明細書で用いられる場合、「アルケニル」とは、少なくとも１つの炭素－炭素二重結
合を有する不飽和分岐鎖又は直鎖アルキルを指し、前記炭素－炭素二重結合は、親アルキ
ルの隣接する炭素原子から１つの水素分子を除去することにより得られる。当該基は、二
重結合のシス又はトランス配置にあってもよい。典型的なアルケニルとしては、ビニルと
、プロパ－１－エン－１－イル、プロパ－１－エン－２－イル、プロパ－２－エン－１－
イル（アリル）、プロパ－２－エン－２－イル等のプロペニルと、ブタ－１－エン－１－
イル、ブタ－１－エン－２－イル、２－メチルプロパ－１－エン－１－イル、ブタ－２－
エン－１－イル、ブタ－２－エン－２－イル、ブタ－１，３－ジエン－１－イル、ブタ－
１，３－ジエン－２－イル等のブテニルと、を含むが、これらに限定されない。ある実施
形態において、アルケニルは２～２０個の炭素原子を有し、他の実施形態においては、２
～１０個、２～８個又は２～６個の炭素原子を有する。アルケニレンは、アルケニルのサ
ブセットであり、アルケニルと同じであるが２つの結合点を有する残基を指す。
本明細書で用いられる場合、「アルキニル」とは、少なくとも１つの炭素－炭素三重結
合を有する不飽和分岐鎖又は直鎖アルキル基を指し、前記炭素－炭素三重結合は、親アル
キルの隣接する炭素原子から２つの水素分子を除去することにより得られる。典型的なア
ルキニルとしては、エチニルと、プロパ－１－イン－１－イル、プロパ－２－イン－１－
イル等のプロピニルと、ブタ－１－イン－１－イル、ブタ－１－イン－３－イル、ブタ－
３－イン－１－イル等のブチニルと、を含むが、これらに限定されない。ある実施形態に
おいて、アルキニルは２～２０個の炭素原子を有し、他の実施形態においては、２～１０
、２～８又は２～６個の炭素原子を有する。アルキニレンは、アルキニルのサブセットで
あり、アルキニルと同じであるが２つの結合点を有する残基を指す。
本明細書で用いられる場合、「アルコキシ」とは、酸素橋により結合した特定の数の炭
素原子のアルキルを指し、例えば、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、イソプロポキシ、
ｎ－ブトキシ、ｓｅｃ－ブトキシ、ｔｅｒｔ－ブトキシ、ペンチルオキシ、２－ペンチル
オキシ、イソペンチルオキシ、ネオペンチルオキシ、ヘキシルオキシ、２－ヘキシルオキ
シ、３－ヘキシルオキシ、３－メチルペンチルオキシ等がある。アルコキシは、通常１～
１０個、１～８個、１～６個又は１～４個の、酸素橋により結合した炭素原子を有する。
本明細書で用いられる場合、「アリール」とは、芳香族単環式又は多環式炭化水素環系
から誘導される、環炭素原子から水素原子を除去して形成された基を指す。前記芳香族単
環式又は多環式炭化水素環系は、水素及び６～１８個の炭素原子の炭素のみを含有し、こ
の環系中の環の少なくとも１つは完全不飽和であり、即ち、それは、ヒュッケル理論に従
う環状、非局在化（４ｎ＋２）π－電子系を含む。アリールとしては、フェニル、フルオ
レニル及びナフチル等の基を含むが、これらに限定されない。アリーレンは、アリールの
サブセットであり、アリールと同じであるが２つの結合点を有する残基を指す。
本明細書で用いられる場合、「シクロアルキル」とは、通常３～７個の環状炭素原子を
有する非芳香族炭素環を指す。環は、飽和であってもよいし、１又は複数の炭素－炭素二
重結合を有してもよい。シクロアルキルの実例としては、シクロプロピル、シクロブチル
、シクロペンチル、シクロペンテニル、シクロヘキシル及びシクロヘキセニル、並びにノ
ルボルナン（ｎｏｒｂｏｒｎａｎｅ）等の架橋及びカゴ状環状基を含む。
本明細書で用いられる場合、「ハロゲン置換基」又は「ハロ」とは、フルオロ、クロロ
、ブロモ及びヨードを指し、用語「ハロゲン」は、フッ素、塩素、臭素及びヨウ素を含む
。
本明細書で用いられる場合、「ハロゲン化アルキル」とは、特定の数の炭素原子が１又
は複数、最大許容数までのハロゲン原子で置換された、上記のように定義されるアルキル
基を指す。ハロゲン化アルキルの実例としては、トリフルオロメチル、ジフルオロメチル
、２－フルオロエチル及びペンタフルオロエチルを含むが、これらに限定されない。
「複素環基」とは、２～１２個の炭素原子と、窒素、酸素及び硫黄から選択される１～
６個のヘテロ原子とを含む、安定した３～１８員非芳香族環状基を指す。明細書において
特に説明がない限り、複素環基は、単環、二環、三環又は四環系であり、縮合環又は架橋
環系を含んでもよい。複素環基におけるヘテロ原子は、任意に酸化されてもよい。１又は
複数の窒素原子（存在する場合）は、任意に４級化される。複素環基は、一部飽和又は完
全飽和である。複素環基は、環の任意の原子を介して分子の残りの部分に結合することが
できる。このような複素環基の実例としては、ジオキサニル、チオフェニル［１，３］ジ
スルホニル、デカヒドロイソキノリニル、イミダゾリニル、イミダゾリジニル、イソチア
ゾリジニル、イソオキサゾリジニル、モルホリニル、オクタヒドロインドール、オクタヒ
ドロイソインドール、２－オキサピペラジニル、２－オキサピペリジル、２－オキサピリ
ミジニル、オキサゾリジニル、ピペリジル、ピペラジニル、４－ピペリドニル、ピロリジ
ニル、ピラゾリジル、キヌクリジニル、チアゾリジニル、テトラヒドロフリル、トリスル
ホニル、テトラヒドロピラニル、チオモルホリニル、チアモルホリニル、１－オキソチオ
モルホリニル及び１，１－ジオキソチオモルホリニルを含むが、これらに限定されない。
「ヘテロアリール」とは、２個～１７個の炭素原子と、窒素、酸素及び硫黄から選択さ
れる１～６個のヘテロ原子とを含む、３～１８員芳香環状基から誘導される基を指す。本
明細書で用いられる場合、ヘテロアリールは、単環、二環、三環又は四環系であってもよ
く、この環系中の環の少なくとも１つは完全不飽和であり、即ち、それは、ヒュッケル理
論に従う環状非局在化（４ｎ＋２）π－電子系を含む。ヘテロアリールは、縮合環又は架
橋環系を含む。ヘテロアリールにおけるヘテロ原子は任意に酸化される。１又は複数の窒
素原子（存在する場合）は、任意に４級化される。ヘテロアリールは、環中の任意の原子
により分子の残りの部分に結合する。ヘテロアリールの実例としては、アゼピニル、アク
リジニル、ベンゾイミダゾリル、ベンゾインドール、１，３－ベンゾジオキサゾリル、ベ
ンゾフリル、ベンゾオキサゾリル、ベンゾ［ｄ］チアゾリル、ベンゾチアジアゾリル、ベ
ンゾ［ｂ］［１，４］ジオキサゾリル、ベンゾ［ｂ］［１，４］オキサゾリル、１，４－
ベンゾジオキサゾリル、ベンゾナフトフラニル、ベンゾジアゾリル、ベンゾジオキサフェ
ニル（ｂｅｎｚｏｄｉｏｘａｐｈｅｎｙｌ）、ベンゾピラニル、ベンゾピラノニル（ｂｅ
ｎｚｏｐｙｒａｎｏｎｙｌ）、ベンゾフリル、ベンゾフラノニル、ベンゾチオフェニル、
ベンゾチエノ［３，２－ｄ］ピリミジニル、ベンゾトリアゾリル、ベンゾ［４，６］イミ
ダゾ［１，２－ａ］ピリジル、カルバゾリル、シンノリル、シクロペンタ［ｄ］ピリミジ
ニル、６，７－ジヒドロ－５Ｈ－シクロペンタ［４，５］チエノ［２，３－ｄ］ピリミジ
ニル、５，６－ジヒドロベンゾ［ｈ］キナゾリニル、５，６－ジヒドロベンゾ［ｈ］シン
ノリニル、６，７－ジヒドロ－５Ｈ－ベンゾ［６，７］シクロヘプタ［１，２－ｃ］ピリ
ダジニル、ジベンゾフリル、ジベンゾチオフェニル、フリル、フラノニル、フロ［３，２
－ｃ］ピリジル、５，６，７，８，９，１０－ヘキサヒドロシクロヘプタ［ｄ］ピリミジ
ニル、５，６，７，８，９，１０－ヘキサヒドロシクロオクタ［ｄ］ピリダジニル、５，
６，７，８，９，１０－ヘキサヒドロシクロオクタ［ｄ］ピリジル、イソチアゾリル、イ
ンダゾリル、イミダゾリル、インドール、イソインドール、インドリニル、イソインドリ
ニル、イソキノリル、インドリジニル、イソオキサゾリル、５，８－メタノ－５，６，７
，８－テトラヒドロキナゾリニル、ナフチリジノニル、１，６－ナフチリジノニル、オキ
サジアゾリル、２－オキソアゼピニル、オキサゾリル、オキシラニル、５，６，６ａ，７
，８，９，１０，１０ａ－オクタヒドロベンゾ［Ｈ］キナゾリニル、１－フェニル－１Ｈ
－ピロリル、フェナジニル、フェノチアジニル、フェノキサジニル、フタロイル、プテリ
ジニル、プリニル、ピロリル、ピラゾリル、ピラゾロ［３，４－ｄ］ピリミジニル、ピリ
ジル、ピリド［３，２－ｄ］ピリミジニル、ピリド［３，４－ｄ］ピリミジニル、ピラジ
ニル、ピリミジニル、ピリダジニル、ピロリル、キナゾリニル、キノキサリニル、キノリ
ル、イソキノリル、テトラヒドロキノリル、５，６，７，８－テトラヒドロキナゾリニル
、５，６，７，８－テトラヒドロベンゾ［４，５］チエノ［２，３－ｄ］ピリミジニル、
６，７，８，９テトラヒドロ－５Ｈ－シクロヘプタ［４，５］チエノ［２，３－ｄ］ピリ
ミジニル、５，６，７，８－テトラヒドロピリド［４，５－ｃ］ピリダジニル、チアゾリ
ル、チアジアゾリル、トリアゾリル、テトラゾリル、トリアジニル、チエノ［２，３－ｄ
］ピリミジニル、チエノ［３，２－ｄ］ピリミジニル、チエノ［２，３－ｃ］プリジニル
及びチオフェニルを含むが、これらに限定されない。
本開示において各種のヒドロキシ保護基を用いることができる。一般的には、保護基は
、化学官能性を特定の反応条件に不敏感にすることができ、且つ分子の残りの部分を実質
的に損傷することなく分子中の当該官能性に付加する、及びそれから除去することができ
る。代表的なヒドロキシ保護基は、Ｂｅａｕｃａｇｅら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ １９
９２，４８，２２２３～２３１１、及びＧｒｅｅｎｅａｎｄ Ｗｕｔｓ，Ｐｒｏｔｅｃｔ
ｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｃｈａｐｔｅｒ
２，２ｄ ｅｄ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９１に
開示されており、引用により、上記文献は、全体として本明細書に組み込まれる。いくつ
かの実施形態において、保護基は、塩基性条件で安定しているが、酸性条件で除去される
ことができる。いくつかの実施形態において、本明細書で使用できるヒドロキシ保護基の
非排他的実例としては、ジメトキシトリチル（ＤＭＴ）、モノメトキシトリチル、９－フ
ェニルキサンテン－９－イル（Ｐｉｘｙｌ）「９－ｐｈｅｎｙｌｘａｎｔｈｅｎ－９－ｙ
ｌ（Ｐｉｘｙｌ）」及び９－（ｐ－メトキシフェニル）キサンテン－９－イル（Ｍｏｘ）
「９－（ｐ－ｍｅｔｈｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）ｘａｎｔｈｅｎ－９－ｙｌ（Ｍｏｘ）」を含
む。いくつかの実施形態において、本明細書で使用できるヒドロキシ保護基の非排他的実
例としては、Ｔｒ（トリチル基）、ＭＭＴｒ（４－メトキシトリチル）、ＤＭＴｒ（４，
４’－ジメトキシトリチル）及びＴＭＴｒ（４，４’，４’’－トリメトキシトリチル）
を含む。
「被験体」という用語は、本明細書で用いられる場合、任意の動物、例えば、哺乳動物
又は有袋動物を指す。本開示の主題としては、ヒト、非ヒト霊長類（例えば、アカゲザル
又は他の種類のマカク属のサル）、マウス、ブタ、ウマ、ロバ、ウシ、ヒツジ、ラット及
び任意の種類の家禽を含むが、これらに限定されない。
本明細書で用いられる場合、「治療方法」、「治療」、「軽減」又は「改善」は、ここ
で互換的に使用されてもよい。これらの用語は、有益な又は所望の結果を得る方法を指し
、治療効果を含むが、これに限定されない。「治療効果」は、治療される潜在的障害を根
絶又は改善することを意味する。また、治療効果は、患者が依然として潜在的障害の苦痛
を受ける可能性があるにもかかわらず、潜在的障害に関連する１又は複数の生理的症状を
根絶又は改善することにより、患者に改善が観察されて得られる。
本明細書で用いられる場合、「防止」と「予防」は互換的に使用されてもよい。これら
の用語は、有益又は所望の結果を得る方法を指し、予防効果を含むが、これに限定されな
い。「予防効果」を得るために、当該疾患に対する診断が行っていないかもしれないが、
複合体又は組成物を特定の疾患に罹患するリスクのある患者に投与し、又は疾患の１又は
複数の病理学的症状が報告された患者に投与することができる。
＜修飾二本鎖オリゴヌクレオチド＞
１つの側面において、本開示は、遺伝子発現を調節できる二本鎖オリゴヌクレオチドを
提供する。
本開示の二本鎖オリゴヌクレオチドは、基本的な構造単位としてヌクレオチド基を含み
、前記ヌクレオチド基がリン酸基、リボース基及び塩基を含むことは、当業者に公知であ
るので、ここでは説明を省略する。
ＣＮ１０２１４０４５８Ｂには、ＨＢＶ遺伝子を特異的に抑制するｓｉＲＮＡが開示さ
れており、当該ｓｉＲＮＡの複数種の化学修飾策略を研究している。当該研究によると、
異なる修飾策略により、ｓｉＲＮＡの安定性、生物活性及び細胞毒性等の指標に全く異な
る影響を与えることを見出した。当該研究では、７種類の有効な修飾方法を実証し、未修
飾ｓｉＲＮＡに比べて、そのうちの１つの修飾方法で得られたｓｉＲＮＡは、血液安定性
を向上させるとともに、未修飾ｓｉＲＮＡと基本的に同等の抑制活性を維持する。
本開示の二本鎖オリゴヌクレオチドは、センス鎖とアンチセンス鎖を含み、前記センス
鎖及びアンチセンス鎖の各ヌクレオチドは、いずれも修飾ヌクレオチドであり、前記セン
ス鎖は、ヌクレオチド配列１を含み、前記アンチセンス鎖は、ヌクレオチド配列２を含み
、前記ヌクレオチド配列１と前記ヌクレオチド配列２の長さは、いずれも１９ヌクレオチ
ドであり、前記ヌクレオチド配列１と前記ヌクレオチド配列２とは、少なくとも一部で逆
相補的に二本鎖領域を形成し、前記ヌクレオチド配列２は、第１のヌクレオチド配列断片
と少なくとも一部で逆相補的であり、前記第１のヌクレオチド配列断片は、標的ｍＲＮＡ
におけるヌクレオチド配列断片であり、５’末端から３’末端に向かって、前記ヌクレオ
チド配列１の第７、８、９位のヌクレオチドがフルオロ修飾ヌクレオチドであり、前記ヌ
クレオチド配列１の他の位置の各ヌクレオチドが独立して非フルオロ修飾ヌクレオチドの
１つであり、前記ヌクレオチド配列２の５’末端の１番目のヌクレオチドがアンチセンス
鎖の５’末端の１番目のヌクレオチドであり、前記ヌクレオチド配列２の第２、６、１４
、１６位のヌクレオチドがフルオロ修飾ヌクレオチドであり、前記ヌクレオチド配列２の
他の位置の各ヌクレオチドが独立して非フルオロ修飾ヌクレオチドの１つである。本開示
の文脈において、「フルオロ修飾ヌクレオチド」とは、ヌクレオチドのリボース基の２’
位のヒドロキシ基がフッ素で置換されたヌクレオチドを指し、「非フルオロ修飾ヌクレオ
チド」とは、ヌクレオチドのリボース基の２’位のヒドロキシ基が非フッ素化基で置換さ
れたヌクレオチド又はヌクレオチドアナログを指す。
「ヌクレオチドアナログ」とは、核酸においてヌクレオチドの代わりとなることができ
るが、アデニンリボヌクレオチド、グアニンリボヌクレオチド、シトシンリボヌクレオチ
ド、ウラシルリボヌクレオチド又はチミンデオキシリボヌクレオチドと構造が異なる基を
指し、例えば、イソヌクレオチド、架橋ヌクレオチド（ｂｒｉｄｇｅｄ ｎｕｃｌｅｉｃ
ａｃｉｄ、ＢＮＡ）又は非環式ヌクレオチドがある。
いくつかの実施形態において、ヌクレオチド配列２は、第１のヌクレオチド配列断片と
基本的に逆相補的、基本的に完全に逆相補的又は完全に逆相補的である。
いくつかの実施形態において、５’末端から３’末端に向かって、前記ヌクレオチド配
列２の少なくとも第２～１９位のヌクレオチドは、第１のヌクレオチド配列断片と相補的
である。いくつかの具体的な実施形態において、５’末端から３’末端に向かって、前記
ヌクレオチド配列２の第１位のヌクレオチドは、Ａ又はＵである。
いくつかの実施形態において、前記ヌクレオチド配列１と前記ヌクレオチド配列２は、
基本的に逆相補的、基本的に完全に逆相補的又は完全に逆相補的である。
いくつかの実施形態において、前記センス鎖は、ヌクレオチド配列３をさらに含み、前
記アンチセンス鎖は、ヌクレオチド配列４をさらに含み、ヌクレオチド配列３とヌクレオ
チド配列４の各ヌクレオチドは、独立して非フルオロ修飾ヌクレオチドの１つであり、前
記ヌクレオチド配列３と前記ヌクレオチド配列４の長さは、それぞれ１～４ヌクレオチド
であり、前記ヌクレオチド配列３と前記ヌクレオチド配列４は、長さが等しく、基本的に
完全に逆相補的又は完全に逆相補的であり、前記ヌクレオチド配列３は、前記ヌクレオチ
ド配列１の５’末端に結合され、前記ヌクレオチド配列４は、前記ヌクレオチド配列２の
３’末端に結合され、前記ヌクレオチド配列４は、第２のヌクレオチド配列断片と基本的
に完全に逆相補的又は完全に逆相補的であり、当該第２のヌクレオチド配列断片とは、標
的ｍＲＮＡにおける第１のヌクレオチド配列断片に隣接し、長さが前記ヌクレオチド配列
４と同じヌクレオチド配列を指す。
いくつかの実施形態において、前記ヌクレオチド配列３と前記ヌクレオチド配列４は、
完全に相補的であり、前記ヌクレオチド配列３と前記ヌクレオチド配列４は、長さがいず
れも１ヌクレオチドであり、ヌクレオチド配列４は、第２のヌクレオチド配列断片と完全
に逆相補的であり、或いは、前記ヌクレオチド配列３と前記ヌクレオチド配列４は、完全
に相補的であり、前記ヌクレオチド配列３と前記ヌクレオチド配列４は、長さがいずれも
２ヌクレオチドであり、ヌクレオチド配列４は、第２のヌクレオチド配列断片と完全に逆
相補的であり、或いは、前記ヌクレオチド配列３と前記ヌクレオチド配列４は、完全に相
補的であり、前記ヌクレオチド配列３と前記ヌクレオチド配列４は、長さがいずれも３ヌ
クレオチドであり、ヌクレオチド配列４は、第２のヌクレオチド配列断片と完全に逆相補
的であり、或いは、前記ヌクレオチド配列３と前記ヌクレオチド配列４は、完全に相補的
であり、前記ヌクレオチド配列３と前記ヌクレオチド配列４は、長さがいずれも４ヌクレ
オチドであり、ヌクレオチド配列４は、第２のヌクレオチド配列断片と完全に逆相補的で
ある。
前記ヌクレオチド配列３と前記ヌクレオチド配列４は、完全に逆相補的であり、ヌクレ
オチド配列４は、第２のヌクレオチド配列断片と完全に逆相補的であり、標的ｍＲＮＡに
関連するヌクレオチド配列が決定されると、前記ヌクレオチド配列３と前記ヌクレオチド
配列４も決定される。
したがって、前記センス鎖又はアンチセンス鎖の長さは、独立して１９～２３ヌクレオ
チドであってもよい。
いくつかの実施形態において、前記二本鎖オリゴヌクレオチドは、ヌクレオチド配列５
をさらに含み、前記ヌクレオチド配列５の各ヌクレオチドは、独立して非フルオロ修飾ヌ
クレオチドの１つであり、前記ヌクレオチド配列５は、長さが１～３ヌクレオチドであり
、前記アンチセンス鎖の３’末端に結合され、前記アンチセンス鎖の３’オーバーハング
末端を構成する。
このように、本開示により提供される二本鎖オリゴヌクレオチドのセンス鎖とアンチセ
ンス鎖の長さの比が、１９／１９、１９／２０、１９／２１、１９／２２、２０／２０、
２０／２１、２０／２２、２０／２３、２１／２１、２１／２２、２１／２３、２１／２
４、２２／２２、２２／２３、２２／２４、２２／２５、２３／２３、２３／２４、２３
／２５又は２３／２６であってもよい。
いくつかの実施形態において、前記ヌクレオチド配列５の長さは、２ヌクレオチドであ
り、５’末端から３’末端に向かって、前記ヌクレオチド配列５は、連続した２個のチミ
ンデオキシリボヌクレオチド、連続した２個のウラシルリボヌクレオチドであり、又は第
３のヌクレオチド配列断片と完全に逆相補的であり、前記第３の配列断片とは、標的ｍＲ
ＮＡにおける第１のヌクレオチド配列断片又は第２のヌクレオチド配列断片に隣接し、長
さが前記ヌクレオチド配列５に等しいヌクレオチド配列を指す。
したがって、いくつかの実施形態において、本開示により提供される二本鎖オリゴヌク
レオチドのセンス鎖とアンチセンス鎖の長さの比が１９／２１又は２１／２３であり、こ
のとき、本開示により提供される二本鎖オリゴヌクレオチドは、より良好な標的ｍＲＮＡ
サイレンシング活性を有する。
文脈において、フルオロ修飾ヌクレオチドとは、式（１０１）に示されるように、ヌク
レオチドのリボース基の２’位のヒドロキシ基がフッ素で置換されたヌクレオチドを指し
、そのうちのＢａｓｅは、Ｃ、Ｇ、Ａ又はＵから選択される塩基を表す。
非フルオロ修飾ヌクレオチドとは、ヌクレオチドのリボース基の２’位のヒドロキシ基
が非フッ素化基で置換されたヌクレオチド又はヌクレオチドアナログを指す。いくつかの
実施形態において、各非フルオロ修飾ヌクレオチドは、ヌクレオチドのリボース基の２’
位のヒドロキシ基が非フッ素化基で置換されたヌクレオチド又はヌクレオチドアナログか
ら独立して選択される１つである。
これらのリボース基の２’位のヒドロキシ基が非フッ素化基で置換されたヌクレオチド
は、当業者に公知であり、これらのヌクレオチドは、例えば、２’－アルコキシ修飾ヌク
レオチド、２’－置換アルコキシ修飾ヌクレオチド、２’－アルキル修飾ヌクレオチド、
２’－置換アルキル修飾ヌクレオチド、２’－アミノ修飾ヌクレオチド、２’－置換アミ
ノ修飾ヌクレオチド、２’－デオキシヌクレオチドから選択される１つであってもよい。
いくつかの実施形態において、２’－アルコキシ修飾ヌクレオチドは、式（１０２）に
示される、メトキシ修飾ヌクレオチド（２’－ＯＭｅ）であってもよい。いくつかの実施
形態において、２’－置換アルコキシ修飾ヌクレオチドは、式（１０３）に示される、２
’－Ｏ－メトキシエチル修飾ヌクレオチド（２’－ＭＯＥ）であってもよい。いくつかの
実施形態において、２’－アミノ修飾ヌクレオチド（２’－ＮＨ２）は、式（１０４）に
示される。いくつかの実施形態において、２’－デオキシヌクレオチド（ＤＮＡ）は、式
（１０５）に示される。
Figure 2023134615000002
ヌクレオチドアナログとは、核酸においてヌクレオチドの代わりとなることができるが、
アデニンリボヌクレオチド、グアニンリボヌクレオチド、シトシンリボヌクレオチド、ウ
ラシルリボヌクレオチド又はチミンデオキシリボヌクレオチドと構造が異なる基を指す。
いくつかの実施形態において、ヌクレオチドアナログは、イソヌクレオチド、架橋ヌクレ
オチド（ｂｒｉｄｇｅｄ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ、ＢＮＡ）又は非環式ヌクレオチド
であってもよい。
ＢＮＡとは、拘束された又は近づけないヌクレオチドを指す。ＢＮＡは、五員環、六員
環、又は七員環の、「固定された」Ｃ３’－エンド糖パッカリングを有する架橋構造を含
んでもよい。通常当該橋を当該リボースの２’－、４’－位に導入して２’，４’－ＢＮ
Ａヌクレオチド、例えば、式（１０６）に示されるＬＮＡ、式（１０７）に示されるＥＮ
Ａ、式（１０８）に示されるｃＥＴ ＢＮＡ等を提供する。
Figure 2023134615000003
非環式ヌクレオチドとは、ヌクレオチドの糖環が開環された「開環」ヌクレオチド、例
えば、式（１０９）に示されるアンロックド核酸（ＵＮＡ）、又は式（１１０）に示され
るグリセロール核酸（ＧＮＡ）を指す。
Figure 2023134615000004
上記式（１０９）及び式（１１０）中、Ｒは、Ｈ、ＯＨ又はアルコキシ（Ｏ－アルキル
）から選択される。
イソヌクレオチドとは、ヌクレオチドにおいて塩基のリボース環における位置が変化し
た化合物を指し、例えば、式（１１１）又は（１１２）に示される、塩基がリボース環の
１’－位から２’－位又は３’－位に移行した化合物であってもよい。
Figure 2023134615000005
上記式（１１１）～式（１１２）の化合物において、Ｂａｓｅは、Ａ、Ｕ、Ｇ、Ｃ又は
Ｔ等の塩基を表し、Ｒは、Ｈ、ＯＨ、Ｆ又は上述した非フッ素化基から選択される。
いくつかの実施形態において、ヌクレオチドアナログは、イソヌクレオチド、ＬＮＡ、
ＥＮＡ、ｃＥＴ、ＵＮＡ及びＧＮＡから選択される１つである。いくつかの実施形態にお
いて、各非フルオロ修飾ヌクレオチドは、いずれもメトキシ修飾ヌクレオチドであり、文
脈において、前記メトキシ修飾ヌクレオチドは、リボース基の２’－ヒドロキシ基がメト
キシ基で置換されたヌクレオチドを指す。
文脈において、「フルオロ修飾ヌクレオチド」、「２’－フルオロ修飾ヌクレオチド」
、「リボース基の２’－ヒドロキシ基がフッ素で置換されたヌクレオチド」及び「２’－
フルオロリボース基」は、意味が同じであり、いずれもヌクレオチドの２’－ヒドロキシ
基がフッ素で置換された、式（１０１）に示される構造を有する化合物を指し、「メトキ
シ修飾ヌクレオチド」、「２’－メトキシ修飾ヌクレオチド」、「リボース基の２’－ヒ
ドロキシ基がメトキシ基で置換されたヌクレオチド」及び「２’－メトキシリボース基」
は、意味が同じであり、いずれもヌクレオチドリボース基の２’－ヒドロキシ基がメトキ
シ基で置換されて式（１０２）に示される構造を形成するものを指す。
いくつかの実施形態において、本開示の二本鎖オリゴヌクレオチドは、血中のリボヌク
レアーゼによる切断に抵抗することにより、核酸の血液安定性を向上させ、核酸により強
いヌクレアーゼ加水分解耐性を持たせるとともに、高い標的遺伝子調節活性を維持するこ
とができる。
いくつかの実施形態において、本開示に記載された二本鎖オリゴヌクレオチドは、動物
実験において血漿中安定性と遺伝子発現調節効率の高度なバランスが取られており、かつ
、いくつかは、より簡単で、コストがより低い利点をさらに有する。いくつかの例を以下
に示す。
５’末端から３’末端に向かって、前記センス鎖において、前記ヌクレオチド配列１の
第７、８、９位のヌクレオチドがフルオロ修飾ヌクレオチドであり、前記センス鎖におい
て他の位置のヌクレオチドがメトキシ修飾ヌクレオチドであり、また、前記アンチセンス
鎖において、前記ヌクレオチド配列２の第２、６、１４、１６位のヌクレオチドがフルオ
ロ修飾ヌクレオチドであり、前記アンチセンス鎖において他の位置のヌクレオチドがメト
キシ修飾ヌクレオチドである。
いくつかの実施形態において、本開示の二本鎖オリゴヌクレオチドは、他の修飾ヌクレ
オチド基をさらに含み、前記修飾ヌクレオチド基により、前記二本鎖オリゴヌクレオチド
が標的遺伝子発現を調節する機能を明らかに弱める又は喪失させることがない。
現在、本分野では、二本鎖オリゴヌクレオチドの修飾に使用できる複数種の方法があり
、以上の文章で言及されたリボース基修飾のほか、骨格修飾（例えば、リン酸基修飾）及
び塩基修飾等をさらに含む（例えば、Ｗａｔｔｓ，Ｊ．Ｋ．，Ｇ．Ｆ．Ｄｅｌｅａｖｅｙ
ａｎｄ Ｍ．Ｊ．Ｄａｍｈａ，Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｓｉＲＮＡ
：ｔｏｏｌｓ ａｎｄ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ． Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ Ｔｏｄ
ａｙ，２００８．１３（１９－２０）：ｐ．８４２～５５を参照し、引用によりその内容
が全体として本明細書に組み込まれる）。
いくつかの実施形態において、前記センス鎖と前記アンチセンス鎖において少なくとも
１本の一本鎖のリン酸－糖骨格中のリン酸エステル基の少なくとも１つは、修飾基を有す
るリン酸エステル基である。前記修飾基を有するリン酸エステル基は、リン酸エステル基
におけるリン酸ジエステル結合の少なくとも１つの酸素原子が硫黄原子で置換されたチオ
リン酸エステル基であり、１つの硫黄原子でリン酸ジエステル結合における非架橋酸素原
子を置換することで、チオリン酸ジエステル結合でリン酸ジエステル結合を置換し、即ち
、２個のヌクレオチド間がチオリン酸エステル基により結合されている、式（１２１）に
示されるチオリン酸（ｐｈｏｓｐｈｏｒｔｈｉｏａｔｅ）構造であってもよい。当該修飾
により、二本鎖オリゴヌクレオチドの構造を安定化させ、塩基対合の高い特異性と高い親
和力を維持することができる。
Figure 2023134615000006
いくつかの実施形態において、前記二本鎖オリゴヌクレオチドにおいて、チオリン酸エ
ステル基は、センス鎖又はアンチセンス鎖の任意の一端の１番目のヌクレオチドと２番目
のヌクレオチドとの間、センス鎖又はアンチセンス鎖の任意の一端の２番目のヌクレオチ
ドと３番目のヌクレオチドとの間、又はそれらの任意の組合せの少なくとも１つに結合さ
れて存在する。いくつかの実施形態において、チオリン酸エステル基は、センス鎖の５’
末端を除く全ての上記位置に結合されて存在する。いくつかの実施形態において、チオリ
ン酸エステル基は、センス鎖の３’末端を除く全ての上記位置に結合されて存在する。い
くつかの実施形態において、チオリン酸エステル基は、以下の位置のうち少なくとも一箇
所に結合されて存在する。
前記センス鎖の５’末端から１番目のヌクレオチドと２番目のヌクレオチドとの間、
前記センス鎖の５’末端から２番目のヌクレオチドと３番目のヌクレオチドとの間、
前記センス鎖の３’末端から１番目のヌクレオチドと２番目のヌクレオチドとの間、
前記センス鎖の３’末端から２番目のヌクレオチドと３番目のヌクレオチドとの間、
前記アンチセンス鎖の５’末端から１番目のヌクレオチドと２番目のヌクレオチドとの
間、
前記アンチセンス鎖の５’末端から２番目のヌクレオチドと３番目のヌクレオチドとの
間、
前記アンチセンス鎖の３’末端から１番目のヌクレオチドと２番目のヌクレオチドとの
間、及び
前記アンチセンス鎖の３’末端から２番目のヌクレオチドと３番目のヌクレオチドとの
間。
いくつかの実施形態において、前記二本鎖オリゴヌクレオチド分子のアンチセンス鎖配
列の５’末端ヌクレオチドは、５’－リン酸ヌクレオチド又は５’－リン酸アナログ修飾
ヌクレオチドである。
いくつかの実施形態において、５’－リン酸ヌクレオチドは、式（１２２）に示される
構造を有する。
Figure 2023134615000007
同時に、慣用の前記５’－リン酸アナログ修飾ヌクレオチドの種類は、当業者に公知で
あり、例えば、Ａｎａｓｔａｓｉａ Ｋｈｖｏｒｏｖａ ａｎｄ Ｊｏｎａｔｈａｎ Ｋ
． Ｗａｔｔｓ，Ｔｈｅ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ｏｌｉｇｏｎ
ｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｔｈｅｒａｐｉｅｓ ｏｆ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｕｔｉｌｉｔｙ．
Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０１７，３５（３）：２３８～４８に
は、式（１２３）から式（１２６）に示されるヌクレオチドが開示されている。
Figure 2023134615000008
 ただし、Ｒは、Ｈ、ＯＨ、Ｆ及びメトキシ基からなる群から選択される基を表し、Ｂａ
ｓｅは、Ａ、Ｕ、Ｃ、Ｇ又はＴから選択される塩基を表す。
いくつかの実施形態において、５’－リン酸アナログ修飾ヌクレオチドは、式（１２３
）に示される、ビニルリン酸エステル（Ｅ－ｖｉｎｙｌｐｈｏｓｐｈｏｎａｔｅ、Ｅ－Ｖ
Ｐ）を含むヌクレオチド、又は式（１２５）に示される、チオリン酸エステルを含むヌク
レオチドである。
本明細書に開示された修飾手段は、遺伝子発現を調節する各種の二本鎖オリゴヌクレオ
チドに適用することができる。いくつかの実施形態において、遺伝子発現を抑制又は下方
制御する二本鎖オリゴヌクレオチド、例えば、ｓｉＲＮＡであってもよく、いくつかの実
施形態において、遺伝子発現を活性化又は上方制御する二本鎖オリゴヌクレオチド、例え
ば、ｓａＲＮＡであってもよい。
本開示の修飾手段を採用した二本鎖オリゴヌクレオチドは、意外に、血液における安定
性を向上させ、リソソームにおける安定性を向上させ、オフターゲット効果を低減し、及
び／又は、二本鎖オリゴヌクレオチドの活性を向上させることができる。同時に、標的遺
伝子発現調節活性は、顕著に低下しておらず、優れた体内抑制効果を示す。
本開示により提供される修飾二本鎖オリゴヌクレオチド、薬物組成物及び複合体は、各
種の遺伝子の異常発現を調節し、遺伝子の異常発現による各種の病理学的状態又は疾患を
治療するために用いることができる。これらの遺伝子は、人体又は動物体内での各種の内
因性遺伝子であってもよく、人体又は動物体内で繁殖する病原体遺伝子であってもよい。
目的とする標的点ｍＲＮＡにより特定のヌクレオチド配列及び前記修飾手段を有する二本
鎖オリゴヌクレオチドを設計し調製することができる。
本開示のいくつかの実施形態により、本開示の二本鎖オリゴヌクレオチドは、例えば、
以下のｓｉＲＮＡであってもよい。
前記ヌクレオチド配列１は、配列番号１に示される配列であり、前記ヌクレオチド配列
２は、配列番号２に示される配列であり、或いは
前記ヌクレオチド配列１は、配列番号３に示される配列であり、前記ヌクレオチド配列
２は、配列番号４に示される配列であり、或いは
前記ヌクレオチド配列１は、配列番号５に示される配列であり、前記ヌクレオチド配列
２は、配列番号６に示される配列であり、或いは
前記ヌクレオチド配列１は、配列番号７に示される配列であり、前記ヌクレオチド配列
２は、配列番号８に示される配列であり、或いは
前記ヌクレオチド配列１は、配列番号９に示される配列であり、前記ヌクレオチド配列
２は、配列番号１０に示される配列であり、或いは
前記ヌクレオチド配列１は、配列番号１１に示される配列であり、前記ヌクレオチド配
列２は、配列番号１２に示される配列であり、或いは
前記ヌクレオチド配列１は、配列番号１３に示される配列であり、前記ヌクレオチド配
列２は、配列番号１４に示される配列である。
５’－ＣｍＣｍＵｍＵｍＧｍＡｍＧｆＧｆＣｆＡｍＵｍＡｍＣｍＵｍＵｍＣｍＡｍＡｍ
Ａｍ－３’（配列番号１）
５’－ＵｍＵｆＵｍＧｍＡｍＡｆＧｍＵｍＡｍＵｍＧｍＣｍＣｍＵｆＣｍＡｆＡｍＧｍ
Ｇｍ－３’（配列番号２）
５’－ＵｍＧｍＣｍＵｍＡｍＵｍＧｆＣｆＣｆＵｍＣｍＡｍＵｍＣｍＵｍＵｍＣｍＵｍ
Ａｍ－３’（配列番号３）
５’－ＵｍＡｆＧｍＡｍＡｍＧｆＡｍＵｍＧｍＡｍＧｍＧｍＣｍＡｆＵｍＡｆＧｍＣｍ
Ａｍ－３’（配列番号４）
５’－ＵｍＣｍＵｍＧｍＵｍＧｍＣｆＣｆＵｆＵｍＣｍＵｍＣｍＡｍＵｍＣｍＵｍＧｍ
Ａｍ－３’（配列番号５）
５’－ＵｍＣｆＡｍＧｍＡｍＵｆＧｍＡｍＧｍＡｍＡｍＧｍＧｍＣｆＡｍＣｆＡｍＧｍ
Ａｍ－３’（配列番号６）
５’－ＣｍＧｍＵｍＧｍＵｍＧｍＣｆＡｆＣｆＵｍＵｍＣｍＧｍＣｍＵｍＵｍＣｍＡｍ
Ａｍ－３’（配列番号７）
５’－ＵｍＵｆＧｍＡｍＡｍＧｆＣｍＧｍＡｍＡｍＧｍＵｍＧｍＣｆＡｍＣｆＡｍＣｍ
Ｇｍ－３’（配列番号８）
５’－ＧｍＡｍＡｍＡｍＧｍＵｍＡｆＵｆＧｆＵｍＣｍＡｍＡｍＣｍＧｍＡｍＡｍＵｍ
Ａｍ－３’（配列番号９）
５’－ＵｍＡｆＵｍＵｍＣｍＧｆＵｍＵｍＧｍＡｍＣｍＡｍＵｍＡｆＣｍＵｆＵｍＵｍ
Ｃｍ－３’（配列番号１０）
５’－ＣｍＣｍＡｍＡｍＧｍＡｍＧｆＣｆＡｆＣｍＣｍＡｍＡｍＧｍＡｍＡｍＣｍＵｍ
Ａｍ－３’（配列番号１１）
５’－ＵｍＡｆＧｍＵｍＵｍＣｆＵｍＵｍＧｍＧｍＵｍＧｍＣｍＵｆＣｍＵｆＵｍＧｍ
Ｇｍ－３’（配列番号１２）
５’－ＣｍＡｍＡｍＵｍＡｍＡｍＡｆＧｆＣｆＵｍＧｍＧｍＡｍＣｍＡｍＡｍＧｍＡｍ
Ａｍ－３’（配列番号１３）
５’－ＵｍＵｆＣｍＵｍＵｍＧｆＵｍＣｍＣｍＡｍＧｍＣｍＵｍＵｆＵｍＡｆＵｍＵｍ
Ｇｍ－３’（配列番号１４）
ただし、大文字Ｃ、Ｇ、Ｕ、Ａはヌクレオチドの塩基配列を表し、小文字ｍは、当該文
字ｍの左側に隣接する１つのヌクレオチドが２’－メトキシ修飾ヌクレオチドであること
を表し、小文字ｆは、当該文字ｆの左側に隣接する１つのヌクレオチドが２’－フルオロ
修飾ヌクレオチドであることを表す。
本開示のいくつかの実施形態により、本開示の二本鎖オリゴヌクレオチドは、例えば、
表１Ａ～１Ｆに示すｓｉＲＮＡであってもよい。
［表１］
いくつかの実施形態におけるｓｉＲＮＡ配列
Figure 2023134615000009
Figure 2023134615000010
Figure 2023134615000011
Figure 2023134615000012
Figure 2023134615000013
Figure 2023134615000014
Figure 2023134615000015
Figure 2023134615000016
＊Ｓ：センス鎖、ＡＳ：アンチセンス鎖
ただし、大文字Ｃ、Ｇ、Ｕ、Ａはヌクレオチドの塩基配列を表し、小文字ｍは、当該文
字ｍの左側に隣接する１つのヌクレオチドが２’－メトキシ修飾ヌクレオチドであること
を表し、小文字ｆは、当該文字ｆの左側に隣接する１つのヌクレオチドが２’－フルオロ
修飾ヌクレオチドであることを表し、小文字ｓは、当該文字ｓの左右に隣接する２個のヌ
クレオチド間がチオリン酸エステル基により結合されていることを表し、Ｐ１は、当該Ｐ
１の右側に隣接する１つのヌクレオチドが５’－リン酸ヌクレオチド又は５’－リン酸ア
ナログ修飾ヌクレオチドであることを表し、いくつかの実施形態において、ビニルリン酸
エステル修飾ヌクレオチド（以下の実施例においてＶＰで表される）、５’－リン酸修飾
ヌクレオチド（以下の実施例においてＰで表される）又はチオリン酸エステル修飾ヌクレ
オチド（以下の実施例においてＰｓで表される）である。
当業者であれば明らかに知っているように、本分野における通常の二本鎖オリゴヌクレ
オチド調製方法（例えば、固相合成方法及び液相合成方法）により本開示に記載された二
本鎖オリゴヌクレオチドを得ることができる。ここで、固相合成は、既に商用カスタマイ
ズサービスが行われている。対応する修飾を有するヌクレオチドモノマーを用いることに
より修飾ヌクレオチド基を本開示に記載された二本鎖オリゴヌクレオチドに導入すること
ができ、対応する修飾を有するヌクレオチドモノマーを調製する方法、及び修飾ヌクレオ
チド基を二本鎖オリゴヌクレオチドに導入する方法も、当業者によく知られている。
本開示により提供される修飾二本鎖オリゴヌクレオチドは、単独で用いられてもよいし
、薬学的に許容可能な担体と薬物組成物を形成してもよいし、複合分子と結合して複合体
を形成してもよいし、他の形式であってもよい。前記二本鎖オリゴヌクレオチド、前記薬
物組成物又は複合体の有効量を細胞と接触し、目的遺伝子の発現を調節し、或いは、前記
二本鎖オリゴヌクレオチド、前記薬物組成物又は複合体を被験体に投与し、目的遺伝子の
発現を調節し、目的遺伝子の異常発現による病理学的状態又は疾患の治療を達成する。
適切な担体と薬物組成物を形成したり、適切な複合分子と複合体を形成することにより
、さらに本開示の二本鎖オリゴヌクレオチドの血液安定性を改善し、その標的性を向上さ
せ、本開示の二本鎖オリゴヌクレオチドの体内送達問題等を解決することができる。二本
鎖オリゴヌクレオチドに対しては、標的性を付与又は向上できる担体又は複合分子は、二
本鎖オリゴヌクレオチドの目的遺伝子発現を調節する効率を大幅に向上させるとともに、
潜在的副作用を低下させるため、十分に有利である。さらに、標的性担体又は複合分子を
導入した後、二本鎖オリゴヌクレオチドは、さらに、標的部位で作用できることが必要で
あり、即ち、担体又は複合分子の包み込み／複合は、二本鎖オリゴヌクレオチド自体の活
性に影響してはならない（例えば、二本鎖オリゴヌクレオチドがｓｉＲＮＡである場合に
、ｓｉＲＮＡを細胞内に取り込むＲＮＡｉ機構、即ち、ＲＩＳＣコンプレックスに影響し
てはならない）。また、これらの標的担体又は複合分子には、さらに、良好な生体適合性
及びできるだけ低い毒性を有することが求められる。
前記薬物組成物は、体の各部位に系統的に分布してもよいし、又は体の特定の部位に特
異的に富化してもよい。前記複合体は、一般的に標的性を有し、標的遺伝子の人体、動物
体内での発現分布により複合分子の種類を相応に変更し、前記二本鎖オリゴヌクレオチド
を関連部位に送達する目的を達成することができ、例えば、複合分子は、肝臓、肺、腎臓
又は癌細胞を標的する複合分子であってもよい。
いくつかの実施形態において、本開示は、上記修飾二本鎖オリゴヌクレオチド及び薬学
的に許容可能な担体を含む薬物組成物をさらに提供する。薬学的に許容可能な担体は、い
かなる使用可能な担体であってもよい。
いくつかの実施形態において、本開示は、上記修飾二本鎖オリゴヌクレオチド及び当該
二本鎖オリゴヌクレオチドに複合して結合されるリガンドを含むオリゴヌクレオチド複合
体をさらに提供する。標的遺伝子の発現分布により、異なる複合分子を用い、二本鎖オリ
ゴヌクレオチドを異なる臓器又は細胞に送達することができる。例えば、後述する複合分
子は、前記二本鎖オリゴヌクレオチドを肝臓に送達し、目的肝臓に発現する内因性遺伝子
又は肝臓で繁殖する病原体遺伝子の発現を調節し、肝臓に発現する内因性遺伝子又は肝臓
で繁殖する病原体遺伝子の異常発現による病理学的状態又は疾患を治療する目的の達成に
適する。
いくつかの実施形態において、本開示は、当該二本鎖オリゴヌクレオチド、上述した二
本鎖オリゴヌクレオチドを含む薬物組成物、又は上記オリゴヌクレオチド複合体の、遺伝
子の過剰発現による病理学的状態又は疾患の治療及び／又は予防のための薬物の調製にお
ける使用を提供する。
いくつかの実施形態において、本開示は、被験体に上記二本鎖オリゴヌクレオチド、上
記薬物組成物又は上記オリゴヌクレオチド複合体の有効量を投与することを含む、遺伝子
の異常発現による病理学的状態又は疾患の治療方法を提供する。
いくつかの実施形態において、本開示は、上記二本鎖オリゴヌクレオチド、上記薬物組
成物又は上記オリゴヌクレオチド複合体の有効量を、上述した当該遺伝子を発現する細胞
と接触させることを含む、遺伝子発現の調節方法を提供する。いくつかの実施形態におい
て、前記異常発現は、過剰発現であり、これに応じて、前記調節は、前記過剰発現に対す
る抑制である。
いくつかの実施形態において、上記二本鎖オリゴヌクレオチド、上記薬物組成物又は上
記オリゴヌクレオチド複合体は、肝臓に発現する遺伝子の調節、又は肝細胞における遺伝
子の異常発現による病理学的状態又は疾患の治療において、予期しない安定性と活性を示
す。肝臓に発現する遺伝子としては、ＡｐｏＢ、ＡｐｏＣ、ＡＮＧＰＴＬ３、ＰＣＳＫ９
、ＳＣＤ１、ＴＩＭＰ－１、Ｃｏｌ１Ａ１、ＦＶＩＩ、ＳＴＡＴ３、ｐ５３、ＨＢＶ、Ｈ
ＣＶ等の遺伝子を含むが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、前記特
定の遺伝子は、Ｂ型肝炎ウイルス遺伝子、アンジオポエチン様タンパク質３遺伝子又はア
ポリポタンパクＣ３遺伝子から選択される。これに応じて、前記疾患は、慢性肝疾患、肝
炎、肝線維性疾患、肝過形成性疾患及び脂質異常から選択される。いくつかの実施形態に
おいて、前記脂質異常は、高コレステロール血症、高トリグリセリド血症又はアテローム
性動脈硬化である。
いくつかの実施形態において、上記二本鎖オリゴヌクレオチド、上記薬物組成物又は上
記オリゴヌクレオチド複合体は、不要な細胞増殖を特徴とする疾患、血液疾患、代謝性疾
患、及び炎症を特徴とする疾患を含む他の肝臓疾患の治療に用いることもできる。肝臓の
増殖性疾患は、良性又は悪性疾患、例えば、癌、肝細胞癌（ＨＣＣ）、肝転移又は肝芽腫
であってもよい。肝臓血液学的又は炎症性疾患は、血液凝固因子、補体媒介炎症又は線維
化に関する疾患であってもよい。肝臓の代謝性疾患は、脂質異常及びグルコースの調節の
不規則性を含む。
本開示は、上記二本鎖オリゴヌクレオチド、上記薬物組成物又は上記オリゴヌクレオチ
ド複合体を含むキットをさらに提供する。
以下に薬物組成物及びオリゴヌクレオチド複合体に関する記載は、前述した、遺伝子の
発現を調節できることに適する二本鎖オリゴヌクレオチドに基づく。しかし、当該記載に
おいて薬学的に許容可能な担体及び薬物複合体におけるリガンドに関する記載は、同様に
、前記修飾二本鎖オリゴヌクレオチドを全身に投与する場合と、前記二本鎖オリゴヌクレ
オチドを標的臓器又は組織、特に肝臓に送達し、目的とする標的臓器若しくは組織に発現
する内因性遺伝子又は標的臓器若しくは組織で繁殖する病原体遺伝子の発現を調節する場
合に適する。
＜薬物組成物＞
１つの側面において、本開示は、活性成分として上述した二本鎖オリゴヌクレオチドと
、薬学的に許容可能な担体を含む薬物組成物を提供する。
前記薬学的に許容可能な担体は、二本鎖オリゴヌクレオチド投与分野で通常用いられる
担体であってもよく、例えば、磁性ナノ粒子（ｍａｇｎｅｔｉｃ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃ
ｌｅｓ、例えば、Ｆｅ３Ｏ４又はＦｅ２Ｏ３に基づくナノ粒子）、カーボンナノチューブ
（ｃａｒｂｏｎ ｎａｎｏｔｕｂｅｓ）、メソポーラスシリコン（ｍｅｓｏｐｏｒｏｕｓ
ｓｉｌｉｃｏｎ）、リン酸カルシウムナノ粒子（ｃａｌｃｉｕｍ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ
ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ）、ポリエチレンイミン（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｉｍｉ
ｎｅ、ＰＥＩ）、ポリアミドアミンデンドリマー（ｐｏｌｙａｍｉｄｏａｍｉｎｅ （Ｐ
ＡＭＡＭ） ｄｅｎｄｒｉｍｅｒ）、ポリリジン（ｐｏｌｙ（Ｌ－ｌｙｓｉｎｅ）、ＰＬ
Ｌ）、キトサン（ｃｈｉｔｏｓａｎ）、１，２－ジオレオイル－３－トリメチルアンモニ
ウムプロパン（１，２－ｄｉｏｌｅｏｙｌ－３－ｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ－
ｐｒｏｐａｎｅ、ＤＯＴＡＰ）、ポリＤ－又はＬ－乳酸／グリコール酸共重合体（ｐｏｌ
ｙ（Ｄ＆Ｌ－ｌａｃｔｉｃ／ｇｌｙｃｏｌｉｃ ａｃｉｄ）ｃｏｐｏｌｙｍｅｒ、ＰＬＧ
Ａ）、ポリ（アミノエチルエチレンリン酸エステル）（ｐｏｌｙ（２－ａｍｉｎｏｅｔｈ
ｙｌ ｅｔｈｙｌｅｎｅ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）、ＰＰＥＥＡ）及びポリ（Ｎ，Ｎ－ジメ
チルアミノエチルメタクリレート）（ｐｏｌｙ（２－ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｅｔｈ
ｙｌ ｍｅｔｈａｃｒｙｌａｔｅ）、ＰＤＭＡＥＭＡ）並びにこれらの誘導体の１又は複
数があるが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態において、前記薬物組成物における二本鎖オリゴヌクレオチド及び
薬学的に許容可能な担体の含有量に対して特段の要件はないが、いくつかの実施形態にお
いては、二本鎖オリゴヌクレオチドと薬学的に許容可能な担体との重量比が、１：（１～
５００）であってもよい。いくつかの具体的な実施形態においては、上記重量比が１：（
１～５０）である。
いくつかの実施形態において、前記薬物組成物には、薬学的に許容できる他の添加剤が
含まれてもよく、当該添加剤は、本分野で通常採用される各種の製剤又は化合物の１種又
は複数種であってもよい。例えば、前記薬学的に許容できる他の添加剤は、ｐＨ緩衝液、
保護剤及び浸透圧調節剤の少なくとも１種を含んでもよい。
前記ｐＨ緩衝液は、ｐＨ７．５～８．５のトリスヒドロキシメチルアミノメタン塩酸塩
緩衝液（ｔｒｉｓ（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ） ａｍｉｎｏｍｅｔｈａｎｅ ｈｙｄ
ｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ ｂｕｆｆｅｒ）及び／又はｐＨ５．５～８．５のリン酸塩緩衝液
であってもよく、例えば、ｐＨ５．５～８．５のリン酸塩緩衝液であってもよい。
前記保護剤は、イノシトール、ソルビトール、スクロース、トレハロース、マンノース
、マルトース、ラクトース及びグルコースの少なくとも１種であってもよい。前記薬物組
成物の全重量を基準とし、前記保護剤の含有量は０．０１～３０重量％であってもよい。
前記浸透圧調節剤は、塩化ナトリウム及び／又は塩化カリウムであってもよい。前記浸
透圧調節剤の含有量は、前記薬物組成物の浸透圧が２００～７００ミリオスモル／キログ
ラムとなるように決定される。所望の浸透圧により、当業者は、前記浸透圧調節剤の含有
量を容易に決定することができる。
いくつかの実施形態において、前記薬物組成物は、注射液等の液体製剤であってもよく
、凍結乾燥粉末注射剤として、投与時に液体添加剤と混合し、液体製剤としてもよい。前
記液体製剤は、皮下、筋肉又は静脈注射投与に用いることができるが、これらに限定され
ず、噴霧により肺に投与し、或いは、噴霧により肺を通して他の臓器組織（例えば、肝臓
）に投与することもできるが、これらに限定されない。いくつかの具体的な実施形態にお
いて、前記薬物組成物は、静脈注射投与に用いられる。
いくつかの実施形態において、前記薬物組成物は、リポソーム製剤の形式であってもよ
い。いくつかの実施形態において、前記リポソーム製剤に用いられる薬学的に許容可能な
担体は、アミン含有トランスフェクション化合物（以下、有機アミンともいう）、補助脂
質及び／又はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）化脂質を含む。ここで、前記有機アミン
、補助脂質及びＰＥＧ化脂質は、ＣＮ１０３３１１３Ａ（引用によりその全体を本明細書
に組み込む）に記載されたアミン含有トランスフェクション化合物又はその薬学的に許容
できる塩又は誘導体、補助脂質及びＰＥＧ化脂質からそれぞれ選択される１種又は複数種
であってもよい。
いくつかの実施形態において、前記有機アミンは、ＣＮ１０３３１１３Ａに記載された
式（２０１）に示される化合物又はその薬学的に許容できる塩であってもよい。
Figure 2023134615000017
 式中、
Ｘ１０１及びＸ１０２はそれぞれ独立してＯ、Ｓ、Ｎ－Ａ又はＣ－Ａであり、Ａは水素
又はＣ１－Ｃ２０炭化水素鎖であり、
Ｙ及びＺはそれぞれ独立してＣ＝Ｏ、Ｃ＝Ｓ、Ｓ＝Ｏ、ＣＨ－ＯＨ又はＳＯ２であり、
Ｒ１０１、Ｒ１０２、Ｒ１０３、Ｒ１０４、Ｒ１０５、Ｒ１０６及びＲ１０７はそれぞ
れ独立して水素、環式又は非環式の、置換又は無置換の、分岐鎖又は直鎖脂肪族基、環式
又は非環式の、置換又は無置換の、分岐鎖又は直鎖ヘテロ脂肪族基、置換又は無置換の、
分岐鎖又は直鎖アシル基、置換又は無置換の、分岐鎖又は直鎖アリール基、置換又は無置
換の、分岐鎖又は直鎖ヘテロアリール基であり、
Ｘが１～１０の整数であり、
ｎが１～３の整数であり、ｍが０～２０の整数であり、ｐが０又は１であり、ここで、
ｍ及びｐがいずれも０である場合、Ｒ１０２は水素であり、
ｎ又はｍの少なくとも１つが２である場合、Ｒ１０３と式（２０１）における窒素とが
、式（２０２）又は式（２０３）に示される構造を形成する。
Figure 2023134615000018
 式中、ｇ、ｅ及びｆはそれぞれ独立して１～６の整数であり、「ＨＣＣ」は炭化水素鎖
を表し、各＊Ｎは式（２０１）に示す窒素原子を表す。
いくつかの実施形態において、Ｒ１０３はポリアミンである。他の実施形態において、
Ｒ１０３はケタールである。いくつかの実施形態において、式（２０１）におけるＲ１０
１及びＲ１０２のそれぞれは、独立して、任意に置換又は無置換の、分岐鎖又は直鎖アル
キル又はアルケニルであり、前記アルキル又はアルケニルは、３～約２０個の炭素原子、
例えば、８～約１８個の炭素原子、及び０～４個の二重結合、例えば、０～２個の二重結
合を有する。
いくつかの実施形態において、ｎ及びｍのそれぞれが独立して１又は３の値である場合
、Ｒ１０３は、下記式（２０４）～式（２１３）のいずれか１つであってもよい。
Figure 2023134615000019
 式（２０４）～式（２１３）中、各「ＨＣＣ」は炭化水素鎖を表し、各＊はＲ１０３と
式（２０１）における窒素原子との結合可能点を示し、任意の＊位置上の各Ｈは、式（２
０１）における窒素原子との結合を実現するために置換されてもよい。
ここで、式（２０１）に示される化合物は、ＣＮ１０３３１１３Ａの記載により調製さ
れてもよい。
いくつかの具体的な実施形態において、前記有機アミンは、式（２１４）に示される有
機アミン及び／又は式（２１５）に示される有機アミンである。
Figure 2023134615000020
前記補助脂質は、コレステロール、コレステロールのアナログ及び／又はコレステロー
ルの誘導体であり、
前記ＰＥＧ化脂質は、１，２－ジパルミトアミド－ｓｎ－グリセロ－３－ホスファチジ
ルエタノールアミン－Ｎ－［メトキシ（ポリエチレングリコール）］－２０００である。
いくつかの実施形態において、前記薬物組成物において、前記有機アミン、前記補助脂
質及び前記ＰＥＧ化脂質のモル比は（１９．７～８０）：（１９．７～８０）：（０．３
～５０）であり、例えば、（５０～７０）：（２０～４０）：（３～２０）であってもよ
い。
いくつかの実施形態において、本開示の二本鎖オリゴヌクレオチドと上記アミン含有ト
ランスフェクション試薬により形成された薬物組成物粒子は、約３０ｎｍ～約２００ｎｍ
の平均径を有し、一般に約４０ｎｍ～約１３５ｎｍであり、より一般的には、当該リポソ
ーム粒子の平均径は、約５０ｎｍ～約１２０ｎｍ、約５０ｎｍ～約１００ｎｍ、約６０ｎ
ｍ～約９０ｎｍ又は約７０ｎｍ～約９０ｎｍであり、例えば、当該リポソーム粒子の平均
径は、約３０、４０、５０、６０、７０、７５、８０、８５、９０、１００、１１０、１
２０、１３０、１４０、１５０又は１６０ｎｍである。
いくつかの実施形態において、本開示の二本鎖オリゴヌクレオチドと上記アミン含有ト
ランスフェクション試薬により形成された薬物組成物において、二本鎖オリゴヌクレオチ
ドと全脂質（例えば有機アミン、補助脂質及び／又はＰＥＧ化脂質）の重量比（重量／重
量比）は、約１：１～約１：５０、約１：１～約１：３０、約１：３～約１：２０、約１
：４～約１：１８、約１：５～約１：１７、約１：５～約１：１５、約１：５～約１：１
２、約１：６～約１：１２又は約１：６～約１：１０の範囲内にあり、例えば、本開示の
二本鎖オリゴヌクレオチドと全脂質の重量比は約１：５、１：６、１：７、１：８、１：
９、１：１０、１：１１，１：１２、１：１３、１：１４、１：１５、１：１６、１：１
７又は１：１８である。
いくつかの実施形態において、前記薬物組成物は、市販時に各成分が独立して存在して
もよく、使用時に液体製剤として存在してもよい。いくつかの実施形態において、本開示
により提供される二本鎖オリゴヌクレオチドと上記薬学的に許容可能な担体により形成さ
れた薬物組成物は、既知の各種の方法に従い調製されてもよく、従来の二本鎖オリゴヌク
レオチドの代わりに本開示により提供される二本鎖オリゴヌクレオチドを用いればよい。
いくつかの具体的な実施形態において、以下の方法に従い調製されてもよい。
有機アミン、補助脂質及びＰＥＧ化脂質を上記モル比でアルコールに懸濁させ均一に混
合して脂質溶液を得る。アルコールの用量は、得られた脂質溶液の総質量濃度が２～２５
ｍｇ／ｍＬ、例えば、８～１８ｍｇ／ｍＬとなるように決定される。前記アルコールは、
薬学的に許容できるアルコール、例えば、エタノール、プロピレングリコール、ベンジル
アルコール、グリセリン、ポリエチレングリコール２００、ポリエチレングリコール３０
０、ポリエチレングリコール４００など、室温付近で液体であるアルコールから選択され
る１種又は複数種であり、例えばエタノールであってもよい。
本開示により提供される二本鎖オリゴヌクレオチドを緩衝塩溶液に溶解し、二本鎖オリ
ゴヌクレオチド水溶液を得る。緩衝塩溶液の濃度が０．０５～０．５Ｍであり、例えば、
０．１～０．２Ｍであってもよく、緩衝塩溶液のｐＨを４．０～５．５に調節し、例えば
、５．０～５．２であってもよく、緩衝塩溶液の用量は、二本鎖オリゴヌクレオチドの濃
度が０．６ｍｇ／ｍＬ以下、例えば、０．２～０．４ｍｇ／ｍＬとなるように決定される
。前記緩衝塩は、可溶性酢酸塩、可溶性クエン酸塩から選択される１種又は複数種であり
、例えば、酢酸ナトリウム及び／又は酢酸カリウムであってもよい。
脂質溶液と二本鎖オリゴヌクレオチド水溶液を混合した後、得られた生成物を４０～６
０℃で少なくとも２分間、例えば、５～３０分間培養し、培養したリポソーム製剤を得る
。脂質溶液と二本鎖オリゴヌクレオチド水溶液の体積比は１：（２～５）、例えば、１：
４であってよい。
培養したリポソーム製剤を濃縮又は希釈し、不純物を除去し、除菌し、本開示により提
供される薬物組成物を得る。その物理化学的パラメーターとしては、ｐＨが６．５～８で
あり、封入効率が８０％以上であり、粒子径が４０～２００ｎｍであり、多分散指数が０
．３０以下であり、浸透圧が２５０～４００ｍＯｓｍ／ｋｇであり、例えば、物理化学的
パラメーターとしては、ｐＨが７．２～７．６、封入効率が９０％以上、粒子径が６０～
１００ｎｍ、多分散指数が０．２０以下、浸透圧が３００～４００ｍＯｓｍ／ｋｇであっ
てもよい。
ここで、濃縮又は希釈は、不純物を除去する前、不純物を除去した後又は同時に行われ
てもよい。不純物を除去する方法としては、従来の各種の方法を採用してもよく、例えば
、タンジェンシャルフロー系、中空糸カラムを用い、１００ＫＤａの条件で限外濾過し、
限外濾過交換溶液をｐＨ７．４のリン酸塩緩衝液（ＰＢＳ）としてもよい。除菌方法とし
ては、従来の各種の方法を採用してもよく、例えば、０．２２μｍのフィルターで濾過し
て除菌してもよい。
＜オリゴヌクレオチド複合体＞
１つの側面において、本開示は、上記二本鎖オリゴヌクレオチド及び当該二本鎖オリゴ
ヌクレオチドに結合される複合基を含むオリゴヌクレオチド複合体を提供する。
本開示の文脈において、特に説明がない限り、「複合」とは、それぞれ特定の機能を有
する２つ以上の化学部分間が共有結合的に互いに結合することを指し、これに応じて、「
複合体」とは、当該各化学部分間が共有結合的に結合することにより形成された化合物を
指す。さらには、「オリゴヌクレオチド複合体」は、特定の機能を有する１又は複数の化
学部分が二本鎖オリゴヌクレオチドに共有結合的に結合して形成された化合物を表す。以
下に、本開示のオリゴヌクレオチド複合体を単に「複合体」ということもある。より具体
的には、本開示の文脈において、「複合分子」は、反応させることにより二本鎖オリゴヌ
クレオチドに複合され、最終的に本開示のオリゴヌクレオチド複合体を形成することがで
きる特定の化合物であると理解すべきである。前記リガンドの種類と結合方法は、当業者
に公知であり、その作用として、一般的に標的細胞表面の特異的受容体と結合し、リガン
ドに結合される二本鎖オリゴヌクレオチドの標的細胞への送達を媒介する。
一般的には、前記複合基は、薬学的に許容できる少なくとも１つの標的基及び任意のリ
ンカー（ｌｉｎｋｅｒ）を含み、前記二本鎖オリゴヌクレオチド、前記リンカー及び前記
標的基は順に結合されている。１つの実施形態において、前記標的基が１～６個である。
１つの実施形態において、前記標的基が２～４個である。前記二本鎖オリゴヌクレオチド
分子は、前記複合基に非共有結合的又は共有結合的に複合されてもよく、例えば、前記複
合基に共有結合的に複合されてもよい。二本鎖オリゴヌクレオチドと複合基との複合部位
は、二本鎖オリゴヌクレオチドのセンス鎖の３’端又は５’端にあってもよく、アンチセ
ンス鎖の５’端にあってもよく、二本鎖オリゴヌクレオチドの内部配列にあってもよい。
いくつかの具体的な実施形態において、前記二本鎖オリゴヌクレオチドと複合基との複合
部位は、二本鎖オリゴヌクレオチドのセンス鎖の３’末端にある。
いくつかの実施形態において、前記複合基は、ヌクレオチドのリン酸基、２’－位のヒ
ドロキシ基又は塩基に結合されてもよい。いくつかの実施形態において、前記複合基は、
３’－位のヒドロキシ基に結合されてもよく、この場合、ヌクレオチド間が２’－５’リ
ン酸ジエステル結合により結合されている。複合基は、二本鎖オリゴヌクレオチド鎖の末
端に結合される場合、通常ヌクレオチドのリン酸基に結合され、二本鎖オリゴヌクレオチ
ドの内部配列に結合される場合、通常リボース糖環或いは塩基に結合される。各種の結合
方法については、Ｍｕｔｈｉａｈ Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ．ａｌ． ｓｉＲＮＡ ｃ
ｏｎｊｕｇａｔｅｓ ｃａｒｒｙｉｎｇ ｓｅｑｕｅｎｔｉａｌｌｙ ａｓｓｅｍｂｌｅ
ｄ ｔｒｉｖａｌｅｎｔ Ｎ－ａｃｅｔｙｌｇａｌａｃｔｏｓａｍｉｎｅ ｌｉｎｋｅｄ
ｔｈｒｏｕｇｈ ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ ｅｌｉｃｉｔ ｒｏｂｕｓｔ ｇｅｎｅ
ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ ｉｎ ｖｉｖｏ ｉｎ ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ． ＡＣＳ Ｃｈ
ｅｍｉｃａｌ ｂｉｏｌｏｇｙ，２０１５，１０ （５）：１１８１～７．を参照するこ
とができる。
いくつかの実施形態において、前記二本鎖オリゴヌクレオチドと複合基との間が酸不安
定又は還元可能な化学結合により結合されてもよく、細胞エンドソームの酸性環境で、こ
れらの化学結合が分解され、二本鎖オリゴヌクレオチドが遊離状態になることができる。
分解できない複合方法については、複合基は、二本鎖オリゴヌクレオチドのセンス鎖に結
合され、複合による二本鎖オリゴヌクレオチド活性への影響をできるだけ低下させること
ができる。
標的基は、適切なリンカーを介して二本鎖オリゴヌクレオチド分子に結合されてもよく
、当業者は、標的基の具体的な種類により適切なリンカーを選択することができる。これ
らのリンカー、標的基の種類及び二本鎖オリゴヌクレオチドへの結合方法については、Ｗ
Ｏ２０１５００６７４０Ａ２の開示内容を参照してもよく、引用によりその内容が全体と
して本明細書に組み込まれる。
いくつかの実施形態において、前記標的基がＮ－アセチルガラクトサミンである場合、
適切なリンカーは、式（３０１）に示される構造であってもよい。
Figure 2023134615000021
 式中、ｋは１～３の整数であり、
ＬＡは、式（３０２）に示される構造を有するアミド結合を含む鎖状部であり、各前記
ＬＡは、その両端でそれぞれ１つの前記標的基及び前記ＬＣ部にエーテル結合により結合
される。
Figure 2023134615000022
 ＬＢは、式（３０３）に示される構造を有するＮ－アシルピロリジンを含む鎖状部であ
り、前記鎖状部は、その一端にカルボニル基を有し、前記ＬＣ部にアミド結合により結合
され、他端に酸素基を有し、前記二本鎖オリゴヌクレオチドにリン酸エステル結合により
結合される。
Figure 2023134615000023
 ＬＣは、ヒドロキシメチルアミノメタン、ジヒドロキシメチルアミノメタン又はトリヒ
ドロキシメチルアミノメタンに基づく２～４価のリンカー基であり、前記ＬＣは、酸素原
子を介してエーテル結合により各前記ＬＡ部に結合されるとともに、窒素原子を介してア
ミド結合により前記ＬＢ部に結合される。
いくつかの実施形態において、ｎ＝３であり、ＬＣがトリヒドロキシメチルアミノメタ
ンに基づく４価のリンカー基である場合、リンカーとしての－（ＬＡ）３トリヒドロキシ
メチルアミノメタン－ＬＢ－によりＮ－アセチルガラクトサミン分子と二本鎖オリゴヌク
レオチド分子を結合して形成されたオリゴヌクレオチド複合体は、その構造が以下の式（
３０４）に示される。
Figure 2023134615000024
 式中、二重螺旋構造は二本鎖オリゴヌクレオチドを表す。
同様に、二本鎖オリゴヌクレオチドと複合基との複合部位は、二本鎖オリゴヌクレオチ
ドのセンス鎖の３’端又は５’端にあってもよく、アンチセンス鎖の５’端にあってもよ
く、二本鎖オリゴヌクレオチドの内部配列にあってもよい。
いくつかの具体的な実施形態において、本開示に記載された二本鎖オリゴヌクレオチド
のセンス鎖の３’末端は、リンカー－（ＬＡ）３トリヒドロキシメチルアミノメタン－Ｌ
Ｂ－により３個のＮ－アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）分子に共有結合的に複合
され、二本鎖オリゴヌクレオチド分子とＧａｌＮＡｃ分子のモル比が１：３である、構造
が以下の式（３０５）に示されるオリゴヌクレオチド複合体（以下、（ＧａｌＮＡｃ）３
－Ｎｕともいう）を得る。
Figure 2023134615000025
 式中、二重螺旋構造は前記二本鎖オリゴヌクレオチドを表し、
前記リンカーは前記二本鎖オリゴヌクレオチドのセンス鎖の３’末端に結合される。
いくつかの実施形態において、前記標的基がＮ－アセチルガラクトサミンである場合、
適切なリンカーは、式（３０６）に示される構造であってもよい。
Figure 2023134615000026
 式中、ｌは０～３の整数であり、
＊は、リンカーにおいてエーテル結合により標的基に結合される部位を表し、
＃は、リンカーにおいてリン酸エステル結合により二本鎖オリゴヌクレオチドに結合さ
れる部位を表す。
いくつかの具体的な実施形態において、ｌ＝２である場合、前記オリゴヌクレオチド複
合体は、式（３０７）に示される構造を有する。
Figure 2023134615000027
 式中、二重螺旋構造は前記二本鎖オリゴヌクレオチドを表し、
前記リンカーは前記二本鎖オリゴヌクレオチドのセンス鎖の３’末端に結合される。
上記複合体は、従来技術において既に詳しく記載された方法により合成されてもよい。
例えば、ＷＯ２０１５００６７４０Ａ２には、複数種の複合体の調製が詳しく記載されて
いる。また、ＷＯ２０１４０２５５Ａ１には、式（３０５）に示される構造の調製方法が
記載されている。さらに、Ｒａｊｅｅｖら、ＣｈｅｍＢｉｏＣｈｅｍ ２０１５，１６，
９０３－９０８に式（３０７）に示される構造の調製方法を記載した。
いくつかの実施形態において、前記複合体は、式（３０８）に示される構造を有する。
Figure 2023134615000028
 式中、ｎ１は、１～３から選択される整数であり、ｎ３は、０～４から選択される整数
であり、
ｍ１、ｍ２及びｍ３は独立して、２～１０から選択される整数であり、
Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１４及びＲ１５は、それぞれ独立して、Ｈであり
、又はＣ１－Ｃ１０アルキル基、Ｃ１－Ｃ１０ハロゲン化アルキル基及びＣ１－Ｃ１０ア
ルコキシ基からなる群から選択され、
Ｒ３は式Ａ５９に示される構造の基である。
Figure 2023134615000029
 式中、Ｅ１はＯＨ、ＳＨ又はＢＨ２であり、Ｎｕは二本鎖オリゴヌクレオチドである。
Ｒ２は、長さ１～２０の炭素原子の直鎖アルキレン基であり、１又は複数の炭素原子は
、Ｃ（Ｏ）、ＮＨ、Ｏ、Ｓ、ＣＨ＝Ｎ、Ｓ（Ｏ）２、Ｃ２－Ｃ１０アルケニレン基、Ｃ２
－Ｃ１０アルキニレン基、Ｃ６－Ｃ１０アリーレン基、Ｃ３－Ｃ１８ヘテロシクリレン基
及びＣ５－Ｃ１０ヘテロアリーレン基からなる群から選択される１又は複数で任意に置換
され、Ｒ２は、Ｃ１－Ｃ１０アルキル基、Ｃ６－Ｃ１０アリール基、Ｃ５－Ｃ１０ヘテロ
アリール基、Ｃ１－Ｃ１０ハロゲン化アルキル基、－ＯＣ１－Ｃ１０アルキル基、－ＯＣ
１－Ｃ１０アルキルフェニル基、－Ｃ１－Ｃ１０アルキル－ＯＨ、－ＯＣ１－Ｃ１０ハロ
ゲン化アルキル基、－ＳＣ１－Ｃ１０アルキル基、－ＳＣ１－Ｃ１０アルキルフェニル基
、－Ｃ１－Ｃ１０アルキル－ＳＨ、－ＳＣ１－Ｃ１０ハロゲン化アルキル基、ハロゲン置
換基、－ＯＨ、－ＳＨ、－ＮＨ２、－Ｃ１－Ｃ１０アルキル－ＮＨ２、－Ｎ（Ｃ１－Ｃ１
０アルキル基）（Ｃ１－Ｃ１０アルキル基）、－ＮＨ（Ｃ１－Ｃ１０アルキル基）、シア
ノ基、ニトロ基、－ＣＯ２Ｈ、－Ｃ（Ｏ）Ｏ（Ｃ１－Ｃ１０アルキル基）、－ＣＯＮ（Ｃ
１－Ｃ１０アルキル基）（Ｃ１－Ｃ１０アルキル基）、－ＣＯＮＨ（Ｃ１－Ｃ１０アルキ
ル基）、－ＣＯＮＨ２、－ＮＨＣ（Ｏ）（Ｃ１－Ｃ１０アルキル基）、－ＮＨＣ（Ｏ）（
フェニル基）、－Ｎ（Ｃ１－Ｃ１０アルキル）Ｃ（Ｏ）（Ｃ１－Ｃ１０アルキル基）、－
Ｎ（Ｃ１－Ｃ１０アルキル）Ｃ（Ｏ）（フェニル基）、－Ｃ（Ｏ）Ｃ１－Ｃ１０アルキル
基、－Ｃ（Ｏ）Ｃ１－Ｃ１０アルキルフェニル基、－Ｃ（Ｏ）Ｃ１－Ｃ１０ハロアルキル
基、－ＯＣ（Ｏ）Ｃ１－Ｃ１０アルキル基、－ＳＯ２（Ｃ１－Ｃ１０アルキル基）、－Ｓ
Ｏ２（フェニル基）、－ＳＯ２（Ｃ１－Ｃ１０ハロゲン化アルキル基）、－ＳＯ２ＮＨ２
、－ＳＯ２ＮＨ（Ｃ１－Ｃ１０アルキル基）、－ＳＯ２ＮＨ（フェニル基）、－ＮＨＳＯ
２（Ｃ１－Ｃ１０アルキル基）、－ＮＨＳＯ２（フェニル基）及び－ＮＨＳＯ２（Ｃ１－
Ｃ１０ハロゲン化アルキル基）からなる群のいずれか１つ又は複数の置換基を任意に有し
てもよい。
各Ｌ１は、長さ１～７０の炭素原子の直鎖アルキレン基であり、１又は複数の炭素原子
は、Ｃ（Ｏ）、ＮＨ、Ｏ、Ｓ、ＣＨ＝Ｎ、Ｓ（Ｏ）２、Ｃ２－Ｃ１０アルケニレン基、Ｃ
２－Ｃ１０アルキニレン基、Ｃ６－Ｃ１０アリーレン基、Ｃ３－Ｃ１８ヘテロシクリレン
基及びＣ５－Ｃ１０ヘテロアリーレン基からなる群から選択される１又は複数で任意に置
換され、Ｌ１は、Ｃ１－Ｃ１０アルキル基、Ｃ６－Ｃ１０アリール基、Ｃ５－Ｃ１０ヘテ
ロアリール基、Ｃ１－Ｃ１０ハロゲン化アルキル基、－ＯＣ１－Ｃ１０アルキル基、－Ｏ
Ｃ１－Ｃ１０アルキルフェニル基、－Ｃ１－Ｃ１０アルキル－ＯＨ、－ＯＣ１－Ｃ１０ハ
ロゲン化アルキル基、－ＳＣ１－Ｃ１０アルキル基、－ＳＣ１－Ｃ１０アルキルフェニル
基、－Ｃ１－Ｃ１０アルキル－ＳＨ、－ＳＣ１－Ｃ１０ハロゲン化アルキル基、ハロゲン
置換基、－ＯＨ、－ＳＨ、－ＮＨ２、－Ｃ１－Ｃ１０アルキル－ＮＨ２、－Ｎ（Ｃ１－Ｃ
１０アルキル基）（Ｃ１－Ｃ１０アルキル基）、－ＮＨ（Ｃ１－Ｃ１０アルキル基）、シ
アノ基、ニトロ基、－ＣＯ２Ｈ、－Ｃ（Ｏ）Ｏ（Ｃ１－Ｃ１０アルキル基）、－ＣＯＮ（
Ｃ１－Ｃ１０アルキル基）（Ｃ１－Ｃ１０アルキル基）、－ＣＯＮＨ（Ｃ１－Ｃ１０アル
キル基）、－ＣＯＮＨ２、－ＮＨＣ（Ｏ）（Ｃ１－Ｃ１０アルキル基）、－ＮＨＣ（Ｏ）
（フェニル基）、－Ｎ（Ｃ１－Ｃ１０アルキル）Ｃ（Ｏ）（Ｃ１－Ｃ１０アルキル基）、
－Ｎ（Ｃ１－Ｃ１０アルキル）Ｃ（Ｏ）（フェニル基）、－Ｃ（Ｏ）Ｃ１－Ｃ１０アルキ
ル基、－Ｃ（Ｏ）Ｃ１－Ｃ１０アルキルフェニル基、－Ｃ（Ｏ）Ｃ１－Ｃ１０ハロアルキ
ル基、－ＯＣ（Ｏ）Ｃ１－Ｃ１０アルキル基、－ＳＯ２（Ｃ１－Ｃ１０アルキル基）、－
ＳＯ２（フェニル基）、－ＳＯ２（Ｃ１－Ｃ１０ハロゲン化アルキル基）、－ＳＯ２ＮＨ
２、－ＳＯ２ＮＨ（Ｃ１－Ｃ１０アルキル基）、－ＳＯ２ＮＨ（フェニル基）、－ＮＨＳ
Ｏ２（Ｃ１－Ｃ１０アルキル基）、－ＮＨＳＯ２（フェニル基）及び－ＮＨＳＯ２（Ｃ１
－Ｃ１０ハロゲン化アルキル基）からなる群のいずれか１つ又は複数の置換基を任意に有
してもよい。Ｍ１は標的基を表す。
いくつかの実施形態において、Ｌ１は、Ａ１～Ａ２６の基又はその任意の組合せからな
る群から選択されてもよく、Ａ１～Ａ２６の構造と定義は以下のとおりである。
Figure 2023134615000030
 ただし、ｊ１は１～２０の整数であり、ｊ２は１～２０の整数であり、
Ｒ’はＣ１－Ｃ１０のアルキル基であり、
Ｒａは、式Ａ２７～Ａ４５の基から選択される１つである。
Figure 2023134615000031
 ＲｂはＣ１－Ｃ１０のアルキル基であり、
Figure 2023134615000032
は、基が分子の残りの部分に結合される部位を表す。
便宜上、Ｌ１は、線形アルキル基として定義されるが、例えば上述の取替及び／又は置
換によって生じるアミンやアルケニル基で、線形基ではない、又は名称が異なる可能性が
あることは、当業者に理解される。本開示内容の目的のために、Ｌ１の長さは、２つの結
合点を結合する鎖における原子数である。この目的のために、前記直鎖アルキレンの炭素
原子を置換して得られた環（例えば、ヘテロシクリレン又はヘテロアリーレン）を、１個
の原子とする。
いくつかの実施形態において、前記薬学的に許容できる標的基は、二本鎖オリゴヌクレ
オチド投与分野で通常用いられるリガンド、例えば、ＷＯ２００９０８２６０７Ａ２に記
載された各種のリガンドであってもよく、引用によりその開示内容が全体として本明細書
に組み込まれる。
いくつかの実施形態において、前記各リガンドは、細胞表面の受容体と結合できるリガ
ンドから独立して選択される。いくつかの実施形態において、少なくとも１つのリガンド
は、肝細胞表面の受容体と結合できるリガンドである。いくつかの実施形態において、少
なくとも１つのリガンドは、哺乳動物の肝細胞表面の受容体と結合できるリガンドである
。いくつかの実施形態において、少なくとも１つのリガンドは、ヒト肝細胞表面の受容体
と結合できるリガンドである。いくつかの実施形態において、少なくとも１つのリガンド
は、肝表面のアシアロ糖タンパク質受容体（ＡＳＧＰＲ）と結合できるリガンドである。
これらのリガンドの種類は、当業者に公知であり、その作用として、一般的に標的細胞表
面の特異的受容体と結合し、リガンドに結合される二本鎖オリゴヌクレオチドの標的細胞
への送達を媒介する。
いくつかの実施形態において、前記薬学的に許容できる標的基は、哺乳動物の肝細胞表
面におけるアシアロ糖タンパク質受容体（ＡＳＧＰＲ）と結合するいずれか１種のリガン
ドであってもよい。１つの実施形態において、各リガンドは、独立してアシアロ糖タンパ
ク質、例えば、アシアロオロソムコイド（ａｓｉａｌｏｏｒｏｓｏｍｕｃｏｉｄ、ＡＳＯ
Ｒ）又はアシアロフェチュイン（ａｓｉａｌｏｆｅｔｕｉｎ、ＡＳＦ）である。
いくつかの実施形態において、前記薬学的に許容できる標的基は、コレステロール、胆
汁酸、ビタミン（例えば、トコフェロール）、鎖長が異なる脂質分子等の親油性分子と、
ポリエチレングリコール等のポリマーと、膜透過性ペプチド等のポリペプチドと、アプタ
マーと、抗体と、量子ドットと、ラクトース、ポリラクトース、マンノース、ガラクトー
ス、Ｎ－アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）等の糖類と、葉酸（ｆｏｌａｔｅ）と
、アシアロ糖タンパク質、アシアロ糖残基、リポタンパク（例えば、高比重リポタンパク
、低比重リポタンパク等）、グルカゴン、神経伝達物質（例えば、アドレナリン）、成長
因子、トランスフェリン等の肝実質細胞に発現する受容体リガンド等の標的分子又はその
誘導体により形成されたリガンドから選択される１種又は複数種てあってよい。
１つの実施形態において、前記リガンドは、糖又は糖の誘導体である。
いくつかの実施形態において、少なくとも１つのリガンドは糖である。いくつかの実施
形態において、各リガンドはいずれも糖である。いくつかの実施形態において、少なくと
も１つのリガンドは、単糖、多糖、修飾単糖、修飾多糖又は糖誘導体である。いくつかの
実施形態において、少なくとも１つの前記リガンドは、単糖、二糖又は三糖であってもよ
い。いくつかの実施形態において、少なくとも１つのリガンドは修飾糖である。いくつか
の実施形態において、各リガンドは、いずれも修飾糖である。いくつかの実施形態におい
て、各リガンドは、いずれも独立して多糖、修飾多糖、単糖、修飾単糖、多糖誘導体又は
単糖誘導体から選択される。いくつかの実施形態において、リガンドのそれぞれ又は少な
くとも１つは、グルコース及びその誘導体、マンナン及びその誘導体、ガラクトース及び
その誘導体、キシロース及びその誘導体、リボース及びその誘導体、フコース及びその誘
導体、ラクトース及びその誘導体、マルトース及びその誘導体、アラビノース及びその誘
導体、フルクトース及びその誘導体並びにシアル酸からなる群から選択される。
いくつかの実施形態において、各前記リガンドは、Ｄ－マンノピラノース、Ｌ－マンノ
ピラノース、Ｄ－アラビノース、Ｄ－キシロフラノース、Ｌ－キシロフラノース、Ｄ－グ
ルコース、Ｌ－グルコース、Ｄ－ガラクトース、Ｌ－ガラクトース、α－Ｄ－マンノフラ
ノース、β－Ｄ－マンノフラノース、α－Ｄ－マンノピラノース、β－Ｄ－マンノピラノ
ース、α－Ｄ－グルコピラノース、β－Ｄ－グルコピラノース、α－Ｄ－グルコフラノー
ス、β－Ｄ－グルコフラノース、α－Ｄ－フルクトフラノース、α－Ｄ－フルクトピラノ
ース、α－Ｄ－ガラクトピラノース、β－Ｄ－ガラクトピラノース、α－Ｄ－ガラクトフ
ラノース、β－Ｄ－ガラクトフラノース、グルコサミン、シアル酸、ガラクトサミン、Ｎ
－アセチルガラクトサミン、Ｎ－トリフルオロアセチルガラクトサミン、Ｎ－プロピオニ
ルガラクトサミン、Ｎ－ｎ－ブチリルガラクトサミン、Ｎ－イソブチリルガラクトサミン
、２－アミノ－３－Ｏ－［（Ｒ）－１－カルボキシエチル］－２－デオキシ－β－Ｄ－グ
ルコピラノース、２－デオキシ－２－メチルアミノ－Ｌ－グルコピラノース、４，６－ジ
デオキシ－４－ホルムアミド－２，３－ジ－Ｏ－メチル－Ｄ－マンノピラノース、２－デ
オキシ－２－スルホアミノ－Ｄ－グルコピラノース、Ｎ－グリコリル－α－ノイラミン酸
、５－チオ－β－Ｄ－グルコピラノース、メチル２，３，４－トリス－Ｏ－アセチル－１
－チオ－６－Ｏ－トリチル－α－Ｄ－グルコピラノシド、４－チオ－β－Ｄ－ガラクトピ
ラノース、エチル３，４，６，７－テトラ－Ｏ－アセチル－２－デオキシ－１，５－ジチ
オ－α－Ｄ－グルコヘプトピラノシド、２，５－アンヒドロ－Ｄ－アロニトリル、リボー
ス、Ｄ－リボース、Ｄ－４－チオリボース、Ｌ－リボース又はＬ－４－チオリボースから
独立して選択されてもよい。前記リガンドの他の選択肢は、例えば、ＣＮ１０５３７８０
８２Ａの記載を参照してもよく、引用によりその開示内容が全体として本明細書に組み込
まれる。
いくつかの実施形態において、前記オリゴヌクレオチド複合体における、薬学的に許容
できる標的基は、ガラクトース又はＮ－アセチルガラクトサミンであってもよく、ガラク
トース又はＮ－アセチルガラクトサミン分子は、１価、２価、３価、４価であってもよい
。ここでいう１価、２価、３価、４価は、それぞれ二本鎖オリゴヌクレオチド分子と、標
的基としてのガラクトース又はＮ－アセチルガラクトサミン分子を含む複合基から形成さ
れたオリゴヌクレオチド複合体における二本鎖オリゴヌクレオチド分子とガラクトース又
はＮ－アセチルガラクトサミン分子とのモル比が１：１、１：２、１：３又は１：４であ
ることを指すと理解すべきである。いくつかの実施形態において、前記薬学的に許容でき
る標的基はＮ－アセチルガラクトサミンである。いくつかの実施形態において、本開示に
記載された二本鎖オリゴヌクレオチドがＮ－アセチルガラクトサミを含む複合基と複合す
る場合、Ｎ－アセチルガラクトサミン分子は３価又は４価である。いくつかの実施形態に
おいて、本開示に記載された二本鎖オリゴヌクレオチドがＮ－アセチルガラクトサミンを
含む複合基と複合する場合、Ｎ－アセチルガラクトサミン分子は３価である。
Ｍ１は、標的基を表し、その定義と選択可能な範囲は上記と同じである。いくつかの実
施形態において、各Ｍ１は、哺乳動物の肝臓細胞表面におけるアシアロ糖タンパク質受容
体に対して親和力を有するリガンドから独立して選択される１つである。
Ｍ１が哺乳動物の肝臓細胞表面におけるアシアロ糖タンパク質受容体に対して親和力を
有するリガンドである場合、いくつかの実施形態において、ｎ１は、１～３の整数であっ
てもよく、ｎ３は、０～４の整数であってもよく、前記複合体におけるＭ１リガンドの個
数が少なくとも２であることを確保する。いくつかの実施形態において、ｎ１＋ｎ３≧２
であり、これにより、Ｍ１リガンドの個数が少なくとも３であり、Ｍ１リガンドと肝表面
のアシアロ糖タンパク質受容体をより容易に結合させ、さらに前記複合体が細胞内取込み
（エンドサイトーシス）作用により細胞に取り込まれることを促進することができる。実
験から分かるように、Ｍ１リガンドの個数が３個以上である場合、Ｍ１リガンドと肝表面
のアシアロ糖タンパク質受容体との結合の容易さの向上が明らかではないので、合成の容
易さ、構造／プロセスコスト及び送達効率等の多方面を総合的に考慮すると、いくつかの
実施形態において、ｎ１は１～２の整数であり、ｎ３は０～１の整数であり、かつ、ｎ１
＋ｎ３＝２～３である。
いくつかの実施形態において、ｍ１、ｍ２及びｍ３は、独立して２～１０の整数から選
択される場合、複数のＭ１リガンド間の空間位置をＭ１リガンドと肝表面のアシアロ糖タ
ンパク質受容体との結合に適合させることができる。本開示により提供される複合体をよ
り簡略化し、より合成しやすく、及び／又はコストを低下させるために、いくつかの実施
形態において、ｍ１、ｍ２及びｍ３は、それぞれ独立して２～５の整数であり、いくつか
の実施形態において、ｍ１＝ｍ２＝ｍ３である。
Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１４及びＲ１５がそれぞれ独立して、Ｈ、Ｃ１－
Ｃ１０アルキル基、Ｃ１－Ｃ１０ハロゲン化アルキル基及びＣ１－Ｃ１０アルコキシから
選択される１つである場合、いずれも本明細書で開示された複合体の性質を変化させるこ
となく、本開示の目的を実現することができることは、当業者に理解され得る。いくつか
の実施形態において、Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１４及びＲ１５は、それぞれ
独立してＨ、メチル基及びエチル基から選択される。いくつかの実施形態において、Ｒ１
０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１４及びＲ１５は、いずれもＨである。
本開示により提供されるオリゴヌクレオチド複合体によれば、Ｒ３は、式Ａ５９に示さ
れる構造の基であり、そのうち、Ｅ１はＯＨ、ＳＨ又はＢＨ２であり、調製原料の入手し
やすさを考慮し、いくつかの実施形態において、Ｅ１はＯＨ又はＳＨである。
いくつかの実施形態において、Ｒ２は、窒素含有骨格上のＮとＡ５９との結合を実現す
るために選択される。本開示の文脈において、「窒素含有骨格」とは、Ｒ１０、Ｒ１１、
Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１４及びＲ１５が結合された炭素原子とＮが互いに結合している鎖状
構造を指す。したがって、Ｒ２は、適当な方法でＡ５９基を窒素含有骨格上のＮに結合す
ることができる任意のリンカー基であってもよい。いくつかの実施形態において、固相合
成プロセスにより本開示のオリゴヌクレオチド複合体を調製する場合に、Ｒ２基には、窒
素含有骨格上のＮに結合される結合部位及びＲ３におけるＰに結合される結合部位がとも
に含まれる必要がある。いくつかの実施形態において、Ｒ２における前記窒素含有骨格中
のＮに結合される部位は、Ｎとアミド結合を形成し、前記Ｒ３上のＰに結合される部位は
、Ｐとリン酸エステル結合を形成する。いくつかの実施形態において、Ｒ２は、Ｂ５、Ｂ
６、Ｂ５’又はＢ６’である。
Figure 2023134615000033
 ただし、
Figure 2023134615000034
は、基が共有結合的に結合する部位を表す。
ｑ２の値の範囲は、１～１０の整数であってもよく、いくつかの実施形態において、ｑ
２は１～５の整数である。
Ｌ１は、Ｍ１リガンドと窒素含有骨格上のＮを結合し、本開示のオリゴヌクレオチド複
合体に標的機能を提供するという役割を果たす。いくつかの実施形態において、Ｌ１は、
式Ａ１～Ａ２６の基から選択される１又は複数の結合の組合せである。いくつかの実施形
態において、Ｌ１は、Ａ１、Ａ４、Ａ５、Ａ６、Ａ８、Ａ１０、Ａ１１及びＡ１３から選
択される１又は複数の結合の組合せである。いくつかの実施形態において、Ｌ１は、Ａ１
、Ａ４、Ａ８、Ａ１０及びＡ１１から選択される少なくとも２つの結合の組合せである。
いくつかの実施形態において、Ｌ１は、Ａ１、Ａ８、Ａ１０から選択される少なくとも２
つの結合の組合せである。
いくつかの実施形態において、Ｌ１の長さは、３～２５個の原子、３～２０個の原子、
４～１５個の原子又は５～１２個の原子であってもよい。いくつかの実施形態において、
Ｌ１の長さは、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、
１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、
２３個、２４個、２５個、３０個、３５個、４０個、４５個、５０個、５５個、６０個の
原子である。
いくつかの実施形態において、ｊ１は２～１０の整数であり、いくつかの実施形態にお
いて、ｊ１は３～５の整数である。いくつかの実施形態において、ｊ２は２～１０の整数
であり、いくつかの実施形態において、ｊ２は３～５の整数である。Ｒ’はＣ１－Ｃ４の
アルキル基であり、いくつかの実施形態において、Ｒ’は、メチル基、エチル基及びイソ
プロピル基の１つである。Ｒａは、Ａ２７、Ａ２８、Ａ２９、Ａ３０及びＡ３１の１つで
あり、いくつかの実施形態において、Ｒａは、Ａ２７又はＡ２８である。Ｒｂは、Ｃ１－
Ｃ５のアルキル基であり、いくつかの実施形態において、Ｒｂは、メチル基、エチル基、
イソプロピル基及びブチル基の１つである。いくつかの実施形態において、式Ａ１～Ａ２
６においてそれぞれｊ１、ｊ２、Ｒ’、Ｒａ、Ｒｂを選択することにより、Ｍ１リガンド
と窒素含有骨格上のＮとの結合を実現し、Ｍ１リガンド間の空間位置をＭ１リガンドと肝
表面のアシアロ糖タンパク質受容体との結合に更に適合させる。
いくつかの実施形態において、本開示のオリゴヌクレオチド複合体は、式（４０３）、
（４０４）、（４０５）、（４０６）、（４０７）、（４０８）、（４０９）、（４１０
）、（４１１）、（４１２）、（４１３）、（４１４）、（４１５）、（４１６）、（４
１７）、（４１８）、（４１９）、（４２０）、（４２１）又は（４２２）に示される構
造を有する。
Figure 2023134615000035
Figure 2023134615000036
Figure 2023134615000037
Figure 2023134615000038
Figure 2023134615000039
Figure 2023134615000040
いくつかの実施形態において、式Ａ５９におけるＰは、二本鎖オリゴヌクレオチド配列
における任意の可能な位置に結合されてもよく、例えば、式Ａ５９におけるＰは、二本鎖
オリゴヌクレオチドのセンス鎖又はアンチセンス鎖のいずれか１つのヌクレオチドに結合
されてもよく、いくつかの実施形態において、式Ａ５９におけるＰは、二本鎖オリゴヌク
レオチドのセンス鎖のいずれか１つのヌクレオチドに結合される。いくつかの実施形態に
おいて、式Ａ５９におけるＰは、二本鎖オリゴヌクレオチドのセンス鎖又はアンチセンス
鎖の端部に結合され、いくつかの実施形態において、式Ａ５９におけるＰは、二本鎖オリ
ゴヌクレオチドのセンス鎖の端部に結合される。前記端部とは、前記センス鎖又は前記ア
ンチセンス鎖においてその一端から前の４ヌクレオチドを指す。いくつかの実施形態にお
いて、式Ａ５９におけるＰは、二本鎖オリゴヌクレオチドのセンス鎖又はアンチセンス鎖
の末端に結合され、いくつかの実施形態において、式Ａ５９におけるＰは、二本鎖オリゴ
ヌクレオチドのセンス鎖の３’末端に結合される。二本鎖オリゴヌクレオチドのセンス鎖
の上記位置に結合される場合に、本開示により提供される複合体は、細胞に入り込んだ後
、巻き戻されるときに、単独の二本鎖オリゴヌクレオチドのアンチセンス鎖を放出し、標
的遺伝子発現を調節することができる。
式Ａ５９におけるＰは、二本鎖オリゴヌクレオチドにおけるヌクレオチド上の任意の可
能な位置、例えば、ヌクレオチドの５’位、ヌクレオチドの２’位、ヌクレオチドの３’
位又はヌクレオチドの塩基に結合されてもよい。いくつかの実施形態において、式Ａ５９
におけるＰは、リン酸ジエステル結合を形成することにより前記二本鎖オリゴヌクレオチ
ドにおけるヌクレオチドの２’位、３’位又は５’位に結合されてもよい。いくつかの実
施形態において、式Ａ５９におけるＰは、二本鎖オリゴヌクレオチドのセンス鎖の３’末
端ヌクレオチドの３’ヒドロキシ基を脱水素した酸素原子に結合され、或いは、式Ａ５９
におけるＰは、二本鎖オリゴヌクレオチドのセンス鎖における１つのヌクレオチドの２’
－ヒドロキシ基中の水素を置換することによりヌクレオチドに結合され、或いは、式Ａ５
９におけるＰは、二本鎖オリゴヌクレオチドのセンス鎖の５’末端ヌクレオチドの５’ヒ
ドロキシ基中の水素を置換することによりヌクレオチドに結合される。
本開示に記載された二本鎖オリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチド複合体において
、各隣接するヌクレオチド間がリン酸ジエステル結合又はチオリン酸ジエステル結合によ
り結合され、リン酸ジエステル結合又はチオリン酸ジエステル結合における非架橋酸素原
子又は硫黄原子は、負電荷を帯び、ヒドロキシ基又はスルフヒドリル基として存在しても
よく、ヒドロキシ基又はスルフヒドリル基における水素イオンは、一部又は全部がカチオ
ンで置換されてもよい。前記カチオンは、任意のカチオン、例えば、金属カチオン、アン
モニウムイオンＮＨ４ ＋、有機アンモニウムカチオンの１つであってもよい。溶解性の向
上を考慮して、１つの実施形態において、前記カチオンは、アルカリ金属イオン、第３級
アミンにより形成されたアンモニウムカチオン及び４級アンモニウムカチオンから選択さ
れる１種又は複数種である。アルカリ金属イオンは、Ｋ＋及び／又はＮａ＋であってもよ
く、第３級アミンにより形成されたカチオンは、トリエチルアミンにより形成されたアン
モニウムイオン、及び／又はＮ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミンにより形成されたアン
モニウムイオンであってもよい。したがって、本開示に記載された二本鎖オリゴヌクレオ
チド又はオリゴヌクレオチド複合体は、少なくとも一部が塩として存在してもよい。１つ
の形態において、リン酸ジエステル結合又はチオリン酸ジエステル結合における非架橋酸
素原子又は硫黄原子は、少なくとも一部がナトリウムイオンに結合され、本開示に記載さ
れた二本鎖オリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチド複合体は、ナトリウム塩又は部分
ナトリウム塩として存在する。
当業者であれば明らかに知っているように、対応する修飾を有するヌクレオシドモノマ
ーを用いることにより修飾ヌクレオチド基を本開示に記載された二本鎖オリゴヌクレオチ
ドに導入することができる。対応する修飾を有するヌクレオシドモノマーを調製する方法
、及び修飾ヌクレオチド基を二本鎖オリゴヌクレオチドに導入する方法も、当業者によく
知られている。全ての修飾ヌクレオシドモノマーは、市販品を購入してもよく、既知の方
法により調製してもよい。
＜式（３０８）のオリゴヌクレオチド複合体の調製＞
任意の合理的な合成経路により本開示のオリゴヌクレオチド複合体を調製してもよい。
いくつかの実施形態において、式（３０８）のオリゴヌクレオチド複合体は、以下の方
法により調製することができる。当該方法は、ホスホルアミダイト固相合成の条件で、そ
れぞれ二本鎖オリゴヌクレオチドのセンス鎖及びアンチセンス鎖のヌクレオチドの種類と
順序により、３’から５’に向かってヌクレオシドモノマーを順に結合し、各ヌクレオシ
ドモノマーの結合が脱保護、カップリング、キャッピング、酸化又は硫化の４つの反応を
含み、二本鎖オリゴヌクレオチドのセンス鎖及びアンチセンス鎖を単離し、アニールを行
うことを含む。前記二本鎖オリゴヌクレオチドは、上記本開示の二本鎖オリゴヌクレオチ
ドである。
また、当該方法は、カップリング反応条件下及びカップリング試薬の存在下で、式（３
２１）に示される化合物を、ヌクレオシドモノマー又は固相担体に結合されたヌクレオチ
ド配列と接触させ、式（３２１）に示される化合物をカップリング反応させてヌクレオチ
ド配列に結合することをさらに含む。以下に、式（３２１）に示される化合物は、複合分
子とも呼ばれる。
Figure 2023134615000041
 式中、
Ｒ４は、本開示の二本鎖オリゴヌクレオチドに結合できる部分である。いくつかの実施
形態において、Ｒ４は、共有結合により本開示の二本鎖オリゴヌクレオチドに結合できる
部分である。いくつかの実施形態において、Ｒ４は、反応させてリン酸ジエステル結合に
より二本鎖オリゴヌクレオチドの任意の官能基に複合されることができる部分であり、
各Ｓ１は、独立してＭ１において全ての活性ヒドロキシ基がＹＣＯＯ－基で置換された
基であり、各Ｙは、メチル基、トリフルオロメチル基、ジフルオロメチル基、フルオロメ
チル基、トリクロロメチル基、ジクロロメチル基、クロロメチル基、エチル基、ｎ－プロ
ピル基、イソプロピル基、フェニル基、ハロフェニル基及びアルキルフェニル基から独立
して選択される１つである。
ｎ１、ｎ３、ｍ１、ｍ２、ｍ３、Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１４、Ｒ１５、
Ｌ１、Ｍ１それぞれの定義と選択可能な範囲は、前述したとおりである。
Ｒ４は、窒素含有骨格上のＮとの結合を実現し、式（３０８）のオリゴヌクレオチド複
合体の合成に適切な反応部位を提供するために選択される。いくつかの実施形態において
、Ｒ４には、Ｒ２リンカー基又は保護されたＲ２リンカー基、及び反応させることにより
二本鎖オリゴヌクレオチドとＡ５９に示される構造を形成することができる官能基が含ま
れる。
いくつかの実施形態において、Ｒ４は、二本鎖オリゴヌクレオチド又はヌクレオシドモ
ノマー上の基と亜リン酸エステルを形成することができる第１の官能基、及びヒドロキシ
基又はアミノ基と反応させて共有結合を形成することができる第２の官能基を含み、或い
は、前記共有結合により結合された固相担体を含む。いくつかの実施形態において、前記
第１の官能基は、ホスホルアミダイト、ヒドロキシ基又は保護されたヒドロキシ基である
。いくつかの実施形態において、前記第２の官能基は、ホスホルアミダイト、カルボン酸
又はカルボン酸塩である。いくつかの実施形態において、前記第２の官能基は、共有結合
を介して分子の他の部分に結合される固相担体であり、前記共有結合は、ヒドロキシ基又
はアミノ基により形成されている。いくつかの実施形態において、前記固相担体は、リン
酸エステル結合、カルボン酸エステル結合又はアミド結合を介して結合されている。いく
つかの実施形態において、前記固相担体は樹脂である。
いくつかの実施形態において、前記第１の官能基は、ヒドロキシ基、－ＯＲｋ又は式（
Ｃ３）に示される基を含み、前記第２の官能基は、式（Ｃ１）、（Ｃ２）、（Ｃ３）、（
Ｃ１’）又は（Ｃ３’）に示される構造を含む。
Figure 2023134615000042
 式中、ｑ１は１～４の整数であり、ＸはＯ又はＮＨであり、Ｍ＋はカチオンであり、Ｒ
ｋはヒドロキシ保護基であり、ＳＰＳは固相担体を表し、
Figure 2023134615000043
は、基が分子の残りの部分に共有結合的に結合される部位を表す。
いくつかの実施形態において、前記第１の官能基は、式（Ｃ３）に示されるように、ホ
スホルアミダイト基を含み、当該ホスホルアミダイト基は、ヌクレオチド上の任意位置の
ヒドロキシ基、例えば、２’位のヒドロキシ基又は３’位のヒドロキシ基とカップリング
反応させて亜リン酸エステルを形成し、酸化又は硫化されて式Ａ５９に示されるリン酸ジ
エステル結合又はチオリン酸エステル結合を形成し、複合分子を二本鎖オリゴヌクレオチ
ドに複合させることができる。この場合、前記第２の官能基が存在しなくても、式（３２
１）の化合物は、ヌクレオチドに複合することもでき、式（３０８）に示されるオリゴヌ
クレオチド複合体の取得に影響することはない。この場合に、ホスホルアミダイト固相合
成等の方法により二本鎖オリゴヌクレオチドのセンス鎖又はアンチセンス鎖を得た後、式
（３２１）の化合物と、ヌクレオチド配列において末端ヌクレオチド上のヒドロキシ基を
反応させ、後の酸化又は硫化過程においてリン酸ジエステル結合結合又はチオリン酸エス
テル結合を形成し、式（３２１）の化合物を二本鎖オリゴヌクレオチドに複合させる。
いくつかの実施形態において、前記第１の官能基は、保護されたヒドロキシ基を含む。
いくつかの実施形態において、前記第２の官能基は、固相担体と反応できる基を含み、前
記反応により固相担体を含む複合分子を提供する。いくつかの実施形態において、前記第
２の官能基は、式（Ｃ１）、（Ｃ２）又は（Ｃ３）に示されるように、カルボキシ基、カ
ルボン酸塩又はホスホルアミダイトを含む。前記第２の官能基がカルボキシ基又はカルボ
ン酸塩を含む場合、式（３２１）の化合物と固相担体、例えば、樹脂におけるヒドロキシ
基又はアミノ基をエステル化反応又はアミド化反応させ、カルボン酸エステル結合により
結合された、又はアミド結合により結合された、固相担体を含む複合分子を形成する。前
記第２の官能基がホスホルアミダイト官能基を含む場合、式（３２１）の化合物と汎用の
固相担体、例えば、樹脂におけるヒドロキシ基をカップリング反応させ、酸化されてリン
酸ジエステル結合により結合された、固相担体を含む複合分子を形成する。その後、上記
固相担体が結合された生成物を出発とし、ホスホルアミダイト固相合成方法に従いヌクレ
オシドモノマーを順に結合し、複合基が結合された二本鎖オリゴヌクレオチドのセンス鎖
又はアンチセンス鎖を得る。ホスホルアミダイト固相合成過程において、前記第１の官能
基は、脱保護され、その後、カップリング反応条件下でヌクレオシドモノマーにおけるホ
スホルアミダイト基とカップリングさせる。
いくつかの実施形態において、前記第１の官能基は、ヒドロキシ基又は保護されたヒド
ロキシ基を含み、前記第２の官能基は、式（Ｃ１’）又は（Ｃ３’）に示されるように、
カルボン酸エステル結合により結合された固相担体又はアミド結合により結合された固相
担体、又はリン酸エステル結合により結合された固相担体を含む。この場合、出発として
固相担体の代わりに式（３２１）の化合物を用い、ホスホルアミダイト固相合成方法に従
いヌクレオシドモノマーを順に結合し、複合基が結合された二本鎖オリゴヌクレオチドの
センス鎖又はアンチセンス鎖を得る。
いくつかの実施形態において、カルボン酸塩は、－ＣＯＯ－Ｍ＋で表されてもよく、こ
こで、Ｍ＋は、カチオンであり、例えば、金属カチオン、アンモニウムカチオンＮＨ４ ＋
、有機アンモニウムカチオンから選択される１つである。１つの実施形態において、前記
金属イオンは、アルカリ金属イオンから選択される１つであり、例えば、Ｋ＋又はＮａ＋
である。溶解性を向上させ、反応をスムーズに行うことを考慮して、いくつかの実施形態
において、有機アンモニウムイオンは、第３級アミンにより形成されたアンモニウムカチ
オン又は４級アンモニウムカチオン、例えば、トリエチルアミンにより形成されたアンモ
ニウムイオン又はＮ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミンにより形成されたアンモニウムイ
オンである。いくつかの実施形態において、カルボン酸塩は、トリエチルアミンカルボン
酸塩又はＮ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミンカルボン酸塩である。
いくつかの実施形態において、Ｒ４は、式（Ｂ９）、（Ｂ１０）、（Ｂ９’）、（Ｂ１
０’）、（Ｂ１１）、（Ｂ１２）、（Ｂ１１’）又は（Ｂ１２’）に示される構造を含む
。
Figure 2023134615000044
 式中、ｑ１は１～４の整数であり、ｑ２は１～１０の整数であり、ＸはＯ又はＮＨであ
り、Ｍ＋はカチオンであり、Ｒｋはヒドロキシ保護基であり、ＳＰＳは固相担体を表し、
Figure 2023134615000045
は、基が分子の残りの部分に共有結合的に結合される部位を表す。いくつかの実施形態に
おいて、ｑ１は１又は２である。いくつかの実施形態において、ｑ２は１～５の整数であ
る。いくつかの実施形態において、Ｒ４は、式（Ｂ９）又は（Ｂ１０）に示される構造を
含む。いくつかの実施形態において、Ｒ４は、式（Ｂ１１）又は（Ｂ１２）に示される構
造を含む。
いくつかの実施形態において、Ｒｋは、Ｔｒ（トリチル基）、ＭＭＴｒ（４－メトキシ
トリチル基）、ＤＭＴｒ（４，４’－ビスメトキシトリチル基）、ＴＭＴｒ（４，４’，
４’－トリメトキシフェニルメチル基）の１又は複数である。いくつかの実施形態におい
て、Ｒｋは、ＤＭＴｒ、即ち、４，４’－ビスメトキシトリチル（４，４’－ｄｉｍｅｔ
ｈｏｘｙｔｒｉｔｙｌ）であってもよい。
Ｌ１とは、長さ１～７０の炭素原子の直鎖アルキレン基を指し、そのうちの１又は複数
の炭素原子が、Ｃ（Ｏ）、ＮＨ、Ｏ、Ｓ、ＣＨ＝Ｎ、Ｓ（Ｏ）２、Ｃ２－Ｃ１０アルケニ
レン基、Ｃ２－Ｃ１０アルキニレン基、Ｃ６－Ｃ１０アリーレン基、Ｃ３－Ｃ１８ヘテロ
シクリレン基及びＣ５－Ｃ１０ヘテロアリーレン基からなる群から選択される１又は複数
で任意に置換され、Ｌ１は、Ｃ１－Ｃ１０アルキル基、Ｃ６－Ｃ１０アリール基、Ｃ５－
Ｃ１０ヘテロアリール基、Ｃ１－Ｃ１０ハロゲン化アルキル基、－ＯＣ１－Ｃ１０アルキ
ル基、－ＯＣ１－Ｃ１０アルキルフェニル基、－Ｃ１－Ｃ１０アルキル－ＯＨ、－ＯＣ１
－Ｃ１０ハロゲン化アルキル基、－ＳＣ１－Ｃ１０アルキル基、－ＳＣ１－Ｃ１０アルキ
ルフェニル基、－Ｃ１－Ｃ１０アルキル－ＳＨ、－ＳＣ１－Ｃ１０ハロゲン化アルキル基
、ハロゲン置換基、－ＯＨ、－ＳＨ、－ＮＨ２、－Ｃ１－Ｃ１０アルキル－ＮＨ２、－Ｎ
（Ｃ１－Ｃ１０アルキル基）（Ｃ１－Ｃ１０アルキル基）、－ＮＨ（Ｃ１－Ｃ１０アルキ
ル基）、シアノ基、ニトロ基、－ＣＯ２Ｈ、－Ｃ（Ｏ）ＯＣ１－Ｃ１０アルキル基、－Ｃ
ＯＮ（Ｃ１－Ｃ１０アルキル基）（Ｃ１－Ｃ１０アルキル基）、－ＣＯＮＨ（Ｃ１－Ｃ１
０アルキル基）、－ＣＯＮＨ２、－ＮＨＣ（Ｏ）（Ｃ１－Ｃ１０アルキル基）、－ＮＨＣ
（Ｏ）（フェニル基）、－Ｎ（Ｃ１－Ｃ１０アルキル）Ｃ（Ｏ）（Ｃ１－Ｃ１０アルキル
基）、－Ｎ（Ｃ１－Ｃ１０アルキル）Ｃ（Ｏ）（フェニル基）、－Ｃ（Ｏ）Ｃ１－Ｃ１０
アルキル基、－Ｃ（Ｏ）Ｃ１－Ｃ１０アルキルフェニル基、－Ｃ（Ｏ）Ｃ１－Ｃ１０ハロ
アルキル基、－ＯＣ（Ｏ）Ｃ１－Ｃ１０アルキル基、－ＳＯ２（Ｃ１－Ｃ１０アルキル基
）、－ＳＯ２（フェニル基）、－ＳＯ２（Ｃ１－Ｃ１０ハロゲン化アルキル基）、－ＳＯ
２ＮＨ２、－ＳＯ２ＮＨ（Ｃ１－Ｃ１０アルキル基）、－ＳＯ２ＮＨ（フェニル基）、－
ＮＨＳＯ２（Ｃ１－Ｃ１０アルキル基）、－ＮＨＳＯ２（フェニル基）及び－ＮＨＳＯ２
（Ｃ１－Ｃ１０ハロゲン化アルキル基）からなる群のいずれか１つ又は複数の置換基を任
意に有してもよい。
いくつかの実施形態において、Ｌ１は、Ｍ１リガンドを窒素含有骨格上のＮ原子に結合
し、オリゴヌクレオチド複合体に肝標的機能を提供するために用いられる。いくつかの実
施形態において、Ｌ１は、Ａ１～Ａ２６のいずれか１つ又はその組合せを含む。
上記記載により、当業者であれば容易に理解できるように、本分野で公知のホスホルア
ミダイト固相合成方法と比較して、上記第１の官能基及び任意の第２の官能基により、複
合分子がヌクレオチド配列の任意の可能な位置、例えば、ヌクレオチド配列の端部、ヌク
レオチド配列の末端に結合された、オリゴヌクレオチド複合体を得ることができる。これ
に応じて、特に説明がない限り、以下に複合体の調製に関する記載において、「脱保護」
、「カップリング」、「キャッピング」、「酸化」、「硫化」等の反応に言及する場合、
本分野で公知のホスホルアミダイト核酸の固相合成方法に係る反応条件と試薬もまた、同
様にこれらの反応に適用されると理解すべきである。例示的な反応条件と試薬は、以下に
詳細に説明する。
いくつかの実施形態において、各Ｓ１は、独立してＭ１である。いくつかの実施形態に
おいて、各Ｓ１は、独立してＭ１において少なくとも１つの活性ヒドロキシ基がヒドロキ
シ保護基で保護された基である。いくつかの実施形態において、各Ｓ１は、独立してＭ１
に存在する活性ヒドロキシ基が全てヒドロキシ保護基で保護された基である。いくつかの
実施形態において、当業者に既知のあらゆるヒドロキシ保護基を、Ｍ１における活性ヒド
ロキシ基を保護するために用いることができる。いくつかの実施形態において、保護され
たヒドロキシ基は、式ＹＣＯＯ－で表されてもよく、各Ｙは、独立してＣ１－Ｃ１０アル
キル基及びＣ６－Ｃ１０アリール基からなる群から選択され、前記Ｃ１－Ｃ１０アルキル
基及びＣ６－Ｃ１０アリール基は、１又は複数の置換基で任意に置換され、前記置換基は
、ハロゲン及びＣ１－Ｃ６アルキル基からなる群から選択される。いくつかの実施形態に
おいて、各Ｙは、独立して、メチル基、トリフルオロメチル基、ジフルオロメチル基、モ
ノフルオロメチル基、トリクロロメチル基、ジクロロメチル基、クロロメチル基、エチル
基、ｎ－プロピル基、イソプロピル基、フェニル基、ハロフェニル基及びＣ１－Ｃ６アル
キルフェニル基からなる群から選択される。
いくつかの実施形態において、各Ｓ１は、それぞれ独立して式Ａ４６～Ａ５４からなる
群から選択される。
Figure 2023134615000046
いくつかの実施形態において、Ｓ１は式Ａ４９又はＡ５０である。
いくつかの実施形態において、各Ｙは、メチル基、トリフルオロメチル基、ジフルオロ
メチル基、フルオロメチル基、トリクロロメチル基、ジクロロメチル基、クロロメチル基
、エチル基、ｎ－プロピル基、イソプロピル基、フェニル基、ハロフェニル基及びアルキ
ルフェニル基から独立して選択される１つであり、いくつかの実施形態において、Ｙはメ
チル基である。
前述したように、本開示のオリゴヌクレオチド複合体の調製方法は、二本鎖オリゴヌク
レオチドの他方の鎖を合成し（例えば、上記工程で、複合基が結合された二本鎖オリゴヌ
クレオチドのセンス鎖を合成した場合、固相合成方法に従い二本鎖オリゴヌクレオチドの
アンチセンス鎖を合成することをさらに含み、その逆も同様である）、センス鎖及びアン
チセンス鎖を単離し、かつ、アニールを行う工程をさらに含む。具体的には、単離工程に
おいて、ヌクレオチド配列及び／又は複合基に結合される固相担体が切断されるとともに
、必要な保護基が除去され（この場合、式（３２１）の化合物における各Ｓ１基が、対応
するＭ１リガンドに変換される）、複合基が結合された二本鎖オリゴヌクレオチドのセン
ス鎖（又はアンチセンス鎖）及び対応するアンチセンス鎖（又はセンス鎖）が得られ、セ
ンス鎖とアンチセンス鎖をアニールして二本鎖ＲＮＡ構造を形成し、式（３０８）に示さ
れるオリゴヌクレオチド複合体を得る。
いくつかの実施形態において、前記オリゴヌクレオチド複合体の調製方法は、カップリ
ング反応条件下及びカップリング試薬の存在下で、式（３２１）に示される化合物をセン
ス鎖又はアンチセンス鎖の３’端の１番目のヌクレオシドモノマーと接触させ、式（３２
１）に示される化合物を配列における１番目のヌクレオチドに結合させ、ホスホルアミダ
イト固相合成の条件で、所望のセンス鎖又はアンチセンス鎖のヌクレオチドの種類と順序
により、３’から５’に向かってヌクレオシドモノマーを順に結合し、二本鎖オリゴヌク
レオチドのセンス鎖又はアンチセンス鎖を合成する工程であって、（３２１）の化合物は
、Ｒ４に、保護されたヒドロキシ基を含む第１の官能基、及び式（Ｃ１’）又は（Ｃ３’
）に示される構造を有する第２の官能基が含まれる、式（３２１）に示される化合物であ
り、１番目のヌクレオシドモノマーと結合する前に、式（３２１）の化合物を脱保護し、
各ヌクレオシドモノマーの結合が脱保護、カップリング、キャッピング、酸化又は硫化の
４つの反応を含み、複合基が結合された核酸のセンス鎖又はアンチセンス鎖を得る工程；
ホスホルアミダイト固相合成の条件で、アンチセンス鎖又はセンス鎖のヌクレオチドの種
類と順序により、３’から５’に向かってヌクレオシドモノマーを順に結合し、核酸のア
ンチセンス鎖又はセンス鎖を合成し、各ヌクレオシドモノマーの結合が脱保護、カップリ
ング、キャッピング、酸化又は硫化の４つの反応を含み、保護基を除去して固相担体から
切断し、単離精製して核酸のセンス鎖及びアンチセンス鎖を得、アニールを行う工程を含
む。
いくつかの実施形態において、前記オリゴヌクレオチド複合体の調製方法は、当該二本
鎖オリゴヌクレオチドにおけるセンス鎖又はアンチセンス鎖のヌクレオチドの種類と順序
により、３’から５’に向かってヌクレオシドモノマーを順に結合し、センス鎖及びアン
チセンス鎖を合成し、各ヌクレオシドモノマーの結合が脱保護、カップリング、キャッピ
ング、酸化又は硫化の４つの反応を含み、固相担体に結合されたセンス鎖、及び固相担体
に結合されたアンチセンス鎖を得る工程と、カップリング反応条件下及びカップリング試
薬の存在下で、式（３２１）に示される化合物を、固相担体に結合されたセンス鎖又は固
相担体に結合されたアンチセンス鎖と接触させ、Ｒ４にホスホルアミダイト基である第１
の官能基が含まれる式（３２１）の化合物をセンス鎖又はアンチセンス鎖に結合させる工
程と、保護基を除去して固相担体から切断し、それぞれ単離精製し、二本鎖オリゴヌクレ
オチドのセンス鎖又はアンチセンス鎖を得、アニールを行う工程を含む。前記二本鎖オリ
ゴヌクレオチドのセンス鎖又はアンチセンス鎖に複合基が結合されている。
いくつかの実施形態において、式Ａ５９におけるＰは、二本鎖オリゴヌクレオチドにお
けるセンス鎖の３’末端に結合され、本開示のオリゴヌクレオチド複合体の調製方法は、
（１）式（３２１）の化合物（式（３２１）の化合物は、Ｒ４に、保護されたヒドロキ
シ基ＯＲｋを含む第１の官能基、及び式（Ｃ１’）又は（Ｃ３’）に示される構造を有す
る第２の官能基が含まれる化合物である）におけるヒドロキシ保護基Ｒｋを除去し、カッ
プリング反応条件下及びカップリング試薬の存在下で、脱保護された生成物をヌクレオシ
ドモノマーと接触させ、複合基により固相担体に結合されるヌクレオシドモノマーを得る
こと、
（２）当該複合分子により固相担体に結合されるヌクレオシドモノマーを出発とし、３
’－５’の方向に従い、ホスホルアミダイト固相合成方法により二本鎖オリゴヌクレオチ
ドのセンス鎖を合成すること、
（３）ホスホルアミダイト固相合成方法により、二本鎖オリゴヌクレオチドのアンチセ
ンス鎖を合成すること、
（４）二本鎖オリゴヌクレオチドのセンス鎖及びアンチセンス鎖を単離してアニールし
、本開示のオリゴヌクレオチド複合体を得ることを含む。
工程（１）において、式（３２１）の化合物における保護基Ｒｋを除去する方法は、脱
保護条件で、式（３２１）の化合物を脱保護試薬と接触させることを含む。脱保護条件と
しては、温度が０～５０℃であり、いくつかの実施形態において、１５～３５℃であり、
反応時間が３０～３００秒であり、いくつかの実施形態において、５０～１５０秒であり
、脱保護試薬は、トリフルオロ酢酸、トリクロロ酢酸、ジクロロ酢酸、クロロ酢酸から選
択される１種又は複数種であってよく、いくつかの実施形態において、ジクロロ酢酸であ
る。脱保護試薬と式（３２１）の化合物とのモル比が１０：１～１０００：１であり、い
くつかの実施形態において、５０：１～５００：１である。
前記カップリング反応条件とカップリング試薬としては、上記カップリング反応に適し
た任意の条件と試薬を用いてもよい。いくつかの実施形態において、採用される固相合成
方法におけるカップリング反応と同じ条件と試薬を用いてもよい。
いくつかの実施形態において、前記カップリング反応の条件としては、反応温度が０～
５０℃であり、いくつかの実施形態において、１５～３５℃であってもよい。式（３２１
）の化合物とヌクレオシドモノマーとのモル比が１：１～１：５０であり、いくつかの実
施形態において、１：２～１：５であり、式（３２１）の化合物とカップリング試薬との
モル比が１：１～１：５０であってもよく、いくつかの実施形態において、１：３～１：
１０であり、反応時間が２００～３０００秒であり、いくつかの実施形態において、５０
０～１５００秒である。カップリング試薬は、１Ｈ－テトラゾール、５－エチルチオ１Ｈ
－テトラゾール、５－ベンジルチオ１Ｈ－テトラゾールから選択される１種又は複数種で
あってよく、いくつかの実施形態においては、５－エチルチオ１Ｈ－テトラゾールである
。前記カップリング反応は、有機溶剤で行われてもよく、前記有機溶剤は、無水アセトニ
トリル、無水ＤＭＦ、無水ジクロロメタンから選択される１種又は複数種であってよく、
いくつかの実施形態においては、無水アセトニトリルである。式（３２１）の化合物に対
して、前記有機溶剤の用量が３～５０Ｌ／ｍｏｌであり、いくつかの実施形態において、
５～２０Ｌ／ｍｏｌである。
工程（２）において、ホスホルアミダイト核酸固相合成方法により、上記工程で調製さ
れた複合分子により固相担体に結合されるヌクレオシドモノマーを出発とし、３’－５’
の方向に従い、オリゴヌクレオチド複合体のセンス鎖Ｓを合成する。この場合、複合基は
、得られたセンス鎖の３’末端に結合される。
工程（２）及び（３）における前記固相合成の他の条件としては、ヌクレオシドモノマ
ーの脱保護条件、脱保護試薬の種類と用量、カップリング反応条件、カップリング試薬の
種類と用量、キャッピング反応の条件、キャッピング試薬の種類と用量、酸化反応条件、
酸化試薬の種類と用量、硫化反応条件、硫化試薬及び用量を含み、本分野で通常用いられ
る各種の試薬、用量及び条件を採用する。
例えば、いくつかの実施形態において、工程（２）及び（３）において、前記固相合成
では、以下の条件を用いてもよい。
ヌクレオシドモノマーの脱保護条件としては、温度が０～５０℃であり、いくつかの実
施形態において、１５～３５℃であり、反応時間が３０～３００秒であり、いくつかの実
施形態において、５０～１５０秒であり、脱保護試薬は、トリフルオロ酢酸、トリクロロ
酢酸、ジクロロ酢酸、クロロ酢酸から選択される１種又は複数種であってよく、いくつか
の実施形態においては、ジクロロ酢酸である。脱保護試薬と固相担体における４，４’－
ジメトキシトリチル保護基とのモル比は、２：１～１００：１であってもよく、いくつか
の実施形態において、３：１～５０：１である。
カップリング反応条件としては、温度が０～５０℃であり、いくつかの実施形態におい
て、１５～３５℃であり、固相担体に結合される核酸配列とヌクレオシドモノマーとのモ
ル比が１：１～１：５０であってもよく、いくつかの実施形態において、１：５～１：１
５であり、固相担体に結合される核酸配列とカップリング試薬とのモル比が１：１～１：
１００であってもよく、いくつかの実施形態において、１：５０～１：８０であり、反応
時間とカップリング試薬の選択は、前記と同じである。
キャッピング反応条件としては、温度が０～５０℃であり、いくつかの実施形態におい
て、１５～３５℃であり、反応時間が５～５００秒であり、いくつかの実施形態において
、１０～１００秒であり、キャッピング試薬の選択は、前記と同じである。キャッピング
試薬の総量と固相担体に結合される核酸配列とのモル比が１：１００～１００：１であり
、いくつかの実施形態において、１：１０～１０：１である。キャッピング試薬として等
モル量の酢酸無水物とＮ－メチルイミダゾールを用いる場合に、酢酸無水物、Ｎ－メチル
イミダゾール及び固相担体に結合される核酸配列のモル比が１：１：１０～１０：１０：
１であり、いくつかの実施形態において、１：１：２～２：２：１である。
酸化反応条件としては、温度が０～５０℃であり、いくつかの実施形態において、１５
～３５℃であり、反応時間が１～１００秒であり、いくつかの実施形態において、５～５
０秒であり、酸化試薬は、いくつかの実施形態において、ヨウ素である（いくつかの実施
形態において、ヨウ素水として提供する）。酸化試薬と、カップリング工程において固相
担体に結合される核酸配列とのモル比が、１：１～１００：１であってもよく、いくつか
の実施形態において、５：１～５０：１である。いくつかの実施形態において、前記酸化
反応は、テトラヒドロフラン：水：ピリジン＝３：１：１～１：１：３の混合溶剤で行わ
れる。硫化反応条件としては、温度が０～５０℃であり、いくつかの実施形態において、
１５～３５℃であり、反応時間が５０～２０００秒であり、いくつかの実施形態において
、１００～１０００秒であり、硫化試薬は、いくつかの実施形態において、キサンタンヒ
ドリドである。硫化試薬と、カップリング工程において固相担体に結合される核酸配列と
のモル比が１０：１～１０００：１であってもよく、いくつかの実施形態において、１０
：１～５００：１である。いくつかの実施形態において、前記硫化反応は、アセトニトリ
ル：ピリジン＝１：３～３：１の混合溶剤で行われる。
全てのヌクレオシドモノマーを結合した後、アニールする前、当該方法は、二本鎖オリ
ゴヌクレオチドのセンス鎖及びアンチセンス鎖を単離することをさらに含む。単離方法は
、当業者に公知であり、一般的に、合成されたヌクレオチド配列を固相担体から切断し、
塩基上、リン酸基上及びリガンド上の保護基を除去し、精製し脱塩することを含む。
合成されたヌクレオチド配列を固相担体から切断し、塩基上、リン酸基上及びリガンド
上の保護基を除去するには、二本鎖オリゴヌクレオチド合成において通常の切断と脱保護
方法により行われてもよい。例えば、得られた固相担体が結合されたヌクレオチド配列を
濃アンモニア水と接触させ、脱保護過程において、Ａ４６～Ａ５４基の保護基ＹＣＯＯ－
をヒドロキシ基に変換させ、Ｓ１基を対応するＭ１基に変換させ、式（３０８）に示され
る複合体を生成する。ここで、前記濃アンモニア水は、２５～３０重量％のアンモニア水
であってもよく、濃アンモニア水の用量は、目的とする二本鎖オリゴヌクレオチド配列に
対して０．２ｍｌ／μｍｏｌ～０．８ｍｌ／μｍｏｌであってもよい。
合成されたヌクレオチド配列に少なくとも１つの２’－ＴＢＤＭＳ保護がある場合、前
記方法は、固相担体が除去されたヌクレオチド配列をトリエチルアミン三フッ化水素酸塩
と接触させることにより、当該２’－ＴＢＤＭＳ保護を除去することをさらに含む。この
場合、得られた目的とする二本鎖オリゴヌクレオチド配列には、遊離の２’－ヒドロキシ
基の対応するヌクレオシドを有する。純粋なトリエチルアミン三フッ化水素酸塩の用量は
、目的とする二本鎖オリゴヌクレオチド配列に対して０．４ｍｌ／μｍｏｌ～１．０ｍｌ
／μｍｏｌであってもよい。このように式（３０８）のオリゴヌクレオチド複合体を得る
ことができる。
精製及び脱塩する方法は、当業者によく知られている。例えば、分取用イオンクロマト
グラフィー精製カラムを用いて、ＮａＢｒ又はＮａＣｌの勾配溶出によって、核酸の精製
を完成し、生成物を回収して合わせた後、逆相クロマトグラフィー精製カラムにより脱塩
することができる。
このように得られたオリゴヌクレオチド複合体において、ヌクレオチド間のリン酸ジエ
ステル結合又はチオリン酸ジエステル結合における非架橋酸素原子又は硫黄原子は、基本
的にナトリウムイオンに結合されており、オリゴヌクレオチド複合体は、基本的にナトリ
ウム塩として存在する。熟知のイオン交換方法により、水素イオン及び／又は他のカチオ
ンで前記ナトリウムイオンを置換し、他の形式のオリゴヌクレオチド複合体を得ることが
できる。前記カチオンは、前述したとおりである。
合成過程において、常に核酸配列の純度と分子量を検出し、合成品質をよりよく制御す
ることができる。このような検出方法は、当業者に公知である。例えば、イオン交換クロ
マトグラフィーにより核酸純度を検出し、液体クロマトグラフィータンデム質量分析によ
り分子量を測定することができる。
アニール方法も、当業者によく知られている。例えば、簡単に合成されたセンス鎖（Ｓ
鎖）とアンチセンス鎖（ＡＳ鎖）を等モル比で注射用水に混合して７０～９５℃に加熱し
、その後室温で冷却し、水素結合により二本鎖構造を形成させることができる。このよう
に本開示のオリゴヌクレオチド複合体を得ることができる。
本開示の複合体を得た後、いくつかの実施形態において、例えば、液体クロマトグラフ
ィータンデム質量分析等の方法を用いて、分子量検出等により合成されたオリゴヌクレオ
チド複合体の特徴を明らかにし、合成されたオリゴヌクレオチド複合体が、目的設計のオ
リゴヌクレオチド複合体であるとともに、合成された二本鎖オリゴヌクレオチドの配列が
、所望の二本鎖オリゴヌクレオチドの配列、例えば表１に示される配列の１つであると確
認することもできる。
式（３２１）に示される化合物は、有機溶剤において、エステル化反応条件下及び塩基
とエステル化触媒の存在下で、式（３１３）に示される化合物を環状酸無水物と接触させ
、イオン交換を行い、単離して式（３２１）に示される化合物を得ることを含む調製方法
により得ることができる。
Figure 2023134615000047
 式中、ｎ１、ｎ３、ｍ１、ｍ２、ｍ３、Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１４、Ｒ
１５、Ｌ１、Ｓ１それぞれの定義と選択可能な範囲は、前述したとおりであり、
Ｒ６は、式（３２１）におけるＲ４を提供する基である。いくつかの実施形態において
、Ｒ６は、式（Ａ６１）に示される構造を有する。
Figure 2023134615000048
 式中、Ｒｉは、窒素含有骨格上のＮとの結合を実現できる、ＲｋＯと結合して１つの遊
離ヒドロキシ基が結合されている任意の基であり、Ｒｋはヒドロキシ保護基である。この
場合、Ｒ４にヒドロキシ保護基としての第１の官能基と第２の官能基が含まれ、前記第２
の官能基が式（Ｃ１）又は（Ｃ２）に示される構造を含む式（３２１）の化合物が得られ
る。
前記エステル化反応条件としては、反応温度が０～１００℃であり、反応時間が８～４
８時間であり、いくつかの実施形態において、前記エステル化反応条件としては、反応温
度が１０～４０℃であり、反応時間が２０～３０時間である。
いくつかの実施形態において、前記有機溶剤は、エポキシ類溶剤、エーテル類溶剤、ハ
ロゲン化アルキル類溶剤、ジメチルスルホキシド、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド及びＮ
，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミンの１種又は複数種を含む。いくつかの実施形態におい
て、前記エポキシ類溶剤は、ジオキサン及び／又はテトラヒドロフランであり、前記エー
テル類溶剤は、エチルエーテル及び／又はメチルｔｅｒｔ－ブチルエーテルであり、前記
ハロゲン化アルキル類溶剤は、ジクロロメタン、トリクロロメタン及び１，２－ジクロロ
エタンの１種又は複数種である。いくつかの実施形態において、前記有機溶剤は、ジクロ
ロメタンである。前記式（３１３）に示される化合物に対して、前記有機溶剤の用量が３
～５０Ｌ／ｍｏｌであり、いくつかの実施形態において、５～２０Ｌ／ｍｏｌである。
いくつかの実施形態において、前記環状酸無水物は、コハク酸無水物、グルタル酸無水
物、アジピン酸無水物又はピメリン酸無水物の１つであり、いくつかの実施形態において
、コハク酸無水物である。前記環状酸無水物と前記式（３１３）に示される化合物とのモ
ル比が１：１～１０：１であり、いくつかの実施形態において、２：１～５：１である。
前記エステル化触媒は、当該エステル化反応を触媒する任意の触媒であってもよく、例
えば、当該触媒は、４－ジメチルアミノピリジンであってもよい。前記触媒と式（３１３
）に示される化合物とのモル比が１：１～１０：１であり、いくつかの実施形態において
、２：１～５：１である。
いくつかの実施形態において、前記塩基は、任意の無機塩基、有機塩基又はこれらの組
合せであってもよい。溶解性及び生成物の安定性を考慮すると、前記塩基は、例えば、第
３級アミン類有機塩基であってもよい。いくつかの実施形態において、前記第３級アミン
類有機塩基は、トリエチルアミン又はＮ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミンである。前記
第３級アミン類有機塩基と式（３１３）に示される化合物とのモル比が１：１～２０：１
であり、いくつかの実施形態において、３：１～１０：１である。
前記イオン交換作用は、式（３２１）の化合物を所望のカルボン酸又はカルボン酸塩の
形式に変換することであり、イオン交換方法は、当業者に公知であり、適切なイオン交換
溶液と交換条件を用い、前述したカチオンがＭ＋である複合分子を得ることができ、ここ
で詳しい説明を省略する。いくつかの実施形態において、前記イオン交換反応は、トリエ
チルアミンリン酸塩溶液を用いて行われ、前記トリエチルアミンリン酸塩溶液の濃度が０
．２～０．８Ｍであり、いくつかの実施形態において、前記トリエチルアミンリン酸塩溶
液の濃度が０．４～０．６Ｍであり、式（３１３）の化合物に対して、前記トリエチルア
ミンリン酸塩溶液の用量が３～６Ｌ／ｍｏｌであり、さらなる実施形態において４～５Ｌ
／ｍｏｌである。
任意の適切な単離方法により反応混合物から式（３２１）の化合物を単離することがで
きる。いくつかの実施形態において、溶剤を蒸発除去した後、クロマトグラフィー方法に
より式（３２１）の化合物を単離することができ、例えば、（１）順相精製シリカゲル：
２００～３００メッシュのシリカゲル充填剤を、１ｗｔ‰トリエチルアミンを含むジクロ
ロメタン：メタノール＝１００：１８～１００：２０で勾配溶出する、又は、（２）逆相
精製：Ｃ１８、Ｃ８逆相充填剤を、メタノール：アセトニトリル＝０．１：１～１：０．
１で勾配溶出するというクロマトグラフィー条件で単離することができる。いくつかの実
施形態において、溶剤を直接に除去して式（３２１）の化合物の粗製品を得ることができ
、当該粗製品は、そのまま後の反応に用いることができる。
いくつかの実施形態において、式（３２１）の化合物の調製方法は、縮合反応条件下で
、有機溶剤において、縮合剤と第３級アミン類有機塩基の存在下で、上記イオン交換反応
により得られた生成物を、さらにアミノ基又はヒドロキシ基を含む固相担体と接触させる
ことをさらに含む。この場合、Ｒ４に第１の官能基及び第２の官能基が含まれ、第１の官
能基がヒドロキシ保護基を含み、第２の官能基が式（Ｃ１’）に示される構造を含む式（
３２１）の化合物が得られる。
前記固相担体は、二本鎖オリゴヌクレオチドの固相合成に用いられる担体の１つであり
、そのうちのいくつかは、当業者に公知である。例えば、前記固相担体は、活性ヒドロキ
シ基又はアミノ官能基を含む固相担体から選択されてもよい。いくつかの実施形態におい
て、前記固相担体は、アミノ樹脂又はヒドロキシ樹脂である。いくつかの実施形態におい
て、前記アミノ樹脂又はヒドロキシ樹脂は、粒子径１００～４００メッシュ（ｍｅｓｈ）
、表面におけるアミノ基又はヒドロキシ基の担持量０．２～０．５ｍｍｏｌ／ｇというパ
ラメーターを有する。前記式（３２１）に示される化合物と固相担体との用量比は１０～
４００μｍｏｌ化合物／グラムの固相担体（μｍｏｌ／ｇ）である。いくつかの実施形態
において、前記式（３２１）に示される化合物と固相担体との用量比は５０～２００μｍ
ｏｌ／ｇである。
前記有機溶剤は、当業者に既知の任意の適切な溶剤又は混合溶剤であってもよい。いく
つかの実施形態において、前記有機溶剤は、アセトニトリル、エポキシ類溶剤、エーテル
類溶剤、ハロゲン化アルキル類溶剤、ジメチルスルホキシド、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムア
ミド及びＮ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミンの１種又は複数種である。いくつかの実施
形態において、前記エポキシ類溶剤は、ジオキサン及び／又はテトラヒドロフランであり
、前記エーテル類溶剤は、エチルエーテル及び／又はメチルｔｅｒｔ－ブチルエーテルで
あり、前記ハロゲン化アルキル類溶剤は、ジクロロメタン、トリクロロメタン及び１，２
－ジクロロエタンの１種又は複数種である。いくつかの実施形態において、前記有機溶剤
は、アセトニトリルである。式（３２１）の化合物に対して、前記有機溶剤の用量は２０
～２００Ｌ／ｍｏｌであり、いくつかの実施形態において、５０～１００Ｌ／ｍｏｌであ
る。
いくつかの実施形態において、前記縮合剤は、（ベンゾトリアゾール－１－イルオキシ
）トリピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスフェート、３－ジエトキシホスホリル
－１，２，３－ベンゾオキサゾール４（３Ｈ）－オン及び／又はＯ－ベンゾトリアゾール
－テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェートであってもよく、いくつかの実施
形態において、前記縮合剤は、Ｏ－ベンゾトリアゾール－テトラメチルウロニウムヘキサ
フルオロホスフェートである。前記縮合剤と式（３２１）に示される化合物とのモル比は
１：１～２０：１であり、さらなる実施形態において１：１～５：１である。
いくつかの実施形態において、前記第３級アミン類有機塩基は、トリエチルアミン及び
／又はＮ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミンであり、いくつかの実施形態において、Ｎ，
Ｎ－ジイソプロピルエチルアミンであり、前記第３級アミン類有機塩基と式（３２１）に
示される化合物とのモル比は１：１～２０：１であり、いくつかの実施形態において、１
：１～５：１である。
いくつかの実施形態において、式（３２１）の化合物の調製方法は、得られた縮合生成
物をキャッピング反応条件下で、有機溶剤において、キャッピング試薬及びアシル化触媒
と接触させ、単離して式（３２１）に示される化合物を得ることをさらに含んでもよい。
前記キャッピング反応の作用は、後の反応において不必要な副生成物が生じることを避け
るために、まだ完全に反応していないあらゆる活性反応官能基を除去することである。前
記キャッピング反応の条件としては、反応温度が０～５０℃であり、いくつかの実施形態
において、１５～３５℃であり、反応時間が１～１０ｈであり、いくつかの実施形態にお
いて、３～６ｈである。キャッピング試薬としては、当業者に公知の、核酸固相合成に用
いられるキャッピング試薬を用いてもよい。
いくつかの実施形態において、前記キャッピング試薬は、キャッピング試薬Ａ（ｃａｐ
Ａ）及びキャッピング試薬Ｂ（ｃａｐＢ）からなり、キャッピング試薬Ａは、Ｎ－メチル
イミダゾールであり、いくつかの実施形態において、Ｎ－メチルイミダゾールのピリジン
／アセトニトリル混合溶液として提供され、ピリジンとアセトニトリルとの体積比は１：
１０～１：１であり、いくつかの実施形態において、１：３～１：１であり、ピリジンと
アセトニトリルの総体積とＮ－メチルイミダゾールとの体積は１：１～１０：１であり、
いくつかの実施形態において、３：１～７：１である。いくつかの実施形態において、前
記キャッピング試薬Ｂは、酢酸無水物である。いくつかの実施形態において、前記キャッ
ピング試薬Ｂは、酢酸無水物のアセトニトリル溶液として提供され、酢酸無水物とアセト
ニトリルとの体積が１：１～１：１０であり、さらなる実施形態において１：２～１：６
である。
いくつかの実施形態において、前記Ｎ－メチルイミダゾールのピリジン／アセトニトリ
ル混合溶液の体積と式（３２１）の化合物の質量との比が５ｍｌ／ｇ～５０ｍｌ／ｇであ
り、いくつかの実施形態において、１５ｍｌ／ｇ～３０ｍｌ／ｇである。前記酢酸無水物
のアセトニトリル溶液の体積と式（３２１）の化合物の質量との比は０．５ｍｌ／ｇ～１
０ｍｌ／ｇであり、いくつかの実施形態において、１ｍｌ／ｇ～５ｍｌ／ｇである。
いくつかの実施形態において、キャッピング試薬としては、等モル量の酢酸無水物とＮ
－メチルイミダゾールを用いる。いくつかの実施形態において、前記有機溶剤は、アセト
ニトリル、エポキシ類溶剤、エーテル類溶剤、ハロゲン化アルキル類溶剤、ジメチルスル
ホキシド、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド及びＮ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミンの１
種又は複数種である。いくつかの実施形態において、前記有機溶剤は、アセトニトリルで
ある。いくつかの実施形態において、式（３２１）の化合物に対して、前記有機溶剤の用
量が１０～５０Ｌ／ｍｏｌであり、いくつかの実施形態において、５～３０Ｌ／ｍｏｌで
ある。
いくつかの実施形態において、前記アシル化触媒は、エステル化縮合又はアミド化縮合
に使用できる任意の触媒、例えばアルカリ複素環化合物から選択されてもよい。いくつか
の実施形態において、前記アシル化触媒は、４－ジメチルアミノピリジンである。前記触
媒と式（３２１）に示される化合物との質量比が０．００１：１～１：１であり、いくつ
かの実施形態において、０．０１：１～０．１：１である。
いくつかの実施形態において、任意の適切な単離方法により反応混合物から式（３２１
）の化合物を単離することができる。いくつかの実施形態において、有機溶剤で十分に洗
浄し、濾過し、未反応の反応物、過剰なキャッピング試薬及び他の不純物を除去すること
により、式（３２１）の化合物を得ることができる。前記有機溶剤は、アセトニトリル、
ジクロロメタン、メタノールから選択され、いくつかの実施形態において、アセトニトリ
ルである。
いくつかの実施形態において、式（３２１）に示される複合分子の調製方法は、有機溶
剤において、カップリング反応条件下及びカップリング試薬の存在下で、式（３１３）に
示される化合物をホスホルジアミダイトと接触させ、単離して式（３２１）に示される化
合物を得ることを含む。この場合、Ｒ４に第１の官能基及び第２の官能基が含まれ、第１
の官能基がヒドロキシ保護基を含み、第２の官能が式（Ｃ３）に示される構造を含む式（
３２１）の化合物が得られる。
いくつかの実施形態において、カップリング反応条件としては、温度が０～５０℃であ
り、例えば１５～３５℃であり、式（３１３）の化合物とホスホルジアミダイトとのモル
比が１：１～１：５０であってもよく、例えば１：５～１：１５であり、式（３１３）の
化合物とカップリング試薬とのモル比が１：１～１：１００であってもよく、例えば１：
５０～１：８０であり、反応時間が２００～３０００秒であってもよく、例えば５００～
１５００秒である。前記ホスホルジアミダイトは、例えばビス（ジイソプロピルアミノ）
（２－シアノエトキシ）ホスフィンを用いてもよく、市販品として購入されてもよく、又
は本分野で公知の方法により合成されてもよい。カップリング試薬は、１Ｈ－テトラゾー
ル、５－エチルチオ１Ｈ－テトラゾール、５－ベンジルチオ１Ｈ－テトラゾールから選択
される１種又は複数種であり、例えば、５－エチルチオ１Ｈ－テトラゾールである。前記
カップリング反応は、有機溶剤で行われてもよく、前記有機溶剤は、無水アセトニトリル
、無水ＤＭＦ、無水ジクロロメタンから選択される１種又は複数種であり、例えば無水ア
セトニトリルである。いくつかの実施形態において、式（３１３）の化合物に対して、前
記有機溶剤の用量が３～５０Ｌ／ｍｏｌであり、例えば、５～２０Ｌ／ｍｏｌであっても
よい。当該カップリング反応を行うことにより、式（３１３）の化合物におけるヒドロキ
シ基とホスホルジアミダイトを反応させてホスホルアミダイト基を形成する。いくつかの
実施形態において、溶剤を直接に除去して式（３２１）の化合物の粗製品を得ることがで
き、当該粗製品は、そのまま後の反応に用いることができる。
いくつかの実施形態において、式（３２１）の化合物の調製方法は、カップリング反応
条件下で、有機溶剤において、カップリング試薬の存在下で、単離して得られた生成物を
、さらにヒドロキシ基含有固相担体と接触させる工程をさらに含む。その後、キャッピン
グ反応、酸化反応を行い、単離して式（３２１）の化合物を得る。この場合、Ｒ４に第１
の官能基及び第２の官能基が含まれ、第１の官能基がヒドロキシ保護基を含み、第２の官
能基が式（Ｃ３’）に示される構造を有する式（３２１）の化合物が得られる。
いくつかの実施形態において、前記固相担体は、本分野で公知の核酸固相合成に使用で
きる固相担体であり、例えば、脱保護反応された市販の汎用の固相担体（ＮｉｔｔｏＰｈ
ａｓｅ（登録商標）ＨＬ ＵｎｙＬｉｎｋｅｒＴＭ ３００ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔ
ｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｓｕｐｐｏｒｔ、Ｋｉｎｏｖａｔｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅ
ｎｃｅｓ社、構造が式Ｂ８０に示される）であってもよい。
Figure 2023134615000049
脱保護反応は、当業者に公知である。いくつかの実施形態において、脱保護条件として
は、温度が０～５０℃であり、例えば１５～３５℃であり、反応時間が３０～３００秒、
例えば５０～１５０秒である。脱保護試薬は、トリフルオロ酢酸、トリクロロ酢酸、ジク
ロロ酢酸、クロロ酢酸から選択される１種又は複数種であってよく、いくつかの実施形態
において、脱保護試薬は、ジクロロ酢酸である。脱保護試薬と固定相における－ＤＭＴｒ
（４，４’－ジメトキシトリチル）保護基とのモル比が２：１～１００：１であり、例え
ば３：１～５０：１である。前記脱保護を行うことにより、前記固相担体の表面に反応活
性を有する遊離ヒドロキシ基が得られ、次のカップリング反応を行いやすくする。
カップリング反応条件及びカップリング試薬の選択は、以上のとおりである。当該カッ
プリング反応を行うことにより、脱保護反応で形成された遊離ヒドロキシ基とホスホルア
ミダイト基を反応させて亜リン酸エステル結合を形成する。
いくつかの実施形態において、キャッピング反応条件としては、温度が０～５０℃であ
り、例えば１５～３５℃であり、反応時間が５～５００秒であり、例えば１０～１００秒
であり、前記キャッピング反応をキャッピング試薬の存在下で行う。キャッピング試薬の
選択と用量は、以上のとおりである。
酸化反応条件としては、温度が０～５０℃であってもよく、例えば、１５～３５℃であ
ってもよく、反応時間が１～１００秒、例えば、５～５０秒であってもよく、酸化試薬は
、例えば、ヨウ素であってもよい（いくつかの実施形態において、ヨウ素水として提供す
る）。いくつかの実施形態において、酸化試薬と亜リン酸エステル基とのモル比が１：１
～１００：１であり、例えば、５：１～５０：１であってもよい。いくつかの実施形態に
おいて、前記酸化反応は、テトラヒドロフラン：水：ピリジン＝３：１：１～１：１：３
の混合溶剤で行われる。
いくつかの実施形態において、Ｒ６は、式Ｂ７又はＢ８の基の１つである。
Figure 2023134615000050
 式中、ｑ２の定義は、前述したとおりである。
この場合、式（３１３）に示される化合物は、有機溶剤において、アミド化反応条件下
及びアミド化反応縮合剤と第３級アミン類有機塩基の存在下で、式（３１４）に示される
化合物を式（Ａ－１）に示される化合物又は式（Ａ－２）の化合物と接触させ、その後単
離する、という調製方法により得ることができる。
Figure 2023134615000051
 式中、ｎ１、ｎ３、ｍ１、ｍ２、ｍ３、Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１４、Ｒ
１５、Ｌ１、Ｓ１、ｑ２及びＲｋそれぞれの定義と選択可能な範囲は、前述したとおりで
ある。
前記アミド化反応条件としては、反応温度が０～１００℃であり、反応時間が１～４８
時間であってもよく、いくつかの実施形態において、前記アミド化反応条件としては、反
応温度が１０～４０℃であり、反応時間が２～１６時間である。
いくつかの実施形態において、前記有機溶剤は、アルコール類溶剤、エポキシ類溶剤、
エーテル類溶剤、ハロゲン化アルキル類溶剤、ジメチルスルホキシド、Ｎ，Ｎ－ジメチル
ホルムアミド及びＮ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミンの１種又は複数種である。前記ア
ルコール類溶剤は、いくつかの実施形態において、メタノール、エタノール、プロパノー
ルの１種又は複数種であり、いくつかの実施形態において、エタノールである。前記エポ
キシ類溶剤は、いくつかの実施形態において、ジオキサン及び／又はテトラヒドロフラン
である。前記エーテル類溶剤は、いくつかの実施形態において、エチルエーテル及び／又
はメチルｔｅｒｔ－ブチルエーテルである。前記ハロゲン化アルキル類溶剤は、いくつか
の実施形態において、ジクロロメタン、トリクロロメタン及び１，２－ジクロロエタンの
１種又は複数種である。いくつかの実施形態において、前記有機溶剤は、ジクロロメタン
である。式（３１４）の化合物に対して、有機溶剤の用量が３～５０Ｌ／ｍｏｌであり、
さらなる実施形態において３～２０Ｌ／ｍｏｌである。
いくつかの実施形態において、前記アミド化反応縮合剤は、（ベンゾトリアゾール－１
－イルオキシ）トリピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスフェート、３－ジエトキ
シホスホリル－１，２，３－ベンゾオキサゾール４（３Ｈ）－オン、４－（４，６－ジメ
トキシトリアジン－２－イル）－４－メチルモルホリン塩酸塩（４－（４，６－ｄｉｍｅ
ｔｈｏｘｙｔｒｉａｚｉｎ－２－ｙｌ）－４－ｍｅｔｈｙｌｍｏｒｐｈｏｌｉｎｅ ｈｙ
ｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）、２－エトキシ－１－エトキシカルボニル－１，２－ジヒドロ
キノリン（ＥＥＤＱ）又はＯ－ベンゾトリアゾール－テトラメチルウロニウムヘキサフル
オロホスフェートであり、さらなる実施形態において、３－ジエトキシホスホリル－１，
２，３－ベンゾオキサゾール４（３Ｈ）－オンである。前記アミド化反応縮合剤と式（３
１４）に示される化合物とのモル比が１：１～１０：１であってもよく、いくつかの実施
形態において、２．５：１～５：１である。
いくつかの実施形態において、前記第３級アミン類有機塩基は、トリエチルアミン又は
Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミンであり、さらなる実施形態において、Ｎ，Ｎ－ジイ
ソプロピルエチルアミンである。前記第３級アミン類有機塩基と式（３１４）に示される
化合物とのモル比が３：１～２０：１であり、いくつかの実施形態において、５：１～１
０：１である。
いくつかの実施形態において、式（Ａ－１）及び式（Ａ－２）の化合物は、任意の適当
な方法により調製されてもよい。例えば、ＲｋがＤＭＴｒ基である場合、グリセリン酸カ
ルシウムとＤＭＴｒＣｌを反応させて式（Ａ－１）の化合物を調製することができる。同
様に、３－アミノ－１，２－プロパンジオールと環状酸無水物を接触させた後、ＤＭＴｒ
Ｃｌと反応させて式（Ａ－２）の化合物を調製することができ、前記環状酸無水物は、炭
素原子数４～１３、いくつかの実施形態においては４～８の環状酸無水物であってもよい
。当業者であれば容易に理解できるように、前記環状酸無水物の選択は、（Ａ－２）の化
合物におけるｑ２の異なる値に対応しており、例えば、前記環状酸無水物がコハク酸無水
物である場合、ｑ２＝１であり、前記環状酸無水物がグルタル酸無水物である場合、ｑ２
＝２であり、以下類推してもよい。
いくつかの変形において、式（３１４）に示される化合物を、前記環状酸無水物、３－
アミノ－１，２－プロパンジオール及びＤＭＴｒＣｌと順に反応させることにより、式（
３１３）の化合物を調製することもできる。当業者であれば容易に理解できるように、こ
れらの変形は、式（３１３）の化合物の構造と機能に影響を与えることがなく、かつ、当
業者が上記方法により容易に実現されるものである。
上記と同様に、任意の適切な単離方法により反応混合物から式（３１３）の化合物を単
離することができる。いくつかの実施形態において、溶剤を蒸発除去した後、クロマトグ
ラフィー方法により式（３１３）の化合物を単離することができ、例えば、（１）順相精
製シリカゲル：２００～３００メッシュのシリカゲル充填剤を、石油エーテル：酢酸エチ
ル：ジクロロメタン：Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド＝１：１：１：０．５～１：１：１
：０．６で勾配溶出する、（２）逆相精製：Ｃ１８、Ｃ８逆相充填剤を、メタノール：ア
セトニトリル＝０．１：１～１：０．１で勾配溶出するという２つのクロマトグラフィー
条件で単離することができる。いくつかの実施形態において、溶剤を直接に除去して式（
３１３）の化合物の粗製品を得ることができ、当該粗製品は、そのまま後の反応に用いる
ことができる。
いくつかの実施形態において、式（３１４）に示される化合物は、有機溶剤において、
脱保護反応条件下で、式（３１５）に示される化合物をハロ酢酸と接触させた後、単離す
ることを含む調製方法により得ることができる。
Figure 2023134615000052
 式中、Ｒ７は、式（３３０）、（３３１）、（３３２）又は（３３３）に示される基か
ら選択され、いくつかの実施形態において、Ｒ７の構造が式（３３０）に示される。
Figure 2023134615000053
 ｎ１、ｎ３、ｍ１、ｍ２、ｍ３、Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１４、Ｒ１５、
Ｌ１、Ｓ１それぞれの定義と選択可能な範囲は、前述したとおりである。
前記ハロ酢酸は、ジクロロ酢酸、トリクロロ酢酸、クロロ酢酸及びトリフルオロ酢酸か
ら選択される１種又は複数種であってよく、いくつかの実施形態において、ジクロロ酢酸
である。
前記脱保護反応条件としては、反応温度が０～１００℃であり、反応時間が０．１～２
４時間であってもよく、いくつかの実施形態において、反応温度が１０～４０℃であり、
反応時間が０．５～１６時間である。
いくつかの実施形態において、前記有機溶剤は、エポキシ類溶剤、エーテル類溶剤、ハ
ロゲン化アルキル類溶剤、ジメチルスルホキシド、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド及びＮ
，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミンの１種又は複数種である。前記エポキシ類溶剤は、い
くつかの実施形態において、ジオキサン及び／又はテトラヒドロフランであり、前記エー
テル類溶剤は、いくつかの実施形態において、エチルエーテル及び／又はメチルｔｅｒｔ
－ブチルエーテルであり、前記ハロゲン化アルキル類溶剤は、いくつかの実施形態におい
て、ジクロロメタン、トリクロロメタン及び１，２－ジクロロエタンの１種又は複数種で
あり、いくつかの実施形態において、前記有機溶剤は、ジクロロメタンである。式（３１
５）の化合物に対して、有機溶剤の用量が３～５０Ｌ／ｍｏｌであり、さらなる実施形態
において、５～２０Ｌ／ｍｏｌである。
前記ハロ酢酸と前記式（３１５）に示される化合物とのモル比が５：１～１００：１で
あってもよく、いくつかの実施形態において、１０：１～５０：１である。
上記と同様に、任意の適切な単離方法により反応混合物から式（３１４）の化合物を単
離することができる。いくつかの実施形態において、溶剤を蒸発除去した後、クロマトグ
ラフィー方法により式（３１４）の化合物を単離することができ、例えば、（１）順相精
製シリカゲル：２００～３００メッシュのシリカゲル充填剤を、ジクロロメタン：メタノ
ール＝１００：３０～１００：４０で勾配溶出する、（２）逆相精製：Ｃ１８、Ｃ８逆相
充填剤を、メタノール：アセトニトリル＝０．１：１～１：０．１で勾配溶出するという
２つのクロマトグラフィー条件で単離することができる。いくつかの実施形態において、
溶剤を直接に除去して式（３１４）の化合物の粗製品を得ることができ、当該粗製品は、
そのまま後の反応に用いることができる。
式（３１５）に示される化合物は、有機溶剤において、アミド化反応縮合剤と第３級ア
ミン類有機塩基の存在下及び縮合反応条件下で、式（３１７）に示される化合物を式（３
１６）に示される化合物と接触させた後、単離することを含む調製方法により得ることが
できる。
Figure 2023134615000054
 式中、ｎ１、ｎ３、ｍ１、ｍ２、ｍ３、Ｒ７、Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１
４、Ｒ１５、Ｌ１、Ｓ１それぞれの定義と選択可能な範囲は、前述したとおりである。
式（３１６）の化合物としては、例えば、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２０１４，１
３６，１６９５８－１６９６１に開示された化合物を用いてもよく、或いは、式（３１６
）の化合物は、当業者が各種の方法により調製することができ、例えば、米国特許ＵＳ８
，１０６，０２２Ｂ２の実施例１に開示された方法を参照していくつかの式（３１６）の
化合物を調製することができ、引用により上記文献の全ての内容が全体として本明細書に
組み込まれる。
いくつかの実施形態において、前記縮合反応条件としては、反応温度が０～１００℃で
あり、反応時間が０．１～２４時間であり、いくつかの実施形態において、反応温度が１
０～４０℃であり、反応時間が０．５～１６時間である。
前記式（３１６）に示される化合物と前記式（３１７）に示される化合物とのモル比が
２：１～１０：１であってもよく、いくつかの実施形態において、２．５：１～５：１で
ある。
いくつかの実施形態において、前記有機溶剤は、アセトニトリル、エポキシ類溶剤、エ
ーテル類溶剤、ハロゲン化アルキル類溶剤、ジメチルスルホキシド、Ｎ，Ｎ－ジメチルホ
ルムアミド及びＮ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミンの１種又は複数種であり、前記エポ
キシ類溶剤は、いくつかの実施形態において、ジオキサン及び／又はテトラヒドロフラン
であり、前記エーテル類溶剤は、いくつかの実施形態において、エチルエーテル及び／又
はメチルｔｅｒｔ－ブチルエーテルであり、前記ハロゲン化アルキル類溶剤は、いくつか
の実施形態において、ジクロロメタン、トリクロロメタン及び１，２－ジクロロエタンの
１種又は複数種であり、いくつかの実施形態において、前記有機溶剤は、アセトニトリル
である。式（３１７）の化合物に対して、前記有機溶剤の用量は３～５０Ｌ／ｍｏｌであ
り、いくつかの実施形態において、５～２０Ｌ／ｍｏｌである。
いくつかの実施形態において、前記アミド化反応縮合剤は、（ベンゾトリアゾール－１
－イルオキシ）トリピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスフェート、３－ジエトキ
シホスホリル－１，２，３－ベンゾオキサゾール４（３Ｈ）－オン（ＤＥＰＢＴ）、Ｏ－
ベンゾトリアゾール－テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート又は４－（４
，６－ジメトキシトリアジン－２－イル）－４－メチルモルホリン塩酸塩であり、さらな
る実施形態において、４－（４，６－ジメトキシトリアジン－２－イル）－４－メチルモ
ルホリン塩酸塩であってもよい。前記アミド化反応縮合剤と式（３１７）に示される化合
物とのモル比は２：１～１０：１であってもよく、いくつかの実施形態において、２．５
：１～５：１である。
前記第３級アミン類有機塩基は、Ｎ－メチルモルホリン、トリエチルアミン又はＮ，Ｎ
－ジイソプロピルエチルアミンであってもよく、いくつかの実施形態において、Ｎ－メチ
ルモルホリンであり、前記第３級アミン類有機塩基と式（３１７）に示される化合物との
モル比が３：１～２０：１であってもよく、いくつかの実施形態において、５：１～１０
：１である。
上記と同様に、任意の適切な単離方法により反応混合物から式（３１５）の化合物を単
離することができる。いくつかの実施形態において、溶剤を蒸発除去した後、クロマトグ
ラフィー方法により式（３１５）の化合物を単離し、例えば、（１）順相精製シリカゲル
：２００～３００メッシュのシリカゲル充填剤を、ジクロロメタン：メタノール＝１００
：５～１００：７で勾配溶出する、（２）逆相精製：Ｃ１８、Ｃ８逆相充填剤を、メタノ
ール：アセトニトリル＝０．１：１～１：０．１で勾配溶出するという２つのクロマトグ
ラフィー条件で単離することができる。いくつかの実施形態において、溶剤を直接に除去
して式（３１５）の化合物の粗製品を得ることができ、当該粗製品は、そのまま後の反応
に用いることができる。
いくつかの実施形態において、式（３１７）の化合物と十分な量の式（３１６）の化合
物を一度反応させるだけで所望の式（３１５）の化合物を生成する。この場合、各Ｓ１－
Ｌ１部分同士が同じである。いくつかの実施形態において、必要に応じて、式（３１７）
の化合物を、異なる式（３１６）の化合物、即ち、Ｌ１及び／又はＳ１が異なる式（３１
６）の化合物とバッチ反応させることにより、生成された式（３１５）の化合物に２種類
以上のＳ１及び／又はＬ１を含ませることができる。例えば、１ｅｑの式（３１７）の化
合物に対して、それを２ｅｑの第１の式（３１６）の化合物と接触させ、式（３１７）の
化合物における２つの末端第一級アミン基に第１のＳ１－Ｌ１部分を結合した後、続いて
（ｎ３＋ｎ１－１）ｅｑの第２の式（３１６）の化合物と接触させ（ｎ３及びｎ１の定義
と値の範囲は、前述したとおりである）、式（３１７）の化合物における（ｎ３＋ｎ１－
１）個の第二級アミン基に第２のＳ１－Ｌ１部分を結合することができる。
いくつかの実施形態において、式（３１７）に示される化合物は、有機溶剤の存在下及
び脱保護反応条件下で、式（３１８）に示される化合物をメチルアミン水溶液と接触させ
た後、単離することを含む調製方法により得ることができる。
Figure 2023134615000055
 式中、ｎ１、ｎ３、ｍ１、ｍ２、ｍ３、Ｒ７、Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１
４、Ｒ１５それぞれの定義と選択可能な範囲は、前述したとおりである。
前記脱保護反応条件としては、反応温度が０～１５０℃であり、反応時間が５～７２時
間であってもよく、いくつかの実施形態において、反応温度が２０～８０℃であり、反応
時間が１０～３０時間である。
前記有機溶剤は、アルコールから選択されてもよく、いくつかの実施形態において、メ
タノール、エタノール及びイソプロパノールの１つであり、いくつかの実施形態において
、メタノールであり、式（３１８）の化合物に対して、前記有機溶剤の用量が１～２０Ｌ
／ｍｏｌであり、いくつかの実施形態において、１．５～１０Ｌ／ｍｏｌである。
前記メチルアミン水溶液の濃度が３０～４０質量％であってもよく、メチルアミンと式
（３１８）に示される化合物とのモル比が１０：１～５００：１であってもよく、いくつ
かの実施形態において、５０：１～２００：１である。
上記と同様に、任意の適切な単離方法により反応混合物から式（３１７）の化合物を単
離することができる。いくつかの実施形態において、溶剤を蒸発除去した後、クロマトグ
ラフィー方法により式（３１７）の化合物を単離することができ、例えば、（１）順相精
製シリカゲル：２００～３００メッシュのシリカゲル充填剤を、ジクロロメタン：メタノ
ール：アンモニア水（２５ｗｔ％）＝１：１：０．０５～１：１：０．２５で勾配溶出す
る、（２）逆相精製：Ｃ１８、Ｃ８逆相充填剤を、メタノール：アセトニトリル＝０．１
：１～１：０．１で勾配溶出するという２つのクロマトグラフィー条件で単離することが
できる。いくつかの実施形態において、溶剤を直接に除去して式（３１７）の化合物の粗
製品を得ることができ、当該粗製品は、そのまま後の反応に用いることができる。
いくつかの実施形態において、式（３１８）に示される化合物は、有機溶剤の存在下及
び置換反応条件下で、式（３１９）に示される化合物を、トリフェニルクロロメタン（Ｔ
ｒＣｌ）、ジフェニルエチルフェニルクロロメタン、フェニルジエチルフェニルクロロメ
タン又はトリエチルフェニルクロロメタン、いくつかの実施形態においてトリフェニルク
ロロメタン（ＴｒＣｌ）と接触させた後、単離することを含む調製方法により得ることが
できる。
Figure 2023134615000056
 式中、ｎ１、ｎ３、ｍ１、ｍ２、ｍ３、Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１４、Ｒ
１５それぞれの定義と選択可能な範囲は、前述したとおりである。
前記置換反応条件としては、反応温度が０～１００℃であり、反応時間が５～７２時間
であってもよく、いくつかの実施形態において、反応条件としては、反応温度が１０～４
０℃であり、反応時間が１０～３０時間である。
トリフェニルクロロメタン（ＴｒＣｌ）、ジフェニルエチルフェニルクロロメタン、フ
ェニルジエチルフェニルクロロメタン又はトリエチルフェニルクロロメタンは、市販品を
購入することができ、トリフェニルクロロメタン（ＴｒＣｌ）、ジフェニルエチルフェニ
ルクロロメタン、フェニルジエチルフェニルクロロメタン又はトリエチルフェニルクロロ
メタンと式（３１９）に示される化合物とのモル比が１：１～１０：１であってもよく、
いくつかの実施形態において、１：１～３：１である。
前記有機溶剤は、エポキシ類溶剤、エーテル類溶剤、ハロゲン化アルキル類溶剤、ジメ
チルスルホキシド、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド及びＮ，Ｎ－ジイソプロピルエチルア
ミンの１種又は複数種であってもよい。前記エポキシ類溶剤は、いくつかの実施形態にお
いて、ジオキサン及び／又はテトラヒドロフランであってもよく、前記エーテル類溶剤は
、いくつかの実施形態において、エチルエーテル及び／又はメチルｔｅｒｔ－ブチルエー
テルであってもよく、前記ハロゲン化アルキル類溶剤は、いくつかの実施形態において、
ジクロロメタン、トリクロロメタン及び１，２－ジクロロエタンの１種又は複数種であっ
てもよく、いくつかの実施形態において、前記有機溶剤は、ジクロロメタンである。式（
３１９）の化合物に対して、前記有機溶剤の用量が３～５０Ｌ／ｍｏｌであってもよく、
いくつかの実施形態において、５～２０Ｌ／ｍｏｌである。
上記と同様に、任意の適切な単離方法により反応混合物から式（３１８）の化合物を単
離することができる。いくつかの実施形態において、溶剤を蒸発除去した後、クロマトグ
ラフィー方法により式（３１８）の化合物を単離することができ、例えば、（１）順相精
製シリカゲル：２００～３００メッシュのシリカゲル充填剤を、メタノール：ジクロロメ
タン＝０．０１：１～０．５：１で、又はメタノール：ジクロロメタン：酢酸エチル：石
油エーテル＝０．１：１：１：１～１：１：１：１で勾配溶出する、（２）逆相精製：Ｃ
１８、Ｃ８逆相充填剤を、メタノール：アセトニトリル＝０．１：１～１：０．１で勾配
溶出するという２つのクロマトグラフィー条件で単離することができる。いくつかの実施
形態において、溶剤を直接に除去して式（３１８）の化合物の粗製品を得ることができ、
当該粗製品は、そのまま後の反応に用いることができる。
いくつかの実施形態において、式（３１９）に示される化合物は、有機溶剤において、
置換反応条件下で、式（３２０）に示される化合物をトリフルオロ酢酸エチルと接触させ
た後、単離することを含む調製方法により得ることができる。
Figure 2023134615000057
 式中、ｎ１、ｎ３、ｍ１、ｍ２、ｍ３、Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１４、Ｒ
１５それぞれの定義と選択可能な範囲は、前述したとおりである。
いくつかの実施形態において、前記有機溶剤は、アセトニトリル、エポキシ類溶剤、エ
ーテル類溶剤、ハロゲン化アルキル類溶剤、ジメチルスルホキシド、Ｎ，Ｎ－ジメチルホ
ルムアミド及びＮ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミンの１種又は複数種である。いくつか
の実施形態において、前記エポキシ類溶剤は、ジオキサン及び／又はテトラヒドロフラン
であり、いくつかの実施形態において、前記エーテル類溶剤は、エチルエーテル及び／又
はメチルｔｅｒｔ－ブチルエーテルであり、いくつかの実施形態において、前記ハロゲン
化アルキル類溶剤は、ジクロロメタン、トリクロロメタン及び１，２－ジクロロエタンの
１種又は複数種であり、いくつかの実施形態において、前記有機溶剤は、アセトニトリル
である。式（３２０）の化合物に対して、前記有機溶剤の用量が１～５０Ｌ／ｍｏｌであ
ってもよく、いくつかの実施形態において、１～２０Ｌ／ｍｏｌである。
前記置換反応条件としては、反応温度が０～１００℃であり、反応時間が５～７２時間
であってもよく、いくつかの実施形態において、前記置換反応条件としては、反応温度が
１０～４０℃であり、反応時間が１０～３０時間である。
式（３２０）の化合物は、市販品を購入して、又は、当業者により既知の方法を用いて
得ることができる。例えば、ｍ１＝ｍ２＝ｍ３＝３、ｎ１＝１、ｎ３＝２であり、Ｒ１０
、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１４、Ｒ１５がいずれもＨである場合、式（３２０）の化
合物は、アルファ・エイサー社から市販品として購入することができる。
前記トリフルオロ酢酸エチルと式（３２０）に示される化合物とのモル比が２：１～１
０：１であり、いくつかの実施形態において、３：１～５：１である。
上記と同様に、任意の適切な単離方法により反応混合物から式（３１９）の化合物を単
離することができる。いくつかの実施形態において、溶剤を蒸発除去した後、クロマトグ
ラフィー方法により式（３１９）の化合物を単離することができ、例えば、（１）順相精
製シリカゲル：２００～３００メッシュのシリカゲル充填剤を、メタノール：ジクロロメ
タン＝０．０１：１～０．５：１で、又はメタノール：ジクロロメタン：酢酸エチル：石
油エーテル＝０．１：１：１：１～１：１：１：１で勾配溶出する、（２）逆相精製：Ｃ
１８、Ｃ８逆相充填剤を、メタノール：アセトニトリル＝０．１：１～１：０．１で勾配
溶出するという２つのクロマトグラフィー条件で単離することができる。いくつかの実施
形態において、溶剤を直接に除去して式（３１９）の化合物の粗製品を得ることができ、
当該粗製品は、そのまま後の反応に用いることができる。
本開示のオリゴヌクレオチド複合体は、薬学的に許容できる他の添加剤と併用してもよ
く、当該添加剤は、本分野で通常採用される各種の製剤又は化合物の１種又は複数種であ
ってもよく、詳細は、上述した本開示の薬物組成物に関する記載を参照のこと。
＜本開示の二本鎖オリゴヌクレオチド、薬物組成物及びオリゴヌクレオチド複合体の使
用＞
いくつかの実施形態において、本開示は、本開示により提供される二本鎖オリゴヌクレ
オチド、薬物組成物及び／又はオリゴヌクレオチド複合体の、細胞における特定の遺伝子
の発現による病理学的状態又は疾患の治療及び／又は予防のための薬物の調製への使用を
提供する。いくつかの実施形態において、前記特定の遺伝子は、肝細胞に異常に発現する
遺伝子である。いくつかの実施形態において、前記特定の遺伝子は、肝臓に発現する内因
性遺伝子である。いくつかの実施形態において、前記特定の遺伝子は、肝臓で繁殖する病
原体遺伝子である。いくつかの実施形態において、前記特定の遺伝子は、ＡｐｏＢ、Ａｐ
ｏＣ、ＡＮＧＰＴＬ３、ＰＣＳＫ９、ＳＣＤ１、ＴＩＭＰ－１、Ｃｏｌ１Ａ１、ＦＶＩＩ
、ＳＴＡＴ３、ｐ５３、ＨＢＶ、ＨＣＶ等の遺伝子から選択される。いくつかの実施形態
において、前記特定の遺伝子は、Ｂ型肝炎ウイルス遺伝子、アンジオポエチン様タンパク
質３遺伝子又はアポリポタンパクＣ３遺伝子から選択される。これに応じて、前記疾患は
、慢性肝疾患、肝炎、肝線維性疾患、肝過形成性疾患及び脂質異常から選択される。いく
つかの実施形態において、前記脂質異常は、高コレステロール血症、高トリグリセリド血
症又はアテローム性動脈硬化である。
いくつかの実施形態において、本開示は、それを必要とする被験体に本開示により提供
される二本鎖オリゴヌクレオチド、薬物組成物及び／又はオリゴヌクレオチド複合体の有
効量を投与することを含む、特定の遺伝子の異常発現による病理学的状態又は疾患の治療
方法を提供する。いくつかの実施形態において、前記特定の遺伝子は、ＡｐｏＢ、Ａｐｏ
Ｃ、ＡＮＧＰＴＬ３、ＰＣＳＫ９、ＳＣＤ１、ＴＩＭＰ－１、Ｃｏｌ１Ａ１、ＦＶＩＩ、
ＳＴＡＴ３、ｐ５３、ＨＢＶ、ＨＣＶ等の遺伝子から選択される。いくつかの実施形態に
おいて、前記特定の遺伝子は、Ｂ型肝炎ウイルス遺伝子、アンジオポエチン様タンパク質
３遺伝子又はアポリポタンパクＣ３遺伝子から選択される。これに応じて、前記疾患は、
慢性肝疾患、肝炎、肝線維性疾患、肝過形成性疾患及び脂質異常から選択される。いくつ
かの実施形態において、前記脂質異常は、高コレステロール血症、高トリグリセリド血症
又はアテローム性動脈硬化である。いくつかの実施形態において、本開示により提供され
る複合体は、不要な細胞増殖を特徴とする疾患、血液疾患、代謝性疾患及び炎症を特徴と
する疾患を含む他の肝臓疾患の治療に用いることもできる。肝臓の増殖性疾患は、良性又
は悪性疾患、例えば、癌、肝細胞癌（ＨＣＣ）、肝転移又は肝芽腫であってもよい。肝臓
血液学的又は炎症性疾患は、血液凝固因子、補体媒介炎症又は線維化に関する疾患であっ
てもよい。肝臓の代謝性疾患は、脂質異常及びグルコースの調節の不規則性を含む。１つ
の実施形態において、疾患に関与する遺伝子配列と高度に同じ配列を有する１又は複数の
二本鎖オリゴヌクレオチドを用いることにより前記疾患を治療する。
いくつかの実施形態において、本開示は、本開示により提供される二本鎖オリゴヌクレ
オチド、薬物組成物及び／又はオリゴヌクレオチド複合体の有効量を細胞と接触させるこ
とを含む、前記細胞における特定の遺伝子の発現の抑制方法を提供する。
本開示の二本鎖オリゴヌクレオチド、薬物組成物及び／又はオリゴヌクレオチド複合体
を、それを必要とする被験体に投与することにより、遺伝子発現調節機構により細胞にお
ける特定の遺伝子の発現による病理学的状態又は疾患を予防及び／又は治療する目的を達
成することができる。したがって、本開示の二本鎖オリゴヌクレオチド、薬物組成物及び
／又はオリゴヌクレオチド複合体は、前記病理学的状態又は疾患の予防及び／又は治療に
用いられ、又は本明細書に記載された病理学的状態又は疾患の予防及び／又は治療のため
の薬物の調製に用いることができる。
本明細書で用いられる用語「薬剤投与／投与」とは、二本鎖オリゴヌクレオチド、薬物
組成物及び／又はオリゴヌクレオチド複合体を少なくとも一部、所望の部位に局在化する
ことにより所望の効果を生じさせる方法又は経路により、二本鎖オリゴヌクレオチド、薬
物組成物及び／又はオリゴヌクレオチド複合体を被験体の体内に入れることを指す。本開
示の方法に適した投与経路は、局所投与と全身投与を含む。一般的には、局所投与により
、被験体全身よりも多くの二本鎖オリゴヌクレオチド、薬物組成物及び／又はオリゴヌク
レオチド複合体が特定の部位に送達されるが、全身投与により、前記二本鎖オリゴヌクレ
オチド、薬物組成物及び／又はオリゴヌクレオチド複合体が被験体のほぼ全身に送達され
る。本開示が肝細胞における特定の遺伝子の発現による病理学的状態又は疾患の予防及び
／又は治療手段を提供することを意図することを考慮すると、いくつかの実施形態におい
て、薬物を肝臓に送達することができる投与方法である。
本分野で既知の任意の適切な経路で被験体に投与することができ、前記経路としては、
経口投与又は胃腸外経路（非経口経路）、例えば、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、
経皮投与、気管内投与（エアロゾル）、肺部投与、鼻部投与、直腸投与及び局所投与（口
腔内投与と舌下投与を含む）を含むが、これらのみに限定されない。投与頻度は、１日、
１週間、２週間、３週間、１ヶ月又は１年に１回若しくは複数回であってもよい。
本開示に記載された二本鎖オリゴヌクレオチド、薬物組成物及び／又はオリゴヌクレオ
チド複合体の用量は、本分野における通常の用量であってもよく、前記用量は、各種のパ
ラメーター、特に被験体の年齢、体重及び性別により決定されてもよい。細胞培養又は実
験動物で標準薬学的手順により毒性と治療効果を測定し、例えば、ＬＤ５０（５０％の群
体を死亡させる用量）及びＥＤ５０（定量的反応において、５０％の最大反応強度を引き
起こすことができる用量を指し、定性的反応において、５０％実験対象に陽性反応が発生
する場合の用量を指す）を測定してもよい。細胞培養分析及び動物研究により得られたデ
ータに基づいてヒト用量の範囲を得ることができる。
本開示に記載された二本鎖オリゴヌクレオチド、薬物組成物及び／又はオリゴヌクレオ
チド複合体を投与する場合、例えば、雄性又は雌性、６～１２週齢、体重１８～２５ｇの
Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ又はＣ３Ｈ／ＨｅＮＣｒｌＶｒマウスに対して、前記二本鎖オリゴヌク
レオチド、薬物組成物及び／又はオリゴヌクレオチド複合体における二本鎖オリゴヌクレ
オチドの量として、二本鎖オリゴヌクレオチド及び薬学的に許容できる複合分子により形
成されたオリゴヌクレオチド複合体について、その二本鎖オリゴヌクレオチド用量が０．
００１～１００ｍｇ／ｋｇ体重であってもよく、いくつかの実施形態において、０．０１
～５０ｍｇ／ｋｇ体重であり、さらなる実施形態において、０．０５～２０ｍｇ／ｋｇ体
重であり、より更なる実施形態において、０．１～１５ｍｇ／ｋｇ体重であり、また更な
る実施形態において、０．１～１０ｍｇ／ｋｇ体重である。本開示に記載された二本鎖オ
リゴヌクレオチド、薬物組成物及び／又はオリゴヌクレオチド複合体を投与する場合、上
記用量が好ましい。
また、本開示の二本鎖オリゴヌクレオチド、薬物組成物及び／又はオリゴヌクレオチド
複合体を、特定の遺伝子が異常に発現する肝細胞に導入することにより、遺伝子発現調節
機構により肝細胞における当該特定の遺伝子の発現を抑制する目的を達成することもでき
る。いくつかの実施形態において、前記肝細胞は肝炎細胞であり、いくつかの実施形態に
おいて、ＨｅｐＧ２．２．１５細胞である。いくつかの実施形態において、前記肝細胞は
、Ｈｅｐ３Ｂ、ＨｅｐＧ２、Ｈｕｈ７等の肝癌細胞系又は単離した初代肝細胞から選択さ
れてもよく、いくつかの実施形態において、Ｈｕｈ７肝癌細胞である。
本開示により提供される方法により肝細胞における特定の遺伝子の発現を抑制する。提
供される二本鎖オリゴヌクレオチド、薬物組成物及び／又はオリゴヌクレオチド複合体に
おける二本鎖オリゴヌクレオチドの用量は、当業者が所望の効果により容易に決定するも
のである。例えば、いくつかの実施形態において、前記二本鎖オリゴヌクレオチド、薬物
組成物及び／又はオリゴヌクレオチド複合体は、ｓｉＲＮＡ複合体であり、提供されるｓ
ｉＲＮＡ複合体におけるｓｉＲＮＡ用量は、以下のような量である：標的遺伝子の発現を
低減でき、標的細胞表面では１ｐＭ～１μＭ、０．０１ｎＭ～１００ｎＭ、０．０５ｎＭ
～５０ｎＭ、又は０．０５ｎＭ～約５ｎＭの細胞外濃度となる量である。当該局所濃度を
達成するのに必要な量は、送達方法、送達部位、送達部位と標的細胞又は組織との間の細
胞層の数、送達するのが局所か全身か等を含む、各種の因子により変化する。送達部位に
おける濃度は、標的細胞又は組織の表面における濃度よりも顕著に高くてもよい。
＜キット＞
本開示は、上述した二本鎖オリゴヌクレオチド、上述した薬物組成物及び／又は上述し
たオリゴヌクレオチド複合体を含むキットを提供する。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載されたキットは、容器で二本鎖オリゴヌ
クレオチドを提供することができる。いくつかの実施形態において、本明細書に記載され
たキットは、薬学的に許容できる賦形剤を提供する容器を含んでもよい。いくつかの実施
形態において、前記キットには、他の成分、例えば、安定化剤又は防腐剤等が含まれても
よい。いくつかの実施形態において、本明細書に記載されたキットは、本明細書に記載さ
れた二本鎖オリゴヌクレオチドを提供する容器とは別の容器で少なくとも１種の他の治療
剤を含んでもよい。いくつかの実施形態において、前記キットは、二本鎖オリゴヌクレオ
チドと薬学的に許容可能な担体及び／又は添加剤又は他の成分（存在する場合）を混合す
るための説明書を含んでもよい。
本開示のキットにおいて、前記二本鎖オリゴヌクレオチド及び薬学的に許容可能な担体
及び／又は添加剤、並びに、前記二本鎖オリゴヌクレオチド組成物及び／又は複合体、及
び／又は薬学的に許容できる添加剤は、任意の形式、例えば、液体形式、乾燥形式又は凍
結乾燥形式として提供されてもよい。いくつかの実施形態において、前記二本鎖オリゴヌ
クレオチド及び薬学的に許容可能な担体及び／又は添加剤、並びに、前記二本鎖オリゴヌ
クレオチド組成物及び／又は複合体及び薬学的に許容できる任意の添加剤は、基本的にク
リーン及び／又は無菌である。いくつかの実施形態において、本開示のキットで無菌水を
提供することができる。
以下に実施例により本開示をさらに説明するが、本開示は、これによって何ら制限され
ない。
限定されることを望まないが、以下の実施形態、及び本開示の組成物及び／又はオリゴ
ヌクレオチド複合体における二本鎖オリゴヌクレオチドが低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ
）である例示的な実施形態に関する実施例において、本発明をさらに詳しく説明する。こ
のような場合に、本開示の二本鎖オリゴヌクレオチド、組成物及びオリゴヌクレオチド複
合体は、それぞれｓｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡを含む組成物及びｓｉＲＮＡ複合体である。本
開示の文脈において、説明の便宜上、これらの実施形態におけるｓｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ
を含む組成物及びｓｉＲＮＡ複合体は、本開示のｓｉＲＮＡ、本開示のｓｉＲＮＡ組成物
及び本開示のｓｉＲＮＡ複合体とも称する。本開示の二本鎖オリゴヌクレオチドがｓｉＲ
ＮＡのみであることを意味するものではなく、逆に、二本鎖オリゴヌクレオチドは、本明
細書に開示された又は当業者に既知の他の変異体、例えば、低分子活性化ＲＮＡ（ｓａＲ
ＮＡ）等であってもよい。ｓｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡを含む組成物及びｓｉＲＮＡ複合体に
対する詳しい説明に基づき、他の機能性二本鎖オリゴヌクレオチドは、単独で用い、又は
本開示に記載された組成物及び／又は複合体を形成する際に同様に作用することを想定す
ることができる。
（発明の効果）
いくつかの実施形態において、本開示により提供される二本鎖オリゴヌクレオチド、組
成物又はオリゴヌクレオチド複合体は、体内でより高い安定性、より低い毒性及び／又は
より高い活性を有することができる。いくつかの実施形態において、本開示により提供さ
れる二本鎖オリゴヌクレオチドは、ｓａＲＮＡである。いくつかの実施形態において、本
開示により提供されるｓａＲＮＡ、ｓａＲＮＡ組成物又はｓａＲＮＡ複合体は、体内で少
なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又は９５％
の標的遺伝子発現向上率を示す。いくつかの実施形態において、本開示により提供される
二本鎖オリゴヌクレオチドは、ｓｉＲＮＡである。いくつかの実施形態において、本開示
により提供されるｓｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ組成物又はｓｉＲＮＡ複合体は、体内で少なく
とも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又は９５％の標
的遺伝子発現抑制率を示す。いくつかの実施形態において、本開示により提供されるｓｉ
ＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ組成物又はｓｉＲＮＡ複合体は、体内で少なくとも２０％、３０％、
４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又は９５％のＨＢＶ遺伝子発現抑制率
を示す。いくつかの実施形態において、本開示により提供されるｓｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ
組成物又はｓｉＲＮＡ複合体は、体内で少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６
０％、７０％、８０％、９０％又は９５％の肝内ＨＢＶ遺伝子発現抑制率を示す。いくつ
かの実施形態において、本開示により提供されるｓｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ組成物又はｓｉ
ＲＮＡ複合体は、体内で少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、
８０％、９０％又は９５％の動物モデルにおける肝内ＨＢＶ遺伝子発現抑制率を示す。い
くつかの実施形態において、本開示により提供されるｓｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ組成物又は
ｓｉＲＮＡ複合体は、体内で少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０
％、８０％、９０％又は９５％のＨＢＶ表面抗原発現抑制率を示す。いくつかの実施形態
において、本開示により提供されるｓｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ組成物又はｓｉＲＮＡ複合体
は、体内で少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０
％又は９５％のＡＮＧＰＴＬ３遺伝子発現抑制率を示す。いくつかの実施形態において、
本開示により提供されるｓｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ組成物又はｓｉＲＮＡ複合体は、体内で
少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又は９５
％の肝内ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子発現抑制率を示す。いくつかの実施形態において、本開示
により提供されるｓｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ組成物又はｓｉＲＮＡ複合体は、体内で少なく
とも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又は９５％の動
物モデルにおける肝内ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子発現抑制率を示す。いくつかの実施形態にお
いて、本開示により提供されるｓｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ組成物又はｓｉＲＮＡ複合体は、
体内で少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又
は９５％のヒト被験体における肝内ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子発現抑制率を示す。いくつかの
実施形態において、本開示により提供されるｓｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ組成物又はｓｉＲＮ
Ａ複合体は、体内で少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０
％、９０％又は９５％のＡＰＯＣ３遺伝子発現抑制率を示す。いくつかの実施形態におい
て、本開示により提供されるｓｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ組成物又はｓｉＲＮＡ複合体は、体
内で少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又は
９５％の肝内ＡＰＯＣ３遺伝子発現抑制率を示す。いくつかの実施形態において、本開示
により提供されるｓｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ組成物又はｓｉＲＮＡ複合体は、体内で少なく
とも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又は９５％の動
物モデルにおける肝内ＡＰＯＣ３遺伝子発現抑制率を示す。いくつかの実施形態において
、本開示により提供されるｓｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ組成物又はｓｉＲＮＡ複合体は、体内
で少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又は９
５％のヒト被験体における肝内ＡＰＯＣ３遺伝子発現抑制率を示す。いくつかの実施形態
において、本開示により提供される二本鎖オリゴヌクレオチド、組成物又はオリゴヌクレ
オチド複合体は、明らかなオフターゲット効果を示していない。オフターゲット効果は、
例えば、標的遺伝子でない遺伝子の正常発現の抑制であってもよい。オフターゲット遺伝
子発現の結合／抑制がオンターゲット遺伝子効果に比べて５０％、４０％、３０％、２０
％又は１０％を下回る場合、当該オフターゲット効果が顕著ではないと考えられている。
本開示のいくつかの実施形態によれば、本開示のｓｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ組成物及びｓ
ｉＲＮＡ複合体は、優れた抑制効果を示す。例えば、本開示の１つの実施形態によれば、
本開示により提供されるｓｉＲＮＡ複合体は、低いオフターゲット効果を有するとともに
、１ｍｇ／ｋｇの用量でＢ型肝炎モデルマウスの肝臓における６６．９％～９０．９％の
ＨＢＶ遺伝子発現を抑制することができるという優れたＨＢＶ遺伝子発現抑制特性を示す
。同時に、本開示のｓｉＲＮＡ複合体は、Ｂ型肝炎モデルマウスにおけるＨＢＶ表面抗原
発現及びＨＢＶ ＤＮＡを効果的に低下させることもできる。特に、従来技術で提供され
るものに比べて、本開示により提供される特定の修飾ｓｉＲＮＡと特定の複合分子により
形成された特定のｓｉＲＮＡ複合体は、低用量で、１４０日間の実験時間と長期間にわた
って優れたＨＢＶ発現抑制作用を示し続けることができる。
本開示の１つの実施形態によれば、本開示により提供されるｓｉＲＮＡ複合体は、低い
オフターゲット効果を有するとともに、１ｍｇ／ｋｇの用量でＢ型肝炎モデルマウスの肝
臓における８１．７～８９．２％のＨＢＶ遺伝子発現を抑制することができるという優れ
たＨＢＶ遺伝子発現抑制特性を示す。同時に、本開示のｓｉＲＮＡ複合体は、Ｂ型肝炎モ
デルマウスにおけるＨＢＶ表面抗原発現及びＨＢＶ ＤＮＡを効果的に低下させることも
できる。特に、従来技術で提供される複合分子により形成された複合体に比べて、本開示
により提供される特定の修飾ｓｉＲＮＡと特定の複合分子により形成された特定のｓｉＲ
ＮＡ複合体は、低用量で、８４日間の実験時間と長期間にわたって優れたＨＢＶ発現抑制
作用を示し続けることができる。
本開示の１つの実施形態によれば、本開示により提供されるｓｉＲＮＡ複合体は、低い
オフターゲット効果を有するとともに、１ｍｇ／ｋｇの用量でＢ型肝炎モデルマウスの肝
臓における９３．８％と高いＨＢＶ遺伝子発現を抑制することができるという優れたＨＢ
Ｖ遺伝子発現抑制特性を示す。同時に、本開示のｓｉＲＮＡ複合体は、Ｂ型肝炎モデルマ
ウスにおけるＨＢＶ表面抗原発現を効果的に低下させることもでき、ひいては３ｍｇ／ｋ
ｇの用量で９０％以上のＨＢＶ表面抗原発現抑制率を達成し、ＨＢＶ ＤＮＡを効果的に
抑制することができる。特に、参照複合体に比べて、本開示により提供される特定の修飾
ｓｉＲＮＡと特定の複合分子により形成された特定のｓｉＲＮＡ複合体は、低用量で、２
１日間の実験時間と長期間にわたって高いＨＢＶ発現抑制作用を示し続けることができる
。
本開示の１つの実施形態によれば、本開示により提供されるｓｉＲＮＡ複合体は、低い
オフターゲット効果を有するとともに、１ｍｇ／ｋｇの用量でＢ型肝炎モデルマウスの肝
臓における９３．６３％と高いＨＢＶ Ｘ遺伝子領域の遺伝子発現を抑制することができ
るという優れたＨＢＶ遺伝子発現抑制特性を示す。同時に、本開示のｓｉＲＮＡ複合体は
、Ｂ型肝炎モデルマウスにおけるＨＢＶ表面抗原発現を効果的に低下させることもでき、
ひいては３ｍｇ／ｋｇの用量で９５％以上のＨＢＶ表面抗原発現抑制率を達成することが
でき、ＨＢＶ ＤＮＡを効果的に抑制することができる。特に、従来技術で提供される複
合分子により形成された複合体に比べて、本開示により提供される特定の修飾ｓｉＲＮＡ
と特定の複合分子により形成された特定のｓｉＲＮＡ複合体は、低用量で、５６日間の実
験時間と長期間にわたって優れたＨＢＶ発現抑制効果を示し続け、ＨＢＶ Ｘ ｍＲＮＡ
抑制率を９０％以上とすることができる。
いくつかの実施形態において、本開示により提供されるｓｉＲＮＡ複合体は、優れたＡ
ＮＧＰＴＬ３ ｍＲＮＡ抑制効率を示し、脂質レベルを顕著に低下させる。例えば、いく
つかの実施形態において、単回皮下投与後の１４日目に、マウスのＡＮＧＰＴＬ３ ｍＲ
ＮＡ抑制率が９５％以上と高く、いくつかの実施形態において、単回皮下投与し、トリグ
リセリド（ＴＧ）に対する最大抑制率が９３％であり、総コレステロール（ＣＨＯ）に対
する最大抑制率が８３％であり、薬剤投与後の１５４日目に、ＴＧに対する抑制率が５５
％以上に維持でき、ＣＨＯに対する抑制率が４０％以上に維持される。特に、従来技術で
提供される複合分子により形成された複合体に比べて、本開示により提供されるｓｉＲＮ
Ａ複合体は、より優れた遺伝子抑制率、より強い脂質低下能力を示す。また、本開示によ
り提供されるｓｉＲＮＡ複合体は、低用量、低投与頻度の場合に、１８９日間の実験時間
と長期間にわたって優れた脂質抑制作用を示し続けることができる。
いくつかの実施形態において、本開示により提供されるｓｉＲＮＡ複合体は、１ｍｇ／
ｋｇの用量で高脂血症モデルマウスの肝臓における少なくとも８８％のＡＰＯＣ３遺伝子
発現を抑制するという優れたＡＰＯＣ３遺伝子発現抑制特性を示す。特に、従来技術で提
供される複合分子により形成された複合体に比べて、本開示により提供される修飾ｓｉＲ
ＮＡとｓｉＲＮＡ複合体は、優れた遺伝子抑制率及び低いオフターゲット効果を示す。ま
た、本開示により提供されるｓｉＲＮＡ複合体は、低用量、低投与頻度の場合に、１８９
日間の実験時間と長期間にわたって優れた脂質抑制作用を示し続けることができる。
ある実施形態において、本開示に記載されたｓｉＲＮＡ複合体は、動物レベルの毒性の
低さ及び良好な安全性をさらに示す。例えば、いくつかの実施形態において、本開示の複
合体については、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスに有効濃度の１００倍（有効濃度を３ｍｇ／ｋ
ｇとする）を投与しても、明らかな毒性反応が認められていない。
以上のことから、本明細書により提供されるｓｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ組成物及びｓｉＲ
ＮＡ複合体は、標的細胞における遺伝子の発現を効率的に低下させ、優れた送達潜力を示
すことが分る。
以下に実施例により本開示を詳しく説明する。特に説明がない限り、以下の実施例で用
いられる試薬、培地は、いずれも市販品であり、用いられる核酸電気泳動、ｒｅａｌ－ｔ
ｉｍｅ ＰＣＲ等の操作は、いずれもＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ（Ｃｏｌｄ
Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ ＬＢｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８９））に記載
された方法を参照して行われる。
ＨＥＫ２９３Ａ細胞は、北京大学分子医学研究所核酸技術実験室により提供され、２０
％のウシ胎児血清（ＦＢＳ、Ｈｙｃｌｏｎｅ社）及び０．２体積％のペニシリン－ストレ
プトマイシン（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ－Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ、Ｇｉｂｃｏ、Ｉｎｖ
ｉｔｒｏｇｅｎ社）を含むＤＭＥＭ完全培地（Ｈｙｃｌｏｎｅ社）で細胞を３７℃で５％
ＣＯ２／９５％空気含有インキュベーターにおいて培養した。
ＨｅｐＧ２．２．１５細胞は、ＡＴＣＣから購入され、１０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ
、Ｇｉｂｃｏ）、２ｍＭのＬ－グルタミン（Ｇｉｂｃｏ）及び３８０μｇ／ｍｌのＧ４１
８を含むＤＭＥＭ完全培地（Ｇｉｂｃｏ）で細胞を３７℃で５％ＣＯ２／９５％空気含有
インキュベーターにおいて培養した。
Ｈｕｈ７細胞は、ＡＴＣＣから購入され、１０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ、Ｇｉｂｃｏ
）、２ｍＭのＬ－グルタミン（Ｇｉｂｃｏ）及び３８０μｇ／ｍｌのＧ４１８を含むＤＭ
ＥＭ完全培地（Ｇｉｂｃｏ）で細胞を３７℃で５％ＣＯ２／９５％空気含有インキュベー
ターにおいて培養した。
特に説明がない限り、以下に合成される各種のｓｉＲＮＡ又はｓｉＲＮＡ複合体で細胞
をトランスフェクションした場合、トランスフェクション試薬としてＬｉｐｏｆｅｃｔａ
ｍｉｎｅＴＭ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用い、具体的な操作については、メー
カーにより提供される説明書を参照のこと。
別に説明がない限り、以下で提供される試薬割合は、いずれも体積比（ｖ／ｖ）として
計算される。
用いられる動物モデルは以下のとおりである。
Ｃ５７ＢＬ／６Ｎマウス：６～８週齢、北京維通利華実験動物技術有限公司から購入、
以下単にＣ５７マウスという。
ＳＤラット：北京維通利華実験動物技術有限公司により提供される。
ＨＢＶトランスジェニックマウスＣ５７ＢＬ／６－ＨＢＶ：品種名：Ｂ６－Ｔｇ ＨＢ
Ｖ／Ｖｓｔ（１．２８ｃｏｐｙ、ｇｅｎｏｔｙｐｅ Ａ）、北京維通達生物技術有限公司
から購入する。実験前にＣＯＩ＞１０４のマウス（以下単に１．２８ｃｏｐｙマウスとも
いう）を選択した。
ＨＢＶトランスジェニックマウスＣ５７ＢＬ／６Ｊ－Ｔｇ（Ａｌｂ１ＨＢＶ）４４Ｂｒ
ｉ／Ｊ：北京大学医学部実験動物科学部から購入する。
ＨＢＶトランスジェニックマウス：Ｍ－ＴｇＨＢＶと命名され、上海市公衆衛生センタ
ー動物部から購入し、トランスジェニックマウスの作製方法は、Ｒｅｎ Ｊ．ら、Ｊ．
Ｍｅｄｉｃａｌ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ． ２００６，７８：５５１～５６０に記載されてい
る。
ＡＡＶ－ＨＢＶトランスジェニックマウス：文献の方法（董小岩ら、Ｃｈｉｎ Ｊ Ｂ
ｉｏｔｅｃｈ ２０１０，Ｍａｙ ２５，２６（５）：６７９～６８６）によりＡＡＶ－
ＨＢＶモデルを作製し、ｒＡＡＶ８－１．３ＨＢＶ、Ｄ型（ａｙｗ）、北京五加和分子医
学研究所有限公司から購入し、１×１０１２ウイルスゲノム（ｖ．ｇ．）／ｍＬ、ロット
番号２０１６１２３０１１。実験前を無菌ＰＢＳで５×１０１１ｖ．ｇ．／ｍＬに希釈し
た。マウス１匹あたり２００μＬ注射し、即ち、マウス１匹あたり１×１０１１ｖ．ｇ．
注射した。ウイルスを注射した後の２８日目に、全てのマウスに対して眼窩採血（約１０
０μＬ）を行い、血清を回収してＨＢｓＡｇ及びＨＢＶ ＤＮＡを検出するために用いら
れる。
低濃度ＡＡＶ－ＨＢＶトランスジェニックマウス：実験前にウイルスを無菌ＰＢＳで１
×１０１１ｖ．ｇ．／ｍＬに希釈し、マウス１匹あたり１００μＬのウイルスを注射し、
即ち、マウス１匹あたり１×１０１０ｖ．ｇ．注射したこと以外、上記と基本的に同じモ
デリング方法を採用した。
ＢＡＬＢ／ｃマウス：６～８週齢、北京維通利華実験動物技術有限公司から購入する。
ｏｂ／ｏｂマウス：６～８週齢、常州キャヴェンス実験動物有限公司から購入する。
ヒトＡＰＯＣ３トランスジェニックマウス：Ｂ６、ＣＢＡ－Ｔｇ（ＡＰＯＣ３）３７０
７Ｂｒｅｓ／Ｊ、米国Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから購入する。
メタボリックシンドロームサル：北京大学分子医学研究所非ヒト霊長類研究センターに
より提供される。
特に説明がない限り、以下の体内／体外効果実験データは、いずれも
で表され、データ分析では、Ｇｒａｐｈｐａｄ ｐｒｉｓｍ５．０統計分析ソフトウェア
を採用した。まずデータに対して正規分布と等分散性検定を行った。正規分布を満たす（
ｐ＞０．２０）とともに分散が等しい（ｐ＞０．１０）場合、複数の群間の比較では、一
元配置分散分析によるＬＳＤ法により多重比較し、ｐ＜０．０５である場合、統計学的に
有意であるとみなした。正規分布を満たしておらず、又は分散が等しくない場合、複数の
群間の比較では、ノンパラメトリック検定であるＫｒｕｓｋａｌ－Ｗａｌｌｉｓ Ｈ方法
を採用し、Ｋｒｕｓｋａｌ－ｗａｌｌｉｓ Ｈ検定結果が有意（ｐ＜０．０５）である場
合、データをランク変換した後、複数の群間の一対比較を行い、ｐ＜０．０５である場合
、統計学的に有意であるとみなした。
（調製例１）本開示のｓｉＲＮＡの調製
本調製例では、以下の方法に従い、表２のｓｉＲＮＡを合成した。
Figure 2023134615000059
 ＊Ｓ：センス鎖、ＡＳ：アンチセンス鎖
注釈：大文字Ｃ、Ｇ、Ｕ、Ａはヌクレオチドの塩基配列を表し、ｄＴは、デオキシチミ
ンヌクレオチドを表し、小文字ｍは、当該文字ｍの左側に隣接する１つのヌクレオチドが
２’－メトキシ修飾ヌクレオチドであることを表し、小文字ｆは、当該文字ｆの左側に隣
接する１つのヌクレオチドが２’－フルオロ修飾ヌクレオチドであることを表し、小文字
ｓは、当該文字ｓの左右に隣接する２個のヌクレオチド間がチオリン酸エステル基により
結合されていることを表し、ＶＰは、当該文字ＶＰの右側の１つのヌクレオチドがビニル
リン酸エステル修飾ヌクレオチドであることを表し、Ｐは、当該文字Ｐの右側の１つのヌ
クレオチドがリン酸エステル修飾ヌクレオチドであることを表し、Ｐｓは、当該文字Ｐｓ
の右側の１つのヌクレオチドがチオリン酸エステル修飾ヌクレオチドであることを表す。
（１－１）ｓｉＲＮＡのセンス鎖の合成
汎用の固相担体（ＵｎｙＬｉｎｋｅｒＴＭ ｌｏａｄｅｄ ＮｉｔｔｏＰｈａｓｅ（登
録商標）ＨＬ Ｓｏｌｉｄ Ｓｕｐｐｏｒｔｓ、Ｋｉｎｏｖａｔｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅ
ｎｃｅｓ社）を出発として循環させ、上記配列並び順に従い３’－５’方向に一つずつヌ
クレオシドモノマーを結合した。ヌクレオシドモノマーを結合するごとに、脱保護、カッ
プリング、キャッピング、酸化の４つの反応を含む。合成条件は、以下のように規定され
た。
ヌクレオシドモノマーを０．１Ｍ濃度のアセトニトリル溶液で提供し、各脱保護反応の
条件が同じであり、即ち、温度が２５℃であり、反応時間が７０秒であり、脱保護試薬は
、ジクロロ酢酸のジクロロメタン溶液（３％ｖ／ｖ）であり、ジクロロ酢酸と固相担体に
おける４，４’－ジメトキシトリチル保護基とのモル比が５：１であった。
各カップリング反応条件は、いずれも同じであり、温度が２５℃であり、固相担体に結
合される核酸配列とヌクレオシドモノマーとのモル比が１：１０であり、固相担体に結合
される核酸配列とカップリング試薬とのモル比が１：６５であり、反応時間が６００秒で
あり、カップリング試薬は、５－エチルチオ－１Ｈ－テトラゾールの０．５Ｍアセトニト
リル溶液であった。
各キャッピング条件は、いずれも同じであり、温度が２５℃であり、反応時間が１５秒
であった。キャッピング試薬溶液は、モル比が１：１であるＣａｐ１とＣａｐ２の混合溶
液であり、キャッピング試薬と固相担体に結合される核酸配列とのモル比が、酢酸無水物
：Ｎ－メチルイミダゾール：固相担体に結合される核酸配列＝１：１：１であった。
各酸化反応条件は同じであり、温度が２５℃であり、反応時間が１５秒であり、酸化試
薬が濃度０．０５Ｍのヨウ素水であった。ヨウ素と、カップリング工程において固相担体
に結合される核酸配列とのモル比が３０：１であった。反応をテトラヒドロフラン：水：
ピリジン＝３：１：１の混合溶剤で行った。
目的配列における２個のヌクレオチド間がチオリン酸エステルにより結合される場合、
当該２つのヌクレオチドのうち後のヌクレオチドの結合における酸化反応工程の代わりに
、以下の硫化反応工程を用いた。各工程の硫化反応条件は同じであり、温度が２５℃であ
り、反応時間が３００秒であり、硫化試薬がキサンタンヒドリドであることを含む。硫化
試薬と、カップリング工程において固相担体に結合される核酸配列とのモル比が１２０：
１であった。反応をアセトニトリル：ピリジン＝１：１の混合溶剤で行った。
切断と脱保護条件は以下のとおりである。合成された担体が結合されたヌクレオチド配
列を、濃度２５ｗｔ％のアンモニア水に加え、アンモニア水の用量が０．５ｍｌ／μｍｏ
ｌであり、５５℃で１６ｈ反応させ、液体を除去し、乾燥させるまで真空濃縮した。アン
モニア水により処理した後、一本鎖核酸の量について、０．４ｍｌ／μｍｏｌのＮ－メチ
ルピロリドンにより製品を溶解させた後、０．３ｍｌ／μｍｏｌのトリエチルアミン及び
０．６ｍｌ／μｍｏｌのトリエチルアミン三フッ化水素酸塩を加え、リボースにおける２
’－ＴＢＤＭＳ保護を除去した。目的配列における全てのヌクレオチドの２’－位がいず
れも修飾ヒドロキシ基である場合、切断と脱保護条件では、リボースにおける２’－ＴＢ
ＤＭＳ保護を除去する工程を含まなかった。
精製と脱塩：分取用イオンクロマトグラフィー精製カラム（Ｓｏｕｒｃｅ １５Ｑ）に
より、ＮａＣｌによる勾配溶出で、核酸の精製を完成した。具体的には、溶出剤Ａ：２０
ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ ８．１）、溶剤が水／アセトニトリル＝９：１（体積比）
であり、溶出剤Ｂ：１．５Ｍ塩化ナトリウム、２０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ ８．１
）、溶剤が水／アセトニトリル＝９：１（体積比）であり、溶出勾配：溶出剤Ａ：溶出剤
Ｂ＝１００：０～５０：５０で勾配溶出した。製品溶出液を回収してからあわせ、逆相ク
ロマトグラフィー精製カラムにより脱塩し、具体的な条件としては、デキストランゲルカ
ラムにより脱塩し、充填剤がデキストランゲルＧ２５であり、脱イオン水で溶出した。
検出：イオン交換クロマトグラフィー（ＩＥＸ－ＨＰＬＣ）を用いて純度を検出し、液
体クロマトグラフィー質量分析（ＬＣ－ＭＳ）により分子量を分析し、理論値と比較した
。
これにより、当該工程においてｓｉＲＮＡのセンス鎖Ｓを合成した。
（１－２）アンチセンス鎖の合成
本工程において、汎用の固相担体（ＵｎｙＬｉｎｋｅｒＴＭ ｌｏａｄｅｄ Ｎｉｔｔ
ｏＰｈａｓｅ（登録商標）ＨＬ Ｓｏｌｉｄ Ｓｕｐｐｏｒｔｓ、Ｋｉｎｏｖａｔｅ Ｌ
ｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社）により、ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖ＡＳを合成した。固
相合成方法における脱保護、カップリング、キャッピング、酸化及び／又は硫化反応条件
、脱保護と切断、単離条件は、センス鎖の合成と同じであった。
ここで、ビニルリン酸エステルで修飾された２’－メトキシ修飾ウラシルヌクレオシド
モノマー（ＶＰ－Ｕｍ）は、以下の方法に従い合成された。
Figure 2023134615000060
（１－２－１）ＶＰ－Ｕ－２の合成
以下の方法に従い、ＶＰ－Ｕ－２分子を合成した。
Figure 2023134615000061
 ２’－メトキシ修飾ウラシルヌクレオチド（２’－ＯＭｅ－Ｕ、５１．３０ｇ、９１．
６ｍｍｏｌ）、ｔｅｒｔ－ブチルジフェニルクロロシラン（ＴＢＤＰＳＣｌ、５０．３５
ｇ、１８３．２ｍｍｏｌ）、イミダゾール（１２．４７ｇ、１８３．２ｍｍｏｌ）を混合
して４５０ｍｌのＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）に溶解させ、室温で２０ｈ攪
拌反応させた。ＤＭＦを留去し、６００ｍｌのジクロロメタンで溶解した後３００ｍｌの
飽和炭酸水素ナトリウムを加えて洗浄し、水相をジクロロメタン（ＤＣＭ）で１回あたり
３００ｍｌで３回抽出し、有機相をあわせ、５％シュウ酸で水相をｐＨ＜５になるまで洗
浄し、乾燥させるまで溶剤を蒸発した後ＶＰ－Ｕ－１粗製品を得、そのまま後のＶＰ－Ｕ
－２の合成に用いた。
ＶＰ－Ｕ－１粗製品を１００ｍｌのジクロロメタンで溶解した後、氷浴を施して１０分
間攪拌し、さらに、予め４℃の冷蔵庫で冷蔵された４５０ｍｌの２％ｐ－トルエンスルホ
ン酸溶液（溶剤が、体積比３：７のメタノール－ジクロロメタン混合溶剤である）を加え
、１０分間反応させた。さらに２００ｍｌの飽和炭酸水素ナトリウムを加えて反応をクエ
ンチングし、有機相に飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加えてｐＨ＝８になるまで洗浄し
た。水相をあわせ、ジクロロメタンで１回あたり２００ｍｌで２回抽出し、有機相をあわ
せ、さらに２００ｍｌの飽和食塩水で１回洗浄し、乾燥させるまで溶剤を蒸発した。２０
０～３００メッシュの順相シリカゲルカラムで精製し、石油エーテルをカラムに入れ、石
油エーテル：酢酸エチル：ジクロロメタン：メタノール＝１：１：１：０．０５～１：１
：１：０．２５で勾配溶出し、生成物溶出液を回収し、溶剤を減圧蒸発乾固し、真空油ポ
ンプで発泡乾燥させて計４０．００ｇの純粋なＶＰ－Ｕ－２を得た。１Ｈ ＮＭＲ （４
００ ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６） δ ７．９６ （ｄ，Ｊ ＝７．８ Ｈｚ，１Ｈ），
７．６４ （ｄｔｄ，Ｊ ＝５．１，４．０，２．２ Ｈｚ，４Ｈ），７．４１－７．３
０ （ｍ，６Ｈ），６．７９ （ｄ，Ｊ ＝４．７ Ｈｚ，１Ｈ），５．７３ （ｄ，Ｊ
＝７．６ Ｈｚ，１Ｈ），４．９４ （ｔ，Ｊ ＝７．０ Ｈｚ，１Ｈ），４．１２
（ｔｄ，Ｊ ＝４．６，３．９ Ｈｚ，１Ｈ），４．０５ （ｄｄ，Ｊ ＝４．８、４．
０ Ｈｚ，１Ｈ），３．９６ （ｔ，Ｊ ＝４．７ Ｈｚ，１Ｈ），３．６８ （ｄｄｄ
，Ｊ ＝１１．８，７．０，４．６ Ｈｚ，１Ｈ），３．５７ － ３．４６ （ｍ，１
Ｈ），３．３９ （ｓ，３Ｈ），１．０５ （ｓ，８Ｈ）． ＭＳ ｍ／ｚ：Ｃ２６Ｈ３
３Ｎ２Ｏ６Ｓｉ、［Ｍ＋Ｈ］＋、理論値：４９７．２１、実測値：４９７．４５。
（１－２－２）ＶＰ－Ｕ－４の合成：
Figure 2023134615000062
 ＶＰ－Ｕ－２（１９．８４ｇ、４０．０ｍｍｏｌ）、ジシクロヘキシルカルボジイミド
（ＤＣＣ、１６．４８ｇ、８０．０ｍｍｏｌ）、ピリジン（４．２０ｇ、５３．２ｍｍｏ
ｌ）、トリフルオロ酢酸（６．６１ｇ、５３．２ｍｍｏｌ）を混合して２００ｍｌのジメ
チルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解させ、室温で２０ｈ攪拌反応させた。別に、メチレ
ンジホスホン酸テトラエチル（２１．４４ｇ、７４．４ｍｍｏｌ）を１２０ｍｌのＴＨＦ
に溶解させ、氷浴で降温し、氷浴温度でｔ－ＢｕＯＫ（１１．３６ｇ、１０１．２ｍｍｏ
ｌ）を加え、氷浴温度で１０ｍｉｎ反応させた後、室温まで昇温して０．５ｈ反応させた
後、約１ｈかけて前述した反応液に加え、氷浴温度で１ｈ反応させた後、室温まで昇温し
て１８ｈ反応させた。水を加えて反応をクエンチングし、水相をジクロロメタンで１回あ
たり２００ｍｌで３回抽出した。有機相をあわせ、２００ｍｌの飽和食塩水で１回洗浄し
た後に乾燥させるまで溶剤を蒸発した。２００～３００メッシュの順相シリカゲルカラム
で精製し、石油エーテルをカラムに入れ、石油エーテル：酢酸エチル＝１：１～１：４で
勾配溶出し、生成物溶出液を回収し、溶剤を減圧蒸発乾固し、真空油ポンプで発泡乾燥さ
せて計１４．００ｇの純粋なＶＰ－Ｕ－４を得た。１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ，Ｄ
ＭＳＯ－ｄ６） δ ７．９６ （ｄ，Ｊ ＝７．８ Ｈｚ，１Ｈ），７．６４ （ｄｔ
ｄ，Ｊ ＝５．１，４．０，２．２ Ｈｚ，４Ｈ），７．４１ － ７．３０ （ｍ，６
Ｈ），６．８２ － ６．７１ （ｍ，２Ｈ），５．９０ （ｄｄｄ，Ｊ ＝２５．９、
１５．０，１．０ Ｈｚ，１Ｈ），５．７３ （ｄ，Ｊ ＝７．６ Ｈｚ，１Ｈ），４．
３６ － ４．２１ （ｍ，３Ｈ），４．１８ （ｔ，Ｊ ＝４．９ Ｈｚ，１Ｈ），４
．０５ （ｄｄｑ，Ｊ ＝９．７，８．５，６．９ Ｈｚ，２Ｈ），３．８７ （ｔ，Ｊ
＝４．８ Ｈｚ，１Ｈ），３．３９ （ｓ，３Ｈ），１．３２ （ｔｄ，Ｊ ＝６．９
，０．７ Ｈｚ，６Ｈ），１．０５ （ｓ，８Ｈ）． ＭＳ ｍ／ｚ：Ｃ３１Ｈ４２Ｎ２
Ｏ８ＰＳｉ、［Ｍ＋Ｈ］＋、理論値：６２９．２４、実測値：６２９．５１。
（１－２－３）ＶＰ－Ｕ－５の合成：
Figure 2023134615000063
 ＶＰ－Ｕ－４（１４．００ｇ、２２．２９ｍｍｏｌ）を１００ｍｌのテトラヒドロフラ
ンに溶解させ、トリエチルアミン三フッ化水素酸（１７．９６ｇ、１１１．４５ｍｍｏｌ
）を加え、室温で２０ｈ攪拌して完全に反応させた。そのまま乾燥させるまで溶剤を蒸発
し、５０ｍｌのジクロロメタンで溶解してから蒸発乾固する操作を２回繰り返し、粗製品
を得た。２００～３００メッシュの順相シリカゲルカラムで精製し、石油エーテルをカラ
ムに入れ、石油エーテル：酢酸エチル：ジクロロメタン：メタノール＝１：１：１：０．
０５～１：１：１：０．２５で勾配溶出し、生成物溶出液を回収し、溶剤を減圧蒸発乾固
し、真空油ポンプで発泡乾燥させて計６．７０ｇの純粋なＶＰ－Ｕ－５を得た。１Ｈ Ｎ
ＭＲ （４００ ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６） δ ７．９６ （ｄ，Ｊ ＝７．８ Ｈｚ
，１Ｈ），６．７７ （ｄｄ，Ｊ ＝１５．０，６．２ Ｈｚ，１Ｈ），５．９９ －
５．８２ （ｍ，２Ｈ），５．７３ （ｄ，Ｊ ＝７．６ Ｈｚ，１Ｈ），５．２７ （
ｄ，Ｊ ＝５．１ Ｈｚ，１Ｈ），５．１０ （ｄｄ，Ｊ ＝５．３，４．７ Ｈｚ，１
Ｈ），４．２９ （ｄｄｑ，Ｊ ＝９．８，８．６，７．０ Ｈｚ，２Ｈ），４．１７
（ｄｄｄ，Ｊ ＝６．２，５．２，１．０ Ｈｚ，１Ｈ），４．１２ － ３．９８ （
ｍ，３Ｈ），３．３９ （ｓ，２Ｈ），１．３２ （ｔｄ，Ｊ ＝６．９，０．６ Ｈｚ
，６Ｈ）． ＭＳ ｍ／ｚ：Ｃ１５Ｈ２４Ｎ２Ｏ８Ｐ、［Ｍ＋Ｈ］＋、理論値：３９１．
１３、実測値：３９１．３８。
（１－２－４）ＶＰ－Ｕ－６の合成：
Figure 2023134615000064
 アルゴン保護条件で１０ｍｌの無水ジクロロメタンにＶＰ－Ｕ－５（３９１ｍｇ、１．
０ｍｍｏｌ）、ピリジントリフルオロアセテート（０．２３２ｇ、１．２ｍｍｏｌ）、Ｎ
－メチルイミダゾール（０．０９９ｇ、１．２ｍｍｏｌ）、ビス（ジイソプロピルアミノ
）（２－シアノエトキシ）ホスフィン（０．４５２ｇ、１．５ｍｍｏｌ）を加え、室温で
５時間攪拌反応させた。乾燥させるまで溶剤を留去し、カラムクロマトグラフィーにより
精製し（２００～３００メッシュの順相シリカゲルを用いて、ジクロロメタン：アセトニ
トリル（０．５ｗｔ％トリエチルアミンを含む）＝３：１～１：３で勾配溶出した）、生
成物溶出液を回収し、溶剤を濃縮除去し、計５０８ｍｇの目的生成物ＶＰ－Ｕ－６を得た
。３１Ｐ ＮＭＲ （１６１ ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６） δ １５０．３４，１５０．
２９，１７．０７，１５．５０． ＭＳ ｍ／ｚ：Ｃ２４Ｈ４１Ｎ４Ｏ９Ｐ２、［Ｍ＋Ｈ
］＋、理論値：５９１．２３、実測値：５９１．５５。ＶＰ－Ｕ－６が目的生成物ＶＰ－
Ｕｍであり、ヌクレオシドモノマーとしてＲＮＡ鎖の合成に関与することを示した。
以下の方法を用いて５’－リン酸エステル修飾をアンチセンス鎖の５’端に結合した。
原料は、以下の式ＣＰＲ－Ｉの構造を有するリン酸化構造モノマーであり、蘇州吉瑪に
より提供され、番号がＣａｔ＃１３～２６０１－ＸＸである。
Figure 2023134615000065
 アンチセンス鎖の全てのヌクレオシドモノマーを結合した後、ホスホルアミダイト核酸
固相合成方法により、脱保護、カップリング、キャッピング、酸化の４つの反応を行って
ＣＰＲ－Ｉモノマーをアンチセンス鎖の５’末端に結合した。その後、以下の条件により
切断と脱保護を行い、アンチセンス鎖を得た。
合成された担体が結合されたヌクレオチド配列を、濃度２５ｗｔ％のアンモニア水に加
え、アンモニア水の用量が０．５ｍｌ／μｍｏｌであり、５５℃で１６ｈ反応させ、液体
を除去し、乾燥させるまで真空濃縮した。アンモニア水により処理した後、一本鎖核酸の
量について、０．４ｍｌ／μｍｏｌのＮ－メチルピロリドンにより製品を溶解させた後、
０．３ｍｌ／μｍｏｌのトリエチルアミン及び０．６ｍｌ／μｍｏｌのトリエチルアミン
三フッ化水素酸塩を加え、リボースにおける２’－ＴＢＤＭＳ保護を除去した。精製と脱
塩：分取用イオンクロマトグラフィー精製カラム（Ｓｏｕｒｃｅ １５Ｑ）により、Ｎａ
Ｃｌによる勾配溶出で、核酸の精製を完成した。具体的には、溶出剤Ａ：２０ｍＭリン酸
ナトリウム（ｐＨ ８．１）、溶剤が水／アセトニトリル＝９：１（体積比）であり、溶
出剤Ｂ：１．５Ｍ塩化ナトリウム、２０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ ８．１）、溶剤が
水／アセトニトリル＝９：１（体積比）であり、溶出勾配：溶出剤Ａ：溶出剤Ｂ＝１００
：０～５０：５０で勾配溶出した。製品溶出液を回収してからあわせ、逆相クロマトグラ
フィー精製カラムにより脱塩し、具体的な条件としては、デキストランゲルカラムにより
脱塩し、充填剤がデキストランゲルＧ２５であり、脱イオン水で溶出した。
目的生成物が５’－チオリン酸エステル修飾を有する場合に、結合する際に、上記酸化
反応条件の代わりに硫化反応条件を用い、硫化反応を行ったこと以外、上記と同じ工程を
用いた。
ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖を同様に分析検出し、用いられた計器と方法は、センス鎖
と同じであり、最終的に、対応するｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖を得たことを確認した。
（１－３）ｓｉＲＮＡの合成
Ｓ鎖とＡＳ鎖を等モル比で混合し、注射用水に溶解させ９５℃に加熱し、室温で冷却し
た後、これらを水素結合により二本鎖構造を形成させた。
上記合成されたセンス鎖及びアンチセンス鎖に対して、イオン交換クロマトグラフィー
（ＩＥＸ－ＨＰＬＣ）により純度を検出し、液体クロマトグラフィータンデム質量分析（
ＬＣ－ＭＳ）により分子量を分析し、合成された核酸配列が表２における各ｓｉＲＮＡに
対応することを確認した。
（調製例２）複合体１の調製
本調製例では、以下の方法に従い、表４Ａにおいて番号が複合体Ａ１であるｓｉＲＮＡ
複合体を合成した。
（２－１）Ｌ－１０化合物の調製
以下の方法に従い、Ｌ－１０化合物を合成した。
Figure 2023134615000066
（２－１－１）複合末端セグメントＧＡＬ－５の合成
Figure 2023134615000067
（２－１－１ａ）ＧＡＬ－２の合成
１００．０ｇのＧＡＬ－１（Ｎ－アセチル－Ｄ－ガラクトサミン塩酸塩、ＣＡＳ番号：
１７７２－０３－８、寧波弘翔生化公司から購入、４６３．８ｍｍｏｌ）を１０００ｍｌ
の無水ピリジンに溶解させ、氷水浴下で５４０ｍｌの酢酸無水物（Ｅｎｏｘ社から購入、
５５６５．６ｍｍｏｌ）を加え、室温で１．５時間攪拌反応した。反応液を１０Ｌの氷水
に注入し、減圧吸引濾過し、ケーキを２Ｌの氷水で洗浄した後、完全に溶解するまでアセ
トニトリル／トルエン混合溶剤（アセトニトリル：トルエンの体積比＝１：１）を加え、
溶剤を蒸発乾固し、１３０．０ｇの白色固形製品ＧＡＬ－２を得た。
（２－１－１ｂ）ＧＡＬ－３の合成
工程（１－１ａ）で得られたＧＡＬ－２（３５．１ｇ、９０．０ｍｍｏｌ）を２１３ｍ
ｌの無水１，２－ジクロロエタンに溶解させ、氷水浴下で、窒素保護条件で、２４．０ｇ
のＴＭＳＯＴｆ（ＣＡＳ番号：２７６０７－７７－８、マックリン社から購入、１０８．
０ｍｍｏｌ）を加え、室温で一晩反応させた。
反応液に４００ｍｌのジクロロメタンを加えて希釈し、珪藻土で濾過し、１Ｌの飽和炭
酸水素ナトリウム水溶液を加え、洗浄し、有機相を分離し、水相をジクロロエタンにより
１回あたり３００ｍｌで２回抽出し、有機相をあわせ、それぞれ３００ｍｌの飽和炭酸水
素ナトリウム水溶液及び３００ｍｌの飽和食塩水で洗浄し、有機相を分離し、無水硫酸ナ
トリウムで乾燥させ、溶剤を減圧蒸発乾固し、２６．９ｇの淡黄色の粘稠な水飴状製品Ｇ
ＡＬ－３を得た。
（２－１－１ｃ）ＧＡＬ－４の合成
工程（１－１ｂ）で得られたＧＡＬ－３（２６．９ｇ、８１．７ｍｍｏｌ）を１３６ｍ
ｌの無水１，２－ジクロロエタンに溶解させ、乾燥した４Å分子篩粉３０ｇを加え、９．
０ｇの５－ヘキセン－１－オール（ＣＡＳ番号：８２１－４１－０、Ａｄａｍａｓ－ｂｅ
ｔａ社から購入、８９．９ｍｍｏｌ）を加え、室温で３０分間攪拌し、氷浴下で窒素保護
下で９．０８ｇのＴＭＳＯＴｆ（４０．９ｍｍｏｌ）を加え、室温で一晩攪拌反応させた
。４Å分子篩粉を濾過除去し、濾液に３００ｍｌのジクロロメタンを加えて希釈し、珪藻
土で濾過し、５００ｍｌの飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加えて１０分間攪拌し洗浄し
、有機相を分離し、水相を３００ｍｌのジクロロエタンで１回抽出し、有機相をあわせ、
それぞれ３００ｍｌの飽和炭酸水素ナトリウム水溶液及び３００ｍｌの飽和食塩水で洗浄
し、有機相を分離し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、溶剤を減圧蒸発乾固し、４１．３
ｇの黄色水飴状製品ＧＡＬ－４を得、精製することなく、そのまま次の酸化反応を行った
。
（２－１－１ｄ）ＧＡＬ－５の合成
工程（１－１ｃ）に記載された方法により得られたＧＡＬ－４（１４．９ｇ、３４．７
ｍｍｏｌ）を７７ｍｌのジクロロメタンと７７ｍｌのアセトニトリルの混合溶剤に溶解さ
せ、それぞれ１０３ｍｌの脱イオン水及び２９．７ｇの過ヨウ素酸ナトリウム（ＣＡＳ番
号：７７９０－２８－５、Ａｌａｄｄｉｎ社から購入、１３８．８ｍｍｏｌ）を加え、氷
水浴下で１０分間攪拌し、塩化ルテニウム（ＩＩＩ）（ＣＡＳ番号：１４８９８－６７－
０、Ｅｎｅｒｇｙ社から購入、２３８ｍｇ、１．１４５ｍｍｏｌ）を加え、システム温度
を３０℃以下に制御し、室温で一晩反応させた。反応液に３００ｍｌの水を加えて希釈攪
拌し、飽和炭酸水素ナトリウムを加えてｐＨを約７．５に調整し、有機相を分離して捨て
、水相をジクロロメタンで１回あたり２００ｍｌで３回抽出し、有機相を捨てた。水相を
固形クエン酸でｐＨを約３に調節し、ジクロロメタンで１回あたり２００ｍｌで３回抽出
し、有機相をあわせ、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、溶剤を減圧蒸発乾固し、６．５ｇ
の白色泡状固形製品ＧＡＬ－５を得た。１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）
δ １２．０１ （ｂｒ，１Ｈ），７．８３ （ｄ，Ｊ ＝９．２ Ｈｚ，１Ｈ），５．
２１ （ｄ，Ｊ ＝３．２ Ｈｚ，１Ｈ），４．９６ （ｄｄ，Ｊ ＝１１．２，３．２
Ｈｚ，１Ｈ），４．４９ （ｄ，Ｊ ＝８．４ Ｈｚ，１Ｈ），４．０７ － ３．９
５ （ｍ，３Ｈ），３．９２ － ３．８５ （ｍ，１Ｈ），３．７４ － ３．６７
（ｍ，１Ｈ），３．４８ － ３．３９ （ｍ，１Ｈ），２．２０ （ｔ，Ｊ ＝６．８
Ｈｚ，２Ｈ），２．１１ （ｓ，３Ｈ），２．００ （ｓ，３Ｈ），１．９０ （ｓ，
３Ｈ），１．７７ （ｓ，３Ｈ），１．５５ － １．４５ （ｍ，４Ｈ）．
（２－１－２）Ｍ－１１－Ｔ３の合成：
Figure 2023134615000068
 Ｊ－０（１．８８３ｇ、１０ｍｍｏｌ、アルファ・エイサー社から購入）を２５ｍｌの
アセトニトリルに溶解させ、トリエチルアミン（４．０４８ｇ、４０ｍｍｏｌ）を加えて
氷水浴で０℃まで冷却し、トリフルオロ酢酸エチル（５．６８３ｇ、４０ｍｍｏｌ）を加
え、室温で２２ｈ反応させ、溶剤を減圧蒸発乾固し、真空油ポンプで１８ｈ発泡乾燥させ
、５．３４２ｇの固形粗製品Ｍ－１１－Ｔ３を得、さらに精製することなく、そのまま後
の反応に用いた。ＭＳ ｍ／ｚ：Ｃ１５Ｈ２２Ｆ９Ｎ４Ｏ３、［Ｍ＋Ｈ］＋、理論値：４
７７．３５、実測値：４７７．６５。
（２－１－３）Ｍ－１１－Ｔ３－Ｔｒの合成：
Figure 2023134615000069
 Ｍ－１１－Ｔ３粗製品（５．３４２ｇ、１０ｍｍｏｌ）を５０ｍｌのジクロロメタンに
溶解させ、反応液にＴｒＣｌ（３．３４５ｇ、１２ｍｍｏｌ）及びトリエチルアミン（１
．５１８ｇ、１５ｍｍｏｌ）を加え、室温で２０ｈ攪拌反応させ、飽和炭酸水素ナトリウ
ムで反応液を１回あたり２０ｍｌで２回洗浄し、２０ｍｌの飽和食塩水で１回洗浄し、有
機相を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過した後有機溶剤を減圧蒸発乾固し、真空油ポ
ンプで一晩発泡乾燥させ、７．７６３ｇの固形粗製品Ｍ－１１－Ｔ３－Ｔｒを得た。ＭＳ
ｍ／ｚ：Ｃ３４Ｈ３６Ｆ９Ｎ４Ｏ３、［Ｍ＋Ｎａ］＋、理論値：７４１．２５、実測値
：７４１．５３。固形粗製品Ｍ－１１－Ｔ３－Ｔｒは、精製することなく、引き続き次の
Ｍ－１８－Ｔｒの合成に使用した。
（２－１－４）Ｍ－１８－Ｔｒの合成：
Figure 2023134615000070
 工程（２－１－３）で得られたＭ－１１－Ｔ３－Ｔｒ粗製品（７．７６３ｇ、１０ｍｍ
ｏｌ）を１００ｍｌのメタノールに溶解させ、１００ｍｌのメチルアミン水溶液（４０質
量％）を加え、５０℃で２３ｈ攪拌反応させ、不溶性粒子を濾過除去し、溶剤を減圧蒸発
乾固し、２００ｍｌの体積比１：１のＤＣＭ：メタノール混合溶剤を加え、５０ｍｌの飽
和炭酸水素ナトリウムで洗浄し、水相をジクロロメタンで１回あたり５０ｍｌで３回抽出
し、有機相をあわせ、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過した後で溶剤を減圧蒸発乾固
し、真空油ポンプで一晩発泡乾燥させ、２００～３００メッシュの順相シリカゲルカラム
で精製し、石油エーテルをカラムに入れ、１ｗｔ％トリエチルアミンでシリカゲルの酸性
を中和し、ジクロロメタン：メタノール：アンモニア水（２５ｗｔ％）＝１：１：０．０
５～１：１：０．２５で勾配溶出し、生成物溶出液を回収し、溶剤を減圧蒸発乾固し、真
空油ポンプで発泡乾燥させて２．８８７ｇの純粋なＭ－１８－Ｔｒを得た。１Ｈ ＮＭＲ
（４００ ＭＨｚ，ＤＭＳＯ） δ７．４７ － ７．３９ （ｍ，６Ｈ），７．３２
－７．２４ （ｍ，６Ｈ），７．１９ － ７．１２ （ｍ，３Ｈ），２．６０ －
２．４７ （ｍ，４Ｈ），２．４６ － ２．１９ （ｍ，１３Ｈ），１．７０ － １
．５５ （ｍ，４Ｈ），１．４０ （ｐ，Ｊ ＝６．８ Ｈｚ，２Ｈ）． ＭＳ ｍ／
ｚ：Ｃ２８Ｈ３９Ｎ４、［Ｍ＋Ｈ］＋、理論値：４３１．６５、実測値：４３２．６１。
（２－１－５）Ｌ－５－Ｔｒの合成：
Figure 2023134615000071
 工程（２－１－４）で得られたＭ－１８－Ｔｒ（２．０２ｇ、４．６９ｍｍｏｌ）と工
程（２－１－１）で得られたＧＡＬ－５（６．９３ｇ、１５．４８ｍｍｏｌ）を混合して
４７ｍｌのアセトニトリルに溶解させ、Ｎ－メチルモルホリン（３．１３ｇ、３０．９６
ｍｍｏｌ）及び４－（４，６－ジメトキシトリアジン－２－イル）－４－メチルモルホリ
ン塩酸塩（ＤＭＴＭＭ、４．２８ｇ、１５．４８ｍｍｏｌ）を加え、室温で２ｈ攪拌反応
させた。２００ｍｌのジクロロメタンで反応液を希釈し、１００ｍｌの飽和炭酸水素ナト
リウム溶液で有機相を洗浄し、１００ｍｌの飽和食塩水で有機相を洗浄し、有機相を無水
硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過した後に溶剤を減圧蒸発乾固して粗製品を得た。２００
～３００メッシュの順相シリカゲルカラムで精製し、石油エーテルをカラムに入れ、１ｗ
ｔ％トリエチルアミンでシリカゲルの酸性を中和し、ジクロロメタン：メタノール＝１０
０：５～１００：７で勾配溶出し、生成物溶出液を回収し、減圧蒸発乾固して７．４９ｇ
の純粋なＬ－５－Ｔｒを得た。１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ，ＤＭＳＯ） δ７．８
３ － ７．１０ （ｍ，４Ｈ），７．６７ － ７．６０ （ｍ，１Ｈ），７．４４
－ ７．３４ （ｍ，６Ｈ），７．３３ － ７．２４ （ｍ，６Ｈ），７．２０ －
７．１５ （ｍ，３Ｈ），５．２２ （ｓ，３Ｈ），４．９７ （ｄ，Ｊ ＝１１．３
Ｈｚ，３Ｈ），４．４９ （ｄ，Ｊ ＝８．４ Ｈｚ，３Ｈ），４．０６ － ３．０７
（ｍ，９Ｈ），３．９５ － ３．８３ （ｍ，３Ｈ），３．７７ － ３．６４ （
ｍ，３Ｈ），３．４５ － ３．３５ （ｍ，３Ｈ），３．１２ － ２．８７ （ｍ，
８Ｈ），２．３０ － ２．１５ （ｍ，３Ｈ），２．１１ － １．９８ （ｍ，２２
Ｈ），１．９５ － １．８４ （ｍ，１１Ｈ），１．８１ － １．６１ （ｍ，１４
Ｈ），１．５４ － １．３６ （ｍ，１４Ｈ）． ＭＳ ｍ／ｚ：Ｃ８５Ｈ１１９Ｎ７
Ｏ３０、［Ｍ＋Ｈ］＋、理論値：１７１８．８１、実測値：１７１８．０３。
（２－１－６）Ｌ－８の合成：
Figure 2023134615000072
 工程（２－１－５）で得られたＬ－５－Ｔｒ（５．９４ｇ、３．４５６ｍｍｏｌ）を６
９ｍｌのジクロロメタンに溶解させ、ジクロロ酢酸（１３．３６７ｇ、１０３．６７ｍｍ
ｏｌ）を加え、室温で２ｈ反応させ、１００ｍｌのジクロロメタンを加えて反応液を希釈
し、飽和炭酸水素ナトリウム溶液を加えて洗浄しｐＨ＝７～８になるように調節し、水相
をジクロロメタンで１回あたり３０ｍｌで６回抽出し、有機相をあわせ、無水硫酸ナトリ
ウムで乾燥させ、濾過した後に溶剤を減圧蒸発乾固して粗製品を得た。精製には、２００
～３００メッシュの順相シリカゲルを用い、１０ｗｔ％トリエチルアミンでシリカゲルの
酸性を中和し、１ｗｔ‰トリエチルアミンでカラムを平衡化し、ジクロロメタン：メタノ
ール＝１００：３０～１００：４０で勾配溶出し、生成物溶出液を回収し、溶剤を減圧蒸
発乾固して４．２６ｇの純粋なＬ－８を得た。１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ，ＤＭＳ
Ｏ） δ ７．８４ （ｄ，Ｊ ＝９．０ Ｈｚ，３Ｈ），７．２７ － ７．２３ （
ｍ，１Ｈ），７．１３ － ７．１８ （ｍ，１Ｈ），５．２２ （ｄ，Ｊ ＝３．１
Ｈｚ，３Ｈ），４．９７ （ｄｄ，Ｊ ＝１１．３，３．１ Ｈｚ，３Ｈ），４．４８
（ｄ，Ｊ ＝８．４ Ｈｚ，３Ｈ），４．０９ － ３．９８ （ｍ，９Ｈ），３．８８
（ｄｄ，Ｊ ＝１９．３，９．３ Ｈｚ，３Ｈ），３．７５ － ３．６６ （ｍ，３
Ｈ），３．４４ － ３．３８ （ｍ，３Ｈ），３．１７ － ３．３０ （ｍ，４Ｈ）
，３．１０ － ２．９７ （ｍ，４Ｈ），２．３５ － ２．２０ （ｍ，６Ｈ），２
．１５ － ２．０８ （ｍ，９Ｈ），２．０７ － １．９８ （ｍ，１３Ｈ），１．
９４ － １．８７ （ｍ，９Ｈ），１．８１ － １．７４ （ｍ，９Ｈ），１．６５
－ １．４２ （ｍ，１８Ｈ）． ＭＳ ｍ／ｚ：Ｃ８５Ｈ１１９Ｎ７Ｏ３０、［Ｍ＋
Ｈ］＋、理論値：１４７７．５９、実測値：１４７７．２３。
（２－１－７ａ）Ａ－１の合成
Figure 2023134615000073
 ＤＭＴｒＣｌ（４，４’－ビスメトキシトリチルクロリド、３８．１２ｇ、１１２．５
ｍｍｏｌ）を４５０ｍｌの無水ピリジンに溶解させ、ＤＬ－グリセリン酸カルシウム水和
物（１２．８８ｇ、４５．０ｍｍｏｌ）を加え、４５℃で２２ｈ反応させ、反応液を濾過
し、ケーキを２００ｍｌのＤＣＭでリンスし、濾液を乾燥させるまで減圧濃縮し、残りを
５００ｍｌのジクロロメタンに改めて溶解させ、０．５Ｍトリエチルアミンリン酸塩（ｐ
Ｈ＝７～８）で１回あたり２００ｍｌで２回洗浄し、水相をジクロロメタンで１回あたり
２００ｍｌで２回抽出し、有機相をあわせ、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、溶
剤を減圧蒸発乾固し、２００～３００メッシュの順相シリカゲルカラムで精製し、石油エ
ーテル：酢酸エチル：ジクロロメタン：メタノール＝１：１：１：０．３５～１：１：１
：０．５５で勾配溶出し、生成物溶出液を回収し、溶剤を減圧蒸発乾固し、５００ｍｌの
ジクロロメタンに改めて溶解させ、２００ｍｌの０．５Ｍトリエチルアミンリン酸塩で１
回洗浄し、水相をジクロロメタンで１回あたり２００ｍｌで２回抽出し、有機相をあわせ
、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、溶剤を減圧蒸発乾固し、真空油ポンプで一晩
減圧し、２０．７ｇの白色固形製品Ａ－１を得た。１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ，Ｄ
ＭＳＯ－ｄ６） δ ７．４６ （ｄｄｄ，Ｊ ＝６．５，２．３，１．１ Ｈｚ，１Ｈ
），７．４０ － ７．２８ （ｍ，７Ｈ），６．８９ － ６．８１ （ｍ，４Ｈ），
４．８４ （ｄ，Ｊ ＝５．０ Ｈｚ，１Ｈ），４．３６ － ４．２４ （ｍ，１Ｈ）
，４．２９ （ｓ，６Ｈ），３．９２ （ｄｄ，Ｊ ＝１２．４，７．０ Ｈｚ，１Ｈ）
，３．６７ （ｄｄ，Ｊ ＝１２．３，７．０ Ｈｚ，１Ｈ），２．５２ （ｑ，Ｊ ＝
６．３ Ｈｚ，６Ｈ），１．０３ （ｔ，Ｊ ＝６．３ Ｈｚ，９Ｈ）． ＭＳ ｍ／ｚ
：Ｃ２４Ｈ２３Ｏ６、［Ｍ－Ｈ］－、理論値：４０７．１５、実測値：４０６．９２。
（２－１－７ｂ）Ｌ－７の合成：
Figure 2023134615000074
 工程（２－１－６）で得られたＬ－８（２．２６２ｇ、１．５３２ｍｍｏｌ）及び工程
（２－１－７ａ）で得られたＡ－１（２．３４２ｇ、４．５９６ｍｍｏｌ）を混合し、１
６ｍｌのジクロロメタンに溶解させ、３－ジエトキシホスホリル－１，２，３－ベンゾオ
キサゾール４（３Ｈ）－オン（ＤＥＰＢＴ）（１．３７５ｇ、４．５９６ｍｍｏｌ）を加
え、さらにジイソプロピルエチルアミン（１．１８８ｇ、９．１９１ｍｍｏｌ）を加え、
２５℃で２ｈ攪拌反応させ、１０ｍｌの飽和炭酸水素ナトリウムで有機相を洗浄し、水相
をジクロロメタンで１回あたり１０ｍｌで３回抽出し、１０ｍｌの飽和食塩水で有機相を
洗浄し、水相をジクロロメタンで１回あたり１０ｍｌで２回抽出し、有機相をあわせ、無
水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過した後に溶剤を減圧蒸発乾固し、真空油ポンプで一晩
発泡乾燥させ、４．９００ｇの粗製品を得た。カラム精製には、１２０ｇの２００～３０
０メッシュの順相シリカゲルを用い、２０ｍｌのトリエチルアミンでシリカゲルの酸性を
中和し、１ｗｔ％トリエチルアミンを含む石油エーテルでカラムを平衡化し、石油エーテ
ル：酢酸エチル：ジクロロメタン：Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド＝１：１：１：０．５
～１：１：１：０．６で勾配溶出し、生成物溶出液を回収し、溶剤を減圧蒸発乾固して２
．３３６ｇの純粋なＬ－７を得た。１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ，ＤＭＳＯ） δ７
．９０ － ７．７８ （ｍ，４Ｈ），７．７５ － ７．６４ （ｍ，１Ｈ），７．３
８ － ７．１８ （ｍ，９Ｈ），６．９１ － ６．８３ （ｍ，４Ｈ），５．２５
－ ５．１０ （ｍ，４Ｈ），４．９７ （ｄｄ，Ｊ ＝１１．２，３．２ Ｈｚ，３Ｈ
），４．４８ － ４．３０ （ｍ，４Ｈ），４．０２ （ｓ，９Ｈ），３．９３ －
３．８４ （ｍ，３Ｈ），３．７６ － ３．６６ （ｍ，９Ｈ），３．４５ － ３．
３５ （ｍ，３Ｈ），３．２４ － ２．９８ （ｍ，１０Ｈ），２．３０ － ２．２
０ （ｍ，２Ｈ），２．１１ － １．８８ （ｍ，３１Ｈ），１．８０ － １．４０
（ｍ，２８Ｈ）． ＭＳ ｍ／ｚ：Ｃ９０Ｈ１２８Ｎ７Ｏ３５、［Ｍ－ＤＭＴｒ］＋、
理論値：１５６４．６５、実測値：１５６４．８８。
（２－１－８）Ｌ－９の合成：
Figure 2023134615000075
 工程（２－１－７ｂ）で得られたＬ－７（２．３００ｇ、１．２６ｍｍｏｌ）、コハク
酸無水物（０．３７８ｇ、３．７８ｍｍｏｌ）及び４－ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡ
Ｐ、０．４６２ｇ、３．７８ｍｍｏｌ）を混合して１３ｍｌのジクロロメタンに溶解させ
、さらにＤＩＰＥＡ（０．８１４ｇ、６．３０ｍｍｏｌ）を加え、２５℃で２４ｈ攪拌し
、５ｍｌの０．５Ｍトリエチルアミンリン酸塩で反応液を洗浄し、水相をジクロロメタン
で１回あたり５ｍｌで３回抽出し、有機相をあわせ、減圧蒸発乾固して２．７７４ｇの粗
製品を得た。カラム精製には、６０ｇの２００～３００メッシュの順相シリカゲルを用い
、１ｗｔ％トリエチルアミンでシリカゲルの酸性を中和し、ジクロロメタンでカラムを平
衡化し、１ｗｔ‰トリエチルアミンを含むジクロロメタン：メタノール＝１００：１８～
１００：２０で勾配溶出し、生成物溶出液を回収し、溶剤を減圧蒸発乾固して１．８７４
ｇの純粋なＬ－９複合分子（複合分子１化合物）を得た。１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨ
ｚ，ＤＭＳＯ） δ ８．５８ （ｄ，Ｊ ＝４．２ Ｈｚ，１Ｈ），７．９４ － ７
．８２ （ｍ，３Ｈ），７．４１ － ７．２９ （ｍ，５Ｈ），７．２２ （ｄ，Ｊ
＝８．１ Ｈｚ，５Ｈ），６．８９ （ｄ，Ｊ ＝８．３ Ｈｚ，４Ｈ），５．４９ －
５．３７ （ｍ，１Ｈ），５．２１ （ｄ，Ｊ ＝３．０ Ｈｚ，３Ｈ），４．９７
（ｄ，Ｊ ＝１１．１ Ｈｚ，３Ｈ），４．４９ （ｄ，Ｊ ＝８．２ Ｈｚ，３Ｈ），
４．０２ （ｓ，９Ｈ），３．８８ （ｄｄ，Ｊ ＝１９．４、９．４ Ｈｚ，３Ｈ），
３．７７ － ３．６５ （ｍ，９Ｈ），３．５０ － ３．３９ （ｍ，６Ｈ），３．
１１ － ２．９０ （ｍ，５Ｈ），２．６１ － ２．５４ （ｍ，４Ｈ），２．４７
－ ２．４１ （ｍ，２Ｈ），２．２６ － ２．１７ （ｍ，２Ｈ），２．１５ －
１．９５ （ｍ，２２Ｈ），１．９２ － １．８４ （ｍ，９Ｈ），１．８０ －
１．７０ （ｍ，１０Ｈ），１．６５ － １．３５ （ｍ，１７Ｈ）、１．３１ －
１．１９ （ｍ，４Ｈ），０．９６ （ｔ，Ｊ ＝７．１ Ｈｚ，９Ｈ）． ＭＳ ｍ／
ｚ：Ｃ９４Ｈ１３２Ｎ７Ｏ３８、［Ｍ－ＤＭＴｒ］＋、理論値：１６６４．７２、実測値
：１６６５．０３。
（２－１－９）Ｌ－１０化合物の合成：
Figure 2023134615000076
 この工程において、Ｌ－９複合分子を固相担体に結合することにより、Ｌ－１０化合物
を調製した。
工程（１－１－８）で得られたＬ－９複合分子（０．２３３ｇ、０．１１２６ｍｍｏｌ
）、Ｏ－ベンゾトリアゾール－テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（Ｈ
ＢＴＵ、０．０６４ｇ、０．１６８９ｍｍｏｌ）及びジイソプロピルエチルアミン（ＤＩ
ＥＡ、０．０２９ｇ、０．２２５２ｍｍｏｌ）を混合し、１９ｍｌのアセトニトリルに溶
解させ、室温で５分間攪拌し、反応液にアミノメチル樹脂（Ｈ２ＮＲｅｓｉｎ、０．９０
１ｇ、１００～２００メッシュ、アミノ基担持量４００μｍｏｌ／ｇ、南開和成社から購
入）を加え、２５℃でシェーカーで反応を行い、回転数２２０回転／分間、１５ｈ反応さ
せた後に濾過し、ケーキをＤＣＭで１回あたり３０ｍｌで２回リンスし、アセトニトリル
で１回あたり３０ｍｌで３回リンスし、３０ｍｌのエチルエーテルで１回リンスし、真空
油ポンプで２ｈ乾燥させ、その後、表３に示す配合割合に従い原料（ＣａｐＡ、ＣａｐＢ
、４－ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）及びアセトニトリル）を加えてキャッピング
反応を行った。２５℃でシェーカーに放置し、回転数２００回転／分間で５ｈ反応させ、
反応液を濾過し、ケーキをアセトニトリルで１回あたり３０ｍｌで３回リンスし、乾燥さ
せるまで吸引濾過し、真空油ポンプで一晩減圧乾燥させ、１．１００ｇ、担持量９０．８
μｍｏｌ／ｇのＬ－１０化合物（即ち、固相担体に結合されたＬ－９複合分子）を得た。
Figure 2023134615000077
 ここで、ＣａｐＡとＣａｐＢは、キャッピング試薬溶液であり、ＣａｐＡは、２０体積
％のＮ－メチルイミダゾールのピリジン／アセトニトリル混合溶液であり、ピリジンとア
セトニトリルとの体積比が３：５であり、ＣａｐＢは、２０体積％酢酸無水物のアセトニ
トリル溶液であった。
以下の合成では、センス鎖及びアンチセンス鎖の配列は、それぞれ表４における複合体
１のＳ配列とＡＳ配列に対応した。
（２－２）センス鎖の合成
固相ホスホルアミダイト法により、上記工程で調製されたＬ－１０化合物を出発として
循環させ、センス鎖のヌクレオチドの並び順に従い３’－５’方向に一つずつヌクレオシ
ドモノマーを結合した。ヌクレオシドモノマーを結合するごとに、脱保護、カップリング
、キャッピング、酸化又は硫化の４つの反応を含む。２個のヌクレオチド間がリン酸エス
テルにより結合される場合、次のヌクレオシドモノマーを結合するとき、脱保護、カップ
リング、キャッピング、酸化の４つの反応を含む。２個のヌクレオチド間がチオリン酸エ
ステルにより結合される場合、次のヌクレオシドモノマーを結合するとき、保護、カップ
リング、キャッピング、硫化の４つの反応を行った。上記反応の条件は、前述した調製例
１でセンス鎖を合成する際に用いられる条件が同じであった。
（２－３）アンチセンス鎖の合成
固相ホスホルアミダイト法により、汎用の固相担体（ＵｎｙＬｉｎｋｅｒＴＭ ｌｏａ
ｄｅｄ ＮｉｔｔｏＰｈａｓｅ（登録商標）ＨＬ Ｓｏｌｉｄ Ｓｕｐｐｏｒｔｓ、Ｋｉ
ｎｏｖａｔｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社）を出発として循環させ、複合体１のアン
チセンス鎖ＡＳを合成した。固相合成方法における脱保護、カップリング、キャッピング
、酸化又は硫化反応条件、切断と脱保護、精製と脱塩条件は、前述した調製例１でアンチ
センス鎖を合成する際に用いられる条件と同じであった。
合成を完成した後、上記センス鎖及びアンチセンス鎖に対して、それぞれイオン交換ク
ロマトグラフィー（ＩＥＸ－ＨＰＬＣ）により純度を検出し、液体クロマトグラフィー質
量分析（ＬＣ－ＭＳ）により分子量を分析し、測定された分子量と理論値を比較し、合成
されたセンス鎖及びアンチセンス鎖を確認した。
（２－４）複合体Ａ１の合成
Ｓ鎖とＡＳ鎖をそれぞれ注射用水に溶解させ、４０ｍｇ／ｍＬの溶液を得、等モル比で
混合し、５０℃で１５ｍｉｎ加熱し、室温で冷却した後、これらを水素結合により二本鎖
構造を形成させた。超純水（Ｍｉｌｌｉ－Ｑ超純水装置で自作、抵抗率１８．２ＭΩ＊ｃ
ｍ（２５℃））を用いて複合体を濃度が０．２ｍｇ／ｍＬになるまで希釈した後、液体ク
ロマトグラフィー質量分析計（ＬＣ－ＭＳ、Ｌｉｑｕｉｄ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈ
ｙ－Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ、Ｗａｔｅｒｓ社から購入、型番：ＬＣＴ Ｐ
ｒｅｍｉｅｒ）により分子量を検出した。その結果、理論値Ｓ：７５１６．３７、ＡＳ：
７０６１．５７、実測値Ｓ：７５１６．６、ＡＳ：７０６０．４９であり、分子量の実測
値が理論値と一致しており、式（４０３）に示される構造の目的複合体Ａ１を得たことを
示した。
（調製例３）本開示の複合体及び比較複合体の調製
前記複合体のｓｉＲＮＡ配列が、それぞれ表４Ａ～４Ｇに示される対応する配列であっ
たこと以外、調製例２と同じ方法により、表４Ａ～４Ｇにおける複合体Ａ２～Ａ７、Ｂ１
～Ｂ２、Ｃ２、Ｃ１２～Ｃ１３、Ｄ２、Ｄ１２～Ｄ１３、Ｅ１～Ｅ４、Ｆ１～Ｆ３、Ｇ１
～Ｇ３及び比較複合体Ａ２、Ｃ１、Ｄ１、Ｅ１、Ｆ１、Ｇ１を合成し、表４Ａ～４Ｇに示
される複合体Ａ８～Ａ１１、Ｂ３～Ｂ７、Ｃ１、Ｃ３、Ｄ１、Ｄ３、Ｅ５～Ｅ９、Ｆ４～
Ｆ１１、Ｇ４～Ｇ９を製造できると予期した。合成を完成した後、調製例２と同じ検出方
法により得られた複合体を確認した。そのうち、
複合体Ａ２の理論値Ｓ：７５１６．３７、ＡＳ：７０６５．５８、実測値Ｓ：７５１６
．６、ＡＳ：７０６４．５、
複合体Ａ３の理論値Ｓ：７５０４．３４、ＡＳ：７１３９．６８、実測値Ｓ：７５１５
．６、ＡＳ：７１３８．９、
複合体Ａ４の理論値Ｓ：７５１６．３７、ＡＳ：７０８１．６４、実測値Ｓ：７５１５
．６、ＡＳ：７０８０．９、
複合体Ａ５の理論値Ｓ：８２１８．８３、ＡＳ：７７０３．０５、実測値Ｓ：８２１８
、ＡＳ：７７０２．５、
複合体Ａ６の理論値Ｓ：７５１６．３７、ＡＳ：６９８５．５８、実測値Ｓ：７５１６
．５、ＡＳ：６９８４．９、
複合体Ｂ１の理論値Ｓ：７４０７．２２、ＡＳ：７２０８．７７、実測値Ｓ：７４０６
．４、ＡＳ：７２０８．１、
複合体Ｂ２の理論値Ｓ：７４０７．２２、ＡＳ：７１７０．７２、実測値Ｓ：７４０６
．５、ＡＳ：７１７０．１、
複合体Ｃ２の理論値Ｓ：７４８５．３、ＡＳ：７１６１．７、実測値Ｓ：７４８４．４
、ＡＳ：７１６０．９、
複合体Ｄ２の理論値Ｓ：７４２３．２２、ＡＳ：７２０７．７８、実測値Ｓ：７４２２
．６、ＡＳ：７２０７．２、
複合体Ｆ２の理論値Ｓ：７６４９．５５、ＡＳ：６９９５．４７、実測値Ｓ：７６４８
．８、ＡＳ：６９９４．８、
複合体Ｆ３の理論値Ｓ：７６４９．５５、ＡＳ：７０１１．５３、実測値Ｓ：７６４８
．８、ＡＳ：７０１０．９、
複合体Ｅ１の理論値Ｓ：７５８４．５、ＡＳ：７００７．４６、実測値Ｓ：７５８４、
ＡＳ：７００６．２、
複合体Ｅ２の理論値Ｓ：７５８４．５、ＡＳ：７０１１．４７、実測値Ｓ：７５８４、
ＡＳ：７０１１．３、
複合体Ｅ４の理論値Ｓ：７５７２．４７、ＡＳ：６９０７．４１、実測値Ｓ：７５７１
．８、ＡＳ：６９０６．９。
分子量の実測値が理論値と一致しており、目的複合体を得たことを示した。これらの複
合体は、いずれも式（４０３）に示される構造を有する。
［表４］
ｓｉＲＮＡ複合体
Figure 2023134615000078
Figure 2023134615000079
Figure 2023134615000080
Figure 2023134615000081
Figure 2023134615000082
Figure 2023134615000083
Figure 2023134615000084
Figure 2023134615000085
Figure 2023134615000086
Figure 2023134615000087
Figure 2023134615000088
Figure 2023134615000089
Figure 2023134615000090
Figure 2023134615000091
Figure 2023134615000092
＊Ｓ：センス鎖、ＡＳ：アンチセンス鎖
注釈：大文字Ｃ、Ｇ、Ｕ、Ａはヌクレオチドの塩基配列を表し、小文字ｍは、当該文字
ｍの左側に隣接する１つのヌクレオチドが２’－メトキシ修飾ヌクレオチドであることを
表し、小文字ｆは、当該文字ｆの左側に隣接する１つのヌクレオチドが２’－フルオロ修
飾ヌクレオチドであることを表し、小文字ｓは、当該文字ｓの左右に隣接する２個のヌク
レオチド間がチオリン酸エステル基により結合されていることを表し、ＶＰは、当該文字
ＶＰの右側の１つのヌクレオチドがビニルリン酸エステル修飾ヌクレオチドであることを
表し、Ｐは、当該文字Ｐの右側の１つのヌクレオチドがリン酸エステル修飾ヌクレオチド
であることを表し、Ｐｓは、当該文字Ｐｓの右側の１つのヌクレオチドがチオリン酸エス
テル修飾ヌクレオチドであることを表す。
以下の調製例４～１２では、各種の複合分子を合成し、調製例２におけるＬ－１０化合
物の代わりに、これらの複合分子をそれぞれ用い、表４Ａ～４Ｇに示される対応する配列
により、表４Ａ～４Ｇにおける複合体Ａ１２～Ａ１９、Ｂ８～Ｂ１５、Ｃ４～Ｃ１１、Ｄ
４～Ｄ１１、Ｅ１０～Ｅ１７、Ｆ１２～Ｆ１９及びＧ１０～Ｇ１７を得ることができると
予期した。
（調製例４）Ｐ１０複合体の調製
本調製例では、以下の方法に従い、複合体Ａ１２、Ｂ８、Ｃ４、Ｄ４、Ｅ１０、Ｆ１２
及びＧ１０（以下、ともいうＰ－１０複合体）を合成できると予期した。
（４－１）Ｐ－１０化合物の合成
以下の方法に従い、Ｐ－１０化合物を合成した。
Figure 2023134615000093
（４－１－１）ＧＡＬ５－Ｃ４－１の合成
４０ｍｌのＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミドに上記工程（２－１－１）に記載された方法
により得られたＧＡＬ－５（１３．４３ｇ、３０．０ｍｍｏｌ）、４－アミノ酸ｔｅｒｔ
－ブチルエステル塩酸塩（５．８７ｇ、３０．０ｍｍｏｌ）、Ｏ－ベンゾトリアゾール－
テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（１３．６５ｇ、３６．０ｍｍｏｌ
）及びジイソプロピルエチルアミン（１１．６３ｇ、９０．０ｍｍｏｌ）を加え、均一に
溶解させた後に室温で５時間攪拌反応させた。反応液に３００ｍｌの飽和炭酸水素ナトリ
ウム水溶液を加え、酢酸エチルで１回あたり２００ｍｌで３回抽出し、有機相をあわせ、
２００ｍｌの飽和食塩水で１回洗浄し、有機相を分離し、さらに無水硫酸ナトリウムで乾
燥させ、乾燥させるまで溶剤を減圧留去して３０．３ｇの油状物粗製品ＧＡＬ５－Ｃ４－
１を得、そのまま次の反応を行った。
（４－１－２）ＧＡＬ５－Ｃ４－２の合成
工程（４－１－１）で得られたＧＡＬ５－Ｃ４－１粗製品（３０．３ｇ、３０ｍｍｏｌ
）を１８０ｍｌギ酸に溶解させ、室温で１６時間攪拌反応させた。乾燥させるまで溶剤を
蒸発し、カラムクロマトグラフィーにより精製し（２００～３００メッシュの順相シリカ
ゲルを、ジクロロメタン：メタノール＝１００：１８～１００：２０で勾配溶出した）、
反応溶出液を回収し、溶剤を濃縮除去し、計１４．８４ｇの目的生成物ＧＡＬ５－Ｃ４－
２を得た。
（４－１－３）Ｐ－６の合成：
工程（２－１－４）に記載された方法により得られたＭ－１８－Ｔｒ（２．０２ｇ、４
．６９ｍｍｏｌ）と工程（４－１－２）で得られたＧＡＬ５－Ｃ４－２（８．２４ｇ、１
５．４８ｍｍｏｌ、２バッチの生成物をあわせたもの）を混合して４７ｍｌのアセトニト
リルに溶解させ、さらにＮ－メチルモルホリン（３．１３ｇ、３０．９６ｍｍｏｌ）を加
え、最後に４－（４，６－ジメトキシトリアジン－２－イル）－４－メチルモルホリン塩
酸塩（ＤＭＴＭＭ、４．２８ｇ、１５．４８ｍｍｏｌ）を加え、室温で２ｈ攪拌反応させ
た。２０ｍｌのジクロロメタンで反応液を希釈し、１０ｍｌの飽和炭酸水素ナトリウム溶
液で有機相を洗浄し、１０ｍｌの飽和食塩水で有機相を洗浄し、有機相をあわせ、無水硫
酸ナトリウムで乾燥させ、濾過した後で溶剤を減圧蒸発乾固して粗製品を得、２００～３
００メッシュの順相シリカゲルカラムで精製し、石油エーテルをカラムに入れ、１ｗｔ％
トリエチルアミンでシリカゲルの酸性を中和し、ジクロロメタン：メタノール＝１００：
５～１００：７で勾配溶出し、生成物溶出液を回収し、減圧蒸発乾固して計８．２７ｇの
純粋なＰ－６を得た。
（４－１－４）Ｐ－７の合成：
上記（４－１－３）で得られたＰ－６（６．８２ｇ、３．４５６ｍｍｏｌ）を６９ｍｌ
のジクロロメタンに溶解させ、ジクロロ酢酸（１３．３６７ｇ、１０３．６７ｍｍｏｌ）
を加え、室温で２ｈ反応させた。１００ｍｌのジクロロメタンを加えて反応液を希釈し、
さらに飽和炭酸水素ナトリウム溶液を加えて洗浄しｐＨ＝７～８になるように調節し、水
相をジクロロメタンで１回あたり３０ｍｌで６回抽出し、有機相をあわせ、無水硫酸ナト
リウムで乾燥させ、濾過した後で溶剤を減圧蒸発乾固して粗製品を得た。２００～３００
メッシュの順相シリカゲルで精製し、１０ｗｔ％トリエチルアミンでシリカゲルの酸性を
中和し、１ｗｔ‰トリエチルアミンでカラムを平衡化し、ジクロロメタン：メタノール＝
１００：３０～１００：４０で勾配溶出し、生成物溶出液を回収し、溶剤を減圧蒸発乾固
して計４．８２ｇのＰ－７を得た。ＭＳ ｍ／ｚ：Ｃ７８Ｈ１２７Ｎ１０Ｏ３３、［Ｍ＋
Ｈ］＋、理論値：１７３２．９１、実測値：１７３５．７３。
（４－１－５）Ｐ－８の合成：
Figure 2023134615000094
 （Ａ－１）
Ｐ－７（２．６５３ｇ、１．５３２ｍｍｏｌ）とＡ－１（２．３４２ｇ、４．５９６ｍ
ｍｏｌ）を混合して１６ｍｌのジクロロメタンに溶解させ、３－ジエトキシホスホリル－
１，２，３－ベンゾオキサゾール４（３Ｈ）－オン（ＤＥＰＢＴ）（１．３７５ｇ、４．
５９６ｍｍｏｌ）を加え、さらにジイソプロピルエチルアミン（１．１８８ｇ、９．１９
１ｍｍｏｌ）を加え、２５℃で２ｈ攪拌反応させた。１０ｍｌの飽和炭酸水素ナトリウム
で有機相を洗浄し、水相をジクロロメタンで１回あたり１０ｍｌで３回抽出し、１０ｍｌ
の飽和食塩水で有機相を洗浄し、水相をジクロロメタンで１回あたり１０ｍｌで２回抽出
し、有機相をあわせ、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過した後で溶剤を減圧蒸発乾固
し、真空油ポンプで一晩発泡乾燥させて粗製品を得た。カラム精製には、１２０ｇの２０
０～３００メッシュの順相シリカゲルを用い、２０ｍｌのトリエチルアミンでシリカゲル
の酸性を中和し、１ｗｔ％トリエチルアミンを含む石油エーテルでカラムを平衡化し、石
油エーテル：酢酸エチル：ジクロロメタン：Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド＝１：１：１
：０．５～１：１：１：０．６で勾配溶出し、生成物溶出液を回収し、溶剤を減圧蒸発乾
固して計２．７９３ｇの純粋なＰ－８を得た。
（４－１－６）Ｐ－９の合成：
Ｐ－８（４９０ｍｇ、０．２３１ｍｍｏｌ）、コハク酸無水物（６９ｍｇ、０．６９３
ｍｍｏｌ）及び４－ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ、６８ｍｇ、０．５５４ｍｍｏｌ
）を混合して２．３ｍｌのジクロロメタンに溶解させ、さらにジイソプロピルエチルアミ
ン（ＤＩＥＡ、１４９ｍｇ、１．１５５ｍｍｏｌ）を加え、２５℃で２１ｈ攪拌反応させ
た。５０ｍｌのジクロロメタンで反応液を希釈し、さらに１００ｍｌの０．５Ｍトリエチ
ルアミンリン酸塩を加えて反応液を洗浄し、水相をジクロロメタンで１回あたり１０ｍｌ
で３回抽出し、有機相をあわせ、減圧蒸発乾固して粗製品を得た。カラム精製には、８０
ｇの２００～３００メッシュの順相シリカゲルを用い、１ｗｔ％トリエチルアミンでシリ
カゲルの酸性を中和し、ジクロロメタンでカラムを平衡化し、１ｗｔ‰トリエチルアミン
を含むジクロロメタン：メタノール＝１００：１８～１００：２０で勾配溶出し、生成物
溶出液を回収し、溶剤を減圧蒸発乾固して計２００ｍｇの純粋なＰ－９複合分子を得た。
ＭＳ ｍ／ｚ：Ｃ１０６Ｈ１５３Ｎ１０Ｏ４１、［Ｍ－ＤＭＴｒ］＋、理論値：１９２１
．０５、実測値：１９２０．９７。
（４－１－７）Ｐ－１０の合成：
Ｌ－９複合分子の代わりにＰ－９複合分子を用い、固相担体に結合されたＰ－９複合分
子を得たこと以外、調製例２における工程（２－１－９）と同じ方法により、Ｐ－１０を
調製した。
（４－２）Ｐ１０複合体の合成
出発としてＬ－１０化合物の代わりにＰ－１０化合物を用いてセンス鎖を合成したこと
以外、調製例２における工程（２－２）、（２－３Ａ）、（２－４）と同じ方法により、
複合体を調製した。構造が式（４０４）に示される複合体Ａ１２、Ｂ８、Ｃ４、Ｄ４、Ｅ
１０、Ｆ１２及びＧ１０を得ることができると予期した。
（調製例５）Ｒ５複合体の調製
本調製例では、以下の方法に従い、複合体Ａ１３、Ｂ９、Ｃ５、Ｄ５、Ｅ１１、Ｆ１３
及びＧ１１（以下、Ｒ５複合体ともいう）を合成できると予期した。
（５－１）Ｒ－５化合物の合成
以下の方法に従い、Ｒ－５化合物を合成した。
Figure 2023134615000095
（５－１－１）ＧＡＬ－Ｃ７－１の合成
工程（２－１－１ｂ）に記載された方法により得られたＧＡＬ－３（２６．４ｇ、８０
．２ｍｍｏｌ）を１３４ｍｌの無水１，２－ジクロロエタンに溶解させ、６０ｇの４Å分
子篩粉を加え、さらに７－オクテン－１－オール（１１．３ｇ、８８．２ｍｍｏｌ）を加
え、室温で１０分間攪拌反応させ、氷浴下で窒素保護下でトリフルオロメタンスルホン酸
トリメチルシリル（８．９ｇ、４０．１ｍｍｏｌ）を加え、室温で２４時間攪拌反応させ
た。４Å分子篩粉を濾過除去し、濾液に５００ｍｌの飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加
えて洗浄し、有機相を分離し、水相を１００ｍｌのジクロロメタンで１回抽出し、有機相
をあわせ、２５０ｍｌの飽和食塩水で１回洗浄し、有機相を分離し、無水硫酸ナトリウム
で乾燥させ、乾燥させるまで溶剤を減圧留去して３３．３ｇの黄色水飴状製品ＧＡＬ－Ｃ
７－１を得、精製することなく、そのまま次の酸化反応を行った。
（５－１－２）ＧＡＬ－Ｃ７－２の合成
工程（５－１－１）で得られたＧＡＬ－Ｃ７－１（３３．３ｇ、７２．８ｍｍｏｌ）を
１６０ｍｌのジクロロメタンと１６０ｍｌのアセトニトリルの混合溶剤に溶解させ、それ
ぞれ２１６ｍｌの水及び固形過ヨウ素酸ナトリウム（６２．３ｇ、２９１．２ｍｍｏｌ）
を加え、氷水浴下で１０分間攪拌し、触媒である塩化ルテニウム（ＩＩＩ）（４９８ｍｇ
、２．４ｍｍｏｌ）を加えて自然に室温まで昇温し２３時間攪拌反応させた。反応液に２
００ｍｌの水を加えて希釈攪拌し、飽和炭酸水素ナトリウムを加えてｐＨを７．５に調節
し、有機相を分離し、水相をジクロロメタンで３回抽出し、有機相を捨て、水相を固形ク
エン酸でｐＨを約３に調節し、ジクロロメタンで１回あたり２００ｍｌで３回抽出し、有
機相をあわせ、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、溶剤を減圧留去した後でカラムクロマト
グラフィー（２００～３００メッシュの順相シリカゲルを、ジクロロメタン：メタノール
＝１００：１８～１００：２０で勾配溶出した）により精製して２２．４ｇの白色泡状固
形製品ＧＡＬ－Ｃ７－２を得た。ＭＳ ｍ／ｚ：Ｃ２１Ｈ３２ＮＯ１１、［Ｍ＋Ｈ］＋、
理論値：４７６．５０、実測値：４７５．９４。
（５－１－３）Ｒ－１の合成：
工程（２－１－４）に記載された方法により得られたＭ－１８－Ｔｒ（２．０２ｇ、４
．６９ｍｍｏｌ）とＧＡＬ－Ｃ７－２（７．３６ｇ、１５．４８ｍｍｏｌ）を混合して４
７ｍｌのアセトニトリルに溶解させ、さらにＮ－メチルモルホリン（３．１３ｇ、３０．
９６ｍｍｏｌ）を加え、最後に４－（４，６－ジメトキシトリアジン－２－イル）－４－
メチルモルホリン塩酸塩（ＤＭＴＭＭ、４．２８ｇ、１５．４８ｍｍｏｌ）を加え、室温
で２ｈ攪拌反応させた。２００ｍｌのジクロロメタンで反応液を希釈し、１００ｍｌの飽
和炭酸水素ナトリウム溶液で有機相を洗浄し、１００ｍｌの飽和食塩水で有機相を洗浄し
、有機相をあわせ、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過した後で溶剤を減圧蒸発乾固し
て粗製品を得、２００～３００メッシュの順相シリカゲルカラムで精製し、石油エーテル
をカラムに入れ、１ｗｔ％トリエチルアミンでシリカゲルの酸性を中和し、ジクロロメタ
ン：メタノール＝１００：５～１００：７で勾配溶出し、生成物溶出液を回収し、減圧蒸
発乾固して７．８２ｇの純粋なＲ－１を得た。
（５－１－４）Ｒ－２の合成：
Ｒ－１（６．２３ｇ、３．４５６ｍｍｏｌ）を６９ｍｌのジクロロメタンに溶解させ、
ジクロロ酢酸（１３．３６７ｇ、１０３．６７ｍｍｏｌ）を加え、室温で２ｈ反応させた
。１００ｍｌのジクロロメタンを加えて反応液を希釈し、飽和炭酸水素ナトリウム溶液を
加えて洗浄しｐＨ＝７～８になるように調節し、水相をジクロロメタンで１回あたり３０
ｍｌで６回抽出し、有機相をあわせ、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過した後で溶剤
を減圧蒸発乾固して粗製品を得た。２００～３００メッシュの順相シリカゲルを用いて、
１０ｗｔ％トリエチルアミンでシリカゲルの酸性を中和し、１ｗｔ‰トリエチルアミンで
カラムを平衡化し、ジクロロメタン：メタノール＝１００：３０～１００：４０で勾配溶
出し、溶剤を減圧蒸発乾固して４．４９ｇの純粋なＲ－２を得た。
（５－１－５）Ｒ－３の合成：
Ｒ－２（２．３９１ｇ、１．５３２ｍｍｏｌ）とＡ－１（２．３４２ｇ、４．５９６ｍ
ｍｏｌ）を混合して１６ｍｌのジクロロメタンに溶解させ、３－ジエトキシホスホリル－
１，２，３－ベンゾオキサゾール４（３Ｈ）－オン（ＤＥＰＢＴ）（１．３７５ｇ、４．
５９６ｍｍｏｌ）を加え、さらにジイソプロピルエチルアミン（１．１８８ｇ、９．１９
１ｍｍｏｌ）を加え、２５℃で２ｈ攪拌反応させた。１０ｍｌの飽和炭酸水素ナトリウム
で有機相を洗浄し、水相をジクロロメタンで１回あたり１０ｍｌで３回抽出し、１０ｍｌ
の飽和食塩水で有機相を洗浄し、水相をジクロロメタンで１回あたり１０ｍｌで２回抽出
し、有機相をあわせ、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過した後で溶剤を減圧蒸発乾固
し、真空油ポンプで一晩発泡乾燥させて粗製品を得た。カラム精製には、１２０ｇの２０
０～３００メッシュの順相シリカゲルを用い、２０ｍｌのトリエチルアミンでシリカゲル
の酸性を中和し、１ｗｔ％トリエチルアミンを含む石油エーテルでカラムを平衡化し、石
油エーテル：酢酸エチル：ジクロロメタン：Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド＝１：１：１
：０．５～１：１：１：０．６で勾配溶出し、溶剤を減圧蒸発乾固して２．６４２ｇの純
粋なＲ－３を得た。
（５－１－６）Ｒ－４の合成：
Ｒ－３（７９５ｍｇ、０．４０７４ｍｍｏｌ）、コハク酸無水物（８２ｍｇ、０．８１
４８ｍｍｏｌ）及び４－ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ、１００ｍｇ、０．８１４８
ｍｍｏｌ）を混合して４ｍｌのジクロロメタンに溶解させ、さらにジイソプロピルエチル
アミン（ＤＩＥＡ、１００ｍｇ、０．８１４８ｍｍｏｌ）を加え、２５℃で１８ｈ攪拌反
応させた。５ｍｌの０．５Ｍトリエチルアミンリン酸塩で反応液を洗浄し、水相をジクロ
ロメタンで１回あたり５ｍｌで３回抽出し、有機相をあわせ、減圧蒸発乾固して粗製品を
得た。カラム精製には、３０ｇの２００～３００メッシュの順相シリカゲルを用い、１ｗ
ｔ％トリエチルアミンでシリカゲルの酸性を中和し、ジクロロメタンでカラムを平衡化し
、１ｗｔ‰トリエチルアミンを含むジクロロメタン：メタノール＝１００：１８～１００
：２０で勾配溶出し、生成物溶出液を回収し、溶剤を減圧蒸発乾固して５０５ｍｇの純粋
なＲ－４複合分子を得た。
（５－１－７）Ｒ－５複合分子の合成：
Ｌ－９複合分子の代わりにＲ－４複合分子を用い、固相担体に結合されたＲ－４複合分
子を得たこと以外、調製例２における工程（２－１－９）と同じ方法により、Ｒ－５を調
製した。
（５－２）Ｒ５複合体の合成
出発としてＬ－１０化合物の代わりにＲ－５化合物を用いてセンス鎖を合成したこと以
外、調製例２における工程（２－２）、（２－３Ａ）、（２－４）と同じ方法により、Ｒ
５複合体を調製した。構造が式（４０７）に示される複合体Ａ１３、Ｂ９、Ｃ５、Ｄ５、
Ｅ１１、Ｆ１３及びＧ１１を得ることができると予期した。
（調製例６）ＬＡ５複合体の調製
本調製例では、以下の方法に従い、複合体Ａ１４、Ｂ１０、Ｃ６、Ｄ６、Ｅ１２、Ｆ１
４及びＧ１２（以下、ＬＡ５複合体ともいう）を合成できると予期した。
以下のプロセス経路により、ＬＡ－５化合物を合成できると予期した。
Figure 2023134615000096
 出発としてＬ－１０化合物の代わりにＬＡ－５化合物を用いてセンス鎖を合成したこと
以外、調製例２における工程（２－２）、（２－３Ａ）、（２－４）と同じ方法により、
ＬＡ複合体を調製した。構造が式（４１２）に示される複合体Ａ１４、Ｂ１０、Ｃ６、Ｄ
６、Ｅ１２、Ｆ１４及びＧ１２を得ることができると予期した。
（調製例７）ＬＢ５複合体の調製
本調製例では、以下の方法に従い、複合体Ａ１５、Ｂ１１、Ｃ７、Ｄ７、Ｅ１３、Ｆ１
５及びＧ１３（以下、ＬＢ５複合体ともいう）を合成できると予期した。
（７－１）ＬＢ－５化合物の合成
以下の方法に従い、ＬＢ－５化合物を合成した。
Figure 2023134615000097
（７－１－１）ＬＢ－１の合成：
工程（２－１－６）に記載された方法により得られたＬ－８（５．０ｇ、３．３８６ｍ
ｍｏｌ）、アジピン酸無水物（８７０ｍｇ、６．７７２ｍｍｏｌ）及び４－ジメチルアミ
ノピリジン（ＤＭＡＰ、８２７ｍｇ、６．７７２ｍｍｏｌ）を混合して１３０ｍｌのジク
ロロメタンに溶解させ、さらにジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ、２．２ｇ、１６
．９３１ｍｍｏｌ）を加え、２５℃で４ｈ攪拌反応させた。７０ｍｌのジクロロメタンを
加えて反応液を希釈し、０．５Ｍトリエチルアミンリン酸塩で反応液を洗浄し、水相をジ
クロロメタンで１回あたり１０ｍｌで４回抽出し、有機相をあわせ、減圧蒸発乾固して粗
製品を得た。カラム精製には、１２０ｇの２００～３００メッシュの順相シリカゲルを用
い、１ｗｔ％トリエチルアミンでシリカゲルの酸性を中和し、ジクロロメタンでカラムを
平衡化し、石油エーテル：酢酸エチル：ジクロロメタン：メタノール＝１：１：１：０．
２～１：１：１：１で勾配溶出し、溶剤を減圧蒸発乾固して４．２６７ｇの純粋なＬＢ－
１を得た。
（７－１－２）ＬＢ－２の合成：
工程（７－１－１）に記載された方法により得られたＬＢ－１（４．６９７ｇ、２．７
５３ｍｍｏｌ、２バッチの生成物をあわせたもの）、３－アミノ－１，２－プロパンジオ
ール（３１３ｍｇ、３．４４２ｍｍｏｌ）、４－（４，６－ジメトキシトリアジン－２－
イル）－４－メチルモルホリン塩酸塩（ＤＭＴＭＭ、９５３ｍｇ、３．４４２ｍｍｏｌ）
及びＮ－メチルモルホリン（７００ｍｇ、６．８８４ｍｍｏｌ）を順に３０ｍｌのアセト
ニトリルと３ｍｌのメタノールの混合液に加え、室温で一晩攪拌反応させた。乾燥させる
まで溶剤を蒸発し、カラムクロマトグラフィー（２００～３００メッシュの順相シリカゲ
ルをジクロロメタン：メタノール＝１：０．０７～１：０．５で勾配溶出した）により精
製し、生成物溶出液を回収し、溶剤を濃縮除去し、３．２７ｇの目的生成物ＬＢ－２を得
た。
（７－１－３）ＬＢ－３の合成：
ＬＢ－２（２．２７ｇ、１．３５３ｍｍｏｌ）を１４ｍｌの無水ピリジンで溶解させた
。さらに４，４’－ビスメトキシトリチルクロリド（６８８ｍｇ、２．０３ｍｍｏｌ）を
加えて室温で一晩攪拌反応させた。１５０ｍｌのメタノールを加えてクエンチングし、乾
燥させるまで溶剤を蒸発した。カラムクロマトグラフィー（２００～３００メッシュの順
相シリカゲルをジクロロメタン：メタノール＝１：０．０５～１：０．２で勾配溶出した
）により精製し、生成物溶出液を回収し、溶剤を濃縮除去し、１．６４７ｇの目的生成物
ＬＢ－３を得た。
（７－１－４）ＬＢ－４の合成：
ＬＢ－３（８２２ｍｇ、０．４１５ｍｍｏｌ）、コハク酸無水物（８３ｇ、０．８３ｍ
ｍｏｌ）及び４－ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ、１０２ｍｇ、０．８３ｍｍｏｌ）
を混合して４ｍｌのジクロロメタンに溶解させ、さらにＤＩＥＡ（２７０ｍｇ、２．０７
５ｍｍｏｌ）を加え、２５℃で一晩攪拌反応させた。０．５Ｍトリエチルアミンリン酸塩
で反応液を３回洗浄し、水相をジクロロメタンで１回あたり２ｍｌで３回抽出し、有機相
をあわせ、減圧蒸発乾固して粗製品を得た。カラム精製には、２００～３００メッシュの
順相シリカゲルを用い、５ｗｔ％トリエチルアミンでシリカゲルの酸性を中和し、石油エ
ーテルでカラムを平衡化し、１ｗｔ‰トリエチルアミンを含むジクロロメタン：メタノー
ル＝１００：５～１００：２０で勾配溶出し、溶剤を減圧蒸発乾固して７８７ｍｇの純粋
なＬＢ－４複合分子を得た。
（７－１－５）ＬＢ－５の合成：
Ｌ－９複合分子の代わりにＬＢ－４複合分子を用い、固相担体に結合されたＬＢ－４複
合分子を得たこと以外、調製例２における工程（２－１－９）と同じ方法により、ＬＢ－
５を調製した。
（７－２）ＬＢ５複合体の合成
出発としてＬ－１０化合物の代わりにＬＢ－５化合物を用いてセンス鎖を合成したこと
以外、調製例２における工程（２－２）、（２－３Ａ）、（２－４）と同じ方法により、
ＬＢ５複合体を調製した。構造が式（４１３）に示される複合体Ａ１５、Ｂ１１、Ｃ７、
Ｄ７、Ｅ１３、Ｆ１５及びＧ１３を得ることができると予期した。
（調製例８）Ｖ８複合体の合成
本調製例では、以下の方法に従い、複合体Ａ１６、Ｂ１２、Ｃ８、Ｄ８、Ｅ１４、Ｆ１
６及びＧ１４（以下、Ｖ８複合体ともいう）を合成できると予期した。
以下のプロセス経路により、Ｖ－８化合物を合成できると予期した。
Figure 2023134615000098
 出発としてＬ－１０化合物の代わりにＶ－８化合物を用いてセンス鎖を合成したこと以
外、調製例２における工程（２－２）、（２－３Ａ）、（２－４）と同じ方法により、Ｖ
８複合体を調製した。構造が式（４１４）に示される複合体Ａ１５、Ｂ１２、Ｃ８、Ｄ８
、Ｅ１４、Ｆ１６及びＧ１４（以下、Ｖ８複合体ともいう）を得ることができると予期し
た。
（調製例９）Ｗ８複合体の調製
本調製例では、以下の方法に従い、複合体Ａ１７、Ｂ１３、Ｃ９、Ｄ９、Ｅ１５、Ｆ１
７及びＧ１５（以下、Ｗ８複合体ともいう）を合成できると予期した。
（９－１）Ｗ－８化合物の合成
以下の方法に従い、Ｗ－８化合物を合成した。
Figure 2023134615000099
（９－１－１）Ｗ－１の合成：
Ｗ－０（２．０２４ｇ、１０ｍｍｏｌ）を２５ｍｌのアセトニトリルに溶解させ、さら
にトリエチルアミン（４．０４８ｇ、４０ｍｍｏｌ）を加え、氷水浴で０℃程度まで冷却
し、トリフルオロ酢酸エチル（５．６８３ｇ、４０ｍｍｏｌ）を加え、室温で２２ｈ反応
させた。溶剤を減圧蒸発乾固し、真空油ポンプで１８ｈ発泡乾燥させ、５．８３５ｇの固
形粗製品Ｗ－１を得た。
（９－１－２）Ｗ－２の合成：
Ｗ－１粗製品（５．８３５ｇ、１０ｍｍｏｌ）を５０ｍｌのジクロロメタンに溶解させ
、反応液にＴｒＣｌ（３．３４５ｇ、１２ｍｍｏｌ）及びトリエチルアミン（１．５１８
ｇ、１５ｍｍｏｌ）を加え、室温で２０ｈ攪拌反応させた。２０ｍｌの飽和炭酸水素ナト
リウムで反応液を２回洗浄し、２０ｍｌの飽和食塩水で１回洗浄し、有機相をあわせ、無
水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過した後で有機溶剤を減圧蒸発乾固し、真空油ポンプで
一晩発泡乾燥させ、８．０１２ｇの固形粗製品Ｗ－２を得た。処理されることなく、次の
脱保護反応を行った。
（９－１－３）Ｗ－３の合成：
Ｗ－２粗製品（８．０１２ｇ、１０ｍｍｏｌ）を１００ｍｌのメタノールに溶解させ、
さらに１００ｍｌのメチルアミン水溶液（４０ｗｔ％）を加え、５０℃で２３ｈ攪拌反応
させた。不溶性粒子を濾過除去し、溶剤を減圧蒸発乾固し、２００ｍｌの体積比１：１の
ＤＣＭ－メタノール混合溶剤を加え、５０ｍｌの飽和炭酸水素ナトリウムで有機相を洗浄
し、水相をジクロロメタンで１回あたり５０ｍｌで３回抽出し、有機相をあわせ、無水硫
酸ナトリウムで乾燥させ、濾過した後で溶剤を減圧蒸発乾固し、真空油ポンプで一晩発泡
乾燥させ、２００～３００メッシュの順相シリカゲルカラムで精製し、石油エーテルをカ
ラムに入れ、１ｗｔ％トリエチルアミンでシリカゲルの酸性を中和し、ジクロロメタン：
メタノール：アンモニア水（２５ｗｔ％）＝１：１：０．０５～１：１：０．２５で勾配
溶出し、生成物溶出液を回収し、溶剤を減圧蒸発乾固し、真空油ポンプで発泡乾燥させて
３．０６２ｇの純粋なＷ－３を得た。
（９－１－４）Ｗ－４の合成：
Ｗ－３（０．６７５ｇ、１．５１７ｍｍｏｌ）とＧＡＬ－Ｃ７－２（２．６０ｇ、５．
４６ｍｍｏｌ）を混合して４７ｍｌのアセトニトリルに溶解させ、さらにジイソプロピル
エチルアミン（１．５７ｇ、１２．１４ｍｍｏｌ）を加え、最後に３－ジエトキシホスホ
リル－１，２，３－ベンゾオキサゾール４（３Ｈ）－オン（ＤＥＰＢＴ、１．８１６ｇ、
６．０４ｍｍｏｌ）を加え、室温で２．５ｈ攪拌反応させた。１００ｍｌのジクロロメタ
ンで反応液を希釈し、８０ｍｌの飽和炭酸水素ナトリウム溶液で有機相を洗浄し、８０ｍ
ｌの飽和食塩水で有機相を洗浄し、有機相をあわせ、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾
過した後で溶剤を減圧蒸発乾固して粗製品を得、２００～３００メッシュの順相シリカゲ
ルカラムで精製し、石油エーテルをカラムに入れ、１ｗｔ％トリエチルアミンでシリカゲ
ルの酸性を中和し、ジクロロメタン：メタノール＝１００：５～１００：７で勾配溶出し
、生成物溶出液を回収し、減圧蒸発乾固して１．６１０ｇの純粋なＷ－４を得た。
（９－１－５）Ｗ－５の合成：
Ｗ－４（１．６１ｇ、０．８８６ｍｍｏｌ）を１２５ｍｌのジクロロメタンに溶解させ
、さらにジクロロ酢酸（３．５ｍｌ、４２．４３ｍｍｏｌ）を加え、室温で１ｈ反応させ
た。１５０ｍｌのピリジンを加えて反応液を中和し、溶剤を減圧蒸発乾固して粗製品を得
た。２００～３００メッシュの順相シリカゲルを用いて、１０ｗｔ％トリエチルアミンで
シリカゲルの酸性を中和し、１ｗｔ‰トリエチルアミンでカラムを平衡化し、ジクロロメ
タン：メタノール＝１００：３０～１００：４０で勾配溶出し、生成物溶出液を回収し、
溶剤を減圧蒸発乾固して１．２６ｇの純粋なＷ－５を得た。
（９－１－６）Ｗ－６の合成：
Ｗ－５（１．２５ｇ、０．７９３ｍｍｏｌ）及び工程（２－１－７ａ）に記載された方
法により得られたＡ－１（１．２１ｇ、２．３８ｍｍｏｌ）を混合して１２ｍｌのジクロ
ロメタンに溶解させ、３－ジエトキシホスホリル－１，２，３－ベンゾオキサゾール４（
３Ｈ）－オン（ＤＥＰＢＴ、０．７１２ｇ、２．３８ｍｍｏｌ）を加え、さらにジイソプ
ロピルエチルアミン（０．６１５ｇ、４．７６ｍｍｏｌ）を加え、２５℃で３ｈ攪拌反応
させた。８０ｍｌの飽和炭酸水素ナトリウムで有機相を洗浄し、水相をジクロロメタンで
１回あたり１０ｍｌで３回抽出し、有機相をあわせ、１０ｍｌの飽和食塩水で洗浄し、有
機相をあわせ、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過した後で溶剤を減圧蒸発乾固し、真
空油ポンプで一晩発泡乾燥させて粗製品を得た。カラム精製には、１８５ｇの２００～３
００メッシュの順相シリカゲルを用い、２０ｍｌのトリエチルアミンでシリカゲルの酸性
を中和し、１ｗｔ％トリエチルアミンを含む石油エーテルでカラムを平衡化し、石油エー
テル：酢酸エチル：ジクロロメタン：Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド＝１：１：１：０．
１～１：１：０．７で勾配溶出し、生成物溶出液を回収し、溶剤を減圧蒸発乾固して１．
５７ｇの純粋なＷ－６を得た。
（９－１－７）Ｗ－７の合成：
Ｗ－６（１．２３８ｇ、０．６３ｍｍｏｌ）、コハク酸無水物（０．１８９ｇ、１．８
９ｍｍｏｌ）及び４－ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ、０．２３１ｇ、１．８９ｍｍ
ｏｌ）を混合して７ｍｌのジクロロメタンに溶解させ、さらにＤＩＥＡ（０．４０７ｇ、
３．１５ｍｍｏｌ）を加え、２５℃で２４ｈ攪拌反応させた。５ｍｌの０．５Ｍトリエチ
ルアミンリン酸塩で反応液を洗浄し、水相をジクロロメタンで１回あたり５ｍｌで３回抽
出し、有機相をあわせ、減圧蒸発乾固して粗製品を得た。カラム精製には、３０ｇの２０
０～３００メッシュの順相シリカゲルを用い、１ｗｔ％トリエチルアミンでシリカゲルの
酸性を中和し、ジクロロメタンでカラムを平衡化し、１ｗｔ‰トリエチルアミンを含むジ
クロロメタン：メタノール＝１００：１８～１００：２０で勾配溶出し、生成物溶出液を
回収し、溶剤を減圧蒸発乾固して１．０３３ｇの純粋なＷ－７複合分子を得た。ＭＳ ｍ
／ｚ：Ｃ１０１Ｈ１４６Ｎ７Ｏ３８、［Ｍ－ＤＭＴｒ］＋、理論値：１７６３．９２、実
測値：１７６３．２１。
（９－１－８）Ｗ－８の合成：
Ｌ－９複合分子の代わりにＷ－７複合分子を用い、固相担体に結合されたＷ－７複合分
子を得たこと以外、調製例２における工程（２－１－９）と同じ方法により、Ｗ－８を調
製した。
（９－２）Ｗ８複合体の合成
出発としてＬ－１０化合物の代わりにＷ－８化合物を用いてセンス鎖を合成したこと以
外、調製例２における工程（２－２）、（２－３Ａ）、（２－４）と同じ方法により、Ｗ
８複合体を調製した。構造が式（４１５）に示される複合体Ａ１７、Ｂ１３、Ｃ９、Ｄ９
、Ｅ１５、Ｆ１７及びＧ１５を得ることができると予期した。
（調製例１０）Ｘ８複合体の調製
本調製例では、以下の方法に従い、複合体Ａ１８、Ｂ１４、Ｃ１０、Ｄ１０、Ｅ１６、
Ｆ１８及びＧ１６（以下、Ｘ８複合体ともいう）を合成できると予期した。
以下のプロセス経路により、Ｘ－８化合物を合成できると予期した。
Figure 2023134615000100
 出発としてＬ－１０化合物の代わりにＸ－８化合物を用いてセンス鎖を合成したこと以
外、調製例２における工程（２－２）、（２－３Ａ）、（２－４）と同じ方法により、Ｘ
８複合体を調製した。本調製例では、以下の方法に従い、構造が式（４２１）に示される
複合体Ａ１８、Ｂ１４、Ｃ１０、Ｄ１０、Ｅ１６、Ｆ１８及びＧ１６を合成できると予期
した。
（調製例１１）Ｚ５複合体の調製
本調製例では、以下の方法に従い、複合体Ａ１９、Ｂ１５、Ｃ１１、Ｄ１１、Ｅ１２、
Ｆ１４及びＧ１２（以下、Ｚ５複合体ともいう）を合成できると予期した。
（１１－１）Ｚ－５化合物の合成
以下の方法に従い、Ｚ－５化合物を合成した。
Figure 2023134615000101
（１１－１－１）Ｚ－１の合成：
工程（９－１－３）に記載された方法により得られたＷ－３（１．５０ｇ、３．３７ｍ
ｍｏｌ）と工程（４－１－２）に記載された方法により得られたＧＡＬ５－Ｃ４－２（７
．１８ｇ、１３．４８ｍｍｏｌ）を混合して３４ｍｌのジクロロメタンに溶解させ、さら
にジイソプロピルエチルアミン（３．４８ｇ、２６．９６ｍｍｏｌ）を加え、最後に３－
ジエトキシホスホリル－１，２，３－ベンゾオキサゾール４（３Ｈ）－オン（ＤＥＰＢＴ
、４．０４ｇ、１３．４８ｍｍｏｌ）を加え、室温で４．５ｈ攪拌反応させた。１００ｍ
ｌのジクロロメタンで反応液を希釈し、８０ｍｌの飽和炭酸水素ナトリウム溶液で有機相
を洗浄し、８０ｍｌの飽和食塩水で有機相を洗浄し、有機相をあわせ、無水硫酸ナトリウ
ムで乾燥させ、濾過した後で溶剤を減圧蒸発乾固して粗製品を得、２００～３００メッシ
ュの順相シリカゲルカラムで精製し、石油エーテルをカラムに入れ、１ｗｔ％トリエチル
アミンでシリカゲルの酸性を中和し、ジクロロメタン：メタノール＝３０：１～１５：１
で勾配溶出し、生成物溶出液を回収し、減圧蒸発乾固して３．９７ｇの純粋なＺ－１を得
た。ＭＳ ｍ／ｚ：Ｃ９８Ｈ１４３Ｎ１０Ｏ３３、［Ｍ＋Ｈ］＋、理論値：１９８７．９
８、実測値：１９８７．９０。
（１１－１－２）Ｚ－２の合成：
Ｚ－１（３．９７ｇ、２．００ｍｍｏｌ）を２５０ｍｌのジクロロメタンに溶解させ、
さらにジクロロ酢酸（１０．９４１ｇ、８４．８５ｍｍｏｌ）を加え、室温で１ｈ反応さ
せた。ピリジンを加えて反応液を中性に中和し、溶剤を減圧蒸発乾固して粗製品を得た。
２２０ｇの２００～３００メッシュの順相シリカゲルをカラムに入れ、１０％ピリジンで
シリカゲルの酸性を中和し、１‰ピリジンでカラムを平衡化し、ジクロロメタン：メタノ
ール＝１０：１～２：１で勾配溶出し、生成物溶出液を回収し、溶剤を減圧蒸発乾固して
３．４９ｇの純粋なＺ－２を得た。ＭＳ ｍ／ｚ：Ｃ７９Ｈ１２９Ｎ１０Ｏ３３、［Ｍ＋
Ｈ］＋、理論値：１７４６．９４、実測値：１７４６．９０。
（１１－１－３）Ｚ－３の合成：
Ｚ－２（３．４９ｇ、２．０ｍｍｏｌ）と工程（２－１－７ａ）に記載された方法によ
り得られたＡ－１（３．０６ｇ、６．０ｍｍｏｌ）を混合して３０ｍｌのジクロロメタン
に溶解させ、３－ジエトキシホスホリル－１，２，３－ベンゾオキサゾール４（３Ｈ）－
オン（ＤＥＰＢＴ、１．８０ｇ、６．０ｍｍｏｌ）を加え、さらにジイソプロピルエチル
アミン（１．５５ｇ、１２．０ｍｍｏｌ）を加え、２５℃で３ｈ攪拌反応させた。１００
ｍｌのジクロロメタンで反応液を希釈し、飽和炭酸水素ナトリウムで有機相を１回あたり
３０ｍｌで２回洗浄し、水相を１０ジクロロメタンで抽出し、有機相をあわせ、５０ｍｌ
の飽和食塩水で洗浄し、有機相をあわせ無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過した後で溶
剤を減圧蒸発乾固し、真空油ポンプで一晩発泡乾燥させて粗製品を得た。カラム精製には
、２００ｇの２００～３００メッシュの順相シリカゲルを用い、２０ｍｌのトリエチルア
ミンでシリカゲルの酸性を中和し、１ｗｔ％トリエチルアミンを含む石油エーテルでカラ
ムを平衡化し、ジクロロメタン：メタノール＝２５：１～１５：１で勾配溶出し、生成物
溶出液を回収し、溶剤を減圧蒸発乾固して２．２ｇの純粋なＺ－３を得た。ＭＳ ｍ／ｚ
：Ｃ１０３Ｈ１５１Ｎ１０Ｏ３８、［Ｍ＋Ｈ］＋、理論値：２１３６．０２、実測値：２
１３６．２０。
（１１－１－４）Ｚ－４の合成：
Ｚ－３（２．１０ｇ、０．９８３ｍｍｏｌ）をＤＩＥＡ（０．６３５ｇ、４．９１５ｍ
ｍｏｌ）を含む１４．８ｍｌのジクロロメタンに溶解させ、４－ジメチルアミノピリジン
（ＤＭＡＰ、２４０ｍｇ、１．９６６ｍｍｏｌ）を加え攪拌して清澄させた後、コハク酸
無水物（１９７ｍｇ、１．９６６ｍｍｏｌ）を加え、２５℃で１８ｈ攪拌反応させた。５
０ｍｌのジクロロメタンを加えて反応液を希釈し、８０ｍｌの０．５Ｍトリエチルアミン
リン酸塩で有機相を洗浄し、水相をジクロロメタンで１回あたり５０ｍｌで２回抽出し、
有機相をあわせ、減圧蒸発乾固して粗製品を得た。カラム精製には、１８８ｇの２００～
３００メッシュの順相シリカゲルを用い、１ｗｔ％トリエチルアミンでシリカゲルの酸性
を中和し、ジクロロメタンでカラムを平衡化し、１ｗｔ‰トリエチルアミンを含むジクロ
ロメタン：メタノール＝１０：１～３：１で勾配溶出し、生成物溶出液を回収し、溶剤を
減圧蒸発乾固して１．９５ｇの純粋なＺ－４複合分子を得た。ＭＳ ｍ／ｚ：Ｃ１０７Ｈ
１５５Ｎ１０Ｏ４１、［Ｍ＋Ｈ］＋、理論値：１９３５．０７、実測値：１９３５．２９
。
（１１－１－５）Ｚ－５の合成
Ｌ－９複合分子の代わりにＺ－４複合分子を用い、固相担体に結合されたＺ－４複合分
子を得たこと以外、調製例２における工程（２－１－９）と同じ方法により、Ｚ－５を調
製した。
（１１－２）Ｚ５複合体の合成
出発としてＬ－１０化合物の代わりにＺ－５化合物を用いてセンス鎖を合成したこと以
外、調製例２における工程（２－２）、（２－３Ａ）、（２－４）と同じ方法により、Ｚ
５複合体を調製した。構造が式（４２２）に示される複合体Ａ１９、Ｂ１５、Ｃ１１、Ｄ
１１、Ｅ１７、Ｆ１９及びＧ１７を得ることができると予期した。
（調製例１２）ＦＩＮ複合体の調製
本調製例では、表４Ａ～４Ｇに示される複合体Ａ２０～Ａ２３、Ｂ１６～Ｂ１７、Ｃ１
４、Ｄ１４、Ｅ１８～Ｅ２０、Ｆ２０及び比較複合体Ａ１、Ｂ１（以下、ＦＩＮ複合体と
もいう）を合成した。これらの複合体に複合されたｓｉＲＮＡの配列は、表４Ａ～４Ｇに
おける対応する配列に示される。
（１２－１）ＦＩＮ－２複合分子の合成
Ｒａｊｅｅｖら、ＣｈｅｍＢｉｏＣｈｅｍ ２０１５，１６，９０３－９０８に記載さ
れた調製方法を参照し、以下のプロセス経路により、ＦＩＮ－２複合分子を合成した。
（１２－１－１）ＰＲＯ－１０の合成
Figure 2023134615000102
（１２－１－１ａ）ＰＲＯ－７の合成
２．９３ｇのＰＲＯ－６（Ｌ－ヒドロキシプロリン、ＣＡＳ番号：５１－３５－４、Ｅ
ｎｅｒｇｙ社から購入、２２．４ｍｍｏｌ）を２２．５ｍｌの１，４－ｄｉｏｘａｎｅ（
１，４－ジオキサン、ＣＡＳ番号：１２３－９１－１）に溶解させ、３４ｍｌの１０％（
ｗ／ｗ）Ｎａ２ＣＯ３の水溶液を加え、懸濁液状態にし、６．９５ｇのＦｍｏｃ－Ｃｌ（
クロロギ酸－９－フルオレニルメチル、ＣＡＳ番号：２８９２０－４３－６、Ｅｎｅｒｇ
ｙ社から購入、２６．８ｍｍｏｌ）を３４ｍｌの１，４－ｄｉｏｘａｎｅに溶解させ、氷
浴下で上記懸濁液中に加え、自然に室温まで昇温し一晩反応させた。反応液を１５０ｍｌ
の氷水に注入し、メチルｔｅｒｔ－ブチルエーテルで１回あたり１００ｍｌで３回抽出し
、有機相を捨て、水相を濃ＨＣｌでｐＨ≦５になるように調節し、１００ｍｌの酢酸エチ
ルで２回抽出し、有機相をあわせ、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、溶剤を減圧蒸発乾固
して７．８３ｇの白色泡状固形製品ＰＲＯ－７を得た。１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ
，ＤＭＳＯ－ｄ６） δ ７．９１ （ｔ，Ｊ ＝７．２ Ｈｚ，２Ｈ），７．６７ （
ｄ，Ｊ ＝７．５ Ｈｚ，２Ｈ），７．４８ － ７．３９ （ｍ，２Ｈ），７．３８
－ ７．２７ （ｍ，２Ｈ），５．１７ （ｓ，１Ｈ），４．２７ （ｓ，２Ｈ），４．
２３ － ４．１１ （ｍ，２Ｈ），３．５５ － ３．４１ （ｍ，３Ｈ），２．３１
－ ２．１０ （ｍ，１Ｈ），２．０８ － １．８８ （ｍ，１Ｈ）． ＨＲＭＳ
（ＥＳＩ） ｍ／ｚ 理論値（ｃａｌｃｄ ｆｏｒ） Ｃ２０Ｈ１９ＮＯ５ ［Ｍ－Ｈ］
－３５２．１１９０、実測値：３５２．１０３３．
（１２－１－１ｂ）ＰＲＯ－８の合成
７．８３ｇのＰＲＯ－７（２２．２ｍｍｏｌ）を８０ｍｌのＴＨＦ（ＣＡＳ番号：１０
９－９９－９）に溶解させ、油浴で６５℃に加熱し、還流状態で３６．６ｍｌの２ｍｏｌ
／ＬのＢＨ３－Ｍｅ２ＳのＴＨＦ溶液（ＣＡＳ番号１３２９２－８７－０、Ｊ＆Ｋ Ｓｃ
ｉｅｎｔｉｆｉｃ社から購入、７３．２ｍｍｏｌ）を加え、３時間還流反応を続けた。反
応液を流出させ、メタノールで残りの固体を溶解させ、攪拌下で反応液に気体がなくなる
までメタノールを加えてから３０分間攪拌し続け、溶剤を減圧留去した後石油エーテルで
３回精製して７．１ｇの白色固形生成物ＰＲＯ－８を得た。１Ｈ ＮＭＲ （４００ Ｍ
Ｈｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６） δ ７．９１ （ｔ，Ｊ ＝６．７ Ｈｚ，２Ｈ），７．６７
（ｄ，Ｊ ＝７．２ Ｈｚ，２Ｈ），７．４９ － ７．３９ （ｍ，２Ｈ），７．３
８ － ７．２６ （ｍ，２Ｈ），５．１８ （ｄｄ，Ｊ ＝６．１，３．８ Ｈｚ，１
Ｈ），４．２８ （ｓ，２Ｈ），４．２３ － ４．１３ （ｍ，２Ｈ），３．５５ －
３．３８ （ｍ，２Ｈ），２．３２ － ２．１１ （ｍ，１Ｈ），２．０８ － １
．８９ （ｍ，１Ｈ）． ＨＲＭＳ （ＥＳＩ） ｍ／ｚ 理論値 Ｃ２０Ｈ２１ＮＯ４
［Ｍ＋Ｎａ］＋３６２．１３６８、実測値：３６２．１０１２．
（１２－１－１ｃ）ＰＲＯ－９の合成
７．１ｇのＰＲＯ－８（２１ｍｍｏｌ）を１００ｍｌのピリジンに溶解させ、１４．２
ｇのＤＭＴｒ－Ｃｌ（４，４’－ビスメトキシトリチルクロリド、４２ｍｍｏｌ）を加え
、室温で５時間攪拌反応させた。溶剤を減圧留去し、粗製品を酢酸エチルで溶解した後に
塩類不純物を濾過除去し、溶剤を減圧留去した後でシリカゲルカラムで精製し、シリカゲ
ルカラムを予めピリジンでアルカリ化してからＤＣＭで粗製品を溶解させ負荷し、１％（
ｖ／ｖ）ピリジンを含むＤＣＭでＤＭＴｒ－Ｃｌを溶出させた後、酢酸エチルで生成物を
溶出させ、生成物溶出液を回収し、溶剤を減圧蒸発乾固し、８．２ｇの白色固形生成物Ｐ
ＲＯ－９を得た。ＨＲＭＳ （ＥＳＩ） ｍ／ｚ 理論値 Ｃ４１Ｈ３９ＮＯ６ ［Ｍ＋
Ｎａ］＋６６４．２６７５、実測６６４．２３４８，Ｃ１８ ＲＰ－ＨＰＬＣ（ロット番
号ＪＪＳ１６０３２４－１）純度９４．２０％。
（１２－１－１ｄ）ＰＲＯ－１０の合成
８．２ｇのＰＲＯ－９（１２．８ｍｍｏｌ）を６４ｍｌのＤＭＦ（Ｎ，Ｎ－ジメチルホ
ルムアミド）に溶解させ、４０ｍｌのピペリジン（３８４ｍｍｏｌ）を加え、室温で３０
分間攪拌反応させた。反応液を３００ｍｌの氷水に注入し、酢酸エチルで１回あたり１５
０ｍｌで３回抽出し、有機相をあわせ、２００ｍｌの飽和食塩水で洗浄した後、有機相を
無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、溶剤を減圧留去した後でシリカゲルカラムで精製し、シ
リカゲルカラムを予めピリジンでアルカリ化してからＤＣＭで粗製品を溶解させ負荷し、
１％（ｖ／ｖ）ピリジンを含むＤＣＭでＦｍｏｃを溶出させた後、酢酸エチルで生成物を
溶出させ、生成物溶出液を回収し、溶剤を減圧蒸発乾固し、４．６５ｇの白色固形生成物
ＰＲＯ－１０を得た。１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６） δ ７．４
０ （ｄ，Ｊ ＝７．２ Ｈｚ，２Ｈ），７．３５ － ７．１８ （ｍ，７Ｈ），６．
９３ － ６．８４ （ｍ，４Ｈ），４．５６ （ｄ，Ｊ ＝３．９ Ｈｚ，１Ｈ），４
．１２ （ｓ，１Ｈ），３．７４ （ｓ，６Ｈ），３．４６ － ３．３７ （ｍ，１Ｈ
），２．８８ （ｄｄｄ，Ｊ ＝１８．５，１０．０，５．５ Ｈｚ，２Ｈ），２．７５
（ｄｄ，Ｊ ＝８．７，５．８ Ｈｚ，１Ｈ），２．６２ （ｄｄ，Ｊ ＝１１．０，
２．７ Ｈｚ，１Ｈ），１．７４ － １．６５ （ｍ，１Ｈ），１．４０ （ｄｄｄ，
Ｊ ＝１２．９，８．５，５．９ Ｈｚ，１Ｈ），ＨＲＭＳ （ＥＳＩ） ｍ／ｚ 理論
値 Ｃ２６Ｈ２９ＮＯ４ ［Ｍ＋Ｎａ］＋４４２．１９９４、実測４４２．１９９９，Ｃ
１８ ＲＰ－ＨＰＬＣ（ロット番号ＪＪＳ１６０３２９－１）純度９７．０７％。
（１２－１－２）ＦＩＮ－１の合成
Figure 2023134615000103
 （２－１－１）に記載された方法により得られたＧＡＬ－５（４．５ｇ、１０ｍｍｏｌ
）を４０ｍｌのＤＭＦに溶解させ、順に３．９ｇのＤＩＥＡ（Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエ
チルアミン、ＣＡＳ番号：７０８７－６８－５、Ａｌａｄｄｉｎ社から購入、３０ｍｍｏ
ｌ）及び３．８ｇのＨＢＴＵ（ベンゾトリアゾール－Ｎ，Ｎ、Ｎ’，Ｎ’－テトラメチル
ウロニウムヘキサフルオロホスフェート、ＣＡＳ番号：９４７９０－３７－２、Ａｌａｄ
ｄｉｎ社から購入、１１ｍｍｏｌ）を加え、室温で１０分間攪拌し、工程（１１－１－１
ｄ）で得られたＰＲＯ－１０（４．２ｇ、１０ｍｍｏｌ）を４０ｍｌのＤＭＦに溶解させ
た後、上記反応液に加え、反応液に無水硫酸ナトリウムを加えて乾燥させ、室温で２時間
攪拌した。反応液を１２０ｍｌの氷水に注入し、酢酸エチルで１回あたり６０ｍｌで３回
抽出し、有機相をあわせ、それぞれ２０ｍｌの水、２０ｍｌの飽和食塩水で洗浄し、有機
相を分離し無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、溶剤を減圧留去し、シリカゲルカラムで精製
し、シリカゲルカラムを予めピリジンでアルカリ化してからそれに試料を負荷し、１体積
％トリエチルアミン及び１体積％メタノールを含むジクロロメタン（ＤＣＭ）溶液で溶出
させ、生成物溶出液を回収し、溶剤を減圧蒸発乾固し、６．５ｇの淡黄色泡状固形製品Ｆ
ＩＮ－１を得た。１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６） δ ７．８３
（ｄ，Ｊ ＝９．２ Ｈｚ，１Ｈ），７．３２ （ｔ，Ｊ ＝６．６ Ｈｚ，４Ｈ），７
．２０ （ｔｄ，Ｊ ＝８．９，３．５ Ｈｚ，５Ｈ），６．９３ － ６．８４ （ｍ
，４Ｈ），５．２１ （ｄ，Ｊ ＝３．２ Ｈｚ，１Ｈ），５．０４ － ４．９０ （
ｍ，２Ｈ），４．４９ （ｓ，１Ｈ），４．４０ （ｄ，Ｊ ＝４．４ Ｈｚ，０．８Ｈ
），４．３１ （ｄ，Ｊ ＝５．０ Ｈｚ，０．２Ｈ），４．１５ （ｓ，１Ｈ），４．
０３ （ｓ，３Ｈ），３．９３ （ｓ，１Ｈ），３．７４ （ｓ、７Ｈ）、３．５９ （
ｄｔ，Ｊ ＝１２．０，６．０ Ｈｚ，１Ｈ），３．５０ － ３．４０ （ｍ，１Ｈ）
，３．３９ － ３．２５ （ｍ，３Ｈ），３．１３ （ｄｄ，Ｊ ＝８．９，５．２
Ｈｚ，１Ｈ），３．００ （ｄｑ，Ｊ ＝９．３，５．３，４．３ Ｈｚ，１Ｈ），２．
２２ （ｓ，２Ｈ），２．０７ （ｓ，３Ｈ），１．９９ （ｓ，３Ｈ），１．９０ （
ｓ，４Ｈ），１．７４ （ｓ，３Ｈ），１．５０ （ｓ，３Ｈ），１．３６ （ｓ，１Ｈ
）。Ｃ１８ ＲＰ－ＨＰＬＣ（ロット番号ＬＪ１６０４２２）純度９５．４５％。
（１２－１－３）ＦＩＮ－２の合成
Figure 2023134615000104
 工程（１２－１－２）で得られたＦＩＮ－１（３．０ｇ、３．５３ｍｍｏｌ）をアセト
ニトリルと共沸させて水を除去し、減圧吸引乾燥させ、１０ｍｌのＤＭＦに溶解させ（分
子篩に浸して水を除去した）、窒素保護下で２．１３ｇのＰＡ（ビス（ジイソプロピルア
ミノ）（２－シアノエトキシ）ホスフィン、Ａｄａｍａｓ社から購入、商品番号１１３５
６Ｂ、７．０６ｍｍｏｌ）、３４６ｍｇのテトラゾール（ＣＡＳ番号：２８８－９４－８
、Ａｌａｄｄｉｎ社から購入、４．９４ｍｍｏｌ）を加え、室温で攪拌反応させ、１０ｍ
ｌのＤＭＦを追加し、１時間攪拌反応を続けた。溶剤を減圧留去した後でシリカゲルカラ
ムクロマトグラフィーにより精製し、シリカゲルカラムを予めピリジンでアルカリ化して
からＤＣＭで粗製品を溶解させ負荷し、酢酸エチルで溶出させ、生成物溶出液を回収し、
溶剤を減圧留去し、４．５ｇの無色シロップ状粗製品を得た。粗製品を５０体積％アセト
ニトリル水溶液で完全に溶解するまで溶解させ、Ｃ－１８、３３０ｇ、３００Å中圧精製
カラムでサンプルを精製し、カラムをまず１体積％ピリジンのアセトニトリル溶液でアル
カリ化し、勾配溶出させて製品のピークを回収し、溶剤を減圧留去して２．２ｇの白色粉
末製品ＦＩＮ－２複合分子を得た。３１Ｐ ＮＭＲ （１６２ ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）
δ １４８．０４，１４７．９４，１４７．６２，１４７．１９、リンスペクトル純度９
２％、Ｃ１８ ＲＰ－ＨＰＬＣ純度９０．５４％。
（１２－２）ＦＩＮ－２複合分子の固相担体への結合
核酸固相合成方法により、工程（１２－１－３）で得られたＦＩＮ－２複合分子を３回
循環させることにより、汎用の固相担体（ＵｎｙＬｉｎｋｅｒＴＭ ｌｏａｄｅｄ Ｎｉ
ｔｔｏＰｈａｓｅ（登録商標）ＨＬ Ｓｏｌｉｄ Ｓｕｐｐｏｒｔｓ）に結合し、複合基
（ＦＩＮ＿ＦＩＮ＿ＦＩＮ）のＲＮＡセンス鎖の３’末端への結合を実現した。
Ｒａｊｅｅｖら、ＣｈｅｍＢｉｏＣｈｅｍ ２０１５，１６，９０３－９０８に記載さ
れた調製方法を参照して上記結合を行い、具体的には、まず、上記汎用の固相担体から始
まり、固相担体におけるヒドロキシ保護基を除去し、カップリング反応条件及びカップリ
ング試薬の存在下でＦＩＮ－２複合分子と接触させてカップリングさせ、キャッピング反
応及び酸化反応を行った後、固相担体に結合されたＦＩＮ複合分子を得た。当該固相担体
に結合されたＦＩＮ複合分子におけるヒドロキシ保護基ＤＭＴｒを除去し、ＦＩＮ－２複
合分子と接触させてカップリングさせ、キャッピング反応及び酸化反応を行い、再び上記
脱保護－カップリング－キャッピング－酸化工程を１回繰り返し、３番目のＦＩＮ－２複
合分子を結合させ、固相担体に結合された複合基（ＦＩＮ＿ＦＩＮ＿ＦＩＮ）を得た。
上記反応において、上述した脱保護、カップリング、キャッピング、酸化は、反応条件
、溶剤及び試薬用量が前述した調製例１に記載された核酸固相合成方法と同じであった。
（１２－３）複合体Ｆ１～Ｆ５の合成
１）工程（１２－２）で得られた化合物を出発としてセンス鎖を合成し、２）複合ｓｉ
ＲＮＡが、表４Ａ～４Ｇに示される複合体Ａ２０～Ａ２３、Ｂ１６～Ｂ１７、Ｃ１４、Ｄ
１４、Ｅ１８～Ｅ２０、Ｆ２０及び比較複合体Ａ１、Ｂ１に対応する配列を有すること以
外、調製例２における工程（２－２）、（２－３Ａ）、（２－４）と同じ方法により、表
題複合体を調製した。
液体クロマトグラフィー質量分析計（ＬＣ－ＭＳ、Ｌｉｑｕｉｄ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇ
ｒａｐｈｙ－Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ、Ｗａｔｅｒｓ社から購入、型番：Ｌ
ＣＴ Ｐｒｅｍｉｅｒ）により分子量を検出した。その結果、実測値が理論値に一致して
おり、合成された複合体は、構造が式（３０７）に示される目的設計の化合物であること
が確認された。
（調製例１３）比較複合体Ａ３、Ｅ２、Ｆ２の調製
本調製例で比較複合体Ａ３、Ｅ２、Ｆ２を合成し、これらの複合体に複合されたｓｉＲ
ＮＡの配列は、表４Ａ、４Ｅ及び４Ｆに示される。
（１３－１）（ＧａｌＮＡｃ）３複合分子の合成
ＷＯ２０１４０２５８０５Ａ１に記載された調製方法により化合物３０、即ち、以上の
ようなリンカー－（ＬＡ）３トリヒドロキシメチルアミノメタン－ＬＢ－及び標的基であ
るＮ－アセチルガラクトサミン分子（ここで、各ＬＡに１つのＮ－アセチルガラクトサミ
ン分子が結合されてもよいので、１つのリンカーに３個のＮ－アセチルガラクトサミン分
子が結合できる）を含む複合分子（（ＧａｌＮＡｃ）３複合分子ともいう）を合成し、前
記化合物３０の構造は、下式に示される。
Figure 2023134615000105
（１３－２）（ＧａｌＮＡｃ）３複合分子の固相担体への結合
調製例２における工程（２－１－９）と同じ方法により、（ＧａｌＮＡｃ）３複合分子
を固相担体に結合し、固相担体に結合された（ＧａｌＮＡｃ）３複合分子を得た。
（１３－３）比較複合体Ａ３、Ｅ２、Ｆ２の合成
１）工程（１３－２）で得られた化合物を出発としてセンス鎖を合成し、２）複合ｓｉ
ＲＮＡが表４Ａ、４Ｅ、４Ｆにおいて番号Ａ３、Ｅ２、Ｆ２に示される配列を有すること
以外、調製例２における工程（２－２）、（２－３Ａ）、（２－４）と同じ方法により、
比較複合体Ａ３、Ｅ２、Ｆ２を調製した。
液体クロマトグラフィー質量分析計（ＬＣ－ＭＳ、Ｌｉｑｕｉｄ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇ
ｒａｐｈｙ－Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ、Ｗａｔｅｒｓ社から購入、型番：Ｌ
ＣＴ Ｐｒｅｍｉｅｒ）により分子量を検出した。その結果、実測値が理論値に一致して
おり、合成された複合体は、構造が式（３０５）に示される目的設計の化合物であること
が確認された。
上記本開示の複合体の調製が完了した後、使用のために、標準的な手段により固体粉末
として凍結乾燥させて保存した。使用時、例えば注射用水を用いて改めて溶解させ所望の
濃度の溶液として用いてもよい。
以下、実験例を通じて以上の通り調製された本開示のｓｉＲＮＡ及びｓｉＲＮＡ複合体
の特性を研究した。
以下、表４ＡのｓｉＲＮＡ複合体の効果実験について説明する。
（実験例Ａ１）本実験では、本開示のｓｉＲＮＡ複合体の毒性について証明している。
Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスにおいて、各マウス１匹あたり１００ｍｇ／ｋｇ又は２００ｍ
ｇ／ｋｇ（ｓｉＲＮＡとして計算）の複合体Ａ１をそれぞれ単回皮下投与し（０．９％塩
化ナトリウム水溶液、濃度がそれぞれ１０ｍｇ／ｍＬ及び２０ｍｇ／ｍＬであり、投与体
積が１０ｍＬ／ｋｇであり、濃度ごとに雌雄マウス各３匹に投与した）、その間に臨床観
察を行ったところ、動物の死亡はなく、薬物の副作用に関連する臨床症状も認められてお
らず、投与した２４ｈ後、血液サンプルを採取して臨床病理学的検査を行い、動物を解剖
した。その結果、臨床病理学的検査及び肉眼解剖のいずれにおいても異常が認められなか
った。上記結果から明らかなように、本開示の複合体は、動物レベルの毒性が低い。
（実験例Ａ２）本実験では、本開示のｓｉＲＮＡ複合体の安定性を証明している
（実験例２－１）ｓｉＲＮＡ複合体の体外リソソーム溶解液における安定性
リソソーム溶解液で処理された試験サンプルの調製：比較複合体Ａ１及び複合体Ａ２１
（それぞれｓｉＲＮＡ濃度２０μＭの０．９％塩化ナトリウム水溶液として提供、１群あ
たり６μｌ）をそれぞれ２７．２μＬのクエン酸ナトリウム水溶液（ｐＨ５．０）、４．
０８μＬの脱イオン水及び２．７２μＬのトリトソーム（Ｘｅｎｏｔｅｃｈ社から購入、
番号Ｒ０６１０ＬＴ、ロット番号１６１００６９）と均一に混合した。３７℃で恒温培養
した。それぞれ０ｈ、１ｈ、２ｈ、４ｈ、６ｈ、８ｈ、２４ｈ、４８ｈに５μｌの試料を
取り出し、それぞれ１５μＬの９Ｍ尿素に加えて変性させた後、４μｌの６×試料負荷緩
衝液（Ｓｏｌａｒｂｉｏ社、番号２０１６０８３０）を加え、直ちに－８０℃の冷蔵庫に
冷凍して反応を停止させた。０時間は、被験サンプルとリソソーム溶解液を均一に混合し
た後、直ちに取り出した時点を表す。
リソソーム溶解液で処理されていない参照サンプルの調製：等モル量の上記複合体（２
０μＭ）を各１．５μｌとり、それぞれ７．５μＬのクエン酸ナトリウム水溶液（ｐＨ５
．０）、１μＬの脱イオン水と均一に混合し、３０μＬの９Ｍ尿素溶液を加えて変性させ
た後、８μＬの６×試料負荷緩衝液を加えて均一に混合し、直ちに－８０℃の冷蔵庫に冷
凍して反応を停止させた。各複合体の参照サンプルは、電気泳動図においてＣｏｎと記し
ている。
１６重量％の非変性ポリアクリルアミドゲルを配合し、上記試験サンプル及び参照サン
プルをそれぞれ２０μｌとり、ゲルに負荷し、２０ｍＡの定電流条件で１０ｍｉｎ電気泳
動した後、４０ｍＡの定電流条件で３０ｍｉｎ電気泳動を続けた。電気泳動終了後、ゲル
をシェーカーに放置し、Ｇｅｌｒｅｄ染料（ＢｉｏＴｉｕｍ社、番号１３Ｇ１２０３）で
１０ｍｉｎ染色した。ゲルイメージングを行い観察して撮影し、結果を図１に示した。
図１は、被験ｓｉＲＮＡ複合体の体外トリトソームにおける安定性の半定量的検出結果
を示すものである。結果から、本開示の複合体は、トリトソームにおいて長期間分解され
ずに維持し、非常に良好な安定性を示すことが示された。
（実験例Ａ２－２）ｓｉＲＮＡ複合体の体外リソソーム溶解液における安定性
被験サンプルが複合体Ａ１、Ａ６及び比較ｓｉＲＮＡ１であり、トリトソームとの培養
時間がそれぞれ０ｈ、５ｍｉｎ、１５ｍｉｎ、３０ｍｉｎ、１ｈ、２ｈ、４ｈ、８ｈであ
ったこと以外、実験例２－１と同じ方法を採用した。
非変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動の結果を図２に示した。
図２は、被験ｓｉＲＮＡ複合体の体外トリトソームにおける安定性の半定量的検出結果
を示すものである。結果から、本開示の複合体は、トリトソームにおいて長期間分解され
ずに維持し、非常に良好な安定性を示すことが示された。
以上の図１及び図２の結果から、本開示の特定の修飾を有するｓｉＲＮＡは、リソソー
ム溶解液において満足できる安定性を示すことが示された。
（実験例Ａ２－３）ヒト血漿における安定性
複合体Ａ１、Ａ６及び比較ｓｉＲＮＡ２（それぞれｓｉＲＮＡ濃度２０μＭの０．９％
塩化ナトリウム水溶液として提供、１群あたり１２μｌ）をそれぞれ１０８μＬの９０％
ヒト血漿（Ｈｕｍａｎ ｐｌａｓｍａ、ＰＢＳで希釈）と均一に混合した。３７℃で恒温
培養した。それぞれ０、２、４、６、８、２４、４８、７２時間で１０μＬのサンプルを
取り出し、直ちに液体窒素により急速冷凍し、－８０℃の冷蔵庫に冷凍して保存した。各
時点でサンプリングした後、上記冷凍保存サンプルをそれぞれ１×ＰＢＳ（ｐＨ７．４）
で５倍希釈した後、各サンプルを１０μＬずつとって使用に備えた。同時に、等モル量の
被験サンプル（２μＭ、２μｌ）を８μｌの１×ＰＢＳ（ｐＨ７．４）と均一に混合し、
ヒト血漿処理されていない１０μＬのサンプルとして調製し、Ｃｏｎと記した。２０重量
％の非変性ポリアクリルアミドゲルを配合し、上記予備サンプルにおける各群の全てのサ
ンプルを４μＬの試料負荷緩衝液（２０ｍＭのＥＤＴＡ、３６重量％グリセリン、０．０
６重量％ブロムフェノールブルーの水溶液）と混合した後、前述したゲルに負荷し、８０
ｍＡの定電流条件で６０分間電気泳動した。電気泳動終了後、１×Ｓｙｂｒ Ｇｏｌｄ染
料（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｔ．１１４９４）で１５分間染色した後イメージングを
行った。結果を図３に示した。
図３は、被験複合体の体外でのヒト血漿における安定性の半定量的検出結果を示すもの
である。
図３の結果から分かるように、本開示の複合体は、ヒト血漿中で７２ｈまでも分解され
ず、ヒト血漿における優れた安定性を示した。
（実験例Ａ２－４）複合体のサル血漿における安定性
複合体Ａ１、Ａ６及び比較ｓｉＲＮＡ２（それぞれｓｉＲＮＡ濃度２０μＭの０．９％
塩化ナトリウム水溶液として提供、１群あたり１２μｌ）を、１０８μＬの９０％カニク
イザル血漿（Ｍｏｎｋｅｙ ｐｌａｓｍａ、鴻泉生物から購入、ＨＱ７００８２、ＰＢＳ
で希釈）とそれぞれ均一に混合した。３７℃で恒温培養した。それぞれ０、２、４、６、
８、２４、４８、７２時間で１０μＬの試料を取り出し、直ちに液体窒素により急速冷凍
し、－８０℃の冷蔵庫に冷凍して保存した。各時点でサンプリングした後、上記冷凍保存
サンプルをそれぞれ１×ＰＢＳ（ｐＨ７．４）で５倍希釈した後、各サンプルを１０μＬ
ずつとって使用に備えた。同時に、等モル量の被験サンプル（２μＭ、２μｌ）を８μｌ
の１×ＰＢＳ（ｐＨ７．４）と均一に混合し、１０μＬサル血漿処理されていないサンプ
ルとして調製し、Ｃｏｎと記した。２０重量％の非変性ポリアクリルアミドゲルを配合し
、上記予備サンプルにおける各群の全てのサンプルを４μＬの試料負荷緩衝液（２０ｍＭ
のＥＤＴＡ、３６重量％グリセリン、０．０６重量％ブロムフェノールブルーの水溶液）
と混合した後、前述したゲルに負荷し、８０ｍＡの定電流条件で６０分間電気泳動した。
電気泳動終了後、１×Ｓｙｂｒ Ｇｏｌｄ染料（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｔ．１１４
９４）で１５分間染色した後イメージングを行った。結果を図４に示した。
図４は、被験ｓｉＲＮＡの体外でのサル血漿における安定性の半定量的検出結果を示す
ものである。
図４の結果から分かるように、本開示のｓｉＲＮＡ複合体は、カニクイザル血漿中で７
２ｈまでも分解されず、サル血漿における優れた安定性を示した。
（Ａ２－５）本実験では、本開示のｓｉＲＮＡ複合体の体外リソソーム溶解液における
安定性を証明している
１）マウス由来のリソソーム溶解液における安定性の検出
リソソーム溶解液で処理された試験サンプルの調製：各６μｌの複合体Ａ２及び比較ｓ
ｉＲＮＡ２（２０μＭ）をそれぞれ２７．２μＬのクエン酸ナトリウム水溶液（ｐＨ５．
０）、４．０８μＬの脱イオン水及び２．７２μＬのマウス由来のリソソーム溶解液（Ｒ
ａｔ Ｌｉｖｅｒ Ｔｒｉｔｏｓｏｍｅｓ、Ｘｅｎｏｔｅｃｈ社、番号Ｒ０６１０．ＬＴ
、ロット番号１６１００６９）と均一に混合し、酸性ホスファターゼの最終濃度が０．２
ｍＵ／μＬであった。３７℃で恒温培養した。それぞれ０、１、２、４、６、２４時間で
それぞれ混合液を５μｌ取り出し、１５μＬの９Ｍ尿素溶液に加えて変性させた後、４μ
ｌの６×試料負荷緩衝液（Ｓｏｌａｒｂｉｏ社、番号２０１６０８３０）を加え、直ちに
－８０℃の冷蔵庫に冷凍して反応を停止させた。０時間は、被験サンプルとリソソーム溶
解液を均一に混合した後、直ちに取り出した時点を表す。
リソソーム溶解液で処理されていない参照サンプルの調製：等モル量の複合体Ａ２及び
比較ｓｉＲＮＡ２（２０μＭ）を各１．５μｌとり、７．５μＬのクエン酸ナトリウム水
溶液（ｐＨ５．０）、１μＬの脱イオン水とそれぞれ均一に混合し、３０μＬの９Ｍ尿素
溶液を加えて変性させた後、８μＬの６×試料負荷緩衝液を加えて均一に混合し、直ちに
－８０℃の冷蔵庫に冷凍して反応を停止させた。各サンプルの参照サンプルは、Ｍと記し
、当該サンプルの電気泳動結果と比較するために用いる。
１６重量％の非変性ポリアクリルアミドゲルを配合し、上記試験サンプル及び参照サン
プルのそれぞれ２０μｌをゲルに負荷し、２０ｍＡの定電流条件で１０ｍｉｎ電気泳動し
た後、４０ｍＡの定電流条件で３０ｍｉｎ電気泳動を続けた。電気泳動終了後、ゲルをシ
ェーカーに放置し、Ｇｅｌｒｅｄ染料（ＢｉｏＴｉｕｍ社、番号１３Ｇ１２０３）で１０
ｍｉｎ染色した。ゲルイメージングを行い観察して撮影し、結果を図５に示した。
２）ヒト由来のリソソーム溶解液における安定性の検出
マウス由来のリソソーム溶解液をヒト由来のリソソーム溶解液（Ｈｕｍａｎ Ｌｉｖｅ
ｒ Ｌｙｓｏｓｏｍｅｓ、Ｘｅｎｏｔｅｃｈ社、番号Ｈ０６１０．Ｌ、ロット番号１６１
０３１６）に変更したこと以外、１）と同じ方法により比較ｓｉＲＮＡ２及び複合体Ａ２
のヒト由来のリソソーム溶解液における安定性を検出した。結果を図６に示した。
結果から明らかなように、本開示のｓｉＲＮＡ複合体は、ヒト由来のリソソーム溶解液
及びマウス由来のリソソーム溶解液のいずれにおいても、満足できる安定性を示し、少な
くとも２４時間分解されずに維持することが可能である。
（実験例Ａ３）本実験では、複合体Ａ１のラット体内での薬物動力学的研究結果を示し
ている
本実験例では、それぞれ各実験群のラット（１群あたり１０匹のラットであり、雌雄が
それぞれ半分であった）に皮下注射により複合体Ａ１を単回投与し、１０ｍｇ／ｋｇ及び
５０ｍｇ／ｋｇの用量で実施した。その後、各時点でのラット血漿の薬物濃度及び肝臓、
腎臓組織の薬物濃度を検出した。
本実験例で用いたＳＤラットは、北京維通利華実験動物技術有限公司により提供された
。
まず、ＰＲＩＳＴＩＭＡ ７．２．０版データシステムにより、ＳＤラットをラットの
体重に応じて性別でランダムに分け、その後、設計された用量でそれぞれ各群の複合体に
投与した。全ての動物について、体重に応じて投与量を算出し、単回投与（皮下投与）し
、用量は１０及び５０ｍｇ／ｋｇであり、それぞれ１ｍｇ／ｍｌ及び５ｍｇ／ｍｌの複合
体の０．９％塩化ナトリウム水溶液を投与し、体積が１０ｍｌ／ｋｇであった。薬剤投与
前及び薬剤投与後の５分間（±３０秒）、３０分間（±１分間）、１時間（±２分間）、
２時間（±２分間）、６時間（±５分間）、２４時間（±１０分間）、４８時間（±２０
分間）、７２時間（±２０分間）、１２０時間（±３０分間）、１６８時間（±３０分間
）でそれぞれ頸静脈からラット全血を採取した後、２～８℃で遠心力１８００×ｇで１０
分間遠心して血漿を単離し、血漿サンプルをチューブに約７０μＬ放置し、残りのサンプ
ルを別のチューブに放置し、検出するまで、－７０～－８６℃で冷凍保存した。それぞれ
薬剤投与後の約２４、４８、７２、１２０、１６８時間で、対応するラットを、体重に応
じてペントバルビタールナトリウムで麻酔させ（６０ｍｇ／ｋｇ腹腔注射した）、腹大動
脈から採血して安楽死させ、肉眼解剖を行うように、ラットの肝臓、腎臓組織を採取した
。各ラットの肝臓、腎臓をサンプリングし、１ｍＬの冷凍保存チューブに保存し、検出・
分析するまで、－６８℃以下で保存した。
ＨＰＬＣ－ＦＬＤ（蛍光検出高速液体クロマトグラフィー）によりラット血漿及び肝臓
、腎臓組織における複合体Ａ１の濃度を定量的に検出した。具体的には、以下の工程によ
る。
（１）組織塊が８０ｍｇ以下となるまで組織を粉砕した後、組織と細胞溶解液（Ｔｉｓ
ｓｕｅ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｌｙｓｉｓ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ、供給者：ｅｐｉｃｅｎｔｒ
ｅ、番号：ＭＴＣ０９６Ｈ）を加えて６６．７ｍｇ／ｍＬの組織ホモジネートとして調製
した。
（２）細胞を破砕するために組織ホモジネートを超音波（１５０Ｗ、３０ｓ）処理した
。
（３）組織サンプルについては、組織サンプル７５μＬを９６ウェルのＰＣＲプレート
に加え、５μＬのプロテアーゼＫ（供給者：Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、番号：２５５３０－
０１５）、１０μＬの１０ｗｔ％アセトニトリル及び０．０１ｗｔ％ツウィーン２０の混
合水溶液を加え、血漿サンプルについては、血漿２０μＬを９６ウェルのＰＣＲプレート
に加え、４５μＬの組織と細胞溶解液、５μＬのプロテアーゼＫ、２０μＬの１０ｗｔ％
アセトニトリル及び０．０１ｗｔ％ツウィーン２０の混合水溶液を加えた。
（４）プレートをシールし、ＰＣＲ器（供給者：Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ
ｓ、型番：ＧｅｎｅＡｍｐ（登録商標） ＰＣＲ ｓｙｓｔｅｍ ９７００）に放置し、
６５℃で４５分間培養した。
（５）培養終了後、１０μＬの３Ｍ ＫＣｌの水溶液（供給者：Ｓｉｇｍａ－ａｌｄｒ
ｉｃｈ、番号：６０１３５－２５０ＭＬ）を加え、振とうして均一にし、４℃、３２００
ｒｃｆで１５分間遠心した。
（６）組織サンプルに対して、上清液８０μＬを１２０μＬのハイブリッド混合液に加
え（ハイブリッド混合液の調製：０．５ｍＬの６μＭ ＰＮＡプローブ（供給者：杭州泰
禾生物科技有限公司）、１ｍＬの２００ｍＭ Ｔｒｉｚｍａ／ｐＨ＝８、５ｍＬの８Ｍ尿
素水溶液、３．５ｍＬのＨ２Ｏ、２ｍＬのアセトニトリル）、
血漿サンプルに対して、上清液４０μＬを１６０μＬのハイブリッド混合液に加えた（
ハイブリッド混合液の調製：０．５ｍＬの６μＭ ＰＮＡプローブ、１ｍＬの２００ｍＭ
Ｔｒｉｚｍａ／ｐＨ＝８、５ｍＬの８Ｍ尿素水溶液、７．５ｍＬのＨ２Ｏ、２ｍＬのア
セトニトリル）。
（７）プレートをシールし、ＰＣＲ器に放置し、９５℃で１５分間培養し、直ちに氷の
上に５分間放置した。
（８）別の円錐底９６ウェルプレートに移し、振とうして均一にした。３２００ｒｃｆ
で１分間遠心した。
（９）サンプルを負荷して検出し、ＨＰＬＣ－ＦＬＤにより分析して定量した（液相系
供給者：Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、クロマトグラフ型番：ｕｌｔｉｍａｔｅ ３００
０）。
分析結果は、図７～図１０に示した。図７～図１０は、それぞれ投与量が１０ｍｇ／ｋ
ｇ又は５０ｍｇ／ｋｇであるとき、複合体Ａ１のラット血漿におけるＰＫ／ＴＫ血漿濃度
の経時的代謝曲線及びラット肝臓及び腎臓におけるＰＫ／ＴＫ組織濃度の経時的代謝曲線
を示している。具体的には、
図７は、投与量が１０ｍｇ／ｋｇであるとき、複合体Ａ１のラット血漿におけるＰＫ／
ＴＫ血漿濃度の経時的代謝曲線を示したものである。
図８は、投与量が１０ｍｇ／ｋｇであるとき、複合体Ａ１のラット肝臓及び腎臓におけ
るＰＫ／ＴＫ組織濃度の経時的代謝曲線を示したものである。
図９は、投与量が５０ｍｇ／ｋｇであるとき、複合体Ａ１のラット血漿におけるＰＫ／
ＴＫ血漿濃度の経時的代謝曲線を示したものである。
図１０は、投与量が５０ｍｇ／ｋｇであるとき、複合体Ａ１のラット肝臓及び腎臓にお
けるＰＫ／ＴＫ組織濃度の経時的代謝曲線を示したものである。
図７～図１０の結果から分かるように、低用量（１０ｍｇ／ｋｇ）であっても比較的高
用量（５０ｍｇ／ｋｇ）であっても、複合体Ａ１のラット血漿における濃度は、いずれも
急速に数時間で検出限界以下まで低下したが、肝臓組織においては、いずれも少なくとも
１６８ｈ以内は、高い安定したレベルの組織濃度が維持された。このことから、本開示の
ｓｉＲＮＡ複合体は、特異的に肝臓において顕著に富化して安定化でき、高度な標的性を
有することが示された。
（実験例Ａ４）本実験では、本開示のＲＮＡ複合体の体内での（ｉｎ ｖｉｖｏ）ＨＢ
Ｖ ｍＲＮＡ発現量に対する抑制効率を証明している
本実験例では、ＨＢＶトランスジェニックマウスＣ５７ＢＬ／６Ｊ－Ｔｇ（Ａｌｂ１Ｈ
ＢＶ）４４Ｂｒｉ／Ｊにおいて複合体Ａ５及びＡ７によるＨＢＶ ｍＲＮＡ発現量に対す
る抑制効率を調べた。
Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原診断キット（酵素結合免疫吸着測定法）（上海科華生物）を
用いてマウス血清におけるＨＢｓＡｇの含有量を検出し、Ｓ／ＣＯＶ＞１０のマウスを選
択し、マウスを４匹／群でランダムに分け（いずれも雌性）、それぞれ複合体Ａ５及び複
合体Ａ７で番号を付けるとともに、ＮＳ対照群を追加した。全ての動物について、体重に
応じて投与量を算出し、単回投与（皮下投与）し、それぞれ１ｍｇ／ｋｇ及び０．１ｍｌ
／ｋｇの異なる用量で投与し、薬物を０．２ｍｇ／ｍｌ及び０．０２ｍｇ／ｍｌの０．９
％塩化ナトリウム水溶液として提供し、投与体積は５ｍｌ／ｋｇであった。薬剤投与後の
１４日目に動物を死亡させ、肝臓を回収し、ＲＮＡ ｌａｔｅｒ（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒ
ｉｃｈ社）で保存し、組織ホモジナイザーで肝組織をホモジナイズし、さらにＴｒｉｚｏ
ｌで全ＲＮＡ抽出の標準操作手順により抽出して全ＲＮＡを得た。
蛍光定量的リアルタイムＰＣＲにより肝組織におけるＨＢＶ ｍＲＮＡの発現量を検出
した。具体的には、ＩｍＰｒｏｍ－ＩＩＴＭ逆転写キット（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を用いて
その説明書により抽出した全ＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写し、続いて、蛍光定量的ＰＣＲキ
ット（北京康為世紀生物科技有限公司）を用い、ｓｉＲＮＡによる肝組織におけるＨＢＶ
ｍＲＮＡ発現に対する抑制効率を検出した。当該蛍光定量的ＰＣＲ法では、β－アクチ
ン（β－ａｃｔｉｎ）遺伝子を内因性参照遺伝子とし、ＨＢＶに対するプライマー及びβ
－アクチンに対するプライマーを用いてそれぞれＨＢＶ及びβ－アクチンを検出した。
検出プライマーの配列を表５Ａに示した。
Figure 2023134615000106
当該蛍光定量的ＰＣＲ法では、ＨＢＶ ｍＲＮＡの発現量は、ＨＢＶ Ｘ遺伝子発現残
量で表され、以下の等式により算出された。
ＨＢＶ Ｘ遺伝子発現残量＝（試験群ＨＢＶ Ｘ遺伝子のコピー数／試験群β－アクチ
ンのコピー数）／（対照群ＨＢＶ Ｘ遺伝子のコピー数／対照群β－アクチンのコピー数
）×１００％。図においてＨＢＶ Ｘ／β－ａｃｔｉｎ ｍＲＮＡ発現量と記した。
その後、下式により複合体によるｍＲＮＡに対する抑制率を算出した。
複合体によるｍＲＮＡに対する抑制率＝（１－ＨＢＶ Ｘ遺伝子発現残量）×１００％
対照群は、本実験においてＮＳが施された対照群マウスであり、各試験群は、それぞれ
異なるｓｉＲＮＡ複合体が施された投与群マウスであった。結果を図１１に示した。
他の実験において、以下の条件でそれぞれいくつかのの実験を行った。
投与するｓｉＲＮＡ複合体を複合体Ａ１及び複合体Ａ６に変更して試験を行い、１４日
目に検出データを回収したこと以外、上記と同じ方法を採用した。結果を図１２に示した
。
投与するｓｉＲＮＡ複合体を複合体Ａ１、Ａ２、Ａ３及びＡ４に変更して試験を行い、
１群あたりの動物は５匹であり、２８日目に検出データを回収し、各複合体に対して、１
ｍｇ／ｋｇ及び０．３ｍｇ／ｋｇの２つの用量で投与した（投与体積を変えることなく複
合体溶液の濃度を相応的に調整した）こと以外、上記と同じ方法を採用した。結果をそれ
ぞれ図１３に示した。
投与するｓｉＲＮＡ複合体を複合体Ａ１と比較複合体Ａ３に変更して試験を行い、１４
日目に検出データを回収し、各複合体に対して、１ｍｇ／ｋｇ及び０．１ｍｇ／ｋｇの２
つの用量で投与した（投与体積を変えずに複合体溶液の濃度を相応的に調整した）こと以
外、上記と同じ方法を採用した。結果をそれぞれ図１４に示した。
上記結果から分かるように、試験時点が異なる複数回の試験において、上記本開示の複
合体は、いずれも高いマウス体内ＨＢＶ ｍＲＮＡ抑制活性を示した。
（実験例Ａ５）本実験では、本開示のｓｉＲＮＡ複合体のＨＢＶトランスジェニックマ
ウスにおけるｓｉＲＮＡの血清ＨＢｓＡｇ発現量及びＨＢＶ ＤＮＡに対する抑制効率の
時間関連性試験を説明している
ＡＡＶ－ＨＢＶマウスを用い、動物のモデリングに成功した後、血清におけるＨＢｓＡ
ｇの含有量別にランダムに分け（５匹／群）、それぞれ複合体Ａ１、比較複合体Ａ２、比
較複合体Ａ３投与及びＮＳブランク対照とした。全ての動物について、体重に応じて投与
量を算出し、単回皮下投与し、用量は３ｍｇ／ｋｇ及び１ｍｇ／ｋｇであり、濃度がそれ
ぞれ０．３ｍｇ／ｍｌ及び０．１ｍｇ／ｍｌの複合体の０．９％塩化ナトリウム水溶液を
使用し、投与体積は５ｍｌ／ｋｇであった。薬剤投与前（Ｄ０と記した）及び薬剤投与後
の７、１４、２１、２８、５６、８４、１１２、１４０、１５４、１６８、１８２日目に
マウスに対して眼窩静脈叢採血を行い、各時点で血清ＨＢｓＡｇレベルを検出した。その
間、検出結果から、血清におけるＨＢｓＡｇの含有量が初期値に近くなった、又はそれを
超えた場合、当該対象の検出を停止させた。
１回あたり約１００μｌ眼窩採血し、遠心後の血清は２０μｌ以上であった。ＨＢｓＡ
ｇ ＣＬＩＡキット（安図生物、ＣＬ０３１０）により血清におけるＨＢｓＡｇの発現含
有量を検出し、ＱＩＡａｍｐ ９６ ＤＮＡ Ｂｌｏｏｄ Ｋｉｔ説明書を参照して血清
におけるＤＮＡを抽出し、定量ＰＣＲを行い、ＨＢＶ ＤＮＡの発現レベルを検出した。
標準化されたＨＢｓＡｇの発現レベル＝（薬剤投与後のＨＢｓＡｇの含有量／薬剤投与
前のＨＢｓＡｇの含有量）×１００％。
ＨＢｓＡｇ抑制率＝（１－薬剤投与後のＨＢｓＡｇの含有量／薬剤投与前のＨＢｓＡｇ
の含有量）×１００％。
ここで、ＨＢｓＡｇの含有量は、血清１ミリリットル（ｍｌ）あたりのＨＢｓＡｇ当量
（ＵＩ）で表される。
標準化されたＨＢＶ ＤＮＡの発現レベル＝（薬剤投与後のＨＢＶ ＤＮＡの含有量／
薬剤投与前のＨＢＶ ＤＮＡの含有量）×１００％。
ＨＢＶ ＤＮＡ抑制率＝（１－薬剤投与後のＨＢＶ ＤＮＡの含有量／薬剤投与前のＨ
ＢＶ ＤＮＡの含有量）×１００％。
ここで、ＨＢＶ ＤＮＡ含有量は、血清１ミリリットル（ｍｌ）あたりのＨＢＶ ＤＮ
Ａのコピー数で表される。
結果を図１５及び図１６に示した。
図１５の結果から分かるように、薬剤投与後の異なる時点で、ＮＳ陰性対照群は、いか
なる抑制作用も示さなかったのに対して、各複合体は、薬剤投与後の異なる時点でＨＢｓ
Ａｇに対して、いずれも優れたＨＢｓＡｇ抑制効果を示した。特に、複合体Ａ１は、１４
０日間という長期間にわたって高い血清ＨＢｓＡｇ抑制率を示し続け、ＨＢＶ遺伝子の発
現を長期間安定的で効率的に抑制できることを示した。
図１６の結果から分かるように、複合体Ａ１は、同様に効率的なＨＢＶ ＤＮＡ発現抑
制を示し、８４日間と長期間にわたって高い抑制率を維持した。
それに対して、比較複合体Ａ２及び比較複合体Ａ３は、体内実験において各複合体と近
いｍＲＮＡ抑制効果を得たが、図１５～１６に示される抑制効果の持続時間が同じ投与レ
ベルの複合体１及び６より明らかに弱くなった。
以下の点を除いて上記と同じ方法により、さらに２回実験を行い、血清ＨＢｓＡｇを検
出した。
Ｍ－Ｔｇモデルを採用し、複合体Ａ６を用い、用量はそれぞれ５、１、０．２ｍｇ／ｋ
ｇであり、また、５ｍｇ／ｋｇの比較複合体Ａ３を用い、７８日目まで試験を行った。結
果を図１７に示した。
１．２８ｃｏｐｙモデルを採用し、複合体Ａ１を用い、用量は３ｍｇ／ｋｇ及び１ｍｇ
／ｋｇであり、２１０日目まで試験を行った。結果を図１８及び図１９に示した。
上記異なる用量について、いずれも投与体積が同じとして、溶液の濃度を相応的に調整
して対応する用量で投与した。
図１５～１９から分かるように、本開示のｓｉＲＮＡ複合体は、複数種の動物モデルに
おいて、いずれも持続的で効率的な血清ＨＢｓＡｇ抑制効率を示し、規律的な用量依存性
を示した。
（実験例Ａ６）本実験では、本開示のｓｉＲＮＡ複合体は、体外で高い活性を有すると
ともに、さらに低いオフターゲット効果を有することを証明している。
（Ａ６－１）本実験例に用いられるＨＥＫ２９３Ａ細胞は、北京大学分子医学研究所核
酸技術実験室により提供され、２０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ、Ｈｙｃｌｏｎｅ社）及び
０．２体積％のペニシリン－ストレプトマイシン（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ－Ｓｔｒｅｐｔ
ｏｍｙｃｉｎ、Ｇｉｂｃｏ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を含むＤＭＥＭ完全培地（Ｈｙｃ
ｌｏｎｅ社）で細胞を３７℃で５％ＣＯ２／９５％空気含有インキュベーターにおいて培
養した。
本実験例では、複合体Ａ１の体外ｐｓｉＣＨＥＣＫ系におけるオンターゲット活性（ｏ
ｎ－ｔａｒｇｅｔ ａｃｔｉｖｉｔｙ）及びオフターゲット効果を調べ、即ち、複合体Ａ
１が、完全マッチングした目的配列（そのヌクレオチド配列が複合体Ａ１のアンチセンス
鎖／センス鎖の全長ヌクレオチド配列と完全に相補的である）又はシード領域がマッチン
グした目的配列（そのヌクレオチド配列が複合体Ａ１のアンチセンス鎖／センス鎖の１～
８位のヌクレオチド配列と相補的である）を標的する活性を測定した。
Ｋｕｍｉｃｏ Ｕｉ－Ｔｅｉ ｅｔ．ａｌ．，Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｄｉｓｓｅｃｔ
ｉｏｎ ｏｆ ｓｉＲＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｂｙ ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ ＤＮＡ
ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ：ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｓｉＲＮＡ ｗｉｔｈ ａ ＤＮＡ ｓ
ｅｅｄ ａｒｍ ｉｓ ａ ｐｏｗｅｒｆｕｌ ｔｏｏｌ ｆｏｒ ｍａｍｍａｌｉａｎ
ｇｅｎｅ ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ ｗｉｔｈ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ ｒｅｄｕｃ
ｅｄ ｏｆｆ－ｔａｒｇｅｔ ｅｆｆｅｃｔ． Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅ
ａｒｃｈ，２００８．３６（７），２１３６－２１５１に記載された方法により、検出プ
ラスミドを構築し、被評価ｓｉＲＮＡ複合体と共にＨＥＫ２９３Ａ細胞にコトランスフェ
クションさせ、デュアルルシフェラーゼレポーター遺伝子の発現レベルにより、ｓｉＲＮ
Ａ複合体のオンターゲット活性及びオフターゲット効果を反映した。具体的な工程は以下
のとおりである。
［１］検出プラスミドの構築
ｐｓｉＣＨＥＣＫＴＭ－２（ＰｒｏｍｅｇａＴＭ）プラスミドにより４つの組換えプラ
スミドを構築した。そのうち、ＧＳＣＭは、オンターゲットプラスミドを表し、ＰＳＣＭ
、ＧＳＳＭ、ＰＳＳＭは、オフターゲットプラスミドを表す。
（１）ＧＳＣＭは、被験複合体（本例では複合体Ａ１）におけるアンチセンス鎖の２１
個のヌクレオチド配列の全てと完全に相補的な目的配列を含む。
（２）ＰＳＣＭは、複合体Ａ１におけるアンチセンス鎖の２１個のヌクレオチド配列の
全てと完全に一致している目的配列を含む。
（３）ＧＳＳＭは、複合体Ａ１においてアンチセンス鎖の５’端から１～８位のヌクレ
オチド配列と完全に相補的であり、残りの部分が複合体１においてアンチセンス鎖の５’
端から９～２１位のヌクレオチド配列に対応し、その配列が全く相補的ではない、即ち、
複合体１においてアンチセンス鎖の５’端から９～２１位のいずれかのヌクレオチドがＧ
、Ｃ、Ａ又はＵである場合、目的配列における対応する位置のヌクレオチドがそれぞれＴ
、Ａ、Ｃ又はＧである目的配列を含む。
（４）ＰＳＳＭは、複合体Ａ１においてセンス鎖の５’端から１～８位のヌクレオチド
配列と完全に相補的であり、残りの部分が複合体Ａ１においてセンス鎖の５’端から９～
１９位のヌクレオチド配列に対応し、その配列が全く相補的でない、即ち、複合体Ａ１に
おいてセンス鎖の５’端から９～１９位のいずれかのヌクレオチドがＧ、Ｃ、Ａ又はＵで
ある場合、目的配列における対応する位置のヌクレオチドがそれぞれＴ、Ａ、Ｃ又はＧで
ある目的配列を含む。ＧＳＳＭ標的配列の長さに等しくするために、目的配列の３’末端
に２つのＣＣを加えた。
目的配列をｐｓｉＣＨＥＣＫＴＭ－２プラスミドのＸｈｏ Ｉ／Ｎｏｔ Ｉ部位にクロ
ーニングした。
［２］トランスフェクション
９６ウェルプレートに、ＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅＴＭ ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏ
ｇｅｎ社）の使用説明書に従って、ｓｉＲＮＡと上記各プラスミドをそれぞれコトランス
フェクションし、プラスミドごとにいくつかのグループの特定の濃度の複合体１が対応し
ている。プラスミドをウェルあたり１０ｎｇずつトランスフェクションし、０．２μＬの
ＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅＴＭ ２０００を用いた。ＧＳＣＭオンターゲットプラスミ
ドに対して、複合体Ａ１の最終濃度（ｓｉＲＮＡの濃度として算出される）が１００ｎＭ
から、０．０００１ｎＭまで１１個の濃度に４倍希釈した。１群あたり３個の複製ウェル
があった。
［３］検出
２４時間コトランスフェクションした後、デュアルルシフェラーゼレポーター遺伝子検
出キット（Ｄｕａｌ ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ ｒｅｐｏｒｔｅｒ ｇｅｎｅ ａｓｓａｙ
ｋｉｔ、Ｐｒｏｍｅｇａ社、ｃａｔ．Ｅ２９４０）を用い、使用説明書に従ってＨＥＫ
２９３Ａ細胞を溶解させ、デュアルルシフェラーゼレポーター遺伝子の発現レベルを検出
した。各特定の濃度の試験群では、複合体処理なしを対照（ｃｏｎ）とした。ホタルルシ
フェラーゼタンパク質レベル（Ｆｉｒ）に対するウミシイタケルシフェラーゼタンパク質
レベル（Ｒｅｎ）で標準化した。
ｓｉＲＮＡの異なる濃度で測定された活性結果から、Ｇｒａｐｈｐａｄ ５．０ソフト
ウェアｌｏｇ（ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ） ｖｓ． ｒｅｓｐｏｎｓｅ―Ｖａｒｉａｂｌｅ
ｓｌｏｐｅ機能により用量－効果曲線をフィッティングし、用量－効果曲線から以下の算
出方法により被験ｓｉＲＮＡのＧＳＣＭを標的したＩＣ５０値を算出した。
式中、
Ｙは、残存ｍＲＮＡの発現レベルであり、
Ｘは、トランスフェクションされたｓｉＲＮＡの濃度の対数値であり、
Ｂｏｔは、定常期の最低のＹ値であり、
Ｔｏｐは、定常期の最高のＹ値であり、
ＬｏｇＩＣ５０は、Ｙが最低と最高との間の半分にある場合のＸ値であり、ＨｉｌｌＳ
ｌｏｐｅは、曲線の傾きである。
用量－効果曲線から、複合体Ａ１のＧＳＣＭを標的したＩＣ５０値を算出した。結果を
図２０Ａ～２０Ｄに示した。その結果から、ＧＳＣＭに対応して、複合体Ａ１のＩＣ５０
が０．０５１３ｎＭであり、ＰＳＣＭ、ＧＳＳＭ、ＰＳＳＭに対応して、複合体Ａ１は、
ｓｉＲＮＡの各濃度でいずれも明らかな抑制効果が認められなかったことが示され、本開
示のｓｉＲＮＡ複合体は、体外で高い活性を有するとともに、さらに低いオフターゲット
効果を有することが証明された。
上記結果から分かるように、複合体Ａ１は、オンターゲットプラスミドにおける標的ｍ
ＲＮＡの発現に対して優れた抑制効果を示し、低いＩＣ５０値を有するが、３本のオフタ
ーゲットプラスミドの発現に対して、いずれも抑制作用がなかった。複合体Ａ１は、優れ
た標的ｍＲＮＡ抑制効率を有することを示すとともに、さらに低いオフターゲット効果を
有することが分かった。
以下、表４ＢのｓｉＲＮＡ複合体の効果実験について説明する。
（実験例Ｂ１）本実験では、本開示のｓｉＲＮＡ複合体の体外（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）で
の抑制活性を証明している
（実験例Ｂ１－１）体外ｐｓｉＣＨＥＣＫ系におけるオンターゲット活性
本実験例に用いられるＨＥＫ２９３Ａ細胞は、北京大学分子医学研究所核酸技術実験室
により提供され、２０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ、Ｈｙｃｌｏｎｅ社）及び０．２体積％
のペニシリン－ストレプトマイシン（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ－Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ
、Ｇｉｂｃｏ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を含むＤＭＥＭ完全培地（Ｈｙｃｌｏｎｅ社）
で細胞を３７℃で５％ＣＯ２／９５％空気含有インキュベーターにおいて培養した。
本実験例では、複合体Ｂ１６及び複合体Ｂ１７の体外ｐｓｉＣＨＥＣＫ系におけるオン
ターゲット活性及びオフターゲット効果を調べ、即ち、複合体Ｂ１６及び複合体Ｂ１７が
、完全マッチングした目的配列（そのヌクレオチド配列が前記複合体のアンチセンス鎖／
センス鎖の全長ヌクレオチド配列と完全に相補的である）又はシード領域がマッチングし
た目的配列（そのヌクレオチド配列が前記複合体のアンチセンス鎖／センス鎖の１～８位
のヌクレオチド配列と相補的である）を標的する活性を測定した。
Ｋｕｍｉｃｏ Ｕｉ－Ｔｅｉ ｅｔ．ａｌ．，Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｄｉｓｓｅｃｔ
ｉｏｎ ｏｆ ｓｉＲＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｂｙ ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ ＤＮＡ
ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ：ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｓｉＲＮＡ ｗｉｔｈ ａ ＤＮＡ ｓ
ｅｅｄ ａｒｍ ｉｓ ａ ｐｏｗｅｒｆｕｌ ｔｏｏｌ ｆｏｒ ｍａｍｍａｌｉａｎ
ｇｅｎｅ ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ ｗｉｔｈ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ ｒｅｄｕｃ
ｅｄ ｏｆｆ－ｔａｒｇｅｔ ｅｆｆｅｃｔ． Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅ
ａｒｃｈ，２００８．３６（７），２１３６－２１５１に記載された方法により、検出プ
ラスミドを構築し、被評価ｓｉＲＮＡ複合体と共にＨＥＫ２９３Ａ細胞にコトランスフェ
クションさせ、デュアルルシフェラーゼレポーター遺伝子の発現レベルにより、ｓｉＲＮ
Ａ複合体のオンターゲット活性を反映した。具体的な工程は以下のとおりである。
［１］検出プラスミドの構築
ｐｓｉＣＨＥＣＫＴＭ－２（ＰｒｏｍｅｇａＴＭ）プラスミドにより、被験複合体（複
合体Ｂ１６又は複合体Ｂ１７）におけるアンチセンス鎖の２１個のヌクレオチド配列の全
てと完全に相補的な目的配列を含むオンターゲットプラスミドを構築した。目的配列をｐ
ｓｉＣＨＥＣＫＴＭ－２プラスミドのＸｈｏ Ｉ／Ｎｏｔ Ｉ部位にクローニングした。
［２］トランスフェクション
９６ウェルプレートに、ＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅＴＭ ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏ
ｇｅｎ社）の使用説明書に従って、ｓｉＲＮＡ複合体及び上記プラスミドをそれぞれコト
ランスフェクションし、プラスミドはウェルあたり１０ｎｇずつトランスフェクションし
、０．２μＬのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅＴＭ ２０００を用い、複合体の最終濃度（
ｓｉＲＮＡの濃度として算出）は順に０．１ｎＭ、０．０５ｎＭ及び０．０１ｎＭであっ
た。各群では、複合体処理なしを対照とした。１群あたり３個の複製ウェルがあった。
ＮＣは、ＧｅｎｅＰｈａｒｍａ社からの、目的遺伝子配列と相同性のない汎用の陰性対
照Ｂ０１００１であった。
［３］検出
２４時間コトランスフェクションした後、デュアルルシフェラーゼレポーター遺伝子検
出キット（Ｄｕａｌ ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ ｒｅｐｏｒｔｅｒ ｇｅｎｅ ａｓｓａｙ
ｋｉｔ、Ｐｒｏｍｅｇａ社、ｃａｔ．Ｅ２９４０）を用い、使用説明書に従ってＨＥＫ
２９３Ａ細胞を溶解させ、デュアルルシフェラーゼレポーター遺伝子の発現レベルを検出
した。ホタルルシフェラーゼタンパク質レベルに対するウミシイタケルシフェラーゼタン
パク質レベルで標準化した。結果を図２１に示した。
結果から明らかなように、複合体Ｂ１６及び複合体Ｂ１７はいずれも良好な体外抑制活
性を有する。
（実験例Ｂ１－２）体外ｐｓｉＣＨＥＣＫ系におけるオンターゲット活性及びオフター
ゲット効果
本実験例では、複合体Ｂ２の体外ｐｓｉＣＨＥＣＫ系におけるオンターゲット活性及び
オフターゲット効果を調べた。
複合体Ｂ２に対応する配列を用いて４本の目的配列を構築し、希釈濃度は０．１ｎＭか
ら０．０００１ｎＭに倍加希釈し、各群のプラスミドが１１群のｓｉＲＮＡ濃度に対応し
ていること以外、実験例Ａ６の方法により複合体Ｂ２に対して試験を行った。試験結果を
図２２に示した。
図２２から分かるように、複合体Ｂ２は、優れた標的ｍＲＮＡ抑制効果を有するととも
に、さらに低いオフターゲット効果を示した。
（実験例Ｂ２）本実験では、本開示のｓｉＲＮＡ複合体の安定性を証明している
（実験例Ｂ２－１）ｓｉＲＮＡ複合体の体外リソソーム溶解液における安定性
リソソーム溶解液で処理された試験サンプルの調製：複合体Ｂ１及び複合体Ｂ２（それ
ぞれｓｉＲＮＡ濃度２０μＭの０．９％塩化ナトリウム水溶液として提供、１群あたり６
μｌ）をそれぞれ２７．２μＬのクエン酸ナトリウム水溶液（ｐＨ５．０）、４．０８μ
Ｌの脱イオン水及び２．７２μＬのトリトソーム（Ｘｅｎｏｔｅｃｈ社から購入、番号Ｒ
０６１０ＬＴ、ロット番号１６１００６９）と均一に混合した。３７℃で恒温培養した。
それぞれ０ｈ、５ｍｉｎ、１５ｍｉｎ、３０ｍｉｎ、１ｈ、２ｈ、４ｈ、８ｈに５μｌの
試料（サンプル）を取り出し、それぞれ１５μＬの９Ｍ尿素に加えて変性させた後、４μ
ｌの６×試料負荷緩衝液（Ｓｏｌａｒｂｉｏ社、番号２０１６０８３０）を加え、直ちに
－８０℃の冷蔵庫に冷凍して反応を停止させた。０時間は、被験サンプルとリソソーム溶
解液を均一に混合した後、直ちに取り出した時点を表す。
リソソーム溶解液で処理されていない参照サンプルの調製：等モル量の対応する複合体
（２０μＭ）を１．５μｌとり、７．５μＬのクエン酸ナトリウム水溶液（ｐＨ５．０）
、１μＬの脱イオン水と均一に混合し、３０μＬの９Ｍ尿素溶液を加えて変性させた後、
８μＬの６×試料負荷緩衝液を加えて均一に混合し、直ちに－８０℃の冷蔵庫に冷凍して
反応を停止させた。参照サンプルは、電気泳動図においてＣｏｎと記されている。
１６重量％の非変性ポリアクリルアミドゲルを配合し、上記試験サンプル及び参照サン
プルをそれぞれ２０μｌとり、ゲルに負荷し、２０ｍＡの定電流条件で１０ｍｉｎ電気泳
動した後、４０ｍＡの定電流条件で３０ｍｉｎ電気泳動を続けた。電気泳動終了後、ゲル
をシェーカーに放置し、Ｇｅｌｒｅｄ染料（ＢｉｏＴｉｕｍ社、番号１３Ｇ１２０３）で
１０ｍｉｎ染色した。ゲルイメージングを行い観察して撮影し、結果を図２３に示した。
図２３は、被験ｓｉＲＮＡ複合体の体外トリトソームにおける安定性の半定量的検出結
果を示すものである。結果から、本開示の複合体は、トリトソームにおいて長期間分解さ
れずに維持し、優れた安定性を示すことが示された。
（実験例Ｂ２－２）ｓｉＲＮＡ複合体のヒト血漿における安定性
複合体Ｂ１、複合体Ｂ２（それぞれｓｉＲＮＡ濃度２０μＭの０．９％塩化ナトリウム
水溶液として提供、１群あたり１２μｌ）をそれぞれ１０８μＬの９０％ヒト血漿（Ｈｕ
ｍａｎ ｐｌａｓｍａ、ＰＢＳで希釈）と均一に混合した。３７℃で恒温培養した。それ
ぞれ０、２、４、６、８、２４、４８、７２時間で１０μＬの試料を取り出し、直ちに液
体窒素により急速冷凍し、－８０℃の冷蔵庫に冷凍して保存した。各時点でサンプリング
した後、上記冷凍保存サンプルをそれぞれ１×ＰＢＳ（ｐＨ７．４）で５倍希釈した後各
サンプルを１０μＬずつとって使用に備えた。同時に、等モル量のｓｉＲＮＡ複合体（ｓ
ｉＲＮＡ濃度は２μＭ、２μｌ）を８μｌの１×ＰＢＳ（ｐＨ７．４）と均一に混合し、
ヒト血漿処理されていない１０μＬのサンプルとして調製し、Ｃｏｎと記した。
２０重量％の非変性ポリアクリルアミドゲルを配合し、上記予備サンプルにおける各群
の全てのサンプルと４μＬの試料負荷緩衝液（２０ｍＭのＥＤＴＡ、３６重量％グリセリ
ン、０．０６重量％ブロムフェノールブルーの水溶液）を混合した後、前述したゲルに負
荷し、８０ｍＡの定電流条件で６０分間電気泳動した。電気泳動終了後、１×Ｓｙｂｒ
Ｇｏｌｄ染料（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｔ．１１４９４）で１５分間染色した後イメ
ージングを行った。結果を図２４に示した。
図２４は、被験複合体の体外でのヒト血漿における安定性の半定量的検出結果を示すも
のである。
図２４の結果から分かるように、本開示の複合体は、ヒト血漿中で７２ｈまでも分解さ
れず、ヒト血漿における優れた安定性を示した。
（実験例Ｂ２－３）ｓｉＲＮＡ複合体のサル血漿における安定性
他の実験において、実験例２－２と同じ方法により複合体Ｂ１、Ｂ２のサル血漿（Ｍｏ
ｎｋｅｙ ｐｌａｓｍａ、鴻泉生物から購入、ＨＱ７００８２、ＰＢＳで希釈）における
安定性を検出した。結果を図２５に示した。
図２５は、被験ｓｉＲＮＡの体外でのサル血漿における安定性の半定量的検出結果を示
すものである。
図２５の結果から分かるように、本開示のｓｉＲＮＡ複合体は、カニクイザル血漿中で
７２ｈまでも分解されず、サル血漿における優れた安定性を示した。
（実験例Ｂ３）本実験例では、本開示の複合体によるマウスにおけるＨＢＶ ｍＲＮＡ
発現に対する抑制を証明している
本実験例では、複合体Ｂ１によるＨＢＶトランスジェニックマウスＣ５７ＢＬ／６Ｊ－
Ｔｇ（Ａｌｂ１ＨＢＶ）４４Ｂｒｉ／ＪにおけるＨＢＶ ｍＲＮＡ発現量に対する抑制効
率を調べた。
まず、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ－Ｔｇ（Ａｌｂ１ＨＢＶ）４４Ｂｒｉ／Ｊマウスを血清におけ
るＨＢｓＡｇの含有量別マウスを４匹／群でランダムに分け（いずれも雌性）、それぞれ
番号を付けるとともに、ＮＳ対照群を追加した。全ての動物について、体重に応じて投与
量を算出し、単回投与（皮下投与）し、それぞれ１ｍｇ／ｋｇ及び０．１ｍｌ／ｋｇの異
なる用量で複合体Ｂ１を投与し、濃度がそれぞれ０．２ｍｇ／ｍｌ及び０．０２ｍｇ／ｍ
ｌの複合体の０．９％塩化ナトリウム水溶液を使用し、投与体積が５ｍｌ／ｋｇであった
。薬剤投与後の７日目に動物を死亡させ、肝臓を回収し、ＲＮＡ ｌａｔｅｒ（Ｓｉｇｍ
ａ Ａｌｄｒｉｃｈ社）で保存し、組織ホモジナイザーで肝組織をホモジナイズし、さら
にＴｒｉｚｏｌで全ＲＮＡ抽出の標準操作手順により抽出して全ＲＮＡを得た。
蛍光定量的リアルタイムＰＣＲにより肝組織におけるＨＢＶ ｍＲＮＡの発現レベルを
検出した。具体的には、ＩｍＰｒｏｍ－ＩＩＴＭ逆転写キット（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を用
いてその説明書により抽出した全ＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写し、続いて、蛍光定量的ＰＣ
Ｒキット（北京康為世紀生物科技有限公司）を用い、ｓｉＲＮＡによる肝組織におけるＨ
ＢＶ ｍＲＮＡ発現に対する抑制効率を検出した。当該蛍光定量的ＰＣＲ法では、グリセ
ルアルデヒド－３－リン酸脱水素酵素（ＧＡＰＤＨ）遺伝子を内因性参照遺伝子とし、Ｈ
ＢＶに対するプライマー及びＧＡＰＤＨに対するプライマーを用いてそれぞれＨＢＶ及び
ＧＡＰＤＨを検出した。
検出プライマーの配列を表５Ｂに示した。
Figure 2023134615000108
当該蛍光定量的ＰＣＲ法では、ｓｉＲＮＡ抑制活性は、ＨＢＶ遺伝子発現残量で表され
、以下の等式により算出された。
ＨＢＶ遺伝子発現残量＝（試験群ＨＢＶ遺伝子のコピー数／試験群ＧＡＰＤＨのコピー
数）／（対照群ＨＢＶ遺伝子のコピー数／対照群ＧＡＰＤＨのコピー数）×１００％
その後、下式によりｍＲＮＡ抑制率を算出した。
ｍＲＮＡ抑制率＝（１－ＨＢＶ遺伝子発現残量）×１００％
対照群は、本実験においてＮＳが施された対照群マウスであり、各試験群は、それぞれ
異なるｓｉＲＮＡ複合体が施された投与群マウスであった。結果を図２６に示した。
他の実験において、以下の条件でそれぞれ実験を２回を行った。
投与するｓｉＲＮＡ複合体を複合体Ｂ２に変更して試験を行い、７日目に検出データを
回収し、結果を図２７に示し、
投与するｓｉＲＮＡ複合体を複合体Ｂ１、複合体Ｂ２に変更して試験を行い、複合体Ｂ
１について、それぞれ１ｍｇ／ｋｇ及び０．１ｍｇ／ｋｇの２つの用量で投与し、複合体
Ｂ２を１ｍｇ／ｋｇの用量で投与し、検出配列を表５Ｃに示される配列に変更し、結果を
図２８に示したこと以外、上記と同じ方法を採用した。
Figure 2023134615000109
図２７及び図２８の結果から分かるように、上記本開示の複合体は、標的ｍＲＮＡに対
していずれも良好な抑制効果を示し、異なるＨＢＶ ｍＲＮＡに対する抑制効果がほぼ一
致した。
（実験例Ｂ４）本実験では、本開示のｓｉＲＮＡ複合体のＨＢＶトランスジェニックマ
ウスにおけるｓｉＲＮＡの血清ＨＢｓＡｇ発現量及びＨＢＶ ＤＮＡに対する抑制効率の
時間関連性試験について説明している
ＡＡＶ－ＨＢＶ低濃度モデルマウスに対して、血清におけるＨＢｓＡｇの含有量別にラ
ンダムに分け（５匹／群）、それぞれ複合体Ｂ２及びＮＳブランク対照を投与した。全て
の動物について、体重に応じて投与量を算出し、単回皮下投与し、用量は３ｍｇ／ｋｇ及
び１ｍｇ／ｋｇの２群であり、濃度がそれぞれ０．６ｍｇ／ｍｌ及び０．２ｍｇ／ｍｌの
複合体の０．９％塩化ナトリウム水溶液を使用し、投与体積は５ｍｌ／ｋｇであった。薬
剤投与前と薬剤投与後の７、１４、２１、２８、５６、８４、９８、１１２、１２６、１
４０日目にマウスに対して眼窩静脈叢採血を行い、各時点で血清ＨＢｓＡｇレベルを検出
した。
１回あたり約１００μｌ眼窩採血し、遠心後の血清は２０μｌ以上であった。ＨＢｓＡ
ｇ ＣＬＩＡキット（安図生物、ＣＬ０３１０）により血清におけるＨＢｓＡｇの含有量
を検出した。ＱＩＡａｍｐ ９６ ＤＮＡ Ｂｌｏｏｄ Ｋｉｔ説明書を参照して血清に
おけるＤＮＡを抽出し、定量ＰＣＲを行い、ＨＢＶ ＤＮＡの発現レベルを検出した。
ＨＢｓＡｇ抑制率は、以下の等式により算出された。
ＨＢｓＡｇ抑制率＝（１－薬剤投与後のＨＢｓＡｇの含有量／薬剤投与前のＨＢｓＡｇ
の含有量）×１００％。ここで、ＨＢｓＡｇの含有量は、血清１ミリリットル（ｍｌ）あ
たりのＨＢｓＡｇ当量（ＵＩ）で表される。
ＨＢＶ ＤＮＡ抑制率は、以下の等式により算出された。
ＨＢＶ ＤＮＡ抑制率＝（１－薬剤投与後のＨＢＶ ＤＮＡの含有量／薬剤投与前のＨ
ＢＶ ＤＮＡの含有量）×１００％。
ここで、ＨＢＶ ＤＮＡ含有量は、血清１ミリリットル（ｍｌ）あたりのＨＢＶ ＤＮ
Ａのコピー数で表される。
結果を図２９に示した。
図２９の結果から分かるように、薬剤投与後の異なる時点で、ＮＳ陰性対照群は、いか
なる抑制作用も示さなかったのに対して、複合体Ｂ２は、薬剤投与後の異なる時点でＨＢ
ｓＡｇに対して、いずれも優れたＨＢｓＡｇ抑制効果を示し、１００日間程度の長期間に
わたって高い血清ＨＢｓＡｇ抑制率を示し続け、ＨＢＶ遺伝子の発現を長期間安定的で効
率的に抑制できることを示した。
さらなる実験では、上記方法により、１．２８ｃｏｐｙモデルマウスにおいて、複合体
Ｂ２を用い、３ｍｇ／ｋｇ及び１ｍｇ／ｋｇの２つの用量群で投与し、濃度がそれぞれ０
．６ｍｇ／ｍｌ及び０．２ｍｇ／ｍｌの複合体の０．９％塩化ナトリウム水溶液を使用し
、投与体積は５ｍｌ／ｋｇであり、投与時間を８５日間まで維持し、上記の方法によりＨ
ＢｓＡｇ及びＨＢＶ ＤＮＡの抑制効果を検出した。結果を図３０と３１に示した。
図３０と３１の結果から分かるように、１．２８ｃｏｐｙマウスにおいて、本開示の複
合体Ｂ２は、８５日間にわたってＨＢＶ遺伝子発現及びＨＢＶ ＤＮＡに対する効率的な
抑制を示し続けた。
以下、表４ＣのｓｉＲＮＡ複合体の性質実験を説明する。
（実験例Ｃ１）本実験では、表のｓｉＲＮＡ複合体の安定性を証明している
（実験例Ｃ１－１）ｓｉＲＮＡ複合体の体外リソソーム溶解液における安定性
リソソーム溶解液で処理された試験サンプルの調製：複合体Ｃ２（ｓｉＲＮＡ濃度２０
μＭの０．９％塩化ナトリウム水溶液として提供、１群あたり６μｌ）をそれぞれ２７．
２μＬのクエン酸ナトリウム水溶液（ｐＨ５．０）、４．０８μＬの脱イオン水及び２．
７２μＬのトリトソーム（Ｘｅｎｏｔｅｃｈ社から購入、番号Ｒ０６１０ＬＴ、ロット番
号１６１００６９）と均一に混合した。３７℃で恒温培養した。それぞれ０ｈ、５ｍｉｎ
、１５ｍｉｎ、３０ｍｉｎ、１ｈ、２ｈ、４ｈ、８ｈに５μｌの試料を取り出し、それぞ
れ１５μＬの９Ｍ尿素に加えて変性させた後、４μｌの６×試料負荷緩衝液（Ｓｏｌａｒ
ｂｉｏ社、番号２０１６０８３０）を加え、直ちに－８０℃の冷蔵庫に冷凍して反応を停
止させた。０時間は、被験サンプルとリソソーム溶解液を均一に混合した後、直ちに取り
出した時点を表す。
リソソーム溶解液で処理されていない参照サンプルの調製：等モル量の複合体Ｃ２（２
０μＭ）１．５μｌを７．５μＬのクエン酸ナトリウム水溶液（ｐＨ５．０）、１μＬの
脱イオン水と均一に混合し、３０μＬの９Ｍ尿素溶液を加えて変性させた後、８μＬの６
×試料負荷緩衝液を加えて均一に混合し、直ちに－８０℃の冷蔵庫に冷凍して反応を停止
させた。参照サンプルは、電気泳動図においてＣｏｎと記した。
１６重量％の非変性ポリアクリルアミドゲルを配合し、上記試験サンプル及び参照サン
プルをそれぞれ２０μｌとり、ゲルに負荷し、２０ｍＡの定電流条件で１０ｍｉｎ電気泳
動した後、４０ｍＡの定電流条件で３０ｍｉｎ電気泳動を続けた。電気泳動終了後、ゲル
をシェーカーに放置し、Ｇｅｌｒｅｄ染料（ＢｉｏＴｉｕｍ社、番号１３Ｇ１２０３）で
１０ｍｉｎ染色した。ゲルイメージングを行い観察して撮影し、結果を図３２に示した。
図３２は、被験ｓｉＲＮＡ複合体の体外でのリソソームにおける安定性の半定量的検出
結果を示すものである。結果から、本開示の複合体は、リソソームにおいて長期間分解さ
れずに維持し、非常に良好な安定性を示すことが示された。
（実験例Ｃ１－２）ｓｉＲＮＡ複合体のヒト血漿における安定性
複合体Ｃ２（ｓｉＲＮＡ濃度２０μＭの０．９％塩化ナトリウム水溶液として提供、１
群あたり１２μｌ）をそれぞれ１０８μＬの９０％ヒト血漿（Ｈｕｍａｎ ｐｌａｓｍａ
、ＰＢＳで希釈）と均一に混合した。３７℃で恒温培養した。それぞれ０、２、４、６、
８、２４、４８、７２時間で１０μＬの試料を取り出し、直ちに液体窒素により急速冷凍
し、－８０℃の冷蔵庫に冷凍して保存した。各時点でサンプリングした後、上記冷凍保存
サンプルをそれぞれ１×ＰＢＳ（ｐＨ７．４）で５倍希釈した後、各サンプルを１０μＬ
ずつとって使用に備えた。同時に、等モル量のｓｉＲＮＡ複合体（ｓｉＲＮＡ濃度は２μ
Ｍ、２μｌ）を８μｌの１×ＰＢＳ（ｐＨ７．４）と均一に混合し、ヒト血漿処理されて
いない１０μＬのサンプルとして調製し、Ｃｏｎと記した。
２０重量％の非変性ポリアクリルアミドゲルを配合し、上記予備サンプルにおける各群
の全てのサンプルと４μＬの試料負荷緩衝液（２０ｍＭのＥＤＴＡ、３６重量％グリセリ
ン、０．０６重量％ブロムフェノールブルーの水溶液）を混合した後、前述したゲルに負
荷し、８０ｍＡの定電流条件で６０分間電気泳動した。電気泳動終了後、１×Ｓｙｂｒ
Ｇｏｌｄ染料（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｔ．１１４９４）で１５分間染色した後イメ
ージングを行った。結果を図３３に示した。
図３３の結果から分かるように、本開示の複合体は、ヒト血漿中で７２ｈまでも分解さ
れず、ヒト血漿における優れた安定性を示した。
（実験例Ｃ１－３）ｓｉＲＮＡ複合体のサル血漿における安定性
他の実験において、実験例Ｃ１－２と同じ方法により複合体Ｃ２のサル血漿（Ｍｏｎｋ
ｅｙ ｐｌａｓｍａ、鴻泉生物から購入、ＨＱ７００８２、ＰＢＳで希釈）における安定
性を検出した。結果を図３４に示した。
図３４は、被験ｓｉＲＮＡの体外でのサル血漿における安定性の半定量的検出結果を示
すものである。
図３４の結果から分かるように、本開示のｓｉＲＮＡ複合体は、カニクイザル血漿中で
７２ｈまでも分解されず、サル血漿における優れた安定性を示した。
（実験例Ｃ２）本実験例では、本開示のｓｉＲＮＡ複合体の体外（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）
での抑制活性を証明している
（実験例Ｃ２－１）体外ｐｓｉＣＨＥＣＫ系におけるオンターゲット活性
複合体Ｃ１４の配列により目的配列を構築したこと以外、実験例Ｂ１－２の方法により
複合体Ｃ１４を検出した。結果を図３５に示した。結果から明らかなように、複合体Ｃ１
４は、良好な体外抑制活性を有している。
（実験例Ｃ２－２）体外ｐｓｉＣＨＥＣＫ系におけるＩＣ５０の測定
複合体Ｃ２の配列により目的配列を構築し、試験濃度が０．１ｎＭから０．０００１ｎ
Ｍに倍加希釈し、各群の配列を１１個の濃度で測定したこと以外、実験例Ａ６の方法によ
り複合体Ｃ２を検出した。結果を図３６に示した。
図３６から分かるように、複合体Ｃ２は、優れた標的ｍＲＮＡ抑制効果を有するととも
に、さらに低いオフターゲット効果を示した。
（実験例Ｃ３）本実験例では、マウスにおいて本開示の複合体によるＨＢＶ ｍＲＮＡ
発現に対する抑制を証明している
本実験例では、ＨＢＶトランスジェニックマウスＣ５７ＢＬ／６Ｊ－Ｔｇ（Ａｌｂ１Ｈ
ＢＶ）４４Ｂｒｉ／Ｊにおいて複合体Ｃ２によるＨＢＶ ｍＲＮＡ発現量に対する抑制効
率を調べた。
まず、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ－Ｔｇ（Ａｌｂ１ＨＢＶ）４４Ｂｒｉ／Ｊマウスマウスを４匹
／群でランダムに分け（いずれも雌性）、それぞれ番号を付け、生理食塩水ＮＳ対照群を
追加した。全ての動物について、体重に応じて投与量を算出し、単回投与（皮下投与）し
、それぞれ１ｍｇ／ｋｇ及び０．１ｍｌ／ｋｇの異なる用量で複合体Ｃ２を投与し（それ
ぞれ０．２ｍｇ／ｍｌ及び０．０２ｍｇ／ｍｌの複合体の０．９％塩化ナトリウム水溶液
として提供）、投与体積は５ｍｌ／ｋｇであった。薬剤投与後の７日目に動物を死亡させ
、肝臓を回収し、ＲＮＡ ｌａｔｅｒ（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ社）で保存し、組織
ホモジナイザーで肝組織をホモジナイズし、さらにＴｒｉｚｏｌで全ＲＮＡ抽出の標準操
作手順により抽出して全ＲＮＡを得た。
蛍光定量的リアルタイムＰＣＲにより肝組織におけるＨＢＶ ｍＲＮＡの発現レベルを
検出した。具体的には、ＩｍＰｒｏｍ－ＩＩＴＭ逆転写キット（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を用
いてその説明書により抽出した全ＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写し、続いて、蛍光定量的ＰＣ
Ｒキット（北京康為世紀生物科技有限公司）を用い、ｓｉＲＮＡによる肝組織におけるＨ
ＢＶ ｍＲＮＡ発現に対する抑制効率を検出した。当該蛍光定量的ＰＣＲ法では、β－ア
クチン（β－ａｃｔｉｎ）遺伝子を内因性参照遺伝子とし、ＨＢＶに対するプライマー及
びβ－アクチンに対するプライマーを用いてそれぞれＨＢＶ及びβ－アクチンを検出した
。
検出プライマーの配列を表５Ａに示した。
当該蛍光定量的ＰＣＲ法では、ｓｉＲＮＡ抑制活性は、ＨＢＶ遺伝子発現残量で表され
、以下の等式により算出された。
ＨＢＶ遺伝子発現残量＝（試験群ＨＢＶ遺伝子のコピー数／試験群β－アクチンのコピ
ー数）／（対照群ＨＢＶ遺伝子のコピー数／対照群β－アクチンのコピー数）×１００％
。図においてＨＢＶ Ｘ／β－ａｃｔｉｎ ｍＲＮＡ発現量と記した。
その後、下式によりｍＲＮＡ抑制率を算出した。
ｍＲＮＡ抑制率＝（１－ＨＢＶ Ｘ遺伝子発現残量）×１００％
対照群は、本実験においてＮＳが施された対照群マウスであり、各試験群は、それぞれ
異なるｓｉＲＮＡ複合体が施された投与群マウスであった。結果を図３７に示した。
図３７の結果から分かるように、本開示の複合体による標的ｍＲＮＡに対する抑制率は
９３．８％に達し、良好な抑制効果を示した。
（実験例Ｃ４）本実験では、本発明のｓｉＲＮＡ複合体のＭ－Ｔｇモデルへの単回投与
によるＨＢｓＡｇ及びＨＢＶ Ｘ ｍＲＮＡに対する抑制作用を証明している
ＨＢＶトランスジェニック（Ｍ－ＴｇＨＢＶ）マウス（上海市公衆衛生センター動物部
から購入）を血清におけるＨＢｓＡｇの含有量別にランダムに分け（６匹／群、いずれも
雄性）、それぞれ生理食塩水（ＮＳ）対照群、複合体Ｃ２ １ｍｇ／ｋｇ及び３ｍｇ／ｋ
ｇ群であった。全ての動物について、体重に応じて投与量を算出し、投与体積が１０ｍｌ
／ｋｇであり、単回皮下投与した。薬剤投与前（Ｄ０と記した）及び薬剤投与後の第７、
１４、２１、２８、４２、５６、７０、８５日目にマウスに対して眼窩静脈叢採血を行い
、各時点で血清ＨＢｓＡｇレベルを検出した。
１回あたり約０．５ｍｌ眼窩採血し、遠心後の血清が２００μｌ以上であった。ＨＢｓ
Ａｇ ＣＬＩＡキット（安図生物、ＣＬ０３１０）により血清におけるＨＢｓＡｇの含有
量を検出した。
標準化された血清ＨＢｓＡｇレベル＝（薬剤投与後の試験群におけるＨＢｓＡｇの含有
量／薬剤投与前の試験群におけるＨＢｓＡｇの含有量）×１００％。
ＨＢｓＡｇ抑制率＝（１－薬剤投与後のＨＢｓＡｇの含有量／薬剤投与前のＨＢｓＡｇ
の含有量）×１００％。
ここで、ＨＢｓＡｇの含有量は、血清１ミリリットル（ｍｌ）あたりのＨＢｓＡｇ当量
（ＵＩ）で表される。
以下の図３８及び図３９は、上記試験ｓｉＲＮＡ複合体のＭ－Ｔｇモデルへの単回投与
によるＨＢｓＡｇ及びＨＢＶ Ｘ ｍＲＮＡ発現に対する抑制作用の検出結果を示してい
る。
図３８及び図３９の結果から分かるように、３ｍｇ／ｋｇ単回投与した複合体Ｃ２は、
２１日間でＨＢｓＡｇに対する９０％以上と高い抑制率を維持した。また、３ｍｇ／ｋｇ
の複合体Ｃ２は、８５日目にＨＢＶ Ｘ ｍＲＮＡ に対して依然として高い抑制率を有
している。
以下、表４ＤのｓｉＲＮＡ複合体の効果実験について説明する。
（実験例Ｄ１）本実験では、本開示のｓｉＲＮＡ複合体の安定性を示している
（実験例Ｄ１－１）ｓｉＲＮＡ複合体の体外リソソーム溶解液における安定性
実験例Ｃ１－１の方法に基づいて、複合体Ｄ２の体外リソソーム溶解液における安定性
に対して試験を行った。結果を図４０に示した。
図４０は、被験ｓｉＲＮＡ複合体の体外でのリソソームにおける安定性の半定量的検出
結果を示すものである。結果から、本開示の複合体は、リソソームにおいて長期間分解さ
れずに維持し、非常に良好な安定性を示すことが示された。
（実験例Ｄ１－２）ｓｉＲＮＡ複合体のヒト血漿／サル血漿における安定性
実験例Ｃ１－２、Ｃ１－３の方法に基づいて、複合体Ｄ２の体外でのヒト血漿、体外で
のカニクイザル血漿における安定性に対してそれぞれ試験を行った。結果を図４１、図４
２に示した。
図４１及び図４２の結果から分かるように、本開示の複合体は、ヒト血漿／サル血漿中
で７２ｈまでも分解されず、優れた安定性を示した。
（実験例Ｄ２）本実験例では、本開示のｓｉＲＮＡ複合体の体外（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）
での抑制活性を証明している
（実験例Ｄ２－１）体外ｐｓｉＣＨＥＣＫ系におけるオンターゲット活性
本実験例に用いたＨＥＫ２９３Ａ細胞は、北京大学分子医学研究所核酸技術実験室によ
り提供され、２０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ、Ｈｙｃｌｏｎｅ社）及び０．２体積％のペ
ニシリン－ストレプトマイシン（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ－Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ、Ｇ
ｉｂｃｏ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を含むＤＭＥＭ完全培地（Ｈｙｃｌｏｎｅ社）で細
胞を３７℃で５％ＣＯ２／９５％空気含有インキュベーターにおいて培養した。
複合体Ｄ１４の配列に基づいて目的配列を構築し、各配列について、０．１ｎＭから０
．０００１ｎＭに倍加希釈し、１１個の濃度点で各配列を測定したこと以外、実験例Ａ６
の方法により複合体Ｄ１４を検出した。結果を図４３に示した。結果から明らかなように
、複合体Ｄ１４は、良好な体外抑制活性を有する。
（実験例Ｄ２－２）体外ｐｓｉＣＨＥＣＫ系におけるＩＣ５０の測定
本実験例では、複合体Ｄ２の体外ｐｓｉＣＨＥＣＫ系におけるＩＣ５０を調べた。
複合体Ｄ２の配列に基づいて４本の目的配列を構築し、各配列について、０．１ｎＭか
ら０．０００１ｎＭに倍加希釈し、１１個の濃度点で各配列を測定したこと以外、実験例
Ｂ１－２の方法により複合体Ｄ２を測定した。結果を図４４に示した。図４４から分かる
ように、複合体Ｄ２は、優れた標的ｍＲＮＡ抑制効果を有するとともに、さらに低いオフ
ターゲット効果を示した。
（実験例Ｄ３）本実験例では、マウスにおいて本開示の複合体によるＨＢＶ ｍＲＮＡ
発現に対する抑制を証明している
本実験例では、ＨＢＶトランスジェニックマウスＣ５７ＢＬ／６Ｊ－Ｔｇ（Ａｌｂ１Ｈ
ＢＶ）４４Ｂｒｉ／Ｊにおいて複合体Ｄ２によるＨＢＶ ｍＲＮＡ発現量に対する抑制効
率を調べた。
実験例Ｃ３に記載された方法に基づいて、複合体Ｄ２を検出した。結果を図４５に示し
た。
図４５の結果から分かるように、本開示の複合体による標的ｍＲＮＡに対する抑制率は
、良好な抑制効果を示し、１ｍｇ／ｋｇの投与量で、標的ｍＲＮＡに対する抑制率が９３
．６３％に達し、より低い濃度（０．１ｍｇ／ｋｇ）の投与量で、依然として７７．０５
％の抑制率を有し、良好な抑制効果を示した。
（実験例Ｄ４）本実験では、本発明のｓｉＲＮＡ複合体のＭ－Ｔｇモデルへの単回投与
によるＨＢｓＡｇ及びＨＢＶ Ｘ ｍＲＮＡに対する抑制作用を証明している
ＨＢＶトランスジェニック（Ｍ－ＴｇＨＢＶ）マウス（上海市公衆衛生センター動物部
から購入）を血清におけるＨＢｓＡｇの含有量別にランダムに分け（６匹／群、いずれも
雄性）、それぞれ生理食塩水（ＮＳ）対照群、複合体Ｄ２ １ｍｇ／ｋｇ及び３ｍｇ／ｋ
ｇ群であった。全ての動物について、体重に応じて投与量を算出し、投与体積が１０ｍｌ
／ｋｇであり、単回皮下投与した。薬剤投与前と薬剤投与後の７、１４、２１、２８、４
２、５６、７０、８５日目にマウスに対して眼窩静脈叢採血を行い、各時点で血清ＨＢｓ
Ａｇレベルを検出した。
１回あたり約０．５ｍｌ眼窩採血し、遠心後の血清が２００μｌ以上であった。ＨＢｓ
Ａｇ ＣＬＩＡキット（安図生物、ＣＬ０３１０）により血清におけるＨＢｓＡｇの含有
量を検出した。ＨＢｓＡｇ発現残量は、以下の等式により算出された。
ＨＢｓＡｇ発現残量＝（試験群におけるＨＢｓＡｇの含有量／ＮＳ対照群におけるＨＢ
ｓＡｇの含有量）×１００％。ここで、ＨＢｓＡｇの含有量は、血清１ミリリットル（ｍ
ｌ）あたりのＨＢｓＡｇ当量（ＵＩ）で表される。
以下の図４６及び図４７には、上記試験ｓｉＲＮＡ複合体のＭ－Ｔｇモデルへの単回投
与によるＨＢｓＡｇ及びＨＢＶ Ｘ ｍＲＮＡ発現に対する抑制作用の検出結果が示され
た。
図４６及び図４７の結果から分かるように、３ｍｇ／ｋｇ単回投与した複合体Ｄ２は、
５０日間でＨＢｓＡｇに対する高い抑制を維持し、抑制率が９０％以上であり、最大抑制
率が９５％以上であった。また、３ｍｇ／ｋｇの複合体Ｄ２は、８５日目にＨＢＶ Ｘ
ｍＲＮＡに対して依然として６２％の抑制率を有している。
以下、表４ＥのｓｉＲＮＡ複合体の効果実験について説明する。
（実験例Ｅ１）ｓｉＲＮＡの体外ｐｓｉＣＨＥＣＫ系における活性抑制及びオフターゲ
ット効果の検出
本実験例では、ｓｉＲＮＡ Ｅ１、Ｅ４及び比較ｓｉＲＮＡ３の体外ｐｓｉＣＨＥＣＫ
系におけるオンターゲット活性及びオフターゲット効果を調べ、即ち、それぞれ３本のｓ
ｉＲＮＡが、完全マッチングした目的配列又はシード領域がマッチングした目的配列を標
的する活性を測定した。
検出された配列により４本の目的配列を構築し、検出濃度が５ｎＭから、０．００００
８ｎＭに３倍希釈し、計１１個の濃度としたこと以外、実験例Ｂ１－２の方法により試験
を行った。比較ｓｉＲＮＡ ３による４つの組換えプラスミドの発現に対する抑制につい
ては、図４８Ａ～４８Ｄを参照する。ｓｉＲＮＡ Ｅ１による４つの組換えプラスミドの
発現に対する抑制については、図４９Ａ～４９Ｄを参照する。図面から分かるように、未
修飾比較ｓｉＲＮＡ ３は、５ｎＭで、ＧＳＳＭとＰＳＣＭの発現に対して約２０％の抑
制率があり、アンチセンス鎖のシード領域のオフターゲット効果及びセンス鎖のオフター
ゲット効果をわずかに示した。しかし、本開示により提供される修飾ｓｉＲＮＡ Ｅ１は
、いかなるオフターゲット効果も認められなかった。ｓｉＲＮＡＥ４とｓｉＲＮＡ Ｅ１
は、発現が一致しており、いかなるオフターゲット効果も認められなかった。
ｓｉＲＮＡの異なる濃度で測定された活性結果に基づき、Ｇｒａｐｈｐａｄ ５．０ソ
フトウェアｌｏｇ（ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ） ｖｓ．ｒｅｓｐｏｎｓｅ－Ｖａｒｉａｂｌｅ
ｓｌｏｐｅ機能によって用量－効果曲線をフィッティングし、用量－効果曲線から、以
下の算出方法により被験ｓｉＲＮＡのＧＳＣＭを標的するＩＣ５０値を算出した。結果を
表５に示した。
式中、
Ｙは、残存ｍＲＮＡの発現レベルであり、
Ｘは、トランスフェクションされたｓｉＲＮＡの濃度の対数値であり、
Ｂｏｔは、定常期の最低のＹ値であり、
Ｔｏｐは、定常期の最高のＹ値であり、
ＬｏｇＩＣ５０は、Ｙが最低と最高との間の半分にある場合のＸ値であり、ＨｉｌｌＳ
ｌｏｐｅは、曲線の傾きである。
Figure 2023134615000111
表６Ｅから、本開示により提供される修飾ｓｉＲＮＡは、体外ｐｓｉＣＨＥＣＫ系にお
いて非常に高い抑制活性を有し、ＩＣ５０が３～３０ｐＭにあり、同時に、５ｎＭでも、
各被験修飾ｓｉＲＮＡにいかなるオフターゲット効果も検出されなかった。
（実験例Ｅ２）ｓｉＲＮＡ及びｓｉＲＮＡ複合体の体外細胞系における抑制活性の検出
（実験例Ｅ２－１）ｓｉＲＮＡのＨｕｈ７細胞におけるＡＮＧＰＴＬ３ ｍＲＮＡ発現
量に対する抑制効率の検出。
ＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅＴＭ ２０００を用いて被験ｓｉＲＮＡ（ｓｉＲＮＡＥ１
、Ｅ２、Ｅ４）をヒト肝癌細胞株Ｈｕｈ７にトランスフェクションし、ｓｉＲＮＡの最終
濃度はそれぞれ５ｎＭ、０．２５ｎＭ及び０．０５ｎＭであった。各濃度につき２つの複
製ウェルがあった。いかなるｓｉＲＮＡ処理も施していない細胞をブランク対照（Ｂｌａ
ｎｋ）とした。
蛍光定量的リアルタイムＰＣＲ（Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ Ｐ
ＣＲ）によりそれぞれ各濃度のｓｉＲＮＡがトランスフェクションされたＨｕｈ７細胞に
おけるＡＮＧＰＴＬ３ ｍＲＮＡの発現量を検出した。具体的な工程としては、トランス
フェクションした細胞を２４時間培養した後、Ｔｒｉｚｏｌ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅ
ｒ社）を用いて全ＲＮＡ抽出の標準操作手順により細胞における全ＲＮＡを抽出し、それ
ぞれ１μｇの全ＲＮＡをとり、逆転写キット（Ｐｒｏｍｅｇａ社、番号Ａ３５００）を用
いてその説明書の操作方法により逆転写してｃＤＮＡを得た。２×Ｕｌｔｒａ ＳＹＢＲ
Ｍｉｘｔｕｒｅ（ｗｉｔｈ ＲＯＸ）（北京康為世紀生物科技有限公司、番号ＣＷ０９
５６）キットを用い、ｃＤＮＡをテンプレートとして説明書の手順によりＡＮＧＰＴＬ３
ｍＲＮＡ発現量を検出した。ＡＮＧＰＴＬ３及び内因性参照遺伝子であるＧＡＰＤＨの
増幅のためのＰＣＲプライマーは、表５Ｅに示すとおりである。
Figure 2023134615000112
ＡＮＧＰＴＬ３ ｍＲＮＡ発現レベルは、ＡＮＧＰＴＬ３ ｍＲＮＡ発現量＝（試験群
ＡＮＧＰＴＬ３ ｍＲＮＡの発現量／試験群ＧＡＰＤＨ ｍＲＮＡの発現量）／（対照群
ＡＮＧＰＴＬ３ ｍＲＮＡの発現量／対照群ＧＡＰＤＨ ｍＲＮＡの発現量）×１００％
という等式により算出された。ｓｉＲＮＡによるＡＮＧＰＴＬ３ ｍＲＮＡ発現量に対す
る抑制率は、（１－ＡＮＧＰＴＬ３ ｍＲＮＡ発現量）×１００％であった。ここで、各
試験群は、それぞれ各濃度のｓｉＲＮＡで処理されたＨｕｈ７細胞であり、対照群は、ｓ
ｉＲＮＡで処理されていないＨｕｈ７細胞であった（図５０Ａにおいて「ブランク」と記
される）。結果を図５０Ａに示した。
図５０Ａから分かるように、本開示により提供される修飾ｓｉＲＮＡは、Ｈｕｈ７細胞
系において高い抑制活性を有する。
（実験例Ｅ２－２）Ｈｕｈ７細胞におけるｓｉＲＮＡ複合体によるＡＮＧＰＴＬ３ ｍ
ＲＮＡ発現量に対する抑制効率の検出。
被験サンプルが複合体Ｅ１８、Ｅ１９であり、複合体の最終濃度（ｓｉＲＮＡの量とし
て）がそれぞれ５０ｎＭ及び５ｎＭであったこと以外、実験例２－１と同じ方法により検
出した。各複合体による体外での抑制活性は、図５０Ｂに示すとおりである。
図５０Ｂから分かるように、本開示により提供されるｓｉＲＮＡ複合体は、Ｈｕｈ７細
胞系において高い抑制活性を有し、５ｎＭの複合体のＡＮＧＰＴＬ３ ｍＲＮＡ発現量に
対する抑制率が６０～８０％に達した。
（実験例Ｅ２－３）Ｈｕｈ７細胞におけるｓｉＲＮＡ複合体のＡＮＧＰＴＬ３ ｍＲＮ
Ａに対するＩＣ５０の測定。
被験サンプルが複合体Ｅ１８、Ｅ１９であり、複合体の最終濃度（ｓｉＲＮＡの量とし
て）が５０ｎＭから、０．０１６ｎＭに５倍希釈し、最低濃度を０．００００１ｎＭとし
、計７個の濃度であり、１群あたり３個の複製ウェルがあったこと以外、実験例Ｅ２－１
と同じ方法により検出した。
他の実験において、被験サンプルが複合体Ｅ２であり、複合体の最終濃度（ｓｉＲＮＡ
の量として）が２ｎＭから、０．００７８ｎＭに倍加希釈し、計９個の濃度であり、１群
あたり２個の複製ウェルがあった。
他の実験において、被験サンプルが複合体Ｅ１、Ｅ４であり、複合体の最終濃度（ｓｉ
ＲＮＡの量として）が０．５ｎＭから、０．０３１２５ｎＭに倍加希釈し、最高濃度を５
ｎＭとし、計６個の濃度であり、１群あたり２個の複製ウェルがあった。
ｓｉＲＮＡ複合体の異なる濃度で測定されたＡＮＧＰＴＬ３ ｍＲＮＡ発現レベルに対
する抑制率から、実験例１と同じ方法によりＩＣ５０を算出し、被験複合体の体外Ｈｕｈ
７細胞におけるＩＣ５０値が得られた。結果を表７に示した。
Figure 2023134615000113
表７Ｅから分かるように、本開示により提供されるｓｉＲＮＡ複合体は、体外細胞系に
おいて非常に高い抑制活性を有し、ＩＣ５０が０．０８５～０．３８３ｎＭであった。
（実験例Ｅ３）ｓｉＲＮＡ及びｓｉＲＮＡ複合体の血漿及びリソソームにおける安定性
の検出
（実験例Ｅ３－１）ｓｉＲＮＡのリソソームにおける安定性の検出。
本実験例では、ｓｉＲＮＡ Ｅ１、Ｅ２、Ｅ４のマウス由来のリソソーム溶解液におけ
る安定性を調べた。
リソソーム溶解液で処理された試験サンプルの調製：６μｌの各ｓｉＲＮＡ（２０μＭ
）をそれぞれ２７．２μＬのクエン酸ナトリウム水溶液（ｐＨ５．０）、４．０８μＬの
脱イオン水及び２．７２μＬのマウス由来のリソソーム溶解液（Ｒａｔ Ｌｉｖｅｒ Ｔ
ｒｉｔｏｓｏｍｅｓ、Ｘｅｎｏｔｅｃｈ社、番号Ｒ０６１０．ＬＴ、ロット番号１６１０
０６９）と均一に混合し、酸性ホスファターゼの最終濃度が０．２ｍＵ／μＬであった。
３７℃で恒温培養した。それぞれ０、１、２、４、６、２４時間でそれぞれ混合液を５μ
ｌ取り出し、１５μＬの９Ｍ尿素溶液に加えて変性させた後、４μｌの６×試料負荷緩衝
液（Ｓｏｌａｒｂｉｏ社、番号２０１６０８３０）を加え、直ちに－８０℃の冷蔵庫に冷
凍して反応を停止させた。０時間は、被験サンプルとリソソーム溶解液を均一に混合した
後、直ちに取り出した時点を表す。
リソソーム溶解液で処理されていない参照サンプルの調製：等モル量のｓｉＲＮＡ（２
０μＭ）を各１．５μｌとり、それぞれ７．５μＬのクエン酸ナトリウム水溶液（ｐＨ５
．０）、１μＬの脱イオン水と均一に混合し、３０μＬの９Ｍ尿素溶液を加えて変性させ
た後、８μＬの６×試料負荷緩衝液を加えて均一に混合し、直ちに－８０℃の冷蔵庫に冷
凍して反応を停止させた。各ｓｉＲＮＡの参照サンプルは、電気泳動図においてＭと記さ
れる。
１６重量％の非変性ポリアクリルアミドゲルを配合し、上記試験サンプル及び参照サン
プルをそれぞれ２０μｌとり、ゲルに負荷し、２０ｍＡの定電流条件で１０ｍｉｎ電気泳
動した後、４０ｍＡの定電流条件で３０ｍｉｎ電気泳動を続けた。電気泳動終了後、ゲル
をシェーカーに放置し、Ｇｅｌｒｅｄ染料（ＢｉｏＴｉｕｍ社、番号１３Ｇ１２０３）で
１０ｍｉｎ染色した。ゲルイメージングを行い観察して撮影し、結果を図５１Ａに示した
。
図５１Ａから分かるように、本開示により提供される修飾ｓｉＲＮＡは、マウス由来の
リソソームにおいて少なくとも２４時間安定して存在することができる。
（実験例Ｅ３－２）ｓｉＲＮＡ複合体のリソソームにおける安定性の検出。
本実験例では、複合体Ｅ１とＥ４のマウス由来のリソソーム溶解液における安定性を調
べた。
被験サンプルが複合体Ｅ１及び複合体Ｅ４であり、複合体の濃度をｓｉＲＮＡの量とし
、検出時点が０時間、５分間、１５分間、３０分間、１時間、２時間、４時間、６時間で
あったこと以外、実験例３－１と同じ方法により検出した。ゲルイメージングは、図５１
Ｂに示すとおりである。
図５１Ｂから分かるように、本開示により提供されるｓｉＲＮＡ複合体は、マウス由来
のリソソームにおいて少なくとも１時間分解されず、その後電気泳動における主バンドは
、下へわずかにシフトしたに過ぎず、対応するｓｉＲＮＡのリソソーム溶解液における高
度な安定性に鑑みて、バンドシフトは、複合基において単糖の開裂である可能性があり、
本開示のｓｉＲＮＡ複合体は、満足できる安定性を示したことが示唆された。
（実験例Ｅ３－３）ｓｉＲＮＡ複合体の血漿における安定性の検出。
本実験例では、複合体Ｅ１とＥ４のヒト血漿における安定性を調べた。
複合体Ｅ１とＥ４及び比較ｓｉＲＮＡ ３（ｓｉＲＮＡ又はｓｉＲＮＡ複合体の濃度が
いずれも２０μＭ、１２μｌであり、複合体をｓｉＲＮＡの量とした）をそれぞれ１０８
μＬの９０％ヒト血漿（Ｈｕｍａｎ ｐｌａｓｍａ、ＰＢＳで希釈）と均一に混合した。
３７℃で恒温培養した。それぞれ０、２、４、６、８、２４、４８、７２時間で１０μＬ
の試料（サンプル）を取り出し、直ちに液体窒素により急速冷凍し、－８０℃の冷蔵庫に
冷凍して保存した。各時点でサンプリングした後、１×ＰＢＳ（ｐＨ７．４）で５倍希釈
した後、各サンプルを１０μＬずつとり、同時に、等モル量のｓｉＲＮＡ（２μＭ、２μ
ｌ）又はｓｉＲＮＡ複合体（ｓｉＲＮＡ濃度は２μＭ、２μｌ）を８μｌの１×ＰＢＳ（
ｐＨ７．４）と均一に混合し、ヒト血漿処理されていない１０μＬのサンプルとして調製
し、Ｍと記した。
２０重量％の非変性ポリアクリルアミドゲルを配合し、上記サンプルと４μｌの試料負
荷緩衝液（２０ｍＭのＥＤＴＡ、３６重量％グリセリン、０．０６重量％ブロムフェノー
ルブルー）を均一に混合した後、試料をゲルに負荷し、８０ｍＡの定電流条件で６０分間
程度電気泳動した。電気泳動終了後、ゲルをシェーカーに放置し、１×Ｓｙｂｒ Ｇｏｌ
ｄ染料（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｔ．１１４９４）で１５分間染色した。ゲルイメー
ジングを行い観察して撮影し、結果を図５１Ｃに示した。
図５１Ｃから分かるように、本開示により提供されるｓｉＲＮＡ複合体は、ヒト血漿中
で７２ｈまでも分解されず、ヒト血漿における優れた安定性を示した。
他の実験において、上記と同じ方法により複合体Ｅ１とＥ４のサル血漿における安定性
を検出した。結果を図５１Ｄに示した。
結果から明らかなように、本開示により提供されるｓｉＲＮＡ複合体は、ヒト血漿及び
サル血漿においていずれも少なくとも７２時間安定して存在し、優れた安定性を示すこと
ができる。
（実験例Ｅ４）マウス体内でのｓｉＲＮＡ複合体のＡＮＧＰＴＬ３ ｍＲＮＡ発現量に
対する抑制効率の検出、及び脂質に対する抑制効果の検出。
（実験例Ｅ４－１）正常マウスＣ５７体内でのｓｉＲＮＡ複合体のＡＮＧＰＴＬ３ ｍ
ＲＮＡに対するＥＤ５０の測定。
本実験例では、複合体Ｅ１８とＥ１９の正常マウスＣ５７体内での抑制活性を調べた。
６～８週齢の正常マウスＣ５７を５匹／群でランダムに分け、それぞれ各群のマウスに
複合体Ｅ１８、Ｅ１９及びＰＢＳを投与した。全ての動物について、体重に応じて投与量
を算出し、皮下注射により単回投与し、各ｓｉＲＮＡ複合体の用量（ｓｉＲＮＡの量とし
て）がそれぞれ１０ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、０．３ｍｇ／ｋｇ、０．
１ｍｇ／ｋｇであり、複合体Ｅ１８とＥ１９の最低用量が０．００３ｍｇ／ｋｇであり、
各試験群の投与体積が１０ｍＬ／ｋｇであった。各ｓｉＲＮＡ複合体は、それぞれＰＢＳ
水溶液として提供され、用量と投与体積により、複合体について設定すべき薬物濃度を換
算した。薬剤投与後３日にマウスを死亡させ、肝臓を回収し、ＲＮＡ ｌａｔｅｒ（Ｓｉ
ｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ社）で保存し、その後、組織ホモジナイザーで肝組織をホモジナ
イズし、さらにＴｒｉｚｏｌ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ社）で全ＲＮＡ抽出の標準操
作手順により抽出して肝組織の全ＲＮＡを得た。
蛍光定量的リアルタイムＰＣＲにより肝組織におけるＡＮＧＰＴＬ３ ｍＲＮＡの発現
レベルを検出し、具体的には、逆転写キット（Ｐｒｏｍｅｇａ社、番号Ａ３５００）を用
いてその説明書の操作方法により逆転写してｃＤＮＡを得た。２×Ｕｌｔｒａ ＳＹＢＲ
Ｍｉｘｔｕｒｅ（ｗｉｔｈ ＲＯＸ）（北京康為世紀生物科技有限公司、番号ＣＷ０９
５６）キットを用い、ｃＤＮＡをテンプレートとして説明書の手順によりＡＮＧＰＴＬ３
ｍＲＮＡ発現量を検出した。ＡＮＧＰＴＬ３及び内因性参照遺伝子であるＧＡＰＤＨの
増幅のためのＰＣＲプライマーは、表８Ｅに示すとおりである。
Figure 2023134615000114
ＡＮＧＰＴＬ３ ｍＲＮＡ発現量は、ＡＮＧＰＴＬ３ ｍＲＮＡ発現量＝［（試験群Ａ
ＮＧＰＴＬ３ ｍＲＮＡの発現量／試験群ＧＡＰＤＨ ｍＲＮＡの発現量）／（対照群Ａ
ＮＧＰＴＬ３ ｍＲＮＡの発現量／対照群ＧＡＰＤＨ ｍＲＮＡの発現量）］×１００％
という等式により算出された。
複合体によるＡＮＧＰＴＬ３ ｍＲＮＡ発現レベルに対する抑制率は、抑制率＝［１－
（試験群ＡＮＧＰＴＬ３ ｍＲＮＡの発現量／試験群β－Ａｃｔｉｎ ｍＲＮＡの発現量
）／（対照群ＡＮＧＰＴＬ３ ｍＲＮＡの発現量／対照群β－Ａｃｔｉｎ ｍＲＮＡの発
現量）］×１００％という等式により算出された。対照群は、本実験においてＰＢＳが施
された対照群マウスであり、各試験群は、それぞれ異なるｓｉＲＮＡ複合体が施された投
与群マウスであった。
ｓｉＲＮＡ複合体の異なる濃度で測定されたＡＮＧＰＴＬ３ ｍＲＮＡ発現レベルに対
する抑制率から、実験例Ｅ１と同じ方法によりＥＤ５０を算出し、被験複合体による正常
マウス体内でのＥＤ５０値を得た。結果を表９Ｅに示した。
Figure 2023134615000115
表９Ｅから分かるように、試験された複合体による正常マウス体内での抑制活性は、実
験例２－３における対応する複合体の体外細胞系における抑制活性と高度に一致しており
、ＥＤ５０が０．１４０３～０．１５９５ｎＭであり、本開示により提供されるｓｉＲＮ
Ａ複合体は、正常マウス体内において非常に高い抑制活性を有することが示された。
（実験例Ｅ４－２）ｓｉＲＮＡ複合体による正常マウスＢＡＬＢ／ｃ体内でのＡＮＧＰ
ＴＬ３ ｍＲＮＡ発現量に対する抑制効率及び脂質に対する影響
本実験例では、複合体Ｅ１８、Ｅ２０による正常マウスＢＡＬＢ／ｃ体内での肝臓組織
におけるＡＮＧＰＴＬ３ ｍＲＮＡに対する抑制率及び脂質に対する影響を調べた。
６～８週齢の正常マウスＢＡＬＢ／ｃを１０匹／群でランダムに分け、それぞれ各群の
マウスに複合体Ｅ１８、Ｅ２０、比較複合体Ｅ２及びＰＢＳを投与した。全ての動物につ
いて、体重に応じて投与量を算出し、皮下注射により単回投与し、ｓｉＲＮＡ複合体の用
量（ｓｉＲＮＡの量として）が３ｍｇ／ｋｇ及び０．３ｍｇ／ｋｇの２つの用量群であり
、投与体積が１０ｍＬ／ｋｇであった。各ｓｉＲＮＡ複合体は、それぞれＰＢＳ水溶液と
して提供され、用量と投与体積により、複合体について設定すべき薬物濃度を換算した。
薬剤投与前と薬剤投与後の７日目と１４日目に動物に対して眼窩静脈採血を行い、各時点
で血清脂質レベルを検出した。薬剤投与後の７日目と１４日目にそれぞれ５匹のマウスを
死亡させ、肝臓を回収し、肝臓におけるＡＮＧＰＴＬ３ ｍＲＮＡの発現レベルを検出し
た。
１回あたり約１００μＬで眼窩静脈採血を行い、遠心して血清を得、さらにＰＭ１Ｐ０
００／３全自動血清生化学分析装置（ＳＡＢＡ、イタリア）を用いて血清における総コレ
ステロール（ＣＨＯ）及びトリグリセリド（ＴＧ）の含有量を検出した。
標準化された脂質レベル＝（薬剤投与後の試験群における脂質の含有量／薬剤投与前の
試験群における脂質の含有量）×１００％。
脂質レベルの抑制率＝（１－薬剤投与後の試験群における脂質の含有量／薬剤投与前の
試験群における脂質の含有量）×１００％。脂質は、総コレステロール又はトリグリセリ
ドを指す。
薬剤投与後の７日目のマウスの脂質の含有量を図５２Ａ～５２Ｂに示し、薬剤投与後の
１４日目のマウスの脂質の含有量を図５２Ｃ～５２Ｄに示した。
図５２Ａ～５２Ｄから分かるように、試験されたｓｉＲＮＡ複合体により正常マウスの
脂質レベルを顕著に低下させることができ、薬剤投与後の１４日に、３ｍｇ／ｋｇの本開
示のｓｉＲＮＡ複合体は、脂質低下能力が陽性対照（比較複合体Ｅ２）よりも強くなった
。
実験例Ｅ４－１と同じ方法により、蛍光定量的リアルタイムＰＣＲによりｓｉＲＮＡ複
合体による肝ＡＮＧＰＴＬ３ ｍＲＮＡ発現量に対する抑制効率を検出した。結果を表１
０Ｅに示した。
Figure 2023134615000116
他の実験において、投与された複合体が複合体Ｅ１、Ｅ４及び比較複合体Ｅ２であり、
検出時間が薬剤投与後の１４日目と２８日目であったこと以外、上記と同じ方法によりマ
ウスの脂質及びＡＮＧＰＴＬ３ ｍＲＮＡ発現量を検出した。各複合体によるＡＮＧＰＴ
Ｌ３ ｍＲＮＡに対する抑制効果については、図５３Ａ～５３Ｄを参照し、脂質に対する
抑制効果を５４Ａ～５４Ｄに示した。
図５３Ａ～５３Ｄから分かるように、薬剤投与後の１４日目に、高用量での本開示によ
り提供されるｓｉＲＮＡ複合体によるＡＮＧＰＴＬ３ ｍＲＮＡに対する抑制率が９５％
以上と高く、その抑制強度は明らかに比較複合体Ｅ２よりも優れていた。低用量の本開示
のｓｉＲＮＡ複合体について、観察時間を薬剤投与後の２８日目まで延長したところ、試
験されたｓｉＲＮＡ複合体は、いずれも正常マウスの肝組織ＡＮＧＰＴＬ３ ｍＲＮＡに
対する強い抑制作用を示し、かつ、その抑制強度が明らかに比較複合体よりも高くなった
。
図５４Ａ～５４Ｄから分かるように、本開示のｓｉＲＮＡ複合体で治療されたマウス血
清におけるＣＨＯとＴＧの含有量は明らかに低下し、かつ、少なくとも２８日目にも依然
として一定の脂質低下効果を示した。３ｍｇ／ｋｇの本開示のｓｉＲＮＡ複合体による脂
質を低下させる能力については、陽性対照（比較複合体Ｅ２）よりも強くなった。
（実験例Ｅ４－３）ｓｉＲＮＡ複合体による肥満マウス体内でのＡＮＧＰＴＬ３ ｍＲ
ＮＡ発現量に対する抑制効率及び脂質に対する影響
本実験例では、複合体Ｅ１８によるｏｂ／ｏｂマウス体内での肝臓組織におけるＡＮＧ
ＰＴＬ３ ｍＲＮＡに対する抑制率及び脂質に対する影響を調べた。
６～８週齢のｏｂ／ｏｂマウスを６匹／群とし、投与された複合体が複合体Ｅ１８であ
り、用量が３ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、０．３ｍｇ／ｋｇであり、採血時間が薬剤投与
前２日（－２日と記した）及び薬剤投与後の７、１４、２１、２８、３４日目であり、３
４日目にマウスを死亡させたこと以外、実験例Ｅ４－２と同じ方法によりｏｂ／ｏｂマウ
スの脂質及びＡＮＧＰＴＬ３ ｍＲＮＡ発現量を検出した。複合体Ｅ１８による脂質に対
する抑制効果については、図５５Ａ～５５Ｂを参照し、ＡＮＧＰＴＬ３ ｍＲＮＡに対す
る抑制効果を５５Ｃに示した。
図から分かるように、本開示のｓｉＲＮＡ複合体で治療されたマウス血清におけるＣＨ
ＯとＴＧの含有量は明らかに低下し、かつ、少なくとも３４日目にも依然として一定の脂
質低下効果を示した。同時に、薬剤投与後の３４日目に、各ｓｉＲＮＡ複合体は、依然と
してＡＮＧＰＴＬ３ ｍＲＮＡの発現を効率的に抑制することができる。
（実験例Ｅ４－４）高脂血症モデルマウス体内でのｓｉＲＮＡ複合体による脂質に対す
る影響
本実験例では、ヒトＡＰＯＣ３トランスジェニックマウス体内での複合体Ｅ１による肝
臓組織におけるＡＮＧＰＴＬ３ ｍＲＮＡに対する抑制率及び脂質に対する影響を調べた
。
ヒトＡＰＯＣ３トランスジェニックマウスＴｇ（ＡＰＯＣ３）３７０７Ｂｒｅを血清Ｔ
Ｇの含有量＞２ｍｍｏｌ／Ｌで６匹／群でランダムに分け、それぞれ各群のマウスに複合
体Ｅ１、比較複合体Ｅ１及びＰＢＳブランク対照を投与した。全ての動物について、体重
に応じて投与量を算出し、皮下注射により単回投与し、ｓｉＲＮＡ複合体の用量（ｓｉＲ
ＮＡの量として）が３ｍｇ／ｋｇ及び１ｍｇ／ｋｇであり、体積が５ｍｌ／ｋｇであった
。各ｓｉＲＮＡ複合体は、それぞれＰＢＳ水溶液として提供され、用量と投与体積により
、複合体について設定すべき濃度を換算した。薬剤投与前（－１日と記した）と薬剤投与
後の７、１４、２１、２８、３５、５６、７０、８４、９８、１１２、１２６、１４０、
１５４、１６８日目にマウスに対して眼窩静脈叢採血を行い、実験例４－２と同じ方法に
より各時点での脂質レベルを検出した。結果を図５６Ａと５６Ｂに示した。
図５６Ａと５６Ｂから分かるように、薬剤投与後の異なる時点で、ＰＢＳブランク対照
群及び比較複合体Ｅ１陰性対照群は、脂質に対していかなる抑制作用も示さなかったのに
対して、複合体Ｅ１によりＴＧ及びＣＨＯを明らかに低下させることができる。ＴＧにつ
いては、高用量群の最大抑制率が薬剤投与後の７日目に現れ、９２．９％であり、低用量
群の最大抑制率が薬剤投与後の２１日目に現れ、７９．１％であった。高用量群について
は、単回薬剤投与後の１５４日間と長期間にわたって、ＴＧに対する抑制率が常に５５％
以上に維持され、低用量群については、単回薬剤投与後の９８日間と長期間にわたって、
ＴＧに対する抑制率が常に５５％以上に維持された。ＣＨＯについては、高用量群の最大
抑制率が薬剤投与後の１４日目に現れ、８２．９％であり、低用量群の最大抑制率が薬剤
投与後の１４日目に現れ、６５．９％であった。高用量群については、単回薬剤投与後の
１５４日間と長期間にわたって、ＣＨＯに対する抑制率が常に４０％以上に維持され、低
用量群については、単回薬剤投与後の５６日間と長期間にわたって、ＣＨＯに対する抑制
率が常に４０％以上に維持された。図５６Ａと５６Ｂから、複合体Ｅ１を単回投与後の１
６８日間に脂質レベルを持続的、安定的且つ効率よく低下させることができることを示し
た。
他の実験において、投与された複合体が複合体Ｅ２及び比較複合体Ｅ２であり、薬剤投
与後の７０日目まで脂質を検出したこと以外、上記と同じ実験方法を採用した。その結果
を図５７Ａ～５７Ｄに示した。
図５７Ａと５７Ｂには、薬剤投与後の異なる時点で、２つの用量での複合体Ｅ２による
ＣＨＯに対する抑制効果が示されている。高用量群については、単回薬剤投与後の２１日
でＣＨＯの最大抑制率が７４．３％に達し、薬剤投与後の７０日間と長期間にわたって、
ＣＨＯの抑制率が常に５０％以上に維持された。低用量群については、ＣＨＯの最大抑制
率が薬剤投与後の１４日で現れ、５９．５％であった。
図５７Ｃ及び５７Ｄには、薬剤投与後の異なる時点で、２つの用量での複合体２による
ＴＧに対する抑制効果が示されている。高用量群については、単回薬剤投与後の１４日で
ＴＧの最大抑制率が９６．３％に達し、薬剤投与後の７０日間と長期間にわたって、ＴＧ
の抑制率が常に７０％以上に維持された。低用量群については、ＴＧの最大抑制率が薬剤
投与後の１４日で現れ、７５．３％であった。
図５７Ａ～５７Ｄから分かるように、複合体Ｅ２は、単回投与した７０日間で脂質レベ
ルを持続的に低下させることができ、明らかに同じ用量での比較複合体Ｅ２よりも優れて
いた。
（実験例Ｅ５）非ヒト霊長類体内でのｓｉＲＮＡ複合体によるＡＮＧＰＴＬ３ ｍＲＮ
Ａ発現量に対する抑制効率の検出、及び脂質に対する抑制効果の検出。
メタボリックシンドロームのサル１２匹（全て雄性）をランダムに分け、８匹に複合体
Ｅ２を投与し、４匹に比較複合体Ｅ１を投与した。各ｓｉＲＮＡ複合体をそれぞれ注射用
生理食塩水で溶解させ、薬物濃度（ｓｉＲＮＡの量として）が１００ｍｇ／ｍｌであった
。全ての動物について、体重に応じて投与量を算出し、皮下注射により単回投与し、用量
はいずれも９ｍｇ／ｋｇであり、注射量は０．０９ｍｌ／ｋｇであり、各注射点は２ｍｌ
以下であった。
薬剤投与前３週間に、週に１回静脈採血し、脂質、肝機能、定期血液検査等の指標を検
出した。薬剤投与後の７、１４、２１、２８、３５日目にそれぞれ再び上記各項の指標を
検出した。
標準化された脂質レベル＝（薬剤投与後の試験群における脂質の含有量／薬剤投与前の
試験群における脂質の含有量）×１００％。
脂質レベルの抑制率＝（１－薬剤投与後の試験群における脂質の含有量／薬剤投与前の
試験群における脂質の含有量）×１００％。脂質は、総コレステロール又はトリグリセリ
ドを指す。
薬剤投与前の脂質の含有量は、薬剤投与前３週間の脂質の含有量の平均値であり、０日
目（Ｄ０）の基準データとして記した。脂質抑制効果については、図５８Ａ～５８Ｂを参
照する。
図５８Ａ～５８Ｂから、単回薬剤投与後の２８日目に、薬剤投与前に対して、複合体Ｅ
２によるＴＧに対する最大抑制率が６８％に達し、ＣＨＯに対する最大抑制率が３０％に
達したことが示された。
肝臓組織におけるＡＮＧＰＴＬ３ ｍＲＮＡ発現レベルを検出するために、投与当日（
投与前と記した）及び薬剤投与後の２８日目に肝穿刺生検を行った。蛍光定量的リアルタ
イムＰＣＲの検出方法は、検出プライマーが異なること以外、実験例４－１と同じであっ
た。用いられたプライマー配列を表１１Ｅに示した。ＡＮＧＰＴＬ３ ｍＲＮＡ抑制率に
ついては、図５８Ｃを参照する。
Figure 2023134615000117
図５８Ｃから、単回投与２８日目以後、薬剤投与前に対して、複合体Ｅ２のＡＮＧＰＴ
Ｌ３ ｍＲＮＡに対する抑制率が８３％に達したことが示されている。
薬剤投与後の各時点で他の指標を検出したところ、血小板、アラニンアミノトランスフ
ェラーゼ（ｇｌｕｔａｍｉｃ－ｐｙｒｕｖｉｃ ｔｒａｎｓａｍｉｎａｓｅ）、アスパラ
ギン酸アミノトランスフェラーゼ（ｇｌｕｔａｍｉｃ ｏｘａｌａｃｅｔｉｃ ｔｒａｎ
ｓａｍｉｎａｓｅ）の異常変化が認められておらず、複合体Ｅ２が比較的安全であり、明
らかな毒性副作用が認められなかったことが示された。
図５８Ａ～５８Ｃから分かるように、複合体Ｅ２は、非ヒト霊長類において明らかな脂
質低下及びＡＮＧＰＴＬ３遺伝子発現抑制効果を示すとともに、比較的安全性を示した。
上記結果から明らかなように、本発明により提供されるｓｉＲＮＡ及び複合体は、肝臓
におけるＡＮＧＰＴＬ３ ｍＲＮＡの発現を効率的に低下させ、血中総コレステロール、
トリグリセリド含有量を低下させることができ、脂質異常を予防及び／又は治療すること
ができ、臨床への応用の将来性がある。
以下、表４ＦのｓｉＲＮＡ複合体の効果実験について説明する。
（実験例Ｆ１）本実験では、本発明のｓｉＲＮＡ複合体の体外（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）で
の抑制活性を調べた
（実験例Ｆ１－１）体外ｐｓｉＣＨＥＣＫ系におけるオンターゲット活性
本実験例では、複合体Ｆ２０の体外ｐｓｉＣＨＥＣＫ系におけるオンターゲット活性を
調べ、即ち、複合体Ｆ２０が、完全マッチングした目的配列（そのヌクレオチド配列が前
記複合体のアンチセンス鎖の全長ヌクレオチド配列と完全に相補的である）を標的する活
性を測定した。
実験例Ａ１－６に示される方法により複合体Ｆ２０に対して試験を行い、結果を図５９
に示した。結果から明らかなように、複合体Ｆ２０は、良好な体外抑制活性を有する。
（実験例Ｆ１－２）体外ｐｓｉＣＨＥＣＫ系におけるＩＣ５０の測定
本実験例では、複合体Ｆ１の体外ｐｓｉＣＨＥＣＫ系におけるＩＣ５０を調べた。
実験例Ｆ１－１と同じ方法により複合体Ｆ１のオンターゲットプラスミドを構築し、複
合体Ｆ１の最終濃度（ｓｉＲＮＡの濃度として算出される）が１ｎＭから、０．００１ｎ
Ｍまで１１個の濃度に倍加希釈した。異なる複合体の濃度で測定された活性結果から、Ｇ
ｒａｐｈｐａｄ ５．０ソフトウェアｌｏｇ（ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ） ｖｓ．ｒｅｓｐｏ
ｎｓｅ－Ｖａｒｉａｂｌｅ ｓｌｏｐｅ機能により用量－効果曲線をフィッティングし、
用量－効果曲線から、複合体Ｆ１のＩＣ５０値を算出した。
Figure 2023134615000118
 式中、
Ｙは、残存ｍＲＮＡの発現レベルであり、
Ｘは、トランスフェクションされたｓｉＲＮＡの濃度の対数値であり、
Ｂｏｔは、定常期の最低のＹ値であり、
Ｔｏｐは、定常期の最高のＹ値であり、
ＬｏｇＩＣ５０は、Ｙが最低と最高との間の半分にある場合のＸ値であり、ＨｉｌｌＳ
ｌｏｐｅは、曲線の傾きである。
検出したところ、複合体Ｆ１の体外ｐｓｉＣＨＥＣＫ系におけるＩＣ５０が０．０１７
４ｎＭであり、本開示のｓｉＲＮＡ複合体は、体外で高い活性を有することが示された。
（実験例Ｆ１－３）体外細胞系におけるＩＣ５０の測定
本実験例では、複合体Ｆ２による体外Ｈｕｈ７細胞におけるＡＰＯＣ３ ｍＲＮＡ発現
量に対する抑制効率を調べた。
ＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅＴＭ ２０００を用いて複合体Ｆ２をヒト肝癌細胞株Ｈｕ
ｈ７にトランスフェクションし、ｓｉＲＮＡ複合体の最終濃度（ｓｉＲＮＡの量として）
が３ｎＭから、０．００４ｎＭまで７個の濃度に３倍希釈した。各濃度につき２つの複製
ウェルがあった。
蛍光定量的リアルタイムＰＣＲ（Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ Ｐ
ＣＲ）によりそれぞれ各濃度の複合体Ｆ２がトランスフェクションされたＨｕｈ７細胞に
おけるＡＰＯＣ３ ｍＲＮＡの発現量を検出した。具体的な工程としては、トランスフェ
クションした細胞を２４時間培養した後、Ｔｒｉｚｏｌ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ社
）を用いて全ＲＮＡ抽出の標準操作手順により細胞における全ＲＮＡを抽出し、それぞれ
１μｇの全ＲＮＡをとり、逆転写キット（Ｐｒｏｍｅｇａ社、番号Ａ３５００）を用いて
その説明書の操作方法により逆転写してｃＤＮＡを得た。２×Ｕｌｔｒａ ＳＹＢＲ Ｍ
ｉｘｔｕｒｅ（ｗｉｔｈ ＲＯＸ）（北京康為世紀生物科技有限公司、番号ＣＷ０９５６
）キットを用い、ｃＤＮＡをテンプレートとして説明書の手順によりＡＰＯＣ３ ｍＲＮ
Ａ発現量を検出した。ここで、ＡＰＯＣ３及び内因性参照遺伝子であるβ－ａｃｔｉｎの
増幅のためのＰＣＲプライマーは、表５Ｆに示すとおりである。
Figure 2023134615000119
ＡＰＯＣ３ ｍＲＮＡ発現量は、ＡＰＯＣ３ ｍＲＮＡ発現量＝［（試験群ＡＰＯＣ３
ｍＲＮＡの発現量／試験群β－Ａｃｔｉｎ ｍＲＮＡの発現量）／（対照群ＡＰＯＣ３
ｍＲＮＡの発現量／対照群β－Ａｃｔｉｎ ｍＲＮＡの発現量）］×１００％という等
式により算出された。
複合体によるＡＰＯＣ３ ｍＲＮＡ発現レベルに対する抑制率は、抑制率＝［１－（試
験群ＡＰＯＣ３ ｍＲＮＡの発現量／試験群β－Ａｃｔｉｎ ｍＲＮＡの発現量）／（対
照群ＡＰＯＣ３ ｍＲＮＡの発現量／対照群β－Ａｃｔｉｎ ｍＲＮＡの発現量）］×１
００％という等式により算出された。ここで、各試験群は、それぞれ各濃度の複合体２で
処理されたＨｕｈ７細胞であり、対照群は、複合体Ｆ２で処理されていないＨｕｈ７細胞
であった。
複合体Ｆ２の異なる濃度で測定されたＡＰＯＣ３ ｍＲＮＡ発現レベルに対する抑制率
から、実験例Ｆ１－２と同じ方法によりＩＣ５０を算出し、複合体Ｆ２の体外Ｈｕｈ７細
胞におけるＩＣ５０が０．００８５ｎＭであり、本開示のｓｉＲＮＡ複合体は、体外で高
い活性を有することが示された。
（実験例Ｆ２）本実験では、本発明のｓｉＲＮＡ複合体による体内（ｉｎ ｖｉｖｏ）
でのＡＰＯＣ３ ｍＲＮＡ発現量に対する抑制効率を調べた
（実験例Ｆ２－１）本実験例では、ヒトＡＰＯＣ３トランスジェニックマウス体内での
複合体Ｆ１による肝臓組織におけるＡＰＯＣ３ ｍＲＮＡ発現レベルに対する抑制率を調
べた。
ヒトＡＰＯＣ３トランスジェニックマウス（Ｂ６、ＣＢＡ－Ｔｇ（ＡＰＯＣ３）３７０
７Ｂｒｅｓ／Ｊ）をトリグリセリド含有量が２ｍｍｏｌ／Ｌより大きくなるように、５匹
／群でランダムに分け、それぞれ各群のマウスに複合体Ｆ１、比較複合体Ｆ１及び生理食
塩水ＮＳを投与した。全ての動物について、体重に応じて投与量を算出し、皮下注射によ
り単回投与し、ｓｉＲＮＡ複合体の用量（ｓｉＲＮＡの量として）は１ｍｇ／ｋｇ及び０
．１ｍｇ／ｋｇの２つの用量群であり、複合体はそれぞれ０．２ｍｇ／ｍｌ及び０．０２
ｍｇ／ｍｌ濃度の０．９％塩化ナトリウム水溶液として提供され、投与体積は５ｍＬ／ｋ
ｇであった。薬剤投与後の１４日目にマウスを死亡させ、肝臓を回収し、ＲＮＡ ｌａｔ
ｅｒ（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ社）で保存し、その後組織ホモジナイザーで肝組織を
ホモジナイズし、さらにＴｒｉｚｏｌ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ社）で全ＲＮＡ抽出
の標準操作手順により抽出して肝組織の全ＲＮＡを得た。
実験例Ｆ１－３と同じ蛍光定量的リアルタイムＰＣＲ方法により肝組織におけるＡＰＯ
Ｃ３ ｍＲＮＡの発現レベルを検出した。当該蛍光定量的ＰＣＲ法では、β－アクチン（
β－ａｃｔｉｎ）遺伝子を内因性参照遺伝子とし、ＡＰＯＣ３に対するプライマー及びβ
－アクチンに対するプライマーを用いてそれぞれＡＰＯＣ３及びβ－アクチンの発現量を
検出した。
検出プライマーの配列を表６Ｆに示した。
Figure 2023134615000120
複合体によるＡＰＯＣ３ ｍＲＮＡ発現レベルに対する抑制率は、抑制率＝［１－（試
験群ＡＰＯＣ３ ｍＲＮＡの発現量／試験群β－Ａｃｔｉｎ ｍＲＮＡの発現量）／（対
照群ＡＰＯＣ３ ｍＲＮＡの発現量／対照群β－Ａｃｔｉｎ ｍＲＮＡの発現量）］×１
００％という等式により算出された。対照群は、本実験において生理食塩水が施された対
照群マウスであり、各試験群は、それぞれ異なるｓｉＲＮＡ複合体が施された投与群マウ
スであった。結果を図６０に示した。
結果から、複合体Ｆ１は、トランスジェニックマウスにおけるヒトＡＰＯＣ３遺伝子に
対して顕著な抑制作用を有することが示された。
（実験例Ｆ２－２）本実験例では、複合体Ｆ１によるカニクイザル体内での肝臓組織に
おけるＡＰＯＣ３ ｍＲＮＡ発現レベルに対する抑制率、及び脂質レベルに対する影響を
調べた。
当該実験例は、蘇州華測生物技術有限公司に委託して行われた。２～４ｋｇの年齢３～
５歳のカニクイザルを１雄１雌／群で２群にランダムに分け、それぞれ複合体Ｆ１及び比
較複合体Ｆ２を投与した。全ての動物について、体重に応じて投与量を算出し、皮下注射
により単回投与し、ｓｉＲＮＡ複合体の用量（ｓｉＲＮＡの量として）は３ｍｇ／ｋｇで
あり、複合体はそれぞれ３ｍｇ／ｍｌ濃度の塩化ナトリウム注射液（山東科倫薬業有限公
司）として提供され、投与体積は１ｍＬ／ｋｇであった。最初の投与当日を試験の１日目
（Ｄ１）として定義し、薬剤投与前日を０日目（Ｄ０）とした。
薬剤投与前と薬剤投与後の７、１４、２１、２８日目に動物に対して静脈採血を行い、
各時点で血清における、脂質（総コレステロールＣＨＯ、トリグリセリドＴＧ）及びトラ
ンスアミナーゼ（アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼＡＳＴ、アラニンアミノトラ
ンスフェラーゼＡＬＴ）である被験物の含有量を検出した。被験物を標準化処理し、各被
験物の抑制率は、抑制率＝（１－薬剤投与後の試験群における被験物の含有量／薬剤投与
前の試験群における被験物の含有量）×１００％という等式により算出された。トリグリ
セリドに対する抑制率を表７Ｆに示した。
Figure 2023134615000121
薬剤投与後に各検出点でのトランスアミナーゼの含有量を検出したところ、肝機能異常
は認められなかった。
薬剤投与後の２８日目に動物を死亡させ、肝臓を摘出した。一通り観察したところ、顕
著な異常は認められなかった。実験例Ｆ２－１と同じ方法により肝組織ＲＮＡを抽出し、
肝臓におけるＡＰＯＣ３ ｍＲＮＡの発現レベルを検出した。検出プライマーの配列を表
８Ｆに示した。
Figure 2023134615000122
蛍光定量的リアルタイムＰＣＲで検出したところ、比較複合体Ｆ２に対して、複合体Ｆ
１は、雌性動物のＡＰＯＣ３ ｍＲＮＡに対する抑制率が５５．３％であり、雄性動物の
ＡＰＯＣ３ ｍＲＮＡに対する抑制率が７８．５％であった。
当該実験から、複合体Ｆ１は、非ヒト霊長類におけるＡＰＯＣ３遺伝子に対して同様に
顕著な抑制作用を有し、血清ＴＧに対しても顕著な抑制作用を有し、同時に肝機能異常が
検出されなかったことが示された。
（実験例Ｆ３）本実験で本発明のｓｉＲＮＡ複合体による体内（ｉｎ ｖｉｖｏ）での
脂質の含有量に対する影響を調べた
（実験例Ｆ３－１）本実験例では、複合体Ｆ１によるヒトＡＰＯＣ３トランスジェニッ
クマウス体内での血清中総コレステロール（ＣＨＯ）及びトリグリセリド（ＴＧ）の含有
量に対する影響を調べた。
ヒトＡＰＯＣ３トランスジェニックマウス（Ｂ６、ＣＢＡ－Ｔｇ（ＡＰＯＣ３）３７０
７Ｂｒｅｓ／Ｊ）を、ＴＧ含有量＞２ｍｍｏｌ／Ｌとして７匹／群でランダムに分け、（
１）生理食塩水対照群、（２）３ｍｇ／ｋｇの複合体Ｆ１群、（３）１ｍｇ／ｋｇの複合
体Ｆ１群とした。全ての動物について、体重に応じて投与量を算出し、皮下注射により単
回投与し、ｓｉＲＮＡ複合体がそれぞれ０．６ｍｇ／ｍｌ及び０．２ｍｇ／ｍｌ濃度の０
．９％塩化ナトリウム水溶液として提供され、投与体積は５ｍＬ／ｋｇであった。
薬剤投与前（０日目と記録する）、及び薬剤投与後の７、１４、２１、２８、３５、４
２、４９、６３、７７、９１、１１２、１３３、１４７、１５４、１６１、１７５、１８
９日目に、それぞれマウスに対して眼窩静脈叢採血を行い、各時点で血清ＣＨＯ及びＴＧ
レベルを検出した。
１回あたり約１００μＬ眼窩採血し、遠心後の血清は２０μＬ以上とし、さらにＰＭ１
Ｐ０００／３全自動血清生化学分析装置（ＳＡＢＡ、イタリア）を用いて血清における総
コレステロール（ＣＨＯ）及びトリグリセリド（ＴＧ）の含有量を検出した。
標準化された脂質レベル＝（薬剤投与後の試験群における脂質の含有量／薬剤投与前の
試験群における脂質の含有量）×１００％。
脂質レベルの抑制率＝（１－薬剤投与後の試験群における脂質の含有量／薬剤投与前の
試験群における脂質の含有量）×１００％。脂質は、総コレステロール又はトリグリセリ
ドを指す。
検出結果を図６１Ａと６１Ｂに示した。
図６１Ａと６１Ｂから分かるように、薬剤投与後の異なる時点で、複合体Ｆ１は、１８
９日間と長期間にわたって、明らかなマウス血清中ＴＧ及びＣＨＯの低下効果を示し、Ａ
ＰＯＣ３遺伝子の発現を長期間安定的で効率的に抑制できることが示された。
（実験例Ｆ３－２）本実験例では、複合体Ｆ２によるヒトＡＰＯＣ３トランスジェニッ
クマウス体内での血清中総コレステロール（ＣＨＯ）及びトリグリセリド（ＴＧ）含有量
に対する影響を調べた。
８匹／群でマウスを分け、投与した複合体が複合体Ｆ２であり、０．１、０．３、１、
３、９ｍｇ／ｋｇの５つの用量群でそれぞれ投与し、投与体積を変えることなく複合体溶
液の濃度を相応的に調整し、薬剤投与後の１１２日目まで試験を続けたこと以外、実験例
Ｆ３－１と同じ方法により検出した。結果を図６２Ａと６２Ｂに示した。
図６２Ａと６２Ｂの結果から分かるように、複合体Ｆ２は、１１２日間と長期間にわた
ってトランスジェニックマウスにおけるＴＧ及びＣＨＯレベルを顕著に低下させることが
でき、当該低下効果は、明らかな用量依存効果があった。
（実験例Ｆ３－３）本実験例で、複合体１～３によるヒトＡＰＯＣ３トランスジェニッ
クマウス体内での血清中総コレステロール（ＣＨＯ）及びトリグリセリド（ＴＧ）の含有
量に対する影響を比較した。
６匹／群でマウスを分け、それぞれ複合体Ｆ１、Ｆ２、Ｆ３及び比較複合体Ｆ２を投与
し、各複合体を１ｍｇ／ｋｇ及び３ｍｇ／ｋｇの２つの用量群で投与し、投与体積を変え
ることなく複合体溶液の濃度を相応的に調整し、薬剤投与後の１１２日目まで試験時間と
したこと以外、実験例３－１と同じ方法によりマウス血清総コレステロール（ＣＨＯ）及
び総脂質（ＴＧ）を測定した。結果を図６３Ａ～図６３Ｄに示した。
図６３Ａ～図６３Ｄの結果から分かるように、１１２日間と長期間にわたって、本開示
の複合体Ｆ１～Ｆ３は、異なる用量でいずれもトランスジェニックマウスにおける脂質に
対して持続的な低下作用を示し、当該持続的な低下効果は、全体として比較複合体Ｆ２よ
りも優れていた。
上記結果から明らかなように、本発明により提供される複合体は、肝臓におけるＡＰＯ
Ｃ３ ｍＲＮＡの発現を効率的に低下させ、血中総コレステロール、トリグリセリドの含
有量を低下させることができ、脂質異常を予防及び／又は治療することができ、臨床への
応用の将来性がある。
以下、表４ＧのｓｉＲＮＡ複合体の効果実験について説明する。
（実験例Ｇ１）本実験では、本開示のｓｉＲＮＡ複合体は、体外で高い活性を有すると
ともに、さらに低いオフターゲット効果を有することを証明している。
本実験例に用いられるＨＥＫ２９３Ａ細胞は、北京大学分子医学研究所核酸技術実験室
により提供され、２０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ、Ｈｙｃｌｏｎｅ社）及び０．２体積％
のペニシリン－ストレプトマイシン（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ－Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ
、Ｇｉｂｃｏ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を含むＤＭＥＭ完全培地（Ｈｙｃｌｏｎｅ社）
で細胞を３７℃で５％ＣＯ２／９５％空気含有インキュベーターにおいて培養した。
本実験例では、複合体Ｇ２の体外ｐｓｉＣＨＥＣＫ系におけるオンターゲット活性及び
オフターゲット効果を調べ、即ち、複合体Ｇ２が、完全マッチングした目的配列（そのヌ
クレオチド配列が複合体Ｇ２のアンチセンス鎖／センス鎖の全長ヌクレオチド配列と完全
に相補的である）又はシード領域がマッチングした目的配列（そのヌクレオチド配列が複
合体Ｇ２のアンチセンス鎖／センス鎖の１～８位のヌクレオチド配列と相補的である）を
標的する活性を測定した。
実験例Ａ１－６の方法を参照して複合体Ｇ２を検出したこと以外、複合体Ｇ２の配列に
より４グループの目的配列を構築し、ＧＳＣＭオンターゲットプラスミドについて、複合
体Ｇ２の最終濃度（ｓｉＲＮＡの濃度として算出される）が１ｎＭから、０．０００９７
７ｎＭまで１１個の濃度に倍加希釈し、他の３個オフターゲットプラスミドについて、複
合体Ｇ２の最終濃度が１０ｎＭから、０．００００３８ｎＭまで１０個の濃度に４倍希釈
した。
ＧＳＣＭに対して、複合体Ｇ２のＩＣ５０が０．０５１３ｎＭであり（Ｒ２＝０．９９
１１）、ＰＳＣＭ、ＧＳＳＭ、ＰＳＳＭに対して、複合体Ｇ２は、ｓｉＲＮＡの各濃度で
いずれも明らかな抑制効果が認められず、本開示のｓｉＲＮＡ複合体は、体外で高い活性
を有するとともに、さらに低いオフターゲット効果を有することが示された。
（実験例Ｇ２）本実験では、本開示のｓｉＲＮＡ複合体の体外リソソーム溶解液におけ
る安定性を証明している
１）マウス由来のリソソーム溶解液における安定性の検出
リソソーム溶解液で処理された試験サンプルの調製：各６μｌの複合体Ｇ２及び比較ｓ
ｉＲＮＡ１（２０μＭ）をそれぞれ２７．２μＬのクエン酸ナトリウム水溶液（ｐＨ５．
０）、４．０８μＬの脱イオン水及び２．７２μＬのマウス由来のリソソーム溶解液（Ｒ
ａｔ Ｌｉｖｅｒ Ｔｒｉｔｏｓｏｍｅｓ、Ｘｅｎｏｔｅｃｈ社、番号Ｒ０６１０．ＬＴ
、ロット番号１６１００６９）と均一に混合し、酸性ホスファターゼの最終濃度が０．２
ｍＵ／μＬであった。３７℃で恒温培養した。それぞれ０、１、２、４、６、２４時間で
それぞれ混合液を５μｌ取り出し、１５μＬの９Ｍ尿素溶液に加えて変性させた後、４μ
ｌの６×試料負荷緩衝液（Ｓｏｌａｒｂｉｏ社、番号２０１６０８３０）を加え、直ちに
－８０℃の冷蔵庫に冷凍して反応を停止させた。０時間は、被験サンプルとリソソーム溶
解液を均一に混合した後、直ちに取り出した時点を表す。
リソソーム溶解液で処理されていない参照サンプルの調製：等モル量の複合体Ｇ２及び
比較ｓｉＲＮＡ１（２０μＭ）を各１．５μｌとり、それぞれ７．５μＬのクエン酸ナト
リウム水溶液（ｐＨ５．０）、１μＬの脱イオン水と均一に混合し、３０μＬの９Ｍ尿素
溶液を加えて変性させた後、８μＬの６×試料負荷緩衝液を加えて均一に混合し、直ちに
－８０℃の冷蔵庫に冷凍して反応を停止させた。各サンプルに対して、参照サンプルをＭ
と記し、当該サンプルの電気泳動結果と比較するために用いた。
１６重量％の非変性ポリアクリルアミドゲルを配合し、上記試験サンプル及び参照サン
プルをそれぞれ２０μｌとり、ゲルに負荷し、２０ｍＡの定電流条件で１０ｍｉｎ電気泳
動した後、４０ｍＡの定電流条件で３０ｍｉｎ電気泳動を続けた。電気泳動終了後、ゲル
をシェーカーに放置し、Ｇｅｌｒｅｄ染料（ＢｉｏＴｉｕｍ社、番号１３Ｇ１２０３）で
１０ｍｉｎ染色した。ゲルイメージングを行い観察して撮影し、結果を図６４に示した。
２）ヒト由来のリソソーム溶解液における安定性の検出
マウス由来のリソソーム溶解液をヒト由来のリソソーム溶解液（Ｈｕｍａｎ Ｌｉｖｅ
ｒ Ｌｙｓｏｓｏｍｅｓ、Ｘｅｎｏｔｅｃｈ社、番号Ｈ０６１０．Ｌ、ロット番号１６１
０３１６）に変更したこと以外、１）と同じ方法により比較ｓｉＲＮＡ１及び複合体Ｇ２
のヒト由来のリソソーム溶解液における安定性を検出した。結果を図６５に示した。
図６４と６５の結果から明らかなように、本開示のｓｉＲＮＡ複合体は、ヒト由来のリ
ソソーム溶解液及びマウス由来のリソソーム溶解液のいずれにおいても、満足できる安定
性を示し、少なくとも２４時間分解されずに維持することが可能である。
（実験例Ｇ３）本実験では、本開示のｓｉＲＮＡ複合体によるＨＢＶモデルマウスにお
けるＨＢＶ ｍＲＮＡ発現量に対する抑制効率を証明している
１）本実験例では、複合体Ｇ１及び複合体Ｇ２によるＨＢＶモデルマウスＣ５７ＢＬ／
６Ｊ－Ｔｇ（Ａｌｂ１ＨＢＶ）４４Ｂｒｉ／ＪにおけるＨＢＶ ｍＲＮＡ発現量に対する
抑制効率を調べた。
本実験例に用いられるＣ５７ＢＬ／６Ｊ－Ｔｇ（Ａｌｂ１ＨＢＶ）４４Ｂｒｉ／Ｊマウ
スは、北京大学医学部実験動物科学部から購入された。０．９％塩化ナトリウム水溶液で
複合体Ｇ２を濃度０．２ｍｇ／ｍｌ（ｓｉＲＮＡの濃度として算出される）の溶液として
調製した。０．９％塩化ナトリウム水溶液で複合体１を濃度０．２ｍｇ／ｍｌ及び０．０
６ｍｇ／ｍｌ（ｓｉＲＮＡの濃度として算出される）の溶液として調製した。
Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原診断キット（酵素結合免疫吸着測定法）（上海科華生物）を
用いてマウス血清におけるＨＢｓＡｇの含有量を検出し、Ｓ／ＣＯＶ＞１０のマウスを選
択し、６匹／群で２群にランダムに分け（いずれも雌性）、それぞれ対照群及び試験群と
記した。各群の動物について、１日目に各種の薬物を皮下注射し、投与体積は５ｍＬ／ｋ
ｇであった。体重に応じて投与体積を算出した。対照群に生理食塩水を注射し、試験群の
動物に複合体Ｇ２を注射し、用量は１ｍｇ／ｋｇであった。薬剤投与後の２８日目に全て
の動物を死亡させ、動物に対して肉眼解剖を行い、体内臓器に病変があるか否かを観察し
、肉眼で病変が観察された組織を１０％ホルマリンで保存してさらに病理観察を行い、肝
臓を回収し、ＲＮＡ ｌａｔｅｒ（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ社）で保存し、組織ホモ
ジナイザーで肝組織をホモジナイズし、さらにＴｒｉｚｏｌで全ＲＮＡ抽出の標準操作手
順により抽出して全ＲＮＡを得た。
蛍光定量的リアルタイムＰＣＲにより肝組織におけるＨＢＶ ｍＲＮＡの発現レベルを
検出した。具体的には、ＩｍＰｒｏｍ－ＩＩＴＭ逆転写キット（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を用
いてその説明書により抽出した全ＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写し、続いて、蛍光定量的ＰＣ
Ｒキット（北京康為世紀生物科技有限公司）を用い、ｓｉＲＮＡによる肝組織におけるＨ
ＢＶ ｍＲＮＡ発現に対する抑制効率を検出した。当該蛍光定量的ＰＣＲ法では、β－ア
クチン（β－ａｃｔｉｎ）遺伝子を内因性参照遺伝子とし、ＨＢＶに対するプライマー及
びβ－アクチンに対するプライマーを用いてそれぞれＨＢＶ及びβ－アクチンを検出した
。
検出プライマーの配列を表５Ａに示した。
当該蛍光定量的ＰＣＲ法では、ｓｉＲＮＡ抑制活性は、ＨＢＶ ｍＲＮＡ抑制率で表さ
れ、以下の等式により算出された。
ＨＢＶ ｍＲＮＡ抑制率＝（１－ＨＢＶ遺伝子発現残量）×１００％。
ＨＢＶ遺伝子発現残量＝（試験群ＨＢＶ遺伝子のコピー数／試験群β－アクチンのコピ
ー数）／（対照群ＨＢＶ遺伝子のコピー数／対照群β－アクチンのコピー数）×１００％
。
結果を以下の表６Ｇに示した。
同じ方法により、異なる用量の複合体１による体内（ｎ＝５）でのＨＢＶ ｍＲＮＡ発
現量に対する抑制効率を検出した。結果を以下の表６Ｇに示した。
Figure 2023134615000123
上記結果から分かるように、本開示の各実施例の複合体は、いずれも高いマウス体内で
のＨＢＶ ｍＲＮＡ抑制活性を示した。本開示のｓｉＲＮＡ複合体は、良好な体内送達効
率を有することも示された。
２）１）と同じ方法により、複合体Ｇ３～複合体Ｇ２０による体内でのＨＢＶ ｍＲＮ
Ａに対する抑制効率を検出し、複合体Ｇ３～複合体２０も、高いｍＲＮＡ抑制活性を有す
ることを予期できる。
（実験例Ｇ４）本実験では、本開示のｓｉＲＮＡ複合体によるＨＢＶモデルマウスにお
ける血清ＨＢｓＡｇ、ＨＢｅＡｇ及びＨＢＶ ＤＮＡ発現量に対する抑制効率の時間関連
性試験を説明している
本実験例に用いられるＨＢＶモデルマウスＣ５７Ｂ／６Ｎ－Ｔｇ（１．２８ＨＢＶ）／
Ｖｓｔ（遺伝子型Ａ型）は、北京維通達生物技術有限公司から購入された。０．９％塩化
ナトリウム水溶液で複合体１を濃度０．６ｍｇ／ｍｌ及び０．２ｍｇ／ｍｌ（ｓｉＲＮＡ
の濃度として算出される）の溶液として調製した。
血清におけるＨＢｓＡｇの含有量が１０４ＣＯＩ以上のマウス（雌雄がそれぞれ半分で
あった）を選択し、６匹／群で３群にランダムに分け、それぞれ対照群、高用量群及び低
用量群と記した。各群の動物について、１日目に各種の薬物を皮下注射し、投与体積は５
ｍＬ／ｋｇであった。体重に応じて投与体積を算出した。全ての動物について、いずれも
午前に投与し、採血する必要がある場合、採血後に投与した。対照群に対しては、生理食
塩水を注射し、試験群の動物に対しては、高用量群３ｍｇ／ｋｇ、低用量群１ｍｇ／ｋｇ
で異なる用量の複合体Ｇ１を注射した。薬剤投与前と薬剤投与後の７、１３、２１、２８
、４２、５６、７０、８４、９８、１１２、１２６、１４０、１５４日目にマウスに対し
て眼窩静脈叢採血を行い、各時点で血清ＨＢｓＡｇ、ＨＢｅＡｇ及びＨＢＶ ＤＮＡレベ
ルを検出した。
１回あたり約１００μｌ眼窩採血し、遠心後の血清が２０μｌ以上であり、ＰＢＳで５
００μｌに再懸濁させ、北京迪安医学検定センターに送って血清におけるＨＢｓＡｇ、Ｈ
ＢｅＡｇ及びＨＢＶ ＤＮＡの含有量を検出し、それぞれＣＯＩ、ＣＯＩ、ＩＵ／ｍｌで
表される。
被験指標（ＨＢｓＡｇ、ＨＢｅＡｇ及びＨＢＶ ＤＮＡ）の標準化レベルは、以下の等
式により算出された。
被験指標の標準化レベル＝（薬剤投与後の被験指標の残存含有量／薬剤投与前の被験指
標の含有量）×１００％
被験指標の抑制率＝（１－被験指標の標準化レベル）×１００％。
実験データは、いずれも
で表され、データ分析では、Ｇｒａｐｈｐａｄ ｐｒｉｓｍ５．０統計分析ソフトウェア
を採用した。まずデータに対して正規分布と等分散性検定を行った。正規分布を満たす（
ｐ＞０．２０）とともに分散が等しい（ｐ＞０．１０）場合、複数の群間の比較では、一
元配置分散分析によるＬＳＤ法により多重比較し、ｐ＜０．０５である場合、統計学的に
有意であるとみなした。正規分布を満たしておらず、又は分散が等しくない場合、複数の
群間の比較では、ノンパラメトリック検定であるＫｒｕｓｋａｌ－Ｗａｌｌｉｓ Ｈ方法
を採用し、Ｋｒｕｓｋａｌ－ｗａｌｌｉｓ Ｈ検定結果が有意（ｐ＜０．０５）である場
合、データをランク変換した後、複数の群間の一対比較を行い、ｐ＜０．０５である場合
、統計学的に有意であるとみなした。
結果を図６６～６８に示した。
図６６から分かるように、薬剤投与後の異なる時点で、生理食塩水が施された陰性対照
群は、血清表面抗原に対していかなる抑制作用も示さなかったのに対して、２つの用量で
の複合体１は、薬剤投与後の異なる時点でＨＢｓＡｇに対していずれも優れた抑制効果を
示した。高用量群については、単回薬剤投与後の１３日目に、ＨＢｓＡｇの最大抑制率が
９９．８％に達し、薬剤投与後の８４日間の長期間にわたって、ＨＢｓＡｇの抑制率は依
然として９０％以上に維持され、観察が完了するまで、ＨＢｓＡｇの抑制効率は依然とし
て８０．１％と高かった。低用量群については、薬剤投与後の１３日目に、ＨＢｓＡｇ最
大抑制率が９９．０％に達し、１５４日間の観察が完了するまで、ＨＢｓＡｇの抑制効率
は依然として６０．８％のレベルに達していた。
図６７から分かるように、複合体Ｇ１は、同様にＨＢｅＡｇの発現を抑制することがで
きた。高用量群については、薬剤投与後の７０日間で、血清ＨＢｅＡｇの発現に対する抑
制は５０％程度であり、１５４日間の観察が完了するまで、ＨＢｅＡｇの抑制効率は薬剤
投与前のレベルに戻っていなかった。
図６８から分かるように、複合体Ｇ１は、さらにＨＢＶ ＤＮＡの発現も効率よく抑制
することができ、１５４日間という長期間にわたって高い抑制率を維持した。高用量群に
ついては、単回薬剤投与後の１３日目に、ＨＢＶ ＤＮＡの最大抑制率が９９．２％に達
し、薬剤投与後の８４日間の長期間にわたって、ＨＢＶ ＤＮＡの抑制率は依然として９
０％以上に維持され、観察が完了するまで、ＨＢＶ ＤＮＡの抑制効率は依然として７７
．０％と高かった。低用量群については、薬剤投与後の１３日目に、ＨＢＶ ＤＮＡの最
大抑制率は９５．４％に達し、１５４日間の観察が完了するまで、ＨＢｓＡｇの抑制効率
は依然として７９．４％のレベルに達していた。
上記結果から、本開示の複合体は、ＨＢＶ遺伝子の発現を長期間安定的で効率的に抑制
することができ、特に、表面抗原に対する長期間の持続的な抑制に対して、優れた効果を
示すことが明らかになった。
以上に本開示の発明を実施するための形態を詳しく記載したが、本開示は、上記実施形
態の具体的な細部に限定されず、本開示の技術的思想の範囲で、本開示の技術的解決手段
に対して種々の簡単な変形が可能であり、これらの簡単な変形は、いずれも本開示の保護
範囲に属する。
このほかに説明すべきこととして、上記発明を実施するための形態に記載された各具体
的な技術的特徴は、矛盾がない場合、任意の適切な方法により組み合わせることができ、
不必要な重複を避けるために、本開示では各種の可能な組合せ方法を別途説明しない。
また、本開示の各種の異なる実施形態は任意に組み合わせることもでき、本開示の精神
から逸脱しない限り、その組み合わせも同様に、本開示に開示された内容とみなすべきで
ある。

Claims (1)

  1. センス鎖とアンチセンス鎖を含む二本鎖オリゴヌクレオチドであって、
    前記センス鎖及びアンチセンス鎖の各ヌクレオチドがいずれも修飾ヌクレオチドであり、前記センス鎖がヌクレオチド配列１を含み、前記アンチセンス鎖がヌクレオチド配列２を含み、前記ヌクレオチド配列１と前記ヌクレオチド配列２の長さがいずれも１９ヌクレオチドであり、前記ヌクレオチド配列１と前記ヌクレオチド配列２とが、少なくとも一部で逆相補的に二本鎖領域を形成し、前記ヌクレオチド配列２が、第１のヌクレオチド配列断片と少なくとも一部で逆相補的であり、前記第１のヌクレオチド配列断片が、標的ｍＲＮＡにおけるヌクレオチド配列断片であり、５’末端から３’末端に向かって、前記ヌクレオチド配列１の第７、８、９位のヌクレオチドがフルオロ修飾ヌクレオチドであり、前記ヌクレオチド配列１の他の位置の各ヌクレオチドが独立して非フルオロ修飾ヌクレオチドの１つであり、前記ヌクレオチド配列２の５’末端の１番目のヌクレオチドがアンチセンス鎖の５’末端の１番目のヌクレオチドであり、前記ヌクレオチド配列２の第２、６、１４、１６位のヌクレオチドがフルオロ修飾ヌクレオチドであり、前記ヌクレオチド配列２の他の位置の各ヌクレオチドが独立して非フルオロ修飾ヌクレオチドの１つである、二本鎖オリゴヌクレオチド。
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