ES2663635T3 - Modulación de la expresión de apolipoproteína CIII (APOCIII) - Google Patents

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Abstract

Un compuesto antisentido dirigido a ApoCIII que comprende un oligonucleótido modificado para su uso en la prevención, tratamiento, retraso o mejora de la pancreatitis en un sujeto, en donde el compuesto antisentido inhibe la expresión de ApoCIII en el sujeto, y en donde el oligonucleótido modificado comprende por lo menos una fracción de azúcar modificado, ligamiento inter-nucleósidos y/o nucleobase modificada.

Description

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El "Fredrickson Tipo I" existe en varias formas: el Tipo 1a es una deficiencia de lipoproteína lipasa debida a una deficiencia de LPL o apoC-II alterada; El Tipo 1b es una deficiencia de apoproteína CII familiar, una afección provocada por una carencia del activador de la lipoproteína lipasa; y el Tipo Ic es una quilomicronemia debida al inhibidor circulante de la lipoproteína lipasa. El Tipo I es un trastorno raro que habitualmente se presenta en la infancia. Está caracterizado por elevaciones severas de los quilomicrones y niveles de TG extremadamente elevados (superando siempre con creces los 1000 mg/dl y aumentando no pocas veces tanto como a 10.000 mg/dl
o más) con episodios de dolor abdominal, pancreatitis aguda recurrente, xantomas cutáneos eruptivos, y hepatoesplenomegalia. Los pacientes rara vez desarrollan aterosclerosis, quizás debido a que sus partículas de lipoproteína en plasma son demasiado grandes para entrar en la íntima arterial (Nordestgaard et al., J Lipid Res, 1988, 29: 1491 -1500; Nordestgaard et al., Arteriosclerosis, 1988, 8: 421 -428). El Tipo I está provocado habitualmente por mutaciones o del gen LPL o del cofactor del gen apoC-II, dando como resultado la incapacidad de los individuos afectados para producir LPL funcionalmente activa. Los pacientes son u homocigotos para tales mutaciones o compuestos heterocigotos. La prevalencia es de aproximadamente 1 en 1.000.000 en la población general y mucho más alta en Sudáfrica y el este de Quebec como resultado de un efecto fundador. Los pacientes responden mínimamente, o no lo hacen, a los fármacos que disminuyen los TG (Tremblay et al., J Clin Lipidol, 2011,
5: 37-44; Brisson y cols., Pharmacogenet Genom, 2010, 20: 742-747) y, por tanto, se usa la restricción de la grasa en la dieta a 20 gramos/día o menos para controlar los síntomas de este trastorno raro.
El "Fredrickson Tipo II" es la forma más común de hiperlipidemia primaria. Se clasifica adicionalmente en Tipo IIa y Tipo IIb, dependiendo principalmente de si hay elevación de VLDL además del colesterol LDL (LDL-C). El Tipo IIa (hipercolesterolemia familiar) puede ser esporádico (debido a factores dietéticos), poligénico o verdaderamente familiar como resultado de una mutación en el gen del receptor de LDL en el cromosoma 19 (0,2% de la población) o la apolipoproteína B (apoB) gen (0.2%). La forma familiar se caracteriza por xantoma de tendón, xantelasma y enfermedad cardiovascular prematura. La incidencia de esta enfermedad es de aproximadamente 1 en 500 para heterocigotos y 1 en 1.000.000 para homocigotos. El Tipo IIb (también conocido como hiperlipoproteinemia familiar combinada) es una hiperlipidemia mixta (colesterol y niveles de TG altos), provocado por elevaciones en LDL-C y en VLDL. Los altos niveles de VLDL se deben a la sobreproducción de sustratos, incluyendo TG, acetil CoA y un aumento en la síntesis de B-100. También pueden ser provocados por la disminución de la depuración de LDL. La prevalencia en la población es de aproximadamente 10%.
El "Fredrickson Tipo III" (también conocido como disbetalipoproteinemia) es una enfermedad de eliminación remanente, o enfermedad de beta amplia (Fern et al., J Clin Pathol, 2008, 61: 1174-118). Se debe a VLDL rica en colesterol (β-VLDL). Típicamente, los pacientes con esta afección tienen niveles elevados de colesterol y TG en plasma debido a la depuración deteriorada de los remanentes de quilomicrones y VLDL (por ejemplo, IDL). La depuración deteriorada es debida a un defecto en la apolipoproteína E (apoE). La apoE que funciona normalmente contenida en los remanentes permitiría el enlace al receptor de LDL y la eliminación de la circulación. La acumulación de los remanentes en individuos afectados puede dar como resultado xantomatosis y enfermedad coronaria y/o vascular periférica prematura. La causa más común para el Tipo III es la presencia del genotipo apoE E2/E2. Su prevalencia se ha estimado en aproximadamente 1 en 10.000.
El "Fredrickson Tipo IV" (también conocido como hipertrigliceridemia familiar) es una afección autosómica dominante que tiene lugar en aproximadamente el 1% de la población. Los niveles de TG son elevados como resultado del exceso de producción hepática de VLDL o deficiencia de LPL heterocigótica, pero son casi siempre menores de1000 mg/dl. Los niveles de colesterol en suero están habitualmente dentro de los límites normales. El trastorno es heterogéneo y el fenotipo está fuertemente influenciado por factores ambientales, particularmente el consumo de carbohidratos y etanol.
El "Fredrickson Tipo V" tiene VLDL y quilomicrones altos. Se caracteriza por portadores de variantes del gen de la LPL con pérdida de función asociados con la actividad de la LPL de por lo menos el 20% (es decir, deficiencia de LPL parcial en comparación con Fredrickson tipo I). Estos pacientes presentan plasma lactescente e hipertrigliceridemia severa debido a quilomicrones y VLDL. Los niveles de TG son invariablemente mayores de 1000 mg/dl y los niveles de colesterol total siempre son elevados. El nivel de LDL-C es habitualmente bajo. También se asocia con un riesgo aumentado de pancreatitis aguda, intolerancia a la glucosa e hiperuricemia. Los síntomas generalmente se presentan en la edad adulta (>35 años) y, aunque la prevalencia es relativamente rara, es mucho más común que los pacientes con deficiencia de LPL homocigoto o heterocigoto compuesta.
"Completamente complementario" o "100% complementario" significa que cada nucleobase de una secuencia de nucleobases de un primer ácido nucleico tiene una nucleobase complementaria en una segunda secuencia de nucleobases de un segundo ácido nucleico. En ciertas realizaciones, un primer ácido nucleico es un compuesto antisentido y un segundo ácido nucleico es un ácido nucleico objetivo.
"Gapmer" significa un compuesto antisentido quimérico en el que una región interna que tiene una pluralidad de nucleósidos que soportan la escisión de RNasa H está posicionada entre regiones externas que tienen uno o más nucleósidos, en donde los nucleósidos que comprenden la región interna son químicamente distintos del nucleósido o nucleósidos que comprenden las regiones externas. La región interna se puede denominar "gap" o
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"segmento gap" y las regiones externas se pueden denominar "alas" o "segmentos de ala".
"Gap-ampliado" significa un compuesto antisentido quimérico que tiene un segmento gap de 12 o más 2'desoxirribonucleósidos contiguos situados entre e inmediatamente adyacentes a los segmentos de ala 5' y 3' que tiene de uno a seis nucleósidos.
"Glucosa" es un monosacárido utilizado por las células como fuente de energía e intermediario inflamatorio. "Glucosa en plasma" se refiere a la glucosa presente en el plasma.
"Llipoproteína C de alta densidad (HDL-C)" significa colesterol asociado con partículas de lipoproteínas de alta densidad. La concentración de HDL-C en suero (o plasma) se cuantifica típicamente en mg/dl o nmol/l. "HDL-C" y " HDL-C en plasma " significan HDL-C en suero y plasma, respectivamente.
"Inhibidor de HMG-CoA reductasa" significa un agente que actúa a través de la inhibición de la enzima HMG-CoA reductasa, como atorvastatina, rosuvastatina, fluvastatina, lovastatina, pravastatina y simvastatina.
"Hibridación" significa el apareamiento de moléculas de ácido nucleico complementarias. En ciertas realizaciones, las moléculas de ácido nucleico complementarias incluyen un compuesto antisentido y un ácido nucleico objetivo.
"Hipercolesterolemia" significa una afección caracterizada por colesterol o colesterol circulante (plasma), colesterol LDL y colesterol VLDL elevados, según las pautas del Expert Panel Report of the National Cholesterol Educational Program (NCEP) of Detection, Evaluation of Treatment of high cholesterol in adults (ver, Arch. Int. Med. (1988) 148, 36-39).
"Hiperlipidemia" o "hiperlipemia" es una afección caracterizada por niveles elevados de lípidos en suero o lípidos circulantes (en plasma). Esta afección manifiesta una concentración anormalmente alta de grasas. Las fracciones de lípidos en la sangre circulante son colesterol, lipoproteínas de baja densidad, lipoproteínas de muy baja densidad, quilomicrones y triglicéridos. La clasificación de hiperlipidemias de Fredrickson se basa en el patrón de TG y partículas de lipoproteínas ricas en colesterol, como se mide por electroforesis o ultracentrifugación, y se usa comúnmente para caracterizar las causas principales de hiperlipidemias como la hipertrigliceridemia (Fredrickson y Lee, Circulation, 1965, 31: 321 -327 ; Fredrickson et al., New Eng J Med, 1967, 276 (1): 34-42).
"Hipertrigliceridemia" significa una condición caracterizada por niveles elevados de triglicéridos. Su etiología incluye factores primarios (es decir, causas genéticas) y secundarios (otras causas subyacentes, como diabetes, síndrome metabólico/resistencia a la insulina, obesidad, inactividad física, tabaquismo, exceso de alcohol y una dieta muy alta en hidratos de carbono) o, más a menudo, una combinación de ambos (Yuan et al. CMAJ, 2007, 176: 11131120).
"Identificar" o "seleccionar un animal con enfermedad metabólica o cardiovascular" significa identificar o seleccionar un sujeto propenso a o al que se le ha diagnosticado una enfermedad metabólica, una enfermedad cardiovascular o un síndrome metabólico; o, identificar o seleccionar un sujeto que tenga cualquier síntoma de una enfermedad metabólica, enfermedad cardiovascular o síndrome metabólico, incluyendo, pero no limitado a, hipercolesterolemia, hiperglucemia, hiperlipidemia, hipertrigliceridemia, hipertensión, resistencia a la insulina aumentada, sensibilidad a la insulina disminuida, peso corporal superior al normal y/o contenido de grasas corporal por encima del normal o cualquier combinación de los mismos. Dicha identificación puede lograrse mediante cualquier método, incluyendo, pero no limitado a, pruebas o evaluaciones clínicas estándar, como medición del colesterol en suero o circulante (plasma), medición de triglicéridos en suero o circulantes (plasma), medición de presión sanguínea, medición de contenido de grasas corporal, medición del peso corporal, y similares.
"Resultado cardiovascular mejorado" significa una reducción en la ocurrencia de eventos cardiovasculares adversos, o el riesgo de los mismos. Los ejemplos de eventos cardiovasculares adversos incluyen, sin limitación, muerte, reinfarto, apoplejía, choque cardiogénico, edema pulmonar, paro cardíaco y arritmia auricular.
"Inmediatamente adyacente" significa que no hay elementos intermedios entre los elementos inmediatamente adyacentes, por ejemplo, entre regiones, segmentos, nucleótidos y/o nucleósidos.
"Aumentar HDL" o "elevar HDL" significa aumentar el nivel de HDL en un animal después de la administración de por lo menos un compuesto de la invención, en comparación con el nivel de HDL en un animal al que no se le ha administrado ningún compuesto.
"Individuo" o "sujeto" o "animal" significa un animal humano o no humano seleccionado para tratamiento o terapia.
"Inducir", "inhibir", "potenciar", "elevar", "aumentar", "disminuir", "reducir" o similares denotan diferencias
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cuantitativas entre dos estados. Por ejemplo, "una cantidad eficaz para inhibir la actividad o expresión de ApoCIII" significa que el nivel de actividad o expresión de ApoCIII en una muestra tratada diferirá del nivel de actividad o expresión de ApoCIII en una muestra no tratada. Tales términos se aplican a, por ejemplo, niveles de expresión, y niveles de actividad.
"Inhibir la expresión o actividad" se refiere a una reducción o bloqueo de la expresión o actividad de un ARN
o proteína y no indica necesariamente una eliminación total de la expresión o actividad.
"Resistencia a la insulina" se define como la condición en la que las cantidades normales de insulina son inadecuadas para producir una respuesta a la insulina normal de las células grasas, musculares y hepáticas. La resistencia a la insulina en las células grasas da como resultado la hidrólisis de triglicéridos almacenados, que eleva los ácidos grasos libres en el plasma sanguíneo. La resistencia a la insulina en el músculo reduce la captación de glucosa, mientras que la resistencia a la insulina en el hígado reduce el almacenamiento de glucosa, sirviendo ambos efectos para elevar la glucosa en sangre. Los niveles en plasma altos de insulina y glucosa debidos a la resistencia a la insulina llevan a menudo al síndrome metabólico y diabetes tipo 2.
"Sensibilidad a la insulina" es una medida de la eficacia con la que un individuo procesa la glucosa. Un individuo que tiene alta sensibilidad a la insulina procesa la glucosa de manera eficaz, mientras que un individuo con baja sensibilidad a la insulina no procesa la glucosa eficazmente.
"Ligamiento inter-nucleósidos" se refiere al enlace químico entre nucleósidos.
"Administración intravenosa" significa la administración en una vena.
"Nucleósidos ligados" significa nucleósidos adyacentes que están enlazados entre sí.
"Disminución de lípidos" significa una reducción en uno o más lípidos en un sujeto. "Elevación de lípidos" significa un aumento en un lípido (por ejemplo, HDL) en un sujeto. La disminución de lípidos o la elevación de lípidos puede tener lugar con una o más dosis a lo largo del tiempo.
"Terapia de disminución de lípidos" o "agente reductor de lípidos" significa un régimen terapéutico proporcionado a un sujeto para reducir uno o más lípidos en un sujeto. En ciertas realizaciones, se proporciona una terapia hipolipemiante para reducir uno o más de CETP, ApoB, colesterol total, LDL-C, VLDL-C, IDL-C, no-HDL-C, triglicéridos, partículas de LDL densas pequeñas, y Lp(a) en un sujeto. Los ejemplos de terapia hipolipemiante incluyen estatinas, fibratos, inhibidores de MTP.
"Llipoproteína", como VLDL, LDL y HDL, se refiere a un grupo de proteínas que se encuentran en el suero, el plasma y la linfa y son importantes para el transporte de lípidos. La composición química de cada lipoproteína difiere en que el HDL tiene una mayor proporción de proteína frente a los lípidos, mientras que el VLDL tiene una menor proporción de proteína frente a los lípidos.
"Lipoproteína-colesterol de baja densidad (LDL-C)" significa colesterol transportado en partículas de lipoproteínas de baja densidad. La concentración de LDL-C en suero (o plasma) típicamente se cuantifica en mg/dl o nmol/l. "LDL-C en suero" y "LDL-C en plasma" significan LDL-C en el suero y plasma, respectivamente.
"Factores de riesgo principales" se refiere a factores que contribuyen a un riesgo alto de una enfermedad o afección en particular. En ciertas realizaciones, los principales factores de riesgo para enfermedad cardíaca coronaria incluyen, sin limitación, tabaquismo, hipertensión, HDL-C bajo, antecedentes familiares de enfermedad cardíaca coronaria, edad y otros factores divulgados en la presente.
"Trastorno metabólico" o "enfermedad metabólica" se refiere a una afección caracterizada por una alteración o perturbación en la función metabólica. "Metabólico" y "metabolismo" son términos bien conocidos en la técnica e incluyen generalmente el rango completo de procesos bioquímicos que se producen dentro de un organismo vivo. Los trastornos metabólicos incluyen, pero no están limitados a, hiperglucemia, prediabetes, diabetes (tipo 1 y tipo 2), obesidad, resistencia a la insulina, síndrome metabólico y dislipidemia debido a diabetes tipo 2.
"Síndrome metabólico" significa una afección caracterizada por un agrupamiento de factores de riesgo cardiovascular de lípidos y no de lípidos de origen metabólico. En ciertas realizaciones, el síndrome metabólico se identifica por la presencia de cualquiera de 3 de los siguientes factores: circunferencia de cintura mayor de 102 cm en hombres o mayor de 88 cm en mujeres; triglicéridos en suero de por lo menos 150 mg/dl; HDL-C menor de 40 mg/dl en hombres o menos de 50 mg/dl en mujeres; presión sanguínea de por lo menos 130/85 mmHg; y glucosa en ayunas de por lo menos 110 mg/dl. Estos determinantes pueden medirse fácilmente en la práctica clínica (JAMA, 2001, 285: 2486-2497).
"Desemparejamiento" o "nucleobase no complementaria" se refiere al caso en el que una nucleobase de un
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"Cambio de estilo de vida terapéutico" significa cambios en la dieta y el estilo de vida destinados a disminuir la masa de grasa/tejido adiposo y/o el colesterol. Dicho cambio puede reducir el riesgo de desarrollar enfermedades cardíacas, y puede incluir recomendaciones para la ingesta dietética de calorías diarias totales, grasa total, grasas saturadas, grasas poliinsaturadas, grasas monoinsaturadas, carbohidratos, proteínas, colesterol, fibra insoluble, así como recomendaciones para la actividad física.
"Tratar" se refiere a administrar un compuesto de la invención para efectuar una alteración o mejora de una enfermedad, trastorno o afección.
"Triglicérido" o "TG" significa un lípido o grasa neutra que consiste de glicerol combinado con tres moléculas de ácido graso.
"Diabetes tipo 2" (también conocida como "diabetes mellitus tipo 2", "diabetes mellitus, tipo 2", "diabetes no dependiente de insulina (NIDDM)", "diabetes relacionada con la obesidad" o "diabetes de aparición en adultos") es un trastorno metabólico que se caracteriza principalmente por resistencia a la insulina, deficiencia relativa de insulina e hiperglucemia.
"Nucleótido no modificado" significa un nucleótido compuesto por nucleobases de origen natural, fracciones de azúcar y ligamientos inter-nucleósidos. En ciertas realizaciones, un nucleótido no modificado es un nucleótido de ARN (es decir, β-D-ribonucleósidos) o un nucleótido de ADN (es decir, β-D-desoxirribonucleósido).
"Segmento de ala" significa uno o una pluralidad de nucleósidos modificados para impartir a un oligonucleótido propiedades como actividad inhibidora aumentada, afinidad de enlace incrementada por un ácido nucleico objetivo, o resistencia a la degradación por nucleasas in vivo.
Cierta Realización de la Divulgación
En la presente se divulga un método para reducir los niveles de ApoCIII en un animal administrando un compuesto al animal dirigido a ApoCIII, disminuyendo de este modo los niveles de ApoCIII. En ciertas realizaciones, los niveles de ApoCIII se reducen en el hígado o el intestino delgado.
En la presente se divulga un método para aumentar los niveles de HDL y/o mejorar la proporción de TG a HDL en un animal administrando un compuesto al animal en donde el compuesto se dirige a ApoCIII y aumenta los niveles de HDL y/o mejora la proporción de TG a HDL.
En la presente se divulga un método para prevenir, retrasar o mejorar una enfermedad, trastorno, afección,
o síntoma de los mismos, cardiovascular en un animal que comprende administrar un compuesto dirigido a ApoCIII al animal, en donde el compuesto administrado al animal previene, trata o mejora la enfermedad, trastorno, afección
o síntoma cardiovascular en el animal aumentando los niveles de HDL en el animal y/o mejorando la proporción de TG a HDL.
En la presente se divulga un método para prevenir, retrasar o mejorar una pancreatitis en un animal que comprende administrar un compuesto dirigido a ApoCIII al animal, donde el compuesto administrado al animal previene, trata o mejora la pancreatitis en el animal aumentando los niveles de HDL en el animal y/o mejorando la proporción de TG a HDL. En ciertas realizaciones, la pancreatitis es pancreatitis aguda.
En la presente se divulga un método para prevenir, tratar, mejorar, retrasar la aparición o reducir el riesgo de una enfermedad, trastorno o afección cardiovascular en un animal, que comprende administrar al animal un compuesto que se dirige a ApoCIII, en el que el compuesto evita, trata, mejora, retrasa la aparición o reduce el riesgo de enfermedad cardiovascular, trastorno o afección en el animal aumentando los niveles de HDL en el animal y/o mejorando la proporción de TG a HDL.
En la presente se divulga un método para disminuir los niveles de CETP administrando un compuesto dirigido a ApoCIII a un animal.
En la presente se divulga un método para aumentar ApoA1, PON1, depuración de grasa, depuración de triglicéridos de quilomicrones y/o HDL administrando un compuesto dirigido a ApoCIII a un animal. En la presente se divulga un método para mejorar la proporción de TG a HDL.
En ciertas realizaciones, el ácido nucleico de ApoCIII es cualquiera de las secuencias expuestas en el Nº de Acceso de GENBANK NM_000040.1 (incorporada en la presente como SEQ ID NO: 1), y el Nº de Acceso GENBANK NT_033899.8 truncado de los nucleótidos 20262640 a 20266603 (incorporado en la presente como SEQ ID NO: 2).
En ciertas realizaciones, el compuesto dirigido a ApoCIII es un oligonucleótido modificado. En realizaciones
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En realizaciones adicionales, los síntomas de una enfermedad cardiovascular incluyen, pero no están limitados a, angina de pecho; dolor de pecho; dificultad para respirar; palpitaciones; debilidad; mareo; náusea; transpiración; taquicardia; bradicardia; arritmia; fibrilación auricular; hinchazón en las extremidades inferiores; cianosis; fatiga; desmayo; entumecimiento de la cara; entumecimiento de las extremidades; claudicación o calambres de los músculos; hinchazón del abdomen; o fiebre
En la presente se divulga un método para aumentar los niveles de HDL y/o mejorar la proporción de TG a HDL en un animal administrando al animal un compuesto que consiste en la secuencia de la nucleobase de ISIS 304801 (SEQ ID NO: 3). También se divulga en la presente un método para prevenir, tratar, mejorar o reducir por lo menos un síntoma de una enfermedad cardiovascular en un animal administrando al animal un compuesto que consiste de la secuencia de nucleobases de ISIS 304801 (SEQ ID NO: 3), aumentando de este modo los niveles de HDL y/o mejorando la proporción de TG a HDL en el animal.
En la presente se divulga un método para aumentar los niveles de HDL y/o mejorar la proporción de TG a HDL en un animal administrando al animal un oligonucleótido modificado que tiene la secuencia de ISIS 304801, en donde el oligonucleótido modificado comprende: (i) un segmento gap que consiste de diez desoxinucleósidos ligados; (ii) un segmento de ala 5' que consiste en cinco nucleósidos ligados; (iii) un segmento de ala 3' que consiste de cinco nucleósidos ligados, en donde el segmento gap está situado inmediatamente adyacente a y entre el segmento de ala 5' y el segmento de ala 3', en donde cada nucleósido de cada segmento de ala comprende un azúcar 2'-O-metoxietil, en donde cada citosina es una 5'-metilcitosina, y en donde cada ligamiento inter-nucleósidos es un ligamiento fosforotioato.
En la presente se divulga un método para prevenir, tratar, mejorar o reducir por lo menos un síntoma de una enfermedad cardiovascular en un animal administrando al animal un oligonucleótido modificado que tiene la secuencia de ISIS 304801 (SEQ ID NO: 3), en donde el oligonucleótido modificado del compuesto comprende: (i) un segmento gap que consiste de diez desoxinucleósidos ligados; (ii) un segmento de ala 5' que consiste de cinco nucleósidos ligados; (iii) un segmento de ala 3' que consiste de cinco nucleósidos ligados, en donde el segmento gap está situado inmediatamente adyacente a y entre el segmento de ala 5' y el segmento de ala 3', en donde cada nucleósido de cada segmento de ala comprende un azúcar 2'-O-metoxietil, en donde cada citosina es una 5'metilcitosina, y en donde cada ligamiento inter-nucleósidos es un ligamiento fosforotioato.
En la presente se divulga un método para elevar los niveles de HDL y/o mejorar la proporción de TG a HDL en un animal administrando al animal un compuesto que comprende un oligonucleótido modificado que consiste de 12 a 30 nucleósidos ligados, en donde el oligonucleótido modificado es complementario a un ácido nucleico de ApoCIII. En ciertas realizaciones, el ácido nucleico de ApoCIII es la SEQ ID NO: 1 o la SEQ ID NO: 2. En ciertas realizaciones, el oligonucleótido modificado es por lo menos un 80%, por lo menos un 85%, por lo menos un 90%, por lo menos un 95%, por lo menos un 98% o por lo menos un 100% complementario a la SEQ ID NO: 1 o la SEQ ID NO: 2.
En la presente se divulga un método para prevenir, tratar, mejorar o reducir por lo menos un síntoma de una enfermedad cardiovascular en un animal mediante la administración al animal de un compuesto que comprende un oligonucleótido modificado que consiste de 12 a 30 nucleósidos ligados, en donde el oligonucleótido modificado es complementario a un ácido nucleico de ApoCIII, y eleva los niveles de HDL en el animal. En ciertas realizaciones, el ácido nucleico de ApoCIII es la SEQ ID NO: 1 o la SEQ ID NO: 2. En ciertas realizaciones, el oligonucleótido modificado es por lo menos un 80%, por lo menos un 85%, por lo menos un 90%, por lo menos un 95%, por lo menos un 98% o por lo menos un 100% complementario a la SEQ ID NO: 1 o la SEQ ID NO: 2.
En la presente se divulga un método para disminuir los niveles de CETP administrando un compuesto dirigido a ApoCIII a un animal. En ciertas realizaciones, el compuesto comprende un oligonucleótido modificado que consiste de 12 a 30 nucleósidos ligados, en donde el oligonucleótido modificado es complementario a un ácido nucleico de ApoCIII. En ciertas realizaciones, el ácido nucleico de ApoCIII es o la SEQ ID NO: 1 o la SEQ ID NO: 2. En ciertas realizaciones, el oligonucleótido modificado es por lo menos un 80%, por lo menos un 85%, por lo menos un 90%, por lo menos un 95%, por lo menos un 98% o por lo menos un 100% complementario a la SEQ ID NO: 1 o la SEQ ID NO: 2. En ciertas realizaciones, el compuesto comprende un oligonucleótido modificado que consiste de 12 a 30 nucleósidos ligados y tiene una secuencia de nucleobases que comprende por lo menos 8 nucleobases contiguas de ISIS 304801 (SEQ ID NO: 3). En ciertas realizaciones, el compuesto consiste de las nucleobases de ISIS 304801 (SEQ ID NO: 3).
En la presente se divulga un método para aumentar ApoA1, PON1, depuración de grasa, depuración de triglicéridos de quilomicrones y/o HDL administrando un compuesto dirigido a ApoCIII a un animal. En ciertas realizaciones, el compuesto comprende un oligonucleótido modificado que consiste de 12 a 30 nucleósidos ligados, en donde el oligonucleótido modificado es complementario a un ácido nucleico de ApoCIII. En ciertas realizaciones, el ácido nucleico de ApoCIII es o la SEQ ID NO: 1 o la SEQ ID NO: 2. En ciertas realizaciones, el oligonucleótido modificado es por lo menos un 80%, por lo menos un 85%, por lo menos un 90%, por lo menos un 95%, por lo menos un 98% o por lo menos un 100% complementario a la SEQ ID NO: 1 o la SEQ ID NO: 2. En ciertas
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objetivo. Por ejemplo, una región objetivo puede abarcar un UTR 3', un UTR 5', un exón, un intrón, una unión exón/intrón, una región codificante, una región de inicio de la traducción, una región de terminación de la traducción u otra región de ácido nucleico definida. Las regiones estructuralmente definidas para ApoCIII pueden obtenerse por número de acceso de bases de datos de secuencias como. En ciertas realizaciones, una región objetivo puede abarcar la secuencia desde un sitio objetivo 5' de un segmento objetivo dentro de la región objetivo hasta un sitio objetivo 3' de otro segmento objetivo dentro de la región objetivo.
En ciertas realizaciones, un "segmento objetivo" es una sub-porción más pequeña de una región objetivo dentro de un ácido nucleico. Por ejemplo, un segmento objetivo puede ser la secuencia de nucleótidos de un ácido nucleico objetivo al que se dirigen uno o más compuestos antisentido. "Sitio objetivo 5'" se refiere al nucleótido más 5' de un segmento objetivo. "Sitio objetivo3'" se refiere al nucleótido más 3' de un segmento objetivo.
Una región objetivo puede contener uno o más segmentos objetivo. Se pueden superponer múltiples segmentos objetivo dentro de una región objetivo. Alternativamente, pueden no superponerse. En ciertas realizaciones, los segmentos objetivo dentro de una región objetivo están separados por no más de aproximadamente 300 nucleótidos. En ciertas realizaciones, los segmentos objetivo dentro de una región objetivo están separados por un número de nucleótidos que es, es aproximadamente, no es más que, no es más que aproximadamente, 250, 200, 150, 100, 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 20 ó 10 nucleótidos en el ácido nucleico objetivo, o es un intervalo definido por dos cualquiera de los valores anteriores. En ciertas realizaciones, los segmentos objetivo dentro de una región objetivo están separados por no más de, o no más de aproximadamente, 5 nucleótidos en el ácido nucleico objetivo. En ciertas realizaciones, los segmentos objetivo son contiguos. Se contemplan regiones objetivo definidas por un intervalo que tiene un ácido nucleico de partida que es cualquiera de los sitios objetivo 5' o sitios objetivo 3' enumerados en la presente.
El direccionamiento incluye la determinación de por lo menos un segmento objetivo al que hibrida un compuesto antisentido, de manera que tiene lugar un efecto deseado. En ciertas realizaciones, el efecto deseado es una reducción en los niveles de ácido nucleico objetivo de ARNm. En ciertas realizaciones, el efecto deseado es la reducción de los niveles de proteína codificada por el ácido nucleico objetivo o un cambio fenotípico asociado con el ácido nucleico objetivo.
Se pueden encontrar segmentos objetivo adecuados dentro de un UTR 5 ', una región codificante, un UTR 3', un intrón, un exón o una unión exón/intrón. Los segmentos objetivo que contienen un codón de inicio o un codón de terminación también son segmentos objetivo adecuados. Un segmento objetivo adecuado puede excluir específicamente una cierta región estructuralmente definida tal como el codón de inicio o el codón de terminación.
La determinación de segmentos objetivo adecuados puede incluir una comparación de la secuencia de un ácido nucleico objetivo con otras secuencias en todo el genoma. Por ejemplo, el algoritmo BLAST puede usarse para identificar regiones de similitud entre diferentes ácidos nucleicos. Esta comparación puede evitar la selección de secuencias de compuestos antisentido que puedan hibridar de una manera no específica con secuencias distintas de las de un ácido nucleico objetivo seleccionado (es decir, secuencias no objetivo o fuera del objetivo).
Puede haber variación en la actividad (por ejemplo, como se define mediante por reducción porcentual de los niveles de ácido nucleico objetivo) de los compuestos antisentido dentro de una región objetivo activa. En ciertas realizaciones, las reducciones en los niveles de ARNm de ApoCIII son indicativos de la inhibición de la expresión de la ApoCIII. Las reducciones en los niveles de una proteína ApoCIII pueden ser indicativas de la inhibición de la expresión del ARNm objetivo. Además, los cambios fenotípicos pueden ser indicativos de inhibición de la expresión de ApoCIII. Por ejemplo, un aumento en los niveles de HDL, disminución en los niveles de LDL, o disminución en los niveles de triglicéridos, se encuentran entre los cambios fenotípicos que pueden ensayarse para la inhibición de la expresión de ApoCIII. También pueden evaluarse, otras indicaciones fenotípicas, por ejemplo, síntomas asociados con una enfermedad cardiovascular; por ejemplo, angina de pecho; dolor de pecho; dificultad para respirar; palpitaciones; debilidad; mareo; náusea; transpiración; taquicardia; bradicardia; arritmia; fibrilación auricular; hinchazón en las extremidades inferiores; cianosis; fatiga; desmayo; entumecimiento de la cara; entumecimiento de las extremidades; claudicación o calambres de los músculos; hinchazón del abdomen; o fiebre
Hibridación
En algunas realizaciones, la hibridación tiene lugar entre un compuesto antisentido divulgado en la presente y un ácido nucleico ApoCIII. El mecanismo más común de hibridación implica enlaces de hidrógeno (por ejemplo, Watson-Crick, Hoogsteen o enlaces de hidrógeno invertidos de Hoogsteen) entre nucleobases complementarias de las moléculas de ácido nucleico.
La hibridación puede tener lugar bajo diferentes condiciones. Las condiciones rigurosas son dependientes de la secuencia y están determinadas por la naturaleza y la composición de las moléculas de ácido nucleico a hibridar.
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Los métodos para determinar si una secuencia es específicamente hibridable con un ácido nucleico objetivo son bien conocidos en la técnica (Sambrooke y Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3ª edición, 2001). En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido divulgados en la presente son específicamente hibridables con un ácido nucleico de ApoCIII.
Complementariedad
Un compuesto antisentido y un ácido nucleico objetivo son complementarios entre sí cuando un número suficiente de nucleobases del compuesto antisentido puede enlazarse por hidrógenos con las nucleobases correspondientes del ácido nucleico objetivo, de manera que se producirá un efecto deseado (por ejemplo, inhibición antisentido de un ácido nucleico objetivo, como un ácido nucleico de ApoCIII).
Un compuesto antisentido puede hibridar sobre uno o más segmentos de un ácido nucleico de ApoCIII de tal manera que los segmentos intermedios o adyacentes no están implicados en el evento de hibridación (por ejemplo, una estructura de giro, desemparejamiento o estructura en horquilla).
En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido divulgados en la presente, o una porción específica de los mismos, son, o son por lo menos, un 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% complementarios a un ácido nucleico de ApoCIII, una región objetivo, un segmento objetivo o una porción específica de los mismos. El porcentaje de complementariedad de un compuesto antisentido con un ácido nucleico objetivo puede determinarse usando métodos rutinarios.
Por ejemplo, un compuesto antisentido en el que 18 de 20 nucleobases del compuesto antisentido son complementarias a una región objetivo, y por lo tanto hibridarían específicamente, representarían un 90 por ciento de complementariedad. En este ejemplo, las nucleobases no complementarias restantes pueden estar agrupadas o intercaladas con nucleobases complementarias y no necesitan ser contiguas entre sí o a nucleobases complementarias. Como tal, un compuesto antisentido que tiene una longitud de 18 nucleobases que tiene 4 (cuatro) nucleobases no complementarias que están flanqueadas por dos regiones de complementariedad completa con el ácido nucleico objetivo tendría un 77,8% de complementariedad global con el ácido nucleico objetivo y por tanto caería dentro del alcance de la presente invención. El porcentaje de complementariedad de un compuesto antisentido con una región de un ácido nucleico objetivo puede determinarse rutinariamente usando programas BLAST (herramientas de búsqueda de alineación local básica) y los programas PowerBLAST conocidos en la técnica Altschul et al., J. Mol. Biol., 1990, 215, 403 410 ; Zhang y Madden, Genome Res., 1997, 7, 649 656). El porcentaje de homología, identidad de secuencia o complementariedad, puede determinarse mediante, por ejemplo, el programa Gap (Wisconsin Sequence Analysis Package, Versión 8 para Unix, Genetics Computer Group, University Research Park, Madison, WI), utilizando la configuración predeterminada, que utiliza la algoritmo de Smith y Waterman (Adv. Appl. Math., 1981, 2, 482 -489).
En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido divulgados en la presente, o porciones específicas de los mismos, son completamente complementarios (es decir, 100% complementarios) a un ácido nucleico objetivo, o una porción específica del mismo. Por ejemplo, un compuesto antisentido puede ser completamente complementario a un ácido nucleico de ApoCIII, o una región objetivo, o un segmento objetivo o secuencia objetivo del mismo. Como se usa en la presente, "completamente complementario" significa que cada nucleobase de un compuesto antisentido es capaz de emparejar bases precisas con las nucleobases correspondientes de un ácido nucleico objetivo. Por ejemplo, un compuesto antisentido de 20 nucleobases es completamente complementario a una secuencia objetivo que tiene una longitud de 400 nucleobases, siempre que haya una porción de 20 nucleobases correspondiente del ácido nucleico objetivo que sea completamente complementaria al compuesto antisentido. Completamente complementario también puede usarse en referencia a una porción especificada del primer y/o el segundo ácido nucleico. Por ejemplo, una porción de 20 nucleobases de un compuesto antisentido de 30 nucleobases puede ser "completamente complementaria" a una secuencia objetivo que es de de 400 nucleobases de longitud. La porción de 20 nucleobases del oligonucleótido de 30 nucleobases es completamente complementaria a la secuencia objetivo si la secuencia objetivo tiene una porción de 20 nucleobases correspondiente en la que cada nucleobase es complementaria a la porción de 20 nucleobases del compuesto antisentido. Al mismo tiempo, el compuesto antisentido de 30 nucleobases completo puede o no ser completamente complementario a la secuencia objetivo, dependiendo de si las 10 nucleobases restantes del compuesto antisentido también son complementarias a la secuencia objetivo.
La localización de una nucleobase(s) no complementaria puede estar en el extremo 5' o en el extremo 3' del compuesto antisentido. Alternativamente, la nucleobase(s) no complementaria puede estar en una posición interna del compuesto antisentido. Cuando hay dos o más nucleobases no complementarias, pueden ser contiguas (es decir, ligadas) o no contiguas. En una realización, una nucleobase no complementaria está localizada en el segmento de ala de un oligonucleótido antisentido gapmer.
En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido que son, o son de hasta 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ó 20 nucleobases de longitud comprenden no más de 4, no más de 3, no más de 2 , o no más de 1 nucleobase(s) no
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en donde Bx es la fracción de base y R es independientemente H, un grupo protector o alquilo C1-C12 . En ciertas realizaciones, se proporcionan nucleósidos bicíclicos que tienen la Fórmula I:
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25 en donde:
Bx es una fracción de base heterocíclico; -Qa -Q b -Qc -es -CH2-N(Rc)CH2-, -C(=O)-N(Rc)-CH2-, -CH2-O-N(Rc)-, CH2-N(Rc)-O-o -N(Rc)-O-CH2; Rc es alquilo C1-C12 o un grupo protector amino; y Ta y Tb son cada uno, independientemente H, un grupo protector hidroxilo, un grupo conjugado, un grupo de fósforo reactivo, una fracción de fósforo o una unión covalente a un medio de soporte.
En ciertas realizaciones, se proporcionan nucleósidos bicíclicos que tienen la Fórmula II: 35
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45 en donde:
Bx es una fracción de base heterocíclica; Ta y Tb son cada uno, independientemente H, un grupo protector hidroxilo, un grupo conjugado, un grupo de fósforo reactivo, una fracción de fósforo o una unión covalente a un medio de soporte; Za es alquilo C1-C6 , alquenilo C2-C6 , alquinilo C2-C6 , alquilo C1-C6 sustituido, alquenilo C2-C6, alquinilo C2-C6 sustituido, acilo, acilo sustituido, amida sustituida, tiol o tiol sustituido.
En una realización, cada uno de los grupos sustituidos está, independientemente, mono o poli sustituido con grupos sustituyentes seleccionados independientemente de halógeno, oxo, hidroxilo, OJc , NJcJd , SJc ,N3 , 55 OC(=X)Jc , y NJeC(=X)NJcJd, en donde cada Jc , Jd y Je es, independientemente, H, alquilo C1-C6 , o alquilo C1
6 sustituido y X es O o NJc .
En ciertas realizaciones, se proporcionan nucleósidos bicíclicos que tienen la Fórmula III:
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ARN son bien conocidos en la técnica (Sambrooke y Russell en Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Tercera edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York, 2001). El ARN se prepara usando métodos bien conocidos en la técnica, por ejemplo, usando el Reactivo TRIZOL® (Invitrogen, Carlsbad, CA) de acuerdo con los protocolos recomendados por el fabricante.
Análisis de la Inhibición de Niveles o Expresión objetivo
La inhibición de los niveles o la expresión de un ácido nucleico de ApoCIII se puede ensayar de varias maneras conocidas en la técnica (Sambrooke y Russell en Molecular Cloning, A Laborator y Manual, Tercera Edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York. 2001) Por ejemplo, los niveles de ácido nucleico objetivo pueden cuantificarse mediante, por ejemplo, análisis de transferencia Northern, reacción en cadena de la polimerasa competitiva (PCR) o PCR cuantitativa en tiempo real. El análisis de ARN puede realizarse en ARN celular total o ARNm poli(A)+. Los métodos de aislamiento de ARN son bien conocidos en la técnica. El análisis de transferencia Northern también es rutinario en la técnica. La PCR cuantitativa en tiempo real se puede llevar a cabo convenientemente usando el Sistema de Detección de Secuencias ABI PRISM® 7600, 7700 o 7900 comercialmente disponible, disponible de PE-Applied Biosystems, Foster City, CA y usado de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
Análisis PCR en Tiempo Real Cuantitativa de los Niveles de ARN Objetivo
La cuantificación de los niveles de ARN objetivo se puede realizar mediante PCR en tiempo real cuantitativa usando el sistema de detección de secuencia ABI PRISM® 7600, 7700 o 7900 (PE-Applied Biosystems, Foster City, CA) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los métodos de PCR en tiempo real cuantitativa son bien conocidos en la técnica.
Antes de la PCR en tiempo real, el ARN aislado se somete a una reacción de transcriptasa inversa (RT), que produce ADN complementario (ADNc) que luego se usa como el sustrato para la amplificación por PCR en tiempo real. La RT y las reacciones de PCR en tiempo real se realizan secuencialmente en la misma muestra. La RT y los reactivos de PCR en tiempo real se obtienen de Invitrogen (Carlsbad, CA). Las reacciones de RT y de PCR en tiempo real se llevan a cabo por métodos bien conocidos por los expertos en la técnica.
Las cantidades objetivo de genes (o ARN) obtenidas por PCR en tiempo real se pueden normalizar usando
o el nivel de expresión de un gen cuya expresión es constante, como la ciclofilina A, o cuantificando el ARN total usando RIBOGREEN® (Invitrogen, Inc. Carlsbad, CA). La expresión de ciclofilina A se cuantifica por PCR en tiempo real, siendo ejecutada simultáneamente con el objetivo, por multiplexación o por separado. El ARN total se cuantifica usando el reactivo de cuantificación de ARN RIBOGREEN® (Invitrogen, Inc. Carlsbad, CA). Los métodos de cuantificación de ARN por RIBOGREEN® se enseñan en Jones, LJ, et al., (Analytical Biochemistry, 1998, 265, 368374). Para medir la fluorescencia RIBOGREEN® se usa un instrumento CYTOFLUOR® 4000 (PE Applied Biosystems, Foster City, CA).
Las sondas y los cebadores están diseñados para hibridar con un ácido nucleico de ApoCIII. Los métodos para diseñar sondas y cebadores para PCR en tiempo real son bien conocidos en la técnica, y pueden incluir el uso de software como el software PRIMER EXPRESS® (Applied Biosystems, Foster City, CA).
Las cantidades objetivo de genes obtenidas por RT, PCR en tiempo real pueden usar el nivel de expresión de GAPDH o ciclofilina A, genes cuya expresión es constante, o cuantificando el ARN total utilizando RiboGreenTM (Molecular Probes, Inc. Eugene, OR). La expresión de GAPDH o ciclofilina A puede cuantificarse mediante RT, PCR en tiempo real, ejecutándose simultáneamente con el objetivo, por multiplexación o por separado. El ARN total se cuantificó usando el reactivo de cuantificación de ARN RiboGreen™ (Molecular Probes, Inc. Eugene, OR).
Análisis de los Niveles de Proteínas
La inhibición antisentido de los ácidos nucleicos de ApoCIII puede evaluarse midiendo los niveles de proteína ApoCIII. Los niveles de proteína ApoCIII pueden evaluarse o cuantificarse en una variedad de maneras bien conocidas en la técnica, como inmunoprecipitación, análisis de transferencia Western (inmunoblotting), ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA), ensayos cuantitativos de proteínas, ensayos de actividad de proteínas (por ejemplo , ensayos de actividad de caspasa), inmunohistoquímica, inmunocitoquímica o clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS) (Sambrooke y Russell en Molecular Cloning. A Laborator y Manual. Tercera edición. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York, 2001) Los anticuerpos dirigidos a un objetivo pueden identificarse y obtenerse a partir de una variedad de fuentes, como el catálogo de anticuerpos MSRS (Aerie Corporation, Birmingham, MI), o pueden prepararse por métodos de generación de anticuerpos monoclonales o policlonales convencionales bien conocidos en la técnica. Los anticuerpos útiles para la detección de ApoCIII humano y de ratón están disponibles comercialmente.
Prueba in vivo de compuestos antisentido
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En ciertas realizaciones, los compuestos dirigidos a ApoCIII como se describen en la presente modulan marcadores o fenotipos fisiológicos de un trastorno metabólico. En ciertas realizaciones, los marcadores fisiológicos de un trastorno metabólico se pueden cuantificar. Por ejemplo, los niveles de glucosa o la resistencia a la insulina pueden medirse y cuantificarse mediante ensayos estándar conocidos en la técnica. Para tales marcadores, en ciertas realizaciones, el marcador puede reducirse en aproximadamente el 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90 , 95 o 99%, o un intervalo definido por dos cualquiera de estos valores. En otro ejemplo, la sensibilidad a la insulina o los niveles de HDL pueden medirse y cuantificarse mediante ensayos estándar conocidos en la técnica. Para tales marcadores, en ciertas realizaciones, el marcador puede aumentarse en aproximadamente el 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90 , 95 o 99%, o un intervalo definido por dos cualquiera de estos valores.
También, se divulgan en la presente métodos para prevenir, tratar o mejorar un síntoma asociado con un trastorno metabólico en un sujeto con necesidad de ello. En ciertas realizaciones, se divulga un método para reducir la velocidad de aparición de un síntoma asociado con un trastorno metabólico. En ciertas realizaciones, se divulga un método para reducir la gravedad de un síntoma asociado con un trastorno metabólico. En dichas realizaciones, los métodos comprenden administrar a un individuo con necesidad de ellos una cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto dirigido a un ácido nucleico de ApoCIII.
Los trastornos metabólicos se caracterizan por numerosos síntomas físicos. Cualquier síntoma conocido por un experto en la técnica que se asocie con un trastorno metabólico puede prevenirse, tratarse, mejorarse o modularse de otra manera como se expone con anterioridad en los métodos descritos anteriormente. En ciertas realizaciones, el síntoma puede ser cualquiera de, pero no está limitado a, producción excesiva de orina (poliuria), sed excesiva y aumento de la ingesta de líquidos (polidipsia), visión borrosa, pérdida de peso inexplicable y letargo.
En ciertas realizaciones, se divulgan métodos para tratar un individuo que comprenden administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de una o más composiciones farmacéuticas como se describe en la presente. En ciertas realizaciones, el individuo tiene una enfermedad cardiovascular. En ciertas realizaciones, la administración de una cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto antisentido dirigido a un ácido nucleico de ApoCIII se acompaña de monitorización de los niveles de ApoCIII o marcadores de enfermedad cardiovascular, diabetes u otro proceso de la enfermedad asociado con la expresión de ApoCIII, para determinar la respuesta de un individuo a la administración del compuesto antisentido. La respuesta de un individuo a la administración del compuesto antisentido se usa por un médico para determinar la cantidad y la duración de la intervención terapéutica.
En ciertas realizaciones, la administración de un compuesto antisentido dirigido a un ácido nucleico de ApoCIII da como resultado la reducción de la expresión de ApoCIII de por lo menos aproximadamente el 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 o 99%, o un intervalo definido por dos cualquiera de estos valores. En ciertas realizaciones, la expresión de ApoCIII se reduce a ≤ 50 mg/l, ≤ 60 mg/l, ≤ 70 mg/l, ≤ 80 mg/l, ≤ 90 mg/l, ≤ 100 mg/l, ≤ 110 mg/l, ≤ 120 mg/l, ≤ 130 mg/l, ≤ 140 mg/l, ≤ 150 mg/l, ≤ 160 mg/l, ≤ 170 mg/l, ≤ 180 mg/l, ≤ 190 mg/l o ≤ 200 mg/l.
En ciertas realizaciones, la administración de un compuesto antisentido dirigido a un ácido nucleico de ApoCIII da como resultado un aumento en los niveles de HDL de por lo menos aproximadamente el 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 o 99%, o un intervalo definido por dos cualquiera de estos valores.
En ciertas realizaciones, la administración de un compuesto antisentido dirigido a un ácido nucleico de ApoCIII da como resultado la reducción de los niveles de TG (posprandial o en ayunas) en por lo menos aproximadamente el 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45% , 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% o 99%, o un intervalo definido por dos cualquiera de estos valores. En ciertas realizaciones, TG (posprandial o en ayunas) se reduce a ≤ 100 mg/dl, ≤ 110 mg/dl, ≤ 120 mg/dl, ≤ 130 mg/dl, ≤ 140 mg/dl, ≤ 150 mg/dl, ≤ 160 mg/dl, ≤ 170 mg/dl, ≤ 180 mg/dl, ≤ 190 mg/dl, ≤ 200 mg/dl, ≤ 210 mg/dl, ≤ 220 mg/dl, ≤ 230 mg/dl, ≤ 240 mg/dl, ≤ 250 mg/dl, ≤ 260 mg/dl, ≤ 270 mg/dl, ≤ 280 mg/dl, ≤ 290 mg/dl, ≤ 300 mg/dl, ≤ 350 mg/dl, ≤ 400 mg/dl, ≤ 450 mg/dl, ≤ 500 mg/dl, ≤ 550 mg/dl, ≤ 600 mg/dl, ≤ 650 mg/dl, ≤ 700 mg/dl, ≤ 750 mg/dl, ≤ 800 mg/dl, ≤ 850 mg/dl, ≤ 900 mg/dl, ≤ 950 mg/dl, ≤ 1000 mg/dl, ≤ 1100 mg/dl, ≤ 1200 mg/dl, ≤ 1300 mg/dl, ≤ 1400 mg/dl, ≤ 1500 mg/dl, ≤ 1600 mg/dl, ≤ 1700 mg/dl, ≤ 1800 mg/dl o ≤ 1900 mg/dl.
En ciertas realizaciones, las composiciones farmacéuticas que comprenden un compuesto antisentido dirigido a ApoCIII se usan para la preparación de un medicamento para tratar a un paciente que sufre o es susceptible a una enfermedad cardiovascular.
Administración
Los compuestos o composiciones farmacéuticas se pueden administrar de varias maneras dependiendo de si se desea un tratamiento local o sistémico y de la zona a ser tratada. La administración puede ser oral o parenteral.
En ciertas realizaciones, los compuestos y las composiciones como se describen en la presente se
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administran parenteralmente. La administración parenteral incluye inyección o infusión intravenosa, intraarterial, subcutánea, intraperitoneal o intramuscular.
En ciertas realizaciones, la administración parenteral es por infusión. La infusión puede ser crónica o continua o corta o intermitente. En ciertas realizaciones, los agentes farmacéuticos infundidos se administran con una bomba. En ciertas realizaciones, la infusión es intravenosa.
En ciertas realizaciones, la administración parenteral es por inyección. La inyección puede administrarse con una jeringuilla o una bomba. En ciertas realizaciones, la inyección es una inyección de bolo. En ciertas realizaciones, la inyección se administra directamente a un tejido u órgano. En ciertas realizaciones, la administración parenteral es subcutánea.
En ciertas realizaciones, las formulaciones para administración parenteral pueden incluir soluciones acuosas estériles que también pueden contener tampones, diluyentes y otros aditivos adecuados como, pero no limitado a, potenciadores de la penetración, compuestos portadores y otros portadores o excipientes farmacéuticamente aceptables.
En ciertas realizaciones, las formulaciones para administración oral de los compuestos o composiciones pueden incluir, pero no están limitados a, portadores farmacéuticos, excipientes, polvos o gránulos, micropartículas, nanopartículas, suspensiones o soluciones en agua o medio no acuoso, cápsulas, cápsulas de gel, bolsitas, comprimidos o minicomprimidos. Pueden ser deseables espesantes, agentes aromatizantes, diluyentes, emulsionantes, dispersantes o aglutinantes. En ciertas realizaciones, las formulaciones orales son aquellas en las que los compuestos se administran junto con uno o más potenciadores de la penetración, surfactantes y quelantes.
Dosificación
En ciertas realizaciones, las composiciones farmacéuticas se administran de acuerdo con un régimen de dosificación (por ejemplo, dosis, frecuencia de dosis y duración) en donde el régimen de dosificación puede seleccionarse para lograr un efecto deseado. El efecto deseado puede ser, por ejemplo, la reducción de ApoCIII o la prevención, reducción, mejora o ralentización de la progresión de una enfermedad o afección asociada con ApoCIII.
En ciertas realizaciones, las variables del régimen de dosificación se ajustan para dar como resultado una concentración deseada de composición farmacéutica en un sujeto. "Concentración de composición farmacéutica" como se usa con respecto al régimen de dosificación puede referirse al compuesto, oligonucleótido o ingrediente activo de la composición farmacéutica. Por ejemplo, en ciertas realizaciones, la dosis y la frecuencia de la dosis se ajustan para proporcionar una concentración en tejido o concentración en plasma de una composición farmacéutica en una cantidad suficiente para lograr un efecto deseado.
La dosificación depende de la gravedad y la sensibilidad del estado de la enfermedad a ser tratada, con el curso del tratamiento durando de varios días a varios meses, o hasta que se efectúa una cura o se logra una disminución del estado de la enfermedad. La dosificación también depende de la potencia del fármaco y del metabolismo. En ciertas realizaciones, la dosificación es de 0,01 μg a 100mg por kg de peso corporal, o dentro de un intervalo de dosificación de 0,001mg -1000mg, y puede administrarse una o más veces al día, semanalmente, mensualmente o anualmente, o incluso una vez cada 2 a 20 años. Después de un tratamiento exitoso, puede ser deseable someter al paciente a terapia de mantenimiento para prevenir la recurrencia del estado de la enfermedad, en donde el oligonucleótido se administra en dosis de mantenimiento, que varían de 0,01 μg a 100 mg por kg de peso corporal, una o más veces al día, a una vez cada 20 años o que varían de 0,001 mg a 1000 mg de dosificación.
Ciertas terapias de combinación
En ciertas realizaciones, un primer agente que comprende el compuesto descrito en la presente se coadministra con uno o más agentes secundarios. En ciertas realizaciones, dichos segundos agentes están diseñados para tratar la misma enfermedad, trastorno o afección que el primer agente descrito en la presente. En ciertas realizaciones, tales segundos agentes están diseñados para tratar una enfermedad, trastorno o afección diferente que la del primer agente descrito en la presente. En ciertas realizaciones, un primer agente está diseñado para tratar un efecto secundario no deseado de un segundo agente. En ciertas realizaciones, los segundos agentes se coadministran con el primer agente para tratar un efecto no deseado del primer agente. En ciertas realizaciones, dichos segundos agentes están diseñados para tratar un efecto secundario no deseado de una o más composiciones farmacéuticas como se describe en la presente. En ciertas realizaciones, los segundos agentes se coadministran con el primer agente para producir un efecto combinatorio. En ciertas realizaciones, los segundos agentes se administran conjuntamente con el primer agente para producir un efecto sinérgico. En ciertas realizaciones, la coadministración del primer y segundo agentes permite el uso de dosificaciones menores de las que se requerirían para lograr un efecto terapéutico o profiláctico si los agentes se administraran como terapia independiente.
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por el sistema de clasificación descrito por Tremblay (Tremblay et al., J Clin Lipidol, 2011, 5: 37-44). En ciertas realizaciones, los compuestos, composiciones y métodos descritos en la presente son útiles en el tratamiento de sujetos con, o con riesgo de, hipertrigliceridemia de Fredrickson tipo II, IV o V.
El Fredrickson Tipo IIb (también conocido como hiperlipoproteinemia familiar combinada) es una hiperlipidemia mixta (colesterol y niveles de TG altos), provocada por elevaciones de LDL-C y VLDL. Los niveles de VLDL altos se deben a la sobreproducción de sustratos, incluidos TG, acetil CoA y un aumento en la síntesis de B
100. También pueden estar provocados por la disminución de la depuración de LDL. La prevalencia en la población es de aproximadamente el 10%.
El Fredrickson Tipo IV (también conocido como hipertrigliceridemia familiar) es una afección autosómica dominante que tiene lugar en aproximadamente el 1% de la población. Los niveles de TG están elevados como resultado del exceso de producción hepática de VLDL o deficiencia de LPL heterocigótica, pero casi siempre son menores a 1000 mg/dl. Los niveles de colesterol en suero generalmente están dentro de los límites normales. El trastorno es heterogéneo y el fenotipo está fuertemente influenciado por factores ambientales, particularmente el consumo de carbohidratos y etanol. En ciertas realizaciones, los compuestos, las composiciones y los métodos descritos en la presente son útiles en el tratamiento de sujetos con un nivel de TG ≥ 200 mg/dl y deficiencia de LPL heterocigótica o sobreproducción de VLDL. En ciertas realizaciones, los compuestos, composiciones y métodos descritos en la presente son útiles en el tratamiento de sujetos con un nivel de TG ≥ 500 mg/dl y deficiencia de LPL heterocigótica o sobreproducción de VLDL.
El Fredrickson Tipo V tiene VLDL y quilomicrones altos. Se caracteriza por portadores de variantes del gen de la LPL con pérdida de función asociadas con la actividad de la LPL de por lo menos el 20% (es decir, deficiencia de LPL parcial). Estos sujetos presentan plasma lactescente e hipertrigliceridemia severa debido a quilomicrones y VLDL. Los niveles de TG son invariablemente superiores a 1000 mg/dl y los niveles de colesterol total siempre son elevados. El nivel de LDL-C es habitualmente bajo. También se asocia con un riesgo incrementado de pancreatitis aguda, intolerancia a la glucosa e hiperuricemia. Los síntomas se presentan generalmente en la edad adulta (> 35 años) y, aunque la prevalencia es relativamente rara, es mucho más común que los sujetos deficientes en LPL de homocigotos o heterocigotos compuestos. En ciertas realizaciones, los compuestos, las composiciones y métodos descritos en la presente son útiles en el tratamiento de sujetos con TG ≥ 1000 mg/dl. En ciertas realizaciones, los compuestos, composiciones y métodos descritos en la presente son útiles para tratar sujetos con, o en riesgo de, pancreatitis asociada con niveles de TG altos en un sujeto. En ciertas realizaciones, los compuestos, composiciones y métodos descritos en la presente son útiles para tratar sujetos con, o en riesgo de, enfermedad cardiovascular o metabólica asociada con altos niveles de TG en un sujeto. En ciertas realizaciones, la enfermedad cardiovascular es aneurisma, angina de pecho, arritmia, aterosclerosis, enfermedad cerebrovascular, enfermedad cardíaca coronaria, hipertensión, dislipidemia, hiperlipidemia, hipertrigliceridemia, hipercolesterolemia, apoplejía y similares. En ciertas realizaciones, la dislipidemia es quilomicronemia. En ciertas realizaciones, la dislipidemia es quilomicronemia. En ciertas realizaciones, las enfermedades o trastornos metabólicos incluyen, pero no están limitados a, hiperglucemia, prediabetes, diabetes (tipo I y tipo II), obesidad, resistencia a la insulina, síndrome metabólico y dislipidemia diabética.
En ciertas realizaciones, el tratamiento con los compuestos divulgados en la presente está indicado para un animal humano con un defecto genético que aumenta los niveles de ApoCIII y/o los niveles de triglicéridos. En ciertas realizaciones, el defecto genético es una variante alélica o polimorfismo que aumenta la expresión de ApoCIII. En ciertas realizaciones, el polimorfismo es T (en la posición 74) a A, C (en la posición -641) a A, G (en la posición -630) a A, T (en la posición -625) a la deleción, C (en la posición -482) a T, T (en la posición -455) a C, C (en la posición 1100) a T, C (en la posición 3175) a G, T (en la posición 3206) a G, C (en la posición 3238) a G, y similares. En ciertas realizaciones, el defecto genético es una deficiencia de LPL heterocigótica.
En ciertas realizaciones, el tratamiento con los compuestos divulgados en la presente memoria está indicado para un animal humano con niveles elevados de ApoCIII. En ciertas realizaciones, el nivel elevado de ApoCIII es ≥ 50 mg/l, ≥ 60 mg/l, ≥ 70 mg/l, ≥ 80 mg/l, ≥ 90 mg/l, ≥ 100 mg/l, ≥ 110 mg/l, ≥ 120 mg/l, ≥ 130 mg/l, ≥ 140 mg/l, ≥ 150 mg/l, ≥ 160 mg/l, ≥ 170 mg/l, ≥ 180 mg/l, ≥ 190 mg/l, ≥ 200 mg/l, ≥ 300 mg/l, ≥ 400 mg/l o ≥ 500 mg/l.
EJEMPLOS
Divulgación no limitativa
Aunque ciertos compuestos, composiciones y métodos descritos en la presente se han descrito con especificidad de acuerdo con ciertas realizaciones, los siguientes ejemplos sirven solamente para ilustrar los compuestos descritos en la presente memoria y no se pretende que limiten los mismos.
Ejemplo 1: Efecto de la inhibición antisentido in vivo de ApoCIII humano en ratones transgénicos huApoCIII
Los ratones transgénicos con el transgén ApoCIII humano utilizado en el estudio fueron la progenie de
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híbridos F1 transgénicos de ofhuApoCIII (Jackson Laboratories, CA) y ratones C57BL/6. Se utilizó en este ensayo ISIS 304801 (previamente divulgado en la Patente US 7.598.227) con un sitio de inicio de 508 en la SEQ ID NO: 1 (número de acceso de GENBANK NM_000040.1) y un sitio de inicio de 3139 en SEQ ID NO: 2 (acceso de GENBANK NT_033899.8 truncado de los nucleótidos 20263040 a 20266203), con el la secuencia 5'-AGCTTCTTGTCCAGCTTTAT-3’ (SEQ ID NO: 3) y un motivo gapmer 5-10-5 MOE. Otro oligonucleótido antisentido ISIS, "Compuesto X", con un motivo gapmer 5-10-5 MOE, dirigido a otra región de la SEQ ID NO: 1 o la SEQ ID NO: 2, también se incluyó en este ensayo. Otro oligonucleótido antisentido ISIS, "Compuesto Y", con un motivo de gapmer 5-10-5 MOE, dirigido a una secuencia ApoCIII de roedor (Nº de Acceso GenBank NM_023114.3, SEQ ID NO: 5) también se incluyó en este ensayo.
Tratamiento
Se mantuvieron ratones transgénicos ApoCIII humanos en un ciclo de luz/oscuridad de 12 horas y se alimentaron ad libitum con comida de laboratorio Teklad. Los animales se aclimataron durante por lo menos 7 días en la instalación de investigación antes del inicio del experimento. Los oligonucleótidos antisentido (ASO) se prepararon en PBS y se esterilizaron filtrando a través de un filtro de 0,2 micrómetros. Los oligonucleótidos se disolvieron en 0,9% de PBS para inyección.
Los ratones machos y hembras se analizaron por separado. Los ratones macho se dividieron en tres grupos de tratamiento que consistían de 5 ratones cada uno. Dos de tales grupos recibieron inyecciones subcutáneas de ISIS 304801 o del Compuesto X a una dosis de 37,5 mg/kg dos veces a la semana durante 2 semanas. Un grupo de ratones recibió inyecciones subcutáneas de PBS dos veces a la semana durante 2 semanas. Los ratones hembra se dividieron en cuatro grupos de tratamiento que consistían en 4-5 ratones cada uno. Tres de tales grupos recibieron inyecciones subcutáneas de ISIS 304801, Compuestos X o Y a una dosis de 37,5 mg/kg dos veces a la semana durante 2 semanas. Un grupo de ratones recibió inyecciones subcutáneas de PBS dos veces a la semana durante 2 semanas. Antes del tratamiento y después de la última dosis, se extrajo sangre de cada ratón y se analizaron las muestras de plasma. Dos días después de la dosis final, se sacrificaron los ratones, se recogieron los órganos y se realizaron los análisis.
Niveles de colesterol y triglicéridos
Los triglicéridos y colesterol en plasma se extrajeron por el método de Bligh y Dyer (Bligh, EG y Dyer, W.J. Can. J. Biochem. Physiol., 37: 911-917, 1959) y se midieron con un kit de triglicéridos comercialmente disponible (DCL Triglyceride Reagent; Diagnostic Chemicals Ltd.).
Los resultados de los análisis de triglicéridos en machos y hembras se presentan en las Tablas 1 y 2, y se expresan en mg/dl. Como se observa, los niveles de triglicéridos en todos los grupos de tratamiento se redujeron significativamente en comparación con los de los grupos de control.
Para medir las diferentes fracciones de colesterol (HDL, LDL y VLDL), las muestras de plasma de los grupos hembra se analizaron por HPLC y se presentan en la Tabla 3. Como se observa, la inhibición antisentido de ApoCIII disminuyó significativamente la VLDL y también aumentó significativamente los niveles de HDL . Un aumento en HDL y una disminución en los niveles de VLDL es un efecto beneficioso cardiovascular de la inhibición antisentido de ApoCIII y puede ser beneficioso para animales con, o en riesgo de, enfermedades dislipidémicas.
Tabla 1
Efecto del tratamiento con oligonucleótidos antisentido sobre los niveles de triglicéridos (mg/dl) en ratones transgénicos hembra
Semana 0
Semana 2 % de cambio
PBS
2144 2533 +21
Compuesto X
2385 677 -72
Compuesto Y
2632 1644 -37
ISIS 304801
2390 542 -75
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Tabla 4
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Efecto del tratamiento con oligonucleótidos antisentido sobre los niveles de colesterol y triglicéridos (mg/dl) en ratones transgénicos
Dosis (mg/kg/sem)
Colesterol Total Trigliceridos
PBS
- 124 1017
ISIS 304801
50.0 105 417
15.0
116 593
5.0
101 871
1.5
125 1092
Compuesto X
50.0 90 496
15.0
127 1168
5.0
166 1506
1.5
168 1518
25 Tabla 5
Efecto del tratamiento con oligonucleótidos antisentido sobre los niveles de colesterol HDL y LDL (mg/dl) en ratones transgénicos
Dosis (mg/kg/sem)
HDL LDL
PBS
- 40 ± 8 42 ± 8
ISIS 304801
50.0 62 ± 19 28 ± 7
15.0
60 ± 9 34 ± 7
5.0
44 ± 3 30 ± 13
1.5
39 ± 2 40 ± 2
Compuesto X
50.0 46 ± 10 25 ± 3
15.0
37 ± 7 40 ± 2
5.0
40 ± 10 47 ± 5
1.5
45 ± 7 44 ± 6
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Ejemplo 3: Efecto de la inhibición antisentido de ApoCIII en Ratones nulos de receptor LDL transgénicos CETP
El compuesto Y se estudió adicionalmente en un modelo de ratón LDLr -/-transgénico CETP humano para examinar los efectos de un inhibidor antisentido de ApoCIII de ratón sobre los lípidos del plasma y el metabolismo de lipoproteínas en ratones hiperlipidémicos.
Tratamiento
55 Se mantuvieron ratones transgénicos transgénicos LDLr-/-CETP humanos en un ciclo de luz/oscuridad de 12 horas y se alimentaron ad libitum con una dieta occidental (42% de calorías de grasa, 0,2% de colesterol). Los animales se aclimataron a esta dieta durante 10 días en la instalación de investigación antes del inicio del experimento. Los oligonucleótidos antisentido (ASO) se prepararon en PBS y se esterilizaron filtrando a través de un filtro de 0,2 micrómetros. Los oligonucleótidos se disolvieron en 0,9% de PBS para inyección.
Se dividieron ratones macho de ocho semanas en tres grupos de tratamiento. Uno de dichos grupos de 6 ratones recibió inyecciones subcutáneas del compuesto Y a una dosis de 12,5 mg/kg/semana durante 4 semanas. Un grupo de 4 ratones recibió inyecciones subcutáneas del oligonucleótido control ISIS 141923 (SEQ ID
65 NO: 4) a una dosis de 12,5 mg/kg/semana durante 4 semanas. Un grupo de 5 ratones recibió inyecciones
subcutáneas de PBS durante 4 semanas. Se tomaron muestras de plasma antes del inicio de la dosificación, y a las 2 y 4 semanas de tratamiento.
Niveles de Colesterol y Triglicéridos
5 Los triglicéridos y el colesterol en plasma se extrajeron por el método de Bligh y Dyer (Bligh, E.G. y Dyer,
W.J. Can. J. Biochem. Physiol., 37: 911-917, 1959) y se midieron con un kit de triglicéridos comercialmente disponible (DCL Triglyceride Reagent; Diagnostic Chemicals Ltd.).
Los resultados de los análisis de colesterol y triglicéridos en los ratones se presentan en las Tablas 6 a 7, y se expresan en mg/dl. Los niveles de colesterol y triglicéridos en el grupo de tratamiento se redujeron significativamente en comparación con los del grupo de control. Una disminución en los niveles de colesterol y TG es un efecto beneficioso cardiovascular de la inhibición antisentido de ApoCIII y puede ser beneficioso para animales con, o en riesgo de, enfermedades dislipidémicas.
15
Tabla 6
Efecto del tratamiento con oligonucleótidos antisentido sobre los niveles de colesterol (mg/dl) en ratones transgénicos
Semana
PBS Compuesto Y
0
1851 1747
2
2035 878
4
2359 686
Tabla 7
Efecto del tratamiento con oligonucleótidos antisentido sobre los niveles de triglicéridos (mg/dl) en ratones transgénicos
Semana
PBS Compuesto Y
0
297 451
2
420 150
4
496 86
Inhibición de los Niveles y Actividad de Proteína CETP
Los niveles de proteína CETP en plasma se midieron usando un kit de ELISA comercial (ALPCO, Cat # 47
45 CETHU-E01). La actividad de la proteína CETP se midió usando un kit de ensayo fluorométrico (Roar Biomedical, Inc. Cat # RB-CETP). Como se presenta en la Tabla 8, el tratamiento con oligonucleótido antisentido redujo la expresión y la actividad de la proteína CETP. La CETP (proteína de transferencia de éster de colesterilo) facilita el intercambio de triglicéridos y ésteres de colesterol entre las lipoproteínas de alta densidad (HDL) y las lipoproteínas que contienen apoB, como las lipoproteínas de muy baja densidad (VLDL), LDL y quilomicrones. Una disminución en la CETP se asocia con niveles de HDL incrementados y niveles de LDL disminuidos (Barter P.J. et al. Artherioscler. Thromb. Vasc. Biol. 23: 160-167, 2003). Por lo tanto, la inhibición de los niveles y la actividad de la proteína CETP es un efecto beneficioso cardiovascular de la inhibición antisentido de ApoCIII y puede ser beneficioso para animales con, o en riesgo de, enfermedades dislipémicas. El oligonucleótido de control no tuvo ningún efecto significativo sobre CETP, como se esperaba.
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Tabla 8
Porcentaje de inhibición de la proteína CETP en ratones transgénicos
Nivel
Actividad
Compuesto Y
24 24
ISIS 141923
0 3
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(DCL Triglyceride Reagent; Diagnostic Chemicals Ltd.).
Los resultados de los análisis de colesterol y triglicéridos en los ratones se presentan en la Tabla 11, y se expresan en mg/dl. Los niveles de colesterol y triglicéridos en el grupo de tratamiento se redujeron significativamente en comparación con el grupo de control. Una disminución en los niveles de colesterol y TG es un efecto beneficioso cardiovascular de la inhibición antisentido de ApoCIII y puede ser beneficioso para animales con, o en riesgo de, enfermedades dislipidémicas.
Tabla 11
Efecto del tratamiento con oligonucleótidos antisentido sobre los niveles de colesterol y triglicéridos (mg/dl) en ratones transgénicos
Colesterol Total
Triglicéridos
PBS
2188 641
Compuesto Y
1402 170
Depuración de HDL
Los ratones de todos los grupos se inyectaron a través de la vena de la cola con 1 x 106 dpm de éter de
3H-colesterilo (3H-CEth)-HDL etiquetado. El éter de colesterilo radiomarcado es estructuralmente similar al colesterol, pero quedará atrapado en los tejidos que lo absorben. Por lo tanto, la depuración del éter de colesterilo radiomarcado del plasma y su acumulación en el hígado puede usarse para evaluar los efectos sobre el transporte
25 de colesterol inverso. Se recogieron muestras de plasma al de 5 min, 1,5 h, 3 h, 6 h y 24 h después de la inyección y se contó la radioactividad usando un contador de centelleo líquido. A las 24 horas, los ratones se sacrificaron y se recogió el hígado. Las muestras de hígado se extrajeron en cloroformo/metanol 2:1 y el extracto se sometió a un proceso de soplado bajo gas de nitrógeno, se solubilizó en un cóctel de centelleo y se contó usando el mismo contador de centelleo líquido.
La disminución del radiomarcado, como se presenta en la Tabla 12, está asociada con la depuración de HDL-Ceth del plasma. Los resultados indican que el tratamiento con el Compuesto Y lleva a una tasa aumentada de depuración de colesterol HDL del plasma. Esto se asoció con la mayor acumulación de eterina de colesteril radiomarcada en el hígado de ratones tratados con Compuesto Y, como se presenta en la Tabla 13. Por lo tanto, los
35 datos indican que la inhibición de ApoCIII en estos ratones transgénicos mejora el transporte de colesterol inverso y, por lo tanto, tendría una efecto beneficioso en pacientes con enfermedad cardiovascular, como pacientes con una enfermedad dislipidémica.
Tabla 12
Efecto del tratamiento con oligonucleótidos antisentido sobre el colesterol HDL en plasma (% de recuento a las 0 h) en ratones transgénicos
1.5 hr
3 hr 6 hr 24 hr
PBS
87 79 64 38
ISIS 141923
84 82 69 39
Compuesto Y
78 71 57 25
Tabla 13
Efecto del tratamiento con oligonucleótidos antisentido sobre la absorción hepática de CEth radiomarcado en ratones transgénicos
% de Incremento (dpm/g tejido hepático)
ISIS 141923
0
Compuesto Y
14
Ejemplo 5: Comparación del efecto de la inhibición antisentido de ApoCIII humana en ratones C57BL/6 con un modelo de ratón knockout de ApoCIII
65 Se obtuvieron ratones knockout ApoCIII de Jackson Laboratories (número de serie 002057) y se
imagen32
15
25
35
45
55
65
Inhibición del ARNm de ApoCIII
El ARN total se extrajo del hígado y del intestino delgado y se cuantificó el ARNm de ApoCIII por RT-PCR usando un conjunto de sonda de cebador ApoCIII y se normalizó a ciclofilina. Los resultados se presentan en la Tabla 15, expresada como porcentaje de inhibición del ARNm de ApoCIII en comparación con el control de PBS. El ISIS 141923 no provocó ninguna reducción en los niveles de ARNm de ApoCIII, como se esperaba. Los datos demostraron la inhibición significativa del ARNm de ApoCIII en el hígado y el intestino delgado por el Compuesto Z en comparación con el control de PBS.
La inhibición de la expresión intestinal de ApoCIII podría ser importante en la prevención de la quilomicronemia (Chait et al., 1992, Adv Intern Med. 1992, 37: 249-73), un estado dislipidémico provocado por la depuración inadecuada de triglicéridos de quilomicrones. Las formas graves de quilomicronemia pueden provocar pancreatitis, una afección potencialmente mortal. Inhibiendo la ApoCIII intestinal, se reduciría la inhibición de la lipoproteína lipasa y se mejoraría la depuración de triglicéridos de quilomicrones, evitando de esta manera la pancreatitis. Adicionalmente, la inhibición de la ApoCIII intestinal mejoraría la depuración de los triglicéridos posprandiales, disminuyendo de este modo la TG posprandial, un factor de riesgo conocido para enfermedad coronaria.
Tabla 15
Porcentaje de inhibición del ARNm de ApoCIII en relación con el control de PBS
% de inhibición
Higado
74
Intestino Delgado
13
Niveles de colesterol y triglicéridos
El colesterol en plasma se extrajo por el método de Bligh y Dyer (Bligh, EG y Dyer, W.J. Can. J. Biochem. Physiol. 37: 911-917, 1959) y se midió con un analizador clínico Olympus (Hitachi Olympus AU400e, Melville, NY). El colesterol HDL y no HDL se midieron individualmente por HPLC. Los niveles de triglicéridos se midieron con el uso de un kit de triglicéridos comercialmente disponible (DCL Triglyceride Reagent, Diagnostic Chemicals Ltd., Charlottetown, Canadá). Los resultados se presentan en la Tabla 16 y se expresan en mg/dl. El tratamiento con el Compuesto Z dio como resultado una reducción significativa de los niveles de colesterol total, colesterol no HDL y triglicéridos en plasma en comparación con el control con PBS. Una disminución en los niveles de colesterol total, colesterol no HDL y dTG es un efecto beneficioso cardiovascular de la inhibición antisentido de ApoCIII y puede ser beneficioso para animales con, o con riesgo de, enfermedades dislipidémicas.
Tabla 16
Niveles de colesterol y triglicéridos en plasma (mg/dl) en ratones C56BL/6
Tratamiento
Dosis (mg/kg/sem) Colesterol Total Colesterol HDL Colesterol LDL Colesterol VLDL Trigliceridos
PBS
- 93 70 20 2.9 84
ISIS 141923
12.5 97 78 19 2.1 82
Compuesto Z
12.5 95 75 17 3.1 70
Depuración de grasas
Se recogieron muestras de plasma al de 30 minutos, 1 hora, 2 horas, 3 horas y 4 horas después de la inyección y se midió el contenido total de lípidos en plasma con un analizador clínico Olympus (Hitachi Olympus AU400e, Melville, NY). El nivel de lípidos en el plasma como se presenta en la Tabla 17 era un indicador inverso de la depuración de lípidos del plasma. Los resultados indican que el tratamiento con el Compuesto Z lleva a una velocidad aumentada de depuración de grasa del plasma.
Por lo tanto, los datos indican que la inhibición de ApoCIII en estos ratones transgénicos mejora el transporte de colesterol inverso, y tendría un efecto beneficioso en pacientes con enfermedad cardiovascular.
Tabla 17
Efecto del tratamiento con oligonucleótidos antisentido sobre los lípidos en plasma (mg/dl) en ratones C57BL/6
0 hr
0.5 hr 1 hr 2 hr 3 hr 4 hr Area bajo la curva
PBS
86 80 64 122 118 90 23631
ISIS 141923
115 142 124 236 225 150 43677
Compuesto Z
66 55 96 156 151 101 28371
Ejemplo 7: Efecto de la inhibición antisentido in vivo de ApoCIII en ratones C57BL/6
15 Se evaluó el efecto de la inhibición antisentido de ApoCIII sobre los niveles de expresión de ApoCIII y la depuración de grasa.
Tratamiento
Se mantuvieron ratones C57/BL6 macho en un ciclo de luz/oscuridad de 12 horas y se les alimentó ad libitum con una dieta occidental (Harland Tekland 88137). Los animales se aclimataron durante por lo menos 7 días en la instalación de investigación antes del inicio del experimento. Los oligonucleótidos antisentido (ASO) se prepararon en PBS y se esterilizaron filtrando a través de un filtro de 0,2 micrómetros. Los oligonucleótidos se
25 disolvieron en 0,9% de PBS para inyección.
Grupos de 5 ratones cada uno recibieron inyecciones intraperitoneales de un oligonucleótido antisentido dirigido a ApoCIII, Compuesto Z, a una dosis de 12,5 mg/kg/semana durante 6 semanas. Otro grupo de ratones recibió inyecciones intraperitoneales del oligonucleótido de control ISIS 141923 a una dosis de 12,5 mg/kg/semana durante 6 semanas. Dos días después de la dosis final, los ratones se dejaron en ayunas durante la noche, y se administró un bolo de 200 µl de aceite de oliva por sonda oral. Después del bolo, se midieron los niveles de triglicéridos en plasma a intervalos regulares durante 4 horas. Los ratones se sacrificaron y se recogieron plasma y tejidos.
35 Inhibición del ARNm de ApoCIII
Se extrajo ARN total del hígado y del intestino delgado y el ARNm de ApoCIII se cuantificó por RT-PCR usando un conjunto de sonda de cebador ApoCIII y se normalizó a ciclofilina. Los resultados se presentan en la Tabla 18, expresada como porcentaje de inhibición del ARNm de ApoCIII en comparación con el control de oligonucleótidos. Los datos demostraron la inhibición significativa de ARNm de ApoCIII en el hígado y el intestino delgado por el Compuesto Z en comparación con el control de oligonucleótidos.
Como se observa en otra parte de la presente, la inhibición de la expresión de ApoCIII intestinal podría ser importante en la prevención de la quilomicronemia (Chait et al., 1992, Adv. Intern Med. 1992, 37: 249-73), un estado
45 dislipidémico provocado por la depuración inadecuada de triglicéridos de quilomicrones. Las formas graves de quilomicronemia pueden provocar pancreatitis, una afección potencialmente mortal. Al inhibir la ApoCIII intestinal, se reduciría la inhibición de la lipoproteína lipasa y se mejoraría la depuración de triglicéridos de quilomicrones, evitando de este modo la pancreatitis. Además, la inhibición de la ApoCIII intestinal mejoraría el depuración de los triglicéridos posprandiales, disminuyendo de ese modo la TG posprandial, un factor de riesgo conocido de enfermedad coronaria.
Tabla 18
Porcentaje de inhibición del ARNm de ApoCIII en relación con el control de ratones C57/BL/6 tratados con oligonucleótidos
Raza de ratones
% de inhibición
C57BL/6
Hígado 74
Intestino Delgado
60
Depuración de grasas
Se recogieron muestras de plasma al de 0 min, 30 min, 60 min, 120 min, 180 min y 240 min después de la 65 inyección y se midieron las concentraciones de triglicéridos en plasma con un analizador clínico Olympus (Hitachi
Olympus AU400e, Melville, NY). Los resultados indican que el tratamiento con el Compuesto Z lleva a una tasa aumentada de eliminación de triglicéridos del plasma.
Este estudio se puede comparar con los ensayos clínicos de bolos de grasa en los que los pacientes que
expresan niveles de apo-CIII elevados mostraron concentraciones de TG postprandiales elevadas (Petersen K.F. et
al., N Engl J Med 2010; 362: 1082-1089).
Tabla 19
Efecto del tratamiento con oligonucleótidos antisentido sobre TG plasmáticos posprandiales (mg/ dl en ratones C57BL/6
Raza de ratones
0 min 30 min 60 min 120 min 180 min 240 min
C57BL/6
ISIS 141923 115 142 124 236 225 150
Compuesto Z
66 55 96 156 151 101
Ejemplo 8: Efecto de la inhibición antisentido in vivo de ApoCIII en ratones C57BL/6
Se evaluó el efecto de la inhibición antisentido de ApoCIII sobre el depuración de grasa.
Tratamiento
25 Se mantuvieron ratones C57/BL6 machos en un ciclo de luz/oscuridad de 12 horas y se les alimentó ad libitum con una dieta occidental (Harland Tekland 88137). Los animales se aclimataron durante por lo menos 7 días en la instalación de investigación antes del inicio del experimento. Los oligonucleótidos antisentido (ASO) se prepararon en PBS y se esterilizaron filtrando a través de un filtro de 0,2 micrómetros. Los oligonucleótidos se disolvieron en 0,9% de PBS para inyección.
Grupos de 6 ratones cada uno recibieron inyecciones intraperitoneales de un oligonucleótido antisentido dirigido a ApoCIII, Compuesto Y o Compuesto Z, a una dosis de 12,5 mg/kg/semana, 6,3 mg/kg/semana o 3,1 mg/kg /semana durante 6 semanas. Otro grupo de ratones recibió inyecciones intraperitoneales del oligonucleótido de control ISIS 141923 a una dosis de 12,5 mg/kg/semana durante 6 semanas. Otro grupo de ratones recibió
35 inyecciones intraperitoneales de PBS durante 6 semanas. Dos días después de la dosis final, los ratones se dejaron en ayunas durante la noche, y se administró un bolo de 200 µl de aceite de oliva por sonda oral. Después del bolo, se midieron los niveles de triglicéridos en plasma a intervalos regulares durante 4 horas.
Depuración de grasas
Se recogieron muestras de plasma al de 0 min, 30 min, 60 min, 120 min, 180 min y 240 min después de la inyección y se midieron las concentraciones de triglicéridos en plasma con un analizador clínico Olympus (Hitachi Olympus AU400e, Melville, NY). Los resultados indican que el tratamiento con el Compuesto Y y el Compuesto Z lleva a una velocidad aumentada de depuración de grasas del plasma. N.d indica que el conjunto de datos no se
45 calculó.
Este estudio se puede comparar con estudios clínicos de bolos de grasa en los que los pacientes que expresaban niveles altos de apo-CIII mostraron concentraciones de TG postprandiales elevadas (Petersen K.F. et al., N Engl J Med 2010; 362: 1082-1089).
55
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imagen34
Tabla 24
Niveles de proteína en plasma ApoCIII (mg/dl) en días diferentes en el mono rhesus en relación con el control de PBS
Grupos
Dosis (mg/kg/sem) Día -7 Día 16 Día 30 Día 86
1
- 4.0 5.5 3.8 5.7
2
10 4.8 3.2 0.2 1.5
3
20 4.5 3.8 0.9 1.6
4
40 5.2 2.9 0.0 0.6
15
Análisis de partículas de lipoproteínas
Para establecer la cinética de la supresión de ApoCIII en plasma, se recogieron muestras de plasma 7 días antes del comienzo de la dosificación, así como en los días 16, 30 y 86 del período de dosificación. Las muestras se sometieron a análisis de partículas de lipoproteínas NMR (Liposcience, Raleigh, NC). Como no hubo diferencias significativas en la disminución de ApoCIII entre los grupos de tratamiento (Grupos 2-4), se presentan solo los análisis del Grupo 2 (grupo de tratamiento que recibió 10 mg/kg/semana). Los datos se presentan en las Tablas 25 y
26.
25 Se observaron cambios medios estadísticamente significativos desde el valor inicial en los triglicéridos totales en plasma (TG) y en VLDL y TG de quilomicrones del grupo de tratamiento en el día 30. Al mismo tiempo, los monos control demostraron aumentos medios en los mismos parámetros. El tratamiento sostenido con ISIS 304801 en estos monos alimentados con fructosa llevó a incrementos dependientes del tiempo en el número de partículas de colesterol HDL de aproximadamente 8 μmol/l (Tabla 27) y no produjo elevaciones en el colesterol LDL en estos estudios (Tabla 28). No hubo cambios significativos en la cantidad de partículas de colesterol LDL durante el período de tratamiento de 12 semanas, en relación con el grupo control PBS.
En el momento del sacrificio, se extrajeron los hígados usando el método de extracción Bligh y Dyer (Bligh EG y Dyer W.J.. Can J Biochem Physiol 1959; 37: 911-917) y se cuantificaron usando un ensayo de TG colorimétrico 35 Wako. La inhibición antisentido de ApoCIII no aumentó la acumulación de TG hepática en ninguno de los grupos de
tratamiento en relación con el grupo de control de PBS (Tabla 29).
Tabla 25
Cambio del el TG (mg/dl) en plasma de valor inicial en días diferentes en el mono rhesus
Dosis (mg/kg/sem)
Día -7 Día 16 Día 30 Día 86
PBS
- 0 18 23 27
ISIS 304801
10 0 -22 -32 -27
Tabla 26
Cambio del VLDL y TG de quilomicrones de valor inicial (mg/dl) en días diferentes en el mono rhesus
Dosis (mg/kg/sem)
Día -7 Día 16 Día 30 Día 86
PBS
- 0 17 22 28
ISIS 304801
10 0 -22 -31 -26
Tabla 27
Cambio de las partículas de colesterol HDL de valor inicial (mmol/l) en días diferentes en el mono rhesus
Dosis (mg/kg/sem)
Día -7 Día 16 Día 30 Día 86
PBS
- 0.3 -5.6 -3.5 -8.1
ISIS 304801
10 0.0 0.5 9.7 8.0
Tabla 28
Partículas de colesterol LDL totales (nmol/l) en días diferentes en el mono rhesus
Dosis (mg/kg/sem)
Día -7 Día 16 Día 30 Día 86
PBS
- 982 928 1005 1184
ISIS 304801
10 1007 938 781 910
Tabla 29
Contenido de triglicéridos hepáticos en cohortes de PBS de control y ISIS 304801 después de 12 semanas en monos rhesus HTG
TG hepáticos(ug/mg)
Media
PBS
9
10mg/kg/sem
16
20mg/kg/sem
18
40mg/kg/sem
6
25
Depuración de TG en plasma posprandial
A las 10 semanas, se midieron los niveles de TG en plasma posprandiales en monos del grupo de 10 mg/kg/semana (Grupo 2) a las 0 h, 1 h, 2 h, 3 h, y 4 h después de proporcionar una comida a los monos. Como se muestra en las Tablas 30 y 31, la depuración de TG plasmático posprandial se incrementó significativamente, como lo muestra la disminución del 38% en el área bajo la curva (AUC)de TG postprandial en monos del grupo de 10 mg/kg/semana.
La depuración de TG postprandial también se evaluó en los grupos 5 y 6 (el control de PBS y el grupo de
35 40 mg/kg/semana después de un desafío con grasas) a las 12 semanas. Los datos se presentan en la Tabla 32, y también indica una disminución significativa en el área bajo la curva (AUC) de TG postprandial en monos de ese grupo en comparación con el control.
Tabla 30
TG en plasma (mg/dl) en el mono rhesus
Dosis (mg/kg/sem)
0 hr 1 hr 2 hr 3 hr 4 hr
PBS
- 167 169 146 147 131
ISIS 304801
10 105 87 95 102 80
Tabla 31
Área bajo la curva (AUC) de TG posprandial en el mono rhesus
AUC
PBS
610
ISIS 304801
376
Tabla 32
Área bajo la curva (AUC) de TG posprandial en el mono rhesus después del desafío de grasas
AUC
PBS
613
ISIS 304801
405
imagen35
Tabla 33
5
15
25
35
45
55
Dieta del Paciente en el Centro de Estudio
Día de Estudio
Ración Servida Descripción del alimento
Día-1 [Admis]
525 ml. 375 ml. 300 ml. • fideos tailandeses con carne de vaca y vegetales mixtos, brócoli, brotes de frijol, pimientos verdes y rojos • Ensalada de fruta fresca • Zumo de naranja
1 250 ml.
• Torta de herradura • 2% de Leche
Día 1
1 2 250 ml. 300 ml. • Croissant de mantequilla • Huevos revueltos • Melocotones en rodajas con almíbar • Zumo de naranja
75 g. 1.5 copa 1-paquete Pequeña Acompañamiento 355 ml.
• Pechuga de pollo a la parrilla [sándwich] en panecillo Kaiser • Crema de Sopa de Champiñones • Crackers • Ensalada Condimentos • Ginger Ale
75 g. 250 ml. 375 ml. Acompañamiento Acompañamiento 300 ml.
• Carne Asada • Puré de Patata • Macedonia de Verduras • Salsa • Pan de Ajo • Zumo de manzana
1 250 ml.
• Muffin de zanahoria • 2% de leche
Día 2
3 Acompañamiento 1 300 ml. • Panqueques • Almíbar • Banana • Zumo de naranja
9" Acompañamiento Copa 1-paquete 355 ml.
• Pollo con mezquite, Pollo, bácon, queso cheddar, tomate, cebolla roja, y lechuga en pan de trigo integral • Aderezo de rancho • Sopa de Brócoli y queso • Crackers • Ginger ale
(continuación)
15
25
35
45
55
Dieta del Paciente en el Centro de Estudio
Día de Estudio
Ración Servida Descripción del Alimento
375 g. 150 g. 1-paquete. 300 ml.
• Salteado de carne y verduras mixtas, brócoli, zanahorias, apio y cebollas • Arroz al vapor • Pasas • Zumo de manzana
250 ml. 300 ml.
• Ensalada de fruta fresca • Zumo de arándanos
Día 3
Med. 300 ml. • Tortilla de queso y verduras en bagel de trigo integral • Zumo de uvas
9" Acompañamiento Copa 1-paquete. 355 ml.
• Filete Black Angus, mozzarella, queso cheddar, cebolla salteada & champiñones en pan de queso • Mostaza de Miel Bourbon, Salsa Zesty Grille • Sopa de fideos con pollo • Crackers • Ginger ale
400 g.
• Pechuga de Pollo a la barbacoa, Verduras, cocido mixto, coliflor, zanahorias, pimientos rojos y verdes, judías verdes
1.5 copas
• Arroz aromatizado
1-paquete.
• Uvas
300 ml.
• Zumo de manzana
1 250 ml.
• Galleta de avena con pasas • 2% de leche
Día 4
1 250 ml. 300 ml. • Croissant de queso • Melocotón en rodajas en almíbar • Zumo de naranja
2 Acompañamiento Copa 1-paquete. 355 ml.
• Pan plano Sammie, con pollo, bácon, cheddar, tomate y lechuga romana • Aderezo ranchero de leche agria • Sopa de brocoli y queso • Crackers • Ginger ale
425 g. 325 g. 1 paquete 250 ml. 300 ml.
• Estofado de ternera, tacos de carne tiernos, con zanahorias, cebollas y patatas • Ensalada tailandesa, con lechuga romana, pasta y aderezos • Pan italiano • Peras en rodajas en almíbar • Zumo de manzana
1 250 ml.
• Muffin de arándanos • 2% de leche
375 ml. Med. 250 ml. 300 ml.
• Copos de maíz • Banana • 2% de leche • Zumo de manzana
6 piezas.
• Alitas de pollo
250 ml.
• Arroz frito
250 ml.
• Verduras cocidas mixtas, judías verdes, zanahorias y pimientos rojos con salsa de tomate secada al sol
(continuación)
5
15
25
35
Dieta del Paciente en el Centro de Estudio
Día de Estudio
Ración Servida Descripción del Alimento
Día 5
355 • 7-up
6" Pizza
• Pizza Pepperoni lovers una porción doble de Pizza deli estilo pepperoni & 100% Mozzarella
Pequeña
• Ensalada
355 ml.
• Ginger Ale
1 250 ml.
• Croissant de almendras • 2% de Leche
Día 6 [Descarga]
45 g. 300 ml. • Bagel con queso en crema • Zumo de naranja
Día 22
450 g. 2 rodajas 300 ml. • Totila de espinacas de desayuno y queso feta • Tostada Marrón • Zumo de naranja
9" Acompañamiento Copa 1-paquete. 355 ml.
• Filete de costilla de Zesty Grille Steak Prime, mozzarella, cheddar, champiñones, cebolla salteada, en pan de queso • Mostaza con miel y Bourbon, Salsa Zesty Grille • Brocoli y sopa de queso • Crackers • Ginger Ale
400 g.
• Pechuga de Pollo con Verduras a la plancha
1.5 copas
• Arroz aromatizado
Pequeña
• Ensalada de fruta fresca
300
• Zumo de manzana
1 250 ml.
• Galleta de avena con pasas • 2% de Leche
Día 23 [Descarga]
45 g. 300 ml. • Croissant de mantequilla • Zumo de naranja
Resultados
En general, el ISIS 304801 demostró un buen perfil de seguridad y fue bien tolerado en todos los sujetos sin elevaciones clínicamente significativas de las enzimas transaminasas y sin eventos adversos significativos.
Las características del valor inicial de las cohortes MAD se muestran en la Tabla 34. Los sujetos MAD
mostraron reducciones dependientes de la dosis sostenidas en los niveles totales de apoC-III y TG expresados como
un cambio porcentual desde el valor inicial en las Tablas 35-36.
Tabla 34
Características de valor inicial de cohortes MAD
Placebo (n=4)
50 mg (n=3) 100 mg (n=3) 200 mg (n=3) 400 mg (n=3)
Género (M:F)
3:1 3:0 3:0 3:0 3:0
Edad (años)
43.0 40.0 40.0 43.0 40.0
BMI (kg/m2)
27.7 24.0 27.3 28.0 27.5
Lípidos & Lipoproteínas, mg/dl
Apo CIII
6.3 10.4 9.5 11.6 8.7
Triglicéridos
97 124 94 195 89
Colesterol Total
195 157 196 185 181
(continuación)
Características de valor inicial de cohortes MAD
HDL-C
45 42 46 43 62
Non-HDL-C
136 118 150 149 126
LDL-C
112 93 131 95 102
Población por protocolo. Los valores presentados son medianos.
Tabla 35
15
25
35
45
Reducción prolongada dependiente de la dosis en ApoCIII en suero: % de cambio mediano en ApoCIII del valor inicial
Día de Estudio
Placebo 50 mg 100 mg 200 mg 400 mg
Día 5
38.6 33.4 -4.5 -10.8 -42.6
Día 8
31.9 17.8 -5.2 -36.0 -78.6
Día 15
0.0 -22.1 -24.0 -54.1 -79.8
Día 22
11.7 -20.9 -21.0 -61.7 -86.4
Día 23
15.8 -15.6 -11.9 -58.7 -79.0
Día 29
-11.0 -19.7 -17.3 -70.5 -77.5
Día 36
1.9 -26.6 -32.1 -57.3 -69.5
Día 50
16.4 21.9 -3.9 -63.0 -78.6
Tabla 36
Reducciones dependientes de la dosis en triglicéridos:% de cambio mediano en triglicéridos del valor inicial
Día de Estudio
Placebo 50 mg 100 mg 200 mg 400 mg
Día 5
78.5 50.0 15.9 -15.6 -7.7
Día 8
34.9 17.7 -24.5 -31.8 -38.5
Día 15
21.2 -27.4 -12.8 -50.8 -46.2
Día 22
12.2 -18.3 -9.8 -25.1 -53.8
Día 23
51.8 -4.0 1.1 -41.0 -44.2
Día 29
28.5 -19.5 -25.0 -43.1 -43.8
Día 36
15.4 -33.1 -34.8 -17.9 -36.5
Día 50
33.1 48.8 -23.9 -48.2 -48.1
El cambio mediano porcentual de los valores iniciales en los grupos de dosis múltiple de 50, 100, 200 y 400
55 mg mostró reducciones de apoC-III totales del 20, 17, 71 y 78% y de TG del 20, 25, 43 y 44%, respectivamente, una semana (Día 29) después de la última dosis. Las reducciones se mantuvieron durante por lo menos cuatro semanas después de la última dosis en los grupos con dosis más altas.
Los niveles de TG se dispararon en el día 5 y 23 para el grupo de placebo, coincidiendo con las estadías nocturnas de los sujetos en el Centro de Estudio. Se cree que la dieta proporcionada por el Centro de Estudio llevó al aumento en los niveles de TG en los sujetos que pasaron la noche en el Centro de Estudio. El ISIS 304801 disminuyó el pico de TG de una manera dependiente de la dosis. De una manera, los resultados mostrados en la presente, indican un efecto posprandial en los TG (aunque los niveles de TG fueron evaluados después de un ayuno de 12 horas) por el ISIS 304801 cuando un aumento repentino inducido por la dieta en los TG disminuyó de manera
65 dependiente de la dosis por ISIS 304801.
15
25
35
45
55
65
Los valores de LDL-C no cambiaron (datos no mostrados) mientras que los valores de HDL-C tendieron a aumentar de una manera dependiente del tratamiento como se muestra en la Tabla 37.
Tabla 37
Sin efectos nocivos en HDL-C
Día de Estudio
Placebo 50 mg 100 mg 200 mg 400 mg
Día 5
-5.9 7.7 -3.1 -3.2 -16.1
Día 8
2.1 2.4 0.0 -11.1 -2.9
Día 15
-2.8 4.8 10.9 4.7 -9.7
Día 22
-0.6 4.8 8.7 11.6 -2.0
Día 23
0.7 7.1 12.5 19.4 -1.6
Día 29
2.1 19.0 0.0 13.9 8.0
Día 36
0.0 23.8 8.8 13.9 1.6
Día 50
-4.8 16.7 5.9 25.0 14.5

Ejemplo 11: Ensayo clínico de Fase II de ISIS 304801
Se planificó un estudio de respuesta a la dosis, aleatorizado, doble ciego, controlado con placebo, para evaluar los efectos farmacodinámicos de dosis/respuesta de ISIS 304801 frente a placebo en apoC-III en ayunas asociados con los niveles de VLDL. Los puntos finales adicionales para evaluar incluyen: los efectos farmacodinámicos de ISIS 304801 frente a placebo en ayunas apoC-III total, TG, apoC-II (total y asociado con VLDL), apolipoproteína B-100 (apoB-100), apolipoproteína A-1 (apoA-1), apolipoproteína A-2 (apoA-2), apolipoproteína E (apoE), colesterol total (TC), colesterol de lipoproteína de baja densidad (LDL-C), LDL-TG, VLDL-C, VLDL-TG , lipoproteína-colesterol no de alta densidad (no-HDL-C), no-HDL-TG, HDL-C, HDL-TG, quilomicrón-C (CM-C), CM-TG, ácidos grasos libres (AGL) y niveles de glicerol; las características y cinéticas de lípidos postprandiales, apolipoproteínas y lipoproteínas, y los niveles de glucosa en un subconjunto de los pacientes en el estudio y se evalúan una PK más extensa en otro subgrupo de pacientes (no serán los mismos pacientes que los sometidos a la evaluación posprandial); y, la seguridad, tolerabilidad y PK de ISIS 304801.
Para cada paciente, el período de participación consiste en un período de examen de ≤5 semanas (que incluye un período de calificación de ejecución de control ajustado de la dieta de 4 semanas), un período de calificación/evaluación de valores iniciales del estudio de 1 semana, un periodo de tratamiento de 13 semanas, y un período de evaluación posterior al tratamiento de 13 semanas, para un total de 32 semanas de participación en el estudio. Las medicaciones concomitantes y los eventos adversos (EA) se registrarán a lo largo de todos los períodos del estudio.
Los pacientes serán de por lo menos 18 años de edad y tendrán TG ≥500mg/dl en ayunas durante el examen y los TG en ayunas ≥300mg/dl y ≤2000mg/dl después de 4 semanas de control de ejecución ajustado de la dieta.
Para este estudio están planificados setenta y dos (72) pacientes. Habrá 24 pacientes planificados por cohorte de dosis (100, 200, 300 mg) con 18 ISIS 304801 (activo) y 6 pacientes con placebo por cohorte. Los pacientes elegibles se inscribirán por igual (1:1) en un grupo PK no extenso/posprandial (Grupo 1) o en un grupo PK extenso/posprandial (Grupo 2). Los pacientes en el Grupo 2 serán aleatorizados por igual (1:1) a un grupo PK extenso (Grupo 2a) o un grupo de evaluación posprandial (Grupo 2b). Los pacientes del grupo 2a serán aleatorizados por igual (1:1:1) a 1 de las 3 cohortes de dosis (100, 200, 300 mg) y, dentro de cada cohorte de dosis,
5:1 para recibir activo o placebo. Los pacientes del grupo 2b se aleatorizarán por igual (1:1) a 1 de 2 cohortes de dosis (200, 300 mg) y, dentro de cada cohorte de dosis, 2:1 para recibir activo o placebo. Los pacientes del grupo 1 se aleatorizarán a cohortes de dosis y tratamiento de una manera que logre una aleatorización del estudio total de
1:1:1 para cohorte de dosis (100, 200, 300 mg) y 3:1 para tratamiento (activo, placebo).
Los pacientes serán colocados en una dieta estrictamente controlada (después de que se realicen los procedimientos de examen) durante la duración de la participación en el estudio. Después de 28 días con la dieta controlada, los pacientes tendrán valores iniciales y serán evaluados para calificación de la inscripción en la fase de tratamiento del estudio. Los pacientes que cumplan con los criterios de inscripción después de la ejecución de la dieta se inscribirán por igual (1:1) en un grupo PK no extenso/posprandial (Grupo 1) o en un grupo PK
imagen36

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  1. imagen1
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