KR20220012284A - 핵산, 약학 조성물, 컨쥬게이트와 이의 제조 방법 및 용도 - Google Patents

핵산, 약학 조성물, 컨쥬게이트와 이의 제조 방법 및 용도 Download PDF

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KR20220012284A
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홍얀 장
샨 가오
다이위 캉
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쑤저우 리보 라이프 사이언스 컴퍼니, 리미티드
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Abstract

본 발명은 보체 단백질 5(C5) 유전자의 발현을 억제하기 위한 siRNA와, siRNA를 함유하는 약학 조성물 및 컨쥬게이트를 제공한다. siRNA내 뉴클레오티드들은 각각 독립적으로 변형 뉴클레오티드 또는 비 변형 뉴클레오티드이다. siRNA는 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함한다. 센스 가닥은 뉴클레오티드 서열 I을 포함하고, 뉴클레오티스 서열 I은 그 길이가 서열 번호 1에 제시된 뉴클레오티드 서열의 길이와 동일하되, 3개 이하의 뉴클레오티드만큼의 차이를 보인다. 안티센스 가닥은 뉴클레오티드 서열 II를 포함하고, 뉴클레오티드 서열 II는 그 길이가 서열 번호 2에 제시된 뉴클레오티드 서열의 길이와 동일하되, 3개 이하의 뉴클레오티드만큼의 차이를 보인다. 본 발명에서 제공하는 siRNA, 약학적 조성물 및 이의 접합체는 중증 근무력증(MG)과 같은 보체 매개 관련 질환을 효과적으로 치료 및/또는 예방할 수 있다.

Description

핵산, 약학 조성물, 컨쥬게이트와 이의 제조 방법 및 용도
본 발명은 보체 단백질 5(C5) 유전자의 발현을 억제할 수 있는 핵산, 약학 조성물 및 siRNA 컨쥬게이트에 관한 것이다. 본 발명은 또한 핵산의 컨쥬게이트, 약학 조성물 및 siRNA 컨쥬게이트의 제조 방법 및 용도에 관한 것이다.
중증근무력증(MG)은, 주로 아세틸콜린 수용체 항체(AchR-Ab)에 의해 매개되고, 세포 면역성에 의존적이며, 보체가 관여하는 후천적 자가면역질환으로서, 신경근접합부의 후시냅스 막 상 아세틸콜린 수용체(AChR)가 관련되어 있다.
보체 단백질(C5)은 중증근무력증을 치료하는데 핵심적인 표적 중 하나이다. 보체가 관여할 때, AchR-Ab는 AchR과 결합한 후, 보체 매개성 세포막 용해를 통해 다수의 AchR을 파괴하고, 그 결과 후시냅스 막 내 아세틸콜린 전달에 장애가 일어나 근력저하가 초래된다. 연구들은, 약물과 보체 단백질 C5가 특이적으로 통합될 때, C5는 C5a와 C5b로 분해될 수 없게 되고, 이로 말미암아 막 공격 복합체 형성이 억제되며, 신경근접합부 상에 있던 막 공격 복합체의 파괴작용과 후속 전염증 인자 생성이 차단되어 면역억제현상이 발생하고, 이로써 중증근무력증은 치료된다고 보여왔다.
RNA 간섭(RNAi) 기작을 기반으로 하는 소형 간섭 RNA(siRNA)는 관심 표적 유전자 발현을 서열 특이적 방식으로 억제하거나 차단할 수 있으며, 이로써 질환 치료라는 목적이 달성된다. 이는, 만일 C5 유전자의 발현이 억제되어 보체 단백질 생성이 차단될 수 있고, 이 C5 유전자 발현은 정상적인 면역 기능을 유지할 수 있으며, mRNA 수준에 따른 비정상적 면역 반응을 억제할 수 있으면, 확실히 가장 이상적인 치료가 될 것이다.
C5 유전자 발현을 억제하고, 중증근무력증을 치료하기 위한 siRNA 약물을 개발함에 있어 핵심은, 적합한 siRNA와 변형, 그리고 이의 유효 전달 시스템을 찾는 것에 있다.
놀랍게도, 본 발명의 발명자들은 본원에 기재된 본 발명에 의해 제공된 siRNA 컨쥬게이트가 C5 유전자 발현을 특이적으로 억제하고, 간을 특이적으로 표적화하여, 간 내 C5 유전자 발현을 억제함으로써 중증근무력증의 치료 또는 예방이 달성될 수 있음을 발견하였다. 게다가 본 발명자들은 또한 활성이 큰 siRNA와 약학 조성물을 발명하였다.
몇몇 구현예에서, 본 발명은 하기 화학식 308로 표시되는 바와 같은 구조를 가지는 siRNA 컨쥬게이트(conjugate)를 제공한다:
화학식 308
Figure pct00001
단 여기서 n1은 1 ~ 3의 정수이고, n3은 0 ~ 4의 정수이고; m1, m2 및 m3은 각각 독립적으로 2 ~ 10의 정수이고; R10, R11, R12, R13, R14 또는 R15는 각각 독립적으로 H이거나, C1 ~ C10 알킬, C1 ~ C10 할로알킬 및 C1 ~ C10 알콕시로 이루어진 군으로부터 선택되고; R3은 화학식 A59, 즉
화학식 A59
Figure pct00002
로 표시되는 바와 같은 구조를 가지는 기이되,
단 여기서 E1은 OH, SH 또는 BH2이고;
Nu는 siRNA이고; siRNA는 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함하되, siRNA 중 뉴클레오티드는 각각 독립적으로 변형 또는 비변형 뉴클레오티드이고, 이 센스 가닥은 뉴클레오티드 서열 I을 포함하고, 이 안티센스 가닥은 뉴클레오티드 서열 II를 포함하고; 이들 뉴클레오티드 서열 I 및 뉴클레오티드 서열 II는 적어도 부분적으로 역 상보성으로서, 이중 가닥 영역을 형성하고; 이들 뉴클레오티드 서열 I 및 뉴클레오티드 서열 II는 하기 i) ~ vi), 즉
i) 서열 번호 1에 보인 뉴클레오티드 서열과 길이가 동일하되 3개 이하의 뉴클레오티드만큼의 차이를 보이는 뉴클레오티드 서열 I; 및 서열 번호 2에 보인 뉴클레오티드 서열과 길이가 동일하되 3개 이하의 뉴클레오티드만큼의 차이를 보이는 뉴클레오티드 서열 II:
5'-CUUCAUUCAUACAGACAAZ1-3' (서열 번호 1);
5'-Z2UUGUCUGUAUGAAUGAAG-3' (서열 번호 2)
[단 여기서 Z1은 A이고, Z2는 U이고, 뉴클레오티드 서열 I은 Z1에 대응하는 부위에 뉴클레오티드 Z3을 포함하고, 뉴클레오티드 서열 II는 Z2에 대응하는 부위에 뉴클레오티드 Z4를 포함하고, Z4는 안티센스 가닥의 5'-말단으로부터 첫 번째 뉴클레오티드임];
ii) 서열 번호 61에 보인 뉴클레오티드 서열과 길이가 동일하되 3개 이하의 뉴클레오티드만큼의 차이를 보이는 뉴클레오티드 서열 I; 및 서열 번호 62에 보인 뉴클레오티드 서열과 길이가 동일하되 3개 이하의 뉴클레오티드만큼의 차이를 보이는 뉴클레오티드 서열 II:
5'-CUACAGUUUAGAAGAUUUZ5-3' (서열 번호 61);
5'-Z6AAAUCUUCUAAACUGUAG-3' (서열 번호 62)
[단 여기서 Z5는 A이고, Z6은 U이고, 뉴클레오티드 서열 I은 Z5에 대응하는 부위에 뉴클레오티드 Z7을 포함하고, 뉴클레오티드 서열 II는 Z6에 대응하는 부위에 뉴클레오티드 Z8를 포함하고, Z8는 안티센스 가닥의 5'-말단으로부터 첫 번째 뉴클레오티드임];
iii) 서열 번호 121에 보인 뉴클레오티드 서열과 길이가 동일하되 3개 이하의 뉴클레오티드만큼의 차이를 보이는 뉴클레오티드 서열 I; 및 서열 번호 122에 보인 뉴클레오티드 서열과 길이가 동일하되 3개 이하의 뉴클레오티드만큼의 차이를 보이는 뉴클레오티드 서열 II:
5'-GGAAGGUUACCGAGCAAUZ9-3' (서열 번호 121);
5'-Z10AUUGCUCGGUAACCUUCC-3' (서열 번호 122)
[단 여기서 Z9는 A이고, Z10은 U이고, 뉴클레오티드 서열 I은 Z9에 대응하는 부위에 뉴클레오티드 Z11을 포함하고, 뉴클레오티드 서열 II는 Z10에 대응하는 부위에 뉴클레오티드 Z12를 포함하고, Z12는 안티센스 가닥의 5'-말단으로부터 첫 번째 뉴클레오티드임];
iv) 서열 번호 181에 보인 뉴클레오티드 서열과 길이가 동일하되 3개 이하의 뉴클레오티드만큼의 차이를 보이는 뉴클레오티드 서열 I; 및 서열 번호 182에 보인 뉴클레오티드 서열과 길이가 동일하되 3개 이하의 뉴클레오티드만큼의 차이를 보이는 뉴클레오티드 서열 II:
5'-AGAACAGACAGCAGAAUUZ13-3' (서열 번호 181);
5'-Z14AAUUCUGCUGUCUGUUCU-3' (서열 번호 182)
[단 여기서 Z13은 A이고, Z14는 U이고, 뉴클레오티드 서열 I은 Z13에 대응하는 부위에 뉴클레오티드 Z15를 포함하고, 뉴클레오티드 서열 II는 Z14에 대응하는 부위에 뉴클레오티드 Z16을 포함하고, Z16은 안티센스 가닥의 5'-말단으로부터 첫 번째 뉴클레오티드임];
v) 서열 번호 241에 보인 뉴클레오티드 서열과 길이가 동일하되 3개 이하의 뉴클레오티드만큼의 차이를 보이는 뉴클레오티드 서열 I; 및 서열 번호 242에 보인 뉴클레오티드 서열과 길이가 동일하되 3개 이하의 뉴클레오티드만큼의 차이를 보이는 뉴클레오티드 서열 II:
5'-CCAAGAAGAACGCUGCAAZ17-3' (서열 번호 241);
5'-Z18UUGCAGCGUUCUUCUUGG-3' (서열 번호 242)
[단 여기서 Z17은 A이고, Z18은 U이고, 뉴클레오티드 서열 I은 Z17에 대응하는 부위에 뉴클레오티드 Z19를 포함하고, 뉴클레오티드 서열 II는 Z18에 대응하는 부위에 뉴클레오티드 Z20을 포함하고, Z20은 안티센스 가닥의 5'-말단으로부터 첫 번째 뉴클레오티드임]; 및
vi) 서열 번호 301에 보인 뉴클레오티드 서열과 길이가 동일하되 3개 이하의 뉴클레오티드만큼의 차이를 보이는 뉴클레오티드 서열 I; 및 서열 번호 302에 보인 뉴클레오티드 서열과 길이가 동일하되 3개 이하의 뉴클레오티드만큼의 차이를 보이는 뉴클레오티드 서열 II:
5'-CCAGUAAGCAAGCCAGAAZ21-3' (서열 번호 301);
5'-Z22UUCUGGCUUGCUUACUGG-3' (서열 번호 302)
[단 여기서 Z21은 A이고, Z22는 U이고, 뉴클레오티드 서열 I은 Z21에 대응하는 부위에 뉴클레오티드 Z23을 포함하고, 뉴클레오티드 서열 II는 Z22에 대응하는 부위에 뉴클레오티드 Z24를 포함하고, Z24는 안티센스 가닥의 5'-말단으로부터 첫 번째 뉴클레오티드임]
에 보인 서열들의 군으로부터 선택되고;
R2는 길이가 탄소 원자 1개 ~ 20개인 선형 알킬렌이되, 탄소 원자 1개 이상은 C(O), NH, O, S, CH=N, S(O)2, C2 ~ C10 알케닐렌, C2 ~ C10 알키닐렌, C6 ~ C10 아릴렌, C3 ~ C18 헤테로사이클릴렌 및 C5 ~ C10 헤테로아릴렌으로 이루어진 군의 임의의 것 1개 이상으로 선택적으로 대체되고; R2는 C1 ~ C10 알킬, C6 ~ C10 아릴, C5 ~ C10 헤테로아릴, C1 ~ C10 할로알킬, -OC1 ~ C10 알킬, -OC1 ~ C10 알킬페닐, -C1 ~ C10 알킬-OH, -OC1 ~ C10 할로알킬, -SC1 ~ C10 알킬, -SC1 ~ C10 알킬페닐, -C1 ~ C10 알킬-SH, -SC1 ~ C10 할로알킬, 할로 치환기, -OH, -SH, -NH2, -C1 ~ C10 알킬-NH2, -N(C1 ~ C10 알킬)(C1 ~ C10 알킬), -NH(C1 ~ C10 알킬), -N(C1 ~ C10 알킬)(C1 ~ C10 알킬페닐), -NH(C1 ~ C10 알킬페닐), 시아노, 니트로, -CO2H, -C(O)O(C1 ~ C10 알킬), -CON(C1 ~ C10 알킬)(C1 ~ C10 알킬), -CONH(C1 ~ C10 알킬), -CONH2, -NHC(O)(C1 ~ C10 알킬), -NHC(O)(페닐), -N(C1 ~ C10 알킬)C(O)(C1 ~ C10 알킬), -N(C1 ~ C10 알킬)C(O)(페닐), -C(O)C1 ~ C10 알킬, -C(O)C1 ~ C10 알킬페닐, -C(O)C1 ~ C10 할로알킬, -OC(O)C1 ~ C10 알킬, -SO2(C1 ~ C10 알킬), -SO2(페닐), -SO2(C1 ~ C10 할로알킬), -SO2NH2, -SO2NH(C1 ~ C10 알킬), -SO2NH(페닐), -NHSO2(C1 ~ C10 알킬), -NHSO2(페닐) 및 -NHSO2(C1 ~ C10 할로알킬)로 이루어진 군의 임의의 것 1개 이상으로 선택적으로 치환되고;
L1은 각각 독립적으로 길이가 탄소 원자 1개 ~ 70개인 선형 알킬렌이되, 탄소 원자 1개 이상은 C(O), NH, O, S, CH=N, S(O)2, C2 ~ C10 알케닐렌, C2 ~ C10 알키닐렌, C6 ~ C10 아릴렌, C3 ~ C18 헤테로사이클릴렌 및 C5 ~ C10 헤테로아릴렌으로 이루어진 군의 임의의 것 1개 이상으로 선택적으로 대체되고; L1은 C1 ~ C10 알킬, C6 ~ C10 아릴, C5 ~ C10 헤테로아릴, C1 ~ C10 할로알킬, -OC1 ~ C10 알킬, -OC1 ~ C10 알킬페닐, -C1 ~ C10 알킬-OH, -OC1 ~ C10 할로알킬, -SC1 ~ C10 알킬, -SC1 ~ C10 알킬페닐, -C1 ~ C10 알킬-SH, -SC1 ~ C10 할로알킬, 할로 치환기, -OH, -SH, -NH2, -C1 ~ C10 알킬-NH2, -N(C1 ~ C10 알킬)(C1 ~ C10 알킬), -NH(C1 ~ C10 알킬), -N(C1 ~ C10 알킬)(C1 ~ C10 알킬페닐), -NH(C1 ~ C10 알킬페닐), 시아노, 니트로, -CO2H, -C(O)O(C1 ~ C10 알킬), -CON(C1 ~ C10 알킬)(C1 ~ C10 알킬), -CONH(C1 ~ C10 알킬), -CONH2, -NHC(O)(C1 ~ C10 알킬), -NHC(O)(페닐), -N(C1 ~ C10 알킬)C(O)(C1 ~ C10 알킬), -N(C1 ~ C10 알킬)C(O)(페닐), -C(O)C1 ~ C10 알킬, -C(O)C1 ~ C10 알킬페닐, -C(O)C1 ~ C10 할로알킬, -OC(O)C1 ~ C10 알킬, -SO2(C1 ~ C10 알킬), -SO2(페닐), -SO2(C1 ~ C10 할로알킬), -SO2NH2, -SO2NH(C1 ~ C10 알킬), -SO2NH(페닐), -NHSO2(C1 ~ C10 알킬), -NHSO2(페닐) 및 -NHSO2(C1 ~ C10 할로알킬)로 이루어진 군의 임의의 것 1개 이상으로 선택적으로 치환되고;
Figure pct00003
는 기가 공유 결합되는 부위를 표시하고; M1은 표적화 기를 표시한다.
몇몇 구현예에서, 본 발명은 C5 유전자의 발현을 억제할 수 있는 siRNA를 제공하는데, 단 이 siRNA는 센스 가닥과 안티센스 가닥을 포함하고, 센스 가닥 및 안티센스 가닥내 뉴클레오티드들은 각각 독립적으로 플루오르화 변형 뉴클레오티드 또는 비 플루오르화 변형 뉴클레오티드이고; 센스 가닥은 뉴클레오티드 서열 I을 포함하고, 안티센스 가닥은 뉴클레오티드 서열 II를 포함하되, 뉴클레오티드 서열 I 및 뉴클레오티드 서열 II는 적어도 부분적으로 역 상보성으로서, 이중 가닥 영역을 형성하고; 이 플루오르화 변형 뉴클레오티드는 뉴클레오티드 서열 I 및 뉴클레오티드 서열 II 내에 5'-말단 → 3'-말단 방향으로 위치하고, 센스 가닥 내 뉴클레오티드 서열 I의 7번, 8번 및 9번 위치에 있는 뉴클레오티드는 플루오르화 변형 뉴클레오티드이고, 센스 가닥의 나머지 위치에 있는 뉴클레오티드는 비 플루오르화 변형 뉴클레오티드이고; 안티센스 가닥 내 뉴클레오티드 서열 II의 5'-말단 → 3'-말단 방향으로 2번, 6번, 14번 및 16번 위치에 있는 뉴클레오티드는 플루오르화 변형 뉴클레오티드이고, 안티 센스 가닥의 나머지 위치에 있는 뉴클레오티드는 비 플루오르화 변형 뉴클레오티드이며, 뉴클레오티드 서열 I 및 뉴클레오티드 서열 II는 상기 i) ~ vi) 중 어느 1개로부터 선택된다.
몇몇 구현예에서, 본 발명은 상기 언급된 본 발명의 siRNA 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약학 조성물을 제공한다.
몇몇 구현예에서, 본 발명은 상기 언급된, 본 발명에 의해 제공되는 siRNA와 이 siRNA에 공액결합하는 공액기(conjugating group)를 포함하는 siRNA 컨쥬게이트를 제공한다.
몇몇 구현예에서, 본 발명은 중증근무력증 치료 및/또는 예방을 위한 의약품을 제조함에 있어 본 발명에 따른 siRNA 및/또는 약학 조성물 및/또는 siRNA 컨쥬게이트의 용도를 제공한다.
몇몇 구현예에서, 본 발명은 중증근무력증이 발병한 환자에게 본 발명의 siRNA 및/또는 약학 조성물 및/또는 siRNA 컨쥬게이트 유효량만큼을 투여하는 단계를 포함하는, 중증근무력증을 치료 및/또는 예방하기 위한 방법을 제공한다.
몇몇 구현예에서, 본 발명은 간세포와, 본 발명의 siRNA 및/또는 약학 조성물 및/또는 siRNA 컨쥬게이트 유효량만큼을 접촉시키는 단계를 포함하는, 간세포에서 C5 유전자의 발현을 억제하기 위한 방법을 제공한다.
몇몇 구현예에서, 본 발명은 본 발명의 siRNA 및/또는 약학 조성물 및/또는 siRNA 컨쥬게이트를 포함하는 키트를 제공한다.
몇몇 구현예에서, 본 발명에 의해 제공되는 siRNA, 약학 조성물 및 siRNA 컨쥬게이트는 더 우수한 안정성, 더 큰 C5 mRNA 억제 활성 및 더 작은 오프-타겟 효과(off-target effect)를 가지고/가지거나 중증근무력증 증상을 유의미하게 치료 또는 완화할 수 있다.
몇몇 구현예에서, 본 발명에 의해 제공되는 siRNA, 약학 조성물 또는 siRNA 컨쥬게이트는 시험관내 세포 실험에서 탁월한 표적 mRNA 억제 활성을 보인다. 몇몇 구현예에서, 본 발명에 의해 제공되는 siRNA, 약학 조성물 또는 siRNA 컨쥬게이트는 적어도 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 95%의 간세포내 표적 mRNA 억제 백분율을 보인다.
몇몇 구현예에서, 본 발명에 의해 제공되는 siRNA는 HepG2 세포내에서 더 큰 억제 활성을 보이고, C5 mRNA에 대한 IC50은 1.494 nM ~ 9.688 nM이다. 몇몇 구현예에서, 본 발명에 따른 siRNA 컨쥬게이트로서 형광 표지를 가지는 siRNA 컨쥬게이트는 C75 마우스를 대상으로 하는 실시간 형광 영상화를 수행하고 장기내 형광 분포를 관찰하기 위해 이 마우스에 피하 주사된다. 48시간 경과 후 마우스는 장기 절개를 위해 사멸되고, 이 때 거의 모든 siRNA 컨쥬게이트가 간에 모여있는 것이 발견되는데, 이는 본 발명에 의해 제공된 siRNA 컨쥬게이트가 siRNA를 간에만 효과적으로 전달할 수 있고, 이 컨쥬게이트는 간 내 표적 mRNA의 발현을 특이적으로 억제할 수 있음을 나타낸다.
몇몇 구현예에서, 본 발명에 의해 제공되는 siRNA, 약학 조성물 또는 siRNA 컨쥬게이트는 생체내 더 큰 안정성 및/또는 더 큰 활성을 보일 수 있다. 몇몇 구현예에서, 본 발명에 의해 제공되는 siRNA, 약학 조성물 또는 siRNA 컨쥬게이트는 적어도 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 95%의 생체내 표적 mRNA 억제 백분율을 보인다. 몇몇 구현예에서, 본 발명에 의해 제공되는 siRNA, 약학 조성물 또는 siRNA 컨쥬게이트는 적어도 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 95%의 생체내 C5 mRNA 발현 억제 백분율을 보인다. 몇몇 구현예에서, 본 발명에 의해 제공되는 siRNA, 약학 조성물 또는 siRNA 컨쥬게이트는 적어도 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 95%의 간 내 C5 mRNA 발현 생체내 억제 백분율을 보인다. 몇몇 구현예에서, 본 발명에 의해 제공되는 siRNA, 약학 조성물 또는 siRNA 컨쥬게이트는 적어도 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 95%의 동물 모델 간 내 C5 mRNA 발현 생체내 억제 백분율을 보인다. 몇몇 구현예에서, 본 발명에 의해 제공되는 siRNA, 약학 조성물 또는 siRNA 컨쥬게이트는 적어도 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 95%의 인간 대상체 간 내 C5 mRNA 발현 생체내 억제 백분율을 보인다.
몇몇 구현예에서, 본 발명에 의해 제공되는 siRNA, 약학 조성물 또는 siRNA 컨쥬게이트는 유의미하지 않은 오프-타겟 효과를 보인다. 오프-타겟 효과는, 예를 들어 표적 유전자가 아닌 유전자의 정상 발현을 억제하는 것일 수 있다. 만일 오프-타겟 유전자 결합/오프-타겟 유전자 발현 억제 수준이 온-타겟 효과의 수준보다 50%, 40%, 30%, 20% 또는 10% 낮으면, 유의미하지 않은 것으로 간주된다.
이러한 방식으로, 본 발명에 의해 제공되는 siRNA, 약학 조성물 및 siRNA 컨쥬게이트는 C5 mRNA 발현을 억제할 수 있고, 중증근무력증 증상을 유효하게 치료 및/또는 예방할 수 있으며, 적용 가능성이 우수할 수 있음을 알 수 있다.
본 발명의 기타 특징 및 이점은 이하 "발명을 실시하기 위한 구체적 내용" 섹션에 상세히 기재될 것이다.
도 1a ~ 도 1h는, 상이한 컨쥬게이트 1 ~ 8을 형질감염시킨 후 HepG2 세포내 C5 mRNA의 상대적 발현 수준에 따라 피팅(fitting)한 용량-반응 곡선이다.
도 2a는, 48시간 동안 1 × PBS 5 ml/kg, Cy5-siRNA 1 3 mg/kg, 또는 Cy5-컨쥬게이트 1 3 mg/kg이 투여되었을 때, C57 마우스의 다양한 장기의 형광 영상화 사진이다.
도 2b는, 48시간 동안 1 × PBS 5 ml/kg, Cy5-siRNA 2 3 mg/kg, 또는 Cy5-컨쥬게이트 2 3 mg/kg이 투여되었을 때, C57 마우스의 다양한 장기의 형광 영상화 사진이다.
본 발명의 특정 구현예는 이하에 상세히 기재되어 있다. 본원에 기재된 특정 구현예는 오로지 본 발명을 예시하고 설명하기 위한 목적으로 제공된 것이지, 본 발명을 어떠한 관점에서도 한정하고자 하는 것은 아님이 이해되어야 할 것이다.
본 발명에서 C5 mRNA란, Genbank 등록 번호 M57729.1로 보인 서열을 가지는 mRNA를 지칭한다. 더욱이, 달리 진술되지 않는 한, 본 발명에 사용된 "표적 유전자"란 용어는, 상기 C5 mRNA를 전사할 수 있는 유전자를 지칭하고, "표적 mRNA"란 용어는 상기 C5 mRNA를 지칭한다.
정의
본 발명의 내용 중 달리 명시되어 있지 않는 한, 대문자 C, G, U 및 A는 뉴클레오티드의 염기 조성을 나타내고; 소문자 m은 글자 "m"의 좌측에 인접하는 뉴클레오티드가 메톡시 변형 뉴클레오티드임을 나타내며; 소문자 f는 글자 "f"의 좌측에 인접하는 뉴클레오티드가 플루오르화 변형 뉴클레오티드임을 나타내고; 소문자 s는 글자 "s"의 좌측 및 우측에 인접하는 뉴클레오티드 2개가 포스포로티오에이트에 의해 결합됨을 나타내고; P1은 "P1"의 우측에 인접하는 뉴클레오티드가 5'-인산염 뉴클레오티드 또는 5'-인산염 유사체 변형 뉴클레오티드임을 나타내고, 글자 조합 VP는 글자 조합 "VP"의 우측에 인접하는 뉴클레오티드가 인산비닐 변형 뉴클레오티드임을 나타내고, 글자 조합 Ps는 글자 조합 "Ps"의 우측에 인접하는 뉴클레오티드가 포스포로티오에이트 변형 뉴클레오티드임을 나타내고, 대문자 P는 글자 "P"의 우측에 인접하는 뉴클레오티드가 5'-인산염 뉴클레오티드임을 나타낸다.
본 발명의 내용 중 "플루오르화 변형 뉴클레오티드"란, 뉴클레오티드 리보스기의 2'-하이드록시를 플루오르기로 치환하여 생성된 뉴클레오티드를 지칭하고, "비 플루오르화 변형 뉴클레오티드"란, 뉴클레오티드 리보스기의 2'-하이드록시를 비 플루오르기로 치환하여 생성된 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 유사체를 지칭한다. "뉴클레오티드 유사체"란, 구조 면에서 아데닌 리보뉴클레오티드, 구아닌 리보뉴클레오티드, 시토신 리보뉴클레오티드, 우라실 리보뉴클레오티드 또는 티미딘 데옥시리보뉴클레오티드와 상이하지만, 핵산내 뉴클레오티드를 어떤 기가 대체하여 들어갈 수 있는 경우를 지칭하며, 예컨대 이소뉴클레오티드, 가교 핵산(BNA) 뉴클레오티드 또는 비사이클릭(acyclic) 뉴클레오티드가 있다. "메톡시 변형 뉴클레오티드"란, 뉴클레오티드 리보스기 2'-하이드록시를 메톡시기로 치환하여 생성된 뉴클레오티드를 지칭한다.
본 발명의 내용 중 "상보성(complementary)" 및 "역 상보성"이란 표현은 호환되어 사용될 수 있는 것으로서, 이중 가닥 핵산 분자 중 하나의 가닥에 있는 염기들은 또 다른 가닥에 있는 염기들과 상보적으로 쌍을 이루는 경우를 의미한다고 당 분야에 널리 공지되어 있다. DNA에서 퓨린 염기인 아데닌(A)은 항상 피리미딘 염기인 티민(T)(또는 RNA의 우라실(U))과 쌍을 이루고; 퓨린 염기인 구아닌(G)은 항상 피리미딘 염기인 시토신(C)과 쌍을 이룬다. 각각의 염기쌍은 퓨린 및 피리미딘을 포함한다. 하나의 가닥에 있는 아데닌은 항상 다른 가닥에 있는 티민(또는 우라실)과 쌍을 이루고, 구아닌은 항상 시토신과 쌍을 이룰 때, 이 두 가닥은 서로 상보성인 것으로 간주되고; 어떤 가닥의 서열은 자체의 상보성 가닥의 서열로부터 추론될 수 있다. 이에 상응하여, "오류 쌍형성(mispairing)"이란, 이중 가닥 핵산에서 대응하는 부위에 있는 염기들이 상보적으로 쌍을 이루는 방식으로 존재하지 않음을 의미한다.
본 발명의 내용 중 달리 명시되지 않는 한, "기본적으로 역 상보성"이란, 뉴클레오티드 서열 2개 사이에 3개 이하의 염기가 오류 쌍형성을 보이는 경우를 의미한다. "실질적으로 역 상보성"이란, 뉴클레오티드 서열 2개 사이에 1개 이하의 염기가 오류 쌍형성을 보이는 경우를 의미한다. "완전 상보성"이란, 뉴클레오티드 서열 2개 사이에 염기 오류 쌍형성이 보이지 않는 경우를 의미한다.
본 발명의 내용 중, 어떤 뉴클레오티드 서열이 다른 뉴클레오티드 서열과 "뉴클레오티드 차이"를 보이면, 이 뉴클레오티드 서열 간 동일 위치에 있는 뉴클레오티드의 염기는 변경된 것이다. 예를 들어 만일 제2 서열의 뉴클레오티드 염기가 A이고, 제1 서열 동일 위치에 있는 뉴클레오티드 염기가 U, C, G 또는 T이면, 이들 뉴클레오티드 서열 2개는 해당 위치에 뉴클레오티드 차이를 보이는 것으로 간주된다. 몇몇 구현예에서, 만일 어떤 위치의 뉴클레오티드가 무염기 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 유사체로 대체되면, 해당 위치에 뉴클레오티드 차이를 보이는 것으로 또한 간주된다.
본 발명의 내용, 구체적으로 본 발명의 siRNA, 이 siRNA를 포함하는 조성물 또는 siRNA 컨쥬게이트를 제조하기 위한 방법을 설명하는 내용 중, 달리 명시되어 있지 않는 한, 뉴클레오티드 단량체란, 제조될 siRNA 또는 siRNA 컨쥬게이트 내 뉴클레오티드의 종류 및 서열에 따라서, 고상 포스포라미다이트 합성에 사용되는 비변형 또는 변형 RNA 포스포라미다이트를 지칭한다(이 RNA 포스포라미다이트는 어딘가에 뉴클레오시드 포스포라미다이트라 칭하여지기도 함). 고상 포스포라미다이트 합성은 RNA 합성에 사용되는 방법으로서, 당 업자들에게 널리 공지되어 있다. 본 발명에 사용된 뉴클레오시드 단량체는 모두 상업상 이용 가능하다.
본 발명의 내용 중 달리 진술되어 있지 않는 한, "공액결합(conjugating)"이란, 2개 이상의 화학기 각각이 공유 결합을 통해 서로 결합하는 특이적 기능을 보이는 경우를 지칭한다. 이에 상응하여, "컨쥬게이트(conjugate)"란, 개별 화학기의 공유 결합에 의해 생성된 화합물을 지칭한다. 또한 "siRNA 컨쥬게이트"란, 화학기 1개 이상이 siRNA에 대해 특이적인 기능을 보이며 공유 결합함으로써 생성된 화합물을 나타낸다. 이하 본 발명의 siRNA 컨쥬게이트는 종종 "컨쥬게이트"라고 축약된다. siRNA 컨쥬게이트는 내용에 따라서, 임의의 화학식에 보인 siRNA 컨쥬게이트 또는 siRNA 컨쥬게이트 다수를 지칭하는 포괄적 용어로서 이해되어야 할 것이다. 본 발명의 내용 중 "공액 분자"는, 반응을 통하여 siRNA와 공액결합하여, 최종적으로 본 발명의 siRNA 컨쥬게이트를 생성할 수 있는 특정 화합물로서 이해되어야 할 것이다.
본원에 사용된 바와 같은 "선택적(optional)" 또는 "선택적으로"란, 후술된 이벤트 또는 조건이 일어날 수/조성될 수 있거나 일어나지 않을 수/조성되지 않을 수 있음을 의미하고, 어떤 서사가 해당 이벤트 또는 조건이 일어날 수/조성될 수 있거나 일어나지 않을 수/조성되지 않을 수 있는 경우를 포함한다. 예를 들어 "선택적으로 치환된""알킬"은 이하에 정의된 바와 같은 "알킬"과 "치환된 알킬" 둘 다를 포함한다. 당 업자들은, 1개 이상의 치환기를 함유하는 임의의 기와 관련하여 이러한 기는, 입체적으로 비실용적이고, 합성에 의해 얻어질 수 없으며/없거나, 본래 불안정한 임의의 치환 패턴 또는 치환을 도입하기 위한 것이 아님을 이해할 것이다.
본원에 사용된 바와 같이 "알킬"이란, 명시된 개수의 탄소 원자, 보통은 1개 ~ 20개의 탄소 원자, 예컨대 1개 ~ 10개의 탄소 원자, 예컨대 1개 ~ 8개 또는 1개 ~ 6개의 탄소 원자를 가지는 직쇄 및 분지쇄를 지칭한다. 예를 들어 C1 ~ C6 알킬은 1개 ~ 6개의 탄소 원자로 된 직쇄 알킬 및 분지쇄 알킬 둘 다를 포함한다. 특정 개수의 탄소 원자를 가지는 알킬 잔기가 명명될 때, 해당 개수의 탄소 원자를 가지는 분지쇄 및 직쇄는 모두 포함될 것이므로; 예를 들어 "부틸"은 n-부틸, sec-부틸, 이소부틸 및 t-부틸을 포함하도록 의도되고; "프로필"은 n-프로필 및 이소프로필을 포함한다. 알킬렌은 알킬의 하위세트로서, 알킬과 동일하되, 결합 위치를 2개 가지는 잔기를 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같은 "알케닐"이란, 모 알킬의 인접 탄소 원자 2개에서 수소 분자 1개를 각각 제거하여 수득된 탄소-탄소 이중 결합을 적어도 1개 가지는 불포화 분지형 또는 선형 알킬을 지칭한다. 이 기는, 이중 결합의 시스 입체배열 또는 트랜스 입체배열 중 어느 하나로 존재할 수 있다. 통상의 알케닐기는 에테닐; 프로페닐, 예컨대 프로프-1-엔-1-일, 프로프-1-엔-2-일, 프로프-2-엔-1-일 (알릴) 및 프로프-2-엔-2-일; 그리고 부테닐, 예컨대 부트-1-엔-1-일, 부트-1-엔-2-일, 2-메틸-프로프-1-엔-1-일, 부트-2-엔-1-일, 부트-2-엔-2-일, 부타-1,3-디엔-1-일, 부타-1,3-디엔-2-일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 임의의 구현예에서, 알케닐기는 2개 ~ 20개의 탄소 원자를 가지고, 다른 구현예에서, 2개 ~ 10개, 2개 ~ 8개, 또는 2개 ~ 6개의 탄소 원자를 가진다. 알케닐렌은 알케닐의 하위세트로서, 알케닐과 동일하되, 결합 위치를 2개 가지는 잔기를 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같은 "알키닐"이란, 모 알킬의 인접 탄소 원자 2개에서 수소 분자 2개를 각각 제거하여 수득된 탄소-탄소 삼중 결합을 적어도 1개 가지는 불포화 분지형 또는 선형 알킬을 지칭한다. 통상의 알키닐기는 에티닐; 프로피닐, 예컨대 프로프-1-인-1-일 및 프로프-2-인-1-일; 그리고 부티닐, 예컨대 부트-1-인-1-일, 부트-1-인-3-일, 부트-3-인-1-일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 임의의 구현예에서, 알키닐기는 2개 ~ 20개의 탄소 원자를 가지고, 다른 구현예에서, 2개 ~ 10개, 2개 ~ 8개 또는 2개 ~ 6개의 탄소 원자를 가진다. 알키닐렌은 알키닐의 하위세트로서, 알키닐과 동일하되, 결합 위치를 2개 가지는 잔기를 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같은 "알콕시"란, 명시된 개수의 탄소 원자가 산소 가교를 통해 결합된 알킬기, 예컨대 메톡시, 에톡시, 프로폭시, 이소프로폭시, n-부톡시, sec-부톡시, tert-부톡시, 펜틸옥시, 2-펜틸옥시, 이소펜틸옥시, 네오펜틸옥시, 헥실옥시, 2-헥실옥시, 3-헥실옥시 및 3-메틸펜틸옥시 등을 지칭한다. 알콕시는, 일반적으로 산소 가교를 통해 결합된 탄소 원자를 1개 ~ 10개, 1개 ~ 8개, 1개 ~ 6개, 또는 1개 ~ 4개 가진다.
본원에 사용된 바와 같은 "아릴"이란, 고리 탄소 원자로부터 수소 원자를 제거함으로써 방향족 모노사이클릭 또는 다중사이클릭 탄화수소 고리계로부터 유래되는 기를 지칭한다. 방향족 모노사이클릭 또는 다중사이클릭 탄화수소 고리계는 오로지 수소와 6개 ~ 18개의 탄소 원자를 함유하는데, 이 고리계의 고리 적어도 1개는 완전 불포화된 것으로서, 즉 휘켈 이론(Huckel theory)에 따른 사이클릭, 비국소화(delocalized) (4n+2)π-전자계를 함유하는 것이다. 아릴기는 페닐, 플루오레닐 및 나프틸 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 아릴렌은 아릴의 하위세트로서, 아릴과 동일하되, 결합 위치를 2개 가지는 잔기를 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같은 "할로 치환기" 또는 "할로겐"이란, 플루오르기, 염소기, 브롬기 및 요오드기를 지칭하고, "할로겐"이란 용어는 플루오르, 염소, 브롬 또는 요오드를 포함한다.
본원에 사용된 바와 같은 "할로알킬"이란, 명시된 개수의 탄소 원자가 1개 이상 ~ 최대 허용 가능한 개수의 할로겐 원자로 치환된, 상기 정의된 바와 같은 알킬을 지칭한다. 할로알킬의 예로서는 트리플루오로메틸, 디플루오로메틸, 2-플루오로에틸 및 펜타플루오로에틸을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
"헤테로사이클릴"이란, 탄소 원자 2개 ~ 12개와, 질소, 산소 또는 황으로부터 선택되는 헤테로원자 1개 ~ 6개를 포함하는 안정적 3원 ~ 18원 비 방향족 고리 라디칼을 지칭한다. 발명의 설명에 달리 진술되지 않는 한, 헤테로사이클릴은 융합 또는 가교된 고리계를 포함할 수 있는, 모노사이클릭, 바이사이클릭, 트리사이클릭 또는 테트라사이클릭 고리계이다. 헤테로사이클릴내 헤테로원자는 선택적으로 산화될 수 있다. 1개 이상의 질소 원자는, 만일 존재한다면, 선택적으로 4차화된다. 헤테로사이클릴은 부분 또는 전체가 포화된다. 헤테로사이클릴은 고리의 임의의 원자를 통해 분자의 나머지에 결합할 수 있다. 이러한 헤테로사이클릴의 예로서는 디옥사닐, 티에닐[1,3]디설포닐, 데카하이드로이소퀴놀릴, 이미다졸리닐, 이미다졸리디닐, 이소티아졸리디닐, 이속사졸리디닐, 모폴리닐, 옥타하이드로인돌릴, 옥타하이드로이소인돌릴, 2-옥사피페라지닐, 2-옥사피페리디닐, 2-옥사피롤리디닐, 옥사졸리디닐, 피페리디닐, 피페라지닐, 4-피페리도닐, 피롤리디닐, 피라졸리디닐, 퀴누클리디닐, 티아졸리디닐, 테트라하이드로푸릴, 트리티아닐, 테트라하이드로피라닐, 티오모폴리닐, 티아모폴리닐, 1-옥소-티오모폴리닐 및 1,1-디옥소-티오모폴리닐을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
"헤테로아릴"이란, 탄소 원자 2개 ~ 17개와, 질소, 산소 및 황으로부터 선택되는 헤테로원자 1개 ~ 6개를 포함하는 3원 ~ 18원 방향족 고리 라디칼로부터 유래하는 기를 지칭한다. 본원에 사용된 바와 같은 헤테로아릴은 모노사이클릭, 바이사이클릭, 트리사이클릭 또는 테트라사이클릭 고리계일 수 있는데, 단 고리계 내 고리 적어도 1개는 전체가 불포화된 것으로서, 즉 휘켈 이론에 따른 사이클릭, 비국소화 (4n+2)π-전자계를 함유하는 것이다. 헤테로아릴은 융합 또는 가교된 고리계를 포함한다. 헤테로아릴 내 헤테로원자는 선택적으로 산화된다. 1개 이상의 질소 원자는, 만일 존재한다면, 선택적으로 4차화된다. 헤테로아릴은 고리의 임의의 원자를 통해 분자의 나머지에 결합할 수 있다. 이러한 헤테로아릴의 예로서는 아제피닐, 아크리디닐, 벤지미다졸릴, 벤즈인돌릴, 1,3-벤조디옥사졸릴, 벤조푸라닐, 벤족사졸릴, 벤조[d]티아졸릴, 벤조티아디아졸릴, 벤조[b][1,4]디옥세피닐, 벤조[b][1,4]옥사지닐, 1,4-벤조디옥사닐, 벤조나프토푸라닐, 벤족사졸릴, 벤조디옥솔릴, 벤조디옥시닐, 벤조피라닐, 벤조피라노닐, 벤조푸라닐, 벤조푸라노닐, 벤조티에닐, 벤조티에노[3,2-d]피리미디닐, 벤조트리아졸릴, 벤조[4,6]이미다조[1,2-a]피리디닐, 카바졸릴, 신놀리닐, 사이클로펜타[d]피리미디닐, 6,7-디하이드로-5H-사이클로펜타[4,5]티에노[2,3-d]피리미디닐, 5,6-디하이드로벤조[h]퀴나졸리닐, 5,6-디하이드로벤조[h]신놀리닐, 6,7-디하이드로-5H-벤조[6,7]사이클로헵타[1,2-c]피리다지닐, 디벤조푸라닐, 디벤조티에닐, 푸라닐, 푸라노닐, 푸로[3,2-c]피리디닐, 5,6,7,8,9,10-헥사하이드로사이클로옥타[d]피리미디닐, 5,6,7,8,9,10-헥사하이드로사이클로옥타[[d]피리다지닐, 5,6,7,8,9,10-헥사하이드로사이클로옥타[d]피리디닐, 이소티아졸릴, 이미다졸릴, 인다졸릴, 인돌릴, 이소인돌릴, 인돌리닐, 이소인돌리닐, 이소퀴놀릴, 인돌리지닐, 이속사졸릴, 5,8-메타노-5,6,7,8-테트라하이드로퀴나졸리닐, 나프티리디닐, 1,6-나프티리디노닐, 옥사디아졸릴, 2-옥소아제피닐, 옥사졸릴, 옥시라닐, 5,6,6a,7,8,9,10,10a-옥타하이드로벤조[h]퀴나졸리닐, 1-페닐-1H-피롤릴, 페나지닐, 페노티아지닐, 페녹사지닐, 프탈라지닐, 프테리디닐, 퓨리닐, 피롤릴, 피라졸릴, 피라졸로[3,4-d]피리미디닐, 피리디닐, 피리도[3,2-d]피리미디닐, 피리도[3,4-d]피리미디닐, 피라지닐, 피리미디닐, 피리다지닐, 퀴나졸리닐, 퀴녹살리닐, 퀴놀리닐, 테트라하이드로퀴놀리닐, 5,6,7,8-테트라하이드로퀴나졸리닐, 5,6,7,8-테트라하이드로벤조[4,5]티에노[2,3-d]피리미디닐, 6,7,8,9-테트라하이드로-5H-사이클로헵타[4,5]티에노[2,3-d]피리미디닐, 5,6,7,8-테트라하이드로피리도[4,5-c]피리다지닐, 티아졸릴, 티아디아졸릴, 트리아졸릴, 테트라졸릴, 트리아지닐, 티에노[2,3-d]피리미디닐, 티에노[3,2-d]피리미디닐, 티에노[2,3-c]피리디닐 및 티오페닐/티에닐을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
다양한 하이드록시 보호기가 본 발명에 사용될 수 있다. 일반적으로, 보호기는 화학 작용기를 특정 반응 조건에 대해 비활성으로 만들고, 분자의 나머지를 실질적으로 손상시키지 않고 분자 내 이러한 작용기에 결합할 수 있고 이 작용기로부터 제거될 수 있다. 대표적인 하이드록시 보호기는 각각 본원에 전체로서 참고문헌으로 인용된문헌[Tetrahedron 1992, 48, 2223-2311, Beaucage, et al.] 및 문헌[Greene and Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis, Chapter 2, 2d ed, John Wiley & Sons, New York, 1991]에 개시되어 있다. 몇몇 구현예에서, 보호기는 염기성 조건하에서 안정적이지만, 산성 조건하에서는 제거될 수 있다. 몇몇 구현예에서, 본원에 사용된 하이드록시 보호기의 배타적이지 않은 예로서는 디메톡시트리틸(DMT), 모노메톡시트리틸, 9-페닐잔텐-9-일(Pixyl) 또는 9-(p-메톡시페닐)잔텐-9-일(Mox)을 포함한다. 몇몇 구현예에서, 본원에 사용된 하이드록시 보호기의 배타적이지 않은 예로서는 Tr(트리틸), MMTr(4-메톡시트리틸), DMTr(4,4'-디메톡시트리틸) 및 TMTr(4,4',4"-트리메톡시트리틸)을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같은 "대상체"란 용어는 임의의 동물, 예컨대 포유동물 또는 유대동물을 지칭한다. 본 발명의 대상체는 인간, 인간 이외의 영장류(예컨대 레서스 원숭이 또는 기타 종류의 마카크 원숭이), 마우스, 돼지, 말, 당나귀, 소, 양, 래트 및 임의의 종류의 가금류를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본원에 사용된 바와 같은 "치료"란, 유리하거나 원하는 결과, 예컨대 치료적 이득(이에 한정되는 것은 아님)을 수득하기 위한 방법을 지칭한다. "치료적 이득"이란, 치료될 잠재적 장애를 없애거나 개선하는 것을 의미한다. 더욱이, 치료적 이득은 대상체가 여전히 잠재적 장애를 앓고있을 수 있음에도 불구하고, 잠재적 장애와 연관된 생리적 증상들 중 1개 이상을 없애거나 완화시켜 대상체에서 개선이 관찰되도록 만듦으로써 달성된다.
본원에 사용된 바와 같은 "예방"이란, 유리하거나 원하는 결과, 예컨대 예방적 이득(이에 한정되는 것은 아님)를 수득하기 위한 방법을 지칭한다. "예방적 이득"을 수득하기 위해 siRNA 컨쥬게이트 또는 조성물은, 특정 질환의 진단이 아직 내려지지 않았을 수 있더라도, 이 질환이 발생할 위험이 있는 대상체, 또는 해당 질환의 생리적 증상 1가지 이상을 호소하는 대상체에 투여될 수 있다.
siRNA
일 양태에서, 본 발명은 C5 유전자의 발현을 억제할 수 있는 6가지 유형의 siRNA를 제공한다.
본 발명의 siRNA는 기본 구조 단위로서 뉴클레오티드를 포함한다. 뉴클레오티드가 인산염기, 리보스기 및 염기를 포함한다는 것은 당 업자들에게 널리 공지되어 있다. 본원에 이러한 기와 관련된 상세한 예시는 생략되었다.
본 발명의 siRNA는 센스 가닥과 안티센스 가닥을 포함하는데, 센스 가닥과 안티센스 가닥의 길이는 동일하거나 상이하고, 센스 가닥의 길이는 19개 ~ 23개 뉴클레오티드이고, 안티센스 가닥의 길이는 19개 ~ 26개 뉴클레오티드이다. 이러한 방식으로, 본 발명에 의해 제공된 siRNA의 센스 가닥 대 안티센스 가닥의 길이 비는 19/19, 19/20, 19/21, 19/22, 19/23, 19/24, 19/25, 19/26, 20/20, 20/21, 20/22, 20/23, 20/24, 20/25, 20/26, 21/20, 21/21, 21/22, 21/23, 21/24, 21/25, 21/26, 22/20, 22/21, 22/22, 22/23, 22/24, 22/25, 22/26, 23/20, 23/21, 23/22, 23/23, 23/24, 23/25 또는 23/26일 수 있다. 몇몇 구현예에서, siRNA의 센스 가닥 대 안티센스 가닥의 길이 비는 19/21, 21/23 또는 23/25이다.
제1 siRNA
본 발명에 따르면, siRNA는 제1 siRNA일 수 있다.
제1 siRNA는 센스 가닥과 안티센스 가닥을 포함한다. 제1 siRNA의 뉴클레오티드들은 각각 독립적으로 변형 또는 비변형 뉴클레오티드로서, 이 센스 가닥은 뉴클레오티드 서열 I을 포함하고, 안티센스 가닥은 뉴클레오티드 서열 II를 포함하며, 뉴클레오티드 서열 I과 뉴클레오티드 서열 II는 적어도 부분적으로 역 상보성으로서, 이중 가닥 영역을 형성하고, 뉴클레오티드 서열 I은 길이가 동일하되 서열 번호 1에 보인 뉴클레오티드 서열과 3개 이하의 뉴클레오티드만큼의 차이를 보이고, 뉴클레오티드 서열 II는 동일하며 서열 번호 2에 보인 뉴클레오티드 서열과 3개 이하의 뉴클레오티드만큼의 차이를 보인다:
5'-CUUCAUUCAUACAGACAAZ1-3' (서열 번호 1);
5'-Z2UUGUCUGUAUGAAUGAAG-3' (서열 번호 2),
[단 여기서 Z1은 A이고, Z2는 U이고, 뉴클레오티드 서열 I은 Z1에 대응하는 부위에 뉴클레오티드 Z3을 포함하고, 뉴클레오티드 서열 II는 Z2에 대응하는 부위에 뉴클레오티드 Z4를 포함하고, Z4는 안티센스 가닥의 5'-말단으로부터 첫 번째 뉴클레오티드임]
이 내용 중, "대응하는 부위"란 용어는, 뉴클레오티드 서열의 동일한 말단으로부터 카운팅하였을 때 뉴클레오티드 서열내 동일한 부위를 의미한다. 예를 들어 뉴클레오티드 서열 I의 3'-말단 첫 번째 뉴클레오티드는 서열 번호 1의 3'-말단 첫 번째 뉴클레오티드에 대응하는 부위에 있는 뉴클레오티드이다.
몇몇 구현예에서, 센스 가닥은 뉴클레오티드 서열 I을 배타적으로 포함하고, 안티센스 가닥은 뉴클레오티드 서열 II를 배타적으로 포함한다.
몇몇 구현예에서, 뉴클레오티드 서열 I은 서열 번호 1에 보인 뉴클레오티드 서열과 1개 이하의 뉴클레오티드만큼의 차이를 보이고/보이거나, 뉴클레오티드 서열 II는 서열 번호 2에 보인 뉴클레오티드 서열과 1개 이하의 뉴클레오티드만큼의 차이를 보인다.
몇몇 구현예에서, 뉴클레오티드 서열 II와 서열 번호 2에 보인 뉴클레오티드 서열 사이의 뉴클레오티드 차이는 Z4 부위에서의 차이를 포함하고, Z4는 A, C 또는 G로부터 선택된다. 몇몇 구현예에서, 뉴클레오티드 차이는 Z4 부위에서의 차이이고, Z4는 A, C 또는 G로부터 선택된다. 몇몇 구현예에서, Z3는 Z4와 상보성인 뉴클레오티드이다. 상기의 뉴클레오티드 차이를 보이는 siRNA는 표적 mRNA를 억제하는 siRNA의 능력보다 더 큰 능력을 가지고, 이러한 siRNA는 또한 본 발명의 범위내에 포함된다.
몇몇 구현예에서, 뉴클레오티드 서열 I은 뉴클레오티드 서열 II와 기본적으로 역 상보성, 실질적으로 역 상보성 또는 완전히 역 상보성이다. 기본적으로 역 상보성이란, 뉴클레오티드 서열 2개 사이에 3개 이하의 염기 오류 쌍형성이 발생한 경우를 지칭하고; 실질적으로 역 상보성이란, 뉴클레오티드 서열 2개 사이에 1개 이하의 염기 오류 쌍형성이 발생한 경우를 지칭하고; 완전히 역 상보성이란, 뉴클레오티드 서열 2개 사이에 염기 오류 쌍형성이 발생하지 않은 경우를 지칭한다.
몇몇 구현예에서, 뉴클레오티드 서열 I은 서열 번호 3에 보인 뉴클레오티드 서열이고, 서열 번호 II는 서열 번호 4에 보인 뉴클레오티드 서열이다:
5'-CUUCAUUCAUACAGACAAZ3-3' (서열 번호 3);
5'-Z4UUGUCUGUAUGAAUGAAG-3' (서열 번호 4)
[단 여기서 Z4는 안티센스 가닥의 5'-말단으로부터 첫 번째 뉴클레오티드이고; Z3은 A, U, G 또는 C로부터 선택되고; Z4는 Z3에 상보성인 뉴클레오티드이고; 몇몇 구현예에서, Z3은 A이고, Z4는 U임]
몇몇 구현예에서, 센스 가닥은 뉴클레오티드 서열 III을 추가로 포함하고, 안티센스 가닥은 뉴클레오티드 서열 IV를 추가로 포함하고, 뉴클레오티드 서열 III 및 뉴클레오티드 서열 IV는 그 길이가 각각 독립적으로 1개 ~ 4개 뉴클레오티드이고; 뉴클레오티드 서열 III은 그 길이가 뉴클레오티드 서열 IV의 길이와 동일하며, 뉴클레오티드 서열 IV에 실질적으로 역 상보성이거나 완전히 역 상보성이고; 뉴클레오티드 서열 III은 뉴클레오티드 서열 I의 5'-말단에 결합하고, 뉴클레오티드 서열 IV는 뉴클레오티드 서열 II의 3'-말단에 결합한다. 몇몇 구현예에서, 뉴클레오티드 서열 IV는 뉴클레오티드 서열 II에 실질적으로 역 상보성이거나 완전히 역 상보성이고, 뉴클레오티드 서열 II는 표적 mRNA 내 서열 번호 1로 표시되는 뉴클레오티드 서열의 5'-말단에 인접하고, 뉴클레오티드 서열 IV와 그 길이가 동일한 뉴클레오티드 서열을 지칭한다.
몇몇 구현예에서, 뉴클레오티드 서열 III 및 뉴클레오티드 서열 IV는 둘 다 길이가 1개 뉴클레오티드이다. 뉴클레오티드 서열 III의 염기가 U이고, 뉴클레오티드 서열 IV의 염기가 A인 경우, 센스 가닥 대 안티센스 가닥의 길이 비는 20/20이거나; 또는 뉴클레오티드 서열 III 및 IV 둘 다의 길이가 2개 뉴클레오티드이며, 뉴클레오티드 서열 III의 5'-말단 → 3'-말단 방향의 염기 조성이 CU이고, 뉴클레오티드 서열 IV의 5'-말단 → 3'-말단 방향 염기 조성이 AG인 경우, 센스 가닥 대 안티센스 가닥의 길이 비는 21/21이거나; 또는 뉴클레오티드 서열 III 및 IV 둘 다의 길이가 3개 뉴클레오티드이며, 뉴클레오티드 서열 III의 5'-말단 → 3'-말단 방향의 염기 조성이 UCU이고, 뉴클레오티드 서열 IV의 5'-말단 → 3'-말단 방향 염기 조성이 AGA인 경우, 센스 가닥 대 안티센스 가닥의 길이 비는 22/22이거나; 또는 뉴클레오티드 서열 III 및 IV 둘 다의 길이가 4개 뉴클레오티드이며, 뉴클레오티드 서열 III의 5'-말단 → 3'-말단 방향의 염기 조성이 UUCU이고, 뉴클레오티드 서열 IV의 5'-말단 → 3'-말단 방향 염기 조성이 AGAA인 경우, 센스 가닥 대 안티센스 가닥의 길이 비는 23/23이다. 몇몇 구현예에서, 뉴클레오티드 서열 III 및 뉴클레오티드 서열 IV는 길이가 2개 뉴클레오티드이고, 뉴클레오티드 서열 III의 5'-말단 → 3'-말단 방향의 염기 조성은 CU이고, 뉴클레오티드 서열 IV의 염기 조성은 AG인 경우, 센스 가닥 대 안티센스 가닥의 길이 비는 21/21이다.
몇몇 구현예에서, 뉴클레오티드 서열 III은 뉴클레오티드 서열 IV에 완전히 역 상보성이다. 그러므로, 만일 뉴클레오티드 서열 III의 염기(들)가 제공되면, 뉴클레오티드 서열 IV의 염기(들)도 또한 결정된다.
제2 siRNA
본 발명에 따르면, siRNA는 제2 siRNA일 수 있다.
제2 siRNA는 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함한다. 제2 siRNA 내 뉴클레오티드들은 각각 독립적으로 변형 뉴클레오티드거나 비변형 뉴클레오티드로서, 센스 가닥은 뉴클레오티드 서열 I을 포함하고, 안티센스 가닥은 뉴클레오티드 서열 II를 포함하고, 뉴클레오티드 서열 I과 뉴클레오티드 서열 II는 적어도 부분적으로 역 상보성으로서, 이중 가닥 영역을 형성하고, 뉴클레오티드 서열 I은 서열 번호 61에 보인 뉴클레오티드 서열과 길이가 동일하고 3개 이하의 뉴클레오티드만큼의 차이를 보이고; 뉴클레오티드 서열 II는 서열 번호 62에 보인 뉴클레오티드 서열과 길이가 동일하되 3개 이하의 뉴클레오티드만큼의 차이를 보인다:
5'-CUACAGUUUAGAAGAUUUZ5-3' (서열 번호 61);
5'-Z6AAAUCUUCUAAACUGUAG-3' (서열 번호 62)
[단 여기서 Z5는 A이고, Z6은 U이고, 뉴클레오티드 서열 I은 Z5에 대응하는 부위에 뉴클레오티드 Z7을 포함하고, 뉴클레오티드 서열 II는 Z6에 대응하는 부위에 뉴클레오티드 Z8을 포함하고, Z8은 안티센스 가닥의 5'-말단으로부터 첫 번째 뉴클레오티드임]
몇몇 구현예에서, 센스 가닥은 뉴클레오티드 서열 I을 배타적으로 포함하고, 안티센스 가닥은 뉴클레오티드 서열 II를 배타적으로 포함한다.
몇몇 구현예에서, 뉴클레오티드 서열 I은 서열 번호 61에 보인 뉴클레오티드 서열과 1개 이하의 뉴클레오티드만큼의 차이를 보이고/보이거나 뉴클레오티드 서열 II는 서열 번호 62에 보인 뉴클레오티드 서열과 1개 이하의 뉴클레오티드만큼의 차이를 보인다.
몇몇 구현예에서, 뉴클레오티드 서열 II 및 서열 번호 62에 보인 뉴클레오티드 서열 사이의 뉴클레오티드 차이는 Z8 부위에서의 차이를 포함하고, Z8은 A, C 또는 G로부터 선택된다. 몇몇 구현예에서, 뉴클레오티드의 차이는 Z8 부위에서의 차이이고, Z8은 A, C 또는 G로부터 선택된다. 몇몇 구현예에서, Z7은 Z8에 상보성인 뉴클레오티드이다. 상기 뉴클레오티드 차이를 보이는 siRNA는 표적 mRNA를 억제하는 siRNA의 능력보다 더 큰 능력을 가지고, 이러한 siRNA도 또한 본 발명의 범위내에 포함된다.
몇몇 구현예에서, 뉴클레오티드 서열 I은 뉴클레오티드 서열 II와 기본적으로 역 상보성, 실질적으로 역 상보성 또는 완전히 역 상보성이다.
몇몇 구현예에서, 뉴클레오티드 I은 서열 번호 63에 보인 뉴클레오티드 서열이고, 뉴클레오티드 서열 II는 서열 번호 64에 보인 뉴클레오티드 서열이다:
5'-CUACAGUUUAGAAGAUUUZ7-3' (서열 번호 63);
5'-Z8AAAUCUUCUAAACUGUAG-3' (서열 번호 64)
[단 여기서 Z8은 안티센스 가닥의 5'-말단으로부터 첫 번째 뉴클레오티드이고; Z7은 A, U, G 또는 C로부터 선택되고; Z8은 Z7에 상보성인 뉴클레오티드이고; 몇몇 구현예에서, Z7은 A이고, Z8은 U임]
몇몇 구현예에서, 센스 가닥은 뉴클레오티드 서열 III을 추가로 포함하고, 안티센스 가닥은 뉴클레오티드 서열 IV를 추가로 포함하고, 뉴클레오티드 서열 III 및 뉴클레오티드 서열 IV는 그 길이가 각각 독립적으로 1개 ~ 4개 뉴클레오티드이고; 뉴클레오티드 서열 III은 그 길이가 뉴클레오티드 서열 IV의 길이와 동일하며, 뉴클레오티드 서열 IV에 실질적으로 역 상보성이거나 완전히 역 상보성이고; 뉴클레오티드 서열 III은 뉴클레오티드 서열 I의 5'-말단에 결합하고, 뉴클레오티드 서열 IV는 뉴클레오티드 서열 II의 3'-말단에 결합한다. 뉴클레오티드 서열 IV는 뉴클레오티드 서열 II에 실질적으로 역 상보성이거나 완전히 역 상보성이고, 뉴클레오티드 서열 II는 표적 mRNA 내 서열 번호 61로 표시되는 뉴클레오티드 서열의 5'-말단에 인접하고, 뉴클레오티드 서열 IV와 그 길이가 동일한 뉴클레오티드 서열을 지칭한다.
몇몇 구현예에서, 뉴클레오티드 서열 III 및 뉴클레오티드 서열 IV는 둘 다 길이가 1개 뉴클레오티드이다. 뉴클레오티드 서열 III의 염기가 A이고, 뉴클레오티드 서열 IV의 염기가 U인 경우, 센스 가닥 대 안티센스 가닥의 길이 비는 20/20이거나; 또는 뉴클레오티드 서열 III 및 IV 둘 다의 길이가 2개 뉴클레오티드이며, 뉴클레오티드 서열 III의 5'-말단 → 3'-말단 방향의 염기 조성이 UA이고, 뉴클레오티드 서열 IV의 5'-말단 → 3'-말단 방향 염기 조성이 UA인 경우, 센스 가닥 대 안티센스 가닥의 길이 비는 21/21이거나; 또는 뉴클레오티드 서열 III 및 IV 둘 다의 길이가 3개 뉴클레오티드이며, 뉴클레오티드 서열 III의 5'-말단 → 3'-말단 방향의 염기 조성이 AUA이고, 뉴클레오티드 서열 IV의 5'-말단 → 3'-말단 방향 염기 조성이 UAU인 경우, 센스 가닥 대 안티센스 가닥의 길이 비는 22/22이거나; 또는 뉴클레오티드 서열 III 및 IV 둘 다의 길이가 4개 뉴클레오티드이며, 뉴클레오티드 서열 III의 5'-말단 → 3'-말단 방향의 염기 조성이 CAUA이고, 뉴클레오티드 서열 IV의 염기 조성이 UAUG인 경우, 센스 가닥 대 안티센스 가닥의 길이 비는 23/23이다. 몇몇 구현예에서, 뉴클레오티드 서열 III 및 뉴클레오티드 서열 IV의 길이가 2개 뉴클레오티드이고, 뉴클레오티드 서열 III의 5'-말단 → 3'-말단 방향의 염기 조성이 UA이고, 뉴클레오티드 서열 IV의 5'-말단 → 3'-말단 방향 염기 조성이 UA인 경우, 센스 가닥 대 안티센스 가닥의 길이 비는 21/21이다.
몇몇 구현예에서, 뉴클레오티드 서열 III은 뉴클레오티드 서열 IV에 완전히 역 상보성이다. 그러므로, 만일 뉴클레오티드 서열 III의 염기(들)가 제공되면, 뉴클레오티드 서열 IV의 염기(들)도 또한 결정된다.
제3 siRNA
본 발명에 따르면, siRNA는 제3 siRNA일 수 있다.
제3 siRNA는 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함한다. 제3 siRNA 내 뉴클레오티드들은 각각 독립적으로 변형 뉴클레오티드거나 비변형 뉴클레오티드로서, 센스 가닥은 뉴클레오티드 서열 I을 포함하고, 안티센스 가닥은 뉴클레오티드 서열 II를 포함하고, 뉴클레오티드 서열 I과 뉴클레오티드 서열 II는 적어도 부분적으로 역 상보성으로서, 이중 가닥 영역을 형성하고, 뉴클레오티드 서열 I은 서열 번호 121에 보인 뉴클레오티드 서열과 길이가 동일하고 3개 이하의 뉴클레오티드만큼의 차이를 보이고; 뉴클레오티드 서열 II는 서열 번호 122에 보인 뉴클레오티드 서열과 길이가 동일하되 3개 이하의 뉴클레오티드만큼의 차이를 보인다:
5'-GGAAGGUUACCGAGCAAUZ9-3' (서열 번호 121);
5'-Z10AUUGCUCGGUAACCUUCC-3' (서열 번호 122)
[단 여기서 Z9는 A이고, Z10은 U이고, 뉴클레오티드 서열 I은 Z9에 대응하는 부위에 뉴클레오티드 Z11을 포함하고, 뉴클레오티드 서열 II는 Z10에 대응하는 부위에 뉴클레오티드 Z12를 포함하고, Z12는 안티센스 가닥의 5'-말단으로부터 첫 번째 뉴클레오티드임]
몇몇 구현예에서, 센스 가닥은 뉴클레오티드 서열 I을 배타적으로 포함하고, 안티센스 가닥은 뉴클레오티드 서열 II를 배타적으로 포함한다.
몇몇 구현예에서, 뉴클레오티드 서열 I은 서열 번호 121에 보인 뉴클레오티드 서열과 1개 이하의 뉴클레오티드만큼의 차이를 보이고/보이거나 뉴클레오티드 서열 II는 서열 번호 122에 보인 뉴클레오티드 서열과 1개 이하의 뉴클레오티드만큼의 차이를 보인다.
몇몇 구현예에서, 뉴클레오티드 서열 II 및 서열 번호 122에 보인 뉴클레오티드 서열 사이의 뉴클레오티드 차이는 Z12 부위에서의 차이를 포함하고, Z12는 A, C 또는 G로부터 선택된다. 몇몇 구현예에서, 뉴클레오티드의 차이는 Z12 부위에서의 차이이고, Z12는 A, C 또는 G로부터 선택된다. 몇몇 구현예에서, Z11은 Z12에 상보성인 뉴클레오티드이다. 상기 뉴클레오티드 차이를 보이는 siRNA는 표적 mRNA를 억제하는 siRNA의 능력보다 더 큰 능력을 가지고, 이러한 siRNA도 또한 본 발명의 범위내에 포함된다.
몇몇 구현예에서, 뉴클레오티드 서열 I은 뉴클레오티드 서열 II와 기본적으로 역 상보성, 실질적으로 역 상보성 또는 완전히 역 상보성이다.
몇몇 구현예에서, 뉴클레오티드 I은 서열 번호 123에 보인 뉴클레오티드 서열이고, 뉴클레오티드 서열 II는 서열 번호 124에 보인 뉴클레오티드 서열이다:
5'-GGAAGGUUACCGAGCAAUZ11-3' (서열 번호 123);
5'-Z12AUUGCUCGGUAACCUUCC-3' (서열 번호 124)
[단 여기서 Z12는 안티센스 가닥의 5'-말단으로부터 첫 번째 뉴클레오티드이고; Z11은 A, U, G 또는 C로부터 선택되고; Z12는 Z11에 상보성인 뉴클레오티드이고; 몇몇 구현예에서, Z11은 A이고, Z12는 U임]
몇몇 구현예에서, 센스 가닥은 뉴클레오티드 서열 III을 추가로 포함하고, 안티센스 가닥은 뉴클레오티드 서열 IV를 추가로 포함하고, 뉴클레오티드 서열 III 및 뉴클레오티드 서열 IV는 그 길이가 각각 독립적으로 1개 ~ 4개 뉴클레오티드이고; 뉴클레오티드 서열 III은 그 길이가 뉴클레오티드 서열 IV의 길이와 동일하며, 뉴클레오티드 서열 IV에 실질적으로 역 상보성이거나 완전히 역 상보성이고; 뉴클레오티드 서열 III은 뉴클레오티드 서열 I의 5'-말단에 결합하고, 뉴클레오티드 서열 IV는 뉴클레오티드 서열 II의 3'-말단에 결합한다. 뉴클레오티드 서열 IV는 뉴클레오티드 서열 II에 실질적으로 역 상보성이거나 완전히 역 상보성이고, 뉴클레오티드 서열 II는 표적 mRNA 내 서열 번호 121로 표시되는 뉴클레오티드 서열의 5'-말단에 인접하고, 뉴클레오티드 서열 IV와 그 길이가 동일한 뉴클레오티드 서열을 지칭한다.
몇몇 구현예에서, 뉴클레오티드 서열 III 및 뉴클레오티드 서열 IV는 둘 다 길이가 1개 뉴클레오티드이다. 뉴클레오티드 서열 III의 염기가 G이고, 뉴클레오티드 서열 IV의 염기가 C인 경우, 센스 가닥 대 안티센스 가닥의 길이 비는 20/20이거나; 또는 뉴클레오티드 서열 III 및 IV 둘 다는 길이가 2개 뉴클레오티드이며, 뉴클레오티드 서열 III의 5'-말단 → 3'-말단 방향의 염기 조성이 AG이고, 뉴클레오티드 서열 IV의 5'-말단 → 3'-말단 방향 염기 조성이 CU인 경우, 센스 가닥 대 안티센스 가닥의 길이 비는 21/21이거나; 또는 뉴클레오티드 서열 III 및 IV 둘 다는 길이가 3개 뉴클레오티드이며, 뉴클레오티드 서열 III의 5'-말단 → 3'-말단 방향의 염기 조성이 CAG이고, 뉴클레오티드 서열 IV의 5'-말단 → 3'-말단 방향 염기 조성이 CUG인 경우, 센스 가닥 대 안티센스 가닥의 길이 비는 22/22이거나; 또는 뉴클레오티드 서열 III 및 IV 둘 다는 길이가 4개 뉴클레오티드이며, 뉴클레오티드 서열 III의 5'-말단 → 3'-말단 방향의 염기 조성이 CCAG이고, 뉴클레오티드 서열 IV의 5'-말단 → 3'-말단 방향 염기 조성이 CUGG인 경우, 센스 가닥 대 안티센스 가닥의 길이 비는 23/23이다. 몇몇 구현예에서, 뉴클레오티드 서열 III 및 뉴클레오티드 서열 IV는 길이가 2개 뉴클레오티드이고, 뉴클레오티드 서열 III의 5'-말단 → 3'-말단 방향의 염기 조성이 AG이고, 뉴클레오티드 서열 IV의 5'-말단 → 3'-말단 방향 염기 조성이 CU인 경우, 센스 가닥 대 안티센스 가닥의 길이 비는 21/21이다.
몇몇 구현예에서, 뉴클레오티드 서열 III은 뉴클레오티드 서열 IV에 완전히 역 상보성이다. 그러므로, 만일 뉴클레오티드 서열 III의 염기(들)가 제공되면, 뉴클레오티드 서열 IV의 염기(들)도 또한 결정된다.
제4 siRNA
본 발명에 따르면, siRNA는 제4 siRNA일 수 있다.
제4 siRNA는 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함한다. 제4 siRNA 내 뉴클레오티드들은 각각 독립적으로 변형 뉴클레오티드거나 비변형 뉴클레오티드로서, 센스 가닥은 뉴클레오티드 서열 I을 포함하고, 안티센스 가닥은 뉴클레오티드 서열 II를 포함하고, 뉴클레오티드 서열 I과 뉴클레오티드 서열 II는 적어도 부분적으로 역 상보성으로서, 이중 가닥 영역을 형성하고, 뉴클레오티드 서열 I은 서열 번호 181에 보인 뉴클레오티드 서열과 길이가 동일하고 3개 이하의 뉴클레오티드만큼의 차이를 보이고; 뉴클레오티드 서열 II는 서열 번호 182에 보인 뉴클레오티드 서열과 길이가 동일하되 3개 이하의 뉴클레오티드만큼의 차이를 보인다:
5'-AGAACAGACAGCAGAAUUZ13-3' (서열 번호 181);
5'-Z14AAUUCUGCUGUCUGUUCU-3' (서열 번호 182)
[단 여기서 Z13은 A이고, Z14는 U이고, 뉴클레오티드 서열 I은 Z13에 대응하는 부위에 뉴클레오티드 Z15를 포함하고, 뉴클레오티드 서열 II는 Z14에 대응하는 부위에 뉴클레오티드 Z16을 포함하고, Z16은 안티센스 가닥의 5'-말단으로부터 첫 번째 뉴클레오티드임]
몇몇 구현예에서, 센스 가닥은 뉴클레오티드 서열 I을 배타적으로 포함하고, 안티센스 가닥은 뉴클레오티드 서열 II를 배타적으로 포함한다.
몇몇 구현예에서, 뉴클레오티드 서열 I은 서열 번호 181에 보인 뉴클레오티드 서열과 1개 이하의 뉴클레오티드만큼의 차이를 보이고/보이거나 뉴클레오티드 서열 II는 서열 번호 182에 보인 뉴클레오티드 서열과 1개 이하의 뉴클레오티드만큼의 차이를 보인다.
몇몇 구현예에서, 뉴클레오티드 서열 II 및 서열 번호 182에 보인 뉴클레오티드 서열 사이의 뉴클레오티드 차이는 Z16 부위에서의 차이를 포함하고, Z16은 A, C 또는 G로부터 선택된다. 몇몇 구현예에서, 뉴클레오티드의 차이는 Z16 부위에서의 차이이고, Z16은 A, C 또는 G로부터 선택된다. 몇몇 구현예에서, Z15는 Z16에 상보성인 뉴클레오티드이다. 상기 뉴클레오티드 차이를 보이는 siRNA는 표적 mRNA를 억제하는 siRNA의 능력보다 더 큰 능력을 가지고, 이러한 siRNA도 또한 본 발명의 범위내에 포함된다.
몇몇 구현예에서, 뉴클레오티드 서열 I은 뉴클레오티드 서열 II와 기본적으로 역 상보성, 실질적으로 역 상보성 또는 완전히 역 상보성이다.
몇몇 구현예에서, 뉴클레오티드 I은 서열 번호 183에 보인 뉴클레오티드 서열이고, 뉴클레오티드 서열 II는 서열 번호 184에 보인 뉴클레오티드 서열이다:
5'-AGAACAGACAGCAGAAUUZ15-3' (서열 번호 183);
5'-Z16AAUUCUGCUGUCUGUUCU-3' (서열 번호 184)
[단 여기서 Z16은 안티센스 가닥의 5'-말단으로부터 첫 번째 뉴클레오티드이고; Z15는 A, U, G 또는 C로부터 선택되고; Z16은 Z15에 상보성인 뉴클레오티드이고; 몇몇 구현예에서, Z15는 A이고, Z16은 U임]
몇몇 구현예에서, 센스 가닥은 뉴클레오티드 서열 III을 추가로 포함하고, 안티센스 가닥은 뉴클레오티드 서열 IV를 추가로 포함하고, 뉴클레오티드 서열 III 및 뉴클레오티드 서열 IV는 그 길이가 각각 독립적으로 1개 ~ 4개 뉴클레오티드이고; 뉴클레오티드 서열 III은 그 길이가 뉴클레오티드 서열 IV의 길이와 동일하며, 뉴클레오티드 서열 IV에 실질적으로 역 상보성이거나 완전히 역 상보성이고; 뉴클레오티드 서열 III은 뉴클레오티드 서열 I의 5'-말단에 결합하고, 뉴클레오티드 서열 IV는 뉴클레오티드 서열 II의 3'-말단에 결합한다. 뉴클레오티드 서열 IV는 뉴클레오티드 서열 II에 실질적으로 역 상보성이거나 완전히 역 상보성이고, 뉴클레오티드 서열 II는 표적 mRNA 내 서열 번호 181로 표시되는 뉴클레오티드 서열의 5'-말단에 인접하고, 뉴클레오티드 서열 IV와 그 길이가 동일한 뉴클레오티드 서열을 지칭한다.
몇몇 구현예에서, 뉴클레오티드 서열 III 및 뉴클레오티드 서열 IV는 둘 다 길이가 1개 뉴클레오티드이다. 뉴클레오티드 서열 III의 염기가 G이고, 뉴클레오티드 서열 IV의 염기가 C인 경우, 센스 가닥 대 안티센스 가닥의 길이 비는 20/20이거나; 또는 뉴클레오티드 서열 III 및 IV 둘 다의 길이가 2개 뉴클레오티드이며, 뉴클레오티드 서열 III의 5'-말단 → 3'-말단 방향의 염기 조성이 GG이고, 뉴클레오티드 서열 IV의 5'-말단 → 3'-말단 방향 염기 조성이 CC인 경우, 센스 가닥 대 안티센스 가닥의 길이 비는 21/21이거나; 또는 뉴클레오티드 서열 III 및 IV 둘 다의 길이가 3개 뉴클레오티드이며, 뉴클레오티드 서열 III의 5'-말단 → 3'-말단 방향의 염기 조성이 AGG이고, 뉴클레오티드 서열 IV의 5'-말단 → 3'-말단 방향 염기 조성이 CCU인 경우, 센스 가닥 대 안티센스 가닥의 길이 비는 22/22이거나; 또는 뉴클레오티드 서열 III 및 IV 둘 다의 길이가 4개 뉴클레오티드이며, 뉴클레오티드 서열 III의 5'-말단 → 3'-말단 방향의 염기 조성이 CAGG이고, 뉴클레오티드 서열 IV의 5'-말단 → 3'-말단 방향 염기 조성이 CCUG인 경우, 센스 가닥 대 안티센스 가닥의 길이 비는 23/23이다. 몇몇 구현예에서, 뉴클레오티드 서열 III 및 뉴클레오티드 서열 IV는 길이가 2개 뉴클레오티드이고, 뉴클레오티드 서열 III의 5'-말단 → 3'-말단 방향의 염기 조성이 GG이고, 뉴클레오티드 서열 IV의 5'-말단 → 3'-말단 방향 염기 조성이 CC인 경우, 센스 가닥 대 안티센스 가닥의 길이 비는 21/21이다.
몇몇 구현예에서, 뉴클레오티드 서열 III은 뉴클레오티드 서열 IV에 완전히 역 상보성이다. 그러므로, 만일 뉴클레오티드 서열 III의 염기(들)가 제공되면, 뉴클레오티드 서열 IV의 염기(들)도 또한 결정된다.
제5 siRNA
본 발명에 따르면, siRNA는 제5 siRNA일 수 있다.
제5 siRNA는 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함한다. 제5 siRNA 내 뉴클레오티드들은 각각 독립적으로 변형 뉴클레오티드거나 비변형 뉴클레오티드로서, 센스 가닥은 뉴클레오티드 서열 I을 포함하고, 안티센스 가닥은 뉴클레오티드 서열 II를 포함하고, 뉴클레오티드 서열 I과 뉴클레오티드 서열 II는 적어도 부분적으로 역 상보성으로서, 이중 가닥 영역을 형성하고, 뉴클레오티드 서열 I은 서열 번호 241에 보인 뉴클레오티드 서열과 길이가 동일하고 3개 이하의 뉴클레오티드만큼의 차이를 보이고; 뉴클레오티드 서열 II는 서열 번호 242에 보인 뉴클레오티드 서열과 길이가 동일하되 3개 이하의 뉴클레오티드만큼의 차이를 보인다:
5'-CCAAGAAGAACGCUGCAAZ17-3' (서열 번호 241);
5'-Z18UUGCAGCGUUCUUCUUGG-3' (서열 번호 242)
[단 여기서 Z17은 A이고, Z18은 U이고, 뉴클레오티드 서열 I은 Z17에 대응하는 부위에 뉴클레오티드 Z19를 포함하고, 뉴클레오티드 서열 II는 Z18에 대응하는 부위에 뉴클레오티드 Z20을 포함하고, Z20은 안티센스 가닥의 5'-말단으로부터 첫 번째 뉴클레오티드임]
몇몇 구현예에서, 센스 가닥은 뉴클레오티드 서열 I을 배타적으로 포함하고, 안티센스 가닥은 뉴클레오티드 서열 II를 배타적으로 포함한다.
몇몇 구현예에서, 뉴클레오티드 서열 I은 서열 번호 241에 보인 뉴클레오티드 서열과 1개 이하의 뉴클레오티드만큼의 차이를 보이고/보이거나 뉴클레오티드 서열 II는 서열 번호 242에 보인 뉴클레오티드 서열과 1개 이하의 뉴클레오티드만큼의 차이를 보인다.
몇몇 구현예에서, 뉴클레오티드 서열 II 및 서열 번호 242에 보인 뉴클레오티드 서열 사이의 뉴클레오티드 차이는 Z20 부위에서의 차이를 포함하고, Z20은 A, C 또는 G로부터 선택된다. 몇몇 구현예에서, 뉴클레오티드의 차이는 Z20 부위에서의 차이이고, Z20은 A, C 또는 G로부터 선택된다. 몇몇 구현예에서, Z19는 Z20에 상보성인 뉴클레오티드이다. 상기 뉴클레오티드 차이를 보이는 siRNA는 표적 mRNA를 억제하는 siRNA의 능력보다 더 큰 능력을 가지고, 이러한 siRNA도 또한 본 발명의 범위내에 포함된다.
몇몇 구현예에서, 뉴클레오티드 서열 I은 뉴클레오티드 서열 II와 기본적으로 역 상보성, 실질적으로 역 상보성 또는 완전히 역 상보성이다.
몇몇 구현예에서, 뉴클레오티드 I은 서열 번호 243에 보인 뉴클레오티드 서열이고, 뉴클레오티드 서열 II는 서열 번호 244에 보인 뉴클레오티드 서열이다:
5'-CCAAGAAGAACGCUGCAAZ19-3' (서열 번호 243);
5'-Z20UUGCAGCGUUCUUCUUGG-3' (서열 번호 244)
[단 여기서 Z20은 안티센스 가닥의 5'-말단으로부터 첫 번째 뉴클레오티드이고; Z19는 A, U, G 또는 C로부터 선택되고; Z20은 Z19에 상보성인 뉴클레오티드이고; 몇몇 구현예에서, Z19는 A이고, Z20은 U임]
몇몇 구현예에서, 센스 가닥은 뉴클레오티드 서열 III을 추가로 포함하고, 안티센스 가닥은 뉴클레오티드 서열 IV를 추가로 포함하고, 뉴클레오티드 서열 III 및 뉴클레오티드 서열 IV는 그 길이가 각각 독립적으로 1개 ~ 4개 뉴클레오티드이고; 뉴클레오티드 서열 III은 그 길이가 뉴클레오티드 서열 IV의 길이와 동일하며, 뉴클레오티드 서열 IV에 실질적으로 역 상보성이거나 완전히 역 상보성이고; 뉴클레오티드 서열 III은 뉴클레오티드 서열 I의 5'-말단에 결합하고, 뉴클레오티드 서열 IV는 뉴클레오티드 서열 II의 3'-말단에 결합한다. 뉴클레오티드 서열 IV는 뉴클레오티드 서열 II에 실질적으로 역 상보성이거나 완전히 역 상보성이고, 뉴클레오티드 서열 II는 표적 mRNA 내 서열 번호 241로 표시되는 뉴클레오티드 서열의 5'-말단에 인접하고, 뉴클레오티드 서열 IV와 그 길이가 동일한 뉴클레오티드 서열을 지칭한다.
몇몇 구현예에서, 뉴클레오티드 서열 III 및 뉴클레오티드 서열 IV는 둘 다 길이가 1개 뉴클레오티드이다. 뉴클레오티드 서열 III의 염기가 G이고, 뉴클레오티드 서열 IV의 염기가 C인 경우, 센스 가닥 대 안티센스 가닥의 길이 비는 20/20이거나; 또는 뉴클레오티드 서열 III 및 IV 둘 다의 길이가 2개 뉴클레오티드이며, 뉴클레오티드 서열 III의 5'-말단 → 3'-말단 방향의 염기 조성이 GG이고, 뉴클레오티드 서열 IV의 5'-말단 → 3'-말단 방향 염기 조성이 CC인 경우, 센스 가닥 대 안티센스 가닥의 길이 비는 21/21이거나; 또는 뉴클레오티드 서열 III 및 IV 둘 다는 길이가 3개 뉴클레오티드이며, 뉴클레오티드 서열 III의 5'-말단 → 3'-말단 방향의 염기 조성이 AGG이고, 뉴클레오티드 서열 IV의 5'-말단 → 3'-말단 방향 염기 조성이 CCU인 경우, 센스 가닥 대 안티센스 가닥의 길이 비는 22/22이거나; 또는 뉴클레오티드 서열 III 및 IV 둘 다의 길이가 4개 뉴클레오티드이며, 뉴클레오티드 서열 III의 5'-말단 → 3'-말단 방향의 염기 조성이 CAGG이고, 뉴클레오티드 서열 IV의 5'-말단 → 3'-말단 방향 염기 조성이 CCUG인 경우, 센스 가닥 대 안티센스 가닥의 길이 비는 23/23이다. 몇몇 구현예에서, 뉴클레오티드 서열 III 및 뉴클레오티드 서열 IV는 길이가 2개 뉴클레오티드이고, 뉴클레오티드 서열 III의 5'-말단 → 3'-말단 방향의 염기 조성이 GG이고, 뉴클레오티드 서열 IV의 5'-말단 → 3'-말단 방향 염기 조성이 CC인 경우, 센스 가닥 대 안티센스 가닥의 길이 비는 21/21이다.
몇몇 구현예에서, 뉴클레오티드 서열 III은 뉴클레오티드 서열 IV에 완전히 역 상보성이다. 그러므로, 만일 뉴클레오티드 서열 III의 염기(들)가 제공되면, 뉴클레오티드 서열 IV의 염기(들)도 또한 결정된다.
제6 siRNA
본 발명에 따르면, siRNA는 제6 siRNA일 수 있다.
제6 siRNA는 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함한다. 제6 siRNA 내 뉴클레오티드들은 각각 독립적으로 변형 뉴클레오티드거나 비변형 뉴클레오티드로서, 센스 가닥은 뉴클레오티드 서열 I을 포함하고, 안티센스 가닥은 뉴클레오티드 서열 II를 포함하고, 뉴클레오티드 서열 I과 뉴클레오티드 서열 II는 적어도 부분적으로 역 상보성으로서, 이중 가닥 영역을 형성하고, 뉴클레오티드 서열 I은 서열 번호 301에 보인 뉴클레오티드 서열과 길이가 동일하고 3개 이하의 뉴클레오티드만큼의 차이를 보이고; 뉴클레오티드 서열 II는 서열 번호 302에 보인 뉴클레오티드 서열과 길이가 동일하되 3개 이하의 뉴클레오티드만큼의 차이를 보인다:
5'-CCAGUAAGCAAGCCAGAAZ21-3' (서열 번호 301);
5'-Z22UUCUGGCUUGCUUACUGG-3' (서열 번호 302)
[단 여기서 Z21은 A이고, Z22는 U이고, 뉴클레오티드 서열 I은 Z21에 대응하는 부위에 뉴클레오티드 Z23을 포함하고, 뉴클레오티드 서열 II는 Z22에 대응하는 부위에 뉴클레오티드 Z24를 포함하고, Z24는 안티센스 가닥의 5'-말단으로부터 첫 번째 뉴클레오티드임]
몇몇 구현예에서, 센스 가닥은 뉴클레오티드 서열 I을 배타적으로 포함하고, 안티센스 가닥은 뉴클레오티드 서열 II를 배타적으로 포함한다.
몇몇 구현예에서, 뉴클레오티드 서열 I은 서열 번호 301에 보인 뉴클레오티드 서열과 1개 이하의 뉴클레오티드만큼의 차이를 보이고/보이거나 뉴클레오티드 서열 II는 서열 번호 302에 보인 뉴클레오티드 서열과 1개 이하의 뉴클레오티드만큼의 차이를 보인다.
몇몇 구현예에서, 뉴클레오티드 서열 II 및 서열 번호 302에 보인 뉴클레오티드 서열 사이의 뉴클레오티드 차이는 Z24 부위에서의 차이를 포함하고, Z24는 A, C 또는 G로부터 선택된다. 몇몇 구현예에서, 뉴클레오티드의 차이는 Z24 부위에서의 차이이고, Z24은 A, C 또는 G로부터 선택된다. 몇몇 구현예에서, Z23는 Z24에 상보성인 뉴클레오티드이다. 상기 뉴클레오티드 차이를 보이는 siRNA는 표적 mRNA를 억제하는 siRNA의 능력보다 더 큰 능력을 가지고, 이러한 siRNA도 또한 본 발명의 범위내에 포함된다.
몇몇 구현예에서, 뉴클레오티드 서열 I은 뉴클레오티드 서열 II와 기본적으로 역 상보성, 실질적으로 역 상보성 또는 완전히 역 상보성이다.
몇몇 구현예에서, 뉴클레오티드 I은 서열 번호 303에 보인 뉴클레오티드 서열이고, 뉴클레오티드 서열 II는 서열 번호 304에 보인 뉴클레오티드 서열이다:
5'-CCAGUAAGCAAGCCAGAAZ23-3' (서열 번호 303);
5'-Z24UUCUGGCUUGCUUACUGG-3' (서열 번호 304)
[단 여기서 Z24는 안티센스 가닥의 5'-말단으로부터 첫 번째 뉴클레오티드이고; Z23은 A, U, G 또는 C로부터 선택되고; Z24는 Z23에 상보성인 뉴클레오티드이고; 몇몇 구현예에서, Z23은 A이고, Z24는 U임]
몇몇 구현예에서, 센스 가닥은 뉴클레오티드 서열 III을 추가로 포함하고, 안티센스 가닥은 뉴클레오티드 서열 IV를 추가로 포함하고, 뉴클레오티드 서열 III 및 뉴클레오티드 서열 IV는 그 길이가 각각 독립적으로 1개 ~ 4개 뉴클레오티드이고; 뉴클레오티드 서열 III은 그 길이가 뉴클레오티드 서열 IV의 길이와 동일하며, 뉴클레오티드 서열 IV에 실질적으로 역 상보성이거나 완전히 역 상보성이고; 뉴클레오티드 서열 III은 뉴클레오티드 서열 I의 5'-말단에 결합하고, 뉴클레오티드 서열 IV는 뉴클레오티드 서열 II의 3'-말단에 결합한다. 뉴클레오티드 서열 IV는 뉴클레오티드 서열 II에 실질적으로 역 상보성이거나 완전히 역 상보성이고, 뉴클레오티드 서열 II는 표적 mRNA 내 서열 번호 301로 표시되는 뉴클레오티드 서열의 5'-말단에 인접하고, 뉴클레오티드 서열 IV와 그 길이가 동일한 뉴클레오티드 서열을 지칭한다.
몇몇 구현예에서, 뉴클레오티드 서열 III 및 뉴클레오티드 서열 IV는 둘 다 길이가 1개 뉴클레오티드이다. 뉴클레오티드 서열 III의 염기가 A이고, 뉴클레오티드 서열 IV의 염기가 U인 경우, 센스 가닥 대 안티센스 가닥의 길이 비는 20/20이거나; 또는 뉴클레오티드 서열 III 및 IV 둘 다의 길이가 2개 뉴클레오티드이며, 뉴클레오티드 서열 III의 5'-말단 → 3'-말단 방향의 염기 조성이 UA이고, 뉴클레오티드 서열 IV의 5'-말단 → 3'-말단 방향 염기 조성이 UA인 경우, 센스 가닥 대 안티센스 가닥의 길이 비는 21/21이거나; 또는 뉴클레오티드 서열 III 및 IV 둘 다의 길이가 3개 뉴클레오티드이며, 뉴클레오티드 서열 III의 5'-말단 → 3'-말단 방향의 염기 조성이 UUA이고, 뉴클레오티드 서열 IV의 5'-말단 → 3'-말단 방향 염기 조성이 UAA인 경우, 센스 가닥 대 안티센스 가닥의 길이 비는 22/22이거나; 또는 뉴클레오티드 서열 III 및 IV 둘 다의 길이가 4개 뉴클레오티드이며, 뉴클레오티드 서열 III의 5'-말단 → 3'-말단 방향의 염기 조성이 GUUA이고, 뉴클레오티드 서열 IV의 5'-말단 → 3'-말단 방향 염기 조성이 UAAC인 경우, 센스 가닥 대 안티센스 가닥의 길이 비는 23/23이다. 몇몇 구현예에서, 뉴클레오티드 서열 III 및 뉴클레오티드 서열 IV는 길이가 2개 뉴클레오티드이고, 뉴클레오티드 서열 III의 5'-말단 → 3'-말단 방향의 염기 조성이 UA이고, 뉴클레오티드 서열 IV의 5'-말단 → 3'-말단 방향 염기 조성이 UA인 경우, 센스 가닥 대 안티센스 가닥의 길이 비는 21/21이다.
몇몇 구현예에서, 뉴클레오티드 서열 III은 뉴클레오티드 서열 IV에 완전히 역 상보성이다. 그러므로, 만일 뉴클레오티드 서열 III의 염기(들)가 제공되면, 뉴클레오티드 서열 IV의 염기(들)도 또한 결정된다.
siRNA의 돌출 외가닥(overhang) 및 변형
이하 뉴클레오티드 서열 V, 핵산 서열, siRNA 내 뉴클레오티드 변형 및 변형된 서열에 관한 설명은 제1 siRNA ~ 제6 siRNA 중 임의의 하나에 적용 가능하다 즉 달리 명시되지 않는 한, 이하 siRNA에 관한 설명은 제1 siRNA, 제2 siRNA, 제3 siRNA, 제4 siRNA, 제5 siRNA 및 제6 siRNA를 하나씩 설명하는 것으로서 간주되어야 한다. 예를 들어 만일 특이적 siRNA가 명시되지 않으면, "는 뉴클레오티드 서열 V를 추가로 포함한다"란, "제1 siRNA, 제2 siRNA, 제3 siRNA, 제4 siRNA, 제5 siRNA 및 제6 siRNA는 뉴클레오티드 서열 V를 추가로 포함한다"를 의미한다.
몇몇 구현예에서, 센스 가닥과 안티센스 가닥은 길이가 상이하다. 뉴클레오티드 서열 II는 길이가 1개 ~ 3개 뉴클레오티드이고, 안티센스 가닥의 3'-말단에 결합되어, 안티센스 가닥의 3' 돌출 외가닥을 구성하는 뉴클레오티드 서열 V를 추가로 포함한다. 이를테면, 본 발명의 siRNA의 센스 가닥 대 안티센스 가닥의 길이 비는 19/20, 19/21, 19/22, 20/21, 20/22, 20/23, 21/22, 21/23, 21/24, 22/23, 22/24, 22/25, 23/24, 23/25 또는 23/26일 수 있다. 몇몇 구현예에서, 뉴클레오티드 서열 V는 길이가 2개 뉴클레오티드이다. 이를테면, 본 발명의 siRNA의 센스 가닥 대 안티센스 가닥의 길이 비는 19/21, 21/23 또는 23/25일 수 있다.
뉴클레오티드 서열 V의 각각의 뉴클레오티드는 임의의 뉴클레오티드일 수 있다. 합성을 촉진하고, 합성 비용을 절약하기 위해, 뉴클레오티드 서열 V는 2개의 연속 티미딘 데옥시리보뉴클레오티드(dTdT) 또는 2개의 연속 우라실 리보뉴클레오티드(UU)이거나; 또는 siRNA의 안티센스 가닥의 표적 mRNA에 대한 친화성을 개선하기 위해, 뉴클레오티드 서열 V는 표적 mRNA의 대응 부위에 있는 뉴클레오티드에 상보성이다. 그러므로 몇몇 구현예에서, 본 발명의 siRNA의 센스 가닥 대 안티센스 가닥의 길이 비는 19/21 또는 21/23이다. 이 경우, 본 발명의 siRNA는 mRNA에 대해 더 우수한 침묵 활성(silencing activity)을 보인다.
표적 mRNA의 대응 부위에 있는 뉴클레오티드란, 5'-말단에서 표적 mRNA의 뉴클레오티드 서열 III에 인접한 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 서열을 지칭한다. 뉴클레오티드 서열 III은 뉴클레오티드 서열 II에 실질적으로 역 상보성이거나 완전히 역 상보성이거나, 또는 뉴클레오티드 서열 II 및 뉴클레오티드 서열 IV에 의해 형성된 뉴클레오티드 서열에 실질적으로 역 상보성이거나 완전히 역 상보성인 뉴클레오티드 서열이다.
몇몇 구현예에서, 제1 siRNA의 경우, siRNA의 센스 가닥은 이하 서열 번호 5에 보인 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 안티센스 가닥은 이하 서열 번호 6에 보인 뉴클레오티드 서열을 포함하거나:
5'-CUUCAUUCAUACAGACAAZ3-3' (서열 번호 5);
5'-Z4UUGUCUGUAUGAAUGAAGAG-3' (서열 번호 6)
또는
siRNA의 센스 가닥은 이하 서열 번호 7에 보인 뉴클레오티드 서열을 포함하고, siRNA의 안티센스 가닥은 이하 서열 번호 8에 보인 뉴클레오티드 서열을 포함하되, 단 Z4는 안티센스 가닥의 5'-말단으로부터 첫 번째 뉴클레오티드이고; Z3은 A, U, G 또는 C로부터 선택되고; Z4는 Z3에 상보성인 뉴클레오티드이다:
5'-CUCUUCAUUCAUACAGACAAZ3-3' (서열 번호 7);
5'-Z4UUGUCUGUAUGAAUGAAGAGAA-3' (서열 번호 8).
몇몇 구현예에서, 제2 siRNA의 경우, siRNA의 센스 가닥은 이하 서열 번호 65에 보인 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 안티센스 가닥은 이하 서열 번호 66에 보인 뉴클레오티드 서열을 포함하거나:
5'-CUACAGUUUAGAAGAUUUZ7-3' (서열 번호 65);
5'-Z8AAAUCUUCUAAACUGUAGUA-3' (서열 번호 66)
또는
siRNA의 센스 가닥은 이하 서열 번호 67에 보인 뉴클레오티드 서열을 포함하고, siRNA의 안티센스 가닥은 이하 서열 번호 68에 보인 뉴클레오티드 서열을 포함하되, 단 Z8은 안티센스 가닥의 5'-말단으로부터 첫 번째 뉴클레오티드이고; Z7은 A, U, G 또는 C로부터 선택되고; Z8은 Z7에 상보성인 뉴클레오티드이다:
5'-UACUACAGUUUAGAAGAUUUZ7-3' (서열 번호 67);
5'-Z8AAAUCUUCUAAACUGUAGUAUG-3' (서열 번호 68).
몇몇 구현예에서, 제3 siRNA의 경우, siRNA의 센스 가닥은 이하 서열 번호 125에 보인 뉴클레오티드 서열을 포함하고, siRNA의 안티 센스 가닥은 이하 서열 번호 126에 보인 뉴클레오티드 서열을 포함하거나:
5'-GGAAGGUUACCGAGCAAUZ11-3' (서열 번호 125);
5'-Z12AUUGCUCGGUAACCUUCCCU-3' (서열 번호 126)
또는 siRNA의 센스 가닥은 이하 서열 번호 127에 보인 뉴클레오티드 서열을 포함하고, siRNA의 안티 센스 가닥은 이하 서열 번호 128에 보인 뉴클레오티드 서열을 포함하되, 단 Z12는 안티센스 가닥의 5'-말단으로부터 첫 번째 뉴클레오티드이고; Z11은 A, U, G 또는 C로부터 선택되고; Z12는 Z11에 상보성인 뉴클레오티드이다:
5'-AGGGAAGGUUACCGAGCAAUZ11-3' (서열 번호 127);
5'-Z12AUUGCUCGGUAACCUUCCCUGG-3' (서열 번호 128).
몇몇 구현예에서, 제4 siRNA의 경우, siRNA의 센스 가닥은 이하 서열 번호 185에 보인 뉴클레오티드 서열을 포함하고, siRNA의 안티 센스 가닥은 이하 서열 번호 186에 보인 뉴클레오티드 서열을 포함하거나:
5'-AGAACAGACAGCAGAAUUZ15-3' (서열 번호 185);
5'-Z16AAUUCUGCUGUCUGUUCUCC-3' (서열 번호 186)
또는 siRNA의 센스 가닥은 이하 서열 번호 187에 보인 뉴클레오티드 서열을 포함하고, siRNA의 안티 센스 가닥은 이하 서열 번호 188에 보인 뉴클레오티드 서열을 포함하되, 단 Z16은 안티센스 가닥의 5'-말단으로부터 첫 번째 뉴클레오티드이고; Z15는 A, U, G 또는 C로부터 선택되고; Z16은 Z15에 상보성인 뉴클레오티드이다:
5'-GGAGAACAGACAGCAGAAUUZ15-3' (서열 번호 187);
5'-Z16AAUUCUGCUGUCUGUUCUCCUG-3' (서열 번호 188).
몇몇 구현예에서, 제5 siRNA의 경우, siRNA의 센스 가닥은 이하 서열 번호 245에 보인 뉴클레오티드 서열을 포함하고, siRNA의 안티 센스 가닥은 이하 서열 번호 246에 보인 뉴클레오티드 서열을 포함하거나:
5'-CCAAGAAGAACGCUGCAAZ19-3' (서열 번호 245);
5'-Z20UUGCAGCGUUCUUCUUGGCC-3' (서열 번호 246)
또는 siRNA의 센스 가닥은 이하 서열 번호 247에 보인 뉴클레오티드 서열을 포함하고, siRNA의 안티 센스 가닥은 이하 서열 번호 248에 보인 뉴클레오티드 서열을 포함하되, 단 Z20은 안티센스 가닥의 5'-말단으로부터 첫 번째 뉴클레오티드이고; Z19는 A, U, G 또는 C로부터 선택되고; Z20은 Z19에 상보성인 뉴클레오티드이다:
5'-GGCCAAGAAGAACGCUGCAAZ19-3' (서열 번호 247);
5'-Z20UUGCAGCGUUCUUCUUGGCCUG-3' (서열 번호 248).
몇몇 구현예에서, 제6 siRNA의 경우, siRNA의 센스 가닥은 이하 서열 번호 305에 보인 뉴클레오티드 서열을 포함하고, siRNA의 안티 센스 가닥은 이하 서열 번호 306에 보인 뉴클레오티드 서열을 포함하거나:
5'-CCAGUAAGCAAGCCAGAAZ23-3' (서열 번호 305);
5'-Z24UUCUGGCUUGCUUACUGGUA-3' (서열 번호 306)
또는 siRNA의 센스 가닥은 이하 서열 번호 307에 보인 뉴클레오티드 서열을 포함하고, siRNA의 안티 센스 가닥은 이하 서열 번호 308에 보인 뉴클레오티드 서열을 포함하되, 단 Z24는 안티센스 가닥의 5'-말단으로부터 첫 번째 뉴클레오티드이고; Z23은 A, U, G 또는 C로부터 선택되고; Z24는 Z23에 상보성인 뉴클레오티드이다:
5'-UACCAGUAAGCAAGCCAGAAZ23-3' (서열 번호 307);
5'-Z24UUCUGGCUUGCUUACUGGUAAC-3' (서열 번호 308).
몇몇 구현예에서, 본 발명의 siRNA는 표 1a ~ 표 1f에 나열된 siC5a1, siC5a2, siC5b1, siC5b2, siC5c1, siC5c2, siC5d1, siC5d2, siC5e1, siC5e2, siC5f1 또는 siC5f2이다.
전술된 바와 같이, 본 발명의 siRNA 내 뉴클레오티드들은 각각 독립적으로 변형 뉴클레오티드 또는 비변형 뉴클레오티드이다. 몇몇 구현예에서, 본 발명의 siRNA 내 뉴클레오티드들은 비변형 뉴클레오티드이다. 몇몇 구현예에서, 본 발명의 siRNA 내 몇몇 뉴클레오티드 또는 모든 뉴클레오티드는 변형 뉴클레오티드이다. 뉴클레오티드에 대한 이와 같은 변형은 C5 유전자 발현을 억제하는, 본 발명의 siRNA의 기능을 유의미하게 감소시키거나 없애지 않을 것이다.
몇몇 구현예에서, 본 발명의 siRNA는 변형 뉴클레오티드를 적어도 1개 포함한다. 본 발명의 내용 중 본원에 사용된 "변형 뉴클레오티드"란 용어는, 뉴클레오티드 리보스기의 2'-하이드록시를 다른 기로 치환함으로써 생성된 뉴클레오티드, 뉴클레오티드 유사체 또는 염기가 변형된 뉴클레오티드를 지칭한다. 이처럼 변형 뉴클레오티드는 유전자 발현을 억제하는, siRNA의 기능을 유의미하게 감소시키거나 없애지 않을 것이다. 예를 들어 문헌[Chemically Modified siRNA: tools and applications. Drug Discov Today, 2008.13(19-20): 842-55, J.K. Watts, G. F. Deleavey 및 M. J.Damha 공저]에 개시된 변형 뉴클레오티드가 선택될 수 있다.
몇몇 구현예에서, 본 발명에 의해 제공된 siRNA의 센스 가닥 또는 안티센스 가닥 내 뉴클레오티드 적어도 1개는 변형 뉴클레오티드이고/이거나, 인산염 적어도 1개는 변형 기를 가지는 인산염기이다. 다시 말해서, 센스 가닥과 안티센스 가닥 중 적어도 1개의 단일 가닥 내 인산염-리보스 주쇄의 인산염이기 및/또는 리보스기 적어도 일부는 변형 기를 가지는 인산염기 및/또는 변형기를 가지는 리보스기이다.
몇몇 구현예에서, 센스 가닥 및/또는 안티센스 가닥의 뉴클레오티드 모두는 변형 뉴클레오티드이다. 몇몇 구현예에서, 본 발명에 의해 제공되는 siRNA의 센스 가닥과 안티센스 가닥 내 뉴클레오티드들은 각각 독립적으로 플루오르화 변형 뉴클레오티드 또는 비 플루오르화 변형 뉴클레오티드이다.
본 발명의 발명자들은 놀랍게도 본 발명의 siRNA가 혈청중 안정성과 동물 실험에서의 유전자 침묵 효율 사이에 고도의 균형을 달성하였음을 발견하였다.
몇몇 구현예에서, 플루오르화 변형 뉴클레오티드는 뉴클레오티드 서열 I과 뉴클레오티드 서열 II에 위치하고; 뉴클레오티드 서열 I의 5'-말단 → 3'-말단 방향으로 7번, 8번 및 9번 위치에 있는 뉴클레오티드는 플루오르화 변형 뉴클레오티드이고, 뉴클레오티드 서열 II의 5'-말단 → 3'-말단 방향으로 2번, 6번, 14번 및 16번 위치에 있는 뉴클레오티드는 플루오르화 변형 뉴클레오티드이다.
몇몇 구현예에서, 플루오르화 변형 뉴클레오티드는 서열 I과 뉴클레오티드 서열 II에 위치하고; 5개 이하의 플루오르화 변형 뉴클레오티드는 뉴클레오티드 서열 I에 존재하며, 뉴클레오티드 서열 I의 5'-말단 → 3'-말단 방향으로 7번, 8번 및 9번 위치에 있는 뉴클레오티드는 플루오르화 변형 뉴클레오티드이고; 7개 이하의 플루오르화 변형 뉴클레오티드는 뉴클레오티드 서열 II에 존재하며, 뉴클레오티드 서열 II의 2번, 6번, 14번 및 16번 위치에 있는 뉴클레오티드는 플루오르화 변형 뉴클레오티드이다.
몇몇 구현예에서, 센스 가닥 내 뉴클레오티드 서열 I의 5'-말단 → 3'-말단 방향으로 7번, 8번 및 9번 위치, 또는 5번, 7번, 8번 및 9번 위치에 있는 뉴클레오티드는 플루오르화 변형 뉴클레오티드이고, 센스 가닥의 나머지 위치에 있는 뉴클레오티드는 비 플루오르화 변형 뉴클레오티드이며; 안티 센스 가닥 내 뉴클레오티드 서열 II의 5'-말단 → 3'-말단 방향으로 2번, 6번, 14번 및 16번 위치, 또는 2번, 6번, 8번, 9번, 14번 및 16번 위치에 있는 뉴클레오티드는 플루오르화 변형 뉴클레오티드이고, 안티 센스 가닥의 나머지 위치에 있는 뉴클레오티드는 비 플루오르화 변형 뉴클레오티드이다.
본 발명의 내용에 있어서, "플루오르화 변형 뉴클레오티드"란, 뉴클레오티드 리보스기의 2'-하이드록시를 플루오르기로 치환하여 생성된 뉴클레오티드로서, 하기 화학식 7로 표시되는 바와 같은 구조를 가지는 뉴클레오티드를 지칭한다. "비 플루오르화 변형 뉴클레오티드"란, 뉴클레오티드 리보스기의 2'-하이드록시를 비 플루오르기로 치환하여 생성된 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 유사체를 지칭한다. 몇몇 구현예에서, 비 플루오르화 변형 뉴클레오티드는 뉴클레오티드 리보스기의 2'-하이드록시를 비 플루오르기로 치환하여 생성된 뉴클레오티드, 또는 뉴클레오티드 유사체로부터 각각 독립적으로 선택된다.
이처럼 리보스기의 2'-하이드록시를 비 플루오르기로 치환하여 생성된 뉴클레오티드는 당 업자들에게 널리 공지되어 있으며, 이러한 뉴클레오티드는 2'-알콕시 변형 뉴클레오티드, 2'-치환 알콕시 변형 뉴클레오티드, 2'-알킬 변형 뉴클레오티드, 2'-치환 알킬 변형 뉴클레오티드, 2'-아미노 변형 뉴클레오티드, 2' -치환 아미노 변형 뉴클레오티드 및 2'-데옥시뉴클레오티드 중 1개로부터 선택될 수 있다.
몇몇 구현예에서, 2'-알콕시 변형 뉴클레오티드는 하기 화학식 8로 표시되는 바와 같은 2'-메톡시 변형 뉴클레오티드(2'-OMe)이다. 몇몇 구현예에서, 2'-치환 알콕시 변형 뉴클레오티드는, 예를 들어 하기 화학식 9로 표시되는 바와 같은 2'-O-메톡시에톡시 변형 뉴클레오티드(2' MOE)이다. 몇몇 구현예에서, 2'-아미노 변형 뉴클레오티드(2'-NH2)는 하기 화학식 10으로 표시되는 바와 같다. 몇몇 구현예에서, 2'-데옥시뉴클레오티드(DNA)는 이하 화학식 11로 표시되는 바와 같다:
Figure pct00004
뉴클레오티드 유사체란, 아데닌 리보뉴클레오티드, 구아닌 리보뉴클레오티드, 시토신 리보뉴클레오티드, 우라실 리보뉴클레오티드 또는 티미딘 데옥시리보뉴클레오티드와는 구조상 상이하지만, 핵산 내 뉴클레오티드를 대체할 수 있는 기를 지칭한다. 몇몇 구현예에서, 뉴클레오티드 유사체는 이소뉴클레오티드, 가교 핵산 또는 비사이클릭 뉴클레오티드일 수 있다.
가교 핵산(BNA)은 접근 불가능하거나 제한된 뉴클레오티드이다. BNA는 "고정된" C3'-엔도 당 퍼커링(C3'-endo sugar puckering)을 보이는 5원 고리, 6원 고리 또는 7원 고리 가교 구조를 함유할 수 있다. 가교는 통상 리보스의 2' 위치 및 4' 위치에 혼입되어, 2',4'-BNA 뉴클레오티드를 이룰 수 있다. 몇몇 구현예에서, BNA는 LNA, ENA 및 cET BNA일 수 있는데, 여기서 LNA는 하기 화학식 12로 표시되는 바와 같고, ENA는 하기 화학식 13로 표시되는 바와 같고, cET BNA는 하기 화학식 14로 표시되는 바와 같다:
Figure pct00005
비사이클릭 뉴클레오티드는 리보스 고리가 개방된 뉴클레오티드이다. 몇몇 구현예에서, 비사이클릭 뉴클레오티드는 폐쇄되지 않은 핵산(UNA) 또는 글리세롤 핵산(GNA)일 수 있으며, 이 경우 UNA는 하기 화학식 15로 표시되는 바와 같고, GNA는 하기 화학식 16로 표시되는 바와 같다:
Figure pct00006
화학식 15 및 화학식 16에서, R은 H, OH 또는 알콕시(O-알킬)로부터 선택된다.
이소뉴클레오티드는 리보스 고리상 염기의 위치가 변경된 뉴클레오티드에 의해 생성되는 화합물이다. 몇몇 구현예에서, 이소뉴클레오티드는, 하기 화학식 17 또는 화학식 18로 표시되는 바와 같이, 염기가 리보스 고리상 1' 위치에서 2' 위치 또는 3' 위치로 이동한 화합물일 수 있다:
Figure pct00007
상기 화학식 17 및 화학식 18로 표시되는 바와 같은 화합물에서, "염기"는 A, U, G, C 또는 T와 같은 염기를 나타내고; "R"은 상기 H, OH, F 또는 비 플루오르기로부터 선택된다.
몇몇 구현예에서, 뉴클레오티드 유사체는 이소뉴클레오티드, LNA, ENA, cET, UNA 및 GNA 중 1개로부터 선택된다. 몇몇 구현예에서, 각각의 비 플루오르화 변형 뉴클레오티드는 메톡시 변형 뉴클레오티드이다. 본 발명의 내용 중 메톡시 변형 뉴클레오티드란, 뉴클레오티드 리보스기의 2'-하이드록시를 메톡시기로 치환함으로써 생성된 뉴클레오티드를 지칭한다.
본 발명의 내용 중 "플루오르화 변형 뉴클레오티드", "2'-플루오르화 변형 뉴클레오티드", "리보스기의 2'-하이드록시가 플루오르기로 치환된 뉴클레오티드" 및 "2'-플루오로리보실"은 동일한 의미를 가지는 용어들로서, 뉴클레오티드 리보스기의 2'-하이드록시를 플루오르기로 치환하여 생성되고, 화학식 7로 표시되는 바와 같은 구조를 가지는 화합물을 지칭한다. "메톡시 변형 뉴클레오티드", "2'-메톡시 변형 뉴클레오티드", "리보스기의 2'-하이드록시가 메톡시로 치환된 뉴클레오티드" 및 "2'-메톡시리보실"은 동일한 의미를 가지며, 뉴클레오티드 리보스기의 2'-하이드록시를 메톡시로 치환하여 생성되고, 화학식 8로 표시되는 바와 같은 구조를 가지는 화합물을 지칭한다.
몇몇 구현예에서, 본 발명의 siRNA는 이하 변형을 가지는 siRNA, 즉 센스 가닥 내 뉴클레오티드 서열 I의 5'-말단 → 3'-말단 방향으로 7번, 8번 및 9번 위치, 또는 5번, 7번, 8번 및 9번 위치에 있는 뉴클레오티드가 플루오르화 변형 뉴클레오티드이고, 센스 가닥의 나머지 위치에 있는 뉴클레오티드는 메톡시 변형 뉴클레오티드이고, 안티센스 가닥 내 뉴클레오티드 서열 II의 5'-말단 → 3'-말단 방향으로 2번, 6번, 14번 및 16번 위치, 또는 2번, 6번, 8번, 9번, 14번 및 16번 위치에 있는 뉴클레오티드가 플루오르화 변형 뉴클레오티드고, 안티센스 가닥의 나머지 위치에 있는 뉴클레오티드가 메톡시 변형 뉴클레오티드인 siRNA이다.
몇몇 구현예에서, 본 발명의 siRNA는 이하 변형을 가지는 siRNA, 즉 siRNA의 센스 가닥 내 뉴클레오티드 서열 I의 5'-말단 → 3'-말단 방향으로 5번, 7번, 8번 및 9번 위치에 있는 뉴클레오티드가 플루오르화 변형 뉴클레오티드고, siRNA의 센스 가닥의 나머지 위치에 있는 뉴클레오티드는 메톡시 변형 뉴클레오티드이고; siRNA의 안티센스 가닥 내 뉴클레오티드 서열 II의 5'-말단 → 3'-말단 방향으로 2번, 6번, 8번, 9번, 14번 및 16번 위치에 있는 뉴클레오티드가 플루오르화 변형 뉴클레오티드고, siRNA의 안티센스 가닥 나머지 위치에 있는 뉴클레오티드가 메톡시 변형 뉴클레오티드이거나;
siRNA의 센스 가닥 내 뉴클레오티드 서열 I의 5'-말단 → 3'-말단 방향으로 5번, 7번, 8번 및 9번 위치에 있는 뉴클레오티드가 플루오르화 변형 뉴클레오티드고, siRNA의 센스 가닥의 나머지 위치에 있는 뉴클레오티드는 메톡시 변형 뉴클레오티드이고; siRNA의 안티센스 가닥 내 뉴클레오티드 서열 II의 5'-말단 → 3'-말단 방향으로 2번, 6번, 14번 및 16번 위치에 있는 뉴클레오티드가 플루오르화 변형 뉴클레오티드고, siRNA의 안티센스 가닥의 나머지 위치에 있는 뉴클레오티드가 메톡시 변형 뉴클레오티드이거나; 또는
siRNA의 센스 가닥 내 뉴클레오티드 서열 I의 5'-말단 → 3'-말단 방향으로 7번, 8번 및 9번 위치에 있는 뉴클레오티드가 플루오르화 변형 뉴클레오티드고, siRNA의 센스 가닥의 나머지 위치에 있는 뉴클레오티드는 메톡시 변형 뉴클레오티드인 siRNA; 그리고 siRNA의 안티센스 가닥 내 뉴클레오티드 서열 II의 5'-말단 → 3'-말단 방향으로 2번, 6번, 14번 및 16번 위치에 있는 뉴클레오티드가 플루오르화 변형 뉴클레오티드고, siRNA의 안티센스 가닥의 나머지 위치에 있는 뉴클레오티드가 메톡시 변형 뉴클레오티드인
siRNA이다.
몇몇 구현예에서, 본 발명에 의해 제공되는 siRNA는 표 1a ~ 표 1f에 나열된 siC5a1-M1, siC5a1-M2, siC5a1-M3, siC5a2-M1, siC5a2-M2, siC5a2-M3, siC5b1-M1, siC5b1-M2, siC5b1-M3, siC5b2-M1, siC5b2-M2, siC5b2-M3, siC5c1-M1, siC5c1-M2, siC5c1-M3, siC5c2-M1, siC5c2-M2, siC5c2-M3, siC5d1-M1, siC5d1-M2, siC5d1-M3, siC5d2-M1, siC5d2-M2, siC5d2-M3, siC5e1-M1, siC5e1-M2, siC5e1-M3, siC5e2-M1, siC5e2-M2, siC5e2-M3, siC5f1-M1, siC5f1-M2, siC5f1-M3, siC5f2-M1, siC5f2-M2 또는 siC5f2-M3 중 임의의 것 1개다.
상기 변형을 가지는 siRNA는 저비용으로 수득될 수 있을 뿐더러, 이 핵산이 혈중 리보뉴클레아제에 의해 절단될 가능성을 줄임으로써, 핵산의 안정성을 증가시킬 수 있으며, 이 핵산이 뉴클레아제 가수분해에 대해 더 큰 저항성을 가지도록 만들 수 있다.
몇몇 구현예에서, 본 발명에 의해 제공되는 siRNA의 센스 가닥과 안티센스 가닥 중 적어도 1개의 단일 가닥의 인산염-리보스 주쇄 내 인산염기 적어도 일부는 변형기를 가지는 인산염기이다. 몇몇 구현예에서, 변형기를 가지는 인산염기는 인산염기의 포스포디에스테르 결합내 적어도 1개의 산소 원자를 황 원자로 치환하여 생성된 포스포로티오에이트기이고; 몇몇 구현예에서, 변형기를 가지는 인산염기는 하기 화학식 1로 표시되는 바와 같은 구조, 즉
화학식 1
Figure pct00008
를 가지는 포스포로티오에이트기이다.
이 변형은 siRNA의 이중 가닥 구조를 안정화하여, 염기 쌍형성을 위해 큰 특이성과 큰 친화성을 유지할 수 있다.
몇몇 구현예에서, 본 발명에 의해 제공된 siRNA에 있어 포스포로티오에이트 결합은 이하 위치들, 즉 센스 가닥 또는 안티센스 가닥의 양 말단 중 어느 한 말단에 있는, 제1 뉴클레오티드와 제2 뉴클레오티드 사이의 위치; 센스 가닥 또는 안티센스 가닥의 양 말단 중 어느 한 말단에 있는, 제2 뉴클레오티드와 제3 뉴클레오티드 사이의 위치; 또는 이것들의 임의의 조합 중 적어도 1개의 위치에 존재한다. 몇몇 구현예에서, 포스포로티오에이트 결합은 센스 가닥의 5'-말단을 제외한 상기 위치 모두에 존재한다. 몇몇 구현예에서, 포스포로티오에이트 결합은 센스 가닥의 3'-말단을 제외한 상기 위치 모두에 존재한다. 몇몇 구현예에서, 포스포로티오에이트 결합은 이하 위치들, 즉
센스 가닥의 5'-말단에 있는, 제1 뉴클레오티드와 제2 뉴클레오티드 사이의 위치;
센스 가닥의 5'-말단에 있는, 제2 뉴클레오티드와 제3 뉴클레오티드 사이의 위치;
센스 가닥의 3'-말단에 있는, 제1 뉴클레오티드와 제2 뉴클레오티드 사이의 위치;
센스 가닥의 3'-말단에 있는, 제2 뉴클레오티드와 제3 뉴클레오티드 사이의 위치;
안티센스 가닥의 5'-말단에 있는, 제1 뉴클레오티드와 제2 뉴클레오티드 사이의 위치;
안티센스 가닥의 5'-말단에 있는, 제2 뉴클레오티드와 제3 뉴클레오티드 사이의 위치;
안티센스 가닥의 3'-말단에 있는, 제1 뉴클레오티드와 제2 뉴클레오티드 사이의 위치;
안티센스 가닥의 3'-말단에 있는, 제2 뉴클레오티드와 제3 뉴클레오티드 사이의 위치
중 적어도 1개의 위치에 존재한다.
몇몇 구현예에서, 본 발명에 의해 제공되는 siRNA는 표 1a ~ 표 1f에 나열된 siC5a1-M1S, siC5a1-M2S, siC5a1-M3S, siC5a2-M1S, siC5a2-M2S, siC5a2-M3S, siC5b1-M1S, siC5b1-M2S, siC5b1-M3S, siC5b2-M1S, siC5b2-M2S, siC5b2-M3S, siC5c1-M1S, siC5c1-M2S, siC5c1-M3S, siC5c2-M1S, siC5c2-M2S, siC5c2-M3S, siC5d1-M1S, siC5d1-M2S, siC5d1-M3S, siC5d2-M1S, siC5d2-M2S, siC5d2-M3S, siC5e1-M1S, siC5e1-M2S, siC5e1-M3S, siC5e2-M1S, siC5e2-M2S, siC5e2-M3S, siC5f1-M1S, siC5f1-M2S, siC5f1-M3S, siC5f2-M1S, siC5f2-M2S 또는 siC5f2-M3S 중 임의의 것 1개이다.
몇몇 구현예에서, siRNA의 안티센스 가닥 5'-말단 뉴클레오티드는 5'-인산염 뉴클레오티드 또는 5'-인산염 유사체 변형 뉴클레오티드이다.
5'-인산염 뉴클레오티드 또는 5'-인산염 유사체 변형 뉴클레오티드의 공통된 유형은 당 업자들에게 널리 공지되어 있는데, 예를 들어 5'-인산염 뉴클레오티드는 이하 구조, 즉
화학식 2
Figure pct00009
를 가질 수 있다.
또 다른 예를 들자면 문헌[The chemical evolution of oligonucleotide therapies of clinical utility. Nature Biotechnology, 2017, 35(3): 238-48, Anastasia Khvorova 및 Jonathan K. Watts 공저]에는 하기 4개의 5'-인산염 유사체 변형 뉴클레오티드, 즉
Figure pct00010
가 개시되어 있는데, 단 여기서 R은 H, OH, 메톡시 또는 F로부터 선택되고; 염기는 A, U, C, G 또는 T로부터 선택되는 염기를 나타낸다.
몇몇 구현예에서, 5'-인산염 뉴클레오티드는 화학식 2로 표시되는 바와 같이 5'-인산염 변형을 가지는 뉴클레오티드이고; 5'-인산염 유사체 변형 뉴클레오티드는 화학식 3로 표시되는 바와 같이 5'-(E)-비닐포스폰산염(E-VP) 변형을 가지는 뉴클레오티드 또는 화학식 5로 표시되는 바와 같은 포스포로티오에이트 변형 뉴클레오티드이다.
몇몇 구현예에서, 본 발명에 의해 제공되는 siRNA는 표 1a ~ 표 1f에 나열된 siC5a1-M1P1, siC5a1-M2P1, siC5a1-M3P1, siC5a2-M1P1, siC5a2-M2P1, siC5a2-M3P1, siC5b1-M1P1, siC5b1-M2P1, siC5b1-M3P1, siC5b2-M1P1, siC5b2-M2P1, siC5b2-M3P1, siC5c1-M1P1, siC5c1-M2P1, siC5c1-M3P1, siC5c2-M1P1, siC5c2-M2P1, siC5c2-M3P1, siC5d1-M1P1, siC5d1-M2P1, siC5d1-M3P1, siC5d2-M1P1, siC5d2-M2P1, siC5d2-M3P1, siC5e1-M1P1, siC5e1-M2P1, siC5e1-M3P1, siC5e2-M1P1, siC5e2-M2P1, siC5e2-M3P1, siC5f1-M1P1, siC5f1-M2P1, siC5f1-M3P1, siC5f2-M1P1, siC5f2-M2P1, siC5f2-M3P1, siC5a1-M1SP1, siC5a1-M2SP1, siC5a1-M3SP1, siC5a2-M1SP1, siC5a2-M2SP1, siC5a2-M3SP1, siC5b1-M1SP1, siC5b1-M2SP1, siC5b1-M3SP1, siC5b2-M1SP1, siC5b2-M2SP1, siC5b2-M3SP1, siC5c1-M1SP1, siC5c1-M2SP1, siC5c1-M3SP1, siC5c2-M1SP1, siC5c2-M2SP1, siC5c2-M3SP1, siC5d1-M1SP1, siC5d1-M2SP1, siC5d1-M3SP1, siC5d2-M1SP1, siC5d2-M2SP1, siC5d2-M3SP1, siC5e1-M1SP1, siC5e1-M2SP1, siC5e1-M3SP1, siC5e2-M1SP1, siC5e2-M2SP1, siC5e2-M3SP1, siC5f1-M1SP1, siC5f1-M2SP1, siC5f1-M3SP1, siC5f2-M1SP1, siC5f2-M2SP1 또는 siC5f2-M3SP1 중 임의의 것 1개이다.
본 발명의 발명자들은 놀랍게도 본 발명에 의해 제공된 siRNA는 유의미하게 향상된 혈장 및 리소좀 안정성을 가지고, 더 큰 표적 mRNA 억제 활성을 가짐을 발견하였다.
본 발명에 의해 제공된 siRNA는, siRNA를 제조하기 위한 당 분야 종래의 방법(예컨대 고상 합성 방법 및 액체상 합성 방법)에 의해 수득될 수 있다. 상업적 맞춤제공 서비스는 이미 고상 합성을 위해 이용 가능하였다. 변형 뉴클레오티드는, 대응하는 변형을 가지는 뉴클레오티드 단량체를 사용함으로써 본 발명의 siRNA에 도입될 수 있는데, 여기서 대응하는 변형을 가지는 뉴클레오티드 단량체를 제조하기 위한 방법과, 변형 뉴클레오티드를 siRNA에 도입하기 위한 방법은 또한 당 업자들에게 널리 공지되어 있다. 변형 뉴클레오티드기는 대응하는 변형을 가지는 뉴클레오티드 단량체를 사용함으로써 본 발명의 siRNA에 도입될 수 있는데, 여기서 대응하는 변형을 가지는 뉴클레오티드 단량체를 제조하기 위한 방법과, 변형 뉴클레오티드기를 siRNA에 도입하기 위한 방법은 또한 당 업자들에게 널리 공지되어 있다.
약학 조성물
본 발명은 활성 성분으로서 상기 siRNA와, 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약학 조성물을 제공한다.
약학적으로 허용 가능한 담체는 siRNA가 투여되는 분야에 통상적으로 사용되는 담체, 예를 들어 자성 나노입자(예컨대 Fe3O4 또는 Fe2O3-기반 나노입자), 탄소 나노튜브, 메조다공성 규소(mesoporous silicon), 인산칼슘 나노입자, 폴리에틸렌이민(PEI), 폴리아미도아민(PAMAM) 덴드리머, 폴리(L-리신)(PLL), 키토산, 1,2-디올레오일-3-트리메틸암모늄-프로판(DOTAP), 폴리(D&L-젖산/글리콜산) 공중합체(PLGA), 폴리(2-아미노 에틸 에틸렌 인산염)(PPEEA), 폴리(2-디메틸아미노에틸 메타크릴산염)(PDMAEMA) 및 이것들의 유도체 중 1개 이상(이에 한정되는 것은 아님)일 수 있다.
약학 조성물에서 각각의 성분의 종래 함량일 수 있는 siRNA와 약학적으로 허용 가능한 담체에 대한 특별한 요건은 존재하지 않는다. 몇몇 구현에예서, siRNA 대 약학적으로 허용 가능한 담체의 중량비는 1 : (1 ~ 500)이고, 몇몇 구현예에서, 상기 중량비는 1 : (1 ~ 50)이다.
몇몇 구현예에서, 본 약학 조성물은 또한 당 분야의 다양한 종래 제형 또는 화합물 중 1개 이상일 수 있는, 기타 약학적으로 허용 가능한 부형제를 포함할 수도 있다. 예를 들어 기타 약학적으로 허용 가능한 부형제는 pH 완충제 용액, 보호제 및 삼투압 조절제 중 적어도 1개를 포함할 수 있다.
pH 완충제 용액은 트리스(하이드록시메틸)아미노메탄 염화수소산염 완충제 용액(pH 7.5 ~ 8.5) 및/또는 인산염 완충제 용액(pH 5.5 ~ 8.5), 바람직하게 인산염 완충제 용액(pH 5.5 ~ 8.5)일 수 있다.
보호제는 이노시톨, 솔비톨, 수크로스, 트레할로스, 만노스, 말토스, 락토스 및 글루코스 중 적어도 1개일 수 있다. 보호제의 함량은 본 약학 조성물의 총 중량을 기준으로 0.01 wt% ~ 30 wt%일 수 있다.
삼투압 조절제는 염화나트륨 및/또는 염화칼륨일 수 있다. 삼투압 조절제의 함량은 약학 조성물의 삼투압을 200 milliosmol/kg(mOsm/kg) ~ 700 milliosmol/kg(mOsm/kg)으로 만들 수 있다. 원하는 삼투압에 따라서, 당 업자들은 삼투압 조절제의 함량을 용이하게 결정할 수 있다.
몇몇 구현예에서, 본 약학 조성물은 액체 제형, 예컨대 주사 용액; 또는 투여시 액체 부형제와 혼합되어 액체 제형을 형성하는 주사용 동결건조 분말일 수 있다. 액체 제형은 피하, 근육내 또는 정맥내 주사 경로로 투여될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며, 스프레이에 의해 폐내 투여될 수 있거나, 또는 스프레이로 폐를 통해 다른 장기(예컨대 간)에 투여될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 몇몇 구현예에서, 본 약학 조성물은 정맥내 주사에 의해 투여된다.
몇몇 구현예에서, 본 약학 조성물은 리포좀 제형의 형태를 가질 수 있다. 몇몇 구현예에서, 리포좀 제형에 사용된 약학적으로 허용 가능한 담체는 아민 함유 형질감염 화합물(이하 유기 아민이라고도 지칭됨), 헬퍼 지질(helper lipid) 및/또는 페그화(pegylated) 지질을 포함한다. 유기 아민, 헬퍼 지질 및 페그화 지질은 각각 (본원에 전체로서 참고문헌으로 첨부된) CN103380113A에 기재된 바와 같은 아민 함유 형질감염 화합물, 이의 약학적으로 허용 가능한 염 또는 유도체, 헬퍼 지질 및 페그화 지질 중 1개 이상으로부터 선택될 수 있다.
몇몇 구현예에서, 유기 아민은 CN103380113A에 기재된 바와 같은 하기 화학식 201, 즉
화학식 201
Figure pct00011
로 표시되는 바와 같은 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염일 수 있으며, 단 여기서 X101 또는 X102는 O, S, N-A 또는 C-A 로부터 독립적으로 선택되되, A는 수소 또는 C1 ~ C20 탄화수소 사슬이고;
Y101 또는 Z101은 C=O, C=S, S=O, CH-OH 또는 SO2로부터 독립적으로 선택되고;
R101, R102, R103, R104, R105, R106 또는 R107은 수소; 사이클릭 또는 지방족, 치환 또는 비치환, 분지형 또는 선형 지방족기; 사이클릭 또는 지방족, 치환 또는 비치환, 분지형 또는 선형 헤테로지방족기; 치환 또는 비치환, 분지형 또는 선형 아실기; 치환 또는 비치환, 분지형 또는 선형 아릴기; 또는 치환 또는 비치환, 분지형 또는 선형 헤테로아릴기로부터 독립적으로 선택되고;
x는 1 ~ 10의 정수이고;
n은 1 ~ 3의 정수이고, m은 0 ~ 20의 정수이고, p는 0 또는 1이되, 만일 m과 p가 둘 다 0이면, R102는 수소이고;
만일 n 또는 m 중 적어도 1개가 2이면, 화학식 201의 R103 및 질소는 하기 화학식 202 또는 203, 즉
Figure pct00012
로 표시되는 바와 같은 구조를 형성하되, 단 g, e 또는 f는 독립적으로 1 ~ 6의 정수이고, "HCC"는 탄화수소 사슬을 나타내며, 각각의 *N은 화학식 201에 표시된 질소 원자를 나타낸다.
몇몇 구현예에서, R103은 폴리아민이다. 다른 구현예에서, R103은 케탈이다. 몇몇 구현예에서, 화학식 201 중 R101 및 R102는 각각 독립적으로 임의의 치환 또는 비치환, 분지형 또는 선형 알킬 또는 알케닐로서, 단 이 알킬 또는 알케닐은 탄소 원자를 3개 ~ 약 20개(예컨대 탄소 원자 8개 ~ 약 18개) 가지고, 이중 결합을 0개 ~ 4개(예컨대 이중 결합 0개 ~ 2개) 가진다.
몇몇 구현예에서, 만일 n 및 m이 각각 독립적으로 1 ~ 3이면, R103은 하기 화학식 204 ~ 213, 즉
Figure pct00013
Figure pct00014
중 임의의 것일 수 있되, 단 화학식 204 ~ 213에 있어 g, e 및 f는 각각 독립적으로 1 ~ 6의 정수이고, 각각의 "HCC"는 탄화수소 사슬을 나타내고, 각각의 *는 화학식 201의 질소 원자에 대한 R103의 잠재적 결합점을 나타내되, 임의의 * 위치에 있는 각각의 H는 대체되어, 화학식 201의 질소 원자에 대한 결합을 실현시킬 수 있다.
화학식 201로 표시되는 바와 같은 화합물은 CN103380113A에 기재된 바와 같이 제조될 수 있다.
몇몇 구현예에서, 유기 아민은 하기 화학식 214, 즉
화학식 214
Figure pct00015
로 표시되는 바와 같은 유기 아민 및/또는 하기 화학식 215, 즉
화학식 215
Figure pct00016
로 표시되는 바와 같은 유기 아민일 수 있다.
헬퍼 지질은 콜레스테롤, 콜레스테롤 유사체 및/또는 콜레스테롤 유도체이다.
페그화 지질은 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스파티딜에탄올아민-N-[메톡시(폴리에틸렌글리콜)]-2000이다.
몇몇 구현예에서, 약학 조성물 중 유기 아민, 헬퍼 지질 및 페그화 지질 사이의 몰비는 (19.7 ~ 80) : (19.7 ~ 80) : (0.3 ~ 50)이고, 예를 들어 이 몰비는 (50 ~ 70) : (20 ~ 40) : (3 ~ 20)일 수 있다.
몇몇 구현예에서, 본 발명의 siRNA와 상기 아민 함유 형질감염 제제에 의해 생성된 약학 조성물은 평균 직경이 약 30 nm ~ 약 200 nm, 통상 약 40 nm ~ 약 135 nm이고, 더욱 통상적으로 리포좀 입자의 평균 직경은 약 50 nm ~ 약 120 nm, 약 50 nm ~ 약 100 nm, 약 60 nm ~ 약 90 nm 또는 약 70 nm ~ 약 90 nm이고, 예를 들어 리포좀 입자의 평균 직경은 약 30 nm, 약 40 nm, 약 50 nm, 약 60 nm, 약 70 nm, 약 75 nm, 약 80 nm, 약 85 nm, 약 90 nm, 약 100 nm, 약 110 nm, 약 120 nm, 약 130 nm, 약 140 nm, 약 150 nm 또는 160 nm이다.
몇몇 구현예에서, 본 발명의 siRNA와 상기 아민 함유 형질감염 제제에 의해 생성된 약학 조성물에 있어, siRNA 대 총 지질(예컨대 유기 아민, 헬퍼 지질 및/또는 페그화 지질)의 중량비(중량/중량 비)는 약 1 : 1 ~ 약 1: 50, 약 1 : 1 ~ 약 1: 30, 약 1 : 3 ~ 약 1 : 20, 약 1 : 4 ~ 약 1 : 18, 약 1 : 5 ~ 약 1 : 17, 약 1 : 5 ~ 약 1 : 15, 약 1 : 5 ~ 약 1 : 12, 약 1 : 6 ~ 약 1 : 12 또는 약 1 : 6 ~ 약 1 : 10이다. 예를 들어 본 발명의 siRNA 대 총 지질의 비는 중량 기준 약 1 : 5, 약 1 : 6, 약 1 : 7, 약 1 : 8, 약 1 : 9, 약 1 : 10, 약 1 : 11, 약 1 : 12, 약 1 : 13, 약 1 : 14, 약 1 : 15, 약 1 : 16, 약 1 : 17 또는 약 1 : 18이다.
몇몇 구현예에서, 본 약학 조성물은 각각의 성분 별도로 시판될 수 있고, 액체 제형의 형태로 사용될 수 있다. 몇몇 구현예에서, 본 발명의 siRNA와 상기 약학적으로 허용 가능한 담체에 의해 생성된 약학 조성물은 기존의 siRNA를 본 발명의 siRNA로 대체하는 방법을 제외하고 공지된 다양한 방법에 의해 제조될 수 있다. 몇몇 구현예에서, 본 약학 조성물은 이하 과정에 따라서 제조될 수 있다.
유기 아민, 헬퍼 지질 및 페그화 지질은 알코올 중에 상기 기재된 바와 같은 몰비로 현탁된 다음, 균질하게 혼합되며, 그 결과 지질 용액이 수득되고; 알코올은, 생성된 지질 용액이 총 질량 농도 2 mg/mL ~ 25 mg/mL, 예컨대 8 mg/mL ~ 18 mg/mL이 되도록 만드는 양만큼 사용된다. 알코올은 약학적으로 허용 가능한 알코올, 예컨대 실온에서 액체 형태를 가지는 알코올, 예컨대 에탄올, 프로필렌글리콜, 벤질알코올, 글리세롤, PEG 200, PEG 300 및 PEG 400 중 1개 이상, 예를 들어 에탄올이다.
본 발명에 의해 제공된 siRNA는 완충 염 용액 중에 용해되고 그 결과 siRNA의 수용액이 제조된다. 완충 염 용액의 농도는 0.05 M ~ 0.5 M, 예컨대 0.1 M ~ 0.2 M이다. 완충 염 용액의 pH는 4.0 ~ 5.5, 예컨대 5.0 ~ 5.2로 조정된다. 완충 염 용액은, siRNA가 0.6 mg/ml 미만, 예컨대 0.2 mg/ml ~ 0.4 mg/ml의 농도로 존재하도록 만드는 양만큼 사용된다. 완충 염은 가용성 아세트산염 및 가용성 시트르산염으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1개 이상, 예컨대 아세트산나트륨 및/또는 아세트산칼륨일 수 있다.
siRNA의 수용액과 지질 용액은 혼합된다. 혼합 후 수득된 생성물은 40℃ ~ 60℃의 온도에서 적어도 2분(예컨대 5분 ~ 30분) 동안 항온처리되고, 그 결과 항온 처리된 지질 제형이 생성된다. 지질 용액 대 siRNA의 수용액의 부피비는 1 : (2 ~ 5)이다.
항온 처리된 리포좀 제형은 농축 또는 희석되고, 불순물을 제거하기 위해 정제된 다음, 멸균됨으로써, 물리화학적 매개변수가 pH 6.5 ~ 8, 캡슐화 백분율 80% 초과, 입도 40 nm ~ 200 nm, 다분산 지수 0.30 미만, 그리고 삼투압 250 mOsm/kg ~ 400 mOsm/kg와 같은 본 발명에 의해 제공되는 약학 조성물이 수득되는데; 이때 물리화학적 매개변수의 예를 들자면 pH 7.2 ~ 7.6, 캡슐화 백분율 90% 초과, 입도 60 nm ~ 100 nm, 다분산 지수 0.20 미만, 그리고 삼투압 300 mOsm/kg ~ 400 mOsm/kg와 같을 수 있다.
농축 또는 희석 단계는 불순물 제거 단계 이전, 이후 또는 불순물 제거 단계와 동시에 수행될 수 있다. 불순물을 제거하기 위한 방법은 현존하는 다양한 방법들 중 임의의 방법, 예를 들어 한외여과 교환 용액 및 접선 유동 시스템으로서 속이 빈 100 KDa 섬유 컬럼 및 인산염 완충제 용액(PBS)(pH 7.4)이 사용되는 한외여과일 수 있다. 멸균을 위한 방법은 현존하는 다양한 방법들 중 임의의 방법, 예컨대 0.22 μm 필터상 여과 멸균법일 수 있다.
siRNA 컨쥬게이트
본 발명은 상기 siRNA와, 이 siRNA에 공액결합된 공액기를 포함하는 siRNA 컨쥬게이트를 제공한다.
공액기는, 통상 적어도 1개의 약학적으로 허용 가능한 표적화기와 선택적 링커를 포함한다. 더욱이, siRNA, 링커 및 표적화기는 일렬로 결합한다. 몇몇 구현예에서, 표적화기는 1개 ~ 6개 존재한다. 몇몇 구현예에서, 표적화기는 2개 ~ 4개 존재한다. siRNA 분자는 비공유적으로나 공유적으로 공액기에 공액결합할 수 있는데, 예컨대 siRNA 분자는 공액기에 공유적으로 공액결합할 수 있다. siRNA와 공액기 사이의 공액결합 부위는 siRNA의 센스 가닥 3'-말단 또는 5'-말단에 존재할 수 있거나, 또는 안티센스 가닥의 5'-말단에 존재할 수 있거나, 또는 siRNA의 내부 서열 안에 존재할 수 있다. 몇몇 구현예에서, siRNA와 공액기 사이의 공액결합 부위는 siRNA의 센스 가닥 3'-말단에 존재한다.
몇몇 구현예에서, 공액기는 뉴클레오티드의 인산염기, 2'-하이드록시 또는 염기에 결합한다. 몇몇 구현예에서, 뉴클레오티드들이 2'-5'-포스포디에스테르 결합을 통해 결합할 때, 공액기는 3'-하이드록시에 결합할 수 있다. 공액기가 siRNA의 말단에 결합할 때, 공액기는 통상 뉴클레오티드의 인산염기에 결합하고; 이 공액기가 siRNA의 내부 서열에 결합할 때, 공액기는 통상 리보스 고리 또는 염기에 결합한다. 특정 결합 모드에 대해서는 문헌["siRNA conjugates carrying sequentially assembled trivalent N-acetylgalactosamine linked through nucleosides elicit robust gene silencing in vivo in hepatocytes."ACS Chemical biology, 2015,10(5):1181-7, Muthiah Manoharan et.al]이 참조될 수 있다.
몇몇 구현예에서, siRNA와 공액기는 산에 불안정하거나 환원가능한 화학 결합에 의해 결합할 수 있고, 이러한 화학 결합은 세포 엔도좀의 산성 환경하에 분해될 수 있어서, siRNA가 자유의 상태로 존재할 수 있도록 만든다. 분해될 수 없는 공액결합 모드일 경우, 공액기는 siRNA의 센스 가닥에 결합할 수 있으며, 이로써 siRNA 활성에 대한 공액결합의 효과는 최소화된다.
몇몇 구현예에서, 약학적으로 허용 가능한 표적화기는 siRNA 투여 분야에 통상 사용되는 리간드, 예를 들어 본원에 전체로서 참고문헌으로 첨부된 WO2009082607A2에 기재된 바와 같은 다양한 리간드일 수 있다.
몇몇 구현예에서, 약학적으로 허용 가능한 표적화기는 하기 표적화 분자 또는 이의 유도체, 즉 친지성 분자, 예컨대 콜레스테롤, 담즙산, 비타민(예컨대 비타민 E), 사슬의 길이가 상이한 지질 분자; 중합체, 예컨대 폴리에틸렌글리콜; 폴리펩티드, 예컨대 세포 투과성 펩티드; 앱타머; 항체; 양자점; 당체, 예컨대 락토스, 폴리락토스, 만노스, 갈락토스 및 N-아세틸갈락토사민(GalNAc); 엽산염; 그리고 간 실질 세포에서 발현되는 수용체 리간드, 예컨대 아시알로당단백질, 아시알로-당 잔기, 리포단백질(예컨대 고밀도 리포단백질, 저밀도 리포단백질), 글루카곤, 신경전달물질(예컨대 아드레날린), 성장 인자 및 트랜스페린 등에 의해 생성된 리간드 1개 이상으로부터 선택될 수 있다.
몇몇 구현예에서, 리간드들은 각각 독립적으로 세포 표면 수용체에 결합할 수 있는 리간드이다. 몇몇 구현예에서, 적어도 1개의 리간드는 간세포 표면 수용체에 결합할 수 있는 리간드이다. 몇몇 구현예에서, 적어도 1개의 리간드는 포유동물 세포 표면 수용체에 결합할 수 있는 리간드이다. 몇몇 구현예에서, 적어도 1개의 리간드는 인간 세포 표면 수용체에 결합할 수 있는 리간드이다. 몇몇 구현예에서, 적어도 1개의 리간드는 간 표면상 아시알로당단백질 수용체(ASGPR)에 결합할 수 있는 리간드이다. 이러한 리간드류들은 당 업자들에게 널리 공지되어 있고, 통상 표적 세포 표면상 특정 수용체와 결합하는 기능을 수행함으로써, 리간드에 결합한 siRNA가 표적 세포에 전달되는 것을 매개한다.
몇몇 구현예에서, 약학적으로 허용 가능한 표적화기는 포유동물 간세포 표면상 아시알로당단백질 수용체(ASGPR)에 결합하는 임의의 리간드일 수 있다. 일 구현예에서, 리간드들은 각각 독립적으로 아시알로당단백질, 예컨대 아시알로오로소무코이드(ASOR) 또는 아시알로페투인(ASF)이다. 몇몇 구현예에서, 리간드는 당체 또는 당체의 유도체이다.
몇몇 구현예에서, 적어도 1개의 리간드는 당체이다. 몇몇 구현예에서 각각의 리간드는 당체이다. 몇몇 구현예에서, 적어도 1개의 리간드는 단당체, 다당체, 변형 단당체, 변형 다당체 또는 당체의 유도체이다. 몇몇 구현예에서, 적어도 1개의 리간드는 단당체, 이당체 또는 삼당체일 수 있다. 몇몇 구현예에서, 적어도 1개의 리간드는 변형 당체이다. 몇몇 구현예에서, 리간드는 변형 당체이다. 몇몇 구현예에서, 각각의 리간드는 다당체, 변형 다당체, 단당체, 변형 단당체, 다당체의 유도체 또는 단당체의 유도체로 이루어진 군으로부터 각각 독립적으로 선택된다. 몇몇 구현예에서, 각각의 리간드 또는 적어도 1개의 리간드는 하기 당체들, 즉 글루코스 및 이의 유도체, 만노스 및 이의 유도체, 갈락토스 및 이의 유도체, 자일로스 및 이의 유도체, 리보스 및 이의 유도체, 푸코스 및 이의 유도체, 락토스 및 이의 유도체, 말토스 및 이의 유도체, 아라비노스 및 이의 유도체, 프럭토스 및 이의 유도체, 그리고 시알산으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
몇몇 구현예에서, 리간드는 D-만노피라노스, L-만노피라노스, D-아라비노스, D-자일로푸라노스, L-자일로푸라노스, D-글루코스, L-글루코스, D-갈락토스, L-갈락토스, α-D-만노푸라노스, β-D-만노푸라노스, α-D-만노피라노스, β-D-만노피라노스, α-D-글루코피라노스, β-D-글루코피라노스, α-D-글루코푸라노스, β-D-글루코푸라노스, α-D-프럭토푸라노스, α-D-프럭토피라노스, α-D-갈락토피라노스, β-D-갈락토피라노스, α-D-갈락토푸라노스, β-D-갈락토푸라노스, 글루코사민, 시알산, 갈락토사민, N-아세틸갈락토사민, N-트리플루오로아세틸갈락토사민, N-프로피오닐갈락토사민, N-n-부티릴갈락토사민, N-이소부티릴갈락토사민, 2-아미노-3-O-[(R)-1-카복시에틸]-2-데옥시-β-D-글루코피라노스, 2-데옥시-2-메틸아미노-L-글루코피라노스, 4,6-다이데옥시-4-포름아미도-2,3-디-O-메틸-D-만노피라노스, 2-데옥시-2-설포아미노-D-글루코피라노스, N-글리콜일-α-뉴라민산, 5-티오-β-D-글루코푸라노스, 메틸 2,3,4-트리스-O-아세틸-1-티오-6-0-트리틸-α-D-글루코푸라노스, 4-티오-β-D-갈락토피라노스, 에틸 3,4,6,7-테트라-O-아세틸-2-데옥시-1,5-디티오-a-D-글루코헵토피라노시드, 2,5-언하이드로-D-알로노니트릴, 리보스, D-리보스, D-4-티오리보스, L-리보스 또는 L-4-티오리보스 중 하나로부터 각각 독립적으로 선택될 수 있다. 기타 리간드 선택은, 예컨대 본원에 전체로서 참고문헌으로 첨부된 CN105378082A의 개시내용에서 확인될 수 있다.
몇몇 구현예에서, siRNA 컨쥬게이트 내 약학적으로 허용 가능한 표적화기는 갈락토스 또는 N-아세틸갈락토사민일 수 있는데, 단 이 갈락토스 또는 N-아세틸갈락토사민 분자는 1가, 2가, 3가 및 4가일 수 있다. 본원에 기재된 1가, 2가, 3가 및 4가라는 용어는 각각 siRNA 컨쥬게이트 내 siRNA 분자 대 갈락토스 또는 N-아세틸갈락토사민 분자의 몰비는 1 : 1, 1 : 2, 1 : 3 또는 1 : 4이되, 이 siRNA 컨쥬게이트는 siRNA 분자, 및 표적화기로서 갈락토스 또는 N-아세틸갈락토사민을 함유하는 공액기로 제조됨이 이해되어야 할 것이다. 몇몇 구현예에서, 약학적으로 허용 가능한 표적화기는 N-아세틸갈락토사민이다. 몇몇 구현예에서, 본 발명의 siRNA가 N-아세틸갈락토사민을 포함하는 공액기에 공액결합할 때, 이 N-아세틸갈락토사민 분자는 3가 또는 4가이다. 몇몇 구현예에서, 본 발명의 siRNA가 N-아세틸갈락토사민을 함유하는 공액기에 공액결합할 때, N-아세틸갈락토사민 분자는 3가이다.
표적화기는 적절한 링커를 통해 siRNA 분자에 결합할 수 있으며, 적절한 링커는 표적화기의 특정 유형에 따라서 당 업자에 의해 선택될 수 있다. 이러한 링커와 표적화기의 유형, 그리고 siRNA와의 결합 모드는 본원에 전체로서 참고문헌으로 첨부된 WO2015006740A2의 개시내용에서 발견될 수 있다.
몇몇 구현예에서, 표적화기가 N-아세틸갈락토사민일 때, 적절한 링커는 하기 화학식 301, 즉
화학식 301
Figure pct00017
로 표시되는 바와 같은 구조를 가질 수 있되,
단 여기서
k는 1 ~ 3의 정수이고;
LA는 하기 화학식 302, 즉
화학식 302
Figure pct00018
로 표시되는 바와 같은 구조를 가지는 아미드 결합 포함 사슬기이고, 각각의 LA는 각각 표적화기에 결합하고, LC기는 자체의 말단 2개에 에테르 결합을 통해 결합하고;
LB는 하기 화학식 303, 즉
화학식 303
Figure pct00019
로 표시되는 바와 같은 구조를 가지는 N-아실피롤리딘 포함 사슬기이되, 사슬기는 자체의 한쪽 말단에 카보닐기를 가지고, 아미드 결합을 통해 LC기에 결합하고, 자체의 다른 쪽 말단에는 옥시기를 가지며, 포스포에스테르 결합을 통해 siRNA에 결합하고;
LC는 하이드록시메틸아미노메탄, 디하이드록시메틸아미노메탄 또는 트리하이드록시메틸아미노메탄을 기반으로 하였을 때 4가 결합기에 대해 2가이되, 이 LC는 산소 원자를 통하여 에테르 결합에 의해 LA기 각각에 결합하고, 질소 원자를 통해 아미드 결합에 의해 LB기에 결합한다.
몇몇 구현예에서, n이 3이고, LC가 트리하이드록시메틸아미노메탄을 기반으로 하였을 때 4가 결합기이면, 링커 -(LA)3-트리하이드록시메틸아미노메탄-LB-을 통하여 N-아세틸갈락토사민 분자와 siRNA 분자를 결합시켜 생성된 siRNA 컨쥬게이트는 하기 화학식 304, 즉
화학식 304
Figure pct00020
로 표시되는 바와 같은 구조를 가지되, 단 여기서 이중 나선 구조는 siRNA를 나타낸다.
마찬가지로, siRNA와 공액기 사이의 공액결합 부위는 siRNA의 센스 가닥 3'-말단 또는 5'-말단, 또는 안티센스 가닥의 5'-말단에 존재할 수 있거나, 또는 siRNA의 내부 서열 내에 존재할 수 있다.
몇몇 구현예에서, 본 발명의 siRNA의 센스 가닥 3'-말단은 링커 -(LA)3-트리하이드록시메틸아미노메탄-LB-을 통해 N-아세틸갈락토사민(GalNAc) 분자 3개에 공유적으로 공액결합하고, 그 결과 siRNA 분자 대 GaINAc 분자의 몰비가 1 : 3인 siRNA 컨쥬게이트가 수득되는데, 이 siRNA 컨쥬게이트는 또한 이하에서 (GaINAc)3-siRNA)로 지칭될 수 있고, siRNA 컨쥬게이트는 하기 화학식 305, 즉
화학식 305
Figure pct00021
로 표시되는 바와 같은 구조를 가지되, 단 여기서 이중 나선 구조는 siRNA를 나타내고; 링커는 siRNA의 센스 가닥 3'-말단에 결합한다.
몇몇 구현예에서, 표적화기가 N-아세틸갈락토사민일 때, 적절한 링커는 하기 화학식 306, 즉
화학식 306
Figure pct00022
로 표시되는 바와 같은 구조를 가질 수 있되,
단 여기서
l은 0 ~ 3의 정수이고;
*는 링커상 에테르 결합을 통해 표적화기에 결합한 부위를 나타내고;
#는 링커상 포스포에스테르 결합을 통해 siRNA에 결합한 부위를 나타낸다.
몇몇 구현예에서, l이 2일 때, siRNA 컨쥬게이트는 하기 화학식 307, 즉
화학식 307
Figure pct00023
로 표시되는 바와 같은 구조를 가지되,
단, 이중 나선체 구조는 siRNA를 나타내고; 링커는 siRNA의 센스 가닥 3'-말단에 결합한다.
상기 컨쥬게이트는 선행 기술에 상세히 기재된 방법에 따라서 합성될 수 있다. 예를 들어 WO 2015006740A2에는 다양한 컨쥬게이트를 제조하는 방법이 상세히 기재되어 있다. 본 발명의 siRNA 컨쥬게이트는 당 업자들에게 널리 공지된 방법에 의해 수득될 수 있다. 또 다른 예로서, WO 2014025805A1에는 화학식 305로 표시되는 바와 같은 구조를 가지는 컨쥬게이트를 제조하는 방법이 기재되어 있다. Rajeev외 다수의 문헌에는 문헌[ChemBioChem 2015, 16, 903-908]의 화학식 307로 표시되는 바와 같은 구조를 가지는 컨쥬게이트를 제조하는 방법이 기재되어 있다.
몇몇 구현예에서, siRNA 컨쥬게이트는 하기 화학식 308, 즉
화학식 308
Figure pct00024
로 표시되는 바와 같은 구조를 가지되,
단 여기서
n1은 1 ~ 3의 정수이고, n3은 0 ~ 4의 정수이고;
m1, m2 및 m3은 각각 독립적으로 2 ~ 10의 정수이고;
R10, R11, R12, R13, R14 또는 R15는 각각 독립적으로 H이거나, C1 ~ C10 알킬, C1 ~ C10 할로알킬 및 C1 ~ C10 알콕시로 이루어진 군으로부터 선택되고;
R3은 하기 화학식 A59, 즉
화학식 A59
Figure pct00025
로 표시되는 바와 같은 구조를 가지는 기이되,
단 여기서
E1은 OH, SH 또는 BH2이고, Nu는 본 발명의 siRNA이고;
R2는 길이가 탄소 원자 1개 ~ 20개인 선형 알킬렌으로서, 탄소 원자 1개 이상은 C(O), NH, O, S, CH=N, S(O)2, C2 ~ C10 알케닐렌, C2 ~ C10 알키닐렌, C6 ~ C10 아릴렌, C3 ~ C18 헤테로사이클릴렌 및 C5 ~ C10 헤테로아릴렌으로 이루어진 군의 임의의 것 1개 이상으로 선택적으로 대체되되, R2는 C1 ~ C10 알킬, C6 ~ C10 아릴, C5 ~ C10 헤테로아릴, C1 ~ C10 할로알킬, -OC1 ~ C10 알킬, -OC1 ~ C10 알킬페닐, -C1 ~ C10 알킬-OH, -OC1 ~ C10 할로알킬, -SC1 ~ C10 알킬, -SC1 ~ C10 알킬페닐, -C1 ~ C10 알킬-SH, -SC1 ~ C10 할로알킬, 할로 치환기, -OH, -SH, -NH2, -C1 ~ C10 알킬-NH2, -N(C1 ~ C10 알킬)(C1 ~ C10 알킬), -NH(C1 ~ C10 알킬), -N(C1 ~ C10 알킬)(C1 ~ C10 알킬페닐), -NH(C1 ~ C10 알킬페닐), 시아노, 니트로, -CO2H, -C(O)O(C1 ~ C10 알킬), -CON(C1 ~ C10 알킬)(C1 ~ C10 알킬), -CONH(C1 ~ C10 알킬), -CONH2, -NHC(O)(C1 ~ C10 알킬), -NHC(O)(페닐), -N(C1 ~ C10 알킬)C(O)(C1 ~ C10 알킬), -N(C1 ~ C10 알킬)C(O)(페닐), -C(O)C1 ~ C10 알킬, -C(O)C1 ~ C10 알킬페닐, -C(O)C1 ~ C10 할로알킬, -OC(O)C1 ~ C10 알킬, -SO2(C1 ~ C10 알킬), -SO2(페닐), -SO2(C1 ~ C10 할로알킬), -SO2NH2, -SO2NH(C1 ~ C10 알킬), -SO2NH(페닐), -NHSO2(C1 ~ C10 알킬), -NHSO2(페닐) 및 -NHSO2(C1 ~ C10 할로알킬)로 이루어진 군의 임의의 것 1개 이상으로 선택적으로 치환되고;
L1은 각각 독립적으로 길이가 1개 ~ 70개 탄소 원자인 선형 알킬렌이되, 탄소 원자 1개 이상은 C(O), NH, O, S, CH=N, S(O)2, C2 ~ C10 알케닐렌, C2 ~ C10 알키닐렌, C6 ~ C10 아릴렌, C3 ~ C18 헤테로사이클릴렌 및 C5 ~ C10 헤테로아릴렌으로 이루어진 군의 임의의 것 1개 이상으로 선택적으로 대체되고; L1은 C1 ~ C10 알킬, C6 ~ C10 아릴, C5 ~ C10 헤테로아릴, C1 ~ C10 할로알킬, -OC1 ~ C10 알킬, -OC1 ~ C10 알킬페닐, -C1 ~ C10 알킬-OH, -OC1 ~ C10 할로알킬, -SC1 ~ C10 알킬, -SC1 ~ C10 알킬페닐, -C1 ~ C10 알킬-SH, -SC1 ~ C10 할로알킬, 할로 치환기, -OH, -SH, -NH2, -C1 ~ C10 알킬-NH2, -N(C1 ~ C10 알킬)(C1 ~ C10 알킬), -NH(C1 ~ C10 알킬), -N(C1 ~ C10 알킬)(C1 ~ C10 알킬페닐), -NH(C1 ~ C10 알킬페닐), 시아노, 니트로, -CO2H, -C(O)O(C1 ~ C10 알킬), -CON(C1 ~ C10 알킬)(C1 ~ C10 알킬), -CONH(C1 ~ C10 알킬), -CONH2, -NHC(O)(C1 ~ C10 알킬), -NHC(O)(페닐), -N(C1 ~ C10 알킬)C(O)(C1 ~ C10 알킬), -N(C1 ~ C10 알킬)C(O)(페닐), -C(O)C1 ~ C10 알킬, -C(O)C1 ~ C10 알킬페닐, -C(O)C1 ~ C10 할로알킬, -OC(O)C1 ~ C10 알킬, -SO2(C1 ~ C10 알킬), -SO2(페닐), -SO2(C1 ~ C10 할로알킬), -SO2NH2, -SO2NH(C1 ~ C10 알킬), -SO2NH(페닐), -NHSO2(C1 ~ C10 알킬), -NHSO2(페닐) 및 -NHSO2(C1 ~ C10 할로알킬)로 이루어진 군의 임의의 것 1개 이상으로 선택적으로 치환된다.
몇몇 구현예에서, L1은 하기 화학식 A1 ~ A26, 즉
Figure pct00026
Figure pct00027
의 기 및 이의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있는데, 화학식 A1 ~ A26의 구조 및 정의는 상기와 같으며, 여기서 j1은 각각 독립적으로 1 ~ 20의 정수이고; j2는 각각 독립적으로 1 ~ 20의 정수이고; R'는 각각 독립적으로 C1 ~ C10 알킬이고; Ra는 하기 화학식 A27 ~ A45, 즉
Figure pct00028
Figure pct00029
의 기 및 이의 임의의 결합 조합체(connection combination)로 이루어진 군으로부터 각각 독립적으로 선택되되, Rb는 각각 독립적으로 C1 ~ C10 알킬이고;
Figure pct00030
는 기가 공유 결합하는 부위를 나타낸다.
L1은 편의상 선형 알킬렌으로 정의되지만, 상기 대체 및/또는 치환에 의해 생성된 아민 또는 알케닐과 같이 선형 기이거나 달리 명명될 수 없음을 당 업자는 이해할 것이다. 본 발명을 위해서, L1의 길이는 결합점 2개를 연결하는 사슬내 원자의 수이다. 이를 위해서, 선형 알킬렌의 탄소 원자를 대체함으로써 수득된 고리, 예컨대 헤테로사이클릴렌 또는 헤테로아릴렌은 하나의 원자로서 계수된다.
M1은 정의 및 선택사항이 전술된 것들과 동일한 표적화기를 나타낸다. 몇몇 구현예에서, M1은 포유동물 간세포 표면상 아시알로당단백질 수용체에 대해 친화성을 가지는 리간드 중 하나로부터 각각 독립적으로 선택된다.
M1이 포유동물 간세포 표면상 아시알로당단백질 수용체에 대해 친화성을 가지는 리간드일 때, 몇몇 구현예에서 siRNA 컨쥬게이트 내 M1 표적화기의 수가 적어도 2가 될 수 있도록 보장하기 위해서, n1은 1 ~ 3의 정수일 수 있고, n3은 0 ~ 4의 정수일 수 있다. 몇몇 구현예에서, 컨쥬게이트 내 M1 표적화기의 수가 적어도 3일 수 있도록 n1 + n3이 2 이상이면, M1 표적화기는 간세포 표면 상 아시알로당단백질 수용체에 더욱 편리하게 결합하는 것이 허용되고, 이로 말미암아 siRNA 컨쥬게이트가 내포작용에 의해 세포내에 들어가는 것이 촉진될 수 있다. 실험은, M1 표적화기의 수가 3보다 클 때, M1 표적화기가 간세포 표면 상 아시알로당단백질 수용체에 결합할 때의 용이함은 유의미하게 증가하지 않음을 보여주었다. 따라서, 다양한 양태, 예컨대 합성의 편리함, 구조/공정 비용 및 전달의 효율성에 비추어 볼 때, 몇몇 구현예에서 n1은 1 ~ 2의 정수이고, n3은 0 ~ 1의 정수이고, n1 + n3은 2 ~ 3이다.
몇몇 구현예에서, m1, m2 또는 m3가 각각 독립적으로 2 ~ 10의 정수로부터 선택될 때, M1 표적화기와 간세포 상 아시알로당단백질 수용체의 결합을 위해서 다수의 M1 표적화기들 간 입체 상호 자리(steric mutual position)는 딱 맞아떨어질 수 있다. 본 발명의 siRNA 컨쥬게이트를 더 간단한 구조를 가지도록 만들고, 더 용이한 합성을 가능하게 하며/가능하게 하거나 비용을 감소시키기 위해, 몇몇 구현예에서 m1, m2 또는 m3은 독립적으로 2 ~ 5의 정수이고, 몇몇 구현예에서, m1과 m2와 m3는 동일하다.
당 업자는, R10, R11, R12, R13, R14 또는 R15가 각각 독립적으로 H, C1~ C10 알킬, C1~ C10 할로알킬 및 C1~ C10 알콕시 중 1개로부터 선택되면, 이것들은 본 발명의 siRNA 컨쥬게이트의 특성을 변경하지 않을 것이고, 모두 본 발명의 목적을 달성할 수 있음을 이해할 것이다. 몇몇 구현예에서, R10, R11, R12, R13, R14 또는 R15는 H, 메틸 또는 에틸로부터 각각 독립적으로 선택된다. 몇몇 구현예에서, R10, R11, R12, R13, R14 및 R15는 모두 H이다.
R3은 화학식 A59로 표시되는 바와 같은 구조를 가지는 기로서, E1은 OH, SH 또는 BH2이고, 출발 재료의 이용 가능성이 고려될 때, 몇몇 구현예에서, E1은 OH 또는 SH이다.
R2는 화학식 A59로 표시되는 바와 같은 기와, 질소 함유 주쇄 상 N 원자 사이의 결합이 달성되도록 선택된다. 본 발명의 내용에서, "질소 함유 주쇄(nitrogenous backbone)"란, R10, R11, R12, R13, R14 및 R15에 결합된 탄소 원자와 N 원자가 서로 결합되어 있는 사슬 구조를 지칭한다. 그러므로 R2는 화학식 A59로 표시되는 바와 같은 기를 적합한 수단에 의해 질소 함유 주쇄 상 N 원자에 결합시킬 수 있는 임의의 결합기일 수 있다. 몇몇 구현예에서, 화학식 308로 표시되는 바와 같은 본 발명의 siRNA 컨쥬게이트가 고상 합성 방법에 의해 제조되는 경우, R2 기는 질소 함유 주쇄 상 N 원자와 결합하는 부위와, R3 내 P 원자와 결합하는 부위 둘 다를 가져야만 한다. 몇몇 구현예에서, R2에 있어 질소 함유 주쇄 상 N 원자에 결합하는 부위는 N 원자와 아미드 결합을 형성하고, R3 내 P 원자와 결합하는 부위는 P 원자와 포스포에스테르 결합을 형성한다. 몇몇 구현예에서, R2는 하기 화학식 B5, 화학식 B6, 화학식 B5' 또는 화학식 B6', 즉
Figure pct00031
일 수 있되, 단
Figure pct00032
는 기가 공유 결합하는 부위를 나타낸다.
q2 값의 범위는 1~ 10의 정수일 수 있으며, 몇몇 구현예에서 q2는 1 ~ 5의 정수이다.
L1은 M1 표적화기를 질소 함유 주쇄 상 N 원자에 결합시켜, 화학식 308로 표시되는 바와 같은 siRNA 컨쥬게이트에 간 표적화 기능을 제공하는데 사용된다. 몇몇 구현예에서, L1은 화학식 A1 ~ A26로 표시되는 바와 같은 기 1개 이상의 결합 조합체들로부터 선택된다. 몇몇 구현예에서, L1은 화학식 A1, A4, A5, A6, A8, A10, A11 및 A13 중 1개 이상의 결합 조합체로부터 선택된다. 몇몇 구현예에서, L1은 화학식 A1, A4, A8, A10 및 A11 중 적어도 2개의 결합 조합체로부터 선택된다. 몇몇 구현예에서, L1은 화학식 A1, A8 및 A10 중 적어도 2개의 결합 조합체로부터 선택된다.
몇몇 구현예에서, L1의 길이는 3개 ~ 25개 원자, 3개 ~ 20개 원자, 4개 ~ 15개 원자 또는 5개 ~ 12개 원자일 수 있다. 몇몇 구현예에서, L1의 길이는 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 21개, 22개, 23개, 24개, 25개, 30개, 35개, 40개, 45개, 50개, 55개, 60개 원자이다.
몇몇 구현예에서, j1은 2 ~ 10의 정수이고, 몇몇 구현예에서, j1은 3 ~ 5의 정수이다. 몇몇 구현예에서, j2는 2 ~ 10의 정수이고, 몇몇 구현예에서, j2는 3 ~ 5의 정수이다. R'는 C1~ C4 알킬이고, 몇몇 구현예에서, R'는 메틸, 에틸 및 이소프로필 중 하나이다. Ra는 A27, A28, A29, A30 및 A31 중 하나이고, 몇몇 구현예에서, Ra는 A27 또는 A28이다. Rb는 C1~ C5 알킬이고, 몇몇 구현예에서, Rb는 메틸, 에틸, 이소프로필 및 부틸 중 하나이다. 몇몇 구현예에서, 화학식 A1 ~ A26의 j1, j2, R', Ra 및 Rb는 각각 질소 함유 주쇄 상 N 원자와 M1 표적화기 사이에 결합을 달성하고, M1 표적화기들 간 입체 상호 자리를, M1 표적화기가 간세포 표면상 아시알로당단백질 수용체와 결합하는데 더욱 적합하게 만들도록 선택된다.
몇몇 구현예에서, siRNA 컨쥬게이트는 하기 화학식 403, 404, 405, 406, 407, 408, 409, 410, 411, 412, 413, 414, 415, 416, 417, 418, 419, 420, 421 또는 422, 즉
Figure pct00033
Figure pct00034
Figure pct00035
Figure pct00036
Figure pct00037
Figure pct00038
Figure pct00039
Figure pct00040
로 표시되는 바와 같은 구조를 가진다.
몇몇 구현예에서, 화학식 A59의 P 원자는 siRNA 서열 내 결합 가능한 임의의 자리에 결합할 수 있는데, 예를 들어 화학식 A59의 P 원자는 siRNA의 센스 가닥 또는 안티센스 가닥의 임의의 뉴클레오티드에 결합할 수 있다. 몇몇 구현예에서, 화학식 A59의 P 원자는 siRNA의 센스 가닥의 임의의 뉴클레오티드에 결합한다. 몇몇 구현예에서, 화학식 A59의 P 원자는 siRNA의 센스 가닥 또는 안티센스 가닥의 말단에 결합한다. 몇몇 구현예에서, 화학식 A59의 P 원자는 siRNA의 센스 가닥의 말단에 결합한다. 말단이란, 센스 가닥 또는 안티센스 가닥의 한쪽 말단으로부터 계수하기 시작하여 바로 출현하는 뉴클레오티드 4개를 지칭한다. 몇몇 구현예에서, 화학식 A59의 P 원자는 siRNA의 센스 가닥 또는 안티센스 가닥 말단에 결합한다. 몇몇 구현예에서, 화학식 A59의 P 원자는 siRNA의 센스 가닥 3'-말단에 결합한다. 화학식 A59의 P 원자가 siRNA의 센스 가닥 내 상기 위치에 결합하는 경우, 화학식 308로 표시되는 바와 같은 siRNA 컨쥬게이트는 세포에 도입되어 그 가닥이 풀릴 때 siRNA의 별도 안티센스 가닥을 방출할 수 있고, 이로써 C5 mRNA가 단백질로 번역되는 것은 차단되고, 보체 단백질 C5 유전자 발현은 억제될 수 있다.
몇몇 구현예에서, 화학식 A59의 P 원자는 siRNA 내 뉴클레오티드의 결합 가능한 임의의 위치, 예컨대 5', 2' 또는 3' 위치, 또는 뉴클레오티드의 염기에 결합할 수 있다. 몇몇 구현예에서, 화학식 A59의 P 원자는 포스포디에스테르 결합을 형성함으로써 siRNA 내 뉴클레오티드 2', 3' 또는 5' 위치에 결합할 수 있다. 몇몇 구현예에서, 화학식 A59의 P 원자는 siRNA 센스 가닥의 3'-말단에 있는 뉴클레오티드 3'-하이드록시의 탈양자화에 의해 생성된 산소 원자에 결합하거나(이 때, 화학식 A59의 P 원자는 siRNA에 함유된 인산염기 내 P 원자로 간주될 수도 있음), 또는 화학식 A59의 P 원자는 siRNA 센스 가닥의 뉴클레오티드 2'-하이드록시의 수소 원자를 치환함으로써 뉴클레오티드에 결합하거나, 또는 화학식 A59의 P 원자는 siRNA 센스 가닥의 5'-말단에 있는 뉴클레오티드 5'-하이드록시의 수소를 치환함으로써 뉴클레오티드에 결합한다.
본 발명의 발명자들은 놀랍게도, 본 발명의 siRNA 컨쥬게이트가 혈장 중 안정성을 유의미하게 개선하고 오프-타겟 활성이 작을뿐 아니라, C5 mRNA에 대한 더 큰 침묵 활성을 보인다는 사실을 발견하였다. 몇몇 구현예에서, 본 발명의 siRNA는 표 1a ~ 1f에 보인 siRNA들 중 1개 일 수 있다. 이러한 siRNA를 함유하는 siRNA 컨쥬게이트는 C5 mRNA에 대한 더 큰 침묵 활성을 보인다.
표 1a
Figure pct00041
Figure pct00042
표 1b
Figure pct00043
Figure pct00044
Figure pct00045
표 1c
Figure pct00046
Figure pct00047
표 1d
Figure pct00048
Figure pct00049
Figure pct00050
표 1e
Figure pct00051
Figure pct00052
표 1f
Figure pct00053
Figure pct00054
본 발명의 siRNA 또는 siRNA 컨쥬게이트에서, 인접 뉴클레오티드들의 각각의 쌍은 포스포디에스테르 결합 또는 포스포로티오에이트 디에스테르 결합을 통해 결합된다. 포스포디에스테르 결합 또는 포스포로티오에이트 디에스테르 결합 내 비 가교 산소 원자 또는 황 원자는 음 하전되며, 하이드록시 또는 설프하이드릴의 형태로 존재할 수 있다. 더욱이, 하이드록시 또는 설프하이드릴 내 수소 이온은 부분적으로나 완전히 양이온으로 치환될 수 있다. 양이온은 임의의 양이온, 예컨대 금속 양이온, 암모늄 이온 NH4 + 또는 유기 암모늄 양이온일 수 있다. 몇몇 구현예에서, 가용성을 증가시키기 위해 양이온은 알칼리 금속 이온, 3차 아민에 의해 생성된 암모늄 양이온 및 4차 암모늄 양이온 중 1개 이상으로부터 선택된다. 알칼리 금속 이온은 K+ 및/또는 Na+일 수 있고, 3차 아민에 의해 생성된 양이온은 트리에틸아민에 의해 생성된 암모늄 이온 및/또는 N,N-디이소프로필에틸아민에 의해 생성된 암모늄 이온일 수 있다. 그러므로 본 발명의 siRNA 또는 siRNA 컨쥬게이트는 적어도 부분적으로 염의 형태로 존재할 수 있다. 일 구현예에서, 포스포디에스테르 결합 또는 포스포로티오에이트 디에스테르 결합 내 비 가교 산소 원자 또는 황 원자는 적어도 부분적으로 나트륨 이온과 결합하므로, 본 발명의 siRNA 또는 siRNA 컨쥬게이트는 나트륨 염의 형태로서 존재하거나, 적어도 부분적으로 나트륨 염의 형태로서 존재한다.
당 업자들은 변형 뉴클레오티드기가 대응하는 변형을 가지는 뉴클레오시드 단량체에 의해 본 발명의 siRNA에 도입될 수 있음을 명확하게 알고 있다. 대응하는 변형을 가지는 뉴클레오시드 단량체를 제조하기 위한 방법과, 변형 뉴클레오티드기를 siRNA에 도입하기 위한 방법은 당 업자들에게 널리 공지되어 있다. 변형 뉴클레오시드 단량체 모두는 시판될 수 있거나 공지된 방법에 의해 제조될 수 있다.
화학식 308로 표시되는 바와 같은 siRNA 컨쥬게이트의 제조
화학식 308로 표시되는 바와 같은 siRNA 컨쥬게이트는 임의의 적절한 합성 경로에 의해 제조될 수 있다.
몇몇 구현예에서, 화학식 308로 표시되는 바와 같은 siRNA 컨쥬게이트는 하기 방법에 의해 제조될 수 있다. 본 방법은 고상 포스포라미다이트 합성 조건하에 센스 가닥과 안티센스 가닥 내 서열 및 뉴클레오티드 유형에 따라 뉴클레오시드 단량체들을 3' → 5' 방향으로 순차 결합시키는 단계[이 단계에서, 각각의 뉴클레오시드 단량체를 결합시키는 단계는 탈보호, 커플링, 캡핑 및 산화 또는 가황(sulfurization)의 4단계 반응을 포함함]; siRNA의 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 단리하는 단계; 그리고 어닐링 단계를 포함하는데, 여기서 siRNA는 전술된 본 발명의 siRNA이다.
더욱이, 본 방법은 화학식 321로 표시되는 바와 같은 화합물을, 커플링 반응 조건과 커플링제의 존재하에 고상 지지체에 결합한 뉴클레오티드 서열 또는 뉴클레오시드 단량체와 접촉시켜, 화학식 321로 표시되는 바와 같은 화합물을, 커플링 반응을 통해 뉴클레오티드 서열에 결합시키는 단계를 추가로 포함한다. 이하, 화학식 321, 즉
화학식 321
Figure pct00055
로 표시되는 바와 같은 화합물은 또한 공액 분자라고 지칭되기도 하는데, 여기서 R4는 화학식 308로 표시되는 바와 같은 화합물 내 Nu로써 표시되는 siRNA와 결합할 수 있는 기이다. 몇몇 구현예에서, R4는 Nu로써 표시되는 siRNA에 공유 결합을 통해 결합할 수 있는 기이다. 몇몇 구현예에서, R4는 Nu로써 표시되는 siRNA의 임의의 작용기에, 반응에 의한 포스포디에스테르 결합을 통해 공액결합할 수 있는 기이고;
S1은 각각 독립적으로 활성 하이드록시 모두를 YCOO-기로 치환하여 생성된 기인 M1이되, Y는 메틸, 트리플루오로메틸, 디플루오로메틸, 모노플루오로메틸, 트리클로로메틸, 디클로로메틸, 모노클로로메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필, 페닐, 할로페닐 및 알킬페닐 중 하나로부터 각각 독립적으로 선택된다. 몇몇 구현예에서, Y는 메틸이다.
n1, n3, m1, m2, m3, R10, R11, R12, R13, R14, R15, L1 및 M1의 정의와 선택사양은 각각 전술된 바와 같다.
R4는 질소 함유 주쇄 상 N 원자와 결합을 달성하고, 화학식 308로 표시되는 바와 같은 siRNA 컨쥬게이트를 합성하는데 적합한 반응 부위를 제공하는 것으로부터 선택된다. 몇몇 구현예에서, R4는 R2 결합기 또는 보호된 R2 결합기를 포함하고, 반응을 통하여 siRNA와 함께, 화학식 A59로 표시되는 바와 같은 작용기를 형성할 수 있다.
몇몇 구현예에서, R4는 siRNA상의 기 또는 Nu로써 표시되는 뉴클레오시드 단량체와 반응하여, 포스파이트 에스테르를 형성할 수 있는 제1 작용기와, 하이드록시 또는 아미노와 공유 결합을 형성할 수 있는 제2 작용기를 포함하거나, 또는 공유 결합을 통해 결합하는 고상 지지체를 포함한다. 몇몇 구현예에서, 제1 작용기는 포스포라미다이트, 하이드록시 또는 보호된 하이드록시이다. 몇몇 구현예에서, 제2 작용기는 포스포라미다이트, 카복실 또는 카복실산염이다. 몇몇 구현예에서, 제2 작용기는 하이드록시 또는 아미노에 의해 형성되는 공유 결합을 통해 분자의 나머지에 결합된 고상 지지체이다. 몇몇 구현예에서, 고상 지지체는 포스포에스테르 결합, 카복실 에스테르 결합 또는 아미드 결합을 통해 결합된다. 몇몇 구현예에서, 고상 지지체는 수지이다.
몇몇 구현예에서, 제1 작용기는 하이드록시, -ORk 또는 하기 화학식 C3로 표시되는 바와 같은 기를 포함하고; 제2 작용기는 하기 화학식 C1, C2, C3, C1' 또는 C3', 즉
Figure pct00056
로 표시되는 바와 같은 기를 포함하되, 단 q1은 1 ~ 4의 정수이고, X는 O 또는 NH이고, M+는 양이온이고, Rk는 하이드록시 보호기이고, SPS는 고상 지지체를 나타내고,
Figure pct00057
는 어떤 기가 공유 결합하는 부위를 나타낸다.
몇몇 구현예에서, 제1 작용기는 화학식 C3로 표시되는 바와 같은 포스포라미다이트기를 포함한다. 포스포라미다이트기는 커플링 반응을 통해 뉴클레오티드 상 임의의 위치에 있는 하이드록시, 예컨대 2' -하이드록시 또는 3' -하이드록시와 포스파이트 에스테르를 형성할 수 있으며, 포스파이트 에스테르는 공액 분자를 siRNA와 공액결합시키기 위하여 산화 또는 가황을 통해 화학식 A59로 표시되는 바와 같은 포스포로티오에이트 에스테르 결합 또는 포스포디에스테르 결합을 형성할 수 있다. 이 경우, 제2 작용기가 존재하지 않더라도, 화학식 321로 표시되는 바와 같은 화합물은, 화학식 308로 표시되는 바와 같은 siRNA 컨쥬게이트의 획득에 영향을 주지 않고 여전히 뉴클레오티드와 공액결합할 수 있을 것이다. 이러한 환경하에서, siRNA의 센스 가닥 또는 안티센스 가닥이 고상 포스포라미다이트 합성과 같은 방법에 의해 수득되면, 화학식 321로 표시되는 바와 같은 화합물은 뉴클레오티드 서열의 말단 뉴클레오티드상 하이드록시와 반응하고, 포스포디에스테르 결합 또는 포스포로티오에이트 결합은 후속 산화 또는 가황 공정에 의해 형성될 수 있으며, 이로써 화학식 321로 표시되는 바와 같은 화합물은 siRNA와 공액결합하게 된다.
몇몇 구현예에서, 제1 작용기는 보호된 하이드록시를 포함한다. 몇몇 구현예에서, 제2 작용기는 고상 지지체와 반응하여, 고상 지지체를 포함하는 공액 분자를 제공할 수 있는 기를 포함한다. 몇몇 구현예에서, 제2 작용기는 화학식 C1, C2 또는 C3로 표시되는 바와 같은 카복실, 카복실산염 또는 포스포라미다이트를 포함한다. 제2 작용기가 카복실 또는 카복실산염을 포함하면, 화학식 321로 표시되는 바와 같은 화합물은 에스테르화 또는 아미드화 반응을 통해 고상 지지체, 예컨대 수지 상 하이드록시 또는 아미노와 반응하고, 이로써 고상 지지체가 카복실 에스테르 결합을 통해 결합되어 포함된 공액 분자가 형성된다. 제2 작용기가 포스포라미다이트 작용기를 포함하면, 화학식 321로 표시되는 바와 같은 화합물은 보편적 고상 지지체, 예컨대 수지 상 하이드록시와 커플링할 수 있고, 이로써 산화에 의해 고상 지지체가 포스포디에스테르 결합을 통해 결합되어 포함되어 있는 공액 분자가 형성될 수 있다. 이후, 고상 지지체에 결합된 상기 생성물을 출발 재료로 하여, 뉴클레오시드 단량체는 고상 포스포라미다이트 합성 방법에 의해 순차 결합하게 되고, 이로써 공액기에 결합되어 있는 siRNA의 센스 가닥 또는 안티센스 가닥이 수득된다. 고상 포스포라미다이트 합성 동안 제1 작용기는 탈보호된 후, 커플링 반응 조건 하에서 뉴클레오시드 단량체 상 포스포라미다이트기와 커플링하게 된다.
몇몇 구현예에서, 화학식 C1' 또는 C3'로 표시되는 바와 같이, 제1 작용기는 하이드록시 또는 보호된 하이드록시를 포함하고, 제2 작용기는 카복시 에스테르 결합을 통해 결합된 고상 지지체, 아미드 결합을 통해 결합된 고상 지지체 또는 포스포에스테르 결합을 통해 결합된 고상 지지체를 포함한다. 이 경우, 고상 지지체 대신 화학식 321로 표시되는 바와 같은 화합물을 출발 재료로 하여, 뉴클레오시드 단량체는 고상 포스포라미다이트 합성에 의해 순차 결합하며, 이로써 공액기에 결합된 siRNA의 센스 가닥 또는 안티센스 가닥이 수득된다.
몇몇 구현예에서, 카복실산염은 -COO-M+로 표현될 수 있는데, 여기서 M+는 금속 양이온, 암모늄 양이온 NH4 + 및 유기 암모늄 양이온 중 하나와 같은 양이온이다. 일 구현예에서, 금속 이온은 알칼리 금속 이온, 예컨대 K+ 또는 Na+이다. 몇몇 구현예에서, 가용성을 증가시키고 반응을 촉진하기 위해, 유기 암모늄 이온은 3차 아민에 의해 생성된 암모늄 양이온 또는 4차 암모늄 양이온, 예컨대 트리에틸아민에 의해 생성된 암모늄 이온, 또는 N,N-디이소프로필에틸아민에 의해 생성된 암모늄 이온이다. 몇몇 구현예에서, 카복실산염은 트리에틸아민카복실산염 또는 N,N-디이소프로필에틸아민카복실산염이다.
몇몇 구현예에서, R4는 하기 화학식 B9, B10, B9', B10', B11, B12, B11' 또는 B12', 즉
Figure pct00058
Figure pct00059
로 표시되는 바와 같은 구조를 포함하되, 여기서 q1은 1 ~ 4의 정수이고, q2는 1 ~ 10의 정수이고, X는 O 또는 NH이고, M+는 양이온이고, Rk는 하이드록시 보호기이고, SPS는 고상 지지체를 나타내고,
Figure pct00060
는 어떤 기가 공유 결합하는 부위를 나타낸다. 몇몇 구현예에서, q1은 1 또는 2이다. 몇몇 구현예에서, q2는 1 ~ 5의 정수이다. 몇몇 구현예에서, R4는 화학식 B9 또는 B10로 표시되는 바와 같은 구조를 포함한다. 몇몇 구현예에서, R4는 화학식 B11 또는 B12로 표시되는 바와 같은 구조를 포함한다.
몇몇 구현예에서, Rk는 Tr(트리틸), MMTr(4-메톡시트리틸), DMTr(4,4'-디메톡시트리틸) 및 TMTr(4,4',4"-트리메톡시트리틸) 중 1개 이상이다. 몇몇 구현예에서, Rk는 DMTr, 즉 4,4'-디메톡시트리틸일 수 있다.
L1의 정의는 전술된 바와 같다.
몇몇 구현예에서, L1은 M1 표적화기를, 질소 함유 주쇄 상 N 원자에 결합시켜, 화학식 308로 표시되는 바와 같은 siRNA 컨쥬게이트에 간 표적화 기능을 제공하는데 사용된다. 몇몇 구현예에서, L1은 화학식 A1 ~ 화학식 A26 중 임의의 1개, 또는 이의 조합을 포함한다.
전술된 바에 따르면, 당 업자들은, 당 분야에 널리 공지된 고상 포스포라미다이트 합성 방법과는 비교되게, 뉴클레오티드 서열의 결합 가능한 임의의 위치에 공액 분자가 결합된 siRNA 컨쥬게이트는 상기 제1 작용기와 선택적 제2 작용기를 통해 수득될 수 있음을 용이하게 이해할 것이다. 예를 들어 공액 분자는 뉴클레오티드 서열의 말단에 결합하거나, 또는 뉴클레오티드 서열의 양 말단 중 어느 한 말단에 결합한다. 이에 대응하여, 달리 명시되지 않는 한, siRNA 컨쥬게이트 및/또는 공액 분자의 제조와 관련한 하기 설명에서 반응, 예컨대 "탈보호", "커플링", "캡핑", "산화" 및 "가황"을 지칭할 때, 당 분야에 널리 공지된 포스포라미다이트 핵산 고상 합성 방법과 관련된 반응 조건과 제제는 이러한 반응에도 또한 적용될 것임이 이해될 것이다. 예시적 반응 조건과 제제는 이하에 상세히 기재될 것이다.
몇몇 구현예에서, S1은 각각 독립적으로 M1이다. 몇몇 구현예에서, S1은 각각 독립적으로 M1의 활성 하이드록시 적어도 1개를 하이드록시 보호기로 보호함으로써 생성된 기이다. 몇몇 구현예에서, S1은 각각 독립적으로 M1의 활성 하이드록시 모두를 하이드록시 보호기로 보호함으로써 생성된 기이다. 몇몇 구현예에서, 당 업자들에게 공지된 임의의 하이드록시 보호기는 M1의 활성 하이드록시를 보호하기 위해 사용될 수 있다. 몇몇 구현예에서, 보호된 하이드록시는 화학식 YCOO-로서 표현되는데, 단 Y는 C1~ C10 알킬 및 C6~ C10 아릴로 이루어진 군으로부터 각각 독립적으로 선택되고, 이 C1~ C10 알킬 및 C6~ C10 아릴은, 할로 및 C1~ C6 알킬로 이루어진 군으로부터 선택되는 치환기 1개 이상으로 선택적으로 치환된다. 몇몇 구현예에서, Y는 메틸, 트리플루오로메틸, 디플루오로메틸, 모노플루오로메틸, 트리클로로메틸, 디클로로메틸, 모노클로로메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필, 페닐, 할로페닐 및 C1~ C6 알킬페닐로 이루어진 군으로부터 각각 독립적으로 선택된다.
몇몇 구현예에서, S1은 하기 화학식 A46 ~ A54, 즉
Figure pct00061
로 이루어진 군으로부터 각각 독립적으로 선택된다.
몇몇 구현예에서, S1은 화학식 A49 또는 A50이다.
몇몇 구현예에서, Y는 메틸, 트리플루오로메틸, 디플루오로메틸, 모노플루오로메틸, 트리클로로메틸, 디클로로메틸, 모노클로로메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필, 페닐, 할로페닐 및 알킬페닐 중 1개로부터 각각 독립적으로 선택된다. 몇몇 구현예에서, Y는 메틸이다.
앞서 언급된 바와 같이, 화학식 308로 표시되는 바와 같은 siRNA 컨쥬게이트를 제조하기 위한 방법은 이하의 단계들, 즉 siRNA의 다른 쪽 가닥을 합성하는 단계(예를 들어 공액 분자에 결합된 siRNA의 센스 가닥이 상기 단계에서 합성될 때, 이 방법은 고상 합성 방법에 의해 siRNA의 안티센스 가닥을 합성하는 단계를 추가로 포함하고, 그 반대도 마찬가지임); 센스 가닥과 안티센스 가닥을 단리하는 단계; 그리고 어닐링하는 단계를 추가로 포함한다. 구체적으로 단리 단계에서, 뉴클레오티드 서열에 결합한 고상 지지체 및/또는 공액 분자는 절단됨과 동시에 필요한 보호기는 제거되고(이 경우, 화학식 321로 표시되는 바와 같은 화합물 내 각각의 S1기는 대응하는 M1 표적화기로 전환되고), 이로써 공액 분자에 결합한 siRNA의 센스 가닥(또는 안티센스 가닥) 그리고 대응하는 안티센스 가닥(또는 센스 가닥)이 제공된다. 센스 가닥과 안티센스 가닥은 어닐링되어 이중 가닥 RNA 구조를 형성하고, 이로써 화학식 308로 표시되는 바와 같은 siRNA 컨쥬게이트가 수득된다.
몇몇 구현예에서, 화학식 308로 표시되는 바와 같은 siRNA 컨쥬게이트를 제조하기 위한 방법은, 하기 단계들, 즉 커플링 반응 조건 및 커플링제의 존재하에 화학식 321로 표시되는 바와 같은 화합물과, 센스 가닥 또는 안티센스 가닥의 3'-말단에 있는 제1 뉴클레오시드 단량체를 접촉시켜, 화학식 321로 표시되는 바와 같은 화합물을 서열 내 제1 뉴클레오티드와 결합시키는 단계; 고상 포스포라미다이트 합성 조건 하에 뉴클레오시드 단량체들을 3' → 5' 방향으로 순차적으로 결합시켜, 센스 가닥 또는 안티센스 가닥의 서열과 원하는 뉴클레오티드의 유형에 따라서 siRNA의 센스 가닥 또는 안티센스 가닥을 합성하여, 공액 분자에 결합된 핵산의 센스 가닥 또는 안티센스 가닥을 수득하는 단계[단 화학식 321로 표시되는 바와 같은 화합물은, R4가 제1 작용기와 제2 작용기를 포함하고, 제1 작용기는 보호된 하이드록시를 포함하고, 제2 작용기는 화학식 C1' 또는 C3'로 표시되는 바와 같은 기를 포함하는 화합물이고, 화학식 321로 표시되는 바와 같은 화합물은 제1 뉴클레오시드 단량체에 결합하기 전 탈보호되고, 각각의 뉴클레오시드 단량체의 결합은 4 단계 반응, 즉 탈보호, 커플링, 캡핑 및 산화 또는 가황을 포함함]; 고상 포스포라미다이트 합성 조건 하에 뉴클레오시드 단량체들을 3' → 5' 방향으로 순차적으로 결합시켜, 센스 가닥 또는 안티센스 가닥의 서열과 원하는 뉴클레오티드의 유형에 따라서 핵산의 센스 가닥 또는 안티센스 가닥을 합성하는 단계[단 각각의 뉴클레오시드 단량체의 결합은 4 단계 반응, 즉 탈보호, 커플링, 캡핑 및 산화 또는 가황을 포함함]; 보호기를 제거하고, 고상 지지체를 절단하는 단계; 단리 및 정제하여, 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 수득하는 단계; 및 어닐링 단계를 추가로 포함한다.
몇몇 구현예에서, 화학식 308로 표시되는 바와 같은 siRNA 컨쥬게이트를 제조하기 위한 방법은 하기 단계들, 즉 뉴클레오시드 단량체들을 3' → 5' 방향으로 순차적으로 결합시켜 이중 가닥 siRNA의 센스 가닥 또는 안티센스 가닥의 서열과 뉴클레오티드 유형에 따라서 센스 가닥 또는 안티센스 가닥을 합성하여, 고상 지지체에 결합된 센스 가닥과 고상 지지체에 결합된 안티센스 가닥을 수득하는 단계[단 각각의 뉴클레오시드 단량체의 결합은 4 단계 반응, 즉 탈보호, 커플링, 캡핑 및 산화 또는 가황을 포함함]; 커플링 반응 조건 및 커플링제의 존재 하에 화학식 321로 표시되는 바와 같은 화합물을, 고상 지지체에 결합된 센스 가닥 또는 고상 지지체에 결합된 안티센스 가닥과 접촉시켜, 화학식 321로 표시되는 바와 같은 화합물을, 센스 가닥 또는 안티센스 가닥에 결합시키는 단계[단 화학식 321로 표시되는 바와 같은 화합물은, R4가 제1 작용기로서 포스포라미다이트기를 포함하는 화합물임]; 보호기를 제거하고, 고상 지지체를 절단하는 단계; 각각 단리 및 정제하여, siRNA의 센스 가닥 또는 안티센스 가닥을 수득하는 단계; 그리고 어닐링시키는 단계[단 siRNA의 센스 가닥 또는 안티센스 가닥은 공액 분자에 결합함]를 추가로 포함한다.
몇몇 구현예에서, 화학식 A59의 P 원자는 siRNA의 센스 가닥 3'-말단에 결합하고, 화학식 308로 표시되는 바와 같은 siRNA 컨쥬게이트를 제조하기 위한 방법은 하기 단계들, 즉
(1) 화학식 321로 표시되는 바와 같은 화합물 내 하이드록시 보호기 Rk를 제거하고, 커플링 반응 조건 및 커플링제 존재 하에 탈보호된 생성물과 뉴클레오시드 단량체를 접촉시켜, 공액 분자를 통해 고상 지지체에 결합된 뉴클레오시드 단량체를 수득하는 단계[단 화학식 321로 표시되는 바와 같은 화합물은, R4가 제1 작용기 및 제2 작용기를 포함하고, 제1 작용기는 보호된 하이드록시 ORk를 포함하고, 제2 작용기는 화학식 C1' 또는 C3'로 표시되는 바와 같은 구조를 가짐];
(2) 공액 분자를 통해 고상 지지체에 결합된 뉴클레오시드 단량체를 출발 물질로 하여, 고상 포스포라미다이트 합성으로 siRNA의 센스 가닥을 3' → 5' 방향으로 합성하는 단계;
(3) 고상 포스포라미다이트 합성 방법에 의해 siRNA의 안티센스 가닥을 합성하는 단계; 및
(4) siRNA의 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 단리한 다음, 이것들을 어닐링시켜, 화학식 308로 표시되는 바와 같은 siRNA 컨쥬게이트를 수득하는 단계
를 포함한다.
단계 1에서, 화학식 321로 표시되는 바와 같은 화합물 내 보호기 Rk를 제거하기 위한 방법은, 탈보호 조건 하에서 화학식 321로 표시되는 바와 같은 화합물을 탈보호제와 접촉시키는 단계를 포함한다. 탈보호 조건은 0℃ ~ 50℃의 온도를 포함하고, 몇몇 구현예에서, 15℃ ~ 35℃의 온도와, 30초 ~ 300초의 반응 시간을 포함하고, 몇몇 구현예에서는 50초 ~ 150초의 반응 시간을 포함한다. 탈보호제는 트리플루오로아세트산, 트리클로로아세트산, 디클로로아세트산 및 모노클로로아세트산 중 1개 이상으로부터 선택될 수 있고, 몇몇 구현예에서, 탈보호제는 디클로로아세트산이다. 탈보호제 대 화학식 321로 표시되는 바와 같은 화합물의 몰비는 10 :1 ~ 1000 : 1일 수 있고, 몇몇 구현예에서, 50 : 1 ~ 500 : 1일 수 있다.
커플링 반응 조건과 커플링제는 상기 커플링 반응에 적합한 임의의 조건과 제제일 수 있다. 몇몇 구현예에서, 고상 합성 방법의 커플링 반응의 조건 및 제제와 동일한, 조건 및 제제가 사용될 수 있다.
몇몇 구현예에서, 커플링 반응 조건은 0℃ ~ 50℃의 반응 온도를 포함하고, 몇몇 구현예에서는 15℃ ~ 35℃의 반응 온도를 포함한다. 화학식 321로 표시되는 바와 같은 화합물 대 뉴클레오시드 단량체의 몰비는 1 : 1 ~ 1 : 50일 수 있고, 몇몇 구현예에서는 1 : 2 ~ 1 : 5일 수 있다. 화학식 321로 표시되는 바와 같은 화합물 대 커플링제의 몰비는 1 : 1 ~ 1 : 50일 수 있고, 몇몇 구현예에서는 1 : 3 ~ 1 : 10일 수 있다. 반응 시간은 200초 ~ 3000초일 수 있고, 몇몇 구현예에서는 500초 ~ 1500초일 수 있다. 커플링제는 1H-테트라졸, 5-에틸티오-1H-테트라졸 및 5-벤질티오-1H-테트라졸 중 1개 이상으로부터 선택될 수 있고, 몇몇 구현예에서는 5-에틸티오-1H-테트라졸이다. 유기 용매는 무수 아세토니트릴, 무수 DMF 및 무수 디클로로메탄 중 1개 이상으로부터 선택될 수 있고, 몇몇 구현예에서는 무수 아세토니트릴이다. 유기 용매의 양은 화학식 321로 표시되는 바와 같은 화합물을 기준으로 3 L/mol ~ 50 L/mol일 수 있고, 몇몇 구현예에서는 5 L/mol ~ 20 L/mol일 수 있다.
단계 2에서, siRNA 컨쥬게이트의 센스 가닥 SS는 상기 단계들에서 제조된 공액 분자를 통해 고상 지지체에 결합된 뉴클레오시드 단량체를 출발 물질로 하여 포스포라미다이트 핵산 고상 합성 방법에 의해 3' → 5' 방향으로 합성된다. 이 경우, 공액 분자는 생성된 센스 가닥의 3'-말단에 결합한다.
뉴클레오시드 단량체에 대한 탈보호 조건, 탈보호제의 유형 및 양, 커플링 반응 조건, 커플링제의 유형과 양, 캡핑 반응 조건, 캡핑제의 유형과 양, 산화 반응 조건, 산화제의 유형과 양, 가황 반응 조건, 그리고 가황제의 유형과 양을 포함하여, 단계 2 및 3에서 고상 합성을 위한 기타 조건은 당 분야의 다양한 종래 제제, 양 및 조건을 채택한다.
예를 들어 몇몇 구현예에서, 단계 2 및 3에서의 고상 합성은 하기 조건들을 이용할 수 있다:
뉴클레오시드 단량체에 대한 탈보호 조건은 0℃ ~ 50℃의 온도를 포함하고, 몇몇 구현예에서는 15℃ ~ 35℃의 온도, 그리고 30초 ~ 300초의 반응 시간을 포함하고, 몇몇 구현예에서는 50초 ~ 150초의 반응 시간을 포함한다. 탈보호제는 트리플루오로아세트산, 트리클로로아세트산, 디클로로아세트산 및 모노클로로아세트산 중 1개 이상으로부터 선택될 수 있으며, 몇몇 구현예에서, 탈보호제는 디클로로아세트산이다. 탈보호제 대 고상 지지체 상 보호기 4,4'-디메톡시트리틸의 몰비는 2 : 1 ~ 100 : 1이고, 몇몇 구현예에서는 3 : 1 ~ 50 : 1이다.
커플링 반응 조건은 0℃ ~ 50℃의 반응 온도를 포함하고, 몇몇 구현예에서는 15℃ ~ 35℃의 반응 온도를 포함한다. 고상 지지체에 결합된 핵산 서열 대 뉴클레오시드 단량체의 몰비는 1 : 1 ~ 1 : 50이고, 몇몇 구현예에서는 1 : 5 ~ 1 : 15이다. 고상 지지체에 결합된 핵산 서열 대 커플링제의 몰비는 1 : 1 ~ 1 : 100이고, 몇몇 구현예에서는 1 : 50 ~ 1 : 80이다. 반응 시간과 커플링제의 선택은 전술된 바와 동일할 수 있다.
캡핑 반응 조건은 0℃ ~ 50℃의 반응 온도를 포함하고, 몇몇 구현예에서는 15℃ ~ 35℃의 반응 온도와 5초 ~ 500초의 반응 시간을 포함하고, 몇몇 구현예에서는 10초 ~ 100초의 반응 시간을 포함한다. 캡핑제의 선택은 전술된 바와 동일할 수 있다. 캡핑제의 총량 대 고상 지지체에 결합된 핵산 서열의 총량의 몰비는 1 : 100 ~ 100 : 1일 수 있고, 몇몇 구현예에서는 1 : 10 ~ 10 : 1일 수 있다. 캡핑제가 동몰의 아세트산 무수물 및 N-메틸이미다졸을 이용하는 경우, 아세트산 무수물 및 N-메틸이미다졸 대 고상 지지체에 결합된 핵산 서열의 몰비는 1 : 1 : 10 ~ 10 : 10 : 1일 수 있고, 몇몇 구현예에서는 1 : 1 : 2 ~ 2 : 2 : 1일 수 있다.
산화 반응 조건은 0℃ ~ 50℃의 반응 온도를 포함하고, 몇몇 구현예에서는 15℃ ~ 35℃의 반응 온도와 1초 ~ 100초의 반응 시간을 포함하고, 몇몇 구현예에서는 5초 ~ 50초의 반응 시간을 포함한다. 몇몇 구현예에서, 산화제는 요오드이다(몇몇 구현예에서는 요오드수로서 제공됨). 커플링 단계에서 산화제 대 고상 지지체에 결합된 핵산 서열의 몰비는 1 : 1 ~ 100 : 1일 수 있고, 몇몇 구현예에서는 5 : 1 ~ 50 : 1이다. 몇몇 구현예에서, 산화 반응은 테트라하이드로푸란 : 물 : 피리딘의 비가 3 : 1 : 1 ~ 1 : 1 : 3인 혼합 용매 중에서 수행된다. 가황 반응 조건은 0℃ ~ 50℃의 반응 온도를 포함하고, 몇몇 구현예에서는 15℃ ~ 35℃의 반응 온도와, 50초 ~ 2000초의 반응 시간을 포함하고, 몇몇 구현예에서는 100초 ~ 1000초의 반응 시간을 포함한다. 몇몇 구현예에서, 가황제는 수소화잔탄이다. 커플링 단계에서 가황제 대 고상 지지체에 결합된 핵산 서열의 몰비는 10 : 1 ~ 1000 : 1이고, 몇몇 구현예에서는 10 : 1 ~ 500 : 1이다. 몇몇 구현예에서, 가황 반응은 아세토니트릴 : 피리딘의 비가 1 : 3 ~ 3 : 1인 혼합 용매 중에서 수행된다.
본 방법은 뉴클레오시드 단량체 모두가 결합한 후, 그리고 어닐링 이전에 siRNA의 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 단리하는 단계를 추가로 포함한다. 단리를 위한 방법은 당 업자들에게 널리 공지되어 있으며, 보통은 합성된 뉴클레오티드 서열을 고상 지지체로부터 절단한 다음, 염기에 있는 보호기, 인산염기 및 리간드를 제거하고, 정제 및 탈염하는 단계를 포함한다.
siRNA 합성에 있어 종래의 절단 및 탈보호 방법은 합성된 뉴클레오티드 서열을 고상 지지체로부터 절단하여, 염기에 있는 보호기, 인산염기 및 리간드를 제거하는데 사용될 수 있다. 예를 들어 탈보호 동안 고상 지지체에 결합되어 생성된 뉴클레오티드 서열과 경수(strong aqua)가 접촉할 때, 화학식 A46 ~ A54의 보호기 YCOO-는 하이드록시로 전환되므로, S1기는 대응하는 M1기로 전환되어 화학식 308로 표시되는 바와 같은 컨쥬게이트가 제공되는데, 단 경수는 중량 기준 25% ~ 30% 농도의 수성 암모니아일 수 있다. 경수의 양은 표적 siRNA를 기준으로 0.2 ml/μmol ~ 0.8 ml/μmol일 수 있다.
합성된 뉴클레오티드 서열에 적어도 1개의 2'-TBDMS 보호가 일어나면, 본 방법은 고상 지지체로부터 분리된 뉴클레오티드 서열을 트리에틸아민 트리하이드로풀루오르화물과 접촉시켜, 2'-TBDMS 보호를 제거하는 단계를 추가로 포함한다. 이 경우, 생성된 표적 siRNA 서열은 자유 2'-하이드록시를 가지는 대응 뉴클레오시드를 포함한다. 순수한 트리하이드로플루오로트리에틸아민의 양은 표적 siRNA 서열을 기준으로 0.4 ml/μmol ~ 1.0 ml/μmol이다. 그러므로, 화학식 308로 표시되는 바와 같은 siRNA 컨쥬게이트가 수득될 수 있다.
정제 및 탈염을 위한 방법은 당 업자들에게 널리 공지되어 있다. 예를 들어 핵산 정제는 예비적 이온 크로마토그래피 정제 컬럼(NaBr 또는 NaCl의 용리 구배 적용)이 사용되어 수행될 수 있고, 탈염은 생성물이 수집 및 조합된 후 역상 크로마토그래피 정제 컬럼이 사용되어 수행될 수 있다.
화학식 308로 표시되는 바와 같은 수득 siRNA 컨쥬게이트 내 뉴클레오티드들 간 포스포디에스테르 결합 또는 포스포로티오에이트 디에스테르 결합 내 비 가교 산소 원자 또는 황 원자는 실질적으로 나트륨 이온과 결합하고, 화학식 308로 표시되는 바와 같은 siRNA 컨쥬게이트는, 실질적으로 나트륨 염의 형태로 존재한다. 나트륨 이온이 수소 이온 및/또는 기타 양이온으로 대체될 수 있어서, 화학식 308로 표시되는 바와 같은 siRNA 컨쥬게이트의 다른 형태가 제공되는 방법으로서, 널리 공지된 이온 교환 방법이 사용될 수 있다. 양이온은 전술된 바와 같다.
합성 중 핵산 서열의 순도와 분자량은 아무때나 확정될 수 있다. 합성의 품질을 더 잘 제어하기 위한, 이러한 검출 방법은 당 업자들에게 널리 공지되어 있다. 예를 들어 핵산의 순도는 이온 교환 크로머토그래피에 의해 검출될 수 있고, 분자량은 액체 크로마토그래피-질량 분광분석법(LC-MS)에 의해 확정될 수 있다.
어닐링을 위한 방법도 또한 당 업자들에게 널리 공지되어 있다. 예를 들어 합성된 센스 가닥(SS 가닥) 및 안티센스 가닥(AS 가닥)은 주사를 위해 수중에 동몰비로 간단히 혼합된 다음, 70℃ ~ 95℃로 가열된 후, 실온으로 냉각될 수 있으며, 그 결과 수소 결합을 통해 이중 가닥 구조가 생성될 수 있다. 그러므로 화학식 308로 표시되는 바와 같은 siRNA 컨쥬게이트가 수득될 수 있다.
몇몇 구현예에서, 컨쥬게이트가 수득된 후, 이처럼 합성된 것으로서, 화학식 308로 표시되는 바와 같은 siRNA 컨쥬게이트는 또한 액체 크로마토그래피-질량 분광분석법과 같은 방법이 사용되는 분자량 검출과 같은 수단에 의해 특성규명될 수 있으며, 그 결과 합성된 siRNA 컨쥬게이트는 화학식 308로 표시되는 바와 같이 디자인된 관심 siRNA 컨쥬게이트일 수도 있고, 합성된 siRNA의 서열은 합성되도록 요망되는 siRNA 서열의 서열, 예를 들어 표 1a ~ 표 1f에 나열된 서열들 중 하나임이 확인될 수 있다.
화학식 321로 표시되는 바와 같은 화합물은 하기 단계, 즉 에스테르화 반응 조건 및 염기와 에스테르화 촉매의 존재하에 화학식 313, 즉
화학식 313
Figure pct00062
로 표시되는 바와 같은 화합물을 유기 용매 중 사이클릭 무수물과 접촉시키는 단계; 및 화학식 313로 표시되는 바와 같은 화합물을 이온 교환에 의해 단리하는 단계를 포함하는, 상기 방법에 의해 제조될 수 있는데, 여기서 n1, n3, m1, m2, m3, R10, R11, R12, R13, R14, R15, L1 및 S1의 정의와 선택사양은 각각 상기 기재된 바와 같고; R6은 화학식 321의 R4를 제공하기 위한 기이다. 몇몇 구현예에서, R6은 하기 화학식 A61, 즉
화학식 A61
Figure pct00063
로 표시되는 바와 같은 구조를 포함하는데, 여기서 Ri는 질소 함유 주쇄 상 N 원자와 결합할 수 있고, RkO와 결합할 수 있으며, 자유 하이드록시와 결합할 수 있는 임의의 기이고; Rk는 하이드록시 보호기이다. 이 경우, 화학식 321로 표시되는 바와 같은 화합물이 수득되는데, 단 R4는 하이드록시 보호기로서 제1 작용기와, 화학식 C1 또는 C2로 표시되는 바와 같은 기를 포함하는 제2 작용기를 포함한다.
에스테르화 반응 조건은 0℃ ~ 100℃의 반응 온도와 8시간 ~ 48시간의 반응 시간을 포함한다. 몇몇 구현예에서, 에스테르화 반응 조건은 10℃ ~ 40℃의 반응 온도와 20시간 ~ 30시간의 반응 시간을 포함한다.
몇몇 구현예에서, 유기 용매는 에폭시 용매, 에테르 용매, 할로알칸 용매, 디메틸 설폭사이드, N,N-디메틸포름아미드 및 N,N-디이소프로필에틸아민 중 1개 이상을 포함한다. 몇몇 구현예에서, 에폭시 용매는 디옥산 및/또는 테트라하이드로푸란이고, 에테르 용매는 디에틸에테르 및/또는 메틸tert-부틸에테르이고, 할로알칸 용매는 디클로로메탄, 트리클로로메탄 및 1,2-디클로로에탄 중 1개 이상이다. 몇몇 구현예에서, 유기 용매는 디클로로메탄이다. 유기 용매의 양은 화학식 313로 표시되는 바와 같은 화합물을 기준으로 3 L/mol ~ 50 L/mol이고, 몇몇 구현예에서는 5 L/mol ~ 20 L/mol이다.
몇몇 구현예에서, 사이클릭 무수물은 숙신산 무수물, 글루타르산 무수물, 아디프산 무수물 또는 피멜산 무수물 중 1개이고, 몇몇 구현예에서, 사이클릭 무수물은 숙신산 무수물이다. 사이클릭 무수물 대 화학식 313로 표시되는 바와 같은 화합물의 몰비는 1 : 1 ~ 10 : 1이고, 몇몇 구현예에서는 2 : 1 ~ 5 : 1이다.
에스테르화 촉매는 에스테르화를 촉매화할 수 있는 임의의 촉매일 수 있고, 예를 들어 촉매는 4-디메틸아미노피리딘일 수 있다. 촉매 대 화학식 313로 표시되는 바와 같은 화합물의 몰비는 1 : 1 ~ 10 : 1이고, 몇몇 구현예에서는 2 : 1 ~ 5 : 1이다.
몇몇 구현예에서, 염기는 임의의 무기 염기, 유기 염기 또는 이의 조합일 수 있다. 가용성과 생성물의 안정성이 고려되었을 때, 염기는, 예컨대 3차 아민일 수 있다. 몇몇 구현예에서, 3차 아민은 트리에틸아민 또는 N,N-디이소프로필에틸아민이다. 3차 아민 대 화학식 313로 표시되는 바와 같은 화합물의 몰비는 1 : 1 ~ 20 : 1이고, 몇몇 구현예에서는 3 : 1 ~ 10 : 1이다.
이온 교환은 화학식 321로 표시되는 바와 같은 화합물을 카복실산 또는 카복실산 염의 원하는 형태로 전환하는 기능을 발휘하고, 이온 교환 방법은 당 업자들에게 널리 공지되어 있다. 양이온이 M+인 상기 공액 분자는 적합한 이온 교환 용액 및 이온 교환 조건을 이용하여 수득될 수 있는데, 이에 대해서는 본원에 상세히 기재되어 있지 않다. 몇몇 구현예에서, 트리에틸아민 인산염 용액은 이온 교환 반응에 사용되고, 트리에틸아민 인산염 용액의 농도는 0.2 M ~ 0.8 M이다. 몇몇 구현예에서, 트리에틸아민 인산염 용액의 농도는 0.4 M ~ 0.6 M이다. 몇몇 구현예에서, 트리에틸아민 인산염 용액의 양은 화학식 313로 표시되는 바와 같은 화합물을 기준으로 3 L/mol ~ 6 L/mol이고, 추가의 구현예에서는 4 L/mol ~ 5 L/mol이다.
화학식 321로 표시되는 바와 같은 화합물은 임의의 적합한 단리 방법이 이용되어 반응 혼합물로부터 단리될 수 있다. 몇몇 구현예에서, 화학식 321로 표시되는 바와 같은 화합물은 증발을 통한 용매 제거 후, 예컨대 하기 단리를 위한 2가지 크로마토그래피 조건, 즉 (1) 200 메쉬 ~ 300 메쉬 실리카 겔 충전재와, 디클로로메탄 중 1wt‰트리에틸아민 : 메탄올 용리 구배 100 : 18 → 100 : 20의 순상 정제; 또는 (2) C18 및 C8 역상 충전재와, 메탄올 : 아세토니트릴 용리 구배 0.1 : 1 → 1 : 0.1의 역상 정제가 이용되는 크로마토그래피에 의해 단리될 수 있다. 몇몇 구현예에서, 용매는 화학식 321로 표시되는 바와 같은 화합물의 미정제 생성물을 수득하기 위해 직접 제거될 수 있으며, 후속 반응에 직접 사용될 수 있다.
몇몇 구현예에서, 화학식 321로 표시되는 바와 같은 화합물을 제조하기 위한 방법은, 축합 반응 조건과, 축합제, 축합 촉매 및 3차 아민의 존재하에 유기 용매 중에서 상기 이온 교환 반응으로부터 수득된 생성물을, 아미노 또는 하이드록시를 함유하는 고상 지지체와 접촉시키는 단계를 추가로 포함한다. 이 경우, R4가 하이드록시 보호기를 포함하는 제1 작용기와 화학식 C1'로 표시되는 바와 같은 구조를 가지는 제2 작용기를 포함하는, 화학식 321로 표시되는 바와 같은 화합물이 수득된다.
고상 지지체는 siRNA 고상 합성에 사용되는 담체의 하나로서, 일부는 당 업자들에게 널리 공지되어 있다. 예를 들어 고상 지지체는 활성 하이드록시 또는 아미노 작용기를 함유하는 고상 지지체들로부터 선택될 수 있다. 몇몇 구현예에서, 고상 지지체는 아미노 수지 또는 하이드록시 수지이다. 몇몇 구현예에서, 아미노 수지 또는 하이드록시 수지는 하기 매개변수, 즉 입도 100 메쉬 ~ 400 메쉬, 및 표면 아미노 또는 하이드록시 부하량 0.2 mmol/g ~ 0.5 mmol/g를 가진다. 화학식 321로 표시되는 바와 같은 화합물 대 고상 지지체의 비는 고상 지지체 1그램당 화합물 10 μmol ~ 400 μmol(10 μmol/g ~ 40 μmol/g)이다. 몇몇 구현예에서, 화학식 321의 화합물 대 고상 지지체의 비는 50 μmol/g ~ 200 μmol/g이다.
유기 용매는 당 업자들에게 공지된 임의의 적합한 용매 또는 혼합 용매일 수 있다. 몇몇 구현예에서, 유기 용매는 아세토니트릴, 에폭시 용매, 에테르 용매, 할로알칸 용매, 디메틸 설폭사이드, N,N-디메틸포름아미드 및 N,N-디이소프로필에틸아민 중 1가지 이상을 포함한다. 몇몇 구현예에서, 에폭시 용매는 디옥산 및/또는 테트라하이드로푸란이고, 에테르 용매는 디에틸에테르 및/또는 메틸 tert-부틸에테르이고, 할로알칸 용매는 디클로로메탄, 트리클로로메탄 및 1,2-디클로로에탄 중 1가지 이상이다. 몇몇 구현예에서, 유기 용매는 아세토니트릴이다. 유기 용매의 양은 화학식 321로 표시되는 바와 같은 화합물을 기준으로 20 L/mol ~ 200 L/mol일 수 있고, 몇몇 구현예에서는 50 L/mol ~ 100 L/mol일 수 있다.
몇몇 구현예에서, 축합제는 벤조트리아졸-1-일-옥시트리피롤리디노포스포늄 헥사플루오로포스페이트(PyBop), 3-(디에톡시포스포릴옥시)-1,2,3-벤조트리아진-4(3H)-온(DEPBT) 및/또는 O-벤조트리아졸-1-일-테트라메틸우로늄 헥사플루오로포스페이트일 수 있다. 몇몇 구현예에서, 축합제는 O-벤조트리아졸-1-일-테트라메틸우로늄 헥사플루오로포스페이트이다. 축합제 대 화학식 321로 표시되는 바와 같은 화합물의 몰비는 1 : 1 ~ 20 : 1이고, 몇몇 구현예에서는 1 : 1 ~ 5 : 1이다.
몇몇 구현예에서, 3차 아민은 트리에틸아민 및/또는 N,N-디이소프로필에틸아민이고, 몇몇 구현예에서는 N,N-디이소프로필에틸아민이다. 3차 아민 대 화학식 321로 표시되는 바와 같은 화합물의 몰비는 1 : 1 ~ 20 : 1이고, 몇몇 구현예에서는 1 : 1 ~ 5 : 1이다.
몇몇 구현예에서, 화학식 321로 표시되는 바와 같은 화합물을 제조하기 위한 방법은 유기 용매중에서 캡핑 반응 조건 하에 수득된 축합 생성물과 캡핑제 및 아실화 촉매를 접촉시키는 단계, 및 화학식 321로 표시되는 바와 같은 화합물을 단리하는 단계를 추가로 포함한다. 후속 반응에서 불필요한 부생성물이 생성되지 않도록, 캡핑 반응은 완전히 반응하지 않는 임의의 활성 작용기를 제거하는데 사용된다. 캡핑 반응 조건은 0℃ ~ 50℃의 반응 온도를 포함하고, 몇몇 구현예에서는 15℃ ~ 35℃의 반응 온도와 1시간 ~ 10시간의 반응 시간을 포함하고, 몇몇 구현예에서는 3시간 ~ 6시간의 반응 시간을 포함한다. 캡핑제는 siRNA의 고상 합성에 사용되는 캡핑제일 수 있고, siRNA의 고상 합성에 사용되는 캡핑제는 당 업자들에게 널리 공지되어 있다.
몇몇 구현예에서, 캡핑제는 캡핑제 1(cap1)과 캡핑제 2(cap2)로 이루어져 있다. cap1은 N-메틸이미다졸이고, 몇몇 구현예에서는 피리딘/아세토니트릴 중 N-메틸이미다졸의 혼합 용액으로서 제공되되, 단 이때의 피리딘 대 아세토니트릴의 부피비는 1 : 10 ~ 1 : 1이고, 몇몇 구현예에서는 1 : 3 ~ 1 : 1이다. 몇몇 구현예에서, 피리딘과 아세토니트릴의 총 부피 대 N-메틸이미다졸의 부피의 비는 1 : 1 ~ 10 : 1이고, 몇몇 구현예들에서는 3 : 1 ~ 7 : 1이다. 캡핑제 2는 아세트산 무수물이다. 몇몇 구현예에서, 캡핑제 2는 아세토니트릴 중 아세트산 무수물의 용액으로서 제공되되, 아세트산 무수물 대 아세토니트릴의 부피비는 1 : 1 ~ 1 : 10이고, 몇몇 구현예에서는 1 : 2 ~ 1 : 6이다.
몇몇 구현예에서, 피리딘/아세토니트릴 중 N-메틸이미다졸의 혼합 용액 부피 대 화학식 321로 표시되는 바와 같은 화합물 질량의 비는 5 ml/g ~ 50 ml/g이고, 몇몇 구현예에서는 15 ml/g ~ 30 ml/g이다. 아세토니트릴 중 아세트산 무수물 용액의 부피 대 화학식 321로 표시되는 바와 같은 화합물 질량의 비는 0.5 ml/g ~ 10 ml/g이고, 몇몇 구현예에서는 1 ml/g ~ 5 ml/g이다.
몇몇 구현예에서, 캡핑제는 동몰의 아세트산 무수물 및 N-메틸이미다졸을 포함한다. 몇몇 구현예에서, 유기 용매는 아세토니트릴, 에폭시 용매, 에테르 용매, 할로알칸 용매, 디메틸 설폭사이드, N,N-디메틸포름아미드 및 N,N-디이소프로필에틸아민 중 1가지 이상을 포함한다. 몇몇 구현예에서, 유기 용매는 아세토니트릴이다. 유기 용매의 양은 화학식 321로 표시되는 바와 같은 화합물을 기준으로 10 L/mol ~ 50 L/mol일 수 있고, 몇몇 구현예에서는 5 L/mol ~ 30 L/mol일 수 있다.
몇몇 구현예에서, 아실화 촉매는 에스테르화 축합 또는 아미드화 축합에 사용될 수 있는 임의의 촉매, 예컨대 알칼리성 헤테로사이클릭 화합물들로부터 선택될 수 있다. 몇몇 구현예에서, 아실화 촉매는 4-디메틸아미노피리딘이다. 촉매 대 화학식 321로 표시되는 바와 같은 화합물의 질량비는 0.001 : 1 ~ 1 : 1일 수 있고, 몇몇 구현예에서는 0.01 : 1 ~ 0.1 : 1일 수 있다.
몇몇 구현예에서, 화학식 321로 표시되는 바와 같은 화합물은 반응 혼합물로부터 임의의 적합한 단리 방법이 사용되어 단리될 수 있다. 몇몇 구현예에서, 화학식 321로 표시되는 바와 같은 화합물은 유기 용매로 철저히 세척하고, 여과하여 미반응 반응물, 과량의 캡핑제 및 기타 불순물을 제거함으로써 수득될 수 있는데, 이때 유기 용매는 아세토니트릴, 디클로로메탄 또는 메탄올으로부터 선택된다. 몇몇 구현예에서, 유기 용매는 아세토니트릴이다.
몇몇 구현예에서, 화학식 321로 표시되는 바와 같은 공액 분자의 제조 방법은 화학식 313로 표시되는 바와 같은 화합물을, 유기 용매 중에서 커플링 반응 조건 및 커플링제의 존재 하에 포스포로디아미다이트와 접촉시키는 단계, 및 화학식 321로 표시되는 바와 같은 화합물을 단리하는 단계를 포함한다. 이 경우, R4는 하이드록시 보호기를 포함하는 제1 작용기와, 화학식 C3로 표시되는 바와 같은 구조를 가지는 제2 작용기를 포함하는, 화학식 321로 표시되는 바와 같은 화합물이 수득된다.
몇몇 구현예에서, 커플링 반응 조건은 0℃ ~ 50℃의 반응 온도, 예컨대 15℃ ~ 35℃의 반응 온도를 포함한다. 화학식 313로 표시되는 바와 같은 화합물 대 포스포로디아미다이트의 몰비는 1 : 1 ~ 1 : 50, 예컨대 1 : 5 ~ 1 : 15일 수 있다. 화학식 313로 표시되는 바와 같은 화합물 대 커플링제의 몰비는 1 : 1 ~ 1: 100, 예컨대 1 : 50 ~ 80일 수 있다. 반응 시간은 200초 ~ 3000초, 예컨대 500초 ~ 1500초일 수 있다. 포스포로디아미다이트는, 예컨대 시판될 수 있거나 당 분야에 널리 공지된 방법에 따라 합성될 수 있는 비스(디이소프로필아미노)(2-시아노에톡시)포스핀일 수 있다. 커플링제는 1H-테트라졸, 5-에틸티오-1H-테트라졸 및 5-벤질티오-1H 테트라졸 중 1가지 이상으로부터 선택되는데, 예컨대 5-에틸티오-1H-테트라졸이다. 커플링 반응은 유기 용매 중에서 수행될 수 있고, 유기 용매는 무수 아세토니트릴, 무수 DMF 및 무수 디클로로메탄 중 1가지 이상으로부터 선택되고, 예컨대 무수 아세토니트릴이다. 유기 용매의 양은 화학식 313로 표시되는 바와 같은 화합물을 기준으로 3 L/mol ~ 50 L/mol, 예컨대 5 L/mol ~ 20 L/mol일 수 있다. 화학식 313로 표시되는 바와 같은 화합물 중 하이드록시는 커플링 반응이 수행됨으로써 포스포로디아미다이트와 반응하게 되고, 그 결과 포스포라미다이트기가 생성된다. 몇몇 구현예에서, 용매는 화학식 321에 이해 표시되는 바와 같은 화합물의 미정제 생성물이 수득되도록 직접 제거될 수 있으며, 이 미정제 생성물은 후속 반응에 직접 사용될 수 있다.
몇몇 구현예에서, 화학식 321에 이해 표시되는 바와 같은 화합물을 제조하기 위한 방법은 유기 용매 중 커플링 반응 조건 및 커플링제의 존재하에 하이드록시 함유 고상 지지체와 단리된 생성물을 접촉키고 나서, 캡핑, 산화 및 단리하여, 화학식 321로 표시되는 바와 같은 화합물을 수득하는 단계를 추가로 포함한다. 이 경우, R4는 하이드록시 보호기를 포함하는 제1 작용기와, 화학식 C3'로 표시되는 바와 같은 구조를 가지는 제2 작용기를 포함하는, 화학식 321로 표시되는 바와 같은 화합물이 수득된다.
몇몇 구현예에서, 고상 지지체는 핵산의 고상 합성용으로서 당 분야에 널리 공지된 고상 지지체, 예컨대 시판되고 있는 보편적 탈보호 고상 지지체(NittoPhase®UnyLinker™ 300, Oligonucleotide Synthesis Support, Kinovate Life Sciences, 화학식 B80, 즉
화학식 B80
Figure pct00064
로 표시되는 바와 같음)이다.
탈보호 반응은 당 분야에 널리 공지되어 있다. 몇몇 구현예에서, 탈보호 조건은 0℃ ~ 50℃의 온도, 예컨대 15℃ ~ 35℃의 온도와, 30초 ~ 300초의 반응 시간, 예컨대 50초 ~ 150초의 반응 시간을 포함한다. 탈보호제는 트리플루오로아세트산, 트리클로로아세트산, 디클로로아세트산 및 모노클로로아세트산 중 1가지 이상으로부터 선택될 수 있다. 몇몇 구현예에서, 탈보호제는 디클로로아세트산이다. 탈보호제 대 고상 보호기 -DMTr(4,4'-디메톡시트리틸)의 몰비는 2 : 1 ~ 100 : 1, 예컨대 3 : 1 ~ 50 : 1일 수 있다. 후속 커플링 반응을 촉진하기 위하여, 반응성을 가지는 하이드록시가 이와 같은 탈보호에 의해 고상 지지체 표면에 수득된다.
커플링 반응 조건 및 커플링제는 전술된 바와 같이 선택될 수 있다. 탈보호 반응에서 생성된 자유 하이드록시는 커플링 반응을 수행함으로써 포스포라미다이트기와 반응하여 포스파이트 에스테르 결합을 형성하게 된다.
몇몇 구현예에서, 캡핑 반응 조건은 0℃ ~ 50℃의 반응 온도, 예컨대 15℃ ~ 35℃의 반응 온도와, 5초 ~ 500초의 반응 시간, 예컨대 10초 ~ 100초의 반응 시간을 포함한다. 캡핑 반응은 캡핑제의 존재하에 수행된다. 캡핑제의 선택과 그 양은 전술된 바와 같다.
산화 반응 조건은 0℃ ~ 50℃의 온도, 예컨대 15℃ ~ 35℃의 온도와, 1초 ~ 100초의 반응 시간, 예컨대 5초 ~ 50초의 반응 시간을 포함할 수 있다. 산화제는, 예컨대 요오드(몇몇 구현예에서는 요오드수로서 제공됨)일 수 있다. 몇몇 구현예에서, 산화제 대 고상 지지체에 결합된 핵산 서열의 몰비는 1 : 1 ~ 100 : 1, 예컨대 5 : 1 ~ 50 : 1이다. 몇몇 구현예에서, 산화 반응은 테트라하이드로푸란 : 물 : 피리딘 비 3 : 1 : 1 ~ 1 : 1 : 3인 혼합 용매 중에서 수행된다.
몇몇 구현예에서, R6은 하기 화학식 B7 또는 B8, 즉
Figure pct00065
로 표시되는 바와 같은 기이되, q2 및 Rk에 관한 정의는 전술된 바와 같다.
이 경우, 화학식 313로 표시되는 바와 같은 화합물은 하기 방법, 즉 화학식 314, 즉
화학식 314
Figure pct00066
로 표시되는 바와 같은 화합물을, 유기 용매 중에서 아미드화 반응 조건 및 아미드화 축합 제제 및 3차 아민의 존재하에 화학식 A-1로 표시되는 바와 같은 화합물 또는 화학식 A-2로 표시되는 바와 같은 화합물, 즉
Figure pct00067
과 접촉시키는 단계; 및 단리하는 단계를 포함하는 방법에 의해 제조될 수 있는데, 단 여기서 n1, n3, m1, m2, m3, R10, R11, R12, R13, R14, R15, L1, S1, q2 및 Rk 에 대한 정의와 선택사양은 각각 전술된 바와 같다.
아미드화 반응 조건은 0℃ ~ 100℃의 반응 온도와 1시간 ~ 48시간의 반응 시간을 포함할 수 있다. 몇몇 구현예에서, 아미드화 반응 조건은 10℃ ~ 40℃의 반응 온도와 2시간 ~ 16시간의 반응 시간을 포함한다.
몇몇 구현예에서, 유기 용매는 알코올 용매, 에폭시 용매, 에테르 용매, 할로알칸 용매, 디메틸 설폭사이드, N,N-디메틸포름아미드 및 N,N-디이소프로필에틸아민중 1가지 이상이다. 몇몇 구현예에서, 알코올 용매는 메탄올, 에탄올 및 프로판올 중 1가지 이상이고, 몇몇 구현예에서는 에탄올이다. 몇몇 구현예에서, 에폭시 용매는 디옥산 및/또는 테트라하이드로푸란이다. 몇몇 구현예에서, 에테르 용매는 디에틸에테르 및/또는 메틸 tert-부틸에테르이다. 몇몇 구현예에서, 할로알칸 용매는 디클로로메탄, 트리클로로메탄 및 1,2-디클로로에탄 중 1가지 이상이다. 몇몇 구현예에서, 유기 용매는 디클로로메탄이다. 유기 용매의 양은 화학식 314로 표시되는 바와 같은 화합물을 기준으로 3 L/mol ~ 50 L/mol 이고, 추가의 구현예에서는 3 L/mol ~ 20 L/mol이다.
몇몇 구현예에서, 아미드화 축합을 위한 제제는 벤조트리아졸-1-일-옥시트리피롤리디노포스포늄 헥사플루오로포스페이트, 3-(디에톡시포스포릴옥시)-1,2,3-벤조트리아진-4(3H)-온, 4-(4,6-디메톡시트리아진-2-일)-4-메틸모폴린 염화수소산염, 2-에톡시-1-에톡시카보닐-1,2-디하이드로퀴놀린(EEDQ) 또는 O-벤조트리아졸-1-일-테트라메틸우로늄 헥사플루오로포스페이트이고, 추가의 구현예에서는 3-(디에톡시포스포릴옥시)-1,2,3-벤조트리아진-4(3H)-온이다. 아미드화 축합을 위한 제제 대 화학식 314로 표시되는 바와 같은 화합물의 몰비는 1 : 1 ~ 10 : 1일 수 있고, 몇몇 구현예에서는 2.5 : 1 ~ 5 : 1일 수 있다.
몇몇 구현예에서, 3차 아민은 트리에틸아민 및/또는 N,N-디이소프로필에틸아민이고, 추가의 구현예에서는 N,N-디이소프로필에틸아민이다. 3차 아민 대 화학식 314로 표시되는 바와 같은 화합물의 몰비는 3 : 1 ~ 20 : 1이고, 몇몇 구현예에서는 5 : 1 ~ 10 : 1이다.
화학식 A-1 및 화학식 A-2로 표시되는 바와 같은 화합물은 임의의 적합한 방법에 의해 제조될 수 있다. 예를 들어 Rk가 DMTr기일 때, 화학식 A-1로 표시되는 바와 같은 화합물은 글리세르산칼슘을 DMTrCl과 반응시킴으로써 제조될 수 있다. 마찬가지로 화학식 A-2로 표시되는 바와 같은 화합물은 사이클릭 무수물과 3-아미노-1,2-프로판디올을 접촉시킨 후, DMTrCl과 반응시킴으로써 제조될 수 있는데, 이때 사이클릭 무수물은 4개 ~ 13개의 탄소 원자를 가질 수 있고, 몇몇 구현예에서는 4개 ~ 8개의 탄소 원자를 가질 수 있다. 당 업자들은, 사이클릭 무수물의 선택이 화학식 A-2로 표시되는 바와 같은 화합물 내 q2에 대한 상이한 값에 대응함을 용이하게 이해할 것이다. 예를 들어 사이클릭 무수물이 숙신산 무수물이면, q2는 1이고; 사이클릭 무수물이 글루타르산 무수물이면, q2는 2인 식이다.
몇몇 변형예에서, 화학식 313로 표시되는 바와 같은 화합물은 또한 화학식 314로 표시되는 바와 같은 화합물을 사이클릭 무수물, 3-아미노-1,2-프로판디올 및 DMTrCl과 순차적으로 반응시킴으로써 제조될 수 있다. 당 업자들은, 이 변형예가 화학식 313로 표시되는 바와 같은 화합물의 구조와 기능에 영향을 미치지 않을 것이고, 상기 방법을 기반으로 하여 당 업자들에 의해 용이하게 달성될 수 있음을 용이하게 이해할 것이다.
마찬가지로 화학식 313로 표시되는 바와 같은 화합물은 임의의 적합한 단리 방법에 의해 반응 혼합물로부터 단리될 수 있다. 몇몇 구현예에서, 화학식 313로 표시되는 바와 같은 화합물은 증발을 통해 용매를 제거한 후 크로마토그래피, 예컨대 2가지 크로마토그래피 조건, 즉 (1) 200 메쉬 ~ 300 메쉬 실리카 겔 충전재와, 석유 에테르 : 아세트산에틸 : 디클로로메탄 : N,N-디메틸포름아미드 용리 구배 1 : 1 : 1 : 0.5 1 : 1 : 1 : 0.6의 순상 정제; 또는 (2) C18 및 C8 역상 충전재와, 메탄올 : 아세토니트릴 용리 구배 0.1 : 1 ~ 1 : 0.1의 역상 정제가 이용되는 크로마토그래피에 의해 단리될 수 있다. 몇몇 구현예에서, 용매는 화학식 313로 표시되는 바와 같은 화합물의 미정제 생성물이 수득되도록 직접 제거될 수 있는데, 이 미정제 생성물은 후속 반응에 직접 사용될 수 있다.
몇몇 구현예에서, 화학식 314로 표시되는 바와 같은 화합물은 하기 방법, 즉 화학식 320, 즉
화학식 320
Figure pct00068
로 표시되는 바와 같은 화합물을, 유기 용매 중에서 축합 반응 조건 및 아미드화 축합을 위한 제제 및 3차 아민의 존재하에서 화학식 316, 즉
화학식 316
Figure pct00069
로 표시되는 바와 같은 화합물을 접촉시키는 단계 및 단리하는 단계를 포함하는 방법에 의해 제조될 수 있는데, 단 여기서 n1, n3, m1, m2, m3, R10, R11, R12, R13, R14 및 R15에 대한 정의와 선택사양은 전술된 바와 같다.
화학식 316로 표시되는 바와 같은 화합물은, 예컨대 문헌[J. Am. Chem. Soc. 2014, 136, 16958-16961]에 개시된 것들일 수 있거나, 또는 화학식 316로 표시되는 바와 같은 화합물은 당 업자들에 의해 다양한 방법을 통해 제조될 수 있다. 예를 들어 화학식 316로 표시되는 바와 같은 화합물 몇몇은 본원에 전체로서 참고문헌으로 첨부되어 있는 미국 특허 제8,106,022 B2호의 실시예 1에 개시된 바와 같은 방법에 따라 제조될 수 있다.
몇몇 구현예에서, 축합 반응 조건은 0℃ ~ 100℃의 반응 온도와 0.1시간 ~ 24시간의 반응 시간을 포함한다. 몇몇 구현예에서, 축합 반응 조건은 10℃ ~ 40℃의 반응 온도와 0.5시간 ~ 16시간의 반응 시간을 포함한다.
화학식 314로 표시되는 바와 같은 원하는 화합물의 구조가 고려되었을 때, 화학식 316로 표시되는 바와 같은 화합물 대 화학식 320로 표시되는 바와 같은 화합물의 몰비는 화학식 320 내 n1 및 n3의 합을 기준으로 확정되어야 한다. 몇몇 구현예에서, 예컨대 n1+n3이 3이면, 반응의 완료 및 반응이 과도하게 진행되지 않도록 보장하기 위해, 화학식 316로 표시되는 바와 같은 화합물 대 화학식 320로 표시되는 바와 같은 화합물의 몰비는 3 : 1 ~ 3.5 : 1일 수 있고, 몇몇 구현예에서는 3.01 : 1 ~ 3.15 : 1일 수 있다.
몇몇 구현예에서, 유기 용매는 아세토니트릴, 에폭시 용매, 에테르 용매, 할로알칸 용매, 디메틸 설폭사이드, N,N-디메틸포름아미드 및 N,N-디이소프로필에틸아민 중 1가지 이상이다. 몇몇 구현예에서, 에폭시 용매는 디옥산 및/또는 테트라하이드로푸란이다. 몇몇 구현예에서, 에테르 용매는 디에틸에테르 및/또는 메틸 tert-부틸에테르이다. 몇몇 구현예에서, 할로알칸 용매는 디클로로메탄, 트리클로로메탄 및 1,2-디클로로에탄 중 1가지 이상이다. 몇몇 구현예에서, 유기 용매는 아세토니트릴이다. 유기 용매의 양은 화학식 320로 표시되는 바와 같은 화합물을 기준으로 3 L/mol ~ 50 L/mol이고, 몇몇 구현예에서는 5 L/mol ~ 20 L/mol이다.
몇몇 구현예에서, 아미드화 축합을 위한 제제는 벤조트리아졸-1-일-옥시트리피롤리디노포스포늄 헥사플루오로포스페이트, 3-(디에톡시포스포릴옥시)-1,2,3-벤조트리아진-4(3H)-온(DEPBT), O-벤조트리아졸-1-일-테트라메틸우로늄 헥사플루오로포스페이트, 4-(4,6-디메톡시트리아진-2-일)-4-메틸모폴린 염화수소산염 또는 1-하이드록시벤조트리아졸이고, 추가의 구현예에서는 헥사플루오로인산벤조트리아졸-1-일-옥시트리피롤리디노포스포늄 및 1-하이드록시벤조트리아졸의 혼합물이되, 벤조트리아졸-1-일-옥시트리피롤리디노포스포늄 헥사플루오로포스페이트(PyBop) 및 1-하이드록시벤조트리아졸은 동몰이다. 아미드화 축합을 위한 전체 제제 대 화학식 316로 표시되는 바와 같은 화합물의 몰비는 1 : 1 ~ 3 : 1일 수 있고, 몇몇 구현예에서는 1.05 : 1 ~ 1.5 : 1이다.
3차 아민은 N-메틸모폴린, 트리에틸아민 또는 N,N-디이소프로필에틸아민일 수 있고, 몇몇 구현예에서는 N-메틸모폴린일 수 있다. 3차 아민 대 화학식 316로 표시되는 바와 같은 화합물의 몰비는 2 : 1 ~ 10 : 1일 수 있고, 몇몇 구현예에서는 2 : 1 ~ 5 : 1이다.
마찬가지로 화학식 314로 표시되는 바와 같은 화합물은 임의의 적합한 단리 방법에 의해 반응 혼합물로부터 단리될 수 있다. 몇몇 구현예에서, 화학식 314로 표시되는 바와 같은 화합물은 증발을 통해 용매를 제거한 후 단리를 위한 크로마토그래피, 예컨대 2가지 크로마토그래피 조건, 즉 (1) 200 메쉬 ~ 300 메쉬 실리카 겔 충전재와, 디클로로메탄 : 메탄올 용리 구배 100 : 5 → 100 : 7의 순상 정제; 및 (2) C18 및 C8 역상 충전재와, 메탄올 : 아세토니트릴 용리 구배 0.1 : 1 → 1 : 0.1의 역상 정제가 이용되는 크로마토그래피에 의해 단리될 수 있다. 몇몇 구현예에서, 용매는 화학식 314로 표시되는 바와 같은 화합물의 미정제 생성물이 수득되도록 직접 제거될 수 있는데, 이 미정제 생성물은 후속 반응에 직접 사용될 수 있다.
화학식 320로 표시되는 바와 같은 화합물은 시판될 수 있거나, 또는 공지의 방법을 통해 당 업자들에 의해 수득될 수 있다. 예를 들어 m1 = m2 = m3 = 3이고, n1 = 1이고, n3 = 2이고, R10, R11, R12, R13, R14 및 R15 모두 H, 화학식 320로 표시되는 바와 같은 화합물은 Alfa Aesar Inc.에 의해 시판되고 있다.
본 발명의 siRNA 컨쥬게이트는 또한 약학적으로 허용 가능한 기타 부형제, 즉 당 분야의 다양한 종래 제형 또는 화합물 중 1가지 이상일 수 있는 기타 부형제와 조합 사용될 수 있다. 자세한 사항은 본 발명의 약학 조성물에 관한 전술된 사항을 참조하시오.
본 발명의 siRNA, 약학 조성물 및 siRNA 컨쥬게이트의 용도
몇몇 구현예에서, 본 발명은 중증근무력증을 치료 및/또는 예방하기 위한 의약품을 제조함에 있어, 본 발명의 siRNA의 용도 및/또는 약학 조성물 및/또는 siRNA 컨쥬게이트를 제공한다.
몇몇 구현예에 따르면, 본 발명은 중증근무력증의 예방 및/또는 치료를 필요로 하는 대상체에, 본 발명의 siRNA 및/또는 약학 조성물 및/또는 siRNA 컨쥬게이트 유효량만큼을 투여하는 단계를 포함하는, 중증근무력증을 예방 및/또는 치료하기 위한 방법을 제공한다.
본 발명의 siRNA의 활성 성분을 중증근무력증의 예방 및/또는 치료를 필요로 하는 대상체에 투여함으로써 RNA 간섭 기작을 기반으로 중증근무력증을 예방 및/또는 치료하기 위한 목적이 달성될 수 있다. 그러므로 본 발명의 siRNA 및/또는 약학 조성물 및/또는 siRNA 컨쥬게이트는 중증근무력증의 예방 및/또는 치료를 위하거나, 또는 중증근무력증의 예방 및/또는 치료를 위한 의약품 제조를 위해 사용될 수 있다.
본원에 사용되는 바와 같은, “투여/투여하다”란 용어는, 본 발명의 siRNA, 약학 조성물 및/또는 siRNA 컨쥬게이트를 적어도 부분적으로나마 원하는 부위에 위치시켜 원하는효과를 발휘시키는 방법 또는 경로에 의해 본 발명의 siRNA, 약학 조성물 및/또는 siRNA 컨쥬게이트를 대상체의 체내에 전달하는 것을 지칭한다. 본 발명의 방법에 적합한 투여 경로는 국소 투여 및 전신 투여를 포함한다. 일반적으로 국소 투여는 대상체의 전신 혈류를 통한 투여에 비하여 더 많은 siRNA 컨쥬게이트를 특정 부위로 전달하는 반면; 전신 투여는 본 발명의 siRNA, 약학 조성물 및/또는 siRNA 컨쥬게이트를, 대상체의 실질적으로 전신의 혈류로 전달한다. 본 발명은 중증근무력증을 예방 및/또는 치료하기 위한 수단을 제공할 수 있음이 고려되었을 때, 몇몇 구현예에서는 간에 약물을 전달할 수 있는 투여 방식이 이용된다.
대상체로의 투여는 당 분야에 공지된 임의의 적합한 경로, 예컨대 경구 또는비경구 경로, 예컨대 정맥내 투여, 근육내 투여, 피하 투여, 경피 투여, 기관지내 투여(에어로졸), 폐내 투여, 비내 투여, 직장 투여 및 국소 투여 경로(예컨대 협측 투여 및 설하 투여 경로)(이에 한정되는 것은 아님)에 의해 달성될 수 있다. 투여 횟수는 매일, 매주, 2주, 3주, 매월, 2개월, 3개월, 6개월 또는 1년에 1회 이상일 수 있다.
본 발명의 siRNA, 약학 조성물 또는 제2 siRNA 컨쥬게이트의 용량은 당 분야에 통상적인 용량일 수 있으며, 이 용량은 다양한 매개변수, 특히 대상체의 나이, 체중 및 성별에 따라서 결정될 수 있다. 독성과 효능은 세포 배양액 또는 실험 동물에서 표준적 약학 방법, 예컨대 LD50(집단 구성원 50%의 사멸을 유발하는 치명적 용량), ED50(정량 반응에서 최대 반응 세기의 50%를 유발할 수 있고, 실험 대상체 50%가 정성 반응에서 긍정적 반응을 보이도록 유도하는 용량), 또는 IC50(정량 반응이 절반만큼 억제될 때의 억제제/의약품의 농도)를 확정함으로써 측정될 수 있다. 인간에 대한 용량 범위는 세포 배양 분석 및 동물 연구로부터 수득된 데이터를 기반으로 추론될 수 있다.
본 발명의 siRNA, 약학 조성물 또는 siRNA 컨쥬게이트가, 예컨대 수컷 또는 암컷 C57BL/6J 마우스(6주령 ~ 12주령, 체중 18 g ~ 25 g)에 투여될 때, 그리고 siRNA의 양을 기반으로 용량이 산정될 때, (i) siRNA 컨쥬게이트의 경우, 이의 siRNA의 투여량은 체중 1 kg당 0.001 mg ~ 100 mg일 수 있고, 추가의 구현예에서는 체중 1 kg당 0.01 mg ~ 50 mg이며, 몇몇 구현예에서는 체중 1 kg당 0.05 mg ~ 20 mg이고, 몇몇 구현예에서는 체중 1 kg당 0.1 mg ~ 15 mg이며, 또 다른 몇몇 구현예에서는 체중 1 kg당 0.1 mg ~ 10 mg이고; (ii) siRNA와 약학적으로 허용 가능한 담체로 생성된 약학 조성물의 경우, 이의 siRNA의 투여량은 체중 1 kg당 0.001 mg ~ 50 mg일 수 있고, 몇몇 구현예에서는 체중 1 kg당 0.01 mg ~ 10 mg이며, 몇몇 구현예에서는 체중 1 kg당 0.05 mg ~ 5 mg이고, 몇몇 구현예에서는 체중 1 kg당 0.1 mg ~ 3 mg이다.
몇몇 구현예에서, 본 발명은 간세포에서 C5 유전자 발현을 억제하기 위한 방법을 제공한다. 본 방법은 본 발명의 siRNA 및/또는 약학 조성물 및/또는 siRNA 컨쥬게이트 유효량만큼을, 간세포와 접촉시키는 단계, 본 발명의 siRNA 및/또는 약학 조성물 및/또는 siRNA 컨쥬게이트를 간세포에 도입하는 단계, 그리고 RNA 간섭 기작을 통해 간세포에서 C5 유전자 발현을 억제하는 목적을 달성하는 단계를 포함한다. 간세포는 SMMC-7721, HepG2, Huh7 및 기타 간종양 세포주 또는 단리된 1차 간세포로부터 선택될 수 있다. 몇몇 구현예에서, 세포는 HepG2 간종양 세포이다.
세포내 C5 발현이 본 발명에 의해 제공되는 방법이 사용됨으로써 억제되는 경우, 제공된 변형 siRNA, 약학 조성물 및/또는 siRNA 컨쥬게이트 중 siRNA의 양은, 통상 표적 유전자의 발현을 감소시키고, 표적 세포 표면상 세포외 농도를 1 pM ~ 1 μM, 또는 0.01 nM ~ 100 nM, 또는 0.05 nM ~ 50 nM, 또는 0.05 nM ~ 약 5 nM로 만들기 충분한 양이다. 이 국소 농도를 달성하는데 필요한 양은 다양한 요인, 예컨대 전달 방법, 전달 부위, 전달 부위와 표적 세포 또는 조직 사이의 세포 층 개수, 전달 경로(국소 또는 전신) 등에 따라 달라질 것이다. 전달 부위에서의 농도는 표적 세포 또는 조직 표면에서의 농도보다 유의미하게 더 높을 수 있다.
키트
본 발명은, 본 발명의 변형 siRNA, 약학 조성물 및 siRNA 컨쥬게이트 중 적어도 1개 유효량만큼을 포함하는 키트를 제공한다.
몇몇 구현예에서, 본원에 개시된 키트는 하나의 용기 안에 변형 siRNA를 제공할 수 있다. 몇몇 구현예에서, 본 발명의 키트는 약학적으로 허용 가능한 부형제를 제공하는 용기를 포함할 수 있다. 몇몇 구현예에서, 본 키트는 추가 성분, 예컨대 안정화제 또는 보존제를 추가로 포함할 수 있다. 몇몇 구현예에서, 본원의 키트는 본원의 변형 siRNA를 제공하는 용기와는 다른 용기에 추가의 치료제 적어도 1가지를 포함할 수 있다. 몇몇 구현예에서, 본 키트는 변형 siRNA와 (존재한다면) 약학적으로 허용 가능한 담체 및/또는 보조제 또는 기타 성분을 혼합하기 위한 지침을 포함할 수 있다.
본 발명의 키트에서 변형 siRNA 및 약학적으로 허용 가능한 담체 및/또는 보조제, 그리고 변형 siRNA, 약학 조성물 및/또는 siRNA 컨쥬게이트 및/또는 약학적으로 허용 가능한 보조제는 임의의 형태, 예컨대 액체 형태, 건조 형태 또는 동결건조 형태로 제공될 수 있다. 몇몇 구현예에서, 변형 siRNA 및 약학적으로 허용 가능한 담체 및/또는 보조제, 그리고 약학 조성물 및/또는 siRNA 컨쥬게이트, 그리고 약학적으로 허용 가능한 선택적 보조제는 실질적으로 순수하고/순수하거나 멸균된 것이다. 몇몇 구현예에서, 멸균수가 본 발명의 키트에 제공될 수 있다.
이하, 본 발명은 실시예에 의해 추가로 기재될 것이지만, 어떠한 관점에서도 이에 제한되지는 않는다.
실시예
달리 명시되지 않는 한, 하기 실시예에 사용된 제제와 배양 배지는 모드 시판되는 것이고, 핵산 전기영동 및 실시간 PCR과 같은 방법에 사용된 절차는 모두 문헌[Molecular Cloning (Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989))]에 기재된 방법에 따라 수행된다.
본 발명에서 합성된, C5 유전자에 대한 siRNA 및 siRNA 컨쥬게이트, 또는 음성 대조군으로서의 siRNA 및 siRNA 컨쥬게이트가 세포를 형질감염할 때 LipofectamineTM2000(Invitrogen)이 형질감염 시약으로 사용되고, 구체적인 조작은 제조자에 의해 제공된 지침을 참조한다.
달리 명시되지 않는 한, 이하 제공된 시약의 비는 모두 부피비(v/v)로 산정된다.
실험 데이터는 모두 X ± SD로 표현되고, 데이터 분석은 Graphpad prism5.0 통계 분석 프로그램을 사용하여 수행된다.
제조 실시예 1. 컨쥬게이트 1의 제조
이 제조 실시예에서, 컨쥬게이트 1(즉 L10-siC5a1M1SP)을 합성하였다. 컨쥬게이트에 공액결합된 siRNA는 표 3의 컨쥬게이트 1에 대응하는 센스 가닥 및 안티센스 가닥 서열을 가진다.
1-1: 화합물 L-10의 합성
하기 방법에 따라서 화합물 L-10을 합성하였다.
Figure pct00070
1-1-1: GAL-5(말단 공액 분자)의 합성
Figure pct00071
1-1-1a: GAL-2의 합성
GAL-1(N-아세틸-D-갈락토사민 염화수소산염, CAS No.: 1772-03-8, Ningbo Hongxiang Bio-Chem Co., Ltd.로부터 구입, 463.8 mmol) 100.0 g을 무수 피리딘 1000 ml에 용해시킨 다음, 이를 얼음물 조에 넣은채 여기에 아세트산 무수물(Enox Inc.로부터 구입, 5565.6 mmol) 540 ml를 첨가한 후, 실온에서 1.5 시간 동안 교반하여 반응시켰다. 생성된 반응 용액을 얼음물 10 L에 붓고 나서, 감압하에 흡인 여과하였다. 잔류물을 얼음물 2 L로 세척한 다음, 아세토니트릴/톨루엔(v/v 비 = 1 : 1)의 혼합 용매와 함께 첨가하여 완전 용해시켰다. 용매를 증발로 제거하였더니, 생성물 GAL-2 130.0 g이 백색 고체로서 수득되었다.
1-1-1b: GAL-3의 합성
단계 1-1-1a에서 수득한 GAL-2(35.1 g, 90.0 mmol)를 무수 1,2-디클로로에탄 213 ml에 용해시킨 다음, 여기에 트리메틸실릴 트리플루오로메탄설폰산염(TMSOTf, CAS No.: 27607-77-8, Macklin Inc.로부터 구입, 108.0 mmol) 24.0 g을 질소 보호하에 얼음물 수조에 첨가하여, 실온에서 밤새도록 반응시켰다.
디클로로메탄 400 ml를 반응 용액에 첨가하여 희석하고 나서, 다이아토마이트로 여과한 후, 중탄산나트륨 포화 수용액 1 L와 함께 첨가한 다음, 고르게 교반하였다. 유기상을 단리하였다. 잔류하는 수성상을, 회당 디클로로에탄 300 ml로 2회 추출하고 나서, 모든 유기상을 합한 후, 중탄산나트륨 포화 수용액 300 ml와 포화 염수 300 ml로 각각 세척하였다. 세척에서 얻어진 유기상을 단리한 다음, 무수 황산나트륨으로 건조하였다. 감압하에 증발로 용매를 제거하였더니, 생성물 GAL-3 26.9 g이 연황색 점성 시럽으로서 수득되었다.
1-1-1c: GAL-4의 합성
단계 1-1-1b에서 수득한 GAL-3(26.9 g, 81.7 mmol)를 무수 1,2-디클로로에탄 136 ml 중에 용해시키고 나서, 무수 4Å 분자체 분말 30 g과 함께 첨가한 후, 5-헥센-1-올(CAS No.: 821-41-0, Adamas-beta Inc.로부터 구입, 89.9 mmol) 9.0 g을 첨가한 다음, 실온에서 30분 동안 교반하였다. TMSOTf(40.9 mmol) 9.08 ml를 얼음조에 넣은채 질소 보호하에 첨가한 후, 실온에서 교반하며 밤새도록 반응시켰다. 4Å 분자체 분말을 여과로 제거하였다. 여과물을 희석하기 위해 디클로로메탄 300 ml와 함께 첨가하고 나서, 다이아토마이트로 여과한 다음, 중탄산나트륨 포화 수용액 500 ml와 함께 첨가하고 나서, 세척하기 위해 10분 동안 교반하였다. 유기상을 단리하였다. 수성상을 디클로로에탄 300 ml로 1회 추출하였다. 유기상 모두를 합한 다음, 중탄산나트륨 포화 수용액 300 ml 및 포화 염수 300 ml로 각각 세척하였다. 세척시 얻어진 유기상을 단리한 다음, 무수 황산나트륨으로 건조하였다. 감압하에 증발로 용매를 제거한 결과, 생성물 GAL-4 41.3 g이 황색 시럽으로서 생성되었는데, 이는 정제 없이 다음 산화 반응에 직접 사용하였다.
1-1-1d: GAL-5의 합성
단계 1-1-1c에 기술된 방법에 따라 수득한 GAL-4(14.9 g, 34.7 mmol)를, 디클로로메탄 77 ml 및 아세토니트릴 77 ml의 혼합 용매에 용해시키고 나서, 각각 탈이온수 103 ml 및 과요오드산나트륨(CAS No.: 7790-28-5, Aladdin Inc.로부터 구입, 138.8 mmol) 29.7 g과 함께 첨가한 후, 얼음조에서 10분 동안 교반하였다. 여기에 삼염화루테늄(CAS No.: 14898-67-0, Energy Chemical로부터 구입, 238 mg, 1.145 mmol)을 첨가하여, 실온에서 밤새 반응시켰다. 생성된 반응 용액에 물 300 ml를 첨가하여 교반하면서 희석한 다음, 여기에 포화 중탄산나트륨을 첨가함으로써 pH를 약 7.5로 조정하였다. 유기상을 단리하여 폐기하였다. 수성상을 3회 추출하였는데, 추출 회당 디클로로메탄 200 ml로 수행하였고, 추출로부터 얻은 유기상은 폐기하였다. 추출로부터 얻은 수성상의 pH를, 시트르산 고체를 사용하여 약 3으로 조정한 후, 3회 추출하였는데, 추출 회당 디클로로메탄 200 ml로 수행하였고, 이때 생성된 유기상들을 합한 후, 무수 황산나트륨으로 건조하였다. 감압하에 증발로 용매를 제거한 결과, 생성물 GAL-5 6.85 g이 백색 거품형 고체로서 수득되었다. 1H NMR(400 MHz, DMSO) δ 12.01(br, 1H), 7.83(d, J = 9.2 Hz, 1H), 5.21(d, J = 3.2 Hz, 1H), 4.96(dd, J = 11.2, 3.2 Hz, 1H), 4.49(d, J = 8.4 Hz, 1H), 4.07 - 3.95(m, 3H), 3.92 - 3.85(m, 1H), 3.74 - 3.67(m, 1H), 3.48 - 3.39(m, 1H), 2.20(t, J = 6.8 Hz, 2H), 2.11(s, 3H), 2.00(s, 3H), 1.90(s, 3H), 1.77(s, 3H), 1.55 - 1.45(m, 4H).
1-1-2: L-8의 합성
Figure pct00072
J-0(9.886 g, 52.5 mmol, AlfaAesar로부터 구입) 및 단계 1-1-1에서 수득한 GAL-5(72.819 g, 162.75 mmol, 다수개의 회분으로부터 생성된 생성물을 합하여 수득)를, 디클로로메탄 525 ml에 용해시키고 나서, 이를 디이소프로필에틸아민(DIEA, 44.782 g, 346.50 mmol), 벤조트리아졸-1-일-옥시트리피롤리디노포스포늄 헥사플루오로포스페이트(PyBop, 90.158 g, 173.25 mmol) 및 하이드록시벤조트리아졸(HOBt, 23.410 g, 173.25 mmol)과 함께 첨가하여, 실온에서 4시간 동안 반응시킨 다음, 세척을 위해 포화 중탄산나트륨 20 ml 및 포화 염수 200 ml와 함께 첨가하였다. 수성상을 2회 추출하였는데, 추출 회당 디클로로메탄 100 ml로 수행하였고, 생성된 유기상들을 합하고 나서, 무수 황산나트륨으로 건조하였다. 감압하에 증발로 용매를 제거하였더니, 미정제 생성물이 수득되었다. 순상 실리카 겔 컬럼(200 메쉬 ~ 300 메쉬)을 사용하여 미정제 생성물을 정제하였다. 실리카 겔의 산성도를 중화하기 위해 컬럼에 트리에틸아민 10wt%과 함께 첨가한 후, 트리에틸아민 1wt‰으로 평형화하고 나서, 디클로로메탄 : 메탄올을 용리시켰다(구배 100: 30 → 100: 40). 용리액을 수집하고 나서, 감압 하에 증발로 용매를 제거한 결과, 순수한 생성물 L-8 38.8 g이 수득되었다. 1H NMR(400 MHz, DMSO) δ 7.84(d, J = 9.0 Hz, 3H), 7.27 - 7.23(m, 1H), 7.13 - 7.18(m, 1H), 5.22(d, J = 3.1 Hz, 3H), 4.97(dd, J = 11.3, 3.1 Hz, 3H), 4.48(d, J = 8.4 Hz, 3H), 4.09 - 3.98(m, 9H), 3.88(dd, J = 19.3, 9.3 Hz, 3H), 3.75 - 3.66(m, 3H), 3.44 - 3.38(m, 3H), 3.17 - 3.30(m, 4H), 3.10 - 2.97(m, 4H), 2.35 - 2.20(m, 6H), 2.15 - 2.08(m, 9H), 2.07 - 1.98(m, 13H), 1.94 - 1.87(m, 9H), 1.81 - 1.74(m, 9H), 1.65 - 1.42(m, 18H). MS m/z: C85H119N7O30, [M+H]+, 이론치: 1477.59, 실측치: 1477.23.
1-1-3a: A-1의 합성
Figure pct00073
DMTrCl(염화4,4'-디메톡시트리틸, 101.65 g, 300 mmol)을 무수 피리딘 1000 ml에 용해시키고 나서, DL-글리세르산칼슘 수화물(28.63 g, 100 mmol)과 함께 첨가하여, 45℃에서 20시간 동안 반응시켰다. 반응 용액을 여과하였다. 잔류물을 DCM 200 ml로 헹군 다음, 여과물을 감압하에 농축 건조하였다. 잔류물을 디클로로메탄 500 ml에 재 용해시키고 나서, 2회 세척하였는데, 세척 회당 0.5 M 트리에틸아민 인산염(pH = 7 ~ 8) 200 ml로 진행하였다. 단리된 수성상을 2회 추출하였는데, 추출 회당 디클로로메탄 200 ml로 진행하였다. 유기상 모두를 합하여, 무수 황산나트륨으로 건조한 후, 여과하였다. 감압 하에 증발로 용매를 제거한 다음, 순상 실리카 겔 컬럼(200 메쉬 ~ 300 메쉬)을 사용하여 잔류물을 정제하였는데, 이때 컬럼에는 석유 에테르 : 아세트산에틸 : 디클로로메탄 : 메탄올을, 구배 1: 1: 1: 0.35 → 1: 1: 1: 0.55로 용리시켰다. 용리물을 수집하고 나서, 감압 하에 증발로 용매를 제거하였다. 잔류물을 디클로로메탄 600 ml 에 재 용해시킨 다음, 0.5 M 트리에틸아민 인산염 200 ml로 1회 세척하였다. 단리된 수성상을, 디클로로메탄 200 ml로 1회 추출하였다. 유기상을 모두 합한 후, 무수 황산나트륨으로 건조하고 나서 여과하였다. 용매를 감압 하에서 증발로, 그리고 감압 하에서 밤새도록 진공 오일 펌프로 제거한 결과, 생성물 A-1 50.7 g이 백색 고체로서 수득되었다. 1H NMR(400 MHz, DMSO-d6) δ 7.46(ddd, J = 6.5, 2.3, 1.1 Hz, 1H), 7.40 - 7.28(m, 7H), 6.89 - 6.81(m, 4H), 4.84(d, J = 5.0 Hz, 1H), 4.36 - 4.24(m, 1H), 4.29(s, 6H), 3.92(dd, J = 12.4, 7.0 Hz, 1H), 3.67(dd, J = 12.3, 7.0 Hz, 1H), 2.52(q, J = 6.3 Hz, 6H), 1.03(t, J = 6.3 Hz, 9H). MS m/z: C24H23O6, [M-H]-, 이론치: 407.15, 실측치: 406.92.
1-1-3b: L-7의 합성
Figure pct00074
단계 1-1-2에서 수득한 L-8(40 g, 27.09 mmol, 다수개의 회분 생성물을 합하여 수득) 및 단계 1-1-3a에서 수득한 A-1(41.418 g, 81.27 mmol)을 혼합한 다음, 디클로로메탄 271 ml에 용해시키고 나서, 3-(디에톡시포스포릴옥시)-1,2,3-벤조트리아진-4(3H)-온(DEPBT, 24.318 g, 81.37 mmol)과 함께 첨가한 다음, 다시 디이소프로필에틸아민(21.007 g, 162.54 mmol)과 함께 첨가하여, 교반하에 25℃에서 1.5시간 동안 반응시켰다. 유기상을 포화 중탄산나트륨 800 ml로 세척하였다. 단리한 수성상을 3회 추출하였는데, 추출 회당 디클로로메탄 50 ml로 진행하였다. 유기상을 포화 염수 150 ml로 세척한 다음, 수성상을 디클로로메탄 50 ml로 1회 추출하였다. 생성된 유기상들을 합한 다음, 무수 황산나트륨으로 건조하였다. 감압하에 증발로 용매를 제거한 후, 잔류물을 밤새도록 진공 오일 펌프로 거품 건조한 결과, 미정제 생성물이 수득되었다. 미정제 생성물을 컬럼 정제하였다. 컬럼을 순상 실리카 겔(200 메쉬 ~ 300 메쉬) 2 kg으로 충전한 후, 실리카 겔의 산도를 중화하기 위해 트리에틸아민 200 ml와 함께 첨가한 다음, 트리에틸아민 1wt%를 함유하는 석유 에테르로 평형화하여, 석유 에테르 : 아세트산에틸 : 디클로로메탄 : N,N-디메틸포름아미드를, 구배 1 : 1 : 1 : 0.5 → 1 : 1 : 1 : 0.6로 용리시켰다. 용리액을 수집하고 나서, 감압하에 증발로 용매를 제거하였더니, 순수한 생성물 L-7 40.4 g이 수득되었다. 1H NMR(400 MHz, DMSO) δ7.90 - 7.78(m, 4H), 7.75 - 7.64(m, 1H), 7.38 - 7.18(m, 9H), 6.91 - 6.83(m, 4H), 5.25 - 5.10(m, 4H), 4.97(dd, J = 11.2, 3.2 Hz, 3H), 4.48 - 4.30(m, 4H), 4.02(s, 9H), 3.93 - 3.84(m, 3H), 3.76 - 3.66(m, 9H), 3.45 - 3.35(m, 3H), 3.24 - 2.98(m, 10H), 2.30 - 2.20(m, 2H), 2.11 - 1.88(m, 31H), 1.80 - 1.40(m, 28H). MS m/z: C90H128N7O35, [M-DMTr]+, 이론치: 1564.65, 실측치: 1564.88.
1-1-4: L-9의 합성
Figure pct00075
단계 1-1-3b에서 수득한 L-7(40 g, 21.4247 mmol), 숙신산 무수물(4.288 g, 42.8494 mmol) 및 4-디메틸아미노피리딘(DMAP, 5.235 g, 42.8494 mmol)을 혼합한 다음, 디클로로메탄 215 ml에 용해시키고 나서, 디이소프로필에틸아민(DIPEA, 13.845 g, 107.1235 mmol)과 함께 다시 첨가하여, 25℃에서 24시간 동안 교반하였다. 반응 용액을 0.5 M 트리에틸아민 인산염 800 ml 로 세척하였다. 수성상을 3회 추출하였는데, 추출 회당 디클로로메탄 5 ml로 진행하였다. 유기상 모두를 합하고 나서, 감압하에 용매를 증발시켰더니, 미정제 생성물이 수득되었다. 미정제 생성물을 컬럼 정제하였다. 컬럼을 순상 실리카 겔(200 메쉬 ~ 300 메쉬) 1 kg로 충전한 다음, 실리카 겔의 산성도를 중화하기 위해 트리에틸아민 1 wt%와 함께 첨가한 후, 디클로로메탄으로 평형화하고 나서, 1 wt% 트리에틸아민 함유 디클로로메탄 : 메탄올을, 구배 100 : 18 → 100 : 20으로 용리시켰다. 용리액을 수집하고 나서, 감압하에 용매를 증발시켰더니, L-9 공액 분자의 순수한 생성물 31.0 g이 수득되었다. 1H NMR(400 MHz, DMSO) δ 8.58(d, J = 4.2 Hz, 1H), 7.94 - 7.82(m, 3H), 7.41 - 7.29(m, 5H), 7.22(d, J = 8.1 Hz, 5H), 6.89(d, J = 8.3 Hz, 4H), 5.49 - 5.37(m, 1H), 5.21(d, J = 3.0 Hz, 3H), 4.97(d, J = 11.1 Hz, 3H), 4.49(d, J = 8.2 Hz, 3H), 4.02(s, 9H), 3.88(dd, J = 19.4, 9.4 Hz, 3H), 3.77 - 3.65(m, 9H), 3.50 - 3.39(m, 6H), 3.11 - 2.90(m, 5H), 2.61 - 2.54(m, 4H), 2.47 - 2.41(m, 2H), 2.26 - 2.17(m, 2H), 2.15 - 1.95(m, 22H), 1.92 - 1.84(m, 9H), 1.80 - 1.70(m, 10H), 1.65 - 1.35(m, 17H), 1.31 - 1.19(m, 4H), 0.96(t, J = 7.1 Hz, 9H). MS m/z: C94H132N7O38, [M-DMTr]+, 이론치: 1664.72, 실측치: 1665.03.
1-1-5: 화합물 L-10의 합성
Figure pct00076
이 단계에서는 L-9 공액 분자를 고상 지지체에 결합시켜 화합물 L-10을 제조하였다.
단계 1-1-4에서 수득한 L-9 공액 분자(22.751 g, 11 mmol), O-벤조트리아졸-1-일-테트라메틸우로늄 헥사플루오로인산염 (HBTU, 6.257 g, 16.5 mmol) 및 디이소프로필에틸아민(DIEA, 2.843 g, 22 mmol)을 혼합한 다음, 아세토니트릴 900 ml에 용해시키고 나서, 실온에서 5분 동안 교반하였다. 아미노메틸 수지(88 g, 100 메쉬 ~ 200 메쉬, 아미노 부하량: 400 μmol/g, Tianjin Nankai HECHENG S&T Co., Ltd.로부터 구입)를 반응액에 첨가하였다. 25℃의 진탕기(150 rpm/min) 상에서 18시간 동안 반응을 수행한 다음, 여과하였다. 잔류물을 2회 헹구었는데, 매회 헹굴때마다 DCM 300 ml로 진행하였고, 3회 더 헹구었는데, 매회 헹굴때마다 아세토니트릴 300 ml로 진행한 후, 18시간 동안 진공 오일 펌프로 건조하였다. 그 다음, 표 2에 보인 충전비(charge ratio)에 따라 출발 재료들(CapA, CapB, 4-디메틸아미노피리딘(DMAP) 및 아세토니트릴)을 첨가하여 캡핑 반응을 수행하였다. 25℃의 진탕기(150 rpm/min) 상에서 5시간 동안 반응을 수행하였다. 반응액을 여과하였다. 여과물을 3회 헹구었는데, 매회 헹굴때마다 아세토니트릴 300 ml로 진행하였고, 용매를 증발시켜 건조하였고, 혼합물을 감압하에 밤새도록 진공 오일 펌프로 건조하였더니, 화합물 L-10(즉 고상 지지체에 결합한 L-9 공액 분자) 102 g이 수득되었다(이때의 부하량 = 90.8 μmol/g).
표 2
Figure pct00077
상기 표에서, CapA 및 CapB는 캡핑제의 용액이다. CapA는 피리딘/아세토니트릴의 혼합물 중 N-메틸이미다졸 20 부피% 용액으로서, 피리딘 대 아세토니트릴의 부피비는 3 : 5였다. CapB는 아세토니트릴 중 아세트산 무수물 20 부피% 용액이다.
1-2: 컨쥬게이트 1의 센스 가닥 합성
상기 단계에서 제조한 화합물 L-10으로 사이클을 개시하여, 고상 포스포라미다이트 방법에 의해 센스 가닥내 뉴클레오티드 정렬 순서에 따라 뉴클레오시드 단량체를 3' → 5' 방향으로 하나씩 결합시켜, 표 3의 컨쥬게이트 1 센스 가닥 SS를 합성하였다. 각각의 뉴클레오시드 단량체 결합에는, 탈보호, 커플링, 캡핑 및 산화 또는 가황으로 구성된 4단계 반응이 포함되었다. 뉴클레오티드 2개가 포스포에스테르를 통해 결합하면, 후기 뉴클레오시드 단량체 결합 도중에 탈보호, 커플링, 캡핑 및 산화로 구성된 4단계 반응이 포함되었다. 뉴클레오티드 2개가 포스포로티오에이트를 통해 결합하면, 후기 뉴클레오시드 단량체 결합 도중에 탈보호, 커플링, 캡핑 및 가황으로 구성된 4단계 반응이 포함되었다. 합성 조건은 이하와 같이 제공되었다.
뉴클레오시드 단량체는 0.1 M 아세토니트릴 용액 중에 제공되었다. 각각의 단계에서의 탈보호 반응 조건은 동일하였는데, 즉 온도는 25℃, 반응 시간은 70초, 탈보호제는 디클로로메탄 중 디클로로아세트산 용액(3% v/v), 그리고 디클로로아세트산 대 고상 지지체상 보호기 4,4'-디메톡시트리틸의 몰비는 5 : 1이었다.
각각의 단계에 있어 커플링 반응 조건은 동일하였는데, 즉 온도는 25℃, 고상 지지체에 결합된 핵산 서열 대 뉴클레오시드 단량체의 몰비는 1 : 10, 고상 지지체에 결합된 핵산 서열 대 커플링제의 몰비 1 : 65, 반응 시간 600초, 그리고 커플링제는 5-에틸티오-1H-테트라졸(ETT)의 0.5 M 아세토니트릴 용액이었다.
각각의 단계에 있어 캡핑 반응 조건은 동일하였는데, 즉 온도는 25℃, 반응 시간은 15초였다. 캡핑제는 Cap A 및 Cap B의 혼합 용액(몰비 1 : 1)이었고, 캡핑제 대 고상 지지체에 결합된 핵산 서열의 몰비는 1 : 1 : 1(무수물 : N-메틸이미다졸 : 고상 지지체에 결합된 핵산 서열)이었다.
각각의 단계에 있어 산화 반응 조건은 동일하였는데, 즉 온도는 25℃, 반응 시간은 15초였고, 산화제는 0.05 M 요오드수였다. 요오드 대 커플링 단계에서 고상 지지체에 결합된 핵산 서열의 몰비는 30 : 1이었다. 테트라하이드로푸란 : 물 : 피리딘의 비가 3 : 1 : 1인 혼합 용매중에서 반응을 수행하였다.
각각의 단계에 있어 가황 반응 조건은 동일하였는데, 즉 온도는 25℃, 반응 시간은 300초였고, 가황제는 수소화잔탄이었다. 가황제 대 커플링 단계에서 고상 지지체에 결합된 핵산 서열의 몰비는 120 : 1이었다. 아세토니트릴 : 피리딘의 비가 1 : 1인 혼합 용매중에서 반응을 수행하였다.
마지막 뉴클레오시드 단량체가 결합하고 나서, 고상 지지체에 결합된 핵산 서열을 절단하여, 차례로 탈보호, 정제 및 탈염한 다음, 동결 건조한 결과, 센스 가닥이 수득되었는데,
절단 및 탈보호 조건은 이하와 같았다: 지지체에 결합된 합성 뉴클레오티드 서열을 수성 암모니아 25 wt%에 첨가하여, 55℃에서 16시간 동안 반응시켰는데, 이때 수성 암모니아의 양은 0.5 ml/μmol이었고; 지지체를 제거하기 위해 여과하였으며, 상청액을 진공하에 농축 건조하였다.
정제 및 탈염 조건은 이하와 같았다: NaCl이 구배를 보이며 용리되는 예비 이온 크로마토그래피 컬럼(Source 15Q)을 사용하여 핵산을 정제하였다. 구체적으로 용리액 A: 20 mM 인산나트륨(pH 8.1), 용매: 물/아세토니트릴 9 : 1(v/v); 용리액 B: 1.5 M 염화나트륨, 20 mM 인산나트륨(pH 8.1), 용매: 물/아세토니트릴 9 : 1(v/v); 용리 구배: 용리액 A : 용리액 B 100 : 0 → 50 : 50. 용리액을 수집하여 합한 다음, 역상 크로마토그래피 정제 컬럼을 사용하여 탈염하였다. 구체적인 조건은, Sephadex 컬럼(충전재: Sephadex-G25)(탈염용) 및 탈이온수(용리용)의 사용을 포함하였다.
검출 방법은 이하와 같았다: 이온 교환 크로마토그래피(IEX-HPLC)에 의해 상기 센스 가닥의 순도를 확정한 다음, 액체 크로마토그래피-질량 분광분석법(LC-MS)에 의해 분자량을 분석하였다. 측정치는 이론치와 일치하였는데, 이는 3'-말단에서 L-9 공액 분자와 공액결합된 센스 가닥 SS가 합성되었음을 나타낸다.
1-3: 컨쥬게이트 1의 안티센스 가닥 합성
고상 포스포라미다이트 방법에 따라 보편적 고상 지지체(UnyLinkerTM 로딩 NittoPhase®HL 고상 지지체, Kinovate Life Sciences Inc.)를 사용하여 사이클을 개시함으로써, 표 3에 제시된 컨쥬게이트 1의 안티센스 가닥 AS를 합성하였다. 고상 합성 방법에 있어 탈보호, 커플링, 캡핑, 산화 또는 가황 반응 조건, 절단 및 탈보호 조건, 정제 및 탈염 조건을 센스 가닥 합성시의 조건과 동일한 조건으로 조성하였다. 다만, 차이점은 안티센스 가닥이 5'-말단 첫 번째 뉴클레오티드에 5'-인산을 가진다는 점이다. 따라서, 고상 포스포라미다이트 방법에 따라 안티센스 가닥을 제조하는 방법에 있어, 안티센스 가닥의 마지막 뉴클레오시드 단량체가 결합된 후, CPR-I 단량체(Suzhou GenePharma, Article No. Cat#13-2601-XX)를 안티센스 가닥의 5'-말단에 결합시킨 후, 4단계, 즉 탈보호, 커플링, 캡핑 및 산화 단계에 의해 5'-포스포에스테르 변형을 달성하였다.
CPR-I
Figure pct00078
이 결합에 있어, 적용된 탈보호, 커플링, 캡핑 및 산화 반응 조건, 절단 및 탈보호 조건, 정제 및 탈염 조건은 센스 가닥 합성시 조건들과 동일하였다. 잔류물을 동결 건조한 결과, 안티센스 가닥이 수득되었다. 이온 교환 크로마토그래피(IEX-HPLC)에 의해 안티센스 가닥의 순도를 확정하였고, 액체 크로마토그래피-질량 분광분석법(LC-MS)에 의해 분자량을 분석하였다. 측정치는 이론치와 일치하였는데, 이는 표적 서열을 가지는 안티센스 가닥 AS가 합성되었음을 나타낸다.
1-4: 컨쥬게이트 1의 합성
주사를 위해 센스 가닥 및 안티센스 가닥 각각을 물에 용해시켜, 40 mg/mL의 용액을 수득하였으며, 이를 동몰비로 혼합한 다음, 50℃에서 15분 동안 가열하고 나서, 실온으로 냉각시킨 결과, 어닐링된 생성물을 수득하였으며, 그 다음 이를 동결건조시켜 동결건조 분말을 수득하였다. 컨쥬게이트를, 농도 0.2 mg/mL가 되도록 초순수(비저항 18.2 MΩ*cm(25℃)에서 Milli-Q 초순수 장치로 제조)로 희석하였다. 액체 크로마토그래피-질량 분광분석법(LC-MS, Waters Corp.로부터 구입, 모델명: LCT Premier)으로 분자량을 측정하였다. 측정치는 이론치와 일치하였던 것으로 보아, 합성된 컨쥬게이트 1은 L-9 공액 분자로 디자인한 관심 이중 가닥 핵산 서열임이 확인되었다. 컨쥬게이트 1의 구조는 화학식 403로 표시된 바와 같았으며, 공액결합한 siRNA 서열은 표 3에 보인 컨쥬게이트 1(즉 L10-siC5a1M1SP)의 서열과 대응하였다
제조 실시예 2: 컨쥬게이트 2 ~ 8의 제조
제조 실시예 1에서의 방법과 동일한 방법에 의해 표 3에 보인 컨쥬게이트 2 ~ 6을 합성하였으며, 분자량을 확정하였다. 다만, 차이점은 본 합성에 사용된 센스 가닥과 안티센스 가닥의 서열들이 컨쥬게이트 2, 컨쥬게이트 3, 컨쥬게이트 4, 컨쥬게이트 5 또는 컨쥬게이트 6 각각에 공액결합되어 있는 siRNA의 센스 가닥들과 안티센스 가닥들에 대응하는, 표 3에 보인 서열들인 관계로, 컨쥬게이트 2 ~ 6 각각이 수득되었다는 점이다.
표 3에 보인 컨쥬게이트 7 ~ 8은 제조 실시예 1에서의 방법과 동일한 방법으로 합성하였고, 분자량을 확정하였다. 다만, 차이점은 본 합성에 사용된 센스 가닥과 안티센스 가닥의 서열들이 컨쥬게이트 7 또는 컨쥬게이트 8 각각에 공액결합되어 있는 siRNA의 센스 가닥들과 안티센스 가닥들에 대응하는, 표 3에 보인 서열들이되, 단 컨쥬게이트 7 및 컨쥬게이트 8의 안티센스 가닥은, 안티센스 가닥의 안티센스 가닥과는 비교되게, 자체의 5'-말단 첫 번째 뉴클레오티드에 5'-인산을 가지지 않았다는 점이다. 따라서 고상 포스포라미다이트 방법에 따라 안티센스 가닥을 제조하는 방법에 있어, 안티센스 가닥의 마지막 뉴클레오시드 단량체 결합 후 CPR-I 단량체를 결합시켜, 컨쥬게이트 7 ~ 8 각각을 수득할 필요는 없다.
표 3은 siRNA 컨쥬게이트 번호와 서열 조성을 나열하고 있다.
표 3
Figure pct00079
Figure pct00080
제조 실시예 3: siRNA 서열의 합성
표 4a에 보인 siRNA 1은, 제조 실시예 1에서의 방법과 동일한 방법에 의해 합성하였는데, 다만, 차이점은
1) 센스 가닥의 경우, 보편적 고상 지지체(UnyLinkerTM 로딩 NittoPhase®HL 고체 지지체, Kinovate Life Sciences Inc.)를 사용하여 사이클을 개시하였고;
2) 안티센스 가닥의 경우, 컨쥬게이트 1에 공액결합된 siRNA의 안티센스 가닥 서열과는 비교되게, siRNA 1의 5'-말단 첫 번째 뉴클레오티드가 5'-인산을 가지지 않았다는 점이다. 따라서, 고상 포스포라미다이트 방법에 따라 안티센스 가닥을 제조하는 방법에 있어, 안티센스 가닥의 마지막 뉴클레오시드 단량체를 결합시킨 후, CPR-I 단량체를 결합시킬 필요는 없었다.
이러한 방식으로, siRNA 1을 제조하였다.
siRNA 1을 제조함에 있어서의 방법과 동일한 방법에 의해 siRNA 2 ~ 6을 합성하였는데, 다만, 차이점은 본 합성에 사용된 siRNA의 센스 가닥과 안티센스 가닥의 서열이 siRNA 2, siRNA 3, siRNA 4, siRNA 5 또는 siRNA 6의 센스가닥 및 안티센스 가닥 각각에 대응하는, 표 4에 보인 서열로서, siRNA 2 ~ 6 각각이 수득되었다는 점이다.
표 4a는 siRNA 번호와 siRNA 서열 조성을 나열하고 있다.
표 4a
Figure pct00081
제조 실시예 4: Cy5-표지화 siRNA 컨쥬게이트 및 Cy5-표지화 siRNA의 합성
4-1: Cy5-컨쥬게이트 1 및 Cy5-컨쥬게이트 2의 합성
표 4b에 보인 Cy5-컨쥬게이트 1은 제조 실시예 1에서의 방법과 동일한 방법으로 합성하였고, 분자량을 확정하였다. 다만, 차이점은 본 합성에 사용된 센스 가닥과 안티센스 가닥의 서열들이 Cy5-컨쥬게이트 1에 공액결합된 siRNA의 센스 가닥 및 안티센스 가닥에 대응하는, 표 4b에 보인 서열들이되, (1) Cy5 형광기는 Cy5-컨쥬게이트 1에 공액결합된 siRNA의 센스 가닥 5'-말단에 공유 결합되었고[그러므로 센스 가닥의 마지막 뉴클레오시드 단량체를 결합시킨 후, 제조 실시예 1의 단계 1-2에 기재된 고상 포스포라미다이트 방법에 따라 센스 가닥을 제조하는 방법에 있어, Cy5 포스포라미다이트 단량체(Shanghai HonGene Biotech로부터 구입, 물품 번호 OP-057)는 탈보호, 커플링, 캡핑 및 산화로 구성된 4단계 반응을 통해 센스 가닥의 5'-말단에 결합하여야 함]; (2) Cy5-컨쥬게이트 1에 공액결합된 siRNA의 5'-말단 첫 번째 뉴클레오티드는 5'-인산을 가지지 않아서, 제조 실시예 1의 단계 1-3에 기재된 고상 포스포라미다이트 방법에 따라 안티센스 가닥을 제조하는 방법에 있어 안티센스 가닥의 마지막 뉴클레오시드 단량체를 결합시킨 후, CPR-I 단량체를 결합시킬 필요가 없었다는 점이다.
Cy5 포스포라미다이트 단량체
Figure pct00082
Cy5 포스포라미다이트 단량체를 센스 가닥의 5'-말단에 결합시키는 방법에 있어, 이에 적용된 탈보호, 커플링, 캡핑 및 산화 반응 조건은 제조 실시예 1의 단계 1-2의 센스 가닥 합성에 기재된 바와 동일하였는데, 다만, 차이점은 1) 탈보호 반응 시간이 300초로 연장하였고; 2) Cy5 커플링 반응 시간은 900초로 연장하였다는 점이다.
그 다음, 센스 가닥의 절단 및 탈보호 조건은 이하와 같았다: 지지체와 결합한 합성 뉴클레오티드 서열을 AMA 용액(40wt% 메틸아민 수용액 및 25wt% 암모니아수의 혼합 용액(부피비 = 1 : 1))에 첨가한 다음(이때 AMA 용액의 양은 0.5 ml/μmol), 25℃ 수조에서 2시간 동안 반응시키고 나서, 잔류하는 지지체를 여과로 제거한 후, 상청액을 농축시켜 진공 하에 건조하였다. 센스 가닥의 정제 및 탈염 조건은, 제조 실시예 1의 단계 1-2에서 센스 가닥을 합성할 때의 조건과 동일하였다. 그 다음, 잔류물을 동결 건조하여, Cy5-컨쥬게이트 1의 센스 가닥을 수득하였다.
이로써, Cy5-컨쥬게이트 1이 수득되었고, Cy5 형광기가 siRNA 컨쥬게이트의 siRNA 센스 가닥 5'-말단에 공유 결합되었는데, 이때 siRNA 컨쥬게이트는 Cy5-컨쥬게이트 1의 것과 대응하는, 표 4b에 보인 센스 가닥 및 안티센스 가닥 서열을 가졌다.
Cy5-컨쥬게이트 2는 Cy5-컨쥬게이트 1을 제조함에 있어 사용된 방법과 동일한 방법으로 제조하였고, 분자량을 확정하였다. 다만, 차이점은 본 합성에 사용된 센스 가닥들과 안티센스 가닥들의 서열들은 표 4b에 보인 서열들로서, 각각 Cy5-컨쥬게이트 2에 공액결합된 siRNA의 센스 가닥 및 안티센스 가닥에 대응하는 서열들이었고, 이로써 Cy5-컨쥬게이트 2를 수득하였다.
4-2: Cy5-siRNA 1 및 Cy5-siRNA 2의 합성
Cy5-siRNA 1은 Cy5-컨쥬게이트 1을 제조함에 있어 사용된 방법과 동일한 방법으로 제조하였고, 분자량을 확정하였다. 다만, 차이점은 보편적 고상 지지체(UnyLinkerTM 로딩 NittoPhase®HL 고상 지지체, Kinovate Life Sciences Inc.)를 사용하여 사이클을 개시함으로써 Cy5-siRNA 1을 수득하였다는 점이다.
Cy5-siRNA 2는 Cy5-siRNA 1을 제조함에 있어 사용된 방법과 동일한 방법에 의해 제조하였고, 분자량을 확정하였다. 다만, 차이점은 본 합성에 사용된 센스 가닥과 안티센스 가닥의 서열들 각각은 Cy5-siRNA의 센스 가닥 및 안티센스 가닥에 대응하는, 표 4b에 보인 서열들로서, Cy5-siRNA 2가 수득되었다는 점이다.
표 4b는 Cy5-컨쥬게이트 1, Cy5-컨쥬게이트 2, Cy5-siRNA 1 및 Cy5-siRNA 2의 siRNA 서열 및 번호를 나열하고 있다.
표 4b
Figure pct00083
실험 실시예 1: siRNA 컨쥬게이트에 의한, HepG2 세포내 C5 mRNA의 IC50 확정
HepG2 세포(Nanjing COBIOER Biotechnology Co., Ltd.로부터 구입)를, 37℃ 및 항온처리기(5% CO2/95% 공기 함유) 내에서 10% 소 태아 혈청(FBS, RMBIO 컴퍼니) 및 0.2v% 페니실린-스트렙토마이신(HyClone 컴퍼니)을 함유하는 H-DMEM 완전 배지(HyClone 컴퍼니)에서 배양하였다.
HepG2 세포를 24웰 평판에 접종하였다(7x104개 세포/웰). 16시간 후, 세포 성장 밀도가 70% ~ 80%에 이르렀을 때, 배양 웰 내 H-DMEM 완전 배지를 흡인하였으며, 각각의 웰에 Opti-MEM 배지(GIBCO 컴퍼니) 500 μl를 첨가하여, 1.5 시간 동안 배양을 계속 진행하였다.
컨쥬게이트 1, 컨쥬게이트 2, 컨쥬게이트 3, 컨쥬게이트 4, 컨쥬게이트 5, 컨쥬게이트 6, 컨쥬게이트 7 및 컨쥬게이트 8 각각을 컨쥬게이트 작업 용액(working solution)으로 제조하였는데, 단 각각에 DEPC 수를 사용하여 7가지의 상이한 농도(siRNA 양을 기준으로 20 μM, 5 μM, 1.25 μM, 0.313 μM, 0.0781 μM, 0.0195 μM 및 0.0049 μM)를 조성하여 적용하였다.
각각의 컨쥬게이트에 대해 A1 ~ A7 용액을 제조하였으며, 각각의 용액은 전술한 바와 같은 7가지 농도가 차례로 적용된 컨쥬게이트 작업 용액 3 μl와 Opti-MEM 배지 50 μl를 함유하였다.
각각의 컨쥬게이트에 대해 B 용액을 별도로 제조하였으며, 각각의 B 용액은 LipofectamineTM 2000 1 μl와 Opti-MEM 배지 50 μl를 함유하였다.
각각의 컨쥬게이트에 대해 B 용액 1부와 A1 ~ A7 용액 1부(portion)씩을 차례로 혼합하고 나서, 실온에서 20분 동안 항온처리한 결과, 형질감염 복합체 X1 ~ X7이 수득되었다. 각각의 형질감염 복합체에 대해 2부씩을 준비하였다.
B 용액 1부를 Opti-MEM 배지 50 μl와 혼합한 다음, 실온에서 20분 동안 항온처리한 결과, 형질감염 복합체 X8이 수득되었다. 형질감염 복합체 4부를 준비하였다.
각각의 컨쥬게이트에 대응하는 형질감염 복합체 X1 ~ X7을 상기 배양 웰에 첨가하여 HepG2 세포를 배양하였고, 이를 웰당 100 μl만큼의 양으로 첨가하여 고르게 혼합한 결과, (siRNA를 기반으로 한) 최종 농도 각각 100 nM, 25 nM, 6.25 nM, 1.56 nM, 0.391 nM, 0.098 nM 및 0.024 nM인 형질감염 혼합물들이 수득되었다. 동일 농도의 형질감염 복합체 X1 ~ X7 2개씩을 상이한 배양액에 첨가하여, 시험군 1 ~ 7로 명명한 컨쥬게이트 함유 형질감염 혼합물들을 수득하였다.
또 다른 배양 웰 4개에는 형질감염 복합체 X8 1부를 웰당 100 μl로 첨가하였고, 그 결과 컨쥬게이트를 함유하지 않는 형질감염 혼합물이 수득되었는데, 이를 대조군이라 명명하였다.
컨쥬게이트를 함유하는 형질감염 혼합물과 컨쥬게이트를 함유하지 않는 형질감염 혼합물을, 배양 웰 내에서 세포와 함께 4시간 동안 항온처리한 후, 각각의 웰에 20% FBS를 함유하는 H-DMEM 완전 배지 1 ml를 보충하였다. 24웰 평판을, 5% CO2/95% 공기를 함유하는 항온처리기에 24시간 동안 넣어두었다.
그 다음, 본원에 기재된 총 RNA 추출 조작 단계에 따라서, RNAVzol(Vigorous Biotechnology Beijing Co., Ltd.로부터 구입, 물품 No. N002)를 사용하여, 각각의 웰에 있는 세포의 총 RNA를 추출하였다.
총 RNA 1 μg을 각각의 웰에 있는 세포용 역 전사 주형으로서 취하였고, 역전사 키트 GoldenstarTM RT6 cDNA 합성 키트(Beijing Tsingke Biotechnology Co., Ltd.로부터 구입, 물품 No. TSK301M)에 의해 제공된 시약을 사용하였는데(이때 GoldenstarTM Oligo(dT)17을 프라이머로 사용함), 역전사 반응 시스템 20 μl는 키트 매뉴얼에 있는 역전사 조작 단계에 따라 구성하여, 각각의 웰에 있는 세포의 총 RNA를 역전사시켰다. 역전사 조건은 이하와 같았다: 역전사 반응 시스템을 50℃에서 50분 동안 항온처리한 다음, 85℃에서 5분 동안 항온처리하고 나서, 마지막으로 4℃에서 30초 동안 항온처리하였다. 반응 후, DEPC 수 80 μl를 역전사 반응 시스템에 첨가하여, cDNA 함유 용액을 수득하였다.
각각의 역전사 반응 시스템에 있어 cDNA 함유 용액 5 μl를 qPCR 주형으로서 취하였으며, NovoStart® SYBR qPCR SuperMix Plus(Novoprotein Science and Technology Co., Ltd.로부터 구입, 물품 No. E096-01B)에 의해 제공된 시약을 사용하여 qPCR 반응 시스템 20 μl을 준비하였는데, 표적 유전자 C5를 증폭하기 위한 PCR 프라이머 서열과 내부 기준 유전자 GAPDH를 표 5에 보였으며, 각각의 프라이머의 최종 농도는 0.25 μM이었다. qPCR 반응 시스템을 ABI StepOnePlus 실시간 PCR 장치에 넣은 후, 3단계 방법으로 증폭하였다. 증폭 과정은, “95℃에서 10분 동안 예비 변성 → 95℃에서 30초 동안 변성 → 60℃에서 30초 동안 어닐링 → 72℃에서 30초 동안 신장”이었다. 상기 변성, 어닐링 및 신장 과정을 40회 반복함으로써, 증폭 표적 유전자 C5 및 내부 기준 유전자 GAPDH를 함유하는 생성물 W를 수득하였다. 그 다음, 생성물 W를 “95℃에서 15초 동안 → 60℃에서 1분 동안 → 95℃에서 15초 동안”의 순서로 항온처리하였다. 생성물 W 중 표적 유전자 C5 및 내부 기준 유전자 GAPDH의 용해 곡선을 실시간 형광 정량 PCR로 작성하였고, 표적 유전자 C5 및 내부 기준 유전자 GAPDH의 Ct 값들을 수득하였다.
표 5
Figure pct00084
비교 Ct(ΔΔCt) 방법을 사용하여, 각각의 시험군 및 대조군 중 표적 유전자 C5의 상대적 발현량을 산정하였다. 산정 방법은 이하와 같았다:
ΔCt(시험군) = Ct(시험군의 표적 유전자) - Ct(시험군의 내부 기준 유전자)
ΔCt(대조군) = Ct(대조군의 표적 유전자) - Ct(대조군의 내부 기준 유전자)
ΔΔCt(시험군) = ΔCt(시험군) - ΔCt(대조군)
ΔΔCt(대조군) = ΔCt(대조군) - ΔCt(대조군의 평균값)
[단 여기서 ΔCt(대조군의 평균값)는 대조군 배양웰 4개 각각의 ΔCt(대조군)의 산술적 평균값임]
그러므로 각각의 시험군의 각각의 배양웰은 ΔΔCt(시험군) 1개와 대응하였고, 대조군의 각각의 배양웰은 ΔΔCt(대조군) 1개와 대응하였다.
대조군을 기반으로, 시험군의 C5 mRNA 발현 수준을 정규화하였으며, 대조군의 C5 mRNA 발현 수준을 100%로 규정하였다.
시험군 내 C5 mRNA의 상대적 발현 수준 = 2(-ΔΔCt(시험군)) × 100%
상이한 컨쥬게이트(컨쥬게이트 1 ~ 8)로 형질감염시킨 HepG2 세포 내 C5 mRNA의 상대적 발현 수준에 따라서, 도 1a ~ 도 1h에 보인 컨쥬게이트 1 ~ 8의 용량-반응 곡선을, 로그(억제제) vs. 반응(Graphpad 5.0 소프트웨어 매개변수 3개)에 피팅하여 수득하였는데, 이때 siRNA 컨쥬게이트의 최종 농도 로그값(lg nM)은 가로 좌표로, 그리고 C5 mRNA의 상대적 발현 수준(%)은 세로 좌표로 취하였고, 각 점은 대조군에 비한 시험군의 배양 웰 2개에서의 C5 mRNA 상대적 발현 수준에 대한 평균값을 나타낸다.
피팅한 용량-효과 곡선에 대응하는 함수에 따라서 C5 mRNA에 대한 각각의 컨쥬게이트 IC50을 산정하였는데, 이때 함수는 이하와 같았다:
Figure pct00085
[단 여기서
Y는 시험군 C5 mRNA의 상대적 발현 수준이고,
X는 siRNA 컨쥬게이트 최종 농도의 로그값이고,
Bot는 정지 단계 최저치에서의 Y값이고,
Top는 정지 단계 최고치에서의 Y값이고,
X'는 Y가 점근선 최저치와 최고치 사이의 중앙값일 때의 X값이고,
HillSlope는 곡선의 X'(여기서는 -1로 규정)에서의 기울기임].
용량-효과 곡선 및 대응하는 함수에 따라서 Y = 50%일 때의 대응 X50 값을 확정하였으며, 각각의 컨쥬게이트의 IC50 값은 10X50(nM)으로 산정하였다.
C5 mRNA에 대한 IC50 값과, 각각의 컨쥬게이트에 대해 피팅된 곡선의 R2 값을 표 6에 요약하여 두었다.
표 6
Figure pct00086
도 1a ~ 도 1h 및 상기 표 6의 결과로부터, 본 발명에 의해 제공된 siRNA 컨쥬게이트는 HepG2 간종양 세포에서의 시험관내 억제 활성이 더 컸으며, IC50은 1.494 nM ~ 9.688 nM이었음을 알 수 있었다.
실험 실시예 2: C57 마우스의 다양한 장기 내 siRNA 컨쥬게이트의 분포
1 × PBS 용액을 사용하여 Cy5-siRNA 1, Cy5-컨쥬게이트 1, Cy5-siRNA 2 또는 Cy5-컨쥬게이트 2를 용해시켜 각각 (siRNA 기준) 0.6 mg/ml 용액으로 만들었다.
6주령 ~ 7주령 C57BL/6J 암컷 마우스 10마리(Beijing Charles River Laboratory Animal Technology Co., Ltd.로부터 구입, 간단히 C57 마우스라 지칭)를 여러 군에 무작위로 나누고 나서(군당 마우스 2마리), 전술한 바와 같이 제조한 Cy5-siRNA 1, Cy5-컨쥬게이트 1, Cy5-siRNA 2 또는 Cy5-컨쥬게이트 2 용액과, 1 × PBS를 각각 피하 주사하였다. 동물 모두에의 투여 용량은 동물의 체중에 따라 산정하였고, 투여 부피는 체중 1 kg당 5 ml였다. siRNA의 양을 기준으로 하였을 때, 각각의 동물에의 투여 용량은 체중 1 kg당 3 mg이었다.
2시간, 6시간, 24시간 및 48시간 동안 투여한 후, 각각의 군의 마우스를 소형의 동물용 생체내 광학 영상화 시스템 IVIS Lumina Series III에 넣었다. 이소플루란 가스로 마우스를 마취시킨 다음, 마취시킨 마우스를 마우스 복부가 위로 향하게 하며 눕혀, 소형의 동물용 생체내 광학 영상화 시스템으로 동영상을 촬영함으로써 Cy5 형광 신호를 동적으로 검출하였고, 살아있는 동물 체내 Cy5 표지화 siRNA 및 Cy5 표지화 컨쥬게이트의 분포를 추적하였다. Cy5 표지화 컨쥬게이트를 투여한 마우스만이 간 구역내 형광 신호가 유의미하게 증가하였으며, Cy5 표지화 siRNA 또는 1 × PBS를 투여한 마우스에서는 간 구역에 그 어떠한 형광 신호도 보이지 않았다.
48시간 후, 마우스 모두를 죽인 다음, 각각의 마우스로부터 심장, 폐, 간, 비장 및 신장을 포함한 장기 5개를 취하여, IVIS Lumina Series III에서 형광 영상화를 실시하였다. 각각의 마우스 군으로부터 동물 1마리를 선택한 다음, 이 동물의 상기 언급한 장기 5개를 차례로 세로 배열하였다. 동일한 시야에서 1 × PBS 또는 Cy5-siRNA 1 또는 Cy5-컨쥬게이트 1를 투여한 마우스의 장기 사진을 촬영하였으며, 그 결과를 도 2a에 보였다. 동일한 시야에서 1 × PBS, 및 Cy5-siRNA 2 또는 Cy5-컨쥬게이트 2를 투여한 마우스의 장기 사진을 촬영하였으며, 그 결과를 도 2b에 보였다.
Cy5-컨쥬게이트 1 및 Cy5-컨쥬게이트 2만이 간 내에서 다량으로 응집될 수 있고, Cy5-컨쥬게이트 1 및 Cy5-컨쥬게이트 2는 신장 내에서 소량으로 응집되지만, 다른 장기에서는 응집되지 않음을 도 2a ~ 도 2b로부터 확인할 수 있었는데, 이는 본 발명의 컨쥬게이트는 siRNA를 특히 간에 효과적으로 전달할 수 있음을 나타낸다. 더욱이, (컨쥬게이트 7은 시험관내에서 더 큰 억제 활성을 보임을 보여주는) 도 1g의 결과와 (컨쥬게이트 6은 시험관내에서 더 큰 억제 활성을 보임을 보여주는) 도 1f의 결과를 종합하여 보았을 때, 본 발명에 의해 제공되는 컨쥬게이트는 간 내 표적 유전자 발현을 특이적으로 억제할 수 있음이 확인되었다.
이상에서 본 발명의 몇몇 실시예가 상세히 기재되었으나, 본 발명은 전술된 구현예의 구체적인 내용으로 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 기술적 해결 방안의 간단한 변형 여러 개는 본 발명의 기술적 사상의 범위 내에서 이루어질 수 있으며, 이러한 간단한 변형도 본 발명의 범위 내에 존재한다.
또한, 상기 실시예에서 설명된 각각의 구체적인 기술적 특징은 모순이 발생하지 않는 한 임의의 적절한 방식으로 조합될 수 있다는 점에 유의해야 한다. 불필요한 반복을 피하기 위해, 가능한 여러 조합 방식에 대해서는 본 명세서에 더 이상 기재하지 않는다.
또한, 본 발명의 여러 상이한 구현예들은 본 발명의 사상에 위배되지 않는 한, 임의의 조합으로 수행될 수도 있으며, 이 또한 본 발명의 개시내용으로서 간주되어야 한다.
<110> SUZHOU RIBO LIFE SCIENCE CO., LTD. <120> NUCLEIC ACID, PHARMACEUTICAL COMPOSITION AND CONJUGATE, PREPARATION METHOD AND USE <130> DSP1V211765ZX <150> CN201910440575.8 <151> 2019-05-24 <160> 388 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <220> <221> misc_feature <222> (19) <223> n is Z1, and Z1 is A <400> 1 cuucauucau acagacaan 19 <210> 2 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <220> <221> misc_feature <222> (1) <223> n is Z2, and Z2 is U <400> 2 nuugucugua ugaaugaag 19 <210> 3 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <220> <221> misc_feature <222> (19) <223> n is Z3, and Z3 is selected from A, U, G or C <400> 3 cuucauucau acagacaan 19 <210> 4 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <220> <221> misc_feature <222> (1) <223> n is Z4, Z4 is a nucleotide complementary to Z3, and Z3 is selected from A, U, G or C <400> 4 nuugucugua ugaaugaag 19 <210> 5 <211> 19 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<223> siRNA <400> 47 cucuucauuc auacagacaa a 21 <210> 48 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 48 uuugucugua ugaaugaaga gaa 23 <210> 49 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 49 cuucauucau acagacaaa 19 <210> 50 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 50 uuugucugua ugaaugaaga g 21 <210> 51 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 51 cuucauucau acagacaaa 19 <210> 52 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 52 uuugucugua ugaaugaaga g 21 <210> 53 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 53 cuucauucau acagacaaa 19 <210> 54 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 54 uuugucugua ugaaugaaga g 21 <210> 55 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 55 cucuucauuc auacagacaa a 21 <210> 56 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 56 uuugucugua ugaaugaaga gaa 23 <210> 57 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 57 cucuucauuc auacagacaa a 21 <210> 58 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 58 uuugucugua ugaaugaaga gaa 23 <210> 59 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 59 cucuucauuc auacagacaa a 21 <210> 60 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 60 uuugucugua ugaaugaaga gaa 23 <210> 61 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <220> <221> misc_feature <222> (19) <223> N is Z5, and Z5 is A <400> 61 cuacaguuua gaagauuun 19 <210> 62 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <220> <221> misc_feature <222> (1) <223> n is Z6, and Z6 is U <400> 62 naaaucuucu aaacuguag 19 <210> 63 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <220> <221> misc_feature <222> (19) <223> n is Z7, and Z7 is selected from A, U, G or C <400> 63 cuacaguuua gaagauuun 19 <210> 64 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <220> <221> misc_feature <222> (1) <223> n is Z8, Z8 is a nucleotide complementary to Z8, and Z7 is selected from A, U, G or C <400> 64 naaaucuucu aaacuguag 19 <210> 65 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <220> <221> misc_feature <222> (19) <223> n is Z7, and Z7 is selected from A, U, G or C <400> 65 cuacaguuua gaagauuun 19 <210> 66 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <220> <221> misc_feature <222> (1) <223> n is Z8, Z8 is a nucleotide complementary to Z8, and Z7 is selected from A, U, G or C <400> 66 naaaucuucu aaacuguagu a 21 <210> 67 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <220> <221> misc_feature <222> (21) <223> n is Z7, and Z7 is selected from A, U, G or C <400> 67 uacuacaguu uagaagauuu n 21 <210> 68 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <220> <221> misc_feature <222> (1) <223> n is Z8, Z8 is a nucleotide complementary to Z8, and Z7 is selected from A, U, G or C <400> 68 naaaucuucu aaacuguagu aug 23 <210> 69 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 69 cuacaguuua gaagauuua 19 <210> 70 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 70 uaaaucuucu aaacuguagu a 21 <210> 71 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 71 uacuacaguu uagaagauuu a 21 <210> 72 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 72 uaaaucuucu aaacuguagu aug 23 <210> 73 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 73 cuacaguuua gaagauuua 19 <210> 74 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 74 uaaaucuucu aaacuguagu a 21 <210> 75 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 75 cuacaguuua gaagauuua 19 <210> 76 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 76 uaaaucuucu aaacuguagu a 21 <210> 77 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 77 cuacaguuua gaagauuua 19 <210> 78 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 78 uaaaucuucu aaacuguagu a 21 <210> 79 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 79 uacuacaguu uagaagauuu a 21 <210> 80 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 80 uaaaucuucu aaacuguagu aug 23 <210> 81 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 81 uacuacaguu uagaagauuu a 21 <210> 82 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 82 uaaaucuucu aaacuguagu aug 23 <210> 83 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 83 uacuacaguu uagaagauuu a 21 <210> 84 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 84 uaaaucuucu aaacuguagu aug 23 <210> 85 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 85 cuacaguuua gaagauuua 19 <210> 86 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 86 uaaaucuucu aaacuguagu a 21 <210> 87 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 87 cuacaguuua gaagauuua 19 <210> 88 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 88 uaaaucuucu aaacuguagu a 21 <210> 89 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 89 cuacaguuua gaagauuua 19 <210> 90 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 90 uaaaucuucu aaacuguagu a 21 <210> 91 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 91 uacuacaguu uagaagauuu a 21 <210> 92 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 92 uaaaucuucu aaacuguagu aug 23 <210> 93 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 93 uacuacaguu uagaagauuu a 21 <210> 94 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 94 uaaaucuucu aaacuguagu aug 23 <210> 95 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 95 uacuacaguu uagaagauuu a 21 <210> 96 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 96 uaaaucuucu aaacuguagu aug 23 <210> 97 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 97 cuacaguuua gaagauuua 19 <210> 98 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 98 uaaaucuucu aaacuguagu a 21 <210> 99 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 99 cuacaguuua gaagauuua 19 <210> 100 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 100 uaaaucuucu aaacuguagu a 21 <210> 101 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 101 cuacaguuua gaagauuua 19 <210> 102 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 102 uaaaucuucu aaacuguagu a 21 <210> 103 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 103 uacuacaguu uagaagauuu a 21 <210> 104 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 104 uaaaucuucu aaacuguagu aug 23 <210> 105 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 105 uacuacaguu uagaagauuu a 21 <210> 106 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 106 uaaaucuucu aaacuguagu aug 23 <210> 107 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 107 uacuacaguu uagaagauuu a 21 <210> 108 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 108 uaaaucuucu aaacuguagu aug 23 <210> 109 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 109 cuacaguuua gaagauuua 19 <210> 110 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 110 uaaaucuucu aaacuguagu a 21 <210> 111 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 111 cuacaguuua gaagauuua 19 <210> 112 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 112 uaaaucuucu aaacuguagu a 21 <210> 113 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 113 cuacaguuua gaagauuua 19 <210> 114 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 114 uaaaucuucu aaacuguagu a 21 <210> 115 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 115 uacuacaguu uagaagauuu a 21 <210> 116 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 116 uaaaucuucu aaacuguagu aug 23 <210> 117 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 117 uacuacaguu uagaagauuu a 21 <210> 118 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 118 uaaaucuucu aaacuguagu aug 23 <210> 119 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 119 uacuacaguu uagaagauuu a 21 <210> 120 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 120 uaaaucuucu aaacuguagu aug 23 <210> 121 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <220> <221> misc_feature <222> (19) <223> n is Z9, and Z9 is A <400> 121 ggaagguuac cgagcaaun 19 <210> 122 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <220> <221> misc_feature <222> (1) <223> n is Z10, and Z10 is U <400> 122 nauugcucgg uaaccuucc 19 <210> 123 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <220> <221> misc_feature <222> (19) <223> n is Z11, and Z11 is selected from A, U, G or C <400> 123 ggaagguuac cgagcaaun 19 <210> 124 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <220> <221> misc_feature <222> (1) <223> N is Z12, Z12 is a nucleotide complementary to Z11, and Z11 is selected from A, U, G or C <400> 124 nauugcucgg uaaccuucc 19 <210> 125 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <220> <221> misc_feature <222> (19) <223> n is Z11, and Z11 is selected from A, U, G or C <400> 125 ggaagguuac cgagcaaun 19 <210> 126 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <220> <221> misc_feature <222> (1) <223> N is Z12, Z12 is a nucleotide complementary to Z11, and Z11 is selected from A, U, G or C <400> 126 nauugcucgg uaaccuuccc u 21 <210> 127 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <220> <221> misc_feature <222> (21) <223> n is Z11, and Z11 is selected from A, U, G or C <400> 127 agggaagguu accgagcaau n 21 <210> 128 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <220> <221> misc_feature <222> (1) <223> N is Z12, Z12 is a nucleotide complementary to Z11, and Z11 is selected from A, U, G or C <400> 128 nauugcucgg uaaccuuccc ugg 23 <210> 129 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 129 ggaagguuac cgagcaaua 19 <210> 130 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 130 uauugcucgg uaaccuuccc u 21 <210> 131 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 131 agggaagguu accgagcaau a 21 <210> 132 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 132 uauugcucgg uaaccuuccc ugg 23 <210> 133 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 133 ggaagguuac cgagcaaua 19 <210> 134 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 134 uauugcucgg uaaccuuccc u 21 <210> 135 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 135 ggaagguuac cgagcaaua 19 <210> 136 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 136 uauugcucgg uaaccuuccc u 21 <210> 137 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 137 ggaagguuac cgagcaaua 19 <210> 138 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 138 uauugcucgg uaaccuuccc u 21 <210> 139 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 139 agggaagguu accgagcaau a 21 <210> 140 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 140 uauugcucgg uaaccuuccc ugg 23 <210> 141 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 141 agggaagguu accgagcaau a 21 <210> 142 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 142 uauugcucgg uaaccuuccc ugg 23 <210> 143 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 143 agggaagguu accgagcaau a 21 <210> 144 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 144 uauugcucgg uaaccuuccc ugg 23 <210> 145 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 145 ggaagguuac cgagcaaua 19 <210> 146 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 146 uauugcucgg uaaccuuccc u 21 <210> 147 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 147 ggaagguuac cgagcaaua 19 <210> 148 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 148 uauugcucgg uaaccuuccc u 21 <210> 149 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 149 ggaagguuac cgagcaaua 19 <210> 150 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 150 uauugcucgg uaaccuuccc u 21 <210> 151 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 151 agggaagguu accgagcaau a 21 <210> 152 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 152 uauugcucgg uaaccuuccc ugg 23 <210> 153 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 153 agggaagguu accgagcaau a 21 <210> 154 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 154 uauugcucgg uaaccuuccc ugg 23 <210> 155 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 155 agggaagguu accgagcaau a 21 <210> 156 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 156 uauugcucgg uaaccuuccc ugg 23 <210> 157 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 157 ggaagguuac cgagcaaua 19 <210> 158 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 158 uauugcucgg uaaccuuccc u 21 <210> 159 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 159 ggaagguuac cgagcaaua 19 <210> 160 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 160 uauugcucgg uaaccuuccc u 21 <210> 161 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 161 ggaagguuac cgagcaaua 19 <210> 162 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 162 uauugcucgg uaaccuuccc u 21 <210> 163 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 163 agggaagguu accgagcaau a 21 <210> 164 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 164 uauugcucgg uaaccuuccc ugg 23 <210> 165 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 165 agggaagguu accgagcaau a 21 <210> 166 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 166 uauugcucgg uaaccuuccc ugg 23 <210> 167 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 167 agggaagguu accgagcaau a 21 <210> 168 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 168 uauugcucgg uaaccuuccc ugg 23 <210> 169 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 169 ggaagguuac cgagcaaua 19 <210> 170 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 170 uauugcucgg uaaccuuccc u 21 <210> 171 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 171 ggaagguuac cgagcaaua 19 <210> 172 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 172 uauugcucgg uaaccuuccc u 21 <210> 173 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 173 ggaagguuac cgagcaaua 19 <210> 174 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 174 uauugcucgg uaaccuuccc u 21 <210> 175 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 175 agggaagguu accgagcaau a 21 <210> 176 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 176 uauugcucgg uaaccuuccc ugg 23 <210> 177 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 177 agggaagguu accgagcaau a 21 <210> 178 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 178 uauugcucgg uaaccuuccc ugg 23 <210> 179 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 179 agggaagguu accgagcaau a 21 <210> 180 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 180 uauugcucgg uaaccuuccc ugg 23 <210> 181 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <220> <221> misc_feature <222> (19) <223> N is Z13, and Z13 is A <400> 181 agaacagaca gcagaauun 19 <210> 182 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <220> <221> misc_feature <222> (1) <223> N is Z14, and Z14 is U <400> 182 naauucugcu gucuguucu 19 <210> 183 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <220> <221> misc_feature <222> (19) <223> n is Z15, and Z15 is selected from A, U, G or C <400> 183 agaacagaca gcagaauun 19 <210> 184 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <220> <221> misc_feature <222> (1) <223> N is Z16, Z16 is a nucleotide complementary to Z15, and Z15 is selected from A, U, G or C <400> 184 naauucugcu gucuguucu 19 <210> 185 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <220> <221> misc_feature <222> (19) <223> n is Z15, and Z15 is selected from A, U, G or C <400> 185 agaacagaca gcagaauun 19 <210> 186 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <220> <221> misc_feature <222> (1) <223> N is Z16, Z16 is a nucleotide complementary to Z15, and Z15 is selected from A, U, G or C <400> 186 naauucugcu gucuguucuc c 21 <210> 187 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <220> <221> misc_feature <222> (21) <223> n is Z15, and Z15 is selected from A, U, G or C <400> 187 ggagaacaga cagcagaauu n 21 <210> 188 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <220> <221> misc_feature <222> (1) <223> N is Z16, Z16 is a nucleotide complementary to Z15, and Z15 is selected from A, U, G or C <400> 188 naauucugcu gucuguucuc cug 23 <210> 189 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 189 agaacagaca gcagaauua 19 <210> 190 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 190 uaauucugcu gucuguucuc c 21 <210> 191 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 191 ggagaacaga cagcagaauu a 21 <210> 192 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 192 uaauucugcu gucuguucuc cug 23 <210> 193 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 193 agaacagaca gcagaauua 19 <210> 194 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 194 uaauucugcu gucuguucuc c 21 <210> 195 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 195 agaacagaca gcagaauua 19 <210> 196 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 196 uaauucugcu gucuguucuc c 21 <210> 197 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 197 agaacagaca gcagaauua 19 <210> 198 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 198 uaauucugcu gucuguucuc c 21 <210> 199 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 199 ggagaacaga cagcagaauu a 21 <210> 200 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 200 uaauucugcu gucuguucuc cug 23 <210> 201 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 201 ggagaacaga cagcagaauu a 21 <210> 202 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 202 uaauucugcu gucuguucuc cug 23 <210> 203 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 203 ggagaacaga cagcagaauu a 21 <210> 204 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 204 uaauucugcu gucuguucuc cug 23 <210> 205 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 205 agaacagaca gcagaauua 19 <210> 206 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 206 uaauucugcu gucuguucuc c 21 <210> 207 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 207 agaacagaca gcagaauua 19 <210> 208 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 208 uaauucugcu gucuguucuc c 21 <210> 209 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 209 agaacagaca gcagaauua 19 <210> 210 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 210 uaauucugcu gucuguucuc c 21 <210> 211 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 211 ggagaacaga cagcagaauu a 21 <210> 212 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 212 uaauucugcu gucuguucuc cug 23 <210> 213 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 213 ggagaacaga cagcagaauu a 21 <210> 214 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 214 uaauucugcu gucuguucuc cug 23 <210> 215 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 215 ggagaacaga cagcagaauu a 21 <210> 216 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 216 uaauucugcu gucuguucuc cug 23 <210> 217 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 217 agaacagaca gcagaauua 19 <210> 218 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 218 uaauucugcu gucuguucuc c 21 <210> 219 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 219 agaacagaca gcagaauua 19 <210> 220 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 220 uaauucugcu gucuguucuc c 21 <210> 221 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 221 agaacagaca gcagaauua 19 <210> 222 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 222 uaauucugcu gucuguucuc c 21 <210> 223 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 223 ggagaacaga cagcagaauu a 21 <210> 224 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 224 uaauucugcu gucuguucuc cug 23 <210> 225 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 225 ggagaacaga cagcagaauu a 21 <210> 226 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 226 uaauucugcu gucuguucuc cug 23 <210> 227 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 227 ggagaacaga cagcagaauu a 21 <210> 228 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 228 uaauucugcu gucuguucuc cug 23 <210> 229 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 229 agaacagaca gcagaauua 19 <210> 230 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 230 uaauucugcu gucuguucuc c 21 <210> 231 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 231 agaacagaca gcagaauua 19 <210> 232 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 232 uaauucugcu gucuguucuc c 21 <210> 233 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 233 agaacagaca gcagaauua 19 <210> 234 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 234 uaauucugcu gucuguucuc c 21 <210> 235 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 235 ggagaacaga cagcagaauu a 21 <210> 236 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 236 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cgcugcaan 19 <210> 244 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <220> <221> misc_feature <222> (1) <223> n is Z20, Z20 is a nucleotide complementary to Z19,and Z19 is selected from A, U, G or C <400> 244 nuugcagcgu ucuucuugg 19 <210> 245 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <220> <221> misc_feature <222> (19) <223> n is Z19, and Z19 is selected from A, U, G or C <400> 245 ccaagaagaa cgcugcaan 19 <210> 246 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <220> <221> misc_feature <222> (1) <223> n is Z20, Z20 is a nucleotide complementary to Z19,and Z19 is selected from A, U, G or C <400> 246 nuugcagcgu ucuucuuggc c 21 <210> 247 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <220> <221> misc_feature <222> (21) <223> n is Z19,and Z19 is selected from A, U, G or C <400> 247 ggccaagaag aacgcugcaa n 21 <210> 248 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <220> <221> misc_feature <222> (1) <223> n is Z20, Z20 is a nucleotide complementary to Z19,and Z19 is selected from A, U, G or C <400> 248 nuugcagcgu ucuucuuggc cug 23 <210> 249 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 249 ccaagaagaa cgcugcaaa 19 <210> 250 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 250 uuugcagcgu ucuucuuggc c 21 <210> 251 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 251 ggccaagaag aacgcugcaa a 21 <210> 252 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 252 uuugcagcgu ucuucuuggc cug 23 <210> 253 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 253 ccaagaagaa cgcugcaaa 19 <210> 254 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 254 uuugcagcgu ucuucuuggc c 21 <210> 255 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 255 ccaagaagaa cgcugcaaa 19 <210> 256 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 256 uuugcagcgu ucuucuuggc c 21 <210> 257 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 257 ccaagaagaa cgcugcaaa 19 <210> 258 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 258 uuugcagcgu ucuucuuggc c 21 <210> 259 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 259 ggccaagaag aacgcugcaa a 21 <210> 260 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 260 uuugcagcgu ucuucuuggc cug 23 <210> 261 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 261 ggccaagaag aacgcugcaa a 21 <210> 262 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 262 uuugcagcgu ucuucuuggc cug 23 <210> 263 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 263 ggccaagaag aacgcugcaa a 21 <210> 264 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 264 uuugcagcgu ucuucuuggc cug 23 <210> 265 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 265 ccaagaagaa cgcugcaaa 19 <210> 266 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from A, U, G or C <400> 306 nuucuggcuu gcuuacuggu a 21 <210> 307 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <220> <221> misc_feature <222> (21) <223> n is Z23, and Z23 is selected from A, U, G or C <400> 307 uaccaguaag caagccagaa n 21 <210> 308 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <220> <221> misc_feature <222> (1) <223> n is Z24, Z24 is a nucleotide complementary to Z23,and Z23 is selected from A, U, G or C <400> 308 nuucuggcuu gcuuacuggu aac 23 <210> 309 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 309 ccaguaagca agccagaaa 19 <210> 310 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 310 uuucuggcuu gcuuacuggu a 21 <210> 311 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 311 uaccaguaag caagccagaa a 21 <210> 312 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 312 uuucuggcuu gcuuacuggu aac 23 <210> 313 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> 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caagccagaa a 21 <210> 332 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 332 uuucuggcuu gcuuacuggu aac 23 <210> 333 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 333 uaccaguaag caagccagaa a 21 <210> 334 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 334 uuucuggcuu gcuuacuggu aac 23 <210> 335 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 335 uaccaguaag caagccagaa a 21 <210> 336 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 336 uuucuggcuu gcuuacuggu aac 23 <210> 337 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 337 ccaguaagca agccagaaa 19 <210> 338 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 338 uuucuggcuu gcuuacuggu a 21 <210> 339 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 339 ccaguaagca agccagaaa 19 <210> 340 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 340 uuucuggcuu gcuuacuggu a 21 <210> 341 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 341 ccaguaagca agccagaaa 19 <210> 342 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 342 uuucuggcuu gcuuacuggu a 21 <210> 343 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 343 uaccaguaag caagccagaa a 21 <210> 344 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 344 uuucuggcuu gcuuacuggu aac 23 <210> 345 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 345 uaccaguaag caagccagaa a 21 <210> 346 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 346 uuucuggcuu gcuuacuggu aac 23 <210> 347 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 347 uaccaguaag caagccagaa a 21 <210> 348 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 348 uuucuggcuu gcuuacuggu aac 23 <210> 349 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 349 ccaguaagca agccagaaa 19 <210> 350 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 350 uuucuggcuu gcuuacuggu a 21 <210> 351 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 351 ccaguaagca agccagaaa 19 <210> 352 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 352 uuucuggcuu gcuuacuggu a 21 <210> 353 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 353 ccaguaagca agccagaaa 19 <210> 354 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 354 uuucuggcuu gcuuacuggu a 21 <210> 355 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 355 uaccaguaag caagccagaa a 21 <210> 356 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 356 uuucuggcuu gcuuacuggu aac 23 <210> 357 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 357 uaccaguaag caagccagaa a 21 <210> 358 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 358 uuucuggcuu gcuuacuggu aac 23 <210> 359 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 359 uaccaguaag caagccagaa a 21 <210> 360 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 360 uuucuggcuu gcuuacuggu aac 23 <210> 361 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 361 cuucauucau acagacaaa 19 <210> 362 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 362 uuugucugua ugaaugaaga g 21 <210> 363 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 363 cuacaguuua gaagauuua 19 <210> 364 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 364 uaaaucuucu aaacuguagu a 21 <210> 365 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 365 ggaagguuac cgagcaaua 19 <210> 366 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 366 uauugcucgg uaaccuuccc u 21 <210> 367 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 367 agaacagaca gcagaauua 19 <210> 368 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 368 uaauucugcu gucuguucuc c 21 <210> 369 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 369 ccaagaagaa cgcugcaaa 19 <210> 370 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 370 uuugcagcgu ucuucuuggc c 21 <210> 371 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 371 ccaguaagca agccagaaa 19 <210> 372 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 372 uuucuggcuu gcuuacuggu a 21 <210> 373 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 373 cuucauucau acagacaaa 19 <210> 374 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 374 uuugucugua ugaaugaaga g 21 <210> 375 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 375 cuacaguuua gaagauuua 19 <210> 376 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 376 uaaaucuucu aaacuguagu a 21 <210> 377 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 377 ggaagguuac cgagcaaua 19 <210> 378 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 378 uauugcucgg uaaccuuccc u 21 <210> 379 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 379 agaacagaca gcagaauua 19 <210> 380 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 380 uaauucugcu gucuguucuc c 21 <210> 381 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 381 ccaagaagaa cgcugcaaa 19 <210> 382 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 382 uuugcagcgu ucuucuuggc c 21 <210> 383 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 383 ccaguaagca agccagaaa 19 <210> 384 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 384 uuucuggcuu gcuuacuggu a 21 <210> 385 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 385 atcaggccag ggaaggttac 20 <210> 386 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 386 tcgggatgaa ggaaccatgt 20 <210> 387 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 387 ggtcggagtc aacggattt 19 <210> 388 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 388 ccagcatcgc cccacttga 19

Claims (58)

  1. 하기 화학식 308, 즉
    화학식 308
    Figure pct00087

    로 표시되는 바와 같은 구조를 가지는 siRNA 컨쥬게이트로서,
    단 여기서 n1은 1 ~ 3의 정수이고, n3은 0 ~ 4의 정수이고; m1, m2 및 m3은 각각 독립적으로 2 ~ 10의 정수이고; R10, R11, R12, R13, R14 또는 R15는 각각 독립적으로 H이거나, C1 ~ C10 알킬, C1 ~ C10 할로알킬 및 C1 ~ C10 알콕시로 이루어진 군으로부터 선택되고;
    R3은 화학식 A59,
    화학식 A59
    Figure pct00088

    로 표시되는 바와 같은 구조를 가지는 기이되, 여기서
    E1은 OH, SH 또는 BH2이고;
    Nu는 siRNA이고; siRNA는 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함하되, siRNA 중 뉴클레오티드는 각각 독립적으로 변형 또는 비변형 뉴클레오티드이고, 이 센스 가닥은 뉴클레오티드 서열 I을 포함하고, 이 안티센스 가닥은 뉴클레오티드 서열 II를 포함하고; 뉴클레오티드 서열 I 및 뉴클레오티드 서열 II는 적어도 부분적으로 역 상보성으로서, 이중 가닥 영역을 형성하고; 뉴클레오티드 서열 I 및 뉴클레오티드 서열 II는 하기 i) ~ vi),
    i) 서열 번호 1에 보인 뉴클레오티드 서열과 길이가 동일하되 3개 이하의 뉴클레오티드만큼의 차이를 보이는 뉴클레오티드 서열 I; 및 서열 번호 2에 보인 뉴클레오티드 서열과 길이가 동일하되 3개 이하의 뉴클레오티드만큼의 차이를 보이는 뉴클레오티드 서열 II:
    5'-CUUCAUUCAUACAGACAAZ1-3' (서열 번호 1);
    5'-Z2UUGUCUGUAUGAAUGAAG-3' (서열 번호 2)
    [여기서, Z1은 A이고, Z2는 U이고, 상기 뉴클레오티드 서열 I은 Z1에 대응하는 부위에 뉴클레오티드 Z3을 포함하고, 상기 뉴클레오티드 서열 II는 Z2에 대응하는 부위에 뉴클레오티드 Z4를 포함하고, Z4는 상기 안티센스 가닥의 5'-말단으로부터 첫 번째 뉴클레오티드임];
    ii) 서열 번호 61에 보인 뉴클레오티드 서열과 길이가 동일하되 3개 이하의 뉴클레오티드만큼의 차이를 보이는 뉴클레오티드 서열 I; 및 서열 번호 62에 보인 뉴클레오티드 서열과 길이가 동일하되 3개 이하의 뉴클레오티드만큼의 차이를 보이는 뉴클레오티드 서열 II:
    5'-CUACAGUUUAGAAGAUUUZ5-3' (서열 번호 61);
    5'-Z6AAAUCUUCUAAACUGUAG-3' (서열 번호 62)
    [여기서 Z5는 A이고, Z6은 U이고, 상기 뉴클레오티드 서열 I은 Z5에 대응하는 부위에 뉴클레오티드 Z7을 포함하고, 상기 뉴클레오티드 서열 II는 Z6에 대응하는 부위에 뉴클레오티드 Z8를 포함하고, Z8는 상기 안티센스 가닥의 5'-말단으로부터 첫 번째 뉴클레오티드임];
    iii) 서열 번호 121에 보인 뉴클레오티드 서열과 길이가 동일하되 3개 이하의 뉴클레오티드만큼의 차이를 보이는 뉴클레오티드 서열 I; 및 서열 번호 122에 보인 뉴클레오티드 서열과 길이가 동일하되 3개 이하의 뉴클레오티드만큼의 차이를 보이는 뉴클레오티드 서열 II:
    5'-GGAAGGUUACCGAGCAAUZ9-3' (서열 번호 121);
    5'-Z10AUUGCUCGGUAACCUUCC-3' (서열 번호 122)
    [여기서 Z9는 A이고, Z10은 U이고, 상기 뉴클레오티드 서열 I은 Z9에 대응하는 부위에 뉴클레오티드 Z11을 포함하고, 상기 뉴클레오티드 서열 II는 Z10에 대응하는 부위에 뉴클레오티드 Z12를 포함하고, Z12는 상기 안티센스 가닥의 5'-말단으로부터 첫 번째 뉴클레오티드임];
    iv) 서열 번호 181에 보인 뉴클레오티드 서열과 길이가 동일하되 3개 이하의 뉴클레오티드만큼의 차이를 보이는 뉴클레오티드 서열 I; 및 서열 번호 182에 보인 뉴클레오티드 서열과 길이가 동일하되 3개 이하의 뉴클레오티드만큼의 차이를 보이는 뉴클레오티드 서열 II:
    5'-AGAACAGACAGCAGAAUUZ13-3' (서열 번호 181);
    5'-Z14AAUUCUGCUGUCUGUUCU-3' (서열 번호 182)
    [여기서 Z13은 A이고, Z14는 U이고, 상기 뉴클레오티드 서열 I은 Z13에 대응하는 부위에 뉴클레오티드 Z15를 포함하고, 상기 뉴클레오티드 서열 II는 Z14에 대응하는 부위에 뉴클레오티드 Z16을 포함하고, Z16은 상기 안티센스 가닥의 5'-말단으로부터 첫 번째 뉴클레오티드임];
    v) 서열 번호 241에 보인 뉴클레오티드 서열과 길이가 동일하되 3개 이하의 뉴클레오티드만큼의 차이를 보이는 뉴클레오티드 서열 I; 및 서열 번호 242에 보인 뉴클레오티드 서열과 길이가 동일하되 3개 이하의 뉴클레오티드만큼의 차이를 보이는 뉴클레오티드 서열 II:
    5'-CCAAGAAGAACGCUGCAAZ17-3' (서열 번호 241);
    5'-Z18UUGCAGCGUUCUUCUUGG-3' (서열 번호 242)
    [여기서 Z17은 A이고, Z18은 U이고, 상기 뉴클레오티드 서열 I은 Z17에 대응하는 부위에 뉴클레오티드 Z19를 포함하고, 상기 뉴클레오티드 서열 II는 Z18에 대응하는 부위에 뉴클레오티드 Z20을 포함하고, Z20은 상기 안티센스 가닥의 5'-말단으로부터 첫 번째 뉴클레오티드임]; 및
    vi) 서열 번호 301에 보인 뉴클레오티드 서열과 길이가 동일하되 3개 이하의 뉴클레오티드만큼의 차이를 보이는 뉴클레오티드 서열 I; 및 서열 번호 302에 보인 뉴클레오티드 서열과 길이가 동일하되 3개 이하의 뉴클레오티드만큼의 차이를 보이는 뉴클레오티드 서열 II:
    5'-CCAGUAAGCAAGCCAGAAZ21-3' (서열 번호 301);
    5'-Z22UUCUGGCUUGCUUACUGG-3' (서열 번호 302)
    [여기서 Z21은 A이고, Z22는 U이고, 상기 뉴클레오티드 서열 I은 Z21에 대응하는 부위에 뉴클레오티드 Z23을 포함하고, 상기 뉴클레오티드 서열 II는 Z22에 대응하는 부위에 뉴클레오티드 Z24를 포함하고, Z24는 상기 안티센스 가닥의 5'-말단으로부터 첫 번째 뉴클레오티드임]
    에 보인 서열들의 군으로부터 선택되고;
    R2는 길이가 탄소 원자 1개 ~ 20개인 선형 알킬렌이되, 탄소 원자 1개 이상은 C(O), NH, O, S, CH=N, S(O)2, C2 ~ C10 알케닐렌, C2 ~ C10 알키닐렌, C6 ~ C10 아릴렌, C3 ~ C18 헤테로사이클릴렌 및 C5 ~ C10 헤테로아릴렌으로 이루어진 군의 임의의 것 1개 이상으로 선택적으로 대체되고; R2는 C1 ~ C10 알킬, C6 ~ C10 아릴, C5 ~ C10 헤테로아릴, C1 ~ C10 할로알킬, -OC1 ~ C10 알킬, -OC1 ~ C10 알킬페닐, -C1 ~ C10 알킬-OH, -OC1 ~ C10 할로알킬, -SC1 ~ C10 알킬, -SC1 ~ C10 알킬페닐, -C1 ~ C10 알킬-SH, -SC1 ~ C10 할로알킬, 할로 치환기, -OH, -SH, -NH2, -C1 ~ C10 알킬-NH2, -N(C1 ~ C10 알킬)(C1 ~ C10 알킬), -NH(C1 ~ C10 알킬), -N(C1 ~ C10 알킬)(C1 ~ C10 알킬페닐), -NH(C1 ~ C10 알킬페닐), 시아노, 니트로, -CO2H, -C(O)O(C1 ~ C10 알킬), -CON(C1 ~ C10 알킬)(C1 ~ C10 알킬), -CONH(C1 ~ C10 알킬), -CONH2, -NHC(O)(C1 ~ C10 알킬), -NHC(O)(페닐), -N(C1 ~ C10 알킬)C(O)(C1 ~ C10 알킬), -N(C1 ~ C10 알킬)C(O)(페닐), -C(O)C1 ~ C10 알킬, -C(O)C1 ~ C10 알킬페닐, -C(O)C1 ~ C10 할로알킬, -OC(O)C1 ~ C10 알킬, -SO2(C1 ~ C10 알킬), -SO2(페닐), -SO2(C1 ~ C10 할로알킬), -SO2NH2, -SO2NH(C1 ~ C10 알킬), -SO2NH(페닐), -NHSO2(C1 ~ C10 알킬), -NHSO2(페닐) 및 -NHSO2(C1 ~ C10 할로알킬)로 이루어진 군의 임의의 것 1개 이상으로 선택적으로 치환되고;
    L1은 각각 독립적으로 길이가 탄소 원자 1개 ~ 70개인 선형 알킬렌이되, 탄소 원자 1개 이상은 C(O), NH, O, S, CH=N, S(O)2, C2 ~ C10 알케닐렌, C2 ~ C10 알키닐렌, C6 ~ C10 아릴렌, C3 ~ C18 헤테로사이클릴렌 및 C5 ~ C10 헤테로아릴렌으로 이루어진 군의 임의의 것 1개 이상으로 선택적으로 대체되고; L1은 C1 ~ C10 알킬, C6 ~ C10 아릴, C5 ~ C10 헤테로아릴, C1 ~ C10 할로알킬, -OC1 ~ C10 알킬, -OC1 ~ C10 알킬페닐, -C1 ~ C10 알킬-OH, -OC1 ~ C10 할로알킬, -SC1 ~ C10 알킬, -SC1 ~ C10 알킬페닐, -C1 ~ C10 알킬-SH, -SC1 ~ C10 할로알킬, 할로 치환기, -OH, -SH, -NH2, -C1 ~ C10 알킬-NH2, -N(C1 ~ C10 알킬)(C1 ~ C10 알킬), -NH(C1 ~ C10 알킬), -N(C1 ~ C10 알킬)(C1 ~ C10 알킬페닐), -NH(C1 ~ C10 알킬페닐), 시아노, 니트로, -CO2H, -C(O)O(C1 ~ C10 알킬), -CON(C1 ~ C10 알킬)(C1 ~ C10 알킬), -CONH(C1 ~ C10 알킬), -CONH2, -NHC(O)(C1 ~ C10 알킬), -NHC(O)(페닐), -N(C1 ~ C10 알킬)C(O)(C1 ~ C10 알킬), -N(C1 ~ C10 알킬)C(O)(페닐), -C(O)C1 ~ C10 알킬, -C(O)C1 ~ C10 알킬페닐, -C(O)C1 ~ C10 할로알킬, -OC(O)C1 ~ C10 알킬, -SO2(C1 ~ C10 알킬), -SO2(페닐), -SO2(C1 ~ C10 할로알킬), -SO2NH2, -SO2NH(C1 ~ C10 알킬), -SO2NH(페닐), -NHSO2(C1 ~ C10 알킬), -NHSO2(페닐) 및 -NHSO2(C1 ~ C10 할로알킬)로 이루어진 군의 임의의 것 1개 이상으로 선택적으로 치환되고;
    Figure pct00089
    는 기가 공유 결합되는 부위를 표시하고; M1은 표적화 기를 표시하는, siRNA 컨쥬게이트.
  2. 제1항에 있어서, L1은 하기 화학식 A1 ~ A26,
    Figure pct00090

    Figure pct00091

    의 기 및 이의 임의의 결합 조합체로 이루어진 군으로부터 각각 독립적으로 선택되되,
    단 j1은 각각 독립적으로 1 ~ 20의 정수이고; j2는 각각 독립적으로 1 ~ 20의 정수이고;
    R'는 각각 독립적으로 C1 ~ C10 알킬이고;
    Ra는 하기 화학식 A27 ~ A45,
    Figure pct00092

    Figure pct00093

    의 기 및 이의 임의의 결합 조합체로 이루어진 군으로부터 각각 독립적으로 선택되되, Rb는 각각 독립적으로 C1 ~ C10 알킬이거나; 또는
    L1은 화학식 A1, A4, A5, A6, A8, A10, A11 및 A13 중 1개 이상의 결합 조합체로부터 선택되거나; 또는
    L1은 화학식 A1, A4, A8, A10 및 A11 중 적어도 2개의 결합 조합체로부터 선택되거나; 또는
    L1은 A1, A18 및 A10 중 적어도 2개의 결합 조합체로부터 선택되거나; 또는
    L1의 길이는 3개 ~ 25개 원자이거나; 또는
    L1의 길이는 4개 ~ 15개 원자이고;
    Figure pct00094
    는 기가 공유 결합하는 부위를 나타내는, siRNA 컨쥬게이트.
  3. 제2항에 있어서, 상기 j1은 2 ~ 10의 정수이고, 상기 j2는 2 ~ 10의 정수이고, 상기 R'는 C1 ~ C4 알킬이고, 상기 Ra는 화학식 A27, A28, A29, A30 및 A31 중 1개로부터 선택되고, Rb는 C1 ~ C5 알킬이거나; 또는
    상기 j1은 3 ~ 5의 정수이고, 상기 j2는 3 ~ 5의 정수이고, 상기 R'는 메틸, 에틸 및 이소프로필 중 1개이고, 상기 Ra는 화학식 A27로 표시되는 바와 같은 기 또는 화학식 A28로 표시되는 바와 같은 기이고, 상기 Rb는 메틸, 에틸, 이소프로필 및 부틸 중 1개인, siRNA 컨쥬게이트.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 n1은 1 ~ 2의 정수이고, 상기 n3은 0 ~ 1의 정수이고, n1 + n3은 2 ~ 3인, siRNA 컨쥬게이트.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 m1, m2 및 m3은 각각 독립적으로 2 ~ 5의 정수이고/정수이거나, m1 = m2 = m3인, siRNA 컨쥬게이트.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 표적화기는 각각 독립적으로 포유동물 간세포 표면상 아시알로당단백질 수용체와 결합하는 리간드이거나; 또는
    상기 표적화기는 각각 독립적으로 아시알로당단백질 또는 당체이거나; 또는
    상기 표적화기는 D-만노피라노스, L-만노피라노스, D-아라비노스, D-자일로푸라노스, L-자일로푸라노스, D-글루코스, L-글루코스, D-갈락토스, L-갈락토스, α-D-만노푸라노스, β-D-만노푸라노스, α-D-만노피라노스, β-D-만노피라노스, α-D-글루코피라노스, β-D-글루코피라노스, α-D-글루코푸라노스, β-D-글루코푸라노스, α-D-프럭토푸라노스, α-D-프럭토피라노스, α-D-갈락토피라노스, β-D-갈락토피라노스, α-D-갈락토푸라노스, β-D-갈락토푸라노스, 글루코사민, 시알산, 갈락토사민, N-아세틸갈락토사민, N-트리플루오로아세틸갈락토사민, N-프로피오닐갈락토사민, N-n-부티릴갈락토사민, N-이소부티릴갈락토사민, 2-아미노-3-O-[(R)-1-카복시에틸]-2-데옥시-β-D-글루코피라노스, 2-데옥시-2-메틸아미노-L-글루코피라노스, 4,6-다이데옥시-4-포름아미도-2,3-디-O-메틸-D-만노피라노스, 2-데옥시-2-설포아미노-D-글루코피라노스, N-글리콜일-α-뉴라민산, 5-티오-β-D-글루코푸라노스, 메틸 2,3,4-트리스-O-아세틸-1-티오-6-0-트리틸-α-D-글루코푸라노스, 4-티오-β-D-갈락토피라노스, 에틸 3,4,6,7-테트라-O-아세틸-2-데옥시-1,5-디티오-a-D-글루코헵토피라노시드, 2,5-언하이드로-D-알로노니트릴, 리보스, D-리보스, D-4-티오리보스, L-리보스 및 L-4-티오리보스 중 1개로부터 각각 독립적으로 선택되거나; 또는
    적어도 1개 또는 각각의 표적화기는 갈락토스 또는 N-아세틸갈락토사민인, siRNA 컨쥬게이트.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 R10, R11, R12, R13, R14 및 R15는 각각 독립적으로 H, 메틸 또는 에틸이거나; 또는
    R10, R11, R12, R13, R14 및 R15는 각각 H인, siRNA 컨쥬게이트.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 R2는 질소 함유 주쇄 상 N 원자와 결합하는 부위와, R3 내 P 원자와 결합하는 부위 둘 다를 가지거나; 또는
    상기 R2에 있어 질소 함유 주쇄 상 N 원자에 결합하는 부위는 N 원자와 아미드 결합을 형성하고, R3 내 P 원자와 결합하는 부위는 P 원자와 포스포에스테르 결합을 형성하거나; 또는
    상기 R2는 화학식 B5, 화학식 B6, 화학식 B5' 또는 화학식 B6'로 표시되는 바와 같은 기로부터 선택되는, siRNA 컨쥬게이트.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 컨쥬게이트는 화학식 403, 404, 405, 406, 407, 408, 409, 410, 411, 412, 413, 414, 415, 416, 417, 418, 419, 420, 421 또는 422로 표시되는 바와 같은 구조를 가지는, siRNA 컨쥬게이트.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 화학식 A59의 P 원자는 siRNA 서열의 센스 가닥 또는 안티센스 가닥의 말단 영역에 결합하고, 상기 말단 영역은 센스 가닥 또는 안티센스 가닥의 한쪽 말단에서 계수하였을 때 바로 출현하여 가장 가까운 뉴클레오티드 4개를 지칭하거나; 또는
    상기 화학식 A59의 P 원자는 siRNA의 센스 가닥 또는 안티센스 가닥의 말단에 결합하거나; 또는
    상기 화학식 A59의 P 원자는 siRNA의 센스 가닥의 3'-말단에 결합하거나; 또는
    상기 화학식 A59의 P 원자는 포스포디에스테르 결합에 의해 siRNA의 2', 3' 또는 5' 위치에 결합하는, siRNA 컨쥬게이트.
  11. 제1항에 있어서,
    i) 상기 뉴클레오티드 서열 I은 서열 번호 1에 보인 뉴클레오티드 서열과 1개 이하의 뉴클레오티드만큼의 차이를 보이고/보이거나, 상기 뉴클레오티드 서열 II는 서열 번호 2에 보인 뉴클레오티드 서열과 1개 이하의 뉴클레오티드만큼의 차이를 보이거나; 또는
    ii) 상기 뉴클레오티드 서열 I은 서열 번호 61에 보인 뉴클레오티드 서열과 1개 이하의 뉴클레오티드만큼의 차이를 보이고/보이거나, 상기 뉴클레오티드 서열 II는 서열 번호 62에 보인 뉴클레오티드 서열과 1개 이하의 뉴클레오티드만큼의 차이를 보이거나; 또는
    iii) 상기 뉴클레오티드 서열 I은 서열 번호 121에 보인 뉴클레오티드 서열과 1개 이하의 뉴클레오티드만큼의 차이를 보이고/보이거나, 상기 뉴클레오티드 서열 II는 서열 번호 122에 보인 뉴클레오티드 서열과 1개 이하의 뉴클레오티드만큼의 차이를 보이거나; 또는
    iv) 상기 뉴클레오티드 서열 I은 서열 번호 181에 보인 뉴클레오티드 서열과 1개 이하의 뉴클레오티드만큼의 차이를 보이고/보이거나, 상기 뉴클레오티드 서열 II는 서열 번호 182에 보인 뉴클레오티드 서열과 1개 이하의 뉴클레오티드만큼의 차이를 보이거나; 또는
    v) 상기 뉴클레오티드 서열 I은 서열 번호 241에 보인 뉴클레오티드 서열과 1개 이하의 뉴클레오티드만큼의 차이를 보이고/보이거나, 상기 뉴클레오티드 서열 II는 서열 번호 242에 보인 뉴클레오티드 서열과 1개 이하의 뉴클레오티드만큼의 차이를 보이거나; 또는
    vi) 상기 뉴클레오티드 서열 I은 서열 번호 301에 보인 뉴클레오티드 서열과 1개 이하의 뉴클레오티드만큼의 차이를 보이고/보이거나, 상기 뉴클레오티드 서열 II는 서열 번호 302에 보인 뉴클레오티드 서열과 1개 이하의 뉴클레오티드만큼의 차이를 보이는, siRNA 컨쥬게이트.
  12. 제1항 또는 제11항에 있어서,
    i) 상기 뉴클레오티드 서열 II와 서열 번호 2에 보인 상기 뉴클레오티드 서열 사이의 뉴클레오티드 차이는 Z4 부위에서의 차이를 포함하고, Z4는 A, C 또는 G로부터 선택되거나; 또는
    ii) 상기 뉴클레오티드 서열 II와 서열 번호 62에 보인 상기 뉴클레오티드 서열 사이의 뉴클레오티드 차이는 Z8 부위에서의 차이를 포함하고, Z8은 A, C 또는 G로부터 선택되거나; 또는
    iii) 상기 뉴클레오티드 서열 II와 서열 번호 122에 보인 상기 뉴클레오티드 서열 사이의 뉴클레오티드 차이는 Z12 부위에서의 차이를 포함하고, Z12는 A, C 또는 G로부터 선택되거나; 또는
    iv) 상기 뉴클레오티드 서열 II와 서열 번호 182에 보인 상기 뉴클레오티드 서열 사이의 뉴클레오티드 차이는 Z16 부위에서의 차이를 포함하고, Z16은 A, C 또는 G로부터 선택되거나; 또는
    v) 상기 뉴클레오티드 서열 II와 서열 번호 242에 보인 상기 뉴클레오티드 서열 사이의 뉴클레오티드 차이는 Z20 부위에서의 차이를 포함하고, Z20은 A, C 또는 G로부터 선택되거나; 또는
    vi) 상기 뉴클레오티드 서열 II와 서열 번호 302에 보인 상기 뉴클레오티드 서열 사이의 뉴클레오티드 차이는 Z24 부위에서의 차이를 포함하고, Z24는 A, C 또는 G로부터 선택되는, siRNA 컨쥬게이트.
  13. 제12항에 있어서, 상기 Z3는 상기 Z4와 상보성인 뉴클레오티드이거나; 또는 상기 Z7은 상기 Z8과 상보성인 뉴클레오티드이거나; 또는 상기 Z11은 상기 Z12와 상보성인 뉴클레오티드이거나; 또는 상기 Z15는 상기 Z16과 상보성인 뉴클레오티드이거나; 또는 상기 Z19는 상기 Z20과 상보성인 뉴클레오티드이거나; 또는 상기 Z23은 상기 Z24와 상보성인 뉴클레오티드인, siRNA 컨쥬게이트.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 뉴클레오티드 서열 I은 뉴클레오티드 서열 II와 기본적으로 역 상보성, 실질적으로 역 상보성 또는 완전히 역 상보성이고; 기본적으로 역 상보성은 뉴클레오티드 서열 2개 사이에 3개 이하의 염기 오류 쌍형성이 발생한 경우를 지칭하고; 실질적으로 역 상보성이란, 뉴클레오티드 서열 2개 사이에 1개 이하의 염기 오류 쌍형성이 발생한 경우를 지칭하고; 완전히 역 상보성이란, 뉴클레오티드 서열 2개 사이에 염기 오류 쌍형성이 발생하지 않은 경우를 지칭하는, siRNA 컨쥬게이트.
  15. 제11항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 센스 가닥은 뉴클레오티드 서열 III을 추가로 포함하고, 상기 안티센스 가닥은 뉴클레오티드 서열 IV를 추가로 포함하고, 상기 뉴클레오티드 서열 III 및 상기 뉴클레오티드 서열 IV는 그 길이가 각각 독립적으로 1개 ~ 4개 뉴클레오티드이고, 상기 뉴클레오티드 서열 III은 상기 뉴클레오티드 서열 I의 5'-말단에 결합하고, 상기 뉴클레오티드 서열 IV는 상기 뉴클레오티드 서열 II의 3'-말단에 결합하고, 상기 뉴클레오티드 서열 III은 그 길이가 상기 뉴클레오티드 서열 IV의 길이와 동일하며, 뉴클레오티드 서열 IV에 실질적으로 역 상보성이거나 완전히 역 상보성이고; 실질적으로 역 상보성이란, 뉴클레오티드 서열 2개 사이에 1개 이하의 염기 오류 쌍형성이 발생한 경우를 지칭하고; 완전히 역 상보성이란, 뉴클레오티드 서열 2개 사이에 염기 오류 쌍형성이 발생하지 않은 경우를 지칭하는, siRNA 컨쥬게이트.
  16. 제15항에 있어서,
    i) 상기 뉴클레오티드 서열 I은 서열 번호 3에 보인 뉴클레오티드 서열이고, 상기 뉴클레오티드 서열 II는 서열 번호 4에 보인 뉴클레오티드 서열이고; 상기 뉴클레오티드 서열 III 및 상기 뉴클레오티드 서열 IV는 둘 다 길이가 1개 뉴클레오티드이고, 상기 뉴클레오티드 서열 III의 염기가 U이거나; 또는 상기 뉴클레오티드 서열 III 및 상기 뉴클레오티드 서열 IV는 둘 다 길이가 2개 뉴클레오티드이고, 상기 뉴클레오티드 서열 III의 5'-말단 → 3'-말단 방향의 염기 조성이 CU이거나; 또는 상기 뉴클레오티드 서열 III 및 상기 뉴클레오티드 서열 IV는 둘 다 길이가 3개 뉴클레오티드이고, 상기 뉴클레오티드 서열 III의 5'-말단 → 3'-말단 방향의 염기 조성이 UCU이거나; 또는 상기 뉴클레오티드 서열 III 및 상기 뉴클레오티드 서열 IV는 둘 다 길이가 4개 뉴클레오티드이고, 상기 뉴클레오티드 서열 III의 5'-말단 → 3'-말단 방향의 염기 조성이 UUCU이거나; 또는
    ii) 상기 뉴클레오티드 서열 I은 서열 번호 63에 보인 뉴클레오티드 서열이고, 상기 뉴클레오티드 서열 II는 서열 번호 64에 보인 뉴클레오티드 서열이고; 상기 뉴클레오티드 서열 III 및 상기 뉴클레오티드 서열 IV는 둘 다 길이가 1개 뉴클레오티드이고, 상기 뉴클레오티드 서열 III의 염기가 A이거나; 또는 상기 뉴클레오티드 서열 III 및 상기 뉴클레오티드 서열 IV는 둘 다 길이가 2개 뉴클레오티드이고, 상기 뉴클레오티드 서열 III의 5'-말단 → 3'-말단 방향의 염기 조성이 UA이거나; 또는 상기 뉴클레오티드 서열 III 및 상기 뉴클레오티드 서열 IV는 둘 다 길이가 3개 뉴클레오티드이고, 상기 뉴클레오티드 서열 III의 5'-말단 → 3'-말단 방향의 염기 조성이 AUA이거나; 또는 상기 뉴클레오티드 서열 III 및 상기 뉴클레오티드 서열 IV는 둘 다 길이가 4개 뉴클레오티드이고, 상기 뉴클레오티드 서열 III의 5'-말단 → 3'-말단 방향의 염기 조성이 CAUA이거나; 또는
    iii) 상기 뉴클레오티드 서열 I은 서열 번호 123에 보인 뉴클레오티드 서열이고, 상기 뉴클레오티드 서열 II는 서열 번호 124에 보인 뉴클레오티드 서열이고; 상기 뉴클레오티드 서열 III 및 상기 뉴클레오티드 서열 IV는 둘 다 길이가 1개 뉴클레오티드이고, 상기 뉴클레오티드 서열 III의 염기가 G이거나; 또는 상기 뉴클레오티드 서열 III 및 상기 뉴클레오티드 서열 IV는 둘 다 길이가 2개 뉴클레오티드이고, 상기 뉴클레오티드 서열 III의 5'-말단 → 3'-말단 방향의 염기 조성이 AG이거나; 또는 상기 뉴클레오티드 서열 III 및 상기 뉴클레오티드 서열 IV는 둘 다 길이가 3개 뉴클레오티드이고, 상기 뉴클레오티드 서열 III의 5'-말단 → 3'-말단 방향의 염기 조성이 CAG이거나; 또는 상기 뉴클레오티드 서열 III 및 상기 뉴클레오티드 서열 IV는 둘 다 길이가 4개 뉴클레오티드이고, 상기 뉴클레오티드 서열 III의 5'-말단 → 3'-말단 방향의 염기 조성이 CCAG이거나; 또는
    iv) 상기 뉴클레오티드 서열 I은 서열 번호 183에 보인 뉴클레오티드 서열이고, 상기 뉴클레오티드 서열 II는 서열 번호 184에 보인 뉴클레오티드 서열이고; 상기 뉴클레오티드 서열 III 및 상기 뉴클레오티드 서열 IV는 둘 다 길이가 1개 뉴클레오티드이고, 상기 뉴클레오티드 서열 III의 염기가 G이거나; 또는 상기 뉴클레오티드 서열 III 및 상기 뉴클레오티드 서열 IV는 둘 다 길이가 2개 뉴클레오티드이고, 상기 뉴클레오티드 서열 III의 5'-말단 → 3'-말단 방향의 염기 조성이 GG이거나; 또는 상기 뉴클레오티드 서열 III 및 상기 뉴클레오티드 서열 IV는 둘 다 길이가 3개 뉴클레오티드이고, 상기 뉴클레오티드 서열 III의 5'-말단 → 3'-말단 방향의 염기 조성이 AGG이거나; 또는 상기 뉴클레오티드 서열 III 및 상기 뉴클레오티드 서열 IV는 둘 다 길이가 4개 뉴클레오티드이고, 상기 뉴클레오티드 서열 III의 5'-말단 → 3'-말단 방향의 염기 조성이 CAGG이거나; 또는
    v) 상기 뉴클레오티드 서열 I은 서열 번호 243에 보인 뉴클레오티드 서열이고, 상기 뉴클레오티드 서열 II는 서열 번호 244에 보인 뉴클레오티드 서열이고; 상기 뉴클레오티드 서열 III 및 상기 뉴클레오티드 서열 IV는 둘 다 길이가 1개 뉴클레오티드이고, 상기 뉴클레오티드 서열 III의 염기가 G이거나; 또는 상기 뉴클레오티드 서열 III 및 상기 뉴클레오티드 서열 IV는 둘 다 길이가 2개 뉴클레오티드이고, 상기 뉴클레오티드 서열 III의 5'-말단 → 3'-말단 방향의 염기 조성이 GG이거나; 또는 상기 뉴클레오티드 서열 III 및 뉴클레오티드 서열 IV는 둘 다 길이가 3개 뉴클레오티드이고, 상기 뉴클레오티드 서열 III의 5'-말단 → 3'-말단 방향의 염기 조성이 AGG이거나; 또는 상기 뉴클레오티드 서열 III 및 상기 뉴클레오티드 서열 IV는 둘 다 길이가 4개 뉴클레오티드이고, 상기 뉴클레오티드 서열 III의 5'-말단 → 3'-말단 방향의 염기 조성이 CAGG이거나; 또는
    vi) 상기 뉴클레오티드 서열 I은 서열 번호 303에 보인 뉴클레오티드 서열이고, 상기 뉴클레오티드 서열 II는 서열 번호 304에 보인 뉴클레오티드 서열이고; 상기 뉴클레오티드 서열 III 및 상기 뉴클레오티드 서열 IV는 둘 다 길이가 1개 뉴클레오티드이고, 상기 뉴클레오티드 서열 III의 염기가 A이거나; 또는 상기 뉴클레오티드 서열 III 및 상기 뉴클레오티드 서열 IV는 둘 다 길이가 2개 뉴클레오티드이고, 상기 뉴클레오티드 서열 III의 5'-말단 → 3'-말단 방향의 염기 조성이 UA이거나; 또는 상기 뉴클레오티드 서열 III 및 상기 뉴클레오티드 서열 IV는 둘 다 길이가 3개 뉴클레오티드이고, 상기 뉴클레오티드 서열 III의 5'-말단 → 3'-말단 방향의 염기 조성이 UUA이거나; 또는 상기 뉴클레오티드 서열 III 및 상기 뉴클레오티드 서열 IV는 둘 다 길이가 4개 뉴클레오티드이고, 상기 뉴클레오티드 서열 III의 5'-말단 → 3'-말단 방향의 염기 조성이 GUUA인, siRNA 컨쥬게이트.
  17. 제16항에 있어서, 상기 뉴클레오티드 서열 III은 상기 뉴클레오티드 서열 IV와 완전히 역 상보성인 siRNA 컨쥬게이트.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 안티센스 가닥은 뉴클레오티드 서열 V를 추가로 포함하고, 상기 뉴클레오티드 서열 V는 그 길이가 1개 ~ 3개 뉴클레오티드로서, 안티센스 가닥의 3'-말단에 결합하여, 안티센스 가닥의 3' -돌출 외가닥을 이루거나; 또는 상기 뉴클레오티드 서열 V는 그 길이가 2개 뉴클레오티드이거나; 또는 상기 뉴클레오티드 서열 V는 2개의 연속 티미딘 데옥시리보뉴클레오티드 또는 2개의 연속 우리딘 리보뉴클레오티드이거나; 또는 상기 뉴클레오티드 서열 V는 표적 mRNA의 대응 부위에 있는 뉴클레오티드에 상보성인, siRNA 컨쥬게이트.
  19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 siRNA의 상기 센스 가닥은 서열 번호 5에 보인 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 상기 안티센스 가닥은 서열 번호 6에 보인 뉴클레오티드 서열을 포함하거나; 또는 상기 siRNA의 상기 센스 가닥은 서열 번호 7에 보인 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 상기 안티센스 가닥은 서열 번호 8에 보인 뉴클레오티드 서열을 포함하거나; 또는
    상기 siRNA의 상기 센스 가닥은 서열 번호 65에 보인 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 상기 안티센스 가닥은 서열 번호 66에 보인 뉴클레오티드 서열을 포함하거나; 또는 상기 siRNA의 상기 센스 가닥은 서열 번호 67에 보인 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 상기 안티센스 가닥은 서열 번호 68에 보인 뉴클레오티드 서열을 포함하거나; 또는
    상기 siRNA의 상기 센스 가닥은 서열 번호 125에 보인 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 상기 siRNA의 상기 안티센스 가닥은 서열 번호 126에 보인 뉴클레오티드 서열을 포함하거나; 또는 상기 siRNA의 상기 센스 가닥은 서열 번호 127에 보인 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 상기 siRNA의 상기 안티센스 가닥은 서열 번호 128에 보인 뉴클레오티드 서열을 포함하거나; 또는
    상기 siRNA의 상기 센스 가닥은 서열 번호 185에 보인 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 상기 안티센스 가닥은 서열 번호 186에 보인 뉴클레오티드 서열을 포함하거나; 또는 상기 siRNA의 상기 센스 가닥은 서열 번호 187에 보인 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 상기 안티센스 가닥은 서열 번호 188에 보인 뉴클레오티드 서열을 포함하거나; 또는
    상기 siRNA의 상기 센스 가닥은 서열 번호 245에 보인 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 상기 siRNA의 상기 안티센스 가닥은 서열 번호 246에 보인 뉴클레오티드 서열을 포함하거나; 또는 상기 siRNA의 상기 센스 가닥은 서열 번호 247에 보인 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 상기 siRNA의 상기 안티센스 가닥은 서열 번호 248에 보인 뉴클레오티드 서열을 포함하거나; 또는
    상기 siRNA의 상기 센스 가닥은 서열 번호 305에 보인 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 상기 siRNA의 상기 안티센스 가닥은 서열 번호 306에 보인 뉴클레오티드 서열을 포함하거나; 또는 상기 siRNA의 상기 센스 가닥은 서열 번호 307에 보인 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 상기 siRNA의 상기 안티센스 가닥은 서열 번호 308에 보인 뉴클레오티드 서열을 포함하는, siRNA 컨쥬게이트.
  20. 제11항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 siRNA는 siC5a1, siC5a2, siC5b1, siC5b2, siC5c1, siC5c2, siC5d1, siC5d2, siC5e1, siC5e2, siC5f1 또는 siC5f2에 보인 뉴클레오티드 서열을 가지는, siRNA 컨쥬게이트.
  21. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 센스 가닥 또는 상기 안티센스 가닥 내 적어도 하나의 뉴클레오티드가 변형된 뉴클레오티드 이고/이거나 적어도 하나의 인산염기가 변형 기를 가지는 인산염기인, siRNA 컨쥬게이트.
  22. 제21항에 있어서, 상기 센스 가닥 및 상기 안티센스 가닥 내 뉴클레오티드는 각각 독립적으로 플루오르화 변형 뉴클레오티드 또는 비 플루오르화 변형 뉴클레오티드이거나; 또는
    상기 플루오르화 변형 뉴클레오티드는 상기 뉴클레오티드 서열 I 및 상기 뉴클레오티드 서열 II 내에 위치하고, 상기 뉴클레오티드 서열 I의 5'-말단 → 3'-말단 방향으로 7번, 8번 및 9번 위치에 있는 뉴클레오티드는 플루오르화 변형 뉴클레오티드이고; 상기 뉴클레오티드 서열 II의 5'-말단 → 3'-말단 방향으로 2번, 6번, 14번 및 16번 위치에 있는 뉴클레오티드는 플루오르화 변형 뉴클레오티드이거나; 또는
    상기 센스 가닥의 상기 뉴클레오티드 서열 I의 5'-말단 → 3'-말단 방향으로 7번, 8번 및 9번, 또는 5번, 7번, 8번 및 9번 위치에 있는 뉴클레오티드는 플루오르화 변형 뉴클레오티드이고, 상기 센스 가닥의 나머지 위치에 있는 뉴클레오티드는 비 플루오르화 변형 뉴클레오티드이고; 상기 안티센스 가닥의 상기 뉴클레오티드 서열 II의 5'-말단 → 3'-말단 방향으로 2번, 6번, 14번 및 16번, 또는 2번, 6번, 8번, 9번, 14번 및 16번 위치에 있는 뉴클레오티드는 플루오르화 변형 뉴클레오티드이고, 상기 안티 센스 가닥의 나머지 위치에 있는 뉴클레오티드는 비 플루오르화 변형 뉴클레오티드인, siRNA 컨쥬게이트.
  23. 제21항 또는 제22항에 있어서, 비 플루오르화 변형 뉴클레오티드는 뉴클레오티드 리보스기의 2'-하이드록시를 비 플루오르기로 치환함으로써 생성된 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 유사체로부터 각각 독립적으로 선택되거나; 또는
    상기 뉴클레오티드 리보스기의 2'-하이드록시를 비 플루오르기로 치환하여 생성된 상기 뉴클레오티드는 2'-알콕시 변형 뉴클레오티드, 2'-치환 알콕시 변형 뉴클레오티드, 2'-알킬 변형 뉴클레오티드, 2'-치환 알킬 변형 뉴클레오티드, 2'-아미노 변형 뉴클레오티드, 2' -치환 아미노 변형 뉴클레오티드 및 2'-데옥시뉴클레오티드 중 1개로부터 선택되고; 상기 뉴클레오티드 유사체는 이소뉴클레오티드, LNA, ENA, cET, UNA 및 GNA 중 1개로부터 선택되거나; 또는
    각각의 비 플루오르화 변형 뉴클레오티드는 메톡시 변형 뉴클레오티드이고, 상기 메톡시 변형 뉴클레오티드는 뉴클레오티드 리보스기의 2'-하이드록시를 메톡시기로 치환함으로써 생성된 뉴클레오티드를 지칭하는, siRNA 컨쥬게이트.
  24. 제21항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 siRNA의 상기 센스 가닥 상기 뉴클레오티드 I의 5'-말단 → 3'-말단 방향으로 5번, 7번, 8번 및 9번 위치에 있는 뉴클레오티드는 플루오르화 변형 뉴클레오티드이고, 상기 siRNA의 상기 센스 가닥의 나머지 위치에 있는 뉴클레오티드는 메톡시 변형 뉴클레오티드이고; 상기 siRNA의 상기 안티센스 가닥 내 상기 뉴클레오티드 서열 II의 5'-말단 → 3'-말단 방향으로 2번, 6번, 8번, 9번, 14번 및 16번 위치에 있는 뉴클레오티드는 플루오르화 변형 뉴클레오티드이고, 상기 siRNA의 안티 센스 가닥의 나머지 위치에 있는 뉴클레오티드는 메톡시 변형 뉴클레오티드이거나; 또는
    상기 siRNA의 상기 센스 가닥 상기 뉴클레오티드 I의 5'-말단 → 3'-말단 방향으로 5번, 7번, 8번 및 9번 위치에 있는 뉴클레오티드는 플루오르화 변형 뉴클레오티드이고, 상기 siRNA의 상기 센스 가닥의 나머지 위치에 있는 뉴클레오티드는 메톡시 변형 뉴클레오티드이고; 상기 siRNA의 상기 안티센스 가닥 내 상기 뉴클레오티드 서열 II의 5'-말단 → 3'-말단 방향으로 2번, 6번, 14번 및 16번 위치에 있는 뉴클레오티드는 플루오르화 변형 뉴클레오티드이고, 상기 siRNA의 상기 안티 센스 가닥의 나머지 위치에 있는 뉴클레오티드는 메톡시 변형 뉴클레오티드이거나; 또는
    상기 siRNA의 상기 센스 가닥 상기 뉴클레오티드 I의 5'-말단 → 3'-말단 방향으로 7번, 8번 및 9번 위치에 있는 뉴클레오티드는 플루오르화 변형 뉴클레오티드이고, 상기 siRNA의 상기 센스 가닥의 나머지 위치에 있는 뉴클레오티드는 메톡시 변형 뉴클레오티드이고; 상기 siRNA의 상기 안티센스 가닥 내 상기 뉴클레오티드 서열 II의 5'-말단 → 3'-말단 방향으로 2번, 6번, 14번 및 16번 위치에 있는 뉴클레오티드는 플루오르화 변형 뉴클레오티드이고, 상기 siRNA의 상기 안티 센스 가닥의 나머지 위치에 있는 뉴클레오티드는 메톡시 변형 뉴클레오티드인, siRNA 컨쥬게이트.
  25. 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 siRNA는 siC5a1-M1, siC5a2-M1, siC5a1-M2, siC5a2-M2, siC5a1-M3, siC5a2-M3, siC5b1-M1, siC5b2-M1, siC5b1-M2, siC5b2-M2, siC5b1-M3, siC5b2-M3, siC5c1-M1, siC5c2-M1, siC5c1-M2, siC5c2-M2, siC5c1-M3, siC5c2-M3, siC5d1-M1, siC5d2-M1, siC5d1-M2, siC5d2-M2, siC5d1-M3, siC5d2-M3, siC5e1-M1, siC5e2-M1, siC5e1-M2, siC5e2-M2, siC5e1-M3, siC5e2-M3, siC5f1-M1, siC5f2-M1, siC5f1-M2, siC5f2-M2, siC5f1-M3 또는 siC5f2-M3 중 임의의 것인 siRNA 컨쥬게이트.
  26. 제21항에 있어서, 상기 변형기를 가지는 인산염기는 인산염기의 포스포디에스테르 결합내 적어도 1개의 산소 원자를 황 원자로 치환하여 생성된 포스포로티오에이트기이거나; 상기 변형기를 가지는 인산염기는 하기 화학식 1로 표시되는 바와 같은 구조,
    화학식 1
    Figure pct00095

    를 가지는 포스포로티오에이트기인, siRNA 컨쥬게이트.
  27. 제26항에 있어서, 상기 siRNA 내 포스포로티오에이트 결합은 이하 위치들:
    상기 센스 가닥의 5'-말단에 있는, 제1 뉴클레오티드와 제2 뉴클레오티드 사이의 위치;
    상기 센스 가닥의 5'-말단에 있는, 제2 뉴클레오티드와 제3 뉴클레오티드 사이의 위치;
    상기 센스 가닥의 3'-말단에 있는, 제1 뉴클레오티드와 제2 뉴클레오티드 사이의 위치;
    상기 센스 가닥의 3'-말단에 있는, 제2 뉴클레오티드와 제3 뉴클레오티드 사이의 위치;
    상기 안티센스 가닥의 5'-말단에 있는, 제1 뉴클레오티드와 제2 뉴클레오티드 사이의 위치;
    상기 안티센스 가닥의 5'-말단에 있는, 제2 뉴클레오티드와 제3 뉴클레오티드 사이의 위치;
    상기 안티센스 가닥의 3'-말단에 있는, 제1 뉴클레오티드와 제2 뉴클레오티드 사이의 위치; 그리고
    상기 안티센스 가닥의 3'-말단에 있는, 제2 뉴클레오티드와 제3 뉴클레오티드 사이의 위치;
    중 적어도 1개의 위치에 존재하는, siRNA 컨쥬게이트.
  28. 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 siRNA는 siC5a1-M1S, siC5a2-M1S, siC5a1-M2S, siC5a2-M2S, siC5a1-M3S, siC5a2-M3S, siC5b1-M1S, siC5b2-M1S, siC5b1-M2S, siC5b2-M2S, siC5b1-M3S, siC5b2-M3S, siC5c1-M1S, siC5c2-M1S, siC5c1-M2S, siC5c2-M2S, siC5c1-M3S, siC5c2-M3S, siC5d1-M1S, siC5d2-M1S, siC5d1-M2S, siC5d2-M2S, siC5d1-M3S, siC5d2-M3S, siC5e1-M1S, siC5e2-M1S, siC5e1-M2S, siC5e2-M2S, siC5e1-M3S, siC5e2-M3S, siC5f1-M1S, siC5f2-M1S, siC5f1-M2S, siC5f2-M2S, siC5f1-M3S 또는 iC5f2-M3S 중 임의의 것 1개인 siRNA 컨쥬게이트.
  29. 제1항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 siRNA의 상기 안티센스 가닥 내 상기 5'-말단 뉴클레오티드는 5'-인산염 뉴클레오티드 또는 5'-인산염 유사체 변형 뉴클레오티드이거나; 또는
    상기 5'-인산염 뉴클레오티드는 화학식 2
    화학식 2
    Figure pct00096

    로 표시되는 바와 같은 뉴클레오티드이고;
    상기 5'-인산염 유사체 변형 뉴클레오티드는 하기 화학식 3 ~ 6
    Figure pct00097

    중 임의의 것 1개로 표시되는 뉴클레오티드로부터 선택되되,
    여기서 R은 H, OH, 메톡시 또는 F로부터 선택되고; 염기는 A, U, C, G 또는 T로부터 선택되는 염기를 나타내는, siRNA 컨쥬게이트.
  30. 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 siRNA는 siC5a1-M1P1, siC5a1-M2P1, siC5a1-M3P1, siC5a2-M1P1, siC5a2-M2P1, siC5a2-M3P1, siC5a1-M1SP1, siC5a1-M2SP1, siC5a1-M3SP1, siC5a2-M1SP1, siC5a2-M2SP1, siC5a2-M3SP1, siC5b1-M1P1, siC5b1-M2P1, siC5b1-M3P1, siC5b2-M1P1, siC5b2-M2P1, siC5b2-M3P1, siC5b1-M1SP1, siC5b1-M2SP1, siC5b1-M3SP1, siC5b2-M1SP1, siC5b2-M2SP1, siC5b2-M3SP1, siC5c1-M1P1, siC5c1-M2P1, siC5c1-M3P1, siC5c2-M1P1, siC5c2-M2P1, siC5c2-M3P1, siC5c1-M1SP1, siC5c1-M2SP1, siC5c1-M3SP1, siC5c2-M1SP1, siC5c2-M2SP1, siC5c2-M3SP1, siC5d1-M1P1, siC5d1-M2P1, siC5d1-M3P1, siC5d2-M1P1, siC5d2-M2P1, siC5d2-M3P1, siC5d1-M1SP1, siC5d1-M2SP1, siC5d1-M3SP1, siC5d2-M1SP1, siC5d2-M2SP1, siC5d2-M3SP1, siC5e1-M1P1, siC5e1-M2P1, siC5e1-M3P1, siC5e2-M1P1, siC5e2-M2P1, siC5e2-M3P1, siC5e1-M1SP1, siC5e1-M2SP1, siC5e1-M3SP1, siC5e2-M1SP1, siC5e2-M2SP1, siC5e2-M3SP1, siC5f1-M1P1, siC5f1-M2P1, siC5f1-M3P1, siC5f2-M1P1, siC5f2-M2P1, siC5f2-M3P1, siC5f1-M1SP1, siC5f1-M2SP1, siC5f1-M3SP1, siC5f2-M1SP1, siC5f2-M2SP1 또는 siC5f2-M3SP1 중 임의의 것 1개인, siRNA 컨쥬게이트.
  31. siRNA로서, 이 siRNA는 센스 가닥과 안티센스 가닥을 포함하고, 센스 가닥 및 안티센스 가닥 내 뉴클레오티드들은 각각 독립적으로 플루오르화 변형 뉴클레오티드 또는 비 플루오르화 변형 뉴클레오티드이고; 상기 센스 가닥은 뉴클레오티드 서열 I을 포함하고, 상기 안티센스 가닥은 뉴클레오티드 서열 II를 포함하고, 상기 뉴클레오티드 서열 I 및 상기 뉴클레오티드 서열 II는 적어도 부분적으로 역 상보성으로서, 이중 가닥 영역을 형성하고, 상기 플루오르화 변형 뉴클레오티드는 상기 뉴클레오티드 I 및 상기 뉴클레오티드 II 내에 위치하고, 상기 센스 가닥 상기 뉴클레오티드 서열 I의 5'-말단 → 3'-말단 방향으로 7번, 8번 및 9번 위치에 있는 뉴클레오티드는 플루오르화 변형 뉴클레오티드이고, 상기 센스 가닥 나머지 위치에 있는 뉴클레오티드는 비 플루오르화 변형 뉴클레오티드이고; 상기 안티센스 가닥 상기 뉴클레오티드 서열 II의 5'-말단 → 3'-말단 방향으로 2번, 6번, 14번 및 16번 위치에 있는 뉴클레오티드는 플루오르화 변형 뉴클레오티드이고, 상기 안티센스 가닥 나머지 위치에 있는 뉴클레오티드는 비 플루오르화 변형 뉴클레오티드이고;
    i) 상기 뉴클레오티드 서열 I은 서열 번호 1에 보인 뉴클레오티드 서열과 길이가 동일하되 3개 이하의 뉴클레오티드만큼의 차이를 보이고; 상기 뉴클레오티드 서열 II는 서열 번호 2에 보인 뉴클레오티드 서열과 길이가 동일하되 3개 이하의 뉴클레오티드만큼의 차이를 보이고; 상기 뉴클레오티드 서열 I은 Z1에 대응하는 부위에 뉴클레오티드 Z3을 포함하고, 상기 뉴클레오티드 서열 II는 Z2에 대응하는 부위에 뉴클레오티드 Z4를 포함하고, Z4는 상기 안티센스 가닥의 5'-말단으로부터 첫 번째 뉴클레오티드이거나; 또는
    ii) 상기 뉴클레오티드 서열 I은 서열 번호 61에 보인 뉴클레오티드 서열과 길이가 동일하되 3개 이하의 뉴클레오티드만큼의 차이를 보이고; 상기 뉴클레오티드 서열 II는 서열 번호 62에 보인 뉴클레오티드 서열과 길이가 동일하되 3개 이하의 뉴클레오티드만큼의 차이를 보이고; 상기 뉴클레오티드 서열 I은 Z5에 대응하는 부위에 뉴클레오티드 Z7을 포함하고, 상기 뉴클레오티드 서열 II는 Z6에 대응하는 부위에 뉴클레오티드 Z8를 포함하고, Z8는 상기 안티센스 가닥의 5'-말단으로부터 첫 번째 뉴클레오티드이거나; 또는
    iii) 상기 뉴클레오티드 서열 I은 서열 번호 121에 보인 뉴클레오티드 서열과 길이가 동일하되 3개 이하의 뉴클레오티드만큼의 차이를 보이고; 상기 뉴클레오티드 서열 II는 서열 번호 122에 보인 뉴클레오티드 서열과 길이가 동일하되 3개 이하의 뉴클레오티드만큼의 차이를 보이고; 상기 뉴클레오티드 서열 I은 Z9에 대응하는 부위에 뉴클레오티드 Z11을 포함하고, 상기 뉴클레오티드 서열 II는 Z10에 대응하는 부위에 뉴클레오티드 Z12를 포함하고, 상기 Z12는 상기 안티센스 가닥의 5'-말단으로부터 첫 번째 뉴클레오티드이거나; 또는
    iv) 상기 뉴클레오티드 서열 I은 서열 번호 181에 보인 뉴클레오티드 서열과 길이가 동일하되 3개 이하의 뉴클레오티드만큼의 차이를 보이고; 상기 뉴클레오티드 서열 II는 서열 번호 182에 보인 뉴클레오티드 서열과 길이가 동일하되 3개 이하의 뉴클레오티드만큼의 차이를 보이고; 상기 뉴클레오티드 서열 I은 Z13에 대응하는 부위에 뉴클레오티드 Z15를 포함하고, 상기 뉴클레오티드 서열 II는 Z14에 대응하는 부위에 뉴클레오티드 Z16을 포함하고, 상기 Z16은 상기 안티센스 가닥의 5'-말단으로부터 첫 번째 뉴클레오티드이거나; 또는
    v) 상기 뉴클레오티드 서열 I은 서열 번호 241에 보인 뉴클레오티드 서열과 길이가 동일하되 3개 이하의 뉴클레오티드만큼의 차이를 보이고; 상기 뉴클레오티드 서열 II는 서열 번호 242에 보인 뉴클레오티드 서열과 길이가 동일하되 3개 이하의 뉴클레오티드만큼의 차이를 보이고; 상기 뉴클레오티드 서열 I은 Z17에 대응하는 부위에 뉴클레오티드 Z19를 포함하고, 상기 뉴클레오티드 서열 II는 Z18에 대응하는 부위에 뉴클레오티드 Z20을 포함하고, Z20은 상기 안티센스 가닥의 5'-말단으로부터 첫 번째 뉴클레오티드이거나; 또는
    vi) 상기 뉴클레오티드 서열 I은 서열 번호 301에 보인 뉴클레오티드 서열과 길이가 동일하되 3개 이하의 뉴클레오티드만큼의 차이를 보이고; 상기 뉴클레오티드 서열 II는 서열 번호 302에 보인 뉴클레오티드 서열과 길이가 동일하되 3개 이하의 뉴클레오티드만큼의 차이를 보이고; 상기 뉴클레오티드 서열 I은 Z21에 대응하는 부위에 뉴클레오티드 Z23을 포함하고, 상기 뉴클레오티드 서열 II는 Z22에 대응하는 부위에 뉴클레오티드 Z24를 포함하고, Z24는 상기 안티센스 가닥의 5'-말단으로부터 첫 번째 뉴클레오티드인, siRNA.
  32. 제31항에 있어서, 비 플루오르화 변형 뉴클레오티드는 각각 독립적으로 상기 뉴클레오티드의 리보스기의 2'-하이드록시를 비 플루오르기로 치환하여 생성된 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 유사체로부터 선택되는 siRNA.
  33. 제32항에 있어서, 상기 뉴클레오티드 리보스기의 2'-하이드록시를 비 플루오르기로 치환하여 생성된 뉴클레오티드는 2'-알콕시 변형 뉴클레오티드, 2'-치환 알콕시 변형 뉴클레오티드, 2'-알킬 변형 뉴클레오티드, 2'-치환 알킬 변형 뉴클레오티드, 2'-아미노 변형 뉴클레오티드, 2'-치환 아미노 변형 뉴클레오티드 및 2'-데옥시뉴클레오티드 중 1개로부터 선택되고; 상기 뉴클레오티드 유사체는 이소뉴클레오티드, LNA, ENA, cET, UNA 및 GNA 중 1개로부터 선택되는, siRNA.
  34. 제31항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 비 플루오르화 변형 뉴클레오티드 각각은 메톡시 변형 뉴클레오티드이고, 상기 메톡시 변형 뉴클레오티드는 뉴클레오티드 리보스기의 2'-하이드록시를 메톡시기로 치환함으로써 생성된 뉴클레오티드를 지칭하는, siRNA.
  35. 제31항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, i) 상기 뉴클레오티드 서열 I은 서열 번호 1에 보인 뉴클레오티드 서열과 1개 이하의 뉴클레오티드만큼의 차이를 보이고/보이거나, 상기 뉴클레오티드 서열 II는 서열 번호 2에 보인 뉴클레오티드 서열과 1개 이하의 뉴클레오티드만큼의 차이를 보이거나; 또는 ii) 상기 뉴클레오티드 서열 I은 서열 번호 61에 보인 뉴클레오티드 서열과 1개 이하의 뉴클레오티드만큼의 차이를 보이고/보이거나, 상기 뉴클레오티드 서열 II는 서열 번호 62에 보인 뉴클레오티드 서열과 1개 이하의 뉴클레오티드만큼의 차이를 보이거나; 또는 iii) 상기 뉴클레오티드 서열 I은 서열 번호 121에 보인 뉴클레오티드 서열과 1개 이하의 뉴클레오티드만큼의 차이를 보이고/보이거나, 상기 뉴클레오티드 서열 II는 서열 번호 122에 보인 뉴클레오티드 서열과 1개 이하의 뉴클레오티드만큼의 차이를 보이거나; 또는 iv) 상기 뉴클레오티드 서열 I은 서열 번호 181에 보인 뉴클레오티드 서열과 1개 이하의 뉴클레오티드만큼의 차이를 보이고/보이거나, 상기 뉴클레오티드 서열 II는 서열 번호 182에 보인 뉴클레오티드 서열과 1개 이하의 뉴클레오티드만큼의 차이를 보이거나; 또는 v) 상기 뉴클레오티드 서열 I은 서열 번호 241에 보인 뉴클레오티드 서열과 1개 이하의 뉴클레오티드만큼의 차이를 보이고/보이거나, 상기 뉴클레오티드 서열 II는 서열 번호 242에 보인 뉴클레오티드 서열과 1개 이하의 뉴클레오티드만큼의 차이를 보이거나; 또는 vi) 상기 뉴클레오티드 서열 I은 서열 번호 301에 보인 뉴클레오티드 서열과 1개 이하의 뉴클레오티드만큼의 차이를 보이고/보이거나, 상기 뉴클레오티드 서열 II는 서열 번호 302에 보인 뉴클레오티드 서열과 1개 이하의 뉴클레오티드만큼의 차이를 보이는, siRNA.
  36. 제31항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, i) 상기 뉴클레오티드 서열 II와 서열 번호 2에 보인 뉴클레오티드 서열 사이의 뉴클레오티드 차이는 Z4 부위에서의 차이를 포함하고, Z4는 A, C 또는 G로부터 선택되거나; 또는 ii) 상기 뉴클레오티드 서열 II와 서열 번호 62에 보인 뉴클레오티드 서열 사이의 뉴클레오티드 차이는 Z8 부위에서의 차이를 포함하고, Z8은 A, C 또는 G로부터 선택되거나; 또는 iii) 상기 뉴클레오티드 서열 II와 서열 번호 122에 보인 뉴클레오티드 서열 사이의 뉴클레오티드 차이는 Z12 부위에서의 차이를 포함하고, Z12는 A, C 또는 G로부터 선택되거나; 또는 iv) 상기 뉴클레오티드 서열 II와 서열 번호 182에 보인 뉴클레오티드 서열 사이의 뉴클레오티드 차이는 Z16 부위에서의 차이를 포함하고, Z16은 A, C 또는 G로부터 선택되거나; 또는 v) 상기 뉴클레오티드 서열 II와 서열 번호 242에 보인 뉴클레오티드 서열 사이의 뉴클레오티드 차이는 Z20 부위에서의 차이를 포함하고, Z20은 A, C 또는 G로부터 선택되거나; 또는 vi) 상기 뉴클레오티드 서열 II와 서열 번호 302에 보인 뉴클레오티드 서열 사이의 뉴클레오티드 차이는 Z24 부위에서의 차이를 포함하고, Z24는 A, C 또는 G로부터 선택되는, siRNA.
  37. 제36항에 있어서, Z3는 Z4와 상보성인 뉴클레오티드이거나; 또는 Z7은 Z8과 상보성인 뉴클레오티드이거나; 또는 Z11은 Z12와 상보성인 뉴클레오티드이거나; 또는 Z15는 Z16과 상보성인 뉴클레오티드이거나; 또는 Z19는 Z20과 상보성인 뉴클레오티드이거나; 또는 Z23은 Z24와 상보성인 뉴클레오티드인, siRNA.
  38. 제31항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 뉴클레오티드 서열 I은 상기 뉴클레오티드 서열 II와 기본적으로 역 상보성, 실질적으로 역 상보성 또는 완전히 역 상보성이고; 기본적으로 역 상보성은 뉴클레오티드 서열 2개 사이에 3개 이하의 염기 오류 쌍형성이 발생한 경우를 지칭하고; 실질적으로 역 상보성이란, 뉴클레오티드 서열 2개 사이에 1개 이하의 염기 오류 쌍형성이 발생한 경우를 지칭하고; 완전히 역 상보성이란, 뉴클레오티드 서열 2개 사이에 염기 오류 쌍형성이 발생하지 않은 경우를 지칭하는, siRNA.
  39. 제31항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 센스 가닥은 뉴클레오티드 서열 III을 추가로 포함하고, 상기 안티센스 가닥은 뉴클레오티드 서열 IV를 추가로 포함하고, 상기 뉴클레오티드 서열 III 및 상기 뉴클레오티드 서열 IV는 그 길이가 각각 독립적으로 1개 ~ 4개 뉴클레오티드이고, 상기 뉴클레오티드 서열 III은 상기 뉴클레오티드 서열 I의 5'-말단에 결합하고, 상기 뉴클레오티드 서열 IV는 상기 뉴클레오티드 서열 II의 3'-말단에 결합하고, 상기 뉴클레오티드 서열 III은 그 길이가 상기 뉴클레오티드 서열 IV의 길이와 동일하며, 이 뉴클레오티드 서열 IV에 실질적으로 역 상보성이거나 완전히 역 상보성이고; 실질적으로 역 상보성은 뉴클레오티드 서열 2개 사이에 1개 이하의 염기 오류 쌍형성이 발생한 경우를 지칭하고; 완전히 역 상보성이란, 뉴클레오티드 서열 2개 사이에 염기 오류 쌍형성이 발생하지 않은 경우를 지칭하는, siRNA.
  40. 제31항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서,
    i) 상기 뉴클레오티드 서열 I은 서열 번호 3에 보인 뉴클레오티드 서열이고, 상기 뉴클레오티드 서열 II는 서열 번호 4에 보인 뉴클레오티드 서열이고; 상기 뉴클레오티드 서열 III 및 상기 뉴클레오티드 서열 IV는 둘 다 길이가 1개 뉴클레오티드이고, 상기 뉴클레오티드 서열 III의 염기가 U이거나; 또는 상기 뉴클레오티드 서열 III 및 상기 뉴클레오티드 서열 IV는 둘 다 길이가 2개 뉴클레오티드이고, 상기 뉴클레오티드 서열 III의 5'-말단 → 3'-말단 방향의 염기 조성이 CU이거나; 또는 상기 뉴클레오티드 서열 III 및 상기 뉴클레오티드 서열 IV는 둘 다 길이가 3개 뉴클레오티드이고, 상기 뉴클레오티드 서열 III의 5'-말단 → 3'-말단 방향의 염기 조성이 UCU이거나; 또는 상기 뉴클레오티드 서열 III 및 상기 뉴클레오티드 서열 IV는 둘 다 길이가 4개 뉴클레오티드이고, 상기 뉴클레오티드 서열 III의 5'-말단 → 3'-말단 방향의 염기 조성이 UUCU이거나; 또는
    ii) 상기 뉴클레오티드 서열 I은 서열 번호 63에 보인 뉴클레오티드 서열이고, 상기 뉴클레오티드 서열 II는 서열 번호 64에 보인 뉴클레오티드 서열이고; 상기 뉴클레오티드 서열 III 및 상기 뉴클레오티드 서열 IV는 둘 다 길이가 1개 뉴클레오티드이고, 상기 뉴클레오티드 서열 III의 염기가 A이거나; 또는 상기 뉴클레오티드 서열 III 및 상기 뉴클레오티드 서열 IV는 둘 다 길이가 2개 뉴클레오티드이고, 상기 뉴클레오티드 서열 III의 5'-말단 → 3'-말단 방향의 염기 조성이 UA이거나; 또는 상기 뉴클레오티드 서열 III 및 상기 뉴클레오티드 서열 IV는 둘 다 길이가 3개 뉴클레오티드이고, 상기 뉴클레오티드 서열 III의 5'-말단 → 3'-말단 방향의 염기 조성이 AUA이거나; 또는 상기 뉴클레오티드 서열 III 및 상기 뉴클레오티드 서열 IV는 둘 다 길이가 4개 뉴클레오티드이고, 상기 뉴클레오티드 서열 III의 5'-말단 → 3'-말단 방향의 염기 조성이 CAUA이거나; 또는
    iii) 상기 뉴클레오티드 서열 I은 서열 번호 123에 보인 뉴클레오티드 서열이고, 상기 뉴클레오티드 서열 II는 서열 번호 124에 보인 뉴클레오티드 서열이고; 상기 뉴클레오티드 서열 III 및 상기 뉴클레오티드 서열 IV는 둘 다 길이가 1개 뉴클레오티드이고, 상기 뉴클레오티드 서열 III의 염기가 G이거나; 또는 상기 뉴클레오티드 서열 III 및 상기 뉴클레오티드 서열 IV는 둘 다 길이가 2개 뉴클레오티드이고, 상기 뉴클레오티드 서열 III의 5'-말단 → 3'-말단 방향의 염기 조성이 AG이거나; 또는 상기 뉴클레오티드 서열 III 및 상기 뉴클레오티드 서열 IV는 둘 다 길이가 3개 뉴클레오티드이고, 상기 뉴클레오티드 서열 III의 5'-말단 → 3'-말단 방향의 염기 조성이 CAG이거나; 또는 상기 뉴클레오티드 서열 III 및 상기 뉴클레오티드 서열 IV는 둘 다 길이가 4개 뉴클레오티드이고, 상기 뉴클레오티드 서열 III의 5'-말단 → 3'-말단 방향의 염기 조성이 CCAG이거나; 또는
    iv) 상기 뉴클레오티드 서열 I은 서열 번호 183에 보인 뉴클레오티드 서열이고, 상기 뉴클레오티드 서열 II는 서열 번호 184에 보인 뉴클레오티드 서열이고; 상기 뉴클레오티드 서열 III 및 상기 뉴클레오티드 서열 IV는 둘 다 길이가 1개 뉴클레오티드이고, 상기 뉴클레오티드 서열 III의 염기가 G이거나; 또는 상기 뉴클레오티드 서열 III 및 상기 뉴클레오티드 서열 IV는 둘 다 길이가 2개 뉴클레오티드이고, 상기 뉴클레오티드 서열 III의 5'-말단 → 3'-말단 방향의 염기 조성이 GG이거나; 또는 상기 뉴클레오티드 서열 III 및 상기 뉴클레오티드 서열 IV는 둘 다 길이가 3개 뉴클레오티드이고, 상기 뉴클레오티드 서열 III의 5'-말단 → 3'-말단 방향의 염기 조성이 AGG이거나; 또는 상기 뉴클레오티드 서열 III 및 상기 뉴클레오티드 서열 IV는 둘 다 길이가 4개 뉴클레오티드이고, 상기 뉴클레오티드 서열 III의 5'-말단 → 3'-말단 방향의 염기 조성이 CAGG이거나; 또는
    v) 상기 뉴클레오티드 서열 I은 서열 번호 243에 보인 뉴클레오티드 서열이고, 상기 뉴클레오티드 서열 II는 서열 번호 244에 보인 뉴클레오티드 서열이고; 상기 뉴클레오티드 서열 III 및 상기 뉴클레오티드 서열 IV는 둘 다 길이가 1개 뉴클레오티드이고, 상기 뉴클레오티드 서열 III의 염기가 G이거나; 또는 상기 뉴클레오티드 서열 III 및 상기 뉴클레오티드 서열 IV는 둘 다 길이가 2개 뉴클레오티드이고, 상기 뉴클레오티드 서열 III의 5'-말단 → 3'-말단 방향의 염기 조성이 GG이거나; 또는 상기 뉴클레오티드 서열 III 및 상기 뉴클레오티드 서열 IV는 둘 다 길이가 3개 뉴클레오티드이고, 상기 뉴클레오티드 서열 III의 5'-말단 → 3'-말단 방향의 염기 조성이 AGG이거나; 또는 상기 뉴클레오티드 서열 III 및 상기 뉴클레오티드 서열 IV는 둘 다 길이가 4개 뉴클레오티드이고, 상기 뉴클레오티드 서열 III의 5'-말단 → 3'-말단 방향의 염기 조성이 CAGG이거나; 또는
    vi) 상기 뉴클레오티드 서열 I은 서열 번호 303에 보인 뉴클레오티드 서열이고, 상기 뉴클레오티드 서열 II는 서열 번호 304에 보인 뉴클레오티드 서열이고; 상기 뉴클레오티드 서열 III 및 상기 뉴클레오티드 서열 IV는 둘 다 길이가 1개 뉴클레오티드이고, 상기 뉴클레오티드 서열 III의 염기가 A이거나; 또는 상기 뉴클레오티드 서열 III 및 상기 뉴클레오티드 서열 IV는 둘 다 길이가 2개 뉴클레오티드이고, 상기 뉴클레오티드 서열 III의 5'-말단 → 3'-말단 방향의 염기 조성이 UA이거나; 또는 상기 뉴클레오티드 서열 III 및 상기 뉴클레오티드 서열 IV는 둘 다 길이가 3개 뉴클레오티드이고, 상기 뉴클레오티드 서열 III의 5'-말단 → 3'-말단 방향의 염기 조성이 UUA이거나; 또는 상기 뉴클레오티드 서열 III 및 상기 뉴클레오티드 서열 IV는 둘 다 길이가 4개 뉴클레오티드이고, 상기 뉴클레오티드 서열 III의 5'-말단 → 3'-말단 방향의 염기 조성이 GUUA인, siRNA.
  41. 제40항에 있어서, 상기 뉴클레오티드 서열 III은 뉴클레오티드 서열 IV와 완전히 역 상보성인 siRNA.
  42. 제31항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 안티센스 가닥은 뉴클레오티드 서열 V를 추가로 포함하고, 상기 뉴클레오티드 서열 V는 그 길이가 1개 ~ 3개 뉴클레오티드로서, 상기 안티센스 가닥의 3'-말단에 결합하여, 안티센스 가닥의 3' -돌출 외가닥을 이루거나; 또는 상기 뉴클레오티드 서열 V는 그 길이가 2개 뉴클레오티드이거나; 또는 상기 뉴클레오티드 서열 V는 2개의 연속 티미딘 데옥시리보뉴클레오티드 또는 2개의 연속 우리딘 리보뉴클레오티드이거나; 또는 상기 뉴클레오티드 서열 V는 표적 mRNA의 대응 부위에 있는 뉴클레오티드에 상보성인, siRNA.
  43. 제31항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 siRNA의 상기 센스 가닥은 서열 번호 5에 보인 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 상기 안티센스 가닥은 서열 번호 6에 보인 뉴클레오티드 서열을 포함하거나; 또는 상기 siRNA의 상기 센스 가닥은 서열 번호 7에 보인 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 상기 안티센스 가닥은 서열 번호 8에 보인 뉴클레오티드 서열을 포함하거나; 또는
    상기 siRNA의 상기 센스 가닥은 서열 번호 65에 보인 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 상기 안티센스 가닥은 서열 번호 66에 보인 뉴클레오티드 서열을 포함하거나; 또는 상기 siRNA의 상기 센스 가닥은 서열 번호 67에 보인 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 상기 안티센스 가닥은 서열 번호 68에 보인 뉴클레오티드 서열을 포함하거나; 또는
    상기 siRNA의 상기 센스 가닥은 서열 번호 125에 보인 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 상기 안티센스 가닥은 서열 번호 126에 보인 뉴클레오티드 서열을 포함하거나; 또는 상기 siRNA의 상기 센스 가닥은 서열 번호 127에 보인 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 상기 안티센스 가닥은 서열 번호 128에 보인 뉴클레오티드 서열을 포함하거나; 또는
    상기 siRNA의 상기 센스 가닥은 서열 번호 185에 보인 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 상기 안티센스 가닥은 서열 번호 186에 보인 뉴클레오티드 서열을 포함하거나; 또는 상기 siRNA의 상기 센스 가닥은 서열 번호 187에 보인 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 상기 안티센스 가닥은 서열 번호 188에 보인 뉴클레오티드 서열을 포함하거나; 또는
    상기 siRNA의 상기 센스 가닥은 서열 번호 245에 보인 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 상기 siRNA의 상기 안티센스 가닥은 서열 번호 246에 보인 뉴클레오티드 서열을 포함하거나; 또는 상기 siRNA의 상기 센스 가닥은 서열 번호 247에 보인 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 상기 siRNA의 상기 안티센스 가닥은 서열 번호 248에 보인 뉴클레오티드 서열을 포함하거나; 또는
    상기 siRNA의 상기 센스 가닥은 서열 번호 305에 보인 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 상기 siRNA의 상기 안티센스 가닥은 서열 번호 306에 보인 뉴클레오티드 서열을 포함하거나; 또는 상기 siRNA의 상기 센스 가닥은 서열 번호 307에 보인 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 상기 siRNA의 상기 안티센스 가닥은 서열 번호 308에 보인 뉴클레오티드 서열을 포함하는, siRNA.
  44. 제31항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 siRNA는 siC5a1, siC5a2, siC5b1, siC5b2, siC5c1, siC5c2, siC5d1, siC5d2, siC5e1, siC5e2, siC5f1 또는 siC5f2에 보인 뉴클레오티드 서열을 가지는, siRNA.
  45. 제31항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 siRNA는 siC5a1-M1, siC5a2-M1, siC5b1-M1, siC5b2-M1, siC5c1-M1, siC5c2-M1, siC5d1-M1, siC5d2-M1, siC5e1-M1, siC5e2-M1, siC5f1-M1 또는 siC5f2-M1 중 임의의 것 1개인, siRNA.
  46. 제31항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 센스 가닥 또는 상기 안티센스 가닥 내 인산염기는 적어도 1개는 변형기를 가지는 인산염기인 siRNA.
  47. 제46항에 있어서, 상기 변형기를 가지는 인산염기는 상기 인산염기의 포스포디에스테르 결합내 적어도 1개의 산소 원자를 황 원자로 치환하여 생성된 포스포로티오에이트기이거나; 상기 변형기를 가지는 인산염기는 하기 화학식 1로 표시되는 바와 같은 구조
    화학식 1
    Figure pct00098

    를 가지는 포스포로티오에이트기인, siRNA.
  48. 제47항에 있어서, siRNA 내 포스포로티오에이트 결합은 이하 위치들:
    상기 센스 가닥의 5'-말단에 있는, 제1 뉴클레오티드와 제2 뉴클레오티드 사이의 위치;
    상기 센스 가닥의 5'-말단에 있는, 제2 뉴클레오티드와 제3 뉴클레오티드 사이의 위치;
    상기 센스 가닥의 3'-말단에 있는, 제1 뉴클레오티드와 제2 뉴클레오티드 사이의 위치;
    상기 센스 가닥의 3'-말단에 있는, 제2 뉴클레오티드와 제3 뉴클레오티드 사이의 위치;
    상기 안티센스 가닥의 5'-말단에 있는, 제1 뉴클레오티드와 제2 뉴클레오티드 사이의 위치;
    상기 안티센스 가닥의 5'-말단에 있는, 제2 뉴클레오티드와 제3 뉴클레오티드 사이의 위치;
    상기 안티센스 가닥의 3'-말단에 있는, 제1 뉴클레오티드와 제2 뉴클레오티드 사이의 위치; 및
    상기 안티센스 가닥의 3'-말단에 있는, 제2 뉴클레오티드와 제3 뉴클레오티드 사이의 위치;
    중 적어도 1개의 위치에 존재하는, siRNA.
  49. 제31항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 siRNA는 siC5a1-M1S, siC5a2-M1S, siC5b1-M1S, siC5b2-M1S, siC5c1-M1S, siC5c2-M1S, siC5d1-M1S, siC5d2-M1S, siC5e1-M1S, siC5e2-M1S, siC5f1-M1S 또는 siC5f2-M1S 중 임의의 것 1개인 siRNA.
  50. 제31항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 siRNA의 안티센스 가닥 내 5'-말단 뉴클레오티드는 5'-인산염 뉴클레오티드 또는 5'-인산염 유사체 변형 뉴클레오티드이거나; 또는
    상기 5'-인산염 뉴클레오티드는 화학식 2
    화학식 2
    Figure pct00099

    로 표시되는 바와 같은 뉴클레오티드이고;
    상기 5'-인산염 유사체 변형 뉴클레오티드는 하기 화학식 3 ~ 6
    Figure pct00100

    중 임의의 1개로 표시되는 바와 같은 뉴클레오티드로부터 선택되되, R은 H, OH, 메톡시 또는 F로부터 선택되고; 염기는 A, U, C, G 또는 T로부터 선택되는 염기를 나타내는, siRNA.
  51. 제31항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 siRNA는 siC5a1-M1P1, siC5a2-M1P1, siC5a1-M1SP1, siC5a2-M1SP1, siC5b1-M1P1, siC5b2-M1P1, siC5b1-M1SP1, siC5b2-M1SP1, siC5c1-M1P1, siC5c2-M1P1, siC5c1-M1SP1, siC5c2-M1SP1, siC5d1-M1P1, siC5d2-M1P1, siC5d1-M1SP1, siC5d2-M1SP1, siC5e1-M1P1, siC5e2-M1P1, siC5e1-M1SP1, siC5e2-M1SP1, siC5f1-M1P1, siC5f2-M1P1, siC5f1-M1SP1 또는 siC5f2-M1SP1 중 임의의 것 1개인, siRNA.
  52. 제31항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 siRNA는 siC5a1-M1SP, siC5b1-M1SP, siC5c1-M1SP, siC5d1-M1SP, siC5e1-M1SP 또는 siC5f1-M1SP 중 임의의 것 1개인, siRNA.
  53. 제31항 내지 제52항 중 어느 한 항에 따른 siRNA와, 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약학 조성물.
  54. 제31항 내지 제52항 중 어느 한 항에 따른 siRNA와, siRNA에 공액 결합한 공액기를 포함하는 siRNA 컨쥬게이트.
  55. 중증근무력증을 치료 및/또는 예방하기 위한 의약품을 제조함에 있어, 제1항 내지 제30항 및 제54항 중 어느 한 항에 따른 siRNA 컨쥬게이트, 제31항 내지 제52항 중 어느 한 항에 따른 siRNA 및/또는 제53항에 따른 약학 조성물의 용도.
  56. 중증근무력증이 발병한 대상체에, 제1항 내지 제30항 및 제54항 중 어느 한 항에 따른 siRNA 컨쥬게이트, 제31항 내지 제52항 중 어느 한 항에 따른 siRNA 및/또는 제53항에 따른 약학 조성물 유효량만큼을 투여하는 단계를 포함하는, 중증근무력증을 치료 및/또는 예방하기 위한 방법.
  57. 간세포와, 제1항 내지 제30항 및 제54항 중 어느 한 항에 따른 siRNA 컨쥬게이트, 제31항 내지 제52항 중 어느 한 항에 따른 siRNA 및/또는 제53항에 의한 약학 조성물 유효량만큼을 접촉시키는 단계를 포함하는, 간세포에서 C5 유전자의 발현을 억제하기 위한 방법.
  58. 제1항 내지 제30항 및 제54항 중 어느 한 항에 따른 siRNA 컨쥬게이트, 제31항 내지 제52항 중 어느 한 항에 따른 siRNA 및/또는 제53항에 의한 약학 조성물을 포함하는 키트.
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