KR20220011689A - 핵산, 약제학적 조성물, 접합체, 제조 방법, 및 용도 - Google Patents

핵산, 약제학적 조성물, 접합체, 제조 방법, 및 용도 Download PDF

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다이우 캉
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Abstract

혈장 응고 인자 XI 유전자 발현을 억제하는 siRNA, siRNA를 함유하는 약제학적 조성물, 접합체, 시약 키트, 및 혈전 질환 및 허혈 뇌졸중을 치료 및/또는 방지하는데 사용하기 위한 약물의 제조시 siRNA, 이의 약제학적 조성물 및 접합체의 용도가 제공된다.

Description

핵산, 약제학적 조성물, 접합체, 제조 방법, 및 용도
본 개시내용은 혈장 응고 인자(Plasma Coagulation Factor) XI(FXI) 유전자의 발현을 억제할 수 있는 핵산, 및 이러한 핵산을 함유하는 약제학적 조성물 및 siRNA 접합체(conjugate)에 관한 것이다. 본 개시내용은 또한 이러한 핵산의 제조 방법 및 용도, 약제학적 조성물 및 siRNA 접합체에 관한 것이다.
접촉 활성화 경로(contact activation pathway)의 필수 구성성분인, 혈장 응고 인자 XI(이후 "FXI"로 지칭됨)는 트롬빈의 생산에 대해 유도성이며, 이는 궁극적으로 피브린 형성에 관여하며 섬유소용해현상(fibrinolysis)으로부터 보호를 제공하는 중요한 구성성분이다. FXI 유전자의 발현을 억제함으로써, 세포 수준에서 혈전 질환(thrombotic disease)(특히 정맥 혈전증(venous thrombosis) 및 허혈성 뇌졸증(ischemic stroke))을 방지 및 치료하는 것이 가능하다.
RNA 간섭(RNAi)의 메카니즘을 기반으로, 작은 간섭 RNA(siRNA)는 서열-특이적인 방식으로 목적한 임의의 표적 유전자의 발현을 억제 또는 차단함으로써 질환을 치료할 목적을 달성할 수 있었다.
FXI 유전자의 발현을 억제하고 혈전 질환을 치료하는 siRNA 약물을 개발하기 위한 중요한 기술 중 하나는 적합한 siRNA 및 이의 변형 및 효과적인 전달 시스템을 발견하는데 있다.
발명의 요약
놀랍게도, 본 개시내용의 발명자는 본원에 제공된 다음의 siRNA 및 이의 변형된 서열이 FXI 유전자의 발현을 유의적으로 억제할 수 있고, 이러한 siRNA를 함유하는 약제학적 조성물 또는 siRNA 접합체가 간을 특이적으로 표적함으로써 이것이 간 내에서 FXI 유전자의 발현을 억제할 수 있도록 하여, 혈전 질환을 방지 또는 예방할 수 있음을 발견함으로써, 본 발명을 완성하였다.
일부 구현예에서, 본 개시내용은 센스 가닥(sense strand) 및 안티센스 가닥(antisense strand)을 포함하는, FXI 유전자의 발현을 억제할 수 있는 제1의 siRNA를 제공하고, siRNA 내 각각의 뉴클레오타이드는 독립적으로 변형되거나 변형되지 않은 뉴클레오타이드이고, 여기서 센스 가닥은 뉴클레오타이드 서열 I을 포함하고, 안티센스 가닥은 뉴클레오타이드 서열 II를 포함하고; 뉴클레오타이드 서열 I 및 뉴클레오타이드 서열 II는 적어도 부분적으로 역 상보성이어서 이중-가닥 영역을 형성하고; 여기서 뉴클레오타이드 서열 I은 서열 번호: 1로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열과 동일한 길이 및 이들 사이에 3개 이하의 뉴클레오타이드 차이를 지니며, 뉴클레오타이드 서열 II는 서열 번호: 2로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열과 동일한 길이 및 이들 사이에 3개 이하의 뉴클레오타이드 차이를 갖는다:
5'-GGGUAUUCUUUCAAGCAAZ1-3' (서열 번호: 1);
5'-Z2UUGCUUGAAAGAAUACCC-3' (서열 번호: 2),
여기서, Z1은 U이고 Z2는 A이고,
뉴클레오타이드 서열 I은 Z1에 상응하는 위치에서 뉴클레오타이드 Z3을 포함하고; 뉴클레오타이드 서열 II는 Z2에 상응하는 위치에서 뉴클레오타이드 Z4를 포함하고, 여기서 Z4는 안티센스 가닥의 5' 말단에서 제1의 뉴클레오타이드이다.
일부 구현예에서, 본 개시내용은 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함하는, FXI 유전자의 발현을 억제할 수 있는 제2의 siRNA를 제공하고, siRNA 내 각각의 뉴클레오타이드는 독립적으로 변형되거나 변형되지 않은 뉴클레오타이드이고, 여기서 센스 가닥은 뉴클레오타이드 서열 I을 포함하고, 안티센스 가닥은 뉴클레오타이드 서열 II를 포함하고; 뉴클레오타이드 서열 I 및 뉴클레오타이드 서열 II는 적어도 부분적으로 역 상보성이어서 이중-가닥 영역을 형성하고; 여기서 뉴클레오타이드 서열 I은 서열 번호: 61로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열과 동일한 길이 및 이들 사이에 3개 이하의 뉴클레오타이드 차이를 갖고, 뉴클레오타이드 서열 II는 서열 번호: 62로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열과 동일한 길이 및 이들 사이에 3개 이하의 뉴클레오타이드 차이를 갖고:
5'-GGCAUAAACUAUAACAGCZ5-3' (서열 번호: 61);
5'-Z6GCUGUUAUAGUUUAUGCC-3' (서열 번호: 62),
여기서, Z5는 U이고 Z6은 A이고,
뉴클레오타이드 서열 I은 Z5에 상응하는 위치에서 뉴클레오타이드 Z7을 포함하고; 뉴클레오타이드 서열 II는 Z6에 상응하는 위치에서 뉴클레오타이드 Z8을 포함하고, 여기서 Z8은 안티센스 가닥의 5' 말단에서 제1의 뉴클레오타이드이다.
일부 구현예에서, 본 개시내용은 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함하는, FXI 유전자의 발현을 억제할 수 있는 제3의 siRNA를 제공하고, siRNA 내 각각의 뉴클레오타이드는 독립적으로 변형되거나 변형되지 않은 뉴클레오타이드이고, 여기서 센스 가닥은 뉴클레오타이드 서열 I을 포함하고, 안티센스 가닥은 뉴클레오타이드 서열 II를 포함하고; 뉴클레오타이드 서열 I 및 뉴클레오타이드 서열 II는 적어도 부분적으로 역 상보성이어서 이중-가닥 영역을 형성하고; 여기서 뉴클레오타이드 서열 I은 서열 번호: 121로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열과 동일한 길이 및 이들 사이에 3개 이하의 뉴클레오타이드 차이를 갖고, 뉴클레오타이드 서열 II는 서열 번호: 122로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열과 동일한 길이 및 이들 사이에 3개 이하의 뉴클레오타이드 차이를 갖고:
5'-GCUCAAGAAUGCCAAGAAZ9-3' (서열 번호: 121);
5'-Z10UUCUUGGCAUUCUUGAGC-3' (서열 번호: 122),
여기서, Z9는 A이고 Z10은 U이고,
뉴클레오타이드 서열 I은 Z9에 상응하는 위치에서 뉴클레오타이드 Z11을 포함하고; 뉴클레오타이드 서열 II는 Z10에 상응하는 위치에서 뉴클레오타이드 Z12를 포함하고, 여기서 Z12는 안티센스 가닥의 5' 말단에서 제1의 뉴클레오타이드이다.
일부 구현예에서, 본 개시내용은 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함하는, FXI 유전자의 발현을 억제할 수 있는 제4의 siRNA를 제공하고, siRNA 내 각각의 뉴클레오타이드는 독립적으로 변형되거나 변형되지 않은 뉴클레오타이드이고, 여기서 센스 가닥은 뉴클레오타이드 서열 I을 포함하고, 안티센스 가닥은 뉴클레오타이드 서열 II를 포함하고; 뉴클레오타이드 서열 I 및 뉴클레오타이드 서열 II는 적어도 부분적으로 역 상보성이어서 이중 가닥 영역을 형성하고; 여기서 뉴클레오타이드 서열 I은 서열 번호: 181로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열과 동일한 길이및 이들 사이에 3개 이하의 뉴클레오타이드 차이를 갖고, 뉴클레오타이드 서열 II는 서열 번호: 182로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열과 동일한 길이 및 이들 사이에 3개 이하의 뉴클레오타이드 차이를 갖고:
5'-GCAACAAAGACAUUUAUGZ13-3' (서열 번호: 181);
5'-Z14CAUAAAUGUCUUUGUUGC-3' (서열 번호: 182),
여기서, Z13은 U이고 Z14는 A이고,
뉴클레오타이드 서열 I은 Z13에 상응하는 위치에서 뉴클레오타이드 Z15를 포함하고; 뉴클레오타이드 서열 II는 Z14에 상응하는 위치에서 뉴클레오타이드 Z16을 포함하고, 여기서 Z16은 안티센스 가닥의 5' 말단에서 제1의 뉴클레오타이드이다.
일부 구현예에서, 본 개시내용은 센스 및 안티센스 가닥을 포함하는, FXI 유전자의 발현을 억제할 수 있는 제5의 siRNA를 제공하고, siRNA 내 각각의 뉴클레오타이드는 독립적으로 변형되거나 변형되지 않은 뉴클레오타이드이고, 여기서 센스 가닥은 뉴클레오타이드 서열 I을 포함하고, 안티센스 가닥은 뉴클레오타이드 서열 II를 포함하고; 뉴클레오타이드 서열 I 및 뉴클레오타이드 서열 II는 적어도 부분적으로 역 상보성이어서 이중 가닥 영역을 형성하고; 여기서 뉴클레오타이드 서열 I은 서열 번호: 241로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열과 동일한 길이 및 이들 사이에 3개 이하의 뉴클레오타이드 차이를 갖고, 뉴클레오타이드 서열 II는 서열 번호: 242에 나타낸 뉴클레오타이드 서열과 동일한 길이 및 이들 사이에 3개 이하의 뉴클레오타이드 차이를 갖고:
5'-GAAUCUCAAAGAAAUCUUZ17-3' (서열 번호: 241);
5'-Z18AAGAUUUCUUUGAGAUUC-3' (서열 번호: 242),
여기서, Z17은 U이고 Z18은 A이고,
뉴클레오타이드 서열 I은 Z17에 상응하는 위치에서 뉴클레오타이드 Z19를 포함하고; 뉴클레오타이드 서열 II는 Z18에 상응하는 위치에서 뉴클레오타이드 Z20을 포함하고, 여기서 Z20은 안티센스 가닥의 5' 말단에서 제1의 뉴클레오타이드이다.
일부 구현예에서, 본 개시내용은 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함하는, FXI 유전자의 발현을 억제할 수 있는 제6의 siRNA를 제공하고, siRNA 내 각각의 뉴클레오타이드는 독립적으로 변형되거나 변형되지 않은 뉴클레오타이드이고, 여기서 센스 가닥은 뉴클레오타이드 서열 I을 포함하고, 안티센스 가닥은 뉴클레오타이드 서열 II를 포함하고; 뉴클레오타이드 서열 I 및 뉴클레오타이드 서열 II는 적어도 부분적으로 역 상보성이어서 이중-가닥 영역을 형성하고; 여기서 뉴클레오타이드 서열 I은 서열 번호: 301로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열과 동일한 길이 및 이들 사이에 3개 이하의 뉴클레오타이드 차이를 갖고, 뉴클레오타이드 서열 II는 서열 번호: 302로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열과 동일한 길이 및 이들 사이에 3개 이하의 뉴클레오타이드를 갖고:
5'-GUACGUGGACUGGAUUCUZ21-3' (서열 번호: 301);
5'-Z22AGAAUCCAGUCCACGUAC-3' (서열 번호: 302),
여기서, Z21은 G이고 Z22는 C이고,
뉴클레오타이드 서열 I은 Z21에 상응하는 위치에서 뉴클레오타이드 Z23을 포함하고; 뉴클레오타이드 서열 II는 Z22에 상응하는 위치에서 뉴클레오타이드 Z24를 포함하고, 여기서 Z24는 안티센스 가닥의 5' 말단에서 제1의 뉴클레오타이드이다.
일부 구현예에서, 본 개시내용은 센스 및 안티센스 가닥을 포함하는, FXI 유전자의 발현을 억제할 수 있는 제7의 siRNA를 제공하고, siRNA 내 각각의 뉴클레오타이드는 독립적으로 변형되거나 변형되지 않은 뉴클레오타이드이고, 여기서 센스 가닥은 뉴클레오타이드 서열 I을 포함하고, 안티센스 가닥은 뉴클레오타이드 서열 II를 포함하고; 뉴클레오타이드 서열 I 및 뉴클레오타이드 서열 II는 적어도 부분적으로 역 상보성이어서 이중-가닥 영역을 형성하고; 여기서 뉴클레오타이드 서열 I은 서열 번호: 361로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열과 동일한 길이 및 이들 사이에 3개 이하의 뉴클레오타이드를 갖고, 뉴클레오타이드 서열 II는 서열 번호: 362로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열과 동일한 길이 및 이들 사이에 3개 이하의 뉴클레오타이드를 갖고:
5'-AUUUCUGGGUAUUCUUUCZ25-3' (서열 번호: 361);
5'-Z26GAAAGAAUACCCAGAAAU-3' (서열 번호: 362),
여기서, Z25는 A이고 Z26은 U이고,
뉴클레오타이드 서열 I은 Z25에 상응하는 위치에서 뉴클레오타이드 Z27을 포함하고; 뉴클레오타이드 서열 II는 Z26에 상응하는 위치에서 뉴클레오타이드 Z28을 포함하고, 여기서 Z28은 안티센스 가닥의 5' 말단에서 제1의 뉴클레오타이드이다.
일부 구현예에서, 본 개시내용은 센스 및 안티센스 가닥을 포함하는, FXI 유전자의 발현을 억제할 수 있는 제8의 siRNA를 제공하고, siRNA 내 각각의 뉴클레오타이드는 독립적으로 변형되거나 변형되지 않은 뉴클레오타이드이고, 여기서 센스 가닥은 뉴클레오타이드 서열 I을 포함하고, 안티센스 가닥은 뉴클레오타이드 서열 II를 포함하고; 뉴클레오타이드 서열 I 및 뉴클레오타이드 서열 II는 적어도 부분적으로 역 상보성이어서 이중-가닥 영역을 형성하고; 여기서 뉴클레오타이드 서열 I은 서열 번호: 421로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열과 동일한 길이 및 이들 사이에 3개 이하의 뉴클레오타이드를 갖고, 뉴클레오타이드 서열 II는 서열 번호: 422로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열과 동일한 길이 및 이들 사이에 3개 이하의 뉴클레오타이드를 갖고:
5'-CAUGAAGGGCAUAAACUAZ29-3' (서열 번호: 421);
5'-Z30UAGUUUAUGCCCUUCAUG-3' (서열 번호: 422),
여기서, Z29는 U이고 Z30은 A이고,
뉴클레오타이드 서열 I은 Z29에 상응하는 위치에서 뉴클레오타이드 Z31을 포함하고; 뉴클레오타이드 서열 II는 Z30에 상응하는 위치에서 뉴클레오타이드 Z32를 포함하고, 여기서 Z32는 안티센스 가닥의 5' 말단에서 제1의 뉴클레오타이드이다.
일부 구현예에서, 본 개시내용은 siRNA 센스 및 안티센스 가닥을 포함하는, FXI 유전자의 발현을 억제할 수 있는 제9의 siRNA를 제공하고, siRNA 내 각각의 뉴클레오타이드는 독립적으로 변형되거나 변형되지 않은 뉴클레오타이드이고, 여기서 센스 가닥은 뉴클레오타이드 서열 I을 포함하고, 안티센스 가닥은 뉴클레오타이드 서열 II를 포함하고; 뉴클레오타이드 서열 I 및 뉴클레오타이드 서열 II는 적어도 부분적으로 역 상보성이어서 이중-가닥 영역을 형성하고; 여기서 뉴클레오타이드 서열 I은 서열 번호: 481로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열과 동일한 길이 및 이들 사이에 3개 이하의 뉴클레오타이드를 갖고, 뉴클레오타이드 서열 II는 서열 번호: 482로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열과 동일한 길이 및 이들 사이에 3개 이하의 뉴클레오타이드를 갖고:
5'-GGAUUCUGGAGAAAACUCZ33-3' (서열 번호: 481);
5'-Z34GAGUUUUCUCCAGAAUCC-3' (서열 번호: 482),
여기서, Z33은 A이고 Z34는 U이고,
뉴클레오타이드 서열 I은 Z33에 상응하는 위치에서 뉴클레오타이드 Z35를 포함하고; 뉴클레오타이드 서열 II는 Z34에 상응하는 위치에서 뉴클레오타이드 Z36을 포함하고, 여기서 Z36은 안티센스 가닥의 5' 말단에서 제1의 뉴클레오타이드이다.
일부 구현예에서, 본 개시내용은 본 개시내용의 siRNA, 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다.
일부 구현예에서, 본 개시내용은 본 개시내용의 siRNA를 포함하는 siRNA 접합체 및 siRNA에 접합된 접합 그룹을 제공한다.
일부 구현예에서, 본 개시내용은 FXI 유전자의 비정상적인 발현에 의해 유발된 혈전 질환 및/또는 허혈성 뇌졸중을 치료 및/또는 방지하기 위한 의약의 제조시 본 개시내용의 siRNA 및/또는 약제학적 조성물 및/또는 siRNA 접합체의 용도를 제공한다.
일부 구현예에서, 본 개시내용은 유효량의 본 개시내용의 siRNA 및/또는 약제학적 조성물 및/또는 siRNA 접합체를 혈전 질환 및/또는 허혈성 뇌졸중을 앓고 있는 대상체(subject)에게 투여함을 포함하여, 혈전 질환 및/또는 허혈성 뇌졸중을 치료 및/또는 방지하는 방법을 제공한다.
일부 구현예에서, 본 개시내용은 유효량의 본 개시내용의 siRNA 및/또는 약제학적 조성물 및/또는 siRNA 접합체를 간세포와 접촉시킴을 포함하여, 간세포에서 FXI 유전자의 발현을 억제하는 방법을 제공한다.
일부 구현예에서, 본 개시내용은 본 개시내용의 siRNA, 및/또는 약제학적 조성물, 및/또는 siRNA 접합체를 포함하는 키트(kit)를 제공한다.
유리한 효과
본 개시내용의 siRNA, 약제학적 조성물, 및 siRNA 접합체는 양호한 안정성, 높은 FXI mRNA 억제 활성, 낮은 오프-표적 효과(off-target effect)를 가지고/가지거나 혈정 질환 및/또는 허혈성 뇌졸중의 증상을 유의적으로 치료 또는 개선시킬 수 있다.
일부 구현예에서, 본 개시내용의 siRNA, 약제학적 조성물 또는 siRNA 접합체는 시험관내(in vitro) 세포 실험에서 표적 유전자에 대해 탁월한 억제 활성을 나타낸다. 일부 구현예에서, 본 개시내용의 siRNA, 약제학적 조성물 또는 siRNA 접합체는 간세포내에서 표적 유전자의 발현에 대해 적어도 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 95%의 억제율을 나타낸다. 일부 구현예에서, 본 개시내용의 siRNA는 psiCHECK 시스템에서 FXI mRNA에 대해 억제 활성을 나타내고, FXI mRNA에 대한 IC50은 0.013 내지 0.119 nM의 범위이다. 일부 구현예에서, 본 개시내용의 siRNA는 HepG2 세포에서 높은 억제 활성을 나타내고, FXI mRNA에 대한 IC50은 1.49 내지 11.1 nM의 범위이다. 일부 구현예에서, 본 개시내용의 siRNA 접합체는 마우스 1차 간세포에서 높은 억제 활성을 나타내고, FXI mRNA에 대한 IC50은 0.012 내지 3.86 nM의 범위이다. 일부 구현예에서, 본 개시내용의 siRNA 접합체는 HepG2 세포내에서 FXI mRNA의 발현을 억제할 수 있고 50 nM의 농도에서 FXI mRNA에 대해 86.9%의 억제율을 나타낸다.
일부 구현예에서, 본 개시내용의 siRNA, 약제학적 조성물, 또는 siRNA 접합체는 생체내(in vivo)에서 훨씬 더 높은 안정성 및/또는 활성을 나타낼 수 있다. 일부 구현예에서, 본 개시내용의 siRNA, 약제학적 조성물, 또는 siRNA 접합체는 표적 유전자의 발현에 대해 생체내에서적어도 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 95%의 억제율을 나타낸다. 일부 구현예에서, 본 개시내용의 siRNA, 약제학적 조성물, 또는 siRNA 접합체는 FXI 유전자의 발현에 대해 생체내에서 적어도 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 95%의 억제율을 나타낸다. 일부 구현예에서, 본 개시내용의 siRNA, 약제학적 조성물, 또는 siRNA 접합체는 간에서 FXI 유전자의 발현에 대해 생체내에서 적어도 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 95%의 억제율을 나타낸다. 일부 구현예에서, 본 개시내용의 siRNA, 약제학적 조성물, 또는 siRNA 접합체는 동물 모델 내 간에서 FXI 유전자의 발현에 대해 생체내에서 적어도 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 95%의 억제율을 나타낸다. 일부 구현예에서, 본 개시내용의 siRNA, 약제학적 조성물, 또는 siRNA 접합체는 사람 대상체내 간에서 FXI 유전자의 발현에 대해 생체내에서 적어도 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 95%의 억제율을 나타낸다. 일부 구현예에서, 본 개시내용의 siRNA 접합체는 5 mg/kg의 siRNA 농도에서 마우스에서 FXI mRNA의 발현에 대해 생체내에서 95.0% 이하의 억제율을 나타낸다. 일부 구현예에서, 본 개시내용의 siRNA 접합체는 3 mg/kg의 siRNA 농도에서 마우스에서 사람 FXI mRNA의 발현에 대해 생체내에서 93.09% 이하의 억제율을 나타낸다. 한편, siRNA 접합체는 약 99%의 억제율로 혈장 FXI 단백질 농도를 억제하는 유의적인 효과를 나타낼 수 있다. 일부 구현예에서, 본 개시내용의 siRNA 접합체는 생체태에서 CD57 마우스에서 혈장 APTT 검정 값을 64.9%까지 연장시키는 유의적인 효과를 나타낼 수 있다.
일부 구현예에서, 본 개시내용의 siRNA, 약제학적 조성물, 또는 siRNA 접합체는 유의적이지 않은 오프-표적 효과를 나타낸다. 오프-표적 효과는 예를 들면, 표적 유전자가 아닌 유전자의 정상적인 발현의 억제일 수 있다. 오프-표적 유전자의 결합/억제가 표적 유전자의 것보다 50%, 40%, 30%, 20%, 또는 10% 이하인 경우, 오프-표적 효과는 유의적이지 않은 것으로 고려된다.
따라서, 본 개시내용의 siRNA, 약제학적 조성물 및 siRNA 접합체는 FXI 유전자의 발현을 억제할 수 있고, FXI 유전자의 과발현에 의해 유발된 혈전 질환 및/또는 허혈성 뇌졸중 상태를 효과적으로 치료 및/또는 방지할 수 있으므로, 촉망된 적용 가능성을 나타낸다.
본 개시내용의 추가의 특징 및 장점은 다음의 "발명의 상세한 설명" 부분에서 상세히 나타낼 것이다.
발명의 상세한 설명
다음은 본 개시내용의 구체적인 구현예의 상세한 설명이다. 본원에 기술된 구체적인 구현예는 본 개시내용을 나타내고 설명하기 위해서만 사용되며 본 개시내용을 제한하는 것이 아님이 이해될 수 있다.
본 개시내용에서, FXI mRNA는 진뱅크(Genbank) 수탁 번호 NM_000128.3으로 나타낸 바와 같은 서열을 갖는 mRNA를 지칭한다. 또한, 달리 나타내지 않는 한, 본 개시내용에서 사용된 용어 "표적 유전자"는 상기 FXI mRNA를 전사할 수 있는 유전자를 지칭하고; 용어 "표적 mRNA"는 상기 FXI mRNA를 지칭한다.
정의
본 개시내용의 맥락에서, 달리 정의하지 않는 한, C, G, U, 및 A는 뉴클레오타이드의 염기 조성을 나타내고; m은 문자 m의 좌측에 인접한 뉴클레오타이드가 메톡시 변형된 뉴클레오타이드임을 나타내고; f는 문자 f의 좌측에 인접한 뉴클레오타이드가 플루오로 변형된 뉴클레오타이드임을 나타내고; s는 문자 s의 양쪽 측면에 인접한 2개의 뉴클레오타이드가 티오포스페이트 연결에 의해 연결됨을 나타내고; P1은 P1의 우측면에 인접한 뉴클레오타이드가 5'-포스페이트 뉴클레오타이드 또는 5'-포스페이트 유사체 변형된 뉴클레오타이드임을 나타내고, VP는 VP의 우측에 인접한 뉴클레오타이드가 비닐 포스페이트 (5'-(E)-비닐포스포네이트, E-VP) 변형된 뉴클레오타이드임을 나타내고; Ps는 Ps의 우측에 인접한 뉴클레오타이드가 티오포스페이트 변형된 뉴클레오타이드임을 나타내고; P는 문자 P의 우측에 인접한 뉴클레오타이드가 5'-포스페이트 뉴클레오타이드임을 나타낸다.
본 개시내용의 맥락에서, "플루오로 변형된 뉴클레오타이드"는 리보스 그룹의 2'-하이드록시를 불소 원자로 치환함으로써 형성된 뉴클레오타이드를 지칭한다. "비-플루오로 변형된 뉴클레오타이드"는 리보스 그룹의 2'-하이드록시를 비-플루오로 그룹으로 치환하여 형성시킨 뉴클레오타이드, 또는 뉴클레오타이드 유사체를 지칭한다. "뉴클레오타이드 유사체"는 핵산 내 뉴클레오타이드를 대체할 수 있지만, 아데닌 리보뉴클레오타이드, 구아닌 리보뉴클레오타이드, 사이토신 리보뉴클레오타이드, 우라실 리보뉴클레오타이드, 또는 티민 데옥시리보뉴클레오타이드, 예를 들면, 이소뉴클레오타이드, 브릿지된(bridged) 뉴클레오타이드(브릿지된 핵산, BNA) 또는 아사이클릭 뉴클레오타이드와는 구조적으로 상이한 그룹을 지칭한다. "메톡시 변형된 뉴클레오타이드"는 리보스 그룹의 2'-하이드록시를 메톡시 그룹으로 치환하여 형성시킨 뉴클레오타이드를 지칭한다.
본 개시내용의 맥락에서, 표현 "상보성" 및 "역 상보성"은 상호교환적으로 사용될 수 있고 당해 분야에 잘 공지된 의미를 가질 수 있는데, 즉, 하나의 가닥에서 염기는 이중 가닥 핵산 분자내 다른 가닥의 것과 상보적으로 쌍을 이룬다. DNA에서, 퓨린 염기 아데노신(A)은 피리미딘 염기 티민(T)(또는 RNA내 우라실(U))과 쌍을 이루고; 퓨린 염기 구아닌(G)은 피리미딘 염기 사이토신(C)과 항상 쌍을 이룬다. 각각의 염기 쌍은 퓨린 및 피리미딘을 포함한다. 하나의 가닥에서 아데노신이 다른 가닥내 티민(또는 우라실)과 항상 쌍을 이루고, 구아닌은 사이토신과 항상 쌍을 이루지만, 2개의 가닥은 서로 상보성인 것으로 고려되고; 가닥의 서열은 이의 상보성 쇄의 서열로부터 유추될 수 있다. 상응하게, "염기쌍오류(mispairing)"는 상응하는 위치에서 염기가 이중 가닥 핵산내 상보성 쌍의 방식으로 존재하지 않음을 의미한다.
본 개시내용의 맥락에서, 달리 나타내지 않는 한, "염기적으로 역 상보성"은 2개의 뉴클레오타이드 서열 사이에 3개 이상의 염기 염기쌍오류가 존재함을 의미한다. "실질적으로 역 상보성"은 2개의 뉴클레오타이드 서열 사이에 1개 이하의 염기쌍오류가 존재함을 의미한다. "완전히 역 상보성"은 2개의 뉴클레오타이드 서열 사이에 염기 염기쌍오류가 존재하지 않음을 의미한다.
본 개시내용의 맥락에서, 뉴클레오타이드 서열과 다른 뉴클레오타이드 서열 사이에 "뉴클레오타이드 차이"는 이들 사이의 동일한 위치에서 뉴클레오타이드의 염기의 유형에서의 변화를 지칭한다. 예를 들면, 후자의 서열내 뉴클레오타이드 염기가 A이지만 전자의 서열 내 동일한 위치에서 뉴클레오타이드 염기가 U, C, G, 또는 T인 경우, 뉴클레오타이드 차이는 이들 2개의 뉴클레오타이드 사이의 당해 위치에 위치하는 것으로 고려된다. 일부 구현예에서, 위치에서 뉴클레오타이드가 무염기성(abasic) 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체로 대체되는 경우, 이러한 위치내에 뉴클레오타이드 차이가 존재하는 것으로 또한 고려된다.
본 개시내용의 맥락에서, 특히 본 개시내용의 siRNA, siRNA를 포함하는 조성물, 또는 SIrna 접합체의 제조 합법의 설명에서, 달리 명시하지 않는 한, "뉴클레오시드 단량체"는 제조될 siRNA 또는 siRNA 접합체내 뉴클레오타이드의 유형 및 서열에 따라서, 포스포르아미디트 고체상 합성에 사용된 변형되지 않거나 변형된 RNA 포스포르아미디트(때때로 RNA 포스포르아미디트는 뉴클레오시드 포스포르아미디트로서 지칭된다)를 지칭한다. 포스포르아미디트 고체 상 합성은 당해 분야의 기술자에 의해 RNA 합성용으로 잘 공지된 방법이다. 본 개시내용에 사용된 뉴클레오시드 단량체는 모두 상업적으로 이용가능하다.
본 개시내용의 맥락에서, 달리 명시하지 않는 한, "접합"은 각각 특이적인 기능을 가진 2개 이상의 화학적 모이어티(moiety)가 개개 화학적 모이어티의 공유결합성 연결을 통해 형성된 화합물을 지칭한다. 또한 "siRNA 접합체"는 특이적인 기능을 지닌 하나 이상의 화학적 모이어티 각각을 siRNA에 공유결합으로 연결시켜 형성된 화합물을 나타낸다. 다음의 내용에서, 본 개시내용의 siRNA 접합체는 "접합체"로서 때때로 약칭된다. 본 개시내용의 내용에 따라서, siRNA 접합체는 siRNA 접합체의 일반명, 또는 화학식 (305) 및 (307)으로 나타낸 바와 같은 siRNA 접합체의 일반명, 또는 화학식 (305), (307) 또는 (308)로 나타낸 바와 같은 siRNA 접합체로서 이해될 수 있다. 본 개시내용의 맥락에서, "접합 분자"는 반응을 통해 siRNA에 접합됨으로써, 최종적으로 본 개시내용의 siRNA 접합체를 형성할 수 있는 구체적인 화합물로서 해석될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 "임의의" 또는 "임의로"는 후속적으로 기술된 현상 또는 상황이 발생하거나 발생하지 않을 수 있음을 의미하고, 이러한 설명은 이러한 현상 또는 상황이 발생하는 예 및 이것이 발생하지 않는 예를 포함한다. 예를 들면, "임의 치환된 알킬"은 하기 정의된 바와 같은 "알킬" 및 "치환된 알킬"을 의미한다. 당해 분야의 기술자는 하나 이상의 치환체를 함유하는 임의의 그룹과 관련하여, 이러한 그룹이 입체적으로 실시불가능하고, 합성적으로 실행불가능하고/하거나 고유하게 불안정한 임의의 치환 또는 치환 패턴을 도입하기 위해 의도되지 않음을 이해할 것이다.
본원에 사용된 바와 같은, "알킬"은 나타낸 수의 탄소 원자, 일반적으로 1 내지 20개의 탄소 원자, 예를 들면 1 내지 10개의 탄소 원자, 예를 들면, 1 내지 8개 또는 1 내지 6개의 탄소 원자를 갖는 직쇄 및 측쇄 알킬을 지칭한다. 예를 들면, C1-C6 알킬은 1 내지 6개의 탄소 원자의 직쇄 및 측쇄 알킬 둘 다를 포함한다. 구체적인 수의 탄소 원자를 갖는 알킬 잔기가 지칭되는 경우, 이러한 수의 탄소 원자를 갖는 모든 측쇄 및 직쇄 형태가 포함되는 것으로 의도되는데; 즉, 예를 들면, "부틸"은 n-부틸, 2급-부틸, 이소부틸, 및 t-부틸을 포함하고; "프로필"은 n-프로필 및 이소프로필을 포함함을 의미한다. 알킬렌은 알킬과 동일한 잔기를 지칭하지만, 2개의 부착 점을 갖는 알킬의 소세트이다.
본원에 사용된 바와 같은, "알케닐"은 모 알킬의 2개의 인접한 탄소 원자로부터 하나의 수소 원자를 각각 제거함으로써 수득된 적어도 하나의 탄소-탄소 이중 결합을 갖는 불포화된 측쇄 또는 직쇄 알킬 그룹을 지칭한다. 그룹은 이중 결합(들)의 시스 또는 트랜스 구조일 수 있다. 대표적인 알케닐 그룹은 에테닐; 프로페닐, 예를 들면, 프로프-1-엔-1-일, 프로프-1-엔-2-일, 프로프-2-엔-1-일(알릴), 프로프-2-엔-2-일; 부테닐, 예를 들면, 부트-1-엔-1-일, 부트-1-엔-2-일, 2-메틸-프로프-1-엔-1-일, 부트-2-엔-1-일, 부트-2-엔-2-일, 부타-1,3-디엔-1-일, 부타-1,3-디엔-2-일 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 특정의 구현예에서, 알키닐 그룹은 2 내지 20개의 탄소 원자, 및 다른 구현예에서 2 내지 10개, 2 내지 8개, 또는 2 내지 6개의 탄소 원자를 갖는다. 알케닐렌은 알케닐과 동일한 잔기를 지칭하지만, 2개의 부착 점을 갖는, 알케닐의 소세트이다.
본원에 사용된 바와 같은, "알키닐"은 모 알킬의 2개의 인접한 탄소 원자로부터 2개의 수소 분자를 각각 제거함으로써 수득된 적어도 하나의 탄소-탄소 삼중 결합을 갖는 불포화된 측쇄 또는 직쇄 알킬 그룹을 지칭한다. 대표적인 알키닐 그룹은 에티닐; 프로피닐, 예를 들면, 프로프-1-인-1-일, 프로프-2-인-1-일; 부티닐, 예를 들면, 부트-1-인-1-일, 부트-1-인-3-일, 부트-3-인-1-일 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 특정의 구현예에서, 알키닐 그룹은 2 내지 20개의 탄소 원자, 다른 구현예에서, 2 내지 10개, 2 내지 8개, 또는 2 내지 6개의 탄소 원자를 갖는다. 알키닐렌은 알키닐과 동일한 잔기를 지칭하지만, 2개의 부착 점을 갖는, 알키닐의 소세트이다.
본원에 사용된 바와 같은, "알콕시"는 산소 브릿지를 통해 부착된 나타낸 수의 탄소 원자의 알킬 그룹, 예를 들면, 메톡시, 에톡시, 프로폭시, 이소프로폭시, n-부톡시, 2급-부톡시, 3급-부톡시, 펜틸옥시, 2-펜틸옥시, 이소펜틸옥시, 네오펜틸옥시, 헥실옥시, 2-헥실옥시, 3-헥실옥시, 3-메틸펜틸옥시 등을 지칭한다. 알콕시 그룹은 일반적으로 산소 브릿지를 통해 부착된 1 내지 10개, 1 내지 8개, 1 내지 6개, 또는 1 내지 4개의 탄소 원자를 갖는다.
본원에 사용된 바와 같은, "아릴"은 환 탄소 원자로부터 수소 원자를 제거함으로써 방향족의 모노사이클릭 또는 멀티사이클릭 탄화수소 환 시스템으로부터 유도된 라디칼을 지칭한다. 방향족의 모노사이클릭 또는 멀티사이클릭 탄화수소 환 시스템은 단지 하나의 수소 원자 및 6 내지 18개의 탄소 원자를 함유하고, 여기서 환 시스템 내 적어도 하나의 환은 완전히 불포화되는데, 즉, 이는 후켈 이론(Huckel theory)에 따라 사이클릭의, 탈국재화된(delocalized)(4n+2)π-전자 시스템을 함유한다. 아릴 그룹은 예를 들면, 페닐, 플루오레닐, 및 나프틸과 같은 그룹을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 아릴렌은 아릴과 동일한 잔기를 지칭하지만 2개의 부착 그룹을 갖는 아릴의 소세트이다.
본원에 사용된 바와 같은, "할로 치환체" 또는 "할로겐"은 플루오로, 클로로, 브로모, 또는 요오도를 지칭하고 용어 "할로겐"은 불소, 염소, 브롬, 또는 요오드를 포함한다.
본원에 사용된 바와 같은, "할로알킬"은 상기 정의된 바와 같은 알킬을 지칭하고 여기서 명시된 수의 탄소 원자는 하나 이상, 최대 허용가능한 수까지의 할로겐 원자로 치환된다. 할로알킬의 예는 트리플루오로메틸, 디플루오로메틸, 2-플루오로에틸, 또는 펜타-플루오로에틸을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
"헤테로사이클릴"은 2 내지 12개의 탄소 원자 및 질소, 산소 또는 황으로부터 선택된 1 내지 6개의 헤테로원자를 포함하는 안정한 3 내지 18원의 비-방향족 환 라디칼을 지칭한다. 명세서에 달리 기술하지 않는 한, 헤테로사이클릴은 모노사이클릭, 비사이클릭, 트리사이클릭, 또는 테트라사이클릭 환 시스템이고, 이는 융합된 또는 브릿지된 환 시스템(들)을 포함할 수 있다. 헤테로사이클릴 내 헤테로원자(들)은 임의로 산화될 수 있다. 하나 이상의 질소 원자는, 존재하는 경우, 임의로 사급화된다. 헤테로사이클릴은 부분적으로 또는 완전히 포화된다. 헤테로사이클릴은 환(들)의 임의의 원자를 통해 분자의 나머지에 부착될 수 있다 이러한 헤테로사이클릴의 예는 디옥솔라닐, 티에닐[1,3]디티아닐, 데카하이드로이소퀴놀릴, 이미다졸리닐, 이미다졸리디닐, 이소티아졸리디닐, 이속사졸리디닐, 모르폴리닐, 옥타하이드로이소인돌릴, 2-옥사피페라지닐, 2-옥사피페리디닐, 2-옥사피롤리디닐, 옥사졸리디닐, 피페리디닐, 피페라지닐, 4-피페리도닐, 피롤리디닐, 피라졸리디닐, 퀴누클리디닐, 티아졸리디닐, 테트라하이드로푸릴, 트리티아닐, 테트라하이드로피라닐, 티오모르폴리닐, 티아모르폴리닐, 1-옥소-티오모르폴리닐, 및 1,1-디옥소-티오모르폴리닐을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
"헤테로아릴"은 2 내지 17개의 탄소 원자 및, 질소, 산소 또는 황으로부터 선택된 1 내지 6개의 헤테로원자를 포함하는 3 내지 18원의 방향족 환 라디칼로부터 유도된 라디칼을 지칭한다. 본원에 사용된 바와 같은, 헤테로아릴은 모노사이클릭, 비사이클릭, 트리사이클릭 또는 테트라사이클릭 환 시스템일 수 있고, 여기서 환 시스템 내 적어도 하나의 환은 충분히 불포화되는데, 즉, 이는 후켈 이론에 따라 사이클릭의, 탈국재화된(4n+2)π-전자 시스템을 함유한다. 헤테로아릴은 융합되거나 브릿지된 환 시스템(들)을 포함한다. 헤테로아릴 라디칼 내 헤테로원자(들)은 임의 산화된다. 하나 이상의 질소 원자는, 존재하는 경우 임의로 사급화된다. 헤테로아릴은 임의의 환 원자를 통해 분자의 나머지에 부착된다. 헤테로아릴의 예는 아제피닐, 아크리디닐, 벤즈이미다졸릴, 벤즈인돌릴, 1,3-벤조디옥사졸릴, 벤조푸라닐, 벤족사졸릴, 벤조[d]티아졸릴, 벤조티아디아졸릴, 벤조[b][1,4]디옥세피닐, 벤조[b][1,4]옥사지닐, 1,4-벤조디옥사닐, 벤조나프토푸라닐, 벤조옥사졸릴, 벤조디옥솔릴, 벤조디옥시닐, 벤조피라닐, 벤조피라노닐, 벤조푸라닐, 벤조푸라노닐, 벤조티에닐, 벤조티에노[3,2-d]피리미디닐, 벤조트리아졸릴, 벤조[4,6]이미다조[1,2-a]피리디닐, 카르바졸릴, 신놀리닐, 사이클로펜타[d]피리미디닐, 6,7-디하이드로-5H-사이클로펜타[4,5]티에노[2,3-d]피리미디닐, 5,6-디하이드로벤조[h]퀴나졸리닐, 5,6-디하이드로벤조[h]신놀리닐, 6,7-디하이드로-5H-벤조[6,7]사이클로헵타[1,2-c]피리다지닐, 디벤조푸라닐, 디벤조티에닐, 푸라닐, 푸라노닐, 푸로[3,2-c]피리디닐, 5,6,7,8,9,10 헥사하이드로사이클로옥타[d]피리미디닐, 5,6,7,8,9,10-헥사하이드로사이클로헵타[d]피리다지닐, 5,6,7,8,9,10- 헥사하이드로사이클로옥타[d]피리디닐, 이소티아졸릴, 이미다졸릴, 인다졸릴, 인돌릴, 이소인돌릴, 인돌리닐, 이소인돌리닐, 이소퀴놀릴, 인돌리지닐, 이속사졸릴, 5,8-메타노-5,6,7,8-테트라하이드로퀴나졸리닐, 나프티리디노닐, 1,6-나프티리디노닐, 옥사디아졸릴, 2-옥소아제피닐, 옥사졸릴, 옥시라닐, 5,6,6a,7,8,9,10,10a-옥타하이드로벤조[h]퀴나졸리닐, 1-페닐-1H-피롤릴, 페나지닐, 페노티아지닐, 페녹사지닐, 프탈라지닐, 프테리디닐, 푸리닐, 피롤릴, 피라졸릴, 피라졸로[3,4-d]피리미디닐, 피리디닐, 피리도[3,2-d]피리미디닐, 피리도[3,4-d]피리미디닐, 피라지닐, 피리미디닐, 피리다지닐, 피롤릴, 퀴나졸리닐, 퀴녹살리닐, 퀴놀리닐, 테트라하이드로퀴놀리닐, 5,6,7,8-테트라하이드로퀴나졸리닐, 5,6,7,8-테트라하이드로벤조[4,5]티에노[2,3-d]피리미디닐, 6,7,8,9-테트라하이드로-5H-사이클로헵타 [4,5]티에노[2,3-d]피리미디닐, 5,6,7,8-테트라하이드로피리도[4,5-c]피리다지닐, 티아졸릴, 티아디아졸릴, 트리아졸릴, 테트라졸릴, 트리아지닐, 티에노[2,3-d]피리미디닐, 티에노[3,2-d]피리미디닐, 티에노[2,3-c]프리디닐 및 티오페닐/티에닐을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
다양한 하이드록실 보호 그룹이 본 개시내용에서 사용될 수 있다. 일반적으로, 보호 그룹은 화학적 작용 그룹을 특수한 반응 조건 하에서 불활성이 되도록 하며, 분자의 나머지에 실질적으로 손상을 입히지 않고 분자내 이러한 작용 그룹으로 확장 및 이로부터 제거할 수 있다. 대표적인 하이드록실 보호 그룹은 문헌: Beaucage et al., Tetrahedron 1992, 48, 2223-2311, 및 또한 문헌: Greene and Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis, Chapter 2, 2d ed, John Wiley & Sons, New York, 1991에 기술되어 있고, 이는 각각 이의 전문이 참고로 본원에 포함된다. 일부 구현예에서, 보호 그룹은 염기성 조건 하에서 안정하지만 산성 조건하에서 제거될 수 있다. 일부 구현예에서, 본원에 사용될 수 있는 하이드록실 보호 그룹의 비-예외적인 예는 디메톡시트리틸(DMT), 모노메톡시트리틸, 9-페닐트산텐-9-일(Pixyl) 및 9-(p-메톡시페닐)크산텐-9-일(Mox)을 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 사용될 수 있는 하이드록실 보호 그룹의 비-예외적인 예는 Tr(트리틸), MMTr(4-메톡시트리틸), DMTr(4,4'-디메톡시트리틸), 및 TMTr (4,4',4''-트리메톡시트리틸)을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "대상체"는 임의의 동물, 예컨대, 포유동물 또는 유대목 동물(marsupial)을 포함한다. 본 개시내용의 대상체는 사람, 비-사람 영장류(예컨대, 레서스(rhesus) 또는 다른 유형의 마카퀴), 마우스, 돼지, 말, 당나귀, 소, 양, 랫트, 및 임의의 종류의 가금류를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
본원에 사용된 바와 같은, "치료하는"은 치료학적 이점을 포함하나 이에 한정되지 않는 유리하거나 목적한 결과를 수득하기 위한 접근법을 지칭한다. "치료학적 이점"은 치료되는 근본적인 장애의 근절 또는 증진을 의미한다. 또한, 치료학적 이점은 잠재적인 장애와 관련된 하나 이상의 생리학적 증상을 근절 또는 개선함으로써, 대상체가 여전히 잠재적인 장애로 고통받을 수 있음에도 불구하고, 대상체에서 개선을 관찰함에 의해 달성된다.
본원에 사용된 바와 같은, "방지하는"는 예방학적 이점을 포함하나, 이에 한정되지 않는, 유리하거나 목적한 결과를 수득하기 위한 접근법을 지칭한다. "예방학적 이점"을 수득하기 위하여, siRNA, siRNA 접합체 또는 약제학적 조성물은 특수한 질환으로 진전될 위험이 있는 대상체, 또는 질환의 하나 이상의 생리학적 증상을 보고하는 대상체에게, 심지어 이러한 질환의 진단이 이루어지지 않았다고 해도, 투여될 수 있다.
일 양태에서, 본 개시내용은 FXI 유전자의 발현을 억제할 수 있는 제1 내지 제9의 siRNA를 제공한다.
본 개시내용의 siRNA는 기본 구조 단위로서 뉴클레오타이드 그룹을 포함한다. 뉴클레오타이드 그룹이 포스페이트 그룹, 리보스 그룹 및 염기를 포함하고 있는 것은 당해 분야의 기술자에게 잘 공지되어 있다. 이러한 그룹의 상세한 설명은 본원에서 빠져 있다.
제1의 siRNA
본 개시내용에 따라서, siRNA는 제1의 siRNA일 수 있다.
제1의 siRNA는 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함하고; 제1의 siRNA 내 각각의 뉴클레오타이드는 독립적으로 변형되거나 변형되지 않은 뉴클레오타이드이고; 여기서 센스 가닥은 뉴클레오타이드 서열 I을 포함하고, 안티센스 가닥은 뉴클레오타이드 서열 II를 포함하고; 뉴클레오타이드 서열 I 및 뉴클레오타이드 서열 II는 적어도 부분적으로 역 상보성이어서 이중-가닥 영역을 형성하고; 여기서 뉴클레오타이드 서열 I은 서열 번호: 1로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열과 동일한 길이 및 이들 사이에 3개 이하의 뉴클레오타이드 차이를 갖고, 뉴클레오타이드 서열 II는 서열 번호: 2로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열과 동일한 길이 및 이들 사이에 3개 이하의 뉴클레오타이드 차이를 갖는다:
5'-GGGUAUUCUUUCAAGCAAZ1-3' (서열 번호: 1);
5'-Z2UUGCUUGAAAGAAUACCC-3' (서열 번호: 2),
여기서, Z1은 U이고 Z2는 A이고,
뉴클레오타이드 서열 I은 Z1에 상응하는 위치에서 뉴클레오타이드 Z3을 포함하고; 뉴클레오타이드 서열 II는 Z2 상응하는 위치에서 뉴클레오타이드 Z4를 포함하고, 여기서 Z4는 안티센스 가닥의 5' 말단에서 제1 뉴클레오타이드이다.
본 개시내용의 맥락에서, "상응하는 위치"는 뉴클레오타이드 서열의 동일한 말단으로부터 계수하는 경우, 뉴클레오타이드 서열내 동일한 위치를 지칭한다. 예를 들면, 뉴클레오타이드 서열 I의 3' 말단에서 제1 뉴클레오타이드는 서열 번호: 1의 3' 말단에서 제1 뉴클레오타이드에 상응하는 위치에서 뉴클레오타이드이다.
일부 구현예에서, 센스 가닥은 뉴클레오타이드 서열 I 만을 포함하고, 안티센스 가닥은 뉴클레오타이드 서열 II 만을 포함한다.
일부 구현예에서, 뉴클레오타이드 서열 I 및 서열 번호: 1로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열은 1개 이하의 뉴클레오타이드 차이를 가지고/가지거나 뉴클레오타이드 서열 II 및 서열 번호: 2로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열은 1개 이하의 뉴클레오타이드 차이를 갖는다.
일부 구현예에서, 뉴클레오타이드 서열 II와 서열 번호: 2로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열 사이의 뉴클레오타이드 차이는 위치 Z4에서의 차이를 포함하고, 여기서 Z4는 U, C 또는 G로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 뉴클레오타이드 차이는 Z4 위치에서의 차이이고, 여기서 Z4는 U, C 또는 G로부터 선택된다. 일부 구현예에서, Z3은 Z4에 대해 상보성인 뉴클레오타이드이다. 상술한 뉴클레오타이드 차이를 지닌 siRNA는 표적 mRNA에 대해 보다 높은 억제능을 가지므로, 뉴클레오타이드 차이를 포함하는 이러한 siRNA는 본 개시내용의 보호 범위 내에 있다.
일부 구현예에서, 뉴클레오타이드 서열 I 및 뉴클레오타이드 서열 II는 서로에 대해 기본적으로 역 상보성, 실질적으로 역 상보성, 또는 완전히 역 상보성이고; "기본적으로 역 상보성"은 2개의 뉴클레오타이드 서열 사이에 3개 이하의 염기 염기쌍오류가 존재함을 의미하고; "실질적으로 역 상보성"은 2개의 뉴클레오타이드 서열 사이에 1개 이하의 염기 염기쌍오류가 존재함을 의미하고; "완전히 역 상보성"은 2개의 뉴클레오타이드 서열 사이에 염기쌍오류가 존재하지 않음을 의미한다.
일부 구현예에서, 뉴클레오타이드 서열 I은 서열 번호: 3으로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열이고, 뉴클레오타이드 서열 II는 서열 번호: 4로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드이다:
5'-GGGUAUUCUUUCAAGCAAZ3-3' (서열 번호: 3);
5'-Z4UUGCUUGAAAGAAUACCC-3' (서열 번호: 4),
여기서, Z4는 안티센스 가닥의 5' 말단에서 제1 뉴클레오타이드이고, Z3은 A, U, G, 또는 C로부터 선택되고, Z4는 Z3에 대해 상보성인 뉴클레오타이드이고; 일부 구현예에서, Z3은 U이고, Z4는 A이다.
또한, 센스 가닥 및 안티센스 가닥은 동일하거나 상이한 길이를 가지고, 여기서 센스 가닥은 19 내지 23개 뉴클레오타이드의 길이를 가지고, 안티센스 가닥은 19 내지 26개의 뉴클레오타이드 길이를 갖는다. 따라서, 본 개시내용의 센스 가닥 대 안티센스 가닥의 길이 비는 19/19, 19/20, 19/21, 19/22, 19/23, 19/24, 19/25, 19/26, 20/20, 20/21, 20/22, 20/23, 20/24, 20/25, 20/26, 21/20, 21/21, 21/22, 21/23, 21/24, 21/25, 21/26, 22/20, 22/21, 22/22, 22/23, 22/24, 22/25, 22/26, 23/20, 23/21, 23/22, 23/23, 23/24, 23/25, 또는 23/26일 수 있다. 일부 구현예에서, 본 개시내용의 siRNA 내 센스 가닥 대 안티센스 가닥의 길이 비는 19/21, 21/23 또는 23/25일 수 있다.
일부 구현예에서 센스 가닥은 뉴클레오타이드 서열 III을 추가로 포함하고, 안티센스 가닥은 뉴클레오타이드 서열 IV를 포함하고, 뉴클레오타이드 서열 III 및 뉴클레오타이드 서열 IV는 서로 독립적으로 1 내지 4개 뉴클레오타이드의 길이를 갖고 뉴클레오타이드 서열 III 및 뉴클레오타이드 서열 IV는 동일한 길이를 갖고 서로에 대해 실질적으로 역 상보성이거나, 완전히 역 상보성이고; 뉴클레오타이드 서열 III은 뉴클레오타이드 서열 I의 5' 말단에 연결되고, 뉴클레오타이드 서열 IV는 뉴클레오타이드 서열 II의 3' 말단에 연결된다. 일부 구현예에서, 뉴클레오타이드 서열 IV는 제2의 뉴클레오타이드 서열에 대해 실질적으로 역 상보성이거나, 완전히 역 상보성이고, 이는 서열 번호: 1로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열의 5' 말단에 인접한 뉴클레오타이드 서열을 지칭하고 뉴클레오타이드 서열 IV와 동일한 길이를 갖는다.
일부 구현예에서, 뉴클레오타이드 서열 III 및 뉴클레오타이드 서열 IV 둘 다는 1개의 뉴클레오타이드 길이를 가지고, 뉴클레오타이드 서열 III의 염기는 U이고, 뉴클레오타이드 서열 IV의 염기는 A이고; 이러한 경우에, 센스 가닥 및 이의 안티센스 가닥의 길이 비는 20/20이거나; 뉴클레오타이드 서열 III 및 뉴클레오타이드 서열 IV 둘 다는 2개의 뉴클레오타이드의 길이를 가지고, 5' 말단으로부터 3' 말단까지의 방향으로, 뉴클레오타이드 서열 III의 염기 조성은 CU이고, 뉴클레오타이드 서열 IV의 염기 조성은 AG이고; 이러한 경우에, 센스 가닥 및 이의 안티센스 가닥의 길이 비는 21/21이거나; 뉴클레오타이드 서열 III 및 뉴클레오타이드 서열 IV 둘 다는 3개의 뉴클레오타이드 길이를 가지고, 5' 말단으로부터 3' 말단까지의 방향으로, 뉴클레오타이드 서열 III의 염기 조성은 UCU이고, 뉴클레오타이드 서열 IV의 염기 조성은 AGA이고; 이러한 경우 센스 가닥 및 이의 안티센스 가닥의 길이 비는 22/22이거나; 뉴클레오타이드 서열 III 및 뉴클레오타이드 서열 IV 둘 다는 4개의 뉴클레오타이드 길이를 가지고, 5' 말단으로부터 3' 말단까지의 방향으로, 뉴클레오타이드 서열 III의 염기 조성은 UUCU이고, 뉴클레오타이드 서열 IV의 염기 조성은 AGAA이고; 이러한 경우 센스 가닥 및 이의 안티센스 가닥의 길이 비는 23/23이다. 일부 구현예에서, 뉴클레오타이드 서열 III 및 뉴클레오타이드 서열 IV은 2개의 뉴클레오타이드 길이를 가지고, 5' 말단으로부터 3' 말단까지의 방향으로, 뉴클레오타이드 서열 III의 염기 조성은 CU이고, 뉴클레오타이드 서열 IV의 염기 조성은 AG이고; 이러한 경우 센스 가닥 및 이의 안티센스 가닥의 길이 비는 21/21이다.
일부 구현예에서, 뉴클레오타이드 서열 III 및 뉴클레오타이드 서열 IV는 완전히 역 상보성이다. 따라서, 뉴클레오타이드 서열 III의 염기(들)이 제공된 경우, 뉴클레오타이드 서열 IV의 염기(들)이 또한 결정된다.
제2의 siRNA
본 개시내용에 따라서, siRNA는 제2의 siRNA일 수 있다.
제2의 siRNA는 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함하고, 제2의 siRNA 내 각각의 뉴클레오타이드는 독립적으로 변형되거나 변형되지 않은 뉴클레오타이드이고; 여기서 센스 가닥은 뉴클레오타이드 서열 I을 포함하고, 안티센스 가닥은 뉴클레오타이드 서열 II를 포함하고; 뉴클레오타이드 서열 I 및 뉴클레오타이드 서열 II는 적어도 부분적으로 역 상보성이어서 이중 가닥 영역을 형성하고; 여기서, 뉴클레오타이드 서열 I 및 서열 번호: 61로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열은 동일한 길이 및 3개 이하의 뉴클레오타이드 차이를 가지고, 뉴클레오타이드 서열 II 및 서열 번호: 62로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열은 동일한 길이 및 이들 사이에 3개 이하의 뉴클레오타이드 차이를 가지고:
5'-GGCAUAAACUAUAACAGCZ5-3' (서열 번호: 61);
5'-Z6GCUGUUAUAGUUUAUGCC-3' (서열 번호: 62),
여기서, Z5는 U이고 Z6는 A이고,
뉴클레오타이드 서열 I은 Z5에 상응하는 위치에서 뉴클레오타이드 Z7을 포함하고; 뉴클레오타이드 서열 II은 Z6에 상응하는 위치에서 뉴클레오타이드 Z8을 포함하고, 여기서 Z8은 안티센스 가닥의 5' 말단에서 제1의 뉴클레오타이드이다.
일부 구현예에서, 센스 가닥은 뉴클레오타이드 서열 I 만을 포함하고, 안티센스 가닥은 뉴클레오타이드 서열 II 만을 포함한다.
일부 구현예에서, 뉴클레오타이드 서열 I와 서열 번호: 61로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열 사이에는 1개 이하의 뉴클레오타이드 차이가 존재하고/하거나, 뉴클레오타이드 서열 II와 서열 번호: 62로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열사이에는 1개 이하의 뉴클레오타이드 차이가 존재한다.
일부 구현예에서, 뉴클레오타이드 서열 II와 서열 번호: 62로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열 사이의 뉴클레오타이드 차이는 Z8 위치에서의 차이를 포함하고, 여기서 Z8은 U, C 또는 G로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 뉴클레오타이드 차이는 Z8 위치에서의 차이이고, 여기서 Z8은 U, C 또는 G로부터 선택된다. 일부 구현예에서, Z7은 Z8에 대해 상보성인 뉴클레오타이드이다. 상술한 뉴클레오타이드 차이를 지닌 siRNA는 표적 mRNA에 대해 보다 높은 억제능을 가지고, 이러한 뉴클레오타이드 차이를 지닌 siRNA는 본 개시내용의 보호 범위 내에 있다.
일부 구현예에서, 뉴클레오타이드 서열 I 및 뉴클레오타이드 서열 II는 서로에 대해 기본적으로 역 상보성, 실질적으로 역 상보성, 또는 완전히 역 상보성이다.
일부 구현예에서, 뉴클레오타이드 서열 I은 서열 번호: 63으로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열이고, 뉴클레오타이드 서열 II는 서열 번호: 64로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열이고:
5'-GGCAUAAACUAUAACAGCZ7-3' (서열 번호: 63);
5'-Z8GCUGUUAUAGUUUAUGCC-3' (서열 번호: 64),
여기서, Z8은 안티센스 가닥의 5' 말단에서 제1의 뉴클레오타이드이고, Z7은 A, U, G, 또는 C로부터 선택되고, Z8은 Z7에 대해 상보성인 뉴클레오타이드이다. 일부 구현예에서, Z7은 U이고, Z8은 A이다.
또한, 센스 가닥 및 안티센스 가닥은 동일하거나 상이한 길이를 갖고, 여기서 센스 가닥은 19 내지 23개 뉴클레오타이드의 길이를 갖고, 안티센스 가닥은 19 내지 26개의 뉴클레오타이드의 길이를 갖는다.
일부 구현예에서, 센스 가닥은 뉴클레오타이드 서열 III을 추가로 포함하고, 안티센스 가닥은 뉴클레오타이드 서열 IV를 추가로 포함하고, 뉴클레오타이드 서열 III 및 뉴클레오타이드 서열 IV는 각각 서로 독립적으로 1 내지 4개의 뉴클레오타이드 길이를 가지고; 뉴클레오타이드 서열 III 및 뉴클레오타이드 서열 IV는 동일한 길이를 가지고, 서로에 대해 실질적으로 역 상보성 또는 완전히 역 상보성이고; 뉴클레오타이드 서열 III은 뉴클레오타이드 서열 I의 5' 말단에 연결되고, 뉴클레오타이드 서열 IV는 뉴클레오타이드 서열 II의 3' 말단에 연결되고; 뉴클레오타이드 서열 IV는 제2의 뉴클레오타이드 서열에 대해 실질적으로 역 상보성 또는 완전히 역 상보성이고, 이는 표적 mRNA의 서열 번호: 61에 나타낸 뉴클레오타이드 서열의 5'에 인접한 뉴클레오타이드 서열을 지칭하고 뉴클레오타이드 서열 IV와 동일한 길이를 갖는다.
일부 구현예에서, 뉴클레오타이드 서열 III 및 뉴클레오타이드 서열 IV 둘 다는 1개의 뉴클레오타이드 길이를 가지고, 뉴클레오타이드 서열 III의 염기는 G이고, 뉴클레오타이드 서열 IV의 염기는 C이고; 이러한 경우에, 센스 가닥 및 이의 안티센스 가닥의 길이 비는 20/20이거나; 뉴클레오타이드 서열 III 및 뉴클레오타이드 서열 IV 둘 다는 2개의 뉴클레오타이드 길이를 가지고, 5' 말단으로부터 3' 말단까지의 방향으로, 뉴클레오타이드 서열 III의 염기 조성은 AG이고, 뉴클레오타이드 서열 IV의 염기 조성은 CU이고; 이러한 경우에, 이의 센스 가닥 및 이의 안티센스 가닥의 길이 비는 21/21이거나; 뉴클레오타이드 서열 III 및 뉴클레오타이드 서열 IV 둘 다는 3개의 뉴클레오타이드의 길이를 가지고, 5' 말단으로부터 3' 말단까지의 방향으로, 뉴클레오타이드 서열 III의 염기 조성은 AAG이고, 뉴클레오타이드 IV의 염기 조성은 CUU이고; 이러한 경우에, 센스 가닥 및 이의 안티센스 가닥의 길이 비는 22/22이거나; 뉴클레오타이드 서열 III 및 뉴클레오타이드 서열 IV 둘 다는 4개의 뉴클레오타이드를 가지고, 5' 말단으로부터 3' 말단까지의 방향으로, 뉴클레오타이드 서열 III의 염기 조성은 GAAG이고, 뉴클레오타이드 IV의 염기 조성은 CUUC이고; 이러한 경우에, 센스 가닥 및 이의 안티센스 가닥의 길이 비는 23/23이다. 일부 구현예에서, 뉴클레오타이드 서열 III 및 뉴클레오타이드 서열 IV는 2개의 뉴클레오타이드의 길이를 가지고, 5' 말단으로부터 3' 말단까지의 방향으로, 뉴클레오타이드 서열 III의 염기 조성은 AG이고, 뉴클레오타이드 IV의 염기 조성은 CU이고; 이러한 경우에, 센스 가닥 및 이의 안티센스 가닥의 길이 비는 21/21이다.
일부 구현예에서, 뉴클레오타이드 서열 III 및 뉴클레오타이드 서열 IV는 완전히 역 상보성이다. 따라서, 뉴클레오타이드 서열 III의 염기(들)이 제공된 경우, 뉴클레오타이드 서열 IV의 염기(들)이 또한 결정된다.
제3의 siRNA
본 개시내용에 따라서, siRNA는 제3의 siRNA일 수 있다.
제3의 siRNA는 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함하고, 제3의 siRNA 내 각각의 뉴클레오타이드는 독립적으로 변형되거나 변형되지 않은 뉴클레오타이드이고; 여기서 센스 가닥은 뉴클레오타이드 서열 I을 포함하고, 안티센스 가닥은 뉴클레오타이드 서열 II를 포함하고; 뉴클레오타이드 서열 I 및 뉴클레오타이드 서열 II는 적어도 부분적으로 역 상보성이어서 이중 가닥 영역을 형성하고; 여기서, 뉴클레오타이드 서열 I은 서열 번호: 121로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열은 동일한 길이 및 3개 이하의 뉴클레오타이드 차이를 가지고, 뉴클레오타이드 서열 II 및 서열 번호: 122로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열은 동일한 길이 및 3개 이하의 뉴클레오타이드 차이를 가지고:
5'-GCUCAAGAAUGCCAAGAAZ9-3' (서열 번호: 121);
5'-Z10UUCUUGGCAUUCUUGAGC-3' (서열 번호: 122),
여기서, Z9는 A이고 Z10은 U이고,
뉴클레오타이드 서열 I은 Z9에 상응하는 위치에서 뉴클레오타이드 Z11을 가지고; 뉴클레오타이드 서열 II는 Z10에 상응하는 위치에서 뉴클레오타이드 Z12를 가지고, 여기서 Z12는 안티센스 가닥의 5' 말단에서 제1의 뉴클레오타이드이고;
일부 구현예에서, 센스 가닥은 뉴클레오타이드 서열 I 만을 포함하고, 안티센스 가닥은 뉴클레오타이드 서열 II만을 포함한다.
일부 구현예에서, 뉴클레오타이드 서열 I과 서열 번호: 121로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열 사이의 1개 이하의 뉴클레오타이드 차이가 존재하고/하거나 뉴클레오타이드 서열 II와 서열 번호: 122로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열 사이에 1개 이하의 뉴클레오타이드 차이가 존재한다.
일부 구현예에서, 뉴클레오타이드 서열 II와 서열 번호: 122로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열 사이의 뉴클레오타이드 차이는 Z12 위치를 포함하고, 여기서 Z12는 A, C 또는 G로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 뉴클레오타이드 차이는 Z12 위치에서의 차이이고, 여기서 Z12는 A, C 또는 G로부터 선택된다. 일부 구현예에서, Z11은 Z12에 대해 상보성인 뉴클레오타이드이다. 상술한 뉴클레오타이드 차이를 지닌 siRNA는 표적 mRNA를 억제하는 높은 능력을 가지고, 뉴클레오타이드 차이를 포함하는 이러한 siRNA는 본 개시내용의 보호 범위 내에 있다.
일부 구현예에서, 뉴클레오타이드 서열 I 및 뉴클레오타이드 서열 II은 서로에 대해 기본적으로 역 상보성, 실질적으로 역 상보성, 또는 완전히 역 상보성이다.
일부 구현예에서, 뉴클레오타이드 서열 I은 서열 번호: 123으로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열이고, 뉴클레오타이드 서열 II는 서열 번호: 124로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열이고:
5'-GCUCAAGAAUGCCAAGAAZ11-3'(서열 번호: 123);
5'-Z12UUCUUGGCAUUCUUGAGC-3'(서열 번호: 124),
여기서, Z12는 안티센스 가닥의 5' 말단에서 제1의 뉴클레오타이드이고, Z11은 A, U, G, 또는 C로부터 선택되고, Z12는 Z11에 대해 상보성인 뉴클레오타이드이고; 일부 구현예에서, Z11은 A이고, Z12는 U이다.
더욱이, 센스 가닥 및 안티센스 가닥은 동일하거나 상이한 길이를 가지고, 여기서 센스 가닥은 19 내지 23개 뉴클레오타이드의 길이를 가지고, 안티센스 가닥은 19 내지 26개 뉴클레오타이드를 갖는다.
일부 구현예에서, 센스 가닥은 뉴클레오타이드 서열 III을 추가로 포함하고, 안티센스 가닥은 뉴클레오타이드 서열 IV를 추가로 포함하고, 뉴클레오타이드 서열 III 및 뉴클레오타이드 서열 IV는 서로 독립적으로 1 내지 4개의 뉴클레오타이드 길이를 가지고; 뉴클레오타이드 서열 III 및 뉴클레오타이드 서열 IV는 동일한 길이를 가지고, 서로에 대해 실질적으로 역 상보성 또는 완전히 역 상보성이고; 뉴클레오타이드 서열 III은 뉴클레오타이드 서열 I의 5' 말단에 연결되고, 뉴클레오타이드 서열 IV는 뉴클레오타이드 서열 II의 3' 말단에 연결되고; 뉴클레오타이드 서열 IV는 제2의 뉴클레오타이드 서열에 대해 실질적으로 역 상보성, 또는 완전히 역 상보성이고, 이는 표적 mRNA의 서열 번호: 121에 나타낸 뉴클레오타이드 서열의 5' 말단에 인접한 뉴클레오타이드 서열을 지칭하고 뉴클레오타이드 서열 IV와 동일한 길이를 갖는다.
일부 구현예에서, 5' 말단으로부터 3' 말단의 방향으로, 뉴클레오타이드 서열 III 및 뉴클레오타이드 서열 IV 둘 다는 1개의 뉴클레오타이드 길이를 가지고, 뉴클레오타이드 서열 III의 염기는 U이고, 뉴클레오타이드 서열 IV의 염기는 A이고; 이러한 경우에, 센스 가닥 및 이의 안티센스 가닥의 길이 비는 20/20이거나; 뉴클레오타이드 서열 III 및 뉴클레오타이드 서열 IV 둘 다는 2개의 뉴클레오타이드의 길이를 가지고, 5' 말단으로부터 3' 말단까지의 방향으로, 뉴클레오타이드 서열 III의 염기 조성은 GU이고, 뉴클레오타이드 IV의 염기 조성은 AC이고; 이러한 경우에, 센스 가닥 및 이의 안티센스 가닥의 길이 비는 21/21이거나; 뉴클레오타이드 서열 III 및 뉴클레오타이드 서열 IV 둘 다는 3개의 뉴클레오타이드 길이를 가지고, 5' 말단으로부터 3' 말단까지의 방향으로, 뉴클레오타이드 서열 III의 염기 조성은 AGU이고, 뉴클레오타이드 IV의 염기 조성은 ACU이고; 이러한 경우에, 센스 가닥 및 이의 안티센스 가닥의 길이 비는 22/22이거나; 뉴클레오타이드 서열 III 및 뉴클레오타이드 서열 IV 둘 다는 4개의 뉴클레오타이드 길이를 가지고, 5' 말단으로부터 3' 말단까지의 방향으로, 뉴클레오타이드 서열 III의 염기 조성은 GAGU이고, 뉴클레오타이드 서열 IV의 염기 조성은 ACUC이고; 이러한 경우에, 센스 가닥 및 이의 안티센스 가닥의 길이 비는 23/23이다. 일부 구현예에서, 뉴클레오타이드 서열 III 및 뉴클레오타이드 서열 IV는 2개의 뉴클레오타이드이 길이를 가지고, 5' 말단으로부터 3' 말단까지의 방향으로, 뉴클레오타이드 서열 III의 염기 조성은 GU이고, 뉴클레오타이드 서열 IV의 염기 조성은 AC이고; 이러한 경우에, 센스 가닥 및 이의 안티센스 가닥의 길이 비는 21/21이다.
일부 구현예에서, 뉴클레오타이드 서열 III 및 뉴클레오타이드 서열 IV는 완전히 역 상보성이다. 따라서, 뉴클레오타이드 서열 III의 염기(들)이 제공되면, 뉴클레오타이드 서열 IV의 염기(들) 또한 결정된다.
제4의 siRNA
본 개시내용에 따라서, siRNA는 제4의 siRNA일 수 있다.
제4의 siRNA는 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함하고, siRNA 내 각각의 뉴클레오타이드는 독립적으로 변형되거나 변형되지 않은 뉴클레오타이드이고; 여기서 센스 가닥은 뉴클레오타이드 서열 I을 포함하고, 안티센스 가닥은 뉴클레오타이드 서열 II를 포함하고; 뉴클레오타이드 서열 I 및 뉴클레오타이드 서열 II는 적어도 부분적으로 역 상보성이어서 이중 가닥 영역을 형성하고; 여기서, 뉴클레오타이드 서열 I 및 서열 번호: 181로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열은 동일한 길이를 가지고 3개 이하의 뉴클레오타이드 차이를 가지고, 뉴클레오타이드 서열 II 및 서열 번호: 182로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열은 동일한 길이 및 3개 이하의 뉴클레오타이드 차이를 가지고:
5'-GCAACAAAGACAUUUAUGZ13-3' (서열 번호: 181);
5'-Z14CAUAAAUGUCUUUGUUGC-3' (서열 번호: 182),
여기서, Z13은 U이고 Z14는 A이고,
뉴클레오타이드 서열 I은 Z13에 상응하는 위치에서 뉴클레오타이드 Z15를 포함하고, 뉴클레오타이드 서열 II는 Z14에 상응하는 위치에서 뉴클레오타이드 Z16을 포함하고, 여기서 Z16은 안티센스 가닥의 5' 말단에서 제1의 뉴클레오타이드이다.
일부 구현예에서, 센스 가닥은 뉴클레오타이드 서열 I 만을 포함하고, 안티센스 가닥은 뉴클레오타이드 서열 II만을 포함한다.
일부 구현예에서, 뉴클레오타이드 서열 I과 서열 번호: 181로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열 사이에 1개 이하의 뉴클레오타이드 차이가 존재하고/하거나 뉴클레오타이드 서열 II아 서열 번호: 182 사이에 1개 이하의 뉴클레오타이드 차이가 존재한다.
일부 구현예에서, 뉴클레오타이드 서열 II와 서열 번호: 182로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열 사이의 뉴클레오타이드 차이는 Z16 위치에서의 차이를 포함하고, 여기서 Z16은 U, C 또는 G로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 뉴클레오타이드 차이는 Z16 위치에서의 차이이고, 여기서 Z16은 U, C 또는 G로부터 선택된다. 일부 구현예에서, Z15는 Z16에 대해 상보성인 뉴클레오타이드이다. 상술한 뉴클레오타이드 차이를 지닌 siRNA는 표적 mRNA를 억제하는 높은 억제능을 나타내고 이러한 뉴클레오타이드 차이를 포함하는 siRNA는 본 개시내용의 보호 범위 내에 있다.
일부 구현예에서, 뉴클레오타이드 서열 I 및 뉴클레오타이드 서열 II는 서로에 대해 기본적으로 역 상보성, 실질적으로 역 상보성, 또는 완전히 역 상보성이다.
일부 구현예에서, 뉴클레오타이드 서열 I은 서열 번호: 183으로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열이고, 뉴클레오타이드 서열 II는 서열 번호: 184로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열이고:
5'-GCAACAAAGACAUUUAUGZ15-3' (서열 번호: 183);
5'-Z16CAUAAAUGUCUUUGUUGC-3' (서열 번호: 184),
여기서, Z16은 안티센스 가닥의 5' 말단에서 제1의 뉴클레오타이드이고, Z15는 A, U, G, 또는 C로부터 선택되고, Z16은 Z15에 대해 상보성인 뉴클레오타이드이고; 일부 구현예에서, Z15는 U이고, Z16은 A이다.
더욱이, 센스 가닥 및 안티센스 가닥은 동일하거나 상이한 길이를 가지고, 여기서 센스 가닥은 19 내지 23개 뉴클레오타이드의 길이를 가지고, 안티센스 가닥은 19 내지 26개 뉴클레오타이드 길이를 갖는다.
일부 구현예에서, 센스 가닥은 뉴클레오타이드 서열 III을 추가로 포함하고, 안티센스 가닥은 뉴클레오타이드 서열 IV를 추가로 포함하고, 뉴클레오타이드 서열 III 및 뉴클레오타이드 서열 IV는 서로 독립적으로 1 내지 4개의 뉴클레오타이드 길이를 가지고; 뉴클레오타이드 서열 III 및 뉴클레오타이드 서열 IV는 동일한 길이를 가지고, 서로에 대해 실질적으로 역 상보성 또는 완전히 역 상보성이고; 뉴클레오타이드 서열 III은 뉴클레오타이드 서열 I의 5' 말단에 연결되고, 뉴클레오타이드 서열 IV는 뉴클레오타이드 서열 II의 3' 말단에 연결되고; 뉴클레오타이드 서열 IV는 제2의 뉴클레오타이드 서열에 대해 실질적으로 역 상보성 또는 완전히 역 상보성이고; 이는 표적 mRNA의 서열 번호: 181에 나타낸 뉴클레오타이드 서열의 5' 말단에 인접한 뉴클레오타이드 서열을 지칭하고 뉴클레오타이드 서열 IV와 동일한 길이를 갖는다.
일부 구현예에서, 5' 말단으로부터 3' 말단의 방향으로, 뉴클레오타이드 서열 III 및 뉴클레오타이드 서열 IV 둘 다는 1개의 뉴클레오타이드 길이를 가지고, 뉴클레오타이드 서열 III의 염기는 U이고, 뉴클레오타이드 서열 IV의 염기는 A이고; 이러한 경우에, 센스 가닥 및 이의 안티센스 가닥의 길이 비는 20/20이거나; 뉴클레오타이드 서열 III 및 뉴클레오타이드 서열 IV 둘 다는 2개의 뉴클레오타이드의 길이를 가지고, 5' 말단으로부터 3' 말단까지의 방향으로, 뉴클레오타이드 서열 III의 염기 조성은 UU이고, 뉴클레오타이드 서열 IV의 염기 조성은 AA이고; 이러한 경우에, 센스 가닥 및 이의 안티센스 가닥의 길이 비는 21/21이거나; 뉴클레오타이드 서열 III 및 뉴클레오타이드 서열 IV 둘 다는 3개의 뉴클레오타이드의 길이를 가지고, 5' 말단으로부터 3' 말단까지의 방향으로, 뉴클레오타이드 서열 III의 염기 조성은 CUU이고, 뉴클레오타이드 서열 IV의 염기 조성은 AAG이고; 이러한 경우에, 센스 가닥 및 이의 안티센스 가닥의 길이 비는 22/22이거나; 뉴클레오타이드 서열 III 및 뉴클레오타이드 서열 IV 둘 다는 4개의 뉴클레오타이드 길이를 가지고, 5' 말단으로부터 3' 말단까지의 방향으로, 뉴클레오타이드 서열 III의 염기 조성은 GCUU이고, 뉴클레오타이드 서열 IV의 염기 조성은 AAGC이고; 이러한 경우에, 센스 가닥 및 이의 안티센스 가닥의 길이 비는 23/23이다. 일부 구현예에서, 뉴클레오타이드 서열 III 및 뉴클레오타이드 서열 IV는 2개의 뉴클레오타이드의 길이를 가지고, 5' 말단으로부터 3' 말단까지의 방향으로, 뉴클레오타이드 서열 III의 염기 조성은 UU이고, 뉴클레오타이드 서열 IV의 염기 조성은 AA이고; 이러한 경우에, 센스 가닥 및 이의 안티센스 가닥의 길이 비는 21/21이다.
일부 구현예에서, 뉴클레오타이드 서열 III 및 뉴클레오타이드 서열 IV는 완전히 역 상보성이다. 따라서, 뉴클레오타이드 서열 III의 염기(들)이 제공된 경우, 뉴클레오타이드 서열 IV의 염기(들) 또한 결정된다.
제5 siRNA
본 개시내용에 따라서, siRNA는 제5의 siRNA일 수 있다.
제5의 siRNA는 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함하고, 제5의 siRNA 내 각각의 뉴클레오타이드는 독립적으로 변형되거나 변형되지 않은 뉴클레오타이드이고; 여기서 센스 가닥은 뉴클레오타이드 서열 I을 포함하고, 안티센스 가닥은 뉴클레오타이드 서열 II를 포함하고; 뉴클레오타이드 서열 I 및 뉴클레오타이드 서열 II은 적어도 부분적으로 역 상보성이어서 이중 가닥 영역을 형성하고; 여기서, 뉴클레오타이드 서열 I은 서열 번호: 241로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열과 동일한 길이 및 이들 사이에 3개 이하의 뉴클레오타이드 차이를 가지고, 뉴클레오타이드 서열 II는 서열 번호: 242로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열은 동일한 길이 및 3개 이하의 뉴클레오타이드 차이를 가지고:
5'-GAAUCUCAAAGAAAUCUUZ17-3' (서열 번호: 241);
5'-Z18AAGAUUUCUUUGAGAUUC-3' (서열 번호: 242),
여기서, Z17은 U이고 Z18은 A이고,
뉴클레오타이드 서열 I은 Z17에 상응하는 위치에서 뉴클레오타이드 Z19를 포함하고, 뉴클레오타이드 서열 II는 Z18에 상응하는 위치에서 뉴클레오타이드 Z20을 포함하고, 여기서 Z20은 안티센스 가닥의 5' 말단에서 제1의 뉴클레오타이드이다.
일부 구현예에서, 센스 가닥은 뉴클레오타이드 서열 I 만을 포함하고, 안티센스 가닥은 뉴클레오타이드 서열 II만을 포함한다.
일부 구현예에서, 뉴클레오타이드 서열 I과 서열 번호: 241로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열 사이는 1개 이하의 뉴클레오타이드 차이가 존재하고/하거나 뉴클레오타이드 서열 II와 및 서열 번호: 242로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열 사이에 1개 이하의 뉴클레오타이드 차이가 존재한다.
일부 구현예에서, 뉴클레오타이드 서열 II와 서열 번호: 242로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열 사이의 뉴클레오타이드 차이는 Z20 위치에서의 차이이고, 여기서 Z20은 U, C 또는 G로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 뉴클레오타이드 차이는 Z20 위치에서의 차이이고, 여기서 Z20은 U, C 또는 G로부터 선택된다. 일부 구현예에서, Z19는 Z20에 대해 상보성인 뉴클레오타이드이다. 이러한 뉴클레오타이드 차이를 지닌 siRNA는 표적 mRNA를 억제하는 높은 억제능을 가지고 이러한 뉴클레오타이드 차이를 포함하는 siRNA는 본 개시내용의 보호 범위 내에 있다.
일부 구현예에서, 뉴클레오타이드 서열 I 및 뉴클레오타이드 서열 II은 서로 기본적으로 역 상보성, 실질적으로 역 상보성, 또는 완전히 역 상보성이다.
일부 구현예에서, 뉴클레오타이드 서열 I은 서열 번호: 243으로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열이고, 뉴클레오타이드 서열 II는 서열 번호: 244로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열이고:
5'-GAAUCUCAAAGAAAUCUUZ19-3' (서열 번호: 243);
5'-Z20AAGAUUUCUUUGAGAUUC-3' (서열 번호: 244),
여기서, Z20는 안티센스 가닥의 5' 말단에서 제1의 뉴클레오타이드이고, Z19는 A, U, G, 또는 C로부터 선택되고, Z20은 Z19에 대해 상보성인 뉴클레오타이드이다. 일부 구현예에서, Z19는 U이고, Z20은 A이다.
더욱이, 센스 가닥 및 안티센스 가닥은 동일하거나 상이한 길이를 가지고, 여기서 센스 가닥은 19 내지 23개의 뉴클레오타이드의 길이를 가지고, 안티센스 가닥은 19 내지 26개 뉴클레오타이드의 길이를 갖는다.
일부 구현예에서, 센스 가닥은 뉴클레오타이드 서열 III을 추가로 포함하고, 안티센스 가닥은 뉴클레오타이드 서열 IV를 추가로 포함하고, 뉴클레오타이드 서열 III 및 뉴클레오타이드 서열 IV는 서로 독립적으로 1 내지 4개의 뉴클레오타이드의 길이를 가지고; 뉴클레오타이드 서열 III 및 뉴클레오타이드 서열 IV는 동일한 길이를 가지고, 서로 실질적으로 역 상보성 또는 완전히 역 상보성이고; 뉴클레오타이드 서열 III은 뉴클레오타이드 서열 I의 5' 말단에 연결되고, 뉴클레오타이드 서열 IV는 뉴클레오타이드 서열 II의 3' 말단에 연결되고; 뉴클레오타이드 서열 IV 및 제2의 뉴클레오타이드 서열은 서로에 대해 실질적으로 역 상보성 또는 완전히 역 상보성이고; 이는 표적 mRNA의 서열 번호: 241에 나타뉴클레오타이드 서열의 5' 말단에 인접한 뉴클레오타이드 서열을 지칭하고 뉴클레오타이드 IV와 동일한 길이를 갖는다.
일부 구현예에서, 5' 말단으로부터 3' 말단의 방향으로, 뉴클레오타이드 서열 III 및 뉴클레오타이드 서열 IV 둘 다는 1개의 뉴클레오타이드의 길이를 가지고, 뉴클레오타이드 서열 III의 염기는 A이고, 뉴클레오타이드 서열 IV의 염기는 U이고; 이러한 경우에, 센스 가닥 및 이의 안티센스 가닥의 길이 비는 20/20이거나; 뉴클레오타이드 서열 III 및 뉴클레오타이드 서열 IV 둘 다는 2개의 뉴클레오타이드의 길이를 가지고, 5' 말단으로부터 3' 말단까지의 방향으로, 뉴클레오타이드 서열 III의 염기 조성은 AA이고, 뉴클레오타이드 서열 IV의 염기 조성은 UU이고; 이러한 경우에, 센스 가닥 및 이의 안티센스 가닥의 길이 비는 21/21이거나; 뉴클레오타이드 서열 III 및 뉴클레오타이드 서열 IV 둘 다는 3개의 뉴클레오타이드의 길이를 가지고, 5' 말단으로부터 3' 말단까지의 방향으로, 뉴클레오타이드 서열 III의 염기 조성은 AAA이고, 뉴클레오타이드 서열 IV의 염기 조성은 UUU이고; 이러한 경우에, 센스 가닥 및 이의 안티센스 가닥의 길이 비는 22/22이거나; 뉴클레오타이드 서열 III 및 뉴클레오타이드 서열 IV 둘 다는 4개의 뉴클레오타이드의 길이를 가지고, 5' 말단으로부터 3' 말단까지의 방향으로, 뉴클레오타이드 서열 III의 염기 조성은 CAAA이고, 뉴클레오타이드 서열 IV의 염기 조성은 UUUG이고; 이러한 경우에, 센스 가닥 및 이의 안티센스 가닥의 길이 비는 23/23이다. 일부 구현예에서, 뉴클레오타이드 서열 III 및 뉴클레오타이드 서열 IV는 2개의 뉴클레오타이드의 길이를 가지고, 5' 말단으로부터 3' 말단까지의 방향으로, 뉴클레오타이드 서열 III의 염기 조성은 AA이고, 뉴클레오타이드 서열 IV의 염기 조성은 UU이고; 이러한 경우에, 센스 가닥 및 이의 안티센스 가닥의 길이 비는 21/21이다.
일부 구현예에서, 뉴클레오타이드 서열 III 및 뉴클레오타이드 서열 IV는 완전히 역 상보성이다. 따라서, 뉴클레오타이드 서열 III의 염기(들)이 제공된 경우, 뉴클레오타이드 서열 IV의 염기(들)이 또한 결정된다.
제6의 siRNA
본 개시내용에 따라서, siRNA는 제6의 siRNA일 수 있다.
제6의 siRNA는 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함하고, siRNA 내 각각의 뉴클레오타이드는 독립적으로 변형되거나 변형되지 않은 뉴클레오타이드이고; 여기서 센스 가닥은 뉴클레오타이드 서열 I을 포함하고, 안티센스 가닥은 뉴클레오타이드 서열 II를 포함하고; 뉴클레오타이드 서열 I 및 뉴클레오타이드 서열 II는 적어도 부분적으로 역 상보성 이중 가닥 영역을 형성하고; 여기서, 뉴클레오타이드 서열 I은 서열 번호: 301로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열과 동일한 길이 및 3개 이하의 뉴클레오타이드 차이를 가지고, 뉴클레오타이드 서열 II는 서열 번호: 302로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열과 동일한 길이 및 3개 이하의 뉴클레오타이드 차이를 가지고:
5'-GUACGUGGACUGGAUUCUZ21-3' (서열 번호: 301);
5'-Z22AGAAUCCAGUCCACGUAC-3' (서열 번호: 302),
여기서, Z21은 G이고 Z22는 C이고,
뉴클레오타이드 서열 I은 Z21에 상응하는 위치에서 뉴클레오타이드 Z23을 포함하고, 뉴클레오타이드 서열 II는 Z22에 상응하는 위치에서 뉴클레오타이드 Z24를 포함하고, 여기서 Z24는 안티센스 가닥의 5' 말단에서 제1의 뉴클레오타이드이다.
일부 구현예에서, 센스 가닥은 뉴클레오타이드 서열 I 만을 포함하고, 안티센스 가닥은 뉴클레오타이드 서열 II만을 포함한다.
일부 구현예에서, 뉴클레오타이드 서열 I과 서열 번호: 301로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열 사이에 1개 이하의 뉴클레오타이드 차이가 존재하고/하거나 뉴클레오타이드 서열 II와 서열 번호: 302로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열 사이에 1개 이하의 뉴클레오타이드 차이가 존재한다.
일부 구현예에서, 뉴클레오타이드 서열 II와 서열 번호: 302로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열 사이의 뉴클레오타이드 차이는 Z24 위치에서의 차이를 포함하고, 여기서 Z24는 U, G 또는 A로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 뉴클레오타이드 차이는 Z24 위치에서의 차이이고, 여기서 Z24는 U, G 또는 A로부터 선택되다. 일부 구현예에서, Z23은 Z24에 대해 상보성인 뉴클레오타이드이다. 상술한 뉴클레오타이드 차이를 지닌 siRNA는 표적 mRNA를 억제하는 높은 억제능을 가지고, 이러한 뉴클레오타이드 차이를 포함하는 siRNA는 본 개시내용의 보호 범위 내에 있다.
일부 구현예에서, 뉴클레오타이드 서열 I 및 뉴클레오타이드 서열 II는 서로에 대해 기본적으로 역 상보성, 실질적으로 역 상보성, 또는 완전히 역 상보성이다.
일부 구현예에서, 뉴클레오타이드 서열 I은 서열 번호: 303으로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열이고, 뉴클레오타이드 서열 II는 서열 번호: 304로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열이다:
5'-GUACGUGGACUGGAUUCUZ23-3' (서열 번호: 303);
5'-Z24AGAAUCCAGUCCACGUAC-3' (서열 번호: 304),
여기서, Z24는 안티센스 가닥의 5' 말단에서 제1의 뉴클레오타이드이고, Z23은 A, U, G, 또는 C로부터 선택되고, Z24는 Z23에 대해 상보성인 뉴클레오타이드이고; 일부 구현예에서, Z23은 G이고, Z24는 C이다.
더욱이, 센스 가닥 및 안티센스 가닥은 동일하거나 상이한 길이를 가지고, 여기서 센스 가닥은 19 내지 23개 뉴클레오타이드의 길이를 가지고 안티센스 가닥은 19 내지 26개 뉴클레오타이드의 길이를 갖는다.
일부 구현예에서, 센스 가닥은 뉴클레오타이드 서열 III을 추가로 포함하고, 안티센스 가닥은 뉴클레오타이드 서열 IV를 추가로 포함하고, 뉴클레오타이드 서열 III 및 뉴클레오타이드 서열 IV은 서로 독립적으로 1 내지 4개의 뉴클레오타이드의 길이를 가지고; 뉴클레오타이드 서열 III 및 뉴클레오타이드 서열 IV는 동일한 길이를 가지고, 서로에 대해 실질적으로 역 상보성 또는 완전히 역 상보성이고; 뉴클레오타이드 서열 III은 뉴클레오타이드 서열 I의 5' 말단에 연결되고, 뉴클레오타이드 서열 IV은 뉴클레오타이드 서열 II의 3' 말단에 연결되고; 뉴클레오타이드 서열 IV는 제2의 뉴클레오타이드 서열과 실질적으로 역 상보성 또는 완전히 역 상보성이고; 이는 표적 mRNA 내 서열 번호: 301에 나타낸 폴리뉴클레오타이드 서열의 5' 말단에 인접한 뉴클레오타이드 서열을 지칭하고 뉴클레오타이드 서열 IV와 동일한 길이를 가질 수 있다.
일부 구현예에서, 5' 말단으로부터 3' 말단의 방향으로, 뉴클레오타이드 서열 III 및 뉴클레오타이드 서열 IV 둘 다는 1개의 뉴클레오타이드의 길이를 가지고, 뉴클레오타이드 서열 III의 염기는 A이고, 뉴클레오타이드 서열 IV의 염기는 U이고; 이러한 경우에, 센스 가닥 및 이의 안티센스 가닥의 길이 비는 20/20이거나; 뉴클레오타이드 서열 III 및 뉴클레오타이드 서열 IV 둘 다는 2개의 뉴클레오타이드의 길이를 가지고, 5' 말단으로부터 3' 말단까지의 방향으로, 뉴클레오타이드 서열 III의 염기 조성은 GA이고, 뉴클레오타이드 서열 IV의 염기 조성은 UC이고; 이러한 경우에, 센스 가닥 및 이의 안티센스 가닥의 길이 비는 21/21이거나; 뉴클레오타이드 서열 III 및 뉴클레오타이드 서열 IV 둘 다는 3개의 뉴클레오타이드의 길이를 가지고, 5' 말단으로부터 3' 말단까지의 방향으로, 뉴클레오타이드 서열 III의 염기 조성은 CGA이고, 뉴클레오타이드 서열 IV의 염기 조성은 UCG이고; 이러한 경우에, 센스 가닥 및 이의 안티센스 가닥의 길이 비는 22/22이거나; 뉴클레오타이드 서열 III 및 뉴클레오타이드 서열 IV 둘 다는 4개의 뉴클레오타이드의 길이를 가지고, 5' 말단으로부터 3' 말단까지의 방향으로, 뉴클레오타이드 서열 III의 염기 조성은 UCGA이고, 뉴클레오타이드 서열 IV의 염기 조성은 UCGA이고; 이러한 경우에, 센스 가닥 및 이의 안티센스 가닥의 길이 비는 23/23이다. 일부 구현예에서, 뉴클레오타이드 서열 III 및 뉴클레오타이드 서열 IV는 2개의 뉴클레오타이드의 길이를 가지고, 5' 말단으로부터 3' 말단까지의 방향으로, 뉴클레오타이드 서열 III의 염기 조성은 GA이고, 뉴클레오타이드 서열 IV의 염기 조성은 UC이고; 이러한 경우에, 센스 가닥 및 이의 안티센스 가닥의 길이 비는 21/21이다.
일부 구현예에서, 뉴클레오타이드 서열 III 및 뉴클레오타이드 서열 IV는 완전히 역 상보성이다. 따라서, 뉴클레오타이드 서열 III의 염기(들)이 제공되는 경우, 뉴클레오타이드 서열 IV의 염기(들) 또한 결정된다.
제7의 siRNA
본 개시내용에 따라서, siRNA는 제7의 siRNA일 수 있다.
제7의 siRNA는 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함하고, siRNA 내 각각의 뉴클레오타이드는 독립적으로 변형되거나 변형되지 않은 뉴클레오타이드이고; 여기서 센스 가닥은 뉴클레오타이드 서열 I을 포함하고, 안티센스 가닥은 뉴클레오타이드 서열 II를 포함하고; 뉴클레오타이드 서열 I 및 뉴클레오타이드 서열 II는 적어도 부분적으로 역 상보성 이중 가닥 영역을 형성하고; 여기서, 뉴클레오타이드 서열 I은 서열 번호: 361로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열과 동일한 길이 및 3개 이하의 뉴클레오타이드 차이를 가지고, 뉴클레오타이드 서열 II는 서열 번호: 362로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열과 동일한 길이 및 3개 이하의 뉴클레오타이드 차이를 가지고:
5'-AUUUCUGGGUAUUCUUUCZ25-3' (서열 번호: 361);
5'-Z26GAAAGAAUACCCAGAAAU-3' (서열 번호: 362),
여기서, Z25는 A이고 Z26은 U이고,
뉴클레오타이드 서열 I은 Z25에 상응하는 위치에서 뉴클레오타이드 Z27을 포함하고, 뉴클레오타이드 서열 II는 Z26에 상응하는 위치에서 뉴클레오타이드 Z28을 포함하고, 여기서 Z28은 안티센스 가닥의 5' 말단에서 제1의 뉴클레오타이드이다.
일부 구현예에서, 센스 가닥은 뉴클레오타이드 서열 I 만을 포함하고, 안티센스 가닥은 뉴클레오타이드 서열 II만을 포함한다.
일부 구현예에서, 뉴클레오타이드 서열 I과 서열 번호: 361로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열 사이에 1개 이하의 뉴클레오타이드 차이가 존재하고/하거나 뉴클레오타이드 서열 II와 서열 번호: 362로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열 사이에 1개 이하의 뉴클레오타이드 차이가 존재한다.
일부 구현예에서, 뉴클레오타이드 서열 II와 서열 번호: 302로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열 사이의 뉴클레오타이드 차이는 Z28 위치에서의 차이를 포함하고, 여기서 Z28은 A, C 또는 G로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 뉴클레오타이드 차이는 Z28 위치에서의 차이이고, 여기서 Z28는 A, C 또는 G로부터 선택된다. 일부 구현예에서, Z27은 Z28에 대해 상보성인 뉴클레오타이드이다. 상술한 뉴클레오타이드 차이를 지닌 siRNA는 표적 mRNA를 억제하는 높은 억제능을 가지고, 이러한 뉴클레오타이드 차이를 포함하는 siRNA는 본 개시내용의 보호 범위 내에 있다.
일부 구현예에서, 뉴클레오타이드 서열 I 및 뉴클레오타이드 서열 II는 서로에 대해 기본적으로 역 상보성, 실질적으로 역 상보성, 또는 완전히 역 상보성이다.
일부 구현예에서, 뉴클레오타이드 서열 I은 서열 번호: 363으로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열이고, 뉴클레오타이드 서열 II는 서열 번호: 364로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열이다:
5'-AUUUCUGGGUAUUCUUUCZ27-3' (서열 번호: 363);
5'-Z28GAAAGAAUACCCAGAAAU-3' (서열 번호: 364),
여기서, Z28은 안티센스 가닥의 5' 말단에서 제1의 뉴클레오타이드이고, Z27은 A, U, G, 또는 C로부터 선택되고, Z28은 Z27에 대해 상보성인 뉴클레오타이드이고; 일부 구현예에서, Z27은 A이고, Z28은 U이다.
더욱이, 센스 가닥 및 안티센스 가닥은 동일하거나 상이한 길이를 가지고, 여기서 센스 가닥은 19 내지 23개 뉴클레오타이드의 길이를 가지고 안티센스 가닥은 19 내지 26개 뉴클레오타이드의 길이를 갖는다.
일부 구현예에서, 센스 가닥은 뉴클레오타이드 서열 III을 추가로 포함하고, 안티센스 가닥은 뉴클레오타이드 서열 IV를 추가로 포함하고, 뉴클레오타이드 서열 III 및 뉴클레오타이드 서열 IV은 서로 독립적으로 1 내지 4개의 뉴클레오타이드의 길이를 가지고; 뉴클레오타이드 서열 III 및 뉴클레오타이드 서열 IV는 동일한 길이를 가지고, 서로에 대해 실질적으로 역 상보성 또는 완전히 역 상보성이고; 뉴클레오타이드 서열 III은 뉴클레오타이드 서열 I의 5' 말단에 연결되고, 뉴클레오타이드 서열 IV은 뉴클레오타이드 서열 II의 3' 말단에 연결되고; 뉴클레오타이드 서열 IV는 제2의 뉴클레오타이드 서열과 실질적으로 역 상보성 또는 완전히 역 상보성이고; 이는 표적 mRNA 내 서열 번호: 361에 나타낸 폴리뉴클레오타이드 서열의 5' 말단에 인접한 뉴클레오타이드 서열을 지칭하고 뉴클레오타이드 서열 IV와 동일한 길이를 가질 수 있다.
일부 구현예에서, 5' 말단으로부터 3' 말단의 방향으로, 뉴클레오타이드 서열 III 및 뉴클레오타이드 서열 IV 둘 다는 1개의 뉴클레오타이드의 길이를 가지고, 뉴클레오타이드 서열 III의 염기는 G이고, 뉴클레오타이드 서열 IV의 염기는 C이고; 이러한 경우에, 센스 가닥 및 이의 안티센스 가닥의 길이 비는 20/20이거나; 뉴클레오타이드 서열 III 및 뉴클레오타이드 서열 IV 둘 다는 2개의 뉴클레오타이드의 길이를 가지고, 5' 말단으로부터 3' 말단까지의 방향으로, 뉴클레오타이드 서열 III의 염기 조성은 CG이고, 뉴클레오타이드 서열 IV의 염기 조성은 CG이고; 이러한 경우에, 센스 가닥 및 이의 안티센스 가닥의 길이 비는 21/21이거나; 뉴클레오타이드 서열 III 및 뉴클레오타이드 서열 IV 둘 다는 3개의 뉴클레오타이드의 길이를 가지고, 5' 말단으로부터 3' 말단까지의 방향으로, 뉴클레오타이드 서열 III의 염기 조성은 GCG이고, 뉴클레오타이드 서열 IV의 염기 조성은 CGC이고; 이러한 경우에, 센스 가닥 및 이의 안티센스 가닥의 길이 비는 22/22이거나; 뉴클레오타이드 서열 III 및 뉴클레오타이드 서열 IV 둘 다는 4개의 뉴클레오타이드의 길이를 가지고, 5' 말단으로부터 3' 말단까지의 방향으로, 뉴클레오타이드 서열 III의 염기 조성은 AGCG이고, 뉴클레오타이드 서열 IV의 염기 조성은 CGCU이고; 이러한 경우에, 센스 가닥 및 이의 안티센스 가닥의 길이 비는 23/23이다. 일부 구현예에서, 뉴클레오타이드 서열 III 및 뉴클레오타이드 서열 IV는 2개의 뉴클레오타이드의 길이를 가지고, 5' 말단으로부터 3' 말단까지의 방향으로, 뉴클레오타이드 서열 III의 염기 조성은 CG이고, 뉴클레오타이드 서열 IV의 염기 조성은 CG이고; 이러한 경우에, 센스 가닥 및 이의 안티센스 가닥의 길이 비는 21/21이다.
일부 구현예에서, 뉴클레오타이드 서열 III 및 뉴클레오타이드 서열 IV는 완전히 역 상보성이다. 따라서, 뉴클레오타이드 서열 III의 염기(들)이 제공되는 경우, 뉴클레오타이드 서열 IV의 염기(들) 또한 결정된다.
제8의 siRNA
본 개시내용에 따라서, siRNA는 제8의 siRNA일 수 있다.
제8의 siRNA는 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함하고, siRNA 내 각각의 뉴클레오타이드는 독립적으로 변형되거나 변형되지 않은 뉴클레오타이드이고; 여기서 센스 가닥은 뉴클레오타이드 서열 I을 포함하고, 안티센스 가닥은 뉴클레오타이드 서열 II를 포함하고; 뉴클레오타이드 서열 I 및 뉴클레오타이드 서열 II는 적어도 부분적으로 역 상보성 이중 가닥 영역을 형성하고; 여기서, 뉴클레오타이드 서열 I은 서열 번호: 421로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열과 동일한 길이 및 3개 이하의 뉴클레오타이드 차이를 가지고, 뉴클레오타이드 서열 II는 서열 번호: 422로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열과 동일한 길이 및 3개 이하의 뉴클레오타이드 차이를 가지고:
5'-CAUGAAGGGCAUAAACUAZ29-3' (서열 번호: 421);
5'-Z30UAGUUUAUGCCCUUCAUG-3' (서열 번호: 422),
여기서, Z29는 U이고 Z30은 A이고,
뉴클레오타이드 서열 I은 Z29에 상응하는 위치에서 뉴클레오타이드 Z31을 포함하고, 뉴클레오타이드 서열 II는 Z30에 상응하는 위치에서 뉴클레오타이드 Z32를 포함하고, 여기서 Z32는 안티센스 가닥의 5' 말단에서 제1의 뉴클레오타이드이다.
일부 구현예에서, 센스 가닥은 뉴클레오타이드 서열 I 만을 포함하고, 안티센스 가닥은 뉴클레오타이드 서열 II만을 포함한다.
일부 구현예에서, 뉴클레오타이드 서열 I과 서열 번호: 421로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열 사이에 1개 이하의 뉴클레오타이드 차이가 존재하고/하거나 뉴클레오타이드 서열 II와 서열 번호: 422로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열 사이에 1개 이하의 뉴클레오타이드 차이가 존재한다.
일부 구현예에서, 뉴클레오타이드 서열 II와 서열 번호: 422로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열 사이의 뉴클레오타이드 차이는 Z32 위치에서의 차이를 포함하고, 여기서 Z32는 U, C 또는 G로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 뉴클레오타이드 차이는 Z32 위치에서의 차이이고, 여기서 Z32는 U, C 또는 G로부터 선택된다. 일부 구현예에서, Z31은 Z32에 대해 상보성인 뉴클레오타이드이다. 이러한 뉴클레오타이드 차이를 지닌 siRNA는 표적 mRNA를 억제하는 높은 억제능을 가지고, 이러한 뉴클레오타이드 차이를 포함하는 siRNA는 본 개시내용의 보호 범위 내에 있다.
일부 구현예에서, 뉴클레오타이드 서열 I 및 뉴클레오타이드 서열 II는 서로에 대해 기본적으로 역 상보성, 실질적으로 역 상보성, 또는 완전히 역 상보성이다.
일부 구현예에서, 뉴클레오타이드 서열 I은 서열 번호: 423으로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열이고, 뉴클레오타이드 서열 II는 서열 번호: 424로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열이다:
5'-CAUGAAGGGCAUAAACUAZ31-3' (서열 번호: 423);
5'-Z32UAGUUUAUGCCCUUCAUG-3' (서열 번호: 424),
여기서, Z32는 안티센스 가닥의 5' 말단에서 제1의 뉴클레오타이드이고, Z31은 A, U, G, 또는 C로부터 선택되고, Z32는 Z31에 대해 상보성인 뉴클레오타이드이고; 일부 구현예에서, Z31은 U이고, Z32는 A이다.
더욱이, 센스 가닥 및 안티센스 가닥은 동일하거나 상이한 길이를 가지고, 여기서 센스 가닥은 19 내지 23개 뉴클레오타이드의 길이를 가지고 안티센스 가닥은 19 내지 26개 뉴클레오타이드의 길이를 갖는다.
일부 구현예에서, 센스 가닥은 뉴클레오타이드 서열 III을 추가로 포함하고, 안티센스 가닥은 뉴클레오타이드 서열 IV를 추가로 포함하고, 뉴클레오타이드 서열 III 및 뉴클레오타이드 서열 IV은 서로 실질적으로 역 상보성 또는 완전히 역 상보성이고; 뉴클레오타이드 서열 III은 뉴클레오타이드 서열 I의 5' 말단에 연결되고, 뉴클레오타이드 서열 IV은 뉴클레오타이드 서열 II의 3' 말단에 연결되고; 뉴클레오타이드 서열 IV는 제2의 뉴클레오타이드 서열과 실질적으로 역 상보성 또는 완전히 역 상보성이고; 이는 표적 mRNA 내 서열 번호: 421에 나타낸 폴리뉴클레오타이드 서열의 5' 말단에 인접한 뉴클레오타이드 서열을 지칭하고 뉴클레오타이드 서열 IV와 동일한 길이를 가질 수 있다.
일부 구현예에서, 5' 말단으로부터 3' 말단의 방향으로, 뉴클레오타이드 서열 III 및 뉴클레오타이드 서열 IV 둘 다는 1개의 뉴클레오타이드의 길이를 가지고, 뉴클레오타이드 서열 III의 염기는 A이고, 뉴클레오타이드 서열 IV의 염기는 U이고; 이러한 경우에, 센스 가닥 및 이의 안티센스 가닥의 길이 비는 20/20이거나; 뉴클레오타이드 서열 III 및 뉴클레오타이드 서열 IV 둘 다는 2개의 뉴클레오타이드의 길이를 가지고, 5' 말단으로부터 3' 말단까지의 방향으로, 뉴클레오타이드 서열 III의 염기 조성은 GA이고, 뉴클레오타이드 서열 IV의 염기 조성은 UC이고; 이러한 경우에, 센스 가닥 및 이의 안티센스 가닥의 길이 비는 21/21이거나; 뉴클레오타이드 서열 III 및 뉴클레오타이드 서열 IV 둘 다는 3개의 뉴클레오타이드의 길이를 가지고, 5' 말단으로부터 3' 말단까지의 방향으로, 뉴클레오타이드 서열 III의 염기 조성은 AGA이고, 뉴클레오타이드 서열 IV의 염기 조성은 UCU이고; 이러한 경우에, 센스 가닥 및 이의 안티센스 가닥의 길이 비는 22/22이거나; 뉴클레오타이드 서열 III 및 뉴클레오타이드 서열 IV 둘 다는 4개의 뉴클레오타이드의 길이를 가지고, 5' 말단으로부터 3' 말단까지의 방향으로, 뉴클레오타이드 서열 III의 염기 조성은 UAGA이고, 뉴클레오타이드 서열 IV의 염기 조성은 UCUA이고; 이러한 경우에, 센스 가닥 및 이의 안티센스 가닥의 길이 비는 23/23이다. 일부 구현예에서, 뉴클레오타이드 서열 III 및 뉴클레오타이드 서열 IV는 2개의 뉴클레오타이드의 길이를 가지고, 5' 말단으로부터 3' 말단까지의 방향으로, 뉴클레오타이드 서열 III의 염기 조성은 GA이고, 뉴클레오타이드 서열 IV의 염기 조성은 UC이고; 이러한 경우에, 센스 가닥 및 이의 안티센스 가닥의 길이 비는 21/21이다.
일부 구현예에서, 뉴클레오타이드 서열 III 및 뉴클레오타이드 서열 IV는 완전히 역 상보성이다. 따라서, 뉴클레오타이드 서열 III의 염기(들)이 제공되는 경우, 뉴클레오타이드 서열 IV의 염기(들) 또한 결정된다.
제9의 siRNA
본 개시내용에 따라서, siRNA는 제9의 siRNA일 수 있다.
제9의 siRNA는 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함하고, siRNA 내 각각의 뉴클레오타이드는 독립적으로 변형되거나 변형되지 않은 뉴클레오타이드이고; 여기서 센스 가닥은 뉴클레오타이드 서열 I을 포함하고, 안티센스 가닥은 뉴클레오타이드 서열 II를 포함하고; 뉴클레오타이드 서열 I 및 뉴클레오타이드 서열 II는 적어도 부분적으로 역 상보성 이중 가닥 영역을 형성하고; 여기서, 뉴클레오타이드 서열 I은 서열 번호: 481로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열과 동일한 길이 및 3개 이하의 뉴클레오타이드 차이를 가지고, 뉴클레오타이드 서열 II는 서열 번호: 482로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열과 동일한 길이 및 3개 이하의 뉴클레오타이드 차이를 가지고:
5'-GGAUUCUGGAGAAAACUCZ33-3' (서열 번호: 481);
5'-Z34GAGUUUUCUCCAGAAUCC-3' (서열 번호: 482),
여기서, Z33은 A이고 Z34는 U이고,
뉴클레오타이드 서열 I은 Z33에 상응하는 위치에서 뉴클레오타이드 Z35를 포함하고, 뉴클레오타이드 서열 II는 Z34에 상응하는 위치에서 뉴클레오타이드 Z36을 포함하고, 여기서 Z36은 안티센스 가닥의 5' 말단에서 제1의 뉴클레오타이드이다.
일부 구현예에서, 센스 가닥은 뉴클레오타이드 서열 I 만을 포함하고, 안티센스 가닥은 뉴클레오타이드 서열 II만을 포함한다.
일부 구현예에서, 뉴클레오타이드 서열 I과 서열 번호: 481로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열 사이에 1개 이하의 뉴클레오타이드 차이가 존재하고/하거나 뉴클레오타이드 서열 II와 서열 번호: 482로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열 사이에 1개 이하의 뉴클레오타이드 차이가 존재한다.
일부 구현예에서, 뉴클레오타이드 서열 II와 서열 번호: 482로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열 사이의 뉴클레오타이드 차이는 Z36 위치에서의 차이를 포함하고, 여기서 Z36은 A, C 또는 G로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 뉴클레오타이드 차이는 Z36 위치에서의 차이이고, 여기서 Z36은 A, C 또는 G로부터 선택된다. 일부 구현예에서, Z35는 Z36에 대해 상보성인 뉴클레오타이드이다. 이러한 뉴클레오타이드 차이를 지닌 siRNA는 표적 mRNA를 억제하는 높은 억제능을 가지고, 이러한 뉴클레오타이드 차이를 포함하는 siRNA는 본 개시내용의 보호 범위 내에 있다.
일부 구현예에서, 뉴클레오타이드 서열 I 및 뉴클레오타이드 서열 II는 서로에 대해 기본적으로 역 상보성, 실질적으로 역 상보성, 또는 완전히 역 상보성이다.
일부 구현예에서, 뉴클레오타이드 서열 I은 서열 번호: 483으로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열이고, 뉴클레오타이드 서열 II는 서열 번호: 484로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열이다:
5'-GGAUUCUGGAGAAAACUCZ35-3' (서열 번호: 483);
5'-Z36GAGUUUUCUCCAGAAUCC-3' (서열 번호: 484),
여기서, Z36은 안티센스 가닥의 5' 말단에서 제1의 뉴클레오타이드이고, Z35는 A, U, G, 또는 C로부터 선택되고, Z36은 Z35에 대해 상보성인 뉴클레오타이드이고; 일부 구현예에서, Z35는 A이고, Z36은 U이다.
더욱이, 센스 가닥 및 안티센스 가닥은 동일하거나 상이한 길이를 가지고, 여기서 센스 가닥은 19 내지 23개 뉴클레오타이드의 길이를 가지고 안티센스 가닥은 19 내지 26개 뉴클레오타이드의 길이를 갖는다.
일부 구현예에서, 센스 가닥은 뉴클레오타이드 서열 III을 추가로 포함하고, 안티센스 가닥은 뉴클레오타이드 서열 IV를 추가로 포함하고, 뉴클레오타이드 서열 III 및 뉴클레오타이드 서열 IV은 서로 독립적으로 1 내지 4개의 뉴클레오타이드를 가지고; 뉴크렐오타이드 III 및 뉴클레오타이드 IV는 동일한 길이를 가지고 서로 실질적으로 역 상보성 또는 완전히 역 상보성이고; 뉴클레오타이드 서열 III은 뉴클레오타이드 서열 I의 5' 말단에 연결되고, 뉴클레오타이드 서열 IV는 뉴클레오타이드 서열 II의 3' 말단에 연결된다. 일부 구현예에서, 뉴클레오타이드 서열 IV는 제2의 뉴클레오타이드 서열에 대해 실질적으로 역 상보성 또는 완전히 역 상보성이고; 이는 표적 mRNA 내 서열 번호: 481에 나타낸 폴리뉴클레오타이드 서열의 5' 말단에 인접한 뉴클레오타이드 서열을 지칭하고 뉴클레오타이드 서열 IV와 동일한 길이를 가질 수 있다.
일부 구현예에서, 5' 말단으로부터 3' 말단의 방향으로, 뉴클레오타이드 서열 III 및 뉴클레오타이드 서열 IV 둘 다는 1개의 뉴클레오타이드의 길이를 가지고, 뉴클레오타이드 서열 III의 염기는 U이고, 뉴클레오타이드 서열 IV의 염기는 A이고; 이러한 경우에, 센스 가닥 및 이의 안티센스 가닥의 길이 비는 20/20이거나; 뉴클레오타이드 서열 III 및 뉴클레오타이드 서열 IV 둘 다는 2개의 뉴클레오타이드의 길이를 가지고, 5' 말단으로부터 3' 말단까지의 방향으로, 뉴클레오타이드 서열 III의 염기 조성은 CU이고, 뉴클레오타이드 서열 IV의 염기 조성은 AG이고; 이러한 경우에, 센스 가닥 및 이의 안티센스 가닥의 길이 비는 21/21이거나; 뉴클레오타이드 서열 III 및 뉴클레오타이드 서열 IV 둘 다는 3개의 뉴클레오타이드의 길이를 가지고, 5' 말단으로부터 3' 말단까지의 방향으로, 뉴클레오타이드 서열 III의 염기 조성은 ACU이고, 뉴클레오타이드 서열 IV의 염기 조성은 AGU이고; 이러한 경우에, 센스 가닥 및 이의 안티센스 가닥의 길이 비는 22/22이거나; 뉴클레오타이드 서열 III 및 뉴클레오타이드 서열 IV 둘 다는 4개의 뉴클레오타이드의 길이를 가지고, 5' 말단으로부터 3' 말단까지의 방향으로, 뉴클레오타이드 서열 III의 염기 조성은 GACU이고, 뉴클레오타이드 서열 IV의 염기 조성은 AGUC이고; 이러한 경우에, 센스 가닥 및 이의 안티센스 가닥의 길이 비는 23/23이다. 일부 구현예에서, 뉴클레오타이드 서열 III 및 뉴클레오타이드 서열 IV는 2개의 뉴클레오타이드의 길이를 가지고, 5' 말단으로부터 3' 말단까지의 방향으로, 뉴클레오타이드 서열 III의 염기 조성은 CU이고, 뉴클레오타이드 서열 IV의 염기 조성은 AG이고; 이러한 경우에, 센스 가닥 및 이의 안티센스 가닥의 길이 비는 21/21이다.
일부 구현예에서, 뉴클레오타이드 서열 III 및 뉴클레오타이드 서열 IV는 완전히 역 상보성이다. 따라서, 뉴클레오타이드 서열 III의 염기(들)이 제공되는 경우, 뉴클레오타이드 서열 IV의 염기(들) 또한 결정된다.
뉴클레오타이드 서열 V에 관한 다음의 설명에서, siRNA 내 핵산 서열, 또는 뉴클레오타이드 변형 및 변형된 서열은 상술한 제1의 siRNA 내지 제9의 siRNA 중 어느 하나에 적용가능하다. 즉, 달리 기술하지 않은 한, siRNA의 다음의 설명은 차례로 제1, 제2, 제3, 제4, 제5, 제6, 제7, 제8, 및 제9의 siRNA의 설명으로서 고려될 수 있다. 예를 들면, 특수한 siRNA를 구체적으로 나타내지 않는 경우, "siRNA는 뉴클레오타이드 서열 V를 추가로 포함한다"는 "제1의 siRNA, 제2의 siRNA, 제3의 siRNA, 제4의 siRNA, 제5의 siRNA, 제6의 siRNA, 제7의 siRNA, 제8의 siRNA, 또는 제9의 siRNA가 뉴클레오타이드 서열 V를 포함한다"를 의미한다.
일부 구현예에서, 안티센스 가닥은 뉴클레오타이드 서열 V를 추가로 포함한다. 뉴클레오타이드 서열 V는 1 내지 3개의 뉴클레오타이드의 길이를 갖고 안티센스 가닥의 3' 말단에 연결됨으로써, 안티센스 가닥의 3' 오버행을 형성한다. 이러한 경우에, 본 개시내용의 siRNA의 센스 가닥과 안티센스 가닥의 길이는 19/20, 19/21, 19/22, 20/21, 20/22, 20/23, 21/22, 21/23, 21/24, 22/23, 22/24, 22/25, 23/24, 23/25, 또는 23/26일 수 있다. 일부 구현예에서, 뉴클레오타이드 서열 V는 2개의 뉴클레오타이드 길이를 갖는다. 이러한 경우에, 본 개시내용의 siRNA의 센스 가닥과 안티센스 가닥의 길이의 비는 19/21, 21/23 또는 23/25일 수 있다.
뉴클레오타이드 서열 V내 각각의 뉴클레오타이드는 임의의 뉴클레오타이드일 수 있다. 합성을 촉진하고 합성 비용을 절약하기 위하여, 뉴클레오타이드 서열 V는 2개의 연속된 티민 데옥시뉴클레오타이드(dTdT) 또는 2개의 연속된 우라실 리보뉴클레오타이드(UU)이거나; siRNA의 안티센스 가닥과 표적 mRNA 사이의 친화성을 향상시키기 위하여, 뉴클레오타이드 서열 V는 표적 mRNA의 상응하는 위치에서 뉴클레오타이드에 대해 상보성이다. 따라서, 일부 구현예에서, 본 개시내용의 siRNA의 센스 가닥과 안티센스 가닥의 길이 비는 19/21 또는 21/23이다. 이러한 경우, 본 개시내용의 siRNA는 표적 mRNA를 사일런싱하기에 보다 우수한 활성을 나타낸다.
표적 mRNA의 상응하는 위치에서 뉴클레오타이드는 표적 mRNA의 뉴클레노타이드 서열의 분절의 5' 말단에 인접한 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 서열을 지칭한다. 표적 mRNA의 뉴클레오타이드 서열의 분절은 뉴클레오타이드 서열 II와 실질적으로 역 상보성 또는 완전히 역 상보성이거나 뉴클레오타이드 서열 II 및 뉴클레오타이드 서열 IV로 이루어진 뉴클레오타이드 서열에 대해 실질적으로 역 상보성 또는 완전히 역 상보성이다.
일부 구현예에서, 제1의 siRNA의 경우, siRNA의 센스 가닥은 서열 번호: 5로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, siRNA의 안티센스 가닥은 서열 번호: 6으로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나:
5'-GGGUAUUCUUUCAAGCAAZ3-3' (서열 번호: 5);
5'-Z4UUGCUUGAAAGAAUACCCAG-3' (서열 번호: 6);
siRNA의 센스 가닥은 서열 번호: 7로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, siRNA의 안티센스 가닥은 서열 번호: 8로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열을 포함한다:
5'-CUGGGUAUUCUUUCAAGCAAZ3-3' (서열 번호: 7);
5'-Z4UUGCUUGAAAGAAUACCCAGAA-3' (서열 번호: 8);
여기서, Z4는 안티센스 가닥의 5' 말단에서 제1의 뉴클레오타이드이고; Z3은 A, U, G 또는 C로부터 선택되고, Z4는 Z3에 대해 상보성인 뉴클레오타이드이다.
일부 구현예에서, 제2의 siRNA의 경우, siRNA의 센스 가닥은 서열 번호: 65로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, siRNA의 안티센스 가닥은 서열 번호: 66으로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나:
5'-GGCAUAAACUAUAACAGCZ7-3' (서열 번호: 65);
5'-Z8GCUGUUAUAGUUUAUGCCCU-3' (서열 번호: 66),
siRNA의 센스 가닥은 서열 번호: 67로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, siRNA의 안티센스 가닥은 서열 번호: 68로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열을 포함한다:
5'-AGGGCAUAAACUAUAACAGCZ7-3' (서열 번호: 67);
5'-Z8GCUGUUAUAGUUUAUGCCCUUC-3' (서열 번호: 68),
여기서, Z8은 안티센스 가닥의 5' 말단에서 제1의 뉴클레오타이드이고; Z7은 A, U, G 또는 C로부터 선택되고, Z8은 Z7에 대해 상보성인 뉴클레오타이드이다.
일부 구현예에서, 제3의 siRNA의 경우, siRNA의 센스 가닥은 서열 번호: 125로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열을 포함하고 siRNA의 안티센스 가닥은 서열 번호: 126으로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나:
5'-GCUCAAGAAUGCCAAGAAZ11-3' (서열 번호: 125);
5'-Z12UUCUUGGCAUUCUUGAGCAC-3' (서열 번호: 126),
siRNA의 센스 가닥은 서열 번호: 127로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, siRNA의 안티센스 가닥은 서열 번호: 128로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열을 포함한다:
5'-GUGCUCAAGAAUGCCAAGAAZ11-3' (서열 번호: 127);
5'-Z12UUCUUGGCAUUCUUGAGCACUC-3' (서열 번호: 128),
여기서, Z12는 안티센스 가닥의 5' 말단에서 제1의 뉴클레오타이드이고; Z11은 A, U, G 또는 C로부터 선택되고, Z12는 Z11에 대해 상보성인 뉴클레오타이드이다.
일부 구현예에서, 제4의 siRNA의 경우, siRNA의 센스 가닥은 서열 번호: 185로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, siRNA의 안티센스 가닥은 서열 번호: 186으로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나:
5'-GCAACAAAGACAUUUAUGZ15-3' (서열 번호: 185);
5'-Z16CAUAAAUGUCUUUGUUGCAA-3' (서열 번호: 186),
siRNA의 센스 가닥은 서열 번호: 187로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, siRNA의 안티센스 가닥은 서열 번호: 188로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열을 포함한다:
5'-UUGCAACAAAGACAUUUAUGZ15-3' (서열 번호: 187);
5'-Z16CAUAAAUGUCUUUGUUGCAAGC-3' (서열 번호: 188),
여기서, Z16은 안티센스 가닥의 5' 말단에서 제1의 뉴클레오타이드이고; Z15는 A, U, G 또는 C로부터 선택되고, Z16은 Z15에 대해 상보성인 뉴클레오타이드이다.
일부 구현예에서, 제5의 siRNA의 경우, siRNA의 센스 가닥은 서열 번호: 245로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, siRNA의 안티센스 가닥은 서열 번호: 246으로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나:
5'-GAAUCUCAAAGAAAUCUUZ19-3' (서열 번호: 245);
5'-Z20AAGAUUUCUUUGAGAUUCUU-3' (서열 번호: 246),
siRNA의 센스 가닥은 서열 번호: 247로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, siRNA의 안티센스 가닥은 서열 번호: 248로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열을 포함한다:
5'-AAGAAUCUCAAAGAAAUCUUZ19-3' (서열 번호: 247);
5'-Z20AAGAUUUCUUUGAGAUUCUUUG-3' (서열 번호: 248),
여기서, Z20은 안티센스 가닥의 5' 말단에서 제1의 뉴클레오타이드이고; Z19는 A, U, G 또는 C로부터 선택되고, Z20은 Z19에 대해 상보성인 뉴클레오타이드이다.
일부 구현예에서, 제6의 siRNA의 경우, siRNA의 센스 가닥은 서열 번호: 305로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, siRNA의 안티센스 가닥은 서열 번호: 306으로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나:
5'-GUACGUGGACUGGAUUCUZ23-3' (서열 번호: 305);
5'-Z24AGAAUCCAGUCCACGUACUC-3' (서열 번호: 306),
siRNA의 센스 가닥은 서열 번호: 307로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, siRNA의 안티센스 가닥은 서열 번호: 308로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열을 포함한다:
5'-GAGUACGUGGACUGGAUUCUZ23-3' (서열 번호: 307);
5'-Z24AGAAUCCAGUCCACGUACUCGA-3' (서열 번호: 308),
여기서, Z24는 안티센스 가닥의 5' 말단에서 제1의 뉴클레오타이드이고; Z23은 A, U, G 또는 C로부터 선택되고, Z24는 Z23에 대해 상보성인 뉴클레오타이드이다.
일부 구현예에서, 제7의 siRNA의 경우, siRNA의 센스 가닥은 서열 번호: 365로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, siRNA의 안티센스 가닥은 서열 번호: 366으로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나:
5'-AUUUCUGGGUAUUCUUUCZ27-3' (서열 번호: 365);
5'-Z28GAAAGAAUACCCAGAAAUCG-3' (서열 번호: 366),
siRNA의 센스 가닥은 서열 번호: 367로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, siRNA의 안티센스 가닥은 서열 번호: 368로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열을 포함한다:
5'-CGAUUUCUGGGUAUUCUUUCZ27-3'(서열 번호: 367);
5'-Z28GAAAGAAUACCCAGAAAUCGCU-3'(서열 번호: 368),
여기서, Z28은 안티센스 가닥의 5' 말단에서 제1의 뉴클레오타이드이고; Z27은 A, U, G 또는 C로부터 선택되고, Z28은 Z27에 대해 상보성인 뉴클레오타이드이다.
일부 구현예에서, 제8의 siRNA의 경우, siRNA의 센스 가닥은 서열 번호: 425로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, siRNA의 안티센스 가닥은 서열 번호: 426으로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나:
5'-CAUGAAGGGCAUAAACUAZ31-3' (서열 번호: 425);
5'-Z32UAGUUUAUGCCCUUCAUGUC-3' (서열 번호: 426),
siRNA의 센스 가닥은 서열 번호: 427로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, siRNA의 안티센스 가닥은 서열 번호: 428로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열을 포함한다:
5'-GACAUGAAGGGCAUAAACUAZ31-3' (서열 번호: 427);
5'-Z32UAGUUUAUGCCCUUCAUGUCUA-3' (서열 번호: 428),
여기서, Z32는 안티센스 가닥의 5' 말단에서 제1의 뉴클레오타이드이고; Z31은 A, U, G 또는 C이고, Z32는 Z31에 대해 상보성인 뉴클레오타이드이다.
일부 구현예에서, 제9의 siRNA이 경우, siRNA의 센스 가닥은 서열 번호: 485로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, siRNA의 안티센스 가닥은 서열 번호: 486으로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나:
5'-GGAUUCUGGAGAAAACUCZ35-3' (서열 번호: 485);
5'-Z36GAGUUUUCUCCAGAAUCCAG-3' (서열 번호: 486),
siRNA의 센스 가닥은 서열 번호: 487로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열을 포함하고. siRNA의 안티센스 가닥은 서열 번호: 488로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열을 포함한다:
5'-CUGGAUUCUGGAGAAAACUCZ35-3' (서열 번호: 487);
5'-Z36GAGUUUUCUCCAGAAUCCAGUC-3' (서열 번호: 488),
여기서, Z36은 안티센스 가닥의 5' 말단에서 제1의 뉴클레오타이드이고; Z35는 A, U, G 또는 C로부터 선택되고, Z36은 Z35에 대해 상보성인 뉴클레오타이드이다.
일부 구현예에서, 본 개시내용의 siRNA는 표 1a 내지 표 1i에 나타낸 바와 같은 siFXIa1, siFXIa2, siFXIb1, siFXIb2, siFXIc1, siFXIc2, siFXId1, siFXId2, siFXIe1, siFXIe2, siFXIf1, siFXIf2, siFXIg1, siFXIg2, siFXIh1, siFXIh2, siFXIi1, 또는 siFXIi2이다.
상술한 바와 같이, 본 개시내용의 siRNA에서 각각의 뉴클레오타이드는 독립적으로 변형되거나 변형되지 않은 뉴클레오타이드이다. 일부 구현예에서, 본 개시내용의 siRNA 내 뉴클레오타이드는 변형되지 않은 뉴클레오타이드이고; 일부 구현예에서, 본 개시내용의 siRNA에서, 뉴클레오타이드 중 일부 또는 모두는 변형된 뉴클레오타이드이다. 뉴클레오타이드 그룹 상의 이러한 변형은 FXI 유전자의 발현을 억제하기 위한 본 개시내용의 siRNA 접합체의 기능의 유의적인 감소 또는 상실을 초래하지 않을 수 있다.
일부 구현예에서, 본 개시내용의 siRNA는 적어도 하나의 변형된 뉴클레오타이드를 포함한다. 본 개시내용의 내용에서, 사용된 용어 "변형된 뉴클레오타이드"는 이의 리보스 그룹의 2'-하이드록시를 다른 그룹으로 치환시켜 형성된 뉴클레오타이드, 또는 변형된 염기를 지닌 뉴클레오타이드이다. 변형된 뉴클레오타이드는 유전자 발현을 억제하기 위한 siRNA의 기능의 유의적인 손상 또는 상실을 초래할 수 있다. 예를 들면, 문헌: J.K. Watts, G. F. Deleavey and M. J. Damha, Chemically Modified siRNA: tools and applications. Drug Discov Today, 2008.13(19-20): p.842-55에 기술된 변형된 뉴클레오타이드가 선택될 수 있다.
일부 구현예에서, 본 개시내용의 siRNA는 적어도 1개의 변형된 뉴클레오타이드를 포함한다. 본 개시내용의 맥락에서, 사용된 용어 "변형된 뉴클레오타이드"는 리보스 그룹의 2'-하이드록시를 다른 그룹으로 치환시켜 형성된 뉴클레오타이드, 또는 뉴클레오타이드 유사체, 또는 변형된 염기를 지닌 뉴클레오타이드를 지칭한다. 변형된 뉴클레오타이드는 siRNA 접합체의 유전자 발현을 억제하기 위한 기능의 유의적인 손상 또는 상실을 초래할 수 있다. 예를 들면, 문헌: Watts, J.K., G. F. Deleavey and M. J. Damha, Chemically Modified siRNA: tools and applications. Drug Discov Today, 2008.13(19-20): p.842-55에 기술된 변형된 뉴클레오타이드가 선택될 수 있다.
일부 구현예에서, 본 개시내용의 siRNA의 센스 가닥 또는 안티센스 가닥 내 적어도 하나의 뉴클레오타이드, 및/또는 적어도 하나의 포스페이트 그룹은 변형된 그룹(들)을 지닌 포스페이트 그룹이다. 다시 말해서, 센스 가닥 및 안티센스 가닥내 적어도 하나의 단일 가닥의 포스페이트-리보스 골격내 포스페이트 및/또는 리보스 그룹 중 적어도 일부는 변형된 그룹을 지닌 포스페이트 그룹 및/또는 변형된 그룹을 지닌 리보스 그룹이다.
일부 구현예에서, 센스 가닥 및/또는 안티센스 가닥 내 모든 뉴클레오타이드는 변형된 뉴클레오타이드이다. 일부 구현예에서, 본 개시내용의 siRNA의 센스 가닥 및 안티센스 가닥 내 각각의 뉴클레오타이드는 독립적으로 플루오로 변형된 뉴클레오타이드 또는 비-플루오로 변형된 뉴클레오타이드이다.
본 개시내용의 발명자는 놀랍게도 본 개시내용의 siRNA가 동물 실험에서 혈장 안정성과 유전자 사일런싱 효능 사이에서 높은 균형을 달성함을 발견하였다.
일부 구현예에서, 플루오로 변형된 뉴클레오타이드는 뉴클레오타이드 서열 I 및 뉴클레오타이드 서열 II 내에 위치하고; 5' 말단으로부터 3' 말단까지의 방향으로, 뉴클레오타이드 서열 I의 적어도 7, 8 및 9번 위치에서 뉴클레오타이드는 플루오로 변형된 뉴클레오타이드이고; 5' 말단으로부터 3' 말단까지의 방향으로, 뉴클레오타이드 II의 2, 6, 14, 및 16번 위치에서 뉴클레오타이드는 플루오로 변형된 뉴클레오타이드이다.
일부 구현예에서, 플루오로 변형된 뉴클레오타이드는 뉴클레오타이드 서열 I 및 뉴클레오타이드 서열 II 내에 위치하고; 뉴클레오타이드 서열 I은 5개 이하의 플루오로 변형된 뉴클레오타이드를 포함하고; 5' 말단으로부터 3' 말단까지의 방향으로, 뉴클레오타이드 서열 I의 7, 8 및 9번 위치에서 뉴클레오타이드는 플루오로 변형된 뉴클레오타이드이고; 뉴클레오타이드 서열 II는 7개 이하의 플루오로 변형된 뉴클레오타이드를 포함하고; 뉴클레오타이드 서열 II의 2, 6, 14, 및 16번 위치에서 뉴클레오타이드는 플루오로 변형된 뉴클레오타이드이다.
일부 구현예에서, 5' 말단으로부터 3' 말단까지의 방향으로, 뉴클레오타이드는 센스 가닥내 서열 I의 7, 8 및 9번 위치 또는 센스 가닥 내 뉴클레오타이드 서열 I의 5, 7, 8 및 9번 위치에서 뉴클레오타이드는 플루오로 변형된 뉴클레오타이드이고, 센스 가닥 내 다른 위치에서의 뉴클레오타이드는 비-플루오로 변형된 뉴클레오타이드이고; 5' 말단으로부터 3' 말단까지의 방향으로, 안티센스 가닥내 뉴클레오타이드 서열 II의 2, 6, 14, 및 16번 위치 또는 안티센스 가닥내 뉴클레오타이드 서열 II의 2, 6, 8, 9, 14, 및 16번 위치에서 에서 뉴클레오타이드는 플루오로 변형된 뉴클레오타이드이고, 안티센스 가닥의 다른 위치에서의 뉴클레오타이드는 비-플루오로 변형된 뉴클레오타이드이다.
본 개시내용의 맥락에서, "플루오로 변형된 뉴클레오타이드"는 리보스 그룹의 2'-하이드록시를 불소 원자로 치환시켜 형성한 뉴클레오타이드를 지칭하고, 이는 다음의 화학식 (7)로 나타낸 바와 같은 구조를 갖는다. "비-플루오로 변형된 뉴클레오타이드"는 리보스 그룹의 2'-하이드록시를 비-플루오로 그룹으로 치환시켜 형성한 뉴클레오타이드, 또는 뉴클레오타이드 유사체를 지칭한다. 일부 구현예에서, 각각의 비-플루오로 변형된 뉴클레오타이드는 뉴클레오타이드의 리보스 그룹의 2'-하이드록시를 비-플루오로 그룹으로 치환시켜 형성한 뉴클레오타이드, 또는 뉴클레오타이드 유사체로부터 독립적으로 선택된다.
리보스 그룹의 2'-하이드록시를 비-플루오로 그룹으로 치환시켜 형성된 뉴클레오타이드는 당해 분야에 잘 공지되어 있고, 2'-알콕시 변형된 뉴클레오타이드, 2'-치환된 알콕시 변형된 뉴클레오타이드, 2'-알킬 변형된 뉴클레오타이드, 2'-치환된 알킬 변형된 뉴클레오타이드, 2'-아미노 변형된 뉴클레오타이드, 2'-치환된 아미노 변형된 뉴클레오타이드, 및 2'-데옥시 뉴클레오타이드로 이루어진 그룹으로부터 선택된 것일 수 있다.
일부 구현예에서, 2'-알콕시 변형된 뉴클레오타이드는 화학식 (8)로 나타낸 바와 같은 2'-메톡시(2'-OMe) 변형된 뉴클레오타이드이다. 일부 구현예에서, 2'-치환된 알콕시 변형된 뉴클레오타이드는 예를 들면 화학식 (9)로 나타낸 바와 같은, 2'-O-메톡시에틸(2'-MOE) 변형된 뉴클레오타이드이다. 일부 구현예에서, 2'-아미노 (2'-NH2) 변형된 뉴클레오타이드는 화학식 (10)으로 나타낸 바와 같은 바와 같다. 일부 구현예에서, 2'-데옥시 뉴클레오타이드(DNA)는 화학식 (11)로 나타낸 바와 같은 바와 같다.
Figure pct00001
뉴클레오타이드 유사체는 핵산 내 뉴클레오타이드를 대체할 수 있지만, 아데노신 리보뉴클레오타이드, 구아닌 리보뉴클레오타이드, 사이토신 리보뉴클레오타이드, 우라실 리보뉴클레오타이드, 또는 티민 데옥시리보뉴클레오타이드와는 구조적으로 상이한 그룹을 지칭한다. 일부 구현예에서, 뉴클레오타이드 유사체는 이소뉴클레오타이드, 브릿지된 뉴클레오타이드 또는 아사이클릭 뉴클레오타이드일 수 있다.
브릿지된 핵산 (BNA)는 구속되거나 접근불가능한 뉴클레오타이드이다. BNA는 "고정된" C3'-엔도 당 푸커링(puckering)을 지닌 5-, 6-원 또는 7-원의 환 브릿지된 구조를 함유할 수 있다. 브릿지는 전형적으로 리보스의 2'- 및 4'-위치에 혼입되어 2',4'-BNA 뉴클레오타이드를 생성한다. 일부 구현예에서, BNA는 LNA, ENA, cET BNA 등일 수 있고 이는 각각 화학식 (12), (13) 및 (14)으로 나타낸 바와 같은다.
Figure pct00002
아크릴성 뉴클레오타이드는 뉴클레오타이드의 부류를 지칭하고 여기서 당 환은 개방되어 있다. 일부 구현예에서, 아크릴성 뉴클레오타이드는 언록킹된(unlocked) 핵산(UNA) 또는 글리세롤 핵산(GNA)이고, 이는 각각 화학식 (15) 및 (16)로 나타낸 바와 같다.
Figure pct00003
상기 화학식(15) 및 (16)에서, R은 H, OH 또는 알콕시(O-알킬)로부터 선택된다.
이소뉴클레오타이드는 뉴클레오타이드내 리보스 환 상의 염기의 위치를 변경시켜 형성한 화합물이다. 일부 구현예에서, 이소뉴클레오타이드는 각각 화학식 (17) 또는 (18)로 나타낸 바와 같은 바와 같이, 리보스 환 상의 1'-위치로부터 2'-위치 또는 3'-위치로 염기를 수송하여 형성시킨 화합물이다.
Figure pct00004
상기 화학식(17) 및 (18)의 화합물에서, "염기"는 A, U, G, C, 또는 T와 같은 염기를 나타내고; R은 H, OH, F, 또는 상기 비-플루오로 그룹으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 뉴클레오타이드 유사체는 이소뉴클레오타이드, LNA, ENA, cET, UNA, 및 GNA로 이루어진 그룹으로부터 선택된 것이다. 일부 구현예에서, 각각의 비-플루오로 변형된 뉴클레오타이드는 메톡시 변형된 뉴클레오타이드이다. 본 개시내용의 맥락에서, 메톡시 변형된 뉴클레오타이드는 리보스 그룹의 2'-하이드록시 그룹을 메톡시 그룹으로 치환시켜 형성한 뉴클레오타이드를 지칭한다.
본 개시내용의 맥락에서, "플루오로 변형된 뉴클레오타이드", "2'-플루오로 변형된 뉴클레오타이드", "리보스 그룹의 2'-하이드록시가 불소 원자로 치환된 뉴클레오타이드", 및 "2'-플루오로리보실을 지닌 뉴클레오타이드"는 동일한 의미를 가지며 뉴클레오타이드의 2'-하이드록시가 불소 원자로 치환된 화합물을 지칭하고, 이는 화학식 (7)로 나타낸 바와 같은 구조를 갖는다. "메톡시 변형된 뉴클레오타이드", "2'-메톡시 변형된 뉴클레오타이드", "리보스 그룹의 2'-하이드록시가 메톡시로 치환된 뉴클레오타이드는 메톡시로 치환된다" 및 "2'-메톡시리보실을 지닌 뉴클레오타이드"는 동일한 의미를 가지고, 뉴클레오타이드내 리보스 그룹의 2'-하이드록시가 메톡시로 치환된 화합물을 지칭하고, 이는 화학식 (8)로 나타낸 바와 같은 구조를 갖는다.
일부 구현예에서, 본 개시내용의 siRNA는 다음의 변형을 지닌 siRNA이다: 5' 말단으로부터 3' 말단까지의 방향으로, 센스 가닥 내 뉴클레오타이드 I의 7, 8 및 9번 위치 또는 5, 7, 8 및 9번 위치에서 뉴클레오타이드는 플루오로 변형된 뉴클레오타이드이고, 센스 가닥의 다른 위치에서의 뉴클레오타이드는 메톡시 변형된 뉴클레오타이드이고; 안티센스 가닥내 뉴클레오타이드 서열 II에서 2, 6, 14, 및 16번 위치 또는 2, 6, 8, 9, 14, 및 16번 위치에서 뉴클레오타이드는 플루오로 변형된 뉴클레오타이드이고, 안티센스 가닥내 다른 위치에서의 뉴클레오타이드는 메톡시 변형된 뉴클레오타이드이다.
일부 구현예에서, 본 개시내용의 siRNA는 다음의 변형을 지닌 siRNA이다: 5' 말단으로부터 3' 말단까지의 방향으로, siRNA의 센스 가닥내 뉴클레오타이드 서열 I의 5, 7, 8, 및 9번 위치에서 뉴클레오타이드는 플루오로 변형된 뉴클레오타이드이고, siRNA의 센스 가닥의 다른 위치에서의 뉴클레오타이드는 메톡시 변형된 뉴클레오타이드이고; 5' 말단으로부터 3' 말단까지의 방향으로, siRNA의 안티센스 가닥내 뉴클레오타이드 서열 II의 2, 6, 8, 9, 14, 및 16번 위치에서 뉴클레오타이드는 플루오로 변형된 뉴클레오타이드이고, siRNA의 안티센스 가닥의 다른 위치에서의 뉴클레오타이드는 메톡시 변형된 뉴클레오타이드이고;
또는, 5' 말단으로부터 3' 말단까지의 방향으로, siRNA의 센스 가닥내 뉴클레오타이드 서열 I의 5, 7, 8, 및 9번 위치에서 뉴클레오타이드는 플루오로 변형된 뉴클레오타이드이고, siRNA의 센스 가닥 내 다른 위치에서의 뉴클레오타이드는 메톡시 변형된 뉴클레오타이드이고; 5' 말단으로부터 3' 말단까지의 방향으로, siRNA의 안티센스 가닥 내 뉴클레오타이드 II의 2, 6, 14, 및 16번 위치에서 뉴클레오타이드는 플루오로 변형된 뉴클레오타이드이고, siRNA의 안티센스 가닥 내 다른 위치에서의 뉴클레오타이드는 메톡시 변형된 뉴클레오타이드이다.
또는, 5' 말단으로부터 3' 말단까지의 방향으로, siRNA의 센스 가닥내 뉴클레오타이드 서열 I의 7, 8 및 9번 위치에서 뉴클레오타이드는 플루오로 변형된 뉴클레오타이드이고, siRNA의 센스 가닥내 다른 위치에서의 뉴클레오타이드는 메톡시 변형된 뉴클레오타이드이고; 5' 말단으로부터 3' 말단까지의 방향으로, siRNA 안티센스 가닥 내 뉴클레오타이드 서열 II의 2, 6, 14, 및 16번 위치에서 뉴클레오타이드는 플루오로 변형된 뉴클레오타이드이고, siRNA의 안티센스 가닥 내 다른 위치에서의 뉴클레오타이드는 메톡시 변형된 뉴클레오타이드이다.
일부 구현예에서, 본 개시내용의 siRNA는 표 1a 내지 표 1i에 나타낸 siFXIa1-M1, siFXIa1-M2, siFXIa1-M3, siFXIa2-M1, siFXIa2-M2, siFXIa2-M3, siFXIb1-M1, siFXIb1-M2, siFXIb1-M3, siFXIb2-M1, siFXIb2-M2, siFXIb2-M3, siFXIc1-M1, siFXIc1-M2, siFXIc1-M3, siFXIc2-M1, siFXIc2-M2, siFXIc2-M3, siFXId1-M1, siFXId1-M2, siFXId1-M3, siFXId2-M1, siFXId2-M2, siFXId2-M3, siFXIe1-M1, siFXIe1-M2, siFXIe1-M3, siFXIe2-M1, siFXIe2-M2, siFXIe2-M3, siFXIf1-M1, siFXIf1-M2, siFXIf1-M3, siFXIf2-M1, siFXIf2-M2, siFXIf2-M3, siFXIg1-M1, siFXIg1-M2, siFXIg1-M3, siFXIg2-M1, siFXIg2-M2, siFXIg2-M3, siFXIh1-M1, siFXIh1-M2, siFXIh1-M3, siFXIh2-M1, siFXIh2-M2, siFXIh2-M3, siFXIi1-M1, siFXIi1-M2, siFXIi1-M3, siFXIi2-M1, siFXIi2-M2, 및 siFXIi2-M3 중 어느 하나이다.
상기 변형을 지닌 siRNA는 보다 낮은 비용을 가질 뿐 아니라, 혈액 속의 리보뉴클레아제는 핵산을 용이하게 분해할 수 없어서, 핵산의 안정성을 증가시키고 핵산이 뉴클레아제 가수분해에 대해 보다 강력한 내성을 가지도록 한다. 한편, 상기 변형을 지닌 siRNA는 또한 표적 mRNA에 대해 보다 높은 억제 활성을 나타낸다.
일부 구현예에서, 본 개시내용의 siRNA의 센스 가닥 및 안티센스 가닥 내 적어도 하나의 단일 가닥의 포스페이트-리보스 골격 내 포스페이트 그룹의 적어도 일부는 변형된 그룹을 지닌 포스페이트 그룹이다. 일부 구현예에서, 변형된 그룹(들)을 지닌 포스페이트 그룹은 포스페이트 그룹 내 포스포디에스테르 결합 내 적어도 하나의 산소를 황 원자로 치환시켜 형성한 포스포로티오에이트 그룹이다. 일부 구현예에서, 변형된 그룹(들)을 지닌 포스페이트 그룹은 화학식 (1)로 나타낸 바와 같은 구조를 갖는 포스포로티오에이트 그룹이다:
Figure pct00005
이러한 변형은 siRNA의 이중 가닥 구조를 안정화시킴으로써 염기 쌍화(base pairing)의 높은 특이성 및 높은 친화성을 유지한다.
일부 구현예에서, 본 개시내용의 siRNA 내, 포스포로티오에이트 연결은 다음의 위치로 이루어진 그룹 중 적어도 하나에 위치한다: 센스 또는 안티센스 가닥의 말단에서 제1과 제2의 뉴클레오타이드 사이의 위치, 센스 또는 안티센스 가닥의 말단에서 제2와 제3의 뉴클레오타이드 사이의 위치, 또는 이의 임의의 조합. 일부 구현예에서, 포스포로티오에이트 연결은 센스 가닥의 5' 말단을 제외하고는 상기 위치에 위치한다. 일부 구현예에서, 포스포로티오에이트 연결은 센스 가닥의 3' 말단을 제외하고는 상기 위치 모두에 위치한다. 일부 구현예에서, 포스포로티오에이트 연결은 다음 위치 중 적어도 하나에 위치한다:
센스 가닥의 5' 말단에서 제1과 제2의 뉴클레오타이드 사이의 위치;
센스 가닥의 5' 말단에서 제2와 제3의 뉴클레오타이드 사이의 위치;
센스 가닥의 3' 말단에서 제1과 제2의 뉴클레오타이드 사이의 위치;
센스 가닥의 3' 말단에서 제2와 제3의 뉴클레오타이드 사이의 위치;
안티센스 가닥의 5' 말단에서 제1과 제2의 뉴클레오타이드 사이의 위치;
안티센스 가닥의 5' 말단에서 제2와 제3의 뉴클레오타이드 사이의 위치;
안티센스 가닥의 3' 말단에서 제1과 제2의 뉴클레오타이드 사이의 위치; 및
안티센스 가닥의 3' 말단에서 제2와 제3의 뉴클레오타이드 사이의 위치.
일부 구현예에서, 본 개시내용의 siRNA는 표 1a 내지 표 1i에 나타낸 siFXIa1-M1S, siFXIa1-M2S, siFXIa1-M3S, siFXIa2-M1S, siFXIa2-M2S, siFXIa2-M3S, siFXIb1-M1S, siFXIb1-M2S, siFXIb1-M3S, siFXIb2-M1S, siFXIb2-M2S, siFXIb2-M3S, siFXIc1-M1S, siFXIc1-M2S, siFXIc1-M3S, siFXIc2-M1S, siFXIc2-M2S, siFXIc2-M3S, siFXId1-M1S, siFXId1-M2S, siFXId1-M3S, siFXId2-M1S, siFXId2-M2S, siFXId2-M3S, siFXIe1-M1S, siFXIe1-M2S, siFXIe1-M3S, siFXIe2-M1S, siFXIe2-M2S, siFXIe2-M3S, siFXIf1-M1S, siFXIf1-M2S, siFXIf1-M3S, siFXIf2-M1S, siFXIf2-M2S, siFXIf2-M3S, siFXIg1-M1S, siFXIg1-M2S, siFXIg1-M3S, siFXIg2-M1S, siFXIg2-M2S, siFXIg2-M3S, siFXIh1-M1S, siFXIh1-M2S, siFXIh1-M3S, siFXIh2-M1S, siFXIh2-M2S, siFXIh2-M3S, FXIi1-M1S, siFXIi1-M2S, siFXIi1-M3S, siFXIi2-M1S, siFXIi2-M2S, 및 siFXIi2-M3S 중 임의의 하나이다.
일부 구현예에서, siRNA의 안티센스 가닥내 5'-말단에서 뉴클레오타이드는 5'-포스페이트 뉴클레오타이드 또는 5'-포스페이트 유사체 변형된 뉴클레오타이드이다.
일반적으로 사용된 5'-포스페이트 뉴클레오타이드 또는 5'-포스페이트 유사체 변형된 뉴클레오타이드는 당해 분야의 기술자에게 잘 공지되어 있다. 예를 들면, 5'-포스페이트 뉴클레오타이드는 다음 구조를 가질 수 있다:
Figure pct00006
다른 예로, 문헌: Anastasia Khvorova and Jonathan K. Watts, The chemical evolution of oligonucleotide therapies of clinical utility. Nature Biotechnology, 2017, 35(3): 238-48은 다음의 4개의 5'-포스페이트 유사체 변형된 뉴클레오타이드를 개시하고 있다:
Figure pct00007
여기서 R은 H, OH, 메톡시, 및 F로부터 선택되고;
"염기"는 A, U, C, G, 또는 T로부터 선택된 핵산 염기를 나타낸다.
일부 구현예에서, 5'-포스페이트 뉴클레오타이드는 화학식 (2)로 나타낸 바와 같은 5'-포스페이트 변형을 지닌 뉴클레오타이드이고; 5'-포스페이트 유사체 변형된 뉴클레오타이드는 화학식 (3)으로 나타낸 바와 같은 비닐포스포네이트 변형을 지닌 뉴클레오타이드, 또는 화학식 (5)로 나타낸 바와 같은 포스포로티오에이트 변형된 뉴클레오타이드이다.
일부 구현예에서, 본 개시내용의 siRNA는 표 1a 내지 표 1i에 나타낸 siFXIa1-M1P1, siFXIa1-M2P1, siFXIa1-M3P1, siFXIa2-M1P1, siFXIa2-M2P1, siFXIa2-M3P1, siFXIa1-M1SP1, siFXIa1-M2SP1, siFXIa1-M3SP1, siFXIa2-M1SP1, siFXIa2-M2SP1, siFXIa2-M3SP1, siFXIb1-M1P1, siFXIb1-M2P1, siFXIb1-M3P1, siFXIb2-M1P1, siFXIb2-M2P1, siFXIb2-M3P1, siFXIb1-M1SP1, siFXIb1-M2SP1, siFXIb1-M3SP1, siFXIb2-M1SP1, siFXIb2-M2SP1, siFXIb2-M3SP1, siFXIc1-M1P1, siFXIc1-M2P1, siFXIc1-M3P1, siFXIc2-M1P1, siFXIc2-M2P1, siFXIc2-M3P1, siFXIc1-M1SP1, siFXIc1-M2SP1, siFXIc1-M3SP1, siFXIc2-M1SP1, siFXIc2-M2SP1, siFXIc2-M3SP1, siFXId1-M1P1, siFXId1-M2P1, siFXId1-M3P1, siFXId2-M1P1, siFXId2-M2P1, siFXId2-M3P1, siFXId1-M1SP1, siFXId1-M2SP1, siFXId1-M3SP1, siFXId2-M1SP1, siFXId2-M2SP1, siFXId2-M3SP1, siFXIe1-M1P1, siFXIe1-M2P1, siFXIe1-M3P1, siFXIe2-M1P1, siFXIe2-M2P1, siFXIe2-M3P1, siFXIe1-M1SP1, siFXIe1-M2SP1, siFXIe1-M3SP1, siFXIe2-M1SP1, siFXIe2-M2SP1, siFXIe2-M3SP1, siFXIf1-M1P1, siFXIf1-M2P1, siFXIf1-M3P1, siFXIf2-M1P1, siFXIf2-M2P1, siFXIf2-M3P1, siFXIf1-M1SP1, siFXIf1-M2SP1, siFXIf1-M3SP1, siFXIf2-M1SP1, siFXIf2-M2SP1, siFXIf2-M3SP1, siFXIg1-M1P1, siFXIg1-M2P1, siFXIg1-M3P1, siFXIg2-M1P1, siFXIg2-M2P1, siFXIg2-M3P1, siFXIg1-M1SP1, siFXIg1-M2SP1, siFXIg1-M3SP1, siFXIg2-M1SP1, siFXIg2-M2SP1, siFXIg2-M3SP1, siFXIh1-M1P1, siFXIh1-M2P1, siFXIh1-M3P1, siFXIh2-M1P1, siFXIh2-M2P1, siFXIh2-M3P1, siFXIh1-M1SP1, siFXIh1-M2SP1, siFXIh1-M3SP1, siFXIh2-M1SP1, siFXIh2-M2SP1, siFXIh2-M3SP1, FXIi1-M1P1, siFXIi1-M2P1, siFXIi1-M3P1, siFXIi2-M1P1, siFXIi2-M2P1, siFXIi2-M3P1, siFXIi1-M1SP1, siFXIi1-M2SP1, siFXIi1-M3SP1, siFXIi2-M1SP1, siFXIi2-M2SP1, 및 siFXIi2-M3SP1 중 어느 하나이다.
본 개시내용의 발명자는 놀랍게도, 본 개시내용의 siRNA가 유의적으로 향상된 혈장 및 라이소솜 안정성을 가지는 한편, 높은 표적 mRNA 억제 활성을 나타냄을 발견하였다.
본 개시내용의 siRNA는 당해 분야에서 siRNA를 제조하는 통상의 방법, 예컨대, 고체 상 합성 방법 및 액체 상 합성 방법으로 수득할 수 있다. 이들 중에서, 시판되는 통상의 장치가 고체 상 합성에 이미 이용가능하다. 변형된 뉴클레오타이드 그룹을 상응하는 변형을 지닌 뉴클레오타이드 단량체를 사용하여 본 개시내용의 siRNA 내로 도입할 수 있다. 상응하는 변형을 가진 뉴클레오타이드 단량체를 제조하는 방법 및 변형된 뉴클레오타이드 그룹을 siRNA 내로 도입하는 방법은 당해 분야의 기술자에게 또한 잘 공지되어 있다.
약제학적 조성물
본 개시내용은 활성 성분으로서 상기 siRNA 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다.
약제학적으로 허용되는 담체는 siRNA 투여 분야에서 통상의 담체, 예를 들면, 그러나 이에 한정되지 않는 자기 나노입자(예를 들면, Fe3O4 및 Fe2O3-기반 나노입자), 탄소 나노튜브, 메소포러스(mesoporous) 규소, 인산칼슘 나노입자, 폴리에틸렌이민(PEI), 폴리아미도아민(PAMAM) 덴드리머, 폴리(L-라이신)(PLL), 키토산, 1,2-디올레오일-3-트리메틸암모늄-프로판(DOTAP), 폴리(D&L-락트산/글리콜산) 공중합체(PLGA), 폴리(2-아미노에틸 에틸렌 포스페이트)(PPEEA), 폴리(2-디메틸아미노에틸 메타크릴레이트)(PDMAEMA), 및 이의 유도체일 수 있다.
약제학적 조성물에서, siRNA 및 약제학적으로 허용되는 담체의 함량은 구체적으로 요구되지 않으며, 개개 구성성분의 통상의 함량일 수 있다. 일부 구현예에서, siRNA 대 약제학적으로 허용되는 담체의 중량 비는 1:(1-500)이고, 일부 구현예에서, 중량비는 1:(1-50)이다.
일부 구현예에서, 약제학적 조성물은 또한 다른 약제학적으로 허용되는 부형제를 함유할 수 있고, 이는 당해 분야에서 다양한 통상의 제형 또는 화합물일 수 있다. 예를 들면, 상기 다른 약제학적으로 허용되는 부형제는 pH 완충제, 보호제 및 삼투압 조절제 중 적어도 하나를 포함할 수 있다.
pH 완충제는 pH가 7.5 내지 8.5인 트리스(하이드록시메틸)아미노메탄 하이드로클로라이드 완충제 용액, 및/또는 pH가 5.5 내지 8.5인 포스페이트 완충제, 예를 들면, pH가 5.5 내지 8.5인 포스페이트 완충제이다.
보호제는 이노시톨, 소르비톨, 슈크로스, 트레할로스, 만노스, 말토스, 락토스, 및 글루코스 중 적어도 하나일 수 있다. 보호제의 함량은 약제학적 조성물의 총 중량을 기준으로 0.01 wt% 내지 30 wt%일 수 있다.
삼투압 조절제는 염화나트륨 및/또는 염화칼륨일 수 있다. 삼투압 조절제의 함량은 약제학적 조성물의 삼투압이 200 내지 700 밀리오스몰(milliosmol)/kg이 되도록 한다. 목적한 삼투압에 따라서, 당해 분야의 기술자는 삼투압 조절제의 함량을 용이하게 결정할 수 있다.
일부 구현예에서, 약제학적 조성물은 액체 제형, 예를 들면, 주사 액제; 도는 주사용 동결건조된 분말일 수 있고; 이는 액체 부형제와 혼합되어 투여시 액체 제형을 형성할 것이다. 액체 제형은 파하, 근육내 또는 정맥내 주사에 의해 투여될 수 있고 또한 폐에 스프레이로 투여될 수 있거나, 다른 기관(예를 들면, 간)에 스프레이로 투여될 수 있다. 일부 구현예에서, 약제학적 조성물은 정맥내 주사로 투여된다.
일부 구현예에서, 약제학적 조성물은 리포좀 제형의 형태일 수 있다. 일부 구현예에서, 리포좀 제형에 사용된 약제학적으로 허용되는 담체는 아민-함유 형질감염 화합물(이후 또한 유기 아민으로 지칭됨), 헬퍼(helper) 지질 및/또는 페길화된(PEGylated) 지질을 포함할 수 있다. 여기서, 유기 아민, 헬퍼 지질 및 페길화된 지질은 각각 아민-함유 형질감염 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염 또는 이의 유도체, 이의 전문이 본원에 참고로 포함된 제CN103380113A호에 기술된 바와 같은 헬퍼 지질 및 페길화된 지질로부터 선택된 하나 이상일 수 있다.
일부 구현예에서, 유기 아민은 제CN103380113A호에 기술된 바와 같은 화학식 (201)로 나타낸 바와 같은 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염이다:
Figure pct00008
여기서,
X101 또는 X102는 서로 독립적으로 O, S, N-A 및 C-A로부터 선택되고, 여기서 A는 수소 또는 C1-C20 탄화수소 쇄이고;
Y101 또는 Z101는 서로 독립적으로 C=O, C=S, S=O, CH-OH 또는 SO2로부터 선택되고;
각각의 R101, R102, R103, R104, R105, R106 또는 R107은 서로 독립적으로 수소; 사이클릭 또는 아사이클릭(acyclic)의, 치환되거나 비치환된, 측쇄 또는 직쇄의 지방족 그룹; 사이클릭 또는 아사이클릭의, 치환되거나 비치환된, 측쇄 또는 직쇄의 헤테로지방족 그룹; 치환되거나 비치환된, 측쇄 또는 직쇄의 아실 그룹; 치환되거나 비치환된, 측쇄 또는 직쇄의 아릴 그룹; 및 치환되거나 비치환된, 측쇄 또는 직쇄의 헤테로아릴 그룹으로부터 선택되고;
x는 1 내지 10의 정수이고;
n은 1 내지 3의 정수이고, m은 0 내지 20의 정수이고, p는 0 또는 1이고, 여기서 m=p=0이면, R102는 수소이고;
n 및 m 중 적어도 하나가 2이면, 화학식 (201) 내 R103 및 질소는 화학식 (202) 또는 (203)으로 나타낸 바와 같은 구조를 형성하고:
Figure pct00009
여기서 g, e 또는 f는 서로 독립적으로 1 내지 6의 정수이고; "HCC"는 탄화수소 쇄를 나타내고, 각각의 *N는 화학식 (201)에 나타낸 질소 원자를 나타낸다.
일부 구현예에서, R103은 폴리아민이다. 다른 구현예에서, R103은 케탈이다. 일부 구현예에서, 화학식 (201) 내 R101 및 R102는 서로 독립적으로 임의의 치환되거나 비치환된, 측쇄 또는 직쇄의 알킬 또는 알케닐이고, 알킬 또는 알케닐은 3 내지 20개의 탄소 원자(예를 들면, 8 내지 18개의 탄소 원자) 및 0 내지 4개의 이중 결합(예를 들면, 0 내지 2개의 이중 결합)을 갖는다.
일부 구현예에서, n 및 m이 서로 독립적으로 1 또는 3인 경우, R103은 임의의 다음 화학식(204) 내지 (213)이고:
Figure pct00010
여기서, 화학식(204) 내지 (213)에서, g, e 및 f는 서로 독립적으로 1 내지 6의 정수이고, 각각의 "HCC"는 탄화수소 쇄를 나타내고, 각각의 *는 화학식 (201)내 질소 원자에 대한 R103의 잠재적인 부착점을 나타내고, 여기서 임의의 * 위치내 각각의 H는 대체되어 화학식 (201)내 질소 원자에 대한 부착을 형성할 수 있다.
화학식 (201)로 나타낸 바와 같은 화합물은 제CN103380113A호에 기술된 바와 같이 제조할 수 있다.
일부 구현예에서, 유기 아민은 화학식 (214)로 나타낸 바와 같은 유기 아민 및/또는 화학식 (215)로 나타낸 바와 같은 유기 아민이고:
Figure pct00011
헬퍼 지질은 콜레스테롤, 콜레스테롤 유사체 및/또는 콜레스테롤 유도체이다.
페길화된 지질은 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스파티딜에탄올아민-N-[메톡시(폴리에틸렌 글리콜)]-2000이다.
일부 구현예에서, 약제학적 조성물 속의 유기 아민, 헬퍼 지질, 및 페길화된 지질 중 몰 비는 (19.7-80):(19.7-80):(0.3-50)이고, 예를 들면, 몰 비는 (50-70):(20-40):(3-20)일 수 있다.
일부 구현예에서, 본 개시내용의 siRNA 및 상기 아민-함유 형질감염 시약에 의해 형성된 약제학적 조성물 입자는 평균 직경이 약 30 nm 내지 약 200 nm이고, 전형적으로 약 40 nm 내지 약 135 nm이고, 보다 전형적으로, 리포좀 입자의 평균 직경은 약 50 nm 내지 약 120 nm, 약 50 nm 내지 약 100 nm, 약 60 nm 내지 약 90 nm, 또는 약 70 nm 내지 약 90 nm이고; 예를 들면, 리포좀 입자의 평균 직경은 약 30, 40, 50, 60, 70, 75, 80, 85, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150 또는 160 nm이다.
일부 구현예에서, 본 개시내용의 siRNA 및 상기 아민-함유 형질감염 시약에 의해 형성된 약제학적 조성물에서 siRNA 대 총 지질, 예컨대, 유기 아민, 헬퍼 지질 및/또는 페길화된 지질의 중량 비(중량/중량 비)는 약 1:1 내지 약 1:50, 약 1:1 내지 약 1:30, 약 1:3 내지 약 1:20, 약 1:4 내지 약 1:18, 약 1:5 내지 약 1:17, 약 1:5 내지 약 1:15, 약 1:5 내지 약 1:12, 약 1:6 내지 약 1:12, 또는 약 1:6 내지 약 1:10의 범위이다. 예를 들면, 본 개시내용의 siRNA 대 총 지질의 중량 비는 약 1:5, 1:6, 1:7, 1:8, 1:9, 1:10, 1:11, 1:12, 1:13, 1:14, 1:15, 1:16, 1:17, 또는 1:18이다.
일부 구현예에서, 약제학적 조성물은 별개인 각각의 구성성분과 함께 시판될 수 있고, 액체 제형의 형태로 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 본 개시내용의 siRNA 및 상기 약제학적으로 허용되는 담체에 의해 형성된 약제학적 조성물은 기존의 siRNA를 본 개시내용의 siRNA로 대체하는 것을 제외하고는, 다양한 공지된 공정으로 제조할 수 있다. 일부 구체적인 구현예에서, 약제학적 조성물은 다음의 공정에 따라 제조할 수 있다:
유기 아민, 헬퍼 지질 및 페길화된 지질을 알코올 속에 상술한 바와 같은 몰 비로 현탁시키고 균질하게 혼합하여 액체 용액을 수득하고; 알코올은 수득되는 액체 용액이 2 내지 25 mg/mL(예컨대, 8 내지 18 mg/mL)의 통 질량 농도에서 존재하도록 하는 양으로 사용된다. 알코올은 약제학적으로 허용되는 알코올, 예를 들면, 약 실온에서 액체 형태인 알코올, 예를 들면, 에탄올, 프로필렌 글리콜, 벤질 알코올, 글리세롤, PEG 200, PEG 300, 및 PEG 400 중 하나 이상, 예를 들면, 에탄올이다.
본 개시내용의 siRNA는 완충된 염 용액 속에 용해되어 siRNA의 수용액을 형성한다. 완충된 염 용액은 0.05 내지 0.5 M, 예를 들면, 0.1 내지 0.2 M의 농도를 갖는다. 완충된 염 용액의 pH는 4.0 내지 5.5, 예를 들면, 5.0 내지 5.2로 조절된다. 완충된 염 용액은 siRNA가 0.6 mg/ml 미만, 예를 들면, 0.2 내지 0.4 mg/mL의 농도로 존재하도록 하는 양이다. 완충된 염은 가용성 아세테이트 및 가용성 시트레이트, 예를 들면, 아세트산나트륨 및/또는 아세트산칼륨으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상일 수 있다.
siRNA의 액체 용액 및 수용액은 혼합된다. 혼합에 의해 수득된 생성물은 40 내지 60℃의 농도에서 적어도 2분(예컨대, 5 내지 30분) 동안 항온처리하여 항온처리된 액체 제형을 생산한다. 액체 용액 대 siRNA의 수용액의 용적 비는 1:(2-5)(예를 들면, 1:4)이다.
항온처리된 리포좀 제형은 농축 또는 희석시키고, 정제하여 불순물을 제거하고 멸균여과하여 본 개시내용의 약제학적 조성물을 수득하고, 이는 다음의 물리화학적 매개변수를 갖는다: 6.5 내지 8의 pH, 80% 이상의 캡슐화 퍼센트(encapsulation percentage), 40 내지 200 nm의 입자 크기, 0.30 미만의 다분산성 지수(polydispersity index), 및 250 내지 400 mOsm/kg의 삼투압. 예를 들면, 물리화학적 매개변수는 다음과 같을 수 있다: 7.2 내지 7.6의 pH, 90% 이상의 캡슐화 퍼센트, 60 내지 100 nm의 입자 크기, 0.20 미만의 다분산성 지수, 및 300 내지 400 mOsm/kg의 삼투압.
여기서, 농축 또는 희석 단계는 불순물의 제거 전, 후 또는 동시에 수행할 수 있다. 불순물을 제거하는 방법은 임의의 다양한 기존의 방법, 예를 들면, 100 kDa이 중공 섬유(hollow fiber) 컬럼 및 접선 유동 시스템을 사용한 한외여과(ultrafiltration) 교환 용액으로서 pH 7.4에서의 PBS를 사용한 한외여과일 수 있다. 멸균 방법은 임의의 다양한 기존의 방법, 예를 들면, 0.22 μm 여과기 상에서의 여과 멸균일 수 있다.
siRNA 접합체
본 개시내용은 상기 siRNA 및 siRNA에 접합하여 연결된 접합 그룹을 포함하는 siRNA 접합체를 제공한다.
일반적으로, 접합 그룹은 적어도 하나의 약제학적으로 허용되는 표적화 그룹 및 임의의 링커를 포함한다. 더욱이, siRNA, 링커 및 표적화 그룹은 순차적으로 연결된다. 일부 구현예에서, 표적화 그룹의 수는 1 내지 6이다. 일부 구현예에서, 표적 그룹의 수는 2 내지 4이다. siRNA 분자는 비-공유결합적으로 또는 공유결합적으로 접합 그룹에 접합될 수 있는데, 예를 들면 siRNA 분자는 접합 그룹에 공유결합적으로 접합될 수 있다. siRNA와 접합 그룹 사이의 접합 부위는 siRNA의 센스 가닥의 3' 말단 또는 5' 말단, 또는 siRNA의 안티센스 가닥의 5' 말단일 수 있고, siRNA의 내부 서열 내에 존재할 수 있다. 일부 구현예에서, siRNA와 접합 그룹 사이의 접합 부위는 siRNA의 센스 가닥의 3' 말단에 존재한다.
일부 구현예에서, 접합 그룹은 뉴클레오타이드의 포스페이트 그룹, 2'-하이드록시 또는 염기에 연결될 수 있다. 접합 그룹은 뉴클레오타이드가 2'-5'-포스포디에스테르 결합을 통해 연결된 경우 3'-하이드록시 그룹에 연결될 수 있다. 접합 그룹이 siRNA의 말단에 연결된 경우, 접합 그룹은 전형적으로 뉴클레오타이드의 포스페이트 그룹에 연결되고; 접합 그룹이 siRNA의 내부 서열에 연결된 경우, 접합 그룹은 리보스 환 또는 염기에 전형적으로 연결된다. 다양한 연결 방식에 대해 다음에 대한 참고가 이루어질 수 있다: Muthiah Manoharan et.al. siRNA conjugates carrying sequentially assembled trivalent N-acetylgalatosamine linked through nucleosides elicit robust gene silencing in vivo in hepatocytes. ACS Chemical biology, 2015, 10(5): 1181-7.
일부 구현예에서, siRNA 및 접합 그룹은 산에 불안정하거나 환원성 화학 결합에 의해 연결될 수 있고 이러한 화학 결합은 세포 엔도소옴의 산성 환경 하에서 분해됨으로써 siRNA를 유리 상태로 만들 수 있다. 비-분해가능한 접합 방식을 위해, 접합 그룹을 siRNA의 센스 가닥에 연결시킴으로써, siRNA의 활성에서 접합 효과를 최소화할 수 있다.
일부 구현예에서, 약제학적으로 허용되는 표적화 그룹은 siRNA 투여 분야에서 통상의 리간드, 예를 들면, 이의 전문이 본원에 참고로 포함된 제WO2009082607A2호에 기술된 다양한 리간드일 수 있다.
일부 구현예에서, 약제학적으로 허용되는 표적화 그룹은 다음의 표적화 분자 또는 이의 유도체에 의해 형성된 리간드로부터 선택된 하나 이상일 수 있다: 친지성 분자, 예를 들면, 콜레스테롤, 담즙 산, 비타민(예를 들면, 비타민 E), 상이한 쇄 길이를 지닌 지질 분자; 중합체, 예를 들면, 폴리에틸렌 글리콜; 폴리펩타이드, 예를 들면, 세포-침투 펩타이드; 아프타머(aptamer); 항체; 양자 점(quantum dot); 사카라이드, 예를 들면, 락토드, 폴리락토스, 만노스, 갈락토스, N-아세틸갈락토스아민(GalNAc); 폴레이트; 또는 간 실질 세포 내에서 발현된 수용체 리간드, 예를 들면, 아시알로당단백질, 아시알로-당 잔기, 지단백질(예를 들면, 고 밀도 지단백질, 저 밀도 지단백질 등), 글루카곤, 신경전달물질(neurotransmitter)(예를 들면, 아드레날린), 성장 인자, 트랜스페린 등.
일부 구현예에서, 각각의 리간드는 세포 표면 수용체에 결합할 수 있는 리간드로부터 독립적으로 선택된다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 리간드는 간세포의 표면 수용체에 결합할 수 있는 리간드이다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 리간드는 포유동물 간세포의 표면 수용체에 결합할 수 있는 리간드이다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 리간드는 사람 간세포의 표면 수용체에 결합할 수 있는 리간드이다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 리간드는 간세포의 표면에서 아시알로당단백질 수용체(ASGPR)에 결합할 수 있는 리간드이다. 이러한 리간드의 유형은 당해 분야의 기술자에게 잘 공지되어 있고 전형적으로 쇼적 세포의 표면에서 특이적인 수용체에 결합하는 기능을 제공함으로써, 표적 세포내로 리간드에 연결된 siRNA의 전달을 매개한다.
일부 구현예에서, 약제학적으로 허용되는 표적화 그룹은 포유동물 간세포의 표면에서 아시알로당단백질 수용체(ASGPR)에 결합하는 임의의 리간드일 수 있다. 일부 구현예에서, 각각의 리간드는 독립적으로 아시알로당단백질, 예를 들면, 아시알로오로소무코이드(ASOR) 또는 아시알로페투인(ASF)이다. 일부 구현예에서, 리간드는 사카라이드 또는 이의 유도체이다.
일부 구현예에서, 적어도 하나의 리간드는 사카라이드이다. 일부 구현예에서, 각각의 리간드는 사카라이드이다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 리간드는 모노사카라이드, 폴리사카라이드, 변형된 모노사카라이드, 변형된 폴리사카라이드, 또는 사카라이드 유도체이다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 리간드는 모노사카라이드, 디사카라이드 또는 트리사카라이드이다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 리간드는 변형된 사카라이드이다. 일부 구현예에서, 각각의 리간드는 변형된 사카라이드이다. 일부 구현예에서, 각각의 리간드는 폴리사카라이드, 변형된 폴리사카라이드, 모노사카라이드, 변형된 모노사카라이드, 폴리사카라이드 유도체, 및 모노사카라이드 유도체로부터 독립적으로 선택된다. 일부 구현예에서, 각각의 리간드 또는 적어도 하나의 리간드는 글루코스 및 이의 유도체, 만노스 및 이의 유도체, 갈락토스 및 이의 유도체, 크실로스 및 이의 유도체, 리보스 및 이의 유도체, 푸코스 및 이의 유도체, 락토스 및 이의 유도체, 말토스 및 이의 유도체, 아라비노스 및 이의 유도체, 프럭토스 및 이의 유도체, 및 시알산으로 이루어진 그룹으로부터 독립적으로 선택될 수 있다.
일부 구현예에서, 각각의 리간드는 D-만노피라노스, L-만노피라노스, D-아라비노스, D-크실로푸라노스, L-크실로푸라노스, D-글루코스, L-글루코스, D-갈락토스, L-갈락토스, α-D-만노푸라노스, β-D-만노푸라노스, α-D-만노피라노스, β-D-만노피라노스, α-D-글루코피라노스, β-D-글루코피라노스, α-D-글루코푸라노스, β-D-글루코푸라노스, α-D-프럭토푸라노스, α-D-프럭토피라노스, α-D-갈락토피라노스, β-D-갈락토피라노스, α-D-갈락토푸라노스, β-D-갈락토푸라노스, 글루코스아민, 시알산, 갈락토스아민, N-아세틸갈락토스아민, N-트리플루오로아세틸갈락토스아민, N-프로피오닐갈락토스아민, N-n-부티릴갈락토스아민, N-이소부티릴갈락토스아민, 2-아미노-3-O-[(R)-1-카복시에틸]-2-데옥시-β-D-글루코피라노스, 2-데옥시-2-메틸아미노-L-글루코피라노스, 4,6-디데옥시-4-포름아미도-2,3-디-O-메틸-D-만노피라노스, 2-데옥시-2-설포아미노-D-글루코피라노스, N-글리콜릴-α-뉴라민산, 5-티오ㅛ-β-D-글루코피라노스, 메틸 2,3,4-트리스-O-아세틸-1-티오-6-O-트리틸-α-D-글루코피라노시드, 4-티오-β-D-갈락토피라노스, 에틸 3,4,6,7-테트라-O-아세틸-2-데옥시-1,5-디티오-α-D-글루코헵토피라노시드, 2,5-안하이드로-D-알로노니트릴, 리보스, D-리보스, D-4-티오리보스, L-리보스, L-4-티오리보스로부터 독립적으로 선택된다. 리간드의 다른 선택사항은 예를 들면, 이의 전문이 본원에 참고로 포함된 제CN105378082A호의 개시내용에서 찾을 수 있다.
일부 구현예에서, siRNA 접합체 내 약제학적으로 허용되는 표적화 그룹은 갈락토스 또는 N-아세틸갈락토스아민일 수 있고, 여기서 갈락토스 또는 N-아세틸갈락토스아민 분자는 1가-, 2가-, 3가-, 또는 4가일 수 있다. 본원에 기술된 용어 1가-, 2가-, 3가-, 또는 4가는 각각 siRNA 접합체내 siRNA 분자 대 갈락토스 또는 N-아세틸갈락토스아민 분자의 몰 비가 1:1, 1:2, 1:3 또는 1:4임을 의미하고, 여기서 siRNA 접합체는 siRNA 분자 및 표적화 그룹으로서 갈락토스 또는 N-아세틸갈락토스아민 분자를 함유하는 접합 그룹으로부터 형성된다. 일부 구현예에서, 약제학적으로 허용되는 표적화 그룹은 N-아세틸갈락토스아민이다. 일부 구현예에서, 본 개시내용의 이중 가닥 올리고뉴클레오타이드가 N-아세틸갈락토스아민을 포함하는 접합 그룹에 접합된 경우, N-아세틸갈락토스아민 분자는 3가 또는 4가이다. 일부 구현예에서, 본 개시내용의 siRNA가 N-아세틸갈락토스아민을 함유하는 접합 그룹에 접합된 경우, N-아세틸갈락토스아민 분자는 3가이다.
표적화 그룹은 적절한 링커를 통해 siRNA 분자에 연결될 수 있고, 적절한 링커는 표적화 그룹의 특수한 유형에 따라 당해 분야의 기술자에 의해 선택될 수 있다. 이러한 링커 및 표적화 그룹 및 siRNA와의 링커 방식의 유형은, 이의 전문이 본원에 참고로 포함된 제WO2015006740A2호의 개시내용에서 찾을 수 있다.
일부 구현예에서, 표적화 그룹이 N-아세틸갈락토스아민인 경우, 적합한 링커는 화학식 (301)로 나타낸 바와 같은 다음의 구조를 가질 수 있다:
Figure pct00012
여기서,
k는 1 내지 3의 정수이고;
LA는 화학식 (302)로 나타낸 바와 같은 구조를 가진 아미드 결합-포함 쇄 모이어티이고, 각각의 LA의 2개의 말단은 표적화 그룹 및 LC 모이어티에 에테르 결합을 통해 각각 연결되고:
Figure pct00013
LB는 화학식 (303)로 나타낸 바와 같은 구조를 갖는 N-아실피롤리딘-포함 쇄 모이어티이고, 여기서 쇄 모이어티는 하나의 말단에서 카보닐 그룹을 갖고 아미드 결합을 통해 LC 모이어티에 연결되고, 다른 말단에서 옥시 그룹을 갖고 포스포에스테르 결합을 통해 siRNA에 연결되고:
Figure pct00014
LC는 하이드록시메틸 아미노메탄, 디하이드록시메틸 아미노메탄 또는 트리하이드록시메틸 아미노메탄을 기반으로 한 2가 내지 3가 연결 그룹이고, LC는 에테르 결합을 통해 산소 원자를 경유하여 LA 모이어티에 연결되고, 아미드 결합을 통해 질소 원자를 경유하여 LB 모이어티에 연결된다.
일부 구현예에서, n=3이고 LC가 트리하이드록시메틸 아미노메탄을 기반으로 한 3가 연결 그룹인 경우, N-아세틸갈락토스아민 분자를 siRNA 분자와 링커로서 -(LA)3-트리하이드록시메틸 아미노메탄-LB-를 통해 연결시켜 형성된 siRNA 접합체는 화학식 (304)로 나타낸 바와 같은 구조를 가지고:
Figure pct00015
화학식 (304),
여기서 이중 나선 구조는 siRNA를 나타낸다.
유사하게, siRNA와 접합 그룹 사이이 접합 부위는 siRNA의 센스 가닥의 3'-말단, 또는 5'-말단에 존재하거나, siRNA의 내부 서열 내에 존재할 수 있다.
일부 구현예에서, 본 개시내용의 siRNA의 센스 가닥의 3'-말단은 3개의 N-아세틸갈락토스아민(GalNAc) 분자에 링커 -(LA)3-트리하이드록시메틸 아미노메탄-LB-를 경유하여 공유결합으로 접합시켜 siRNA 분자 대 GalNAc 분자의 몰 비가 1:3인 siRNA 접합체(이후 또한 (GalNAc)3-siRNA로 지칭됨)를 수득하고, 이러한 접합체는 화학식 (305)로 나타낸 바와 같은 구조를 갖는다:
Figure pct00016
화학식 (305),
여기서 이중 나선 구조는 siRNA를 나타내고; 링커는 siRNA의 센스 가닥의 3'-말단에 연결된다.
일부 구현예에서, 표적화 그룹이 N-아세틸갈락토스아민인 경우, 적합한 링커는 화학식 (306)으로 나타낸 바와 같은 구조를 가질 수 있다:
Figure pct00017
여기서,
l은 0 내지 3의 정수이고;
*는 표적화 그룹에 에테르 결합을 경유하여 연결된 부위를 나타내고;
#는 siRNA에 포스포에스테르 결합을 경유하여 연결된 부위를 나타낸다.
일부 구체적인 구현예에서, l=2인 경우, siRNA 접합체는 화학식 (307)로 나타낸 바와 같은 구조를 갖는다:
Figure pct00018
화학식 (307),
여기서, 이중 나선 구조는 siRNA를 나타내고; 링커는 siRNA의 센스 가닥의 3'-말단에 연결된다.
상기 접합체는 선행 기술에 상세히 기술된 방법에 따라 합성할 수 있다. 예를 들면, 제WO2015006740 A2호는 다양한 접합체의 제조 방법을 상세히 기술한다. 본 개시내용의 siRNA 접합체는 당해 분야의 기술자에게 잘 공지된 방법으로 수득할 수 있다. 예를 들면, 제WO2014025805A1호는 화학식 (305)로 나타낸 바와 같은 구조를 갖는 접합체의 제조 방법을 기술한다. 문헌: Rajeev et al., ChemBioChem 2015, 16, 903-908은 화학식 (307)로 나타낸 바와 같은 구조를 갖는 접합체의 제조 방법을 기술한다.
일부 구현예에서, siRNA 접합체는 화학식 (308)로 나타낸 바와 같은 구조를 갖고:
Figure pct00019
여기서,
n1은 1 내지 3의 정수이고, n3은 0 내지 4의 정수이고;
m1, m2, 또는 m3은 서로 독립적으로 2 내지 10의 정수이고;
R10, R11, R12, R13, R14, 또는 R15는 서로 독립적으로 H이거나, C1-C10 알킬, C1-C10 할로알킬, 및 C1-C10 알콕시로 이루어진 그룹으로부터 선택되고,
R3는 화학식 (A59)로 나타낸 바와 같은 구조를 갖는 그룹이고:
Figure pct00020
여기서 E1은 OH, SH 또는 BH2이고; Nu는 본 개시내용의 siRNA이고;
R2는 길이가 1 내지 20개 탄소 원자인 직쇄 알킬렌이고, 여기서 하나 이상의 탄소 원자는 C(O), NH, O, S, CH=N, S(O)2, C2-C10 알케닐렌, C2-C10 알키닐렌, C6-C10 아릴렌, C3-C18 헤테로사이클릴렌, 및 C5-C10 헤테로아릴렌로 이루어진 그룹으로부터 선택된 임의의 하나 이상의 그룹으로 임의 대체되고, 여기서 R2는 임의로 C1-C10 알킬, C6-C10 아릴, C5-C10 헤테로아릴, C1-C10 할로알킬, -OC1-C10 알킬, -OC1-C10 알킬페닐, -C1-C10 알킬-OH, -OC1-C10 할로알킬, -SC1-C10 알킬, -SC1-C10 알킬페닐, -C1-C10 알킬-SH, -SC1-C10 할로알킬, 할로, -OH, -SH, -NH2, -C1-C10 알킬-NH2, -N(C1-C10 알킬)(C1-C10 알킬), -NH(C1-C10 알킬), N(C1-C10 알킬)(C1-C10 알킬페닐), NH(C1-C10 알킬페닐), 시아노, 니트로, -CO2H, -C(O)OC1-C10 알킬, -CON(C1-C10 알킬)(C1-C10 알킬), -CONH(C1-C10 알킬), -CONH2, -NHC(O)(C1-C10 알킬), -NHC(O)(페닐), -N(C1-C10 알킬)C(O)(C1-C10 알킬), -N(C1-C10 알킬)C(O)(페닐), -C(O)C1-C10 알킬, -C(O)C1-C10 알킬페닐, -C(O)C1-C10 할로알킬, -OC(O)C1-C10 알킬, -SO2(C1-C10 알킬), -SO2(페닐), -SO2(C1-C10 할로알킬), -SO2NH2, -SO2NH(C1-C10 알킬), -SO2NH(페닐), -NHSO2(C1-C10 알킬), -NHSO2(페닐), 및 -NHSO2(C1-C10 할로알킬)로 이루어진 그룹으로부터 선택된 임의의 하나 이상의 치환체를 가지고;
각각의 L1은 독립적으로 길이가 1 내지 70개 탄소 원자인 직쇄 알킬렌이고, 여기서 하나 이상의 탄소 원자는 C(O), NH, O, S, CH=N, S(O)2, C2-C10 알케닐렌, C2-C10 알키닐렌, C6-C10 아릴렌, C3-C18 헤테로사이클릴렌, 및 C5-C10 헤테로아릴렌로 이루어진 그룹으로부터 선택된 임의의 하나 이상의 그룹으로 임의 대체되고, 여기서 L1은 임의로 C1-C10 알킬, C6-C10 아릴, C5-C10 헤테로아릴, C1-C10 할로알킬, -OC1-C10 알킬, -OC1-C10 알킬페닐, -C1-C10 알킬-OH, -OC1-C10 할로알킬, -SC1-C10 알킬, -SC1-C10 알킬페닐, -C1-C10 알킬-SH, -SC1-C10 할로알킬, 할로, -OH, -SH, -NH2, -C1-C10 알킬-NH2, -N(C1-C10 알킬)(C1-C10 알킬), -NH(C1-C10 알킬), N(C1-C10 알킬)(C1-C10 알킬페닐), NH(C1-C10 알킬페닐), 시아노, 니트로, -CO2H, -C(O)OC1-C10 알킬, -CON(C1-C10 알킬)(C1-C10 알킬), -CONH(C1-C10 알킬), -CONH2, -NHC(O)(C1-C10 알킬), -NHC(O)(페닐), -N(C1-C10 알킬)C(O)(C1-C10 알킬), -N(C1-C10 알킬)C(O)(페닐), -C(O)C1-C10 알킬, -C(O)C1-C10 알킬페닐, -C(O)C1-C10 할로알킬, -OC(O)C1-C10 알킬, -SO2(C1-C10 알킬), -SO2(페닐), -SO2(C1-C10 할로알킬), -SO2NH2, -SO2NH(C1-C10 알킬), -SO2NH(페닐), -NHSO2(C1-C10 알킬), -NHSO2(페닐), 및 -NHSO2(C1-C10 할로알킬)로 이루어진 그룹으로부터 선택된 임의의 하나 이상의 치환체를 갖는다.
일부 구현예에서, L1은 화학식(A1) 내지 (A26) 및 이의 임의의 조합의 그룹으로 이루어진 그룹으로부터 선택될 수 있고, 여기서 A1 내지 A26의 구조 및 정의는 다음과 같고:
Figure pct00021
여기서 j1은 1 내지 20의 정수이고; j2는 1 내지 20의 정수이고;
R'는 독립적으로 C1-C10 알킬이고;
Ra는 독립적으로 화학식 (A27) 내지 (A45) 또는 이의 임의의 조합의 그룹으로 이루어진 그룹으로부터 선택되고:
Figure pct00022
Figure pct00023
Rb는 독립적으로 C1-C10 알킬이고;
Figure pct00024
는 그룹이 공유결합으로 연결된 부위를 나타낸다.
당해 분야의 기술자는, L1이 편의상 직쇄 알킬로 정의되어 있지만, 이는 직쇄 그룹이 아닐 수 있거나 상이하게, 예를 들면, 상기 대체 및/또는 치환에 의해 생산된 아민 또는 알케닐로 명명될 수 있다. 본 개시내용의 목적을 위해, L1의 길이는 2개의 부착 점을 연결하는 쇄 내 원자의 수이다. 이러한 목적을 위해, 직쇄 알킬렌 속의 탄소 원자를 대체함으로써 수득된 환, 예를 들면, 헤테로사이클릴렌 또는 헤테로아릴렌은 하나의 원자로 계수된다.
M1은 표적화 그룹을 나타내고, 이의 정의 및 선택사항은 상기 표적화 그룹의 것과 동일하다. 일부 구현예에서, 각각의 M1은 독립적으로 포유동물 간세포의 표면에서 아시알로당단백질 수용체에 대한 친화성을 갖는 리간드로부터 선택된 것이다.
M1이 포유동물 간세포 상의 아시알로당단백질 수용체에 대한 친화성을 갖는 리간드인 경우, 일부 구현예에서, n1는 1 내지 3의 정수일 수 있고, n3은 0 내지 4의 정수이어서 접합체내 M1 표적화 그룹의 수가 적어도 2일 수 있도록 보증한다. 일부 구현예에서, n1+n3 ≥ 2이어서, M1 표적화 그룹의 수가 적어도 3임으로써, M1 표적화 그룹이 간세포의 표면 상의 아시알로당단백질 수용체에 보다 용이하게 결합ㅎ도록 하며, 이는 세포내로 접합체의 세포내이입(endocytosis)을 촉진한다. 실험은 M1 리간드의 수가 3을 초과하는 경우, 간세포의 표면 상의 M1 리간드와 아시알로당단백질 수용체 사이의 결합의 용이성이 유의적으로 증가하지 않는다. 따라서, 다양한 양태, 예를 들면, 합성 편의성, 구조/공정 비용 및 전달 효능에서, 일부 구현예에서, n1은 1 또는 2의 정수이고, n3은 0 또는 1의 정수이고, n1+n3은 2 내지 3이다.
일부 구현예에서, 각각의 m1, m2, 또는 m3이 서로 독립적으로 2 내지 10으로부터 선택된 정수인 경우, 많은 M1 리간드 중에서 입체 위치는 M1 리간드와 간세포의 표면 상에서의 아시알로당단백질 수용체 사이의 결합에 적합할 수 있다. 본 개시내용의 접합체가 보다 간단한 구조, 보다 용이한 합성 및/또는 감소된 비용을 갖도록 하기 위하여, 일부 구현예에서, 각각의 m1, m2 또는 m3는 서로 독립적으로 2 내지 5의 정수이고; 일부 구현예에서, m1 = m2 = m3이다.
당해 분야의 기술자는 R10, R11, R12, R13, R14, 또는 R15가 서로 독립적으로 H, C1-C10 알킬, C1-C10 할로알킬, 및 C1-C10 알콕시로부터 선택된 경우, 이는 본 개시내용의 siRNA 접합체의 특성을 변화시키지 않을 수 있고 본 개시내용의 목적을 모두 달성할 수 있음을 이해할 수 있다. 일부 구현예에서, R10, R11, R12, R13, R14, 또는 R15는 서로 독립적으로 H, 메틸 또는 에틸로부터 선택된다. 일부 구현예에서, R10, R11, R12, R13, R14, 및 R15는 H이다.
R3은 화학식 (A59)로 나타낸 바와 같은 구조를 갖는 그룹이고, 여기서 E1은 OH, SH 또는 BH2이고, 출발 물질의 용이한 이용가능성을 고려할 때, 일부 구현예에서, E1은 OH 또는 SH이다.
R2는 화학식 (A59)로 나타낸 바와 같은 그룹과 질소 골격 상의 N 원자 사이에 연결을 달성하기 위해 선택된다. 본 개시내용의 맥락에서, "질소 골격"은 N 원자가 R10, R11, R12, R13, R14, 및 R15가 부착된 탄소 원자에 상호인접하게 연결된 쇄 구조를 지칭한다. 따라서, R2는 화학식 (A59)로 나타낸 바와 같은 그룹을 질소 골격 상의 N 원자에 적합한 수단으로 연결시킬 수 있는 임의의 연결그룹이다. 일부 구현예에서, 화학식 (308)로 나타낸 바와 같은 siRNA 접합체가 고체상 합성 공정으로 제조되는 경우에, R2 그룹은 질소 골경 상의 N 원자에 연결하는 부위 및 R3내 P 원자에 연결하는 부위 둘 다를 가질 필요가 있다. 일부 구현예에서, R2 내에서, 질소 골격 상의 N 원자에 연결하는 부위는 N 원자와 함께 아미드 결합을 형성하고, R3내 P 원자에 연결하는 부위는 P 원자와 함게 포스포에스테르 결합을 형성한다. 일부 구현예에서, R2는 B5, B6, B5', 또는 B6'일 수 있고:
Figure pct00025
여기서
Figure pct00026
는 그룹이 공유 결합을 경유하여 연결되는 부위를 나타내고;
q2는 1 내지 10의 정수이고; 일부 구현예에서, q2는 1 내지 5의 정수이다.
L1은 M1 표적화 그룹을 질소 골격 상의 N 원자에 연결시켜 화학식 (308)로 나탄내 바와 같은 siRNA 접합체에 대해 간 표적화 기능을 제공하는데 사용된다. 일부 구현예에서, L1은 화학식(A1) 내지 (A26) 중 하나 이상의 연결 조합으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, L1은 화학식(A1), (A4), (A5), (A6), (A8), (A10), (A11), 및 (A13) 중 하나 이상의 연결 조합으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, L1은 화학식(A1), (A4), (A8), (A10), 및 (A11) 중 적어도 2개의 연결 조합으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, L1은 화학식(A1), (A8) 및 (A10) 중 적어도 2개의 연결 조합으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, L1은 3 내지 25, 3 내지 20, 4 내지 15 또는 5 내지 12개의 원자를 가질 수 있다. 일부 구현예에서, L1은 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 또는 60개 원자의 길이를 갖는다.
일부 구현예에서, j1은 2 내지 10의 정수이고, 일부 구현예에서, j1은 3 내지 5의 정수이다. 일부 구현예에서, j2는 2 내지 10의 정수이고, 일부 구현예에서, j2는 3 내지 5의 정수이다. R'는 C1-C4 알킬이고, 일부 구현예에서, R'는 메틸, 에틸 및 이소프로필 중 하나이다. Ra는 화학식(A27), (A28), (A29), (A30), 및 (A31) 중 하나이고, 일부 구현예에서, Ra는 화학식 (A27) 또는 (A28)이다. Rb는 C1-C5 알킬이고, 일부 구현예에서, 메틸, 에틸, 이소프로필, 및 부틸 중 하나이다. 일부 구현예에서, 화학식(A1) 내지 (A26) 내 j1, j2, R', Ra, 및 Rb는 각각 M1 표적화 그룹과 질소 골격 상의 N 원자 사이에 연결을 달성하고 M1 표적화 그룹 중 입체적 위치가 M1 표적화 그룹과 간세포의 표면 상의 아시알로당단백질(asialoglycoprotein) 수용체 사이의 결합에 보다 적합하도록 하기 위해 선택된다.
일부 구현예에서, siRNA 접합체는 화학식 (403), (404), (405), (406), (407), (408), (409), (410), (411), (412), (413), (414), (415), (416), (417), (418), (419), (420), (421) 또는 (422)로 나타낸 바와 같은 구조를 갖는다:
Figure pct00027
Figure pct00028
Figure pct00029
Figure pct00030
Figure pct00031
Figure pct00032
Figure pct00033
일부 구현예에서, 화학식 (A59) 내 P 원자는 siRNA 서열 내 임의의 가능한 위치에 연결될 수 있다. 예를 들면, 화학식 (A59) 내 P 원자는 siRNA의 센스 또는 안티센스 가닥내 임의의 뉴클레오타이드에 연결될 수 있다. 일부 구현예에서, 화학식 (A59) 내 P 원자는 siRNA의 센스 가닥 내 임의의 뉴클레오타이드에 연결된다. 일부 구현예에서, 화학식 (A59) 내 P 원자는 siRNA의 센스 또는 안티센스 가닥의 말단 영역에 연결될 수 있다. 일부 구현예에서, 화학식 (A59)내 P 원자는 siRNA의 센스 가닥의 말단 영역에 연결될 수 있다. 상기 말단 영역은 센스 또는 안티센스 가닥의 하나의 말단으로부터 계수하여 제1의 4개 뉴클레오타이드를 지칭한다. 일부 구현예에서, 화학식 (A59)내 P 원자는 siRNA의 안티센스 가닥의 말단 어느 하나에 연결된다. 일부 구현예에서, 화학식 (A59) 내 P 원자는 siRNA의 센스 가닥의 3' 말단에 연결된다. 화학식 (A59) 내 P 원자가 siRNA의 센스 가닥의 상기 위치에 연결된 경우, 세포 내로 도입된 후, 화학식 (308)로 나타낸 바와 같은 siRNA 접합체는 풀리는(unwinding) 동안에 별개의 siRNA의 안티센스 가닥을 방출함으로써 단백질로의 FXI mRNA의 해독을 차단하고 FXI 유전자의 발현을 억제한다.
일부 구현예에서, 화학식 (A59) 내 P 원자는 siRNA내 뉴클레오타이드의 임의의 가능한 위치, 예를 들면, 5' 위치, 2' 위치, 3' 위치, 또는 뉴클레오타이드의 염기에 연결될 수 있다. 일부 구현예에서, 화학식 (A59) 내 P 원자는 포스포디에스테르 결합을 형성함으로써 siRNA 내 뉴클레오타이드의 2', 3', 또는 5' 위치에 연결될 수 있다. 일부 구현예에서, 화학식 (A59) 내 P 원자는 siRNA의 센스 가닥의 3' 말단에서 뉴클레오타이드의 3'-하이드록시의 탈수에 의해 형성되거나(이러한 경우에, 화학식 (A59) 내 P 원자는 siRNA 내에 함유된 포스페이트 그룹의 P 원자로 고려될 수 있다), 화학식 (A59) 내 P 원자는 siRNA의 센스 가닥의 뉴클레오타이드의 2'-하이드록시 내 수소 원자를 치환시킴으로써 뉴클레오타이드에 연결되거나, 화학식 (A59) 내 P 원자는 siRNA의 센스 가닥의 5' 말단에서 뉴클레오타이드의 5'-하이드록시 내 수소 원자를 치환함으로써 뉴클레오타이드에 연결된다.
본 개시내용의 발명자는 놀랍게도 본 개시내용의 siRNA 접합체가 유의적으로 증진된 혈장 내 안정성 및 낮은 오프-표적 효과(off-target effect)를 나타내고, FXI mRNA에 대해 비교적 높은 사일런싱 활성을 나타낸다. 일부 구현예에서, 본 개시내용의 siRNA는 표 1a 내지 표 1i에 나타낸 siRNA 중 임의의 하나일 수 있다. 이러한 siRNA를 포함하는 접합체는 FXI mRNA에 대해 보다 높은 사일런싱 활성을 나타낸다.
[표 1a]
Figure pct00034
Figure pct00035
[표 1b]
Figure pct00036
Figure pct00037
[표 1c]
Figure pct00038
Figure pct00039
[표 1d]
Figure pct00040
Figure pct00041
Figure pct00042
[표 1e]
Figure pct00043
Figure pct00044
Figure pct00045
[표 1f]
Figure pct00046
Figure pct00047
Figure pct00048
[표 1g]
Figure pct00049
Figure pct00050
Figure pct00051
[표 1h]
Figure pct00052
Figure pct00053
[표 1i]
Figure pct00054
Figure pct00055
여기서, C, G, U, 및 A는 뉴클레오타이드의 염기 조합을 나타내고; m은 문자 m의 좌측면에 인접한 뉴클레오타이드가 메톡시 변형된 뉴클레오타이드임을 나타내고; f는 문자 f의 좌측면에 인접한 뉴클레오타이드가 플루오로 변형된 뉴클레오타이드임을 나타내고; s는 문자 s의 양측면에 인접한 2개의 뉴클레오타이드가 티오포스페이트 연결에 의해 연결됨을 나타내고; P1은 P1의 우측면에 인접한 뉴클레오타이드가 5'-포스페이트 뉴클레오타이드 또는 5'-포스페이트 유사체 변형된 뉴클레오타이드임을 나타내고; 일부 구현예에서, P1은 특이적인 변형된 뉴클레오타이드 VP, Ps 또는 P를 나타내고, 여기서 VP는 VP의 우측면에 인접한 뉴클레오타이드가 비닐 포스페이트 변형된 뉴클레오타이드임을 나타내고; Ps는 Ps의 우측면에 인접한 뉴클레오타이드가 티오포스페이트 변형된 뉴클레오타이드임을 나타내고; P는 문자 P의 우측면에 인접한 뉴클레오타이드가 5'-포스페이트 뉴클레오타이드임을 나타낸다.
본 개시내용의 siRNA 또는 siRNA 접합체에서 인접한 뉴클레오타이드의 각각의 쌍은 포스포디에스테르 결합 또는 포스포로티오에이트 디에스테르 결합을 경유하여 연결된다. 포스포디에스테르 결합 또는 포스포로티오에이트 디에스테르 결합 내 비-브릿지된 산소 또는 황은 음으로 하전되며, 하이드록시 또는 설프하이드릴의 형태로 존재할 수 있다. 더욱이, 하이드록시 또는 설프하이드릴 내 수소 이온은 양이온과 부분적으로 또는 완전히 치환될 수 있다. 양이온은 임의의 양이온, 예를 들면, 금속 양이온, 암모늄 양이온 NH4 + 또는 유기 암모늄 양이온일 수 있다. 용해도를 증가시키기 위하여, 일 구현예에서, 양이온은 알칼리 금속 양이온, 3급 아민과 4급 암모늄 양이온에 의해 형성된 암모늄 양이온으로부터 선택된 하나 이상이다. 알칼리 금속 이온은 K+ 및/또는 Na+일 수 있고 3급 아민에 의해 형성된 양이온은 트리에틸아민에 의해 형성된 암모늄 양이온 및/또는 N,N-디이소프로필에틸아민에 의해 형성된 암모늄 양이온일 수 있다. 따라서, 본 개시내용의 siRNA 및 siRNA 접합체는 적어도 부분적으로 염의 형태로 존재할 수 있다. 일 구현예에서, 포스포디에스테르 결합 또는 포스포로티오에이트 디에스테르 결합내 비-브릿징 산소 또는 황 원자는 적어도 부분적으로 나트륨 이온에 결합하며, 따라서, 본 개시내용의 siRNA 및 siRNA 접합체는 나트륨 염의 형태로 존재하거나 부분적으로 존재한다.
당해 분야의 기술자는 변형된 뉴클레오타이드 그룹을 상응하는 변형을 지닌 뉴클레오시드 단량체에 의해 본 개시내용의 siRNA 내로 도입할 수 있음을 명확하게 알고 있다. 상응하는 변형을 가진 뉴클레오시드 단량체를 제조하는 방법 및 변형된 뉴클레오타이드를 siRNA 내로 도입하는 방법은 당해 분야의 기술자에게 또한 잘 공지되어 있다. 모든 변형된 뉴클레오시드 단량체는 상업적으로 이용가능하거나 공지된 방법으로 제조할 수 있다.
화학식 (308)로 나타낸 바와 같은 siRNA 접합체의 제조
화학식 (308)로 나타낸 바와 같은 siRNA 접합체는 임의의 적절한 합성 경로로 제조할 수 있다.
일부 구현예에서, 화학식 (308)로 나타낸 바와 같은 siRNA 접합체는 siRNA의 센스 가닥 및 안티센스 가닥 내 뉴클레오타이드의 유형 및 서열에 따라 3' 내지 5' 방향에서 뉴클레오시드 단량체를 포스포르아미디트 고체 상 합성을 위한 조건 하에서 순차적으로 연결시키는 단계(여기서, 각각의 뉴클레오시드 단량체를 연결시키는 단계는 탈보호, 커플링, 캡핑, 및 산화 또는 황화의 4-단계 반응을 포함한다); siRNA의 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 단리하는 단계; 및 어닐링하는 단계(여기서 siRNA는 상기 본 개시내용의 siRNA이다)를 포함하는, 다음의 방법에 의해 제조할 수 있다.
더욱이, 이러한 방법은 화학식 (321)로 나타낸 바와 같은 siRNA를 고체 상 지지체에 부착된 뉴클레오시드 단량체 또는 뉴클레오타이드 서열과 커플링 반응 조건 하에서 및 커플링제의 존재하에 부착시킴으로써 화학식 (321)에 나타낸 바와 같은 화합물을 뉴클레오타이드 서열에 커플링 반응을 경유하여 연결시키는 단계를 추가로 포함한다. 이후에, 화학식 (321)로 나타낸 바와 같은 화합물은 또한 접합 분자로 지칭된다.
Figure pct00056
(화학식 321)
여기서,
R4는 화학식 (308)로 나타낸 바와 같은 화합물 내에서 Nu로 나타낸 바와 같은 siRNA에 결합할 수 있는 그룹이다. 일부 구현예에서, R4는 Nu로 나타낸 바와 같은 siRNA에 공유 결합을 경유하여 결합할 수 있는 그룹이다. 일부 구현예에서, R4는 Nu로 나타낸 바와 같은 siRNA에 포스포디에스테르 결합을 경유하여 반응에 의해 접합시킬 수 있는 임의의 작용 그룹을 포함하는 그룹이고;
각각의 S1은 독립적으로 M1 내 모든 활성 하이드록실 그룹을 그룹 YCOO-로 치환시켜 형성시킨 그룹이고, 여기서 각각의 Y는 독립적으로 메틸, 트리플루오로메틸, 디플루오로메틸, 모노플루오로메틸, 트리클로로메틸, 디클로로메틸, 모노클로로메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필, 페닐, 할로페닐, 및 알킬페닐로 이루어진 그룹으로부터 선택된 것이고; 일부 구현예에서, Y는 메틸이다.
n1, n3, m1, m2, m3, R10, R11, R12, R13, R14, R15, L1, 및 M1의 정의 및 선택사항은 각각 상술한 바와 같다.
R4는 질소 골격에 N 원자에 대한 연결을 달성하고 화학식 (308)로 나타낸 바와 같은 siRNA 접합체를 합성하기에 적합한 반응 부위를 제공하기 위해 선택된다. 일부 구현예에서, R4는 R2 연결 그룹 또는 보호된 R2 연결 그룹, 및 siRNA와 반응하여 화학식 (A59)로 나타낸 바와 같은 구조를 형성할 수 있는 임의의 작용 그룹을 포함하는 그룹이다.
일부 구현예에서, R4는 Nu로 나타낸 바와 같은 siRNA 상의 그룹 또는 뉴클레오시드 단량체와 반응하여 포스파이트 에스테르를 형성하는 제1의 작용 그룹, 및 하이드록시 그룹 또는 아미노 그룹과 반응하여 이와 공유 결합을 형성하거나, 공유 결합에 의해 연결된 고체 지지체를 포함하는 제2의 작용 그룹을 포함한다. 일부 구현예에서, 제1의 작용 그룹은 포스포르아미디트, 하이드록시 또는 보호된 하이드록시이다. 일부 구현예에서, 제2의 작용 그룹은 포스포르아미디트, 카복실 또는 카복실레이트 염이다. 일부 구현예에서, 제2의 작용 그룹은 하이드록시 그룹 또는 아미노 그룹에 의해 형성된 공유 결합을 경유하여 분자의 나머지에 연결된 고체 상 지지체이다. 일부 구현예에서, 고체 상 지지체는 포스포디에스테르 결합, 카복실 에스테르 결합 또는 아미드 결합을 경유하여 연결된다. 일부 구현예에서, 고체 상 지지체는 수지이다.
일부 구현예에서, 제1의 작용 그룹은 하이드록시, -ORk 또는 화학식 (C3)으로 나타낸 바와 같은 그룹을 포함하고; 제2의 작용 그룹은 화학식 (C1), (C2), (C3), (C1'), 또는 (C3')로 나타낸 바와 같은 그룹을 포함한다:
Figure pct00057
여기서 q1은 1 내지 4의 정수이고, X는 O 또는 NH이고, M+는 양이온이고, Rk는 하이드록시 보호 그룹이고, SPS는 고체 상 지지체를 나타내고
Figure pct00058
는 그룹이 공유결합으로 부착된 부위를 나타낸다.
일부 구현예에서, 제1의 작용 그룹은 포스포르아미디트 그룹, 예를 들면, 화학식 (C3)로 나타낸 바와 같은 그룹을 포함한다. 포스포르아미디트 그룹은 커플링 반응에 의해 뉴클레오타이드의 임의의 위치(예를 들면, 2'-하이드록시 또는 3'-하이드록시)에서 하이드록시와 포스파이트 에스테르를 형성할 수 있고, 포스파이트 에스테르른 산화 또는 황화를 통해 화학식 (A59)로 나타낸 바와 같은 포스포디에스테르 결합 또는 포스포로티오에이트 에스테르 결합을 형성함으로써, 접합 분자를 siRNA에 접합시킬 수 있다. 여기서, 제2의 작용 그룹이 존재하지 않는 경우에도, 화학식 (321)로 나타낸 바와 같은 화합물은 여전히 뉴클레오타이드에 접합할 수 있지만, 화학식 (308)로 나타낸 바와 같은 siRNA 접합체를 수득하는데 영향을 미치지 않는다. 이러한 상황하에서, 방법, 예를 들면, 포스포르아미디트 고체 상 합성에 의해 siRNA의 센스 또는 안티센스 가닥을 수득한 후, 화학식 (321)로 나타낸 바와 같은 화합물을 뉴클레오타이드 서열의 말단에서 뉴클레오타이드 상의 하이드록시와 방응시키고, 포스포로디에스테르 결합 연결 또는 포스포로티오에이트 결합 연결을 후속적인 산화 또는 황화 공정에서 형성시킴으로써 화학식 (321)로 나타낸 바와 같은 화합물을 siRNA에 접합시킨다.
일부 구현예에서, 제1의 작용 그룹은 보호된 하이드록시를 포함한다. 일부 구현예에서, 제2의 작용 그룹은 고체 상 지지체와 반응하여 고체 상 지지체를 포함하는 접합 분자를 제공할 수 있는 그룹을 포함한다. 일부 구현예에서, 제2의 작용 그룹은 카복실, 카복실레이트 염 또는 포스포르아미디트, 예를 들면, 화학식 (C1), (C2) 또는 (C3)으로 나타낸 바와 같은 작용 그룹을 포함한다. 제2의 작용 그룹이 카복실 또는 카복실레이트 염을 포함하는 경우, 화학식 (321)의 화합물은 고체 상 지지체(예를 들면, 수지) 상에서 하이드록시 또는 아미노 그룹과 에스테르화 또는 아미드화 반응을 경유하여 반응함으로써, 카복실레이트 에스테르 결합을 경유하여 연결된 고체 상 지지체를 포함하는 접합 분자를 형성한다. 제2의 작용 그룹이 포스포르아미디트 작용 그룹을 포함하는 경우, 화학식 (321)의 화합물은 공통적인 고체 상 지지체(예를 들면, 수지) 상의 하이드록시 그룹과 커플링하고, 산화에 의해 포스포디에스테르 결합을 경유하여 고체 상 지지체를 포함하는 접합 분자를 형성할 수 있다. 다음에, 고체 상 지지체에 연결된 상기 생성물로부터 출발하여, 뉴클레오시드 단량체를 포스포르아미디트 고체 상 합성 방법을 통해 순차적으로 연결시킴으로써, 접합 그룹에 연결된 siRNA의 센스 가닥 또는 안티센스 가닥을 수득한다. 포스포르아미디트 고체 상 합성의 공정에서, 제1의 작용 그룹은 탈보호된 다음 커플링 반응 조건 하에서 뉴클레오시드 단량체 상의 포스포르아미디트 그룹과 커플링된다.
일부 구현예에서, 제1의 작용 그룹은 하이드록시 또는 보호된 하이드록시 그룹을 포함하고; 제2의 작용 그룹은 화학식 (C1') 또는 (C3')으로 나타낸 바와 같은 바와 같이, 카복실레이트 에스테르 결합, 아미드 결합, 또는 포스포디에스테르 결합을 경유하여 연결된 고체 상 지지체를 포함한다. 이러한 경우에, 고체 상 지지체 대신에 화학식 (321)의 화합물로부터 출발하여, 뉴클레오시드 단량체를 포스포르아미디트 고체 상 합성 방법을 통해 순차적으로 연결함으로써, 접합 그룹에 연결된 siRNA의 센스 가닥 또는 안티센스 가닥을 수득한다.
일부 구현예에서, 카복실레이트는 -COO-M+로 나타낼 수 있고, 여기서 M+는 양이온, 예를 들면, 금속 양이온, 암모늄 양이온 NH4 + 및 유기 암모늄 양이온으로부터 선택된 것이다. 일 구현예에서, 금속 양이온은 알칼리 금속 양이온, 예를 들면, K+ 또는 Na+일 수 있다. 용해도를 증가시키고 반응을 촉진시키기 위해, 일부 구현예에서, 유기 암모늄 양이온은 3급 아민 또는 4급 암모늄 양이온에 의해 형성된 암모늄 양이온, 예를 들면, 트리에틸아민에 의해 형성된 암모늄 양이온 또는 N,N-디이소프로필에틸아민에 의해 형성된 암모늄 양이온이다. 일부 구현예에서, 카복실레이트는 트리에틸아민 카복실레이트 또는 N,N-디이소프로필에틸아민 카복실레이트이다.
일부 구현예에서, R4는 화학식 (B9), (B10), (B9'), (B10'), (B11), (B12), (B11'), 또는 B(12')로 나타낸 바와 같은 구조를 포함하고:
Figure pct00059
Figure pct00060
여기서 q1은 1 내지 4의 정수이고, q2는 1 내지 10의 정수이고, X는 O 또는 NH이고, M+는 양이온이고, Rk는 하이드록시 보호 그룹이고, SPS는 고체 상 지지체를 나타내고
Figure pct00061
는 그룹이 공유결합된 부위를 나타낸다. 일부 구현예에서, q1은 1 또는 2이다. 일부 구현예에서, q2는 1 내지 5의 정수이다. 일부 구현예에서, R4는 화학식 (B9) 또는 (B10)로 나타낸 바와 같은 구조를 포함한다. 일부 구현예에서, R4는 화학식 (B11) 또는 (B12)로 나타낸 바와 같은 구조를 포함한다.
일부 구현예에서, Rk는 Tr(트리틸), MMTr(4-메톡시트리틸), DMTr(4,4'-디메톡시트리틸), 및 TMTr(4,4',4''-트리메톡시트리틸) 중 하나 이상이다. 일부 구현예에서, Rk는 DMTr, 즉, 4,4'-디메톡시트리틸일 수 있다.
L1의 정의는 상술한 바와 같다.
일부 구현예에서, L1은 M1 표적화 그룹을 질소 골격의 N 원자에 연결함으로써, 화학식 (308)로 나타낸 바와 같은 siRNA 접합체에 대한 간 표적화 기능을 제공하는데 사용된다. 일부 구현예에서, L1은 화학식(A1) 내지 (A26) 중 어느 하나, 및 이의 임의의 조합을 포함한다.
상기 설명에 따라서, 당해 분야의 기술자는 당해 분야에 잘 공지된 포스포르아미디트 고체 상 합성 방법과 비교하여, 접합 분자가 뉴클레오타이드 서열의 임의의 가능한 위치에 연결되어 있는 화학식 (308)로 나타낸 바와 같은 siRNA 접합체가 상기 제1의 작용 그룹 및 임의로 제2의 작용 그룹을 사용함으로써 수득될 수 있음을 용이하게 이해할 수 있다. 예를 들면, 접합 분자는 뉴클레오타이드 서열의 말단 영역, 또는 뉴클레오타이드 서열의 말단 영역에 연결된다. 상응하게, 달리 명시하지 않는 한, 접합체 및/또는 접합 분자의 제조에 관한 다음의 설명에서, 반응, 예를 들면, "탈보호", "커플링", "캡핑", "산화", "황화"를 지칭하는 경우, 당해 분야에서 잘 공지된 포스포르아미디트 고체 상 합성 방법에 포함된 반응 조건 및 시약은 또한 이러한 방법에 적용될 수 있음이 이해될 것이다. 예시적인 반응 조건 및 시약은 이후 상세히 설명될 것이다.
일부 구현예에서, 각각의 S1은 독립적으로 M1이다. 일부 구현예에서, 각각의 S1은 독립적으로 M1 내 적어도 하나의 활성 하이드록실 그룹을 하이드록실 보호 그룹으로 보호합으로써 형성된 그룹이다. 일부 구현예에서, 각각의 S1은 독립적으로 M1 내 모든 존재하는 활성 하이드록실 그룹을 하이드록실 보호 그룹으로 보호함으로써 형성된 그룹이다. 일부 구현예에서, 기술자에게 공지된 임의의 하이드록실 보호 그룹을 사용하여 M1 내 활성 하이드록실 그룹을 보호할 수 있다. 일부 구현예에서, 보호된 하이드록시는 화학식 YCOO-로 나타내고, 여기서 각각의 Y는 독립적으로 C1-C10 알킬 및 C6-C10 아릴로 이루어진 그룹으로부터 선택되고, 이는 할로 및 C1-C6 그룹으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 치환체로 임의 치환된다. 일부 구현예에서, 각각의 Y는 독립적으로 메틸, 트리플루오로메틸, 디플루오로메틸, 모노플루오로메틸, 트리클로로메틸, 디클로로메틸, 모노클로로메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필, 페닐, 할로페닐, 및 C1-C6 알킬페닐로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 각각의 S1은 화학식(A46) 내지 (A54)로 이루어진 그룹으로부터 독립적으로 선택된다:
Figure pct00062
일부 구현예에서, S1는 A49 또는 A50이다.
일부 구현예에서, 각각의 Y는 독립적으로 메틸, 트리플루오로메틸, 디플루오로메틸, 모노플루오로메틸, 트리클로로메틸, 디클로로메틸, 모노클로로메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필, 페닐, 할로페닐, 및 알킬페닐로부터의 것이다. 일부 구현예에서, Y는 메틸이다.
상술한 바와 같이, 화학식 (308)로 나타낸 바와 같은 siRNA 접합체를 제조하는 방법은 다음 단계를 추가로 포함한다: siRNA의 다른 가닥을 합성하는 단계(예를 들면, 접합 그룹에 연결된 siRNA의 센스 가닥이 상기 단계에서 합성된 경우, 이러한 방법은 고체 상 합성 방법에 따라 siRNA의 안티센스 가닥을 합성하는 단계, 또는 이의 역을 추가로 포함한다), 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 단리하는 단계, 및 어닐링하는 단계. 특히, 단리하는 단계에서, 뉴클레오타이드 서열 및/또는 접합 분자에 연결된 고체 상 지지체를 절단(cleaving)하고, 필수 보호 그룹을 제거(이러한 경우에, 화학식 (321)의 화합물 내 각각의 S1 그룹을 상응하는 M1 표적화 그룹으로 전환시킨다)하여 접합 그룹에 연결된 siRNA의 센스 가닥(또는 안티센스 가닥) 및 상응하는 안티센스 가닥(또는 센스 가닥)을 수득한다. 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 어닐링하여 이중 가닥 RNA를 형성시킴으로써 화학식 (308)에 나타낸 바와 같은 siRNA 접합체를 수득한다.
일부 구현예에서, 화학식 (308)로 나타낸 바와 같은 siRNA 접합체를 제조하는 방법은 다음 단계를 포함한다: 화학식 (321)로 나타낸 바와 같은 화합물을 제1의 뉴클레오시드 단량체와 센스 가닥 또는 안티센스 가닥의 3' 말단에서 커플링제의 존재하에 커플링 반응 조건 하에서 접촉시킴으로써 화학식 (321)로 나타낸 바와 같은 화합물을 서열 내 제1의 뉴클레오타이드에 연결시키는 단계; 뉴클레오시드 단량체를 3' 내지 5' 방향으로 순차적으로 연결시켜 이러한 유형에 따른 siRNA의 센스 또는 안티센스 가닥 및 목적한 센스 또는 안티센스 가닥내 뉴클레오타이드의 서열을 포스포르아미디티 고체 상 합성을 위한 조건 하에서 합성하는 단계(여기서 화학식 (321)의 화합물은 R4가 제1의 작용 그룹 및 제2의 작용 그룹을 포함하는 화합물이고, 여기서 제1의 작용 그룹은 보호된 하이드록실을 포함하고 제2의 작용 그룹은 화학식 (C1') 또는 (C3')으로 나타낸 바와 같은 구조를 갖고, (321)의 화합물은 탈보호된 후 제1의 뉴클레오시드 단량체에 연결되고; 각각의 뉴클레오시드 단량체의 연결은 탈보호, 커플링, 캡핑, 및 산화 또는 황화의 4개 단계 반응을 포함한다); 따라서 접합 그룹에 연결된 핵산의 센스 또는 안티센스 가닥을 수득하는 단계; 뉴클레오시드 단량체를 3' 내지 5' 방향으로 순차적으로 연결시켜 유형에 따른 핵산의 안티센스 또는 센스 가닥 및 센스 또는 안티센스 가닥내 뉴클레오타이드의 서열을 포스포르아미디트 고체 상 합성을 위한 조건 하에서 합성하는 단계(여기서 각각의 뉴클레오시드 단량체의 연결은 탈보호, 커플링, 캡핑, 및 산화 또는 황화의 4-단계를 포함한다); 보호 그룹을 제거하고 고체 상 지지체를 절단하는 단계; 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 단리 및 정제하는 단계; 및 어닐링 단계.
일부 구현예에서, 화학식 (308)로 나타낸 바와 같은 siRNA 접합체를 제조하는 방법은 다음 단계를 포함한다: 이중 가닥 siRNA의 센스 또는 안티센스 가닥의 유형 및 서열에 따라서, 뉴클레오시드 단량체를 3' 내지 5' 방향으로 순차적으로 연결하여 안티센스 및 센스 가닥을 합성(여기서 각각의 뉴클레오시드 단량체의 연결은 탈보호, 커플링, 캡핑, 및 산화 또는 황화의 4-단계 반응을 포함한다)함으로써 고체 상 지지체에 연결된 센스 가닥 및 고체 상 지지체에 연결된 안티센스 가닥을 수득하는 단계; 화학식 (321)로 나타낸 바와 같은 화합물을 고체 상 지지체에 연결된 센스 가닥 또는 고체 상 지지체에 연결된 안티센스 가닥과 커플링제의 존재하에 커플링 반응하에 접촉시킴으로써 화학식 (321)로 나타낸 바와 같은 화합물을 센스 가닥 또는 안티센스 가닥에 연결시키는 단계(여기서 화학식 (321)로 나타낸 바와 같은 화합물은 R4가 포스포르아미디트 그룹인 제1의 작용 그룹을 포함하는 화합물이다); 보호 그룹을 제거하고 고체 상 지지체를 절단하는 단계; siRNA의 센스 가닥 또는 안티센스 가닥을 단리 및 정제하는 단계; 및 어닐링하는 단계(여기서, siRNA의 센스 또는 안티센스 가닥은 접합 그룹에 연결된다).
일부 구현예에서, 화학식 (A59) 내 P 원자는 siRNA의 센스 가닥의 3' 말단에 연결되고, 화학식 (308)로 나타낸 바와 같은 siRNA 접합체를 제조하는 방법은:
(1) 화학식 (321)의 화합물 내 하이드록실 보호 그룹 Pk를 제거하는 단계로서, 여기서 화학식 (321)의 화합물은 R4가 보호된 하이드록실 ORk를 포함하는 제1의 작용 그룹, 및 화학식 (C1') 또는 (C3')로 나타낸 바와 같은 구조를 갖는 제2의 작용 그룹을 포함하는 화합물인 단계; 탈보호된 생성물을 뉴클레오시드 단량체와 접촉시켜 커플링제의 존재하에서 커플링 반응 조건 하에 접합 분자를 경유하여 고체 상 지지체에 연결된 뉴클레오시드 단량체를 수득하는 단계;
(2) 접합 분자를 경유하여 고체 상 지지체에 연결된 뉴클레오시드 단량체로부터 출발하여, siRNA의 센스 가닥을 포스포르아미디트 고체 상 합성 방법에 의해 3' 내지 5' 방향으로 합성하는 단계;
(3) siRNA의 안티센스 가닥을 포스포르아미디트 고체 상 합성 방법에 의해 합성하는 단계; 및
(4) siRNA의 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 단리하고 이를 어닐링하여 화학식 (308)에 나타낸 바와 같은 siRNA 접합체를 수득하는 단계를 포함한다.
여기서, 단계 (1)에서, 상기 화학식 (321)의 화합물내 보호 그룹 Rk를 제거하는 방법은 화학식 (321)의 화합물을 탈보호제와 탈보호 조건 하에서 접촉시킴을 포함한다. 탈보호 조건은 0 내지 50℃의 온도, 및 일부 구현예에서, 15 내지 35℃ 및 30 내지 300초, 및 일부 구현예에서, 50 내지 150초의 반응 시간을 포함한다. 탈보호제는 트리플루오로아세트산, 트리클로로아세트산, 디클로로아세트산, 및 모노클로로아세트산으로부터 선택된 것, 일부 구현예에서, 디클로로아세트산일 수 있다. 탈보호제 대 화학식 (321)로 나타낸 바와 같은 화합물의 몰 비는 10:1 내지 1000:1이고, 일부 구현예에서, 50:1 내지 500:1이다.
커플링 반응 조건 및 커플링제는 상기 커플링 반응에 적합한 임의의 조건 및 제제일 수 있다. 일부 구현예에서, 고체 상 합성 방법에서의 커플링 반응의 것과 동일한 조건 및 제제가 사용될 수 있다.
일부 구현예에서, 커플링 반응 조건은 0 내지 50℃, 및 일부 구현예에서, 15 내지 35℃의 반응 온도를 포함한다. 화학식 (321)의 화합물 대 뉴클레오시드 단량체의 몰 비는 1:1 내지 1:50이고, 일부 구현예에서, 1:2 내지 1:5이다. 화학식 (321)의 화합물 대 커플링제의 몰 비는 1:1 내지 1:50일 수 있고, 일부 구현예에서, 1:3 내지 1:10일 수 있다. 반응 시간은 200 내지 3,000 초, 및 일부 구현예에서, 500 내지 1,500초이다. 커플링제는 1H-테트라졸, 5-에틸티오-1H-테트라졸 및 5-벤질티오-1H-테트라졸로부터 선택된 하나 이상이고, 일부 구현예에서, 5-에틸티오-1H-테트라졸이다. 커플링 반응은 유기 용매 속에서 수행할 수 있다. 유기 용매는 무수 아세토니트릴, 무수 DMF 및 무수 디클로로메탄으로부터 선택된 하나 이상이고, 일부 구현예에서, 무수 아세토니트릴이다. 화학식 (321)로 나타낸 바와 같은 화합물과 관련하여, 유기 용매의 양은 3 내지 50 L/mol, 및 일부 구현예에서, 5 내지 20 L/mol이다.
단계 (2)에서, 상기 단계에서 제조된 접합 분자를 경유하여 고체 상 지지체에 연결된 뉴클레오시드 단량체로부터 출발하여, siRNA 접합체의 센스 가닥 SS는 3' 내지 5' 방향으로 포스포르아미디트 고체 상 합성 방법에 의해 합성된다. 이러한 경우에, 접합 분자는 수득되는 센스 가닥의 3' 말단에 연결된다.
뉴클레오시드 단량체에 대한 탈보호 조건을 포함하는, 단계 (2) 및 (3)에서의 고체 상 합성을 위한 다른 조건, 탈보호제의 유형 및 양, 커플링 반응 조건, 커플링제의 유형 및 양, 캡핑 반응 조건, 캡핑제의 유형 및 양, 산화 반응 조건, 산화제의 유형 및 양, 황화 반응 조건, 및 황화제의 유형 및 양은 당해 분야에서 다양한 통상의 제제, 양, 및 조건을 채택한다.
일부 구현예에서, 예를 들면, 단계 (2) 및 (3)에서 고체 상 합성은 다음 조건을 사용할 수 있다:
뉴클레오시드 단량체에 대한 탈보호 조건은 0 내지 50℃, 및 일부 구현예에서, 15 내지 35℃의 반응 온도, 및 30 내지 300초, 및 일부 구현예에서, 50 내지 150초의 반응 시간을 포함한다. 탈보호제는 트리플루오로아세트산, 트리클로로아세트산, 디클로로아세트산, 및 모노클로로아세트산으로부터 선택된 하나 이상일 수 있고, 일부 구현예에서, 디클로로아세트산이다. 고체 상 지지체에서 탈보호제 대 보호 그룹 4,4'-디메톡시트리틸의 몰 비는 2:1 내지 100:1이고, 일부 구현예에서, 3:1 내지 50:1이다.
커플링 반응 조건은 0 내지 50℃, 및 일부 구현예에서, 15 내지 35℃의 반응 온도를 포함한다. 고체 상 지지체에 연결된 핵산 서열 대 뉴클레오시드 단량체의 몰 비는 1:1 내지 1:50이고, 일부 구현예에서, 1:5 내지 1:15이다. 고체 상 지지체에 연결된 핵산 서열 대 커플링제의 몰 비는 1:1 내지 1:100, 및 일부 구현예에서, 1:50 내지 1:80이다. 반응 시간 및 커플링제의 선택은 상기와 동일하다.
캡핑 반응 조건은 0 내지 50℃, 및 일부 구현예에서, 15 내지 35℃의 반응 온도, 및 5 내지 500초, 및 일부 구현예에서, 10 내지 100초의 반응 시간을 포함한다. 캡핑제의 선택은 상기와 동일하다. 캡핑제의 총 양 대 고체상 지지체에 연결된 핵산 서열의 몰 비는 1:100 내지 100:1이고, 일부 구현예에서, 1:10 내지 10:1이다. 캡핑제가 아세트산무수물 및 N-메틸이미다졸을 사용하는 경우에, 아세트산 무수물, N-메틸이미다졸, 및 고체 상 지지체에 연결된 핵산 서열의 몰 비는 1:1:10 내지 10:10:1일 수 있고, 일부 구현예에서, 1:1:2 내지 2:2:1이다.
산화 반응 조건은 0 내지 50℃, 및 일부 구현예에서, 15 내지 35℃의 반응 온도, 및 1 내지 100초, 및 일부 구현예에서, 5 내지 50초의 반응 시간을 포함한다. 일부 구현예에서, 산화제는 요오드(일부 구현예에서 요오드 수로서 제공됨)이다. 커플링 단계에서 산화제 대 고체 상 지지체에 연결된 핵산 서열의 몰 비는 1:1 내지 100:1일 수 있고, 일부 구현예에서, 5:1 내지 50:1이다. 일부 구현예에서, 산화 반응은 혼합 용매 속에서 수행하며 여기서 테트라하이드로푸란:물:피리딘의 비는 3:1:1 내지 1:1:3이다. 황화 반응 조건은 0 내지 50℃, 및 일부 구현예에서, 15 내지 35℃의 반응 온도, 및 50 내지 2,000초, 및 일부 구현예에서, 100 내지 1,000초의 반응 시간을 포함한다. 일부 구현예에서, 황화제는 크산탄 하이드라이드이다. 커플링 단계에서 황화제 대 고체 상 지지체에 연결된 핵산 서열의 몰 비는 10:1 내지 1,000:1이고, 일부 구현예에서, 10:1 내지 500:1이다. 일부 구현예에서, 황화 반응은 혼합 용매 속에서 수행되며 여기서 아세토니트릴:피리딘의 비는 1:3 내지 3:1이다.
방법은 모든 뉴클레오시드 단량체를 연결한 후 및 어닐링 전에 siRNA의 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 단리하는 단계를 포함한다. 단리 방법은 당해 분야의 기술자에게 잘 공지되어 있고 일반적으로 고체 상 지지체로부터 합성된 뉴클레오타이드 서열을 절단하는 단계, 염기, 포스페이트 그룹 및 리간드 상의 보호 그룹을 제거하는 단계, 정제하는 단계, 및 탈염하는 단계를 포함한다.
siRNA의 합성에서 통상의 절단 및 탈보호 방법에 따라서, 고체 상 지지체로부터 합성된 뉴클레오타이드 서열을 절단하고, 염기, 포스페이트 그룹 및 리간드 상의 보호 그룹을 제거할 수 있다. 예를 들면, 고체 상 지지체에 연결된 수득되는 뉴클레오타이드 서열을 농축된 수성 암모니아와 접촉시키며; 탈접촉 동안, 그s A46 내지 A54 내 보호 그룹 YCOO-를 하이드록실 그룹으로 전환시키며, 따라서 S1 그룹은 상응하는 M1 그룹으로 전환되어, 화학식 (308)로 나타낸 바와 같은 siRNA 접합체를 제공하고; 여기서 농축된 수성 암모니아는 25 내지 30 wt%의 수성 암모니아일 수 있다. 표적 siRNA 서열과 관련하여, 농축된 수성 암모니아의 양은 0.2 ml/μmol 내지 0.8 ml/μmol일 수 있다.
합성된 뉴클레오타이드 서열 상에 적어도 하나의 2'-TBDMS 보호가 존재하는 경우, 이러한 방법은 고체상 지지체로부터 제거된 뉴클레오타이드 서열을 트리에틸아민 트리하이드로플루오라이드와 접촉시켜 2'-TBDMS 보호를 제거하는 단계를 추가로 포함한다. 여기서, 수득되는 표적 siRNA 서열내 상응하는 뉴클레오타이드는 유리된 2'-하이드록시를 갖는다. 표적 siRNA 서열과 관련하여, 순수한 트리에틸아민 트리하이드로플루오라이드의 양은 0.4 ml/μmol 내지 1.0 ml/μmol이다. 따라서 화학식 (308)로 나타낸 바와 같은 siRNA 접합체가 수득될 수 있다.
정제 및 탈염 방법은 당해 분야의 기술자에게 잘 공지되어 있다. 예를 들면, 핵산 정제를 NaBr 또는 NaCl의 구배 용출을 사용한 제조 이온 크로마토그래피 정제를 사용하여 수행할 수 있고; 생성물의 수집 및 조합 후, 탈염을 역상 크로마토그래피 정제 컬럼을 사용하여 수행할 수 있다.
화학식 (308)로 나타낸 바와 같은 수득되는 siRNA 접합체에서, 뉴클레오타이드 사이의 포스포디에스테르 결합 또는 포스포로티오에이트 디에스테르 결합 내 비-브릿징 산소 또는 황은 실질적으로 나트륨 이온에 결합하며, 화학식 (308)로 나타낸 바와 같은 siRNA 접합체는 나트륨 염의 형태로 실질적으로 존재한다. 잘-공지된 이온-교환 방법을 사용할 수 있고, 여기서 나트륨 이온은 수소 이온 및/또는 다른 양이온으로 대체됨으로써, 화학식 (308)에 나타낸 바와 같은 siRNA 접합체의 다른 형태를 제공할 수 있다. 양이온은 상술된 바와 같다.
합성 동안, 핵산 서열의 순도 및 분자량을 임의의 시간에 측정하여 합성 품질을 보다 잘 제어할 수 있다. 이러한 측정 방법은 당해 분야의 기술자에게 잘 공지되어 있다. 예를 들면, 핵산의 순도는 이온 교환 크로마토그래피로 측정할 수 있고, 액체 크로마토그래피-질량 분석법(LC-MS)으로 측정할 수 있다.
어닐링 방법은 당해 분야의 기술자에게 또한 잘 공지되어 있다. 예를 들면, 합성된 센스 가닥(SS 가닥) 및 안티센스 가닥(AS 가닥)을 등몰 비의 주사용 수와 단순 혼합하고, 70 내지 95℃로 가열하고, 실온으로 냉각시켜 수소 결합을 경유하여 이중 가닥 구조를 형성시킨다. 따라서, 화학식 (308)에 나타낸 바와 같은 siRNA 접합체를 수득할 수 있다.
접합체를 수득한 후, 일부 구현예에서, 화학식 (308)로 나타낸 바와 같은 합성된 siRNA 접합체를 또한 수단, 예를 들면, 방법, 예를 들면, 액체 크로마토그래피-질량 분광법을 사용한 분자량 검출로 특성화시켜 합성된 siRNA 접합체가 목적한 화학식 (308)로 나타낸 바와 같은 설계된 siRNA 접합체인지, 및 합성된 siRNA의 서열이 목적한 siRNA 서열의 서열인지, 예를 들면, 표 1에 나타낸 서열 중 하나인지를 확인한다.
이온 교환은 화학식 (321)로 나타낸 바와 같은 화합물은 화학식 (313)으로 나타낸 바와 같은 화합물을 사이클릭 무수물과 유기 용매 속에서 에스테르화 반응 조건 하에 염기 및 에스테르화 촉매의 존재하에서 접촉시키는 단계; 화학식 (321)로 나타낸 바와 같은 화합물을 이온 교환에 의해 단리하는 단계를 포함하는 제조 방법에 의해 수득할 수 있다:
Figure pct00063
화학식 (313)
여기서 n1, n3, m1, m2, m3, R10, R11, R12, R13, R14, R15, L1, 및 S1은 각각 상술한 바와 같고;
R6은 화학식 (321)의 R4를 제공하기 위한 그룹이고; 일부 구현예에서, R6은 화학식 (A61)로 나타낸 바와 같은 구조를 갖는다:
Figure pct00064
여기서 Ri는 질소 골격 상의 N 원자, RkO 및 유리 하이드록시 그룹에 연결할 수 있는 임의의 그룹이고; Rk는 하이드록시 보호 그룹이다. 이러한 경우에, 화학식 (321)로 나타낸 바와 같은 화합물이 수득되고, 여기서 R4는 하이드록시 보호 그룹을 포함하는 제1의 작용 그룹 및 화학식 (C1) 또는 (C2)으로 나타낸 바와 같은 구조를 포함하는 제2의 작용 그룹을 포함한다.
에스테르화 반응 조건은 0 내지 100℃의 반응 온도 및 8 내지 48시간의 반응 시간을 포함한다. 일부 구현예에서, 에스테르화 반응 조건은 10 내지 40℃의 반응 온도 및 20 내지 30시간의 반응 시간을 포함한다.
일부 구현예에서, 유기 용매는 에폭시 용매, 에테르 용매, 할로알칸 용매, 디메틸 설폭사이드, N,N-디메틸포름아미드, 및 N,N-디이소프로필에틸아민 중 하나 이상을 포함한다. 일부 구현예에서, 에폭시 용매는 디옥산 및/또는 테트라하이드로푸란이고, 에테르 용매는 디에틸 에테르 및/또는 메틸 3급부틸 에테르이고, 할로알칸 용매는 디클로로메탄, 트리클로로메탄 및 1,2-디클로로에탄 중 하나 이상이다. 일부 구현예에서, 유기 용매는 디클로로메탄이다. 화학식 (313)으로 나타낸 바와 같은 화합물과 관련하여, 유기 용매의 양은 3 내지 50 L/mol이고, 일부 구현예에서, 5 내지 20 L/mol이다.
일부 구현예에서, 사이클릭 무수물은 석신산 무수물, 글루타르산 무수물, 아디프산 무수물 또는 피멜산 무수물 중 하나이고, 일부 구현예에서, 사이클릭 무수물은 석신산 무수물이다. 사이클릭 무수물 대 화학식 (313)으로 나타낸 바와 같은 화합물의 몰 비는 1:1 내지 10:1이고, 일부 구현예에서, 2:1 내지 5:1이다.
에스테르화 촉매는 에스테르화 반응을 촉매할 수 있는 임의의 촉매, 예를 들면, 4-디메틸아미노피리딘일 수 있다. 촉매 대 화학식 (313)으로 나타낸 바와 같은 화합물의 몰 비는 1:1 내지 10:1이고, 일부 구현예에서, 2:1 내지 5:1이다.
일부 구현예에서, 염기는 임의의 무기 염기, 유기 염기 또는 이의 조합일 수 있다. 용해도 및 생성물 안정성을 고려할 때, 염기는 예를 들면, 3급 아민일 수 있다. 일부 구현예에서, 3급 아민은 트리에틸아민 또는 N,N-디이소프로필에틸아민이다. 3급 아민 대 화학식 (313)으로 나타낸 바와 같은 화합물의 몰 비는 1:1 내지 20:1이고, 일부 구현예에서, 3:1 내지 10:1이다.
화학식 (321)로 나타낸 바와 같은 화합물을 목적한 형태의 카복실산 또는 카복실산 염으로 전환시키는 기능을 제공하며 이온 교환 방법은 당해 분야의 기술자에게 잘 공지되어 있다. M+ 양이온을 가진 접합 분자는 적합한 이온 교환 용액 및 이온 교환 조건을 사용함으로써 수득할 수 있고, 이는 본원에서 빠져 있다. 일부 구현예에서, 이온 교환 반응은 트리에틸아민 포스페이트 용액을 사용하여 수행하며, 트리에틸아민 포스페이트 용액의 농도는 0.2 내지 0.8 M이다. 일부 구현예에서, 트리에틸아민 포스페이트 용액의 농도는 0.4 내지 0.6 M이고, 화학식 (313)으로 나타낸 바와 같은 화합물과 관련하여, 트리에틸아민 포스페이트 용액의 양은 3 내지 6 L/mol이고, 추가의 구현예에서, 4 내지 5 L/mol이다.
화학식 (321)의 화합물은 임의의 적합한 단리 방법을 사용하여 반응 혼합물로부터 단리할 수 있다. 일부 구현예에서, 화학식 (321)의 화합물은 증발을 통해 용매를 제거한 후 크로마토그래피로 단리할 수 있다. 예를 들면, 다음의 2개의 크로마토그래피 조건을 단리에 사용할 수 있다: (1) 실리카 겔의 정상 상의 정제: 200 내지 300 메쉬의 실리카 겔 여과기, 디클로로메탄 중 1wt% 트리에틸아민:메탄올 = 100:18 내지 100:20의 구배 용출; 또는 (2) 역상 정제: C18 및 C8 역상 여과기, 메탄올:아세토니트릴 = 0.1:1 내지 1:0.1의 구배 용출. 일부 구현예에서, 용매를 직접 제거하여 화학식 (321)의 화합물의 조 생성물을 수득하고, 이를 후속 반응에 직접 사용할 수 있다.
일부 구현예에서, 화학식 (321)의 화합물을 제조하는 방법은 상기 이온 교환 반응에 의해 수득된 생성물을 아미노 또는 하이드록시 그룹을 지닌 고체 상 지지체와 유기 용매 속에서 축합 반응 조건 하에 축합제, 촉합 촉매 및 3급 아민의 존재하에서 추가로 접촉시키는 단계를 추가로 포함한다. 이러한 경우에, 화학식 (321)로 나타낸 바와 같은 화합물이 수득되며, 여기서 R4는 하이드록시 보호 그룹을 포함하는 제1의 작용 그룹 및 화학식 (C1')로 나타낸 바와 같은 구조를 포함하는 제2의 작용 그룹을 포함한다.
고체 상 지지체는 siRNA의 고체 상 합성에 사용된 지지체 중 하나이고, 이들 중 일부는 당해 분야의 기술자에게 잘 공지되어 있다. 예를 들면, 고체 상 지지체는 활성의 하이드록시 또는 아미노 작용 그룹(들)을 함유하는 고체 상 지지체로부터 선택할 수 있고, 일부 구현예에서, 아미노 또는 하이드록시 수지이다. 일부 구현예에서, 아미노 또는 하이드록시 수지는 다음의 매개변수를 갖는다: 100 내지 400 메쉬의 입자 크기, 및 0.2 내지 0.5 mmol/g의 표면 아미노 또는 하이드록시 로딩. 화학식 (321)로 나타낸 바와 같은 화합물 대 고체 상 지지체의 비는 10 내지 400 μmol의 화합물/g의 고체 상 지지체이다. 일부 구현예에서, 화학식 (321)의 화합물 대 고체 상 지지체의 비는 50 μmol/g 내지 200 μmol/g이다.
유기 용매는 임의의 적합한 용매일 수 있거나 당해 분야의 기술자에게 공지된 혼합 용매일 수 있다. 일부 구현예에서, 유기 용매는 아세토니트릴, 에폭시 용매, 에테르 용매, 할로알칸 용매, 디메틸 설폭사이드, N,N-디메틸포름아미드, 및 N,N-디이소프로필에틸아민 중 하나 이상이다. 일부 구현예에서, 에폭시 용매는 디옥산 및/또는 테트라하이드로푸란이고; 에테르 용매는 에테르 및/또는 메틸 3급부틸 에테르이고; 할로알칸 용매는 디클로로메탄, 트리클로로메탄 및 1,2-디클로로에탄 중 하나 이상이다. 일부 구현예에서, 유기 용매는 아세토니트릴이다. 화학식 (321)의 화합물의 화합물과 관련하여, 유기 용매의 양은 20 내지 200 L/mol이고, 일부 구현예에서, 50 내지 100 L/mol이다.
일부 구현예에서, 축합제는 벤조트리아졸-1-일-옥시트리피롤리디노 포스포늄 헥사플루오로포스페이트(PyBop), 3-디에톡시포스포릴-1,2,3-벤조트리진-4(3H)-온(DEPBT) 및/또는 O-벤조트리아졸-테트라메틸우로늄 헥사플루오로포스페이트이다. 일부 구현예에서, 축합제는 O-벤조트리아졸-테트라메틸우로늄 헥사플루오로포스페이트이다. 축합제 대 화학식 (321)로 나타낸 바와 같은 화합물의 몰 비는 1:1 내지 20:1이고, 다른 구현예에서, 1:1 내지 5:1이다.
일부 구현예에서, 3급 아민은 트리에틸아민 및/또는 N,N-디이소프로필에틸아민이고, 일부 구현예에서, N,N-디이소프로필에틸아민이다. 3급 아민 대 화학식 (321)로 나타낸 바와 같은 화합물의 몰 비는 1:1 내지 20:1이고, 일부 구현예에서, 1:1 내지 5:1이다.
일부 구현예에서, 화학식 (321)의 화합물을 제조하는 방법은 수득되는 축합 생성물을 캡핑제 및 아실화 촉매와 유기 용매 속에서 캡핑 반응 조건 하에 접촉시키는 단계, 및 화학식 (321)의 화합물을 단리하는 단계를 추가로 포함한다. 캡핑 반응을 사용하여 완전히 반응하지 않은 활성 작용 그룹을 제거함으로써, 수속적인 반응에서 불필요한 부산물이 생산되는 것을 피한다. 캡핑 반응 조건은 0 내지 50℃의 반응 온도, 및 구현예에서, 15 내지 35℃의 반응 온도, 및 1 내지 10시간, 및 일부 구현žŸ에서 3 내지 6시간의 반응 시간를 포함한다. 캡핑제는 siRNA의 고체 상 합성에 사용된 캡핑제일 수 있고, 이는 당해 분야의 기술자에게 잘 공지되어 있다.
일부 구현예에서, 캡핑제는 캡핑제 1(cap1) 및 캡핑제 2(cap2)로 구성된다. cap1은 N-메틸이미다졸이고, 일부 구현예에서, 피리딘/아세토니트릴 중 N-메틸이미다졸의 혼합 용액으로서 제공되고, 여기서 피리딘 대 아세토니트릴의 용적 비는 1:10 내지 1:1이고, 일부 구현예에서, 1:3 내지 1:1이다. 일부 구현예에서, 피리딘 및 아세노니트릴의 총 용적 대 N-메틸이미다졸의 용적 비는 1:1 내지 10:1, 및 일부 구현예에서, 3:1 내지 7:1이다. cap2는 아세트산 무수물이고, 일부 구현예에서, 아세토니트릴 중 아세트산 무수물의 용액으로서 제공되고, 여기서 아세트산 무수물 대 아세토니트릴의 용적 비는 1:1 내지 1:10, 및 추가의 구현예에서, 1:2 내지 1:6이다.
일부 구현예에서, 피리딘/아세토니트릴 중 N-메틸이미다졸의 혼합 용액의 용적 대 화학식 (321)의 화합물의 중량의 비는 5 ml/g 내지 50 ml/g, 및 일부 구현예에서, 15 ml/g 내지 30 ml/g이다. 아세토니트릴 중 아세트산 무수물의 용적 대 화학식 (321)의 화합물의 중량의 비는 0.5 ml/g 내지 10 ml/g, 및 일부 구현예에서, 1 ml/g 내지 5 ml/g이다.
일부 구현예에서, 캡핑제는 등몰의 아세트산 무수물 및 N-메틸이미다졸을 포함한다. 유기 용매는 아세토니트릴, 에폭시 용매, 에테르 용매, 할로알칸 용매, 디메틸설폭사이드, N,N-디메틸포름아미드, 및 N,N-디이소프로필에틸아민 중 하나 이상이다. 일부 구현예에서, 유기 용매는 아세토니트릴이다. 화학식 (321)의 화합물과 관련하여, 유기 용매의 양은 10 내지 50 L/mol, 및 일부 구현예에서, 5 내지 30 L/mol이다.
일부 구현예에서, 아실화 촉매는 에트테르화 축합 또는 아미드화 축합에 사용될 수 있는 임의의 촉매, 예를 들면, 알칼린 헤테로사이클릭 화합물로부터 선택될 수 있다. 일부 구현예에서, 아실화 촉매는 4-디메틸아미노피리딘이다. 촉매 대 화학식 (321)로 나타낸 바와 같은 화합물의 중량 비는 0.001:1 내지 1:1, 및 일부 구현예에서, 0.01:1 내지 0.1:1일 수 있다.
일부 구현예에서, 화학식 (321)의 화합물은 반응 혼합물로부터 임의의 적합한 분리 방법에 의해 단리할 수 있다. 일부 구현예에서, 화학식 (321)의 화합물은 유기 용매를 완전히 세척하고 여과하여 반응하지 않은 반응물, 과도한 캡핑제 및 다른 불순물을 제거함으로써 수득할 수 있고, 여기서 유기 용매는 아세토니트릴, 디클로로메탄 및 메탄올로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 유기 용매는 아세토니트릴이다.
일부 구현예에서, 화학식 (321)로 나타낸 바와 같은 접합 분자의 제조 방법은 화학식 (313)으로 나타낸 바와 같은 화합물을 포스포로디아미디트와 유기 용매 속에서 커플링 반응 조건 하에 커플링제의 존재하에서 추가로 접촉시키는 단계, 및 화학식 (321)로 나타낸 바와 같은 화합물을 단리하는 단계를 추가로 포함한다. 이러한 경우에, 화학식 (321)로 나타낸 바와 같은 화합물이 수득되며, 여기서 R4는 하이드록시 보호 그룹을 포함하는 제1의 작용 그룹 및 화학식 (C3)로 나타낸 바와 같은 구조를 포함하는 제2의 작용 그룹을 포함한다.
일부 구현예에서, 커플링 반응 조건은 0 내지 50℃, 예를 들면, 15 내지 35℃의 반응 온도; 1:1 내지 1:50, 예를 들면, 1:5 내지 1:15의 화학식 (313)의 화합물 대 포스포로디아미디트의 몰 비; 1:1 내지 1:100, 예를 들면, 1:50 내지 1:80의 화학식 (313) 대 커플링제의 몰 비; 및 200 내지 3,000초, 예를 들면, 500 내지 1,500초의 반응 시간을 포함한다. 포스포로디아미디트는, 예를 들면, 비스(디이소프로필아미노)(2-시아노에톡시)포스핀일 수 있고, 이는 상업적으로 이용가능할 수 있거나 당해 분야에 잘 공지된 방법에 따라 합성할 수 있다. 커플링제는 1H-테트라졸, 5-에틸티오-1H-테트라졸 및 5-벤질티오-1H-테트라졸로부터 선택된 하나 이상, 예를 들면, 5-에틸티오-1H-테트라졸이다. 커플링 반응은 유기 용매 속에서 수행될 수 있다. 유기 용매는 무수 아세토니트릴, 무수 DMF 및 무수 디클로로메탄로부터 선택된 하나 이상, 예를 들면, 무수 아세토니트릴이다. 화학식 (313)의 화합물과 관련하여, 유기 용매의 양은 3 내지 50 L/mol, 예를 들면, 5 내지 20 L/mol이다. 커플링 반응에 의해, 화학식 (313)의 화합물 내 하이드록시 그룹은 포스포로디아미디트와 반응하여 포스포르아미디트 그룹을 형성한다. 일부 구현예에서, 용매를 직접 제거하여 화학식 (321)의 화합물의 조 생성물을 수득할 수 있고, 이는 후속적인 반응에서 직접 사용할 수 있다.
일부 구현예에서, 화학식 (321)의 화합물의 제조 방법은 다음의 단계를 추가로 포함한다: 단리된 용매를 하이드록시 그룹을 지닌 고체 상 지지체와 유기 용매 속에서 커플링 반응 조건 하에 커플링제의 존재하에서 접촉시킨 다음, 캡핑, 산화, 및 단리하여 화학식 (321)의 화합물을 수득하는 단계(여기서 R4는 하이드록시 보호 그룹을 포함하는 제1의 작용 그룹을 포함하고 제2의 작용 그룹은 화학식 (C3')로 나타낸 바와 같은 구조를 포함한다).
일부 구현예에서, 고체 상 지지체는 핵산의 고체 상 합성을 위해 당해 분야에 잘 공지된 고체 지지체, 예를 들면, 탈보호된 상업적으로 이용가능한 공통의 고체 상 지지체(NittoPhase®HL UnyLinker™ 300 Oligo뉴클레오타이드 Synthesis Support, Kinovate Life Sciences, 화학식 (B80)로 나타낸 바와 같은 바와 같음)이다:
Figure pct00065
탈보호 반응은 당해 분야의 기술자에게 잘 공지되어 있다. 일부 구현예에서, 탈보호 조건은 0 내지 50℃, 예를 들면, 15 내지 35℃의 온도, 및 30 내지 300초, 예를 들면, 50 내지 150초의 반응 시간을 포함한다. 탈보호제는 트리플루오로아세트산, 트리클로로아세트산, 디클로로아세트산, 및 모노클로로아세트산으로부터 선택된 하나 이상일 수 있다. 일부 구현예에서, 탈보호제는 디클로로아세트산이다. 탈보호제 대 고체 상 지지체 상의 보호 그룹-DMTr (4,4'-디메톡시트리틸)의 몰 비는 2:1 내지 100:1, 예를 들면, 3:1 내지 50:1이다. 이러한 탈보호를 통해, 반응성의 유리 하이드록시 그룹이 후속적인 커플링 반응을 촉진하기 위해, 고체 상 지지체의 표면 위에 수득한다.
커플링 반응 조건 및 커플링제는 상기와 같이 선택할 수 있다. 커플링 반응을 통해, 탈보호시 형성된 유리 하이드록시 그룹은 포스포르아미디트 그룹과 반응함으로써, 포스파이트 에스테르 연결을 형성한다.
일부 구현예에서, 캡핑 반응 조건은 0 내지 50℃, 예를 들면, 15 내지 35℃의 반응 온도, 및 5 내지 500초, 예를 들면, 10 내지 100초의 반응 시간을 포함한다. 캡핑 반응은 캡핑제의 존재하에서 수행된다. 캡핑제의 선택 및 양은 상술한 바와 같다.
산화 반응 조건은 0 내지 50℃, 예를 들면, 15 내지 35℃의 온도, 및 1 내지 100초, 예를 들면, 5 내지 50초의 반응 시간을 포함한다. 산화제는, 예를 들면, 요오드(일부 구현예에서, 요오드 수로서 제공됨)이다. 산화제 대 고체 상 지지체에 연결된 핵산 서열의 몰 비는 1:1 내지 100:1이고, 예를 들면, 5:1 내지 50:1일 수 있다. 일부 구현예에서, 산화 반응은 테트라하이드로푸란:물:피리딘의 비가 3:1:1 내지 1:1:3인 혼합 용매 속에서 수행된다.
일부 구현예에서, R6은 화학식 (B7) 또는 (B8)의 그룹 중 하나이고:
Figure pct00066
여기서 q2 및 Rk의 정의는 상술한 바와 같다.
이러한 경우에, 화학식 (313)으로 나타낸 바와 같은 화합물은 다음의 제조 방법에 의해 수득할 수 있다: 화학식 (314)으로나타낸 바와 같은 화합물을 화학식 (A-1) 또는 (A-2)로 나타낸 바와 같은 화합물과 유기 용매 속에서 아미드화 반응 조건 하에 아미드화 반응용 축합제 및 3급 아민의 존재하에서 접촉시키는 단계 이후에 단리하는 단계:
Figure pct00067
Figure pct00068
여기서 n1, n3, m1, m2, m3, R10, R11, R12, R13, R14, R15, L1, S1, q2, 및 Rk의 정의 및 선택사항은 각각 상술한 바와 같다.
아미드화 반응 조건은 0 내지 100℃의 반응 온도 및 1 내지 48시간의 반응 시간을 포함한다. 일부 구현예에서, 아미드화 반응 조건은 10 내지 40℃의 반응 시간 및 2 내지 16시간의 반응 시간을 포함한다.
일부 구현예에서, 유기 용매는 알코올 용매, 에폭시 용매, 에테르 용매, 할로알칸 용매, 디메틸 설폭사이드, N,N-디메틸포름아미드, 및 N,N-디이소프로필에틸아민 중 하나 이상이다. 일부 구현예에서, 알코올 용매는 메탄올, 에탄올 및 프로판올 중 하나 이상이고, 일부 구현예에서, 에탄올이다. 일부 구현예에서, 에폭시 용매는 디옥산 및/또는 테트라하이드로푸란이다. 일부 구현예에서, 에테르 용매는 디에틸 에테르 및/또는 메틸 3급-부틸 에테르이다. 일부 구현예에서, 할로알칸 용매는 디클로로메탄, 트리클로로메탄 및 1,2-디클로로에탄 중 하나 이상이다. 일부 구현예에서, 유기 용매는 디클로로메탄이다. 화학식 (314)의 화합물과 관련하여, 유기 용매의 양은 3 내지 50 L/mol, 및 일부 구현예에서, 3 내지 20 L/mol이다.
일부 구현예에서, 아미드화 반응을 위한 축합제는 벤조트리아졸-1-일-옥시트리피롤리디노포스포늄 헥사플루오로포스페이트, 3-디에톡시포스포릴-1,2,3-벤조트리진-4(3H)-온, 4-(4,6-디메톡시트리아진-2-일)-4-메틸모르폴린 하이드로클로라이드, 2-에톡시-1-에톡시카보닐-1,2-디하이드로퀴놀린(EEDQ), 또는 O-벤조트리아졸-테트라메틸우로늄 헥사플루오로포스페이트이고, 추가의 구현예에서, 3-디에톡시포스포릴-1,2,3-벤조트리아진-4(3H)-온이다. 아미드화 반응용 축합제 대 화학식 (314)로 나타낸 바와 같은 화합물의 몰 비는 1:1 내지 10:1이고, 일부 구현예에서, 2.5:1 내지 5:1이다.
일부 구현예에서, 3급 아민은 트리에틸아민 또는 N,N-디이소프로필에틸아민이고, 일부 구현예에서, N,N-디이소프로필에틸아민이다. 3급 아민 대 화학식 (314)로 나타낸 바와 같은 화합물의 몰 비는 3:1 내지 20:1, 및 일부 구현예에서, 5:1 내지 10:1이다.
화학식 (A-1) 및 (A-2)의 화합물은 임의의 적합한 수단으로 제조할 수 있다. 예를 들면, Rk가 DMTr 그룹인 경우, 화학식 (A-1)의 화합물은 칼슘 글리세레이트를 DMTrCl과 반응시켜 제조할 수 있다. 유사하게, 화학식 (A-2)의 화합물은 3-아미노-1,2-프로판디올을 사이클릭 무수물과 우선 접촉시키고 DMTrCl과 반응시켜 제조할 수 있고, 여기서 사이클릭 무수물은 4 내지 13개의 탄소 원자를 가지고, 일부 구현예에서, 4 내지 8개의 탄소 원자를 가진다. 당해 분야의 기술자는 상이한 사이클릭 무수물의 선택이 화학식 (A-2)의 화합물내 q2에 대한 상이한 값에 상응함을 용이하게 이해할 수 있다. 예를 들면, 사이클릭 무수물이 석신산 무수물인 경우, q2=1이고; 사이클릭 무수물이 글루타르산 무수물인 경우, q2=2이고 등이다.
일부 변형에서, 화학식 (313)의 화합물은 또한 화학식 (314)으로 나타낸 바와 같은 화합물을 사이클릭 무수물, 3-아미노-1,2-프로판디올 및 DMTrCl과 순차적으로 반응시켜 제조할 수 있다. 당해 분야의 기술자는 이러한 변형이 화학식 (313)의 화합물의 구조 및 기능에 영향을 미치지 않을 수 있고 이러한 변형이 상기 방법을 기반으로 당해 분야의 기술자에 의해 용이하게 실현됨을 용이하게 이해할 수 있다.
유사하게, 화학식 (313)의 화합물은 반응 혼합물로부터 임의의 적합한 단리 방법에 의해 단리할 수 있다. 일부 구현예에서, 화학식 (313)의 화합물은 증발에 이은 크로마토그래피로 용매를 제거함으로써 단리할 수 있다. 예를 들면, 다음의 크로마토그래피 조건을 단리에 사용할 수 있다: (1) 실리카 겔의 정상 상의 정제: 석유 에테르:에틸 아세테이트:디클로로메탄:N,N-디메틸포름아미드 = 1:1:1:0.5 내지 1:1:1:0.6의 용출 구배를 지닌 200 내지 300 메쉬의 실리카 겔 여과기; 및 (2) 역상 정제: 메탄올:아세토니트릴 = 0.1:1 내지 1:0.1의 구배 용출을 지닌 C18 및 C8 역상 여과기. 일부 구현예에서, 용매를 직접 제거하여 화학식 (313)의 화합물의 조 생성물을 수득하고, 이를 후속적인 반응에서 직접 사용할 수 있다.
일부 구현예에서, 화학식 (314)로 나타낸 바와 같은 화합물은 다음의 단계를 포함하는 제조 방법으로 수득할 수 있다: 화학식 (320)으로 나타낸 바와 같은 화합물을 화학식 (316)으로 나타낸 바와 같은 화합물과 유기 용매 속에서 축합 반응 조건 하에 아미드화 반응용 축합제 및 3급 아민의 존재하에서 접촉시키는 단계에 이은 단리 단계:
Figure pct00069
Figure pct00070
여기서 n1, n3, m1, m2, m3, R10, R11, R12, R13, R14, 및 R15의 정의 및 선택사항은 각각 상술된 바와 같다.
화학식 (316)의 화합물은, 예를 들면, 문헌: J. Am. Chem. Soc. 2014, 136, 16958-16961에 개시된 것일 수 있다. 대안적으로, 화학식 (316)의 화합물은 다양한 방법을 통해 당해 분야의 기술자에 의해 제조될 수 있다. 예를 들면, 화학식 (316)의 일부 화합물은 이의 전문이 본원에 참고로 포함된, 미국 특허 제US8106022B2호의 실시예 1에 개시된 방법에 따라 제조할 수 있다.
일부 구현예에서, 축합 반응 조건은 0 내지 100℃의 반응 온도 및 0.1 내지 24시간의 반응 시간, 및 일부 구현예에서, 10 내지 40℃의 반응 온도 및 0.5 내지 16시간의 반응 시간을 포함한다.
화학식 (314)의 목적한 생성물 화합물의 구조를 고려하여, 화학식 (316)으로 나타낸 바와 같은 화합물 대 화학식 (320)으로 나타낸 바와 같은 화합물의 몰 비는 화학식 (320)에서 n1 및 n3의 합을 기반으로 측정할 수 있다. 일부 구현예에서, 예를 들면, n1+n3=3인 경우, 임의의 과도함 없이 완전한 반응을 보증하기 위하여, 화학식 (316)으로 나타낸 바와 같은 화합물 대 화학식 (320)으로 나타낸 바와 같은 화합물의 몰 비는 3:1 내지 3.5:1, 및 일부 구현예에서, 3.01:1 내지 3.15:1일 수 있다.
일부 구현예에서, 유기 용매는 아세토니트릴, 에폭시 용매, 에테르 용매, 할로알칸 용매, 디메틸 설폭사이드, N,N-디메틸포름아미드, 및 N,N-디이소프로필에틸아민 중 하나 이상이다. 일부 구현예에서, 에폭시 용매는 디옥산 및/또는 테트라하이드로푸란이다. 일부 구현예에서, 에테르 용매는 디에틸 에테르 및/또는 메틸 3급-부틸 에테르이다. 일부 구현예에서, 할로알칸 용매는 디클로로메탄, 트리클로로메탄 및 1,2-디클로로에탄 중 하나 이상이다. 일부 구현예에서, 유기 용매는 디클로로메탄이다. 화학식 (320)의 화합물과 관련하여, 유기 용매의 양은 3 내지 50 L/mol, 및 일부 구현예에서, 5 내지 20 L/mol일 수 있다.
일부 구현예에서, 아미드화 반응용 축합제는 벤조트리아졸-1-일-옥시트리피롤리디노포스포늄 헥사플루오로포스페이트, 3-디에톡시포스포릴옥시-1,2,3-벤조트리아진-4(3H)-온(DEPBT), O-벤조트리아졸-테트라메틸우로늄 헥사플루오로포스페이트, 4-(4,6-디메톡시트리아진-2-일)-4-메틸모르폴린 하이드로클로라이드, 또는 1-하이드록시벤조트리아졸이고, 추가의 구현예에서 벤조트리아졸-1-일-옥시트리피롤리디노포스포늄 헥사플루오로포스페이트 및 1-하이드록시벤조트리아졸의 혼합물이고, 여기서 벤조트리아졸-1-일-옥시트리피롤리디노포스포늄 및 1-하이드록시벤조트리아졸은 등몰량으로 사용된다. 아미드화 반응용 촉 축합제 대 화학식 (316)으로 나타낸 바와 같은 화합물의 몰 비는 1:1 내지 3:1, 및 일부 구현예에서, 1.05:1 내지 1.5:1일 수 있다.
3급 아민은 N-메틸모르폴린, 트리에틸아민 또는 N,N-디이소프로필에틸아민일 수 있고, 일부 구현예에서, N-메틸모르폴린일 수 있다. 3급 아민 대 화학식 (316)으로 나타낸 바와 같은 화합물의 몰 비는 2:1 내지 10:1, 및 일부 구현예에서, 2:1 내지 5:1일 수 있다.
유사하게, 화학식 (314)로 나타낸 바와 같은 화합물은 반응 혼합물로부터 임의의 적합한 단리 방법으로 단리할 수 있다. 일부 구현예에서, 화학식 (314)로 나타낸 바와 같은 화합물은 증발에 이은 크로마토그래피를 통해, 예를 들면, 단리를 위한 다음의 2개의 크로마토그래피 조건을 사용하여 용매를 제거함으로써 단리할 수 있다: (1) 실리카 겔의 정상 상 정제: 디클로로메탄:메탄올 = 100:5 내지 100:7의 구배 용출을 사용하는 200 내지 300 메쉬 실리카 겔 여과기; 및 (2) 역상 정제: 메탄올:아세토니트릴 = 0.1:1 내지 1:0.1의 구배 용출을 사용하는 C18 및 C8 역상 여과기. 일부 구현예에서, 용매를 직접 제거하여 화학식 (314)의 화합물의 조 생성물을 수득할 수 있고, 이는 후속적인 반응에서 직접 사용할 수 있다.
화학식 (320)의 화합물은 상업적으로 이용가능할 수 있거나 공지된 방법을 통해 당해 분야의 기술자에 의해 제조될 수 있다. 예를 들면, m1=m2=m3=3이고, n1=1이고, n3=2이고, 각각의 R10, R11, R12, R13, R14, 및 R15가 H인 경우, 화학식 (320)의 화합물은 Alfa Aesar Inc.로부터 상업적으로 이용가능할 수 있다.
본 개시내용의 siRNA 접합체는 또한 다른 약제학적으로 허용되는 부형제와 함께 사용될 수 있고, 이는 당해 분야에서 다양한 통상의 제형 또는 화합물 중 하나 이상일 수 있다. 세부사항에 대해서는, 본 개시내용의 약제학적 조성물의 상기 설명을 참고한다.
본 개시내용의 siRNA, siRNA를 포함하는 약제학적 조성물 및 접합체의 용도
일부 구현예에서, 본 개시내용은 혈전 질환 및/또는 허혈성 뇌졸중을 치료 및/또는 방지하기 위한 의약의 제조시 본 개시내용의 siRNA 및/또는 siRNA의 약제학적 조성물 및/또는 siRNA 접합체의 용도를 제공한다.
일부 구현예에서, 본 개시내용은 유효량의 본 개시내용의 siRNA 및/또는 약제학적 조성물 및/또는 siRNA 접합체를 이를 필요로 하는 대상체에게 투여함을 포함하여, 혈전 질환 및/또는 허혈성 뇌졸중을 방지 및/또는 치료하기 위한 방법을 제공한다.
혈전 질환 및/또는 허혈성 뇌졸중을 방지 및/또는 치료하기 위한 목적은 본 개시내용의 siRNA 활성 성분을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여함으로써 RNA 간섭 메카니즘을 통해 달성할 수 있다. 따라서, 본 개시내용의 siRNA 및/또는 약제학적 조성물 및/또는 siRNA 접합체는 혈전 질환 및/또는 허혈성 뇌졸중을 방지 및/또는 치료하거나, 혈전 질환 및/또는 허혈성 뇌졸중을 방지 및/또는 치료하기 위한 의약의 제조에 사용될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "투여/투여하다"는 본 개시내용의 siRNA 및/또는 약제학적 조성물 및/또는 본 개시내용의 siRNA 접합체를 목적한 효과를 생산하기 위한 목적한 부위에 적어도 부분적으로 위치시키는 방법 및 경로에 의한, 본 개시내용의 siRNA 및/또는 약제학적 조성물 및/또는 siRNA 접합체의 대상체의 체내로의 전달을 지칭한다. 본 개시내용의 방법에 적합한 투여 경로는 국소 투여 및 전신계 투여를 포함한다. 일반적으로, 국소 투여는 대상체의 전신 순환과 비교하여 보다 많은 siRNA 접합체의 특수한 부위로의 전달을 야기하는 반면; 전신 투여는 대상체의 기본적인 전신 순환으로 본 개시내용의 siRNA 및/또는 약제학적 조성물 및/또는 siRNA 접합체의 전달을 야기한다. 본 개시내용이 혈전 질환 및/또는 허혈성 뇌졸중의 방지 및/또는 치료용 수단을 제공하기 위한 것임을 고려할 때, 일부 구현예에서, 의약을 간으로 전달할 수 있는 투여 방식이 사용된다.
대상체에 대한 투여는 당해 분야에 공지된 임의의 적합한 경로, 예를 들면, 그러나 이에 한정되지 않는, 경구 및 비경구 경로, 예를 들면, 정맥내 투여, 근육내 투여, 피하 투여, 경피 투여, 기관내 투여(에어로졸), 폐 투여, 비강 투여, 직장 투여, 및 국소 투여(볼내 투여 및 설하 투여 포함)에 의해 달성될 수 있다. 투여 빈도는 1일, 1주, 격주, 3주, 1개월, 2개월, 4개월, 6개월, 또는 1년마다 1회 이상일 수 있다.
본 개시내용의 siRNA 또는 약제학적 조성물 또는 siRNA 접합체의 용량은 당해 분야의 통상의 용량일 수 있고, 이는 다양한 매개변수, 특히, 대상체의 연령, 체중 및 성별에 따라 결정될 수 있다. 독성 및 효능은 표준 약제학적 과정, 예를 들면, LD50(집단의 50% 사망을 유발하는 치사 용량), ED50(등급화된 반응에서 최대 반응의 50%를 유발할 수 있고, 실험 대상체의 50%가 정성적인 반응에서 양성 반응을 가지도록 유발할 수 있는 용량), 또는 IC50(등급화된 반응이 1/2까지 억제되는 억제제/약물의 농도)를 측정함으로써, 세포 배양물 또는 실험 동물에서 측정할 수 있다. 사람에 대한 용량 범위는 세포 배양 분석 및 동물 연구로부터 수득된 데이타를 기반으로 유도할 수 있다.
본 개시내용의 siRNA, 약제학적 조성물 및/또는 siRNA 접합체가 예를 들면, 수컷 또는 암컷의 3 내지 5년생의 체중이 2 내지 6 kg인 시노몰구스 원숭이에게 투여된 경우, (i) siRNA 접합체의 경우, 이의 siRNA의 양은 0.001 내지 100 mg/kg의 체중, 일부 구현예에서 0.01 내지 50 mg/kg의 체중, 일부 구현예에서 0.05 내지 20 mg/kg의 체중, 다른 구현예에서 0.1 내지 15 mg/kg의 체중, 및 다른 구현예에서 0.1 내지 10 mg/kg의 체중일 수 있고; (ii) siRNA 및 약제학적으로 허용되는 담체로부터 형성된 약제학적 조성물의 경우, 이의 siRNA의 양은 siRNA의 양을 기반으로, 0.001 내지 50 mg/kg의 체중, 일부 구현예에서 0.01 내지 10 mg/kg의 체중, 일부 구현예에서 0.05 내지 5 mg/kg의 체중, 및 일부 구현예에서 0.1 내지 3 mg/kg의 체중일 수 있다.
일부 구현예에서, 본 개시내용은 유효량의 본 개시내용의 siRNA 및/또는 약제학적 조성물 및/또는 siRNA 접합체를 간세포와 접촉시키는 단계, 및 본 개시내용의 siRNA 및/또는 약제학적 조성물 및/또는 siRNA 접합체를 간세포내로 도입시켜, RNA 간섭 메카니즘을 통해 간세포내 PCSK9 유전자의 발현을 억제하는 목적을 실현하는 단계를 포함하여, 간세포내에서 PCSK9 유전자의 발현을 억제하는 방법을 제공한다. 간세포는 간암 세포주(예를 들면, SMMC-7721, HepG2 및 Huh7), 및 단리된 1차 간세포로부터 선택할 수 있다. 일부 구현예에서, 간세포는 HepG2 간암 세포이다.
세포 내에서 FXI 유전자의 발현이 본 개시내용의 방법에 의해 억제되는 경우, 본 개시내용의 변형된 siRNA 및/또는 약제학적 조성물 및/또는 siRNA 접합체 중 siRNA의 양은 일반적으로 표적 유전자의 발현을 감소시키고 표적 세포의 표면에서 1 pM 내지 1 μM, 또는 0.01 nM 내지 100 nM, 또는 0.05 nM 내지 50 nM, 또는 0.05 nM 내지 약 5 nM의 세포외 농도를 생성하기에 충분한 양이다. 이러한 국소 농도를 달성하는데 요구되는 양은 다양한 인자, 예를 들면, 전달 방법, 전달 부위, 전달 부위와 표적 세포 또는 조직 사이의 세포 층의 수, 전달 경로(국소 또는 전신계) 등으로 변할 것이다. 전달 부위에서 농도는 표적 세포 또는 조직의 표면에서의 것보다 유의적으로 더 높을 수 있다.
키트(kit)
본 개시내용은 유효량의 본 개시내용의 변형된 siRNA, 약제학적 조성물, 및 siRNA 접합체 중 적어도 하나를 포함하는 키트를 제공한다.
일부 구현예에서, 본 개시내용의 키트는 용기 속에 변형된 siRNA를 제공할 수 있다. 일부 구현예에서, 본 개시내용의 키트는 약제학적으로 허용되는 부형제를 함유하는 용기를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 키트는 다른 성분, 예를 들면, 안정화제 또는 방부제를 추가로 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 본 개시내용의 키트는 변형된 본 개시내용의 siRNA를 제공하기 위한 용기와는 상이한 다른 용기 속에 적어도 하나의 추가의 치료제를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 키트는 변형된 siRNA와 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제 다른 성분(존재하는 경우)을 혼합하기 위한 설명서를 포함할 수 있다.
본 개시내용의 키트에서, 변형된 siRNA 및 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제, 뿐만 아니라 변형된 siRNA, 약제학적 조성물, 및/또는 siRNA 접합체 및/또는 the 접합체, 및/또는 약제학적으로 허용되는 부형제는 임의의 형태, 예를 들면, 액체형, 무수형 또는 동결건조형으로 제공될 수 있다. 일부 구현예에서, 변형된 siRNA 및 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제, 및 약제학적 조성물 및/또는 접합체 및 임의의 약제학적으로 허용되는 부형제(들)은 실질적으로 순수하고/하거나 멸균되어 있다. 일부 구현예에서, 본 개시내용의 키트는 멸균수를 제공할 수 있다.
이후에, 본 개시내용을 실시예로 추가로 나타낼 것이지만, 어떠한 양태에서도 이에 한정되지 않을 것이다.
실시예
달리 명시하지 않는 한, 다음의 실시예에 사용된 시약 및 배양 배지는 모두 상업적으로 이용가능하며 사용된 과정, 예를 들면, 핵산 전기영동 및 실시간 PCR은 모두 문헌: Molecular Cloning (Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989))에 기술된 방법에 따른다.
본 개시내용에서 합성된 FXI 유전자에 대한 siRNA 또는 siRNA 접합체 또는 음성 대조군으로서의 siRNA 또는 siRNA 접합체를 사용하여 세포를 형질감염시킨 경우, LipofectamineTM 2000(Invitrogen)을 형질감염 시약으로서 사용하였다. 구체적인 과정은 제조업자가 제공한 설명서를 참고할 수 있었다.
C57BL/6N 마우스: 6 내지 8주령으로, Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd.로부터 구매하였으며 이후 C57 마우스로 지칭됨.
이형접합성의 사람화된 마우스: 6 내지 8주령으로, Cyagen Biosciences Inc.로부터 구입함.
달리 명시하지 않는 한, 하기 제공된 시약의 비는 모두 용적 비(v/v)로 계산된다.
모든 실험 데이타는
Figure pct00071
(평균±표준 오차)로 나타내고, 데이타는 Graphpad prism 6.0 통계 분석 소프트웨어를 사용하여 분석한다.
제조 실시예 1: 접합체 L10-siFXIf1MIS의 제조
당해 제조 실시예에서, 접합체 L10-siPCSKa1M1S을 합성하였다. 당해 접합체는 L-9 접합 분자를 siRNA 번호 siFXIf1M1S에 접합시켜 형성시킨 siRNA 접합체이었다. 당해 접합체로 접합된 siRNA의 서열은 표 3에서 찾을 수 있다.
(1-1) 화합물 L-10의 합성:
화합물 L-10을 다음의 방법에 따라 합성하였다:
Figure pct00072
(1-1-1) 접합하는 말단 분절 GAL-5의 합성
Figure pct00073
(1-1-1a) GAL-2의 합성
100.0 g의 GAL-1(N-아세틸-D-갈락토스아민 하이드로클로라이드, CAS 번호: 1772-03-8, NingBo hongxiang bio-chem Co., Ltd.로부터 시판됨, 463.8 mmol)을 1000 ml의 무수 피리딘 속에 용해하고, 여기에 540 ml의 아세트산 무수물(Enox Inc.로부터 구입, 5565.6 mmol)을 빙수 욕에 가하여 실온에서 1.5시간 동안 교반하에 반응시켰다. 수득되는 반응 용액을 10 L의 빙수에 붓고 감압하에 흡입 여과시켰다. 잔사를 2 L의 물 속에 용해하고 아세토니트릴/톨루엔(아세토니트릴:톨루엔의 v/v 비 = 1:1)의 혼합 용매와 함께 완전히 용해될 때까지 가하였다. 용매를 증발로 제거하여 130.0 g의 생성물 GAL-2를 백색 고체로서 수득하였다.
(1-1-1b) GAL-3의 합성
단계(1-1-1a)에서 수득한 GAL-2(35.1 g, 90.0 mmol)를 213 ml의 무수 1,2-디클로로에탄 속에 용해하고, 여기에 24.0 g의 트리메틸실릴 트리플루오로메탄설포네이트(TMSOTf, CAS 번호: 27607-77-8, Macklin Inc.로부터 구입, 108.0 mmol)을 빙수 욕 속에서 질소 대기하에 가하여 실온에서 밤새 반응시켰다.
반응 용액을 희석용 400 ml 디클로로메탄과 함께 가하고, 규조토로 여과하고 1L의 포화된 수성 중탄산나트륨 용액과 함께 가하고 균일하게 혼합하였다. 유기 상을 단리하였다. 남아있는 수성 상을 각각 300 ml의 디클로로에탄으로 2회 추출하였다. 유기 상을 합하고 300 ml의 포화된 수성 중탄산나트륨 용액 및 300 ml의 포화된 염수로 각각 세척하였다. 유기 상을 단리하고 무수 황산나트륨으로 건조시켰다. 용매를 감압하에 증발 건조시켜 26.9 g의 생성물 GAL-3을 담황색의 점성 시럽으로 수득하였다.
(1-1-1c) GAL-4의 합성
단계(1-1-1b)에서 수득한 GAL-3(26.9 g, 81.7 mmol)을 136 ml의 무수 1,2-디클로로에탄 속에 용해하고, 30 g의 무수 4A 분자체 분말에 이어 9.0 g의 5-헥센-1-올(CAS 번호: 821-41-0, Adamas-beta Inc.로부터 구입, 89.9 mmol)과 함께 가하고, 실온에서 30분 동안 교반하였다. 9.08 g의 TMSOTf(40.9 mmol)를 빙수 욕 속에서 질소 대기 하에 가하여 실온에서 밤새 교반하에 반응시켰다. 4A 분자 체 분말을 여과로 제거하였다. 여액을 희석용의 300 ml의 디클로로에탄과 함께 가하고, 규조토로 여과하고 500 ml의 포화된 수성 중탄산나트륨 용액과 함께 가하고 세척을 위해 10분 동안 교반하였다. 유기 상을 단리하였다. 수성 상을 300 ml의 디클로로에탄으로 1회 추출하였다. 유기 상을 합하고 300 ml의 포화된 수성 중탄산나트륨 용액 및 300 ml의 포화된 염수로 각각 추출하였다. 유기 상을 단리하고 무수 황산나트륨으로 건조시켰다. 용매를 증발 건조로 감압하에 제거하여 41.3g의 생성물 GAL-4를 황색 시럽으로서 수득하고, 이를 다음의 산화 반응에서 정제없이 직접 사용하였다.
(1-1-1d) GAL-5의 합성
단계(1-1-1c)에 기술된 방법에 따라 수득된 GAL-4(14.9 g, 34.7 mmol)를 77 ml의 디클로로메탄 및 77 ml의 아세토니트릴의 혼합 용매 속에 용해하고, 103 ml의 탈이온수 및 29.7 g의 퍼요오드화나트륨(CAS 번호: 7790-28-5, Aladdin Inc.로부터 구입, 138.8 mmol) 각각과 함께 가하고, 빙욕 속에서 10분 동안 교반하였다. 삼염화루테늄(CAS 번호: 14898-67-0, Energy Chemical로부터 이용가능, 238 mg, 1.145 mmol)을 가하여 실온에서 밤새 반응시켰다. 수득되는 반응 용액을 교반 하에 300 ml의 물을 가하여 희석시키고, 포화된 중탄산나트륨을 가하여 pH를 약 7.5로 조절하였다. 유기 상을 단리하고 경사제거하였다. 수성 상을 단리하고 경사제거하였다. 수성 상을 200 ml의 디클로로메탄으로 각각 3회 추출하고, 유기 상을 경사제거하였다. 수성 상을 시트르산 고체를 사용하여 pH를 약 3으로 조절하고 200 ml의 디클로로메탄을 사용하여 각각 3회 추출하고, 수득되는 유기 상을 합하고 무수 황산나트륨으로 건조시켰다. 용매를 증발 건조로 감압하에 제거하여 6.85 g의 생성물 GAL-5를 백색 발포성 고체로서 수득하였다. 1H NMR (400 MHz, DMSO) δ 12.01 (br, 1H), 7.83 (d, J = 9.2 Hz, 1H), 5.21 (d, J = 3.2 Hz, 1H), 4.96 (dd, J = 11.2, 3.2 Hz, 1H), 4.49 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 4.07 - 3.95 (m, 3H), 3.92 - 3.85 (m, 1H), 3.74 - 3.67 (m, 1H), 3.48 - 3.39 (m, 1H), 2.20 (t, J = 6.8 Hz, 2H), 2.11 (s, 3H), 2.00 (s, 3H), 1.90 (s, 3H), 1.77 (s, 3H), 1.55 - 1.45 (m, 4H).
(1-1-2) L-8의 합성
Figure pct00074
J-0(9.886 g, 52.5 mmol, Alfa Aesar Inc.로부터 구입) 및 단계(1-1-1)에서 수득한 GAL-5(72.819 g, 162.75 mmol, 생성물의 수개의 배치를 합하여 수득함)를 525 ml의 디클로로메탄 속에 용해하고, 디이소프로필에틸아민(DIEA, 44.782 g, 346.50 mmol), 벤조트리아졸-1-일-옥시트리피롤리디노 포스로늄 헥사플루오로포스페이트(PyBOP, 90.158 g, 173.25 mmol) 및 하이드록시벤조트리아졸(HOBt, 23.410 g, 173.25mmol)과 함께 가하여 실온에서 4시간 동안 반응시켰다. 수득되는 반응 용액을 20 ml의 포화된 중탄산나트륨 용액 및 200 ml의 포화된 염수를 가하여 세척하였다. 수성 상을 2회, 각각 100 ml의 디클로로메탄으로 추출하였다. 유기 상을 합하고, 무수 황산나트륨으로 건조시키고, 여과하였다. 이후에, 용매를 증발 건조로 감압하에 제거하여 조 생성물을 수득하였다. 조 생성물을 정상 상 실리카 겔 컬럼(200 내지 300 메쉬)를 사용하여 정제하였다. 컬럼에 실리카 겔의 산도를 중화시키기 위한 10 wt% 트리에틸아민을 가하고, 1wt‰ 트리에틸아민으로 평형화하고, 디클로로메탄:메탄올 = 100:25 내지 100:40의 구배 용출로 용출하였다. 용출물을 수집하고, 용매를 증발 건조로 감압하에 제거하여 38.8 g의 순수한 생성물 L-8을 수득하였다. 1H NMR (400 MHz, DMSO) δ 7.84 (d, J = 9.0 Hz, 3H), 7.27 - 7.23 (m, 1H), 7.13 - 7.18 (m, 1H), 5.22 (d, J = 3.1 Hz, 3H), 4.97 (dd, J = 11.3, 3.1 Hz, 3H), 4.48 (d, J = 8.4 Hz, 3H), 4.09 - 3.98 (m, 9H), 3.88 (dd, J = 19.3, 9.3 Hz, 3H), 3.75 - 3.66 (m, 3H), 3.44 - 3.38 (m, 3H), 3.17 - 3.30 (m, 4H), 3.10 - 2.97 (m, 4H), 2.35 - 2.20 (m, 6H), 2.15 - 2.08 (m, 9H), 2.07 - 1.98 (m, 13H), 1.94 - 1.87 (m, 9H), 1.81 - 1.74 (m, 9H), 1.65 - 1.42 (m, 18H). MS m/z: C85H119N7O30, [M+H]+, 계산치: 1477.59, 측정치: 1477.23.
(1-1-3) L-7의 합성
(1-1-3a) A-1의 합성
Figure pct00075
DMTrCl(4,4'-디메톡시트리틸 클로라이드, 101.65 g, 300 mmol)을 1000 ml의 무수 피리딘 속에 용해하고, 칼슘 DL-글리세레이트 하이드레이트(28.63 g, 100 mmol)와 함께 가하여 45℃에서 20시간 동안 반응시켰다. 수득되는 반응 용액을 여과하였다. 잔사를 200 ml의 DCM으로 세정하고, 여액을 감압하에 농축 건조시켰다. 잔사를 500 ml의 디클로로메탄 속에 재용해하고 각각 200 ml의 0.5 M 트리에틸아민 포스페이트(pH = 7-8)로 2회 세척하였다. 수성 상을 각각 200 ml의 디클로로메탄을 사용하여 2회 추출하였다. 유기 상을 합하고, 무수 황산나트륨으로 건조시키고, 여과하였다. 용매를 감압하에 증발 건조시켜 제거하고, 잔사를 정상 상 실리카 겔 컬럼(200-300 메쉬)을 사용하여 정제하였다. 컬럼을 석유 에테르:에틸 아세테이트:디클로로메탄:메탄올 = 1:1:1:0.35 내지 1:1:1:0.55의 구배 용출로 용출하였다. 용출물을 수집하고, 용매를 감압하에 증발 건조시켜 제거하였다. 잔사를 600 ml의 디클로로메탄 속에 재용해하고, 200 ml의 0.5 M 트리에틸아민 포스페이트로 1회 세척하였다. 수성 상을 200 ml의 디클로로메탄으로 1회 추출하였다. 유기 상을 합하고, 무수 황산나트륨으로 건조시키고, 여과하였다. 용매를 감압하에 증발 건조시켜 제거하고, 잔사를 감압하에 진공 오일 펌프 속에서 밤새 건조시켜 50.7 g의 생성물 A-1을 백색 고체로서 수득하였다. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 7.46 (ddd, J = 6.5, 2.3, 1.1 Hz, 1H), 7.40 - 7.28 (m, 7H), 6.89 - 6.81 (m, 4H), 4.84 (d, J = 5.0 Hz, 1H), 4.36 - 4.24 (m, 1H), 4.29 (s, 6H), 3.92 (dd, J = 12.4, 7.0 Hz, 1H), 3.67 (dd, J = 12.3, 7.0 Hz, 1H), 2.52 (q, J = 6.3 Hz, 6H), 1.03 (t, J = 6.3 Hz, 9H). MS m/z: C24H23O6, [M-H]-, 계산치: 407.15, 측정치: 406.92.
(1-1-3b) L-7의 합성
Figure pct00076
단계(1-1-2)에서 수득한 L-8(40 g, 27.09 mmol, 생성물의 수개의 배치를 합하여 수득함) 및 단계(1-1-3a)에서 수득한 A-1(41.418 g, 81.27 mmol)을 합하고 271 ml의 디클로로메탄 속에 용해하고, 3-디에톡시포스포릴-1,2,3-벤조트리아진-4(3H)-온(DEPBT)(24.318 g, 81.37 mmol)을 가하고, 디이소프로필에틸아민(21.007 g, 162.54 mmol)과 함께 추가로 가하여 교반하에 25℃에서 1.5시간 동안 반응시켰다. 유기 상을 800 ml의 포화된 중탄산나트륨으로 세척하였다. 수성 상을 각각 50 ml의 디클로로메탄으로 3회 추출하였다. 유기 상을 150 ml의 포화된 염수로 세척하고, 수성 상을 50 ml의 디클로로메탄으로 1회 추출하고, 유기 상을 합하고, 무수 황산나트륨으로 건조시키고 여과하였다. 용매를 감압하에 증밞 건조로 제거하고, 잔사를 진공 오일 펌프 속에서 밤새 발포-건조시켜 조 생성물을 수득하였다. 조 생성물을 컬럼 정제에 적용시켰다. 컬럼을 2 kg의 정상 상 실리카 겔(200-300 메쉬)로 채우고, 실리카 겔의 산도를 중화시키기 위해 200 ml의 트리에틸아민을 가하고, 1 wt% 트리에틸아민을 함유하는 석유 에테르로 평형화시키고, 석유 에테르:에틸아세테이트:디클로로메탄:N,N-디메틸포름아미드 = 1:1:1:0.5 내지 1:1:1:0.6의 구배 용출로 용출시켰다. 용출물을 수집하고, 용매를 감압하에 증발 건조시켜 제거함으로써 40.4 g의 순수한 생성물 L-7을 수득하였다. 1H NMR (400 MHz, DMSO) δ7.90 - 7.78 (m, 4H), 7.75 - 7.64 (m, 1H), 7.38 - 7.18 (m, 9H), 6.91 - 6.83 (m, 4H), 5.25 - 5.10 (m, 4H), 4.97 (dd, J = 11.2, 3.2 Hz, 3H), 4.48 - 4.30 (m, 4H), 4.02 (s, 9H), 3.93 - 3.84 (m, 3H), 3.76 - 3.66 (m, 9H), 3.45 - 3.35 (m, 3H), 3.24 - 2.98 (m, 10H), 2.30 - 2.20 (m, 2H), 2.11 - 1.88 (m, 31H), 1.80 - 1.40 (m, 28H). MS m/z: C90H128N7O35, [M-DMTr]+, 계산치: 1564.65, 측정치: 1564.88.
(1-1-4) L-9의 합성
Figure pct00077
단계(1-1-3b)에서 수득한 L-7(40g, 21.4247mmol), 석신산 무수물(4.288g, 42.8494mmol) 및 4-디메틸아미노피리딘(DMAP, 5.235g, 42.8494mmol)을 혼합하고 215 ml의 디클로로메탄 속에 용해하고, 디이소프로필에틸아민(DIEA, 13.845g, 107.1235mmol)을 추가로 가하고, 25℃에서 24시간 동안 교반하였다. 수득되는 반응 용액을 800 ml의 0.5 M 트리에틸아민 포스페이트로 세척하였다. 수성 상을 각각 5 ml의 디클로로메탄으로 3회 추출하였다. 유기 상을 합하고 감압하에 무수 건조시켜 조 생성물을 수득하였다. 조 생성물을 컬럼 정제에 적용하였다. 컬럼에 1 kg의 정상 상 실리카 겔(200-300 메쉬)을 충전시키고, 1 wt%의 트리에틸아민을 실리카겔의 산도를 중화시키기 위해 가하고, 디클로로메탄으로 평형화시키고, 디클로로메탄:메탄올 = 100:18-100:20 중 1wt‰ 트리에틸아민의 용출 구배로 용출시켰다. 용출물을 수집하고, 용매를 감압하에 증발 건조시켜 제거함으로써 31.0 g의 조 생성물 L-9 접합 분자를 수득하였다. 1H NMR (400 MHz, DMSO) δ 8.58 (d, J = 4.2 Hz, 1H), 7.94 - 7.82 (m, 3H), 7.41 - 7.29 (m, 5H), 7.22 (d, J = 8.1 Hz, 5H), 6.89 (d, J = 8.3 Hz, 4H), 5.49 - 5.37 (m, 1H), 5.21 (d, J = 3.0 Hz, 3H), 4.97 (d, J = 11.1 Hz, 3H), 4.49 (d, J = 8.2 Hz, 3H), 4.02 (s, 9H), 3.88 (dd, J = 19.4, 9.4 Hz, 3H), 3.77 - 3.65 (m, 9H), 3.50 - 3.39 (m, 6H), 3.11 - 2.90 (m, 5H), 2.61 - 2.54 (m, 4H), 2.47 - 2.41 (m, 2H), 2.26 - 2.17 (m, 2H), 2.15 - 1.95 (m, 22H), 1.92 - 1.84 (m, 9H), 1.80 - 1.70 (m, 10H), 1.65 - 1.35 (m, 17H), 1.31 - 1.19 (m, 4H), 0.96 (t, J = 7.1 Hz, 9H). MS m/z: C94H132N7O38, [M-DMTr]+, 계산치: 1664.72, 측정치: 1665.03.
(1-1-5) 화합물 L-10의 합성
Figure pct00078
당해 단계에서, 화합물 L-10을 L-9 접합 분자를 고체 상 지지체에 연결시켜 제조하였다.
단계(1-1-4)에서 수득한 L-9 접합 분자(22.751 g, 11 mmol), O-벤조트리아졸-테트라메틸우로늄 헥사플루오로포스페이트(HBTU, 6.257 g, 16.5 mmol) 및 디이소프로필에틸아민(DIEA, 2.843 g, 22 mmol)을 혼합하고 900 ml의 아세토니트릴 속에 용해하고, 실온에서 5분 동안 교반하였다. 수득되는 반응 용액을 아미노메틸 수지(H2NResin, 88 g, 100-200 메쉬, 아미노 로딩: 400 μmol/g, Tianjin Nankai HECHENG S&T Co., Ltd.로부터 시판됨)와 함께 가하였다. 반응을 진탕기 상에서 25℃에서 150 rpm/min의 회전 속도로 18시간 동안 수행하였다. 잔사를 2회(각각 300 ml의 DCM) 및 3회(각각 300 ml의 아세토니트릴) 세척하고, 진공 오일 펌프 속에서 18시간 동안 건조시켰다. 이후에, 출발 물질(CapA, CapB, 4-디메틸아미노피리딘(DMAP) 및 아세토니트릴)을 캡핑 반응을 위해 표 2에 나타낸 바와 같은 충전 비에 따라 가하였다. 반응을 진탕기 상에서 25℃에서 150 rpm/min의 회전 속도로 5시간 동안 수행하였다. 반응액을 여과하였다. 잔사를 각각 300 ml의 아세토니트릴로 3회 세정하였다. 용매를 감압하에 증발 건조시키고, 잔사를 감압하에 진공 오일 펌프 속에서 밤새 건조시켜 102 g의 화합물 L-10(즉, 고체 상 지지체에 연결된 L-9 접합 분자)을 90.8 μmol/g의 부하(loading)를 사용하여 수득하였다.
[표 2]
Figure pct00079
상기 표에서, 캡(Cap) A 및 캡 B는 캡핑제의 용액이다. 캡 A는 피리딘/아세토니트릴 중 20 용적%의 N-메틸이미다졸의 혼합 용액이고, 여기서 피리딘 대 아세토니트릴의 용적 비는 3:5이다. 캡 B는 아세토니트릴 중 20 용적%의 아세트산 무수물의 용액이다.
(1-2) 접합체 L10-siFXIf1M1S의 센스 가닥의 합성
뉴클레오시드 단량체를 상기 단계에서 제조한 화합물 L-10으로부터의 주기로 출발하여, 포스포르아미디트 고체 상 합성 방법에 의해 센스 가닥으로 뉴클레오타이드의 정렬 서열에 따라 3' 내지 5' 방향으로 하나씩 연결시켰다. 각각의 뉴클레오시드 단량체의 연결은 탈보호, 커플링, 캡핑, 및 산화 또는 환원의 4-단계 반응을 포함하였다. 여기서, 2개의 뉴클레오타이드가 포스포디에스테르 연결을 경유에 연결된 경우, 탈보호, 커플링, 캡핑, 및 산화의 4-단계 반응은 이후의 뉴클레오시드 단량체의 연결 동안 포함되었고; 2개의 뉴클레오타이드가 포스포로티오에이트 연결을 경유하여 연결된 경우, 탈보호, 커플링, 캡핑, 및 황화의 4-단계 반응이 이후의 뉴클레오시드 단량체의 연결 동안 포함되었다. 합성 조건은 다음과 같다.
뉴클레오시드 단량체를 0.1 M 아세토니트릴 용액 속에 제공한다. 각각의 단계에서 탈보호 반응을 위한 조건은 동일한데, 즉, 25℃의 온도, 70초의 반응 시간, 탈보호 시약으로서 디클로로메탄(3% v/v) 중 디클로로아세트산의 용액, 및 5:1의 디클로로아세트산 대 고체상 지지체 상의 4,4'-디메톡시트리틸의 몰 비이다.
각각의 단계에서 커플링 반응에 대한 조건은 동일하며, 25℃의 온도, 1:10의 고체 상에 연결된 핵산 서열 대 뉴클레오시드 단량체의 몰 비, 1:10의 고체 상 지지체에 연결된 핵산 서열 대 커플링 시약의 몰비, 1:65의 고체 상 지지체에 연결된 핵산 서열 대 커플링 시약의 몰 비, 600초의 반응 시간, 커플링 시약으로서 5-에틸티오-1H-테트라졸(ETT)의 0.5 M 아세토니트릴 용액이다.
각각의 단계에서 캡핑 반응에 대한 조건은 동일하며, 25℃의 온도, 15초의 반응 시간, 캡핑제의 용액으로서 1:1의 몰 비의 캡 A 및 B의 혼합 용액, 및 1:1:1의 캡핑제 대 고체상 지지체에 연결된 핵산 서열의 몰비(아세트산 무수물: N-메틸이미다졸: 고체 상 지지체에 연결된 핵산 서열)이다.
각각의 단계에서 산화 반응에 대한 조건은 동일하며, 25℃의 온도, 15초의 반응 시간, 및 산화제로서 0.05 M 요오드 수; 및 30:1의 요오드 대 커플링 단계에서 고체 상에 연결된 핵산 서열의 몰 비이다. 반응은 테트라하이드로푸란:물:피리딘의 혼합 용매 = 3:1:1 속에서 수행한다.
각각의 단계에서 황화 반응에 대한 조건은 동일하며, 25℃의 온도, 300초의 반응 시간, 및 황화 시약으로서 크산탄 하이브리드; 및 황화 시약 대 커플링 단계에서 고체 상 지지체에 연결된 핵산 서열의 120:1의 몰 비를 포함한다. 반응은 아세토니트릴:피리딘의 혼합 용매 = 1:1 속에서 수행한다.
마지막 뉴클레오시드 단량체의 연결이 완료된 후, 고체 상 지지체에 연결된 핵산 서열을 절단하고, 탈보호, 정제, 탈염 및 동결건조시켜 센스 가닥을 수득하며, 여기서,
절단 및 탈보호를 위한 조건은 다음과 같다: 지지체에 연결된 합성된 뉴클레오타이드 서열을 25 wt% 수성 암모니아에 가하여 55℃에서 16시간 동안 반응시키고, 여기서 수성 암모니아의 양은 0.5 ml/μmol이다. 남아있는 지지체를 여과로 제거하고, 상층액을 진공 하에 농축 건조시켰다.
정제 및 탈염 조건은 다음과 같다: 핵산의 정제는 NaCl의 구배 용출로 제조 이온 크로마토그래피 정제 컬럼(Source 15Q)을 사용하여 달성한다. 구체적으로, 용출제 A는 20 mM 인산나트륨(pH 8.1)이고, 용매는 9:1(v/v)의 물/아세토니트릴이고; 용출제 B는 1.5 M 염화나트륨, 20 mM 인산나트륨(pH 8.1)이고, 용매는 9:1(v/v)의 물/아세토니트릴이고; 용출 구배: 용출제 A:용출제 B = 100:0 내지 50:50이다. 용출물을 수집하고, 합하고 역상 크로마토그래피 정제 컬럼을 사용하여 탈염시킨다. 구체적인 조건은 탈염용 세파덱스 컬럼(Sephadex column)(여과기: 세파덱스 G25) 및 탈이온수를 사용한 용출이다.
검출 방법은 다음과 같다: 상술한 센스 가닥의 순도는 이온 교환 크로마토그래피(IEX-HPLC)로 측정하였고; 분자량은 액체 크로마토그래피-질량 분광법(LC-MS)으로 분석하였다. 측정한 값이 계산된 값으로 확인되었다는 사실은 이의 3' 말단이 l-9 접합 분자에 접합된 센스 가닥 SS가 합성되었음을 나타낸다.
(1-3) 접합체 L10-siFXIf1M1S의 안티센스 가닥의 합성
접합체 L10-siFXIf1M1S의 안티센스 가닥을 포스포르아미디트 고체 상 합성 방법에 의해, 공통의 고체 상 지지체(UnyLinker™ 로딩된 NittoPhase®HL 고체 지지체, Kinovate Life Sciences Inc.)로부터의 주기로 출발하여 합성하였다. 고체 상 합성 방법에서 탈보호, 커플링, 캡핑, 산화 또는 황화, 절단 및 탈보호, 및 정제 및 탈염의 반응 조건은 센스 가닥의 합성에 사용된 것과 동일하였다. 안티센스 가닥 AS는 동결건조에 의해 수득하였다.
안티센스 가닥의 순도는 이온 교환 크로마토그래피(IEX-HPLC)로 검출하였고; 분자량은 액체 크로마토그래피-질량 분광법(LC-MS)으로 분석하였다. 측정된 값이 계산된 값과 일치하였다는 결과는 표적 서열을 가진 안티센스 가닥 AS가 합성되었음을 나타낸다.
(1-4) 접합체 L10-siFXIf1M1S의 합성
접합체 L10-siFXIf1M1S의 경우, 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 각각 주사용 수에 용해하여 40 mg/mL의 용액을 수득하였다. 이를 등몰 비로 혼합하고, 50℃에서 15분 동안 가열하고, 실온으로 냉각시켜 어닐링된 생성물을 생산하고, 동결건조시켜 동결건조된 분말을 수득하였다. 접합체를 초 순수 물(18.2MΩ*cm (25℃)의 저항성을 지닌 Milli-Q 초 순수 물 장치(ultra-pure water instrument))를 사용하여 0.2 mg/mL의 농도로 희석시키고, 분자량을 액체 크로마토그래피-질량 분광법(LC-MS) 장치(Waters Corp.로부터 구입, 모델: LCT Premier)로 측정하였다. 측정된 값이 계산된 값과 일치하였다는 사실은 합성된 접합체 1이 L-9 접합 분자를 진니 설계된 표적 이중 가닥 핵산 서열이었음을 나타낸다. siRNA 접합체는 화학식 (403)으로 나타낸 바와 같은 구조를 갖는다. siRNA는 표 3에 나타낸 바와 같은 접합체 L10-siFXIf1M1S의 서열을 갖는다.
[표 3]
Figure pct00080
여기서, C, G, U, 및 A는 뉴클레오타이드의 염기 조성을 나타내고; m은 문자 m의 좌측면에 인접합 뉴클레오타이드가 메톡시 변형된 뉴클레오타이드임을 나타내고; f는 문자 f의 좌측면에 인접한 뉴클레오타이드가 플루오로 변형된 뉴클레오타이드임을 나타내고; s는 문자 s의 양 측면에 인접한 2개의 뉴클레오타이드가 티오포스페이트 연결에 의해 연결됨을 나타내고; P는 문자 P의 우측에 인접한 뉴클레오타이드가 5'-포스페이트 뉴클레오타이드임을 나타낸다.
제조 실시예 2 내지 10: 본 개시내용의 siRNA 접합체의 합성
본 개시내용의 siRNA 접합체: L10-siFXIa1M1SP, L10-siFXIb1M1SP, L10-siFXIc1M1SP, L10-siFXId1M1SP, L10-siFXIe1M1SP, L10-siFXIg1M1SP, L10-siFXIh1M1SP, L10-siFXIi1M1S 및 L10-siFXIi1M1SP(이는 각각 표 3에 나타낸 바와 같은 siFXIa1M1SP, siFXIb1M1SP, siFXIc1M1SP, siFXId1M1SP, siFXIe1M1SP, siFXIg1M1SP, siFXIh1M1SP, siFXIi1M1S 및 siFXIi1M1SP에 상응하는 서열을 갖는다)를, (1) 접합체 L10-siFXIf1M1S의 센스 가닥 및 안티센스 가닥의 서열을 각각 표 3에 나타낸 바와 같은 접합체의 센스 가닥 및 안티센스 가닥의 것으로 대체하고; (2) 접합체 L10-siFXIa1M1SP, L10-siFXIb1M1SP, L10-siFXIc1M1SP, L10-siFXId1M1SP, L10-siFXIe1M1SP, L10-siFXIg1M1SP, L10-siFXIh1M1SP 및 L10-siFXIi1M1SP에 대해, 이의 안티센스 가닥의 5' 말단에서 제1의 뉴클레오타이드가 5'-포스페이트 뉴클레오타이드이었고; 상응하게, 포스포르아미디트 고체 상 합성 벙법에 따라 안티센스 가닥의 제조 동안, 마지막 뉴클레오시드 단량체의 연결 후, 화학식 (CPR-I)의 단량체(Suzhou GenePharma Inc.로부터 제품 번호 13-2601-XX로 구입함)를 탈보호, 커플링, 캡핑, 및 산화의 4-단계 반응에 의해 안티센스 가닥의 5' 말단에 연결함으로써 5'-포스페이트 뉴클레오타이드를 형성시키는 것을 제외하고는, 제조 실시예 1에 기술된 바와 동일한 방법으로 각각 추가로 합성하였다.
Figure pct00081
연결 동안, 사용된 탈보호, 커플링, 캡핑 및 산화의 조건은 센스 가닥의 합성시 사용된 것과 동일하였다. 완전히 연결시킨 후, 서열을 추가로 전단, 탈보호, 정제, 탈염, 및 최종적으로 동결건조시켜 안티센스 가닥 AS를 수득하였다.
접합체를 제조한 후, 이의 분자량을 각각 제조 실시예 1에서와 동일한 방법으로 측정하였다. 결과는 측정된 값이 계산된 값과 일치하였음을 나타내었고, 이는 합성된 siRNA 접합체가 L-9 접합 분자를 지니조 화학식 (403)으로 나타낸 바와 같은 구조를 갖는 표적 이중 가닥 핵산 서열이었음을 나타낸다. 이러한 접합체 속에 함유된 siRNA는 표 3에 나타낸 바와 같이 접합체 L10-siFXIa1M1SP, L10-siFXIb1M1SP, L10-siFXIc1M1SP, L10-siFXId1M1SP, L10-siFXIe1M1SP, L10-siFXIg1M1SP, L10-siFXIh1M1SP, L10-siFXIi1M1S 또는 L10-siFXIi1M1SP에 상응하는 서열을 갖는다.
제조 실시예 11 내지 20: 본 개시내용의 siRNA의 합성
표 4에 나타낸 바와 같은 siRNA 서열을 각각 고체 상 합성 방법으로 합성하고, 이의 분자량을 측정하였다. 표 4에 나타낸 바와 같이, 등몰 비로 존재하고 서로에 대해 상보성인 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 DEPC 물 속에 용해한 다음, 어닐링하여 표 4에 나타낸 바와 같은, 본 개시내용의 siRNA를 수득하였다: siFXIa1M1SP, siFXIb1M1SP, siFXIc1M1SP, siFXId1M1SP, siFXIe1M1SP, siFXIf1M1SP, siFXIg1M1SP, siFXIh1M1SP, siFXIi1M1SP, 및 siFXIe1.
서열 siFXIe1의 제조 동안, 표적 서열은 변형되지 않은 뉴클레오타이드를 포함한다. 이러한 경우, 절단 및 탈보호 조건 하에서, 수성 암모니아로 처리한 후, 생성물을 0.4 ml/μmol의 N-메틸피롤리돈 속에 용해한 후, 0.3 ml/μmol의 트리에틸아민 및 0.6 ml/μmol의 트리에틸아민 트리하이드로플루오라이드를 단일 가닥 핵산의 양을 기반으로 가함으로써, 리보스 상의 2'-TBDMS 보호를 제거하였다.
더욱이, 표적 서열내 안티센스 가닥의 5' 말단에서 제1 뉴클레오타이드가 5'-포스페이트 뉴클레오타이등었던 경우에, 포스포르아미디트 고체 상 합성 방법에 따른 안티센스 가닥의 제조 동안에, 안티센스 가닥내 마지막 뉴클레오사이드 단량체의 연결 후, 화학식 (CPR-I)의 단량체(Suzhou GenePharma Inc.로부터 제품 번호13-2601-XX로 구입함)를 탈보호, 커플링, 캡핑, 및 산화의 4-단계 반응에 의해 안티센스 가닥의 5' 말단에 연결시켜, 5'-포스페이트 뉴클레오타이드를 형성시켰다.
Figure pct00082
연결 동안, 사용된 탈보호, 커플링, 캡핑 및 산화의 조건은 센스 가닥의 합성시 사용된 것과 동일하였다. 완전히 연결시킨 후, 서열을 추가로 절단, 탈보호, 정제, 탈염, 및 최종적으로 동결건조시켜 안티센스 가닥 AS를 수득하였다.
비교 제조 실시예 1: 비교 siRNA의 합성
표 4에 NC로서 번호매김된 siRNA의 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 각각 고체 상 합성 방법으로 합성하고, 이의 분자량을 측정하였다. 등몰 비로 존재하는 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 DEPC 물 속에 용해한 다음 어닐링하여 NC로서 번호매김된 비교 siRNA를 수득하였다.
[표 4]
Figure pct00083
여기서, C, G, U, 및 A는 뉴클레오타이드의 염기 조성을 나타내고; m은 문자 m의 좌측에 인접한 뉴클레오타이드가 메톡시 변형된 뉴클레오타이드임을 나타내고; f는 문자 f의 좌측에 인접한 뉴클레오타이드가 플루오로 변형된 뉴클레오타이드임을 나타내고; s는 문자 s의 양쪽 측면에 인접한 2개의 뉴클레오타이드가 티오포스페이트 연결에 의해 연결됨을 나타내고; P는 문자 P의 우측면에 인접한 뉴클레오타이드가 5'-포스페이트 뉴클레오타이드임을 나타낸다.
본 개시내용의 상기 siRNA 또는 접합체를 완전히 제조한 후, 이를 고체 분말로 동결건조시키고 사용할 때까지 저장하였다. 사용시, 이를 주사용 수, 정상 염수(NS), 인산염 완충제(PB) 또는 포스페이트 염 완충제(PBS)를 사용하여 목적한 농도에서 용액으로 재구성하였다.
실험 실시예 1 본 개시내용의 siRNA의 시험관내 억제 활성
HEK293A 세포(Nanjing Cobioer Biosciences Co., LTD로부터 구입함)를 10% 태아 소 혈청(FBS, Hyclone company), 및 0.2v% 페니실린-스트렙토마이신(Gibco, Invitrogen company)을 함유하는 DMEM 완전 배지(Hyclone company) 속에서 37℃에서 5% CO2/95% 공기를 함유하는 항온처리기 속에서 배양하였다.
문헌: Kumico Ui-Tei et. al., Functional dissection of siRNA sequence by systematic DNA substitution: modified siRNA with a DNA seed arm is a powerful tool for mammalian gene silencing with significantly reduced off-target effect. Nucleic Acids Research, 2008.36(7), 2136-2151에 기술된 방법에 따라서, 검출용 플라스미드를 작제하고 평가할 siRNA(siFXIe1)를 사용하여 HEK293A 세포 내로 동시-형질감염시키고; 이중 루시퍼라제 리포터 유전자의 발현 수준에 의해 siRNA의 억제 활성을 반영시켰다. 구체적인 단계는 다음과 같다:
[1] 검출용 플라스미드의 작제
검출용 플라스미드를 psiCHECKTM-2(PromegaTM) 플라스미드를 사용하여 작제하였다. 당해 플라스미드는 표적 서열, 즉, siRNA 표적 서열을 함유한다. 검출될 siRNA는 하기 나타낸 표적 서열을 갖는다. 특히, siFXIe1(제조 실시예 20으로부터 제조)은 다음의 표적 서열을 갖는다:
GAATCTCAAAGAAATCTTT (서열 번호: 565).
표적 서열을 psiCHECKTM-2 플라스미드의 Xho I/Not I 부위내로 클로닝하였다.
[2] 형질감염(transfection)
HEK293A 세포를 96-웰 플레이트에 8 × 103개의 세포/웰에서 접종하였다. 16시간 후, 세포 성장 밀도는 70 내지 80%에 도달하였다. 이때에, 배양 웰 속의 H-DMEM 완전 배지를 흡입하였다. 80 μl의 Opti-MEM 배지(GIBCO company)를 각각의 웰에 가하고 배양을 1.5 시간 동안 지속하였다.
상기 검출용 플라스미드를 DEPC-처리된 물로 희석하여 200 ng/μl의 검출 플라스미드가 들어있는 작업 용액을 수득하고; siFXIe1을 DEPC-처리된 물 속에서 siRNA 작업 용액으로 각각 10 nM 및 3 nM(siRNA의 양을 기반으로 함)의 농도에서 제조하였다.
1A1 용액을 제조하였다. 1A1 용액 각각의 부위는 10 nM의 농도에서 1 μl의 siRNA 작업 용액, 검출용 플라스미드(검출용 플라스미드 10 ng을 함유)가 들어있는 0.05 μl의 작업 용액(10 ng의 검출 플라스미드 함유) 및 10 μl의 Opti-MEM 배지를 함유한다.
1A2 용액을 제조하였다. 1A2 용액의 각각의 부위는 3 nM의 농도에서 1 μl의 siRNA 작업 용액, 검출용 플라스미드(검출용 플라스미드 10 ng을 함유)가 들어있는 0.05 μl의 작업 용액(10 ng의 검출 플라스미드 함유) 및 10 μl의 Opti-MEM 배지를 함유한다.
1B 용액을 제조하였다. 1B 용액의 각각의 부위는 0.2 μl의 Lipofectamine™ 2000 및 10 μl의 Opti-MEM 배지를 함유한다.
1C 용액을 제조하였다. 1C 용액의 각각의 부위는 검출용 플라스미드가 들어있는 0.05 μl의 작업 용액(10 ng의 검출 플라스미드 함유) 및 10 μl의 Opti-MEM 배지를 함유한다.
1B 용액의 하나의 부위를 1A1 용액의 하나의 부위 또는 1A2 용액의 하나의 부위와 각각 순차적으로 혼합하였다. 혼합물을 20분 동안 실온에서 항온처리하여 형질감염 복합체 1X1 및 1X2를 수득하였다. 1B 용액의 하나의 부위를 1C 용액의 하나의 부위와 혼합하고, 혼합된 용액을 20분 동안 실온에서 항온처리하여 형질감염 복합체를 1X3을 제조하였다.
형질감염 복합체 1X1을 3개의 배양 웰 각각에 20 μl/웰의 양으로 가한 다음, 균일하게 혼합하여 최종 0.1 nM의 siRNA 농도를 수득하였다(시험 그룹 1으로 기록함).
형질감염 복합체 1X2를 각각 3개의 추가의 배양 웰에 20 μl/웰의 양으로 가한 다음, 균일하게 혼합하여 0.03 nM의 농도의 최종 siRNA 농도에서 공-형질감염 혼합물(시험 그룹 2로 기록함)을 수득하였다.
형질감염 복합체 1X3을 20 μl/웰의 양으로 3개의 추가의 배양 웰 각각에 가하여, siRNA가 없는 형질감염 혼합물(대조군 그룹으로 기록함)을 수득하였다.
siRNA-함유 공-형질감염 혼합물 및 siRNA가 없는 형질감염 혼합물을 배양 웰 속에서 4시간 동안 동시-형질감염시킨 후, 각각의 웰에 20% FBS를 함유하는 100 μl의 H-DMEM 완전 배지를 보충하였다. 96-웰 플레이트를 CO2 항온처리기에 두고 항온처리를 24시간 동안 지속시켰다.
[3] 검출
배양 웰 속의 배지를 흡입하였다. 150 μl의 Dual-Glo® 루시퍼라제 시약과 H-DMEM의 혼합 용액(1:1의 용적 비)를 각각의 웰에 가하고, 완전히 배합하였다. 항온처리를 10분 동안 실온에서 수행한 후, 120 μl의 혼합된 용액을 96-웰 ELISA 플레이트로 이전시켰다. ELISA 플레이트의 각각의 웰 속에서 개똥벌래(Fir)의 화학발광성 값을 Synergy II 다중모드 미세플레이트 판독기(multimode microplate reader)(BioTek company) 속에서 판독하였다. 이후에, 60 μl의 Dual-Glo® Stop & Glo® 시약을 ELISA 플레이트의 각각의 웰에 가하고, 완전히 배합하였다. 실온에서 10분 동안 항온처리를 수행한 후, ELISA 플레이트의 각각의 웰에서 Renilla(Ren)의 화학발광성 값을 Fir을 판독하기 위한 정렬에 따라 미세플레이트 판독기를 사용하여 판독하였다.
각각의 웰의 발광성 비(비 = Ren/Fir)를 계산하고, 각각의 시험 그룹 또는 대조군 그룹의 발광성 비(비(시험) 또는 비(대조군))은 3개의 배양 웰의 비의 평균이었다. 참고 값으로서 대조군 그룹의 발광성 비를 사용하여, 각각의 시험 그룹의 발광성 비를 표준화함으로써 비(시험)/비(대조군)의 비 R을 수득하였으며, 이는 발현 수준, 즉, 리포터 유전자 Renilla의 상대적인 잔류 활성을 나타낸다. siRNA의 억제율은 (1-R) x 100%이었다.
표적 서열에 대한 상이한 농도에서 siFXIe1의 억제 활성 결과는 표 5에 나타낸 바와 같다.
비교 실험 실시예 1: 비교 siRNA NC의 시험관내 억제 활성
psiCHECK 시스템에서 비교 siRNA NC의 억제 활성을 시험할 siRNA를 비교 siRNA NC로 대체하는 것 외에는, 실험 실시예 1에 기술된 바와 동일한 방법으로 시험하였다. 결과는 표 5에 나타낸 바와 같았다.
[표 5]
Figure pct00084
결과는 siFXIe1이각각의 농도에서 표적 서열에 대해 시험관내에서 양호한 농도-의존성 억제 활성을 나타내었음을 나타내었다. 특히, 0.1 nM의 siRNA 농도에서 표적 서열에 대한 siFXIe1의 억제율은 72.43%이었고, 이는 FXI 유전자의 발현을 억제하는 양호한 효과를 나타낸다.
실험 실시예 2: psiCHECK 시스템에서 FXI mRNA에 대한 siRNA 서열의 IC 50 의 측정
당해 실험 실시예에서, 시험관내에서 psiCHECK 시스템 내 siFXIa1M1SP, siFXIb1M1SP, siFXIc1M1SP, siFXId1M1SP, siFXIe1M1SP 및 siFXIi1M1SP의 IC50 값을 시험하였다.
문헌: Kumico Ui-Tei et. al., Functional dissection of siRNA sequence by systematic DNA substitution: modified siRNA with a DNA seed arm is a powerful tool for mammalian gene silencing with significantly reduced off-target effect. Nucleic Acids Research, 2008.36(7), 2136-2151에 기술된 방법에 따라서, 검출용 플라스미드를 작제하고 평가할 siRNA를 사용하여 HepG2 세포 내로 동시-형질감염시키고; 이중 루시퍼라제 리포터 유전자의 발현 수준에 의해 siRNA의 온-표적 활성 및 오프-표적 활성을 반영시켰다. 구체적인 단계는 다음과 같다:
[1] 검출용 플라스미드의 작제
검출용 플라스미드를 psiCHECKTM-2(PromegaTM) 플라스미드를 사용하여 작제하였다. 당해 플라스미드는 표적 서열을 함유하며, 이는 진뱅크 수탁 번호 NM_000128.3으로 나타낸 바와 같은 서열이었다.
표적 서열을 psiCHECKTM-2 플라스미드의 Xho I/Not I 부위내로 클로닝하였다.
[2] 세포 배양 및 형질감염
HepG2 세포(GuangZhou Jennio Biotech Co., Ltd로부터 구입함)를 20% 태아 소 혈청(FBS, Hyclone company), 및 0.2v% 페니실린-스트렙토마이신(Gibco, Invitrogen company)을 함유하는 DMEM 완전 배지(Hyclone company) 속에서 37℃에서 5% CO2/95% 공기를 함유하는 항온처리기 속에서 배양하였다.
HepG2 세포를 96-웰 플레이트에 8 Х 103 세포/웰에서 항온처리하였다. 16시간 후, 세포 성장 밀도는 70 내지 80%에 도달하였다. 이때, 배양 웰 속의 H-DMEM 완전 배지를 흡인하였다. 80 μl의 Opti-MEM 배지(GIBCO company)를 각각의 웰에 가하고 1.5 시간 동안 추가로 배양하였다.
상기 검출용 플라스미드를 DEPC-처리된 물로 희석하여 검출용 플라스미드가 들어있는 200 ng/μl의 작업 용액을 수득하였다; 각각의 다음 siRNA를 DEPC-처리된 물을 사용하여 siRNA 작업 용액으로 각각 100 nM, 33.3 nM, 11.1 nM, 3.70 nM, 1.23 nM, 4.12 nM, 0.137 nM, 0.0457 nM, 0.0152 nM 및 0.00508 nM의 10개의 상이한 농도에서 제조하였다. 사용된 siRNA는 각각 siFXIa1M1SP, siFXIb1M1SP, siFXIc1M1SP, siFXId1M1SP, siFXIe1M1SP 및 siFXIi1M1SP이다.
각각의 siRNA의 경우, 2A1 내지 2A10 용액을 각각 제조하였다. 2A1 내지 2A10 용액의 각각의 부위는 상기 10개의 농도에서 1 μl의 각각의 siRNA 작업 용액, 검출용 플라스미드가 들어있는 0.05 μl의 작업 용액(10 ng의 검출용 플라스미드 함유) 및 10 μl의 Opti-MEM 배지를 함유한다.
1B 용액의 하나의 부위를 각각의 siRNA에 대해 수득된 2A1 내지 2A10 용액의 하나의 부위와 혼합하였다. 혼합된 용액을 20분 동안 실온에서 항온처리하여 각각의 siRNA에 대해 형질감염 복합체 2X1 내지 2X10을 수득하였다.
각각의 siRNA에 대해 형질감염 복합체 2X1 내지 2X10을 20 μl/웰의 양으로 배양 웰 각각에 가한 다음, 균일하게 혼합하여 각각의 siRNA에 대해 약 1 nM, 0.333 nM, 0.111 nM, 0.0370 nM, 0.0123 nM, 0.00412 nM, 0.00137 nM, 0.000457 nM, 0.000152 nM, 및 0.0000508 nM의 최종 농도에서 형질감염 복합체를 수득하였다. 각각의 siRNA에 대해 형질감염 복합체 2X1 내지 2X10을 각각 3개의 배양 세포 내에 형질감염시켜 siRNA-함유 동시-형질감염 혼합물(시험 그룹으로 기록함)을 수득하였다.
형질감염 복합체 1X3을 20 μl/웰의 양으로 추가의 배양 웰 각각에 가하여, siRNA가 없는 동시-형질감염 혼합물(대조군 그룹으로 기록함)을 수득하였다.
siRNA-함유 동시-형질감염 혼합물 및 siRNA가 없는 동시-형질감염 혼합물을 배양 웰 속에서 4시간 동안 형질감염시킨 후, 각각의 웰에 20% FBS를 함유하는 100 μl의 H-DMEM 완전 배지를 보충하였다. 96-웰 플레이트를 CO2 항온처리기 속에 두고 24시간 동안 추가로 배양하였다.
[3] 검출
배양 웰 속의 배지를 흡입하였다. 150 μl의 Dual-Glo® 루시퍼라제 시약과 H-DMEM의 혼합 용액(1:1의 용적 비)를 각각의 웰에 가하고, 완전히 배합하였다. 항온처리를 10분 동안 실온에서 수행한 후, 120 μl의 혼합된 용액을 96-웰 ELISA 플레이트로 이전시켰다. ELISA 플레이트의 각각의 웰 속에서 개똥벌래(Fir)의 화학발광성 값을 Synergy II 다중모드 미세플레이트 판독기(multimode microplate reader)(BioTek company) 속에서 판독하였다. 이후에, 60 μl의 Dual-Glo® Stop & Glo® 시약을 ELISA 플레이트의 각각의 웰에 가하고, 완전히 배합하였다. 실온에서 10분 동안 항온처리를 수행한 후, ELISA 플레이트의 각각의 웰에서 Renilla(Ren)의 화학발광성 값을 Fir을 판독하기 위한 정렬에 따라 미세플레이트 판독기를 사용하여 판독하였다.
각각의 웰의 발광성 비(비 = Ren/Fir)를 계산하고, 각각의 시험 그룹 또는 대조군 그룹의 발광성 비(비(시험) 또는 비(대조군))은 3개의 배양 웰의 비의 평균이었다. 참고 값으로서 대조군 그룹의 발광성 비를 사용하여, 각각의 시험 그룹의 발광성 비를 표준화함으로써 비(시험)/비(대조군)의 비 R을 수득하였으며, 이는 발현 수준, 즉, 리포터 유전자 Renilla의 상대적인 잔류 활성을 나타낸다. siRNA의 억제율은 (1-R) x 100%이었다.
용량-반응 곡선을 Graphpad 5.0 소프트웨어의 함수 log(억제제) 대 반응-가변 기울기를 사용하여 핏팅하였다. GSCM을 표적화하는 siRNA의 IC50 값을 용량-효과 곡선을 기반으로 계산하였다. 특히, 핏팅된 용량-반응 곡선은 하기 수학식에 부합하였다:
Figure pct00085
여기서:
Y는 비 R, 즉, 잔류 활성이고,
X는 형질감염된 siRNA의 농도의 대수이고,
Bot는 정상 상태의 하단에서 Y 값이고,
Top는 정상 상태의 상단에서 Y 값이고,
X'는 Y가 하한과 상한 사이의 중간 값인 상태에서 핏팅으로 수득된 X 값이고,
HillSlope는 X'에서 핏팅에 의한 곡선의 기울기이다.
Y가 50%인 경우, 상응하는 X50 값은 용량-효과 곡선 및 상응하는 수학식을 기반으로 측정하였다. 각각의 siRNA의 IC50 값은 10^X50으로 계산되었다.
구체적인 IC50 값은 표 6에 요약하였다.
[표 6]
Figure pct00086
표 6의 결과로부터 알 수 있는 바와 같이, 본 개시내용의 siRNA는 HepG2 세포내에서 시험관내에서 표적 서열 1에 대해 매우 높은 억제 활성을 나타내었고, IC50 값은 0.013 내지 0.119 nM의 범위이었다.
실험 실시예 3: HepG2 세포내에서 FXI mRNA에 대한 siRNA의 IC 50 의 측정
HepG2 세포를 24-웰 플레이트에 7 Х 104 세포/웰에서 항온처리하였다. 16시간 후, 세포 성장 밀도는 70 내지 80%에 도달하였다. 이때, 배양 웰 속의 H-DMEM 완전 배지를 흡인하였다. 500 μl의 Opti-MEM 배지(GIBCO company)를 각각의 웰에 가하고 1.5 시간 동안 추가로 배양하였다.
다음의 siRNA 각각을 DEPC-처리된 물을 사용하여 siRNA 작업 용액으로 각각 20 μM, 6.67 μM, 2.22 μM, 0.741 μM, 0.247 μM, 0.0823 μM 및 0.0274 μM의 7개의 상이한 농도에서 제조하였다. 사용된 siRNA는 각각 siFXIa1M1SP, siFXIb1M1SP, siFXIc1M1SP 또는 siFXId1M1SP이다.
각각의 siRNA의 경우, 3A1 내지 3A7 용액을 각각 제조하였다. 3A1 내지 3A7 용액의 각각의 부위는 궁극적으로, 상기 7개의 농도에서 3 μl의 각각의 siRNA 작업 용액 및 50 μl의 Opti-MEM 배지를 함유한다.
3B 용액을 제조하였다. 3B 용액의 하나의 부위는 1 μl의 LipofectamineTM 2000 및 50 μl의 Opti-MEM 배지를 함유한다.
3B 용액의 하나의 부위를 수득된 3A1 내지 3A7 용액의 하나의 부위와 각각의 siRNA 각각에 대해 혼합하였다. 혼합된 용액을 20분 동안 실온에서 항온처리하여 각각의 siRNA에 대해 형질감염 복합체 3X1 내지 3X7을 수득하였다.
3B 용액의 하나의 부위를 50 μl의 Opti-MEM 배지와 혼합하였다. 혼합된 용액을 20분 동안 실온에서 항온처리하여 형질감염 복합체 3X8을 형성시켰다.
각각의 siRNA에 대해 형질감염 복합체 3X1 내지 3X7을 100 μl/웰의 양으로 배양 웰 각각에 가한 다음, 균일하게 혼합하여 각각의 siRNA에 대해 약 100 nM, 33.3 nM, 11.1 nM, 3.70 nM, 1.23 nM, 0.412 nM, 0.137 nM의 최종 농도에서 형질감염 복합체를 수득하였다. 각각의 siRNA에 대해 형질감염 복합체 3X1 내지 3X7을 각각 3개의 배양 세포 내에 형질감염시켜 siRNA-함유 형질감염 혼합물(시험 그룹으로 기록함)을 수득하였다.
형질감염 복합체 3X8을 100 μl/웰의 양으로 3개의 추가의 배양 웰 각각에 가하여, siRNA가 없는 동시-형질감염 혼합물(대조군 그룹으로 기록함)을 수득하였다.
siRNA-함유 형질감염 혼합물 및 siRNA가 없는 형질감염 혼합물을 배양 웰 속에서 4시간 동안 형질감염시킨 후, 각각의 웰에 20% FBS를 함유하는 1 mL의 H-DMEM 완전 배지를 보충하였다. 24-웰 플레이트를 CO2 항온처리기 속에 두고 24시간 동안 추가로 배양하였다.
후속적으로 각각의 웰의 세포 내 총 RNA를 RNAVzol(Vigorous Biotechnology Beijing Co., Ltd.로부터 구입함. 제품 번호 N0002)를 사용하여 설명서에 기술된 상세한 단계에 따라 추출하였다.
각각의 웰의 세포에 대해, 1 μg의 총 RNA를 취하고, 시약을 역 전사 키트 GoldenstarTM RT6 cDNA 합성 키트(Beijing Tsingke Biotechnology Co., Ltd.로부터 구입함, 제품 번호 TSK301M) 속에 제공하였으며, 여기서 GoldenstarTM 올리고 (dT)17을 프라이머로서 선택하였다. 20 μl의 역 전사 반응 시스템을 키트 설명서 내 역 전사용 과정에 따라 제조하여 각각의 웰내 세포의 총 rna를 역 전사하였다. 역 전사용 조건은 다음과 같았다: 각각의 역 전사 반응 시스템을 두고 50℃에서 50분 동안 항온처리한 다음 85℃에서 5분 동안 항온처리하고, 최종적으로 4℃에서 30초 동안 항온처리하고; 반응이 완료된 후, 80 μl의 DEPC 물을 각각의 전사 반응 시스템에 가하여 cDNA-함유 용액을 수득하였다.
각각의 역 전사 반응 시스템에 대해, 5 μl의 전술한 cDNA-함유 용액을 주형으로서 취히고 시약을 NovoStart® SYBR qPCR SuperMix Plus kit(Novoprotein Scientific Co., Ltd.로부터 구입함, 제품 번호 E096-01B)에서 제공된 시약을 사용하여 20 μl의 qPCR 반응 시스템을 제조하였으며, 여기서 표적 유전자 FXI 및 내부 참고 유전자 GAPDH를 증폭시키는데 사용된 PCR 프라이머의 서열은 표 7에 나타낸 바와 같았고, 각각의 프라이머의 최종 농도는 0.25 μM이다. 각각의 qPCR 반응 시스템을 ABI StepOnePlus 실시간 PCR 장치 상에 두고, 3-단계 방법을 사용하여 증폭시켰다. 증폭 과정은 95℃에서 10분 동안 예비-변성에 이어 95℃에서 30초 동안 변성, 및 60℃에서 30초 동안 어닐링, 및 72℃에서 30초 동안 연장이었다. 상술한 변형, 어닐링, 및 연장을 40회 반복한 후, 증폭된 표적 유전자 FXI 및 내부 참고 유전자 GAPDH를 함유하는 생성물 W를 수득하였다. 생성물 W를 이후에 95℃에서 15초 동안, 60℃에서 1분 동안, 및 95℃에서 15초 동안 항온처리하였다. 생성물 W내 표적 유전자 FXI 및 내부 참고 유전자 GAPDH의 용융 곡선을 각각 실시간 형광성 qPCR 장치를 사용하여 수집하고, 표적 유전자 FXI 및 내부 참고 유전자 GAPDH의 Ct 값을 수득하였다.
[표 7]
Figure pct00087
각각의 시험 그룹 및 대조군 그룹에서 표적 유전자 FXI의 상대적인 발현 수준을 비교 Ct(△△Ct) 방법으로 정량적으로 계산하였다. 계산 방법은 다음과 같이 기술되었다:
△Ct(시험 그룹) = Ct(시험 그룹 내 표적 유전자) - Ct(시험 그룹 내 내부 표준 유전자)
△Ct(대조군 그룹) = Ct(대조군 그룹 내 표적 유전자) - Ct(대조군 그룹 내 내부 표준 유전자)
△△Ct(시험 그룹) = △Ct(시험 그룹) - △Ct(대조군 그룹 내 평균 값)
△△Ct(대조군 그룹) = △Ct(대조군 그룹) - △Ct(대조군 그룹 내 평균 값)
여기서, △Ct(대조군 그룹 내 평균 값)는 대조군 그룹 내 3개의 배양 웰 각각의 △Ct(대조군 그룹)의 수학적 평균 값이다. 따라서, 시험 그룹 또는 대조군 그룹내 각각의 배양 웰은 △△Ct 값에 상응한다.
시험 그룹 내 FXI mRNA의 발현 수준을 대조군 그룹내에서의 것을 기반으로 표준화하였으며, 여기서 대조군 그룹 내 FXI mRNA의 발현 수준은 100%로 정의하였다;
시험 그룹 내 FXI mRNA의 상대적인 발현 수준 = 2-△△Ct(시험 그룹) Х 100%.
동일한 시험 그룹에서 siRNA의 경우, 각각의 농도에서 시험 그룹 내 FXI mRNA의 상대적인 발현 수준의 평균 값은 당해 농도에서 3개의 배양 웰의 상대적인 발현 수준의 수학적 평균 값이었다.
용량 반응 곡선을 Graphpad 5.0 소프트웨어의 함수 log(억제제) 대 반응-가변 기울기를 사용하여 핏팅하였다. FXI mRNA에 대한 각각의 siRNA의 IC50 값을 용량-효과 곡선을 기반으로 계산하였다. 특히, 핏팅에 의해 수득된 용량-반응 곡선은 하기 수학식에 부합하였다:
Figure pct00088
여기서:
Y는 각각의 시험 그룹에서 FXI mRNA의 상대적인 발현 수준이고,
X는 상응하는 시험 그룹에서 사용된 siRNA의 최종 농도의 대수이고,
Bot는 정상 상태의 하단에서 Y 값이고,
Top는 정상 상태의 상단에서 Y 값이고,
X'는 Y가 하한과 상한 사이의 중간 값인 상태에서 핏팅으로 수득된 X 값이고,
HillSlope는 X'에서 핏팅에 의한 곡선의 기울기이다.
Y가 50%인 경우, 상응하는 X50 값은 용량-효과 곡선 및 상응하는 수학식을 기반으로 측정하였다. 각각의 siRNA의 IC50 값은 10^X50으로 계산되었다.
FXI mRNA에 대한 각각의 siRNA의 IC50 값은 표 8에 요약하였다.
[표 8]
Figure pct00089
표 8로부터 알 수 있는 바와 같이, 본 개시내용의 siRNA는 HepG2 세포주내에서 시험관내 FXI mRNA에 대해 매우 높은 억제 활성을 나타내었고, IC50 값은 1.49 내지 11.1 nM의 범위이었다.
실험 실시예 4: 마우스 영장류 간세포내에서 FXI mRNA에 대한 siRNA의 IC 50 의 측정
마우스 영장류 간세포를 정상 C57BL/6N 마우스의 신선한 간 조직으로부터 추출하였다. 적절한 밀도에서 간 세포를 콜라겐 제I형-코팅된 유리, 플라스틱 커버 슬립 또는 조직 배양 디쉬 속에 접종하고, 1Х 이중 항체 및 10% FBS를 함유하는 RPMI 1460 배지 속에서 배양하고, 5% CO2/95% 공기를 함유하는 항온처리기 속에서 37℃에서 30분 동안 추가로 배양하였다.
FXI mRNA에 대한 siRNA의 억제 활성 및 IC50 값은, 검출할 siRNA가 siFXIf1M1SP이었고; 사용된 세포가 마우스 1차 간세포이었고; 최종 siRNA 농도가 각각 총 8개의 농도(100 nM, 25 nM, 6.25 nM, 1.56 nM, 0.391 nM, 0.098 nM, 0.0244 nM, 및 6.1Х10-3 nM)를 포함하였다는 것을 제외하고는, 실험 실시예 3에 기술된 바와 동일한 방법으로 측정하였다. 결과는 표 9에 나타낸 바와 같았다.
[표 9]
Figure pct00090
표 9로부터 알 수 있는 바와 같이, siFXIf1M1SP는 마우스 1차 간세포내에서 시험관내 FXI mRNA에 대해 매우 높은 억제 활성을 나타내었고, IC50 값은 0.021 nM이었다.
실험 실시예 5: HepG2 세포내에서 FXI mRNA의 발현 수준에 대한 siRNA의 억제 효능의 검출
FXI mRNA의 발현 수준에 대한 siRNA의 억제율을, 사용된 siRNA가 siFXIg1M1SP 및 siFXIh1M1SP이었고; 각각의 siRNA에 대해, 최종 siRNA 농도는 각각 총 3개의 농도(50 nM, 5 nM 및 0.5 nM)를 포함하였고; 2개의 배양 웰을 각각의 농도에서 사용하였다는 것을 제외하고는, 실험 실시예 3에 기술된 바와 동일한 방법으로 측정하였다. 결과는 표 10에 나타낸다.
[표 10]
Figure pct00091
표 10으로부터 알 수 있는 바와 같이, 본 개시내용의 siRNA는 HepG2 세포내에서 시험관내에서 매우 높은 억제 활성을 나타내었고; 83% 이하의 FXI mRNA에 대한 억제율을 50 nM의 siRNA 농도에서 달성할 수 있었다.
실험 실시예 6: 생체내에서 마우스 내 FACI mRNA의 발현 수준에 대한 접합체 L10-siFXIf1M1S, L10-siFXIi1M1S 및 L10-siFXIi1M1SP의 억제 효능의 검출
C57BL/6N 마우스(모두 암컷)을 그룹(각각의 그룹에서 5마리)으로 무작위로 나투고 각각 번호를 매겼다. 시험할 접합체(즉, L10-siFXIf1M1S, L10-siFXIi1M1S 또는 L10-siFXIi1M1SP)를 각각의 그룹 내 마우스에게 5 mg/kg 및 1 mg/kg(siRNA의 양을 기반으로 함)의 2개의 상이한 용량으로 피하 주사하였다. 각각의 siRNA 접합체를 1 mg/mL 및 0.2 mg/mL의 농도에서 0.9 wt% NaCl 수용액 및 5 mL/kg의 투여 용적의 형태로 투여하였다.
마우스의 그룹 중 하나에게 1ХPBS를 사용하여 5 mL/kg의 투여 용적으로 투여하고 대조군 그룹으로 기록하였다.
마우스를 투여 7일 후에 희생시켰다. 각각의 마우스의 간 조직을 수집하고 후에 RNA를 유지시키고(Sigma Aldrich company), 간 조직을 조직 균질화기를 사용하여 균질화하였다. 이후에, 총 RNA를 추출하고 설명서에 기술된 과정에 따라 트리졸을 사용함으로써 수득하였다.
FXI mRNA의 발현 수준을 형광성 qPCR로 측정하고 FXI mRNA에 대한 억제율을, 추출된 총 RNA를 cDNA로 ImProm-IITM 역 전사 키트(Promega company)를 사용하여 이의 설명서에 따라 역 전사하여 cDNA 함유 용액을 수득하는 것을 제외하고는, 실험 실시예 3에 기술된 바와 동일한 방법으로 계산하였다. 다음에, 간 조직 내 FXI mRNA의 발현 수준을 형광성 qPCR 키트(Beijing ComWin Biotech Co., Ltd)를 사용하여 측정하였다. 당해 형광성 qPCR 방법에서, 마우스 GAPDH(mGAPDH) 유전자를 내부 표준 유전자로서 사용하였고, FXI 및 마우스 GAPDH는 FXI 및 마우스 GAPDH 각각에 대한 프라이머를 사용하여 검출하였다. 검출용 프라이머의 서열은 표 11에 나타낸 바와 같았다.
FXI mRNA의 발현 수준을 측정하고 FXI mRNA에 대한 억제율을 계산하는 과정에서, 본 실험의 대조군 그룹 내 마우스에게 PBS를 투여하고; 시험 그룹의 마우스에게 상이한 siRNA 접합체를 각각 투여하였다. 대조군 그룹 내 FXI mRNA의 발현 수준을 100%로서 기록하고; 상응하게, FXI mRNA의 발현 수준에 대한 억제율은 0%로서 기록하였다. 시험 결과를 표 12에 나타낸 바와 같이, 대조군 그룹에서 FXI mRNA의 발현 수준을 기반으로 표준화하였다.
[표 11]
Figure pct00092
[표 12]
Figure pct00093
표 12로부터 알 수 있는 바와 같이, 본 개시내용의 siRNA 접합체는 1 mg/kg의 siRNA 용량에서 FXI mRNA에 대해 56.8 내지 78.4%의 범위의 억제율을 나타내었고; 95.0%의 억제율은 5 mg/kg의 siRNA 농도에서 달성되었으며, 이는 FXI mRNA의 탁월한 억제 효능을 시사한다.
실험 실시예 7: FXI mRNA에 대한 접합체 L10-siFXIf1M1S 및 L10-siFXIi1M1SP의 억제 및 생체내에서 마우스스에서 투여 후 상이한 시점에서 활성화된 부분 트롬보플라시틴 시간(APTT)의 연장의 검출
C57BL/6N 마우스(모두 수컷)을 7개 그룹(각각의 그룹 당 5마리 마우스)으로 무작위로 나누고 각각 번호매겼다. 접합체 L10-siFXIf1M1S 및 L10-siFXIi1M1SP를 각각 모든 3개의 그룹에 투여하였다. 마우스의 나머지 그룹에게 염수를 대조군 그룹으로서 투여하였다. 투여 경로는 피하 주사이다. 접합체를 1.8 mg/ml(siRNA를 기반으로 함)의 농도에서 0.9 % NaCl 수용액 및 9 mg/kg의 투여량의 형태로 투여하였다. 정상 염수는 0.9 % NaCl 수용액이었다. 투여 용적은 5 mL/kg이었다. 혈장 샘플을 투여 후 각각 8, 15 및 29일 째에 수집하였다. 접합체가 투여된 마우스의 그룹을 투여 29일 후에 희생시키고; NS가 투여된 마우스의 그룹은 투여 8일 후에 희생시켰다. 각각의 마우스의 간 조직을 수집하고 이후 RNA를 유지시키고(Sigma Aldrich company), 간 조직을 조직 균질화기로 균질화하였다. 이후에, 총 RNA를 추출하고 설명서에 기술된 바와 같은 과정에 따라 트리졸을 사용하여 수득하였다.
FXI mRNA의 발현 수준을 형광성 qPCR로 측정하고 FXI mRNA에 대한 억제율을, 추출된 총 RNA를 cDNA 내로 ImProm-IITM 역 전사 키트(Promega company)를 사용하여 이의 설명서에 따라 역 전사하여 cDNA-함유 용액을 수득한 것을 제외하고는, 실험 실시예 3에 기술된 바와 동일한 방법으로 계산하였다. 다음에, 간 조직 내 FXI mRNA의 발현 수준을 형광성 qPCR 키트(Beijing ComWin Biotech Co., Ltd)를 사용하여 측정하였다. 당해 형광성 qPCR 방법에서, 마우스 GAPDH(mGAPDH) 유전자를 내부 참고 유전자로서 사용하고, FXI 및 마우스 GAPDH를 FXI 및 마우스 GAPDH 각각에 대한 프라이머를 사용하여 검출하였다. 검출용 프라이머의 서열은 표 11에 나타낸다.
FXI mRNA의 발현 수준을 측정하고 FXI mRNA에 대한 억제율을 계산하는 과정에서, 당해 실험의 대조군 그룹 내 마우스에게 염수를 투여하고; 시험 그룹내 마우스에게 상이한 siRNA 접합체 각각을 투여하고, 샘플은 투여 후 상이한 시점에서 취하였다. 대조군 그룹 내 FXI mRNA의 발현 수준을 100%로서 기록하였고; 상응하게, FXI mRNA의 발현 수준에 대한 억제율은 0%로서 기록하였다. 시험 결과는 표 13에 나타낸 바와 같이, 대조군 그룹에서 FXI mRNA의 발현 수준을 기반으로 표준화하였다. 당해 표에서, FXI mRNA의 발현 수준에 대한 억제율은 상응하는 siRNA 접합체의 투여 후 상응하는 날에 동일한 그룹의 5마리 마우스에서 측정한 FXI mRNA의 발현 수준에 대한 억제율의 수학적 평균 값이다.
[표 13]
Figure pct00094
표 13의 결과로부터 알 수 있는 바와 같이, 마우스 내에 단일 피하 투여 후, 본 개시내용의 siRNA 접합체는 연장된 기간에 걸쳐 상이한 시점에서 간 내 FXI mRNA에 대해 탁월한 억제율을 나타내었고 적어도 89.18% 또는 심지어 92.89% 이하의 억제률을 나타내었다.
추가로, 상기 수집한 바와 같은 혈장 샘플의 경우, APTT 키트(Rayto company, 제품 번호 20190402M)를 사용하여 반-자동화 응고 분석기(Rayto company, 모델 번호 RT-2202) 속에서 혼탁도 검정에 의해 각각의 마우스의 혈장 APTT 값을 측정하였다. 특이적인 검출 방법을 APTT 키트의 설명서에 기술된 바와 같이 수행하다. 측정된 APTT 값을 대조군 그룹의 것과 비교함으로써, 마우스 당 APTT의 상대적인 연장은 (시험 그룹 내 APTT의 측정된 값 - 대조군 그룹 내 APTT의 측정된 평균 값)/(대조군 그룹내 APTT의 측정된 평균 값) Х 100%이었다. 측정된 결과는 표 14에 나타낸 바와 같았다. 당해 표에서, APTT의 상대적인 연장은 상응하는 siRNA 접합체의 투여 후 상응하는 날에 동일한 그룹의 5마리 마우스에서 측정한 APTT의 상대적인 연장의 평균 값을 지칭한다.
[표 14]
Figure pct00095
표 14의 결과로부터 알 수 있는 바와 같이, 측정된 APTT의 값은 연장된 기간에 걸쳐 본 개시내용의 siRNA 접합체를 투여한 마우스에서 유의적으로 연장되었고; 64.9% 이하의 연장이 달성될 수 있었다. 명확하게, 본 개시내용의 siRNA 접합체는 마우스의 응고 시간을 효과적으로 연장시킬 수 있었으며, 이들이 혈전 질환 및/또는 허혈 뇌졸중의 치료 및/또는 방지를 위한 적용의 촉망되는 가능성을 가짐을 시사한다.
실험 실시예 8: 생체내에서 사람화된 마우스에서 본 개시내용의 siRNA 접합체의 활성의 측정
당해 실험에서 사용된 사람화된 마우스를 Cyagen Biosciences Inc.로부터 구입하였다. 마우스를 각각의 그룹 당 4마리의 마우스(2마리의 수컷 및 2마리의 암컷 마우스)를 지닌 그룹으로 무작위로 나누었다.접합체 L10-siFXIf1M1S, L10-siFXIa1M1SP, L10-siFXIb1M1SP, L10-siFXIc1M1SP, L10-siFXId1M1SP, L10-siFXIe1M1SP, L10-siFXIg1M1SP, L10-siFXIh1M1SP 및 L10-siFXIi1M1S를 각각의 그룹 내 마우스에게 개별적으로 투여하고; 염수를 대조군으로서 사용하였다. 모든 동물에 대한 약물 투여량을 체중(단일 피하 투여)에 따라 계산하였다. 각각의 접합체를 0.3 mg/mL의 농도에서(siRNA를 기반으로 함) 0.9 wt% NaCl 수용액 및 10 mL/kg의 투여 용적으로 투여하였는데, 즉, 각각의 접합체의 투여량은 3 mg/kg이었다(siRNA를 기반으로 함). 마우스를 투여 8일째에 희생시켰다. 혈장 샘플을 수집하고, 3.2 wt%(0.109 mol/L)의 시트르산나트륨 이수화물 수용액을 1:9(v/v)의 항응고제 대 혈장의 용적 비에서 가하고; 혈장 샘플을 원심분리로 분리하였다.
약 100 mg/마우스의 간의 좌엽(left lobe)을 취하고 이후 RNA(Sigma Aldrich)와 함께 유지시켰다. 후속적으로 각각의 마우스의 간 조직을 조직 균질화기로 균질화시켰다. 이후에, 각각의 마우스의 간 조직의 총 RNA를 추출하고 설명서에 기술된 바와 같은 과정에 따라서 트리졸(Thermo Fisher company)을 사용하여 수득하였다.
실험 실시예 6에 기술된 바와 동일한 방법에 따라, 본 개시내용의 상이한 siRNA 접합체를 투여받은 마우스내 및 대조군 그룹에서 마우스내 간 조직의 FXI mRNA의 발현 수준을, 내부 참고 유전자로서 사람 FXI 및 마우스 GAPDH를 증폭시키기 위한 프라이머의 서열이 표 15에 나타낸 바와 같다는 것을 제외하고는, 실시간 형광성 qPCR 방법으로 측정하였다.
[표 15]
Figure pct00096
FXI mRNA의 발현 수준을 측정하고 FXI mRNA에 대한 억제율을 실험 실시예 3에 기술된 바와 동일한 방법으로 계산하였다. 대조군 그룹 내 FXI mRNA의 발현 수준을 100%로 기록하였고; 상응하게, FXI mRNA의 발현 수준에 대한 억제율을 0%로서 기록하였다. 시험 결과를 표 16에 나타낸 바와 같이, 대조군 그룹 내 FXI mRNA의 발현 수준을 기반으로 표준화하였다. 당해 표에서, 사람 mRNA에 대한 억제율은 상응하는 siRNA 접합체를 투여한 동일한 그룹의 마우스에서 계산된 사람 FXI mRNA에 대한 억제율의 평균 값 및 이의 표준 편차이다.
[표 16]
Figure pct00097
표 16의 결과로부터 알 수 있는 바와 같이, 본 개시내용의 siRNA 접합체는 사람화된 이협접합체 마우스 간에서 사람 FXI mRNA에 대해 양호한 억제 효가를 나타내었고, FXI mRNA에 대해 약 71 내지 93% 이하의 억제율을 나타내었다.
추가로, 상기 각각의 마우스의 그룹(접합체 L10-siFXIf1M1S, L10-siFXIa1M1SP, L10-siFXIb1M1SP, L10-siFXIc1M1SP, L10-siFXId1M1SP, L10-siFXIe1M1SP, L10-siFXIg1M1SP, L10-siFXIh1M1SP 또는 L10-siFXIi1M1S 각각을 투여한 시험 그룹에서 마우스 및 염수를 투여한 대조군 그룹을 사람 응고 인자 X ELISA 키트(Sigma company, 로트 번호 0926F2350, 제품 번호 RAB1385-1KT)를 사용하여 시험함으로써 혈장 FXI 단백질 농도를 측정하였다.
ELISA 키트 내 샘플 희석액(키트내에서 ItemE2로 표지됨)은 희석된 샘플 희석액을 수득하기 위한 탈이온수로 5배 희석시켰다.
접합체 L10-siFXIa1M1SP 또는 L10-siFXIg1M1SP를 투여한 마우스의 혈장에 대해, 108 μL의 희석된 샘플 희석액을 12 μL의 혈장에 가하여 시험함 샘플 용액을 형성시키고, 이를 사용할 때까지 유지시켰다.
다른 접합체 또는 염수를 투여한 마우스의 혈장에 대해, 108 μL의 희석된 샘플 희석액을 12 μL의 혈장에 가하여 10배 희석된 샘플을 수득하고; 45 μL의 희석된 샘플을 5 μL의 10배 희석된 혈장에 가하여 100배 희석된 혈장을 수득한 다음; 108 μL의 희석된 샘플 희석액을 12 μL의 100배 희석된 혈장에 가하여 1000배 희석된 샘플 희석액을 시험할 샘플 용액으로서 수득하고, 이를 사용할 때까지 유지시켰다.
키트내 FXI 항체 검출물(키트 내에서 ItemF로 표지됨)을 100 μL의 희석된 샘플 희석액을 사용하여 항체 샘플 내로 용해한 다음, 75 μL의 항체 샘플을 취하고 5925 μL의 희석된 샘플 희석액을 80배 희석시키며 항체 검출 용액을 형성시켰다.
키트내 스트렙토마이신 농축물(키트내에서 ItemG로 표지됨)을 희석된 샘플 희석액으로 250배 희석시켜 스트렙토마이신 희석 용액을 형성시켰다.
키트 내 세척 완충제(키트내에서 ItemB로 표지됨)를 탈이온수로 20배 희석시켜 희석된 세척 용액을 형성시켰다.
8개의 표준 농도 구배를 지닌 용액을 제공하였고; 용액들 중 하나는 희석된 샘플 희석액(이는 0 pg/mL의 농도에서 표준 용액으로 고려할 수 있었다)이었고, 다른 7개의 용액은 키트 내 표준 생성물(키트 내에서 항목 C로 표지됨)을 상술한 희석된 샘플 희석액으로 연속적으로 희석시켜 수득한 2500 pg/mL, 1000 pg/mL, 400 pg/mL, 160 pg/mL, 64 pg/mL, 25.6 pg/mL 및 10.24 pg/mL의 7개 농도의 표준 용액이었다.
ELISA 검정
사람 응고 인자 X ELISA 키트(SIGMA company, 제품 번호 RAB1385-1KT)를 사용하였다. 표준 웰 및 샘플 웰을 사용을 위한 설명서 매뉴얼에 따라 정렬하였다. 상이한 표준 농도 구배를 지닌 용액 또는 시험한 샘플 용액을 웰당 100 μL의 양으로 개별적으로 플레이팅한 다음, 실온에서 2.5시간 동안 항온처리하였다. 이로부터 용액을 제거한 후, 300 μL의 희석된 세척 용액을 웰당 가하여 웰을 1분 동안 세척한 다음, 세척 용액을 제거하였다. 100 μL의 항체 검출 용액을 웰다 가한 다음 실온에서 1시간 동안 항온처리하였다. 이로부터 용액을 제거한 후, 300 μL의 희석된 세척 용액을 웰 당 가하여 1분 동안 웰을 세척한 다음, 세척 용액을 제거하였다. 당해 세척 과정을 3회 반복하였다(즉, 총 4회 세척). 100 μL의 스트렙토마이신 희석 용액을 웰 당 가한 다음, 실온에서 45분 동안 항온처리하였다. 이로부터 용액을 제거한 후, 300 μL의 희석된 세척 용액을 웰당 가하여 웰을 1분 동안 세척한 다음 세척 용액을 제거하였다. 당해 세척 과정을 3회 반복하였다(즉, 총 4회 세척). 100 μL의 TMB(키트 내에서 ItemH로 표지됨)를 웰 당 가한 다음, 30분 동안 항온처리하였다. 50 μL의 정지 용액(키트 내에 제공됨)을 웰 당 가하여 반응을 정지시켰다. 450 nm에서의 흡광도를 완전 자동 미세플레이트 판독기(BioTek company, Biotck SYNERGY MX)를 사용하여 즉시 판독하였다. 특수한 농도의 siRNA 접합체를 사용한 각각의 시험 그룹의 결과를 염수를 사용한 대조군 그룹과 비교하였다.
표준 농도 구배를 지닌 용액에서 측정된 활성 결과에 따라, 용량-반응 표준 곡선을 Graphpad 6.0 소프트웨어의 함수 log(억제제) 대 반응-가변 기울기를 사용하여 핏팅하였다. 혈장 단백질 농도를 용량-반응 곡선을 기반으로 게산하고, 핏팅된 곡선은 하기 계산식에 부합하였다:
Figure pct00098
여기서:
Y는 450 NM에서 판독한 상응하는 광학 밀도 값이고,
X는 표준 곡선의 농도의 대수 값(μg/mL)이고,
Bot는 정상 상태의 하단에서 Y 값이고,
Top는 정상 상태의 상단에서 Y 값이고,
X'는 Y가 하한과 상한 사이의 중간 값인 상태에서 핏팅으로 수득된 X 값이고,
HillSlope는 X'에서 핏팅에 의한 곡선의 기울기이다.
각각의 샘플의 상응하는 농도의 대수 값 X는 핏팅된 표준 곡선을 기반으로 제형 속의 각각의 혈장 샘플 속에서 측정한 광학 밀도 값을 두어서 수득하였고; 상이한 siRNA 접합체가 투여된 각각의 샘플의 혈장 FXI 단백질 농도 값 = 10^X(μg/mL)를 계산하였다.
혈장 FXI 단백질 농도 값에 따라서, FXI 단백질에 대한 억제율 = (대조군 그룹 내 단백질 농도 - 시험 그룹 내 단백질 농도)/대조군 그룹 내 단백질 농도 Х 100%를 대조군 그룹 내 단백질 농도를 기반으로 계산하엿다. 수득된 농도 결과 및 억제율 데이타는 표 17에 나타낸 바와 같았다. 당해 표에서, FXI 단백질 농도 및 FXI 단백질에 대한 억제율은 FXI 단백질 농도의 대수 평균 값 및 상응하는 siRNA 접합체 각각이 투여된 마우스의 동일한 그룹에서 FXI 단백질에 대한 억제율이었다.
[표 17]
Figure pct00099
표 17의 결과로부터 알 수 있는 바와 같이, 본 개시내용의 siRNA 접합체 모두는 사람화된 이종접합체 마우스의 혈장 속에서 사람 FXI 단백질의 발현을 억제하는 탁월한 효과를 나타내었고; 특히, 접합체 L10-siFXIa1M1SP 및 L10- siFXIg1M1SP 둘 다는 약 99% 이하의 FXI 단백질에 대해 높은 억제율을 나타내었다.
본 개시내용의 일부 구현예를 상기에 상세히 기술하지만, 본 개시내용은 상기 구현예의 구체적인 세부사항에 한정되지 않는다. 본 개시내용의 기술적 해결책에 대한 다양한 단순 변화가 본 개시내용의 기술적 개념의 범위내에서 이루어질 수 있으며 이러한 단순한 변화는 본 개시내용의 영역 내에 있다.
상기 구현에에 기술된 구체적인 기술적 특징 각각은 모순이 유발되지 않는 한 임의의 적합한 방식으로 조합될 수 있음을 주목해야 한다. 불필요한 반복을 피하기 위하여, 다양한 조합 방식은 본 개시내용에서 더 이상 기술되지 않는다.
또한, 본 개시내용의 다양한 상이한 구현예는 본 개시내용의 개념으로부터 벗어나지 않는 한 조합될 수 있고, 이는 또한 본 개시내용으로 고려되어야 한다.
참고문헌의 혼입
본 명세서에 언급된 모든 공보, 특허 및 특허원은 각각의 공보, 특허 및 특허원은 참고에 의해 본원에 구체적으로 및 별도로 포함된 경우와 같은 정도로 참고에 의해 본원에 포함된다.
<110> SU ZHOU RIBO LIFE SCIENCE CO.,LTD <120> NUCLEIC ACID, PHARMACEUTICAL COMPOSITION, CONJUGATE, PREPARATION METHOD, AND USE <130> PI21-0110 <150> CN 2019104305887 <151> 2019-05-22 <160> 577 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> n is Z1, Z1 is U <220> <221> misc_feature <222> (19) <400> 1 ggguauucuu ucaagcaan 19 <210> 2 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> n is Z2, Z2 is A <220> <221> misc_feature <222> (1) <400> 2 nuugcuugaa agaauaccc 19 <210> 3 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> n is Z3, Z3 is A, U, G or C <220> <221> misc_feature <222> (19) <400> 3 ggguauucuu ucaagcaan 19 <210> 4 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> n is Z4, Z4 is a nucleotide complementary to Z3, Z3 is selected from A, U, G or C <220> <221> misc_feature <222> (1) <400> 4 nuugcuugaa agaauaccc 19 <210> 5 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> n is Z3, Z3 is A, U, G or C <220> <221> 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Artificial Sequence <220> <223> Sense sequence for L10-siFXIe1M1SPP <400> 551 gaaucucaaa gaaaucuuu 19 <210> 552 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense sequence for L10-siFXIe1M1SP <400> 552 aaagauuucu uugagauucu u 21 <210> 553 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sense sequence for L10-siFXIg1M1SP <400> 553 auuucugggu auucuuuca 19 <210> 554 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense sequence for L10-siFXIg1M1SP <400> 554 ugaaagaaua cccagaaauc g 21 <210> 555 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sense sequence for L10-siFXIh1M1SP <400> 555 caugaagggc auaaacuau 19 <210> 556 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense sequence for L10-siFXIh1M1SP <400> 556 auaguuuaug cccuucaugu c 21 <210> 557 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sense sequence for L10-siFXIi1M1S <400> 557 ggauucugga gaaaacuca 19 <210> 558 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense sequence for L10-siFXIi1M1S <400> 558 ugaguuuucu ccagaaucca g 21 <210> 559 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sense sequence for L10-siFXIi1M1SP <400> 559 ggauucugga gaaaacuca 19 <210> 560 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense sequence for L10-siFXIi1M1SP <400> 560 ugaguuuucu ccagaaucca g 21 <210> 561 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sense sequence for siFXIe1 <400> 561 gaaucucaaa gaaaucuuu 19 <210> 562 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense sequence for siFXIe1 <400> 562 aaagauuucu uugagauuc 19 <210> 563 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sense sequence for NC <400> 563 uucuccgaac gugucacgu 19 <210> 564 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense sequence for NC <400> 564 acgugacacg uucggagaac u 21 <210> 565 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> The target sequence for siFXIe1 <400> 565 gaatctcaaa gaaatcttt 19 <210> 566 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Upstream Primer for Human FXI <400> 566 tcacggcgga atcaccatc 19 <210> 567 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Downstream Primer for Human FXI <400> 567 tgtcctattc actcttggca gt 22 <210> 568 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Upstream Primer for Human GAPDH <400> 568 ggtcggagtc aacggattt 19 <210> 569 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Downstream Primer for Human GAPDH <400> 569 ccagcatcgc cccacttga 19 <210> 570 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Upstream Primer for Human FXI <400> 570 tcacggcgga atcaccatc 19 <210> 571 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Downstream Primer for Human FXI <400> 571 tgtcctattc actcttggca gt 22 <210> 572 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Upstream Primer for Mouse GAPDH <400> 572 aactttggca ttgtggaagg gctc 24 <210> 573 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Downstream Primer for Mouse GAPDH <400> 573 tggaagagtg ggagttgctg ttga 24 <210> 574 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Upstream Primer for Mouse FXI <400> 574 gccctgttaa aactggaatc agc 23 <210> 575 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Downstream Primer for Mouse FXI <400> 575 cgtttctatc tcctttggaa ggc 23 <210> 576 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Upstream Primer for Mouse GAPDH <400> 576 tgcaccacca actgcttag 19 <210> 577 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Downstream Primer for Mouse GAPDH <400> 577 ggatgcaggg atgatgttc 19

Claims (71)

  1. siRNA로서, 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함하고, siRNA 내 각각의 뉴클레오타이드는 독립적으로 변형되거나 변형되지 않은 뉴클레오타이드이고, 여기서 센스 가닥은 뉴클레오타이드 서열 I을 포함하고, 안티센스 가닥은 뉴클레오타이드 서열 II를 포함하고; 뉴클레오타이드 서열 I 및 뉴클레오타이드 서열 II는 적어도 부분적으로 역 상보성이어서 이중-가닥 영역을 형성하고; 여기서 뉴클레오타이드 서열 I 및 뉴클레오타이드 서열 II는 i) 내지 ix) 중 어느 것에 나타낸 바와 같은 서열로부터 선택되고:
    i) 뉴클레오타이드 서열 I은 서열 번호: 1로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열과 동일한 길이 및 이들 사이에 3개 이하의 뉴클레오타이드 차이를 가지고, 뉴클레오타이드 서열 II는 서열 번호: 2로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열과 동일한 길이 및 이들 사이에 3개 이하의 뉴클레오타이드 차이를 가지며:
    5'-GGGUAUUCUUUCAAGCAAZ1-3' (서열 번호: 1);
    5'-Z2UUGCUUGAAAGAAUACCC-3' (서열 번호: 2),
    여기서, Z1은 U이고 Z2는 A이고,
    뉴클레오타이드 서열 I은 Z1에 상응하는 위치에서 뉴클레오타이드 Z3을 포함하고; 뉴클레오타이드 서열 II는 Z2에 상응하는 위치에서 뉴클레오타이드 Z4를 포함하고, 여기서 Z4는 안티센스 가닥의 5' 말단에서 제1의 뉴클레오타이드이고;
    ii) 뉴클레오타이드 서열 I은 서열 번호: 61로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열과 동일한 길이 및 이들 사이에 3개 이하의 뉴클레오타이드 차이를 갖고, 뉴클레오타이드 서열 II는 서열 번호: 62로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열과 동일한 길이 및 이들 사이에 3개 이하의 뉴클레오타이드 차이를 갖고:
    5'-GGCAUAAACUAUAACAGCZ5-3' (서열 번호: 61);
    5'-Z6GCUGUUAUAGUUUAUGCC-3' (서열 번호: 62),
    여기서, Z5는 U이고 Z6은 A이고,
    뉴클레오타이드 서열 I은 Z5에 상응하는 위치에서 뉴클레오타이드 Z7을 포함하고; 뉴클레오타이드 서열 II는 Z6에 상응하는 위치에서 뉴클레오타이드 Z8을 포함하고, 여기서 Z은 안티센스 가닥의 5' 말단에서 제1의 뉴클레오타이드를 포함하고;
    iii) 뉴클레오타이드 서열 I은 서열 번호: 121로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열과 동일한 길이 및 이들 사이에 3개 이하의 뉴클레오타이드 차이를 갖고, 뉴클레오타이드 서열 II는 서열 번호: 122로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열과 동일한 길이 및 이들 사이에 3개 이하의 뉴클레오타이드 차이를 갖고:
    5'-GCUCAAGAAUGCCAAGAAZ9-3' (서열 번호: 121);
    5'-Z10UUCUUGGCAUUCUUGAGC-3' (서열 번호: 122),
    여기서, Z9는 A이고 Z10은 U이고,
    뉴클레오타이드 서열 I은 Z9에 상응하는 위치에서 뉴클레오타이드 Z11을 포함하고; 뉴클레오타이드 서열 II는 Z10에 상응하는 위치에서 뉴클레오타이드 Z12를 포함하고, 여기서 Z12는 안티센스 가닥의 5' 말단에서 제1의 뉴클레오타이드이고;
    iv) 뉴클레오타이드 서열 I은 서열 번호: 181로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열과 동일한 길이및 이들 사이에 3개 이하의 뉴클레오타이드 차이를 갖고, 뉴클레오타이드 서열 II는 서열 번호: 182로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열과 동일한 길이 및 이들 사이에 3개 이하의 뉴클레오타이드 차이를 갖고:
    5'-GCAACAAAGACAUUUAUGZ13-3' (서열 번호: 181);
    5'-Z14CAUAAAUGUCUUUGUUGC-3' (서열 번호: 182),
    여기서, Z13은 U이고 Z14는 A이고,
    뉴클레오타이드 서열 I은 Z13에 상응하는 위치에서 뉴클레오타이드 Z15를 포함하고; 뉴클레오타이드 서열 II는 Z14에 상응하는 위치에서 뉴클레오타이드 Z16을 포함하고, 여기서 Z16은 안티센스 가닥의 5' 말단에서 제1의 뉴클레오타이드이고;
    v) 뉴클레오타이드 서열 I은 서열 번호: 241로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열과 동일한 길이 및 이들 사이에 3개 이하의 뉴클레오타이드 차이를 갖고, 뉴클레오타이드 서열 II는 서열 번호: 242에 나타낸 뉴클레오타이드 서열과 동일한 길이 및 이들 사이에 3개 이하의 뉴클레오타이드 차이를 갖고:
    5'-GAAUCUCAAAGAAAUCUUZ17-3' (서열 번호: 241);
    5'-Z18AAGAUUUCUUUGAGAUUC-3' (서열 번호: 242),
    여기서, Z17은 U이고 Z18은 A이고,
    뉴클레오타이드 서열 I은 Z17에 상응하는 위치에서 뉴클레오타이드 Z19를 포함하고; 뉴클레오타이드 서열 II는 Z18에 상응하는 위치에서 뉴클레오타이드 Z20을 포함하고, 여기서 Z20은 안티센스 가닥의 5' 말단에서 제1의 뉴클레오타이드이고;
    vi) 뉴클레오타이드 서열 I은 서열 번호: 301로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열과 동일한 길이 및 이들 사이에 3개 이하의 뉴클레오타이드 차이를 갖고, 뉴클레오타이드 서열 II는 서열 번호: 302로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열과 동일한 길이 및 이들 사이에 3개 이하의 뉴클레오타이드 차이를 갖고:
    5'-GUACGUGGACUGGAUUCUZ21-3' (서열 번호: 301);
    5'-Z22AGAAUCCAGUCCACGUAC-3' (서열 번호: 302),
    여기서, Z21은 G이고 Z22는 C이고,
    뉴클레오타이드 서열 I은 Z21에 상응하는 위치에서 뉴클레오타이드 Z23을 포함하고; 뉴클레오타이드 서열 II는 Z22에 상응하는 위치에서 뉴클레오타이드 Z24를 포함하고, 여기서 Z24는 안티센스 가닥의 5' 말단에서 제1의 뉴클레오타이드이고;
    vii) 뉴클레오타이드 서열 I은 서열 번호: 361로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열과 동일한 길이 및 이들 사이에 3개 이하의 뉴클레오타이드를 갖고, 뉴클레오타이드 서열 II는 서열 번호: 362로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열과 동일한 길이 및 이들 사이에 3개 이하의 뉴클레오타이드 차이를 갖고:
    5'-AUUUCUGGGUAUUCUUUCZ25-3' (서열 번호: 361);
    5'-Z26GAAAGAAUACCCAGAAAU-3' (서열 번호: 362),
    여기서, Z25는 A이고 Z26은 U이고,
    뉴클레오타이드 서열 I은 Z25에 상응하는 위치에서 뉴클레오타이드 Z27을 포함하고; 뉴클레오타이드 서열 II는 Z26에 상응하는 위치에서 뉴클레오타이드 Z28을 포함하고, 여기서 Z28은 안티센스 가닥의 5' 말단에서 제1의 뉴클레오타이드이고;
    viii) 뉴클레오타이드 서열 I은 서열 번호: 421로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열과 동일한 길이 및 이들 사이에 3개 이하의 뉴클레오타이드를 갖고, 뉴클레오타이드 서열 II는 서열 번호: 422로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열과 동일한 길이 및 이들 사이에 3개 이하의 뉴클레오타이드 차이를 갖고:
    5'-CAUGAAGGGCAUAAACUAZ29-3' (서열 번호: 421);
    5'-Z30UAGUUUAUGCCCUUCAUG-3' (서열 번호: 422),
    여기서, Z29는 U이고 Z30은 A이고,
    뉴클레오타이드 서열 I은 Z29에 상응하는 위치에서 뉴클레오타이드 Z31을 포함하고; 뉴클레오타이드 서열 II는 Z30에 상응하는 위치에서 뉴클레오타이드 Z32를 포함하고, 여기서 Z32는 안티센스 가닥의 5' 말단에서 제1의 뉴클레오타이드이고;
    ix) 뉴클레오타이드 서열 I은 서열 번호: 481로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열과 동일한 길이 및 이들 사이에 3개 이하의 뉴클레오타이드를 갖고, 뉴클레오타이드 서열 II는 서열 번호: 482로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열과 동일한 길이 및 이들 사이에 3개 이하의 뉴클레오타이드 차이를 갖고:
    5'-GGAUUCUGGAGAAAACUCZ33-3' (서열 번호: 481);
    5'-Z34GAGUUUUCUCCAGAAUCC-3' (서열 번호: 482),
    여기서, Z33은 A이고 Z34는 U이고,
    뉴클레오타이드 서열 I은 Z33에 상응하는 위치에서 뉴클레오타이드 Z35를 포함하고; 뉴클레오타이드 서열 II는 Z34에 상응하는 위치에서 뉴클레오타이드 Z36을 포함하고, 여기서 Z36은 안티센스 가닥의 5' 말단에서 제1의 뉴클레오타이드인, siRNA.
  2. 제1항에 있어서, 뉴클레오타이드 서열 I 및 서열 번호: 1로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열 사이에 1개 이하의 뉴클레오타이드 차이가 존재하고/하거나 뉴클레오타이드 서열 II와 서열 번호: 2로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열 사이에 1개 이하의 뉴클레오타이드 차이가 존재하고; 또는
    뉴클레오타이드 서열 I 및 서열 번호: 61로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열 사이에 1개 이하의 뉴클레오타이드 차이가 존재하고/하거나 뉴클레오타이드 서열 II와 서열 번호: 62로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열 사이에 1개 이하의 뉴클레오타이드 차이가 존재하고; 또는
    뉴클레오타이드 서열 I 및 서열 번호: 121로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열 사이에 1개 이하의 뉴클레오타이드 차이가 존재하고/하거나 뉴클레오타이드 서열 II와 서열 번호: 122로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열 사이에 1개 이하의 뉴클레오타이드 차이가 존재하고; 또는
    뉴클레오타이드 서열 I 및 서열 번호: 181로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열 사이에 1개 이하의 뉴클레오타이드 차이가 존재하고/하거나 뉴클레오타이드 서열 II와 서열 번호: 182로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열 사이에 1개 이하의 뉴클레오타이드 차이가 존재하고; 또는
    뉴클레오타이드 서열 I 및 서열 번호: 241로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열 사이에 1개 이하의 뉴클레오타이드 차이가 존재하고/하거나 뉴클레오타이드 서열 II와 서열 번호: 242로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열 사이에 1개 이하의 뉴클레오타이드 차이가 존재하고; 또는
    뉴클레오타이드 서열 I 및 서열 번호: 301로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열 사이에 1개 이하의 뉴클레오타이드 차이가 존재하고/하거나 뉴클레오타이드 서열 II와 서열 번호: 302로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열 사이에 1개 이하의 뉴클레오타이드 차이가 존재하고; 또는
    뉴클레오타이드 서열 I 및 서열 번호: 361로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열 사이에 1개 이하의 뉴클레오타이드 차이가 존재하고/하거나 뉴클레오타이드 서열 II와 서열 번호: 362로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열 사이에 1개 이하의 뉴클레오타이드 차이가 존재하고; 또는
    뉴클레오타이드 서열 I 및 서열 번호: 421로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열 사이에 1개 이하의 뉴클레오타이드 차이가 존재하고/하거나 뉴클레오타이드 서열 II와 서열 번호: 422로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열 사이에 1개 이하의 뉴클레오타이드 차이가 존재하고; 또는
    뉴클레오타이드 서열 I 및 서열 번호: 481로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열 사이에 1개 이하의 뉴클레오타이드 차이가 존재하고/하거나 뉴클레오타이드 서열 II와 서열 번호: 482로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열 사이에 1개 이하의 뉴클레오타이드 차이가 존재하는, siRNA.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 뉴클레오타이드 서열 II와 서열 번호: 2로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열 사이의 뉴클레오타이드 차이는 위치 Z4에서의 차이를 포함하고, 여기서 Z4는 U, C 또는 G로부터 선택되거나;
    뉴클레오타이드 서열 II와 서열 번호: 62로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열 사이의 뉴클레오타이드 차이는 위치 Z8에서의 차이를 포함하고, 여기서 Z8은 U, C 또는 G로부터 선택되거나;
    뉴클레오타이드 서열 II와 서열 번호: 122로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열 사이의 뉴클레오타이드 차이는 위치 Z12에서의 차이를 포함하고, 여기서 Z12는 A, C 또는 G로부터 선택되거나;
    뉴클레오타이드 서열 II와 서열 번호: 182로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열 사이의 뉴클레오타이드 차이는 위치 Z16에서의 차이를 포함하고, 여기서 Z16은 U, C 또는 G로부터 선택되거나;
    뉴클레오타이드 서열 II와 서열 번호: 242로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열 사이의 뉴클레오타이드 차이는 위치 Z20에서의 차이를 포함하고, 여기서 Z20은 U, C 또는 G로부터 선택되거나;
    뉴클레오타이드 서열 II와 서열 번호: 302로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열 사이의 뉴클레오타이드 차이는 위치 Z24에서의 차이를 포함하고, 여기서 Z24는 A, U 또는 G로부터 선택되거나;
    뉴클레오타이드 서열 II와 서열 번호: 362로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열 사이의 뉴클레오타이드 차이는 위치 Z28에서의 차이를 포함하고, 여기서 Z28은 A, C 또는 G로부터 선택되거나;
    뉴클레오타이드 서열 II와 서열 번호: 422로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열 사이의 뉴클레오타이드 차이는 위치 Z32에서의 차이를 포함하고, 여기서 Z32는 U, C 또는 G로부터 선택되거나;
    뉴클레오타이드 서열 II와 서열 번호: 482로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열 사이의 뉴클레오타이드 차이는 위치 Z36에서의 차이를 포함하고, 여기서 Z36은 A, C 또는 G로부터 선택된, siRNA.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, Z3이 Z4에 대해 상보성인 뉴클레오타이드이거나; Z7이 Z8에 대해 상보성인 뉴클레오타이드이거나; Z11이 Z12에 대해 상보성인 뉴클레오타이드이거나; Z15가 Z16에 대해 상보성인 뉴클레오타이드이거나; Z19가 Z20에 대해 상보성인 뉴클레오타이드이거나; Z23이 Z24에 대해 상보성인 뉴클레오타이드이거나; Z27이 Z28에 대해 상보성인 뉴클레오타이드이거나; Z31이 Z32에 대해 상보성인 뉴클레오타이드이거나; Z35가 Z36에 대해 상보성인 뉴클레오타이드인, siRNA.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 센스 가닥 및 안티센스 가닥이 동일하거나 상이한 길이를 갖고, 여기서 센스 가닥이 19 내지 23개 뉴클레오타이드 길이를 갖고, 안티센스 가닥이 19 내지 26개 뉴클레오타이드 길이를 갖고;
    뉴클레오타이드 서열 I이 서열 번호: 3으로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열이고, 뉴클레오타이드 서열 II가 서열 번호: 4로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열:
    5'-GGGUAUUCUUUCAAGCAAZ3-3' (서열 번호: 3);
    5'-Z4UUGCUUGAAAGAAUACCC-3' (서열 번호: 4),
    (여기서, Z3은 A, U, G, 또는 C로부터 선택되고, Z4는 Z3에 대해 상보성인 뉴클레오타이드이다)이거나;
    뉴클레오타이드 서열 I이 서열 번호: 63으로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열이고, 뉴클레오타이드 서열 II가 서열 번호: 64로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열:
    5'-GGCAUAAACUAUAACAGCZ7-3' (서열 번호: 63);
    5'-Z8GCUGUUAUAGUUUAUGCC-3' (서열 번호: 64),
    (여기서, Z7은 A, U, G, 또는 C로부터 선택되고, Z8은 Z7에 대해 상보성인 뉴클레오타이드이다)이거나;
    뉴클레오타이드 서열 I이 서열 번호: 123으로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열이고, 뉴클레오타이드 서열 II가 서열 번호: 124로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열:
    5'-GCUCAAGAAUGCCAAGAAZ11-3'(서열 번호: 123);
    5'-Z12UUCUUGGCAUUCUUGAGC-3'(서열 번호: 124),
    (여기서, Z11은 A, U, G, 또는 C로부터 선택되고, Z12는 Z11에 대해 상보성인 뉴클레오타이드이다)이거나;
    뉴클레오타이드 서열 I이 서열 번호: 183으로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열이고, 뉴클레오타이드 서열 II가 서열 번호: 184로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열:
    5'-GCAACAAAGACAUUUAUGZ15-3' (서열 번호: 183);
    5'-Z16CAUAAAUGUCUUUGUUGC-3' (서열 번호: 184),
    (여기서, Z15는 A, U, G, 또는 C로부터 선택되고, Z16은 Z15에 대해 상보성인 뉴클레오타이드이다)이거나;
    뉴클레오타이드 서열 I이 서열 번호: 243으로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열이고, 뉴클레오타이드 서열 II가 서열 번호: 244로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열:
    5'-GAAUCUCAAAGAAAUCUUZ19-3' (서열 번호: 243);
    5'-Z20AAGAUUUCUUUGAGAUUC-3' (서열 번호: 244),
    여기서, Z19는 A, U, G, 또는 C로부터 선택되고, Z20은 Z19에 대해 상보성인 뉴클레오타이드이다)이거나;
    뉴클레오타이드 서열 I이 서열 번호: 303으로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열이고, 뉴클레오타이드 서열 II가 서열 번호: 304로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열:
    5'-GUACGUGGACUGGAUUCUZ23-3' (서열 번호: 303);
    5'-Z24AGAAUCCAGUCCACGUAC-3' (서열 번호: 304),
    (여기서, Z23은 A, U, G, 또는 C로부터 선택되고, Z24는 Z23에 대해 상보성인 뉴클레오타이드이다)이거나;
    뉴클레오타이드 서열 I이 서열 번호: 363으로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열이고, 뉴클레오타이드 서열 II가 서열 번호: 364로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열:
    5'-AUUUCUGGGUAUUCUUUCZ27-3' (서열 번호: 363);
    5'-Z28GAAAGAAUACCCAGAAAU-3' (서열 번호: 364),
    (여기서, Z27은 A, U, G, 또는 C로부터 선택되고, Z28은 Z27에 대해 상보성인 뉴클레오타이드이다)이거나;
    뉴클레오타이드 서열 I이 서열 번호: 423으로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열이고, 뉴클레오타이드 서열 II가 서열 번호: 424로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열:
    5'-CAUGAAGGGCAUAAACUAZ31-3' (서열 번호: 423);
    5'-Z32UAGUUUAUGCCCUUCAUG-3' (서열 번호: 424),
    (여기서, Z31은 A, U, G, 또는 C로부터 선택되고, Z32는 Z31에 대해 상보성인 뉴클레오타이드이다)이거나;
    뉴클레오타이드 서열 I이 서열 번호: 483으로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열이고, 뉴클레오타이드 서열 II가 서열 번호: 484로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열:
    5'-GGAUUCUGGAGAAAACUCZ35-3' (서열 번호: 483);
    5'-Z36GAGUUUUCUCCAGAAUCC-3' (서열 번호: 484),
    (여기서, Z35는 A, U, G, 또는 C로부터 선택되고, Z36은 Z35에 대해 상보성인 뉴클레오타이드이다)인, siRNA.
  6. 제5항에 있어서, Z3이 U이고, Z4이 A이거나; Z7이 U이고, Z8이 A이거나; Z11이 A이고, Z12가 U이거나; Z15가 U이고, Z16이 A이거나; Z19가 U이고, Z20이 A이거나; Z23이 G이고, Z24가 C이거나; Z27이 A이고, Z28이 U이거나; Z31이 U이고, Z32이 A이거나; Z35가 A이고, Z36이 U인, siRNA.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 센스 가닥이 뉴클레오타이드 서열 III을 추가로 포함하고, 안티센스 가닥이 뉴클레오타이드 서열 IV를 포함하고, 뉴클레오타이드 서열 III 및 뉴클레오타이드 서열 IV가 서로 독립적으로 1 내지 4개의 뉴클레오타이드 길이를 갖고; 뉴클레오타이드 서열 III이 뉴클레오타이드 서열 I의 5' 말단에 연결되고, 뉴클레오타이드 서열 IV가 뉴클레오타이드 서열 II의 3' 말단에 연결되고; 뉴클레오타이드 III 및 뉴클레오타이드 서열 IV가 동일한 길이를 갖고, 서로에 대해 실질적으로 역 상보성이거나 완전히 역 상보성이고; "실질적으로 역 상보성"은 2개의 뉴클레오타이드 서열 사이에 1개 이하의 염기쌍오류(base mispairing)가 존재함을 의미하고; "완전히 역 상보성"은 2개의 뉴클레오타이드 서열 사이에 염기쌍오류(mispairing)가 존재하지 않음을 의미하는, siRNA.
  8. 제7항에 있어서, 뉴클레오타이드 서열 I이 서열 번호: 1에 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열과 동일한 길이 및 이들 사이에 3개 이하의 뉴클레오타이드 차이를 가지고;
    뉴클레오타이드 서열 III 및 뉴클레오타이드 서열 IV 둘 다는 1개의 뉴클레오타이드 길이를 가지고, 뉴클레오타이드 서열 III의 염기는 U이거나; 또는
    뉴클레오타이드 서열 III 및 뉴클레오타이드 서열 IV 둘 다는 2개의 뉴클레오타이드의 길이를 가지고, 5' 말단으로부터 3' 말단까지의 방향으로, 뉴클레오타이드 서열 III의 염기 조성은 CU이거나; 또는
    뉴클레오타이드 서열 III 및 뉴클레오타이드 서열 IV 둘 다는 3개의 뉴클레오타이드 길이를 가지고, 5' 말단으로부터 3' 말단까지의 방향으로, 뉴클레오타이드 서열 III의 염기 조성은 UCU이거나; 또는
    뉴클레오타이드 서열 III 및 뉴클레오타이드 서열 IV 둘 다는 4개의 뉴클레오타이드 길이를 가지고, 5' 말단으로부터 3' 말단까지의 방향으로, 뉴클레오타이드 서열 III의 염기 조성은 UUCU이거나; 또는
    뉴클레오타이드 서열 I은 서열 번호: 61로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열과 동일한 길이 및 이들 사이에 3개 이하의 뉴클레오타이드 차이를 가지고;
    뉴클레오타이드 서열 III 및 뉴클레오타이드 서열 IV 둘 다는 1개의 뉴클레오타이드 길이를 가지고, 뉴클레오타이드 서열 III의 염기는 G이거나; 또는
    뉴클레오타이드 서열 III 및 뉴클레오타이드 서열 IV 둘 다는 2개의 뉴클레오타이드 길이를 가지고, 5' 말단으로부터 3' 말단까지의 방향으로, 뉴클레오타이드 서열 III의 염기 조성은 AG이거나; 또는
    뉴클레오타이드 서열 III 및 뉴클레오타이드 서열 IV 둘 다는 3개의 뉴클레오타이드의 길이를 가지고, 5' 말단으로부터 3' 말단까지의 방향으로, 뉴클레오타이드 서열 III의 염기 조성은 AAG이거나; 또는
    뉴클레오타이드 서열 III 및 뉴클레오타이드 서열 IV 둘 다는 4개의 뉴클레오타이드를 가지고, 5' 말단으로부터 3' 말단까지의 방향으로, 뉴클레오타이드 서열 III의 염기 조성은 GAAG이거나; 또는
    뉴클레오타이드 서열 I은 서열 번호: 121로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열과 동일한 길이 및 이들 사이에 3개 이하의 뉴클레오타이드 차이를 가지고;
    뉴클레오타이드 서열 III 및 뉴클레오타이드 서열 IV 둘 다는 1개의 뉴클레오타이드 길이를 가지고, 뉴클레오타이드 서열 III의 염기는 U이거나; 또는
    뉴클레오타이드 서열 III 및 뉴클레오타이드 서열 IV 둘 다는 2개의 뉴클레오타이드 길이를 가지고, 5' 말단으로부터 3' 말단까지의 방향으로, 뉴클레오타이드 서열 III의 염기 조성은 GU이거나; 또는
    뉴클레오타이드 서열 III 및 뉴클레오타이드 서열 IV 둘 다는 3개의 뉴클레오타이드의 길이를 가지고, 5' 말단으로부터 3' 말단까지의 방향으로, 뉴클레오타이드 서열 III의 염기 조성은 AGU이거나; 또는
    뉴클레오타이드 서열 III 및 뉴클레오타이드 서열 IV 둘 다는 4개의 뉴클레오타이드를 가지고, 5' 말단으로부터 3' 말단까지의 방향으로, 뉴클레오타이드 서열 III의 염기 조성은 GAGU이거나; 또는
    뉴클레오타이드 서열 I은 서열 번호: 181로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열과 동일한 길이 및 이들 사이에 3개 이하의 뉴클레오타이드 차이를 가지고;
    뉴클레오타이드 서열 III 및 뉴클레오타이드 서열 IV 둘 다는 1개의 뉴클레오타이드 길이를 가지고, 뉴클레오타이드 서열 III의 염기는 U이거나; 또는
    뉴클레오타이드 서열 III 및 뉴클레오타이드 서열 IV 둘 다는 2개의 뉴클레오타이드 길이를 가지고, 5' 말단으로부터 3' 말단까지의 방향으로, 뉴클레오타이드 서열 III의 염기 조성은 UU이거나; 또는
    뉴클레오타이드 서열 III 및 뉴클레오타이드 서열 IV 둘 다는 3개의 뉴클레오타이드의 길이를 가지고, 5' 말단으로부터 3' 말단까지의 방향으로, 뉴클레오타이드 서열 III의 염기 조성은 CUU이거나; 또는
    뉴클레오타이드 서열 III 및 뉴클레오타이드 서열 IV 둘 다는 4개의 뉴클레오타이드를 가지고, 5' 말단으로부터 3' 말단까지의 방향으로, 뉴클레오타이드 서열 III의 염기 조성은 GCUU이거나; 또는
    뉴클레오타이드 서열 I은 서열 번호: 241로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열과 동일한 길이 및 이들 사이에 3개 이하의 뉴클레오타이드 차이를 가지고;
    뉴클레오타이드 서열 III 및 뉴클레오타이드 서열 IV 둘 다는 1개의 뉴클레오타이드 길이를 가지고, 뉴클레오타이드 서열 III의 염기는 A이거나; 또는
    뉴클레오타이드 서열 III 및 뉴클레오타이드 서열 IV 둘 다는 2개의 뉴클레오타이드 길이를 가지고, 5' 말단으로부터 3' 말단까지의 방향으로, 뉴클레오타이드 서열 III의 염기 조성은 AA이거나; 또는
    뉴클레오타이드 서열 III 및 뉴클레오타이드 서열 IV 둘 다는 3개의 뉴클레오타이드의 길이를 가지고, 5' 말단으로부터 3' 말단까지의 방향으로, 뉴클레오타이드 서열 III의 염기 조성은 AAA이거나; 또는
    뉴클레오타이드 서열 III 및 뉴클레오타이드 서열 IV 둘 다는 4개의 뉴클레오타이드를 가지고, 5' 말단으로부터 3' 말단까지의 방향으로, 뉴클레오타이드 서열 III의 염기 조성은 CAAA이거나; 또는
    뉴클레오타이드 서열 I은 서열 번호: 301로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열과 동일한 길이 및 이들 사이에 3개 이하의 뉴클레오타이드 차이를 가지고;
    뉴클레오타이드 서열 III 및 뉴클레오타이드 서열 IV 둘 다는 1개의 뉴클레오타이드 길이를 가지고, 뉴클레오타이드 서열 III의 염기는 A이거나; 또는
    뉴클레오타이드 서열 III 및 뉴클레오타이드 서열 IV 둘 다는 2개의 뉴클레오타이드 길이를 가지고, 5' 말단으로부터 3' 말단까지의 방향으로, 뉴클레오타이드 서열 III의 염기 조성은 GA이거나; 또는
    뉴클레오타이드 서열 III 및 뉴클레오타이드 서열 IV 둘 다는 3개의 뉴클레오타이드의 길이를 가지고, 5' 말단으로부터 3' 말단까지의 방향으로, 뉴클레오타이드 서열 III의 염기 조성은 CGA이거나; 또는
    뉴클레오타이드 서열 III 및 뉴클레오타이드 서열 IV 둘 다는 4개의 뉴클레오타이드를 가지고, 5' 말단으로부터 3' 말단까지의 방향으로, 뉴클레오타이드 서열 III의 염기 조성은 UCGA이거나; 또는
    뉴클레오타이드 서열 I은 서열 번호: 361로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열과 동일한 길이 및 이들 사이에 3개 이하의 뉴클레오타이드 차이를 가지고;
    뉴클레오타이드 서열 III 및 뉴클레오타이드 서열 IV 둘 다는 1개의 뉴클레오타이드 길이를 가지고, 뉴클레오타이드 서열 III의 염기는 G이거나; 또는
    뉴클레오타이드 서열 III 및 뉴클레오타이드 서열 IV 둘 다는 2개의 뉴클레오타이드 길이를 가지고, 5' 말단으로부터 3' 말단까지의 방향으로, 뉴클레오타이드 서열 III의 염기 조성은 CG이거나; 또는
    뉴클레오타이드 서열 III 및 뉴클레오타이드 서열 IV 둘 다는 3개의 뉴클레오타이드의 길이를 가지고, 5' 말단으로부터 3' 말단까지의 방향으로, 뉴클레오타이드 서열 III의 염기 조성은 GCG이거나; 또는
    뉴클레오타이드 서열 III 및 뉴클레오타이드 서열 IV 둘 다는 4개의 뉴클레오타이드를 가지고, 5' 말단으로부터 3' 말단까지의 방향으로, 뉴클레오타이드 서열 III의 염기 조성은 AGCG이거나; 또는
    뉴클레오타이드 서열 I은 서열 번호: 421로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열과 동일한 길이 및 이들 사이에 3개 이하의 뉴클레오타이드 차이를 가지고;
    뉴클레오타이드 서열 III 및 뉴클레오타이드 서열 IV 둘 다는 1개의 뉴클레오타이드 길이를 가지고, 뉴클레오타이드 서열 III의 염기는 A이거나; 또는
    뉴클레오타이드 서열 III 및 뉴클레오타이드 서열 IV 둘 다는 2개의 뉴클레오타이드 길이를 가지고, 5' 말단으로부터 3' 말단까지의 방향으로, 뉴클레오타이드 서열 III의 염기 조성은 GA이거나; 또는
    뉴클레오타이드 서열 III 및 뉴클레오타이드 서열 IV 둘 다는 3개의 뉴클레오타이드의 길이를 가지고, 5' 말단으로부터 3' 말단까지의 방향으로, 뉴클레오타이드 서열 III의 염기 조성은 AGA이거나; 또는
    뉴클레오타이드 서열 III 및 뉴클레오타이드 서열 IV 둘 다는 4개의 뉴클레오타이드를 가지고, 5' 말단으로부터 3' 말단까지의 방향으로, 뉴클레오타이드 서열 III의 염기 조성은 UAGA이거나; 또는
    뉴클레오타이드 서열 I은 서열 번호: 481로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열과 동일한 길이 및 이들 사이에 3개 이하의 뉴클레오타이드 차이를 가지고;
    뉴클레오타이드 서열 III 및 뉴클레오타이드 서열 IV 둘 다는 1개의 뉴클레오타이드 길이를 가지고, 뉴클레오타이드 서열 III의 염기는 U이거나; 또는
    뉴클레오타이드 서열 III 및 뉴클레오타이드 서열 IV 둘 다는 2개의 뉴클레오타이드 길이를 가지고, 5' 말단으로부터 3' 말단까지의 방향으로, 뉴클레오타이드 서열 III의 염기 조성은 CU이거나; 또는
    뉴클레오타이드 서열 III 및 뉴클레오타이드 서열 IV 둘 다는 3개의 뉴클레오타이드의 길이를 가지고, 5' 말단으로부터 3' 말단까지의 방향으로, 뉴클레오타이드 서열 III의 염기 조성은 ACU이거나; 또는
    뉴클레오타이드 서열 III 및 뉴클레오타이드 서열 IV 둘 다는 4개의 뉴클레오타이드를 가지고, 5' 말단으로부터 3' 말단까지의 방향으로, 뉴클레오타이드 서열 III의 염기 조성은 GACU인, siRNA.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 안티센스 가닥이 뉴클레오타이드 서열 V를 추가로 포함하고; 뉴클레오타이드 서열 V가 1 내지 3개의 뉴클레오타이드의 길이를 가지고 안티센스 가닥의 3' 말단에 연결됨으로써, 안티센스 가닥의 3' 오버행을 형성하는, siRNA.
  10. 제9항에 있어서, 뉴클레오타이드 서열 V가 2개의 뉴클레오타이드의 길이를 갖는, siRNA.
  11. 제9항 또는 제10항에 있어서, 뉴클레오타이드 서열 V가 2개의 연속적인 티민 데옥시리보뉴클레오타이드 또는 2개의 연속적인 우라실 리보뉴클레오타이드이거나; 뉴클레오타이드 서열 V는 표적 mRNA의 상응하는 위치에서 뉴클레오타이드에 대해 상보성인, siRNA.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, siRNA의 센스 가닥이 서열 번호: 5로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, siRNA의 안티센스 가닥이 서열 번호: 6으로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나:
    5'-GGGUAUUCUUUCAAGCAAZ3-3' (서열 번호: 5);
    5'-Z4UUGCUUGAAAGAAUACCCAG-3' (서열 번호: 6);
    siRNA의 센스 가닥이 서열 번호: 7로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, siRNA의 안티센스 가닥이 서열 번호: 8로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나:
    5'-CUGGGUAUUCUUUCAAGCAAZ3-3' (서열 번호: 7);
    5'-Z4UUGCUUGAAAGAAUACCCAGAA-3' (서열 번호: 8);
    (여기서, Z4는 안티센스 가닥의 5' 말단에서 제1의 뉴클레오타이드이고; Z3은 A, U, G 또는 C로부터 선택되고, Z4는 Z3에 대해 상보성인 뉴클레오타이드이다);
    siRNA의 센스 가닥이 서열 번호: 65로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, siRNA의 안티센스 가닥이 서열 번호: 66으로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나:
    5'-GGCAUAAACUAUAACAGCZ7-3' (서열 번호: 65);
    5'-Z8GCUGUUAUAGUUUAUGCCCU-3' (서열 번호: 66);
    siRNA의 센스 가닥이 서열 번호: 67로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, siRNA의 안티센스 가닥은 서열 번호: 68로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나:
    5'-AGGGCAUAAACUAUAACAGCZ7-3' (서열 번호: 67);
    5'-Z8GCUGUUAUAGUUUAUGCCCUUC-3' (서열 번호: 68)
    (여기서, Z8은 안티센스 가닥의 5' 말단에서 제1의 뉴클레오타이드이고; Z7은 A, U, G 또는 C로부터 선택되고, Z8은 Z7에 대해 상보성인 뉴클레오타이드이다);
    siRNA의 센스 가닥이 서열 번호: 125로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열을 포함하고 siRNA의 안티센스 가닥이 서열 번호: 126으로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나:
    5'-GCUCAAGAAUGCCAAGAAZ11-3' (서열 번호: 125);
    5'-Z12UUCUUGGCAUUCUUGAGCAC-3' (서열 번호: 126);
    siRNA의 센스 가닥이 서열 번호: 127로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, siRNA의 안티센스 가닥이 서열 번호: 128로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나:
    5'-GUGCUCAAGAAUGCCAAGAAZ11-3' (서열 번호: 127);
    5'-Z12UUCUUGGCAUUCUUGAGCACUC-3' (서열 번호: 128)
    (여기서, Z12는 안티센스 가닥의 5' 말단에서 제1의 뉴클레오타이드이고; Z11은 A, U, G 또는 C로부터 선택되고, Z12는 Z11에 대해 상보성인 뉴클레오타이드이다);
    siRNA의 센스 가닥이 서열 번호: 185로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, siRNA의 안티센스 가닥이 서열 번호: 186으로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나:
    5'-GCAACAAAGACAUUUAUGZ15-3' (서열 번호: 185);
    5'-Z16CAUAAAUGUCUUUGUUGCAA-3' (서열 번호: 186);
    siRNA의 센스 가닥이 서열 번호: 187로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, siRNA의 안티센스 가닥이 서열 번호: 188로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나:
    5'-UUGCAACAAAGACAUUUAUGZ15-3' (서열 번호: 187);
    5'-Z16CAUAAAUGUCUUUGUUGCAAGC-3' (서열 번호: 188)
    (여기서, Z16은 안티센스 가닥의 5' 말단에서 제1의 뉴클레오타이드이고; Z15는 A, U, G 또는 C로부터 선택되고, Z16은 Z15에 대해 상보성인 뉴클레오타이드이다);
    siRNA의 센스 가닥이 서열 번호: 245로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, siRNA의 안티센스 가닥은 서열 번호: 246으로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나:
    5'-GAAUCUCAAAGAAAUCUUZ19-3' (서열 번호: 245);
    5'-Z20AAGAUUUCUUUGAGAUUCUU-3' (서열 번호: 246);
    siRNA의 센스 가닥이 서열 번호: 247로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, siRNA의 안티센스 가닥이 서열 번호: 248로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나:
    5'-AAGAAUCUCAAAGAAAUCUUZ19-3' (서열 번호: 247);
    5'-Z20AAGAUUUCUUUGAGAUUCUUUG-3' (서열 번호: 248)
    (여기서, Z20은 안티센스 가닥의 5' 말단에서 제1의 뉴클레오타이드이고; Z19는 A, U, G 또는 C로부터 선택되고, Z20은 Z19에 대해 상보성인 뉴클레오타이드이다);
    siRNA의 센스 가닥이 서열 번호: 305로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, siRNA의 안티센스 가닥은 서열 번호: 306으로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나:
    5'-GUACGUGGACUGGAUUCUZ23-3' (서열 번호: 305);
    5'-Z24AGAAUCCAGUCCACGUACUC-3' (서열 번호: 306);
    siRNA의 센스 가닥이 서열 번호: 307로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, siRNA의 안티센스 가닥은 서열 번호: 308로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나:
    5'-GAGUACGUGGACUGGAUUCUZ23-3' (서열 번호: 307);
    5'-Z24AGAAUCCAGUCCACGUACUCGA-3' (서열 번호: 308)
    (여기서, Z24는 안티센스 가닥의 5' 말단에서 제1의 뉴클레오타이드이고; Z23은 A, U, G 또는 C로부터 선택되고, Z24는 Z23에 대해 상보성인 뉴클레오타이드이다);
    siRNA의 센스 가닥이 서열 번호: 365로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, siRNA의 안티센스 가닥은 서열 번호: 366으로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나:
    5'-AUUUCUGGGUAUUCUUUCZ27-3' (서열 번호: 365);
    5'-Z28GAAAGAAUACCCAGAAAUCG-3' (서열 번호: 366);
    siRNA의 센스 가닥이 서열 번호: 367로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, siRNA의 안티센스 가닥이 서열 번호: 368로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나:
    5'-CGAUUUCUGGGUAUUCUUUCZ27-3'(서열 번호: 367);
    5'-Z28GAAAGAAUACCCAGAAAUCGCU-3'(서열 번호: 368)
    (여기서, Z28은 안티센스 가닥의 5' 말단에서 제1의 뉴클레오타이드이고; Z27은 A, U, G 또는 C로부터 선택되고, Z28은 Z27에 대해 상보성인 뉴클레오타이드이다);
    siRNA의 센스 가닥이 서열 번호: 425로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, siRNA의 안티센스 가닥은 서열 번호: 426으로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나:
    5'-CAUGAAGGGCAUAAACUAZ31-3' (서열 번호: 425);
    5'-Z32UAGUUUAUGCCCUUCAUGUC-3' (서열 번호: 426);
    siRNA의 센스 가닥이 서열 번호: 427로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, siRNA의 안티센스 가닥은 서열 번호: 428로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나:
    5'-GACAUGAAGGGCAUAAACUAZ31-3' (서열 번호: 427);
    5'-Z32UAGUUUAUGCCCUUCAUGUCUA-3' (서열 번호: 428)
    (여기서, Z32는 안티센스 가닥의 5' 말단에서 제1의 뉴클레오타이드이고; Z31은 A, U, G 또는 C이고, Z32는 Z31에 대해 상보성인 뉴클레오타이드이다);
    siRNA의 센스 가닥이 서열 번호: 485로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, siRNA의 안티센스 가닥은 서열 번호: 486으로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나:
    5'-GGAUUCUGGAGAAAACUCZ35-3' (서열 번호: 485);
    5'-Z36GAGUUUUCUCCAGAAUCCAG-3' (서열 번호: 486);
    siRNA의 센스 가닥이 서열 번호: 487로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, siRNA의 안티센스 가닥이 서열 번호: 488로 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 siRNA:
    5'-CUGGAUUCUGGAGAAAACUCZ35-3' (서열 번호: 487);
    5'-Z36GAGUUUUCUCCAGAAUCCAGUC-3' (서열 번호: 488)
    (여기서, Z36은 안티센스 가닥의 5' 말단에서 제1의 뉴클레오타이드이고; Z35는 A, U, G 또는 C로부터 선택되고, Z36은 Z35에 대해 상보성인 뉴클레오타이드이다).
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, siRNA가 siFXIa1, siFXIa2, siFXIb1, siFXIb2, siFXIc1, siFXIc2, siFXId1, siFXId2, siFXIe1, siFXIe2, siFXIf1, siFXIf2, siFXIg1, siFXIg2, siFXIh1, siFXIh2, siFXIi1, 또는 siFXIi2 중 어느 하나인, siRNA.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 센스 가닥 또는 안티센스 가닥 내 적어도 하나의 뉴클레오타이드가 변형된 뉴클레오타이드이고/이거나, 적어도 하나의 포스페이트 그룹이 변형된 그룹(들)을 지닌 포스페이트 그룹인, siRNA.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 센스 가닥 및 안티센스 가닥 내 각각의 뉴클레오타이드가 독립적으로 플루오로 변형된 뉴클레오타이드 또는 비-플루오로(non-fluoro) 변형된 뉴클레오타이드인, siRNA.
  16. 제15항에 있어서, 플루오로 변형된 뉴클레오타이드가 뉴클레오타이드 서열 I 및 뉴클레오타이드 서열 II 내에 위치하고; 5' 말단으로부터 3' 말단까지의 방향으로, 뉴클레오타이드 서열 I의 적어도 7, 8 및 9번 위치에서 뉴클레오타이드가 플루오로 변형된 뉴클레오타이드이고; 5' 말단으로부터 3' 말단까지의 방향으로, 뉴클레오타이드 II의 2, 6, 14, 및 16번 위치에서 적어도 뉴클레오타이드가 플루오로 변형된 뉴클레오타이드인, siRNA.
  17. 제16항에 있어서, 5' 말단으로부터 3' 말단까지의 방향으로, 뉴클레오타이드 서열 I의 7, 8 및 9번 위치 또는 5, 7, 8 및 9번 위치에서 뉴클레오타이드가 플루오로 변형된 뉴클레오타이드이고, 센스 가닥내 다른 위치에서 뉴클레오타이드가 비-플루오로 변형된 뉴클레오타이드이고; 5' 말단으로부터 3' 말단까지, 안티센스 가닥내 뉴클레오타이드 서열 II의 2, 6, 14, 및 16번 위치 또는 2, 6, 8, 9, 14, 및 16번 위치에서 뉴클레오타이드가 플루오로 변형된 뉴클레오타이드이고, 안티센스 가닥내 다른 위치에서 뉴클레오타이드가 비-플루오로 변형된 뉴클레오타이드인, siRNA.
  18. 제15항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 비-플루오로 변형된 뉴클레오타이드가 이의 리보스 그룹의 2'-하이드록시를 비-플루오로 그룹, 또는 뉴클레오타이드 유사체로 치환함으로써 형성된 뉴클레오타이드로부터 독립적으로 선택된, siRNA.
  19. 제18항에 있어서, 리보스 그룹의 2'-하이드록시를 비-플루오로 그룹으로 치환시켜 형성한 뉴클레오타이드가 2'-알콕시 변형된 뉴클레오타이드, 2'-치환된 알콕시 변형된 뉴클레오타이드, 2'-알킬 변형된 뉴클레오타이드, 2'-치환된 알킬 변형된 뉴클레오타이드, 2'-아미노 변형된 뉴클레오타이드, 2'-치환된 아미노 변형된 뉴클레오타이드, 및 2'-데옥시 뉴클레오타이드로 이루어진 그룹으로부터 선택된 것이고; 뉴클레오타이드 유사체가 LNA, ENA, cET, UNA, 및 GNA로 이루어진 그룹으로부터 선택된 것인, siRNA.
  20. 제15항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 비-플루오로 변형된 뉴클레오타이드가 메톡시 변형된 뉴클레오타이드이고; 메토시 변형된 뉴클레오타이드가 리보스 그룹의 2'-하이드록시를 메톡시 그룹으로 치환시켜 형성된 뉴클레오타이드를 지칭하는, siRNA.
  21. 제17항에 있어서, 5' 말단으로부터 3' 말단까지의 방향으로, siRNA의 센스 가닥 내 뉴클레오타이드 서열 I의 5, 7, 8 및 9번 위치에서 뉴클레오타이드가 플루오로 변형된 뉴클레오타이드이고, siRNA의 센스 가닥 내 다른 위치에서의 뉴클레오타이드가 메톡시 변형된 뉴클레오타이드이고; 5' 말단으로부터 3' 말단까지의 방향으로, siRNA의 안티센스 가닥 내 뉴클레오타이드 서열 II의 2, 6, 8, 9, 14, 및 16번 위치에서 뉴클레오타이드가 플루오로 변형된 뉴클레오타이드이고, siRNA의 안티센스 가닥의 다른 위치에서의 뉴클레오타이드가 메톡시 변형된 뉴클레오타이드이거나;
    5' 말단으로부터 3' 말단까지의 방향으로, siRNA의 센스 가닥 내 뉴클레오타이드 서열 I의 5, 7, 8 및 9번 위치에서 뉴클레오타이드가 플루오로 변형된 뉴클레오타이드이고, siRNA의 센스 가닥 내 다른 위치에서의 뉴클레오타이드가 메톡시 변형된 뉴클레오타이드이고; 5' 말단으로부터 3' 말단까지의 방향으로, siRNA의 안티센스 가닥 내 뉴클레오타이드 서열 II의 2, 6, 14, 및 16번 위치에서 뉴클레오타이드가 플루오로 변형된 뉴클레오타이드이고, siRNA의 안티센스 가닥의 다른 위치에서의 뉴클레오타이드가 메톡시 변형된 뉴클레오타이드이거나;
    5' 말단으로부터 3' 말단까지의 방향으로, siRNA의 센스 가닥 내 뉴클레오타이드 서열 I의 7, 8 및 9번 위치에서 뉴클레오타이드가 플루오로 변형된 뉴클레오타이드이고, siRNA의 센스 가닥 내 다른 위치에서의 뉴클레오타이드가 메톡시 변형된 뉴클레오타이드이고; 5' 말단으로부터 3' 말단까지의 방향으로, siRNA의 안티센스 가닥 내 뉴클레오타이드 서열 II의 2, 6, 14, 및 16번 위치에서 뉴클레오타이드가 플루오로 변형된 뉴클레오타이드이고, siRNA의 안티센스 가닥의 다른 위치에서의 뉴클레오타이드가 메톡시 변형된 뉴클레오타이드인, siRNA.
  22. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, siRNA가 siFXIa1-M1, siFXIa1-M2, siFXIa1-M3, siFXIa2-M1, siFXIa2-M2, siFXIa2-M3, siFXIb1-M1, siFXIb1-M2, siFXIb1-M3, siFXIb2-M1, siFXIb2-M2, siFXIb2-M3, siFXIc1-M1, siFXIc1-M2, siFXIc1-M3, siFXIc2-M1, siFXIc2-M2, siFXIc2-M3, siFXId1-M1, siFXId1-M2, siFXId1-M3, siFXId2-M1, siFXId2-M2, siFXId2-M3, siFXIe1-M1, siFXIe1-M2, siFXIe1-M3, siFXIe2-M1, siFXIe2-M2, siFXIe2-M3, siFXIf1-M1, siFXIf1-M2, siFXIf1-M3, siFXIf2-M1, siFXIf2-M2, siFXIf2-M3, siFXIg1-M1, siFXIg1-M2, siFXIg1-M3, siFXIg2-M1, siFXIg2-M2, siFXIg2-M3, siFXIh1-M1, siFXIh1-M2, siFXIh1-M3, siFXIh2-M1, siFXIh2-M2, siFXIh2-M3, siFXIi1-M1, siFXIi1-M2, siFXIi1-M3, siFXIi2-M1, siFXIi2-M2, 및 siFXIi2-M3 중 어느 하나인, siRNA.
  23. 제14항에 있어서, 변형된 그룹(들)을 지닌 포스페이트 그룹이 포스페이트 그룹 내 포스포디에스테르 결합내 적어도 하나의 산소 원자를 황 원자로 치환함으로써 형성된 포스포로티오에이트 그룹인, siRNA.
  24. 제14항 또는 제23항에 있어서, 상기 변형된 그룹(들)을 지닌 포스페이트 그룹은 화학식 (1)으로 나타낸 바와 같은 구조를 가진 포스포로티오에이트 그룹인, siRNA:
    Figure pct00100
  25. 제23항 또는 제24항에 있어서, 포스포로티오에이트 연결이 다음의 위치로 이루어진 그룹 중 적어도 하나에 위치하는 siRNA:
    센스 가닥의 5' 말단에서 제1과 제2의 뉴클레오타이드 사이의 위치;
    센스 가닥의 5' 말단에서 제2와 제3의 뉴클레오타이드 사이의 위치;
    센스 가닥의 3' 말단에서 제1과 제2의 뉴클레오타이드 사이의 위치;
    센스 가닥의 3' 말단에서 제2와 제3의 뉴클레오타이드 사이의 위치;
    안티센스 가닥의 5' 말단에서 제1과 제2의 뉴클레오타이드 사이의 위치;
    안티센스 가닥의 5' 말단에서 제2와 제3의 뉴클레오타이드 사이의 위치;
    안티센스 가닥의 3' 말단에서 제1과 제2의 뉴클레오타이드 사이의 위치; 및
    안티센스 가닥의 3' 말단에서 제2와 제3의 뉴클레오타이드 사이의 위치.
  26. 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, siRNA가 siFXIa1-M1S, siFXIa1-M2S, siFXIa1-M3S, siFXIa2-M1S, siFXIa2-M2S, siFXIa2-M3S, siFXIb1-M1S, siFXIb1-M2S, siFXIb1-M3S, siFXIb2-M1S, siFXIb2-M2S, siFXIb2-M3S, siFXIc1-M1S, siFXIc1-M2S, siFXIc1-M3S, siFXIc2-M1S, siFXIc2-M2S, siFXIc2-M3S, siFXId1-M1S, siFXId1-M2S, siFXId1-M3S, siFXId2-M1S, siFXId2-M2S, siFXId2-M3S, siFXIe1-M1S, siFXIe1-M2S, siFXIe1-M3S, siFXIe2-M1S, siFXIe2-M2S, siFXIe2-M3S, siFXIf1-M1S, siFXIf1-M2S, siFXIf1-M3S, siFXIf2-M1S, siFXIf2-M2S, siFXIf2-M3S, siFXIg1-M1S, siFXIg1-M2S, siFXIg1-M3S, siFXIg2-M1S, siFXIg2-M2S, siFXIg2-M3S, siFXIh1-M1S, siFXIh1-M2S, siFXIh1-M3S, siFXIh2-M1S, siFXIh2-M2S, siFXIh2-M3S, FXIi1-M1S, siFXIi1-M2S, siFXIi1-M3S, siFXIi2-M1S, siFXIi2-M2S, 및 siFXIi2-M3S 중 임의의 하나인, siRNA.
  27. 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, siRNA가 siFXIa1-M1P1, siFXIa1-M2P1, siFXIa1-M3P1, siFXIa2-M1P1, siFXIa2-M2P1, siFXIa2-M3P1, siFXIa1-M1SP1, siFXIa1-M2SP1, siFXIa1-M3SP1, siFXIa2-M1SP1, siFXIa2-M2SP1, siFXIa2-M3SP1, siFXIb1-M1P1, siFXIb1-M2P1, siFXIb1-M3P1, siFXIb2-M1P1, siFXIb2-M2P1, siFXIb2-M3P1, siFXIb1-M1SP1, siFXIb1-M2SP1, siFXIb1-M3SP1, siFXIb2-M1SP1, siFXIb2-M2SP1, siFXIb2-M3SP1, siFXIc1-M1P1, siFXIc1-M2P1, siFXIc1-M3P1, siFXIc2-M1P1, siFXIc2-M2P1, siFXIc2-M3P1, siFXIc1-M1SP1, siFXIc1-M2SP1, siFXIc1-M3SP1, siFXIc2-M1SP1, siFXIc2-M2SP1, siFXIc2-M3SP1, siFXId1-M1P1, siFXId1-M2P1, siFXId1-M3P1, siFXId2-M1P1, siFXId2-M2P1, siFXId2-M3P1, siFXId1-M1SP1, siFXId1-M2SP1, siFXId1-M3SP1, siFXId2-M1SP1, siFXId2-M2SP1, siFXId2-M3SP1, siFXIe1-M1P1, siFXIe1-M2P1, siFXIe1-M3P1, siFXIe2-M1P1, siFXIe2-M2P1, siFXIe2-M3P1, siFXIe1-M1SP1, siFXIe1-M2SP1, siFXIe1-M3SP1, siFXIe2-M1SP1, siFXIe2-M2SP1, siFXIe2-M3SP1, siFXIf1-M1P1, siFXIf1-M2P1, siFXIf1-M3P1, siFXIf2-M1P1, siFXIf2-M2P1, siFXIf2-M3P1, siFXIf1-M1SP1, siFXIf1-M2SP1, siFXIf1-M3SP1, siFXIf2-M1SP1, siFXIf2-M2SP1, siFXIf2-M3SP1, siFXIg1-M1P1, siFXIg1-M2P1, siFXIg1-M3P1, siFXIg2-M1P1, siFXIg2-M2P1, siFXIg2-M3P1, siFXIg1-M1SP1, siFXIg1-M2SP1, siFXIg1-M3SP1, siFXIg2-M1SP1, siFXIg2-M2SP1, siFXIg2-M3SP1, siFXIh1-M1P1, siFXIh1-M2P1, siFXIh1-M3P1, siFXIh2-M1P1, siFXIh2-M2P1, siFXIh2-M3P1, siFXIh1-M1SP1, siFXIh1-M2SP1, siFXIh1-M3SP1, siFXIh2-M1SP1, siFXIh2-M2SP1, siFXIh2-M3SP1, FXIi1-M1P1, siFXIi1-M2P1, siFXIi1-M3P1, siFXIi2-M1P1, siFXIi2-M2P1, siFXIi2-M3P1, siFXIi1-M1SP1, siFXIi1-M2SP1, siFXIi1-M3SP1, siFXIi2-M1SP1, siFXIi2-M2SP1, 및 siFXIi2-M3SP1 중 어느 하나인, siRNA.
  28. 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 따른 siRNA, 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함함을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
  29. 제28항에 있어서, siRNA 대 약제학적으로 허용되는 담체의 중량 비가 1:(1-500)인, 약제학적 조성물.
  30. 제29항에 있어서, siRNA 대 약제학적으로 허용되는 담체의 중량 비가 1:(1-50)인, 약제학적 조성물.
  31. 제28항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 약제학적으로 허용되는 담체가 유기 아민, 헬퍼 지질 및 페길화된(PEGylated) 지질을 포함하고; 여기서 유기 아민이 화학식 (201)로 나타낸 바와 같은 화합물 및/또는 이의 약제학적으로 허용되는 염인, 약제학적 조성물:
    Figure pct00101

    여기서,
    X101 또는 X102는 서로 독립적으로 O, S, N-A 또는 C-A로부터 선택되고, 여기서 A는 수소 또는 C1-C20 탄화수소 쇄이고;
    Y101 및 Z101은 서로 독립적으로 C=O, C=S, S=O, CH-OH 또는 SO2로부터 선택되고;
    R101, R102, R103, R104, R105, R106 및 R107은 서로 독립적으로 수소; 사이클릭 또는 아사이클릭(acyclic)의, 치환되거나 비치환된, 측쇄 또는 직쇄의 지방족 그룹; 사이클릭 또는 아사이클릭의, 치환되거나 비치환된, 측쇄 또는 직쇄의 헤테로지방족 그룹; 치환되거나 비치환된, 측쇄 또는 직쇄의 아실 그룹; 치환되거나 비치환된, 측쇄 또는 직쇄의 아릴 그룹; 및 치환되거나 비치환된, 측쇄 또는 직쇄의 헤테로아릴 그룹으로부터 선택되고;
    x는 1 내지 10의 정수이고;
    n은 1 내지 3의 정수이고, m은 0 내지 20의 정수이고, p는 0 또는 1이고, 여기서 m=p=0이면, R102는 수소이고;
    n 및 m 중 적어도 하나가 2이면, 화학식 (201) 내 R103 및 질소는 화학식 (202) 또는 (203)으로 나타낸 바와 같은 구조를 형성하고:
    Figure pct00102

    여기서 g, e 및 f는 서로 독립적으로 1 내지 6의 정수이고; "HCC"는 탄화수소 쇄를 나타내고, 각각의 *N은 화학식 (201)에 나타낸 질소 원자를 나타낸다.
  32. 제31항에 있어서, 유기 아민이 화학식 (214)로 나타낸 바와 같은 유기 아민 및/또는 화학식 (215)로 나타낸 바와 같은 유기 아민이고:
    Figure pct00103

    헬퍼 지질이 콜레스테롤, 콜레스테롤 유사체 및/또는 콜레스테롤 유도체이고,
    페길화된 지질이 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스파티딜에탄올아민-N-[메톡시(폴리에틸렌 글리콜)]-2000인, 약제학적 조성물.
  33. 제31항 또는 제32항에 있어서, 유기 아민, 헬퍼 지질, 및 페길화된 지질 중 몰 비가 (19.7-80):(19.7-80):(0.3-50)인, 약제학적 조성물.
  34. 제33항에 있어서, 유기 아민, 헬퍼 지질, 및 페길화된 지질 중 몰 비가 (50-70):(20-40):(3-20)인, 약제학적 조성물.
  35. 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 따른 siRNA, 및 siRNA에 접합적으로 연결된 접합 그룹을 포함하는, siRNA 접합체.
  36. 제35항에 있어서, 접합 그룹이 약제학적으로 허용되는 표적화 그룹 및 링커를 포함하고; siRNA, 링커 및 표적화 그룹이 비-공유결합적으로 또는 공유결합적으로 순차적으로 연결되는, siRNA 접합체.
  37. 제36항에 있어서, 링커가 화학식 (301)로 나타낸 바와 같은 구조를 갖는, siRNA 접합체:
    Figure pct00104

    여기서,
    k는 1 내지 3의 정수이고;
    LA는 화학식 (302)로 나타낸 바와 같은 구조를 가진 아미드 결합-포함 쇄 모이어티이고, 각각의 LA는 표적화 그룹 및 LC 모이어티에 에테르 결합을 통해 이의 두개의 말단에서 각각 연결되고:
    Figure pct00105

    LB는 화학식 (303)로 나타낸 바와 같은 구조를 갖는 N-아실피롤리딘-포함 쇄 모이어티이고, 여기서 쇄 모이어티는 하나의 말단에서 카보닐 그룹을 갖고 아미드 결합을 통해 LC 모이어티에 연결되고, 다른 말단에서 옥시 그룹을 갖고 포스포에스테르 결합을 통해 siRNA에 연결되고:
    Figure pct00106

    LC는 하이드록시메틸 아미노메탄, 디하이드록시메틸 아미노메탄 또는 트리하이드록시메틸 아미노메탄을 기반으로 한 2가 내지 3가 연결 그룹이고, LC는 에테르 결합을 통해 산소 원자를 경유하여 LA 모이어티에 연결되고, 아미드 결합을 통해 질소 원자를 경유하여 LB 모이어티에 연결된다.
  38. 제35항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, siRNA 접합체가 화학식 (305)로 나타낸 바와 같은 구조를 갖는 siRNA 접합체:
    Figure pct00107

    화학식 (305),
    여기서 이중 나선 구조는 siRNA를 나타낸다.
  39. 제38항에 있어서, 링커가 화학식 (306)으로 나타낸 바와 같은 구조를 갖는, siRNA:
    Figure pct00108

    여기서,
    l은 0 내지 3의 정수이고;
    *는 표적화 그룹에 에테르 결합을 경유하여 연결된 링커 부위(a site on the linker)를 나타내고;
    #는 siRNA에 포스포에스테르 결합을 경유하여 연결된 링커 부위를 나타낸다.
  40. 제35항, 제36항 및 제39항 중 어느 한 항에 있어서, siRNA 접합체가 화학식 (307)로 나타낸 바와 같은 구조를 갖는, siRNA 접합체:
    Figure pct00109

    화학식 (307),
    여기서, 이중 나선 구조는 siRNA를 나타낸다.
  41. 제36항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 링커가 siRNA의 센스 가닥의 3' 말단에 연결된, siRNA 접합체.
  42. 제35항에 있어서, siRNA 접합체가 화학식 (308)로 나타낸 바와 같은 구조를 갖는, siRNA 접합체:
    Figure pct00110

    여기서,
    n1은 1 내지 3의 정수이고, n3은 0 내지 4의 정수이고;
    m1, m2, 또는 m3은 서로 독립적으로 2 내지 10의 정수이고;
    R10, R11, R12, R13, R14, 및 R15는 서로 독립적으로 H이거나, C1-C10 알킬, C1-C10 할로알킬, 및 C1-C10 알콕시로 이루어진 그룹으로부터 선택되고,
    R3는 화학식 (A59)로 나타낸 바와 같은 구조를 갖는 그룹이고:
    Figure pct00111

    여기서 E1은 OH, SH 또는 BH2이고; Nu는 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 따른 siRNA이고;
    R2는 길이가 1 내지 20개 탄소 원자의 직쇄 알킬렌이고, 여기서 하나 이상의 탄소 원자는 임의로 C(O), NH, O, S, CH=N, S(O)2, C2-C10 알케닐렌, C2-C10 알키닐렌, C6-C10 아릴렌, C3-C18 헤테로사이클릴렌, 및 C5-C10 헤테로아릴렌로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 그룹으로 대체되고, 여기서 R2는 임의로 C1-C10 알킬, C6-C10 아릴, C5-C10 헤테로아릴, C1-C10 할로알킬, -OC1-C10 알킬, -OC1-C10 알킬페닐, -C1-C10 알킬-OH, -OC1-C10 할로알킬, -SC1-C10 알킬, -SC1-C10 알킬페닐, -C1-C10 알킬-SH, -SC1-C10 할로알킬, 할로, -OH, -SH, -NH2, -C1-C10 알킬-NH2, -N(C1-C10 알킬)(C1-C10 알킬), -NH(C1-C10 알킬), N(C1-C10 알킬)(C1-C10 알킬페닐), NH(C1-C10 알킬페닐), 시아노, 니트로, -CO2H, -C(O)OC1-C10 알킬, -CON(C1-C10 알킬)(C1-C10 알킬), -CONH(C1-C10 알킬), -CONH2, -NHC(O)(C1-C10 알킬), -NHC(O)(페닐), -N(C1-C10 알킬)C(O)(C1-C10 알킬), -N(C1-C10 알킬)C(O)(페닐), -C(O)C1-C10 알킬, -C(O)C1-C10 알킬페닐, -C(O)C1-C10 할로알킬, -OC(O)C1-C10 알킬, -SO2(C1-C10 알킬), -SO2(페닐), -SO2(C1-C10 할로알킬), -SO2NH2, -SO2NH(C1-C10 알킬), -SO2NH(페닐), -NHSO2(C1-C10 알킬), -NHSO2(페닐), 및 -NHSO2(C1-C10 할로알킬)로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 치환체를 가지고;
    각각의 L1은 독립적으로 길이가 1 내지 70개 탄소 원자의 직쇄 알킬렌이고, 여기서 하나 이상의 탄소 원자는 임의로 C(O), NH, O, S, CH=N, S(O)2, C2-C10 알케닐렌, C2-C10 알키닐렌, C6-C10 아릴렌, C3-C18 헤테로사이클릴렌, 및 C5-C10 헤테로아릴렌로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 그룹으로 대체되고, 여기서 L1은 임의로 C1-C10 알킬, C6-C10 아릴, C5-C10 헤테로아릴, C1-C10 할로알킬, -OC1-C10 알킬, -OC1-C10 알킬페닐, -C1-C10 알킬-OH, -OC1-C10 할로알킬, -SC1-C10 알킬, -SC1-C10 알킬페닐, -C1-C10 알킬-SH, -SC1-C10 할로알킬, 할로, -OH, -SH, -NH2, -C1-C10 알킬-NH2, -N(C1-C10 알킬)(C1-C10 알킬), -NH(C1-C10 알킬), N(C1-C10 알킬)(C1-C10 알킬페닐), NH(C1-C10 알킬페닐), 시아노, 니트로, -CO2H, -C(O)OC1-C10 알킬, -CON(C1-C10 알킬)(C1-C10 알킬), -CONH(C1-C10 알킬), -CONH2, -NHC(O)(C1-C10 알킬), -NHC(O)(페닐), -N(C1-C10 알킬)C(O)(C1-C10 알킬), -N(C1-C10 알킬)C(O)(페닐), -C(O)C1-C10 알킬, -C(O)C1-C10 알킬페닐, -C(O)C1-C10 할로알킬, -OC(O)C1-C10 알킬, -SO2(C1-C10 알킬), -SO2(페닐), -SO2(C1-C10 할로알킬), -SO2NH2, -SO2NH(C1-C10 알킬), -SO2NH(페닐), -NHSO2(C1-C10 알킬), -NHSO2(페닐), 및 -NHSO2(C1-C10 할로알킬)로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 치환체를 갖고;
    Figure pct00112
    는 그룹이 공유결합으로 연결된 부위를 나타내고;
    M1은 표적화 그룹을 나타낸다.
  43. 제42항에 있어서, 각각의 L1이 독립적으로 화학식(A1) 내지 (A26)의 그룹 및 이의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, siRNA 접합체:
    Figure pct00113

    여기서 각각의 j1은 독립적으로 1 내지 20의 정수이고;
    각각의 j2는 독립적으로 1 내지 20의 정수이고;
    각각의 R'는 독립적으로 C1-C10 알킬이고;
    각각의 Ra는 독립적으로 화학식 (A27) 내지 (A45)의 그룹 또는 이의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택되고:
    Figure pct00114

    Figure pct00115

    각각의 Rb는 독립적으로 C1-C10 알킬이고;
    Figure pct00116
    는 그룹이 공유결합으로 연결된 부위를 나타낸다.
  44. 제43항에 있어서, L1이 화학식 (A1), (A4), (A5), (A6), (A8), (A10), (A11), 및 (A13)의 그룹 및 이의 연결 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택된, siRNA 접합체.
  45. 제44항에 있어서, L1이 화학식 (A1), (A4), (A8), (A10), 및 (A11)의 그룹 중 적어도 2개의 연결 조합인, siRNA 접합체.
  46. 제45항에 있어서, L1이 화학식 (A1), (A8) 및 (A10)의 그룹 중 적어도 2개의 연결 조합인, siRNA 접합체.
  47. 제42항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서, L1이 3 내지 25개 원자의 길이를 갖는, siRNA 접합체.
  48. 제47항에 있어서, L1이 4 내지 15개 원자의 길이를 갖는, siRNA 접합체.
  49. 제43항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, j1이 2 내지 10의 정수이고, j2가 2 내지 10의 정수이고, R'가 C1-C4 알킬이고; Ra가 화학식(A27), (A28), (A29), (A30), 및 (A31) 중 하나이고, Rb가 C1-C5 알킬인, siRNA.
  50. 제49항에 있어서, j1이 3 내지 5의 정수이고, j2가 3 내지 5의 정수이고, R'가 메틸, 에틸 및 이소프로필 중 하나이고; Ra가 화학식 (A27) 또는 (A28)이고; Rb가 메틸, 에틸, 이소프로필, 및 부틸 중 하나인, siRNA 접합체.
  51. 제42항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, n1이 1 또는 2의 정수이고; n3이 0 또는 1의 정수이고; n1+n3 = 2 또는 3인, siRNA.
  52. 제42항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 m1, m2 및 m3이 서로 독립적으로 2 내지 5의 정수인, siRNA 접합체.
  53. 제42항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서, m1 = m2 = m3인, siRNA 접합체.
  54. 제35항 내지 제53항 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 표적화 그룹이 독립적으로 포유동물 간세포의 표면에서 아시알로당단백질(asialoglycoprotein) 수용체에 대해 친화성을 갖는 리간드인, siRNA 접합체.
  55. 제54항에 있어서, 각각의 표적화 그룹이 독립적으로 아시알로당단백질 또는 사카라이드인, siRNA 접합체.
  56. 제55항에 있어서, 각각의 표적화 그룹이 D-만노피라노스, L-만노피라노스, D-아라비노스, D-크실로푸라노스, L-크실로푸라노스, D-글루코스, L-글루코스, D-갈락토스, L-갈락토스, α-D-만노푸라노스, β-D-만노푸라노스, α-D-만노피라노스, β-D-만노피라노스, α-D-글루코피라노스, β-D-글루코피라노스, α-D-글루코푸라노스, β-D-글루코푸라노스, α-D-프럭토푸라노스, α-D-프럭토피라노스, α-D-갈락토피라노스, β-D-갈락토피라노스, α-D-갈락토푸라노스, β-D-갈락토푸라노스, 글루코스아민, 시알산, 갈락토스아민, N-아세틸갈락토스아민, N-트리플루오로아세틸갈락토스아민, N-프로피오닐갈락토스아민, N-n-부티릴갈락토스아민, N-이소부티릴갈락토스아민, 2-아미노-3-O-[(R)-1-카복시에틸]-2-데옥시-β-D-글루코피라노스, 2-데옥시-2-메틸아미노-L-글루코피라노스, 4,6-디데옥시-4-포름아미도-2,3-디-O-메틸-D-만노피라노스, 2-데옥시-2-설포아미노-D-글루코피라노스, N-글리콜릴-α-뉴라민산, 5-티오-β-D-글루코피라노스, 메틸 2,3,4-트리스-O-아세틸-1-티오-6-O-트리틸-α-D-글루코피라노시드, 4-티오-β-D-갈락토피라노스, 에틸 3,4,6,7-테트라-O-아세틸-2-데옥시-1,5-디티오-α-D-글루코헵토피라노시드, 2,5-안하이드로-D-알로노니트릴, 리보스, D-리보스, D-4-티오리보스, L-리보스, L-4-티오리보스로 이루어진 그룹으로부터 독립적으로 선택된, siRNA 접합체.
  57. 제56항에 있어서, 표적화 그룹 중 적어도 하나 또는 각각이 갈락토스 또는 N-아세틸갈락토스아민인, siRNA 접합체.
  58. 제42항 내지 제57항 중 어느 한 항에 있어서, R10, R11, R12, R13, R14, 및 R15RK 서로 독립적으로 H, 메틸 및 에틸로부터 선택되는, siRNA 접합채.
  59. 제43항 내지 제58항 중 어느 한 항에 있어서, R2 그룹이 질소 골격 상에 N 원자에 연결시키는 부위 및 R3 내 P 원자에 연결시키는 부위 둘 다를 갖는, siRNA 접합체.
  60. 제42항 내지 제59항 중 어느 한 항에 있어서, R2 내에, 질소생성 골격 상의 N 원자에 연결시키는 부위가 상기 N 원자와 아미드 결합을 형성하고, R3 내 P 원자에 연결시키는 부위가 상기 P 원자와 포스포에스테르 결합을 형성하는, siRNA 접합체.
  61. 제42항 내지 제60항 중 어느 한 항에 있어서, R2가 B5, B6, B5', 또는 B6'로부터 선택되는, siRNA 접합체:
    Figure pct00117

    여기서
    Figure pct00118
    는 그룹이 공유 결합적으로 연결된 부위를 나타내고;
    q2는 1 내지 10의 정수이다.
  62. 제61항에 있어서, q2가 1 내지 5의 정수인, siRNA 접합체.
  63. 제35항 및 제42항 내지 제62항 중 어느 한 항에 있어서, siRNA 접합체가 화학식 (403), (404), (405), (406), (407), (408), (409), (410), (411), (412), (413), (414), (415), (416), (417), (418), (419), (420), (421) 또는 (422)로 나타낸 바와 같은 구조를 갖는, siRNA 접합체:
    Figure pct00119

    Figure pct00120

    Figure pct00121

    Figure pct00122

    Figure pct00123

    Figure pct00124

    Figure pct00125
  64. 제42항 내지 제63항 중 어느 한 항에 있어서, 화학식 (A59) 내 P 원자가 siRNA의 센스 또는 안티센스 가닥의 말단 영역에 연결되고; 말단 영역이 센스 또는 안티센스 가닥의 하나의 말단으로부터 계산하여 첫번째 4개의 뉴클레오타이드를 지칭하는, siRNA 접합체.
  65. 제64항에 있어서, 화학식 (A59) 내 P 원자가 siRNA의 센스 또는 안티센스 가닥의 말단에 연결된, siRNA 접합체.
  66. 제65항에 있어서, 화학식 (A59) 내 P 원자가 siRNA의 센스 가닥의 3' 말단에 연결된, siRNA 접합체.
  67. 제42항 내지 제66항 중 어느 한 항에 있어서, 화학식 (A59) 내 P 원자가 포스포디에스테르 결합을 형성함으로써 siRNA 내 뉴클레오타이드의 2', 3', 또는 5' 위치에 연결된, siRNA 접합체.
  68. 혈전 질환 및/또는 허혈 뇌졸중을 치료 및/또는 방지하기 위한 의약의 제조시의, 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 따른 siRNA 및/또는 제28항 내지 제34항 중 어느 한 항에 따른 약제학적 조성물 및/또는 제35항 내지 제67항 중 어느 한 항에 따른 siRNA 접합체의 용도.
  69. 유효량의 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 따른 siRNA 및/또는 제28항 내지 제34항 중 어느 한 항에 따른 약제학적 조성물 및/또는 제35항 내지 제67항 중 어느 한 항에 따른 siRNA 접합체를 혈전 질환 및/또는 허혈 뇌졸중을 앓고 있는 대상체에게 투여함을 포함하여, 혈전 질환 및/또는 허혈 뇌졸중을 치료 및/또는 방지하기 위한 방법.
  70. 유효량의 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 따른 siRNA 및/또는 제28항 내지 제34항 중 어느 한 항에 따른 약제학적 조성물 및/또는 제35항 내지 제67항 중 어느 한 항에 따른 siRNA 접합체를 세포와 접촉시킴을 포함하여, 응고 인자 XI 유전자의 발현을 억제하는 방법.
  71. 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 따른 siRNA 및/또는 제28항 내지 제34항 중 어느 한 항에 따른 약제학적 조성물 및/또는 제35항 내지 제67항 중 어느 한 항에 따른 siRNA 접합체를 포함하는 키트(kit).
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