JP2013510161A - トランスサイレチン（ｔｔｒ）を阻害する脂質製剤化組成物及び方法 - Google Patents

トランスサイレチン（ｔｔｒ）を阻害する脂質製剤化組成物及び方法 Download PDF

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Abstract

本発明は、トランスサイレチン（ＴＴＲ）遺伝子を標的とする脂質製剤二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）、及びＴＴＲの発現を阻害するｄｓＲＮＡを使用する方法に関する。

Description

関連出願の相互参照
本願は、２００９年１１月３日出願の米国特許仮出願第６１／２５７，７６３号、及び２００９年１２月１１日出願の米国特許仮出願第６１／２８５，６０６号、及び２００９年１２月１８日出願の米国特許仮出願第６１／２８８，２２４号、及び２０１０年２月１日出願の米国特許仮出願第６１／３００，２９９号の利益を主張するものであり、これらの出願はすべて、参照によりその全体がすべての目的に関して本明細書に組み込まれる。
配列表への参照
本願は、 ．ｔｘｔと名前をつけ、２０１０年 に作成し、 バイトの大きさのテキストファイルとして電子的に提出された配列表を含む。配列表は参照により組み込まれる。
本発明は、トランスサイレチン（ＴＴＲ）遺伝子を標的とする脂質製剤化二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）、及びＴＴＲの発現を阻害するｄｓＲＮＡを使用する方法に関する。
トランスサイレチン（ＴＴＲ）は、分泌甲状腺ホルモン結合タンパク質である。ＴＴＲは、血漿及び脳脊髄液中でレチノール結合タンパク質（ＲＢＰ）／ビタミンＡ及び血清サイロキシン（Ｔ４）に結合して輸送する。
正常配列ＴＴＲ及び変異配列ＴＴＲは、双方ともアミロドーシスを引き起こす。正常配列ＴＴＲは、高齢者に心アミロイドーシスを引き起こし、老人性全身性アミロドーシス（ＳＳＡ）と呼ばれる（老人性心アミロイドーシス（ＳＣＡ）とも呼ばれる）。ＳＳＡは、しばしば、他の多くの臓器で微細な沈着を伴う。ＴＴＲ突然変異はＴＴＲアミロイド形成のプロセスを加速し、臨床的に重要なＴＴＲアミロイドーシス（ＡＴＴＲ（アミロイドーシス‐トランスサイレチン型）とも呼ばれる）の進行の最も重要な危険因子である。８５を超えるアミロイド生成性のＴＴＲ変異が全身性家族性アミロイドーシスを引き起こすことが知られている。肝臓はＴＴＲ発現の主要な部位である。その他の重要な部位として、脈絡叢、網膜及び膵臓が挙げられる。
ＴＴＲアミロイドーシスはさまざまな形で現れる。末梢神経系がより顕著に冒された場合、疾患は家族性アミロイド神経障害（ＦＡＰ）と呼ばれる。主として心臓に関与し神経系には関与しない場合、疾患は家族性アミロイド心筋症（ＦＡＣ）と呼ばれる。ＴＴＲアミロイドーシスの３番目の型は、軟髄膜／ＣＮＳ（中枢神経系）アミロイドーシスと呼ばれる。
二本鎖ＲＮＡ分子（ｄｓＲＮＡ）は、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）として知られる高度に保存された調節機構で、遺伝子発現を妨げることが示されてきている。国際公開第９９／３２６１９号（Ｆｉｒｅ ｅｔ ａｌ．）は、線虫（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）において遺伝子の発現を阻害する長さ２５ヌクレオチドのｄｓＲＮＡの使用を開示した。ｄｓＲＮＡは、植物（例えば、国際公開第９９／５３０５０号，Ｗａｔｅｒｈｏｕｓｅ ｅｔ ａｌ．；及び国際公開第９９／６１６３１号，Ｈｅｉｆｅｔｚ ｅｔ ａｌ．を参照のこと）、ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）（例えば、Ｙａｎｇ，Ｄ．，ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．（２０００）１０：１１９１‐１２００）を参照のこと）、及び哺乳類（国際公開第００／４４８９５，Ｌｉｍｍｅｒ；及びＤＥ １０１ ００ ５８６．５，Ｋｒｅｕｔｚｅｒ ｅｔ ａｌ．を参照のこと）を含む、他の生物でも標的ＲＮＡを分解することが示されてきた。
米国特許出願公開第２００７０２０７９７４号（米国特許出願第１１／０９５，３８３号、２００５年３月３０日出願）は、機能性及び超機能性ｓｉＲＮＡを開示する。米国特許出願公開第２００９００８２３００号（米国特許出願第１２／２７３，７３１号、２００８年１１月１９日出願）は、トランスサイレチン（ＴＴＲ）を標的とするアンチセンス分子を開示する。米国特許第７，２５０，４９６号（米国特許出願公開第１０／３１０，９１４号、２００８年１２月６日出願）は、トランスサイレチン（ＴＴＲ）を標的とするミクロＲＮＡを開示する。国際公開第２０１０／０４８２２８（国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０６１３８１号、２００９年１０月２０日出願）及び米国特許出願公開第２０１００１２０８９３号（米国特許出願第１２／５８２，６６９号、２００９年１０月２０日出願）は、トランスサイレチン（ＴＴＲ）の発現を阻害する組成物（例えば、ｓｉＲＮＡ）及び方法を開示する。
対象におけるＴＴＲの発現を阻害するＴＴＲ ｄｓＲＮＡの有効量を投与することにより対象におけるＴＴＲアミロイド沈着を減少させる方法が開示され、ＴＴＲ ｄｓＲＮＡがセンス鎖及びアンチセンス鎖及び長さ１５〜３０の塩基対の二本鎖構造を有し、アンチセンス鎖が配列番号１７０の１５以上連続するヌクレオチドを有する方法である。幾つかの実施形態では、アンチセンス鎖は、配列番号１７０を含み、センス鎖は、配列番号１６９を含み；その他の実施形態では、アンチセンス鎖は、配列番号７３０を含み、センス鎖は、配列番号７２９を含む。
ｄｓＲＮＡは、少なくとも１つの修飾ヌクレオチド、例えば、２’‐Ｏ‐メチル修飾ヌクレオチド、５’‐ホスホロチオエート基を含むヌクレオチド、コレステリル誘導体又はドデカン酸ビスデシルアミド基に結合した末端ヌクレオチド基、２’‐デオキシ‐２’‐フルオロ修飾ヌクレオチド、２’‐デオキシ‐修飾ヌクレオチド、ロックト(locked)ヌクレオチド、脱塩基ヌクレオチド、２’‐アミノ修飾ヌクレオチド、２’‐アルキル修飾ヌクレオチド、モルホリノヌクレオチド、ホスホロアミド酸、及びヌクレオチドを含む非天然塩基などを含むことができる。
１つの実施形態では、アンチセンス鎖が配列番号１０１０からなり、センス鎖が配列番号１００９からなる。
ｄｓＲＮＡ組成物は、例えばＤＬｉｎＤＭＡ、ＭＣ３、又はＴｅｃｈＧ１（Ｃ１２‐２００）などの陽イオン性脂質を含む核酸脂質製剤であることができる。
幾つかの実施形態では、ＴＴＲアミロイド沈着はＶ３０Ｍ変異ＴＴＲを含む。対象はヒト対象であることができる。有効量は、例えば、０．０１〜３０．０ｍｇ／ｋｇの投与量であることができる。
幾つかの実施形態では、方法は対象におけるＴＴＲ沈着を測定することを含む。
また、６．８〜７．８の範囲のｐＨ、２５０〜３５０ｍＯｓｍ／ｋｇの範囲のオスモル濃度、５．６〜８．４ｍｇ／ｍｇの範囲の脂質：ｓｉＲＮＡ比、及び６０〜１２０ｎｍ≦０．１５の範囲の粒径を含む、表１７の製剤ＡＬＮ‐ＴＴＲ０１からなる組成物、並びに対象におけるＴＴＲアミロイド沈着を減少させるためにこの組成物を使用する方法が開示される。
さらに、ＡＤ‐１８３２８からなるＴＴＲ ｄｓＲＮＡを単回投与で０．０１〜３０．０ｍｇ／ｋｇ霊長類に投与することにより、少なくとも３日間、霊長類におけるＴＴＲのｍＲＮＡ発現を減少させる方法が開示される。幾つかの実施形態では、ＴＴＲのｍＲＮＡ発現は３０日間減少される。霊長類はヒト対象であることができる。幾つかの実施形態では、単回投与量は１．０又は３．０又は１０．０ｍｇ／ｋｇである。ＴＴＲ ｄｓＲＮＡを、例えば、ＳＮＡＬＰ製剤化（ＡＬＮ‐ＴＴＲ０１）のように脂質製剤化することができる。幾つかの実施形態では、方法は対象におけるＴＴＲのｍＲＮＡ発現を測定することを含む。
また、組成物を０．０３ｍｇ／ｋｇの投与量にて対象に投与することを含む、対象におけるＴＴＲのｍＲＮＡ発現を減少させる方法であって、その組成物がＴＴＲ ｄｓＲＮＡ ＡＤ‐１８３２８及び脂質製剤を含む方法が開示される。幾つかの実施形態では、対象はヒトである。脂質製剤は、陽イオン性脂質であるＭＣ３又はＴｅｃｈ Ｇ１（Ｃ１２‐２００）を含むことができ、及びＬＮＰ‐１２（５０／１０／３８．５／１．５のモル比のＴｅｃｈ Ｇ１／ＤＳＰＣ／コレステロール／ＰＥＧ２００‐ＤＭＧ）であることができる。該方法は、対象におけるＴＴＲのｍＲＮＡ発現を測定することを含むことができる。
本発明の１つ以上の実施形態の詳細を、以下の記述で説明する。本発明の他の特徴、目的、及び利点は、その説明及び図面から、並びに特許請求の範囲から明らかになるであろう。
図１は、ＴＴＲ ｓｉＲＮＡでトランスフェクションした後の培養ヒトＰＢＭＣにおけるＴＮＦα及びＩＦＮαのレベルのグラフである。 図２Ａ及び２Ｂは、ＨｅｐＧ２細胞におけるＡＤ‐１８３２４及びＡＤ‐１８３２８のそれぞれに対する投与量応答曲線である。 図３は、ＨｅｐＧ２細胞におけるＡＤ‐１８２４６の投与量応答曲線である。 図４Ａ及び図４Ｂは、トランスジェニックＨ１２９‐ｍＴＴＲ‐ＫＯ／ｉＮＯＳ‐ＫＯ／ｈＴＴＲマウスにおける、ＬＮＰ０１に製剤化されたＴＴＲ‐ｄｓＲＮＡ（ＡＤ‐１８３２４、ＡＤ‐１８３２８及びＡＤ‐１８２４６）の静脈内ボーラス投与による肝臓ｍＲＮＡ及び血漿タンパク質レベルの阻害をそれぞれ示す。 図５は、ＳＮＡＬＰに配合されたＴＴＲ‐ｄｓＲＮＡ（ＡＤ‐１８３２４及びＡＤ‐１８３２８）の１５分間静脈内注入後の非ヒト霊長類の肝臓におけるＴＴＲのｍＲＮＡレベルの測定をまとめたグラフである。 図６Ａ及び図６Ｂは、トランスジェニックマウスおけるＳＮＡＬＰ‐１８３２８の静脈内ボーラス投与によるヒトＶ３０ＭＴＴＲ肝臓ｍＲＮＡ及び血清タンパク質レベルのそれぞれの阻害を示す。群平均をもとめ、ＰＢＳ対照群に対して正規化し、次いでプロットした。エラーバーは標準偏差を表す。ＰＢＳと比較した群平均の減少の割合（％）を、ＳＮＡＬＰ‐１９５５及びＳＮＡＬＰ‐１８３２８群について示す（＊＊＊ｐ＜０．００１、一元配置分散分析、ダンのポスト・ホック（Ｄｕｎｎ’ｓ ｐｏｓｔ‐ｈｏｃ）検定）。 図７Ａ及び図７Ｂは、トランスジェニックのマウスおけるＳＮＡＬＰ‐１８３２８の単回静脈内ボーラス投与後２２日にわたるヒトＶ３０ＭＴＴＲ肝臓ｍＲＮＡ及び血清タンパク質レベルのそれぞれの阻害の持続性を示す。群平均をもとめ、ＴＴＲ／ＧＡＰＤＨ ｍＲＮＡを、０日目に対して正規化し、プロットした。ＳＮＡＬＰ‐１９５５と比較した正規化したＴＴＲのｍＲＮＡレベルの減少の割合（％）を各時点について算出し、ＳＮＡＬＰ‐１８３２８群について示す（＊＊＊ｐ＜０．００１、一元配置分散分析、ダンのポスト・ホック（Ｄｕｎｎ’ｓ ｐｏｓｔ‐ｈｏｃ）検定）。 図８は、ＳＮＡＬＰ‐１８３２８の単回１５分間静脈内注入後の１４日にわたる非ヒト霊長類おけるＴＴＲ血清タンパク質レベルの経時変化を示す。 図９は、ＳＮＡＬＰ‐１８３２８の静脈内ボーラス投与後の、ヒトＶ３０Ｍ ＴＴＲ／ＨＳＦ‐１ノックアウトマウスのさまざまな組織におけるＴＴＲ免疫反応性の減少を示す。Ｅ：食道；Ｓ：胃；Ｉ１：腸／十二指腸；Ｉ４：腸／結腸；Ｎ：神経；Ｄ：後根神経節。 図１０は、ＸＴＣ‐ＳＮＡＬＰ‐１８３２８の１５分間静脈内注入後の、非ヒト霊長類の肝臓におけるＴＴＲのｍＲＮＡレベルの測定値を示す。 図１１Ａ及び１１Ｂは、ＬＮＰ０９‐１８３２８又はＬＮＰ１１‐１８３２８の１５分間静脈内注入後の、非ヒト霊長類の肝臓におけるＴＴＲのｍＲＮＡ及び血清タンパク質レベルのそれぞれの測定値を示す。図１１Ｃは、ＰＢＳ対照群と比較したときの、０．３ｍｇ／ｋｇのＬＮＰ０９‐１８３２８の１５分間静脈内注入後２８日間にわたる、ＴＴＲの血清タンパク質レベルの経時変化を示す。 図１２は、ヒトＴＴＲのｍＲＮＡの配列（Ｒｅｆ．Ｓｅｑ．ＮＭ＿０００３７１．３、配列番号１３３１）を示す。図１３Ａ及び１３Ｂは、それぞれ、ヒト及びラットＴＴＲのｍＲＮＡの配列を示す。 図１３Ａは、ヒトＴＴＲのｍＲＮＡの配列（Ｒｅｆ．Ｓｅｑ．ＮＭ＿０００３７１．２、配列番号１３２９）を示す。図１３Ｂは、ラットＴＴＲのｍＲＮＡの配列（Ｒｅｆ．Ｓｅｑ．ＮＭ＿０１２６８１．１、配列番号１３３０）を示す。 図１４は、ＮＭ＿０００３７１．３、ＮＭ＿０００３７１．２、及びＡＤ‐１８３２８のヌクレオチドアライメントを示す。 図１５は、家族性アミロイド神経障害、家族性アミロイド心筋症、及びＣＮＳアミロイドーシスと関連するＴＴＲにおける、症状及び変異を図示する。 図１６は、異なる注入持続時間での、ＳＮＡＬＰ‐１８５３４を用いた肝臓におけるＴＴＲのｍＲＮＡレベルの減少を示す。動物群（ｎ＝４／群）に、１５分間、又は１、２、又は３時間の注入を介して、１ｍｇ／ｋｇのＳＮＡＬＰ‐１８５３４を投与した。４８時間後、ラットを安楽死させ、肝臓を採集した。ＴＴＲ及びＧＡＰＤＨのｍＲＮＡレベルを、Ｑｕａｎｔｉｇｅｎｅ ｂＤＮＡアッセイを使って、肝臓溶解物から測定した。ＴＴＲのｍＲＮＡレベルとＧＡＰＤＨのｍＲＮＡレベルとの比を各動物について算出した。群平均をもとめ、ＰＢＳ対照群に対して正規化し、次いでプロットした。エラーバーは標準偏差を表わす（＊＊＊ｐ＜０．００１、一元配置分散分析、ダンのポスト・ホック（Ｄｕｎｎ’ｓ ｐｏｓｔ‐ｈｏｃ）検定、ＰＢＳと比較）。 図１７は、ＬＮＰ０７‐１８５３４又はＬＮＰ０８‐１８５３４の１５分間静脈内注入後の、ラットの肝臓におけるＴＴＲのｍＲＮＡレベルの測定値を示す。 図１８は、ＬＮＰ０９‐１８５３４又はＬＮＰ１１‐１８５３４の１５分間静脈内注入後の、Ｓｐｒａｇｕｅ‐Ｄａｗｌｅｙラットの肝臓中における内在性ＴＴＲのｍＲＮＡレベルの生体内阻害を示す。動物群（ｎ＝４／群）に、１５分注入を介して、０．０１、０．０３、０．１、又は０．３ｍｇ／ｋｇのＬＮＰ０９‐１８５３４、ＬＮＰ‐１１‐１８５３４、又はＰＢＳを静脈内に投与した。４８時間後、動物を安楽死させ、肝臓を採集した。ＴＴＲ及びＧＡＰＤＨのｍＲＮＡレベルを、Ｑｕａｎｔｉｇｅｎｅ ｂＤＮＡアッセイを使って、肝臓生検から測定した。ＴＴＲのｍＲＮＡレベルとＧＡＰＤＨのｍＲＮＡレベルとの比を各動物について算出した。群平均をもとめ、ＰＢＳ対照群に対して正規化し、次いでプロットした。エラーバーは標準偏差を表す。 図１９は、ＬＮＰ１２製剤化された、ＴＴＲを標的にするｓｉＲＮＡの非ヒト霊長類における有効性を示す。データ点は群平均値±ｓ．ｄ．を表す。 図２０は、ＡＬＮ‐ＴＴＲ０１によるｍＲＮＡ抑制の持続性を説明する非哺乳類動物のｓＧＬＰ研究からの結果を含むグラフである。 図２１は、ＳＮＡＬＰ‐１８３２８（ＡＬＮ‐ＴＴＲ０１）の静脈内ボーラス投与後の成熟動物（ｈＶ３０Ｍ ＴＴＲ／ＨＳＦ‐１ノックアウトマウス）のさまざまな組織におけるＴＴＲ沈着の退縮を図示するグラフである。
本発明は、ｄｓＲＮＡ、及びｄｓＲＮＡがＴＴＲ遺伝子を標的とする際の、細胞又は哺乳動物におけるＴＴＲ遺伝子の発現を阻害するｄｓＲＮＡを使用する方法を提供する。また、本発明は、ＴＴＲ遺伝子の発現によって引き起こされる、哺乳動物における、ＴＴＲアミロイドーシスなどの病態及び疾患を治療する組成物及び方法も提供する。ｄｓＲＮＡは、ｍＲＮＡの配列に特異的な分解を導く。
Ｉ．定義
便宜上、本明細書、実施例、及び添付の特許請求の範囲において用いられる特定の用語及び語句の意味を以下に提供する。本明細書の他の部分の用語の用法と本項に提供されるその定義との間に明らかな矛盾がある場合、本項の定義が優先される。
「Ｇ」、「Ｃ」、「Ａ」、及び「Ｕ」はそれぞれ一般に、塩基としてグアニン、シトシン、アデニン、及びウラシルをそれぞれ含有するヌクレオチドを表す。「Ｔ」及び「ｄＴ」は、本明細書で交換可能に使用され、核酸塩基がチミン、例えば、デオキシリボチミン（ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｔｈｙｍｉｎｅ）である、デオキシリボヌクレオチドを指す。しかしながら、「リボヌクレオチド」又は「ヌクレオチド」又は「デオキシリボヌクレオチド」という用語は、以下でさらに詳述するように、修飾ヌクレオチド又は代替の置換部分を指すことができることが理解されるであろう。当業者は、そのような置換部分を担持するヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドの塩基対形成特性を実質的に変えることなく、グアニン、シトシン、アデニン、及びウラシルを他の部分によって置き換えうることを十分に承知している。例えば、限定されないが、その塩基としてイノシンを含むヌクレオチドは、アデニン、シトシン、又はウラシルを含有するヌクレオチドと塩基対を形成しうる。したがって、ウラシル、グアニン、又はアデニンを含むヌクレオチドは本発明のヌクレオチド配列において、例えば、イノシンを含むヌクレオチドで置換されうる。そのような置換部分を含む配列は本発明の実施形態である。
本明細書において使用される、「トランスサイレチン」（「ＴＴＲ」）とは、細胞内の遺伝子を指す。ＴＴＲはまた、ＡＴＴＲ、ＨｓＴ２６５１、ＰＡＬＢ、プレアルブミン、ＴＢＰＡ、及びトランスサイレチン（プレアルブミン、アミロイドーシスＩ型）としても知られている。ヒトＴＴＲのｍＲＮＡ転写物の配列は、ＮＭ＿０００３７１で見いだすことができる。マウスＴＴＲのｍＲＮＡの配列は、ＮＭ＿０１３６９７．２で見いだすことができ、ラットＴＴＲのｍＲＮＡの配列は、ＮＭ＿０１２６８１．１で見いだすことができる。
本明細書において使用される、「標的配列」は、一次転写産物のＲＮＡプロセシングの産物であるｍＲＮＡを含む、ＴＴＲ遺伝子の転写の間に形成される、ｍＲＮＡ分子のヌクレオチド配列の連続する部分を指す。
本明細書において使用される、「配列を含む鎖」という用語は、標準的なヌクレオチド命名法を使って参照される配列によって記載される、ヌクレオチド鎖を含むオリゴヌクレオチドを指す。
本明細書において使用する場合、特に記載がない限り、「相補的」という用語は、当業者には理解されるであろう通り、第一のヌクレオチド配列を第二のヌクレオチド配列に関連して記載するために用いるとき、第一のヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドの、第二のヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドと、特定の条件下でハイブリダイズして二重鎖構造を形成する能力を指す。そのような条件は、例えば、ストリンジェントな条件でありえ、ここでストリンジェントな条件は、４００ｍＭ ＮａＣｌ、４０ｍＭ ＰＩＰＥＳ ｐＨ６．４、１ｍＭ ＥＤＴＡ、５０℃又は７０℃で１２〜１６時間、その後の洗浄を含みうる。生物の内部で遭遇しうる、生理学的に関連する条件などの、他の条件を適用することもできる。当業者は、ハイブリダイズされたヌクレオチドの最終的な適用に応じて、２つの配列の相補性の試験に最も適切な一連の条件を決定することができるであろう。
これには第一のヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドの、第二のヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドへの、第一及び第二のヌクレオチド配列の全長にわたる塩基対形成が含まれる。そのような配列は、本明細書において、互いに「完全に相補的」と呼ぶことができる。しかしながら、本明細書において、第一の配列が第二の配列に対して「実質的に相補的」と言及される場合、２つの配列は完全に相補的であることもあり、又はそれらの最終的な適用に最も関連している条件下でハイブリダイゼーションする能力を保持する一方で、それらはハイブリダイゼーションの際に１つ以上であるが、一般には４、３、若しくは２つ以下のミスマッチ塩基対を形成することもある。しかしながら、２つのオリゴヌクレオチドが、ハイブリダイゼーションの際に１つ以上の一本鎖のオーバーハングを形成するように設計されている場合、そのようなオーバーハングは、相補性の決定に関してミスマッチとは見なされないものとする。例えば、ｄｓＲＮＡが長さが２１ヌクレオチドである１つのオリゴヌクレオチドと、長さが２３ヌクレオチドであるもう１つのオリゴヌクレオチドとを含み、ここで長い方のオリゴヌクレオチドは短い方のオリゴヌクレオチドに完全に相補的な２１ヌクレオチドの配列を含む場合、このｄｓＲＮＡは本発明の目的上、やはり「完全に相補的」と言及されうる。
本明細書において使用される「相補的」配列は、それらのハイブリダイズする能力に関する上記の要件が満たされる限り、非ワトソン−クリック塩基対、並びに／又は非天然及び修飾ヌクレオチドから形成される塩基対を含みうるか、又は完全にそれらから形成されうる。そのような非ワトソン‐クリック塩基対には、Ｇ：Ｕゆらぎ又はフーグスティーン塩基対が含まれるが、これらに限定されない。
本明細書における「相補的」、「完全に相補的」、及び「実質的に相補的」という用語は、それらが使用される文脈から理解されるように、ｄｓＲＮＡのセンス鎖とアンチセンス鎖との間、又はｄｓＲＮＡのアンチセンス鎖と標的配列との間の塩基マッチングに対して使用されうる。
本明細書において使用される、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）「の少なくとも一部に実質的に相補的」なポリヌクレオチドは、５’ＵＴＲ、オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）、又は３’ＵＴＲを含む、目的のｍＲＮＡ（例えば、ＴＴＲをコードするｍＲＮＡ）の連続する部分に実質的に相補的であるポリヌクレオチドを指す。例えば、ポリヌクレオチドは、その配列がＴＴＲをコードするｍＲＮＡの中断されていない部分に実質的に相補的である場合、ＴＴＲのｍＲＮＡの少なくとも一部に相補的である。
本明細書において使用される「二本鎖ＲＮＡ」又は「ｄｓＲＮＡ」という用語は、２本の逆平行で、上で定義されるように実質的に相補的な核酸鎖を含む二重鎖構造を有するリボ核酸分子の複合体を指す。一般に、各鎖のヌクレオチドの大半はリボヌクレオチドであるが、本明細書において詳細に説明されるように、それぞれ又は両方の鎖は、少なくとも１つの非リボヌクレオチド、例えば、デオキシリボヌクレオチド及び／又は修飾ヌクレオチドも含みうる。くわえて、本明細書において使用される「ｄｓＲＮＡ」は、複数のヌクレオチドでの大幅な修飾を含み、本明細書において開示されるか、又は当該技術分野において公知であるすべての種類の修飾を含む、リボヌクレオチドへの化学修飾を含みうる。ｓｉＲＮＡ型分子内で使用される、このようないずれの修飾も、本明細書及び特許請求の範囲の目的上、「ｄｓＲＮＡ」によって包含される。
二本鎖構造を形成する２本の鎖は、より長い１つのＲＮＡ分子の異なる部分でありうるか、又はそれらは別個のＲＮＡ分子であるうる。２本の鎖がより長い１つの分子の一部であり、したがって二本鎖構造を形成する１本の鎖の３’末端とそれぞれのもう一方の鎖の５’末端との間の中断されていないヌクレオチド鎖によって連結されている場合、連結するＲＮＡ鎖は、「ヘアピンループ」と呼ばれる。２本の鎖が、二本鎖構造を形成している１本の鎖の３’末端とそれぞれのもう一方の鎖の５’末端との間の、中断されていないヌクレオチド鎖以外の手段によって共有結合で連結される場合、その連結構造は、「リンカー」と呼ばれる。ＲＮＡ鎖は同じ又は異なる数のヌクレオチドを有しうる。塩基対の最大数は、ｄｓＲＮＡの最も短い鎖のヌクレオチドの数から、二重鎖に存在するいかなるオーバーハングを引いたものである。二本鎖構造にくわえて、ｄｓＲＮＡは１つ以上のヌクレオチドオーバーハングを含みうる。また、「ｓｉＲＮＡ」という用語は、上に記載のように、ｄｓＲＮＡを指すように本明細書において使用される。
本明細書において使用される、「ヌクレオチドオーバーハング」とは、ｄｓＲＮＡの１本の鎖の３’末端がもう一方の鎖の５’末端を越えて延びるか、又はその逆であるときに、ｄｓＲＮＡの二本鎖構造から突出する、対を形成していない１つ又は複数のヌクレオチドを指す。「平滑」又は「平滑末端」とは、ｄｓＲＮＡのその末端に対を形成していないヌクレオチドがない、すなわち、ヌクレオチドオーバーハングがないことを意味する。「平滑末端」ｄｓＲＮＡは、その長さ全体にわたって二本鎖であるｄｓＲＮＡであり、すなわち、分子のいずれの末端にもヌクレオチドオーバーハングがないｄｓＲＮＡである。
「アンチセンス鎖」という用語は、標的配列に実質的に相補的な領域を含むｄｓＲＮＡの鎖を指す。本明細書において使用される、「相補性の領域」という用語は、本明細書において定義される配列、例えば標的配列に実質的に相補的なアンチセンス鎖の領域を指す。相補性の領域が標的配列に完全に相補的でない場合、ミスマッチは、末端領域で最も許容され、ミスマッチが存在する場合、一般に、１つ又は複数の末端領域で、例えば、５’及び／又は３’末端の６、５、４、３、若しくは２ヌクレオチド以内にある。
本明細書において使用される、「センス鎖」という用語は、アンチセンス鎖の領域に実質的に相補的な領域を含むｄｓＲＮＡの鎖を指す。
ＴＴＲを標的とする例示的なｄｓＲＮＡとしては、二本鎖ＡＤ‐１８３２８（配列番号：１００９及び１０１０）などが挙げられる。















Figure 2013510161
本明細書において使用される、「核酸脂質粒子」という用語は、「ＳＮＡＬＰ」という用語を含み、ｄｓＲＮＡ、又はｄｓＲＮＡが転写されるプラスミドなどの核酸を含む、少量の水性内部を被覆する脂質の小胞を指す。核酸脂質粒子、例えば、ＳＮＡＬＰは、例えば、米国特許出願公開第２００６０２４００９３号、同第２００７０１３５３７２号、及び２００８年４月１５日出願の米国特許出願第６１／０４５，２２８号に記載されている。これらの出願は、参照により本明細書に組み込まれる。
ｄｓＲＮＡについて言及する場合、「細胞に導入する」とは、当業者に理解されるように、細胞への取り込み又は吸収を促進することを意味する。ｄｓＲＮＡの吸収又は取り込みは、補助を受けない拡散若しくは能動的な細胞プロセスを通して、又は補助的な薬剤又は装置によって起こることができる。この用語の意味はインビトロでの細胞に限定されるものではなく；ｄｓＲＮＡは細胞が生きている生物の一部である場合にも「細胞に導入」されうる。そのような場合、細胞への導入は生物への送達も含むことになる。例えば、生体内送達のために、ｄｓＲＮＡを組織部位に注射することもでき、又は全身投与することもできる。インビトロでの細胞への導入には、電気穿孔法及びリポフェクションなどの当該技術分野において公知の方法が含まれる。さらなる方法は、本明細書に説明されているか、又は当該技術分野において公知である。
「サイレンシングする」、「発現を阻害する」、「発現を下方制御する」、及び「発現を抑制する」などの用語は、それらがＴＴＲ遺伝子について言及する限り、本明細書において、ＴＴＲ遺伝子が転写され、ＴＴＲ遺伝子の発現が阻害されるように処理された第１の細胞又は細胞群から単離されうる、及び／又は検出されうるｍＲＮＡの量の、第１の細胞又は細胞群と実質的に同一であるが、そのように処理されていない第２の細胞又は細胞群（対照細胞）と比較しての減少によって現れる、ＴＴＲ遺伝子の発現の少なくとも部分的な抑制を指す。阻害の程度は、通常、下式で表される。
Figure 2013510161
あるいは、阻害の程度はＴＴＲ遺伝子発現に機能的に関連するパラメーター、例えば、ＴＴＲ遺伝子によりコードされ、細胞により分泌されるタンパク質の量、又は特定の表現型、例えばアポトーシスを見せる細胞の数の減少という点から示されうる。原則として、ＴＴＲ遺伝子サイレンシングは、構成的か、又はゲノム操作によってかのいずれか、及び任意の適切なアッセイにより、標的を発現する任意の細胞において決定されうる。しかしながら、所与のｄｓＲＮＡが特定の程度までＴＴＲ遺伝子の発現を阻害し、したがって本発明に包含されるかどうかを決定するために参照が必要とされる場合、以下の実施例で提供されるアッセイはそのような参照の役割を果たすことになる。
例えば、特定の場合において、ＴＴＲ遺伝子の発現は、本発明で取り上げられる二本鎖オリゴヌクレオチドの投与により、少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、又は５０％抑制される。幾つかの実施形態では、ＴＴＲ遺伝子は、本発明で取り上げられる二本鎖オリゴヌクレオチドの投与によって、少なくとも約６０％、７０％、又は８０％抑制される。幾つかの実施形態では、ＴＴＲ遺伝子は、本発明で取り上げられる二本鎖オリゴヌクレオチドの投与によって、少なくとも約８５％、９０％、又は９５％抑制される。
ＴＴＲ発現の文脈で本明細書において使用される「治療する」、「治療」などの用語は、ＴＴＲ発現により仲介される病理学的過程の軽減又は緩和を指す。本発明の文脈において、本明細書において以下に列挙されるその他の病態のいずれか（ＴＴＲ発現により媒介される病理学的過程以外）に関する限り、「治療する」、「治療」などの用語は、そのような病態に関連する少なくとも１つの症状を軽減若しくは緩和する、又はＦＡＰなどのＴＴＲアミロイドーシスの進行を遅延させることなどの、そのような病態の進行を遅延若しくは後退させることを意味する。ＴＴＲアミロイドーシスの症状としては、感覚性ニューロパチー（例えば、知覚障害、遠位部の感覚鈍麻）、自律性ニューロパチー（例えば、胃潰瘍又は起立性低血圧症などの胃腸障害）、運動神経障害、発作、認知症、ミエロパシー、多発ニューロパチー、手根管症候群、自律神経不全症、心筋症、硝子体混濁、腎不全、腎障害、実質的に低下したｍＢＭＩ（改変肥満指数）、脳神経障害、及び角膜格子状ジストロフィーが含まれる。
本明細書において使用される、「有効量」という語句は、ＴＴＲの発現により媒介される病理学的過程の治療、予防、若しくは管理、又はＴＴＲの発現により媒介される病理学的過程の明らかな症状において、治療上の利益を提供する量を指す。有効である具体的な量は当業者であれば容易に決定することができ、例えば、ＴＴＲ発現により媒介される病理学的過程の種類、患者の既往歴及び年齢、ＴＴＲ発現により媒介される病理学的過程の病期、並びにＴＴＲの発現により媒介される病理学的過程に抗するその他の薬剤の投与などの、当該技術分野において公知の因子に応じて変動しうる。
本明細書において使用される、「医薬組成物」は、ｄｓＲＮＡの薬理学的に有効な量及び薬学的に許容可能な担体を含む。本明細書において使用される、「薬理学的に有効な量」、「治療上有効な量」又は単に「有効量」とは、意図された薬理学的、治療的、又は予防的結果を生むのに有効なＲＮＡの量を指す。例えば、疾患又は障害に関連する測定可能なパラメーターにおいて少なくとも２５％の減少があるときに所与の臨床治療を有効と考える場合、その疾患又は障害を治療するための薬物の治療上有効な量は、そのパラメーターにおける少なくとも２５％の減少をもたらすために必要な量である。例えば、ＴＴＲを標的とするｄｓＲＮＡの治療上有効な量は、ＴＴＲの血清レベルを少なくとも２５％減少させることができる。別の例では、ＴＴＲを標的とするｄｓＲＮＡの治療上有効な量は、肝機能又は腎機能を少なくとも２５％向上させることができる。
「薬学的に許容可能な担体」という用語は、治療薬の投与のための担体を指す。そのような担体としては、食塩水、緩衝食塩水、デキストロース、水、グリセロール、エタノール、及びそれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。この用語は特に細胞培養培地を除外する。経口投与される薬物について、薬学的に許容可能な担体としては、不活性希釈剤、崩壊剤、結合剤、滑沢剤、甘味料、着香料、着色料、及び保存剤などの薬学的に許容可能な賦形剤が挙げられるが、これらに限定されない。好適な不活性希釈剤としては、炭酸ナトリウム及びカルシウム、リン酸ナトリウム及びリン酸カルシウム、並びにラクトースが挙げられ、コーンスターチ及びアルギン酸が好適な崩壊剤である。結合剤には、デンプン及びゼラチンが含まれうる一方、滑沢剤は、存在する場合には、一般にステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸又はタルクであろう。所望の場合、錠剤をモノステアリン酸グリセリル又はジステアリン酸グリセリルなどの材料で被覆して、胃腸における吸収を遅延させうる。
本明細書において使用される「形質転換細胞」とは、ｄｓＲＮＡ分子が発現されうるベクターが導入されている細胞である。
ＩＩ．二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）
本明細書においてより詳細に記載されるように、本発明は、細胞又は哺乳類、例えばアミロイド沈着を有するヒトなどにおいて、ＴＴＲ遺伝子の発現を阻害するための二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）分子を提供し、ｄｓＲＮＡは、ＴＴＲ遺伝子の発現において形成されるｍＲＮＡの少なくとも一部と相補的である相補性の領域を有するアンチセンス鎖を含み、相補性の領域は、３０ヌクレオチド未満の長さであって、一般に、１９〜２４ヌクレオチドの長さであり、前記ｄｓＲＮＡは、前記ＴＴＲ遺伝子を発現する細胞と接触した際、例えばＰＣＲ若しくは分岐ＤＮＡ（ｂＤＮＡ）法、又はウェスタンブロットなどタンパク質に基づく方法によりアッセイしたとき、前記ＴＴＲ遺伝子の発現を少なくとも３０％阻害する。ＴＴＲ遺伝子の発現は、下の実施例で説明されるように、アッセイによって測定したとき少なくとも３０％減少させることができる。例えば、Ｈｅｐ３Ｂ細胞などの細胞培養中のＴＴＲ遺伝子の発現は、ｂＤＮＡ又はＴａｑＭａｎアッセイなどによるＴＴＲのｍＲＮＡレベルを測定することにより、又はＥＬＩＳＡアッセイなどによるタンパク質レベルを測定することによりアッセイされることができる。本発明のｄｓＲＮＡは、１本以上の一本鎖のヌクレオチドのオーバーハングをさらに含むことができる。
ｄｓＲＮＡは、以下でさらに説明されるように、当該技術分野において公知の標準的な方法、例えば、バイオサーチ（Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ）、アプライド・バイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．）から市販されるなどの自動ＤＮＡ合成装置の使用により合成されることができる。ｄｓＲＮＡは、ハイブリダイズして二本鎖構造を形成するのに十分相補的である２本のＲＮＡ鎖を含む。ｄｓＲＮＡの１本の鎖（アンチセンス鎖）は、ＴＴＲ遺伝子の発現の間に形成されたｍＲＮＡの配列に由来する標的配列に実質的に相補的であり、一般に完全に相補的である相補性の領域を含み、もう一方の鎖（センス鎖）は、２本の鎖が好適な条件下において合わされると、ハイブリダイズして二本鎖構造を形成するように、アンチセンス鎖に相補的である領域を含む。一般に、二本鎖構造は、長さ１５〜３０又は２５〜３０、又は１８〜２５又は１９〜２４、又は１９〜２１、又は１９、２０若しくは２１塩基対である。１つの実施形態では、二本鎖は長さ１９塩基対である。別の実施形態では、二本鎖は長さ２１塩基対である。２本の異なるｓｉＲＮＡが組み合わせて使用される場合、二本鎖の長さは同一である又は異なることができる。
本発明のｄｓＲＮＡの各鎖は、一般に、長さ１５〜３０、又は１８〜２５、又は１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、若しくは２５ヌクレオチドである。その他の実施形態において、各々は長さ２５〜３０ヌクレオチドである。二本鎖の各鎖は、同じ長さ又は異なる長さであることができる。２本の異なるｓｉＲＮＡが組み合わせて使用される場合、各ｓｉＲＮＡの各鎖の長さは、同一である又は異なることができる。
本発明のｄｓＲＮＡは、１つ以上のヌクレオチドの１つ以上の一本鎖のオーバーハングを含むことができる。１つの実施形態では、ｄｓＲＮＡの少なくとも１つの末端は、１〜４、一般には１つ又は２つのヌクレオチドの一本鎖のヌクレオチドオーバーハングを有する。別の実施形態では、ｄｓＲＮＡのアンチセンス鎖は、センス鎖の３’末端及び５’末端のそれぞれに１〜１０個のヌクレオチドのオーバーハングを有する。さらなる実施形態では、ｄｓＲＮＡのセンス鎖は、アンチセンス鎖の３’末端及び５’末端のそれぞれに１〜１０個のヌクレオチドのオーバーハングを有する。
少なくとも１つのヌクレオチドオーバーハングを有するｄｓＲＮＡは、平滑末端の対応物より予想外に優れた阻害特性を有することができる。幾つかの実施形態では、ただ１つのヌクレオチドオーバーハングの存在は、その全体的な安定性に影響を及ぼすことなくｄｓＲＮＡの干渉活性を強化する。オーバーハングを１つだけ有するｄｓＲＮＡは、生体内、並びにさまざまな細胞、細胞培養培地、血液、及び血清中で特に安定で効果的であることが証明されてきた。一般に、一本鎖のオーバーハングは、アンチセンス鎖の３’末端、又は、代替的に、センス鎖の３’末端に位置する。ｄｓＲＮＡは、一般にアンチセンス鎖の５’末端に位置する平滑末端も有することができる。そのようなｄｓＲＮＡは向上した安定性及び阻害活性を有することができ、よって、低投与量、すなわち、１日当たりレシピエントの体重１ｋｇにつき５ｍｇ未満の投与を可能にする。一般に、ｄｓＲＮＡのアンチセンス鎖は、３’末端にヌクレオチドオーバーハングを有し、５’末端は平滑である。別の実施形態では、オーバーハング中の１つ以上のヌクレオチドは、ヌクレオシドチオリン酸で置換される。
１つの実施形態では、ＴＴＲ遺伝子はヒトＴＴＲ遺伝子である。特定の実施形態では、ｄｓＲＮＡのセンス鎖は、表３Ａ、３Ｂ、４、６Ａ、６Ｂ、又は７からのセンス配列のうちの１つであり、アンチセンス鎖は、表３Ａ、３Ｂ、４、６Ａ、６Ｂ、又は７からのセンス配列のうちの１つである。表３Ａ、３Ｂ、４、６Ａ、６Ｂ、又は７に提供される標的配列の他の箇所を標的とする代替的なアンチセンス剤は、標的配列及び隣接するＴＴＲ配列を使って容易に決定されることができる。
当業者は、２０〜２３であって、特に２１個の塩基対の二本鎖構造を有するｄｓＲＮＡが、ＲＮＡ干渉の誘発に特に効果的であるとして認められていることをよく知っている（Ｅｌｂａｓｈｉｒ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ ２００１，２０：６８７７‐６８８８）。しかしながら、他の者は、より短い又はより長いｄｓＲＮＡが、同様に効果的であることができることを見いだしている。上記の実施形態では、表３Ａ、３Ｂ、４、６Ａ、６Ｂ、又は７に提供されるオリゴヌクレオチド配列の性質のために、本発明で取り上げられるｄｓＲＮＡは、本明細書において記載される長さの少なくとも１本の鎖を含むことができる。一端又は両端のわずかな数のヌクレオチドを差し引いた、表３Ａ、３Ｂ、４、６Ａ、６Ｂ、又は７の配列のうちの１つを有するより短いｄｓＲＮＡが、上記のｄｓＲＮＡと比較して同様に効果的でありうることは、妥当に予想されることができる。したがって、表３、４、６、又は７の配列のうちの１つからの、少なくとも１５、１６、１７、１８、１９、２０個、又はそれ以上の連続するヌクレオチドの部分的配列を有し、本明細書において以下に記載されるアッセイにおいて、それらのＴＴＲ遺伝子の発現を阻害する能力が５、１０、１５、２０、２５、又は３０％以下の阻害で、完全な配列を含むｄｓＲＮＡと異なるｄｓＲＮＡが、本発明により想定される。さらに、所望のＴＴＲ標的配列内で切断するｄｓＲＮＡは、対応するＴＴＲアンチセンス配列及び相補的なセンス配列を使って容易に作製されることができる。
くわえて、表３Ａ、３Ｂ、４、６Ａ、６Ｂ、又は７に提供されるｄｓＲＮＡは、ＲＮＡｉに基づく切断の影響を受けやすいＴＴＲ中の部位を特定する。したがって、本発明は、本発明の薬剤の１つにより標的とされる配列内を標的とするｄｓＲＮＡをさらに特徴とする。本明細書において使用される、第２のｄｓＲＮＡは、第２のｄｓＲＮＡが第１のｄｓＲＮＡのアンチセンス鎖に相補的であるｍＲＮＡ内のいずれかの箇所でメッセージを切断する場合、第１のｄｓＲＮＡの配列内を標的とすると言われる。そのような第２のｄｓＲＮＡは、一般に、ＴＴＲ遺伝子の選択された配列に隣接する領域から取られた追加のヌクレオチド配列につなげられた、表３Ａ、３Ｂ、４、６Ａ、６Ｂ、又は７に提供される配列のうちの１つからの少なくとも１５個の連続するヌクレオチドからなるであろう。
ＲＮＡ標的の切断は、ゲル電気泳動及び、必要ならば、当該技術分野で公知の核酸ハイブリダイゼ―ション技術により日常的に検出することができる。ｄｓＲＮＡの標的ｍＲＮＡ上の切断部位は、例えば、Ｓｏｕｔｓｃｈｅｋ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ； ２００４， Ｖｏｌ． ４３２， ｐｐ． １７３‐１７８（すべての目的に関して参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている５’‐ＲＡＣＥ法などの一般に当業者に公知の方法を使って検出されることができる。ある実施形態では、Ｓｏｕｔｓｃｈｅｋ ｅｔ ａｌ．により記載された５’‐ＲＡＣＥ法を使って、ＡＬＮ‐１８３２８は、配列番号１３３１（ＮＭ＿０００３７１．３）の６３６位のグアニンヌクレオチドと配列番号１３３１の６３７位のアデニンヌクレオチドの間でＴＴＲのｍＲＮＡを切断することが見つけだされた。ある実施形態では、ＡＬＮ‐１８３２８は、配列番号１３３１の６３７位のアデニンヌクレオチドと配列番号１３３１の６３８位のグアニンヌクレオチドの間ではＴＴＲのｍＲＮＡを切断しないことが明らかになった。
本発明で取り上げられるｄｓＲＮＡは、標的配列と１つ以上のミスマッチを含有することができる。１つの実施形態では、本発明で取り上げられるｄｓＲＮＡは、３つ以下のミスマッチを含有する。ｄｓＲＮＡのアンチセンス鎖が標的配列とのミスマッチを含有する場合、ミスマッチの領域は、相補性の領域の中心に位置しないことが好ましい。ｄｓＲＮＡのアンチセンス鎖が標的配列とのミスマッチを含有する場合、ミスマッチは、いずれかの末端から５ヌクレオチド、例えば、相補性の領域の５’又は３’末端のいずれかから５、４、３、２、又は１ヌクレオチドに限られることが好ましい。例えば、ＴＴＲ遺伝子の領域に相補的である２３ヌクレオチドのｄｓＲＮＡ鎖について、ｄｓＲＮＡは、一般に、中央の１３個のヌクレオチド内にはいかなるミスマッチも含有しない。本発明内で記載される方法を使用して、標的配列とのミスマッチを含有するｄｓＲＮＡがＴＴＲ遺伝子の発現の阻害に効果的であるかどうかを決めることができる。ＴＴＲ遺伝子の発現の阻害においてミスマッチを有するｄｓＲＮＡの有効性を考慮することは、特にＴＴＲ遺伝子中の特定の相補性の領域が、集団内に多型の配列変異を有することが公知である場合に重要である。
修飾
さらに別の実施形態では、ｄｓＲＮＡは安定性を増強するよう化学修飾される。本発明の核酸は、当該技術分野で十分に確立された方法、例えば、参照により本明細書に組み込まれる、「Ｃｕｒｒｅｎｔ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ」、Ｂｅａｕｃａｇｅ，Ｓ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．（Ｅｄｓ．）、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ＮＹ、ＵＳＡに記載されるものなどによって合成及び／又は修飾されうる。本発明に有用なｄｓＲＮＡ構成要素の具体的な例として、修飾骨格又は非天然ヌクレオシド連結を含有するｄｓＲＮＡが挙げられる。本明細書において定義されるように、修飾骨格を有するｄｓＲＮＡは、骨格にリン原子をもつもの及び骨格にリン原子をもたないものを含む。本明細書の目的のため、及び当該技術分野で参照されることがあるように、そのヌクレオシド間骨格にリン原子を有さない修飾ｄｓＲＮＡもオリゴヌクレオシドであると考えることができる。
修飾ｄｓＲＮＡ骨格として、例えば、ホスホロチオエート、キラルホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、メチル及びその他のアルキルホスホネート、例えば、３’‐アルキレンホスホネート及びキラルホスホネート、ホスフィネート、ホスホルアミダート、例えば、３’‐アミノホスホルアミダート及びアミノアルキルホスホルアミダート、チオノホスホルアミダート、チオノアルキルホスホネート、チオノアルキルホスホトリエステル及び通常の３’‐５’結合を有するボラノホスフェート、これらの２’‐５’連結している類似体及びヌクレオシド単位の隣接する対が、３’‐５’から５’‐３’又は２’‐５’から５’‐２’に連結している逆の極性を有するものが挙げられる。さまざまな塩、混合塩及び遊離酸の形態も含まれる。
上記のリン原子含有連結の調製を教示する代表的な米国特許として、限定されないが、米国特許第３，６８７，８０８号；同第４，４６９，８６３号；同第４，４７６，３０１号；同第５，０２３，２４３号；同第５，１７７，１９５号；同第５，１８８，８９７号；同第５，２６４，４２３号；同第５，２７６，０１９号；同第５，２７８，３０２号；同第５，２８６，７１７号；同第５，３２１，１３１号；同第５，３９９，６７６号；同第５，４０５，９３９号；同第５，４５３，４９６号；同第５，４５５，２３３号；同第５，４６６，６７７号；同第５，４７６，９２５号；同第５，５１９，１２６号；同第５，５３６，８２１号；同第５，５４１，３１６号；同第５，５５０，１１１号；同第５，５６３，２５３号；同第５，５７１，７９９号；同第５，５８７，３６１号；及び同第５，６２５，０５０号が挙げられ、該特許は各々、参照により本明細書に組み込まれる。
内部ににリン原子を含まない修飾ｄｓＲＮＡ骨格は、短鎖アルキル又はシクロアルキルヌクレオシド間連結、混合ヘテロ原子及びアルキル又はシクロアルキルヌクレオシド間連結又は１つ又は複数の短鎖ヘテロ原子ヌクレオシド間連結又は複素環式ヌクレオシド間連結によって形成される骨格を有する。これらには、モルホリノ連結（一部は、ヌクレオシドの糖部分から形成される）；シロキサン骨格；スルフィド、スルホキシド及びスルホン骨格；ホルムアセチル及びチオホルムアセチル骨格；メチレンホルムアセチル及びチオホルムアセチル骨格；アルケン含有骨格；スルファマート骨格；メチレンイミノ及びメチレンヒドラジノ骨格；スルホネート及びスルホンアミド骨格；アミド骨格を有するもの及び混合Ｎ、Ｏ、Ｓ及びＣＨ２成分部分を有するその他のものが挙げられる。
上記のオリゴヌクレオシドの調製を教示する代表的な米国特許として、限定されないが、米国特許第５，０３４，５０６号；同第５，１６６，３１５号；同第５，１８５，４４４号；同第５，２１４，１３４号；同第５，２１６，１４１号；同第５，２３５，０３３号；同第５，２６４，５６２号；同第５，２６４，５６４号；同第５，４０５，９３８号；同第５，４３４，２５７号；同第５，４６６，６７７号；同第５，４７０，９６７号；同第５，４８９，６７７号；同第５，５４１，３０７号；同第５，５６１，２２５号；同第５，５９６，０８６号；同第５，６０２，２４０号；同第５，６０２，２４０号；同第５，６０８，０４６号；同第５，６１０，２８９号；同第５，６１８，７０４号；同第５，６２３，０７０号；同第５，６６３，３１２号；同第５，６３３，３６０号；同第５，６７７，４３７号及び同第５，６７７，４３９号が挙げられ、該特許は各々、参照により本明細書に組み込まれる。
他の好適なｄｓＲＮＡ模倣体では、ヌクレオチド単位の糖及びヌクレオシド間連結の両方、すなわち、骨格は新規の基で置換される。塩基単位は、適切な核酸標的化合物とハイブリダイズするために維持される。優れたハイブリダイゼーション特性を有することが示されてきたそのようなオリゴマー化合物の１つであるｄｓＲＮＡ模倣体は、ペプチド核酸（ＰＮＡ）と呼ばれる。ＰＮＡ化合物では、ｄｓＲＮＡの糖骨格が、アミド含有骨格、特にアミノエチルグリシン骨格で置換される。核酸塩基は保持され、骨格のアミド部分のアザ窒素原子に直接的又は間接的に結合される。ＰＮＡ化合物の調製を教示する代表的な米国特許としては、米国特許第５，５３９，０８２号、同第５，７１４，３３１号、及び同第５，７１９，２６２号が挙げられるが、これらに限定されず、該特許は各々、参照により本明細書に組み込まれる。ＰＮＡ化合物のさらなる教示は、Ｎｉｅｌｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９１，２５４，１４９７‐１５００に見いだすことができる。
本発明のその他の実施形態は、ホスホロチオエート骨格を有するｄｓＲＮＡ、並びにヘテロ原子骨格、特に、上で参照された米国特許第５，４８９，６７７号の‐‐ＣＨ２‐‐ＮＨ‐‐ＣＨ２‐‐、‐‐ＣＨ２‐‐Ｎ（ＣＨ３）‐‐Ｏ‐‐ＣＨ２‐‐［メチレン（メチルイミノ）又はＭＭＩ骨格として知られる］、‐‐ＣＨ２‐‐Ｏ‐‐Ｎ（ＣＨ３）‐‐ＣＨ２‐‐、‐‐ＣＨ２‐‐Ｎ（ＣＨ３）‐‐Ｎ（ＣＨ３）‐‐ＣＨ２‐‐、及び‐‐Ｎ（ＣＨ３）‐‐ＣＨ２‐‐ＣＨ２‐‐［式中、自然のホスホジエステル骨格は、‐‐Ｏ‐‐Ｐ‐‐Ｏ‐‐ＣＨ２‐‐として表される］、及び上で参照された米国特許第５，６０２，２４０号のアミド骨格を有するオリゴヌクレオシドである。また好ましいのは、上で参照された米国特許第５，０３４，５０６号のモルホリノ骨格構造を有するｄｓＲＮＡである。
また、修飾ｄｓＲＮＡは、１つ以上の置換糖部分も含有しうる。好ましいｄｓＲＮＡは、２’位に次の１つを含む：ＯＨ；Ｆ；Ｏ‐、Ｓ‐、若しくはＮ‐アルキル；Ｏ‐、Ｓ‐、若しくはＮ‐アルケニル；Ｏ‐、Ｓ‐、若しくはＮ‐アルキニル；又はＯ‐アルキル‐Ｏ‐アルキル、ここで、アルキル、アルケニル、及びアルキニルは、置換若しくは非置換のＣ１‐Ｃ１０アルキル又はＣ２‐Ｃ１０アルケニル及びアルキニルでありうる。特に好ましいのは、Ｏ［（ＣＨ２）ｎＯ］ｍＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＮＨ２、Ｏ（ＣＨ２）ｎＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＮＨ２、及びＯ（ＣＨ２）ｎＯＮ［（ＣＨ２）ｎＣＨ３）］２であり、ここで、ｎ及びｍは１〜約１０である。他の好ましいｄｓＲＮＡは、２’位に次の１つを含む：Ｃ１‐Ｃ１０低級アルキル、置換低級アルキル、アルカリル、アラルキル、Ｏ‐アルカリル、若しくはＯ‐アラルキル、ＳＨ、ＳＣＨ３、ＯＣＮ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＮ、ＣＦ３、ＯＣＦ３、ＳＯＣＨ３、ＳＯ２ＣＨ３、ＯＮＯ２、ＮＯ２、Ｎ３、ＮＨ２、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルカリル、アミノアルキルアミノ、ポリアルキルアミノ、置換シリル、ＲＮＡ切断基、レポーター基、挿入分子、ｄｓＲＮＡの薬物動態特性を向上するための基、又はｄｓＲＮＡの薬力学的特性を向上するための基、並びに類似した特性を有する他の置換基。好ましい修飾としては、２’‐メトキシエトキシ（２’‐Ｏ‐‐ＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３であって、２’‐Ｏ‐（２‐メトキシエチル）又は２’‐ＭＯＥとしても知られる）（Ｍａｒｔｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ，１９９５，７８，４８６‐５０４）すなわち、アルコキシ‐アルコキシ基が挙げられる。さらなる好ましい修飾としては、本明細書において以下の例に記載される、２’‐ＤＭＡＯＥとしても知られる、２’‐ジメチルアミノオキシエトキシ、すなわち、Ｏ（ＣＨ２）２ＯＮ（ＣＨ３）２基、並びに、同様に、本明細書において以下の例に記載される、２’‐ジメチルアミノエトキシエトキシ（当該技術分野で２’‐Ｏ‐ジメチルアミノエトキシエチル又は２’‐ＤＭＡＥＯＥとしても知られる）、すなわち、２’‐Ｏ‐‐ＣＨ２‐‐Ｏ‐‐ＣＨ２‐‐Ｎ（ＣＨ２）２が挙げられる。
その他の好ましい修飾としては、２’‐メトキシ（２’‐ＯＣＨ３）、２’‐アミノプロポキシ（２’‐ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２）、及び２’‐フルオロ（２’‐Ｆ）が挙げられる。同様の修飾を、ｄｓＲＮＡの他の位置、特に３’末端ヌクレオチド又は２’‐５’連結ｄｓＲＮＡの糖の３’位、及び５’末端ヌクレオチドの５’位に施しうる。また、ｄｓＲＮＡは、ペントフラノシル糖の代わりに、シクロブチル部分などの糖模倣体を有しうる。そのような修飾糖構造の調製を教示する代表的な米国特許としては、米国特許第４，９８１，９５７号、同第５，１１８，８００号、同第５，３１９，０８０号、同第５，３５９，０４４号、同第５，３９３，８７８号、同第５，４４６，１３７号、同第５，４６６，７８６号、同第５，５１４，７８５号、同第５，５１９，１３４号、同第５，５６７，８１１号、同第５，５７６，４２７号、同第５，５９１，７２２号、同第５，５９７，９０９号、同第５，６１０，３００号、同第５，６２７，０５３号、同第５，６３９，８７３号、同第５，６４６，２６５号、同第５，６５８，８７３号、同第５，６７０，６３３号、及び同第５，７００，９２０号が挙げられるが、これらに限定されず、あるものは本願と共同所有され、該特許は各々、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
また、ｄｓＲＮＡは、核酸塩基（当該技術分野において、しばしば単に「塩基」と呼ばれる）修飾又は置換も含みうる。本明細書において使用される、「非修飾」又は「天然」の核酸塩基としては、プリン塩基であるアデニン（Ａ）及びグアニン（Ｇ）、並びにピリミジン塩基であるチミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）、及びウラシル（Ｕ）が挙げられる。修飾核酸塩基としては、５‐メチルシトシン（５‐ｍｅ‐Ｃ）、５‐ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、２‐アミノアデニン、アデニン及びグアニンの６‐メチル及びその他のアルキル誘導体、アデニン及びグアニンの２‐プロピル及びその他のアルキル誘導体、２‐チオウラシル、２‐チオチミン及び２‐チオシトシン、５‐ハロウラシル及びシトシン、５‐プロピニルウラシル及びシトシン、６‐アゾ ウラシル、６‐アゾ シトシン及び６‐アゾ チミン、５‐ウラシル（シュードウラシル）、４‐チオウラシル、８‐ハロ、８‐アミノ、８‐チオール、８‐チオアルキル、８‐ヒドロキシル及びその他の８‐置換アデニン及びグアニン、５‐ハロ、特に５‐ブロモ、５‐トリフルオロメチル及びその他の５‐置換ウラシル及びシトシン、７‐メチルグアニン及び７‐メチルアデニン、８‐アザグアニン及び８‐アザアデニン、７‐デアザグアニン及び７‐デアザアデニン、並びに３‐デアザグアニン及び３‐デアザアデニンなどの、その他の合成及び天然の核酸塩基が挙げられる。さらなる核酸塩基としては、米国特許第３，６８７，８０８号で開示されるもの、Ｔｈｅ Ｃｏｎｃｉｓｅ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ Ｏｆ Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ａｎｄ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，ｐａｇｅｓ ８５８‐８５９，Ｋｒｏｓｃｈｗｉｔｚ，Ｊ．Ｌ，ｅｄ．Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，１９９０で開示されるもの、Ｅｎｇｌｉｓｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ Ｃｈｅｍｉｅ，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｅｄｉｔｉｏｎ，１９９１，３０，６１３で開示されるもの、及びＳａｎｇｈｖｉ，Ｙ Ｓ．，Ｃｈａｐｔｅｒ １５，ＤｓＲＮＡ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ｐａｇｅｓ ２８９‐３０２，Ｃｒｏｏｋｅ，Ｓ．Ｔ．ａｎｄ Ｌｅｂｌｅｕ，Ｂ．，Ｅｄ．，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，１９９３で開示されるものが挙げられる。これらの核酸塩基のうちの特定のものは、本発明で取り上げられるオリゴマー化合物の結合親和性を増やすために特に有用である。これらとしては、２‐アミノプロピルアデニン、５‐プロピニルウラシル、及び５‐プロピニルシトシンを含む、５‐置換ピリミジン、６‐アザピリミジン、並びにＮ‐２、Ｎ‐６、及びＯ‐６置換プリンが挙げられる。５‐メチルシトシン置換は、核酸二本鎖の安定性を０．６〜１．２℃増加させることが示されており（Ｓａｎｇｈｖｉ，Ｙ．Ｓ．，Ｃｒｏｏｋｅ，Ｓ．Ｔ．ａｎｄ Ｌｅｂｌｅｕ，Ｂ．，Ｅｄｓ．，ＤｓＲＮＡ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，１９９３，ｐｐ．２７６‐２７８）、例示的な塩基置換であり、特に２’‐Ｏ‐メトキシエチル糖修飾と組み合わされた場合、さらにより例示的である。
上記の修飾核酸塩基の特定のもの、及びその他の修飾核酸塩基の調製を教示する代表的な米国特許としては、上記の米国特許第３，６８７，８０８号、並びに米国特許第４，８４５，２０５号、同第５，１３０，３０号、同第５，１３４，０６６号、同第５，１７５，２７３号、同第５，３６７，０６６号、同第５，４３２，２７２号、同第５，４５７，１８７号、同第５，４５９，２５５号、同第５，４８４，９０８号、同第５，５０２，１７７号、同第５，５２５，７１１号、同第５，５５２，５４０号、同第５，５８７，４６９号、同第５，５９４，１２１号、同第５，５９６，０９１号、同第５，６１４，６１７号、及び同第５，６８１，９４１号が含まれるが、これらに限定されず、特許は各々、参照により本明細書に組み込まれ、米国特許第５，７５０，６９２号も参照により本明細書に組み込まれる。
複合体
本発明のｄｓＲＮＡの別の修飾は、ｄｓＲＮＡの活性、細胞分布又は細胞取り込みを高める、１つ以上の部分又は複合体をｄｓＲＮＡに化学的に連結することを伴う。そのような部分としては、コレステロール部分（Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃｉｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９９，８６，６５５３‐６５５６）、コール酸（Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔ．，１９９４ ４ １０５３‐１０６０）、チオエーテル、例えば、ベリル‐Ｓ‐トリチルチオール（ｂｅｒｙｌ‐Ｓ‐ｔｒｉｔｙｌｔｈｉｏｌ）（Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，１９９２，６６０，３０６‐３０９、Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔ．，１９９３，３，２７６５‐２７７０）、チオコレステロール（Ｏｂｅｒｈａｕｓｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１９９２，２０，５３３‐５３８）、脂肪族鎖、例えば、ドデカンジオール若しくはウンデシル残基（Ｓａｉｓｏｎ‐Ｂｅｈｍｏａｒａｓ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ，１９９１，１０，１１１１‐１１１８、Ｋａｂａｎｏｖ ｅｔ ａｌ．，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．，１９９０，２５９，３２７‐３３０、Ｓｖｉｎａｒｃｈｕｋ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ，１９９３，７５，４９‐５４）、リン脂質、例えば、ジ‐ヘキサデシル‐ｒａｃ‐グリセロール若しくはトリエチル‐アンモニウム１，２‐ジ‐Ｏ‐ヘキサデシル‐ｒａｃ‐グリセロ‐３‐Ｈホスホネート（Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．，１９９５，３６，３６５１‐３６５４、Ｓｈｅａ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１９９０，１８，３７７７‐３７８３）、ポリアミン若しくはポリエチレングリコール鎖（Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ＆Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，１９９５，１４，９６９‐９７３）、又はアダマンタン酢酸（Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．，１９９５，３６，３６５１‐３６５４）、パルミチル部分（Ｍｉｓｈｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１９９５，１２６４，２２９‐２３７）、又はオクタデシルアミン若しくはヘキシルアミノ‐カルボニルオキシコレステロール部分（Ｃｒｏｏｋｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．，１９９６，２７７，９２３‐９３７）などの脂質部分が挙げられるが、これらに限定されない。
そのようなｄｓＲＮＡ複合体の調製を教示する代表的な米国特許としては、米国特許第４，８２８，９７９号、同第４，９４８，８８２号、同第５，２１８，１０５号、同第５，５２５，４６５号、同第５，５４１，３１３号、同第５，５４５，７３０号、同第５，５５２，５３８号、同第５，５７８，７１７号、同第５，５８０，７３１号、同第５，５９１，５８４号、同第５，１０９，１２４号、同第５，１１８，８０２号、同第５，１３８，０４５号、同第５，４１４，０７７号、同第５，４８６，６０３号、同第５，５１２，４３９号、同第５，５７８，７１８号、同第５，６０８，０４６号、同第４，５８７，０４４号、同第４，６０５，７３５号、同第４，６６７，０２５号、同第４，７６２，７７９号、同第４，７８９，７３７号、同第４，８２４，９４１号、同第４，８３５，２６３号、同第４，８７６，３３５号、同第４，９０４，５８２号、同第４，９５８，０１３号、同第５，０８２，８３０号、同第５，１１２，９６３号、同第５，２１４，１３６号、同第５，０８２，８３０号、同第５，１１２，９６３号、同第５，２１４，１３６号、同第５，２４５，０２２号、同第５，２５４，４６９号、同第５，２５８，５０６号、同第５，２６２，５３６号、同第５，２７２，２５０号、同第５，２９２，８７３号、同第５，３１７，０９８号、同第５，３７１，２４１号、同第５，３９１，７２３号、同第５，４１６，２０３号、同第５，４５１，４６３号、同第５，５１０，４７５号、同第５，５１２，６６７号、同第５，５１４，７８５号、同第５，５６５，５５２号、同第５，５６７，８１０号、同第５，５７４，１４２号、同第５，５８５，４８１号、同第５，５８７，３７１号、同第５，５９５，７２６号、同第５，５９７，６９６号、同第５，５９９，９２３号、同第５，５９９，９２８号、及び同第５，６８８，９４１号が挙げられるが、これらに限定されず、該特許は各々、参照により本明細書に組み込まれる。
所与の化合物のすべての位置が均一に修飾されている必要はなく、実際、前述の修飾の１つ以上は、単一化合物に、又はさらにはｄｓＲＮＡの単一ヌクレオシドに組み込まれうる。また、本発明は、キメラ化合物であるｄｓＲＮＡ化合物も含む。本発明の文脈において、「キメラ（ｃｈｉｍｅｒｉｃ）」ｄｓＲＮＡ化合物又は「キメラ（ｃｈｉｍｅｒａ）」は、ｄｓＲＮＡ化合物であり、特に２つ以上の化学的にはっきりと異なる領域を含有し、各々少なくとも１つの単量体単位、すなわち、ｄｓＲＮＡ化合物の場合はヌクレオチドからなる、ｄｓＲＮＡである。これらのｄｓＲＮＡは、典型的には、ｄｓＲＮＡは少なくとも１つの領域を含有し、そのｄｓＲＮＡは、ヌクレアーゼ分解に対する耐性の増加、細胞取り込みの増加、及び／又は標的核酸に対する結合親和性の増加をｄｓＲＮＡに付与するように、修飾される。ｄｓＲＮＡのさらなる領域は、ＲＮＡ：ＤＮＡ又はＲＮＡ：ＲＮＡハイブリッドを切断することができる酵素に対する基質としての役割を果たしうる。例として、リボヌクレアーゼＨは、ＲＮＡ：ＤＮＡ二本鎖のＲＮＡ鎖を切断する細胞エンドヌクレアーゼである。したがって、リボヌクレアーゼＨの活性化はＲＮＡ標的の切断をもたらし、それにより遺伝子発現のｄｓＲＮＡ阻害の効率を大きく強化する。結果的に、キメラｄｓＲＮＡが使用される場合、同一標的領域にハイブリダイズするホスホロチオエートデオキシｄｓＲＮＡと比較して、より短いｄｓＲＮＡ使って同様の結果が得られることが多い。
場合によっては、ｄｓＲＮＡは、非リガンド基により修飾されうる。多くの非リガンド分子が、ｄｓＲＮＡの活性、細胞分布、又は細胞取り込みを高めるためにｄｓＲＮＡに接合されており、そのような接合を実施するための手順は、科学文献で入手可能である。そのような非リガンド部分としては、コレステロール（Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９８９，８６：６５５３）、コール酸（Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．，１９９４，４：１０５３）、チオエーテル、例えば、ヘキシル‐Ｓ‐トリチルチオール（Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，１９９２，６６０：３０６、Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔ．，１９９３，３：２７６５）、チオコレステロール（Ｏｂｅｒｈａｕｓｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１９９２，２０：５３３）、脂肪族鎖、例えば、ドデカンジオール若しくはウンデシル残基（Ｓａｉｓｏｎ‐Ｂｅｈｍｏａｒａｓ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ．，１９９１，１０：１１１、Ｋａｂａｎｏｖ ｅｔ ａｌ．，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．，１９９０，２５９：３２７、Ｓｖｉｎａｒｃｈｕｋ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ，１９９３，７５：４９）、リン脂質、例えば、ジ‐ヘキサデシル‐ｒａｃ‐グリセロール若しくはトリエチルアンモニウム１，２‐ジ‐Ｏ‐ヘキサデシル‐ｒａｃ‐グリセロ‐３‐Ｈ‐ホスホネート（Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．，１９９５，３６：３６５１、Ｓｈｅａ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１９９０，１８：３７７７）、ポリアミン若しくはポリエチレングリコール鎖（Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ＆Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，１９９５，１４：９６９）、又はアダマンタン酢酸（Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．，１９９５，３６：３６５１）、パルミチル部分（Ｍｉｓｈｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１９９５，１２６４：２２９）、又はオクタデシルアミン若しくはヘキシルアミノ‐カルボニル‐オキシコレステロール部分（Ｃｒｏｏｋｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．，１９９６，２７７：９２３）などの脂質部分が挙げられる。そのようなｄｓＲＮＡ複合体の調製を教示する代表的な米国特許は、上に列記されている。典型的な接合プロトコールは、配列の１つ以上の位置にアミノリンカーを有するｄｓＲＮＡの合成を含む。次に、アミノ基を適切なカップリング又は活性化試薬を使って接合される分子と反応させる。接合反応は、固体支持体に依然として結合されたｄｓＲＮＡを用いるか、又は溶液相中でのｄｓＲＮＡの切断後のいずれかに行われうる。典型的に、ＨＰＬＣによるｄｓＲＮＡ複合体の精製によって、純粋な複合体が得られる。
ベクターがコードするｄｓＲＮＡ
別の態様では、ＴＴＲｄｓＲＮＡ分子は、ＤＮＡ又はＲＮＡに挿入された転写ユニットから発現される（例えば、 Ｃｏｕｔｕｒｅ， Ａ， ｅｔ ａｌ．， ＴＩＧ． （１９９６）， １２：５‐１０； Ｓｋｉｌｌｅｒｎ， Ａ．， ｅｔ ａｌ．，国際公開ＰＣＴ第００／２２１１３号， Ｃｏｎｒａｄ， 国際公開ＰＣＴ第００／２２１１４及び，Ｃｏｎｒａｄ，米国特許第６，０５４，２９９号を参照のこと．）。これらの導入遺伝子は、宿主ゲノムに組み入れられた導入遺伝子として組み込まれ、受け継がれることができる、直鎖コンストラクト、環状コンストラクト、又はウイルスベクターとして導入されることができる。また、導入遺伝子は、染色体外プラスミドとして受け継がれることができるよう構築されることができる（Ｇａｓｓｍａｎｎ， ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ （１９９５） ９２：１２９２）。
ｄｓＲＮＡの個々の鎖を、２つの別個の発現ベクター上のプロモーターを用いて転写し、標的細胞に同時にトランスフェクションすることができる。あるいは、ｄｓＲＮＡの個々の鎖それぞれを、いずれも同一発現プラスミド上に位置するプロモーターによって転写することができる。１つの実施形態では、ｄｓＲＮＡは、ｄｓＲＮＡがステムアンドループ構造を有するように、リンカーポリヌクレオチド配列によってつなぎ合わせた逆方向反復として発現される。
組換えｄｓＲＮＡ発現ベクターは、一般に、ＤＮＡプラスミド又はウイルスベクターである。ｄｓＲＮＡを発現するウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルス（総説として、Ｍｕｚｙｃｚｋａ，ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐｉｃｓ Ｍｉｃｒｏ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９２）１５８：９７‐１２９を参照のこと）、アデノウイルス（例えば、Ｂｅｒｋｎｅｒ，ｅｔ ａｌ．，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（１９９８）６：６１６）、Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄ ｅｔ ａｌ．（１９９１，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５２：４３１‐４３４）、及びＲｏｓｅｎｆｅｌｄ ｅｔ ａｌ．（１９９２）、Ｃｅｌｌ ６８：１４３‐１５５を参照のこと））、又はアルファウイルス、並びに当該技術分野において公知他のものに基づいて構築することができるが、これらに限定されない。レトロウイルスは、さまざまな遺伝子を、上皮細胞を含む多くの異なる細胞型にインビトロ及び／又は生体内で導入するために使用されてきた（例えば、Ｅｇｌｉｔｉｓ，ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８５）２３０：１３９５‐１３９８、Ｄａｎｏｓ ａｎｄ Ｍｕｌｌｉｇａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９８）８５：６４６０‐６４６４、Ｗｉｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９８８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：３０１４‐３０１８、Ａｒｍｅｎｔａｎｏ ｅｔ ａｌ．，１９９０，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７：６１４１６１４５、Ｈｕｂｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：８０３９‐８０４３、Ｆｅｒｒｙ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：８３７７‐８３８１、Ｃｈｏｗｄｈｕｒｙ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５４：１８０２‐１８０５、ｖａｎ Ｂｅｕｓｅｃｈｅｍ．ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：７６４０‐１９、Ｋａｙ ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ３：６４１‐６４７、Ｄａｉ ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：１０８９２‐１０８９５、Ｈｗｕ ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５０：４１０４‐４１１５、米国特許第４，８６８，１１６号、米国特許第４，９８０，２８６号、国際公開第８９／０７１３６号、国際公開第８９／０２４６８号、国際公開第８９／０５３４５号、及び国際公開第９２／０７５７３号を参照のこと）。細胞のゲノムに挿入された遺伝子を形質導入し発現することができる組換えレトロウイルスベクターは、組換えレトロウイルスゲノムを、ＰＡ３１７及びＰｓｉ‐ＣＲＩＰなどの好適なパッケージング細胞系にトランスフェクションすることにより作製することができる（Ｃｏｍｅｔｔｅ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ２：５‐１０、Ｃｏｎｅ ｅｔ ａｌ．，１９８４，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８１：６３４９）。組換えアデノウイルスベクターは、感受性宿主（例えば、ラット、ハムスター、イヌ、及びチンパンジー）の多種多様の細胞及び組織を感染させるために使用することができ（Ｈｓｕ ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅ，１６６：７６９）、感染に有糸分裂的に活性である細胞を必要としないという利点も有する。
発現されるべきｄｓＲＮＡ分子のコード配列を受け入れることができる任意のウイルスベクターを使用することができ、例えば、アデノウイルス（ＡＶ）、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、レトロウイルス（例えば、レンチウイルス（ＬＶ）、ラブドウイルス、マウス白血病ウイルス）、ヘルペスウイルスなどに由来するベクターがある。ウイルスベクターの向性は、エンベロープタンパク質若しくは他のウイルスからの他の表面抗原を用いてベクターをシュードタイピングするか、又は異なるウイルスのキャプシドタンパク質を必要に応じて置換することにより改変することができる。
例えば、本発明で取り上げられるレンチウイルスベクターは、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）、狂犬病、エボラ、モコラなどからの表面タンパク質でシュードタイピングすることができる。本発明で取り上げられるＡＡＶベクターは、異なるキャプシドタンパク質の血清型を発現するようにベクターを変更することによって異なる細胞を標的とするようにすることができる。例えば、血清型２のゲノム上に血清型２のキャプシドを発現するＡＡＶベクターは、ＡＡＶ２／２と呼ばれる。ＡＡＶ２／２ベクターのこの血清型２のキャプシド遺伝子を、血清型５のキャプシド遺伝子と置換して、ＡＡＶ２／５ベクターを作製することができる。異なるキャプシドタンパク質血清型を発現するＡＡＶベクターを構築する技法は、当業者の技能の範囲内であり、例えば、Ｒａｂｉｎｏｗｉｔｚ Ｊ Ｅ ｅｔ ａｌ．（２００２），Ｊ Ｖｉｒｏｌ ７６：７９１‐８０１を参照されたく、その開示全体が、参照により本明細書に組み込まれる。
本発明における使用に適した組換えウイルスベクターの選択、ｄｓＲＮＡを発現するための核酸配列をベクターに挿入する方法、及びウイルスベクターを目的の細胞に送達する方法は、当該技術分野における技術の範囲内である。例えば、Ｄｏｒｎｂｕｒｇ Ｒ （１９９５）， Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐ． ２： ３０１‐３１０；Ｅｇｌｉｔｉｓ Ｍ Ａ （１９８８）， Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ６： ６０８‐６１４；Ｍｉｌｌｅｒ Ａ Ｄ （１９９０）， Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐ． １： ５‐１４；Ａｎｄｅｒｓｏｎ Ｗ Ｆ （１９９８）， Ｎａｔｕｒｅ ３９２： ２５‐３０；及びＲｕｂｉｎｓｏｎ Ｄ Ａ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ． Ｇｅｎｅｔ． ３３： ４０１‐４０６を参照のされたく、それら全開示は参照により本明細書に組み込まれる。
ウイルスベクターはＡＶ及びＡＡＶ由来であることができる。１つの実施形態では、本発明で取り上げられるｄｓＲＮＡは、例えば、Ｕ６若しくはＨ１ ＲＮＡプロモーター、又はサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターのいずれかを有する組換えＡＡＶベクターから２つの別個の相補的な一本鎖鎖ＲＮＡ分子として発現される。
本発明のｄｓＲＮＡを発現するために好適なＡＶベクター、組換えＡＶベクターを構築する方法、ベクターを標的細胞に送達する方法は、Ｘｉａ Ｈ ｅｔ ａｌ．（２００２），Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２０：１００６‐１０１０に記載されている。
発明で取り上げられるｄｓＲＮＡを発現するために好適なＡＡＶベクター、組換えＡＶベクターを構築する方法、ベクターを標的細胞に送達する方法は、Ｓａｍｕｌｓｋｉ Ｒ ｅｔ ａｌ．（１９８７），Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６１：３０９６‐３１０１、Ｆｉｓｈｅｒ Ｋ Ｊ ｅｔ ａｌ．（１９９６），Ｊ．Ｖｉｒｏｌ，７０：５２０‐５３２、Ｓａｍｕｌｓｋｉ Ｒ ｅｔ ａｌ．（１９８９），Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６３：３８２２‐３８２６、米国特許第５，２５２，４７９号、米国特許第５，１３９，９４１号、国際公開第９４／１３７８８号、及び国際公開第９３／２４６４１号に記載され、それらの開示全体が、参照により本明細書に組み込まれる。
本発明で取り上げられるＤＮＡプラスミド又はウイルスベクターのいずれかにおいてｄｓＲＮＡの発現を駆動するプロモーターは、真核生物ＲＮＡポリメラーゼＩ（例えばリボソームＲＮＡプロモーター）、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ（例えばＣＭＶ初期プロモーター、若しくはアクチンプロモーター、若しくはＵ１ ｓｎＲＮＡプロモーター）、又は一般にＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーター（例えばＵ６ ｓｎＲＮＡ若しくは７ＳＫ ＲＮＡプロモーター）、又は原核生物プロモーター、例えば、発現プラスミドもＴ７プロモーターからの転写に必要なＴ７ ＲＮＡポリメラーゼをコードするという条件で、Ｔ７プロモーターでありうる。プロモーターは、膵臓への導入遺伝子の発現を導くこともできる（例えば、ｔｈｅ ｉｎｓｕｌｉｎ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｆｏｒ ｐａｎｃｒｅａｓ（Ｂｕｃｃｈｉｎｉ ｅｔ ａｌ．，１９８６，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８３：２５１１‐２５１５）を参照のこと）。
くわえて、導入遺伝子の発現は、例えば、特定の生理的調節因子、例えば、循環ブドウ糖レベル、又はホルモンに感受性である調節配列などの誘導可能な調節配列及び発現系を使用することにより精密に調節することができる（Ｄｏｃｈｅｒｔｙ ｅｔ ａｌ．，１９９４，ＦＡＳＥＢ Ｊ．８：２０‐２４）。細胞又は哺乳動物において導入遺伝子の発現を制御するために好適である、そのような誘導可能な発現系としては、エクジソン、エストロゲン、プロゲステロン、テトラサイクリン、二量化の化学誘導物質、及びイソプロピル‐ベータ‐Ｄ１‐チオガラクトピラノシド（ＥＰＴＧ）による調節が挙げられる。当業者は、ｄｓＲＮＡ導入遺伝子の意図される用途に基づいて、適切な調節／プロモーター配列を選択することができるであろう。
一般に、ｄｓＲＮＡ分子を発現することができる組換えベクターは、以下に記載するように送達され、標的細胞中で存続する。あるいは、ｄｓＲＮＡ分子の一過性発現を提供するウイルスベクターを使用することができる。そのようなベクターは、必要に応じて繰り返し投与することができる。一旦発現すると、ｄｓＲＮＡは標的ＲＮＡに結合し、その機能又は発現を調節する。ｄｓＲＮＡを発現するベクターの送達は、静脈内若しくは筋肉内投与等によって全身的、患者から外植された標的細胞に投与した後、患者へ再導入することによって、又は所望の標的細胞への導入を可能にする任意のその他の手段などによってであることができる。
ｄｓＲＮＡ発現ＤＮＡプラスミドは、典型的に、陽イオン性脂質担体（例えばオリゴフェクタミン（Ｏｌｉｇｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ））、又は非陽イオン性脂質に基づく担体（例えばＴｒａｎｓｉｔ‐ＴＫＯ（商標））との複合体として標的細胞にトランスフェクションされる。また、１週間以上の期間にわたる、単一のＴＴＲ遺伝子の異なる領域又は複数のＴＴＲ遺伝子を標的とする、ｄｓＲＮＡにより媒介されるノックダウンのための複数回の脂質トランスフェクションも、本発明によって想定される。ベクターの宿主細胞への導入の成功は、さまざまな公知の方法を使って監視することができる。例えば、一過性トランスフェクションは、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）などの蛍光マーカーなどのレポーターを用いて示すことができる。ハイグロマイシンＢ耐性などの特定の環境因子（例えば、抗生物質及び薬物）に対する耐性をトランスフェクションした細胞に提供するマーカーを使って、生体外における細胞の安定したトランスフェクションを確保することができる。
また、ＴＴＲに特異的なｄｓＲＮＡ分子をベクターに挿入して、ヒト患者に対する遺伝子治療ベクターとして使用することもできる。遺伝子治療ベクターは、例えば、静脈内注射、局所投与（米国特許第５，３２８，４７０号を参照のこと）、又は定位固定注射（例えば、Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９１：３０５４‐３０５７を参照のこと）によって対象に送達することができる。遺伝子療法ベクターの医薬調製品は、許容可能な希釈剤中の遺伝子治療ベクターを含むことができ、又は遺伝子送達媒体が埋め込まれる徐放性基質を含むことができる。あるいは、組換え細胞から完全な遺伝子送達ベクター、例えばレトロウイルスベクターを完全なままに産生することができる場合、医薬調製品は遺伝子送達系を産生する１つ以上の細胞を含むことができる。
ＩＩＩ．ｄｓＲＮＡを含有する医薬組成物
１つの態様では、本発明は、本明細書において記載のｄｓＲＮＡ、及び薬学的に許容可能な担体を含有する医薬組成物を提供する。ｄｓＲＮＡを含有する医薬組成物は、ＴＴＲ発現により仲介される病的過程などのＴＴＲ遺伝子の発現又は活性に関連する疾患又は障害を治療するために有用である。そのような医薬組成物を送達の様式に基づいて製剤化する。一例としては、例えば静脈内（ＩＶ）送達などの非経口送達を介する全身投与のために製剤化される組成物である。別の例は、例えば連続ポンプ注入などの脳への注入によるなど、脳実質への直接送達のために製剤化される組成物である。
本発明の医薬組成物は、ＴＴＲ遺伝子の発現を阻害するのに十分な投与量で投与される。
一般に、ｄｓＲＮＡの好適な投与量は１日にレシピエントの体重１キログラムあたり０．０１マイクログラム〜２００．０ミリグラムの範囲、一般には１日に体重１キログラムあたり１〜５０ｍｇの範囲であろう。例えば、ｄｓＲＮＡは、単回投与当たり、０．００５９ｍｇ／ｋｇ、０．０１ｍｇ／ｋｇ、０．０２９５ｍｇ／ｋｇ、０．０５ｍｇ／ｋｇ、０．０５９０ｍｇ／ｋｇ、０．１６３ｍｇ／ｋｇ、０．２ｍｇ／ｋｇ、０．３ｍｇ／ｋｇ、０．４ｍｇ／ｋｇ、０．５ｍｇ／ｋｇ、０．５４３ｍｇ／ｋｇ、０．５９００ｍｇ／ｋｇ、０．６ｍｇ／ｋｇ、０．７ｍｇ／ｋｇ、０．８ｍｇ／ｋｇ、０．９ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、１．１ｍｇ／ｋｇ、１．２ｍｇ／ｋｇ、１．３ｍｇ／ｋｇ、１．４ｍｇ／ｋｇ、１．５ｍｇ／ｋｇ、１．６２８ｍｇ／ｋｇ、２ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇ、５．０ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、２０ｍｇ／ｋｇ、３０ｍｇ／ｋｇ、４０ｍｇ／ｋｇ、又は５０ｍｇ／ｋｇにて投与されることができる。
１つの実施形態では、投与量は０．０１〜０．２ｍｇ／ｋｇの間である。例えば、ｄｓＲＮＡは、０．０１ｍｇ／ｋｇ、０．０２ｍｇ／ｋｇ、０．０３ｍｇ／ｋｇ、０．０４ｍｇ／ｋｇ、０．０５ｍｇ／ｋｇ、０．０６ｍｇ／ｋｇ、０．０７ｍｇ／ｋｇ０．０８ｍｇ／ｋｇ０．０９ｍｇ／ｋｇ、０．１０ｍｇ／ｋｇ、０．１１ｍｇ／ｋｇ、０．１２ｍｇ／ｋｇ、０．１３ｍｇ／ｋｇ、０．１４ｍｇ／ｋｇ、０．１５ｍｇ／ｋｇ、０．１６ｍｇ／ｋｇ、０．１７ｍｇ／ｋｇ、０．１８ｍｇ／ｋｇ、０．１９ｍｇ／ｋｇ、又は０．２０ｍｇ／ｋｇの投与量にて投与されることができる。
１つの実施形態では、投与量は０．００５ｍｇ／ｋｇ〜１．６２８ｍｇ／ｋｇの間である。例えば、ｄｓＲＮＡは、０．００５９ｍｇ／ｋｇ、０．０２９５ｍｇ／ｋｇ、０．０５９０ｍｇ／ｋｇ、０．１６３ｍｇ／ｋｇ、０．５４３ｍｇ／ｋｇ、０．５９００ｍｇ／ｋｇ、又は１．６２８ｍｇ／ｋｇの投与量にて投与されることができる。
１つの実施形態では、投与量は０．２ｍｇ／ｋｇ〜１．５ｍｇ／ｋｇの間である。例えば、ｄｓＲＮＡは、０．２ｍｇ／ｋｇ、０．３ｍｇ／ｋｇ、０．４ｍｇ／ｋｇ、０．５ｍｇ／ｋｇ、０．６ｍｇ／ｋｇ、０．７ｍｇ／ｋｇ、０．８ｍｇ／ｋｇ、０．９ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、１．１ｍｇ／ｋｇ、１．２ｍｇ／ｋｇ、１．３ｍｇ／ｋｇ、１．４ｍｇ／ｋｇ、又は１．５ｍｇ／ｋｇの投与量にて投与されることができる。
ｄｓＲＮＡは、０．０３ｍｇ／ｋｇ、若しくは０．０３、０．１、０．２、又は０．４ｍｇ／ｋｇの投与量にて投与されることができる。
医薬組成物は１日１回投与されうるか、若しくはｄｓＲＮＡは１日を通して適切な間隔で２、３、又はそれ以上の部分投与として、若しくは持続注入若しくは制御放出製剤による送達を用いて投与されうる。その場合、各部分投与に含有されるｄｓＲＮＡは、１日合計投与量に達するために、対応して少ない量でなければならない。また、投与単位を、例えば数日間にわたってｄｓＲＮＡの持続放出を提供する従来の持続放出製剤を用いるなどの、数日にわたる送達のために、製剤化することもできる。持続放出製剤は当該技術分野において周知であり、本発明の薬剤で用いられることができるような、薬剤を特定の部位に送達するために特に有用である。本実施形態では、投与単位は１日投与量の対応する倍数を含有する。
単回投与のＴＴＲレベルへの効果は、次の投与が３以下、４、又は５日間隔若しくは、１以下、２、３、又は４週間隔、若しくは５以下、６、７、８、９、又は１０週間隔にて投与されるように、長く続く。
当業者は、疾患又は障害の重症度、過去の治療、対象の全身の健康及び／又は年齢、並びに存在するその他の疾患を含むが、それらに限定されるわけではない、特定の因子が、対象を効果的に治療するために必要とされる投与量及びタイミングに影響しうることを理解するであろう。そのうえ、治療上有効な量の組成物での対象の治療は、１回の治療及び一連の治療を含むことができる。本発明により包含される個々のｄｓＲＮＡについての有効な投与量及び生体内での半減期の推定は、従来の方法を用いて、又は本明細書における他所に記載のように、適切な動物モデルを用いる生体内試験に基づいて行なわれることができる。
マウス遺伝学の進歩によって、ＴＴＲの発現により媒介される病理学的過程などのさまざまなヒト疾患の研究のために多くのマウスモデルが生成されている。そのようなモデルは、ｄｓＲＮＡの生体内試験、及び治療上有効な投与量を決定するために使用される。好適なマウスモデルは、例えば、ヒトＴＴＲを発現するプラスミドを含有するマウスである。別の好適なマウスモデルは、ヒトＴＴＲを発現する導入遺伝子を保有するトランスジェニックマウスである。
細胞培養アッセイ及び動物試験から得たデータは、ヒトにおいて用いるための一連の投与量を製剤化するために用いられることができる。本発明で取り上げられる組成物の投与量は、一般に、毒性がほとんど又は全くなく、ＥＤ５０を含む循環濃度の範囲内にある。投与量は、用いられる剤形及び利用される投与経路に応じて、この範囲内で変動しうる。本発明で取り上げられる方法において使用されるいずれの化合物についても、治療上有効な投与量を最初に細胞培養アッセイから推定することができる。細胞培養でもとめられたＩＣ５０（すなわち、症状の最大阻害の１／２を達成する試験化合物の濃度）を含む、化合物、又は適当な場合は、標的配列のポリペプチド生成物の循環血漿濃度範囲を達成する（例えば、ポリペプチドの濃度の低下を達成する）ように、投与量を動物モデルにおいて処方しうる。そのような情報を使用して、ヒトにおける有用な投与量をより正確に決定することができる。血漿中のレベルは、例えば高性能液体クロマトグラフィーによって測定しうる。
本発明で取り上げられるｄｓＲＮＡは、標的遺伝子の発現により媒介される病理学的過程の治療に効果的な他の公知の薬剤と組み合わせて投与することができる。いずれにせよ、投与を施す医師は、当該技術分野において公知又は本明細書において記載の有効性の標準的尺度を用いて観察された結果に基づいて、ｄｓＲＮＡ投与の量及びタイミングを調整することができる。
投与
本発明はまた、本発明で取り上げられるｄｓＲＮＡ化合物を含む医薬組成物及び製剤も含む。本発明の医薬組成物は、局所的又は全身的な治療が望まれるどうか、及び処置される範囲に依存して、多くの方法で投与されうる。投与は、局所的、噴霧器によってを含む、例えば、粉末若しくは噴霧剤の吸入若しくは吹送による経肺、気管内、経鼻、表皮及び経皮、経口若しくは非経口でありうる。非経口投与としては、静脈内、動脈内、皮下、腔内、若しくは筋肉内注射若しくは注入、又は頭蓋内、例えば、実質内、くも膜下腔内、若しくは脳室内投与が挙げられる。
ｄｓＲＮＡは、肝臓（例えば、肝臓の肝細胞）などの特定の組織を標的とする方法で送達することができる。
本発明は、脳への直接注射によって送達されることができる医薬組成物を含む。注射は、脳の特定領域（例えば、黒質、皮質、海馬、線条体、又は淡蒼球）への定位固定注射によるものであることができ、ｄｓＲＮＡは、中枢神経系への複数領域（例えば、脳、及び／又は脊髄の複数領域）へ送達されることができる。また、ｄｓＲＮＡは、脳の拡散領域に送達（例えば、脳の皮質への拡散送達）されることができる。
１つの実施形態において、ＴＴＲを標的とするｄｓＲＮＡは、カニューレ、又は例えば、脳などの組織、例えば、脳の黒質、皮質、海馬、線条体、若しくは淡蒼球などに埋め込まれた一端を有するその他の送達装置を経由して送達されることができる。カニューレは、ｄｓＲＮＡ組成物の貯蔵容器に接続することができる。流入又は送達は、ポンプ、例えば、Ａｌｚｅｔポンプ（Ｄｕｒｅｃｔ，Ｃｕｐｅｒｔｉｎｏ，ＣＡ）などの浸透圧ポンプ又はミニポンプによって媒介されることができる。１つの実施形態において、ポンプ及び貯蔵容器は、組織から離れた場所、例えば腹部内に埋め込まれ、送達は、ポンプ又は貯蔵所から放出部位につながる導管によって達成される。ｄｓＲＮＡ組成物の脳への注入は、数時間にわたって、又は数日間、例えば、１、２、３、５、若しくは７日間、若しくはそれ以上であることができる。脳への送達用の装置は、例えば、米国特許第６，０９３，１８０号、及び同第５，８１４，０１４号に記載されている。
局所投与用の医薬組成物及び製剤には、経皮パッチ、軟膏、ローション、グリーム、ゲル、ドロップ剤、坐薬、スプレー、液体、及び粉末が含まれうる。従来の医薬用担体、水性、粉末、若しくは油性基剤、増粘剤などが必要であるか又は望ましくありうる。被覆したコンドーム、手袋なども有用でありうる。好適な局所製剤としては、本発明で取り上げられるｄｓＲＮＡが、脂質、リポソーム、脂肪酸、脂肪酸エステル、ステロイド、キレート剤、及び界面活性剤などの局所送達剤と混合されるものが挙げられる。好適な脂質及びリポソームとしては、中性（例えば、ジオレオイルホスファチジル（ＤＯＰＥ）エタノールアミン、ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）、ジステアロイルホスファチジルコリン）、陰性（例えば、ジミリストイルホスファチジルグリセロール（ＤＭＰＧ））、並びに陽イオン性（例えば、ジオレオイルテトラメチルアミノプロピル（ＤＯＴＡＰ）、及びジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＴＭＡ））が挙げられる。本発明で取り上げられるｄｓＲＮＡは、リポソーム内にカプセル化されるか、又はそこに、特に陽イオン性リポソームに複合体を形成してもよい。あるいは、ｄｓＲＮＡは、脂質、特に陽イオン性脂質に複合されうる。好適な脂肪酸及びエステルとしては、アラキドン酸、オレイン酸、エイコサン酸、ラウリン酸、カプリル酸、カプリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸、リノレン酸、ジカプリン酸、トリカプリン酸、モノオレイン、ジラウリン、グリセリル１‐モノカプリン酸、１‐ドデシルアザシクロヘプタン‐２‐オン、アシルカルニチン、アシルコリン、又はＣ１‐１０アルキルエステル（例えば、ミリスチン酸イソプロピル（ＩＰＭ））、モノグリセリド、ジグリセリド、あるいはその薬学的に許容可能な塩が含まれるが、これらに限定されない。局所製剤は、米国特許第６，７４７，０１４号に詳細に記載され、当該特許は、参照により本明細書に組み込まれる。
リポソーム製剤
薬物の製剤化のために研究及び使用されているマイクロエマルジョンの他に、組織立った多くの界面活性剤の構造がある。これらとしては、単層、ミセル、二重層、及び小胞が挙げられる。リポソーム等の小胞は、薬物送達の観点から、それらが提示する特異性及び作用の持続時間のため大きな関心を集めてきた。本発明において使用される、「リポソーム」という用語は、球状の１つ又は複数の二重層に配置された両親媒性脂質でできている小胞を意味する。
リポソームは、親油性の材料及び水性の内部から形成される膜を有する、単層状又は多層状の小胞である。水性の部分が、送達される組成物を含有する。陽イオン性リポソームは、細胞壁に融合することができる利点をもつ。非陽イオン性のリポソームは、細胞壁に同じように効率的に融合することはできないが、生体内でマクロファージによって取り込まれる。
哺乳動物の傷がない皮膚を横断するために、脂質小胞は、好適な経皮勾配の影響下、各々５０ｎｍ未満の直径を有する一連の微細孔を通過しなければならない。したがって、高度に変形可能で、そのような微細孔を通過することができるリポソームを使用することが望ましい。
リポソームのさらなる利点としては、天然のリン脂質から得られたリポソームは、生体適合性及び生分解性であること、リポソームは、広範な水溶性及び脂溶性の薬物を組み込むことができること、リポソームは、それらの内部区画でカプセル化された薬物を代謝及び分解から保護できること、が挙げられる（Ｒｏｓｏｆｆ，ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｖｏｌｕｍｅ １，ｐ．２４５）。リポソーム製剤の調製において考慮すべき重要なことは、脂質の表面電荷、小胞の大きさ、及びリポソームの水性容積である。
リポソームは、活性成分の作用部位への移送及び送達に有用である。リポソーム膜は構造的に生体膜と同類であるため、リポソームが組織に適用されると、リポソームは細胞膜との融合を開始し、リポソームと細胞との融合が進行するにつれて、リポソームの内容物が活性薬剤が作用しうる細胞へ流れ出る。
リポソーム製剤は、多くの薬物のための送達様式として広範な研究の焦点となってきた。局所投与に関して、リポソームが他の製剤に勝る幾つかの利点を提示するという証拠が増えつつある。そのような利点としては、投与された薬物の高度な体内吸収に関連する副作用の減少、投与された薬物の所望の標的での蓄積の増加、並びに親水性及び疎水性の両方の多種多様な薬物を皮膚へ投与する能力が挙げられる。
幾つかの報告は、高分子量のＤＮＡを含む薬剤を皮膚へ送達するリポソームの能力について詳述している。鎮痛剤、抗体、ホルモン、及び高分子量のＤＮＡを含む化合物が、皮膚に投与されている。大部分の適用が、表皮上層の標的化をもたらした。
リポソームは、２つの広義のクラスに分類される。陽イオン性リポソームは、負に荷電したＤＮＡ分子と相互に作用して安定な複合体を形成する正に荷電したリポソームである。正に荷電したＤＮＡ／リポソーム複合体は、負に荷電した細胞表面に結合し、エンドソーム内に取り入れられる。エンドソーム内の酸性ｐＨにより、リポソームが破裂し、それらの内容物を細胞の細胞質に放出する（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１９８７，１４７，９８０‐９８５）。
ｐＨ感受性であるか、又は負に荷電したリポソームは、ＤＮＡと複合するのではなく、それを封入する。ＤＮＡ及び脂質双方は同様に荷電されているため、複合体形成ではなく反発が起こる。それでもなお、幾らかのＤＮＡはこれらのリポソームの水性内部内に封入される。チミジンキナーゼ遺伝子をコードするＤＮＡを培養下の細胞単層へ送達するために、ｐＨ感受性リポソームが使用されてきた。外因性遺伝子の発現が、標的細胞中で検出された（Ｚｈｏｕ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ，１９９２，１９，２６９‐２７４）。
リポソーム組成物の１つの主要な種類には、天然由来のホスファチジルコリン以外のリン脂質が含まれる。例えば、中性のリポソーム組成物は、ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）、又はジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）から形成することができる。陰イオン性のリポソーム組成物は、一般にジミリストイルホスファチジルグリセロールから形成され、一方陰イオン性の膜融合性リポソームは、主にジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）から形成される。リポソーム組成物の別の種類は、例えば、大豆ホスファチジルコリン、及び卵ホスファチジルコリン等のホスファチジルコリン（ＰＣ）から形成される。別の種類は、リン脂質、及び／又はホスファチジルコリン、及び／又はコレステロールの混合物から形成される。
幾つかの研究が、リポソーム製剤の皮膚への局所送達を評価してきた。インターフェロンを含有するリポソームのモルモットの皮膚への適用は、皮膚のヘルペスによる傷の軽減をもたらし、一方で他の手段（例えば、溶液又はエマルジョンとして）を介したインターフェロンの送達には効果がなかった（Ｗｅｉｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｄｒｕｇ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ，１９９２，２，４０５‐４１０）。さらに、さらなる研究は、水性系を使用するインターフェロンの投与に対する、リポソーム製剤の一部として投与されたインターフェロンの有効性を検証し、リポソーム製剤は水性投与より優れていると結論付けた（ｄｕ Ｐｌｅｓｓｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｔｉｖｉｒａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９９２，１８，２５９‐２６５）。
また、非イオン性のリポソーム系は、特に非イオン性界面活性剤及びコレステロールを含む系における薬物の皮膚への送達の実用性を決定するために調べられてきた。Ｎｏｖａｓｏｍｅ（商標）Ｉ（ジラウリン酸グリセリル／コレステロール／ポリオキシエチレン‐１０‐ステアリルエーテル）及びＮｏｖａｓｏｍｅ（商標）ＩＩ（ジステアリン酸グリセリル／コレステロール／ポリオキシエチレン‐１０‐ステアリルエーテル）を含む非イオン性リポソーム製剤が、シクロスポリンＡをマウス皮膚の真皮に送達するために使用された。結果は、そのような非イオン性リポソーム系が、皮膚の異なる層へのシクロスポリンＡの沈着の促進に効果的であることを示した（Ｈｕ ｅｔ ａｌ．Ｓ．Ｔ．Ｐ．Ｐｈａｒｍａ．Ｓｃｉ．，１９９４，４，６，４６６）。
また、リポソームには、「立体的に安定化された」リポソームが含まれ、この用語は、本明細書で使用される場合、１つ以上の特定化された脂質を含むリポソームを指し、リポソームに組み込まれた際、そのような特定化された脂質を欠くリポソームと比較して、循環寿命の向上をもたらす。立体的に安定化されたリポソームの例は、リポソームの小胞を形成する脂質部分の一部が、（Ａ）モノシアロガングリオシドＧＭ１などの１つ以上の糖脂質を含む、又は（Ｂ）ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分などの１つ以上の親水性ポリマーで誘導体化されるものである。いずれの特定の理論にも束縛されるものではないが、少なくともガングリオシド、スフィンゴミエリン、又はＰＥＧ誘導体化脂質を含有する立体的に安定化されたリポソームについて、これらの立体的に安定化されたリポソームの循環半減期の増加は、細網内皮系（ＲＥＳ）の細胞内への取り込みの減少から来ていると当該技術分野では考えられている（Ａｌｌｅｎ ｅｔ ａｌ．，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ，１９８７，２２３，４２、Ｗｕ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９９３，５３，３７６５）。
１つ以上の糖脂質を含むさまざまなリポソームが当該技術分野において公知である。Ｐａｐａｈａｄｊｏｐｏｕｌｏｓ ｅｔ ａｌ．（Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，１９８７，５０７，６４）は、モノシアロガングリオシドＧＭ１、ガラクトセレブロシド硫酸、及びホスファチジルイノシトールの、リポソームの血中半減期を改善する能力について報告した。これらの結果は、Ｇａｂｉｚｏｎ ｅｔ ａｌ．（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，１９８８，８５，６９４９）によって詳しく説明されている。米国特許第４，８３７，０２８号及び国際公開第８８／０４９２４号は、共にＡｌｌｅｎ ｅｔ ａｌ．により、（１）スフィンゴミエリン、及び（２）ガングリオシドＧＭ１又はガラクトセレブロシド硫酸エステルを含むリポソームを開示している。米国特許第５，５４３，１５２号（Ｗｅｂｂ ｅｔ ａｌ．）は、スフィンゴミエリンを含むリポソームを開示している。１，２‐ｓｎ‐ジミリストイルホスファチジルコリンを含むリポソームは、国際公開第９７／１３４９９号（Ｌｉｍ ｅｔ ａｌ．）に開示されている。
１つ以上の親水性ポリマーによって誘導体化された脂質を含む多くのリポソーム、及びその調製方法は、当該技術分野において公知である。Ｓｕｎａｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．（Ｂｕｌｌ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｊｐｎ．，１９８０，５３，２７７８）は、ＰＥＧ部分を含有する非イオン性界面活性剤、２Ｃ１２１５Ｇを含むリポソームについて記載している。Ｉｌｌｕｍ ｅｔ ａｌ．（ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．，１９８４，１６７，７９）は、ポリスチレン粒子のポリマーグリコールによる親水性コーティングが、血中半減期の著しい増加をもたらすことを指摘している。ポリアルキレングリコール（例えば、ＰＥＧ）のカルボン酸基の結合によって修飾された合成リン脂質が、Ｓｅａｒｓ（米国特許第４，４２６，３３０号及び同第４，５３４，８９９号）によって記載されている。Ｋｌｉｂａｎｏｖ ｅｔ ａｌ．（ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．，１９９０，２６８，２３５）は、ＰＥＧ又はステアリン酸ＰＥＧによって誘導体化されたホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）を含むリポソームが、血中循環半減期の著しい増加を有することを示す実験について記載している。Ｂｌｕｍｅ ｅｔ ａｌ．（Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ，１９９０，１０２９，９１）は、このような観察を、他のＰＥＧ誘導体化リン脂質、例えば、ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ）とＰＥＧとの組み合わせから形成されるＤＳＰＥ‐ＰＥＧに広げた。外部表面に共有結合されたＰＥＧ部分を有するリポソームが、欧州特許第０４４５１３１（Ｂ１）号及び国際公開第９０／０４３８４号（Ｆｉｓｈｅｒ）に記載されている。ＰＥＧによって誘導体化された１〜２０モルパーセントのＰＥを含有するリポソーム組成物、及びその使用方法が、Ｗｏｏｄｌｅ ｅｔ ａｌ（米国特許第５，０１３，５５６号及び同第５，３５６，６３３号）、並びにＭａｒｔｉｎ ｅｔ ａｌ（（米国特許第５，２１３，８０４号及び欧州特許第０４９６８１３（Ｂ１）号）によって記載されている。その他の多くの脂質‐ポリマー複合体を含むリポソームが、国際公開第９１／０５５４５号及び米国特許第５，２２５，２１２号（共にＭａｒｔｉｎ ｅｔ ａｌ．による）、並びに国際公開第９４／２００７３号（Ｚａｌｉｐｓｋｙ ｅｔ ａｌ）に開示されている。ＰＥＧ修飾セラミド脂質を含むリポソームが、国際公開第９６／１０３９１号（Ｃｈｏｉ ｅｔ ａｌ．）に記載されている。米国特許第５，５４０，９３５号（Ｍｉｙａｚａｋｉ ｅｔ ａｌ．）及び米国特許第５，５５６，９４８号（Ｔａｇａｗａ ｅｔ ａｌ．）は、表面に官能基部分をさらに誘導体化することができるＰＥＧ含有リポソームについて記載している。
核酸を含む多くのリポソームが当該技術分野において公知である。Ｔｈｉｅｒｒｙ ｅｔ ａｌ．による国際公開第９６／４００６２号は、高分子量の核酸をリポソーム中にカプセル化するための方法を開示している。Ｔａｇａｗａらによる米国特許第５，２６４，２２１号は、タンパク質結合リポソームを開示し、そのようなリポソームの内容物にはｄｓＲＮＡが含まれうると主張している。Ｒａｈｍａｎ ｅｔ ａｌ．による米国特許第５，６６５，７１０号は、オリゴデオキシヌクレオチドをリポソーム中にカプセル化する特定の方法について記載している。Ｌｏｖｅらによる国際公開第９７／０４７８７号は、ｒａｆ遺伝子を標的とするｄｓＲＮＡを含むリポソームを開示している。
トランスファーソームはさらに別の種類のリポソームであり、薬物送達媒体の興味を引く候補である、高度に変形可能な脂質凝集物である。トランスファーソームは、高度に変形可能であるので、この小滴より小さな孔に容易に浸透することができる、脂質小滴として記載されうる。トランスファーソームは、それらが使用される環境に適合可能であり、例えば、自己最適性（皮膚の孔の形状に適合する）であり、自己修復性であり、断片化されることなく標的に高い頻度で到達し、しばしば自動装填（ｓｅｌｆ‐ｌｏａｄｉｎｇ）である。トランスファーソームを作製するために、標準的なリポソーム組成物に対して、表面エッジ活性化剤（ｓｕｒｆａｃｅ ｅｄｇ‐ａｃｔｉｖａｔｏｒ）、通常は界面活性剤を添加することができる。トランスファーソームは、血清アルブミンを皮膚へ送達するために使用されてきている。血清アルブミンのトランスファーソームにより媒介される送達は、血清アルブミンを含有する溶液の皮下注射と同程度効果的であることが示されている。
界面活性剤は、エマルジョン（マイクロエマルジョンを含む）及びリポソームなどの製剤に幅広い用途を見いだす。天然及び合成の両方の、多くの異なる種類の界面活性剤の性質を分類及び順位付ける最も一般的な方法は、親水性／親油性バランス（ＨＬＢ）の使用によるものである。親水性基（「頭部基」としても知られる）の性質が、製剤に使用される異なる界面活性剤を分類するための最も有用な手段を提供する（Ｒｉｅｇｅｒ，ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，１９８８，ｐ．２８５）。
界面活性剤分子がイオン化されていない場合、それは、非イオン性界面活性剤として分類される。非イオン性界面活性剤は、医薬品及び化粧品に幅広い用途を見いだし、広範なｐＨ値にわたって使用可能である。一般に、それらのＨＬＢ値は、その構造に依存して、２〜約１８の範囲である。非イオン性界面活性剤としては、エチレングリコールエステル、プロピレングリコールエステル、グリセリルエステル、ポリグリセリルエステル、ソルビタンエステル、スクロースエステル、及びエトキシ化エステルなどの非イオン性エステルが挙げられる。脂肪アルコールエトキシレート、プロポキシル化アルコール、及びエトキシル化／プロポキシル化ブロックポリマーなどの非イオン性アルカノールアミド及びエーテルも、このクラスに含まれる。ポリオキシエチレン界面活性剤は、非イオン性界面活性剤のクラスのうちの最も一般的な構成物質である。
界面活性剤分子が水中に溶解又は分散された時に負の電荷を保有する場合、その界面活性剤は、陰イオン性として分類される。陰イオン性界面活性剤としては、石鹸等のカルボン酸塩、アシルラクチレート（ｌａｃｔｙｌａｔｅ）、アミノ酸のアシルアミド、アルキル硫酸塩及びエトキシル化アルキル硫酸塩などの硫酸のエステル、アルキルベンゼンスルホネート、アシルイセチオネート（ａｃｙｌ ｉｓｅｔｈｉｏｎａｔｅ）、アシルタウレート、及びスルホコハク酸塩などのスルホネート、並びにリン酸塩が挙げられる。陰イオン性界面活性剤のクラスのうちの最も重要な構成物質は、アルキル硫酸塩及び石鹸である。
界面活性剤分子が水中に溶解又は分散された時に正の電荷を保有する場合、その界面活性剤は、陽イオン性として分類される。陽イオン性界面活性剤としては、第四アンモニウム塩及びエトキシ化アミンが挙げられる。第四アンモニウム塩は、このクラスのうちの最も使用される構成物質である。
界面活性剤分子が正又は負の電荷のいずれをも保有する能力を有する場合、その界面活性剤は、両性として分類される。両性界面活性剤としては、アクリル酸誘導体、置換アルキルアミド、Ｎ‐アルキルベタイン、及びフォスファチドが挙げられる。
薬物製品、製剤、及びエマルジョンにおける界面活性剤の使用が概説されている（Ｒｉｅｇｅｒ，ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，１９８８，ｐ．２８５）。
核酸脂質粒子
１つの実施形態では、本発明で取り上げられるＴＴＲのｄｓＲＮＡは、脂質製剤中に完全にカプセル化されて、ＳＰＬＰ、ｐＳＰＬＰ、ＳＮＡＬＰ、又は他の核酸脂質粒子を形成する。本明細書において使用される、「ＳＮＡＬＰ」という用語は、ＳＰＬＰを含む安定な核酸脂質粒子を指す。本明細書において使用される、「ＳＰＬＰ」という用語は、脂質小胞内にカプセル化されたプラスミドＤＮＡを含む核酸脂質粒子を指す。ＳＮＡＬＰ及びＳＰＬＰは、典型的に、陽イオン性脂質、非陽イオン性脂質、及び粒子の凝集を阻止する脂質（例えば、ＰＥＧ脂質複合体）を含有する。ＳＮＡＬＰ及びＳＰＬＰは、静脈内（ｉ．ｖ．）注射後に長時間の循環寿命を呈し、遠位の部位（例えば、投与部位から物理的に離れた部位）に蓄積するため、全身適用に非常に有用である。ＳＰＬＰには、国際公開００／０３６８３号に記載されるカプセル化された縮合剤と核酸との複合体を含む「ｐＳＰＬＰ」が含まれる。本発明の粒子は、典型的には約５０ｎｍ〜約１５０ｎｍ、より典型的には約６０ｎｍ〜約１３０ｎｍ、より典型的には約７０ｎｍ〜約１１０ｎｍ、最も典型的には約７０〜約９０ｎｍの平均直径を有し、実質的に無毒である。くわえて、本発明の核酸脂質粒子中に存在する場合、核酸は水溶液中でヌクレアーゼによる分解に抵抗性である。核酸脂質粒子及びその調製方法は、例えば、米国特許第５，９７６，５６７号、同第５，９８１，５０１号、同第６，５３４，４８４号、同第６，５８６，４１０号、同第６，８１５，４３２号、及び国際公開９６／４０９６４号に開示されている。
１つの実施形態では、脂質の薬物に対する比率（質量／質量比）（例えば、脂質のｄｓＲＮＡに対する比率）は、約１：１〜約５０：１、約１：１〜約２５：１、約３：１〜約１５：１、約４：１〜約１０：１、約５：１〜約９：１、又は約６：１〜約９：１の範囲内であろう。幾つかの実施形態では、脂質のｄｓＲＮＡに対する比率は、約１：１、２：１、３：１、４：１、５：１、６：１、７：１、８：１、９：１、１０：１、又は１１：１であることができる。
一般に、脂質‐核酸粒子は、投与のために緩衝液、例えばＰＢＳに懸濁される。１つの実施形態では、脂質で製剤化されたｓｉＲＮＡのｐＨは、６．８〜７．８、例えば、７．３又は７．４である。オスモル濃度は、例えば、２５０〜３５０ｍＯｓｍ／ｋｇ、例えば、約３００、例えば、２９８、２９９、３００、３０１、３０２、３０３、３０４、又は３０５であることができる。
陽イオン性脂質は、例えば、Ｎ，Ｎ‐ジオレイル‐Ｎ，Ｎ‐ジメチルクロライド（ＤＯＤＡＣ）、Ｎ，Ｎ‐ジステアリル‐Ｎ，Ｎ‐ジメチルアンモニウムブロミド（ＤＤＡＢ）、Ｎ‐（Ｉ‐（２，３‐ジオレオイルオキシ）プロピル）‐Ｎ，Ｎ，Ｎ‐トリメチルクロライド（ＤＯＴＡＰ）、Ｎ‐（Ｉ‐（２，３‐ジオレイルオキシ）プロピル）‐Ｎ，Ｎ，Ｎ‐トリメチルアンモニウムクロライド（ＤＯＴＭＡ）、Ｎ，Ｎ‐ジメチル‐２，３‐ジオレイルオキシ）プロピルアミン（ＤＯＤＭＡ）、１，２‐ジリノレイルオキシ（ＤｉＬｉｎｏｌｅｙｌｏｘｙ）‐Ｎ，Ｎ‐ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎＤＭＡ）、１，２‐ジリノレニルオキシ（Ｄｉｌｉｎｏｌｅｎｙｌｏｘｙ）‐Ｎ，Ｎ‐ジメチルアミノプロパン（ＤＬｅｎＤＭＡ）、１，２‐ジリノレイルカルバモイルオキシ（Ｄｉｌｉｎｏｌｅｙｌｃａｒｂａｍｏｙｌｏｘｙ）‐３‐ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎ‐Ｃ‐ＤＡＰ）、１，２‐ジリノレイオキシ（Ｄｉｌｉｎｏｌｅｙｏｘｙ）‐３‐（ジメチルアミノ）アセトキシプロパン（ＤＬｉｎ‐ＤＡＣ）、１，２‐ジリノレイオキシ‐３‐モルホリノプロパン（ＤＬｉｎ‐ＭＡ）、１，２‐ジリノレオイル‐３‐ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎＤＡＰ）、１，２‐ジリノレイルチオ（Ｄｉｌｉｎｏｌｅｙｌｔｈｉｏ）‐３‐ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎ‐Ｓ‐ＤＭＡ）、１‐リノレオイル‐２‐リノレイルオキシ（ｌｉｎｏｌｅｙｌｏｘｙ）‐３‐ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎ‐２‐ＤＭＡＰ）、１，２‐ジリノレイルオキシ‐３‐トリメチルアミノプロパンクロライド塩（ＤＬｉｎ‐ＴＭＡ．Ｃｌ）、１，２‐ジリノレオイル‐３‐トリメチルアミノプロパンクロライド塩（ＤＬｉｎ‐ＴＡＰ．Ｃｌ）、１，２‐ジリノレイルオキシ‐３‐（Ｎ‐メチルピペラジノ）プロパン（ＤＬｉｎ‐ＭＰＺ）、又は３‐（Ｎ，Ｎ‐ジリノレイルアミノ（Ｄｉｏｌｅｙｌａｍｉｎｏ）‐１，２‐プロパンジオール（ＤＬｉｎＡＰ）、３‐（Ｎ，Ｎ‐ジオレイルアミノ）‐１，２‐プロパンジオ（ｐｒｏｐａｎｅｄｉｏ）（ＤＯＡＰ）、１，２‐ジリノレイルオキソ（Ｄｉｌｉｎｏｌｅｙｌｏｘｏ）‐３‐（２‐Ｎ，Ｎ‐ジメチルアミノ）エトキシプロパン（ＤＬｉｎ‐ＥＧ‐ＤＭＡ）、１，２‐ジリノレニルオキシ‐Ｎ，Ｎ‐ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎＤＭＡ）、２，２‐ジリノレイル（Ｄｉｌｉｎｏｌｅｙｌ）‐４‐ジメチルアミノメチル‐［１，３］‐ジオキソラン（ＤＬｉｎ‐Ｋ‐ＤＭＡ）、又はそれらの類似体、（３ａＲ，５ｓ，６ａＳ）‐Ｎ，Ｎ‐ジメチル‐２，２‐ジ（（９Ｚ，１２Ｚ）‐オクタデカ‐９，１２‐ジエニル）テトラヒドロ‐３ａＨ‐シクロペンタ［ｄ］［１，３］ジオキソール‐５‐アミン（ＡＬＮ１００）、（６Ｚ，９Ｚ，２８Ｚ，３１Ｚ）‐ヘプタトリアコンタ‐６，９，２８，３１‐テトラエン‐１９‐イル４‐（ジメチルアミノ）ブタノエート（ＭＣ３）、１，１’‐（２‐（４‐（２‐（（２‐（ビス（２‐ヒドロキシドデシル）アミノ）エチル）（２‐ヒドロキシドデシル）アミノ）エチル）ピペラジン‐１‐イル）エチルアザネジイル）ジドデカン‐２‐オール（Ｔｅｃｈ Ｇ１）、又はそれらの混合物でありうる。陽イオン性脂質は、粒子中に存在する総脂質の約２０モル％〜約５０モル％、又は約４０モル％からなりうる。
非陽イオン性脂質は、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルグリセロール（ＤＯＰＧ）、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール（ＤＰＰＧ）、ジオレオイル‐ホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）、パルミトイルオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＰＯＰＥ）、ジオレオイル‐ホスファチジルエタノールアミン ４‐（Ｎ‐マレイミドメチル）‐シクロヘキサン‐１‐カルボキシレート（ＤＯＰＥ‐ｍａｌ）、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、ジミリストイルホスホエタノールアミン（ＤＭＰＥ）、ジステアロイル‐ホスファチジル‐エタノールアミン（ＤＳＰＥ）、１６‐Ｏ‐モノメチルＰＥ、１６‐Ｏ‐ジメチルＰＥ、１８‐１‐トランスＰＥ、１‐ステアロイル‐２‐オレオイル‐ホスファチジエタノールアミン（ＳＯＰＥ）、コレステロール、又はそれらの混合物を含むが、これらに限定されない、陰イオン性脂質又は中性脂質でありうる。非陽イオン性脂質は、コレステロールが含まれる場合、粒子中に存在する総脂質の約５モル％〜約９０モル％、約１０モル％、又は約５８モル％でありうる。
粒子の凝集を阻害する接合された脂質は、例えば、制限されないが、ＰＥＧ‐ジアシルグリセロール（ＤＡＧ）、ＰＥＧ‐ジアルキルオキシプロピル（ＤＡＡ）、ＰＥＧ‐リン脂質、ＰＥＧ‐セラミド（Ｃｅｒ）、又はそれらの混合物を含む、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）‐脂質でありうる。ＰＥＧ‐ＤＡＡ複合体は、例えば、ＰＥＧ‐ジラウリルオキシプロピル（Ｃｉ２）、ＰＥＧ‐ジミリスチルオキシプロピル（Ｃｉ４）、ＰＥＧ‐ジパルミチルオキシプロピル（Ｃｉ６）、又はＰＥＧ‐ジステアリルオキシプロピル（Ｃ］８）でありうる。ＰＥＧ複合体のその他の例としては、ＰＥＧ‐ｃＤＭＡ（Ｎ‐［（メトキシポリ（エチレングリコール）２０００）カルバミル］‐１，２‐ジミリスチルオキシプロピル‐３‐アミン）、ｍＰＥＧ２０００‐ＤＭＧ（ｍＰＥＧ‐ジミリスチルグリセロール（ｄｉｍｙｒｙｓｔｙｌｇｌｙｃｅｒｏｌ）（平均分子量２，０００をもつ）及びＰＥＧ‐Ｃ‐ＤＯＭＧ（Ｒ‐３‐［（ω‐メトキシ‐ポリ（エチレングリコール）２０００）カルバミル）］‐１，２‐ジミリスチルオキシプロピル‐３‐アミン）が挙げられる。粒子の凝集を阻止する接合された脂質は、粒子中に存在する総脂質の０モル％〜約２０モル％、又は約１．０、１．１．、１．２、．１３、１．４、１．５、１．６，１．７、１．８、１．９、又は２モル％でありうる。
幾つかの実施形態では、核酸‐脂質粒子は、例えば、粒子中に存在する総脂質の約１０モル％〜約６０モル％、又は約４８モル％のコレステロールをさらに含む。
１つの実施形態では、脂質‐ｓｉＲＮＡナノ粒子を調製するために、化合物、２，２‐ジリノレイル‐４‐ジメチルアミノエチル‐［１，３］‐ジオキソランを使用することができる。２，２‐ジリノレイル‐４‐ジメチルアミノエチル‐［１，３］‐ジオキソランの合成は、２００８年１０月２３日出願の米国特許仮出願第６１／１０７，９９８号に記載され、この出願は、参照により本明細書に組み込まれる。
例えば、脂質‐ｓｉＲＮＡ粒子は、４０％の２，２‐ジリノレイル‐４‐ジメチルアミノエチル‐［１，３］‐ジオキソラン、１０％のＤＳＰＣ、４０％のコレステロール、１０％（モルパーセント）のＰＥＧ‐Ｃ‐ＤＯＭＧを含み、粒径６３．０±２０ｎｍ及び０．０２７のｓｉＲＮＡ／脂質比であることができる。
さらに別の実施形態では、脂質‐ｓｉＲＮＡ粒子を調製するために、化合物、１，１’‐（２‐（４‐（２‐（（２‐（ビス（２‐ヒドロキシドデシル）アミノ）エチル）（２‐ヒドロキシドデシル）アミノ）エチル）ピペラジン‐１‐イル）エチルアザネジイル）ジドデカン‐２‐オール（Ｔｅｃｈ Ｇ１）を使用することができる。例えば、ｄｓＲＮＡを、５０：１０：３８．５：１．５の比でＴａｃｈ‐１、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、コレステロール及びｍＰＥＧ２０００‐ＤＭＧを含む脂質製剤に、７：１の総脂質のｓｉＲＮＡに対する比（重量：重量）で製剤化することができる。
ＬＮＰ０１
１つの実施形態では、リピオイドＮＤ９８‐４ＨＣｌ（ＭＷ１４８７）（化学式１）、コレステロール（シグマ‐アルドリッチ（Ｓｉｇｍａ‐Ａｌｄｒｉｃｈ））、及びＰＥＧ‐Ｃｅｒａｍｉｄｅ Ｃ１６（アバンティポーラリピッド（Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ））を使用して、脂質ｓｉＲＮＡナノ粒子（すなわち、ＬＮＰ０１粒子）を調製することができる。各々のエタノール中の原液を、次のように調製することができる：ＮＤ９８、１３３ｍｇ／ｍＬ；コレステロール、２５ｍｇ／ｍＬ；ＰＥＧ‐Ｃｅｒａｍｉｄｅ Ｃ１６、１００ｍｇ／ｍＬ。次に、ＮＤ９８、コレステロール、及びＰＥＧ‐Ｃｅｒａｍｉｄｅ Ｃ１６の原液を、例えば、４２：４８：１０のモル比に混合することができる。混合した脂質溶液を、最終エタノール濃度が約３５〜４５％、及び最終酢酸ナトリウム濃度が約１００〜３００ｍＭになるように、（例えば、ｐＨ５の酢酸ナトリウム中の）ｓｉＲＮＡ水溶液と混合することができる。脂質‐ｓｉＲＮＡナノ粒子は、典型的には、混合時に自然発生的に形成される。所望の粒径分布に依存して、得られたナノ粒子混合物は、例えば、Ｌｉｐｅｘ Ｅｘｔｒｕｄｅｒ（Ｎｏｒｔｈｅｒｎ Ｌｉｐｉｄｓ，Ｉｎｃ）などのサーモバレル押出機（ｔｈｅｒｍｏｂａｒｒｅｌ ｅｘｔｒｕｄｅｒ）を使って、ポリカーボネート膜（例えば、１００ｎｍカットオフ）を通して押し出すことができる。場合によっては、押出工程を割愛することができる。エタノール除去及び同時の緩衝液交換は、例えば、透析又は接線流濾過によって達成することができる。緩衝液は、例えば、約ｐＨ７、例えば、約ｐＨ６．９、約ｐＨ７．０、約ｐＨ７．１、約ｐＨ７．２、約ｐＨ７．３、又は約ｐＨ７．４のリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）と交換することができる。
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 化学式１
ＬＮＰ０１化学式は、例えば、国際公開第２００８／０４２９７３号に記載されており、出願は、参照により本明細書に組み込まれる。追加の例示的な化学式を表Ａに記載する。














Figure 2013510161
Figure 2013510161
ＳＮＡＬＰ（１，２‐ジリノレニルオキシ‐Ｎ，Ｎ‐ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎＤＭＡ））を含む製剤は、２００９年４月１５日出願の国際公開第２００９／１２７０６０号に記載されており、それは、参照により本明細書に組み込まれる。
ＸＴＣを含む製剤は、例えば、２００９年９月３日出願の米国特許仮出願第６１／２３９，６８６号及び２０１０年１月２９日出願の国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ１０／２２６１４に記載されており、それらは参照により本明細書に組み込まれる。
ＭＣ３を含む製剤は、例えば、２００９年９月２２日出願の米国特許仮出願（Ｕ．Ｓ． Ｐｒｏｖｉｓｉｏｎａｌ Ｓｅｒｉａｌ）第６１／２４４，８３４号及び２００９年６月１０日出願の米国特許仮出願（Ｕ．Ｓ． Ｐｒｏｖｉｓｉｏｎａｌ Ｓｅｒｉａｌ）第６１／１８５，８００号に記載されており、それらは参照により本明細書に組み込まれる。
ＡＬＮ１００、すなわちＡＬＮＹ‐１００を含む製剤は、例えば、２００９年１１月１０日出願の国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ０９／６３９３３に記載されており、それは参照により本明細書に組み込まれる。
Ｃ１２‐２００、すなわちＴｅｃｈ Ｇ１を含む製剤は、例えば、２００９年５月５日出願の米国特許仮出願第６１／１７５，７７０号に記載されており、この出願は参照により本明細書に組み込まれる。
標準的な方法又は押出を伴わない方法のいずれかによって調製された製剤を同様の様態で特徴付けることができる。例えば製剤は、典型的には、目視検査によって特徴付けられる。それらは、凝集物又は沈降物のない白っぽい半透明の溶液であるべきである。脂質ナノ粒子の粒径及び粒径分布は、例えば、Ｍａｌｖｅｒｎ Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ ＺＳ（Ｍａｌｖｅｒｎ，ＵＳＡ）を使用して、光散乱によって測定することができる。粒子は、４０〜１００ｎｍなどの約２０〜３００ｎｍの粒径であるべきである。粒径分布は、単峰型であるべきである。製剤中及び封入された画分中の総ｓｉＲＮＡ濃度は、色素排除アッセイを使って推定される。製剤化されたｓｉＲＮＡの試料を、製剤を分裂する界面活性剤、例えば、０．５％のＴｒｉｔｏｎ‐Ｘ１００の存在又は非存在下においてＲｉｂｏｇｒｅｅｎ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）などのＲＮＡに結合する色素を用いてインキュベーションすることができる。製剤中の総ｓｉＲＮＡは、標準曲線に対する、界面活性剤を含有する試料からのシグナルによって決定することができる。封入された画分を、総ｓｉＲＮＡ含有量からｓｉＲＮＡを「含まない」含有量（界面活性剤の非存在下のシグナルによって測定される）を引くことによって決定する。封入されたｓｉＲＮＡの割合は、典型的には８５％超である。ＳＮＡＬＰ製剤については、粒径は、少なくとも３０ｎｍ、少なくとも４０ｎｍ、少なくとも５０ｎｍ、少なくとも６０ｎｍ、少なくとも７０ｎｍ、少なくとも８０ｎｍ、少なくとも９０ｎｍ、少なくとも１００ｎｍ、少なくとも１１０ｎｍ、及び少なくとも１２０ｎｍである。好適な範囲は、典型的には少なくとも約５０ｎｍ〜少なくとも約１１０ｎｍ、少なくとも約６０ｎｍ〜少なくとも約１００ｎｍ、又は少なくとも約８０ｎｍ〜少なくとも約９０ｎｍである。
経口投与用の組成物及び製剤としては、粉末若しくは顆粒、微粒子、ナノ粒子、水若しくは非水性媒質中の懸濁液若しくは溶液、カプセル、ゲルカプセル、サシェット、錠剤、又はミニタブレットが挙げられる。増粘剤、香味剤、希釈剤、乳化剤、分散助剤、又は結合剤が望ましくありうる。幾つかの実施形態では、経口製剤とは、本発明で取り上げられるｄｓＲＮＡが、１つ以上の浸透促進剤、界面活性剤、及びキレート化剤と共に投与されるものである。好適な界面活性剤としては、脂肪酸及び／又はそのエステル若しくは塩、胆汁酸及び／又はその塩が挙げられる。好適な胆汁酸／塩にとしては、ケノデオキシコール酸（ＣＤＣＡ）及びウルソデオキシケノデオキシコール酸（ＵＤＣＡ）、コール酸、デヒドロコール酸、デオキシコール酸、グルコール酸（ｇｌｕｃｈｏｌｉｃ ａｃｉｄ）、グリコール酸（ｇｌｙｃｈｏｌｉｃ ａｃｉｄ）、グリコデオキシコール酸、タウロコール酸、タウロデオキシコール酸、タウロ‐２４，２５‐ジヒドロ‐フシジン酸ナトリウム、並びにグリコジヒドロフシジン酸ナトリウムが挙げられる。好適な脂肪酸としては、アラキドン酸、ウンデカン酸、オレイン酸、ラウリン酸、カプリル酸、カプリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸、リノレン酸、ジカプリン酸、トリカプリン酸、モノオレイン、ジラウリン、グリセリル１‐モノカプリン酸、１‐ドデシルアザシクロヘプタン‐２‐オン、アシルカルニチン、アシルコリン、又はモノグリセリド、ジグリセリド、若しくはその薬学的に許容可能な塩（例えば、ナトリウム）が挙げられる。幾つかの実施形態では、浸透促進剤の組み合わせが使用され、例えば、胆汁酸／塩と組み合わせた脂肪酸／塩がある。例示的な１つの組み合わせは、ラウリン酸、カプリン酸、及びＵＤＣＡのナトリウム塩である。さらなる浸透促進剤としては、ポリオキシエチレン‐９‐ラウリルエーテル、ポリオキシエチレン‐２０‐セチルエーテルが挙げられる。本発明で取り上げられるｄｓＲＮＡは、噴霧乾燥粒子を含む、又は微小若しくはナノ粒子を形成するように複合された顆粒形態で経口的に送達されうる。ｄｓＲＮＡ複合剤としては、ポリ‐アミノ酸；ポリイミン；ポリアクリレート；ポリアルキルアクリレート、ポリオキセタン、ポリアルキルシアノアクリレート；カチオン化ゼラチン、アルブミン、デンプン、アクリレート、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、及びデンプン；ポリアルキルシアノアクリレート；ＤＥＡＥ誘導体化ポリイミン、プルラン（ｐｏｌｌｕｌａｎ）、セルロース、及びデンプンが挙げられる。好適な複合剤としては、キトサン、Ｎ‐トリメチルキトサン、ポリ‐Ｌ‐リジン、ポリヒスチジン、ポリオルニチン、ポリスペルミン、プロタミン、ポリビニルピリジン、ポリチオジエチルアミノメチルエチレンＰ（ＴＤＡＥ）、ポリアミノスチレン（例えば、ｐ‐アミノ）、ポリ（メチルシアノアクリレート）、ポリ（エチルシアノアクリレート）、ポリ（ブチルシアノアクリレート）、ポリ（イソブチルシアノアクリレート）、ポリ（イソヘキシルシアノアクリレート）、ＤＥＡＥ‐メタクリレート、ＤＥＡＥ‐ヘキシルアクリレート、ＤＥＡＥ‐アクリルアミド、ＤＥＡＥ‐アルブミン及びＤＥＡＥ‐デキストラン、ポリメチルアクリレート、ポリヘキシルアクリレート、ポリ（Ｄ，Ｌ‐乳酸）、ポリ（ＤＬ‐乳酸‐ｃｏ‐グリコール酸（ＰＬＧＡ）、アルギン酸塩、並びにポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が挙げられる。ｄｓＲＮＡ用の経口製剤及びそれらの調製は、米国特許第６，８８７，９０６号、米国特許出願公開第２００３００２７７８０号、及び米国特許第６，７４７，０１４号に詳細に記載され、それらは各々、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
非経口、実質内（脳内への）、くも膜下腔内、脳室内、又は肝内投与用の組成物及び製剤には、滅菌水溶液が含み、限定されないが、浸透促進剤、担体化合物、及び他の薬剤として許容される担体若しくは賦形剤等の緩衝液、希釈剤、及び他の好適な添加剤も含有しうる。
本発明の医薬組成物としては、溶液、エマルジョン、及びリポソームを含有する製剤が挙げられるが、これらに限定されない。これらの組成物は、限定されないが、予め形成された液体、自己乳化固体及び、自己乳化半固体を含むさまざまな成分から生成されうる。特に好ましいのは、肝癌などの肝障害を処置する場合、肝臓を標的とする製剤である。
本発明の医薬製剤は、簡便に単位剤形で提示することができ、製薬産業において周知の従来の技法によって調製することができる。そのような技法には、活性成分を１つ若しくは複数の医薬担体又は１つ若しくは複数の賦形剤と合わせる工程を含まれる。一般に、製剤は、活性成分を液体担体若しくは微粉化した固体担体又はその両方と均一に及び密接につながりをもたせ、次に必要であれば生成物を成形することによって調製される。
本発明の組成物は、限定されないが、錠剤、カプセル、ゲルカプセル、液体シロップ、軟質ゲル、坐薬、及び浣腸剤などの考えられる多くの剤形のうちのいずれかに製剤化されうる。また、本発明の組成物は、水性、非水性、又は混合媒質中の懸濁液として製剤化されうる。水性懸濁液は、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール及び／又はデキストランを含む懸濁液の粘性を増加する物質をさらに含有しうる。また、懸濁液は安定化剤も含有しうる。
エマルジョン
本発明の組成物は、エマルジョンとして調製し、製剤化されうる。エマルジョンは典型的には、１つの液体がもう１つの液体中に、通常は直径０．１μｍを超える液滴の形態で分散した不均質系である（Ｉｄｓｏｎ， ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ， Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ， Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ （Ｅｄｓ．）， １９８８， Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ， Ｉｎｃ．， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， Ｎ． Ｙ．， ｖｏｌｕｍｅ １， ｐ． １９９；Ｒｏｓｏｆｆ， ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ， Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ， Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ （Ｅｄｓ．）， １９８８， Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ， Ｉｎｃ．， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， Ｎ． Ｙ．， Ｖｏｌｕｍｅ １， ｐ． ２４５；Ｂｌｏｃｋ ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ， Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ， Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ （Ｅｄｓ．）， １９８８， Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ， Ｉｎｃ．， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， Ｎ．Ｙ．， ｖｏｌｕｍｅ ２， ｐ． ３３５；Ｈｉｇｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ．， ｉｎ Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．， Ｅａｓｔｏｎ， Ｐａ．， １９８５， ｐ． ３０１）。エマルジョンは、密接に混合し、互いに分散した、２つの不混和性液相を含む二相系であることが多い。一般に、エマルジョンは油中水（ｗ／ｏ）又は水中油（ｏ／ｗ）のいずれかの種でありうる。水相が大量の油相中に微粒化し、微小液滴として分散している場合、得られる組成物は油中水（ｗ／ｏ）エマルジョンと呼ばれる。あるいは、油相が大量の水相中に微粒化し、微小液滴として分散している場合、得られる組成物は水中油（ｏ／ｗ）エマルジョンと呼ばれる。エマルジョンは、分散相、及び水相中又は油相中いずれかの溶液として、若しくはそれ自体が別の相として存在しうる活性薬物にくわえて、追加の成分を含有しうる。乳化剤、安定化剤、色素、及び抗酸化剤などの薬学的賦形剤も、必要に応じてエマルジョン中に存在しうる。また、薬学的エマルジョンは、例えば油中水中油（ｏ／ｗ／ｏ）及び水中油中水（ｗ／ｏ／ｗ）エマルジョンの場合などの３相以上からなる多相エマルジョンでもありうる。そのような複合製剤はしばしば、単純な二相エマルジョンでは得られない特定の利点を提供する。ｏ／ｗエマルジョンの個々の油滴が小さい水滴を封入する多相エマルジョンは、ｗ／ｏ／ｗエマルジョンを構成する。同様に、油性連続相中に安定化された水の小滴中に封入された油滴の系はｏ／ｗ／ｏエマルジョンを提供する。
エマルジョンは、熱力学的安定性がほとんど、又は全くないことによって特徴付けられる。しばしば、エマルジョンの分散又は不連続相は外部又は連続相中によく分散し、乳化剤又は製剤の粘性の手段によってこの形態に維持される。エマルジョン型軟膏基剤及びクリームの場合と同様に、エマルジョンの相のいずれかは半固体又は固体でありうる。エマルジョンを安定化するその他の手段は、エマルジョンのいずれかの相に組み込まれうる乳化剤の使用を伴う。乳化剤は次の４つの範疇に大きく分類されうる：合成界面活性剤、天然乳化剤、吸収基剤、及び微細分散固体（Ｉｄｓｏｎ， ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ， Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ， Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ （Ｅｄｓ．）， １９８８， Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ， Ｉｎｃ．， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， Ｎ．Ｙ．， ｖｏｌｕｍｅ １， ｐ． １９９）。
表面活性剤としても公知の合成界面活性剤は、エマルジョンの製剤において広い適用性が見いだされてきており、文献に概説されている（Ｒｉｅｇｅｒ， ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ， Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ， Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ （Ｅｄｓ．）， １９８８， Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ， Ｉｎｃ．， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， Ｎ．Ｙ．， ｖｏｌｕｍｅ １， ｐ． ２８５；Ｉｄｓｏｎ， ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ， Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ， Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ （Ｅｄｓ．）， Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ， Ｉｎｃ．， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， Ｎ．Ｙ．， １９８８， ｖｏｌｕｍｅ １， ｐ． １９９）。界面活性剤は、典型的に両親媒性で、親水性及び疎水性部分を含む。界面活性剤の疎水性に対する親水性の比は親水親油バランス（ＨＬＢ）と命名され、製剤の調製において界面活性剤を分類し、選択する際に価値あるツールである。界面活性剤は、親水性基の性質に基づいて次の異なるクラスに分類されうる：非イオン性、陰イオン性、陽イオン性及び両性（Ｒｉｅｇｅｒ， ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ， Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ， Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ （Ｅｄｓ．）， １９８８， Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ， Ｉｎｃ．， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， Ｎ．Ｙ．， ｖｏｌｕｍｅ １， ｐ． ２８５）。
エマルジョン製剤において用いられる天然乳化剤には、ラノリン、蜜蝋、ホスファチド、レシチン、及びアカシアを含む。無水ラノリン及び親水性ワセリンなどの吸収基剤は、それらが水を吸収してｗ／ｏエマルジョンを形成し、なおそれらの半固体の堅さを保持しうるような親水特性を有する。また、微粒子固体も、特に界面活性剤との組み合わせ、及び粘性製剤で、良好な乳化剤として使われてきた。これらには、重金属の水酸化物などの極性無機固体；ベントナイト、アタパルガイト、ヘクトライト、カオリン、モンモリロナイト、コロイド状ケイ酸アルミニウム及びコロイド状ケイ酸アルミニウムマグネシウムなどの非膨潤クレー、色素並びに炭素又はトリステアリン酸グリセリンなどの非極性固体が含まれる。
また、非常に多様な非乳化材料もエマルジョン製剤に含まれ、エマルジョンの性質に貢献している。これらには、脂肪、油、ワックス、脂肪酸、脂肪アルコール、脂肪エステル、湿潤薬、親水性コロイド、保存剤及び抗酸化剤が含まれる（Ｂｌｏｃｋ， ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ， Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ， Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ （Ｅｄｓ．）， １９８８， Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ， Ｉｎｃ．， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， Ｎ．Ｙ．， ｖｏｌｕｍｅ １， ｐ． ３３５；Ｉｄｓｏｎ， ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ， Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ， Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ （Ｅｄｓ．）， １９８８， Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ， Ｉｎｃ．， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， Ｎ．Ｙ．， ｖｏｌｕｍｅ １， ｐ． １９９）。
親水性コロイド又はハイドロコロイドとしは、多糖（例えば、アカシア、寒天、アルギン酸、カラゲナン、ガーゴム、カラヤゴム、及びトラガカント）、セルロース誘導体（例えば、カルボキシメチルセルロース及びカルボキシプロピルセルロース）、並びに合成ポリマー（例えば、カルボマー、セルロースエーテル、及びカルボキシビニルポリマー）などの天然ゴム及び合成ポリマーが挙げられる。これらは水に分散又は膨潤して、分散相液滴の周囲に強い界面フィルムを形成すること、及び外部相の粘性を増加することにより、エマルジョンを安定化するコロイド状溶液を形成する。
エマルジョンは、微生物の成長を容易に助けうる、炭水化物、タンパク質、ステロール及びホスファチドなどの多くの成分を含有することが多いため、これらの製剤は保存剤を組み込むことが多い。エマルジョン製剤に含まれる普通に用いられる保存剤としては、メチルパラベン、プロピルパラベン、４級アンモニウム塩、塩化ベンザルコニウム、ｐ‐ヒドロキシ安息香酸のエステル、及びホウ酸が挙げられる。また、抗酸化剤も、普通、エマルジョン製剤に加えられ、製剤の劣化を防止する。用いられる抗酸化剤は、トコフェロール、没食子酸アルキル、ブチル化ヒドロキシアニソール、ブチル化ヒドロキシトルエンなどのフリーラジカル捕捉剤、又はアスコルビン酸及びメタ重亜硫酸ナトリウムなどの還元剤、並びにクエン酸、酒石酸、及びレシチンなどの抗酸化剤相乗剤でありうる。
エマルジョン製剤の皮膚、経口及び非経口経路による適用、並びにそれらの製造方法は、文献に概説されている（Ｉｄｓｏｎ， ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ， Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ， Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ （Ｅｄｓ．）， １９８８， Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ， Ｉｎｃ．， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， Ｎ．Ｙ．， ｖｏｌｕｍｅ １， ｐ． １９９）。経口送達用のエマルジョン製剤は、製剤が容易で、かつ吸収及びバイオアベイラビリティの見地から有効であるため、非常に広く用いられている（Ｒｏｓｏｆｆ， ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ， Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ， Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ （Ｅｄｓ．）， １９８８， Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ， Ｉｎｃ．， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， Ｎ．Ｙ．， ｖｏｌｕｍｅ １， ｐ． ２４５；Ｉｄｓｏｎ， ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ， Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ， Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ （Ｅｄｓ．）， １９８８， Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ， Ｉｎｃ．， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， Ｎ．Ｙ．， ｖｏｌｕｍｅ １， ｐ． １９９）。鉱油系の緩下剤、脂溶性ビタミン及び高脂肪栄養製剤は、普通、ｏ／ｗエマルジョンとして経口投与されている材料に含まれる。
本発明の１つの実施形態では、ｄｓＲＮＡ及び核酸の組成物はマイクロエマルジョンとして製剤化される。マイクロエマルジョンは、単一の光学的に等方性で熱力学的に安定な液体溶液である、水、油及び両親媒性の系と定義されうる（Ｒｏｓｏｆｆ， ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ， Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ， Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ （Ｅｄｓ．）， １９８８， Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ， Ｉｎｃ．， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， Ｎ．Ｙ．， ｖｏｌｕｍｅ １， ｐ． ２４５）。典型的に、マイクロエマルジョンは、まず油を水性界面活性剤溶液に分散し、次に十分な量の第４の成分、一般には中鎖アルコールを加えて、透明な系を形成することにより調製される系である。したがって、マイクロエマルジョンは、表面活性分子の界面フィルムにより安定化されている２つの不混和性液体の熱力学的に安定で等方的に澄明な分散液とも記載されている（Ｌｅｕｎｇ ａｎｄ Ｓｈａｈ， ｉｎ： Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ ｏｆ Ｄｒｕｇｓ： Ｐｏｌｙｍｅｒｓ ａｎｄ Ａｇｇｒｅｇａｔｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ， Ｒｏｓｏｆｆ， Ｍ．， Ｅｄ．， １９８９， ＶＣＨ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ｐａｇｅｓ １８５‐２１５）。マイクロエマルジョンは、普通、油、水、界面活性剤、コサーファクタント及び電解質を含む３から５つの成分の組み合わせを介して調製される。マイクロエマルジョンが油中水（ｗ／ｏ）又は水中油（ｏ／ｗ）型のいずれであるかは、使われる油及び界面活性剤の性質、並びに界面活性剤分子の極性頭部及び炭化水素尾部の構造及び幾何学的充填に依存する（Ｓｃｈｏｔｔ， ｉｎ Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．， Ｅａｓｔｏｎ， Ｐａ．， １９８５， ｐ． ２７１）。
相ダイアグラムを利用する現象学的アプローチが広く研究されてきており、当業者にはマイクロエマルジョンをどのようにして製剤化するかの包括的知識が得られている（Ｒｏｓｏｆｆ， ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ， Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ， Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ （Ｅｄｓ．）， １９８８， Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ， Ｉｎｃ．， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， Ｎ．Ｙ．， ｖｏｌｕｍｅ １， ｐ． ２４５；Ｂｌｏｃｋ， ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ， Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ， Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ （Ｅｄｓ．）， １９８８， Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ， Ｉｎｃ．， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， Ｎ．Ｙ．， ｖｏｌｕｍｅ １， ｐ． ３３５）。従来のエマルジョンと比較して、マイクロエマルジョンは水不溶性薬物を自然発生的に形成される熱力学的に安定な液滴の製剤中に可溶化するという利点を提供する。
マイクロエマルジョンの調製に用いられる界面活性剤としては、イオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤、ブリッジ９６、ポリオキシエチレンオレイルエーテル、ポリグリセロール脂肪酸エステル、テトラグリセロールモノラウレート（ＭＬ３１０）、テトラグリセロールモノオレエート（ＭＯ３１０）、ヘキサグリセロールモノオレエート（ＰＯ３１０）、ヘキサグリセロールペンタオレエート（ＰＯ５００）、デカグリセロールモノカプレート（ＭＣＡ７５０）、デカグリセロールモノオレエート（ＭＯ７５０）、デカグリセロールセスキオレエート（ＳＯ７５０）、デカグリセロールデカオレエート（ＤＡＯ７５０）が単独又はコサーファクタントとの組み合わせが挙げられるが、それらに限定されるわけではない。コサーファクタントは、通常はエタノール、１‐プロパノール、及び１‐ブタノールなどの短鎖アルコールで、界面活性剤フィルムに浸透し、その結果、界面活性剤分子の間に生じる空間のために無秩序なフィルムを生成することにより、界面の流動性を増加する役割を果たす。しかしながら、マイクロエマルジョンはコサーファクタントを用いることなく調製されうり、アルコールを含まない自己乳化マイクロエマルジョン系が当該技術分野において公知である。水相は、典型的に、水、薬物の水溶液、グリセロール、ＰＥＧ３００、ＰＥＧ４００、ポリグリセロール、プロピレングリコール、及びエチレングリコールの誘導体でありうるが、それらに限定されるわけではない。油相としては、Ｃａｐｔｅｘ ３００、Ｃａｐｔｅｘ ３５５、Ｃａｐｍｕｌ ＭＣＭ、脂肪酸エステル、中鎖（Ｃ８‐Ｃ１２）モノ、ジ、及びトリグリセリド、ポリオキシエチル化グリセリル脂肪酸エステル、脂肪アルコール、ポリグリコール化グリセリド、飽和ポリグリコール化Ｃ８‐Ｃ１０グリセリド、植物油並びにシリコーン油などの材料が挙げられうるが、それらに限定されるわけではない。
マイクロエマルジョンは特に薬物可溶化及び薬物の吸収増強の見地から興味深い。脂質性マイクロエマルジョン（ｏ／ｗ及びｗ／ｏの両方）はペプチドを含む薬物の経口バイオアベイラビリティを増強すると提唱されてきている（Ｃｏｎｓｔａｎｔｉｎｉｄｅｓ ｅｔ ａｌ．， Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， １９９４， １１， １３８５‐１３９０；Ｒｉｔｓｃｈｅｌ， Ｍｅｔｈ． Ｆｉｎｄ． Ｅｘｐ． Ｃｌｉｎ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．， １９９３， １３， ２０５）。マイクロエマルジョンは薬物の可溶化改善、酵素加水分解からの薬物の保護、界面活性剤により誘起される膜の流動性及び透過性の変化による薬物吸収の増強の可能性、調製が容易であること、固体剤形よりも経口投与が容易であること、臨床効力の向上、及び毒性の低減という利点を提供する（Ｃｏｎｓｔａｎｔｉｎｉｄｅｓ ｅｔ ａｌ．， Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， １９９４， １１， １３８５；Ｈｏ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｐｈａｒｍ． Ｓｃｉ．， １９９６， ８５， １３８‐１４３）。しばしば、マイクロエマルジョンは、その成分が周囲温度で一緒になったときに自然発生的に形成することがある。これは、熱に不安定な薬物、ペプチド又はｄｓＲＮＡを製剤化する際に特に有利でありうる。また、マイクロエマルジョンは、美容及び薬学的適用の両方で、活性成分の経皮送達においても効果的であった。発明のマイクロエマルジョン組成物及び製剤は、ｄｓＲＮＡ及び核酸の胃腸管からの全身吸収増大を促進し、同様に、ｄｓＲＮＡ及び核酸の局所細胞取り込みを向上することが期待されている。
本発明のマイクロエマルジョンは、製剤の性質を向上するため、並びに本発明のｄｓＲＮＡ及び核酸の吸収を増強するために、ソルビタンモノステアレート（Ｇｒｉｌｌ ３）、ラブラソール（Ｌａｂｒａｓｏｌ）、及び浸透増強剤などの追加の成分及び添加物を含みうる。本発明のマイクロエマルジョンにおいて用いられる浸透増強剤は５つの大きい範疇‐界面活性剤、脂肪酸、胆汁酸塩、キレート化剤、及び非キレート化非界面活性剤の１つに属するとして分類されうる（Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．， Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９９１，ｐ．９２）。これらのクラスの各々は上で論じられている。
浸透促進剤
１つの実施形態では、本発明は、核酸、特にｄｓＲＮＡの、動物の皮膚への効率的な送達を達成させるために、さまざまな浸透促進剤を用いる。大部分の薬物は、イオン化及び非イオン化の両方の形態で溶液中に存在する。しかしながら、通常、脂溶性又は親油性の薬物のみが、容易に細胞膜を横断する。横断される膜が浸透促進剤で処理されている場合、非親油性薬物でさえも細胞膜を横断しうることが発見されている。非親油性薬物の細胞膜を横断する拡散を補助することにくわえて、浸透促進剤は、親油性薬物の透過性も高める。
浸透促進剤は、界面活性剤、脂肪酸、胆汁塩、キレート剤、及び非キレート非界面活性剤の５つの大きな範疇のうちの１つに属するものとして分類することができる（Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９９１，ｐ．９２）。浸透促進剤の前述のクラスの各々について、以下に、より詳細に記載する。
界面活性剤：本発明に関連して、界面活性剤（又は「表面活性剤」）とは、水溶液中に溶解された際、溶液の表面張力又は水溶液と別の液体との間の界面張力を減少させ、粘膜を通るｄｓＲＮＡの吸収が高められるという結果をもたらす化学物質である。胆汁塩及び脂肪酸にくわえて、これらの浸透促進剤としては、例えば、ラウリル硫酸ナトリウム、ポリオキシエチレン‐９‐ラウリルエーテル、及びポリオキシエチレン‐２０‐セチルエーテル）（Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９９１，ｐ．９２）、並びにＦＣ‐４３などのペルフルオロ化合物エマルジョンが挙げられる（Ｔａｋａｈａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，１９８８，４０，２５２）。
脂肪酸：浸透促進剤として作用する種々の脂肪酸及びそれらの誘導体としては、例えば、オレイン酸、ラウリン酸、カプリン酸（ｎ‐デカン酸）、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸、リノレン酸、ジカプリン酸、トリカプリン酸、モノオレイン（１‐モノオレオイル‐ｒａｃ‐グリセロール）、ジラウリン、カプリル酸、アラキドン酸、グリセロール １‐モノカプリン酸、１‐ドデシルアザシクロヘプタン‐２‐オン、アシルカルニチン、アシルコリン、それらのＣ．ｓｕｂ．１‐１０アルキルエステル（例えば、メチル、イソプロピル、及びｔ‐ブチル）、並びにそれらのモノ及びジ‐グリセリド（すなわち、オレイン酸塩、ラウリン酸塩、カプリン酸塩、ミリスチン酸塩、パルミチン酸塩、ステアリン酸塩、リノール酸塩等）が挙げられる（Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｙｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９９１，ｐ．９２、Ｍｕｒａｎｉｓｈｉ，Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９９０，７，１‐３３、Ｅｌ Ｈａｒｉｒｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，１９９２，４４，６５１‐６５４）。
胆汁塩：胆汁の生理学的役割には、脂質及び脂溶性ビタミンの分散及び吸収の促進が含まれる（Ｂｒｕｎｔｏｎ，Ｃｈａｐｔｅｒ ３８ ｉｎ： Ｇｏｏｄｍａｎ ＆ Ｇｉｌｍａｎ’ｓ Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，９ｔｈ Ｅｄ．，Ｈａｒｄｍａｎ ｅｔ ａｌ． Ｅｄｓ．，ＭｃＧｒａｗ‐Ｈｉｌｌ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９６，ｐｐ．９３４‐９３５）。さまざまな天然胆汁塩、及びそれらの合成誘導体は、浸透促進剤として作用する。よって、「胆汁塩」という用語は、胆汁の天然に存在する構成成分のいずれも、及びそれらの合成誘導体のいずれもを含む。好適な胆汁塩には、例えば、コール酸（又はその薬学的に許容可能なナトリウム塩、コール酸ナトリウム）、デヒドロコール酸（デヒドロコール酸ナトリウム）、デオキシコール酸（デオキシコール酸ナトリウム）、グルコール酸（グルコール酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ ｇｌｕｃｈｏｌａｔｅ））、グリコール酸（グリココール酸ナトリウム）、グリコデオキシコール酸（グリコデオキシコール酸ナトリウム）、タウロコール酸（タウロコール酸ナトリウム）、タウロデオキシコール酸（タウロデオキシコール酸ナトリウム）、ケノデオキシコール酸（ケノデオキシコール酸ナトリウム）、ウルソデオキシコール酸（ＵＤＣＡ）、タウロ‐２４，２５‐ジヒドロ‐フシジン酸ナトリウム（ＳＴＤＨＦ）、グリコジヒドロフシジン酸ナトリウム、及びポリオキシエチレン‐９‐ラウリルエーテル（ＰＯＥ）が含まれる（Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９９１，ｐａｇｅ ９２；Ｓｗｉｎｙａｒｄ，Ｃｈａｐｔｅｒ ３９ Ｉｎ： Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ Ｅｄ．，Ｇｅｎｎａｒｏ，ｅｄ．，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．，１９９０，ｐａｇｅｓ ７８２‐７８３、Ｍｕｒａｎｉｓｈｉ，Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９９０，７，１‐３３、Ｙａｍａｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．，１９９２，２６３，２５、Ｙａｍａｓｈｉｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．，１９９０，７９，５７９‐５８３）。
キレート剤：本発明に関連して使用されるキレート剤は、金属イオンとの複合体を形成することによって溶液から金属イオンを除去し、粘膜を通るｄｓＲＮＡの吸収を高めるという結果をもたらす化合物として定義することができる。本発明における浸透促進剤としての使用に関して、大部分の特徴付けられたＤＮＡヌクレアーゼは、触媒作用に二価金属イオンを必要とし、よってキレート剤により阻害されるため、キレート剤は、ＤＮａｓｅ阻害剤としても機能するさらなる利点を有する（Ｊａｒｒｅｔｔ，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．，１９９３，６１８，３１５‐３３９）。好適なキレート剤としては、エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム（ＥＤＴＡ）、クエン酸、サリチル酸塩（例えば、サリチル酸ナトリウム、５‐メトキシサリチル酸塩、及びホモバニレート（ｈｏｍｏｖａｎｉｌａｔｅ））、コラーゲンのＮ‐アシル誘導体、ラウレス‐９、及びベータ‐ジケトンのＮ‐アミノアシル誘導体（エナミン）が挙げられるが、これらに限定されない（Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９９１，ｐａｇｅ ９２、Ｍｕｒａｎｉｓｈｉ，Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９９０，７，１‐３３、Ｂｕｕｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｒｅｌ．，１９９０，１４，４３‐５１）。
非キレート非界面活性剤：本明細書において使用される、非キレート非界面活性剤の浸透促進化合物は、キレート剤又は界面活性剤としてわずかな活性しか示さないが、それにもかかわらず消化器粘膜を通じてのｄｓＲＮＡの吸収を高める化合物として定義することができる（Ｍｕｒａｎｉｓｈｉ，Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９９０，７，１‐３３）。このクラスの浸透促進剤としては、例えば、不飽和環状尿素、１‐アルキル‐及び１‐アルケニルアザシクロ‐アルカノン誘導体（Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９９１，ｐａｇｅ ９２）、並びにジクロフェナクナトリウム、インドメタシン、及びフェニルブタゾンなどの非ステロイド性抗炎症薬（Ｙａｍａｓｈｉｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，１９８７，３９，６２１‐６２６）が挙げられる。
担体
また、本発明の特定の組成物は、製剤中に担体化合物を組み込む。本明細書において使用される、「担体化合物」又は「担体」は、不活性である（すなわち、それ自体生理活性を有さない）が、例えば、生理活性のある核酸の分解、又は循環からのその除去の促進によって、生理活性を有する核酸の生物学的な利用可能性を減少させる生体内プロセスによって、核酸として認識される、核酸又はその類似体を指すことができる。核酸と担体化合物との同時投与は、典型的には後者の物質を過剰に伴い、おそらく共通の受容体に対する担体化合物と核酸との間の競合により、肝臓、腎臓、又はその他の循環外の貯蔵所で回収される核酸の量の著しい減少をもたらしうる。例えば、肝組織中の部分的ホスホロチオエートｄｓＲＮＡの回収は、それがポリイノシン酸、硫酸デキストラン、ポリシチジル酸（ｐｏｌｙｃｙｔｉｄｉｃ ａｃｉｄ）、又は４‐アセトアミド‐４’イソチオシアノ‐スチルベン‐２，２’‐ジスルホン酸と同時投与される場合、減少されうる（Ｍｉｙａｏ ｅｔ ａｌ．，ＤｓＲＮＡ Ｒｅｓ．Ｄｅｖ．，１９９５，５，１１５‐１２１、Ｔａｋａｋｕｒａ ｅｔ ａｌ．，ＤｓＲＮＡ ＆ Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖ．，１９９６，６，１７７‐１８３）。
賦形剤
担体化合物とは対照的に、「医薬用担体」又は「賦形剤」は、１つ以上の核酸を動物に送達するための、薬学的に許容可能な溶媒、懸濁剤、又は任意の他の薬理学的に不活性な媒体である。賦形剤は液体又は固体でありえ、核酸及び所与の医薬組成物の他の構成成分と組み合わされた際、所望の容量、稠度などを提供するように、計画された投与の様態を念頭において選択される。典型的な医薬用担体としては、結合剤（例えば、アルファ化トウモロコシデンプン、ポリビニルピロリドン、又はヒドロキシプロピルメチルセルロースなど）、充填剤（例えば、ラクトース及びその他の糖、微結晶性セルロース、ペクチン、ゼラチン、硫酸カルシウム、エチルセルロース、ポリアクリレート、又はリン酸水素カルシウムなど）、滑沢剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム、タルク、シリカ、コロイド状二酸化ケイ素、ステアリン酸、金属ステアリン酸塩、硬化植物油、コーンスターチ、ポリエチレングリコール、安息香酸ナトリウム、酢酸ナトリウムなど）、崩壊剤（例えば、デンプン、デンプングリコール酸ナトリウムなど）、並びに湿潤剤（例えば、ラウリル硫酸ナトリウムなど）が挙げられるが、これらに限定されない。
また、核酸と有害に反応しない、経口投与に好適な薬学的に許容可能な有機又は無機賦形剤を、本発明の組成物の製剤化に使用することができる。好適な薬学的に許容可能な担体としては、水、塩類溶液、アルコール、ポリエチレングリコール、ゼラチン、ラクトース、アミロース、ステアリン酸マグネシウム、タルク、ケイ酸、粘性パラフィン、ヒドロキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドンなどが挙げられるが、これらに限定されない。
核酸の局所投与用の製剤には、滅菌及び非滅菌水溶液、アルコールなどの一般的な溶媒中の非水溶液、又は液体若しくは固形の油基剤中の核酸の溶液が含まれうる。溶液は、緩衝液、希釈剤、及びその他の好適な添加剤も含有しうる。核酸と有害に反応しない、経口投与に好適な薬学的に許容可能な有機又は無機賦形剤を使用することができる。
好適な薬学的に許容可能な賦形剤としては、水、塩類溶液、アルコール、ポリエチレングリコール、ゼラチン、ラクトース、アミロース、ステアリン酸マグネシウム、タルク、ケイ酸、粘性パラフィン、ヒドロキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドンなどが挙げられるが、これらに限定されない。
その他の成分
本発明の組成物は、医薬組成物中に従来見いだされるその他の補助成分を、それらの当該技術分野において確立されている用法レベルでさらに含有しうる。よって、例えば、組成物は、例えば、止痒剤、収斂剤、局所麻酔薬若しくは抗炎症剤などの追加の適合性薬学的活性材料を含有し、又は色素、着香剤、保存剤、抗酸化剤、乳白剤、増粘剤及び安定化剤などの、本発明の組成物をさまざまな剤形に物理的に製剤化するにあたって有用な追加の材料を含有しうる。しかしながら、そのような材料は、添加したときに、本発明の組成物の成分の生理活性を過度に妨害すべきではない。製剤は滅菌されることができ、望まれる場合には、製剤の核酸と有害な相互作用をしない補助物質、例えば、滑沢剤、保存剤、安定化剤、湿潤剤、乳化剤、浸透圧に影響をおよぼすための塩、緩衝剤、着色剤、着香剤及び／又は芳香物質などと混合することもできる。
水性懸濁液は、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール及び／又はデキストランを含む懸濁液の粘性を増加する物質を含有しうる。懸濁液は安定化剤も含有しうる。
幾つかの実施形態では、本発明の医薬組成物は、（ａ）１つ以上のｄｓＲＮＡ組成物及び（ｂ）非ＲＮＡ干渉メカニズムにより機能する、１つ以上の抗サイトカイン生物薬剤を含む。そのような生物薬剤の例としては、ＩＬ１βを標的とする生物薬剤（例えばアナキンラ）、ＩＬ６を標的とする生物薬剤（トシリズマブ）、又はＴＮＦを標的とする生物薬剤（エタネルセプト、インフリキシマブ、アダリムマブ （ａｄｌｉｍｕｍａｂ）、若しくはセルトリズマブ）が挙げられる。
そのような化合物の毒性及び治療上の有効性は、例えば、ＬＤ５０（集団の５０％に致死的である投与量）及びＥＤ５０（集団の５０％に治療上有効な投与量）を決定するためなどの、細胞培養物又は実験動物における標準的な薬学的方法によって決められることができる。毒性と治療上の効果との間の投与量比が治療指数であり、ＬＤ５０／ＥＤ５０の比として表されることができる。高い治療指数を示す化合物が好ましい。
細胞培養アッセイ及び動物試験から得たデータは、ヒトにおいて用いるための一連の投与量を製剤化するために用いられることができる。本発明の組成物の投与量は、一般に、毒性がほとんど又は全くなく、ＥＤ５０を含む循環濃度の範囲内にある。投与量は、用いられる剤形及び利用される投与経路に応じて、この範囲内で変動しうる。本発明の方法において用いる任意の化合物に関して、治療上有効な投与量はまず細胞培養アッセイから推定されることができる。細胞培養で決定されたＩＣ５０（すなわち、症状の最大阻害の１／２を達成する試験化合物の濃度）を含む、化合物、又は適当な場合には標的配列のポリペプチド生成物の循環血漿濃度範囲を達成する（例えば、ポリペプチドの濃度低下を達成する）ために、投与量は動物モデルにおいて製剤化されうる。ヒトにおける有用な投与量をより正確に決定するために、そのような情報は用いられることができる。血漿中のレベルは、例えば高性能液体クロマトグラフィーによって測定されうる。
前述のように、それらの投与にくわえて、本発明のｄｓＲＮＡはＴＴＲ発現により仲介される病的過程の治療において有効なその他の公知の薬剤と組み合わせて投与されることができる。いずれにせよ、投与を施す医師は、当該技術分野において公知又は本明細書において記載の有効性の標準的尺度を用いて観察された結果に基づいて、ｄｓＲＮＡ投与の量及びタイミングを調整することができる。
ＴＴＲ遺伝子の発現によって引き起こされる疾患を治療する方法
本発明は、特に、ＴＴＲを標的とするｄｓＲＮＡ、及びＴＴＲにより媒介される障害又は疾患の治療のための、そのようなｄｓＲＮＡの少なくとも１つを含有する組成物の使用に関する。例えば、ＴＴＲ遺伝子を標的とするｄｓＲＮＡは、家族性アミロイド神経障害（ＦＡＰ）、家族性アミロイド心筋症（ＦＡＣ）、髄膜／ＣＮＳアミロイドーシス、アミロイドーシスＶＩＩ型（髄膜若しくは脳血管性アミロイドーシスとしても知られている）、高サイロキシン血症、及び心アミロイドーシス（老人性全身性アミロイドーシス（ＳＳＡ）及び老人性心アミロイドーシス（ＳＣＡ）とも呼ばれる）などのＴＴＲアミロイドーシスの治療に有用でありことができる。治療は、疾患を治す及び／又は予防するものであることができる。
図１５は、家族性アミロイド神経障害、家族性アミロイド心筋症、及びＣＮＳアミロイドーシスと関連するＴＴＲにおける、症状及び変異を図示する。本発明は、これらの疾患及び症状の治療のための組成物及び方法を含み、ＴＴＲのこれらの変異型を対象とする。
また、ＴＴＲ遺伝子を標的とするｄｓＲＮＡは、ＴＴＲアミロイドーシスなどの症状及び障害の治療にも使用される。そのようなアミロイドーシスと関連する症状としては、例えば、発作、認知症、ミエロパシー、多発性神経障害、手根管症候群、自律神経不全症、心筋症、胃腸障害（例えば、胃潰瘍、下痢、便秘、又は吸収不良）、体重の減少、肝腫大、リンパ節腫脹症、甲状腺腫、硝子体混濁、腎不全（タンパク尿及び腎機能障害を含む）、腎障害、脳神経障害、角膜格子状ジストロフィー、及び全身衰弱を伴ううっ血性心不全、並びに体液貯留による呼吸困難が挙げられる。
幾つかの実施形態では、ＴＴＲ ｓｉＲＮＡは、末梢神経系でのＴＴＲアミロイド班の沈着などの、ＴＴＲアミロイド班をもたらすＴＴＲに関連する障害の治療に使用される。例として、トランスサイレチンアミロイドーシス（ＡＴＴＲ）及び家族性アミロイド神経障害（ＦＡＰ）が挙げられる。治療は沈着の予防をもたらす治療など、予防的であることができる。あるいは、又はくわえて、治療は、すでに存在する班の退縮をもたらす治療など、疾患を治すものであることができる。治療は、例えば、限定はされないが、食道、胃、腸（十二指腸及び結腸）、座骨神経、及び／又は後根神経節などのどれだけの数の組織においても、ＴＴＲ沈着を減少させるか予防することができる。
例えば、本発明は、ＦＡＰ患者などの、そのような治療を必要とするヒト対象におけるＴＴＲ沈着の治療法を含む。該方法は、例えばＡＬＮ‐ＴＴＲ０１などのＴＴＲ ｓｉＲＮＡを投与することを含み、その治療は、治療後ＴＴＲアミロイド沈着の量における減少及び／又はすでに存在しているＴＴＲアミロイド沈着における減少をもたらす。
ＴＴＲ発現に対する阻害効果のため、本発明による組成物又はそれから調製した医薬組成物は生活の質を高めることができる。
本発明はさらに、ｄｓＲＮＡ又はその医薬組成物、他の薬剤及び／又は他の治療法、例えばＴＴＲアミロイド症を治療するための 例えばこれら障害を治療するために現在用いられているものなどの、公知の医薬及び／又は公知の治療法などの、その他医薬及び／又はその他治療法の組み合わせての使用に関する。一例では、ＴＴＲを標的とするｄｓＲＮＡを、肝臓移植と組み合わせて投与することができる。他の例では、ＴＴＲを標的とするｄｓＲＮＡを、例えば腎機能の管理のための、利尿薬、ＡＣＥ（アンジオテンシン変換酵素）阻害剤、アンジオテンシン受容体遮断剤（ＡＲＢ）、又は透析療法などの、ＴＴＲ疾患の症状を治療するための薬学的又は治療的方法と組み合わせて投与することができる。
ｄｓＲＮＡ及び追加の治療薬は、同じの組み合わせで、例えば非経口で投与することができるか、又は追加の治療薬は、別個の組成物の一部として、又は本明細書において記載の別の方法によって投与されることができる。
本発明は、ＴＴＲを標的とするｄｓＲＮＡを、ＴＴＲアミロイドーシス、例えばＦＡＰなどのＴＴＲの発現により媒介される疾患又は障害を有する患者に投与する方法を取り上げる。ｄｓＲＮＡの投与は、例えばＦＡＰの患者において、末梢神経の機能を安定させ、向上させることができる。患者は、ｄｓＲＮＡの治療量、例えば０．１ｍｇ／ｋｇ、０．２ｍｇ／ｋｇ、０．５ｍｇ／ｋｇ、１．０ｍｇ／ｋｇ、１．５ｍｇ／ｋｇ、２．０ｍｇ／ｋｇ、又は２．５ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡを投与されることができる。ｄｓＲＮＡは、例えば５分間、１０分間、１５分間、２０分間、２５分間、６０分間、１２０分間、又は１８０分間などの期間にわたって静脈内注入により投与することができる。例えば、投与は、隔週（すなわち２週間ごとに）など定期的に、１ヶ月、２ヶ月、３ヶ月、４ヶ月、又はそれより長い期間、繰り返される。初期治療レジメンの後、治療は、より低い頻度で投与することができる。例えば、隔週で３ヶ月間投与した後、６ヶ月間又は１年又はそれより長い期間、１ヶ月に１回、投与を繰り返すことができる。ｄｓＲＮＡの投与は、患者における血中又は尿中のＴＴＲレベルを、少なくとも２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、又は９０％又はそれ以上減少させることができる。
総投与量のｄｓＲＮＡを投与する前に、患者は、総投与量の５％である投与量などの少量の投与量を投与され、アレルギー反応又は肝機能の変化などの副作用を監視されることができる。例えば、肝機能の変化について監視される患者において、ＬＦＴ（肝機能検査）の変化の低い発生率（例えば、ＬＦＴの１０〜２０％発生率）は許容される（例えば、可逆的な、ＡＬＴ（アラニンアミノトランスフェラーゼ）及び／又はＡＳＴ（アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ）レベルの３倍の増加）。
多くのＴＴＲ関連の疾病及び障害は、遺伝性である。したがって、ＴＴＲのｄｓＲＮＡを必要とする患者を、家族歴をとることにより特定することができる。医者、看護師、又は家族などのヘルスケア提供者は、ＴＴＲのｄｓＲＮＡを処方又は投与する前に家族歴をとることができる。ＤＮＡ検査を、ＴＴＲのｄｓＲＮＡを患者に投与する前に、ＴＴＲ遺伝子の変異を特定するために患者に実施しうる。
ＴＴＲ ｄｓＲＮＡを受ける前に、患者に生検を実施しうる。生検は、例えば、胃粘膜、末梢神経、皮膚、腹部脂肪、肝臓、又は腎臓などの組織でありえ、生検は、ＴＴＲにより媒介される障害を示すアミロイド斑を明らかにしうる。アミロイド斑が確認されると、患者にＴＴＲ ｄｓＲＮＡを投与する。
ＴＴＲ遺伝子の発現を阻害する方法
さらに別の態様では、本発明は哺乳動物においてＴＴＲ遺伝子の発現を阻害する方法を提供する。その方法は、標的ＴＴＲ遺伝子の発現がサイレンシングされるように、本発明の組成物を哺乳動物に投与することを含む。
治療を受ける生物がヒトなどの哺乳動物である場合、組成物は、経口、又は頭蓋内（例えば脳室内、実質内及びくも膜下腔内）、静脈内、筋肉内、皮下、経皮、気道（噴霧剤）、経鼻、直腸内、並びに局所（口腔内及び舌下を含む）投与を含む非経口経路を含むが、それらに限定されるわけではない、当該技術分野において公知の任意の手段によって投与されうる。ある実施形態では、組成物は静脈内注入又は注射により投与される。
特に記載がない限り、本明細書において用いられるすべての技術及び科学用語は、本発明が属する分野の当業者に普通に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書において記載されるものと類似又は等価の方法及び材料を本発明のｄｓＲＮＡ及び方法の実施又は試験に用いることができるが、好適な方法及び材料を以下に記載する。本明細書において言及されるすべての刊行物、特許出願、特許、及びその他の参照文献は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。矛盾がある場合、定義を含む本明細書が支配することになるであろう。くわえて、材料、方法、及び例は例示にすぎず、限定することを意図するものではない。
実施例１．ｄｓＲＮＡ合成
試薬の供給元
試薬の供給元が本明細書において具体的に示されていない場合、かかる試薬は任意の分子生物学試薬の供給元から、分子生物学の適用に標準的な品質／純度で入手しうる。
ｓｉＲＮＡ合成
一本鎖ＲＮＡを、Ｅｘｐｅｄｉｔｅ ８９０９合成装置（アプライド・バイオシステムズ，Ａｐｐｌｅｒａ Ｄｅｕｔｓｃｈｌａｎｄ ＧｍｂＨ，Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）及び固体支持体としてガラス多孔体（ＣＰＧ，５００Ａ，Ｐｒｏｌｉｇｏ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｅ ＧｍｂＨ，Ｈａｍｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使って、１μモルのスケールで固相合成により作製した。ＲＮＡ及び２’‐Ｏ‐メチルヌクレオチド含有ＲＮＡを、対応するホスホラミダイト及び２’‐Ｏ‐メチルホスホラミダイトをそれぞれ用いて（Ｐｒｏｌｉｇｏ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｅ ＧｍｂＨ， Ｈａｍｂｕｒｇ， Ｇｅｒｍａｎｙ）固相合成により生成した。これらの構築ブロックを、Ｃｕｒｒｅｎｔ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｂｅａｕｃａｇｅ，Ｓ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．（Ｅｄｒｓ．），Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ．，ＮＹ，ＵＳＡに記載のような標準的なヌクレオシドホスホラミダイト化学を使ってオリゴリボヌクレオチド鎖の配列内の選択された部位に組み込んだ。ホスホロチオエート結合を、アセトニトリル中のビューケージ（Ｂｅａｕｃａｇｅ）試薬 （Ｃｈｒｕａｃｈｅｍ Ｌｔｄ，Ｇｌａｓｇｏｗ，ＵＫ）の溶液（１％）でヨウ素酸化剤溶液を置換することにより導入した。さらなる補助試薬はマリンクロット・ベーカー（Ｍａｌｌｉｎｃｋｒｏｄｔ Ｂａｋｅｒ），Ｇｒｉｅｓｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）から入手した。
粗製オリゴリボヌクレオチドの陰イオン交換ＨＰＬＣによる脱保護及び精製を、確立された手順に従って実施した。収量及び濃度を、分光光度計（ＤＵ ６４０Ｂ，ベックマンコルター（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ），ＧｍｂＨ，Ｕｎｔｅｒｓｃｈｌｅｉｓｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使って、対応するＲＮＡの溶液の波長２６０ｎｍでの紫外線吸収により決定した。二本鎖ＲＮＡを、アニーリング緩衝液（２０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ ６．８；１００ｍＭ塩化ナトリウム）中の相補鎖の等モル溶液と混合することによって生成し、８５〜９０℃で３分間水浴槽中で加熱し、３〜４時間かけて室温まで冷却した。アニーリングしたＲＮＡ溶液を使用まで−２０℃で保存した。
３’‐コレステロール接合ｓｉＲＮＡｓ（本明細書において−Ｃｈｏｌ‐３’と呼ぶ）の合成のために、適切に改変した固体支持体を使用した。改変固体支持体を以下のように調製した。
２‐アザブタン‐１，４‐ジカルボン酸ジエチル ＡＡ
Figure 2013510161
 ＡＡ
５０ｍＬのエチルグリシネート塩酸塩（３２．１９ｇ、０．２３モル）の水溶液を、撹拌、氷冷した４．７Ｍの水酸化ナトリウム水溶液（５０ｍＬ）に加えた。次に、アクリル酸エチル（２３．１ｇ、０．２３モル）を加え、混合物をＴＬＣにより反応完了が確認されるまで室温で撹拌した。１９時間後、溶液をジクロロメタン（３×１００ｍＬ）で分画した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過して蒸発させた。残渣を蒸留して、ＡＡ（２８．８ｇ、６１％）を得た。
３‐｛エトキシカルボニルメチル‐［６‐（９Ｈ‐フルオレン‐９‐イルメトキシカルボニル‐アミノ）‐ヘキサノイル］‐アミノ｝‐プロピオン酸エチルエステル ＡＢ
Figure 2013510161
 ＡＢ
Ｆｍｏｃ‐６‐アミノ‐ヘキサン酸（９．１２ｇ、２５．８３ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（５０ｍＬ）に溶解し、氷で冷却した。ジイソプロピルカルボジイミド（３．２５ｇ、３．９９ｍＬ、２５．８３ｍｍｏｌ）を溶液に０℃で加えた。次に、アザブタン‐１，４‐ジカルボン酸ジエチル（５ｇ、２４．６ｍｍｏｌ）及びジメチルアミノピリジン（０．３０５ｇ、２．５ｍｍｏｌ）を加えた。溶液を室温に戻し、さらに６時間撹拌した。反応の完了をＴＬＣで確認した。反応混合物を減圧下で濃縮し、酢酸エチルを加えてジイソプロピル尿素を沈澱させた。懸濁液をろ過した。ろ液を５％塩酸水溶液、５％炭酸水素ナトリウム及び水で洗浄した。合わせた有機層を硫酸ナトリウムで乾燥し、濃縮して、粗生成物を得て、これをカラムクロマトグラフィ（５０％ＥｔＯＡＣ／ヘキサン）で精製して、１１．８７ｇ（８８％）のＡＢを得た。
３‐［（６‐アミノ‐ヘキサノイル）‐エトキシカルボニルメチル‐アミノ］‐プロピオン酸エチルエステル ＡＣ
Figure 2013510161
 ＡＣ
３‐｛エトキシカルボニルメチル‐［６‐（９Ｈ‐フルオレン‐９‐イルメトキシカルボニルアミノ）‐ヘキサノイル］‐アミノ｝‐プロピオン酸エチルエステルＡＢ（１１．５ｇ、２１．３ｍｍｏｌ）をジメチルホルムアミド中の２０％ピペリジンに０℃で溶解した。溶液を１時間撹拌し続けた。反応混合物を減圧下で濃縮し、残渣に水を加え、生成物を酢酸エチルで抽出した。粗生成物をその塩酸塩に変換することにより精製した。
３‐（｛６‐［１７‐（１，５‐ジメチル‐ヘキシル）‐１０，１３‐ジメチル‐２，３，４，７，８，９，１０，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７‐テトラデカヒドロ‐１Ｈ‐シクロペンタ［ａ］フェナントレン‐３‐イルオキシカルボニルアミノ］‐ヘキサノイル｝エトキシカルボニルメチル‐アミノ）‐プロピオン酸エチルエステル ＡＤ
Figure 2013510161
 ＡＤ
３‐［（６‐アミノ‐ヘキサノイル）‐エトキシカルボニルメチル‐アミノ］‐プロピオン酸エチルエステルＡＣ（４．７ｇ、１４．８ｍｍｏｌ）の塩酸塩をジクロロメタンに溶解した。懸濁液を氷上で０℃に冷却した。懸濁液にジイソプロピルエチルアミン（３．８７ｇ、５．２ｍＬ、３０ｍｍｏｌ）を加えた。得られた溶液にクロロギ酸コレステリル（６．６７５ｇ、１４．８ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を一晩撹拌した。反応混合物をジクロロメタンで希釈し、１０％塩酸で洗浄した。生成物をフラッシュクロマトグラフィで精製した（１０．３ｇ、９２％）。
１‐｛６‐［１７‐（１，５‐ジメチル‐ヘキシル）‐１０，１３‐ジメチル‐２，３，４，７，８，９，１０，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７‐テトラデカヒドロ‐１Ｈ‐シクロペンタ［ａ］フェナントレン‐３‐イルオキシカルボニルアミノ］‐ヘキサノイル｝‐４‐オキソ‐ピロリジン‐３‐カルボン酸エチルエステル ＡＥ
Figure 2013510161
 ＡＥ
カリウムｔ‐ブトキシド（１．１ｇ、９．８ｍｍｏｌ）を無水トルエン３０ｍＬ中でスラリー化した。混合物を氷上で０℃に冷却し、ジエステルＡＤ ５ｇ（６．６ｍｍｏｌ）を撹拌しながら２０分以内にゆっくり加えた。温度を添加中は５℃未満に維持した。撹拌を０℃で３０分間続け、氷酢酸１ｍＬを加え、その直後に水４０ｍＬ中のＮａＨ２ＰＯ４・Ｈ２Ｏ ４ｇを加えた。得られた混合物をジクロロメタン各１００ｍＬで２回抽出し、合わせた有機抽出物をリン酸緩衝液各１０ｍＬで２回洗浄し、乾燥し、蒸発乾固させた。残渣をトルエン６０ｍＬに溶解し、０℃に冷却し、冷却したｐＨ９．５の炭酸緩衝液５０ｍＬで３回抽出した。水性抽出物をリン酸でｐＨ３に調節し、クロロホルム４０ｍＬで５回抽出し、これを合わせて乾燥し、蒸発乾固させた。残渣をカラムクロマトグラフィで２５％酢酸エチル／ヘキサンを用いて精製し、１．９ｇのｂ‐ケトエステル（３９％）を得た。
［６‐（３‐ヒドロキシ‐４‐ヒドロキシメチル‐ピロリジン‐１‐イル）‐６‐オキソ‐ヘキシル］‐カルバミン酸１７‐（１，５‐ジメチル‐ヘキシル）‐１０，１３‐ジメチル‐２，３，４，７，８，９，１０，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７‐テトラデカヒドロ‐１Ｈ‐シクロペンタ［ａ］フェナントレン‐３‐イルエステル ＡＦ
Figure 2013510161
 ＡＦ
テトラヒドロフラン（１０ｍＬ）中のｂ‐ケトエステルＡＥ（１．５ｇ、２．２ｍｍｏｌ）及び水素化ホウ素ナトリウム（０．２２６ｇ、６ｍｍｏｌ）の還流混合物に、これにメタノール（２ｍＬ）を１時間かけて滴下した。撹拌を還流温度で１時間続けた。室温まで冷却した後、１Ｎ ＨＣｌ（１２．５ｍＬ）を加え、混合物を酢酸エチル（３×４０ｍＬ）で抽出した。合わせた酢酸エチル層を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、減圧下で濃縮して生成物を得て、これをカラムクロマトグラフィ（１０％ＭｅＯＨ／ＣＨＣｌ３）で精製した（８９％）。
（６‐｛３‐［ビス‐（４‐メトキシ‐フェニル）‐フェニル‐メトキシメチル］‐４‐ヒドロキシ‐ピロリジン‐１‐イル｝‐６‐オキソ‐ヘキシル）‐カルバミン酸１７‐（１，５‐ジメチル‐ヘキシル）‐１０，１３‐ジメチル‐２，３，４，７，８，９，１０，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７‐テトラデカヒドロ‐１Ｈ‐シクロペンタ［ａ］フェナントレン‐３‐イルエステル ＡＧ
Figure 2013510161
 ＡＧ
ジオールＡＦ（１．２５ｇ、１．９９４ｍｍｏｌ）をピリジン（２×５ｍＬ）と共に減圧下で蒸発させて乾燥した。無水ピリジン（１０ｍＬ）及び塩化４，４’‐ジメトキシトリチル（０．７２４ｇ、２．１３ｍｍｏｌ）を撹拌しながら加えた。反応を室温で一晩実施した。メタノールを加えることにより反応を停止した。反応混合物を減圧下で濃縮し、残渣にジクロロメタン（５０ｍＬ）を加えた。有機層を１Ｍ炭酸水素ナトリウム水溶液で洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過して濃縮した。残留ピリジンをトルエンと共に蒸発させることにより除去した。粗生成物をカラムクロマトグラフィ（２％ＭｅＯＨ／クロロホルム、５％ＭｅＯＨ／ＣＨＣｌ３中のＲｆ＝０．５）で精製した（１．７５ｇ、９５％）。
コハク酸モノ‐（４‐［ビス‐（４‐メトキシ‐フェニル）‐フェニル‐メトキシメチル］‐１‐｛６‐［１７‐（１，５‐ジメチル‐ヘキシル）‐１０，１３‐ジメチル２，３，４，７，８，９，１０，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７‐テトラデカヒドロ‐１Ｈシクロペンタ［ａ］フェナントレン‐３‐イルオキシカルボニルアミノ］‐ヘキサノイル｝‐ピロリジン‐３‐イル）エステル ＡＨ
Figure 2013510161
 ＡＨ
化合物ＡＧ（１．０ｇ、１．０５ｍｍｏｌ）を無水コハク酸（０．１５０ｇ、１．５ｍｍｏｌ）及びＤＭＡＰ（０．０７３ｇ、０．６ｍｍｏｌ）と混合し、減圧下で４０℃で一晩乾燥した。混合物を無水ジクロロメタン（３ｍＬ）に溶解し、トリエチルアミン（０．３１８ｇ、０．４４０ｍＬ、３．１５ｍｍｏｌ）を加え、溶液をアルゴン雰囲気下、室温で１６時間撹拌した。次に、ジクロロメタン（４０ｍＬ）で希釈し、氷冷クエン酸水溶液（５重量％、３０ｍＬ）及び水（２×２０ｍＬ）で洗浄した。有機相を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、濃縮乾固した。残渣は、次の工程でそのまま用いた。
コレステロール誘導体化ＣＰＧ ＡＩ
Figure 2013510161
 ＡＩ
コハク酸エステルＡＨ（０．２５４ｇ、０．２４２ｍｍｏｌ）をジクロロメタン／アセトニトリル（３：２、３ｍＬ）の混合物に溶解した。その溶液にアセトニトリル（１．２５ｍＬ）中のＤＭＡＰ（０．０２９６ｇ、０．２４２ｍｍｏｌ）、アセトニトリル／ジクロロエタン（３：１、１．２５ｍＬ）中の２，２’‐ジチオ‐ビス（５‐ニトロピリジン）（０．０７５ｇ、０．２４２ｍｍｏｌ）を逐次加えた。得られた溶液にアセトニトリル（０．６ｍＬ）中のトリフェニルホスフィン（０．０６４ｇ、０．２４２ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物は明橙色に変わった。溶液をリストアクション撹拌機を用いて短時間（５分間）撹拌した。長鎖アルキルアミン‐ＣＰＧ（ＬＣＡＡ‐ＣＰＧ）（１．５ｇ、６１ｍＭ）を加えた。懸濁液を２時間撹拌した。ＣＰＧをガラスフィルターを通してろ過し、アセトニトリル、ジクロロメタン及びエーテルで逐次洗浄した。未反応のアミノ基を無水酢酸／ピリジンを用いてマスクした。達成したＣＰＧのローディングをＵＶ測定により調べた（３７ｍＭ／ｇ）。
５’‐１２‐ドデカン酸ビスデシルアミド基（本明細書において「５’‐Ｃ３２‐」と呼ぶ）又は５’‐コレステリル誘導体基（本明細書において「５’‐Ｃｈｏｌ‐」と呼ぶ）を有するｓｉＲＮＡの合成を、コレステリル誘導体に関して、酸化工程を核酸オリゴマーの５’‐末端にホスホロチオエート連結を導入するためにビューケージ（Ｂｅａｕｃａｇｅ）試薬を用いて実施した以外は、国際公開第２００４／０６５６０１号に記載のとおりに実施した。
核酸配列を、標準の命名法、及び具体的には表１の略称を使って以下に示す。






Figure 2013510161
実施例２Ａ．
ＴＴＲ ｓｉＲＮＡの設計
転写物
ｓｉＲＮＡ設計をヒト（記号ＴＴＲ）及びラット（記号Ｔｔｒ）のトランスサイレチン遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡを特定するために実施した。設計には、ＮＣＢＩ Ｒｅｆｓｅｑ ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎからＴＴＲ転写物であるＮＭ＿０００３７１．２（配列番号：１３２９）（ヒト）及びＮＭ＿０１２６８１．１（配列番号：１３３０）（ラット）を使用した。それらの対応するＴＴＲ遺伝子に対して１００％の同一性をもつｓｉＲＮＡ二本鎖を設計した。ｓｉＲＮＡの設計及び特異性の予測
すべての候補１９ヌクレオチドの予測される特異性を各々の配列について決定した。ＴＴＲ ｓｉＲＮＡを、ＦＡＳＴＡアルゴリズムを使ってヒト及びラットトランスクリプトーム（ＮＣＢＩ Ｒｅｆｓｅｑセット内のＮＭ＿及びＸＭ＿レコードのセットとして定義される）に対する包括的検索に使用した。次に、パイソンスクリプト（Ｐｙｔｈｏｎ ｓｃｒｉｐｔ）「ｏｆｆｔａｒｇｅｔＦａｓｔａ．ｐｙ」を使用して、アライメントを解析し、ｓｉＲＮＡとあらゆる可能性のある「オフターゲット」転写物の間のミスマッチの位置及び数に基づいてスコアを出した。オフターゲットスコアを重み付けし、分子の５’末端部から２〜９位にある、ｓｉＲＮＡの「シード（ｓｅｅｄ）」領域における違いに重点をおく。オフターゲットスコアを以下のように算出する：オリゴと転写物の間のミスマッチにペナルティを与える。オリゴの２〜９位にあるシード領域におけるミスマッチには２．８のペナルティを与え；推定切断部位１０及び１１におけるミスマッチには１．２のペナルティ、並びに１２〜１９位におけるミスマッチには１のペナルティを与える。１位におけるミスマッチは考慮しない。次に、ミスマッチペナルティを合計することにより各オリゴ‐転写物対についてのオフターゲットスコアを算出する。次いで、すべてのオリゴ‐転写物対から最も低いオフターゲットスコアを決定し、オリゴのその後の分類に使用する。両方のｓｉＲＮＡ鎖を算出したスコアに従って特異性の範疇に割り当てた：３を超えるスコアは高度に特異的として適格とし、３に等しいスコアは特異的として、及び２．２〜２．８のスコアは、中程度に特異的とした。合成すべきオリゴを選択するにあたり、アンチセンス鎖のオフターゲットスコアを高いものから低いものへ分類し、ヒトから最良（最も低いオフターゲットスコア）の１４４のオリゴ対を、ラットから最良の２６対を選択した。
ｓｉＲＮＡ配列の選択
ｓｉＲＮＡオリゴに由来する、合計１４０のセンス鎖及び１４０のアンチセンス鎖のヒトＴＴＲを合成し、二本鎖に形成した。ｓｉＲＮＡオリゴに由来する、合計２６のセンス鎖及び２６のアンチセンス鎖のヒトＴＴＲを合成し、二本鎖に形成した。オリゴを含む二本鎖を表２〜４（ヒトＴＴＲ）及び表５〜７（ラットＴＴＲ）に示す。
































Figure 2013510161
Figure 2013510161
Figure 2013510161
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Figure 2013510161


































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Figure 2013510161
ＴＴＲ配列の合成
ＴＴＲ配列をＭｅｒＭａｄｅ１９２合成装置で１μｍｏｌスケールにて合成した。表にあるすべての配列について、以下に詳しく述べるように「エンドライト（ｅｎｄｏｌｉｇｈｔ）」化学を適用した。
● センス鎖にあるすべてのピリミジン（シトシン及びウリジン）を対応する２’‐Ｏ‐メチル塩基（２’‐Ｏ‐メチルＣ及び２’‐Ｏ‐メチルＵ）に置き換えた。
● アンチセンス鎖において、リボＡヌクレオシドに（５’位方向に）隣接したピリミジンをそれらの対応する２‐Ｏ‐メチルヌクレオシドに置き換えた。
● センス及びアンチセンスの配列双方の３’末端に２塩基ｄＴｄＴ伸長を導入した。
● 配列ファイルをテキストファイルに変換し、ＭｅｒＭａｄｅ１９２合成ソフトウエアへの搭載に適合させた。
ＴＴＲ配列の合成は、ホスホラミダイト化学を用いた固相担持オリゴヌクレオチド合成を使用した。上記の配列の合成を、９６ウェルプレートで１ｕｍスケールで実施した。アミダイト溶液を０．１Ｍ濃度に調製し、エチルチオテトラゾール（アセトニトリル中０．６Ｍ）を活性剤として使用した。
合成した配列を、第１工程ではメチルアミンを、第２工程ではトリエチルアミン三フッ化水素を使って、９６ウェルプレートで切断及び脱保護した。こうして得られた粗配列を、アセトン：エタノール混合物を使って沈殿させ、沈殿物を０．５Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液に再懸濁した。各配列からのサンプルは、ＬＣ‐ＭＳにて分析し、得られた質量分析データにより配列の同一性を確認した。また、試料の選ばれたセットをＩＥＸクロマトグラフィーにて分析した。
プロセスの次の工程は精製であった。すべての配列を、Ｓｏｕｒｃｅ１５Ｑカラムを使ってＡＫＴＡ ｅｘｐｌｏｒｅｒ精製システムで精製した。全長配列に対応する単一ピークを溶出液に集め、続いてイオン交換クロマトグラフィーにて純度を分析した。
精製した配列を、ＡＫＴＡ精製器を使ってＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ２５カラムで脱塩した。脱塩したＴＴＲ配列を、濃度及び純度について分析した。次に、一本鎖をアニーリングしてＴＴＲ‐ｄｓＲＮＡを形成した。
実施例２Ｂ：ｍＲＮＡ抑制に関するＴＴＲ ｓｉＲＮＡのインビトロスクリーニング
ヒトＴＴＲｄｓＲＮＡ（表２）を、ＨｅｐＧ２及びＨｅｐ３Ｂ細胞における内在性ＴＴＲ発現の阻害について、ＴＴＲのｍＲＮＡの定量のためにｑＰＣＲ（リアルタイムＰＣＲ）及びｂＤＮＡ（分枝鎖ＤＮＡ）分析を使ってアッセイした。げっ歯類ＴＴＲを標的とするｄｓＲＮＡ（表５）を合成し、ｂＤＮＡ分析を使って内在性ＴＴＲ発現の阻害について、Ｈ．４．ＩＩ．Ｅ細胞でアッセイした。単回投与分析の結果を使用して、投与量応答実験のためのＴＴＲ ｄｓＲＮＡ二本鎖のサブセットを選択し、ＩＣ５０ｓを計算した。ＩＣ５０の結果を使用して、さらなる試験用のＴＴＲ ｄｓＲＮＡを選択した。
細胞培養及びトランスフェクション：
肝細胞系のＨｅｐＧ２、Ｈｅｐ３Ｂ及びＨ．４．ＩＩ．Ｅ細胞（ＡＴＣＣ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）を、１０％ＦＢＳ、ストレプトマイシン、及びグルタミン（ＡＴＣＣ）を補完したダルベッコ改変イーグル培地（ＡＴＣＣ）中で３７℃にて５％ＣＯ２雰囲気下においてコンフルエント近くまで育て、トリプシン処理によってプレートから剥がした。また、Ｈ．４．ＩＩ．Ｅ細胞をイーグル最小必須培地で育てた。９６ウェルプレートの１ウェル当たり５μＬのＯｐｔｉ‐ＭＥＭを５μＬのｓｉＲＮＡ二本鎖に、１ウェル当たり１０μＬのＯｐｔｉ‐ＭＥＭと、０．２μＬのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＲＮＡｉＭａｘ（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ），Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，カタログ番号１３７７８‐１５０）と共に加えることによってリバーストランスフェクションを実施し、室温で１５分間インキュベーションした。次に、４×１０４（ＨｅｐＧ２）、２×１０４（Ｈｅｐ３Ｂ）又は２×１０４（Ｈ．４．ＩＩ．Ｅ）細胞を含んだ、８０μＬの抗生物質を含まない完全成長培地を加えた。細胞を２４時間培養して、ＲＮＡを精製した。単回投与実験を１０ｎＭの最終二本鎖濃度で実施し、投与量応答実験を１０、１、０．５、０．１，０．０５、０．０１、０．００５、０．００１、０．０００５、０．０００１、０．００００５、０．００００１ｎＭで行った。
ＭａｇＭＡＸ‐９６全ＲＮＡ単離キット（アプライド・バイオシステムズ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ，部品番号：ＡＭ１８３０）を使った全ＲＮＡ単離：
細胞を採集し、１４０μＬの溶解／結合溶液で溶解し、次に、エッペンドルフ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）サーモミキサーを使って１分間８５０ｒｐｍで混合した（混合速度をプロセス全体を通して同一とした）。２０マイクロリットルの磁気ビーズを細胞溶解物に加え、５分間混合した。磁気ビーズを磁気スタンドを使って捕獲し、ビーズを乱すことなく上清を取り除いた。上清を取り除いた後、磁気ビーズを（イソプロパノールを加えた）洗浄溶液１で洗浄し、１分間混合した。ビーズを再度捕獲し、上清を取り除いた。次に、磁気ビーズを１５０μＬの（エタノールを加えた）洗浄溶液２で洗浄、捕獲し、上清を取り除いた。次いで、５０μＬのデオキシリボヌクレアーゼ混合物（ＭａｇＭａｘ ｔｕｒｂｏデオキシリボヌクレアーゼバッファー及びＴｕｒｂｏデオキシリボヌクレアーゼ）をビーズに加えて、それらを１０〜１５分間混合した。混合後、１００μＬのＲＮＡ再結合溶液を加え、３分間混合した。上清を取り除き、磁気ビーズを１５０μＬの洗浄溶液２で再度洗浄して、１分間混合し、上清を完全に取り除いた。磁気ビーズを２分間混合して乾燥し、ＲＮＡを５０μＬの水で溶出した。
ＡＢＩ高性能ｃＤＮＡ逆転写キット（アプライド・バイオシステムズ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ，カタログ番号４３６８８１３）を使ったｃＤＮＡ合成：
１反応当たり２μＬの１０×バッファー、０．８μＬの２５×ｄＮＴＰ、２μＬのランダムプライマー、１μＬの逆転写酵素、１μＬのＲＮａｓｅ阻害剤、及び３．２μＬのＨ２Ｏのマスターミックスを１０μＬの全ＲＮＡに加えた。ｃＤＮＡをバイオ・ラッド（Ｂｉｏ‐Ｒａｄ）Ｃ‐１０００又はＳ‐１０００サーマルサイクラー（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）を使い、次のステップを通じて生成した：２５℃で１０分、３７℃で１２０分、８５℃で５秒、４℃で保持。
リアルタイムＰＣＲ：
ＭｉｃｒｏＡｍｐ Ｏｐｔｉｃａｌ ９６ウェルプレート（アプライド・バイオシステムズ カタログ番号４３２６６５９）で、１ウェル当たり２μＬのｃＤＮＡを１μＬの１８Ｓ ＴａｑＭａｎプローブ（アプライド・バイオシステムズ カタログ番号４３１９４１３Ｅ）、１μＬのＴＴＲ ＴａｑＭａｎプローブ（アプライド・バイオシステムズ カタログ番号ＨＳ００１７４９１４ Ｍ１）及び１０μＬのＴａｑＭａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＰＣＲマスターミックス（アプライドバイオシステムズ カタログ番号４３２４０１８）のマスターミックスに加えた。ＡＢＩ ７０００ Ｐｒｉｓｍ又はＡＢＩ ７９００ＨＴリアルタイムＰＣＲシステム（アプライド・バイオシステムズ）でΔΔＣｔ（ＲＱ）アッセイを使ってリアルタイムＰＣＲを行った。反応はすべて３連で行った。
リアルタイムデータを、ΔΔＣｔ法を使って分析し、１０ｎＭ ＢｌｏｃｋＩＴ蛍光オリゴ（インビトロジェン カタログ番号２０１３）又は１０ｎＭ ＡＤ‐１９５５（非哺乳類ルシフェラーゼ遺伝子を標的とする対照二本鎖）でトランスフェクションした細胞で行ったアッセイに対して正規化し、何倍変化したかを計算した。
分岐ＤＮＡアッセイ‐ＱｕａｎｔｉＧｅｎｅ １．０（Ｐａｎｏｍｉｃｓ，Ｆｒｅｍｏｎｔ，ＣＡ カタログ番号：ＱＧ０００４）‐げっ歯類特異的二本鎖のスクリーニングに使用
Ｈ．４．ＩＩ．Ｅ細胞（ＡＴＣＣ）を、１０ｎＭｓｉＲＮＡでトランスフェクションした。培地を取り除いた後、Ｈ．４．ＩＩ．Ｅ を１００ｕＬの希釈した溶解混合物（１容積の溶解混合物、２容積のヌクレアーゼを含まない水及び最終濃度の２０ｍｇ／ｍＬ１ｍＬにための当たり１０ｕＬのプロテイナーゼ‐Ｋの混合物）に溶解し、次に６５℃にて３５分間インキュベーションした。次いて、８０μＬのワーキングプローブセット（ＴＴＲ又はＧＡＰＤＨプローブの混合物）及び２０ｕＬの細胞溶解物をキャプチャープレート（Ｃａｐｔｕｒｅ Ｐｌａｔｅ）に加えた。キャプチャープレートを５３℃±１℃で一晩（約１６〜２０時間）インキュベーションした。キャプチャープレートを、１×洗浄バッファー（ヌクレアーゼを含まない水、バッファーコンポーネント（Ｂｕｆｆｅｒ Ｃｏｍｐｏｎｅｔ）１及び洗浄バッファーコンポーネント（Ｗａｓｈ Ｂｕｆｆｅｒ Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ）２の混合物）で３回洗浄し、次に１分間１０００ｒｐｍでの遠心分離により乾燥した。１００μＬのＡｍｐｌｉｆｉｅｒワーキング試薬（Ｗｏｒｋｉｎｇ Ｒｅａｇｅｎｔ）をキャプチャープレートに加え、次いで、密閉して４６℃±１℃で１時間インキュベーションした。１時間のインキュベーション後、洗浄及び乾燥工程を繰り返し、１００μＬのラベル溶液試薬（Ｌａｂｅｌ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ）を加えた。次に、プレートを洗浄、乾燥し、１００μＬの基質（ラウリル硫酸リチウム及び基質溶液の混合物）を加えた。キャプチャープレートを４６℃±１℃でインキュベーターに置いた。次に、キャプチャープレートをインキュベーターから取り出し、室温で３０分間インキュベーションした。最後に、Ｖｉｃｔｏｒルミノメーター（パーキンエルマー（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ），Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）を使って、キャプチャープレートを読み取った。
分岐ＤＮＡアッセイ‐ＱｕａｎｔｉＧｅｎｅ２．０（Ｐａｎｏｍｉｃｓ カタログ番号：ＱＳ００１１）：その他すべての二本鎖のスクリーニングに使用
提示された１又は複数の投与量で２４時間インキュベーションした後、培地を取り除き、細胞を１００ｕＬの溶解混合物（１容積の溶解混合物、２容積のヌクレアーゼを含まない水及び最終濃度の２０ｍｇ／ｍＬのための１ｍＬ当たり１０ｕＬのプロテイナーゼ‐Ｋの混合物）に溶解し、次に６５℃にて３５分間インキュベーションした。次に、２０μＬのワーキングプローブセット（Ｗｏｒｋｉｎｇ Ｐｒｏｂｅ Ｓｅｔ）（遺伝子標的用にＴＴＲ及び内在対照用にＧＡＰＤＨプローブ）及び８０ｕＬの細胞溶解物をキャプチャープレートに加えた。キャプチャープレートを５５℃±１℃でインキュベーションした（約１６〜２０時間）。翌日、キャプチャープレートを、１×洗浄緩衝液（ヌクレアーゼを含まない水、バッファーコンポーネント１及び洗浄バッファーコンポーネント２）で３回洗浄し、次に１分間２４０ｇでの遠心分離により乾燥した。１００μＬのｐｒｅ‐Ａｍｐｌｉｆｉｅｒワーキング試薬をキャプチャープレートに加え、次いで、アルミホイルで密閉して５５℃±１℃で１時間インキュベーションした。１時間のインキュベーションに続いて、洗浄工程を繰り返し、次に１００μＬのＡｍｐｌｉｆｉｅｒワーキング試薬を加えた。１時間後、洗浄及び乾燥工程を繰り返し、１００μＬのラベルプローブ（Ｌａｂｅｌ Ｐｒｏｂｅ）を加えた。キャプチャープレートを５０℃±１℃で１時間インキュベーションした。次にプレートを１×洗浄バッファーで洗浄、乾燥し、次いで１００μＬの基質をキャプチャープレートに加えた。５〜１５分のインキュベーションに続いて、キャプチャープレートをＳｐｅｃｔｒａＭａｘルミノメーター（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）を使って読んだ。
ｂＤＮＡデータ分析：
ｂＤＮＡデータを、（ｉ）各３連サンプルから平均バックグラウンドを引くこと、（ｉｉ）得られた３連ＧＡＰＤＨ（対照プローブ）及びＴＴＲ（実験プローブ）値を平均すること、及び次に（ｉｉｉ）比：（実験プローブ−バックグラウンド）／（対照プローブ−バックグラウンド）をとることにより分析した。
結果
ＴＴＲ‐ｄｓＲＮＡ（ＴＴＲ ｓｉＲＮＡ）の単回投与及びＩＣ５０結果のまとめを下記の表８に示す。単回投与の結果は、ＨｅｐＧ２細胞でアッセイした対照に対するＴＴＲのｍＲＮＡの割合（％）として表わす。示されているように、ＨｅｐＧ２及び／又はＨｅｐ３Ｂ細胞で、ＩＣ５０をもとめた。
























Figure 2013510161




Figure 2013510161




Figure 2013510161




Figure 2013510161
５つのＴＴＲ−ｄｓＲＮＡ（ＡＤ−１８２５８、ＡＤ−１８２７４、ＡＤ−１８３２４、ＡＤ−１８３２８、及びＡＤ−１８３３９）のＩＣ５０を特定するために使用した投与量応答データを下の表９に詳細に示す。５つのｓｉＲＮＡすべてはｐＭのＩＣ５０を有することがもとめられた。表８のｄｓＲＮＡのＩＣ５０データは下の表９に提示されたデータのまとめである。












Figure 2013510161
げっ歯類特異的ＴＴＲ‐ｄｓＲＮＡ（ＴＴＲ ｓｉＲＮＡ）の単回投与の結果のまとめを下の表１０に示す。単回投与の結果は、げっ歯類特異的ＴＴＲｓｉＲＮＡを１０ｎＭでトランスフェクションした後、ラットＨ．４．ＩＩ．Ｅ細胞でアッセイした対照に対しするＴＴＲのｍＲＮＡの割合（％）として表す。これらの結果は、幾つかのげっ歯類特異的ＴＴＲは内在性ラットＴＴＲのｍＲＮＡのインビトロでの抑制に効果的であることを示す。
Figure 2013510161
実施例３．ＴＴＲ ｓｉＲＮＡのＴＮＦ‐α及びＩＦＮ‐α分泌の誘導に関するインビトロアッセイ
免疫刺激の効力を評価するために、ＴＴＲ ｓｉＲＮＡをＴＮＦ‐α及びＩＦＮ‐α分泌の誘導についてインビトロでアッセイした。
標準的なＦｉｃｏｌｌ‐Ｈｙｐａｑｕｅ密度遠心分離により、ヒトＰＢＭＣを、健康なドナーから入手した、採取したばかりの軟膜から単離した（Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｂｌｏｏｄ Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ，Ｉｎｃ．，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）。単離したばかりの細胞（１×１０５／ウェル／１００μＬ）を９６ウェルプレートに播種し、１０％加熱不活性化ウシ胎児血清及び１％抗生物質／抗真菌剤（インビトロジェン）で補完したＲＰＭＩ １６４０ ＧｌｕｔａＭａｘ培地（インビトロジェン）中で培養した。ｓｉＲＮＡをＤＯＴＡＰトランスフェクション試薬（ロシュ・アプライド・サイエンス（Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ））を使ってＰＢＭＣにトランスフェクションした。最初にＤＯＴＡＰをＯｐｔｉ‐ＭＥＭ（インビトロジェン）で希釈し、５分間後、ｓｉＲＮＡのを含む等量のＯｐｔｉ‐ＭＥＭと混合した。
ｓｉＲＮＡ／ＤＯＴＡＰ複合体を、製造業者の取り扱い説明書に明記の通りインキュベーションし、続いてＰＢＭＣ（５０μＬ／ウェル）に加え、次いで２４時間培養した。陽性及び陰性対照ｓｉＲＮＡをすべてのアッセイに含めた。ＡＤ‐５０４８を陽性対照ｓｉＲＮＡとして使用した。ＡＤ‐５０４８はヒトアポリポタンパク質Ｂを標的とする配列に対応し（Ｓｏｕｔｓｃｈｅｋ ｅｔ ａｌ．，２００４）、このアッセイで、ＩＦＮ‐α及びＴＮＦ‐α両方の分泌を誘導する。このアッセイでＩＦＮ‐α及びＴＮＦ‐α分泌を引き起こさないＡＤ‐１９５５を陰性対照ｓｉＲＮＡとして使用した。ｓｉＲＮＡはすべて、１３３ｎＭの最終濃度にて使用した。ＲＮＡのトランスフェクション試薬に対する割合は、１μｇのＤＯＴＡＰ当たり１６．５ｐｍｏｌであった。
共にＢｅｎｄｅｒ ＭｅｄＳｙｓｔｅｍｓ（Ｖｉｅｎｎａ， Ａｕｓｔｒｉａ）からのＩＦＮ‐α（ＢＭＳ２１６ＩＮＳＴ）及びＴＮＦ‐α（ＢＭＳ２２３ＩＮＳＴ）用市販ＥＬＩＳＡキットを使って、サイトカインを培養上清中で検出及び定量した。ＴＴＲ ｓｉＲＮＡサイトカイン誘導は、陽性対照ｓｉＲＮＡ ＡＤ‐５０４８に対する産生ＩＦＮ‐α又はＴＮＦ‐αの割合（％）として表わす。
多くのＴＴＲ ｓｉＲＮＡのＩＦＮ‐α及びＴＮＦ‐α刺激結果を図１（四連のウェルの平均値±ＳＤ）及び下の表１１（ＡＤ‐５０４８に対するパーセント）に示す。評価したどのＴＴＲ ｓｉＲＮＡも、培養ヒトＰＢＭＣによる顕著なＴＮＦ‐α分泌、ＩＦＮ‐α分泌を誘導しなかった。








































Figure 2013510161







Figure 2013510161
その５つから、ＴＴＲを標的とするｄｓＲＮＡ（ＴＴＲ ｓｉＲＮＡ）をヒト肝細胞系であるＨｅｐＧ２及びＨｅｐ３ＢでｐＭの範囲のＩＣ５０、及び免疫刺激活性の欠如に基づいて選択することになった。オリゴとｍＲＮＡとの間にミスマッチが全くない二本鎖のほうが、ミスマッチのある二本鎖より顕著な標的転写物のノックダウンを達成する傾向が強い。異種間の毒物学的データをよりよく解釈するため、及びヒト患者に最大限広い範囲で適用可能にするために、ラット、カニクイザル及びヒトからのオーソロガス遺伝子で１００％同一性を有し、公知の遺伝子多型のある領域を標的としない二本鎖が、一般に好ましい。その５つから、化合物を、肝細胞系でｐＭの範囲のＩＣ５０、免疫刺激活性の欠如、ヒトＴＴＲ転写物に対する特異性、及び二本鎖によって標的とされるｍＲＮＡの領域での公知の遺伝子多型（突然変異）の欠如に基づいて選択することになった。ＴＴＲの場合、１９塩基オリゴで、ヒト、ラット及びカニクイザルで完全な同一性をもつものは見いだされなかった。これらのデータのまとめを表１２に示し、その表は、二本鎖によって標的とされる領域中の公知のＴＴＲ突然変異及び異種間の反応性に関する情報をも含む。














Figure 2013510161
実施例４．トランスジェニックマウスにおけるＬＮＰ０１‐１８３２４、ＬＮＰ０１‐１８３２８及びＬＮＰ０１‐１８２４６による肝臓ＴＴＲのｍＲＮＡ及び血漿ＴＴＲタンパク質の生体内減少
２つのＴＴＲ ｓｉＲＮＡ、ＡＤ‐１８３２４及びＡＤ‐１８３２８を生体内評価のために選択した。これらの二本鎖は、肝細胞系（例えばＨｅｐＧ２）でインビトロにおける投与量依存的な強いサイレンシングを示した。図２Ａ及び図２Ｂは、ＨｅｐＧ２細胞におけるＡＤ‐１８３２４（図２Ａ）又はＡＤ‐１８３２８（図２Ｂ）でのトランスフェクション後の投与量応答を示し、ｘ軸は投与量をｎＭで表わし、ｙ軸は応答を対照に対する残存ＴＴＲのｍＲＮＡの割合として表わす。ＨｅｐＧ２細胞で、ＡＤ‐１８３２４及びＡＤ‐１８３２８のＩＣ５０をもとめ、それぞれ２ｐＭ及び３ｐＭであった。両方のＴＴＲ標的部位から、ｄｓＲＮＡ候補はＴＴＲのｍＲＮＡの３’非翻訳領域にあることになり、その領域には文献で報告されている突然変異は存在しない。
２つの各鎖の配列から、候補を下の表から再作製することになった。鎖：ｓ＝センス鎖；ａｓ＝アンチセンス鎖；位置：転写物（ＮＭ＿０００３７１．２）上の５’塩基の位置




Figure 2013510161
くわえて、げっ歯類交差反応性のＴＴＲ ｄｓＲＮＡであるＡＤ‐１８２４６をさらなる生体内評価のために選択した。ＡＤ‐１８２４６は、オープンリーディングフレームの８８位にて始まる配列で、文献で報告されている３つの突然変異が存在する配列を標的とする。ＨｅｐＧ２細胞におけるＡＤ‐１８２４６の投与量応答曲線を図３に示す。ＡＤ‐１８２４６は、実質的にＡＤ‐１８３２４及びＡＤ‐１８３２８より弱く；ＡＤ‐１８２４６のＩＣ５０をもとめ、２６５ｐＭであった。
ＡＤ‐１８３２４、ＡＤ‐１８３２８、及びＡＤ‐１８２４６を、ＬＮＰ０１に製剤化後、トランスジェニックマウスに投与した。３〜５月齢のＨ１２９‐ｍＴＴＲ‐ＫＯ／ｉＮＯＳ‐ＫＯ／ｈＴＴＲトランスジェニックマウス（マウストランスサイレチンのノックアウト／誘導可能な一酸化窒素合成酵素のノックアウト／ヒトトランスサイレチントランスジェニック）に、２００μＬのＬＮＰ０１に製剤化したトランスサイレチン特異的ｓｉＲＮＡ（ＡＤ‐１８３２４、ＡＤ‐１８３２８、又はＡＤ‐１８２４６）、ＬＮＰ０１に製剤化した非哺乳類のルシフェラーゼ遺伝子を標的とする（ＡＤ‐１９５５）並びにリン酸緩衝食塩水を、ｓｉＲＮＡｓＡＤ‐１８３２４及びＡＤ‐１８３２８については１．０ｍｇ／ｋｇ、３．０ｍｇ／ｋｇ、又は６．０ｍｇ／ｋｇの濃度で、ｓｉＲＮＡＡＤ‐１８２４６については３．０ｍｇ／ｋｇ、並びにｓｉＲＮＡＡＤ‐１９５５については６．０ｍｇ／ｋｇの濃度で、尾部静脈を経て静脈内（ＩＶ）投与した。ＬＮＰ０１はＮＤ９８、コレステロール、及びＰＥＧ‐セラミドＣ１６を含むリピオイド製剤である。
約４０時間後、マウスに２００μＬのケタミンで麻酔をかけ、次に右尾動脈を切って血液を抜いた。全血液を分離して、血漿を分離し、アッセイまで−８０℃で保存した。肝組織を採集し、急速冷凍して、処理するまで−８０℃で保存した。
治療の有効性は、（ｉ）投与後４８時間での肝臓におけるＴＴＲのｍＲＮＡの測定、並びに（ｉｉ）採血前及び投与後４８時間での血漿におけるＴＴＲタンパク質の測定により評価した。ＴＴＲ肝臓ｍＲＮＡレベルを分岐ＤＮＡアッセイ‐ＱｕａｎｔｉＧｅｎｅ ２．０（Ｐａｎｏｍｉｃｓ カタログ番号：ＱＳ００１１）を利用してアッセイした。簡潔に言うと、マウス肝臓試料を破砕し、組織溶解物を調製した。肝臓溶解混合物（１容積の溶解混合物、２容積のヌクレアーゼを含まない水及び最終濃度の２０ｍｇ／ｍＬのための１ｍＬ当たり１０ｕＬのプロテイナーゼ‐Ｋの混合物）を６５℃にて３５分間インキュベーションした。次に、２０μＬのワーキングプローブセット（遺伝子標的用にＴＴＲ及び内在対照用にＧＡＰＤＨプローブ）及び８０ｕＬの細胞溶解物をキャプチャープレートに加えた。キャプチャープレートを５５℃±１℃で約１６〜２０時間インキュベーションした。翌日、キャプチャープレートを、１×洗浄緩衝液（ヌクレアーゼを含まない水、バッファーコンポーネント１及び洗浄バッファーコンポーネント２）で３回洗浄し、次に１分間２４０ｇでの遠心分離により乾燥した。１００μＬのｐｒｅ‐Ａｍｐｌｉｆｉｅｒワーキング試薬をキャプチャープレートに加え、次いで、アルミホイルで密閉して５５℃±１℃で１時間インキュベーションした。１時間のインキュベーションに続いて、洗浄工程を繰り返し、次に１００μＬのＡｍｐｌｉｆｉｅｒワーキング試薬を加えた。１時間後、洗浄及び乾燥工程を繰り返し、１００μＬのラベルプローブを加えた。キャプチャープレートを５０℃±１℃で１時間インキュベーションした。次にプレートを１×洗浄バッファーで洗浄、乾燥し、次いで１００μＬの基質をキャプチャープレートに加えた。５〜１５分のインキュベーションに続いて、キャプチャープレートをＳｐｅｃｔｒａＭａｘルミノメーターを使って読んだ。ｂＤＮＡデータを、（ｉ）各３連サンプルから平均バックグラウンドを引くこと、（ｉｉ）得られた３連ＧＡＰＤＨ（対照プローブ）及びＴＴＲ（実験プローブ）値を平均すること、及び次に（ｉｉｉ）比：（実験プローブ−バックグラウンド）／（対照プローブ−バックグラウンド）を計算することにより分析した。
ＴＴＲ血漿レベルを市販のキットである「ＡｓｓａｙＭａｘヒトプレアルブミンＥＬＩＳＡキット」（ＡｓｓａｙＰｒｏ，Ｓｔ．Ｃｈａｒｌｅｓ，ＭＯ，カタログ番号ＥＰ３０１０‐１）を利用して、製造業者のガイドラインに従ってアッセイした。簡潔に言うと、マウス血漿を１×ミックス（ｍｉｘ）希釈剤で１：１０，０００に希釈し、キットの標準試料とともに予め被覆されたプレートに加え、室温で２時間インキュベーションした後、キットの洗浄バッファーで５回洗浄した。５０マイクロリットルのビオチン化プレアルブミン抗体を各ウェルに加え、室温で１時間インキュベーションし、洗浄バッファーで５回洗浄した。５０マイクロリットルのストレプトアビジン‐ペルオキシダーゼ複合体を各ウェルに加え、プレートを室温で３０分間インキュベーションし、続いて上記のように洗浄した。反応を５０μＬ／ウェルの色原体基質を加えることで顕色させ、室温で１０分間インキュベーションし、５０μＬ／ウェルの停止溶液を加えることで反応を停止した。４５０ｎｍでの吸光度をＶｅｒｓａｍａｘマイクロプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）で読み、データをＳｏｆｔｍａｘ４．６ソフトウエアパッケージ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）を利用して分析した。
ＬＮＰ０１‐１８３２４及びＬＮＰ０１‐１８３２８は、肝臓ＴＴＲｍＲＮＡ（図４Ａ）及び血漿ＴＴＲタンパク質（図４Ｂ）レベルをＩＶボーラス投与で投与量依存的に減少させることが見いだされた。ＬＮＰ０１‐１８３２８のｍＲＮＡ ＥＤ５０をもとめ、〜１ｍｇ／ｋｇであった一方、ＬＮＰ０１‐１８３２４のｍＲＮＡ ＥＤ５０をもとめ、〜２ｍｇ／ｋｇであった。対照であるＬＮＰ０１‐１９５５は６ｍｇ／ｋｇでも、リン酸緩衝食塩水群と比較して、肝臓ＴＴＲのｍＲＮＡレベルに著しく影響を及ぼさなかったため、ＬＮＰ０１‐１８３２４及びＬＮＰ０１‐１８３２８の効果は特異的であった。ＬＮＰ０１‐１８３２４及びＬＮＰ０１‐１８３２８は、リン酸緩衝食塩水群と比較して、血漿ＴＴＲタンパク質レベルを、ＴＴＲのｍＲＮＡレベルへの効力に類似した効力で減少させた。３ｍｇ／ｋｇで、ＬＮＰ０１‐１８２４６は、肝臓ＴＴＲのｍＲＮＡレベルを、３ｍｇ／ｋｇのＬＮＰ０１‐１８３２４又はＬＮＰ０１‐１８３２８より少ない程度まで減少させた。
これらの結果は、ＬＮＰ０１‐１８３２４及びＬＮＰ０１‐１８３２８は、ＩＶボーラス投与により投与した場合、トランスジェニックマウスの肝臓に発現するヒトＴＴＲのｍＲＮＡを実質的に減少させ、結果として循環血液中においてヒトＴＴＲタンパク質の減少をもたらすことを示す。
実施例５．非ヒト霊長類の肝臓におけるＳＮＡＬＰ‐１８３２４及びＳＮＡＬＰ‐１８３２８による野生型ＴＴＲのｍＲＮＡの生体内減少
ＴＴＲ ｓｉＲＮＡ ＡＤ‐１８３２４及びＡＤ‐１８３２８の非ヒト霊長類における肝臓ＴＴＲのｍＲＮＡレベルへの有効性を評価するために、ｓｉＲＮＡｓをＳＮＡＬＰに製剤化し、１５分間静脈内注入により投与した。カニクイザル（Ｍａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）（２〜５ｋｇ、１群当たり３匹の動物）に、ＳＮＡＬＰ‐１８３２４（０．３、１．０又は３．０ｍｇ／ｋｇ）、ＳＮＡＬＰ‐１８３２８（０．３、１又は３ｍｇ／ｋｇ）、若しくはＳＮＡＬＰ‐１９５５（３ｍｇ／ｋｇ、非哺乳類の遺伝子ルシフェラーゼを標的とする陰性対照ｓｉＲＮＡであるＡＤ‐１９５５を含む）を１５分間静脈内注入投与した。投与後４８時間に、サルをペントバルビタールナトリウムで麻酔をかけ、血液を抜いた。ＴＴＲのｍＲＮＡ測定のための肝組織を採集し、急速冷凍して、処理するまで−８０℃で保存した。
肝臓におけるＴＴＲのｍＲＮＡレベルを、特注設計の分岐ＤＮＡアッセイ、ＱｕａｎｔｉＧｅｎｅ１．０ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙを利用してアッセイした。簡潔に言うと、サル肝臓試料を破砕し、組織溶解物を調製した。肝臓溶解混合物（１容積の溶解混合物、２容積のヌクレアーゼを含まない水及び最終濃度の２０ｍｇ／ｍＬのための１ｍＬ当たり１０μＬのプロテイナーゼ‐Ｋ）を６５℃にて３５分間インキュベーションした。次に、２０μＬのワーキングプローブセット（遺伝子標的用にＴＴＲ及び内在対照用にＧＡＰＤＨプローブ）及び８０μＬの細胞溶解物をキャプチャープレートに加えた。キャプチャープレートを５５℃±１℃でインキュベーションした（約１６〜２０時間）。翌日、キャプチャープレートを、１×洗浄緩衝液（ヌクレアーゼを含まない水、バッファーコンポーネント１及び洗浄バッファーコンポーネント２）で３回洗浄し、次に１分間２４０ｇでの遠心分離により乾燥した。１００μＬのｐｒｅ‐Ａｍｐｌｉｆｉｅｒワーキング試薬をキャプチャープレートに加え、次いで、アルミホイルで密閉して５５℃±１℃で１時間インキュベーションした。１時間のインキュベーションに続いて、洗浄工程を繰り返し、次に１００μＬのＡｍｐｌｉｆｉｅｒワーキング試薬を加えた。１時間後、洗浄及び乾燥工程を繰り返し、１００μＬのラベルプローブを加えた。キャプチャープレートを５０℃±１℃で１時間インキュベーションした。次にプレートを１×洗浄バッファーで洗浄、乾燥し、次いで１００μＬの基質をキャプチャープレートに加えた。５〜１５分のインキュベーションに続いて、キャプチャープレートをＳｐｅｃｔｒａＭａｘルミノメーターを使って読んだ。ｂＤＮＡデータを、（ｉ）各３連サンプルから平均バックグラウンドを引くこと、（ｉｉ）得られたＧＡＰＤＨ（対照プローブ）及びＴＴＲ（実験プローブ）値を平均すること、及び次に（ｉｉｉ）比：（実験プローブ−バックグラウンド）／（対照プローブ−バックグラウンド）をとることにより分析した。
結果を図５に示す。ＳＮＡＬＰ‐１８３２４及びＳＮＡＬＰ‐１８３２８は、陰性対照ＳＮＡＬＰ‐１９５５と比較して肝臓におけるＴＴＲｍＲＮＡレベルを投与量依存的に減少させた。ＳＮＡＬＰ‐１８３２８及びＳＮＡＬＰ‐１８３２４のｍＲＮＡ ＥＤ５０をもとめ、それぞれ〜０．３及び〜１ｍｇ／ｋｇであった。
これらの結果は、ＳＮＡＬＰ‐１８３２４及びＳＮＡＬＰ‐１８３２８は、ＩＶ注入により投与した場合、非ヒト霊長類の肝臓において野生型ＴＴＲのｍＲＮＡを抑制するのに効果的であることを示す。
実施例６
トランスジェニックマウスにおけるＳＮＡＬＰ‐１８３２８による変異（Ｖ３０Ｍ）ＴＴＲのｍＲＮＡ及びタンパク質の生体内減少
ＴＴＲのｓｉＲＮＡ ＡＤ‐１８３２８の、肝臓中の変異（Ｖ３０Ｍ）ＴＴＲのｍＲＮＡ及び血清中の変異（Ｖ３０Ｍ）ＴＴＲタンパク質への有効性を評価するために、ＡＤ‐１８３２８を、ＳＮＡＬＰに製剤化し、Ｖ３０Ｍ ｈＴＴＲトランスジェニックマウスに、ＩＶボーラスにより投与した。８〜１２週齢のＶ３０Ｍ ｈＴＴＲトランスジェニックマウス（５匹の動物／群）に、２００μＬのＳＮＡＬＰ‐１８３２８（０．０３、０．３、若しくは３ｍｇ／ｋｇ）、ＳＮＡＬＰ‐１９５５（３ｍｇ／ｋｇ、非哺乳類動物のルシフェラーゼ遺伝子を標的とする陰性対照ｓｉＲＮＡ ＡＤ‐１９５５を含む）、又はＰＢＳを静脈内（ＩＶ）投与した。使用したマウスは、Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｐｏｒｔｏ，ＰｏｒｔｕｇａｌからのＭｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ株Ｈ１２９‐ｈＴＴＲ ＫＯであった。簡潔に言うと、ｈＴＴＲ Ｈ１２９トランスジェニックマウスを、Ｈ１２９内在性ＴＴＲ ＫＯマウス（ヌルマウスＴＴＲのバックグラウンドにおいて、Ｈ１２９‐ｈＴＴＲトランスジェニックマウスを生成するためのヌルマウス（Ｍａｅｄａ，Ｓ．，（２００３），Ｕｓｅ ｏｆ ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ ａｌｔｅｒｅｄ ｍｉｃｅ ｔｏ ｓｔｕｄｙ ｔｈｅ ｒｏｌｅ ｏｆ ｓｅｒｕｍ ａｍｙｌｏｉｄ Ｐ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ ｉｎ ａｍｙｌｏｉｄ ｄｅｐｏｓｉｔｉｏｎ．Ａｍｙｌｏｉｄ Ｓｕｐｐｌ．１，１７‐２０．）と交配した。
注射してから４８時間後、すべての５つの治療群の動物に、致死量のケタミン／キシラジンを与えた。血清試料を採集し、分析まで−８０℃で保存した。肝組織を採集し、急速冷凍して、処理するまで−８０℃で保存した。
ＴＴＲのｍＲＮＡ定量のために、冷凍肝組織を粉末に破砕し、溶解物を調製した。分岐ＤＮＡアッセイ（ＱｕａｎｔｉＧｅｎｅ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｓｙｓｔｅｍ，Ｐａｎｏｍｉｃｓ，Ｆｒｅｍｏｎｔ，ＣＡ）を使用することにより、ＧＡＰＤＨのｍＲＮＡレベルと比較したＴＴＲのｍＲＮＡレベルを溶解物中で決定した。簡潔に言うと、製造業者の取扱説明書に従って、組織試料の溶解物中のｍＲＮＡレベルを定量化するためにＱｕａｎｔｉＧｅｎｅアッセイ（Ｇｅｎｏｓｐｅｃｔｒａ）を使用した。ＴＴＲのｍＲＮＡの平均レベルを、それぞれの試料についてＧＡＰＤＨのｍＲＮＡの平均レベルに対して正規化した。次に、正規化した値の群平均を、ＰＢＳ処理群に対する平均値に対してさらに正規化し、ＴＴＲのｍＲＮＡ発現の相対レベルを得た。
ＴＴＲタンパク質の定量化に関しては、製造業者のプロトコールに従って、ＡｓｓａｙＰｒｏ（Ｓｔ．Ｃｈａｒｌｅｓ，ＭＯ）のＡｓｓａｙｍａｘ ＰｒｅＡｌｂｕｍｉｎ ＥＬＩＳＡキットを使って血清をアッセイした。
肝臓ｍＲＮＡ及び血清タンパク質についての結果を、それぞれ、図６Ａ及び図６Ｂに示す。ＳＮＡＬＰ‐１８３２８で処置したＶ３０Ｍ ｈＴＴＲトランスジェニックマウスは、ＰＢＳ対照群と比較して、肝臓ＴＴＲのｍＲＮＡレベルにおいて、投与量依存的、かつ有意な減少があり、ＳＮＡＬＰ‐１８３２８の３ｍｇ／ｋｇで、９７％（ｐ＜０．００１）の最大減少、及びＳＮＡＬＰ‐１８３２８の〜０．１５ｍｇ／ｋｇで、５０％減少（ＥＤ５０）に達した。血清ＴＴＲタンパク質はまた、ＳＮＡＬＰ‐１８３２８の３ｍｇ／ｋｇで、（投与前のレベルと比較して）血清ＴＴＲタンパク質の９９％（ｐ＜０．０１）の最大減少を有する、投与量依存的な様式で抑制され、これは、ＴＴＲのｍＲＮＡレベルの減少と一致した。３ｍｇ／ｋｇでのＳＮＡＬＰ‐１９５５は、ＰＢＳと比較して、ＴＴＲのｍＲＮＡにもタンパク質レベルにも統計的に有意な効果はなかった。
これらの結果は、ＩＶ投与した場合、ＳＮＡＬＰ‐１８３２８はトランスジェニックマウス肝臓中の変異Ｖ３０Ｍ ＴＴＲのｍＲＮＡを抑制する活性があり、血液循環中の変異Ｖ３０Ｍ ＴＴＲタンパク質の減少をもたらすこと示す。
実施例７．トランスジェニックマウスにおけるＳＮＡＬＰ‐１８３２８によるＴＴＲのｍＲＮ及びタンパク質抑制の持続性
ＳＮＡＬＰ‐１８３２８によるＴＴＲのｍＲＮＡ及びタンパク質抑制の持続性を評価するために、ＡＤ‐１８３２８をＳＮＡＬＰに製剤化し、Ｖ３０Ｍ ｈＴＴＲトランスジェニックマウスにＩＶボーラス投与した。投与後のさまざまな時点で、肝臓ＴＴＲのｍＲＮＡレベル及び血清ＴＴＲのタンパク質レベルを定量した。８〜１２週齢のＶ３０Ｍ ｈＴＴＲトランスジェニックマウス（４匹の動物／群）に、２００μＬのＳＮＡＬＰ‐１８３２８（１ｍｇ／ｋｇ）又はＳＮＡＬＰ‐１９５５（１ｍｇ／ｋｇ、非哺乳類動物のルシフェラーゼ遺伝子を標的とする陰性対照ｓｉＲＮＡ ＡＤ‐１９５５を含む）を静脈内（ＩＶ）投与した。使用したマウスは、Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｐｏｒｔｏ，ＰｏｒｔｕｇａｌからのＭｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ株Ｈ１２９‐ｈＴＴＲ ＫＯであった。簡潔に言うと、ｈＴＴＲ Ｈ１２９トランスジェニックマウスを、Ｈ１２９内在性ＴＴＲ ＫＯマウス（ヌルマウスＴＴＲのバックグラウンドにおいて、Ｈ１２９‐ｈＴＴＲトランスジェニックマウスを生成するためのヌルマウス（Ｍａｅｄａ，Ｓ．，（２００３），Ｕｓｅ ｏｆ ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ ａｌｔｅｒｅｄ ｍｉｃｅ ｔｏ ｓｔｕｄｙ ｔｈｅ ｒｏｌｅ ｏｆ ｓｅｒｕｍ ａｍｙｌｏｉｄ Ｐ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ ｉｎ ａｍｙｌｏｉｄ ｄｅｐｏｓｉｔｉｏｎ．Ａｍｙｌｏｉｄ Ｓｕｐｐｌ．１，１７‐２０．）と交配した。投与から３日目、８日目、１５日目、又は２２日目に、両方の処置群の動物に、致死量のケタミン／キシラジンを与えた。血清試料を採集し、分析まで−８０℃で保存した。肝組織を採集し、急速冷凍して、処理するまで−８０℃で保存した。
ＴＴＲのｍＲＮＡ定量のために、冷凍肝組織を粉末に破砕し、溶解物を調製した。分岐ＤＮＡアッセイ（ＱｕａｎｔｉＧｅｎｅ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｓｙｓｔｅｍ，Ｐａｎｏｍｉｃｓ，Ｆｒｅｍｏｎｔ，ＣＡ）を使用することにより、ＧＡＰＤＨのｍＲＮＡレベルと比較したＴＴＲのｍＲＮＡレベルを溶解物中で決定した。簡潔に言うと、製造業者の取扱説明書に従って、組織試料の溶解物中のｍＲＮＡレベルを定量化するためにＱｕａｎｔｉＧｅｎｅアッセイ（Ｇｅｎｏｓｐｅｃｔｒａ）を使用した。ＴＴＲのｍＲＮＡの平均レベルを、それぞれの試料についてＧＡＰＤＨのｍＲＮＡの平均レベルに対して正規化した。次に、正規化した値の群平均を、ＰＢＳ処理群に対する平均値に対してさらに正規化し、ＴＴＲのｍＲＮＡ発現の相対レベルを得た。
ＴＴＲタンパク質の定量化に関しては、製造業者のプロトコールに従って、ＡｓｓａｙＰｒｏ（Ｓｔ．Ｃｈａｒｌｅｓ，ＭＯ）のＡｓｓａｙｍａｘ ＰｒｅＡｌｂｕｍｉｎ ＥＬＩＳＡキットを使って血清をアッセイした。
肝臓ｍＲＮＡ及び血清タンパク質についての結果を、それぞれ、図７Ａ及び図７Ｂに示す。ｈＴＴＲ Ｖ３０Ｍトランスジェニックマウスにおいて、ＳＮＡＬＰ‐１８３２８の単回ＩＶボーラス投与は、肝臓中のＴＴＲのｍＲＮＡレベル及び血清中のＴＴＲタンパク質レベルの持続的な阻害をもたらした。対照群（１ｍｇ／ｍＬ ＳＮＡＬＰ‐１９５５）と比較して、１ｍｇ／ｋｇでのＳＮＡＬＰ‐１８３２８の単回ＩＶ投与は、投与から３日目、８日目、１５日目、及び２２日目の相対的ＴＴＲのｍＲＮＡレベルを、それぞれ、９６％（ｐ＜０．００１）、９０％（ｐ＜０．００１）、８２％（ｐ＜０．００１）、及び７３％（ｐ＜０．００１）で有意に減少させ、研究の終了時（投与から２２日目）に、基線レベルに戻らなかった。また、タンパク質レベルは、投与から３日目で、（ＳＮＡＬＰ‐１９５５と比較して）９７％（ｐ＜０．００１）の血清ＴＴＲの最大の減少を伴って減少した。投与から８日目、１５日目、及び２２日目で、ＴＴＲタンパク質レベルは、ＳＮＡＬＰ‐１９５５と比較して、それぞれ、７２％（ｐ＜０．０５）、３２％（ｐ＜０．０５）、及び４０％（ｐ＜０．００１）で抑制された。
これらの結果は、ＳＮＡＬＰ‐１８３２８の単回ＩＶ投与は、Ｖ３０Ｍ ｈＴＴＲトランスジェニックマウスにおいて、投与から２２日目で肝臓ＴＴＲのｍＲＮＡ及び血清ＴＴＲタンパク質の有意な減少を伴った、標的肝臓ｍＲＮＡ及び血清タンパク質レベルの持続的な抑制を生むことを示す。
実施例８．非ヒト霊長類におけるＳＮＡＬＰ‐１８３２８による血清ＴＴＲタンパク質及び肝臓ｍＲＮＡ抑制の持続性
ＳＮＡＬＰ‐１８３２８による血清ＴＴＲタンパク質抑制の持続性を評価するために、ＡＤ‐１８３２８をＳＮＡＬＰに製剤化し、非ヒト霊長類にＩＶ注入により投与した。投与後のさまざまな時点で、血清ＴＴＲのタンパク質レベルを定量した。
カニクイザル（Ｍａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）（ＳＮＡＬＰ‐１８３２８群についてｎ＝５匹の動物／群及びＳＮＡＬＰ‐１９５５群及びＰＢＳ群についてのｎ＝３匹の動物／群）に、ＳＮＡＬＰ‐１８３２８（０．３、１、又は３ｍｇ／ｋｇ）、ＳＮＡＬＰ‐１９５５（３ｍｇ／ｋｇ、非哺乳動物のルシフェラーゼ遺伝子を標的とする、陰性対照ｓｉＲＮＡ ＡＤ‐１９５５を含む）、若しくはＰＢＳを１５分間のＩＶ注入で投与した。投与段階の０日目、１日目、２日目、３日目、４日目、５日目、７日目、１０日目、及び１４日目に、血清試料を採集し、分析まで−８０℃で保存した。
ウェスタンブロット分析を使用して、血清試料におけるＴＴＲタンパク質レベルを評価した。各群からの血清試料をプールし、（１：２０希釈でβ‐メルカプトエタノールを添加した）Ｌａｅｍｍｌｉサンプルバッファーで１：１に希釈した。試料を９５℃で１０分間加熱した。１２．５μＬの各試料を１０〜２０％Ｃｒｉｔｅｒｉｏｎ（バイオ・ラッド，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）プレップゲル（ｐｒｅｐ ｇｅｌ）の各レーンにのせ、１２０Ｖ、１．５時間のＳＤＳ‐ＰＡＧＥにより分離した、次に、セミドライシステムを使って１５Ｖで１時間ニトロセルロース膜へ移した。膜を、１Ｘリン酸緩衝食塩水で１：１希釈したＬｉＣＯＲ（Ｌｉｎｃｏｌｎ，ＮＥ）ブロッキングバッファー中で、４℃にて一晩ブロッキングした。ブロットを、最初に１：１０００の希釈でＬｉＣＯＲブロッキングバッファーに希釈した一次抗体（サンタ・クルーズ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ），ＣＡからのヤギ抗‐ＴＴＲ）を使って、揺動装置（ｒｏｃｋｅｒ）上で室温にて１時間プローブした。ブロットをリン酸緩衝食塩水＋０．２％Ｔｗｅｅｎ ２０で４回（洗浄１回当たり１０分）洗浄した。蛍光標識二次抗体（抗ヤギ、６８０ｎｍ、インビトロジェン（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を、ＬｉＣＯＲブロッキングバッファー／リン酸緩衝食塩水に１：１０，０００の希釈で加え、ブロットを室温で１時間インキュベーションした。インキュベーション後、ブロットをリン酸緩衝食塩水＋０．２％Ｔｗｅｅｎ２０で４回洗浄し、続いて、１×リン酸緩衝食塩水で１回洗浄した。Ｌｉ‐ＣＯＲ’ｓ Ｏｄｙｓｓｅｙ赤外線イメージングシステムを使用して、タンパク質バンドを検出した。ＴＴＲ単量体は１５ｋＤａに移動した。
結果を図８に示す。血清ＴＴＲタンパク質レベルは、投与前（Ｄａｙ ０）レベルと比較して、１又は３ｍｇ／ｋｇのＳＮＡＬＰ‐１８３２８で投与量依存的な減少を示した。単回ＳＮＡＬＰ‐１８３２８のＩＶ投与から続いた抑制の期間は、１又は３ｍｇ／ｋｇのＳＮＡＬＰ‐１８３２８での治療後、少なくとも１４日である。
これらの結果は、非ヒト霊長類（Ｍａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）において、単回のＳＮＡＬＰ‐１８３２８のＩＶ投与は、投与後１４日でＴＴＲタンパク質の顕著な減少を伴った、循環血液中における持続性のあるＴＴＲタンパク質の抑制を生じることを示す。
ＳＮＡＬＰ‐１８３２８による肝臓ＴＴＲのｍＲＮＡ抑制の持続性を評価するために、ＡＤ‐１８３２８をＳＮＡＬＰ（ＡＬＮ‐ＴＴＲ０１）に製剤化し、単回のＩＶ注入にて非ヒト霊長類に投与した。肝臓ｍＲＮＡレベルを、投与してから３日又は３０日後に本明細書において記載のように測定した。
結果を図２０に示し、野生型ＴＴＲのｍＲＮＡのＡＬＮ‐ＴＴＲ０１抑制は、非ヒト霊長類において、１．０及び ３．０ｍｇ／ｋｇの投与量で３日、１０ｍｇ／ｋｇの投与量で３０日にわたって持続性があることを示す。
実施例９：トランスジェニックマウスにおけるＳＮＡＬＰ‐１８３２８による末梢組織中の変異（Ｖ３０Ｍ）ＴＴＲの生体内減少
予防有効性
末梢組織中のＴＴＲを減少させる際のＳＮＡＬＰ‐１８３２８（ＡＬＮ‐ＴＴＲ０１）の有効性を評価するために、ｈＴＴＲ Ｖ３０ＭΔＨＳＦ‐１ノックアウトマウスをＴＴＲに対する免疫組織化学染色で評価した。２月齢のｈＴＴＲ Ｖ３０ＭΔＨＳＦ‐１ノックアウトマウス（Ｍａｅｄａ，Ｓ．，（２００３），アミロイド沈着における血清アミロイドＰ成分の役割研究のための遺伝子改変マウスの利用（Ｕｓｅ ｏｆ ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ ａｌｔｅｒｅｄ ｍｉｃｅ ｔｏ ｓｔｕｄｙ ｔｈｅ ｒｏｌｅ ｏｆ ｓｅｒｕｍ ａｍｙｌｏｉｄ Ｐ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ ｉｎ ａｍｙｌｏｉｄ ｄｅｐｏｓｉｔｉｏｎ．）Ａｍｙｌｏｉｄ Ｓｕｐｐｌ．１，１７‐２０）に、３ｍｇ／ｋｇのＳＮＡＬＰ‐１８３２８（１２匹の動物），３ｍｇ／ｋｇのＳＮＡＬＰ‐１９５５（非哺乳類のルシフェラーゼ遺伝子を標的とする陰性対照ｓｉＲＮＡ ＡＤ‐１９５５を含む、４匹の動物）、又はリン酸緩衝食塩水（４匹の動物）のＩＶボーラス投与し、投与は、２週間に１回、０日、１４日、２８日、及び ４２日目に計４回施した。複数の末梢組織中のＴＴＲ肝臓ｍＲＮＡレベル及びＴＴＲ免疫活性を、最初の投与から８週間、５６日目に評価した。
マウスに、１ｍｇ／ｋｇのメデトミジンで麻酔をかけ、致死量のケタミンを与えた。目的の組織及び臓器を採集した。免疫組織化学のために、食道（Ｅ）、胃（Ｓ）、腸（十二指腸（Ｉ１）及び結腸（Ｉ４））、神経（Ｎ）、並びに後根神経節（Ｄ）を、中性緩衝ホルマリン中で固定し、パラフィンで包埋した。ＴＴＲ検出のために、ウサギ抗ヒトＴＴＲ１次抗体（１：１０００、ＤＡＫＯ，Ｄｅｎｍａｒｋ）、及び抗ウサギビオチン接合２次抗体（１：２０ シグマ（Ｓｉｇｍａ），ＵＳＡ）を、ＴＴＲタンパク質を染色するために、ｅｘｔｒａｖｉｄｉｎ標識（１：２０，シグマ，ＵＳＡ）を続けた。反応は、３‐アミノ‐９‐エチルカルバゾール、ＡＥＣ（シグマ，ＵＳＡ）を用いて顕色させた。基質の反応色によって占められる領域を測定し、総画像領域に対してのこの値を正規化する、Ｓｃｉｏｎ ｉｍａｇｅ ｑｕａｎｔプログラムを使って免疫組織化学スライドの半定量分析を行った。占領領域の割合（％）の平均値を、対応する標準偏差と共に表示する。各動物組織を、４つの異なる領域について評価した。胃及び腸の副交感神経節中のヒトＴＴＲの存在は、一次抗体としてウサギ抗ヒトＴＴＲ（１：１０００，ＤＡＫＯ，Ｄｅｎｍａｒｋ）及びマウス抗ＰＧＰ９．５（１：４０，Ｓｅｒｏｔｅｃ，ＵＳＡ）で染色する二重免疫蛍光によって調べ、二次抗体は、それぞれ、抗ウサギＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｐｒｏｂｅｓ，ＵＫ）及びヤギ抗マウスＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５６８（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｐｒｏｂｅｓ，ＵＫ）であった。スライドを、ｖｅｃｔａｓｈｉｅｌｄ（Ｖｅｃｔｏｒ）と取り付け、ＦＩＴＣ及びローダミン用のフィルターを装備するツァイス（Ｚｅｉｓｓ） Ｃｅｌｌ Ｏｂｓｅｒｖｅｒ Ｓｙｓｔｅｍ顕微鏡（カールツァイス（Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ），Ｇｅｒｍａｎｙ）で可視化した。
結果を図９にグラフに描いた。ＰＢＳ及びＳＮＡＬＰ‐１９５５で処置した動物と比較して、ＳＮＡＬＰ‐１８３２８で処置した動物は、調べたすべての組織（食道（Ｅ）、胃（Ｓ）、腸（十二指腸（Ｉ１）及び結腸（Ｉ４））、神経（Ｎ）、並びに後根神経節（Ｄ））において、ＴＴＲの免疫活性が有意に減少した。
これらの結果は、ｈＴＴＲ Ｖ３０Ｍ／ＨＳＦ‐１ノックアウトマウスへのＳＮＡＬＰ‐１８３２８投与は、食道、胃、腸（十二指腸及び結腸）、神経、及び後根神経節を含む末梢組織及び臓器において、ＴＴＲタンパク質の有意な減少を引き起こすことを示す。
治療有効性
ＡＬＮ‐ＴＴＲ０１を、変異ヒトＴＴＲ沈着の退縮へのＴＴＲ ｓｉＲＮＡ治療の効果を決めるために、成熟ｈＴＴＲ Ｖ３０ＭΔＨＳＦ‐１ノックアウトマウスに投与した。
２１月齢の動物（ｈＴＴＲ Ｖ３０ＭΔＨＳＦ‐１ノックアウトマウス）の群に、０日目、１４日目、２８日目、１４日目、５６日目、及び７０日目に、３ｍｇ／ｋｇの投与量にて ＡＬＮ‐ＴＴＲ０１又は対照ｓｉＲＮＡのＩＶボーラス投与を静脈内投与した。７７日目に、マウスを安楽死させ、組織を採集し、ＴＴＲ沈着を、本明細書において記載されているように、免疫組織化学的染色スライドの半定量分析を介し、Ｓｃｉｏｎ ｉｍａｇｅ ｑｕａｎｔプログラムを使ってアッセイした。食道、結腸；胃、坐骨神経；及び後根神経節組織を調べ、結果を、この年齢で組織中に存在するＴＴＲ沈着及びＴＴＲ原線維を示す動物モデルにおける病歴データと比較した。
結果を図２１のグラフに示す。結果は、９０％を超える既存のＶ３０Ｍ ｈＴＴＲ組織沈着の退縮をもたらすことを示す。
実施例１０．非ヒト霊長類の肝臓におけるＸＴＣ‐ＳＮＡＬＰ‐１８３２８による野生型ＴＴＲのｍＲＮＡの生体内減少
非ヒト霊長類におけるｓｉＲＮＡの送達のために、新規の脂質ナノ粒子製剤のＸＴＣ‐ＳＮＡＬＰの有効性を評価するために、ＴＴＲ ｓｉＲＮＡ ＡＤ‐１８３２８を、ＸＴＣ‐ＳＮＡＬＰ（ＸＴＣ‐ＳＮＡＬＰ‐１８３２８）に製剤化し、１５分間のＩＶ注入により投与し、肝臓ＴＴＲのｍＲＮＡを定量した。カニクイザル（Ｍａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）に、ＸＴＣ‐ＳＮＡＬＰ‐１８３２８（０．０３、０．１、０．３若しくは１ｍｇ／ｋｇ）又は非哺乳類のルシフェラーゼ遺伝子を標的とする陰性対照ｓｉＲＮＡ ＡＤ‐１９５５を含むＸＴＣ‐ＳＮＡＬＰ‐１９５５（１ｍｇ／ｋｇ）、を、１５分間のＩＶ注入により投与した。投与後４８時間に、サルをペントバルビタールナトリウムで麻酔をかけ、血液を抜いた。ＴＴＲのｍＲＮＡ測定のための肝組織を採集し、急速冷凍して、処理するまで−８０℃で保存した。肝組織におけるＴＴＲのｍＲＮＡの定量に使用した方法は、上記実施例５に記載のものと同様であった。
結果を図１０に示す。ＸＴＣ‐ＳＮＡＬＰ‐１８３２８は、陰性対照ＸＴＣ‐ＳＮＡＬＰ‐１９５５と比較して肝臓におけるＴＴＲのｍＲＮＡレベルを投与量依存的に減少させた。ｍＲＮＡ ＥＤ５０をもとめ、〜０．１ｍｇ／ｋｇのＸＴＣ‐ＳＮＡＬＰ‐１８３２８であった。これらの結果は、ＸＴＣ‐ＳＮＡＬＰ‐１８３２８は、静脈内注入により投与した場合、非ヒト霊長類の肝臓において野生型ＴＴＲのｍＲＮＡを抑制するのに効果的であることを示す。
実施例１１．非ヒト霊長類の肝臓におけるＬＮＰ０９‐１８３２８及びＬＮＰ１１‐１８３２８による野生型ＴＴＲのｍＲＮＡの生体内減少
非ヒト霊長類におけるｓｉＲＮＡの送達についての、２つの新規の脂質ナノ粒子製剤のＬＮＰ０９及びＬＮＰ１１の有効性を評価するために、ＴＴＲのｓｉＲＮＡ ＡＤ‐１８３２８を、ＬＮＰ０９（ＬＮＰ０９‐１８３２８）又はＬＮＰ１１（ＬＮＰ１１‐１８３２８）に製剤化し、１５分間のＩＶ注入により投与し、肝臓ＴＴＲのｍＲＮＡ及び血清ＴＴＲのタンパク質レベルをアッセイした。カニクイザル（Ｍａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）に、ＬＮＰ０９‐１８３２８（０．０３、０．１、若しくは０．３ｍｇ／ｋｇ）、ＬＮＰ１１‐１８３２８（０．０３、０．１、若しくは０．３ｍｇ／ｋｇ）、又はＰＢＳを、１５分間のＩＶ注入により投与した。肝生検試料を、投薬から４８時間後に採集、急速冷凍し、処理するまで−８０℃で保存した。血清を、投与する前（採血前）、及び投与から１日目、２日目、４日目、７日目、１４日目、２１日目、及び２８日目に採集し、処理するまで−８０℃で保存した。肝組織及び血清ＴＴＲタンパク質の評価におけるＴＴＲのｍＲＮＡの定量に使用された方法は、上記の実施例５及び８に記載のものと同様であった。
結果を、ｍＲＮＡについては図１１Ａ、及びタンパク質については図１１Ｂ及び図１１Ｃに示す。ＬＮＰ０９‐１８３２８及びＬＮＰ１１‐１８３２８で処置した動物は、肝臓中のＴＴＲのｍＲＮＡレベルの投与量依存的な減少を示し、ＰＢＳ対照と比較して、０．３ｍｇ／ｋｇで、〜８５％（ＬＮＰ０９‐１８３２８）及び〜９０％（ＬＮＰ１１‐１８３２８）のｍＲＮＡの最大減少に達した。ｍＲＮＡ ＥＤ５０をもとめ、ＬＮＰ０９‐１８３２８及びＬＮＰ１１‐１８３２８の両方について〜０．０２ｍｇ／ｋｇであった。投与から７日目で、血清試料も、ＰＢＳ対照レベルと比較して、０．１及び０．３ｍｇ／ｋｇのＬＮＰ０９‐１８３２８及びＬＮＰ１１‐１８３２８に対して、ＴＴＲタンパク質の投与量依存的な減少を示した。図１１Ｃは、ＬＮＰ０９‐１８３２８の０．３ｍｇ／ｋｇの用量を有するＴＴＲタンパク質レベルの減少が、ＰＢＳ対照群と比較して、及び採血前の試料と比較して、投与から少なくとも２８日間にわたって存続することを示す。
これらの結果は、ＬＮＰ０９‐１８３２８及びＬＮＰ１１‐１８３２８は、ＩＶ注入によって投与した場合、非ヒト霊長類肝臓中の野生型ＴＴＲのｍＲＮＡ及び循環血液中の野生型ＴＴＲタンパク質を抑制するのに効果的であることを示す。さらにそのうえ、ＬＮ０９‐１８３２８による抑制は、持続性があり、ＩＶ注入から少なくとも２８日間存続する。
実施例１２．非ヒト霊長類の肝臓におけるＬＮＰ１２‐１８３２８による野生型ＴＴＲのｍＲＮＡの生体内減少
ＬＮＰ１２製剤化されたＡＤ‐１８３２８を、この製剤の有効性を評価するために非ヒト霊長類に投与した。
ＬＮＰ１２‐ＡＤ‐１８３２８製剤を、Ｊｅｆｆｓ ｅｔ ａｌ．（Ｊｅｆｆｓ ＬＢ， ｅｔ ａｌ．（２００４）Ａ Ｓｃａｌａｂｌｅ， Ｅｘｔｒｕｓｉｏｎ‐Ｆｒｅｅ Ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ Ｌｉｐｏｓｏｍａｌ Ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｌａｓｍｉｄ ＤＮＡ．Ｐｈａｒｍ Ｒｅｓ ２２：３６２‐３７２）から適応した方法を使って調製した。簡潔に言うと、Ｔｅｃｈ‐Ｇ１（上記）、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、コレステロール及びｍＰＥＧ２０００‐ＤＭＧを、５０：１０：３８．５：１．５のモル比で９０％エタノールに溶かした。ｓｉＲＮＡを、０．４ｍｇ／ｍＬの濃度でｐＨ３の１０ｍＭクエン酸緩衝液に溶かした。エタノール脂質溶液及びｓｉＲＮＡ水溶液を、デュアルポンプヘッドを装着した蠕動ポンプを用いて等体積流量で送り込み、「Ｔ」‐接合部で混合した。脂質を、７：１（重量：重量）の総脂質のｓｉＲＮＡに対する比率で、ｓｉＲＮＡと混合した。自然発生的に形成したＬＮＰ１２‐ＡＤ１８３２８製剤を、ＰＢＳ（１５５ｍＭ ＮａＣｌ、３ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４、１ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４、ｐＨ７．５）に対して透析し、エタノールを除去し、バッファーを交換した。この製剤は、約９０％のｓｉＲＮＡ封入効率で８０ｎｍの平均粒径を生みだした。
カニクイザル（Ｍａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）に、ＰＢＳ又は０．０３、０．１、若しくは０．３ｍｇ／ｋｇのＬＮＰ１２‐ＡＤ‐１８３２８を、１５分間のＩＶ注入（５ｍＬ／ｋｇ）として橈側皮静脈を経て与えた。投与してから４８時間後、肝生検を動物から採集した。ＧＡＰＤＨのｍＲＮＡに対するＴＴＲのｍＲＮＡレベルを、本明細書において記載されているように、肝試料中で測定した。
図１９に示されているように、投与量０．０３ｍｇ／ｋｇでも高いレベルの野生型トランスサイレチン（ＴＴＲ）遺伝子の特異的なノックダウンが観察された。これは、ＬＮＰ１２製剤は、前述のｓｉＲＮＡ肝臓送達系のいずれよりも桁が違う低さで遺伝子サイレンシングを促進することを示す。
実施例１３．ＴＴＲが並べられた配列の合成
ＡＤ‐１８３２８の標的領域付近でＴＴＲ遺伝子を標的とされる、ＴＴＲ二本鎖（「並べられた二本鎖」）のセットを設計し、それは、ＮＭ＿０００３７１．３のヌクレオチド６２８で始まるヒトＴＴＲ遺伝子を標的とする。
下の実施例では、転写物上のｓｉＲＮＡの５’位の塩基を示す番号付けは、ＮＭ＿０００３７１．３（図１２、配列番号１３３１）に基づいている。上記の実施例では、ヒトｓｉＲＮＡを標的とするｓｉＲＮＡの番号付けは、ＮＭ＿０００３７１．２（図１３Ａ）に基づいていた。ＮＭ＿０００３７１．３は、図１４に示すように、ＮＭ＿０００３７１．２と比較して、１１０塩基まで５’ＵＴＲの配列を伸長する。よって、一例として、ＡＤ‐１８３２８の開始位置は、ＮＭ＿０００３７１．３上の６２８及びＮＭ＿０００３７１．２上の５１８である（図１４）。
ＴＴＲが並べられた配列をＭｅｒＭａｄｅ１９２合成装置で１μｍｏｌスケールにて合成した。表にあるすべての配列に関して、以下に詳しく述べるように「エンドライト（ｅｎｄｏｌｉｇｈｔ）」化学を適用した。
● センス鎖内のすべてのピリミジン（シトシン及びウリジン）は、２’‐Ｏ‐メチル塩基（２’Ｏ‐メチルＣ及び２’‐Ｏ‐メチルＵ）を含有した。
● アンチセンス鎖において、リボＡヌクレオシドに（５’位方向に）隣接したピリミジンをそれらの対応する２‐Ｏ‐メチルヌクレオシドに置き換えた。
● センス及びアンチセンスの配列双方の３’末端に２塩基ｄＴｄＴ伸長を導入した。
● 配列ファイルをテキストファイルに変換し、ＭｅｒＭａｄｅ１９２合成ソフトウエアへの搭載に適合させた。
合成、切断、及び脱保護：
ＴＴＲ配列の合成は、ホスホラミダイト化学を用いた固相担持オリゴヌクレオチド合成を使用した。配列の合成を、９６ウェルプレートで１ｕｍスケールにて実施した。アミダイト溶液を０．１Ｍ濃度に調製し、エチルチオテトラゾール（アセトニトリル中０．６Ｍ）を活性剤として使用した。合成した配列を切断し、第１工程ではメチルアミンを、第２工程ではフッ化物試薬を使って、９６ウェルプレート中で脱保護した。粗配列を、アセトン：エタノール（８０：２０）混合物を使って沈殿させ、沈殿物を０．２Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液に再懸濁した。それぞれの配列からの試料を、ＬＣ‐ＭＳにより分析して同一性を確認し、紫外線により定量し、選択された試料のセットをＩＥＸクロマトグラフィーにより分析して純度を決定した。
精製及び脱塩：
ＴＴＲが並べられた配列を、Ｓｏｕｒｃｅ１５Ｑカラムを使ってＡＫＴＡ ｅｘｐｌｏｒｅｒ精製システムで精製した。６５℃のカラム温度を精製中維持した。試料の注射及び採集を、９６ウェル（１．８ｍＬの深いウェル）プレート中で行った。完全長配列に対応する単一ピークを、溶離液中に採集した。精製した配列を、ＡＫＴＡ ｐｕｒｉｆｉｅｒを使ってＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ２５カラムで脱塩した。脱塩したＴＴＲ配列を、濃度（Ａ２６０での紫外線測定によって）及び純度（イオン交換ＨＰＬＣによって）について分析した。次に、一本鎖をアニーリングに提供した。
ＴＴＲの一本鎖及び二本鎖：
ＴＴＲが並べられた二本鎖及び対応する一本鎖（センス及びアンチセンス）の詳細な表を、下の表（表１３）に示す。

Figure 2013510161



Figure 2013510161
実施例１４．ＴＴＲが並べられたｓｉＲＮＡのインビトロスクリーニング
ＴＴＲが並べられた二本鎖を、リアルタイムＰＣＲアッセイを用いて、内在性ＴＴＲの発現の阻害についてＨｅｐ３Ｂ細胞内でアッセイした。
細胞培養及びトランスフェクション：
Ｈｅｐ３Ｂ細胞（ＡＴＣＣ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）を、１０％ＦＢＳ、ストレプトマイシン、及びグルタミン（ＡＴＣＣ）を補完したＥａｇｌｅ’ｓイーグル最小必須培地（ＡＴＣＣ）中で３７℃にて５％ＣＯ２雰囲気下においてコンフルエント近くまで育て、トリプシン処理によってプレートから剥がした。９６ウェルプレートの個々のウェルに、５μＬのＯｐｔｉ‐ＭＥＭを５μＬの各ｓｉＲＮＡに添加することによって、リバーストランスフェクションを実施した。これに、１ウェル当たり、１０μＬのＯｐｔｉ‐ＭＥＭと０．２μＬのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＲＮＡｉＭａｘ（インビトロジェン，Ｃａｒｌｓｂａｄ ＣＡ．カタログ番号１３７７８‐１５０）を加えて、混合物を室温で１５分間インキュベーションした。次に、上記に記載の完全成長培地で、２．０×１０４のＨｅｐ３Ｂ細胞を含み、抗生物質を含まないものを８０μＬ加えた。細胞を２４時間培養して、ＲＮＡを精製した。０．１又は１０ｎＭの最終二本鎖濃度にて実験を行った。
ＭａｇＭＡＸ‐９６全ＲＮＡ単離キット（アプライド・バイオシステムズ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ，部品番号：ＡＭ１８３０）を使った全ＲＮＡ単離：細胞を採集し、１４０μＬの溶解／結合溶液で溶解し、次に、エッペンドルフ サーモミキサーを使って１分間８５０ｒｐｍで混合した（混合速度をプロセス全体を通して同一とした）。２０マイクロリットルの磁気ビーズ及び溶解／結合エンハンサーの混合物を細胞溶解物に加え、５分間混合した。磁気ビーズを磁気スタンドを使って捕獲し、ビーズを乱すことなく上清を取り除いた。上清を取り除いた後、磁気ビーズを（イソプロパノールを加えた）洗浄溶液１で洗浄し、１分間混合した。ビーズを再度捕獲し、上清を取り除いた。次に、磁気ビーズを１５０μＬの（エタノールを加えた）洗浄溶液２で洗浄、捕獲し、上清を取り除いた。次いで、５０μＬのデオキシリボヌクレアーゼ混合物（ＭａｇＭａｘ ｔｕｒｂｏデオキシリボヌクレアーゼバッファー及び Ｔｕｒｂｏデオキシリボヌクレアーゼ）をビーズに加えて、それらを１０〜１５分間混合した。混合後、１００μＬのＲＮＡ再結合溶液を加え、３分間混合した。上清を取り除き、磁気ビーズを１５０μＬの洗浄溶液２で再度洗浄して、１分間混合し、上清を完全に取り除いた。磁気ビーズを２分間混合して乾燥し、ＲＮＡを５０μＬの水で溶出した。
ＡＢＩ高性能ｃＤＮＡ逆転写キット（アプライド・バイオシステムズ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ，カタログ番号４３６８８１３）を使ったｃＤＮＡ合成：２μＬの１０×バッファー、０．８μＬの２５×ｄＮＴＰ、２μＬのランダムプライマー、１μＬの逆転写酵素、１μＬのＲＮａｓｅ阻害剤、及び１反応当たり３．２μＬのＨ２Ｏのマスターミックスを、１０μＬの全ＲＮＡに加えた。ｃＤＮＡをバイオ・ラッドＣ‐１０００又はＳ‐１０００サーマルサイクラー（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）を使い、次のステップを通じて生成した：２５℃で１０分、３７℃で１２０分、８５℃で５秒、４℃で保持。
リアルタイムＰＣＲ：２μＬのｃＤＮＡを、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ ４８０ ３８４ウェルプレート（ロッシュ（Ｒｏｃｈｅ） カタログ番号０４７２９７４００１）中の１ウェル当たり、０．５μＬのＧＡＰＤＨ ＴａｑＭａｎプローブ（アプライド・バイオシステムズ カタログ番号４３２６３１７Ｅ）、０．５μＬのＴＴＲ ＴａｑＭａｎプローブ（アプライド・バイオシステムズ カタログ番号ＨＳ００１７４９１４ Ｍ１）、及び１０μＬのロッシュＰｒｏｂｅｓ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（ロッシュ カタログ番号０４８８７３０１００１）を含有するマスターミックスに加えた。ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ ４８０リアルタイムＰＣＲ装置（ロッシュ）において、リアルタイムＰＣＲを行った。各二本鎖を、２つの独立したトランスフェクションで検証し、各トランスフェクションを二連でアッセイした。
ΔΔＣｔ法を使って、リアルタイムデータを分析した。各試料を、ＧＡＰＤＨの発現に対して正規化し、ノックダウンを非標的二本鎖ＡＤ‐１９５５でトランスフェクションした細胞と比較して評価した。表１４は、ｓｉＲＮＡを用いたＴＴＲのノックダウンを示す。データは、ＡＤ‐１９５５で標的とされた細胞に対する残存するメッセージの割合（％）として表される。
ＡＤ‐１８３２８の標的近くのＴＴＲを標的とする、多数ではあるが、すべてではない並べられたＴＴＲ‐ｄｓＲＮＡは、０．１ｎＭでＨｅｐ３Ｂ細胞にトランスフェクションした場合、ＴＴＲのｍＲＮＡ少なくとも７０％減少した。

Figure 2013510161



実施例１５．Ｓｐｒａｇｕｅ‐ＤａｗｌｅｙラットにおけるＳＮＡＬＰ‐１８５３４の単回静脈内投与の有効性における注入持続時間の評価
目的
Ｓｐｒａｇｕｅ‐Ｄａｗｌｅｙラットにおいて、肝臓ＴＴＲのｍＲＮＡレベルにおけるＳＮＡＬＰ‐１８５３４の単回ＩＶ注入の有効性における注入持続時間の効果を決定すること。









































Figure 2013510161
上の表からのＡＤ‐１８５３４のセンス鎖及びアンチセンス鎖の配列を以下に再現する。





































Figure 2013510161
研究材料
被験物質
ＳＮＡＬＰ‐１８５３４は、標的組織に送達するために安定した核酸脂質粒子（ＳＮＡＬＰ）に製剤化された、齧歯類ＴＴＲのｍＲＮＡ（ＡＤ‐１８５３４）を標的とするｓｉＲＮＡからなる。ＳＮＡＬＰ製剤（脂質粒子）は、新規のアミノ脂質（ＤＬｉｎＤＭＡ）、ＰＥＧ化脂質（ｍＰＥＧ２０００‐Ｃ‐ＤＭＡ）、中性脂質（ＤＰＰＣ）、及びコレステロールからなる。ＳＮＡＬＰ製剤中の脂質の核酸に対する比は、約５．８：１（重量：重量）である。ＳＮＡＬＰ‐１９５５は、非哺乳動物のルシフェラーゼｍＲＮＡを標的とするｓｉＲＮＡを含有し、ＳＮＡＬＰ‐１８５３４と同一の脂質粒子で製剤化される、非薬理学的に活性な対照としての役割を果たす。投与レベルは、ｓｉＲＮＡ含有量の重量に基づいて、ｍｇ／ｋｇとして表す。
研究設計及び手順
動物及び被験物質の投与：
研究は、Ｓｐｒａｇｕｅ‐Ｄａｗｌｅｙラットの９つの群（４匹の雄／群）からなった。動物は、研究前の少なくとも２日間の順応期間が与えられ、すべての動物は、投与開始時、７週齢であった。投与された量は、１日目の投与前に収集された体重データに基づいて算出された。試験及び対照物質は、Ｂａｘｔｅｒ ＡＳ４０Ａ注射器ポンプに２７Ｇテルモ翼状針を介して接続されたＢａｘｔｅｒ注射部位の隔膜で密閉された２４Ｇ ３／４インチのカニューレを用いて、尾静脈を経て、単回１５分間、１時間、２時間、又は３時間のＩＶ注入として投与された。投与容量は３ｍＬ／ｋｇであり、注入速度は１２ｍＬ／ｋｇ／時であり、動物は、投与中、ケージ中で自由に動いていた。ラットは、９つの処置群に分割され、表１６に示されるように、ＳＮＡＬＰ‐１８５３４、ＳＮＡＬＰ‐１９５５、又はＰＢＳの単回ＩＶ注入で投与した。

















Figure 2013510161
組織採集及びＲＮＡ単離：
０日目に、イソフルレン吸入で動物に麻酔をかけ、投与前の血液試料を、後眼窩採血により血清分離管に採集した。４℃で遠心分離を行う前に、室温で約３０分間、血液試料を凝固させた。次に、血清試料を、分析を行うまで−８０℃で保存した。３日目に、すべての９つの処置群の動物に、致死量のケタミン／キシラジンを与えた。後大静脈を経て血清分離管に血液を採集し、次に、４℃で遠心分離を行う前に、室温で約３０分間凝固させた。血清試料を、分析を行うまで−８０℃で保存した。肝組織を採集し、ドライアイス上で瞬間凍結した。凍結した肝組織を破砕し、組織溶解物を肝臓ｍＲＮＡの定量のために調製した。
ＴＴＲのｍＲＮＡの定量：
分岐ＤＮＡアッセイ（ＱｕａｎｔｉＧｅｎｅ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｓｙｓｔｅｍ，Ｐａｎｏｍｉｃｓ，Ｆｒｅｍｏｎｔ，ＣＡ）を使用することにより、ＧＡＰＤＨのｍＲＮＡレベルと比較したＴＴＲのｍＲＮＡレベルを溶解物中で決定した。簡潔に言うと、製造業者の取扱説明書に従って、組織試料の溶解物中のｍＲＮＡレベルを定量化するためにＱｕａｎｔｉＧｅｎｅアッセイ（Ｇｅｎｏｓｐｅｃｔｒａ）を使用した。ＴＴＲのｍＲＮＡの平均レベルを、それぞれの試料についてＧＡＰＤＨのｍＲＮＡの平均レベルに対して正規化した。
ＴＴＲのｍＲＮＡの発現の相対レベルを得るために、次に、１５分間、１時間、及び２時間の注入持続時間でのＳＮＡＬＰ‐１９５５及びＳＮＡＬＰ‐１８５３４処置群についての群平均値を、１５分間の注入時間でのＰＢＳ処置群についての平均値に対して正規化し、一方、次に、３時間の注入時間でのＳＮＡＬＰ‐１９５５及びＳＮＡＬＰ‐１８５３４処置群についての群平均値は、３時間の注入持続時間でのＰＢＳ処置群についての平均値に対して正規化した。
結果
図１６に示されるように、１５分間〜３時間の異なる注入持続時間での１ｍｇ／ｋｇのＳＮＡＬＰ‐１８５３４の単回ＩＶ注入は、投与から２日後に測定した肝臓ＴＴＲのｍＲＮＡレベルに匹敵する阻害をもたらす。また、１ｍｇ／ｋｇのＳＮＡＬＰ‐１８５３４の単回ＩＶ注入は、ＳＮＡＬＰ‐１９５５対照と比較した場合、１５分間の単回ＩＶ注入から２９日間にわたって持続性のあるＴＴＲの下方調節を示した（データは示さず）。ＰＢＳ処置群と比較して、ＳＮＡＬＰ‐１８５３４の単回１５分間、１時間、２時間、又は３時間のＩＶ注入は、１ｍｇ／ｋｇにて、相対ＴＴＲのｍＲＮＡ発現レベルを、それぞれ、９４％（ｐ＜０．００１）、９４％（ｐ＜０．００１）、９２％（ｐ＜０．００１）、及び９３％（ｐ＜０．００１）有意に減少させた。ＳＮＡＬＰ‐１８５３４活性の特異性は、同一の投与量レベルにての１時間、２時間、又は３時間のＩＶ注入でのＳＮＡＬＰ‐１９５５投与による有意な標的阻害の欠如により示される。
結論
本研究は、１５分間から最長３時間の異なる注入持続時間は、肝臓中のＴＴＲのｍＲＮＡレベルの減少により評価したとき、ラットにおける１ｍｇ／ｋｇのＳＮＡＬＰ‐１８５３４の単回ＩＶ投与の有効性に影響を及ぼさないことを示す。
実施例１６．ＬＮＰ０７‐１８５３４及びＬＮＰ０８‐１８５３４によるラット肝臓における野生型ＴＴＲのｍＲＮＡの生体内減少
ｓｉＲＮＡの送達についての２つの新規の脂質ナノ粒子製剤であるＬＮＰ０７及びＬＮＰ０８の有効性をラットにおいて評価するために、齧歯類特異的なＴＴＲのｓｉＲＮＡ、ＡＤ‐１８５３４を、ＬＮＰ０７（ＬＮＰ０７‐１８５３４）又はＬＮＰ０８（ＬＮＰ０８‐１８５３４）に製剤化し、１５分間のＩＶ注入により投与し、肝臓ＴＴＲのｍＲＮＡを定量した。Ｓｐｒａｇｕｅ‐Ｄａｗｌｅｙラット（１群当たり４匹の動物）に、ＬＮＰ０７‐１８５３４（０．０３、０．１、０．３、若しくは１ｍｇ／ｋｇ）、ＬＮＰ０８‐１８５３４（０．０１、０．０３、若しくは０．１ｍｇ／ｋｇ）、又は非哺乳動物のルシフェラーゼ遺伝子を標的とする陰性対照ｓｉＲＮＡ ＡＤ‐１９５５を含有するＬＮＰ０７‐１９５５（１ｍｇ／ｋｇ）若しくはＬＮＰ０８‐１９５５（０．１ｍｇ／ｋｇ）の１５分間のＩＶ注入により投与した。４８時間後、動物に麻酔をかけ、肝組織を採集し、急速冷凍し、処理するまで−８０℃で保存した。
ＴＴＲのｍＲＮＡ定量のために、冷凍肝組織を粉末に破砕し、溶解物を調製した。分岐ＤＮＡアッセイ（ＱｕａｎｔｉＧｅｎｅ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｓｙｓｔｅｍ，Ｐａｎｏｍｉｃｓ，Ｆｒｅｍｏｎｔ，ＣＡ）を使用することにより、ＧＡＰＤＨのｍＲＮＡレベルと比較したＴＴＲのｍＲＮＡレベルを溶解物中で決定した。簡潔に言うと、製造業者の取扱説明書に従って、組織試料の溶解物中のｍＲＮＡレベルを定量化するためにＱｕａｎｔｉＧｅｎｅアッセイ（Ｇｅｎｏｓｐｅｃｔｒａ）を使用した。ＴＴＲのｍＲＮＡの平均レベルを、それぞれの試料についてＧＡＰＤＨのｍＲＮＡの平均レベルに対して正規化した。次に、正規化した値の群平均を、ＰＢＳ処理群に対する平均値に対してさらに正規化し、ＴＴＲのｍＲＮＡ発現の相対レベルを得た。
結果を図１７に示す。ＬＮＰ０７‐１８５３４は、投与量依存的な様式で、肝臓におけるＴＴＲのｍＲＮＡレベルを減少させ、１ｍｇ／ｋｇでＴＴＲのｍＲＮＡの９４％抑制を得た。ＰＢＳ対照と比較して、１ｍｇ／ｋｇで陰性対照ＬＮＰ０７‐１９５５はＴＴＲのｍＲＮＡレベルに大きな影響を及ぼさなかったので、効果は特異的であった。ｍＲＮＡ ＥＤ５０をもとめ、〜０．０５ｍｇ／ｋｇのＬＮＰ０７‐１８５３４であった。ＬＮＰ０８‐１８５３４は、投与量依存的な様式で、肝臓中のＴＴＲのｍＲＮＡレベルを減少させ、０．１ｍｇ／ｋｇでＴＴＲのｍＲＮＡの８６％抑制を得た。ＰＢＳ対照と比較して、０．１ｍｇ／ｋｇで陰性対照ＬＮＰ０８‐１９５５はＴＴＲのｍＲＮＡレベルに大きな影響を及ぼさなかったので、効果は特異的であった。ｍＲＮＡ ＥＤ５０をもとめ、〜０．０２ｍｇ／ｋｇのＬＮＰ０８‐１８５３４であった。
これらの結果は、ＬＮＰ０７‐１８５３４及びＬＮＰ０８‐１８５３４は、ＩＶ注入により投与した場合、ラット肝臓中の野生型ＴＴＲのｍＲＮＡを抑制するのに効果的であり、ＬＮＰ０７及びＬＮＰ０８は、肝臓にｓｉＲＮＡを送達するための効果的な製剤であることを示す。
実施例１７：Ｓｐｒａｇｕｅ‐ＤａｗｌｅｙラットにおけるＬＮＰ０９‐１８５３４又はＬＮＰ１１‐１８５３４の単回静脈内投与によるＴＴＲ肝臓ｍＲＮＡの減少
目的：
内在性（野生型）肝臓ＴＴＲのｍＲＮＡレベルを減少させることに対する、Ｓｐｒａｇｕｅ‐Ｄａｗｌｅｙラットにおける、齧歯類ＴＴＲ特異的なｓｉＲＮＡのＡＤ‐１８５３４の送達についての２つの新規の脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）製剤の有効性を評価すること。ラットに、０．０１、０．０３、０．１、若しくは０．３ｍｇ／ｋｇのＬＮＰ０９‐１８５３４、ＬＮＰ１１‐１８５３４、又はリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）のいずれかで１５分間の注入を介して静脈内に投与し、ＴＴＲ肝臓のｍＲＮＡレベルを、処置から４８時間後にアッセイした。
材料及び方法：
ＬＮＰ０９製剤：（ＸＴＣ／ＤＳＰＣ／Ｃｈｏｌ／ＰＥＧ２０００‐Ｃ１４）＝５０／１０／３８．５／１．５モル％；脂質：ｓｉＲＮＡ 〜１１：１。ＬＮＰ１１製剤：（ＭＣ３／ＤＳＰＣ／Ｃｈｏｌ／ＰＥＧ２０００‐Ｃ１４）＝５０／１０／３８．５／１．５モル％；脂質：ｓｉＲＮＡ 〜１１．１：１。
組織採集及びＲＮＡ単離：３日目に、すべての処置群の動物に、致死量のケタミン／キシラジンを与えた。後大静脈を経て血清分離管に血液を採集し、次に、４℃で遠心分離を行う前に、室温で約３０分間凝固させた。血清試料をその後の分析まで−８０℃で保存した。肝組織を採集し、ドライアイス上で瞬間凍結した。凍結した肝組織を破砕し、組織溶解物を肝臓ｍＲＮＡの定量のために調製した。
ＴＴＲのｍＲＮＡの定量：分岐ＤＮＡアッセイ（ＱｕａｎｔｉＧｅｎｅ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｓｙｓｔｅｍ，Ｐａｎｏｍｉｃｓ，Ｆｒｅｍｏｎｔ，ＣＡ）を使用することにより、ＧＡＰＤＨのｍＲＮＡレベルと比較したＴＴＲのｍＲＮＡレベルを溶解物中で決定した。簡潔に言うと、製造業者の取扱説明書に従って、組織試料の溶解物中のｍＲＮＡレベルを定量するためにＱｕａｎｔｉＧｅｎｅアッセイ（Ｇｅｎｏｓｐｅｃｔｒａ）を使用した。ＴＴＲのｍＲＮＡの平均レベルを、それぞれの試料についてＧＡＰＤＨのｍＲＮＡの平均レベルに対して正規化した。次に、群平均値を、ＰＢＳ処置群についての平均値に対して正規化し、ＴＴＲのｍＲＮＡ発現の相対レベルを得た。
結果：
図１８に示されるように、ＰＢＳ処置動物と比較して、ＬＮＰ０９‐１８５３４及びＬＮＰ１１‐１８５３４で処置した動物は、肝臓中のＴＴＲのｍＲＮＡレベルが投与量依存的に有意に減少し、ＰＢＣ対照群と比較して、０．３ｍｇ／ｋｇで、ＬＮＰ０９及びＬＮＰ１１製剤化群の両方に対して、約９０％のｍＲＮＡの最大減少に達し、投与量は、ＬＮＰ１１‐１８５３４の０．０３ｍｇ／ｋｇ未満及びＬＮＰ０９‐１８５３４の０．１ｍｇ／ｋｇ未満で５０％減少（ＥＤ５０）に達した。
結論
本研究は、Ｓｐｒａｇｕｅ‐Ｄａｗｌｅｙラットにおいて、ＬＮＰ０９‐１８５３４又はＬＮＰ１１‐１８５３４の単回１５分間のＩＶ注入は、肝臓ＴＴＲのｍＲＮＡの投与量依存的な減少をもたらすことを示す。これらのデータは、ＬＮＰ１１‐１８５３４及びＬＮＰ０９‐１８５３４、それぞれ、０．０３ｍｇ／ｋｇ未満及び０．１ｍｇ／ｋｇ未満のＥＤ５０レベルで内在的に発現する（野生型）ＴＴＲのｍＲＮＡを減少させることにおけるＬＮＰ０９‐１８３２８及びＬＮＰ１１‐１８３２８の有効性を示す。
実施例１８：動物における毒性アッセイ
ＡＬＮ‐ＴＴＲ０１を非ＧＬＰ及びＧＬＰ条件下における安全性及び毒物学（ｔｏｘｉｃｌｏｇｏｙ）についてアッセイした。ＡＬＮ‐ＴＴＲ０１は、ＳＮＡＬＰ製剤（ＤＬｉｎＤＭＡ／ＤＰＰＣ／コレステロール／ＰＥＧ２０００‐ｃＤＭＡ（５７．１／７．１／３４．４／１．４）脂質：ｓｉＲＮＡ〜７）中のｓｉＲＮＡ ＡＤ‐１８３２８である。アッセイは、カニクイザル（１、３、６、１０、３０、１００ｍｇ／ｋｇ）及びＳｐｒａｇｕｅ‐Ｄａｗｌｅｙラット（０．３、１、３、６、１０ｍｇ／ｋｇ）で行った。ラットでは１ｍｇ／ｋｇ未満、非ヒト霊長類では１０ｍｇ／ｋｇ未満で毒性は見られなかった（データは示さず）。
実施例１９：製剤ＡＬＮ‐ＴＴＲ０１
製剤であるＡＬＮ ＴＴＲ０１ Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎは、等張のリン酸緩衝食塩水中に、脂質賦形剤（安定核酸脂質粒子［ＳＮＡＬＰ］と呼ばれる）を含む、ｓｉＲＮＡ ＡＬＮ １８３２８の白色からオフホワイト色の均質の滅菌液体懸濁液である。ＡＬＮ ＴＴＲ０１の組成物を下の表に示す。



































Figure 2013510161
脂質賦形剤は、下の表に示した分子量及び構造を有する。



















Figure 2013510161
ａ 別名：ｍＰＥＧ２０００‐Ｃ‐ＤＭＡ
ＡＬＮ ＴＴＲ０１製剤は、５．５ｍＬの充填容積（１バイアル当たり１１ｍｇのＡＬＮ‐１８３２８）で１０ｍＬのガラスバイアルに包装されている。容器密閉システムは、ＵＳＰ／ＥＰＩ型ホウケイ酸ガラス、テフロン（登録商標）表面のブチルゴム栓、アルミニウムのフリップオフキャップから構成される。製剤は５±３℃で保存されるであろう。
製剤の安定性を最長２４カ月間アッセイし、以下の基準を決定した：
外観：白色からオフホワイト色、均一な乳白色液体、異物無し
ｐＨ：６．８〜７．８
浸透圧：２５０〜３５０ｍＯｓｍ／ｋｇ
脂質：ｓｉＲＮＡ比：５．６〜８．４ｍｇ／ｍｇ
粒径（Ｚ平均）：６０〜１２０ｎｍ≦０．１５
実施例２０：ヒトにおけるＴＴＲの阻害
ヒト対象をＴＴＲ遺伝子の発現を阻害するＴＴＲ遺伝子を標的とするｄｓＲＮＡで処置し、病態を治療する。
治療を必要とする対象を選択又は特定する。対象は、肝臓疾患、トランスサイレチンアミロイドーシス、及び／又は移植肝臓を有することができる。例えば、生検に基づいてＡＴＴＲ（ＦＡＰ又はＦＡＣ）との確定診断を受けた、いかなる変異ＴＴＲ遺伝子型の患者で、肝移植を受けたことがない患者を選ぶことができる。幾つかの実施形態では、患者は、十分な活動状態、十分な肝機能及び腎機能を有し、活動性感染症も炎症障害もなく、安定した心臓状態を有する。
対象の特定は、臨床的な環境、又はその他の場所、例えば対象自身が自己検査キットを使用することを通して対象の自宅などにおいて行うことができる。
時間０で、好適な第１の用量の抗ＴＴＲ ｓｉＲＮＡを対象に投与する。本明細書において記載のように、ｄｓＲＮＡを製剤化する。第１の投与をしてからの期間、例えば、７日、１４日、及び２１日後、例えば、肝機能を測定することにより対象の病態を評価する。この測定は、前記対象におけるＴＴＲの発現、及び／又はＴＴＲのｍＲＮＡの成功したｓｉＲＮＡ標的の成果の測定を伴うことができる。また、その他の関連する基準も測定することができる。投与の回数及び強さを対象の必要性に従って調整する。
例えば、ＡＬＮ‐ＴＴＲ０１又は通常の生理食塩水プラセボの単回投与を、１５分間のＩＶ注入により投与することができる。開始投与レベルは、０．０３ｍｇ／ｋｇで、４投与レベル：０．０３、０．１、０．２及び０．４ｍｇ／ｋｇにわたって投与量を上げることができる。ＡＴＴＲ患者における薬力学効果は、０．１〜０．３ｍｇ／ｋｇの投与量から見られうる。最大投与量は、例えば０．４ｍｇ／ｋｇ又はＥＤ７０投与量（コホート内の少なくとも２人の患者で全ＴＴＲの基線７０％を超える抑制をもたらすＡＬＮ‐ＴＴＲ０１の投与量）より低いものであろう。
患者に、注入反応の恐れを減らすために、投与前に、１）投与前日の夕方に経口で８ｍｇのデキサメタゾン、２）投与３０分前に、静注で２０ｍｇのデキサメタゾン、静注で５０ｍｇのジフェンヒドラミン、静注で５０ｍｇのラニチジン又は２０ｍｇのファモチジン、及び経口で６５０ｍｇのアセトアミノフェンを前投与することができる。注入は、より遅い速度で行いうる（最大注入時間３時間）。
ＡＬＮ‐ＴＴＲ０１を投与した後、ビタミンＡ及びＲＢＰレベル並びに甲状腺機能検査を、毎週続けることができる（ＴＴＲは、レチノール結合タンパク質（ＲＢＰ）とともにビタミンＡ輸送において役割を担い、循環サイロキシンの結合において、サイログロブリンと比べて小さい役割を担う）。男性では、テストステロン、黄体形成ホルモン（ＬＨ）、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）レベルの連続的な測定を通して、精巣機能が注意深く監視されるであろう。
血清ＴＴＲレベルの連続的な測定によって、投与後の最下点並びに投与後最下点の時期及びＴＴＲ抑制の持続期間を決めることができるであろう。
治療後、対象の腫瘍増殖率は、治療前に存在した比率、又は同様に罹患したが治療を受けなかった対象で測定された比率と比較して低下している。

Claims (24)

  1. 組成物の有効量を投与することを含む、対象におけるＴＴＲアミロイド沈着を減少させる方法であって、前記組成物が前記対象におけるＴＴＲの発現を阻害するＴＴＲ ｄｓＲＮＡを含み、前記ＴＴＲ ｄｓＲＮＡがセンス鎖及びアンチセンス鎖及び長さ１５〜３０の塩基対の二本鎖構造を含み、前記アンチセンス鎖が配列番号１７０の１５個以上の連続するヌクレオチドを含む方法。
  2. アンチセンス鎖が配列番号１７０を含み、センス鎖が配列番号１６９を含む請求項１に記載の方法。
  3. アンチセンス鎖が配列番号７３０からなり、センス鎖が配列番号７２９からなる請求項１に記載の方法。
  4. ｓｉＲＮＡが、２’‐Ｏ‐メチル修飾ヌクレオチド、５’‐ホスホロチオエート基を含むヌクレオチド、コレステリル誘導体又はドデカン酸ビスデシルアミド基に連結した末端ヌクレオチド、２’‐デオキシ‐２’‐フルオロ修飾ヌクレオチド、２’‐デオキシ‐修飾ヌクレオチド、ロックトヌクレオチド、脱塩基ヌクレオチド、２’‐アミノ修飾ヌクレオチド、２’‐アルキル修飾ヌクレオチド、モルホリノヌクレオチド、ホスホロアミデート、及びヌクレオチドを含む非天然塩基からなる群から選択される少なくとも１つの修飾ヌクレオチドを含む、請求項１又は２又は３に記載の方法。
  5. アンチセンス鎖が配列番号１０１０からなり、センス鎖が配列番号１００９からなる請求項１に記載の方法。
  6. 前記組成物が陽イオン性脂質を含む核酸脂質製剤を含む請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
  7. 前記陽イオン脂質がＤＬｉｎＤＭＡ、ＭＣ３、又はＴｅｃｈＧ１（Ｃ１２‐２００）を含む請求項６に記載の方法。
  8. 前記ＴＴＲアミロイド沈着がＶ３０Ｍ変異ＴＴＲを含む請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
  9. 前記対象がヒト対象である請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
  10. 前記有効量が０．０１〜３０．０ｍｇ／ｋｇの投与量である請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
  11. 対象におけるＴＴＲ沈着を測定することを更に含む請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
  12. ６．８〜７．８の範囲のｐＨ、２５０〜３５０ｍＯｓｍ／ｋｇの範囲のオスモル濃度、５．６〜８．４ｍｇ／ｍｇの範囲の脂質：ｓｉＲＮＡ比、及び６０〜１２０ｎｍ≦０．１５の範囲の粒径を含む、表１７の製剤ＡＬＮ‐ＴＴＲ０１からなる組成物。
  13. 対象におけるＴＴＲアミロイド沈着を減少させる方法であって、請求項１２の組成物の有効量を前記対象に投与すること及び前記対象におけるＴＴＲ沈着を測定することを含む方法。
  14. 少なくとも３日間、霊長類におけるＴＴＲのｍＲＮＡ発現を減少させる方法であって、ＡＤ‐１８３２８からなるＴＴＲ ｄｓＲＮＡの０．０１〜３０．０ｍｇ／ｋｇの単回用量を前記霊長類に投与することを含む方法。
  15. ＴＴＲのｍＲＮＡ発現が３０日間減少する請求項１４に記載の方法。
  16. 前記霊長類がヒトである請求項１４又は１５に記載の方法。
  17. 単回用量が１．０又は３．０又は１０．０ｍｇ／ｋｇである請求項１４〜１６のいずれか一項に記載の方法。
  18. 前記ＴＴＲ ｄｓＲＮＡがＳＮＡＬＰ（ＡＬＮ‐ＴＴＲ０１）製剤化される請求項１４〜１７のいずれか一項に記載の方法。
  19. 対象におけるＴＴＲのｍＲＮＡ発現を測定することを更に含む請求項１４〜１８のいずれか一項に記載の方法。
  20. 組成物を０．０３ｍｇ／ｋｇの投与量にて対象に投与することを含む、対象におけるＴＴＲのｍＲＮＡ発現を減少させる方法であって、前記組成物がＴＴＲ ｄｓＲＮＡ ＡＤ‐１８３２８及び脂質製剤を含む方法。
  21. 前記対象がヒトである請求項２０に記載の方法。
  22. 前記脂質製剤が陽イオン性脂質であるＭＣ３又はＴｅｃｈ Ｇ１（Ｃ１２‐２００）を含む請求項２０又は２１に記載の方法。
  23. 前記脂質製剤がＬＮＰ‐１２（５０／１０／３８．５／１．５のモル比のＴｅｃｈ Ｇ１／ＤＳＰＣ／コレステロール／ＰＥＧ２００‐ＤＭＧ）を含む請求項２０又は２１に記載の方法。
  24. 対象におけるＴＴＲのｍＲＮＡ発現を測定することを更に含む請求項２０〜２３のいずれか一項に記載の方法。
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