ES2941742T3 - Composiciones y procedimientos para modular la expresión del factor B del complemento - Google Patents

Composiciones y procedimientos para modular la expresión del factor B del complemento Download PDF

Info

Publication number
ES2941742T3
ES2941742T3 ES19184459T ES19184459T ES2941742T3 ES 2941742 T3 ES2941742 T3 ES 2941742T3 ES 19184459 T ES19184459 T ES 19184459T ES 19184459 T ES19184459 T ES 19184459T ES 2941742 T3 ES2941742 T3 ES 2941742T3
Authority
ES
Spain
Prior art keywords
compound
modified
certain embodiments
carbohydrate
antisense
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
ES19184459T
Other languages
English (en)
Inventor
Thazha Prakash
Punit Seth
Eric Swayze
Tamar Grossman
Michael Mccaleb
Andrew Watt
Susan Freier
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Ionis Pharmaceuticals Inc
Original Assignee
Ionis Pharmaceuticals Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Ionis Pharmaceuticals Inc filed Critical Ionis Pharmaceuticals Inc
Application granted granted Critical
Publication of ES2941742T3 publication Critical patent/ES2941742T3/es
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/54—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound
    • A61K47/555—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound pre-targeting systems involving an organic compound, other than a peptide, protein or antibody, for targeting specific cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C12N15/1137—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against enzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y304/00—Hydrolases acting on peptide bonds, i.e. peptidases (3.4)
    • C12Y304/21—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • C12Y304/21047—Alternative-complement-pathway C3/C5 convertase (3.4.21.47), i.e. properdin factor B
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/11—Antisense
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/31—Chemical structure of the backbone
    • C12N2310/315—Phosphorothioates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/32—Chemical structure of the sugar
    • C12N2310/321—2'-O-R Modification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/33—Chemical structure of the base
    • C12N2310/334—Modified C
    • C12N2310/3341—5-Methylcytosine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/34—Spatial arrangement of the modifications
    • C12N2310/341—Gapmers, i.e. of the type ===---===
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/34—Spatial arrangement of the modifications
    • C12N2310/346—Spatial arrangement of the modifications having a combination of backbone and sugar modifications
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/35—Nature of the modification
    • C12N2310/351—Conjugate
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/35—Nature of the modification
    • C12N2310/352—Nature of the modification linked to the nucleic acid via a carbon atom
    • C12N2310/3525—MOE, methoxyethoxy

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Ophthalmology & Optometry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

Las presentes realizaciones proporcionan métodos, compuestos y composiciones para tratar, prevenir o mejorar una enfermedad asociada con la desregulación de la vía alternativa del complemento mediante la administración de un inhibidor específico del factor B del complemento (CFB) a un sujeto. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Composiciones y procedimientos para modular la expresión del factor B del complemento
Campo
La presente solicitud se refiere a procedimientos, compuestos y composiciones para tratar, prevenir o mejorar una enfermedad asociada con la regulación incorrecta de la vía alternativa del complemento administrando un inhibidor específico del factor B del complemento (CFB) a un sujeto.
Antecedentes
El sistema del complemento es parte del sistema inmunitario innato del huésped implicado en lisar células exógenas, potenciar la fagocitosis de antígenos, aglutinar agentes portadores de antígenos y atraer macrófagos y neutrófilos. El sistema del complemento se divide en tres vías de iniciación, las vías clásica, de lectina y alternativa, que convergen en el componente C3 para generar un complejo enzimático conocido como C3 convertasa, que escinde C3 en C3a y C3b. C3b se asocia con C3 convertasa mediada por CFB y da como resultado la generación de C5 convertasa, que escinde C5 en C5a y C5b, lo que inicia la vía de ataque a la membrana que da como resultado la formación del complejo de ataque a la membrana (CAM) que comprende los componentes C5b, C6, C7, C8 y C9. El complejo de ataque a la membrana (CAM) forma canales transmembranarios y altera la bicapa fosfolipídica de las células diana, dando lugar a la lisis celular.
En el estado homeostático, la vía alternativa se activa continuamente a un nivel bajo de "marcha" ("tickovef) como resultado de la activación de la vía alternativa por hidrólisis espontánea de C3 y la producción de C3b, que genera la C5 convertasa.
El documento US7696344 B2 se refiere a maximizar la generación de un reactivo de silenciamiento génico eficaz seleccionando ARNip particulares por un diseño racional, así como procedimientos para silenciar genes.
El documento US2004/249178 A1 se refiere a conjugados, conectores degradables, composiciones, procedimientos de síntesis y aplicaciones de los mismos, incluyendo conjugados derivados de colesterol, folato, galactosa, galactosamina, N-acetilgalactosamina, PEG, fosfolípido, péptido y seroalbúmina humana (HSA) de compuestos biológicamente activos.
El documento WO2012/177947 A2 se refiere a un ácido ribonucleico bicatenario (ARNbc) dirigido a un gen APOC3 y procedimientos de uso del ARNbc para inhibir la expresión de APOC3.
El documento WO2013/166121 A1 se refiere a conjugados que contienen tetraGalNAc y procedimientos para el suministro de oligonucleótidos.
M. Maier et al. (2003) se refiere a un motivo de reconocimiento de carbohidrato multivalente para el receptor de asialoglucoproteína, diseñado para el suministro específico de célula y tejido de fármacos antisentido a células hepáticas parenquimatosas.
Sumario de la invención
La presente invención proporciona un compuesto que comprende un oligonucleótido modificado monocatenario y un grupo conjugado, en el que el oligonucleótido modificado consiste en de 16 a 30 nucleósidos unidos y tiene una secuencia de nucleobases que comprende una cualquiera de SEQ ID NO: 455, 237, 448, 453, 444, 450, 598, 198, 549 y 228 en el que el oligonucleótido modificado tiene:
un segmento de hueco que consiste en desoxinucleósidos enlazados;
un segmento de ala 5' que consiste en nucleósidos enlazados; y
un segmento de ala 3' que consiste en nucleósidos enlazados;
en el que el segmento de hueco se sitúa entre el segmento de ala 5' y el segmento de ala 3' y en el que cada nucleósido de cada segmento de ala comprende un glúcido modificado;
en el que el grupo conjugado comprende:
Figure imgf000003_0001
La presente invención también proporciona una composición que comprende el compuesto de la invención o una sal del mismo y al menos uno de un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable.
La presente invención también proporciona el compuesto o la composición de la invención para su uso en el tratamiento de una enfermedad asociada con la regulación incorrecta de la vía alternativa del complemento en un sujeto.
Sumario de la divulgación
El sistema del complemento media en la inmunidad innata y desempeña un papel importante en la respuesta inflamatoria normal a la lesión, pero su regulación incorrecta puede provocar lesiones graves. La activación de la vía alternativa del complemento más allá de su nivel constitutivo de "marcha" puede dar lugar a una hiperactividad incontrolada y manifestarse como enfermedades de regulación incorrecta del complemento. Las referencias a procedimientos de tratamiento en los párrafos posteriores de la presente descripción se deben interpretar como referencias a los compuestos, composiciones farmacéuticas y medicamentos de la presente invención para su uso en un procedimiento para el tratamiento del cuerpo humano (o animal) por tratamiento.
Determinados modos de realización de la divulgación se refieren a procedimientos para tratar, prevenir o mejorar una enfermedad asociada con la regulación incorrecta de la vía alternativa del complemento en un sujeto por la administración de un inhibidor específico del factor B del complemento (CFB). Varios modos de realización de la divulgación se refieren a un procedimiento para inhibir la expresión de CFB en un sujeto que tiene, o está en riesgo de tener, una enfermedad asociada con la regulación incorrecta de la vía alternativa del complemento administrando un inhibidor específico de CFB al sujeto. En determinados modos de realización de la divulgación, un procedimiento para reducir o inhibir la acumulación de depósitos de C3 en el ojo de un sujeto que tiene, o está en riesgo de tener, una enfermedad asociada con la regulación incorrecta de la vía alternativa del complemento comprende administrar un inhibidor específico de CFB al sujeto. En varios modos de realización de la divulgación, un procedimiento para reducir o inhibir la acumulación de depósitos de C3 en el riñón de un sujeto que tiene, o está en riesgo de tener, una enfermedad asociada con la regulación incorrecta de la vía alternativa del complemento comprende administrar un inhibidor específico de CFB al sujeto.
Descripción detallada
Se debe entender que tanto la descripción general anterior como la siguiente descripción detallada son solo ejemplares y explicativas y no son restrictivas de la invención, como se reivindica. En el presente documento, el uso del singular incluye el plural a menos que se establezca específicamente de otro modo. Como se usa en el presente documento, el uso de "o" quiere decir "y/o" a menos que se establezca de otro modo. Además, el uso del término "incluyendo", así como otras formas, tales como "incluye" e "incluido", no es limitante. Además, términos tales como "elemento" o "componente" engloban tanto elementos como componentes que comprenden una unidad y elementos y componentes que comprenden más de una subunidad, a menos que se establezca específicamente de otro modo.
Los encabezados de sección usados en el presente documento solo son por motivos de organización y no se deben entender como limitantes de la materia objeto descrita.
A menos que se proporcionen definiciones específicas, la nomenclatura usada en relación con, y los procedimientos y técnicas de, química analítica, química orgánica sintética y química médica y farmacéutica descritas en el presente documento son los bien conocidos y comúnmente usados en la técnica. Se pueden usar técnicas estándar para la síntesis química y el análisis químico. Determinadas de dichas técnicas y procedimientos se pueden encontrar, por ejemplo, en "Carbohydrate Modifications in Antisense Research" editado por Sangvi and Cook, American Chemical Society, Washington D.C., 1994; "Remington's Pharmaceutical Sciences," Mack Publishing Co., Easton, Pa., 21.a edición, 2005; y "Antisense Drug Technology, Principles, Strategies, and Applications" editado por Stanley T. Crooke, CRC Press, Boca Raton, Florida; y Sambrook et al., "Molecular Cloning, A laboratory Manual", 2.a edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989.
A menos que se indique de otro modo, los siguientes términos tienen los siguientes significados:
"2'-F nucleósido" se refiere a un nucleósido que comprende un glúcido que comprende flúor en la posición 2'. A menos que se indique de otro modo, el flúor en un 2'-F nucleósido está en la posición ribo (reemplazando el OH de una ribosa natural).
"2'-O-metoxietilo" (también 2'-MOE y 2'-O(CH2)2-OCH3) se refiere a una modificación de O-metoxi-etilo en la posición 2' de un anillo furanosa. Un glúcido 2'-O-metoxietilo modificado es un glúcido modificado.
"2'-MOE nucleósido" (también 2'-O-metoxietilo-nucleósido) quiere decir un nucleósido que comprende un resto glucídico 2'-MOE modificado.
"Nucleósido 2'-sustituido" quiere decir un nucleósido que comprende un sustituyente en la posición 2' del anillo furanosilo distinto de H u OH. En determinados modos de realización, los nucleósidos 2'-sustituidos incluyen nucleósidos con modificaciones glucídicas bicíclicas.
"Sitio diana 3'" se refiere al nucleótido de un ácido nucleico diana que es complementario al nucleótido más hacia 3' de un compuesto antisentido particular.
"Sitio diana 5'" se refiere al nucleótido de un ácido nucleico diana que es complementario al nucleótido más hacia 5' de un compuesto antisentido particular.
"5-metilcitosina" quiere decir una citosina modificada con un grupo metilo unido a la posición 5'. Una 5-metilcitosina es una nucleobase modificada.
"Aproximadamente" quiere decir dentro de ±10 % de un valor. Por ejemplo, si se establece, "los compuestos afectaron a al menos aproximadamente un 70 % de la inhibición de CFB", denota que los niveles de CFB se inhiben dentro de un intervalo de un 60 % y 80 %.
"Administración" o "administrar" se refiere a vías para introducir un compuesto antisentido proporcionado en el presente documento a un sujeto para realizar su función prevista. Un ejemplo de una vía de administración que se puede usar incluye, pero no se limita a, administración parenteral, tal como inyección o infusión subcutánea, intravenosa o intramuscular.
"Alquilo", como se usa en el presente documento, quiere decir un radical hidrocarburo lineal o ramificado saturado que contiene hasta veinticuatro átomos de carbono. Los ejemplos de grupos alquilo incluyen, sin limitación, metilo, etilo, propilo, butilo, isopropilo, n-hexilo, octilo, decilo, dodecilo y similares. Los grupos alquilo típicamente incluyen de 1 a aproximadamente 24 átomos de carbono, más típicamente de 1 a aproximadamente 12 átomos de carbono (alquilo C1-C12) siendo más preferente de 1 a aproximadamente 6 átomos de carbono.
Como se usa en el presente documento, "alquenilo" quiere decir un radical de cadena hidrocarbonada lineal o ramificado que contiene hasta veinticuatro átomos de carbono y que tiene al menos un doble enlace carbonocarbono. Los ejemplos de grupos alquenilo incluyen sin limitación, etenilo, propenilo, butenilo, 1-metil-2-buten-1-ilo, dienos tales como 1,3-butadieno y similares. Los grupos alquenilo típicamente incluyen de 2 a aproximadamente 24 átomos de carbono, más típicamente de 2 a aproximadamente 12 átomos de carbono, siendo más preferentes de 2 a aproximadamente 6 átomos de carbono. Los grupos alquenilo como se usa en el presente documento pueden incluir opcionalmente uno o más de otros grupos sustituyentes.
Como se usa en el presente documento, "alquinilo" quiere decir un radical hidrocarburo lineal o ramificado que contiene hasta veinticuatro átomos de carbono y que tiene al menos un triple enlace carbono-carbono. Los ejemplos de grupos alquinilo incluyen, sin limitación, etinilo, 1-propinilo, 1 -butinilo y similares. Los grupos alquinilo típicamente incluyen de 2 a aproximadamente 24 átomos de carbono, más típicamente de 2 a aproximadamente 12 átomos de carbono, siendo más preferentes de 2 a aproximadamente 6 átomos de carbono. Los grupos alquinilo como se usa en el presente documento pueden incluir opcionalmente uno o más de otros grupos sustituyentes.
Como se usa en el presente documento, "acilo" quiere decir un radical formado por la retirada de un grupo hidroxilo de un ácido orgánico y tiene la fórmula general -C(O)-X donde X es típicamente alifático, alicíclico o aromático. Los ejemplos incluyen carbonilos alifáticos, carbonilos aromáticos, sulfonilos alifáticos, sulfinilos aromáticos, sulfinilos alifáticos, fosfatos aromáticos, fosfatos alifáticos y similares. Los grupos acilo como se usa en el presente documento pueden incluir opcionalmente otros grupos sustituyentes.
Como se usa en el presente documento, "aliddico" quiere decir un sistema de anillo cíclico en el que el anillo es alifático. El sistema de anillo puede comprender uno o más anillos en el que al menos un anillo es alifático. Los alicíclicos preferentes incluyen anillos que tienen de aproximadamente 5 a aproximadamente 9 átomos de carbono en el anillo. Alicíclico como se usa en el presente documento puede incluir opcionalmente otros grupos sustituyentes.
Como se usa en el presente documento, "alifático" quiere decir un radical hidrocarburo lineal o ramificado que contiene hasta veinticuatro átomos de carbono en el que la saturación entre dos átomos de carbono cualesquiera es un enlace simple, doble o triple. Un grupo alifático contiene preferentemente de 1 a aproximadamente 24 átomos de carbono, más típicamente de 1 a aproximadamente 12 átomos de carbono, siendo más preferente de 1 a aproximadamente 6 átomos de carbono. La cadena lineal o ramificada de un grupo alifático se puede interrumpir con uno o más heteroátomos que incluyen nitrógeno, oxígeno, azufre y fósforo. Dichos grupos alifáticos interrumpidos por heteroátomos incluyen sin limitación, polialcoxis, tales como polialquilenglicoles, poliaminas y poliiminas. Los grupos alifáticos como se usa en el presente documento pueden incluir opcionalmente otros grupos sustituyentes.
Como se usa en el presente documento, "alcoxi" quiere decir un radical formado entre un grupo alquilo y un átomo de oxígeno en el que el átomo de oxígeno se usa para unir el grupo alcoxi a una molécula original. Los ejemplos de grupos alcoxi incluyen sin limitación, metoxi, etoxi, propoxi, isopropoxi, n-butoxi, sec-butoxi, terc-butoxi, npentoxi, neopentoxi, n-hexoxi y similares. Los grupos alcoxi como se usa en el presente documento pueden incluir opcionalmente otros grupos sustituyentes.
Como se usa en el presente documento, "aminoalquilo" quiere decir un radical alquilo C1-C12 sustituido con amino. La porción de alquilo del radical forma un enlace covalente con una molécula original. El grupo amino se puede localizar en cualquier posición y el grupo aminoalquilo puede estar sustituido con otro grupo sustituyente en las porciones alquilo y/o amino.
Como se usa en el presente documento, "aralquilo" y "arilalquilo" quieren decir un grupo aromático que está enlazado covalentemente a un radical alquilo C1-C12. La porción de radical alquilo del grupo aralquilo (o arilalquilo) resultante forma un enlace covalente con una molécula original. Los ejemplos incluyen sin limitación, bencilo, fenetilo y similares. Los grupos aralquilo como se usa en el presente documento pueden incluir opcionalmente otros grupos sustituyentes unidos al alquilo, al arilo o a ambos grupos que forman el grupo radical.
Como se usa en el presente documento, "arilo" y "aromático" quieren decir radicales de sistema de anillo carbocíclico mono o policíclico que tiene uno o más anillos aromáticos. Los ejemplos de grupos arilo incluyen sin limitación, fenilo, naftilo, tetrahidronaftilo, indanilo, idenilo y similares. Los sistemas de anillo arilo preferentes tienen de aproximadamente 5 a aproximadamente 20 átomos de carbono en uno o más anillos. Los grupos arilo como se usa en el presente documento pueden incluir opcionalmente otros grupos sustituyentes.
"Mejoría" se refiere a una disminución de al menos un indicador, signo o síntoma de una enfermedad, trastorno o afección asociados. En determinados modos de realización, la mejora incluye un retraso o ralentización en la progresión de uno o más indicadores de una afección o enfermedad. La gravedad de los indicadores se puede determinar por medidas subjetivas u objetivas, que son conocidas para los expertos en la técnica.
"Animal" se refiere a un animal humano o no humano, incluyendo, pero sin limitarse a, ratones, ratas, conejos, perros, gatos, cerdos y primates no humanos, incluyendo pero sin limitarse a, monos y chimpancés.
"Actividad antisentido" quiere decir cualquier actividad detectable o medible atribuible a la hibridación de un compuesto antisentido a su ácido nucleico diana. En determinados modos de realización, la actividad antisentido es una disminución en la cantidad o expresión de un ácido nucleico diana o proteína codificada por dicho ácido nucleico diana.
"Compuesto antisentido" quiere decir un compuesto oligomérico que puede experimentar hibridación a un ácido nucleico diana a través de enlaces de hidrógeno. Los ejemplos de compuestos antisentido incluyen compuestos monocatenarios y bicatenarios, tales como oligonucleótidos antisentido, ARNip, ARNhc, ARNmc y compuestos basados en ocupación.
"Inhibición antisentido" quiere decir la reducción de los niveles de ácido nucleico diana en presencia de un compuesto antisentido complementario a un ácido nucleico diana en comparación con los niveles de ácido nucleico diana en ausencia del compuesto antisentido.
Los "mecanismos antisentido" son todos los mecanismos que implican la hibridación de un compuesto con el ácido nucleico diana, en los que el resultado o efecto de la hibridación es la degradación de la diana o bien la ocupación de la diana con el estancamiento concomitante de la maquinaria celular que implica, por ejemplo, la transcripción o el empalme.
"Oligonudeótido antisentido" quiere decir un oligonucleótido monocatenario que tiene una secuencia de nucleobases que permite la hibridación a una región o segmento correspondiente de un ácido nucleico diana.
La "complementariedad de bases" se refiere a la capacidad para el emparejamiento de bases preciso de nucleobases de un oligonucleótido antisentido con las correspondientes nucleobases en un ácido nucleico diana (es decir, hibridación), y está mediada por la unión de hidrógeno de Watson-Crick, Hoogsteen o Hoogsteen inversa entre las correspondientes nucleobases.
"Resto glucídico bicíclico" quiere decir un resto glucídico modificado que comprende un anillo de 4 a 7 miembros (incluyendo pero sin limitarse a un furanosilo) que comprende un puente que conecta dos átomos del anillo de 4 a 7 miembros para formar un segundo anillo, lo que da como resultado una estructura bicíclica. En determinados modos de realización, el anillo de 4 a 7 miembros es un anillo glucídico. En determinados modos de realización, el anillo de 4 a 7 miembros es un furanosilo. En determinados de dichos modos de realización, el puente conecta el carbono 2' y el carbono 4' del furanosilo.
"Ácido nucleico bicíclico" o "BNA" o "nucleósidos BNA" quiere decir monómeros de ácido nucleico que tienen un puente que conecta dos átomos de carbono entre la posición 4' y 2' de la unidad glucídica nucleosídica, formando de este modo un glúcido bicíclico. Los ejemplos de dichos glúcidos bicíclicos incluyen, pero no se limitan a A) a-L-metilenoxi (4'-CH2-O-2') LNA, (B) p-D-metilenoxi (4'-CH2-O-2') LNA, (C) etilenoxi (4'-(CH2)2-O-2') LNA, (D) aminooxi (4'-CH2-O-N(R)-2') LNA y (E) oxiamino (4'-CH2-N(R)-O-2') l Na , como se representa a continuación.
Figure imgf000006_0001
Como se usa en el presente documento, los compuestos de LNA incluyen, pero no se limitan a, compuestos que tienen al menos un puente entre la posición 4' y la 2' del glúcido en los que cada uno de los puentes comprende independientemente 1 o de 2 a 4 grupos enlazados seleccionados independientemente de -[C(Ri)(R2)]n-, -C(Ri)=C(R2) -, -C(R i)=N-, -C(=NRi) -, -C(=O)-, -C(=S) -, -O -, -Si(Ri)2-, -S(=O)x- y -N(R i) -; en los que: x es 0, i o 2; n es i, 2, 3 o 4; cada Ri y R2 es, independientemente , H, un grupo protector, hidroxilo, alquilo Ci-Ci2, alquilo Ci-Ci2 sustituido, alquenilo C2-Ci2, alquenilo C2-Ci2 sustituido, alquinilo C2-Ci2, alquinilo C2-Ci2 sustituido, arilo C5-C20, arilo C5-C20 sustituido, un radical heterociclo, un radical heterociclo sustituido, heteroarilo, heteroarilo sustituido, radical alicíclico C5-C7, radical alicíclico C5-C7 sustituido, halógeno, OJi, NJJ2, SJi, N3, COOJi, acilo (C(=O)-H), acilo sustituido, CN, sulfonilo (S(=O)2-Ji) o sulfoxilo (S(=O)-Ji); y cada Ji y J2 es, independientemente, H, alquilo Ci-Ci2, alquilo Ci-Ci2 sustituido, alquenilo C2-Ci2, alquenilo C2-Ci2 sustituido, alquinilo C2-Ci2, alquinilo C2-Ci2 sustituido, arilo C5-C20, arilo C5-C20 sustituido, acilo (C(=O)-H), acilo sustituido, un radical heterociclo, un radical heterociclo sustituido, aminoalquilo Ci-Ci2, aminoalquilo Ci-Ci2 sustituido o un grupo protector.
Los ejemplos de grupos puente 4'- 2' englobados dentro de la definición de LNA incluyen, pero no se limitan a una de las fórmulas: -[C(Ri)(R2)]n-, -[C(Ri)(R2)]n-O-, -C(RiR2)-N(Ri)-O- o -C(RiR2)-O-N(Ri)-. Además, otros grupos puente englobados con la definición de l Na son los puentes 4'-CH2-2', 4'-(CH2)2-2', 4'-(CH2)3-2', 4'-CH2-O-2', 4'-(CH2)2-O-2', 4'-CH2-O-N(Ri)-2' y 4'-CH2-N(Ri)-O-2'-, en los que cada Ri y R2 es, independientemente, H, un grupo protector o alquilo Ci-Ci2.
También se incluyen dentro de la definición de LNA de acuerdo con la invención LNA en los que el grupo 2'-hidroxilo del anillo glucídico ribosilo está conectado al átomo de carbono 4' del anillo glucídico, formando de este modo un puente metilenoxi (4'-CH2-O-2') para formar un resto glucídico bicíclico. El puente también puede ser un grupo metileno (-CH2-) que conecta el átomo de oxígeno 2' y el átomo de carbono 4', para el que se usa el término metilenoxi (4'-CH2-O-2') LNA. Además; en el caso del resto glucídico bicíclico que tiene un grupo puente etileno en esta posición, se usa el término etilenoxi (4'-CH2CH2-O-2') LNA, a - L - metilenoxi (4'-CH2-O-2'), un isómero de metilenoxi (4'-CH2-O-2') LNA también se engloba dentro de la definición de LNA, como se usa en el presente documento.
"Estructura de caperuza" o "resto de caperuza terminal" quiere decir modificaciones químicas que se han incorporado en cualquier extremo de un compuesto antisentido.
"Carbohidrato" quiere decir un carbohidrato natural, un carbohidrato modificado o un derivado de carbohidrato.
"Agrupación de carbohidrato" quiere decir un compuesto que tiene uno o más residuos de carbohidrato unidos a un andamio o grupo conector. (véanse, por ejemplo, Maier et al., "Synthesis of Antisense Oligonucleotides Conjugated to a Multivalent Carbohydrate Cluster for Cellular Targeting", Bioconjugate Chemistry, 2003, (14): 18­ 29, o Rensen et al., "Design and Synthesis of Novel N-Acetylgalactosamine-Terminated Glycolipids for Targeting of Lipoproteins to the Hepatic Asiaglycoprotein Receptor", J. Med. Chem. 2004, (47): 5798-5808, para ejemplos de agrupaciones de conjugados de carbohidratos).
"Derivado de carbohidrato" quiere decir cualquier compuesto que se puede sintetizar usando un carbohidrato como material de partida o intermedio.
"cEt" o "etilo restringido" quiere decir un resto glucídico bicíclico que comprende un puente que conecta el carbono 4' y el carbono 2', en el que el puente tiene la fórmula: 4'-CH(CH3)-O-2'.
"Modificación química" quiere decir una diferencia química en un compuesto cuando se compara con su homólogo natural. Las modificaciones químicas de oligonucleótidos incluyen modificaciones nucleosídicas (incluyendo modificaciones de restos glucídicos y modificaciones de nucleobases) y modificaciones de enlaces internucleosídicos. En referencia a un oligonucleótido, la modificación química no incluye diferencias solo en la secuencia de nucleobases.
"Enlace escindible" quiere decir cualquier enlace químico que se puede dividir. En determinados modos de realización, un enlace escindible se selecciona de entre: una amida, una poliamida, un éster, un éter, uno o ambos ésteres de un fosfodiéster, un éster de fosfato, un carbamato, un disulfuro o un péptido.
"Resto escindible" (CM) quiere decir un enlace o grupo que se puede escindir en condiciones fisiológicas. En determinados modos de realización, un resto escindible se escinde dentro de una célula o compartimentos subcelulares, tales como un lisosoma. En determinados modos de realización, un resto escindible se escinde por enzimas endógenas, tales como nucleasas. En determinados modos de realización, un resto escindible comprende un grupo de átomos que tienen uno, dos, tres, cuatro o más de cuatro enlaces escindibles.
"Conjugado" o "grupo conjugado" quiere decir un átomo o grupo de átomos unido a un oligonucleótido o compuesto oligomérico. En general, los grupos conjugados modifican una o más propiedades del compuesto al que se unen, incluyendo, pero sin limitarse a, propiedades farmacodinámicas, farmacocinéticas, de unión, absorción, distribución celular, captación celular, carga y/o eliminación.
"Conector conjugado" o "conector" en el contexto de un grupo conjugado quiere decir una porción de un grupo conjugado que comprende cualquier átomo o grupo de átomos y que enlaza covalentemente (1) un oligonucleótido a otra porción del grupo conjugado o (2) dos o más porciones del grupo conjugado.
Los grupos conjugados se muestran en el presente documento como radicales, proporcionando un enlace para formar una unión covalente a un compuesto oligomérico tal como un oligonucleótido antisentido. En determinados modos de realización, el punto de unión en el compuesto oligomérico es el átomo de oxígeno 3' del grupo hidroxilo 3' del nucleósido terminal 3' del compuesto oligomérico. En determinados modos de realización, el punto de unión en el compuesto oligomérico es el átomo de oxígeno 5' del grupo hidroxilo 5' del nucleósido terminal 5' del compuesto oligomérico. En determinados modos de realización, el enlace para formar la unión al compuesto oligomérico es un enlace escindible. En determinados de dichos modos de realización, dicho enlace escindible constituye todo o parte de un resto escindible.
En determinados modos de realización, los grupos conjugados comprenden un resto escindible (por ejemplo, un enlace escindible o nucleósido escindible) y una porción de agrupación de carbohidrato, tal como una porción de agrupación de GalNAc. Dicha porción de agrupación de carbohidrato comprende: un resto dirigido y, opcionalmente, un conector conjugado. En determinados modos de realización, la porción de agrupación de carbohidrato se identifica por el número e identidad del ligando. Por ejemplo, en determinados modos de realización, la porción de agrupación de carbohidrato comprende 3 grupos GalNAc y se denomina "GalNAc3". En determinados modos de realización, la porción de agrupación de carbohidrato comprende 4 grupos GalNAc y se denomina "GalNAc4". Las porciones de agrupaciones de carbohidratos específicos (que tienen grupos conectores conjugados, de ramificación y de anclaje específicos) se describen en el presente documento y se designan por números romanos seguidos del subíndice "a". En consecuencia, "GalNac3-1a" se refiere a una porción de agrupación de carbohidrato específica de un grupo conjugado que tiene 3 grupos GalNac y grupos de anclaje, ramificación y de enlace específicamente identificados. Dicho fragmento de agrupación de carbohidrato se une a un compuesto oligomérico por medio de un resto escindible, tal como un enlace escindible o nucleósido escindible.
"Compuesto conjugado" quiere decir cualquier átomo, grupo de átomos o grupo de átomos enlazados adecuado para su uso como grupo conjugado. En determinados modos de realización, los compuestos conjugados pueden poseer o impartir una o más propiedades, incluyendo, pero sin limitarse a, propiedades farmacodinámicas, farmacocinéticas, de unión, absorción, distribución celular, captación celular, carga y/o eliminación.
"Nucleósido de etilo restringido" (también nucleósido cEt) quiere decir un nucleósido que comprende un resto glucídico bicíclico que comprende un puente 4'-CH(CH3)-O-2'.
"Factor B del complemento (CFB)" quiere decir cualquier ácido nucleico o proteína de CFB. "Ácido nucleico de CFB" quiere decir cualquier ácido nucleico que codifica CFB. Por ejemplo, en determinados modos de realización, un ácido nucleico de CFB incluye una secuencia de ADN que codifica CFB, una secuencia de ARN transcrita a partir de ADN que codifica CFB (incluyendo ADN genómico que comprende intrones y exones), incluyendo una secuencia de a Rn que no codifica proteínas (es decir, no codificante) y una secuencia de ARNm que codifica CFB. "ARNm de CFB" quiere decir un ARNm que codifica una proteína de CFB.
"Inhibidor específico de CFB" se refiere a cualquier agente que puede inhibir específicamente la actividad o expresión de ARN de CFB y/o proteína de CFB a nivel molecular. Por ejemplo, los inhibidores específicos de CFB incluyen ácidos nucleicos (incluyendo compuestos antisentido), péptidos, anticuerpos, moléculas pequeñas y otros agentes que pueden inhibir la expresión de ARN de CFB y/o proteína de CFB.
"Región químicamente distinta" se refiere a una región de un compuesto antisentido que es de alguna manera químicamente diferente de otra región del mismo compuesto antisentido. Por ejemplo, una región que tiene 2'-O-metoxietil-nucleótidos es químicamente distinta de una región que tiene nucleótidos sin modificaciones de 2'-O-metoxietilo.
"Compuestos antisentido quiméricos" quiere decir compuestos antisentido que tienen al menos 2 regiones químicamente distintas, teniendo cada posición una pluralidad de subunidades.
"Complementariedad" quiere decir la capacidad de emparejamiento entre nucleobases de un primer ácido nucleico y un segundo ácido nucleico.
Se entenderá que "comprender", "comprende" y "comprendiendo" implican la inclusión de una etapa o elemento o grupo de etapas o elementos establecidos, pero no la exclusión de cualquier otra etapa o elemento o grupo de etapas o elementos.
"Nucleobases contiguas" quiere decir nucleobases inmediatamente adyacentes entre sí.
"Desoxinucleósido" quiere decir un nucleósido que comprende un resto glucídico 2'-H furanosilo, como se encuentra en desoxirribonucleósidos (ADN) naturales. En determinados modos de realización, un 2'-desoxinucleósido puede comprender una nucleobase modificada o puede comprender una nucleobase de ARN (por ejemplo, uracilo).
"Desoxirribonucleótido" quiere decir un nucleótido que tiene un hidrógeno en la posición 2' de la porción glucídica del nucleótido. Los desoxirribonucleótidos se pueden modificar con cualquiera de una variedad de sustituyentes.
"Diseño" o "diseñado para" se refiere al proceso de diseño de un compuesto oligomérico que se hibrida específicamente con una molécula de ácido nucleico seleccionada.
"Modificado de manera diferente" quiere decir modificaciones químicas o sustituyentes químicos que son diferentes entre sí, incluyendo ausencia de modificaciones. Por tanto, por ejemplo, un nucleósido MOE y un nucleósido de ADN no modificado están "modificados de manera diferente", aunque el nucleósido de ADN no esté modificado. Asimismo, ADN y ARN están "modificados de manera diferente", aunque ambos son nucleósidos no modificados naturales. Los nucleósidos que son iguales pero que comprenden diferentes nucleobases no están modificados de manera diferente. Por ejemplo, un nucleósido que comprende un glúcido 2'-OMe modificado y una nucleobase de adenina no modificada y un nucleósido que comprende un glúcido 2'-OMe modificado y una nucleobase de timina no modificada no están modificados de manera diferente.
"Bicatenario" se refiere a dos compuestos oligoméricos separados que se hibridan entre sí. Dichos compuestos bicatenarios pueden tener uno o más nucleósidos no hibridantes en uno o ambos extremos de una o ambas hebras (protuberancias) y/o uno o más nucleósidos no hibridantes internos (emparejamientos erróneos) siempre que exista suficiente complementariedad para mantener la hibridación en condiciones fisiológicamente pertinentes.
"Cantidad eficaz" quiere decir la cantidad de agente farmacéutico activo suficiente para efectuar un resultado fisiológico deseado en un individuo que necesita el agente. La cantidad eficaz puede variar entre individuos dependiendo de la salud y el estado físico del individuo que se va a tratar, el grupo taxonómico de los individuos que se van a tratar, la formulación de la composición, evaluación de la afección médica del individuo y otros factores pertinentes.
"Eficacia" quiere decir la capacidad para producir un efecto deseado.
"Expresión" incluye todas las funciones por las que la información codificada de un gen se convierte en estructuras presentes y funcionales en una célula. Dichas estructuras incluyen, pero no se limitan a los productos de transcripción y traducción.
"Totalmente complementario" o "100 % complementario" quiere decir que cada nucleobase de un primer ácido nucleico tiene una nucleobase complementaria en un segundo ácido nucleico. En determinados modos de realización, un primer ácido nucleico es un compuesto antisentido y un ácido nucleico diana es un segundo ácido nucleico.
"Furanosilo" quiere decir una estructura que comprende un anillo de 5 miembros que comprende cuatro átomos de carbono y un átomo de oxígeno.
"Gápmero" quiere decir un compuesto antisentido quimérico en el que una región interna que tiene una pluralidad de nucleósidos que soportan la escisión por RNasa H se sitúa entre regiones externas que tienen uno o más nucleósidos, en el que los nucleósidos que comprenden la región interna son químicamente distintos del nucleósido o nucleósidos que comprenden las regiones externas. La región interna se puede denominar "hueco" y las regiones externas se pueden denominar "alas".
"Halo" y "halógeno" quieren decir un átomo seleccionado de flúor, cloro, bromo y yodo.
"Heteroarilo" y "heteroaromático" quieren decir un radical que comprende un anillo, sistema de anillo o sistema de anillo fusionado mono o policíclico aromático en el que al menos uno de los anillos es aromático e incluye uno o más heteroátomos. Heteroarilo también pretende incluir sistemas de anillo fusionado que incluyen sistemas donde uno o más de los anillos fusionados no contienen heteroátomos. Los grupos heteroarilo típicamente incluyen un átomo en el anillo seleccionado de azufre, nitrógeno u oxígeno. Los ejemplos de grupos heteroarilo incluyen sin limitación, piridinilo, piracinilo, pirimidinilo, pirrolilo, pirazolilo, imidazolilo, tiazolilo, oxazolilo, isooxazolilo, tiadiazolilo, oxadiazolilo, tiofenilo, furanilo, quinolinilo, isoquinolinilo, bencimidazolilo, benzooxazolilo, quinoxalinilo y similares. Los radicales heteroarilo se pueden unir a una molécula original directamente o a través de un resto de enlace tal como un grupo alifático o heteroátomo. Los grupos heteroarilo como se usa en el presente documento pueden incluir opcionalmente otros grupos sustituyentes.
"Hibridación" quiere decir la hibridación de moléculas de ácido nucleico complementarias. En determinados modos de realización, las moléculas de ácido nucleico complementarias incluyen, pero no se limitan a, un compuesto antisentido y una diana de ácido nucleico. En determinados modos de realización, las moléculas de ácido nucleico complementarias incluyen, pero no se limitan a, un oligonucleótido antisentido y una diana de ácido nucleico. "Identificar a un animal que tiene, o está en riesgo de tener, una enfermedad, trastorno y/o afección" quiere decir identificar a un animal que se ha diagnosticado con la enfermedad, trastorno y/o afección o identificar a un animal predispuesto a desarrollar la enfermedad, trastorno y/o afección. Dicha identificación se puede lograr por cualquier procedimiento, incluyendo evaluar los antecedentes médicos de un individuo y las pruebas o evaluaciones clínicas estándar.
"Inmediatamente adyacente" quiere decir que no hay elementos intermedios entre los elementos inmediatamente adyacentes.
"Individuo" quiere decir un animal humano o no humano seleccionado para un tratamiento.
"Inhibir la expresión o actividad" se refiere a una reducción, bloqueo de la expresión o actividad y no indica necesariamente una eliminación total de expresión o actividad.
"Enlace internucleosídico" se refiere al enlace químico entre nucleósidos.
"Grupo de enlace neutro internucleosídico" quiere decir un grupo de enlace neutro que enlaza directamente dos nucleósidos.
"Grupo de enlace de fósforo internucleosídico" quiere decir un grupo de enlace de fósforo que enlaza directamente dos nucleósidos.
Oligonucleótidos antisentido "alargados" son los que tienen uno o más nucleósidos adicionales en relación con un oligonucleótido antisentido divulgado en el presente documento.
"Motivo de enlace" quiere decir un patrón de modificaciones de enlace en un oligonucleótido o región del mismo. Los nucleósidos de dicho oligonucleótido pueden estar modificados o no modificados. A menos que se indique de otro modo, los motivos en el presente documento que describen solo enlaces pretenden ser motivos de enlace. Por tanto, en dichos casos, los nucleósidos no están limitados.
"Desoxinucleósido enlazado" quiere decir una base de ácido nucleico (A, G, C, T, U) sustituida por desoxirribosa enlazada por un éster de fosfato para formar un nucleótido.
"Nucleósidos enlazados" quiere decir nucleósidos adyacentes enlazados entre sí por un enlace intemudeosídico.
"Nucleósido de ácido nucleico bloqueado" o "LNA" quiere decir un nucleósido que comprende un resto glucídico bicíclico que comprende un puente 4-CH2-O-2'.
"Emparejamiento erróneo" o "nucleobase no complementaria" se refiere al caso en que una nucleobase de un primer ácido nucleico no se puede emparejar con la correspondiente nucleobase de un segundo ácido nucleico o ácido nucleico diana.
"Enlace internucleosídico modificado" se refiere a una sustitución o cualquier cambio de un enlace internucleosídico natural (es decir, un enlace internucleosídico fosfodiéster).
"Nucleobase modificada" quiere decir cualquier nucleobase distinta de adenina, citosina, guanina, timidina o uracilo. Una "nucleobase no modificada" quiere decir las bases purínicas adenina (A) y guanina (G), y las bases pirimidínicas timina (T), citosina (C) y uracilo (U).
"Nucleósido modificado" quiere decir un nucleósido que tiene, independientemente, un resto glucídico modificado y/o una nucleobase modificada.
"Nucleótido modificado" quiere decir un nucleótido que tiene, independientemente, un resto glucídico modificado, enlace internucleosídico modificado o nucleobase modificada.
"Oligonucleótido modificado" quiere decir un oligonucleótido que comprende al menos un enlace internucleosídico modificado, un glúcido modificado y/o una nucleobase modificada.
"Glúcido modificado" quiere decir sustitución y/o cualquier cambio de un resto glucídico natural.
"Modular" se refiere a cambiar o ajustar un rasgo característico en una célula, tejido, órgano u organismo. Por ejemplo, modular ARNm de CFB puede querer decir incrementar o disminuir el nivel de ARNm de CFB y/o proteína de CFB en una célula, tejido, órgano u organismo. Un "modulador" efectúa el cambio en la célula, tejido, órgano u organismo. Por ejemplo, un compuesto antisentido de CFB puede ser un modulador que disminuye la cantidad de ARNm de CFB y/o proteína de CFB en una célula, tejido, órgano u organismo.
"Monómero" se refiere a una sola unidad de un oligómero. Los monómeros incluyen, pero no se limitan a, nucleósidos y nucleótidos, ya sean naturales o modificados.
"Sistema de anillo mono o policíclico" pretende incluir todos los sistemas de anillo seleccionados de sistemas de anillo de radical único o policíclico en los que los anillos están fusionados o enlazados y pretende la inclusión de sistemas de anillo único y mixto seleccionados individualmente de alifático, alicíclico, arilo, heteroarilo, aralquilo, arilalquilo, heterocíclico, heteroarilo, heteroaromático y heteroarilalquilo. Dichas estructuras mono y policíclicas pueden contener anillos que tienen cada uno el mismo nivel de saturación o cada uno, independientemente, tiene grados variables de saturación incluyendo totalmente saturado, parcialmente saturado o totalmente insaturado. Cada anillo puede comprender átomos de anillo seleccionados de C, N, O y S para dar lugar a anillos heterocíclicos, así como anillos que comprenden solo átomos de anillo de C que pueden estar presentes en un motivo mixto tal como, por ejemplo, bencimidazol, en el que un anillo tiene solo átomos de anillo de carbono y el anillo fusionado tiene dos átomos de nitrógeno. El sistema de anillo mono o policíclico puede estar sustituido además con grupos sustituyentes tales como, por ejemplo, ftalimida que tiene dos grupos =O unidos a uno de los anillos. Los sistemas de anillo mono o policíclicos se pueden unir a moléculas originales usando diversas estrategias tales como directamente a través de un átomo del anillo, fusionado a través de múltiples átomos del anillo, a través de un grupo sustituyente o a través de un resto de enlace bifuncional.
"Motivo" quiere decir el patrón de nucleósidos no modificados y modificados en un compuesto antisentido.
"Resto glucídico natural" quiere decir un resto glucídico hallado en el ADN (2'-H) o ARN (2'-OH).
"Enlace internucleosídico natural" quiere decir un enlace fosfodiéster 3' a 5'.
"Grupo de enlace neutro" quiere decir un grupo de enlace que no se carga. Los grupos de enlace neutros incluyen sin limitación, fosfotriésteres, metilfosfonatos, MMI (-CH2-N(CH3)-O-), amida-3 (-CH2-C(=O)-N(H)-), amida-4 (-CH2-N(H)-C(=O)-), formacetal (-O-CH2-O-) y tioformacetal (-S-CH2-O-). Otros grupos de enlace neutros incluyen enlaces no iónicos que comprenden siloxano (dialquilsiloxano), éster de carboxilato, carboxamida, sulfuro, éster de sulfonato y amidas (véase por ejemplo: Carbohydrate Modifications in Antisense Research; Y.S. Sanghvi and P.D. Cook Eds. ACS Symposium Series 580; capítulos 3 y 4, (pp. 40-65)). Otros grupos de enlace neutros incluyen enlaces no iónicos que comprenden partes componentes de N, O, S y CH2 mixtas.
"Nucleobase no complementaria" se refiere a un par de nucleobases que no forman enlaces de hidrógeno entre sí ni soportan de otro modo la hibridación.
"Grupo de enlace neutro no internucleosídico" quiere decir un grupo de enlace neutro que no enlaza directamente dos nucleósidos. En determinados modos de realización, un grupo de enlace neutro no internucleosídico enlaza un nucleósido a un grupo distinto de un nucleósido. En determinados modos de realización, un grupo de enlace neutro no internucleosídico enlaza dos grupos, de los que ninguno es un nucleósido.
"Grupo de enlace de fósforo no internucleosídico" quiere decir un grupo de enlace de fósforo que no enlaza directamente dos nucleósidos. En determinados modos de realización, un grupo de enlace de fósforo no internucleosídico enlaza un nucleósido a un grupo distinto de un nucleósido. En determinados modos de realización, un grupo de enlace de fósforo no internucleosídico enlaza dos grupos, de los que ninguno es un nucleósido.
"Ácido nucleico" se refiere a moléculas compuestas por nucleótidos monoméricos. Un ácido nucleico incluye, pero no se limita a, ácidos ribonucleicos (ARN), ácidos desoxirribonucleicos (ADN), ácidos nucleicos monocatenarios y ácidos nucleicos bicatenarios.
"Nucleobase" quiere decir un resto heterocíclico que se puede emparejar con una base de otro ácido nucleico.
"Complementariedad de nucleobases" se refiere a una nucleobase que puede realizar emparejamiento de bases con otra nucleobase. Por ejemplo, en el ADN, adenina (A) es complementaria a timina (T). Por ejemplo, en el ARN, adenina (A) es complementaria a uracilo (U). En determinados modos de realización, nucleobase complementaria se refiere a una nucleobase de un compuesto antisentido que puede realizar emparejamiento de bases con una nucleobase de su ácido nucleico diana. Por ejemplo, si una nucleobase en una determinada posición de un compuesto antisentido puede formar enlaces de hidrógeno con una nucleobase en una determinada posición de un ácido nucleico diana, entonces se considera que la posición del enlace de hidrógeno entre el oligonucleótido y el ácido nucleico diana es complementaria en ese par de nucleobases.
"Motivo de modificación de nucleobase" quiere decir un patrón de modificaciones a nucleobases a lo largo de un oligonucleótido. A menos que se indique de otro modo, un motivo de modificación de nucleobase es independiente de la secuencia de nucleobase.
"Secuencia de nucleobases" quiere decir el orden de nucleobases contiguas independientemente de cualquier modificación de glúcido, enlace y/o nucleobase.
"Nucleósido" quiere decir una nucleobase enlazada a un glúcido.
"Mimético nucleosídico" incluye las estructuras usadas para reemplazar el glúcido o el glúcido y la base y no necesariamente el enlace en una o más posiciones de un compuesto oligomérico tales como, por ejemplo, miméticos nucleosídicos que tienen morfolino, ciclohexenilo, ciclohexilo, tetrahidropiranilo o miméticos glucídicos biciclo o triciclo, por ejemplo, unidades glucídicas distintas de furanosa. Los miméticos de nucleótidos incluyen las estructuras usadas para reemplazar el nucleósido y el enlace en una o más posiciones de un compuesto oligomérico tal como, por ejemplo, ácidos nucleicos peptídicos o morfolinos (morfolinos enlazados por -N(H)-C(=O)-O- u otro enlace distinto de fosfodiéster). El sustituto glucídico se superpone con el mimético nucleosídico de término ligeramente más amplio, pero pretende indicar solo el reemplazo de la unidad glucídica (anillo furanosa). Los anillos tetrahidropi ranilo proporcionados en el presente documento son ilustrativos de un ejemplo de un sustituto glucídico en el que el grupo glucídico furanosa se ha reemplazado con un sistema de anillo tetrahidropi ranilo. "Mimético" se refiere a grupos que se sustituyen por un glúcido, una nucleobase y/o un enlace internucleosídico. En general, se usa un mimético en lugar del glúcido o combinación de enlace glúcidointernucleósido, y la nucleobase se mantiene para la hibridación a una diana seleccionada.
"Motivo nucleosídico" quiere decir un patrón de modificaciones nucleosídicas en un oligonucleótido o una región del mismo. Los enlaces de dicho oligonucleótido pueden estar modificados o no modificados. A menos que se indique de otro modo, los motivos en el presente documento que describen solo nucleósidos pretenden ser motivos nucleosídicos. Por tanto, en dichos casos, los enlaces no están limitados.
"Nucleótido" quiere decir un nucleósido que tiene un grupo fosfato enlazado covalentemente a la porción glucídica del nucleósido.
"Compuesto oligomérico" quiere decir un polímero de subunidades monoméricas enlazadas que se puede hibridar a al menos una región de una molécula de ácido nucleico.
"Oligonucleósido" quiere decir un oligonucleótido en el que los enlaces internucleosídicos no contienen un átomo de fósforo.
"Oligonudeótido" quiere decir un polímero de nucleósidos enlazados, de los que cada uno puede estar modificado o no modificado, independientemente entre sí.
"Administración parenteral" quiere decir administración a través de inyección o infusión. Administración parenteral incluye administración subcutánea, administración intravenosa, administración intramuscular, administración intraarterial, administración intraperitoneal o administración intracraneal, por ejemplo, administración intratecal o intracerebroventricular.
"Composición farmacéutica" quiere decir una mezcla de sustancias adecuada para administrar a un individuo. Por ejemplo, una composición farmacéutica puede comprender uno o más agentes farmacéuticos activos y una solución acuosa estéril.
"Sales farmacéuticamente aceptables" quiere decir sales fisiológica y farmacéuticamente aceptables de compuestos antisentido, es decir, sales que conservan la actividad biológica deseada del oligonucleótido original y no confieren efectos toxicológicos no deseados al mismo.
"Enlace fosforotioato" quiere decir un enlace entre nucleósidos donde el enlace fosfodiéster se modifica reemplazando uno de los átomos de oxígeno que no forma puente con un átomo de azufre. Un enlace fosforotioato es un enlace internucleosídico modificado.
"Grupo de enlace de fósforo" quiere decir un grupo de enlace que comprende un átomo de fósforo. Los grupos de enlace de fósforo incluyen sin limitación, grupos que tienen la fórmula:
Figure imgf000012_0001
R J Wid
V
en la que:
Ra y Rd son cada uno, independientemente, O, S, CH2, NH, o NJ1 en la que J1 es alquilo C1-C6 o alquilo C1-C6 sustituido;
Rb es O S;
Rc es OH, SH, alquilo C1-C6, alquilo C1-C6 sustituido, alcoxi C1-C6, alcoxi C1-C6 sustituido, amino o amino sustituido; y
J1 es Rb es O o S.
Los grupos de enlace de fósforo incluyen sin limitación, fosfodiéster, fosforotioato, fosforoditioato, fosfonato, fosforamidato, fosforotioamidato, tionoalquilfosfonato, fosfotriésteres, tionoalquilfosfotriéster y boranofosfato.
"Porción" quiere decir un número definido de nucleobases contiguas (es decir, enlazadas) de un ácido nucleico. En determinados modos de realización, una porción es un número definido de nucleobases contiguas de un ácido nucleico diana. En determinados modos de realización, una porción es un número definido de nucleobases contiguas de un compuesto antisentido
"Prevenir" se refiere a retrasar o evitar la aparición, desarrollo o progresión de una enfermedad, trastorno o afección durante un período de tiempo de minutos a indefinidamente. Prevenir también quiere decir reducir el riesgo de desarrollar una enfermedad, trastorno o afección.
"Profármaco" quiere decir una forma inactiva o menos activa de un compuesto que, cuando se administra a un sujeto, se metaboliza para formar el compuesto activo o más activo (por ejemplo, fármaco).
"Cantidad profilácticamente eficaz" se refiere a una cantidad de un agente farmacéutico que proporciona un beneficio profiláctico o preventivo a un animal.
"Grupo protector" quiere decir cualquier compuesto o grupo protector conocido para los expertos en la técnica. Los ejemplos no limitantes de grupos protectores se pueden encontrar en "Protective Groups in Organic Chemistry", T. W. Greene, P. G. M. Wuts, ISBN 0-471-62301-6, John Wiley & Sons, Inc, New York.
"Región" se define como una porción del ácido nucleico diana que tiene al menos una estructura, función o característica identificable.
"Ribonucleótido" quiere decir un nucleótido que tiene un hidroxi en la posición 2' de la porción glucídica del nucleótido. Los ribonucleótidos se pueden modificar con cualquiera de una variedad de sustituyentes.
"Compuesto antisentido basado en RISC" quiere decir un compuesto antisentido en el que al menos parte de la actividad antisentido del compuesto antisentido es atribuible al complejo de silenciamiento inducido por ARN (RISC).
"Compuesto antisentido basado en RNasa H" quiere decir un compuesto antisentido en el que al menos parte de la actividad antisentido del compuesto antisentido es atribuible a la hibridación del compuesto antisentido con un ácido nucleico diana y posterior escisión del ácido nucleico diana por la RNasa H.
"Segmentos" se definen como porciones más pequeñas o subporciones de regiones dentro de un ácido nucleico diana.
"Regiones separadas" quiere decir porciones de un oligonucleótido en las que las modificaciones químicas o el motivo de las modificaciones químicas de cualquier porción vecina incluyen al menos una diferencia para permitir que las regiones separadas se distingan entre sí.
"Motivo de secuencia" quiere decir un patrón de nucleobases dispuestas a lo largo de un oligonucleótido o una porción del mismo. A menos que se indique de otro modo, un motivo de secuencia es independiente de las modificaciones químicas y por tanto, puede tener cualquier combinación de modificaciones químicas, incluyendo sin modificaciones químicas.
"Efectos secundarios" quiere decir enfermedades y/o afecciones fisiológicas atribuibles a un tratamiento distinto de los efectos deseados. En determinados modos de realización, los efectos secundarios incluyen reacciones en el sitio de inyección, anomalías en las pruebas de función hepática, anomalías de la función renal, toxicidad hepática, toxicidad renal, alteraciones del sistema nervioso central, miopatías y malestar general. Por ejemplo, un incremento en los niveles de aminotransferasa en suero puede indicar toxicidad hepática o anomalía de la función hepática. Por ejemplo, un incremento en los niveles de bilirrubina puede indicar toxicidad hepática o anomalía de la función hepática.
"Sitios", como se usa en el presente documento, se definen como posiciones de nucleobases únicas dentro de un ácido nucleico diana.
"Ralentiza la progresión" quiere decir disminución en el desarrollo de la dicha enfermedad.
"Específicamente hibridable" se refiere a un compuesto antisentido que tiene un grado suficiente de complementariedad entre un oligonucleótido antisentido y un ácido nucleico diana para inducir un efecto deseado, presentando al mismo tiempo efectos mínimos o nulos sobre los ácidos nucleicos distintos de diana en condiciones en las que se desea una unión específica, es decir, en condiciones fisiológicas en el caso de ensayos in vivo y tratamientos terapéuticos. "Condiciones de hibridación rigurosas" o "condiciones rigurosas" se refieren a condiciones en las que un compuesto oligomérico se hibridará a su secuencia diana, pero a un número mínimo de otras secuencias.
"Sujeto" quiere decir un animal humano o no humano seleccionado para tratamiento.
"Sustituyente" y "grupo sustituyente" quiere decir un átomo o grupo que reemplaza al átomo o grupo de un compuesto original mencionado. Por ejemplo, un sustituyente de un nucleósido modificado es cualquier átomo o grupo que difiere del átomo o grupo hallado en un nucleósido natural (por ejemplo, un sustituyente 2' modificado es cualquier átomo o grupo en la posición 2' de un nucleósido distinto de H u OH). Los grupos sustituyentes pueden estar protegidos o no protegidos. En determinados modos de realización, los compuestos de la presente divulgación tienen sustituyentes en una o en más de una posición del compuesto original. Los sustituyentes también pueden estar sustituidos además con otros grupos sustituyentes y pueden estar unidos directamente o por medio de un grupo de enlace tal como un grupo alquilo o hidrocarbilo, a un compuesto original.
Asimismo, como se usa en el presente documento, "sustituyente" en referencia a un grupo funcional químico quiere decir un átomo o grupo de átomos que difiere del átomo o grupo de átomos normalmente presente en el grupo funcional mencionado. En determinados modos de realización, un sustituyente reemplaza un átomo de hidrógeno del grupo funcional (por ejemplo, en determinados modos de realización, el sustituyente de un grupo metilo sustituido es un átomo o grupo distinto de hidrógeno que reemplaza uno de los átomos de hidrógeno de un grupo metilo no sustituido). A menos que se indique de otro modo, los grupos susceptibles para su uso como sustituyentes incluyen sin limitación, halógeno, hidroxilo, alquilo, alquenilo, alquinilo, acilo (-C(O)Raa), carboxilo (-C(O)O-Raa), grupos alifáticos, grupos alicíclicos, alcoxi, oxi sustituido (-O-Raa), arilo, aralquilo, radical heterocíclico, heteroarilo, heteroarilalquilo, amino (N(Rbb)(Rcc)), imino(=NRbb), amido (C(O)N(Rbb)(Rcc) o N(Rbb)C(O)Raa), acido (-N3), nitro (NO2), ciano (-CN), carbamido (OC(O)N(Rbb)(Rcc) o N(Rbb)C(O)ORaa), ureido (N(Rbb)C(O)N(Rbb)(Rcc)), tioureido (N(Rbb)C(S)N(Rbb)(Rcc)), guanidinilo (N(Rbb)C(=NRbb)-N(Rbb)(Rcc)), amidinilo (C(=NRbb)N(Rbb)(Rcc) o N(Rbb)C(=NRbb)(Raa)), tiol (-SRbb), sulfinilo (S(O)Rbb), sulfonilo (-S(O)2Rbb) y sulfonamidilo (-s(O)2N(Rbb)(Rcc) o N(Rbb)S(O)2Rbb). en los que cada Raa, Rbb y Rcc es, independientemente, H, un grupo funcional químico opcionalmente enlazado u otro grupo sustituyente con una lista preferente que incluye sin limitación, alquilo, alquenilo, alquinilo, alifático, alcoxi, acilo, arilo, aralquilo, heteroarilo, alicíclico, heterocíclico y heteroarilalquilo. Los sustituyentes seleccionados dentro de los compuestos descritos en el presente documento están presentes en un grado recursivo.
"Resto glucídico sustituido" quiere decir un furanosilo que no es un resto glucídico natural. Los restos glucídicos sustituidos incluyen, pero no se limitan a, furanosilos que comprenden sustituyentes en la posición 2', la posición 3', la posición 5' y/o la posición 4'. Determinados restos glucídicos sustituidos son restos glucídicos bicíclicos.
"Resto glucídico" quiere decir un resto glucídico natural o un resto glucídico modificado de un nucleósido.
"Motivo glucídico" quiere decir un patrón de modificaciones glucídicas en un oligonucleótido o una región del mismo.
"Sustituto glucídico" quiere decir una estructura que no comprende un furanosilo y que puede reemplazar el resto glucídico natural de un nucleósido, de modo que las subunidades nucleosídicas resultantes se pueden enlazar entre sí y/o unirse a otros nucleósidos para formar un compuesto oligomérico que se puede hibridar a un compuesto oligomérico complementario. Dichas estructuras incluyen anillos que comprenden un número de átomos diferente de furanosilo (por ejemplo, anillos de 4, 6 o 7 miembros); reemplazo del oxígeno de un furanosilo con un átomo distinto de oxígeno (por ejemplo, carbono, azufre o nitrógeno); o tanto un cambio en el número de átomos como un reemplazo del oxígeno. Dichas estructuras también pueden comprender sustituciones correspondientes a las descritas para restos glucídicos sustituidos (por ejemplo, sustitutos glucídicos bicíclicos carbocíclicos de 6 miembros que comprenden opcionalmente sustituyentes adicionales). Los sustitutos glucídicos también incluyen reemplazos glucídicos más complejos (por ejemplo, los sistemas sin anillo de ácido nucleico peptídico). Los sustitutos glucídicos incluyen sin limitación, morfolinos, ciclohexenilos y ciclohexitoles.
"Diana" se refiere a una proteína, con una modulación que se desea.
"Gen diana" se refiere a un gen que codifica una diana.
"Dirigido" quiere decir el proceso de diseño y selección de un compuesto antisentido que se hibridará específicamente a un ácido nucleico diana e inducirá un efecto deseado.
"Ácido nucleico diana", "ARN diana", "transcrito de ARN diana" y "ácido nucleico diana" quieren decir todos un ácido nucleico al que se pueden dirigir compuestos antisentido.
"Región diana" quiere decir una porción de un ácido nucleico diana al que se dirigen uno o más compuestos antisentido.
"Segmento diana" quiere decir la secuencia de nucleótidos de un ácido nucleico diana al que se dirige un compuesto antisentido. "Sitio diana 5'" se refiere al nucleótido más hacia 5' de un segmento diana. "Sitio diana 3'" se refiere al nucleótido más hacia 3' de un segmento diana.
"Grupo terminal" quiere decir uno o más átomos unidos a cualquiera, o ambos, del extremo 3' o el extremo 5' de un oligonucleótido. En determinados modos de realización, un grupo terminal es un grupo conjugado. En determinados modos de realización, un grupo terminal comprende uno o más nucleósidos de grupo terminal.
"Enlace internucleosídico terminal" quiere decir el enlace entre los dos últimos nucleósidos de un oligonucleótido o región definida del mismo.
"Cantidad terapéuticamente eficaz" quiere decir una cantidad de un agente farmacéutico que proporciona un beneficio terapéutico a un individuo.
"Tratar" se refiere a administrar una composición farmacéutica a un animal para efectuar una alteración o mejora de una enfermedad, trastorno o afección en el animal. En determinados modos de realización, una o más composiciones farmacéuticas se pueden administrar al animal.
Nucleobases "no modificadas" quieren decir las bases purínicas adenina (A) y guanina (G), y las bases pirimidínicas timina (T), citosina (C) y uracilo (U).
"Nucleótido no modificado" quiere decir un nucleótido compuesto de nucleobases, restos glucídicos y enlaces internucleosídicos naturales. En determinados modos de realización, un nucleótido no modificado es un nucleótido de ARN (es decir, p-D-ribonucleósidos) o un nucleótido de ADN (es decir, p-D-desoxirribonucleósido).
Determinados modos de realización
En la invención reivindicada, el compuesto comprende un oligonucleótido modificado y un grupo conjugado, en el que el oligonucleótido modificado consiste en de 16 a 30 nucleósidos enlazados que tienen una secuencia de nucleobases que comprende una cualquiera de SEQ ID NO: 198, 228, 237, 444, 448, 450, 453, 455, 549 y 598. En determinados modos de realización, un compuesto comprende un oligonucleótido modificado y un grupo conjugado, en el que el oligonucleótido modificado tiene una secuencia de nucleobases que consiste en una cualquiera de SEQ ID NO: 198, 228, 237, 444, 448, 450, 453, 455, 549, y 598.
En determinados modos de realización, cualquiera de los compuestos u oligonucleótidos anteriores puede comprender al menos un enlace internucleosídico modificado, al menos un glúcido modificado y/o al menos una nucleobase modificada.
Los compuestos u oligonucleótidos anteriores comprenden al menos un glúcido modificado. En determinados aspectos, al menos un glúcido modificado comprende un grupo 2'-O-metoxietilo. En determinados aspectos, al menos un glúcido modificado es un glúcido bicíclico, tal como un grupo 4'-CH(CH3)-O-2', un grupo 4'-CH2-O-2' o un grupo 4'-(CH2)2-O-2'.
En determinados aspectos, el oligonucleótido modificado comprende al menos un enlace internucleosídico modificado, tal como un enlace internucleosídico fosforotioato.
En determinados modos de realización, el oligonucleótido modificado comprende al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6 o 7 enlaces internucleosídicos fosfodiéster.
En determinados modos de realización, cada enlace internucleosídico del oligonucleótido modificado se selecciona de un enlace internucleosídico fosfodiéster y un enlace internucleosídico fosforotioato.
En determinados modos de realización, cada enlace internucleosídico del oligonucleótido modificado es un enlace fosforotioato.
En determinados modos de realización, cualquiera de los compuestos u oligonucleótidos anteriores comprende al menos una nucleobase modificada, tal como 5-metilcitosina.
En la invención reivindicada, el compuesto comprende un grupo conjugado y un oligonucleótido modificado que comprende:
un segmento de hueco que consiste en desoxinucleósidos enlazados;
un segmento de ala 5' que consiste en nucleósidos enlazados; y
un segmento de ala 3' que consiste en nucleósidos enlazados;
en el que el segmento de hueco se sitúa entre el segmento de ala 5' y el segmento de ala 3' y en el que cada nucleósido de cada segmento de ala comprende un glúcido modificado.
En determinados modos de realización, el oligonucleótido modificado tiene una secuencia de nucleobases que comprende o que consiste en la secuencia enumerada en SEQ ID NO: 198, 228, 237, 444, 448, 450, 453 o 455, en el que el oligonucleótido modificado comprende:
un segmento de hueco que consiste en diez desoxinucleósidos enlazados;
un segmento de ala 5' que consiste en cinco nucleósidos enlazados; y
un segmento de ala 3' que consiste en cinco nucleósidos enlazados;
en el que el segmento de hueco se sitúa entre el segmento de ala 5' y el segmento de ala 3', en el que cada nucleósido de cada segmento de ala comprende un glúcido 2'-O-metoxietilo; en el que cada enlace internucleosídico es un enlace fosforotioato y en el que cada citosina es una 5-metilcitosina.
En determinados modos de realización, un compuesto comprende o consiste en un oligonucleótido modificado monocatenario y un grupo conjugado, en el que el oligonucleótido modificado consiste en 20 nucleósidos enlazados que tienen una secuencia de nucleobases que consiste en la secuencia enumerada en SEQ ID NO: 198, 228, 237, 444, 448, 450, 453 o 455, en el que el oligonucleótido comprende:
un segmento de hueco que consiste en diez desoxinucleósidos enlazados;
un segmento de ala 5' que consiste en cinco nucleósidos enlazados; y
un segmento de ala 3' que consiste en cinco nucleósidos enlazados;
en el que el segmento de hueco se sitúa entre el segmento de ala 5' y el segmento de ala 3', en el que cada nucleósido de cada segmento de ala comprende un glúcido 2'-O-metoxietilo; en el que cada enlace internucleosídico es un enlace fosforotioato; y en el que cada citosina es una 5-metilcitosina.
En determinados modos de realización, el oligonucleótido modificado tiene una secuencia de nucleobases que comprende o que consiste en la secuencia enumerada en SEQ ID NO: 549, en el que el oligonucleótido modificado comprende
un segmento de hueco que consiste en diez desoxinucleósidos enlazados;
un segmento de ala 5' que consiste en tres nucleósidos enlazados; y
un segmento de ala 3' que consiste en tres nucleósidos enlazados;
en el que el segmento de hueco se sitúa entre el segmento de ala 5' y el segmento de ala 3', en el que cada nucleósido de cada segmento de ala comprende un glúcido cEt; en el que cada enlace internucleosídico es un enlace fosforotioato y en el que cada citosina es una 5-metilcitosina.
En determinados aspectos, el oligonucleótido modificado tiene una secuencia de nucleobases que comprende o que consiste en la secuencia enumerada en SEQ ID NO: 598, en el que el oligonucleótido modificado comprende un segmento de hueco que consiste en diez desoxinucleósidos enlazados;
un segmento de ala 5' que consiste en tres nucleósidos enlazados; y
un segmento de ala 3' que consiste en tres nucleósidos enlazados;
en el que el segmento de hueco se sitúa entre el segmento de ala 5' y el segmento de ala 3'; en el que el segmento de ala 5' comprende un glúcido 2'-O-metoxietilo, glúcido 2'-O-metoxietilo y glúcido cEt en la dirección 5' a 3'; en el que el segmento de ala 3' comprende un glúcido cEt, glúcido cEt y glúcido 2'-O-metoxietilo en la dirección 5' a 3'; en el que cada enlace internucleosídico es un enlace fosforotioato; y en el que cada citosina es una 5-metilcitosina. En cualquiera de los modos de realización anteriores, el compuesto u oligonucleótido puede ser al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 %, al menos un 99 % o 100 % complementario a un ácido nucleico que codifica CFB.
En la invención reivindicada, el compuesto u oligonucleótido es monocatenario.
En determinados modos de realización, el grupo conjugado se enlaza al oligonucleótido modificado en el extremo 5' del oligonucleótido modificado. En determinados modos de realización, el grupo conjugado se enlaza al oligonucleótido modificado en el extremo 3' del oligonucleótido modificado. En la invención reivindicada, el grupo conjugado comprende tres N-acetilgalactosaminas (GalNAc).
Determinados modos de realización incluyen composiciones que comprenden cualquiera de los compuestos de la invención que comprenden o consisten en un oligonucleótido modificado dirigido a CFB o una sal del mismo y un grupo conjugado, y al menos uno de un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable.
En determinados modos de realización, los compuestos o composiciones como se describe en el presente documento son eficaces en virtud de tener al menos una de CI50 in vitro de menos de 250 nM, menos de 200 nM, menos de 150 nM, menos de 100 nM, menos de 90 nM, menos de 80 nM, menos de 70 nM, menos de 65 nM, menos de 60 nM, menos de 55 nM, menos de 50 nM, menos de 45 nM, menos de 40 nM, menos de 35 nM, menos de 30 nM, menos de 25 nM o menos de 20 nM.
En determinados modos de realización, los compuestos o composiciones como se describe en el presente documento son altamente tolerables como se demuestra al tener al menos uno de un incremento en el valor de ALT o AST de no más de 4 veces, 3 veces o 2 veces en animales tratados con solución salina o un incremento en peso de hígado, bazo o riñón de no más de un 30 %, 20 %, 15 %, 12 %, 10 %, 5 % o 2 %. En determinados modos de realización, los compuestos o composiciones que se describe en el presente documento son altamente tolerables como se demuestra al no tener un incremento de ALT o AST sobre animales tratados con solución salina. En determinados modos de realización, los compuestos o composiciones como se describe en el presente documento son altamente tolerables como se demuestra al no tener un incremento en el peso de hígado, bazo o riñón sobre animales tratados con solución salina.
Determinados modos de realización proporcionan una composición que comprende el compuesto de cualquiera de los modos de realización mencionadas anteriormente o una sal del mismo y al menos uno de un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable. En determinados aspectos, la composición tiene una viscosidad menor de aproximadamente 40 centipoise (cP, 1 cP = 1 mPas), menor de aproximadamente 30 centipoise (cP), menor de aproximadamente 20 centipoise (cP), menor de aproximadamente 15 centipoise (cP), o menor de aproximadamente 10 centipoise (cP). En determinados aspectos, la composición que tiene cualquiera de las viscosidades mencionadas anteriormente comprende un compuesto proporcionado en el presente documento a una concentración de aproximadamente 100 mg/ml, aproximadamente 125 mg/ml, aproximadamente 150 mg/ml, aproximadamente 175 mg/ml, aproximadamente 200 mg/ml, aproximadamente 225 mg/ml, aproximadamente 250 mg/ml, aproximadamente 275 mg/ml o aproximadamente 300 mg/ml. En determinados aspectos, la composición que tiene cualquiera de las viscosidades y/o concentraciones de compuesto mencionadas anteriormente tiene una temperatura de temperatura ambiente o aproximadamente 20 °C, aproximadamente 21 °C, aproximadamente 22 °C, aproximadamente 23 °C, aproximadamente 24 °C, aproximadamente 25 °C, aproximadamente 26 °C, aproximadamente 27 °C, aproximadamente 28 °C, aproximadamente 29 °C o aproximadamente 30 °C.
En determinados modos de realización de la divulgación, un procedimiento para tratar, prevenir o mejorar una enfermedad asociada con la regulación incorrecta de la vía alternativa del complemento en un sujeto comprende administrar al sujeto un compuesto o composición descrito en el presente documento, tratando, previniendo o mejorando de este modo la enfermedad. En determinados aspectos, la vía alternativa del complemento se activa más de lo normal. En determinados modos de realización de la divulgación, un procedimiento para tratar, prevenir o mejorar una enfermedad asociada con la regulación incorrecta de la vía alternativa del complemento en un sujeto comprende administrar al sujeto un compuesto que comprende o que consiste en un oligonucleótido modificado y un grupo conjugado, en el que el oligonucleótido modificado consiste en de 10 a 30 nucleósidos enlazados y tiene una secuencia de nucleobases que comprende la secuencia de nucleobases de una cualquiera de SEQ ID NO: 6­ 808. En determinados modos de realización de la divulgación, un procedimiento para tratar, prevenir o mejorar una enfermedad asociada con la regulación incorrecta de la vía alternativa del complemento en un sujeto comprende administrar al sujeto un compuesto que comprende o que consiste en un oligonucleótido modificado y un grupo conjugado, en el que el oligonucleótido modificado consiste en de 10 a 30 nucleósidos enlazados que tienen una secuencia de nucleobases que comprende una cualquiera de SEQ ID NO: 198, 228, 237, 440, 444, 448, 450, 453, 455, 549 y 598. En determinados modos de realización de la divulgación, un procedimiento para tratar, prevenir o mejorar una enfermedad asociada con la regulación incorrecta de la vía alternativa del complemento en un sujeto comprende administrar al sujeto un compuesto que comprende o que consiste en ISIS 696844, ISIS 696845, ISIS 698969 o ISIS 698970.
En determinados modos de realización de la divulgación, un procedimiento para tratar, prevenir o mejorar la degeneración macular, tal como la degeneración macular senil (DMS) en un sujeto comprende administrar al sujeto un compuesto o composición descrito en el presente documento, tratando, previniendo o mejorando de este modo la DMS. En determinados aspectos, la vía alternativa del complemento se activa más de lo normal. En determinados aspectos, la DMS es DMS húmeda. En determinados aspectos, la DMS es DMS seca, tal como atrofia geográfica. En determinados modos de realización de la divulgación, un procedimiento para tratar, prevenir o mejorar la degeneración macular en un sujeto, tal como degeneración macular senil (DMS), DMS húmeda, DMS seca o atrofia geográfica comprende administrar al sujeto un compuesto que comprende o que consiste en un oligonucleótido modificado y un grupo conjugado, en el que el oligonucleótido modificado consiste en de 10 a 30 nucleósidos enlazados y tiene una secuencia de nucleobases que comprende la secuencia de nucleobases de una cualquiera de SEQ ID NO: 6-808. En determinados modos de realización de la divulgación, un procedimiento para tratar, prevenir o mejorar la degeneración macular, tal como degeneración macular senil (DMS), DMS húmeda, DMS seca o atrofia geográfica en un sujeto comprende administrar al sujeto un compuesto que comprende administrar al sujeto un compuesto que comprende o que consiste en un oligonucleótido modificado y un grupo conjugado, en el que el oligonucleótido modificado consiste en de 10 a 30 nucleósidos enlazados que tienen una secuencia de nucleobases que comprende una cualquiera de SEQ ID NO: 198, 228, 237, 440, 444, 448, 450, 453, 455, 549 y 598. En determinados modos de realización de la divulgación, un procedimiento para tratar, prevenir o mejorar la degeneración macular, tal como degeneración macular relacionada senil (DMS), DMS húmeda, DMS seca o atrofia geográfica en un sujeto comprende administrar al sujeto un compuesto que comprende o que consiste en ISIS 696844, ISIS 696845, ISIS 698969 o ISIS 698970. En determinados aspectos, el compuesto o composición se administra al sujeto por vía parenteral.
En determinados modos de realización de la divulgación, un procedimiento para tratar, prevenir o mejorar una nefropatía asociada con la regulación incorrecta de la vía alternativa del complemento en un sujeto comprende administrar al sujeto un compuesto o composición descrito en el presente documento, tratando, previniendo o mejorando de este modo la nefropatía. En determinados modos de realización de la divulgación, un procedimiento para tratar, prevenir o mejorar una nefropatía asociada con la regulación incorrecta de la vía alternativa del complemento en un sujeto comprende administrar al sujeto un compuesto que comprende o que consiste en un oligonucleótido modificado y un grupo conjugado, en el que el oligonucleótido modificado consiste en de 10 a 30 nucleósidos enlazados y tiene una secuencia de nucleobases que comprende la secuencia de nucleobases de una cualquiera de SEQ ID NO: 6-808. En determinados modos de realización de la divulgación, un procedimiento para tratar, prevenir o mejorar una nefropatía asociada con la regulación incorrecta de la vía alternativa del complemento en un sujeto comprende administrar al sujeto un compuesto que comprende o que consiste en un oligonucleótido modificado y un grupo conjugado, en el que el oligonucleótido modificado consiste en de 10 a 30 nucleósidos enlazados que tienen una secuencia de nucleobases que comprende una cualquiera de SEQ ID NO: 198, 228, 237, 440, 444, 448, 450, 453, 455, 549 y 598. En determinados modos de realización de la divulgación, un procedimiento para tratar, prevenir o mejorar una nefropatía asociada con la regulación incorrecta de la vía alternativa del complemento en un sujeto comprende administrar al sujeto un compuesto que comprende o que consiste en ISIS 696844, ISIS 696845, ISIS 698969 o ISIS 698970. En determinados aspectos, la vía alternativa del complemento se activa más de lo normal. En determinados aspectos, la nefropatía es nefritis lúpica, lupus eritematoso sistémico (LES), enfermedad por depósitos densos (e Dd ), glomerulonefritis C3 (C3GN), nefropatía CFHR5 o síndrome hemolítico urémico atípico (SHUa), o cualquier combinación de los mismos. En determinados aspectos, la nefropatía se asocia con depósitos de C3, tales como depósitos de C3 en el glomérulo. En determinados aspectos, la nefropatía se asocia con niveles de C3 circulantes menores de lo normal, tales como niveles de C3 en suero o plasma. En determinados aspectos, administrar el compuesto o composición reduce o inhibe la acumulación de niveles de C3 oculares, tales como niveles de proteína C3. En determinados aspectos, administrar el compuesto o composición reduce el nivel de depósitos de C3 oculares o inhibe la acumulación de depósitos de C3 oculares. En determinados aspectos, el compuesto o composición se administra al sujeto por vía parenteral. En determinados aspectos, administrar el compuesto o composición reduce o inhibe la acumulación de niveles de C3 en el riñón, tales como niveles de proteína C3. En determinados aspectos, administrar el compuesto o composición reduce el nivel de depósitos de C3 en el riñón o inhibe la acumulación de depósitos de c 3 en el riñón, tales como niveles de C3 en el glomérulo. En determinados aspectos, se identifica que el sujeto tiene o está en riesgo de tener una enfermedad asociada con la regulación incorrecta de la vía alternativa del complemento, por ejemplo, detectando niveles del complemento o niveles del complejo de ataque de membrana en la sangre del sujeto y/o realizando una prueba genética para detectar mutaciones génicas de factores del complemento asociadas con la enfermedad.
En determinados modos de realización de la divulgación, un procedimiento para inhibir la expresión del factor B del complemento (CFB) en un sujeto que tiene, o está en riesgo de tener, una enfermedad asociada con la regulación incorrecta de la vía alternativa del complemento comprende administrar un compuesto o composición descrito en el presente documento al sujeto, inhibiendo de este modo la expresión de CFB en el sujeto. En determinados modos de realización de la divulgación, un procedimiento para inhibir la expresión del factor B del complemento (CFB) en un sujeto que tiene, o está en riesgo de tener, una enfermedad asociada con la regulación incorrecta de la vía alternativa del complemento comprende administrar al sujeto un compuesto que comprende o que consiste en un oligonucleótido modificado y un grupo conjugado, en el que el oligonucleótido modificado consiste en de 10 a 30 nucleósidos enlazados y tiene una secuencia de nucleobases que comprende la secuencia de nucleobases de una cualquiera de SEQ ID NO: 6-808. En determinados modos de realización de la divulgación, un procedimiento para inhibir la expresión del factor B del complemento (CFB) en un sujeto que tiene, o está en riesgo de tener, una enfermedad asociada con la regulación incorrecta de la vía alternativa del complemento comprende administrar al sujeto un compuesto que comprende o que consiste en un oligonucleótido modificado y un grupo conjugado, en el que el oligonucleótido modificado consiste en de 10 a 30 nucleósidos enlazados que tienen una secuencia de nucleobases que comprende una cualquiera de SEQ ID NO: 198, 228, 237, 440, 444, 448, 450, 453, 455, 549 y 598. En determinados modos de realización de la divulgación, un procedimiento para inhibir la expresión del factor B del complemento (CFB) en un sujeto que tiene, o está en riesgo de tener, una enfermedad asociada con la regulación incorrecta de la vía alternativa del complemento comprende administrar al sujeto un compuesto que comprende o que consiste en ISIS 696844, ISIS 696845, ISIS 698969 o ISIS 698970. En determinados aspectos, administrar el compuesto o composición inhibe la expresión de CFB en el ojo. En determinados aspectos, el sujeto tiene, o está en riesgo de tener, degeneración macular senil (DMS), tal como DMS húmeda y DMS seca. En determinados aspectos, la DMS seca puede ser atrofia geográfica. La atrofia geográfica se considera una forma avanzada de d Ms seca que implica degeneración de la retina. En determinados aspectos, administrar el compuesto o composición inhibe la expresión de CFB en el riñón, tal como en el glomérulo. En determinados aspectos, el sujeto tiene, o está en riesgo de tener, nefritis lúpica, lupus eritematoso sistémico (LES), enfermedad por depósitos densos (EDD), glomerulonefritis C3 (C3GN), nefropatía CFHR5 o síndrome hemolítico urémico atípico (SHUa), o cualquier combinación de los mismos.
En determinados modos de realización de la divulgación, un procedimiento para reducir o inhibir la acumulación de depósitos de C3 en el ojo de un sujeto que tiene, o está en riesgo de tener, una enfermedad asociada con la regulación incorrecta de la vía alternativa del complemento comprende administrar un compuesto o composición descrito en el presente documento al sujeto, reduciendo o inhibiendo de este modo la acumulación de depósitos de C3 en el ojo del sujeto. En determinados modos de realización de la divulgación, un procedimiento para reducir o inhibir la acumulación de depósitos de C3 en el ojo de un sujeto que tiene, o está en riesgo de tener, una enfermedad asociada con la regulación incorrecta de la vía alternativa del complemento comprende administrar al sujeto un compuesto que comprende o que consiste en un oligonucleótido modificado y un grupo conjugado, en el que el oligonucleótido modificado consiste en de 10 a 30 nucleósidos enlazados y tiene una secuencia de nucleobases que comprende la secuencia de nucleobases de una cualquiera de SEQ ID NO: 6-808. En determinados modos de realización de la divulgación, un procedimiento para reducir o inhibir la acumulación de depósitos de C3 en el ojo de un sujeto que tiene, o está en riesgo de tener, una enfermedad asociada con la regulación incorrecta de la vía alternativa del complemento comprende administrar al sujeto un compuesto que comprende o que consiste en un oligonucleótido modificado y un grupo conjugado, en el que el oligonucleótido modificado consiste en de 10 a 30 nucleósidos enlazados que tienen una secuencia de nucleobases que comprende una cualquiera de SEQ ID NO: 198, 228, 237, 440, 444, 448, 450, 453, 455, 549 y 598. En determinados modos de realización de la divulgación, un procedimiento para reducir o inhibir la acumulación de depósitos de C3 en el ojo de un sujeto que tiene, o está en riesgo de tener, una enfermedad asociada con la regulación incorrecta de la vía alternativa del complemento comprende administrar al sujeto un compuesto que comprende o que consiste en ISIS 696844, ISIS 696845, ISIS 698969 o ISIS 698970. En determinados aspectos, el sujeto tiene, o está en riesgo de tener, degeneración macular senil (DMS), tal como DMS húmeda y DMS seca. En determinados aspectos, la DMS seca puede ser atrofia geográfica. En determinados aspectos, el compuesto o composición se administra al sujeto por vía parenteral.
En determinados modos de realización de la divulgación, un procedimiento para reducir o inhibir la acumulación de depósitos de C3 en el riñón de un sujeto que tiene, o está en riesgo de tener, una enfermedad asociada con la regulación incorrecta de la vía alternativa del complemento comprende administrar un compuesto o composición descrito en el presente documento al sujeto, reduciendo o inhibiendo de este modo la acumulación de depósitos de C3 en el riñón del sujeto. En determinados modos de realización de la divulgación, un procedimiento para reducir o inhibir la acumulación de depósitos de C3 en el riñón de un sujeto que tiene, o está en riesgo de tener, una enfermedad asociada con la regulación incorrecta de la vía alternativa del complemento comprende administrar al sujeto un compuesto que comprende o que consiste en un oligonucleótido modificado y un grupo conjugado, en el que el oligonucleótido modificado consiste en de 10 a 30 nucleósidos enlazados y tiene una secuencia de nucleobases que comprende la secuencia de nucleobases de una cualquiera de SEQ ID NO: 6-808. En determinados modos de realización de la divulgación, un procedimiento para reducir o inhibir la acumulación de depósitos de C3 en el riñón de un sujeto que tiene, o está en riesgo de tener, una enfermedad asociada con la regulación incorrecta de la vía alternativa del complemento comprende administrar al sujeto un compuesto que comprende o que consiste en un oligonucleótido modificado y un grupo conjugado, en el que el oligonucleótido modificado consiste en de 10 a 30 nucleósidos enlazados que tienen una secuencia de nucleobases que comprende una cualquiera de SEQ ID NO: 198, 228, 237, 440, 444, 448, 450, 453, 455, 549 y 598. En determinados modos de realización de la divulgación, un procedimiento para reducir o inhibir la acumulación de depósitos de C3 en el riñón de un sujeto que tiene, o está en riesgo de tener, una enfermedad asociada con la regulación incorrecta de la vía alternativa del complemento comprende administrar al sujeto un compuesto que comprende o que consiste en ISIS 696844, ISIS 696845, ISIS 698969 o ISIS 698970. En determinados aspectos, el sujeto tiene, o está en riesgo de tener, nefritis lúpica, lupus eritematoso sistémico (LES), enfermedad por depósitos densos (EDD), glomerulonefritis C3 (C3GN), nefropatía CFHR5 o síndrome hemolítico urémico atípico (SHUa), o cualquier combinación de los mismos. En determinados aspectos, el compuesto o composición se administra al sujeto por vía parenteral.
Determinados modos de realización de la divulgación se refieren al uso de un compuesto o composición descrito en el presente documento para tratar una enfermedad asociada con la regulación incorrecta de la vía alternativa del complemento. Determinados modos de realización de la divulgación se refieren al uso de un compuesto que comprende o que consiste en un oligonucleótido modificado y un grupo conjugado, en el que el oligonucleótido modificado consiste en de 10 a 30 nucleósidos enlazados y tiene una secuencia de nucleobases que comprende la secuencia de nucleobases de una cualquiera de SEQ ID NO: 6-808, para tratar una enfermedad asociada con la regulación incorrecta de la vía alternativa del complemento. Determinados modos de realización de la divulgación se refieren al uso de un compuesto que comprende o que consiste en un oligonucleótido modificado y un grupo conjugado, en el que el oligonucleótido modificado consiste en de 10 a 30 nucleósidos enlazados que tienen una secuencia de nucleobases que comprende una cualquiera de SEQ ID NO: 198, 228, 237, 440, 444, 448, 450, 453, 455, 549 y 598, para tratar una enfermedad asociada con la regulación incorrecta de la vía alternativa del complemento. Determinados modos de realización de la divulgación se refieren al uso de un compuesto que comprende o que consiste en ISIS 696844, ISIS 696845, ISIS 698969 o ISIS 698970 para tratar una enfermedad asociada con la regulación incorrecta de la vía alternativa del complemento. En determinados aspectos, la vía alternativa del complemento se activa más de lo normal. En determinados aspectos, la enfermedad es degeneración macular, tal como degeneración macular senil (DMS), que puede ser DMS húmeda o DMS seca. En determinados aspectos, la DMS seca puede ser atrofia geográfica. En determinados aspectos, la enfermedad es una nefropatía tal como nefritis lúpica, lupus eritematoso sistémico (LES), enfermedad por depósitos densos (EDD), glomerulonefritis C3 (C3GN), nefropatía CFHR5 o síndrome hemolítico urémico atípico (SHUa), o cualquier combinación. del mismo. En determinados aspectos, el compuesto o composición se administra al sujeto por vía parenteral.
En determinados modos de realización de la divulgación, un compuesto o composición descrito en el presente documento se administra por vía parenteral. Por ejemplo, en determinados modos de realización, el compuesto o composición se puede administrar a través de inyección o infusión. Administración parenteral incluye administración subcutánea, administración intravenosa, administración intramuscular, administración intraarterial, administración intraperitoneal o administración intracraneal, por ejemplo, administración intratecal o intracerebroventricular.
Compuestos antisentido
Los compuestos oligoméricos incluyen, pero no se limitan a, oligonucleótidos, oligonucleósidos, análogos oligonucleotídicos, miméticos oligonucleotídicos, compuestos antisentido, oligonucleótidos antisentido y ARNip. Un compuesto oligomérico puede ser "antisentido" con respecto a un ácido nucleico diana, lo que quiere decir que puede experimentar hibridación a un ácido nucleico diana a través de enlaces de hidrógeno.
En determinados modos de realización, un compuesto antisentido tiene una secuencia de nucleobases que, cuando se escribe en dirección 5' a 3', comprende el complemento inverso del segmento diana de un ácido nucleico diana al que se dirige.
En la invención reivindicada, el compuesto antisentido tiene una longitud de 16 a 30 subunidades. En determinados modos de realización, un compuesto antisentido tiene una longitud de 16 a 20 subunidades. En determinados modos de realización, un compuesto antisentido tiene una longitud de 17 a 30 subunidades. En determinados modos de realización, un compuesto antisentido tiene una longitud de 17 a 20 subunidades. En determinados modos de realización, un compuesto antisentido tiene una longitud de 18 a 30 subunidades. En determinados modos de realización, un compuesto antisentido tiene una longitud de 18 a 21 subunidades. En determinados modos de realización, un compuesto antisentido tiene una longitud de 18 a 20 subunidades. En determinados modos de realización, un compuesto antisentido tiene una longitud de 20 a 30 subunidades. En otras palabras, dichos compuestos antisentido son de 16 a 30 subunidades, de 16 a 20 subunidades, de 17 a 30 subunidades, de 17 a 20 subunidades, de 18 a 30 subunidades, de 18 a 20 subunidades, de 18 a 21 subunidades, de 20 a 30 subunidades, o de 12 a 22 subunidades enlazadas, respectivamente. En determinados modos de realización, un compuesto antisentido tiene una longitud de 16 subunidades. En determinados modos de realización, un compuesto antisentido tiene una longitud de 17 subunidades. En determinados modos de realización, un compuesto antisentido tiene una longitud de 18 subunidades. En determinados modos de realización, un compuesto antisentido tiene una longitud de 19 subunidades. En determinados modos de realización, un compuesto antisentido tiene una longitud de 20 subunidades. En otros modos de realización, el compuesto antisentido tiene de 16 a 30, de 17 a 30, de 17 a 50, de 18 a 22, de 18 a 24, de 18 a 30, de 18 a 50, de 19 a 22, de 19 a 30, de 19 a 50 o de 20 a 30 subunidades enlazadas. En determinados de dichos modos de realización, los compuestos antisentido tienen una longitud de 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 o 30 subunidades enlazadas, o un intervalo definido por dos cualesquiera de los valores anteriores. En algunos modos de realización, el compuesto antisentido es un oligonucleótido antisentido y las subunidades enlazadas son nucleótidos.
En determinados modos de realización, los oligonucleótidos antisentido se pueden acortar o truncar. Por ejemplo, una única subunidad puede delecionar del extremo 5' (truncamiento en 5') o, de forma alternativa, del extremo 3' (truncamiento en 3'). Un compuesto antisentido acortado o truncado dirigido a un ácido nucleico de CFB puede tener dos subunidades delecionadas del extremo 5', o de forma alternativa puede tener dos subunidades delecionadas del extremo 3' del compuesto antisentido. De forma alternativa, los nucleósidos delecionados se pueden dispersar por todo el compuesto antisentido, por ejemplo, en un compuesto antisentido que tiene un nucleósido delecionado del extremo 5' y un nucleósido delecionado del extremo 3'.
Cuando una única subunidad adicional está presente en un compuesto antisentido alargado, la subunidad adicional se puede localizar en el extremo 5' o 3' del compuesto antisentido. Cuando dos o más subunidades adicionales están presentes, las subunidades añadidas pueden ser adyacentes entre sí, por ejemplo, en un compuesto antisentido que tiene dos subunidades añadidas al extremo 5' (adición en 5'), o de forma alternativa al extremo 3' (adición en 3'), del compuesto antisentido. De forma alternativa, las subunidades añadidas se pueden dispersar por todo el compuesto antisentido, por ejemplo, en un compuesto antisentido que tiene una subunidad añadida al extremo 5' y una subunidad añadida al extremo 3'.
Es posible incrementar o disminuir la longitud de un compuesto antisentido, tal como un oligonucleótido antisentido, y/o introducir bases de emparejamiento erróneo sin eliminar la actividad. Por ejemplo, en Woolf et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:7305-7309, 1992), se sometió a prueba una serie de oligonucleótidos antisentido de 13-25 nucleobases de longitud para determinar su capacidad de inducir la escisión de un ARN diana en un modelo de inyección de oocito. Los oligonucleótidos antisentido de 25 nucleobases de longitud con 8 u 11 bases de emparejamiento erróneo cerca de los extremos de los oligonucleótidos antisentido pudieron dirigir la escisión específica del ARNm diana, aunque en menor medida que los oligonucleótidos antisentido que no contenían emparejamientos erróneos. De forma similar, se logró la escisión específica de diana usando oligonucleótidos antisentido de 13 nucleobases, incluyendo los de 1 o 3 emparejamientos erróneos.
Gautschi et al. (J. Natl. Cáncer Inst. 93:463-471, marzo de 2001) demostraron la capacidad de un oligonucleótido que tiene un 100 % de complementariedad con el ARNm de bcl-2 y que tiene 3 emparejamientos erróneos con el ARNm de bcl-xL para reducir la expresión tanto de bcl-2 como de bcl-xL in vitro e in vivo. Además, este oligonucleótido demostró una potente actividad antitumoral in vivo.
Maher y Dolnick (Nuc. Acid. Res. 16:3341-3358,1988) sometieron a prueba una serie de oligonucleótidos antisentido de 14 nucleobases en tándem, y oligonucleótidos antisentido de 28 y 42 nucleobases compuestos de la secuencia de dos o tres de los oligonucleótidos antisentido en tándem, respectivamente, para determinar su capacidad para detener la traducción de DHFR humano en un ensayo de reticulocitos de conejo. Cada uno de los tres oligonucleótidos antisentido de 14 nucleobases por sí solo pudo inhibir la traducción, aunque a un nivel más moderado que los oligonucleótidos antisentido de 28 o 42 nucleobases.
Determinados motivos de compuestos antisentido y mecanismos
En determinados modos de realización, los compuestos antisentido tienen subunidades modificadas químicamente dispuestas en patrones, o motivos, para conferir a los compuestos antisentido propiedades tales como potenciación en la actividad inhibidora, incremento en la afinidad de unión por un ácido nucleico diana o resistencia a la degradación por nucleasas in vivo.
Los compuestos antisentido quiméricos típicamente contienen al menos una región modificada para conferir un incremento en la resistencia a la degradación por nucleasas, incremento en la captación celular, incremento en la afinidad de unión por el ácido nucleico diana y/o incremento en la actividad inhibidora. Una segunda región de un compuesto antisentido quimérico puede conferir otra propiedad deseada, por ejemplo, servir como sustrato para la endonucleasa celular RNasa H, que escinde la hebra de ARN de un dúplex ARN:ADN.
La actividad antisentido puede resultar de cualquier mecanismo que implica la hibridación del compuesto antisentido (por ejemplo, oligonucleótido) con un ácido nucleico diana, en el que la hibridación finalmente da como resultado un efecto biológico. En determinados modos de realización, se modula la cantidad y/o actividad del ácido nucleico diana. En determinados modos de realización, se reduce la cantidad y/o actividad del ácido nucleico diana. En determinados modos de realización, la hibridación del compuesto antisentido al ácido nucleico diana finalmente da como resultado la degradación del ácido nucleico diana. En determinados modos de realización, la hibridación del compuesto antisentido al ácido nucleico diana no da como resultado la degradación del ácido nucleico diana. En determinados de dichos modos de realización, la presencia del compuesto antisentido hibridado con el ácido nucleico diana (ocupación) da como resultado una modulación de la actividad antisentido. En determinados modos de realización, los compuestos antisentido que tienen un motivo químico particular o patrón de modificaciones químicas son particularmente adecuados para explotar uno o más mecanismos. En determinados modos de realización, los compuestos antisentido funcionan a través de más de un mecanismo y/o a través de mecanismos que no se han dilucidado. En consecuencia, los compuestos antisentido descritos en el presente documento no están limitados por un mecanismo particular.
Los mecanismos antisentido incluyen, sin limitación, antisentido mediado por RNasa H; mecanismos de ARNi, que utilizan la vía RISC e incluyen, sin limitación, mecanismos de ARNip, ARNmc y microARN; y mecanismos basados en ocupación. Determinados compuestos antisentido pueden actuar a través de más de uno de dichos y/o a través de mecanismos adicionales.
Antisentido mediado por RNasa H
En determinados modos de realización, la actividad antisentido resulta al menos en parte de la degradación del ARN diana por la RNasa H. La RNasa H es una endonucleasa celular que escinde la hebra de ARN de un dúplex ARN:ADN. Es conocido en la técnica que los compuestos antisentido monocatenarios que son "similares a ADN" provocan actividad RNasa H en células de mamífero. En consecuencia, los compuestos antisentido que comprenden al menos una porción de nucleósidos de ADN o similares a ADN pueden activar la RNasa H, lo que da como resultado la escisión del ácido nucleico diana. En determinados modos de realización, los compuestos antisentido que utilizan RNasa H comprenden uno o más nucleósidos modificados. En determinados modos de realización, dichos compuestos antisentido comprenden al menos un bloque de 1-8 nucleósidos modificados. En determinados de dichos modos de realización, los nucleósidos modificados no soportan la actividad de la RNasa H. En determinados modos de realización, dichos compuestos antisentido son gápmeros, como se describe en el presente documento. En determinados de dichos modos de realización, el hueco del gápmero comprende nucleósidos de ADN. En determinados de dichos modos de realización, el hueco del gápmero comprende nucleósidos similares a ADN. En determinados de dichos modos de realización, el hueco del gápmero comprende nucleósidos de ADN y nucleósidos similares a ADN.
Determinados compuestos antisentido que tienen un motivo gápmero se consideran compuestos antisentido quiméricos. En un gápmero, una región interna que tiene una pluralidad de nucleótidos que soporta la escisión por RNasa H se sitúa entre regiones externas que tienen una pluralidad de nucleótidos que son químicamente distintos de los nucleósidos de la región interna. En el caso de un oligonucleótido antisentido que tiene un motivo gápmero, el segmento de hueco en general sirve como sustrato para la escisión por endonucleasas, mientras que los segmentos de ala comprenden nucleósidos modificados. En determinados modos de realización, las regiones de un gápmero se diferencian por los tipos de restos glucídicos que comprende cada región distinta. Los tipos de restos glucídicos que se usan para diferenciar las regiones de un gápmero pueden incluir en algunos modos de realización p-D-ribonucleósidos, p-D-desoxirribonucleósidos, nucleósidos 2'-modificados (dichos nucleósidos 2'-modificados pueden incluir 2 '-MOe y 2-O-CH3, entre otros), y nucleósidos modificados con glúcidos bicíclicos (dichos nucleósidos modificados con glúcidos bicíclicos pueden incluir los que tienen un etilo restringido). En determinados modos de realización, los nucleósidos en las alas pueden incluir varios restos glucídicos modificados, incluyendo, por ejemplo, restos glucídicos 2'-MOE y bicíclicos tales como etilo restringido o LNA. En determinados modos de realización, las alas pueden incluir varios restos glucídicos modificados y no modificados. En determinados modos de realización, las alas pueden incluir varias combinaciones de nucleósidos 2'-MOE, restos glucídicos bicíclicos tales como nucleósidos de etilo restringido o nucleósidos LNA y 2'-desoxinucleósidos.
Cada región distinta puede comprender restos glucídicos uniformes, restos glucídicos variantes o alternos. El motivo ala-hueco-ala se describe con frecuencia como "X-Y-Z", donde "X" representa la longitud del ala 5', "Y" representa la longitud del hueco y "Z" representa la longitud del ala 3'. "X" y "Z" pueden comprender restos glucídicos uniformes, variantes o alternos. En determinados modos de realización, "X" e "Y" pueden incluir uno o más 2'-desoxinucleósidos. "Y" puede comprender 2'-desoxinucleósidos. Como se usa en el presente documento, un gápmero descrito como "X-Y-Z" tiene una configuración tal que el hueco se sitúa inmediatamente adyacente a cada una del ala 5' y el ala 3'. Por tanto, no existen nucleótidos intermedios entre el ala 5' y el hueco, o entre el hueco y el ala 3'. Cualquiera de los compuestos antisentido descritos en el presente documento puede tener un motivo gápmero. En determinados modos de realización, "X" y "Z" son iguales; en otros modos de realización son diferentes. En determinados modos de realización, "Y" tiene entre 8 y 15 nucleósidos. X, Y o Z puede ser cualquiera de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30 o más nucleósidos.
En determinados modos de realización, el compuesto antisentido dirigido a un ácido nucleico de CFB tiene un motivo gápmero en el que el hueco consiste en 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 o 16 nucleósidos enlazados.
En determinados modos de realización, el oligonucleótido antisentido tiene un motivo glucídico descrito por la fórmula A como sigue: (J)m-(B)n-(J)p-(B)r-(A)t-(D)g-(A)v-(B)w-(J)x-(B)y-(J)z
en la que:
cada A es independientemente un nucleósido 2'-sustituido;
cada B es independientemente un nucleósido bicíclico;
cada J es independientemente un nucleósido 2'-sustituido o un 2'-desoxinucleósido;
cada D es un 2'-desoxinucleósido;
m es 0-4; n es 0-2; p es 0-2; r es 0-2; t es 0-2; v es 0-2; w es 0-4; x es 0-2; y es 0-2; z es 0-4; g es 6-14; siempre que:
al menos uno de m, n y r sea distinto de 0;
al menos uno de w e y sea distinto de 0;
la suma de m, n, p, r y t sea de 2 a 5; y
la suma de v, w, x, y y z sea de 2 a 5.
Ácidos nucleicos diana, regiones diana y secuencias de nucleótidos
Las secuencias de nucleótidos que codifican el factor B del complemento (CFB) incluyen, sin limitación, las siguientes: n.° de acceso GENBANk NM_001710.5 (incorporado en el presente documento como SEQ ID NO: 1), n.° de acceso GENBANK NT_007592.15 truncado de los nucleótidos 31852000 a 31861000 (incorporado en el presente documento como SEQ ID NO: 2), n.° de acceso GENBANK NW_001116486.1 truncados de los nucleótidos 536000 a 545000 (incorporado en el presente documento como SEQ ID NO: 3), n.° de acceso GENBANK XM_001113553.2 (incorporado en el presente documento como SEQ ID NO: 4) o n.° de acceso GENBANK NM_008198.2 (incorporado en el presente documento como SEQ ID NO: 5).
Hibridación
En algunos modos de realización, la hibridación se produce entre un compuesto antisentido divulgado en el presente documento y un ácido nucleico de CFB. El mecanismo más común de hibridación implica enlaces de hidrógeno (por ejemplo, enlace de hidrógeno tipo Watson-Crick, Hoogsteen o Hoogsteen inverso) entre nucleobases complementarias de las moléculas de ácido nucleico.
Se puede producir hibridación en condiciones variables. Las condiciones rigurosas son dependientes de la secuencia y se determinan por la naturaleza y la composición de las moléculas de ácido nucleico que se van a hibridar.
Los procedimientos para determinar si una secuencia es específicamente hibridable a un ácido nucleico diana son bien conocidos en la técnica. En determinados modos de realización, los compuestos antisentido proporcionados en el presente documento son específicamente hibridables con un ácido nucleico de CFB.
Com plementariedad
Un compuesto antisentido y un ácido nucleico diana son complementarios entre sí cuando un número suficiente de nucleobases del compuesto antisentido puede formar enlaces de hidrógeno con las correspondientes nucleobases del ácido nucleico diana, de modo que se produzca un efecto deseado (por ejemplo, inhibición antisentido de un ácido nucleico diana, tal como un ácido nucleico de CFB).
Las nucleobases no complementarias entre un compuesto antisentido y un ácido nucleico de CFB se pueden tolerar siempre que el compuesto antisentido siga pudiendo hibridarse específicamente a un ácido nucleico diana. Además, un compuesto antisentido se puede hibridar sobre uno o más segmentos de un ácido nucleico de CFB de modo que los segmentos intermedios o adyacentes no se impliquen en el acontecimiento de hibridación (por ejemplo, una estructura de bucle, una estructura de horquilla o emparejamiento erróneo).
En determinados modos de realización, los compuestos antisentido proporcionados en el presente documento, o una porción especificada de los mismos, son, o son al menos, un 70 %, 80 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % complementarios a un ácido nucleico de CFB, una región diana, segmento diana o porción especificada de los mismos. El porcentaje de complementariedad de un compuesto antisentido con un ácido nucleico diana se puede determinar usando procedimientos habituales.
Por ejemplo, un compuesto antisentido en el que 18 de las 20 nucleobases del compuesto antisentido son complementarias a una región diana y, por lo tanto, se hibridarían específicamente, representarían un 90 por ciento de complementariedad. En este ejemplo, las nucleobases no complementarias restantes se pueden agrupar o intercalar con nucleobases complementarias y no necesitan ser contiguas entre sí o a nucleobases complementarias. Como tal, un compuesto antisentido que tiene una longitud de 18 nucleobases que tiene cuatro nucleobases no complementarias que se flanquean por dos regiones de complementariedad completa con el ácido nucleico diana tendría un 77,8 % de complementariedad global con el ácido nucleico diana. El porcentaje de complementariedad de un compuesto antisentido con una región de un ácido nucleico diana se puede determinar de forma rutinaria usando programas BLAST (herramientas de búsqueda de alineación local básica) y programas PowerBLAST conocidos en la técnica (Altschul et al., J. Mol. Biol., 1990, 215, 403 410; Zhang and Madden, Genome Res., 1997, 7, 649 656). El porcentaje de homología, identidad de secuencia o complementariedad se puede determinar, por ejemplo, por el programa Gap (Wisconsin Sequence Analysis Package, versión 8 para Unix, Genetics Computer Group, University Research Park, Madison Wis.), usando la configuración predeterminada, que usa el algoritmo de Smith y Waterman (Adv. Appl. Math., 1981, 2, 482489).
En determinados modos de realización, los compuestos antisentido proporcionados en el presente documento, o porciones especificadas de los mismos, son totalmente complementarios (es decir, 100 % complementarios) a un ácido nucleico diana, o porción especificada del mismo. Por ejemplo, un compuesto antisentido puede ser totalmente complementario a un ácido nucleico de CFB, o una región diana, o un segmento diana o secuencia diana del mismo. Como se usa en el presente documento, "totalmente complementario" quiere decir que cada nucleobase de un compuesto antisentido puede formar emparejamientos de bases precisos con las correspondientes nucleobases de un ácido nucleico diana. Por ejemplo, un compuesto antisentido de 20 nucleobases es totalmente complementario a una secuencia diana que tiene una longitud de 400 nucleobases, siempre que exista una correspondiente porción de 20 nucleobases del ácido nucleico diana que sea totalmente complementaria al compuesto antisentido. Totalmente complementario también se puede usar en referencia a una porción especificada del primer y/o el segundo ácido nucleico. Por ejemplo, una porción de 20 nucleobases de un compuesto antisentido de 30 nucleobases puede ser "totalmente complementaria" a una secuencia diana que tiene una longitud de 400 nucleobases. La porción de 20 nucleobases del oligonucleótido de 30 nucleobases es totalmente complementaria a la secuencia diana si la secuencia diana tiene una correspondiente porción de 20 nucleobases en la que cada nucleobase es complementaria a la porción de 20 nucleobases del compuesto antisentido. Al mismo tiempo, el compuesto antisentido de 30 nucleobases completo puede o no ser totalmente complementario a la secuencia diana, dependiendo de si las 10 nucleobases restantes del compuesto antisentido también son complementarias a la secuencia diana.
La localización de una nucleobase no complementaria puede estar en el extremo 5' o en el extremo 3' del compuesto antisentido. De forma alternativa, la nucleobase o nucleobases no complementarias pueden estar en una posición interna del compuesto antisentido. Cuando están presentes dos o más nucleobases no complementarias, pueden ser contiguas (es decir, estar enlazadas) o no contiguas. En un modo de realización, una nucleobase no complementaria se localiza en el segmento de ala de un oligonucleótido antisentido gápmero.
En determinados modos de realización, los compuestos antisentido que tienen, o tienen hasta, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 nucleobases de longitud comprenden no más de 4, no más de 3, no más de 2 o no más de 1 nucleobase(s) no complementaria(s) con respecto a un ácido nucleico diana, tal como un ácido nucleico de CFB, o una porción especificada del mismo.
En determinados modos de realización, los compuestos antisentido que tienen, o tienen hasta, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 o 30 nucleobases de longitud comprenden no más de 6, no más de 5, no más de 4, no más de 3, no más de 2, o no más de 1 nucleobase(s) no complementaria(s) en relación con un ácido nucleico diana, tal como un ácido nucleico de CFB, o una porción especificada del mismo.
Los compuestos antisentido en el presente documento también incluyen los que son complementarios a una porción de un ácido nucleico diana. Como se usa en el presente documento, "porción" se refiere a un número definido de nucleobases contiguas (es decir, enlazadas) dentro de una región o segmento de un ácido nucleico diana. Una "porción" también se puede referir a un número definido de nucleobases contiguas de un compuesto antisentido. En determinados modos de realización, los compuestos antisentido son complementarios a al menos una porción de 8 nucleobases de un segmento diana. En determinados modos de realización, los compuestos antisentido son complementarios a al menos una porción de 9 nucleobases de un segmento diana. En determinados modos de realización, los compuestos antisentido son complementarios a al menos una porción de 10 nucleobases de un segmento diana. En determinados modos de realización, los compuestos antisentido son complementarios a al menos una porción de 11 nucleobases de un segmento diana. En determinados modos de realización, los compuestos antisentido son complementarios a al menos una porción de 12 nucleobases de un segmento diana. En determinados modos de realización, los compuestos antisentido son complementarios a al menos una porción de 13 nucleobases de un segmento diana. En determinados modos de realización, los compuestos antisentido son complementarios a al menos una porción de 14 nucleobases de un segmento diana. En determinados modos de realización, los compuestos antisentido son complementarios a al menos una porción de 15 nucleobases de un segmento diana. También se contemplan compuestos antisentido que son complementarios a al menos una porción de 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 o más nucleobases de un segmento diana, o un intervalo definido por dos cualesquiera de estos valores.
Identidad
Los compuestos antisentido en el presente documento también pueden tener un porcentaje de identidad definido con una secuencia de nucleótidos particular, SEQ ID NO, o compuesto representado por un número Isis específico, o una porción del mismo. Como se usa en el presente documento, un compuesto antisentido es idéntico a la secuencia divulgada en el presente documento si tiene la misma capacidad de emparejamiento de nucleobases. Por ejemplo, un ARN que contiene uracilo en lugar de timidina en una secuencia de ADN divulgada se consideraría idéntico a la secuencia de ADN puesto que tanto uracilo como timidina se emparejan con adenina. También se contemplan versiones acortadas y alargadas de los compuestos antisentido descritos en el presente documento, así como compuestos que tienen bases no idénticas en relación con los compuestos antisentido en el presente documento. Las bases no idénticas pueden estar adyacentes entre sí o dispersarse por todo el compuesto antisentido. El porcentaje de identidad de un compuesto antisentido se calcula de acuerdo con el número de bases que tienen un apareamiento de bases idéntico en relación con la secuencia con la que se compara.
En determinados modos de realización, los compuestos antisentido, o porciones de los mismos, son al menos un 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idénticos a uno o más de los compuestos antisentido o SEQ ID NO, o una porción de los mismos, divulgados en el presente documento.
En determinados modos de realización, una porción del compuesto antisentido se compara con una porción de igual longitud del ácido nucleico diana. En determinados modos de realización, una porción de 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24 o 25 nucleobases se compara con una porción de igual longitud del ácido nucleico diana.
En determinados modos de realización, una porción del oligonucleótido antisentido se compara con una porción de igual longitud del ácido nucleico diana. En determinados modos de realización, una porción de 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 o 25 nucleobases se compara con una porción de igual longitud del ácido nucleico diana.
Modificaciones
Un nucleósido es una combinación base-glúcido. La porción de nucleobases (también conocida como base) del nucleósido es normalmente un resto de bases heterocíclico. Los nucleótidos son nucleósidos que incluyen además un grupo fosfato enlazado covalentemente a la porción glucídica del nucleósido. Para aquellos nucleósidos que incluyen un glúcido pentofuranosílico, el grupo fosfato se puede enlazar al resto hidroxilo 2', 3' o 5' del glúcido. Los oligonucleótidos se forman a través del enlace covalente de nucleósidos adyacentes entre sí, para formar un oligonucleótido polimérico lineal. Dentro de la estructura oligonucleotídica, comúnmente se hace referencia a los grupos fosfato como formadores de los enlaces internudeosídicos del oligonucleótido.
Las modificaciones para los compuestos antisentido engloban sustituciones o cambios en enlaces internudeosídicos, restos glucídicos o nucleobases. Los compuestos antisentido modificados a menudo son preferentes a las formas naturales debido a propiedades deseables tales como, por ejemplo, potenciación en la captación celular, potenciación en la afinidad por ácido nucleico diana, incremento en la estabilidad en presencia de nucleasas o incremento en la actividad inhibidora.
También se pueden emplear nucleósidos modificados químicamente para incrementar la afinidad de unión de un oligonucleótido antisentido acortado o truncado por su ácido nucleico diana. En consecuencia, a menudo se pueden obtener resultados comparables con compuestos antisentido más cortos que tienen dichos nucleósidos modificados químicamente.
Enlaces internudeosídicos modificados
El enlace internucleosídico natural de ARN y el ADN es un enlace fosfodiéster 3' a 5'. Los compuestos antisentido que tienen uno o más enlaces internudeosídicos modificados, es decir, no naturales, a menudo se seleccionan frente a los compuestos antisentido que tienen enlaces internudeosídicos naturales debido a propiedades deseables tales como, por ejemplo, potenciación en la captación celular, potenciación en la afinidad por ácidos nucleicos diana e incremento en la estabilidad en presencia de nucleasas.
Los oligonucleótidos que tienen enlaces internudeosídicos modificados incluyen enlaces internudeosídicos que conservan un átomo de fósforo así como enlaces internudeosídicos que no tienen un átomo de fósforo. Los fósforos representativos que contienen enlaces internudeosídicos incluyen, pero no se limitan a, fosfodiésteres, fosfotriésteres, metilfosfonatos, fosforamidato y fosforotioatos. Los procedimientos de preparación de enlaces que contienen fósforo y que no contienen fósforo son bien conocidos.
En determinados modos de realización, los compuestos antisentido dirigidos a un ácido nucleico de CFB comprenden uno o más enlaces internudeosídicos modificados. En determinados modos de realización, los enlaces internudeosídicos modificados son enlaces fosforotioato. En determinados modos de realización, cada enlace internucleosídico de un compuesto antisentido es un enlace internucleosídico fosforotioato.
En determinados modos de realización, los oligonucleótidos comprenden enlaces internudeosídicos modificados dispuestos a lo largo del oligonucleótido o región del mismo en un patrón definido o motivo de enlace internucleosídico modificado. En determinados modos de realización, los enlaces internudeosídicos se disponen en un motivo con huecos. En dichos modos de realización, los enlaces internudeosídicos en cada una de las dos regiones de ala son diferentes de los enlaces internudeosídicos en la región de hueco. En determinados modos de realización, los enlaces internudeosídicos en las alas son fosfodiéster y los enlaces internudeosídicos en el hueco son fosforotioato. El motivo nucleosídico se selecciona independientemente, por lo que dichos oligonucleótidos que tienen un motivo de enlace internucleosídico con huecos pueden tener o no un motivo nucleosídico con huecos y, si tienen un motivo nucleosídico con huecos, las longitudes de ala y hueco pueden ser o no iguales.
En determinados modos de realización, los oligonucleótidos comprenden una región que tiene un motivo de enlace internucleosídico alterno. En determinados modos de realización, los oligonucleótidos de la presente invención comprenden una región de enlaces internudeosídicos uniformemente modificados. En determinados de dichos modos de realización, el oligonucleótido comprende una región que se enlaza uniformemente por enlaces internudeosídicos fosforotioato. En determinados modos de realización, el oligonucleótido se enlaza uniformemente por fosforotioato. En determinados modos de realización, cada enlace internucleosídico del oligonucleótido se selecciona de fosfodiéster y fosforotioato. En determinados modos de realización, cada enlace internucleosídico del oligonucleótido se selecciona de fosfodiéster y fosforotioato y al menos un enlace internucleosídico es fosforotioato.
En determinados modos de realización, el oligonucleótido comprende al menos 6 enlaces internudeosídicos fosforotioato. En determinados modos de realización, el oligonucleótido comprende al menos 8 enlaces internucleosídicos fosforotioato. En determinados modos de realización, el oligonucleótido comprende al menos 10 enlaces internudeosídicos fosforotioato. En determinados modos de realización, el oligonucleótido comprende al menos un bloque de al menos 6 enlaces internudeosídicos fosforotioato consecutivos. En determinados modos de realización, el oligonucleótido comprende al menos un bloque de al menos 8 enlaces internudeosídicos fosforotioato consecutivos. En determinados modos de realización, el oligonucleótido comprende al menos un bloque de al menos 10 enlaces internudeosídicos fosforotioato consecutivos. En determinados modos de realización, el oligonucleótido comprende al menos un bloque de al menos 12 enlaces internudeosídicos fosforotioato consecutivos. En determinados de dichos modos de realización, al menos uno de dicho bloque se localiza en el extremo 3' del oligonucleótido. En determinados de dichos modos de realización, al menos uno de dicho bloque se localiza dentro de 3 nucleósidos del extremo 3' del oligonucleótido.
En determinados modos de realización, los oligonucleótidos comprenden uno o más enlaces metilfosfonato. En determinados modos de realización, los oligonucleótidos que tienen un motivo nucleosídico gápmero comprenden un motivo de enlace que comprende todos los enlaces fosforotioato excepto uno o dos enlaces metilfosfonato. En determinados modos de realización, un enlace metilfosfonato está en el hueco central de un oligonucleótido que tiene un motivo nucleosídico gápmero.
En determinados modos de realización, es deseable disponer el número de enlaces internucleosídicos fosforotioato y enlaces internucleosídicos fosfodiéster para mantener la resistencia a la nucleasa. En determinados modos de realización, es deseable disponer el número y posición de enlaces internucleosídicos fosforotioato y el número y posición de enlaces internucleosídicos fosfodiéster para mantener la resistencia a la nucleasa. En determinados modos de realización, el número de enlaces internucleosídicos fosforotioato puede disminuir y el número de enlaces internucleosídicos fosfodiéster se puede incrementar. En determinados modos de realización, el número de enlaces internucleosídicos fosforotioato puede disminuir y el número de enlaces internucleosídicos fosfodiéster se puede incrementar mientras todavía se mantiene la resistencia a la nucleasa. En determinados modos de realización, es deseable disminuir el número de enlaces internucleosídicos fosforotioato mientras se mantiene la resistencia a la nucleasa. En determinados modos de realización, es deseable incrementar el número de enlaces internucleosídicos fosfodiéster mientras se mantiene la resistencia a la nucleasa.
Restos glucídicos modificados
Los compuestos antisentido pueden contener opcionalmente uno o más nucleósidos en los que se ha modificado el grupo glúcido. Dichos nucleósidos modificados con glúcido pueden impartir una potenciación en la estabilidad por nucleasas, un incremento en la afinidad de unión o alguna otra propiedad biológica beneficiosa a los compuestos antisentido. En determinados modos de realización, los nucleósidos comprenden restos de anillo ribofuranosa modificados químicamente. Los ejemplos de anillos ribofuranosa modificados químicamente incluyen sin limitación, la adición de grupos sustituyentes (incluyendo grupos sustituyentes 5' y 2', puentes de átomos de anillo no germinales para formar ácidos nucleicos bicíclicos (BNA), reemplazo sustitución del átomo de oxígeno de anillo ribosilo con S, N(R) o C(R1)(R2) (R, R1 y R2 son cada uno independientemente H, alquilo C1-C12 o un grupo protector) y combinaciones de los mismos. Los ejemplos de glúcidos modificados químicamente incluyen nucleósido 2'-F-5'-metilo-sustituido (véase la solicitud internacional PCT WO 2008/101157 publicada el 21/8/08 para otros nucleósidos 5',2'-bis-sustituidos divulgados) o el reemplazo del átomo de oxígeno del anillo ribosilo con S con sustitución adicional en la posición 2' (véase la solicitud de patente de EE. UU. publicada US2005-0130923, publicada el 16 de junio de 2005) o, de forma alternativa, la sustitución en 5' de un BNA (véase la solicitud internacional PCT WO 2007/134181 publicada el 22/11/07 en la que LNA está sustituido con, por ejemplo, un grupo 5'-metilo o 5'-vinilo).
Los ejemplos de nucleósidos que tienen restos glucídicos modificados incluyen sin limitación nucleósidos que comprenden los grupos sustituyentes 5'-vinilo, 5'-metilo (R o S), 4'-S, 2'-F, 2-OCH3, 2-OCH2CH3, 2-OCH2CH2F y 2'-O(CH2)2OCH3. El sustituyente en la posición 2' también se puede seleccionar de alilo, amino, acido, tio, O-alilo, alquilo O-C1-C10, OCF3, OCH2F, O(CH2)2SCH3, O(CH2)2-O-N(Rm)(Rn), O-CH2-C(=O)-N(Rm)(Rn) y O-CH2-C(=O)-N(R1)-(CH2)2-N(Rm)(Rn), donde cada R1, Rm y Rn es, independientemente, H o alquilo C1-C10 sustituido o no sustituido.
Como se usa en el presente documento, "nucleósidos bicíclicos" se refiere a nucleósidos modificados que comprenden un resto glucídico bicíclico. Los ejemplos de nucleósidos bicíclicos incluyen sin limitación, nucleósidos que comprenden un puente entre los átomos de anillo ribosilo 4' y 2'. En determinados modos de realización, los compuestos antisentido proporcionados en el presente documento incluyen uno o más nucleósidos bicíclicos que comprenden un puente 4' a 2'. Los ejemplos de dichos nucleósidos bicíclicos con puente 4' a 2' incluyen pero no se limitan a una de las fórmulas: 4'-(CH2)-O-2' (LNA); 4'-(CH2)-S-2'; 4'-(CH2)2-O-2' (ENA); 4'-CH(CH3)-O-2' (también denominada etilo restringido o cEt) y 4'-CH(CH2OCH3)-O-2' (y análogos de la misma, véase la patente de EE. UU.
7.399.845, presentada el 15 de julio de 2008); 4 '-C(Ch 3)(c H3)-O-2' (y análogos de la misma, véase la solicitud internacional WO 2009/006478, publicada el 8 de enero de 2009); 4'-CH2-N(OCH3)-2' (y análogos de la misma, véase la solicitud internacional publicada WO/2008/150729, publicada el 11 de diciembre de 2008); 4-CH2-O-N(CH3)-2' (véase la solicitud de patente de EE. UU. publicada US2004-0171570, publicada el 2 de septiembre de 2004); 4'-CH2-N(R)-O-2', en la que R es H, alquilo C1-C12, o un grupo protector (véase la patente de EE. UU.
7.427.672, presentada el 23 de septiembre de 2008); 4'-CH2-C(H)(CH3)-2' (véase Zhou et al., J. Org. Chem., 2009, 74, 118-134); y 4'-CH2-C(=CH2)-2' (y análogos de la misma, véase la solicitud internacional publicada WO 2008/154401, publicada el 8 de diciembre de 2008).
También se pueden encontrar otros informes relacionados con nucleósidos bicíclicos en la literatura publicada (véase por ejemplo: Singh et al., Chem. Commun., 1998, 4, 455-456; Koshkin et al., Tetrahedron, 1998, 54, 3607­ 3630; Wahlestedt et al., Proc. Natl. Acad. Sei. U. S. A., 2000,97, 5633-5638; Kumar et al., Bioorg. Med. Chem. Lett., 1998, 8, 2219-2222; Singh et al., J. Org. Chem., 1998, 63, 10035-10039; Srivastava et al., J. Am. Chem. Soc., 2007,129(26) 8362-8379; Elayadi et al., Curr. Opinion Invest. Drugs, 2001, 2, 558-561; Braasch et al., Chem. Biol., 2001, 8, 1-7; y Orum et al., Curr. Opinion Mol. Ther., 2001, 3, 239-243; patentes de EE. UU. n.os 6.268.490; 6.525.191; 6.670.461; 6.770.748; 6.794.499; 7.034.133; 7.053.207; 7.399.845; 7.547.684; 8.530.640; y 7.696.345; publicaciones de patente de EE. UU. n.os US2008-0039618; US2009-0012281; patentes de EE. UU. n.os 61/026.995 y 61/097.787; solicitudes internacionales PCT publicadas; WO 2009/067647; WO 2011/017521; WO 2010/036698 WO 1999/014226; WO 2004/106356; WO 2005/021570; WO 2007/134181; WO 2008/150729; WO 2008/154401; y WO 2009/006478. Se puede preparar cada uno de los nucleósidos bicíclicos anteriores para que tengan una o más configuraciones glucídicas estereoquímicas incluyendo, por ejemplo, a-L-ribofuranosa y p-D-ribofuranosa (véase la solicitud internacional PCT PCT/DK98/00393, publicada el 25 de marzo de 1999 como WO 99/14226).
En determinados modos de realización, los restos glucídicos bicíclicos de nucleósidos de BNA incluyen, pero no se limitan a, compuestos que tienen al menos un puente entre la posición 4' y la 2' del resto glucídico de pentofuranosilo en el que dichos puentes comprenden independientemente 1 o de 2 a 4 grupos enlazados seleccionados independientemente de -[C(Ra)(Rb)]n-, -C(Ra)=C(Rb)-, -C(Ra)=N-, -C(=O )-, -C(=NRa)-, -C(=S)-, -O -, -Si(Ra)2-, -S(=O)x- y -N(Ra)-;
en los que:
x es 0, 1 o 2;
n es 1, 2, 3 o 4;
cada Ra y Rb es, independientemente, H, un grupo protector, hidroxilo, alquilo C1-C12, alquilo C1-C12 sustituido, alquenilo C2-C12, alquenilo C2-C12 sustituido, alquinilo C2-C12, alquinilo C2-C12 sustituido, arilo C5-C20, arilo C5-C20 sustituido, radical heterociclo, radical heterociclo sustituido, heteroarilo, heteroarilo sustituido, radical alicíclico C5-C7, radical alicíclico C5-C7 sustituido, halógeno, OJ1, NJ1J2, SJ1, N3, COOJ1, acilo (C(=O)-H), acilo sustituido, CN, sulfonilo (S(=O)2-J1), o sulfoxilo (S(=O)-J1); y
cada J1 y J2 es, independientemente, H, alquilo C1-C12, alquilo C1-C12 sustituido, alquenilo C2-C12, alquenilo C2-C12 sustituido, alquinilo C2-C12, alquinilo C2-C12 sustituido, arilo C5-C20, arilo C5-C20 sustituido, acilo (C(=O)-H), acilo sustituido, un radical heterociclo, un radical heterociclo sustituido, aminoalquilo C1-C12, aminoalquilo C1-C12 sustituido o un grupo protector.
En determinados modos de realización, el puente de un resto glucídico bicíclico es -[C(Ra)(Rb)]n-, -[C(Ra)(Rb)]n-O-, -C(RaRb)-N(R)-O- o -C(RaRb)-O-N(R)-. En determinados modos de realización, el puente es 4 '-Ch 2-2', 4'-(CH2)2-2', 4'-(CH2)3-2', 4'-CH2-O-2', 4'-(CH2)2-O-2', 4'-CH2-O-N(R)-2' y 4'-CH2-N(R)-O-2'- en el que cada R es, independientemente, H, un grupo protector o alquilo C1-C12.
En determinados modos de realización, los nucleósidos bicíclicos se definen además por su configuración isomérica. Por ejemplo, un nucleósido que comprende un puente 4'-2' metilen-oxi, puede estar en la configuración a-L o en la configuración p-D. Previamente, los BNA de a-L-metilenoxi (4'-CH2-O-2') se han incorporado en oligonucleótidos antisentido que mostraron actividad antisentido (Frieden et al., Nucleic Acids Research, 2003, 21, 6365-6372).
En determinados modos de realización, los nucleósidos bicíclicos incluyen, pero no se limitan a, (A) a-L-metilenoxi (4'-CH2-O-2') BNA, (B) p-D-metilenoxi (4'-CH2-O-2') BNA, (C) etilenoxi (4'-(CH2)2-O-2') BNA, (D) aminooxi (4'-CH2-O-N(R)-2') BNA, (E) oxiamino (4'-CH2-N(R)-O-2') BNA y (F) metil(metilenoxi) (4'-CH(CH3)-O-2') BNA, (G) metilentio (4'-CH2-S-2') BNA, (H) metilen-amino (4'-CH2-N(R)-2') BNA, (I) metil-carbocíclico (4'-CH2-CH(CH3)-2') BNA, (J) propilen-carbocíclico (4'-(CH2)3-2') BNA y (K) vinil-BNA como se representa a continuación:
Figure imgf000028_0001
En determinados modos de realización, se proporcionan nucleósidos bicíclicos que tienen la fórmula I:
Figure imgf000028_0002
Bx es un resto de base heterocíclico;
-Qa-Qb-Qc- es -CH2-N(Rc)-CH2-, -C(=O)-N(Rc)-CH2-, -CH2-O-N(Rc) -, -CH2-N(Rc)-O- o -N(Rc)-O-CH2;
Rc es alquilo C1-C12 o un grupo protector amino; y
Ta y Tb son cada uno, independientemente H, un grupo protector de hidroxilo, un grupo conjugado, un grupo de fósforo reactivo, un resto de fósforo o una unión covalente a un medio de soporte.
En determinados modos de realización, se proporcionan nucleósidos bicíclicos que tienen la fórmula II:
Figure imgf000028_0003
Bx es un resto de base heterocíclico;
Ta y Tb son cada uno, independientemente H, un grupo protector de hidroxilo, un grupo conjugado, un grupo de fósforo reactivo, un resto de fósforo o una unión covalente a un medio de soporte;
Za es alquilo C1-C6, alquenilo C2-C6, alquinilo C2-C6, alquilo C1-C6 sustituido, alquenilo C2-C6 sustituido, alquinilo C2-C6 sustituido, acilo, acilo sustituido, amida sustituida, tiol o tio sustituido.
En un modo de realización, cada uno de los grupos sustituidos está, independientemente, mono o polisustituido con grupos sustituyentes seleccionados independientemente de halógeno, oxo, hidroxilo, OJc, NJcJd, SJc, N3, OC(=X)Jc y NJeC(=X)NJcJd, en los que cada Jc, Jd y Je es, independientemente, H, alquilo C1-C6, o alquilo C1-C6 sustituido y X es O o NJc.
En determinados modos de realización, se proporcionan nucleósidos bicíclicos que tienen la fórmula III:
Figure imgf000029_0001
Bx es un resto de base heterocíclico;
Ta y Tb son cada uno, independientemente H, un grupo protector de hidroxilo, un grupo conjugado, un grupo de fósforo reactivo, un resto de fósforo o una unión covalente a un medio de soporte;
Zb es alquilo C1-C6, alquenilo C2-C6, alquinilo C2-C6, alquilo C1-C6 sustituido, alquenilo C2-C6 sustituido, alquinilo C2-C6 sustituido o acilo sustituido (C(=O)-).
En determinados modos de realización, se proporcionan nucleósidos bicíclicos que tienen la fórmula IV:
Figure imgf000029_0002
Bx es un resto de base heterocíclico;
Ta y Tb son cada uno, independientemente H, un grupo protector de hidroxilo, un grupo conjugado, un grupo de fósforo reactivo, un resto de fósforo o una unión covalente a un medio de soporte;
Rd es alquilo C1-C6, alquilo C1-C6 sustituido, alquenilo C2-C6, alquenilo C2-C6 sustituido, alquinilo C2-C6 o alquinilo C2-C6 sustituido;
cada qa, qb, qc y qd es, independientemente, H, halógeno, alquilo C1-C6, alquilo C1-C6 sustituido, alquenilo C2-C6, alquenilo C2-C6 sustituido, alquinilo C2-C6 o alquinilo C2-C6 sustituido, alcoxilo C2-C6, alcoxilo C1-C6 sustituido, acilo, acilo sustituido, aminoalquilo C1-C6 o aminoalquilo C1-C6 sustituido;
En determinados modos de realización, se proporcionan nucleósidos bicíclicos que tienen la Fórmula V:
Figure imgf000030_0001
en la que:
Bx es un resto de base heterocíclico;
Ta y Tb son cada uno, independientemente H, un grupo protector de hidroxilo, un grupo conjugado, un grupo de fósforo reactivo, un resto de fósforo o una unión covalente a un medio de soporte;
qa, qb, qe y qf son cada uno, independientemente, hidrógeno, halógeno, alquilo C1-C12, alquilo C1-C12 sustituido, alquenilo C2-C12, alquenilo C2-C12 sustituido, alquinilo C2-C12, alquinilo C2-C12 sustituido, alcoxi C1-C12, alcoxi C1-C12 sustituido, OJj, SJj, SOJj, SO2Jj, NJjJk, N3, CN, C(=O)OJj, C(=O)NJjJk, C(=O)Jj, O-C(=O)NJjJk, N(H)C(=NH)NJjJk, N(H)C(=O)NJjJk o N(H)C(=S)NJjJk;
o qe y qf juntos son =C(qg)(qh);
qg y qh son cada uno, independientemente, H, halógeno, alquilo C1-C12 o alquilo C1-C12 sustituido.
Se ha descrito la síntesis y preparación de los monómeros metilenoxi (4'-CH2-O-2') BNA adenina, citosina, guanina, 5-metil-citosina, timina y uracilo, junto con sus propiedades de oligomerización y reconocimiento de ácidos nucleicos (Koshkin et al., Tetrahedron, 1998, 54, 3607-3630). Los BNA y la preparación de los mismos también se describen en los documentos WO 98/39352 y WO 99/14226.
También se han preparado análogos de metilenoxi (4'-CH2-O-2') BNA y 2'-tio-BNA (Kumar et al., Bioorg. Med. Chem. Lett., 1998, 8, 2219-2222). También se ha descrito la preparación de análogos nucleosídicos bloqueados que comprenden dúplex de oligodesoxirribonucleótidos como sustratos para las ácido nucleico polimerasas (Wengel et al., WO 99/14226). Además, la síntesis de 2'-amino-BNA, un análogo oligonucleotídico de alta afinidad conformacionalmente restringido novedoso se ha descrito en la técnica (Singh et al., J. Org. Chem., 1998, 63, 10035-10039). Además, se han preparado 2'-amino- y 2'-metilamino-BNA y se ha informado previamente de la estabilidad térmica de sus dúplex con hebras de ARN y ADN complementarias.
En determinados modos de realización, se proporcionan nucleósidos bicíclicos que tienen la fórmula VI:
Figure imgf000030_0002
en la que:
Bx es un resto de base heterocíclico;
Ta y Tb son cada uno, independientemente H, un grupo protector de hidroxilo, un grupo conjugado, un grupo de fósforo reactivo, un resto de fósforo o una unión covalente a un medio de soporte;
cada qi qj, qk y q1 es, independientemente, H, halógeno, alquilo C1-C12, alquilo C1-C12 sustituido, alquenilo C2-C12, alquenilo C2-C12 sustituido, alquinilo C2-C12, alquinilo C2-C12 sustituido, alcoxilo C1-C12, alcoxilo C1-C12 sustituido, OJj, SJj, SOJj, SO2Jj, NJjJk, N3, CN, C(=O)OJj, C(=O)NJjJk, C(=O)Jj, O-C(=O)NJjJk, N(H)C(=NH)NJjJk, N(H)C(=O)NJjJk o N(H)C(=S)NJjJk; y
qi y qj o ql y qk juntos son =C(qg)(qh), en la que qg y qh son cada uno, independientemente, H, halógeno, alquilo C1C12 o alquilo C1-C12 sustituido.
Se han descrito un nucleósido bicíclico carbocíclico que tiene un puente 4'-(CH2)3-2' y el puente análogo de alquenilo 4'-CH=CH-CH2-2' (Freier et al., Nucleic Acids Research, 1997, 25(22), 4429-4443 y Albaek et al., J. Org. Chem., 2006, 71, 7731-7740). También se han descrito la síntesis y preparación de nucleósidos bicíclicos carbocíclicos junto con su oligomerización y estudios bioquímicos (Srivastava et al., J. Am. Chem. Soc., 2007, 129(26), 8362-8379).
Como se usa en el presente documento, "nucleósido bicíclico 4'-2'" o "nucleósido bicíclico 4' a 2'" se refiere a un nucleósido bicíclico que comprende un anillo furanosa que comprende un puente que conecta dos átomos de carbono del anillo furanosa conecta el átomo de carbono 2' y el átomo de carbono 4' del anillo glucídico.
Como se usa en el presente documento, "nucleósidos monocíclicos" se refiere a nucleósidos que comprenden restos glucídicos modificados que no son restos glucídicos bicíclicos. En determinados modos de realización, el resto glucídico, o el análogo de resto glucídico, de un nucleósido se puede modificar o sustituir en cualquier posición.
Como se usa en el presente documento, "glúcido 2'-modificado" quiere decir un glúcido furanosilo modificado en la posición 2'. En determinados modos de realización, dichas modificaciones incluyen sustituyentes seleccionados de: un haluro, incluyendo, pero sin limitarse a, alcoxi sustituido y no sustituido, tioalquilo sustituido y no sustituido, aminoalquilo sustituido y no sustituido, alquilo sustituido y no sustituido, alilo sustituido y no sustituido y alquinilo sustituido y no sustituido. En determinados modos de realización, las modificaciones en 2' se seleccionan de sustituyentes incluyendo, pero sin limitarse a: O[(CH2)nO]mCH3, O(CH2)nNH2, O(CH2)nCH3, O(CH2)nF, O(CH2)nONH2, OCH2C(=O)N(H)CH3, and O(CH2)nON[(CH2)nCHa]2, donde n y m son de 1 a aproximadamente 10. Otros grupos sustituyentes 2' también se pueden seleccionar de: alquilo C1-C12, alquilo sustituido, alquenilo, alquinilo, alcarilo, aralquilo, O-alcarilo u O-aralquilo, SH, SCH3, OCN, Cl, Br, CN, F, CF3, OCF3, SOCH3, SO2CH3, ONO2, NO2, N3, NH2, heterocicloalquilo, heterocicloalcarilo, aminoalquilamino, polialquilamino, sililo sustituido, un grupo de escisión de ARN, un grupo informador, un intercalador, un grupo para mejorar las propiedades farmacocinéticas, o un grupo para mejorar las propiedades farmacocinéticas de un compuesto antisentido, y otros sustituyentes que tienen propiedades similares. En determinados modos de realización, los nucleósidos modificados comprenden una cadena lateral 2'-MOE (Baker et al., J. Biol. Chem., 1997, 272, 11944-12000). Se ha descrito que dicha sustitución de 2'-MOE tiene una mejora en la afinidad de unión en comparación con nucleósidos no modificados y con otros nucleósidos modificados, tales como 2'-O-metilo, O-propilo y O-aminopropilo. También se ha demostrado que los oligonucleótidos que tienen el sustituyente 2'-MOE son inhibidores antisentido de la expresión génica con rasgos característicos prometedores para su uso in vivo (Martin, Helv. Chim. Acta, 1995, 78, 486-504; Altmann et al., Chimia, 1996, 50, 168-176; Altmann et al., Biochem. Soc. Trans., 1996, 24, 630-637; y Altmann et al., Nucleosides Nucleotides, 1997, 16, 917-926).
Como se usa en el presente documento, un "nucleósido de tetrahidropirano modificado" o "nucleósido de THP modificado" quiere decir un nucleósido que tiene un "glúcido" de tetrahidropirano de seis miembros sustituido en por el residuo pentofuranosilo en nucleósidos normales (un sustituto glucídico). Los nucleósidos de THP modificados incluyen, pero no se limitan a, lo que se denomina en la técnica ácido nucleico de hexitol (HNA), ácido nucleico de anitol (ANA), ácido nucleico de manitol (MNA) (véase Leumann, Bioorg. Med. Chem., 2002, 10, 841­ 854) o fluoro-HNA (F-HNA) que tiene un sistema de anillo tetrahidropirano como se ilustra a continuación:
Figure imgf000031_0001
En determinados modos de realización, se seleccionan sustitutos glucídicos que tienen la fórmula VII:
Figure imgf000031_0002
en la que independientemente para cada uno de dichos al menos un análogo nucleosídico de tetrahidropirano de fórmula VII:
Bx es un resto de base heterocíclico;
Ta y Tb son cada uno, independientemente, un grupo de enlace intemucleosídico que une el análogo nucleosídico de tetrahidropirano al compuesto antisentido o uno de Ta and Tb es un grupo de enlace internucleosídico que une el análogo nucleosídico de tetrahidropirano al compuesto antisentido y el otro de Ta and Tb es H, un grupo protector de hidroxilo, un grupo conjugado enlazado o un grupo terminal 5' o 3';
q-i, q2, q3, q4, q5, qa, y q7 son cada uno independientemente, H, alquilo C1-C6, alquilo C1-C6 sustituido, alquenilo C2-Ca, alquenilo C2-Ca sustituido, alquinilo C2-Ca o alquinilo C2-Ca sustituido; y cada uno de Ri y R2 se selecciona de hidrógeno, hidroxilo, halógeno, alcoxi sustituido o no sustituido, NJ1J2, SJi, N3, OC(=X)Ji, OC(=X)NJiJ2, NJ3C(=X)NJiJ2 y CN, en la que X es O, S o NJi y cada Ji, J2 y J3 es, independientemente, H o alquilo Ci-Ca.
En determinados modos de realización, se proporcionan los nucleósidos de THP modificados de fórmula VII en la que qi, q2, q3, q4, q5, qa, y q7 son cada uno H. En determinados modos de realización, al menos uno de qi, q2, q3, q4, q5, qa, y q7 es distinto de H. En determinados modos de realización, al menos uno de qi, q2, q3, q4, q5, qa, y q7 es metilo. En determinados modos de realización, se proporcionan nucleósidos de THP de fórmula VII en la que uno de R i y R 2 es fluoro. En determinados modos de realización, Ri es fluoro y R2 es H; Ri es metoxi y R2 es H, y Ri es metoxietoxi y R2 es H.
En determinados modos de realización, los sustitutos glucídicos comprenden anillos que tienen más de 5 átomos y más de un heteroátomo. Por ejemplo, se ha informado de nucleósidos que comprenden restos glucídicos morfolino y su uso en compuestos oligoméricos (véanse por ejemplo: Braasch et al., Biochemistry, 2002, 41, 4503-45i0; las patentes de e E. UU. 5.a98.a85; 5.ia a .3 i5; 5.i85.444; y 5.034.50a). Como se usa aquí, el término "morfolino" quiere decir un sustituto glucídico que tiene la siguiente fórmula:
Figure imgf000032_0001
En determinados modos de realización, las morfolinas se pueden modificar, por ejemplo, añadiendo o alterando diversos grupos sustituyentes de la estructura de morfolina anterior. Dichos sustitutos glucídicos se denominan en el presente documento "morfolinos modificados".
También se proporcionan combinaciones de modificaciones sin limitación, tales como nucleósidos 2'-F-5'-metilo--sustituidos (véase la solicitud internacional PCT WO 2008 /i0 ii57 publicada el 2i/8/08 para otros nucleósidos 5', 2'-bis-sustituidos divulgados) y el reemplazo del átomo de oxígeno del anillo ribosilo con S y sustitución adicional en la posición 2' (véase la solicitud de patente de EE.UU. US2005-0i30923, publicada el ia de junio de 2005) o de forma alternativa la sustitución en 5' de un ácido nucleico bicíclico (véase la solicitud internacional PCT WO 2 007 /i34 i8 i, publicada el 22 /ii/07 en la que un 4'-CH2-O-2'-nucleósido bicíclico está sustituido además en la posición 5' con un grupo 5'-metilo o 5'-vinilo). También se ha descrito la síntesis y preparación de nucleósidos bicíclicos carbocíclicos junto con su oligomerización y estudios bioquímicos (véase por ejemplo, Srivastava et al., J. Am. Chem. Soc. 2007, 129(26), 83a2-8379).
En determinados modos de realización, los compuestos antisentido comprenden uno o más nucleósidos de ciclohexenilo modificados, que es un nucleósido que tiene un ciclohexenilo de seis miembros en lugar del residuo pentofuranosilo en nucleósidos naturales. Los nucleósidos de ciclohexenilo modificados incluyen, pero no se limitan a, los descritos en la técnica (véanse, por ejemplo, la solicitud PCT publicada, de propiedad común, WO 20i0/03aa9a publicada el i0 de abril de 20i0, Robeyns et al., J. Am. Chem. Soc., 2008, 130(6), i979-i984; Horváth et al., Tetrahedron Letters, 2007, 48, 3a2i-3a23; Nauwelaerts et al., J. Am. Chem. Soc., 2007,129(30), 9340-9348; Gu et al., Nucleosides, Nucleotides & Nucleic Acids, 2005, 24(5-7), 993-998; Nauwelaerts et al., Nucleic Acids Research, 2005, 33(8), 2452-24a3; Robeyns et al., Acta Crystallographica, Section F: Structural Biology and Crystallization Communications, 2005, F61(6), 585-58a; Gu et al., Tetrahedron, 2004, 60(9), 2 i i i -2 i23 ; Gu et al., Oligonucleotides, 2003, 13(6), 479-489; Wang et al., J. Org. Chem., 2003, 68, 4499-4505; Verbeure et al., Nucleic Acids Research, 200i, 29(24), 494i-4947; Wang et al., J. Org. Chem., 200i, 66, 8478-82; Wang et al., Nucleosides, Nucleotides & Nucleic Acids, 200i, 20(4-7), 785-788; Wang et al., J. Am. Chem., 2000, 122, 8595-8a02; solicitud PCT publicada, documento WO 0a/047842; y solicitud PCT publicada WO 0i/049a87). Determinados nucleósidos de ciclohexenilo modificados tienen la fórmula X.
Figure imgf000033_0001
en la que independientemente para cada uno de dichos al menos un análogo nucleosídico de ciclohexenilo de fórmula X:
Bx es un resto de base heterocíclico;
T 3 y T4 son cada uno, independientemente, un grupo de enlace internucleosídico que une el análogo nucleosídico de ciclohexenilo a un compuesto antisentido o uno de T3 y T4 es un grupo de enlace internucleosídico que une el análogo nucleosídico de tetrahidropirano a un compuesto antisentido y el otro de T3 y T4 es H, un grupo protector de hidroxilo, un grupo conjugado enlazado o un grupo terminal 5' o 3'; y
q-i, q2 , q3, q4, q5 qa, q7, q8 y q9 son cada uno, independientemente, H, alquilo C1-C6 , alquilo C1-C6 sustituido, alquenilo C2 -C6 , alquenilo C2-Ca sustituido, alquinilo C2-Ca, alquinilo C2-Ca sustituido u otro grupo sustituyente glucídico.
Como se usa en el presente documento, "2'-modificado" o "2'-sustituido" se refiere a un nucleósido que comprende un glúcido que comprende un sustituyente en la posición 2' distinto de H u OH. Los nucleósidos 2'-modificados incluyen, pero no se limitan a, nucleósidos bicíclicos en los que el puente que conecta dos átomos de carbono del anillo glucídico conecta el carbono 2' y otro carbono del anillo glucídico; y nucleósidos con sustituyentes 2' distintos del puente, tales como alilo, amino, acido, tio, O-alilo, O-alquilo C1-C1 0 , -OCF 3 , O-(CH2)2-O-CH3, 2'-O(CH2)2SCH3, O-(CH2 )2-O-N(Rm)(Rn) o O-CH2-C(=O)-N(Rm)(Rn), donde cada Rm y Rn es, independientemente, H o alquilo C1-C10 sustituido o no sustituido. Los nucleósidos 2'-modificados pueden comprender además otras modificaciones, por ejemplo, en otras posiciones del glúcido y/o en la nucleobase.
Como se usa en el presente documento, "2'-F" se refiere a un nucleósido que comprende un glúcido que comprende un grupo fluoro en la posición 2' del anillo glucídico.
Como se usa en el presente documento, "2'-OMe" o "2'-OCH3" o "2'-O-metilo" cada uno se refiere a un nucleósido que comprende un glúcido que comprende un grupo -OCH3 en la posición 2' del anillo glucídico.
Como se usa en el presente documento, "2'-OMe" o "2 -OCH3" o "2'-O-metilo" cada uno se refiere a un nucleósido que comprende un glúcido que comprende un grupo -OCH3 en la posición 2' del anillo glucídico.
Como se usa en el presente documento, "MOE" o "2'-MOE" o "2 -OCH2 CH2 OCH3" o "2'-O-metoxietilo" cada uno se refiere a un nucleósido que comprende un glúcido que comprende un grupo -OCH2 CH2 OCH3 en la posición 2' del anillo glucídico.
Como se usa en el presente documento, "oligonucleótido" se refiere a un compuesto que comprende una pluralidad de nucleósidos enlazados. En determinados modos de realización, se modifica uno o más de la pluralidad de nucleósidos. En determinados modos de realización, un oligonucleótido comprende uno o más ribonucleósidos (ARN) y/o desoxirribonucleósidos (ADN).
También son conocidos en la técnica muchos otros sistemas de anillo sustitutos glucídicos biciclo y triciclo que se pueden usar para modificar nucleósidos para su incorporación en compuestos antisentido (véase, por ejemplo, el artículo de revisión: Leumann, Bioorg. Med. Chem., 2002, 10, 841-854). Dichos sistemas de anillo pueden experimentar diversas sustituciones adicionales para potenciar su actividad.
Los procedimientos para la preparación de glúcidos modificados son bien conocidos para los expertos en la técnica. Algunas patentes de EE. UU. representativas que enseñan la preparación de dichos glúcidos modificados incluyen sin limitación, US: 4.981.957; 5.118.800; 5.319.080; 5.359.044; 5.393.878; 5.446.137; 5.466.786; 5.514.785; 5.519.134; 5.567.811; 5.576.427; 5.591.722; 5.597.909; 5.610.300; 5.627.053; 5.639.873; 5.646.265; 5.670.633; 5.700.920; 5.792.847 y 6.600.032 y la solicitud internacional PCT/US2005/019219, presentada el 2 de junio de 2005 y publicada como WO 2005/121371 el 22 de diciembre de 2005.
En los nucleótidos que tienen fracciones glucídicas modificadas, las fracciones de nucleobase (naturales, modificadas o una combinación de las mismas) se mantienen para la hibridación con una diana de ácido nucleico apropiada.
En la invención reivindicada, los compuestos antisentido comprenden uno o más nucleósidos que tienen restos glucídicos modificados. En determinados modos de realización, el resto glucídico modificado es 2'-MOE. En determinados modos de realización, los nucleósidos 2'-MOE modificados se disponen en un motivo gápmero. En determinados modos de realización, el resto glucídico modificado es un nucleósido bicíclico que tiene un grupo puente (4'-CH(CH3)-O-2'). En determinados modos de realización, los nucleósidos (4'-CH(CH3)-O-2') modificados se disponen a lo largo de las alas de un motivo gápmero.
Nucleobases modificadas
Las modificaciones o sustituciones de nucleobases (o bases) son estructuralmente distinguibles de, pero funcionalmente intercambiables con, nucleobases naturales o sintéticas no modificadas. Las nucleobases tanto naturales como modificadas pueden participar en el enlace de hidrógeno. Dichas modificaciones de nucleobases pueden impartir estabilidad a la nucleasa, afinidad de unión o alguna otra propiedad biológica beneficiosa a los compuestos antisentido. Las nucleobases modificadas incluyen nucleobases sintéticas y naturales tales como, por ejemplo, 5-metilcitosina (5-me-C). Determinadas sustituciones de nucleobases, incluyendo sustituciones de 5-metilcitosina, son en particular útiles para incrementar la afinidad de unión de un compuesto antisentido por un ácido nucleico diana. Por ejemplo, se ha demostrado que las sustituciones de 5-metilcitosina incrementan la estabilidad del dúplex de ácido nucleico en 0,6-1,2 °C (Sanghvi, Y.S., Crooke, S.T. and Lebleu, B., eds., Antisense Research and Applications, CRC Press, Boca Raton, 1993, pp. 276-278).
Las nucleobases modificadas adicionales incluyen 5-hidroximetil-citosina, xantina, hipoxantina, 2-aminoadenina, 6-metil- y otros derivados alquílicos de adenina y guanina, 2-propil- y otros derivados alquílicos de adenina y guanina, 2-tiouracilo, 2-tiotimina y 2-tiocitosina, 5-halouracilo y citosina, 5-propinil-(-CEC-CH3) uracilo y citosina y otros derivados alquinílicos de bases pirimidínicas, 6-azo-uracilo, citosina y timina, 5-uracilo (pseudouracilo), 4-tiouracilo, 8-halo, 8-amino, 8-tiol, 8-tioalquil-, 8-hidroxil- y otras adeninas y guaninas 8-sustituidas, 5-halo en particular 5-bromo, 5-trifluorometil- y otros uracilos y citosinas 5-sustituidos, 7-metilguanina y 7-metiladenina, 2-F-adenina, 2-aminoadenina, 8-azaguanina y 8-azaadenina, 7-desazaguanina y 7-desazaadenina y 3-desazaguanina y 3-desazaadenina.
Los restos de base heterocíclicos también pueden incluir aquellos en los que la base purínica o pirimidínica se reemplaza con otros heterociclos, por ejemplo, 7-desaza-adenina, 7-desazaguanosina, 2-aminopiridina y 2-piridona. Las nucleobases que son en particular útiles para incrementar la afinidad de unión de compuestos antisentido incluyen pirimidinas 5-sustituidas, 6-azapirimidinas y purinas N-2, N-6 y O-6 sustituidas, incluyendo 2-aminopropiladenina, 5-propiniluracilo y 5-propinilcitosina.
En determinados modos de realización, los compuestos antisentido dirigidos a un ácido nucleico de CFB comprenden una o más nucleobases modificadas. En determinados modos de realización, los oligonucleótidos antisentido acortados o con huecos ensanchados dirigidos a un ácido nucleico de CFB comprenden una o más nucleobases modificadas. En determinados modos de realización, la nucleobase modificada es 5-metilcitosina. En determinados modos de realización, cada citosina es una 5-metilcitosina.
Compuestos antisentido conjugados
En determinados modos de realización, la presente divulgación proporciona compuestos antisentido conjugados. En determinados modos de realización, la presente divulgación proporciona compuestos antisentido conjugados que comprenden un oligonucleótido antisentido complementario a un transcrito de ácido nucleico. En determinados modos de realización, la presente divulgación proporciona procedimientos que comprenden poner en contacto una célula con un compuesto antisentido conjugado que comprende un oligonucleótido antisentido complementario a un transcrito de ácido nucleico. En determinados modos de realización, la presente divulgación proporciona procedimientos que comprenden poner en contacto una célula con un compuesto antisentido conjugado que comprende un oligonucleótido antisentido y reducir la cantidad o actividad de un transcrito de ácido nucleico en una célula.
El receptor de asialoglucoproteína (ASGP-R) se ha descrito previamente. Véase, por ejemplo, Park et al., PNAS vol. 102, No. 47, pp 17125-17129 (2005). Dichos receptores se expresan en las células hepáticas, en particular hepatocitos. Además, se ha demostrado que los compuestos que comprenden agrupaciones de tres ligandos N-acetilgalactosamina (GalNAc) se pueden unir al ASGP-R, dando como resultado la captación del compuesto en la célula. Véase, por ejemplo, Khorev et al., Bioorganic and Medicinal Chemistry, 16,9, pp 5216-5231 (mayo 2008). En consecuencia, los conjugados que comprenden dichas agrupaciones de GalNAc se han usado para facilitar la captación de determinados compuestos en células hepáticas, específicamente hepatocitos. Por ejemplo, se ha demostrado que determinados conjugados que contienen GalNAc incrementan la actividad de compuestos de ARNip dúplex en células hepáticas in vivo. En dichos casos, el conjugado que contiene GalNAc típicamente se une a la hebra de sentido del dúplex de ARNip. Puesto que la hebra de sentido se desecha antes de que la hebra de antisentido se hibride finalmente con el ácido nucleico diana, existe poca preocupación de que el conjugado interfiera con la actividad. Típicamente, el conjugado se une al extremo 3' de la hebra de sentido del ARNip. Véase, por ejemplo, la patente de EE. UU. 8.106.022. Determinados grupos conjugados descritos en el presente documento son más activos y/o más fáciles de sintetizar que los grupos conjugados descritos previamente.
En determinados modos de realización de la presente invención, los conjugados se unen a compuestos antisentido monocatenarios, incluyendo, pero sin limitarse a compuestos antisentido basados en RNasa H y compuestos antisentido que alteran el corte y empalme de un ácido nucleico diana pre-ARNm. En dichos modos de realización, el conjugado debe permanecer unido al compuesto antisentido lo suficiente para proporcionar un beneficio (mejora en la captación en las células), pero a continuación se debe escindir o bien no interferir de otro modo con las etapas posteriores necesarias para la actividad, tales como hibridación a un ácido nucleico diana e interacción con RNasa H o enzimas asociadas con el empalme o la modulación del empalme. Este equilibrio de propiedades es más importante en el establecimiento de compuestos antisentido monocatenarios que en compuestos de ARNip, donde el conjugado se puede unir simplemente a la hebra de sentido. En el presente documento se divulgan compuestos antisentido monocatenarios conjugados que tienen una mejora en la potencia en células hepáticas in vivo en comparación con el mismo compuesto antisentido que carece del conjugado. Dado el equilibrio requerido de propiedades para estos compuestos, dicha mejora en la potencia es sorprendente.
En determinados modos de realización, los grupos conjugados en el presente documento comprenden un resto escindible. Como se indica, sin querer limitarse por el mecanismo, es lógico que el conjugado deba permanecer en el compuesto lo suficiente para proporcionar una potenciación en la captación, pero después de eso, es deseable que una porción o, idealmente, todo el conjugado se escinda, liberando el compuesto original (por ejemplo, compuesto antisentido) en su forma más activa. En determinados modos de realización, el resto escindible es un nucleósido escindible. Dichos modos de realización aprovechan las nucleasas endógenas en la célula uniendo el resto del conjugado (la agrupación) al oligonucleótido antisentido a través de un nucleósido por medio de uno o más enlaces escindibles, tales como los de un enlace fosfodiéster. En determinados modos de realización, la agrupación se une al nucleósido escindible a través de un enlace fosfodiéster. En determinados modos de realización, el nucleósido escindible se une al oligonucleótido antisentido (compuesto antisentido) por un enlace fosfodiéster. En determinados modos de realización, el grupo conjugado puede comprender dos o tres nucleósidos escindibles. En dichos modos de realización, dichos nucleósidos escindibles se enlazan entre sí, al compuesto antisentido y/o a la agrupación por medio de enlaces escindibles (tales como los de un enlace fosfodiéster). Determinados conjugados en el presente documento no comprenden un nucleósido escindible y en su lugar comprenden un enlace escindible. Se muestra que esa escisión suficiente del conjugado del oligonucleótido se proporciona por al menos un enlace que es vulnerable a la escisión en la célula (un enlace escindible).
En determinados modos de realización, los compuestos antisentido conjugados son profármacos. Dichos profármacos se administran a un animal y finalmente se metabolizan a una forma más activa. Por ejemplo, los compuestos antisentido conjugados se escinden para retirar todo o parte del conjugado dando como resultado la forma activa (o más activa) del compuesto antisentido que carece de todo o parte del conjugado.
En determinados modos de realización, los conjugados se unen al extremo 5' de un oligonucleótido. Determinados de dichos conjugados en 5' se escinden de forma más eficaz que los homólogos que tienen un grupo conjugado similar unido al extremo 3'. En determinados modos de realización, la mejora en la actividad se puede correlacionar con una mejora en la escisión. En determinados modos de realización, los oligonucleótidos que comprenden un conjugado en el extremo 5' tienen mayor eficacia que los oligonucleótidos que comprenden un conjugado en el extremo 3' (véanse, por ejemplo, los ejemplos 56, 81, 83 y 84). Además, la unión en 5' permite una síntesis oligonucleotídica más sencilla. Típicamente, los oligonucleótidos se sintetizan sobre un soporte sólido en la dirección 3' a 5'. Para preparar un oligonucleótido conjugado en 3', típicamente se une un nucleósido preconjugado en 3' al soporte sólido y a continuación se construye el oligonucleótido como de costumbre. Sin embargo, unir ese nucleósido conjugado al soporte sólido añade complicación a la síntesis. Además, usando ese enfoque, el conjugado está presente a continuación en toda la síntesis del oligonucleótido y se puede degradar durante las etapas posteriores o puede limitar los tipos de reacciones y reactivos que se pueden usar. Usando las estructuras y técnicas descritas en el presente documento para oligonucleótidos conjugados en 5', se puede sintetizar el oligonucleótido usando técnicas automatizadas estándar e introducir el conjugado con el nucleósido final (lo más hacia 5') o después de que el oligonucleótido se haya escindido del soporte sólido.
En vista de la técnica y la presente divulgación, un experto en la técnica puede preparar fácilmente cualquiera de los conjugados y oligonucleótidos conjugados en el presente documento. Además, la síntesis de determinados de dichos conjugados y oligonucleótidos conjugados divulgados en el presente documento es más fácil y/o requiere pocas etapas y por lo tanto, es menos costosa que la de los conjugados divulgados previamente, proporcionando ventajas en la fabricación. Por ejemplo, la síntesis de determinados grupos conjugados consiste en menos etapas sintéticas, lo que da como resultado un incremento en el rendimiento, en relación con los grupos conjugados descritos anteriormente. Los grupos conjugados tales como GalNAc3-10 en el ejemplo 46 y GalNAc3-7 en el ejemplo 48 son mucho más sencillas que los conjugados descritos previamente tales como los descritos en los documentos US 8.106.022 o US 7.262.177 que requieren el conjunto de más intermedios químicos. En consecuencia, estos y otros conjugados descritos en el presente documento tienen ventajas sobre los compuestos descritos previamente para su uso con cualquier oligonucleótido, incluyendo oligonucleótidos monocatenarios y cualquier hebra de oligonucleótidos bicatenarios (por ejemplo, ARNip).
De forma similar, en el presente documento se divulgan grupos conjugados que tienen solo uno o dos ligandos de GalNAc. Como se muestra, dichos grupos conjugados mejoran la actividad de los compuestos antisentido. Dichos compuestos son mucho más fáciles de preparar que los conjugados que comprenden tres ligandos de GalNAc. Los grupos conjugados que comprenden uno o dos ligandos de GalNAc se pueden unir a cualquier compuesto antisentido, incluyendo oligonucleótidos monocatenarios y cualquier hebra de oligonucleótidos bicatenarios (por ejemplo, ARNip).
En determinados modos de realización, los conjugados en el presente documento no alteran sustancialmente determinadas medidas de tolerabilidad. Por ejemplo, se muestra en el presente documento que los compuestos antisentido conjugados no son más inmunógenos que los compuestos originales no conjugados. Puesto que se mejora la potencia, los modos de realización en los que la tolerabilidad sigue siendo la misma (o incluso si la tolerabilidad empeora solo ligeramente en comparación con las ganancias de potencia) tienen una mejora en las propiedades para el tratamiento.
En determinados modos de realización, la conjugación permite alterar compuestos antisentido de formas que tienen consecuencias menos atractivas en ausencia de conjugación. Por ejemplo, en determinados modos de realización, reemplazar uno o más enlaces fosforotioato de un compuesto antisentido totalmente fosforotioato con enlaces fosfodiéster da como resultado una mejora en algunas medidas de tolerabilidad. Por ejemplo, en determinados casos, dichos compuestos antisentido que tienen uno o más fosfodiésteres son menos inmunogénicos que el mismo compuesto en el que cada enlace es un fosforotioato. Sin embargo, en determinados casos, como se muestra en el ejemplo 26, ese mismo reemplazo de uno o más enlaces fosforotioato con enlaces fosfodiéster también da como resultado una reducción en la captación celular y/o pérdida de potencia. En determinados modos de realización, los compuestos antisentido conjugados descritos en el presente documento toleran dicho cambio en los enlaces con poca o ninguna pérdida de captación y potencia en comparación con el homólogo de fosforotioato completo conjugado. De hecho, en determinados modos de realización, por ejemplo, en los ejemplos 44, 57, 59 y 86, los oligonucleótidos que comprenden un conjugado y al menos un enlace internucleosídico fosfodiéster en realidad presentan un incremento en la potencia in vivo incluso en relación con un homólogo de fosforotioato completo que también comprende el mismo conjugado. Además, puesto que la conjugación da como resultado incrementos sustanciales en la captación/potencia, una pequeña pérdida en esa ganancia sustancial puede ser aceptable para lograr una mejora en la tolerabilidad. En consecuencia, en determinados modos de realización, los compuestos antisentido conjugados comprenden al menos un enlace fosfodiéster.
En determinados modos de realización, la conjugación de compuestos antisentido en el presente documento da como resultado un incremento en el suministro, captación y actividad en los hepatocitos. Por tanto, se suministra más compuesto al tejido hepático. Sin embargo, en determinados modos de realización, ese incremento en el suministro por sí solo no explica todo el incremento en la actividad. En determinados de dichos modos de realización, entra más compuesto en los hepatocitos. En determinados modos de realización, incluso ese incremento en la captación de hepatocitos no explica todo el incremento en la actividad. En dichos modos de realización, se incrementa la captación productiva del compuesto conjugado. Por ejemplo, como se muestra en el ejemplo 102, determinados modos de realización de conjugados que contienen GalNAc incrementan el enriquecimiento de oligonucleótidos antisentido en hepatocitos frente a células no parenquimatosas. Este enriquecimiento es beneficioso para oligonucleótidos que se dirigen a genes que se expresan en hepatocitos.
En determinados modos de realización, los compuestos antisentido conjugados en el presente documento dan como resultado una reducción en la exposición renal. Por ejemplo, como se muestra en el ejemplo 20, las concentraciones de oligonucleótidos antisentido que comprenden determinados modos de realización de conjugados que contienen GalNAc son menores en el riñón que las de oligonucleótidos antisentido que carecen de un conjugado que contiene GalNAc. Esto tiene varias implicaciones terapéuticas beneficiosas. Para indicaciones terapéuticas donde no se busca actividad en el riñón, la exposición al riñón presenta riesgo de toxicidad renal sin el correspondiente beneficio. Además, la alta concentración en el riñón típicamente da como resultado la pérdida del compuesto en la orina, dando como resultado una eliminación más rápida. En consecuencia, para dianas no renales, no se desea la acumulación renal.
En determinados modos de realización, se proporcionan compuestos antisentido conjugados que tienen la estructura:
Figure imgf000037_0001
En determinados modos de realización, un resto escindible es un enlace escindible. En determinados modos de realización, un resto escindible comprende un enlace escindible. En determinados modos de realización, el grupo conjugado comprende un resto escindible. En determinados de dichos modos de realización, el resto escindible se une al oligonucleótido antisentido. En determinados de dichos modos de realización, el resto escindible se une directamente al resto dirigido a célula. En determinados de dichos modos de realización, el resto escindible se une al conector conjugado. En determinados modos de realización, el resto escindible comprende un fosfato o fosfodiéster. En determinados modos de realización, el resto escindible es un nucleósido escindible o un análogo nucleosídico. En determinados modos de realización, el nucleósido o análogo nucleosídico comprende una base heterocíclica opcionalmente protegida seleccionada de una purina, purina sustituida, pirimidina o pirimidina sustituida. En determinados modos de realización, el resto escindible es un nucleósido que comprende una base heterocíclica opcionalmente protegida seleccionada de uracilo, timina, citosina, 4-N-benzoilcitosina, 5-metilcitosina, 4-N-benzoil-5-metilcitosina, adenina, 6-N-benzoiladenina, guanina y 2-N-isobutirilguanina. En determinados modos de realización, el resto escindible es 2'-desoxinucleósido que se une a la posición 3' del oligonucleótido antisentido por un enlace fosfodiéster y se une al conector por un enlace fosfodiéster o fosforotioato. En determinados modos de realización, el resto escindible es 2'-desoxiadenosina que se une a la posición 3' del oligonucleótido antisentido por un enlace fosfodiéster y se une al conector por un enlace fosfodiéster o fosforotioato. En determinados modos de realización, el resto escindible es 2'-desoxiadenosina que se une a la posición 3' del oligonucleótido antisentido por un enlace fosfodiéster y se une al conector por un enlace fosfodiéster.
En determinados modos de realización, el resto escindible se une a la posición 3' del oligonucleótido antisentido. En determinados modos de realización, el resto escindible se une a la posición 5' del oligonucleótido antisentido. En determinados modos de realización, el resto escindible se une a una posición 2' del oligonucleótido antisentido. En determinados modos de realización, el resto escindible se une al oligonucleótido antisentido por un enlace fosfodiéster. En determinados modos de realización, el resto escindible se une al conector por un enlace fosfodiéster o bien fosforotioato. En determinados modos de realización, el resto escindible se une al conector por un enlace fosfodiéster. En determinados modos de realización, el grupo conjugado no incluye un resto escindible.
En determinados modos de realización, el resto escindible se escinde después de que el complejo se haya administrado a un animal solo después de internalizarse por una célula diana. Dentro de la célula, el resto escindible se escinde liberando de este modo el oligonucleótido antisentido activo. Sin pretender limitarse por la teoría, se cree que el resto escindible se escinde por una o más nucleasas dentro de la célula. En determinados modos de realización, la una o más nucleasas escinden el enlace fosfodiéster entre el resto escindible y el conector.
ii Determinados conectores
El grupo conjugado del compuesto de la invención comprende un conector. En determinados de dichos modos de realización, el conector se une covalentemente al resto escindible. En determinados de dichos modos de realización, el conector se une covalentemente al oligonucleótido antisentido. El conector se une covalentemente a un resto dirigido a célula.
El conector es un grupo lineal que comprende grupos alquilo, amida y éter. En determinados modos de realización, el grupo lineal se une covalentemente al resto dirigido a célula y al resto escindible. En determinados modos de realización, el grupo lineal se une covalentemente al resto dirigido a célula y al oligonucleótido antisentido.
El conector conjugado del compuesto de la invención tiene la estructura:
Figure imgf000038_0001
iii Determinados restos dirigidos a células
El grupo conjugado del compuesto de la invención comprende restos dirigidos a células. Determinados de dichos restos dirigidos a células incrementan la captación celular de compuestos antisentido. Los restos dirigidos a células comprenden un grupo de ramificación, tres anclajes y tres ligandos.
1. Determinados grupos de ramificación
El grupo conjugado del compuesto de la invención comprende un resto dirigido que comprende un grupo de ramificación y tres ligandos anclados. El grupo de ramificación se une al conector conjugado. El grupo de ramificación se une covalentemente al conector y a cada uno de los ligandos anclados. El grupo de ramificación del compuesto de la invención tiene la estructura:
Figure imgf000038_0002
2. Determinados anclajes
El grupo conjugado del compuesto de la invención comprende tres anclajes unidos covalentemente al grupo de ramificación. El anclaje se une al grupo de ramificación a través de un grupo éter. El anclaje se une al ligando a través de un grupo éter.
El anclaje del compuesto de la invención tiene la estructura:
Figure imgf000038_0003
3. Determinados ligandos
Cada ligando del compuesto de la invención se une covalentemente a un anclaje. En determinados modos de realización, se selecciona cada ligando para que tener afinidad por al menos un tipo de receptor en una célula diana. En determinados modos de realización, se seleccionan ligandos que tienen una afinidad por al menos un tipo de receptor en la superficie de una célula hepática de mamífero. En determinados modos de realización, se seleccionan ligandos que tienen una afinidad por el receptor de asialoglucoproteína hepática (ASGP-R). En determinados modos de realización de la divulgación, cada ligando es un carbohidrato. Cada ligando del compuesto de la invención es N-acetilgalactosamina (GalNAc). En determinados modos de realización de la divulgación, el resto dirigido comprende 3 ligandos. El resto dirigido del compuesto de la invención comprende ligandos 3N-acetilgalactosamina.
En determinados modos de realización, "GalNac" o "Gal-NAc" se refiere a 2-(acetilamino)-2-desoxi-D-galactopiranosa, comúnmente denominada en la literatura N-acetilgalactosamina. En determinados modos de realización, "N-acetilgalactosamina" se refiere a 2-(acetilamino)-2-desoxi-D-galactopiranosa. "GalNac" o "Gal-NAc" del compuesto de la invención se refiere a 2-(acetilamino)-2-desoxi-D-galactopiranosa, que está en la forma p: 2-(acetilamino)-2-desoxi-p-D-galactopiranosa. Además de la presente invención, en el presente documento se divulga la forma a: 2-(acetilamino)-2-desoxi-D-galactopiranosa, que se representa por referencia a continuación.
Figure imgf000039_0001
2-(acetilamino)-2-desoxi-D-galactopiranosa
Figure imgf000039_0002
2-(acetilamino)-2-desoxi-a-D-galactopiranosa
i Determinados conjugados
En determinados modos de realización, los grupos conjugados comprenden los rasgos característicos estructurales anteriores que son consecuentes con las reivindicaciones adjuntas.
En determinados de dichos modos de realización, los grupos conjugados tienen la siguiente estructura:
Figure imgf000040_0001
En determinados de dichos modos de realización, los grupos conjugados tienen la siguiente estructura:
Figure imgf000040_0002
En determinados modos de realización, los conjugados se unen a un nucleósido del oligonucleótido antisentido en la posición 2', 3' o 5' del nucleósido. El compuesto antisentido conjugado puede tener la siguiente estructura:
A-------B------- C------- D---- f -E ----- F)
en la que
A es el oligonucleótido antisentido;
B es el resto escindible
C es el conector conjugado
D es el grupo de ramificación
cada E es un anclaje;
cada F es un ligando; y
q es un número entero entre 1 y 5.
En determinados modos de realización de la divulgación, un compuesto antisentido conjugado tiene la siguiente estructura:
Figure imgf000041_0001
en la que
A es el oligonucleótido antisentido;
C es el conector conjugado
D es el grupo de ramificación
cada E es un anclaje;
cada F es un ligando; y
q es un número entero entre 1 y 5.
En determinados de dichos modos de realización, el conector conjugado comprende al menos un enlace escindible. En determinados de dichos modos de realización, el grupo de ramificación comprende al menos un enlace escindible.
En determinados modos de realización, cada anclaje comprende al menos un enlace escindible.
En determinados modos de realización, los conjugados se unen a un nucleósido del oligonucleótido antisentido en la posición 2', 3' o 5' del nucleósido.
En determinados modos de realización de la divulgación, un compuesto antisentido conjugado tiene la siguiente estructura:
Figure imgf000041_0002
en la que
A es el oligonucleótido antisentido;
B es el resto escindible
C es el conector conjugado
cada E es un anclaje;
cada F es un ligando; y
q es un número entero entre 1 y 5.
En determinados modos de realización, los conjugados se unen a un nucleósido del oligonucleótido antisentido en la posición 2', 3' o 5' del nucleósido. En determinados modos de realización de la divulgación, un compuesto antisentido conjugado tiene la siguiente estructura:
Figure imgf000041_0003
en la que
A es el oligonucleótido antisentido;
C es el conector conjugado
cada E es un anclaje;
cada F es un ligando; y
q es un número entero entre 1 y 5.
En determinados modos de realización de la divulgación, un compuesto antisentido conjugado tiene la siguiente estructura:
Figure imgf000042_0001
en la que
A es el oligonucleótido antisentido;
B es el resto escindible
D es el grupo de ramificación
cada E es un anclaje;
cada F es un ligando; y
q es un número entero entre 1 y 5.
En determinados modos de realización de la divulgación, un compuesto antisentido conjugado tiene la siguiente estructura:
Figure imgf000042_0002
en la que
A es el oligonucleótido antisentido;
D es el grupo de ramificación
cada E es un anclaje;
cada F es un ligando; y
q es un número entero entre 1 y 5.
Las patentes de Estados Unidos, publicaciones de solicitudes de patentes de Estados Unidos y publicaciones de solicitudes de patentes internacionales representativas que enseñan la preparación de determinados de los conjugados, compuestos antisentido conjugados, anclajes, conectores, grupos de ramificación, ligandos, restos escindibles indicados anteriormente así como otras modificaciones incluyen sin limitación, US 5.994.517, US 6.300.319, US 6.660.720, US 6.906.182, US 7.262.177, US 7.491.805, US 8.106.022, US 7.723.509, US 2006/0148740, US 2011/0123520, WO 2013/033230 y WO 2012/037254.
Las publicaciones representativas que enseñan la preparación de determinados de los conjugados, compuestos antisentido conjugados, anclajes, conectores, grupos de ramificación, ligandos, restos escindibles indicados anteriormente así como otras modificaciones incluyen sin limitación, BIESSEN et al., "The Cholesterol Derivative of a Triantennary Galactoside with High Affinity for the Hepatic Asialoglycoprotein Receptor: a Potent Cholesterol Lowering Agent" J. Med. Chem. (1995) 38:1846-1852, BIESSEN et al., "Synthesis of Cluster Galactosides with High Affinity for the Hepatic Asialoglycoprotein Receptor" J. Med. Chem. (1995) 38:1538-1546, LEE et al., "New and more efficient multivalent glyco-ligands for asialoglycoprotein receptor of mammalian hepatocytes" Bioorganic & Medicinal Chemistry (2011) 19:2494-2500, RENSe N et al., "Determination of the Upper Size Limit for Uptake and Processing of Ligands by the Asialoglycoprotein Receptor on Hepatocytes in Vitro and in Vivo" J. Biol. Chem.
(2001) 276(40):37577-37584, RENSEN et al., "Design and Synthesis of Novel N-Acetylgalactosamine-Terminated Glycolipids for Targeting of Lipoproteins to the Hepatic Asialoglycoprotein Receptor" J. Med. Chem. (2004) 47:5798-5808, SLIEDREGT et al., "Design and Synthesis of Novel Amphiphilic Dendritic Galactosides for Selective Targeting of Liposomes to the Hepatic Asialoglycoprotein Receptor" J. Med. Chem. (1999)42:609-618, y Valentijn et al., "Solid-phase synthesis of lysine-based cluster galactosides with high affinity for the Asialoglycoprotein Receptor" Tetrahedron, 1997, 53(2), 759-770.
En determinados modos de realización, los compuestos antisentido conjugados comprenden un oligonucleótido basado en RNasa H (tal como un gápmero) o un oligonucleótido de modulación de empalme (tal como un oligonucleótido totalmente modificado) y cualquier grupo conjugado que comprende al menos uno, dos o tres grupos GalNAc. En determinados modos de realización un compuesto antisentido conjugado comprende cualquier grupo conjugado hallado en cualquiera de las siguientes referencias: Lee, Carbohydr Res, 1978, 67, 509-514; Connolly et al., J Biol Chem, 1982, 257, 939-945; Pavia et al., Int J Pep Protein Res, 1983, 22, 539-548; Lee et al., Biochem, 1984, 23, 4255-4261; Lee et al., Glycoconjugate J, 1987, 4, 317-328; Toyokuni et al., Tetrahedron Lett, 1990, 31, 2673-2676; Biessen et al., J Med Chem, 1995, 38, 1538-1546; Valentijn et al., Tetrahedron, 1997, 53, 759-770; Kim et al., Tetrahedron Lett, 1997, 38, 3487-3490; Lee et al., Bioconjug Chem, 1997, 8, 762-765; Kato et al., Glycobiol, 2001, 11, 821-829; Rensen et al., J Biol Chem, 2001, 276, 37577-37584; Lee et al., Methods Enzymol, 2003, 362, 38-43; Westerlind et al., Glycoconj J, 2004, 21, 227-241; Lee et al., Bioorg Med Chem Lett, 2006, 16(19), 5132-5135; Maierhofer et al., Bioorg Med Chem, 2007, 15, 7661-7676; Khorev et al., Bioorg Med Chem, 2008, 16, 5216-5231; Lee et al., Bioorg Med Chem, 2011, 19, 2494-2500; Kornilova et al., Analyt Biochem, 2012, 425, 43-46; Pujol et al., Angew Chemie Int Ed Engl, 2012, 51, 7445-7448; Biessen et al., J Med Chem, 1995, 38, 1846-1852; Sliedregt et al., J Med Chem, 1999, 42, 609-618; Rensen et al., J Med Chem, 2004, 47, 5798-5808; Rensen et al., Arterioscler Thromb Vase Biol, 2006, 26, 169-175; van Rossenberg et al., Gene Ther, 2004, 11,457­ 464; Sato et al., J Am Chem Soc, 2004, 126, 14013-14022; Lee et al., J Org Chem, 2012, 77, 7564-7571; Biessen et al., FASEB J, 2000, 14, 1784-1792; Rajur et al., Bioconjug Chem, 1997, 8, 935-940; Duff et al., Methods Enzymol, 2000, 313, 297-321; Maier et al., Bioconjug Chem, 2003, 14, 18-29; Jayaprakash et al., Org Lett, 2010, 12, 5410­ 5413; Manoharan, Antisense Nucleic Acid Drug Dev, 2002, 12, 103-128; Merwin et al., Bioconjug Chem, 1994, 5 612-620; Tomiya et al., Bioorg Med Chem, 2013, 21, 5275-5281; solicitudes internacionales WO1998/013381 WO2011/038356; WO1997/046098 WO2008/098788 WO2004/101619; WO2012/037254; WO2011/120053 WO2011/100131; WO2011/163121 WO2012/177947 WO2013/033230; WO2013/075035; WO2012/083185 WO2012/083046; WO2009/082607 WO2009/134487 WO2010/144740; WO2010/148013; WO1997/020563 WO2010/088537; WO2002/043771 WO2010/129709 WO2012/068187; WO2009/126933; WO2004/024757 WO2010/054406; WO2012/089352; WO2012/089602 WO2013/166121; WO2013/165816; patentes de EE. UU 4.751.219 8.552.163; 6.908.903; 7.262.177; 5.994.517; 6.300.319; 8.106.022; 7.491.805; 7.491.805; 7.582.744 8.137.695 6.383.812; 6.525.031; 6.660.720; 7.723.509; 8.541.548; 8.344.125; 8.313.772; 8.349.308; 8.450.467 8.501.930 8.158.601; 7.262.177; 6.906.182; 6.620.916; 8.435.491; 8.404.862; 7.851.615; publicaciones de solicitudes de patentes de EE. UU. publicadas US2011/0097264; US2011/0097265 US2013/0004427 US2005/0164235 US2006/0148740 US2008/0281044 US2010/0240730 US2003/0119724 US2006/0183886 US2008/0206869 US2011/0269814 US2009/0286973 US2011/0207799 US2012/0136042 US2012/0165393 US2008/0281041 US2009/0203135 US2012/0035115 US2012/0095075 US2012/0101148 US2012/0128760 US2012/0157509 US2012/0230938 US2013/0109817 US2013/0121954 US2013/0178512 US2013/0236968 US2011/0123520 US2003/0077829; US2008/0108801; y US2009/0203132.
Pruebas in vitro de oligonucleótidos antisentido
En el presente documento se describen procedimientos para el tratamiento de células con oligonucleótidos antisentido, que se pueden modificar apropiadamente para el tratamiento con otros compuestos antisentido.
Las células se pueden tratar con oligonucleótidos antisentido cuando las células alcanzan aproximadamente un 60-80 % de confluencia en cultivo.
Un reactivo usado comúnmente para introducir oligonucleótidos antisentido en células cultivadas incluye el reactivo de transfección de lípidos catiónicos LIPOFECTIN (Invitrogen, Carlsbad, CA). Los oligonucleótidos antisentido se pueden mezclar con LIPOFECTIN en OPTI-MEM1 (Invitrogen, Carlsbad, CA) para lograr la concentración final deseada de oligonucleótido antisentido y una concentración de LIPOFECTIN que puede variar de 2 a 12 ug/ml por 100 nM de oligonucleótido antisentido.
Otro reactivo usado para introducir oligonucleótidos antisentido en células cultivadas incluye LIPOFECTAMINA (Invitrogen, Carlsbad, CA). El oligonucleótido antisentido se mezcla con LIPOFECTAMINA en medio de suero reducido OPTI-MEM1 (Invitrogen, Carlsbad, CA) para lograr la concentración deseada de oligonucleótido antisentido y una concentración de LIPOFECTAMINA que puede variar de 2 a 12 ug/ml por 100 nM de oligonucleótido antisentido.
Otra técnica usada para introducir oligonucleótidos antisentido en células cultivadas incluye la electroporación.
Aún otra técnica usada para introducir oligonucleótidos antisentido en células cultivadas incluye la captación libre de los oligonucleótidos por las células.
Las células se tratan con oligonucleótidos antisentido por procedimientos habituales. Se pueden obtener células 16-24 horas después del tratamiento con oligonucleótidos antisentido, momento en el que se miden los niveles de ARN o proteína de ácidos nucleicos diana por procedimientos conocidos en la técnica y descritos en el presente documento. En general, cuando se realizan tratamientos en múltiples duplicados, los datos se presentan como el promedio de los tratamientos duplicados.
La concentración de oligonucleótido antisentido usada varía de una línea celular a otra. Los procedimientos para determinar la concentración de oligonucleótido antisentido óptima para una línea celular particular son bien conocidos en la técnica. Los oligonucleótidos antisentido se usan típicamente en concentraciones que varían de 1 nM a 300 nM cuando se transfectan con LIPOFECTAMINA. Los oligonucleótidos antisentido se usan en concentraciones mayores que varían de 625 a 20.000 nM cuando se transfectan usando electroporación.
Aislam iento de ARN
El análisis de ARN se puede realizar en ARN celular total o ARNm poli(A)+. Los procedimientos de aislamiento de ARN son bien conocidos en la técnica. El ARN se prepara usando procedimientos bien conocidos en la técnica, por ejemplo, usando el reactivo TRIZOL (Invitrogen, Carlsbad, CA) de acuerdo con los protocolos recomendados por el fabricante.
Determinadas indicaciones
Determinados modos de realización de la divulgación se refieren a procedimientos para tratar, prevenir o mejorar una enfermedad asociada con la regulación incorrecta de la vía alternativa del complemento en un sujeto por la administración de un inhibidor específico de CFB, tal como un compuesto antisentido dirigido a CFB.
Los ejemplos de nefropatías asociadas con la regulación incorrecta de la vía alternativa del complemento que se pueden tratar, prevenir y/o mejorar con los procedimientos divulgados en el presente documento incluyen glomerulopatía C3, síndrome hemolítico urémico atípico (SHUa), enfermedad por depósitos densos (EDD; también conocida como MPGN tipo II o C3Neph) y nefropatía CFHR5.
Otras nefropatías asociadas con la regulación incorrecta de la vía alternativa del complemento que se pueden tratar, prevenir y/o mejorar con los procedimientos divulgados en el presente documento incluyen nefropatía por IgA; glomerulonefritis mesangiocapilar (membranoproliferativa)(GMC); trastornos autoinmunitarios que incluyen nefritis lúpica y lupus eritematoso sistémico (LES); glomerulonefritis inducida por infección (también conocida como glomerulonefritis posinfecciosa); y lesión por isquemia-reperfusión renal, por ejemplo, lesión por isquemiareperfusión renal posterior a trasplante.
Los ejemplos de trastornos no renales asociados con la regulación incorrecta de la vía alternativa del complemento tratables y/o prevenibles con los procedimientos divulgados en el presente documento incluyen enfermedades oculares tales como degeneración macular, por ejemplo, degeneración macular senil (DMS), que incluye la DMS húmeda y la DMS seca, tales como atrofia geográfica; neuromielitis óptica; enfermedad de la córnea, tal como inflamación de la córnea; uveítis autoinmunitaria; y retinopatía diabética. Se ha informado de que el sistema del complemento está implicado en enfermedades oculares. Jha P, et al., Mol Immunol (2007) 44(16): 3901-3908. Los ejemplos adicionales de trastornos no renales asociados con la regulación incorrecta de la vía alternativa del complemento tratables y/o prevenibles con los procedimientos divulgados en el presente documento incluyen vasculitis asociada a ANCA, síndrome antifosfolipídico (también conocido como síndrome de anticuerpos antifosfolipídicos (APS)), asma, artritis reumatoide, miastenia grave y esclerosis múltiple.
Determinados modos de realización de la divulgación se refieren a procedimientos para tratar, prevenir o mejorar una nefropatía asociada con la regulación incorrecta de la vía alternativa del complemento en un sujeto por la administración de un inhibidor específico de CFB, tal como un compuesto antisentido dirigido a CFB. En determinados aspectos, la nefropatía es nefritis lúpica, lupus eritematoso sistémico (LES), enfermedad por depósitos densos (EDD), glomerulonefritis C3 (C3GN), nefropatía CFHR5 o síndrome hemolítico urémico atípico (SHUa), o cualquier combinación de los mismos.
Determinados modos de realización de la divulgación se refieren a procedimientos para tratar, prevenir o mejorar la degeneración macular, tal como degeneración macular senil (DMS), en un sujeto por la administración de un inhibidor específico de CFB, tal como un compuesto antisentido dirigido a CFB. En determinados aspectos, la DMS es DMS húmeda o DMS seca. En determinados aspectos, la DMS seca puede ser atrofia geográfica. Los estudios han demostrado la asociación de la regulación incorrecta de la vía alternativa del complemento y DMS. Los componentes del complemento son constituyentes comunes de las drusas oculares, el material extracelular que se acumula en la mácula de los pacientes con DMS. Además, se ha informado de que las variantes CFH y CFB representan casi un 75 % de casos de DMS en el norte de Europa y Norteamérica. También se ha descubierto que un polimorfismo de CFB específico confiere protección contra DMS. Patel, N. et al., Eye (2008) 22(6):768-76.
Adicionalmente, los ratones homocigóticos deficientes en CFB tienen una actividad de la vía del complemento menor, presentan lesiones oculares más pequeñas y neovascularización coroidea (NVC) después de fotocoagulación por láser. Rohrer, B. et al., Invest Ophthalmol Vis Sci. (2009) 50(7):3056-64. Además, el tratamiento con ARNip de CFB protege a los ratones de la NVC inducida por láser. Bora, NS et al., J Immunol. (2006) 177(3):1872-8. Los estudios también han demostrado que el riñón y el ojo comparten vías de desarrollo y rasgos característicos estructurales, incluyendo composición del protómero de colágeno IV de la membrana basal y vascularización. Savige et al., J Am Soc Nephrol. (2011) 22(8):1403-15. Existen pruebas de que la vía del complemento está implicada en enfermedades renales y oculares. Por ejemplo, la carencia de proteína reguladora del complemento hereditaria provoca predisposición al síndrome hemolítico urémico atípico y DMS. Richards A et al., Adv Immunol. (2007) 96:141-77. Adicionalmente, la nefropatía crónica se ha asociado con DMS. Nitsch, D. et al., Ophthalmic Epidemiol. (2009) 16(3):181-6; Choi, J. et al, Ophthalmic Epidemiol. (2011) 18(6):259-63. La enfermedad por depósitos densos (EDD), una nefropatía asociada con la vía alternativa del complemento regulada incorrectamente, se caracteriza por síndrome nefrítico agudo y drusas oculares. Cruz y Smith, GeneReviews (2007) Jul 20. Además, los ratones que albergan la deleción genética de un componente de la vía alternativa del complemento tienen fenotipos de enfermedades oculares y renales coexistentes. Se ha informado de que los ratones homocigóticos deficientes en CFH desarrollan EDD y presentan anomalías retinianas y disfunción visual. Pickering et al., Nat Genet. (2002) 31(4):424-8. Los modelos de ratón de nefropatías asociadas con la regulación incorrecta de la vía alternativa del complemento también se aceptan como modelos de DMS. Pennesi ME et al., Mol Aspects Med (2012) 33:487-509. Los ratones deficientes en CFH, por ejemplo, son un modelo aceptado para nefropatías, tales como EDD y DMS. Además, se ha informado de que la DMS se asocia con la fuente sistémica de factores del complemento, que se acumulan localmente en el ojo para impulsar la activación del complemento en la vía alternativa. Loyet et al., Invest Ophthalmol Vis Sci. (2012) 53(10):6628-37.
Ejemplos
Los siguientes ejemplos ilustran determinados modos de realización de la presente divulgación y no son limitantes. Además, cuando se proporcionan modos de realización específicos, los autores de la invención han contemplado la aplicación genérica de esos modos de realización específicos. Por ejemplo, la divulgación de un oligonucleótido que tiene un motivo particular proporciona un soporte razonable para oligonucleótidos adicionales que tienen el mismo motivo o similar. Y, por ejemplo, cuando una modificación de alta afinidad particular aparece en una posición particular, otras modificaciones de alta afinidad en la misma posición se consideran adecuadas, a menos que se indique de otro modo.
Ejemplo 1: procedimiento general para la preparación de fosforamiditas, compuestos 1, 1a y 2
Figure imgf000045_0001
Bx es una base heterocíclica;
Los compuestos 1, 1a y 2 se prepararon según los procedimientos bien conocidos en la técnica como se describe en la memoria descriptiva en el presente documento (véase Seth et al., Bioorg. Med. Chem., 2011, 21(4), 1122­ 1125, J. Org. Chem., 2010,75(5), 1569-1581, Nucleic Acids Symposium Series, 2008, 52(1), 553-554); y véanse también las solicitudes internacionales PCT publicadas (WO 2011/115818, WO 2010/077578, WO2010/036698, WO2009/143369, WO 2009/006478 y WO 2007/090071), la patente de EE. UU. 7.569.686).
Ejemplo 2: preparación del compuesto 7
Figure imgf000046_0001
El compuesto 3 (2-acetamido-1,3,4,6-tetra-0-acetil-2-desoxi-p-D-galactopiranosa o pentaacetato de galactosamina) está disponible comercialmente. El compuesto 5 se preparó de acuerdo con los procedimientos publicados (Weber et al., J. Med. Chem., 1991, 34, 2692).
Ejemplo 3: preparación del compuesto 11
Figure imgf000046_0002
Los compuestos 8 y 9 están disponibles comercialmente.
Ejemplo 4: preparación del compuesto 18
Figure imgf000047_0001
El compuesto 11 se preparó según los procedimientos ilustrados en el ejemplo 3. El compuesto 14 está disponible comercialmente. El compuesto 17 se preparó usando procedimientos similares informados por Rensen et al., J. Med. Chem., 2004, 47, 5798-5808.
Ejemplo 39: procedimiento general para la preparación del compuesto oligom érico 83h que comprende un conjugado de GalNAc3-3 en el extremo 5' (GalNAc3-1 modificado para unión al extremo 5') por medio de soporte sólido
Figure imgf000048_0001
Figure imgf000049_0001
El compuesto 18 se preparó según los procedimientos ilustrados en el ejemplo 4. Los compuestos 83a y 83b están disponibles comercialmente. El compuesto oligomérico 83e que comprende una hexilamina enlazada a fosfodiéster se preparó usando procedimientos de síntesis oligonucleotídica estándar. El tratamiento del compuesto oligomérico protegido con amoníaco acuoso proporcionó el compuesto oligomérico conjugado de 5'-GalNAc3-3 (83h).
En el que GalNAc3-3 tiene la estructura:
Figure imgf000049_0002
La porción de agrupación de GalNAc3 del grupo conjugado de GalNAc3-3 (GalNAc3-3a) se puede combinar con cualquier resto escindible para proporcionar una variedad de grupos conjugados. En el que GalNAc3-3a tiene la fórmula:
Figure imgf000050_0001
Ejemplo 44: efecto de enlaces PO/PS sobre la inhibición antisentido de ASO que comprenden el conjugado de GalNAc3-1 (véase el ejemplo 9) en el extremo 3' d irig ido a SRB-1
ISIS 655861 y 655862 que comprenden un conjugado de GalNAc3-1 en el extremo 3', cada uno dirigido a SRB-1, se sometieron a prueba en un estudio de administración única para determinar su capacidad para inhibir SRB-1 en ratones. El compuesto no conjugado original, ISIS 353382, se incluyó en el estudio para comparación.
Los ASO son gápmeros 5-10-5 MOE, en los que la región de hueco comprende diez 2'-desoxirribonucleósidos y cada región de ala comprende cinco nucleósidos 2'-MOE modificados. Los ASO se prepararon usando procedimientos similares a los ilustrados previamente en el ejemplo 19 y se describen en la tabla 36, a continuación.
Tabla 36
ASO m odificados que comprenden el conjugado de GalNAc3-1 en el extremo 3' d irig ido a SRB-1
Figure imgf000050_0002
Subíndices: "e" indica nucleósido 2'-MOE modificado; "d" indica p-D-2-desoxirribonucleósido; "s" indica enlaces internucleosídicos fosforotioato (PS); "o" indica enlaces internucleosídicos fosfodiéster (PO); y "o" indica -O-P(=O)(OH)-. El superíndice "m" indica 5-metilcitosinas. La estructura de "GalNAc3-1" se muestra en el ejemplo 9.
Tratamiento
A ratones Balb/c macho de seis semanas de edad (Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME) se les inyectó por vía subcutánea una vez a la dosificación mostrada a continuación ISIS 353382, 655861, 655862 o control tratado con PBS. Cada grupo de tratamiento consistió en 4 animales. Antes del tratamiento así como después de la última dosis, se extrajo sangre de cada ratón y se analizaron muestras de plasma. Los ratones se sacrificaron 72 horas después de la administración final para determinar los niveles de ARNm de SRB-1 hepáticos usando PCR ultrarrápida y reactivo de cuantificación de ARN RIBOGREEN® (Molecular Probes, Inc. Eugene, OR) de acuerdo con protocolos estándar. Los niveles de ARNm de SRB-1 se determinaron en relación con ARN total (usando Ribogreen), antes de la normalización al control tratado con PBS. Los resultados a continuación se presentan como el promedio del porcentaje de niveles de ARNm de SRB-1 para cada grupo de tratamiento, normalizados al control tratado con PBS y se indican como "% de PBS". Las DE5 0 se midieron usando procedimientos similares a los descritos previamente y se informan a continuación.
Como se ilustra en la tabla 37, el tratamiento con oligonucleótidos antisentido redujo los niveles de ARNm de SRB-1 de manera dependiente de la dosis en comparación con el control tratado con PBS. De hecho, los oligonucleótidos antisentido que comprenden el conjugado de GalNAc3-1 en el extremo 3' (ISIS 655861 y 655862) mostraron una mejora sustancial en la potencia en comparación con el oligonucleótido antisentido no conjugado (ISIS 353382). Además, ISIS 655862 con enlaces PS/PO mixtos mostró una mejora en la potencia en relación con PS total (ISIS 655861).
Tabla 37
Efecto de enlaces PO/PS sobre la inhibición antisentido de ASO que comprenden el conjugado de GalNAc3-1 en el extremo 3' d irig ido a SRB-1
Figure imgf000051_0001
Los niveles de transaminasas hepáticas, alanina aminotransferasa (ALT) y aspartato aminotransferasa (AST), en suero, se midieron en relación con ratones inyectados con solución salina usando protocolos estándar. También se evaluaron los pesos de órganos. Los resultados demostraron que no se observó elevación en los niveles de transaminasas (tabla 38) o en pesos de órganos (datos no mostrados) en ratones tratados con ASO en comparación con el control de PBS. Además, el ASO con enlaces PS/PO mixtos (ISIS 655862) mostró niveles de transaminasas similares en comparación con PS completo (ISIS 655861).
Tabla 38
Efecto de enlaces PO/PS sobre los niveles de transaminasas de ASO que comprenden el conjugado de GalNAc3-1 en el extremo 3' d irig ido a SRB-1
Figure imgf000051_0002
Ejemplo 45: preparación de éster PFP, compuesto 110a
Figure imgf000052_0001
Figure imgf000053_0001
El compuesto 4 (9,5 g, 28,8 mmol) se trató con el compuesto 103a o 103b (38 mmol), individualmente, y TMSOTf (0,5 eq.) y tamices moleculares en diclorometano (200 ml), y se agitó durante 16 horas a temperatura ambiente. En ese momento, la capa orgánica se filtró a través de celite, a continuación se lavó con bicarbonato de sodio, agua y salmuera. A continuación, la capa orgánica se separó y se secó sobre sulfato de sodio, se filtró y se redujo a presión reducida. El aceite resultante se purificó por cromatografía en gel de sílice (2 %->10 % de metanol/diclorometano) para dar los compuestos 104a y 104b con un rendimiento de un >80 %. CLEM y RMN de protones fueron consecuentes con la estructura.
Los compuestos 104a y 104b se trataron en las mismas condiciones que para los compuestos 100a-d (ejemplo 47), para dar los compuestos 105a y 105b con un rendimiento de un >90 %. CLEM y RMN de protones fueron consecuentes con la estructura.
Los compuestos 105a y 105b se trataron individualmente con el compuesto 90 en las mismas condiciones que para los compuestos 901a-d, para dar los compuestos 106a (80 %) y 106b (20 %). CLEM y RMN de protones fueron consecuentes con la estructura.
Los compuestos 106a y 106b se trataron en las mismas condiciones que para los compuestos 96a-d (ejemplo 47), para dar 107a (60 %) y 107b (20 %). CLEM y RMN de protones fueron consecuentes con la estructura.
Los compuestos 107a y 107b se trataron en las mismas condiciones que para los compuestos 97a-d (ejemplo 47), para dar los compuestos 108a y 108b con un rendimiento de un 40-60 %. CLEM y RMN de protones fueron consecuentes con la estructura.
Los compuestos 108a (60 %) y 108b (40 %) se trataron en las mismas condiciones que para los compuestos 100ad (ejemplo 47), para dar los compuestos 109a y 109b con rendimientos de un >80 %. CLEM y RMN de protones fueron consecuentes con la estructura.
El compuesto 109a se trató en las mismas condiciones que para los compuestos 101a-d (ejemplo 47). para dar el compuesto 110a con un rendimiento de un 30-60 %. CLEM y RMN de protones fueron consecuentes con la estructura. De forma alternativa, el compuesto 110b se puede preparar de forma similar comenzando con el compuesto 109b.
Ejemplo 46: procedimiento general para conjugación con ésteres de PEP (oligonucleótido 111); preparación de ISIS 666881 (GalNAc3-10)
Un oligonucleótido 5'-hexilamino modificado se sintetizó y purificó usando procedimientos de oligonucleótidos en fase sólida estándar. El oligonucleótido 5'-hexilamino modificado se disolvió en tetraborato de sodio 0,1 M, pH 8,5 (200 |jl) y se añadieron 3 equivalentes de una agrupación de GalNAc3 esterificada con PFP seleccionada disuelta en DMSO (50 jl). Si el éster PFP precipitó tras la adición a la solución de ASO, se añadió DMSO hasta que todo el éster PFP estuvo en solución. La reacción se completó después de aproximadamente 16 h de mezclado a temperatura ambiente. La solución resultante se diluyó con agua hasta 12 ml y a continuación se centrifugó a 3000 rpm en un filtro giratorio con un límite de masa de 3000 Da. Este proceso se repitió dos veces para retirar impurezas de moléculas pequeñas. A continuación, la solución se liofilizó hasta sequedad y se redisolvió en amoníaco acuoso concentrado y se mezcló a temperatura ambiente durante 2,5 h, seguido de concentración al vacío para retirar la mayor parte del amoníaco. El oligonucleótido conjugado se purificó y desaló por RP-HPLC y se liofilizó para proporcionar el oligonucleótido conjugado de GalNAc3.
Figure imgf000054_0001
El oligonucleótido 111 se conjuga con GalNAc3-10. La porción de agrupación de GalNAc3 del grupo conjugado de GalNAc3-10 (GalNAc3-10a) se puede combinar con cualquier resto escindible para proporcionar una variedad de grupos conjugados. En determinados modos de realización, el resto escindible es -P(=O)(OH)-Ad-P(=O)(OH)-como se muestra en el oligonucleótido (ISIS 666881) sintetizado con GalNAc3-10 a continuación. La estructura de GalNAc3-10 (GalNAc3-10a-CM-) se muestra a continuación:
Figure imgf000054_0002
Siguiendo este procedimiento general se preparó ISIS 666881. El oligonucleótido 5'-hexilamino modificado, ISIS 660254, se sintetizó y purificó usando procedimientos de oligonucleótidos en fase sólida estándar. Se disolvió ISIS 660254 (40 mg, 5,2 jmol) en tetraborato de sodio 0,1 M, pH 8,5 (200 jl) y se añadieron 3 equivalentes de éster PFP (compuesto 110a) disueltos en DMSO (50 jl). El éster PFP precipitó tras la adición a la solución de ASO, lo que requirió DMSO adicional (600 jl) para disolver totalmente el éster PFP. La reacción se completó después de 16 h de mezclado a temperatura ambiente. La solución se diluyó con agua hasta un volumen total de 12 ml y se centrifugó a 3000 rpm en un filtro giratorio con un límite de masa de 3000 Da. Este proceso se repitió dos veces para retirar impurezas de moléculas pequeñas. La solución se liofilizó hasta sequedad y se redisolvió en amoníaco acuoso concentrado mezclando a temperatura ambiente durante 2,5 h, seguido de concentración a vacío para retirar la mayor parte del amoníaco. El oligonucleótido conjugado se purificó y desaló por RP-HPLC y se liofilizó para dar ISIS 666881 con un rendimiento de un 90 % en peso (42 mg, 4,7 |jmol).
Figure imgf000055_0001
Las letras mayúsculas indican la nucleobase para cada nucleósido y mC indica una 5-metil-citosina. Subíndices: "e" indica un nucleósido 2'-MOE modificado; "d" indica un p-D-2-desoxirribonucleósido; "s" indica un enlace internucleosídico (PS) fosforotioato; "o" indica un enlace internucleosídico fosfodiéster (PO); y "o"' indica -O-P(=O)(OH)-. Los grupos conjugados están en negrita.
Ejemplo 48: preparación de oligonucleótido 119 que comprende GalNAc3-7
Figure imgf000055_0002
4
Figure imgf000056_0001
El compuesto 112 (5 g, 8,6 mmol) se disolvió en metanol/acetato de etilo 1:1 (22 ml/22 ml). Se añadió hidróxido de paladio sobre carbono (0,5 g). La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente bajo hidrógeno durante 12 h. La mezcla de reacción se filtró a través de una almohadilla de celite y se lavó la almohadilla con metanol/acetato de etilo 1:1. El filtrado y los lavados se combinaron y se concentró hasta sequedad para proporcionar el compuesto 105a (cuantitativo). La estructura se confirmó por CLEM.
El compuesto 113 (1,25 g, 2,7 mmol), HBTU (3,2 g, 8,4 mmol) y DIEA (2,8 ml, 16,2 mmol) se disolvieron en DMF anhidra (17 ml) y la mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 5 min. A esto se le añadió una solución del compuesto 105a (3,77 g, 8,4 mmol) en DMF anhidra (20 ml). La reacción se agitó a temperatura ambiente durante 6 h. El disolvente se retiró a presión reducida para obtener un aceite. El residuo se disolvió en CH2 O 2 (100 ml) y se lavó con solución acuosa saturada de NaHCÜ3 (100 ml) y salmuera (100 ml). La fase orgánica se separó, secó (Na2SÜ4), se filtró y se evaporó. El residuo se purificó por cromatografía en columna en gel de sílice y se eluyó con MeÜH del 10 al 20 % en diclorometano para proporcionar el compuesto 114 (1,45 g, 30 %). La estructura se confirmó por CLEM y análisis de RMN de 1H.
El compuesto 114 (1,43 g, 0,8 mmol) se disolvió en metanol/acetato de etilo 1:1 (4 ml/4 ml). Se añadió paladio sobre carbono (húmedo, 0,14 g). La mezcla de reacción se purgó con hidrógeno y se agitó a temperatura ambiente bajo hidrógeno durante 12 h. La mezcla de reacción se filtró a través de una almohadilla de celite. La almohadilla de celite se lavó con metanol/acetato de etilo (1:1). El filtrado y los lavados se combinaron juntos y se evaporó a presión reducida para proporcionar el compuesto 115 (cuantitativo). La estructura se confirmó por CLEM y análisis de RMN de 1H.
El compuesto 83a (0,17 g, 0,75 mmol), HBTU (0,31 g, 0,83 mmol) y DIEA (0,26 ml, 1,5 mmol) se disolvieron en DMF anhidra (5 ml) y la mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 5 min. A esto se le añadió una solución del compuesto 115 (1,22 g, 0,75 mmol) en DMF anhidra y la reacción se agitó a temperatura ambiente durante 6 h. El disolvente se retiró a presión reducida y el residuo se disolvió en CH2 Cl2. La capa orgánica se lavó con solución acuosa saturada de NaHcÜ3 y salmuera y se secó sobre Na2SÜ4 anhidro y se filtró. La capa orgánica se concentró hasta sequedad y el residuo obtenido se purificó por cromatografía en columna en gel de sílice y se eluyó con MeOH del 3 al 15 % en diclorometano para proporcionar el compuesto 116 (0,84 g, 61 %). La estructura se confirmó por CLEM y análisis de RMN de 1H.
Figure imgf000057_0001
El compuesto 116 (0,74 g, 0,4 mmol) se disolvió en metanol/acetato de etilo 1:1 (5 ml/5 ml). Se añadió paladio sobre carbono (húmedo, 0,074 g). La mezcla de reacción se purgó con hidrógeno y se agitó a temperatura ambiente bajo hidrógeno durante 12 h. La mezcla de reacción se filtró a través de una almohadilla de celite. La almohadilla de celite se lavó con metanol/acetato de etilo (1:1). El filtrado y los lavados se combinaron juntos y se evaporó a presión reducida para proporcionar el compuesto 117 (0,73 g, 98 %). La estructura se confirmó por CLEM y análisis de RMN de 1H.
El compuesto 117 (0,63 g, 0,36 mmol) se disolvió en DMF anhidra (3 ml). A esta solución se añadieron N,N-diisopropiletilamina (70 pl, 0,4 mmol) y trifluoroacetato de pentafluorofenilo (72 pl, 0,42 mmol). La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 12 h y se vertió en una solución acuosa saturada de NaHCO3. La mezcla se extrajo con diclorometano, se lavó con salmuera y se secó sobre Na2SO4 anhidro. La solución de diclorometano se concentró hasta sequedad y se purificó con cromatografía en columna en gel de sílice y se eluyó con MeOH del 5 al 10 % H en diclorometano para proporcionar el compuesto 118 (0,51 g, 79 %). La estructura se confirmó por CLEM y RMN de 1H y 1H y 19F.
Figure imgf000058_0001
El compuesto oligomérico 119, que comprende un grupo conjugado de GalNAc3-7, se preparó usando los procedimientos generales ilustrados en el ejemplo 46. La porción de agrupación GalNAc3 del grupo conjugado de GalNAc3-7 (GalNAc3-7a) se puede combinar con cualquier resto escindible para proporcionar una variedad de grupos conjugados. En determinados modos de realización, el resto escindible es -P(=O)(OH)-Ad-P(=O)(OH)-.
La estructura de GalNAc3-7 (GalNAc3-7a-CM-) se muestra a continuación:
Figure imgf000058_0002
El compuesto 146 se sintetizó como se describe en la literatura (Analytical Biochemistry 1995, 229, 54-60).
T
Figure imgf000059_0001
Figure imgf000059_0002
El compuesto 4 (15 g, 45,55 mmol) y el compuesto 35b (14,3 gramos, 57 mmol) se disolvieron en CH2 CI2 (200 ml). Se añadieron tamices moleculares activados (4 A, 2 g, en polvo) y la reacción se dejó en agitación durante 30 minutos en atmósfera de nitrógeno. Se añadió TMS-OTf (4,1 l, 22,77 mmol) y la reacción se dejó en agitación a temperatura ambiente durante la noche. Tras la finalización, la reacción se desactivó vertiéndola en una solución de NaHCO3 acuoso saturado (500 ml) y hielo picado (~ 150 g). La capa orgánica se separó, se lavó con salmuera, se secó sobre MgSO4, se filtró y se concentró a un aceite naranja a presión reducida. El material bruto se purificó por cromatografía en columna en gel de sílice y se eluyó con MeOH al 2-10 % en CH2 O 2 para proporcionar el compuesto 112 (16,53 g, 63 %). CLEM y RMN de 1H fueron consecuentes con el compuesto esperado.
El compuesto 112 (4,27 g, 7,35 mmol) se disolvió en MeOH/EtOAc 1:1 (40 ml). La mezcla de reacción se purgó burbujeando una corriente de argón a través de la solución durante 15 minutos. Se añadió catalizador de Pearlman (hidróxido de paladio sobre carbono, 400 mg) y se burbujeó gas hidrógeno a través de la solución durante 30 minutos. Tras la finalización (TLC, MeOH al 10 % MeOH en CH2 O 2 , y CLEM), el catalizador se retiró por filtración a través de una almohadilla de celite. El filtrado se concentró por evaporación rotatoria y se secó brevemente a alto vacío para proporcionar el compuesto 105a (3,28 g). CLEM y RMN de 1H fueron consecuentes con el producto deseado.
El compuesto 147 (2,31 g, 11 mmol) se disolvió en DMF anhidra (100 ml). Se añadió W,W-diisopropiletilamina (DIEA, 3,9 ml, 22 mmol), seguido de HBTU (4 g, 10,5 mmol). La mezcla de reacción se dejó en agitación durante ~ 15 minutos bajo nitrógeno. A esto se le añadió una solución del compuesto 105a (3,3 g, 7,4 mmol) en DMF seca y se agitó durante 2 h en atmósfera de nitrógeno. La reacción se diluyó con EtOAc y se lavó con NaHCO3 acuoso saturado y salmuera. La fase orgánica se separó, se secó (MgSO4), se filtró y se concentró hasta un jarabe naranja. El material bruto se purificó por cromatografía en columna, Material por cromatografía al 2-5 % en CH2 O 2 , para proporcionar el compuesto 148 (3,44 g, 73 %). CLEM y RMN de 1H fueron consecuentes con el producto esperado.
El compuesto 148 (3,3 g, 5,2 mmol) se disolvió en MeOH/EtOAc 1:1 (75 ml). La mezcla de reacción se purgó burbujeando una corriente de argón a través de la solución durante 15 minutos. Se añadió catalizador de Pearlman (hidróxido de paladio sobre carbono) (350 mg). Se burbujeó gas hidrógeno a través de la solución durante 30 minutos. Tras la finalización (TLC, MeOH al 10 % en DCM y CLEM), el catalizador se retiró por filtración a través de una almohadilla de celite. El filtrado se concentró por evaporación rotatoria y se secó brevemente a alto vacío para proporcionar el compuesto 149 (2,6 g). CLEM fue consecuente con el producto deseado. El residuo se disolvió en DMF seco (10 ml) y se usó de inmediato en la siguiente etapa.
Figure imgf000060_0001
El compuesto 146 (0,68 g, 1,73 mmol) se disolvió en DMF seca (20 ml). A esto se le añadieron DIEA (450 pl, 2,6 mmol, 1,5 eq.) y HBTU (1,96 g, 0,5,2 mmol). La mezcla de reacción se dejó en agitación durante 15 minutos a temperatura ambiente bajo nitrógeno. Se añadió una solución del compuesto 149 (2,6 g) en DMF anhidra (10 ml). El pH de la reacción se ajustó hasta pH = 9-10 por adición de DIEA (si era necesario). La reacción se dejó en agitación a temperatura ambiente bajo nitrógeno durante 2 h. Tras la finalización, la reacción se diluyó con EtOAc (100 ml) y se lavó con NaHCO3 acuoso saturado, seguido de salmuera. La fase orgánica se separó, se secó sobre MgSO4, se filtró y se concentró. El residuo se purificó por cromatografía en columna en gel de sílice y se eluyó con MeOH al 2-10 % en CH2 Cl2 para proporcionar el compuesto 150 (0,62 g, 20 %). CLEM y RMN de 1H fueron consecuentes con el producto deseado.
El compuesto 150 (0,62 g) se disolvió en MeOH/EtOAc 1:1 (5 l). La mezcla de reacción se purgó burbujeando una corriente de argón a través de la solución durante 15 minutos. Se añadió catalizador de Pearlman (hidróxido de paladio sobre carbono) (60 mg). Se burbujeó gas hidrógeno a través de la solución durante 30 minutos. Tras la finalización (TLC, MeOH al 10 % en DCM y CLEM), el catalizador se retiró por filtración (filtro de teflón con punta de jeringuilla, 0,45 pm). El filtrado se concentró por evaporación rotatoria y se secó brevemente a alto vacío para proporcionar el compuesto 151 (0,57 g). La CLEM fue consecuente con el producto deseado. El producto se disolvió en 4 ml de DMF seca y se usó de inmediato en la siguiente etapa.
Figure imgf000061_0001
Se disolvió el compuesto 83a (0,11 g, 0,33 mmol) en DMF anhidra (5 ml) y se añadieron N,N-diisopropiletilamina (75 |jl, 1 mmol) y PFP-TFA (90 jl, 0,76 mmol). La mezcla de reacción se volvió fucsia tras el contacto y gradualmente se volvió naranja durante los siguientes 30 minutos. El progreso de la reacción se siguió por TLC y CLEM. Tras la finalización (formación del éster PFP), se añadió una solución del compuesto 151 (0,57 g, 0,33 mmol) en DMF. El pH de la reacción se ajustó hasta pH = 9-10 por adición de N,N-diisopropiletilamina (si era necesario). La mezcla de reacción se agitó bajo nitrógeno durante ~ 30 min. Tras la finalización, la mayoría del disolvente se retiró a presión reducida. El residuo se diluyó con CH2 Cl2 y se lavó con NaHCO3 acuoso saturado, seguido de salmuera. La fase orgánica se separó, se secó sobre MgSO4, se filtró y se concentró hasta un jarabe naranja. El residuo se purificó por cromatografía en columna en gel de sílice (MeOH al 2-10 % en CH2 O 2 ) para proporcionar el compuesto 152 (0,35 g, 55 %). CLEM y RMN de 1H fueron consecuentes con el producto deseado.
El compuesto 152 (0,35 g, 0,182 mmol) se disolvió en MeOH/EtOAc 1:1 (10 ml). La mezcla de reacción se purgó burbujeando una corriente de argón a través de la solución durante 15 minutos. Se añadió catalizador de Pearlman (hidróxido de paladio sobre carbono) (35 mg). Se burbujeó gas hidrógeno a través de la solución durante 30 minutos. Tras la finalización (TLC, MeOH al 10 % en DCM y CLEM), el catalizador se retiró por filtración (filtro de teflón con punta de jeringuilla, 0,45 jm). El filtrado se concentró por evaporación rotatoria y se secó brevemente a alto vacío para proporcionar el compuesto 153 (0,33 g, cuantitativo). La CLEM fue consecuente con el producto deseado.
El compuesto 153 (0,33 g, 0,18 mmol) se disolvió en DMF anhidra (5 ml) con agitación bajo nitrógeno. A esto se le añadieron N,N-diisopropiletilamina (65 pl, 0,37 mmol) y PFP-TFA (35 pl, 0,28 mmol). La mezcla de reacción se agitó bajo nitrógeno durante ~ 30 min. La mezcla de reacción se volvió fucsia tras el contacto y gradualmente se volvió naranja. El pH de la mezcla de reacción se mantuvo a pH = 9-10 añadiendo más N,N-diisopropiletilamina. El progreso de la reacción se siguió por TLC y CLEM. Tras la finalización, la mayoría del disolvente se retiró a presión reducida. El residuo se diluyó con CH2 O 2 (50 ml), y se lavó con NaHCO3 acuoso saturado, seguido de salmuera. La capa orgánica se secó sobre MgSO4, se filtró y se concentró hasta un jarabe naranja. El residuo se purificó por cromatografía en columna y se eluyó con MeOH al 2-10 % en CH2 O 2 para proporcionar el compuesto 154 (0,29 g, 79 %). CLEM y RMN de 1H fueron consecuentes con el producto deseado.
Figure imgf000062_0001
El compuesto oligomérico 155, que comprende un grupo conjugado de GalNAc3-6, se preparó usando los procedimientos generales ilustrados en el ejemplo 46. La porción de agrupación de GalNAc3 del grupo conjugado de GalNAc3-6 (GalNAc3-6a) se puede combinar con cualquier resto escindible para proporcionar una variedad de grupos conjugados. En determinados modos de realización, el resto escindible es -P(=O)(OH)-Ad-P(=O)(OH)-.
La estructura de GalNAc3-6 (GalNAc3-6a-CM-) se muestra a continuación:
Figure imgf000062_0002
Ejemplo 56: estudio dependiente de la dosis de oligonucleótidos que comprenden un grupo conjugado en 3' o 5' (comparación de GalNAc3-1, 2, 3, 5, 6, 7 y 10) dirigidos a SRB-1 in v iv o
Los oligonucleótidos enumerados a continuación se sometieron a prueba en un estudio dependiente de la dosis para determinar la inhibición antisentido de SRB-1 en ratones. Se incluyó ISIS 353382 no conjugado como estándar. Cada uno de los diversos grupos conjugados de GalNAc3 se unió al extremo 5' del respectivo oligonucleótido por un nucleósido 2'-desoxiadenosina enlazado a fosfodiéster (resto escindible) excepto ISIS 655861 que tenía el grupo conjugado de GalNAc3 unido al extremo 3'.
Tabla 42
ASO modificado d irig ido a SRB-1
Figure imgf000062_0003
Figure imgf000063_0001
Las letras mayúsculas indican la nucleobase para cada nucleósido y mC indica una 5-metil-citosina. Subíndices: "e" indica un nucleósido 2'-MOE modificado; "d" indica un p-D-2-desoxirribonucleósido; "s" indica un enlace internudeosídico (PS) fosforotioato; "o" indica un enlace internucleosídico fosfodiéster (PO); y "o'" indica -O -P(=O)(OH)-. Los grupos conjugados están en negrita.
La estructura de GalNAc3-1a se mostró previamente en el ejemplo 9. La estructura de GalNAc3-2a se mostró previamente en el ejemplo 37. La estructura de GalNAc3-3a se mostró previamente en el ejemplo 39. La estructura de GalNAc3-5a se mostró previamente en el ejemplo 49. La estructura de GalNAc3-6a se mostró previamente en el ejemplo 51. La estructura de GalNAc3-7a se mostró previamente en el ejemplo 48. La estructura de GalNAc3-10a se mostró previamente en el ejemplo 46.
Tratamiento
A ratones Balb/c macho de seis semanas de edad (Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME) se les inyectó por vía subcutánea una vez a la dosificación mostrada a continuación ISIS 353382, 655861, 664507, 661161, 666224, 666961, 666981, 666881 o solución salina. Cada grupo de tratamiento consistió en 4 animales. Los ratones se sacrificaron 72 horas después de la administración final para determinar los niveles de ARNm de SRB-1 hepáticos usando PCR ultrarrápida y reactivo de cuantificación de ARN RIBOGREEN® (Molecular Probes, Inc. Eugene, OR) de acuerdo con protocolos estándar. Los resultados a continuación se presentan como el promedio del porcentaje de niveles de ARNm de SRB-1 para cada grupo de tratamiento, normalizados al control de solución salina.
Como se ilustra en la tabla 43, el tratamiento con oligonucleótidos antisentido redujo los niveles de ARNm de SRB-1 de manera dependiente de la dosis. De hecho, los oligonucleótidos antisentido conjugados mostraron una mejora sustancial en la potencia en comparación con el oligonucleótido antisentido no conjugado (ISIS 353382). Los oligonucleótidos antisentido conjugados en 5' mostraron un ligero incremento en la potencia en comparación con los oligonucleótidos antisentido conjugados en 3'.
Tabla 43
Figure imgf000063_0002
Figure imgf000064_0001
Los niveles de transaminasas hepáticas, alanina aminotransferasa (ALT) y aspartato aminotransferasa (AST), en suero, se midieron en relación con ratones inyectados con solución salina usando protocolos estándar. También se evaluaron la bilirrubina total y BUN (nitrógeno ureico sanguíneo). El cambio en los pesos corporales se evaluó sin cambios significativos con el grupo de solución salina. Los valores de ALT, AST, bilirrubina total y BUN se muestran en la tabla 44 a continuación.
Tabla 44
Figure imgf000064_0002
Figure imgf000065_0001
Ejemplo 60: efectos de ASO conjugados dirigidos a SRB-1 in v itro
Los oligonucleótidos enumerados a continuación se sometieron a prueba en un estudio de dosis múltiples para determinar la inhibición antisentido de SRB-1 en hepatocitos primarios de ratón. ISIS 353382 se incluyó como estándar no conjugado. Cada uno de los grupos conjugados se unió al extremo 3' o 5' del respectivo oligonucleótido por un resto escindible de nucleósido 2'-desoxiadenosina enlazado a fosfodiéster.
Tabla 52
ASO modificado d irig ido a SRB-1
Figure imgf000065_0002
Figure imgf000066_0001
Las letras mayúsculas indican la nucleobase para cada nucleósido y mC indica una 5-metil-citosina. Subíndices: "e" indica un nucleósido 2'-MOE modificado; "d" indica un p-D-2-desoxirribonucleósido; "s" indica un enlace internudeosídico (PS) fosforotioato; "o" indica un enlace internucleosídico fosfodiéster (PO); y "o'" indica -O -P(=O)(OH)-. Los grupos conjugados están en negrita.
La estructura de GalNAc3-1a se mostró previamente en el ejemplo 9. La estructura de GalNAc3-3a se mostró previamente en el ejemplo 39. La estructura de GalNAc3-8a se mostró previamente en el ejemplo 47. La estructura de GalNAc3-9a se mostró previamente en el ejemplo 52. La estructura de GalNAc3-6a se mostró previamente en el ejemplo 51. La estructura de GalNAc3-2a se mostró previamente en el ejemplo 37. La estructura de GalNAc3-10a se mostró previamente en el ejemplo 46. La estructura de GalNAc3-5a se mostró previamente en el ejemplo 49. La estructura de GalNAc3-7a se mostró previamente en el ejemplo 48.
Tratamiento
Los oligonucleótidos enumerados anteriormente se sometieron a prueba in vitro en hepatocitos primarios de ratón preparados a una densidad de 25.000 células por pocillo y se trataron con 0,03, 0,08, 0,24, 0,74, 2,22, 6,67 o 20 nM de oligonucleótido modificado. Después de un período de tratamiento de aproximadamente 16 horas, se aisló ARN de las células y se midieron los niveles de ARNm por PCR ultrarrápida cuantitativa y se ajustaron los niveles de ARNm de SRB-1 de acuerdo con el contenido de ARN total, como se mide por RIBOGREEN®.
La CI50 se calculó usando procedimientos estándar y los resultados se presentan en la tabla 53. Los resultados muestran que, en condiciones de captación libre en las que no se usan reactivos ni técnicas de electroporación para promover artificialmente la entrada de los oligonucleótidos en las células, los oligonucleótidos que comprenden un conjugado de GalNAc fueron significativamente más potentes en hepatocitos que el oligonucleótido original (ISIS 353382) que no comprende un conjugado de GalNAc.
Tabla 53
Figure imgf000066_0002
Figure imgf000067_0001
aPromedio de múltiples ciclos.
Ejemplo 79: duración de la acción in v iv o de oligonucleótidos dirigidos a APOC-III que comprenden un conjugado de GalNAc3
Los oligonucleótidos enumerados en la tabla 70 a continuación se sometieron a prueba en un estudio de dosis única para determinar la duración de la acción en ratones.
Tabla 70
ASO m odificados d irigidos a APOC-III
Figure imgf000067_0002
La estructura de GalNAc3-1a se mostró previamente en el ejemplo 9, GalNAc3-3a se mostró en el ejemplo 39, GalNAc3-7a se mostró en el ejemplo 48, GalNAc3-10a se mostró en el ejemplo 46, y GalNAc3-13a se mostró en el e je m p lo 62.
Tratamiento
A ratones transgénicos de seis a ocho semanas de edad que expresan APOC-III humana se les inyectó a cada uno por vía subcutánea una vez un oligonucleótido enumerado en la tabla 70 o PBS. Cada grupo de tratamiento consistió en 3 animales. Se extrajo sangre antes de la dosificación para determinar el valor de referencia y a las 72 horas, 1 semana, 2 semanas, 3 semanas, 4 semanas, 5 semanas y 6 semanas después de la dosis. Los niveles de proteína APOC-III y triglicéridos en plasma se midieron como se describe en el ejemplo 20. Los resultados a continuación se presentan como el promedio del porcentaje de niveles de triglicéridos y APOC-III en plasma para cada grupo de tratamiento, normalizados a niveles de referencia, mostrando que los oligonucleótidos que comprenden un grupo conjugado de GalNAc presentaron una mayor duración de la acción que el oligonucleótido original sin un grupo conjugado (ISIS 304801) aunque la dosificación del original fue tres veces la dosificación de los oligonucleótidos que comprenden un grupo conjugado de GalNAc.
Tabla 71
Niveles de proteína APOC-III y trig licéridos en plasma en ratones transgénicos
Figure imgf000068_0001
Figure imgf000069_0001
Ejemplo 80: inhibición antisentido in v iv o por oligonucleótidos d irigidos a alfa-1 antitripsina (A1AT) que comprenden un conjugado de GalNAc 3
Los oligonucleótidos enumerados en la tabla 72 a continuación se sometieron a prueba en un estudio para determinar la inhibición dependiente de la dosis de A1AT en ratones.
Tabla 72
ASO m odificados d irigidos a A1AT
Figure imgf000069_0002
La estructura de GalNAc3-1a se mostró previamente en el ejemplo 9, GalNAc3-3a se mostró en el ejemplo 39, GalNAc3-7a se mostró en el ejemplo 48, GalNAc3-10a se mostró en el ejemplo 46, y GalNAc3-13a se mostró en el ejemplo 62.
Tratamiento
A ratones C57BL/6 macho de seis semanas de edad (Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME) se les inyectó a cada uno por vía subcutánea una vez por semana a una dosificación mostrada a continuación, para un total de tres dosis, un oligonucleótido enumerado en la tabla 72 o PBS. Cada grupo de tratamiento consistió en 4 animales. Los ratones se sacrificaron 72 horas después de la administración final. Los niveles de ARNm hepático de A1AT se determinaron usando PCR ultrarrápida y reactivo de cuantificación de ARN RIBOGREEN® (Molecular Probes, Inc. Eugene, OR) de acuerdo con protocolos estándar. Los niveles de proteína en plasma de A1AT se determinaron usando el ELISA de alfa 1 -antitripsina de ratón (n.° de catálogo 41-A1AMS-E01, Alpco, Salem, NH). Los resultados a continuación se presentan como el promedio del porcentaje de niveles de proteína en plasma y ARNm hepático de A1AT para cada grupo de tratamiento, normalizados al control de PBS.
Como se ilustra en la tabla 73, el tratamiento con oligonucleótidos antisentido redujo los niveles de proteína en plasma de A1AT y ARNm hepático de A1AT de manera dependiente de la dosis. Los oligonucleótidos que comprenden un conjugado de GalNAc fueron significativamente más potentes que el original (ISIS 476366). Tabla 73
Niveles de proteína en plasma y ARNm hepático de A1AT
Figure imgf000070_0001
Los niveles de transaminasa hepática y BUN en plasma se midieron en el momento del sacrificio usando protocolos estándar. También se midieron los pesos corporales y pesos de órganos. Los resultados se muestran en la tabla 74 a continuación. El peso corporal se muestra como % relativo al valor de referencia. Los pesos de órganos se muestran como % de peso corporal en relación con el grupo de control de PBS.
Tabla 74
Figure imgf000071_0001
Ejemplo 81: duración de la acción in v iv o de oligonucleótidos dirigidos a A1AT que comprenden una agrupación de GalNAc3
Los oligonucleótidos enumerados en la tabla 72 se sometieron a prueba en un estudio de dosis única para determinar la duración de la acción en ratones.
Tratamiento
A ratones C57BL/6 macho de seis semanas de edad se les inyectó a cada uno por vía subcutánea una vez un oligonucleótido enumerado en la tabla 72 o PBS. Cada grupo de tratamiento consistió en 4 animales. Se extrajo sangre el día antes de la dosificación para determinar el valor de referencia y a los 5, 12, 19 y 25 días después de la dosis. Los niveles de proteína A1At en plasma se midieron por medio de ELISA (véase el ejemplo 80). Los resultados a continuación se presentan como el promedio del porcentaje de niveles de proteína A1AT en plasma para cada grupo de tratamiento, normalizados a niveles de referencia. Los resultados muestran que los oligonucleótidos que comprenden un conjugado de GalNAc fueron más potentes y tuvieron una mayor duración de la acción que el original que carece de un conjugado de GalNAc (ISIS 476366). Además, los oligonucleótidos que comprenden un conjugado de 5'-GalNAc (ISIS 678381, 678382, 678383 y 678384) fueron en general aún más potentes con una duración de la acción aún mayor que el oligonucleótido que comprende un conjugado de 3'-GalNAc (ISIS 656326).
Tabla 75
Niveles de proteína A1AT en plasma en ratones
Figure imgf000072_0001
Ejemplo 82: inhibición antisentido in v itro por oligonucleótidos d irigidos a SRB-1 que comprenden un conjugado de GalNAc 3
Se prepararon hepatocitos primarios de hígado de ratón en placas de 96 pocilios a 15.000 células/pocillo 2 horas antes del tratamiento. Los oligonucleótidos enumerados en la tabla 76 se añadieron a 2, 10, 50 o 250 nM en medio Williams E y las células se incubaron durante la noche a 37 °C en CO2 al 5 %. Las células se lisaron 16 horas después de la adición del oligonucleótido y el ARN total se purificó usando RNease 3000 BioRobot (Qiagen). Los niveles de ARNm de SRB-1 se determinaron usando p Cr ultrarrápida y reactivo de cuantificación de ARN RIBOGREEN® (Molecular Probes, Inc. Eugene, OR) de acuerdo con protocolos estándar. Los valores de CI50 se determinaron usando el programa informático Prism 4 (GraphPad). Los resultados muestran que los oligonucleótidos que comprenden una variedad de diferentes grupos conjugados de GalNAc y una variedad de diferentes restos escindibles son significativamente más potentes en un experimento de captación libre in vitro que los oligonucleótidos originales que carecen de un grupo conjugado de GalNAc (ISIS 353382 y 666841).
Tabla 76
Inhibición de la expresión de SRB-1 in v itro
Figure imgf000072_0002
Figure imgf000073_0001
Figure imgf000074_0001
La estructura de GalNAc3-1a se mostró previamente en el ejemplo 9, GalNAc3-3a se mostró en el ejemplo 39, GalNAc3-5a se mostró en el ejemplo 49, GalNAc3-6a se mostró en el ejemplo 51, GalNAc3-7a se mostró en el ejemplo 48, GalNAc3-8a se mostró en el ejemplo 47, GalNAc3-9a se mostró en el ejemplo 52, GalNAc3-10a se mostró en el ejemplo 46, GalNAc3-12a se mostró en el ejemplo 61, GalNAc3-13a se mostró en el ejemplo 62, GalNAc3-14a se mostró en el ejemplo 63, GalNAc3-15a se mostró en el ejemplo 64, GalNAc3-17a se mostró en el ejemplo 68, GalNAc3-18a se mostró en el ejemplo 69, GalNAc3-19a se mostró en el ejemplo 70, GalNAc3-20a se mostró en el ejemplo 71 y GalNAc3-23a se mostró en el ejemplo 76.
Ejemplo 83: inhibición antisentido in v iv o por oligonucleótidos dirigidos al factor XI que comprenden una agrupación de GalNAc3
Los oligonucleótidos enumerados en la tabla 77 a continuación se sometieron a prueba en un estudio para determinar la inhibición dependiente de la dosis de factor XI en ratones.
Tabla 77
Oligonucleótidos modificados dirigidos al factor XI
Figure imgf000075_0001
La estructura de GalNAc3-1a se mostró previamente en el ejemplo 9, GalNAc3-3a se mostró en el ejemplo 39, GalNAc3-7a se mostró en el ejemplo 48, GalNAc3-10a se mostró en el ejemplo 46, y GalNAc3-13a se mostró en el ejemplo 62.
Tratamiento
A ratones de seis a ocho semanas de edad se les inyectó a cada uno por vía subcutánea una vez por semana en una dosificación mostrada a continuación, para un total de tres dosis, un oligonucleótido enumerado a continuación o PBS. Cada grupo de tratamiento consistió en 4 animales. Los ratones se sacrificaron 72 horas después de la dosis final. Los niveles de ARNm hepático de factor XI se midieron usando PCR ultrarrápida y se normalizaron a ciclofilina de acuerdo con protocolos estándar. También se midieron transaminasas hepáticas, BUN y bilirrubina. Los resultados a continuación se presentan como el promedio del porcentaje para cada grupo de tratamiento, normalizados al control de PBS.
Como se ilustra en la tabla 78, el tratamiento con oligonucleótidos antisentido redujo el ARNm hepático de factor XI de manera dependiente de la dosis. Los resultados muestran que los oligonucleótidos que comprenden un conjugado de GalNAc fueron más potentes que el original que carece de un conjugado de GalNAc (ISIS 404071). Además, los oligonucleótidos que comprenden un conjugado de 5'-GalNAc (ISIS 663086, 678347, 678348 y 678349) fueron incluso más potentes que el oligonucleótido que comprende un conjugado de 3'-GalNAc (ISIS 656173).
Tabla 78
Niveles de ARNm hepático de factor XI, transaminasa hepática, BUN y bilirrubina
Figure imgf000076_0001
Ejemplo 84: duración de la acción in v iv o de oligonucleótidos d irigidos al factor XI que comprenden un conjugado de GalNAc3
Los oligonucleótidos enumerados en la tabla 77 se sometieron a prueba en un estudio de dosis única para determinar la duración de la acción en ratones.
Tratamiento
A ratones de seis a ocho semanas de edad se les inyectó a cada uno por vía subcutánea una vez un oligonucleótido enumerado en la tabla 77 o PBS. Cada grupo de tratamiento consistió en 4 animales. Se extrajo sangre por extracciones en la cola el día antes de la dosificación para determinar el valor de referencia y a los 3, 10 y 17 días después de la dosis. Los niveles de proteína factor XI en plasma se midieron por ELISA usando anticuerpos de detección biotinilados y de captura del factor XI de R & D Systems, Minneapolis, MN (n.° de catálogo AF2460 y n.° BAF2460, respectivamente) y el juego de reactivos OptEIA B (n.° de catálogo 550534, BD Biosciences, San José, CA). Los resultados a continuación se presentan como el promedio del porcentaje de niveles de proteína factor XI en plasma para cada grupo de tratamiento, normalizados a niveles de referencia. Los resultados muestran que los oligonucleótidos que comprenden un conjugado de GalNAc fueron más potentes y con mayor duración de la acción que el original que carece de un conjugado de GalNAc (ISIS 404071). Además, los oligonucleótidos que comprenden un conjugado de 5'-GalNAc (ISIS 663086, 678347, 678348 y 678349) fueron aún más potentes con una duración de la acción aún mayor que el oligonucleótido que comprende un conjugado de 3'-GalNAc (ISIS 656173).
Tabla 79
Niveles de proteína factor XI en plasma en ratones
Figure imgf000076_0002
Figure imgf000077_0001
Ejemplo 85: inhibición antisentido in v iv o por o ligonucleótidos dirigidos a SRB-1 que comprenden un conjugado de GalNAc3
Los oligonucleótidos enumerados en la tabla 76 se sometieron a prueba en un estudio dependiente de la dosis para determinar la inhibición antisentido de SRB-1 en ratones.
Tratamiento
A ratones C57BL/6 de seis a ocho semanas de edad se les inyectó a cada uno por vía subcutánea una vez por semana a una dosificación mostrada a continuación, para un total de tres dosis, un oligonucleótido enumerado en la tabla 76 o solución salina. Cada grupo de tratamiento consistió en 4 animales. Los ratones se sacrificaron 48 horas después de la administración final para determinar los niveles de ARNm de SRB-1 usando PCR ultrarrápida y reactivo de cuantificación de ARN RIBOGREEN® (Molecular Probes, Inc. Eugene, OR) de acuerdo con protocolos estándar. Los resultados a continuación se presentan como el promedio del porcentaje de niveles de ARNm de SRB-1 hepáticos para cada grupo de tratamiento, normalizados al control de solución salina.
Como se ilustra en las tablas 80 y 81, el tratamiento con oligonucleótidos antisentido redujo los niveles de ARNm de SRB-1 de manera dependiente de la dosis.
Tabla 80
ARNm de SRB-1 en hígado
Figure imgf000077_0002
Figure imgf000078_0001
Tabla 81
ARNm de SRB-1 en hígado
Figure imgf000078_0002
También se midieron los niveles de transaminasas hepáticas, bilirrubina total, BUN y pesos corporales usando protocolos estándar. Los valores promedio para cada grupo de tratamiento se muestran en la tabla 82 a continuación.
Tabla 82
Figure imgf000078_0003
Ejemplo 8 6 : inhibición antisentido in v iv o por o ligonucleótidos d irigidos a TTR que comprenden una agrupación de GalNAc3
Los oligonucleótidos enumerados en la tabla 83 a continuación se sometieron a prueba en un estudio dependiente de la dosis para determinar la inhibición antisentido de la transtiretina humana (TTR) en ratones transgénicos que expresan el gen TTR humano.
Tratamiento
A ratones transgénicos TTR de ocho semanas de edad se les inyectó a cada uno por vía subcutánea una vez por semana durante tres semanas, para un total de tres dosis, un oligonucleótido y la dosificación enumerados en las tablas a continuación o PBS. Cada grupo de tratamiento consistió en 4 animales. Los ratones se sacrificaron 72 horas después de la administración final. Se realizaron extracciones en la cola en diversos puntos temporales a lo largo del experimento, y se midieron los niveles de ALT, AST y proteína TTR en plasma y se informó en las tablas 85-87. Después de que se sacrificaran los animales, se midieron los niveles de ALT, AST y TTR humana en plasma, así como peso corporal, pesos de órganos y niveles de ARNm de TTR humana hepáticos. Los niveles de proteína TTR se midieron usando un analizador clínico (AU480, Beckman Coulter, CA). Se usaron PCR ultrarrápida y reactivo de cuantificación de ARN RIBOGREEN® (Molecular Probes, Inc. Eugene, OR) de acuerdo con protocolos estándar para determinar los niveles de ARNm de TTR humana en hígado. Los resultados presentados en las tablas 84-87 son los valores medios para cada grupo de tratamiento. Los niveles de ARNm son los valores promedio relativos al promedio para el grupo PBS. Los niveles de proteína en plasma son los valores promedio en relación con el valor promedio para el grupo de PBS al inicio del estudio. Los pesos corporales son el promedio del cambio de porcentaje en peso del valor de referencia hasta el sacrificio para cada grupo de tratamiento individual. Los pesos de órgano mostrados se normalizan al peso corporal del animal, y a continuación se presenta el promedio del peso de órgano normalizado para cada grupo de tratamiento en relación con el promedio del peso de órgano normalizado para el grupo de PBS.
En las tablas 84-87, "BL" indica el valor de referencia, las mediciones que se tomaron justo antes de la primera dosis. Como se ilustra en las tablas 84 y 85, el tratamiento con oligonucleótidos antisentido redujo los niveles de expresión de TTR de manera dependiente de la dosis. Los oligonucleótidos que comprenden un conjugado de GalNAc fueron más potentes que el original que carece de un conjugado de GalNAc (ISIS 420915). Además, los oligonucleótidos que comprenden un conjugado de GalNAc y enlaces internucleosídicos PS/PO mixtos fueron incluso más potentes que el oligonucleótido que comprende un conjugado de GalNAc y enlaces PS totales.
Tabla 83
Oligonucleótidos d irigidos a TTR humana
Figure imgf000079_0001
La leyenda para la tabla 85 se puede encontrar en el ejemplo 74. La estructura de GalNAc3-1 se mostró en el ejemplo 9. La estructura de GalNAc3-3a se mostró en el ejemplo 39. La estructura de GalNAc3-7a se mostró en el ejemplo 48. La estructura de GalNAc3-10a se mostró en el ejemplo 46. La estructura de GalNAc3-13a se mostró en el ejemplo 62. La estructura de GalNAc3-19a se mostró en el ejemplo 70.
Tabla 84
Inhibición antisentido de TTR humana in v ivo
Figure imgf000080_0001
Tabla 85
Inhibición antisentido de TTR humana in v ivo
Figure imgf000080_0002
Tabla 86
Niveles de transaminasas, cambios en peso corporal y pesos de órganos relativos
Figure imgf000080_0003
Niveles de transaminasas, cambios en peso corporal y pesos de órganos relativos
Figure imgf000081_0001
Ejemplo 8 8 : modulación de empalme in v iv o por o ligonucleótidos dirigidos a SMN que comprenden un conjugado de GalNAc3
Los oligonucleótidos enumerados en la tabla 90 se sometieron a prueba para determinar la modulación de empalme de la supervivencia de la neurona motora (SMN) humana en ratones.
Tabla 90
ASO m odificados d irigidos a SMN
Figure imgf000081_0002
La estructura de GalNAc3-7a se mostró previamente en el ejemplo 48. "X" indica una amina primaria 5' generada por Gene Tools (Philomath, OR), y GalNAc3-7b indica la estructura de GalNAc3-7a que carece de la porción -NH-Ca-O del conector como se muestra a continuación:
Figure imgf000082_0001
Los números ISIS 703421 y 703422 son oligonucleótidos de morfolino, en los que cada nucleótido de los dos oligonucleótidos es un nucleótido de morfolino.
Tratamiento
A ratones transgénicos de seis semanas de edad que expresan SMN humana se les inyectó por vía subcutánea una vez un oligonucleótido enumerado en la tabla 91 o solución salina. Cada grupo de tratamiento consistió en 2 machos y 2 hembras. Los ratones se sacrificaron 3 días después de la dosis para determinar los niveles de ARNm de SMN humana hepáticos tanto con como sin el exón 7 usando PCR ultrarrápida de acuerdo con protocolos estándar. El ARN total se midió usando el reactivo Ribogreen. Los niveles de ARNm de SMN se normalizaron a ARNm total y se normalizaron además a los promedios para el grupo de tratamiento con solución salina. El promedio de proporciones resultantes de ARNm de SMN que incluye el exón 7 con respecto al ARNm de SMN que carece del exón 7 se muestran en la tabla 91. Los resultados muestran que los oligonucleótidos totalmente modificados que modulan el empalme y comprenden un conjugado de GalNAc son significativamente más potentes para alterar el empalme en el hígado que los oligonucleótidos originales que carecen de un conjugado de GalNAc. Además, esta tendencia se mantiene para múltiples químicas de modificación, incluyendo los oligonucleótidos 2'-MOE y morfolino modificados.
Tabla 91
Efecto de oligonucleótidos d irigidos a SMN humana in v ivo
Figure imgf000082_0002
Ejemplo 89: inhibición antisentido in v iv o por o ligonucleótidos dirigidos a apolipoproteína A (Apo(a)) que comprenden un conjugado de GalNAc 3
Los oligonucleótidos enumerados en la tabla 92 a continuación se sometieron a prueba en un estudio para determinar la inhibición dependiente de la dosis de Apo(a) en ratones transgénicos.
Tabla 92
ASO m odificados d irigidos a Apo(a)
Figure imgf000083_0001
La estructura de GalNAc3-7a se mostró en el ejemplo 48.
Tratamiento
A ratones C57BL/6 hembra de ocho semanas de edad (Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME) se les inyectó a cada uno por vía subcutánea una vez por semana en una dosificación mostrada a continuación, para un total de seis dosis, un oligonucleótido enumerado en la tabla 92 o PBS. Cada grupo de tratamiento consistió en 3-4 animales. Se realizaron extracciones en la cola el día antes de la primera dosis y semanalmente después de cada dosis para determinar los niveles de proteína Apo(a) en plasma. Los ratones se sacrificaron dos días después de la administración final. Los niveles de ARNm hepático de Apo(a) se determinaron usando PCR ultrarrápida y reactivo de cuantificación de ARN RIBOGREEN® (Molecular Probes, Inc. Eugene, OR) de acuerdo con protocolos estándar. Se determinaron los niveles de proteína en plasma de Apo(a) usando ELISA y se determinaron los niveles de transaminasas hepáticas. Los resultados de proteína en plasma y ARNm en la tabla 93 se presentan como el promedio del porcentaje del grupo de tratamiento en relación con el grupo tratado con PBS. Los niveles de proteína en plasma se normalizaron además al valor de referencia (BL) para el grupo de PBS. Se informa del promedio absoluto de niveles de transaminasas y los pesos corporales (% en relación con los promedios de referencia) en la tabla 94.
Como se ilustra en la tabla 93, el tratamiento con los oligonucleótidos redujo los niveles de proteína en plasma y ARNm hepático de Apo(a) de manera dependiente de la dosis. Además, el oligonucleótido que comprende el conjugado de GalNAc fue significativamente más potente con una mayor duración de la acción que el oligonucleótido original que carece de un conjugado de GalNAc. Como se ilustra en la tabla 94, los niveles de transaminasas y los pesos corporales no se vieron afectados por los oligonucleótidos, lo que indica que los oligonucleótidos se toleraron bien.
Tabla 93
Niveles de proteína en plasma y ARNm hepático de Apo(a)
Figure imgf000083_0002
Tabla 94
Figure imgf000083_0003
Ejemplo 90: inhibición antisentido in v iv o por o ligonucleótidos dirigidos a TTR que comprenden una agrupación de GalNAc3
Los oligonucleótidos enumerados en la tabla 95 a continuación se sometieron a prueba en un estudio dependiente de la dosis para determinar la inhibición antisentido de la transtiretina humana (TTR) en ratones transgénicos que expresan el gen TTR humano.
Tratamiento
A ratones transgénicos TTR se les inyectó a cada uno por vía subcutánea una vez por semana durante tres semanas, para un total de tres dosis, un oligonucleótido y la dosificación enumerados en la tabla 96 o PBS. Cada grupo de tratamiento consistió en 4 animales. Antes de la primera dosis, se realizó una extracción en la cola para determinar los niveles de proteína TTR en plasma al inicio del estudio (BL). Los ratones se sacrificaron 72 horas después de la administración final. Los niveles de proteína TTR se midieron usando un analizador clínico (AU480, Beckman Coulter, CA). Se usaron PCR ultrarrápida y reactivo de cuantificación de ARN RIBOGREEN® (Molecular Probes, Inc. Eugene, OR) de acuerdo con protocolos estándar para determinar los niveles de ARNm de TTR humana en hígado. Los resultados presentados en la tabla 96 son los valores promedio para cada grupo de tratamiento. Los niveles de ARNm son los valores promedio relativos al promedio para el grupo PBS. Los niveles de proteína en plasma son los valores promedio en relación con el valor promedio para el grupo de PBS al inicio del estudio. "BL" indica el valor de referencia, las mediciones que se tomaron justo antes de la primera dosis. Como se ilustra en la tabla 96, el tratamiento con oligonucleótidos antisentido redujo los niveles de expresión de TTR de manera dependiente de la dosis. Los oligonucleótidos que comprenden un conjugado de GalNAc fueron más potentes que el original que carece de un conjugado de GalNAc (ISIS 420915), y los oligonucleótidos que comprenden un resto escindible de fosfodiéster o desoxiadenosina mostraron mejoras significativas en la potencia en comparación con el original que carece de un conjugado (véanse los números ISIS 682883 y 666943 frente a 420915 y véanse los ejemplos 86 y 87).
Tabla 95
Oligonucleótidos dirigidos a TTR humana
Figure imgf000084_0001
La leyenda para la tabla 95 se puede encontrar en el ejemplo 74. La estructura de GalNAc3-3a se mostró en el ejemplo 39. La estructura de GalNAc3-7a se mostró en el ejemplo 48. La estructura de GalNAc3-10a se mostró en el ejemplo 46. La estructura de GalNAc3-13a se mostró en el ejemplo 62.
Tabla 96
Inhibición antisentido de TTR humana in v ivo
Figure imgf000085_0001
Ejemplo 92: inhibición antisentido en hepatocitos primarios por oligonucleótidos antisentido dirigidos a Apo-CIII que comprenden un conjugado de GalNAc3
Se prepararon hepatocitos primarios de ratón en placas de 96 pocilios a 15.000 células por pocilio, y se añadieron los oligonucleótidos enumerados en la tabla 99, dirigidos a ApoC-III de ratón, a 0,46, 1,37, 4,12 o 12,35, 37,04, 111,11 o 333,33 nM o 1,00 |jM. Después de la incubación con los oligonucleótidos durante 24 horas, las células se lisaron y el ARN total se purificó usando RNeasy (Qiagen). Los niveles de ARNm de ApoC-III se determinaron usando PCR ultrarrápida y reactivo de cuantificación de ARN RIBOGREEN® (Molecular Probes, Inc.) de acuerdo con protocolos estándar. Los valores de CI50 se determinaron usando el programa informático Prism 4 (GraphPad). Los resultados muestran que independientemente de si el resto escindible fue un fosfodiéster o una desoxiadenosina enlazada a fosfodiéster, los oligonucleótidos que comprenden un conjugado de GalNAc fueron significativamente más potentes que el oligonucleótido original que carece de un conjugado.
Tabla 99
Inhibición de la expresión de APOC-III de ratón en hepatocitos primarios de ratón
Figure imgf000085_0002
Figure imgf000086_0001
La estructura de GalNAc3-1a se mostró previamente en el ejemplo 9, GalNAc3-3a se mostró en el ejemplo 39, GalNAc3-7a se mostró en el ejemplo 48, GalNAc3-10a se mostró en el ejemplo 46, GalNAc3-13a se mostró en el ejemplo 62 y GalNAc3-19a se mostró en el ejemplo 70.
Ejemplo 93: inhibición antisentido in v iv o por o ligonucleótidos dirigidos a SRB-1 que comprenden alas mixtas y un conjugado de 5 '-GalNAc3
Los oligonucleótidos enumerados en la tabla 100 se sometieron a prueba en un estudio dependiente de la dosis para determinar la inhibición antisentido de SRB-1 en ratones.
Tabla 100
ASO m odificados d irigidos a SRB-1
Figure imgf000086_0002
La estructura de GalNAc3-3 a se mostró previamente en el ejemplo 39, y la estructura de GalNAc3-7a se mostró previamente en el ejemplo 48. Subíndices: "e" indica nucleósido 2'-MOE modificado; "d" indica p-D-2'-desoxirribonucleósido; "k" indica nucleósido bicíclico 6’-(SJ-CH3 (cEt); "s" indica enlaces internucleosídicos fosforotioato (PS); "o" indica enlaces internucleosídicos fosfodiéster (PO). El superíndice "m" indica 5-metilcitosinas.
Tratamiento
A ratones C57BL/6 de seis a ocho semanas de edad (Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME) se les inyectó por vía subcutánea una vez a la dosificación mostrada a continuación un oligonucleótido enumerado en la tabla 100 o solución salina. Cada grupo de tratamiento consistió en 4 animales. Los ratones se sacrificaron 72 horas después de la administración final. Los niveles de ARNm de SRB-1 hepáticos se midieron usando PCR ultrarrápida. Los niveles de ARNm de SRB-1 se normalizaron a niveles de ARNm de ciclofilina de acuerdo con protocolos estándar. Los resultados se presentan como el promedio del porcentaje de niveles de ARNm de SRB-1 para cada grupo de tratamiento en relación con el grupo de control de solución salina. Como se ilustra en la tabla 101, el tratamiento con oligonucleótidos antisentido redujo los niveles de ARNm de SRB-1 de manera dependiente de la dosis, y los oligonucleótidos gápmeros que comprenden un conjugado de GalNAc y que tienen alas que eran modificaciones glucídicas de cEt completas o mixtas fueron significativamente más potentes que el oligonucleótido original que carece de un conjugado y que comprende alas modificadas de cEt completas.
También se midieron los pesos corporales, transaminasas hepáticas, bilirrubina total y BUN, y los valores promedio para cada grupo de tratamiento se muestran en la tabla 101. El peso corporal se muestra como el promedio del porcentaje de peso corporal en relación con el peso corporal de referencia (% BL) medido justo antes de la dosis de oligonucleótido.
Tabla 101
Niveles de ARNm de SRB-1, ALT, AST, BUN y bilirrubina total y pesos corporales
Figure imgf000087_0001
Ejemplo 94: inhibición antisentido in v iv o por oligonucleótidos dirigidos a SRB-1 que comprenden modificaciones glucídicas en 2' y un conjugado de 5'-GalNAc3
Los oligonucleótidos enumerados en la tabla 102 se sometieron a prueba en un estudio dependiente de la dosis para determinar la inhibición antisentido de SRB-1 en ratones.
Tabla 102
ASO m odificados d irigidos a SRB-1
Figure imgf000087_0002
Figure imgf000088_0001
El subíndice "m" indica un nucleósido 2'-O-metil modificado. Véase el ejemplo 74 para la leyenda de la tabla completa. La estructura de GalNAc3-3 a se mostró previamente en el ejemplo 39, y la estructura de GalNAc3-7a se mostró previamente en el ejemplo 48.
Tratamiento
El estudio se completó usando el protocolo descrito en el ejemplo 93. Los resultados se muestran en la tabla 103 a continuación y muestran que los oligonucleótidos tanto 2 '-MOe como 2'-OMe modificados que comprenden un conjugado de GalNAc fueron significativamente más potentes que los respectivos oligonucleótidos originales que carecen de un conjugado. Los resultados de los pesos corporales, mediciones de transaminasas hepáticas, bilirrubina total y BUN indicaron que todos los compuestos se toleraron bien.
Tabla 103
ARNm de SRB-1
Figure imgf000088_0002
Ejemplo 95: inhibición antisentido in v iv o por oligonucleótidos dirigidos a SRB-1 que comprenden nucleósidos bicíclicos y un conjugado de 5'-GalNAc3
Los oligonucleótidos enumerados en la tabla 104 se sometieron a prueba en un estudio dependiente de la dosis para determinar la inhibición antisentido de SRB-1 en ratones.
Tabla 104
ASO m odificados d irigidos a SRB-1
Figure imgf000088_0003
El subíndice "g" indica un nucleósido fluoro-HNA, el subíndice "1" indica un nucleósido bloqueado que comprende un puente 2-O-CH2-4'. Véase la leyenda de la tabla del ejemplo 74 para otras abreviaturas. La estructura de GalNAc3-1a se mostró previamente en el ejemplo 9, la estructura de GalNAc3-3a se mostró previamente en el ejemplo 39, y la estructura de GalNAc3-7a se mostró previamente en el ejemplo 48.
Tratamiento
El estudio se completó usando el protocolo descrito en el ejemplo 93. Los resultados se muestran en la tabla 105 a continuación y muestran que los oligonucleótidos que comprenden un conjugado de GalNAc y diversas modificaciones nucleosídicas bicíclicas fueron significativamente más potentes que el oligonucleótido original que carece de un conjugado y comprende modificaciones nucleosídicas bicíclicas. Además, el oligonucleótido que comprende un conjugado de GalNAc y modificaciones fluoro-HNA fue significativamente más potente que el original que carece de un conjugado y que comprende modificaciones fluoro-HNA. Los resultados de los pesos corporales, mediciones de transaminasas hepáticas, bilirrubina total y BUN indicaron que todos los compuestos se toleraron bien.
Tabla 105
Niveles de ARNm de SRB-1, ALT, AST, BUN y bilirrubina total y pesos corporales
Figure imgf000089_0001
Ejemplo 96: unión a proteína en plasma de oligonucleótidos antisentido que comprenden un grupo conjugado de GalNAc3
Los oligonucleótidos enumerados en la tabla 70 dirigidos a ApoC-III y los oligonucleótidos en la tabla 106 dirigidos a Apo(a) se sometieron a prueba en un ensayo de ultrafiltración para evaluar la unión a proteína en plasma.
Oligonucleótidos modificados d irigidos a Apo(a)
Figure imgf000090_0001
Véase el ejemplo 74 para la leyenda de la tabla. La estructura de GalNAc3-7a se mostró previamente en el ejemplo 48.
Las unidades de ultrafiltración Ultrafree-MC (30.000 NMWL, membrana de celulosa regenerada de baja unión, Millipore, Bedford, MA) se preacondicionaron con 300 |jl de Tween 80 al 0,5 % y se centrifugó a 2000 g durante 10 minutos, a continuación con 300 j l de una solución de 300 jg/m l de un oligonucleótido control en H2 O y se centrifugó a 2000 g durante 16 minutos. Para evaluar la unión inespecífica a los filtros de cada oligonucleótido de prueba de las tablas 70 y 106 que se van a usar en los estudios, se colocaron 300 j l de una solución de 250 ng/ml de oligonucleótido en H2 O a pH 7,4 en los filtros preacondicionados y se centrifugó a 2000 g durante 16 minutos. Las muestras sin filtrar y filtradas se analizaron por un ensayo ELISA para determinar las concentraciones de oligonucleótidos. Se usaron tres duplicados para obtener un promedio de concentración para cada muestra. El promedio de concentración de la muestra filtrada en relación con la muestra sin filtrar se usa para determinar el porcentaje de oligonucleótido que se recupera a través del filtro en ausencia de plasma (% recuperación).
Las muestras de plasma completo congelado obtenidas en K3-EDTA de voluntarios humanos normales, libres de fármacos, macacos cangrejeros y ratones CD-1, se adquirieron de Bioreclamation LLC (Westbury, NY). Los oligonucleótidos de prueba se añadieron a alícuotas de 1,2 ml de plasma en dos concentraciones (5 y 150 jg/ml). Se dispuso una alícuota (300 jl) de cada muestra de plasma enriquecida en una unidad de filtro preacondicionada y se incubó a 37 °C durante 30 minutos, seguido de inmediato de centrifugación a 2000 g durante 16 minutos. Se analizaron alícuotas de muestras de plasma enriquecido filtradas y sin filtrar por un ELISA para determinar la concentración de oligonucleótido en cada muestra. Se usaron tres duplicados por concentración para determinar el promedio del porcentaje de oligonucleótido unido y no unido en cada muestra. El promedio de concentración de la muestra filtrada en relación con la concentración de la muestra sin filtrar se usa para determinar el porcentaje de oligonucleótido en el plasma que no se une a proteínas en plasma (% no unido). Los valores de oligonucleótidos no unidos finales se corrigen para la unión inespecífica dividiendo el % no unido entre el % de recuperación para cada oligonucleótido. Los valores de % de oligonucleótido unido final se determina restando a 100 los valores de % no unido final. Los resultados se muestran en la tabla 107 para las dos concentraciones de oligonucleótido sometidas a prueba (5 y 150 jg/ml) en cada especie de plasma. Los resultados muestran que los grupos conjugados de GalNAc no tienen un impacto significativo en la unión a proteína en plasma. Además, los oligonucleótidos con enlaces internucleosídicos PS totales y enlaces PO/PS mixtos se unen ambos a proteínas en plasma, y aquellos con enlaces PS totales se unen a proteínas en plasma en un grado algo mayor que aquellos con enlaces PO/PS mixtos.
Tabla 107
Porcentaje de oligonucleótido modificado unido a proteínas en plasma
Figure imgf000090_0002
Ejemplo 97: oligonucleótidos modificados d irigidos a TTR que comprenden un grupo conjugado de GalNAc3
Los oligonucleótidos mostrados en la tabla 108 que comprenden un conjugado de GalNAc se diseñaron para dirigirse a TTR.
Tabla 108
Oligonucleótidos modificados d irigidos a TTR
Figure imgf000091_0001
La leyenda para la tabla 108 se puede encontrar en el ejemplo 74. La estructura de GalNAc3-1 se mostró en el ejemplo 9. La estructura de GalNAc3-3a se mostró en el ejemplo 39. La estructura de GalNAc3-7a se mostró en el ejemplo 48. La estructura de GalNAc3-10a se mostró en el ejemplo 46. La estructura de GalNAc3-13a se mostró en el ejemplo 62. La estructura de GalNAc3-19a se mostró en el ejemplo 70.
Ejemplo 98: evaluación de los efectos proinflamatorios de los oligonucleótidos que comprenden un conjugado de GalNAc en el ensayo de hPMBC
Los oligonucleótidos enumerados en la tabla 109 se sometieron a prueba para determinar los efectos proinflamatorios en un ensayo de hPMBC como se describe en los ejemplos 23 y 24. (Véanse las tablas 30, 83, 95 y 108 para las descripciones de los oligonucleótidos). ISIS 353512 es un respondedor alto usado como control positivo, y los otros oligonucleótidos se describen en las tablas 83, 95 y 108. Los resultados mostrados en la tabla 109 se obtuvieron usando sangre de un donante voluntario. Los resultados muestran que los oligonucleótidos que comprenden enlaces internucleosídicos mixtos PO/PS produjeron respuestas proinflamatorias significativamente menores en comparación con los mismos oligonucleótidos que tienen enlaces PS totales. Además, el grupo conjugado de GalNAc no tuvo un efecto significativo en este ensayo.
Tabla 109
Figure imgf000092_0001
Ejemplo 99: afinidades de unión de oligonucleótidos que comprenden un conjugado de GalNAc para el receptor de asialoglucoproteína
Las afinidades de unión de los oligonucleótidos enumerados en la tabla 110 (véase la tabla 76 para las descripciones de los oligonucleótidos) para el receptor de asialoglucoproteína se sometieron a prueba en un ensayo de unión a receptor competitivo. El ligando competidor, glucoproteína ácida a l (AGP), se incubó en tampón acetato de sodio 50 mM (pH 5) con 1 U de neuraminidasa-agarosa durante 16 horas a 37 °C, y se confirmó una desialilación > 90 % por ensayo de ácido siálico o bien cromatografía de exclusión por tamaño (SEC). Se usó monocloruro de yodo para yodar la AGP de acuerdo con el procedimiento de Atsma et al. (véase J Lipid Res. 1991 Jan; 32(1): 173-81.) En este procedimiento, se añadió glucoproteína ácida a1 desialilada (des-AGP) a cloruro de yodo 10 mM, Na125I y glicina 1 M en NaOH 0,25 M. Después de incubación durante 10 minutos a temperatura ambiente, se separó des-AGP marcada con 125I del 125I libre concentrando la mezcla dos veces utilizando una columna de centrifugación 3 KDMWCO. La proteína se sometió a prueba para determinar la eficacia y la pureza del marcado en un sistema de HPLC equipado con una columna Agilent SEC-3 (7,8 x 300 mm) y un contador 13-RAM. Los experimentos de competencia utilizando des-AGP marcada con 125I y diversos ASO que contenían agrupaciones de GalNAc se realizaron como sigue. Se prepararon células HepG2 humanas (106 células/ml) en placas de 6 pocillos en 2 ml de medio de crecimiento apropiado. Se usó medio MEM complementado con suero fetal bovino (FBS) al 10 %, L-glutamina 2 mM y HEPES 10 mM. Las células se incubaron 16-20 horas a 37 °C con CO2 al 5 % y al 10 % respectivamente. Las células se lavaron con medio sin FBS antes del experimento. Las células se incubaron durante 30 min a 37 °C con 1 ml de mezcla de competencia que contenía medios de crecimiento apropiados con FBS al 2 %, des-AGP marcada con 125I 10'8 M y a So que contenían agrupaciones de GalNAc en concentraciones que varían de 10'11 a 10'5 M. La unión inespecífica se determinó en presencia de glúcido GalNAc 10-2 M. Las células se lavaron dos veces con medio sin FBS para retirar des-AGP marcada con 125I no unida y el competidor ASO de GalNAc. Las células se lisaron usando tampón RLT de Qiagen que contenía p-mercaptoetanol al 1 %. Los lisados se transfirieron a tubos de ensayo de fondo redondo después de un breve ciclo de congelación/descongelación de 10 min y se sometieron a ensayo en un contador y. La unión inespecífica se restó antes de dividir los recuentos de proteína 125I entre el valor de los recuentos de concentración de GalNAc-ASO más bajos. Las curvas de inhibición se ajustaron de acuerdo con una ecuación de unión competitiva de sitio único usando un algoritmo de regresión no lineal para calcular las afinidades de unión (Kd).
Los resultados en la tabla 110 se obtuvieron a partir de experimentos realizados en cinco días diferentes. Los resultados para oligonucleótidos marcados con el superíndice "a" son el promedio de los experimentos realizados en dos días diferentes. Los resultados muestran que los oligonucleótidos que comprenden un grupo conjugado de GalNAc en el extremo 5' se unen al receptor de asialoglucoproteína en células HepG2 humanas con una afinidad de 1,5 a 16 veces mayor que los oligonucleótidos que comprenden un grupo conjugado de GalNAc en el extremo 3'.
Tabla 110
Resultados del ensayo de unión a receptor de asialoglucoproteína
Figure imgf000092_0002
Ejemplo 100: inhibición antisentido in v iv o por o ligonucleótidos que comprenden un grupo conjugado de GalNAc d irig ido a Apo(a) in v iv o
Los oligonucleótidos enumerados en la tabla 111a a continuación se sometieron a prueba en un estudio de dosis única para determinar la duración de la acción en ratones.
Tabla 111a
ASO modificados dirigidos a APO(a)
Figure imgf000093_0001
La estructura de GalNAc3-7a se mostró en el ejemplo 48.
Tratamiento
A ratones transgénicos hembra que expresan Apo(a) humana se les inyectó a cada uno por vía subcutánea una vez por semana, para un total de 6 dosis, un oligonucleótido y la dosificación enumerados en la tabla 111b o PBS. Cada grupo de tratamiento consistió en 3 animales. Se extrajo sangre el día antes de la dosificación para determinar los niveles de referencia de la proteína Apo(a) en plasma y a las 72 horas, 1 semana y 2 semanas después de la primera dosis. Se realizan extracciones de sangre adicionales a las 3 semanas, 4 semanas, 5 semanas y 6 semanas después de la primera dosis. Los niveles de proteína Apo(a) en plasma se midieron usando un ELISA. Los resultados en la tabla 111b se presentan como el promedio del porcentaje de niveles de proteína Apo(a) en plasma para cada grupo de tratamiento, normalizados a niveles de referencia (% BL). Los resultados muestran que los oligonucleótidos que comprenden un grupo conjugado de GalNAc presentaron una potente reducción en la expresión de Apo(a). Este potente efecto se observó para el oligonucleótido que comprende enlaces internucleosídicos de PS completos y el oligonucleótido que comprende enlaces de PO y Ps mixtos.
Tabla 111b
Niveles de proteína en plasma de Apo(a)
Figure imgf000093_0002
Ejemplo 101: inhibición antisentido por oligonucleótidos que comprenden una agrupación de GalNAc enlazada por medio de un resto estable
Los oligonucleótidos enumerados en la tabla 112 se sometieron a prueba para determinar la inhibición de la expresión de APOC-III de ratón in vivo. A ratones C57B1/6 se les inyectó a cada uno por vía subcutánea una vez un oligonucleótido enumerado en la tabla 112 o PBS. Cada grupo de tratamiento consistió en 4 animales. Cada ratón tratado con ISIS 440670 recibió una dosis de 2, 6, 20 o 60 mg/kg. Cada ratón tratado con ISIS 680772 o 696847 recibió 0,6, 2, 6 o 20 mg/kg. El grupo conjugado de GalNAc de ISIS 696847 se enlaza por medio de un resto estable, un enlace fosforotioato en lugar de un enlace que contiene fosfodiéster fácilmente escindible. Los animales se sacrificaron 72 horas después de la dosis. Los niveles de ARNm de APOC-III hepáticos se midieron usando PCR ultrarrápida. Los niveles de ARNm de APOC-III se normalizaron a niveles de ARNm de ciclofilina de acuerdo con protocolos estándar. Los resultados se presentan en la tabla 112 como el promedio del porcentaje de niveles de ARNm de APOC-III para cada grupo de tratamiento en relación con el grupo de control de solución salina. Los resultados muestran que los oligonucleótidos que comprenden un grupo conjugado de GalNAc fueron significativamente más potentes que el oligonucleótido que carece de un grupo conjugado. Además, el oligonucleótido que comprende un grupo conjugado de GalNAc enlazado al oligonucleótido por medio de un resto escindible (ISIS 680772) fue aún más potente que el oligonucleótido que comprende un grupo conjugado de GalNAc enlazado al oligonucleótido por medio de un resto estable (ISIS 696847).
Tabla 112
Oligonucleótidos modificados dirigidos a APOC-III de ratón
Figure imgf000094_0001
La estructura de GalNAc3-7a se mostró en el ejemplo 48.
Ejemplo 108: inhibición antisentido in v iv o por o ligonucleótidos que comprenden un grupo conjugado de GalNAc d irig ido a Apo(a) in v iv o
Los oligonucleótidos enumerados en la tabla 118 a continuación se sometieron a prueba en un estudio de dosis única en ratones.
Tabla 118
ASO modificados dirigidos a APO(a)
Figure imgf000094_0002
La estructura de GalNAc3-7a se mostró en el ejemplo 48.
Tratamiento
A ratones transgénicos macho que expresan Apo(a) humana se les inyectó a cada uno por vía subcutánea una vez un oligonucleótido y la dosificación enumerados en la tabla 119 o PBS. Cada grupo de tratamiento consistió en 4 animales. Se extrajo sangre el día antes de la dosificación para determinar los niveles de referencia de la proteína Apo(a) en plasma y 1 semana después de la primera dosis. Se realizan extracciones de sangre adicionales semanalmente durante aproximadamente 8 semanas. Los niveles de proteína Apo(a) en plasma se midieron usando un ELISA. Los resultados en la tabla 119 se presentan como el promedio del porcentaje de niveles de proteína Apo(a) en plasma para cada grupo de tratamiento, normalizados a niveles de referencia (% BL). Los resultados muestran que los oligonucleótidos antisentido redujeron la expresión de proteína Apo(a). Además, los oligonucleótidos que comprenden un grupo conjugado de GalNAc presentaron una reducción aún más potente en la expresión de Apo(a) que el oligonucleótido que no comprende un grupo conjugado.
Tabla 119
Niveles de proteína en plasma de Apo(a)
Figure imgf000095_0001
Ejemplo 113: inhibición antisentido in v iv o por o ligonucleótidos dirigidos a CEB
Los oligonucleótidos enumerados en la tabla 121 se sometieron a prueba en un estudio dependiente de la dosis para determinar la inhibición antisentido del factor B del complemento humano (CFB) en ratones.
Tabla 121
ASO m odificados d irigidos a CFB
Figure imgf000095_0002
La estructura de GalNAc3-3a se mostró previamente en el ejemplo 39.
Tratamiento
A ratones transgénicos que expresan CFB humano (Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME) se les inyectó por vía subcutánea una vez por semana durante 3 semanas (un total de 4 dosis) un oligonucleótido enumerado en la tabla 122 o solución salina. Los cuatro grupos de tratamiento que recibieron n.° ISIS 588540 recibieron 6, 12, 25 o 50 mg/kg por dosis. Los cuatro grupos de tratamiento que recibieron n.° ISIS 687301 recibieron 0,25, 0,5, 2 o 6 mg/kg por dosis. Cada grupo de tratamiento consistió en 4 animales. Los ratones se sacrificaron 2 días después de la administración final para determinar los niveles de ARNm de ciclofilina y CFB humano hepáticos y renales usando PCR ultrarrápida de acuerdo con protocolos estándar. Los niveles de ARNm de CFB se normalizaron a los niveles de ciclofilina, y los promedios para cada grupo de tratamiento se usaron para determinar la dosis que logró una un 50 % de inhibición de la expresión de transcrito de CFB humano (DE5 0 ). Los resultados son los promedios de cuatro experimentos completados con dos conjuntos de sonda y cebador diferentes y se muestran en la tabla 122.
Tabla 122
Potencias de oligonucleótidos d irigidos a CFB humano in v iv o
Figure imgf000096_0001
Los niveles de transaminasas hepáticas, alanina aminotransferasa (ALT) y aspartato aminotransferasa (AST), en suero, se midieron en relación con ratones inyectados con solución salina usando protocolos estándar. También se evaluaron la bilirrubina total, BUN y pesos corporales. Los resultados muestran que no hubo cambios significativos en ninguno de los grupos de tratamiento en relación con el grupo tratado con solución salina (datos no mostrados), lo que indica que ambos oligonucleótidos se toleraron muy bien.
Ejemplo 114: inhibición antisentido in v iv o por o ligonucleótidos dirigidos a CFB
Los oligonucleótidos enumerados en la tabla 123 se sometieron a prueba en un estudio dependiente de la dosis para determinar la inhibición antisentido de CFB humano en ratones.
Tratamiento
A ratones transgénicos que expresan CFB humano (Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME) se les inyectaron por vía subcutánea una vez 0,6, 1, 6 o 18 mg/kg de un oligonucleótido enumerado en la tabla 123 o solución salina. Cada grupo de tratamiento consistió en 4 o 5 animales. Los ratones se sacrificaron 72 horas después de la dosis para determinar los niveles de ARNm de ciclofilina y CFB humano hepáticos usando PCR ultrarrápida de acuerdo con protocolos estándar. Los niveles de ARNm de CFB se normalizaron a los niveles de ciclofilina, y los promedios para cada grupo de tratamiento se usaron para determinar la dosis que logró una un 50 % de inhibición de la expresión de transcrito de CFB humano (DE5 0 ). Los resultados se muestran en la tabla 123.
Tabla 123
ASO m odificados d irigidos a CFB
Figure imgf000096_0002
La estructura de GalNAc3-7a se mostró previamente en el ejemplo 48.
Ejemplo 115: inhibición antisentido del factor B del complemento humano (CFB) en células HepG2 por gápmeros MOE
Se diseñaron oligonucleótidos antisentido dirigidos al ácido nucleico del factor B del complemento humano (CFB) y se sometieron a prueba para determinar sus efectos sobre el ARNm de CFB in vitro. Los oligonucleótidos antisentido se sometieron a prueba en una serie de experimentos que tuvieron condiciones de cultivo similares. Los resultados de cada experimento se presentan en tablas separadas mostradas a continuación. Se transfectaron células HepG2 cultivadas a una densidad de 20.000 células por pocillo usando electroporación con oligonucleótido antisentido 4.500 nM. Después de un período de tratamiento de aproximadamente 24 horas, se aisló el ARN de las células y se midieron los niveles de ARNm de CFB por PCR ultrarrápida cuantitativa. Se usó el conjunto de sonda y cebador humano RTS3459 (secuencia directa AG TC TC TG TG G C ATG G TTTG G , designada en el presente documento como SEQ ID NO: 810; secuencia inversa O G G C G A A T G A C 'lG A ü A l 'C lT G , designada en el presente documento como SEQ ID NO: 811; secuencia de sonda T A C C G A T T A C ’C a C A A G C A A C C A T G G C 'A , designada en el presente documento como SEQ ID NO: 812) para medir los niveles de ARNm. Los niveles de ARNm de CFB se ajustaron de acuerdo con el contenido de ARN total, como se mide por RIBOGREEN®. Los resultados se presentan como porcentaje de inhibición de CFB, en relación con las células de control no tratadas.
Los oligonucleótidos antisentido quiméricos recientemente diseñados en las tablas a continuación se diseñaron como gápmeros 5-10-5 MOE. Los gápmeros 5-10-5 MOE tienen una longitud de 20 nucleósidos, en los que el segmento de hueco central comprende diez 2'-desoxinucleósidos y se flanquea por segmentos de ala en la dirección 5' y la dirección 3' que comprenden cinco nucleósidos cada uno. Cada nucleósido en el segmento de ala 5' y cada nucleósido en el segmento de ala 3' tiene una modificación 2'-MOE. Los enlaces internucleosídicos a lo largo de cada gápmero son enlaces fosforotioato (P=S). Todos los residuos de citosina en cada gápmero son 5-metilcitosinas. "Sitio de inicio" indica el nucleósido más hacia 5' al que se dirige el gápmero en la secuencia génica humana. "Sitio de parada" indica el nucleósido más hacia 3' al que se dirige el gápmero en la secuencia génica humana. Cada gápmero enumerado en las tablas a continuación se dirige al ARNm de CFB humano, designado en el presente documento como SEQ ID NO: 1 (n.° de acceso GENBANK NM_001710.5) o bien a la secuencia genómica de CFB humano, designada en el presente documento como SEQ ID NO: 2 (n.° de acceso GENBANK NT_007592.15 truncada de los nucleótidos 31852000 a 31861000), o a ambos, 'np' indica que el oligonucleótido antisentido no se dirige a esa secuencia génica particular con un 100 % de complementariedad.
Tabla 124
Inhibición de ARNm de CFB por gápmeros 5-10-5 MOE dirigidos a SEQ ID NO: 1 y 2
Figure imgf000097_0001
Figure imgf000098_0001
Figure imgf000099_0001
Figure imgf000100_0001
Tabla 125
Inhibición de ARNm de CFB por gápmeros 5-10-5 MOE dirigidos a SEQ ID NO: 1 y 2
Figure imgf000100_0002
Figure imgf000101_0001
Figure imgf000102_0001
Figure imgf000103_0001
Tabla 126
Inhibición de ARNm de CFB por gápmeros 5-10-5 MOE dirigidos a SEQ ID NO: 1 y 2
Figure imgf000103_0002
Figure imgf000104_0001
Figure imgf000105_0001
Figure imgf000106_0001
Tabla 127
Inhibición de ARNm de CFB por gápmeros 5-10-5 MOE dirigidos a SEQ ID NO: 1 y 2
Figure imgf000106_0002
Figure imgf000107_0001
Figure imgf000108_0001
Tabla 128
Inhibición de ARNm de CFB por gápmeros 5-10-5 MOE dirigidos a SEQ ID NO: 1 y 2
Figure imgf000108_0002
Figure imgf000109_0001
Figure imgf000110_0001
Figure imgf000111_0001
Ejemplo 116: inhibición antisentido del factor B del complemento humano (CFB) en células HepG2 por gápmeros MOE
Se diseñaron oligonudeótidos antisentido adicionales dirigidos al ácido nucleico del factor B del complemento humano (CFB) y se sometieron a prueba para determinar sus efectos sobre el ARNm de CFB in vitro. Se transfectaron células HepG2 cultivadas a una densidad de 20.000 células por pocillo usando electroporación con oligonucleótido antisentido 4.500 nM. Después de un período de tratamiento de aproximadamente 24 horas, se aisló el ARN de las células y se midieron los niveles de ARNm de CFB por PCR ultrarrápida cuantitativa. Se usó el conjunto de sonda y cebador humano RTS3460_MGB (secuencia directa CGA A GC AGCTC A ATO A A ATC A A, designada en el presente documento como SEQ ID NO: 813; secuencia inversa TGCCTGGAGGGCCITCIT, designada en el presente documento como SEQ ID NO: 814; secuencia de sonda AGACCACAAGTTGAAGTC, designada en el presente documento como SEQ ID NO: 815) para medir los niveles de ARNm. Los niveles de ARNm de CFB se ajustaron de acuerdo con el contenido de ARN total, como se mide por RIBOGREEN®. Los resultados se presentan como porcentaje de inhibición de CFB, en relación con las células de control no tratadas.
Los oligonucleótidos antisentido quiméricos recientemente diseñados en las tablas a continuación se diseñaron como gápmeros 5-10-5 MOE. Los gápmeros 5-10-5 MOE tienen una longitud de 20 nucleósidos, en los que el segmento de hueco central comprende diez 2'-desoxinucleósidos y se flanquea por segmentos de ala en la dirección 5' y la dirección 3' que comprenden cinco nucleósidos cada uno. Cada nucleósido en el segmento de ala 5' y cada nucleósido en el segmento de ala 3' tiene una modificación 2'-MOE. Los enlaces internucleosídicos a lo largo de cada gápmero son enlaces fosforotioato (P=S). Todos los residuos de citosina en cada gápmero son 5-metilcitosinas. "Sitio de inicio" indica el nucleósido más hacia 5' al que se dirige el gápmero en la secuencia génica humana. "Sitio de parada" indica el nucleósido más hacia 3' al que se dirige el gápmero en la secuencia génica humana. Cada gápmero enumerado en las tablas a continuación se dirige al ARNm de CFB humano, designado en el presente documento como SEQ ID NO: 1 (n.° de acceso GENBANK NM_001710.5) o bien a la secuencia genómica de CFB humano, designada en el presente documento como SEQ ID NO: 2 (n.° de acceso GENBANK NT_007592.15 truncada de los nucleótidos 31852000 a 31861000), o a ambos, 'np' indica que el oligonucleótido antisentido no se dirige a esa secuencia génica particular con un 100 % de complementariedad.
Tabla 129
Inhibición de ARNm de CFB or á meros 5-10-5 MOE diri idos a SEQ ID NO: 1 2
Figure imgf000112_0001
Figure imgf000113_0001
Ejemplo 117: inhibición antisentido del factor B del complemento humano (CFB) en células HepG2 por gápmeros MOE
Se diseñaron oligonucleótidos antisentido adicionales dirigidos al ácido nucleico del factor B del complemento humano (CFB) y se sometieron a prueba para determinar sus efectos sobre el ARNm de CFB in vitro. Los oligonucleótidos antisentido se sometieron a prueba en una serie de experimentos que tuvieron condiciones de cultivo similares. Los resultados de cada experimento se presentan en tablas separadas mostradas a continuación. Se transfectaron células HepG2 cultivadas a una densidad de 20.000 células por pocillo usando electroporación con oligonucleótido antisentido 5.000 nM. Después de un período de tratamiento de aproximadamente 24 horas, se aisló el ARN de las células y se midieron los niveles de ARNm de CFB por PCR ultrarrápida cuantitativa. Se usó el conjunto de sonda y cebador humano RTS3459 para medir los niveles de ARNm. Los niveles de ARNm de CFB se ajustaron de acuerdo con el contenido de ARN total, como se mide por RIBOGREEN®. Los resultados se presentan como porcentaje de inhibición de CFB, en relación con las células de control no tratadas.
Los oligonucleótidos antisentido quiméricos recientemente diseñados en las tablas a continuación se diseñaron como gápmeros 5-10-5 MOE. Los gápmeros tienen una longitud de 20 nucleósidos, en los que el segmento de hueco central comprende diez 2-desoxinucleósidos y se flanquea por segmentos de ala en la dirección 5' y la dirección 3' que comprenden cinco nucleósidos cada uno. Cada nucleósido en el segmento de ala 5' y cada nucleósido en el segmento de ala 3' tiene una modificación 2'-MOE. Los enlaces intemucleosídicos a lo largo de cada gápmero son enlaces fosforotioato (P=S). Todos los residuos de citosina en cada gápmero son 5-metilcitosinas. "Sitio de inicio" indica el nucleósido más hacia 5' al que se dirige el gápmero en la secuencia génica humana. "Sitio de parada" indica el nucleósido más hacia 3' al que se dirige el gápmero en la secuencia génica humana. Cada gápmero enumerado en las tablas a continuación se dirige al ARNm de CFB humano, designado en el presente documento como SEQ ID NO: 1 (n.° de acceso GENBANK NM_001710.5) o bien a la secuencia genómica de CFB humano, designada en el presente documento como SEQ ID NO: 2 (n.° de acceso GENBANK NT_007592.15 truncada de los nucleótidos 31852000 a 31861000), o a ambos, 'np' indica que el oligonucleótido antisentido no se dirige a esa secuencia génica particular con un 100 % de complementariedad. En caso de que no se muestre la alineación de secuencias para un gen diana en una tabla particular, se entiende que ninguno de los oligonucleótidos presentados en esa tabla se alinea con un 100 % de complementariedad con ese gen diana.
Tabla 130
Inhibición de ARNm de CFB por gápmeros 5-10-5 MOE dirigidos a SEQ ID NO: 1
Figure imgf000114_0001
Figure imgf000115_0001
Figure imgf000116_0001
a a
Inhibición de ARNm de CFB por gápmeros 5-10-5 MOE dirigidos a SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2
Figure imgf000117_0001
Figure imgf000118_0001
Ejemplo 118: inhibición antisentido del factor B del complemento humano (CFB) en células HepG2 por gápmeros MOE
Se diseñaron oligonucleótidos antisentido dirigidos al ácido nucleico del factor B del complemento humano (CFB) y se sometieron a prueba para determinar sus efectos sobre el ARNm de CFB in vitro. Los oligonucleótidos antisentido se sometieron a prueba en una serie de experimentos que tuvieron condiciones de cultivo similares.
Los resultados de cada experimento se presentan en tablas separadas mostradas a continuación. Se transfectaron células HepG2 cultivadas a una densidad de 20.000 células por pocillo usando electroporación con oligonucleótido antisentido 3.000 nM. Después de un período de tratamiento de aproximadamente 24 horas, se aisló el ARN de las células y se midieron los niveles de ARNm de CFB por PCR ultrarrápida cuantitativa. Se usó el conjunto de sonda y cebador humano RTS3459 para medir los niveles de ARNm. Los niveles de ARNm de CFB se ajustaron de acuerdo con el contenido de ARN total, como se mide por RIBOGREEN®. Los resultados se presentan como porcentaje de inhibición de CFB, en relación con las células de control no tratadas.
Los oligonucleótidos antisentido quiméricos recientemente diseñados en las tablas a continuación se diseñaron como gápmeros 4-8-5 MOE, 5-9-5 MOE, 5-10-5 MOE, 3-10-4 MOE, 3-10-7 MOE, 6-7-6- MOE, 6-8-6 MOE o 5-7-5 MOE, o como oligonucleótidos desoxi, MOE y (S)-cEt.
Los gápmeros 4-8-5 MOE tienen una longitud de 17 nucleósidos, en los que el segmento de hueco central comprende ocho 2'-desoxinucleósidos y se flanquea por segmentos de ala en la dirección 5' y la dirección 3' que comprenden cuatro y cinco nucleósidos respectivamente. Los gápmeros 5-9-5 MOE tienen una longitud de 19 nucleósidos, en los que el segmento de hueco central comprende nueve 2'-desoxinucleósidos y se flanquea por segmentos de ala en la dirección 5' y la dirección 3' que comprenden cinco nucleósidos cada uno. Los gápmeros 5-10-5 MOE tienen una longitud de 20 nucleósidos, en los que el segmento de hueco central comprende diez 2'-desoxinucleósidos y se flanquea por segmentos de ala en la dirección 5' y la dirección 3' que comprenden cinco nucleósidos cada uno. Los gápmeros 5-7-5 MOE tienen una longitud de 17 nucleósidos, en los que el segmento de hueco central comprende siete 2'-desoxinucleósidos y se flanquea por segmentos de ala en la dirección 5' y la dirección 3' que comprenden cinco nucleósidos cada uno. Los gápmeros 3-10-4 MOE tienen una longitud de 17 nucleósidos, en los que el segmento de hueco central comprende diez 2'-desoxinucleósidos y se flanquea por segmentos de ala en la dirección 5' y la dirección 3' que comprenden tres y cuatro nucleósidos respectivamente. Los gápmeros 3-10-7 MOE tienen una longitud de 20 nucleósidos, en los que el segmento central comprende diez 2'-desoxinucleósidos y se flanquea por segmentos de ala en la dirección 5' y la dirección 3' que comprenden tres y siete nucleósidos respectivamente. Los gápmeros 6-7-6 MOE tienen una longitud de 19 nucleósidos, en los que el segmento de hueco central comprende siete 2'-desoxinucleósidos y se flanquea por segmentos de ala en la dirección 5' y la dirección 3' que comprenden seis nucleósidos cada uno. Los gápmeros 6-8-6 MOE tienen una longitud de 20 nucleósidos, en los que el segmento de hueco central comprende ocho 2'-desoxinucleósidos y se flanquea por segmentos de ala en la dirección 5' y la dirección 3' que comprenden seis nucleósidos cada uno. Los enlaces internucleosídicos a lo largo de cada gápmero son enlaces fosforotioato (P=S). Todos los residuos de citosina en cada gápmero son 5-metilcitosinas.
Los oligonucleótidos desoxi, MOE y (S)-cEt tienen una longitud de 16 nucleósidos en los que el nucleósido tiene una modificación glucídica MOE, una modificación glucídica (S)-cEt o bien una modificación desoxi. La columna 'Química' describe las modificaciones glucídicas de cada oligonucleótido, 'k' indica una modificación glucídica (S)-cEt; 'd' indica desoxirribosa; y 'e' indica una modificación MOE.
"Sitio de inicio" indica el nucleósido más hacia 5' al que se dirige el gápmero en la secuencia génica humana. "Sitio de parada" indica el nucleósido más hacia 3' al que se dirige el gápmero en la secuencia génica humana. Cada gápmero enumerado en las tablas a continuación se dirige al ARNm de CFB humano, designado en el presente documento como SEQ ID NO: 1 (n.° de acceso GENBANK NM_001710.5) o bien a la secuencia genómica de CFB humano, designada en el presente documento como SEQ ID NO: 2 (n.° de acceso GENBANK NT_007592.15 truncada de los nucleótidos 31852000 a 31861000), o a ambos, 'np' indica que el oligonucleótido antisentido no se dirige a esa secuencia génica particular con un 100 % de complementariedad.
Tabla 132
Inhibición de ARNm de CFB por oligonucleótidos desoxi, MOE y (S)-cEt dirigidos a SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2
Figure imgf000119_0001
Figure imgf000120_0001
Figure imgf000121_0001
Tabla 133
Inhibición de ARNm de CFB por gápmeros 5-10-5 MOE dirigidos a SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2
Figure imgf000121_0002
Figure imgf000122_0001
Figure imgf000123_0001
Figure imgf000124_0001
Figure imgf000125_0001
Tabla 134
Inhibición de ARNm de CFB por gápmeros MOE dirigidos a SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2
Figure imgf000125_0002
Figure imgf000126_0001
Figure imgf000127_0001
Tabla 135
Inhibición de ARNm de CFB por gápmeros MOE dirigidos a SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2
Figure imgf000127_0002
Figure imgf000128_0001
Figure imgf000129_0001
Tabla 136
Inhibición de ARNm de CFB por gápmeros MOE dirigidos a SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2
Figure imgf000129_0002
Figure imgf000130_0001
Figure imgf000131_0001
Figure imgf000132_0001
Tabla 137
Inhibición de ARNm de CFB por gápmeros MOE dirigidos a SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2
Figure imgf000132_0002
Figure imgf000133_0001
Figure imgf000134_0001
Figure imgf000135_0001
Ejemplo 119: inhibición antisentido del factor B del complemento humano (CFB) en células HepG2 por gápmeros MOE
Se diseñaron oligonucleótidos antisentido adicionales dirigidos al ácido nucleico del factor B del complemento humano (CFB) y se sometieron a prueba para determinar sus efectos sobre el ARNm de CFB in vitro. Los oligonucleótidos antisentido se sometieron a prueba en una serie de experimentos que tuvieron condiciones de cultivo similares. Los resultados de cada experimento se presentan en tablas separadas mostradas a continuación. Se transfectaron células HepG2 cultivadas a una densidad de 20.000 células por pocillo usando electroporación con oligonucleótido antisentido 2.000 nM. Después de un período de tratamiento de aproximadamente 24 horas, se aisló el ARN de las células y se midieron los niveles de ARNm de CFB por PCR ultrarrápida cuantitativa. Se usó el conjunto de sonda y cebador humano RTS3459 para medir los niveles de ARNm. Los niveles de ARNm de CFB se ajustaron de acuerdo con el contenido de ARN total, como se mide por RIBOGREEN®. Los resultados se presentan como porcentaje de inhibición de CFB, en relación con las células de control no tratadas.
Los oligonucleótidos antisentido quiméricos recientemente diseñados en las tablas a continuación se diseñaron como gápmeros 4-8-5 MOE, 5-8-5 MOE, 5-9-5 MOE, 5-10-5 MOE, 6-7-6- MOE, 3-10-5 MOE, o 6-8-6 MOE.
Los gápmeros 4-8-5 MOE tienen una longitud de 17 nucleósidos, en los que el segmento de hueco central comprende ocho 2'-desoxinucleósidos y se flanquea por segmentos de ala en la dirección 5' y la dirección 3' que comprenden cuatro y cinco nucleósidos respectivamente. Los gápmeros 5-8-5 MOE tienen una longitud de 18 nucleósidos, en los que el segmento de hueco central comprende ocho 2'-desoxinucleósidos y se flanquea por segmentos de ala en la dirección 5' y la dirección 3' que comprenden cinco nucleósidos cada uno. Los gápmeros 5- 9-5 MOE tienen una longitud de 19 nucleósidos, en los que el segmento de hueco central comprende nueve 2'-desoxinucleósidos y se flanquea por segmentos de ala en la dirección 5' y la dirección 3' que comprenden cinco nucleósidos cada uno. Los gápmeros 5-10-5 MOE tienen una longitud de 20 nucleósidos, en los que el segmento de hueco central comprende diez 2'-desoxinucleósidos y se flanquea por segmentos de ala en la dirección 5' y la dirección 3' que comprenden cinco nucleósidos cada uno. Los gápmeros 3-10-5 MOE tienen una longitud de 18 nucleósidos, en los que el segmento central comprende diez 2'-desoxinucleósidos y se flanquea por segmentos de ala en la dirección 5' y la dirección 3' que comprenden tres y cinco nucleósidos respectivamente. Los gápmeros 6- 7-6 MOE tienen una longitud de 19 nucleósidos, en los que el segmento de hueco central comprende siete 2'-desoxinucleósidos y se flanquea por segmentos de ala en la dirección 5' y la dirección 3' que comprenden seis nucleósidos cada uno. Los gápmeros 6-8-6 MOE tienen una longitud de 20 nucleósidos, en los que el segmento de hueco central comprende ocho 2'-desoxinucleósidos y se flanquea por segmentos de ala en la dirección 5' y la dirección 3' que comprenden seis nucleósidos cada uno. Cada nucleósido en el segmento de ala 5' y cada nucleósido en el segmento de ala 3' tiene una modificación 2'-MOE. Los enlaces internucleosídicos a lo largo de cada gápmero son enlaces fosforotioato (P=S). Todos los residuos de citosina en cada gápmero son 5­ metilcitosinas.
"Sitio de inicio" indica el nucleósido más hacia 5' al que se dirige el gápmero en la secuencia génica humana. "Sitio de parada" indica el nucleósido más hacia 3' al que se dirige el gápmero en la secuencia génica humana. Cada gápmero enumerado en las tablas a continuación se dirige al ARNm de CFB humano, designado en el presente documento como SEQ ID NO: 1 (n.° de acceso GENBANK NM_001710.5) o bien a la secuencia genómica de CFB humano, designada en el presente documento como SEQ ID NO: 2 (n.° de acceso GENBANK NT_007592.15 truncada de los nucleótidos 31852000 a 31861000), o a ambos, 'np' indica que el oligonucleótido antisentido no se dirige a esa secuencia génica particular con un 100 % de complementariedad.
Tabla 138
Inhibición de ARNm de CFB por gápmeros MOE dirigidos a SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2
Figure imgf000136_0001
Figure imgf000137_0001
Figure imgf000138_0001
Figure imgf000139_0001
a a
Inhibición de ARNm de CFB por gápmeros MOE dirigidos a SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2
Figure imgf000140_0001
Figure imgf000141_0001
Figure imgf000142_0001
Tabla 140
Inhibición de ARNm de CFB por gápmeros MOE dirigidos a SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2
Figure imgf000142_0002
Figure imgf000143_0001
Figure imgf000144_0001
Figure imgf000145_0001
Ejemplo 120: inhibición antisentido del factor B del complemento humano (CFB) en células HepG2 por gápmeros MOE
Se diseñaron oligonucleótidos antisentido adicionales dirigidos al ácido nucleico del factor B del complemento humano (CFB) y se sometieron a prueba para determinar sus efectos sobre el ARNm de CFB in vitro. Se transfectaron células HepG2 cultivadas a una densidad de 20.000 células por pocillo usando electroporación con oligonucleótido antisentido 1.000 nM. Después de un período de tratamiento de aproximadamente 24 horas, se aisló el ARN de las células y se midieron los niveles de ARNm de CFB por PCR ultrarrápida cuantitativa. Se usó el conjunto de sonda y cebador humano RTS3459 para medir los niveles de ARNm. Los niveles de ARNm de CFB se ajustaron de acuerdo con el contenido de ARN total, como se mide por RIBOGREEN®. Los resultados se presentan como porcentaje de inhibición de CFB, en relación con las células de control no tratadas.
Los oligonucleótidos antisentido quiméricos recientemente diseñados en las tablas a continuación se diseñaron como oligonucleótidos desoxi, MOE y (S)-cEt. Los oligonucleótidos desoxi, MOE y (S)-cEt tienen una longitud de 16 nucleósidos en los que el nucleósido tiene una modificación glucídica MOE, una modificación glucídica (S)-cEt o bien una modificación desoxi. La columna 'Química' describe las modificaciones glucídicas de cada oligonucleótido, 'k' indica una modificación glucídica (S)-cEt; 'd' indica desoxirribosa; y 'e' indica una modificación MOE.
"Sitio de inicio" indica el nucleósido más hacia 5' al que se dirige el gápmero en la secuencia génica humana. "Sitio de parada" indica el nucleósido más hacia 3' al que se dirige el gápmero en la secuencia génica humana. Cada gápmero enumerado en las tablas a continuación se dirige al ARNm de CFB humano, designado en el presente documento como SEQ ID NO: 1 (n.° de acceso GENBANK NM_001710.5) o bien a la secuencia genómica de CFB humano, designada en el presente documento como SEQ ID NO: 2 (n.° de acceso GENBANK NT_007592.15 truncada de los nucleótidos 31852000 a 31861000), o a ambos, 'np' indica que el oligonucleótido antisentido no se dirige a esa secuencia génica particular con un 100 % de complementariedad.
Tabla 141
Inhibición de ARNm de CFB por oligonucleótidos desoxi, MOE y (S)-cEt dirigidos a SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2
Figure imgf000145_0002
Figure imgf000146_0001
Figure imgf000147_0001
Figure imgf000148_0001
Ejemplo 121: inhibición antisentido del factor B del complemento humano (CFB) en células HepG2 por gápmeros MOE
Se diseñaron oligonucleótidos antisentido adicionales dirigidos al ácido nucleico del factor B del complemento humano (CFB) y se sometieron a prueba para determinar sus efectos sobre el ARNm de CFB in vitro. Los oligonucleótidos antisentido se sometieron a prueba en una serie de experimentos que tuvieron condiciones de cultivo similares. Los resultados de cada experimento se presentan en tablas separadas mostradas a continuación. Se transfectaron células HepG2 cultivadas a una densidad de 20.000 células por pocillo usando electroporación con oligonucleótido antisentido 500 nM. Después de un período de tratamiento de aproximadamente 24 horas, se aisló el ARN de las células y se midieron los niveles de ARNm de CFB por PCR ultrarrápida cuantitativa. Se usó el conjunto de sonda y cebador humano RTS3459 para medir los niveles de ARNm. Los niveles de ARNm de CFB se ajustaron de acuerdo con el contenido de ARN total, como se mide por RIBOGREEN®. Los resultados se presentan como porcentaje de inhibición de CFB, en relación con las células de control no tratadas.
Los oligonucleótidos antisentido quiméricos recientemente diseñados en las tablas a continuación se diseñaron como oligonucleótidos desoxi, MOE y (S)-cEt, o como gápmeros 5-8-5 MOE, 5-9-5 MOE, 5-10-5 MOE, 6-7-6- MOE, 3-10-5 MOE o 6-8-6 MOE.
Los oligonucleótidos desoxi, MOE y (S)-cEt tienen una longitud de 16 nucleósidos en los que el nucleósido tiene una modificación glucídica MOE, una modificación glucídica (S)-cEt o bien una modificación desoxi. La columna 'Química' describe las modificaciones glucídicas de cada oligonucleótido, 'k' indica una modificación glucídica (S)-cEt; 'd' indica desoxirribosa; y 'e' indica una modificación MOE.
Los gápmeros 5-8-5 MOE tienen una longitud de 18 nucleósidos, en los que el segmento de hueco central comprende ocho 2'-desoxinucleósidos y se flanquea por segmentos de ala en la dirección 5' y la dirección 3' que comprenden cinco nucleósidos cada uno. Los gápmeros 5-9-5 MOE tienen una longitud de 19 nucleósidos, en los que el segmento de hueco central comprende nueve 2'-desoxinucleósidos y se flanquea por segmentos de ala en la dirección 5' y la dirección 3' que comprenden cinco nucleósidos cada uno. Los gápmeros 5-10-5 MOE tienen una longitud de 20 nucleósidos, en los que el segmento de hueco central comprende diez 2'-desoxinucleósidos y se flanquea por segmentos de ala en la dirección 5' y la dirección 3' que comprenden cinco nucleósidos cada uno. Los gápmeros 3-10-5 MOE tienen una longitud de 18 nucleósidos, en los que el segmento central comprende diez 2'-desoxinucleósidos y se flanquea por segmentos de ala en la dirección 5' y la dirección 3' que comprenden tres y cinco nucleósidos respectivamente. Los gápmeros 6-7-6 MOE tienen una longitud de 19 nucleósidos, en los que el segmento de hueco central comprende siete 2'-desoxinucleósidos y se flanquea por segmentos de ala en la dirección 5' y la dirección 3' que comprenden seis nucleósidos cada uno. Los gápmeros 6-8-6 MOE tienen una longitud de 20 nucleósidos, en los que el segmento de hueco central comprende ocho 2'-desoxinucleósidos y se flanquea por segmentos de ala en la dirección 5' y la dirección 3' que comprenden seis nucleósidos cada uno. Cada nucleósido en el segmento de ala 5' y cada nucleósido en el segmento de ala 3' tiene una modificación 2'-MOE. Los enlaces internucleosídicos a lo largo de cada gápmero son enlaces fosforotioato (P=S). Todos los residuos de citosina en cada gápmero son 5-metilcitosinas.
"Sitio de inicio" indica el nucleósido más hacia 5' al que se dirige el gápmero en la secuencia génica humana. "Sitio de parada" indica el nucleósido más hacia 3' al que se dirige el gápmero en la secuencia génica humana. Cada gápmero enumerado en las tablas a continuación se dirige al ARNm de CFB humano, designado en el presente documento como SEQ ID NO: 1 (n.° de acceso GENBANK NM_001710.5) o bien a la secuencia genómica de CFB humano, designada en el presente documento como SEQ ID NO: 2 (n.° de acceso GENBANK NT_007592.15 truncada de los nucleótidos 31852000 a 31861000), o a ambos, 'np' indica que el oligonucleótido antisentido no se dirige a esa secuencia génica particular con un 100 % de complementariedad.
Tabla 142
Inhibición de ARNm de CFB por oligonucleótidos desoxi, MOE y (S)-cEt dirigidos a SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2
Figure imgf000149_0001
Figure imgf000150_0001
Figure imgf000151_0001
Figure imgf000152_0001
Tabla 143
Inhibición de ARNm de CFB por oligonucleótidos desoxi, MOE y (S)-cEt dirigidos a SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2
Figure imgf000152_0002
Figure imgf000153_0001
Figure imgf000154_0001
Figure imgf000155_0001
Inhibición de ARNm de CFB por oligonucleótidos desoxi, MOE y (S)-cEt dirigidos a SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2
Figure imgf000156_0001
Figure imgf000157_0001
Figure imgf000158_0001
Figure imgf000159_0001
Tabla 145
Inhibición de ARNm de CFB por gápmeros MOE dirigidos a SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2
Figure imgf000159_0002
Figure imgf000160_0001
Figure imgf000161_0001
Figure imgf000162_0001
Tabla 146
Inhibición de ARNm de CFB por gápmeros MOE dirigidos a SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2
Figure imgf000162_0002
Figure imgf000163_0001
Figure imgf000164_0001
Tabla 147
Inhibición de ARNm de CFB por gápmeros 5-10-5 MOE dirigidos a SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2
Figure imgf000164_0002
Figure imgf000165_0001
Ejemplo 122: inhibición antisentido dependiente de la dosis de CFB humano en células HepG2 por gápmeros 5-10-5 MOE
Los gápmeros de los estudios descritos anteriormente que muestran inhibición in vitro de ARNm de CFB se seleccionaron y se sometieron a prueba a diversas dosis en células HepG2. Se prepararon células a una densidad de 20.000 células por pocillo y se transfectaron usando electroporación con concentraciones de 0,313 |j M, 0,625 j M, 1,25 j M, 2,50 j M, 5,00 j M o 10,00 j M de oligonucleótido antisentido, como se especifica en la tabla a continuación. Después de un período de tratamiento de aproximadamente 16 horas, se aisló el ARN de las células y se midieron los niveles de ARNm de CFB por PCR ultrarrápida cuantitativa. Se usó el conjunto de sonda y cebador humano RTS3459 para medir los niveles de ARNm. Los niveles de ARNm de CFB se ajustaron de acuerdo con el contenido de ARN total, como se mide por RIBOGREEN®. Los resultados se presentan como porcentaje de inhibición de CFB, en relación con las células de control no tratadas.
También se presenta la concentración inhibidora semimáxima (CI5 0 ) de cada oligonucleótido. Los niveles de ARNm de CFB se redujeron de manera dependiente de la dosis en las células tratadas con oligonucleótidos antisentido.
Tabla 148
Figure imgf000166_0001
Ejemplo 123: inhibición antisentido dependiente de la dosis de CFB humano en células HepG2
Los gápmeros de los estudios descritos anteriormente que muestran inhibición in vitro de ARNm de CFB se seleccionaron y se sometieron a prueba a diversas dosis en células HepG2. Los oligonucleótidos antisentido se sometieron a prueba en un número de experimentos con condiciones de cultivo similares. Los resultados de cada experimento se presentan en tablas separadas mostradas a continuación. Se prepararon células a una densidad de 20.000 células por pocillo y se transfectaron usando electroporación con concentraciones de 0,08 j M, 0,25 j M, 0,74 j M, 2,22 j M, 6,67 j M y 20,00 j M de oligonucleótido antisentido, como se especifica en la tabla a continuación. Después de un período de tratamiento de aproximadamente 16 horas, se aisló el ARN de las células y se midieron los niveles de ARNm de CFB por PCR ultrarrápida cuantitativa. Se usó el conjunto de sonda y cebador humano RTS3459 para medir los niveles de ARNm. Los niveles de ARNm de CFB se ajustaron de acuerdo con el contenido de ARN total, como se mide por RIBOGREEN®. Los resultados se presentan como porcentaje de inhibición de CFB, en relación con las células de control no tratadas.
También se presenta la concentración inhibidora semimáxima (CI5 0 ) de cada oligonucleótido. Los niveles de ARNm de CFB se redujeron de manera dependiente de la dosis en las células tratadas con oligonucleótidos antisentido.
Tabla 149
Figure imgf000166_0002
Figure imgf000167_0001
Tabla 150
Figure imgf000167_0002
Tabla 151
Figure imgf000167_0003
Tabla 152
Figure imgf000167_0004
Figure imgf000168_0001
Tabla 153
Figure imgf000168_0002
Tabla 154
Figure imgf000168_0003
Ejemplo 124: inhibición antisentido dependiente de la dosis de CFB humano en células HepG2
Los gápmeros de los estudios descritos anteriormente que muestran inhibición in vitro de ARNm de CFB se seleccionaron y se sometieron a prueba a diversas dosis en células HepG2. Los oligonudeótidos antisentido se sometieron a prueba en un número de experimentos con condiciones de cultivo similares. Los resultados de cada experimento se presentan en tablas separadas mostradas a continuación. Se prepararon células a una densidad de 20.000 células por pocillo y se transfectaron usando electroporación con concentraciones de 0,06 |j M, 0,25 |j M, 1,00 j M y 4,00 j M de oligonucleótido antisentido, como se especifica en la tabla a continuación. Después de un período de tratamiento de aproximadamente 16 horas, se aisló el ARN de las células y se midieron los niveles de ARNm de CFB por PCR ultrarrápida cuantitativa. Se usó el conjunto de sonda y cebador humano RTS3459 para medir los niveles de ARNm. Los niveles de ARNm de CFB se ajustaron de acuerdo con el contenido de ARN total, como se mide por RIBOGREEN®. Los resultados se presentan como porcentaje de inhibición de CFB, en relación con las células de control no tratadas.
También se presenta la concentración inhibidora semimáxima (CI5 0 ) de cada oligonucleótido. Los niveles de ARNm de CFB se redujeron de manera dependiente de la dosis en las células tratadas con oligonucleótidos antisentido.
Tabla 155
Figure imgf000169_0001
Tabla 156
Figure imgf000169_0002
Figure imgf000170_0001
Tabla 157
Figure imgf000170_0002
Tabla 158
Figure imgf000170_0003
Figure imgf000171_0001
Tabla 159
Figure imgf000171_0002
Figure imgf000172_0001
Ejemplo 125: inhibición antisentido dependiente de la dosis de CFB humano en células HepG2
Los gápmeros de los estudios descritos anteriormente que muestran inhibición in vitro de ARNm de CFB se seleccionaron y se sometieron a prueba a diversas dosis en células HepG2. Adicionalmente, se diseñó un
oligonucleótido desoxi, MOE y (S)-cEt, ISIS 594430, con la misma secuencia (< T(.( TT(.(.CiAC!T( A(¡(. i SEQ ID NO: 549) y la región diana (sitio de inicio diana 2195 de SEQ ID NO: 1 y sitio de inicio diana 6983 de SED ID NO: 2) como iS iS 588870, otro oligonucleótido desoxi, MOE y (S)-cEt. ISIS 594430 es un gápmero 3-10-3 (S)-cEt.
Se prepararon células a una densidad de 20.000 células por pocillo y se transfectaron usando electroporación con concentraciones de oligonucleótido antisentido de 0,01 |jM, 0,04 |jM, 0,12 |jM, 0,37 |jM, 1,11 |jM, 3,33 |jM y 10,00 jiM, como se especifica en la tabla a continuación. Después de un período de tratamiento de aproximadamente 16 horas, se aisló el ARN de las células y se midieron los niveles de ARNm de CFB por PCR ultrarrápida cuantitativa. Se usó el conjunto de sonda y cebador humano RTS3459 para medir los niveles de ARNm. Los niveles de ARNm de CFB se ajustaron de acuerdo con el contenido de ARN total, como se mide por RIBOGREEN®. Los resultados se presentan como porcentaje de inhibición de CFB, en relación con las células de control no tratadas.
También se presenta la concentración inhibidora semimáxima (CI5 0 ) de cada oligonucleótido. Los niveles de ARNm de CFB se redujeron de manera dependiente de la dosis en las células tratadas con oligonucleótidos antisentido.
Tabla 160
Figure imgf000172_0002
Ejemplo 126: tolerabilidad de gápmeros MOE dirigidos a CFB humano en ratones CD1
Los ratones CD1® (Charles River, MA) son un modelo de ratón polivalente, utilizado con frecuencia para pruebas de seguridad y eficacia. Los ratones se trataron con oligonucleótidos antisentido ISIS seleccionados de estudios descritos anteriormente y se evaluaron para determinar cambios en los niveles de diversos marcadores de química plasmática.
Estudio 1 (con gápmeros 5-10-5 MOE)
A grupos de ratones CD1 macho de siete semanas de edad se les inyectaron por vía subcutánea una vez a la semana durante 6 semanas 100 mg/kg de oligonucleótido ISIS. A un grupo de ratones CD1 macho se les inyectó por vía subcutánea una vez a la semana durante 6 semanas PBS. A un grupo de ratones se le inyectó por vía subcutánea una vez a la semana durante 6 semanas 100 mg/kg de oligonucleótido de control ISIS 141923 ( CC TTC CC TG A A G G TTCC TCC , designado en el presente documento como SEQ ID NO: 809, gápmero 5-10-5 MOE sin diana murina conocida). Se sacrificaron los ratones 48 horas después de la última dosis y se obtuvieron órganos y plasma para su análisis adicional.
Marcadores de química plasmática
Para evaluar el efecto de los oligonucleótidos ISIS sobre la función hepática y renal, se midieron los niveles plasmáticos de transaminasas y BUN usando un analizador de bioquímica clínica automatizado (Hitachi Olympus AU400e, Melville, NY). Los resultados se presentan en la tabla a continuación. Los oligonucleótidos ISIS que provocaron cambios en los niveles de cualquiera de los marcadores de función hepática o renal fuera del intervalo esperado para oligonucleótidos antisentido se excluyeron en otros estudios.
Tabla 161
Marcadores de química plasmática en plasma de ratones CD1 el día 40
Figure imgf000173_0002
Pesos
Los pesos corporales de los ratones se midieron el día 40 antes de sacrificar a los ratones. También se midieron los pesos de órganos, hígado, riñón y bazo después de que se sacrificaran los ratones. Los resultados se presentan en la tabla a continuación. Los oligonucleótidos ISIS que provocaron cambios en los pesos fuera del intervalo esperado para oligonucleótidos antisentido se excluyeron en otros estudios.
Tabla 162
Pesos (g) de ratones CD1 el día 40
Figure imgf000173_0001
Estudio 2 (con gápmeros 5-10-5 MOE)
A grupos de ratones GD1 macho de seis a ocho semanas de edad se les inyectaron por vía subcutánea una vez a la semana durante 6 semanas 100 mg/kg de oligonucleótido ISIS. A dos grupos de ratones GD1 macho se les inyectó por vía subcutánea una vez a la semana durante 6 semanas PBS. A un grupo de ratones se le inyectó por vía subcutánea una vez a la semana durante 6 semanas 100 mg/kg de oligonucleótido de control ISIS 141923. Se sacrificaron los ratones 48 horas después de la última dosis y se obtuvieron órganos y plasma para su análisis adicional.
Marcadores de química plasmática
Para evaluar el efecto de los oligonucleótidos ISIS sobre la función hepática y renal, se midieron los niveles plasmáticos de transaminasas, albúmina y BUN usando un analizador de bioquímica clínica automatizado (Hitachi Olympus AU400e, Melville, NY). Los resultados se presentan en la tabla a continuación. Los oligonucleótidos ISIS que provocaron cambios en los niveles de cualquiera de los marcadores de función hepática o renal fuera del intervalo esperado para oligonucleótidos antisentido se excluyeron en otros estudios.
Tabla 163
Marcadores de química plasmática en plasma de ratones CD1 el día 45
Figure imgf000174_0001
Pesos
Los pesos corporales de los ratones se midieron el día 42. También se midieron los pesos de órganos, hígado, riñón y bazo después de que se sacrificaran los ratones el día 45. Los resultados se presentan en la tabla a continuación. Los oligonucleótidos ISIS que provocaron cambios en los pesos fuera del intervalo esperado para oligonucleótidos antisentido se excluyeron en otros estudios.
Tabla 164
Pesos (g) de ratones CD1 el día 40
Figure imgf000174_0002
Figure imgf000175_0002
Estudio 3 (con gápmeros 5-10-5 MOE)
A grupos de ratones CD1 macho de seis a ocho semanas de edad se les inyectaron por vía subcutánea una vez a la semana durante 6 semanas 100 mg/kg de oligonucleótido ISIS. A dos grupos de ratones CD1 macho se les inyectó por vía subcutánea una vez a la semana durante 6 semanas PBS. Se sacrificaron los ratones 48 horas después de la última dosis y se obtuvieron órganos y plasma para su análisis adicional.
Marcadores de química plasmática
Para evaluar el efecto de los oligonucleótidos ISIS sobre la función hepática y renal, se midieron los niveles plasmáticos de transaminasas, albúmina y BUN usando un analizador de bioquímica clínica automatizado (Hitachi Olympus AU400e, Melville, NY). Los resultados se presentan en la tabla a continuación. Los oligonucleótidos ISIS que provocaron cambios en los niveles de cualquiera de los marcadores de función hepática o renal fuera del intervalo esperado para oligonucleótidos antisentido se excluyeron en otros estudios.
Tabla 165
Marcadores de química plasmática en plasma de ratones CD1 el día 42
Figure imgf000175_0001
Figure imgf000176_0001
Pesos
Los pesos corporales de los ratones se midieron el día 42. También se midieron los pesos de órganos, hígado, riñón y bazo después de que se sacrificaran los ratones el día 42. Los resultados se presentan en la tabla a continuación. Los oligonucleótidos ISIS que provocaron cambios en los pesos fuera del intervalo esperado para oligonucleótidos antisentido se excluyeron en otros estudios.
Tabla 166
Pesos (g) de ratones CD1 el día 40
Figure imgf000176_0002
Estudio 4 (con gápmeros (S)-cEt y oligonucleótidos desoxi, MOE y (S)-cEt)
A grupos de ratones CD1 macho de diez semanas de edad se les inyectaron por vía subcutánea una vez a la semana durante 6 semanas 50 mg/kg de oligonucleótido ISIS de los estudios descritos anteriormente. Además, dos oligonucleótidos, ISIS 594431 e ISIS 594432, se diseñaron como gápmeros 3-10-3 (S)-cEt y también se sometieron a prueba en este estudio. ISIS 594431 (ACCTCCTTCCGAGTCA i SEQ ID NO: 550) se dirige a la misma región que ISIS 588871, un gápmero desoxi, MOE y (S)-cEt (sitio de inicio diana 2197 de SEQ ID NO: 1 y sitio de inicio diana 6985 de SEQ ID NO: 2). ISIS 594432 (TGGTCACATTCCCTTC, SEQ ID NO: 542) se dirige a la misma región que ISIS 588872, un gápmero desoxi, MOE y (S)-cEt (sitio de inicio diana 154 de SEQ ID NO: 1 y sitio de inicio diana 1875 de SEQ ID n O: 2).
A dos grupos de ratones CD1 macho se les inyectó por vía subcutánea una vez a la semana durante 6 semanas PBS. Se sacrificaron los ratones 48 horas después de la última dosis y se obtuvieron órganos y plasma para su análisis adicional.
Marcadores de química plasmática
Para evaluar el efecto de los oligonucleótidos ISIS sobre la función hepática y renal, se midieron los niveles plasmáticos de transaminasas, albúmina, creatinina y BUN usando un analizador de bioquímica clínica automatizado (Hitachi Olympus AU400e, Melville, NY). Los resultados se presentan en la tabla a continuación. Los oligonucleótidos ISIS que provocaron cambios en los niveles de cualquiera de los marcadores de función hepática o renal fuera del intervalo esperado para oligonucleótidos antisentido se excluyeron en otros estudios.
Tabla 167
Marcadores de química plasmática en plasma de ratones CD1 el día 42
Figure imgf000177_0001
Pesos
Los pesos corporales de los ratones se midieron el día 39. También se midieron los pesos de órganos, hígado, riñón y bazo después de que se sacrificaran los ratones el día 42. Los resultados se presentan en la tabla a continuación. Los oligonucleótidos ISIS que provocaron cambios en los pesos fuera del intervalo esperado para oligonucleótidos antisentido se excluyeron en otros estudios.
Tabla 168
Pesos (g) de ratones CD1
Figure imgf000177_0002
Figure imgf000178_0002
Estudio 5 (con gápmeros MOE, gápmeros (S)-cEt y o ligonucleótidos desoxi, MOE y (S)-cEt)
A grupos de ratones CD1 macho de ocho a nueve semanas de edad se les inyectaron por vía subcutánea una vez a la semana durante 6 semanas 50 mg/kg de oligonucleótido ISIS. A dos grupos de ratones CD1 macho se les inyectó por vía subcutánea una vez a la semana durante 6 semanas PBS. Se sacrificaron los ratones 48 horas después de la última dosis y se obtuvieron órganos y plasma para su análisis adicional.
Marcadores de química plasmática
Para evaluar el efecto de los oligonucleótidos ISIS sobre la función hepática y renal, se midieron los niveles plasmáticos de transaminasas, albúmina, creatinina y BUN usando un analizador de bioquímica clínica automatizado (Hitachi Olympus AU400e, Melville, NY). Los resultados se presentan en la tabla a continuación. Los oligonucleótidos ISIS que provocaron cambios en los niveles de cualquiera de los marcadores de función hepática o renal fuera del intervalo esperado para oligonucleótidos antisentido se excluyeron en otros estudios.
Tabla 169
Marcadores de química plasmática en plasma de ratones CD1 el día 42
Figure imgf000178_0001
Figure imgf000179_0001
Pesos
Los pesos corporales de los ratones se midieron el día 40. También se midieron los pesos de órganos, hígado, riñón y bazo después de que se sacrificaran los ratones el día 42. Los resultados se presentan en la tabla a continuación. Los oligonucleótidos ISIS que provocaron cambios en los pesos fuera del intervalo esperado para oligonucleótidos antisentido se excluyeron en otros estudios.
Tabla 170
Pesos (g) de ratones CD1
Figure imgf000179_0002
Estudio 6 (con oligonucleótidos desoxi, MOE y (S)-cEt)
A grupos de ratones CD1 macho de ocho a nueve semanas de edad se les inyectaron por vía subcutánea una vez a la semana durante 6 semanas 50 mg/kg de oligonucleótidos desoxi, MOE y (S)-cEt. A dos grupos de ratones CD1 macho se les inyectó por vía subcutánea una vez a la semana durante 6 semanas PBS. Se sacrificaron los ratones 48 horas después de la última dosis y se obtuvieron órganos y plasma para su análisis adicional.
Marcadores de química plasmática
Para evaluar el efecto de los oligonucleótidos ISIS sobre la función hepática y renal, se midieron los niveles plasmáticos de transaminasas, albúmina, creatinina, bilirrubina y BUN usando un analizador de bioquímica clínica automatizado (Hitachi Olympus AU400e, Melville, NY). Los resultados se presentan en la tabla a continuación. Los oligonucleótidos ISIS que provocaron cambios en los niveles de cualquiera de los marcadores de función hepática o renal fuera del intervalo esperado para oligonucleótidos antisentido se excluyeron en otros estudios.
Tabla 171
Marcadores de química plasmática en plasma de ratones CD1 el día 45
Figure imgf000180_0001
Pesos
Los pesos corporales de los ratones se midieron el día 40. También se midieron los pesos de órganos, hígado, riñón y bazo después de que se sacrificaran los ratones el día 45. Los resultados se presentan en la tabla a continuación. Los oligonucleótidos ISIS que provocaron cambios en los pesos fuera del intervalo esperado para oligonucleótidos antisentido se excluyeron en otros estudios.
Tabla 172
Pesos (g) de ratones CD1
Figure imgf000180_0002
Figure imgf000181_0002
Estudio 7 (con gápmeros MOE y oligonucleótidos desoxi, MOE y (S)-cEt)
A grupos de ratones CD1 macho de ocho a nueve semanas de edad se les inyectaron por vía subcutánea una vez a la semana durante 6 semanas 100 mg/kg de oligonucleótidos ISIS. A un grupo de ratones CD1 macho se les inyectó por vía subcutánea una vez a la semana durante 6 semanas PBS. Se sacrificaron los ratones 48 horas después de la última dosis y se obtuvieron órganos y plasma para su análisis adicional.
Marcadores de química plasmática
Para evaluar el efecto de los oligonucleótidos ISIS sobre la función hepática y renal, se midieron los niveles plasmáticos de transaminasas, albúmina, creatinina y BUN usando un analizador de bioquímica clínica automatizado (Hitachi Olympus AU400e, Melville, NY). Los resultados se presentan en la tabla a continuación. Los oligonucleótidos ISIS que provocaron cambios en los niveles de cualquiera de los marcadores de función hepática o renal fuera del intervalo esperado para oligonucleótidos antisentido se excluyeron en otros estudios.
Tabla 173
Marcadores de química plasmática en plasma de ratones CD1 el día 45
Figure imgf000181_0001
Pesos
Los pesos corporales de los ratones se midieron el día 44. También se midieron los pesos de órganos, hígado, riñón y bazo después de que se sacrificaran los ratones el día 49. Los resultados se presentan en la tabla a continuación. Los oligonucleótidos ISIS que provocaron cambios en los pesos fuera del intervalo esperado para oligonucleótidos antisentido se excluyeron en otros estudios.
Tabla 174
Pesos (g) de ratones CD1
Figure imgf000182_0001
Estudio 8 (con gápmeros MOE, oligonucleótidos desoxi, MOE y (S)-cEt y gápmeros (S)-cEt)
A grupos de ratones macho CD1 de ocho a nueve semanas de edad se les inyectaron por vía subcutánea una vez a la semana durante 6 semanas 100 mg/kg de gápmeros MOE, o 50 mg/kg de oligonucleótidos desoxi, MOE y (S)-cEt o gápmeros (S)-cEt. A un grupo de ratones c D1 macho se les inyectó por vía subcutánea una vez a la semana durante 6 semanas PBS. Se sacrificaron los ratones 48 horas después de la última dosis y se obtuvieron órganos y plasma para su análisis adicional.
Marcadores de química plasmática
Para evaluar el efecto de los oligonucleótidos ISIS sobre la función hepática y renal, se midieron los niveles plasmáticos de transaminasas, albúmina, creatinina y BUN usando un analizador de bioquímica clínica automatizado (Hitachi Olympus AU400e, Melville, NY). Los resultados se presentan en la tabla a continuación.
Tabla 175
Marcadores de química plasmática en plasma de ratones CD1 el día 43
Figure imgf000183_0001
Pesos
Los pesos corporales de los ratones se midieron el día 36. También se midieron los pesos de órganos, hígado, riñón y bazo después de que se sacrificaran los ratones el día 43. Los resultados de los pesos de órganos se expresaron como una proporción con respecto a los pesos corporales y se normalizaron a la proporción de control de PBS.
Tabla 176
Pesos de órganos/peso corporal (PC) de ratones CD1
Figure imgf000183_0002
Ensayos de citocinas
La sangre obtenida de todos los grupos de ratones se envió a Antech Diagnostics para las mediciones de los diversos niveles de citocinas, tales como IL-6, MDC, MIP1p, IP-10, MCP1, MIP-1a y Ra NTES. Los resultados se presentan en la tabla 54.
Tabla 177
Niveles de citocinas (pg/ml) en plasma de ratones CD1
Figure imgf000184_0001
Ensayos de hematología
La sangre obtenida de todos los grupos de ratones se envió a Antech Diagnostics para las mediciones de hematocrito (HCT), así como de las diversas células sanguíneas, tales como WBC, RBC y plaquetas, y el contenido de hemoglobina (Hb) total. Los resultados se presentan en la tabla 55.
Tabla 178
Marcadores de hematología en plasma de ratones CD1
Figure imgf000184_0002
Ejemplo 127: tolerabilidad de oligonucleótidos antisentido dirigidos a CFB humano en ratas Sprague-Dawley
Las ratas Sprague-Dawley son un modelo polivalente usado para evaluaciones de seguridad y eficacia. Las ratas se trataron con oligonucleótidos antisentido ISIS de los estudios descritos en los ejemplos anteriores y se evaluaron para determinar cambios en los niveles de diversos marcadores de química plasmática.
Estudio 1 (con gápmeros 5-10-5 MOE)
Las ratas Sprague-Dawley macho, de siete a ocho semanas de edad, se mantuvieron en un ciclo de luz/oscuridad de 12 horas y se alimentaron a voluntad con comida normal para ratas Purina, dieta 5001. A grupos de 4 ratas Sprague-Dawley se les inyectaron a cada uno por vía subcutánea una vez a la semana durante 6 semanas 100 mg/kg de gápmeros 5-10-5 MOE. A un grupo de control de 6 ratas se le inyectó por vía subcutánea una vez a la semana durante 6 semanas PBS. Cuarenta y ocho horas después de la última dosis, se sacrificaron las ratas y se obtuvieron órganos y plasma para su análisis adicional.
Función hepática
Para evaluar el efecto de los oligonucleótidos ISIS sobre la función hepática, se midieron los niveles plasmáticos de transaminasas usando un analizador de bioquímica clínica automatizado (Hitachi Olympus AU400e, Melville, NY). Se midieron los niveles plasmáticos de a Lt (alanina transaminasa) y AST (aspartato transaminasa) y los resultados se presentan en la tabla a continuación expresados en UI/l. Los oligonucleótidos ISIS que provocaron cambios en los niveles de cualquier marcador de función hepática fuera del intervalo esperado para oligonucleótidos antisentido se excluyeron en otros estudios.
Tabla 179
Marcadores de función hepática en ratas Sprague-Dawley
Figure imgf000185_0002
Función renal
Para evaluar el efecto de los oligonucleótidos ISIS sobre la función renal, se midieron los niveles plasmáticos de nitrógeno ureico sanguíneo (BUN) y creatinina usando un analizador de bioquímica clínica automatizado (Hitachi Olympus AU400e, Melville, NY). Los resultados se presentan en la tabla a continuación, expresados en mg/dl. Los oligonucleótidos ISIS que provocaron cambios en los niveles de cualquiera de los marcadores de función renal fuera del intervalo esperado para oligonucleótidos antisentido se excluyeron en otros estudios.
Tabla 180
Marcadores de función renal (mg/dl) en ratas Sprague-Dawley
Figure imgf000185_0001
Figure imgf000186_0002
Pesos
Las mediciones de peso corporal se tomaron el día 39. Se midieron los pesos de hígado, corazón, bazo y riñón al final del estudio el día 42, y se presentan en la tabla a continuación. Los oligonucleótidos ISIS que provocaron cualquier cambio en los pesos de órganos fuera del intervalo esperado para oligonucleótidos antisentido se excluyeron de otros estudios.
Tabla 181
Pesos (g)
Figure imgf000186_0001
Estudio 2 (con oligonucleótidos desoxi, MOE y (S)-cEt)
Las ratas Sprague-Dawley macho, de nueve a diez semanas de edad, se mantuvieron en un ciclo de luz/oscuridad de 12 horas y se alimentaron a voluntad con comida normal para ratas Purina, dieta 5001. A grupos de 4 ratas Sprague-Dawley se les inyectaron a cada uno por vía subcutánea una vez a la semana durante 6 semanas 100 mg/kg de oligonucleótidos desoxi, MOE y (S)-cEt. A dos grupos de control de 3 ratas se les inyectó a cada uno por vía subcutánea una vez a la semana durante 6 semanas PBS. Cuarenta y ocho horas después de la última dosis, se sacrificaron las ratas y se obtuvieron órganos y plasma para su análisis adicional.
Función hepática
Para evaluar el efecto de los oligonucleótidos ISIS sobre la función hepática, se midieron los niveles plasmáticos de transaminasas el día 42 usando un analizador de bioquímica clínica automatizado (Hitachi Olympus AU400e, Melville, NY). Se midieron los niveles plasmáticos de ALT (alanina transaminasa) y AST (aspartato transaminasa) y albúmina y los resultados se presentan en la tabla a continuación. Los oligonucleótidos ISIS que provocaron cambios en los niveles de cualquier marcador de función hepática fuera del intervalo esperado para oligonucleótidos antisentido se excluyeron en otros estudios.
Tabla 182
Marcadores de función hepática en ratas Sprague-Dawley
Figure imgf000187_0001
Función renal
Para evaluar el efecto de los oligonudeótidos ISIS sobre la función renal, se midieron los niveles plasmáticos de nitrógeno ureico sanguíneo (BUN) y creatinina usando un analizador de bioquímica clínica automatizado (Hitachi Olympus AU400e, Melville, NY). Los resultados se presentan en la tabla a continuación, expresados en mg/dl. Los oligonucleótidos ISIS que provocaron cambios en los niveles de cualquiera de los marcadores de función renal fuera del intervalo esperado para oligonucleótidos antisentido se excluyeron en otros estudios.
Tabla 183
Marcadores de función renal (mg/dl) en ratas Sprague-Dawley
Figure imgf000187_0002
Pesos
Las mediciones de peso corporal se tomaron el día 39. Se midieron los pesos de hígado, corazón, bazo y riñón al final del estudio el día 42, y se presentan en la tabla a continuación. Los oligonucleótidos ISIS que provocaron cualquier cambio en los pesos de órganos fuera del intervalo esperado para oligonucleótidos antisentido se excluyeron de otros estudios.
Tabla 184
Pesos (g)
Figure imgf000188_0002
Estudio 3 (con gápmeros MOE)
Las ratas Sprague-Dawley macho, de nueve a diez semanas de edad, se mantuvieron en un ciclo de luz/oscuridad de 12 horas y se alimentaron a voluntad con comida normal para ratas Purina, dieta 5001. A grupos de 4 ratas Sprague-Dawley se les inyectaron a cada uno por vía subcutánea una vez a la semana durante 6 semanas 100 mg/kg de gápmeros MOE. A un grupo de control de 6 ratas se le inyectó por vía subcutánea una vez a la semana durante 6 semanas PBS. Cuarenta y ocho horas después de la última dosis, se sacrificaron las ratas y se obtuvieron órganos y plasma para su análisis adicional.
Función hepática
Para evaluar el efecto de los oligonucleótidos ISIS sobre la función hepática, se midieron los niveles plasmáticos de transaminasas el día 43 usando un analizador de bioquímica clínica automatizado (Hitachi Olympus AU400e, Melville, NY). Se midieron los niveles plasmáticos de ALT (alanina transaminasa) y AST (aspartato transaminasa) y los resultados se presentan en la tabla a continuación expresados en UI/l. Los oligonucleótidos ISIS que provocaron cambios en los niveles de cualquier marcador de función hepática fuera del intervalo esperado para oligonucleótidos antisentido se excluyeron en otros estudios.
Tabla 185
Marcadores de función hepática en ratas Sprague-Dawley
Figure imgf000188_0001
Función renal
Para evaluar el efecto de los oligonucleótidos ISIS sobre la función renal, se midieron los niveles plasmáticos de nitrógeno ureico sanguíneo (BUN) y creatinina usando un analizador de bioquímica clínica automatizado (Hitachi Olympus AU400e, Melville, NY). Los resultados se presentan en la tabla a continuación, expresados en mg/dl. Los oligonucleótidos ISIS que provocaron cambios en los niveles de cualquiera de los marcadores de función renal fuera del intervalo esperado para oligonucleótidos antisentido se excluyeron en otros estudios.
Tabla 186
Marcadores de función renal (mg/dl) en ratas Sprague-Dawley
Figure imgf000189_0002
Pesos
Las mediciones de peso corporal se tomaron el día 39. Se midieron los pesos de hígado, corazón, bazo y riñón al final del estudio el día 42, y se presentan en la tabla a continuación. Los oligonucleótidos ISIS que provocaron cualquier cambio en los pesos de órganos fuera del intervalo esperado para oligonucleótidos antisentido se excluyeron de otros estudios.
Tabla 187
Pesos (g)
Figure imgf000189_0001
Estudio 4 (con gápmeros MOE)
Las ratas Sprague-Dawley macho, de nueve a diez semanas de edad, se mantuvieron en un ciclo de luz/oscuridad de 12 horas y se alimentaron a voluntad con comida normal para ratas Purina, dieta 5001. A grupos de 4 ratas Sprague-Dawley se les inyectaron a cada uno por vía subcutánea una vez a la semana durante 6 semanas 100 mg/kg de gápmeros MOE. A un grupo de control de 6 ratas se le inyectó por vía subcutánea una vez a la semana durante 6 semanas PBS. Cuarenta y ocho horas después de la última dosis, se sacrificaron las ratas y se obtuvieron órganos y plasma para su análisis adicional.
Función hepática
Para evaluar el efecto de los oligonucleótidos ISIS sobre la función hepática, se midieron los niveles plasmáticos de transaminasas el día 42 usando un analizador de bioquímica clínica automatizado (Hitachi Olympus AU400e, Melville, NY). Se midieron los niveles plasmáticos de ALT (alanina transaminasa) y AST (aspartato transaminasa) y los resultados se presentan en la tabla a continuación expresados en UI/l. Los oligonucleótidos ISIS que provocaron cambios en los niveles de cualquier marcador de función hepática fuera del intervalo esperado para oligonucleótidos antisentido se excluyeron en otros estudios.
Tabla 188
Marcadores de función hepática en ratas Sprague-Dawley
Figure imgf000190_0001
Función renal
Para evaluar el efecto de los oligonucleótidos ISIS sobre la función renal, se midieron los niveles plasmáticos de nitrógeno ureico sanguíneo (BUN) y creatinina usando un analizador de bioquímica clínica automatizado (Hitachi Olympus AU400e, Melville, NY). Los resultados se presentan en la tabla a continuación, expresados en mg/dl. Los oligonucleótidos ISIS que provocaron cambios en los niveles de cualquiera de los marcadores de función renal fuera del intervalo esperado para oligonucleótidos antisentido se excluyeron en otros estudios.
Tabla 189
Marcadores de función renal (mg/dl) en ratas Sprague-Dawley
Figure imgf000190_0002
Pesos
Las mediciones de peso corporal se tomaron el día 39. Se midieron los pesos de hígado, corazón, bazo y riñón al final del estudio el día 42, y se presentan en la tabla a continuación. Los oligonucleótidos ISIS que provocaron cualquier cambio en los pesos de órganos fuera del intervalo esperado para oligonucleótidos antisentido se excluyeron de otros estudios.
Tabla 190
Pesos (g)
Figure imgf000191_0002
Estudio 5 (con gápmeros MOE y oligonucleótidos desoxi, MOE y (S)-cEt)
Las ratas Sprague-Dawley macho, de nueve a diez semanas de edad, se mantuvieron en un ciclo de luz/oscuridad de 12 horas y se alimentaron a voluntad con comida normal para ratas Purina, dieta 5001. A grupos de 4 ratas Sprague-Dawley se les inyectaron a cada uno por vía subcutánea una vez a la semana durante 6 semanas 100 mg/kg de gápmero MOE o 50 mg/kg de oligonucleótidos desoxi, MOE y (S)-cEt. A un grupo de control de 4 ratas se le inyectó por vía subcutánea una vez a la semana durante 6 semanas PBS. Cuarenta y ocho horas después de la última dosis, se sacrificaron las ratas y se obtuvieron órganos y plasma para su análisis adicional. Función hepática
Para evaluar el efecto de los oligonucleótidos ISIS sobre la función hepática, se midieron los niveles plasmáticos de transaminasas el día 42 usando un analizador de bioquímica clínica automatizado (Hitachi Olympus AU400e, Melville, NY). Se midieron los niveles plasmáticos de ALT (alanina transaminasa) y AST (aspartato transaminasa) y los resultados se presentan en la tabla a continuación expresados en UI/l. Los oligonucleótidos ISIS que provocaron cambios en los niveles de cualquier marcador de función hepática fuera del intervalo esperado para oligonucleótidos antisentido se excluyeron en otros estudios.
Tabla 191
Marcadores de función hepática en ratas Sprague-Dawley
Figure imgf000191_0001
Función renal
Para evaluar el efecto de los oligonucleótidos ISIS sobre la función renal, se midieron los niveles plasmáticos y ureicos de nitrógeno ureico sanguíneo (BUN) y creatinina usando un analizador de bioquímica clínica automatizado (Hitachi Olympus AU400e, Melville, NY). Los resultados se presentan en las tablas a continuación, expresados en mg/dl. Los oligonucleótidos ISIS que provocaron cambios en los niveles de cualquiera de los marcadores de función renal fuera del intervalo esperado para oligonucleótidos antisentido se excluyeron en otros estudios.
Tabla 192
Marcadores de función renal (mg/dl) en el plasma de ratas Sprague-Dawley
Figure imgf000192_0002
Tabla 193
Marcadores de función renal (mg/dl) en la orina de ratas Sprague-Dawley
Figure imgf000192_0003
Pesos
Las mediciones de peso corporal se tomaron el día 39. Se midieron los pesos de hígado, corazón, bazo y riñón al final del estudio el día 42, y se presentan en la tabla a continuación. Los oligonucleótidos ISIS que provocaron cualquier cambio en los pesos de órganos fuera del intervalo esperado para oligonucleótidos antisentido se excluyeron de otros estudios.
Tabla 194
Pesos (g)
Figure imgf000192_0001
Figure imgf000193_0002
Estudio 6 (con gápmeros MOE, oligonucleótidos desoxi, MOE y (S)-cEt y gápmeros (S)-cEt)
Las ratas se mantuvieron en un ciclo de luz/oscuridad de 12 horas y se alimentaron a voluntad con comida normal para ratas Purina, dieta 5001. A grupos de 4 ratas se les inyectaron a cada uno por vía subcutánea una vez a la semana durante 6 semanas 100 mg/kg de gápmeros MOE o 50 mg/kg de oligonucleótido desoxi, MOE y (S)-cEt o gápmero (S)-cEt. A un grupo de control de 4 ratas se le inyectó por vía subcutánea una vez a la semana durante 6 semanas PBS. Cuarenta y ocho horas después de la última dosis, se sacrificaron las ratas y se obtuvieron órganos y plasma para su análisis adicional.
Función hepática
Para evaluar el efecto de los oligonucleótidos ISIS sobre la función hepática, se midieron los niveles plasmáticos de transaminasas el día 42 usando un analizador de bioquímica clínica automatizado (Hitachi Olympus AU400e, Melville, NY). Se midieron los niveles plasmáticos de ALT (alanina transaminasa) y AST (aspartato transaminasa) y los resultados se presentan en la tabla a continuación expresados en UI/l.
Tabla 195
Marcadores de función hepática
Figure imgf000193_0001
Función renal
Para evaluar el efecto de los oligonucleótidos ISIS sobre la función renal, se midieron los niveles ureicos de proteína total y creatinina usando un analizador de bioquímica clínica automatizado (Hitachi Olympus AU400e, Melville, NY). Los resultados se presentan en la tabla a continuación. Los oligonucleótidos ISIS que provocaron cambios en los niveles de cualquiera de los marcadores de función renal fuera del intervalo esperado para oligonucleótidos antisentido se excluyeron en otros estudios.
Tabla 196
Proporción proteína total/creatinina en la orina de ratas
Figure imgf000194_0002
Pesos
Las mediciones de peso corporal se tomaron el día 39. Se midieron los pesos de hígado, corazón, bazo y riñón al final del estudio el día 42, y se presentan en la tabla a continuación. Los resultados de los pesos de órganos se expresaron como una proporción con respecto a los pesos corporales y se normalizaron a la proporción de control de PBS.
Tabla 197
Proporciones pesos de órganos/peso corporal (PC)
Figure imgf000194_0001
Ejemplo 128: eficacia de los oligonucleótidos antisentido frente a ARNm de CFB en ratones hCFB
Se sometieron a prueba los compuestos seleccionados para determinar la eficacia en ratones transgénicos CFB humanos, línea fundadora n.° 6. El gen CFB humano se localiza en el cromosoma 6: posición 31913721 -31919861. Se seleccionó un fósmido (ABC14-50933200C23) que contenía la secuencia de CFB para producir ratones transgénicos que expresan el gen CFB humano. Se usaron enzimas de restricción Cla I (31926612) y Age I (31926815) para generar un fragmento de 22.127 pb que contenía el gen CFB para inyección pronuclear. El ADN se confirmó por análisis de enzimas de restricción usando Pvu I. El fragmento de ADN de 22.127 pb se inyectó en embriones C57BL/6NTac. Se criaron 6 fundadores positivos. El fundador n.° 6 expresó el ARNm de CFB humano hepático y se cruzó con la 3.a generación. Se usó la descendencia de ratones de 3.a generación para evaluar los ASO de CFB humanos para determinar la reducción de ARNm de CFB humano.
Tratamiento
A grupos de 3 ratones se les inyectaron a cada uno por vía subcutánea dos veces por semana durante la primera semana 50 mg/kg de oligonucleótidos ISIS, seguido de una dosificación una vez por semana de 50 mg/kg de oligonucleótidos ISIS durante tres semanas adicionales. A un grupo de control de 4 ratones se le inyectó por vía subcutánea dos veces por semana durante 2 semanas durante la primera semana PBS durante la primera semana durante tres semanas adicionales. Cuarenta y ocho horas después de la última dosis, se sacrificaron los ratones y se obtuvieron órganos y plasma para su análisis adicional.
Análisis de ARN
Al final del período de dosificación, se extrajo ARN del hígado y el riñón para análisis de PCR ultrarrápida de los niveles de ARNm de CFB. Los niveles de ARNm de CFB humano se midieron usando el conjunto de sonda y cebador humano RTS3459. Los niveles de ARNm de CFB se normalizaron a RIBOGREEN®, y también al gen constitutivo, ciclofilina. Los resultados se calcularon como el porcentaje de inhibición de la expresión de ARNm de CFB en comparación con el control. Todos los oligonucleótidos antisentido efectuaron la inhibición de los niveles de ARNm de CFB humano en el hígado.
Tabla 198
Porcentaje de reducción de los niveles de ARNm de CFB en ratones hCFB
Figure imgf000195_0002
Ejemplo 129: inhibición antisentido in v iv o de CFB murino
Se diseñaron varios oligonucleótidos antisentido que se dirigieron a ARNm de CFB murino (n.° de acceso GENBANK NM_008198.2, incorporado en el presente documento como SEQ ID NO: 5). Los sitios de inicio diana y las secuencias de cada oligonucleótido se describen en la tabla a continuación. Los oligonucleótidos antisentido quiméricos en la tabla a continuación se diseñaron como gápmeros 5-10-5 MOE. Los gápmeros tienen una longitud de 20 nucleósidos, en los que el segmento de hueco central está compuesto de 10 2'-desoxinucleósidos y se flanquea en ambos lados (en las direcciones 5' y 3') por alas que comprenden 5 nucleósidos cada una. Cada nucleósido en el segmento de ala 5' y cada nucleósido en el segmento de ala 3' tiene una modificación 2'-MOE. Los enlaces internucleosídicos a lo largo de cada gápmero son enlaces fosforotioato (P=S). Todos los residuos de citosina en cada gápmero son 5-metilcitosinas.
Tabla 199
Gápmeros dirigidos a CFB murino
Figure imgf000195_0001
Figure imgf000196_0001
Tratamiento
A grupos de cuatro ratones C57BL/6 se les inyectaron a cada uno 50 mg/kg de ISIS 516269, ISIS 516272, ISIS 516323, ISIS 516330 o ISIS 516341 administrados semanalmente durante 3 semanas. A un grupo de control de ratones se le inyectó solución salina tamponada con fosfato (PBS) administrada semanalmente durante 3 semanas.
Análisis de ARN de CFB
Al final del estudio, se extrajo ARN del tejido hepático para el análisis de PCR ultrarrápida de CFB, usando el
conjunto de sonda y cebador RTS3430 (secuencia directa CCGCAAACACCAAT H'CI'ü a . designada en el presente
docum ento com o SEQ ID NO: 816; secuencia inversa t G(K'TACCCACCTTCCTTOT. designada en el presente
documento como SEQ ID NO: 817; secuencia de sonda CTGGATACTGTCCCAATCCCGGTATTÍ CX designada en el presente documento como SEQ ID NO: 818). Los niveles de ARNm se normalizaron usando RIBOGREEN®. Como se muestra en la tabla a continuación, algunos de los oligonucleótidos antisentido lograron la reducción de CFB murino sobre el control de PBS. Los resultados se presentan como porcentaje de inhibición de CFB, en relación con el control.
Tabla 200
Porcentaje de inhibición de ARNm de CFB murino en ratones C57BL/6
Figure imgf000196_0003
Análisis de proteínas
Los niveles de proteína CFB se midieron en el riñón, hígado, plasma y en el ojo por inmunoelectrotransferencia usando anticuerpo anti-CFB de cabra (Sigma Aldrich). Los resultados se presentan como porcentaje de inhibición de CFB, en relación con el control de PBS. 'np' indica que no se tomaron medidas para esa muestra. Como se muestra en la tabla a continuación, la inhibición antisentido de CFB por oligonucleótidos ISIS dio como resultado una reducción de proteína CFB en diversos tejidos. Como se muestra en la tabla a continuación, la administración sistémica de oligonucleótidos ISIS fue eficaz para reducir los niveles de CFB en el ojo.
Tabla 201
Porcentaje de inhibición de proteína CFB murina en ratones C57BL/6
Figure imgf000196_0002
Ejemplo 130: inhibición antisentido dependiente de la dosis de CFB murino
A grupos de cuatro ratones C57BL/6 se les inyectaron a cada uno 25 mg/kg, 50 mg/kg o 100 mg/kg de ISIS 516272 e ISIS 516323 administrados semanalmente durante 6 semanas. A otros dos grupos de ratones se les inyectaron 100 mg/kg de ISIS 516330 o ISIS 516341 administrados semanalmente durante 6 semanas. A dos grupos de control de ratones se les inyectó solución salina tamponada con fosfato (PBS) administrada semanalmente durante 6 semanas.
Análisis de ARN de CFB
Se extrajo ARN de tejidos hepáticos y renales para el análisis de PCR ultrarrápida de CFB, usando el conjunto de sonda y cebador RTS3430. Los niveles de ARNm se normalizaron usando RIBOGREEN®. Como se muestra en la tabla a continuación, los oligonucleótidos antisentido lograron una reducción dependiente de la dosis de CFB murino sobre el control de PBS. Los resultados se presentan como porcentaje de inhibición de CFB, en relación con el control.
Tabla 202
Porcentaje de inhibición de ARNm de CFB murino en ratones C57BL/6
Figure imgf000197_0001
Análisis de proteínas
Los niveles de proteína CFB se midieron en el plasma por inmunoelectrotransferencia usando anticuerpo anti-CFB de cabra (Sigma Aldrich). Como se muestra en la tabla a continuación, la inhibición antisentido de CFB por los oligonucleótidos ISIS dio como resultado una reducción de proteína CFB. Los resultados se presentan como porcentaje de inhibición de CFB, en relación con el control de PBS. 'np' indica que no se tomaron medidas para esa muestra.
Los niveles de proteína CFB también se midieron en el ojo por inmunoelectrotransferencia. Todos los grupos de tratamiento demostraron una inhibición de CFB en un 95 %, estando algunas mediciones de muestras por debajo de los niveles de detección del ensayo.
Tabla 203
Porcentaje de inhibición de proteína CFB murina en ratones C57BL/6
Figure imgf000197_0002
Ejemplo 131: efecto de la inhibición antisentido de CFB en el modelo de ratón NZB/W F1
El NZB/W F1 es el modelo clásico más antiguo de lupus, donde los ratones desarrollan fenotipos similares a lupus grave comparables a los de los pacientes con lupus (Theofilopoulos, A.N. y Dixon, F.J. Advances in Immunology, vol. 37, pp. 269-390, 1985). Estos fenotipos similares a lupus incluyen linfadenopatía, esplenomegalia, niveles elevados de autoanticuerpos antinucleares (AAN) séricos, incluyendo IgG anti-ADNbc, de los que una mayoría son IgG2a e IgG3, y glomerulonefritis (GN) mediada por complejos inmunitarios que se vuelve evidente a los 5-6 meses de edad, dando lugar a insuficiencia renal y muerte a los 10-12 meses de edad.
Estudio 1
Se realizó un estudio para demostrar que el tratamiento con oligonucleótidos antisentido dirigidos a CFB mejoraría la patología renal en el modelo de ratón. Se adquirieron ratones hembra NZB/W F1, de 17 semanas de edad, de Jackson Laboratories. Cada grupo de 16 ratones recibió cada uno dosis de 100 |jg/kg/semana de ISIS 516272 o ISIS 516323 durante 20 semanas. Otro grupo de 16 ratones recibió dosis de 100 jg/kg/semana del oligonucleótido control ISIS 141923 durante 20 semanas. Otro grupo de 10 ratones recibió dosis de PBS durante 20 semanas y sirvió como grupo de control con el que se compararon todos los otros grupos. Los criterios de valoración terminales se obtuvieron 48 horas después de inyectar la última dosis.
Análisis de ARN de CFB
Se extrajo ARN de tejido hepático y renal para el análisis de PCR ultrarrápida de CFB, usando el conjunto de sonda y cebador RTS3430. Los niveles de ARNm se normalizaron usando RIBOGREEN®. Como se muestra en la tabla a continuación, algunos de los oligonucleótidos antisentido lograron la reducción de CFB murino sobre el control de PBS. Los resultados se presentan como porcentaje de inhibición de CFB, en relación con el control.
Tabla 204
Porcentaje de inhibición de ARNm de CFB murino en ratones NZB/W F1
Figure imgf000198_0001
Proteinuria
Se espera proteinuria en un 60 % de los animales en este modelo de ratón. La incidencia acumulada de proteinuria grave se midió calculando la proporción de proteína total con respecto a creatinina usando un analizador clínico. Los resultados se presentan en la tabla a continuación y demuestran que el tratamiento con oligonucleótidos antisentido dirigidos a CFB logró una reducción de la proteinuria en los ratones en comparación con el control de PBS y los ratones tratados con oligonucleótidos de control.
Tabla 205
Porcentaje de incidencia acumulada de proteinuria grave en ratones NZB/W F1
Figure imgf000198_0002
Supervivencia
La supervivencia de los ratones se siguió llevando el recuento de los ratones al comienzo del tratamiento y a continuación de nuevo en la semana 20. Los resultados se presentan en la tabla a continuación y demuestran que el tratamiento con oligonucleótidos antisentido dirigidos a CFB incrementó la supervivencia en los ratones en comparación con el control de PBS y los ratones tratados con oligonucleótidos de control.
Tabla 206
Número de ratones supervivientes y % supervivencia
Figure imgf000199_0001
Depósito glomerular
La cantidad de depósito de C3, así como el depósito de IgG, en los glomérulos de los riñones se midió por inmunohistoquímica con un anticuerpo anti-C3. Los resultados se presentan en la tabla a continuación y demuestran que el tratamiento con oligonucleótidos antisentido dirigidos a CFB logró una reducción de depósitos tanto de C3 como de IgG en los glomérulos renales en comparación con el control de PBS y los ratones tratados con oligonucleótidos de control.
Tabla 207
Porcentaje de inhibición del depósito de glomérulos en ratones NZB/W F1
Figure imgf000199_0002
Estudio 2
Se adquirieron ratones hembra NZB/W F1, de 16 semanas de edad, de Jackson Laboratories. Un grupo de 10 ratones recibió dosis de 100 |jg/kg/semana de ISIS 516323 durante 12 semanas. Otro grupo de 10 ratones recibió dosis de 100 jg/kg/semana del oligonucleótido control ISIS 141923 durante 12 semanas. Otro grupo de 10 ratones recibió dosis de PBS durante 12 semanas y sirvió como grupo de control con el que se compararon todos los otros grupos. Los criterios de valoración terminales se obtuvieron 48 horas después de inyectar la última dosis.
Análisis de ARN de CFB
Se extrajo ARN de tejido hepático y renal para el análisis de PCR ultrarrápida de CFB, usando el conjunto de sonda y cebador RTS3430. Como se muestra en la tabla a continuación, el tratamiento con ISIS 516323 logró una reducción de CFB murino sobre el control de PBS. Los resultados se presentan como porcentaje de inhibición de CFB, en relación con el control.
Tabla 208
Porcentaje de inhibición de ARNm de CFB murino en ratones NZB/W F1
Figure imgf000199_0003
Proteinuria
La incidencia acumulada de proteinuria grave se evaluó midiendo la proporción de proteína total en orina con respecto a creatinina, así como midiendo los niveles de microalbúmina total. Los resultados se presentan en las tablas a continuación y demuestran que el tratamiento con oligonucleótidos antisentido dirigidos a CFB redujo la proteinuria en los ratones en comparación con el control de PBS y los ratones tratados con oligonucleótidos de control.
Tabla 209
Proteinuria en ratones NZB/W F1 medida como niveles de microalbúmina en orina (mg/dl)
Figure imgf000200_0001
Tabla 210
Proteinuria en ratones NZB/W F1 medida como proporción de proteína total con respecto a creatinina
Figure imgf000200_0002
Supervivencia
La supervivencia de los ratones se siguió llevando el recuento de los ratones al comienzo del tratamiento y a continuación de nuevo en la semana 12. Los resultados se presentan en la tabla a continuación y demuestran que el tratamiento con oligonucleótidos antisentido dirigidos a CFB incrementó la supervivencia en los ratones en comparación con el control de PBS y los ratones tratados con oligonucleótidos de control.
Tabla 211
Número de ratones supervivientes
Figure imgf000200_0003
Ejemplo 132: efecto de la inhibición antisentido de CFB en el modelo de ratón MRL
El modelo de ratón con nefritis lúpica MRL/lpr desarrolla un fenotipo similar a LES caracterizado por linfadenopatía debido a una acumulación de linfocitos T doble negativo (CD4- CD8 -) y B220+. Estos ratones muestran una tasa de mortalidad acelerada. Además, los ratones tienen altas concentraciones de inmunoglobulinas circulantes, que incluyen niveles elevados de autoanticuerpos tales como ANA, anti-ADNmc, anti-ADNbc, anti-Sm y factores reumatoides, lo que da como resultado grandes cantidades de inmunocomplejos (Andrews, B. et al., J. Exp. Med.
148: 1198-1215, 1978).
Tratamiento
Se realizó un estudio para investigar si el tratamiento con oligonucleótidos antisentido dirigidos a CFB invertiría la patología renal en el modelo de ratón. Se adquirieron ratones hembra MRL/lpr, de 14 semanas de edad, de Jackson Laboratories. Un grupo de 10 ratones recibió dosis de 50 |jg/kg/semana de ISIS 516323 durante 7 semanas. Otro grupo de 10 ratones recibió dosis de 50 jg/kg/semana del oligonucleótido control ISIS 141923 durante 7 semanas. Otro grupo de 10 ratones recibió dosis de PBS durante 7 semanas y sirvió como grupo de control con el que se compararon todos los otros grupos. Los criterios de valoración terminales se obtuvieron 48 horas después de inyectar la última dosis.
Análisis de ARN de CFB
Se extrajo ARN de tejido hepático para el análisis de PCR ultrarrápida de CFB, usando el conjunto de sonda y cebador RTS3430. Como se muestra en la tabla a continuación, ISIS 516323 redujo CFB sobre el control de PBS. Los resultados se presentan como porcentaje de inhibición de CFB, en relación con el control.
Tabla 212
Porcentaje de inhibición de ARNm de CFB murino en ratones MRL/lpr
Figure imgf000201_0003
Patología renal
La patología renal se evaluó por dos procedimientos. Los cortes histológicos del riñón se tiñeron con hematoxilina y eosina. El control de PBS demostró la presencia de cilindros tubulares en semilunas multiglomerulares, lo que es un síntoma de glomeruloesclerosis. Por el contrario, los cortes de ratones tratados con ISIS 516323 mostraron cilindros tubulares en semilunas ausentes con cambios fibróticos mínimos en la cápsula de Bowman, expansión de células mesangiales segmentarias de moderada a grave y engrosamiento de la membrana basal glomerular. La acumulación de C3 en el riñón también se evaluó por inmunohistoquímica con anticuerpos anti-C3. La puntuación de intensidad inmunohistoquímica de C3 de riñón completo se calculó por un sistema de puntuación de intensidad, que se computó capturando 10 glomérulos por riñón y calculando la intensidad de la tinción de C3 positiva. Los resultados se presentan en la tabla a continuación y demuestran que el tratamiento con ISIS 516323 redujo la acumulación de C3 renal en comparación con los grupos de control.
Tabla 213
Acumulación de C3 renal en ratones MRL/lpr
Figure imgf000201_0001
Niveles de C3 en plasma
La reducción de CFB inhibe la activación de la vía alternativa del complemento, previniendo el consumo de C3 y dando lugar a una elevación aparente de los niveles de C3 en plasma. Los niveles de C3 en plasma de una extracción terminal se midieron por un analizador clínico. Los resultados se presentan en la tabla a continuación y demuestran que el tratamiento con ISIS 516323 incrementó los niveles de C3 (p< 0,001) en el plasma en comparación con los grupos de control.
Tabla 214
Niveles de C3 en plasma (mg/dl) en ratones MRL/lpr
Figure imgf000201_0002
Los resultados indican que el tratamiento con oligonucleótidos antisentido dirigidos a CFB invierte la patología renal en el modelo de ratón con lupus.
Ejemplo 133: efecto de la inhibición antisentido de CFB en el modelo de ratón CFH Het
El modelo de ratón heterocigoto CFH (CFH Het, CFH+/-) expresa una proteína factor H mutante en combinación con la proteína de ratón de longitud completa (Pickering, M.C. etal., J. Exp. Med. 2007. 204: 1249-56). La histología renal sigue siendo normal en estos ratones hasta los seis meses de edad.
Estudio 1
Grupos de 8 ratones CFH+/-, de 6 semanas de edad, recibieron cada uno dosis de 75 mg/kg/semana de ISIS 516323 o ISIS 516341 durante 6 semanas. Otro grupo de 8 ratones recibió dosis de 75 mg/kg/semana del oligonucleótido de control ISIS 141923 durante 6 semanas. Otro grupo de 8 ratones recibió dosis de PBS durante 6 semanas y sirvió como grupo de control con el que se compararon todos los otros grupos. Los criterios de valoración terminales se obtuvieron 48 horas después de inyectar la última dosis.
Análisis de ARN de CFB
Se extrajo ARN de tejido hepático y renal para el análisis de PCR ultrarrápida de CFB, usando el conjunto de sonda y cebador RTS3430. Como se muestra en la tabla a continuación, los oligonucleótidos antisentido redujeron CFB sobre el control de PBS. Los resultados se presentan como porcentaje de inhibición de CFB, en relación con el control.
Tabla 215
Porcentaje de inhibición de ARNm de CFB murino en ratones CFH+/-
Figure imgf000202_0001
Niveles de C3 en plasma
La reducción de CFB inhibe la activación de la vía alternativa del complemento, previniendo el consumo de C3 y dando lugar a una elevación aparente de los niveles de C3 en plasma. Los niveles de C3 en plasma de la obtención de plasma terminal se midieron por un analizador clínico. Los resultados se presentan en la tabla a continuación y demuestran que el tratamiento con ISIS 516323 incrementó C3 a niveles normales en el plasma.
Tabla 216
Niveles de C3 en plasma (mg/dl) en ratones CFH+/-
Figure imgf000202_0003
Estudio 2
Cada grupo de 5 ratones CFH+/- recibió dosis de 12,5 mg/kg/semana, 25 mg/kg/semana, 50 mg/kg/semana, 75 mg/kg/semana o 100 mg/kg/semana de ISIS 516323 o ISIS 516341 durante 6 semanas. Otro grupo de 5 ratones recibió dosis de 75 |jg/kg/semana del oligonucleótido control ISIS 141923 durante 6 semanas. Otro grupo de 5 ratones recibió dosis de PBS durante 6 semanas y sirvió como grupo de control con el que se compararon todos los otros grupos. Los criterios de valoración terminales se obtuvieron 48 horas después de inyectar la última dosis. Análisis de ARN de CFB
Se extrajo ARN de tejido hepático y renal para el análisis de PCR ultrarrápida de CFB, usando el conjunto de sonda y cebador RTS3430. Como se muestra en la tabla a continuación, los oligonucleótidos antisentido redujeron CFB sobre el control de PBS de manera dependiente de la dosis. Los resultados se presentan como porcentaje de inhibición de CFB, en relación con el control.
Tabla 217
Porcentaje de inhibición de ARNm de CFB murino en el hígado de ratones CFH+/-
Figure imgf000202_0002
Figure imgf000203_0001
Niveles de C3 en plasma
La reducción de CFB inhibe la activación de la vía alternativa del complemento, previniendo el consumo de C3 y dando lugar a una elevación aparente de los niveles de C3 en plasma. Los niveles de C3 en plasma de la obtención de plasma terminal se midieron por un analizador clínico. Los resultados se presentan en la tabla a continuación y demuestran que el tratamiento con oligonucleótidos ISIS dirigidos a CFB incrementó los niveles de C3 en el plasma.
Tabla 218
Niveles de C3 en plasma (mg/dl) en ratones CFH+/-
Figure imgf000203_0002
Ejemplo 134: efecto de los oligonucleótidos antisentido ISIS dirigidos a CFB humano en macacos cangrejeros
Se trataron macacos cangrejeros con oligonucleótidos antisentido ISIS seleccionados de estudios descritos en los ejemplos anteriores. Se evaluaron la eficacia y la tolerabilidad de oligonucleótidos antisentido, así como su perfil farmacocinético en el hígado y el riñón.
En el momento en que se llevó a cabo este estudio, la secuencia genómica del macaco cangrejero no estaba disponible en la base de datos del National Center for Biotechnology Information (NCBI); por lo tanto, no se pudo confirmar la reactividad cruzada con la secuencia génica del macaco cangrejero. En cambio, las secuencias de los oligonucleótidos antisentido ISIS usados en los macacos cangrejeros se compararon con una secuencia de macaco de la India para determinar la homología. Se espera que los oligonucleótidos ISIS con homología para la secuencia del macaco de la India tengan reactividad cruzada completa también con la secuencia del macaco cangrejero. Los oligonucleótidos antisentido humanos sometidos a prueba tienen reactividad cruzada con la secuencia genómica de macaco de la India (n.° de acceso GENBANK NW_001116486.1 truncado de los nucleótidos 536000 a 545000, designado en el presente documento como SEQ ID NO: 3). Cuanto mayor sea la complementariedad entre el oligonucleótido humano y la secuencia de macaco de la India, más probable es que el oligonucleótido humano pueda reaccionar de forma cruzada con la secuencia de macaco de la India. Los sitios de inicio y parada de cada oligonucleótido dirigido a SEQ ID NO: 3 se presentan en la tabla a continuación. "Sitio de inicio" indica el nucleótido más hacia 5' al que se dirige el gápmero en la secuencia génica de macaco de la India. "Emparejamientos erróneos" indica el número de nucleobases en el oligonucleótido humano que se emparejan erróneamente con la secuencia genómica de macaco de la India.
Tabla 219
Oligonucleótidos antisentido complementarios a la secuencia genómica de CFB de macaco de la India (SEQ ID NO: 3)
Figure imgf000204_0001
Tratamiento
Antes del estudio, los monos se mantuvieron en cuarentena durante al menos un período de 30 días, durante el que se observó a los animales diariamente para comprobar su salud general. Los monos tenían 2-4 años de edad y pesaban entre 2 y 4 kg. A once grupos de 4-6 macacos cangrejeros macho asignados al azar se les inyectó subcutáneamente oligonucleótido ISIS o PBS en cuatro sitios en el lomo en una rotación horaria (es decir, izquierda, arriba, derecha y abajo), un sitio por dosis. Los monos recibieron cuatro dosis de carga de PBS o 40 mg/kg de ISIS 532800, ISIS 532809, ISIS 588540, ISIS 588544, ISIS 588548, ISIS 588550, ISIS 588553, ISIS 588555, ISIS 588848 o ISIS 594430 durante la primera semana (días 1, 3, 5 y 7), y posteriormente recibieron dosis una vez por semana durante 12 semanas (días 14, 21,28, 35, 42, 49, 56, 63, 70, 77 y 84) con PBS o 40 mg/kg de oligonucleótido ISIS. ISIS 532770 se sometió a prueba en un estudio separado con condiciones similares con dos macacos cangrejeros macho y dos hembras en el grupo.
Reducción de diana hepática
Análisis de ARN
El día 86, se obtuvieron muestras de hígado y riñón por duplicado (aproximadamente 250 mg cada una) para el análisis de ARNm de CFB. Las muestras se ultracongelaron en nitrógeno líquido en la necropsia en aproximadamente 10 minutos desde el sacrificio.
Se extrajo ARN de hígado y riñón para el análisis de PCR ultrarrápida de la medición de la expresión del ARNm de CFB. Los resultados se presentan como porcentaje de cambio de ARNm, en relación con el control de PBS, normalizado con RIBOGREEn®. Los niveles de ARN también se normalizaron con el gen constitutivo, ciclofilina A. Los niveles de ARN se midieron con los conjuntos de sonda y cebador RTS3459, descritos anteriormente, o
RTS4445_MGB (secuencia directa CCAAGAAGCTC'AGTG.AAATCAA. designada en el presente documento como SEQ
ID NO: 819; secuencia inversa rOTCTGOAGGOCCC T( n designada en el presente documento como SEQ ID NO:
820; secuencia de sonda AUACt'ACAAüTTGAAGTC. designada en el presente documento como SEQ ID NO: 815).
Como se muestra en las tablas a continuación, el tratamiento con oligonucleótidos antisentido ISIS dio como resultado una reducción del ARNm de CFB en comparación con el control de PBS. El análisis de los niveles de ARNm de CFB reveló que varios de los oligonucleótidos ISIS redujeron los niveles de CFB en hígado y/o riñón. Aquí '0' indica que los niveles de expresión no se inhibieron. '*' indica que el oligonucleótido se sometió a prueba en un estudio separado con condiciones similares.
Tabla 220
Porcentaje de inhibición de ARNm de CFB en el hígado de macaco cangrejero en relación con el control de PBS
Figure imgf000205_0001
Tabla 221
Porcentaje de inhibición de ARNm de CFB en el riñón de macaco cangrejero en relación con el control de PBS
Figure imgf000205_0002
Análisis de proteínas
Se obtuvo aproximadamente 1 ml de sangre de todos los animales disponibles el día 85 y se colocó en tubos que contenían la sal potásica de EDTA. Las muestras de sangre se dispusieron de inmediato en hielo o Kryorack y se centrifugaron (3000 rpm durante 10 min a 4 °C) para obtener plasma (aproximadamente 0,4 ml) dentro de los 60 minutos de la obtención. Se midieron los niveles plasmáticos de CFB en el plasma por inmunodifusión radial (RID), usando un anticuerpo policlonal anti-factor B. Los resultados se presentan en la tabla a continuación. ISIS 532770 se sometió a prueba en un estudio separado y los niveles de proteína en plasma se midieron el día 91 o 92 en ese grupo.
El análisis de CFB en plasma reveló que varios oligonucleótidos ISIS redujeron los niveles de proteína de manera prolongada. ISIS 532770, que se sometió a prueba en un estudio separado, redujo los niveles de proteína CFB el día 91/92 en un 50 % en comparación con los valores de referencia. La reducción en los niveles de proteína de CFB en plasma se correlaciona bien con la reducción del nivel de ARNm de CFB hepático en los correspondientes grupos de animales.
Tabla 222
Niveles de proteína en plasma (% valores de referencia) en el macaco cangrejero
Figure imgf000205_0003
Figure imgf000206_0002
Estudios de tolerabilidad
Mediciones de peso corporal
Para evaluar el efecto de los oligonucleótidos ISIS sobre la salud general de los animales, se midieron los pesos corporales y de órganos y se presentan en la tabla a continuación. '*' indica que el oligonucleótido se sometió a prueba en un estudio separado con condiciones similares y es el promedio de las mediciones de monos macho y hembra. Los resultados indican que el efecto del tratamiento con oligonucleótidos antisentido sobre el peso corporal y de órganos estuvo dentro del intervalo esperado para oligonucleótidos antisentido.
Tabla 223
Pesos corporales finales (g) en macaco cangrejero
Figure imgf000206_0001
Tabla 224
Pesos de órganos finales (g) en macaco cangrejero
Figure imgf000206_0003
Función hepática
Para evaluar el efecto de los oligonucleótidos ISIS sobre la función hepática, se obtuvieron muestras de sangre de todos los grupos de estudio. Las muestras de sangre se obtuvieron de las venas cefálica, safena o femoral, 48 horas después de la dosificación. Los monos se mantuvieron en ayunas durante la noche antes de la obtención de sangre. Se obtuvo sangre (1,5 ml) en tubos sin anticoagulante para la separación del suero. Los tubos se mantuvieron a temperatura ambiente durante un mínimo de 90 minutos y a continuación se centrifugaron (aproximadamente 3000 rpm durante 10 min) para obtener suero. Los niveles de diversos marcadores de función hepática se midieron usando un analizador químico Toshiba 200FR NEO (Toshiba Co., Japón).
Se midieron los niveles plasmáticos de ALT y AST y los resultados se presentan en la tabla a continuación, expresados en IU/l. La bilirrubina, un marcador de la función hepática, se midió de forma similar y se presenta en la tabla a continuación expresada en mg/dl. '*' indica que el oligonucleótido se sometió a prueba en un estudio separado con condiciones similares y es el promedio de las mediciones de monos macho y hembra. Los resultados indican que la mayoría de los oligonucleótidos antisentido no tuvieron ningún efecto sobre la función hepática fuera del intervalo esperado para oligonucleótidos antisentido.
Tabla 225
Niveles de marcadores de química hepática en plasma de macaco cangrejero el día 86
Figure imgf000207_0002
Función renal
Para evaluar el efecto de los oligonucleótidos ISIS sobre la función renal, se obtuvieron muestras de sangre de todos los grupos de estudio. Las muestras de sangre se obtuvieron de las venas cefálica, safena o femoral, 48 horas después de la dosificación. Los monos se mantuvieron en ayunas durante la noche antes de la obtención de sangre. Se obtuvo sangre en tubos sin anticoagulante para la separación del suero. Los tubos se mantuvieron a temperatura ambiente durante un mínimo de 90 minutos y a continuación se centrifugaron (aproximadamente 3000 rpm durante 10 min) para obtener suero. Los niveles de BUN y creatinina se midieron usando un analizador químico Toshiba 200FR NEO (Toshiba Co., Japón). Los resultados se presentan en la tabla a continuación, expresados en mg/dl. '*' indica que el oligonucleótido se sometió a prueba en un estudio separado con condiciones similares y es el promedio de las mediciones de monos macho y hembra.
Para el análisis de orina, se obtuvo orina fresca de todos los animales por la mañana usando una bandeja de jaula limpia sobre hielo húmedo. Se retiró la comida durante la noche del día antes de la obtención de orina, pero se suministró agua. Las muestras de orina (aproximadamente 1 ml) se analizaron para determinar la proporción de proteína con respecto a creatinina (P/C) usando un analizador químico automatizado Toshiba 200FR Ne O (Toshiba Co., Japón), 'nd' indica que el nivel de proteína ureico estaba por debajo del límite de detección del analizador.
Los datos químicos de plasma y orina indican que la mayoría de los oligonucleótidos ISIS no tuvieron ningún efecto sobre la función renal fuera del intervalo esperado para oligonucleótidos antisentido.
Tabla 226
Niveles de marcadores de química renal (mg/dl) en plasma de macaco cangrejero el día 86
Figure imgf000207_0001
Figure imgf000208_0002
Tabla 227
Niveles de marcadores de química renal en orina de macaco cangrejero el día 44 y el día 86
Figure imgf000208_0003
Hematología
Para evaluar cualquier efecto de los oligonucleótidos ISIS en macacos cangrejeros sobre parámetros hemáticos, se obtuvieron muestras sanguíneas de aproximadamente 0,5 ml de sangre de cada uno de los animales de estudio disponibles en tubos que contenían K2-EDTA. Las muestras se analizaron para determinar el recuento de glóbulos rojos (RBC), recuento de glóbulos blancos (WBC), recuento de glóbulos blancos individuales, tales como monocitos, neutrófilos, linfocitos, así como recuento de plaquetas, contenido en hemoglobina y hematocrito, usando un analizador de hematología ADVIA120 (Bayer, e E. UU.). Los datos se presentan en las tablas a continuación. '*' indica que el oligonucleótido se sometió a prueba en un estudio separado con condiciones similares y es el promedio de las mediciones de monos macho y hembra.
Los datos indican que los oligonucleótidos no provocaron ningún cambio en parámetros hemáticos fuera del intervalo esperado para oligonucleótidos antisentido a esta dosis.
Tabla 228
Hemogramas en macacos cangrejeros
Figure imgf000208_0001
Figure imgf000209_0001
Tabla 229
Parámetros hemáticos en macacos cangrejeros
Figure imgf000209_0003
Medición de la concentración de oligonucleótido
La concentración del oligonucleótido de longitud completa se midió en los tejidos renales y hepáticos. El procedimiento usado es una modificación de procedimientos previamente publicados (Leeds et al., 1996; Geary et al., 1999) que consisten en una extracción con fenol-cloroformo (líquido-líquido) seguida de una extracción en fase sólida. Las concentraciones de muestras tisulares se calcularon usando curvas de calibración, con un límite inferior de cuantificación (LLOQ) de aproximadamente 1,14 |jg/g. Los resultados se presentan en la tabla a continuación, expresados como |jg/g de tejido hepático o renal.
Tabla 230
Distribución de oligonucleótidos antisentido
Figure imgf000209_0002
Ejemplo 135: estudio de eficacia de 6 semanas de oligonucleótidos antisentido no conjugados y 5'-THA-GalNAc3-conjugados dirigidos a CFB humano en ratones transgénicos
Se sometieron a prueba dos oligonucleótidos antisentido que tienen la misma secuencia de nucleobases: oligonucleótido antisentido no conjugado ISIS 588540 y oligonucleótido antisentido 5'-THA-GalNAc3-conjugado ISIS 696844, en ratones transgénicos CFB humanos (ratones hCFB-Tg).
A los ratones se les administró por vía subcutánea ISIS 696844 en dosis de 0,1, 1,25, 0,5, 2,0, 6,0 o 12,0 mg/kg/semana o ISIS 588540 en dosis de 2, 6, 12, 25 o 50 mg/kg/semana durante 6 semanas. A un grupo de control de ratones se les administró por vía subcutánea PBS durante 6 semanas. Los ratones se sacrificaron 48 horas después de la última dosis. Los niveles de ARNm hepático se analizaron por qRT-PCR.
Estudio 1
Los resultados se presentan en la tabla a continuación y demuestran que el oligonucleótido antisentido 5'-THA-GalNAc3-conjugado dirigido a CFB es más potente que el oligonucleótido antisentido no conjugado con la misma secuencia.
Tabla 231
Eficacia de los oligonucleótidos antisentido dirigidos a CFB
Figure imgf000210_0002
Estudio 2
Los niveles de ARNm hepático se midieron con dos conjuntos de sonda y cebador diferentes dirigidos a diferentes regiones del ARNm y se normalizaron a RIBOGREEN® (RGB) o bien ciclofilina. Los conjuntos de sonda y cebador fueron RTS3459, descrito anteriormente, y RTS3460 (secuencia directa C'OAACiC'AOC'.'C AA l'GAAA i'( AA. designada en el presente documento como SEQ ID NO: 813; secuencia inversa l'CiC'CIGOAGOGCCI IC"I l. designada en el presente documento como SEQ ID NO: 814; secuencia de sonda AGACCACAAC lTGAAGrc designada en el presente documento como SEQ ID NO: 815). Los resultados se presentan en la tabla a continuación y demuestran que el oligonucleótido antisentido 5'-THA-GalNAc3-conjugado dirigido a CFB es más potente que el oligonucleótido antisentido no conjugado con la misma secuencia, independientemente del conjunto de sonda y cebador usado. Tabla 231
Eficacia de los oligonucleótidos antisentido dirigidos a CFB
Figure imgf000210_0001

Claims (14)

REIVINDICACIONES
1. Un compuesto que comprende un oligonucleótido modificado monocatenario y un grupo conjugado, en el que el oligonucleótido modificado consiste en de 16 a 30 nucleósidos enlazados y tiene una secuencia de nucleobases que comprende una cualquiera de SEQ ID NO: 455, 237, 448, 453, 444, 450, 598, 198, 549 y 228 en el que el oligonucleótido modificado tiene:
un segmento de hueco que consiste en desoxinucleósidos enlazados;
un segmento de ala 5' que consiste en nucleósidos enlazados; y
un segmento de ala 3' que consiste en nucleósidos enlazados;
en el que el segmento de hueco se sitúa entre el segmento de ala 5' y el segmento de ala 3' y en el que cada nucleósido de cada segmento de ala comprende un glúcido modificado;
en el que el grupo conjugado comprende:
Figure imgf000435_0001
y en el que el compuesto puede inhibir la expresión del factor B del complemento (CFB).
2. El compuesto de la reivindicación 1, en el que el oligonucleótido modificado consiste en 20 nucleósidos enlazados y tiene una secuencia de nucleobases que consiste en la secuencia enumerada en SEQ ID NO: 455, 237, 453, 444, 448, 450, 198 o 228, en el que el oligonucleótido modificado tiene:
un segmento de hueco que consiste en diez desoxinucleósidos enlazados;
un segmento de ala 5' que consiste en cinco nucleósidos enlazados; y
un segmento de ala 3' que consiste en cinco nucleósidos enlazados;
en el que el segmento de hueco se sitúa entre el segmento de ala 5' y el segmento de ala 3', en el que cada nucleósido de cada segmento de ala comprende un glúcido 2'-O-metoxietilo; en el que cada enlace internucleosídico del oligonucleótido modificado es un enlace fosforotioato y en el que cada citosina es una 5-metilcitosina.
3. El compuesto de la reivindicación 1, en el que el oligonucleótido modificado consiste en 16 nucleósidos enlazados y tiene una secuencia de nucleobases que consiste en la secuencia enumerada en SEQ ID NO: 598, en el que el oligonucleótido modificado tiene:
un segmento de hueco que consiste en diez desoxinucleósidos enlazados;
un segmento de ala 5' que consiste en tres nucleósidos enlazados; y
un segmento de ala 3' que consiste en tres nucleósidos enlazados;
en el que el segmento de hueco se sitúa entre el segmento de ala 5' y el segmento de ala 3'; en el que el segmento de ala 5' comprende un glúcido 2'-O-metoxietilo, glúcido 2'-O-metoxietilo y glúcido cEt en la dirección 5' a 3'; en el que el segmento de ala 3' comprende un glúcido cEt, glúcido cEt y glúcido 2'-O-metoxietilo en la dirección 5' a 3'; en el que cada enlace internucleosídico del oligonucleótido modificado es un enlace fosforotioato; y en el que cada citosina es una 5-metilcitosina.
4. El compuesto de la reivindicación 1, en el que el oligonucleótido modificado consiste en 16 nucleósidos enlazados y tiene una secuencia de nucleobases que consiste en la secuencia enumerada en SEQ ID NO: 549, en el que el oligonucleótido modificado tiene:
un segmento de hueco que consiste en diez desoxinucleósidos enlazados;
un segmento de ala 5' que consiste en tres nucleósidos enlazados; y
un segmento de ala 3' que consiste en tres nucleósidos enlazados;
en el que el segmento de hueco se sitúa entre el segmento de ala 5' y el segmento de ala 3'; en el que cada nucleósido de cada segmento de ala comprende un glúcido cEt; en el que cada enlace internucleosídico del oligonucleótido modificado es un enlace fosforotioato; y en el que cada citosina es una 5-metilcitosina.
5. El compuesto de la reivindicación 1, en el que el oligonucleótido es al menos un 80 %, 85 %, 90 %, 95 % o 100 % complementario a SEQ ID NO: 1 o 2.
6. El compuesto de la reivindicación 1 o reivindicación 5, en el que el glúcido modificado es un glúcido bicíclico, opcionalmente en el que el glúcido bicíclico se selecciona del grupo que consiste en: 4'-(CH2)-O-2' (LNA); 4'-(CH2)2-O-2' (ENA); y 4'-CH(CH3)-O-2' (cEt).
7. El compuesto de una cualquiera de las reivindicaciones 1, 5 o 6, en el que el glúcido modificado es 2'-O-metoxietilo.
8. El compuesto de la reivindicación 1, o una cualquiera de las reivindicaciones 5-7, en el que el oligonucleótido modificado comprende al menos un enlace internucleosídico modificado o al menos una nucleobase modificada.
9. El compuesto de la reivindicación 8, en el que el enlace internucleosídico modificado es un enlace internucleosídico fosforotioato o en el que cada enlace internucleosídico del oligonucleótido modificado comprende un enlace internucleosídico fosforotioato.
10. El compuesto de la reivindicación 8 o la reivindicación 9, en el que la nucleobase modificada es una 5-metilcitosina.
11. El compuesto de una cualquiera de las reivindicaciones 1-10, en el que el grupo conjugado se enlaza al oligonucleótido modificado:
(i) en el extremo 5' del oligonucleótido modificado; o
(ii) en el extremo 3' del oligonucleótido modificado.
12. Una composición que comprende el compuesto de una cualquiera de las reivindicaciones 1-11 o una sal del mismo y al menos uno de un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable.
13. Un compuesto de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-11 o una composición de acuerdo con la reivindicación 12 para su uso en el tratamiento de una enfermedad asociada con la regulación incorrecta de la vía alternativa del complemento en un sujeto.
14. El compuesto o composición para su uso de la reivindicación 13, en el que la enfermedad es:
a) degeneración macular, degeneración macular senil (DMS), DMS húmeda, DMS seca o atrofia geográfica; b) una nefropatía, opcionalmente en la que la nefropatía es nefritis lúpica, lupus eritematoso sistémico (LES), enfermedad por depósitos densos (EDD), glomerulonefritis C3 (C3GN), nefropatía CFHR5 o síndrome hemolítico urémico atípico (SHUa).
ES19184459T 2014-05-01 2015-05-01 Composiciones y procedimientos para modular la expresión del factor B del complemento Active ES2941742T3 (es)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201461987471P 2014-05-01 2014-05-01
US201462076273P 2014-11-06 2014-11-06

Publications (1)

Publication Number Publication Date
ES2941742T3 true ES2941742T3 (es) 2023-05-25

Family

ID=54359510

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES19184459T Active ES2941742T3 (es) 2014-05-01 2015-05-01 Composiciones y procedimientos para modular la expresión del factor B del complemento
ES15786214T Active ES2745825T3 (es) 2014-05-01 2015-05-01 Composiciones y métodos para modular la expresión del factor B del complemento

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES15786214T Active ES2745825T3 (es) 2014-05-01 2015-05-01 Composiciones y métodos para modular la expresión del factor B del complemento

Country Status (29)

Country Link
US (4) US10280423B2 (es)
EP (3) EP3608406B1 (es)
JP (2) JP6637442B2 (es)
KR (1) KR102369736B1 (es)
CN (2) CN110724687B (es)
AU (1) AU2015252858C1 (es)
BR (1) BR112016022593B1 (es)
CA (1) CA2943894A1 (es)
CL (2) CL2016002764A1 (es)
CR (2) CR20160554A (es)
DK (1) DK3137596T3 (es)
DO (1) DOP2016000291A (es)
EA (1) EA036496B1 (es)
ES (2) ES2941742T3 (es)
HR (1) HRP20191664T1 (es)
HU (1) HUE046272T2 (es)
IL (2) IL247883B (es)
LT (1) LT3137596T (es)
MX (1) MX2016014294A (es)
PE (2) PE20170010A1 (es)
PH (1) PH12016502062A1 (es)
PL (2) PL3608406T3 (es)
PT (1) PT3137596T (es)
RS (1) RS59182B1 (es)
RU (1) RU2701645C2 (es)
SG (2) SG11201608502TA (es)
SI (1) SI3137596T1 (es)
UA (1) UA121656C2 (es)
WO (1) WO2015168635A2 (es)

Families Citing this family (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3336189A1 (en) * 2012-04-20 2018-06-20 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Oligomeric compounds comprising bicyclic nucleotides and uses thereof
EP2992098B1 (en) 2013-05-01 2019-03-27 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for modulating hbv and ttr expression
CN105744959B (zh) * 2013-09-13 2020-12-01 Ionis制药公司 补体因子b的调节剂
KR102369736B1 (ko) 2014-05-01 2022-03-02 아이오니스 파마수티컬즈, 인코포레이티드 보체 인자 b 발현을 조절하기 위한 조성물 및 방법
JP6667453B2 (ja) 2014-05-01 2020-03-18 アイオーニス ファーマシューティカルズ， インコーポレーテッドＩｏｎｉｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ． 成長ホルモン受容体発現を調節するための組成物及び方法
WO2016055601A1 (en) 2014-10-10 2016-04-14 F. Hoffmann-La Roche Ag Galnac phosphoramidites, nucleic acid conjugates thereof and their use
BR122023026882A2 (pt) * 2015-11-06 2024-01-23 Ionis Pharmaceuticals, Inc Uso de um composto oligomérico
US10781175B2 (en) 2016-07-15 2020-09-22 Am Chemicals Llc Solid supports and phosphoramidite building blocks for oligonucleotide conjugates
JOP20190215A1 (ar) * 2017-03-24 2019-09-19 Ionis Pharmaceuticals Inc مُعدّلات التعبير الوراثي عن pcsk9
WO2020109343A1 (en) 2018-11-29 2020-06-04 F. Hoffmann-La Roche Ag Combination therapy for treatment of macular degeneration
WO2021046260A1 (en) 2019-09-03 2021-03-11 Arcturus Therapeutics, Inc. Asialoglycoprotein receptor mediated delivery of therapeutically active conjugates
IL297680A (en) * 2020-04-30 2022-12-01 Alnylam Pharmaceuticals Inc IRNA compounds complement factor b (cfb) and methods of using them
CN118234861A (zh) 2021-09-02 2024-06-21 赛伦斯治疗有限责任公司 用于抑制细胞中的补体因子b(cfb)表达的核酸
EP4423273A1 (en) * 2021-10-29 2024-09-04 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Complement factor b (cfb) irna compositions and methods of use thereof
WO2024097861A1 (en) * 2022-11-02 2024-05-10 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Methods for modulating complement factor b expression
WO2024137590A2 (en) * 2022-12-19 2024-06-27 Sanegene Bio Usa Inc. Small interfering rna targeting cfb and uses thereof

Family Cites Families (297)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US2699508A (en) 1951-12-21 1955-01-11 Selectronics Inc Method of mounting and construction of mounting for low frequency piezoelectric crystals
US3687808A (en) 1969-08-14 1972-08-29 Univ Leland Stanford Junior Synthetic polynucleotides
US4458066A (en) 1980-02-29 1984-07-03 University Patents, Inc. Process for preparing polynucleotides
US5132418A (en) 1980-02-29 1992-07-21 University Patents, Inc. Process for preparing polynucleotides
US4500707A (en) 1980-02-29 1985-02-19 University Patents, Inc. Nucleosides useful in the preparation of polynucleotides
US4469863A (en) 1980-11-12 1984-09-04 Ts O Paul O P Nonionic nucleic acid alkyl and aryl phosphonates and processes for manufacture and use thereof
US4973679A (en) 1981-03-27 1990-11-27 University Patents, Inc. Process for oligonucleo tide synthesis using phosphormidite intermediates
US4415732A (en) 1981-03-27 1983-11-15 University Patents, Inc. Phosphoramidite compounds and processes
US4668777A (en) 1981-03-27 1987-05-26 University Patents, Inc. Phosphoramidite nucleoside compounds
US5023243A (en) 1981-10-23 1991-06-11 Molecular Biosystems, Inc. Oligonucleotide therapeutic agent and method of making same
US4476301A (en) 1982-04-29 1984-10-09 Centre National De La Recherche Scientifique Oligonucleotides, a process for preparing the same and their application as mediators of the action of interferon
DE3329892A1 (de) 1983-08-18 1985-03-07 Köster, Hubert, Prof. Dr., 2000 Hamburg Verfahren zur herstellung von oligonucleotiden
US5118800A (en) 1983-12-20 1992-06-02 California Institute Of Technology Oligonucleotides possessing a primary amino group in the terminal nucleotide
USRE34036E (en) 1984-06-06 1992-08-18 National Research Development Corporation Data transmission using a transparent tone-in band system
US5550111A (en) 1984-07-11 1996-08-27 Temple University-Of The Commonwealth System Of Higher Education Dual action 2',5'-oligoadenylate antiviral derivatives and uses thereof
FR2567892B1 (fr) 1984-07-19 1989-02-17 Centre Nat Rech Scient Nouveaux oligonucleotides, leur procede de preparation et leurs applications comme mediateurs dans le developpement des effets des interferons
US5367066A (en) 1984-10-16 1994-11-22 Chiron Corporation Oligonucleotides with selectably cleavable and/or abasic sites
FR2575751B1 (fr) 1985-01-08 1987-04-03 Pasteur Institut Nouveaux nucleosides de derives de l'adenosine, leur preparation et leurs applications biologiques
US4751219A (en) 1985-02-05 1988-06-14 Nederlandse Centrale Organisatie Voor Toegepast-Natuur-Wetenschappelijk Onderzoek Synthetic glycolipides, a process for the preparation thereof and several uses for these synthetic glycolipides
US5235033A (en) 1985-03-15 1993-08-10 Anti-Gene Development Group Alpha-morpholino ribonucleoside derivatives and polymers thereof
US5506337A (en) 1985-03-15 1996-04-09 Antivirals Inc. Morpholino-subunit combinatorial library and method
US5405938A (en) 1989-12-20 1995-04-11 Anti-Gene Development Group Sequence-specific binding polymers for duplex nucleic acids
US5185444A (en) 1985-03-15 1993-02-09 Anti-Gene Deveopment Group Uncharged morpolino-based polymers having phosphorous containing chiral intersubunit linkages
US5034506A (en) 1985-03-15 1991-07-23 Anti-Gene Development Group Uncharged morpholino-based polymers having achiral intersubunit linkages
US5166315A (en) 1989-12-20 1992-11-24 Anti-Gene Development Group Sequence-specific binding polymers for duplex nucleic acids
DE3788914T2 (de) 1986-09-08 1994-08-25 Ajinomoto Kk Verbindungen zur Spaltung von RNS an eine spezifische Position, Oligomere, verwendet bei der Herstellung dieser Verbindungen und Ausgangsprodukte für die Synthese dieser Oligomere.
US5264423A (en) 1987-03-25 1993-11-23 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Inhibitors for replication of retroviruses and for the expression of oncogene products
US5276019A (en) 1987-03-25 1994-01-04 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Inhibitors for replication of retroviruses and for the expression of oncogene products
WO1988010264A1 (en) 1987-06-24 1988-12-29 Howard Florey Institute Of Experimental Physiology Nucleoside derivatives
US4924624A (en) 1987-10-22 1990-05-15 Temple University-Of The Commonwealth System Of Higher Education 2,',5'-phosphorothioate oligoadenylates and plant antiviral uses thereof
US5188897A (en) 1987-10-22 1993-02-23 Temple University Of The Commonwealth System Of Higher Education Encapsulated 2',5'-phosphorothioate oligoadenylates
ATE151467T1 (de) 1987-11-30 1997-04-15 Univ Iowa Res Found Durch modifikationen an der 3'-terminalen phosphodiesterbindung stabilisierte dna moleküle, ihre verwendung als nukleinsäuresonden sowie als therapeutische mittel zur hemmung der expression spezifischer zielgene
US5403711A (en) 1987-11-30 1995-04-04 University Of Iowa Research Foundation Nucleic acid hybridization and amplification method for detection of specific sequences in which a complementary labeled nucleic acid probe is cleaved
WO1989009221A1 (en) 1988-03-25 1989-10-05 University Of Virginia Alumni Patents Foundation Oligonucleotide n-alkylphosphoramidates
US5278302A (en) 1988-05-26 1994-01-11 University Patents, Inc. Polynucleotide phosphorodithioates
US5216141A (en) 1988-06-06 1993-06-01 Benner Steven A Oligonucleotide analogs containing sulfur linkages
US5175273A (en) 1988-07-01 1992-12-29 Genentech, Inc. Nucleic acid intercalating agents
US5194599A (en) 1988-09-23 1993-03-16 Gilead Sciences, Inc. Hydrogen phosphonodithioate compositions
US5256775A (en) 1989-06-05 1993-10-26 Gilead Sciences, Inc. Exonuclease-resistant oligonucleotides
US5134066A (en) 1989-08-29 1992-07-28 Monsanto Company Improved probes using nucleosides containing 3-dezauracil analogs
US5591722A (en) 1989-09-15 1997-01-07 Southern Research Institute 2'-deoxy-4'-thioribonucleosides and their antiviral activity
US5721218A (en) 1989-10-23 1998-02-24 Gilead Sciences, Inc. Oligonucleotides with inverted polarity
US5399676A (en) 1989-10-23 1995-03-21 Gilead Sciences Oligonucleotides with inverted polarity
EP0942000B1 (en) 1989-10-24 2004-06-23 Isis Pharmaceuticals, Inc. 2'-Modified oligonucleotides
US5264564A (en) 1989-10-24 1993-11-23 Gilead Sciences Oligonucleotide analogs with novel linkages
US5264562A (en) 1989-10-24 1993-11-23 Gilead Sciences, Inc. Oligonucleotide analogs with novel linkages
US5177198A (en) 1989-11-30 1993-01-05 University Of N.C. At Chapel Hill Process for preparing oligoribonucleoside and oligodeoxyribonucleoside boranophosphates
US5130302A (en) 1989-12-20 1992-07-14 Boron Bilogicals, Inc. Boronated nucleoside, nucleotide and oligonucleotide compounds, compositions and methods for using same
US5623065A (en) 1990-08-13 1997-04-22 Isis Pharmaceuticals, Inc. Gapped 2' modified oligonucleotides
US5681941A (en) 1990-01-11 1997-10-28 Isis Pharmaceuticals, Inc. Substituted purines and oligonucleotide cross-linking
US6005087A (en) 1995-06-06 1999-12-21 Isis Pharmaceuticals, Inc. 2'-modified oligonucleotides
US7101993B1 (en) 1990-01-11 2006-09-05 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleotides containing 2′-O-modified purines
US5587470A (en) 1990-01-11 1996-12-24 Isis Pharmaceuticals, Inc. 3-deazapurines
US5459255A (en) 1990-01-11 1995-10-17 Isis Pharmaceuticals, Inc. N-2 substituted purines
US5587361A (en) 1991-10-15 1996-12-24 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleotides having phosphorothioate linkages of high chiral purity
US5646265A (en) 1990-01-11 1997-07-08 Isis Pharmceuticals, Inc. Process for the preparation of 2'-O-alkyl purine phosphoramidites
US5457191A (en) 1990-01-11 1995-10-10 Isis Pharmaceuticals, Inc. 3-deazapurines
US5859221A (en) 1990-01-11 1999-01-12 Isis Pharmaceuticals, Inc. 2'-modified oligonucleotides
US5670633A (en) 1990-01-11 1997-09-23 Isis Pharmaceuticals, Inc. Sugar modified oligonucleotides that detect and modulate gene expression
US5220007A (en) 1990-02-15 1993-06-15 The Worcester Foundation For Experimental Biology Method of site-specific alteration of RNA and production of encoded polypeptides
US5149797A (en) 1990-02-15 1992-09-22 The Worcester Foundation For Experimental Biology Method of site-specific alteration of rna and production of encoded polypeptides
US5321131A (en) 1990-03-08 1994-06-14 Hybridon, Inc. Site-specific functionalization of oligodeoxynucleotides for non-radioactive labelling
US5470967A (en) 1990-04-10 1995-11-28 The Dupont Merck Pharmaceutical Company Oligonucleotide analogs with sulfamate linkages
GB9009980D0 (en) 1990-05-03 1990-06-27 Amersham Int Plc Phosphoramidite derivatives,their preparation and the use thereof in the incorporation of reporter groups on synthetic oligonucleotides
ES2116977T3 (es) 1990-05-11 1998-08-01 Microprobe Corp Soportes solidos para ensayos de hibridacion de acidos nucleicos y metodos para inmovilizar oligonucleotidos de modo covalente.
US5618704A (en) 1990-07-27 1997-04-08 Isis Pharmacueticals, Inc. Backbone-modified oligonucleotide analogs and preparation thereof through radical coupling
US5677437A (en) 1990-07-27 1997-10-14 Isis Pharmaceuticals, Inc. Heteroatomic oligonucleoside linkages
US5489677A (en) 1990-07-27 1996-02-06 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleoside linkages containing adjacent oxygen and nitrogen atoms
US5610289A (en) 1990-07-27 1997-03-11 Isis Pharmaceuticals, Inc. Backbone modified oligonucleotide analogues
US5608046A (en) 1990-07-27 1997-03-04 Isis Pharmaceuticals, Inc. Conjugated 4'-desmethyl nucleoside analog compounds
US5378825A (en) 1990-07-27 1995-01-03 Isis Pharmaceuticals, Inc. Backbone modified oligonucleotide analogs
US5386023A (en) 1990-07-27 1995-01-31 Isis Pharmaceuticals Backbone modified oligonucleotide analogs and preparation thereof through reductive coupling
US5223618A (en) 1990-08-13 1993-06-29 Isis Pharmaceuticals, Inc. 4'-desmethyl nucleoside analog compounds
US5541307A (en) 1990-07-27 1996-07-30 Isis Pharmaceuticals, Inc. Backbone modified oligonucleotide analogs and solid phase synthesis thereof
US5623070A (en) 1990-07-27 1997-04-22 Isis Pharmaceuticals, Inc. Heteroatomic oligonucleoside linkages
US5602240A (en) 1990-07-27 1997-02-11 Ciba Geigy Ag. Backbone modified oligonucleotide analogs
US5614617A (en) 1990-07-27 1997-03-25 Isis Pharmaceuticals, Inc. Nuclease resistant, pyrimidine modified oligonucleotides that detect and modulate gene expression
ES2083593T3 (es) 1990-08-03 1996-04-16 Sterling Winthrop Inc Compuestos y metodos para inhibir la expresion de genes.
US5177196A (en) 1990-08-16 1993-01-05 Microprobe Corporation Oligo (α-arabinofuranosyl nucleotides) and α-arabinofuranosyl precursors thereof
US5214134A (en) 1990-09-12 1993-05-25 Sterling Winthrop Inc. Process of linking nucleosides with a siloxane bridge
US5561225A (en) 1990-09-19 1996-10-01 Southern Research Institute Polynucleotide analogs containing sulfonate and sulfonamide internucleoside linkages
WO1992005186A1 (en) 1990-09-20 1992-04-02 Gilead Sciences Modified internucleoside linkages
US5432272A (en) 1990-10-09 1995-07-11 Benner; Steven A. Method for incorporating into a DNA or RNA oligonucleotide using nucleotides bearing heterocyclic bases
US6582908B2 (en) 1990-12-06 2003-06-24 Affymetrix, Inc. Oligonucleotides
US5948903A (en) 1991-01-11 1999-09-07 Isis Pharmaceuticals, Inc. Synthesis of 3-deazapurines
US5672697A (en) 1991-02-08 1997-09-30 Gilead Sciences, Inc. Nucleoside 5'-methylene phosphonates
US7015315B1 (en) 1991-12-24 2006-03-21 Isis Pharmaceuticals, Inc. Gapped oligonucleotides
US5571799A (en) 1991-08-12 1996-11-05 Basco, Ltd. (2'-5') oligoadenylate analogues useful as inhibitors of host-v5.-graft response
ES2103918T3 (es) 1991-10-17 1997-10-01 Ciba Geigy Ag Nucleosidos biciclicos, oligonucleotidos, procedimiento para su obtencion y productos intermedios.
US5594121A (en) 1991-11-07 1997-01-14 Gilead Sciences, Inc. Enhanced triple-helix and double-helix formation with oligomers containing modified purines
JP3739785B2 (ja) 1991-11-26 2006-01-25 アイシス ファーマシューティカルズ，インコーポレイティド 修飾されたピリミジンを含有するオリゴマーを使用する増強された三重らせんおよび二重らせんの成形
TW393513B (en) 1991-11-26 2000-06-11 Isis Pharmaceuticals Inc Enhanced triple-helix and double-helix formation with oligomers containing modified pyrimidines
US5484908A (en) 1991-11-26 1996-01-16 Gilead Sciences, Inc. Oligonucleotides containing 5-propynyl pyrimidines
US5792608A (en) 1991-12-12 1998-08-11 Gilead Sciences, Inc. Nuclease stable and binding competent oligomers and methods for their use
US5359044A (en) 1991-12-13 1994-10-25 Isis Pharmaceuticals Cyclobutyl oligonucleotide surrogates
US5700922A (en) 1991-12-24 1997-12-23 Isis Pharmaceuticals, Inc. PNA-DNA-PNA chimeric macromolecules
AU669353B2 (en) * 1991-12-24 1996-06-06 Isis Pharmaceuticals, Inc. Gapped 2' modified oligonucleotides
FR2687679B1 (fr) 1992-02-05 1994-10-28 Centre Nat Rech Scient Oligothionucleotides.
US5633360A (en) 1992-04-14 1997-05-27 Gilead Sciences, Inc. Oligonucleotide analogs capable of passive cell membrane permeation
US20030206887A1 (en) * 1992-05-14 2003-11-06 David Morrissey RNA interference mediated inhibition of hepatitis B virus (HBV) using short interfering nucleic acid (siNA)
US5434257A (en) 1992-06-01 1995-07-18 Gilead Sciences, Inc. Binding compentent oligomers containing unsaturated 3',5' and 2',5' linkages
EP0577558A2 (de) 1992-07-01 1994-01-05 Ciba-Geigy Ag Carbocyclische Nukleoside mit bicyclischen Ringen, Oligonukleotide daraus, Verfahren zu deren Herstellung, deren Verwendung und Zwischenproduckte
US5652355A (en) 1992-07-23 1997-07-29 Worcester Foundation For Experimental Biology Hybrid oligonucleotide phosphorothioates
RU95104940A (ru) 1992-07-27 1997-01-10 Хайбрайдон Способ введения в олигонуклеотид алкилфосфонотиоатной или арилфосфонотиоатной межнуклеотидной связи, способ получения олигонуклеотида, олигонуклеотиды, способ ингибирования генной экспрессии, способ лечения
JPH08508714A (ja) 1993-01-25 1996-09-17 ハイブライドン インコーポレイテッド オリゴヌクレオチド・アルキルホスホネートおよびアルキルホスホノチオエート
US5476925A (en) 1993-02-01 1995-12-19 Northwestern University Oligodeoxyribonucleotides including 3'-aminonucleoside-phosphoramidate linkages and terminal 3'-amino groups
GB9304620D0 (en) 1993-03-06 1993-04-21 Ciba Geigy Ag Compounds
GB9304618D0 (en) 1993-03-06 1993-04-21 Ciba Geigy Ag Chemical compounds
DK0691968T3 (da) 1993-03-30 1998-02-23 Sanofi Sa Acykliske nukleosid-analoge og oligonukleotidsekvenser indeholdende disse
AU6412794A (en) 1993-03-31 1994-10-24 Sterling Winthrop Inc. Oligonucleotides with amide linkages replacing phosphodiester linkages
US5502177A (en) 1993-09-17 1996-03-26 Gilead Sciences, Inc. Pyrimidine derivatives for labeled binding partners
US5801154A (en) 1993-10-18 1998-09-01 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense oligonucleotide modulation of multidrug resistance-associated protein
US5457187A (en) 1993-12-08 1995-10-10 Board Of Regents University Of Nebraska Oligonucleotides containing 5-fluorouracil
US5446137B1 (en) 1993-12-09 1998-10-06 Behringwerke Ag Oligonucleotides containing 4'-substituted nucleotides
PT733059E (pt) 1993-12-09 2001-03-30 Univ Jefferson Compostos e metodos para mutacoes dirigidas ao local em celulas eucarioticas
US5519134A (en) 1994-01-11 1996-05-21 Isis Pharmaceuticals, Inc. Pyrrolidine-containing monomers and oligomers
US5596091A (en) 1994-03-18 1997-01-21 The Regents Of The University Of California Antisense oligonucleotides comprising 5-aminoalkyl pyrimidine nucleotides
US5627053A (en) 1994-03-29 1997-05-06 Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. 2'deoxy-2'-alkylnucleotide containing nucleic acid
US5625050A (en) 1994-03-31 1997-04-29 Amgen Inc. Modified oligonucleotides and intermediates useful in nucleic acid therapeutics
US5646269A (en) 1994-04-28 1997-07-08 Gilead Sciences, Inc. Method for oligonucleotide analog synthesis
US5525711A (en) 1994-05-18 1996-06-11 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Pteridine nucleotide analogs as fluorescent DNA probes
US5597909A (en) 1994-08-25 1997-01-28 Chiron Corporation Polynucleotide reagents containing modified deoxyribose moieties, and associated methods of synthesis and use
US5681940A (en) * 1994-11-02 1997-10-28 Icn Pharmaceuticals Sugar modified nucleosides and oligonucleotides
US6172045B1 (en) 1994-12-07 2001-01-09 Neorx Corporation Cluster clearing agents
US6908903B1 (en) 1994-12-07 2005-06-21 Aletheon Pharmaceuticals, Inc. Cluster clearing agents
US5652356A (en) 1995-08-17 1997-07-29 Hybridon, Inc. Inverted chimeric and hybrid oligonucleotides
US20030119724A1 (en) 1995-11-22 2003-06-26 Ts`O Paul O.P. Ligands to enhance cellular uptake of biomolecules
AU1039397A (en) 1995-11-22 1997-06-27 Johns Hopkins University, The Ligands to enhance cellular uptake of biomolecules
US5998203A (en) 1996-04-16 1999-12-07 Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. Enzymatic nucleic acids containing 5'-and/or 3'-cap structures
WO2005121370A2 (en) 2004-06-03 2005-12-22 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligomeric compounds that facilitate risc loading
WO1998013381A1 (fr) 1996-09-26 1998-04-02 Ajinomoto Co., Inc. Proteines modifiees physiologiquement actives et compositions medicamenteuses les contenant
USRE44779E1 (en) 1997-03-07 2014-02-25 Santaris Pharma A/S Bicyclonucleoside and oligonucleotide analogues
US6770748B2 (en) 1997-03-07 2004-08-03 Takeshi Imanishi Bicyclonucleoside and oligonucleotide analogue
JP3756313B2 (ja) 1997-03-07 2006-03-15 武 今西 新規ビシクロヌクレオシド及びオリゴヌクレオチド類縁体
EP1557424A1 (en) 1997-09-12 2005-07-27 Exiqon A/S Bi-cyclic nucleoside, nucleotide and oligonucleoide analogues
US6794499B2 (en) 1997-09-12 2004-09-21 Exiqon A/S Oligonucleotide analogues
US7572582B2 (en) 1997-09-12 2009-08-11 Exiqon A/S Oligonucleotide analogues
US20030228597A1 (en) 1998-04-13 2003-12-11 Cowsert Lex M. Identification of genetic targets for modulation by oligonucleotides and generation of oligonucleotides for gene modulation
US6300319B1 (en) 1998-06-16 2001-10-09 Isis Pharmaceuticals, Inc. Targeted oligonucleotide conjugates
US6043352A (en) 1998-08-07 2000-03-28 Isis Pharmaceuticals, Inc. 2'-O-Dimethylaminoethyloxyethyl-modified oligonucleotides
US6166239A (en) 1998-09-04 2000-12-26 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleotide protecting groups
AU1705100A (en) 1998-10-09 2000-05-01 Musc Foundation For Research Development Blocking factor b to treat complement-mediated immune disease
US20030064944A1 (en) * 2001-06-21 2003-04-03 Isis Pharmaceuticals Inc. Antisense modulation of transforming growth factor beta receptor II expression
ID30093A (id) 1999-02-12 2001-11-01 Sankyo Co Analog-analog nukleosida dan oligonukleotida baru
US20030170249A1 (en) 1999-02-19 2003-09-11 Hakomori Sen-Itiroh Vaccines directed to cancer-associated carbohydrate antigens
US7084125B2 (en) 1999-03-18 2006-08-01 Exiqon A/S Xylo-LNA analogues
WO2000063364A2 (en) 1999-04-21 2000-10-26 American Home Products Corporation Methods and compositions for inhibiting the function of polynucleotide sequences
ES2283298T3 (es) 1999-05-04 2007-11-01 Santaris Pharma A/S Analogos de l-ribo-lna.
US6525191B1 (en) 1999-05-11 2003-02-25 Kanda S. Ramasamy Conformationally constrained L-nucleosides
US6383812B1 (en) 1999-05-28 2002-05-07 Academia Sinica Anti liver disease drug R-YEEE and method of synthesizing branched galactose-terminal glycoproteins
US20080281041A1 (en) 1999-06-07 2008-11-13 Rozema David B Reversibly Masked Polymers
US8541548B2 (en) 1999-06-07 2013-09-24 Arrowhead Madison Inc. Compounds and methods for reversible modification of biologically active molecules
JP4151751B2 (ja) 1999-07-22 2008-09-17 第一三共株式会社 新規ビシクロヌクレオシド類縁体
DE19935303A1 (de) * 1999-07-28 2001-02-08 Aventis Pharma Gmbh Oligonukleotide zur Inhibierung der Expression von humanem eg5
US20020082227A1 (en) * 1999-09-30 2002-06-27 Scott Henry Use of oligonucleotides for inhibition of complement activation
AU2698301A (en) 1999-12-30 2001-07-16 K.U. Leuven Research And Development Cyclohexene nucleic acids
US7491805B2 (en) * 2001-05-18 2009-02-17 Sirna Therapeutics, Inc. Conjugates and compositions for cellular delivery
US7833992B2 (en) 2001-05-18 2010-11-16 Merck Sharpe & Dohme Conjugates and compositions for cellular delivery
US7053199B2 (en) 2000-08-29 2006-05-30 Takeshi Imanishi Nucleoside analogs and oligonucleotide derivatives containing these analogs
US6426220B1 (en) 2000-10-30 2002-07-30 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense modulation of calreticulin expression
AU2002217980A1 (en) 2000-12-01 2002-06-11 Cell Works Inc. Conjugates of glycosylated/galactosylated peptide
WO2002087541A1 (en) 2001-04-30 2002-11-07 Protiva Biotherapeutics Inc. Lipid-based formulations for gene transfer
JP2005504020A (ja) 2001-07-03 2005-02-10 アイシス・ファーマシューティカルス・インコーポレーテッド ヌクレアーゼ耐性キメラオリゴヌクレオチド
US20030175906A1 (en) 2001-07-03 2003-09-18 Muthiah Manoharan Nuclease resistant chimeric oligonucleotides
US20030158403A1 (en) 2001-07-03 2003-08-21 Isis Pharmaceuticals, Inc. Nuclease resistant chimeric oligonucleotides
US6964950B2 (en) 2001-07-25 2005-11-15 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense modulation of C-reactive protein expression
US20030073623A1 (en) * 2001-07-30 2003-04-17 Drmanac Radoje T. Novel nucleic acid sequences obtained from various cDNA libraries
US7060809B2 (en) 2001-09-04 2006-06-13 Exiqon A/S LNA compositions and uses thereof
US7439043B2 (en) 2001-10-10 2008-10-21 Neose Technologies, Inc. Galactosyl nucleotide sugars
US20100240730A1 (en) 2002-02-20 2010-09-23 Merck Sharp And Dohme Corp. RNA Interference Mediated Inhibition of Gene Expression Using Chemically Modified Short Interfering Nucleic Acid (siNA)
EP1540004A4 (en) 2002-07-31 2007-10-03 Nucleonics Inc DOUBLE-STRING RNA STRUCTURES AND CONSTRUCTS AND METHOD FOR THE PRODUCTION AND USE THEREOF
WO2004014933A1 (en) * 2002-08-07 2004-02-19 University Of Massachusetts Compositions for rna interference and methods of use thereof
WO2004024757A2 (en) 2002-09-11 2004-03-25 Santaris Pharma A/S Modified pna molecules
AU2003284323A1 (en) 2002-10-18 2004-05-04 Alnylam Pharmaceuticals Inc Double-stranded rna structures and constructs, and methods for generating and using the same
AU2003287502B2 (en) 2002-11-05 2010-12-09 Isis Pharmaceuticals, Inc. Compositions comprising alternating 2'-modified nucleosides for use in gene modulation
AU2003291753B2 (en) 2002-11-05 2010-07-08 Isis Pharmaceuticals, Inc. Polycyclic sugar surrogate-containing oligomeric compounds and compositions for use in gene modulation
DK2284266T3 (da) * 2002-11-14 2014-01-13 Thermo Fisher Scient Biosciences Inc sIRNA-MOLEKYLE MOD TP53
US6673661B1 (en) 2002-12-20 2004-01-06 Taiwan Semiconductor Manufacturing Co., Ltd. Self-aligned method for forming dual gate thin film transistor (TFT) device
US20070015927A1 (en) 2003-01-09 2007-01-18 Kim Byeang H New phosphoramidite compounds
CA2518475C (en) 2003-03-07 2014-12-23 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Irna agents comprising asymmetrical modifications
US7723509B2 (en) 2003-04-17 2010-05-25 Alnylam Pharmaceuticals IRNA agents with biocleavable tethers
US7851615B2 (en) 2003-04-17 2010-12-14 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Lipophilic conjugated iRNA agents
JP4597976B2 (ja) 2003-04-17 2010-12-15 アルナイラム ファーマシューティカルズ インコーポレイテッド 修飾ｉＲＮＡ剤
WO2004103288A2 (en) 2003-05-13 2004-12-02 New York Society For The Ruptured And Crippled Maintaining The Hospital For Special Surgery Method of preventing recurrent miscarriages
JPWO2004101619A1 (ja) 2003-05-15 2006-10-26 塩野義製薬株式会社 機能的糖ペプチドの合理的設計および合成
WO2004106356A1 (en) 2003-05-27 2004-12-09 Syddansk Universitet Functionalized nucleotide derivatives
ATE555118T1 (de) 2003-08-28 2012-05-15 Takeshi Imanishi Neue synthetische nukleidsäuren vom typ mit quervernetzter n-o-bindung
JP2007505605A (ja) * 2003-09-16 2007-03-15 サーナ・セラピューティクス・インコーポレイテッド 低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ）を使用したＲＮＡ干渉により媒介される血管内皮増殖因子遺伝子発現および血管内皮増殖因子遺伝子受容体遺伝子発現のＲＮＡ干渉媒介性抑制
JP5379347B2 (ja) 2003-09-18 2013-12-25 アイシス ファーマシューティカルズ， インコーポレーテッド ４’−チオヌクレオシドおよびオリゴマー化合物
US7959919B2 (en) 2003-11-19 2011-06-14 Novelmed Therapeutics, Inc. Method of inhibiting factor B-mediated complement activation
US20060019941A1 (en) 2003-12-23 2006-01-26 Infinity Pharmaceuticals, Inc. Analogs of benzoquinone-containing ansamycins and methods of use thereof
WO2005061707A1 (ja) 2003-12-24 2005-07-07 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. 癌細胞のEg5阻害剤に対する感受性を判定する方法
US20050244851A1 (en) 2004-01-13 2005-11-03 Affymetrix, Inc. Methods of analysis of alternative splicing in human
EP2340850A1 (en) 2004-02-10 2011-07-06 The Regents of the University of Colorado, a Body Corporate Inhibition of factor B, the alternative complement pathway and methods related thereto
US20050244869A1 (en) 2004-04-05 2005-11-03 Brown-Driver Vickie L Modulation of transthyretin expression
JPWO2005097155A1 (ja) 2004-04-08 2008-02-28 タカラバイオ株式会社 神経突起伸長誘導剤
JP5192234B2 (ja) 2004-08-10 2013-05-08 アルナイラム ファーマシューティカルズ， インコーポレイテッド 化学修飾オリゴヌクレオチド
WO2006031461A2 (en) 2004-09-09 2006-03-23 Isis Pharmaceuticals, Inc. Pyrrolidinyl groups for attaching conjugates to oligomeric compounds
CA2580504C (en) 2004-09-17 2013-10-29 Isis Pharmaceuticals, Inc. Enhanced antisense oligonucleotides
EP1812569A2 (en) 2004-11-08 2007-08-01 K.U. Leuven Research and Development Modified nucleosides for rna interference
US20060148740A1 (en) 2005-01-05 2006-07-06 Prosensa B.V. Mannose-6-phosphate receptor mediated gene transfer into muscle cells
WO2006078217A1 (en) 2005-01-24 2006-07-27 Avaris Ab COMPLEX CONTAINING SiRNA, ShRNA OR ANTISENSE MOLECULE AND FUNCTIONAL ENTITY, FOR IMPROVED SPECIFICITY AND DELIVERY
EP1941040A1 (en) 2005-09-19 2008-07-09 Johnson &amp; Johnson Pharmaceutical Research &amp; Development L.L.C. Modulation of glucocorticoid receptor expression
AU2006311966A1 (en) * 2005-11-02 2007-05-18 The Government Of The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Method evolved for recognition and testing of age related macular degeneration (MERT-ARMD)
US7569686B1 (en) 2006-01-27 2009-08-04 Isis Pharmaceuticals, Inc. Compounds and methods for synthesis of bicyclic nucleic acid analogs
AU2007211080B9 (en) 2006-01-27 2012-05-03 Isis Pharmaceuticals, Inc. 6-modified bicyclic nucleic acid analogs
AU2007257094B2 (en) * 2006-05-05 2012-10-25 Isis Pharmaceuticals, Inc. Compounds and methods for modulating expression of SGLT2
US7666854B2 (en) 2006-05-11 2010-02-23 Isis Pharmaceuticals, Inc. Bis-modified bicyclic nucleic acid analogs
US7547684B2 (en) 2006-05-11 2009-06-16 Isis Pharmaceuticals, Inc. 5′-modified bicyclic nucleic acid analogs
CN102614528B (zh) 2006-08-18 2014-02-26 箭头研究公司 用于体内递送多核苷酸的多缀合物
US8658211B2 (en) 2006-08-18 2014-02-25 Arrowhead Madison Inc. Polyconjugates for in vivo delivery of polynucleotides
JP5352462B2 (ja) 2006-09-22 2013-11-27 ダーマコン， インコーポレイテッド 二本鎖オリゴヌクレオチド複合体、ｒｎａ干渉による遺伝子サイレンシング方法、および医薬品組成物
DK2092065T4 (da) 2006-10-18 2019-10-21 Ionis Pharmaceuticals Inc Antisense-forbindelser
US20100190837A1 (en) 2007-02-15 2010-07-29 Isis Pharmaceuticals, Inc. 5'-Substituted-2-F' Modified Nucleosides and Oligomeric Compounds Prepared Therefrom
EP2604283A1 (en) 2007-02-16 2013-06-19 KTB Tumorforschungsgesellschaft mbH Receptor And Antigen Targeted Prodrug
CA2678774A1 (en) 2007-03-01 2008-09-04 Advanced Vision Therapies, Inc. Treatment of diseases characterized by inflammation
EP2126085A2 (en) * 2007-03-02 2009-12-02 MDRNA, Inc. Nucleic acid compounds for inhibiting myc gene expression and uses thereof
AU2008242583B2 (en) 2007-04-23 2013-10-10 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Glycoconjugates of RNA interference agents
CA2688321A1 (en) 2007-05-30 2008-12-11 Isis Pharmaceuticals, Inc. N-substituted-aminomethylene bridged bicyclic nucleic acid analogs
DK2173760T4 (en) 2007-06-08 2016-02-08 Isis Pharmaceuticals Inc Carbocyclic bicyclic nukleinsyreanaloge
US20090004140A1 (en) 2007-06-26 2009-01-01 Yao-Ling Qiu 4-substituted pyrrolidine as anti-infectives
ES2376507T5 (es) 2007-07-05 2015-08-31 Isis Pharmaceuticals, Inc. Análogos de ácidos nucleicos bicíclicos 6-disustituidos
AU2008286771B2 (en) 2007-08-15 2013-08-15 Isis Pharmaceuticals, Inc. Tetrahydropyran nucleic acid analogs
US20090123928A1 (en) 2007-10-11 2009-05-14 The Johns Hopkins University Genomic Landscapes of Human Breast and Colorectal Cancers
US8546556B2 (en) 2007-11-21 2013-10-01 Isis Pharmaceuticals, Inc Carbocyclic alpha-L-bicyclic nucleic acid analogs
EP4074344A1 (en) 2007-12-04 2022-10-19 Arbutus Biopharma Corporation Targeting lipids
BRPI0907008A2 (pt) 2008-01-31 2015-07-07 Alnylam Pharmaceuticals Inc Métodos otimizados para liberação de dsrna alvejando o gene pcsk9
WO2009100320A2 (en) 2008-02-07 2009-08-13 Isis Pharmaceuticals, Inc. Bicyclic cyclohexitol nucleic acid analogs
US20110269814A1 (en) 2008-03-26 2011-11-03 Alnylam Pharamaceuticals, Inc. 2'-f modified rna interference agents
EP3604533A1 (en) 2008-04-11 2020-02-05 Arbutus Biopharma Corporation Site-specific delivery of nucleic acids by combining targeting ligands with endosomolytic components
WO2009143369A2 (en) 2008-05-22 2009-11-26 Isis Pharmaceuticals, Inc. Method of preparing nucleosides and analogs thereof without using chromatography
NZ591057A (en) 2008-07-10 2012-11-30 Az Univ Amsterdam Complement antagonists and uses thereof
EP2323667A4 (en) 2008-08-07 2012-07-25 Isis Pharmaceuticals Inc MODULATION OF TRANSTHYRETIN EXPRESSION BY TREATMENT OF CNS DISEASES
EP3587434A1 (en) 2008-09-23 2020-01-01 Alnylam Pharmaceuticals Inc. Chemical modifications of monomers and oligonucleotides with click components for conjugation with ligands
EP2356129B1 (en) 2008-09-24 2013-04-03 Isis Pharmaceuticals, Inc. Substituted alpha-l-bicyclic nucleosides
DK2361256T3 (da) 2008-09-24 2013-07-01 Isis Pharmaceuticals Inc Cyclohexenyl-nukleinsyreanaloger
CN103937793B (zh) 2008-10-20 2017-08-11 阿尔尼拉姆医药品有限公司 抑制运甲状腺素蛋白表达的组合物和方法
US20120059045A1 (en) 2008-10-24 2012-03-08 Isis Pharmaceuticals, Inc. Methods of using oligomeric compounds comprising 2'-substituted nucleosides
WO2010048585A2 (en) 2008-10-24 2010-04-29 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligomeric compounds and methods
EP3808177A1 (en) 2008-11-10 2021-04-21 Arbutus Biopharma Corporation Novel lipids and compositions for the delivery of therapeutics
CA3036963A1 (en) 2009-01-29 2010-08-05 Arbutus Biopharma Corporation Lipid formulations comprising cationic lipid and a targeting lipid comprising n-acetyl galactosamine for delivery of nucleic acid
CA2753975C (en) 2009-03-02 2017-09-26 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Nucleic acid chemical modifications
FR2943060B1 (fr) 2009-03-13 2013-01-04 Commissariat Energie Atomique Agents chelatants d'ions metalliques, leurs procedes de preparation et leurs applications
EP2416760A4 (en) 2009-05-05 2014-01-22 Tekmira Pharmaceuticals Corp LIPID COMPOSITIONS
PL3431076T3 (pl) 2009-06-10 2022-01-31 Arbutus Biopharma Corporation Ulepszona formulacja lipidowa
KR20120050429A (ko) 2009-06-15 2012-05-18 알닐람 파마슈티칼스 인코포레이티드 Ｐｃｓｋ9 유전자를 표적으로 하는 지질 제형된 ｄｓｒｎａ
WO2011005861A1 (en) 2009-07-07 2011-01-13 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleotide end caps
US8927513B2 (en) 2009-07-07 2015-01-06 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. 5′ phosphate mimics
WO2011017521A2 (en) 2009-08-06 2011-02-10 Isis Pharmaceuticals, Inc. Bicyclic cyclohexose nucleic acid analogs
WO2011038356A2 (en) 2009-09-25 2011-03-31 Johns Hopkins University Novel liver-targeting agents and their synthesis
WO2011047312A1 (en) 2009-10-16 2011-04-21 Glaxo Group Limited Hbv antisense inhibitors
TWI388338B (zh) 2009-10-26 2013-03-11 Iner Aec Executive Yuan 對聚合醣鏈進行放射標誌以作為肝受體造影劑之方法
TWI391144B (zh) 2009-10-26 2013-04-01 Iner Aec Executive Yuan 一種定量肝殘餘功能的檢驗方法與其新穎肝受體造影檢驗藥劑
WO2011072290A2 (en) 2009-12-11 2011-06-16 The Regents Of The University Of Michigan Targeted dendrimer-drug conjugates
WO2011100131A2 (en) 2010-01-28 2011-08-18 Alnylam Pharmacuticals, Inc. Monomers and oligonucleotides comprising cycloaddition adduct(s)
DK2539451T3 (da) 2010-02-24 2016-04-04 Arrowhead Res Corp Sammensætninger til målrettet tilførsel af siRNA
WO2011115818A1 (en) 2010-03-17 2011-09-22 Isis Pharmaceuticals, Inc. 5'-substituted bicyclic nucleosides and oligomeric compounds prepared therefrom
JP2013528665A (ja) 2010-03-26 2013-07-11 メルサナ セラピューティックス， インコーポレイテッド ポリヌクレオチドの送達のための修飾ポリマー、その製造方法、およびその使用方法
US20130109817A1 (en) 2010-03-26 2013-05-02 Mersana Therapeutics, Inc. Modified Polymers for Delivery of Polynucleotides, Method of Manufacture, and Methods of Use Thereof
US9102938B2 (en) 2010-04-01 2015-08-11 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. 2′ and 5′ modified monomers and oligonucleotides
US10913767B2 (en) 2010-04-22 2021-02-09 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleotides comprising acyclic and abasic nucleosides and analogs
WO2011133871A2 (en) 2010-04-22 2011-10-27 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. 5'-end derivatives
US8993738B2 (en) 2010-04-28 2015-03-31 Isis Pharmaceuticals, Inc. Modified nucleosides, analogs thereof and oligomeric compounds prepared therefrom
PT2563920T (pt) 2010-04-29 2017-05-26 Ionis Pharmaceuticals Inc Modulação da expressão de transtirretina
US20130236968A1 (en) 2010-06-21 2013-09-12 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Multifunctional copolymers for nucleic acid delivery
EP2616543A1 (en) 2010-09-15 2013-07-24 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. MODIFIED iRNA AGENTS
WO2012068187A1 (en) 2010-11-19 2012-05-24 Merck Sharp & Dohme Corp. Poly(amide) polymers for the delivery of oligonucleotides
JP2014504295A (ja) 2010-12-17 2014-02-20 アローヘッド リサーチ コーポレイション ｓｉＲＮＡ用ガラクトースクラスター−薬物動態調節剤標的指向部分
US8501930B2 (en) 2010-12-17 2013-08-06 Arrowhead Madison Inc. Peptide-based in vivo siRNA delivery system
EP2658981B1 (en) 2010-12-29 2016-09-28 F.Hoffmann-La Roche Ag Small molecule conjugates for intracellular delivery of nucleic acids
EP3067421B1 (en) 2011-02-08 2018-10-10 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Oligomeric compounds comprising bicyclic nucleotides and uses thereof
CN107012144A (zh) 2011-04-01 2017-08-04 Ionis制药公司 信号转导及转录激活蛋白3(stat3)表达的调节
SI3505528T1 (sl) 2011-04-21 2021-04-30 Glaxo Group Limited Modulacija izražanja virusa hepatitisa B (HBV)
TW201303013A (zh) 2011-04-21 2013-01-16 Isis Pharmaceuticals Inc Ｂ型肝炎病毒（ｈｂｖ）表現之調節
EP2723758B1 (en) 2011-06-21 2018-06-20 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Angiopoietin-like 3 (angptl3) irna compostions and methods of use thereof
KR102540778B1 (ko) 2011-06-21 2023-06-07 알닐람 파마슈티칼스 인코포레이티드 아포리포단백질 c-iii(apoc3) 유전자의 발현 억제를 위한 조성물 및 방법
US8932572B2 (en) 2011-08-26 2015-01-13 Arrowhead Madison Inc. Poly(vinyl ester) polymers for in vivo nucleic acid delivery
DK2751270T3 (en) 2011-08-29 2018-10-29 Ionis Pharmaceuticals Inc OLIGOMER-CONJUGATE COMPLEXES AND THEIR USE
DK3301177T3 (da) * 2011-11-18 2020-06-15 Alnylam Pharmaceuticals Inc Rnai-midler, sammensætninger og fremgangsmåder til anvendelse deraf til behandling af transthyretin (ttr)-forbundne sygdomme
JP2015507924A (ja) 2012-02-08 2015-03-16 アイシス ファーマシューティカルズ， インコーポレーテッド 第ｖｉｉ因子の発現を調節するための方法と組成物
EP3336189A1 (en) 2012-04-20 2018-06-20 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Oligomeric compounds comprising bicyclic nucleotides and uses thereof
WO2013165816A2 (en) 2012-05-02 2013-11-07 Merck Sharp & Dohme Corp. SHORT INTERFERING NUCLEIC ACID (siNA) COMPOSITIONS
TWI595885B (zh) 2012-05-02 2017-08-21 喜納製藥公司 包含四ｇａｌｎａｃ之新穎結合物及傳送寡核苷酸之方法
US20160002624A1 (en) 2012-05-17 2016-01-07 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense oligonucleotide compositions
US9695418B2 (en) 2012-10-11 2017-07-04 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Oligomeric compounds comprising bicyclic nucleosides and uses thereof
EP2920304B1 (en) 2012-11-15 2019-03-06 Roche Innovation Center Copenhagen A/S Oligonucleotide conjugates
WO2014118272A1 (en) 2013-01-30 2014-08-07 Santaris Pharma A/S Antimir-122 oligonucleotide carbohydrate conjugates
EP2951305B1 (en) 2013-01-30 2018-08-15 F.Hoffmann-La Roche Ag Lna oligonucleotide carbohydrate conjugates
EA201591707A1 (ru) * 2013-03-14 2016-03-31 Элнилэм Фармасьютикалз, Инк. КОМПОЗИЦИИ иРНК КОМПОНЕНТА КОМПЛЕМЕНТА C5 И СПОСОБЫ ИХ ПРИМЕНЕНИЯ
EP2992098B1 (en) 2013-05-01 2019-03-27 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for modulating hbv and ttr expression
EP3730619A1 (en) * 2013-06-21 2020-10-28 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for modulation of target nucleic acids
SG10201908122XA (en) 2013-06-27 2019-10-30 Roche Innovation Ct Copenhagen As Antisense oligomers and conjugates targeting pcsk9
DE102013106985A1 (de) * 2013-07-03 2015-01-22 Osram Oled Gmbh Optoelektronische Bauelementevorrichtung und Verfahren zum Herstellen einer optoelektronischen Bauelementevorrichtung
EP3019200B1 (en) * 2013-07-11 2022-03-23 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleotide-ligand conjugates and process for their preparation
CN105744959B (zh) 2013-09-13 2020-12-01 Ionis制药公司 补体因子b的调节剂
WO2015089368A2 (en) 2013-12-12 2015-06-18 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Complement component irna compositions and methods of use thereof
KR102369736B1 (ko) 2014-05-01 2022-03-02 아이오니스 파마수티컬즈, 인코포레이티드 보체 인자 b 발현을 조절하기 위한 조성물 및 방법

Also Published As

Publication number Publication date
US20230057718A1 (en) 2023-02-23
BR112016022593B1 (pt) 2022-04-26
PL3137596T3 (pl) 2019-11-29
AU2015252858B2 (en) 2020-12-10
MX2016014294A (es) 2017-02-02
EA036496B1 (ru) 2020-11-17
US10280423B2 (en) 2019-05-07
WO2015168635A2 (en) 2015-11-05
HUE046272T2 (hu) 2020-02-28
PT3137596T (pt) 2019-09-27
LT3137596T (lt) 2019-09-10
KR102369736B1 (ko) 2022-03-02
CN106232804A (zh) 2016-12-14
AU2015252858A1 (en) 2016-10-06
EP3608406A1 (en) 2020-02-12
US20230357776A1 (en) 2023-11-09
CN110724687B (zh) 2023-10-13
PE20190626A1 (es) 2019-04-26
WO2015168635A3 (en) 2016-01-07
NZ724366A (en) 2023-10-27
US20170159055A1 (en) 2017-06-08
EP3137596A2 (en) 2017-03-08
RS59182B1 (sr) 2019-10-31
IL247883B (en) 2021-03-25
NZ763982A (en) 2023-11-24
CA2943894A1 (en) 2015-11-05
RU2016147047A (ru) 2018-06-01
PE20170010A1 (es) 2017-03-04
EP3137596B1 (en) 2019-07-10
DK3137596T3 (da) 2019-09-02
JP2017514489A (ja) 2017-06-08
PH12016502062A1 (en) 2016-12-19
EP4219718A3 (en) 2024-01-10
BR112016022593A2 (pt) 2017-10-10
CR20200228A (es) 2020-07-09
EP4219718A2 (en) 2023-08-02
EP3608406B1 (en) 2023-02-15
KR20160147892A (ko) 2016-12-23
CL2016002764A1 (es) 2017-12-29
EA201692204A1 (ru) 2017-04-28
RU2016147047A3 (es) 2018-10-26
ES2745825T3 (es) 2020-03-03
CN106232804B (zh) 2019-10-25
JP7001663B2 (ja) 2022-02-04
SG10201809953QA (en) 2018-12-28
CR20160554A (es) 2017-03-07
HRP20191664T1 (hr) 2019-12-13
AU2015252858C1 (en) 2021-09-16
SI3137596T1 (sl) 2019-08-30
CN110724687A (zh) 2020-01-24
IL247883A0 (en) 2016-11-30
IL271659A (en) 2020-02-27
CL2018001996A1 (es) 2019-03-08
JP2020058368A (ja) 2020-04-16
DOP2016000291A (es) 2017-02-15
US11732265B2 (en) 2023-08-22
PL3608406T3 (pl) 2023-05-22
SG11201608502TA (en) 2016-11-29
JP6637442B2 (ja) 2020-01-29
US20200048638A1 (en) 2020-02-13
RU2701645C2 (ru) 2019-09-30
EP3137596A4 (en) 2017-09-20
UA121656C2 (uk) 2020-07-10

Similar Documents

Publication Publication Date Title
ES2941742T3 (es) Composiciones y procedimientos para modular la expresión del factor B del complemento
US11312964B2 (en) Compositions and methods for modulating growth hormone receptor expression
ES2885174T3 (es) Composiciones y métodos para modular expresión de TTR
EP3137091B1 (en) Conjugates of modified antisense oligonucleotides and their use for modulating pkk expression
AU2015252895B2 (en) Compositions and methods for modulating angiopoietin-like 3 expression
ES2745758T3 (es) Moduladores del factor B del complemento