CN106232804A - 用于调节补体因子b表达的组合物和方法 - Google Patents

用于调节补体因子b表达的组合物和方法 Download PDF

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Abstract

本实施方案提供通过向受试者施用补体因子B(CFB)特异性抑制剂用于治疗、预防或减轻与补体替代途径失调相关的疾病的方法、化合物以及组合物。

Description

用于调节补体因子B表达的组合物和方法
序列表
本申请连同序列表一起以电子格式提交。序列表提供为在2015年4月28日创建的名称为BIOL0251WOSEQ_ST25.txt的文件，所述文件的大小为204kb。电子格式的序列表中的信息以引用的方式整体并入本文。
领域
本实施方案提供通过向受试者施用补体因子B(CFB)特异性抑制剂用于治疗、预防或减轻与补体替代途径失调相关的疾病的方法、化合物以及组合物。
背景
补体系统是涉及裂解异物细胞、增强抗原吞噬作用、凝集承载抗原的试剂以及吸引巨噬细胞和嗜中性白细胞的宿主先天免疫系统的一部分。补体系统分为三个激活途径：经典途径、凝集素途径以及替代途径，所述激活途径集中在组分C3处以产生称为C3转化酶的酶复合物，所述C3转化酶使C3裂解成C3a和C3b。C3b与由CFB调节的C3转化酶结合并且导致产生使C5裂解成C5a和C5b的C5转化酶，所述C5转化酶激活膜攻击途径，导致形成包含组分C5b、C6、C7、C8以及C9的膜攻击复合物(MAC)。膜攻击复合物(MAC)形成跨膜通道并且破坏靶细胞的磷脂双层，导致细胞裂解。
在稳态中，由于通过自发水解C3且产生C3b(其生成C5转化酶)来激活替代途径，所以替代途径以低“空转”水平连续地被激活。
发明内容
补体系统调节先天免疫并且在对损伤的正常炎症反应中起到重要作用，但是补体系统的失调可引起严重损伤。激活补体替代途径超出其组成性“空转”水平可导致不可制止性机能亢进以及显示为补体失调的疾病。
本文提供的某些实施方案涉及通过施用补体因子B(CFB)特异性抑制剂治疗、预防或减轻与受试者补体替代途径失调相关的疾病的方法。本文提供的某些实施方案涉及通过向受试者施用CFB特异性抑制剂抑制CFB在具有与补体替代途径失调相关的疾病或处于患有与补体替代途径失调相关的疾病的风险的受试者中的表达的方法。在某些实施方案中，减少或抑制C3沉积物在具有与补体替代途径失调相关的疾病或处于患有与补体替代途径失调相关的疾病的风险的受试者眼睛中的积累的方法包括向受试者施用CFB特异性抑制剂。在若干实施方案中，减少或抑制C3沉积物在具有与补体替代途径失调相关的疾病或处于患有与补体替代途径失调相关的疾病的风险的受试者肾中的积累的方法包括向受试者施用CFB特异性抑制剂。
详述
要理解，以上概述和以下详述都仅是示例性和解释性的，并且不限制要求保护的本发明。在本文中，除非另外确切说明，否则单数的使用包括复数。如本文所使用，除非另外说明，否则“或”的使用意指“和/或”。此外，术语“包括(including)”以及其他形式诸如“包括(includes)”和“包括(included)”的使用不是限制性的。另外，除非另外确切说明，否则术语诸如“元件”或“组分”既涵盖包含一个单元的元件和组分，又涵盖包含多于一个子单元的元件和组分。
本文所用的章节标题仅出于组织目的，并且不应解释为限制所述主题。本申请中引用的所有文献或文献的部分(包括但不限于专利、专利申请、文章、书籍及论文)关于本文所论述的文献部分明确地以引用方式特此并入以及以引用方式特此整体并入。
除非提供确切的定义，否则结合本文所描述的分析化学、合成有机化学和医药化学所使用的命名法和这些化学领域的工序和技术为本领域熟知和常用的那些。标准技术可用于化学合成和化学分析。某些此类技术和工序可见于“Carbohydrate Modifications inAntisense Research”，Sangvi和Cook编，美国化学学会，Washington D.C.,1994；“Remington's Pharmaceutical Sciences”，Mack Publishing Co.,Easton,Pa.，第21版，2005；和“Antisense Drug Technology,Principles,Strategies,and Applications”，Stanley T.Crooke编，CRC Press,Boca Raton,Florida；和Sambrook等,“MolecularCloning,A laboratory Manual,”第2版，Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989，所述文献出于任何目的而以引用方式并入本文。如果允许，本公开通篇提及的所有专利、申请、已公布的申请和其他出版物以及其他数据以引用的方式整体并入本文。
除非另外指出，否则以下术语具有以下含义：
“2’-F核苷”是指包含在2’位上包含氟的糖的核苷。除非另外指出，否则2’-F核苷中的氟在核糖位上(替代天然核糖的OH)。
“2'-O-甲氧基乙基”(又为2'-MOE和2’-O(CH2)2-OCH3)是指呋喃糖环的2'位上的O-甲氧基-乙基修饰。2’-O-甲氧基乙基修饰的糖是修饰的糖。
“2'-MOE核苷”(又为2'-O-甲氧基乙基核苷)意谓包含2'-MOE修饰的糖部分的核苷。
“2'-取代的核苷”意谓在呋喃糖基环的2'位上包含除H或OH以外的取代基的核苷。在某些实施方案中，2'-取代的核苷包括具有双环糖修饰的核苷。
“3’靶位点”是指与特定反义化合物的最3’核苷酸互补的靶核酸的核苷酸。
“5’靶位点”是指与特定反义化合物的最5’核苷酸互补的靶核酸的核苷酸。
“5-甲基胞嘧啶”意谓用连接至5位的甲基修饰的胞嘧啶。5-甲基胞嘧啶是修饰的核碱基。
“约”意指在值的±10％以内。例如，如果指出“化合物影响CFB至少约70％的抑制”，那么表示60％至80％范围内的CFB水平被抑制。
“施用(Administration)”或“施用(administering)”是指将本文所提供的反义化合物引入受试者以进行其预期功能的路线。可以使用的施用路线的实例包括但不限于肠胃外施用，诸如皮下、静脉内或肌肉内注射或输注。
如本文所使用的“烷基”意指含有最多至二十四个碳原子的饱和直链或支链烃基。烷基的实例包括但不限于甲基、乙基、丙基、丁基、异丙基、正己基、辛基、癸基、十二烷基等。烷基通常包括1至约24个碳原子，更通常地1至约12个碳原子(C1-C12烷基)，其中1至约6个碳原子更优选。
如本文所使用，“烯基”意指含有最多至二十四个碳原子并且具有至少一个碳-碳双键的直链或支链链烃基。烯基的实例包括但不限于乙烯基、丙烯基、丁烯基、1-甲基-2-丁烯-1-基、二烯如1,3-丁二烯等。烯基通常包括2至约24个碳原子，更通常地2至约12个碳原子，其中2至约6个碳原子更优选。如本文所使用的烯基可任选地包括一个或多个另外的取代基。
如本文所使用，“炔基”意指含有最多至二十四个碳原子并且具有至少一个碳-碳三键的直链或支链烃基。炔基的实例包括但不限于乙炔基、1-丙炔基、1-丁炔基等。炔基通常包括2至约24个碳原子，更通常地2至约12个碳原子，其中2至约6个碳原子更优选。如本文所使用的炔基可任选地包括一个或多个另外的取代基。
如本文所使用，“酰基”意指通过从有机酸中去除羟基形成的基团并且具有通式-C(O)-X，其中X通常为脂肪族、脂环族或芳香族。实例包括脂肪族羰基、芳香族羰基、脂肪族磺酰基、芳香族亚硫酰基、脂肪族亚硫酰基、芳香族磷酸酯、脂肪族磷酸酯等。如本文所使用的酰基可任选地包括另外的取代基。
如本文所使用，“脂环族”意指其中环为脂肪族的环系统。环系统可包含一个或多个环，其中至少一个环为脂肪族。优选的脂环族包括其中具有约5至约9个碳原子的环。如本文所使用的脂环族可任选地包括另外的取代基。
如本文所使用，“脂肪族”意指含有最多至二十四个碳原子的直链或支链烃基，其中任何两个碳原子之间的饱和度为单键、双键或三键。脂肪族基团优选含有1至约24个碳原子，更通常地1至约12个碳原子，其中1至约6个碳原子更优选。脂肪族基团的直链或支链可被一个或多个杂原子中断，所述杂原子包括氮、氧、硫和磷。被杂原子中断的所述脂肪族基团包括但不限于聚烷氧基，如聚亚烷基二醇、聚胺和聚亚胺。如本文所使用的脂肪族基团可任选地包括另外的取代基。
如本文所使用，“烷氧基”意指在烷基与氧原子之间形成的基团，其中氧原子用来将烷氧基连接至母体分子。烷氧基的实例包括但不限于甲氧基、乙氧基、丙氧基、异丙氧基、正丁氧基、仲丁氧基、叔丁氧基、正戊氧基、新戊氧基、正己氧基等。如本文所使用的烷氧基可任选地包括另外的取代基。
如本文所使用，“氨基烷基”意指氨基取代的C1-C12烷基。基团的烷基部分与母体分子形成共价键。氨基可位于任何位置并且氨基烷基可在烷基和/或氨基部分上被另外的取代基取代。
如本文所使用，“芳烷基”和“芳基烷基”意指共价连接至C1-C12烷基的芳香族基团。所得到的芳烷基(或芳基烷基)的烷基部分与母体分子形成共价键。实例包括但不限于苯甲基、苯乙基等。如本文所使用的芳烷基可任选地包括连接至烷基、芳基或形成基团的这两个基团的另外的取代基。
如本文所使用，“芳基”和“芳香族”意指具有一个或多个芳环的单环或多环碳环系统基团。芳基的实例包括但不限于苯基、萘基、四氢萘基、茚满基、茚基等。优选的芳环系统在一个或多个环中具有约5至约20个碳原子。如本文所使用的芳基可任选地包括另外的取代基。
“改善”是指相关疾病、病症或病状的至少一种指标、体征或症状的减轻。在某些实施方案中，改善包括延缓或减缓病状或疾病的一个或多个指标的进展。指标的严重性可通过本领域的技术人员已知的主观或客观度量来确定。
“动物”是指人类或非人类动物，包括但不限于小鼠、大鼠、家兔、狗、猫、猪，以及非人灵长类，包括但不限于猴子和猩猩。
“反义活性”意指可归因于反义化合物与其靶核酸的杂交的任何可检测或可测量的活性。在某些实施方案中，反义活性为靶核酸或由这种靶核酸所编码的蛋白质的量或表达的减少。
“反义化合物”意谓能够与目标核酸经由氢键进行杂交的低聚化合物。反义化合物的实例包括单链和双链化合物，诸如反义寡核苷酸、siRNA、shRNA、ssRNA及占位型化合物。
“反义抑制”意谓在与目标核酸互补的反义化合物存在下目标核酸水平相较于在不存在反义化合物下的目标核酸水平有所减少。
“反义机制”为所有涉及化合物与目标核酸的杂交的机制，其中杂交的结果或效果为目标降解或目标占位，伴随阻碍涉及例如转录或剪接的细胞机构。
“反义寡核苷酸”意指具有允许与靶核酸的对应区或片段杂交的核碱基序列的单链寡核苷酸。
“碱基互补性”是指反义寡核苷酸的核碱基与目标核酸中的相应核碱基进行准确碱基配对(即杂交)的能力，且由相应核碱基之间的沃森-克里克(Watson-Crick)、霍氏(Hoogsteen)或反霍氏氢键结合介导。
“双环糖部分”意指包含4至7元环的修饰的糖部分(包括但不限于呋喃糖基)，所述糖部分包含连接4至7元环的两个原子以形成第二个环，从而产生双环结构的桥联。在某些实施方案中，4至7元环为糖环。在某些实施方案中，4至7元环为呋喃糖基。在某些所述实施方案中，桥联连接了呋喃糖基的2’-碳和4’-碳。
“双环核酸”或“BNA”或“BNA核苷”意谓在核苷糖单位的4'位与2'位之间具有连接两个碳原子，从而形成双环糖的桥的核酸单体。此类双环糖的实例包括但不限于A)α-L-亚甲氧基(4’-CH2-O-2’)LNA；(B)β-D-亚甲氧基(4’-CH2-O-2’)LNA；(C)亚乙氧基(4’-(CH2)2-O-2’)LNA；(D)氨氧基(4’-CH2-O-N(R)-2’)LNA；及(E)氧氨基(4’-CH2-N(R)-O-2’)LNA，如下文所示。
如本文所使用，LNA化合物包括但不限于在糖的4'位与2'位之间具有至少一个桥的化合物，其中所述桥中的每一个独立地包含1个或2至4个独立地选自以下的连接基团：-[C(R1)(R2)]n-、-C(R1)＝C(R2)-、-C(R1)＝N-、-C(＝NR1)-、-C(＝O)-、-C(＝S)-、-O-、-Si(R1)2-、-S(＝O)x-以及-N(R1)-；其中：x为0、1或2；n为1、2、3或4；R1和R2各自独立地为H、保护基、羟基、C1-C12烷基、取代的C1-C12烷基、C2-C12烯基、取代的C2-C12烯基、C2-C12炔基、取代的C2-C12炔基、C5-C20芳基、取代的C5-C20芳基、杂环基、取代的杂环基、杂芳基、取代的杂芳基、C5-C7脂环基、取代的C5-C7脂环基、卤素、OJ1、NJ1J2、SJ1、N3、COOJ1、酰基(C(＝O)-H)、取代的酰基、CN、磺酰基(S(＝O)2-J1)或磺酸氧基(S(＝O)-J1)；并且J1和J2各自独立地为H、C1-C12烷基、取代的C1-C12烷基、C2-C12烯基、取代的C2-C12烯基、C2-C12炔基、取代的C2-C12炔基、C5-C20芳基、取代的C5-C20芳基、酰基(C(＝O)-H)、取代的酰基、杂环基、取代的杂环基、C1-C12氨基烷基、取代的C1-C12氨基烷基或保护基。
LNA的定义内所涵盖的4'-2'桥连基团的实例包括但不限于下式中的一种：-[C(R1)(R2)]n-、-[C(R1)(R2)]n-O-、-C(R1R2)-N(R1)-O-或–C(R1R2)-O-N(R1)-。此外，LNA定义中所涵盖的其他桥连基团为4'-CH2-2'、4'-(CH2)2-2'、4'-(CH2)3-2'、4'-CH2-O-2'、4'-(CH2)2-O-2'、4'-CH2-O-N(R1)-2'以及4'-CH2-N(R1)-O-2'-桥，其中R1和R2各自独立地为H、保护基或C1-C12烷基。
根据本发明的LNA的定义内还包括如下LNA，其中核糖基糖环的2'-羟基连接至糖环的4'碳原子，从而形成亚甲氧基(4’-CH2-O-2’)桥而形成双环糖部分。桥还可为连接2'氧原子与4'碳原子的亚甲基(-CH2-)，对于其使用术语亚甲氧基(4’-CH2-O-2’)LNA。此外，在于这个位置上具有亚乙基桥连基团的双环糖部分的情况下，使用术语亚乙氧基(4’-CH2CH2-O-2’)LNA。在本文所用的LNA的定义内还涵盖α-L-亚甲氧基(4’-CH2-O-2’)，其为亚甲氧基(4’-CH2-O-2’)LNA的异构体。
“帽结构”或“端帽部分”意指已在反义化合物的任一末端并入的化学修饰。
“碳水化合物”意指天然存在的碳水化合物、修饰的碳水化合物或碳水化合物衍生物。
“碳水化合物聚簇”意指具有连接至支架或接头基团的一个或多个碳水化合物残基的化合物。(参见针对碳水化合物聚簇的实例，例如Maier等,“Synthesis of AntisenseOligonucleotides Conjugated to a Multivalent Carbohydrate Cluster forCellular Targeting”，Bioconju gate Chemistry,2003,(14):18-29)，所述文献以引用方式全部并入本文，或Rensen等“Design and Synthesis of Novel N-Acetylgalactosamine-Terminated Glycolipids for Targeting of Lipoproteins to the HepaticAsiaglycoprotein Receptor”，J.Med.Chem.2004,(47):5798-5808)。
“碳水化合物衍生物”意指可使用碳水化合物作为起始材料或中间体合成的任何化合物。
“cEt”或“限制性乙基”意指包含连接4'-碳与2'-碳的桥的双环糖部分，其中所述桥具有下式：4’-CH(CH3)-O-2’。
“化学修饰”意指当与天然存在的对应物相比时化合物的化学差异。寡核苷酸的化学修饰包括核苷修饰(包括糖部分修饰和核碱基修饰)和核苷间键联修饰。就寡核苷酸而言，化学修饰不包括仅在核碱基序列上的差异。
“可裂解键”意指能够被分裂的任何化学键。在某些实施方案中，可裂解键选自以下：酰胺、聚酰胺、酯、醚、磷酸二酯的一个或两个酯、磷酸酯、氨基甲酸酯、二硫化物或肽。
“可裂解部分”意指能够在生理条件下分裂的键或基团。在某些实施方案中，可裂解部分在细胞或亚细胞区室(如溶酶体)内部裂解。在某些实施方案中，可裂解部分通过内源性酶如核酸酶裂解。在某些实施方案中，可裂解部分包含具有一个、两个、三个、四个或多于四个可裂解键的原子基团。
“缀合物”或“缀合物基团”意指结合至寡核苷酸或低聚化合物的原子或原子基团。通常，缀合物基团改变它们所连接至的化合物的一种或多种性质，包括但不限于药效学、药物代谢动力学、结合、吸收、细胞分布、细胞摄取、电荷和/或清除性质。
在缀合物基团背景下的“缀合物接头”或“接头”意指包含任何原子或原子基团的缀合物基团的一部分并且其(1)将寡核苷酸共价连接至缀合物基团的另一个部分或(2)共价连接缀合物基团的两个或更多个部分。
缀合物基团在本文中示为基团，提供用于形成至低聚化合物如反义寡核苷酸的共价连接的键。在某些实施方案中，低聚化合物上的连接点为低聚化合物的3’末端核苷的3'-羟基的3'-氧原子。在某些实施方案中，低聚化合物上的连接点为低聚化合物的5’末端核苷的5'-羟基的5'-氧原子。在某些实施方案中，用于形成至低聚化合物的连接的键为可裂解键。在某些所述实施方案中，所述可裂解键构成可裂解部分的全部或部分。
在某些实施方案中，缀合物基团包含可裂解部分(例如，可裂解键或可裂解核苷)和碳水化合物聚簇部分，如GalNAc聚簇部分。此碳水化合物聚簇部分包含：靶向部分和任选地缀合物接头。在某些实施方案中，通过配体的数目和身份来鉴定碳水化合物聚簇部分。例如，在某些实施方案中，碳水化合物聚簇部分包含3个GalNAc基团并且命名为“GalNAc3”。在某些实施方案中，碳水化合物聚簇部分包含4个GalNAc基团并且命名为“GalNAc4”。本文描述了具体的碳水化合物聚簇部分(具有具体系链、支链基团和缀合物接头基团)并且由后面跟着下标“a”的罗马数字命名。因此“GalNac3-1a”是指具有3个GalNac基团和明确鉴定的系链、支链基团和连接基团的缀合物基团的具体碳水化合物聚簇部分。所述碳水化合物聚簇片段通过可裂解部分(如可裂解键或可裂解核苷)连接至低聚化合物。
“缀合物化合物”意指适合用作缀合物基团的任何原子、原子基团或连接的原子基团。在某些实施方案中，缀合物化合物可具有或赋予一种或多种性质，包括但不限于药效学、药物代谢动力学、结合、吸收、细胞分布、细胞摄取、电荷和/或清除性质。
“限制性乙基核苷”(又为cEt核苷)意指包含含有4’-CH(CH3)-O-2’桥的双环糖部分的核苷。
“补体因子B(CFB)”意指CFB的任何核酸或蛋白质。“CFB核酸”意指编码CFB的任何核酸。例如，在某些实施方案中，CFB核酸包括编码CFB的DNA序列、从编码CFB的DNA(包括含有内含子和外显子的基因组DNA)转录的RNA序列(包括非蛋白质编码(即非编码)的RNA序列)以及编码CFB的mRNA序列。“CFB mRNA”意指编码CFB蛋白质的mRNA。
“CFB特异性抑制剂”意指能够在分子水平上特异性抑制CFB RNA和/或CFB蛋白质表达或活性的任何试剂。例如，CFB特异性抑制剂包括核酸(包括反义化合物)、肽、抗体、小分子和其他能够抑制CFB RNA和/或CFB蛋白的表达的试剂。
“化学上不同的区”是指以某种方式化学上不同于同一反义化合物的另一区的反义化合物的区。例如，具有2’-O-甲氧基乙基核苷酸的区化学上不同于具有无2’-O-甲氧基乙基修饰的核苷酸的区。
“嵌合反义化合物”意谓具有至少2个化学相异区的反义化合物，每一位置具有多个亚单位。
“互补性”意指第一核酸与第二核酸的核碱基之间配对的能力。
“包含(comprise)”、“包含(comprises)”及“包含(comprising)”应理解为意指包括所述步骤或要素或步骤或要素的群组，但不排除任何其他步骤或要素或步骤或要素的群组。
“连续核碱基”意指彼此紧邻的核碱基。
“脱氧核糖核苷”是指包含2'-H呋喃糖部分的核苷，如在天然存在的脱氧核糖核苷(DNA)中发现。在某些实施方案中，2’-脱氧核苷可包含修饰的核碱基或可包含RNA核碱基(例如，尿嘧啶)。
“脱氧核糖核苷酸”意指在核苷酸的糖部分的2’位具有氢的核苷酸。脱氧核糖核苷酸可用多种取代基中的任一种进行修饰。
“设计”或“被设计来”是指设计与所选核酸分子特异性杂交的低聚化合物的方法。
“不同修饰的”意指彼此不同的化学修饰或化学取代基，包括不存在修饰。因此，例如，MOE核苷和未修饰的DNA核苷为“不同修饰的”，即使DNA核苷为未修饰的。同样，DNA和RNA为“不同修饰的”，即使这两者均为天然存在的未修饰的核苷。相同但包含不同核碱基的核苷不为不同修饰的。例如，包含2’-OMe修饰的糖和未修饰的腺嘌呤核碱基的核苷和包含2’-OMe修饰的糖和未修饰的胸腺嘧啶核碱基的核苷不为不同修饰的。
“双链”是指彼此杂交的两个分离的低聚化合物。所述双链化合物可在一个或两个链的一个或两个末端上具有一个或多个或非杂交的核苷(突出端)和/或一个或多个内部非杂交核苷(错配)，前提是存在足够互补性，以维持在生理学相关条件下的杂交。
“有效量”意指足以在需要活性药剂的个体中实现所需生理学结果的药剂的量。有效量可在个体间变化，取决于待治疗个体的健康和身体条件、待治疗个体的分类群、组合物的制剂、个体的医疗条件的评价以及其他相关因素。
“功效”意谓产生所需效果的能力。
“表达”包括基因密码信息借以转化成细胞中存在且起作用的结构的所有功能。所述结构包括但不限于转录及转译的产物。
“完全互补”或“100％互补”意谓第一核酸的每个核碱基在第二核酸中皆具有互补核碱基。在某些实施方案中，第一核酸是反义化合物且靶核酸是第二核酸。
“呋喃糖基”是指包含5元环的结构，所述5元环包含四个碳原子和一个氧原子。
“缺口聚物(Gapmer)”意指其中具有多个支持RNA酶H裂解的核苷的内部区域位于具有一个或多个核苷的外部区域之间的嵌合反义化合物，其中包含内部区域的核苷化学上不同于包含外部区域的核苷。内部区域可称为“缺口区”且外部区域可称为“翼区”。
“卤基”和“卤素”意指选自氟、氯、溴以及碘的原子。
“杂芳基”和“杂芳香族”意指包含单环或多环芳环、环系统或稠环系统的基团，其中至少一个环为芳香族的并且包括一个或多个杂原子。杂芳基还意图包括稠环系统，所述稠环系统包括其中一个或多个稠环不含有杂原子的系统。杂芳基通常包括一个选自硫、氮或氧的环原子。杂芳基的实例包括但不限于吡啶基、吡嗪基、嘧啶基、吡咯基、吡唑基、咪唑基、噻唑基、噁唑基、异噁唑基、噻二唑基、噁二唑基、噻吩基、呋喃基、喹啉基、异喹啉基、苯并咪唑基、苯并噁唑基、喹喔啉基等。杂芳基可直接或通过连接部分如脂肪族基团或杂原子连接至母体分子。如本文所使用的杂芳基可任选地包括另外的取代基。
“杂交”意指互补核酸分子的退火。在某些实施方案中，互补核酸分子包括但不限于反义化合物与核酸目标。在某些实施方案中，互补核酸分子包括但不限于反义寡核苷酸与核酸目标。
“鉴定具有疾病、病症和/或病状或处于患有疾病、病症和/或病状的风险的动物”意指鉴定已被诊断为疾病、病症和/或病状的动物或鉴定易发展疾病、病症和/或病状的动物。此鉴定可通过包括评估个体的医疗史和标准临床测试或评估的任何方法来实现。
“紧邻”意指在紧邻的要素之间没有插入要素。
“个体”意谓选用于治疗或疗法的人或非人动物。
“抑制表达或活性”是指降低、阻断表达或活性且不一定指示完全消除表达或活性。
“核苷间键联”是指核苷之间的化学键。
“核苷间中性连接基团”意指直接连接两个核苷的中性连接基团。
“核苷间磷连接基团”意指直接连接两个核苷的磷连接基团。
“延长的”反义寡核苷酸为相对于本文所公开的反义寡核苷酸具有一个或多个额外核苷的反义寡核苷酸。
“键联基序”意指寡核苷酸或其区中的键联修饰的模式。这样的寡核苷酸的核苷可为修饰或未修饰的。除非另外指出，否则本文中仅描述键联的基序意图为键联基序。因此，在所述情况下，核苷不受限制。
“连接的脱氧核苷”意谓由磷酸酯连接形成核苷酸的被脱氧核糖取代的核酸碱基(A、G、C、T、U)。
“连接的核苷”意谓由核苷间键连接在一起的相邻核苷。
“锁核酸核苷”或“LNA”意指包含双环糖部分的核苷，所述双环糖部分包含4’-CH2-O-2’桥。
“错配”或“非互补核碱基”是指当第一核酸的核碱基不能与第二或靶核酸的对应核碱基配对的情况。
“修饰的核苷间键联”是指来自天然存在核苷间键(即，磷酸二酯核苷间键)的取代或任何变化。
“修饰的核碱基”意谓任何除腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤、胸腺嘧啶或尿嘧啶以外的核碱基。“未修饰的核碱基”意谓嘌呤碱基腺嘌呤(A)和鸟嘌呤(G)，以及嘧啶碱基胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)及尿嘧啶(U)。
“修饰的核苷”意谓独立地具有修饰的糖部分和/或修饰的核碱基的核苷。
“修饰的核苷酸”意指单独地具有修饰的糖部分、修饰的核苷间键联或修饰的核碱基的核苷酸。
“修饰的寡核苷酸”意谓包含至少一个修饰的核苷间键、修饰的糖和/或修饰的核酸碱基的寡核苷酸。
“修饰的糖”意谓与天然糖部分相比存在取代和/或任何变化。
“调节”是指改变或调整细胞、组织、器官或生物体的特征。例如，调节CFB的mRNA意指增加或降低细胞、组织、器官或生物体中的CFB mRNA和/或CFB蛋白质的水平。“调节剂”实现细胞、组织、器官或生物体的改变。例如，CFB反义化合物可以为降低细胞、组织、器官或生物体中的CFB mRNA和/或CFB蛋白质的量的调节剂。
“单体”是指寡聚物的单个单元。单体包括但不限于天然存在或修饰的核苷及核苷酸。
术语“单环系统或多环系统”意指包括选自单一或多环基团环系统的所有环系统，其中环稠合或连接并且意图包括单独地选自以下的单环系统和混合环系统：脂肪族、脂环族、芳基、杂芳基、芳烷基、芳基烷基、杂环、杂芳基、杂芳香族和杂芳基烷基。所述单环结构和多环结构可含有环，所述环各自具有相同水平的饱和或各自独立地具有不同程度的饱和，包括完全饱和、部分饱和或完全不饱和。每个环可包含选自C、N、O和S的环原子以产生杂环以及仅包含C环原子的环，所述环可存在于混合基序中，例如像苯并咪唑，其中一个环仅具有碳环原子并且稠环具有两个氮原子。单环系统或多环系统可进一步被取代基取代，例如像具有两个连接至环中的一个的＝O基团的邻苯二甲酰亚胺。单环系统或多环系统可使用各种策略连接至母体分子，如直接通过环原子、通过多个环原子稠合、通过取代基或通过双官能连接部分。
“基序”意谓反义化合物中未修饰的及修饰的核苷的型态。
“天然糖部分”意谓见于DNA(2'-H)或RNA(2'-OH)中的糖部分。
“天然存在的核苷间键联”意指3'至5'磷酸二酯键联。
“中性连接基团”意指不带电荷的连接基团。中性连接基团包括但不限于磷酸三酯、甲基膦酸酯、MMI(-CH2-N(CH3)-O-)、酰胺-3(-CH2-C(＝O)-N(H)-)、酰胺-4(-CH2-N(H)-C(＝O)-)、甲乙缩醛(-O-CH2-O-)以及硫代甲乙缩醛(-S-CH2-O-)。另外的中性连接基团包括包含硅氧烷(二烷基硅氧烷)的非离子键联、羧酸盐酯、羧酰胺、硫醚、磺酸酯以及磺酰胺(参见例如：Carbohydrate Modifications in Antisense Research；Y.S.Sanghvi和P.D.Cook编，ACS Symposium Series 580；第3和4章，(第40-65页))。另外的中性连接基团包括包含混合的N、O、S和CH2组成部分的非离子键联。
“非互补核碱基”是指一对彼此不形成氢键或以其它方式支持杂交的核碱基。
“非核苷间中性连接基团”意指不直接连接两个核苷的中性连接基团。在某些实施方案中，非核苷间中性连接基团将核苷连接至除核苷之外的基团。在某些实施方案中，非核苷间中性连接基团连接两个基团，所述两个基团中没有一个为核苷。
“非核苷间磷连接基团”意指不直接连接两个核苷的磷连接基团。在某些实施方案中，非核苷间磷连接基团将核苷连接至除核苷之外的基团。在某些实施方案中，非核苷间磷连接基团连接两个基团，所述两个基团中没有一个为核苷。
“核酸”是指由单体核苷酸组成的分子。核酸包括但不限于核糖核酸(RNA)、脱氧核糖核酸(DNA)、单链核酸以及双链核酸。
“核碱基”意指能够与另一核酸的碱基配对的杂环部分。
“核碱基互补性”是指能够与另一核碱基进行碱基配对的核碱基。例如，在DNA中，腺嘌呤(A)与胸腺嘧啶(T)互补。例如，在RNA中，腺嘌呤(A)与尿嘧啶(U)互补。在某些实施方案中，互补核碱基是指反义化合物中能够与其目标核酸的核碱基进行碱基配对的核碱基。例如，如果反义化合物的某个位置上的核碱基能够与靶核酸的某个位置上的核碱基氢键合，那么寡核苷酸与靶核酸之间的氢键合的位置被认为在所述核碱基对上是互补的。
“核碱基修饰基序”意指沿着寡核苷酸的核碱基的修饰的模式。除非另外指出，否则核碱基修饰基序不依赖于核碱基序列。
“核碱基序列”意谓连续核碱基的次序，而与任何糖、键和/或核碱基修饰无关。
“核苷”意谓连接至糖的核碱基。
“核苷模拟物”包括用于在低聚化合物的一个或多个位置处置换糖或糖和碱基且不一定要置换键联的那些结构：例如像具有吗啉代、环己烯基、环己基、四氢吡喃基、双环或三环糖模拟物例如非呋喃糖单元的核苷模拟物。核苷酸模拟物包括用于在低聚化合物的一个或多个位置处置换核苷及键联的那些结构，如肽核酸或N-吗啉基(由-N(H)-C(＝O)-O-或其他非磷酸二酯键联连接的N-吗啉基)。糖替代物与稍微更广泛的术语核苷模拟物重叠，但仅旨在指示置换糖单位(呋喃糖环)。本文提供的四氢吡喃基环说明糖替代物的一个实例，其中呋喃糖糖基已被四氢吡喃基环系统置换。“模拟物”是指替代糖、核碱基和/或核苷间键的基团。一般而言，使用模拟物替代糖或糖-核苷间键组合，且维持核碱基以便与所选目标杂交。
“核苷基序”意指寡核苷酸或其区中的核苷修饰的模式。这样的寡核苷酸的键联可为修饰或未修饰的。除非另外指出，否则本文中仅描述核苷的基序意图为核苷基序。因此，在所述情况下，键联不受限制。
“核苷酸”意指具有共价连接至核苷的糖部分的磷酸酯基团的核苷。
“低聚化合物”意谓具有连接的单体亚单位且能够与核酸分子的至少一个区杂交的聚合物。
“寡核苷”意谓核苷间键不含磷原子的寡核苷酸。
“寡核苷酸”意指连接核苷的聚合物，每个核苷可被修饰或未修饰，彼此无关。
“肠胃外施用”意指通过注射或输注来施用。肠胃外施用包括皮下施用、静脉内施用、肌肉内施用、动脉内施用、腹膜内施用或颅内施用，例如鞘内或脑室内施用。
“药物组合物”意指适用于对个体施用的物质的混合物。例如，药物组合物可包含一种或多种活性剂和无菌水溶液。
“药学上可接受的盐”意指反义化合物的生理上和药学上可接受的盐，即，保留母体化合物的所需生物活性且不会赋予不希望的毒理学效应的盐。
“硫代磷酸酯键联”意指核苷之间的键联，其中磷酸二酯键通过用硫原子置换非桥联氧原子之一而被修饰。硫代磷酸酯键联为修饰的核苷间键联。
“磷连接基团”意指包含磷原子的连接基团。磷连接基团包括但不限于具有下式的基团：
其中：
Ra和Rd各自独立地为O、S、CH2、NH或NJ1，其中J1为C1-C6烷基或取代的C1-C6烷基；
Rb为O或S；
Rc为OH、SH、C1-C6烷基、取代的C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、取代的C1-C6烷氧基、氨基或取代的氨基；并且
J1为Rb为O或S。
磷连接基团包括但不限于磷酸二酯、硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、膦酸酯、氨基磷酸酯、硫代氨基磷酸酯、硫羰基烷基膦酸酯、磷酸三酯、硫羰基烷基磷酸三酯以及硼烷磷酸酯。
“部分”意谓核酸中确定数目的连续(即连接的)核碱基。在某些实施方案中，部分是靶核酸的限定数目的连续核碱基。在某些实施方案中，部分是反义化合物的限定数目的连续核碱基。
“预防”是指延迟或阻止疾病、病症或病状的发作、发展或进程达数分钟到无限期的时间段。预防还意指降低发展疾病、病症或病状的风险。
“前药”意指化合物的无活性或具有较小活性的形式，当向受试者施用时，所述前药被代谢形成活性或更具活性的化合物(例如，药物)。
“防治有效量”是指向动物提供防治或预防益处的药剂的量。
“保护基”意指本领域技术人员已知的任何化合物或保护基。保护基的非限制性实例可见于"Protective Groups in Organic Chemistry",T.W.Greene、P.G.M.Wuts,ISBN0-471-62301-6,John Wiley&Sons,Inc,New York，所述参考文献以引用的方式整体并入本文。
“区”被定义为目标核酸中具有至少一个可鉴别的结构、功能或特征的部分。
“核糖核苷酸”意谓在核苷酸的糖部分的2'位上具有羟基的核苷酸。核糖核苷酸可被多种取代基中的任一种修饰。
“基于RISC的反义化合物”意指反义化合物，其中反义化合物的至少一些反义活性可归因于RNA诱导的沉默复合物(RISC)。
“基于RNA酶H的反义化合物”意指反义化合物，其中反义化合物的至少一些反义活性可归因于反义化合物与靶核酸的杂交和随后的RNA酶H对靶核酸的裂解。
“区段”被定义为目标核酸内的区的较小部分或子部分。
“单独区”意指寡核苷酸的部分，其中任何相邻部分的化学修饰或化学修饰的基序包括至少一个差异以允许单独的区彼此区分。
“序列基序”意指沿着寡核苷酸或其部分布置的核碱基的模式。除非另外指出，否则序列基序不依赖于化学修饰并且因此可具有化学修饰的任何组合，包括没有化学修饰。
“副作用”意指可归因于治疗的非所需作用的生理疾病和/或病状。在某些实施方案中，副作用包括注射部位反应、肝功能测试异常、肾功能异常、肝毒性、肾毒性、中枢神经系统异常、肌病和不适。举例来说，血清中的转氨酶水平升高可指示肝中毒或肝功能异常。举例来说，胆红素增加可指示肝中毒或肝功能异常。
本文所用的“位点”被定义为目标核酸内的独特核碱基位置。
“减缓进展”意谓减慢所述疾病的发展。
“可特异性杂交”是指反义化合物在反义寡核苷酸与目标核酸之间具有足够的互补度以在需要特异性结合的条件下，即在体内测定及治疗性治疗的状况下于生理条件下诱导所需作用，而对非目标核酸展现极小的影响或无影响。“严格杂交条件”或“严格条件”是指低聚化合物与其目标序列杂交，但与极少数目的其他序列杂交的条件。
“受试者”意谓选用于治疗或疗法的人或非人动物。
“取代基(substituent)”和“取代基(substituent group)”意指置换指定母体化合物的原子或基团的原子或基团。例如，修饰核苷的取代基为不同于在天然存在的核苷中发现的原子或基团的任何原子或基团(例如，修饰的2’-取代基为在核苷的2’-位上的除H或OH之外的任何原子或基团)。取代基可为保护或未保护的。在某些实施方案中，本公开的化合物在母体化合物的一个位置上或多于一个位置上具有取代基。取代基还可进一步被其他取代基取代并且可直接连接或通过连接基团如烷基或烃基连接至母体化合物。
同样，如本文所使用，关于化学官能团的“取代基”意指不同于通常存在于指定官能团中的原子或原子基团的原子或原子基团。在某些实施方案中，取代基替代官能团的氢原子(例如，在某些实施方案中，取代的甲基的取代基为替代未取代的甲基的一个氢原子的除氢之外的原子或基团)。除非另外指出，否则适合用作取代基的基团包括但不限于卤素、羟基、烷基、烯基、炔基、酰基羧基(-C(O)O-Raa)、脂族基团、脂环基、烷氧基、取代的氧基(-O-Raa)、芳基、芳烷基、杂环基、杂芳基、杂芳基烷基、氨基亚氨基(＝NRbb)、酰胺基(或N(Rbb)C(O)Raa)、叠氮基(-N3)、硝基(-NO2)、氰基(-CN)、脲基(carbamido)(OC(O)N(Rbb)(Rcc)或)、脲基硫脲基胍基 脒基(或N(Rbb)C(＝NRbb)(Raa))、巯基(-SRbb)、亚硫酰基(-S(O)Rbb)、磺酰基(-S(O)2Rbb)以及氨磺酰基(-S(O)2N(Rbb)(Rcc)或)。其中每个Raa、Rbb和Rcc独立地为H、任选连接的化学官能团或另外的具有优选列表的取代基，所述列表包括但不限于烷基、烯基、炔基、脂肪族、烷氧基、酰基、芳基、芳烷基、杂芳基、脂环族、杂环和杂芳基烷基。本文描述的化合物内的所选取代基以一定递归度存在。
“取代的糖部分”意指并非天然存在的糖部分的呋喃糖基。取代的糖部分包括但不限于在2’-位、3’-位、5’-位和/或4’-位上包含取代基的呋喃糖基。某些取代的糖部分为双环糖部分。
“糖部分”是指核苷的天然存在的糖部分或修饰的糖部分。
“糖基序”意指寡核苷酸或其区中的糖修饰的模式。
术语“糖替代物”意指如下结构：所述结构不包含呋喃糖基并且能够置换核苷的天然存在的糖部分，使得所得到的核苷亚基能够连接在一起和/或与其他核苷连接以形成能够与互补的低聚化合物杂交的低聚化合物。所述结构包括如下环：所述环包含与呋喃糖基(例如，4元环、6元环或7元环)不同的原子数；用非氧原子(例如，碳、硫或氮)替代呋喃糖基的氧；或原子数和氧替代均有所变化。所述结构还可包含对应于对于取代的糖部分所描述的那些取代的取代(例如，任选包含另外取代基的6元碳环双环糖替代物)。糖替代物还包括更复杂的糖代替物(例如，肽核酸的非环系统)。糖替代物包括但不限于吗啉代、环己烯基和环己六醇。
“目标”是指需要调节的蛋白质。
“目标基因”是指编码目标的基因。
“靶向”意谓设计及选择将与目标核酸特异性杂交并诱导所需效应的反义化合物的过程。
“目标核酸”、“目标RNA”、“目标RNA转录物”及“核酸目标”都意谓能够由反义化合物靶向的核酸。
“目标区”意谓目标核酸中由一种或多种反义化合物所靶向的部分。
“靶区段”意指反义化合物所靶向的靶核酸的核苷酸的序列。“5’靶位点”是指靶区段的最5’核苷酸。“3’靶位点”是指靶区段的最3’核苷酸。
“端基”意指连接至寡核苷酸的3’末端或5’末端中的任一或两者的一个或多个原子。在某些实施方案中，端基为缀合物基团。在某些实施方案中，端基包含一个或多个端基核苷。
“末端核苷间键联”意指寡核苷酸或其限定区的最后两个核苷之间的键联。
“治疗有效量”意指向个体提供治疗益处的药剂的量。
“治疗”是指向动物施用药物组合物以便实现动物的疾病、病症或病状的改变或改善。在某些实施方案中，可向动物施用一种或多种药物组合物。
“未修饰的”核碱基意谓嘌呤碱基腺嘌呤(A)和鸟嘌呤(G)，以及嘧啶碱基胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)及尿嘧啶(U)。
“未修饰的核苷酸”意谓由天然存在的核碱基、糖部分及核苷间键构成的核苷酸。在某些实施方案中，未修饰的核苷酸为RNA核苷酸(即，β-D-核糖核苷)或DNA核苷酸(即，β-D-脱氧核糖核苷)。
某些实施方案
某些实施方案提供用于补体因子B(CFB)表达的方法、化合物以及组合物。
某些实施方案提供靶向CFB核酸的反义化合物。在某些实施方案中，CFB核酸为GENBANK登录号NM_001710.5(以SEQ ID NO:1形式并入本文)、从核苷酸31852000至31861000截短的GENBANK登录号NT_007592.15(以SEQ ID NO:2形式并入本文)、从核苷酸536000至545000截短的GENBANK登录号NW_001116486.1(以SEQ ID NO:3形式并入本文)、GENBANK登录号XM_001113553.2(以SEQ ID NO:4形式并入本文)或GENBANK登录号NM_008198.2(以SEQ ID NO:5形式并入本文)中所列的序列。
某些实施方案提供包含修饰寡核苷酸和缀合物基团的化合物，其中修饰寡核苷酸由10至30个连接核苷组成并且具有包含SEQ ID NO:6-808的核碱基序列中的任一个的至少8个连续核碱基的核碱基序列。
某些实施方案提供包含修饰寡核苷酸和缀合物基团的化合物，其中修饰寡核苷酸由10至30个连接核苷组成并且具有包含SEQ ID NO:6-808的核碱基序列中的任一个的至少9个连续核碱基的核碱基序列。
某些实施方案提供包含修饰寡核苷酸和缀合物基团的化合物，其中修饰寡核苷酸由10至30个连接核苷组成并且具有包含SEQ ID NO:6-808的核碱基序列中的任一个的至少10个连续核碱基的核碱基序列。
某些实施方案提供包含修饰寡核苷酸和缀合物基团的化合物，其中修饰寡核苷酸由10至30个连接核苷组成并且具有包含SEQ ID NO:6-808的核碱基序列中的任一个的至少11个连续核碱基的核碱基序列。
某些实施方案提供包含修饰寡核苷酸和缀合物基团的化合物，其中修饰寡核苷酸由10至30个连接核苷组成并且具有包含SEQ ID NO:6-808的核碱基序列中的任一个的至少12个连续核碱基的核碱基序列。
某些实施方案提供包含修饰寡核苷酸和缀合物基团的化合物，其中修饰寡核苷酸由10至30个连接核苷组成并且具有包含SEQ ID NO:6-808的任一个的核碱基序列的核碱基序列。
某些实施方案提供包含修饰寡核苷酸和缀合物基团的化合物，其中修饰寡核苷酸由SEQ ID NO:6-808的任一个的核碱基序列组成。
某些实施方案提供包含修饰寡核苷酸和缀合物基团的化合物，其中修饰寡核苷酸由在SEQ ID NO:1的以下各项核碱基内互补的10至30个连接核苷组成：30-49、48-63、150-169、151-170、152-171、154-169、154-173、156-171、156-175、157-176、158-173、158-177、480-499、600-619、638-657、644-663、738-757、1089-1108、1135-1154、1141-1160、1147-1166、1150-1169、1153-1172、1159-1178、1162-1181、1165-1184、1171-1186、1171-1190、1173-1188、1173-1192、1175-1190、1175-1194、1177-1196、1183-1202、1208-1227、1235-1254、1298-1317、1304-1323、1310-1329、1316-1335、1319-1338、1322-1341、1328-1347、1349-1368、1355-1374、1393-1412、1396-1415、1399-1418、1405-1424、1421-1440、1621-1640、1646-1665、1646-1665、1647-1666、1689-1708、1749-1768、1763-1782、1912-1931、2073-2092、2085-2104、2166-2185、2172-2191、2189-2208、2191-2210、2193-2212、2195-2210、2195-2214、2196-2215、2197-2212、2197-2216、2202-2221、2223-2238、2223-2242、2225-2240、2226-2245、2227-2242、2227-2246、2238-2257、2241-2260、2267-2286、2361-2380、2388-2407、2397-2416、2448-2467、2453-2472、2455-2474、2457-2472、2457-2476、2459-2474、2459-2478、2461-2476、2461-2480、2532-2551、2550-2569、2551-2566、2551-2570、2552-2568、2552-2570、2552-2571、2553-2568、2553-2570、2553-2571、2553-2572、2554-2571、2554-2572、2554-2573、2555-2570、2555-2572、2555-2574、2556-2573、2556-2574、2556-2575、2557-2573、2557-2574、2557-2575、2557-2576、2558-2575、2558-2576、2558-2577、2559-2576、2559-2577、2559-2578、2560-2577、2560-2578、2560-2579、2561-2576、2561-2578、2561-2579、2561-2580、2562-2577、2562-2579、2562-2581、2563-2578、2563-2580、2563-2582、2564-2581、2564-2583、2565-2584、2566-2583、2566-2585、2567-2582、2567-2584、2567-2586、2568-2583、2568-2585、2568-2587、2569-2586、2569-2588、2570-2585、2570-2587、2570-2589、2571-2586、2571-2588、2571-2590、2572-2589、2572-2590、2572-2591、2573-2590、2573-2592、2574-2590、2574-2591、2574-2593、2575-2590、2575-2591、2575-2592、2575-2594、2576-2593、2576-2595、2577-2594、2577-2595、2577-2596、2578-2594、2578-2596、2578-2597、2579-2598、2580-2596、2580-2597、2580-2598、2580-2599、2581-2597、2581-2598、2581-2599、2581-2600、2582-2598、2582-2599、2582-2600、2582-2601、2583-2599、2583-2600、2583-2601、2583-2602、2584-2600、2584-2601、2584-2602、2584-2603、2585-2601、2585-2603、2585-2604、2586-2601、2586-2602、2586-2604、2586-2605、2587-2602、2587-2603、2587-2605、2587-2606、2588-2603、2588-2604、2588-2605、2588-2606、2588-2607、2589-2604、2589-2605、2589-2606、2589-2607、2589-2608、2590-2605、2590-2606、2590-2607、2590-2608、2590-2609、2590-2609、2591-2607、2591-2608、2591-2609、2591-2610、2592-2607、2592-2608、2592-2609、2592-2610、2592-2611、2593-2608、2593-2609、2593-2610、2593-2612、2594-2609、2594-2610、2594-2611、2594-2612、2594-2613、2595-2610、2595-2611、2595-2612、2595-2613、2595-2614、2596-2611、2596-2612、2596-2613、2596-2614、2596-2615、2597-2612、2597-2612、2597-2613、2597-2614、2597-2615、2597-2616、2598-2613、2598-2614、2598-2615、2598-2616、2598-2617、2599-2614、2599-2615、2599-2616、2599-2617、2599-2618、2600-2615、2600-2616、2600-2617、2600-2618、2600-2619、2601-2616、2601-2617、2601-2618、2601-2619、2601-2620、2602-2617、2602-2618、2602-2619、2602-2620、2602-2621、2603-2618、2603-2619、2603-2620、2603-2621、2603-2622、2604-2619、2604-2620、2604-2621、2604-2622、2604-2623、2605-2620、2605-2621、2605-2622、2605-2623、2605-2624、2606-2621、2606-2622、2606-2623、2606-2624、2606-2625、2607-2622、2607-2623、2607-2624、2607-2625、2607-2626、2608-2623、2608-2624、2608-2625、2608-2626、2608-2627、2609-2624、2609-2625、2609-2626、2609-2627、2609-2628、2610-2625、2610-2626、2610-2627、2610-2628、2610-2629、2611-2626、2611-2627、2611-2628、2611-2629、2611-2630、2612-2627、2612-2628、2612-2629、2612-2630、2612-2631、2613-2628、2613-2629、2613-2630、2613-2631、2614-2629、2614-2630、2614-2631、2615-2630、2615-2631或2616-2631，并且其中所述修饰寡核苷酸与SEQ ID NO:1至少85％、至少90％、至少95％或100％互补。
某些实施方案提供包含修饰寡核苷酸和缀合物基团的化合物，其中修饰寡核苷酸由10至30个连接核苷组成，所述连接核苷具有包含与SEQ ID NO:1的以下各项核碱基的等长部分互补的至少8个连续核碱基的部分的核碱基序列：30-49、48-63、150-169、151-170、152-171、154-169、154-173、156-171、156-175、157-176、158-173、158-177、480-499、600-619、638-657、644-663、738-757、1089-1108、1135-1154、1141-1160、1147-1166、1150-1169、1153-1172、1159-1178、1162-1181、1165-1184、1171-1186、1171-1190、1173-1188、1173-1192、1175-1190、1175-1194、1177-1196、1183-1202、1208-1227、1235-1254、1298-1317、1304-1323、1310-1329、1316-1335、1319-1338、1322-1341、1328-1347、1349-1368、1355-1374、1393-1412、1396-1415、1399-1418、1405-1424、1421-1440、1621-1640、1646-1665、1646-1665、1647-1666、1689-1708、1749-1768、1763-1782、1912-1931、2073-2092、2085-2104、2166-2185、2172-2191、2189-2208、2191-2210、2193-2212、2195-2210、2195-2214、2196-2215、2197-2212、2197-2216、2202-2221、2223-2238、2223-2242、2225-2240、2226-2245、2227-2242、2227-2246、2238-2257、2241-2260、2267-2286、2361-2380、2388-2407、2397-2416、2448-2467、2453-2472、2455-2474、2457-2472、2457-2476、2459-2474、2459-2478、2461-2476、2461-2480、2532-2551、2550-2569、2551-2566、2551-2570、2552-2568、2552-2570、2552-2571、2553-2568、2553-2570、2553-2571、2553-2572、2554-2571、2554-2572、2554-2573、2555-2570、2555-2572、2555-2574、2556-2573、2556-2574、2556-2575、2557-2573、2557-2574、2557-2575、2557-2576、2558-2575、2558-2576、2558-2577、2559-2576、2559-2577、2559-2578、2560-2577、2560-2578、2560-2579、2561-2576、2561-2578、2561-2579、2561-2580、2562-2577、2562-2579、2562-2581、2563-2578、2563-2580、2563-2582、2564-2581、2564-2583、2565-2584、2566-2583、2566-2585、2567-2582、2567-2584、2567-2586、2568-2583、2568-2585、2568-2587、2569-2586、2569-2588、2570-2585、2570-2587、2570-2589、2571-2586、2571-2588、2571-2590、2572-2589、2572-2590、2572-2591、2573-2590、2573-2592、2574-2590、2574-2591、2574-2593、2575-2590、2575-2591、2575-2592、2575-2594、2576-2593、2576-2595、2577-2594、2577-2595、2577-2596、2578-2594、2578-2596、2578-2597、2579-2598、2580-2596、2580-2597、2580-2598、2580-2599、2581-2597、2581-2598、2581-2599、2581-2600、2582-2598、2582-2599、2582-2600、2582-2601、2583-2599、2583-2600、2583-2601、2583-2602、2584-2600、2584-2601、2584-2602、2584-2603、2585-2601、2585-2603、2585-2604、2586-2601、2586-2602、2586-2604、2586-2605、2587-2602、2587-2603、2587-2605、2587-2606、2588-2603、2588-2604、2588-2605、2588-2606、2588-2607、2589-2604、2589-2605、2589-2606、2589-2607、2589-2608、2590-2605、2590-2606、2590-2607、2590-2608、2590-2609、2590-2609、2591-2607、2591-2608、2591-2609、2591-2610、2592-2607、2592-2608、2592-2609、2592-2610、2592-2611、2593-2608、2593-2609、2593-2610、2593-2612、2594-2609、2594-2610、2594-2611、2594-2612、2594-2613、2595-2610、2595-2611、2595-2612、2595-2613、2595-2614、2596-2611、2596-2612、2596-2613、2596-2614、2596-2615、2597-2612、2597-2612、2597-2613、2597-2614、2597-2615、2597-2616、2598-2613、2598-2614、2598-2615、2598-2616、2598-2617、2599-2614、2599-2615、2599-2616、2599-2617、2599-2618、2600-2615、2600-2616、2600-2617、2600-2618、2600-2619、2601-2616、2601-2617、2601-2618、2601-2619、2601-2620、2602-2617、2602-2618、2602-2619、2602-2620、2602-2621、2603-2618、2603-2619、2603-2620、2603-2621、2603-2622、2604-2619、2604-2620、2604-2621、2604-2622、2604-2623、2605-2620、2605-2621、2605-2622、2605-2623、2605-2624、2606-2621、2606-2622、2606-2623、2606-2624、2606-2625、2607-2622、2607-2623、2607-2624、2607-2625、2607-2626、2608-2623、2608-2624、2608-2625、2608-2626、2608-2627、2609-2624、2609-2625、2609-2626、2609-2627、2609-2628、2610-2625、2610-2626、2610-2627、2610-2628、2610-2629、2611-2626、2611-2627、2611-2628、2611-2629、2611-2630、2612-2627、2612-2628、2612-2629、2612-2630、2612-2631、2613-2628、2613-2629、2613-2630、2613-2631、2614-2629、2614-2630、2614-2631、2615-2630、2615-2631或2616-2631，并且其中所述修饰寡核苷酸与SEQID NO:1至少85％、至少90％、至少95％或100％互补。
某些实施方案提供包含修饰寡核苷酸和缀合物基团的化合物，其中修饰寡核苷酸由在SEQ ID NO:2的以下各项核碱基内互补的10至30个连接核苷组成：1608-1627、1685-1704、1686-1705、1751-1770、1769-1784、1871-1890、1872-1891、1873-1892、1875-1890、1875-1894、1877-1892、1877-1896、1878-1897、1879-1894、1879-1898、2288-2307、2808-2827、2846-2865、2852-2871、2946-2965、3773-3792、3819-3838、3825-3844、3831-3850、3834-3853、3837-3856、3843-3862、4151-4166、4151-4170、4153-4172、4159-4178、4184-4203、4211-4230、4609-4628、4612-4631、4615-4634、4621-4640、4642-4661、4648-4667、4686-4705、4689-4708、4692-4711、4698-4717、4714-4733、5270-5289、5295-5314、5296-5315、5830-5849、5890-5909、5904-5923、6406-6425、6662-6681、6674-6693、6954-6973、6960-6979、6977-6996、6979-6998、6981-7000、6983-6998、6983-7002、6984-7003、6985-7000、6985-7004、6990-7009、7122-7141、7125-7144、7151-7170、7353-7372、7362-7381、7683-7702、7688-7707、7690-7709、7692-7707、7692-7711、7694-7709、7694-7713、7696-7711、7696-7715、7767-7786、7785-7804、7786-7801、7787-7803、7787-7805、7787-7806、7788-7803、7788-7805、7788-7806、7788-7807、7789-7806、7789-7807、7789-7808、7790-7805、7790-7807、7790-7809、7791-7808、7791-7809、7791-7810、7792-7808、7792-7809、7792-7810、7792-7811、7793-7810、7793-7811、7793-7812、7794-7811、7794-7812、7794-7813、7795-7812、7795-7813、7795-7814、7796-7811、7796-7813、7796-7814、7796-7815、7797-7812、7797-7814、7797-7816、7798-7813、7798-7815、7798-7817、7799-7816、7799-7818、7800-7819、7801-7818、7801-7820、7802-7817、7802-7819、7802-7821、7803-7818、7803-7820、7803-7822、7804-7821、7804-7823、7805-7820、7805-7822、7805-7824、7806-7821、7806-7823、7806-7825、7807-7824、7807-7825、7807-7826、7808-7825、7808-7827、7809-7825、7809-7826、7809-7828、7810-7825、7810-7826、7810-7827、7810-7829、7811-7828、7811-7830、7812-7829、7812-7830、7812-7831、7813-7829、7813-7831、7813-7832、7814-7833、7815-7831、7815-7832、7815-7833、7815-7834、7816-7832、7816-7833、7816-7834、7816-7835、7817-7833、7817-7834、7817-7835、7817-7836、7818-7834、7818-7835、7818-7836、7818-7837、7819-7835、7819-7836、7819-7837、7819-7838、7820-7836、7820-7838、7820-7839、7821-7836、7821-7837、7821-7839、7821-7840、7822-7837、7822-7838、7822-7840、7822-7841、7823-7838、7823-7839、7823-7839、7823-7840、7823-7841、7823-7842、7824-7839、7824-7840、7824-7840、7824-7841、7824-7842、7824-7843、7825-7840、7825-7841、7825-7842、7825-7843、7825-7844、7826-7842、7826-7843、7826-7844、7826-7845、7827-7842、7827-7843、7827-7844、7827-7845、7827-7846、7828-7843、7828-7844、7828-7845、7828-7847、7829-7844、7829-7845、7829-7846、7829-7847、7829-7848、7830-7845、7830-7846、7830-7847、7830-7848、7830-7849、7831-7846、7831-7847、7831-7848、7831-7849、7831-7850、7832-7847、7832-7848、7832-7849、7832-7850、7832-7851、7833-7848、7833-7849、7833-7850、7833-7851、7833-7852、7834-7849、7834-7850、7834-7851、7834-7852、7834-7853、7835-7850、7835-7851、7835-7852、7835-7853、7835-7854、7836-7851、7836-7852、7836-7853、7836-7854、7836-7855、7837-7852、7837-7853、7837-7854、7837-7855、7837-7856、7838-7853、7838-7854、7838-7855、7838-7856、7838-7857、7839-7854、7839-7855、7839-7856、7839-7857、7839-7858、7840-7855、7840-7856、7840-7857、7840-7858、7840-7859、7841-7856、7841-7857、7841-7858、7841-7859、7841-7860、7842-7857、7842-7858、7842-7859、7842-7860、7842-7861、7843-7858、7843-7859、7843-7860、7843-7861、7843-7862、7844-7859、7844-7860、7844-7861、7844-7862、7845-7860、7845-7861、7845-7862、7846-7861或7846-7862，并且其中所述修饰寡核苷酸与SEQ ID NO:2至少85％、至少90％、至少95％或100％互补。
某些实施方案提供包含修饰寡核苷酸和缀合物基团的化合物，其中修饰寡核苷酸由10至30个连接核苷组成，所述连接核苷具有包含与SEQ ID NO:2的以下各项核碱基的等长部分互补的至少8个连续核碱基的部分的核碱基序列：1608-1627、1685-1704、1686-1705、1751-1770、1769-1784、1871-1890、1872-1891、1873-1892、1875-1890、1875-1894、1877-1892、1877-1896、1878-1897、1879-1894、1879-1898、2288-2307、2808-2827、2846-2865、2852-2871、2946-2965、3773-3792、3819-3838、3825-3844、3831-3850、3834-3853、3837-3856、3843-3862、4151-4166、4151-4170、4153-4172、4159-4178、4184-4203、4211-4230、4609-4628、4612-4631、4615-4634、4621-4640、4642-4661、4648-4667、4686-4705、4689-4708、4692-4711、4698-4717、4714-4733、5270-5289、5295-5314、5296-5315、5830-5849、5890-5909、5904-5923、6406-6425、6662-6681、6674-6693、6954-6973、6960-6979、6977-6996、6979-6998、6981-7000、6983-6998、6983-7002、6984-7003、6985-7000、6985-7004、6990-7009、7122-7141、7125-7144、7151-7170、7353-7372、7362-7381、7683-7702、7688-7707、7690-7709、7692-7707、7692-7711、7694-7709、7694-7713、7696-7711、7696-7715、7767-7786、7785-7804、7786-7801、7787-7803、7787-7805、7787-7806、7788-7803、7788-7805、7788-7806、7788-7807、7789-7806、7789-7807、7789-7808、7790-7805、7790-7807、7790-7809、7791-7808、7791-7809、7791-7810、7792-7808、7792-7809、7792-7810、7792-7811、7793-7810、7793-7811、7793-7812、7794-7811、7794-7812、7794-7813、7795-7812、7795-7813、7795-7814、7796-7811、7796-7813、7796-7814、7796-7815、7797-7812、7797-7814、7797-7816、7798-7813、7798-7815、7798-7817、7799-7816、7799-7818、7800-7819、7801-7818、7801-7820、7802-7817、7802-7819、7802-7821、7803-7818、7803-7820、7803-7822、7804-7821、7804-7823、7805-7820、7805-7822、7805-7824、7806-7821、7806-7823、7806-7825、7807-7824、7807-7825、7807-7826、7808-7825、7808-7827、7809-7825、7809-7826、7809-7828、7810-7825、7810-7826、7810-7827、7810-7829、7811-7828、7811-7830、7812-7829、7812-7830、7812-7831、7813-7829、7813-7831、7813-7832、7814-7833、7815-7831、7815-7832、7815-7833、7815-7834、7816-7832、7816-7833、7816-7834、7816-7835、7817-7833、7817-7834、7817-7835、7817-7836、7818-7834、7818-7835、7818-7836、7818-7837、7819-7835、7819-7836、7819-7837、7819-7838、7820-7836、7820-7838、7820-7839、7821-7836、7821-7837、7821-7839、7821-7840、7822-7837、7822-7838、7822-7840、7822-7841、7823-7838、7823-7839、7823-7839、7823-7840、7823-7841、7823-7842、7824-7839、7824-7840、7824-7840、7824-7841、7824-7842、7824-7843、7825-7840、7825-7841、7825-7842、7825-7843、7825-7844、7826-7842、7826-7843、7826-7844、7826-7845、7827-7842、7827-7843、7827-7844、7827-7845、7827-7846、7828-7843、7828-7844、7828-7845、7828-7847、7829-7844、7829-7845、7829-7846、7829-7847、7829-7848、7830-7845、7830-7846、7830-7847、7830-7848、7830-7849、7831-7846、7831-7847、7831-7848、7831-7849、7831-7850、7832-7847、7832-7848、7832-7849、7832-7850、7832-7851、7833-7848、7833-7849、7833-7850、7833-7851、7833-7852、7834-7849、7834-7850、7834-7851、7834-7852、7834-7853、7835-7850、7835-7851、7835-7852、7835-7853、7835-7854、7836-7851、7836-7852、7836-7853、7836-7854、7836-7855、7837-7852、7837-7853、7837-7854、7837-7855、7837-7856、7838-7853、7838-7854、7838-7855、7838-7856、7838-7857、7839-7854、7839-7855、7839-7856、7839-7857、7839-7858、7840-7855、7840-7856、7840-7857、7840-7858、7840-7859、7841-7856、7841-7857、7841-7858、7841-7859、7841-7860、7842-7857、7842-7858、7842-7859、7842-7860、7842-7861、7843-7858、7843-7859、7843-7860、7843-7861、7843-7862、7844-7859、7844-7860、7844-7861、7844-7862、7845-7860、7845-7861、7845-7862、7846-7861或7846-7862，并且其中所述修饰寡核苷酸的核碱基序列与SEQ ID NO:2至少85％、至少90％、至少95％或100％互补。
在某些实施方案中，反义化合物或寡核苷酸靶向CFB核酸的区。在某些实施方案中，所述靶向CFB核酸的区的化合物或寡核苷酸具有与所述区的等长核碱基部分互补的连续核碱基部分。例如，所述部分可为具有至少8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个或16个连续核碱基且与本文所示的区的等长部分互补的部分。在某些实施方案中，化合物包含缀合物和修饰寡核苷酸或者由缀合物和修饰寡核苷酸组成，所述修饰寡核苷酸靶向SEQID NO:1的任何下列核苷酸区：30-49、48-63、150-169、151-170、152-171、154-169、154-173、156-171、156-175、157-176、158-173、158-177、480-499、600-619、638-657、644-663、738-757、1089-1108、1135-1154、1141-1160、1147-1166、1150-1169、1153-1172、1159-1178、1162-1181、1165-1184、1171-1186、1171-1190、1173-1188、1173-1192、1175-1190、1175-1194、1177-1196、1183-1202、1208-1227、1235-1254、1298-1317、1304-1323、1310-1329、1316-1335、1319-1338、1322-1341、1328-1347、1349-1368、1355-1374、1393-1412、1396-1415、1399-1418、1405-1424、1421-1440、1621-1640、1646-1665、1646-1665、1647-1666、1689-1708、1749-1768、1763-1782、1912-1931、2073-2092、2085-2104、2166-2185、2172-2191、2189-2208、2191-2210、2193-2212、2195-2210、2195-2214、2196-2215、2197-2212、2197-2216、2202-2221、2223-2238、2223-2242、2225-2240、2226-2245、2227-2242、2227-2246、2238-2257、2241-2260、2267-2286、2361-2380、2388-2407、2397-2416、2448-2467、2453-2472、2455-2474、2457-2472、2457-2476、2459-2474、2459-2478、2461-2476、2461-2480、2532-2551、2550-2569、2551-2566、2551-2570、2552-2568、2552-2570、2552-2571、2553-2568、2553-2570、2553-2571、2553-2572、2554-2571、2554-2572、2554-2573、2555-2570、2555-2572、2555-2574、2556-2573、2556-2574、2556-2575、2557-2573、2557-2574、2557-2575、2557-2576、2558-2575、2558-2576、2558-2577、2559-2576、2559-2577、2559-2578、2560-2577、2560-2578、2560-2579、2561-2576、2561-2578、2561-2579、2561-2580、2562-2577、2562-2579、2562-2581、2563-2578、2563-2580、2563-2582、2564-2581、2564-2583、2565-2584、2566-2583、2566-2585、2567-2582、2567-2584、2567-2586、2568-2583、2568-2585、2568-2587、2569-2586、2569-2588、2570-2585、2570-2587、2570-2589、2571-2586、2571-2588、2571-2590、2572-2589、2572-2590、2572-2591、2573-2590、2573-2592、2574-2590、2574-2591、2574-2593、2575-2590、2575-2591、2575-2592、2575-2594、2576-2593、2576-2595、2577-2594、2577-2595、2577-2596、2578-2594、2578-2596、2578-2597、2579-2598、2580-2596、2580-2597、2580-2598、2580-2599、2581-2597、2581-2598、2581-2599、2581-2600、2582-2598、2582-2599、2582-2600、2582-2601、2583-2599、2583-2600、2583-2601、2583-2602、2584-2600、2584-2601、2584-2602、2584-2603、2585-2601、2585-2603、2585-2604、2586-2601、2586-2602、2586-2604、2586-2605、2587-2602、2587-2603、2587-2605、2587-2606、2588-2603、2588-2604、2588-2605、2588-2606、2588-2607、2589-2604、2589-2605、2589-2606、2589-2607、2589-2608、2590-2605、2590-2606、2590-2607、2590-2608、2590-2609、2590-2609、2591-2607、2591-2608、2591-2609、2591-2610、2592-2607、2592-2608、2592-2609、2592-2610、2592-2611、2593-2608、2593-2609、2593-2610、2593-2612、2594-2609、2594-2610、2594-2611、2594-2612、2594-2613、2595-2610、2595-2611、2595-2612、2595-2613、2595-2614、2596-2611、2596-2612、2596-2613、2596-2614、2596-2615、2597-2612、2597-2612、2597-2613、2597-2614、2597-2615、2597-2616、2598-2613、2598-2614、2598-2615、2598-2616、2598-2617、2599-2614、2599-2615、2599-2616、2599-2617、2599-2618、2600-2615、2600-2616、2600-2617、2600-2618、2600-2619、2601-2616、2601-2617、2601-2618、2601-2619、2601-2620、2602-2617、2602-2618、2602-2619、2602-2620、2602-2621、2603-2618、2603-2619、2603-2620、2603-2621、2603-2622、2604-2619、2604-2620、2604-2621、2604-2622、2604-2623、2605-2620、2605-2621、2605-2622、2605-2623、2605-2624、2606-2621、2606-2622、2606-2623、2606-2624、2606-2625、2607-2622、2607-2623、2607-2624、2607-2625、2607-2626、2608-2623、2608-2624、2608-2625、2608-2626、2608-2627、2609-2624、2609-2625、2609-2626、2609-2627、2609-2628、2610-2625、2610-2626、2610-2627、2610-2628、2610-2629、2611-2626、2611-2627、2611-2628、2611-2629、2611-2630、2612-2627、2612-2628、2612-2629、2612-2630、2612-2631、2613-2628、2613-2629、2613-2630、2613-2631、2614-2629、2614-2630、2614-2631、2615-2630、2615-2631以及2616-2631。
在某些实施方案中，反义化合物或寡核苷酸靶向CFB核酸的区。在某些实施方案中，所述靶向CFB核酸的区的化合物或寡核苷酸具有与所述区的等长核碱基部分互补的连续核碱基部分。例如，所述部分可为具有至少8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个或16个连续核碱基且与本文所示的区的等长部分互补的部分。在某些实施方案中，化合物包含缀合物和修饰寡核苷酸或者由缀合物和修饰寡核苷酸组成，所述修饰寡核苷酸靶向SEQID NO:2的下列核苷酸区：1608-1627、1685-1704、1686-1705、1751-1770、1769-1784、1871-1890、1872-1891、1873-1892、1875-1890、1875-1894、1877-1892、1877-1896、1878-1897、1879-1894、1879-1898、2288-2307、2808-2827、2846-2865、2852-2871、2946-2965、3773-3792、3819-3838、3825-3844、3831-3850、3834-3853、3837-3856、3843-3862、4151-4166、4151-4170、4153-4172、4159-4178、4184-4203、4211-4230、4609-4628、4612-4631、4615-4634、4621-4640、4642-4661、4648-4667、4686-4705、4689-4708、4692-4711、4698-4717、4714-4733、5270-5289、5295-5314、5296-5315、5830-5849、5890-5909、5904-5923、6406-6425、6662-6681、6674-6693、6954-6973、6960-6979、6977-6996、6979-6998、6981-7000、6983-6998、6983-7002、6984-7003、6985-7000、6985-7004、6990-7009、7122-7141、7125-7144、7151-7170、7353-7372、7362-7381、7683-7702、7688-7707、7690-7709、7692-7707、7692-7711、7694-7709、7694-7713、7696-7711、7696-7715、7767-7786、7785-7804、7786-7801、7787-7803、7787-7805、7787-7806、7788-7803、7788-7805、7788-7806、7788-7807、7789-7806、7789-7807、7789-7808、7790-7805、7790-7807、7790-7809、7791-7808、7791-7809、7791-7810、7792-7808、7792-7809、7792-7810、7792-7811、7793-7810、7793-7811、7793-7812、7794-7811、7794-7812、7794-7813、7795-7812、7795-7813、7795-7814、7796-7811、7796-7813、7796-7814、7796-7815、7797-7812、7797-7814、7797-7816、7798-7813、7798-7815、7798-7817、7799-7816、7799-7818、7800-7819、7801-7818、7801-7820、7802-7817、7802-7819、7802-7821、7803-7818、7803-7820、7803-7822、7804-7821、7804-7823、7805-7820、7805-7822、7805-7824、7806-7821、7806-7823、7806-7825、7807-7824、7807-7825、7807-7826、7808-7825、7808-7827、7809-7825、7809-7826、7809-7828、7810-7825、7810-7826、7810-7827、7810-7829、7811-7828、7811-7830、7812-7829、7812-7830、7812-7831、7813-7829、7813-7831、7813-7832、7814-7833、7815-7831、7815-7832、7815-7833、7815-7834、7816-7832、7816-7833、7816-7834、7816-7835、7817-7833、7817-7834、7817-7835、7817-7836、7818-7834、7818-7835、7818-7836、7818-7837、7819-7835、7819-7836、7819-7837、7819-7838、7820-7836、7820-7838、7820-7839、7821-7836、7821-7837、7821-7839、7821-7840、7822-7837、7822-7838、7822-7840、7822-7841、7823-7838、7823-7839、7823-7839、7823-7840、7823-7841、7823-7842、7824-7839、7824-7840、7824-7840、7824-7841、7824-7842、7824-7843、7825-7840、7825-7841、7825-7842、7825-7843、7825-7844、7826-7842、7826-7843、7826-7844、7826-7845、7827-7842、7827-7843、7827-7844、7827-7845、7827-7846、7828-7843、7828-7844、7828-7845、7828-7847、7829-7844、7829-7845、7829-7846、7829-7847、7829-7848、7830-7845、7830-7846、7830-7847、7830-7848、7830-7849、7831-7846、7831-7847、7831-7848、7831-7849、7831-7850、7832-7847、7832-7848、7832-7849、7832-7850、7832-7851、7833-7848、7833-7849、7833-7850、7833-7851、7833-7852、7834-7849、7834-7850、7834-7851、7834-7852、7834-7853、7835-7850、7835-7851、7835-7852、7835-7853、7835-7854、7836-7851、7836-7852、7836-7853、7836-7854、7836-7855、7837-7852、7837-7853、7837-7854、7837-7855、7837-7856、7838-7853、7838-7854、7838-7855、7838-7856、7838-7857、7839-7854、7839-7855、7839-7856、7839-7857、7839-7858、7840-7855、7840-7856、7840-7857、7840-7858、7840-7859、7841-7856、7841-7857、7841-7858、7841-7859、7841-7860、7842-7857、7842-7858、7842-7859、7842-7860、7842-7861、7843-7858、7843-7859、7843-7860、7843-7861、7843-7862、7844-7859、7844-7860、7844-7861、7844-7862、7845-7860、7845-7861、7845-7862、7846-7861以及7846-7862。
在某些实施方案中，化合物包含缀合物和靶向CFB核酸的3’UTR的修饰寡核苷酸或者由缀合物和靶向CFB核酸的3’UTR的修饰寡核苷酸组成。在某些方面中，所述修饰寡核苷酸靶向在具有SEQ ID NO:1的核碱基序列的CFB核酸的核苷酸2574-2626内。在某些方面中，修饰寡核苷酸具有至少8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个或16个连续核碱基部分与具有SEQ ID NO:1的核碱基序列的CFB核酸的核苷酸2574-2626内的等长部分互补。
在某些实施方案中，化合物包含缀合物和修饰寡核苷酸或者由缀合物和修饰寡核苷酸组成，所述修饰寡核苷酸靶向具有以下各项核碱基内的SEQ ID NO:1的核碱基序列的CFB核酸的区：2457-2631、2457-2472、2457-2474、2457-2476、2457-2566、2457-2570、2457-2571、2457-2572、2457-2573、2457-2574、2457-2575、2457-2576、2457-2577、2457-2578、2457-2579、2457-2580、2457-2581、2457-2582、2457-2583、2457-2584、2457-2585、2457-2586、2457-2587、2457-2588、2457-2589、2457-2590、2457-2591、2457-2592、2457-2593、2457-2594、2457-2595、2457-2596、2457-2597、2457-2598、2457-2599、2457-2600、2457-2601、2457-2602、2457-2603、2457-2604、2457-2605、2457-2606、2457-2607、2457-2608、2457-2609、2457-2610、2457-2611、2457-2612、2457-2613、2457-2614、2457-2615、2457-2616、2457-2617、2457-2618、2457-2619、2457-2620、2457-2621、2457-2622、2457-2623、2457-2624、2457-2625、2457-2626、2457-2627、2457-2628、2457-2629、2457-2630、2457-2631、2459-2474、2459-2476、2459-2566、2459-2570、2459-2571、2459-2572、2459-2573、2459-2574、2459-2575、2459-2576、2459-2577、2459-2578、2459-2579、2459-2580、2459-2581、2459-2582、2459-2583、2459-2584、2459-2585、2459-2586、2459-2587、2459-2588、2459-2589、2459-2590、2459-2591、2459-2592、2459-2593、2459-2594、2459-2595、2459-2596、2459-2597、2459-2598、2459-2599、2459-2600、2459-2601、2459-2602、2459-2603、2459-2604、2459-2605、2459-2606、2459-2607、2459-2608、2459-2609、2459-2610、2459-2611、2459-2612、2459-2613、2459-2614、2459-2615、2459-2616、2459-2617、2459-2618、2459-2619、2459-2620、2459-2621、2459-2622、2459-2623、2459-2624、2459-2625、2459-2626、2459-2627、2459-2628、2459-2629、2459-2630、2459-2631、2461-2476、2461-2566、2461-2570、2461-2571、2461-2572、2461-2573、2461-2574、2461-2575、2461-2576、2461-2577、2461-2578、2461-2579、2461-2580、2461-2581、2461-2582、2461-2583、2461-2584、2461-2585、2461-2586、2461-2587、2461-2588、2461-2589、2461-2590、2461-2591、2461-2592、2461-2593、2461-2594、2461-2595、2461-2596、2461-2597、2461-2598、2461-2599、2461-2600、2461-2601、2461-2602、2461-2603、2461-2604、2461-2605、2461-2606、2461-2607、2461-2608、2461-2609、2461-2610、2461-2611、2461-2612、2461-2613、2461-2614、2461-2615、2461-2616、2461-2617、2461-2618、2461-2619、2461-2620、2461-2621、2461-2622、2461-2623、2461-2624、2461-2625、2461-2626、2461-2627、2461-2628、2461-2629、2461-2630、2461-2631、2551-2566、2551-2570、2551-2571、2551-2572、2551-2573、2551-2574、2551-2575、2551-2576、2551-2577、2551-2578、2551-2579、2551-2580、2551-2581、2551-2582、2551-2583、2551-2584、2551-2585、2551-2586、2551-2587、2551-2588、2551-2589、2551-2590、2551-2591、2551-2592、2551-2593、2551-2594、2551-2595、2551-2596、2551-2597、2551-2598、2551-2599、2551-2600、2551-2601、2551-2602、2551-2603、2551-2604、2551-2605、2551-2606、2551-2607、2551-2608、2551-2609、2551-2610、2551-2611、2551-2612、2551-2613、2551-2614、2551-2615、2551-2616、2551-2617、2551-2618、2551-2619、2551-2620、2551-2621、2551-2622、2551-2623、2551-2624、2551-2625、2551-2626、2551-2627、2551-2628、2551-2629、2551-2630、2551-2631、2553-2570、2553-2571、2553-2572、2553-2573、2553-2574、2553-2575、2553-2576、2553-2577、2553-2578、2553-2579、2553-2580、2553-2581、2553-2582、2553-2583、2553-2584、2553-2585、2553-2586、2553-2587、2553-2588、2553-2589、2553-2590、2553-2591、2553-2592、2553-2593、2553-2594、2553-2595、2553-2596、2553-2597、2553-2598、2553-2599、2553-2600、2553-2601、2553-2602、2553-2603、2553-2604、2553-2605、2553-2606、2553-2607、2553-2608、2553-2609、2553-2610、2553-2611、2553-2612、2553-2613、2553-2614、2553-2615、2553-2616、2553-2617、2553-2618、2553-2619、2553-2620、2553-2621、2553-2622、2553-2623、2553-2624、2553-2625、2553-2626、2553-2627、2553-2628、2553-2629、2553-2630、2553-2631、2554-2573、2554-2574、2554-2575、2554-2576、2554-2577、2554-2578、2554-2579、2554-2580、2554-2581、2554-2582、2554-2583、2554-2584、2554-2585、2554-2586、2554-2587、2554-2588、2554-2589、2554-2590、2554-2591、2554-2592、2554-2593、2554-2594、2554-2595、2554-2596、2554-2597、2554-2598、2554-2599、2554-2600、2554-2601、2554-2602、2554-2603、2554-2604、2554-2605、2554-2606、2554-2607、2554-2608、2554-2609、2554-2610、2554-2611、2554-2612、2554-2613、2554-2614、2554-2615、2554-2616、2554-2617、2554-2618、2554-2619、2554-2620、2554-2621、2554-2622、2554-2623、2554-2624、2554-2625、2554-2626、2554-2627、2554-2628、2554-2629、2554-2630、2554-2631、2555-2572、2555-2573、2555-2574、2555-2575、2555-2576、2555-2577、2555-2578、2555-2579、2555-2580、2555-2581、2555-2582、2555-2583、2555-2584、2555-2585、2555-2586、2555-2587、2555-2588、2555-2589、2555-2590、2555-2591、2555-2592、2555-2593、2555-2594、2555-2595、2555-2596、2555-2597、2555-2598、2555-2599、2555-2600、2555-2601、2555-2602、2555-2603、2555-2604、2555-2605、2555-2606、2555-2607、2555-2608、2555-2609、2555-2610、2555-2611、2555-2612、2555-2613、2555-2614、2555-2615、2555-2616、2555-2617、2555-2618、2555-2619、2555-2620、2555-2621、2555-2622、2555-2623、2555-2624、2555-2625、2555-2626、2555-2627、2555-2628、2555-2629、2555-2630、2555-2631、2556-2573、2556-2574、2556-2575、2556-2576、2556-2577、2556-2578、2556-2579、2556-2580、2556-2581、2556-2582、2556-2583、2556-2584、2556-2585、2556-2586、2556-2587、2556-2588、2556-2589、2556-2590、2556-2591、2556-2592、2556-2593、2556-2594、2556-2595、2556-2596、2556-2597、2556-2598、2556-2599、2556-2600、2556-2601、2556-2602、2556-2603、2556-2604、2556-2605、2556-2606、2556-2607、2556-2608、2556-2609、2556-2610、2556-2611、2556-2612、2556-2613、2556-2614、2556-2615、2556-2616、2556-2617、2556-2618、2556-2619、2556-2620、2556-2621、2556-2622、2556-2623、2556-2624、2556-2625、2556-2626、2556-2627、2556-2628、2556-2629、2556-2630、2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在某些实施方案中，当通过反义化合物或寡核苷酸靶向时，SEQ ID NO:1的下列核苷酸区显示至少50％的抑制：30-49、48-63、150-169、151-170、152-171、154-169、154-173、156-171、156-175、157-176、158-173、158-177、480-499、600-619、638-657、644-663、738-757、1089-1108、1135-1154、1141-1160、1147-1166、1150-1169、1153-1172、1159-1178、1162-1181、1165-1184、1171-1186、1171-1190、1173-1188、1173-1192、1175-1190、1175-1194、1177-1196、1183-1202、1208-1227、1235-1254、1298-1317、1304-1323、1310-1329、1316-1335、1319-1338、1322-1341、1328-1347、1349-1368、1355-1374、1393-1412、1396-1415、1399-1418、1405-1424、1421-1440、1621-1640、1646-1665、1646-1665、1647-1666、1689-1708、1749-1768、1763-1782、1912-1931、2073-2092、2085-2104、2166-2185、2172-2191、2189-2208、2191-2210、2193-2212、2195-2210、2195-2214、2196-2215、2197-2212、2197-2216、2202-2221、2223-2238、2223-2242、2225-2240、2226-2245、2227-2242、2227-2246、2238-2257、2241-2260、2267-2286、2361-2380、2388-2407、2397-2416、2448-2467、2453-2472、2455-2474、2457-2472、2457-2476、2459-2474、2459-2478、2461-2476、2461-2480、2532-2551、2550-2569、2551-2566、2551-2570、2552-2568、2552-2570、2552-2571、2553-2568、2553-2570、2553-2571、2553-2572、2554-2571、2554-2572、2554-2573、2555-2570、2555-2572、2555-2574、2556-2573、2556-2574、2556-2575、2557-2573、2557-2574、2557-2575、2557-2576、2558-2575、2558-2576、2558-2577、2559-2576、2559-2577、2559-2578、2560-2577、2560-2578、2560-2579、2561-2576、2561-2578、2561-2579、2561-2580、2562-2577、2562-2579、2562-2581、2563-2578、2563-2580、2563-2582、2564-2581、2564-2583、2565-2584、2566-2583、2566-2585、2567-2582、2567-2584、2567-2586、2568-2583、2568-2585、2568-2587、2569-2586、2569-2588、2570-2585、2570-2587、2570-2589、2571-2586、2571-2588、2571-2590、2572-2589、2572-2590、2572-2591、2573-2590、2573-2592、2574-2590、2574-2591、2574-2593、2575-2590、2575-2591、2575-2592、2575-2594、2576-2593、2576-2595、2577-2594、2577-2595、2577-2596、2578-2594、2578-2596、2578-2597、2579-2598、2580-2596、2580-2597、2580-2598、2580-2599、2581-2597、2581-2598、2581-2599、2581-2600、2582-2598、2582-2599、2582-2600、2582-2601、2583-2599、2583-2600、2583-2601、2583-2602、2584-2600、2584-2601、2584-2602、2584-2603、2585-2601、2585-2603、2585-2604、2586-2601、2586-2602、2586-2604、2586-2605、2587-2602、2587-2603、2587-2605、2587-2606、2588-2603、2588-2604、2588-2605、2588-2606、2588-2607、2589-2604、2589-2605、2589-2606、2589-2607、2589-2608、2590-2605、2590-2606、2590-2607、2590-2608、2590-2609、2590-2609、2591-2607、2591-2608、2591-2609、2591-2610、2592-2607、2592-2608、2592-2609、2592-2610、2592-2611、2593-2608、2593-2609、2593-2610、2593-2612、2594-2609、2594-2610、2594-2611、2594-2612、2594-2613、2595-2610、2595-2611、2595-2612、2595-2613、2595-2614、2596-2611、2596-2612、2596-2613、2596-2614、2596-2615、2597-2612、2597-2612、2597-2613、2597-2614、2597-2615、2597-2616、2598-2613、2598-2614、2598-2615、2598-2616、2598-2617、2599-2614、2599-2615、2599-2616、2599-2617、2599-2618、2600-2615、2600-2616、2600-2617、2600-2618、2600-2619、2601-2616、2601-2617、2601-2618、2601-2619、2601-2620、2602-2617、2602-2618、2602-2619、2602-2620、2602-2621、2603-2618、2603-2619、2603-2620、2603-2621、2603-2622、2604-2619、2604-2620、2604-2621、2604-2622、2604-2623、2605-2620、2605-2621、2605-2622、2605-2623、2605-2624、2606-2621、2606-2622、2606-2623、2606-2624、2606-2625、2607-2622、2607-2623、2607-2624、2607-2625、2607-2626、2608-2623、2608-2624、2608-2625、2608-2626、2608-2627、2609-2624、2609-2625、2609-2626、2609-2627、2609-2628、2610-2625、2610-2626、2610-2627、2610-2628、2610-2629、2611-2626、2611-2627、2611-2628、2611-2629、2611-2630、2612-2627、2612-2628、2612-2629、2612-2630、2612-2631、2613-2628、2613-2629、2613-2630、2613-2631、2614-2629、2614-2630、2614-2631、2615-2630、2615-2631以及2616-2631。
在某些实施方案中，当通过反义化合物或寡核苷酸靶向时，SEQ ID NO:2的下列核苷酸区显示至少50％的抑制：1608-1627、1685-1704、1686-1705、1751-1770、1769-1784、1871-1890、1872-1891、1873-1892、1875-1890、1875-1894、1877-1892、1877-1896、1878-1897、1879-1894、1879-1898、2288-2307、2808-2827、2846-2865、2852-2871、2946-2965、3773-3792、3819-3838、3825-3844、3831-3850、3834-3853、3837-3856、3843-3862、4151-4166、4151-4170、4153-4172、4159-4178、4184-4203、4211-4230、4609-4628、4612-4631、4615-4634、4621-4640、4642-4661、4648-4667、4686-4705、4689-4708、4692-4711、4698-4717、4714-4733、5270-5289、5295-5314、5296-5315、5830-5849、5890-5909、5904-5923、6406-6425、6662-6681、6674-6693、6954-6973、6960-6979、6977-6996、6979-6998、6981-7000、6983-6998、6983-7002、6984-7003、6985-7000、6985-7004、6990-7009、7122-7141、7125-7144、7151-7170、7353-7372、7362-7381、7683-7702、7688-7707、7690-7709、7692-7707、7692-7711、7694-7709、7694-7713、7696-7711、7696-7715、7767-7786、7785-7804、7786-7801、7787-7803、7787-7805、7787-7806、7788-7803、7788-7805、7788-7806、7788-7807、7789-7806、7789-7807、7789-7808、7790-7805、7790-7807、7790-7809、7791-7808、7791-7809、7791-7810、7792-7808、7792-7809、7792-7810、7792-7811、7793-7810、7793-7811、7793-7812、7794-7811、7794-7812、7794-7813、7795-7812、7795-7813、7795-7814、7796-7811、7796-7813、7796-7814、7796-7815、7797-7812、7797-7814、7797-7816、7798-7813、7798-7815、7798-7817、7799-7816、7799-7818、7800-7819、7801-7818、7801-7820、7802-7817、7802-7819、7802-7821、7803-7818、7803-7820、7803-7822、7804-7821、7804-7823、7805-7820、7805-7822、7805-7824、7806-7821、7806-7823、7806-7825、7807-7824、7807-7825、7807-7826、7808-7825、7808-7827、7809-7825、7809-7826、7809-7828、7810-7825、7810-7826、7810-7827、7810-7829、7811-7828、7811-7830、7812-7829、7812-7830、7812-7831、7813-7829、7813-7831、7813-7832、7814-7833、7815-7831、7815-7832、7815-7833、7815-7834、7816-7832、7816-7833、7816-7834、7816-7835、7817-7833、7817-7834、7817-7835、7817-7836、7818-7834、7818-7835、7818-7836、7818-7837、7819-7835、7819-7836、7819-7837、7819-7838、7820-7836、7820-7838、7820-7839、7821-7836、7821-7837、7821-7839、7821-7840、7822-7837、7822-7838、7822-7840、7822-7841、7823-7838、7823-7839、7823-7839、7823-7840、7823-7841、7823-7842、7824-7839、7824-7840、7824-7840、7824-7841、7824-7842、7824-7843、7825-7840、7825-7841、7825-7842、7825-7843、7825-7844、7826-7842、7826-7843、7826-7844、7826-7845、7827-7842、7827-7843、7827-7844、7827-7845、7827-7846、7828-7843、7828-7844、7828-7845、7828-7847、7829-7844、7829-7845、7829-7846、7829-7847、7829-7848、7830-7845、7830-7846、7830-7847、7830-7848、7830-7849、7831-7846、7831-7847、7831-7848、7831-7849、7831-7850、7832-7847、7832-7848、7832-7849、7832-7850、7832-7851、7833-7848、7833-7849、7833-7850、7833-7851、7833-7852、7834-7849、7834-7850、7834-7851、7834-7852、7834-7853、7835-7850、7835-7851、7835-7852、7835-7853、7835-7854、7836-7851、7836-7852、7836-7853、7836-7854、7836-7855、7837-7852、7837-7853、7837-7854、7837-7855、7837-7856、7838-7853、7838-7854、7838-7855、7838-7856、7838-7857、7839-7854、7839-7855、7839-7856、7839-7857、7839-7858、7840-7855、7840-7856、7840-7857、7840-7858、7840-7859、7841-7856、7841-7857、7841-7858、7841-7859、7841-7860、7842-7857、7842-7858、7842-7859、7842-7860、7842-7861、7843-7858、7843-7859、7843-7860、7843-7861、7843-7862、7844-7859、7844-7860、7844-7861、7844-7862、7845-7860、7845-7861、7845-7862、7846-7861以及7846-7862。
在某些实施方案中，当通过反义化合物或寡核苷酸靶向时，SEQ ID NO:1的下列核苷酸区显示至少60％的抑制：48-63、150-169、152-171、154-169、154-173、156-171、156-175、158-173、158-177、600-619、1135-1154、1141-1160、1147-1166、1153-1172、1171-1186、1173-1188、1175-1190、1749-1768、1763-1782、1763-1782、1912-1931、2189-2208、2191-2210、2193-2212、2195-2210、2195-2214、2197-2212、2197-2216、2223-2238、2225-2240、2227-2242、2238-2257、2448-2467、2453-2472、2455-2474、2457-2472、2457-2476、2459-2474、2459-2478、2461-2476、2461-2480、2550-2569、2551-2566、2552-2571、2553-2568、2553-2570、2553-2571、2553-2572、2554-2571、2554-2572、2554-2573、2555-2572、2555-2574、2556-2573、2556-2574、2556-2575、2557-2574、2557-2575、2557-2576、2558-2575、2558-2576、2558-2577、2559-2576、2559-2577、2559-2578、2560-2577、2560-2578、2560-2579、2561-2578、2561-2579、2561-2580、2562-2577、2562-2579、2562-2581、2563-2578、2563-2580、2563-2582、2564-2581、2564-2583、2565-2584、2566-2583、2566-2585、2567-2582、2567-2584、2567-2586、2568-2583、2568-2585、2568-2587、2569-2586、2569-2588、2570-2587、2570-2589、2571-2588、2572-2590、2572-2591、2573-2590、2573-2592、2574-2591、2574-2593、2575-2590、2575-2592、2575-2594、2576-2593、2576-2595、2577-2594、2577-2595、2577-2596、2578-2594、2578-2597、2579-2598、2580-2596、2580-2597、2580-2598、2580-2599、2581-2597、2581-2598、2581-2599、2581-2600、2582-2598、2582-2599、2582-2600、2582-2601、2583-2599、2583-2600、2583-2601、2583-2602、2584-2600、2584-2602、2584-2603、2585-2601、2585-2603、2585-2604、2586-2602、2586-2604、2586-2605、2587-2603、2587-2605、2587-2606、2588-2603、2588-2604、2588-2606、2588-2607、2589-2605、2589-2606、2589-2607、2589-2608、2590-2605、2590-2606、2590-2607、2590-2608、2590-2609、2591-2607、2591-2609、2591-2610、2592-2608、2592-2609、2592-2611、2593-2608、2593-2609、2593-2612、2594-2609、2594-2610、2594-2611、2594-2612、2594-2613、2595-2610、2595-2611、2595-2612、2595-2613、2595-2614、2596-2611、2596-2612、2596-2613、2596-2614、2596-2615、2597-2612、2597-2613、2597-2614、2597-2615、2597-2616、2598-2613、2598-2614、2598-2615、2598-2616、2598-2617、2599-2614、2599-2615、2599-2616、2599-2617、2599-2618、2600-2615、2600-2616、2600-2617、2600-2618、2600-2619、2601-2616、2601-2617、2601-2618、2601-2619、2601-2620、2602-2617、2602-2618、2602-2619、2602-2620、2602-2621、2603-2618、2603-2619、2603-2620、2603-2621、2603-2622、2604-2619、2604-2620、2604-2621、2604-2622、2604-2623、2605-2620、2605-2621、2605-2622、2605-2623、2605-2624、2606-2621、2606-2622、2606-2623、2606-2624、2606-2625、2607-2622、2607-2623、2607-2624、2607-2625、2607-2626、2608-2623、2608-2624、2608-2625、2608-2625、2608-2626、2608-2627、2609-2624、2609-2625、2609-2626、2609-2627、2609-2628、2610-2625、2610-2626、2610-2627、2610-2628、2610-2629、2611-2626、2611-2626、2611-2627、2611-2628、2611-2629、2611-2630、2612-2627、2612-2628、2612-2629、2612-2630、2612-2631、2613-2628、2613-2629、2613-2630、2613-2631、2614-2629、2614-2630、2614-2631、2615-2630、2615-2630、2615-2631、2615-2631以及2616-2631。
在某些实施方案中，当通过反义化合物或寡核苷酸靶向时，SEQ ID NO:2的下列核苷酸区显示至少60％的抑制：1685-1704、1686-1705、1769-1784、1871-1890、1873-1892、1875-1890、1875-1894、1877-1892、1877-1896、1879-1894、1879-1898、2808-2827、3819-3838、3825-3844、3831-3850、3837-3856、4151-4166、5890-5909、5904-5923、5904-5923、6406-6425、6977-6996、6979-6998、6981-7000、6983-6998、6983-7002、6985-7000、6985-7004、7122-7141、7683-7702、7688-7707、7690-7709、7692-7707、7692-7711、7694-7709、7696-7711、7696-7715、7786-7801、7787-7806、7788-7803、7788-7805、7788-7806、7788-7807、7789-7806、7789-7807、7789-7808、7790-7807、7790-7809、7791-7808、7791-7809、7791-7810、7792-7809、7792-7810、7792-7811、7793-7810、7793-7811、7793-7812、7794-7811、7794-7812、7794-7813、7795-7812、7795-7813、7795-7814、7796-7813、7796-7814、7796-7815、7797-7812、7797-7814、7797-7816、7798-7813、7798-7815、7798-7817、7799-7816、7799-7818、7800-7819、7801-7818、7801-7820、7802-7817、7802-7819、7802-7821、7803-7818、7803-7820、7803-7822、7804-7821、7804-7823、7805-7822、7805-7824、7806-7823、7806-7825、7807-7824、7807-7825、7807-7826、7808-7825、7808-7827、7809-7826、7809-7828、7810-7825、7810-7827、7810-7829、7811-7828、7811-7830、7812-7829、7812-7830、7812-7831、7813-7829、7813-7832、7814-7833、7815-7831、7815-7832、7815-7833、7815-7834、7816-7832、7816-7833、7816-7834、7816-7835、7817-7833、7817-7834、7817-7835、7817-7836、7818-7834、7818-7835、7818-7836、7818-7837、7819-7835、7819-7837、7819-7838、7820-7836、7820-7838、7820-7839、7821-7837、7821-7839、7821-7840、7822-7838、7822-7840、7822-7841、7823-7838、7823-7839、7823-7841、7823-7842、7824-7840、7824-7841、7824-7842、7824-7843、7825-7840、7825-7841、7825-7842、7825-7843、7825-7844、7826-7842、7826-7844、7826-7845、7827-7843、7827-7844、7827-7846、7828-7843、7828-7844、7828-7847、7829-7844、7829-7845、7829-7846、7829-7847、7829-7848、7830-7845、7830-7846、7830-7847、7830-7848、7830-7849、7831-7846、7831-7847、7831-7848、7831-7849、7831-7850、7832-7847、7832-7848、7832-7849、7832-7850、7832-7851、7833-7848、7833-7849、7833-7850、7833-7851、7833-7852、7834-7849、7834-7850、7834-7851、7834-7852、7834-7853、7835-7850、7835-7851、7835-7852、7835-7853、7835-7854、7836-7851、7836-7852、7836-7853、7836-7854、7836-7855、7837-7852、7837-7853、7837-7854、7837-7855、7837-7856、7838-7853、7838-7854、7838-7855、7838-7856、7838-7857、7839-7854、7839-7855、7839-7856、7839-7857、7839-7858、7840-7855、7840-7856、7840-7857、7840-7858、7840-7859、7841-7856、7841-7857、7841-7858、7841-7859、7841-7860、7842-7857、7842-7858、7842-7859、7842-7860、7842-7861、7843-7858、7843-7859、7843-7860、7843-7861、7843-7862、7844-7859、7844-7860、7844-7861、7844-7862、7845-7860、7845-7861、7845-7862、7846-7861、7846-7862以及7847-7862。
在某些实施方案中，当通过反义化合物或寡核苷酸靶向时，SEQ ID NO:1的下列核苷酸区显示至少70％的抑制：48-63、150-169、152-171、154-169、154-173、156-171、156-175、158-173、158-177、1135-1154、1141-1160、1147-1166、1171-1186、1173-1188、1175-1190、1749-1768、1763-1782、1912-1931、2193-2212、2195-2210、2195-2214、2197-2212、2197-2216、2223-2238、2225-2240、2227-2242、2453-2472、2455-2474、2457-2472、2457-2476、2459-2474、2461-2476、2461-2480、2550-2569、2551-2566、2552-2571、2553-2570、2553-2571、2553-2572、2554-2571、2554-2572、2554-2573、2554-2573、2555-2572、2555-2574、2555-2574、2556-2573、2556-2574、2556-2575、2557-2574、2557-2576、2558-2575、2558-2576、2558-2577、2559-2576、2559-2577、2559-2578、2560-2577、2560-2578、2560-2579、2561-2578、2561-2579、2561-2580、2562-2577、2562-2579、2562-2581、2563-2578、2563-2580、2563-2582、2564-2581、2564-2583、2565-2584、2566-2583、2566-2585、2567-2582、2567-2584、2567-2586、2568-2585、2568-2587、2569-2586、2569-2588、2570-2587、2570-2589、2571-2588、2571-2590、2572-2589、2572-2591、2573-2590、2573-2592、2574-2591、2574-2593、2575-2592、2575-2594、2576-2593、2576-2595、2577-2594、2577-2596、2578-2597、2579-2598、2580-2596、2580-2598、2580-2599、2581-2597、2581-2600、2582-2598、2582-2600、2582-2601、2583-2599、2583-2601、2583-2602、2584-2600、2584-2602、2584-2603、2585-2601、2585-2603、2585-2604、2586-2605、2587-2606、2588-2604、2588-2606、2588-2607、2589-2605、2589-2606、2589-2607、2589-2608、2590-2605、2590-2606、2590-2607、2590-2609、2591-2607、2591-2610、2592-2611、2593-2608、2593-2612、2594-2609、2594-2610、2594-2612、2594-2613、2595-2610、2595-2611、2595-2612、2595-2613、2595-2614、2596-2611、2596-2614、2596-2615、2597-2612、2597-2613、2597-2614、2597-2615、2597-2616、2598-2613、2598-2614、2598-2615、2598-2616、2598-2617、2599-2614、2599-2615、2599-2616、2599-2617、2599-2618、2600-2615、2600-2616、2600-2617、2600-2618、2600-2619、2601-2616、2601-2617、2601-2618、2601-2619、2601-2620、2602-2617、2602-2618、2602-2619、2602-2620、2602-2621、2603-2619、2603-2620、2603-2621、2603-2622、2604-2619、2604-2620、2604-2621、2604-2622、2604-2623、2605-2620、2605-2621、2605-2622、2605-2623、2605-2624、2606-2621、2606-2622、2606-2623、2606-2624、2606-2625、2607-2622、2607-2623、2607-2624、2607-2625、2607-2626、2608-2623、2608-2624、2608-2625、2608-2626、2608-2627、2609-2624、2609-2625、2609-2626、2609-2627、2609-2628、2610-2625、2610-2626、2610-2627、2610-2628、2610-2629、2611-2626、2611-2627、2611-2629、2611-2630、2612-2627、2612-2628、2612-2629、2612-2630、2612-2631、2613-2628、2613-2629、2613-2630、2613-2631、2614-2629、2614-2630、2614-2631、2615-2630、2615-2630、2615-2631以及2616-2631。
在某些实施方案中，当通过反义化合物或寡核苷酸靶向时，SEQ ID NO:2的下列核苷酸区显示至少70％的抑制：1685-1704、1686-1705、1769-1784、1871-1890、1873-1892、1875-1890、1875-1894、1877-1892、1877-1896、1879-1894、1879-1898、3819-3838、3825-3844、3831-3850、4151-4166、5890-5909、5904-5923、5904-5923、6406-6425、6983-6998、6983-7002、6985-7000、6985-7004、7688-7707、7690-7709、7692-7707、7692-7711、7694-7709、7696-7711、7696-7715、7786-7801、7787-7806、7788-7805、7788-7806、7788-7807、7789-7806、7789-7807、7789-7808、7790-7807、7790-7809、7791-7808、7791-7809、7791-7810、7792-7809、7792-7811、7793-7810、7793-7811、7793-7812、7794-7811、7794-7812、7794-7813、7795-7812、7795-7813、7795-7814、7796-7813、7796-7814、7796-7815、7797-7812、7797-7814、7797-7816、7798-7813、7798-7815、7798-7817、7799-7816、7799-7818、7800-7819、7801-7818、7801-7820、7802-7817、7802-7819、7802-7821、7803-7820、7803-7822、7804-7821、7804-7823、7805-7822、7805-7824、7806-7823、7806-7825、7807-7824、7807-7826、7808-7825、7808-7827、7809-7826、7809-7828、7810-7827、7811-7828、7811-7830、7812-7829、7812-7831、7813-7832、7814-7833、7815-7831、7815-7833、7815-7834、7816-7832、7816-7835、7817-7833、7817-7835、7817-7836、7818-7834、7818-7836、7818-7837、7819-7835、7819-7837、7819-7838、7820-7836、7820-7838、7820-7839、7821-7840、7822-7841、7823-7839、7823-7841、7823-7842、7824-7840、7824-7841、7824-7842、7824-7843、7825-7840、7825-7841、7825-7842、7825-7844、7826-7842、7826-7845、7827-7846、7828-7843、7828-7847、7829-7844、7829-7845、7829-7847、7829-7848、7830-7845、7830-7846、7830-7847、7830-7848、7830-7849、7831-7846、7831-7849、7831-7850、7832-7847、7832-7848、7832-7849、7832-7850、7832-7851、7833-7848、7833-7849、7833-7850、7833-7851、7833-7852、7834-7849、7834-7850、7834-7851、7834-7852、7834-7853、7835-7850、7835-7851、7835-7852、7835-7853、7835-7854、7836-7851、7836-7852、7836-7853、7836-7854、7836-7855、7837-7852、7837-7853、7837-7854、7837-7855、7837-7856、7838-7854、7838-7855、7838-7856、7838-7857、7839-7854、7839-7855、7839-7856、7839-7857、7839-7858、7840-7855、7840-7856、7840-7857、7840-7858、7840-7859、7841-7856、7841-7857、7841-7858、7841-7859、7841-7860、7842-7857、7842-7858、7842-7859、7842-7860、7842-7861、7843-7858、7843-7859、7843-7860、7843-7861、7843-7862、7844-7859、7844-7860、7844-7861、7844-7862、7845-7860、7845-7861、7845-7862、7846-7861、7846-7862以及7847-7862。
在某些实施方案中，当通过反义化合物或寡核苷酸靶向时，SEQ ID NO:1的下列核苷酸区显示至少80％的抑制：152-171、154-169、156-171、158-173、1135-1154、1171-1186、1173-1188、1175-1190、1763-1782、1912-1931、2197-2212、2223-2238、2225-2240、2227-2242、2457-2472、2459-2474、2461-2476、2551-2566、2553-2570、2553-2571、2553-2572、2554-2573、2555-2572、2555-2574、2556-2573、2556-2574、2556-2575、2557-2574、2557-2576、2558-2575、2558-2576、2559-2577、2559-2578、2560-2577、2560-2578、2560-2579、2561-2578、2561-2579、2561-2580、2562-2577、2562-2579、2562-2581、2563-2580、2563-2582、2564-2581、2564-2583、2565-2584、2566-2583、2567-2584、2567-2586、2568-2585、2568-2587、2569-2586、2569-2588、2570-2587、2571-2588、2571-2590、2572-2589、2572-2591、2573-2590、2573-2592、2574-2591、2574-2593、2575-2592、2576-2593、2576-2595、2577-2594、2577-2596、2578-2597、2580-2598、2580-2599、2581-2597、2581-2600、2582-2601、2583-2602、2584-2603、2585-2604、2586-2605、2587-2606、2588-2607、2589-2608、2590-2606、2590-2607、2590-2609、2591-2610、2592-2611、2593-2608、2593-2612、2594-2613、2595-2611、2595-2614、2596-2615、2597-2612、2597-2613、2597-2614、2597-2615、2597-2616、2598-2613、2598-2613、2598-2614、2598-2615、2598-2616、2598-2617、2599-2614、2599-2617、2599-2618、2600-2615、2600-2617、2600-2618、2600-2619、2601-2616、2601-2617、2601-2619、2601-2620、2602-2618、2602-2621、2603-2620、2603-2621、2603-2622、2604-2619、2604-2620、2604-2621、2604-2622、2604-2623、2605-2620、2605-2621、2605-2622、2605-2623、2605-2624、2606-2621、2606-2622、2606-2623、2606-2624、2606-2625、2607-2622、2607-2623、2607-2624、2607-2625、2607-2626、2608-2623、2608-2624、2608-2625、2608-2627、2609-2624、2609-2626、2609-2627、2609-2628、2610-2625、2610-2626、2610-2628、2610-2629、2611-2626、2611-2627、2611-2629、2611-2630、2612-2627、2612-2628、2612-2630、2612-2631、2613-2628、2613-2629、2613-2631、2614-2629、2614-2630、2614-2631、2615-2630以及2616-2631。
在某些实施方案中，当通过反义化合物或寡核苷酸靶向时，SEQ ID NO:2的下列核苷酸区显示至少80％的抑制：1685-1704、1686-1705、1873-1892、1875-1890、1877-1892、1879-1894、3819-3838、4151-4166、5904-5923、6406-6425、6985-7000、7692-7707、7694-7709、7696-7711、7786-7801、7788-7805、7788-7806、7788-7807、7789-7808、7790-7807、7790-7809、7791-7808、7791-7809、7791-7810、7792-7809、7792-7811、7793-7810、7793-7811、7794-7812、7794-7813、7795-7812、7795-7813、7795-7814、7796-7813、7796-7814、7796-7815、7797-7812、7797-7814、7797-7816、7798-7815、7798-7817、7799-7816、7799-7818、7800-7819、7801-7818、7802-7819、7802-7821、7803-7820、7803-7822、7804-7821、7804-7823、7805-7822、7806-7823、7806-7825、7807-7824、7807-7826、7808-7825、7808-7827、7809-7826、7809-7828、7810-7827、7811-7828、7812-7829、7812-7831、7813-7832、7814-7833、7815-7834、7816-7832、7816-7835、7817-7836、7818-7837、7819-7838、7820-7839、7821-7840、7822-7841、7823-7842、7824-7843、7825-7841、7825-7842、7825-7844、7826-7845、7827-7846、7828-7843、7828-7847、7829-7848、7830-7846、7830-7849、7831-7850、7832-7847、7832-7848、7832-7849、7832-7850、7832-7851、7833-7848、7833-7849、7833-7850、7833-7851、7833-7852、7834-7849、7834-7852、7834-7853、7835-7850、7835-7852、7835-7853、7835-7854、7836-7851、7836-7852、7836-7854、7836-7855、7837-7853、7837-7856、7838-7855、7838-7856、7838-7857、7839-7854、7839-7855、7839-7856、7839-7857、7839-7858、7840-7855、7840-7856、7840-7857、7840-7858、7840-7859、7841-7856、7841-7857、7841-7858、7841-7859、7841-7860、7842-7857、7842-7858、7842-7859、7842-7860、7842-7861、7843-7858、7843-7859、7843-7860、7843-7862、7844-7859、7844-7861、7844-7862、7845-7860、7845-7861、7846-7862以及7847-7862。
在某些实施方案中，当通过反义化合物或寡核苷酸靶向时，SEQ ID NO:1的下列核苷酸区显示至少90％的抑制：154-169、156-171、158-173、1135-1154、1171-1186、1173-1188、1763-1782、1912-1931、2223-2238、2227-2242、2459-2474、2461-2476、2554-2573、2555-2574、2560-2577、2561-2578、2561-2579、2562-2581、2563-2580、2563-2582、2564-2581、2566-2583、2567-2584、2568-2585、2568-2587、2569-2586、2570-2587、2576-2593、2577-2594、2577-2596、2578-2597、2580-2599、2581-2600、2582-2601、2583-2602、2584-2603、2586-2605、2587-2605、2587-2606、2588-2607、2589-2608、2590-2607、2590-2609、2592-2611、2595-2614、2596-2615、2597-2612、2597-2613、2597-2615、2597-2616、2598-2613、2598-2613、2598-2617、2599-2614、2599-2618、2600-2615、2600-2619、2601-2617、2601-2620、2602-2621、2603-2622、2604-2623、2605-2621、2605-2622、2605-2624、2606-2625、2607-2626、2608-2623、2608-2625、2609-2628、2611-2627、2611-2630、2612-2628、2612-2631、2613-2629、2614-2629、2615-2630以及2616-2631。
在某些实施方案中，当通过反义化合物或寡核苷酸靶向时，SEQ ID NO:2的下列核苷酸区显示至少90％的抑制：1685-1704、1686-1705、1875-1890、1877-1892、1879-1894、3819-3838、5904-5923、6406-6425、7694-7709、7696-7711、7789-7808、7790-7809、7795-7812、7795-7813、7796-7813、7796-7814、7797-7814、7797-7816、7798-7815、7798-7817、7799-7816、7801-7818、7802-7819、7803-7820、7803-7822、7804-7821、7805-7822、7811-7828、7812-7829、7812-7831、7813-7832、7815-7834、7818-7837、7819-7838、7821-7840、7822-7840、7822-7841、7825-7842、7832-7847、7832-7848、7832-7850、7833-7848、7833-7852、7834-7849、7834-7853、7835-7850、7836-7852、7836-7855、7837-7856、7838-7856、7839-7857、7839-7858、7840-7856、7840-7857、7840-7859、7843-7858、7843-7860以及7846-7862。
在某些实施方案中，下列反义化合物或寡核苷酸靶向CFB核酸的区并且实现下列CFB mRNA的至少50％的抑制，ISIS NO:516350、532614、532632、532635、532638、532639、532686、532687、532688、532689、532690、532691、532692、532692、532693、532694、532695、532696、532697、532698、532699、532700、532701、532702、532703、532704、532705、532706、532707、532770、532775、532778、532780、532791、532800、532809、532810、532811、532917、532952、588509、588510、588511、588512、588513、588514、588515、588516、588517、588518、588519、588520、588522、588523、588524、588525、588527、588528、588529、588530、588531、588532、588533、588534、588535、588536、588537、588538、588539、588540、588541、588542、588543、588544、588545、588546、588547、588548、588549、588550、588551、588552、588553、588554、588555、588556、588557、588558、588559、588560、588561、588562、588563、588564、588565、588566、588567、588568、588569、588570、588571、588572、588573、588574、588575、588576、588577、588580、588581、588585、588586、588589、588590、588599、588603、588606、588608、588610、588614、588616、588628、588631、588632、588634、588636、588638、588640、588645、588646、588654、588656、588658、588660、588662、588664、588670、588672、588676、588682、588688、588696、588698、588807、588808、588809、588813、588814、588815、588819、588820、588822、588823、588838、588839、588840、588841、588842、588846、588847、588848、588849、588850、588851、588852、588853、588854、588855、588856、588857、588858、588859、588860、588861、588862、588863、588864、588865、588866、588867、588868、588870、588871、588872、588873、588874、588875、588876、588877、588878、588879、588880、588881、588882、588883、588884、598999、599000、599001、599002、599003、599004、599005、599006、599007、599008、599009、599010、599011、599012、599013、599014、599015、599018、599019、599023、599024、599025、599026、599027、599028、599029、599030、599031、599032、599033、599034、599035、599058、599062、599063、599064、599065、599070、599071、599072、599073、599074、599076、599077、599078、599079、599080、599081、599082、599083、599084、599085、599086、599087、599088、599089、599090、599091、599092、599093、599094、599095、599096、599097、599098、599102、599119、599123、599124、599125、599126、599127、599128、599132、599133、599134、599135、599136、599137、599138、599139、599140、599141、599142、599143、599144、599145、599147、599148、599149、599150、599151、599152、599153、599154、599155、599156、599157、599158、599159、599178、599179、599180、599181、599182、599186、599187、599188、599189、599190、599191、599192、599193、599194、599195、599196、599197、599198、599199、599200、599201、599202、599203、599204、599205、599206、599207、599208、599209、599210、599211、599212、599213、599214、599215、599216、599217、599218、599219、599220、599221、599221、599222、599223、599224、599225、599226、599227、599228、599229、599230、599231、599232、599233、599234、599235、599236、599241、599247、599248、599249、599255、599256、599257、599258、599260、599261、599262、599263、599264、599265、599266、599267、599268、599269、599270、599271、599272、599273、599274、599275、599276、599277、599278、599279、599280、599297、599299、599306、599307、599308、599309、599311、599312、599313、599314、599315、599316、599317、599318、599319、599320、599321、599322、599323、599324、599325、599326、599327、599328、599329、599330、599338、599349、599353、599354、599355、599356、599357、599358、599359、599360、599361、599362、599363、599364、599369、599371、599372、599373、599376、599378、599379、599382、599383、599384、599385、599386、599387、599388、599389、599390、599391、599392、599393、599394、599395、599396、599397、599398、599399、599400、599401、599402、599403、599404、599405、599406、599407、599408、599409、599410、599412、599413、599414、599415、599416、599417、599418、599419、599420、599421、599422、599423、599424、599425、599426、599433、599434、599435、599436、599437、599438、599439、599440、599441、599442、599443、599444、599445、599446、599447、599448、599450、599454、599455、599456、599467、599468、599469、599471、599472、599473、599474、599475、599476、599477、599478、599479、599480、599481、599482、599483、599484、599485、599486、599487、599488、599489、599490、599491、599492、599493、599494、599495、599496、599497、599498、599499、599500、599501、599502、599503、599504、599505、599506、599507、599508、599509、599512、599515、599518、599531、599541、599541、599546、599547、599548、599549、599550、599552、599553、599554、599555、599557、599558、599561、599562、599563、599564、599565、599566、599567、599568、599569、599570、599577、599578、599579、599580、599581、599581、599582、599584、599585、599586、599587、599588、599589、599590、599591、599592、599593、599594、599595、601321、601322、601323、601325、601327、601328、601329、601330、601332、601333、601334、601335、601336、601337、601338、601339、601341、601342、601343、601344、601345、601346、601347、601348、601349、601362、601367、601368、601369、601371、601372、601373、601374、601375、601377、601378、601380、601381、601382、601383、601384、601385、601386、601387以及601388。
在某些实施方案中，下列反义化合物或寡核苷酸靶向CFB核酸的区并且实现下列CFB mRNA的至少50％的抑制，SEQ ID NO:12、30、33、36、37、84、85、86、87、88、89、90、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、198、203、206、208、219、228、237、238、239、317、395、396、397、398、399、400、401、402、403、404、405、406、407、408、409、410、411、412、413、414、415、416、417、418、419、420、421、422、423、424、425、426、427、428、429、430、431、432、433、434、434、435、436、437、438、439、440、441、442、443、444、445、446、447、448、449、450、451、452、453、454、455、456、457、458、459、460、461、462、463、464、465、468、472、473、475、478、479、488、492、494、495、498、499、500、502、503、509、510、511、512、513、514、515、517、518、522、523、524、525、529、530、531、534、535、537、540、541、542、543、544、545、546、547、549、550、551、552、553、554、555、556、557、558、559、563、564、565、569、570、572、573、577、588、589、590、591、592、594、595、596、597、598、599、600、601、602、603、604、605、606、607、608、609、610、611、612、613、614、615、616、617、618、619、623、640、641、644、645、646、647、648、649、650、651、652、653、654、655、656、657、658、659、660、661、662、663、664、665、666、667、668、669、670、671、672、673、674、675、676、677、678、679、680、681、682、683、684、685、686、687、688、689、700、704、705、706、707、708、709、711、712、713、714、715、716、717、718、720、721、722、723、724、725、726、727、728、729、730、731、732、733、734、735、736、737、738、739、740、741、742、743、744、745、745、746、747、748、749、750、751、752、753、754、755、756、758、759、760、761、762、766、767、768、769、770、771、772、773、774、775、776、777、778、779、780、781、782、783、784、785、786、787、788、789、790、791、792、793、794、795、796、797、798、799、813、833、834、841、846、849、850、867以及873。
在某些实施方案中，下列反义化合物或寡核苷酸靶向CFB核酸的区并且实现下列CFB mRNA的至少60％的抑制，SEQ ID NO:516350、532614、532635、532686、532687、532688、532689、532770、532800、532809、532810、532811、532917、532952、588512、588513、588514、588515、588516、588517、588518、588519、588522、588523、588524、588525、588527、588528、588529、588530、588531、588532、588533、588534、588535、588536、588537、588538、588539、588540、588541、588542、588543、588544、588545、588546、588547、588548、588549、588550、588551、588552、588553、588554、588555、588556、588557、588558、588559、588560、588561、588562、588563、588564、588565、588566、588567、588568、588569、588570、588571、588572、588573、588574、588575、588576、588577、588636、588638、588640、588664、588676、588696、588698、588807、588808、588814、588815、588819、588820、588840、588842、588846、588847、588848、588849、588850、588851、588852、588853、588854、588855、588856、588857、588858、588859、588860、588861、588862、588863、588864、588866、588867、588868、588870、588871、588872、588873、588874、588875、588876、588877、588878、588879、588880、588881、588882、588883、588884、598999、599000、599001、599002、599003、599004、599005、599006、599007、599008、599009、599010、599011、599012、599013、599014、599015、599019、599024、599025、599026、599027、599028、599029、599030、599031、599032、599033、599034、599035、599064、599065、599071、599072、599077、599078、599079、599080、599083、599084、599085、599086、599087、599088、599089、599090、599091、599092、599093、599094、599095、599096、599097、599125、599126、599127、599133、599134、599135、599136、599138、599139、599140、599141、599142、599148、599149、599150、599151、599152、599154、599155、599156、599157、599158、599159、599178、599179、599180、599181、599187、599188、599190、599192、599193、599194、599195、599196、599197、599198、599199、599200、599201、599202、599203、599204、599205、599206、599207、599208、599209、599210、599211、599212、599213、599214、599215、599216、599217、599218、599219、599220、599221、599222、599223、599224、599225、599226、599227、599228、599229、599230、599231、599232、599233、599234、599235、599236、599247、599255、599256、599257、599263、599264、599265、599266、599270、599271、599272、599273、599274、599275、599276、599277、599278、599279、599280、599306、599307、599308、599311、599312、599313、599314、599315、599316、599317、599318、599319、599320、599321、599322、599323、599324、599325、599327、599328、599329、599330、599349、599353、599355、599356、599357、599358、599359、599360、599361、599362、599363、599364、599369、599371、599372、599373、599376、599378、599379、599382、599384、599386、599387、599388、599389、599390、599391、599392、599393、599394、599395、599396、599397、599398、599399、599400、599401、599402、599403、599404、599405、599406、599407、599408、599409、599410、599412、599413、599414、599415、599416、599417、599418、599419、599420、599421、599422、599423、599424、599425、599433、599434、599435、599436、599437、599438、599439、599440、599441、599442、599443、599444、599445、599446、599447、599448、599456、599467、599468、599471、599472、599473、599474、599475、599476、599477、599478、599479、599480、599481、599482、599483、599484、599485、599486、599487、599488、599489、599490、599491、599492、599493、599494、599495、599496、599497、599498、599499、599500、599501、599502、599503、599504、599505、599506、599507、599508、599512、599531、599547、599548、599549、599552、599553、599554、599555、599557、599558、599562、599563、599564、599565、599566、599567、599568、599569、599570、599577、599578、599579、599580、599581、599582、599584、599585、599586、599587、599588、599589、599590、599591、599592、599593、599594、599595、601323、601327、601329、601332、601333、601333、601334、601335、601336、601338、601339、601341、601342、601343、601344、601345、601346、601347、601348、601349、601368、601369、601371、601372、601374、601375、601377、601378、601380、601381、601382、601383、601384、601385、601386、601387以及601388。
在某些实施方案中，下列反义化合物或寡核苷酸靶向CFB核酸的区并且实现下列CFB mRNA的至少60％的抑制，SEQ ID NO:12、33、84、85、86、87、198、228、237、238、239、317、395、396、397、398、399、400、401、402、403、404、405、406、407、408、410、411、412、413、414、415、416、417、418、419、420、421、422、423、424、425、426、427、428、429、430、431、432、433、434、435、436、437、438、439、440、441、442、443、444、445、446、447、448、449、450、451、452、453、454、455、456、457、458、459、460、461、462、463、464、465、472、473、513、514、515、531、537、541、542、543、544、545、546、547、549、550、551、552、553、554、555、556、557、558、564、565、569、570、577、590、592、595、596、597、598、599、600、601、602、603、604、605、606、607、608、609、610、611、612、613、614、615、616、617、618、644、645、646、647、648、649、650、651、652、653、654、655、656、657、658、659、660、661、662、663、664、665、666、667、668、669、670、671、672、673、674、675、676、677、678、679、680、682、683、684、685、686、687、688、689、700、704、706、707、708、709、711、712、713、714、715、716、717、720、721、722、723、724、725、726、727、727、728、729、730、731、732、733、734、736、737、738、739、740、741、742、743、744、745、745、746、747、748、749、750、751、752、753、754、755、756、758、759、760、761、767、768、770、772、773、774、775、775、776、776、777、777、778、779、780、781、782、783、783、784、784、785、786、787、788、789、790、791、792、793、794、795、796、797、798、799、813、833、834、841、846、849以及850。
在某些实施方案中，下列反义化合物或寡核苷酸靶向CFB核酸的区并且实现下列CFB mRNA的至少70％的抑制，ISIS NO:516350、532614、532686、532687、532688、532770、532800、532809、532810、532811、532917、532952、588512、588513、588514、588515、588516、588517、588518、588524、588529、588530、588531、588532、588533、588534、588535、588536、588537、588538、588539、588540、588541、588542、588543、588544、588545、588546、588547、588548、588549、588550、588551、588552、588553、588554、588555、588556、588557、588558、588559、588560、588561、588562、588563、588564、588565、588568、588569、588570、588571、588572、588573、588574、588575、588577、588636、588638、588640、588696、588698、588807、588814、588815、588819、588842、588847、588848、588849、588850、588851、588852、588853、588856、588857、588858、588859、588860、588861、588862、588863、588866、588867、588870、588871、588872、588873、588874、588875、588876、588877、588878、588879、588880、588881、588882、588883、588884、599000、599001、599003、599004、599005、599008、599009、599010、599011、599014、599015、599024、599025、599027、599028、599029、599030、599031、599032、599033、599034、599072、599077、599080、599085、599086、599087、599088、599089、599090、599091、599093、599094、599095、599096、599097、599125、599126、599134、599138、599139、599148、599149、599150、599151、599152、599154、599155、599156、599157、599158、599187、599188、599193、599195、599196、599197、599198、599199、599200、599201、599202、599203、599204、599205、599206、599207、599208、599210、599211、599212、599213、599214、599215、599216、599217、599218、599219、599220、599221、599222、599223、599224、599225、599226、599227、599228、599229、599230、599231、599232、599233、599234、599235、599236、599266、599272、599272、599273、599274、599275、599277、599278、599279、599280、599280、599306、599311、599312、599313、599314、599315、599316、599317、599318、599319、599320、599321、599322、599323、599325、599327、599328、599329、599330、599355、599357、599358、599359、599360、599361、599362、599363、599364、599369、599371、599372、599373、599378、599379、599382、599384、599386、599387、599388、599389、599390、599391、599392、599393、599394、599395、599396、599397、599398、599399、599400、599401、599402、599403、599404、599405、599406、599407、599408、599409、599410、599413、599414、599415、599416、599417、599418、599419、599420、599421、599422、599423、599424、599433、599434、599435、599436、599437、599438、599439、599440、599441、599442、599443、599445、599446、599447、599448、599472、599473、599474、599475、599476、599477、599478、599479、599480、599481、599482、599483、599484、599485、599486、599487、599488、599489、599490、599491、599492、599493、599494、599495、599496、599497、599498、599499、599500、599501、599502、599503、599504、599505、599506、599507、599508、599512、599547、599548、599552、599553、599554、599555、599558、599562、599563、599564、599566、599567、599568、599569、599570、599577、599578、599579、599580、599581、599582、599585、599586、599587、599588、599589、599590、599591、599592、599593、599594、599595、601332、601335、601341、601343、601344、601345、601346、601347、601348、601349、601371、601372、601380、601382、601383、601384、601385、601386以及601387。
在某些实施方案中，下列反义化合物或寡核苷酸靶向CFB核酸的区并且实现下列CFB mRNA的至少70％的抑制，SEQ ID NO:12、84、85、86、198、228、237、238、239、317、395、396、397、398、399、402、403、404、405、407、408、410、411、412、412、413、414、415、416、417、418、419、420、421、422、423、424、425、426、427、428、429、430、431、432、433、433、434、435、436、437、438、439、440、441、442、443、444、445、446、447、448、449、450、451、452、453、454、455、456、457、458、459、460、461、462、463、464、464、465、472、473、513、514、515、541、542、543、544、545、546、547、549、550、551、552、553、554、555、556、557、564、565、569、592、595、596、597、598、599、600、601、602、603、604、606、607、608、609、610、611、612、613、614、615、616、617、618、645、646、647、648、649、650、653、654、655、656、659、660、662、663、664、665、666、668、669、670、671、672、673、674、675、676、677、677、678、679、680、682、683、684、686、687、688、689、706、708、709、711、712、713、714、715、720、721、722、723、724、725、726、727、728、729、730、731、732、733、734、736、737、738、739、740、741、742、743、744、745、746、747、748、749、750、751、752、753、754、755、756、767、768、773、775、776、777、778、779、780、781、782、783、784、785、786、787、788、789、790、791、792、793、793、794、795、797、798、799、813、833、834、841、846、849、867以及873。
在某些实施方案中，下列反义化合物或寡核苷酸靶向CFB核酸的区并且实现下列CFB mRNA的至少80％的抑制，ISIS NO:532686、532809、532810、532811、532917、532952、588512、588517、588518、588533、588534、588535、588536、588537、588538、588539、588540、588542、588543、588544、588545、588546、588547、588548、588549、588550、588551、588552、588553、588554、588555、588556、588557、588558、588559、588560、588561、588562、588563、588564、588565、588571、588638、588640、588696、588698、588807、588814、588849、588850、588851、588853、588857、588858、588859、588860、588861、588862、588863、588866、588867、588871、588872、588873、588874、588875、588876、588877、588878、588879、588880、588881、588882、588883、599001、599024、599025、599033、599086、599087、599088、599089、599093、599094、599095、599096、599134、599139、599148、599149、599151、599154、599155、599156、599158、599188、599195、599196、599198、599201、599202、599203、599204、599205、599206、599207、599212、599213、599215、599216、599217、599218、599219、599220、599221、599222、599223、599224、599225、599226、599227、599228、599229、599230、599231、599232、599233、599234、599235、599236、599272、599273、599275、599277、599278、599279、599280、599311、599313、599314、599316、599317、599318、599320、599321、599322、599323、599327、599328、599329、599330、599355、599357、599358、599359、599360、599361、599362、599363、599364、599371、599372、599373、599378、599379、599382、599384、599386、599387、599388、599389、599390、599391、599392、599393、599397、599398、599399、599400、599401、599403、599404、599405、599407、599408、599409、599410、599413、599414、599415、599416、599417、599418、599419、599420、599421、599422、599423、599424、599433、599434、599435、599436、599437、599438、599439、599440、599441、599445、599446、599447、599448、599474、599476、599477、599479、599481、599482、599483、599485、599486、599487、599488、599489、599490、599491、599492、599494、599495、599496、599497、599498、599499、599500、599502、599503、599504、599505、599506、599507、599508、599547、599552、599553、599554、599558、599563、599567、599568、599569、599570、599577、599578、599581、599582、599585、599587、599588、599590、599591、599592、599593、599594、601332、601344、601345、601382、601383以及601385。
在某些实施方案中，下列反义化合物或寡核苷酸靶向CFB核酸的区并且实现下列CFB mRNA的至少80％的抑制，SEQ ID NO:84、237、238、239、317、395、397、411、412、413、414、415、417、418、419、420、421、422、423、425、426、427、429、430、431、433、434、435、436、437、438、439、440、441、442、443、444、445、446、447、448、449、450、451、452、453、454、455、456、457、458、459、460、461、462、463、464、465、472、473、514、515、542、543、544、545、546、547、550、551、552、553、554、555、556、557、564、595、599、600、601、602、603、606、607、608、609、610、611、612、613、614、615、616、617、618、646、655、660、662、663、666、669、670、671、672、673、675、676、677、678、679、682、684、686、687、688、689、706、708、709、711、712、713、714、715、720、722、723、724、725、726、727、729、730、731、732、733、736、737、738、739、740、741、742、743、744、745、746、747、748、749、750、751、752、753、754、755、756、768、775、776、778、781、782、783、784、785、787、788、789、790、791、792、793、794、799、813、833、834、841、849、867以及873。
在某些实施方案中，下列反义化合物或寡核苷酸靶向CFB核酸的区并且实现下列CFB mRNA的至少90％的抑制，ISIS NO:532686、532811、532917、588536、588537、588538、588539、588544、588545、588546、588548、588551、588552、588553、588554、588555、588556、588557、588558、588559、588560、588561、588562、588564、588638、588640、588696、588698、588849、588850、588851、588860、588866、588867、588872、588873、588874、588876、588877、588878、588879、588881、588883、599149、599188、599203、599206、599220、599221、599222、599223、599224、599225、599226、599227、599228、599229、599235、599236、599279、599280、599314、599321、599362、599378、599390、599391、599398、599399、599404、599413、599414、599416、599419、599420、599422、599435、599437、599438、599441、599483、599494、599508、599552、599553、599554、599568、599570、599577、599581、599591、599592以及599593。
在某些实施方案中，下列反义化合物或寡核苷酸靶向CFB核酸的区并且实现下列CFB mRNA的至少90％的抑制，SEQ ID NO:84、238、239、317、412、413、420、421、426、434、436、437、438、439、440、442、443、444、445、446、448、451、452、453、454、455、456、457、458、459、460、461、462、464、465、472、473、514、515、542、543、544、545、546、551、553、555、556、599、600、601、602、610、616、617、618、662、666、670、676、677、678、688、689、713、723、729、730、740、741、742、743、744、745、746、747、748、749、755、756、768、783、793、833以及867。
在某些实施方案中，化合物可包含本文所述的靶向CFB的任何寡核苷酸和缀合物基团或者由本文所述的靶向CFB的任何寡核苷酸和缀合物基团组成。
在某些实施方案中，化合物可包含修饰寡核苷酸和缀合物基团，其中所述修饰寡核苷酸由在SEQ ID NO:1的核苷酸2193-2212、2195-2210、2457-2476、2571-2590、2584-2603、2588-2607、2592-2611、2594-2613、2597-2616、2600-2619或2596-2611内互补的10至30个连接核苷组成。
在某些实施方案中，化合物可包含修饰寡核苷酸和缀合物基团，其中所述修饰寡核苷酸由具有包含SEQ ID NO:198、228、237、440、444、448、450、453、455、549以及598的任一个的核碱基序列的10至30个连接核苷组成。
在某些实施方案中，化合物可包含修饰寡核苷酸和缀合物基团，其中所述修饰寡核苷酸具有由SEQ ID NO:198、228、237、440、444、448、450、453、455、549以及598的任一个组成的核碱基序列。
在某些实施方案中，前述化合物或寡核苷酸的任一个可包含至少一个修饰的核苷间键联、至少一个修饰的糖和/或至少一个修饰的核碱基。
在某些方面中，前述化合物或寡核苷酸的任一个可包含至少一个修饰的糖。在某些方面中，至少一个修饰的糖包含2'-O-甲氧基乙基基团。在某些方面中，至少一个修饰的糖为双环糖，诸如4’-CH(CH3)-O-2’基团、4’-CH2-O-2’基团或4’-(CH2)2-O-2’基团。
在某些方面中，修饰寡核苷酸包含至少一个修饰的核苷间键联，诸如硫代磷酸酯核苷间键联。
在某些实施方案中，修饰寡核苷酸包含至少1个、2个、3个、4个、5个、6个或7个磷酸二酯核苷间键联。
在某些实施方案中，修饰寡核苷酸的每个核苷间键联选自磷酸二酯核苷间键联和硫代磷酸酯核苷间键联。
在某些实施方案中，修饰寡核苷酸的每个核苷间键联为硫代磷酸酯核苷间键联。
在某些实施方案中，前述化合物或寡核苷酸的任一个包含至少一个修饰的核碱基，诸如5-甲基胞嘧啶。
在某些实施方案中，化合物包含缀合物基团和修饰寡核苷酸，所述寡核苷酸包含：
由连接脱氧核苷组成的缺口区段；
由连接核苷组成的5’翼区段；以及
由连接核苷组成的3’翼区段；
其中所述缺口区段定位在所述5’翼区段与所述3’翼区段之间并且其中每个翼区段的每个核苷包含修饰的糖。在某些实施方案中，寡核苷酸由具有包含SEQ ID NO:198、228、237、440、444、448、450、453、455、549或598中所示的序列的核碱基序列的10至30个连接核苷组成。
在某些实施方案中，修饰的寡核苷酸具有包含SEQ ID NO:198、228、237、440、444、448、450、453或455中所示的序列的核碱基序列或者由SEQ ID NO:198、228、237、440、444、448、450、453或455中所示的序列组成的核碱基序列，其中所述修饰寡核苷酸包含：
由十个连接脱氧核苷组成的缺口区段；
由五个连接核苷组成的5’翼区段；以及
由五个连接核苷组成的3’翼区段；
其中所述缺口区段定位在所述5’翼区段与所述3’翼区段之间并且其中每个翼区段的每个核苷包含2’-O-甲氧基乙基糖，其中每个核苷间键联为硫代磷酸酯键联并且其中每个胞嘧啶为5-甲基胞嘧啶。
在某些实施方案中，化合物包含单链修饰寡核苷酸和缀合物基团或者由单链修饰寡核苷酸和缀合物基团组成，其中所述寡核苷酸由具有由SEQ ID NO:198、228、237、440、444、448、450、453或455中所示的序列组成的核碱基序列的20个连接的核苷组成，其中所述寡核苷酸包含：
由十个连接脱氧核苷组成的缺口区段；
由五个连接核苷组成的5’翼区段；以及
由五个连接核苷组成的3’翼区段；
其中所述缺口区段定位在所述5’翼区段与所述3’翼区段之间并且其中每个翼区段的每个核苷包含2’-O-甲氧基乙基糖，其中每个核苷间键联为硫代磷酸酯键联并且其中每个胞嘧啶为5-甲基胞嘧啶。
在某些实施方案中，化合物包含ISIS 588540和缀合物基团或由ISIS 588540和缀合物基团组成。在某些实施方案中，ISIS 588540具有以下化学结构：
在某些实施方案中，修饰的寡核苷酸具有包含SEQ ID NO:549中所述的序列的核碱基序列或者由SEQ ID NO:549中所示的序列组成的核碱基序列，其中所述修饰寡核苷酸包含：
由十个连接脱氧核苷组成的缺口区段；
由三个连接的核苷组成的5’翼区段；以及
由三个连接的核苷组成的3’翼区段；
其中所述缺口区段定位在所述5’翼区段与所述3’翼区段之间并且其中每个翼区段的每个核苷包含cEt糖，其中每个核苷间键联为硫代磷酸酯键联并且其中每个胞嘧啶为5-甲基胞嘧啶。
在某些方面，修饰的寡核苷酸具有包含SEQ ID NO:598中所述的序列的核碱基序列或者由SEQ ID NO:598中所示的序列组成的核碱基序列，其中所述修饰寡核苷酸包含：
由十个连接脱氧核苷组成的缺口区段；
由三个连接的核苷组成的5’翼区段；以及
由三个连接的核苷组成的3’翼区段；
其中所述缺口区段定位在所述5’翼区段与所述3’翼区段之间；其中所述5’翼区段包含2’-O-甲氧基乙基糖、2’-O-甲氧基乙基糖以及5’至3’方向上的cEt糖；其中所述3’翼区段包含cEt糖、cEt糖以及5’至3’方向上的2’-O-甲氧基乙基糖；其中每个核苷间键联为硫代磷酸酯键联；并且其中每个胞嘧啶为5-甲基胞嘧啶。
在前述实施方案的任一个中，化合物或寡核苷酸与编码CFB的核酸可以至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％互补。
在前述实施方案的任一个中，化合物或寡核苷酸可以是单链的。
在某些实施方案中，缀合物基团在修饰寡核苷酸的5’端连接至修饰寡核苷酸。在某些实施方案中，缀合物基团在修饰寡核苷酸的3’端连接至修饰寡核苷酸。在某些实施方案中，缀合物基团包含至少一个N-乙酰基半乳糖胺(GalNAc)、至少两个N-乙酰基半乳糖胺(GalNAc)或至少三个N-乙酰基半乳糖胺(GalNAc)。
在某些实施方案中，具有以下化学结构的化合物包含具有5’-X的ISIS 588540或者由具有5’-X的ISIS 588540组成，其中X为包含如本文所述的GalNAc的缀合物基团：
在某些实施方案中，化合物包含SEQ ID NO:440、5’-GalNAc以及以下化学结构所表示的化学修饰或者由SEQ ID NO:440、5’-GalNAc以及以下化学结构所表示的化学修饰组成：
其中R1为–OCH2CH2OCH3(MOE)并且R2为H；或者R1和R2一起形成桥，其中R1为–O-并且R2为–CH2-、-CH(CH3)-或-CH2CH2-，并且R1和R2直接连接使得所形成的桥选自：-O-CH2-、-O-CH(CH3)-以及–O-CH2CH2-；
并且对于相同环(每个环为独立地)上的R3和R4的每一对：R3选自H和-OCH2CH2OCH3并且R4为H；或者R3和R4一起形成桥，其中R3为–O-并且R4为–CH2-、-CH(CH3)-或-CH2CH2-，并且R3和R4直接连接使得所形成的桥选自：-O-CH2-、-O-CH(CH3)-以及–O-CH2CH2-；
并且R5选自H和–CH3；
并且Z选自S-和O-。
在某些实施方案中，化合物包含ISIS 696844。在某些实施方案中，化合物由ISIS696844组成。在某些实施方案中，ISIS 696844具有以下化学结构：
在某些实施方案中，化合物包含ISIS 696845。在某些实施方案中，化合物由ISIS696845组成。在某些实施方案中，ISIS 696845具有以下化学结构：
在某些实施方案中，化合物包含ISIS 698969。在某些实施方案中，化合物由ISIS698969组成。在某些实施方案中，ISIS 698969具有以下化学结构：
在某些实施方案中，化合物包含ISIS 698970。在某些实施方案中，化合物由ISIS698970组成。在某些实施方案中，ISIS 698970具有以下化学结构：
某些实施方案提供包含化合物中的任一种以及药学上可接受的载体或稀释剂中的至少一种的组合物，所述化合物包含靶向CFB的修饰寡核苷酸或其盐以及缀合物基团或者由靶向CFB的修饰寡核苷酸或其盐以及缀合物基团组成。
在某些实施方案中，如本文所述的化合物或组合物因具有以下至少一种体外IC50而有效：低于250nM、低于200nM、低于150nM、低于100nM、低于90nM、低于80nM、低于70nM、低于65nM、低于60nM、低于55nM、低于50nM、低于45nM、低于40nM、低于35nM、低于30nM、低于25nM或低于20nM的体外IC50。
在某些实施方案中，如本文所述的化合物或组合物具有高度可耐受性，如由以下至少一个所表明：ALT或AST值增加至用生理盐水处理过的动物的至多4倍、3倍或2倍，或肝脏、脾脏或肾脏重量增加至多30％、20％、15％、12％、10％、5％或2％。在某些实施方案中，如本文所述的化合物或组合物具有高度可耐受性，如由相较于用生理盐水处理过的动物而言ALT或AST未增加所表明。在某些实施方案中，如本文所述的化合物或组合物具有高度可耐受性，如由相较于用生理盐水处理过的动物而言肝脏、脾脏或肾脏重量未增加所表明。
某些实施方案提供一种组合物，其包含前述实施方案的任一个的化合物或其盐、和药学上可接受的载体或稀释剂中的至少一种。在某些方面中，所述组合物具有小于约40厘泊(cP)、小于约30厘泊(cP)、小于约20厘泊(cP)、小于约15厘泊(cP)或小于约10厘泊(cP)的黏度。在某些方面中，具有任何前述黏度的任一个的组合物以约100mg/mL、约125mg/mL、约150mg/mL、约175mg/mL、约200mg/mL、约225mg/mL、约250mg/mL、约275mg/mL或约300mg/mL的浓度包含本文提供的化合物。在某些方面中，具有任何前述黏度和/或化合物浓度的任一个的组合物具有室温或约20℃、约21℃、约22℃、约23℃、约24℃、约25℃、约26℃、约27℃、约28℃、约29℃或约30℃的温度。
在某些实施方案中，治疗、预防或减轻与受试者补体替代途径失调相关的疾病的方法包括向受试者施用本文所述的化合物或组合物，由此治疗、预防或减轻疾病。在某些方面中，补体替代途径的激活程度高于正常程度。在某些实施方案中，治疗、预防或减轻与受试者补体替代途径失调相关的疾病的方法包括向受试者施用包含修饰寡核苷酸和缀合物基团的化合物或者由修饰寡核苷酸和缀合物基团组成的化合物，其中修饰寡核苷酸由10至30个连接核苷组成并且具有包含SEQ ID NO:6-808的任一个的核碱基序列的核碱基序列。在某些实施方案中，治疗、预防或减轻与受试者补体替代途径失调相关的疾病的方法包括向受试者施用包含修饰寡核苷酸和缀合物基团的化合物或者由修饰寡核苷酸和缀合物基团组成的化合物，其中修饰寡核苷酸由具有包含SEQ ID NO:198、228、237、440、444、448、450、453、455、549以及598的任一个的核碱基序列的10至30个连接核苷组成。在某些实施方案中，治疗、预防或减轻与受试者补体替代途径失调相关的疾病的方法包括向受试者施用包含ISIS 696844、ISIS696845、ISIS 698969或ISIS 698970的化合物或者由ISIS 696844、ISIS696845、ISIS 698969或ISIS 698970组成的化合物。
在某些实施方案中，治疗、预防或减轻受试者的黄斑变性诸如老年性黄斑变性(AMD)的方法包括向受试者施用本文所述的化合物或组合物，由此治疗、预防或减轻疾病。在某些方面中，补体替代途径的激活程度高于正常程度。在某些方面中，AMD是湿性AMD。在某些方面中，AMD是干性AMD，诸如地图样萎缩。在某些实施方案中，治疗、预防或减轻受试者的黄斑变性诸如老年性黄斑变性(AMD)、湿性AMD、干性AMD或地图样萎缩的方法包括向受试者施用包含修饰寡核苷酸和缀合物基团的化合物或者由修饰寡核苷酸和缀合物基团组成的化合物，其中修饰寡核苷酸由10至30个连接核苷组成并且具有包含SEQ ID NO:6-808的任一个的核碱基序列的核碱基序列。在某些实施方案中，治疗、预防或减轻受试者的黄斑变性诸如老年性黄斑变性(AMD)、湿性AMD、干性AMD或地图样萎缩的方法包括向受试者施用包含修饰寡核苷酸和缀合物基团的化合物或者由修饰寡核苷酸和缀合物基团组成的化合物，其中修饰寡核苷酸由具有包含SEQ ID NO:198、228、237、440、444、448、450、453、455、549以及598的任一个的核碱基序列的10至30个连接核苷组成。在某些实施方案中，治疗、预防或减轻受试者的黄斑变性诸如老年性黄斑变性(AMD)、湿性AMD、干性AMD或地图样萎缩的方法包括向受试者施用包含ISIS 696844、ISIS 696845、ISIS 698969或ISIS 698970的化合物或者由ISIS 696844、ISIS 696845、ISIS 698969或ISIS 698970组成的化合物。在某些方面中，化合物或组合物以肠胃外方式施用至受试者。
在某些实施方案中，治疗、预防或减轻与受试者补体替代途径失调相关的肾病的方法包括向受试者施用本文所述的化合物或组合物，由此治疗、预防或减轻肾病。在某些实施方案中，治疗、预防或减轻与受试者补体替代途径失调相关的肾病的方法包括向受试者施用包含修饰寡核苷酸和缀合物基团的化合物或者由修饰寡核苷酸和缀合物基团组成的化合物，其中修饰寡核苷酸由10至30个连接核苷组成并且具有包含SEQ ID NO:6-808的任一个的核碱基序列的核碱基序列。在某些实施方案中，治疗、预防或减轻与受试者补体替代途径失调相关的肾病的方法包括向受试者施用包含修饰寡核苷酸和缀合物基团的化合物或者由修饰寡核苷酸和缀合物基团组成的化合物，其中修饰寡核苷酸由具有包含SEQ IDNO:198、228、237、440、444、448、450、453、455、549以及598的任一个的核碱基序列的10至30个连接核苷组成。在某些实施方案中，治疗、预防或减轻与受试者补体替代途径失调相关的肾病的方法包括向受试者施用包含ISIS 696844、ISIS 696845、ISIS 698969或ISIS698970的化合物或者由ISIS 696844、ISIS 696845、ISIS 698969或ISIS 698970组成的化合物。在某些方面中，补体替代途径的激活程度高于正常程度。在某些方面中，肾病为狼疮肾炎、系统性红斑狼疮(SLE)、致密沉积物疾病(DDD)、C3肾小球肾炎(C3GN)、CFHR5肾病或非典型的溶血性尿毒性综合征(aHUS)或其任何组合。在某些方面中，肾病与C3沉积物诸如肾小球中的C3沉积物相关。在某些方面中，肾病与低于正常循环的C3水平诸如血清或血浆C3水平相关。在某些方面中，施用化合物或组合物减少或抑制眼睛C3水平诸如C3蛋白质水平的积累。在某些方面中，施用化合物或组合物减少眼睛C3沉积物的水平或者抑制眼睛C3沉积物的积累。在某些方面中，化合物或组合物以肠胃外方式施用至受试者。在某些方面中，施用化合物或组合物减少或抑制肾中C3水平诸如C3蛋白质水平的积累。在某些方面中，施用化合物或组合物减少肾C3沉积物的水平或者抑制肾C3沉积物诸如肾小球中的C3水平的积累。在某些方面中，例如通过检测受试者血液中的补体水平或膜攻击复合物水平和/或进行针对与疾病相关的补体因子的基因突变的基因测试，受试者被鉴定为具有与补体替代途径失调相关的疾病或处于患有与补体替代途径失调相关的疾病的风险。
在某些实施方案中，抑制具有与补体替代途径失调相关的疾病或处于患有与补体替代途径失调相关的疾病的风险的受试者的补体因子B(CFB)表达的方法包括向受试者施用本文所述的化合物或组合物，由此抑制受试者CFB表达。在某些实施方案中，抑制具有与补体替代途径失调相关的疾病或处于患有与补体替代途径失调相关的疾病的风险的受试者的补体因子B(CFB)表达的方法包括向受试者施用包含修饰寡核苷酸和缀合物基团的化合物或者由修饰寡核苷酸和缀合物基团组成的化合物，其中修饰寡核苷酸由10至30个连接核苷组成并且具有包含SEQ ID NO:6-808的任一个的核碱基序列的核碱基序列。在某些实施方案中，抑制具有与补体替代途径失调相关的疾病或处于患有与补体替代途径失调相关的疾病的风险的受试者的补体因子B(CFB)表达的方法包括向受试者施用包含修饰寡核苷酸和缀合物基团的化合物或者由修饰寡核苷酸和缀合物基团组成的化合物，其中修饰寡核苷酸由具有包含SEQ ID NO:198、228、237、440、444、448、450、453、455、549以及598的任一个的核碱基序列的10至30个连接核苷组成。在某些实施方案中，抑制具有与补体替代途径失调相关的疾病或处于患有与补体替代途径失调相关的疾病的风险的受试者的补体因子B(CFB)表达的方法包括向受试者施用包含ISIS 696844、ISIS 696845、ISIS 698969或ISIS698970的化合物或者由ISIS 696844、ISIS 696845、ISIS 698969或ISIS 698970组成的化合物。在某些方面中，施用化合物或组合物抑制眼睛中的CFB的表达。在某些方面中，受试者具有老年性黄斑变性(AMD)诸如湿性AMD和干性AMD或者处于患有老年性黄斑变性(AMD)诸如湿性AMD和干性AMD的风险。在某些方面中，干性AMD可以为地图样萎缩。地图样萎缩被视为涉及视网膜变性的晚期型干性AMD。在某些方面中，施用化合物或组合物抑制肾诸如肾小球中的CFB的表达。在某些方面中，受试者具有狼疮肾炎、系统性红斑狼疮(SLE)、致密沉积物疾病(DDD)、C3肾小球肾炎(C3GN)、CFHR5肾病或非典型的溶血性尿毒性综合征(aHUS)或其任何组合或者处于患有狼疮肾炎、系统性红斑狼疮(SLE)、致密沉积物疾病(DDD)、C3肾小球肾炎(C3GN)、CFHR5肾病或非典型的溶血性尿毒性综合征(aHUS)或其任何组合的风险。
在某些实施方案中，减少或抑制具有与补体替代途径失调相关的疾病或处于患有与补体替代途径失调相关的疾病的风险的受试者眼睛中的C3沉积物的积累的方法包括向受试者施用本文所述的化合物或组合物，由此减少或抑制受试者眼睛中的C3沉积物的积累。在某些实施方案中，减少或抑制具有与补体替代途径失调相关的疾病或处于患有与补体替代途径失调相关的疾病的风险的受试者眼睛中的C3沉积物的积累的方法包括向受试者施用包含修饰寡核苷酸和缀合物基团的化合物或者由修饰寡核苷酸和缀合物基团组成的化合物，其中修饰寡核苷酸由10至30个连接核苷组成并且具有包含SEQ ID NO:6-808的任一个的核碱基序列的核碱基序列。在某些实施方案中，抑制具有与补体替代途径失调相关的疾病或处于患有与补体替代途径失调相关的疾病的风险的受试者眼睛中的C3沉积物的积累的方法包括向受试者施用包含修饰寡核苷酸和缀合物基团的化合物或者由修饰寡核苷酸和缀合物基团组成的化合物，其中修饰寡核苷酸由具有包含SEQ ID NO:198、228、237、440、444、448、450、453、455、549以及598的任一个的核碱基序列的10至30个连接核苷组成。在某些实施方案中，减少或抑制具有与补体替代途径失调相关的疾病或处于患有与补体替代途径失调相关的疾病的风险的受试者眼睛中的C3沉积物的积累的方法包括向受试者施用包含ISIS 696844、ISIS 696845、ISIS 698969或ISIS 698970的化合物或者由ISIS 696844、ISIS 696845、ISIS 698969或ISIS 698970组成的化合物。在某些方面中，受试者具有老年性黄斑变性(AMD)诸如湿性AMD和干性AMD或者处于患有老年性黄斑变性(AMD)诸如湿性AMD和干性AMD的风险。在某些方面中，干性AMD可以为地图样萎缩。在某些方面中，化合物或组合物以肠胃外方式施用至受试者。
在某些实施方案中，减少或抑制具有与补体替代途径失调相关的疾病或处于患有与补体替代途径失调相关的疾病的风险的受试者肾中的C3沉积物的积累的方法包括向受试者施用本文所述的化合物或组合物，由此减少或抑制受试者肾中的C3沉积物的积累。在某些实施方案中，减少或抑制具有与补体替代途径失调相关的疾病或处于患有与补体替代途径失调相关的疾病的风险的受试者肾中的C3沉积物的积累的方法包括向受试者施用包含修饰寡核苷酸和缀合物基团的化合物或者由修饰寡核苷酸和缀合物基团组成的化合物，其中修饰寡核苷酸由10至30个连接核苷组成并且具有包含SEQ ID NO:6-808的任一个的核碱基序列的核碱基序列。在某些实施方案中，抑制具有与补体替代途径失调相关的疾病或处于患有与补体替代途径失调相关的疾病的风险的受试者肾中的C3沉积物的积累的方法包括向受试者施用包含修饰寡核苷酸和缀合物基团的化合物或者由修饰寡核苷酸和缀合物基团组成的化合物，其中修饰寡核苷酸由具有包含SEQ ID NO:198、228、237、440、444、448、450、453、455、549以及598的任一个的核碱基序列的10至30个连接核苷组成。在某些实施方案中，减少或抑制具有与补体替代途径失调相关的疾病或处于患有与补体替代途径失调相关的疾病的风险的受试者肾中的C3沉积物的积累的方法包括向受试者施用包含ISIS696844、ISIS 696845、ISIS 698969或ISIS 698970的化合物或者由ISIS 696844、ISIS696845、ISIS 698969或ISIS 698970组成的化合物。在某些方面中，受试者具有狼疮肾炎、系统性红斑狼疮(SLE)、致密沉积物疾病(DDD)、C3肾小球肾炎(C3GN)、CFHR5肾病或非典型的溶血性尿毒性综合征(aHUS)或其任何组合或者处于患有狼疮肾炎、系统性红斑狼疮(SLE)、致密沉积物疾病(DDD)、C3肾小球肾炎(C3GN)、CFHR5肾病或非典型的溶血性尿毒性综合征(aHUS)或其任何组合的风险。在某些方面中，化合物或组合物以肠胃外方式施用至受试者。
某些实施方案涉及本文所述的化合物或组合物用于治疗与补体替代途径失调相关的疾病的用途。某些实施方案涉及使用包含修饰寡核苷酸和缀合物基团的化合物或者由修饰寡核苷酸和缀合物基团组成的化合物用于治疗与补体替代途径失调相关的疾病，其中修饰寡核苷酸由10至30个连接核苷组成并且具有包含SEQ ID NO:6-808的任一个的核碱基序列的核碱基序列。某些实施方案涉及包含修饰寡核苷酸和缀合物基团的化合物或者由修饰寡核苷酸和缀合物基团组成的化合物用于治疗与补体替代途径失调相关的疾病的用途，其中修饰寡核苷酸由具有包含SEQ ID NO:198、228、237、440、444、448、450、453、455、549以及598的任一个的核碱基序列的10至30个连接核苷组成。某些实施方案涉及包含ISIS696844、ISIS 696845、ISIS 698969或ISIS 698970的化合物或者由ISIS 696844、ISIS696845、ISIS 698969或ISIS 698970组成的化合物用于治疗与补体替代途径失调相关的疾病的用途。在某些方面中，补体替代途径的激活程度高于正常程度。在某些方面中，疾病为黄斑变性，诸如可以为湿性AMD或干性AMD的老年性黄斑变性(AMD)。在某些方面中，干性AMD可以为地图样萎缩。在某些方面中，肾病为肾病，诸如狼疮肾炎、系统性红斑狼疮(SLE)、致密沉积物疾病(DDD)、C3肾小球肾炎(C3GN)、CFHR5肾病或非典型的溶血性尿毒性综合征(aHUS)或其任何组合。在某些方面中，所述化合物或组合物以肠胃外方式施用至受试者。
在某些实施方案中，本文所述的化合物或组合物以肠胃外方式施用。例如，在某些实施方案中，化合物或组合物可通过注射或输注施用。肠胃外施用包括皮下施用、静脉内施用、肌肉内施用、动脉内施用、腹膜内施用或颅内施用，例如鞘内或脑室内施用。
反义化合物
寡聚化合物包括但不限于寡核苷酸、寡核苷、寡核苷酸类似物、寡核苷酸模拟物、反义化合物、反义寡核苷酸及siRNA。寡聚化合物可为目标核酸的“反义序列”，意味着其能够与目标核酸经由氢键合进行杂交。
在某些实施方案中，反义化合物具有在按5'至3'方向书写时包含其所靶向的目标核酸的目标区段的反向互补序列的核碱基序列。
在某些实施方案中，反义化合物的长度为10至30个亚单位。在某些实施方案中，反义化合物的长度为12至30个亚单位。在某些实施方案中，反义化合物的长度为12至22个亚单位。在某些实施方案中，反义化合物的长度为14至30个亚单位。在某些实施方案中，反义化合物的长度为14至20个亚单位。在某些实施方案中，反义化合物的长度为15至30个亚单位。在某些实施方案中，反义化合物的长度为15至20个亚单位。在某些实施方案中，反义化合物的长度为16至30个亚单位。在某些实施方案中，反义化合物的长度为16至20个亚单位。在某些实施方案中，反义化合物的长度为17至30个亚单位。在某些实施方案中，反义化合物的长度为17至20个亚单位。在某些实施方案中，反义化合物的长度为18至30个亚单位。在某些实施方案中，反义化合物的长度为18至21个亚单位。在某些实施方案中，反义化合物的长度为18至20个亚单位。在某些实施方案中，反义化合物的长度为20至30个亚单位。换句话来说，所述反义化合物分别为12至30个连接的亚单位、14至30个连接的亚单位、14至20个亚单位、15至30个亚单位、15至20个亚单位、16至30个亚单位、16至20个亚单位、17至30个亚单位、17至20个亚单位、18至30个亚单位、18至20个亚单位、18至21个亚单位、20至30个亚单位或12至22个连接的亚单位。在某些实施方案中，反义化合物的长度为14个亚单位。在某些实施方案中，反义化合物的长度为16个亚单位。在某些实施方案中，反义化合物的长度为17个亚单位。在某些实施方案中，反义化合物的长度为18个亚单位。在某些实施方案中，反义化合物的长度为19个亚单位。在某些实施方案中，反义化合物的长度为20个亚单位。在其他实施方案中，反义化合物为8至80个、12至50个、13至30个、13至50个、14至30个、14至50个、15至30个、15至50个、16至30个、16至50个、17至30个、17至50个、18至22个、18至24个、18至30个、18至50个、19至22个、19至30个、19至50个或20至30个连接的亚单位。在某些这类实施方案中，反义化合物的长度为8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、31个、32个、33个、34个、35个、36个、37个、38个、39个、40个、41个、42个、43个、44个、45个、46个、47个、48个、49个、50个、51个、52个、53个、54个、55个、56个、57个、58个、59个、60个、61个、62个、63个、64个、65个、66个、67个、68个、69个、70个、71个、72个、73个、74个、75个、76个、77个、78个、79个或80个连接的亚单位，或处于由上述任何两个值所界定的范围内。在一些实施方案中，反义化合物为反义寡核苷酸，且连接的亚单位为核苷酸。
在某些实施方案中，反义寡核苷酸可为缩短或截短的反义寡核苷酸。举例来说，单个亚单位可自5'端缺失(5'截短)，或者自3'端缺失(3'截短)。靶向CFB核酸的缩短或截短的反义化合物可有两个亚单位自反义化合物的5'端缺失，或者可有两个亚单位自反义化合物的3'端缺失。或者，缺失的核苷可散布于整个反义化合物中，例如在5'端有一个核苷缺失和3'端有一个核苷缺失的反义化合物中。
当单个额外亚单位存在于延长的反义化合物中时，所述额外亚单位可位于反义化合物的5'端或3'端处。当存在两个或更多个额外亚单位时，所添加的亚单位可彼此邻近，例如在反义化合物的5'端上添加有两个亚单位(5'添加)或3'端上添加有两个亚单位(3'添加)的反义化合物中。或者，所添加的亚单位可散布于整个反义化合物中，例如在5'端上添加有一个亚单位和3'端上添加有一个亚单位的反义化合物中。
有可能增加或减少反义化合物(如反义寡核苷酸)的长度和/或引入错配碱基而不消除活性。例如，在Woolf等(Proc.Natl.Acad.Sci.USA89:7305-7309,1992)中，测试长度为13-25个核碱基的一系列反义寡核苷酸在卵母细胞注射模型中诱导目标RNA裂解的能力。长度为25个核碱基且在接近反义寡核苷酸的末端处具有8或11个错配碱基的反义寡核苷酸能够导引目标mRNA进行特异性裂解，但程度低于不含错配的反义寡核苷酸。同样，目标特异性裂解可使用具有13个核碱基的反义寡核苷酸(包括具有1或3个错配者)达成。
Gautschi等(J.Natl.Cancer Inst.93:463-471,March 2001)表明与bcl-2mRNA具有100％互补性且与bcl-xL mRNA具有3个错配的寡核苷酸在体外及体内减少bcl-2及bcl-xL两者的表达的能力。此外，这个寡核苷酸展现有效的体内抗肿瘤活性。
Maher和Dolnick(Nuc.Acid.Res.16:3341-3358,1988)分别测试一系列具有14个核碱基的串联反义寡核苷酸以及包含所述串联反义寡核苷酸中的两个或三个的序列的具有28个和42个核碱基的反义寡核苷酸在家兔网状红血球测定中阻止人DHFR转译的能力。3个具有14个核碱基的反义寡核苷酸各自能够单独抑制转译，但程度相较于具有28个或42个核碱基的反义寡核苷酸而言更适中。
某些反义化合物基序和机制
在某些实施方案中，反义化合物具有排列成一定型态或基序的化学上修饰的亚单位，以赋予反义化合物以诸如抑制活性增强、对目标核酸的结合亲和力增强或对由体内核酸酶引起的降解具抗性的性质。
嵌合反义化合物通常含有至少一个修饰的以赋予增强的核酸酶降解抗性、增加的细胞吸收、增强的对目标核酸的结合亲和力和/或增强的抑制活性的区。嵌合反义化合物的第二区可赋予另一个所需的性质，例如用作细胞核酸内切酶RNA酶H的底物，所述酶裂解RNA:DNA双螺旋体的RNA链。
反义活性可以从涉及反义化合物(例如，寡核苷酸)与靶核酸的杂交的任何机制获得，其中杂交最终产生生物作用。在某些实施方案中，调节靶核酸的量和/或活性。在某些实施方案中，减少靶核酸的量和/或活性。在某些实施方案中，反义化合物与靶核酸的杂交最终导致靶核酸降解。在某些实施方案中，反义化合物与靶核酸的杂交未导致靶核酸降解。在某些实施方案中，反义化合物与靶核酸杂交的出现(占位)导致反义活性的调节。在某些实施方案中，具有特定化学基序或化学修饰的模式的反义化合物特别适合采用一种或多种机制。在某些实施方案中，反义化合物通过一种以上的机制和/或通过从未被阐述的机制起作用。因此，本文所述的反义化合物不限于特定机制。
反义机制包括但不限于RNA酶H介导的反义；RNAi机制，其利用RISC途径并且包括但不限于siRNA、ssRNA和微RNA机制；以及占位型机制。某些反义化合物可通过一种以上的此机制和/或通过另外的机制起作用。
RNA酶H介导的反义
在某些实施方案中，反义活性通过RNA酶H导致靶RNA的至少部分地裂解。RNA酶H为裂解RNA:DNA双链体的RNA链的细胞核酸内切酶。本领域已知“DNA样”的单链反义化合物在哺乳动物细胞中引发RNA酶H活性。因此，包含DNA或DNA状核苷的至少一部分的反义化合物可激活RNA酶H，导致靶核酸的裂解。在某些实施方案中，利用RNA酶H的反义化合物包含一种或多种修饰核苷。在某些实施方案中，此类反义化合物包含至少一个1-8修饰核苷的嵌段。在某些实施方案中，修饰核苷不支持RNA酶H活性。在某些实施方案中，此类反义化合物为如本文所述的缺口聚物。在某些实施方案中，缺口聚物的缺口包含DNA核苷。在某些实施方案中，缺口聚物的缺口包含DNA样核苷。在某些实施方案中，缺口聚物的缺口包含DNA核苷和DNA样核苷。
具有缺口聚物基序的某些反义化合物被认为是嵌合反义化合物。在缺口聚物中，具有多个支持核糖核酸酶H裂解的核苷酸的内部区位于具有多个在化学上与内部区的核苷不同的核苷酸的外部区之间。在具有缺口聚物基序的反义寡核苷酸的状况下，缺口区段一般用作核酸内切酶裂解的底物，而翼区段包含修饰的核苷。在某些实施方案中，缺口聚物的每个区由构成每个相异区的糖部分的类型来区分。用于区分缺口聚物的每个区的糖部分的类型在一些实施方案中可包括β-D-核糖核苷、β-D-脱氧核糖核苷、2'-修饰的核苷(此2'-修饰的核苷可尤其包括2'-MOE和2'-O-CH3)，以及双环糖修饰的核苷(此双环糖修饰的核苷可包括具有限制性乙基的核苷)。在某些实施方案中，翼中的核苷可包括若干修饰的糖部分，包括例如2'-MOE及双环糖部分，如限制性乙基或LNA。在某些实施方案中，翼可包括若干修饰的及未修饰的糖部分。在某些实施方案中，翼可包括2'-MOE核苷、双环糖部分(如限制性乙基核苷或LNA核苷)及2'-脱氧核苷的各种组合。
每个相异区可包含均一糖部分、变化或交替的糖部分。翼-缺口-翼基序常被描述为“X-Y-Z”，其中“X”表示5'翼的长度，“Y”表示缺口的长度，且“Z”表示3'翼的长度。“X”及“Z”可包含均一、变化或交替的糖部分。在某些实施方案中，“X”及“Y”可包含一个或多个2'-脱氧核苷。“Y”可包含2’-脱氧核苷。本文所用的描述为“X-Y-Z”的缺口聚物具有一定构型以使缺口紧邻5'翼及3'翼中的每一个而定位。因此，在5'翼与缺口之间，或缺口与3'翼之间不存在介入的核苷酸。本文所述的任何反义化合物均可具有缺口聚物基序。在某些实施方案中，“X”与“Z”相同；在其他实施方案中，它们不同。在某些实施方案中，“Y”为8至15个核苷。X、Y或Z可为1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、25个、30个或超过30个核苷中的任一个。
在某些实施方案中，靶向CFB核酸的反义化合物具有其中缺口由6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个或16个连接核苷组成的缺口聚物基序。
在某些实施方案中，反义寡核苷酸具有式A所述的糖基序，如下：(J)m-(B)n-(J)p-(B)r-(A)t-(D)g-(A)v-(B)w-(J)x-(B)y-(J)z
其中：
每个A独立地为2'-取代的核苷；
每个B独立地为双环核苷；
每个J独立地为2'-取代的核苷或2'-脱氧核苷；
每个D为2'-脱氧核苷；
m为0-4；n为0-2；p为0-2；r为0-2；t为0-2；v为0-2；w为0-4；x为0-2；y为0-2；z为0-4；g为6-14；
其限制条件为：
m、n及r中的至少一个不为0；
w和y中的至少一个不为0；
m、n、p、r及t的总和为2至5；并且
v、w、x、y及z的总和为2至5。
RNAi化合物
在某些实施方案中，反义化合物干扰RNA化合物(RNAi)，所述RNA化合物包括双链RNA化合物(也称为短干扰RNA或siRNA)和单链RNAi化合物(或ssRNA)。此化合物至少部分地通过RISC途径起作用以降解和/或螯合靶核酸(因此包括微RNA/微RNA模拟化合物)。在某些实施方案中，反义化合物包含使其特别适合于此机制的修饰。
i.ssRNA化合物
在某些实施方案中，包括特别适合用作单链RNAi化合物(ssRNA)的那些的反义化合物包含修饰的5’末端。在某些实施方案中，5’末端包含修饰的磷酸酯部分。在某些实施方案中，此修饰的磷酸酯是稳定的(例如，与未修饰的5’磷酸酯相比，对降解/裂解有抗性)。在某些实施方案中，此5’末端核苷使5’磷酸酯部分保持稳定。某些修饰的5’末端核苷可见于例如WO/2011/139702中的领域。
在某些实施方案中，ssRNA化合物的5’核苷具有式IIc：
其中：
T1为任选地保护磷部分；
T2为连接式IIc的化合物与低聚化合物的核苷间连接基团；
A具有下式的一种：
Q1和Q2各自独立地为H、卤素、C1-C6烷基、取代的C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、取代的C1-C6烷氧基、C2-C6烯基、取代的C2-C6烯基、C2-C6炔基、取代的C2-C6炔基或N(R3)(R4)；
Q3为O、S、N(R5)或C(R6)(R7)；
R3、R4、R5、R6以及R7各自独立地为H、C1-C6烷基、取代的C1-C6烷基或C1-C6烷氧基；
M3为O、S、NR14、C(R15)(R16)、C(R15)(R16)C(R17)(R18)、C(R15)＝C(R17)、OC(R15)(R16)或OC(R15)(Bx2)；
R14为H、C1-C6烷基、取代的C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、取代的C1-C6烷氧基、C2-C6烯基、取代的C2-C6烯基、C2-C6炔基或取代的C2-C6炔基；
R15、R16、R17以及R18各自独立地为H、卤素、C1-C6烷基、取代的C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、取代的C1-C6烷氧基、C2-C6烯基、取代的C2-C6烯基、C2-C6炔基或取代的C2-C6炔基；
Bx1为杂环碱基部分；
或者如果存在Bx2，则Bx2为杂环碱基部分并且Bx1为H、卤素、C1-C6烷基、取代的C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、取代的C1-C6烷氧基、C2-C6烯基、取代的C2-C6烯基、C2-C6炔基或取代的C2-C6炔基；
J4、J5、J6以及J7各自独立地为H、卤素、C1-C6烷基、取代的C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、取代的C1-C6烷氧基、C2-C6烯基、取代的C2-C6烯基、C2-C6炔基或取代的C2-C6炔基；
或者J4与J5或J7中的一者形成桥，其中所述桥包括选自O、S、NR19、C(R20)(R21)、C(R20)＝C(R21)、C[＝C(R20)(R21)]以及C(＝O)的1至3连接双基基团并且J5、J6以及J7的另外两个各自独立地为H、卤素、C1-C6烷基、取代的C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、取代的C1-C6烷氧基、C2-C6烯基、取代的C2-C6烯基、C2-C6炔基或取代的C2-C6炔基；
R19、R20、以及R21各自独立地为H、C1-C6烷基、取代的C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、取代的C1-C6烷氧基、C2-C6烯基、取代的C2-C6烯基、C2-C6炔基或取代的C2-C6炔基；
G为H、OH、卤素或O-[C(R8)(R9)]n-[(C＝O)m-X1]j-Z；
R8和R9各自独立地为H、卤素、C1-C6烷基或取代的C1-C6烷基；
X1为O、S或N(E1)；
Z为H、卤素、C1-C6烷基、取代的C1-C6烷基、C2-C6烯基、取代的C2-C6烯基、C2-C6炔基、取代的C2-C6炔基或N(E2)(E3)；
E1、E2以及E3各自独立地为H、C1-C6烷基或取代的C1-C6烷基；
n为1至约6；
m为0或1；
j为0或1；
每个取代的基团包含独立地选自卤素、OJ1、N(J1)(J2)、＝NJ1、SJ1、N3、CN、OC(＝X2)J1、OC(＝X2)N(J1)(J2)以及C(＝X2)N(J1)(J2)的一个或多个任选地保护的取代基；
X2为O、S或NJ3；
J1、J2以及J3各自独立地为H或C1-C6烷基；
当j为1时，那么Z不为卤素或N(E2)(E3)；并且
其中所述低聚化合物包含8至40个单体亚单位并且与靶核酸的至少一部分是可杂交的。
在某些实施方案中，M3为O、CH＝CH、OCH2或OC(H)(Bx2)。在某些实施方案中，M3是O。
在某些实施方案中，J4、J5、J6以及J7各自为H。在某些实施方案中，J4与J5或J7中的一者形成桥。
在某些实施方案中，A具有下式的一种：
其中：
Q1和Q2各自独立地为H、卤素、C1-C6烷基、取代的C1-C6烷基、C1-C6烷氧基或取代的C1-C6烷氧基。在某些实施方案中，Q1和Q2各自为H。在某些实施方案中，Q1和Q2各自独立地为H或卤素。在某些实施方案中，Q1和Q2为H并且Q1和Q2的另一者为F、CH3或OCH3。
在某些实施方案中，T1具有下式：
其中：
Ra和Rc各自独立地为保护羟基、保护巯基、C1-C6烷基、取代的C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、取代的C1-C6烷氧基、保护氨基或取代的氨基；并且
Rb为O或S。在某些实施方案中，Rb为O并且Ra和Rc各自独立地为OCH3、OCH2CH3或CH(CH3)2。
在某些实施方案中，G为卤素、OCH3、OCH2F、OCHF2、OCF3、OCH2CH3、O(CH2)2F、OCH2CHF2、OCH2CF3、OCH2-CH＝CH2、O(CH2)2-OCH3、O(CH2)2-SCH3、O(CH2)2-OCF3、O(CH2)3-N(R10)(R11)、O(CH2)2-ON(R10)(R11)、O(CH2)2-O(CH2)2-N(R10)(R11)、OCH2C(＝O)-N(R10)(R11)、OCH2C(＝O)-N(R12)-(CH2)2-N(R10)(R11)或O(CH2)2-N(R12)-C(＝NR13)[N(R10)(R11)]，其中R10、R11、R12以及R13各自独立地为H或C1-C6烷基。在某些实施方案中，G为卤素、OCH3、OCF3、OCH2CH3、OCH2CF3、OCH2-CH＝CH2、O(CH2)2-OCH3、O(CH2)2-O(CH2)2-N(CH3)2、OCH2C(＝O)-N(H)CH3、OCH2C(＝O)-N(H)-(CH2)2-N(CH3)2或OCH2-N(H)-C(＝NH)NH2。在某些实施方案中，G为F、OCH3或O(CH2)2-OCH3。在某些实施方案中，G为O(CH2)3-OCH3。
在某些实施方案中，5’末端核苷具有式IIe：
在某些实施方案中，反义化合物(包括特别适合于ssRNA的那些)包含以限定的模式或糖修饰基序沿着寡核苷酸或其区布置的一种或多种类型的修饰的糖部分和/或天然存在的糖部分。所述基序可包括本文讨论的任何糖修饰和/或其他已知的糖修饰。
在某些实施方案中，寡核苷酸包含具有均匀糖修饰的区或者由具有均匀糖修饰的区组成。在某些实施方案中，所述区的每一个核苷均包含相同的RNA样糖修饰。在某些实施方案中，所述区的每一个核苷均为2’-F核苷。在某些实施方案中，所述区的每一个核苷均为2’-OMe核苷。在某些实施方案中，所述区的每一个核苷均为2’-MOE核苷。在某些实施方案中，所述区的每一个核苷均为cEt核苷。在某些实施方案中，所述区的每一个核苷均为LNA核苷。在某些实施方案中，统一区构成了寡核苷酸的全部或基本上全部。在某些实施方案中，所述区构成了全部寡核苷酸，除1-4个末端核苷之外。
在某些实施方案中，寡核苷酸包含重复糖修饰的一个或多个区，其中所述核苷在具有第一类型的糖修饰的核苷与具有第二类型的糖修饰的核苷之间交替。在某些实施方案中，两种类型的核苷均为RNA样核苷。在某些实施方案中，交替核苷选自2’-OMe、2’-F、2’-MOE、LNA以及cEt。在某些实施方案中，交替修饰为2’-F和2’-OMe。此类区可以是连续的或可以夹杂不同修饰的核苷或缀合核苷。
在某些实施方案中，交替修饰的交替区各自由单个核苷组成(即模式为(AB)xAy，其中A为具有第一类型的糖修饰的核苷并且B为具有第二类型的糖修饰的核苷；x为1-20并且y为0或1)。在某些实施方案中，交替基序中的一个或多个交替区包括不只一种类型的单个核苷。例如，寡核苷酸可包括以下核苷基序中的任一个的一个或多个区：
AABBAA、
ABBABB、
AABAAB、
ABBABAABB、
ABABAA、
AABABAB、
ABABAA、
ABBAABBABABAA、
BABBAABBABABAA、或
ABABBAABBABABAA；
其中，A为第一类型的核苷并且B为第二类型的核苷。在某些实施方案中，A和B各自选自2’-F、2’-OMe、BNA以及MOE。
在某些实施方案中，具有此交替基序的寡核苷酸还包含修饰的5’末端核苷，诸如式IIc或IIe的那些。
在某些实施方案中，寡核苷酸包含具2-2-3基序的区。此类区包含以下基序：
-(A)2-(B)x-(A)2-(C)y-(A)3-
其中：A为第一类型的修饰核苷；
B和C为具有与A不同修饰的核苷，然而，B和C两者彼此可具有相同或不同的修饰；
x和y为1至15。
在某些实施方案中，A为2'-OMe修饰核苷。在某些实施方案中，B和C两者均为2’-F修饰核苷。在某些实施方案中，A为2'-OMe修饰核苷并且B和C两者均为2’-F修饰核苷。
在某些实施方案中，寡核苷酸具有以下糖基序：5’-(Q)-(AB)xAy-(D)z
其中：
Q为包含稳定的磷酸酯部分的核苷。在某些实施方案中，Q为具有式IIc或IIe的核苷；
A为第一类型的修饰核苷；
B为第二类型的修饰核苷；
D为包含与其邻近的核苷不同的修饰的修饰核苷。因此，如果y为0，那么D与B必须是不同修饰的并且如果y为1，那么D与A必须是不同修饰的。在某些实施方案中，D不同于A和B两者。
X为5-15；
Y为0或1；
Z为0-4。
在某些实施方案中，寡核苷酸具有以下糖基序：5’-(Q)-(A)x-(D)z
其中：
Q为包含稳定的磷酸酯部分的核苷。在某些实施方案中，Q为具有式IIc或IIe的核苷：
A为第一类型的修饰核苷；
D为包含不同于A的修饰的修饰核苷。
X为11-30；
Z为0-4。
在某些实施方案中，以上基序中的A、B、C以及D选自：2’-OMe、2’-F、2’-MOE、LNA以及cEt。在某些实施方案中，D表示末端核苷。在某些实施方案中，此类末端核苷不被设计来与靶核酸杂交(尽管一个或多个可能偶然杂交)。在某些实施方案中，每个D核苷的核碱基为腺嘌呤，与靶核酸的相应位置处的核碱基的同一性无关。在某些实施方案中，每个D核苷的核碱基为胸腺嘧啶。
在某些实施方案中，包括特别适合用作ssRNA的那些的反义化合物包含以限定的模式或修饰的核苷间键联基序沿着寡核苷酸或其区布置的修饰的核苷间键联。在某些实施方案中，寡核苷酸包含具有交替的核苷间键联基序的区。在某些实施方案中，寡核苷酸包含具有统一修饰的核苷间键联的区。在某些所述实施方案中，寡核苷酸包含通过硫代磷酸酯核苷间键联统一连接的区。在某些实施方案中，寡核苷酸通过硫代磷酸酯核苷间键联统一连接。在某些实施方案中，寡核苷酸的每个核苷间键联选自磷酸二酯和硫代磷酸酯。在某些实施方案中，寡核苷酸的每个核苷间键联选自磷酸二酯和硫代磷酸酯并且至少一个核苷间键联为硫代磷酸酯。
在某些实施方案中，寡核苷酸包含至少6个硫代磷酸酯核苷间键联。在某些实施方案中，寡核苷酸包含至少8个硫代磷酸酯核苷间键联。在某些实施方案中，寡核苷酸包含至少10个硫代磷酸酯核苷间键联。在某些实施方案中，寡核苷酸包含至少一个具有至少6个连续的硫代磷酸酯核苷间键联的嵌段。在某些实施方案中，寡核苷酸包含至少一个具有至少8个连续的硫代磷酸酯核苷间键联的嵌段。在某些实施方案中，寡核苷酸包含至少一个具有至少10个连续的硫代磷酸酯核苷间键联的嵌段。在某些实施方案中，寡核苷酸包含至少一个具有至少12个连续的硫代磷酸酯核苷间键联的嵌段。在某些所述实施方案中，至少一个所述嵌段位于寡核苷酸的3’末端。在某些所述实施方案中，至少一个所述嵌段位于寡核苷酸的3’末端的3个核苷内。
具有本文所述的各种糖基序中的任一个的寡核苷酸可以具有任何键联基序。例如，包括但不限于以上所述的那些的寡核苷酸可以具有选自非限制性下表的键联基序：
5’最末端键联 中心区 3’区
PS 交替PO/PS 6PS
PS 交替PO/PS 7PS
PS 交替PO/PS 8PS
ii.siRNA化合物
在某些实施方案中，反义化合物为双链RNAi化合物(siRNA)。在此类实施方案中，一条或两条链可以包含针对ssRNA的以上所述的任何修饰基序。在某些实施方案中，ssRNA化合物可以是未修饰的RNA。在某些实施方案中，siRNA化合物可以包含未修饰的RNA核苷，但是是修饰的核苷间键联。
若干实施方案涉及双链组合物，其中每条链包含由一个或多个修饰或未修饰的核苷的位置限定的基序。在某些实施方案中，提供包含完全或至少部分杂交以形成双链体的第一和第二低聚化合物并且还包含与核酸目标互补并且杂交的区的组合物。此组合物包含第一低聚化合物(其为与核酸目标具有完全或部分互补性的反义链)和第二低聚化合物(其为与第一低聚化合物的一个或多个区具有互补性并且形成至少一个双链体区的有义链)是合适的。
若干实施方案的所述组合物通过与核酸目标杂交调节基因表达，从而导致正常功能的损失。在一些实施方案中，靶核酸为CFB。在某些实施方案中，通过激活用本发明的组合物形成的RISC复合物促进靶向CFB的降解。
若干实施方案涉及双链组合物，其中所述链中的一条用于例如影响相反的链优选装载入(或裂解)RISC复合物中。所述组合物用于靶向所选择的核酸分子并且调节一个或多个基因的表达。在一个实施方案中，本发明的组合物与目标RNA的一部分杂交，导致目标RNA的正常功能的损失。
若干实施方案涉及双链组合物，其中两条链均包括半修饰基序、完全修饰的基序、定位修饰的基序或交替基序。本发明的组合物的每条链可被修饰以在例如siRNA途径中充当特定的角色。使用每条链中的不同基序或每条链中具有不同化学修饰的相同基序使得靶向RISC复合物的反义链，同时抑制有义链的并入。在该模型中，每条链可以独立地被修饰以使得增强其特定的作用。反义链可以在5'末端进行修饰以增强在RISC的一个区的作用，而3'末端可以进行不同修饰以增强在RISC的不同区域的作用。
双链寡核苷酸分子可以是包含自身互补的有义和反义区的双链多核苷酸分子，其中反义区包含与靶核酸分子或其一部分中的核苷酸序列互补的核苷酸序列，并且有义区具有与靶核酸序列或其一部分对应的核苷酸序列。双链寡核苷酸分子可以由两个单独的寡核苷酸组装，其中一条链是有义链并且另一条链是反义链，其中反义链和有义链是自身互补的(即，每条链包含与另一条链中的核苷酸序列互补的核苷酸序列；诸如其中反义链和有义链形成双链体或双链结构，例如其中双链区为约15至约30，例如约15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个碱基对；反义链包括与靶核酸分子或其一部分中的核苷酸序列互补的核苷酸序列，并且有义链包含与靶核酸序列或其一部分对应的核苷酸序列(例如，双链寡核苷酸分子的约15至约25个或更多个核苷酸与靶核酸或其一部分互补)。或者，双链寡核苷酸由单一寡核苷酸组装，其中siRNA的自身互补的有义和反义区借助于基于核酸或不基于核酸的连接基连接。
双链寡核苷酸可以是具有双链体、不对称双链体、发夹或不对称发夹二级结构的多核苷酸，其具有自身互补的有义和反义区，其中反义区包含与单独的靶核酸分子或其一部分中的核苷酸序列互补的核苷酸序列，并且有义区具有与靶核酸序列或其一部分对应的核苷酸序列。双链寡核苷酸可以是具有两个或更多个环结构以及茎的环形单链多核苷酸，所述主干包含自身互补的有义和反义区，其中反义区包括与靶核酸分子或其一部分中的核苷酸序列互补的核苷酸序列，并且有义区具有与靶核酸序列或其一部分对应的核苷酸序列，并且其中环形多核苷酸可以在体内或体外处理产生能够介导RNAi的活性siRNA分子。
在某些实施方案中，双链寡核苷酸包含分开的有义和反义序列或区，其中有义和反义区通过如本领域已知的核苷酸或非核苷酸连接基共价连接，或者可替代地通过离子相互作用、氢键合、范德华相互作用、疏水性相互作用和/或堆积相互作用非共价连接。在某些实施方案中，双链寡核苷酸包含与靶基因的核苷酸序列互补的核苷酸序列。在另一个实施方案中，双链寡核苷酸以引起靶基因表达抑制的方式来与靶基因的核苷酸序列相互作用。
如本文所用，双链寡核苷酸无需限于仅含有RNA的那些分子，而是进一步涵盖化学修饰的核苷酸和非核苷酸。在某些实施方案中，短干扰核酸分子缺乏含有2'-羟基(2'-OH)的核苷酸。在某些实施方案中，短干扰核酸任选地不包括任何核糖核苷酸(例如，具有2'-OH基团的核苷酸)。然而，不要求分子内存在核糖核苷酸来支持RNAi的这类双链寡核苷酸可以具有连接的一个或多个连接基或其他连接或缔合的基团、部分或含有一个或多个具有2'-OH基团的核苷酸的链。任选地，双链寡核苷酸可以在约5％、10％、20％、30％、40％或50％的核苷酸位置上包括核糖核苷酸。如本文所用，术语siRNA意思等同于用来描述能够介导序列特异性RNAi的核酸分子的其他术语，例如，短干扰RNA(siRNA)、双链RNA(dsRNA)、微RNA(miRNA)、短发夹RNA(shRNA)、短干扰寡核苷酸、短干扰核酸、短干扰修饰寡核苷酸、化学修饰的siRNA、转录后基因沉默RNA(ptgsRNA)以及其他。此外，如本文所用，术语RNAi意思等同于用来描述序列特异性RNA干扰，诸如转录后基因沉默、转录抑制或表观遗传的其他术语。例如，双链寡核苷酸可以以转录后水平和转录前水平二者用于表观遗传学沉默基因。在非限制性实例中，通过本发明的siRNA分子表观遗传学调节基因表达可以由染色质结构的siRNA介导的修饰或甲基化模式以改变基因表达导致(参见例如，Verdel等,2004,Science,303,672-676；Pal-Bhadra等,2004,Science,303,669-672；Allshire,2002,Science,297,1818-1819；Volpe等,2002,Science,297,1833-1837；Jenuwein,2002,Science,297,2215-2218以及Hall等,2002,Science,297,2232-2237)。
可以设想本文提供的若干实施方案的化合物和组合物可以通过dsRNA介导的基因沉默或RNAi机制靶向CFB，包括例如“发夹”或茎-环双链RNA效应分子，其中具有自身互补序列的单个RNA链能够形成双链构型或包含两个单独的RNA链的双链体dsRNA效应分子。在各种实施方案中，dsRNA完全由核糖核苷酸组成或由核糖核苷酸和脱氧核苷酸的混合物(诸如例如通过2000年4月19日提交的WO 00/63364或1999年4月21日提交的美国序列号60/130,377所公开的RNA/DNA杂合体)组成。dsRNA或dsRNA效应分子可以是具有自身互补性的区的单个分子使得分子的一个区段中的核苷酸与分子的另一个区段中的核苷酸进行碱基配对。在各种实施方案中，由单个分子组成的dsRNA完全由核糖核苷酸组成或包括与脱氧核糖核苷酸的区互补的核糖核苷酸的区。或者，dsRNA可以包括具有彼此互补的区的两个不同的链。
在各种实施方案中，两条链完全由核糖核苷酸组成，一条链完全由核糖核苷酸组成并且一条链完全由脱氧核糖核苷酸组成，或者一条或两条链含有核糖核苷酸和脱氧核糖核苷酸的混合物。在某些实施方案中，互补的区彼此或与目标核酸序列具有至少70％、80％、90％、95％、98％或100％互补性。在某些实施方案中，以双链构型存在的dsRNA的区包括至少19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、50、75、100、200、500、1000、2000或5000个核苷酸或者包括所有的cDNA中或由dsRNA表示的其他目标核酸序列中的核苷酸。在一些实施方案中，dsRNA不含有任何单链区诸如单链区末端或者dsRNA为发夹。在其他实施方案中，dsRNA具有一个或多个单链区或突出端。在某些实施方案中，RNA/DNA杂合体包括为反义链或区的DNA链或区(例如，与目标核酸具有至少70、80、90、95、98或100％互补性)以及为有义链或区的RNA链或区(例如，与目标核酸具有至少70、80、90、95、98或100％互补性)，并且反之亦然。
在各种实施方案中，RNA/DNA杂合体是使用酶法或化学合成方法诸如本文所述的那些或在2000年4月19日提交的WO 00/63364或1999年4月21日提交的美国序列号60/130,377中所述的那些在体外制成的。在其他实施方案中，体外所合成的DNA链在其转化进入细胞之前、之后或同时与体内或体外所制成的RNA链复合。在其他实施方案中，dsRNA为含有有义和反义区的单环核酸，或者dsRNA包括环状核酸和第二个环状核酸或线性核酸(参见，例如2000年4月19日提交的WO 00/63364或1999年4月21日提交的美国序列号60/130,377)。示例性环状核酸包括套索结构，其中核苷酸的游离5'磷酰基以环回方式连接到另一个核苷酸的2'羟基。
在其他实施方案中，dsRNA包括其中糖的2'位含有卤素(诸如氟基)或者含有烷氧基(诸如甲氧基)的一个或多个修饰的核苷酸，其相比于其中相应的2'位含有氢或羟基的相应的dsRNA增加了体外或体内dsRNA的半衰期。在其他实施方案中，dsRNA包括相邻核苷酸之间的一个或多个键而非自然存在的磷酸二酯键联。此类键联的实例包括磷酰胺、硫代磷酸酯以及二硫代磷酸酯键联。dsRNAs还可以是如美国专利号6,673,661中所教导的化学修饰地核酸分子。在其他实施方案中，dsRNA含有一个或两个加帽链，如例如由2000年4月19日提交的WO 00/63364或1999年4月21日提交的美国序列号60/130,377所公开的。
在其他实施方案中，dsRNA可以是任何WO 00/63364中所公开的至少部分dsRNA分子，以及任何美国临时申请60/399,998以及美国临时申请60/419,532和PCT/US2003/033466中所述的dsRNA分子，所述申请的教义以引用的方式并入本文。任何dsRNA可使用本文所述的方法或标准方法诸如WO 00/63364中所述的那些在体外或体内进行表达。
占位
在某些实施方案中，预期反义化合物或靶核酸不通过RNA酶H导致裂解或者通过RISC途径导致裂解或螯合。在某些此类实施方案中，反义活性可以由占位产生，其中杂交反义化合物的存在破坏了目标核酸的活性。在某些此类实施方案中，反义化合物可以是统一修饰的或者可以包含修饰的混合和/或包含修饰的和未修饰的核苷酸。
目标核酸、目标区及核苷酸序列
编码补体因子B(CFB)的核苷酸序列包括但不限于以下：GENBANK登录号NM_001710.5(以SEQ ID NO:1形式并入本文)、从核苷酸31852000至31861000截短的GENBANK登录号NT_007592.15(以SEQ ID NO:2形式并入本文)、从核苷酸536000至545000截短的GENBANK登录号NW_001116486.1(以SEQ ID NO:3形式并入本文)、GENBANK登录号XM_001113553.2(以SEQ ID NO:4形式并入本文)或GENBANK登录号NM_008198.2(以SEQ ID NO:5形式并入本文)。
杂交
在一些实施方案中，在本文公开的反义化合物与CFB核酸之间进行杂交。杂交的最常见机制涉及核酸分子的互补核碱基之间的氢键合(例如沃森-克里克、霍氏或反霍氏氢键合)。
杂交可在不同条件下进行。严格条件具序列依赖性且由待杂交的核酸分子的性质和组成决定。
确定序列是否可与目标核酸特异性杂交的方法在本领域中为熟知的。在某些实施方案中，本文提供的反义化合物可与CFB核酸特异性杂交。
互补性
当反义化合物中足够数目的核碱基可与靶核酸中的相应核碱基进行氢键合，从而出现所需作用(例如对靶核酸(诸如CFB核酸)的反义抑制)时，反义化合物与靶核酸彼此互补。
可容忍反义化合物与CFB核酸之间的非互补性核碱基，前提是所述反义化合物仍能够与靶核酸特异性杂交。此外，反义化合物可在CFB核酸的一个或多个区段上杂交，以使得介入或相邻区段不参与杂交事件(例如环结构、错配或发夹结构)。
在某些实施方案中，本文提供的反义化合物或其指定部分与CFB核酸、目标区、目标区段或其指定部分具有或具有至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％互补性。反义化合物与目标核酸的互补性百分比可使用常规方法测定。
举例来说，反义化合物中反义化合物的20个核碱基中有18个核碱基与目标区互补且因此特异性杂交将表示90％互补性。在这个实例中，其余非互补核碱基可与互补核碱基丛集或交替并且不需要彼此相邻或与互补核碱基相邻。因而，长度为18个核碱基并具有4个非互补核碱基且所述非互补核碱基由与目标核酸完全互补的两个区侧接的反义化合物与目标核酸将具有77.8％的总体互补性且因而处于本发明的范围内。反义化合物与靶核酸的区的互补性百分比可常规地使用本领域中已知的BLAST程序(基本局部比对搜寻工具(basic local alignment search tool))和PowerBLAST程序来测定(Altschul等人，J.Mol.Biol.,1990,215,403 410；Zhang和Madden，Genome Res.,1997,7,649 656)。同源性、序列同一性或互补性的百分比可通过例如使用Smith和Waterman(Adv.Appl.Math.,1981,2,482 489)的算法的Gap程序(Wisconsin Sequence Analysis Package,Version8for Unix,Genetics Computer Group,University Research Park,Madison Wis.)使用默认设置来测定。
在某些实施方案中，本文提供的反义化合物或其指定部分与目标核酸或其指定部分完全互补(即100％互补)。例如，反义化合物可与CFB核酸或其目标区或目标区段或目标序列完全互补。本文所用的“完全互补”意指反义化合物的每个核碱基皆能够与目标核酸的相应核碱基进行准确碱基配对。举例来说，具有20个核碱基的反义化合物与长度为400个核碱基的目标序列完全互补，只要目标核酸中有具有20个核碱基的相应部分与反义化合物完全互补即可。完全互补还可对于第一和/或第二核酸的指定部分来使用。举例来说，具有30个核碱基的反义化合物中的20个核碱基的部分可与长度为400个核碱基的目标序列“完全互补”。具有30个核碱基的寡核苷酸中的20个核碱基的部分在目标序列具有含20个核碱基且每个核碱基与反义化合物中的所述20个核碱基的部分互补的相应部分的情况下与目标序列完全互补。同时，整个具有30个核碱基的反义化合物与目标序列可能完全互补或可能不是完全互补，这取决于反义化合物的其余10个核碱基是否也与目标序列互补。
非互补核碱基的位置可处于反义化合物的5’端或3’端处。或者，一个或多个非互补核碱基可处于反义化合物的内部位置处。当存在两个或更多个非互补核碱基时，它们可为连续(即连接的)或不连续的。在一个实施方案中，非互补核碱基位于缺口聚物反义寡核苷酸的翼区段中。
在某些实施方案中，长度为或为多达11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个或20个核碱基的反义化合物相对于目标核酸(诸如CFB核酸)或其指定部分包含至多4个、至多3个、至多2个或至多1个非互补核碱基。
在某些实施方案中，长度为或为多达11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个或30个核碱基的反义化合物相对于目标核酸(诸如CFB核酸)或其指定部分包含至多6个、至多5个、至多4个、至多3个、至多2个或至多1个非互补核碱基。
所提供的反义化合物还包括与目标核酸的一部分互补的反义化合物。本文所用的“部分”是指目标核酸的区或区段内确定数目的连续(即连接的)核碱基。“部分”还可指反义化合物中确定数目的连续核碱基。在某些实施方案中，反义化合物与目标区段中具有至少8个核碱基的部分互补。在某些实施方案中，反义化合物与目标区段中具有至少9个核碱基的部分互补。在某些实施方案中，反义化合物与目标区段中具有至少10个核碱基的部分互补。在某些实施方案中，反义化合物与目标区段中具有至少11个核碱基的部分互补。在某些实施方案中，反义化合物与目标区段中具有至少12个核碱基的部分互补。在某些实施方案中，反义化合物与目标区段中具有至少13个核碱基的部分互补。在某些实施方案中，反义化合物与目标区段中具有至少14个核碱基的部分互补。在某些实施方案中，反义化合物与目标区段中具有至少15个核碱基的部分互补。还涵盖与目标区段中具有至少9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个或更多个(或由这些值中的任何两个所界定的范围)核碱基的部分互补的反义化合物。
同一性
本文提供的反义化合物还可与特定核苷酸序列SEQ ID NO或由特定Isis编号表示的化合物或其部分具有确定的同一性百分比。如本文所用，如果反义化合物具有相同的核碱基配对能力，那么其与本文公开的序列同一。举例来说，在所公开的DNA序列中含有尿嘧啶代替胸苷的RNA将被视作与DNA序列同一，因为尿嘧啶和胸苷皆与腺嘌呤配对。还涵盖本文所述的反义化合物的缩短及延长型式以及相对于本文提供的反义化合物具有非同一碱基的化合物。非同一碱基可彼此相邻或散布于整个反义化合物中。反义化合物的同一性百分比是根据相对于与其比较的序列具有同一碱基配对的碱基的数目来计算的。
在某些实施方案中，反义化合物或其部分与本文公开的一种或多种反义化合物或SEQ ID NO或其部分具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性。
在某些实施方案中，将反义化合物的一部分与目标核酸的等长部分相比较。在某些实施方案中，将具有8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个或25个核碱基的部分与目标核酸的等长部分相比较。
在某些实施方案中，将反义寡核苷酸的一部分与目标核酸的等长部分相比较。在某些实施方案中，将具有8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个或25个核碱基的部分与目标核酸的等长部分相比较。
修饰
核苷为碱基-糖组合。核苷的核碱基(又称为碱基)部分通常为杂环碱基部分。核苷酸为还包括共价连接至核苷的糖部分的磷酸酯基团的核苷。对于包括呋喃戊糖基糖的那些核苷，磷酸酯基可连接至糖的2'、3'或5'羟基部分。寡核苷酸是经由相邻核苷彼此共价键联形成线性聚合寡核苷酸而形成的。在寡核苷酸结构内，磷酸酯基通常被视作形成寡核苷酸的核苷间键。
反义化合物的修饰涵盖核苷间键、糖部分或核碱基的取代或改变。修饰的反义化合物常因具有如以下的所需性质而优于原生形式：细胞吸收增强、对核酸目标的亲和力增强、在核酸酶存在下的稳定性增强或抑制活性增强。
化学上修饰的核苷还可用于增强缩短或截短型反义寡核苷酸对其目标核酸的结合亲和力。因此，常可以具有所述化学上修饰的核苷的较短反义化合物获得类似结果。
修饰的核苷间键联
RNA和DNA的天然存在的核苷间键联为3'至5'磷酸二酯键联。相较于具有天然存在的核苷间键联的反义化合物，具有一个或多个修饰的(即非天然存在)的核苷间键联的反义化合物常会因具有所需性质(例如像细胞吸收增强、对目标核酸的亲和力增强及在核酸酶存在下的稳定性增强)而被优先选择。
具有修饰的核苷间键联的寡核苷酸包括保留磷原子的核苷间键联以及不具磷原子的核苷间键联。代表性含磷的核苷间键联包括但不限于磷酸二酯、磷酸三酯、甲基膦酸酯、氨基磷酸酯及硫代磷酸酯。制备含磷键及不含磷键的方法为熟知的。
在某些实施方案中，靶向CFB核酸的反义化合物包含一个或多个修饰的核苷间键联。在某些实施方案中，修饰的核苷间键联为硫代磷酸酯键。在某些实施方案中，反义化合物的每个核苷间键联为硫代磷酸酯核苷间键联。
在某些实施方案中，寡核苷酸包含以限定的模式或修饰的核苷间键联基序沿着寡核苷酸或其区布置的修饰的核苷间键联。在某些实施方案中，核苷间键联以有缺口的基序布置。在所述实施方案中，两个翼区的每一个中的核苷间键联不同于缺口区中的核苷间键联。在某些实施方案中，翼中的核苷间键联为磷酸二酯并且缺口中的核苷间键联为硫代磷酸酯。核苷基序被独立地选择，使得具有有缺口的核苷间键联基序的所述寡核苷酸可以具有或可不具有有缺口的核苷基序并且如果它具有有缺口的核苷基序，那么翼和缺口长度可以相同或可不同。
在某些实施方案中，寡核苷酸包含具有交替的核苷间键联基序的区。在某些实施方案中，本发明的寡核苷酸包含具有统一修饰的核苷间键联的区。在某些所述实施方案中，寡核苷酸包含通过硫代磷酸酯核苷间键联统一连接的区。在某些实施方案中，寡核苷酸通过硫代磷酸酯统一连接。在某些实施方案中，寡核苷酸的每个核苷间键联选自磷酸二酯和硫代磷酸酯。在某些实施方案中，寡核苷酸的每个核苷间键联选自磷酸二酯和硫代磷酸酯并且至少一个核苷间键联为硫代磷酸酯。
在某些实施方案中，寡核苷酸包含至少6个硫代磷酸酯核苷间键联。在某些实施方案中，寡核苷酸包含至少8个硫代磷酸酯核苷间键联。在某些实施方案中，寡核苷酸包含至少10个硫代磷酸酯核苷间键联。在某些实施方案中，寡核苷酸包含至少一个具有至少6个连续的硫代磷酸酯核苷间键联的嵌段。在某些实施方案中，寡核苷酸包含至少一个具有至少8个连续的硫代磷酸酯核苷间键联的嵌段。在某些实施方案中，寡核苷酸包含至少一个具有至少10个连续的硫代磷酸酯核苷间键联的嵌段。在某些实施方案中，寡核苷酸包含至少一个具有至少12个连续的硫代磷酸酯核苷间键联的嵌段。在某些所述实施方案中，至少一个所述嵌段位于寡核苷酸的3’末端。在某些所述实施方案中，至少一个所述嵌段位于寡核苷酸的3’末端的3个核苷内。
在某些实施方案中，寡核苷酸包含一个或多个甲基膦酸酯键。在某些实施方案中，具有缺口聚物核苷基序的寡核苷酸包含包括除一个或两个甲基膦酸酯键联之外所有的硫代磷酸酯键联的键联基序。在某些实施方案中，一个甲基膦酸酯键联位于具有缺口聚物核苷基序的寡核苷酸的中心缺口中。
在某些实施方案中，布置硫代磷酸酯核苷间键联和磷酸二酯核苷间键联的数量以保持核酸酶抗性是所需的。在某些实施方案中，布置硫代磷酸酯核苷间键联的数量和位置与磷酸二酯核苷间键联的数量和位置以保持核酸酶抗性是所需的。在某些实施方案中，可以减小硫代磷酸酯核苷间键联的数量并且可以增加磷酸二酯核苷间键联的数量。在某些实施方案中，在可以减小硫代磷酸酯核苷间键联的数量并且可以增加磷酸二酯核苷间键联的数量的同时还能保持核酸酶抗性。在某些实施方案中，在减小硫代磷酸酯核苷间键联的数量的同时保持核酸酶抗性是所需的。在某些实施方案中，在增加磷酸二酯核苷间键联的数量的同时保持核酸酶抗性是所需的。
修饰的糖部分
反义化合物可任选含有其中糖基已被修饰的一个或多个核苷。所述糖修饰的核苷可赋予反义化合物以增强的核酸酶稳定性、增强的结合亲和力或某种其他有利生物性质。在某些实施方案中，核苷包含化学上修饰的呋喃核糖环部分。化学上修饰的呋喃核糖环的实例包括不限于添加取代基(包括5'及2'取代基)；非偕位环原子桥连形成双环核酸(BNA)；核糖基环氧原子用S、N(R)或C(R1)(R2)(R、R1和R2各自独立地为H、C1-C12烷基或保护基团)置换；及其组合。化学上修饰的糖的实例包括2'-F-5'-甲基取代的核苷(关于其他所公开的5',2'-双取代的核苷，参见08年8月21日公开的PCT国际申请WO 2008/101157)或核糖基环氧原子被S置换且2'位上被进一步取代(参见2005年6月16日公开的公开美国专利申请US2005-0130923)；或者BNA的5'-取代(参见07年11月22日公开的PCT国际申请WO 2007/134181，其中LNA被例如5'-甲基或5'-乙烯基取代)。
具有修饰的糖部分的核苷的实例包括不限于包含5'-乙烯基、5'-甲基(R或S)、4'-S、2'-F、2'-OCH3、2’-OCH2CH3、2’-OCH2CH2F和2'-O(CH2)2OCH3取代基的核苷。2’位置处的取代基还可以选自烯丙基、氨基、叠氮基、巯基、O-烯丙基、O-C1-C10烷基、OCF3、OCH2F、O(CH2)2SCH3、O(CH2)2-O-N(Rm)(Rn)、O-CH2-C(＝O)-N(Rm)(Rn)以及O-CH2-C(＝O)-N(Rl)-(CH2)2-N(Rm)(Rn)其中Rl、Rm以及Rn各自独立地为H或取代的或未取代的C1-C10烷基。
本文所用的“双环核苷”是指包含双环糖部分的修饰的核苷。双环核苷的实例包括不限于在4'与2'核糖基环原子之间包含桥的核苷。在某些实施方案中，本文提供的反义化合物包括一个或多个双环核苷，其中包含4'至2'桥。此类4'至2'桥连的双环核苷的实例包括但不限于下式的一个：4'-(CH2)-O-2'(LNA)、4'-(CH2)-S-2'、4'-(CH2)2-O-2'(ENA)、4'-CH(CH3)-O-2'(也称为限制性乙基或cEt)以及4'-C-H(CH2OCH3)-O-2'(以及其类似物，参见2008年7月15日颁发的美国专利7,399,845)；4'-C(CH3)(CH3)-O-2'(以及其类似物，参见2009年1月8日公布的已公布的国际申请WO 2009/006478)；4'-CH2-N(OCH3)-2'(以及其类似物，参见2008年12月11日公布的已公布的国际申请WO/2008/150729)；4'-CH2-O-N(CH3)-2'(参见2004年9月2日公布的已公布的美国专利申请US2004-0171570)；4'-CH2-N(R)-O-2'，其中R为H、C1-C12烷基或保护基团(参见参见2008年9月23日颁发的美国专利7,427,672)；4'-CH2-C(H)(CH3)-2'(参见Zhou等,J.Org.Chem.,2009,74,118-134)；以及4'-CH2-C(＝CH2)-2'(以及其类似物，参见2008年12月8日公布的已公布的国际申请WO2008/154401)。
涉及双环核苷的另外的报告还可以见于已公布的文献(参见例如：Singh等,Chem.Commun.,1998,4,455-456；Koshkin等,Tetrahedron,1998,54,3607-3630；Wahlestedt等,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,2000,97,5633-5638；Kumar等,Bioorg.Med.Chem.Lett.,1998,8,2219-2222；Singh等,J.Org.Chem.,1998,63,10035-10039；Srivastava等,J.Am.Chem.Soc.,2007,129(26)8362-8379；Elayadi等,Curr.Opinion Invest.Drugs,2001,2,558-561；Braasch等,Chem.Biol.,2001,8,1-7；以及Orum等,Curr.Opinion Mol.Ther.,2001,3,239-243；美国专利号6,268,490；6,525,191；6,670,461；6,770,748；6,794,499；7,034,133；7,053,207；7,399,845；7,547,684；8,530,640；以及7,696,345；美国专利公布号US2008-0039618；US2009-0012281；美国专利序列号61/026,995和61/097,787；已公布的PCT国际申请；WO2009/067647；WO 2011/017521；WO2010/036698WO 1999/014226；WO 2004/106356；WO 2005/021570；WO 2007/134181；WO2008/150729；WO 2008/154401以及WO 2009/006478中。上述各双环核苷可被制备而具有一种或多种立体化学糖构型，包括例如α-L-呋喃核糖及β-D-呋喃核糖(参见1999年3月25日公开为WO 99/14226的PCT国际申请PCT/DK98/00393)。
在某些实施方案中，BNA核苷的双环糖部分包括但不限于在呋喃戊糖基糖部分的4'位与2’位之间具有至少一个桥的化合物，其中所述桥独立地包含1个或2至4个独立地选自以下的连接基团：-[C(Ra)(Rb)]n-、-C(Ra)＝C(Rb)-、-C(Ra)＝N-、-C(＝O)-、-C(＝NRa)-、-C(＝S)-、-O-、-Si(Ra)2-、-S(＝O)x-以及-N(Ra)-；
其中：
x为0、1或2；
n为1、2、3或4；
Ra和Rb各自独立地为H、保护基、羟基、C1-C12烷基、取代的C1-C12烷基、C2-C12烯基、取代的C2-C12烯基、C2-C12炔基、取代的C2-C12炔基、C5-C20芳基、取代的C5-C20芳基、杂环基、取代的杂环基、杂芳基、取代的杂芳基、C5-C7脂环基、取代的C5-C7脂环基、卤素、OJ1、NJ1J2、SJ1、N3、COOJ1、酰基(C(＝O)-H)、取代的酰基、CN、磺酰基(S(＝O)2-J1)或亚硫酸基(S(＝O)-J1)；并且
J1和J2各自独立地为H、C1-C12烷基、取代的C1-C12烷基、C2-C12烯基、取代的C2-C12烯基、C2-C12炔基、取代的C2-C12炔基、C5-C20芳基、取代的C5-C20芳基、酰基(C(＝O)-H)、取代的酰基、杂环基、取代的杂环基、C1-C12氨基烷基、取代的C1-C12氨基烷基或保护基。
在某些实施方案中，双环糖部分的桥为-[C(Ra)(Rb)]n-、-[C(Ra)(Rb)]n-O-、-C(RaRb)-N(R)-O-或–C(RaRb)-O-N(R)-。在某些实施方案中，桥为4'-CH2-2'、4'-(CH2)2-2'、4'-(CH2)3-2'、4'-CH2-O-2'、4'-(CH2)2-O-2'、4'-CH2-O-N(R)-2'以及4'-CH2-N(R)-O-2'-，其中每个R独立地为H、保护基或C1-C12烷基。
在某些实施方案中，双环核苷进一步由异构构型定义。例如，包含4’-2’亚甲基-氧基桥联的核苷可呈α-L构型或呈β-D构型。α-L-亚甲氧基(4’-CH2-O-2’)BNA先前已并入展示反义活性的反义寡核苷酸中(Frieden等,Nucleic Acids Research,2003,21,6365-6372)。
在某些实施方案中，双环核苷包括但不限于(A)α-L-亚甲氧基(4’-CH2-O-2’)BNA；(B)β-D-亚甲氧基(4’-CH2-O-2’)BNA；(C)亚乙氧基(4’-(CH2)2-O-2’)BNA；(D)氨氧基(4’-CH2-O-N(R)-2’)BNA；(E)氧氨基(4’-CH2-N(R)-O-2’)BNA；和(F)甲基(亚甲氧基)(4’-CH(CH3)-O-2’)BNA；(G)亚甲基-硫基(4’-CH2-S-2’)BNA；(H)亚甲基-氨基(4’-CH2-N(R)-2’)BNA；(I)甲基碳环(4’-CH2-CH(CH3)-2’)BNA；(J)亚丙基碳环(4’-(CH2)3-2’)BNA；以及(K)乙烯基BNA；如下文所描绘：
其中Bx为碱基部分且R独立地为H、保护基、C1-C12烷基或C1-C12烷氧基。
在某些实施方案中，提供的双环核苷具有式I：
其中：
Bx为杂环碱基部分；
-Qa-Qb-Qc-为-CH2-N(Rc)-CH2-、-C(＝O)-N(Rc)-CH2-、-CH2-O-N(Rc)-、-CH2-N(Rc)-O-或-N(Rc)-O-CH2；
Rc为C1-C12烷基或氨基保护基；并且
Ta及Tb各自独立地为H、羟基保护基、缀合基团、反应性磷基、磷部分或与支撑介质的共价连接。
在某些实施方案中，提供的双环核苷具有式II：
其中：
Bx为杂环碱基部分；
Ta和Tb各自独立地为H、羟基保护基、缀合基团、反应性磷基、磷部分或与支撑介质的共价连接；
Za为C1-C6烷基、取代的C2-C6烯基、C2-C6炔基、取代的C1-C6烷基、取代的C2-C6烯基、取代的C2-C6炔基、酰基、取代的酰基、取代的酰胺、巯基或取代的巯基。
在一个实施方案中，每个取代的基团独立地被独立地选自以下的取代基单取代或多取代：卤素、氧基、羟基、OJc、NJcJd、SJc、N3、OC(＝X)Jc及NJeC(＝X)NJcJd，其中每个Jc、Jd以及Je独立地为H、C1-C6烷基或取代的C1-C6烷基且X为O或NJc。
在某些实施方案中，提供的双环核苷具有式III：
其中：
Bx为杂环碱基部分；
Ta和Tb各自独立地为H、羟基保护基、缀合基团、反应性磷基、磷部分或与支撑介质的共价连接；
Zb为C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、取代的C1-C6烷基、取代的C2-C6烯基、取代的C2-C6炔基或取代的酰基(C(＝O)-)。
在某些实施方案中，双环核苷具有式IV：
其中：
Bx为杂环碱基部分；
Ta和Tb各自独立地为H、羟基保护基、缀合基团、反应性磷基、磷部分或与支撑介质的共价连接；
Rd为C1-C6烷基、取代的C1-C6烷基、C2-C6烯基、取代的C2-C6烯基、C2-C6炔基或取代的C2-C6炔基；
qa、qb、qc以及qd各自独立地为H、卤素、C1-C6烷基、取代的C1-C6烷基、C2-C6烯基、取代的C2-C6烯基、C2-C6炔基或取代的C2-C6炔基、C1-C6烷氧基、取代的C1-C6烷氧基、酰基、取代的酰基、C1-C6氨基烷基或取代的C1-C6氨基烷基；
在某些实施方案中，提供的双环核苷具有式V：
其中：
Bx为杂环碱基部分；
Ta和Tb各自独立地为H、羟基保护基、缀合基团、反应性磷基、磷部分或与支撑介质的共价连接；
qa、qb、qe以及qf各自独立地为氢、卤素、C1-C12烷基、取代的C1-C12烷基、C2-C12烯基、取代的C2-C12烯基、C2-C12炔基、取代的C2-C12炔基、C1-C12烷氧基、取代的C1-C12烷氧基、OJj、SJj、SOJj、SO2Jj、NJjJk、N3、CN、C(＝O)OJj、C(＝O)NJjJk、C(＝O)Jj、O-C(＝O)NJjJk、N(H)C(＝NH)NJjJk、N(H)C(＝O)NJjJk或N(H)C(＝S)NJjJk；
或qe连同qf一起为＝C(qg)(qh)；
qg和qh各自独立地为H、卤素、C1-C12烷基或取代的C1-C12烷基。
亚甲氧基(4’-CH2-O-2’)BNA单体腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤、5-甲基-胞嘧啶、胸腺嘧啶以及尿嘧啶的合成和制备以及它们的寡聚和核酸识别性质已有所描述(Koshkin等人，Tetrahedron,1998,54,3607-3630)。BNA及其制备还描述于WO 98/39352及WO 99/14226中。
亚甲氧基(4’-CH2-O-2’)BNA及2'-硫基-BNA的类似物也已被制备(Kumar等人，Bioorg.Med.Chem.Lett.,1998,8,2219-2222)。构成作为核酸聚合酶的底物的寡脱氧核糖核苷酸双螺旋体的锁核苷类似物的制备也已有所描述(Wengel等人,WO 99/14226)。此外，2'-氨基-BNA(一种新颖的构形受限的高亲和力寡核苷酸类似物)的合成在本领域中已有所描述(Singh等人，J.Org.Chem.,1998,63,10035-10039)。另外，2'-氨基-BNA及2'-甲基氨基-BNA已被制备且它们与互补的RNA及DNA链的双螺旋体的热稳定性先前已有所报导。
在某些实施方案中，提供的双环核苷具有式VI：
其中：
Bx为杂环碱基部分；
Ta和Tb各自独立地为H、羟基保护基、缀合基团、反应性磷基、磷部分或与支撑介质的共价连接；
qi、qj、qk以及ql各自独立地为H、卤素、C1-C12烷基、取代的C1-C12烷基、C2-C12烯基、取代的C2-C12烯基、C2-C12炔基、取代的C2-C12炔基、C1-C12烷氧基、取代的C1-C12烷氧基、OJj、SJj、SOJj、SO2Jj、NJjJk、N3、CN、C(＝O)OJj、C(＝O)NJjJk、C(＝O)Jj、O-C(＝O)NJjJk、N(H)C(＝NH)NJjJk、N(H)C(＝O)NJjJk或N(H)C(＝S)NJjJk；并且
qi和qj或ql和qk一起为＝C(qg)(qh)，其中qg和qh各自独立地为H、卤素、C1-C12烷基或取代的C1-C12烷基。
一种具有4'-(CH2)3-2'桥和烯基类似物桥4'-CH＝CH-CH2-2'的碳环双环核苷已有所描述(Freier等人，Nucleic Acids Research,1997,25(22),4429-4443和Albaek等人，J.Org.Chem.,2006,71,7731-7740)。碳环双环核苷的合成和制备以及它们的寡聚及生物化学研究也已有所描述(Srivastava等人,J.Am.Chem.Soc.,2007,129(26),8362-8379)。
本文所用的“4’-2’双环核苷”或“4’至2’双环核苷”是指包含含连接2’碳原子与4’碳原子的桥的呋喃糖环的双环核苷。
本文所用的“单环核苷”是指包含不为双环糖部分的修饰的糖部分的核苷。在某些实施方案中，核苷的糖部分或糖部分类似物可在任何位置上被修饰或取代。
本文所用的“2’-修饰的糖”意谓在2’位上修饰的呋喃糖基糖。在某些实施方案中，所述修饰包括选自以下的取代基：包括但不限于卤基、取代及未取代的烷氧基、取代及未取代的硫烷基、取代及未取代的氨基烷基、取代及未取代的烷基、取代及未取代的烯丙基以及取代及未取代的炔基。在某些实施方案中，2’修饰选自包括但不限于以下的取代基：O[(CH2)nO]mCH3、O(CH2)nNH2、O(CH2)nCH3、O(CH2)nF、O(CH2)nONH2、OCH2C(＝O)N(H)CH3以及O(CH2)nON[(CH2)nCH3]2，其中n和m为1至约10。其他2'取代基还可选自：C1-C12烷基、取代的烷基、烯基、炔基、烷芳基、芳烷基、O-烷芳基或O-芳烷基、SH、SCH3、OCN、Cl、Br、CN、F、CF3、OCF3、SOCH3、SO2CH3、ONO2、NO2、N3、NH2、杂环烷基、杂环烷芳基、氨基烷氨基、聚烷氨基、取代的硅烷基、RNA裂解基团、报告基团、嵌入剂、改进药物动力学性质的基团、或改进反义化合物的药效学性质的基团，以及其他具有类似性质的取代基。在某些实施方案中，修饰的核苷包含2’-MOE侧链(Baker等人,J.Biol.Chem.,1997,272,11944-12000)。所述2'-MOE取代已被描述为相较于未修饰的核苷及其他修饰的核苷(如2’-O-甲基、O-丙基及O-氨基丙基)具有改善的结合亲和力。具有2'-MOE取代基的寡核苷酸还被示为在体内使用中具有良好特征的基因表达的反义抑制剂(Martin,Helv.Chim.Acta,1995,78,486-504；Altmann等,Chimia,1996,50,168-176；Altmann等,Biochem.Soc.Trans.,1996,24,630-637以及Altmann等,Nucleosides Nucleotides,1997,16,917-926)。
本文所用的“修饰的四氢吡喃核苷”或“修饰的THP核苷”意谓具有取代普通核苷中的呋喃戊糖基残基的6元四氢吡喃“糖”(糖替代物)的核苷。修饰的THP核苷包括但不限于在本领域中称为己糖醇核酸(HNA)、anitol核酸(ANA)、甘露醇核酸(MNA)(参见Leumann,Bioorg.Med.Chem.,2002,10,841-854)或具有如下所示的四氢呋喃环系统的氟HNA(F-HNA)：
在某些实施方案中，选择具有式VII的糖替代物：
其中独立地对于所述至少一种式VII的四氢吡喃核苷类似物中的每一个：
Bx为杂环碱基部分；
Ta和Tb各自独立地为将四氢吡喃核苷类似物连接至反义化合物的核苷间连接基团，或者Ta和Tb中的一个为将四氢吡喃核苷类似物连接至反义化合物的核苷间连接基团且Ta和Tb中的另一个为H、羟基保护基、连接的缀合基团或5'或3'-端基；
q1、q2、q3、q4、q5、q6以及q7各自独立地为H、C1-C6烷基、取代的C1-C6烷基、C2-C6烯基、取代的C2-C6烯基、C2-C6炔基或取代的C2-C6炔基；并且R1和R2各自选自氢、羟基、卤素、取代的或未取代的烷氧基、NJ1J2、SJ1、N3、OC(＝X)J1、OC(＝X)NJ1J2、NJ3C(＝X)NJ1J2以及CN，其中X为O、S或NJ1并且J1、J2以及J3各自独立地为H或C1-C6烷基。
在某些实施方案中，提供了式VII的修饰THP核苷，其中q1、q2、q3、q4、q5、q6以及q7各自为H。在某些实施方案中，q1、q2、q3、q4、q5、q6以及q7中的至少一个不为H。在某些实施方案中，q1、q2、q3、q4、q5、q6以及q7中的至少一个为甲基。在某些实施方案中，提供了式VII的THP核苷,其中R1和R2中的一个是氟。在某些实施方案中，R1为氟并且R2为H；R1为甲氧基并且R2为H，并且R1为甲氧基乙氧基并且R2为H。
在某些实施方案中，糖替代物包含具有多于5个原子和多于一个杂原子的环。例如包含吗啉代糖部分的核苷以及它们在低聚化合物中的用途已有所报告(参见例如：Braasch等,Biochemistry,2002,41,4503-4510；和美国专利5,698,685；5,166,315；5,185,444以及5,034,506)。如在此所使用，术语“吗啉代”意指具有以下式的糖替代物：
在某些实施方案中，可例如通过添加或改变来自以上吗啉代结构的各种取代基来修饰吗啉代。所述糖替代物在本文中称为“修饰的吗啉代”。
还提供了修饰的组合，不限于如2'-F-5'-甲基取代的核苷(对于其他公开的5',2'-双取代核苷，参见8/21/08公布的PCT国际申请WO2008/101157)和用S替代核糖基环氧原子以及在2'-位上的进一步取代(参见2005年6月16日公布的已公布的美国专利申请US2005-0130923)或替代地双环核酸的5'-取代(参见11/22/07公布的PCT国际申请WO2007/134181，其中4'-CH2-O-2'双环核苷在5'位上被5'-甲基或5'-乙烯基进一步取代)。碳环双环核苷的合成和制备连同其低聚和生物化学研究也已有所描述(参见，例如，Srivastava等，J.Am.Chem.Soc.2007,129(26),8362-8379)。
在某些实施方案中，反义化合物包含一个或多个修饰的环己烯基核苷，其为用六元环己烯基替代天然存在的核苷中的呋喃戊糖基残基的核苷。修饰的环己烯基核苷包括但不限于本领域中描述的那些(参见例如共同拥有的已公布的2010年4月10日公布的PCT申请WO2010/036696，Robeyns等,J.Am.Chem.Soc.,2008,130(6),1979-1984；Horváth等,Tetrahedron Letters,2007,48,3621-3623；Nauwelaerts等,J.Am.Chem.Soc.,2007,129(30),9340-9348；Gu等,,Nucleosides,Nucleotides&Nucleic Acids,2005,24(5-7),993-998；Nauwelaerts等,Nucleic Acids Research,2005,33(8),2452-2463；Robeyns等,ActaCrystallographica,Section F:Structural Biology and CrystallizationCommunications,2005,F61(6),585-586；Gu等,Tetrahedron,2004,60(9),2111-2123；Gu等,Oligonucleotides,2003,13(6),479-489；Wang等,J.Org.Chem.,2003,68,4499-4505；Verbeure等,Nucleic Acids Research,2001,29(24),4941-4947；Wang等,J.Org.Chem.,2001,66,8478-82；Wang等,Nucleosides,Nucleotides&Nucleic Acids,2001,20(4-7),785-788；Wang等,J.Am.Chem.,2000,122,8595-8602；已公布的PCT申请WO 06/047842以及已公布的PCT申请WO 01/049687；每项申请的内容以引用的方式整体并入本文)。某些修饰的环己烯基核苷具有式X。
其中独立地对于所述至少一种式X的环己烯基核苷类似物中的每一个：
Bx为杂环碱基部分；
T3和T4各自独立地为将环己烯基核苷类似物连接至反义化合物的核苷间连接基团，或者T3和T4中的一个为将四氢吡喃核苷类似物连接至反义化合物的核苷间连接基团且T3和T4中的另一个为H、羟基保护基、连接的缀合基团或5'或3'-端基；并且
q1、q2、q3、q4、q5、q6、q7、q8以及q9各自独立地为H、C1-C6烷基、取代的C1-C6烷基、C2-C6烯基、取代的C2-C6烯基、C2-C6炔基、取代的C2-C6炔基或其他糖取代基。
本文所用的“2’-修饰的核苷”或“2’-取代的核苷”是指包含在2’位上包含除H或OH以外的取代基的糖的核苷。2’-修饰的核苷包括但不限于其中连接糖环的两个碳原子的桥连接糖环的2’碳与另一个碳的双环核苷以及具有如以下的非桥连2’取代基的核苷：烯丙基、氨基、叠氮基、硫基、O-烯丙基、O-C1-C10烷基、-OCF3、O-(CH2)2-O-CH3、2'-O(CH2)2SCH3、O-(CH2)2-O-N(Rm)(Rn)或O-CH2-C(＝O)-N(Rm)(Rn)，其中Rm和Rn各自独立地为H或取代或未取代的C1-C10烷基。2’-修饰的核苷可进一步例如在糖的其他位置上和/或在核碱基上包含其他修饰。
本文所用的“2’-F”是指包括在糖环的2’位上包含氟基的糖的核苷。
本文所用的“2’-OMe”或“2’-OCH3”或“2’-O-甲基”各自是指包含在糖环的2’位上包含-OCH3基团的糖的核苷。
本文所用的“MOE”或“2’-MOE”或“2’-OCH2CH2OCH3”或“2’-O-甲氧基乙基”各自是指包含在糖环的2’位上包含-OCH2CH2OCH3基团的糖的核苷。
本文所用的“寡核苷酸”是指包含多个连接的核苷的化合物。在某些实施方案中，多个核苷中的一或多个是修饰的。在某些实施方案中，寡核苷酸包含一个或多个核糖核苷(RNA)和/或脱氧核糖核苷(DNA)。
许多其他双环和三环糖替代物环系统在本领域中也是已知的，其可用于修饰用于并入反义化合物中的核苷(参见例如综述文章：Leumann,Bioorg.Med.Chem.,2002,10,841-854)。可对所述环系统进行各种其它取代以增强活性。
用于制备修饰的糖的方法为本领域技术人员所熟知。教导此类修饰的糖的制备的一些代表性美国专利包括但不限于U.S.4,981,957、5,118,800、5,319,080、5,359,044、5,393,878、5,446,137、5,466,786、5,514,785、5,519,134、5,567,811、5,576,427、5,591,722、5,597,909、5,610,300、5,627,053、5,639,873、5,646,265、5,670,633、5,700,920、5,792,847以及6,600,032以及2005年6月2日提交的国际申请PCT/US2005/019219和2005年12月22日公布的WO 2005/121371，并且每篇所述专利以引用的方式整体并入本文。
在具有修饰的糖部分的核苷酸中，核碱基部分(天然、修饰的或其组合)被维持以便与适当核酸目标杂交。
在某些实施方案中，反义化合物包含一个或多个具有修饰的糖部分的核苷酸。在某些实施方案中，修饰的糖部分为2’-MOE。在某些实施方案中，2’-MOE修饰的核苷酸排列于缺口聚物基序中。在某些实施方案中，修饰的糖部分是具有(4’-CH(CH3)-O-2’)桥接基团的双环核苷。在某些实施方案中，(4’-CH(CH3)-O-2’)修饰的核苷布置在整个缺口聚物基序的翼中。
修饰的核碱基
核碱基(或碱基)修饰或取代与天然存在的或合成的未修饰核碱基在结构上不同，但在功能上是可以互换的。天然和修饰的核碱基能够参与氢键合。这样的核碱基修饰可赋予反义化合物以核酸酶稳定性、结合亲和力或一些其他有益的生物学特性。修饰的核碱基包括合成的和天然的核碱基，诸如，例如，5-甲基胞嘧啶(5-me-C)。某些核碱基取代，包括5-甲基胞嘧啶取代，对于增加反义化合物的目标核酸结合亲和力是特别有用的。例如，5-甲基胞嘧啶取代已显示出增加核酸双链体稳定性0.6-1.2℃(Sanghvi,Y.S.,Crooke,S.T.和Lebleu,B.编,Antisense Research and Applications,CRC Press,Boca Raton,1993,第276-278页)。
额外修饰核碱基包括但不限于5-羟甲基胞嘧啶、黄嘌呤、次黄嘌呤、2-氨基腺嘌呤、腺嘌呤和鸟嘌呤的6-甲基及其他烷基衍生物、腺嘌呤和鸟嘌呤的2-丙基及其他烷基衍生物、2-硫尿嘧啶、2-硫代胸腺嘧啶和2-硫代胞嘧啶、5-卤代尿嘧啶和胞嘧啶、5-丙炔基(-C≡C-CH3)尿嘧啶和胞嘧啶以及嘧啶碱基的其他炔基衍生物、6-偶氮尿嘧啶、胞嘧啶和胸腺嘧啶、5-尿嘧啶(假尿嘧啶)、4-硫代尿嘧啶、8-卤基、8-氨基、8-硫醇、8-硫代烷基、8-羟基和其他8-位取代的腺嘌呤和鸟嘌呤、5-卤基尤其是5-溴基、5-三氟甲基和其他5-位取代的尿嘧啶和胞嘧啶、7-甲基鸟嘌呤和7-甲基腺嘌呤、2-F-腺嘌呤、2-氨基腺嘌呤、8-氮鸟嘌呤和8-氮腺嘌呤、7-脱氮鸟嘌呤和7-脱氮腺嘌呤和3-脱氮鸟嘌呤和3-脱氮腺嘌呤。
杂环碱基部分还可包括其中嘌呤或嘧啶碱基被其他杂环替代的那些，例如7-脱氮腺嘌呤、7-脱氮鸟苷、2-氨基吡啶和2-吡啶酮。尤其可用于提高反义化合物的结合亲和性的核碱基包括5-取代的嘧啶、6-氮嘧啶和N-2、N-6和O-6取代的嘌呤，包括2-氨丙基腺嘌呤、5-丙炔基尿嘧啶和5-丙炔基胞嘧啶。
在某些实施方案中，靶向CFB核酸的反义化合物包含一个或多个修饰的核碱基。在某些实施方案中，靶向CFB核酸的缩短或缺口加宽的反义化合物包含一个或多个修饰的核碱基。在某些实施方案中，修饰的核碱基为5-甲基胞嘧啶。在某些实施方案中，每个胞嘧啶为5-甲基胞嘧啶。
缀合的反义化合物
在某些实施方案中，本公开提供缀合反义化合物。在某些实施方案中，本公开提供包含与核酸转录物互补的反义寡核苷酸的缀合反义化合物。在某些实施方案中，本公开提供包括使细胞与包含与核酸转录物互补的反义寡核苷酸的缀合反义化合物接触的方法。在某些实施方案中，本公开提供包括使细胞与包含反义寡核苷酸的缀合反义化合物接触并且降低细胞中核酸转录物的量或活性的方法。
去唾液酸糖蛋白受体(ASGP-R)先前已有描述。参见例如，Park等，PNAS第102卷，第47期，第17125-17129页(2005)。所述受体在肝脏细胞尤其是肝细胞上表达。此外，已显示，包含三个N-乙酰基半乳糖胺(GalNAc)配体的聚簇的化合物能够结合ASGP-R，从而导致化合物被摄取到细胞中。参见例如，Khorev等，Bioorganic and Medicinal Chemistry16,9，第5216-5231页(May 2008)。因此，包含所述GalNAc聚簇的缀合物已用来促进将某些化合物摄取到肝脏细胞(确切地是肝细胞)中。例如，已显示，某些含有GalNAc的缀合物在体内增加双链siRNA化合物在肝脏细胞中的活性。在所述情况下，含有GalNAc的缀合物通常连接至siRNA双链体的有义链。因为在反义链最终与靶核酸杂交之前丢弃有义链，所以存在很少关于缀合物将干扰活性的问题。通常，缀合物连接至siRNA的有义链的3’末端。参见例如，美国专利8,106,022。本文描述的某些缀合物基团比先前描述的缀合物基团更有活性和/或更易于合成。
在本发明的某些实施方案中，缀合物连接至单链反义化合物，包括但不限于基于RNA酶H的反义化合物和改变前体mRNA靶核酸的剪接的反义化合物。在所述实施方案中，缀合物应该保持连接至反义化合物足以提供益处(摄取到细胞中的改进)的时间，但是随后应裂解或以其它方式不干扰对于活性所必需的后续步骤，如与靶核酸杂交以及与RNA酶H或与和剪接或剪接调节相关的酶相互作用。这种性质平衡在单链反义化合物的环境中比在其中缀合物可简单连接至有义链的siRNA化合物中更为重要。本文公开了与缺乏缀合物的相同反义化合物相比在体内在肝脏细胞中具有改进效力的缀合的单链反义化合物。已知这些化合物所需的性质平衡如改进的效力是令人惊奇的。
在某些实施方案中，本文的缀合物基团包含可裂解部分。如所指出的，不希望受机制的束缚，合乎逻辑的是，缀合物应在化合物上保持足以提供摄取增强的时间，但其后，希望缀合物的一些部分或理想的是缀合物的全部均裂解，从而释放呈其最具活性形式的母体化合物(例如，反义化合物)。在某些实施方案中，可裂解部分为可裂解核苷。所述实施方案通过经由一个或多个可裂解键(如具有磷酸二酯键联的那些)通过核苷使缀合物的其余部分(聚簇)连接至反义寡核苷酸来利用细胞中的内源性核酸酶。在某些实施方案中，聚簇通过磷酸二酯键联与可裂解核苷结合。在某些实施方案中，可裂解核苷通过磷酸二酯键联连接至反义寡核苷酸(反义化合物)。在某些实施方案中，缀合物基团可包含两个或三个可裂解核苷。在所述实施方案中，所述可裂解核苷通过可裂解键(如具有磷酸二酯键联的那些)彼此连接，连接至反义化合物和/或连接至聚簇。本文的某些缀合物不包含可裂解核苷而是包含可裂解键。显示了通过至少一个在细胞中易受裂解的键(可裂解键)来提供缀合物自寡核苷酸的充分裂解。
在某些实施方案中，缀合反义化合物为前药。向动物施用所述前药并且其最终代谢为更具活性的形式。例如，使缀合反义化合物裂解以去除缀合物的全部或部分，从而产生缺乏缀合物的全部或一些的反义化合物的活性(或更具活性)形式。
在某些实施方案中，缀合物连接在寡核苷酸的5’末端。某些所述5’-缀合物比具有连接在3’末端的类似缀合物基团的对应物更有效地裂解。在某些实施方案中，改进的活性可与改进的裂解相关。在某些实施方案中，在5’末端包含缀合物的寡核苷酸比在3’末端包含缀合物的寡核苷酸具有更大的效能(参见，例如，实施例56、81、83和84)。此外，5’-连接允许更简单的寡核苷酸合成。通常，在固体载体上在3’至5’方向上合成寡核苷酸。为了制得3’-缀合寡核苷酸，通常将预先缀合的3’核苷连接至固体载体，然后按常规构造寡核苷酸。然而，将所述缀合核苷连接至固体载体增加了合成的复杂性。此外，使用所述方法，缀合物则存在于寡核苷酸的整个合成中并且在后续步骤期间可能发生降解或可能限制可使用的反应和试剂的种类。使用本文针对5’-缀合寡核苷酸所述的结构和技术，可使用标准自动化技术合成寡核苷酸并且与最后(最5’)的核苷一起或在寡核苷酸从固体载体上裂解之后引入缀合物。
鉴于现有技术和本公开，普通技术人员可简单制得本文的任何缀合物和缀合寡核苷酸。此外，本文公开的某些所述缀合物和缀合寡核苷酸的合成更简单和/或需要更少步骤，并且因此比先前公开的缀合物的合成更低廉，从而在制造上提供优点。例如，某些缀合物基团的合成由较少合成步骤组成，从而导致相对先前所述的缀合物基团产率增加。缀合物基团如实施例46中的GalNAc3-10和实施例48中的GalNAc3-7比先前描述的缀合物简单得更多，所述先前描述的缀合物如需要装配更多化学中间体的U.S.8,106,022或U.S.7,262,177中所述的那些。因此，本文描述的这些和其他缀合物在与任何寡核苷酸一起使用方面优于先前描述的化合物，所述寡核苷酸包括单链寡核苷酸和双链寡核苷酸(例如，siRNA)的任一链。
类似地，本文公开了仅具有一个或两个GalNAc配体的缀合物基团。如所示出的，所述缀合物基团改进了反义化合物的活性。所述化合物比包含三个GalNAc配体的缀合物更易于制备。包含一个或两个GalNAc配体的缀合物基团可连接至任何反义化合物，包括单链寡核苷酸和双链寡核苷酸(例如，siRNA)的任一链。
在某些实施方案中，本文的缀合物大致上不改变耐受性的某些量度。例如，本文显示缀合反义化合物不比未缀合的母体化合物更具有免疫原性。因为效力得到改进，所以其中耐受性保持相同(或甚至与效力增益相比耐受性实际上仅略微变差)的实施方案对于治疗具有改进的性质。
在某些实施方案中，缀合允许人们以在不存在缀合的情况下具有较不吸引人的结果的方式改变反义化合物。例如，在某些实施方案中，用磷酸二酯键联替代完全的硫代磷酸酯反义化合物的一个或多个硫代磷酸酯键联造成耐受性的一些量度的改进。例如，在某些情况下，具有一个或多个磷酸二酯的所述反义化合物比其中每个键联为硫代磷酸酯的相同化合物具有更小的免疫原性。然而，在某些情况下，如实施例26中所示，用磷酸二酯键联同样替代一个或多个硫代磷酸酯键联还造成细胞摄取减少和/或效力损失。在某些实施方案中，本文描述的缀合反义化合物耐受所述键联变化，其中当与缀合的完全硫代磷酸酯对应物相比时摄取和效力损失很少或没有损失。事实上，在某些实施方案中，例如在实施例44、57、59和86中，包含缀合物和至少一个磷酸二酯核苷间键联的寡核苷酸实际上表现出增加的体内效力，即使是相对于也包含相同缀合物的完全硫代磷酸酯对应物来说。此外，因为缀合导致摄取/效力的实质增加，所以为实现改进的耐受性，所述实质增益的些微损失是可接受的。因此，在某些实施方案中，缀合反义化合物包含至少一个磷酸二酯键联。
在某些实施方案中，本文的反义化合物的缀合造成肝细胞中递送、摄取和活性的增加。因此，向肝脏组织递送更多的化合物。然而，在某些实施方案中，仅递送增加不能解释活性的整体增加。在某些所述实施方案中，更多化合物进入肝细胞。在某些实施方案中，即使是肝细胞摄取增加也不能解释活性的整体增加。在所述实施方案中，缀合化合物的生产性(productive)摄取增加。例如，如实施例102中所示，相对于非实质细胞，含有GalNAc的缀合物的某些实施方案增加了反义寡核苷酸在肝细胞中的富集。此富集对靶向在肝细胞中表达的基因的寡核苷酸是有益的。
在某些实施方案中，本文的缀合反义化合物造成肾暴露减少。例如，如实施例20中所示，包含含有GalNAc的缀合物的某些实施方案的反义寡核苷酸在肾中的浓度低于缺乏含有GalNAc的缀合物的反义寡核苷酸的浓度。这具有若干有益的治疗意义。对于不想要在肾中的活性的治疗适应症(indication)，对肾的暴露具有肾毒性的风险而没有相应的益处。此外，肾中的高浓度通常导致化合物流失至尿液，从而导致更快的清除。因此对于非肾靶标，肾积累是不希望的。
在某些实施方案中，本公开提供由下式表示的缀合反义化合物：
其中
A为反义寡核苷酸；
B为可裂解部分
C为缀合物接头
D为支链基团
每个E为系链；
每个F为配体；并且
q为1与5之间的整数。
在上图和在本文的类似图中，支链基团“D”支化多次，所述次数是适应由“q”指示的(E-F)基团数目所必需的。因此，在q＝1时，式为：
A-B-C-D-E-F
在q＝2时，式为：
在q＝3时，式为：
在q＝4时，式为：
在q＝5时，式为：
在某些实施方案中，提供具有以下结构的缀合反义化合物：
在某些实施方案中，提供具有以下结构的缀合反义化合物：
在某些实施方案中，提供具有以下结构的缀合反义化合物：
在某些实施方案中，提供具有以下结构的缀合反义化合物：
本公开提供以下非限制性编号的实施方案：
实施方案1.如实施方案1179至1182中任一个所述的缀合反义化合物，其中系链具有选自以下的结构：
其中每个n独立地为0、1、2、3、4、5、6或7。
实施方案2.如实施方案1179至1182中任一个所述的缀合反义化合物，其中系链具有以下结构：
实施方案3.如实施方案1179至1182或1688至1689中任一个所述的缀合反义化合物，其中接头具有选自以下的结构：
实施方案4.如实施方案1179至1182或1688至1689中任一个所述的缀合反义化合物，其中接头具有选自以下的结构：
其中每个n独立地为0、1、2、3、4、5、6或7。
实施方案5.如实施方案1179至1182或1688至1689中任一个所述的缀合反义化合物，其中接头具有以下结构：
在具有多于一个具体变量(例如，多于一个“m”或“n”)的实施方案中，除非另外指出，否则独立选择每个所述具体变量。因此，对于具有多于一个n的结构，独立地选择每个n，所以它们可为或可不为彼此相同的。
i.某些可裂解部分
在某些实施方案中，可裂解部分为可裂解键。在某些实施方案中，可裂解部分包含可裂解键。在某些实施方案中，缀合物基团包含可裂解部分。在某些所述实施方案中，可裂解部分连接至反义寡核苷酸。在某些所述实施方案中，可裂解部分直接连接至细胞靶向部分。在某些所述实施方案中，可裂解部分连接至缀合物接头。在某些实施方案中，可裂解部分包含磷酸酯或磷酸二酯。在某些实施方案中，可裂解部分为可裂解核苷或核苷类似物。在某些实施方案中，核苷或核苷类似物包含选自以下的任选保护的杂环碱基：嘌呤、取代的嘌呤、嘧啶或取代的嘧啶。在某些实施方案中，可裂解部分为包含选自以下的任何保护的杂环碱基的核苷：尿嘧啶、胸腺嘧啶、胞嘧啶、4-N-苯甲酰基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、4-N-苯甲酰基-5-甲基胞嘧啶、腺嘌呤、6-N-苯甲酰基腺嘌呤、鸟嘌呤以及2-N-异丁酰基鸟嘌呤。在某些实施方案中，可裂解部分为2'-脱氧核苷，所述2'-脱氧核苷通过磷酸二酯键联连接至反义寡核苷酸的3'位并且通过磷酸二酯或硫代磷酸酯键联连接至接头。在某些实施方案中，可裂解部分为2'-脱氧腺苷，所述2'-脱氧腺苷通过磷酸二酯键联连接至反义寡核苷酸的3'位并且通过磷酸二酯或硫代磷酸酯键联连接至接头。在某些实施方案中，可裂解部分为2'-脱氧腺苷，所述2'-脱氧腺苷通过磷酸二酯键联连接至反义寡核苷酸的3'位并且通过磷酸二酯键联连接至接头。
在某些实施方案中，可裂解部分连接至反义寡核苷酸的3'位。在某些实施方案中，可裂解部分连接至反义寡核苷酸的5'位。在某些实施方案中，可裂解部分连接至反义寡核苷酸的2'位。在某些实施方案中，可裂解部分通过磷酸二酯键联连接至反义寡核苷酸。在某些实施方案中，可裂解部分通过磷酸二酯或硫代磷酸酯键联连接至接头。在某些实施方案中，可裂解部分通过磷酸二酯键联连接至接头。在某些实施方案中，缀合物基团不包括可裂解部分。
在某些实施方案中，在将复合物施用至动物之后，仅在被靶细胞内化之后，可裂解部分才被裂解。在细胞内部，可裂解部分裂解，从而释放活性反义寡核苷酸。虽然不希望受理论的束缚，但是据信可裂解部分在细胞内被一种或多种核酸酶裂解。在某些实施方案中，一种或多种核酸酶裂解可裂解部分与接头之间的磷酸二酯键联。在某些实施方案中，可裂解部分具有选自以下的结构：
其中Bx、Bx1、Bx2以及Bx3各自独立地为杂环碱基部分。在某些实施方案中，可裂解部分具有选自以下的结构：
ii.某些接头
在某些实施方案中，缀合物基团包含接头。在某些所述实施方案中，接头共价结合至可裂解部分。在某些所述实施方案中，接头共价结合至反义寡核苷酸。在某些实施方案中，接头共价结合至细胞靶向部分。在某些实施方案中，接头还包含对固体载体的共价连接。在某些实施方案中，接头还包含对蛋白质结合部分的共价连接。在某些实施方案中，接头还包含对固体载体的共价连接并且还包含对蛋白质结合部分的共价连接。在某些实施方案中，接头包括多个用于连接束缚配体(tethered ligand)的位置。在某些实施方案中，接头包括多个用于连接束缚配体的位置并且不连接至支链基团。在某些实施方案中，接头还包含一个或多个可裂解键。在某些实施方案中，缀合物基团不包括接头。
在某些实施方案中，接头包括至少线性基团，所述线性基团包含选自以下的基团：烷基、酰胺、二硫化物、聚乙二醇、醚、硫醚(-S-)和羟氨基(-O-N(H)-)。在某些实施方案中，线性基团包含选自以下的基团：烷基、酰胺和醚基团。在某些实施方案中，线性基团包含选自烷基和醚基团的基团。在某些实施方案中，线性基团包含至少一个磷连接基团。在某些实施方案中，线性基团包含至少一个磷酸二酯基团。在某些实施方案中，线性基团包括至少一个中性连接基团。在某些实施方案中，线性基团共价连接至细胞靶向部分和可裂解部分。在某些实施方案中，线性基团共价连接至细胞靶向部分和反义寡核苷酸。在某些实施方案中，线性基团共价连接至细胞靶向部分、可裂解部分和固体载体。在某些实施方案中，线性基团共价连接至细胞靶向部分、可裂解部分、固体载体和蛋白质结合部分。在某些实施方案中，线性基团包括一个或多个可裂解键。
在某些实施方案中，接头包括共价连接至支架基团的线性基团。在某些实施方案中，支架包括支链脂肪族基团，所述支链脂肪族基团包含选自以下的基团：烷基、酰胺、二硫化物、聚乙二醇、醚、硫醚和羟氨基。在某些实施方案中，支架包括支链脂肪族基团，所述支链脂肪族基团包含选自以下的基团：烷基、酰胺和醚基团。在某些实施方案中，支架包括至少一个单环系统或多环系统。在某些实施方案中，支架包括至少两个单环系统或多环系统。在某些实施方案中，线性基团共价连接至支架基团并且支架基团共价连接至可裂解部分和接头。在某些实施方案中，线性基团共价连接至支架基团并且支架基团共价连接至可裂解部分、接头和固体载体。在某些实施方案中，线性基团共价连接至支架基团并且支架基团共价连接至可裂解部分、接头和蛋白质结合部分。在某些实施方案中，线性基团共价连接至支架基团并且支架基团共价连接至可裂解部分、接头、蛋白质结合部分和固体载体。在某些实施方案中，支架基团包括一个或多个可裂解键。
在某些实施方案中，接头包括蛋白质结合部分。在某些实施方案中，蛋白质结合部分为脂质，例如像包括但不限于：胆固醇、胆酸、金刚烷乙酸、1-芘丁酸、二氢睾酮、1,3-二-O(十六烷基)甘油、香叶基氧基己基、十六烷基甘油、冰片、薄荷醇、1,3-丙二醇、十七烷基、棕榈酸、肉豆蔻酸、O3-(油酰基)石胆酸、O3-(油酰基)胆烯酸、二甲氧基三苯甲基或吩噁嗪)、维生素(例如，叶酸、维生素A、维生素E、生物素、吡哆醛)、肽、碳水化合物(例如，单糖、二糖、三糖、四糖、寡糖、多糖)、溶内体组分、类固醇(例如，熊果醇、龙舌兰皂苷配基、薯蓣皂苷配基)、萜烯(例如，三萜烯，例如萨洒皂角苷配基、木栓酮、表木栓醇衍生的石胆酸)或阳离子脂质。在某些实施方案中，蛋白质结合部分为C16至C22长链饱和或不饱和的脂肪酸、胆固醇、胆酸、维生素E、金刚烷或1-五氟丙基。
在某些实施方案中，接头具有选自以下的结构：
其中每个n独立地为1至20；并且p为1至6。
在某些实施方案中，接头具有选自以下的结构：
其中每个n独立地为1至20。
在某些实施方案中，接头具有选自以下的结构：
其中n为1至20。
在某些实施方案中，接头具有选自以下的结构：
其中每个L独立地为磷连接基团或中性连接基团；并且
每个n独立地为1至20。
在某些实施方案中，接头具有选自以下的结构：
在某些实施方案中，接头具有选自以下的结构：
在某些实施方案中，接头具有选自以下的结构：
在某些实施方案中，接头具有选自以下的结构：
其中n为1至20。
在某些实施方案中，接头具有选自以下的结构：
在某些实施方案中，接头具有选自以下的结构：
在某些实施方案中，接头具有选自以下的结构：
在某些实施方案中，缀合物接头具有以下结构：
在某些实施方案中，缀合物接头具有以下结构：
在某些实施方案中，接头具有选自以下的结构：
在某些实施方案中，接头具有选自以下的结构：
乙醇；
其中每个n独立地为0、1、2、3、4、5、6或7。
iii.某些细胞靶向部分
在某些实施方案中，缀合物基团包含细胞靶向部分。某些所述细胞-靶向部分使反义化合物的细胞摄取增加。在某些实施方案中，细胞靶向部分包含支链基团、一个或多个系链和一个或多个配体。在某些实施方案中，细胞靶向部分包含支链基团、一个或多个系链、一个或多个配体以及一个或多个可裂解键。
1.某些支链基团
在某些实施方案中，缀合物基团包含靶向部分，所述靶向部分包含支链基团和至少两个束缚配体。在某些实施方案中，支链基团连接缀合物接头。在某些实施方案中，支链基团连接可裂解部分。在某些实施方案中，支链基团连接反义寡核苷酸。在某些实施方案中，支链基团共价连接至接头和每个束缚配体。在某些实施方案中，支链基团包含支链脂肪族基团，所述支链脂肪族基团包含选自以下的基团：烷基、酰胺、二硫化物、聚乙二醇、醚、硫醚和羟氨基。在某些实施方案中，支链基团包含选自以下的基团：烷基、酰胺和醚基团。在某些实施方案中，支链基团包含选自烷基和醚基团的基团。在某些实施方案中，支链基团包含单环系统或多环系统。在某些实施方案中，支链基团包含一个或多个可裂解键。在某些实施方案中，缀合物基团不包括支链基团。
在某些实施方案中，支链基团具有选自以下的结构：
其中每个n独立地为1至20；
j为1至3；并且
m为2至6。
在某些实施方案中，支链基团具有选自以下的结构：
其中每个n独立地为1至20；并且
m为2至6。
在某些实施方案中，支链基团具有选自以下的结构：
在某些实施方案中，支链基团具有选自以下的结构：
其中A1各自独立地为O、S、C＝O或NH；并且
每个n独立地为1至20。
在某些实施方案中，支链基团具有选自以下的结构：
其中A1各自独立地为O、S、C＝O或NH；并且
每个n独立地为1至20。
在某些实施方案中，支链基团具有选自以下的结构：
其中A1为O、S、C＝O或NH；并且
每个n独立地为1至20。
在某些实施方案中，支链基团具有选自以下的结构：
在某些实施方案中，支链基团具有选自以下的结构：
在某些实施方案中，支链基团具有选自以下的结构：
2.某些系链
在某些实施方案中，缀合物基团包含共价连接至支链基团的一个或多个系链。在某些实施方案中，缀合物基团包含共价连接至连接基团的一个或多个系链。在某些实施方案中，每个系链为包含选自以下的一个或多个基团的线性脂肪族基团：处于任何组合的烷基、醚、硫醚、二硫化物、酰胺和聚乙二醇基团。在某些实施方案中，每个系链为包含选自以下的一个或多个基团的线性脂肪族基团：处于任何组合的烷基、取代的烷基、醚、硫醚、二硫化物、酰胺、磷酸二酯和聚乙二醇基团。在某些实施方案中，每个系链为包含选自以下的一个或多个基团的线性脂肪族基团：处于任何组合的烷基、醚和酰胺基团。在某些实施方案中，每个系链为包含选自以下的一个或多个基团的线性脂肪族基团：处于任何组合的烷基、取代的烷基、磷酸二酯、醚和酰胺基团。在某些实施方案中，每个系链为包含选自以下的一个或多个基团的线性脂肪族基团：处于任何组合的烷基和磷酸二酯。在某些实施方案中，每个系链包含至少一个磷连接基团或中性连接基团。
在某些实施方案中，系链包括一个或多个可裂解键。在某些实施方案中，系链通过酰胺或醚基团连接至支链基团。在某些实施方案中，系链通过磷酸二酯基团连接至支链基团。在某些实施方案中，系链通过磷连接基团或中性连接基团连接至支链基团。在某些实施方案中，系链通过醚基团连接至支链基团。在某些实施方案中，系链通过酰胺或醚基团连接至配体。在某些实施方案中，系链通过醚基团连接至配体。在某些实施方案中，系链通过酰胺或醚基团连接至配体。在某些实施方案中，系链通过醚基团连接至配体。
在某些实施方案中，每个系链在配体与支链基团之间包含约8至约20个原子的链长。在某些实施方案中，每个系链基团在配体与支链基团之间包含约10至约18个原子的链长。在某些实施方案中，每个系链基团包含约13个原子的链长。
在某些实施方案中，系链具有选自以下的结构：
其中每个n独立地为1至20；并且
每个p为1至约6。
在某些实施方案中，系链具有选自以下的结构：
在某些实施方案中，系链具有选自以下的结构：
其中每个n独立地为1至20。
在某些实施方案中，系链具有选自以下的结构：
其中L为磷连接基团或中性连接基团；
Z1为C(＝O)O-R2；
Z2为H、C1-C6烷基或取代的C1-C6烷基；
R2为H、C1-C6烷基或取代的C1-C6烷基；并且
每个m1独立地为0至20，其中对于每个系链，至少一个m1大于0。
在某些实施方案中，系链具有选自以下的结构：
在某些实施方案中，系链具有选自以下的结构：
其中Z2为H或CH3；并且
每个m1独立地为0至20，其中对于每个系链，至少一个m1大于0。
在某些实施方案中，系链具有选自以下的结构：
其中每个n独立地为0、1、2、3、4、5、6或7。
在某些实施方案中，系链包含磷连接基团。在某些实施方案中，系链不包含任何酰胺键。在某些实施方案中，系链包含磷连接基团并且不包含任何酰胺键。
3.某些配体
在某些实施方案中，本公开提供了配体，其中每个配体共价连接至系链。在某些实施方案中，每个配体经过选择以对靶细胞上的至少一种类型的受体具有亲合力。在某些实施方案中，选择对哺乳动物肝脏细胞表面上的至少一种类型的受体具有亲合力的配体。在某些实施方案中，选择对肝去唾液酸糖蛋白受体(ASGP-R)具有亲合力的配体。在某些实施方案中，每个配体为碳水化合物。在某些实施方案中，每个配体独立地选自半乳糖、N-乙酰基半乳糖胺、甘露糖、葡萄糖、葡糖胺以及岩藻糖。在某些实施方案中，每个配体为N-乙酰基半乳糖胺(GalNAc)。在某些实施方案中，靶向部分包含2至6个配体。在某些实施方案中，靶向部分包含3个配体。在某些实施方案中，靶向部分包含3个N-乙酰基半乳糖胺配体。
在某些实施方案中，配体为碳水化合物、碳水化合物衍生物、改性的碳水化合物、多价碳水化合物聚簇、多糖、修饰的多糖或多糖衍生物。在某些实施方案中，配体为氨基糖或硫代糖。例如，氨基糖可选自任何数目的本领域中已知的化合物，例如葡糖胺、唾液酸、α-D-半乳糖胺、N-乙酰基半乳糖胺、2-乙酰氨基-2-脱氧-D-吡喃半乳糖(GalNAc)、2-氨基-3-O-[(R)-1-羧乙基]-2-脱氧-β-D-吡喃葡萄糖(β-胞壁酸)、2-脱氧-2-甲基氨基-L-吡喃葡萄糖、4,6-二脱氧-4-甲酰氨基-2,3-二-O-甲基-D-吡喃甘露糖、2-脱氧-2-磺氨基-D-吡喃葡萄糖和N-磺基-D-葡糖胺以及N-乙醇酰基-α-神经氨酸。例如，硫代糖可选自由以下组成的组：5-硫代-β-D-吡喃葡萄糖、2,3,4-三-O-乙酰基-1-硫代-6-O-三苯甲基-α-D-吡喃葡萄糖苷甲酯、4-硫代-β-D-吡喃半乳糖以及3,4,6,7-四-O-乙酰基-2-脱氧-1,5-二硫代-α-D-吡喃葡庚糖苷乙酯。
在某些实施方案中，“GalNac”或“Gal-NAc”是指2-(乙酰氨基)-2-脱氧-D-吡喃半乳糖，在文献中通常称为N-乙酰基半乳糖胺。在某些实施方案中，“N-乙酰基半乳糖胺”是指2-(乙酰氨基)-2-脱氧-D-吡喃半乳糖。在某些实施方案中，“GalNac”或“Gal-NAc”是指2-(乙酰氨基)-2-脱氧-D-吡喃半乳糖。在某些实施方案中，“GalNac”或“Gal-NAc”是指2-(乙酰氨基)-2-脱氧-D-吡喃半乳糖，其包括两种β形式：2-(乙酰氨基)-2-脱氧-β-D-吡喃半乳糖和α-形式：2-(乙酰氨基)-2-脱氧-D-吡喃半乳糖。在某些实施方案中，两种β形式：2-(乙酰氨基)-2-脱氧-β-D-吡喃半乳糖和α-形式：2-(乙酰氨基)-2-脱氧-D-吡喃半乳糖可以互换使用。因此，在其中描绘一种形式的结构中，这些结构也意图包括另一种形式。例如，在针对α形式：2-(乙酰氨基)-2-脱氧-D-吡喃半乳糖示出结构时，该结构也意图包括另一种形式。在某些实施方案中，在某些优选的实施方案中，β形式2-(乙酰氨基)-2-脱氧-D-吡喃半乳糖为优选的实施方案。
2-(乙酰氨基)-2-脱氧-β-D-吡喃半乳糖
2-(乙酰氨基)-2-脱氧-β-D-吡喃半乳糖
2-(乙酰氨基)-2-脱氧-α-D-吡喃半乳糖
在某些实施方案中，一个或多个配体具有选自以下的结构：
其中R1各自选自OH和NHCOOH。
在某些实施方案中，一个或多个配体具有选自以下的结构：
在某些实施方案中，一个或多个配体具有选自以下的结构：
在某些实施方案中，一个或多个配体具有选自以下的结构：
i.某些缀合物
在某些实施方案中，缀合物基团包含以上结构特征。在某些所述实施方案中，缀合物基团具有以下结构：
其中每个n独立地为1至20。
在某些所述实施方案中，缀合物基团具有以下结构：
在某些所述实施方案中，缀合物基团具有以下结构：
其中每个n独立地为1至20；
Z为H或连接的固体载体；
Q为反义化合物；
X为O或S；并且
Bx为杂环碱基部分。
在某些所述实施方案中，缀合物基团具有以下结构：
在某些所述实施方案中，缀合物基团具有以下结构：
在某些所述实施方案中，缀合物基团具有以下结构：
在某些所述实施方案中，缀合物基团具有以下结构：
在某些所述实施方案中，缀合物基团具有以下结构：
在某些所述实施方案中，缀合物基团具有以下结构：
在某些所述实施方案中，缀合物基团具有以下结构：
在某些所述实施方案中，缀合物基团具有以下结构：
在某些实施方案中，缀合物不包含吡咯烷。
在某些所述实施方案中，缀合物基团具有以下结构：
在某些所述实施方案中，缀合物基团具有以下结构：
在某些所述实施方案中，缀合物基团具有以下结构：
在某些所述实施方案中，缀合物基团具有以下结构：
在某些所述实施方案中，缀合物基团具有以下结构：
在某些所述实施方案中，缀合物基团具有以下结构：
在某些所述实施方案中，缀合物基团具有以下结构：
在某些所述实施方案中，缀合物基团具有以下结构：
在某些所述实施方案中，缀合物基团具有以下结构：
在某些所述实施方案中，缀合物基团具有以下结构：
在某些所述实施方案中，缀合物基团具有以下结构：
在某些实施方案中，缀合物基团的细胞靶向部分具有以下结构：
其中X为具有六至十一个连续键合的原子的取代或未取代的系链。
在某些实施方案中，缀合物基团的细胞靶向部分具有以下结构：
其中X为具有十个连续键合的原子的取代或未取代的系链。
在某些实施方案中，缀合物基团的细胞靶向部分具有以下结构：
其中X为具有四至十一个连续键合的原子的取代或未取代的系链并且其中系链包含恰好一个酰胺键。
在某些实施方案中，缀合物基团的细胞靶向部分具有以下结构：
其中Y和Z独立地选自C1-C12取代或未取代的烷基、烯基或炔基，或包含醚、酮、酰胺、酯、氨基甲酸酯、胺、哌啶、磷酸酯、磷酸二酯、硫代磷酸酯、三唑、吡咯烷、二硫化物或硫醚的基团。
在某些所述实施方案中，缀合物基团的细胞靶向部分具有以下结构：
其中Y和Z独立地选自C1-C12取代或未取代的烷基，或包含恰好一个醚或恰好两个醚、酰胺、胺、哌啶、磷酸酯、硫酸二酯或硫代磷酸酯的基团。
在某些所述实施方案中，缀合物基团的细胞靶向部分具有以下结构：
其中Y和Z独立地选自C1-C12取代或未取代的烷基。
在某些所述实施方案中，缀合物基团的细胞靶向部分具有以下结构：
其中m和n独立地选自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11和12。
在某些所述实施方案中，缀合物基团的细胞靶向部分具有以下结构：
其中m为4、5、6、7或8，并且n为1、2、3或4。
在某些实施方案中，缀合物基团的细胞靶向部分具有以下结构：
其中X为具有四至十三个连续键合的原子的取代或未取代的系链，并且其中X不包含醚基团。
在某些实施方案中，缀合物基团的细胞靶向部分具有以下结构：
其中X为具有八个连续键合的原子的取代或未取代的系链，并且其中X不包含醚基团。
在某些实施方案中，缀合物基团的细胞靶向部分具有以下结构：
其中X为具有四至十三个连续键合的原子的取代或未取代的系链，并且其中系链包含恰好一个酰胺键，并且其中X不包含醚基团。
在某些实施方案中，缀合物基团的细胞靶向部分具有以下结构：
其中X为具有四至十三个连续键合的原子的取代或未取代的系链并且其中系链由酰胺键和取代或未取代的C2-C11烷基组成。
在某些实施方案中，缀合物基团的细胞靶向部分具有以下结构：
其中Y选自C1-C12取代或未取代的烷基、烯基或炔基，或包含醚、酮、酰胺、酯、氨基甲酸酯、胺、哌啶、磷酸酯、磷酸二酯、硫代磷酸酯、三唑、吡咯烷、二硫化物或硫醚的基团。
在某些所述实施方案中，缀合物基团的细胞靶向部分具有以下结构：
其中Y选自C1-C12取代或未取代的烷基，或包含醚、胺、哌啶、磷酸酯、磷酸二酯或硫代磷酸酯的基团。
在某些所述实施方案中，缀合物基团的细胞靶向部分具有以下结构：
其中Y选自C1-C12取代或未取代的烷基。
在某些所述实施方案中，缀合物基团的细胞靶向部分具有以下结构：
其中n为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12。
在某些所述实施方案中，缀合物基团的细胞靶向部分具有以下结构：
其中n为4、5、6、7或8。
在某些实施方案中，缀合物不包含吡咯烷。
某些缀合反义化合物
在某些实施方案中，缀合物在核苷的2’、3’或5’位上结合至反义寡核苷酸的核苷。在某些实施方案中，缀合反义化合物具有以下结构：
其中
A为反义寡核苷酸；
B为可裂解部分
C为缀合物接头
D为支链基团
每个E为系链；
每个F为配体；并且
q为1与5之间的整数。
在某些实施方案中，缀合反义化合物具有以下结构：
其中
A为反义寡核苷酸；
C为缀合物接头
D为支链基团
每个E为系链；
每个F为配体；并且
q为1与5之间的整数。
在某些所述实施方案中，缀合物接头包含至少一个可裂解键。
在某些所述实施方案中，支链基团包含至少一个可裂解键。
在某些实施方案中，每个系链包含至少一个可裂解键。
在某些实施方案中，缀合物在核苷的2’、3’或5’位上结合至反义寡核苷酸的核苷。
在某些实施方案中，缀合反义化合物具有以下结构：
其中
A为反义寡核苷酸；
B为可裂解部分
C为缀合物接头
每个E为系链；
每个F为配体；并且
q为1与5之间的整数。
在某些实施方案中，缀合物在核苷的2’、3’或5’位上结合至反义寡核苷酸的核苷。在某些实施方案中，缀合反义化合物具有以下结构：
其中
A为反义寡核苷酸；
C为缀合物接头
每个E为系链；
每个F为配体；并且
q为1与5之间的整数。
在某些实施方案中，缀合反义化合物具有以下结构：
其中
A为反义寡核苷酸；
B为可裂解部分
D为支链基团
每个E为系链；
每个F为配体；并且
q为1与5之间的整数。
在某些实施方案中，缀合反义化合物具有以下结构：
其中
A为反义寡核苷酸；
D为支链基团
每个E为系链；
每个F为配体；并且
q为1与5之间的整数。
在某些所述实施方案中，缀合物接头包含至少一个可裂解键。在某些实施方案中，每个系链包含至少一个可裂解键。
在某些实施方案中，缀合反义化合物具有选自以下的结构：
在某些实施方案中，缀合反义化合物具有选自以下的结构：
在某些实施方案中，缀合反义化合物具有选自以下的结构：
教导某些上述缀合物、缀合反义化合物、系链、接头、支链基团、配体、可裂解部分以及其他修饰的制备的代表性美国专利、美国专利申请公布和国际专利申请公布包括但不限于US 5,994,517、US 6,300,319、US 6,660,720、US 6,906,182、US 7,262,177、US 7,491,805、US 8,106,022、US 7,723,509、US 2006/0148740、US 2011/0123520、WO 2013/033230和WO 2012/037254，所述专利中的每一个均以引用的方式整体并入本文。
教导某些上述缀合物、缀合反义化合物、系链、接头、支链基团、配体、可裂解部分以及其他修饰的制备的代表性公布包括但不限于BIESSEN等,"The CholesterolDerivative of a Triantennary Galactoside with High Affinity for the HepaticAsialoglycoprotein Receptor:a Potent Cholesterol Lowering Agent"J.Med.Chem.(1995)38:1846-1852、BIESSEN等,"Synthesis of Cluster Galactosides with HighAffinity for the Hepatic Asialoglycoprotein Receptor"J.Med.Chem.(1995)38:1538-1546、LEE等,"New and more efficient multivalent glyco-ligands forasialoglycoprotein receptor of mammalian hepatocytes"Bioorganic&MedicinalChemistry(2011)19:2494-2500、RENSEN等,"Determination of the Upper Size Limitfor Uptake and Processing of Ligands by the Asialoglycoprotein Receptor onHepatocytes in Vitro and in Vivo"J.Biol.Chem.(2001)276(40):37577-37584、RENSEN等,"Design and Synthesis of Novel N-Acetylgalactosamine-TerminatedGlycolipids for Targeting of Lipoproteins to the Hepatic AsialoglycoproteinReceptor"J.Med.Chem.(2004)47:5798-5808、SLIEDREGT等,"Design and Synthesis ofNovel Amphiphilic Dendritic Galactosides for Selective Targeting of Liposomesto the Hepatic Asialoglycoprotein Receptor"J.Med.Chem.(1999)42:609-618以及Valentijn等,“Solid-phase synthesis of lysine-based cluster galactosides withhigh affinity for the Asialoglycoprotein Receptor”Tetrahedron,1997,53(2),759-770，所述专利中的每一项均以引用的方式整体并入本文。
在某些实施方案中，缀合反义化合物包含基于RNA酶H的寡核苷酸(如缺口聚物)或剪接调节寡核苷酸(如完全修饰的寡核苷酸)和包含至少一个、两个或三个GalNAc基团的任何缀合物基团。在某些实施方案中，缀合反义化合物包含见于任何以下参考文献中的任何缀合物基团：Lee,Carbohydr Res,1978,67,509-514；Connolly等，J Bi ol Chem,1982,257,939-945；Pavia等，Int J Pep Protein Res,1983,22,539-548；Lee等，Biochem,1984,23,4255-4261；Lee等，G lycoconjugate J,1987,4,317-328；Toyokuni等，TetrahedronLett,1990,31,2673-2676；Biessen等，J Med Chem,1995,38,1538-1546；Valentijn等，Tetrahedron,1997,53,759-770；Kim等，Tetrahedron Lett,1997,38,3487-3490；Lee等，Bioconjug Chem,1997,8,762-765；Kato等，Glycobiol,2001,11,821-829；Rensen等，JBiol Ch em,2001,276,37577-37584；Lee等，Methods Enzymol,2003,362,38-43；Westerlind等，Glycoconj J,2004,21,227-241；Lee等，Bi oorg Med Chem Lett,2006,16(19),5132-5135；Maierhofer等，Bio org Med Chem,2007,15,7661-7676；Khorev等，Bioorg Med Che m,2008,16,5216-5231；Lee等，Bioorg Med Chem,2011,19,2494-2500；Kornilova等，Analyt Biochem,2012,425,43-46；Pujol等，Angew Chemie Int Ed Engl,2012,51,7445-7448；Biessen等，J M ed Chem,1995,38,1846-1852；Sliedregt等，J MedChem,1999,42,609-618；Rensen等，J Med Chem,2004,47,5798-5808；Rense n等，Arterioscler Thromb Vasc Biol,2006,26,169-175；van Rosse nberg等，Gene Ther,2004,11,457-464；Sato等，J Am Chem Soc,2004,126,14013-14022；Lee等，J Org Chem,2012,77,7564-7571；Biessen等，FASEB J,2000,14,1784-1792；Rajur等，Bioconj ugChem,1997,8,935-940；Duff等，Methods Enzymol,2000,313,297-321；Maier等，BioconjugChem,2003,14,18-29；Jayaprakas h等，Org Lett,2010,12,5410-5413；Manoharan,Antisense Nuclei c Acid Drug Dev,2002,12,103-128；Merwin等，Bioconjug Chem,1994,5,612-620；Tomiya等，Bioorg Med Chem,2013,21,5275-5281；国际申请WO1998/013381；WO2011/038356；WO1997/046098；WO2008/098788；WO2004/101619；WO2012/037254；WO2011/120053；WO2011/100131；WO2011/163121；WO2012/177947；WO2013/033230；WO2013/075035；WO2012/083185；WO2012/083046；WO2009/082607；WO2009/134487；WO2010/144740；WO2010/148013；WO1997/020563；WO2010/088537；WO2002/043771；WO2010/129709；WO2012/068187；WO2009/126933；WO2004/024757；WO2010/054406；WO2012/089352；WO2012/089602；WO2013/166121；WO2013/165816；美国专利4,751,219；8,552,163；6,908,903；7,262,177；5,994,517；6,300,319；8,106,022；7,491,805；7,491,805；7,582,744；8,137,695；6,383,812；6,525,031；6,660,720；7,723,509；8,541,548；8,344,125；8,313,772；8,349,308；8,450,467；8,501,930；8,158,601；7,262,177；6,906,182；6,620,916；8,435,491；8,404,862；7,851,615；已公布的美国专利申请公布US2011/0097264；US2011/0097265；US2013/0004427；US2005/0164235；US2006/0148740；US2008/0281044；US2010/0240730；US2003/0119724；US2006/0183886；US2008/0206869；US2011/0269814；US2009/0286973；US2011/0207799；US2012/0136042；US2012/0165393；US2008/0281041；US2009/0203135；US2012/0035115；US2012/0095075；US2012/0101148；US2012/0128760；US2012/0157509；US2012/0230938；US2013/0109817；US2013/0121954；US2013/0178512；US2013/0236968；US2011/0123520；US2003/0077829；US2008/0108801以及US2009/0203132；所述参考文献中的每一个均以引用的方式整体并入。
体外测试反义寡核苷酸
本文描述用反义寡核苷酸处理细胞的方法，所述方法可被适当修改以用于用其他反义化合物进行的处理。
可当细胞在培养中达到约60％至80％汇合度时，用反义寡核苷酸处理细胞。
一种常用于将反义寡核苷酸引入培养细胞中的试剂包括阳离子型脂质转染试剂LIPOFECTIN(Invitrogen,Carlsbad,CA)。可将反义寡核苷酸与LIPOFECTIN在OPTI-MEM 1(Invitrogen,Carlsbad,CA)中混合以达成反义寡核苷酸的所需最终浓度及可在每100nM反义寡核苷酸2至12ug/mL范围内的LIPOFECTIN浓度。
另一种用于将反义寡核苷酸引入培养细胞中的试剂包括LIPOFECTAMINE(Invitrogen,Carlsbad,CA)。将反义寡核苷酸与LIPOFECTAMINE在OPTI-MEM 1血清减少型培养基(Invitrogen,Carlsbad,CA)中混合以达成反义寡核苷酸的所需浓度及可在每100nM反义寡核苷酸2至12ug/mL范围内的LIPOFECTAMINE浓度。
另一种用于将反义寡核苷酸引入培养细胞中的技术包括电穿孔。
又一种用于将反义寡核苷酸引入培养细胞中的技术包括细胞对寡核苷酸的自由摄取。
通过常规方法用反义寡核苷酸处理细胞。可在反义寡核苷酸处理后16至24小时收获细胞，此时通过本领域中已知及本文所述的方法测量目标核酸的RNA或蛋白质水平。一般来说，当在多次重复实验中进行处理时，数据呈现为重复处理的平均值。
所用的反义寡核苷酸浓度在细胞系之间有所不同。确定用于特定细胞系的最佳反义寡核苷酸浓度的方法在本领域中为熟知的。当用LIPOFECTAMINE转染时，通常使用浓度在1nM至300nM范围内的反义寡核苷酸。当使用电穿孔进行转染时，使用625nM至20,000nM范围内的较高浓度的反义寡核苷酸。
RNA分离
可对总细胞RNA或聚(A)+mRNA进行RNA分析。RNA分离方法在本领域中是熟知的。RNA是使用本领域中熟知的方法，例如使用TRIZOL试剂(Invitrogen,Carlsbad,CA)，根据制造商推荐的方案来制备。
某些适应症
本文提供的某些实施方案涉及通过施用CFB特异性抑制剂(诸如靶向CFB的反义化合物)治疗、预防或减轻与受试者补体替代途径失调相关的疾病的方法。
用本文所提供的方法治疗、预防和/或减轻与补体替代途径失调相关的肾病的实例包括C3肾小球炎、非典型的溶血性尿毒性综合征(aHUS)、致密沉积物疾病(DDD；也称为MPGN II型或C3Neph)以及CFHR5肾病。
用本文所提供的方法治疗、预防和/或减轻与补体替代途径失调相关的肾病的额外的实例包括IgA肾病；肾小球系膜毛细血管性(膜性增生性)肾小球肾炎(MPGN)；包括狼疮肾炎和系统性红斑狼疮(SLE)的自身免疫性疾病；感染诱发的肾小球肾炎(也称为感染后肾小球肾炎)以及肾脏缺血-再灌注损伤，例如移植后肾脏缺血-再灌注损伤。
用本文所提供的方法治疗和/或预防与补体替代途径失调相关的非肾病的实例包括眼部疾病诸如黄斑变性，例如老年性黄斑变性(AMD)，包括湿性AMD和干性AMD，诸如地图样萎缩；视神经脊髓炎；角膜疾病，诸如角膜炎；自身免疫性葡萄膜炎以及糖尿病性视网膜病。补体系统涉及眼部疾病已有所报告。Jha P等，Mol Immunol(2007)44(16):3901-3908。用本文所提供的方法治疗和/或预防与补体替代途径失调相关的非肾病的额外的实例包括ANCA相关的脉管炎、抗磷脂综合症(也称为抗磷脂抗体综合征(APS))、哮喘、类风湿性关节炎、重症肌无力以及多发性硬化症。
本文提供的某些实施方案涉及通过施用CFB特异性抑制剂(诸如靶向CFB的反义化合物)治疗、预防或减轻与受试者补体替代途径失调相关的肾病的方法。在某些方面中，肾病为狼疮肾炎、系统性红斑狼疮(SLE)、致密沉积物疾病(DDD)、C3肾小球肾炎(C3GN)、CFHR5肾病或非典型的溶血性尿毒性综合征(aHUS)或其任何组合。
本文提供的某些实施方案涉及通过施用CFB特异性抑制剂(诸如靶向CFB的反义化合物)治疗、预防或减轻黄斑变性诸如老年性黄斑变性(AMD)的方法。在某些方面中，AMD是湿性AMD或干性AMD。在某些方面中，干性AMD可以为地图样萎缩。研究已证明补体替代途径失调和AMD的相关性。补体组分是眼部玻璃疣和在AMD患者的黄斑中积累的细胞外材料的共同组分。此外，已报告CFH和CFB变体占北欧和北美AMD病例的近75％。还发现特异性CFB多态性赋予针对AMD的保护作用。Patel,N.等,Eye(2008)22(6):768-76。此外，CFB纯合无效小鼠在进行激光凝固之后具有较低的替代途径活性，表现出较小的眼损伤和脉络膜新血管形成(CNV)。Rohrer,B.等,Invest Ophthalmol Vis Sci.(2009)50(7):3056-64。此外，CFBsiRNA治疗保护小鼠免于遭受激光诱导的CNV。Bora,NS等,J Immunol.(2006)177(3):1872-8。研究还显示肾脏和眼睛共用发育途径以及包括基底膜胶原IV原聚体组成和血管分布的结构特征。Savige等,J Am Soc Nephrol.(2011)22(8):1403-15。有证据说明补体替代途径涉及肾病和眼病。例如，遗传性补体调节蛋白质缺陷引起非典型的溶血性尿毒性综合征和AMD的倾向。Richards A等,Adv Immunol.(2007)96:141-77。此外，慢性肾病与AMD有关。Nitsch,D.等,Ophthalmic Epidemiol.(2009)16(3):181-6；Choi,J.等,OphthalmicEpidemiol.(2011)18(6):259-63。与失调的补体替代途径相关的致密沉积物疾病(DDD)、肾病的特征在于急性肾炎综合征和眼部玻璃疣。Cruz和Smith,GeneReviews(2007)7月20日。此外，带有补体替代途径组分的基因缺失的小鼠具有共存的肾病和眼病表型。CFH纯合无效小鼠发育为DDD并且表现出视网膜异常和视觉功能障碍已有所报告。Pickering等,NatGenet.(2002)31(4):424-8。与补体替代途径失调相关的肾病的小鼠模型作为AMD的模型可是可以接收的。Pennesi ME等,Mol Aspects Med(2012)33:487-509。例如CFH无效小鼠是针对肾病诸如DDD和AMD的可接受的模型。此外，已报告AMD与补体因子的系统性来源有关，所述补体因子在眼睛中局部积累以驱使补体替代途径激活。Loyet等,Invest OphthalmolVis Sci.(2012)53(10):6628-37。
实施例
以下实施例说明了本公开的某些实施方案并且不是限制性的。此外，在提供具体实施方案时，发明人已预期了那些具体实施方案的一般应用。例如，具有具体基序的寡核苷酸的公开为具有相同或类似基序的另外的寡核苷酸提供了合理支持。并且，例如，在特别高亲合力的修饰出现在具体位置上时，相同位置上的其他高亲合力修饰也认为是合适的，除非另外指出。
实施例1：用于制备亚磷酰胺化合物1、1a和2的一般方法
Bx为杂环基；
根据如本文说明书所述的本领域已知的程序制备化合物1、1a和2(参见Seth等,Bioorg.Med.Chem.,2011,21(4),1122-1125,J.Org.Chem.,2010,75(5),1569-1581,Nucleic Acids Symposium Series,2008,52(1),553-554)；并且还参见已公布的PCT国际申请(WO 2011/115818、WO 2010/077578、WO2010/036698、WO2009/143369、WO 2009/006478以及WO 2007/090071)和美国专利7,569,686)。
实施例2：制备化合物7
化合物3(2-乙酰氨基-1,3,4,6-四-O-乙酰基-2-脱氧-β-D吡喃半乳糖或半乳糖胺五乙酸酯)为商业上可获得的。根据公布的工序制备化合物5(Weber等，J.Med.Chem.,1991,34,2692)。
实施例3：制备化合物11
化合物8和9为商业上可获得的。
实施例4：制备化合物18
根据实施例3中说明的工序制备化合物11。化合物14为商业上可获得的。使用由Rensen等，J.Med.Chem.,2004,47,5798-5808所报道的类似工序制备化合物17。
实施例5：制备化合物23
化合物19和21为商业上可获得的。
实施例6：制备化合物24
根据实施例4和5中说明的工序制备化合物18和23。
实施例7：制备化合物25
根据实施例6中说明的工序制备化合物24。
实施例8：制备化合物26
根据实施例6中说明的工序制备化合物24。
实施例9：在3’末端包含GalNAc3-1的缀合ASO化合物29的一般制备
其中受保护的GalNAc3-1具有以下结构：
缀合物基团GalNAc3-1的GalNAc3聚簇部分(GalNAc3-1a)可与任何可裂解部分组合以提供各种缀合物基团。其中GalNAc3-1a具有下式：
根据实施例7中说明的程序制备固体载体结合的受保护的GalNAc3-1，即化合物25。使用自动化DNA/RNA合成中的标准程序制备在3’末端包含GalNAc3-1的低聚化合物29(参见Dupouy等,Angew.Chem.Int.Ed.,2006,45,3623-3627)。根据实施例1中说明的工序制备亚磷酰胺结构单元，即化合物1和1a。所述的亚磷酰胺意在为代表性的并且不意图为限制性的，因为可使用其他亚磷酰胺结构单元来制备具有预先确定的序列和组成的低聚化合物。可调节添加至固体载体的亚磷酰胺的顺序和量以制备如本文所述的有缺口的低聚化合物。所述有缺口的低聚化合物可具有如任何给定靶标所指示的预先确定的组成和碱基序列。
实施例10：在5’末端包含GalNAc3-1的缀合ASO化合物34的一般制备
UnylinkerTM 30为商业上可获得的。使用自动化DNA/RNA合成中的标准程序制备在5’末端包含GalNAc3-1聚簇的低聚化合物34(参见Dupouy等,Angew.Chem.Int.Ed.,2006,45,3623-3627)。根据实施例1中说明的工序制备亚磷酰胺结构单元，即化合物1和1a。所述的亚磷酰胺意在为代表性的并且不意图为限制性的，因为可使用其他亚磷酰胺结构单元来制备具有预先确定的序列和组成的低聚化合物。可调节添加至固体载体的亚磷酰胺的顺序和量以制备如本文所述的有缺口的低聚化合物。所述有缺口的低聚化合物可具有如任何给定靶标所指示的预先确定的组成和碱基序列。
实施例11：制备化合物39
根据实施例2、4和5中说明的工序制备化合物4、13和23。使用公布于以下的类似工序制备化合物35：Rouchaud等，Eur.J.Org.Chem.,2011,12,2346-2353。
实施例12：制备化合物40
根据实施例11中说明的工序制备化合物38。
实施例13：制备化合物44
根据实施例5和11中说明的工序制备化合物23和36。使用公布于WO 2009082607中的类似工序制备化合物41。
实施例14：制备化合物45
根据实施例13中说明的工序制备化合物43。
实施例15：制备化合物47
化合物46为商业上可获得的。
实施例16：制备化合物53
化合物48和49为商业上可获得的。根据实施例4和15中说明的工序制备化合物17和47。
实施例17：制备化合物54
根据实施例16中说明的工序制备化合物53。
实施例18：制备化合物55
根据实施例16中说明的工序制备化合物53。
实施例19：用于通过固相技术制备在3’位包含GalNAc3-1的缀合ASO的一般方法(ISIS 647535、647536以及651900的制备)
除非另外说明，否则用于合成低聚化合物的所有试剂和溶液均购自商业来源。使用标准亚磷酰胺结构单元和固体载体来掺入核苷残基，所述核苷残基包括例如T、A、G以及mC残基。0.1M的亚磷酰胺在无水乙腈中的溶液用于β-D-2’-脱氧核糖核苷和2’-MOE。
在ABI 394合成器(1-2μmol规模)上或在GE Healthcare Bioscienceoligopilot合成器(40-200μmol规模)上通过填充在柱中的负载GalNAc3-1的VIMAD固体载体(110μmol/g，Guzaev等，2003)上的亚磷酰胺偶联方法来进行ASO合成。对于偶联步骤，以超过固体载体上的负载量4倍的量递送亚磷酰胺并且持续10min进行亚磷酰胺缩合。所有其他步骤遵循由生厂商供应的标准协议。使用6％二氯乙酸在甲苯中的溶液来从核苷酸的5’-羟基上去除二甲氧基三苯甲基(DMT)。无水CH3CN中的4,5-二氰基咪唑(0.7M)用作偶联步骤过程中的活化剂。通过用苍耳烷氢化物在1:1吡啶/CH3CN中的0.1M溶液硫化3分钟的接触时间来引入硫代磷酸酯键联。使用20％叔丁基过氧化氢在含有6％水的CH3CN中的溶液作为氧化剂来提供磷酸二酯核苷间键联，其中接触时间为12分钟。
在装配希望的序列之后，使用三乙胺和乙腈的1:1(v/v)混合物将磷酸氰基乙酯保护基去保护，其中接触时间为45分钟。将固体载体结合的ASO悬浮在氨水(28-30重量％)中并且在55℃下加热6h。
然后过滤未结合的ASO并且将氨煮沸掉。将残余物通过高压液相色谱在强阴离子交换柱上纯化(GE Healthcare Bioscience，Source30Q，30μm，2.54x 8cm，A＝100mM于30％CH3CN水溶液中的醋酸铵，B＝1.5M于A中的NaBr，0-40％的B持续60min，流速14mL min-1，λ＝260nm)。残余物通过HPLC在反相柱上脱盐以得到基于固体载体上的初始负载量为15％-30％的分离产率的希望的ASO。使用Agilent 1100MSD系统通过离子对HPLC偶联的MS分析来表征ASO。
使用本领域中熟知的标准寡核苷酸合成工序合成不包含缀合物的反义寡核苷酸。
使用这些方法，制备了靶向ApoC III的三种单独的反义化合物。如以下表17中所概述，靶向ApoC III的三种反义化合物中的每一种均具有相同的核碱基序列；ISIS 304801为具有所有硫代磷酸酯键联的5-10-5MOE缺口聚物；ISIS 647535与ISIS 304801相同，除了ISIS 647535具有缀合在其3’末端的GalNAc3-1；并且ISIS 647536与ISIS 647535相同，除了所述化合物的某些核苷间键联为磷酸二酯键联。如表17中进一步概述，合成了靶向SRB-1的两种单独的反义化合物。ISIS 440762为具有所有硫代磷酸酯核苷间键联的2-10-2cEt缺口聚物；ISIS 651900与ISIS 440762相同，除了ISIS 651900在其3’-末端包括GalNAc3-1。
表17
靶向ApoC III和SRB-1的修饰ASO
下标：“e”指示2’-MOE修饰核苷；“d”指示β-D-2’-脱氧核糖核苷；“k”指示6’-(S)-CH3双环核苷(例如cEt)；“s”指示硫代磷酸酯核苷间键联(PS)；“o”指示磷酸二酯核苷间键联(PO)；并且“o’”指示-O-P(＝O)(OH)-。上标“m”指示5-甲基胞嘧啶。“GalNAc3-1”指示具有先前在实施例9中示出的结构的缀合物基团。应注意，GalNAc3-1包含将ASO连接至缀合物的剩余部分的可裂解腺苷，所述可裂解腺苷命名为“GalNAc3-1a”。这种命名法用于上表以显示整个核碱基序列，包括作为缀合物的一部分的腺苷。因此，在上表中，序列还可列为以“GalNAc3-1”结尾，其中省略“Ado”。在全部这些实施例中使用了这种惯例：使用下标“a”来指示缺乏可裂解核苷或可裂解部分的缀合物基团的部分。缺乏可裂解部分的缀合物基团的此部分在本文中是指“聚簇”或“缀合物聚簇”或“GalNAc3聚簇”。在某些情况下，通过单独提供其聚簇和其可裂解部分来方便地描述缀合物基团。
实施例20：huApoC III转基因小鼠中的人ApoC III的剂量依赖性反义抑制
在剂量依赖性研究中，针对其抑制人ApoC III转基因小鼠中的人ApoC III的能力，对各自靶向人ApoC III并且以上描述的ISIS 304801和ISIS 647535进行单独测试和评价。
处理
将人ApoCIII转基因小鼠维持在12小时亮/暗循环中并且随意喂食Teklad实验室食物。在开始实验之前，使动物在研究设备中适应至少7天。在PBS中制备ASO并且通过过滤通过0.2微米过滤器进行灭菌。将ASO溶解于0.9％PBS中用于注射。
每周一次在0.08、0.25、0.75、2.25或6.75μmol/kg下用ISIS 304801或647535或使用PBS作为对照腹膜内注射人ApoC III转基因小鼠，持续两周。每个处理组由4只动物组成。在施用最后剂量之后的四十八小时，从每只小鼠中抽血并且将小鼠处死并收集组织。
ApoC III mRNA分析
使用实时PCR和RNA定量试剂(Molecular Probes,Inc.Eugene,OR)根据标准方案来测定小鼠肝脏中的ApoC III mRNA水平。在归一化为PBS处理的对照之前，测定相对于总RNA的ApoC III mRNA水平(使用Ribogreen)。以下结果以归一化为PBS处理的对照的每个处理组的ApoC III mRNA水平的平均百分比呈现并且表示为“％PBS”。每个ASO的半数最大有效剂量(ED50)也呈现于以下表18中。
如所说明的，相对于PBS对照，这两种反义化合物使ApoC III RNA减少。此外，缀合至GalNAc3-1的反义化合物(ISIS 647535)大致上比缺乏GalNAc3-1缀合物的反义化合物(ISIS 304801)更有效。
表18
ASO处理对人ApoC III转基因小鼠中ApoC III mRNA水平的影响
ApoC III蛋白分析(浊度测定)
使用在2013年3月29日印刷之前在线公布的Graham等，Circulation Research所报道的工序确定血浆ApoC III蛋白分析。
在不稀释的情况下，使用Olympus临床分析仪和可商购获得的浊度ApoC III测定法(Kamiya,Cat#KAI-006,Kamiya Biomedical,Seattle,WA)对从小鼠分离的约100μl血浆进行分析。如供应商所述执行测定方案。
如以下表19中所示，相对于PBS对照，这两种反义化合物使ApoC III蛋白减少。此外，缀合至GalNAc3-1的反义化合物(ISIS647535)大致上比缺乏GalNAc3-1缀合物的反义化合物(ISIS 304801)更有效。
表19
ASO处理对人ApoC III转基因小鼠中ApoC III血浆蛋白水平的影响
通过Bligh和Dyer(Bligh,E.G.和Dyer,W.J.Can.J.Biochem.Physiol.37:911-917,1959)(Bligh,E和Dyer,W,Can J Biochem Physiol,37,911-917,1959)(Bligh,E和Dyer,W,Can J Biochem Physiol,37,911-917,1959)的方法提取血浆甘油三酯和胆固醇并且通过使用Beckmann Coulter临床分析器和商业上可获得的试剂来测量。
相对于PBS注射的小鼠测量甘油三酯水平并且表示为“％PBS”。结果呈现于表20中。如所说明的，这两种反义化合物使甘油三酯水平降低。此外，缀合至GalNAc3-1的反义化合物(ISIS 647535)大致上比缺乏GalNAc3-1缀合物的反义化合物(ISIS 304801)更有效。
表20
ASO处理对转基因小鼠中甘油三酯水平的影响
通过HPLC分析血浆样品来测定总胆固醇和不同级分的胆固醇(HDL和LDL)的量。结果呈现于表21和22中。如所说明的，这两种反义化合物使总胆固醇水平降低；均使LDL降低；并且均使HDL升高。此外，缀合至GalNAc3-1的反义化合物(ISIS 647535)大致上比缺乏GalNAc3-1缀合物的反义化合物(ISIS 304801)更有效。HDL水平增加和LDL水平降低为反义抑制ApoC III的心血管有益作用。
表21
ASO处理对转基因小鼠中总胆固醇水平的影响
表22
ASO处理对转基因小鼠中HDL和LDL胆固醇水平的影响
药物代谢动力学分析(PK)
还评价了ASO的PK。使用标准方案切碎并且提取肝脏和肾样品。在MSD1上利用IP-HPLC-MS分析样品。测量全长ISIS 304801和647535的组织水平(μg/g)并且结果提供于表23中。如所说明的，对于两种反义化合物，总全长反义化合物的肝脏浓度类似。因此，即使GalNAc3-1-缀合的反义化合物在肝脏中更具活性(如通过以上RNA和蛋白质数据所展示)，但它在肝脏中不以大致上更高的浓度存在。事实上，所计算的EC50(提供于表23中)证实了所观察到的缀合化合物的效力增加不能完全归因于积累增加。此结果表明缀合物不仅仅通过肝脏积累的机制，还可能通过改进细胞对反义化合物的产生性摄取来改进效力。
结果还显示GalNAc3-1缀合反义化合物在肾中的浓度低于缺乏GalNAc缀合物的反义化合物的浓度。这具有若干有益的治疗意义。对于不想要在肾中的活性的治疗适应症(indication)，对肾的暴露具有肾毒性的风险而没有相应的益处。此外，肾中的高浓度通常导致化合物流失至尿液，从而导致更快的清除。因此，对于非肾靶标，肾积累为不希望的。这些数据表明GalNAc3-1缀合使肾积累减少。
表23
转基因小鼠中ASO处理的PK分析
还鉴定了ISIS 647535的代谢物并且通过高分辨率质谱分析证实了其质量。以下示出所观察到的代谢物的裂解位点和结构。使用标准工序计算全长ASO的相对％并且结果呈现于表23a中。ISIS 647535的主要代谢物为缺乏整个缀合物的全长ASO(即ISIS304801)，其由在以下示出的裂解位点A处裂解产生。此外，还观察到由其他裂解位点产生的另外代谢物。这些结果表明在GalNAc3-1糖与ASO之间引入其他可裂解键如酯、肽、二硫化物、氨基磷酸酯或酰基腙也可以是有用的，所述可裂解键可被细胞内部的酶裂解或所述可裂解键可在细胞液的还原性环境中裂解或所述可裂解键对内体和溶酶体内部的酸性pH不稳定。
表23a
所观察到的ISIS 647535的全长代谢物
实施例21：单一施用研究中人ApoC III转基因小鼠中的人ApoC III的反义抑制
在单一施用研究中，针对其抑制人ApoC III转基因小鼠中的人ApoC III的能力，对各自靶向人ApoC III并且描述于表17中的ISIS304801、647535和647536进行进一步评价。
处理
将人ApoCIII转基因小鼠维持在12小时亮/暗循环中并且随意喂食Teklad实验室食物。在开始实验之前，使动物在研究设备中适应至少7天。在PBS中制备ASO并且通过过滤通过0.2微米过滤器进行灭菌。将ASO溶解于0.9％PBS中用于注射。
在以下示出的剂量下，用ISIS 304801、647535或647536(以上所述)或用PBS处理的对照腹膜内注射人ApoC III转基因小鼠一次。处理组由3只动物组成并且对照组由4只动物组成。在处理之前以及在最后一次剂量之后，从每只小鼠中抽血并且分析血浆样品。在最后施用之后72小时将小鼠处死。
收集样品并且分析以测定肝脏中的ApoC III mRNA和蛋白质水平；血浆甘油三酯；以及胆固醇，包括如上所述(实施例20)评估的HDL和LDL级分。来自那些分析的数据呈现于以下表24-28中。使用标准方案，相对于盐水注射的小鼠测量血清中的肝脏转氨酶水平，即丙氨酸氨基转移酶(ALT)和天冬氨酸氨基转移酶(AST)。ALT和AST水平显示反义化合物在所有施用的剂量下为耐受良好的。
这些结果显示了与缺乏GalNAc3-1缀合物的反义化合物(ISIS 304801)相比，在3’末端包含GalNAc3-1缀合物的反义化合物(ISIS 647535和647536)的效力的改进。此外，包含GalNAc3-1缀合物和一些磷酸二酯键联的ISIS 647536与ISIS 647535一样有效，所述ISIS647535包含相同的缀合物并且ASO内的所有核苷间键联为硫代磷酸酯。
表24
ASO处理对人ApoC III转基因小鼠中ApoC III mRNA水平的影响
表25
ASO处理对人ApoC III转基因小鼠中ApoC III血浆蛋白水平的影响
表26
ASO处理对转基因小鼠中甘油三酯水平的影响
表27
ASO处理对转基因小鼠中总胆固醇水平的影响
表28
ASO处理对转基因小鼠中HDL和LDL胆固醇水平的影响
这些结果证实GalNAc3-1缀合物改进了反义化合物的效力。结果还显示了其中反义寡核苷酸具有混合的键联的GalNAc3-1缀合反义化合物(具有六个磷酸二酯键联的ISIS647536)和相同反义化合物的全部硫代磷酸酯型式(ISIS 647535)的相等效力。
硫代磷酸酯键联为反义化合物提供若干性质。例如，它们抗核酸酶消化并且它们结合导致化合物在肝脏中积累而不是在肾/尿液中积累的蛋白质。这些为希望的性质，特别是当治疗肝脏中的适应症时。然而，硫代磷酸酯键联还与炎症性应答相关。因此，减少化合物中硫代磷酸酯键联的数目预期会减小炎症的风险，但是也降低化合物在肝脏中的浓度，增加在肾和尿液中的浓度，减小在核酸酶存在下的稳定性并且降低总体效力。本结果显示其中某些硫代磷酸酯键联已被磷酸二酯键联替代的GalNAc3-1缀合反义化合物与具有全部硫代磷酸酯键联的对应物在对抗肝脏中的靶标方面一样有效。所述化合物预期为促炎性较少的(参见实施例24，其描述了显示PS的减少导致炎症性作用减小的实验)。
实施例22：靶向SRB-1的GalNAc3-1缀合的修饰ASO在体内的作用
在剂量依赖性研究中，针对其抑制Balb/c小鼠中的SRB-1的能力，对各自靶向SRB-1并且描述于表17中的ISIS 440762和651900进行评价。
处理
在以下示出的剂量下，用ISIS 440762、651900或用PBS处理的对照皮下注射六周龄雄性Balb/c小鼠(Jackson Laboratory,Bar Harbor,ME)一次。每个处理组由4只动物组成。在最后施用之后48小时将小鼠处死以使用实时PCR和RNA定量试剂(Molecular Probes,Inc.Eugene,OR)根据标准方案测定肝脏SRB-1mRNA水平。在归一化为PBS处理的对照之前，测定相对于总RNA的SRB-1 mRNA水平(使用Ribogreen)。以下结果以归一化为PBS处理的对照的每个处理组的SRB-1 mRNA水平的平均百分比呈现并且表示为“％PBS”。
如表29中所说明的，这两种反义化合物使SRB-1 mRNA水平降低。此外，包含GalNAc3-1缀合物的反义化合物(ISIS 651900)大致上比缺乏GalNAc3-1缀合物的反义化合物(ISIS 440762)更有效。这些结果展示使用与不同靶标互补并且具有不同化学修饰核苷的反义寡核苷酸观察到GalNAc3-1缀合物的效力益处，在这种情况下，修饰核苷包含约束乙基糖部分(双环糖部分)。
表29
ASO处理对Balb/c小鼠中SRB-1 mRNA水平的影响
实施例23：人外周血单核细胞(hPBMC)测定方案
使用BD Vautainer CPT管法进行hPBMC测定。从在美国健康工作诊所(Faraday&ElCamino Real,Carlsbad)具有知情同意书的志愿供体中获得全血样品并且收集在4-15个BDVacutainer CPT 8ml管中(VWR Cat.#BD362753)。使用PBMC测定数据表记录每个供体的CPT管中的大约起始总全血体积。
通过将管轻轻倒置8-10次在离心之前立即重新混合血液样品。将CPT管在具有制动的1500-1800RCF(2700RPM Beckman Allegra6R)下、在水平(摆动)转子中在室温(18-25℃)下离心30min。从血沉棕黄层界面(在Ficoll与聚合物凝胶层之间)取回细胞；转移至无菌50ml圆锥管并且汇集至5个CPT管/50ml圆锥管/供体。然后用PBS(无Ca++、Mg++；GIBCO)洗涤细胞两次。将管加满至50ml并且通过倒置若干次来混合。然后将样品在室温下在330x g下(在Beckman Allegra 6R中的1215RPM)离心15分钟并且在不干扰沉淀物的情况下尽可能多的抽吸上清液。通过轻轻旋转管使细胞沉淀物脱落并且将细胞重新悬浮在RPMI+10％FBS+青霉素/链霉素(大约1ml/10ml起始全血体积)中。将60μl样品用移液管移入到具有600μlVersaLyse试剂(Beckman Coulter Cat#A09777)的样品小瓶(Beckman Coulter)中并且轻轻涡旋10-15秒。将样品在室温下孵育10min并且在计数之前再次混合。使用PBMC细胞类型(1:11的稀释因子与其他参数一起存储)在Vicell XR细胞活力分析器(Beckman Coulter)上计数细胞悬浮液。记录活细胞/ml和活力。在RPMI+10％FBS+青霉素/链霉素中将细胞悬浮液稀释至1x 107活PBMC/ml。
将细胞以5x 105涂布在50μl/孔的96孔组织培养平板(Falcon Microtest)中。根据实验模板(总共100μl/孔)添加50μl/孔的稀释在RPMI+10％FBS+青霉素/链霉素中的2x浓度寡核苷酸/对照。将平板放置在振荡器上并且允许混合约1min。在37℃、5％CO2下孵育24小时之后，将平板在400x g下离心10分钟，之后去除上清液用于MSD细胞因子测定(即人IL-6、IL-10、IL-8以及MCP-1)。
实施例24：在hPBMC测定中评价GalNAc3-1缀合ASO的促炎性作用
使用实施例23中描述的方案，在hPBMC测定中评价列于表30中的反义寡核苷酸(ASO)的促炎性作用。ISIS 353512为已知为测定中的IL-6释放的高响应者的内标物。从新鲜志愿供体中分离hPBMC并且用0μM、0.0128μM、0.064μM、0.32μM、1.6μM、8μM、40μM和200μM浓度下的ASO处理。在24小时处理之后，测量细胞因子水平。
IL-6的水平用作原始读出。使用标准工序计算EC50和Emax。结果表达为来自两个供体的Emax/EC50的平均比率并且表示为“Emax/EC50”。较低的比率表明促炎性反应相对减小并且较高的比率表明促炎性反应相对增加。
对于测试化合物，促炎性最小的化合物为PS/PO连接的ASO(ISIS 616468)。GalNAc3-1缀合ASO(ISIS 647535)比其未缀合的对应物ISIS 304801的促炎性稍小。这些结果表明掺入一些PO键联使促炎性反应减小并且添加GalNAc3-1缀合物并不使化合物更具有促炎性并且可能减小促炎性反应。因此，人们将预期包含混合的PS/PO键联和GalNAc3-1缀合物的反义化合物将相对于具有或不具有GalNAc3-1缀合物的全部PS连接的反义化合物产生较低的促炎性反应。这些结果表明GalNAc3-1缀合反义化合物(尤其是具有减小的PS含量的那些)为促炎性较小的。
总之，这些结果表明GalNAc3-1缀合化合物(尤其是具有减小的PS含量的缀合化合物)可在比缺乏GalNAc3-1缀合物的对应全部PS反义化合物更高的剂量下施用。因为不预期这些化合物的半衰期是大致上不同的，所以所述较高施用将导致较不频繁的给药。事实上，所述施用可为甚至更不频繁的，因为GalNAc3-1缀合化合物为更有效的(参见实施例20-22)并且一旦化合物的浓度下降到低于所需要的水平，重新给药是必要的，其中所述需要的水平基于效力。
表30
修饰ASO
下标：“e”指示2’-MOE修饰核苷；“d”指示β-D-2’-脱氧核糖核苷；“k”指示6’-(S)-CH3双环核苷(例如cEt)；“s”指示硫代磷酸酯核苷间键联(PS)；“o”指示磷酸二酯核苷间键联(PO)；并且“o’”指示-O-P(＝O)(OH)-。上标“m”指示5-甲基胞嘧啶。“Ado’-GalNAc3-1a”指示所指的具有连接至反义寡核苷酸的3’-末端的在实施例9中示出的结构GalNAc3-1的缀合物。
表31
靶向ApoC III的ASO在hPBMC测定中的促炎性作用
实施例25：靶向人ApoC III的GalNAc3-1缀合的修饰ASO在体外的作用
在体外测试以上所述的ISIS 304801和647535。用0.03μM、0.08μM、0.24μM、0.74μM、2.22μM、6.67μM和20μM浓度的修饰寡核苷酸处理密度为25,000个细胞/孔的来自转基因小鼠的原代肝细胞。在大约16小时的处理期后，从细胞中分离RNA并且通过定量实时PCR测量mRNA水平并且如通过RIBOGREEN所测量，根据总RNA含量调节hApoC III mRNA水平。
使用标准方法计算IC50并且结果呈现于表32中。如所说明的，与对照ISIS 304801相比，在用ISIS 647535处理的细胞中观察到可比的效力。
表32
靶向原代肝细胞中的人ApoC III的修饰ASO
在本实验中，在体外没有观察到在体内所观察到的GalNAc3-1缀合的极大效力益处。随后体外的在原代肝细胞中的自由摄取实验确实显示了包含各种GalNAc缀合物的寡核苷酸相对于缺乏GalNAc缀合物的寡核苷酸的效力增加。(参见实施例60、82以及92)
实施例26：PO/PS键联对ApoC III ASO活性的影响
每周一次以25mg/kg的ISIS 304801或ISIS 616468(上述两者)或用PBS处理的对照腹膜内注射人ApoC III转基因小鼠，持续两周。处理组由3只动物组成并且对照组由4只动物组成。在处理之前以及在最后一次剂量之后，从每只小鼠中抽血并且分析血浆样品。在最后施用之后72小时将小鼠处死。
如上所述收集样品并且分析以测定肝脏中的ApoC III蛋白水平(实施例20)。来自那些分析的数据呈现于以下表33中。
这些结果表明相对于全部PS(ISIS 304801)，在翼中具有PO/PS的反义化合物(ISIS 616468)效力减小。
表33
ASO处理对人ApoC III转基因小鼠中ApoC III蛋白水平的影响
实施例27：化合物56
化合物56可从Glen Research商业上获得或可根据由Shchepinov等，NucleicAcids Research,1997,25(22),4447-4454所报道的已公布工序制备。
实施例28：制备化合物60
根据实施例2中说明的工序制备化合物4。化合物57为商业上可获得的。通过结构分析来证实化合物60。
化合物57意在为代表性的并且不意图为限制性的，因为可使用其他单保护的取代或未取代的烷基二醇包括但不限于在本文的说明书中呈现的那些来制备具有预先确定的组成的亚磷酰胺。
实施例29：制备化合物63
使用类似于由Tober等,Eur.J.Org.Chem.,2013,3,566-577和Jiang等,Tetrahedron,2007,63(19),3982-3988所报道的那些的工序制备化合物61和62。
或者，使用类似于由Kim等，Synlett,2003,12,1838-1840；和Kim等，已公布的PCT国际申请WO 2004063208的科学和专利文献中所报道的那些的工序制备化合物63。实施例30：制备化合物63b
使用类似于由Hanessian等，Canadian Journal of Chemistry,1996,74(9),1731-1737所报道的那些的工序制备化合物63a。
实施例31：制备化合物63d
使用类似于由Chen等，Chinese Chemical Letters,1998,9(5),451-453所报道的那些的工序制备化合物63c。
实施例32：制备化合物67
根据实施例2中说明的工序制备化合物64。使用类似于由Or等，已公布的PCT国际申请WO 2009003009所报道的那些的工序制备化合物65。用于化合物65的保护基意在为代表性的并且不意图为限制性的，因为可使用其他保护基包括但不限于在本文的说明书中呈现的那些。
实施例33：制备化合物70
根据实施例2中说明的工序制备化合物64。化合物68为商业上可获得的。用于化合物68的保护基意在为代表性的并且不意图为限制性的，因为可使用其他保护基包括但不限于在本文的说明书中呈现的那些。
实施例34：制备化合物75a
根据由Shchepinov等，Nucleic Acids Research,1997,25(22),4447-4454所报道的公布的工序制备化合物75。
实施例35：制备化合物79
根据由Shchepinov等，Nucleic Acids Research,1997,25(22),4447-4454所报道的公布的工序制备化合物76。
实施例36：制备化合物79a
根据实施例35中说明的工序制备化合物77。
实施例37：用于通过固体载体制备在5’末端包含磷酸二酯连接的GalNAc3-2缀合物的缀合低聚化合物82的一般方法(方法I)
其中GalNAc3-2具有以下结构：
缀合物基团GalNAc3-2的GalNAc3聚簇部分(GalNAc3-2a)可与任何可裂解部分组合以提供各种缀合物基团。其中GalNAc3-2a具有下式：
使用用于自动化DNA/RNA合成的标准工序制备VIMAD结合的低聚化合物79b(参见Dupouy等，Angew.Chem.Int.Ed.,2006,45,3623-3627)。分别根据实施例27和28中说明的工序制备亚磷酰胺化合物56和60。所说明的亚磷酰胺意在为代表性的并且不意图为限制性的，因为可使用其他亚磷酰胺结构单元包括但不限于在本文的说明书中呈现的那些来制备在5’末端具有磷酸二酯连接的缀合物基团的低聚化合物。可调节添加至固体载体的亚磷酰胺的顺序和量来制备具有任何预先确定的序列和组成的如本文所述的低聚化合物。
实施例38：用于制备在5’末端包含磷酸二酯连接的GalNAc3-2缀合物的低聚化合物82的替代方法(方法II)
使用用于自动化DNA/RNA合成的标准工序制备VIMAD结合的低聚化合物79b(参见Dupouy等，Angew.Chem.Int.Ed.,2006,45,3623-3627)。根据实施例35中说明的工序制备GalNAc3-2聚簇亚磷酰胺，即化合物79。此替代方法允许在合成的最后一步将磷酸二酯连接的GalNAc3-2缀合物一步装至低聚化合物。所说明的亚磷酰胺意在为代表性的并且不意图为限制性的，因为可使用其他亚磷酰胺结构单元包括但不限于在本文的说明书中呈现的那些来制备在5’末端具有磷酸二酯缀合物的低聚化合物。可调节添加至固体载体的亚磷酰胺的顺序和量来制备具有任何预先确定的序列和组成的如本文所述的低聚化合物。
实施例39：用于通过固体载体制备在5’末端包含GalNAc3-3缀合物的低聚化合物83h(针对5'末端连接修饰的GalNAc3-1)的一般方法
根据实施例4中说明的工序制备化合物18。化合物83a和83b为商业上可获得的。使用标准寡核苷酸合成工序制备包含磷酸二酯连接的己胺的低聚化合物83e。用氨水处理受保护的低聚化合物提供5'-GalNAc3-3缀合的低聚化合物(83h)。
其中GalNAc3-3具有以下结构：
缀合物基团GalNAc3-3的GalNAc3聚簇部分(GalNAc3-3a)可与任何可裂解部分组合以提供各种缀合物基团。其中GalNAc3-3a具有下式：
实施例40：用于通过固体载体制备在3’末端包含磷酸二酯连接的GalNAc3-4缀合物的低聚化合物89的一般方法
其中GalNAc3-4具有以下结构：
其中CM为可裂解部分。在某些实施方案中，可裂解部分为：
缀合物基团GalNAc3-4的GalNAc3聚簇部分(GalNAc3-4a)可与任何可裂解部分组合以提供各种缀合物基团。其中GalNAc3-4a具有下式：
受保护的Unylinker官能团化的固体载体化合物30为商业上可获得的。使用类似于文献中所报道的那些的工序制备化合物84(参见Shchepinov等，Nucleic AcidsResearch,1997,25(22),4447-4454；Shchepinov等，Nucleic Acids Research,1999,27,3035-3041；以及Hornet等，Nucleic Acids Research,1997,25,4842-4849)。
根据实施例28和36中说明的工序制备亚磷酰胺结构单元，即化合物60和79a。所说明的亚磷酰胺意在为代表性的并且不意图为限制性的，因为可使用其他亚磷酰胺结构单元来制备具有预先确定的序列和组成的在3’末端具有磷酸二酯连接的缀合物的低聚化合物。可调节添加至固体载体的亚磷酰胺的顺序和量来制备具有任何预先确定的序列和组成的如本文所述的低聚化合物。
实施例41：用于通过固相技术制备在5’位上包含磷酸二酯连接的GalNAc3-2(参见实施例37，Bx为腺嘌呤)缀合物的ASO的一般方法(ISIS 661134的制备)
除非另外说明，否则用于合成低聚化合物的所有试剂和溶液均购自商业来源。使用标准亚磷酰胺结构单元和固体载体来掺入核苷残基，所述核苷残基包括例如T、A、G以及mC残基。使用亚磷酰胺化合物56和60来合成5’末端处的磷酸二酯连接的GalNAc3-2缀合物。0.1M的亚磷酰胺在无水乙腈中的溶液用于β-D-2’-脱氧核糖核苷和2’-MOE。
在ABI 394合成器(1-2μmol规模)上或在GE Healthcare Bioscienceoligopilot合成器(40-200μmol规模)上通过填充在柱中的VIMAD固体载体(110μmol/g，Guzaev等，2003)上的亚磷酰胺偶联方法来进行ASO合成。对于偶联步骤，以超过固体载体的初始负载量4倍的量递送亚磷酰胺并且持续10min进行亚磷酰胺偶联。所有其他步骤遵循由生厂商供应的标准协议。使用6％二氯乙酸在甲苯中的溶液来从核苷酸的5’-羟基上去除二甲氧基三苯甲基(DMT)。无水CH3CN中的4,5-二氰基咪唑(0.7M)用作偶联步骤过程中的活化剂。通过用苍耳烷氢化物在1:1吡啶/CH3CN中的0.1M溶液硫化3分钟的接触时间来引入硫代磷酸酯键联。使用20％叔丁基过氧化氢在含有6％水的CH3CN中的溶液作为氧化剂来提供磷酸二酯核苷间键联，其中接触时间为12分钟。
在装配希望的序列之后，使用20％甲苯中的二乙胺(v/v)将磷酸氰基乙酯保护基去保护，其中接触时间为45分钟。将固体载体结合的ASO悬浮在氨水(28-30重量％)中并且在55℃下加热6h。然后过滤未结合的ASO并且将氨煮沸掉。将残余物通过高压液相色谱在强阴离子交换柱上纯化(GE Healthcare Bioscience，Source 30Q，30μm，2.54x 8cm，A＝100mM于30％CH3CN水溶液中的醋酸铵，B＝1.5M于A中的NaBr，60min内0-40％的B，流速14mLmin-1，λ＝260nm)。残余物通过HPLC在反相柱上脱盐以得到基于固体载体上的初始负载量为15％-30％的分离产率的希望的ASO。使用Agilent 1100MSD系统通过离子对HPLC偶联的MS分析来表征ASO。
表34
靶向SRB-1的在5’位上包含磷酸二酯连接的GalNAc3-2缀合物的ASO
下标：“e”指示2’-MOE修饰核苷；“d”指示β-D-2’-脱氧核糖核苷；“k”指示6’-(S)-CH3双环核苷(例如cEt)；“s”指示硫代磷酸酯核苷间键联(PS)；“o”指示磷酸二酯核苷间键联(PO)；并且“o’”指示-O-P(＝O)(OH)-。上标“m”指示5-甲基胞嘧啶。“GalNAc3-2a”的结构在实施例37中示出。
实施例42：用于通过固相技术制备在5’位上包含GalNAc3-3缀合物的ASO的一般方法(ISIS 661166的制备)
使用如实施例39和41中所说明的类似工序进行ISIS 661166的合成。
ISIS 661166为5-10-5MOE缺口聚物，其中5’位包含GalNAc3-3缀合物。使用Agilent 1100MSD系统通过离子对HPLC偶联的MS分析来表征ASO。
表34a
靶向Malat-1的通过己基氨基磷酸二酯键联在5’位上包含GalNAc3-3缀合物的ASO
下标：“e”指示2’-MOE修饰核苷；“d”指示β-D-2’-脱氧核糖核苷；“s”指示硫代磷酸酯核苷间键联(PS)；“o”指示磷酸二酯核苷间键联(PO)；并且“o’”指示-O-P(＝O)(OH)-。上标“m”指示5-甲基胞嘧啶。“5’-GalNAc3-3a”的结构在实施例39中示出。
实施例43：靶向SRB-1的5’末端处的磷酸二酯连接的GalNAc3-2(参见实施例37和41，Bx为腺嘌呤)的体内剂量依赖性研究
在剂量依赖性研究中，测试在5’末端包含磷酸二酯连接的GalNAc3-2缀合物的ISIS 661134(参见实施例41)对小鼠中SRB-1的反义抑制。未缀合的ISIS 440762和651900(3’末端处的GalNAc3-1缀合物，参见实施例9)包括在研究中用于比较并且先前描述于表17中。
处理
在以下示出的剂量下，用ISIS 440762、651900、661134或用PBS处理的对照皮下注射六周龄雄性Balb/c小鼠(Jackson Laboratory,Bar Harbor,ME)一次。每个处理组由4只动物组成。在最后施用之后72小时将小鼠处死，以使用实时PCR和RNA定量试剂(Molecular Probes,Inc.Eugene,OR)根据标准方案测定肝脏SRB-1mRNA水平。在归一化为PBS处理的对照之前，测定相对于总RNA的SRB-1 mRNA水平(使用Ribogreen)。以下结果以归一化为PBS处理的对照的每个处理组的SRB-1 mRNA水平的平均百分比呈现并且表示为“％PBS”。使用如先前所述的类似方法测量ED50并且在以下呈现。
如表35中所说明，用反义寡核苷酸处理以剂量依赖性方式降低SRB-1 mRNA水平。事实上，在5’末端包含磷酸二酯连接的GalNAc3-2缀合物的反义寡核苷酸(ISIS 661134)或包含连接在3’末端的GalNAc3-1缀合物的反义寡核苷酸(ISIS 651900)与未缀合的反义寡核苷酸(ISIS 440762)相比显示出效力的大致改进。此外，在5’末端包含磷酸二酯连接的GalNAc3-2缀合物的ISIS 661134与在3’末端包含GalNAc3-1缀合物的ISIS 651900相比效力相等。
表35
靶向SRB-1的含有GalNAc3-1或GalNAc3-2的ASO
先前在实施例9和37中描述了3’GalNAc3-1和5’GalNAc3-2的结构。
药物代谢动力学分析(PK)
如实施例20中所说明，以相同方式检验和评价来自高剂量组(7mg/kg)的ASO的PK。使用标准方案切碎并且提取肝脏样品。鉴定了661134(5’GalNAc3-2)和ISIS 651900(3’GalNAc3-1)的全长代谢物并且通过高分辨率质谱分析证实了其质量。结果显示针对在5’末端包含磷酸二酯连接的GalNAc3-2缀合物的ASO(ISIS 661134)所检测到的主要代谢物为ISIS 440762(数据未示出)。在可检测水平下没有观察到另外的代谢物。不像其对应物，针对在3’末端具有GalNAc3-1缀合物的ASO(ISIS 651900)观察到类似于先前在表23a中报道的那些的另外的代谢物。这些结果表明具有磷酸二酯连接的GalNAc3-1或GalNAc3-2缀合物可在不损害其效力的情况下改进ASO的PK特征。
实施例44：PO/PS键联对靶向SRB-1的在3’末端包含GalNAc3-1缀合物(参见实施例9)的ASO的反义抑制的影响
在单一施用研究中，针对其抑制小鼠中SRB-1的能力，对各自靶向SRB-1的在3’末端包含GalNAc3-1缀合物的ISIS 655861和655862进行测试。在研究中包括母体未缀合化合物ISIS 353382用于比较。
ASO为5-10-5MOE缺口聚物，其中缺口区包含十个2’-脱氧核糖核苷并且每个翼区包含五个2’-MOE修饰核苷。使用如先前在实施例19中所说明的类似方法制备ASO并且在以下表36中描述。
表36
靶向SRB-1的在3’末端包含GalNAc3-1缀合物的修饰ASO
下标：“e”指示2’-MOE修饰核苷；“d”指示β-D-2’-脱氧核糖核苷；“s”指示硫代磷酸酯核苷间键联(PS)；“o”指示磷酸二酯核苷间键联(PO)；并且“o’”指示-O-P(＝O)(OH)-。上标“m”指示5-甲基胞嘧啶。“GalNAc3-1”的结构在实施例9中示出。
处理
在以下示出的剂量下，用ISIS 353382、655861、655862或用PBS处理的对照皮下注射六周龄雄性Balb/c小鼠(Jackson Laboratory,Bar Harbor,ME)一次。每个处理组由4只动物组成。在处理之前以及在最后一次剂量之后，从每只小鼠中抽血并且分析血浆样品。在最后施用之后72小时将小鼠处死，以使用实时PCR和RNA定量试剂(Molecular Probes,Inc.Eugene,OR)根据标准方案测定肝脏SRB-1 mRNA水平。在归一化为PBS处理的对照之前，测定相对于总RNA的SRB-1 mRNA水平(使用Ribogreen)。以下结果以归一化为PBS处理的对照的每个处理组的SRB-1 mRNA水平的平均百分比呈现并且表示为“％PBS”。使用如先前所述的类似方法测量ED50并且在以下报告。
如表37中所说明，与PBS处理的对照相比，用反义寡核苷酸处理以剂量依赖性方式降低SRB-1 mRNA水平。事实上，在3’末端包含GalNAc3-1缀合物的反义寡核苷酸(ISIS655861和655862)与未缀合反义寡核苷酸(ISIS 353382)相比显示出效力的大致改进。此外，相对于全部PS(ISIS 655861)，具有混合的PS/PO键联的ISIS 655862显示出效力的改进。
表37
PO/PS键联对靶向SRB-1的在3’末端包含GalNAc3-1缀合物的ASO的转氨酶水平的影响
使用标准方案，相对于盐水注射的小鼠测量血清中的肝脏转氨酶水平，即丙氨酸氨基转移酶(ALT)和天冬氨酸氨基转移酶(AST)。还评价了器官重量。结果展示相比于PBS对照，在用ASO处理的小鼠中没有观察到转氨酶水平(表38)或器官重量(数据未示出)上升。此外，与全部PS(ISIS 655861)相比，具有混合的PS/PO键联的ASO(ISIS655862)显示出类似的转氨酶水平。
表38
PO/PS键联对靶向SRB-1的在3’末端包含GalNAc3-1缀合物的ASO的转氨酶水平的影响
实施例45：PFP酯化合物110a的制备
单独用化合物103a或103b(38毫摩尔)和TMSOTf(0.5当量)以及二氯甲烷(200mL)中的分子筛处理化合物4(9.5g，28.8毫摩尔)，并且在室温下搅拌16小时。这时使有机层过滤通过硅藻土，然后用碳酸氢钠、水和盐水洗涤。然后将有机层分离并且通过硫酸钠干燥，过滤并且在减压下缩减。通过硅胶色谱法(2％-->10％甲醇/二氯甲烷)纯化所得到的油状物，得到>80％产率的化合物104a和104b。LCMS和质子NMR与结构一致。
将化合物104a和104b处理至与对于化合物100a-d(实施例47)相同的条件，得到>90％产率的化合物105a和105b。LCMS和质子NMR与结构一致。
在与对于化合物901a-d相同的条件下单独用化合物90处理化合物105a和105b，得到化合物106a(80％)和106b(20％)。LCMS和质子NMR与结构一致。
将化合物106a和106b处理至与对于化合物96a-d(实施例47)相同的条件，得到107a(60％)和107b(20％)。LCMS和质子NMR与结构一致。
将化合物107a和107b处理至与对于化合物97a-d(实施例47)相同的条件，得到40％-60％产率的化合物108a和108b。LCMS和质子NMR与结构一致。
将化合物108a(60％)和108b(40％)处理至与对于化合物100a-d(实施例47)相同的条件，得到>80％产率的化合物109a和109b。LCMS和质子NMR与结构一致。
将化合物109a处理至与对于化合物101a-d(实施例47)相同的条件，得到30％-60％产率的化合物110a。LCMS和质子NMR与结构一致。或者，可以类似方式用化合物109b起始制备化合物110b。
实施例46：用于与PFP酯(寡核苷酸111)缀合的一般工序；ISIS666881(GalNAc3-10)的制备
使用标准固相寡核苷酸工序合成并纯化5’-己基氨基修饰的寡核苷酸。将5’-己基氨基修饰的寡核苷酸溶解于pH 8.5的0.1M四硼酸钠(200μL)中，并且添加3当量的溶解于DMSO(50μL)中的所选的PFP酯化GalNAc3聚簇。如果在添加至ASO溶液时PFP酯沉淀，那么添加DMSO直到所有PFP酯溶解。在室温下混合约16h之后反应完全。用水将所得到的溶液稀释至12mL，然后在具有3000Da的质量截留的旋转过滤器中在3000rpm下离心沉降。将此过程重复两次以去除小分子杂质。然后将溶液冻干至干燥并且重新溶解于浓氨水中，并且在室温下混合2.5h，接着在真空中浓缩以去除大部分氨。通过RP-HPLC将缀合寡核苷酸纯化和脱盐并且将其冻干以提供GalNAc3缀合的寡核苷酸。
将寡核苷酸111与GalNAc3-10缀合。缀合物基团GalNAc3-10的GalNAc3聚簇部分(GalNAc3-10a)可与任何可裂解部分组合以提供各种缀合物基团。在某些实施方案中，可裂解部分为-P(＝O)(OH)-Ad-P(＝O)(OH)-，如用以下GalNAc3-10合成的寡核苷酸(ISIS666881)中所示。GalNAc3-10(GalNAc3-10a-CM-)的结构在以下示出：
根据此一般工序制备ISIS 666881。使用标准固相寡核苷酸工序合成并且纯化5’-己基氨基修饰的寡核苷酸ISIS 660254。将ISIS660254(40mg，5.2μmol)溶解于pH 8.5的0.1M四硼酸钠(200μL)中，并且添加3当量溶解于DMSO(50μL)中的PFP酯(化合物110a)。在添加至ASO溶液时PFP酯沉淀，则需要另外的DMSO(600μL)来完全溶解PFP酯。在室温下混合16h之后反应完全。用水将溶液稀释至12mL总体积，并且在具有3000Da的质量截留的旋转过滤器中在3000rpm下离心沉降。将此过程重复两次以去除小分子杂质。将溶液冻干至干燥并且重新溶解于浓氨水中，同时在室温下混合2.5h，接着在真空中浓缩以去除大部分氨。通过RP-HPLC将缀合的寡核苷酸纯化和脱盐并且将其冻干，得到90重量％产率的ISIS 666881(42mg，4.7μmol)。
GalNAc3-10缀合的寡核苷酸
大写字母指示每个核苷的核碱基并且mC指示5-甲基胞嘧啶。下标：“e”指示2’-MOE修饰核苷；“d”指示β-D-2’-脱氧核糖核苷；“s”指示硫代磷酸酯核苷间键联(PS)；“o”指示磷酸二酯核苷间键联(PO)；并且“o’”指示-O-P(＝O)(OH)-。缀合物基团以粗体表示。
实施例47：制备包含GalNAc3-8的寡核苷酸102
将三元酸90(4g，14.43mmol)溶解于DMF(120mL)和N,N-二异丙基乙胺(12.35mL，72毫摩尔)中。在氩气下逐滴添加三氟乙酸五氟苯基酯(8.9mL，52毫摩尔)，并且使反应物在室温下搅拌30分钟。连同N,N-二异丙基乙胺(12.35mL，72毫摩尔)一起添加Boc-二胺91a或91b(68.87mmol)，并且使反应物在室温下搅拌16小时。这时在减压下使DMF缩减>75％，然后将混合物溶解于二氯甲烷中。将有机层用碳酸氢钠、水和盐水洗涤。然后将有机层分离并且通过硫酸钠干燥，过滤并且在减压下缩减至油状物。通过硅胶色谱法(2％-->10％甲醇/二氯甲烷)纯化所得到的油状物，得到大约80％产率的化合物92a和92b。LCMS和质子NMR与结构一致。
在室温下用20mL二氯甲烷和20mL三氟乙酸将化合物92a或92b(6.7毫摩尔)处理16小时。蒸发所得到的溶液，然后溶解于甲醇中，并且用DOWEX-OH树脂处理30分钟。过滤所得到的溶液并且在减压下缩减至油状物，得到85％-90％产率的化合物93a和93b。
将化合物7或64(9.6毫摩尔)在DMF(20mL)中用HBTU(3.7g，9.6毫摩尔)和N,N-二异丙基乙胺(5mL)处理15分钟。向其中添加化合物93a或93b(3毫摩尔)，并且使其在室温下搅拌16小时。这时在减压下使DMF缩减>75％，然后将混合物溶解于二氯甲烷中。将有机层用碳酸氢钠、水和盐水洗涤。然后将有机层分离并且通过硫酸钠干燥，过滤并且在减压下缩减至油状物。通过硅胶色谱法(5％-->20％甲醇/二氯甲烷)纯化所得到的油状物，得到20％-40％产率的化合物96a-d。LCMS和质子NMR与结构一致。
在乙醇(75mL)中通过雷尼镍单独地将化合物96a-d(0.75毫摩尔)氢化3小时。这时通过过滤通过硅藻土来去除催化剂并且在减压下去除乙醇，得到80％-90％产率的化合物97a-d。LCMS和质子NMR与结构一致。
将化合物23(0.32g，0.53毫摩尔)在DMF(30mL)中用HBTU(0.2g，0.53毫摩尔)和N,N-二异丙基乙胺(0.19mL，1.14毫摩尔)处理15分钟。单独地向其中添加化合物97a-d(0.38毫摩尔)，并且使其在室温下搅拌16小时。这时在减压下使DMF缩减>75％，然后将混合物溶解于二氯甲烷中。将有机层用碳酸氢钠、水和盐水洗涤。然后将有机层分离并且通过硫酸钠干燥，过滤并且在减压下缩减至油状物。通过硅胶色谱法(2％-->20％甲醇/二氯甲烷)纯化所得到的油状物，得到30％-40％产率的化合物98a-d。LCMS和质子NMR与结构一致。
将化合物99(0.17g，0.76毫摩尔)在DMF(50mL)中用HBTU(0.29g，0.76毫摩尔)和N,N-二异丙基乙胺(0.35mL，2.0毫摩尔)处理15分钟。单独地向其中添加化合物97a-d(0.51毫摩尔)，并且使其在室温下搅拌16小时。这时在减压下使DMF缩减>75％，然后将混合物溶解于二氯甲烷中。将有机层用碳酸氢钠、水和盐水洗涤。然后将有机层分离并且通过硫酸钠干燥，过滤并且在减压下缩减至油状物。通过硅胶色谱法(5％-->20％甲醇/二氯甲烷)纯化所得到的油状物，得到40％-60％产率的化合物100a-d。LCMS和质子NMR与结构一致。
单独地在甲醇/乙酸乙酯(1:1，50mL)中通过10％Pd(OH)2/C将化合物100a-d(0.16毫摩尔)氢化3小时。这时通过过滤通过硅藻土来去除催化剂并且在减压下去除有机物，得到80％-90％产率的化合物101a-d。LCMS和质子NMR与结构一致。
单独地将化合物101a-d(0.15毫摩尔)溶解于DMF(15mL)和吡啶(0.016mL，0.2毫摩尔)中。在氩气下逐滴添加三氟乙酸五氟苯基酯(0.034mL，0.2毫摩尔)，并且使反应物在室温下搅拌30分钟。这时在减压下使DMF缩减>75％，然后将混合物溶解于二氯甲烷中。将有机层用碳酸氢钠、水和盐水洗涤。然后将有机层分离并且通过硫酸钠干燥，过滤并且在减压下缩减至油状物。通过硅胶色谱法(2％-->5％甲醇/二氯甲烷)纯化所得到的油状物，得到大约80％产率的化合物102a-d。LCMS和质子NMR与结构一致。
使用实施例46中说明的一般工序制备包含GalNAc3-8缀合物基团的低聚化合物102。缀合物基团GalNAc3-8的GalNAc3聚簇部分(GalNAc3-8a)可与任何可裂解部分组合以提供各种缀合物基团。在优选的实施方案中，可裂解部分为-P(＝O)(OH)-Ad-P(＝O)(OH)-。
GalNAc3-8(GalNAc3-8a-CM-)的结构在以下示出：
实施例48：制备包含GalNAc3-7的寡核苷酸119
根据文献中描述的工序合成化合物112(J.Med.Chem.2004,47,5798-5808)。
将化合物112(5g，8.6mmol)溶解于1:1甲醇/乙酸乙酯(22mL/22mL)中。添加碳上氢氧化钯(0.5g)。将此反应混合物在室温下在氢气下搅拌12h。将反应混合物通过硅藻土垫过滤，并且用1:1甲醇/乙酸乙酯洗涤所述垫。合并滤液和洗涤物并且浓缩至干燥，得到化合物105a(定量的)。通过LCMS证实结构。
将化合物113(1.25g，2.7mmol)、HBTU(3.2g，8.4mmol)和DIEA(2.8mL，16.2mmol)溶解于无水DMF(17mL)中并且将反应混合物在室温下搅拌5min。添加该化合物105a(3.77g，8.4mmol)在无水DMF(20mL)中的溶液。将反应在室温下搅拌6h。在减压下去除溶剂以得到油。将残余物溶解于CH2Cl2(100mL)中并且用饱和NaHCO3水溶液(100mL)和盐水(100mL)洗涤。将有机相分离、干燥(Na2SO4)、过滤并且蒸发。通过硅胶柱色谱法纯化残余物并且用10％至20％的二氯甲烷中的MeOH洗脱，得到化合物114(1.45g，30％)。通过LCMS和1H NMR分析来证实结构。
将化合物114(1.43g，0.8mmol)溶解于1:1甲醇/乙酸乙酯(4mL/4mL)中。添加钯碳(湿润，0.14g)。用氢气冲洗反应混合物并且在氢气下在室温下搅拌12h。将反应混合物通过硅藻土垫过滤。用甲醇/乙酸乙酯(1:1)洗涤硅藻土垫。将滤液和洗涤物合并在一起并且在减压下蒸发，得到化合物115(定量的)。通过LCMS和1H NMR分析来证实结构。
将化合物83a(0.17g，0.75mmol)、HBTU(0.31g，0.83mmol)和DIEA(0.26mL，1.5mmol)溶解于无水DMF(5mL)中并且将反应混合物在室温下搅拌5min。添加该化合物115(1.22g，0.75mmol)在无水DMF中的溶液，并且将反应在室温下搅拌6h。在减压下去除溶剂并且将残余物溶解于CH2Cl2中。将有机层用饱和NaHCO3水溶液和盐水洗涤并且通过无水Na2SO4干燥并且过滤。将有机层浓缩至干燥，并且通过硅胶柱色谱法纯化所获得的残余物并且用3％至15％的二氯甲烷中的MeOH洗脱，得到化合物116(0.84g，61％)。通过LC MS和1H NMR分析来证实结构。
将化合物116(0.74g，0.4mmol)溶解于1:1甲醇/乙酸乙酯(5mL/5mL)中。添加钯碳(湿润，0.074g)。用氢气冲洗反应混合物并且在氢气下在室温下搅拌12h。将反应混合物通过硅藻土垫过滤。用甲醇/乙酸乙酯(1:1)洗涤硅藻土垫。将滤液和洗涤物合并在一起并且在减压下蒸发，得到化合物117(0.73g，98％)。通过LCMS和1H NMR分析来证实结构。
将化合物117(0.63g，0.36mmol)溶解于无水DMF(3mL)中。向此溶液中添加N,N-二异丙基乙胺(70μL，0.4mmol)和三氟乙酸五氟苯基酯(72μL，0.42mmol)。将反应混合物在室温下搅拌12h并且倾入到饱和NaHCO3水溶液中。将混合物用二氯甲烷萃取，用盐水洗涤并且通过无水Na2SO4干燥。将二氯甲烷溶液浓缩至干燥并且用硅胶柱色谱法纯化并且用5％至10％的二氯甲烷中的MeOH洗脱，得到化合物118(0.51g，79％)。通过LCMS以及1H与1H和19FNMR证实结构。
使用实施例46中说明的一般工序制备包含GalNAc3-7缀合物基团的低聚化合物119。缀合物基团GalNAc3-7的GalNAc3聚簇部分(GalNAc3-7a)可与任何可裂解部分组合以提供各种缀合物基团。在某些实施方案中，可裂解部分为-P(＝O)(OH)-Ad-P(＝O)(OH)-。
GalNAc3-7(GalNAc3-7a-CM-)的结构在以下示出：
实施例49：制备包含GalNAc3-5的寡核苷酸132
将化合物120(14.01g，40mmol)和HBTU(14.06g，37mmol)溶解于无水DMF(80mL)中。添加三乙胺(11.2mL，80.35mmol)并且搅拌5min。在冰浴中冷却反应混合物并且添加化合物121(10g，mmol)在无水DMF(20mL)中的溶液。添加另外的三乙胺(4.5mL，32.28mmol)并且将反应混合物在氩气气氛下搅拌18h。通过TLC(乙酸乙酯:己烷；1:1；Rf＝0.47)监测反应。在减压下移除溶剂。将残余物吸收于EtOAc(300mL)中并且用1M NaHSO4(3x 150mL)、饱和NaHCO3水溶液(3x 150mL)和盐水(2x 100mL)洗涤。用Na2SO4干燥有机层。通过过滤去除干燥剂并且通过旋转蒸发浓缩有机层。通过硅胶柱色谱法纯化粗混合物并且通过使用35％–50％的己烷中的EtOAc洗脱，得到化合物122(15.50g，78.13％)。通过LCMS和1H NMR分析来证实结构。质量m/z 589.3[M+H]+。
将LiOH(92.15mmol)在水(20mL)和THF(10mL)中的溶液添加至溶解于甲醇(15mL)中的化合物122(7.75g，13.16mmol)的冷却溶液中。将反应混合物在室温下搅拌45min并且通过TLC(EtOAc:己烷；1:1)监测。在减压下将反应混合物浓缩至一半体积。在冰浴中冷却剩余的溶液并且通过添加浓HCl来中和。将反应混合物稀释，用EtOAc(120mL)萃取并且用盐水洗涤(100mL)。当静置过夜时形成乳液并且澄清。将有机层分离、干燥(Na2SO4)、过滤并且蒸发，得到化合物123(8.42g)。残余的盐可能为质量过量的原因。LCMS与结构一致。产物无需任何进一步纯化即使用。计算的分子量：574.36；实测的分子量：575.3[M+H]+。
根据文献中描述的工序合成化合物126(J.Am.Chem.Soc.2011,133,958-963)。
将化合物123(7.419g，12.91mmol)、HOBt(3.49g，25.82mmol)和化合物126(6.33g，16.14mmol)溶解于DMF(40mL)中，并且在冰浴中冷却所得到的反应混合物。在氩气气氛下，向其中添加N,N-二异丙基乙胺(4.42mL，25.82mmol)、PyBop(8.7g，16.7mmol)，接着添加Bop偶联试剂(1.17g，2.66mmol)。去除冰浴并且使溶液升温至室温。在1h后反应完成，如通过TLC(DCM:MeOH:AA；89:10:1)所测定的。在减压下浓缩反应混合物。将残余物溶解于EtOAc(200mL)中并且用1M NaHSO4(3x100mL)、饱和NaHCO3水溶液(3x100mL)和盐水(2x100mL)洗涤。将有机相分离、干燥(Na2SO4)、过滤并且浓缩。通过硅胶柱色谱法用50％己烷/EtOAC至100％EtOAc梯度纯化残余物，得到呈白色泡沫的化合物127(9.4g)。LCMS和1H NMR与结构一致。质量m/z 778.4[M+H]+。
将三氟乙酸(12mL)添加至化合物127(1.57g，2.02mmol)在二氯甲烷(12mL)中的溶液中，并且在室温下搅拌1h。将反应混合物与甲苯(30mL)在减压条件下共蒸发至干燥。使所获得的残余物与乙腈(30mL)和甲苯(40mL)共蒸发两次，得到呈三氟乙酸盐的化合物128(1.67g)并且无需进一步纯化即用于下一步。LCMS和1H NMR与结构一致。质量m/z 478.2[M+H]+。
将化合物7(0.43g，0.963mmol)、HATU(0.35g，0.91mmol)和HOAt(0.035g，0.26mmol)合并在一起并且在圆底烧瓶中在减压下通过P2O5干燥4h，然后溶解于无水DMF(1mL)中并且搅拌5min。添加该化合物128(0.20g，0.26mmol)在无水DMF(0.2mL)和N,N-二异丙基乙胺(0.2mL)中的溶液。在氩气气氛下在室温下搅拌反应混合物。在30min之后反应完全，如通过LCMS和TLC(7％MeOH/DCM)所测定的。在减压下浓缩反应混合物。将残余物溶解于DCM(30mL)中并且用1M NaHSO4(3x20mL)、饱和NaHCO3水溶液(3x20mL)和盐水(3x20mL)洗涤。将有机相分离、用Na2SO4干燥、过滤并且浓缩。通过硅胶柱色谱法使用5％-15％的二氯甲烷中的MeOH来纯化残余物，得到化合物129(96.6mg)。LC MS和1H NMR与结构一致。质量m/z883.4[M+2H]+。
在20mL闪烁瓶中将化合物129(0.09g，0.051mmol)溶解于甲醇(5mL)中。向其中添加少量的10％Pd/C(0.015mg)并且用H2气体冲洗反应容器。将此反应混合物在室温下在H2气氛下搅拌18h。将反应混合物通过硅藻土垫过滤，并且用甲醇洗涤硅藻土垫。将滤液洗涤物汇集在一起并且在减压下浓缩，得到化合物130(0.08g)。LCMS和1H NMR与结构一致。产物未进行进一步纯化即使用。质量m/z838.3[M+2H]+。
向10mL刻度的圆底烧瓶中添加化合物130(75.8mg，0.046mmol)、0.37M吡啶/DMF(200μL)和搅拌棒。在搅拌的情况下向此溶液中逐滴添加0.7M三氟乙酸五氟苯基酯/DMF(100μL)。在1h后反应完成，如通过LC MS所测定的。在减压下去除溶剂并且将残余物溶解于CHCl3(大约10mL)中。将有机层用NaHSO4(1M，10mL)、饱和NaHCO3水溶液(10mL)和盐水(10mL)各分配三次。将有机相分离并且通过Na2SO4干燥、过滤并且浓缩，得到化合物131(77.7mg)。LCMS与结构一致。无需进一步纯化即使用。质量m/z 921.3[M+2H]+。
使用实施例46中说明的一般工序制备包含GalNAc3-5缀合物基团的低聚化合物132。缀合物基团GalNAc3-5的GalNAc3聚簇部分(GalNAc3-5a)可与任何可裂解部分组合以提供各种缀合物基团。在某些实施方案中，可裂解部分为-P(＝O)(OH)-Ad-P(＝O)(OH)-。
GalNAc3-5(GalNAc3-5a-CM-)的结构在以下示出：
实施例50：制备包含GalNAc4-11的寡核苷酸144
化合物134的合成。向Merrifield烧瓶中添加用乙腈、二甲基甲酰胺、二氯甲烷和乙腈洗涤的氨甲基VIMAD树脂(2.5g，450μmol/g)。树脂在乙腈(4mL)中溶胀。通过添加20(1.0mmol，0.747g)、TBTU(1.0mmol,0.321g)、乙腈(5mL)和DIEA(3.0mmol，0.5mL)将化合物133在100mL圆底烧瓶中预先活化。使此溶液搅拌5min，然后在振荡的情况下添加至Merrifield烧瓶。使悬浮液震荡3h。排出反应混合物并且用乙腈、DMF和DCM洗涤树脂。通过测量DCM中的DMT阳离子在500nm(消光系数＝76000)处的吸光度来定量新树脂负载量并且测定为238μmol/g。通过悬浮于乙酸酐溶液中持续十分钟，进行三次，来将树脂加帽。
使用反复基于Fmoc(iterative Fmoc-based)的固相肽合成方法来合成固体载体结合的化合物141。拆下少量的固体载体并且将其悬浮于氨水(28-30wt％)中6h。通过LC-MS分析裂解的化合物并且所观察到的质量与结构一致。质量m/z 1063.8[M+2H]+。
使用固相肽合成方法来合成固体载体结合的化合物142。
在DNA合成器上使用标准固相合成来合成固体载体结合的化合物143。
将固体载体结合的化合物143悬浮于氨水(28wt％-30wt％)中并且在55℃下加热16h。将溶液冷却并且过滤固体载体。浓缩滤液，将残余物溶解于水中并且通过HPLC在强阴离子交换柱上纯化。将含有全长化合物144的级分汇集在一起并且脱盐。通过LC-MS分析所得到的GalNAc4-11缀合的低聚化合物并且所观察到的质量与结构一致。
缀合物基团GalNAc4-11的GalNAc4聚簇部分(GalNAc4-11a)可与任何可裂解部分组合以提供各种缀合物基团。在某些实施方案中，可裂解部分为-P(＝O)(OH)-Ad-P(＝O)(OH)-。
GalNAc4-11(GalNAc4-11a-CM)的结构在以下示出：
实施例51：制备包含GalNAc3-6的寡核苷酸155
如文献中所描述来合成化合物146(Analytical Biochemistry 1995,229,54-60)。
将化合物4(15g，45.55mmol)和化合物35b(14.3克，57mmol)溶解于CH2Cl2(200ml)中。添加活化的分子筛(粉末状)，并且使反应物在氮气气氛下搅拌30分钟。添加TMS-OTf(4.1ml，22.77mmol)并且使反应物在室温下搅拌过夜。当完成时，通过倾入到饱和NaHCO3水溶液(500ml)和碎冰(大约150g)的溶液中来猝灭反应。将有机层分离、用盐水洗涤、通过MgSO4干燥、过滤并且在减压下浓缩至橙色油状物。通过硅胶柱色谱法纯化粗材料并且用2％-10％的CH2Cl2中的MeOH洗脱，得到化合物112(16.53g，63％)。LCMS和1H NMR与预期的化合物一致。
将化合物112(4.27g，7.35mmol)溶解于1:1MeOH/EtOAc(40ml)中。通过使氩气流鼓泡穿过溶液15分钟来吹扫反应混合物。添加Pearlman氏催化剂(碳上氢氧化钯，400mg)，并且使氢气鼓泡穿过溶液30分钟。在完成时(TLC 10％的CH2Cl2中的MeOH和LCMS)，通过过滤通过硅藻土垫来去除催化剂。通过旋转蒸发来浓缩滤液，并且在高真空下简单干燥以得到化合物105a(3.28g)。LCMS和1H NMR与希望的产物一致。
将化合物147(2.31g，11mmol)溶解于无水DMF(100mL)中。添加N,N-二异丙基乙胺(DIEA，3.9mL，22mmol)，接着添加HBTU(4g，10.5mmol)。使反应混合物在氮气下搅拌大约15分钟。向其中添加化合物105a(3.3g，7.4mmol)在干燥DMF中的溶液并且在氮气气氛下搅拌2h。将反应物用EtOAc稀释并且用饱和NaHCO3水溶液和盐水洗涤。将有机相分离、干燥(MgSO4)、过滤并且浓缩至橙色浆状物。通过柱色谱法2％-5％的CH2Cl2中的MeOH来纯化粗材料，得到化合物148(3.44g，73％)。LCMS和1H NMR与预期的产物一致。
将化合物148(3.3g，5.2mmol)溶解于1:1MeOH/EtOAc(75ml)中。通过使氩气流鼓泡穿过溶液15分钟来吹扫反应混合物。添加Pearlman氏催化剂(碳上氢氧化钯)(350mg)。使氢气鼓泡穿过溶液30分钟。在完成时(TLC 10％的DCM中的MeOH和LCMS)，通过过滤通过硅藻土垫来去除催化剂。通过旋转蒸发浓缩滤液并且将其在高真空下简单干燥，得到化合物149(2.6g)。LCMS与希望的产物一致。将残余物溶解于干燥DMF(10ml)中，其立即用于下一步。
将化合物146(0.68g，1.73mmol)溶解于干燥DMF(20ml)中。向其中添加DIEA(450μL，2.6mmol，1.5当量)和HBTU(1.96g，0.5.2mmol)。使反应混合物在氮气下在室温下搅拌15分钟。添加化合物149(2.6g)在无水DMF(10mL)中的溶液。通过添加DIEA(如果必要的话)将反应物的pH调节至pH＝9-10。使反应在室温下在氮气下搅拌2h。在完成时，将反应物用EtOAc(100mL)稀释，并且用饱和NaHCO3水溶液洗涤、接着用盐水洗涤。将有机相分离、用MgSO4干燥、过滤并且浓缩。通过硅胶柱色谱法纯化残余物并且用2％-10％的CH2Cl2中的MeOH洗脱，得到化合物150(0.62g，20％)。LCMS和1H NMR与所需的产物一致。
将化合物150(0.62g)溶解于1:1MeOH/EtOAc(5L)中。通过使氩气流鼓泡穿过溶液15分钟来吹扫反应混合物。添加Pearlman氏催化剂(碳上氢氧化钯)(60mg)。使氢气鼓泡穿过溶液30分钟。在完成时(TLC 10％的DCM中的MeOH和LCMS)，通过过滤(注射器针头式特氟龙过滤器，0.45μm)来去除催化剂。通过旋转蒸发浓缩滤液并且将其在高真空下简单干燥，得到化合物151(0.57g)。LCMS与希望的产物一致。将产物溶解于4mL干燥DMF中并且立即用于下一步。
将化合物83a(0.11g，0.33mmol)溶解于无水DMF(5mL)中并且添加N,N-二异丙基乙胺(75μL，1mmol)和PFP-TFA(90μL，0.76mmol)。当接触时反应混合物变为洋红色，并且在接下来的30分钟里逐渐变为橙色。通过TLC和LCMS监测反应的进展。当完成时(形成PFP酯)，添加化合物151(0.57g，0.33mmol)在DMF中的溶液。通过添加N,N-二异丙基乙胺(如果必要的话)将反应物的pH调节至pH＝9-10。将反应混合物在氮气下搅拌大约30min。当完成时，在减压下去除大部分溶剂。用CH2Cl2稀释残余物并且用饱和NaHCO3水溶液洗涤，接着用盐水洗涤。将有机相分离、通过MgSO4干燥、过滤并且浓缩至橙色浆状物。通过硅胶柱色谱法(2％-10％的CH2Cl2中的MeOH)纯化残余物，得到化合物152(0.35g，55％)。LCMS和1H NMR与所需的产物一致。
将化合物152(0.35g，0.182mmol)溶解于1:1MeOH/EtOAc(10mL)中。通过使氩气流鼓泡穿过溶液15分钟来吹扫反应混合物。添加Pearlman氏催化剂(碳上氢氧化钯)(35mg)。使氢气鼓泡穿过溶液30分钟。在完成时(TLC 10％的DCM中的MeOH和LCMS)，通过过滤(注射器针头式特氟龙过滤器，0.45μm)来去除催化剂。通过旋转蒸发来浓缩滤液并且将其在高真空下简单干燥，得到化合物153(0.33g，定量的)。LCMS与希望的产物一致。
在氮气下搅拌的情况下，将化合物153(0.33g，0.18mmol)溶解于无水DMF(5mL)中。向其中添加N,N-二异丙基乙胺(65μL，0.37mmol)和PFP-TFA(35μL，0.28mmol)。将反应混合物在氮气下搅拌大约30min。当接触时反应混合物变为洋红色，并且逐渐变为橙色。通过添加更多的N,-二异丙基乙胺将反应混合物的pH维持在pH＝9-10。通过TLC和LCMS监测反应的进展。当完成时，在减压下去除大部分溶剂。用CH2Cl2(50mL)稀释残余物并且用饱和NaHCO3水溶液洗涤，接着用盐水洗涤。将有机层分离、通过MgSO4干燥、过滤并且浓缩至橙色浆状物。通过柱色谱法纯化残余物并且用2％-10％的CH2Cl2中的MeOH洗脱，得到化合物154(0.29g，79％)。LCMS和1H NMR与所需的产物一致。
使用实施例46中说明的一般工序制备包含GalNAc3-6缀合物基团的低聚化合物155。缀合物基团GalNAc3-6的GalNAc3聚簇部分(GalNAc3-6a)可与任何可裂解部分组合以提供各种缀合物基团。在某些实施方案中，可裂解部分为-P(＝O)(OH)-Ad-P(＝O)(OH)-。
GalNAc3-6(GalNAc3-6a-CM-)的结构在以下示出：
实施例52：制备包含GalNAc3-9的寡核苷酸160
根据文献中描述的工序合成化合物156(J.Med.Chem.2004,47,5798-5808)。
将化合物156(18.60g，29.28mmol)溶解于甲醇(200mL)中。添加钯碳(6.15g，10wt％，负载量(干基)，基质碳粉，湿润)。将此反应混合物在室温下在氢气下搅拌18h。将反应混合物通过硅藻土垫过滤，并且用甲醇彻底洗涤硅藻土垫。洗涤合并的滤液并且浓缩至干燥。通过硅胶柱色谱法纯化残余物并且用5％-10％的二氯甲烷中的甲醇洗脱，得到化合物157(14.26g，89％)。质量m/z 544.1[M-H]-。
将化合物157(5g，9.17mmol)溶解于无水DMF(30mL)中。添加HBTU(3.65g，9.61mmol)和N,N-二异丙基乙胺(13.73mL，78.81mmol)并且将反应混合物在室温下搅拌5分钟。向其中添加化合物47(2.96g，7.04mmol)的溶液。将反应在室温下搅拌8h。将反应混合物倾入到饱和NaHCO3水溶液中。用乙酸乙酯萃取混合物，并且将有机层用盐水洗涤并干燥(Na2SO4)、过滤和蒸发。通过硅胶柱色谱法纯化所获得的残余物并且用50％的己烷中的乙酸乙酯洗脱，得到化合物158(8.25g，73.3％)。通过MS和1H NMR分析来证实结构。
在减压下通过P2O5干燥化合物158(7.2g，7.61mmol)。将干燥的化合物溶解于无水DMF(50mL)中。向其中添加1H-四唑(0.43g，6.09mmol)和N-甲基咪唑(0.3mL，3.81mmol)以及2-氰乙基-N,N,N’,N’-四异丙基二氨基磷酸酯(3.65mL，11.50mmol)。将反应混合物在氩气气氛下搅拌4h。将反应混合物用乙酸乙酯(200mL)稀释。用饱和NaHCO3和盐水洗涤反应混合物。将有机相分离、干燥(Na2SO4)、过滤并且蒸发。通过硅胶柱色谱法纯化残余物并且用50％-90％的己烷中的乙酸乙酯洗脱，得到化合物159(7.82g，80.5％)。通过LCMS和31P NMR分析来证实结构。
使用标准寡核苷酸合成工序制备包含GalNAc3-9缀合物基团的低聚化合物160。将化合物159的三个单元偶联至固体载体，接着偶联核苷酸亚磷酰胺。用氨水处理受保护的低聚化合物得到化合物160。缀合物基团GalNAc3-9的GalNAc3聚簇部分(GalNAc3-9a)可与任何可裂解部分组合以提供各种缀合物基团。在某些实施方案中，可裂解部分为-P(＝O)(OH)-Ad-P(＝O)(OH)-。GalNAc3-9(GalNAc3-9a-CM)的结构在以下示出：
实施例53：用于制备化合物18(GalNAc3-1a和GalNAc3-3a)的替代工序
使内酯161与二氨基丙烷(3-5当量)或单-Boc保护的二氨基丙烷(1当量)反应，以提供醇162a或162b。当未受保护的丙二胺用于上述反应时，通过在高真空下蒸发来去除过量的二胺并且使用CbzCl保护162a中的游离氨基，以在通过柱色谱法纯化之后提供呈白色固体的162b。在TMSOTf的存在下，使醇162b与化合物4进一步反应，以提供163a，所述163a通过使用催化氢化去除Cbz基团而转化为163b。通过使三元酸113(参见实施例48)与DMF(0.1M至0.5M)中的PFPTFA(3.5当量)和吡啶(3.5当量)反应来制备五氟苯基(PFP)酯164。使三酯164与胺163b(3-4当量)和DIPEA(3-4当量)直接反应，以提供化合物18。以上方法极大地促进中间体的纯化并且使副产物的形成最小化，所述副产物使用实施例4中描述的工序形成。
实施例54：用于制备化合物18(GalNAc3-1a和GalNAc3-3a)的替代工序
使用实施例53中概述的工序由酸113制备三PFP酯164并且使其与单-Boc保护的二胺反应，以提供基本上定量产率的165。用盐酸或三氟乙酸去除Boc基团以提供三胺，所述三胺在合适的碱如DIPEA的存在下与PFP活化的酸166反应，以提供化合物18。
通过用DMF中的PFPTFA(1-1.2当量)和吡啶(1-1.2当量)处理来由对应的酸制备PFP保护的Gal-NAc酸166。继而通过使用乙腈和水中的TEMPO(0.2当量)和BAIB的氧化来由对应的醇制备前体酸。使用先前在实施例47中描述的条件，通过与1,6-己二醇(或1,5-戊二醇或对于其他n值的其他二元醇)(2-4当量)和TMSOTf反应来由糖中间体4制备前体醇。
实施例55：靶向SRB-1的包含3'-缀合物基团或5'-缀合物基团的寡核苷酸(比较GalNAc3-1、3、8以及9)的体内剂量依赖性研究
在剂量依赖性研究中测试以下列出的寡核苷酸对小鼠中的SRB-1的反义抑制。包括未缀合的ISIS 353382作为标准物。各种GalNAc3缀合物基团中的每一个均通过磷酸二酯连接的2'-脱氧腺苷核苷(可裂解部分)连接在相应寡核苷酸的3'或5'末端处。
表39
靶向SRB-1的修饰ASO
大写字母指示每个核苷的核碱基并且mC指示5-甲基胞嘧啶。下标：“e”指示2’-MOE修饰核苷；“d”指示β-D-2’-脱氧核糖核苷；“s”指示硫代磷酸酯核苷间键联(PS)；“o”指示磷酸二酯核苷间键联(PO)；并且“o’”指示-O-P(＝O)(OH)-。缀合物基团以粗体表示。
GalNAc3-1a的结构先前在实施例9中示出。GalNAc3-9的结构先前在实施例52中示出。GalNAc3-3的结构先前在实施例39中示出。GalNAc3-8的结构先前在实施例47中示出。
处理
在以下示出的剂量下用ISIS 353382、655861、664078、661161、665001或用盐水皮下注射六周龄雄性Balb/c小鼠(Jackson Laboratory,Bar Harbor,ME)一次。每个处理组由4只动物组成。在最后施用之后72小时将小鼠处死，以使用实时PCR和RNA定量试剂(Molecular Probes,Inc.Eugene,OR)根据标准方案测定肝脏SRB-1mRNA水平。以下结果以归一化为盐水对照的每个处理组的SRB-1mRNA水平的平均百分比呈现。
如表40中所说明，用反义寡核苷酸处理以剂量依赖性方式降低SRB-1 mRNA水平。事实上，在3’末端包含磷酸二酯连接的GalNAc3-1和GalNAc3-9缀合物的反义寡核苷酸(ISIS655861和ISIS 664078)和包含连接在5’末端的GalNAc3-3和GalNAc3-8缀合物的反义寡核苷酸(ISIS 661161和ISIS 665001)与未缀合的反义寡核苷酸(ISIS 353382)相比显示出效力的大致改进。此外，在3'末端包含GalNAc3-9缀合物的ISIS 664078与在3’末端包含GalNAc3-1缀合物的ISIS 655861相比基本上效力相等。分别包含GalNAc3-3或GalNAc3-9的5'缀合的反义寡核苷酸ISIS 661161和ISIS 665001与3'缀合的反义寡核苷酸(ISIS655861和ISIS664078)相比具有增加的效力。
表40
靶向SRB-1的含有GalNAc3-1、3、8或9的ASO
使用标准方案，相对于盐水注射的小鼠测量血清中的肝脏转氨酶水平，即丙氨酸氨基转移酶(ALT)和天冬氨酸氨基转移酶(AST)。还评价了总胆红素和BUN。评价了体重变化，其中与盐水组相比没有显著变化。ALT、AST、总胆红素和BUN值在下表中示出。
表41
实施例56：靶向SRB-1的包含3'-缀合物基团或5'-缀合物基团的寡核苷酸(比较GalNAc3-1、2、3、5、6、7以及10)的体内剂量依赖性研究
在剂量依赖性研究中测试以下列出的寡核苷酸对小鼠中的SRB-1的反义抑制。包括未缀合的ISIS 353382作为标准物。各种GalNAc3缀合物基团中的每一个均通过磷酸二酯连接的2'-脱氧腺苷核苷(可裂解部分)连接在相应寡核苷酸的5'末端处，具有连接在3’末端处的GalNAc3缀合物基团的ISIS 655861除外。
表42
靶向SRB-1的修饰ASO
大写字母指示每个核苷的核碱基并且mC指示5-甲基胞嘧啶。下标：“e”指示2’-MOE修饰核苷；“d”指示β-D-2’-脱氧核糖核苷；“s”指示硫代磷酸酯核苷间键联(PS)；“o”指示磷酸二酯核苷间键联(PO)；并且“o’”指示-O-P(＝O)(OH)-。缀合物基团以粗体表示。
GalNAc3-1a的结构先前在实施例9中示出。GalNAc3-2a的结构先前在实施例37中示出。GalNAc3-3a的结构先前在实施例39中示出。GalNAc3-5a的结构先前在实施例49中示出。GalNAc3-6a的结构先前在实施例51中示出。GalNAc3-7a的结构先前在实施例48中示出。GalNAc3-10a的结构先前在实施例46中示出。
处理
在以下示出的剂量下用ISIS 353382、655861、664507、661161、666224、666961、666981、666881或用盐水皮下注射六周龄雄性Balb/c小鼠(Jackson Laboratory,BarHarbor,ME)一次。每个处理组由4只动物组成。在最后施用之后72小时将小鼠处死，以使用实时PCR和RNA定量试剂(Molecular Probes,Inc.Eugene,OR)根据标准方案测定肝脏SRB-1 mRNA水平。以下结果以归一化为盐水对照的每个处理组的SRB-1 mRNA水平的平均百分比呈现。
如表43中所说明，用反义寡核苷酸处理以剂量依赖性方式降低SRB-1 mRNA水平。事实上，缀合反义寡核苷酸与未缀合反义寡核苷酸(ISIS 353382)相比显示出效力的大致改进。5'缀合的反义寡核苷酸与3'缀合的反义寡核苷酸相比显示出效力稍微增加。
表43
使用标准方案，相对于盐水注射的小鼠测量血清中的肝脏转氨酶水平，即丙氨酸氨基转移酶(ALT)和天冬氨酸氨基转移酶(AST)。还评价了总胆红素和BUN。评价了体重变化，其中与盐水组相比没有显著变化。ALT、AST、总胆红素和BUN值在以下表44中示出。
表44
实施例57：靶向ApoC III的包含3'-缀合物基团的寡核苷酸的体内作用持续时间研究
用以下指示的剂量注射小鼠一次并且经过42天的过程监测ApoC-III和血浆甘油三酯(血浆TG)水平。在每个组中使用3只表达人APOC-III的转基因小鼠进行研究。
表45
靶向ApoC III的修饰ASO
大写字母指示每个核苷的核碱基并且mC指示5-甲基胞嘧啶。下标：“e”指示2’-MOE修饰核苷；“d”指示β-D-2’-脱氧核糖核苷；“s”指示硫代磷酸酯核苷间键联(PS)；“o”指示磷酸二酯核苷间键联(PO)；并且“o’”指示-O-P(＝O)(OH)-。缀合物基团以粗体表示。
GalNAc3-1a的结构先前在实施例9中示出。
表46
ApoC III mRNA(第1天时的％盐水)和血浆TG水平(第1天时的％盐水)
如上表中可看出，与未缀合寡核苷酸相比，作用持续时间随着3'-缀合物基团的添加而增加。与缀合的全部PS寡核苷酸647535相比，对于缀合的混合PO/PS寡核苷酸647536存在作用持续时间的进一步增加。
实施例58：靶向SRB-1的包含3’-缀合物基团的寡核苷酸(比较GalNAc3-1和GalNAc4-11)的体内剂量依赖性研究
在剂量依赖性研究中测试以下列出的寡核苷酸对小鼠中的SRB-1的反义抑制。包括未缀合的ISIS 440762作为未缀合标准物。缀合物基团中的每一个均通过磷酸二酯连接的2'-脱氧腺苷核苷可裂解部分连接在相应寡核苷酸的3'末端处。
GalNAc3-1a的结构先前在实施例9中示出。GalNAc3-11a的结构先前在实施例50中示出。
处理
在以下示出的剂量下用ISIS 440762、651900、663748或用盐水皮下注射六周龄雄性Balb/c小鼠(Jackson Laboratory,Bar Harbor,ME)一次。每个处理组由4只动物组成。在最后施用之后72小时将小鼠处死，以使用实时PCR和RNA定量试剂(Molecular Probes,Inc.Eugene,OR)根据标准方案测定肝脏SRB-1 mRNA水平。以下结果以归一化为盐水对照的每个处理组的SRB-1 mRNA水平的平均百分比呈现。
如表47中所说明，用反义寡核苷酸处理以剂量依赖性方式降低SRB-1 mRNA水平。在3’末端包含磷酸二酯连接的GalNAc3-1和GalNAc4-11缀合物的反义寡核苷酸(ISIS651900和ISIS 663748)与未缀合的反义寡核苷酸(ISIS 440762)相比显示出效力的大致改进。两种缀合寡核苷酸GalNAc3-1和GalNAc4-11效力相等。
表47
靶向SRB-1的修饰ASO
大写字母指示每个核苷的核碱基并且mC指示5-甲基胞嘧啶。下标：“e”指示2’-MOE修饰核苷；“k”指示6’-(S)-CH3双环核苷；“d”指示β-D-2’-脱氧核糖核苷；“s”指示硫代磷酸酯核苷间键联(PS)；“o”指示磷酸二酯核苷间键联(PO)；并且“o’”指示-O-P(＝O)(OH)-。缀合物基团以粗体表示。
使用标准方案，相对于盐水注射的小鼠测量血清中的肝脏转氨酶水平，即丙氨酸氨基转移酶(ALT)和天冬氨酸氨基转移酶(AST)。还评价了总胆红素和BUN。评价了体重变化，其中与盐水组相比没有显著变化。ALT、AST、总胆红素和BUN值在以下表48中示出。
表48
实施例59：靶向FXI的GalNAc3-1缀合的ASO的体内作用
在多剂量研究中测试以下列出的寡核苷酸对小鼠中的FXI的反义抑制。包括ISIS404071作为未缀合标准物。缀合物基团中的每一个均通过磷酸二酯连接的2'-脱氧腺苷核苷可裂解部分连接在相应寡核苷酸的3'末端处。
表49
靶向FXI的修饰ASO
大写字母指示每个核苷的核碱基并且mC指示5-甲基胞嘧啶。下标：“e”指示2’-MOE修饰核苷；“d”指示β-D-2’-脱氧核糖核苷；“s”指示硫代磷酸酯核苷间键联(PS)；“o”指示磷酸二酯核苷间键联(PO)；并且“o’”指示-O-P(＝O)(OH)-。缀合物基团以粗体表示。
GalNAc3-1a的结构先前在实施例9中示出。
处理
在以下示出的剂量下用ISIS 404071、656172、656173或用PBS处理的对照皮下注射六周龄雄性Balb/c小鼠(Jackson Laboratory,Bar Harbor,ME)，一周两次，持续3周。每个处理组由4只动物组成。在最后施用之后72小时将小鼠处死以使用实时PCR和RNA定量试剂(Molecular Probes,Inc.Eugene,OR)根据标准方案测定肝脏FXI mRNA水平。还使用ELISA测量了血浆FXI蛋白水平。在归一化为PBS处理的对照之前，确定相对于总RNA的FXI mRNA水平(使用)。以下结果以每个处理组的FXImRNA水平的平均百分比呈现。将数据归一化为PBS处理的对照并且表示为“％PBS”。使用如先前所述的类似方法测量ED50并且在以下呈现。
表50
因子XI mRNA(％盐水)
如表50中所说明，用反义寡核苷酸处理以剂量依赖性方式降低FXI mRNA水平。包含3'-GalNAc3-1缀合物基团的寡核苷酸与未缀合的反义寡核苷酸(ISIS 404071)相比显示出效力的大致改进。在两种缀合寡核苷酸之间，通过用PO取代一些PS键联(ISIS 656173)来进一步提供效力改进。
如表50a中所说明，用反义寡核苷酸处理以剂量依赖性方式降低FXI蛋白水平。包含3'-GalNAc3-1缀合物基团的寡核苷酸与未缀合的反义寡核苷酸(ISIS 404071)相比显示出效力的大致改进。在两种缀合寡核苷酸之间，通过用PO取代一些PS键联(ISIS 656173)来进一步提供效力改进。
表50a
因子XI蛋白(％盐水)
使用标准方案，相对于盐水注射的小鼠测量血清中的肝脏转氨酶水平，即丙氨酸氨基转移酶(ALT)和天冬氨酸氨基转移酶(AST)。还评价了总胆红素、总白蛋白、CRE和BUN。评价了体重变化，其中与盐水组相比没有显著变化。ALT、AST、总胆红素和BUN值在下表中示出。
表51
实施例60：靶向SRB-1的缀合ASO的体外作用
在多剂量研究中测试以下列出的寡核苷酸对原代小鼠肝细胞中的SRB-1的反义抑制。包括ISIS 353382作为未缀合标准物。缀合物基团中的每一个均通过磷酸二酯连接的2'-脱氧腺苷核苷可裂解部分连接在相应寡核苷酸的3'或5'末端处。
表52
靶向SRB-1的修饰ASO
大写字母指示每个核苷的核碱基并且mC指示5-甲基胞嘧啶。下标：“e”指示2’-MOE修饰核苷；“d”指示β-D-2’-脱氧核糖核苷；“s”指示硫代磷酸酯核苷间键联(PS)；“o”指示磷酸二酯核苷间键联(PO)；并且“o’”指示-O-P(＝O)(OH)-。缀合物基团以粗体表示。
GalNAc3-1a的结构先前在实施例9中示出。GalNAc3-3a的结构先前在实施例39中示出。GalNAc3-8a的结构先前在实施例47中示出。GalNAc3-9a的结构先前在实施例52中示出。GalNAc3-6a的结构先前在实施例51中示出。GalNAc3-2a的结构先前在实施例37中示出。GalNAc3-10a的结构先前在实施例46中示出。GalNAc3-5a的结构先前在实施例49中示出。GalNAc3-7a的结构先前在实施例48中示出。
处理
在体外在小鼠原代肝细胞中测试以上列出的寡核苷酸，所述小鼠原代肝细胞以25,000个细胞/孔的密度涂布并且用0.03、0.08、0.24、0.74、2.22、6.67或20nM修饰寡核苷酸处理。在大约16小时的处理期之后，从细胞中分离RNA并且通过定量实时PCR测量mRNA水平并且如通过所测量，根据总RNA含量调节SRB-1mRNA水平。
使用标准方法计算IC50并且结果呈现于表53中。结果显示，在其中没有使用试剂或电穿孔技术来人工促进寡核苷酸进入到细胞中的自由摄取条件下，包含GalNAc缀合物的寡核苷酸比不包含GalNAc缀合物的母体寡核苷酸(ISIS 353382)在肝细胞中显著更有效。
表53
a多次运行的平均值。
实施例61：制备包含GalNAc3-12的低聚化合物175
化合物169为商业上可获得的。通过向化合物171添加苯甲基(全氟苯基)戊二酸酯来制备化合物172。通过向DMF中的5-(苯甲氧基)-5-氧戊酸添加PFP-TFA和DIEA来制备苯甲基(全氟苯基)戊二酸酯。使用实施例46中说明的一般工序从化合物174制备包含GalNAc3-12缀合物基团的低聚化合物175。缀合物基团GalNAc3-12的GalNAc3聚簇部分(GalNAc3-12a)可与任何可裂解部分组合以提供各种缀合物基团。在某一实施方案中，可裂解部分为-P(＝O)(OH)-Ad-P(＝O)(OH)-。GalNAc3-12(GalNAc3-12a-CM-)的结构在以下示出：
实施例62：制备包含GalNAc3-13的低聚化合物180
使用实施例2中示出的一般工序制备化合物176。使用实施例49中说明的一般工序从化合物177制备包含GalNAc3-13缀合物基团的低聚化合物180。缀合物基团GalNAc3-13的GalNAc3聚簇部分(GalNAc3-13a)可与任何可裂解部分组合以提供各种缀合物基团。在某一实施方案中，可裂解部分为-P(＝O)(OH)-Ad-P(＝O)(OH)-。GalNAc3-13(GalNAc3-13a-CM-)的结构在以下示出：
实施例63：制备包含GalNAc3-14的低聚化合物188
化合物181和185为商业上可获得的。使用实施例46中说明的一般工序从化合物187制备包含GalNAc3-14缀合物基团的低聚化合物188。缀合物基团GalNAc3-14的GalNAc3聚簇部分(GalNAc3-14a)可与任何可裂解部分组合以提供各种缀合物基团。在某些实施方案中，可裂解部分为-P(＝O)(OH)-Ad-P(＝O)(OH)-。GalNAc3-14(GalNAc3-14a-CM-)的结构在以下示出：
实施例64：制备包含GalNAc3-15的低聚化合物197
化合物189为商业上可获得的。使用实施例31中示出的一般工序制备化合物195。使用标准寡核苷酸合成工序由化合物194和195制备包含GalNAc3-15缀合物基团的低聚化合物197。缀合物基团GalNAc3-15的GalNAc3聚簇部分(GalNAc3-15a)可与任何可裂解部分组合以提供各种缀合物基团。在某些实施方案中，可裂解部分为-P(＝O)(OH)-Ad-P(＝O)(OH)-。GalNAc3-15(GalNAc3-15a-CM-)的结构在以下示出：
实施例65：靶向SRB-1的包含5'-缀合物基团的寡核苷酸(比较GalNAc3-3、12、13、14以及15)的体内剂量依赖性研究
在剂量依赖性研究中测试以下列出的寡核苷酸对小鼠中的SRB-1的反义抑制。包括未缀合的ISIS 353382作为标准物。将GalNAc3缀合物基团中的每一个均通过磷酸二酯连接的2'-脱氧腺苷核苷(可裂解部分)连接在相应寡核苷酸的5'末端处。
表54
靶向SRB-1的修饰ASO
大写字母指示每个核苷的核碱基并且mC指示5-甲基胞嘧啶。下标：“e”指示2’-MOE修饰核苷；“d”指示β-D-2’-脱氧核糖核苷；“s”指示硫代磷酸酯核苷间键联(PS)；“o”指示磷酸二酯核苷间键联(PO)；并且“o’”指示-O-P(＝O)(OH)-。缀合物基团以粗体表示。
GalNAc3-3a的结构先前在实施例39中示出。GalNAc3-12a的结构先前在实施例61中示出。GalNAc3-13a的结构先前在实施例62中示出。GalNAc3-14a的结构先前在实施例63中示出。GalNAc3-15a的结构先前在实施例64中示出。
处理
在以下示出的剂量下用ISIS 353382、661161、671144、670061、671261、671262或用盐水皮下注射六至八周龄C57bl6小鼠(Jackson Laboratory,Bar Harbor,ME)一次或两次。给药两次的小鼠在第一次剂量之后三天接受第二次剂量。每个处理组由4只动物组成。在最后施用之后72小时将小鼠处死，以使用实时PCR和RNA定量试剂(Molecular Probes,Inc.Eugene,OR)根据标准方案测定肝脏SRB-1 mRNA水平。以下结果以归一化为盐水对照的每个处理组的SRB-1 mRNA水平的平均百分比呈现。
如表55中所说明，用反义寡核苷酸处理以剂量依赖性方式降低SRB-1 mRNA水平。在接受单一剂量的动物与接受两次剂量的动物之间没有观察到靶敲除的显著差异(参见ISIS 353382剂量30mg/kg和2x 15mg/kg；以及ISIS 661161剂量5mg/kg和2x 2.5mg/kg)。包含磷酸二酯连接的GalNAc3-3、12、13、14以及15缀合物的反义寡核苷酸与未缀合的反义寡核苷酸(ISIS 335382)相比显示出效力的大致改进。
表55
SRB-1 mRNA(％盐水)
使用标准方案，相对于盐水注射的小鼠测量血清中的肝脏转氨酶水平，即丙氨酸氨基转移酶(ALT)和天冬氨酸氨基转移酶(AST)。还评价了总胆红素和BUN。评价了体重变化，其中与盐水组相比没有显著差异(数据未示出)。ALT、AST、总胆红素和BUN值在以下表56中示出。
表56
实施例66：各种可裂解部分对通过包含5’-GalNAc3聚簇的靶向SRB-1的寡核苷酸进行的体内反义抑制的影响
在剂量依赖性研究中测试以下列出的寡核苷酸对小鼠中的SRB-1的反义抑制。GalNAc3缀合物基团中的每一个均通过磷酸二酯连接的核苷(可裂解部分(CM))连接在相应寡核苷酸的5'末端处。
表57
靶向SRB-1的修饰ASO
大写字母指示每个核苷的核碱基并且mC指示5-甲基胞嘧啶。下标：“e”指示2’-MOE修饰核苷；“d”指示β-D-2’-脱氧核糖核苷；“s”指示硫代磷酸酯核苷间键联(PS)；“o”指示磷酸二酯核苷间键联(PO)；并且“o’”指示-O-P(＝O)(OH)-。缀合物基团以粗体表示。
GalNAc3-3a的结构先前在实施例39中示出。GalNAc3-13a的结构先前在实施例62中示出。
处理
在以下示出的剂量下用ISIS 661161、670699、670700、670701、671165或用盐水皮下注射六至八周龄C57bl6小鼠(Jackson Laboratory,Bar Harbor,ME)一次。每个处理组由4只动物组成。在最后施用之后72小时将小鼠处死，以使用实时PCR和RNA定量试剂(Molecular Probes,Inc.Eugene,OR)根据标准方案测定肝脏SRB-1mRNA水平。以下结果以归一化为盐水对照的每个处理组的SRB-1mRNA水平的平均百分比呈现。
如表58中所说明，用反义寡核苷酸处理以剂量依赖性方式降低SRB-1 mRNA水平。包含各种可裂解部分的反义寡核苷酸均显示出类似的效力。
表58
SRB-1 mRNA(％盐水)
使用标准方案，相对于盐水注射的小鼠测量血清中的肝脏转氨酶水平，即丙氨酸氨基转移酶(ALT)和天冬氨酸氨基转移酶(AST)。还评价了总胆红素和BUN。评价了体重变化，其中与盐水组相比没有显著差异(数据未示出)。ALT、AST、总胆红素和BUN值在以下表56中示出。
表59
实施例67：制备包含GalNAc3-16的低聚化合物199
使用实施例7和9中说明的一般工序制备包含GalNAc3-16缀合物基团的低聚化合物199。缀合物基团GalNAc3-16的GalNAc3聚簇部分(GalNAc3-16a)可与任何可裂解部分组合以提供各种缀合物基团。在某些实施方案中，可裂解部分为-P(＝O)(OH)-Ad-P(＝O)(OH)-。GalNAc3-16(GalNAc3-16a-CM-)的结构在以下示出：
实施例68：制备包含GalNAc3-17的低聚化合物200
使用实施例46中说明的一般工序制备包含GalNAc3-17缀合物基团的低聚化合物200。缀合物基团GalNAc3-17的GalNAc3聚簇部分(GalNAc3-17a)可与任何可裂解部分组合以提供各种缀合物基团。在某些实施方案中，可裂解部分为-P(＝O)(OH)-Ad-P(＝O)(OH)-。GalNAc3-17(GalNAc3-17a-CM-)的结构在以下示出：
实施例69：制备包含GalNAc3-18的低聚化合物201
使用实施例46中说明的一般工序制备包含GalNAc3-18缀合物基团的低聚化合物201。缀合物基团GalNAc3-18的GalNAc3聚簇部分(GalNAc3-18a)可与任何可裂解部分组合以提供各种缀合物基团。在某些实施方案中，可裂解部分为-P(＝O)(OH)-Ad-P(＝O)(OH)-。GalNAc3-18(GalNAc3-18a-CM-)的结构在以下示出：
实施例70：制备包含GalNAc3-19的低聚化合物204
使用实施例52中说明的一般工序从化合物64制备包含GalNAc3-19缀合物基团的低聚化合物204。缀合物基团GalNAc3-19的GalNAc3聚簇部分(GalNAc3-19a)可与任何可裂解部分组合以提供各种缀合物基团。在某些实施方案中，可裂解部分为-P(＝O)(OH)-Ad-P(＝O)(OH)-。GalNAc3-19(GalNAc3-19a-CM-)的结构在以下示出：
实施例71：制备包含GalNAc3-20的低聚化合物210
通过将PFP-TFA和DIEA添加至乙腈中的6-(2,2,2-三氟乙酰氨基)己酸来制备化合物205，所述乙腈中的6-(2,2,2-三氟乙酰氨基)己酸通过将三氟甲磺酸酐添加至6-氨基己酸来制备。将反应混合物加热至80℃，然后降低至室温。使用实施例52中说明的一般工序从化合物208制备包含GalNAc3-20缀合物基团的低聚化合物210。缀合物基团GalNAc3-20的GalNAc3聚簇部分(GalNAc3-20a)可与任何可裂解部分组合以提供各种缀合物基团。在某些实施方案中，可裂解部分为-P(＝O)(OH)-Ad-P(＝O)(OH)-。GalNAc3-20(GalNAc3-20a-CM-)的结构在以下示出：
实施例72：制备包含GalNAc3-21的低聚化合物215
化合物211为商业上可获得的。使用实施例52中说明的一般工序从化合物213制备包含GalNAc3-21缀合物基团的低聚化合物215。缀合物基团GalNAc3-21的GalNAc3聚簇部分(GalNAc3-21a)可与任何可裂解部分组合以提供各种缀合物基团。在某些实施方案中，可裂解部分为-P(＝O)(OH)-Ad-P(＝O)(OH)-。GalNAc3-21(GalNAc3-21a-CM-)的结构在以下示出：
实施例73：制备包含GalNAc3-22的低聚化合物221
使用二异丙基铵四唑由化合物219制备化合物220。使用实施例52中说明的一般工序从化合物220制备包含GalNAc3-21缀合物基团的低聚化合物221。缀合物基团GalNAc3-22的GalNAc3聚簇部分(GalNAc3-22a)可与任何可裂解部分组合以提供各种缀合物基团。在某些实施方案中，可裂解部分为-P(＝O)(OH)-Ad-P(＝O)(OH)-。GalNAc3-22(GalNAc3-22a-CM-)的结构在以下示出：
实施例74：各种可裂解部分对通过包含5’-GalNAc3缀合物的靶向SRB-1的寡核苷酸进行的体内反义抑制的影响
在剂量依赖性研究中测试以下列出的寡核苷酸对小鼠中的SRB-1的反义抑制。GalNAc3缀合物基团中的每一个均连接在相应寡核苷酸的5'末端处。
表60
靶向SRB-1的修饰ASO
在所有表格中，大写字母指示每个核苷的核碱基并且mC指示5-甲基胞嘧啶。下标：“e”指示2’-MOE修饰核苷；“d”指示β-D-2’-脱氧核糖核苷；“s”指示硫代磷酸酯核苷间键联(PS)；“o”指示磷酸二酯核苷间键联(PO)；并且“o’”指示-O-P(＝O)(OH)-。缀合物基团以粗体表示。
GalNAc3-3a的结构先前在实施例39中示出。GalNAc3-17a的结构先前在实施例68中示出，并且GalNAc3-18a的结构在实施例69中示出。
处理
在以下示出的剂量下用列于表60中的寡核苷酸或用盐水皮下注射六至八周龄C57BL/6小鼠(Jackson Laboratory,Bar Harbor,ME)一次。每个处理组由4只动物组成。在最后施用之后72小时将小鼠处死以使用实时PCR和RNA定量试剂(Molecular Probes,Inc.Eugene,OR)根据标准方案测定SRB-1 mRNA水平。以下结果以归一化为盐水对照的每个处理组的SRB-1 mRNA水平的平均百分比呈现。
如表61中所说明，用反义寡核苷酸处理以剂量依赖性方式降低SRB-1 mRNA水平。包含GalNAc缀合物的反义寡核苷酸显示出类似的效力并且比缺乏GalNAc缀合物的母体寡核苷酸显著更有效。
表61
SRB-1 mRNA(％盐水)
使用标准方案，相对于盐水注射的小鼠测量血清中的肝脏转氨酶水平，即丙氨酸氨基转移酶(ALT)和天冬氨酸氨基转移酶(AST)。还评价了总胆红素和BUN。评价了体重变化，其中与盐水组相比没有显著变化(数据未示出)。ALT、AST、总胆红素和BUN值在以下表62中示出。
表62
实施例75：包含5’-缀合物基团的寡核苷酸的药物代谢动力学分析
使用根据实施例65、66和74中描述的处理工序所获得的肝脏样品来评价以上表54、57和60中的ASO的PK。使用标准方案切碎并提取肝脏样品并且与内标物一起通过IP-HPLC-MS进行分析。通过对适当的UV峰进行积分，测量组合组织水平(μg/g)并且使用适当的提取离子色谱图(EIC)测量全长ASO缺失缀合物(“亲本”，在该情况下的Isis No为353382)的组织水平。
表63
肝脏中的PK分析
以上表63中的结果显示，在寡核苷酸施用之后72小时，尤其当考虑到具有与不具有GalNAc3缀合物基团的寡核苷酸之间的给药差异时，包含GalNAc3缀合物基团的寡核苷酸的肝脏组织水平比不包含GalNAc3缀合物基团的母体寡核苷酸(ISIS 353382)更高。此外，至72小时，40％-98％的包含GalNAc3缀合物基团的每个寡核苷酸代谢为母体化合物，表明GalNAc3缀合物基团从寡核苷酸上裂解。
实施例76：制备包含GalNAc3-23的低聚化合物230
化合物222为商业上可获得的。将44.48ml(0.33mol)的化合物222用吡啶(500mL)中的甲苯磺酰氯(25.39g，0.13mol)处理16小时。然后将反应物蒸发至油状物，溶解于EtOAc中并且用水、饱和NaHCO3、盐水洗涤，并且通过Na2SO4干燥。将乙酸乙酯浓缩至干燥并且通过柱色谱法纯化，用EtOAc/己烷(1:1)洗脱，接着用10％的CH2Cl2中的甲醇洗脱，得到呈无色油状物的化合物223。LCMS和NMR与结构一致。在室温下将10g(32.86mmol)的1-甲苯磺酰基三甘醇(化合物223)用DMSO(100mL)中的叠氮化钠(10.68g，164.28mmol)处理17小时。然后将反应混合物倾倒在水上，并且用EtOAc萃取。将有机层用水洗涤三次并且通过Na2SO4干燥。将有机层浓缩至干燥，得到5.3g的化合物224(92％)。LCMS和NMR与结构一致。在惰性气氛下用4A分子筛(5g)和二氯甲烷(100mL)中的TMSOTf(1.65ml，9.11mmol)处理1-叠氮基三甘醇(化合物224，5.53g，23.69mmol)和化合物4(6g，18.22mmol)。在14小时之后，过滤反应物以去除分子筛，并且将有机层用饱和NaHCO3、水、盐水洗涤，并且通过Na2SO4干燥。将有机层浓缩至干燥并且通过柱色谱法纯化，用2％至4％梯度的二氯甲烷中的甲醇洗脱，得到化合物225。LCMS和NMR与结构一致。通过Pearlman氏催化剂在EtOAc/甲醇(4:1，250mL)中氢化化合物225(11.9g，23.59mmol)。在8小时之后，通过过滤去除催化剂并且去除溶剂至干燥，得到化合物226。LCMS和NMR与结构一致。
为了生成化合物227，用五氟三氟乙酸酯(9.05ml，52.65mmol)逐滴处理硝基甲烷三丙酸(4.17g，15.04mmol)和Hunig氏碱(10.3ml，60.17mmol)在DMF(100mL)中的溶液。在30分钟之后，将反应物倾倒在冰水上并且用EtOAc萃取。将有机层用水、盐水洗涤并且通过Na2SO4干燥。将有机层浓缩至干燥并且然后从庚烷中重结晶，得到呈白色固体的化合物227。LCMS和NMR与结构一致。将化合物227(1.5g，1.93mmol)和化合物226(3.7g，7.74mmol)在室温下在乙腈(15mL)中搅拌2小时。然后将反应物蒸发至干燥并且通过柱色谱法纯化，用2％至10％梯度的二氯甲烷中的甲醇洗脱，得到化合物228。LCMS和NMR与结构一致。在氢气气氛中，用乙醇(100mL)中的雷尼镍(约2g湿润)处理化合物228(1.7g，1.02mmol)。在12小时之后，通过过滤去除催化剂并且将有机层蒸发至固体，所述固体直接用于下一步。LCMS和NMR与结构一致。用DMF(5mL)中的苯甲基戊二酸(0.18g，0.8mmol)、HBTU(0.3g，0.8mmol)和DIEA(273.7μl，1.6mmol)处理此固体(0.87g，0.53mmol)。在16小时之后，在减压下在65℃下去除DMF至油状物，并且将油状物溶解于二氯甲烷。将有机层用饱和NaHCO3、盐水洗涤并且通过Na2SO4干燥。在有机层蒸发之后，通过柱色谱法纯化化合物并且用2％至20％梯度的二氯甲烷中的甲醇洗脱，得到偶联的产物。LCMS和NMR与结构一致。将苯甲酯在氢气气氛下用Pearlman氏催化剂去保护，持续1小时。然后通过过滤去除催化剂并且去除溶剂至干燥，得到酸。LCMS和NMR与结构一致。将酸(486mg，0.27mmol)溶解于干燥DMF(3mL)中。添加吡啶(53.61μl，0.66mmol)并且用氩气吹扫反应物。将五氟三氟乙酸酯(46.39μl，0.4mmol)缓慢添加至反应混合物中。反应物的颜色从浅黄色变为酒红色，并且放出轻烟，所述轻烟用氩气流吹走。使反应物在室温下搅拌一小时(通过LCMS证实反应完全)。在减压(旋转蒸发仪)下在70℃下去除溶剂。将残余物用DCM稀释并且用1N NaHSO4、盐水洗涤，再次用饱和碳酸氢钠和盐水洗涤。将有机物通过Na2SO4干燥、过滤并且浓缩至干燥，得到225mg的呈易碎黄色泡沫的化合物229。LCMS和NMR与结构一致。
使用实施例46中说明的一般工序由化合物229制备包含GalNAc3-23缀合物基团的低聚化合物230。GalNAc3-23缀合物基团的GalNAc3聚簇部分(GalNAc3-23a)可与任何可裂解部分组合以提供各种缀合物基团。GalNAc3-23(GalNAc3-23a-CM)的结构在以下示出：
实施例77：通过包含GalNAc3缀合物的靶向SRB-1的寡核苷酸进行的体内反义抑制
在剂量依赖性研究中测试以下列出的寡核苷酸对小鼠中的SRB-1的反义抑制。
表64
靶向SRB-1的修饰ASO
GalNAc3-1a的结构先前在实施例9中示出，GalNAc3-3a在实施例39中示出，GalNAc3-9a在实施例52中示出，GalNAc3-10a在实施例46中示出，GalNAc3-19a在实施例70中示出，GalNAc3-20a在实施例71中示出，并且GalNAc3-23a在实施例76中示出。
处理
在以下示出的剂量下用列于表64中的寡核苷酸或用盐水各自皮下注射六至八周龄C57BL/6小鼠(Jackson Laboratory,Bar Harbor,ME)一次。每个处理组由4只动物组成。在最后施用之后72小时将小鼠处死以使用实时PCR和RNA定量试剂(Molecular Probes,Inc.Eugene,OR)根据标准方案测定SRB-1 mRNA水平。以下结果以归一化为盐水对照的每个处理组的SRB-1 mRNA水平的平均百分比呈现。
如表65中所说明，用反义寡核苷酸处理以剂量依赖性方式降低SRB-1 mRNA水平。
表65
SRB-1 mRNA(％盐水)
使用标准方案，还测量了血清中的肝脏转氨酶水平，即丙氨酸氨基转移酶(ALT)和天冬氨酸氨基转移酶(AST)。还评价了总胆红素和BUN。评价了体重变化，其中与盐水组相比没有显著变化(数据未示出)。ALT、AST、总胆红素和BUN值在以下表66中示出。
表66
实施例78：通过包含GalNAc3缀合物的靶向血管紧张素原的寡核苷酸进行的体内反义抑制
在剂量依赖性研究中测试以下列出的寡核苷酸对血压正常的斯普拉道来大鼠中的血管紧张素原(AGT)的反义抑制。
表67
靶向AGT的修饰ASO
GalNAc3-1a的结构先前在实施例9中示出。
处理
在以下示出的剂量(总共三次剂量)下，每周一次用列于表67中的寡核苷酸或用PBS各自皮下注射六周龄雄性斯普拉道来大鼠。每个处理组由4只动物组成。在最后剂量之后72小时将大鼠处死。使用实时PCR和RNA定量试剂(Molecular Probes,Inc.Eugene,OR)根据标准方案测量AGT肝脏mRNA水平。用1:20,000稀释的血浆使用总血管紧张素原ELISA(目录号JP27412,IBL International,Toronto,ON)来测量AGT血浆蛋白水平。以下结果以归一化为PBS对照的每个处理组的肝脏中AGT mRNA水平或血浆中AGT蛋白水平的平均百分比呈现。
如表68中所说明，用反义寡核苷酸处理以剂量依赖性方式降低AGT肝脏mRNA和血浆蛋白水平，并且包含GalNAc缀合物的寡核苷酸比缺乏GalNAc缀合物的母体寡核苷酸显著更有效。
表68
AGT肝脏mRNA和血浆蛋白水平
使用标准方案，在处死时还测量了血浆中的肝脏转氨酶水平(即丙氨酸氨基转移酶(ALT)和天冬氨酸氨基转移酶(AST))和体重。结果在以下表69中示出。
表69
肝脏转氨酶水平和大鼠体重
实施例79：包含GalNAc3缀合物的靶向APOC-III的寡核苷酸的体内作用持续时间
在单一剂量研究中测试列于以下表70中的寡核苷酸在小鼠中的作用持续时间。
表70
靶向APOC-III的修饰ASO
GalNAc3-1a的结构先前在实施例9中示出，GalNAc3-3a在实施例39中示出，GalNAc3-7a在实施例48中示出，GalNAc3-10a在实施例46中示出，并且GalNAc3-13a在实施例62中示出。
处理
用列于表70中的寡核苷酸或用PBS各自皮下注射表达人APOC-III的六至八周龄转基因小鼠一次。每个处理组由3只动物组成。在给药之前抽血以确定基线并且在剂量之后72小时、1周、2周、3周、4周、5周和6周时抽血。如实施例20中所描述来测量血浆甘油三酯和APOC-III蛋白水平。以下结果以归一化为基线水平的每个处理组的血浆甘油三酯和APOC-III水平的平均百分比呈现，表明包含GalNAc缀合物基团的寡核苷酸表现出比不具有缀合物基团的母体寡核苷酸(ISIS 304801)更长的作用持续时间，即使母体剂量为包含GalNAc缀合物基团的寡核苷酸剂量的三倍也是如此。
表71
转基因小鼠中的血浆甘油三酯和APOC-III蛋白水平
实施例80：通过包含GalNAc3缀合物的靶向α-抗胰蛋白酶(A1AT)的寡核苷酸进行的体内反义抑制
在研究中测试列于以下表72中的寡核苷酸对小鼠中的A1AT的剂量依赖性抑制。
表72
靶向A1AT的修饰ASO
GalNAc3-1a的结构先前在实施例9中示出，GalNAc3-3a在实施例39中示出，GalNAc3-7a在实施例48中示出，GalNAc3-10a在实施例46中示出，并且GalNAc3-13a在实施例62中示出。
处理
在以下示出的剂量(总共三次剂量)下，每周一次用列于表72中的寡核苷酸或用PBS各自皮下注射六周龄雄性C57BL/6小鼠(Jackson Laboratory,Bar Harbor,ME)。每个处理组由4只动物组成。在最后施用之后72小时将小鼠处死。使用实时PCR和RNA定量试剂(Molecular Probes,Inc.Eugene,OR)根据标准方案测定A1AT肝脏mRNA水平。使用小鼠α1-抗胰蛋白酶ELISA(目录号41-A1AMS-E01,Alpco,Salem,NH)测定A1AT血浆蛋白水平。以下结果以归一化为PBS对照的每个处理组的A1AT肝脏mRNA和血浆蛋白水平的平均百分比呈现。
如表73中所说明，用反义寡核苷酸处理以剂量依赖性方式降低A1AT肝脏mRNA和A1AT血浆蛋白水平。包含GalNAc缀合物的寡核苷酸比母体(ISIS 476366)显著更有效。
表73
A1AT肝脏mRNA和血浆蛋白水平
使用标准方案在处死时测量血浆中的肝脏转氨酶和BUN水平。还测量了体重和器官重量。结果在以下表74中示出。体重以相对于基线的％示出。器官重量以相对于PBS对照组的体重的％示出。
表74
实施例81：包含GalNAc3聚簇的靶向A1AT的寡核苷酸的体内作用持续时间
在单一剂量研究中测试列于表72中的寡核苷酸在小鼠中的作用持续时间。
处理
用列于表72中的寡核苷酸或用PBS各自皮下注射六周龄雄性C57BL/6小鼠一次。每个处理组由4只动物组成。在给药前一天抽血以确定基线并且在剂量之后5天、12天、19天和25天时抽血。通过ELISA测量血浆A1AT蛋白水平(参见实施例80)。以下结果以归一化为基线水平的每个处理组的血浆A1AT蛋白水平的平均百分比呈现。结果显示，包含GalNAc缀合物的寡核苷酸更有效并且比缺乏GalNAc缀合物的母体(ISIS 476366)具有更长的作用持续时间。此外，包含5’-GalNAc缀合物的寡核苷酸(ISIS 678381、678382、678383和678384)通常比包含3’-GalNAc缀合物的寡核苷酸(ISIS 656326)甚至更有效并且作用持续时间甚至更长。
表75
小鼠中的血浆A1AT蛋白水平
实施例82：通过包含GalNAc3缀合物的靶向SRB-1的寡核苷酸进行的体外反义抑制
在处理之前2小时，以15,000个细胞/孔将小鼠原代肝脏肝细胞接种于96孔平板中。以2、10、50或250nM在Williams E培养基中添加列于表76中的寡核苷酸，并且将细胞在37℃下在5％CO2中孵育过夜。在寡核苷酸添加之后16小时使细胞裂解，并且使用RNease3000BioRobot(Qiagen)纯化总RNA。使用实时PCR和RNA定量试剂(Molecular Probes,Inc.Eugene,OR)根据标准方案测定SRB-1 mRNA水平。使用Prism 4软件(GraphPad)确定IC50值。结果显示，包含各种不同GalNAc缀合物基团和各种不同可裂解部分的寡核苷酸在体外自由摄取实验中比缺乏GalNAc缀合物基团的母体寡核苷酸(ISIS353382和666841)显著更有效。
表76
SRB-1表达的体外抑制
GalNAc3-1a的结构先前在实施例9中示出，GalNAc3-3a在实施例39中示出，GalNAc3-5a在实施例49中示出，GalNAc3-6a在实施例51中示出，GalNAc3-7a在实施例48中示出，GalNAc3-8a在实施例47中示出，GalNAc3-9a在实施例52中示出，GalNAc3-10a在实施例46中示出，GalNAc3-12a在实施例61中示出，GalNAc3-13a在实施例62中示出，GalNAc3-14a在实施例63中示出，GalNAc3-15a在实施例64中示出，GalNAc3-17a在实施例68中示出，GalNAc3-18a在实施例69中示出，GalNAc3-19a在实施例70中示出，GalNAc3-20a在实施例71中示出，并且GalNAc3-23a在实施例76中示出。
实施例83：通过包含GalNAc3聚簇的靶向因子XI的寡核苷酸进行的体内反义抑制
在研究中测试列于以下表77中的寡核苷酸对小鼠中的因子XI的剂量依赖性抑制。
表77
靶向因子XI的修饰寡核苷酸
GalNAc3-1a的结构先前在实施例9中示出，GalNAc3-3a在实施例39中示出，GalNAc3-7a在实施例48中示出，GalNAc3-10a在实施例46中示出，并且GalNAc3-13a在实施例62中示出。
处理
在以下示出的剂量(总共三次剂量)下，每周一次用以下列出的寡核苷酸或用PBS各自皮下注射六至八周龄小鼠。每个处理组由4只动物组成。在最后剂量之后72小时将小鼠处死。根据标准方案使用实时PCR测量因子XI肝脏mRNA水平并且归一化为亲环蛋白。还测量了肝脏转氨酶、BUN和胆红素。以下结果以归一化为PBS对照的每个处理组的平均百分比呈现。
如表78中所说明，用反义寡核苷酸处理以剂量依赖性方式降低因子XI肝脏mRNA。结果显示包含GalNAc缀合物的寡核苷酸比缺乏GalNAc缀合物的母体(ISIS 404071)更有效。此外，包含5’-GalNAc缀合物的寡核苷酸(ISIS 663086、678347、678348和678349)甚至比包含3’-GalNAc缀合物的寡核苷酸(ISIS 656173)更有效。
表78
因子XI肝脏mRNA、肝脏转氨酶、BUN和胆红素水平
实施例84：包含GalNAc3缀合物的靶向因子XI的寡核苷酸的体内作用持续时间
在单一剂量研究中测试列于表77中的寡核苷酸在小鼠中的作用持续时间。
处理
用列于表77中的寡核苷酸或用PBS各自皮下注射六至八周龄小鼠一次。每个处理组由4只动物组成。在给药前一天通过尾部放血抽血以确定基线并且在剂量之后3天、10天和17天时抽血。使用来自R&D Systems,Minneapolis,MN的因子XI捕获和生物素化的检测抗体(分别为目录号AF2460和BAF2460)和OptEIA Reagent Set B(目录号550534,BDBiosciences,San Jose,CA)通过ELISA测量血浆因子XI蛋白水平。以下结果以归一化为基线水平的每个处理组的血浆因子XI蛋白水平的平均百分比呈现。结果显示包含GalNAc缀合物的寡核苷酸比缺乏GalNAc缀合物的母体(ISIS 404071)更有效且作用持续时间更长。此外，包含5’-GalNAc缀合物的寡核苷酸(ISIS 663086、678347、678348和678349)甚至比包含3’-GalNAc缀合物的寡核苷酸(ISIS 656173)更有效并且作用持续时间甚至更长。
表79
小鼠中的血浆因子XI蛋白水平
实施例85：通过包含GalNAc3缀合物的靶向SRB-1的寡核苷酸进行的体内反义抑制
在剂量依赖性研究中测试列于表76中的寡核苷酸对小鼠中的SRB-1的反义抑制。
处理
在以下示出的剂量(总共三次剂量)下，每周一次用列于表76中的寡核苷酸或用盐水各自皮下注射六至八周龄C57BL/6小鼠。每个处理组由4只动物组成。在最后施用之后48小时将小鼠处死以使用实时PCR和RNA定量试剂(Molecular Probes,Inc.Eugene,OR)根据标准方案测定SRB-1 mRNA水平。以下结果以归一化为盐水对照的每个处理组的肝脏SRB-1 mRNA水平的平均百分比呈现。
如表80和81中所说明，用反义寡核苷酸处理以剂量依赖性方式降低SRB-1 mRNA水平。
表80
肝脏中的SRB-1 mRNA
表81
肝脏中的SRB-1 mRNA
还使用标准方案测量了肝脏转氨酶水平、总胆红素、BUN和体重。每个处理组的平均值在以下表82中示出。
表82
实施例86：通过包含GalNAc3聚簇的靶向TTR的寡核苷酸进行的体内反义抑制
在剂量依赖性研究中测试列于以下表83中的寡核苷酸对表达人TTR基因的转基因小鼠中的人甲状腺素运载蛋白(TTR)的反义抑制。
处理
每周一次用列于下表中的寡核苷酸和剂量或用PBS各自皮下注射八周龄TTR转基因小鼠，持续三周，总共三次剂量。每个处理组由4只动物组成。在最后施用之后72小时将小鼠处死。在整个实验的各个时间点进行尾部放血，测量血浆TTR蛋白、ALT和AST水平并且报道于表85-87中。在将动物处死之后，测量血浆ALT、AST和人TTR水平以及体重、器官重量和肝脏人TTR mRNA水平。使用临床分析仪(AU480,Beckman Coulter,CA)测量TTR蛋白水平。根据标准方案使用实时PCR和RNA定量试剂(Molecular Probes,Inc.Eugene,OR)来测定肝脏人TTR mRNA水平。呈现于表84-87中的结果为每个处理组的平均值。mRNA水平为相对于PBS组的平均值的平均值。血浆蛋白水平为相对于基线处的PBS组的平均值的平均值。体重为每个单独处理组的直到处死时从基线的重量变化的平均百分比。将示出的器官重量归一化为动物的体重，然后相对于PBS组的平均归一化器官重量呈现每个处理组的平均归一化器官重量。
在表84-87中，“BL”指示基线，即刚好在第一次剂量之前取得的测量结果。如表84和85中所说明，用反义寡核苷酸处理以剂量依赖性方式降低TTR表达水平。包含GalNAc缀合物的寡核苷酸比缺乏GalNAc缀合物的母体(ISIS 420915)更有效。此外，包含GalNAc缀合物和混合的PS/PO核苷间键联的寡核苷酸甚至比包含GalNAc缀合物和全部PS键联的寡核苷酸更有效。
表83
靶向人TTR的寡核苷酸
表85的图例可见于实施例74。GalNAc3-1的结构在实施例9中示出。GalNAc3-3a的结构在实施例39中示出。GalNAc3-7a的结构在实施例48中示出。GalNAc3-10a的结构在实施例46中示出。GalNAc3-13a的结构在实施例62中示出。GalNAc3-19a的结构在实施例70中示出。
表84
人TTR的体内反义抑制
表85
人TTR的体内反义抑制
表86
转氨酶水平、体重变化和相对器官重量
表87
转氨酶水平、体重变化和相对器官重量
实施例87：单一剂量的包含GalNAc3聚簇的靶向TTR的寡核苷酸的体内作用持续时间
在单一剂量研究中测试ISIS号420915和660261(参见表83)在小鼠中的作用持续时间。在单一剂量研究中还测试ISIS号420915、682883和682885(参见表83)在小鼠中的作用持续时间。
处理
用100mg/kg ISIS No.420915或13.5mg/kg ISIS No.660261各自皮下注射表达人TTR的八周龄雄性转基因小鼠一次。每个处理组由4只动物组成。在给药之前进行尾部放血以确定基线并且在剂量之后第3天、第7天、第10天、第17天、第24天和第39天时进行尾部放血。如实施例86中所描述来测量血浆TTR蛋白水平。以下结果以归一化为基线水平的每个处理组的血浆TTR水平的平均百分比呈现。
表88
血浆TTR蛋白水平
处理
用100mg/kg ISIS No.420915、10.0mg/kg ISIS No.682883或10.0mg/kg 682885各自皮下注射表达人TTR的雌性转基因小鼠一次。每个处理组由4只动物组成。在给药之前进行尾部放血以确定基线并且在剂量之后第3天、第7天、第10天、第17天、第24天和第39天时进行尾部放血。如实施例86中所描述来测量血浆TTR蛋白水平。以下结果以归一化为基线水平的每个处理组的血浆TTR水平的平均百分比呈现。
表89
血浆TTR蛋白水平
表88和89中的结果显示包含GalNAc缀合物的寡核苷酸比缺乏缀合物的母体寡核苷酸(ISIS 420915)更有效并且作用持续时间更长。
实施例88：通过包含GalNAc3缀合物的靶向SMN的寡核苷酸进行的体内剪接调节
测试列于表90中的寡核苷酸对小鼠中的人存活运动神经元(SMN)的剪接调节。
表90
靶向SMN的修饰ASO
GalNAc3-7a的结构先前在实施例48中示出。“X”指示通过Gene Tools(Philomath,OR)产生的5’伯胺，并且GalNAc3-7b指示缺乏如下所示的接头的–NH-C6-O部分的GalNAc3-7a的结构：
ISIS号703421和703422为吗啉代寡核苷酸，其中两个寡核苷酸中的每个核苷酸为吗啉代核苷酸。
处理
用列于表91中的寡核苷酸或用盐水皮下注射表达人SMN的六周龄转基因小鼠一次。每个处理组由2只雄性和2只雌性组成。在剂量之后3天将小鼠处死，以根据标准方案使用实时PCR测定具有和不具有外显子7的肝脏人SMN mRNA水平。使用Ribogreen试剂测量总RNA。将SMN mRNA水平归一化为总mRNA，并且进一步归一化为盐水处理组的平均值。包括外显子7的SMN mRNA与缺失外显子7的SMN mRNA的所得平均比率在表91中示出。结果显示，调节剪接并包含GalNAc缀合物的完全修饰的寡核苷酸比缺乏GalNAc缀合物的母体寡核苷酸在改变肝脏中的剪接上显著更有效。此外，对于多种修饰化学包括2’-MOE和吗啉代修饰的寡核苷酸，将维持这个趋势。
表91
靶向人SMN的寡核苷酸的体内作用
实施例89：通过包含GalNAc3缀合物的靶向载脂蛋白A(Apo(a))的寡核苷酸进行的体内反义抑制
在研究中测试列于以下表92中的寡核苷酸对转基因小鼠中的Apo(a)的剂量依赖性抑制。
表92
靶向Apo(a)的修饰ASO
GalNAc3-7a的结构在实施例48中示出。
处理
在以下示出的剂量(总共六次剂量)下，每周一次用列于表92中的寡核苷酸或用PBS各自皮下注射八周龄雌性C57BL/6小鼠(Jackson Laboratory,Bar Harbor,ME)。每个处理组由3-4只动物组成。在第一次剂量前一天进行尾部放血并且每周在每次剂量之后进行尾部放血以测定血浆Apo(a)蛋白水平。在最后施用之后两天将小鼠处死。使用实时PCR和RNA定量试剂(Molecular Probes,Inc.Eugene,OR)根据标准方案测定Apo(a)肝脏mRNA水平。使用ELISA测定Apo(a)血浆蛋白水平，并且测定肝脏转氨酶水平。表93中的mRNA和血浆蛋白结果以相对于PBS处理组的处理组平均百分比呈现。将血浆蛋白水平进一步归一化为PBS组的基线(BL)值。平均绝对转氨酶水平和体重(相对于基线平均值的％)报道于表94中。
如表93中所说明，用寡核苷酸处理以剂量依赖性方式降低Apo(a)肝脏mRNA和血浆蛋白水平。此外，包含GalNAc缀合物的寡核苷酸比缺乏GalNAc缀合物的母体寡核苷酸显著更有效并且作用持续时间更长。如表94中所说明，转氨酶水平和体重不受寡核苷酸的影响，表明寡核苷酸为耐受良好的。
表93
Apo(a)肝脏mRNA和血浆蛋白水平
表94
实施例90：通过包含GalNAc3聚簇的靶向TTR的寡核苷酸进行的体内反义抑制
在剂量依赖性研究中测试列于以下表95中的寡核苷酸对表达人TTR基因的转基因小鼠中的人甲状腺素运载蛋白(TTR)的反义抑制。
处理
每周一次用列于表96中的寡核苷酸和剂量或用PBS各自皮下注射TTR转基因小鼠，持续三周，总共三次剂量。每个处理组由4只动物组成。在第一次剂量之前，进行尾部放血以测定基线(BL)处的血浆TTR蛋白水平。在最后施用之后72小时将小鼠处死。使用临床分析器(AU480,Beckman Coulter,CA)测量TTR蛋白水平。根据标准方案使用实时PCR和RNA定量试剂(Molecular Probes,Inc.Eugene,OR)来测定肝脏人TTRmRNA水平。呈现于表96中的结果为每个处理组的平均值。mRNA水平为相对于PBS组的平均值的平均值。血浆蛋白水平为相对于基线处的PBS组的平均值的平均值。“BL”指示基线，即刚好在第一次剂量之前取得的测量结果。如表96中所说明，用反义寡核苷酸处理以剂量依赖性方式降低TTR表达水平。包含GalNAc缀合物的寡核苷酸比缺乏GalNAc缀合物的母体(ISIS420915)更有效，并且包含磷酸二酯或脱氧腺苷可裂解部分的寡核苷酸与缺乏缀合物的母体相比显示出效力的显著改进(参见ISIS号682883和666943相对于420915并且参见实施例86和87)。
表95
靶向人TTR的寡核苷酸
表95的图例可见于实施例74。GalNAc3-3a的结构在实施例39中示出。GalNAc3-7a的结构在实施例48中示出。GalNAc3-10a的结构在实施例46中示出。GalNAc3-13a的结构在实施例62中示出。
表96
人TTR的体内反义抑制
实施例91：通过包含GalNAc3缀合物的靶向因子VII的寡核苷酸在非人灵长类动物中进行的体内反义抑制
在非终止的剂量递增研究(non-terminal,dose escalation study)中测试列于以下表97中的寡核苷酸对猴子中的因子VII的反义抑制。
处理
用递增剂量的列于表97中的寡核苷酸或用PBS在第0天、第15天和第29天时各自皮下注射非首次用于实验的猴子。每个处理组由4只雄性和1只雌性组成。在第一次剂量之前并且在此后的各个时间点进行抽血以测定血浆因子VII蛋白水平。通过ELISA测量因子VII蛋白水平。呈现于表98中的结果为相对于基线(BL)处的PBS组的平均值(刚好在第一次剂量之前取得的测量结果)的每个处理组的平均值。如表98中所说明，用反义寡核苷酸处理以剂量依赖性方式降低因子VII表达水平，并且包含GalNAc缀合物的寡核苷酸与缺乏GalNAc缀合物的寡核苷酸相比在猴子中显著更有效。
表97
靶向因子VII的寡核苷酸
表97的图例可见于实施例74。GalNAc3-10a的结构在实施例46中示出。
表98
因子VII血浆蛋白水平
实施例92：通过包含GalNAc3缀合物的靶向Apo-CIII的反义寡核苷酸在原代肝细胞中进行的反义抑制
以15,000个细胞/孔将小鼠原代肝细胞接种于96孔平板中，并且以0.46nM、1.37nM、4.12nM或12.35nM、37.04nM、111.11nM或333.33nM或1.00μM添加靶向小鼠ApoC-III的列于表99中的寡核苷酸。在用寡核苷酸孵育24小时之后，使细胞裂解并且使用RNeasy(Qiagen)纯化总RNA。使用实时PCR和RNA定量试剂(Molecular Probes,Inc.)根据标准方案测定ApoC-III mRNA水平。使用Prism 4软件(GraphPad)确定IC50值。结果显示无论可裂解部分是否为磷酸二酯或磷酸二酯连接的脱氧腺苷，包含GalNAc缀合物的寡核苷酸均比缺乏缀合物的母体寡核苷酸显著更有效。
表99
小鼠原代肝细胞中小鼠APOC-III表达的抑制
GalNAc3-1a的结构先前在实施例9中示出，GalNAc3-3a在实施例39中示出，GalNAc3-7a在实施例48中示出，GalNAc3-10a在实施例46中示出，GalNAc3-13a在实施例62中示出，并且GalNAc3-19a在实施例70中示出。
实施例93：通过包含混合翼和5’-GalNAc3缀合物的靶向SRB-1的寡核苷酸进行的体内反义抑制
在剂量依赖性研究中测试列于表100中的寡核苷酸对小鼠中的SRB-1的反义抑制。
表100
靶向SRB-1的修饰ASO
GalNAc3-3a的结构先前在实施例39中示出，并且GalNAc3-7a的结构先前在实施例48中示出。下标：“e”指示2’-MOE修饰核苷；“d”指示β-D-2’-脱氧核糖核苷；“k”指示6’-(S)-CH3双环核苷(cEt)；“s”指示硫代磷酸酯核苷间键联(PS)；“o”指示磷酸二酯核苷间键联(PO)。上标“m”指示5-甲基胞嘧啶。
处理
在以下示出的剂量下用列于表100中的寡核苷酸或用盐水皮下注射六至八周龄C57BL/6小鼠(Jackson Laboratory,Bar Harbor,ME)一次。每个处理组由4只动物组成。在最后施用之后72小时将小鼠处死。使用实时PCR测量肝脏SRB-1 mRNA水平。根据标准方案将SRB-1 mRNA水平归一化为亲环蛋白mRNA水平。结果以相对于盐水对照组的每个处理组的SRB-1 mRNA水平的平均百分比呈现。如表101中所说明，用反义寡核苷酸处理以剂量依赖性方式降低SRB-1mRNA水平，并且包含GalNAc缀合物并具有为全部cEt或混合糖修饰的翼的缺口聚物寡核苷酸比缺乏缀合物并包含全部cEt修饰的翼的母体寡核苷酸显著更有效。
还测量了体重、肝脏转氨酶、总胆红素和BUN，并且每个处理组的平均值在表101中示出。体重以相对于刚好在寡核苷酸剂量之前测量的基线体重的体重平均百分比(％BL)示出。
表101
SRB-1 mRNA、ALT、AST、BUN和总胆红素水平以及体重
实施例94：通过包含2’-糖修饰和5’-GalNAc3缀合物的靶向SRB-1的寡核苷酸进行的体内反义抑制
在剂量依赖性研究中测试列于表102中的寡核苷酸对小鼠中的SRB-1的反义抑制。
表102
靶向SRB-1的修饰ASO
下标“m”指示2’-O-甲基修饰的核苷。对于完整的表格图例参见实施例74。GalNAc3-3a的结构先前在实施例39中示出，并且GalNAc3-7a的结构先前在实施例48中示出。
处理
使用实施例93中描述的方案完成研究。结果在以下表103中示出并且显示包含GalNAc缀合物的2’-MOE和2’-OMe修饰的寡核苷酸比缺乏缀合物的相应母体寡核苷酸显著更有效。体重、肝脏转氨酶、总胆红素和BUN测量的结果表明化合物均为耐受良好的。
表103
SRB-1 mRNA
实施例95：通过包含双环核苷和5’-GalNAc3缀合物的靶向SRB-1的寡核苷酸进行的体内反义抑制
在剂量依赖性研究中测试列于表104中的寡核苷酸对小鼠中的SRB-1的反义抑制。
表104
靶向SRB-1的修饰ASO
下标“g”指示氟-HNA核苷，下标“l”指示包含2’-O-CH2-4’桥联的锁核苷。对于其他缩写参见实施例74表格图例。GalNAc3-1a的结构先前在实施例9中示出，GalNAc3-3a的结构先前在实施例39中示出，并且GalNAc3-7a的结构先前在实施例48中示出。
处理
使用实施例93中描述的方案完成研究。结果在以下表105中示出并且显示包含GalNAc缀合物和各种双环核苷修饰的寡核苷酸比缺乏缀合物并包含双环核苷修饰的母体寡核苷酸显著更有效。此外，包含GalNAc缀合物和氟-HNA修饰的寡核苷酸比缺乏缀合物并包含氟-HNA修饰的母体显著更有效。体重、肝脏转氨酶、总胆红素和BUN测量的结果表明化合物均为耐受良好的。
表105
SRB-1 mRNA、ALT、AST、BUN和总胆红素水平以及体重
实施例96：包含GalNAc3缀合物基团的反义寡核苷酸的血浆蛋白结合
在超滤测定中测试靶向ApoC-III的列于表70中的寡核苷酸和靶向Apo(a)的列于表106中的寡核苷酸以便评估血浆蛋白结合。
表106
靶向Apo(a)的修饰寡核苷酸
对于表格图例参见实施例74。GalNAc3-7a的结构先前在实施例48中示出。
将Ultrafree-MC超滤单元(30,000NMWL，低结合再生的纤维素膜，Millipore,Bedford,MA)用300μL的0.5％Tween 80预调节并且在2000g下离心10分钟，然后用300μL的对照寡核苷酸在H2O中的300μg/mL溶液预调节并且在2000g下离心16分钟。为了评估待用于研究中的来自表70和106的每个测试寡核苷酸对过滤器的非特异性结合，将300μL的pH 7.4的寡核苷酸在H2O中的250ng/mL溶液放置于预调节的过滤器中并且在2000g下离心16分钟。通过ELISA测定分析未过滤和过滤的样品以测定寡核苷酸浓度。对于每个样品，使用三次重复以获得平均浓度。相对于未过滤样品的过滤样品的平均浓度用来确定在不存在血浆的情况下通过过滤器回收的寡核苷酸的百分比(％回收)。
收集于K3-EDTA中的来自正常的无药物人志愿者、食蟹猴和CD-1小鼠的冷冻全血浆样品购自Bioreclamation LLC(Westbury,NY)。在两种浓度(5μg/mL和150μg/mL)下将测试寡核苷酸添加至1.2mL血浆等分试样中。将每个掺加的血浆样品的等分试样(300μL)放置于预调节的过滤器单元中并且在37℃下孵育30分钟，接着立即在2000g下离心16分钟。通过ELISA分析过滤和未过滤的掺加的血浆样品的等分试样，以测定每个样品中的寡核苷酸浓度。每个浓度使用三次重复，以确定每个样品中结合和未结合的寡核苷酸的平均百分数。使用相对于未过滤样品的浓度的过滤样品的平均浓度来确定血浆中未结合至血浆蛋白的寡核苷酸的百分比(％未结合)。通过将每个寡核苷酸的％未结合除以％回收来校正非特异性结合的最终未结合寡核苷酸值。通过从100中扣除最终％未结合值来确定最终％结合寡核苷酸值。对于在每种血浆中测试的两种浓度的寡核苷酸(5μg/mL和150μg/mL)，结果在表107中示出。结果显示GalNAc缀合物基团对血浆蛋白结合不具有显著影响。此外，具有全部PS核苷间键联的寡核苷酸和具有混合PO/PS键联的寡核苷酸均结合血浆蛋白，并且具有全部PS键联的那些寡核苷酸比具有混合PO/PS键联的那些寡核苷酸结合血浆蛋白的程度略微更大。
表107
结合至血浆蛋白的修饰寡核苷酸的百分比
实施例97：包含GalNAc3缀合物基团的靶向TTR的修饰寡核苷酸
将包含GalNAc缀合物的示于表108中的寡核苷酸设计成靶向TTR。
表108
靶向TTR的修饰寡核苷酸
表108的图例可见于实施例74。GalNAc3-1的结构在实施例9中示出。GalNAc3-3a的结构在实施例39中示出。GalNAc3-7a的结构在实施例48中示出。GalNAc3-10a的结构在实施例46中示出。GalNAc3-13a的结构在实施例62中示出。GalNAc3-19a的结构在实施例70中示出。
实施例98：在hPMBC测定中评价包含GalNAc缀合物的寡核苷酸的促炎性作用
在如实施例23和24中所描述的hPMBC测定中测试列于表109中的寡核苷酸的促炎性作用。(对于寡核苷酸的描述参见表30、83、95和108)。ISIS 353512为用作阳性对照的高响应者，并且其他寡核苷酸描述于表83、95和108中。使用来自一位志愿者供体的血液获得示于表109中的结果。结果显示，与具有全部PS键联的相同寡核苷酸相比，包含混合PO/PS核苷间键联的寡核苷酸产生显著较低的促炎性反应。此外，GalNAc缀合物基团在此测定中不具有显著作用。
表109
ISIS No. Emax/EC50 GalNAc3聚簇 键联 CM
353512 3630 n/a PS n/a
420915 802 n/a PS n/a
682881 1311 GalNAc3-10 PS Ad
682888 0.26 GalNAc3-10 PO/PS Ad
684057 1.03 GalNAc3-19 PO/PS Ad
实施例99：包含GalNAc缀合物的寡核苷酸对去唾液酸糖蛋白受体的结合亲和力
在竞争性受体结合测定中测试列于表110中的寡核苷酸对去唾液酸糖蛋白受体的结合亲和力(对于寡核苷酸的描述，参见表76)。将竞争配体α1-酸糖蛋白(AGP)在50mM乙酸钠缓冲液(pH 5)中用1U神经氨酸酶-琼脂糖在37℃下孵育16小时，并且通过唾液酸测定或尺寸排阻色谱法(SEC)来证实>90％的去唾液酸化。根据Atsma等的工序使用一氯化碘来碘化AGP(参见J Lipid Res.1991Jan；32(1):173-81)。在此方法中，将去唾液酸化的α1-酸糖蛋白(de-AGP)添加至0.25M NaOH中的10mM氯化碘、Na125I和1M甘氨酸中。在室温下孵育10分钟之后，通过利用3KDMWCO自旋柱将混合物浓缩两次来从游离的125I中分离出125I-标记的de-AGP。在配备有Agilent SEC-3柱(7.8x300mm)和β-RAM计数器的HPLC系统上测试蛋白质的标记效率和纯度。如下进行利用125I-标记的de-AGP和含有ASO的各种GalNAc-聚簇的竞争实验。将人HepG2细胞(106个细胞/毫升)涂布在6孔平板上处于2ml适当的生长培养基中。使用了用10％胎牛血清(FBS)、2mM L-谷氨酰胺和10mM HEPES补充的MEM培养基。将细胞分别在5％和10％CO2下在37℃下孵育16-20小时。在实验之前用不具有FBS的培养基洗涤细胞。将细胞在37℃下用1ml含有适当生长培养基的竞争混合物孵育30min，所述培养基具有2％FBS、10-8M 125I-标记的de-AGP和浓度在10-11至10-5M范围内的含有GalNAc-聚簇的ASO。在10-2M GalNAc糖存在下测定非特异性结合。将细胞用不具有FBS的培养基洗涤两次，以去除未结合的125I-标记的de-AGP和竞争者GalNAc ASO。使用含有1％β-巯基乙醇的Qiagen的RLT缓冲液使细胞裂解。在简短的10min冻/融循环之后将裂解液转移至圆底测定管中并且在γ-计数器上测定。在将125I蛋白计数除以最低GalNAc-ASO浓度计数的值之前扣除非特异性结合。使用非线性回归算法根据单一位点竞争结合方程式拟合抑制曲线以计算结合亲和力(KD’s)。
从在五个不同日子进行的实验中获得表110中的结果。用上标“a”标志的寡核苷酸的结果为在两个不同日子进行的实验的平均值。结果显示，在5’-末端包含GalNAc缀合物基团的寡核苷酸以比在3’-末端包含GalNAc缀合物基团的寡核苷酸大1.5倍至16倍的亲和力结合人HepG2细胞上的去唾液酸糖蛋白受体。
表110
去唾液酸糖蛋白受体结合测定结果
实施例100：靶向Apo(a)的包含GalNAc缀合物基团的寡核苷酸的体内反义抑制
在单一剂量研究中测试列于以下表111a中的寡核苷酸在小鼠中的作用持续时间。
表111a
靶向APO(a)的修饰ASO
GalNAc3-7a的结构在实施例48中示出。
处理
每周一次用列于表111b中的寡核苷酸和剂量或用PBS各自皮下注射表达人Apo(a)的雌性转基因小鼠，总共6次剂量。每个处理组由3只动物组成。在给药前一天抽血以测定血浆中Apo(a)蛋白的基线水平并且在第一次剂量之后72小时、1周和2周时抽血。在第一次剂量之后3周、4周、5周和6周时将发生另外的抽血。使用ELISA测量血浆Apo(a)蛋白水平。表111b中的结果以归一化为基线水平(基线％)的每个处理组的血浆Apo(a)蛋白水平的平均百分比呈现，所述结果表明包含GalNAc缀合物基团的寡核苷酸在Apo(a)表达中表现出蛋白质减少。对于包含全部PS核苷间键联的寡核苷酸和包含混合PO和PS键联的寡核苷酸观察到这种有效作用。
表111b
Apo(a)血浆蛋白水平
实施例101：通过包含经由稳定部分连接的GalNAc聚簇的寡核苷酸进行的反义抑制
测试列于表112中的寡核苷酸对小鼠APOC-III表达的体内抑制。用列于表112中的寡核苷酸或用PBS各自皮下注射C57Bl/6小鼠一次。每个处理组由4只动物组成。用ISIS440670处理的每只小鼠接受2mg/kg、6mg/kg、20mg/kg或60mg/kg的剂量。用ISIS 680772或696847处理的每只小鼠接受0.6mg/kg、2mg/kg、6mg/kg或20mg/kg。ISIS 696847的GalNAc缀合物基团经由稳定部分连接，所述稳定部分为硫代磷酸酯键联而不是能够易于裂解的含磷酸二酯的键联。在剂量之后72小时将动物处死。使用实时PCR测量肝脏APOC-III mRNA水平。根据标准方案将APOC-III mRNA水平归一化为亲环蛋白mRNA水平。结果以相对于盐水对照组的每个处理组的APOC-III mRNA水平的平均百分比呈现于表112中。结果显示包含GalNAc缀合物基团的寡核苷酸比缺乏缀合物基团的寡核苷酸显著更有效。此外，包含经由可裂解部分连接至寡核苷酸的GalNAc缀合物基团的寡核苷酸(ISIS 680772)甚至比包含经由稳定部分连接至寡核苷酸的GalNAc缀合物基团的寡核苷酸(ISIS 696847)更有效。
表112
靶向小鼠APOC-III的修饰寡核苷酸
GalNAc3-7a的结构在实施例48中示出。
实施例102：包含GalNAc缀合物的反义寡核苷酸在肝脏中的分布
评价了不包含GalNAc缀合物的ISIS 353382(参见表36)和包含GalNAc缀合物的ISIS 655861(参见表36)的肝脏分布。以列于表113中的剂量用ISIS 353382或655861皮下注射雄性balb/c小鼠一次。每个处理组由3只动物组成，除了ISIS 655861的18mg/kg组，所述组由2只动物组成。在剂量之后48小时将动物处死以确定寡核苷酸的肝脏分布。为了测量每个细胞的反义寡核苷酸分子的数量，将钌(II)三-联吡啶标签(MSD TAG，Meso ScaleDiscovery)缀合至用来检测反义寡核苷酸的寡核苷酸探针。呈现于表113中的结果为以百万个寡核苷酸分子/细胞单位计的每个处理组的寡核苷酸的平均浓度。结果显示，在等效剂量下，包含GalNAc缀合物的寡核苷酸比不包含GalNAc缀合物的寡核苷酸以更高的浓度存在于总肝脏和肝细胞中。此外，包含GalNAc缀合物的寡核苷酸比不包含GalNAc缀合物的寡核苷酸以更低的浓度存在于非实质肝脏细胞中。虽然ISIS 655861在肝细胞和非实质肝脏细胞中的浓度为每个细胞类似的，但是肝脏大约为80体积％肝细胞。因此，存在于肝脏中的大多数ISIS 655861寡核苷酸见于肝细胞中，而存在于肝脏中的大多数ISIS 353382寡核苷酸见于非实质肝脏细胞中。
表113
实施例103：包含GalNAc3缀合物的靶向APOC-III的寡核苷酸的体内作用持续时间
在单一剂量研究中测试列于以下表114中的寡核苷酸在小鼠中的作用持续时间。
表114
靶向APOC-III的修饰ASO
GalNAc3-3a的结构在实施例39中示出，并且GalNAc3-19a的结构在实施例70中示出。
处理
用列于表114中的寡核苷酸或用PBS各自皮下注射表达人APOC-III的雌性转基因小鼠一次。每个处理组由3只动物组成。在给药之前抽血以确定基线并且在剂量之后3天、7天、14天、21天、28天、35天和42天时抽血。如实施例20中所描述来测量血浆甘油三酯和APOC-III蛋白水平。表115中的结果以归一化为基线水平的每个处理组的血浆甘油三酯和APOC-III水平的平均百分比呈现。实施例79的表71中的结果与以下表115中的结果的比较显示，包含磷酸二酯和硫代磷酸酯核苷间键联的混合物的寡核苷酸表现出比仅包含硫代磷酸酯核苷间键联的相当(equivalent)寡核苷酸增加的作用持续时间。
表115
转基因小鼠中的血浆甘油三酯和APOC-III蛋白水平
实施例104：包含5’-GalNAc2缀合物的寡核苷酸的合成
化合物120为商业上可获得的，并且化合物126的合成描述于实施例49中。将化合物120(1g，2.89mmol)、HBTU(0.39g，2.89mmol)以及HOBt(1.64g，4.33mmol)溶解于DMF(10mL中，并且添加N,N-二异丙基乙胺(1.75mL，10.1mmol)。在约5min之后，将氨基己酸苄基酯(1.36g，3.46mmol)添加至反应物中。在3h之后，将反应混合物倾入100mL的1M NaHSO4中并且用2x 50mL乙酸乙酯萃取。合并有机层并且用3x 40mL饱和NaHCO3和2x盐水洗涤，用Na2SO4干燥，过滤并且浓缩。通过硅胶柱色谱法(DCM:EA:Hex，1:1:1)纯化产物，得到化合物231。LCMS和NMR与结构一致。将化合物231(1.34g，2.438mmol)溶解于二氯甲烷(10mL)中并且添加三氟乙酸(10mL)。在室温下搅拌2h之后，将反应混合物在减压下浓缩并且与甲苯共蒸发(3x 10mL)。在减压下干燥残余物，得到呈三氟乙酸盐的化合物232。化合物166的合成描述于实施例54中。将化合物166(3.39g，5.40mmol)溶解于DMF(3mL)中。将化合物232(1.3g，2.25mmol)的溶液溶解于DMF(3mL)中并且添加N,N-二异丙基乙胺(1.55mL)。将反应物在室温下搅拌30分钟，然后倾入水(80mL)并且用EtOAc(2x100mL)萃取水层。将有机相分离并且用饱和NaHCO3水溶液(3x80mL)、1M NaHSO4(3x 80mL)和盐水(2x 80mL)洗涤，然后干燥(Na2SO4)、过滤并且浓缩。通过硅胶柱色谱法纯化残余物，得到化合物233。LCMS和NMR与结构一致。将化合物233(0.59g，0.48mmol)溶解于甲醇(2.2mL)和乙酸乙酯(2.2mL)中。添加钯/碳(10重量％Pd/C，湿，0.07g)并且将反应混合物在氢气气氛下搅拌3h。将反应混合物通过硅藻土垫过滤，并且浓缩以得到羧酸。将羧酸(1.32g，1.15mmol，不含聚簇的酸)溶解于DMF(3.2mL)中。向其中添加N,N-二异丙基乙胺(0.3mL，1.73mmol)和PFPTFA(0.30mL，1.73mmol)。在室温下搅拌30min之后，将反应混合物倾入水(40mL)中并且用EtOAc(2x50mL)萃取。如上所述完成标准的后处理，得到化合物234。LCMS和NMR与结构一致。使用实施例46中描述的一般工序制备寡核苷酸235。缀合物基团GalNAc2-24的GalNAc2聚簇部分(GalNAc2-24a)可与寡核苷酸上存在的任何可裂解部分组合以提供各种缀合物基团。GalNAc2-24(GalNAc2-24a-CM)的结构在以下示出：
实施例105：包含GalNAc1-25缀合物的寡核苷酸的合成
化合物166的合成描述于实施例54中。使用实施例46中描述的一般工序制备寡核苷酸236。
或者，使用以下示出的方案合成寡核苷酸236，并且使用实施例10中描述的工序使用化合物238来形成寡核苷酸236。
缀合物基团GalNAc1-25的GalNAc1聚簇部分(GalNAc1-25a)可与寡核苷酸上存在的任何可裂解部分组合以提供各种缀合物基团。GalNAc1-25(GalNAc1-25a-CM)的结构在以下示出：
实施例106：通过包含5’-GalNAc2或5’-GalNAc3缀合物的靶向SRB-1的寡核苷酸进行的体内反义抑制
在剂量依赖性研究中测试列于表116和117中的寡核苷酸对小鼠中的SRB-1的反义抑制。
处理
用2mg/kg、7mg/kg或20mg/kg的ISIS No.440762，或用0.2mg/kg、0.6mg/kg、2mg/kg、6mg/kg或20mg/kg的ISIS No.686221、686222或708561，或用盐水皮下注射六周龄雄性C57BL/6小鼠(Jackson Laboratory,Bar Harbor,ME)一次。每个处理组由4只动物组成。在最后施用之后72小时将小鼠处死。使用实时PCR测量肝脏SRB-1 mRNA水平。根据标准方案将SRB-1 mRNA水平归一化为亲环蛋白mRNA水平。反义寡核苷酸以剂量依赖性方式降低SRB-1mRNA水平，并且ED50结果呈现于表116和117中。尽管先前的研究示出三价的GalNAc缀合的寡核苷酸比二价的GalNAc缀合的寡核苷酸显著更有效，所述二价的GalNAc缀合的寡核苷酸继而比一价的GalNAc缀合的寡核苷酸显著更有效(参见例如Khorev等,Bioorg.&Med.Chem.,第16卷,5216-5231(2008))，用包含一价、二价以及三价的GalNAc聚簇的反义寡核苷酸处理以如表116和117中所示的相似效力降低SRB-1 mRNA水平。
表116
靶向SRB-1的修饰寡核苷酸
对于表格图例，参见实施例93。GalNAc3-13a的结构在实施例62中示出，并且GalNAc2-24a的结构在实施例104中示出。
表117
靶向SRB-1的修饰寡核苷酸
对于表格图例，参见实施例93。GalNAc1-25a的结构在实施例105中示出。
使用实施例75中描述的工序，还评价了表116和117中的寡核苷酸在肝脏中的浓度。如通过UV以μg寡核苷酸/克肝脏组织的单位所测量，示于以下表117a和117b中的结果为每个处理组的平均总反义寡核苷酸组织水平。结果显示，包含GalNAc缀合物基团的寡核苷酸以显著高于相同剂量的缺乏GalNAc缀合物基团的寡核苷酸的水平在肝脏中积累。此外，在其相应缀合物基团中包含一个、两个或三个GalNAc配体的反义寡核苷酸均以类似水平在肝脏中积累。由以上引用的Khorev等参考文献来看此结果为令人惊奇的并且与示于以上表116和117中的活性数据一致。
表117a
包含GalNAc2或GalNAc3缀合物基团的寡核苷酸的肝脏浓度
表117b
包含GalNAc1缀合物基团的寡核苷酸的肝脏浓度
实施例107：包含GalNAc1-26或GalNAc1-27缀合物的寡核苷酸的合成
通过使用DMF中的HBTU和DIEA将化合物47(参见实施例15)偶联至酸64(参见实施例32)来合成寡核苷酸239。将所得到的含酰胺化合物亚磷酸酯化，然后使用实施例10中描述的工序添加至寡核苷酸的5’-末端。缀合物基团GalNAc1-26的GalNAc1聚簇部分(GalNAc1-26a)可与寡核苷酸上存在的任何可裂解部分组合以提供各种缀合物基团。GalNAc1-26(GalNAc1-26a-CM)的结构在以下示出：
为了将GalNAc1缀合物基团添加至寡核苷酸的3’-末端，使用实施例7中描述的工序将由化合物47和64反应所形成的酰胺添加至固体载体上。然后使用实施例9中描述的工序完成寡核苷酸合成以便形成寡核苷酸240。
缀合物基团GalNAc1-27的GalNAc1聚簇部分(GalNAc1-27a)可与寡核苷酸上存在的任何可裂解部分组合以提供各种缀合物基团。GalNAc1-27(GalNAc1-27a-CM)的结构在以下示出：
实施例108：靶向Apo(a)的包含GalNAc缀合物基团的寡核苷酸的体内反义抑制
在单一剂量研究中在小鼠中测试列于以下表118中的寡核苷酸。
表118
靶向APO(a)的修饰ASO
GalNAc3-7a的结构在实施例48中示出。
处理
用列于表119中的寡核苷酸和剂量或用PBS各自皮下注射表达人Apo(a)的雄性转基因小鼠一次。每个处理组由4只动物组成。在给药前一天抽血以确定血浆中Apo(a)蛋白的基线水平并且在第一次剂量之后1周时抽血。另外的抽血将每周发生，持续大约8周。使用ELISA测量血浆Apo(a)蛋白水平。表119中的结果以归一化为基线水平(基线％)的每个处理组的血浆Apo(a)蛋白水平的平均百分比呈现，所述结果表明反义寡核苷酸减少了Apo(a)蛋白表达。此外，包含GalNAc缀合物基团的寡核苷酸表现出甚至比不包含缀合物基团的寡核苷酸更有效的Apo(a)表达减少。
表119
Apo(a)血浆蛋白水平
实施例109：包含GalNAc1-28或GalNAc1-29缀合物的寡核苷酸的合成
使用类似于实施例71中描述的那些的工序形成亚磷酰胺中间体，接着使用实施例10中描述的工序合成寡核苷酸来合成寡核苷酸241。缀合物基团GalNAc1-28的GalNAc1聚簇部分(GalNAc1-28a)可与寡核苷酸上存在的任何可裂解部分组合以提供各种缀合物基团。GalNAc1-28(GalNAc1-28a-CM)的结构在以下示出：
为了将GalNAc1缀合物基团添加至寡核苷酸的3’-末端，使用类似于实施例71中描述的那些的工序形成羟基中间体，然后使用实施例7中描述的工序将所述羟基中间体添加至固体载体。然后使用实施例9中描述的工序完成寡核苷酸合成以便形成寡核苷酸242。
缀合物基团GalNAc1-29的GalNAc1聚簇部分(GalNAc1-29a)可与寡核苷酸上存在的任何可裂解部分组合以提供各种缀合物基团。GalNAc1-29(GalNAc1-29a-CM)的结构在以下示出：
实施例110：包含GalNAc1-30缀合物的寡核苷酸的合成
如上所示，合成包含GalNAc1-30缀合物基团的寡核苷酸246，其中Y选自O、S、取代或未取代的C1-C10烷基、氨基、取代的氨基、叠氮基、烯基或炔基。缀合物基团GalNAc1-30的GalNAc1聚簇部分(GalNAc1-30a)可与任何可裂解部分组合以提供各种缀合物基团。在某些实施方案中，Y为可裂解部分的一部分。在某些实施方案中，Y为稳定部分的一部分，并且可裂解部分存在于寡核苷酸上。GalNAc1-30a的结构如下所示：
实施例111：包含GalNAc2-31或GalNAc2-32缀合物的寡核苷酸的合成
如上所示，合成包含GalNAc2-31缀合物基团的寡核苷酸250，其中Y选自O、S、取代或未取代的C1-C10烷基、氨基、取代的氨基、叠氮基、烯基或炔基。缀合物基团GalNAc2-31的GalNAc2聚簇部分(GalNAc2-31a)可与任何可裂解部分组合以提供各种缀合物基团。在某些实施方案中，直接与寡核苷酸的5’-末端相邻的含Y基团为可裂解部分的一部分。在某些实施方案中，直接与寡核苷酸的5’-末端相邻的含Y基团为稳定部分的一部分，并且可裂解部分存在于寡核苷酸上。GalNAc2-31a的结构如下所示：
以下示出包含GalNAc2-32缀合物的寡核苷酸的合成。
如上所示，合成包含GalNAc2-32缀合物基团的寡核苷酸252，其中Y选自O、S、取代或未取代的C1-C10烷基、氨基、取代的氨基、叠氮基、烯基或炔基。缀合物基团GalNAc2-32的GalNAc2聚簇部分(GalNAc2-32a)可与任何可裂解部分组合以提供各种缀合物基团。在某些实施方案中，直接与寡核苷酸的5’-末端相邻的含Y基团为可裂解部分的一部分。在某些实施方案中，直接与寡核苷酸的5’-末端相邻的含Y基团为稳定部分的一部分，并且可裂解部分存在于寡核苷酸上。GalNAc2-32a的结构如下所示：
实施例112：包含GalNAc1缀合物的修饰寡核苷酸
用GalNAc1缀合物基团合成靶向SRB-1的表120中的寡核苷酸，以便进一步测试包含含有一个GalNAc配体的缀合物基团的寡核苷酸的效力。
表120
实施例113：通过靶向CFB的寡核苷酸进行的体内反义抑制
在剂量依赖性研究中测试列于表121中的寡核苷酸对小鼠中的人类补体因子B(CFB)的反义抑制。
表121
靶向CFB的修饰ASO
GalNAc3-3a的结构先前在实施例39中示出。
处理
每周一次用列于表122中的寡核苷酸或用盐水皮下注射表达人类CFB的转基因小鼠(Jackson Laboratory,Bar Harbor,ME)3周(总共4次剂量)。将接收ISIS No.588540的四个处理组以6、12、25或50mg/kg/剂量给予。将接收ISIS No.687301的四个处理组以0.25、0.5、2或6mg/kg/剂量给予。每个处理组由4只动物组成。在最后施用之后2天将小鼠处死，以根据标准方案使用实时PCR测定肝脏和肾脏人类CFB和亲环蛋白mRNA水平。将CFB mRNA水平归一化为亲环蛋白水平，并且使用每个处理组的平均值确定实现50％抑制人类CFB转录表达的剂量(ED50)。所述结果为用两个不同引物探针集完成的四个实验的平均值并且在表122中示出。
表122
靶向人CFB的寡核苷酸的体内效力
使用标准方案，相对于盐水注射的小鼠测量血清中的肝脏转氨酶水平，即丙氨酸氨基转移酶(ALT)和天冬氨酸氨基转移酶(AST)。还评价了总胆红素、BUN以及体重。所述结果示出处理组的任一个相对于盐水处理组没有显著变化(数据未示出)，表明两种寡核苷酸均为耐受良好的。
实施例114：通过靶向CFB的寡核苷酸进行的体内反义抑制
在剂量依赖性研究中测试列于表123中的寡核苷酸对小鼠中的人类CFB的反义抑制。
处理
用0.6、1、6或18mg/kg列于表123中的寡核苷酸或用盐水皮下注射表达人类CFB的转基因小鼠(Jackson Laboratory,Bar Harbor,ME)一次。每个处理组由4或5只动物组成。在给药之后72小时将小鼠处死，以根据标准方案使用实时PCR测定肝脏人类CFB和亲环蛋白mRNA水平。将CFB mRNA水平归一化为亲环蛋白水平，并且使用每个处理组的平均值确定实现50％抑制人类CFB转录表达的剂量(ED50)。结果在表123中示出。
表123
靶向CFB的修饰ASO
GalNAc3-7a的结构先前在实施例48中示出。
实施例115：由MOE缺口聚物对HepG2细胞中的人类补体因子B(CFB)的反义抑制
设计靶向人类补体因子B(CFB)核酸的反义寡核苷酸并且测试其在体外对CFBmRNA的作用。在具有类似培养条件的一系列实验中测试反义寡核苷酸。每个实验的结果呈现在以下所示的单独表格中。使用电穿孔以4,500nM反义寡核苷酸转染密度为每孔20,000个细胞的培养的HepG2细胞。在约24小时的处理期后，自细胞分离RNA且通过定量实时PCR测量CFB mRNA水平。使用人类引物探针集RTS3459(正向序列AGTCTCTGTGGCATGGTTTGG，在本文中命名为SEQ ID NO:810；反向序列GGGCGAATGACTGAGATCTTG，在本文中命名为SEQ ID NO:811；探针序列TACCGATTACCACAAGCAACCATGGCA，在本文中命名为SEQ ID NO:812)测量mRNA水平。根据如由所测量的总RNA含量调整CFB mRNA水平。结果呈现为相对于未处理的对照细胞的CFB的抑制百分比。
以下表中新设计的嵌合反义寡核苷酸被设计为5-10-5MOE缺口聚物。5-10-5MOE缺口聚物的长度为20个核苷，其中，中心缺口区段包含十个2’-脱氧核苷并且在5’方向和3’方向上各自侧接包含五个核苷的翼区段。5’翼区段中的每个核苷和3’翼区段中的每个核苷具有2’-MOE修饰。每个缺口聚物整个的核苷间键联为硫代磷酸酯(P＝S)键联。每个缺口聚物整个的所有胞嘧啶残基为5-甲基胞嘧啶。“起始位点”表示人基因序列中缺口聚物所靶向的最5’核苷酸。“终止位点”表示人基因序列中缺口聚物所靶向的最3’核苷酸。将列于以下表中的每个缺口聚物靶向在本文中指定为SEQ ID NO:1的人CFB mRNA(GENBANK登录号NM_001710.5)或在本文中指定为SEQ ID NO:2的人CFB基因组序列(GENBANK登录号NT_007592.15，从31852000至31861000截短的核苷酸)或二者。‘n/a’表示反义寡核苷酸不以100％互补性靶向那个特定基因序列。
表124
由靶向SEQ ID NO:1和2的5-10-5MOE缺口聚物对CFB mRNA的抑制
表125
由靶向SEQ ID NO:1和2的5-10-5MOE缺口聚物对CFB mRNA的抑制
表126
由靶向SEQ ID NO:1和2的5-10-5MOE缺口聚物对CFB mRNA的抑制
表127
由靶向SEQ ID NO:1和2的5-10-5MOE缺口聚物对CFB mRNA的抑制
表128
由靶向SEQ ID NO:1和2的5-10-5MOE缺口聚物对CFB mRNA的抑制
实施例116：由MOE缺口聚物对HepG2细胞中的人类补体因子B(CFB)的反义抑制
设计靶向人类补体因子B(CFB)核酸的额外的反义寡核苷酸并且测试其在体外对CFB mRNA的作用。使用电穿孔以4,500nM反义寡核苷酸转染密度为每孔20,000个细胞的培养的HepG2细胞。在约24小时的处理期后，自细胞分离RNA且通过定量实时PCR测量CFB mRNA水平。使用人类引物探针集RTS3460_MGB(正向序列CGAAGCAGCTCAATGAAATCAA，在本文中指定为SEQ ID NO:813；反向序列TGCCTGGAGGGCCTTCTT，在本文中指定为SEQ ID NO:814；探针序列AGACCACAAGTTGAAGTC，在本文中指定为SEQ ID NO:815)测量mRNA水平。根据如由所测量的总RNA含量调整CFB mRNA水平。结果呈现为相对于未处理的对照细胞的CFB的抑制百分比。
以下表中新设计的嵌合反义寡核苷酸被设计为5-10-5MOE缺口聚物。5-10-5MOE缺口聚物的长度为20个核苷，其中，中心缺口区段包含十个2’-脱氧核苷并且在5’方向和3’方向上各自侧接包含五个核苷的翼区段。5’翼区段中的每个核苷和3’翼区段中的每个核苷具有2’-MOE修饰。每个缺口聚物整个的核苷间键联为硫代磷酸酯(P＝S)键联。每个缺口聚物整个的所有胞嘧啶残基为5-甲基胞嘧啶。“起始位点”表示人基因序列中缺口聚物所靶向的最5’核苷酸。“终止位点”表示人基因序列中缺口聚物所靶向的最3’核苷酸。将列于以下表中的每个缺口聚物靶向在本文中指定为SEQ ID NO:1的人CFB mRNA(GENBANK登录号NM_001710.5)或在本文中指定为SEQ ID NO:2的人CFB基因组序列(GENBANK登录号NT_007592.15，从31852000至31861000截短的核苷酸)或二者。‘n/a’表示反义寡核苷酸不以100％互补性靶向那个特定基因序列。
表129
由靶向SEQ ID NO:1和2的5-10-5MOE缺口聚物对CFB mRNA的抑制
实施例117：由MOE缺口聚物对HepG2细胞中的人类补体因子B(CFB)的反义抑制
设计靶向人类补体因子B(CFB)核酸的额外的反义寡核苷酸并且测试其在体外对CFB mRNA的作用。在具有类似培养条件的一系列实验中测试反义寡核苷酸。每个实验的结果呈现在以下所示的单独表格中。使用电穿孔以5,000nM反义寡核苷酸转染密度为每孔20,000个细胞的培养的HepG2细胞。在约24小时的处理期后，自细胞分离RNA且通过定量实时PCR测量CFB mRNA水平。使用人引物探针集RTS3459测量mRNA水平。根据如由所测量的总RNA含量调整CFB mRNA水平。结果呈现为相对于未处理的对照细胞的CFB的抑制百分比。
以下表中新设计的嵌合反义寡核苷酸被设计为5-10-5MOE缺口聚物。缺口聚物的长度为20个核苷，其中，中心缺口区段包含十个2’-脱氧核苷并且在5’方向和3’方向上各自侧接包含五个核苷的翼区段。5’翼区段中的每个核苷和3’翼区段中的每个核苷具有2’-MOE修饰。每个缺口聚物整个的核苷间键联为硫代磷酸酯(P＝S)键联。每个缺口聚物整个的所有胞嘧啶残基为5-甲基胞嘧啶。“起始位点”表示人基因序列中缺口聚物所靶向的最5’核苷酸。“终止位点”表示人基因序列中缺口聚物所靶向的最3’核苷酸。将列于以下表中的每个缺口聚物靶向在本文中指定为SEQ ID NO:1的人CFB mRNA(GENBANK登录号NM_001710.5)或在本文中指定为SEQ ID NO:2的人CFB基因组序列(GENBANK登录号NT_007592.15，从31852000至31861000截短的核苷酸)或二者。‘n/a’表示反义寡核苷酸不以100％互补性靶向那个特定基因序列。特定的表中未示出靶基因的序列比对情况，应理解所述表中呈现的寡核苷酸没有一个以100％互补性比对靶基因。
表130
由靶向SEQ ID NO:1的5-10-5MOE缺口聚物对CFB mRNA的抑制
表131
由靶向SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的5-10-5MOE缺口聚物对CFB mRNA的抑制
实施例118：由MOE缺口聚物对HepG2细胞中的人类补体因子B(CFB)的反义抑制
设计靶向人类补体因子B(CFB)核酸的反义寡核苷酸并且测试其在体外对CFBmRNA的作用。在具有类似培养条件的一系列实验中测试反义寡核苷酸。每个实验的结果呈现在以下所示的单独表格中。使用电穿孔以3,000nM反义寡核苷酸转染密度为每孔20,000个细胞的培养的HepG2细胞。在约24小时的处理期后，自细胞分离RNA且通过定量实时PCR测量CFB mRNA水平。使用人引物探针集RTS3459测量mRNA水平。根据如由所测量的总RNA含量调整CFB mRNA水平。结果呈现为相对于未处理的对照细胞的CFB的抑制百分比。
以下表中新设计的嵌合反义寡核苷酸被设计为4-8-5MOE、5-9-5MOE、5-10-5MOE、3-10-4MOE、3-10-7MOE、6-7-6-MOE、6-8-6MOE或5-7-5MOE缺口聚物或为脱氧、MOE以及(S)-cEt寡核苷酸。
4-8-5MOE缺口聚物的长度为17个核苷，其中，中心缺口区段包含八个2’-脱氧核苷并且在5’方向和3’方向上分别侧接包含四和五个核苷的翼区段。5-9-5MOE缺口聚物的长度为19个核苷，其中，中心缺口区段包含九个2’-脱氧核苷并且在5’方向和3’方向上各自侧接包含五个核苷的翼区段。5-10-5MOE缺口聚物的长度为20个核苷，其中，中心缺口区段包含十个2’-脱氧核苷并且在5’方向和3’方向上各自侧接包含五个核苷的翼区段。5-7-5MOE缺口聚物的长度为17个核苷，其中，中心缺口区段包含七个2’-脱氧核苷并且在5’方向和3’方向上各自侧接包含五个核苷的翼区段。3-10-4MOE缺口聚物的长度为17个核苷，其中，中心缺口区段包含十个2’-脱氧核苷并且在5’方向和3’方向上分别侧接包含三和四个核苷的翼区段。3-10-7MOE缺口聚物的长度为20个核苷，其中，中心缺口区段包含十个2’-脱氧核苷并且在5’方向和3’方向上分别侧接包含三和七个核苷的翼区段。6-7-6MOE缺口聚物的长度为19个核苷，其中，中心缺口区段包含七个2’-脱氧核苷并且在5’方向和3’方向上各自侧接包含六个核苷的翼区段。6-8-6MOE缺口聚物的长度为20个核苷，其中，中心缺口区段包含八个2’-脱氧核苷并且在5’方向和3’方向上各自侧接包含六个核苷的翼区段。每个缺口聚物整个的核苷间键联为硫代磷酸酯(P＝S)键联。每个缺口聚物整个的所有胞嘧啶残基为5-甲基胞嘧啶。
脱氧、MOE及(S)-cEt寡核苷酸的长度为16个核苷，其中核苷具有MOE糖修饰、(S)-cEt糖修饰或脱氧修饰。‘化学’列描述各寡核苷酸的糖修饰。‘k’指示(S)-cEt糖修饰；‘d’指示脱氧核糖；并且‘e’指示MOE修饰。
“起始位点”表示人基因序列中缺口聚物所靶向的最5’核苷酸。“终止位点”表示人基因序列中缺口聚物所靶向的最3’核苷酸。将列于以下表中的每个缺口聚物靶向在本文中指定为SEQ ID NO:1的人CFB mRNA(GENBANK登录号NM_001710.5)或在本文中指定为SEQ IDNO:2的人CFB基因组序列(GENBANK登录号NT_007592.15，从31852000至31861000截短的核苷酸)或二者。‘n/a’表示反义寡核苷酸不以100％互补性靶向那个特定基因序列。
表132
由靶向SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的脱氧、MOE及(S)-cEt寡核苷酸对CFB mRNA的抑制
表133
由靶向SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的5-10-5MOE缺口聚物对CFB mRNA的抑制
表134
由靶向SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的MOE缺口聚物对CFB mRNA的抑制
表135
由靶向SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的MOE缺口聚物对CFB mRNA的抑制
表136
由靶向SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的MOE缺口聚物对CFB mRNA的抑制
表137
由靶向SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的MOE缺口聚物对CFB mRNA的抑制
实施例119：由MOE缺口聚物对HepG2细胞中的人类补体因子B(CFB)的反义抑制
设计靶向人类补体因子B(CFB)核酸的额外的反义寡核苷酸并且测试其在体外对CFB mRNA的作用。在具有类似培养条件的一系列实验中测试反义寡核苷酸。每个实验的结果呈现在以下所示的单独表格中。使用电穿孔以2,000nM反义寡核苷酸转染密度为每孔20,000个细胞的培养的HepG2细胞。在约24小时的处理期后，自细胞分离RNA且通过定量实时PCR测量CFB mRNA水平。使用人引物探针集RTS3459测量mRNA水平。根据如由所测量的总RNA含量调整CFB mRNA水平。结果呈现为相对于未处理的对照细胞的CFB的抑制百分比。
以下表中新设计的嵌合反义寡核苷酸被设计为4-8-5MOE、5-8-5MOE、5-9-5MOE、5-10-5MOE、6-7-6-MOE、3-10-5MOE或6-8-6MOE缺口聚物。
4-8-5MOE缺口聚物的长度为17个核苷，其中，中心缺口区段包含八个2’-脱氧核苷并且在5’方向和3’方向上分别侧接包含四和五个核苷的翼区段。5-8-5MOE缺口聚物的长度为18个核苷，其中，中心缺口区段包含八个2’-脱氧核苷并且在5’方向和3’方向上各自侧接包含五个核苷的翼区段。5-9-5MOE缺口聚物的长度为19个核苷，其中，中心缺口区段包含九个2’-脱氧核苷并且在5’方向和3’方向上各自侧接包含五个核苷的翼区段。5-10-5MOE缺口聚物的长度为20个核苷，其中，中心缺口区段包含十个2’-脱氧核苷并且在5’方向和3’方向上各自侧接包含五个核苷的翼区段。3-10-5MOE缺口聚物的长度为18个核苷，其中，中心缺口区段包含十个2’-脱氧核苷并且在5’方向和3’方向上分别侧接包含三和五个核苷的翼区段。6-7-6MOE缺口聚物的长度为19个核苷，其中，中心缺口区段包含七个2’-脱氧核苷并且在5’方向和3’方向上各自侧接包含六个核苷的翼区段。6-8-6MOE缺口聚物的长度为20个核苷，其中，中心缺口区段包含八个2’-脱氧核苷并且在5’方向和3’方向上各自侧接包含六个核苷的翼区段。5’翼区段中的每个核苷和3’翼区段中的每个核苷具有2’-MOE修饰。每个缺口聚物整个的核苷间键联为硫代磷酸酯(P＝S)键联。每个缺口聚物整个的所有胞嘧啶残基为5-甲基胞嘧啶。
“起始位点”表示人基因序列中缺口聚物所靶向的最5’核苷酸。“终止位点”表示人基因序列中缺口聚物所靶向的最3’核苷酸。将列于以下表中的每个缺口聚物靶向在本文中指定为SEQ ID NO:1的人CFB mRNA(GENBANK登录号NM_001710.5)或在本文中指定为SEQ IDNO:2的人CFB基因组序列(GENBANK登录号NT_007592.15，从31852000至31861000截短的核苷酸)或二者。‘n/a’表示反义寡核苷酸不以100％互补性靶向那个特定基因序列。
表138
由靶向SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的MOE缺口聚物对CFB mRNA的抑制
表139
由靶向SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的MOE缺口聚物对CFB mRNA的抑制
表140
由靶向SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的MOE缺口聚物对CFB mRNA的抑制
实施例120：由MOE缺口聚物对HepG2细胞中的人类补体因子B(CFB)的反义抑制
设计靶向人类补体因子B(CFB)核酸的额外的反义寡核苷酸并且测试其在体外对CFB mRNA的作用。使用电穿孔以1,000nM反义寡核苷酸转染密度为每孔20,000个细胞的培养的HepG2细胞。在约24小时的处理期后，自细胞分离RNA且通过定量实时PCR测量CFB mRNA水平。使用人引物探针集RTS3459测量mRNA水平。根据如由所测量的总RNA含量调整CFB mRNA水平。结果呈现为相对于未处理的对照细胞的CFB的抑制百分比。
下表中新设计的嵌合反义寡核苷酸被设计为脱氧、MOE以及(S)-cEt寡核苷酸。脱氧、MOE及(S)-cEt寡核苷酸的长度为16个核苷，其中核苷具有MOE糖修饰、(S)-cEt糖修饰或脱氧修饰。‘化学’列描述各寡核苷酸的糖修饰。‘k’指示(S)-cEt糖修饰；‘d’指示脱氧核糖；并且‘e’指示MOE修饰。
“起始位点”表示人基因序列中缺口聚物所靶向的最5’核苷酸。“终止位点”表示人基因序列中缺口聚物所靶向的最3’核苷酸。将列于以下表中的每个缺口聚物靶向在本文中指定为SEQ ID NO:1的人CFB mRNA(GENBANK登录号NM_001710.5)或在本文中指定为SEQ IDNO:2的人CFB基因组序列(GENBANK登录号NT_007592.15，从31852000至31861000截短的核苷酸)或二者。‘n/a’表示反义寡核苷酸不以100％互补性靶向那个特定基因序列。
表141
由靶向SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的脱氧、MOE及(S)-cEt寡核苷酸对CFB mRNA的抑制
实施例121：由MOE缺口聚物对HepG2细胞中的人类补体因子B(CFB)的反义抑制
设计靶向人类补体因子B(CFB)核酸的额外的反义寡核苷酸并且测试其在体外对CFB mRNA的作用。在具有类似培养条件的一系列实验中测试反义寡核苷酸。每个实验的结果呈现在以下所示的单独表格中。使用电穿孔以500nM反义寡核苷酸转染密度为每孔20,000个细胞的培养的HepG2细胞。在约24小时的处理期后，自细胞分离RNA且通过定量实时PCR测量CFB mRNA水平。使用人引物探针集RTS3459测量mRNA水平。根据如由所测量的总RNA含量调整CFB mRNA水平。结果呈现为相对于未处理的对照细胞的CFB的抑制百分比。
以下表中新设计的嵌合反义寡核苷酸被设计为脱氧、MOE以及(S)-cEt寡核苷酸或为5-8-5MOE、5-9-5MOE、5-10-5MOE、6-7-6-MOE、3-10-5MOE或6-8-6MOE缺口聚物。
脱氧、MOE及(S)-cEt寡核苷酸的长度为16个核苷，其中核苷具有MOE糖修饰、(S)-cEt糖修饰或脱氧修饰。‘化学’列描述各寡核苷酸的糖修饰。‘k’指示(S)-cEt糖修饰；‘d’指示脱氧核糖；并且‘e’指示MOE修饰。
5-8-5MOE缺口聚物的长度为18个核苷，其中，中心缺口区段包含八个2’-脱氧核苷并且在5’方向和3’方向上各自侧接包含五个核苷的翼区段。5-9-5MOE缺口聚物的长度为19个核苷，其中，中心缺口区段包含九个2’-脱氧核苷并且在5’方向和3’方向上各自侧接包含五个核苷的翼区段。5-10-5MOE缺口聚物的长度为20个核苷，其中，中心缺口区段包含十个2’-脱氧核苷并且在5’方向和3’方向上各自侧接包含五个核苷的翼区段。3-10-5MOE缺口聚物的长度为18个核苷，其中，中心缺口区段包含十个2’-脱氧核苷并且在5’方向和3’方向上分别侧接包含三和五个核苷的翼区段。6-7-6MOE缺口聚物的长度为19个核苷，其中，中心缺口区段包含七个2’-脱氧核苷并且在5’方向和3’方向上各自侧接包含六个核苷的翼区段。6-8-6MOE缺口聚物的长度为20个核苷，其中，中心缺口区段包含八个2’-脱氧核苷并且在5’方向和3’方向上各自侧接包含六个核苷的翼区段。5’翼区段中的每个核苷和3’翼区段中的每个核苷具有2’-MOE修饰。每个缺口聚物整个的核苷间键联为硫代磷酸酯(P＝S)键联。每个缺口聚物整个的所有胞嘧啶残基为5-甲基胞嘧啶。
“起始位点”表示人基因序列中缺口聚物所靶向的最5’核苷酸。“终止位点”表示人基因序列中缺口聚物所靶向的最3’核苷酸。将列于以下表中的每个缺口聚物靶向在本文中指定为SEQ ID NO:1的人CFB mRNA(GENBANK登录号NM_001710.5)或在本文中指定为SEQ IDNO:2的人CFB基因组序列(GENBANK登录号NT_007592.15，从31852000至31861000截短的核苷酸)或二者。‘n/a’表示反义寡核苷酸不以100％互补性靶向那个特定基因序列。
表142
由靶向SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的脱氧、MOE及(S)-cEt寡核苷酸对CFB mRNA的抑制
表143
由靶向SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的脱氧、MOE及(S)-cEt寡核苷酸对CFB mRNA的抑制
表144
由靶向SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的脱氧、MOE及(S)-cEt寡核苷酸对CFB mRNA的抑制
表145
由靶向SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的MOE缺口聚物对CFB mRNA的抑制
表146
由靶向SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的MOE缺口聚物对CFB mRNA的抑制
表147
由靶向SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的5-10-5MOE缺口聚物对CFB mRNA的抑制
实施例122：在HepG2细胞中由5-10-5MOE缺口聚物对人CFB的剂量依赖性反义抑制
选择来自以上所述的研究且对CFB mRNA展现体外抑制的缺口聚物且在HepG2细胞中以各种剂量测试。将细胞以20,000个细胞/孔的密度铺板并且使用电穿孔，以下表中规定的0.313μM、0.625μM、1.25μM、2.50μM、5.00μM或10.00μM浓度的反义寡核苷酸进行转染。在约16小时的处理期后，自细胞分离RNA且通过定量实时PCR测量CFB mRNA水平。使用人引物探针集RTS3459测量mRNA水平。根据如由所测量的总RNA含量调整CFBmRNA水平。结果呈现为相对于未处理的对照细胞的CFB的抑制百分比。
也呈现了各寡核苷酸的半数最大抑制浓度(IC50)。在反义寡核苷酸处理的细胞中，CFB mRNA水平以剂量依赖性反式降低。
表148
实施例123：在HepG2细胞中对人CFB的剂量依赖性反义抑制
选择来自以上所述的研究且对CFB mRNA展现体外抑制的缺口聚物且在HepG2细胞中以各种剂量测试。在具有类似培养条件的许多实验中测试反义寡核苷酸。每个实验的结果呈现在以下所示的单独表格中。将细胞以20,000个细胞/孔的密度铺板并且使用电穿孔，以下表中规定的0.08μM、0.25μM、0.74μM、2.22μM、6.67μM以及20.00μM浓度的反义寡核苷酸进行转染。在约16小时的处理期后，自细胞分离RNA且通过定量实时PCR测量CFB mRNA水平。使用人引物探针集RTS3459测量mRNA水平。根据如由所测量的总RNA含量调整CFB mRNA水平。结果呈现为相对于未处理的对照细胞的CFB的抑制百分比。
也呈现了各寡核苷酸的半数最大抑制浓度(IC50)。在反义寡核苷酸处理的细胞中，CFB mRNA水平以剂量依赖性反式降低。
表149
表150
表151
表152
表153
表154
实施例124：在HepG2细胞中对人CFB的剂量依赖性反义抑制
选择来自以上所述的研究且对CFB mRNA展现体外抑制的缺口聚物且在HepG2细胞中以各种剂量测试。在具有类似培养条件的许多实验中测试反义寡核苷酸。每个实验的结果呈现在以下所示的单独表格中。将细胞以20,000个细胞/孔的密度铺板并且使用电穿孔，以下表中规定的0.06μM、0.25μM、1.00μM以及4.00μM浓度的反义寡核苷酸进行转染。在约16小时的处理期后，自细胞分离RNA且通过定量实时PCR测量CFB mRNA水平。使用人引物探针集RTS3459测量mRNA水平。根据如由所测量的总RNA含量调整CFB mRNA水平。结果呈现为相对于未处理的对照细胞的CFB的抑制百分比。
也呈现了各寡核苷酸的半数最大抑制浓度(IC50)。在反义寡核苷酸处理的细胞中，CFB mRNA水平以剂量依赖性反式降低。
表155
表156
表157
表158
表159
实施例125：在HepG2细胞中对人CFB的剂量依赖性反义抑制
选择来自以上所述的研究且对CFB mRNA展现体外抑制的缺口聚物且在HepG2细胞中以各种剂量测试。此外，以与ISIS 588870相同的序列(CTCCTTCCGAGTCAGC，SEQ ID NO:549)和靶区(SEQ ID NO:1的目标起始位点2195和SED ID NO:2的目标起始位点6983)涉及脱氧、MOE以及(S)-cEt寡核苷酸ISIS 594430，另一个脱氧、MOE以及(S)-cEt寡核苷酸。ISIS594430为3-10-3(S)-cEt缺口聚物。
将细胞以20,000个细胞/孔的密度铺板并且使用电穿孔，以下表中规定的0.01μM、0.04μM、0.12μM、0.37μM、1.11μM、3.33μM以及10.00μM浓度的反义寡核苷酸进行转染。在约16小时的处理期后，自细胞分离RNA且通过定量实时PCR测量CFB mRNA水平。使用人引物探针集RTS3459测量mRNA水平。根据如由所测量的总RNA含量调整CFB mRNA水平。结果呈现为相对于未处理的对照细胞的CFB的抑制百分比。
也呈现了各寡核苷酸的半数最大抑制浓度(IC50)。在反义寡核苷酸处理的细胞中，CFB mRNA水平以剂量依赖性反式降低。
表160
实施例126：靶向人CFB的MOE缺口聚物在CD1小鼠中的耐受性
小鼠(Charles River,MA)是经常被用于安全性和功效测试的多用途小鼠模型。将小鼠用选自上述研究的ISIS反义寡核苷酸处理，并且评价各种血浆化学标志物水平的改变。
研究1(具有5-10-5 MOE缺口聚物)
每周一次向七周大的雄性CD1小鼠的组皮下注射100mg/kg的ISIS寡核苷酸，持续6周。每周一次向一组雄性CD1小鼠皮下注射PBS，持续6周。每周一次向一组小鼠皮下注射100mg/kg的对照寡核苷酸ISIS 141923(CCTTCCCTGAAGGTTCCTCC，在本文中称为SEQ ID NO:809，无已知小鼠靶标的5-10-5MOE缺口聚物)，持续6周。最后一次剂量48小时后使小鼠安乐死，并且收获器官和血浆用于进一步分析。
血浆化学标志物
为了评价ISIS寡核苷酸对肝脏和肾脏功能的作用，使用自动临床化学分析器(Hitachi Olympus AU400e,Melville,NY)测量转氨酶和BUN的血浆水平。结果在下表中呈现。引起超出反义寡核苷酸预期范围之外的肝脏或肾脏功能标志物的水平改变的ISIS寡核苷酸被排除在进一步的研究之外。
表161
在第40天时CD1小鼠血浆中的血浆化学标志物
重量
在处死小鼠前第40天时，测量小鼠的体重。处死小鼠之后，还测量器官、肝脏、肾脏以及脾脏的重量。结果在下表中呈现。引起超出反义寡核苷酸预期范围的重量改变的ISIS寡核苷酸被排除在进一步的研究之外。
表162
第40天时CD1小鼠的重量(g)
身体 肾 肝 脾
PBS 44 0.8 2.0 0.1
ISIS 532614 43 0.7 4.3 0.2
ISIS 532692 42 0.7 2.6 0.2
ISIS 532770 42 0.6 2.3 0.2
ISIS 532775 42 0.7 2.5 0.2
ISIS 532800 43 0.6 2.8 0.3
ISIS 532809 42 0.6 2.2 0.1
ISIS 532810 43 0.6 2.3 0.2
ISIS 532811 41 0.7 2.4 0.2
ISIS 532917 42 0.7 3.0 0.2
ISIS 532952 44 0.8 2.5 0.3
ISIS 141923 41 0.6 2.0 0.1
研究2(具有5-10-5 MOE缺口聚物)
每周一次向六至八周大的雄性CD1小鼠的组皮下注射100mg/kg的ISIS寡核苷酸，持续6周。每周一次向两组雄性CD1小鼠皮下注射PBS，持续6周。每周一次向一组小鼠皮下注射100mg/kg的对照寡核苷酸ISIS 141923，持续6周。最后一次剂量48小时后使小鼠安乐死，并且收获器官和血浆用于进一步分析。
血浆化学标志物
为了评价ISIS寡核苷酸对肝脏和肾脏功能的作用，使用自动临床化学分析器(Hitachi Olympus AU400e,Melville,NY)测量转氨酶、白蛋白以及BUN的血浆水平。结果在下表中呈现。引起超出反义寡核苷酸预期范围之外的肝脏或肾脏功能标志物的水平改变的ISIS寡核苷酸被排除在进一步的研究之外。
表163
在第45天时CD1小鼠血浆中的血浆化学标志物
重量
在第42天时，测量小鼠的体重。在处死小鼠后45天时，还测量器官、肝脏、肾脏以及脾脏的重量。结果在下表中呈现。引起超出反义寡核苷酸预期范围之外的重量改变的ISIS寡核苷酸被排除在进一步的研究之外。
表164
第40天时CD1小鼠的重量(g)
身体 肾 肝 脾
PBS 44 0.7 2.4 0.1
PBS 43 0.7 2.4 0.2
ISIS 141923 43 0.6 2.4 0.2
ISIS 532810 41 0.6 1.9 0.1
ISIS 532952 43 0.6 2.4 0.2
ISIS 588534 44 0.7 2.8 0.2
ISIS 588536 43 0.7 2.7 0.2
ISIS 588537 43 0.7 2.4 0.2
ISIS 588538 44 0.7 2.8 0.2
ISIS 588539 44 0.6 2.7 0.2
ISIS 588545 44 0.8 3.3 0.3
ISIS 588547 42 0.6 3.3 0.3
ISIS 588548 43 0.6 2.8 0.2
ISIS 588549 42 0.6 2.8 0.3
ISIS 588551 39 0.6 2.2 0.2
ISIS 588552 41 0.6 2.2 0.2
ISIS 588558 44 0.7 3.3 0.3
ISIS 588559 43 0.6 2.7 0.3
ISIS 588561 40 0.7 2.4 0.3
ISIS 588563 41 0.7 2.4 0.2
研究3(具有5-10-5 MOE缺口聚物)
每周一次向六至八周大的雄性CD1小鼠的组皮下注射100mg/kg的ISIS寡核苷酸，持续6周。每周一次向两组雄性CD1小鼠皮下注射PBS，持续6周。最后一次剂量48小时后使小鼠安乐死，并且收获器官和血浆用于进一步分析。
血浆化学标志物
为了评价ISIS寡核苷酸对肝脏和肾脏功能的作用，使用自动临床化学分析器(Hitachi Olympus AU400e,Melville,NY)测量转氨酶、白蛋白以及BUN的血浆水平。结果在下表中呈现。引起超出反义寡核苷酸预期范围之外的肝脏或肾脏功能标志物的水平改变的ISIS寡核苷酸被排除在进一步的研究之外。
表165
在第42天时CD1小鼠血浆中的血浆化学标志物
重量
在第42天时，测量小鼠的体重。在处死小鼠后42天时，还测量器官、肝脏、肾脏以及脾脏的重量。结果在下表中呈现。引起超出反义寡核苷酸预期范围之外的重量改变的ISIS寡核苷酸被排除在进一步的研究之外。
表166
第40天时CD1小鼠的重量(g)
身体 肾 肝 脾
PBS 42 0.7 2.4 0.1
PBS 41 0.7 2.4 0.2
ISIS 588544 44 0.6 1.9 0.1
ISIS 588546 43 0.6 2.4 0.2
ISIS 588550 41 0.7 2.8 0.2
ISIS 588553 44 0.7 2.7 0.2
ISIS 588554 40 0.7 2.4 0.2
ISIS 588555 44 0.7 2.8 0.2
ISIS 588556 39 0.6 2.7 0.2
ISIS 588557 41 0.8 3.3 0.3
ISIS 588560 38 0.6 3.2 0.3
ISIS 588562 41 0.6 2.8 0.2
ISIS 588564 40 0.6 2.8 0.3
ISIS 588565 39 0.6 2.2 0.2
研究4(具有(S)cEt缺口聚物以及脱氧、MOE和(S)-cEt寡核苷酸)
每周一次向十周大的雄性CD1小鼠的组皮下注射50mg/kg来自以上所述的研究的ISIS寡核苷酸，持续6周。此外，将两个寡核苷酸、ISIS 594431以及ISIS 594432设计为3-10-3(S)-cEt缺口聚物并且在本研究中进行测试。ISIS 594431(ACCTCCTTCCGAGTCA，SEQ IDNO:550)靶向与脱氧、MOE以及(S)-cEt缺口聚物ISIS 588871相同的区(SEQ ID NO:1的目标起始位点2197和SEQ ID NO:2的目标起始位点6985)。ISIS 594432(TGGTCACATTCCCTTC，SEQID NO:542)靶向与脱氧、MOE以及(S)-cEt缺口聚物ISIS 588872相同的区(SEQ ID NO:1的目标起始位点154和SEQ ID NO:2的目标起始位点1875)。
每周一次向两组雄性CD1小鼠皮下注射PBS，持续6周。最后一次剂量48小时后使小鼠安乐死，并且收获器官和血浆用于进一步分析。
血浆化学标志物
为了评价ISIS寡核苷酸对肝脏和肾脏功能的作用，使用自动临床化学分析器(Hitachi Olympus AU400e,Melville,NY)测量转氨酶、白蛋白、肌酸酐以及BUN的血浆水平。结果在下表中呈现。引起超出反义寡核苷酸预期范围之外的肝脏或肾脏功能标志物的水平改变的ISIS寡核苷酸被排除在进一步的研究之外。
表167
在第42天时CD1小鼠血浆中的血浆化学标志物
重量
在第39天时，测量小鼠的体重。在处死小鼠后42天时，还测量器官、肝脏、肾脏以及脾脏的重量。结果在下表中呈现。引起超出反义寡核苷酸预期范围之外的重量改变的ISIS寡核苷酸被排除在进一步的研究之外。
表168
CD1小鼠的重量(g)
研究5(具有MOE缺口聚物、(S)cEt缺口聚物以及脱氧、MOE和(S)-cEt寡核苷酸)
每周一次向八至九周大的雄性CD1小鼠的组皮下注射50mg/kg的ISIS寡核苷酸，持续6周。每周一次向两组雄性CD1小鼠皮下注射PBS，持续6周。最后一次剂量48小时后使小鼠安乐死，并且收获器官和血浆用于进一步分析。
血浆化学标志物
为了评价ISIS寡核苷酸对肝脏和肾脏功能的作用，使用自动临床化学分析器(Hitachi Olympus AU400e,Melville,NY)测量转氨酶、白蛋白、肌酸酐以及BUN的血浆水平。结果在下表中呈现。引起超出反义寡核苷酸预期范围之外的肝脏或肾脏功能标志物的水平改变的ISIS寡核苷酸被排除在进一步的研究之外。
表169
在第42天时CD1小鼠血浆中的血浆化学标志物
重量
在第40天时，测量小鼠的体重。在处死小鼠后42天时，还测量器官、肝脏、肾脏以及脾脏的重量。结果在下表中呈现。引起超出反义寡核苷酸预期范围之外的重量改变的ISIS寡核苷酸被排除在进一步的研究之外。
表170
CD1小鼠的重量(g)
研究6(具有脱氧、MOE以及(S)-cEt寡核苷酸)
每周一次向八至九周大的雄性CD1小鼠的组皮下注射50mg/kg的脱氧、MOE以及(S)-cEt寡核苷酸，持续6周。每周一次向两组雄性CD1小鼠皮下注射PBS，持续6周。最后一次剂量48小时后使小鼠安乐死，并且收获器官和血浆用于进一步分析。
血浆化学标志物
为了评价ISIS寡核苷酸对肝脏和肾脏功能的作用，使用自动临床化学分析器(Hitachi Olympus AU400e,Melville,NY)测量转氨酶、白蛋白、肌酸酐、胆红素以及BUN的血浆水平。结果在下表中呈现。引起超出反义寡核苷酸预期范围之外的肝脏或肾脏功能标志物的水平改变的ISIS寡核苷酸被排除在进一步的研究之外。
表171
在第45天时CD1小鼠血浆中的血浆化学标志物
重量
在第40天时，测量小鼠的体重。在处死小鼠后45天时，还测量器官、肝脏、肾脏以及脾脏的重量。结果在下表中呈现。引起超出反义寡核苷酸预期范围之外的重量改变的ISIS寡核苷酸被排除在进一步的研究之外。
表172
CD1小鼠的重量(g)
研究7(具有MOE缺口聚物以及脱氧、MOE和(S)-cEt寡核苷酸)
每周一次向八至九周大的雄性CD1小鼠的组皮下注射100mg/kg的ISIS寡核苷酸，持续6周。每周一次向一组雄性CD1小鼠皮下注射PBS，持续6周。最后一次剂量48小时后使小鼠安乐死，并且收获器官和血浆用于进一步分析。
血浆化学标志物
为了评价ISIS寡核苷酸对肝脏和肾脏功能的作用，使用自动临床化学分析器(Hitachi Olympus AU400e,Melville,NY)测量转氨酶、白蛋白、肌酸酐以及BUN的血浆水平。结果在下表中呈现。引起超出反义寡核苷酸预期范围之外的肝脏或肾脏功能标志物的水平改变的ISIS寡核苷酸被排除在进一步的研究之外。
表173
在第45天时CD1小鼠血浆中的血浆化学标志物
重量
在第44天时，测量小鼠的体重。在处死小鼠后49天时，还测量器官、肝脏、肾脏以及脾脏的重量。结果在下表中呈现。引起超出反义寡核苷酸预期范围之外的重量改变的ISIS寡核苷酸被排除在进一步的研究之外。
表174
CD1小鼠的重量(g)
研究8(具有MOE缺口聚物、脱氧、MOE和(S)-cEt寡核苷酸以及(S)-cEt缺口聚物)
每周一次向八至九周大的雄性CD1小鼠的组皮下注射100mg/kg的MOE缺口聚物或50mg/kg的脱氧、MOE以及(S)-cEt ISIS寡核苷酸或(S)-cEt缺口聚物，持续6周。每周一次向一组雄性CD1小鼠皮下注射PBS，持续6周。最后一次剂量48小时后使小鼠安乐死，并且收获器官和血浆用于进一步分析。
血浆化学标志物
为了评价ISIS寡核苷酸对肝脏和肾脏功能的作用，使用自动临床化学分析器(Hitachi Olympus AU400e,Melville,NY)测量转氨酶、白蛋白、肌酸酐以及BUN的血浆水平。结果在下表中呈现。
表175
在第43天时CD1小鼠血浆中的血浆化学标志物
重量
在第36天时，测量小鼠的体重。在处死小鼠后43天时，还测量器官、肝脏、肾脏以及脾脏的重量。将器官重量的结果表示为与体重的比并且归一化为PBS对照比。
表176
CD1小鼠的器官重量/体重(BW)
细胞因子测定
将从所有小鼠组获得的血液送至Antech Diagnostic用于各种细胞因子诸如IL-6、MDC、MIP1β、IP-10、MCP1、MIP-1α以及RANTES水平的测量。结果呈现于表54中。
表177
CD1小鼠血浆中的细胞因子水平(pg/mL)
血液学测定
将从所有小鼠组获得的血液送至Antech Diagnostic用于红细胞压积(HCT)以及各种血细胞诸如WBC、RBC以及血小板以及总血红蛋白(Hb)含量的测量。结果呈现于表55中。
表178
CD1小鼠血浆中的血液学标志物
实施例127：靶向人CFB的反义寡核苷酸在Sprague-Dawley大鼠中的耐受性
Sprague-Dawley大鼠是用于安全性和功效评价的多用途模型。将大鼠用选自以上实施例中所述的研究的ISIS反义寡核苷酸处理，并且评价各种血浆化学标志物水平的改变。
研究1(具有5-10-5 MOE缺口聚物)
将七至八周大的雄Sprague-Dawley大鼠维持在12小时亮/暗循环中并且随意喂食Purina正常大鼠食物饲料5001。每周一次向各组4只Sprague-Dawley大鼠皮下注射100mg/kg的5-10-5MOE缺口聚物，持续6周。每周一次向一个对照组的6只大鼠皮下注射PBS，持续6周。最后一次剂量48小时后使大鼠安乐死，并且收获器官和血浆用于进一步分析。
肝功能
为评价ISIS寡核苷酸对肝功能的影响，使用自动临床化学分析器(HitachiOlympus AU400e,Melville,NY)测量转氨酶的血浆水平。测量ALT(丙氨酸转氨酶)和AST(天冬氨酸转氨酶)的血浆水平且结果呈现于下表中，以IU/L表示。引起超出反义寡核苷酸预期范围之外的肝脏功能标志物的水平改变的ISIS寡核苷酸被排除在进一步的研究之外。
表179
Sprague-Dawley大鼠中的肝脏功能标志物
肾功能
为评价ISIS寡核苷酸对肾功能的影响，使用自动临床化学分析器(HitachiOlympus AU400e,Melville,NY)测量血液尿素氮(BUN)和肌酸酐的血浆水平。结果呈现在下表中，以mg/dL表示。引起超出反义寡核苷酸预期范围之外的任何肾脏功能标志物的水平改变的ISIS寡核苷酸被排除在进一步的研究之外。
表180
Sprague-Dawley大鼠中的肾功能标志物(mg/dL)
BUN 肌酸酐
PBS 18 3.5
ISIS 588544 21 3.1
ISIS 588550 21 3.0
ISIS 588553 22 2.8
ISIS 588554 23 3.0
ISIS 588555 22 3.5
ISIS 588556 21 3.2
ISIS 588560 26 2.4
ISIS 588564 24 2.7
重量
在第39天时，对体重进行测量。在研究结束后第42天时测量肝、心脏、脾和肾的重量，并且呈现在下表中。引起超出反义寡核苷酸预期范围之外的器官重量的任何改变的ISIS寡核苷酸被排除在进一步的研究之外。
表181
重量(g)
研究2(具有脱氧、MOE以及(S)-cEt寡核苷酸)
将九至十周大的雄Sprague-Dawley大鼠维持在12小时亮/暗循环中并且随意喂食Purina正常大鼠食物饲料5001。每周一次向各组4只Sprague-Dawley大鼠皮下注射100mg/kg的脱氧、MOE以及(S)-cEt寡核苷酸，持续6周。每周一次向两个对照组的3只大鼠皮下注射PBS，持续6周。最后一次剂量48小时后使大鼠安乐死，并且收获器官和血浆用于进一步分析。
肝功能
为评价ISIS寡核苷酸对肝功能的影响，在第42天时，使用自动临床化学分析器(Hitachi Olympus AU400e,Melville,NY)测量转氨酶的血浆水平。测量ALT(丙氨酸转氨酶)和AST(天冬氨酸转氨酶)以及白蛋白的血浆水平且结果呈现于下表中。引起超出反义寡核苷酸预期范围之外的肝脏功能标志物的水平改变的ISIS寡核苷酸被排除在进一步的研究之外。
表182
Sprague-Dawley大鼠中的肝脏功能标志物
肾功能
为评价ISIS寡核苷酸对肾功能的影响，使用自动临床化学分析器(HitachiOlympus AU400e,Melville,NY)测量血液尿素氮(BUN)和肌酸酐的血浆水平。结果呈现在下表中，以mg/dL表示。引起超出反义寡核苷酸预期范围之外的任何肾脏功能标志物的水平改变的ISIS寡核苷酸被排除在进一步的研究之外。
表183
Sprague-Dawley大鼠中的肾功能标志物(mg/dL)
重量
在第39天时，对体重进行测量。在研究结束后第42天时测量肝、心脏、脾和肾的重量，并且呈现在下表中。引起超出反义寡核苷酸预期范围之外的器官重量的任何改变的ISIS寡核苷酸被排除在进一步的研究之外。
表184
重量(g)
研究3(使用MOE缺口聚物)
将九至十周大的雄Sprague-Dawley大鼠维持在12小时亮/暗循环中并且随意喂食Purina正常大鼠食物饲料5001。每周一次向各组4只Sprague-Dawley大鼠皮下注射100mg/kg的MOE缺口聚物，持续6周。每周一次向一个对照组的6只大鼠皮下注射PBS，持续6周。最后一次剂量48小时后使大鼠安乐死，并且收获器官和血浆用于进一步分析。
肝功能
为评价ISIS寡核苷酸对肝功能的影响，在第43天时，使用自动临床化学分析器(Hitachi Olympus AU400e,Melville,NY)测量转氨酶的血浆水平。测量ALT(丙氨酸转氨酶)和AST(天冬氨酸转氨酶)的血浆水平且结果呈现于下表中，以IU/L表示。引起超出反义寡核苷酸预期范围之外的肝脏功能标志物的水平改变的ISIS寡核苷酸被排除在进一步的研究之外。
表185
Sprague-Dawley大鼠中的肝脏功能标志物
肾功能
为评价ISIS寡核苷酸对肾功能的影响，使用自动临床化学分析器(HitachiOlympus AU400e,Melville,NY)测量血液尿素氮(BUN)和肌酸酐的血浆水平。结果呈现在下表中，以mg/dL表示。引起超出反义寡核苷酸预期范围之外的任何肾脏功能标志物的水平改变的ISIS寡核苷酸被排除在进一步的研究之外。
表186
Sprague-Dawley大鼠中的肾功能标志物(mg/dL)
重量
在第39天时，对体重进行测量。在研究结束后第42天时测量肝、心脏、脾和肾的重量，并且呈现在下表中。引起超出反义寡核苷酸预期范围之外的器官重量的任何改变的ISIS寡核苷酸被排除在进一步的研究之外。
表187
重量(g)
研究4(使用MOE缺口聚物)
将九至十周大的雄Sprague-Dawley大鼠维持在12小时亮/暗循环中并且随意喂食Purina正常大鼠食物饲料5001。每周一次向各组4只Sprague-Dawley大鼠皮下注射100mg/kg的MOE缺口聚物，持续6周。每周一次向一个对照组的6只大鼠皮下注射PBS，持续6周。最后一次剂量48小时后使大鼠安乐死，并且收获器官和血浆用于进一步分析。
肝功能
为评价ISIS寡核苷酸对肝功能的影响，在第42天时，使用自动临床化学分析器(Hitachi Olympus AU400e,Melville,NY)测量转氨酶的血浆水平。测量ALT(丙氨酸转氨酶)和AST(天冬氨酸转氨酶)的血浆水平且结果呈现于下表中，以IU/L表示。引起超出反义寡核苷酸预期范围之外的肝脏功能标志物的水平改变的ISIS寡核苷酸被排除在进一步的研究之外。
表188
Sprague-Dawley大鼠中的肝脏功能标志物
肾功能
为评价ISIS寡核苷酸对肾功能的影响，使用自动临床化学分析器(HitachiOlympus AU400e,Melville,NY)测量血液尿素氮(BUN)和肌酸酐的血浆水平。结果呈现在下表中，以mg/dL表示。引起超出反义寡核苷酸预期范围之外的任何肾脏功能标志物的水平改变的ISIS寡核苷酸被排除在进一步的研究之外。
表189
Sprague-Dawley大鼠中的肾功能标志物(mg/dL)
重量
在第39天时，对体重进行测量。在研究结束后第42天时测量肝、心脏、脾和肾的重量，并且呈现在下表中。引起超出反义寡核苷酸预期范围之外的器官重量的任何改变的ISIS寡核苷酸被排除在进一步的研究之外。
表190
重量(g)
研究5(具有MOE缺口聚物以及脱氧、MOE和(S)-cEt寡核苷酸)
将九至十周大的雄Sprague-Dawley大鼠维持在12小时亮/暗循环中并且随意喂食Purina正常大鼠食物饲料5001。每周一次向各组4只Sprague-Dawley大鼠皮下注射100mg/kg的MOE缺口聚物或50mg/kg的脱氧、MOE以及(S)-cEt寡核苷酸，持续6周。每周一次向一个对照组的4只大鼠皮下注射PBS，持续6周。最后一次剂量48小时后使大鼠安乐死，并且收获器官和血浆用于进一步分析。
肝功能
为评价ISIS寡核苷酸对肝功能的影响，在第42天时，使用自动临床化学分析器(Hitachi Olympus AU400e,Melville,NY)测量转氨酶的血浆水平。测量ALT(丙氨酸转氨酶)和AST(天冬氨酸转氨酶)的血浆水平且结果呈现于下表中，以IU/L表示。引起超出反义寡核苷酸预期范围之外的肝脏功能标志物的水平改变的ISIS寡核苷酸被排除在进一步的研究之外。
表191
Sprague-Dawley大鼠中的肝脏功能标志物
肾功能
为评价ISIS寡核苷酸对肾功能的影响，使用自动临床化学分析器(HitachiOlympus AU400e,Melville,NY)测量血液尿素氮(BUN)和肌酸酐的血浆和尿液水平。结果呈现在下表中，以mg/dL表示。引起超出反义寡核苷酸预期范围之外的任何肾脏功能标志物的水平改变的ISIS寡核苷酸被排除在进一步的研究之外。
表192
Sprague-Dawley大鼠的血浆中的肾功能标志物(mg/dL)
化学 BUN 肌酸酐
PBS - 18 0.3
ISIS 532770 5-10-5MOE 20 0.4
ISIS 588851 脱氧、MOE以及(S)-cEt 20 0.4
ISIS 588856 脱氧、MOE以及(S)-cEt 22 0.4
ISIS 588865 脱氧、MOE以及(S)-cEt 24 0.5
ISIS 588867 脱氧、MOE以及(S)-cEt 22 0.4
ISIS 588868 脱氧、MOE以及(S)-cEt 19 0.4
ISIS 588870 脱氧、MOE以及(S)-cEt 20 0.5
表193
Sprague-Dawley大鼠的尿液中的肾功能标志物(mg/dL)
重量
在第39天时，对体重进行测量。在研究结束后第42天时测量肝、心脏、脾和肾的重量，并且呈现在下表中。引起超出反义寡核苷酸预期范围之外的器官重量的任何改变的ISIS寡核苷酸被排除在进一步的研究之外。
表194
重量(g)
化学 身体 肝 脾 肾
PBS - 489 16 0.9 3.5
ISIS 532770 5-10-5MOE 372 15 1.7 3.1
ISIS 588851 脱氧、MOE以及(S)-cEt 285 14 1.4 3.2
ISIS 588856 脱氧、MOE以及(S)-cEt 415 15 1.1 3.3
ISIS 588865 脱氧、MOE以及(S)-cEt 362 14 2.0 3.3
ISIS 588867 脱氧、MOE以及(S)-cEt 406 15 2.4 3.4
ISIS 588868 脱氧、MOE以及(S)-cEt 399 15 1.5 3.4
ISIS 588870 脱氧、MOE以及(S)-cEt 446 14 1.4 3.3
研究6(具有MOE缺口聚物、脱氧、MOE和(S)-cEt寡核苷酸以及(S)-cEt缺口聚物)
将雄性大鼠维持在12小时亮/暗循环中并且随意喂食Purina正常大鼠食物饲料5001。每周一次向各组4只大鼠皮下注射100mg/kg的MOE缺口聚物或50mg/kg的脱氧、MOE以及(S)-cEt寡核苷酸或(S)-cEt缺口聚物，持续6周。每周一次向一个对照组的4只大鼠皮下注射PBS，持续6周。最后一次剂量48小时后使大鼠安乐死，并且收获器官和血浆用于进一步分析。
肝功能
为评价ISIS寡核苷酸对肝功能的影响，在第42天时，使用自动临床化学分析器(Hitachi Olympus AU400e,Melville,NY)测量转氨酶的血浆水平。测量ALT(丙氨酸转氨酶)和AST(天冬氨酸转氨酶)的血浆水平且结果呈现于下表中，以IU/L表示。
表195
肝功能标志物
肾功能
为了评价ISIS寡核苷酸对肝功能的作用，使用自动临床化学分析器(HitachiOlympus AU400e,Melville,NY)测量总蛋白和肌酸酐的尿液水平。结果在下表中呈现。引起超出反义寡核苷酸预期范围之外的任何肾脏功能标志物的水平改变的ISIS寡核苷酸被排除在进一步的研究之外。
表196
大鼠尿液中的总蛋白/肌酸酐比
重量
在第39天时，对体重进行测量。在研究结束后第42天时测量肝、心脏、脾和肾的重量，并且呈现在下表中。将器官重量的结果表示为与体重的比并且归一化为PBS对照比。
表197
器官重量/体重(BW)比
实施例128：对抗CFB mRNA的反义寡核苷酸在hCFB小鼠中的功效
测试所选择的化合物在人CFB转基因小鼠起始细胞系#6中的功效人CFB基因位于基因组6上：31913721-31919861位。选择含有CFB序列的质粒(ABC14-50933200C23)以产生表达人CFB基因的转基因小鼠。使用Cla I(31926612)和Age I(31926815)限制酶以产生含有CFB基因的22,127bp片段用于原核注射。使用Pvu I通过限制酶分析确认DNA。将22,127bpDNA片段注射进C57BL/6NTac胚胎内。繁殖6只阳性起始小鼠系。起始小鼠系#6表达肝人CFBmRNA并且杂交至第3代。使用来自第3代小鼠的后代以评估人CFB ASO用于人CFB mRNA减少。
处理
每周两次向各3只小鼠的组皮下注射50mg/kg的ISIS寡核苷酸，持续一周，接着每周一次给药50mg/kg的ISIS寡核苷酸，持续额外的三周。每周两次向一个对照组的4只小鼠皮下注射PBS，持续2周，对于第一周，对于第一周，持续另外的三周。最后一次剂量48小时后使小鼠安乐死，并且收获器官和血浆用于进一步分析。
RNA分析
在给药期结束时，从肝脏和肾脏提取RNA用于CFB mRNA水平的实时PCR分析。使用人引物探针集RTS3459测量人CFB mRNA水平。将CFB mRNA水平归一化为并且还归一化为管家基因亲环蛋白。将结果计算为相比于对照组的CFB mRNA表达的抑制百分比。所有反义寡核苷酸影响肝脏中的人CFB mRNA水平的抑制。
表198
hCFB小鼠中的CFB mRNA水平的减少百分比
实施例129：小鼠CFB的体内反义抑制
设计若干靶向小鼠CFB mRNA(GENBANK登录号NM_008198.2，以SEQ ID NO:5并入本文)的反义寡核苷酸。每个寡核苷酸的目标起始位点和序列在下表中有所描述。以下表中的嵌合反义寡核苷酸被设计为5-10-5MOE缺口聚物。所述缺口聚物的长度为20个核苷，其中中心缺口区段包含10个2'-脱氧核苷且在两侧上(在5'及3'方向上)由各自包含5个核苷的翼侧接。5’翼区段中的每个核苷和3’翼区段中的每个核苷具有2’-MOE修饰。每个缺口聚物整个的核苷间键联为硫代磷酸酯(P＝S)键联。每个缺口聚物整个的所有胞嘧啶残基为5-甲基胞嘧啶。
表199
靶向小鼠CFB的缺口聚物
处理
向包括四只C57BL/6小鼠的组各自注射50mg/kg的ISIS 516269、ISIS 516272、ISIS 516323、ISIS 516330或ISIS 516341，施用持续3周。向对照组小鼠注射磷酸盐缓冲溶液(PBS)，施用持续3周。
CFB RNA分析
在研究结束时，自肝脏组织提取RNA，以使用引物探针集RTS3430(正向序列GGGCAAACAGCAATTTGTGA，在本文中称为SEQ ID NO:816，反向序列TGGCTACCCACCTTCCTTGT，在本文中称为SEQ ID NO:817；探针序列CTGGATACTGTCCCAATCCCGGTA TTCCX，在本文中称为SEQ ID NO:818)，进行CFB的实时PCR分析。使用归一化mRNA水平。如下表所示，相较于PBS对照组，一些反义寡核苷酸使得小鼠CFB有所减少。结果呈现为相对于对照的CFB的抑制百分比。
表200
C57BL/6小鼠中的小鼠CFB mRNA的抑制百分比
ISIS No ％
516269 29
516272 72
516323 77
516330 62
516341 72
蛋白质分析
通过蛋白质印迹使用山羊抗CFB抗体(Sigma Aldrich)测量肾脏、肝脏、血浆以及眼睛中的CFB蛋白水平。结果呈现为相对于PBS对照的CFB的抑制百分比。‘n/a’表示所述样本未进行的测量。如下表所示，由ISIS寡核苷酸对CFB的反义抑制导致各种组织中的CFB蛋白质减少。如下表所示，ISIS寡核苷酸的全身性施用有效用于减少眼睛中的CFB水平。
表201
C57BL/6小鼠中的小鼠CFB蛋白的抑制百分比
实施例130：小鼠CFB的剂量依赖性反义抑制
向包括四只C57BL/6小鼠的组各自注射25mg/kg、50mg/kg或100mg/kg的ISIS516272和ISIS 516323，施用持续6周。向另外两个组的小鼠注射100mg/kg的ISIS 516330或ISIS 516341，施用持续6周。向两个对照组的小鼠注射磷酸盐缓冲溶液(PBS)，施用持续6周。
CFB RNA分析
自肝脏和肾脏组织提取RNA以使用引物探针集RTS3430对CFB进行实时PCR分析。使用归一化mRNA水平。如下表所示，相较于PBS对照组，反义寡核苷酸获得小鼠CFB的剂量依赖性减少。结果呈现为相对于对照的CFB的抑制百分比。
表202
C57BL/6小鼠中的小鼠CFB mRNA的抑制百分比
蛋白质分析
通过蛋白质印迹使用山羊抗CFB抗体(Sigma Aldrich)测量血浆中的CFB蛋白水平。如下表所示，由ISIS寡核苷酸对CFB的反义抑制导致CFB蛋白质减少。结果呈现为相对于PBS对照的CFB的抑制百分比。‘n/a’表示所述样本未进行的测量。
还通过免疫印迹测量眼睛中的CFB蛋白水平。所有的处理组表明CFB抑制95％，一些样品测量低于测定的检测水平。
表203
C57BL/6小鼠中的小鼠CFB蛋白的抑制百分比
实施例131：NZB/W F1小鼠模型中的CFB反义抑制的作用
NZB/W F1为狼疮的最古老经典模型，其中小鼠相比于狼疮患者的表型发育严重的狼疮样表型(Theofilopoulos,A.N.和Dixon,F.J.Advances in Immunology,第37卷，第269–390页,1985)。这些狼疮样表型包括淋巴结病、脾肿大、包括抗dsDNA IgG的增加的血清抗核自身抗体(ANA)、IgG2a和IgG3的大多数以及(5-6个月大明显，导致肾衰竭和10–12个月大死亡)免疫复合物性肾小球肾炎(GN)。
研究1
研究旨在证明用靶向CFB的反义寡核苷酸处理将改善小鼠模型中的肾脏病理。17周大的雌性NZB/W F1小鼠购自Jackson Laboratories。16只小鼠的各组接受剂量为100μg/kg/周的ISIS 516272或ISIS 516323，持续20周。另一组的16只小鼠接受剂量为100μg/kg/周的对照寡核苷酸ISIS 141923，持续20周。另一组的10只小鼠接受同等剂量的PBS，持续20周并且充当与所有其他组做比较的对照组。在最后的剂量注射后48小时，收集端点。
CFB RNA分析
自肝脏和肾脏组织提取RNA以使用引物探针集RTS3430对CFB进行实时PCR分析。使用归一化mRNA水平。如下表所示，相较于PBS对照组，一些反义寡核苷酸使得小鼠CFB有所减少。结果呈现为相对于对照的CFB的抑制百分比。
表204
NZB/W F1小鼠中的小鼠CFB mRNA的抑制百分比
ISIS No 肝 肾
516272 55 25
516323 63 43
141923 0 0
蛋白尿
预期该小鼠模型中的60％的动物为蛋白尿。通过使用临床分析仪计算总蛋白与肌酸酐的比测量重度蛋白尿的累积发生率。结果呈现于下表中，并且表明用靶向CFB的反义寡核苷酸处理相比于PBS对照和对照寡核苷酸处理的小鼠，使得小鼠中的蛋白尿有所减少。
表205
NZB/W F1小鼠中的重度蛋白尿的累积发生率百分比
存活
通过在处理开始时并且然后再次在第20周时保持小鼠的计数进行监测小鼠的存活。结果呈现于下表中，并且表明用靶向CFB的反义寡核苷酸处理相比于PBS对照和对照寡核苷酸处理的小鼠，增加了小鼠的存活。
表206
存活小鼠的数量和存活％
肾小球沉积
通过用抗C3抗体免疫组化，测量肾脏的肾小球中的C3沉积以及IgG沉积的量。结果呈现于下表中，并且表明用靶向CFB的反义寡核苷酸处理相比于PBS对照和对照寡核苷酸处理的小鼠，使得肾脏肾小球中的C3和IgG沉积两者有所减少。
表207
NZB/W F1小鼠中的肾小球沉积的抑制百分比
ISIS No C3 IgG
516272 45 20
516323 48 2
141923 0 0
研究2
16周大的雌NZB/W F1小鼠购自Jackson Laboratories。10只小鼠的组接受剂量为100μg/kg/周的ISIS 516323，持续12周。另一组的10只小鼠接受剂量为100μg/kg/周的对照寡核苷酸ISIS 141923，持续12周。另一组的10只小鼠接受同等剂量的PBS，持续12周并且充当与所有其他组做比较的对照组。在最后的剂量注射后48小时，收集端点。
CFB RNA分析
自肝脏和肾脏组织提取RNA以使用引物探针集RTS3430对CFB进行实时PCR分析。如下表所示，相较于PBS对照组，用ISIS 516323处理使得小鼠CFB有所减少。结果呈现为相对于对照的CFB的抑制百分比。
表208
NZB/W F1小鼠中的小鼠CFB mRNA的抑制百分比
ISIS No 肝 肾
516323 75 46
141923 0 6
蛋白尿
通过测量尿液总蛋白与肌酸酐的比以及通过测量总微白蛋白水平评估重度蛋白尿的累积发生率。结果呈现于下表中，并且表明用靶向CFB的反义寡核苷酸处理相比于PBS对照和对照寡核苷酸处理的小鼠，减少了小鼠的蛋白尿。
表209
以尿液微白蛋白水平(mg/dl)测量的NZB/W F1小鼠中的蛋白尿
ISIS No 第0周 第6周 第8周 第10周
516323 0 0 5.4 0.4
141923 0 8.28 8.6 5.6
表210
以总蛋白与肌酸酐的比测量的NZB/W F1小鼠中的蛋白尿
ISIS No 第0周 第6周 第8周 第10周
516323 5.5 7.8 8.6 7.2
141923 6.9 10.0 13.5 7.2
存活
通过在处理开始时并且然后再次在第12周时保持小鼠的计数进行监测小鼠的存活。结果呈现于下表中，并且表明用靶向CFB的反义寡核苷酸处理相比于PBS对照和对照寡核苷酸处理的小鼠，增加了小鼠的存活。
表211
存活小鼠的数量
第1周 第12周
PBS 10 9
ISIS516323 10 10
ISIS141923 10 9
实施例132：MRL小鼠模型中的CFB反义抑制的作用
由于双阴性(CD4-CD8-)和B220+T细胞的积累，MRL/lpr狼疮肾炎小鼠模型发育为其特征为淋巴结病的SLE样表型。这些小鼠表现出加速的死亡率。此外，小鼠具有高浓度的循环免疫球蛋白(包括升高水平的自身抗体诸如ANA、抗ssDNA、抗dsDNA、抗-Sm以及类风湿因子)，导致大量的免疫复合物(Andrews,B.等,J.Exp.Med.148:1198-1215,1978)。
处理
研究旨在调查用靶向CFB的反义寡核苷酸处理是否将逆转小鼠模型中的肾脏病理。14周大的雌MRL/lpr小鼠购自Jackson Laboratories。10只小鼠的组接受剂量为50μg/kg/周的ISIS 516323，持续7周。另一组的10只小鼠接受剂量为50μg/kg/周的对照寡核苷酸ISIS 141923，持续7周。另一组的10只小鼠接受同等剂量的PBS，持续7周并且充当与所有其他组做比较的对照组。在最后的剂量注射后48小时，收集端点。
CFB RNA分析
自肝脏组织提取RNA以使用引物探针集RTS3430对CFB进行实时PCR分析。如下表所示，相较于PBS对照组，ISIS 516323减少了CFB。结果呈现为相对于对照的CFB的抑制百分比。
表212
MRL/lpr小鼠中的小鼠CFB mRNA的抑制百分比
ISIS No ％
516323 68
141923 4
肾脏病理
通过两种方法评估肾脏病理。用苏木精和伊红对肾脏的组织切片进行染色。PBS对照表明存在多血管球新月体管状铸型，其为肾小球硬化症的症状。相反，从用ISIS 516323处理的小鼠的部分示出缺乏具有最小鲍氏囊纤维化改变、中度到重度节段性肾小球膜细胞表达以及肾小球基底膜增厚的新月体管状铸型。
还通过用抗C3抗体免疫组化，评估肾脏中的C3积累。整个肾脏的C3免疫组化强度得分通过强度记分系统进行计算，其通过捕获10个肾小球/肾脏并且计算阳性C3染色的强度进行计算。结果呈现于下表中，并且表明用ISIS 516323处理相比于对照组减少了肾脏C3积累。
表213
MRL/lpr小鼠中的肾脏C3积累
血浆C3水平
CFB的减少抑制替代途径互补的激活、阻止C3食用并且导致血浆C3水平的显著升高。通过临床分析仪从终点放血测量血浆C3水平。结果呈现于下表中，并且表明用ISIS516323处理相比于对照组增加了血浆中的C3水平(p<0.001)。
表214
MRL/lpr小鼠中的血浆C3水平(mg/dL)
ISIS No C3
516323 28
141923 16
结果示出用靶向CFB的反义寡核苷酸处理逆转了狼疮小鼠模型中的肾脏病理。
实施例133：CFH Het小鼠模型中的CFB反义抑制的作用
CFH杂合(CFH Het，CFH+/-)小鼠模型与全长小鼠蛋白组合表达突变因子H蛋白(Pickering,M.C.等,J.Exp.Med.2007.204:1249-56)。肾脏组织在这些小鼠达到六个月大时保持正常。
研究1
8只6周大的CFH+/-小鼠的各组接受剂量为75mg/kg/周的ISIS516323或ISIS516341，持续6周。另一组的8只小鼠接受剂量为75mg/kg/周的对照寡核苷酸ISIS 141923，持续6周。另一组的8只小鼠接受同等剂量的PBS，持续6周并且充当与所有其他组做比较的对照组。在最后的剂量注射后48小时，收集端点。
CFB RNA分析
自肝脏和肾脏组织提取RNA以使用引物探针集RTS3430对CFB进行实时PCR分析。如以下表所示，相对于PBS对照，反义寡核苷酸减少了CFB。结果呈现为相对于对照的CFB的抑制百分比。
表215
CFH+/-小鼠中的小鼠CFB mRNA的抑制百分比
ISIS No 肝 肾
516323 80 38
516341 90 44
141923 0 17
血浆C3水平
CFB的减少抑制替代途径互补的激活、阻止C3食用并且导致血浆C3水平的显著升高。通过临床分析仪从终点血浆收集测量血浆C3水平。结果呈现于下表中，并且表明用ISIS516323处理使血浆中的C3水平增加至正常水平。
表216
CFH+/-小鼠中的血浆C3水平(mg/dL)
ISIS No C3
516323 15
516341 17
141923 8
研究2
5只CFH+/-小鼠的各组接受剂量为12.5mg/kg/周、25mg/kg/周、50mg/kg/周、75mg/kg/周或100mg/kg/周的ISIS 516323或ISIS516341，持续6周。另一组的5只小鼠接受剂量为75μg/kg/周的对照寡核苷酸ISIS 141923，持续6周。另一组的5只小鼠接受同等剂量的PBS，持续6周并且充当与所有其他组做比较的对照组。在最后的剂量注射后48小时，收集端点。
CFB RNA分析
自肝脏和肾脏组织提取RNA以使用引物探针集RTS3430对CFB进行实时PCR分析。如下表所示，相较于PBS对照组反义寡核苷酸以剂量依赖性方式减少了CFB。结果呈现为相对于对照的CFB的抑制百分比。
表217
CFH+/-小鼠肝脏中的小鼠CFB mRNA的抑制百分比
血浆C3水平
CFB的减少抑制替代途径互补的激活、阻止C3食用并且导致血浆C3水平的显著升高。通过临床分析仪从终点血浆收集测量血浆C3水平。结果呈现于下表中，并且表明用靶向CFB的ISIS寡核苷酸处理增加血浆中的C3水平。
表218
CFH+/-小鼠中的血浆C3水平(mg/dL)
实施例134：食蟹猴中靶向人CFB的ISIS反义寡核苷酸的作用
将食蟹猴用选自以上实施例中所述的研究的ISIS反义寡核苷酸处理。评估反义寡核苷酸功效和耐受性以及它们在肝和肾中的药代动力学特征。
在进行此研究时，食蟹猴基因组序列在National Center for BiotechnologyInformation(NCBI)数据库中是不可用的；因此，不能确认与食蟹猴基因序列的交叉反应性。取而代之，将食蟹猴中所用的ISIS反义寡核苷酸的序列与恒河猴序列针对同源性进行比较。预期与恒河猴序列具有同源性的ISIS寡核苷酸也与食蟹猴序列完全交叉反应。所测试的人反义寡核苷酸与恒河猴基因组序列(从核苷酸536000至545000截短的GENBANK登录号NW_001116486.1，在本文中命名为SEQ ID NO:3)交叉反应。人寡核苷酸与恒河猴序列之间的互补性越高，人寡核苷酸与恒河猴序列交叉反应的可能性越大。靶向SEQ ID NO:3的每个寡核苷酸的起始和终止位点呈现于下表中。“起始位点”表示恒河猴基因序列中缺口聚物所靶向的最5’核苷酸。‘错配’表示与恒河猴基因组序列错配的人寡核苷酸中的核碱基的数量。
表219
与恒河猴CFB基因组序列(SEQ ID NO:3)互补的反义寡核苷酸
处理
在研究之前，将猴子保持隔离至少30天的时间，在此期间，每天观察动物的一般健康状况。猴子是2-4岁并且重量在2至4kg之间。以顺时针旋转向十一组4-6只随意分配的雄食蟹猴的背部上的四个位点处(即左、顶部、右以及底部)各皮下注射ISIS寡核苷酸或PBS，每剂量一个位点。第一周(第1、3、5以及7天)给予猴子四个负荷剂量的PBS或40mg/kg的ISIS532800、ISIS 532809、ISIS 588540、ISIS 588544、ISIS 588548、ISIS 588550、ISIS588553、ISIS 588555、ISIS 588848或ISIS 594430，并且随后一周一次给药PBS或40mg/kg的ISIS寡核苷酸，持续12周(第14、21、28、35、42、49、56、63、70、77以及84)。使用类似的条件，用组中的两只雄性和两只雌性食蟹猴在单独的研究中测试ISIS 532770。
肝目标减少
RNA分析
第86天时，收集双份(每份大约250mg)肝和肾样品用于CFB mRNA分析。将样品冷冻于液氮中，在处死大约10分钟内验尸。
自肝脏和肾脏提取RNA以用于测量CFB的mRNA表达的实时PCR分析。结果呈现为相对于PBS对照的用归一化的mRNA的变化百分比。还将RNA水平用管家基因、亲环蛋白A进行归一化。使用以上所述的引物探针集RTS3459或RTS4445_MGB(正向序列CGAAGAAGCTCAGTGAAATCAA，在本文中命名为SEQ ID NO:819；反向序列TGCCTGGAGGGCCCTCTT，在本文中命名为SEQ ID NO:820；探针序列AGACCACAAGTTGAAGTC，在本文中命名为SEQ ID NO:815)测量RNA水平。
如下表中所示，用ISIS反义寡核苷酸处理导致与PBS对照相比，CFB mRNA减少。CFBmRNA水平的分析揭示若干ISIS寡核苷酸减少了肝脏和/或肾脏中的CFB水平。这里‘0’表示表达水平不受抑制。‘*’表示在单独的研究中，使用类似的条件测试寡核苷酸。
表220
相对于PBS对照的食蟹猴肝中CFB mRNA的抑制百分比
表221
相对于PBS对照的食蟹猴肾中CFB mRNA的抑制百分比
蛋白质分析
在第85天时，自所有可用的动物中收集大约1mL血液并且放入含有EDTA的钾盐的管中。即刻将血液样品放入湿冰或Kryorack中，并且在采集后60分钟内离心(以3000rpm保持10min，在4℃下)以获得血浆(大约0.4mL)。通过放射免疫扩散法(RID)使用多克隆抗因子B抗体测量血浆中的CFB的血浆水平。结果在下表中呈现。在单独的研究中测试ISIS 532770并且在第91或92天时测量所述组中的血浆蛋白质水平。
血浆CFB的分析揭示若干ISIS寡核苷酸以持续方式减少蛋白质水平。在单独的研究中测试的ISIS 532770相比于基线值，在第91/92天时，CFB蛋白质水平减少了50％。血浆CFB蛋白水平的减少与相应动物组中的肝CFB mRNA水平减少良好相关。
表222
食蟹猴中的血浆蛋白水平(基线值％)
耐受性研究
体重测量
为了评估ISIS寡核苷酸对动物总体健康的影响，测量体重和器官重量并且结果呈现于下表中。‘*’表示在单独的研究中，使用类似的条件测试寡核苷酸并且为自雄性和雌性猴的测量结果的平均值。所述结果表示用反义寡核苷酸处理对体重和器官重量的作用在反义寡核苷酸的预期范围内。
表223
食蟹猴中的最终体重(g)
表224
食蟹猴中的最终器官重量(g)
脾 心脏 肾 肝
PBS 2.8 11.6 11.9 55.8
ISIS 532770* 5.0 11.3 20.6 77.9
ISIS 532800 6.2 11.9 18.6 94.4
ISIS 588540 4.0 11.4 13.5 67.1
ISIS 588548 4.1 11.7 17.3 72.0
ISIS 588550 5.8 10.9 18.5 81.8
ISIS 588553 5.0 12.7 17.2 85.9
ISIS 588555 4.7 11.8 15.9 88.3
ISIS 588848 5.0 12.7 14.4 75.7
ISIS 594430 3.9 11.9 14.8 69.9
肝功能
为了评估ISIS寡核苷酸对肝功能的效果，从所有研究组中收集血液样本。给药后48小时，自颅骨、隐静脉或股静脉收集血液样本。在采血之前，猴子禁食过夜。在无用于血清分离的抗凝剂情况下，将血液(1.5mL)收集于试管中。将试管在室温下保持最少90分钟，并且然后离心(以大约3,000rpm保持10分钟)以得到血清。各种肝功能标记物的水平使用Toshiba 200FR NEO化学分析器(Toshiba Co.,Japan)来测量。
测量ALT和AST的血浆水平并且结果呈现于下表中，以IU/L表示。胆红素，一种肝功能标记物，类似地加以测量并且结果呈现于下表中，以mg/dL表示。‘*’表示在单独的研究中，使用类似的条件测试寡核苷酸并且为自雄性和雌性猴的测量结果的平均值。所述结果表示大部分反义寡核苷酸对超出反义寡核苷酸预期范围之外的肝功能没有作用。
表225
在第86天时食蟹猴血浆中的肝化学标志物水平
肾功能
为了评估ISIS寡核苷酸对肾功能的效果，从所有研究组中收集血液样本。给药后48小时，自颅骨、隐静脉或股静脉收集血液样本。在采血之前，猴子禁食过夜。在无用于血清分离的抗凝剂情况下，将血液收集于试管中。将试管在室温下保持最少90分钟，并且然后离心(以大约3,000rpm保持10分钟)以得到血清。使用Toshiba 200FR NEO化学分析器(Toshiba Co.,Japan)来测量BUN和肌酸酐的水平。结果呈现在下表中，以mg/dL表示。‘*’表示在单独的研究中，使用类似的条件测试寡核苷酸并且为自雄性和雌性猴的测量结果的平均值。
用于尿分析，早上使用干净的保持盘自所有的动物，将新鲜的尿液收集于湿冰上。在尿液收集前一天，禁食一整夜，但是供应水。使用Toshiba 200FR NEO自动化学分析器(Toshiba Co.,Japan)分析尿液样本(大约1mL)蛋白质与肌酸酐(P/C)的比。‘n.d.’表示尿液蛋白水平在分析器的检测限之下。
血浆和尿液化学数据表示大部分ISIS寡核苷酸对超出反义寡核苷酸预期范围之外的肾功能没有任何作用。
表226
在第86天时食蟹猴血浆中的肾化学标志物水平(mg/dL)
表227
在第44天和86天时食蟹猴尿液中的肾化学标志物水平
血液学
为了评价食蟹猴中的ISIS寡核苷酸对血液学参数的任何效果，从每个可用的研究动物收集大约0.5mL的血液的血液样品置于含有K2-EDTA的试管中。使用ADVIA120血细胞分析器(Bayer,USA)分析样品的红细胞(RBC)计数、白细胞(WBC)计数、个别白细胞计数(诸如单核细胞、中性粒细胞、淋巴细胞的计数)以及对血小板计数，血红蛋白含量以及红细胞压积。数据呈现于下表中。‘*’表示在单独的研究中，使用类似的条件测试寡核苷酸并且为自雄性和雌性猴的测量结果的平均值。
所述数据示出寡核苷酸不会引起超出在该剂量下的寡核苷酸的预期范围之外的血液学参数的任何改变。
表228
食蟹猴的血球计数
表229
食蟹猴中的血液学参数
寡核苷酸浓度的测量
测量肾和肝组织中全长寡核苷酸的浓度。所使用的方法是先前公开的方法(Leeds等，1996；Geary等，1999)的改进版本，其由苯酚-氯仿(液-液)萃取、然后是固相萃取组成。使用校准曲线计算组织样品的浓度，检测下限(LLOQ)为约1.14μg/g。结果呈现在下表中，表达为μg/g肝或肾组织。
表230
反义寡核苷酸分布
实施例135：转基因小鼠中靶向人CFB的未缀合的和5’-THA-GalNAc3缀合的反义化合物的6周功效研究
在人CFB转基因小鼠(hCFB-Tg小鼠)中测试两种具有相同核碱基序列的反义化合物：未缀合的反义寡核苷酸ISIS 588540和5’-THA-GalNAc3缀合的反义寡核苷酸ISIS696844。
向小鼠皮下施用0.1、1.25、0.5、2.0、6.0或12.0mg/kg/周剂量的ISIS 696844或2、6、12、25或50mg/kg/周剂量的ISIS 588540，持续6周。向对照组小鼠皮下施用PBS，持续6周。在最后给药之后48小时将小鼠处死。通过qRT-PCR分析Hepatic mRNA水平。
研究1
结果呈现于下表中，并且表明靶向CFB的5’-THA-GalNAc3缀合的反义寡核苷酸比具有相同序列的未缀合的反义寡核苷酸更有效。
表231
靶向CFB的反义寡核苷酸的功效
研究2
用靶向mRNA的不同区的两种不同引物探针集测量肝mRNA水平并且归一化为(RGB)或亲环蛋白。所述引物探针集为如上所述的RTS3459或RTS3460(正向序列CGAAGCAGCTCAATGAAATCAA，在本文中命名为SEQ ID NO:813；反向序列TGCCTGGAGGGCCTTCTT，在本文中命名为SEQ ID NO:814；探针序列AGACCACAAGTTGAAGTC，在本文中命名为SEQ ID NO:815)测量mRNA水平。结果呈现于下表中，并且表明靶向CFB的5’-THA-GalNAc3缀合的反义寡核苷酸比具有相同序列的未缀合的反义寡核苷酸更有效，不考虑所使用的引物探针集。
表231
靶向CFB的反义寡核苷酸的功效

Claims (253)

1.一种包含修饰寡核苷酸和缀合物基团的化合物，其中所述修饰寡核苷酸由在SEQ IDNO:1的以下各项核碱基内互补的8至80个连接核苷组成：30-49、48-63、150-169、151-170、152-171、154-169、154-173、156-171、156-175、157-176、158-173、158-177、480-499、600-619、638-657、644-663、738-757、1089-1108、1135-1154、1141-1160、1147-1166、1150-1169、1153-1172、1159-1178、1162-1181、1165-1184、1171-1186、1171-1190、1173-1188、1173-1192、1175-1190、1175-1194、1177-1196、1183-1202、1208-1227、1235-1254、1298-1317、1304-1323、1310-1329、1316-1335、1319-1338、1322-1341、1328-1347、1349-1368、1355-1374、1393-1412、1396-1415、1399-1418、1405-1424、1421-1440、1621-1640、1646-1665、1646-1665、1647-1666、1689-1708、1749-1768、1763-1782、1912-1931、2073-2092、2085-2104、2166-2185、2172-2191、2189-2208、2191-2210、2193-2212、2195-2210、2195-2214、2196-2215、2197-2212、2197-2216、2202-2221、2223-2238、2223-2242、2225-2240、2226-2245、2227-2242、2227-2246、2238-2257、2241-2260、2267-2286、2361-2380、2388-2407、2397-2416、2448-2467、2453-2472、2455-2474、2457-2472、2457-2476、2459-2474、2459-2478、2461-2476、2461-2480、2532-2551、2550-2569、2551-2566、2551-2570、2552-2568、2552-2570、2552-2571、2553-2568、2553-2570、2553-2571、2553-2572、2554-2571、2554-2572、2554-2573、2555-2570、2555-2572、2555-2574、2556-2573、2556-2574、2556-2575、2557-2573、2557-2574、2557-2575、2557-2576、2558-2575、2558-2576、2558-2577、2559-2576、2559-2577、2559-2578、2560-2577、2560-2578、2560-2579、2561-2576、2561-2578、2561-2579、2561-2580、2562-2577、2562-2579、2562-2581、2563-2578、2563-2580、2563-2582、2564-2581、2564-2583、2565-2584、2566-2583、2566-2585、2567-2582、2567-2584、2567-2586、2568-2583、2568-2585、2568-2587、2569-2586、2569-2588、2570-2585、2570-2587、2570-2589、2571-2586、2571-2588、2571-2590、2572-2589、2572-2590、2572-2591、2573-2590、2573-2592、2574-2590、2574-2591、2574-2593、2575-2590、2575-2591、2575-2592、2575-2594、2576-2593、2576-2595、2577-2594、2577-2595、2577-2596、2578-2594、2578-2596、2578-2597、2579-2598、2580-2596、2580-2597、2580-2598、2580-2599、2581-2597、2581-2598、2581-2599、2581-2600、2582-2598、2582-2599、2582-2600、2582-2601、2583-2599、2583-2600、2583-2601、2583-2602、2584-2600、2584-2601、2584-2602、2584-2603、2585-2601、2585-2603、2585-2604、2586-2601、2586-2602、2586-2604、2586-2605、2587-2602、2587-2603、2587-2605、2587-2606、2588-2603、2588-2604、2588-2605、2588-2606、2588-2607、2589-2604、2589-2605、2589-2606、2589-2607、2589-2608、2590-2605、2590-2606、2590-2607、2590-2608、2590-2609、2590-2609、2591-2607、2591-2608、2591-2609、2591-2610、2592-2607、2592-2608、2592-2609、2592-2610、2592-2611、2593-2608、2593-2609、2593-2610、2593-2612、2594-2609、2594-2610、2594-2611、2594-2612、2594-2613、2595-2610、2595-2611、2595-2612、2595-2613、2595-2614、2596-2611、2596-2612、2596-2613、2596-2614、2596-2615、2597-2612、2597-2612、2597-2613、2597-2614、2597-2615、2597-2616、2598-2613、2598-2614、2598-2615、2598-2616、2598-2617、2599-2614、2599-2615、2599-2616、2599-2617、2599-2618、2600-2615、2600-2616、2600-2617、2600-2618、2600-2619、2601-2616、2601-2617、2601-2618、2601-2619、2601-2620、2602-2617、2602-2618、2602-2619、2602-2620、2602-2621、2603-2618、2603-2619、2603-2620、2603-2621、2603-2622、2604-2619、2604-2620、2604-2621、2604-2622、2604-2623、2605-2620、2605-2621、2605-2622、2605-2623、2605-2624、2606-2621、2606-2622、2606-2623、2606-2624、2606-2625、2607-2622、2607-2623、2607-2624、2607-2625、2607-2626、2608-2623、2608-2624、2608-2625、2608-2626、2608-2627、2609-2624、2609-2625、2609-2626、2609-2627、2609-2628、2610-2625、2610-2626、2610-2627、2610-2628、2610-2629、2611-2626、2611-2627、2611-2628、2611-2629、2611-2630、2612-2627、2612-2628、2612-2629、2612-2630、2612-2631、2613-2628、2613-2629、2613-2630、2613-2631、2614-2629、2614-2630、2614-2631、2615-2630、2615-2631或2616-2631，并且其中所述修饰寡核苷酸与SEQID NO:1至少85％、90％、95％或100％互补。
2.一种包含修饰寡核苷酸和缀合物基团的化合物，其中所述修饰寡核苷酸，其中所述修饰寡核苷酸由8至80个连接核苷组成，所述连接核苷具有包含与SEQ ID NO:1的以下各项核碱基的等长部分100％互补的至少8个连续核碱基的部分的核碱基序列：30-49、48-63、150-169、151-170、152-171、154-169、154-173、156-171、156-175、157-176、158-173、158-177、480-499、600-619、638-657、644-663、738-757、1089-1108、1135-1154、1141-1160、1147-1166、1150-1169、1153-1172、1159-1178、1162-1181、1165-1184、1171-1186、1171-1190、1173-1188、1173-1192、1175-1190、1175-1194、1177-1196、1183-1202、1208-1227、1235-1254、1298-1317、1304-1323、1310-1329、1316-1335、1319-1338、1322-1341、1328-1347、1349-1368、1355-1374、1393-1412、1396-1415、1399-1418、1405-1424、1421-1440、1621-1640、1646-1665、1646-1665、1647-1666、1689-1708、1749-1768、1763-1782、1912-1931、2073-2092、2085-2104、2166-2185、2172-2191、2189-2208、2191-2210、2193-2212、2195-2210、2195-2214、2196-2215、2197-2212、2197-2216、2202-2221、2223-2238、2223-2242、2225-2240、2226-2245、2227-2242、2227-2246、2238-2257、2241-2260、2267-2286、2361-2380、2388-2407、2397-2416、2448-2467、2453-2472、2455-2474、2457-2472、2457-2476、2459-2474、2459-2478、2461-2476、2461-2480、2532-2551、2550-2569、2551-2566、2551-2570、2552-2568、2552-2570、2552-2571、2553-2568、2553-2570、2553-2571、2553-2572、2554-2571、2554-2572、2554-2573、2555-2570、2555-2572、2555-2574、2556-2573、2556-2574、2556-2575、2557-2573、2557-2574、2557-2575、2557-2576、2558-2575、2558-2576、2558-2577、2559-2576、2559-2577、2559-2578、2560-2577、2560-2578、2560-2579、2561-2576、2561-2578、2561-2579、2561-2580、2562-2577、2562-2579、2562-2581、2563-2578、2563-2580、2563-2582、2564-2581、2564-2583、2565-2584、2566-2583、2566-2585、2567-2582、2567-2584、2567-2586、2568-2583、2568-2585、2568-2587、2569-2586、2569-2588、2570-2585、2570-2587、2570-2589、2571-2586、2571-2588、2571-2590、2572-2589、2572-2590、2572-2591、2573-2590、2573-2592、2574-2590、2574-2591、2574-2593、2575-2590、2575-2591、2575-2592、2575-2594、2576-2593、2576-2595、2577-2594、2577-2595、2577-2596、2578-2594、2578-2596、2578-2597、2579-2598、2580-2596、2580-2597、2580-2598、2580-2599、2581-2597、2581-2598、2581-2599、2581-2600、2582-2598、2582-2599、2582-2600、2582-2601、2583-2599、2583-2600、2583-2601、2583-2602、2584-2600、2584-2601、2584-2602、2584-2603、2585-2601、2585-2603、2585-2604、2586-2601、2586-2602、2586-2604、2586-2605、2587-2602、2587-2603、2587-2605、2587-2606、2588-2603、2588-2604、2588-2605、2588-2606、2588-2607、2589-2604、2589-2605、2589-2606、2589-2607、2589-2608、2590-2605、2590-2606、2590-2607、2590-2608、2590-2609、2590-2609、2591-2607、2591-2608、2591-2609、2591-2610、2592-2607、2592-2608、2592-2609、2592-2610、2592-2611、2593-2608、2593-2609、2593-2610、2593-2612、2594-2609、2594-2610、2594-2611、2594-2612、2594-2613、2595-2610、2595-2611、2595-2612、2595-2613、2595-2614、2596-2611、2596-2612、2596-2613、2596-2614、2596-2615、2597-2612、2597-2612、2597-2613、2597-2614、2597-2615、2597-2616、2598-2613、2598-2614、2598-2615、2598-2616、2598-2617、2599-2614、2599-2615、2599-2616、2599-2617、2599-2618、2600-2615、2600-2616、2600-2617、2600-2618、2600-2619、2601-2616、2601-2617、2601-2618、2601-2619、2601-2620、2602-2617、2602-2618、2602-2619、2602-2620、2602-2621、2603-2618、2603-2619、2603-2620、2603-2621、2603-2622、2604-2619、2604-2620、2604-2621、2604-2622、2604-2623、2605-2620、2605-2621、2605-2622、2605-2623、2605-2624、2606-2621、2606-2622、2606-2623、2606-2624、2606-2625、2607-2622、2607-2623、2607-2624、2607-2625、2607-2626、2608-2623、2608-2624、2608-2625、2608-2626、2608-2627、2609-2624、2609-2625、2609-2626、2609-2627、2609-2628、2610-2625、2610-2626、2610-2627、2610-2628、2610-2629、2611-2626、2611-2627、2611-2628、2611-2629、2611-2630、2612-2627、2612-2628、2612-2629、2612-2630、2612-2631、2613-2628、2613-2629、2613-2630、2613-2631、2614-2629、2614-2630、2614-2631、2615-2630、2615-2631或2616-2631，并且其中所述修饰寡核苷酸与SEQ ID NO:1至少85％、90％、95％或100％互补。
3.一种包含修饰寡核苷酸和缀合物基团的化合物，其中所述修饰寡核苷酸由在SEQ IDNO:2的以下各项核碱基内互补的8至80个连接核苷组成：1608-1627、1685-1704、1686-1705、1751-1770、1769-1784、1871-1890、1872-1891、1873-1892、1875-1890、1875-1894、1877-1892、1877-1896、1878-1897、1879-1894、1879-1898、2288-2307、2808-2827、2846-2865、2852-2871、2946-2965、3773-3792、3819-3838、3825-3844、3831-3850、3834-3853、3837-3856、3843-3862、4151-4166、4151-4170、4153-4172、4159-4178、4184-4203、4211-4230、4609-4628、4612-4631、4615-4634、4621-4640、4642-4661、4648-4667、4686-4705、4689-4708、4692-4711、4698-4717、4714-4733、5270-5289、5295-5314、5296-5315、5830-5849、5890-5909、5904-5923、6406-6425、6662-6681、6674-6693、6954-6973、6960-6979、6977-6996、6979-6998、6981-7000、6983-6998、6983-7002、6984-7003、6985-7000、6985-7004、6990-7009、7122-7141、7125-7144、7151-7170、7353-7372、7362-7381、7683-7702、7688-7707、7690-7709、7692-7707、7692-7711、7694-7709、7694-7713、7696-7711、7696-7715、7767-7786、7785-7804、7786-7801、7787-7803、7787-7805、7787-7806、7788-7803、7788-7805、7788-7806、7788-7807、7789-7806、7789-7807、7789-7808、7790-7805、7790-7807、7790-7809、7791-7808、7791-7809、7791-7810、7792-7808、7792-7809、7792-7810、7792-7811、7793-7810、7793-7811、7793-7812、7794-7811、7794-7812、7794-7813、7795-7812、7795-7813、7795-7814、7796-7811、7796-7813、7796-7814、7796-7815、7797-7812、7797-7814、7797-7816、7798-7813、7798-7815、7798-7817、7799-7816、7799-7818、7800-7819、7801-7818、7801-7820、7802-7817、7802-7819、7802-7821、7803-7818、7803-7820、7803-7822、7804-7821、7804-7823、7805-7820、7805-7822、7805-7824、7806-7821、7806-7823、7806-7825、7807-7824、7807-7825、7807-7826、7808-7825、7808-7827、7809-7825、7809-7826、7809-7828、7810-7825、7810-7826、7810-7827、7810-7829、7811-7828、7811-7830、7812-7829、7812-7830、7812-7831、7813-7829、7813-7831、7813-7832、7814-7833、7815-7831、7815-7832、7815-7833、7815-7834、7816-7832、7816-7833、7816-7834、7816-7835、7817-7833、7817-7834、7817-7835、7817-7836、7818-7834、7818-7835、7818-7836、7818-7837、7819-7835、7819-7836、7819-7837、7819-7838、7820-7836、7820-7838、7820-7839、7821-7836、7821-7837、7821-7839、7821-7840、7822-7837、7822-7838、7822-7840、7822-7841、7823-7838、7823-7839、7823-7839、7823-7840、7823-7841、7823-7842、7824-7839、7824-7840、7824-7840、7824-7841、7824-7842、7824-7843、7825-7840、7825-7841、7825-7842、7825-7843、7825-7844、7826-7842、7826-7843、7826-7844、7826-7845、7827-7842、7827-7843、7827-7844、7827-7845、7827-7846、7828-7843、7828-7844、7828-7845、7828-7847、7829-7844、7829-7845、7829-7846、7829-7847、7829-7848、7830-7845、7830-7846、7830-7847、7830-7848、7830-7849、7831-7846、7831-7847、7831-7848、7831-7849、7831-7850、7832-7847、7832-7848、7832-7849、7832-7850、7832-7851、7833-7848、7833-7849、7833-7850、7833-7851、7833-7852、7834-7849、7834-7850、7834-7851、7834-7852、7834-7853、7835-7850、7835-7851、7835-7852、7835-7853、7835-7854、7836-7851、7836-7852、7836-7853、7836-7854、7836-7855、7837-7852、7837-7853、7837-7854、7837-7855、7837-7856、7838-7853、7838-7854、7838-7855、7838-7856、7838-7857、7839-7854、7839-7855、7839-7856、7839-7857、7839-7858、7840-7855、7840-7856、7840-7857、7840-7858、7840-7859、7841-7856、7841-7857、7841-7858、7841-7859、7841-7860、7842-7857、7842-7858、7842-7859、7842-7860、7842-7861、7843-7858、7843-7859、7843-7860、7843-7861、7843-7862、7844-7859、7844-7860、7844-7861、7844-7862、7845-7860、7845-7861、7845-7862、7846-7861或7846-7862，并且其中所述修饰寡核苷酸与SEQ ID NO:2至少85％、90％、95％或100％互补。
4.一种包含修饰寡核苷酸和缀合物基团的化合物，其中所述修饰寡核苷酸由8至80个连接核苷组成，所述连接核苷具有包含与SEQ ID NO:2的以下各项核碱基的等长部分100％互补的至少8个连续核碱基的部分的核碱基序列：1608-1627、1685-1704、1686-1705、1751-1770、1769-1784、1871-1890、1872-1891、1873-1892、1875-1890、1875-1894、1877-1892、1877-1896、1878-1897、1879-1894、1879-1898、2288-2307、2808-2827、2846-2865、2852-2871、2946-2965、3773-3792、3819-3838、3825-3844、3831-3850、3834-3853、3837-3856、3843-3862、4151-4166、4151-4170、4153-4172、4159-4178、4184-4203、4211-4230、4609-4628、4612-4631、4615-4634、4621-4640、4642-4661、4648-4667、4686-4705、4689-4708、4692-4711、4698-4717、4714-4733、5270-5289、5295-5314、5296-5315、5830-5849、5890-5909、5904-5923、6406-6425、6662-6681、6674-6693、6954-6973、6960-6979、6977-6996、6979-6998、6981-7000、6983-6998、6983-7002、6984-7003、6985-7000、6985-7004、6990-7009、7122-7141、7125-7144、7151-7170、7353-7372、7362-7381、7683-7702、7688-7707、7690-7709、7692-7707、7692-7711、7694-7709、7694-7713、7696-7711、7696-7715、7767-7786、7785-7804、7786-7801、7787-7803、7787-7805、7787-7806、7788-7803、7788-7805、7788-7806、7788-7807、7789-7806、7789-7807、7789-7808、7790-7805、7790-7807、7790-7809、7791-7808、7791-7809、7791-7810、7792-7808、7792-7809、7792-7810、7792-7811、7793-7810、7793-7811、7793-7812、7794-7811、7794-7812、7794-7813、7795-7812、7795-7813、7795-7814、7796-7811、7796-7813、7796-7814、7796-7815、7797-7812、7797-7814、7797-7816、7798-7813、7798-7815、7798-7817、7799-7816、7799-7818、7800-7819、7801-7818、7801-7820、7802-7817、7802-7819、7802-7821、7803-7818、7803-7820、7803-7822、7804-7821、7804-7823、7805-7820、7805-7822、7805-7824、7806-7821、7806-7823、7806-7825、7807-7824、7807-7825、7807-7826、7808-7825、7808-7827、7809-7825、7809-7826、7809-7828、7810-7825、7810-7826、7810-7827、7810-7829、7811-7828、7811-7830、7812-7829、7812-7830、7812-7831、7813-7829、7813-7831、7813-7832、7814-7833、7815-7831、7815-7832、7815-7833、7815-7834、7816-7832、7816-7833、7816-7834、7816-7835、7817-7833、7817-7834、7817-7835、7817-7836、7818-7834、7818-7835、7818-7836、7818-7837、7819-7835、7819-7836、7819-7837、7819-7838、7820-7836、7820-7838、7820-7839、7821-7836、7821-7837、7821-7839、7821-7840、7822-7837、7822-7838、7822-7840、7822-7841、7823-7838、7823-7839、7823-7839、7823-7840、7823-7841、7823-7842、7824-7839、7824-7840、7824-7840、7824-7841、7824-7842、7824-7843、7825-7840、7825-7841、7825-7842、7825-7843、7825-7844、7826-7842、7826-7843、7826-7844、7826-7845、7827-7842、7827-7843、7827-7844、7827-7845、7827-7846、7828-7843、7828-7844、7828-7845、7828-7847、7829-7844、7829-7845、7829-7846、7829-7847、7829-7848、7830-7845、7830-7846、7830-7847、7830-7848、7830-7849、7831-7846、7831-7847、7831-7848、7831-7849、7831-7850、7832-7847、7832-7848、7832-7849、7832-7850、7832-7851、7833-7848、7833-7849、7833-7850、7833-7851、7833-7852、7834-7849、7834-7850、7834-7851、7834-7852、7834-7853、7835-7850、7835-7851、7835-7852、7835-7853、7835-7854、7836-7851、7836-7852、7836-7853、7836-7854、7836-7855、7837-7852、7837-7853、7837-7854、7837-7855、7837-7856、7838-7853、7838-7854、7838-7855、7838-7856、7838-7857、7839-7854、7839-7855、7839-7856、7839-7857、7839-7858、7840-7855、7840-7856、7840-7857、7840-7858、7840-7859、7841-7856、7841-7857、7841-7858、7841-7859、7841-7860、7842-7857、7842-7858、7842-7859、7842-7860、7842-7861、7843-7858、7843-7859、7843-7860、7843-7861、7843-7862、7844-7859、7844-7860、7844-7861、7844-7862、7845-7860、7845-7861、7845-7862、7846-7861或7846-7862，并且其中所述修饰寡核苷酸的所述核碱基序列与SEQ ID NO:2至少85％、90％、95％或100％互补。
5.一种包含修饰寡核苷酸和缀合物基团的化合物，其中所述修饰寡核苷酸靶向CFB核酸的3’UTR。
6.如权利要求5所述的化合物，其中所述修饰寡核苷酸靶向在具有SEQ ID NO:1的所述核碱基序列的CFB核酸的核苷酸2574-2626内。
7.一种包含修饰寡核苷酸和缀合物基团的化合物，其中所述修饰寡核苷酸由8至80个连接核苷组成，所述连接核苷具有包含与具有SEQ ID NO:1的核碱基序列的CFB核酸的以下各项核碱基的等长部分互补的至少8个连续核碱基的部分的所述核碱基序列：2457-2631、2457-2472、2457-2474、2457-2476、2457-2566、2457-2570、2457-2571、2457-2572、2457-2573、2457-2574、2457-2575、2457-2576、2457-2577、2457-2578、2457-2579、2457-2580、2457-2581、2457-2582、2457-2583、2457-2584、2457-2585、2457-2586、2457-2587、2457-2588、2457-2589、2457-2590、2457-2591、2457-2592、2457-2593、2457-2594、2457-2595、2457-2596、2457-2597、2457-2598、2457-2599、2457-2600、2457-2601、2457-2602、2457-2603、2457-2604、2457-2605、2457-2606、2457-2607、2457-2608、2457-2609、2457-2610、2457-2611、2457-2612、2457-2613、2457-2614、2457-2615、2457-2616、2457-2617、2457-2618、2457-2619、2457-2620、2457-2621、2457-2622、2457-2623、2457-2624、2457-2625、2457-2626、2457-2627、2457-2628、2457-2629、2457-2630、2457-2631、2459-2474、2459-2476、2459-2566、2459-2570、2459-2571、2459-2572、2459-2573、2459-2574、2459-2575、2459-2576、2459-2577、2459-2578、2459-2579、2459-2580、2459-2581、2459-2582、2459-2583、2459-2584、2459-2585、2459-2586、2459-2587、2459-2588、2459-2589、2459-2590、2459-2591、2459-2592、2459-2593、2459-2594、2459-2595、2459-2596、2459-2597、2459-2598、2459-2599、2459-2600、2459-2601、2459-2602、2459-2603、2459-2604、2459-2605、2459-2606、2459-2607、2459-2608、2459-2609、2459-2610、2459-2611、2459-2612、2459-2613、2459-2614、2459-2615、2459-2616、2459-2617、2459-2618、2459-2619、2459-2620、2459-2621、2459-2622、2459-2623、2459-2624、2459-2625、2459-2626、2459-2627、2459-2628、2459-2629、2459-2630、2459-2631、2461-2476、2461-2566、2461-2570、2461-2571、2461-2572、2461-2573、2461-2574、2461-2575、2461-2576、2461-2577、2461-2578、2461-2579、2461-2580、2461-2581、2461-2582、2461-2583、2461-2584、2461-2585、2461-2586、2461-2587、2461-2588、2461-2589、2461-2590、2461-2591、2461-2592、2461-2593、2461-2594、2461-2595、2461-2596、2461-2597、2461-2598、2461-2599、2461-2600、2461-2601、2461-2602、2461-2603、2461-2604、2461-2605、2461-2606、2461-2607、2461-2608、2461-2609、2461-2610、2461-2611、2461-2612、2461-2613、2461-2614、2461-2615、2461-2616、2461-2617、2461-2618、2461-2619、2461-2620、2461-2621、2461-2622、2461-2623、2461-2624、2461-2625、2461-2626、2461-2627、2461-2628、2461-2629、2461-2630、2461-2631、2551-2566、2551-2570、2551-2571、2551-2572、2551-2573、2551-2574、2551-2575、2551-2576、2551-2577、2551-2578、2551-2579、2551-2580、2551-2581、2551-2582、2551-2583、2551-2584、2551-2585、2551-2586、2551-2587、2551-2588、2551-2589、2551-2590、2551-2591、2551-2592、2551-2593、2551-2594、2551-2595、2551-2596、2551-2597、2551-2598、2551-2599、2551-2600、2551-2601、2551-2602、2551-2603、2551-2604、2551-2605、2551-2606、2551-2607、2551-2608、2551-2609、2551-2610、2551-2611、2551-2612、2551-2613、2551-2614、2551-2615、2551-2616、2551-2617、2551-2618、2551-2619、2551-2620、2551-2621、2551-2622、2551-2623、2551-2624、2551-2625、2551-2626、2551-2627、2551-2628、2551-2629、2551-2630、2551-2631、2553-2570、2553-2571、2553-2572、2553-2573、2553-2574、2553-2575、2553-2576、2553-2577、2553-2578、2553-2579、2553-2580、2553-2581、2553-2582、2553-2583、2553-2584、2553-2585、2553-2586、2553-2587、2553-2588、2553-2589、2553-2590、2553-2591、2553-2592、2553-2593、2553-2594、2553-2595、2553-2596、2553-2597、2553-2598、2553-2599、2553-2600、2553-2601、2553-2602、2553-2603、2553-2604、2553-2605、2553-2606、2553-2607、2553-2608、2553-2609、2553-2610、2553-2611、2553-2612、2553-2613、2553-2614、2553-2615、2553-2616、2553-2617、2553-2618、2553-2619、2553-2620、2553-2621、2553-2622、2553-2623、2553-2624、2553-2625、2553-2626、2553-2627、2553-2628、2553-2629、2553-2630、2553-2631、2554-2573、2554-2574、2554-2575、2554-2576、2554-2577、2554-2578、2554-2579、2554-2580、2554-2581、2554-2582、2554-2583、2554-2584、2554-2585、2554-2586、2554-2587、2554-2588、2554-2589、2554-2590、2554-2591、2554-2592、2554-2593、2554-2594、2554-2595、2554-2596、2554-2597、2554-2598、2554-2599、2554-2600、2554-2601、2554-2602、2554-2603、2554-2604、2554-2605、2554-2606、2554-2607、2554-2608、2554-2609、2554-2610、2554-2611、2554-2612、2554-2613、2554-2614、2554-2615、2554-2616、2554-2617、2554-2618、2554-2619、2554-2620、2554-2621、2554-2622、2554-2623、2554-2624、2554-2625、2554-2626、2554-2627、2554-2628、2554-2629、2554-2630、2554-2631、2555-2572、2555-2573、2555-2574、2555-2575、2555-2576、2555-2577、2555-2578、2555-2579、2555-2580、2555-2581、2555-2582、2555-2583、2555-2584、2555-2585、2555-2586、2555-2587、2555-2588、2555-2589、2555-2590、2555-2591、2555-2592、2555-2593、2555-2594、2555-2595、2555-2596、2555-2597、2555-2598、2555-2599、2555-2600、2555-2601、2555-2602、2555-2603、2555-2604、2555-2605、2555-2606、2555-2607、2555-2608、2555-2609、2555-2610、2555-2611、2555-2612、2555-2613、2555-2614、2555-2615、2555-2616、2555-2617、2555-2618、2555-2619、2555-2620、2555-2621、2555-2622、2555-2623、2555-2624、2555-2625、2555-2626、2555-2627、2555-2628、2555-2629、2555-2630、2555-2631、2556-2573、2556-2574、2556-2575、2556-2576、2556-2577、2556-2578、2556-2579、2556-2580、2556-2581、2556-2582、2556-2583、2556-2584、2556-2585、2556-2586、2556-2587、2556-2588、2556-2589、2556-2590、2556-2591、2556-2592、2556-2593、2556-2594、2556-2595、2556-2596、2556-2597、2556-2598、2556-2599、2556-2600、2556-2601、2556-2602、2556-2603、2556-2604、2556-2605、2556-2606、2556-2607、2556-2608、2556-2609、2556-2610、2556-2611、2556-2612、2556-2613、2556-2614、2556-2615、2556-2616、2556-2617、2556-2618、2556-2619、2556-2620、2556-2621、2556-2622、2556-2623、2556-2624、2556-2625、2556-2626、2556-26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18、2577-2619、2577-2620、2577-2621、2577-2622、2577-2623、2577-2624、2577-2625、2577-2626、2577-2627、2577-2628、2577-2629、2577-2630、2577-2631、2578-2597、2578-2598、2578-2599、2578-2600、2578-2601、2578-2602、2578-2603、2578-2604、2578-2605、2578-2606、2578-2607、2578-2608、2578-2609、2578-2610、2578-2611、2578-2612、2578-2613、2578-2614、2578-2615、2578-2616、2578-2617、2578-2618、2578-2619、2578-2620、2578-2621、2578-2622、2578-2623、2578-2624、2578-2625、2578-2626、2578-2627、2578-2628、2578-2629、2578-2630、2578-2631、2579-2598、2579-2599、2579-2600、2579-2601、2579-2602、2579-2603、2579-2604、2579-2605、2579-2606、2579-2607、2579-2608、2579-2609、2579-2610、2579-2611、2579-2612、2579-2613、2579-2614、2579-2615、2579-2616、2579-2617、2579-2618、2579-2619、2579-2620、2579-2621、2579-2622、2579-2623、2579-2624、2579-2625、2579-2626、2579-2627、2579-2628、2579-2629、2579-2630、2579-2631、2580-2598、2580-2599、2580-2600、2580-2601、2580-2602、2580-2603、2580-2604、2580-2605、2580-2606、2580-2607、2580-2608、2580-2609、2580-2610、2580-2611、2580-2612、2580-2613、2580-2614、2580-2615、2580-2616、2580-2617、2580-2618、2580-2619、2580-2620、2580-2621、2580-2622、2580-2623、2580-2624、2580-2625、2580-2626、2580-2627、2580-2628、2580-2629、2580-2630、2580-2631、2581-2597、2581-2598、2581-2599、2581-2600、2581-2601、2581-2602、2581-2603、2581-2604、2581-2605、2581-2606、2581-2607、2581-2608、2581-2609、2581-2610、2581-2611、2581-2612、2581-2613、2581-2614、2581-2615、2581-2616、2581-2617、2581-2618、2581-2619、2581-2620、2581-2621、2581-2622、2581-2623、2581-2624、2581-2625、2581-2626、2581-2627、2581-2628、2581-2629、2581-2630、2581-2631、2582-2600、2582-2601、2582-2602、2582-2603、2582-2604、2582-2605、2582-2606、2582-2607、2582-2608、2582-2609、2582-2610、2582-2611、2582-2612、2582-2613、2582-2614、2582-2615、2582-2616、2582-2617、2582-2618、2582-2619、2582-2620、2582-2621、2582-2622、2582-2623、2582-2624、2582-2625、2582-2626、2582-2627、2582-2628、2582-2629、2582-2630、2582-2631、2583-2601、2583-2602、2583-2603、2583-2604、2583-2605、2583-2606、2583-2607、2583-2608、2583-2609、2583-2610、2583-2611、2583-2612、2583-2613、2583-2614、2583-2615、2583-2616、2583-2617、2583-2618、2583-2619、2583-2620、2583-2621、2583-2622、2583-2623、2583-2624、2583-2625、2583-2626、2583-2627、2583-2628、2583-2629、2583-2630、2583-2631、2585-2603、2585-2604、2585-2605、2585-2606、2585-2607、2585-2608、2585-2609、2585-2610、2585-2611、2585-2612、2585-2613、2585-2614、2585-2615、2585-2616、2585-2617、2585-2618、2585-2619、2585-2620、2585-2621、2585-2622、2585-2623、2585-2624、2585-2625、2585-2626、2585-2627、2585-2628、2585-2629、2585-2630、2585-2631、2586-2604、2586-2605、2586-2606、2586-2607、2586-2608、2586-2609、2586-2610、2586-2611、2586-2612、2586-2613、2586-2614、2586-2615、2586-2616、2586-2617、2586-2618、2586-2619、2586-2620、2586-2621、2586-2622、2586-2623、2586-2624、2586-2625、2586-2626、2586-2627、2586-2628、2586-2629、2586-2630、2586-2631、2587-2605、2587-2606、2587-2607、2587-2608、2587-2609、2587-2610、2587-2611、2587-2612、2587-2613、2587-2614、2587-2615、2587-2616、2587-2617、2587-2618、2587-2619、2587-2620、2587-2621、2587-2622、2587-2623、2587-2624、2587-2625、2587-2626、2587-2627、2587-2628、2587-2629、2587-2630、2587-2631、2588-2606、2588-2607、2588-2608、2588-2609、2588-2610、2588-2611、2588-2612、2588-2613、2588-2614、2588-2615、2588-2616、2588-2617、2588-2618、2588-2619、2588-2620、2588-2621、2588-2622、2588-2623、2588-2624、2588-2625、2588-2626、2588-2627、2588-2628、2588-2629、2588-2630、2588-2631、2589-2607、2589-2608、2589-2609、2589-2610、2589-2611、2589-2612、2589-2613、2589-2614、2589-2615、2589-2616、2589-2617、2589-2618、2589-2619、2589-2620、2589-2621、2589-2622、2589-2623、2589-2624、2589-2625、2589-2626、2589-2627、2589-2628、2589-2629、2589-2630、2589-2631、2590-2606、2590-2607、2590-2608、2590-2609、2590-2610、2590-2611、2590-2612、2590-2613、2590-2614、2590-2615、2590-2616、2590-2617、2590-2618、2590-2619、2590-2620、2590-2621、2590-2622、2590-2623、2590-2624、2590-2625、2590-2626、2590-2627、2590-2628、2590-2629、2590-2630、2590-2631、2591-2610、2591-2611、2591-2612、2591-2613、2591-2614、2591-2615、2591-2616、2591-2617、2591-2618、2591-2619、2591-2620、2591-2621、2591-2622、2591-2623、2591-2624、2591-2625、2591-2626、2591-2627、2591-2628、2591-2629、2591-2630、2591-2631、2592-2611、2592-2612、2592-2613、2592-2614、2592-2615、2592-2616、2592-2617、2592-2618、2592-2619、2592-2620、2592-2621、2592-2622、2592-2623、2592-2624、2592-2625、2592-2626、2592-2627、2592-2628、2592-2629、2592-2630、2592-2631、2593-2608、2593-2612、2593-2613、2593-2614、2593-2615、2593-2616、2593-2617、2593-2618、2593-2619、2593-2620、2593-2621、2593-2622、2593-2623、2593-2624、2593-2625、2593-2626、2593-2627、2593-2628、2593-2629、2593-2630、2593-2631、2594-2612、2594-2613、2594-2614、2594-2615、2594-2616、2594-2617、2594-2618、2594-2619、2594-2620、2594-2621、2594-2622、2594-2623、2594-2624、2594-2625、2594-2626、2594-2627、2594-2628、2594-2629、2594-2630、2594-2631、2595-2611、2595-2612、2595-2613、2595-2614、2595-2615、2595-2616、2595-2617、2595-2618、2595-2619、2595-2620、2595-2621、2595-2622、2595-2623、2595-2624、2595-2625、2595-2626、2595-2627、2595-2628、2595-2629、2595-2630、2595-2631、2596-2614、2596-2615、2596-2616、2596-2617、2596-2618、2596-2619、2596-2620、2596-2621、2596-2622、2596-2623、2596-2624、2596-2625、2596-2626、2596-2627、2596-2628、2596-2629、2596-2630、2596-2631、2597-2612、2597-26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ID NO:1互补。
8.一种包含修饰寡核苷酸和缀合物基团的化合物，其中所述修饰寡核苷酸由在SEQ IDNO:1的核苷酸2193-2212、2195-2210、2457-2476、2571-2590、2584-2603、2588-2607、2592-2611、2594-2613、2597-2616、2600-2619或2596-2611内互补的8至80个连接核苷组成。
9.一种包含修饰寡核苷酸和缀合物基团的化合物，其中所述修饰寡核苷酸由具有包含SEQ ID NO:198、228、237、440、444、448、450、453、455、549以及598的任一个的核碱基序列的8至80个连接核苷组成。
10.一种包含修饰寡核苷酸和缀合物基团的化合物，其中所述修饰寡核苷酸具有由SEQID NO:198、228、237、440、444、448、450、453、455、549以及598的任一个组成的核碱基序列。
11.一种包含修饰寡核苷酸和缀合物基团的化合物，其中所述修饰寡核苷酸由10至30个连接核苷组成并且具有包含SEQ ID NO:6-808的核碱基序列中任一个的至少8个连续核碱基的所述核碱基序列。
12.一种包含修饰寡核苷酸和缀合物基团的化合物，其中所述修饰寡核苷酸由10至30个连接核苷组成并且具有包含SEQ ID NO:6-808的所述核碱基序列中的任一个的至少9个连续核碱基的核碱基序列。
13.一种包含修饰寡核苷酸和缀合物基团的化合物，其中所述修饰寡核苷酸由10至30个连接核苷组成并且具有包含SEQ ID NO:6-808的核碱基序列中任一个的至少10个连续核碱基的所述核碱基序列。
14.一种包含修饰寡核苷酸和缀合物基团的化合物，其中所述修饰寡核苷酸由10至30个连接核苷组成并且具有包含SEQ ID NO:6-808的核碱基序列中任一个的至少11个连续核碱基的所述核碱基序列。
15.一种包含修饰寡核苷酸和缀合物基团的化合物，其中所述修饰寡核苷酸由10至30个连接核苷组成并且具有包含SEQ ID NO:6-808的核碱基序列中任一个的至少12个连续核碱基的所述核碱基序列。
16.一种包含修饰寡核苷酸和缀合物基团的化合物，其中所述修饰寡核苷酸由10至30个连接核苷组成并且具有包含SEQ ID NO:6-808的任一个的核碱基序列的所述核碱基序列。
17.一种包含修饰寡核苷酸和缀合物基团的化合物，其中所述修饰寡核苷酸由SEQ IDNO:6-808的任一个的所述核碱基序列组成。
18.一种包含修饰寡核苷酸和缀合物基团的化合物，其中所述修饰寡核苷酸具有包含以下SEQ ID NO的任一个的至少一个8个核碱基的部分的核碱基序列：84、238、239、317、412、413、420、421、426、434、436、437、438、439、440、442、443、444、445、446、448、451、452、453、454、455、456、457、458、459、460、461、462、464、465、472、473、514、515、542、543、544、545、546、551、553、555、556、599、600、601、602、610、616、617、618、662、666、670、676、677、678、688、689、713、723、729、730、740、741、742、743、744、745、746、747、748、749、755、756、768、783、793、833以及867。
19.一种包含修饰寡核苷酸和缀合物基团的化合物，其中所述修饰寡核苷酸由具有包含SEQ ID NO:198、228、237、440、444、448、450、453、455、549以及598的任一个的核碱基序列的10至30个连接核苷组成，其中所述修饰寡核苷酸包含：
由连接脱氧核苷组成的缺口区段；
由连接核苷组成的5’翼区段；以及
由连接核苷组成的3’翼区段；
其中所述缺口区段定位在所述5’翼区段与所述3’翼区段之间并且其中每个翼区段的每个核苷包含修饰的糖。
20.一种包含修饰寡核苷酸和缀合物基团的化合物，其中所述修饰寡核苷酸由具有包含SEQ ID NO:198、228、237、440、444、448、450、453以及455中所示的序列组成的核碱基序列的20个连接核苷组成，其中所述修饰寡核苷酸包含：
由十个连接脱氧核苷组成的缺口区段；
由五个连接核苷组成的5’翼区段；以及
由五个连接核苷组成的3’翼区段；
其中所述缺口区段定位在所述5’翼区段与所述3’翼区段之间并且其中每个翼区段的每个核苷包含2’-O-甲氧基乙基糖，其中每个核苷间键联为硫代磷酸酯键联并且其中每个胞嘧啶为5-甲基胞嘧啶。
21.一种包含修饰寡核苷酸和缀合物基团的化合物，其中所述修饰寡核苷酸由具有包含SEQ ID NO:598中所示的序列组成的核碱基序列的16个连接核苷组成，其中所述修饰寡核苷酸包含：
由十个连接脱氧核苷组成的缺口区段；
由三个连接的核苷组成的5’翼区段；以及
由三个连接的核苷组成的3’翼区段；
其中所述缺口区段定位在所述5’翼区段与所述3’翼区段之间；其中所述5’翼区段包含2’-O-甲氧基乙基糖、2’-O-甲氧基乙基糖以及5’至3’方向上的cEt糖；其中所述3’翼区段包含cEt糖、cEt糖以及5’至3’方向上的2’-O-甲氧基乙基糖；其中每个核苷间键联为硫代磷酸酯键联；并且其中每个胞嘧啶为5-甲基胞嘧啶。
22.一种包含修饰寡核苷酸和缀合物基团的化合物，其中所述修饰寡核苷酸由具有包含SEQ ID NO:549中所示的序列组成的核碱基序列的16个连接核苷组成，其中所述修饰寡核苷酸包含：
由十个连接脱氧核苷组成的缺口区段；
由三个连接的核苷组成的5’翼区段；以及
由三个连接的核苷组成的3’翼区段；
其中所述缺口区段定位在所述5’翼区段与所述3’翼区段之间并且其中每个翼区段的每个核苷包含cEt糖，其中每个核苷间键联为硫代磷酸酯键联并且其中每个胞嘧啶为5-甲基胞嘧啶。
23.如权利要求1-22中任一项所述的化合物，其中所述寡核苷酸与SEQ ID NO:1或2至少80％、85％、90％、95％或100％互补。
24.如权利要求1-23中任一项所述的化合物，其中所述修饰寡核苷酸包含至少一个修饰的核苷间键联、至少一个修饰的糖或至少一个修饰的核碱基。
25.如权利要求24所述的化合物，其中所述修饰的核苷间键联为硫代磷酸酯核苷间键联。
26.如权利要求25所述的化合物，其中所述修饰寡核苷酸包含至少1个磷酸二酯核苷间键联。
27.如权利要求25所述的化合物，其中所述修饰寡核苷酸包含至少2个磷酸二酯核苷间键联。
28.如权利要求25所述的化合物，其中所述修饰寡核苷酸包含至少3个磷酸二酯核苷间键联。
29.如权利要求25所述的化合物，其中所述修饰寡核苷酸包含至少4个磷酸二酯核苷间键联。
30.如权利要求25所述的化合物，其中所述修饰寡核苷酸包含至少5个磷酸二酯核苷间键联。
31.如权利要求25所述的化合物，其中所述修饰寡核苷酸包含至少6个磷酸二酯核苷间键联。
32.如权利要求25所述的化合物，其中所述修饰寡核苷酸包含至少7个磷酸二酯核苷间键联。
33.如权利要求26-32中任一项所述的化合物，其中所述修饰寡核苷酸的每个核苷间键联选自磷酸二酯核苷间键联和硫代磷酸酯核苷间键联。
34.如权利要求25所述的化合物，其中所述修饰寡核苷酸的每个核苷间键联包含硫代磷酸酯核苷间键联。
35.如权利要求24-34中任一项所述的化合物，其中所述修饰的糖为双环糖。
36.如权利要求35所述的化合物，其中所述双环糖选自由以下组成的组：4'-(CH2)-O-2'(LNA)、4'-(CH2)2-O-2'(ENA)以及4'-CH(CH3)-O-2'(cEt)。
37.如权利要求24-34中任一项所述的化合物，其中所述修饰的糖为2’-O-甲氧基乙基。
38.如权利要求24-37中任一项所述的化合物，其中所述修饰的核碱基为5-甲基胞嘧啶。
39.如权利要求1-38中任一项所述的化合物，其中所述修饰的寡核苷酸包含：
(a)由连接脱氧核苷组成的缺口区段；
(b)由连接核苷组成的5’翼区段；以及
(c)由连接核苷组成的3’翼区段；
其中所述缺口区段被定位成直接相邻于所述5’翼区段与所述3’翼区段且在所述5’翼区段与所述3’翼区段之间并且其中每个翼区段的每个核苷包含修饰的糖。
40.如权利要求1-39中任一项所述的化合物，其中所述化合物为单链的。
41.如权利要求1-39中任一项所述的化合物，其中所述化合物为双链的。
42.如权利要求1-41中任一项所述的化合物，其中所述化合物包含核糖核苷酸。
43.如权利要求1-41中任一项所述的化合物，其中所述化合物包含脱氧核糖核苷酸。
44.如权利要求1-43中任一项所述的化合物，其中所述修饰寡核苷酸由10至30个连接核苷组成。
45.如权利要求1-43中任一项所述的化合物，其中所述修饰寡核苷酸由12至30个连接核苷组成。
46.如权利要求1-43中任一项所述的化合物，其中所述修饰寡核苷酸由15至30个连接核苷组成。
47.一种化合物，所述化合物由ISIS 532770、ISIS 532800、ISIS 532809、ISIS588540、ISIS 588544、ISIS 588548、ISIS 588550、ISIS 588553、ISIS 588555、ISIS588848或ISIS 594430以及缀合物基团组成。
48.如权利要求1至47中任一项所述的化合物，其中所述缀合物基团在所述修饰寡核苷酸的5’末端处连接至所述修饰寡核苷酸。
49.如权利要求1至47中任一项所述的化合物，其中所述缀合物基团在所述修饰寡核苷酸的3’末端处连接至所述修饰寡核苷酸。
50.如权利要求1-49中任一项所述的化合物，其中所述缀合物基团包含恰好一个配体。
51.如权利要求1-49中任一项所述的化合物，其中所述缀合物基团包含恰好两个配体。
52.如权利要求1-49中任一项所述的化合物，其中所述缀合物基团包含三个或更多个配体。
53.如权利要求1-49中任一项所述的化合物，其中所述缀合物基团包含恰好三个配体。
54.如权利要求50-53中任一项所述的化合物，其中每个配体选自以下：多糖、修饰的多糖、甘露糖、半乳糖、甘露糖衍生物、半乳糖衍生物、D-吡喃甘露糖、L-吡喃甘露糖、D-阿拉伯糖、L-半乳糖、D-呋喃木糖、L-呋喃木糖、D-葡萄糖、L-葡萄糖、D-半乳糖、L-半乳糖、α-D-呋喃甘露糖、β-D-呋喃甘露糖、α-D-吡喃甘露糖、β-D-吡喃甘露糖、α-D-吡喃葡萄糖、β-D-吡喃葡萄糖、α-D-呋喃葡萄糖、β-D-呋喃葡萄糖、α-D-呋喃果糖、α-D-吡喃果糖、α-D-吡喃半乳糖、β-D-吡喃半乳糖、α-D-呋喃半乳糖、β-D-呋喃半乳糖、葡萄糖胺、唾液酸、α-D-半乳糖胺、N-乙酰基半乳糖胺、2-氨基-3-O-[(R)-1-羧乙基]-2-脱氧-β-D-吡喃葡萄糖、2-脱氧-2-甲基氨基-L-吡喃葡萄糖、4,6-二脱氧-4-甲酰氨基-2,3-二-O-甲基-D-吡喃甘露糖、2-脱氧-2-磺氨基-D-吡喃葡萄糖、N-乙醇酰基-α-神经氨酸、5-硫代-β-D-吡喃葡萄糖、2,3,4-三-O-乙酰基-1-硫代-6-O-三苯甲基-α-D-吡喃葡萄糖苷甲酯、4-硫代-β-D-吡喃半乳糖、3,4,6,7-四-O-乙酰基-2-脱氧-1,5-二硫代-α-D-吡喃葡庚糖苷乙酯、2,5-脱水-D-阿洛糖腈、核糖、D-核糖、D-4-硫代核糖、L-核糖、L-4-硫代核糖。
55.如权利要求54所述的化合物，其中每个配体为N-乙酰基半乳糖胺。
56.如权利要求1至55中任一项所述的化合物，其中所述缀合物基团包含：
57.如权利要求1至55中任一项所述的化合物，其中所述缀合物基团包含：
58.如权利要求1至55中任一项所述的化合物，其中所述缀合物基团包含：
59.如权利要求1至55中任一项所述的化合物，其中所述缀合物基团包含：
60.如权利要求1至55中任一项所述的化合物，其中所述缀合物基团包含：
61.如权利要求49至60中任一项所述的化合物，其中所述缀合物基团包含至少一个磷连接基团或中性连接基团。
62.如权利要求1至61中任一项所述的化合物，其中所述缀合物基团包含选自以下的结构：
其中n为1至12；并且
其中m为1至12。
63.如权利要求1至62中任一项所述的化合物，其中所述缀合物基团具有其结构选自以下的系链：
其中L为磷连接基团或中性连接基团；
Z1为C(＝O)O-R2；
Z2为H、C1-C6烷基或取代的C1-C6烷基；
R2为H、C1-C6烷基或取代的C1-C6烷基；并且
每个m1独立地为0至20，其中对于每个系链，至少一个m1大于0。
64.如权利要求63所述的化合物，其中缀合物基团包含具有选自以下的结构的系链：
其中Z2为H或CH3；并且
每个m1独立地为0至20，其中对于每个系链，至少一个m1大于0。
65.如权利要求1至64中任一项所述的化合物，其中所述缀合物基团具有其结构选自以下的系链：
其中n为1至12；并且
其中m为1至12。
66.如权利要求1至65中任一项所述的化合物，其中所述缀合物基团共价连接至所述修饰寡核苷酸。
67.如权利要求1至66中任一项所述的化合物，其中所述化合物具有由下式表示的结构：
其中
A为所述修饰寡核苷酸；
B为可裂解部分
C为缀合物接头
D为支链基团
每个E为系链；
每个F为配体；并且
q为1与5之间的整数。
68.如权利要求1至66中任一项所述的化合物，其中所述化合物具有由下式表示的结构：
其中：
A为所述修饰寡核苷酸；
B为可裂解部分
C为缀合物接头
D为支链基团
每个E为系链；
每个F为配体；
每个n独立地为0或1；并且
q为1与5之间的整数。
69.如权利要求1至66中任一项所述的化合物，其中所述化合物具有由下式表示的结构：
其中
A为所述修饰寡核苷酸；
B为可裂解部分；
C为缀合物接头；
每个E为系链；
每个F为配体；并且
q为1与5之间的整数。
70.如权利要求1至66中任一项所述的化合物，其中所述化合物具有由下式表示的结构：
其中
A为所述修饰寡核苷酸；
C为缀合物接头；
D为支链基团；
每个E为系链；
每个F为配体；并且
q为1与5之间的整数。
71.如权利要求1至66中任一项所述的化合物，其中所述化合物具有由下式表示的结构：
其中
A为所述修饰寡核苷酸；
C为缀合物接头；
每个E为系链；
每个F为配体；并且
q为1与5之间的整数。
72.如权利要求1至66中任一项所述的化合物，其中所述化合物具有由下式表示的结构：
其中
A为所述修饰寡核苷酸；
B为可裂解部分；
D为支链基团；
每个E为系链；
每个F为配体；并且
q为1与5之间的整数。
73.如权利要求1至66中任一项所述的化合物，其中所述化合物具有由下式表示的结构：
其中
A为所述修饰寡核苷酸；
B为可裂解部分；
每个E为系链；
每个F为配体；并且
q为1与5之间的整数。
74.如权利要求1至66中任一项所述的化合物，其中所述化合物具有由下式表示的结构：
其中
A为所述修饰寡核苷酸；
D为支链基团；
每个E为系链；
每个F为配体；并且
q为1与5之间的整数。
75.如权利要求1至74中任一项所述的化合物，其中所述缀合物接头具有选自以下的结构：
其中每个L独立地为磷连接基团或中性连接基团；并且
每个n独立地为1至20。
76.如权利要求1至74中任一项所述的化合物，其中所述缀合物接头具有选自以下的结构：
77.如权利要求1至74中任一项所述的化合物，其中所述缀合物接头具有以下结构：
78.如权利要求1至74中任一项所述的化合物，其中所述缀合物接头具有选自以下的结构：
79.如权利要求1至74中任一项所述的化合物，其中所述缀合物接头具有选自以下的结构：
80.如权利要求1至74中任一项所述的化合物，其中所述缀合物接头具有选自以下的结构：
81.如权利要求1至80中任一项所述的化合物，其中所述缀合物接头包含吡咯烷。
82.如权利要求1至80中任一项所述的化合物，其中所述缀合物接头不包含吡咯烷。
83.如权利要求1至82中任一项所述的化合物，其中所述缀合物接头包含PEG。
84.如权利要求1至83中任一项所述的化合物，其中所述缀合物接头包含酰胺。
85.如权利要求1至84中任一项所述的化合物，其中所述缀合物接头包含至少两个酰胺。
86.如权利要求1至83中任一项所述的化合物，其中所述缀合物接头不包含酰胺。
87.如权利要求1至86中任一项所述的化合物，其中所述缀合物接头包含聚酰胺。
88.如权利要求1至87中任一项所述的化合物，其中所述缀合物接头包含胺。
89.如权利要求1至88中任一项所述的化合物，其中所述缀合物接头包含一个或多个二硫键。
90.如权利要求1至89中任一项所述的化合物，其中所述缀合物接头包含蛋白质结合部分。
91.如权利要求90所述的化合物，其中所述蛋白质结合部分包含脂质。
92.如权利要求90所述的化合物，其中所述蛋白质结合部分选自以下：胆固醇、胆酸、金刚烷乙酸、1-芘丁酸、二氢睾酮、1,3-二-O(十六烷基)甘油、香叶基氧基己基、十六烷基甘油、冰片、薄荷醇、1,3-丙二醇、十七烷基、棕榈酸、肉豆蔻酸、O3-(油酰基)石胆酸、O3-(油酰基)胆烯酸、二甲氧基三苯甲基或吩噁嗪)、维生素(例如，叶酸、维生素A、维生素E、生物素、吡哆醛)、肽、碳水化合物(例如，单糖、二糖、三糖、四糖、寡糖、多糖)、溶内体组分、类固醇(例如，熊果醇、龙舌兰皂苷配基、薯蓣皂苷配基)、萜烯(例如，三萜烯，例如萨洒皂角苷配基、木栓酮、表木栓醇衍生的石胆酸)或阳离子脂质。
93.如权利要求90所述的化合物，其中所述蛋白质结合部分选自以下：C16至C22长链饱和或不饱和的脂肪酸、胆固醇、胆酸、维生素E、金刚烷或1-五氟丙基。
94.如权利要求1至93中任一项所述的化合物，其中所述缀合物接头具有选自以下的结构：
其中每个n独立地为1至20；并且p为1至6。
95.如权利要求1至94中任一项所述的化合物，其中所述缀合物接头具有选自以下的结构：
其中每个n独立地为1至20。
96.如权利要求1至94中任一项所述的化合物，其中所述缀合物接头具有选自以下的结构：
97.如权利要求1至94中任一项所述的化合物，其中所述缀合物接头具有选自以下的结构：
其中n为1至20。
98.如权利要求1至94中任一项所述的化合物，其中所述缀合物接头具有选自以下的结构：
99.如权利要求1至94中任一项所述的化合物，其中所述缀合物接头具有选自以下的结构：
其中每个n独立地为0、1、2、3、4、5、6或7。
100.如权利要求1至94中任一项所述的化合物，其中所述缀合物接头具有以下结构：
101.如权利要求1至100中任一项所述的化合物，其中所述支链基团具有以下结构之一：
其中A1各自独立地为O、S、C＝O或NH；并且
每个n独立地为1至20。
102.如权利要求1至100中任一项所述的化合物，其中所述支链基团具有以下结构之一：
其中A1各自独立地为O、S、C＝O或NH；并且
每个n独立地为1至20。
103.如权利要求1至100中任一项所述的化合物，其中所述支链基团具有以下结构：
104.如权利要求1至100中任一项所述的化合物，其中所述支链基团具有以下结构：
105.如权利要求1至100中任一项所述的化合物，其中所述支链基团具有以下结构：
106.如权利要求1至100中任一项所述的化合物，其中所述支链基团具有以下结构：
107.如权利要求1至100中任一项所述的化合物，其中所述支链基团包含醚。
108.如权利要求1至100中任一项所述的化合物，其中所述支链基团具有以下结构：
每个n独立地为1至20；并且
m为2至6。
109.如权利要求1至100中任一项所述的化合物，其中所述支链基团具有以下结构：
110.如权利要求1至100中任一项所述的化合物，其中所述支链基团具有以下结构：
111.如权利要求1至100中任一项所述的化合物，其中所述支链基团包含：
其中每个j为1至3的整数；并且
其中每个n为1至20的整数。
112.如权利要求1至100中任一项所述的化合物，其中所述支链基团包含：
113.如权利要求1至112中任一项所述的化合物，其中每个系链选自以下：
其中L选自磷连接基团和中性连接基团；
Z1为C(＝O)O-R2；
Z2为H、C1-C6烷基或取代的C1-C6烷基；
R2为H、C1-C6烷基或取代的C1-C6烷基；并且
每个m1独立地为0至20，其中对于每个系链，至少一个m1大于0。
114.如权利要求1至112中任一项所述的化合物，其中每个系链选自以下：
其中Z2为H或CH3；并且
每个m2独立地为0至20，其中对于每个系链，至少一个m2大于0。
115.如权利要求1至112中任一项所述的化合物，其中每个系链选自以下：
其中n为1至12，并且
其中m为1至12。
116.如权利要求1至112中任一项所述的化合物，其中至少一个系链包含乙二醇。
117.如权利要求1至116中任一项所述的化合物，其中至少一个系链包含酰胺。
118.如权利要求1至117中任一项所述的化合物，其中至少一个系链包含聚酰胺。
119.如权利要求1至118中任一项所述的化合物，其中至少一个系链包含胺。
120.如权利要求1至119中任一项所述的化合物，其中至少两个系链彼此不同。
121.如权利要求1至120中任一项所述的化合物，其中所有系链彼此相同。
122.如权利要求1至121中任一项所述的化合物，其中每个系链选自以下：
其中每个n独立地为1至20；并且
每个p为1至约6。
123.如权利要求1至122中任一项所述的化合物，其中每个系链选自以下：
124.如权利要求1至123中任一项所述的化合物，其中每个系链具有以下结构：
其中每个n独立地为1至20。
125.如权利要求1至124中任一项所述的化合物，其中每个系链具有以下结构：
126.如权利要求1至125中任一项所述的化合物，其中所述系链具有选自以下的结构：
或其中每个n独立地为0、1、2、3、4、5、6或7。
127.如权利要求126所述的化合物，其中所述系链具有以下结构：
128.如权利要求126所述的化合物，其中n是3。
129.如权利要求1至128中任一项所述的化合物，其中所述配体为半乳糖。
130.如权利要求1至128中任一项所述的化合物，其中所述配体为甘露糖-6-磷酸。
131.如权利要求1至128中任一项所述的化合物，其中每个配体选自以下：
其中R1各自选自OH和NHCOOH。
132.如权利要求1至128中任一项所述的化合物，其中每个配体选自以下：
133.如权利要求1至128中任一项所述的化合物，其中每个配体具有以下结构：
134.如权利要求124至127中任一项所述的缀合反义化合物，其中每个配体具有以下结构：
135.如权利要求1至134中任一项所述的化合物，其中所述缀合物基团包含细胞靶向部分。
136.如权利要求135所述的化合物，其中所述缀合物基团包含具有以下结构的细胞靶向部分：
其中每个n独立地为1至20。
137.如权利要求135所述的化合物，其中所述细胞靶向部分具有以下结构：
138.如权利要求135所述的化合物，其中所述细胞靶向部分具有以下结构：
其中每个n独立地为1至20。
139.如权利要求135所述的化合物，其中所述细胞靶向部分具有以下结构：
140.如权利要求135所述的化合物，其中所述细胞靶向部分包含：
141.如权利要求135所述的化合物，其中所述细胞靶向部分包含：
142.如权利要求135所述的化合物，其中所述细胞靶向部分具有以下结构：
143.如权利要求135所述的化合物，其中所述细胞靶向部分具有以下结构：
144.如权利要求135所述的化合物，其中所述细胞靶向部分包含：
145.如权利要求135所述的化合物，其中所述细胞靶向部分具有以下结构：
146.如权利要求135所述的化合物，其中所述细胞靶向部分包含：
147.如权利要求135所述的化合物，其中所述细胞靶向部分包含：
148.如权利要求135所述的化合物，其中所述细胞靶向部分包含：
149.如权利要求135所述的化合物，其中所述细胞靶向部分具有以下结构：
150.如权利要求135所述的化合物，其中所述细胞靶向部分具有以下结构：
151.如权利要求135所述的化合物，其中所述细胞靶向部分具有以下结构：
152.如权利要求135所述的化合物，其中所述细胞靶向部分具有以下结构：
153.如权利要求135所述的化合物，其中所述细胞靶向部分具有以下结构：
154.如权利要求135所述的化合物，其中所述细胞靶向部分包含：
155.如权利要求135所述的化合物，其中所述细胞靶向部分包含：
156.如权利要求135所述的化合物，其中所述细胞靶向部分包含：
157.如权利要求135所述的化合物，其中所述细胞靶向部分包含：
158.如权利要求135所述的化合物，其中所述细胞靶向部分具有以下结构：
159.如权利要求135所述的化合物，其中所述细胞靶向部分包含：
160.如权利要求135所述的化合物，其中所述细胞靶向部分具有以下结构：
161.如权利要求135所述的化合物，其中所述细胞靶向部分包含：
其中每个Y选自O、S、取代或未取代的C1-C10烷基、氨基、取代的氨基、叠氮基、烯基或炔基。
162.如权利要求135所述的化合物，其中所述缀合物基团包含：
其中每个Y选自O、S、取代或未取代的C1-C10烷基、氨基、取代的氨基、叠氮基、烯基或炔基。
163.如权利要求135所述的化合物，其中所述细胞靶向部分具有以下结构：
其中每个Y选自O、S、取代或未取代的C1-C10烷基、氨基、取代的氨基、叠氮基、烯基或炔基。
164.如权利要求1至163中任一项所述的化合物，其中所述缀合物基团包含：
165.如权利要求1至164中任一项所述的化合物，其中所述缀合物基团包含：
166.如权利要求1至164中任一项所述的化合物，其中所述缀合物基团包含：
167.如权利要求166所述的化合物，其中所述缀合物基团包含：
168.如权利要求1至167中任一项所述的化合物，其中所述缀合物基团包含选自以下的可裂解部分：磷酸二酯、酰胺或酯。
169.如权利要求1至168中任一项所述的化合物，其中所述缀合物基团包含磷酸二酯可裂解部分。
170.如权利要求1至169中任一项所述的化合物，其中所述缀合物基团不包含可裂解部分，并且其中所述缀合物基团包含处于所述缀合物基团与所述寡核苷酸之间的硫代磷酸酯键联。
171.如权利要求1至170中任一项所述的化合物，其中所述缀合物基团包含酰胺可裂解部分。
172.如权利要求1至171中任一项所述的化合物，其中所述缀合物基团包含酯可裂解部分。
173.如权利要求1至172中任一项所述的化合物，其中所述化合物具有以下结构：
其中每个n独立地为1至20；
Q13为H或O(CH2)2-OCH3；
A为所述修饰寡核苷酸；并且
Bx为杂环碱基部分。
174.如权利要求1至172中任一项所述的化合物，其中所述化合物具有以下结构：
其中每个n独立地为1至20；
Q13为H或O(CH2)2-OCH3；
A为所述修饰寡核苷酸；并且
Bx为杂环碱基部分。
175.如权利要求1至172中任一项所述的化合物，其中所述化合物具有以下结构：
其中每个n独立地为1至20；
Q13为H或O(CH2)2-OCH3；
A为所述修饰寡核苷酸；
Z为H或连接的固体载体；并且
Bx为杂环碱基部分。
176.如权利要求1至172中任一项所述的化合物，其中所述化合物具有以下结构：
其中每个n独立地为1至20；
Q13为H或O(CH2)2-OCH3；
A为所述修饰寡核苷酸；
Z为H或连接的固体载体；并且
Bx为杂环碱基部分。
177.如权利要求1至172中任一项所述的化合物，其中所述化合物具有以下结构：
其中Q13为H或O(CH2)2-OCH3；
A为所述修饰寡核苷酸；并且
Bx为杂环碱基部分。
178.如权利要求1至172中任一项所述的化合物，其中所述化合物具有以下结构：
其中Q13为H或O(CH2)2-OCH3；
A为所述修饰寡核苷酸；并且
Bx为杂环碱基部分。
179.如权利要求1至172中任一项所述的化合物，其中所述化合物具有以下结构：
其中Q13为H或O(CH2)2-OCH3；
A为所述修饰寡核苷酸；并且
Bx为杂环碱基部分。
180.如权利要求1至172中任一项所述的化合物，其中所述化合物具有以下结构：
其中Q13为H或O(CH2)2-OCH3；
A为所述修饰寡核苷酸；并且
Bx为杂环碱基部分。
181.如权利要求1至172中任一项所述的化合物，其中所述化合物具有以下结构：
其中Q13为H或O(CH2)2-OCH3；
A为所述修饰寡核苷酸；并且
Bx为杂环碱基部分。
182.如权利要求1至172中任一项所述的化合物，其中所述化合物具有以下结构：
其中Q13为H或O(CH2)2-OCH3；
A为所述修饰寡核苷酸；并且
Bx为杂环碱基部分。
183.如权利要求1至172中任一项所述的化合物，其中所述化合物具有以下结构：
其中Q13为H或O(CH2)2-OCH3；
A为所述修饰寡核苷酸；并且
Bx为杂环碱基部分。
184.如权利要求1至172中任一项所述的化合物，其中所述化合物具有以下结构：
其中Q13为H或O(CH2)2-OCH3；
A为所述修饰寡核苷酸；并且
Bx为杂环碱基部分。
185.如权利要求1至172中任一项所述的化合物，其中所述化合物具有以下结构：
其中Q13为H或O(CH2)2-OCH3；
A为所述修饰寡核苷酸；并且
Bx为杂环碱基部分。
186.如权利要求1至172中任一项所述的化合物，其中所述化合物具有以下结构：
其中Q13为H或O(CH2)2-OCH3；
A为所述修饰寡核苷酸；并且
Bx为杂环碱基部分。
187.如权利要求1至172中任一项所述的化合物，其中所述化合物具有以下结构：
其中Q13为H或O(CH2)2-OCH3；
A为所述修饰寡核苷酸；并且
Bx为杂环碱基部分。
188.如权利要求1至172中任一项所述的化合物，其中所述缀合物基团包含：
其中Q13为H或O(CH2)2-OCH3；
A为所述修饰寡核苷酸；并且
Bx为杂环碱基部分。
189.如权利要求1至172中任一项所述的化合物，其中所述缀合物基团包含：
其中Q13为H或O(CH2)2-OCH3；
A为所述修饰寡核苷酸；并且
Bx为杂环碱基部分。
190.如权利要求1至172中任一项所述的化合物，其中所述缀合物基团包含：
其中Q13为H或O(CH2)2-OCH3；
A为所述修饰寡核苷酸；并且
Bx为杂环碱基部分。
191.如权利要求173至200中任一项所述的化合物，其中Bx选自腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、尿嘧啶或胞嘧啶或5-甲基胞嘧啶。
192.如权利要求173至200中任一项所述的化合物，其中Bx为腺嘌呤。
193.如权利要求173至200中任一项所述的化合物，其中Bx为胸腺嘧啶。
194.如权利要求173至200中任一项所述的化合物，其中Q13为O(CH2)2-OCH3。
195.如权利要求173至200中任一项所述的化合物，其中Q13为H。
196.一种化合物，所述化合物包含ISIS 696844、ISIS 696845、ISIS 698969或ISIS698970。
197.一种化合物，所述化合物由ISIS 696844、ISIS 696845、ISIS 698969或ISIS698970组成。
198.一种组合物，其包含根据权利要求1-207中任一项所述的化合物或其盐、和药学上可接受的载体或稀释剂中的至少一种。
199.一种前药，其包含如权利要求1至208中任一项所述的化合物。
200.一种治疗、预防或减轻与受试者补体替代途径失调相关的疾病的方法，所述方法包括向所述受试者施用如权利要求1-207中任一项所述的化合物、如权利要求208所述的组合物或如权利要求209所述的前药，由此治疗、预防或减轻所述疾病。
201.如权利要求210所述的方法，其中所述补体替代途径的激活程度高于正常程度。
202.如权利要求210或211所述的方法，其中所述疾病为黄斑变性。
203.如权利要求212所述的方法，其中所述黄斑变性为老年性黄斑变性(AMD)。
204.如权利要求213所述的方法，其中所述AMD为湿性AMD。
205.如权利要求213所述的方法，其中所述AMD为干性AMD。
206.如权利要求215所述的方法，其中所述干性AMD为地图样萎缩。
207.如权利要求210或211所述的方法，其中所述疾病为肾病。
208.如权利要求217所述的方法，其中所述肾病为狼疮肾炎。
209.如权利要求217所述的方法，其中所述肾病为系统性红斑狼疮(SLE)
210.如权利要求217所述的方法，其中所述肾病为致密沉积物疾病(DDD)。
211.如权利要求217所述的方法，其中所述肾病为C3肾小球肾炎(C3GN)。
212.如权利要求217所述的方法，其中所述肾病为CFHR5肾病。
213.如权利要求217所述的方法，其中所述肾病为非典型的溶血性尿毒性综合征(aHUS)。
214.如权利要求223所述的方法，其中所述aHUS的特征为血栓性毛细血管病。
215.如权利要求217-224中任一项所述的方法，其中所述肾病与C3沉积物相关。
216.如权利要求225所述的方法，其中所述肾病与肾小球中的C3沉积物相关。
217.如权利要求217-226中任一项所述的方法，其中所述肾病与低于正常循环C3水平相关。
218.如权利要求227所述的方法，其中所述循环C3水平为血清或血浆C3水平。
219.如权利要求210-216中任一项所述的方法，其中施用所述化合物或组合物减少或抑制眼睛的C3水平。
220.如权利要求229所述的方法，其中所述C3水平为C3蛋白质水平。
221.如权利要求210-216中任一项所述的方法，其中施用所述化合物或组合物减少眼睛的C3沉积物的水平或抑制眼睛的C3沉积物的积累。
222.如权利要求229-231中任一项所述的方法，其中所述化合物或组合物以肠胃外方式施用至受试者。
223.如权利要求217-228中任一项所述的方法，其中施用所述化合物或组合物减少或抑制肾中的C3水平的积累。
224.如权利要求233所述的方法，其中所述C3水平为C3蛋白质水平。
225.如权利要求233或234所述的方法，其中施用所述化合物或组合物减少所述肾C3沉积物的水平或抑制肾C3沉积物的积累。
226.如权利要求233-235中任一项所述的方法，其中所述肾中的所述C3水平为肾小球中的C3水平。
227.如权利要求233-236中任一项所述的方法，其中所述化合物或组合物以肠胃外方式施用至所述受试者。
228.如权利要求210-237中任一项所述的方法，其中所述受试者被鉴定为具有与所述补体替代途径失调相关的疾病或处于患有与所述补体替代途径失调相关的疾病的风险。
229.如权利要求238所述的方法，其中所述鉴定包括检测所述受试者血清中的补体水平或膜攻击复合物水平。
230.如权利要求238所述的方法，其中所述鉴定包括进行针对与所述疾病相关的补体因子的基因突变的基因测试。
231.一种抑制补体因子B(CFB)在具有与所述补体替代途径失调相关的疾病或处于患有与所述补体替代途径失调相关的疾病的风险的受试者中的表达的方法，所述方法包括向所述受试者施用如权利要求1-207中任一项所述的化合物、如权利要求208所述的组合物或如权利要求209所述的前药，由此抑制所述受试者中的CFB表达。
232.如权利要求241所述的方法，其中所述补体替代途径的激活程度高于正常程度。
233.如权利要求241或242所述的方法，其中施用所述化合物或组合物抑制CFB在眼睛中的表达。
234.如权利要求243所述的方法，其中所述受试者具有老年性黄斑变性(AMD)或处于患有老年性黄斑变性(AMD)的风险。
235.如权利要求241或242所述的方法，其中施用所述化合物或组合物抑制CFB在肾中的表达。
236.如权利要求245所述的方法，其中施用所述化合物或组合物抑制CFB在肾小球中的表达。
237.如权利要求245或246所述的方法，其中所述受试者具有狼疮肾炎、致密沉积物疾病(DDD)、C3肾小球肾炎(C3GN)、CFHR5肾病或非典型的溶血性尿毒性综合征(aHUS)或其任何组合或者处于患有狼疮肾炎、致密沉积物疾病(DDD)、C3肾小球肾炎(C3GN)、CFHR5肾病或非典型的溶血性尿毒性综合征(aHUS)或其任何组合的风险。
238.一种减少或抑制C3沉积物在具有与所述补体替代途径失调相关的疾病或处于患有与所述补体替代途径失调相关的疾病的风险的受试者眼睛中的积累的方法，所述方法包括向所述受试者施用如权利要求1-207中任一项所述的化合物、如权利要求208所述的组合物或如权利要求209所述的前药，由此减少或抑制C3沉积物在所述受试者眼睛中的积累。
239.如权利要求248所述的方法，其中所述补体替代途径的激活程度高于正常程度。
240.如权利要求248或249所述的方法，其中所述受试者具有老年性黄斑变性(AMD)或处于患有老年性黄斑变性(AMD)的风险。
241.一种减少或抑制C3沉积物在具有与所述补体替代途径失调相关的疾病或处于患有与所述补体替代途径失调相关的疾病的风险的受试者肾中的积累的方法，所述方法包括向所述受试者施用如权利要求1-207中任一项所述的化合物、如权利要求208所述的组合物或如权利要求209所述的前药，由此减少或抑制C3沉积物在所述受试者肾中的积累。
242.如权利要求251所述的方法，其中所述补体替代途径的激活程度高于正常程度。
243.如权利要求251或252所述的方法，其中所述受试者具有狼疮肾炎、致密沉积物疾病(DDD)、C3肾小球肾炎(C3GN)、CFHR5肾病或非典型的溶血性尿毒性综合征(aHUS)或其任何组合或者处于患有狼疮肾炎、致密沉积物疾病(DDD)、C3肾小球肾炎(C3GN)、CFHR5肾病或非典型的溶血性尿毒性综合征(aHUS)或其任何组合的风险。
244.如权利要求241-253中任一项所述的方法，其中所述化合物或组合物以肠胃外方式施用至所述受试者。
245.如权利要求1-207中任一项所述的化合物、如权利要求208所述的组合物或如权利要求209所述的前药用于治疗、预防或减轻与所述补体替代途径失调相关的疾病的用途。
246.如权利要求255所述的用途，其中所述补体替代途径的激活程度高于正常程度。
247.如权利要求255或256所述的用途，其中所述疾病为黄斑变性。
248.如权利要求257所述的用途，其中所述黄斑变性为老年性黄斑变性(AMD)。
249.如权利要求258所述的用途，其中所述AMD为湿性AMD。
250.如权利要求258所述的用途，其中所述AMD为干性AMD。
251.如权利要求260所述的用途，其中所述干性AMD为地图样萎缩。
252.如权利要求255或256所述的用途，其中所述疾病为肾病。
253.如权利要求262所述的用途，其中所述肾病为狼疮肾炎、致密沉积物疾病(DDD)、C3肾小球肾炎(C3GN)、CFHR5肾病或非典型的溶血性尿毒性综合征(aHUS)或其任何组合。
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