JPH083186A - 修飾オリゴヌクレオチド、その調製およびその使用 - Google Patents

修飾オリゴヌクレオチド、その調製およびその使用

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JPH083186A
JPH083186A JP7107299A JP10729995A JPH083186A JP H083186 A JPH083186 A JP H083186A JP 7107299 A JP7107299 A JP 7107299A JP 10729995 A JP10729995 A JP 10729995A JP H083186 A JPH083186 A JP H083186A
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hydrogen
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フランク・ゼーラ
Sigrid Lampe
ジーグリト・ラムペ
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Hoechst AG
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Abstract

(57)【要約】 【構成】 8−アザプリン塩基を少なくとも1つ含み、
核酸とより安定なハイブリダイゼーション複合体を形成
する新しい修飾オリゴヌクレオチドとその調製方法の提
供。 【効果】 この修飾オリゴヌクレオチドは遺伝子発現の
抑制剤、核酸検出のためのプローブ、分子生物学におけ
る手段、および薬剤または診断薬として有用である。

Description

【発明の詳細な説明】
【0001】本発明は、修飾塩基を有し、価値ある物理
的、生理学的および薬理学的性質を有する新しいオリゴ
ヌクレオチド、その調製方法、遺伝子発現の抑制剤(ア
ンチセンスオリゴヌクレオチド、リボチーム、センスオ
リゴヌクレオチドおよびトリプレックス形成オリゴヌク
レオチド)、核酸の検出のためのプローブ、分子生物学
における手段、薬剤または診断薬としてのその使用に関
する。オリゴヌクレオチドの多くの化学修飾が文献に記
載されている。これらの修飾は糖リン酸エステル骨格ま
たは核酸塩基に影響する可能性がある。現在の技術は例
えばUhlmann & PeymanのChem. Rev. 1990, 90, 543お
よびMilligan等のJ. Med. Chem. 1993, 36, 1923に記載
されている。
【0002】細胞内および細胞培養の培地内の両方で未
修飾のオリゴヌクレオチドは核分解活性物質により極め
て急速に分解されるため、原則として、オリゴヌクレオ
チドを化学的に修飾することが必要である。核分解に対
抗する安定化は、糖リン酸エステル骨格を置き換える
か、または、リン酸エステルの架橋、糖成分またはヌク
レオチド塩基を修飾することにより行なうことができる
〔Milligan等、上記およびUhlmann & Peyman、上記参
照〕。核分解に対する安定性が増強されたオリゴヌクレ
オチドをもたらすような修飾のほかに、修飾されたオリ
ゴヌクレオチドのハイブリダイゼーション挙動を、これ
らのオリゴヌクレオチドが例えば細胞内核酸(いわゆる
標的核酸)とより安定なハイブリダイゼーション複合体
(二重らせん)を形成することができるように変える修
飾も興味深いものである。オリゴヌクレオチドのハイブ
リダイゼーション特性の変化は、例えば、その塩基を変
成することによっても行なうことができる。このような
修飾オリゴヌクレオチドの変化したハイブリダイゼーシ
ョン特性は、例えば、二重らせんの融点(Tm値)が使用
した未修飾のオリゴヌクレオチドを用いた場合と比較し
て変化しているという事実により知ることができる。
【0003】即ち、PCT出願WO 92/00225
8号は、一重鎖および二重鎖の標的核酸に対する結合親
和性が増強されているのではなく低下しているような、
ピリミジン修飾オリゴヌクレオチドを記載している。P
CT出願WO 93/10820号もまた、修飾ウラシ
ル塩基およびシトシン塩基を含み、未修飾のオリゴヌク
レオチドを用いた場合よりも安定な標的核酸との二重ら
せんまたは三重らせんを形成することができるようなオ
リゴヌクレオチドを開示している。塩基類縁体ピリドピ
リミジンを含んでいる合成12量体オリゴヌクレオチド
のハイブリダイゼーション特性もまた研究されている
〔Inoue等,(1985),Nucleic Acid Res.,13, 7119-712
9〕。塩基類縁体2−アミノアデニンを含んでいるオリ
ゴヌクレオチドもまた改善されたハイブリダイゼーショ
ン特性を有するものとして報告されている〔Chollet
等., (1988), Nucleic Acid Research, 6, 305-317〕。
【0004】従って、本発明の目的は好都合な特性を有
する使用可能な新規なオリゴヌクレオチドを作製するこ
とである。意外にも、8−アザプリン塩基、例えば8−
アザグアニンまたは8−アザアデニンを少なくとも1つ
有するオリゴヌクレオチドが、未修飾のプリン塩基を有
する類似のオリゴヌクレオチドにより形成されたものよ
りも著しく安定な標的核酸とのハイブリダイゼーション
複合体を形成することが解った。
【0005】即ち、本発明は、下記式I:
【化9】 〔式中、R1は水素、C1〜C18−アルキル、C2〜C18
−アルケニル、C2〜C18−アルキニル、C2〜C18−ア
ルキルカルボニル、C3〜C19−アルケニルカルボニ
ル、C3〜C19−アルキニルカルボニル、(C6〜C14
−アリール−(C1〜C8)−アルキル、ヌクレオチド化
学で慣用の保護基、または下記式IIa:
【化10】 の基であり、
【0006】R1aは水素、C1〜C18−アルキル、C2
18−アルケニル、C2〜C18−アルキニル、C2〜C18
−アルキルカルボニル、C3〜C19−アルケニルカルボ
ニル、C3〜C19−アルキニルカルボニル、(C6
14)−アリール−(C1〜C8)−アルキル、または下
記式IIb:
【化11】 の基であり、R2は水素、ヒドロキシル、C1〜C18−ア
ルコキシ、C1〜C6−アルケニルオキシ、特にアリルオ
キシ、ハロゲン、アジドまたはNH2であり;aはオキ
シまたはメチレンであり;nは3〜99の整数であり;
Wはオキソ、チオキソまたはセレノキソであり;Vはオ
キシ、スルファンジイルまたはイミノであり;Yはオキ
シ、スルファンジイル、イミノまたはメチレンであり;
Y′はオキシ、スルファンジイル、イミノ、(CH2)m
たはV(CH2)mであり、ここで、mは1〜18の整数で
あり;Xはヒドロキシルまたはメルカプトであり;
【0007】Uはヒドロキシル、メルカプト、SeH、
1〜C18−アルコキシ、C1〜C18−アルキル、C6
20−アリール、(C6〜C14)−アリール−(C1〜C
8)−アルキル、NHR3、NR34または式III: (OCH2CH2)pO(CH2)qCH25 (III) の基であり、ここで、R3はC1〜C18−アルキル、C6
〜C20−アリール、(C6〜C14)−アリール−(C1
8)−アルキル、または2−(CH2)c−〔NH(CH2)
cd−NR66、ここでcは2〜6の整数であり、そし
てdは0〜6の整数であり、そして、R6はそれぞれ独
立して、水素またはC1〜C6−アルキルまたはC1〜C4
−アルコキシ−C1〜C6−アルキルであり;R4はC1
18−アルキル、C6〜C20−アリールまたは(C6〜C
10)−アリール−(C1〜C8)−アルキルであるか、ま
たはNR34の場合はR3およびこれらが結合している
窒素原子と一緒になって5〜6員のヘテロ環を形成し、
これは更にO、SおよびNから選択されるヘテロ原子を
有することができ、pは1〜100の整数であり、qは
0〜22の整数であり、
【0008】R5は水素または官能基、例えばヒドロキ
シル、アミノ、C1〜C18−アルキルアミノ、COO
H、CONH2、COO(C1〜C4)−アルキルまたは
ハロゲンであり;ZおよびZ′は相互に独立して、ヒド
ロキシル、メルカプト、SeH、C1〜C22−アルコキ
シ、−O−(CH2)b−NR67、ただしここでbは1〜
6の整数であり、そしてR7はC1〜C6−アルキルであ
るか、または、R6およびR7はそれらが結合している窒
素原子と一緒になって3〜6員の環を形成するもの、C
1〜C18−アルキル、C6〜C20−アリール、(C6〜C
14)−アリール−(C1〜C8)−アルキル、(C6〜C
14)−アリール−(C1〜C8)−アルコキシ、ただしこ
こでアリールはヘテロアリールであってもよく、そして
アリールは場合によりカルボキシル、アミノ、ニトロ、
1〜C4−アルキルアミノ、C1〜C6−アルコキシ、ヒ
ドロキシル、ハロゲンおよびシアノよりなる群から選択
される同じかまたは異なる基1、2または3個で置換さ
れているもの、C1〜C18−アルキルメルカプト、NH
3、NR34、式IIIの基またはDNAプローブの細胞
内取り込みを促進するかまたはその標識として作用する
基、またはオリゴヌクレオチド類縁体が標的核酸にハイ
ブリッド化する場合は、これを結合、交叉結合または分
解により攻撃する基であり、そして、曲線の括弧はR2
と隣接するホスホリル基が2′および3′位、あるいは
逆に3′および2′位の何れかに位置することを指し、
ここで各ヌクレオチドはDまたはL型で存在し、そして
塩基Bはαまたはβ位に位置し、そして
【0009】Bは相互に独立してヌクレオチド化学で慣
用的な塩基、例えば天然の塩基、例えばアデニン、シト
シン、チミン、グアニン、ウラシルまたはヒポキサンチ
ン、または非天然の塩基、例えばプリン、8−アザプリ
ン、2,6−ジアミノプリン、7−デアザアデニン、7
−デアザグアニン、N44−エタンシトシン、N66
エタノ−2,6−ジアミノプリン、シュードイソチトシ
ン、5−メチルシトシン、5−フルオロウラシル、5−
(C3〜C6)−アルキニルウラシル、5−(C 3〜C6
−アルキニルシトシン、またはそのプロドラッグ形態で
あり、ここで少くとも1つのBは下記式IV:
【化12】 {式中EおよびFは相互に独立してH、OHまたはNH
2である}の塩基である〕のオリゴヌクレオチドおよび
生理学的に許容しうるその塩に関する。
【0010】EがNH2であり、FがOHであるか、ま
たは、EがHであり、FがNH2である式Iの化合物が
好ましい。EがNH2であり、FがOHである式Iの化
合物が特に好ましい。塩基が糖β位に位置し、ヌクレオ
シドがD型で存在し、R2が2′位に位置し、そしてa
がオキシである式Iの化合物も好適である。相補的な核
酸(標的核酸)に連結した場合、新しいオリゴヌクレオ
チドは天然のオリゴヌクレオチドが示す結合親和性と比
較して改善した結合親和性を示す。これらの新しいオリ
ゴヌクレオチドを治療に用いた場合、例えばリン酸エス
テル骨格、リボース単位またはオリゴヌクレオチド末端
の付加的な修飾を導入するのが有利である〔J. S. Cohe
n, Topics in Molecular and Structural Biology 12(1
989), Macmillan Press, E. Uhlmann等、上記参照〕。
例えば新しいオリゴヌクレオチドはより効果的にヌクレ
アーゼ攻撃から保護され、これはそれ自体知られている
修飾をその糖リン酸エステル骨格で行なった場合に好都
合である。
【0011】従って、V、Y、Y′およびWがチオキ
ソ、セノキソ、オキシ、オキソ、スルファンジイル、イ
ミノまたはメチレンの意味を有し、そして、Uがヒドロ
キシ、メルカプトまたはメチルの意味を有する式Iの化
合物も好適である。後者の化合物は、R2がやはりヒド
ロキシルまたは水素、特に水素である場合が特に好まし
い。R1およびR1aが水素である式Iの化合物もまた好
ましい実施態様である。
【0012】R1および/またはR1aが水素であり、R2
がヒドロキシルまたは水素であり、Uがヒドロキシルま
たはメルカプトであり、そしてV、Y、Y′およびWが
チオキソ、オキシ、オキソまたはヒドロキシルの意味を
有する式Iの化合物が極めて好ましい。ヌクレオチド化
学において慣用的な保護基とは、例えば、アミノ保護
基、ヒドロキシル保護基または文献記載〔E. Sonveaux,
1986, Bioorganic Chemistry, 14, 274-325またはS.
L. Beaucage等., 1992, Tetrahedron, 48, 2223-2311〕
の他の保護基を指すものとする。
【0013】アルキル、アルケニル、またはアルキニル
は、直鎖または分枝鎖であってよい。シクロアルキルは
アルキル置換環を指すものとする。(C6〜C20)−ア
リールの例は、フェニル、ナフチルまたはビフェニル、
好ましくはフェニルである。ヘテロアリールとは特に、
フェニルまたはナフチルより誘導され、そして、CH基
1つ以上がNで置き換えられ、そして/または、隣接す
るCH基の少なくとも2つがS、NHまたはOで置き換
えられ(同時に5員の芳香族環を形成)る基を指すもの
とする。更に、2環の基の縮合部位の一方または両方の
原子は(インドリジニルの場合のように)N原子であっ
てよい。フラニル、チエニル、ピロリル、イミダゾリ
ル、ピラゾリル、トリアゾリル、テトラゾリル、オキサ
ゾリル、イソキサゾリル、チアゾリル、イソチアゾリ
ル、ピリジル、ピラジニル、ピリミジニル、ピリダジニ
ル、インドリル、インダゾリル、キノリル、イソキノリ
ル、フタラジニル、キノキサリニル、キナゾリニルおよ
びシンノリニルが特にヘテロアリールであると見なされ
る。
【0014】式(I)の化合物の生理学的に許容しうる塩
とはRemingtonのPharmaceutical Science(17版、1418
ページ(1985))に記載されているような無機および有
機の塩の両方を指すものとする。物理的および化学的安
定性および溶解度のため、酸の基に対してはナトリウム
塩、カリウム塩、カルシウム塩およびアンモニウム塩が
特に好ましい。本発明はα−およびβ−D−およびL−
リボフラノシド、およびα−およびβ−D−およびL−
デオキシリボフラノシドおよび相当する炭素環5員環類
縁体にのみ限定されるものではなく、その他の糖ビルデ
ィングブロック、例えばキシロフラノースおよびアラビ
ノフラノース誘導体、環拡張および環収縮糖、またはそ
の他の種類の適当な糖誘導体から構築されたオリゴヌク
レオチド類縁体にも適用される。更に、本発明は式Iで
例示するホスフェート基の誘導体に限定されるわけでは
なく、知られたデホスホ誘導体にも関する。
【0015】結果的に、新しいオリゴヌクレオチドは広
範囲の種類の天然の構造を修飾することにより誘導する
ことができる。これらの修飾の例は、それ自体知られた
方法により導入され得るものであり、以下に示すとおり
である。 a) ホスフェート架橋の修飾 以下にその例を記載する。ホスホロチオエート、ホスホ
ロジチオエート、メチルホスホネート、ホスホアミデー
ト、ボラノホスフェート、メチルホスフェート、エチル
ホスフェートおよびフェニルホスホネート。ホスホロチ
オエート、ホスホロジチオエートおよびメチルホスホネ
ートがホスフェート架橋の好ましい修飾型である。 b) ホスフェート架橋の置き換え 以下にその例を記載する。ホルムアセタール、3′−チ
オホルムアセタール、メチルヒドロキシルアミン、オキ
シム、メチレンジメチルヒドラゾ、ジメチレンスルホン
またはシリル基の置き換え。ホルムアセタールおよび
3′−チオホルムアセタールの置き換えが好ましい。
【0016】c) 糖の修飾 以下にその例を記載する。α−アノマー糖、2′−O−
メチルリボース、2′−O−ブチルリボース、2′−O
−アリルリボース、2−フルオロ−2′−デオキシリボ
ース、2′−アミノ−2′−デオキシリボースおよびα
−アラビノフロースおよび炭素環糖類縁体。好ましい修
飾型は2′−O−メチルリボースおよび2′−O−n−
ブチルリボースである。 d) 糖とホスフェート架橋の修飾 糖/ホスフェート骨格がアミノグリシン骨格で置き換え
られているペプチド核酸(PNA)およびカーバメート
架橋モルホリノオキゴマーを例示することができる。 e) 塩基、特にピリミジン塩基のその他の修飾 以下に示す例えば、5−プロピニル−2′−デオキシウ
リジン、5−プロピニル−2′−デオキシシチジン、5
−ヘキシニル−2′−デオキシウリジン、5−ヘキシニ
ル−2′−デオキシシチジン、5−フルオロ−2′−デ
オキシシチジン、5−フルオロ−2′−デオキシウリジ
ン、5−ヒドロキシメチル−2′−デオキシウリジン、
5−メチル−2′−デオキシシチジンおよび5−ブロモ
−2′−デオキシシチジン。5−プロピニル−2′−デ
オキシウリジン、5−ヘキシニル−2′−デオキシシチ
ジンおよび5−プロピニル−2′−デオキシシチジンが
好ましい修飾型である。
【0017】f) 3′−3′転化および5′−5′転
化〔例えばM. Koga等,J. Org. Chem.56 (1991) 3757〕 g) 5′コンジュゲートおよび3′コンジュゲート 細胞内取り込を促進する基の例は種々の新油性の基であ
り、例えば、−O−(CH2)x−CH3(式中xは6〜1
8の整数)、−O−(CH2)n−CH=CH−(CH2)m
CH3(式中nおよびmは相互に独立して6〜12の整
数)、−O−(CH2CH2O)4−(CH2)9−CH3、−O
−(CH2CH2O)8−(CH2)13−CHC3および−O−
(CH2CH2O)7−(CH2)15−CH3、およびステロイ
ド残基、例えばコレステリル、またはビタミン残基例え
ばビタミンE、ビタミンAまたはビタミンD、および天
然の担体系を開発するためのその他のコンジュゲート、
例えばコリン酸、葉酸、2−(N−アルキル、N−アル
コキシ)−アミノアントラキノン、および、マンノース
のコンジュゲート、および、オリゴヌクレオチドの受容
体媒介のエンドサイトシスをもたらすような相当する受
容体のペプチド、例えばEGF(表皮生育因子)、ブラ
ディキニンおよびPDGF(血小板誘導生育因子)であ
る。標識基とは蛍光基、例えばダンシル(=N−ジメチ
ル−1−アミノナフチル−5−スルホニル)誘導体、フ
ルオレセイン誘導体またはクマリン誘導体、または、例
えばアクリジン誘導体の化学発光基、更に、ELISA
により検出できるジゴキシゲニン系、ピオチン/アビジ
ン系で検出できるビオチン基、または、検出可能な受容
体基で後に誘導化できる官能基を有するその他のリンカ
ーアーム、例えば活性アクリジニウムエステルと反応し
て化学発光プローブを形成するアミノアルキルリンカー
である。以下に示すものは典型的な標識基である。
【0018】
【化13】
【0019】
【化14】
【0020】核酸と結合するか、これに介在し、そして
/またはそれらを分解または交叉結合するオリゴヌクレ
オチド類縁体は、例えばアクリジン、ソラレン、フェナ
ントリジン、ナフトキノン、ダウノマイシンまたはクロ
ロエチルアミノアリールのコンジュゲートである。典型
的な介在性および交叉結合性の残基を以下に示す。
【0021】
【化15】
【0022】
【化16】
【0023】R3とR4がそれらが結合する窒素原子と一
緒になって更にヘテロ原子を含む5員または6員のヘテ
ロ環を形成するNR34基の例は、モルホリニル残基お
よびイミダゾリジニル残基である。
【0024】本発明は更に下記式V:
【化17】 〔式中Vはオキシ、スルファンジイルまたはイミノであ
り;Ybはオキシ、スルファンジイルまたはメチレンで
あり;aはオキシまたはメチレンであり;R2bは水素、
OR12、C1〜C18−アルコキシ、C1〜C6−アルケニ
ルオキシ、特にアリルオキシ、ハロゲン、アジドまたは
NR1011であり;R1はヌクレオチド化学で慣用的な
保護基であり;
【0025】R1bは下記式IIcまたはIId:
【化18】 {式中UはO−R7またはS−R7であり;Qは基−NR
89であり;R7は−(CH2)2−CNであり;R8および
9は同じかまたは異なっていてC1〜C6−アルキル、
特にイソプロピルまたはエチルであるか、または、それ
らが結合している窒素原子と一緒になって5〜9−員の
ヘテロ環を形成し、これは更に、O、SおよびNから選
択されるヘテロ原子を含んでおり、特に、
【化19】 である}の基であり;
【0026】E′およびF′は相互に独立して、H、O
HまたはNR1011であり;R10およびR11は同じかま
たは異なっていて水素またはヌクレオチド化学で慣用的
なアミノ保護基であるか、または、R10とR11は一緒に
なってヌクレオチド化学で慣用的なアミノ保護基を形成
し、R12はヌクレオチド化学で慣用的なヒドロキシル保
護基、例えば、t−ブチルジメチルシリル、トリイソプ
ロピルシリル、o−ニトロベンジル、p−ニトロベンジ
ル、トリス(1−メチルエチル)シリルまたは2−フル
オロフェニル−4−メトキシピペリジン−4−イル(F
PMP)であり、そして曲線の括弧はR2と隣接するホ
スホリル基が2′および3′位、あるいは逆に3′およ
び2′位の何れかに位置することを示す〕の化合物に関
する。
【0027】V、Ybおよびaがオキシであり、R2b
水素またはOR12、特に水素であり、そして、R1bは式
(IIc)または(IId)(式中UはO−(CH2)2−C
N)であり、R8およびR9は同じかまたは異なっていて
イソプロピルまたはエチルである(V)の化合物は好ま
しい実施態様を示す。これらの化合物は更に糖上の塩基
がβ位にあり、そしてR2bが2′位にある場合に極めて
好ましい。本発明は更にまた糖への連結が8−アザプリ
ン塩基のN2原子により形成されている式Vの化合物に
も関する。好ましいアミノ保護基の例はアシル保護基ま
たはアミジン保護基である。
【0028】本発明はまた、下記式VI:
【化20】 〔式中、相互に独立して、U′=U″=U′′′はヒド
ロキシルまたはメルカプトであり;eおよびfは0また
は1であり;R13は水素またはOHであり、そしてEお
よびFはH、OHまたはNH2である〕の化合物にも関
するが、ただし、U′、U″、U′′′、R13およびF
がOHであり、EがNH2であり、そしてeおよびfが
1である式VIの化合物は除外される。U′がヒドロキシ
ルまたはメルカプトであり、U″=U′′′がヒドロキ
シルであり、そしてeおよび/またはfが1であるよう
な式VIの化合物が好ましい。
【0029】更に、EがHであり、FがNH2である
か、またはEがNH2でありFがOHである場合はR13
はHであるか、またはEがNH2であり、F、R13
U′、U″およびU′′′がOHである場合は、eおよ
び/またはfが0であるか、または、EがNH2であ
り、F、R13、U″およびU′′′がOHであり、eお
よびFが1である場合はU′はメルカプトである式VIの
化合物も好ましい。
【0030】式VIの新しい化合物は例えばPCR反応
(e=f=1,R13=OH)において、または配列決定
(e=f=1,R13=HまたはOH)のために、分子生
物学における手段として使用できる。式VIの化合物は一
般的に知られた方法を用いて相当する8−アザプリンヌ
クレオシドから調製できる。式VIの化合物は、好ましく
は、1,8−ビス(ジメチルアミノ)ナフテンおよびト
リメチルホスフェートの存在下Ludwigのワンポット工程
の簡略化した方法を用いて調製する〔J. Ludwig等,(19
81) Acta Biochem. Biophys. Sci. Hung., 16, 131〕。
【0031】本発明はまた、式I、VおよびVIの化合物
の全ての互変異体、特に式IVの8−アザプリン塩基の全
ての互変異性体を包含する。本発明は更にまた、式Iの
新しい化合物を調製するための方法に関する。Grunberg
er等〔Biochem. Biophys. Acta, (1968) 161, 147-15
5〕は酵素的または化学酵素的な経路による8−アザグ
アニンを含むトリリボヌクレオシドホスフェートの調製
を記載している。Bodnar等はDNAポリメラーゼを用い
た二重鎖8−アザグアニン含有ファージDNAの酵素的
合成を記載している〔Bodnar等,(1983), J. Biol. Che
m., 258, 15206-15213〕。8−アザデオキシグアノシン
のN−グリコシド結合が酸に対して極めて安定であるた
め〔Seela等,(1993), Helv. Chem. Acta, 76, 2388-23
97〕、オリゴヌクレオチドの化学合成で慣用的に用いら
れている標準的な条件を新しい8−アザプリン含有オリ
ゴヌクレオチドの調製のために用いることができる。
【0032】式Iの新しい化合物は、溶液中、または好
ましくは、固相上で、適切には自動合成装置を用いて調
製する。式Iのオリゴマーの構築は、適切に誘導体化さ
れた支持体上に、または成長中のオリゴマー鎖上に、1
回に1個、各々の場合1つのヌクレオチド塩基を含有す
るモノヌクレオチドを縮合させることにより段階的に行
なうことができる。オリゴヌクレオチドは、当該分野で
知られた方法、例えばトリエステル法、H−ホスホネー
ト法、またはホスホアミダイト法を用いて構築する〔E.
Sonveaux,(1986), Bioorganic Chemistry, 14, 274-32
5; S. L. Beaucage等,(1992), Tetrahedron, 48, 2223
-2311〕。式Vのヌクレオチドモノマービルディングブ
ロックは好ましくは8−アザプリン誘導体を導入するた
めに好ましく用いられ、E′がNR1011でありF′が
OHであるような式Vのヌクレオチドモノマーが特に好
ましい。
【0033】オリゴヌクレオチド固相合成のためのビル
ディングブロックとしての式Vの化合物は、相当する8
−アザプリンヌクレオシドから調製できる。8−アザプ
リン塩基のアミノ基および糖の遊離の5′−ヒドロキシ
ル基のための適切な保護基を導入した後、モノマーを相
当するホスホネートまたはホスホアミダイト誘導体に変
換する。適当なアミノ保護基、例えばホルムアミジン保
護基((ジメチルアミノ)メチリデン)またはアシル保
護基の形態のものを、一般的に知られた方法〔L. J. Mc
Bride等,(1983) Tetrahedron Lett., 24, 2953, G. S.
Ti等,(1982)J. Am. Chem. Soc., 104, 1316; H. Scha
ller等,(1963), J. Am. Chem. Soc.,85, 3821〕を用い
て導入するが、アミノ基をアシル化する場合はSchaller
の過アシル化法が好都合である。糖の遊離の5′−OH
基の適当な保護基の例は4,4′−ジメトキシトリチル
であり、これは知られた方法で同様に導入される〔C.
B. Reese (1978), Tetrahedron, 34, 3143; D. Flocker
zi等,(1981), Leibigs Ann. Chem., 1568〕。この方法
で保護されたモノマーは、Froehler等により開発された
方法を用いて、相当するホスホネートに変換することが
できる〔B. C. Froehler等,(1986), Nucl. Acid Res.,
14, 5399〕。シアノエチルホスホアミダイト誘導体
は、例えば、無水ジクロロメタン中クロロ−β−シアノ
エトキシ(N,N−ジイソプロピルアミノ)ホスファン
とモノマーを反応させることにより調製できる〔N. D.
Sinha等,(1984) Nucl. Acid Res., 12, 4539〕。
【0034】オリゴヌクレオチド合成は、2′−OH基
が付加する結果、デオキシリボオリゴヌクレオチドの合
成と比較して、より困難になっている。最初の困難な点
は相互に適合性を有する2′−OH基と5′−OH基の
組み合わせを見つけることである。即ち、オリゴヌクレ
オチド合成の間、O−2′位の残基はトリチル保護基の
加水分解に用いられる酸条件に対して安定でなければな
らない。更に、3′位から2′位へのホスフェート基の
移行をもたらすような条件を回避しなければならない。
領域選択的な反応が保護基の導入の際には望ましい。式
(I)の新しいオリゴヌクレオチドの合成のためには
2′−OH保護基としてトリイソプロピルシリルクロリ
ドを用いるのが好都合であり、これにより、高い水準の
選択性および十分な安定性と穏やかな除去条件(TBA
F/THF)が達成される。反応の選択性は、イミダゾ
ールの代わりに硝酸銀を触媒として使用すると更に向上
する〔F. Seela, K. Mersmann, J. A. Grasby, M. J. G
ait, Helv. Chim. Acta 1993, 76, 1809〕。
【0035】デオキシリボヌクレオチドの固相合成の場
合とは対照的に、ホスホアミダイトビルディングブロッ
クはオリゴヌクレオチドの固相合成には必ずしも適する
ものではない。これは、特に、反応性ホスホアミダイト
が大型の2′−シリル保護基により立体的に遮蔽されて
いる結果、比較的長いカップリング時間が必要なためで
あり〔N. Usman, R. T. Pon, K. K. Ogilvie, Tetrahed
ron Lett. 1985, 26,4567〕、このような遮蔽効果は低
いカップリングをもたらす。リボヌクレオシドホスホネ
ートはホスホアミダイトよりも加水分解および酸化に対
してより安定であり、比較的短いサイクル時間でオリゴ
ヌクレオチド合成を行なうことが可能になる。
【0036】本発明のリボヌクレオチドホスホネートは
Froehlerにより開発された方法を用いて調製してよい
〔B. Froehler, P. G. Nug, M. D. Mateuci, Nucl. Aci
ds Res. 1986, 14, 5399〕。オリゴヌクレオチド部分が
3′および/または5′末端で修飾されている式Iの化
合物は、これらの修飾に関し、EP−A 0 552 7
66に記載の方法を用いて合成する。本発明は更にまた
薬剤の調製のための式Iの新しい化合物の使用、およ
び、新しいオリゴヌクレオチドを生理学的に許容性のあ
る賦形剤および適切には適当な添加剤および/または補
助物質と混合することからなる薬剤の調製方法に関す
る。
【0037】最も一般的な態様においては、本発明は薬
剤の治療活性成分としての式Iの化合物の使用に関す
る。一般的に、治療活性オリゴヌクレオチド誘導体はア
ンチセンスオリゴヌクレオチド、三重螺旋形成オリゴヌ
クレオチド、アプタマーまたはリボソーム、特に、アン
チセンスオリゴヌクレオチドを指すものとする。更に、
本発明はまた8−アザプリンを少なくとも1つ含む、好
ましくは8−アザグアニンまたは8−アザアデニンを含
むオリゴヌクレオチドの使用に関し、例えば、生物学的
試料中の特定の二重鎖または一重鎖の核酸分子の存在ま
たは不存在またはその量を検出するための、診断薬とし
ての使用に関する。本発明に従って使用するためには、
オリゴヌクレオチドは4〜100、好ましくは約5〜4
0、特に約6〜30個のヌクレオチドの長さを有する。
このほか、上記した好ましい範囲、修飾およびコンジュ
ゲート形成もまた、この例に適用される。本発明の薬剤
は、例えばHIV、HSV−1、HSV−2、インフル
エンザ、VSV、B型肝炎またはパピローマウイルスに
より誘発される疾患の治療に用いることができる。
【0038】新しいアンチセンスオリゴヌクレオチド誘
導体、即ち、プリン塩基の少なくとも1つが8−アザプ
リン塩基で置き換えられており、この性質の標的に対し
て活性を有するようなアンチセンスオリゴヌクレオチド
は例えば以下に示すような塩基配列を有する。 a) HIVに対して活性を有する例 5′-ACACCCAATTCTGAAAATGG-3′ (I) 5-AGGTCCCTGTTCGGGCGCCA-3′ (II) 5′-GTCGACACCCAATTCTGAAAATGGATAA-3′ (III) 5′-GCTATGTCGACACCCAATTCTGAAA-3′ (IV) 5′-CTGTCTCCGCTTCTTCTTCCTGCCATAGGAG (V) 5-TCGTCGCTGTCTCCGCTTCTTCTTCCTGCCA (VI) b) HSV−1に対して活性を有する例 5′-GCGGGGCTCCATGGGGGTCG-3′ (VII)
【0039】本発明の薬剤はまた、例えば癌の治療に適
する。例えば、癌の発生と増殖に関与する標的に対する
オリゴヌクレオチド配列をこの観点において使用でき
る。このような標的の例を以下に示す。 1) 核腫瘍蛋白、例えばc−myc、N−myc、c
−myb、c−fos、c−fos/jun、PCNA
およびp120 2) 原形質/膜関連腫瘍蛋白、例えばEJ−ras、
c−Ha−ras、N−ras、rrg、bcl−2、
cdc−2、c−raf−1、c−mos、c−src
およびc−abl 3) 細胞受容体、例えばEGF受容体、c−erb
A、レチノイド受容体、蛋白キナーゼ調節サブユニット
およびc−fms 4) サイトカイン、生長因子および細胞外マトリック
ス、例えば、CSF−1、IL−6、IL−1a、IL
−1b、IL−2、IL−4、bFGF、ミエロブラス
チンおよびフィブロネクチン
【0040】この性質の標的に対する活性を有する式I
の新しいアンチセンスオリゴヌクレオチドは、例えば以
下に示す塩基配列を有する。 a) c−Ha−rasに対して活性を有する例 5′-CAGCTGCAACCCAGC-3′ (VIII) c) c−myc 5′-GGCTGCTGGAGCGGGGCACAC-3′ (IX) 5′-AACGTTGAGGGGCAT-3′ (X) d) c−myb 5′-GTGCCGGGGTCTTCGGGC-3′ (XI) e) c−fos 5′-GGAGAACATCATGGTCGAAAG-3′ (XII) 5′-CCCGAGAACATCATGGTCGAAG-3′ (XIII) 5′-GGGGAAAGCCCGGCAAGGGG-3′ (XIV) f) p120 5′-CACCCGCCTTGGCCTCCCAC-3′ (XV) g) EGF受容体 5′-GGGACTCCGGCGCAGCGC-3′ (XVI) 5′-GGCAAACTTTCTTTTCCTCC-3′ (XVII) h) p53腫瘍抑制物質 5′-GGGAAGGAGGAGGATGAGG-3′ (XVIII) 5′-GGCAGTCATCCAGCTTCGGAG-3′r (XIX)
【0041】本発明の薬剤はまた、インテグリンまたは
細胞−細胞付着受容体、例えば、VLA−4、VLA−
2、ICAM、VCAMまたはELAMの影響を受ける
疾患の治療に適している。この性質の標的に対して活性
を有する新しいアンチセンスオリゴヌクレオチド誘導体
は、例えば以下に示すような塩基配列を有する。 a) VLA−4 5′-GCAGTAAGCATCCATATC-3′ (XX) b) ICAM 5′-CCCCCACCACTTCCCCTCTC-3′ (XXI) 5′-CTCCCCCACCACTTCCCCTC-3′ (XXII) 5′-GCTGGGAGCCATAGCGAGG-3′ (XXIII) c) ELAM−1 5′-ACTGCTGCCTCTTGTCTCAGG-3′ (XXIV) 5′-CAATCAATGACTTCAAGAGTTC-3′ (XXV)
【0042】本発明の薬剤はまた、例えば、再狭窄を防
止するのに適している。例えば、増殖または移行に関与
する標的に対するオリゴヌクレオチド配列を、この観点
において使用してよい。このような性質の標的の例を以
下に示す。 1) 核相互活性化蛋白およびサイクリン、例えば、c
−myc、c−myb、c−fos、c−fos/ju
n、サイクリンおよびcdc2キナーゼ 2) 有糸分裂促進物質または生長因子、例えばPDG
F、bFGF、EGF、HB−EGFおよびTGH−β 3) 細胞受容体、例えば、bFGF受容体、EGF受
容体およびPDGF受容体
【0043】この性質の標的に対して活性を示す式Iの
新しいオリゴヌクレオチドは、例えば以下に示す塩基配
列を有する。 a) c−myb 5′-GTGTCGGGGTCTCCGGGC-3′ (XXVI) b) c−myc 5-CACGTTGAGGGGCAT-3′ (XXVII) c) cdc2キナーゼ 5′-GTCTTCCATAGTTACTCA-3′ (XXVIII) d) PCNA(ラット増殖細胞核抗原) 5′-GATCAGGCGTGCCTCAAA-3′ (XXIX)
【0044】薬剤は、例えば、経口投与できる試薬製剤
の形態、例えば錠剤、コーティングされた錠剤、ハード
またはソフトゼラチンカプセル、溶液、乳液または懸濁
液の形態で使用してよい。適切には蛋白のような別の成
分も含有する薬剤のリポソームへの封入もまた、適当な
投与形態である。これらはまた、肛門から例えば坐薬の
形態で、または、非経腸的に例えば注射溶液の形態で投
与してよい。薬学的製剤を調製するためには、これらの
化合物を治療不活性の有機および無機の賦形剤中に配合
する。錠剤、コーティングされた錠剤およびハードゼラ
チンカプセルに適するこのような性質の賦形剤の例は、
乳糖、コーンスターチまたはその誘導体、タローおよび
ステアリン酸またはその塩である。水、ポリオール、ス
クロース、転化糖およびグルコースは溶液調製のために
適する賦形剤である。水、アルコール、ポリオール、グ
リセロールおよび植物油は、注射溶液に適する賦形剤で
ある。植物油および硬化油、ワックス、脂肪および半液
体ポリオールは坐薬に適する賦形剤である。薬学的製剤
はまた、保存料、溶媒、安定剤、湿潤剤、乳化剤、甘味
料、着色料、フレーバー剤、浸透圧調製用の塩、緩衝
剤、コーティング剤および抗酸化剤、更に、適切な場合
は、その他の治療活性物質も含有してよい。
【0045】好ましい形態の投与は、例えばカテーテル
や注射を用いた局所投与である。注射のためには、アン
チセンスオリゴヌクレオチド誘導体を、液体溶液、好ま
しくは生理学的に許容される緩衝液、例えば、ハンク液
またはリンゲル液中に製剤する。しかしながら、アンチ
センスオリゴヌクレオチドはまた、固体形態に製剤し、
そして溶解または懸濁した後に使用することができる。
全身投与に好適な用量は、1日当たり約0.01mg/kg
〜約50mg/kg体重である。極めて一般的な態様におい
て、本発明は、DNAプローブまたはDNA診断におけ
るプライマーとして、そして、一般的には、分子生物学
における手段としての式Iの化合物の使用にも関する。
【0046】好ましい形態の投与は、例えばカテーテル
や注射を用いた局所投与である。注射のためには、アン
チセンスオリゴヌクレオチド誘導体を、液体溶液、好ま
しくは生理学的に許容される緩衝液、例えば、ハンク液
またはリンゲル液中に製剤する。しかしながら、アンチ
センスオリゴヌクレオチドはまた、固体形態に製剤し、
そして溶解または懸濁した後に使用することができる。
全身投与のために好適な用量は、一日当たり約0.01m
g/kg〜約50mg/kg体重である。
【0047】極めて一般的な態様において、本発明は、
DNAプローブまたはDNA診断におけるプライマーと
して、そして、一般的には、分子生物学における手段と
しての式Iの化合物の使用にも関する。
【0048】例:実施例で記載する化合物(1)〜(1
6)は、以下に示す構造を有する。
【化21】
【0049】
【化22】
【0050】実施例1 5−アミノ−3−(2−デオキシ−β−D−エリスロペ
ントフラノシル)−3H−1,2,3−トリアゾロ〔4,
5−d〕ピリミジン−7−(6H)−オン−5′−O−
トリホスフェート、トリエチルアンモニウム塩(8−ア
ザ−2′−デオキシグアノシン5′−トリホスフェー
ト) 穏やかに加温しながら、3−(2−デオキシ−β−D−
エリスロペントフラノシル)−5−アミノ−3H−1,
2,3−トリアゾロ〔4,5−d〕ピリミジン−7−(6
H)−オン(8−アザ−2′−デオキシグアノシン
(1)(26mg;0.09ミリモル)を1,8−ビス(ジ
メチルアミノ)ナフタレン(33mg、0.15ミリモ
ル)とともにトリメチルホスフェート溶液(0.25m
l)中に入れた。溶液を0℃に冷却した後、新しく蒸留
したPOCl3(12μl、0.13ミリモル)を添加し
た。反応を4℃で4時間維持し、次にトリ−n−ブチル
アンモニウムジホスフェート(DMF中0.5mM、1m
l)およびトリ−n−ブチルアミン(100μl、0.4
2ミリモル)よりなる溶液を添加した。3分間0℃でこ
の混合物を撹拌した後、1M TBC緩衝液(10ml)
を添加し、全体を蒸発乾固させた。残留物をDEADセ
ファデックスR(1.5×20cmカラム、HCO3 -型)上
のクロマトグラフィーに付した。水約500mlでカラム
を洗浄した後、水/0.9M TBC緩衝液(各々1L)
の一次勾配を用いてクロマトグラフィーを行なった。こ
れにより、0.5M TBC緩衝液(0.019mM、20
%)にほぼ主要領域が得られた。TLC(シリカゲル、
i−プロパノール/水/アンモニア、3:1:1) Rf 0.2。UV(H2O):λmax256nm。31 P-NMR(0.1 Mトリス−HCl, pH 8.0, 100mM EDTA/D
2O):-10.27(d, J=19.3, Px);-10.63(td, J=20.2およ
び6.0, Pα);-22.60(t, J=19.8, Pβ)。
【0051】実施例2 3−(2−デオキシ−β−D−エリスロペントフラノシ
ル)−5−{〔(ジメチルアミノ)メチリデン〕アミ
ノ}−3H−1,2,3−トリアゾロ〔4,5−d〕ピリ
ミジン−7−(6H)−オン(2) 3−(2−デオキシ−β−D−エリスロペントフラノシ
ル)−5−アミノ−3H−1,2,3−トリアゾロ〔4,
5−d〕ピリミジン−7−(6H)−オン(8−アザ−
2′−デオキシグアノシン(1))(290mg;1.0
6ミリモル)を無水DMF(7ml)に溶解し、N,N−
ジメチルホルムアミドジエチルアセタール(5ml)を添
加した。混合物を24時間室温で撹拌した後、ロータリ
ーエバポレーターで真空下に蒸発させ、残留物をトルエ
ンと共蒸発させた。残留物をシリカゲル上のクロマトグ
ラフィーにより精製した(カラム:20×4cm、0.5b
ar、CH2Cl2/MeOH 8:2)。化合物(2)
(320mg、92%)が無色の泡状物として得られ、こ
れをメタノールから結晶化させた。 m.p. 236℃。 TLC(CH2Cl2/MeOH 8:2):Rf 0.7。UV(MeOH):301(2650
0), 244(15500)。1 H-NMR((D6)DMSO:8.66(s, CH);6.43(t, J=6.32, H-C
(1′));5.40(br. s, OH-C(3′));4.79(br. s, OH-C
(5′));4.48(m, H-C(3′));3.85(m, H-C(4′));3.57
(m, H-C(5′));3.19, 3.06(2 s, 2CH3);2.90(m, Hβ-
C(2′));2.34(m, H(α)-C(2′))。 元素分析値(C121774(323.31)として) 計算値:C 44.56;H 5.29;N 30.32 測定値:C 44.64;H 5.26;N 30.37
【0052】実施例3 3−〔2−デオキシ−5−O−(4,4′−ジメトキシ
トリチル)−β−D−エリスロペントフラノシル〕−5
−{〔(ジメチルアミノ)メチリデン〕アミノ}−3H
−1,2,3−トリアゾロ〔4,5−d〕ピリミジン−7
−(6H)−オン(3) 実施例2のアミノ保護した8−アザ−2′−デオキシグ
アノシン(2)(170mg、0.53ミリモル)を無水
ピリジンとともにくり返し共蒸発させることにより処理
し、次に後者6ml中に溶解した。4,4′−ジメトキシ
トリチルクロリド(260mg、0.7ミリモル)を室温
で添加し、この混合物を3時間撹拌した。溶液を5%炭
酸水素ナトリウム(40ml)中に注加し、この混合物を
各々塩化メチレン30mlで2回抽出した。合わせた有機
層を硫酸ナトリウム上で乾燥し、真空下ロータリーエバ
ポレーターで蒸発させた。残留物をシリカゲル上のクロ
マトグラフィーに付した(カラム:15×4cm、0.5
bar、CH2Cl2/MeOH 95:5)。無色の泡状物
270mg(82%)を得た。 TLC(CH2Cl2/MeOH 95:5):Rf 0.3。 UV(MeOH):302(24600), 235(35000)。1 H-NMR;((D6)DMSO:12.03(s, NH);8.66(s, CH);7.39
〜6.70(2 m, 芳香族 H);6.48(m, H-C(1′));4.57(m,
H-C(3′));3.97(m, H-C(4′));3.69(s, 2 OCH 3);3.3
7(m, H-C(5′));3.22, 3.07(2s, 2CH3);2.90(m, Hβ-
C(2′));2.40(m, H(α)-C(2′))。 元素分析値(C333576(625.68)として) 計算値:C 63.34;H 5.64;N 15.67 測定値:C 63.42;H 5.72;N 15.71
【0053】実施例4 3−〔2−デオキシ−5−O−(4,4′−ジメトキシ
トリチル)−β−D−エリスロペントフラノシル〕−5
−{〔(ジメチルアミノ)メチリデン〕アミノ}−3H
−1,2,3−トリアゾロ〔4,5−d〕ピリミジン−7
−(6H)−オン3′(トリエチルアンモニウムホスホ
ネート)(4) 1,2,4−トリアゾール(0.54g、7.56ミリモ
ル)を塩化メチレン(10ml)中の三塩化リン(200
μl、0.22ミリモル)およびN−メチルモルホリン
(2.7ml、2.24ミリモル)の溶液に添加した。溶液
を30分間撹拌放置し、次に0℃に冷却した。実施例3
の5′−O−ジメトキシトリチル化合物3(220mg、
0.35ミリモル)を乾燥シアン化メチルとともに共蒸
発させることにより乾燥させ、次に、塩化メチレン(5
ml)中に溶解した後に添加した。10分間撹拌した後、
混合物を1M(Et3NH)HCO3(TBC緩衝液、pH
8.0、30ml)中に注加し、後者の混合物を塩化メチ
レンとともに振盪して相を分離することにより2回抽出
した。合わせた有機溶液を硫酸ナトリウム上で乾燥し、
蒸発させた。残留物をシリカゲル上のクロマトグラフィ
ーに付した(カラム:4×15cm、0.5 bar;1.ジ
クロロメタン/トリエチルアミン 98:2;2.ジク
ロロメタン/メタノール/トリエチルアミン 88:1
0:2)。主要領域に存在する物質を塩化メチレン(1
0ml)中に溶解し、この溶液を0.1M TBC緩衝液
(pH8.0)とともに振盪することにより数回抽出し
た。H−ホスホネート4(240mg、85%)を無色の
泡状物として得た。 TLC(CH2Cl2/MeOH/Et3N 88:10:2):Rf 0.3。 UV(MeOH):285(sh, 14900), 303(18400)。1 H-NMR;((D6)DMSO:11.68(s, NH);8.83(s, CH);7.7
7, 5.45(d, J=585, HP);7.24〜6.69(2 m, 芳香族 H),
6.53(m, J=4.5, H-Cl′));5.22(m, H-C(3′));4.09
(m, H-C(4′));3.67(s, 2 OCH3);3.07, 3.23(s, 2 CH
3, H-C(5′));2.97(m, CH3CH2);2.56(m, H-C(2′));
1.13(m, CH3CH2)。31 P-NMR((D6)DMSO):1.16(1J(P,H)=585);3J(P,H-C
(3′)-8.90。 元素分析値(C3951881(790.87)とし
て) 計算値:C 59.23;H 6.49;N 14.17 測定値:C 59.33;H 6.79;N 13.95
【0054】実施例5 3−〔2−デオキシ−5′−O−(4,4′−ジメトキ
シトリチル)−β−D−エリスロペントフラノシル〕−
5−{〔(ジメチルアミノ)メチリデン〕アミノ}−3
H−1,2,3−トリアゾロ〔4,5−d〕ピリミジン−
7−(6H)−オン3′〔(2−シアノエチル)−N,N
−ジイソプロピルホスホアミダイド〕(5) (i−Pr)2EtN(56μl、0.27ミリモル)お
よびクロロ(2−シアノエトキシ)ジイソプロピルアミ
ノホスファン(115μl、0.51ミリモル)を塩化
メチレン(1ml)中の実施例3の化合物(3)(50m
g、0.08ミリモル)の溶液に添加した。混合物をアル
ゴン下2時間室温で撹拌した。次に5%炭酸水素ナトリ
ウム(3ml)中に注加し、この混合物を塩化メチレン
(30ml)で2回抽出した。合わせた有機層を硫酸ナト
リウム上で乾燥し、ロータリーエバポレーター上で蒸発
乾固した。残留物をシリカゲル上のクロマトグラフィー
に付した(カラム:7×2cm、0.5bar、ジクロロメタ
ン/酢酸エチル/トリエチルアミン 45:45:1
0)。ホスホアミダイド(5)のジアステレオマーの2
つの重複する領域を判別することが可能であり、ジアス
テレオマーは無色の泡状物として得られた(35mg、5
5%)。 TLC(CH2Cl2/AcOET/Et3N 45:45:10);Rf 0.4。31 P-NMR((D6)DMSO):149.4,148.9。
【0055】実施例6 2−〔2−デオキシ−5−O−(4,4′−ジメトキシ
トリチル)−3′−O−スクシニル−β−D−エリスロ
ペントフラノシル〕−5−{〔(ジメチルアミノ)メチ
リデン〕アミノ}−3H−1,2,3−トリアゾロ〔4,
5−d〕ピリミジン−7−(6H)−オン(6) 4−ジメチルアミノピリジン(30mg、0.23ミリモ
ル)および無水コハク酸(90mg、0.88ミリモル)
をピリジン(5ml)中の実施例3の保護したヌクレオシ
ド(3)(110mg、0.18ミリモル)の溶液に添加
した。混合物を48時間室温で撹拌放置した。水2mlを
添加することにより反応を停止した。混合物を蒸発乾固
した後、残留物をトルエンとともに共蒸発させることに
より、残留するピリジンを除去した。残留物を少量の塩
化メチレン中に溶解し、この溶液をクエン酸10%水溶
液および水で洗浄した。有機層を硫酸ナトリウム上で乾
燥し、真空下に濃縮した。残留物をジクロロメタン/ピ
リジン(95:5、2ml)中に溶解した後、n−ペンタ
ン/エーテル(1:1、30ml)を急速に添加した。上
澄みを濾去し、無色の粉末が残留した(85mg、66
%)。 TLC(CH2Cl2/MeOH 9:1):Rf 0.2
5。1 H-NMR((D6)DMSO):8.71(s, CH);7.28〜6.75(2 m, 芳
香族 H);6.46(m, J=4.1,H-C(1′));5.48(m, H-C
(3′));4.21(m, H-C(4′));3.36(s, 2 OCH3);3.18,
3.05(2 s, 2 CH3);3.10(m, H-C(5′));2.51(m, H-C
(2′), 2 CH2)。
【0056】実施例7 7−(ベンゾイルアミノ)−1,2,3−トリアゾロ
〔4,5−d〕ピリミジン8−アザアデニン(200m
g、1.47ミリモル)を乾燥ピリジン中で3回蒸発さ
せ、次に乾燥ピリジン5ml中に溶解した。次にベンゾイ
ルクロリド(0.28ml、2.20ミリモル)を滴加し、
混合物を3時間60℃で撹拌した。次に更に1時間還流
下に煮沸した。反応混合物を一夜放置し、次に約1mlと
なるまで濃縮した。この混合物に冷水15mlを添加し、
5分間撹拌放置し、得られた沈殿を吸引濾去した。わず
かに黄色味を帯びた沈殿を各々冷水1mlおよび冷アセト
ニトリル1mlで2回洗浄した。無色の結晶0.30g(8
5%)を得た(メタノール)。 m.p.=263℃(分解)。 TLC(シリカゲル、CH2Cl2/MeOH=8:2);Rf=0.6。 UV(メタノール)λmax(ε)=242(12100);291(16000)。1 H-NMR(D6-DMSO)δ:7.58;7.69;8.13(芳香族 -H5) 8.
89(s, H-5), 11.99(s-N6-H)。 元素分析値(C1186Oとして) 計算値:C 54.99;H 3.36;N 34.99 測定値:C 55.10;H 3.34;N 35.04
【0057】実施例8 7−(ノナノイルアミノ)−3−〔(2,3,5−トリ−
O−アセチル)−β−D−リボフラノシル〕−3H−1,
2,3−トリアゾロ〔4,5−d〕ピリミジン(7) 7−ノナノイルアミド−1,2,3−トリアゾロ〔4,5
−d〕ピリミジン500mg(1.18ミリモル)を乾燥
ピリジン中で3回蒸発乾固させた。残留物を乾燥アセト
ニトリル20ml中に溶解した。1,2,3,5−テトラ−
O−アセチル−β−D−リボフラノース0.58g(1.
81ミリモル)を添加し、四塩化スズ0.64ml(5.4
3ミリモル)を滴加し、反応混合物を24時間室温で撹
拌した。反応溶液を飽和炭酸水素ナトリウム溶液25ml
中に添加し、この混合物を各々ジクロロメタン15mlで
4回抽出した。硫酸ナトリウム上で乾燥させた後、合わ
せた有機層を蒸発乾固した。油状の残留物0.81gが
得られた。生成物混合物をカラムクロマトグラフィー
(5.5×30cmカラム、シリカゲル、溶離剤:ジクロ
ロメタン/メタノール 95:5)により分画した。無
色のヌクレオシド0.27g(28%)が比較的速く移
行する領域から得られた。 TLC(シリカゲル、CH2Cl2/MeOH);Rf=0.75。 UV(メタノール)λmax(ε)=275(16800)。1 H-NMR(D6-DMSO)δ:0.82(m, -CH3-9″);1.22(m, -(CH
2)5-);1.62(m, J=6.8 Hz, -CH2-3″);1.93;2.08;2.
11(3s, O=CCH3);2.61(t, J=7.2 Hz, -CH2-2″);4.26
(m, H-5′);4.52(m, H-4′);5.77(m, H-3′);6.12
(m, H-2′);6.63(d, J=3.4 Hz, H-1′);8.89(s, H-
5);11.48(s, br, N6-H)。
【0058】実施例9 7−アミノ−1,2,3−トリアゾロ〔4,5−d〕ピリ
ミジンの1,2,3,5−テトラ−O−アセチル−β−D
−リボフラノースとのグリコシル化 7−アミノ−1,2,3−トリアゾロ〔4,5−d〕ピリ
ミジン340mg(2.5ミリモル)および1,2,3,5−
テトラ−O−アセチル−β−D−リボフラノース800
mg(2.5ミリモル)を乾燥アセトニトリル10ml中に
懸濁した。四塩化スズ0.88ml(7.5ミリモル)をア
ルゴン下、5分間かけてこの混合物に滴加し、次に全体
を24時間室温で撹拌した。得られた溶液を飽和炭酸水
素ナトリウム溶液32mlに慎重に注加した。生じた沈殿
を吸引濾過し、各々水10mlで2回洗浄した。濾液と洗
浄水を各々塩化メチレン15mlで4回抽出した。硫酸ナ
トリウム上で乾燥し、溶媒を蒸発させた後、わずかに黄
色味を帯びた泡状物0.87gを得た。反応生成物をカ
ラムクロマトグラフィー(カラム:5.5×20cm、シ
リカゲル、ジクロロメタン/メタノール 98:2−9
0:10)により分画した。
【0059】実施例10 7−アミノ−3−〔(2,3,5−トリ−O−アセチル)
−β−D−リボフラノシル〕−3H−1,2,3−トリア
ゾロ〔4,5−d〕ピリミジン(8) 比較的速く移行する領域から無色泡状物0.34g(3
4%)を得た。 TLC(シリカゲル、CH2Cl2/MeOH 9:1);Rf=0.45。 UV(メタノール)λmax(ε)=280(10900)。1 H-NMR(D6-DMSO)δ:1.89;2.10;2.11(3 s, 2′,3′,
5′-O-C=O);4.20(m, H2-5′);4.48(m, H-4′);5.74
(t, J=5.5 Hz, H-3′);6.07(t, J=3.7 Hz, H-2′);6.
48(d, J=2.8, H-1′);8.25;8.6(2 s, N6-H2), 8.34
(s, H-5)。 元素分析値(C151867として) 計算値:C 45.68;H 4.61;N 21.31 測定値:C 45.98;H 4.72;N 21.40
【0060】実施例11 7−アミノ−2−〔(2,3,5−トリ−O−アセチル)
−β−D−リボフラノシル〕−2H−1,2,3−トリア
ゾロ〔4,5−d〕ピリミジン 無色の泡状物0.46g(47%)をクロマトグラフィ
ー精製段階の比較的遅く移行する領域から得た。 TLC(シリカゲル、CH2Cl2/MeOH);Rf=0.35。 UV(メタノール)λmax(ε)=253(3900), 300(10400)。1 H-NMR(D6-DMSO)δ:1.94;2.07;2.11(3 s, 2′,3′,
5′-O-C=O);4.25(m, H2-5′);4.52(m, H-4′);5.74
(t, J=6.0, H-3′);5.91(d, J=3.4, H-2′);6.53(s,
H-1′);8.3;8.45(2 s, N6-H2), 8.34(H-5)。 元素分析値(C151867として) 計算値:C 45.68;H 4.61;N 21.31 測定値:C 45.86;H 4.71;N 21.22
【0061】実施例12 7−アミノ−3(β−D−リボフラノシル)−3H−
1,2,3−トリアゾロ〔4,5−d〕ピリミジン(8−
アザアデノシン,9) 化合物(8)2.04g(5.17ミリモル)をメタノー
ル5mlおよびアンモニア水(25%)5ml中で2時間室
温で撹拌した。水3ml中の残留物を蒸発乾固させて再結
晶させた後、無色の結晶1.04g(75%)を得た
が、これは217℃で分解した。 TLC(シリカゲル、CH2Cl2/MeOH=8:2);Rf=0.45。 UVλmax(pH 7)=279(11600);λmax(pH 1)=263, λmax(p
H 14)=279。1 H-NMR(D6-DMSO)δ:3.56(m, H2-5′);4.01(m, H-
4′);4.29(m, 3′);4.85(m, H-2′);5.01(t, J=5.9
Hz, HO-5′);5.28(d, J=5.7, HO-3′);5.56(d, J=6.0
HO-2′);6.15(d, J=5.2 Hz, H-1′);8.31(s, H-5);
8.53;8.19(2 s, N7H2)。
【0062】実施例13 7−アミノ−2−(β−D−リボフラノシル)−2H−
1,2,3−トリアゾロ〔4,5−d〕ピリミジン メタノール5mlおよびアンモニア水(25%)5ml中2
時間室温で実施例11の化合物0.81g(2.05ミリ
モル)を撹拌した。蒸発乾固させ、残留物を水2.5ml
から再結晶させた後、無色の結晶0.32g(59%)
が得られたが、これは209℃で分解した。 TLC(CH2Cl2/MeOH=8:2);Rf=0.20。 UV(メタノール)λmax(ε)=255(4400), 263(4100), 297
(10400)。1 H-NMR(D6-DMSO)δ:3.59(m, H2-5′);4.06(m, H-
4′);4.33(m, H-3′);4.61(m, H-2′);4.76(t, J=5.
3 Hz, HO-5′);5.27(d, J=5.8 Hz, HO-3′);5.68(d,
J=5.5 Hz, HO-2′);6.08(s, J=3.4 Hz, H-1′);8.31
(s, H-5);8.12(s, N7-H2)。
【0063】実施例14 7−ベンゾイルアミノ−3(β−D−リボフラノシル)
−3H−1,2,3−トリアゾロ〔4,5−d〕ピリミジ
ン(10) 7−アミノ−3−β−D−リボフラノシル−3H−1,
2,3−トリアゾロ〔4,5−d〕ピリミジン100mg
(0.37ミリモル)をまず乾燥ピリジン5ml中に入れ
た。トリメチルシリルクロリド0.47ml(3.7ミリモ
ル)をアルゴン雰囲気下この溶液に滴加した。混合物を
0.5時間室温で撹拌した後(TLCモニター)、ベン
ゾイルクロリド0.25ml(2.0ミリモル)を滴加し、
この反応混合物を4時間室温で撹拌した。次に0〜5℃
に冷却し、水1mlを添加し、5分後にアンモニア水(2
5%)2mlを添加した。次にこの混合物を更に30分間
撹拌した。溶媒を蒸発させ、残留物をトルエンとともに
蒸発させた。残留物を飽和炭酸水素ナトリウム溶液15
ml中に溶解し、この混合物を1回塩化メチレン25ml
で、そして数回酢酸エチルで抽出した。合わせた有機層
を硫酸ナトリウム上で乾燥した。溶媒を蒸発させた後、
無色の結晶性物質0.05g(36%)が得られ、これ
はメタノールから結晶化させた後、188℃で分解しな
がら溶融した。 TLC(シリカゲル、CH2Cl2/MeOH 9:1);Rf=0.25。 UV(メタノール)λmax(ε)=242(9400), 282(20300)。1 H-NMR(D6-DMSO)δ:3.56(m, H2-5′);4.04(m, H-
4′);4.36(m, H-3′);4.84(t, HO-5′);4.92(m, H-
2′);5.33(d, J=5.2 Hz, HO-3′);5.66(d, J=5.4 Hz,
HO-2′);6.30(d, J=4.3 Hz, 1′);7.54〜8.11(m, 芳
香族 -H5);8.94(s, H-5);11.99(s, br, N6-H)。 元素分析値(C161666として) 計算値:C 51.60;H 4.34;N 22.57 測定値:C 51.49;H 4.43;N 22.74
【0064】実施例15 7−{〔(ジメチルアミノ)メチリデン〕アミノ}−3
−(β−D−リボフラノシル)−3H−1,2,3−トリ
アゾロ〔4,5−d〕ピリミジン(11) 7−アミノ−3−β−D−リボフラノシル−(3H)−
1,2,3−トリアゾロ〔4,5−d〕ピリミジン 100
mg(0.37ミリモル)を乾燥DMF 2mlおよびN,N
−ジメチルホルムアミドジメチルアセタール0.25ml
(1.85ミリモル)中、室温で一夜撹拌放置した。次
にこの反応混合物にメタノール4mlを添加した。更に2
時間撹拌した後、混合物を蒸発乾固させ、残留物をトル
エンと共に共蒸発させ、次に、シリカゲル上のクロマト
グラフィーに付した(カラム:3×20cm、溶離剤ジク
ロロメタン/メタノール 98:2−90:10)。無
色のガラス状の固化した物質0.06g(52%)が主
要領域中に得られた。 TLC(シリカゲル、CH2Cl2/MeOH=9:1);Rf=0.25。 UVλmax(ε)=235, 325。1 H-NMR(D6-DMSO)δ:3.21;3.27(2 s, N(CH3)2);3.55
(m, H2-5′);4.00(m, H-4′);4.31(m, H-3′);4.87
(m, H-2′);4.96(t, HO-5′);5.32(d, HO-3′);5.60
(d, HO-2′);6.19(d, J=4.7 Hz, H-1′);8.57(s, H-
5);9.06(s, N=CH)。
【0065】実施例16 7−{〔1−(ジメチルアミノ)エチリデン〕アミノ}
−3−(β−D−リボフラノシル)−3H−1,2,3−
トリアゾロ〔4,5−d〕ピリミジン(12) N,N−ジメチルアセトアミドジメチルアセタール0.9
1ml(5.59ミリモル)を分析等級のメタノール10m
l中の物質9の500mg(1.86ミリモル)に添加し
た。懸濁液を14時間室温で撹拌放置した。得られた溶
液からロータリーエバポレーターを用いて溶媒を除去
し、残留物をトルエンとともに共蒸発させた。更にメタ
ノール10mlを残留物に添加し、この混合物を2時間室
温で撹拌した。溶媒を除去した後、残留物をシリカゲル
上のクロマトグラフィーに付した(カラム:4×20c
m、溶離剤ジクロロメタン/メタノール=98:2−9
0:10)。収量:無色の泡状物0.48g(76
%)。 TLC(シリカゲル、CH2Cl2/MeOH=9:1);Rf=0.35。 UV(メタノール)λmax(ε)=233(9300), 270(3600), 324
(26100)。1 H-NMR(D6-DMSO)δ:2.28(s, N=C-CH3);3.20(s, N(C
H3)2);3.55(m, H2-5′);4.00(m, H-4′);4.30(m, H-
3′);4.86(m, H-2′);4.98(t, HO-5′);5.29(d,J=5.
2 Hz, HO-3′);5.57(d, J=5.9 Hz, HO-2′);6.18(d,
J=5.2 Hz, H-1′);8.54(s, H-5)。 元素分析値(C131974として) 計算値:C 46.28;H 5.69;N 29.07 測定値:C 46.45;H 5.63;N 28.97
【0066】実施例17 7−{〔1−(ジメチルアミノ)エチリデン〕アミノ}
−3−〔5−O−(4,4′−ジメトキシトリフェニル
メチル)−β−D−リボフラノシル〕−3H−1,2,3
−トリアゾロ〔4,5−d〕ピリミジン(13) 乾燥させるために化合物12(0.34g、1.00ミリ
モル)を乾燥ピリジン中で2回蒸発させた。その物質を
乾燥ピリジン4mlに溶解し、4,4′−ジメトキシトリ
チルクロリド0.41g(1.20ミリモル)を添加し、
次に、2時間40℃で混合物を撹拌した。混合物を室温
に冷却した後、分析等級のメタノール5mlを添加し、こ
の混合物を更に30分間撹拌した。反応溶液をほぼ半分
の容量になるまで濃縮した。炭酸水素ナトリウム飽和溶
液8mlを添加し、全体を、各々塩化メチレン10mlで4
回抽出した。合わせた有機層を塩化ナトリウム飽和溶液
15mlとともに振盪することにより抽出し、硫酸ナトリ
ウム上で乾燥し、蒸発させた。残留物(淡黄色泡状物
0.73g)をカラムクロマトグラフィー(カラム:2
×20cm、シリカゲル、ジクロロメタン/メタノール9
5:5)を用いることにより更に精製した。収量:無色
泡状物0.52g(81%) TLC(シリカゲル、CH2Cl2/MeOH=9:1);Rf=0.45。 UV(メタノール)λmax(ε)=234(29900), 275(13800), 32
4(24800)。1 H-NMR(D6-DMSO)δ:2.24(s, N=CCH3);3.10(m, H2-
5′);3.19(s, N(CH3)2);3.69(s, (OCH3)2);4.14(m,
H-4′);4.51(m, H-3′);4.86(m, H-2′);5.28(d,J=
6.2 Hz, HO-3′);5.68(d, J=5.1 Hz, HO-2′);6.25
(d, H-1′);6.71〜7.26(m, 13芳香族 H);8.54(s, H-
5)。 元素分析値(C343776として) 計算値:C 63.83;H 5.84;N 15.33 測定値:C 63.64;H 5.84;N 15.31
【0067】実施例18 7−{〔1−(ジメチルアミノ)エチリデン〕アミノ}
−3−{5−O−(4,4′−ジメトキシトリフェニル
メチル)−2−O−〔トリス(1−メチルエチル)シリ
ル〕−β−D−リボフラノシル}−3H−1,2,3−ト
リアゾロ〔4,5−d〕ピリミジン(14) 乾燥したトリチル化合物13(0.35g、0.55ミリ
モル)をまず乾燥ピリジン4ml中に導入した。硝酸銀1
40mg(0.82ミリモル)をこの溶液に添加し、次に
テトラヒドロフラン5ml中に溶解しておいたトリイソプ
ロピルクロリド145μl(0.69ミリモル)をアル
ゴン雰囲気下に添加した。混合物を遮光下室温で撹拌放
置した。24時間後、トリイソプロピルシリルクロリド
120μl(0.55ミリモル)を更に添加し、混合物
を更に48時間室温で撹拌放置した。析出した塩化銀を
濾去し、少量のテトラヒドロフランで洗浄した。濾液を
飽和炭酸水素ナトリウム溶液を添加した。これを4回各
々ジクロロメタン10mlで抽出し、合わせた有機層を硫
酸ナトリウム上で乾燥した。蒸発乾固させ、わずかに黄
色味を帯びた油状物0.60gを得た。反応生成物は、
カラムクロマトグラフィー(カラム:3×20cm、シリ
カゲル、溶離剤、酢酸エチル/石油エーテル8:2)で
精製分画した。無色の泡状物0.31g(71%)を比
較的速く移行する主要領域から得た。 TLC(シリカゲル、酢酸エチル/石油エーテル 9:1);Rf
=0.30。 UV(メタノール)λmax(ε)=234(29600), 274(6800), 325
(25900)。1 H-NMR(D6-DMSO)δ:0.83〜0.97(m, Si-〔CH(C
H3)2〕);2.24(s, N=CCH3), 3.10(m, H2-5′);3.19(s,
N(CH3)2);3.70(s, O-CH3)2);4.19(m, H-4′);4.43
(m,H-3′);5.21(t, J=4.4 Hz, H-2′);5.27(d, J=6.3
Hz, HO-3′);6.30(d, J=4.3 Hz, H-1′);6.75〜7.
35(m, 13芳香族 H);8.53(s, H-5)。 元素分析値(C435776として) 計算値:C 64.87;H 7.23;N 12.23 測定値:C 64.94;H 7.37;N 12.13
【0068】実施例19 7−{〔1−(ジメチルアミノ)エチリデン〕アミノ}
−3−{5−O−(4,4′−ジメトキシトリフェニル
メチル)−3−O−〔トリス(1−メチルエチル)シリ
ル〕−β−D−リボフラノシル}−3H−1,2,3−ト
リアゾロ〔4,5−d〕ピリミジン(15) 化合物14に関して上記したとおり行なったカラムクロ
マトグラフィーの比較的遅く移行する領域から無色の泡
状物0.08g(18%)を得た。 TLC(シリカゲル、酢酸エチル/石油エーテル 9:1);Rf
=0.15。 UV(メタノール)λmax(ε)=234(29800), 274(7400), 327
(24700)。1 H-NMR(D6-DMSO)δ:0.98(s, Si〔CH(CH3)23);2.19
(s, N=CCH3);3.10(m, H2-5′);3.18(s, N(CH3)2);3.
68(s, (OCH3)2);4.17(m, H-4′);4.92(m, H-3′,H-
2′);5.64(d, J=5.1 Hz, HO-2′);6.27(d, J=6.0 Hz,
H-1′);6.70〜7.20(m, 13芳香族 H);8.55(s, H-5)。
【0069】実施例20 7−{〔1−(ジメチルアミノ)エチリデン〕アミノ}
−3−{5−O−(4,4′−ジメトキシトリフェニル
メチル)−2−O−〔トリス(1−メチルエチル)シリ
ル〕−β−D−リボフラノシル}−3H−1,2,3−ト
リアゾロ〔4,5−d〕ピリミジン−3−O−ホスホネ
ート、トリエチルアンモニウム塩(16) 乾燥ジクロロメタン10ml中の三塩化リン114μl
(1.3ミリモル)およびN−メチルモルホリン1.43
ml(13.0ミリモル)の溶液に、アルゴン雰囲気下1,
2,4−トリアゾール0.67g(9.75ミリモル)を
添加した。反応混合物を30分間室温で撹拌した後、0
℃まで冷却し、乾燥ジクロロメタン2.5mlに溶解した
シリル化合物(14)を10分間かけて滴加した。反応
混合物を更に20分間0℃で撹拌し、次に、1M TB
C緩衝液で加水分解した、水層を3回各々ジクロロメタ
ン20mlで抽出した。合わせた有機層を、硫酸ナトリウ
ム上で乾燥し、蒸発乾固させた、残留物をシリカゲルカ
ラム上でクロマトグラフィーに付した(3×10cm、ジ
クロロメタン/メタノール/TEA 88:10:
2)。生成物を含有する画分を合わせて蒸発させること
により濃縮し、残留物をジクロロメタン20ml中に溶解
し、この溶液を4回各々0.1M TBC緩衝液5mlとと
もに振盪することにより抽出し、硫酸ナトリウム上で乾
燥し、溶媒を除去した。収量:無色泡状物0.21g
(83%) TLC(シリカゲル、CH2Cl2/MeOH/TEA 88:10:2);Rf=
0.6。 UV(メタノール)λmax(ε)=234(27300), 274(11700), 32
5(16400)。1 H-NMR(D6-DMSO)δ:0.75〜0.95(m, Si〔CH(C
H3)23);1.15;2.99(m, (CH3CH2)3N);2.24(s, N=CCH
3);3.20(s, N(CH3)2);(H2-5′verdeckt);3.69(s, (O
-CH 3)2);4.40(m, H-4′);4.79(m, H-3′);5.44(m, H
-2′);5.50 u. 7.91(d, 1J=602 Hz, P-H);6.27(d, J=
6.0 Hz, H-1′);6.76〜7.40(m, 13芳香族 H);8.50(s,
H-5);10.90(s, br, N+-H)。31 P-NMRδ:2.55(dd, 1PPH=602 H2, 3JPH=9.5 H2)。
【0070】実施例21 ホスホネート法を用いたオリゴヌクレオチドの固相合成 ホスホネート法およびApplied Biosystems(Weiterstad
t)のDNA合成装置を用いて1μmolの規模でオリゴリ
ボヌクレオチドを合成した。最終酸化は手操作で行なっ
た。 1.アンモニア(25%水溶液/エタノール 3:1
1)の作用に16時間曝露することにより支持体カラム
上のCPG支持体からオリゴリボヌクレオチドを単離し
た。 2.塩基保護基の除去 オリゴマーのアンモニア性の溶液を、未修飾(AU)6
列の場合は16時間55℃で、8−アザアデノシン含有
12量体の場合は3時間40℃で、ウォーターバス中加
熱した。溶液を室温で蒸発乾固させ、残留物を無水エタ
ノールとともに共蒸発させた。 3.2′−シリル保護基はTBAF/THFの1モル溶
液の作用に室温で16時間曝露することにより除去し
た。
【0071】実施例22 5′−(z8A−U)6−3′(17)の合成 オリゴリボヌクレオチド5′−(z8A−U)6−3′(1
7)の合成のために8−アザアデノシンの3′−ホスホ
ネートを用いた。ここでは、化合物(16)をウリジン
の5′−(MeO)2Tr−,2′−t−BuMe2Si
−保護3′−ホスホネートとともに使用した。3′から
5′の方向にControlled Pore Glass(CPG)上でオリゴヌ
クレオチドを合成し、その際、3′−末端保護ヌクレオ
シドをスクシニルスペーサーを介して固相に共有結合さ
せた。合成の最初では、支持体結合ヌクレオシドの5′
Dmt基をジクロロメタン中2.5%ジクロロ酢酸を用
いて除去した。次にピバロイルクロリドを用いて活性化
しておいたホスホネートを用いてカップリングを行なっ
た。不正確な配列となることを防止するために、未反応
の5′−OH基をイソプロピルホスファイトと反応させ
た。
【0072】実施例23 オリゴリボヌクレオチドの精製 1) 予備脱塩 Qiagenチップ500陰イオン交換カラムを用いた。RQia
genカラムを0.1MのTBC緩衝液5mlで平衡化し、オ
リゴマー溶液を充填し、0.1MのTBC緩衝液5mlで
洗浄した。次に、オリゴマーを1MのTBC緩衝液でカ
ラムから溶離させた。生成物画分をUV/TLCプレー
トを用いて検出した。緩衝液をオリゴマー含有画分から
RSpeed Vac遠心分離器を用いて真空下に除去した。 2) 調製用HPLC オリゴマーをRP 18 RLiChrosorbカラム上の逆相H
PLCにより単離した。この目的のために、オリゴマー
をジエチルピロカーボネート(DEPC)の1%水溶液
400μl中に溶解し、次にこの試料を2〜3分間95
℃で加熱し、次に急速に0℃に冷却し、これにより、二
次構造の形成を防止した。次にこの溶液の試料(10μ
l)を注入して保持時間を測定した。溶液は50〜10
0μlづつRP−18カラムに注入した。主要ピークを
分離し、合わせた画分を濃縮して、容量を約5mlとし
た。
【0073】移動相: A:0.1M TEAA(滅菌、pH7.5)/シアン化メ
チル 95:5 B:シアン化メチル 溶媒系I:20分、A中0〜20%B 溶媒系II:30分、A中0〜20%B
【0074】オリゴマー17の保持時間オリゴマー 保持時間(分) 溶媒系 (z8A−U)6 28.6 II 流速:1ml/分
【0075】3)脱塩 オリゴマー溶液5mlをあらかじめオートクレーブしシア
ン化メチル5ml、0.05M TEAA緩衝液(pH7.
0)/シアン化メチル1:1 5mlおよび0.05M T
EAA緩衝液5mlで平衡化したカラム(Millipore, Esch
born)に添加した。次にカラムを0.05M TEAA溶
液5mlで洗浄し、オリゴマーリボヌクレオチドをメタノ
ール/シアン化メチル/水1:1:1混合物1mlづつを
用いながらカラムから溶離させた。オリゴマー含有画分
をHPLCで同定した。RSpeedVac濃縮装置で凍結乾燥
した後、オリゴリボヌクレオチドを−25℃で保存し
た。
【0076】実施例24 オリゴリボヌクレオチドの全加水分解 オリゴマー0.2 A260単位をトリス塩酸緩衝液(pH8.
3)200μlに溶解し、次に、ヘビ毒ホスホジエステ
ラーゼ(Boehringer Mannheim)4μg(2μl)を添加
し、混合物を30分間37℃でインキュベートした。ア
ルカリホスファターゼ3μg(5μl)を添加した後、
溶液を更に15分間37℃で維持した。反応溶液のヌク
レオシド組成をHPLCで測定した(RP−18カラ
ム;移動相:0.1M TEAA緩衝液/シアン化メチル
95:5、流速1ml/分)。 ヌクレオシドの保持時間 A=11.4分、z8A=10.0分、l=4.8分、U=
3.6分 HPLCピーク面積は個々の消衰係数で割り、相対比較
した。 260nmにおける消衰係数:ε(A)=15300, ε(z8A)=710
0, ε(U)=10200, ε(l)=7400
【0077】実施例25 フラクトシルR結合N8−8−アザ−2′−デオキシグア
ノシン p−ニトロフェノール(7mg、0.05ミリモル)およ
びN,N−ジシクロヘキシルカルボジイミド(10mg、
0.048ミリモル)を1,4−ジオキサン/5%ピリジ
ン(1ml)中の実施例6の3′−O−スクシネート
(6)(30mg、0.04ミリモル)の溶液に添加し
た。混合物を2時間室温で撹拌した後、溶液の濾液をD
MF(1ml)中のフラクトシル200R(80mg、45
0μmol/g;Merck)の懸濁液に添加した。トリエチル
アミン(100μl)を添加した後、混合物を無水酢酸
(20μl)を添加しながら4時間振盪した。重合体支
持体を濾去し、DMF、エタノールおよびエーテル各々
30mlで洗浄し、真空下に乾燥した。重合体結合ヌクレ
オシドの収量を測定するために、物質をシアン化メチル
中0.1M p−トルエンスルホン酸(5ml)に溶解し
た。支持体投入量はUVスペクトル分析により、498
nmの消光から計算したところ(Dmt=70000)、
8−アザ−2′−デオキシグアノシン64マイクロモル
/g FractosilRであった。
【0078】実施例26 ホスホネート法によるオリゴデオキシリボヌクレオチド
の固相合成 3′−5′方向に合成したDNAフラグメントを用い
て、ホスホネート法および380 B DNA合成装置(A
pplied Biosystems)を用いながら固相(CPG:RControlle
d Pore Glass)上で1マイクロモルの規模でオリゴデオ
キシリボヌクレオチドの合成を行なった。ここでは酸化
サイクル(脱トリチル化、カップリング、キャッピング
および酸化)は、ホスホネート化学用に開発されたプロ
グラムに従った〔H. Koester, K. Kulikowsky, T. Lies
e, W. Heikens, V. Kohli, Tetrahedron 1981, 37, 36
3〕。5′−ヒドロキシル基でやはりDmt保護されて
いる塩基保護オリゴヌクレオチドを25%アンモニア水
を用いて30分以内に支持体から単離した。更にアンモ
ニア水(1ml、25%)を添加した後、ヘテロ環上の保
護基を60℃で24時間以内に除去した。トリエチルア
ミン1滴(5′−OH保護基の早期除去の防止)を添加
した後、試料を約200μlとなるまでSpeed VacR濃縮
装置で濃縮した。この状態で−25℃で数ケ月保存され
た。
【0079】実施例27 ホスホアミダイド法によるオリゴデオキシリボヌクレオ
チドの固相合成 最初のヌクレオシド単位がその3′末端で結合している
RCPG(Controlled PoreGlass)またはRFractosilを用い
て、自動380 B DNA合成装置(Applied Biosystems)上
で、固相ホスホアミダイド法を用いて1マイクロモルの
規模でオリゴデオキシリボヌクレオチドの合成を行なっ
た。この場合、以下の工程を実施した。 1.無水アセトニトリルで洗浄 2.ジクロロメタン中3%トリクロロ酢酸処理 3.無水アセトニトリルで洗浄 4.無水アセトニトリル0.3ml中5′−O−ジメトキ
シトリチルヌクレオシド−3′−β−シアノエチルホス
ファイトジイソプロピルアミダイド10μmolおよびテ
トラゾール50μmolとの結合 5.アセトニトリルで洗浄 6.40%ルチジンおよび10%ジメチルアミノビリジ
ンを含有するTHF中20%無水酢酸によるキャッピン
グ 7.アセトニトリルで洗浄 8.ヨウ素(THF/水/ピリジン;70:20:5=
v:v:v中1.3g)による酸化 下記にDNA反応サイクルと称する段階1〜8を合成す
べき配列に相当するオリゴヌクレオチドの構築のために
反復し、配列に相当する5′−O−ジメトキシトリチル
(ヌクレオシド塩基)−3′−β−シアノエチルホスフ
ァイト−ジイソプロピルアミダイドは各々の場合工程4
で使用した。合成が終了した後、実施例8に記載の通り
後処理を行なった。
【0080】実施例28 d(Cz8GCGCG)の合成 CPG−結合5′−O−ジメトキシトリチル−2′−デ
オキシグアノシンを出発物質として実施例25に記載の
とおり合成を行なった。最初の3個のヌクレオシド付加
工程は、市販の5′−O−ジメトキシトリチル(ヌクレ
オシド塩基)−3′−H−ホスホネートを用いて実施し
た。8−アザ−2′−デオキシグアノシンを導入するた
めに、実施例4の3′−〔2−デオキシ−5−O−
(4,4′−ジメトキシトリチル)−β−D−エリスロ
ペントフラノシル〕−5−{〔(ジメチルアミノ)メチ
リデン〕アミノ}−3H−1,2,3−トリアゾロ〔4,
5−d〕ピリミジン−7−(6H)−オン3′−(トリ
エチルアンモニウムホスホネート)(4)を第4の縮合
サイクルに用いた。
【0081】実施例29 d(Cz8GCz8GCG)の合成 実施例28に記載の方法と類似の方法を用いて合成を行
ない、実施例4の3−〔2−デオキシ−5−O−(4,
4′−ジメトキシトリエチル)−β−D−エリスロペン
トフラノシル〕−5−{〔(ジメチルアミノ)メチリデ
ン〕アミノ}−3H−1,2,3−トリアゾロ〔4,5−
d〕ピリミジン−7−(6H)−オン3′−(トリエチ
ルアンモニウムホスホネート)(4)を第2および第4
の縮合サイクルに各々用いて8−アザ−2′−デオキシ
グアノシンを導入した。
【0082】実施例30 d(GCz8GCGC)の合成 シジチンを担持させたCPG支持体を出発物質として、
実施例29に記載の方法と類似の方法で合成を行ない、
実施例4の3−〔2−デオキシ−5−O−(4,4′−
ジメトキシトリエチル)−β−D−エリスロペントフラ
ノシル〕−5−{〔(ジメチルアミノ)メチリデン〕ア
ミノ}−3H−1,2,3−トリアゾロ〔4,5−d〕ピ
リミジン−7−(6H)−オン3′−(トリエチルアン
モニウムホスホネート)(4)を第3の縮合サイクルに
用いて8−アザ−2′−デオキシグアノシンを導入し
た。
【0083】実施例31 d(Tz8GGGGT)の合成 CPG−結合5′−O−ジメトキシトリチルチミジンを
出発物質として実施例28に記載の方法と類似の方法で
合成を行ない、実施例4の3−〔2−デオキシ−5−O
−(4,4′−ジメトキシトリエチル)−β−D−エリ
スロペントフラノシル〕−5−{〔(ジメチルアミノ)
メチリデン〕アミノ}−3H−1,2,3−トリアゾロ
〔4,5−d〕ピリミジン−7−(6H)−オン3′−
(トリエチルアンモニウムホスホネート)(4)を第4
の縮合サイクルに用いて8−アザ−2′−デオキシグア
ノシンを導入した。
【0084】実施例32 d(TGz8GGGT)の合成 CPG−結合5′−O−ジメトキシトリチルチミジンを
出発物質として実施例30に記載の方法と類似の方法で
合成を行ない、実施例4の3−〔2−デオキシ−5−O
−(4,4′−ジメトキシトリエチル)−β−D−エリ
スロペントフラノシル〕5−{〔(ジメチルアミノ)メ
チリデン〕アミノ}−3H−1,2,3−トリアゾロ
〔4,5−d〕ピリミジン−7−(6H)−オン3′−
(トリエチルアンモニウムホスホネート)(4)を第3
の縮合サイクルに用いて8−アザ−2′−デオキシグア
ノシンを導入した。
【0085】実施例33 d(Tz8Gz8Gz8Gz8GT)の合成 CPG−結合5′−O−ジメトキシトリチルチミジンを
出発物質として実施例30に記載の方法と類似の方法で
合成を行ない、実施例4の3−〔2−デオキシ−5−O
−(4,4′−ジメトキシトリチル)−β−D−エリス
ロペントフラノシル〕5−{〔(ジメチルアミノ)メチ
リデン〕アミノ}−3H−1,2,3−トリアゾロ〔4,
5−d〕ピリミジン−7−(6H)−オン3′−(トリ
エチルアンモニウムホスホネート)(4)を第1〜第4
の縮合サイクルに各々用いて8−アザ−2′−デオキシ
グアノシンを導入した。
【0086】実施例34 d(GTAz8GAATTCTAG)の合成 CPG−結合5′−O−ジメトキシトリチル−2′−デ
オキシグアノシンを出発物質として実施例26に記載の
方法と類似の方法で合成を行なった。実施例4の3−
〔2−デオキシ−5−O−(4,4′−ジメトキシトリ
チル)−β−D−エリスロペントフラノシル〕5−
{〔(ジメチルアミノ)メチリデン〕アミノ}−3H−
1,2,3−トリアゾロ〔4,5−d〕ピリミジン−7−
(6H)−オン3′−(トリメチルアンモニウムホスホ
ネート)(4)を第8の縮合サイクルに用いて8−アザ
−2′−デオキシグアノシンを導入した。
【0087】実施例35 HPLCによるトリチル保護および脱保護オリゴヌクレ
オチドの精製 第1精製工程においてRP−18シリカゲル(溶離剤系
I)上のHPLCによりDmt−保護オリゴマーを精製
し、40℃で真空下に蒸発乾固させた。次いで80%酢
酸250μlで20分間処理することにより5′−トリ
チル基を除去した。第2の精製工程ではこの時点で完全
に脱保護されているオリゴマーをRP−18 HPLC
(溶離剤系II)で再度精製した。合わせた主要領域を蒸
発させ、残留物を水約500μl中に溶解し、次にこの
溶液を短いRP−18カラムを通すことにより脱塩した
(溶離剤系III)。凍結乾燥の後、オリゴマー(5−20
260単位)を水100μlに溶解し、これらの溶液を
−25℃で保存した。以下の組成の溶離剤系を用いた。 * 0.1Mトリエチルアンモニウムアセテート、pH7.0/
5%アセトニトリル(A) * アセトニトリル(B) * 水(C) * メタノール/水(3:2)(D) I:20分A中(0〜20%B) II:20分A中(15〜40%B) III:15分C、10分D IV:100%A V:100%B オリゴマーは以下の保持時間を有していた。
【0088】
【表1】
【0089】実施例36 酵素加水分解によるオリゴデオキシリボヌクレオチドの
特性化 オリゴマー0.2 A260単位を0.1Mトリス/塩酸(pH
8.3、200μl)中に溶解し、45分間37℃でヘ
ビ毒ホスホジエステラーゼ(EC 3.1.4.1,Crotallus du
rissus, Boehringer Mannheim;6μg)とともに、そ
して、30分間37℃でアルカリホスファターゼ(EC 3.
1.3.1, ウシ肝臓、Boehringer Mannheim;2μg)とと
もにインキュベートした。加水分解生成物を逆相HPL
C(RP−18、溶離剤系IV)を用いて260nmで検出
した。オリゴデオキシリボヌクレオチドの組成はヌクレ
オシドのピーク面積と消衰係数を用いて定量した(ε
260:dA 15400, dC 7300, dG 11700, dT 8800, z8Gd 12
000)。
【0090】実施例37 酵素淡色性の測定 オリゴマー約0.2 A260単位の260nmにおけるUV
吸光度をヘビ毒ホスホジエステラーゼ(10μg)の添
加の前後に0.1Mトリス/塩酸緩衝液(pH8.3、20
0μl)中で測定した。酵素による吸光度を考慮した場
合、淡色性は以下の関係により表される。
【数1】
【0091】実施例38 Tm値のUVスペクトル分析およびCDスペクトル分析
および熱力学的データの計算 オリゴマーのTm値をUV/vis分光光度計(Varian, Mel
bourne, Australia)を用いて測定した。温度は1分当た
り0.5または1.0℃の割合で直線的に変化させた。融
点を測定するために、60mMナトリウムカコジレート緩
衝液(pH7.5、1M NaCl、100mM MgCl2
1ml中0.2〜0.8 A260単位のオリゴマー濃度を用い
た。非自己相補性オリゴヌクレオチドを用いて行なった
実験においては、一重鎖の濃度は0.2〜0.6 ODで
あった。%表示の融解淡色性は以下の式に従って、融解
の前後の吸光度の変化から求めた。
【0092】
【数2】
【0093】融解曲線は以下の式に従って2状態モデル
(重層/非重層)に基づいたプログラムを用いて分析し
た。 ln K=ln〔(ES−E)/(EU−E)〕=S/R−H
/RT 式中Eはそれぞれの波長における吸光度であり、Sは重
層Uは非重層を示す。温度依存性CDスペクトルを、波
長範囲200〜350nmで、温度調節可能な石英キュベ
ットを用いて、Jasco 600スペクトロポラリメーターで
プロットした。温度は60mM Naカコジレート緩衝液
中3〜15μmの濃度で、そして0.1M、1Mおよび
4M NaClを用いて、5〜80℃の範囲で5〜10
℃の間隔で上昇させた。
【0094】実施例39 二重ラセン形成a)に関するTm値および淡色性
【表2】 a) 1M NaCl、100mM MgCl2、60mMカコジレート緩衝液、p
H7.0中で測定
【0095】実施例40 ヌクレアーゼ安定性に関する試験 試験すべきオリゴヌクレオチド10nmolをRPMI培地
中20%ウシ胎児血清450μlおよび二重蒸留水50
ml中に溶解し、この溶液を37℃でインキュベートし
た。ゲル電気泳動の試料10μlおよびHPLC用の試
料20μlを即座に、そして1、2、4、7および24
時間後に採取し、これらの試料をそれぞれホルムアミド
5μlまたは10μlで処理して反応を停止し、次に5
分間95℃で加熱した。ゲル電気泳動のために、試料を
15%ポリアクリルアミドゲル(2%BIS)に加え、
これを約3000ボルト時で展開した。銀染色によりバ
ンドを可視化した。HPLC分析のためには、試料をGe
ne-Pack Fax HPLCカラム(Waters/Millipore)に注入
し、緩衝液B中5〜50%Aを用いて1ml/分でクロマ
トグラフィーに付した(緩衝液A:10mMリン酸2水素
ナトリウム、アセトニトリル/水(1:4 v:v)中
0.1M NaCl、pH6.8;緩衝液B:1.5MNaC
lを含有する以外はAと同様)。
【0096】実施例41 抗ウィルス活性試験 ヒトに対して病原性を有する種々のヘルペスウィルスに
対する被験物質の抗ウィルス活性を細胞培養試験系で調
べた。実験のために、血清含有ダルベッコMEM(5%
ウシ胎児血清、FCS)中のサル腎細胞(Vero、2×1
5/ml)を96ウエルマイクロタイタープレート内に
播種し24時間5%二酸化炭素条件下37℃でインキュ
ベートした。次に血清含有培地を吸引除去し、細胞を2
回血清非含有ダルベッコMEM(−FCS)中に浮遊さ
せた。使用前に、被験物質を水で希釈して600μMの
濃度とし、−18℃で保存した。試験のために、更にダ
ルベッコの最小必須培地(MEM)で希釈を行なった。
各々の場合、個々の被験物質希釈液100μlを血清非
含有ダルベッコMEM(−FCS)100μlとともに
洗浄細胞に添加した。3時間5%二酸化炭素条件下37
℃でインキュベートした後、3日以内に細胞叢が完全に
破壊されるような濃度で単純ヘルペスウィルス1型(A
TCC VR733、HSV−1 F株)または単純ヘル
ペスウィルス2型(ATCC VR734、HSV−2
G株)に細胞を感染させた。HSV−1の場合は、感染
程度を1ウエル当たり500プラーク形成単位(PF
U)とし、HSV−2の場合は350 PFU/ウエル
とした、次に実験試料に、100U/mlペニシリンGお
よび100mg/1ストレプトマイシン添加MEM中80
μM〜0.04μMの濃度で被験物質を含有させた。1
プレート当たり8検体を用いた対照群を除き、すべての
実験は2連で行なった。実験試料は17時間5%二酸化
炭素条件下37℃でインキュベートした。被験物質の細
胞毒性は培養細胞を顕微鏡で観察することにより、合計
インキュベート時間20時間の後に測定した。所定の実
験条件下で顕微鏡で認識できる細胞の損傷に到らない最
高製剤濃度を最大許容用量(MTD)とした。次に、F
CSを最終濃度4%で添加し、プレートを5%二酸化炭
素条件下37℃で55時間更にインキュベートした。未
処置の感染対照群は完全な細胞病原性作用(CPE)を
示した。顕微鏡で培養細胞を観察した後、Finter(1966)
の生存染色方法を用いてニュートラルレッドで染色し
た。被験物質の抗ウィルス活性はウィルスによる細胞病
原性作用から細胞を30〜60%保護するために必要と
される最小阻止濃度(MIC)として定義した。
【0097】略記法 A アデノシン bz ベンゾイル br. ブロード calc. 計算値 CD 円2色性 d ダブレット dG 2′−デオキシグアノシン dA 2′−デオキシアデノシン dC 2′−デオキシシチジン dT 2′−デオキシチミジン DEPC ジエチルピロカーボネート DMA ジメチルアセトアミド (D6)DMSO ジメチルスルホキシド、重水素化6回 DMF ジメチルホルムアミド DNA デオキシリボ核酸 Dmt 4,4′−ジメトキシトリチル、(4,
4′−ジメトキシトリフェニルメチル) EDTA エチレンジアミン四酢酸塩 EtOAc 酢酸エチル Et3N トリエチルアミン FC フラッシュクロマトグラフィー G 自由エンタルピー h 時間 H 2重型形成エンタルピー HPLC 高速液体クロマトグラフィー Hyp. 淡色性 I イノシン ibu イソブチル J 結合定数 Km ミカエリス−メンテン定数 m.p. 融点 NMR 核磁気共鳴 PAGE ポリアクリルアミドゲル電気泳動 PCR ポリメラーゼ連鎖反応 ppm 100万分の1部 2−P−OH イソプロパノール Rf TLCにおける展開液先端に対する保
持位置 RNA リボ核酸 RP 逆相 R.T. 室温 s 一重線 S 二重型形成エントロピー SVPD ヘビ毒ホスホジエステラーゼ t 三重線 TBAF テトラブチルアンモニウムフロリド TBC トリエチルアンモニウムビカーボネー
ト TEP トリエチルアンモニウムホスホネート TLC 薄層クロマトグラフィー Tms トリス(1−メチルエチル)シリル Tris トリス(ヒドロキシメチル)アミノメ
タン Tm オリゴマー融点 U ウリジン UV 紫外線 vmax 最大反応速度 z8A 8−アザアデノシン z8G 8−アザ−2′−デオキシグアノシン λ 波長 ε モル消衰係数
【配列表】
【0098】配列番号:1 配列の長さ:20 配列の型:核酸 鎖の数:一本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:Genomic DNA ハイポセティカル配列:No アンチセンス:Yes 起源 生物名:HIV 配列の特徴 特徴を表す記号:エクソン 存在位置:1..20 配列 ACACCCAATT CTGAAAATGG
【0099】配列番号:2 配列の長さ:20 配列の型:核酸 鎖の数:一本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:Genomic DNA ハイポセティカル配列:No アンチセンス:Yes 起源 生物名:HIV 配列の特徴 特徴を表す記号:エクソン 存在位置:1..20 配列 AGGTCCCTGT TCGGGCGCCA
【0100】配列番号:3 配列の長さ:28 配列の型:核酸 鎖の数:一本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:Genomic DNA ハイポセティカル配列:No アンチセンス:Yes 起源 生物名:HIV 配列の特徴 特徴を表す記号:エクソン 存在位置:1..28 配列 GTCGACACCC AATTCTGAAA ATGGATAA
【0101】配列番号:4 配列の長さ:25 配列の型:核酸 鎖の数:一本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:Genomic DNA ハイポセティカル配列:No アンチセンス:Yes 起源 生物名:HIV 配列の特徴 特徴を表す記号:エクソン 存在位置:1..25 配列 GCTATGTCGA CACCCAATTC TGAAA
【0102】配列番号:5 配列の長さ:31 配列の型:核酸 鎖の数:一本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:Genomic DNA ハイポセティカル配列:No アンチセンス:Yes 起源 生物名:HIV 配列の特徴 特徴を表す記号:エクソン 存在位置:1..31 配列 TCGTCGCTGT CTCCGCTTCT TCTTCCTGCC A
【0103】配列番号:6 配列の長さ:31 配列の型:核酸 鎖の数:一本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:Genomic DNA ハイポセティカル配列:No アンチセンス:Yes 起源 生物名:HIV 配列の特徴 特徴を表す記号:エクソン 存在位置:1..31 配列 CTGTCTCCGC TTCTTCTTCC TGCCATAGGA G
【0104】配列番号:7 配列の長さ:20 配列の型:核酸 鎖の数:一本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:Genomic DNA ハイポセティカル配列:No アンチセンス:Yes 起源 生物名:HSV−1 配列の特徴 特徴を表す記号:エクソン 存在位置:1..20 配列 GCGGGGCTCC ATGGGGGTCG
【0105】配列番号:8 配列の長さ:15 配列の型:核酸 鎖の数:一本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:Genomic DNA ハイポセティカル配列:No アンチセンス:Yes 起源 生物名:ヒト 配列の特徴 特徴を表す記号:エクソン 存在位置:1..15 他の情報:note=c−Ha−ras 配列 CAGCTGCAAC CCAGC
【0106】配列番号:9 配列の長さ:21 配列の型:核酸 鎖の数:一本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:Genomic DNA ハイポセティカル配列:No アンチセンス:Yes 起源 生物名:ヒト 配列の特徴 特徴を表す記号:エクソン 存在位置:1..21 他の情報:note=c−myc 配列 GGCTGCTGGA GCGGGGCACA C
【0107】配列番号:10 配列の長さ:15 配列の型:核酸 鎖の数:一本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:Genomic DNA ハイポセティカル配列:No アンチセンス:Yes 起源 生物名:ヒト 配列の特徴 特徴を表す記号:エクソン 存在位置:1..15 他の情報:note=c−myc 配列 AACGTTGAGG GGCAT
【0108】配列番号:11 配列の長さ:15 配列の型:核酸 鎖の数:一本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:Genomic DNA ハイポセティカル配列:No アンチセンス:Yes 起源 生物名:ヒト 配列の特徴 特徴を表す記号:エクソン 存在位置:1..15 他の情報:note=c−myb 配列 CACGTTGAGG GGCAT
【0109】配列番号:12 配列の長さ:18 配列の型:核酸 鎖の数:一本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:Genomic DNA ハイポセティカル配列:No アンチセンス:Yes 起源 生物名:ヒト 配列の特徴 特徴を表す記号:エクソン 存在位置:1..18 他の情報:note=c−myb 配列 GTGCCGGGGT CTTCGGGC
【0110】配列番号:13 配列の長さ:18 配列の型:核酸 鎖の数:一本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:Genomic DNA ハイポセティカル配列:No アンチセンス:Yes 起源 生物名:マウス 配列の特徴 特徴を表す記号:エクソン 存在位置:1..18 他の情報:note=c−myb 配列 GTGTCGGGGT CTCCGGGC
【0111】配列番号:14 配列の長さ:21 配列の型:核酸 鎖の数:一本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:Genomic DNA ハイポセティカル配列:No アンチセンス:Yes 起源 生物名:ヒト 配列の特徴 特徴を表す記号:エクソン 存在位置:1..21 他の情報:note=c−fos 配列 GGAGAACATC ATGGTCGAAA G
【0112】配列番号:15 配列の長さ:22 配列の型:核酸 鎖の数:一本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:Genomic DNA ハイポセティカル配列:No アンチセンス:Yes 起源 生物名:ヒト 配列の特徴 特徴を表す記号:エクソン 存在位置:1..22 他の情報:note=c−fos 配列 CCCGAGAACA TCATGGTCGA AG
【0113】配列番号:16 配列の長さ:20 配列の型:核酸 鎖の数:一本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:Genomic DNA ハイポセティカル配列:No アンチセンス:Yes 起源 生物名:ヒト 配列の特徴 特徴を表す記号:エクソン 存在位置:1..20 他の情報:note=c−fos 配列 GGGGAAAGCC CGGCAAGGGG
【0114】配列番号:17 配列の長さ:20 配列の型:核酸 鎖の数:一本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:Genomic DNA ハイポセティカル配列:No アンチセンス:Yes 起源 生物名:ヒト 配列の特徴 特徴を表す記号:エクソン 存在位置:1..20 他の情報:note=p−120 配列 CACCCGCCTT GGCCTCCCAC
【0115】配列番号:18 配列の長さ:18 配列の型:核酸 鎖の数:一本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:Genomic DNA ハイポセティカル配列:No アンチセンス:Yes 起源 生物名:ヒト 配列の特徴 特徴を表す記号:エクソン 存在位置:1..18 他の情報:note=EGF−レセプター 配列 GGGACTCCGG CGCAGCGC
【0116】配列番号:19 配列の長さ:20 配列の型:核酸 鎖の数:一本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:Genomic DNA ハイポセティカル配列:No アンチセンス:Yes 起源 生物名:ヒト 配列の特徴 特徴を表す記号:エクソン 存在位置:1..20 他の情報:note=EGF−レセプター 配列 GGCAAACTTT CTTTTCCTCC
【0117】配列番号:20 配列の長さ:19 配列の型:核酸 鎖の数:一本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:Genomic DNA ハイポセティカル配列:No アンチセンス:Yes 起源 生物名:ヒト 配列の特徴 特徴を表す記号:エクソン 存在位置:1..19 他の情報:note=p53腫瘍抑制剤 配列 GGGAAGGAGG AGGATGAGG
【0118】配列番号:21 配列の長さ:21 配列の型:核酸 鎖の数:一本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:Genomic DNA ハイポセティカル配列:No アンチセンス:Yes 起源 生物名:ヒト 配列の特徴 特徴を表す記号:エクソン 存在位置:1..21 他の情報:note=p53腫瘍抑制剤 配列 GGCAGTCATC CAGCTTCGGA G
【0119】配列番号:22 配列の長さ:18 配列の型:核酸 鎖の数:一本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:Genomic DNA ハイポセティカル配列:No アンチセンス:Yes 起源 生物名:ヒト 配列の特徴 特徴を表す記号:エクソン 存在位置:1..18 他の情報:note=cdc2−カイネース 配列 GTCTTCCATA GTTACTCA
【0120】配列番号:23 配列の長さ:18 配列の型:核酸 鎖の数:一本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:Genomic DNA ハイポセティカル配列:No アンチセンス:Yes 起源 生物名:ヒト 配列の特徴 特徴を表す記号:エクソン 存在位置:1..18 他の情報:note=PCNA(増殖細胞核抗原) 配列 GATCAGGCGT GCCTCAAA
【0121】配列番号:24 配列の長さ:18 配列の型:核酸 鎖の数:一本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:Genomic DNA ハイポセティカル配列:No アンチセンス:Yes 起源 生物名:ヒト 配列の特徴 特徴を表す記号:エクソン 存在位置:1..18 他の情報:note=VLA−4 配列 GCAGTAAGCA TCCATATC
【0122】配列番号:25 配列の長さ:20 配列の型:核酸 鎖の数:一本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:Genomic DNA ハイポセティカル配列:No アンチセンス:Yes 起源 生物名:ヒト 配列の特徴 特徴を表す記号:エクソン 存在位置:1..20 他の情報:note=ICAM 配列 CCCCCACCAC TTCCCCTCTC
【0123】配列番号:26 配列の長さ:20 配列の型:核酸 鎖の数:一本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:Genomic DNA ハイポセティカル配列:No アンチセンス:Yes 起源 生物名:ヒト 配列の特徴 特徴を表す記号:エクソン 存在位置:1..20 他の情報:note=ICAM 配列 CTCCCCCACC ACTTCCCCTC
【0124】配列番号:27 配列の長さ:19 配列の型:核酸 鎖の数:一本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:Genomic DNA ハイポセティカル配列:No アンチセンス:Yes 起源 生物名:ヒト 配列の特徴 特徴を表す記号:エクソン 存在位置:1..19 他の情報:note=ICAM 配列 GCTGGGAGCC ATAGCGAGG
【0125】配列番号:28 配列の長さ:21 配列の型:核酸 鎖の数:一本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:Genomic DNA ハイポセティカル配列:No アンチセンス:Yes 起源 生物名:ヒト 配列の特徴 特徴を表す記号:エクソン 存在位置:1..21 他の情報:note=ELAM−1 配列 ACTGCTGCCT CTTGTCTCAG G
【0126】配列番号:29 配列の長さ:22 配列の型:核酸 鎖の数:一本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:Genomic DNA ハイポセティカル配列:No アンチセンス:Yes 起源 生物名:ヒト 配列の特徴 特徴を表す記号:エクソン 存在位置:1..22 他の情報:note=ELAM−1 配列 CAATCAATGA CTTCAAGAGT TC
【0127】配列番号:30 配列の長さ:11 配列の型:核酸 鎖の数:一本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:DNA ハイポセティカル配列:Yes アンチセンス:Yes 配列の特徴 特徴を表す記号:− 存在位置:1..11 他の情報:note=N=8−アザグアニン 配列 GTANAATTCT AG
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 FI 技術表示箇所 C08G 79/04 NUP C12N 15/09 ZNA G01N 33/50 T P 33/566

Claims (17)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項1】 下記式Iのオリゴヌクレオチドおよび生
    理学的に許容しうるその塩。 【化1】 〔式中、R1は水素、C1〜C18−アルキル、C2〜C18
    −アルケニル、C2〜C18−アルキニル、C2〜C18−ア
    ルキルカルボニル、C3〜C19−アルケニルカルボニ
    ル、C3〜C19−アルキニルカルボニル、(C6〜C14
    −アリール−(C1〜C8)−アルキル、ヌクレオチド化
    学で慣用的な保護基、または下記式IIa: 【化2】 の基であり、 R1aは水素、C1〜C18−アルキル、C2〜C18−アルケ
    ニル、C2〜C18−アルキニル、C2〜C18−アルキルカ
    ルボニル、C3〜C19−アルケニルカルボニル、C3〜C
    19−アルキニルカルボニル、(C6〜C14)−アリール
    −(C1〜C8)−アルキル、または下記式IIb: 【化3】 の基であり、 R2は水素、ヒドロキシル、C1〜C18−アルコキシ、C
    1〜C6−アルケニルオキシ、特にアリルオキシ、ハロゲ
    ン、アジドまたはNH2であり;aはオキシまたはメチ
    レンであり;nは3〜99の整数であり;Wはオキソ、
    チオキソまたはセレノキソであり;Vはオキシ、スルフ
    ァンジイルまたはイミノであり;Yはオキシ、スルファ
    ンジイル、イミノまたはメチレンであり;Y′はオキ
    シ、スルファンジイル、イミノ、(CH2)mまたはV(C
    2)mであり、 ここで、mは1〜18の整数であり;Xはヒドロキシル
    またはメルカプトであり;Uはヒドロキシル、メルカプ
    ト、SeH、C1〜C18−アルコキシ、C1〜C18−アル
    キル、C6〜C20−アリール、(C6〜C14)−アリール
    −(C1〜C8)−アルキル、NHR3、NR34または
    式III: (OCH2CH2)pO(CH2)qCH25 (III) の基であり、 ここで、R3はC1〜C18−アルキル、C6〜C20−アリ
    ール、(C6〜C14)−アリール−(C1〜C8)−アルキ
    ル、または2−(CH2)c−〔NH(CH2)cd−NR6
    6、ここでcは2〜6の整数であり、そしてdは0〜6
    の整数であり、そして、R6はそれぞれ独立して、水素
    またはC1〜C6−アルキルまたはC1〜C4−アルコキシ
    −C1〜C6−アルキルであり;R4はC1〜C18−アルキ
    ル、C6〜C20−アリールまたは(C6〜C10)−アリー
    ル−(C1〜C8)−アルキルであるか、またはNR34
    の場合はR3およびこれらが結合している窒素原子と一
    緒になって5〜6員のヘテロ環を形成し、これは更に
    O、SおよびNから選択されるヘテロ原子を有すること
    ができ、 pは1〜100の整数であり、 qは0〜22の整数であり、 R5は水素または官能基、例えばヒドロキシル、アミ
    ノ、C1〜C18−アルキルアミノ、COOH、CON
    2、COO(C1〜C4)−アルキルまたはハロゲンで
    あり;ZおよびZ′は相互に独立して、ヒドロキシル、
    メルカプト、SeH、C1〜C22−アルコキシ、−O−
    (CH2)b−NR67、ただしここでbは1〜6の整数で
    あり、そしてR7はC1〜C6−アルキルであるか、また
    は、R6およびR7はそれらが結合している窒素原子と一
    緒になって3〜6員の環を形成するもの、C1〜C18
    アルキル、C6〜C20−アリール、(C6〜C14)−アリ
    ール−(C1〜C8)−アルキル、(C6〜C14)−アリ
    ール−(C1〜C8)−アルコキシ、ただしここでアリー
    ルはヘテロアリールであってもよく、そしてアリールは
    場合によりカルボキシル、アミノ、ニトロ、C1〜C4
    アルキルアミノ、C1〜C6−アルコキシ、ヒドロキシ
    ル、ハロゲンおよびシアノよりなる群から選択される同
    じかまたは異なる基1、2または3個で置換されている
    もの、C1〜C18−アルキルメルカプト、NHR3、NR
    34、式IIIの基またはDNAプローブの細胞内取り込
    みを促進するか、またはその標識として作用する基、ま
    たはオリゴヌクレオチド類縁体が標的核酸にハイブリッ
    ド化する場合は、これを結合、交叉結合または分解によ
    り攻撃する基であり、そして、曲線の括弧はR2と隣接
    するホスホリル基が2′および3′位、あるいは逆に
    3′および2′位の何れかに位置することを指し、ここ
    で各ヌクレオチドはDまたはL型で存在し、そして塩基
    Bはαまたはβ位に位置し、そしてBは相互に独立して
    ヌクレオチド化学で慣用的な塩基、例えば天然の塩基、
    例えばアデニン、シトシン、チミン、グアニン、ウラシ
    ルまたはヒポキサンチン、または非天然の塩基、例えば
    プリン、8−アザプリン、2,6−ジアミノプリン、7
    −デアザアデニン、7−デアザグアニン、N44−エタ
    ンシトシン、N66−エタノ−2,6−ジアミノプリ
    ン、シュードイソチトシン、5−メチルシトシン、5−
    フルオロウラシル、5−(C3〜C6)−アルキニルウラ
    シル、5−(C 3〜C6)−アルキニルシトシン、または
    そのプロドラッグ形態であり、ここで少くとも1つのB
    は下記式IV: 【化4】 {式中EおよびFは相互に独立してH、OHまたはNH
    2である}の塩基である〕。
  2. 【請求項2】 塩基Bがβ位にあり、ヌクレオチドがD
    型であり、R2が2′位にあり、そしてaがオキシであ
    る請求項1記載のオリゴヌクレオチド。
  3. 【請求項3】 R1が水素、C1〜C6−アルキル、特に
    メチルまたは式IIaの基であり;R1aが水素、C1〜C6
    −アルキル、特にメチルまたは式IIbの基であり;R2
    が水素、C1〜C6−アルコキシ、C1〜C6−アルケニル
    オキシ、特にアリルオキシ、またはヒドロキシル、特に
    水素であり;nは4〜39、特に5〜29の整数であ
    り;mは1〜6の整数、特に1であり;Uはヒドロキシ
    ル、メルカプト、C1〜C6−アルコキシ、C1〜C6−ア
    ルキル、NR34またはNHR3、特にヒドロキシルま
    たはC1〜C6−アルキルであり、 ここで、R3はC1〜C8−アルキル、好ましくはC1〜C
    4−アルキル、またはメトキシエチルであり、そして、 B、W、V、Y、Y′、XおよびZは請求項1に記載し
    た意味を有する、請求項1または2記載のオリゴヌクレ
    オチド。
  4. 【請求項4】 V、YおよびY′がオキシ、スルファン
    ジイルまたはイミノを表わす請求項1、2または3のい
    ずれか1項記載のオリゴヌクレオチド。
  5. 【請求項5】 Wがオキソまたはチオキソを表わす請求
    項1〜4のいずれか1項記載のオリゴヌクレオチド。
  6. 【請求項6】 Uがヒドロキシル、メチルまたはメルカ
    プトを表わす請求項1〜5のいずれか1項記載のオリゴ
    ヌクレオチド。
  7. 【請求項7】 R1および/またはR1aが水素である請
    求項1〜6のいずれか1項記載のオリゴヌクレオチド。
  8. 【請求項8】 ヌクレオチドが、ヌクレオチド塩基を含
    んでいる各場合に、適切に誘導体化された支持体または
    成長中のオリゴマー鎖に1回縮合されている、請求項1
    〜7のいずれか1項記載の式Iのオリゴヌクレオチドお
    よび生理学的に許容しうるその塩の調製方法。
  9. 【請求項9】 薬剤または診断薬を調製するための請求
    項1〜7のいずれか1項記載のオリゴヌクレオチドの使
    用。
  10. 【請求項10】 請求項1〜7に記載のオリゴヌクレオ
    チドの少なくとも1つを生理学的に許容しうる賦形剤お
    よび更に適切には適当な添加剤および/または補助物質
    と混合する薬剤または診断薬の調製方法。
  11. 【請求項11】 請求項1〜7に記載の化合物の1つ以
    上を適切には生理学的に許容しうる賦形剤および/また
    は補助物質とともに含有する薬剤または診断薬。
  12. 【請求項12】 下記式V: 【化5】 〔式中Vはオキシ、スルファンジイルまたはイミノであ
    り;Ybはオキシ、スルファンジイルまたはメチレンで
    あり;aはオキシまたはメチレンであり;R2bは水素、
    OR12、C1〜C18−アルコキシ、C1〜C6−アルケニ
    ルオキシ、特にアリルオキシ、ハロゲン、アジドまたは
    NR1011であり;R1はヌクレオチド化学で慣用的な
    保護基であり;R1bは下記式IIcまたはIId: 【化6】 {式中UはO−R7またはS−R7であり;Qは基−NR
    89であり;R7は−(CH2)2−CNであり;R8および
    9は同じかまたは異なっていてC1〜C6−アルキル、
    特にイソプロピルまたはエチルであるか、または、それ
    らが結合している窒素原子と一緒になって5〜9−員の
    ヘテロ環を形成し、これは更に、O、SおよびNから選
    択されるヘテロ原子を含んでおり、特に、 【化7】 である}の基であり;E′およびF′は相互に独立し
    て、H、OHまたはNR1011であり;R10およびR11
    は同じかまたは異なっていて水素またはヌクレオチド化
    学で慣用的なアミノ保護基であるか、または、R10とR
    11は一緒になってヌクレオチド化学で慣用的なアミノ保
    護基を形成し、 R12はヌクレオチド化学で慣用的なヒドロキシル保護
    基、例えば、t−ブチルジメチルシリル、トリイソプロ
    ピルシリル、o−ニトロベンジル、p−ニトロベンジ
    ル、トリス(1−メチルエチル)シリルまたは2−フル
    オロフェニル−4−メトキシピペリジン−4−イル(F
    PMP)であり、 そして、曲線の括弧はR2と隣接するホスホリル基が
    2′および3′位、あるいは逆に3′および2′位の何
    れかに位置することを示す〕のヌクレオチド単量体。
  13. 【請求項13】 式Vの相当するヌクレオチド単量体が
    適切なアミノ保護基またはヒドロキシル保護基の導入の
    後、相当するホスホネート誘導体またはホスホアミダイ
    ト誘導体に変換される、請求項12に記載の式Vのヌク
    レオチド単量体の調製方法。
  14. 【請求項14】 その標的核酸と安定なハイブリッドを
    形成するオリゴヌクレオチドの調製のための請求項12
    に記載のヌクレオチド単量体の使用。
  15. 【請求項15】 下記式VI: 【化8】 〔式中、相互に独立して、U′=U″=U′′′はヒド
    ロキシルまたはメルカプトであり;eおよびfは0また
    は1であり;R13は水素またはOHであり、そして、 EおよびFはH、OHまたはNH2である〕の化合物、
    ただし、U′、U″、U′′′、R13およびFがOHで
    あり、 EがNH2であり、そしてeおよびfが1である式VIの
    化合物は除外する。
  16. 【請求項16】 分子生物学における手段としての請求
    項15に記載の式VIのヌクレオチド単量体の使用。
  17. 【請求項17】 分子生物学における手段としての請求
    項1〜7のいずれか1項記載の式Iのオリゴヌクレオチ
    ドの使用。
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