JPH083186A - 修飾オリゴヌクレオチド、その調製およびその使用 - Google Patents

修飾オリゴヌクレオチド、その調製およびその使用

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JPH083186A
JPH083186A JP7107299A JP10729995A JPH083186A JP H083186 A JPH083186 A JP H083186A JP 7107299 A JP7107299 A JP 7107299A JP 10729995 A JP10729995 A JP 10729995A JP H083186 A JPH083186 A JP H083186A
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hydrogen
aryl
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フランク・ゼーラ
Sigrid Lampe
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Hoechst AG
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Abstract

(57)【要約】 【構成】 ８−アザプリン塩基を少なくとも１つ含み、
核酸とより安定なハイブリダイゼーション複合体を形成
する新しい修飾オリゴヌクレオチドとその調製方法の提
供。 【効果】 この修飾オリゴヌクレオチドは遺伝子発現の
抑制剤、核酸検出のためのプローブ、分子生物学におけ
る手段、および薬剤または診断薬として有用である。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】本発明は、修飾塩基を有し、価値ある物理
的、生理学的および薬理学的性質を有する新しいオリゴ
ヌクレオチド、その調製方法、遺伝子発現の抑制剤（ア
ンチセンスオリゴヌクレオチド、リボチーム、センスオ
リゴヌクレオチドおよびトリプレックス形成オリゴヌク
レオチド）、核酸の検出のためのプローブ、分子生物学
における手段、薬剤または診断薬としてのその使用に関
する。オリゴヌクレオチドの多くの化学修飾が文献に記
載されている。これらの修飾は糖リン酸エステル骨格ま
たは核酸塩基に影響する可能性がある。現在の技術は例
えばUhlmann ＆ PeymanのChem. Rev. 1990, 90, 543お
よびMilligan等のJ. Med. Chem. 1993, 36, 1923に記載
されている。
【０００２】細胞内および細胞培養の培地内の両方で未
修飾のオリゴヌクレオチドは核分解活性物質により極め
て急速に分解されるため、原則として、オリゴヌクレオ
チドを化学的に修飾することが必要である。核分解に対
抗する安定化は、糖リン酸エステル骨格を置き換える
か、または、リン酸エステルの架橋、糖成分またはヌク
レオチド塩基を修飾することにより行なうことができる
〔Milligan等、上記およびUhlmann ＆ Peyman、上記参
照〕。核分解に対する安定性が増強されたオリゴヌクレ
オチドをもたらすような修飾のほかに、修飾されたオリ
ゴヌクレオチドのハイブリダイゼーション挙動を、これ
らのオリゴヌクレオチドが例えば細胞内核酸（いわゆる
標的核酸）とより安定なハイブリダイゼーション複合体
（二重らせん）を形成することができるように変える修
飾も興味深いものである。オリゴヌクレオチドのハイブ
リダイゼーション特性の変化は、例えば、その塩基を変
成することによっても行なうことができる。このような
修飾オリゴヌクレオチドの変化したハイブリダイゼーシ
ョン特性は、例えば、二重らせんの融点（Tm値）が使用
した未修飾のオリゴヌクレオチドを用いた場合と比較し
て変化しているという事実により知ることができる。
【０００３】即ち、ＰＣＴ出願ＷＯ ９２／００２２５
８号は、一重鎖および二重鎖の標的核酸に対する結合親
和性が増強されているのではなく低下しているような、
ピリミジン修飾オリゴヌクレオチドを記載している。Ｐ
ＣＴ出願ＷＯ ９３／１０８２０号もまた、修飾ウラシ
ル塩基およびシトシン塩基を含み、未修飾のオリゴヌク
レオチドを用いた場合よりも安定な標的核酸との二重ら
せんまたは三重らせんを形成することができるようなオ
リゴヌクレオチドを開示している。塩基類縁体ピリドピ
リミジンを含んでいる合成１２量体オリゴヌクレオチド
のハイブリダイゼーション特性もまた研究されている
〔Inoue等，(1985)，Nucleic Acid Res.,13, 7119-712
9〕。塩基類縁体２−アミノアデニンを含んでいるオリ
ゴヌクレオチドもまた改善されたハイブリダイゼーショ
ン特性を有するものとして報告されている〔Chollet
等., (1988), Nucleic Acid Research, 6, 305-317〕。
【０００４】従って、本発明の目的は好都合な特性を有
する使用可能な新規なオリゴヌクレオチドを作製するこ
とである。意外にも、８−アザプリン塩基、例えば８−
アザグアニンまたは８−アザアデニンを少なくとも１つ
有するオリゴヌクレオチドが、未修飾のプリン塩基を有
する類似のオリゴヌクレオチドにより形成されたものよ
りも著しく安定な標的核酸とのハイブリダイゼーション
複合体を形成することが解った。
【０００５】即ち、本発明は、下記式Ｉ：
【化９】 〔式中、Ｒ1は水素、Ｃ1〜Ｃ18−アルキル、Ｃ2〜Ｃ18
−アルケニル、Ｃ2〜Ｃ18−アルキニル、Ｃ2〜Ｃ18−ア
ルキルカルボニル、Ｃ3〜Ｃ19−アルケニルカルボニ
ル、Ｃ3〜Ｃ19−アルキニルカルボニル、（Ｃ6〜Ｃ14）
−アリール−（Ｃ1〜Ｃ8）−アルキル、ヌクレオチド化
学で慣用の保護基、または下記式IIａ：
【化１０】 の基であり、
【０００６】Ｒ1aは水素、Ｃ1〜Ｃ18−アルキル、Ｃ2〜
Ｃ18−アルケニル、Ｃ2〜Ｃ18−アルキニル、Ｃ2〜Ｃ18
−アルキルカルボニル、Ｃ3〜Ｃ19−アルケニルカルボ
ニル、Ｃ3〜Ｃ19−アルキニルカルボニル、（Ｃ6〜
Ｃ14）−アリール−（Ｃ1〜Ｃ8）−アルキル、または下
記式IIｂ：
【化１１】 の基であり、Ｒ2は水素、ヒドロキシル、Ｃ1〜Ｃ18−ア
ルコキシ、Ｃ1〜Ｃ6−アルケニルオキシ、特にアリルオ
キシ、ハロゲン、アジドまたはＮＨ2であり；ａはオキ
シまたはメチレンであり；ｎは３〜９９の整数であり；
Ｗはオキソ、チオキソまたはセレノキソであり；Ｖはオ
キシ、スルファンジイルまたはイミノであり；Ｙはオキ
シ、スルファンジイル、イミノまたはメチレンであり；
Ｙ′はオキシ、スルファンジイル、イミノ、(ＣＨ2)mま
たはＶ(ＣＨ2)mであり、ここで、ｍは１〜１８の整数で
あり；Ｘはヒドロキシルまたはメルカプトであり；
【０００７】Ｕはヒドロキシル、メルカプト、ＳｅＨ、
Ｃ1〜Ｃ18−アルコキシ、Ｃ1〜Ｃ18−アルキル、Ｃ6〜
Ｃ20−アリール、（Ｃ6〜Ｃ14）−アリール−（Ｃ1〜Ｃ
8）−アルキル、ＮＨＲ3、ＮＲ3Ｒ4または式III： (ＯＣＨ2ＣＨ2)pＯ(ＣＨ2)qＣＨ2Ｒ5 （III） の基であり、ここで、Ｒ3はＣ1〜Ｃ18−アルキル、Ｃ6
〜Ｃ20−アリール、（Ｃ6〜Ｃ14）−アリール−(Ｃ1〜
Ｃ8）−アルキル、または２−(ＣＨ2)c−〔ＮＨ(ＣＨ2)
c〕d−ＮＲ6Ｒ6、ここでｃは２〜６の整数であり、そし
てｄは０〜６の整数であり、そして、Ｒ6はそれぞれ独
立して、水素またはＣ1〜Ｃ6−アルキルまたはＣ1〜Ｃ4
−アルコキシ−Ｃ1〜Ｃ6−アルキルであり；Ｒ4はＣ1〜
Ｃ18−アルキル、Ｃ6〜Ｃ20−アリールまたは（Ｃ6〜Ｃ
10）−アリール−（Ｃ1〜Ｃ8）−アルキルであるか、ま
たはＮＲ3Ｒ4の場合はＲ3およびこれらが結合している
窒素原子と一緒になって５〜６員のヘテロ環を形成し、
これは更にＯ、ＳおよびＮから選択されるヘテロ原子を
有することができ、ｐは１〜１００の整数であり、ｑは
０〜２２の整数であり、
【０００８】Ｒ5は水素または官能基、例えばヒドロキ
シル、アミノ、Ｃ1〜Ｃ18−アルキルアミノ、ＣＯＯ
Ｈ、ＣＯＮＨ2、ＣＯＯ（Ｃ1〜Ｃ4）−アルキルまたは
ハロゲンであり；ＺおよびＺ′は相互に独立して、ヒド
ロキシル、メルカプト、ＳｅＨ、Ｃ1〜Ｃ22−アルコキ
シ、−Ｏ−(ＣＨ2)b−ＮＲ6Ｒ7、ただしここでｂは１〜
６の整数であり、そしてＲ7はＣ1〜Ｃ6−アルキルであ
るか、または、Ｒ6およびＲ7はそれらが結合している窒
素原子と一緒になって３〜６員の環を形成するもの、Ｃ
1〜Ｃ18−アルキル、Ｃ6〜Ｃ20−アリール、（Ｃ6〜Ｃ
14）−アリール−（Ｃ1〜Ｃ8）−アルキル、（Ｃ6〜Ｃ
14）−アリール−（Ｃ1〜Ｃ8）−アルコキシ、ただしこ
こでアリールはヘテロアリールであってもよく、そして
アリールは場合によりカルボキシル、アミノ、ニトロ、
Ｃ1〜Ｃ4−アルキルアミノ、Ｃ1〜Ｃ6−アルコキシ、ヒ
ドロキシル、ハロゲンおよびシアノよりなる群から選択
される同じかまたは異なる基１、２または３個で置換さ
れているもの、Ｃ1〜Ｃ18−アルキルメルカプト、ＮＨ
Ｒ3、ＮＲ3Ｒ4、式IIIの基またはＤＮＡプローブの細胞
内取り込みを促進するかまたはその標識として作用する
基、またはオリゴヌクレオチド類縁体が標的核酸にハイ
ブリッド化する場合は、これを結合、交叉結合または分
解により攻撃する基であり、そして、曲線の括弧はＲ2
と隣接するホスホリル基が２′および３′位、あるいは
逆に３′および２′位の何れかに位置することを指し、
ここで各ヌクレオチドはＤまたはＬ型で存在し、そして
塩基Ｂはαまたはβ位に位置し、そして
【０００９】Ｂは相互に独立してヌクレオチド化学で慣
用的な塩基、例えば天然の塩基、例えばアデニン、シト
シン、チミン、グアニン、ウラシルまたはヒポキサンチ
ン、または非天然の塩基、例えばプリン、８−アザプリ
ン、２,６−ジアミノプリン、７−デアザアデニン、７
−デアザグアニン、Ｎ4Ｎ4−エタンシトシン、Ｎ6Ｎ6−
エタノ−２,６−ジアミノプリン、シュードイソチトシ
ン、５−メチルシトシン、５−フルオロウラシル、５−
（Ｃ3〜Ｃ6）−アルキニルウラシル、５−（Ｃ 3〜Ｃ6）
−アルキニルシトシン、またはそのプロドラッグ形態で
あり、ここで少くとも１つのＢは下記式IV：
【化１２】 ｛式中ＥおよびＦは相互に独立してＨ、ＯＨまたはＮＨ
2である｝の塩基である〕のオリゴヌクレオチドおよび
生理学的に許容しうるその塩に関する。
【００１０】ＥがＮＨ2であり、ＦがＯＨであるか、ま
たは、ＥがＨであり、ＦがＮＨ2である式Ｉの化合物が
好ましい。ＥがＮＨ2であり、ＦがＯＨである式Ｉの化
合物が特に好ましい。塩基が糖β位に位置し、ヌクレオ
シドがＤ型で存在し、Ｒ2が２′位に位置し、そしてａ
がオキシである式Ｉの化合物も好適である。相補的な核
酸（標的核酸）に連結した場合、新しいオリゴヌクレオ
チドは天然のオリゴヌクレオチドが示す結合親和性と比
較して改善した結合親和性を示す。これらの新しいオリ
ゴヌクレオチドを治療に用いた場合、例えばリン酸エス
テル骨格、リボース単位またはオリゴヌクレオチド末端
の付加的な修飾を導入するのが有利である〔J. S. Cohe
n, Topics in Molecular and Structural Biology 12(1
989), Macmillan Press, E. Uhlmann等、上記参照〕。
例えば新しいオリゴヌクレオチドはより効果的にヌクレ
アーゼ攻撃から保護され、これはそれ自体知られている
修飾をその糖リン酸エステル骨格で行なった場合に好都
合である。
【００１１】従って、Ｖ、Ｙ、Ｙ′およびＷがチオキ
ソ、セノキソ、オキシ、オキソ、スルファンジイル、イ
ミノまたはメチレンの意味を有し、そして、Ｕがヒドロ
キシ、メルカプトまたはメチルの意味を有する式Ｉの化
合物も好適である。後者の化合物は、Ｒ2がやはりヒド
ロキシルまたは水素、特に水素である場合が特に好まし
い。Ｒ1およびＲ1aが水素である式Ｉの化合物もまた好
ましい実施態様である。
【００１２】Ｒ1および／またはＲ1aが水素であり、Ｒ2
がヒドロキシルまたは水素であり、Ｕがヒドロキシルま
たはメルカプトであり、そしてＶ、Ｙ、Ｙ′およびＷが
チオキソ、オキシ、オキソまたはヒドロキシルの意味を
有する式Ｉの化合物が極めて好ましい。ヌクレオチド化
学において慣用的な保護基とは、例えば、アミノ保護
基、ヒドロキシル保護基または文献記載〔E. Sonveaux,
1986, Bioorganic Chemistry, 14, 274-325またはS.
L. Beaucage等., 1992, Tetrahedron, 48, 2223-2311〕
の他の保護基を指すものとする。
【００１３】アルキル、アルケニル、またはアルキニル
は、直鎖または分枝鎖であってよい。シクロアルキルは
アルキル置換環を指すものとする。（Ｃ6〜Ｃ20）−ア
リールの例は、フェニル、ナフチルまたはビフェニル、
好ましくはフェニルである。ヘテロアリールとは特に、
フェニルまたはナフチルより誘導され、そして、ＣＨ基
１つ以上がＮで置き換えられ、そして／または、隣接す
るＣＨ基の少なくとも２つがＳ、ＮＨまたはＯで置き換
えられ（同時に５員の芳香族環を形成）る基を指すもの
とする。更に、２環の基の縮合部位の一方または両方の
原子は（インドリジニルの場合のように）Ｎ原子であっ
てよい。フラニル、チエニル、ピロリル、イミダゾリ
ル、ピラゾリル、トリアゾリル、テトラゾリル、オキサ
ゾリル、イソキサゾリル、チアゾリル、イソチアゾリ
ル、ピリジル、ピラジニル、ピリミジニル、ピリダジニ
ル、インドリル、インダゾリル、キノリル、イソキノリ
ル、フタラジニル、キノキサリニル、キナゾリニルおよ
びシンノリニルが特にヘテロアリールであると見なされ
る。
【００１４】式(Ｉ)の化合物の生理学的に許容しうる塩
とはRemingtonのPharmaceutical Science（17版、1418
ページ（1985）)に記載されているような無機および有
機の塩の両方を指すものとする。物理的および化学的安
定性および溶解度のため、酸の基に対してはナトリウム
塩、カリウム塩、カルシウム塩およびアンモニウム塩が
特に好ましい。本発明はα−およびβ−Ｄ−およびＬ−
リボフラノシド、およびα−およびβ−Ｄ−およびＬ−
デオキシリボフラノシドおよび相当する炭素環５員環類
縁体にのみ限定されるものではなく、その他の糖ビルデ
ィングブロック、例えばキシロフラノースおよびアラビ
ノフラノース誘導体、環拡張および環収縮糖、またはそ
の他の種類の適当な糖誘導体から構築されたオリゴヌク
レオチド類縁体にも適用される。更に、本発明は式Ｉで
例示するホスフェート基の誘導体に限定されるわけでは
なく、知られたデホスホ誘導体にも関する。
【００１５】結果的に、新しいオリゴヌクレオチドは広
範囲の種類の天然の構造を修飾することにより誘導する
ことができる。これらの修飾の例は、それ自体知られた
方法により導入され得るものであり、以下に示すとおり
である。 ａ） ホスフェート架橋の修飾 以下にその例を記載する。ホスホロチオエート、ホスホ
ロジチオエート、メチルホスホネート、ホスホアミデー
ト、ボラノホスフェート、メチルホスフェート、エチル
ホスフェートおよびフェニルホスホネート。ホスホロチ
オエート、ホスホロジチオエートおよびメチルホスホネ
ートがホスフェート架橋の好ましい修飾型である。 ｂ） ホスフェート架橋の置き換え 以下にその例を記載する。ホルムアセタール、３′−チ
オホルムアセタール、メチルヒドロキシルアミン、オキ
シム、メチレンジメチルヒドラゾ、ジメチレンスルホン
またはシリル基の置き換え。ホルムアセタールおよび
３′−チオホルムアセタールの置き換えが好ましい。
【００１６】ｃ） 糖の修飾 以下にその例を記載する。α−アノマー糖、２′−Ｏ−
メチルリボース、２′−Ｏ−ブチルリボース、２′−Ｏ
−アリルリボース、２−フルオロ−２′−デオキシリボ
ース、２′−アミノ−２′−デオキシリボースおよびα
−アラビノフロースおよび炭素環糖類縁体。好ましい修
飾型は２′−Ｏ−メチルリボースおよび２′−Ｏ−ｎ−
ブチルリボースである。 ｄ） 糖とホスフェート架橋の修飾 糖／ホスフェート骨格がアミノグリシン骨格で置き換え
られているペプチド核酸（ＰＮＡ）およびカーバメート
架橋モルホリノオキゴマーを例示することができる。 ｅ） 塩基、特にピリミジン塩基のその他の修飾 以下に示す例えば、５−プロピニル−２′−デオキシウ
リジン、５−プロピニル−２′−デオキシシチジン、５
−ヘキシニル−２′−デオキシウリジン、５−ヘキシニ
ル−２′−デオキシシチジン、５−フルオロ−２′−デ
オキシシチジン、５−フルオロ−２′−デオキシウリジ
ン、５−ヒドロキシメチル−２′−デオキシウリジン、
５−メチル−２′−デオキシシチジンおよび５−ブロモ
−２′−デオキシシチジン。５−プロピニル−２′−デ
オキシウリジン、５−ヘキシニル−２′−デオキシシチ
ジンおよび５−プロピニル−２′−デオキシシチジンが
好ましい修飾型である。
【００１７】ｆ） ３′−３′転化および５′−５′転
化〔例えばM. Koga等，J. Org. Chem.56 (1991) 3757〕 ｇ） ５′コンジュゲートおよび３′コンジュゲート 細胞内取り込を促進する基の例は種々の新油性の基であ
り、例えば、−Ｏ−(ＣＨ2)x−ＣＨ3（式中ｘは６〜１
８の整数）、−Ｏ−(ＣＨ2)n−ＣＨ＝ＣＨ−(ＣＨ2)m−
ＣＨ3（式中ｎおよびｍは相互に独立して６〜１２の整
数）、−Ｏ−(ＣＨ2ＣＨ2Ｏ)4−(ＣＨ2)9−ＣＨ3、−Ｏ
−(ＣＨ2ＣＨ2Ｏ)8−(ＣＨ2)13−ＣＨＣ3および−Ｏ−
(ＣＨ2ＣＨ2Ｏ)7−(ＣＨ2)15−ＣＨ3、およびステロイ
ド残基、例えばコレステリル、またはビタミン残基例え
ばビタミンＥ、ビタミンＡまたはビタミンＤ、および天
然の担体系を開発するためのその他のコンジュゲート、
例えばコリン酸、葉酸、２−（Ｎ−アルキル、Ｎ−アル
コキシ）−アミノアントラキノン、および、マンノース
のコンジュゲート、および、オリゴヌクレオチドの受容
体媒介のエンドサイトシスをもたらすような相当する受
容体のペプチド、例えばＥＧＦ（表皮生育因子）、ブラ
ディキニンおよびＰＤＧＦ（血小板誘導生育因子）であ
る。標識基とは蛍光基、例えばダンシル（＝Ｎ−ジメチ
ル−１−アミノナフチル−５−スルホニル）誘導体、フ
ルオレセイン誘導体またはクマリン誘導体、または、例
えばアクリジン誘導体の化学発光基、更に、ＥＬＩＳＡ
により検出できるジゴキシゲニン系、ピオチン／アビジ
ン系で検出できるビオチン基、または、検出可能な受容
体基で後に誘導化できる官能基を有するその他のリンカ
ーアーム、例えば活性アクリジニウムエステルと反応し
て化学発光プローブを形成するアミノアルキルリンカー
である。以下に示すものは典型的な標識基である。
【００１８】
【化１３】
【００１９】
【化１４】
【００２０】核酸と結合するか、これに介在し、そして
／またはそれらを分解または交叉結合するオリゴヌクレ
オチド類縁体は、例えばアクリジン、ソラレン、フェナ
ントリジン、ナフトキノン、ダウノマイシンまたはクロ
ロエチルアミノアリールのコンジュゲートである。典型
的な介在性および交叉結合性の残基を以下に示す。
【００２１】
【化１５】
【００２２】
【化１６】
【００２３】Ｒ3とＲ4がそれらが結合する窒素原子と一
緒になって更にヘテロ原子を含む５員または６員のヘテ
ロ環を形成するＮＲ3Ｒ4基の例は、モルホリニル残基お
よびイミダゾリジニル残基である。
【００２４】本発明は更に下記式Ｖ：
【化１７】 〔式中Ｖはオキシ、スルファンジイルまたはイミノであ
り；Ｙbはオキシ、スルファンジイルまたはメチレンで
あり；ａはオキシまたはメチレンであり；Ｒ2bは水素、
ＯＲ12、Ｃ1〜Ｃ18−アルコキシ、Ｃ1〜Ｃ6−アルケニ
ルオキシ、特にアリルオキシ、ハロゲン、アジドまたは
ＮＲ10Ｒ11であり；Ｒ1はヌクレオチド化学で慣用的な
保護基であり；
【００２５】Ｒ1bは下記式IIｃまたはIIｄ：
【化１８】 ｛式中ＵはＯ−Ｒ7またはＳ−Ｒ7であり；Ｑは基−ＮＲ
8Ｒ9であり；Ｒ7は−(ＣＨ2)2−ＣＮであり；Ｒ8および
Ｒ9は同じかまたは異なっていてＣ1〜Ｃ6−アルキル、
特にイソプロピルまたはエチルであるか、または、それ
らが結合している窒素原子と一緒になって５〜９−員の
ヘテロ環を形成し、これは更に、Ｏ、ＳおよびＮから選
択されるヘテロ原子を含んでおり、特に、
【化１９】 である｝の基であり；
【００２６】Ｅ′およびＦ′は相互に独立して、Ｈ、Ｏ
ＨまたはＮＲ10Ｒ11であり；Ｒ10およびＲ11は同じかま
たは異なっていて水素またはヌクレオチド化学で慣用的
なアミノ保護基であるか、または、Ｒ10とＲ11は一緒に
なってヌクレオチド化学で慣用的なアミノ保護基を形成
し、Ｒ12はヌクレオチド化学で慣用的なヒドロキシル保
護基、例えば、ｔ−ブチルジメチルシリル、トリイソプ
ロピルシリル、ｏ−ニトロベンジル、ｐ−ニトロベンジ
ル、トリス（１−メチルエチル）シリルまたは２−フル
オロフェニル−４−メトキシピペリジン−４−イル（Ｆ
ＰＭＰ）であり、そして曲線の括弧はＲ2と隣接するホ
スホリル基が２′および３′位、あるいは逆に３′およ
び２′位の何れかに位置することを示す〕の化合物に関
する。
【００２７】Ｖ、Ｙbおよびａがオキシであり、Ｒ2bが
水素またはＯＲ12、特に水素であり、そして、Ｒ1bは式
（IIｃ）または（IIｄ）（式中ＵはＯ−(ＣＨ2)2−Ｃ
Ｎ）であり、Ｒ8およびＲ9は同じかまたは異なっていて
イソプロピルまたはエチルである（Ｖ）の化合物は好ま
しい実施態様を示す。これらの化合物は更に糖上の塩基
がβ位にあり、そしてＲ2bが２′位にある場合に極めて
好ましい。本発明は更にまた糖への連結が８−アザプリ
ン塩基のＮ２原子により形成されている式Ｖの化合物に
も関する。好ましいアミノ保護基の例はアシル保護基ま
たはアミジン保護基である。
【００２８】本発明はまた、下記式VI：
【化２０】 〔式中、相互に独立して、Ｕ′＝Ｕ″＝Ｕ′′′はヒド
ロキシルまたはメルカプトであり；ｅおよびｆは０また
は１であり；Ｒ13は水素またはＯＨであり、そしてＥお
よびＦはＨ、ＯＨまたはＮＨ2である〕の化合物にも関
するが、ただし、Ｕ′、Ｕ″、Ｕ′′′、Ｒ13およびＦ
がＯＨであり、ＥがＮＨ2であり、そしてｅおよびｆが
１である式VIの化合物は除外される。Ｕ′がヒドロキシ
ルまたはメルカプトであり、Ｕ″＝Ｕ′′′がヒドロキ
シルであり、そしてｅおよび／またはｆが１であるよう
な式VIの化合物が好ましい。
【００２９】更に、ＥがＨであり、ＦがＮＨ2である
か、またはＥがＮＨ2でありＦがＯＨである場合はＲ13
はＨであるか、またはＥがＮＨ2であり、Ｆ、Ｒ13、
Ｕ′、Ｕ″およびＵ′′′がＯＨである場合は、ｅおよ
び／またはｆが０であるか、または、ＥがＮＨ2であ
り、Ｆ、Ｒ13、Ｕ″およびＵ′′′がＯＨであり、ｅお
よびＦが１である場合はＵ′はメルカプトである式VIの
化合物も好ましい。
【００３０】式VIの新しい化合物は例えばＰＣＲ反応
（ｅ＝ｆ＝１，Ｒ13＝ＯＨ）において、または配列決定
（ｅ＝ｆ＝１，Ｒ13＝ＨまたはＯＨ）のために、分子生
物学における手段として使用できる。式VIの化合物は一
般的に知られた方法を用いて相当する８−アザプリンヌ
クレオシドから調製できる。式VIの化合物は、好ましく
は、１,８−ビス（ジメチルアミノ）ナフテンおよびト
リメチルホスフェートの存在下Ludwigのワンポット工程
の簡略化した方法を用いて調製する〔J. Ludwig等，(19
81) Acta Biochem. Biophys. Sci. Hung., 16, 131〕。
【００３１】本発明はまた、式Ｉ、ＶおよびVIの化合物
の全ての互変異体、特に式IVの８−アザプリン塩基の全
ての互変異性体を包含する。本発明は更にまた、式Ｉの
新しい化合物を調製するための方法に関する。Grunberg
er等〔Biochem. Biophys. Acta, (1968) 161, 147-15
5〕は酵素的または化学酵素的な経路による８−アザグ
アニンを含むトリリボヌクレオシドホスフェートの調製
を記載している。Bodnar等はＤＮＡポリメラーゼを用い
た二重鎖８−アザグアニン含有ファージＤＮＡの酵素的
合成を記載している〔Bodnar等，(1983), J. Biol. Che
m., 258, 15206-15213〕。８−アザデオキシグアノシン
のＮ−グリコシド結合が酸に対して極めて安定であるた
め〔Seela等，(1993), Helv. Chem. Acta, 76, 2388-23
97〕、オリゴヌクレオチドの化学合成で慣用的に用いら
れている標準的な条件を新しい８−アザプリン含有オリ
ゴヌクレオチドの調製のために用いることができる。
【００３２】式Ｉの新しい化合物は、溶液中、または好
ましくは、固相上で、適切には自動合成装置を用いて調
製する。式Ｉのオリゴマーの構築は、適切に誘導体化さ
れた支持体上に、または成長中のオリゴマー鎖上に、１
回に１個、各々の場合１つのヌクレオチド塩基を含有す
るモノヌクレオチドを縮合させることにより段階的に行
なうことができる。オリゴヌクレオチドは、当該分野で
知られた方法、例えばトリエステル法、Ｈ−ホスホネー
ト法、またはホスホアミダイト法を用いて構築する〔E.
Sonveaux,(1986), Bioorganic Chemistry, 14, 274-32
5; S. L. Beaucage等，(1992), Tetrahedron, 48, 2223
-2311〕。式Ｖのヌクレオチドモノマービルディングブ
ロックは好ましくは８−アザプリン誘導体を導入するた
めに好ましく用いられ、Ｅ′がＮＲ10Ｒ11でありＦ′が
ＯＨであるような式Ｖのヌクレオチドモノマーが特に好
ましい。
【００３３】オリゴヌクレオチド固相合成のためのビル
ディングブロックとしての式Ｖの化合物は、相当する８
−アザプリンヌクレオシドから調製できる。８−アザプ
リン塩基のアミノ基および糖の遊離の５′−ヒドロキシ
ル基のための適切な保護基を導入した後、モノマーを相
当するホスホネートまたはホスホアミダイト誘導体に変
換する。適当なアミノ保護基、例えばホルムアミジン保
護基（（ジメチルアミノ）メチリデン）またはアシル保
護基の形態のものを、一般的に知られた方法〔L. J. Mc
Bride等，(1983) Tetrahedron Lett., 24, 2953, G. S.
Ti等，(1982)J. Am. Chem. Soc., 104, 1316; H. Scha
ller等，(1963), J. Am. Chem. Soc.,85, 3821〕を用い
て導入するが、アミノ基をアシル化する場合はSchaller
の過アシル化法が好都合である。糖の遊離の５′−ＯＨ
基の適当な保護基の例は４,４′−ジメトキシトリチル
であり、これは知られた方法で同様に導入される〔C.
B. Reese (1978), Tetrahedron, 34, 3143; D. Flocker
zi等，(1981), Leibigs Ann. Chem., 1568〕。この方法
で保護されたモノマーは、Froehler等により開発された
方法を用いて、相当するホスホネートに変換することが
できる〔B. C. Froehler等，(1986), Nucl. Acid Res.,
14, 5399〕。シアノエチルホスホアミダイト誘導体
は、例えば、無水ジクロロメタン中クロロ−β−シアノ
エトキシ（Ｎ,Ｎ−ジイソプロピルアミノ）ホスファン
とモノマーを反応させることにより調製できる〔N. D.
Sinha等，(1984) Nucl. Acid Res., 12, 4539〕。
【００３４】オリゴヌクレオチド合成は、２′−ＯＨ基
が付加する結果、デオキシリボオリゴヌクレオチドの合
成と比較して、より困難になっている。最初の困難な点
は相互に適合性を有する２′−ＯＨ基と５′−ＯＨ基の
組み合わせを見つけることである。即ち、オリゴヌクレ
オチド合成の間、Ｏ−２′位の残基はトリチル保護基の
加水分解に用いられる酸条件に対して安定でなければな
らない。更に、３′位から２′位へのホスフェート基の
移行をもたらすような条件を回避しなければならない。
領域選択的な反応が保護基の導入の際には望ましい。式
（Ｉ）の新しいオリゴヌクレオチドの合成のためには
２′−ＯＨ保護基としてトリイソプロピルシリルクロリ
ドを用いるのが好都合であり、これにより、高い水準の
選択性および十分な安定性と穏やかな除去条件（ＴＢＡ
Ｆ／ＴＨＦ）が達成される。反応の選択性は、イミダゾ
ールの代わりに硝酸銀を触媒として使用すると更に向上
する〔F. Seela, K. Mersmann, J. A. Grasby, M. J. G
ait, Helv. Chim. Acta 1993, 76, 1809〕。
【００３５】デオキシリボヌクレオチドの固相合成の場
合とは対照的に、ホスホアミダイトビルディングブロッ
クはオリゴヌクレオチドの固相合成には必ずしも適する
ものではない。これは、特に、反応性ホスホアミダイト
が大型の２′−シリル保護基により立体的に遮蔽されて
いる結果、比較的長いカップリング時間が必要なためで
あり〔N. Usman, R. T. Pon, K. K. Ogilvie, Tetrahed
ron Lett. 1985, 26,4567〕、このような遮蔽効果は低
いカップリングをもたらす。リボヌクレオシドホスホネ
ートはホスホアミダイトよりも加水分解および酸化に対
してより安定であり、比較的短いサイクル時間でオリゴ
ヌクレオチド合成を行なうことが可能になる。
【００３６】本発明のリボヌクレオチドホスホネートは
Froehlerにより開発された方法を用いて調製してよい
〔B. Froehler, P. G. Nug, M. D. Mateuci, Nucl. Aci
ds Res. 1986, 14, 5399〕。オリゴヌクレオチド部分が
３′および／または５′末端で修飾されている式Ｉの化
合物は、これらの修飾に関し、ＥＰ−Ａ ０ ５５２ ７
６６に記載の方法を用いて合成する。本発明は更にまた
薬剤の調製のための式Ｉの新しい化合物の使用、およ
び、新しいオリゴヌクレオチドを生理学的に許容性のあ
る賦形剤および適切には適当な添加剤および／または補
助物質と混合することからなる薬剤の調製方法に関す
る。
【００３７】最も一般的な態様においては、本発明は薬
剤の治療活性成分としての式Ｉの化合物の使用に関す
る。一般的に、治療活性オリゴヌクレオチド誘導体はア
ンチセンスオリゴヌクレオチド、三重螺旋形成オリゴヌ
クレオチド、アプタマーまたはリボソーム、特に、アン
チセンスオリゴヌクレオチドを指すものとする。更に、
本発明はまた８−アザプリンを少なくとも１つ含む、好
ましくは８−アザグアニンまたは８−アザアデニンを含
むオリゴヌクレオチドの使用に関し、例えば、生物学的
試料中の特定の二重鎖または一重鎖の核酸分子の存在ま
たは不存在またはその量を検出するための、診断薬とし
ての使用に関する。本発明に従って使用するためには、
オリゴヌクレオチドは４〜１００、好ましくは約５〜４
０、特に約６〜３０個のヌクレオチドの長さを有する。
このほか、上記した好ましい範囲、修飾およびコンジュ
ゲート形成もまた、この例に適用される。本発明の薬剤
は、例えばＨＩＶ、ＨＳＶ−１、ＨＳＶ−２、インフル
エンザ、ＶＳＶ、Ｂ型肝炎またはパピローマウイルスに
より誘発される疾患の治療に用いることができる。
【００３８】新しいアンチセンスオリゴヌクレオチド誘
導体、即ち、プリン塩基の少なくとも１つが８−アザプ
リン塩基で置き換えられており、この性質の標的に対し
て活性を有するようなアンチセンスオリゴヌクレオチド
は例えば以下に示すような塩基配列を有する。 ａ） ＨＩＶに対して活性を有する例 5′-ACACCCAATTCTGAAAATGG-3′ (Ｉ) 5-AGGTCCCTGTTCGGGCGCCA-3′ (II) 5′-GTCGACACCCAATTCTGAAAATGGATAA-3′ (III) 5′-GCTATGTCGACACCCAATTCTGAAA-3′ (IV) 5′-CTGTCTCCGCTTCTTCTTCCTGCCATAGGAG (Ｖ) 5-TCGTCGCTGTCTCCGCTTCTTCTTCCTGCCA (VI) ｂ） ＨＳＶ−１に対して活性を有する例 5′-GCGGGGCTCCATGGGGGTCG-3′ （VII）
【００３９】本発明の薬剤はまた、例えば癌の治療に適
する。例えば、癌の発生と増殖に関与する標的に対する
オリゴヌクレオチド配列をこの観点において使用でき
る。このような標的の例を以下に示す。 １） 核腫瘍蛋白、例えばｃ−ｍｙｃ、Ｎ−ｍｙｃ、ｃ
−ｍｙｂ、ｃ−ｆｏｓ、ｃ−ｆｏｓ／ｊｕｎ、ＰＣＮＡ
およびｐ１２０ ２） 原形質／膜関連腫瘍蛋白、例えばＥＪ−ｒａｓ、
ｃ−Ｈａ−ｒａｓ、Ｎ−ｒａｓ、ｒｒｇ、ｂｃｌ−２、
ｃｄｃ−２、ｃ−ｒａｆ−１、ｃ−ｍｏｓ、ｃ−ｓｒｃ
およびｃ−ａｂｌ ３） 細胞受容体、例えばＥＧＦ受容体、ｃ−ｅｒｂ
Ａ、レチノイド受容体、蛋白キナーゼ調節サブユニット
およびｃ−ｆｍｓ ４） サイトカイン、生長因子および細胞外マトリック
ス、例えば、ＣＳＦ−１、ＩＬ−６、ＩＬ−１ａ、ＩＬ
−１ｂ、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ｂＦＧＦ、ミエロブラス
チンおよびフィブロネクチン
【００４０】この性質の標的に対する活性を有する式Ｉ
の新しいアンチセンスオリゴヌクレオチドは、例えば以
下に示す塩基配列を有する。 ａ） ｃ−Ｈａ−ｒａｓに対して活性を有する例 5′-CAGCTGCAACCCAGC-3′ (VIII) ｃ） ｃ−ｍｙｃ 5′-GGCTGCTGGAGCGGGGCACAC-3′ (IX) 5′-AACGTTGAGGGGCAT-3′ (Ｘ) ｄ） ｃ−ｍｙｂ 5′-GTGCCGGGGTCTTCGGGC-3′ (XI) ｅ） ｃ−ｆｏｓ 5′-GGAGAACATCATGGTCGAAAG-3′ (XII) 5′-CCCGAGAACATCATGGTCGAAG-3′ (XIII) 5′-GGGGAAAGCCCGGCAAGGGG-3′ (XIV) ｆ） ｐ１２０ 5′-CACCCGCCTTGGCCTCCCAC-3′ (XV) ｇ） ＥＧＦ受容体 5′-GGGACTCCGGCGCAGCGC-3′ (XVI) 5′-GGCAAACTTTCTTTTCCTCC-3′ (XVII) ｈ） ｐ５３腫瘍抑制物質 5′-GGGAAGGAGGAGGATGAGG-3′ (XVIII) 5′-GGCAGTCATCCAGCTTCGGAG-3′r (XIX)
【００４１】本発明の薬剤はまた、インテグリンまたは
細胞−細胞付着受容体、例えば、ＶＬＡ−４、ＶＬＡ−
２、ＩＣＡＭ、ＶＣＡＭまたはＥＬＡＭの影響を受ける
疾患の治療に適している。この性質の標的に対して活性
を有する新しいアンチセンスオリゴヌクレオチド誘導体
は、例えば以下に示すような塩基配列を有する。 ａ） ＶＬＡ−４ 5′-GCAGTAAGCATCCATATC-3′ (XX) ｂ） ＩＣＡＭ 5′-CCCCCACCACTTCCCCTCTC-3′ (XXI) 5′-CTCCCCCACCACTTCCCCTC-3′ (XXII) 5′-GCTGGGAGCCATAGCGAGG-3′ (XXIII) ｃ） ＥＬＡＭ−１ 5′-ACTGCTGCCTCTTGTCTCAGG-3′ (XXIV) 5′-CAATCAATGACTTCAAGAGTTC-3′ (XXV)
【００４２】本発明の薬剤はまた、例えば、再狭窄を防
止するのに適している。例えば、増殖または移行に関与
する標的に対するオリゴヌクレオチド配列を、この観点
において使用してよい。このような性質の標的の例を以
下に示す。 １） 核相互活性化蛋白およびサイクリン、例えば、ｃ
−ｍｙｃ、ｃ−ｍｙｂ、ｃ−ｆｏｓ、ｃ−ｆｏｓ／ｊｕ
ｎ、サイクリンおよびｃｄｃ２キナーゼ ２） 有糸分裂促進物質または生長因子、例えばＰＤＧ
Ｆ、ｂＦＧＦ、ＥＧＦ、ＨＢ−ＥＧＦおよびＴＧＨ−β ３） 細胞受容体、例えば、ｂＦＧＦ受容体、ＥＧＦ受
容体およびＰＤＧＦ受容体
【００４３】この性質の標的に対して活性を示す式Ｉの
新しいオリゴヌクレオチドは、例えば以下に示す塩基配
列を有する。 ａ） ｃ−ｍｙｂ 5′-GTGTCGGGGTCTCCGGGC-3′ (XXVI) ｂ） ｃ−ｍｙｃ 5-CACGTTGAGGGGCAT-3′ (XXVII) ｃ） ｃｄｃ２キナーゼ 5′-GTCTTCCATAGTTACTCA-3′ (XXVIII) ｄ） ＰＣＮＡ（ラット増殖細胞核抗原） 5′-GATCAGGCGTGCCTCAAA-3′ (XXIX)
【００４４】薬剤は、例えば、経口投与できる試薬製剤
の形態、例えば錠剤、コーティングされた錠剤、ハード
またはソフトゼラチンカプセル、溶液、乳液または懸濁
液の形態で使用してよい。適切には蛋白のような別の成
分も含有する薬剤のリポソームへの封入もまた、適当な
投与形態である。これらはまた、肛門から例えば坐薬の
形態で、または、非経腸的に例えば注射溶液の形態で投
与してよい。薬学的製剤を調製するためには、これらの
化合物を治療不活性の有機および無機の賦形剤中に配合
する。錠剤、コーティングされた錠剤およびハードゼラ
チンカプセルに適するこのような性質の賦形剤の例は、
乳糖、コーンスターチまたはその誘導体、タローおよび
ステアリン酸またはその塩である。水、ポリオール、ス
クロース、転化糖およびグルコースは溶液調製のために
適する賦形剤である。水、アルコール、ポリオール、グ
リセロールおよび植物油は、注射溶液に適する賦形剤で
ある。植物油および硬化油、ワックス、脂肪および半液
体ポリオールは坐薬に適する賦形剤である。薬学的製剤
はまた、保存料、溶媒、安定剤、湿潤剤、乳化剤、甘味
料、着色料、フレーバー剤、浸透圧調製用の塩、緩衝
剤、コーティング剤および抗酸化剤、更に、適切な場合
は、その他の治療活性物質も含有してよい。
【００４５】好ましい形態の投与は、例えばカテーテル
や注射を用いた局所投与である。注射のためには、アン
チセンスオリゴヌクレオチド誘導体を、液体溶液、好ま
しくは生理学的に許容される緩衝液、例えば、ハンク液
またはリンゲル液中に製剤する。しかしながら、アンチ
センスオリゴヌクレオチドはまた、固体形態に製剤し、
そして溶解または懸濁した後に使用することができる。
全身投与に好適な用量は、１日当たり約０.０１mg／kg
〜約５０mg／kg体重である。極めて一般的な態様におい
て、本発明は、ＤＮＡプローブまたはＤＮＡ診断におけ
るプライマーとして、そして、一般的には、分子生物学
における手段としての式Ｉの化合物の使用にも関する。
【００４６】好ましい形態の投与は、例えばカテーテル
や注射を用いた局所投与である。注射のためには、アン
チセンスオリゴヌクレオチド誘導体を、液体溶液、好ま
しくは生理学的に許容される緩衝液、例えば、ハンク液
またはリンゲル液中に製剤する。しかしながら、アンチ
センスオリゴヌクレオチドはまた、固体形態に製剤し、
そして溶解または懸濁した後に使用することができる。
全身投与のために好適な用量は、一日当たり約０.０１m
g／kg〜約５０mg／kg体重である。
【００４７】極めて一般的な態様において、本発明は、
ＤＮＡプローブまたはＤＮＡ診断におけるプライマーと
して、そして、一般的には、分子生物学における手段と
しての式Ｉの化合物の使用にも関する。
【００４８】例：実施例で記載する化合物（１）〜（１
６）は、以下に示す構造を有する。
【化２１】
【００４９】
【化２２】
【００５０】実施例１ ５−アミノ−３−（２−デオキシ−β−Ｄ−エリスロペ
ントフラノシル）−３Ｈ−１,２,３−トリアゾロ〔４,
５−ｄ〕ピリミジン−７−（６Ｈ）−オン−５′−Ｏ−
トリホスフェート、トリエチルアンモニウム塩（８−ア
ザ−２′−デオキシグアノシン５′−トリホスフェー
ト） 穏やかに加温しながら、３−（２−デオキシ−β−Ｄ−
エリスロペントフラノシル）−５−アミノ−３Ｈ−１,
２,３−トリアゾロ〔４,５−ｄ〕ピリミジン−７−（６
Ｈ）−オン（８−アザ−２′−デオキシグアノシン
（１）（２６mg；０.０９ミリモル）を１,８−ビス（ジ
メチルアミノ）ナフタレン（３３mg、０.１５ミリモ
ル）とともにトリメチルホスフェート溶液（０.２５m
l）中に入れた。溶液を０℃に冷却した後、新しく蒸留
したＰＯＣｌ3（１２μｌ、０.１３ミリモル）を添加し
た。反応を４℃で４時間維持し、次にトリ−ｎ−ブチル
アンモニウムジホスフェート（ＤＭＦ中０.５mM、１m
l）およびトリ−ｎ−ブチルアミン（１００μｌ、０.４
２ミリモル）よりなる溶液を添加した。３分間０℃でこ
の混合物を撹拌した後、１Ｍ ＴＢＣ緩衝液（１０ml）
を添加し、全体を蒸発乾固させた。残留物をＤＥＡＤセ
ファデックスR(１.５×２０cmカラム、ＨＣＯ3 -型）上
のクロマトグラフィーに付した。水約５００mlでカラム
を洗浄した後、水／０.９Ｍ ＴＢＣ緩衝液（各々１Ｌ）
の一次勾配を用いてクロマトグラフィーを行なった。こ
れにより、０.５Ｍ ＴＢＣ緩衝液（０.０１９mM、２０
％）にほぼ主要領域が得られた。ＴＬＣ（シリカゲル、
ｉ−プロパノール／水／アンモニア、３：１：１） Rf 0.2。UV(H2O)：λmax256nm。31 P-NMR(0.1 Mトリス−HCl, pH 8.0, 100mM EDTA／D
2O)：-10.27(d, J=19.3, Px)；-10.63(td, J=20.2およ
び6.0, Pα)；-22.60(t, J=19.8, Pβ)。
【００５１】実施例２ ３−（２−デオキシ−β−Ｄ−エリスロペントフラノシ
ル）−５−｛〔（ジメチルアミノ）メチリデン〕アミ
ノ｝−３Ｈ−１,２,３−トリアゾロ〔４,５−ｄ〕ピリ
ミジン−７−（６Ｈ）−オン（２） ３−（２−デオキシ−β−Ｄ−エリスロペントフラノシ
ル）−５−アミノ−３Ｈ−１,２,３−トリアゾロ〔４,
５−ｄ〕ピリミジン−７−（６Ｈ）−オン（８−アザ−
２′−デオキシグアノシン（１））（２９０mg；１.０
６ミリモル）を無水ＤＭＦ（７ml）に溶解し、Ｎ,Ｎ−
ジメチルホルムアミドジエチルアセタール（５ml）を添
加した。混合物を２４時間室温で撹拌した後、ロータリ
ーエバポレーターで真空下に蒸発させ、残留物をトルエ
ンと共蒸発させた。残留物をシリカゲル上のクロマトグ
ラフィーにより精製した（カラム：２０×４cm、０.５b
ar、ＣＨ2Ｃｌ2／ＭｅＯＨ ８：２）。化合物（２）
（３２０mg、９２％）が無色の泡状物として得られ、こ
れをメタノールから結晶化させた。 m.p. 236℃。 TLC(CH2Cl2／MeOH 8：2)：Rf 0.7。UV(MeOH)：301(2650
0), 244(15500)。1 H-NMR((D6)DMSO：8.66(s, CH)；6.43(t, J=6.32, H-C
(1′))；5.40(br. s, OH-C(3′))；4.79(br. s, OH-C
(5′))；4.48(m, H-C(3′))；3.85(m, H-C(4′))；3.57
(m, H-C(5′))；3.19, 3.06(2 s, 2CH3)；2.90(m, Hβ-
C(2′))；2.34(m, H(α)-C(2′))。 元素分析値（Ｃ12Ｈ17Ｎ7Ｏ4（３２３.３１）として） 計算値：Ｃ ４４.５６；Ｈ ５.２９；Ｎ ３０.３２ 測定値：Ｃ ４４.６４；Ｈ ５.２６；Ｎ ３０.３７
【００５２】実施例３ ３−〔２−デオキシ−５−Ｏ−（４,４′−ジメトキシ
トリチル）−β−Ｄ−エリスロペントフラノシル〕−５
−｛〔（ジメチルアミノ）メチリデン〕アミノ｝−３Ｈ
−１,２,３−トリアゾロ〔４,５−ｄ〕ピリミジン−７
−（６Ｈ）−オン（３） 実施例２のアミノ保護した８−アザ−２′−デオキシグ
アノシン（２）（１７０mg、０.５３ミリモル）を無水
ピリジンとともにくり返し共蒸発させることにより処理
し、次に後者６ml中に溶解した。４,４′−ジメトキシ
トリチルクロリド（２６０mg、０.７ミリモル）を室温
で添加し、この混合物を３時間撹拌した。溶液を５％炭
酸水素ナトリウム（４０ml）中に注加し、この混合物を
各々塩化メチレン３０mlで２回抽出した。合わせた有機
層を硫酸ナトリウム上で乾燥し、真空下ロータリーエバ
ポレーターで蒸発させた。残留物をシリカゲル上のクロ
マトグラフィーに付した（カラム：１５×４cm、０.５
bar、ＣＨ2Ｃｌ2／ＭｅＯＨ ９５：５）。無色の泡状物
２７０mg（８２％）を得た。 TLC(CH2Cl2／MeOH 95：5）：Rf 0.3。 UV(MeOH)：302(24600), 235(35000)。1 H-NMR；((D6)DMSO：12.03(s, NH)；8.66(s, CH)；7.39
〜6.70(2 m, 芳香族 H)；6.48(m, H-C(1′))；4.57(m,
H-C(3′))；3.97(m, H-C(4′))；3.69(s, 2 OCH 3)；3.3
7(m, H-C(5′))；3.22, 3.07(2s, 2CH3)；2.90(m, Hβ-
C(2′))；2.40(m, H(α)-C(2′))。 元素分析値（Ｃ33Ｈ35Ｎ7Ｏ6（６２５.６８）として） 計算値：Ｃ ６３.３４；Ｈ ５.６４；Ｎ １５.６７ 測定値：Ｃ ６３.４２；Ｈ ５.７２；Ｎ １５.７１
【００５３】実施例４ ３−〔２−デオキシ−５−Ｏ−（４,４′−ジメトキシ
トリチル）−β−Ｄ−エリスロペントフラノシル〕−５
−｛〔（ジメチルアミノ）メチリデン〕アミノ｝−３Ｈ
−１,２,３−トリアゾロ〔４,５−ｄ〕ピリミジン−７
−（６Ｈ）−オン３′（トリエチルアンモニウムホスホ
ネート）（４） １,２,４−トリアゾール（０.５４ｇ、７.５６ミリモ
ル）を塩化メチレン（１０ml）中の三塩化リン（２００
μｌ、０.２２ミリモル）およびＮ−メチルモルホリン
（２.７ml、２.２４ミリモル）の溶液に添加した。溶液
を３０分間撹拌放置し、次に０℃に冷却した。実施例３
の５′−Ｏ−ジメトキシトリチル化合物３（２２０mg、
０.３５ミリモル）を乾燥シアン化メチルとともに共蒸
発させることにより乾燥させ、次に、塩化メチレン（５
ml）中に溶解した後に添加した。１０分間撹拌した後、
混合物を１Ｍ（Ｅｔ3ＮＨ）ＨＣＯ3（ＴＢＣ緩衝液、pH
８.０、３０ml）中に注加し、後者の混合物を塩化メチ
レンとともに振盪して相を分離することにより２回抽出
した。合わせた有機溶液を硫酸ナトリウム上で乾燥し、
蒸発させた。残留物をシリカゲル上のクロマトグラフィ
ーに付した（カラム：４×１５cm、０.５ bar；１．ジ
クロロメタン／トリエチルアミン ９８：２；２．ジク
ロロメタン／メタノール／トリエチルアミン ８８：１
０：２）。主要領域に存在する物質を塩化メチレン（１
０ml）中に溶解し、この溶液を０.１Ｍ ＴＢＣ緩衝液
（pH８.０）とともに振盪することにより数回抽出し
た。Ｈ−ホスホネート４（２４０mg、８５％）を無色の
泡状物として得た。 TLC(CH2Cl2／MeOH／Et3N 88：10：2）：Rf 0.3。 UV(MeOH)：285(sh, 14900), 303(18400)。1 H-NMR；((D6)DMSO：11.68(s, NH)；8.83(s, CH)；7.7
7, 5.45(d, J=585, HP)；7.24〜6.69(2 m, 芳香族 H),
6.53(m, J=4.5, H-Cl′))；5.22(m, H-C(3′))；4.09
(m, H-C(4′))；3.67(s, 2 OCH3)；3.07, 3.23(s, 2 CH
3, H-C(5′))；2.97(m, CH3CH2)；2.56(m, H-C(2′))；
1.13(m, CH3CH2)。31 P-NMR((D6)DMSO)：1.16(1J(P,H)=585)；3Ｊ(P,H-C
(3′)-8.90。 元素分析値（Ｃ39Ｈ51Ｎ8Ｏ8Ｐ1（７９０.８７）とし
て） 計算値：Ｃ ５９.２３；Ｈ ６.４９；Ｎ １４.１７ 測定値：Ｃ ５９.３３；Ｈ ６.７９；Ｎ １３.９５
【００５４】実施例５ ３−〔２−デオキシ−５′−Ｏ−（４,４′−ジメトキ
シトリチル）−β−Ｄ−エリスロペントフラノシル〕−
５−｛〔（ジメチルアミノ）メチリデン〕アミノ｝−３
Ｈ−１,２,３−トリアゾロ〔４,５−ｄ〕ピリミジン−
７−（６Ｈ）−オン３′〔(２−シアノエチル)−Ｎ,Ｎ
−ジイソプロピルホスホアミダイド〕(５) （ｉ−Ｐｒ）2ＥｔＮ（５６μｌ、０.２７ミリモル）お
よびクロロ（２−シアノエトキシ）ジイソプロピルアミ
ノホスファン（１１５μｌ、０.５１ミリモル）を塩化
メチレン（１ml）中の実施例３の化合物（３）（５０m
g、０.０８ミリモル）の溶液に添加した。混合物をアル
ゴン下２時間室温で撹拌した。次に５％炭酸水素ナトリ
ウム（３ml）中に注加し、この混合物を塩化メチレン
（３０ml）で２回抽出した。合わせた有機層を硫酸ナト
リウム上で乾燥し、ロータリーエバポレーター上で蒸発
乾固した。残留物をシリカゲル上のクロマトグラフィー
に付した（カラム：７×２cm、０.５bar、ジクロロメタ
ン／酢酸エチル／トリエチルアミン ４５：４５：１
０）。ホスホアミダイド（５）のジアステレオマーの２
つの重複する領域を判別することが可能であり、ジアス
テレオマーは無色の泡状物として得られた（３５mg、５
５％）。 TLC(CH2Cl2／AcOET／Et3N 45：45：10)；Rf 0.4。31 P-NMR((D6)DMSO)：149.4，148.9。
【００５５】実施例６ ２−〔２−デオキシ−５−Ｏ−（４,４′−ジメトキシ
トリチル）−３′−Ｏ−スクシニル−β−Ｄ−エリスロ
ペントフラノシル〕−５−｛〔（ジメチルアミノ）メチ
リデン〕アミノ｝−３Ｈ−１,２,３−トリアゾロ〔４,
５−ｄ〕ピリミジン−７−（６Ｈ）−オン（６） ４−ジメチルアミノピリジン（３０mg、０.２３ミリモ
ル）および無水コハク酸（９０mg、０.８８ミリモル）
をピリジン（５ml）中の実施例３の保護したヌクレオシ
ド（３）（１１０mg、０.１８ミリモル）の溶液に添加
した。混合物を４８時間室温で撹拌放置した。水２mlを
添加することにより反応を停止した。混合物を蒸発乾固
した後、残留物をトルエンとともに共蒸発させることに
より、残留するピリジンを除去した。残留物を少量の塩
化メチレン中に溶解し、この溶液をクエン酸１０％水溶
液および水で洗浄した。有機層を硫酸ナトリウム上で乾
燥し、真空下に濃縮した。残留物をジクロロメタン／ピ
リジン（９５：５、２ml）中に溶解した後、ｎ−ペンタ
ン／エーテル（１：１、３０ml）を急速に添加した。上
澄みを濾去し、無色の粉末が残留した（８５mg、６６
％）。 ＴＬＣ（ＣＨ2Ｃｌ2／ＭｅＯＨ ９：１）：Ｒf ０.２
５。1 H-NMR((D6)DMSO)：8.71(s, CH)；7.28〜6.75(2 m, 芳
香族 H)；6.46(m, J=4.1,H-C(1′))；5.48(m, H-C
(3′))；4.21(m, H-C(4′))；3.36(s, 2 OCH3)；3.18,
3.05(2 s, 2 CH3)；3.10(m, H-C(5′))；2.51(m, H-C
(2′), 2 CH2)。
【００５６】実施例７ ７−（ベンゾイルアミノ）−１,２,３−トリアゾロ
〔４,５−ｄ〕ピリミジン８−アザアデニン（２００m
g、１.４７ミリモル）を乾燥ピリジン中で３回蒸発さ
せ、次に乾燥ピリジン５ml中に溶解した。次にベンゾイ
ルクロリド（０.２８ml、２.２０ミリモル）を滴加し、
混合物を３時間６０℃で撹拌した。次に更に１時間還流
下に煮沸した。反応混合物を一夜放置し、次に約１mlと
なるまで濃縮した。この混合物に冷水１５mlを添加し、
５分間撹拌放置し、得られた沈殿を吸引濾去した。わず
かに黄色味を帯びた沈殿を各々冷水１mlおよび冷アセト
ニトリル１mlで２回洗浄した。無色の結晶０.３０ｇ(８
５％)を得た(メタノール)。 m.p.＝263℃(分解)。 TLC(シリカゲル、CH2Cl2／MeOH=8：2)；Rf=0.6。 UV(メタノール）λmax(ε)=242(12100)；291(16000)。1 H-NMR(D6-DMSO)δ：7.58；7.69；8.13(芳香族 -H5) 8.
89(s, H-5), 11.99(s-N6-H)。 元素分析値（Ｃ11Ｈ8Ｎ6Ｏとして） 計算値：Ｃ ５４.９９；Ｈ ３.３６；Ｎ ３４.９９ 測定値：Ｃ ５５.１０；Ｈ ３.３４；Ｎ ３５.０４
【００５７】実施例８ ７−（ノナノイルアミノ）−３−〔(２,３,５−トリ−
Ｏ−アセチル)−β−Ｄ−リボフラノシル〕−３Ｈ−１,
２,３−トリアゾロ〔４,５−ｄ〕ピリミジン(７) ７−ノナノイルアミド−１,２,３−トリアゾロ〔４,５
−ｄ〕ピリミジン５００mg（１.１８ミリモル）を乾燥
ピリジン中で３回蒸発乾固させた。残留物を乾燥アセト
ニトリル２０ml中に溶解した。１,２,３,５−テトラ−
Ｏ−アセチル−β−Ｄ−リボフラノース０.５８ｇ（１.
８１ミリモル）を添加し、四塩化スズ０.６４ml（５.４
３ミリモル）を滴加し、反応混合物を２４時間室温で撹
拌した。反応溶液を飽和炭酸水素ナトリウム溶液２５ml
中に添加し、この混合物を各々ジクロロメタン１５mlで
４回抽出した。硫酸ナトリウム上で乾燥させた後、合わ
せた有機層を蒸発乾固した。油状の残留物０.８１ｇが
得られた。生成物混合物をカラムクロマトグラフィー
（５.５×３０cmカラム、シリカゲル、溶離剤：ジクロ
ロメタン／メタノール ９５：５）により分画した。無
色のヌクレオシド０.２７ｇ（２８％）が比較的速く移
行する領域から得られた。 TLC(シリカゲル、CH2Cl2／MeOH)；Rf=0.75。 UV(メタノール）λmax(ε)=275(16800)。1 H-NMR(D6-DMSO)δ：0.82(m, -CH3-9″)；1.22(m, -(CH
2)5-)；1.62(m, J=6.8 Hz, -CH2-3″)；1.93；2.08；2.
11(3s, O=CCH3)；2.61(t, J=7.2 Hz, -CH2-2″)；4.26
(m, H-5′)；4.52(m, H-4′)；5.77(m, H-3′)；6.12
(m, H-2′)；6.63(d, J=3.4 Hz, H-1′)；8.89(s, H-
5)；11.48(s, br, N6-H)。
【００５８】実施例９ ７−アミノ−１,２,３−トリアゾロ〔４,５−ｄ〕ピリ
ミジンの１,２,３,５−テトラ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ
−リボフラノースとのグリコシル化 ７−アミノ−１,２,３−トリアゾロ〔４,５−ｄ〕ピリ
ミジン３４０mg（２.５ミリモル）および１,２,３,５−
テトラ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−リボフラノース８００
mg（２.５ミリモル）を乾燥アセトニトリル１０ml中に
懸濁した。四塩化スズ０.８８ml（７.５ミリモル）をア
ルゴン下、５分間かけてこの混合物に滴加し、次に全体
を２４時間室温で撹拌した。得られた溶液を飽和炭酸水
素ナトリウム溶液３２mlに慎重に注加した。生じた沈殿
を吸引濾過し、各々水１０mlで２回洗浄した。濾液と洗
浄水を各々塩化メチレン１５mlで４回抽出した。硫酸ナ
トリウム上で乾燥し、溶媒を蒸発させた後、わずかに黄
色味を帯びた泡状物０.８７ｇを得た。反応生成物をカ
ラムクロマトグラフィー（カラム：５.５×２０cm、シ
リカゲル、ジクロロメタン／メタノール ９８：２−９
０：１０）により分画した。
【００５９】実施例１０ ７−アミノ−３−〔（２,３,５−トリ−Ｏ−アセチル）
−β−Ｄ−リボフラノシル〕−３Ｈ−１,２,３−トリア
ゾロ〔４,５−ｄ〕ピリミジン（８） 比較的速く移行する領域から無色泡状物０.３４ｇ（３
４％）を得た。 TLC(シリカゲル、CH2Cl2／MeOH 9：1)；Rf=0.45。 UV(メタノール）λmax(ε)=280(10900)。1 H-NMR(D6-DMSO)δ：1.89；2.10；2.11(3 s, 2′,3′,
5′-O-C=O)；4.20(m, H2-5′)；4.48(m, H-4′)；5.74
(t, J=5.5 Hz, H-3′)；6.07(t, J=3.7 Hz, H-2′)；6.
48(d, J=2.8, H-1′)；8.25；8.6(2 s, N6-H2), 8.34
(s, H-5)。 元素分析値（Ｃ15Ｈ18Ｎ6Ｏ7として） 計算値：Ｃ ４５.６８；Ｈ ４.６１；Ｎ ２１.３１ 測定値：Ｃ ４５.９８；Ｈ ４.７２；Ｎ ２１.４０
【００６０】実施例１１ ７−アミノ−２−〔（２,３,５−トリ−Ｏ−アセチル）
−β−Ｄ−リボフラノシル〕−２Ｈ−１,２,３−トリア
ゾロ〔４,５−ｄ〕ピリミジン 無色の泡状物０.４６ｇ（４７％）をクロマトグラフィ
ー精製段階の比較的遅く移行する領域から得た。 TLC(シリカゲル、CH2Cl2／MeOH)；Rf=0.35。 UV(メタノール）λmax(ε)=253(3900), 300(10400)。1 H-NMR(D6-DMSO)δ：1.94；2.07；2.11(3 s, 2′,3′,
5′-O-C=O)；4.25(m, H2-5′)；4.52(m, H-4′)；5.74
(t, J=6.0, H-3′)；5.91(d, J=3.4, H-2′)；6.53(s,
H-1′)；8.3；8.45(2 s, N6-H2), 8.34(H-5)。 元素分析値（Ｃ15Ｈ18Ｎ6Ｏ7として） 計算値：Ｃ ４５.６８；Ｈ ４.６１；Ｎ ２１.３１ 測定値：Ｃ ４５.８６；Ｈ ４.７１；Ｎ ２１.２２
【００６１】実施例１２ ７−アミノ−３（β−Ｄ−リボフラノシル）−３Ｈ−
１,２,３−トリアゾロ〔４,５−ｄ〕ピリミジン（８−
アザアデノシン，９） 化合物（８）２.０４ｇ（５.１７ミリモル）をメタノー
ル５mlおよびアンモニア水（２５％）５ml中で２時間室
温で撹拌した。水３ml中の残留物を蒸発乾固させて再結
晶させた後、無色の結晶１.０４ｇ（７５％）を得た
が、これは２１７℃で分解した。 TLC(シリカゲル、CH2Cl2／MeOH=8：2)；Rf=0.45。 UVλmax(pH 7)=279(11600)；λmax(pH 1)=263, λmax(p
H 14)=279。1 H-NMR(D6-DMSO)δ：3.56(m, H2-5′)；4.01(m, H-
4′)；4.29(m, 3′)；4.85(m, H-2′)；5.01(t, J=5.9
Hz, HO-5′)；5.28(d, J=5.7, HO-3′)；5.56(d, J=6.0
HO-2′)；6.15(d, J=5.2 Hz, H-1′)；8.31(s, H-5)；
8.53；8.19(2 s, N7H2)。
【００６２】実施例１３ ７−アミノ−２−（β−Ｄ−リボフラノシル）−２Ｈ−
１,２,３−トリアゾロ〔４,５−ｄ〕ピリミジン メタノール５mlおよびアンモニア水（２５％）５ml中２
時間室温で実施例１１の化合物０.８１ｇ（２.０５ミリ
モル）を撹拌した。蒸発乾固させ、残留物を水２.５ml
から再結晶させた後、無色の結晶０.３２ｇ（５９％）
が得られたが、これは２０９℃で分解した。 TLC(CH2Cl2／MeOH=8：2)；Rf=0.20。 UV(メタノール）λmax(ε)=255(4400), 263(4100), 297
(10400)。1 H-NMR(D6-DMSO)δ：3.59(m, H2-5′)；4.06(m, H-
4′)；4.33(m, H-3′)；4.61(m, H-2′)；4.76(t, J=5.
3 Hz, HO-5′)；5.27(d, J=5.8 Hz, HO-3′)；5.68(d,
J=5.5 Hz, HO-2′)；6.08(s, J=3.4 Hz, H-1′)；8.31
(s, H-5)；8.12(s, N7-H2)。
【００６３】実施例１４ ７−ベンゾイルアミノ−３（β−Ｄ−リボフラノシル）
−３Ｈ−１,２,３−トリアゾロ〔４,５−ｄ〕ピリミジ
ン（１０） ７−アミノ−３−β−Ｄ−リボフラノシル−３Ｈ−１,
２,３−トリアゾロ〔４,５−ｄ〕ピリミジン１００mg
（０.３７ミリモル）をまず乾燥ピリジン５ml中に入れ
た。トリメチルシリルクロリド０.４７ml（３.７ミリモ
ル）をアルゴン雰囲気下この溶液に滴加した。混合物を
０.５時間室温で撹拌した後（ＴＬＣモニター）、ベン
ゾイルクロリド０.２５ml（２.０ミリモル）を滴加し、
この反応混合物を４時間室温で撹拌した。次に０〜５℃
に冷却し、水１mlを添加し、５分後にアンモニア水（２
５％）２mlを添加した。次にこの混合物を更に３０分間
撹拌した。溶媒を蒸発させ、残留物をトルエンとともに
蒸発させた。残留物を飽和炭酸水素ナトリウム溶液１５
ml中に溶解し、この混合物を１回塩化メチレン２５ml
で、そして数回酢酸エチルで抽出した。合わせた有機層
を硫酸ナトリウム上で乾燥した。溶媒を蒸発させた後、
無色の結晶性物質０.０５ｇ（３６％）が得られ、これ
はメタノールから結晶化させた後、１８８℃で分解しな
がら溶融した。 TLC(シリカゲル、CH2Cl2／MeOH 9：1)；Rf=0.25。 UV(メタノール）λmax(ε)=242(9400), 282(20300)。1 H-NMR(D6-DMSO)δ：3.56(m, H2-5′)；4.04(m, H-
4′)；4.36(m, H-3′)；4.84(t, HO-5′)；4.92(m, H-
2′)；5.33(d, J=5.2 Hz, HO-3′)；5.66(d, J=5.4 Hz,
HO-2′)；6.30(d, J=4.3 Hz, 1′)；7.54〜8.11(m, 芳
香族 -H5)；8.94(s, H-5)；11.99(s, br, N6-H)。 元素分析値（Ｃ16Ｈ16Ｎ6Ｏ6として） 計算値：Ｃ ５１.６０；Ｈ ４.３４；Ｎ ２２.５７ 測定値：Ｃ ５１.４９；Ｈ ４.４３；Ｎ ２２.７４
【００６４】実施例１５ ７−｛〔（ジメチルアミノ）メチリデン〕アミノ｝−３
−（β−Ｄ−リボフラノシル）−３Ｈ−１,２,３−トリ
アゾロ〔４,５−ｄ〕ピリミジン（１１） ７−アミノ−３−β−Ｄ−リボフラノシル−（３Ｈ）−
１,２,３−トリアゾロ〔４,５−ｄ〕ピリミジン １００
mg（０.３７ミリモル）を乾燥ＤＭＦ ２mlおよびＮ,Ｎ
−ジメチルホルムアミドジメチルアセタール０.２５ml
（１.８５ミリモル）中、室温で一夜撹拌放置した。次
にこの反応混合物にメタノール４mlを添加した。更に２
時間撹拌した後、混合物を蒸発乾固させ、残留物をトル
エンと共に共蒸発させ、次に、シリカゲル上のクロマト
グラフィーに付した（カラム：３×２０cm、溶離剤ジク
ロロメタン／メタノール ９８：２−９０：１０）。無
色のガラス状の固化した物質０.０６ｇ（５２％）が主
要領域中に得られた。 TLC(シリカゲル、CH2Cl2／MeOH=9：1)；Rf=0.25。 UVλmax(ε)=235, 325。1 H-NMR(D6-DMSO)δ：3.21；3.27(2 s, N(CH3)2)；3.55
(m, H2-5′)；4.00(m, H-4′)；4.31(m, H-3′)；4.87
(m, H-2′)；4.96(t, HO-5′)；5.32(d, HO-3′)；5.60
(d, HO-2′)；6.19(d, J=4.7 Hz, H-1′)；8.57(s, H-
5)；9.06(s, N=CH)。
【００６５】実施例１６ ７−｛〔１−（ジメチルアミノ）エチリデン〕アミノ｝
−３−（β−Ｄ−リボフラノシル）−３Ｈ−１,２,３−
トリアゾロ〔４,５−ｄ〕ピリミジン（１２） Ｎ,Ｎ−ジメチルアセトアミドジメチルアセタール０.９
１ml（５.５９ミリモル）を分析等級のメタノール１０m
l中の物質９の５００mg（１.８６ミリモル）に添加し
た。懸濁液を１４時間室温で撹拌放置した。得られた溶
液からロータリーエバポレーターを用いて溶媒を除去
し、残留物をトルエンとともに共蒸発させた。更にメタ
ノール１０mlを残留物に添加し、この混合物を２時間室
温で撹拌した。溶媒を除去した後、残留物をシリカゲル
上のクロマトグラフィーに付した（カラム：４×２０c
m、溶離剤ジクロロメタン／メタノール＝９８：２−９
０：１０）。収量：無色の泡状物０.４８ｇ（７６
％）。 TLC(シリカゲル、CH2Cl2／MeOH=9：1)；Rf=0.35。 UV(メタノール)λmax(ε)=233(9300), 270(3600), 324
(26100)。1 H-NMR(D6-DMSO)δ：2.28(s, N=C-CH3)；3.20(s, N(C
H3)2)；3.55(m, H2-5′)；4.00(m, H-4′)；4.30(m, H-
3′)；4.86(m, H-2′)；4.98(t, HO-5′)；5.29(d,J=5.
2 Hz, HO-3′)；5.57(d, J=5.9 Hz, HO-2′)；6.18(d,
J=5.2 Hz, H-1′)；8.54(s, H-5)。 元素分析値（Ｃ13Ｈ19Ｎ7Ｏ4として） 計算値：Ｃ ４６.２８；Ｈ ５.６９；Ｎ ２９.０７ 測定値：Ｃ ４６.４５；Ｈ ５.６３；Ｎ ２８.９７
【００６６】実施例１７ ７−｛〔１−（ジメチルアミノ）エチリデン〕アミノ｝
−３−〔５−Ｏ−（４,４′−ジメトキシトリフェニル
メチル）−β−Ｄ−リボフラノシル〕−３Ｈ−１,２,３
−トリアゾロ〔４,５−ｄ〕ピリミジン（１３） 乾燥させるために化合物１２（０.３４ｇ、１.００ミリ
モル）を乾燥ピリジン中で２回蒸発させた。その物質を
乾燥ピリジン４mlに溶解し、４,４′−ジメトキシトリ
チルクロリド０.４１ｇ（１.２０ミリモル）を添加し、
次に、２時間４０℃で混合物を撹拌した。混合物を室温
に冷却した後、分析等級のメタノール５mlを添加し、こ
の混合物を更に３０分間撹拌した。反応溶液をほぼ半分
の容量になるまで濃縮した。炭酸水素ナトリウム飽和溶
液８mlを添加し、全体を、各々塩化メチレン１０mlで４
回抽出した。合わせた有機層を塩化ナトリウム飽和溶液
１５mlとともに振盪することにより抽出し、硫酸ナトリ
ウム上で乾燥し、蒸発させた。残留物（淡黄色泡状物
０.７３ｇ）をカラムクロマトグラフィー（カラム：２
×２０cm、シリカゲル、ジクロロメタン／メタノール９
５：５）を用いることにより更に精製した。収量：無色
泡状物０.５２ｇ（８１％） TLC(シリカゲル、CH2Cl2／MeOH=9：1)；Rf=0.45。 UV(メタノール)λmax(ε)=234(29900), 275(13800), 32
4(24800)。1 H-NMR(D6-DMSO)δ：2.24(s, N=CCH3)；3.10(m, H2-
5′)；3.19(s, N(CH3)2)；3.69(s, (OCH3)2)；4.14(m,
H-4′)；4.51(m, H-3′)；4.86(m, H-2′)；5.28(d,J=
6.2 Hz, HO-3′)；5.68(d, J=5.1 Hz, HO-2′)；6.25
(d, H-1′)；6.71〜7.26(m, 13芳香族 H)；8.54(s, H-
5)。 元素分析値（Ｃ34Ｈ37Ｎ7Ｏ6として） 計算値：Ｃ ６３.８３；Ｈ ５.８４；Ｎ １５.３３ 測定値：Ｃ ６３.６４；Ｈ ５.８４；Ｎ １５.３１
【００６７】実施例１８ ７−｛〔１−（ジメチルアミノ）エチリデン〕アミノ｝
−３−｛５−Ｏ−（４,４′−ジメトキシトリフェニル
メチル）−２−Ｏ−〔トリス（１−メチルエチル）シリ
ル〕−β−Ｄ−リボフラノシル｝−３Ｈ−１,２,３−ト
リアゾロ〔４,５−ｄ〕ピリミジン（１４） 乾燥したトリチル化合物１３（０.３５ｇ、０.５５ミリ
モル）をまず乾燥ピリジン４ml中に導入した。硝酸銀１
４０mg（０.８２ミリモル）をこの溶液に添加し、次に
テトラヒドロフラン５ml中に溶解しておいたトリイソプ
ロピルクロリド１４５μｌ（０.６９ミリモル）をアル
ゴン雰囲気下に添加した。混合物を遮光下室温で撹拌放
置した。２４時間後、トリイソプロピルシリルクロリド
１２０μｌ（０.５５ミリモル）を更に添加し、混合物
を更に４８時間室温で撹拌放置した。析出した塩化銀を
濾去し、少量のテトラヒドロフランで洗浄した。濾液を
飽和炭酸水素ナトリウム溶液を添加した。これを４回各
々ジクロロメタン１０mlで抽出し、合わせた有機層を硫
酸ナトリウム上で乾燥した。蒸発乾固させ、わずかに黄
色味を帯びた油状物０.６０ｇを得た。反応生成物は、
カラムクロマトグラフィー（カラム：３×２０cm、シリ
カゲル、溶離剤、酢酸エチル／石油エーテル８：２）で
精製分画した。無色の泡状物０.３１ｇ（７１％）を比
較的速く移行する主要領域から得た。 TLC(シリカゲル、酢酸エチル／石油エーテル 9：1)；Rf
=0.30。 UV(メタノール)λmax(ε)=234(29600), 274(6800), 325
(25900)。1 H-NMR(D6-DMSO)δ：0.83〜0.97(m, Si-〔CH(C
H3)2〕)；2.24(s, N=CCH3), 3.10(m, H2-5′)；3.19(s,
N(CH3)2)；3.70(s, O-CH3)2)；4.19(m, H-4′)；4.43
(m,H-3′)；5.21(t, J=4.4 Hz, H-2′)；5.27(d, J=6.3
Hz, HO-3′)；6.30(d, J=4.3 Hz, H-1′)；6.7５〜7.
３５(m, 13芳香族 H)；8.5３(s, H-5)。 元素分析値（Ｃ43Ｈ57Ｎ7Ｏ6として） 計算値：Ｃ ６４.８７；Ｈ ７.２３；Ｎ １２.２３ 測定値：Ｃ ６４.９４；Ｈ ７.３７；Ｎ １２.１３
【００６８】実施例１９ ７−｛〔１−（ジメチルアミノ）エチリデン〕アミノ｝
−３−｛５−Ｏ−（４,４′−ジメトキシトリフェニル
メチル）−３−Ｏ−〔トリス（１−メチルエチル）シリ
ル〕−β−Ｄ−リボフラノシル｝−３Ｈ−１,２,３−ト
リアゾロ〔４,５−ｄ〕ピリミジン（１５） 化合物１４に関して上記したとおり行なったカラムクロ
マトグラフィーの比較的遅く移行する領域から無色の泡
状物０.０８ｇ（１８％）を得た。 TLC(シリカゲル、酢酸エチル／石油エーテル 9：1)；Rf
=0.15。 UV(メタノール)λmax(ε)=234(29800), 274(7400), 327
(24700)。1 H-NMR(D6-DMSO)δ：0.98(s, Si〔CH(CH3)2〕3)；2.19
(s, N=CCH3)；3.10(m, H2-5′)；3.18(s, N(CH3)2)；3.
68(s, (OCH3)2)；4.17(m, H-4′)；4.92(m, H-3′,H-
2′)；5.64(d, J=5.1 Hz, HO-2′)；6.27(d, J=6.0 Hz,
H-1′)；6.70〜7.20(m, 13芳香族 H)；8.55(s, H-5)。
【００６９】実施例２０ ７−｛〔１−（ジメチルアミノ）エチリデン〕アミノ｝
−３−｛５−Ｏ−（４,４′−ジメトキシトリフェニル
メチル）−２−Ｏ−〔トリス（１−メチルエチル）シリ
ル〕−β−Ｄ−リボフラノシル｝−３Ｈ−１,２,３−ト
リアゾロ〔４,５−ｄ〕ピリミジン−３−Ｏ−ホスホネ
ート、トリエチルアンモニウム塩(１６) 乾燥ジクロロメタン１０ml中の三塩化リン１１４μｌ
（１.３ミリモル）およびＮ−メチルモルホリン１.４３
ml（１３.０ミリモル）の溶液に、アルゴン雰囲気下１,
２,４−トリアゾール０.６７ｇ（９.７５ミリモル）を
添加した。反応混合物を３０分間室温で撹拌した後、０
℃まで冷却し、乾燥ジクロロメタン２.５mlに溶解した
シリル化合物（１４）を１０分間かけて滴加した。反応
混合物を更に２０分間０℃で撹拌し、次に、１Ｍ ＴＢ
Ｃ緩衝液で加水分解した、水層を３回各々ジクロロメタ
ン２０mlで抽出した。合わせた有機層を、硫酸ナトリウ
ム上で乾燥し、蒸発乾固させた、残留物をシリカゲルカ
ラム上でクロマトグラフィーに付した（３×１０cm、ジ
クロロメタン／メタノール／ＴＥＡ ８８：１０：
２）。生成物を含有する画分を合わせて蒸発させること
により濃縮し、残留物をジクロロメタン２０ml中に溶解
し、この溶液を４回各々０.１Ｍ ＴＢＣ緩衝液５mlとと
もに振盪することにより抽出し、硫酸ナトリウム上で乾
燥し、溶媒を除去した。収量：無色泡状物０.２１ｇ
（８３％） TLC(シリカゲル、CH2Cl2／MeOH／TEA 88：10：2)；Rf=
0.6。 UV(メタノール)λmax(ε)=234(27300), 274(11700), 32
5(16400)。1 H-NMR(D6-DMSO)δ：0.75〜0.95(m, Si〔CH(C
H3)2〕3)；1.15；2.99(m, (CH3CH2)3N)；2.24(s, N=CCH
3)；3.20(s, N(CH3)2)；(H2-5′verdeckt)；3.69(s, (O
-CH 3)2)；4.40(m, H-4′)；4.79(m, H-3′)；5.44(m, H
-2′)；5.50 u. 7.91(d, 1J=602 Hz, P-H)；6.27(d, J=
6.0 Hz, H-1′)；6.76〜7.40(m, 13芳香族 H)；8.50(s,
H-5)；10.90(s, br, N+-H)。31 P-NMRδ：2.55(dd, 1PPH=602 H2, 3JPH=9.5 H2)。
【００７０】実施例２１ ホスホネート法を用いたオリゴヌクレオチドの固相合成 ホスホネート法およびApplied Biosystems(Weiterstad
t)のＤＮＡ合成装置を用いて１μmolの規模でオリゴリ
ボヌクレオチドを合成した。最終酸化は手操作で行なっ
た。 １．アンモニア（２５％水溶液／エタノール ３：１
１）の作用に１６時間曝露することにより支持体カラム
上のＣＰＧ支持体からオリゴリボヌクレオチドを単離し
た。 ２．塩基保護基の除去 オリゴマーのアンモニア性の溶液を、未修飾(ＡＵ)6配
列の場合は１６時間５５℃で、８−アザアデノシン含有
１２量体の場合は３時間４０℃で、ウォーターバス中加
熱した。溶液を室温で蒸発乾固させ、残留物を無水エタ
ノールとともに共蒸発させた。 ３．２′−シリル保護基はＴＢＡＦ／ＴＨＦの１モル溶
液の作用に室温で１６時間曝露することにより除去し
た。
【００７１】実施例２２ ５′−（ｚ8Ａ−Ｕ)6−３′(１７）の合成 オリゴリボヌクレオチド５′−（ｚ8Ａ−Ｕ)6−３′(１
７）の合成のために８−アザアデノシンの３′−ホスホ
ネートを用いた。ここでは、化合物（１６）をウリジン
の５′−（ＭｅＯ)2Ｔｒ−，２′−ｔ−ＢｕＭｅ2Ｓｉ
−保護３′−ホスホネートとともに使用した。３′から
５′の方向にControlled Pore Glass(CPG)上でオリゴヌ
クレオチドを合成し、その際、３′−末端保護ヌクレオ
シドをスクシニルスペーサーを介して固相に共有結合さ
せた。合成の最初では、支持体結合ヌクレオシドの５′
Ｄｍｔ基をジクロロメタン中２.５％ジクロロ酢酸を用
いて除去した。次にピバロイルクロリドを用いて活性化
しておいたホスホネートを用いてカップリングを行なっ
た。不正確な配列となることを防止するために、未反応
の５′−ＯＨ基をイソプロピルホスファイトと反応させ
た。
【００７２】実施例２３ オリゴリボヌクレオチドの精製 １） 予備脱塩 Qiagenチップ５００陰イオン交換カラムを用いた。RQia
genカラムを０.１ＭのＴＢＣ緩衝液５mlで平衡化し、オ
リゴマー溶液を充填し、０.１ＭのＴＢＣ緩衝液５mlで
洗浄した。次に、オリゴマーを１ＭのＴＢＣ緩衝液でカ
ラムから溶離させた。生成物画分をＵＶ／ＴＬＣプレー
トを用いて検出した。緩衝液をオリゴマー含有画分から
RSpeed Vac遠心分離器を用いて真空下に除去した。 ２） 調製用ＨＰＬＣ オリゴマーをＲＰ １８ RLiChrosorbカラム上の逆相Ｈ
ＰＬＣにより単離した。この目的のために、オリゴマー
をジエチルピロカーボネート（ＤＥＰＣ）の１％水溶液
４００μｌ中に溶解し、次にこの試料を２〜３分間９５
℃で加熱し、次に急速に０℃に冷却し、これにより、二
次構造の形成を防止した。次にこの溶液の試料（１０μ
ｌ）を注入して保持時間を測定した。溶液は５０〜１０
０μｌづつＲＰ−１８カラムに注入した。主要ピークを
分離し、合わせた画分を濃縮して、容量を約５mlとし
た。
【００７３】移動相： Ａ：０.１Ｍ ＴＥＡＡ（滅菌、pH７.５）／シアン化メ
チル ９５：５ Ｂ：シアン化メチル 溶媒系Ｉ：２０分、Ａ中０〜２０％Ｂ 溶媒系II：３０分、Ａ中０〜２０％Ｂ
【００７４】オリゴマー１７の保持時間オリゴマー 保持時間（分） 溶媒系 (ｚ8Ａ−Ｕ)6 ２８.６ II 流速：１ml／分
【００７５】３）脱塩 オリゴマー溶液５mlをあらかじめオートクレーブしシア
ン化メチル５ml、０.０５Ｍ ＴＥＡＡ緩衝液（pH７.
０）／シアン化メチル１：１ ５mlおよび０.０５Ｍ Ｔ
ＥＡＡ緩衝液５mlで平衡化したカラム(Millipore, Esch
born)に添加した。次にカラムを０.０５Ｍ ＴＥＡＡ溶
液５mlで洗浄し、オリゴマーリボヌクレオチドをメタノ
ール／シアン化メチル／水１：１：１混合物１mlづつを
用いながらカラムから溶離させた。オリゴマー含有画分
をＨＰＬＣで同定した。RSpeedVac濃縮装置で凍結乾燥
した後、オリゴリボヌクレオチドを−２５℃で保存し
た。
【００７６】実施例２４ オリゴリボヌクレオチドの全加水分解 オリゴマー０.２ Ａ260単位をトリス塩酸緩衝液（pH８.
３）２００μｌに溶解し、次に、ヘビ毒ホスホジエステ
ラーゼ(Boehringer Mannheim)４μｇ（２μｌ）を添加
し、混合物を３０分間３７℃でインキュベートした。ア
ルカリホスファターゼ３μｇ（５μｌ）を添加した後、
溶液を更に１５分間３７℃で維持した。反応溶液のヌク
レオシド組成をＨＰＬＣで測定した（ＲＰ−１８カラ
ム；移動相：０.１Ｍ ＴＥＡＡ緩衝液／シアン化メチル
９５：５、流速１ml／分）。 ヌクレオシドの保持時間 Ａ＝１１.４分、ｚ8Ａ＝１０.０分、ｌ＝４.８分、Ｕ＝
３.６分 ＨＰＬＣピーク面積は個々の消衰係数で割り、相対比較
した。 ２６０nmにおける消衰係数：ε(A)=15300, ε(z8A)=710
0, ε(U)=10200, ε(l)=7400
【００７７】実施例２５ フラクトシルR結合Ｎ8−８−アザ−２′−デオキシグア
ノシン ｐ−ニトロフェノール（７mg、０.０５ミリモル）およ
びＮ,Ｎ−ジシクロヘキシルカルボジイミド（１０mg、
０.０４８ミリモル）を１,４−ジオキサン／５％ピリジ
ン（１ml）中の実施例６の３′−Ｏ−スクシネート
（６）（３０mg、０.０４ミリモル）の溶液に添加し
た。混合物を２時間室温で撹拌した後、溶液の濾液をＤ
ＭＦ（１ml）中のフラクトシル２００R（８０mg、４５
０μmol／ｇ；Merck)の懸濁液に添加した。トリエチル
アミン（１００μｌ）を添加した後、混合物を無水酢酸
（２０μｌ）を添加しながら４時間振盪した。重合体支
持体を濾去し、ＤＭＦ、エタノールおよびエーテル各々
３０mlで洗浄し、真空下に乾燥した。重合体結合ヌクレ
オシドの収量を測定するために、物質をシアン化メチル
中０.１Ｍ ｐ−トルエンスルホン酸（５ml）に溶解し
た。支持体投入量はＵＶスペクトル分析により、４９８
nmの消光から計算したところ（Ｄｍｔ＝７００００）、
８−アザ−２′−デオキシグアノシン６４マイクロモル
／ｇ FractosilRであった。
【００７８】実施例２６ ホスホネート法によるオリゴデオキシリボヌクレオチド
の固相合成 ３′−５′方向に合成したＤＮＡフラグメントを用い
て、ホスホネート法および３８０ Ｂ ＤＮＡ合成装置(A
pplied Biosystems)を用いながら固相(CPG：RControlle
d Pore Glass)上で１マイクロモルの規模でオリゴデオ
キシリボヌクレオチドの合成を行なった。ここでは酸化
サイクル（脱トリチル化、カップリング、キャッピング
および酸化）は、ホスホネート化学用に開発されたプロ
グラムに従った〔H. Koester, K. Kulikowsky, T. Lies
e, W. Heikens, V. Kohli, Tetrahedron 1981, 37, 36
3〕。５′−ヒドロキシル基でやはりＤｍｔ保護されて
いる塩基保護オリゴヌクレオチドを２５％アンモニア水
を用いて３０分以内に支持体から単離した。更にアンモ
ニア水（１ml、２５％）を添加した後、ヘテロ環上の保
護基を６０℃で２４時間以内に除去した。トリエチルア
ミン１滴（５′−ＯＨ保護基の早期除去の防止）を添加
した後、試料を約２００μｌとなるまでSpeed VacR濃縮
装置で濃縮した。この状態で−２５℃で数ケ月保存され
た。
【００７９】実施例２７ ホスホアミダイド法によるオリゴデオキシリボヌクレオ
チドの固相合成 最初のヌクレオシド単位がその３′末端で結合している
RCPG(Controlled PoreGlass)またはRFractosilを用い
て、自動380 B DNA合成装置(Applied Biosystems)上
で、固相ホスホアミダイド法を用いて１マイクロモルの
規模でオリゴデオキシリボヌクレオチドの合成を行なっ
た。この場合、以下の工程を実施した。 １．無水アセトニトリルで洗浄 ２．ジクロロメタン中３％トリクロロ酢酸処理 ３．無水アセトニトリルで洗浄 ４．無水アセトニトリル０.３ml中５′−Ｏ−ジメトキ
シトリチルヌクレオシド−３′−β−シアノエチルホス
ファイトジイソプロピルアミダイド１０μmolおよびテ
トラゾール５０μmolとの結合 ５．アセトニトリルで洗浄 ６．４０％ルチジンおよび１０％ジメチルアミノビリジ
ンを含有するＴＨＦ中２０％無水酢酸によるキャッピン
グ ７．アセトニトリルで洗浄 ８．ヨウ素（ＴＨＦ／水／ピリジン；７０：２０：５＝
ｖ：ｖ：ｖ中１.３ｇ）による酸化 下記にＤＮＡ反応サイクルと称する段階１〜８を合成す
べき配列に相当するオリゴヌクレオチドの構築のために
反復し、配列に相当する５′−Ｏ−ジメトキシトリチル
（ヌクレオシド塩基）−３′−β−シアノエチルホスフ
ァイト−ジイソプロピルアミダイドは各々の場合工程４
で使用した。合成が終了した後、実施例８に記載の通り
後処理を行なった。
【００８０】実施例２８ ｄ（Ｃｚ8ＧＣＧＣＧ）の合成 ＣＰＧ−結合５′−Ｏ−ジメトキシトリチル−２′−デ
オキシグアノシンを出発物質として実施例２５に記載の
とおり合成を行なった。最初の３個のヌクレオシド付加
工程は、市販の５′−Ｏ−ジメトキシトリチル（ヌクレ
オシド塩基）−３′−Ｈ−ホスホネートを用いて実施し
た。８−アザ−２′−デオキシグアノシンを導入するた
めに、実施例４の３′−〔２−デオキシ−５−Ｏ−
（４,４′−ジメトキシトリチル）−β−Ｄ−エリスロ
ペントフラノシル〕−５−｛〔（ジメチルアミノ）メチ
リデン〕アミノ｝−３Ｈ−１,２,３−トリアゾロ〔４,
５−ｄ〕ピリミジン−７−（６Ｈ）−オン３′−（トリ
エチルアンモニウムホスホネート）（４）を第４の縮合
サイクルに用いた。
【００８１】実施例２９ ｄ（Ｃｚ8ＧＣｚ8ＧＣＧ）の合成 実施例２８に記載の方法と類似の方法を用いて合成を行
ない、実施例４の３−〔２−デオキシ−５−Ｏ−（４,
４′−ジメトキシトリエチル）−β−Ｄ−エリスロペン
トフラノシル〕−５−｛〔（ジメチルアミノ）メチリデ
ン〕アミノ｝−３Ｈ−１,２,３−トリアゾロ〔４,５−
ｄ〕ピリミジン−７−（６Ｈ）−オン３′−（トリエチ
ルアンモニウムホスホネート）（４）を第２および第４
の縮合サイクルに各々用いて８−アザ−２′−デオキシ
グアノシンを導入した。
【００８２】実施例３０ ｄ（ＧＣｚ8ＧＣＧＣ）の合成 シジチンを担持させたＣＰＧ支持体を出発物質として、
実施例２９に記載の方法と類似の方法で合成を行ない、
実施例４の３−〔２−デオキシ−５−Ｏ−（４,４′−
ジメトキシトリエチル）−β−Ｄ−エリスロペントフラ
ノシル〕−５−｛〔（ジメチルアミノ）メチリデン〕ア
ミノ｝−３Ｈ−１,２,３−トリアゾロ〔４,５−ｄ〕ピ
リミジン−７−（６Ｈ）−オン３′−（トリエチルアン
モニウムホスホネート）（４）を第３の縮合サイクルに
用いて８−アザ−２′−デオキシグアノシンを導入し
た。
【００８３】実施例３１ ｄ（Ｔｚ8ＧＧＧＧＴ）の合成 ＣＰＧ−結合５′−Ｏ−ジメトキシトリチルチミジンを
出発物質として実施例２８に記載の方法と類似の方法で
合成を行ない、実施例４の３−〔２−デオキシ−５−Ｏ
−（４,４′−ジメトキシトリエチル）−β−Ｄ−エリ
スロペントフラノシル〕−５−｛〔（ジメチルアミノ）
メチリデン〕アミノ｝−３Ｈ−１,２,３−トリアゾロ
〔４,５−ｄ〕ピリミジン−７−（６Ｈ）−オン３′−
（トリエチルアンモニウムホスホネート）（４）を第４
の縮合サイクルに用いて８−アザ−２′−デオキシグア
ノシンを導入した。
【００８４】実施例３２ ｄ（ＴＧｚ8ＧＧＧＴ）の合成 ＣＰＧ−結合５′−Ｏ−ジメトキシトリチルチミジンを
出発物質として実施例３０に記載の方法と類似の方法で
合成を行ない、実施例４の３−〔２−デオキシ−５−Ｏ
−（４,４′−ジメトキシトリエチル）−β−Ｄ−エリ
スロペントフラノシル〕５−｛〔（ジメチルアミノ）メ
チリデン〕アミノ｝−３Ｈ−１,２,３−トリアゾロ
〔４,５−ｄ〕ピリミジン−７−（６Ｈ）−オン３′−
（トリエチルアンモニウムホスホネート）（４）を第３
の縮合サイクルに用いて８−アザ−２′−デオキシグア
ノシンを導入した。
【００８５】実施例３３ ｄ（Ｔｚ8Ｇｚ8Ｇｚ8Ｇｚ8ＧＴ）の合成 ＣＰＧ−結合５′−Ｏ−ジメトキシトリチルチミジンを
出発物質として実施例３０に記載の方法と類似の方法で
合成を行ない、実施例４の３−〔２−デオキシ−５−Ｏ
−（４,４′−ジメトキシトリチル）−β−Ｄ−エリス
ロペントフラノシル〕５−｛〔（ジメチルアミノ）メチ
リデン〕アミノ｝−３Ｈ−１,２,３−トリアゾロ〔４,
５−ｄ〕ピリミジン−７−（６Ｈ）−オン３′−（トリ
エチルアンモニウムホスホネート）（４）を第１〜第４
の縮合サイクルに各々用いて８−アザ−２′−デオキシ
グアノシンを導入した。
【００８６】実施例３４ ｄ（ＧＴＡｚ8ＧＡＡＴＴＣＴＡＧ）の合成 ＣＰＧ−結合５′−Ｏ−ジメトキシトリチル−２′−デ
オキシグアノシンを出発物質として実施例２６に記載の
方法と類似の方法で合成を行なった。実施例４の３−
〔２−デオキシ−５−Ｏ−（４,４′−ジメトキシトリ
チル）−β−Ｄ−エリスロペントフラノシル〕５−
｛〔（ジメチルアミノ）メチリデン〕アミノ｝−３Ｈ−
１,２,３−トリアゾロ〔４,５−ｄ〕ピリミジン−７−
（６Ｈ）−オン３′−（トリメチルアンモニウムホスホ
ネート）（４）を第８の縮合サイクルに用いて８−アザ
−２′−デオキシグアノシンを導入した。
【００８７】実施例３５ ＨＰＬＣによるトリチル保護および脱保護オリゴヌクレ
オチドの精製 第１精製工程においてＲＰ−１８シリカゲル（溶離剤系
Ｉ）上のＨＰＬＣによりＤｍｔ−保護オリゴマーを精製
し、４０℃で真空下に蒸発乾固させた。次いで８０％酢
酸２５０μｌで２０分間処理することにより５′−トリ
チル基を除去した。第２の精製工程ではこの時点で完全
に脱保護されているオリゴマーをＲＰ−１８ ＨＰＬＣ
（溶離剤系II）で再度精製した。合わせた主要領域を蒸
発させ、残留物を水約５００μｌ中に溶解し、次にこの
溶液を短いＲＰ−１８カラムを通すことにより脱塩した
（溶離剤系III)。凍結乾燥の後、オリゴマー（５−２０
Ａ 260単位）を水１００μｌに溶解し、これらの溶液を
−２５℃で保存した。以下の組成の溶離剤系を用いた。 ＊ 0.1Ｍトリエチルアンモニウムアセテート、pH7.0／
5％アセトニトリル(Ａ) ＊ アセトニトリル（Ｂ） ＊ 水（Ｃ） ＊ メタノール／水（３：２）（Ｄ） Ｉ：２０分Ａ中（０〜２０％Ｂ） II：２０分Ａ中（１５〜４０％Ｂ） III：１５分Ｃ、１０分Ｄ IV：１００％Ａ Ｖ：１００％Ｂ オリゴマーは以下の保持時間を有していた。
【００８８】
【表１】
【００８９】実施例３６ 酵素加水分解によるオリゴデオキシリボヌクレオチドの
特性化 オリゴマー０.２ Ａ260単位を０.１Ｍトリス／塩酸（pH
８.３、２００μｌ）中に溶解し、４５分間３７℃でヘ
ビ毒ホスホジエステラーゼ（EC 3.1.4.1，Crotallus du
rissus, Boehringer Mannheim；６μｇ）とともに、そ
して、３０分間３７℃でアルカリホスファターゼ(EC 3.
1.3.1, ウシ肝臓、Boehringer Mannheim；２μｇ）とと
もにインキュベートした。加水分解生成物を逆相ＨＰＬ
Ｃ（ＲＰ−１８、溶離剤系IV)を用いて２６０nmで検出
した。オリゴデオキシリボヌクレオチドの組成はヌクレ
オシドのピーク面積と消衰係数を用いて定量した（ε
260：dA 15400, dC 7300, dG 11700, dT 8800, z8Gd 12
000)。
【００９０】実施例３７ 酵素淡色性の測定 オリゴマー約０.２ Ａ260単位の２６０nmにおけるＵＶ
吸光度をヘビ毒ホスホジエステラーゼ（１０μｇ）の添
加の前後に０.１Ｍトリス／塩酸緩衝液（pH８.３、２０
０μｌ）中で測定した。酵素による吸光度を考慮した場
合、淡色性は以下の関係により表される。
【数１】
【００９１】実施例３８ Ｔm値のＵＶスペクトル分析およびＣＤスペクトル分析
および熱力学的データの計算 オリゴマーのＴm値をＵＶ／vis分光光度計(Varian, Mel
bourne, Australia)を用いて測定した。温度は１分当た
り０.５または１.０℃の割合で直線的に変化させた。融
点を測定するために、６０mMナトリウムカコジレート緩
衝液（pH７.５、１Ｍ ＮａＣｌ、１００mM ＭｇＣｌ2）
１ml中０.２〜０.８ Ａ260単位のオリゴマー濃度を用い
た。非自己相補性オリゴヌクレオチドを用いて行なった
実験においては、一重鎖の濃度は０.２〜０.６ ＯＤで
あった。％表示の融解淡色性は以下の式に従って、融解
の前後の吸光度の変化から求めた。
【００９２】
【数２】
【００９３】融解曲線は以下の式に従って２状態モデル
（重層／非重層）に基づいたプログラムを用いて分析し
た。 ln Ｋ＝ln〔（ＥS−Ｅ）／（ＥU−Ｅ）〕＝Ｓ／Ｒ−Ｈ
／ＲＴ 式中Ｅはそれぞれの波長における吸光度であり、Ｓは重
層Ｕは非重層を示す。温度依存性ＣＤスペクトルを、波
長範囲２００〜３５０nmで、温度調節可能な石英キュベ
ットを用いて、Jasco 600スペクトロポラリメーターで
プロットした。温度は６０mM Ｎａカコジレート緩衝液
中３〜１５μｍの濃度で、そして０.１Ｍ、１Ｍおよび
４Ｍ ＮａＣｌを用いて、５〜８０℃の範囲で５〜１０
℃の間隔で上昇させた。
【００９４】実施例３９ 二重ラセン形成ａ）に関するＴm値および淡色性
【表２】 a) 1M NaCl、100mM MgCl2、60mMカコジレート緩衝液、p
H7.0中で測定
【００９５】実施例４０ ヌクレアーゼ安定性に関する試験 試験すべきオリゴヌクレオチド１０nmolをＲＰＭＩ培地
中２０％ウシ胎児血清４５０μｌおよび二重蒸留水５０
ml中に溶解し、この溶液を３７℃でインキュベートし
た。ゲル電気泳動の試料１０μｌおよびＨＰＬＣ用の試
料２０μｌを即座に、そして１、２、４、７および２４
時間後に採取し、これらの試料をそれぞれホルムアミド
５μｌまたは１０μｌで処理して反応を停止し、次に５
分間９５℃で加熱した。ゲル電気泳動のために、試料を
１５％ポリアクリルアミドゲル（２％ＢＩＳ）に加え、
これを約３０００ボルト時で展開した。銀染色によりバ
ンドを可視化した。ＨＰＬＣ分析のためには、試料をGe
ne-Pack Fax HPLCカラム(Waters／Millipore)に注入
し、緩衝液Ｂ中５〜５０％Ａを用いて１ml／分でクロマ
トグラフィーに付した（緩衝液Ａ：１０mMリン酸２水素
ナトリウム、アセトニトリル／水（１：４ ｖ：ｖ）中
０.１Ｍ ＮａＣｌ、pH６.８；緩衝液Ｂ：１.５ＭＮａＣ
ｌを含有する以外はＡと同様）。
【００９６】実施例４１ 抗ウィルス活性試験 ヒトに対して病原性を有する種々のヘルペスウィルスに
対する被験物質の抗ウィルス活性を細胞培養試験系で調
べた。実験のために、血清含有ダルベッコＭＥＭ（５％
ウシ胎児血清、ＦＣＳ）中のサル腎細胞（Vero、２×１
０5／ml）を９６ウエルマイクロタイタープレート内に
播種し２４時間５％二酸化炭素条件下３７℃でインキュ
ベートした。次に血清含有培地を吸引除去し、細胞を２
回血清非含有ダルベッコＭＥＭ（−ＦＣＳ）中に浮遊さ
せた。使用前に、被験物質を水で希釈して６００μＭの
濃度とし、−１８℃で保存した。試験のために、更にダ
ルベッコの最小必須培地（ＭＥＭ）で希釈を行なった。
各々の場合、個々の被験物質希釈液１００μｌを血清非
含有ダルベッコＭＥＭ（−ＦＣＳ）１００μｌとともに
洗浄細胞に添加した。３時間５％二酸化炭素条件下３７
℃でインキュベートした後、３日以内に細胞叢が完全に
破壊されるような濃度で単純ヘルペスウィルス１型（Ａ
ＴＣＣ ＶＲ７３３、ＨＳＶ−１ Ｆ株）または単純ヘル
ペスウィルス２型（ＡＴＣＣ ＶＲ７３４、ＨＳＶ−２
Ｇ株）に細胞を感染させた。ＨＳＶ−１の場合は、感染
程度を１ウエル当たり５００プラーク形成単位（ＰＦ
Ｕ）とし、ＨＳＶ−２の場合は３５０ ＰＦＵ／ウエル
とした、次に実験試料に、１００Ｕ／mlペニシリンＧお
よび１００mg／１ストレプトマイシン添加ＭＥＭ中８０
μＭ〜０.０４μＭの濃度で被験物質を含有させた。１
プレート当たり８検体を用いた対照群を除き、すべての
実験は２連で行なった。実験試料は１７時間５％二酸化
炭素条件下３７℃でインキュベートした。被験物質の細
胞毒性は培養細胞を顕微鏡で観察することにより、合計
インキュベート時間２０時間の後に測定した。所定の実
験条件下で顕微鏡で認識できる細胞の損傷に到らない最
高製剤濃度を最大許容用量（ＭＴＤ）とした。次に、Ｆ
ＣＳを最終濃度４％で添加し、プレートを５％二酸化炭
素条件下３７℃で５５時間更にインキュベートした。未
処置の感染対照群は完全な細胞病原性作用（ＣＰＥ）を
示した。顕微鏡で培養細胞を観察した後、Finter(1966)
の生存染色方法を用いてニュートラルレッドで染色し
た。被験物質の抗ウィルス活性はウィルスによる細胞病
原性作用から細胞を３０〜６０％保護するために必要と
される最小阻止濃度（ＭＩＣ）として定義した。
【００９７】略記法 Ａ アデノシン ｂｚ ベンゾイル ｂｒ． ブロード ｃａｌｃ． 計算値 ＣＤ 円２色性 ｄ ダブレット ｄＧ ２′−デオキシグアノシン ｄＡ ２′−デオキシアデノシン ｄＣ ２′−デオキシシチジン ｄＴ ２′−デオキシチミジン ＤＥＰＣ ジエチルピロカーボネート ＤＭＡ ジメチルアセトアミド (Ｄ6)ＤＭＳＯ ジメチルスルホキシド、重水素化６回 ＤＭＦ ジメチルホルムアミド ＤＮＡ デオキシリボ核酸 Ｄｍｔ ４,４′−ジメトキシトリチル、（４,
４′−ジメトキシトリフェニルメチル） ＥＤＴＡ エチレンジアミン四酢酸塩 ＥｔＯＡｃ 酢酸エチル Ｅｔ3Ｎ トリエチルアミン ＦＣ フラッシュクロマトグラフィー Ｇ 自由エンタルピー ｈ 時間 Ｈ ２重型形成エンタルピー ＨＰＬＣ 高速液体クロマトグラフィー Ｈｙｐ． 淡色性 Ｉ イノシン ｉｂｕ イソブチル Ｊ 結合定数 Ｋm ミカエリス−メンテン定数 m.p. 融点 ＮＭＲ 核磁気共鳴 ＰＡＧＥ ポリアクリルアミドゲル電気泳動 ＰＣＲ ポリメラーゼ連鎖反応 ppm １００万分の１部 ２−Ｐ−ＯＨ イソプロパノール Ｒf ＴＬＣにおける展開液先端に対する保
持位置 ＲＮＡ リボ核酸 ＲＰ 逆相 Ｒ.Ｔ. 室温 ｓ 一重線 Ｓ 二重型形成エントロピー ＳＶＰＤ ヘビ毒ホスホジエステラーゼ ｔ 三重線 ＴＢＡＦ テトラブチルアンモニウムフロリド ＴＢＣ トリエチルアンモニウムビカーボネー
ト ＴＥＰ トリエチルアンモニウムホスホネート ＴＬＣ 薄層クロマトグラフィー Ｔｍｓ トリス（１−メチルエチル）シリル Tris トリス（ヒドロキシメチル）アミノメ
タン Ｔm オリゴマー融点 Ｕ ウリジン ＵＶ 紫外線 ｖmax 最大反応速度 ｚ8Ａ ８−アザアデノシン ｚ8Ｇ ８−アザ−２′−デオキシグアノシン λ 波長 ε モル消衰係数
【配列表】
【００９８】配列番号：１ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ ハイポセティカル配列：Ｎｏ アンチセンス：Ｙｅｓ 起源 生物名：ＨＩＶ 配列の特徴 特徴を表す記号：エクソン 存在位置：１．．２０ 配列 ACACCCAATT CTGAAAATGG
【００９９】配列番号：２ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ ハイポセティカル配列：Ｎｏ アンチセンス：Ｙｅｓ 起源 生物名：ＨＩＶ 配列の特徴 特徴を表す記号：エクソン 存在位置：１．．２０ 配列 AGGTCCCTGT TCGGGCGCCA
【０１００】配列番号：３ 配列の長さ：２８ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ ハイポセティカル配列：Ｎｏ アンチセンス：Ｙｅｓ 起源 生物名：ＨＩＶ 配列の特徴 特徴を表す記号：エクソン 存在位置：１．．２８ 配列 GTCGACACCC AATTCTGAAA ATGGATAA
【０１０１】配列番号：４ 配列の長さ：２５ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ ハイポセティカル配列：Ｎｏ アンチセンス：Ｙｅｓ 起源 生物名：ＨＩＶ 配列の特徴 特徴を表す記号：エクソン 存在位置：１．．２５ 配列 GCTATGTCGA CACCCAATTC TGAAA
【０１０２】配列番号：５ 配列の長さ：３１ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ ハイポセティカル配列：Ｎｏ アンチセンス：Ｙｅｓ 起源 生物名：ＨＩＶ 配列の特徴 特徴を表す記号：エクソン 存在位置：１．．３１ 配列 TCGTCGCTGT CTCCGCTTCT TCTTCCTGCC A
【０１０３】配列番号：６ 配列の長さ：３１ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ ハイポセティカル配列：Ｎｏ アンチセンス：Ｙｅｓ 起源 生物名：ＨＩＶ 配列の特徴 特徴を表す記号：エクソン 存在位置：１．．３１ 配列 CTGTCTCCGC TTCTTCTTCC TGCCATAGGA G
【０１０４】配列番号：７ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ ハイポセティカル配列：Ｎｏ アンチセンス：Ｙｅｓ 起源 生物名：ＨＳＶ−１ 配列の特徴 特徴を表す記号：エクソン 存在位置：１．．２０ 配列 GCGGGGCTCC ATGGGGGTCG
【０１０５】配列番号：８ 配列の長さ：１５ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ ハイポセティカル配列：Ｎｏ アンチセンス：Ｙｅｓ 起源 生物名：ヒト 配列の特徴 特徴を表す記号：エクソン 存在位置：１．．１５ 他の情報：ｎｏｔｅ＝ｃ−Ｈａ−ｒａｓ 配列 CAGCTGCAAC CCAGC
【０１０６】配列番号：９ 配列の長さ：２１ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ ハイポセティカル配列：Ｎｏ アンチセンス：Ｙｅｓ 起源 生物名：ヒト 配列の特徴 特徴を表す記号：エクソン 存在位置：１．．２１ 他の情報：ｎｏｔｅ＝ｃ−ｍｙｃ 配列 GGCTGCTGGA GCGGGGCACA C
【０１０７】配列番号：１０ 配列の長さ：１５ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ ハイポセティカル配列：Ｎｏ アンチセンス：Ｙｅｓ 起源 生物名：ヒト 配列の特徴 特徴を表す記号：エクソン 存在位置：１．．１５ 他の情報：ｎｏｔｅ＝ｃ−ｍｙｃ 配列 AACGTTGAGG GGCAT
【０１０８】配列番号：１１ 配列の長さ：１５ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ ハイポセティカル配列：Ｎｏ アンチセンス：Ｙｅｓ 起源 生物名：ヒト 配列の特徴 特徴を表す記号：エクソン 存在位置：１．．１５ 他の情報：ｎｏｔｅ＝ｃ−ｍｙｂ 配列 CACGTTGAGG GGCAT
【０１０９】配列番号：１２ 配列の長さ：１８ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ ハイポセティカル配列：Ｎｏ アンチセンス：Ｙｅｓ 起源 生物名：ヒト 配列の特徴 特徴を表す記号：エクソン 存在位置：１．．１８ 他の情報：ｎｏｔｅ＝ｃ−ｍｙｂ 配列 GTGCCGGGGT CTTCGGGC
【０１１０】配列番号：１３ 配列の長さ：１８ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ ハイポセティカル配列：Ｎｏ アンチセンス：Ｙｅｓ 起源 生物名：マウス 配列の特徴 特徴を表す記号：エクソン 存在位置：１．．１８ 他の情報：ｎｏｔｅ＝ｃ−ｍｙｂ 配列 GTGTCGGGGT CTCCGGGC
【０１１１】配列番号：１４ 配列の長さ：２１ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ ハイポセティカル配列：Ｎｏ アンチセンス：Ｙｅｓ 起源 生物名：ヒト 配列の特徴 特徴を表す記号：エクソン 存在位置：１．．２１ 他の情報：ｎｏｔｅ＝ｃ−ｆｏｓ 配列 GGAGAACATC ATGGTCGAAA G
【０１１２】配列番号：１５ 配列の長さ：２２ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ ハイポセティカル配列：Ｎｏ アンチセンス：Ｙｅｓ 起源 生物名：ヒト 配列の特徴 特徴を表す記号：エクソン 存在位置：１．．２２ 他の情報：ｎｏｔｅ＝ｃ−ｆｏｓ 配列 CCCGAGAACA TCATGGTCGA AG
【０１１３】配列番号：１６ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ ハイポセティカル配列：Ｎｏ アンチセンス：Ｙｅｓ 起源 生物名：ヒト 配列の特徴 特徴を表す記号：エクソン 存在位置：１．．２０ 他の情報：ｎｏｔｅ＝ｃ−ｆｏｓ 配列 GGGGAAAGCC CGGCAAGGGG
【０１１４】配列番号：１７ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ ハイポセティカル配列：Ｎｏ アンチセンス：Ｙｅｓ 起源 生物名：ヒト 配列の特徴 特徴を表す記号：エクソン 存在位置：１．．２０ 他の情報：ｎｏｔｅ＝ｐ−１２０ 配列 CACCCGCCTT GGCCTCCCAC
【０１１５】配列番号：１８ 配列の長さ：１８ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ ハイポセティカル配列：Ｎｏ アンチセンス：Ｙｅｓ 起源 生物名：ヒト 配列の特徴 特徴を表す記号：エクソン 存在位置：１．．１８ 他の情報：ｎｏｔｅ＝ＥＧＦ−レセプター 配列 GGGACTCCGG CGCAGCGC
【０１１６】配列番号：１９ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ ハイポセティカル配列：Ｎｏ アンチセンス：Ｙｅｓ 起源 生物名：ヒト 配列の特徴 特徴を表す記号：エクソン 存在位置：１．．２０ 他の情報：ｎｏｔｅ＝ＥＧＦ−レセプター 配列 GGCAAACTTT CTTTTCCTCC
【０１１７】配列番号：２０ 配列の長さ：１９ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ ハイポセティカル配列：Ｎｏ アンチセンス：Ｙｅｓ 起源 生物名：ヒト 配列の特徴 特徴を表す記号：エクソン 存在位置：１．．１９ 他の情報：ｎｏｔｅ＝ｐ５３腫瘍抑制剤 配列 GGGAAGGAGG AGGATGAGG
【０１１８】配列番号：２１ 配列の長さ：２１ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ ハイポセティカル配列：Ｎｏ アンチセンス：Ｙｅｓ 起源 生物名：ヒト 配列の特徴 特徴を表す記号：エクソン 存在位置：１．．２１ 他の情報：ｎｏｔｅ＝ｐ５３腫瘍抑制剤 配列 GGCAGTCATC CAGCTTCGGA G
【０１１９】配列番号：２２ 配列の長さ：１８ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ ハイポセティカル配列：Ｎｏ アンチセンス：Ｙｅｓ 起源 生物名：ヒト 配列の特徴 特徴を表す記号：エクソン 存在位置：１．．１８ 他の情報：ｎｏｔｅ＝ｃｄｃ２−カイネース 配列 GTCTTCCATA GTTACTCA
【０１２０】配列番号：２３ 配列の長さ：１８ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ ハイポセティカル配列：Ｎｏ アンチセンス：Ｙｅｓ 起源 生物名：ヒト 配列の特徴 特徴を表す記号：エクソン 存在位置：１．．１８ 他の情報：ｎｏｔｅ＝ＰＣＮＡ（増殖細胞核抗原） 配列 GATCAGGCGT GCCTCAAA
【０１２１】配列番号：２４ 配列の長さ：１８ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ ハイポセティカル配列：Ｎｏ アンチセンス：Ｙｅｓ 起源 生物名：ヒト 配列の特徴 特徴を表す記号：エクソン 存在位置：１．．１８ 他の情報：ｎｏｔｅ＝ＶＬＡ−４ 配列 GCAGTAAGCA TCCATATC
【０１２２】配列番号：２５ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ ハイポセティカル配列：Ｎｏ アンチセンス：Ｙｅｓ 起源 生物名：ヒト 配列の特徴 特徴を表す記号：エクソン 存在位置：１．．２０ 他の情報：ｎｏｔｅ＝ＩＣＡＭ 配列 CCCCCACCAC TTCCCCTCTC
【０１２３】配列番号：２６ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ ハイポセティカル配列：Ｎｏ アンチセンス：Ｙｅｓ 起源 生物名：ヒト 配列の特徴 特徴を表す記号：エクソン 存在位置：１．．２０ 他の情報：ｎｏｔｅ＝ＩＣＡＭ 配列 CTCCCCCACC ACTTCCCCTC
【０１２４】配列番号：２７ 配列の長さ：１９ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ ハイポセティカル配列：Ｎｏ アンチセンス：Ｙｅｓ 起源 生物名：ヒト 配列の特徴 特徴を表す記号：エクソン 存在位置：１．．１９ 他の情報：ｎｏｔｅ＝ＩＣＡＭ 配列 GCTGGGAGCC ATAGCGAGG
【０１２５】配列番号：２８ 配列の長さ：２１ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ ハイポセティカル配列：Ｎｏ アンチセンス：Ｙｅｓ 起源 生物名：ヒト 配列の特徴 特徴を表す記号：エクソン 存在位置：１．．２１ 他の情報：ｎｏｔｅ＝ＥＬＡＭ−１ 配列 ACTGCTGCCT CTTGTCTCAG G
【０１２６】配列番号：２９ 配列の長さ：２２ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ ハイポセティカル配列：Ｎｏ アンチセンス：Ｙｅｓ 起源 生物名：ヒト 配列の特徴 特徴を表す記号：エクソン 存在位置：１．．２２ 他の情報：ｎｏｔｅ＝ＥＬＡＭ−１ 配列 CAATCAATGA CTTCAAGAGT TC
【０１２７】配列番号：３０ 配列の長さ：１１ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ＤＮＡ ハイポセティカル配列：Ｙｅｓ アンチセンス：Ｙｅｓ 配列の特徴 特徴を表す記号：− 存在位置：１．．１１ 他の情報：ｎｏｔｅ＝Ｎ＝８−アザグアニン 配列 GTANAATTCT AG
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ０８Ｇ 79/04 ＮＵＰ Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｇ０１Ｎ 33/50 Ｔ Ｐ 33/566

Claims (17)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 下記式Ｉのオリゴヌクレオチドおよび生
    理学的に許容しうるその塩。 【化１】 〔式中、Ｒ1は水素、Ｃ1〜Ｃ18−アルキル、Ｃ2〜Ｃ18
    −アルケニル、Ｃ2〜Ｃ18−アルキニル、Ｃ2〜Ｃ18−ア
    ルキルカルボニル、Ｃ3〜Ｃ19−アルケニルカルボニ
    ル、Ｃ3〜Ｃ19−アルキニルカルボニル、（Ｃ6〜Ｃ14）
    −アリール−（Ｃ1〜Ｃ8）−アルキル、ヌクレオチド化
    学で慣用的な保護基、または下記式IIａ： 【化２】 の基であり、 Ｒ1aは水素、Ｃ1〜Ｃ18−アルキル、Ｃ2〜Ｃ18−アルケ
    ニル、Ｃ2〜Ｃ18−アルキニル、Ｃ2〜Ｃ18−アルキルカ
    ルボニル、Ｃ3〜Ｃ19−アルケニルカルボニル、Ｃ3〜Ｃ
    19−アルキニルカルボニル、（Ｃ6〜Ｃ14）−アリール
    −（Ｃ1〜Ｃ8）−アルキル、または下記式IIｂ： 【化３】 の基であり、 Ｒ2は水素、ヒドロキシル、Ｃ1〜Ｃ18−アルコキシ、Ｃ
    1〜Ｃ6−アルケニルオキシ、特にアリルオキシ、ハロゲ
    ン、アジドまたはＮＨ2であり；ａはオキシまたはメチ
    レンであり；ｎは３〜９９の整数であり；Ｗはオキソ、
    チオキソまたはセレノキソであり；Ｖはオキシ、スルフ
    ァンジイルまたはイミノであり；Ｙはオキシ、スルファ
    ンジイル、イミノまたはメチレンであり；Ｙ′はオキ
    シ、スルファンジイル、イミノ、(ＣＨ2)mまたはＶ(Ｃ
    Ｈ2)mであり、 ここで、ｍは１〜１８の整数であり；Ｘはヒドロキシル
    またはメルカプトであり；Ｕはヒドロキシル、メルカプ
    ト、ＳｅＨ、Ｃ1〜Ｃ18−アルコキシ、Ｃ1〜Ｃ18−アル
    キル、Ｃ6〜Ｃ20−アリール、（Ｃ6〜Ｃ14）−アリール
    −（Ｃ1〜Ｃ8）−アルキル、ＮＨＲ3、ＮＲ3Ｒ4または
    式III： (ＯＣＨ2ＣＨ2)pＯ(ＣＨ2)qＣＨ2Ｒ5 （III） の基であり、 ここで、Ｒ3はＣ1〜Ｃ18−アルキル、Ｃ6〜Ｃ20−アリ
    ール、（Ｃ6〜Ｃ14）−アリール−(Ｃ1〜Ｃ8）−アルキ
    ル、または２−(ＣＨ2)c−〔ＮＨ(ＣＨ2)c〕d−ＮＲ6Ｒ
    6、ここでｃは２〜６の整数であり、そしてｄは０〜６
    の整数であり、そして、Ｒ6はそれぞれ独立して、水素
    またはＣ1〜Ｃ6−アルキルまたはＣ1〜Ｃ4−アルコキシ
    −Ｃ1〜Ｃ6−アルキルであり；Ｒ4はＣ1〜Ｃ18−アルキ
    ル、Ｃ6〜Ｃ20−アリールまたは（Ｃ6〜Ｃ10）−アリー
    ル−（Ｃ1〜Ｃ8）−アルキルであるか、またはＮＲ3Ｒ4
    の場合はＲ3およびこれらが結合している窒素原子と一
    緒になって５〜６員のヘテロ環を形成し、これは更に
    Ｏ、ＳおよびＮから選択されるヘテロ原子を有すること
    ができ、 ｐは１〜１００の整数であり、 ｑは０〜２２の整数であり、 Ｒ5は水素または官能基、例えばヒドロキシル、アミ
    ノ、Ｃ1〜Ｃ18−アルキルアミノ、ＣＯＯＨ、ＣＯＮ
    Ｈ2、ＣＯＯ（Ｃ1〜Ｃ4）−アルキルまたはハロゲンで
    あり；ＺおよびＺ′は相互に独立して、ヒドロキシル、
    メルカプト、ＳｅＨ、Ｃ1〜Ｃ22−アルコキシ、−Ｏ−
    (ＣＨ2)b−ＮＲ6Ｒ7、ただしここでｂは１〜６の整数で
    あり、そしてＲ7はＣ1〜Ｃ6−アルキルであるか、また
    は、Ｒ6およびＲ7はそれらが結合している窒素原子と一
    緒になって３〜６員の環を形成するもの、Ｃ1〜Ｃ18−
    アルキル、Ｃ6〜Ｃ20−アリール、（Ｃ6〜Ｃ14）−アリ
    ール−（Ｃ1〜Ｃ8）−アルキル、（Ｃ6〜Ｃ14）−アリ
    ール−（Ｃ1〜Ｃ8）−アルコキシ、ただしここでアリー
    ルはヘテロアリールであってもよく、そしてアリールは
    場合によりカルボキシル、アミノ、ニトロ、Ｃ1〜Ｃ4−
    アルキルアミノ、Ｃ1〜Ｃ6−アルコキシ、ヒドロキシ
    ル、ハロゲンおよびシアノよりなる群から選択される同
    じかまたは異なる基１、２または３個で置換されている
    もの、Ｃ1〜Ｃ18−アルキルメルカプト、ＮＨＲ3、ＮＲ
    3Ｒ4、式IIIの基またはＤＮＡプローブの細胞内取り込
    みを促進するか、またはその標識として作用する基、ま
    たはオリゴヌクレオチド類縁体が標的核酸にハイブリッ
    ド化する場合は、これを結合、交叉結合または分解によ
    り攻撃する基であり、そして、曲線の括弧はＲ2と隣接
    するホスホリル基が２′および３′位、あるいは逆に
    ３′および２′位の何れかに位置することを指し、ここ
    で各ヌクレオチドはＤまたはＬ型で存在し、そして塩基
    Ｂはαまたはβ位に位置し、そしてＢは相互に独立して
    ヌクレオチド化学で慣用的な塩基、例えば天然の塩基、
    例えばアデニン、シトシン、チミン、グアニン、ウラシ
    ルまたはヒポキサンチン、または非天然の塩基、例えば
    プリン、８−アザプリン、２,６−ジアミノプリン、７
    −デアザアデニン、７−デアザグアニン、Ｎ4Ｎ4−エタ
    ンシトシン、Ｎ6Ｎ6−エタノ−２,６−ジアミノプリ
    ン、シュードイソチトシン、５−メチルシトシン、５−
    フルオロウラシル、５−（Ｃ3〜Ｃ6）−アルキニルウラ
    シル、５−（Ｃ 3〜Ｃ6）−アルキニルシトシン、または
    そのプロドラッグ形態であり、ここで少くとも１つのＢ
    は下記式IV： 【化４】 ｛式中ＥおよびＦは相互に独立してＨ、ＯＨまたはＮＨ
    2である｝の塩基である〕。
  2. 【請求項２】 塩基Ｂがβ位にあり、ヌクレオチドがＤ
    型であり、Ｒ2が２′位にあり、そしてａがオキシであ
    る請求項１記載のオリゴヌクレオチド。
  3. 【請求項３】 Ｒ1が水素、Ｃ1〜Ｃ6−アルキル、特に
    メチルまたは式IIａの基であり；Ｒ1aが水素、Ｃ1〜Ｃ6
    −アルキル、特にメチルまたは式IIｂの基であり；Ｒ2
    が水素、Ｃ1〜Ｃ6−アルコキシ、Ｃ1〜Ｃ6−アルケニル
    オキシ、特にアリルオキシ、またはヒドロキシル、特に
    水素であり；ｎは４〜３９、特に５〜２９の整数であ
    り；ｍは１〜６の整数、特に１であり；Ｕはヒドロキシ
    ル、メルカプト、Ｃ1〜Ｃ6−アルコキシ、Ｃ1〜Ｃ6−ア
    ルキル、ＮＲ3Ｒ4またはＮＨＲ3、特にヒドロキシルま
    たはＣ1〜Ｃ6−アルキルであり、 ここで、Ｒ3はＣ1〜Ｃ8−アルキル、好ましくはＣ1〜Ｃ
    4−アルキル、またはメトキシエチルであり、そして、 Ｂ、Ｗ、Ｖ、Ｙ、Ｙ′、ＸおよびＺは請求項１に記載し
    た意味を有する、請求項１または２記載のオリゴヌクレ
    オチド。
  4. 【請求項４】 Ｖ、ＹおよびＹ′がオキシ、スルファン
    ジイルまたはイミノを表わす請求項１、２または３のい
    ずれか１項記載のオリゴヌクレオチド。
  5. 【請求項５】 Ｗがオキソまたはチオキソを表わす請求
    項１〜４のいずれか１項記載のオリゴヌクレオチド。
  6. 【請求項６】 Ｕがヒドロキシル、メチルまたはメルカ
    プトを表わす請求項１〜５のいずれか１項記載のオリゴ
    ヌクレオチド。
  7. 【請求項７】 Ｒ1および／またはＲ1aが水素である請
    求項１〜６のいずれか１項記載のオリゴヌクレオチド。
  8. 【請求項８】 ヌクレオチドが、ヌクレオチド塩基を含
    んでいる各場合に、適切に誘導体化された支持体または
    成長中のオリゴマー鎖に１回縮合されている、請求項１
    〜７のいずれか１項記載の式Ｉのオリゴヌクレオチドお
    よび生理学的に許容しうるその塩の調製方法。
  9. 【請求項９】 薬剤または診断薬を調製するための請求
    項１〜７のいずれか１項記載のオリゴヌクレオチドの使
    用。
  10. 【請求項１０】 請求項１〜７に記載のオリゴヌクレオ
    チドの少なくとも１つを生理学的に許容しうる賦形剤お
    よび更に適切には適当な添加剤および／または補助物質
    と混合する薬剤または診断薬の調製方法。
  11. 【請求項１１】 請求項１〜７に記載の化合物の１つ以
    上を適切には生理学的に許容しうる賦形剤および／また
    は補助物質とともに含有する薬剤または診断薬。
  12. 【請求項１２】 下記式Ｖ： 【化５】 〔式中Ｖはオキシ、スルファンジイルまたはイミノであ
    り；Ｙbはオキシ、スルファンジイルまたはメチレンで
    あり；ａはオキシまたはメチレンであり；Ｒ2bは水素、
    ＯＲ12、Ｃ1〜Ｃ18−アルコキシ、Ｃ1〜Ｃ6−アルケニ
    ルオキシ、特にアリルオキシ、ハロゲン、アジドまたは
    ＮＲ10Ｒ11であり；Ｒ1はヌクレオチド化学で慣用的な
    保護基であり；Ｒ1bは下記式IIｃまたはIIｄ： 【化６】 ｛式中ＵはＯ−Ｒ7またはＳ−Ｒ7であり；Ｑは基−ＮＲ
    8Ｒ9であり；Ｒ7は−(ＣＨ2)2−ＣＮであり；Ｒ8および
    Ｒ9は同じかまたは異なっていてＣ1〜Ｃ6−アルキル、
    特にイソプロピルまたはエチルであるか、または、それ
    らが結合している窒素原子と一緒になって５〜９−員の
    ヘテロ環を形成し、これは更に、Ｏ、ＳおよびＮから選
    択されるヘテロ原子を含んでおり、特に、 【化７】 である｝の基であり；Ｅ′およびＦ′は相互に独立し
    て、Ｈ、ＯＨまたはＮＲ10Ｒ11であり；Ｒ10およびＲ11
    は同じかまたは異なっていて水素またはヌクレオチド化
    学で慣用的なアミノ保護基であるか、または、Ｒ10とＲ
    11は一緒になってヌクレオチド化学で慣用的なアミノ保
    護基を形成し、 Ｒ12はヌクレオチド化学で慣用的なヒドロキシル保護
    基、例えば、ｔ−ブチルジメチルシリル、トリイソプロ
    ピルシリル、ｏ−ニトロベンジル、ｐ−ニトロベンジ
    ル、トリス（１−メチルエチル）シリルまたは２−フル
    オロフェニル−４−メトキシピペリジン−４−イル（Ｆ
    ＰＭＰ）であり、 そして、曲線の括弧はＲ2と隣接するホスホリル基が
    ２′および３′位、あるいは逆に３′および２′位の何
    れかに位置することを示す〕のヌクレオチド単量体。
  13. 【請求項１３】 式Ｖの相当するヌクレオチド単量体が
    適切なアミノ保護基またはヒドロキシル保護基の導入の
    後、相当するホスホネート誘導体またはホスホアミダイ
    ト誘導体に変換される、請求項１２に記載の式Ｖのヌク
    レオチド単量体の調製方法。
  14. 【請求項１４】 その標的核酸と安定なハイブリッドを
    形成するオリゴヌクレオチドの調製のための請求項１２
    に記載のヌクレオチド単量体の使用。
  15. 【請求項１５】 下記式VI： 【化８】 〔式中、相互に独立して、Ｕ′＝Ｕ″＝Ｕ′′′はヒド
    ロキシルまたはメルカプトであり；ｅおよびｆは０また
    は１であり；Ｒ13は水素またはＯＨであり、そして、 ＥおよびＦはＨ、ＯＨまたはＮＨ2である〕の化合物、
    ただし、Ｕ′、Ｕ″、Ｕ′′′、Ｒ13およびＦがＯＨで
    あり、 ＥがＮＨ2であり、そしてｅおよびｆが１である式VIの
    化合物は除外する。
  16. 【請求項１６】 分子生物学における手段としての請求
    項１５に記載の式VIのヌクレオチド単量体の使用。
  17. 【請求項１７】 分子生物学における手段としての請求
    項１〜７のいずれか１項記載の式Ｉのオリゴヌクレオチ
    ドの使用。
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