WO2005030960A1

WO2005030960A1 - ステイプル型オリゴヌクレオチドおよびそれからなる医薬

Info

Publication number: WO2005030960A1
Application number: PCT/JP2004/014694
Authority: WO
Inventors: Yasuo Kunugiza; Naruya Tomita; Hideo Hashimoto; Hideki Yoshikawa; Ryuichi Morishita
Original assignee: Anges Mg, Inc.
Priority date: 2003-09-30
Filing date: 2004-09-29
Publication date: 2005-04-07
Also published as: EP1669450B1; AU2004276684A1; CN1860228A; JPWO2005030960A1; EP1669450A4; US20060276421A1; US7595301B2; CA2538215A1; EP1669450A1; CN1860228B; ATE532865T1

Abstract

本発明は、従来型のオリゴヌクレオチドは両端が開放になっているために不安定であること、ホスホロチオエート化(S化)修飾により分解酵素に対する安定性高めることも行われているがホスホロチオエートに起因する毒性が生じることなどの問題点を改善したオリゴヌクレオチドと医薬を提供する。詳しくは、ステイプル型オリゴヌクレオチドおよびそれを有効成分とする医薬。具体的には転写因子阻害剤、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはsiRNAであり、より具体的には炎症、自己免疫疾患、中枢性疾患、虚血性疾患の再潅流障害、臓器移植又は臓器の手術後の予後の悪化またはPTCA後の再狭窄の予防・治療・改善剤であり、さらに具体的には関節炎、皮膚炎、腎炎、肝炎、腎不全、膀胱炎、前立腺炎、尿道炎、潰瘍性大腸炎またはクローン病、慢性関節リウマチまたは変形性関節症、アトピー性皮膚炎、接触性皮膚炎、乾癬、皮膚潰瘍または褥瘡の予防・治療・改善剤である。

Description

明細書スティプノレ型ォリゴヌクレオチドぉよびそれからなる医薬皮術分野

本発明は、新規なスティプル型ォリゴヌクレオチド、およびそれを有効成分とする医薬に関する。従来技術

従来ォリゴヌクレオチドは、転写因子阻害剤、ァンチセンスオリゴヌクレオヂド、 siRNAなどとして広く利用されてきた。

これらの中でも、例えば転写因子阻害剤として具体的には、遺伝子発現を調整する転写因子の活性を特異的に阻害する分子おとり（デコイオリゴヌクレオチド、以下デコイ）型核酸を挙げることができる。 .

ここで転写とは、生体内の遺伝情報が発現する際、 DNAを鍚型にしてメッセンジャー RNAを合成する過程を指し、転写によって作られたメッセンジャー R A O情報をもとにタンパク質が合成される。この転写を調整する因子を転写調節 H子と呼んでいる。

具体的には、 NF- ic B、 STAT- 1、 STAT- 2、 STAT- 3、 STAT_4、 STAT-5、 STAT - β、 GATA- 3、 AP- 1、 E2F、 Ets、 CREなど 54種類が知られている。

アンチセンスとして具体的には、目的の遺伝子と対合する配列を持ち、その遺伝子の発現を抑止する医薬を挙げることができる。

siRNAとして具体的には、 RNA干渉（RNA interference； RNAi)によって、標的遺伝子の発現阻害する医薬を挙げることができる。

またこれらのオリゴヌクレオチドは、構造上、二本鎖を構成していることが特徴である。

本発明の背景となる先行文献は、 Biochem Biophys Res Commun. 2003 Sep 5 ; 308 (4) : 689-97、 Gene Ther. 2002 Dec ;9 (24) : 1682- 92および Circ Res. 2002 Jun 28；90 (12) : 1325-32 である。発明の開示

本発明において解決しょうとする問題点は、従来型のオリゴヌクレオチドは両端が開放 (open)になっているために不安定であること、またホスホロチェート化（Sィ匕）修飾によりェキソヌクレアーゼ（exonuclease)等の分解酵素に対する安定性を高めることも行われているが、ホスホロチォエートに起因する毒性が生じることである。

本発明は、具体的には下記の物質およぴ医薬である。

(1) 一本鎖オリゴヌクレオチドであって、 5'端配列が中間部配列に逆向きの相ネ甫性を有し、 3'端配列も中間部配列に逆向きの相補性を有し、中間部の両端に分子内で相補的な結合を形成しない 3〜10の塩基配列からなるループ部を有するスティプノレ型ォリゴヌクレオチド。

(2) 一本鎖オリゴヌクレオチドが ³0〜⁷0塩基長である、（1)記載のスティプル型ォリゴヌクレオチド。

(3) 一本鎖オリゴヌクレオチドが 34〜64塩基長である、（1)ないし（2)記载のスティプノレ型ォリゴヌクレオチド。

(4) 一本鎖オリゴヌクレオチドが 38〜58塩基長である、（1)ないし（3)記載のスティプル型ォリゴヌクレオチド。 .

(5) 一本鎖オリゴヌクレオチドが 42〜54塩基長である、（1)ないし（4)記载のスティプノレ型ォリゴヌクレオチド。

(6) ループ部が、 4〜6塩基長である（1)ないし（5)記載のスティプル型オリゴヌクレオチド。

(7) 一本鎖ォリゴヌクレオチドが 4²〜54塩基長であり、ループ部が 4〜6 基長である、（1)ないし（6)記載のスティプル型オリゴヌクレオチド。

(8) オリゴヌクレオチドが DNAまたは DNA誘導体である、（1)ないし (7)記のスティプノレ型ォリゴヌクレオチド。

(9) リン酸基がホスホロチォエート化されていないことを特徴とする、（1)ないし（8)記載のスティプル型オリゴヌクレオチド。

(10) 配列表の配列番号 1ないし 3で表されるオリゴデォキシヌクレオチドから選ばれた 1種である、（1)ないし（9)記載のスティプル型オリゴヌクレオチド。

(11) (1)ないし（10)記載のスティプル型ォリゴヌクレオチドからなる医薬。

(12) 医薬が転写因子阻害剤、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたは siR A である（11)記載の医薬。

(13) 転写因子阻害剤が拮抗的阻害剤である、（12)記載の医薬。

(14) 転写因子が、 NF - κ Β、 STAT- 1、 STAT_2、 STAT- 3、 STAT- 4、 STAT- 5、 STAT- 6、 GATA-3、 AP-1、 E2F、 Etsおよび CREから選ばれた 1種である、 (12)または (13)記載の医薬。

(15) 医薬が、炎症、アレルギー性疾患、自己免疫疾患、中枢性疾患、虑血性疾患の再灌流障害、臓器移植又は臓器の手術後の予後の悪化または経皮的冠動ル I形成卞了 (percutaneous transluminal coronary angiop丄 astyS PTCA)後の冉狭窄の予防 ·治療 ·改善剤である、（12)ないし（14)記載の医薬。.

(16) 炎症が、関節炎、皮膚炎、腎炎、肝炎、腎不全、膀胱炎、前立腺:^、尿道炎、潰瘍性大腸炎またはクローン病である、（12)ないし（15)記載の医薬。

(17) 関節炎が、慢 1"生関節リウマチまたは変形性関節症である、（16)記载の医

(18) 皮膚炎が、アトピー性皮膚炎、接触性皮膚炎、乾癬、皮膚潰瘍または褥瘡である、（16)記載の医薬。

(19) (1)ないし (10)のいずれかに記載したスティプル型ォリゴヌクレチドを転写因子阻害剤、アンチセンスまたは siRNAの製造のために用いる用途。

(20) (1)ないし（10)のいずれかに記載したスティプル型ォリゴヌタレ才チドの薬理学上有効量を患者に投与することにより、転写因子阻害剤、アンチセンスまたは siRNAが有効な疾患を予防 ·治療 ·改善する方法。

本発明におけるスティプル型オリゴヌクレオチドは一本鎖であって、 5'端配列が中間部配列に逆向きの相補性を有し、 3'端配列も中間部配列に逆向きの相補性を有し、中間部の両端に分子内で相補的な結合を形成しない 3〜10の塩基配列からなるループ部を有するスティプル型構造 (押圧後のホッチキス針の形状）を有しており、具体的には例えば、下記化学式のような構造を有する。

A A A GGAGGGAAATCCCTTCAAGG A S^E。- ¹ A CCTCCCTTTA pGGAAGTTCC A

A A

C A

CAGGAGGGAAATCCCTTCAAGG

SEQ. 2

GGTCCTCCCTTTA [GGGAAGTTCC A

A A

SEQ 3 AAAGGGAAATCCCTTCAAGA T

T TTTCCCTTTAI GGGAAGTTCT T

T ' T

式中、縦線は非結合部 [5'端および 3'端]を意味する。

またその鎖長は限定されないが、通常は 30〜70塩基長であり、好ましくは 34〜64塩基長であり、より好ましくは 38〜58塩基長であり、さらに好ましくは 42〜54塩基長である。

次にループ部は 3〜10塩基長であり、好ましくは 4〜6塩基長である。

さらに 5'端および 3'端の折り返し部配列（5'端または 3'端からループ部までの相補性を有する配列）の鎖長も限定されないが、通常は 4〜20塩基長であり好ましくは 6〜18塩基長であり、より好ましくは 8〜16塩基長である。

なお 5'端おょぴ 3'端の折り返し部配列の鎖長は、同一（対称形）であっても異なって（非対称形)いてもよい。

さらに本発明におけるオリゴヌクレオチドは限定されず、 DNA、 DNA誘導体、 RNAあるいは RNA誘導体であってもよいが、 DNAまたは DNA誘導体がより好ましい。

本発明におけるスティプル型オリゴヌクレオチドの具体例としては、例えば配列表の配列番号 1ないし 3で表されるオリゴデォキシヌクレオチドを挙げることができる。なお本発明にかかるスティプノレ型オリゴヌクレオチドは、常法に従い、 DNA 合成機などで目的とする一本鎖配列を合成した後、溶媒中で加温することにつて得ることができる。

また本発明におけるホスホロチォエートとは、リン酸基中の酸素原子が一 13 または全部、硫黄原子で置換された構造を意味する。

本発明におけるスティプル型オリゴヌクレオチドの医薬用途は限定されなレ、が、具体的には、例えば転写因子阻害剤、アンチセンスオリゴヌクレオチド、 siRNA等であり、より具体的には、例えば炎症、自己免疫疾患、中枢性疾患、虚血性疾患の再灌流障害、臓器移植又は臓器の手術後の予後の悪化、 PTCA後の再狭窄等の予防 ·治療 ·改善剤である。

ここで炎症としてさらに具体的には、例えば関節炎、皮膚炎、腎炎、肝炎、腎不全、膀胱炎、前立腺炎、尿道炎、潰瘍性大腸炎、クローン病等を挙げることができる。

次に関節炎としてさらに具体的には、例えば慢性関節リウマチ (RA)、変形十生関節症 (OA)等を挙げることができる。

続いて皮膚炎としてさらに具体的には、例えばアトピー性皮膚炎、接触†生皮膚炎、乾癬、皮膚潰瘍、褥瘡等を挙げることができる。

本発明におけるスティプル型オリゴヌクレオチドの投与量あるいは投与経路も、疾患の種類 ·程度、症状、患者の年齢、性別、合併症、併用薬等によって異なり限定されないが、通常 1回あたり ΙΟ g〜：0gを、好ましくは 100 /z g 5gを、より好ましくは lmg〜lgを、経皮、皮下、関節内、筋肉内、静脈内または経口投与する。

なお本発明とは別に、例えば W003/091432号公報等に開示された環状デコイ (リボン型デコィ）もあるが、本発明にかかるスティプル型は開環部を有しており、構造的に全く異なる。

本発明の実施により、従来型オリゴヌクレオチドが有する不安定性が改善され、投与量低減が可能となり、また安全性も向上させることができる。図面の簡単な説明

図 1は、 LPS刺激 24時間後の、培養上清中の IL- 1 β量を示した図である。図 2は、 LPS刺激 24時間後の、滑膜上清中の IL- 1 量を示した図である。図 3は、スティプル型デコイの安定性を示した電気泳動図である。実施例

以下に、実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明がこれらに限定されないことは言うまでもない。

実施例 1

スティプル型オリゴヌクレオチドの抗炎症効果の検討

Α. サイトカインの定量

1. 滑膜組織の処理

(1) 手術時に採取した関節リゥマチ患者の滑膜組織をホモジナイズ

(homogenize)した後、 lOOmgずつ 24wel l plateに播いた。（無血清培地 [serum rree medium] 500 l, weilJ

NF - κ B アコィ、 Scrambl e テコィのトランスフエクシヨン (transfection) (HVJ envelope法） .

(2) HVJ 1. 1 X 10⁴ HAU/1. 1 ml BSS [Balanced Salt Solution (137mM NaCl, 5. 4raM KC1, lOmM Tri s-HCl, pH7. 6]の状態で 99mJん m²で UV処理した。 .

(3) lmlずつ 1. 5mlチューブに分注し、 4°C, 15000rpm， 15min遠心処理した。

(4) 200 gのデコイに BSSを添カ卩し 92 At 1とした。

(5) 3% TritonX-100/ΤΕ Buffer溶液 8 μ 1を添加した。

(6) 4°C， 15000rpra, 15min遠心後上清除去した。

(7) BSS lmlを加えて混合後 15000rpm, 15min遠心分離した。

(8) 上清除去後 200 μ 1の PBSに懸濁した。

(9) 15 / Μになるようにデコイ- HVJ envelope混合体を滑膜組織に加えて 37°C の C0₂ィンキュベータ一で 30分ィンキュベートした。

加えたデコイの配列二重鎖 NF- κ Βデコイ

5' -CCTTGAAGGGATTTCCCTCC-3 ' /5' -GGAGGGAAATCCCTTCAAGG-3 ' (二本鎖） Scramble アコィ

5， -CATGTCGTCACTGCGCTCAT-3 ' /5' - ATGAGCGCAGTGACGACATG- 3，（二本鎖）スティプル型オリゴヌクレオチド（i)

5' -ATTTCCCTCCAAAAGGAGGGAAATCCCTTCAAGGAAAACCTTGAAGGG-3' (1ケ所で ligation

リボン型オリゴヌクレオチド（ii)

5' -ATTTCCCTCCAAAAGGAGGGAAATCCCTTCAAGGAAAACCTTGAAGGG-3' (2ケ所で ligation)

2. LPS刺激

(10) デコイ- HVJ envelope混合体を除去し 10%FBS入り培養液 (medium) 500 1 を加えて 0. 01 μ g/mlとなるように LPSを添加した。

3. 培養液、滑膜組織回収、 IL - 1 β測定 .

(11) 24時間後に培養液及び滑膜組織を回収。滑膜組織に PBS 500 μ 1を加えてホモシナイサー (homogenizer)でホモンナイス (homogenize;し 7こ。

5000rpm, lOmin遠心後上清を採取した。 IL- 1 β測定まで- 20°Cで保存した。

(12) 培養上清、滑膜上清を IL- l j3 ELISAキット（END0GEN社、カタログ No.： EH21L1B) で測定した。 .

4. 結果培養上清中の IL- l i3量（pgZml) (図 1参照）

NT (LPSO) 90. 8 NT (LPS0. 01) 303. 9

SC (LPSO) 49. 6 SC (LPS0. 01) 370. 7

NF (LPSO) 102. 1 NF (LPS0. 01) 312. 6

Rl (LPS0) 14. 6 Rl (LPS0. 01) 25. 1

R2 (LPS0) 22. 9 R2 (LPSO. 01) 74. 3 滑膜上清中の IL- 1 量（pg/ml) (図 2参照）

NT(LPSO) 17.5 NT(LPS0.01) 170.9

SC(LPSO) 7.2 SC(LPS0.01) 145.7

NF(LPSO) 10.5 NF(LPS0.01) 484.8

Rl(LPSO) 13.5 Rl (LPSO.01) 38.9

R2 (LPSO) 15.6 R2 (LPSO.01) 111.2

NT：未処置群

SC： scramble デコイ投与群

NF： NF κ B デコイ投与群

R1：スティプル型オリゴヌクレオチド（ligationlか所）

R2：リボン型オリゴヌクレオチド（ligation2か所）

スティプル型オリゴヌクレオチド作用群において培養上清、滑膜上清中の IL-1 βの産出を抑えていた。 1ケ所ライゲーション（ligation)したスティブノレ型ォリゴヌクレオチドの方が抑制効果は強かつた。（二重鎖 NF κ B作用群で今回の実験では抑制効果が弱かった。）

上記サイトカイン定量の全体の流れを下記に示す。

方法 RA患者の培養滑膜組織

Decoyを jfransfection (ETVJ envelope)去)

①

ELISA(IL-1 β一) 実施例 2

B . リボン型デコィの安定性試験（図 3参照）

目的：関節液 (原液）中でのデコイの耐性比較

配列、実験条件：

1) S化二重鎖デコイ

2) S化スティプル型デコイ

3) 非 S化スティプル型デコイ (S化なし）

4) 一本鎖デコイ（スティプル型ォリゴヌクレオチドの ligationする前の段階）

5) 断端 S化一本鎖デコイ（スティプル型オリゴヌクレオチドの ligationする前の段階、両断端のみ S化したもの）

それぞれに関節液 (原液）を 0°ん 50%または 100%加え、安定性を電気泳動にて比較した。

結果：関節液中で 1) S化二重鎖デコイ、 2) S化スティプル型デコイと 5)断 S化一本鎖デコイは安定、 3) 非 S化スティプル型デコイはほ.ぼ安定、 4) 一本鎖デコイは分解されていた。

詳しくは、 1) S化二重鎖デコイ、 2) S化スティプル型デコイは、共に 100%関節液中においても 0% (無添加）と同様に安定であった。

また 3)非 S化スティプル型デコイでは、関節液濃度依存的にデコイの安定†生は減少したものの、 100%関節液中においても、十分に検出可能な安定なデコイが存在した。

一方、 4)断端 S化一本鎖デコイと 5)—本鎖デコイは、 1)〜3)と比較して関節液中での安定性は低かった。

しかし 4)断端 S化一本鎖デコイと 5)—本鎖デコイを比較すると、 4)断端 S 化一本鎖デコイでは 100%関節液中においても、安定なデコイがわずかに認められたが、 5)—本鎖デコイでは 50%関節液中でも安定なデコイは認められなかつた。

Claims

請求の範囲

1 . 一本鎖オリゴヌクレオチドであって、 5'端配列が中間配列に逆向きの相補性を有し、 3'端配列も中間部配列に逆向きの相補性を有し、中間部の両端に分子内で相補的な結合を形成しない 3〜 1 0の塩基配列からなるループ部を有するスティプル型ォリゴヌクレオチド。

2 . 一本鎖ォリゴヌクレオチドが 30〜70塩基長である、請求項 1記載のスティプル型ォリゴヌクレオチド。

3 . 一本鎖オリゴヌクレオチドが 34〜64塩基長である、請求項 1または 2 記載のスティプル型ォリゴヌクレオチド。

4 . 一本鎖オリゴヌクレオチドが 38〜58塩基長である、請求項 1ないし 3 のいずれかに記載のスティプル型オリゴヌクレオチド。

5 . 一本鎖ォリゴヌクレオチドが 42〜54塩基長である、請求項 1ないし 4 のいずれかに記載のスティプル型オリゴヌクレオチド。

6 . ループ部が、 4〜6塩基長である請求項 1ないし 5のいずれかに記載のスティプノレ型ォリゴヌクレオチド。

7 . 一本鎖ォリゴヌクレオチドが 42〜54塩基長であり、 /レープ部が 4〜6塩基長である、請求項 1ないし 6のいずれかに記載のスティブノレ型オリゴヌタレォチド。 .

8 . オリゴヌクレオチドが DNAまたは DNA誘導体である、請求項 1ないし 7 のいずれかに記載のスティプル型オリゴヌクレオチド。

9 . リン酸基がホスホロチォエート化されていないことを特徴とする、請求項 1ないし 8のいずれかに記載のスティプル型オリゴヌクレオチド。

1 0 . 配列表の配列番号 1ないし 3、または下記構造式で表されるオリゴデォキシヌクレオチドから選ばれた 1種である、請求項 1ないし 9のいずれかに記載のスティプル型ォリゴヌクレオチド。 A A

GGAGGGAAATCCCTTCAAGG A

SEQ.1 A

A Λ CCTCCCTTTAI IGGGAAGTTCC A

A Λ

C A

SEQ.2 CAGGAGGGAAATCCCTTCAAGG

GGTCCTCCCTTTA IGGGAAGTTCC A

A A

SEQ.3 AAAGGGAAATCCCTTCAAGA

TTTCCCTTTA] GGGAAGTTCT 式中、縦線は非結合部 [5'端および 3'端]を意味する。

1 1 . 請求項 1ないし 1 0のいずれかに記載のスティプル型オリゴヌクレオチドからなる医薬。

1 2 . 医薬が転写因子阻害剤、アンチセンスまた fま siRNAである請求項 1 1 に記載の医薬。

1 3 . 転写因子阻害剤が拮抗的阻害剤である、請求項 1 2記載の医薬。

1 4 . 転写因子が、 NF- κ Β、 STAT- 1、 STAT- 2、 STAT- 3、 STAT-4、 STAT- 5、 STAT- 6、 GATA- 3、 AP- 1、 E2F、 Etsおよび CREから選ばれた 1種である、請求項 1 2または 1 3記載の医薬。 .

1 5 . 医薬が、炎症、アレルギー性疾患、自己免疫疾患、中枢性疾患、虚血性疾患の再灌流障害、臓器移植又は臓器の手術後の予後の悪化または経皮的冠動脈形成術 (percutaneous transluminal coronary angioplasty*, PTCA)後の再狭窄の予防 ·治療 ·改善剤である、請求項 1 2ないし 1 4のいずれかに記載の

1 6 . 炎症が、関節炎、皮膚炎、腎炎、肝炎、腎不全、膀胱炎、前立腺炎、尿道炎、潰瘍性大腸炎またはクローン病である、請求項 1 2ないし 1 5のいずれかに記載の医薬。

1 7 . 関節炎が、慢性関節リゥマチまたは変形性関節症である、請求項 1 6

1 8 . 皮膚炎が、アトピー性皮膚炎、接触†生皮膚炎、乾癬、皮膚潰瘍または褥瘡である、請求項 1 6記載の医薬。

1 9 . 請求項 1ないし 1 0のいずれかに記載したスティプル型オリゴヌクレォチドを転写因子阻害剤、アンチセンスまた ίま siRNAの製造のために用いる用途。

2 0 . 請求項 1ないし 1 0のいずれかに記載したスティプル型オリゴヌタレォチドの薬理学上有効量を患者に投与することにより、転写因子阻害剤、アンチセンスまたは siRNAが有効な疾患を予防 · '/台療 .改善する方法。