JP2012130342A - 遺伝子発現制御のための一本鎖核酸分子 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】 標的遺伝子の発現を抑制する発現抑制配列を含む一本鎖核酸分子であって、5’側から3’側にかけて、5’側領域(Xc)、内部領域(Z)および3’側領域(Yc)を、前記順序で含み、前記内部領域(Z)が、内部5’側領域(X)および内部3’側領域(Y)が連結して構成され、前記5’側領域(Xc)が、前記内部5’側領域(X)と相補的であり、前記3’側領域(Yc)が、前記内部3’側領域(Y)と相補的であり、前記内部領域(Z)、前記5’側領域および前記3’側領域の少なくともいずれかが、前記発現抑制配列を含むことを特徴とする分子とする。この一本鎖核酸分子によれば、前記標的遺伝子の発現を抑制できる。
【選択図】図1
Description
5’側から3’側にかけて、5’側領域(Xc)、内部領域(Z)および3’側領域(Yc)を、前記順序で含み、
前記内部領域(Z)が、内部5’側領域(X)および内部3’側領域(Y)が連結して構成され、
前記5’側領域(Xc)が、前記内部5’側領域(X)と相補的であり、
前記3’側領域(Yc)が、前記内部3’側領域(Y)と相補的であり、
前記内部領域(Z)、前記5’側領域(Xc)および前記3’側領域(Yc)の少なくとも一つが、前記発現抑制配列を含むことを特徴とする。
本発明の一本鎖核酸分子は、前述のように、標的遺伝子の発現を抑制する発現抑制配列を含む一本鎖核酸分子であって、
5’側から3’側にかけて、5’側領域(Xc)、内部領域(Z)および3’側領域(Yc)を、前記順序で含み、
前記内部領域(Z)が、内部5’側領域(X)および内部3’側領域(Y)が連結して構成され、
前記5’側領域(Xc)が、前記内部5’側領域(X)と相補的であり、
前記3’側領域(Yc)が、前記内部3’側領域(Y)と相補的であり、
前記内部領域(Z)、前記5’側領域(Xc)および前記3’側領域(Yc)の少なくとも一つが、前記発現抑制配列を含むことを特徴とする。
5’-GUUGUCAUACUUCUCAUGG-3’(配列番号1)
5’-AAAGUCAAUGUACAGCUGCUU-3’(配列番号16)
5’-AUUGUAACGAGACAAACAC-3’(配列番号5)
5’-UUGCGCUUUUUGGUGACGC-3’(配列番号6)
Z=X+Y ・・・(1)
Z≧Xc+Yc ・・・(2)
X=Y ・・・(19)
X<Y ・・・(20)
X>Y ・・・(21)
(a)下記式(3)および(4)の条件を満たす。
X>Xc ・・・(3)
Y=Yc ・・・(4)
(b)下記式(5)および(6)の条件を満たす。
X=Xc ・・・(5)
Y>Yc ・・・(6)
(c)下記式(7)および(8)の条件を満たす。
X>Xc ・・・(7)
Y>Yc ・・・(8)
(d)下記式(9)および(10)の条件を満たす。
X=Xc ・・・(9)
Y=Yc ・・・(10)
(a)下記式(11)および(12)の条件を満たす。
X−Xc=1〜10、好ましくは1、2、3または4、
より好ましくは1、2または3 ・・・(11)
Y−Yc=0 ・・・(12)
(b)下記式(13)および(14)の条件を満たす。
X−Xc=0 ・・・(13)
Y−Yc=1〜10、好ましくは1、2、3または4、
より好ましくは1、2または3 ・・・(14)
(c)下記式(15)および(16)の条件を満たす。
X−Xc=1〜10、好ましくは、1、2または3、
より好ましくは1または2 ・・・(15)
Y−Yc=1〜10、好ましくは、1、2または3、
より好ましくは1または2 ・・・(16)
(d)下記式(17)および(18)の条件を満たす。
X−Xc=0 ・・・(17)
Y−Yc=0 ・・・(18)
(1)非修飾ヌクレオチド残基
(2)修飾ヌクレオチド残基
(3)非修飾ヌクレオチド残基および修飾ヌクレオチド残基
(1)非修飾ヌクレオチド残基
(2)修飾ヌクレオチド残基
(3)非修飾ヌクレオチド残基および修飾ヌクレオチド残基
(4)非ヌクレオチド残基
(5)非ヌクレオチド残基および非修飾ヌクレオチド残基
(6)非ヌクレオチド残基および修飾ヌクレオチド残基
(7)非ヌクレオチド残基、非修飾ヌクレオチド残基および修飾ヌクレオチド残基
前記ヌクレオチド残基は、例えば、構成要素として、糖、塩基およびリン酸を含む。前記ヌクレオチド残基は、前述のように、例えば、リボヌクレオチド残基およびデオキシリボヌクレオチド残基があげられる。前記リボヌクレオチド残基は、例えば、糖としてリボース残基を有し、塩基として、アデニン(A)、グアニン(G)、シトシン(C)およびU(ウラシル)を有し、前記デオキシリボース残基は、例えば、糖としてデオキシリボース残基を有し、塩基として、アデニン(A)、グアニン(G)、シトシン(C)およびチミン(T)を有する。
前記非ヌクレオチド残基は、特に制限されない。本発明のssNc分子は、例えば、前記非ヌクレオチド残基として、ピロリジン骨格またはピペリジン骨格を含む非ヌクレオチド構造を有してもよい。前記非ヌクレオチド残基は、例えば、前記リンカー領域(Lx)および前記リンカー領域(Ly)の少なくとも一方に有することが好ましい。前記非ヌクレオチド残基は、例えば、前記リンカー領域(Lx)に有してもよいし、前記リンカー領域(Ly)に有してもよいし、両方の前記リンカー領域に有してもよい。前記リンカー領域(Lx)および前記リンカー領域(Ly)は、例えば、同じでもよいし、異なってもよい。
X1およびX2は、それぞれ独立して、H2、O、SまたはNHであり;
Y1およびY2は、それぞれ独立して、単結合、CH2、NH、OまたはSであり;
R3は、環A上のC−3、C−4、C−5またはC−6に結合する水素原子または置換基であり、
前記置換基は、OH、OR4、NH2、NHR4、NR4R5、SH、SR4またはオキソ基(=O)であり;
R3が前記置換基の場合、置換基R3は、1でも複数でも、存在しなくてもよく、複数の場合、同一でも異なってもよく;
R4およびR5は、置換基または保護基であり、同一でも異なってもよく;
L1は、n個の原子からなるアルキレン鎖であり、ここで、アルキレン炭素原子上の水素原子は、OH、ORa、NH2、NHRa、NRaRb、SHもしくはSRaで置換されても置換されていなくてもよく、または、
L1は、前記アルキレン鎖の一つ以上の炭素原子が、酸素原子で置換されたポリエーテル鎖であり、
ただし、Y1が、NH、OまたはSの場合、Y1に結合するL1の原子は炭素であり、OR1に結合するL1の原子は炭素であり、酸素原子同士は隣接せず;
L2は、m個の原子からなるアルキレン鎖であり、ここで、アルキレン炭素原子上の水素原子は、OH、ORc、NH2、NHRc、NRcRd、SHもしくはSRcで置換されても置換されていなくてもよく、または、
L2は、前記アルキレン鎖の一つ以上の炭素原子が、酸素原子で置換されたポリエーテル鎖であり、
ただし、Y2が、NH、OまたはSの場合、Y2に結合するL2の原子は炭素であり、OR2に結合するL2の原子は炭素であり、酸素原子同士は隣接せず;
Ra、Rb、RcおよびRdは、それぞれ独立して、置換基または保護基であり;
lは、1または2であり;
mは、0〜30の範囲の整数であり;
nは、0〜30の範囲の整数であり;
環Aは、前記環A上のC−2以外の1個の炭素原子が、窒素、酸素、または硫黄で置換されてもよく、
前記環A内に、炭素−炭素二重結合、または、炭素−窒素二重結合を含んでもよい。前記リンカー領域(Lx)が前記式(I)で表わされる場合、前記領域(Xc)および前記領域(X)は、それぞれ、−OR1−または−OR2−を介して、前記リンカー領域(Lx)に結合する。また、前記リンカー領域(Ly)が前記式(I)で表わされる場合、前記領域(Yc)および前記領域(Y)は、それぞれ、−OR1−または−OR2−を介して、前記リンカー領域(Ly)に結合する。ここで、R1およびR2は、存在しても存在しなくてもよく、存在する場合、R1およびR2は、それぞれ独立して、ヌクレオチド残基または前記構造(I)である。
条件(1)
前記領域(Xc)は、−OR2−を介して、前記領域(X)は、−OR1−を介して、前記式(I)の構造と結合し、
前記領域(Yc)は、−OR1−を介して、前記領域(Y)は、−OR2−を介して、前記式(I)の構造と結合する。
条件(2)
前記領域(Xc)は、−OR2−を介して、前記領域(X)は、−OR1−を介して、前記式(I)の構造と結合し、
前記領域(Yc)は、−OR2−を介して、前記領域(Y)は、−OR1−を介して、前記式(I)の構造と結合する。
条件(3)
前記領域(Xc)は、−OR1−を介して、前記領域(X)は、−OR2−を介して、前記式(I)の構造と結合し、
前記領域(Yc)は、−OR1−を介して、前記領域(Y)は、−OR2−を介して、前記式(I)の構造と結合する。
条件(4)
前記領域(Xc)は、−OR1−を介して、前記領域(X)は、−OR2−を介して、前記式(I)の構造と結合し、
前記領域(Yc)は、−OR2−を介して、前記領域(Y)は、−OR1−を介して、前記式(I)の構造と結合する。
本発明のssNc分子の合成方法は、特に制限されず、従来公知の方法が採用できる。前記合成方法は、例えば、遺伝子工学的手法による合成法、化学合成法等があげられる。遺伝子工学的手法は、例えば、インビトロ転写合成法、ベクターを用いる方法、PCRカセットによる方法があげられる。前記ベクターは、特に制限されず、プラスミド等の非ウイルスベクター、ウイルスベクター等があげられる。前記化学合成法は、特に制限されず、例えば、ホスホロアミダイト法およびH−ホスホネート法等があげられる。前記化学合成法は、例えば、市販の自動核酸合成機を使用可能である。前記化学合成法は、一般に、アミダイトが使用される。前記アミダイトは、特に制限されず、市販のアミダイトとして、例えば、RNA Phosphoramidites(2’−O−TBDMSi、商品名、三千里製薬)、ACEアミダイトおよびTOMアミダイト、CEEアミダイト、CEMアミダイト、TEMアミダイト等があげられる。
本発明の発現抑制用組成物は、前述のように、標的遺伝子の発現を抑制するための組成物であり、前記本発明のssNc分子を含むことを特徴とする。本発明の組成物は、前記本発明のssNc分子を含むことが特徴であり、その他の構成は、何ら制限されない。本発明の発現抑制用組成物は、例えば、発現抑制用試薬ということもできる。
本発明の発現抑制方法は、前述のように、標的遺伝子の発現を抑制する方法であって、前記本発明のssNc分子を使用することを特徴とする。本発明の発現抑制方法は、前記本発明のssNc分子を使用することが特徴であって、その他の工程および条件は、何ら制限されない。
本発明の疾患の治療方法は、前述のように、前記本発明のssNc分子を、患者に投与する工程を含み、前記ssNc分子が、前記発現抑制配列として、前記疾患の原因となる遺伝子の発現を抑制する配列を有することを特徴とする。本発明の治療方法は、前記本発明のssNc分子を使用することが特徴であって、その他の工程および条件は、何ら制限されない。
本発明の使用は、前記標的遺伝子の発現抑制のための、前記本発明のssNc分子の使用である。また、本発明の使用は、RNA干渉の誘導のための、前記本発明のssNc分子の使用である。
実施例のRNA(Ex)として、以下に示すssRNA(NK−0016)を合成した。前記NK−0016は、GAPDH遺伝子の発現を抑制する19塩基長の発現抑制配列(配列番号1)を有する。NK−0016の配列において、領域(Xc)と領域(X)との間が、リンカー領域(Lx)であり、領域(Y)と領域(Yc)との間が、リンカー領域(Ly)である(以下、同様)。配列において、5’領域(Xc)および3’領域(Yc)は、それぞれ小文字で表わす(以下、同様)。
GAPDH遺伝子発現抑制配列(配列番号1)
5’-GUUGUCAUACUUCUCAUGG-3’
本発明のssRNAを用いて、in vitroにおけるGAPDH遺伝子の発現抑制を確認した。
実施例のRNA(Ex)として、前記実施例A1のssRNA(NK−0016)を使用した。
GAPDH遺伝子用プライマーセット
5’-GGAGAAGGCTGGGGCTCATTTGC-3’(配列番号9)
5’-TGGCCAGGGGTGCTAAGCAGTTG-3’(配列番号10)
β−アクチン遺伝子用プライマーセット
5’-GCCACGGCTGCTTCCAGCTCCTC-3’(配列番号11)
5’-AGGTCTTTGCGGATGTCCACGTCAC-3’(配列番号12)
これらの結果を、図4に示す。図4は、GAPDH遺伝子発現量の相対値を示すグラフである。図4に示すように、前記NK−0016は、RNA未添加のコントロール(−)よりも低い発現量であり、GAPHD遺伝子の発現を抑制したことがわかった。また、図4に示すように、投与量依存的に遺伝子発現抑制効果を示すことがわかった。
本発明のssRNAを用いて、in vitroにおけるGAPDH遺伝子の発現抑制を確認した。
実施例のRNA(Ex)として、前記実施例A1のssRNA(NK−0016)を使用した。比較例のRNAとして、RNAiポジティブコントロール(Pc)の前記dsRNA(NI−0011)を使用した。前記RNAを、40μmol/Lとなるように、注射用蒸留水に溶解し、RNA溶液を調製した。
これらの結果を、図5に示す。図5は、GAPDH遺伝子発現量の相対値を示すグラフであり、縦軸は、相対遺伝子発現量である。図5に示すように、前記実施例のNK−0016は、比較例のNI−0011と比較して、極めて強い遺伝子発現抑制活性を示した。
本発明のssRNAを用いて、in vitroにおけるGAPDH遺伝子の発現抑制を確認した。
実施例のRNA(Ex)として、前記実施例A1のNK−0016および以下のEx−ssRNA(PK−0004)を使用した。前記PK−0004において、リンカー領域(Lx)およびリンカー領域(Ly)は、XcとXとの間、YcとYとの間を、実施例Bに示すスキーム3の化合物10(L−プロリンジアミドアミダイト)を用いて結合させた。前記両リンカーの化学式を以下に示す。前記NK−0016と前記PK−0004は、XcとXとの間のリンカー領域(Lx)、およびYcとYとの間のリンカー領域(Ly)が異なる以外は、同じ配列とした。
これらの結果を、図6および7に示す。図6は、A549細胞の結果であり、図7は、293細胞の結果である。図6および7は、GAPDH遺伝子発現量の相対値を示すグラフである。図6および7に示すように、実施例のNK−0016およびPK−0004は、強い遺伝子発現抑制活性を示し、濃度依存的に効果を示すことがわかった。
本発明のssRNAについて、in vitroでのTGF−β1遺伝子の発現抑制効果を確認した。
実施例のRNA(Ex)として、以下に示すssRNA(NK−0033)を使用した。前記NK−0033は、TGF−β1遺伝子の発現を抑制する21塩基長の下記配列を有している。この配列は、Chengらが用いたsiRNA(Mol.Pharm.,2009,6,772−779)に基づいて、設計した。
TGF−β1遺伝子発現抑制配列(配列番号16)
5’−AAAGUCAAUGUACAGCUGCUU−3’
TGF−β1遺伝子用プライマーセット
5’-CCATTGCTGTCCCGTGCAGAGCTG-3’(配列番号17)
5’-ATGGTAGCCCTTGGGCTCGTGGATC-3’(配列番号18)
β−アクチン遺伝子増幅用プライマーセット
5’-GTCGTACCACAGGCATTGTGATGG-3’(配列番号19)
5’-GCAATGCCTGGGTACATGGTGG-3’ (配列番号20)
これらの結果を、図8に示す。図8は、TGF−β1遺伝子発現量の相対値を示すグラフである。図8に示すように、前記実施例のNK−0033は、in vitroにおいて、TGF−β1遺伝子の発現を抑制した。他方、ネガティブコントロールのNK−0035は、TGF−β1遺伝子の発現を抑制しなかった。
本発明のssRNAについて、in vivoでの遺伝子発現抑制および急性肺傷害抑制の効果を確認した。前記効果の確認は、Takagiら(J.Thromb Hemost 2009;7:2053−2063)に記載の方法に従って行った。
(1.1)急性肺傷害マウスへのssRNAの投与
実施例のRNA(Ex)は、前記実施例A5のssRNA(NK−0033)を使用した。比較例のRNAは、前記実施例A5に示す、RNAiネガティブコントロール(Nc)のssRNA(NK−0035)を使用した。
・投与群1
滅菌生理食塩水80μLの投与から1時間後、滅菌生理食塩水50μLを投与
・投与群2
RNA溶液(NK−0033)80μLの投与から1時間後、滅菌生理食塩水50μLを投与
・投与群3
RNA溶液(NK−0035)80μLの投与から1時間後、滅菌生理食塩水50μLを投与
・投与群4
滅菌生理食塩水80μLの投与から1時間後、前記LPS溶液50μLを投与
・投与群5
RNA溶液(NK−0033)80μLの投与から1時間後、前記LPS溶液50μLを投与
・投与群6
RNA溶液(NK−0035)80μLの投与から1時間後、前記LPS溶液50μLを投与
前記LPS溶液を滴下してから24時間後、前記マウスの腹腔に、過剰量のペントバルビタールを投与して安楽死させ、生化学的解析および組織学的解析のサンプルとした。ネガティブコントロールは、前記LPS溶液に代えて、滅菌生理食塩水を添加した。
(2.1)肺におけるTGF−β1遺伝子発現の抑制
前記マウスの肺サンプルについて、TGF−β1 QuantikineColorimetric Sandwich ELISA(商品名、R&D Systems社)を用いて、単位重量の肺あたりのTGF−β1発現量を測定した。
急性肺傷害における炎症は、好中球等の細胞が肺に浸潤することによって生じる。このため、肺に対する好中球等の細胞の浸潤を抑制する薬物は、急性肺傷害における炎症の治療薬となる。そこで、気管支肺胞洗浄液(BALF)中の細胞数を、肺へ浸潤した細胞数の指標として、本発明のssRNAの薬理効果を確認した。
ギムザ染色の結果を、図12に示す。図12は、前記BALFサンプル中の細胞のギムザ染色の結果を示す写真である(倍率100倍)。図12において、(A)は、LPS(+)/RNA(−)の投与群4の結果であり、(B)は、LPS(+)/ネガティブコントロールNK−0035(+)の投与群6の結果であり、(C)は、LPS(+)/NK−0033(+)の実施例投与群5の結果を示す。
HE染色の結果を、図13に示す。図13は、前記肺組織のHE染色の結果を示す写真である(倍率10倍)。図13において、(A)は、LPS(+)/RNA(−)の投与群4の結果であり、(B)は、LPS(+)/ネガティブコントロールNK−0035(+)の投与群6の結果であり、(C)は、LPS(+)/NK−0033(+)の実施例投与群5の結果を示す。図13から、血管周囲、肺胞腔内、肺胞壁および気管支周辺への、好中球等の細胞の浸潤が減少し、肺組織の傷害性が低減していることがわかった。
従来法のiRNA剤は、副作用としてインターフェロンを配列非依存的に誘導することが知られており、この副作用が問題視されている。そこで、本発明のssRNAについて、インターフェロン誘導の副作用を評価した。
前記実施例A6と同じ方法および条件により、急性肺傷害マウスへのssRNAの投与を行った。そして、前記実施例A6と同様にして、前記LPS溶液または滅菌生理食塩水(LPSに対するネガティブコントロール)を滴下してから24時間後、マウスを安楽死させ、肺組織を採取した。
GAPDH遺伝子用プライマーセット
5’-CCCTTATTGACCTCAACTACATGGT-3’(配列番号21)
5’-GAGGGGCCATCCACAGTCTTCTG-3’ (配列番号22)
TGF−β1遺伝子用プライマーセット
5’-ACTCCACGTGGAAATCAACGG-3’(配列番号23)
5’-TAGTAGACGATGGGCAGTGG-3’(配列番号24)
IFN−α遺伝子用プライマーセット
5’-ATGGCTAGRCTCTGTGCTTCCT-3’ (配列番号25)
5’-AGGGCTCTCCAGAYTTCTGCTCTG-3’(配列番号26)
IFN−β遺伝子用プライマーセット
5’-CATCAACTATAAGCAGCTCCA-3’(配列番号27)
5’-TTCAAGTGGAGAGCAGTTCAG-3 (配列番号28)
前記TGF−β1遺伝子、IFN−α遺伝子およびIFN−β遺伝子の発現量に関する定量的解析結果を、それぞれ、図14(A)〜(C)のグラフに示す。各投与群は、前記実施例A6と同様に以下の通りである。
本発明のssRNAについて、in vitroでのTGF−β1遺伝子の発現抑制効果を確認した。
実施例のRNA(Ex)として、前記実施例A5のNK−0033、以下に示すNK−0061、NK−0055、NK−0062を使用した。下記配列において、「*」は、フリー塩基を示す。
凍結保存した前記RNAを、20μmol/Lとなるように、注射用蒸留水に溶解し、RNA溶液を調製した。そして、前記RNA溶液を使用した以外は、前記実施例A5と同様にして、Hepal−6細胞への前記ssRNAのトランスフェクション、RNA回収、cDNA合成およびPCRを行い。TGF−β1遺伝子の相対的発現量を測定した。トランスフェクション時のRNA濃度は、1nmol/Lとした。
これらの結果を、図15および16に示す。図15および図16は、それぞれ、TGF−β1遺伝子発現量の相対値を示すグラフである。図15は、NK−0033、NK−0061、NK−0055およびNK−0062を使用した結果であり、図16は、PK−0007、PK−0026、PK−0027およびPK−0028を使用した結果である。図15および図16に示すように、いずれのssRNAも、強い遺伝子発現抑制活性を示した。
in vivoでのTGF−β1遺伝子発現抑制効果および急性肺傷害抑制効果
本発明のssRNAを用いて、in vivoでのTGF−β1遺伝子の発現抑制効果を確認した。
急性肺傷害マウスへのRNAの投与は、特に示さない限り、前記実施例A6と同様にして行った。
・投与群1
滅菌生理食塩水75μLの投与から5分後、滅菌生理食塩水50μLを投与
・投与群2
滅菌生理食塩水75μLの投与から5分後、LPS溶液50μLを投与
・投与群3
RNA溶液(PK−0007)75μLの投与から5分後、LPS溶液50μLを投与
・投与群4
RNA溶液(PK−0008)75μLの投与から5分後、LPS溶液50μLを投与
・投与群5
RNA溶液(NK−0033)75μLの投与から5分後、LPS溶液50μLを投与
・投与群6
RNA溶液(NK−0035)75μLの投与から5分後、LPS溶液50μLを投与
・投与群7
RNA溶液(NI−0030)75μLの投与から5分後、LPS溶液50μLを投与
・投与群8
RNA溶液(NI−0031)50μLの投与から5分後、LPS溶液50μLを投与
本発明のssRNAを用いて、in vivoでのオフターゲット効果を確認し、副作用を評価した。
・投与群1
滅菌生理食塩水75μLを投与
・投与群2
RNA溶液(PK−0007)75μLを投与
・投与群3
RNA溶液(PK−0008)75μLを投与
本発明のssRNAを用いて、in vitroにおけるLAMA1遺伝子の発現抑制を確認した。
実施例のRNA(Ex)として、以下に示すNK−0043、NK−0064を使用した。下記配列において、「*」は、フリー塩基を示す(以下、同様)。
LAMA1遺伝子用プライマーセット
5’-AAAGCTGCCAATGCCCCTCGACC-3’(配列番号45)
5’-TAGGTGGGTGGCCCTCGTCTTG-3’(配列番号46)
これらの結果を、図19に示す。図19は、293細胞におけるLAMA1遺伝子の発現量の相対値を示すグラフである。図19に示すように、実施例のNK−0043およびNK−0064は、強い遺伝子発現抑制活性を示すことがわかった。
本発明のssRNAを用いて、RNA干渉効果による、in vitroにおけるLMNA遺伝子の発現抑制を確認した。
実施例のRNA(Ex)として、以下に示すNK−0063、NK−0066を使用した。下記配列において、「*」は、フリー塩基を示す。
LMNA遺伝子用プライマーセット
5’-CTGGACATCAAGCTGGCCCTGGAC-3’(配列番号49)
5’-CACCAGCTTGCGCATGGCCACTTC-3’(配列番号50)
これらの結果を、図20に示す。図20は、A549細胞におけるLMNA遺伝子の発現量の相対値を示すグラフである。図20に示すように、実施例のNK−0063およびNK−0066は、強い遺伝子発現抑制活性を示すことがわかった。
本発明のssRNAについて、前記内部5’側領域(X)に相補的な前記5’側領域(Xc)の長さ、および、前記内部3’側領域(Y)に相補的な前記3’側領域(Yc)の長さを変化させ、in vitroにおけるGAPDH遺伝子の発現抑制を確認した。
実施例のRNAとして、図21に示すssRNAを使用した。図21において、右端の番号は、配列番号を示す。図21において、5’側から、小文字下線の領域は、前記領域(Xc)、大文字下線の領域は、前記内部領域(Z)、小文字下線の領域は、前記領域(Yc)を示す。前記Xcと前記Zとの間が、リンカー領域(Lx)であり、前記Zと前記Ycとの間が、リンカー領域(Ly)である。また、「Xc/Yc」は、前記領域(Xc)の塩基長(Xc)と、前記領域(Yc)の塩基長(Yc)との比を示す。図21において、「*」は、フリー塩基を示す。
これらの結果を、図22に示す。図22は、終濃度10nmol/LのRNAを使用した場合におけるGAPDH遺伝子発現量の相対値を示すグラフである。図22に示すように、前記5’側領域(Xc)および前記3’側領域(Yc)の長さを変化させたいずれのssRNAについても、GAPDH遺伝子の発現抑制が確認できた。
本発明のssRNAについて、前記内部5’側領域(X)、前記5’側領域(Xc)、前記内部3’側領域(Y)および前記3’側領域(Yc)の各長さを変化させ、in vitroにおけるGAPDH遺伝子の発現抑制を確認した。
実施例のRNAとして、図23に示すssRNAを使用した。図23において、右端の番号は、配列番号を示す。図23において、5’側から、小文字下線の領域は、前記領域(Xc)、大文字下線の領域は、前記内部領域(Z)、小文字下線の領域は、前記領域(Yc)を示す。また、「Xc+Yc/X+Y」は、前記領域(Xc)と前記領域(Yc)の塩基長の合計と、前記領域(X)と前記領域(Y)の塩基長の合計との比を示す。図23において、「*」は、フリー塩基を示す。
これらの結果を、図24に示す。図24は、終濃度1nmol/LのRNAを使用した場合におけるGAPDH遺伝子発現量の相対値を示すグラフである。図24に示すように、前記領域(X)、前記領域(Xc)、前記領域(Y)および前記領域(Yc)の長さを変化させたいずれのssRNAについても、GAPDH遺伝子の発現抑制が確認できた。また、前記実施例A2において、NK−0016は、極めて強い発現抑制活性が確認されている。本実施例において、NK−0016以外のssRNAは、全てNK−0016をさらに上回る活性が認められた。
本発明のssRNAについて、前記内部5’側領域(X)に相補的な前記5’側領域(Xc)の長さを変化させ、in vitroにおけるGAPDH遺伝子の発現抑制を確認した。
実施例のRNAとして、図25に示すssRNAを使用した。図25において、5’側から、小文字下線の領域は、前記領域(Xc)、大文字下線の領域は、前記内部5’領域(X)、小文字下線の領域は、前記領域(Yc)を示す。また、「Xc/Xc」は、前記領域(Xc)の塩基長(Xc)と、前記領域(X)の塩基長(X)との比を示す。図25において、「*」は、フリー塩基を示す。下記RNAの配列は、配列番号74〜76に示す。
これらの結果を、図26に示す。図26は、終濃度1nmol/LのRNAを使用した場合におけるGAPDH遺伝子発現量の相対値を示すグラフである。図26に示すように、前記5’側領域(Xc)の長さを変化させたいずれのssRNAについても、GAPDH遺伝子の発現抑制が確認できた。特に、フリー塩基を有する場合、その数が少ない程、前記発現抑制活性を向上できると考えられる。また、前記実施例A2において、NK−0016は、極めて強い発現抑制活性が確認されている。本実施例において、NK−0016以外のssRNAは、全てNK−0016をさらに上回る活性が認められた。
本発明のssRNAについて、前記内部5’側領域(X)と前記5’側領域(Xc)との間のリンカー領域(Lx)および前記内部3’側領域(Y)と前記3’側領域(Yc)との間のリンカー領域(Ly)を変化させ、in vitroにおけるGAPDH遺伝子の発現抑制を確認した。
実施例のRNAとして、図27に示すssRNAを使用した。図27において、5’側から、小文字下線の領域は、前記5’側領域(Xc)、大文字下線の領域は、前記内部領域(Z)、小文字下線の領域は、前記3’側領域(Yc)を示す。前記Xと前記Xcとの間の配列が、リンカー領域(Lx)であり、前記Yと前記Ycとの間の配列が、リンカー領域(Ly)である。また、各RNAについて、リンカー領域(Lx)の塩基長(Lx)と、リンカー領域(Ly)の塩基長(Ly)との比(Lx/Ly)を示す。図27において、「*」は、フリー塩基を示す。
これらの結果を、図28に示す。図28は、終濃度1nmol/LのRNAを使用した場合におけるGAPDH遺伝子発現量の相対値を示すグラフである。図28に示すように、前記リンカー領域(Lx)および(Ly)の条件、すなわち、長さ、両者間の長さの比、配列等を変化させたいずれのssRNAについても、同様に、GAPDH遺伝子の発現抑制が確認できた。この結果から、前記リンカー領域(Lx)および(Ly)の条件は、特に制限されず、様々な長さ、配列等に設計可能であることがわかった。
プロリンまたはプロリノールを有するリンカーで置換したssRNAを用いて、HCT116細胞でのGAPDH発現抑制効果を確認した。
実施例のRNA(Ex)として、以下に示すRNA(Ex ssRNA)を合成した。また、比較例のRNAとして、以下に示す、RNAiのネガティブコントロール(Nc)のNc ssRNAを合成した。下記式において、リンカー領域(Lx)およびリンカー領域(Ly)は、XcXとの間、および、YcYとの間を、プロリンまたはプロリノールを有する下記表のアミダイト(実施例B参照)を用いて結合させた。
これらの結果を、図29に示す。図29は、GAPDH遺伝子発現量の相対値を示すグラフである。図29に示すように、リンカー領域(Lx)およびリンカー領域(Ly)としてプロリンまたはプロリノールを含むEx ssRNAは、いずれも、強い遺伝子発現抑制活性が確認でき、濃度依存的に効果を示すことがわかった。他方、ネガティブコントロールのssRNAは、抑制効果が観察されなかった。
プロリンを有するリンカーで置換したssRNAを用いて、HCT116細胞でのGAPDH発現抑制効果を確認した。
実施例のRNA(Ex)として、以下に示すRNA(Ex ssRNA)を合成した。また、比較例のRNAとして、以下に示す、RNAiのネガティブコントロール(Nc)のNc ssRNAを合成した。下記式において、リンカー領域(Lx)およびリンカー領域(Ly)は、XcとXとの間、および、YcYとの間を、プロリンまたはプロリノールを有する下記表のアミダイト(実施例B参照)を用いて結合させた。
これらの結果を、図30に示す。図30は、HCT116細胞のGAPDH遺伝子発現量の相対値を示すグラフである。図30に示すように、リンカー領域(Lx)およびリンカー領域(Ly)としてプロリンを含むEx ssRNAは、強い遺伝子発現抑制活性を示し、濃度依存的に効果を示すことがわかった。他方、ネガティブコントロールのssRNAは、抑制効果が観察されなかった。
本発明のssRNAについて、リボヌクレアーゼ耐性を確認した。
実施例のRNA(Ex)として、実施例A5におけるNK−0033および実施例A8におけるPK−0007を使用した。また、比較例のRNAとして、実施例A9におけるポジティブコントロール(Pc)のdsRNA(NI−0030)を使用した。
この結果を図31に示す。図31は、リボヌクレアーゼ耐性を示す電気泳動写真である。図31において、レーン「M」は、分子量マーカーであり、minは、インキュベート時間を示す。
本発明のssRNAについて、ヌクレアーゼ耐性を確認した。
前記実施例A18と同じRNAを使用した。まず、5mmol/L CaCl2を含む50mmol/L Tris−HCl(pH8)に、60pmolの前記RNA、0.5ユニットのS7ヌクレアーゼ(Roche)を混合し、37℃にてインキュベートした。インキュベート開始(0h)から0.5時間後に、定法に従ってS7ヌクレアーゼの反応を停止させた。そして、そして、前記反応液を定法に従い、7M尿素−15%ポリアクリルアミドゲルで電気泳動した後、SYBR Green II(商品名、Lonza)で染色し、E−BOX−VX2(商品名、エムエス機器)を用いて分析した。
この結果を図32に示す。図32は、S7ヌクレアーゼ耐性を示す電気泳動写真である。図32において、レーン「M」は、分子量マーカーである。また、hは、インキュベート時間を示す。
1.プロリノールの合成
下記式に示すスキーム1に従い、ジメトキシトリチル基で保護されたプロリノールを合成した。
L−プロリノール(化合物1)(0.61g、6.0mmol)を、純水70mLに溶解し、L−プロリノール水溶液を調製した。N−(9−フルオレニルメトキシカルボニロキシ)スクシンイミド(Fmoc−OSu)(2.0g、6.0mmol)を、THF10mLに溶解した。このTHF溶液を、前記L−プロリノール水溶液に加え、1時間撹拌して、両者を反応させた。この反応液を、液体画分と沈殿画分とに分離し、それぞれの画分を酢酸エチルで抽出し、それぞれ有機層を回収した。そして、それぞれの有機層を合わせた後、無水硫酸ナトリウムを添加して、水分を吸収させた(以下、乾燥という)。前記有機層をろ過して、ろ液を回収し、前記ろ液を減圧濃縮した。得られた残渣を、シリカゲルカラムクロマトグラフィー(展開溶媒 ヘキサン:酢酸エチル=1:1)により精製し、化合物2を得た(1.4g、収率74%)。以下に、化合物のNMRの結果を示す。
1H−NMR(CDCl3): δ7.77(2H,d,J=7.7Hz,Ar−H),7.60(2H,d,J=7.3Hz,Ar−H),7.40(2H,t,J=7.5Hz,Ar−H),7.31(2H,t,J=7.6Hz,Ar−H),4.40−4.50(2H,m,COOCH2),4.22(1H,t,J=6.5Hz,Ar−CH),3.20−3.80(5H,m,H−5,H−6),1.75(3H,m,H−3,H−4),1.40(1H,m,H−3).
前記Fmoc−L−プロリノール(化合物2)(1.4g、4.3mmol)を、ピリジン20mLに溶解して、3回共沸した。得られた残留物を、ピリジン20mLに溶解した。この溶液を、アルゴン下、氷浴中で、撹拌しながら、4,4’−ジメトキシトリチルクロリド(DMTr−Cl)(1.8g、5.3mmol)を添加した。この反応液について、クロロホルム/メタノールのTLCにより反応を追跡し、Fmoc−L−プロリノールのスポットが消えるまで、4時間反応させた。そして、過剰のDMTr−Clをクエンチするために、前記反応液に、メタノール3mLを加えて10分撹拌した。前記反応液に、さらに、クロロホルムを加えた後、有機層を回収した。回収した前記有機層に、飽和食塩水による洗浄、5%炭酸水素ナトリウム水溶液による洗浄を行い、もう一度、飽和食塩水による洗浄を行った。洗浄後の有機層を、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。前記有機層をろ過して、得られたろ液を減圧濃縮した。得られた残渣を、シリカゲルカラムクロマトグラフィー(展開溶媒 クロロホルム、1%ピリジン)により精製し、化合物3を得た(2.0g、収率74%)。以下に、化合物のNMRの結果を示す。
1H−NMR(CDCl3): δ7.77(2H,d,J=7.7Hz,Ar−H),7.60(2H,d,J=7.3Hz,Ar−H),7.40−7.18(13H,m,Ar−H),6.89(4H,d,J=8.6Hz,Ar−H),4.20−4.40(2H,m,COOCH2),4.02(1H,t,J=6.5Hz,Ar−CH),3.80−3.10(5H,m,H−5,H−6),3.73(s,6H,OCH3),1.84(3H,m,H−3,H−4),1.58(1H,m,H−3).
前記Fmoc−DMTr−L−プロリノール(化合物3)(2.0g、3.2mmol)を、20%ピペリジンを含むDMF溶液25mLに溶解し、12時間撹拌した。この溶液を減圧濃縮し、得られた残渣を、シリカゲルカラムクロマトグラフィー(クロロホルム:メタノール=85:15、1%ピリジン含有)で精製し、化合物4を得た(1.0g、収率78%)。以下に、化合物のNMRの結果を示す。
1H−NMR(CDCl3): δ7.40−7.14(9H,m,Ar−H),6.82(4H,d,J=8.6Hz,Ar−H),3.78(6H,s,OCH3),3.31(1H,m,H−6),3.07(2H,m,H−2,H−6),2.90(2H,m,H−5),1.84(3H,m,H−3,H−4),1.40(1H,m,H−3).
つぎに、下記式に示すスキーム2に従い、プロリノールを有するアミダイト誘導体を合成した。以下、1−エチル−3−(3−ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩を、「EDC」、N,N−ジメチルアミノピリジン(4−ジメチルアミノピリジン)を「DMAP」という。
前記DMTr−L−プロリノール(化合物4)(0.80g、2.0mmol)、EDC(0.46g、2.4mmol)およびDMAP(0.29g、2.4mmol)を、ジクロロメタン20mLに溶解して撹拌した。この溶液に、10−ヒドロキシデカン酸(0.45g、2.4mmol)を添加し、撹拌した。この反応液について、酢酸エチルのTLCにより反応を追跡し、DMTr−L−プロリノールのスポットが消えるまで、20時間反応させた。そして、前記反応液に、ジクロロメタンを加えた後、有機層を回収した。回収した前記有機層を、飽和食塩水で洗浄した後、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。前記有機層をろ過して、得られたろ液を減圧濃縮し、その残渣を、シリカゲルカラムクロマトグラフィー(酢酸エチル、1%ピリジン含有)により精製し、化合物5を得た(0.71g,収率62%)。以下に、化合物のNMRの結果を示す。
1H−NMR(CDCl3): δ7.40−7.14(9H,m,Ar−H),6.82(4H,d,J=8.6Hz,Ar−H),3.78(6H,s,OCH3),3.68−2.93(7H,m,H−2,H−5,H−6),2.27−1.72(6H,m,アルキル,H−3,H−4),1.58(4H,s,アルキル),1.30(10H,s,アルキル).
前記DMTr−L−プロリノール(化合物4)(0.80g、2.0mmol)を、メタノール15mLに溶解し、5−ヒドロキシペンタナール(0.31g、3.0mmol)を加えて撹拌した。この溶液に、シアノ水素化ホウ素ナトリウム(0.25g、4.0mmol)を加え、さらに撹拌した。この反応液について、酢酸エチル/ヘキサンのTLCにより反応を追跡し、DMTr−L−プロリノールのスポットが消えるまで、24時間反応させた。そして、前記反応液に、酢酸エチルを加え、有機層を回収した。回収した前記有機層を、飽和食塩水で洗浄した後、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。前記有機層をろ過して、得られたろ液を減圧濃縮し、その残渣を、シリカゲルカラムクロマトグラフィー(ヘキサン:酢酸エチル=1:1、1%ピリジン含有)により精製し、化合物6を得た(0.62g、収率63%)。以下に、化合物のNMRの結果を示す。
1H−NMR(CDCl3): δ7.40−7.14(9H,m,Ar−H),6.82(4H,d,J=8.6Hz,Ar−H),3.78(6H,s,OCH3),3.70−2.86(4H,m,CH2OH,H−6),2.06−1.79(5H,m,アルキル,H−2,H−5),1.74−1.49(6H,m,アルキル,H−3,H−4),1.45−1.27(4H,m,アルキル).
1,4−ブタンジオール(0.90g、10mmol)を、ジクロロメタン30mLに溶解し、さらに、カルボニルジイミダゾール(1.4g、8.6mmol)を加え、3時間撹拌した。この反応液の有機層を、飽和食塩水で洗浄した後、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。前記有機層をろ過して、得られたろ液を減圧濃縮し、その残渣を、シリカゲルカラムクロマトグラフィー(クロロホルム:メタノール=9:1)により精製した。これによって、1,4−ブタンジオールの一方の末端がカルボニルジイミダゾールで活性化された化合物を得た(0.25g,1.5mmol)。この化合物をジクロロメタン15mLに溶解し、前記DMTr−L−プロリノール(化合物4)(0.6g、1.5mmol)を添加し、24時間撹拌した。この混合液に、さらに、酢酸エチルを加え、有機層を回収した。回収した前記有機層を、飽和食塩水で洗浄した後、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。前記有機層をろ過して、得られたろ液を減圧濃縮し、その残渣を、シリカゲルカラムクロマトグラフィー(ヘキサン:酢酸エチル=1:1、1%ピリジン含有)により精製し、化合物7を得た(0.61g、収率77%)。以下に、化合物のNMRの結果を示す。
1H−NMR(CDCl3): δ7.40−7.14(9H,m,Ar−H),6.82(4H,d,J=8.6Hz,Ar−H),4.24−3.94(2H,m,COOCH2),3.78(s,6H,OCH3),3.72−2.96(7H,m,アルキル,H−2,H−5,H−6),2.10−1.30(8H,m,アルキル,H−3,H−4).
前記DMTr−L−プロリノール(化合物4)(0.50g、1.2mmol)およびトリホスゲン(0.12g、0.40mmol)を、ジクロロメタン8mLに溶解し、アルゴン下、氷浴中で、撹拌した。そして、前記溶液に、N,N−ジイソプロピルエチルアミン(0.31g、2.4mmol)を添加し、1時間撹拌した。さらに、前記溶液に、8−アミノ−1−オクタノール(0.17g、1.2mmol)を添加し、同様にして氷浴中で30分撹拌した後、室温で20時間撹拌した。前記溶液に、ジクロロメタンを加え、有機層を回収した。回収した前記有機層を、飽和食塩水で洗浄した後、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。前記有機層をろ過して、得られたろ液を減圧濃縮し、その残渣を、シリカゲルカラムクロマトグラフィー(ヘキサン:酢酸エチル=4:1、1%トリエチルアミン含有)により精製し、化合物8を得た(0.44g、収率62%)。以下に、化合物のNMRの結果を示す。
1H−NMR(CDCl3):δ7.40−7.14(9H,m,Ar−H),6.82(4H,m,Ar−H),3.78(s,6H,OCH3),3.68−3.25(9H,m,CH2NH,CH2OH,H−2,H−5,H−6),1.74−1.18(16H,m,アルキル,H−3,H−4).
前記修飾プロリノール(化合物5〜8)を、それぞれ原料として、以下に示す方法により、化合物9〜12を合成した。前記修飾プロリノールおよび5−ベンジルチオ−1H−テトラゾールを、アセトニトリル3mLに溶解した。前記修飾プロリノールの使用量は、化合物5の場合、0.69g(1.2mmol)、化合物6の場合、0.60g(1.2mmol)、化合物7の場合、0.60g(1.2mmol)、化合物8の場合、0.25g(0.43mmol)とした。また、5−ベンジルチオ−1H−テトラゾールの使用量は、化合物5〜7に対しては、0.15g(0.78mmol)、化合物8に対しては、54mg(0.15mmol)とした。前記溶液に、アルゴン下、2−シアノエチルN,N,N’,N’−テトライソプロピルホスホロジアミダイトを添加し、2時間撹拌した。前記2−シアノエチルN,N,N’,N’−テトライソプロピルホスホロジアミダイトの添加量は、前記化合物5〜7を使用した系では、0.54g(1.8mmol)とし、前記化合物8を使用した系では、0.19g(0.64mmol)とした。そして、前記溶液に、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を添加し、さらに、ジクロロメタンで抽出し、有機層を回収した。回収した前記有機層を、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。前記有機層をろ過して、得られたろ液を減圧濃縮し、その残渣を、シリカゲルカラムクロマトグラフィー(ヘキサン:酢酸エチル=1:1、1%トリエチルアミン含有)により精製し、化合物9〜12を得た。以下に、各化合物のNMRの結果を示す。
1H−NMR(CDCl3)δ7.40−7.14(9H,m,Ar−H),6.82(4H,d,J=8.6Hz,Ar−H),3.78(6H,s,OCH3),3.68−2.93(11H,m,CH2O,POCH2,CHCH3,H−2,H−5,H−6),2.58(2H,m,CH2CN),2.27−1.72(6H,m,アルキル,H−3,H−4),1.58(4H,s,アルキル),1.30(22H,s,アルキル,CHCH3).
1H−NMR(CDCl3): δ7.40−7.14(9H,m,Ar−H),6.82(4H,d,J=8.6Hz,Ar−H),3.78(6H,s,OCH3),3.70−2.86(8H,m,CH2O,POCH2,CHCH3,H−6),2.58(2H,m,CH2CN),2.06−1.79(5H,m,アルキル,H−2,H−5),1.74−1.49(6H,m,アルキル,H−3,H−4),1.37−1.10(16H,m,アルキル,CHCH3).
1H−NMR(CDCl3): δ7.40−7.14(9H,m,Ar−H),6.82(4H,d,J=8.6Hz,Ar−H),4.24−3.94(2H,m,COOCH2),3.78(s,6H,OCH3),3.72−2.96(11H,m,CH2O,POCH2,CHCH3,H−2,H−5,H−6),2.58(2H,m,CH2CN),2.10−1.46(8H,m,アルキル,H−3,H−4),1.34−1.10(12H,m,CHCH3).
1H−NMR(CDCl3): δ7.40−7.14(9H,m,Ar−H),6.82(4H,m,Ar−H),3.78(s,6H,OCH3),3.65−3.25(13H,m,CH2O,POCH2,CHCH3,H−2,CH2NH,CH2OH,H−2,H−5,H−6),2.73(2H,m,CH2CN),2.10−1.48(16H,m,アルキル,H−3,H−4),1.35−1.10(12H,m,CHCH3).
つぎに、下記式に示すスキーム3に従い、L−プロリンを有するアミダイト誘導体を合成した。
DMTr−アミド−L−プロリン(化合物6)(1.00g、2.05mmol)および5−ヒドロキシペンタナール(0.33g、3.07mmol)を含むエタノール溶液(7mL)に、氷冷下、酢酸緩衝液(7mL)を加えた。この混合液を、氷冷下、20分撹拌した後、シアノ化ホウ素ナトリウム(0.77g、12.28mmol)を加え、さらに、室温下、7時間撹拌した。前記混合液をジクロロメタンで希釈し、水で洗浄した後、さらに飽和食塩水で洗浄した。そして、前記有機層を回収し、硫酸ナトリウムで乾燥させた。前記有機層をろ過し、ろ液について、減圧下で溶媒を留去した。得られた残渣を、シリカゲルカラムクロマトグラフィー(展開溶媒 CH2Cl2:CH3OH=98:2、0.05%ピリジン含有)に供した。ついで、得られた生成物を、シリカゲルカラムクロマトグラフィー(展開溶媒 CH2Cl2:CH3OH=98:2、0.05%ピリジン含有)に供し、さらに、得られた生成物を、シリカゲルカラムクロマトグラフィー(展開溶媒 ジクロロメタン:アセトン=7:3、0.05%ピリジン含有)に供した。これによって、無色シロップ状の化合物11を得た(0.49g、収率41%)。
Ms(FAB+): m/z 575(M+)、303(DMTr+)
得られた前記DMTr−ヒドロキシアミドアミノ−L−プロリン(化合物11)(0.50g、0.87mmol)を無水アセトニトリルと混合し、室温で共沸乾燥した。得られた残留物に、ジイソプロピルアンモニウムテトラゾリド(178mg、1.04mmol)を加え、減圧下で脱気し、アルゴンガスを充填した。前記混合物に対し、無水アセトニトリル(1mL)を加え、さらに、2−シアノエトキシ−N,N,N’,N’−テトライソプロピルホスホロジアミダイト(313mg、1.04mmol)の無水アセトニトリル溶液(1mL)を加えた。この混合物を、アルゴン雰囲気下、室温で4時間撹拌した。そして、前記混合物をジクロロメタンで希釈し、飽和重曹水および飽和食塩水で、順次洗浄した。有機層を回収し、硫酸ナトリウムで乾燥した後、前記有機層をろ過した。得られた前記ろ液について、減圧下で溶媒を留去した。得られた残渣を、充填剤としてアミノシリカを用いたカラムクロマトグラフィー(展開溶媒 ヘキサン:アセトン=7:3、0.05%ピリジン含有)に供し、無色シロップ状の化合物12(0.57g、純度93%、収率79%)を得た。前記純度は、HPLCにより測定した(以下、同様)。以下に、化合物のNMRの結果を示す。
1H−NMR(CDCl3): δ7.41−7.43(m,2H,Ar−H)、7.28−7.32(m,4H,Ar−H)、7.25−7.27(m,2H,Ar−H)、7.18−7.21(m,1H,Ar−H)、6.80−6.84(m,4H,Ar−H)、3.73−3.84(m,1H)、3.79(s,6H,OCH3)、3.47−3.64(m,3H)、3.12−3.26(m,2H)、3.05(t,J=6.4Hz,2H,CH2)、2.98−2.02(m,2H)、2.61(t,J=5.8Hz,2H,CH2)、2.55−2.63(m,2H)、2.27−2.42(m,1H,CH)、2.31(t,7.8Hz,2H,CH2)、2.03−2.19(m,1H,CH)、1.40−1.90(m,8H)、1.23−1.33(m,5H)、1.14−1.20(m,12H,CH3);
P−NMR(CDCl3): δ146.91;
Ms(FAB+): m/z 774(M+)、303(DMTr+),201(C8H19N2OP+).
DMTr−アミド−L−プロリン(化合物6)(1.00g、2.05mmol)を溶解した無水アセトニトリル溶液(10mL)に、1−イミダゾカルボニルオキシ−8−ヒドロキシオクタン(1.12g,4.92mmol)を溶解した無水アセトニトリル溶液(20mL)を、アルゴン雰囲気下、室温で加えた。この混合液を、40〜50℃で2日間加熱した後、5日間室温で放置した。前記混合液について、減圧下で溶媒を留去した。得られた残渣を、シリカゲルカラムクロマトグラフィー(展開溶媒 ジクロロメタン:アセトン=4:1、0.05%ピリジン含有)に供した。これによって、無色シロップ状の化合物13を得た(0.68g、収率50%)。以下に、化合物のNMRの結果を示す。
1H−NMR (CDCl3): δ7.40−7.42(m,2H,Ar−H)、7.27−7.31(m,6H,Ar−H)、7.17−7.21(m,1H,Ar−H)、6.79−6.82(m,4H,Ar−H)、4.23−4.30(m,1H)、4.05−4.10(m,2H)、3.79(s,6H,OCH3)、3.60−3.65(m,2H)、3.32−3.55(m,2H)、3.16−3.29(m,2H),3.01−3.07(m,2H)、2.38−2.40(m,1H,CH)、1.83−1.90(m,2H)、1.57−1.69(m,8H)、1.26−1.36(m,2H);
Ms(FAB+): m/z 602(M+)、303(DMTr+).
得られた前記DMTr−ヒドロキシアミドカルバモイル−L−プロリン(化合物13)(0.63g、1.00mmol)を無水ピリジンと混合し、室温で共沸乾燥した。得られた残留物に、ジイソプロピルアンモニウムテトラゾリド(206mg、1.20mmol)を加え、減圧下に脱気し、アルゴンガスを充填した。前記混合物に対し、無水アセトニトリル(1mL)を加え、さらに、2−シアノエトキシ−N,N,N’,N’−テトライソプロピルホスホロジアミダイト(282mg、1.12mmol)の無水アセトニトリル溶液(1mL)を加えた。この混合物を、アルゴン雰囲気下、室温で4時間撹拌した。そして、前記混合物をジクロロメタンで希釈し、飽和重曹水および飽和食塩水で順次洗浄した。有機層を回収し、硫酸ナトリウムで乾燥した後、前記有機層をろ過した。得られたろ液について、減圧下で溶媒を留去した。得られた残渣を、充填剤としてアミノシリカを用いたカラムクロマト(展開溶媒 ヘキサン:アセトン=7:3、0.5%ピリジン含有)に供し、無色シロップ状の化合物14(0.74g、純度100%、収率87%)を得た。以下に、化合物のNMRの結果を示す。
P−NMR(CDCl3): δ147.19;
Ms(FAB+): m/z 860(M+)、303(DMTr+),201(C8H19N2OP+).
トリホスゲン(1.22g、4.10mmol)に、アルゴン雰囲気および氷冷下、無水テトラヒドロフラン溶液(10mL)を加えた。この混合液に、アルゴン雰囲気および氷冷下、DMTr−アミド−L−プロリン(化合物6)(1.00g、2.05mmol)およびDIEA(9.80g、75.8mmol)を溶解した無水テトラヒドロフラン溶液(10mL)を、30分間で滴下し、その後、室温で1時間撹拌した。前記混合液に、アルゴン雰囲気および氷冷下、10−アミノ−1−t−ブチルジメチルシロキシデカン(2.66g、10.25mmol)およびDIEA(3.20g、24.76mmol)を溶解した無水テトラヒドロフラン溶液(20mL)を、45分間で滴下した。そして、前記混合物を、アルゴン雰囲気下、室温で一晩撹拌した。この混合液を酢酸エチル(200mL)で希釈し、有機層を回収した。前記有機層を、飽和重曹水で洗浄した後、さらに、飽和食塩水で洗浄した。そして、有機層を回収し、硫酸ナトリウムで乾燥させた。前記有機層をろ過し、ろ液について、減圧下で溶媒を留去した。得られた残渣を、シリカゲルカラムクロマトグラフィー(展開溶媒 ジクロロメタン:アセトン=4:1、0.05%ピリジン含有)に供した。これによって、無色シロップ状の化合物15を得た(0.87g、収率55%)。
得られた前記DMTr−t−ブチルジメチルシロキシアミドウレイド−L−プロリン(15)(0.87g、1.12mmol)に、アルゴン雰囲気下、無水テトラヒドロフランジクロロメタン溶液(10mL)を室温で加えた。前記混合液に、アルゴン雰囲気下、1mol/Lテトラブチルアンモニウムフルオリド含有テトラヒドロフラン溶液(4.69mL、東京化成)を加え、室温で3日間撹拌した。前記混合液をジクロロメタン(150mL)で希釈し、水で洗浄した後、さらに飽和食塩水で洗浄した。有機層を回収し、硫酸ナトリウムで乾燥した後、前記有機層をろ過した。得られたろ液について、減圧下で溶媒を留去した。得られた残渣を、シリカゲルカラムクロマトグラフィー(展開溶媒 ジクロロメタン:アセトン=1:1、0.05%ピリジン含有)に供し、無色シロップ状の化合物16を得た(0.68g、収率92%)。以下に、化合物のNMRの結果を示す。
1H−NMR(CDCl3): δ7.41−7.43(m,2H,Ar−H)、7.27−7.31(m,4H,Ar−H)、7.19−7.26(m,2H,Ar−H)、7.19−7.21(m,1H,Ar−H)、6.80−6.83(m,4H,Ar−H)、4.34(t,2H,CH2)、3.79(s,6H,OCH3)、3.63(d,1H,J=6.4Hz,CH2)、3.61(d,1H,J=6.4Hz,CH2)、3.34−3.37(m,1H,CH)、3.16−3.27(m,5H),3.04(t,J=5.9Hz,2H,CH2)、2.38−2.45(m,1H,CH)、1.83−2.05(m,3H)、1.45−1.64(m,8H)、1.25−1.38(m,7H).
得られた前記DMTr−ヒドロキシアミドウレイド−L−プロリン(化合物16)(0.62g、0.94mmol)を無水アセトニトリルと混合し、室温で共沸乾燥した。得られた残留物に、ジイソプロピルアンモニウムテトラゾリド(192mg、1.12mmol)を加え、減圧下で脱気し、アルゴンガスを充填した。前記混合液に対し、無水アセトニトリル(1mL)を加え、さらに、2−シアノエトキシ−N,N,N’,N’−テトライソプロピルホスホロジアミダイト(282mg、1.12mmol)の無水アセトニトリル溶液(1mL)を加えた。この混合物を、アルゴン雰囲気下、室温で4時間撹拌した。そして、前記混合物をジクロロメタンで希釈し、飽和重曹水および飽和食塩水で、順次洗浄した。有機層を回収し、硫酸ナトリウムで乾燥した後、前記有機層をろ過した。得られた前記ろ液について、減圧下で溶媒を留去した。得られた残渣を、充填剤としてアミノシリカを用いたカラムクロマト(展開溶媒 ヘキサン:アセトン=1:1、0.05%ピリジン含有)に供し、無色シロップ状の化合物17を得た(0.77g、純度88%、収率84%)。以下に、化合物のNMRの結果を示す。
P−NMR(CDCl3): δ147.27;
Ms(FAB+): m/z 860(M++1)、303(DMTr+),201(C8H19N2OP+).
プロリン骨格を有するリンカーを含む本発明の核酸分子を生成するため、前記スキーム3により、L−プロリンジアミドアミダイトおよびD−プロリンジアミドアミダイトを合成した。
(1)Fmoc−ヒドロキシアミド−L−プロリン(化合物4)
前記スキーム3の化合物2(Fmoc−L−プロリン)を開始原料とした。前記化合物2(10.00g、29.64mmol)、4−アミノ−1−ブタノール(3.18g、35.56mmol)および1−ヒドロキシベンゾトリアゾール(10.90g、70.72mmol)を混合し、前記混合物に対し、減圧下で脱気し、アルゴンガスを充填した。前記混合物に、無水アセトニトリル(140mL)を室温で加え、さらに、ジシクロヘキシルカルボジイミド(7.34g、35.56mmol)の無水アセトニトリル溶液(70mL)を添加した後、アルゴン雰囲気下、室温で15時間撹拌した。反応終了後、生成した沈殿をろ別し、回収したろ液について、減圧下で溶媒を留去した。得られた残渣にジクロロメタン(200mL)を加え、飽和重曹水(200mL)で洗浄した。そして、有機層を回収し、硫酸マグネシウムで乾燥した後、前記有機層をろ過した。得られたろ液について、減圧下で溶媒を留去し、その残渣にジエチルエーテル(200mL)を加え、粉末化した。生じた粉末を濾取することにより、無色粉末状の化合物4(10.34g、収率84%)を得た。以下に、前記化合物のNMRの結果を示す。
1H−NMR(CDCl3): δ7.76−7.83(m,2H,Ar−H)、7.50−7.63(m,2H,Ar−H)、7.38−7.43(m,2H,Ar−H)、7.28−7.33(m,2H,Ar−H),4.40−4.46(m,1H,CH),4.15−4.31(m,2H,CH2),3.67−3.73(m,2H,CH2)、3.35−3.52(m,2H,CH2)、3.18−3.30(m,2H,CH2)、2.20−2.50(m,4H)、1.81−2.03(m,3H)、1.47−1.54(m,2H);
Ms(FAB+): m/z 409(M+H+).
Fmoc−ヒドロキシアミド−L−プロリン(化合物4)(7.80g、19.09mmol)を無水ピリジン(5mL)と混合し、室温で2回共沸乾燥した。得られた残留物に、4,4’−ジメトキシトリチルクロリド(8.20g、24.20mmol)、DMAP(23mg、0.19mmol)および無水ピリジン(39mL)を加えた。この混合物を、室温で1時間撹拌した後、メタノール(7.8mL)を加え、室温で30分撹拌した。この混合物を、ジクロロメタン(100mL)で希釈し、飽和重曹水(150mL)で洗浄後、有機層を分離した。前記有機層を、硫酸ナトリウムで乾燥した後、前記有機層をろ過した。得られたろ液について、減圧下で溶媒を留去した。得られた未精製の残渣に、無水ジメチルホルムアミド(39mL)およびピペリジン(18.7mL、189mmol)を加え、室温で1時間撹拌した。反応終了後、前記混合液について、減圧下、室温で、溶媒を留去した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(商品名Wakogel C−300、展開溶媒 CH2Cl2:CH3OH=9:1、0.05%ピリジン含有に供し、淡黄色油状の化合物6(9.11g、収率98%)を得た。以下に、前記化合物のNMRの結果を示す。
1H−NMR(CDCl3): δ7.39−7.43(m,2H,Ar−H)、7.30(d,J=8.8Hz,4H,Ar−H)、7,21(tt,1H,4.9,1.3Hz,Ar−H)、6.81(d,J=8.8Hz,4H,Ar−H)、3.78(s,6H,OCH3)、3.71(dd,H,J=6.3Hz,5.4Hz,CH)、3.21(2H,12.9,6.3Hz,2H,CH2)、3.05(t,J=6.3Hz,2H,CH2)、2.85−2.91(m,2H,CH2)、2.08−2.17(m,1H,CH)、1.85−2.00(m,3H)、1.55−1.65(m,5H):
Ms(FAB+); m/z 489(M+H+)、303(DMTr+).
得られた前記DMTr−アミド−L−プロリン(化合物6)(6.01g、12.28mmol)、EDC(2.83g、14.74mmol)、1−ヒドロキシベンゾトリアゾール(3.98g、29.47mmol)およびトリエチルアミン(4.47g、44.21mmol)の無水ジクロロメタン溶液(120mL)を混合した。この混合液に、さらに、アルゴン雰囲気下、室温で、6−ヒドロキシヘキサン酸(1.95g、14.47mmol)を加え、その後、アルゴン雰囲気下、室温で、1時間撹拌した。前記混合液をジクロロメタン(600mL)で希釈し、飽和食塩水(800mL)で3回洗浄した。有機層を回収し、前記有機層を、硫酸ナトリウムで乾燥した後、前記有機層をろ過した。得られたろ液について、減圧下で溶媒を留去した。これにより、淡黄色泡状の前記化合物8(6.29g、収率85%)を得た。以下に、前記化合物のNMRの結果を示す。
1H−NMR(CDCl3): δ7.41−7.43(m,2H,Ar−H)、7.27−7.31(m,4H,Ar−H)、7.19−7.26(m,2H,Ar−H)、7.17−7.21(m,1H,Ar−H)、6.79−6.82(m,4H,Ar−H)、4.51−4.53(m,1H,CH)、3.79(s,6H,OCH3)、3.61(t,2H,J=6.4Hz,CH2)、3.50−3.55(m,1H,CH)、3.36−3.43(m,1H,CH),3.15−3.24(m,2H,CH2),3.04(t,J=6.3Hz,2H,CH2)、2.38−2.45(m,1H,CH)、2.31(t,6.8Hz,2H,CH2)、2.05−2.20(m,1H,CH)、1.92−2.00(m,1H,CH)、1.75−1.83(m,1H,CH)、1.48−1.71(m,8H)、1.35−1.44(m,2H,CH2);
Ms(FAB+): m/z 602(M+)、303(DMTr+).
得られた前記DMTr−ヒドロキシジアミド−L−プロリン(化合物8)(8.55g、14.18mmol)を無水アセトニトリルと混合し、室温で3回共沸乾燥した。得られた残留物に、ジイソプロピルアンモニウムテトラゾリド(2.91g、17.02mmol)を加え、減圧下で脱気し、アルゴンガスを充填した。前記混合物に対し、無水アセトニトリル(10mL)を加え、さらに、2−シアノエトキシ−N,N,N’,N’−テトライソプロピルホスホロジアミダイト(5.13g、17.02mmol)の無水アセトニトリル溶液(7mL)を加えた。この混合物を、アルゴン雰囲気下、室温で2時間撹拌した。そして、前記混合物をジクロロメタンで希釈し、飽和重曹水(200mL)で3回洗浄した後、飽和食塩水(200mL)で洗浄した。有機層を回収し、硫酸ナトリウムで乾燥した後、前記有機層をろ過した。得られた前記ろ液について、減圧下に溶媒を留去した。得られた残渣を、充填剤としてアミノシリカゲルを用いたカラムクロマトグラフィー(展開溶媒 ヘキサン:酢酸エチル=1:3、0.05%ピリジン含有)に供し、無色シロップ状の化合物10(10.25g、純度92%、収率83%)を得た。以下に、前記化合物のNMRの結果を示す。
1H−NMR(CDCl3): δ7.40−7.42(m,2H,Ar−H)、7.29−7.31(m,4H,Ar−H)、7.25−7.27(m,2H,Ar−H)、7.17−7.21(m,1H,Ar−H)、6.80−6.82(m,4H,Ar−H)、4.51−4.53(m,1H,CH)、3.75−3.93(m,4H)、3.79(s,6H,OCH3)、3.45−3.60(m,4H)、3.35−3.45(m,1H,CH)、3.20−3.29(m,1H)、3.04(t,J=6.4Hz,2H,CH2)、2.62(t,J=5.8Hz,2H,CH2)、2.40−2.44(m,1H,CH)、2.31(t,7.8Hz,2H,CH2)、2.03−2.19(m,1H,CH)、1.92−2.02(m,1H,CH)、1.70−1.83(m,1H,CH)、1.51−1.71(m,8H)、1.35−1.44(m,2H,CH2)、1.18(d,J=6.8Hz,6H,CH3)、1.16(d,J=6.8Hz,6H,CH3);
P−NMR(CDCl3): Msδ147.17;
Ms(FAB+): m/z 802(M+)、303(DMTr+),201(C8H19N2OP+).
(1)Fmoc−ヒドロキシアミド−D−プロリン(化合物3)
前記スキーム3の化合物1(Fmoc−D−プロリン)を開始原料とした。前記化合物1(1.5g、4.45mmol)、ジシクロヘキシルカルボジイミド(1.1g、5.34mmol)および1−ヒドロキシベンゾトリアゾール(1.5g、10.69mmol)の混合物に対し、減圧下で脱気し、アルゴンガスを充填した。前記混合物に、無水アセトニトリル(24mL)を室温で加え、さらに、4−アミノ−1−ブタノール(0.48g、5.34mmol)の無水アセトニトリル溶液(6mL)添加した後、アルゴン雰囲気下、室温で15時間撹拌した。反応終了後、生成した沈殿をろ別し、回収したろ液について、減圧下で溶媒を留去した。得られた残渣にジクロロメタンを加え、酢酸緩衝液(pH4.0)で3回、飽和重曹水で3回洗浄した。そして、有機層を回収し、硫酸マグネシウムで乾燥した後、前記有機層をろ過した。得られたろ液について、減圧下で溶媒留去し、その残渣にジエチルエーテル(50mL)を加え、粉末化した。生じた粉末を濾取することにより、白色粉末状の化合物3を得た。以下に、前記化合物のNMRの結果を示す。
1H−NMR(400MHz,CDCl3): δ7.77(d,J=7.3Hz,2H);7.58(br,2H);7.41(t,J=7.3Hz,2H);7.32(t,J=7.3Hz,2H);4.25−4.43(m,4H);3.25−3.61(m,6H);1.57−1.92(m,8H).
MS(FAB+): m/z 409(M+H+).
Fmoc−ヒドロキシアミド−D−プロリン(化合物3)(1.0g、2.45mmol)を無水ピリジン(5mL)と混合し、室温で2回共沸乾燥した。得られた残留物に、4,4’−ジメトキシトリチルクロリド(1.05g、3.10mmol)、DMAP(3mg、0.024mmol)および無水ピリジン(5mL)を加えた。この混合物を、室温で1時間撹拌した後、メタノール(1mL)を加え、室温で30分撹拌した。この混合物を、ジクロロメタンで希釈し、飽和重曹水で洗浄後、有機層を分離した。前記有機層を、硫酸ナトリウムで乾燥した後、前記有機層をろ過した。得られたろ液について、減圧下で溶媒を留去した。得られた未精製の残渣に、無水ジメチルホルムアミド(5mL)およびピペリジン(2.4mL、24mmol)を加え、室温で1時間撹拌した。反応終了後、前記混合液について、減圧下、室温で、溶媒を留去した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(商品名Wakogel C−300、展開溶媒 CH2Cl2:CH3OH=9:1、0.05%ピリジン含有)に供し、淡黄色油状の化合物5(1.26g、収率96%)を得た。以下に、前記化合物のNMRの結果を示す。
1H−NMR(400MHz,CDCl3): δ7.62(br,1H);7.41−7.44(m,2H);7.26−7.33(m,6H);7.17−7.22(m,1H);6.80−6.84(m,4H);3.78(s,6H);3.71(dd,J=8.8,5.4Hz,1H);3.22(q,6.5Hz,2H);3.07(t,J=6.1Hz,2H);2.97−3.03(m,1H);2.85−2.91(m,1H);1.85−2.15(m,3H);1.55−1.73(m,6H).
MS(FAB+): m/z 489(M+H+),303(DMTr+).
得られた前記DMTr−アミド−D−プロリン(化合物5)(1.2g、2.45mmol)、EDC(566mg、2.95mmol)、1−ヒドロキシベンゾトリアゾール(796mg、5.89mmol)、およびトリエチルアミン(1.2mL、8.84mmol)の無水ジクロロメタン溶液(24mL)を混合した。この混合液に、さらに、アルゴン雰囲気下、室温で、6−ヒドロキシヘキサン酸(390mg、2.95mmol)を加え、その後、アルゴン雰囲気下、室温で1時間撹拌した。前記混合液をジクロロメタンで希釈し、飽和重曹水で3回洗浄した。有機層を回収し、前記有機層を、硫酸ナトリウムで乾燥した後、前記有機層をろ過した。得られたろ液について、減圧下で溶媒を留去した。これにより、淡黄色油状の化合物7(1.4g、収率95%)を得た。以下に、前記化合物のNMRの結果を示す。
1H−NMR(400MHz,CDCl3): δ7.40−7.43(m,2H);7.25−7.32(m,6H);7.17−7.22(m,1H);6.79−6.83(m,4H);3.79(s,6H);3.58−3.63(m,2H);3.49−3.55(m,1H);3.15−3.26(m,2H);3.02−3.07(m,2H);2.30−2.33(m,2H);2.11−2.20(m,1H);1.50−1.99(m,13H);1.36−1.43(m,2H).
MS(FAB+): m/z 602(M+),303(DMTr+).
得られた前記DMTr−ヒドロキシジアミド−D−プロリン(化合物7)(1.2g、1.99mmol)を無水アセトニトリルと混合し、室温で3回共沸乾燥した。得られた残留物に、ジイソプロピルアンモニウムテトラゾリド(410mg、2.40mmol)を加え、減圧下で脱気し、アルゴンガスを充填した。前記混合物に対し、無水アセトニトリル(2.4mL)を加え、さらに、2−シアノエトキシ−N,N,N’,N’−テトライソプロピルホスホロジアミダイト(722mg、2.40mmol)を加えた。この混合物を、アルゴン雰囲気下、室温で2時間撹拌した。そして、前記混合物をジクロロメタンで希釈し、飽和重曹水で3回洗浄後、飽和食塩水で洗浄した。有機層を回収し、硫酸ナトリウムで乾燥した後、前記有機層をろ過した。得られたろ液について、減圧下で溶媒を留去した。得られた残渣を、充填剤としてアミノシリカゲルを用いたカラムクロマトグラフィー(展開溶媒 ヘキサン:酢酸エチル=1:3)に供し、無色油状の化合物9(1.4g、純度95%、収率83%)を得た。以下に、前記化合物のNMRの結果を示す。
1H−NMR(400MHz,CDCl3): δ7.40−7.43(m,2H);7.25−7.32(m,6H);7.14−7.21(m,1H);6.80−6.83(m,4H);3.80−3.85(m,2H);3.79(s,6H);3.49−3.65(m,5H);3.02−3.06(m,2H);2.60−2.63(m,2H);2.29−2.33(m,2H);1.77−1.82(m,2H);1.56−1.68(m,8H);1.38−1.43(m,2H);1.15−1.29(m,18H).
31P−NMR(162MHz,CDCl3): δ146.94.
MS(FAB+): m/z 802(M+),303(DMTr+),201(C8H19N2OP+).
プロリン骨格を有するリンカーを含む本発明の核酸分子を生成するため、下記スキーム4により、L−プロリンジアミドアミダイトタイプBを合成した。
Fmoc−ヒドロキシアミド−L−プロリン(化合物4)(2.00g、30mmol)、t−ブチル−ジメチルシリルクロリド(1.11g、35mmol)およびイミダゾール(10.90g、71mmol)を混合した。前記混合物に対し、減圧下に脱気し、アルゴンガスを充填した。前記混合物に、無水アセトニトリル(20mL)を室温で加え、アルゴン雰囲気下、室温で終夜撹拌した。反応終了後、前記混合物にジクロロメタン(150mL)を加え、水で3回洗浄し、飽和食塩水で洗浄した。有機層を回収し、硫酸マグネシウムで乾燥した後、前記有機層をろ過した。得られたろ液について、減圧下で溶媒を留去し、その残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(展開溶媒 CH2Cl2:CH3OH=95:5)に供し、無色シロップ状の化合物18(2.35g、収率92%)を得た。以下に、前記化合物のNMRの結果を示す。
1H−NMR(CDCl3): δ7.76−7.78(m,2H,Ar−H)、7.50−7.63(m,2H,Ar−H)、7.38−7.42(m,2H,Ar−H)、7.29−7.34(m,2H,Ar−H),4.10−4.46(m,4H,CH2),3.47−3.59(m,4H,CH2)、3.20−3.26(m,2H,CH)、1.85−1.95(m,2H)、1.42−1.55(m,6H)、0.96(s,9H,t−Bu)、0.02(s,6H,SiCH3);
Ms(FAB+): m/z 523(M+H+).
得られた前記Fmoc−t−ブチル−ジメチルシロキシアミド−L−プロリン(化合物18)(1.18g、2.5mmol)に対し、無水アセトニトリル(5mL)およびピペリジン(2.4mL)を加え、室温で1時間撹拌した。反応終了後、前記混合物にアセトニトリル(50mL)を加え、不溶物をろ別した。得られたろ液について、減圧下で溶媒を留去し、得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(展開溶媒 CH2Cl2:CH3OH=9:1)に供し、無色シロップ状の化合物19(0.61g、収率90%)を得た。以下に、前記化合物のNMRの結果を示す。
1H−NMR(CDCl3): δ3.71(dd,1H,J=9.0Hz,5.2Hz,CH)、3.61−3.64(m,2H,CH2)、3.22−3.28(m,2H,CH2)、2.98−3.04(m,1H,CH)、2.86−2.91(m,1H,CH)、2.08−2.17(m,1H,CH)、1.86−1.93(m,1H,CH)、1.66−1.75(m,2H,CH2)、1.52−1.57(m,4H)、0.89(s,9H,t−Bu)、0.05(s,6H,SiCH3):
Ms(FAB+); m/z 301(M+H+).
得られた前記t−ブチル−ジメチルシロキシアミド−L−プロリン(化合物19)(550mg、1.8mmol)、6−ヒドロキシヘキサン酸(300mg、2.3mmol)、EDC(434mg、2.3mmol)、および1−ヒドロキシベンゾトリアゾール(695mg、4.5mmol)の無水ジクロロメタン溶液(20mL)を混合した。前記混合物に、アルゴン雰囲気下、室温で、トリエチルアミン(689mg、6.8mmol)を加え、その後、アルゴン雰囲気下、室温で、終夜撹拌した。前記混合液を飽和食塩水で洗浄した。有機層を回収し、前記を硫酸ナトリウムで乾燥した後、前記有機層をろ過した。得られたろ液について、減圧下で溶媒を留去した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(展開溶媒 CH2Cl2:CH3OH=9:1)に供し、無色シロップ状の化合物20(696mg、収率92%)を得た。以下に、前記化合物のNMRの結果を示す。
1H−NMR(CDCl3): δ4.54(d,1H,CH)、3.58−3.67(m,5H)、3.52−3.56(m,1H,CH),3.32−3.39(m,1H),3.20−3.25(m,2H)、2.40−2.43(m,1H,CH)、2.33(t,J=7.3Hz,2H,CH2)、2.05−2.25(m,2H)、1.93−2.03(m,1H,CH)、1.75−1.85(m,1H,CH)、1.50−1.73(m,8H)、1.37−1.46(m,2H,CH2)、0.87(s,9H,t−Bu)、0.04(s,6H,SiCH3);
Ms(FAB+): m/z 415(M++1).
得られた前記t−ブチル−ジメチルシロキシアミドヒドロキシアミド−L−プロリン(化合物20)(640mg、1.54mmol)を無水ピリジン(1mL)と混合し、室温で共沸乾燥した。得られた残留物に、4,4’−ジメトキシトリチルクロリド(657mg、1.85mmol)、DMAP(2mg)および無水ピリジン(5mL)を加え、室温で4時間撹拌した後、メタノール(1mL)を加え、30分室温で撹拌した。前記混合物をジクロロメタンで希釈し、飽和重曹水で洗浄した。有機層を回収し、硫酸ナトリウムで乾燥した後、前記有機層をろ過した。得られたろ液について、減圧下で溶媒を留去した。得られた残渣に、無水アセトニトリル(5mL)および1mol/Lテトラブチルアンモニウムフルオリド含有テトラヒドロフラン溶液(1.42mL、テトラブチルアンモニウムフルオリド1.42mmol)を加え、室温で終夜撹拌した。反応終了後、前記混合物に酢酸エチル(100mL)を加え、水で洗浄した後、飽和食塩水で洗浄した。有機層を回収し、硫酸ナトリウムで乾燥した後、前記有機層をろ過した。得られたろ液について、減圧下に溶媒を留去した。得られた残渣を、シリカゲルカラムクロマトグラフィー(展開溶媒 CH2Cl2:CH3OH=95:5、0.05%ピリジン含有)に供し、無色シロップ状の化合物21(680mg、収率73%)を得た。以下に、前記化合物のNMRの結果を示す。
1H−NMR(CDCl3): δ7.41−7.44(m,2H,Ar−H)、7.26−7.33(m,4H,Ar−H)、7.18−7.21(m,2H,Ar−H)、7.17−7.21(m,1H,Ar−H)、6.80−6.84(m,4H,Ar−H)、4.51−4.53(d,6.8Hz,1H,CH)、3.79(s,6H,OCH3)、3.61(dd,2H,J=11Hz,5.4Hz,CH2)、3.50−3.54(m,1H,CH)、3.36−3.43(m,1H,CH),3.20−3.26(m,2H,CH2),3.05(t,J=6.4Hz,2H,CH2)、2.38−2.45(m,1H,CH)、2.30(t,J=7.8Hz,2H,CH2)、2.05−2.25(m,1H,CH)、1.92−2.00(m,1H,CH)、1.75−1.83(m,1H,CH)、1.52−1.67(m,8H)、1.35−1.45(m,2H,CH2);
Ms(FAB+): m/z 602(M+)、303(DMTr+).
得られた前記DMTr−ヒドロキシジアミド−L−プロリンタイプB(化合物21)(637mg、1.06mmol)を無水アセトニトリルと混合し、室温で共沸乾燥した。得られた残留物に、ジイソプロピルアンモニウムテトラゾリド(201mg、1.16mmol)を加え、減圧下で脱気し、アルゴンガスを充填した。前記混合物に対し、無水アセトニトリル(1mL)を加え、さらに、2−シアノエトキシ−N,N,N’,N’−テトライソプロピルホスホロジアミダイト(350mg、1.16mmol)の無水アセトニトリル溶液(1mL)を加えた。この混合物を、アルゴン雰囲気下、室温で4時間撹拌した。前記混合物をジクロロメタンで希釈し、飽和重曹水および飽和食塩水で洗浄した。有機層を回収し、硫酸ナトリウムで乾燥した後、前記有機層をろ過した。得られたろ液について、減圧下で溶媒を留去した。得られた残渣を、充填剤としてアミノシリカゲルを用いたカラムクロマトグラフィー(展開溶媒 ヘキサン:アセトン=7:3)に供し、無色シロップ状の化合物22(680mg、純度95%、収率76%)を得た。以下に、前記化合物のNMRの結果を示す。
1H−NMR(CDCl3): δ7.41−7.43(m,2H,Ar−H)、7.25−7.32(m,4H,Ar−H)、7.17−7.22(m,2H,Ar−H)、6.80−6.83(m,4H,Ar−H)、4.53(d,J=7.8Hz,1H,CH)、3.75−3.93(m,3H)、3.79(s,6H,OCH3)、3.46−3.68(m,5H)、3.34−3.41(m,1H,CH)、3.10−3.31(m,1H,CH)、3.05(t,J=6.3Hz,2H,CH2)、2.62(t,J=6.3Hz,2H,CH2)、2.39−2.46(m,1H,CH)、2.29(t,7.3Hz,2H,CH2)、2.03−2.19(m,1H,CH)、1.90−2.00(m,1H,CH)、1.70−1.83(m,1H,CH)、1.51−1.71(m,8H)、1.35−1.45(m,2H,CH2)、1.18(d,J=6.4Hz,6H,CH3)、1.16(d,J=6.4Hz,6H,CH3);
P−NMR(CH3CN): δ146.90;
Ms(FAB+): m/z 803(M++1)、303(DMTr+).
プロリン骨格を有するリンカーを含む本発明の核酸分子を生成するため、下記スキーム5により、DMTr−アミドエチレンオキシエチルアミノ−L−プロリンアミダイト(以下、PEGスペーサータイプという)を合成した。
DMTr−アミド−L−プロリン(化合物6)(1.00g、2.05mmol)、4−トルエンスルホン酸2−(2−ヒドロキシエトキシ)エチルエステル(3.10g、12.30mmol)、および炭酸カリウム(0.85g、6.15mmol)の無水ジメチルホルムアミド溶液(10mL)を混合し、アルゴン雰囲気下、室温で4日間撹拌した。前記混合物について、減圧化、室温で溶媒を留去した後、ジクロロメタン(20mL)を加え、ろ過した。ろ液を濃縮し、得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーに供した。前記シリカゲルカラムクロマトグラフィーの添加溶媒は、まず、0.05%ピリジンを含む酢酸エチルを使用した後、0.05%ピリジンを含むCH2Cl2とCH3OHの混合液(CH2Cl2:CH3OH=9:1)を使用した。その結果、無色シロップ状の化合物23(1.15g、収率97%)を得た。以下に、前記化合物のNMRの結果を示す。
1H−NMR(CDCl3): δ7.41−7.45(m,2H,Ar−H)、7.27−7.31(m,6H,Ar−H)、7.17−7.21(m,1H,Ar−H)、6.79−6.82(m,4H,Ar−H)、3.79(s,6H,OCH3)、3.60−3.70(m,2H)、3.39−3.57(m,4H),3.13−3.27(m,3H),3.07−3.08(m,2H)、2.71−2.84(m,1H)、2.38−2.46(m,1H)、2.14−2.19(m,1H)、1.84−1.87(m,1H)、1.57−1.76(m,8H).
得られた前記DMTr−アミドヒドロキシエトキシエチルアミノ−L−プロリン(化合物23)(0.63g、1.00mmol)を無水ピリジンと混合し、室温で共沸乾燥した。得られた残留物に、ジイソプロピルアンモニウムテトラゾリド(206mg、1.20mmol)を加え、減圧下で脱気し、アルゴンガスを充填した。前記混合物に対し、無水アセトニトリル(1mL)を加え、さらに、2−シアノエトキシ−N,N,N’,N’−テトライソプロピルホスホロジアミダイト(282mg、1.12mmol)の無水アセトニトリル溶液(1mL)を加えた。この混合物を、アルゴン雰囲気下、室温で4時間撹拌した。そして、前記混合物をジクロロメタンで希釈し、飽和重曹水および飽和食塩水で洗浄した。有機層を回収し、硫酸ナトリウムで乾燥した後、前記有機層をろ過した。得られた前記ろ液について、減圧下で溶媒を留去した。得られた残渣を、充填剤としてアミノシリカゲルを用いたカラムクロマトグラフィー(展開溶媒 ヘキサン:アセトン=7:3、0.05%ピリジン含有)に供し、無色シロップ状の化合物24(0.74g、純度100%、収率87%)を得た。以下に、前記化合物のNMRの結果を示す。
1H−NMR(CD3CN): δ7.41−7.43(m,2H,Ar−H)、7.28−7.31(m,6H,Ar−H)、7.18−7.22(m,1H,Ar−H)、6.84−6.86(m,4H,Ar−H)、3.73−3.84(m,2H,CH2)、3.79(s,6H,OCH3)、3.47−3.64(m,7H)、3.15−3.23(m,1H)、3.11(t,J=6.4Hz,2H,CH2)、3.01(t,J=5.9Hz,2H,CH2)、2.95−2.99(m,1H)、2.58−2.63(m,2H)、2.31−2.35(m,1H,CH)、2.03−2.19(m,1H,CH)、1.48−1.78(m,10H)、1.12−1.57(m,12H,CH3);
P−NMR(CD3CN):δ148.00;
Ms(FAB+): m/z 776(M+)、303(DMTr+)201(C8H19N2OP+).
1.保護プロリノールの合成
以下に示すスキーム6に従い、ジメトキシトリチル基で保護されたプロリノール(化合物3)を合成した。
L−プロリノール(2.0g、20mmol)をTHF20mLに溶解した。他方、トリフルオロ酢酸エチル(3.0g、21mmol)をTHF20mLに溶解した。そして、後者のTHF溶液を、前者のL−プロリノール含有THF溶液に滴下し、12時間撹拌した。この反応液を減圧濃縮し、化合物1を得た(3.7g、収率97%)。以下に、前記化合物のNMRの結果を示す。
1H−NMR(CDCl3): δ4.28−4,23(1.0H,m,OH),3.90−3.41(5H,H−2,H−5,H−6,m),2.27−1.77(4H,H−3,H−4,m).
得られた前記トリフルオロアセチル−L−プロリノール(化合物1)(3.7g、19mmol)をピリジンに溶解して、3回、室温で共沸乾燥した。得られた残留物をピリジン15mLに溶かし、アルゴン下、氷浴中で撹拌しながら、4,4’−ジメトキシトリチルクロリド(DMTr−Cl)(8.1g、24mmol)を加え、さらに、室温で4時間反応させた。そして、過剰のDMTr−Clをクエンチするために、前記反応液に、さらに、メタノール10mLを加え10分撹拌した。その後、前記反応液に、ジクロロメタンを加え飽和炭酸水素ナトリウム水溶液と飽和食塩水で洗浄した。洗浄後の回収した有機層を、硫酸ナトリウムで乾燥させた。前記有機層をろ過して、得られたろ液を減圧濃縮し、その残渣を、シリカゲルカラムクロマトグラフィー(展開溶媒 CH2Cl2:CH3OH=95:5、0.1%ピリジン含有)に供し、精製した化合物2を得た(8.5g、収率89%)。以下に、前記化合物のNMRの結果を示す。
1H−NMR(CDCl3):δ7.39−7.18(9H,m,Ar−H),6.82(4H,d,J=8.6Hz,Ar−H),3.78(6H,s,OCH3),3.70−3.41(5H,H−2,H−5,H−6,m),2.19−1.85(4H,H−3,H−4,m).
得られた前記トリフルオロアセチル−DMTr−L−プロリノール(化合物2)(5g、10mmol)をTHF100mLに溶解した。このTHF溶液に5%水酸化ナトリウム水溶液100mLを加え、撹拌した。この溶液に、1M フッ化テトラ−n−ブチルアンモニウム(TBAF)溶液5mL加え、室温で12時間撹拌した。この反応液を、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液と飽和食塩水で洗浄した。洗浄後の回収した有機層を、硫酸ナトリウムで乾燥させた。前記有機層をろ過して、得られたろ液を減圧濃縮し、化合物3を得た(3.6g、収率90%)。以下に、前記化合物のNMRの結果を示す。
1H−NMR(CDCl3): δ7.40−7.14(9H,m,Ar−H),6.82(4H,d,J=8.6Hz,Ar−H),3.78(6H,s,OCH3),3.31(1H,m,H−6),3.07(2H,m,H−2,H−6),2.90(2H,m,H−5),1.84(3H,m,H−3,H−4),1.40(1H,m,H−3).
前記「1.」で合成した保護プロリノール(化合物3)を用いて、下記スキーム7により、結合形式が異なる、プロリノールを有するアミダイト誘導体を合成した。
1,8−オクタンジオール(9.0g、62mmol)をTHF90mLに溶解し、アルゴン下に置いた。他方、カルボニルジイミダゾール(2.0g、12mmol)をTHF10mLに溶解した。後者のTHF溶液を、前者のTHF溶液に加え、室温で1時間撹拌した。この反応液を、1,8−オクタンジオールのTLCスポットが消えるまで、水で洗浄した。さらに、洗浄後に回収した有機層を、飽和食塩水で洗浄し、回収した有機層を、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。前記有機層をろ過し、得られたろ液を減圧濃縮した。その残渣を、シリカゲルカラムクロマトグラフィー(展開溶媒 CH2Cl2:CH3OH=95:5)に供し、精製した化合物を得た。この化合物は、1,8−オクタンジオールの片末端がカルボニルジイミダゾールで活性化された化合物であった(2.3g、収率77%)。
1H−NMR(CDCl3): δ7.40−7.14(9H,m,Ar−H),6.82(4H,d,J=8.6Hz,Ar−H),4.24−3.94(2H,m,COOCH2),3.78(s,6H,OCH3),3.72−2.96(7H,m,alkyl,H−2,H−5,H−6),2.10−1.30(16H,m,alkyl,H−3,H−4).
FAB−MS: 576 [M+H]+.
アルゴン下、トリホスゲン(2.0g、6.7mmol)をTHF10mLに溶解し、0℃で撹拌した。他方、DMTr−L−プロリノール(化合物3)(1.3g、3.2mmol)およびN,N−ジイソプロピルエチルアミン(16g、124mmol)をTHF10mLに溶解し、前記トリホスゲンのTHF溶液に滴下した。この反応液を、0℃で1時間、続いて、室温で2時間撹拌した。そして、8−アミノ−1−オクタノール(2.3g、16mmol)およびN,N−ジイソプロピルエチルアミン(5.0g、38mmol)をTHF30mLに溶解した。このTHF溶液に、前記撹拌後の反応液を滴下し、0℃で1時間、続いて、室温で48時間撹拌した。この反応液を減圧濃縮し、その残渣をジクロロメタンに溶解した。この溶液を、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液と飽和食塩水で洗浄し、回収した有機層を、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。前記有機層をろ過して、得られたろ液を減圧濃縮し、その残渣を、逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィーに供して、精製した。この際、展開溶媒は、0.1%ピリジンを含有するアセトンと水との混合溶媒を使用し、前記アセトンと水との混合割合は、ステップワイズとし、具体的には、アセトン:水のモル比を、2:8、3:7、4:6および5:5の順に変化させた。目的の化合物5を含むフラクションを、ジクロロメタンで抽出し、この有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。前記有機層をろ過し、得られたろ液を減圧濃縮し、化合物5(プロリノールウレイドアミダイト)を得た(0.9g、収率49%)。以下に、前記化合物のNMRの結果を示す。
1H−NMR(CDCl3): δ7.40−7.14(9H,m,Ar−H),6.82(4H,m,Ar−H),3.78(s,6H,OCH3),3.68−3.25(9H,m,CH2NH,CH2OH,H−2,H−5,H−6),1.74−1.18(16H,m,alkyl,H−3,H−4).
FAB−MS: 575 [M+H]+.
修飾プロリノールとして、得られた前記化合物4(0.80g、1.4mmol)をアセトニトリルに溶解し、室温で3回共沸乾燥した。得られた残留物をアセトニトリル1mLに溶解し、アルゴン下においた。このアセトニトリル溶液に、ジイソプロピルアンモニウムテトラゾリド(0.24g,1.4mmol)を添加し、反応液とした。他方、2−シアノエチルN,N,N’,N’−テトライソプロピルホスホロジアミダイト(0.50g、1.7mmol)をアセトニトリル1mLに溶解した。これを、前記反応液に添加し、室温で4時間撹拌した。前記反応液に、ジクロロメタンを加え、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液と飽和食塩水で洗浄した。洗浄後の回収した有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、前記有機層をろ過して、得られたろ液を減圧濃縮した。その残渣を、アミノシリカゲルカラムクロマトグラフィー(展開溶媒 ヘキサン:アセトン=10:1、0.1%ピリジン含有)に供し、精製した化合物6(DMTr−ウレタン−L−プロリノールアミダイト)(0.90g、収率83%)を得た。以下に、前記化合物のNMRの結果を示す。
1H−NMR(CDCl3): δ7.40−7.14(9H,m,Ar−H),6.82(4H,d,J=8.6Hz,Ar−H),4.24−3.94(2H,m,COOCH2),3.78(s,6H,OCH3),3.72−2.96(11H,m,CH2O,POCH2,CHCH3,H−2,H−5,H−6),2.58(2H,m,CH2CN),2.10−1.46(16H,m,alkyl,H−3,H−4),1.34−1.10(12H,m,CHCH3).
31P−NMR(CD3CN)δ 146.82.
FAB−MS: 776 [M+H]+.
1H−NMR(CDCl3): δ7.40−7.14(9H,m,Ar−H),6.82(4H,m,Ar−H),3.78(s,6H,OCH3),3.65−3.25(13H,m,CH2O,POCH2,CHCH3,H−2,CH2NH,CH2OH,H−2,H−5,H−6),2.73(2H,m,CH2CN),2.10−1.48(16H,m,alkyl,H−3,H−4),1.35−1.10(12H,m,CHCH3).
31P−NMR(CD3CN)δ 146.83.
FAB−MS: 775 [M+H]+.
Claims (37)
- 標的遺伝子の発現を抑制する発現抑制配列を含む一本鎖核酸分子であって、
5’側から3’側にかけて、5’側領域(Xc)、内部領域(Z)および3’側領域(Yc)を、前記順序で含み、
前記内部領域(Z)が、内部5’側領域(X)および内部3’側領域(Y)が連結して構成され、
前記5’側領域(Xc)が、前記内部5’側領域(X)と相補的であり、
前記3’側領域(Yc)が、前記内部3’側領域(Y)と相補的であり、
前記内部領域(Z)、前記5’側領域(Xc)および前記3’側領域(Yc)の少なくとも一つが、前記発現抑制配列を含むことを特徴とする一本鎖核酸分子。 - 前記5’側領域(Xc)と前記内部5’側領域(X)との間に、リンカー領域(Lx)を有し、
前記リンカー領域(Lx)を介して、前記5’側領域(Xc)と前記内部5’側領域(X)とが連結している、請求項1記載の一本鎖核酸分子。 - 前記3’側領域(Yc)と前記内部3’側領域(Y)との間に、リンカー領域(Ly)を有し、
前記リンカー領域(Ly)を介して、前記3’側領域(Yc)と前記内部3’側領域(Y)とが連結している、請求項1または2記載の一本鎖核酸分子。 - 前記5’側領域(Xc)と前記内部5’側領域(X)との間に、リンカー領域(Lx)を有し、
前記リンカー領域(Lx)を介して、前記5’側領域(Xc)と前記内部5’側領域(X)とが連結し、
前記3’側領域(Yc)と前記内部3’側領域(Y)との間に、リンカー領域(Ly)を有し、
前記リンカー領域(Ly)を介して、前記3’側領域(Yc)と前記内部3’側領域(Y)とが連結している、請求項1記載の一本鎖核酸分子。 - 前記内部領域(Z)の塩基数(Z)、前記内部5’側領域(X)の塩基数(X)、前記内部3’側領域(Y)の塩基数(Y)、前記5’側領域(Xc)の塩基数(Xc)および前記3’側領域(Yc)の塩基数(Yc)が、下記式(1)および(2)の条件を満たす、請求項1から4のいずれか一項に記載の一本鎖核酸分子。
Z=X+Y ・・・(1)
Z≧Xc+Yc ・・・(2)
- 前記内部5’側領域(X)の塩基数(X)、前記5’側領域(Xc)の塩基数(Xc)、前記内部3’側領域(Y)の塩基数(Y)および前記3’側領域(Yc)の塩基数(Yc)が、下記(a)〜(d)のいずれかの条件を満たす、請求項1から5のいずれか一項に記載の一本鎖核酸分子。
(a)下記式(3)および(4)の条件を満たす。
X>Xc ・・・(3)
Y=Yc ・・・(4)
(b)下記式(5)および(6)の条件を満たす。
X=Xc ・・・(5)
Y>Yc ・・・(6)
(c)下記式(7)および(8)の条件を満たす。
X>Xc ・・・(7)
Y>Yc ・・・(8)
(d)下記式(9)および(10)の条件を満たす。
X=Xc ・・・(9)
Y=Yc ・・・(10)
- 前記(a)〜(d)において、前記内部5’側領域(X)の塩基数(X)と前記5’側領域(Xc)の塩基数(Xc)の差、前記内部3’側領域(Y)の塩基数(Y)と前記3’側領域(Yc)の塩基数(Yc)の差が、下記条件を満たす、請求項6記載の一本鎖核酸分子。
(a)下記式(11)および(12)の条件を満たす。
X−Xc=1、2または3 ・・・(11)
Y−Yc=0 ・・・(12)
(b)下記式(13)および(14)の条件を満たす。
X−Xc=0 ・・・(13)
Y−Yc=1、2または3 ・・・(14)
(c)下記式(15)および(16)の条件を満たす。
X−Xc=1、2または3 ・・・(15)
Y−Yc=1、2または3 ・・・(16)
(d)下記式(17)および(18)の条件を満たす。
X−Xc=0 ・・・(17)
Y−Yc=0 ・・・(18)
- 前記内部領域(Z)の塩基数(Z)が、19塩基以上である、請求項1から7のいずれか一項に記載の一本鎖核酸分子。
- 前記内部領域(Z)の塩基数(Z)が、19塩基〜30塩基である、請求項8記載の一本鎖核酸分子。
- 前記5’側領域(Xc)の塩基数(Xc)が、1〜11塩基である、請求項1から9のいずれか一項に記載の一本鎖核酸分子。
- 前記5’側領域(Xc)の塩基数(Xc)が、1〜7塩基である、請求項10記載の一本鎖核酸分子。
- 前記5’側領域(Xc)の塩基数(Xc)が、1〜3塩基である、請求項10記載の一本鎖核酸分子。
- 前記3’側領域(Yc)の塩基数(Yc)が、1〜11塩基である、請求項1から12のいずれか一項に記載の一本鎖核酸分子。
- 前記3’側領域(Yc)の塩基数(Yc)が、1〜7塩基である、請求項13記載の一本鎖核酸分子。
- 前記3’側領域(Yc)の塩基数(Yc)が、1〜3塩基である、請求項13記載の一本鎖核酸分子。
- 少なくとも1つの修飾された残基を含む、請求項1から15のいずれか一項に記載の一本鎖核酸分子。
- 標識物質を含む、請求項1から16のいずれか一項に記載の一本鎖核酸分子。
- 安定同位体を含む、請求項1から17のいずれか一項に記載の一本鎖核酸分子。
- RNA分子である、請求項1から18のいずれか一項に記載の一本鎖核酸分子。
- 前記リンカー領域(Lx)および/または前記リンカー領域(Ly)が、ヌクレオチド残基および非ヌクレオチド残基の少なくとも一つから構成される、請求項2から19のいずれか一項に記載の一本鎖核酸分子。
- 前記ヌクレオチド残基が、非修飾ヌクレオチド残基および/または修飾ヌクレオチド残基である、請求項20記載の一本鎖核酸分子。
- 前記リンカー領域(Lx)および/または前記リンカー領域(Ly)が、下記(1)〜(7)のいずれかの残基で構成される、請求項20または21記載の一本鎖核酸分子。
(1)非修飾ヌクレオチド残基
(2)修飾ヌクレオチド残基
(3)非修飾ヌクレオチド残基および修飾ヌクレオチド残基
(4)非ヌクレオチド残基
(5)非ヌクレオチド残基および非修飾ヌクレオチド残基
(6)非ヌクレオチド残基および修飾ヌクレオチド残基
(7)非ヌクレオチド残基、非修飾ヌクレオチド残基および修飾ヌクレオチド残基 - 前記一本鎖核酸分子において、塩基数の合計が、50塩基以上である、請求項1から22のいずれか一項に記載の一本鎖核酸分子。
- 前記遺伝子の発現抑制が、RNA干渉による発現抑制である、請求項1から23のいずれか一項に記載の一本鎖核酸分子。
- 前記一本鎖核酸分子の塩基配列が、
配列番号2、7、8、13、14、29−35、37、43、44、47、48および51−80のいずれかの塩基配列である、請求項1から24のいずれか一項に記載の一本鎖核酸分子。 - 標的遺伝子の発現を抑制するための組成物であって、
請求項1から25のいずれか一項に記載の一本鎖核酸分子を含むことを特徴とする、発現抑制用組成物。 - 請求項1から25のいずれか一項に記載の一本鎖核酸分子を含むことを特徴とする、薬学的組成物。
- 炎症治療用である、請求項27記載の薬学組成物。
- 標的遺伝子の発現を抑制する方法であって、
請求項1から25のいずれか一項に記載の一本鎖核酸分子を使用することを特徴とする発現抑制方法。 - 前記一本鎖核酸分子を、細胞、組織または器官に投与する工程を含む、請求項29記載の発現抑制方法。
- 前記一本鎖核酸分子を、in vivoまたはin vitroで投与する、請求項30記載の発現抑制方法。
- 前記遺伝子の発現抑制が、RNA干渉による発現抑制である、請求項29から31のいずれか一項に記載の発現抑制方法。
- 標的遺伝子の発現を抑制するRNA干渉を誘導する方法であって、
請求項1から25のいずれか一項に記載の一本鎖核酸分子を使用することを特徴とする発現誘導方法。 - 疾患の治療方法であって、
請求項1から25のいずれか一項に記載の一本鎖核酸分子を、患者に投与する工程を含み、
前記一本鎖核酸分子が、前記発現抑制配列として、前記疾患の原因となる遺伝子の発現を抑制する配列を有することを特徴とする治療方法。 - 標的遺伝子の発現抑制のための、請求項1から25のいずれか一項に記載の一本鎖核酸分子の使用。
- RNA干渉の誘導のための、請求項1から25のいずれか一項に記載の一本鎖核酸分子の使用。
- 疾患の治療に使用するための核酸分子であって、
前記核酸分子は、請求項1から25のいずれか一項に記載の一本鎖核酸分子であり、
前記一本鎖核酸分子が、前記発現抑制配列として、前記疾患の原因となる遺伝子の発現を抑制する配列を有することを特徴とする核酸分子。
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