TW201627500A - 用以控制基因表現之單股核酸分子（一） - Google Patents

用以控制基因表現之單股核酸分子（一） Download PDF

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Abstract

本發明提供一種可抑制基因表現之新穎核酸分子，且該核酸分子可容易且有效率地進行製造。即，製成一種單股核酸分子，係含有抑制目標基因表現之抑制表現序列，其特徵在於：從5’端側至3’端側，依序含有5’端側區域(Xc)、內部領域(Z)及3’端側區域(Yc)，前述內部區域(Z)係由內部5’端側區域(X)與內部3’端側區域(Y)連結而構成者，前述5’端側區域(Xc)與前述內部5’端側區域(X)互補，前述3’端側區域(Yc)與前述內部3’端側區域(Y)互補，前述內部區域(Z)、前述5’端側區域及前述3’端側區域中之至少任一者含有前述抑制表現序列。若以此種單股核酸分子，即可抑制前述目標基因之表現。

Description

用以控制基因表現之單股核酸分子(一)
本發明有關於一種抑制基因表現之單股核酸分子、含有其之組成物及其用途。
背景技術
就抑制基因表現之技術而言，舉例來說，已知有RNA干擾(RNAi)(非專利文獻1)。RNA干擾所致之抑制基因表現，舉例而言，一般是藉由將短雙股之RNA分子投予細胞等來實施。前述雙股RNA分子通常被稱為siRNA(small interfering RNA)。此外，有報告指出，透過屬環狀RNA分子且因分子內黏著(anneal)而部分形成雙股之RNA分子，亦可抑制基因表現(專利文獻1)。然而，在此等手法中，誘導抑制基因表現之RNA分子具有如下述般之問題。
首先，製造前述siRNA時，必須具備一先分別合成出正意股及反意股，最後使此等股進行雜交之步驟。因此而有製造效率不佳之問題。此外，將前述siRNA投予細胞時，必須在抑制朝單股RNA解離之狀態下投予至細胞，因此其處理條件之設定亦需煞費勞力。其次，在環狀RNA分子之狀況下，還有其合成甚是困難之問題。
先行技術文獻 專利文獻
【專利文獻1】日本特開2008-278784
非專利文獻
【非專利文獻1】法伊亞氏等(Fire,et al.)，Nature第391巻，p.806-811，1998年。
發明概要
於此，本發明之目的在於提供一種可抑制基因表現之新穎核酸分子，該核酸分子可容易並且效率良好地進行製造。
為了達成前述目的，本發明之單股核酸分子含有抑制目標基因表現之抑制表現序列，其特徵在於：從5’端側至3’端側，依序含有5’端側區域(Xc)、內部區域(Z)及3’端側區域(Yc)，前述內部區域(Z)係由內部5’端側區域(X)及內部3’端側區域(Y)連結所構成，前述5’端側區域(Xc)與前述內部5’端側區域(X)互補，前述3’端側區域(Yc)與前述內部3’端側區域(Y)互補，並且前述內部區域(Z)、前述5’端側區域(Xc)及前述3’端側區域(Yc)中之至少一者含有前述抑制表現序列。
本發明之組成物係用以抑制目標基因表現之組成物，其特徵在於含有前述本發明之單股核酸分子。
本發明之組成物為藥學組成物，其特徵在於含有前述本發明之單股核酸分子。
本發明之抑制表現方法係抑制目標基因表現之方法，其特徵在於使用前述本發明之單股核酸分子。
本發明之疾病治療方法之特徵在於：包含將前述本發明之單股核酸分子投予患者之步驟，前述單股核酸分子具有抑制基因表現之序列作為前述前述抑制表現序列，且該序列為前述疾病之成因。
若依本發明之單股核酸分子，則可抑制基因表現，且因非呈環狀，其合成甚容易，又因屬單股，而無需雙股之黏合步驟，可效率良好地進行製造。
另，本發明之單股核酸分子結構可抑制基因表現一事，乃由本案發明人所首先發現者。本發明之單股核酸分子之抑制基因表現效果雖推測係因與RNA干擾之相同現象所致，但本發明中之抑制基因表現並不侷限及限制於RNA干擾。
第1(A)~1(B)圖為模式圖，顯示本發明之單股核酸分子之一例。
第2(A)~2(B)圖為模式圖，顯示本發明之單股核酸分子之另一例。
第3(A)~3(D)圖為模式圖，顯示本發明之單股核酸分子之其他例。
第4圖為圖表，顯示本發明實施例中之GAPDH基因表現量的相對值。
第5圖為圖表，顯示本發明實施例中之GAPDH基因表現量之相對值。
第6圖為圖表，顯示本發明實施例中A549細胞之GAPDH基因表現量的相對值。
第7圖為圖表，顯示本發明實施例中293細胞之GAPDH基因表現量的相對值。
第8圖為圖表，顯示本發明實施例中之TGF-β1基因表現量的相對值。
第9圖為圖表，顯示本發明實施例中各投予群中每單位重量之肺的TGF-β1基因表現量。
第10圖為圖表，顯示本發明實施例中各投予群之BAFL樣本中的細胞數。
第11圖為圖表，顯示本發明實施例中各投予群之BALF樣本中的嗜中性球細胞數。
第12圖為照片，顯示本發明實施例中BALF樣本中之細胞的吉姆沙染色(Giemsa stain)結果：(A)為LPS(+)/RNA(-)投予群4之結果，(B)為LPS(+)/陰性控制組NK-0035(+)之投予群6的結果，(C)為LPS(+)/NK-0033(+)之實施例投予群5的結果。
第13圖為照片，顯示本發明實施例之肺組織HE染色結果：(A)為LPS(+)/RNA(-)之投予群4的結果，(B)為LPS(+)/陰性控制組NK-0035(+)之投予群6的結果，(C)為LPS(+)/NK-0033(+)之實施例投予群5的結果。
第14(A)圖係顯示本發明實施例中之TGF-β1基因表現量的結果；第14(B)圖係顯示本發明實施例中之IFN-α基因表現量的結果；第14(C)圖係顯示本發明實施例中之IFN-β基因表現量的結果。
第15圖為圖表，顯示本發明實施例中TGF-β1基因表現量之相對值。
第16圖為圖表，顯示本發明實施例TGF-β1基因表現量之相對值。
第17圖為圖表，顯示本發明實施例中各投予群之每單位重量之肺的TGF-β1表現量。
第18(A)圖為圖表，顯示本發明實施例中各投予群之BALF樣本中之 TNF-α量；第18(B)圖為圖表，顯示本發明實施例中各投予群之BALF樣本中之IFN-β量。
第19圖為圖表，顯示本發明實施例中293細胞之LAMA基因表現量的相對值。
第20圖為圖表，顯示本發明實施例中A549細胞之LMNA基因表現量的相對值。
第21圖係一顯示本發明實施例所使用ssRNA之圖。
第22圖為圖表，顯示本發明實施例中GAPDH基因表現量之相對值。
第23圖係一顯示本發明實施例所使用ssRNA之圖。
第24圖為圖表，顯示本發明實施例中GAPDH基因表現量之相對值。
第25圖係一顯示本發明實施例所使用ssRNA之圖。
第26圖為圖表，顯示本發明實施例中GAPDH基因表現量之相對值。
第27圖係一顯示本發明實施例所使用ssRNA之圖。
第28圖為圖表，顯示本發明實施例中GAPDH基因表現量之相對值。
第29圖為圖表，顯示本發明實施例中GAPDH基因表現量之相對值。
第30圖為圖表，顯示本發明實施例中HCT116細胞之GAPDH基因表現量的相對值。
第31圖為電泳照片，顯示本發明實施例中之核糖核酸酶耐性。
第32圖為電泳照片，顯示本發明實施例中之S7核酸酶耐性。
本發明之實施形態
本說明書所使用之用語只要未特別提及，即可使用所屬技術領域通常使用之意義。
1. ssNc分子
如前所述，本發明之單股核酸分子係一種含有抑制目標基因表現之抑制表現序列的單股核酸分子，其特徵在於：從5’端側至3’端側依序含有5’端側區域(Xc)、內部區域(Z)及3’端側區域(Yc)，前述內部區域(Z)係由內部5’端側區域(X)與內部3’端側區域(Y)連結而構成者，前述5’端側區域(Xc)與前述內部5’端側區域(X)互補，前述3’端側區域(Yc)與前述內部3’端側區 域(Y)互補，且前述內部區域(Z)、前述5’端側區域(Xc)及前述3’端側區域(Yc)中之至少一者含有前述抑制表現序列。
於本發明中，舉例來說，「抑制目標基因表現」意指妨礙前述目標基因之表現。前述抑制之機制並未特別受限，舉例而言，可為調降(down-regulation)或靜默(silencing)。前述目標基因表現之抑制，舉例而言，可透過源自前述目標基因之轉錄產物生成量減少、前述轉錄產物活性減少、源自前述目標基因之轉譯產物生成量減少、或是前述轉譯產物活性減少等來確認。舉例來說，前述蛋白質可列舉如成熟蛋白質、或是經處理(processing)或轉譯後接受修飾前之前驅蛋白質。
以下，本發明之單股核酸分子亦稱為本發明之「ssNc分子」。舉例來說，由於本發明之ssNc分子可於活體內(in vivo)或活體外(in vitro)使用於抑制目標基因表現，因此亦稱為「用於抑制目標基因表現之ssNc分子」或「目標基因表現抑制劑」。此外，舉例來說，本發明之ssNc分子可透過RNA干擾來抑制前述目標基因表現，因此亦稱為「RNA干擾用ssNc分子」、「RNA干擾誘導分子」、「RNA干擾劑」或「RNA干擾誘導劑」。再者，舉例來說，本發明之ssNc分子可抑制干擾素誘導(interferon induction)等之副作用。
本發明之ssNc分子之5’端與3’端未連結，因此亦可稱為線狀單股核酸分子。舉例來說，本發明之ssNc分子於其前述內部區域(Z)中，前述內部5’區域(X)與前述內部3’區域(Y)直接連結。
於本發明之ssNc分子中，前述5’端側區域(Xc)與前述內部5’端側區域(X)互補，且前述3’端側區域(Yc)與前述內部3’端側區域(Y)互補。因此，於5’端側中，前述區域(Xc)朝前述區域(X)回折，前述區域(Xc)與前述區域(X)可透過自黏合(self-annealing)而形成雙股，又，於3’端側中，前述區域(Yc)朝前述區域(Y)回折，前述區域(Yc)與前述區域(Y)可透過自黏合而形成雙股。本發明之ssNc分子可如此這般於分子內形成雙股，舉例來說，與習知之用於RNA干擾之siRNA(已分離之兩條單股RNA透過黏合而形成雙股RNA)結構明顯不同。
本發明之ssNc分子中，舉例來說，前述抑制表現序列在本發明之ssNc分子以in vivo或in vitro形式導入細胞內時，係一顯示出抑制前述目標基因 表現之活性的序列。前述抑制表現序列並未特別受限，可因應目標基因種類來適當設定。舉例來說，前述抑制表現序列可適當地運用與利用siRNA所致RNA干擾相關之序列。一般而言，RNA干擾為下述現象：長雙股RNA(dsRNA)在細胞內透過截切器(Dicer)而被截斷成3’端突出之19~21鹼基對程度的雙股RNA(siRNA：small interfering RNA)，其中一單股RNA與目標mRNA結合，藉由分解前述mRNA來抑制前述mRNA之轉譯。舉例來說，與前述目標mRNA結合之前述siRNA中，單股RNA之序列依目標基因之種類而異，已有各種受到報告。於本發明中，舉例而言，可將前述siRNA之單股RNA序列用作前述抑制表現序列。
另，本發明並非將相對前述目標基因之前述抑制表現序列的序列資訊作為重點，而是關於一種核酸分子之結構，該核酸分子係用以使前述抑制表現序列所產生之抑制前述目標基因表現的活性在諸如細胞內發揮機能。因此，於本發明中，舉例而言，除了申請時已成為習知之前述siRNA的單股RNA序列之外，即便是將來才會明朗化之序列，亦可作為前述抑制抑制表現序列來予以利用。
舉例來說，前述抑制表現序列相對於前述目標基因之預定區域宜具有90%以上之互補性，且宜為95%，更宜為98%，而以100%尤佳。藉由滿足此種互補性，舉例來說，可使脫靶(off-target)情況充分減少。
作為具體例，在目標基因為GAPDH基因時，前述抑制表現序列可使用例如序列編號1所示19個鹼基長之序列；目標基因為TGF-β1時，前述抑制表現序列可使用例如序列編號16所示21個鹼基長之序列；目標基因為LAMA1基因時，前述抑制表現序列可使用例如序列編號5所示19個鹼基長之序列；目標基因為LMNA基因時，可使用序列編號6所示19個鹼基長之序列。
5’-GUUGUCAUACUUCUCAUGG-3’(序列編號1)
5’-AAAGUCAAUGUACAGCUGCUU-3’(序列編號16)
5’-AUUGUAACGAGACAAACAC-3’(序列編號5)
5’-UUGCGCUUUUUGGUGACGC-3’(序列編號6)
推測本發明之ssNc分子所致前述目標基因表現之抑制係因RNA干擾 或類似於RNA干擾之現象(類RNA干擾之現象)所引起，該現象舉例來說係藉由採用前述內部區域(Z)、前述5’端側區域(Xc)及前述3’端側區域(Yc)中之至少一者配置有前述抑制表現序列之結構而產生。此外，本發明並不受該機制所限制。舉例來說，本發明之ssNc分子並非如所謂之siRNA般以兩條單股RNA所構成之dsRNA形式來導入細胞等，又，舉例來說，在細胞內未必需要前述抑制表現序列之切斷。因此，舉例來說，亦可稱本發明之ssNc分子具有類RNA干擾之機能。
於本發明之ssNc分子中，前述抑制表現序列係如前所述，包含在前述內部區域(Z)、前述5’端側區域(Xc)及前述3’端側區域(Yc)中之至少一者。舉例而言，本發明之ssNc分子可具有1個前述抑制表現序列，且亦可具有2個。
在後者之情況下，舉例來說，本發明之ssNc分子可具有2個以上相對於相同目標基因之相同抑制表現序列，且可具有2個以上相對於相同目標基因之相異抑制表現序列，亦可具有2個以上相對於相異目標基因之相異抑制表現序列。本發明之ssNc分子具有2個以上前述抑制表現序列時，各抑制表現序列之配置處並未特別受限，可為前述內部區域(Z)、前述5’端側區域(Xc)及前述3’端側區域(Yc)中之任一區域，且亦可為不同區域。本發明之ssNc分子具有2個以上相對於相異目標基因之前述抑制表現序列時，舉例來說，依本發明之ssNc分子而定，可抑制2種以上之相異目標基因的表現。
前述內部區域(Z)係如前述般，前述內部5’端區域(X)前述內部3’端區域(Y)呈連結。舉例來說，前述區域(X)與前述區域(Y)直接連結，其間不具有介入序列。前述內部區域(Z)為了表示與前述5’端側區域(Xc)及前述3’端側區域(Xc)之序列關係，而表記成「係由前述內部5’端側區域(X)與前述內部3’端側區域(Y)連結所構成」，且於前述內部區域(Z)中，舉例來說，前述5’端側區域(Xc)與前述3’端側區域(Xc)在前述ssNc分子之使用過程中，並未限定為各別獨立之區域。即，舉例來說，前述內部區域(Z)具有前述抑制表現序列時，於前述內部區域(Z)中，前述抑制表現序列可跨前述區域(X)與前述區域(Y)作配置。
本發明之ssNc分子中，前述5’端側區域(Xc)與前述內部5’端側區域(X)互補。於此，前述區域(Xc)僅需具有相對於前述區域(X)之全區域或其部分區域呈互補之序列即可，具體來說，例如，以含有與前述區域(X)之全區域或其部分區域互補之序列，或是由前述互補序列所構成為佳。舉例來說，前述區域(Xc)相對於前述區域(X)之前述互補全區域或前述互補部分區域可為完全互補，亦可有1個或數個鹼基非呈互補，但以完全互補為佳。本發明之ssNc分子中，前述3’端側區域(Yc)與前述內部3’端側區域(Y)互補。於此，前述區域(Yc)僅需具有與前述區域(Y)之全區域或其部分區域互補之序列即可，具體來說，例如，以含有相對於前述區域(Y)之全區域或其部分區域呈互補之序列，或是由前述互補序列所構成為佳。前述區域(Yc)相對於前述區域(Y)之前述互補全區域或前述互補部分區域，舉例來說，可為完全互補，亦可有1個或數個鹼基非呈互補，但以完全互補為佳。舉例來說，前述1個鹼基或數個鹼基為1~3個鹼基，且宜為1個鹼基或2個鹼基。
本發明之ssNc分子中，舉例而言，前述5’端側區域(Xc)與前述內部5’端側區域(X)可直接連結，亦可間接連結。在前者之情況下，直接連結可列舉如利用磷酸二酯(phosphodiester)鍵之連結。在後者之情況下，舉例來說可列舉如：前述區域(Xc)與前述區域(X)之間具有連結區域(Lx)，且前述區域(Xc)與前述區域(X)透過前述連結區域(Lx)而連結的形態。
本發明之ssNc分子中，舉例來說，前述3’端側區域(Yc)與前述內部3’端側區域(Y)可直接連結，亦可間接連結。在前者之情況下，直接連結可列舉如利用磷酸二酯鍵之連結。後者之情況下，舉例來說則可列舉如：前述區域(Yc)與前述區域(Y)之間具有連結區域(Ly)，且前述區域(Yc)與前述區域(Y)透過前述連結區域(Ly)而連結的形態。
舉例而言，本發明之ssNc分子可具有前述連結區域(Lx)及前述連結區域(Ly)兩者，亦可具有其中之任一者。在後者之情況下，舉例來說，可列舉如：前述5’端側區域(Xc)與前述內部5’端側區域(X)之間具有前述連結區域(Lx)，且前述3’端側區域(Yc)與前述內部3’端側區域(Y)之間不具有前述連結區域(Ly)，即，前述區域(Yc)與前述區域(Y)直接連結之形態。此外，在後者之情況下，舉例來說，可列舉如：前述3’端側區域(Yc)與前述內部3’ 端側區域(Y)之間具有前述連結區域(Ly)，且前述5’端側區域(Xc)與前述內部5’端側區域(X)之間不具有前述連結區域(Lx)，即，前述區域(Xc)與前述區域(X)直接連結之形態。
前述連結區域(Lx)及前述連結區域(Ly)宜分別呈在本身之區域內部不會發生自黏合之結構。
就本發明之ssNc分子，茲將不具有前述連結區域之ssNc分子之一例顯示於第1圖之模式圖中。第1(A)圖係一模式圖，其針對前述ssNc分子顯示從5’端側朝3’端側之各區域順序概略，第1(B)圖則是顯示前述ssNc分子在前述分子內形成雙股之狀態的模式圖。如第1(B)圖所示，前述ssNc分子中，前述5’端側區域(Xc)回折，前述5’端側區域(Xc)與前述內部5’端側區域(X)之間形成雙股，前述3’端側區域(Yc)回折，前述3’端側區域(Yc)與前述內部3’端側區域(Y)之間形成雙股。第1圖僅用以顯示各區域之連結順序及形成雙股之各區域的位置關係，舉例來說，各區域之長度等並不受其限制。
就本發明之ssNc分子，茲將具有前述連結區域之ssNc分子之一例顯示於第2圖之模式圖中。第2(A)圖為模式圖，其針對前述ssNc分子顯示從5’端側朝3’端側之各區域順序概略作為一例，第2(B)圖則是顯示前述ssNc分子於前述分子內形成雙股之狀態的模式圖。如第2(B)圖所示，前述ssNc分子中，前述5’端側區域(Xc)與前述內部5’端側區域(X)之間以及前述內部3’端側區域(Y)與前述3’端側區域(Yc)之間形成雙股，前述Lx區域及前述Ly區域採迴圈結構(loop structure)。第2圖僅用以顯示各區域之連結順序及形成雙股之各區域的位置關係，舉例來說，各區域之長度等並不受其限制。
於本發明之ssNc分子中，前述5’端側區域(Xc)、前述內部5’端側區域(X)、前述內部3’端側區域(Y)及前述3’端側區域(Yc)之鹼基數並未特別受限，例如下述者。於本發明中，舉例來說，「鹼基數」意指「長度」，亦可稱為「鹼基長」。
前述5’端側區域(Xc)係如前述，舉例來說，亦可與前述內部5’端側區域(X)之全區域互補。此時，舉例來說，前述區域(Xc)宜與前述區域(X)為相同鹼基長，且宜由與前述區域(X)之5’端至3’端之全區域互補的鹼基序列所 構成。前述區域(Xc)更宜與前述區域(X)為相同鹼基長，且前述區域(Xc)之全部鹼基與前述區域(X)之全部鹼基互補，即，例如宜呈完全互補。另，並不受限於此，舉例來說亦可如前述，有1或數個鹼基非呈互補。
此外，前述5’端側區域(Xc)係如前所述，例如，可與前述內部5’端側區域(X)之部分區域互補。此時，舉例來說，前述區域(Xc)與前述區域(X)之部分區域宜為相同鹼基長，即，宜由較前述區域(X)短1個鹼基以上之鹼基長的鹼基序列所構成。前述區域(Xc)更宜與前述區域(X)之前述部分區域為相同鹼基長，且前述區域(Xc)之全部鹼基與前述區域(X)之前述部分區域的全部鹼基互補，即，例如宜完全互補。舉例來說，前述區域(X)之前述部分區域宜為前述區域(X)中由5’端之鹼基(第1個鹼基)起連續之鹼基序列所構成的區域(片段)。
前述3’端側區域(Yc)係如前所述，舉例來說，亦可與前述內部3’端側區域(Y)之全區域互補。此時，舉例來說，前述區域(Yc)宜與前述區域(Y)為相同鹼基長，且宜由與前述區域(Y)之5’端至3’端之全區域互補的鹼基序列所構成。前述區域(Yc)更宜與前述區域(Y)為相同鹼基長，且前述區域(Yc)之全部鹼基與前述區域(Y)之全部鹼基互補，即，例如宜完全互補。另，不受此限，舉例來說，亦可如前述般有1或數個鹼基非為互補。
此外，此外，前述3’端側區域(Yc)係如前所述，例如，可與前述內部3’端側區域(Y)之部分區域互補。此時，舉例來說，前述區域(Yc)宜與前述區域(Y)之部分區域為相同鹼基長，即，宜由較前述區域(Y)短1個鹼基以上之鹼基長的鹼基序列所構成。前述區域(Yc)更宜與前述區域(Y)之前述部分區域為相同鹼基長，且前述區域(Yc)之全部鹼基與前述區域(Y)之前述部分區域的全部鹼基互補，即，例如宜完全互補。舉例來說，前述區域(Y)之前述部分區域宜為前述區域(Y)中由3’端之鹼基(第1個鹼基)起連續之鹼基序列所構成的區域(片段)。
本發明之ssNc分子中，前述內部區域(Z)之鹼基數(Z)與前述內部5’端側區域(X)之鹼基數(X)及前述內部3’端側區域(Y)之鹼基數(Y)的關係、以及前述內部區域(Z)之鹼基數(Z)與前述內部5’端側區域(X)之鹼基數(X)及前述5’端側區域(Xc)之鹼基數(Xc)的關係，舉例來說，滿足下述式(1)及(2)之條件。
Z=X+Y‧‧‧(1)
Z≧Xc+Yc‧‧‧(2)
本發明之ssNc分子中，前述內部5’端側區域(X)之鹼基數(X)與前述內部3’端側區域(Y)之鹼基數(Y)的長度關係並未特別受限，舉例來說，亦可滿足下述式中之任一條件。
X=Y‧‧‧(19)
X<Y‧‧‧(20)
X>Y‧‧‧(21)
本發明之ssNc分子中，前述內部5’端側區域(X)之鹼基數(X)、前述5’端側區域(Xc)之鹼基數(Xc)、前述內部3’端側區域(Y)之鹼基數(Y)及前述3’端側區域(Yc)之鹼基數(Yc)的關係舉例來說滿足下述(a)~(d)中之任一條件。(a)滿足下述式(3)及(4)之條件。
X>Xc‧‧‧(3)
Y=Yc‧‧‧(4)
(b)滿足下述式(5)及(6)之條件。
X=Xc‧‧‧(5)
Y>Yc‧‧‧(6)
(c)滿足下述式(7)及(8)之條件。
X>Xc‧‧‧(7)
Y>Yc‧‧‧(8)
(d)滿足下述式(9)及(10)之條件。
X=Xc‧‧‧(9)
Y=Yc‧‧‧(10)
前述(a)~(d)中，前述內部5’端側區域(X)之鹼基數(X)與前述5’端側區域(Xc)之鹼基數(Xc)的差、前述內部3’端側區域(Y)之鹼基數(Y)與前述3’端側區域(Yc)之鹼基數(Yc)的差，舉例來說宜滿足下述條件。
(a)滿足下述式(11)及(12)之條件。
X-Xc=1~10；且以1、2、3或4為宜，更自為1、2或3。‧‧‧(11)
Y-Yc=0‧‧‧(12)
(b)滿足下述式(13)及(14)之條件。
X-Xc=0‧‧‧(13)
Y-Yc=1~10；且以1、2、3或4為宜，更自為1、2或3。‧‧‧(14)
(c)滿足下述式(15)及(16)之條件。
X-Xc=1~10；且以1、2或3為宜，更宜為1或2。‧‧‧(15)
Y-Yc=1~10；且以1、2或3為宜，更宜為1或2。‧‧‧(16)
(d)滿足下述式(17)及(18)之條件。
X-Xc=0‧‧‧(17)
Y-Yc=0‧‧‧(18)
茲就前述(a)~(d)之ssNc分子，將其等之個別結構的一例顯示於第3圖之模式圖。第3圖為含有前述連結區域(Lx)及前述連結區域(Ly)之ssNc，(A)為前述(a)之ssNc分子之例，(B)為前述(b)之ssNc分子之例，(C)為前述(c)之ssNc分子之例，(D)為前述(d)之ssNc分子之例。於第3圖中，虛線表示因自黏合而結合形成雙股的狀態。第3圖之ssNc分子將前述內部5’端側區域(X)之鹼基數(X)與前述內部3’端側區域(Y)之鹼基數(Y)以前述式(20)之「X<Y」形式來表現，但並不限於此，而如前述般可為前述式(19)之「X=Y」，亦可為前述式(21)之「X>Y」。此外，第3圖僅是用以表示前述內部5’端側區域(X)與前述5’端側區域(Xc)之關係以及前述內部3’端側區域(Y)與前述3’端側區域(Yc)之關係的模式圖，舉例來說，各區域之長度及形狀等並侷限於此，又，連結區域(Lx)及連結區域(Ly)之有無亦不受其限制。
舉例而言，前述(a)~(c)之ssNc分子藉由前述5’端側區域(Xc)與前述內部5’端側區域(X)以及前述3’端側區域(Yc)與前述內部3’端側區域(Y)分別形成雙股，而成為於前述內部區域(Z)中前述5’端側區域(Xc)及前述3’端側區域(Yc)均具有無法對準(alignment)之鹼基的結構，亦可稱為具有不形成雙股之鹼基的結構。以下，將前述內部區域(Z)中之前述無法對準之鹼基(亦稱為不形成雙股之鹼基)稱為「自由鹼基」。於第3圖中，以「F」表示前述自由鹼基之區域。前述區域(F)之鹼基數並未特別受限。舉例來說，前述區域(F)之鹼基數(F)在前述(a)之ssNc分子的情況下為「X-Xc」之鹼基數，在前述(b)之ssNc分子的情況下為「Y-Yc」之鹼基數，在前述(c)之ssNc分子的 情況下則為「X-Xc」之鹼基數與「Y-Yc」之鹼基數的合計數值。
另一方面，前述(d)之ssNc分子呈現例如前述內部區域(Z)之全區域與前述5’端側區域(Xc)及前述3’端側區域(Yc)對準之結構，亦可稱為前述內部區域(Z)之全區域形成雙股之結構。另外，前述(d)之ssNc分子中，前述5’端側區域(Xc)之5’端與前述3’端側區域(Yc)之3’端未連結。
茲就本發明之ssNc分子，將各區域之長度例示如下，但本發明並不受其侷限。於本發明中，舉例來說，鹼基數之數值範圍係將隸屬該範圍之全部正整數予以揭示，例如，「1~4鹼基」之記載意指「1、2、3、4鹼基」之全部揭示內容(以下同樣)。
舉例來說，前述5’端側區域(Xc)、前述3’端側區域(Yc)及前述內部區域(Z)中之前述自由鹼基(F)之鹼基數合計會成為前述內部區域(Z)之鹼基數。因此，前述5’端側區域(Xc)及前述3’端側區域(Yc)之長度舉例來說可因應前述內部區域(Z)之長度、前述自由鹼基數(F)及其位置來適當決定。
舉例來說，前述內部區域(Z)之鹼基數在19個鹼基以上。舉例來說，前述鹼基數之下限為19個鹼基，且宜為20個鹼基，更宜為21個鹼基。舉例而言，前述鹼基數之上限為50個鹼基，且宜為40個鹼基，更宜為30個鹼基。前述內部區域(Z)之鹼基數的具體例係例如19個鹼基、20個鹼基、21個鹼基、22個鹼基、23個鹼基、24個鹼基、25個鹼基、26個鹼基、27個鹼基、28個鹼基、29個鹼基或30個鹼基。
前述內部區域(Z)含有前述抑制表現序列時，舉例來說，前述內部區域(Z)可為僅由前述抑制表現序列所構成之區域，亦可為含有前述抑制表現序列之區域。前述抑制表現序列之鹼基數舉例來說為19~30個鹼基，且宜為19、20或21個鹼基。前述內部區域(Z)含有前述抑制表現序列時，前述抑制表現序列之5’端側及/或3’端側亦可更具有附加序列。前述附加序列之鹼基數舉例來說為1~31個鹼基，且宜為1~21個鹼基，更宜為1~11個鹼基，尤宜為1~7個鹼基。
舉例來說，前述5’端側區域(Xc)之鹼基數為1~29個鹼基，且宜為1~11個鹼基，較宜為1~7個鹼基，更宜為1~4個鹼基，而以1個鹼基、2個鹼基、3個鹼基尤佳。前述內部區域(Z)或前述3’端側區域(Yc)含有前述抑制表現 序列時，舉例而言，宜具有此種鹼基數。作為具體例，前述內部區域(Z)之鹼基數為19~30個鹼基(例如19個鹼基)時，舉例來說，前述5’端側區域(Xc)之鹼基數為1~11個鹼基，且宜為1~7個鹼基，較宜為1~4個鹼基，且更宜為1個鹼基、2個鹼基、3個鹼基。
前述5’端側區域(Xc)含有前述抑制表現序列時，舉例來說，前述5’端側區域(Xc)可為僅由前述抑制表現序列所構成之區域，亦可為含有前述抑制表現序列之區域。前述抑制表現序列之長度例如前述。前述5’端側區域(Xc)含有前述抑制表現序列時，前述抑制表現序列之5’端側及/或3’端側亦可更具有附加序列。舉例來說，前述附加序列之鹼基數為1~11個鹼基，且以1~7個鹼基為佳。
舉例來說，前述3’端側區域(Yc)之鹼基數為1~29個鹼基，且宜為1~11個鹼基，較宜為1~7個鹼基，更宜為1~4個鹼基，且以1個鹼基、2個鹼基、3個鹼基尤佳。前述內部區域(Z)或前述5’端側區域(Xc)含有前述抑制表現序列時，舉例來說，宜為此種鹼基數。作為具體例，前述內部區域(Z)之鹼基數為19~30個鹼基(例如19個鹼基)時，舉例來說，前述3’端側區域(Yc)之鹼基數為1~11個鹼基，且宜為1~7個鹼基，更宜為1~4個鹼基，且以1個鹼基、2個鹼基、3個鹼基尤佳。
前述3’端側區域(Yc)含有前述抑制表現序列的情況下，舉例來說，前述3’端側區域(Yc)可為僅由前述抑制表現序列所構成之區域，亦可是含有前述抑制表現序列之區域。前述抑制表現序列之長度如前述所示。前述3’端側區域(Yc)含有前述抑制表現序列時，前述抑制表現序列之5’端側及/或3’端側亦可更具有附加序列。前述附加序列之鹼基數例如可為1~11個鹼基，且以1~7個鹼基為佳。
如前所述，前述內部區域(Z)、前述5’端側區域(Xc)及前述3’端側區域(Yc)之鹼基數舉例來說可以前述式(2)之「Z≧Xc+Yc」來表示。作為具體例，舉例來說，「Xc+Yc」之鹼基數與前述內部區域(Z)相同，或是較前述內部區域(Z)更小。在後者之情況下，舉例來說「Z-(Xc+Yc)」為1~10，且宜為1~4，更宜為1、2或3。舉例而言，前述「Z-(Xc+Yc)」相當於前述內部區域(Z)中前述自由鹼基之區域(F)的鹼基數(F)。
於本發明之ssNc分子中，前述連結區域(Lx)及前述連結區域(Ly)之長度並未特別受限。舉例來說，前述連結區域(Lx)宜為前述內部5’端側區域(X)與前述5’端側區域(Xc)可形成雙股之長度，舉例來說，前述連結區域(Ly)宜為前述內部3’端側區域(Y)與前述3’端側區域(Yc)可形成雙股之長度。前述連結區域(Lx)及前述連結區域(Ly)之構成單元含有鹼基時，前述連結區域(Lx)及前述連結區域(Ly)各別之鹼基數可相同亦可不同，此外，其鹼基序列亦可相同或不同。前述連結區域(Lx)及前述連結區域(Ly)之鹼基數的下限舉例來說為1個鹼基，且宜為2個鹼基，更宜為3個鹼基，其上限則舉例來說為100個鹼基，且宜為80個鹼基，更宜為50個鹼基。前述各連結區域之鹼基數就具體例而言，舉例來說可例示如1~50個鹼基、1~30個鹼基、1~20個鹼基、1~10個鹼基、1~7個鹼基及1~4個鹼基等，但並不侷限於此。
本發明之ssNc分子的全長並未特別受限。本發明之ssNc分子中，前述鹼基數合計(全長之鹼基數)的下限舉例來說為38個鹼基，且宜為42個鹼基，更宜為50個鹼基，且更以51個鹼基為佳，尤宜為52個鹼基；其上限舉例來說為300個鹼基，且宜為200個鹼基，更宜為150個鹼基，更以100個鹼基為佳，且尤宜為80個鹼基。本發明之ssNc分子中，前述連結區域(Lx)及連結區域(Ly)除外之鹼基數合計的下限舉例來說為38個鹼基，且以42個鹼基為宜，更宜為50個鹼基，且更以51個鹼基為佳，尤宜為52個鹼基；上限則舉例來說為300個鹼基，並以200個鹼基為宜，更宜為150個鹼基，更以100個鹼基為佳，尤宜為80個鹼基。
本發明之ssNc分子的構成單元並未特別受限，可列舉如核苷酸殘基。前述核苷酸殘基則可列舉如核糖核苷酸殘基及去氧核糖核苷酸殘基。前述核苷酸殘基可列舉如未經修飾之非修飾核苷酸殘基以及業經修飾之修飾核苷酸殘基。舉例而言，本發明之ssNc分子可藉由含有前述修飾核苷酸殘基而提高核酸酶耐性，並提高安定性。再者，舉例來說，本發明之ssNc分子除了前述核苷酸殘基之外，更可含有非核苷酸殘基。前述核苷酸殘基及前述非核苷酸殘基之詳情則如後述。
於本發明之ssNc分子中，前述內部區域(Z)、前述5’端側區域(Xc)及前述3’端側區域(Yc)之構成單元分別以前述核苷酸殘基為宜。舉例來說，前 述各區域可以下述(1)~(3)之殘基來構成：(1)非修飾核苷酸殘基；(2)修飾核苷酸殘基；以及(3)非修飾核苷酸殘基及修飾核苷酸殘基。
於本發明之ssNc分子中，前述連結區域(Lx)及前述連結區域(Ly)之構成單元並未特別受限，舉例來說，可列舉如前述核苷酸殘基及前述非核苷酸殘基。前述連結區域舉例來說可僅由前述核苷酸殘基所構成，亦可僅由前述非核苷酸殘基所構成，尚可由前述核苷酸殘基與前述非核苷酸殘基所構成。前述連結區域舉例來說由下述(1)~(7)之殘基所構成：(1)非修飾核苷酸殘基；(2)修飾核苷酸殘基；(3)非修飾核苷酸殘基及修飾核苷酸殘基；(4)非核苷酸殘基；(5)非核苷酸殘基及非修飾核苷酸殘基；(6)非核苷酸殘基及修飾核苷酸殘基；以及(7)非核苷酸殘基、非修飾核苷酸殘基及修飾核苷酸殘基。
本發明之ssNc分子具有前述連結區域(Lx)及前述連結區域(Ly)兩者時，舉例來說，兩者之構成單元可相同亦可不同。就具體例來說，可列舉如：兩者之連結區域的構成單元為前述核苷酸殘基之形態；兩者之連結區域的構成單元為前述非核苷酸殘基之形態；以及，其中一區域之構成單元為前述核苷酸殘基，另一連結區域之構成單元則為非核苷酸殘基的形態等。
本發明之ssNc分子舉例來說可列舉如僅由前述核苷酸殘基所構成之分子、除了前述核苷酸殘基之外還含有前述非核苷酸殘基之分子等。於本發明之ssNc分子中，前述核苷酸殘基係如前所述，舉例來說，可僅為前述非修飾核苷酸殘基，亦可僅為前述修飾核苷酸殘基，尚可為前述非修飾核苷酸殘基與前述修飾核苷酸殘基兩者。前述ssNc分子含有前述非修飾核苷酸殘基與前述修飾核苷酸殘基時，前述修飾核苷酸殘基之個數並未特別受限，例如為「1或數個」，具體而言則例如為1~5個，且宜為1~4個，更宜為1~3個，而最宜為1或2個。本發明之ssNc分子含有前述非核苷酸殘基 時，前述非核苷酸殘基之個數並未特別受限，舉例來說為「1或數個」，具體而言則例如為1~8個、1~6個、1~4個、1、2或3個。
本發明之ssNc分子中，舉例來說前述核苷酸殘基宜為核糖核苷酸殘基。此時，舉例而言，本發明之ssNc分子亦稱為「RNA分子」或「ssRNA分子」。前述ssRNA分子可列舉如僅由前述核糖核苷酸殘基所構成之分子、除前述核糖核苷酸殘基之外還含有前述非核苷酸殘基之分子。前述ssRNA分子中，前述核糖核苷酸殘基如前所述般，舉例來說可僅為前述非修飾核糖核苷酸殘基，亦可僅為前述修飾核糖核苷酸殘基，亦可含有前述非修飾核糖核苷酸殘基與前述修飾核糖核苷酸殘基兩者。
舉例來說，前述ssRNA分子在除了前述非修飾核糖核苷酸殘基之外還含有前述修飾核糖核苷酸殘基時，前述修飾核糖核苷酸殘基之個數並未特別受限，例如為「1或數個」，具體來說例如為1~5個，且宜為1~4個，更宜為1~3個，而最宜為1或2個。舉例來說，相對於前述非修飾核糖核苷酸殘基之前述修飾核糖核苷酸殘基亦可為核糖殘基業經去氧核糖殘基取代之前述去氧核糖核苷酸殘基。舉例來說，前述ssRNA分子在除了前述非修飾核糖核苷酸殘基之外還含有前述去氧核糖核苷酸殘基時，前述去氧核糖核苷酸殘基之個數並未特別受限，例如為「1或數個」，具體來說則例如為1~5個，且宜為1~4個，更宜為1~3個，且最宜為1或2個。
舉例來說，本發明之ssNc分子亦可含有標識物質且以前述標識物質而受到標識化。前述標識物質並未特別受限，可列舉如螢光物質、色素及同位素等。前述標識物質可列舉如芘、TAMRA、螢光黃(fluorescein)、Cy3色素、Cy5色素等之螢光團，且前述色素可列舉如Alexa488等之Alexa色素等。前述同位素可列舉如穩定同位素及放射性同位素，且宜為穩定同位素。前述穩定同位素舉例來說由於幅射外洩之危險性較少，且無需專門設備而具優異之處理性，此外，亦可減低成本。再者，舉例來說，經前述穩定同位素標識之化合物無物性變化，用作示蹤劑(tracer)之性質亦優異。前述穩定同位素並無特別受限，可列舉如2H、13C、15N、17O、18O、33S、34S及36S。
本發明之ssNc分子如前述般可抑制前述目標基因之表現。因此，舉例來說，本發明之ssNc分子可用作基因為成因之疾病的治療劑。舉例來說， 本發明之ssNc分子在含有可抑制前述疾病成因之基因表現的序列來作為前述抑制表現序列時，例如，可透過抑制前述目標基因之表現來治療前述疾病。於本發明中，舉例來說，「治療」包含前述疾病之預防、疾病之改善及預後之改善等意義，可為其中任一者。
本發明之ssNc分子之使用方法並未特別受限，例如，對具有前述目標基因之投予對象投予前述ssNc分子即可。
前述投予對象可列舉如細胞、組織或器官。前述投予對象可列舉如人類以及人類以外之非人哺乳類等之非人動物。舉例來說，前述投予可作活體內(in vivo)亦可作活體外(in vitro)。前述細胞並未特別受限，可列舉如HeLa細胞、293細胞、NIH3T3細胞、COS細胞等之各種培養細胞、ES細胞、造血幹細胞等之幹細胞、初代培養細胞等由活體單離出之細胞等。
於本發明中，抑制表現對象之前述目標基因並未特別受限，可設定所欲之基因。且如前所述，僅需因應前述目標基因之種類來適當設計前述抑制表現序列即可。
茲將本發明之ssNc分子之具體例顯示如下，但本發明並不因此而受到任何限制。前述ssNc分子之鹼基序列可例示如序列編號2、7、8、13、14、29-35、37、43、44、47、48及51-80之鹼基序列，此外，前述鹼基序列中，舉例來說亦可是1或數個缺損、取代及/或附加之鹼基序列。前述目標基因為GAPDH基因時，可列舉如序列編號2、7、8、13、37及51-80之鹼基序列；目標基因為TGF-β1時，可列舉如序列編號14、29-35之鹼基序列；前述目標基因為LAMA1基因時，可列舉如序列編號43、44之鹼基序列；前述目標基因為LMNA基因時，則可列舉如序列編號47、48之鹼基序列。
關於本發明之ssNc分子的用途，則可參照後述之本發明組成物、抑制表現方法及治療方法等之記載。
如前所述，由於本發明之ssNc分子可抑制目標基因之表現，舉例來說，作為醫藥品、診斷藥、農藥以及農藥、醫學、生命科學等之研究工具等甚是有用。
2. 核苷酸殘基
舉例來說，前述核苷酸殘基含有糖、鹼基及磷酸作為構成要素。前述 核苷酸殘基係如前述，可列舉如核糖核苷酸殘基及去氧核糖核苷酸殘基。舉例而言，前述核糖核苷酸殘基具有核糖殘基作為糖，且具有腺嘌呤(A)、鳥嘌呤(G)、胞嘧啶(C)及U(尿嘧啶)作為鹼基；前述去氧核糖殘基則例如具有去氧核糖殘基作為糖，且具有腺嘌呤(A)、鳥嘌呤(G)、胞嘧啶(C)及胸腺嘧啶(T)作為鹼基。
前述核苷酸殘基可列舉未修飾核苷酸殘基及修飾核苷酸殘基。舉例來說，前述未修飾核苷酸殘基之前述各構成要素可與天然存在物相同或實質相同，且宜與天然存在於人體內者相同或實質相同。
舉例來說，前述修飾核苷酸殘基為將前述未修飾核苷酸殘基予以修飾而成之核苷酸殘基。又舉例來說，前述修飾核苷酸殘基之前述未修飾核苷酸殘基的構成要素中之任一者亦可經修飾。於本發明中，舉例來說，「修飾」即是前述構成要素之取代、附加及/或缺損、前述構成要素中之原子及/或官能基之取代、附加及/或缺損，亦可稱為「改變」。前述修飾核苷酸殘基可列舉如天然存在之核苷酸殘基、經人工修飾之核苷酸殘基等。前述源自天然之修飾核苷酸殘基可參照如林巴赫氏等人(Limbach et al.,1994,Summary：the modified nucleosides of RNA,Nucleic Acids Res.22：2183~2196)。此外，前述修飾核苷酸殘基舉例來說亦可為前述核苷酸替代物之殘基。
前述核苷酸殘基之修飾可列舉如核糖-磷酸骨架(以下稱核糖磷酸骨架)之修飾。
前述核糖磷酸骨架中，例如可將核糖殘基進行修飾。舉例來說，前述核糖殘基可修飾2’位之碳，具體來說例如可將與2’位之碳鍵結之羥基取代成氫或氟等鹵素。藉由將前述2’位碳之羥基取代成氫，可將核糖殘基取代成去氧核糖。舉例來說，前述核糖殘基可取代成立體異構物，例如，亦可取代成阿拉伯糖殘基。
前述核糖磷酸骨架舉例來說亦可取代成具有非核糖殘基及/或非磷酸之非核糖磷酸骨架。前述非核糖磷酸骨架可列舉如前述核糖磷酸骨架之非帶電體。經取代為前述非核糖磷酸骨架之前述核苷酸替代物可列舉如N-嗎啉基(morpholino)、環丁基、吡啶等。前述替代物除前述者外還可列舉如人工核酸單體殘基。作為具體例，可列舉如PNA(肽核酸)、LNA(鎖固核酸：Locked Nucleic Acid)、ENA(2’-O，4’-C-伸乙基橋接核酸：2’-O，4’-C-Ethylene bridged Nucleic Acid)等，且宜為PNA。
於前述核糖磷酸骨架中，舉例來說，可將磷酸基予以修飾。於前述核糖磷酸骨架中，最與糖殘基鄰接之磷酸基被稱為α磷酸基。前述α磷酸基帶負電，其電荷跨非與糖殘基結合之2個氧原子而均勻分佈。前述α磷酸基之4個氧原子中，在核苷酸殘基間之磷酸二酯鍵結中非與糖殘基鍵結之2個氧原子以下亦稱作「非結合(non-linking)氧」。另一方面，在前述核苷酸殘基間之磷酸二酯鍵結中，與糖殘基鍵結之2個氧原子則以下稱為「結合(linking)氧」。舉例來說，前述α磷酸基宜進行呈非帶電之修飾，或是使前述非結合氧中之電荷分布呈非對稱型之修飾。
舉例而言，前述磷酸基亦可將前述非結合氧取代。前述之氧可藉由例如S(硫)、Se(砷)、B(硼)、C(碳)、H(氫)、N(氮)及OR(R為烷基或芳基)中之任一原子作取代，且宜以S作取代。舉例來說，前述非結合氧例宜兩者均被取代，且更宜兩者均被S取代。前述修飾磷酸基可列舉如硫代磷酸酯(phosphorothioate)、二硫代磷酸酯(phosphorodithioate)、磷砷酸酯(phosphoroselenate)、硼烷磷酸鹽(boranophosphate)、硼烷磷酸酯(boranophosphate ester)、氫磷酸酯、磷醯胺酯(phosphoroamidate)、烷基或芳基磷酸酯、以及磷酸三酯(phosphotriester)等，其中尤以前述2個非結合氧均以S取代之二硫代磷酸酯為佳。
舉例來說，前述磷酸基亦可將前述結合氧作取代。前述氧可以例如S(硫)、C(碳)及N(氮)中之任一原子作取代。前述修飾磷酸基可列舉如經N取代之交聯磷酸胺酯、經S取代之交聯硫代磷酸酯及經C取代之交聯亞甲基磷酸酯等。舉例來說，前述結合氧之取代宜在本發明之ssNc分子之5’末端核苷酸殘基及3’末端核苷酸殘基中之至少一者中進行，且在5’端側時宜以C作取代，在3’端側時則宜以N作取代。
舉例來說，前述磷酸基亦可取代為前述非含磷之連接子(linker)。前述連接子包含如矽氧烷、碳酸酯、羧甲基、胺甲酸酯(carbamate)、醯胺、硫醚、環氧乙烷連接子、磺酸酯(sulfonate)、磺醯胺、硫代甲縮醛(thioformacetal)、甲縮醛、肟、亞甲基醯亞胺基、亞甲基甲基醯亞胺基、亞甲基伸肼基、亞 甲基二甲基伸肼基及亞甲基氧基甲基醯亞胺基等，且宜包含亞甲基羰胺基及亞甲基甲基醯亞胺基。
舉例來說，本發明之ssNc分子之3’末端及5’末端中之至少一者的核苷酸殘基亦可受到修飾。前述修飾例如可為3’末端及5’末端中之任一者，亦可為兩者。前述修飾例如前述，且宜對末端之磷酸基進行。舉例來說，前述磷酸基可將全體作修飾，亦可將前述磷酸基中之1個以上原子作修飾。在前者之情況下，例如，可為磷酸基全體之取代，亦可為缺損。
前述末端核苷酸殘基之修飾可列舉如附加其他分子。前述其他分子如前述般可列舉如標識物質、保護基等之機能性分子。前述保護基可列舉如S(硫)、Si(矽)、B(硼)、含酯之基團等。前述標識物質等之機能性分子，舉例來說可利用於本發明ssNc分子之檢測等。
前述其他分子例如可附加至前述核苷酸殘基之磷酸基，亦可透過間隔子(spacer)而附加至前述磷酸基或前述糖殘基。舉例來說，前述間隔子之末端原子可對前述磷酸基之前述結合氧或者糖殘基之O、N、S或C作附加或取代。前述糖殘基之結合部位例如宜為3’位之C或5’位之C，或者是與其等結合之原子。例如前述間隔子可對前述PNA等之核苷酸替代物之末端原子作附加或取代。
前述間隔子並未特別受限，舉例來說可包含-(CH2)n-、-(CH2)nN-、-(CH2)nO-、-(CH2)nS-、O(CH2CH2O)nCH2CH2OH、無鹼基糖、醯胺、羧基、胺、氧基胺、氧基亞胺、硫醚、二硫化物、硫脲、磺醯胺及N-啉基等，以及生物素試劑及螢光黃試劑等。於前述式中，n宜為正整數，且宜n=3或6。
附加於前述末端之分子除了此等之外，尚可例示如色素、插入(Intercalate)劑(例如吖啶)、交聯劑(例如補骨脂素(psoralen)、絲裂黴素C)、紫質(TPPC4、Texaphyrin、Sapphyrin)、多環式芳香族烴(例如啡、二氫啡)、人工內核酸酶(例如EDTA)、親油性載體(例如膽固醇、膽酸、金剛烷乙酸、1-芘酪酸、二氫睪固酮、1,3-雙-O(十六烷基)甘油、香葉基氧基己基、十六烷基甘油、冰片、薄荷醇、1,3-丙二醇、十七烷基、棕櫚酸、肉豆蔻酸、O3-(油醯基)石膽酸、O3-(油醯基)膽酸、二甲氧基三苯甲基或啡)及肽複 合物(例如Antennapedia peptide、Tat肽)、烷基化劑、磷酸、胺基、巰基、PEG(例如PEG-40K)、MPEG、[MPEG]2、聚胺基、烷基、經取代烷基、放射線標識標記、酵素、半抗原(例如生物素)、輸送/吸收促進劑(例如阿斯匹靈、維生素E、葉酸)、合成核糖核酸酶(例如咪唑、雙咪唑、組織胺、咪唑簇(imidazole cluster)、吖啶-咪唑複合物、四氮巨環(tetraza micro ring)之Eu3+複合物)等。
舉例來說，本發明之ssNc分子的前述5’末端亦可以磷酸基或磷酸基類似物作修飾。前述磷酸基可列舉如5’單磷酸((HO)2(O)P-O-5’)、5’二磷酸((HO)2(O)P-O-P(HO)(O)-O-5’)、5’三磷酸((HO)2(O)P-O-(HO)(O)P-O-P(HO)(O)-O-5’)、5’-鳥苷帽(7-甲基化或非甲基化7m-G-O-5’-(HO)(O)P-O-(HO)(O)P-O-P(HO)(O)-O-5’)、5’-腺苷帽(Appp)、任意修飾或非修飾核苷酸帽結構(N-O-5’-(HO)(O)P-O-(HO)(O)P-O-P(HO)(O)-O-5’)、5’單硫代磷酸(硫代磷酸酯：(HO)2(S)P-O-5’)、5’一二硫代磷酸(二硫代磷酸酯：(HO)(HS)(S)P-O-5’)、5’-磷硫醇酸((HO)2(O)P-S-5’)、經硫取代之單磷酸、二磷酸及三磷酸(例如5’-α-硫代三磷酸、5’-γ-硫代三磷酸等)、5’-磷醯胺酯((HO)2(O)P-NH-5’、(HO)(NH2)(O)P-O-5’)、5’-烷基膦酸(例如RP(OH)(O)-O-5’、(OH)2(O)P-5’-CH2；R為烷基(例如甲基、乙基、異丙基、丙基等))、5’-烷基醚膦酸(例如RP(OH)(O)-O-5’；R為烷基醚(例如甲氧基甲基、乙氧基甲基等))等。
於前述核苷酸殘基中，前述鹼基並未特別受限。舉例來說，前述鹼基可為天然鹼基，亦可為非天然鹼基。舉例來說，前述鹼基可源自天然，亦可為合成品。舉例來說，前述鹼基可使用一般之鹼基，亦可使用其修飾類似物等。
前述鹼基可列舉如腺嘌呤及鳥嘌呤等之嘌呤鹼基、胞嘧啶、尿嘧啶及胸腺嘧啶等之嘧啶鹼基。前述鹼基除此之外還可列舉如肉苷、胸腺嘧啶、黃嘌呤、次黃嘌呤、nubularine、isoguanisine、殺結核菌素(tubercidine)等。前述鹼基可列舉如2-胺基腺嘌呤、6-甲基化嘌呤等之烷基衍生物；2-丙基化嘌呤等之烷基衍生物；5-鹵基尿嘧啶及5-鹵基胞嘧啶；5-丙炔基尿嘧啶及 5-丙炔基胞嘧啶；6-偶氮尿嘧啶、6-偶氮胞嘧啶及6-偶氮胸腺嘧啶；5-尿嘧啶(假尿嘧啶)、4-硫代尿嘧啶、5-鹵基尿嘧啶、5-(2-胺基丙基)尿嘧啶、5-胺基烯丙基尿嘧啶；8-鹵基化、胺基化、硫醇化、硫烷基化、羥基化及其他之8-取代嘌呤；5-三氟甲基化及其他之5-取代嘧啶；7-甲基鳥嘌呤；5-取代嘧啶；6-氮雜嘧啶；N-2、N-6及O-6取代嘌呤(含2-胺基丙基腺嘌呤)；5-丙炔基尿嘧啶及5-丙炔基胞嘧啶；二氫尿嘧啶；3-去氮-5-氮雜胞嘧啶(3-deaza-5-azacytosine)；2-胺基嘌呤；5-烷基尿嘧啶；7-烷基鳥嘌呤；5-烷基胞嘧啶；7-去氮腺嘌呤；N6,N6-二甲基腺嘌呤；2,6-二胺基嘌呤；5-胺基-烯丙基-尿嘧啶；N3-甲基尿嘧啶；取代1，2，4-三唑；2-吡啶酮；5-硝基吲哚；3-硝基吡咯；5-甲氧基尿嘧啶；尿嘧啶-5-氧乙酸；5-甲氧羰基甲基尿嘧啶；5-甲基-2-硫代尿嘧啶；5-甲氧羰基甲基-2-硫代尿嘧啶；5-甲基胺基-2-硫代尿嘧啶；3-(3-胺基-3-羧丙基)尿嘧啶；3-甲基胞嘧啶；5-甲基胞嘧啶；N4-乙醯基胞嘧啶；2-硫代胞嘧啶；N6-甲基腺嘌呤；N6-異戊基腺嘌呤；2-甲基硫代-N6-異戊烯基腺嘌呤；N-甲基鳥嘌呤；O-烷基化鹼基等。此外，舉例來說，嘌呤及嘧啶包含：美國專利第3,687,808號「Concise Encyclopedia Of Polymer Science And Engineering」，第858~859頁，克羅修比茲.J.I.氏(Kroschwitz J.I.)編，John Wiley & Sons，1990；及，英格利修氏等人(Englisch等)，Angewandte Chemie，International Edition，1991，第30卷，p.613所揭示之物。
前述修飾核苷酸殘基除了此等之外，舉例來說，亦可包含缺損鹼基之殘基，即無鹼基之核糖磷酸骨架。又，舉例來說，前述修飾核苷酸殘基可使用如美國暫時申請案第60/465,665號(申請日：2003年4月25日)及國際申請案第PCT/US04/07070號(申請日：2004年3月8日)所記載之殘基，本發明可援用此等文獻。
3. 非核苷酸殘基
前述非核苷酸殘基並未特別受限。舉例來說，本發明之ssNc分子可具有含吡啶骨架或哌啶骨架之非核苷酸結構作為前述非核苷酸殘基。舉例來說，宜於前述連結區域(Lx)及前述連結區域(Ly)中之至少一者具有前述非核苷酸殘基。舉例來說，可於前述連結區域(Lx)具有前述非核苷酸殘基，亦可 於前述連結區域(Ly)具有前述非核苷酸殘基，還可在前述連結區域之兩者中具有前述非核苷酸殘基。舉例來說，前述連結區域(Lx)及前述連結區域(Ly)可相同亦可相異。
舉例來說，前述吡啶骨架亦可為：構成吡啶之5員環的碳中有1個以上受到取代之哌啶衍生物的骨架，且受取代的情況下，舉例來說宜為C-2之碳以外的碳原子。舉例來說，前述碳可以氮、氧或硫來取代。舉例來說，前述吡啶骨架亦可在吡啶之5員環內含有例如碳-碳雙鍵或碳-氮雙鍵。前述吡啶骨架中，舉例來說，構成吡啶之5員環的碳及氮可結合有氫基，亦可結合有如後述之取代基。舉例來說，前述連結區域(Lx)亦可透過前述吡啶骨架中之任一基而與前述區域(X)及前述區域(Xc)結合，且宜為前述5員環中之任一個碳原子與氮原子，更宜為前述5員環之2位碳(C-2)與氮。前述吡啶骨架可列舉如脯胺酸(proline)骨架、脯胺醇(prolinol)骨架等。舉例來說，前述脯胺酸骨架及脯胺醇骨架等由於是活體內物質及其還原物，在安全性上亦優異。
舉例來說，前述哌啶骨架亦可為構成哌啶之6員環的碳有1個以上受到取代之哌啶衍生物的骨架，受取代時，舉例來說宜為C-2之碳以外的碳原子。舉例來說，前述碳可以氮、氧或硫來取代。舉例來說，前述哌啶骨架亦可在哌啶之6員環內含有例如碳-碳雙鍵或碳-氮雙鍵。前述哌啶骨架中，舉例來說，構成哌啶之6員環的碳及氮亦可結合氫基，亦可結合如後述之取代基。舉例來說，前述連結區域(Lx)可透過前述哌啶骨架中之任一基而與前述區域(X)及前述區域(Xc)結合，且宜是前述6員環中之任一個碳原子與氮，且更宜是前述6員環之2位碳(C-2)與氮。就前述連結區域(Ly)而言，亦是相同。
舉例來說，前述連結區域亦可僅是由前述非核苷酸結構所構成之非核苷酸殘基，亦可含有前述非核苷酸構所構成之非核苷酸殘基與核苷酸殘基。
前述連結區域例如可以下述式(I)表示。
【化1】
前述式(I)中，X1及X2各自獨立為H2、O、S或NH；Y1及Y2各自獨立為單鍵、CH2、NH、O、或S；R3為結合至環A上之C-3、C-4、C-5或C-6的氫原子或取代基，且前述取代基為OH、OR4、NH2、NHR4、NR4R5、SH、SR4或側氧基(=O)；R3為前述取代基時，取代基R3可為1個或多數個，亦可不存在，且有多數個時可相同亦可不同；R4及R5為取代基或保護基，且可相同或不同；L1為n個原子所構成之伸烷基鏈，於此，伸烷基碳原子上之氫原子可以OH、ORa、NH2、NHRa、NRaRb、SH或SRa取代，且亦可不受取代，或者是L1為前述伸烷基鏈中之一個以上碳原子受到氧原子取代而成之聚醚鏈；但Y1為NH、O或S時，與Y1結合之L1的原子為碳，且與OR1結合之L1的原子為碳，氧原子則彼此不鄰接；L2為m個原子所構成之伸烷基鏈，於此，伸烷基碳原子上之氫原子可以OH、ORc、NH2、NHRc、NRcRd、SH或SRc取代或不受取代，或者，L2為前述伸烷基鏈中之一個以上碳原子受到氧原子取代而成之聚醚鏈；但，Y2為NH、O或S時，與Y2結合之L2的原子為碳，與OR2結合之L2的原子為碳，氧原子彼此則不鄰接；Ra、Rb、Rc及Rd各自獨立為取代基或保護基；l為1或2；m為0~30範圍內之整數； n為0~30範圍內之整數；環A中之前述環A上之C-2以外的1個碳原子亦可以氮、氧或硫來取代；前述環A內亦可含有碳-碳雙鍵或碳-氮雙鍵。前述連結區域(Lx)以前述式(1)表示時，前述區域(Xc)及前述區域(X)分別透過-OR1-或-OR2-而結合至前述連結區域(Lx)。再者，前述連結區域(Ly)以前述式(1)表示時，前述區域(Yc)及前述區域(Y)分別透過-OR1-或-OR2-而結合至前述連結區域(Ly)。於此，R1及R2可存在亦可不存在，且存在時，R1及R2分別獨立為核苷酸殘基或前述構造(I)。
前述式(I)中，舉例來說，X1及X2分別獨立為H2、O、S或NH。前述式(I)中，X1為H2意指：X1與X1所結合之碳原子共同形成CH2(亞甲基)。就X2而言亦是相同。
於前述式(I)中，環A中之l為1或2。l=1時，環A為5員環，舉例來說則為前述吡啶骨架。前述吡啶骨架可例示如脯胺酸骨架、脯胺醇骨架等，其等之二價結構。l=2時，環A為6員環，舉例來說則為前述哌啶骨架。環A之中，環A上之C-2以外的1個碳原子亦可經氮、氧或硫取代。此外，環A亦可在環A之中含有碳-碳雙鍵或碳-氮雙鍵。舉例來說，環A可為L型及D型中之任一者。
前述式(I)中，Y1及Y2分別獨立為單鍵、CH2、NH、O或S。
前述式(I)中，R3係與環A上之C-3、C-4、C-5或C-6結合的氫原子或取代基。前述取代基為OH、OR4、NH2、NHR4、NR4R5、SH、SR4或側氧基(=O)。R3為前述取代基時，取代基R3可為1個或多數個，亦可不存在；有多數個時，可相同亦可不同。R4及R5為取代基或保護基，且可相同亦可不同。
前述取代基可列舉如鹵素、烷基、烯基、炔基、鹵烷基、芳基、雜芳基、芳烷基、環烷基、環烯基、環烷基烷基、環基烷基(cyclylalkyl)、羥烷基、烷氧基烷基、胺烷基、雜環基烯基(heterocyclyl alkenyl)、雜環基烷基、雜芳基烷基、矽基及矽氧烷基等。以下相同。
舉例來說，前述保護基係將反應性較高之官能基轉換成不活性之官能 基，可列舉如習知之保護基等。前述保護基可援用例如文獻(J.F.W.McOmie,「Protecting Groups in Organic Chemistry」Prenum Press,London and New York,1973)之記載。前述保護基並未特別受限，可列舉如第三丁基二甲基矽基(TBDMS基)、雙(2-乙醯氧基乙基氧基)甲基(ACE基)、三異丙基矽氧基甲基(TOM基)、1-(2-氰基乙氧基)乙基(CEE基)、2-氰基乙氧基甲基(CEM基)及甲苯磺醯基乙氧基甲基(TEM基)、二甲氧基三苯甲基(DMTr基)等。R3為OR4時，前述保護基並未特別受限，可列舉如TBDMS基、ACE基、TOM基、CEE基、CEM基及TEM基等。此外，亦可列舉如後述[化5]之含矽基的基團。以下相同。
前述式(I)中，L1為n個原子所構成之伸烷基鏈。舉例來說，前述伸烷基碳原子上之氫原子亦可經OH、ORa、NH2、NHRa、NRaRb、SH或SRa取代，亦可不受取代。或者，L1亦可為前述伸烷基鏈之一個以上碳原子經氧原子取代而成的聚醚鏈。舉例來說，前述聚醚鏈為聚乙二醇。此外，Y1為NH、O或S時，與Y1結合之L1的原子為碳，與OR1結合之L1的原子為碳，氧原子彼此不鄰接。亦即，例如Y1為O時，其氧原子與L1之氧原子不鄰接，且OR1之氧原子與L1之氧原子不鄰接。
前述式(I)中，L2為m個原子所構成之伸烷基鏈。舉例來說，前述伸烷基碳原子上之氫原子可經OH、ORc、NH2、NHRc、NRcRd、SH或SRc取代，亦可不受取代。或者，L2亦可為前述伸烷基鏈之一個以上碳原子經氧原子取代而成之聚醚鏈。另，Y2為NH、O或S時，與Y2結合之L2的原子為碳，與OR2結合之L2的原子為碳，氧原子則彼此不鄰接。亦即，例如Y2為O時，其氧原子與L2之氧原子不鄰接，OR2之氧原子與L2之氧原子不鄰接。
L1之n及L2之m並未特別受限，各自之下限例如為0，上限亦未特別受限。舉例來說，n及m可因應前述連結區域(Lx)之所欲長度而適當地予以設定。舉例來說，從製造成本及收率等觀點來看，n及m分別宜為0~30，且更宜為0~20，尤宜為0~15。n與m可相同(n=m)亦可不同。舉例來說，n+m為0~30，且宜為0~20，更宜為0~15。
Ra、Rb、Rc及Rd各自獨立，可列舉如取代基或保護基。舉例來說，前述取代基及前述保護基與前述者相同。
前述式(I)中，舉例來說氫原子可分別獨立地被Cl、Br、F及I等鹵素取代。
前述連結區域(Lx)以前述式(I)表示時，舉例來說，前述區域(Xc)及前述區域(X)分別透過-OR1-或-OR2-而與前述連結區域(Lx)結合。於此，R1及R2可存在亦可不存在。R1及R2存在時，R1及R2各自獨立為核苷酸殘基或前述式(I)之結構。R1及/或R2為前述核苷酸殘基時，舉例來說，前述連結區域(Lx)係由下述者形成：由核苷酸殘基R1及/或R2除外之前述式(I)結構所構成的前述非核苷酸殘基；及，前述核苷酸殘基。R1及/或R2為前述式(I)結構時，舉例來說，前述連結區域(Lx)會成為連結有2個以上前述式(I)結構所構成之前述非核苷酸殘基而成的結構。前述式(I)之結構例如可含有1個、2個、3個或4個。如前述般含有多數前述結構時，舉例來說，前述(I)之結構可直接連結亦可透過前述核苷酸殘基而連結。另一方面，R1及R2不存在時，舉例來說，前述連結區域(Lx)僅由前述式(I)結構所構成之前述非核苷酸殘基所形成。此外，前述連結區域(Ly)以前述式(I)表示時，舉例來說，前述區域(Yc)、前述區域(Y)及前述連結區域(Ly)亦可援用前述連結區域(Lx)之說明。
前述區域(Xc)及前述區域(X)、以及前述區域(Yc)及前述區域(Y)與前述-OR1-及-OR2-之結合的組合並未特別受限，可列舉如下述任一條件。
條件(1)
前述區域(Xc)透過-OR2-且前述區域(X)透過-OR1-而與前述式(I)之結構結合；並且前述區域(Yc)透過-OR1-且前述區域(Y)透過-OR2-而與前述式(I)之結構結合。
條件(2)
前述區域(Xc)透過-OR2-且前述區域(X)透過-OR1-而與前述式(I)之結構結合；並且前述區域(Yc)透過-OR2-且前述區域(Y)透過-OR1-而與前述式(I)之結構結合。
條件(3)
前述區域(Xc)透過-OR1-且前述區域(X)透過-OR2-而與前述式(I)之結構 結合；並且前述區域(Yc)透過-OR1-且前述區域(Y)透過-OR2-而與前述式(I)之結構結合。
前述式(I)之結構可例示如下述式(I-1)~式(I-9)，於下述式中，n及m與前述式(I)相同。下述式中，q為0~10之整數。
【化2】
前述式(I-1)~(I-9)中，n、m及q並未特別受限，如同前述。作為具體例，可列舉如：前述式(I-1)中，n=8；前述(I-2)中，n=3；前述式(I-3)中，n=4或8，前述(I-4)中，n=7或8；前述式(I-5)中，n=3且m=4；前述(I-6)中，n=8且m=4；前述式(I-7)中，n=8且m=4；前述(I-8)中，n=5且m=4；前述式(I-9)中，q=1且m=4。茲將前述式(I-4)之一例(n=8)示於下述式(I-4a)，並將前述式(I-6)之一例(n=5、m=4)示於下述式(I-6a)。
於本發明中，舉例來說「烷基」包含直鏈狀或分枝狀烷基。前述烷基之碳數並未特別受限，例如為1~30，且宜為1~6或1~4。前述烷基可列舉如：甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、異丁基、第二丁基、第三丁基、正戊基、異戊基、新戊基、正己基、異己基、正庚基、正辛基、正壬基及正癸基等。且較佳者可列舉如甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、異丁基、第二丁基、第三丁基、正戊基、異戊基、新戊基、正己基及異己基等。
於本發明中，舉例來說「烯基」包含直鏈狀或分枝狀之烯基。前述烯基可列舉如在前述烷基中具有1個或多數個雙鍵者等。前述烯基之碳數並未特別受限，舉例來說與前述烷基相同，且宜為2~8。前述烯基可列舉如乙烯基、1-丙烯基、2-丙烯基、1-丁烯基、2-丁烯基、3-丁烯基、1，3-丁二烯基、3-甲基-2-丁烯基等。
於本發明中，舉例來說「炔基」包含直鏈狀或分枝狀炔基。前述炔基 可列舉如在前述烷基中具有1個或多數個參鍵者等。前述炔基之碳數並未特別受限，舉例來說與前述烷基相同，且宜為2~8。前述炔基可列舉如乙炔基、丙炔基、丁炔基等。舉例來說，前述炔基亦可更具有1個或多數個雙鍵。
於本發明中，舉例來說「芳基」包含單環芳香族烴基及多環芳香族烴基。前述單環芳香族烴基可列舉如苯基等。前述多環芳香族烴基可列舉如1-萘基、2-萘基、1-蒽基、2-蒽基、9-蒽基、1-菲基、2-菲基、3-菲基、4-菲基及9-菲基等。且較佳者可列舉如苯基、1-萘基及2-萘基等之萘基等。
於本發明中，舉例來說「雜芳基」包含單環芳香族雜環基及縮合芳香族雜環基。前述雜芳基可列舉如呋喃基(例如：2-呋喃基、3-呋喃基)、噻吩基(例如：2-噻吩基、3-噻吩基)、吡咯基(例如：1-吡咯基、2-吡咯基、3-吡咯基)、咪唑基(例如：1-咪唑基、2-咪唑基、4-咪唑基)、吡唑基(例如：1-吡唑基、3-吡唑基、4-吡唑基)、三唑基(例如：1，2，4-三唑-1-基、1，2，4-三唑-3-基、1，2，4-三唑-4-基)、四唑基(例如：1-四唑基、2-四唑基、5-四唑基)、唑基(例如：2-唑基、4-唑基、5-唑基)、異唑基(例如：3-異唑基、4-異唑基、5-異唑基)、噻唑基(例如：2-噻唑基、4-噻唑基、5-噻唑基)、噻二唑基、異噻唑基(例如：3-異噻唑基、4-異噻唑基、5-異噻唑基)、吡啶基(例如：2-吡啶基、3-吡啶基、4-吡啶基)、嗒基(例如：3-嗒基、4-嗒基)、嘧啶基(例如：2-嘧啶基、4-嘧啶基、5-嘧啶基)、呋呫基(例如：3-呋呫基)、吡基(例如：2-吡基)、二唑基(例如：1，3，4-二唑-2-基)、苯并呋喃基(例如：2-苯并[b]呋喃基、-苯并[b]呋喃基、4-苯并[b]呋喃基、5-苯并[b]呋喃基、6-苯并[b]呋喃基、7-苯并[b]呋喃基)、苯并噻吩基(例如：2-苯并[b]噻吩基、3-苯并[b]噻吩基、4-苯并[b]噻吩基、5-苯并[b]噻吩基、6-苯并[b]噻吩基、7-苯并[b]噻吩基)、苯并咪唑基(例如：1-苯并咪唑基、2-苯并咪唑基、4-苯并咪唑基、5-苯并咪唑基)、二苯并呋喃基、苯并唑基、苯并噻唑基、喹啉基(例如：2-喹啉基、5-喹啉基、6-喹啉基)、啉基(例如：3-啉基、4-啉基、5-啉基、6-啉基、7-啉基、8-啉基)、喹唑啉基(例如：2-喹唑啉基、4-喹唑啉基、5-喹唑啉基、6-喹唑啉基、7-喹唑啉基、8-喹唑啉基)、喹啉基(例如：2-喹啉基、3- 喹啉基、4-喹啉基、5-喹啉基、6-喹啉基、7-喹啉基、8-喹啉基)、呔基(例如：1-呔基、5-呔基、6-呔基)、異喹啉基(例如：1-異喹啉基、3-異喹啉基、4-異喹啉基、5-異喹啉基、6-異喹啉基、7-異喹啉基、8-異喹啉基)、嘌呤基、喋啶基(例如：2-喋啶基、4-喋啶基、6-喋啶基、7-喋啶基)、咔唑基、啡啶基、吖啶基(例如：1-吖啶基、2-吖啶基、3-吖啶基、4-吖啶基、9-吖啶基)、吲哚基(例如：1-吲哚基、2-吲哚基、3-吲哚基、4-吲哚基、5-吲哚基、6-吲哚基、7-吲哚基)、異吲哚基、啡基(例如：1-啡基、2-啡基)或啡噻基(例：1-啡噻基、2-啡噻基、3-啡噻基、4-啡噻基)等。
於本發明中，舉例來說，「環烷基」為環狀飽和烴基，碳數則例如3~15。前述環烷基可列舉如環丙基、環丁基、環戊基、環己基、環庚基、環辛基、橋接環烴基及螺烴基等，且宜為環丙基、環丁基、環戊基、環己基及橋接環烴基等。
於本發明中，「橋接環烴基」可列舉如雙環[2.1.0]戊基、雙環[2.2.1]庚基、雙環[2.2.2]辛基及雙環[3.2.1]辛基、三環[2.2.1.0]庚基、雙環[3.3.1]壬烷、1-金剛烷基、2-金剛烷基等。
於本發明中「螺烴基」可列舉如螺[3.4]辛基等。
於本發明中，舉例來說「環烯基」包含環狀不飽和脂肪族烴基，碳數則例如3~7個。前述基可列舉如環丙烯基、環丁烯基、環戊烯基、環己烯基及環庚烯基等，且宜為環丙烯基、環丁烯基、環戊烯基及環己烯基等。舉例來說，前述環烯基亦包含環中具有不飽和鍵之橋接環烴基及螺烴基。
於本發明中，「芳烷基」可列舉如苄基、2-苯乙基及萘甲基等，「環烷基烷基」或「環基烷基(cyclylalkyl)」可列舉如環己基甲基及金剛烷基甲基等，「羥烷基」則可列舉如羥甲基及2-羥乙基等。
於本發明中，「烷氧基」包含前述烷基-O-基，可列舉如甲氧基、乙氧基、正丙氧基、異丙氧基及正丁氧基等，「烷氧基烷基」可列舉如甲氧基甲基等，「胺基烷基」則可列舉如2-胺基乙基等。
於本發明中，「雜環基(heterocyclyl)」可列舉如1-吡咯啉基、2-吡咯啉基、3-吡咯啉基、1-吡咯啶基、2-吡咯啶基、3-吡咯啶基、吡咯啶酮、1-咪唑啉基、2-咪唑啉基、4-咪唑啉基、1-咪唑啶基、2-咪唑啶基、4-咪唑啶基、 咪唑啶酮、1-吡唑啉基、3-吡唑啉基、4-吡唑啉基、1-吡唑啶基、3-吡唑啶基、4-吡唑啶基、吡唑啶酮、N-六氫吡啶基、2-哌啶基、3-哌啶基、4-哌啶基、1-哌基、2-哌基、哌酮、2-啉基、3-啉基、N-啉基、四氫哌喃基及四氫呋喃基等。
於本發明中，「雜環基烷基」可列舉如哌啶基甲基、哌基甲基等，「雜環基烯基」可列舉如2-哌啶基乙烯基等，「雜芳基烷基」則可列舉如吡啶基甲基及喹啉-3-基甲基等。
於本發明中，「矽基」包含式R3Si-所示之基，R可獨立選自前述烷基、芳基及環烷基，可列舉如三甲基矽基、第三丁基二甲基矽基等，「矽氧基」可列舉如三甲基矽氧基等，「矽氧基烷基」可列舉如三甲基矽氧基甲基等。
於本發明中，「伸烷基」可列舉如亞甲基、伸乙基及伸丙基等。
於本發明中，前述各種基亦可經取代。前述取代基可列舉如羥基、羧基、鹵素、鹵化烷基(例如：CF3、CH2CF3、CH2CCl3)、硝基、亞硝基、氰基、烷基(例如：甲基、乙基、異丙基、第三丁基)、烯基(例如：乙烯基)、炔基(例如：乙炔基)、環烷基(例如：環丙基、金剛烷基)、環烷基烷基(例如：環己基甲基、金剛烷基甲基)、環烯基(例如：環丙烯基)、芳基(例如：苯基、萘基)、芳烷基(例如：苄基、苯乙基)、雜芳基(例如：吡啶基、呋喃基)、雜芳烷基(例如：吡啶基甲基)、雜環基(例如：哌啶基)、雜環基烷基(例如：Morpholylmethyl)、烷氧基(例如：甲氧基、乙氧基、丙氧基、丁氧基)、鹵化烷氧基(例如：OCF3)、烯氧基(例如：乙烯氧基、烯丙氧基)、芳氧基(例如：苯氧基)、烷氧羰基(例如：甲氧羰基、乙氧羰基、第三丁氧羰基)、芳烷氧基(例：苄氧基)、胺基[烷基胺基(例如：甲基胺基、乙基胺基、二甲基胺基)、醯基胺基(例如：乙醯基胺基、苯甲醯基胺基)、芳烷基胺基(例如：苄基胺基、三苯甲基胺基)、羥基胺基]、烷基胺基烷基(例如：二甲基胺基甲基)、胺磺醯基、側氧基等。
4.本發明之ssNc分子之合成方法
本發明之ssNc分子合成方法並未特別受限，可採用習用公知之方法。前述合成方法可列舉如利用基因工學手法之合成法及化學合成法等。基因工學手法可列舉如活體外轉錄合成法、使用載體之方法、利用PCR卡匣之 方法。前述載體並未特別受限，可列舉如質體等之非病毒載體以及病毒載體等。前述化學合成法並未特別受限，可列舉如亞磷醯胺法(phosphoramidites method)及H-膦酸鹽法(H-phosphonate method)。舉例來說，前述化學合成法可使用市售之自動核酸合成機。前述化學合成法一般使用亞醯胺(amidite)。前述亞醯胺並未特別受限，市售之亞醯胺可列舉如RNA Phosphoramidites(2’-O-TBDMSi，商品名，三千里製藥)、ACE亞醯胺及TOM亞醯胺、CEE亞醯胺、CEM亞醯胺、TEM亞醯胺等。
5.組成物
如前述，本發明之抑制表現用組成物係一種用以抑制目標基因表現之組成物，特徵在於含有前述本發明之ssNc分子。本發明之組成物係以含有前述本發明之ssNc分子為特徵，至於其他構成則並未受到任何限制。舉例來說，本發明之抑制表現用組成物亦可稱為抑制表現用試劑。
若依本發明，舉例來說，可藉由投藥予存有前述目標基因之對象來進行前述目標基因之表現抑制。
此外，本發明之藥學組成物係如前述，其特徵在於含有前述本發明之ssNc分子。本發明之組成物係以含有前述本發明之ssNc分子為特徴，至於其他構成則並未受到任何限制。本發明之藥學組成物例如亦可稱為醫藥品。
若依本發明，舉例來說，藉由投藥予基因為疾病成因之患者，則可抑制前述基因之表現進而治療前述疾病。於本發明中，舉例來說，「治療」如前述般包含前述疾病之預防、疾病之改善及預後之改善等意義，且可為其中任一者。
於本發明中，治療對象之疾病並未特別受限，可列舉如基因表現為成因之疾病。僅需因應前述疾病之種類，將該疾病成因之基因設定為前述目標基因，再因應前述目標基因來適當設定前述抑制表現序列即可。
作為具體例，若將前述目標基因設為前述TGF-β1基因，並將對於前述基因之抑制表現序列配置於前述ssNc分子，則可使用於例如炎症性疾病(具體來說則是急性肺傷害)等的治療上。
本發明之抑制表現用組成物及藥學組成物(以下稱為組成物)的使用方法並未特別受限，舉例來說，僅需將前述ssNc分子投予具有前述目標基因 之投予對象即可。
前述投藥對象可列舉如細胞、組織或器官。前述投藥對象可列舉如人類、人類除外之非人哺乳類等之非人動物。舉例來說，前述投予可為活體內(in vivo)亦可為活體外(in vitro)。前述細胞並未特別受限，可列舉如HeLa細胞、293細胞、NIH3T3細胞、COS細胞等之各種培養細胞、ES細胞、造血幹細胞等之幹細胞及初代培養細胞等從活體單離出之細胞等。
前述投予方法並未特別受限，舉例來說，可因應投予對象來適當決定。前述投予對象為培養細胞時，舉例來說，可列舉如使用轉染試劑之方法及電穿孔法(electroporation method)等。
舉例來說，本發明之組成物可僅含本發明之ssNc分子，亦可更含有其他添加物。前述添加物並未特別受限，舉例來說，宜為藥學上可接受之添加物。前述添加物之種類並未特別受限，舉例來說可因應投予對象之種類來適當選擇。
於本發明之組成物中，舉例來說，前述ssNc分子亦可與前述添加物形成錯合物。前述添加物舉例來說亦可稱為錯化劑。藉由形成前述錯合物，舉例來說，可有效率地輸送前述ssNc分子。前述ssNc分子與前述錯化劑之結合並未特別受限，可列舉如非共價結合。前述錯合物可列舉如內含錯合物(inclusion complexation)。
前述錯化劑並未特別受限，可列舉如聚合物、環糊精及金剛烷胺等。前述環糊精可列舉如線狀環糊精共聚物、線狀氧化環糊精共聚物等。
除此之外，前述添加劑可列舉如載子(carrier)、對目標細胞之結合物質、縮合劑、融合劑及賦形劑等。
舉例來說，前述載子宜為高分子，更宜為生源高分子。舉例來說，前述載子宜具生分解性。前述載子可列舉如：人類血清白蛋白(HSA)、低密度脂蛋白(LDL)、球蛋白等之蛋白質；聚葡糖、聚三葡萄糖(pullulan)、幾丁質、幾丁聚糖、菊糖、環糊精、玻尿酸等之糖質；脂質等。前述載子舉例來說亦可使用合成聚胺基酸等之合成聚合物。前述聚胺基酸可列舉如聚離胺酸(PLL)、聚L-天門冬醯胺酸、聚L-麩醯胺酸、苯乙烯-順丁烯二酸酐共聚物、聚(L-乳酸交酯-共-乙交酯)共聚物、二乙烯醚-順丁烯二酸酐共聚物、N-(2- 羥丙基)甲基丙烯醯胺共聚物(HMPA)、聚乙二醇(PEG)、聚乙烯醇(PVA)、聚胺甲酸酯、聚(2-乙基丙烯酸)、N-異丙基丙烯醯胺聚合物或聚磷腈(polyphosphazine)等。
前述結合物質可列舉如促甲狀腺激素、促黑細胞素、凝集素、醣蛋白、表面張力素蛋白A(surfactant protein A)、黏蛋白糖質、多價乳糖、多價半乳糖、N-乙醯半乳胺糖、N-乙醯葡萄糖胺、多價甘露糖、多價海藻糖、醣化聚胺基酸、多價半乳糖、運鐵蛋白、雙膦酸鹽(酯)類(Bisphosphonate)、聚麩醯胺酸、聚天門冬醯胺酸、脂質、膽固醇、類固醇、膽汁酸、葉酸鹽、維生素B12、生物素、納普洛仙(Neproxin)、RGD肽、RDG肽擬似物等。
前述融合劑及縮合劑可列舉如聚乙亞胺(PEI)等之聚胺基酸鏈等。舉例來說，PEI為直鏈狀及分枝狀中之任一者皆可，且可為合成物及天然物中之任一者。舉例來說，前述PEI可經烷基取代，亦可經脂質取代。再者，除此之外，前述融合劑可使用聚組胺酸、聚咪唑、聚吡啶、聚丙亞胺、蜂毒肽(melittin)及聚乙縮醛物質(例如陽離子性聚乙縮醛等)等。舉例而言，前述融合劑亦可具有α螺旋結構。前述融合劑舉例來說亦可為蜂毒肽等之膜崩解劑。
舉例而言，本發明之組成物就前述錯合物之形成等可援用美國專利第6,509,323號、美國專利公報第2003/0008818號及PCT/US04/07070號等。
除此之外，前述添加劑可列舉如兩親媒性分子。舉例而言，前述兩親媒性分子為具有疎水性區域及親水性區域之分子。前述分子舉例來說宜為聚合物。舉例而言，前述聚合物為具有二級結構之聚合物，且宜為具有反復性二級結構之聚合物。作為具體例，聚例來說宜為多肽，更宜為α螺旋狀多肽等。
前述兩親媒性聚合物舉例來說亦可為具有2個以上兩親媒性次單元之聚合物。前述次單元(subunit)可列舉如具有環狀結構之次單元，且該環狀結構具有至少1個親水性基及1個疎水性基。前述次單元舉例來說亦可具有膽酸等之類固醇、芳香族結構等。舉例來說，前述聚合物亦可具有芳香族次單元等之環狀結構次單元與胺基酸兩者。
6. 表現抑制方法
如前述，本發明之表現抑制方法係一種抑制目標基因表現之方法，特徵在於使用前述本發明之ssNc分子。本發明之表現抑制方法係以使用前述本發明之ssNc分子作為特徵，至於其他步驟及條件則不受任何限制。
本發明之表現抑制方法中，抑制前述基因表現之機制並未特別受限，可列舉如RNA干擾或類RNA干擾現象所引起之表現抑制。於此，舉例來說，本發明之表現抑制方法係一誘導可抑制前述目標基因表現之RNA干擾的方法，亦可說是以使用前述本發明之ssNc分子為特徵之表現誘導方法。
本發明之表現抑制方法舉例來說包含一對存有前述目標基因之對象投予前述ssNc分子的步驟。透過前述投予步驟，舉例來說，使前述ssNc分子接觸前述投予對象。前述投予對象可列舉如細胞、組織或器官。前述投予對象可列舉如人類、人類以外之非人哺乳類等之非人動物。前述投予舉例來說可在活體內(in vivo)亦可在活體外(in vitro)。
舉例而言，本發明之表現抑制方法可單獨投予前述ssNc分子，亦可投予含有前述ssNc分子之前述本發明組成物。前述投予方法並未特別受限，舉例來說可因應投予對象之種類來適當選擇。
7. 治療方法
本發明之疾病治療方法係如前述，包含一將前述本發明之ssNc分子投予患者之步驟，且特徵在於：前述ssNc分子具有一可抑制前述疾病成因之基因表現的序列作為前述抑制表現序列。本發明之治療方法係以使用前述本發明之ssNc分子作為特徴，至於其他步驟及條件則不受任何限制。本發明之治療方法舉例來說可援用前述本發明之表現抑制方法。前述投予方法不受特別限制，例如可為經口投予及非經口投予中之任一者。
8. ssNc分子之用途
本發明之用途係一種用以抑制前述目標基因之表現的前述本發明ssNc分子的用途。此外，本發明之用途係一種用以誘導RNA干擾之前述本發明ssNc分子的用途。
本發明之核酸分子係一種用於治療疾病之核酸分子，前述核酸分子為前述本發明之ssNc分子，且前述ssNc分子之特徵在於：具有可抑制前述疾病成因之基因表現的序列作為前述抑制表現序列。
以下藉由實施例等來詳細說明本發明，但本發明不受此等之限定。
【實施例】
(實施例A1)RNA之合成
合成如下所示之ssRNA(NK-0016)作為實施例之RNA(Ex)。前述NK-0016具有19個鹼基長的抑制表現序列(序列編號1)，其可抑制GAPDH基因之表現。NK-0016之序列中，區域(Xc)與區域(X)之間為連結區域(Lx)，區域(Y)與區域(Yc)之間為連結區域(Ly)(以下相同)。
GAPDH基因抑制表現序列(序列編號1)
5’-GUUGUCAUACUUCUCAUGG-3’
合成如下所示之RNAi陽性控制組(Pc)之dsRNA(NI-0011)作為比較例之RNA。NI-0011於各單股之3’末端具有2個鹼基之突出(overhang)，且序列編號4之單股與前述NK-0016相同地具有前述19個鹼基長之抑制表現序列。
【化5】Pc：NI-0011 5’-CCAUGAGAAGUAUGACAACAG-3’(序列編號3) 3’-UUGGUACUCUUCAUACUGUUG-5’(序列編號4)
前述RNA係以亞磷醯胺法為準且利用核酸合成機(商品名ABI Expedite(註冊商標)8909 Nucleic Acid Synthesis System，Applied Biosystems)來合成。前述合成中，RNA亞醯胺係使用RNA Phosphoramidites(2’-O-TBDMSi，商品名，三千里製藥)(以下相同)。前述亞醯胺之脫保護係依定法進行者。以HPLC純化所合成之RNA。純化後之RNA分別進行冷凍乾燥。於以下之實施例中，只要無特別表示，即與本實施例相同地進行RNA之合成。
使用注射用蒸餾水(大塚製藥，以下相同)，使經冷凍乾燥之RNA溶解 成所需濃度。
(實施例A2)HCT116細胞中之GAPDH基因之表現抑制效果
使用本發明之ssRNA，確認活體外(in vitro)之GAPDH基因表現抑制。
(1)材料及方法
使用前述實施例A1之ssRNA(NK-0016)作為實施例之RNA(Ex)。
使前述RNA溶解於注射用蒸餾水至所需濃度，調製出RNA溶液。細胞使用HCT116細胞(DS Pharma Biomedical Co.,Ltd)，培養基使用含有10%FBS之McCoy’s 5A(Invitrogen)培養基，令培養條件為37℃且5%CO2下。
首先，於前述培養基中培養HCT116細胞，將400μL之該培養液分別注入24井皿中而成為2×104細胞/井。更將前述井中之細胞培養24小時後，使用轉染試劑Lipofectamine 2000(商品名，Invitrogen)，依照所附規程(protocol)將前述RNA進行轉染。具體來說，則是將前述每井之組成設定如下並進行轉染。此外，於前述井中，令前述RNA之最終濃度為5nmol/L、10nmol/L、20nmol/L、40nmol/L。
轉染後，將前述井中之細胞培養48小時，之後使用RNeasy Mini Kit(商品名，Qiagen)，依照所附規程回收RNA。接著，使用逆轉錄酶(商品名SuperScript III，Invitrogen)，依照所附規程而從前述RNA合成出cDNA。 接著，以合成出之前述cDNA為模板進行PCR，測定GAPDH基因之表現量以及為內部標準之β-肌動蛋白基因的表現量。前述GAPDH基因之表現量已藉前述β-肌動蛋白基因之表現量來修正。
前述PCR使用LightCycler FastStart DNA Master SYBR Green I(商品名，Roche)作為試劑，並使用Light Cycler DX400(商品名，Roche)作為機器(以下相同)。前述GAPDH基因及β-肌動蛋白基因之擴增分別使用以下之引子組。
GAPDH基因用引子組
5’-GGAGAAGGCTGGGGCTCATTTGC-3’(序列編號9)
5’-TGGCCAGGGGTGCTAAGCAGTTG-3’(序列編號10)
β-肌動蛋白基因用引子組
5’-GCCACGGCTGCTTCCAGCTCCTC-3’(序列編號11)
5’-AGGTCTTTGCGGATGTCCACGTCAC-3’(序列編號12)
此外，作為控制組1，亦對僅添加前述(B)100μL之細胞測定基因表現量(-)。又，作為控制組2，亦對在轉染過程中未添加前述RNA溶液而添加前述(A)1.5μL與前述(B)共100μL以外經同樣處理之細胞測定基因表現量(mock)。
而就修正後之GAPDH基因表現量，則令控制組(-)之表現量為1，求出已導入各RNA之細胞的表現量相對值。
(2)結果
茲將其等之結果示於第4圖。第4圖為顯示GAPDH基因表現量相對值之圖表。如第4圖所示般，前述NK-0016與未添加RNA之控制組(-)相較下為較低之表現量，而得知已抑制GAPHD基因之表現。此外，如第4圖所示，得知顯示出投予量相依性之基因表現抑制效果。
(實施例A3)HCT116細胞中之GAPDH基因之表現抑制效果
使用本發明之ssRNA，確認活體外(in vitro)之GAPDH基因表現抑制。
(1)材料及方法
使用前述實施例A1之ssRNA(NK-0016)作為實施例之RNA(Ex)。比較例之RNA則使用RNAi陽性控制組(Pc)之前述dsRNA(NI-0011)。使前述 RNA溶解於注射用蒸餾水至成為40μmol/L，調製出RNA溶液。
除使用前述RNA溶液之外，與前述實施例A2同樣地確認HCT116細胞中之GAPDH基因表現量。令轉染時之RNA濃度為40nmol/L。
(2)結果
茲將其等之結果示於第5圖。第5圖係一顯示GAPDH基因表現量相對值之圖表，縱軸為相對基因表現量。如第5圖所示，前述實施例之NK-0016與比較例之NI-0011相較下，顯示出極強之基因表現抑制活性。
(實施例A4)A549細胞及293細胞中之GAPDH基因表現抑制效果
使用本發明之ssRNA，確認RNA干擾效果所引起之活體外(in vitro)GAPDH基因表現抑制。
(1)材料及方法
實施例之RNA(Ex)使用前述實施例A1之NK-0016及以下之Ex-ssRNA(PK-0004)。前述PK-0004中，連結區域(Lx)及連結區域(Ly)係使用實施例B所示流程3之化合物10(L-脯胺酸二醯胺亞醯胺)而使Xc與X之間及Yc與Y之間結合。茲將前述兩鏈結(linker)之化學式顯示於下。前述NK-0016與前述PK-0004除了Xc與X之間的連結區域(Lx)以及Yc與Y之間的連結區域(Ly)不同之外，製成相同序列。
使前述RNA溶解於注射用蒸餾水至成為20μmol/L，調製出RNA溶液。細胞使用A549細胞及293細胞(DS Pharma Biomedical)。前者之培養基使用含10%FBS之DMEM(Invitrogen)，後者之培養基則使用含10%FBS之MEM(Invitrogen)培養基。令培養條件為37℃且於5%CO2下。
首先，於前述培養基中培養細胞，並將該培養液以400μL各別注入24井皿而成為5×104細胞/井。更將前述井中之細胞培養24小時後，使用轉染試劑Lipofectamine 2000(商品名，Invitrogen)並依照所附規程而將前述RNA予以轉染。具體來說，則是對A549細胞及293細胞分別將前述每井之組成設定如下並進行轉染。於下述組成中，(B)為Opti-MEM(商品名，Invitrogen)，(C)為20μmol/L之前述RNA溶液，將兩者一起添加98.5μL或99μL。此外，於前述井中，令前述RNA之最終濃度為1nmol/L、3nmol/L、10nmol/L。
轉染後，將前述細胞培養48小時，與前述實施例A2同樣地進行RNA回收、cDNA合成及PCR，測定GAPDH基因之相對表現量。
(2)結果
茲將該等結果示於第6及7圖。第6圖為A549細胞之結果，第7圖為293細胞之結果。第6及7圖為顯示GAPDH基因表現量相對值之圖表。如第6及7圖所示，實施例之NK-0016及PK-0004顯示出強烈之基因表現抑制活性，且顯示出濃度相依性之效果。
(實施例A5)Hepa1-6細胞中之TGF-β 1基因表現抑制效果
就本發明之ssRNA，確認活體外之TGF-β1基因表現抑制效果。
(1)材料及方法
實施例之RNA(Ex)使用以下所示之ssRNA(NK-0023)。前述NK-0033 具有可抑制TGF-β1基因表現且21個鹼基長之下述序列。該序列係以Cheng氏等人所使用之siRNA(Mol.Pharm.,2009,6,772-779)為準設計者。
TGF-β 1基因抑制表現序列(序列編號16)
5’-AAAGUCAAUGUACAGCUGCUU-3’
比較例之RNA使用如下所示之RNAi陰性控制組(Nc)的ssRNA(NK-0035)。NK-0035並非組入前述抑制表現序列，而是組入與表現抑制無關之擾亂序列(scramble sequences)。
使前述RNA溶解於注射用蒸餾水而調製出RNA溶液。細胞使用Hepa1-6細胞(理化學研究所BioResource Center)，培養基使用含10%FBS之DMEM(Invitrogen)培養基，令培養條件為37℃、5%CO2。
首先，於前述培養基中培養Hepa1-6細胞，將該培養液各以400μL分別注入24井皿中，成為3×104細胞/井。更將前述井中之細胞培養24小時後，使用轉染試劑Lipofectamine 2000(商品名，Invitrogen)並依照所附規程，將前述ssRNA予以轉染。具體來說，則是將前述每井之組成設定如下並進行轉染。於下述組成中，(B)為Opti-MEM(商品名，Invitrogen)，(C)為20μmol/L之前述RNA溶液，將兩者一起添加98.5μL。此外，於前述井中，令前述RNA之最終濃度為10nmol/L、25nmol/L、50nmol/L及100nmol/L。
合計 500
轉染後，將前述井中之細胞培養48小時，之後使用RNeasy Mini Kit(商品名，Qiagen)並依照所附規程回收RNA。接著，使用逆轉錄酶(商品名SuperScript III(Invitrogen))，依照所附規程而從前述RNA合成出cDNA。接著，除了使用下述TGF-β1基因用PCR引子組及β-肌動蛋白基因用引子組之外，與前述實施例A2同樣地進行PCR，測定TGF-β1基因表現量及內部標準之β-肌動蛋白基因表現量。前述TGF-β1基因之表現量係以前述β-肌動蛋白基因之表現量來修正。
TGF-β1基因用引子組
5’-CCATTGCTGTCCCGTGCAGAGCTG-3’(序列編號17)
5’-ATGGTAGCCCTTGGGCTCGTGGATC-3’(序列編號18)
β-肌動蛋白基因擴增用引子組
5’-GTCGTACCACAGGCATTGTGATGG-3’(序列編號19)
5’-GCAATGCCTGGGTACATGGTGG-3’(序列編號20)
首先，與前述實施例A2同樣地就控制組(-)及控制組(mock)測定基因表現量。接著，針對補正後之TGF-β1基因表現量，令控制組(-)之細胞表現量為1，求出導入有各RNA之細胞的表現量相對值。
(2)結果
茲將該等結果示於第8圖。第8圖為顯示TGF-β1基因表現量相對值之圖表。如第8圖所示，前述實施例之NK-0033於活體外抑制了TGF-β1基因之表現。另一方面，陰性控制組之NK-0035則未抑制TGF-β1基因之表現。
(實施例A6)活體內(in vivo)之TGF-β 1基因表現抑制效果及急性肺傷害抑制效果
針對本發明之ssRNA確認活體內之基因表現抑制及急性肺傷害抑制效果。前述效果之確認係依照Takagi氏等人(J.Thromb Hemost 2009；7：2053-2063)所記載之方法進行。
(1)材料及方法
(1.1)對急性肺傷害小鼠投予ssRNA
實施例之RNA(Ex)使用前述實施例A5之ssRNA(NK-0033)。比較例之RNA則使用前述實施例A5所示之RNAi陰性控制組(Nc)的ssRNA(NK-0035)。
使100μg之前述RNA溶解於滅菌生理食鹽水(日本化藥，以下相同)80μL，調製出RNA溶液。另一方面，使100μg之脂多醣(LPS)溶解於滅菌生理食鹽水50μL，調製出LPS溶液。
首先，使80μL之前述RNA溶液滴定至小鼠之氣管內。從滴定起1小時後，使50μL之前述LPS溶液滴定至前述小鼠之氣管內而誘發肺傷害。
作為相對於前述LPS之陰性控制組，使用50μL未添加LPS之滅菌生理食鹽水來取代前述LPS溶液。此外，相對於前述RNA溶液之陰性控制組則使用80μL之滅菌生理食鹽水。
以下顯示各投予群。各投予群使用4~6隻小鼠。
‧投予群1
自投予80μL之滅菌生理食鹽水起1小時後，投予50μL之滅菌生理食鹽水。
‧投予群2
自投予80μL之RNA溶液(NK-0033)起1小時後，投予50μL之滅菌生理食鹽水。
‧投予群3
自投予80μL之RNA溶液(NK-0035)起1小時後，投予50μL之滅菌生理食鹽水。
‧投予群4
自投予80μL之滅菌生理食鹽水起1小時後，投予50μL之前述LPS溶液。
‧投予群5
自投予80μL之RNA溶液(NK-0033)起1小時後，投予50μL之前述LPS溶液。
‧投予群6
自投予80μL之RNA溶液(NK-0035)起1小時後，投予50μL之前述LPS 溶液。
(1.2)支氣管肺胞洗淨液(BALF)之採樣
自滴定前述LPS溶液起24小時後，對前述小鼠之腹腔投予過剩量之戊巴比妥使其安樂死，製成生化學解析及組織學解析之樣本。陰性控制組則是添加滅菌生理食鹽水來取代前述LPS溶液。
穿刺前述小鼠之心臓，回收血液樣本並添加至含有3.8%檸檬酸鈉水溶液之試管。令前述檸檬酸鈉水溶液之量(體積)為前述血液樣本之1/10。依照Yasui氏等人(Am J Respir Crit Care Med 2001：163：1660-8)之記載，從該混合液回收BALF樣本。接著，使用NucleoCounter(商品名，ChemoMeted社)測定前述BALF樣本中之總細胞數。
此外，將前述BALF樣本供予離心分離，回收前述BALF樣本之上清液，至進行生化學分析為止，保存於-80℃下。再者，為了計數前述BALF樣本所含不同種類之細胞，使用細胞離心塗片器(CytoSpin)將前述BALF樣本作離心分離，並使用May-Grunwald-Giemsa(商品名，Merck)將分離出之細胞作吉姆沙染色。此外，從前述小鼠採取肺組織，進行HE染色。
(2)結果
(2.1)肺中之TGF-β 1基因表現抑制
針對前述小鼠之肺樣本，使用TGF-β1 Quantikine Colorimetric Sandwich ELISA(商品名，R&D Systems社)，測定每單位重量之肺的TGF-β1表現量。
茲將其結果示於第9圖。第9圖為圖表，顯示各投予群中每單位重量之肺的TGF-β1基因表現量。LPS(+)/RNA(-)之投予群4與LPS(-)/RNA(-)之投予群1相較下，經LPS處理之結果即是前述基因之表現量增加。且LPS(+)/NK-0033(+)之實施例投予群5與LPS(+)/RNA(-)投予群4相較下，前述基因之表現量上昇受到抑制。該抑制效果並未在LPS(+)/陰性控制組NK-0035(+)之投予群6觀察到。從此一結果得知，可藉由前述實施例之NK-0033來有效抑制TGF-β1基因之表現。
(2.2)急性肺傷害抑制效果
急性肺傷害之炎症係因嗜中性球等之細胞浸潤至肺而產生。因此，可抑制嗜中性球等細胞對肺浸潤之藥物會成為急性肺傷害之炎症治療藥。在 此，將支氣管肺胞洗淨液(BALF)中之細胞數作為已朝肺浸潤之細胞數的指標，確認本發明ssRNA之藥理效果。
茲將前述BALF樣本中之細胞數測定結果示於第10圖。第10圖為圖表，顯示各投予群之BAFL樣本中之細胞數。LPS(+)/RNA(-)之投予群4與LPS(-)/RNA(-)之投予群1相較下，經LPS處理之結果即是前述BALF樣本中之細胞數增加。這顯示出炎症作用因LPS而受到誘導，其結果為細胞浸潤至肺。再者，LPS(+)/NK-0033(+)之實施例投予群5與LPS(+)/RNA(-)之投予群4相較下，細胞數之上昇受到抑制。這顯示急性肺傷害之炎症因前述NK-0033而受到抑制。此一抑制效果並未在LPS(+)/陰性控制組NK-0035(+)之投予群6中觀察到。由此結果得知，可藉由前述實施例之NK-0033來有效抑制急性肺傷害之炎症。
茲將前述BALF樣本中之嗜中性球數測定結果示於第11圖。第11圖為圖表，顯示各投予群之BALF樣本中之嗜中性球細胞數。LPS(+)/RNA(-)之投予群4與LPS(-)/RNA(-)之投予群1相較下，經LPS處理之結果即是前述BALF樣本中之嗜中性球數增加。這顯示炎症作用因LPS而受到誘導，其結果為嗜中性球浸潤至肺。再者，LPS(+)/NK-0033(+)之實施例投予群5與LPS(+)/ssRNA(-)之投予群4相較下，前述BALF樣本中之嗜中性球數之上昇受到抑制。這顯示急性肺傷害之炎症因前述NK-0033而受到抑制。此一抑制效果並未在LPS(+)/陰性控制組NK-0035(+)之投予群6中觀察到。由此結果得知，可藉由前述實施例之NK-0033來有效抑制急性肺傷害之炎症。
(2.3)組織學上的觀察：吉姆沙染色
茲將吉姆沙染色之結果示於第12圖。第12圖為照片，顯示前述BALF樣本中之細胞的吉姆沙染色結果(倍率100倍)。於第12圖中，(A)為LPS(+)/RNA(-)之投予群4的結果，(B)為LPS(+)/陰性控制組NK-0035(+)之投予群6的結果，(C)顯示LPS(+)/NK-0033(+)之實施例投予群5的結果。
如第12圖所示，LPS(+)/NK-0033(+)之實施例投予群5(C)與LPS(+)/RNA(-)之投予群4(A)及LPS(+)/陰性控制組NK-0035(+)之投予群6(B)相較下，浸潤至肺之細胞數顯著較少。此種組織學上的觀察與前述BALF樣本中之細胞數結果一致。
(2.4)組織學上的觀察：HE染色
茲將HE染色之結果示於第13圖。第10圖為照片，顯示前述肺組織之HE染色結果(倍率10倍)。於第10圖中，(A)為LPS(+)/RNA(-)之投予群4的結果，(B)為LPS(+)/陰性控制組NK-0035(+)之投予群6的結果，(C)顯示LPS(+)/NK-0033(+)之實施例投予群5的結果。從第13圖得知，嗜中性球等之細胞朝血管周圍、肺胞腔內、肺胞壁及支氣管周邊之浸潤減少，肺組織之傷害性降低。
(實施例A7)以誘導干擾素為指標之副作用評估
習知方法之iRNA劑已知其副作用會序列非相依性地誘導干擾素，且該副作用被視為問題。於此，就本發明之ssRNA評估誘導干擾素之副作用。
(1)材料及方法
藉由與前述實施例A6相同之方法及條件，對急性肺傷害小鼠進行ssRNA之投予。接著，與前述實施例A6相同地滴定前述LPS溶液或滅菌生理食鹽水(相對於LPS之陰性控制組)，過24小時後使小鼠安樂死，採取肺組織。
為了測定各基因之表現量，使用TRIZOL(商品名，Invitrogen)從前述肺組織分離出RNA。其次，使用逆轉錄酶(商品名SuperScriptII，Invitrogen)，依照所附規程從前述RNA合成出cDNA。接著，將合成出之前述cDNA用作模板進行PCR，測定出TGF-β1基因、IFN-α基因及IFN-β基因之表現量。 前述PCR使用Gold AmpliTaq(商品名，Applied Biosystem，美國)作為試劑，測定機器則使用AB Applied Biosystem 7600(商品名，Applied Biosystem)。TGF-β1基因、IFN-α基因及IFN-β基因之擴增分別使用以下之引子組。
GAPDH基因用引子組
5’-CCCTTATTGACCTCAACTACATGGT-3’(序列編號21)
5’-GAGGGGCCATCCACAGTCTTCTG-3’(序列編號22)
TGF-β 1基因用引子組
5’-ACTCCACGTGGAAATCAACGG-3’(序列編號23)
5’-TAGTAGACGATGGGCAGTGG-3’(序列編號24)
IFN-α基因用引子組
5’-ATGGCTAGRCTCTGTGCTTCCT-3’(序列編號25)
5’-AGGGCTCTCCAGAYTTCTGCTCTG-3’(序列編號26)
IFN-β基因用引子組
5’-CATCAACTATAAGCAGCTCCA-3’(序列編號27)
5’-TTCAAGTGGAGAGCAGTTCAG-3(序列編號28)
接著，使所得PCR產物進行瓊脂電泳。此外，針對電泳後之瓊脂使用NIH imaging system進行密度解析，確認各基因之表現量。前述TGF-β1基因、前述IFN-α基因及前述IFN-β基因之表現量係各自以前述GAPDH基因之表現量為標準，並相對性地作評估。具體來說，則是令使用前述GAPDH基因用引子組之PCR產物的測定強度為標準1，求出使用各基因用引子組之PCR產物的測定強度相對值並進行評估。
(2)結果及考察
茲將關於前述TGF-β1基因、IFN-α基因及IFN-β基因之表現量的定量解析結果分別顯示於第14(A)~(C)圖之圖表。各投予群與前述實施例A6同樣地係如下所示。
第14(A)圖為TGF-β1基因表現量之結果。如第14(A)圖所示，已投予前述NK-0033之實施例投予群5與RNA(-)之投予群4相較下，以抑制了受LPS誘導之TGF-β1基因表現上昇。此一結果與前述實施例A5之第8圖所 示TGF-β1表現量的測定結果呈正相關。
第14(B)圖係顯示IFN-α基因表現量之結果，第14(C)圖係顯示IFN-β基因表現量之結果。如第14(B)圖及第14(C)圖所示，未添加LPS時，將RNA(-)之投予群1與RNA(+)之投予群2予以比較之結果，並未發生因添加ssRNA所導致之IFN-α基因及IFN-β基因(屬I型干擾素)的表現誘導。此外，如第14(B)圖及第14(C)圖所示，添加LPS時，將RNA(-)之投予群4與NK-0033(+)之投予群5予以比較的結果，同樣地未發生因添加ssRNA所導致之IFN-α基因及IFN-β基因的表現誘導。
此一結果與會產生I型干擾素誘導之副作用的習知siRNA結果呈對照。亦即，本發明之ssRNA超乎意料地不會產生在習知方法中成為問題之干擾素誘導的副作用，此一事實已受到證實。
(實施例A8)Hepa1-6細胞中之TGF-β 1基因的表現抑制效果
針對本發明之ssRNA，確認活體外之TGF-β1基因的表現抑制效果。
(1)材料及方法
實施例之RNA(Ex)使用前述實施例A5之NK-0033以及如下所示之NK-0061、NK-0055及NK-0062。於下述序列中，「＊」表示自由鹼基。
【化9】
此外，實施例之RNA(Ex)使用下述PK-0007、PK-0026、PK-0027及PK-0028。該等ssRNA中，連結區域(Lx)及連結區域(Ly)係使用實施例B所示流程3之化合物10(L-脯胺酸二亞醯胺)而使Xc與X之間以及Yc與Y之間結合。
[NK-0033、NK-0061、NK-0055、NK-0062]與[PK-0007、PK-0026、PK-0027]及[PK-0028]除了前述第1連接子(L1)及第2連接子(L2)不同之外，為相同之序列，且均有可抑制TGF-β1基因表現之序列(序列編號16)。
(1.2)基因之表現抑制
使已冷凍保存之前述RNA溶解於注射用蒸餾水而成為20μmol/L，調製出RNA溶液。接著，除了使用前述RNA溶液之外，與前述實施例A5同樣地進行前述ssRNA對Hepa1-6細胞之轉染、RNA回收、cDNA合成及PCR。測定TGF-β1基因之相對表現量。令轉染時之RNA濃度為1nmol/L。
(2)結果
茲將此等結果示於第15及16圖。第15圖及第16圖為圖表，分別顯示TGF-β1基因表現量之相對值。第15圖係使用NK-0033、NK-0061、NK-0055及NK-0062之結果，第16圖係使用PK-0007、PK-0026、PK-0027及PK-0028之結果。如第15及16圖所示，任一個ssRNA均顯示出強烈之基因表現抑制活性。
(實施例A9)
活體內之TGF-β1基因表現抑制效果及急性肺傷害抑制效果
(A9-1)活體內之TGF-β 1基因表現抑制效果
使用本發明之ssRNA，確認活體內之TGF-β1基因的表現抑制效果。
(1)材料及方法
對於急性肺傷害小鼠之RNA投予，只要未特別表示，即與前述實施例A6相同地進行。
實施例之RNA(Ex)使用前述實施例A85之PK-0007及NK0033。此外，比較例之RNA則使用以下所示之RNAi陰性控制組(Nc)的PK-0008及NK-0035、RNAi陽性控制組(Pc)之dsRNA(NI-0030)及RNAi陰性控制組(Nc)之dsRNA(NI-0031)。陰性控制組之PK-0008與PK-0007相同，具有源自前述亞醯胺(流程3之前述化合物10：L-脯胺酸二醯胺亞醯胺)之連接子Lx及Ly。
【化11】
使100μg之前述RNA溶解於滅菌生理食鹽水75μL，調製出RNA溶液。另一方面，使100μg之脂多醣(LPS)溶解於滅菌生理食鹽水50μL，調製出LPS溶液。
茲將各投予群顯示如下。只要無特別表示，即與前述實施例A6同樣地進行投予。各投予群中使用4~6隻小鼠。
‧投予群1
自投予滅菌生理食鹽水75μL起5分鐘後，投予滅菌生理食鹽水50μL。
‧投予群2
自投予滅菌生理食鹽水75μL起5分鐘後，投予前述LPS溶液50μL。
‧投予群3
自投予75μL之RNA溶液(PK-0007)起5分鐘後，投予前述LPS溶液50μL。
‧投予群4
自投予75μL之RNA溶液(PK-0008)起5分鐘後，投予前述LPS溶液 50μL。
‧投予群5
自投予75μL之RNA溶液(PK-0033)起5分鐘後，投予前述LPS溶液50μL。
‧投予群6
自投予75μL之RNA溶液(PK-0035)起5分鐘後，投予前述LPS溶液50μL。
‧投予群7
自投予75μL之RNA溶液(PK-0030)起5分鐘後，投予前述LPS溶液50μL。
‧投予群8
自投予50μL之RNA溶液(PK-0031)起5分鐘後，投予前述LPS溶液50μL。
接著，與前述實施例A6同樣地調製肺樣本，測定每單位重量之肺的TGF-β1表現量。
茲將其結果示於第17圖。第17圖為圖表，顯示各投予群中每單位重量之肺的TGF-β1表現量。LPS(+)/PK-0007(+)之投予群3及LPS(+)/NK-0033(+)之投予群5分別與LPS(+)/ssRNA(-)之投予群2相較，TGF-β1基因之表現量受到抑制。此一抑制效果與LPS(+)/陽性控制組NI-0030之投予群7相較下明顯較強。特別是，LPS(+)/PK-0007(+)之投予群3顯示出顯著之抑制效果。另，經投予陰性控制組之RNA的投予群4(PK-0008)、投予群6(NK-0035)及投予群8(NI-0031)未確認抑制效果。
(A9-2)活體內之脫靶(off-target)效果
使用本發明之ssRNA，確認活體內之脫靶效果，並評估副作用。
實施例之RNA使用前述實施例A8之ssRNA(PK-0007)。比較例之RNA則使用前述實施例A9-1所示之RNAi陰性控制組(Nc)的ssRNA(PK-0008)、RNAi陽性控制組(Pc)之dsRNA(NI-0030)及RNAi陰性控制組之dsRNA(NI-0031)。接著，使100μg之前述RNA溶解於滅菌生理食鹽水75μL，調製出RNA溶液。
茲將各投予群顯示如下。各投予群中使用2~4隻小鼠。
‧投予群1
投予滅菌生理食鹽水75μL。
‧投予群2
投予75μL之RNA溶液(PK-0007)。
‧投予群3
投予75μL之RNA溶液(PK-0008)。
接著，從投予起24小時後，與前述實施例A6相同地從小鼠回收BALF樣本，獲得前述BALF樣本之上清液。就前述上清液測定TNF-α量及IFN-β量。前述TNF-α量係使用商品名Mouse TNF set II(Beckton Dickinson and Company)，依照其使用說明書作定量。此外，前述IFN-β量係使用利用商品名Rabbit Anti-Mouse Interferonβ(PBL InterferonSource)及商品名Biotin Labeling Kit-NH2(同仁化學研究所)而製作出之ELISA分析微量盤(ELISA plate)，依照其等之使用說明書作定量。
茲將其等之結果示於第18圖。第18(A)圖為圖表，顯示各投予群之BALF樣本中之TNF-α量；第18(B)圖為圖表，顯示各投予群之BALF樣本中之IFN-β量。於第18圖中，橫軸顯示個別之量。前述PK-0007(+)之投予群2與RNA(-)之投予群1相較下，並未引發TNF-α及IFN-β之表現。
(實施例A10)293細胞中之LAMA1基因表現抑制效果
使用本發明之ssRNA，確認RNA干擾效果所導致之活體外LAMA1基因的表現抑制。
(1)材料及方法
實施例之RNA(Ex)使用下示NK-0043及NK-0064。於下述序列中，「＊」表示自由鹼基(以下相同)。
【化12】
除了使用前述RNA之外，與前述實施例A4相同地對293細胞進行轉染，將前述細胞培養48小時。令轉染時之RNA濃度為10nmol/L。接著，除了引子使用以下之LAMA1基因用引子組之外，與前述實施例A2相同地進行RNA回收、cDNA合成及PCR，測定LAMA1基因表現量及內部標準之β-肌動蛋白基因表現量。藉由內部標準之β-肌動蛋白基因表現量來修正前述LAMA1基因之表現量。
LAMA1基因用引子組
5’-AAAGCTGCCAATGCCCCTCGACC-3’(序列編號45)
5’-TAGGTGGGTGGCCCTCGTCTTG-3’(序列編號46)
此外，與前述實施例A2同樣地，亦就控制組1(-)及控制組2(mock)測定表現量。之後，針對修正後之LAMA1基因表現量，令控制組(-)之細胞表現量為1，求出已導入各RNA之細胞的表現量相對值。
(2)結果
茲將該等結果示於第19圖。第19圖為圖表，顯示293細胞之LAMA1基因表現量的相對值。如第19圖所示，得知實施例之NK-0043及NK-0064顯示出強烈的基因表現抑制活性。
(實施例A11)A549細胞中之LMNA基因表現抑制效果
使用本發明之ssRNA，確認RNA干擾效果所導致之活體外LMNA基因的表現抑制。
(1)材料及方法
實施例之RNA(Ex)使用以下所示之NK-0063及NK-0066。於下述序列 中，「＊」表示自由鹼基(以下相同)。
除了使用前述RNA之外，與前述實施例A4相同地對A549細胞進行轉染，培養前述細胞48小時。令轉染時之RNA濃度為3nmol/L。接著，除了引子使用以下之LMNA基因用引子組之外，與前述實施例A2相同地進行RNA回收、cDNA合成及PCR，測定LMNA基因之表現量及內部標準之β-肌動蛋白基因表現量。藉由內部標準之β-肌動蛋白基因表現量修正前述LMNA基因表現量。
LMNA基因用引子組
5’-CTGGACATCAAGCTGGCCCTGGAC-3’(序列編號49)
5’-CACCAGCTTGCGCATGGCCACTTC-3’(序列編號50)
此外，與前述實施例A2相同地，亦就控制組1(-)及控制組2(mock)測定表現量。接著，針對修正後之LMNA基因表現量，令控制組(-)之細胞表現量為1，求出已導入各RNA之細胞的表現量相對值。
(2)結果
茲將該等結果顯示於第20圖。第20圖為圖表，顯示A549細胞之LMNA基因表現量的相對值。如第20圖所示，得知實施例之NK-0063及NK-0066顯示出強烈之基因表現抑制活性。
(實施例A12)Xc與Yc之長度
針對本發明之ssRNA，使與前述內部5’端側區域(X)互補之前述5’端側區域(Xc)的長度以及與前述內部3’端側區域(Y)互補之前述3’端側區域(Yc) 的長度發生變化，確認活體外之GAPDH基因表現抑制。
(1)材料及方法
實施例之RNA使用第21圖所示ssRNA。於第21圖中，右端之編號表示序列編號。於第21圖中，從5’端側起，劃底線之小寫字母區域表示前述區域(Xc)，劃底線之大寫字母區域表示前述內部區域(Z)，劃底線之小寫字母區域表示前述區域(Yc)。前述Xc與前述Z之間為連結區域(Lx)，前述Z與前述Yc之間為連結區域(Ly)。此外，「Xc/Yc」表示前述區域(Xc)之鹼基長(Xc)與前述區域(Yc)之鹼基長(Yc)的比。於第21圖中，「＊」表示自由鹼基(以下相同)。
各ssRNA均令內部區域(Z)之鹼基長為26個鹼基、連結區域(Lx)之鹼基長為7個鹼基、連結區域(Ly)之鹼基長為4個鹼基。此外，NK-0036及NK-0040係令前述區域(Xc)與前述區域(Yc)之合計鹼基數(Xc+Yc)為26鹼基，除此之外，令前述區域(Xc)與前述區域(Yc)之合計鹼基數(Xc+Yc)為25個鹼基。接著，在此條件下，使前述區域(Xc)及前述區域(Yc)之鹼基長發生變化。藉此，將NK-0036及NK-0040製成不具有自由鹼基之分子。其等之外的各ssRNA則是令前述內部區域(Z)中不形成雙股之自由鹼基全部成為1個鹼基，且使前述內部區域(Z)中前述自由鹼基之位置從3’端側變動為5’端側。
除了使用前述RNA之外，與前述實施例A2相同地進行對於HCT116細胞之轉染、培養、RNA回收、cDNA合成及PCR，測定GAPDH基因之相對表現量。令轉染時之RNA濃度為10nmol/L。
(2)結果及考察
茲將該等結果示於第22圖。第22圖為圖表，顯示使用最終濃度為10nmol/L之RNA時的GAPDH基因表現量相對值。如第22圖所示，已使前述5’端側區域(Xc)及前述3’端側區域(Yc)之長度發生變化的任一ssRNA均可確認到GAPDH基因之表現抑制。
特別是，已確認隨著前述區域(Xc)之鹼基長與前述區域(Xc)之鹼基長的差增大，基因表現量相對降低，表現抑制活性增加。亦即，越是將前述內部區域(Z)中自由鹼基之位置配置在較前述內部區域中央更偏5’端側或3’端 側，越可提高前述表現抑制活性。
於前述實施例A2中，已確認NK-0016具有極強烈之表現抑制活性。在本實施例中，則是確認NK-0025及NK-0037具有更超越前述NK-0016之活性。
另外，關於自由鹼基之位置，舉例來說，即使是以不同於本實施例之TGF-β1基因作為對象的實施例A8、以LAMA1基因作為對象之實施例A10、以LMNA基因作為對象之實施例A11，亦獲得同樣之效果。
亦即，在前述實施例A8中，如前述序列所示，NK-0033與NK-0055均具有1個鹼基之自由鹼基，前者位在內部區域(Z)之3’末端起算第4個，後者位在內部區域(Z)之3’末端起算第2個。接著，如前述第15圖所示，自由鹼基位在更靠3’末端側之NK-0055顯示出較高之表現抑制。即使在自由鹼基為2個鹼基之NK-0061與NK-0062之間，亦是同樣的結果。此外，實施例A9及實施例10係在與前述實施例8相同之條件下使自由鹼基之位置發生變化，但仍是相同地，自由鹼基位在更靠3’末端側之ssRNA顯示出較高之表現抑制。
從此等結果亦可明確看出，無論目標基因之種類以及對其之抑制表現序列，均顯示出同樣的行為(behavior)。因此，本發明之ssRNA可說是可不論目標基因種類而均適用之工具。
(實施例A13)X、Xc、Y及Yc之長度
針對本發明之ssRNA，使前述內部5’端側區域(X)、前述5’端側區域(Xc)、前述內部3’端側區域(Y)及前述3’端側區域(Yc)之各個長度發生變化，並確認活體外之GAPDH基因表現抑制。
(1)材料及方法
實施例之RNA使用第23圖所示ssRNA。第23圖中，右端編號表示序列編號。第23圖中，自5’端側起，劃底線之小寫字母區域表示前述區域(Xc)，劃底線之大寫字母區域表示前述內部區域(Z)，劃底線之小寫字母區域表示前述區域(Yc)。此外，「Xc+Yc/X+Y」表示前述區域(Xc)及前述區域(Yc)之鹼基長合計與前述區域(X)及前述區域(Y)之鹼基長合計的比。於第23圖中，「＊」表示自由鹼基。
各ssRNA均令連結區域(Lx)之鹼基長為7個鹼基、連結區域(Ly)之鹼基長為4個鹼基、前述區域(Yc)之鹼基長為1個鹼基，且令前述內部區域(Z)之3’端側起第2個鹼基為自由鹼基。接著，使前述內部區域(Z)之鹼基長與前述區域(Xc)之鹼基長發生變動。
只要無特別表示，即與前述實施例A2相同地就前述RNA，進行對HCT116細胞之轉染、培養、RNA回收、cDNA合成及PCR，測定GAPDH基因表現量。前述轉染條件係使前述每井之組成設定如下。於下述組成中，(B)為Opti-MEM(商品名、Invitrogen)，(C)為20μmol/L之前述RNA溶液，兩者合併添加98.5μL。於前述井中，令前述RNA之最終濃度為1nmol/L。利用內部標準之修正以及表現量相對值之算出亦是與前述實施例A2相同地進行。
(2)結果及考察
茲將該等結果示於第24圖。第24圖為圖表，顯示使用最終濃度為1nmol/L之RNA時GAPDH基因表現量之相對值。如第24圖所示，針對業已使前述區域(X)、前述區域(Xc)、前述區域(Y)及前述區域(Yc)之長度發生變化之任一ssRNA，均已確認到GAPDH基因之表現抑制。此外，前述實施例A2中，已確認NK-0016顯示出極強烈之表現抑制活性。在本實施例中，則是確認NK-0016以外之ssRNA均具有更超越NK-0016之活性。
(實施例A14)Xc之長度
針對本發明之ssRNA，使與前述內部5’端側區域(X)互補之前述5’端側區域(Xc)的長度發生變化，確認活體外之GAPDH基因表現抑制。
(1)材料及方法
實施例之RNA使用第25圖所示ssRNA。於第25圖中，自5’端側起，劃底線之小寫字母區域表示前述區域(Xc)，劃底線之大寫字母區域表示前述內部5’區域(X)，劃底線之小寫字母區域表示前述區域(Yc)。此外，「Xc/Yc」表示前述區域(Xc)之鹼基長(Xc)與前述區域(X)之鹼基長(X)的比。第25圖中，「＊」表示自由鹼基。下述RNA之序列顯示於序列編號74~76。
各ssRNA均令內部區域(Z)之鹼基長為26個鹼基、前述區域(X)為25個鹼基、前述區域(Y)為1個鹼基、前述區域(Yc)為1個鹼基、連結區域(Lx)之鹼基長為7個鹼基、連結區域(Ly)之鹼基長為4個鹼基。接著在此條件下，使前述區域(Xc)之鹼基長發生變化。各ssRNA藉此使前述內部區域(Z)中不形成雙股之自由鹼基的有無及數量發生變化。另外，NK-0001不具有自由鹼基。
除了使用前述RNA之外，與前述實施例A13同樣地進行對HCT116細胞之轉染、培養、RNA回收、cDNA合成及PCR，測定GAPDH基因表現量。利用內部標準之修正以及表現量相對值之算出亦是與前述實施例A13同樣地進行。
(2)結果及考察
茲將其該等結果示於第26圖。第26圖為圖表，顯示使用最終濃度為1nmol/L之RNA時GAPDH基因表現量之相對值。如第26圖所示，已使前述5’端側區域(Xc)長度發生變化之任一ssRNA均已確認到GAPDH基因之表現抑制。特別是在具有自由鹼基時，其數量越少，越可提高前述表現抑制活性。此外，前述實施例A2中，已確認NK-0016具有極強烈之表現抑制活性。在本實施例中，則是確認NK-0016以外之ssRNA全部具有超越NK-0016之活性。
另外，就自由鹼基之個數，舉例來說，即使是以不同本實施例之TGF-β1基因作為對象的實施例A8，亦獲得同樣之效果。亦即，如前述實施例A8之序列所示，NK-0033與NK-0061之自由鹼基在前者為1個鹼基，後者為2個鹼基。接著，如前述第15圖所示，自由鹼基較少之NK-0033顯示出較高之表現抑制。再者，NK-0055與NK-0062係如實施例A12所示，與前述NK-0033及前述NK-0061相較下，使自由鹼基之位置變動至更偏內部區域 (Z)之3’端側，藉此表現出較高之表現抑制。由此等結果亦可明確得知，無論目標基因之種類以及對其之抑制表現序列，均顯示出同樣的行為。因此，本發明之ssRNA可說是可不論目標基因種類而均適用之工具。
(實施例A15)連接子(linker)之互換性
針對本發明之ssRNA，使前述內部5’端側區域(X)與前述5’端側區域(Xc)間之連結區域(Lx)以及前述內部3’端側區域(Y)與前述3’端側區域(Yc)間之連結區域(Ly)發生變化，並確認活體外之GAPDH基因表現抑制。
(1)材料及方法
實施例之RNA使用第27圖所示ssRNA。第27圖中，從5’端側起，劃底線之小寫字母區域表示前述5’端側區域(Xc)，劃底線之大寫字母區域表示前述內部區域(Z)，劃底線之小寫字母區域表示前述3’端側區域(Yc)。前述X與前述Xc間之序列為連結區域(Lx)，前述Y與前述Yc間之序列為連結區域(Ly)。此外，針對各RNA，顯示連結區域(Lx)之鹼基長(Lx)與連結區域(Ly)之鹼基長(Ly)的比(Lx/Ly)。於第27圖中，「＊」表示自由鹼基。
除了使用前述RNA以外，與前述實施例A13相同地進行對HCT116細胞之轉染、培養、RNA回收、cDNA合成及PCR，測定GAPDH基因表現量。利用內部標準之修正、表現量相對值之算出亦是與前述實施例A13同樣地進行。
(2)結果及考察
茲將此等結果示於第28圖。第28圖為圖表，顯示用最終濃度為1nmol/L之RNA時GAPDH基因表現量之相對值。如第28圖所示，即使就已使前述連結區域(Lx)及(Ly)之條件(即長度、兩者間之長度比、序列等)發生變化的任一ssRNA而言，同樣地確認到GAPDH基因之表現抑制。從此結果得知，前述連結區域(Lx)及(Ly)之條件並未特別受限，可設計成各種長度及序列等。
(實施例A16)HCT116細胞中GAPDH基因之表現抑制效果
使用已藉具有脯胺酸或脯胺醇之連接子作置換的ssRNA，確認HCT116細胞中之GAPDH表現抑制效果。
(1)材料及方法
合成下示RNA(Ex ssRNA)以作為實施例之RNA(Ex)。此外，合成下示RNAi之陰性控制組(Nc)的Nc ssRNA以作為合成比較例之RNA。於下述式中，連結區域(Lx)及連結區域(Ly)使用具有脯胺酸或脯胺醇之下表的亞醯胺(實施例B參照)，使Xc與X之間以及Yc與Y之間結合。
除了使用前述RNA以外，與前述實施例A13同樣地進行對HCT116細胞之轉染、培養、RNA回收、cDNA合成及PCR，測定GAPDH基因之表現量。利用內部標準之修正、表現量相對值之算出亦是與前述實施例A13同樣地進行。
(2)結果
茲將該等結果示於第29圖。第29圖為圖表，顯示GAPDH基因表現量之相對值。如第29圖所示，得知含有脯胺酸或脯胺醇之連結區域(Lx)及連結區域(Ly)的每一Ex ssRNA均確認有強烈之基因表現抑制活性，且顯示濃度相依性之效果。另一方面，陰性控制組之ssRNA則未觀察到抑制效果。
(實施例A17)HCT116細胞中GAPDH基因之表現抑制效果
使用業已經具有脯胺酸之連結子置換的ssRNA，並確認HCT116細胞中之GAPDH表現抑制效果。
(1)材料及方法
合成出下示之RNA(Ex ssRNA)作為合成實施例之RNA(Ex)。此外，合成出下示RNAi之陰性控制組(Nc)的Nc ssRNA作為比較例之RNA。於下述式中，連結區域(Lx)及連結區域(Ly)係使用具有脯胺酸或脯胺醇之下述表中之亞醯胺(參照實施例B)而使Xc與X之間及Yc與Y之間結合。
除了使用前述RNA之外，與前述實施例A13同樣地進行對HCT116細胞之轉染、培養、RNA回收、cDNA合成及PCR，測定GAPDH基因之表現量。利用內部標準之修正、表現量相對值之算出亦是與前述實施例A13同樣地進行。
(2)結果
茲將該等結果示於第30圖。第30圖為圖表，顯示HCT116細胞之GAPDH基因表現量相對值。如第30圖所示，得知含有脯胺酸作為連結區域(Lx)及連結區域(Ly)之Ex ssRNA顯示出強烈基因表現抑制活性，顯示出濃度相依性之效果。另一方面，陰性控制組之ssRNA則未觀察到抑制效果。
(實施例A18)核糖核酸酶耐性
針對本發明之ssRNA確認核糖核酸酶耐性。
(1)材料及方法
實施例之RNA(Ex)使用實施例A5之NK-0033及實施例A8之PK-0007。此外，比較例之RNA使用實施例A9之陽性控制組(Pc)之dsRNA(NI-0030)。
首先，於20mmol/L之Tris-HCl(pH8)中混入60pmol之前述RNA、5×10-5單位之RNase A(Roche)及5×10-5單位之RNase T1(Roche)，於37℃下保溫(incubate)。自開始保溫起算10分鐘、20分鐘、30分鐘後依定法使RNase反應停止。接著，使前述反應液於15%聚丙烯醯胺凝膠中電泳後，以SYBR Green II(Lonza，瑞士)染色，並使用E-BOX-VX2(MS機器，東京)進行分析。
(2)結果
茲將該結果示於第31圖。第31圖為顯示核糖核酸酶耐性之電泳照片。於第31圖中，巷(lane)「M」為分子量標記，min表示保溫時間。
如第31圖所示，比較例之NI-0030於保溫10分鐘後幾乎完全分解。相對於此，實施例之NK-0033及PK-0007即使在保溫10分鐘後亦殘存下來。從此結果得知，本發明之ssRNA較dsRNA具有更優異之核糖核酸酶耐性。
(實施例A19)核酸酶耐性
針對本發明之ssRNA確認核酸酶耐性。
(1)材料及方法
與前述實施例A18相同地使用RNA。首先，於含有5mmol/L CaCl2之50mmol/L Tris-HCl(pH8)中，混入60pmol之前述RNA、0.5單位之S7核酸酶(Roche)，於37℃下保溫。自保溫開始(0h)起0.5小時後，依定法使S7核酸酶之反應停止。接著，使前述反應液依定法而在7M尿素-15%聚丙烯醯胺凝膠中電泳後，以SYBR Green II(商品名，Lonza)染色，並使用E-BOX-VX2(商品名，MS機器)分析。
(2)結果
茲將該結果示於第32圖。第32圖為顯示S7核酸酶耐性之電泳照片。 於第32圖中，巷「M」為分子量標記。此外，h表示保溫時間。
如第32圖所示，比較例之NI-0030在保溫0.5小時後幾乎全部分解。相對來說，實施例之NK-0033及PK-0007即使在保溫0.5小時後亦殘存下來。從此結果得知，本發明之ssRNA較dsRNA具有更優異之S7核酸酶耐性。
從前述實施例A之結果得知，本發明之ssRNA舉例來說可不依賴目標基因種類而構築。具體來說，則是得知前述ssRNA中，例如前述區域(X)與前述區域(Xc)所形成之雙股長度及前述區域(Y)與前述區域(Yc)所形成之雙股長度、前述內部區域(Z)中不形成雙股之自由鹼基的有無、個數及位置、以及連結區域(Lx)與連結區域(Ly)之有無、種類及長度等均可改變。據此，本發明之ssRNA可不依賴目標基因種類地使用在基因之表現抑制上，而可說是具泛用性之新穎工具。
(實施例B1)
1. 脯胺醇之合成
依照下式所示流程1，合成出經二甲氧基三苯甲基保護之脯胺醇。
(1)Fmoc-L-脯胺醇(化合物2)
將L-脯胺醇(化合物1)(0.61g，6.0mmol)溶解於純水70mL中，調製出L-脯胺醇水溶液。將N-(9-茀基甲氧基羰氧基)琥珀醯亞胺(Fmoc-OSu)(2.0g，6.0mmol)溶解於THF 10mL。將該THF溶液加至前述L-脯胺醇水溶液，攪拌1小時使兩者反應。使該反應液分離成液體部分(liquid fraction)與沉澱部分，再以乙酸乙酯將各部份抽提，分別回收有機層。接著，合併各各別之有機層後，添加無水硫酸鈉，使其吸收水分(以下稱為乾燥)。過濾前述有機層，回收濾液，減壓濃縮前述濾液。將所得殘渣以二氧化矽凝膠管柱層析法(展開溶劑己烷：乙酸乙酯=1：1)純化，製得化合物2(1.4g，收率74%)。 以下顯示化合物之NMR結果。
1H-NMR(CDCl3)：δ7.77(2H,d,J=7.7Hz,Ar-H),7.60(2H,d,J=7.3Hz,Ar-H),7.40(2H,t,J=7.5Hz,Ar-H),7.31(2H,t,J=7.6Hz,Ar-H),4.40-4.50(2H,m,COOCH2),4.22(1H,t,J=6.5Hz,Ar-CH),3.20-3.80(5H,m,H-5,H-6),1.75(3H,m,H-3,H-4),1.40(1H,m,H-3).
(2)Fmoc-DMTr-L-脯胺醇(化合物3)
使前述Fmoc-L-脯胺醇(化合物2)(1.4g，4.3mmol)溶解於吡啶20mL中，共沸3次。使所得殘留物溶解於吡啶20mL中。將該溶液於氬氣下且在冰浴中一邊攪拌一邊添加4，4’-二甲氧基三苯甲基氯(DMTr-Cl)(1.8g，5.3mmol)。針對該反應液，以氯仿/甲醇之TLC追蹤反應，至Fmoc-L-脯胺醇之點(spot)消失為止，使其反應4小時。接著，為了使過剩之DMTr-Cl淬冷(quench)，於前述反應液中加入甲醇3mL並攪拌10分鐘。更於前述反應液中加入氯仿後，回收有機層。對回收之前述有機層進行飽和食鹽水之洗淨及5%碳酸氫鈉水溶液之洗淨，再次進行飽和食鹽水之洗淨。以無水硫酸鈉使洗淨後之有機層乾燥。過濾前述有機層，使所得濾液減壓濃縮。以二氧化矽凝膠管柱層析法(展開溶劑氯仿，1%吡啶)純化所得殘渣，製得化合物3(2.0g，收率74%)。茲將化合物之NMR結果顯示如下。
1H-NMR(CDCl3)：δ7.77(2H,d,J=7.7Hz,Ar-H),7.60(2H,d,J=7.3Hz,Ar-H),7.40-7.18(13H,m,Ar-H),6.89(4H,d,J=8.6Hz,Ar-H),4.20-4.40(2H,m,COOCH2),4.02(1H,t,J=6.5Hz,Ar-CH),3.80-3.10(5H,m,H-5,H-6),3.73(s, 6H,OCH3),1.84(3H,m,H-3,H-4),1.58(1H,m,H-3).
(3)DMTr-L-脯胺醇(化合物4)
使前述Fmoc-DMTr-L-脯胺醇(化合物3)(2.0g，3.2mmol)溶解於含20%哌啶之DMF溶液25mL中，攪拌12小時。將該溶液減壓濃縮，使所得殘渣以二氧化矽凝膠管柱層析法(氯仿：甲醇=85：15，含1%吡啶)純化，製得化合物4(1.0g，收率78%)。茲將化合物之NMR結果顯示如下。
1H-NMR(CDCl3)：δ7.40-7.14(9H,m,Ar-H),6.82(4H,d,J=8.6Hz,Ar-H),3.78(6H,s,OCH3),3.31(1H,m,H-6),3.07(2H,m,H-2,H-6),2.90(2H,m,H-5),1.84(3H,m,H-3,H-4),1.40(1H,m,H-3).
2. 亞醯胺衍生物之合成
其次，依照下式所示流程2，合成出具有脯胺醇之亞醯胺衍生物。以下，將1-乙基-3-(3-二甲基胺基丙基)碳二醯亞胺鹽酸鹽稱為「EDC」，將N，N-二甲基胺基吡啶(4-二甲基胺基吡啶)稱為「DMAP」。
(1)DMTr-醯胺-L-脯胺醇(化合物5)
使前述DMTr-L-脯胺醇(化合物4)(0.80g，2.0mmol)、EDC(0.46g，2.4mmol)及DMAP(0.29g，2.4mmol)溶解於二氯甲烷20mL並進行攪拌。於該溶液中添加10-羥基癸酸(0.45g，2.4mmol)並攪拌。針對該反應液，以乙酸乙酯之TLC追蹤反應，至DMTr-L-脯胺醇之點消失為止，使其反應20小時。接著，於前述反應液中添加二氯甲烷後，回收有機層。將回收之前述有機層以飽和食鹽水洗淨後，以無水硫酸鈉使其乾燥。過濾前述有機層，將所得濾液減壓濃縮，再使其殘渣以二氧化矽凝膠管柱層析法(乙酸乙酯，含1%吡啶)純化，製得化合物5(0.71g，收率62%)。以下顯示化合物之NMR結果。
1H-NMR(CDCl3)：δ7.40-7.14(9H,m,Ar-H),6.82(4H,d,J=8.6Hz,Ar-H),3.78(6H,s,OCH3),3.68-2.93(7H,m,H-2,H-5,H-6),2.27-1.72(6H,m，烷基，H-3,H-4),1.58(4H,s，烷基)，1.30(10H,s，烷基).
(2)DMTr-烷基-L-脯胺醇(化合物6)
使前述DMTr-L-脯胺醇(化合物4)(0.80g，2.0mmol)溶解於甲醇15mL，添加5-羥基戊醛(0.31g，3.0mmol)並攪拌。於溶液中添加氰基氫化硼鈉(0.25g，4.0mmol)，更進行攪拌。針對該反應液，以乙酸乙酯/己烷之TLC追蹤反應，至DMTr-L-脯胺醇之點消失為止，使其反應24小時。接著，於前述反應液中添加乙酸乙酯，回收有機層。將回收之前述有機層以飽和食鹽水洗淨後，以無水硫酸鈉使其乾燥。過濾前述有機層，將所得濾液減壓濃縮，再使其殘渣以二氧化矽凝膠管柱層析法(己烷：乙酸乙酯=1：1，含1%吡啶)純化，製得化合物6(0.62g，收率63%)。以下顯示化合物之NMR結果。
1H-NMR(CDCl3)：δ7.40-7.14(9H,m,Ar-H),6.82(4H,d,J=8.6Hz,Ar-H),3.78(6H,s,OCH3),3.70-2.86(4H,m,CH2OH,H-6),2.06-1.79(5H,m，烷基，H-2,H-5),1.74-1.49(6H,m，烷基，H-3,H-4),1.45-1.27(4H,m，烷基).
(3)DMTr-胺甲酸酯-L-脯胺醇(化合物7)
使1,4-丁二醇(0.90g，10mmol)溶解於二氯甲烷30Ml，更添加羰基二咪唑(1.4g，8.6mmol)後攪拌3小時。將該反應液之有機層以飽和食鹽水洗淨後，以無水硫酸鈉使其乾燥。過濾前述有機層，將所得濾液減壓濃縮，使 其殘渣以二氧化矽凝膠管柱層析法(氯仿：甲醇=9：1)純化。藉此，製得1,4-丁二醇之一側末端業經羰基二咪唑活性化之化合物(0.25g，1.5mmol)。將該化合物溶解於二氯甲烷15mL中，添加前述DMTr-L-脯胺醇(化合物4)(0.6g，1.5mmol)，攪拌24小時。於該混合液中更添加乙酸乙酯，回收有機層。將回收之前述有機層以飽和食鹽水洗淨後，以無水硫酸鈉使其乾燥。過濾前述有機層，將所得濾液減壓濃縮，使其殘渣以二氧化矽凝膠管柱層析法(己烷：乙酸乙酯=1：1，含1%吡啶)純化，製得化合物7(0.61g，收率77%)。以下顯示化合物之NMR結果。
1H-NMR(CDCl3)：δ7.40-7.14(9H,m,Ar-H),6.82(4H,d,J=8.6Hz,Ar-H),4.24-3.94(2H,m,COOCH2),3.78(s,6H,OCH3),3.72-2.96(7H,m，烷基，H-2,H-5,H-6),2.10-1.30(8H,m，烷基，H-3,H-4).
(4)DMTr-醯脲-L-脯胺醇(化合物8)
使前述DMTr-L-脯胺醇(化合物4)(0.50g，1.2mmol)及三光氣(0.12g、0.40mmol)溶解於二氯甲烷8mL，於氬氣下且在冰浴中攪拌。接著，對前述溶液添加N,N-二異丙基乙基胺(0.31g，2.4mmol)，攪拌1小時。更對前述溶液添加8-胺基-1-辛醇(0.17g，1.2mmol)，同樣於冰浴中攪拌30分鐘後，於室溫下攪拌20小時。於前述溶液中加入二氯甲烷，回收有機層。將回收之前述有機層以飽和食鹽水洗淨後，以無水硫酸鈉使其乾燥。過濾前述有機層，將所得濾液減壓濃縮，並使其殘渣以二氧化矽凝膠管柱層析法(己烷：乙酸乙酯=4：1，含1%三乙胺)純化，製得化合物8(0.44g，收率62%)。以下顯示化合物之NMR結果。
1H-NMR(CDCl3)：δ7.40-7.14(9H,m,Ar-H),6.82(4H,m,Ar-H),3.78(s,6H,OCH3),3.68-3.25(9H,m,CH2NH,CH2OH,H-2,H-5,H-6),1.74-1.18(16H,m,烷基，H-3,H-4).
(5)具有脯胺醇之亞醯胺衍生物(化合物9~12)
將前述經修飾之脯胺醇(化合物5~8)分別用作原料，藉以下所示方法合成出化合物9~12。將前述經修飾之脯胺醇及5-苄基硫代-1H-四唑溶解於乙腈3mL中。前述經修飾之脯胺醇的使用量在化合物5時為0.69g(1.2mmol)，在化合物6時為0.60g(1.2mmol)，在化合物7時為0.60g(1.2mmol)，在化合 物8時為0.25g(0.43mmol)。此外，5-苄基硫代-1H-四唑之使用量對於化合物5~7為0.15g(0.78mmol)，對於化合物8則是54mg(0.15mmol)。於氬氣下，對前述溶液添加2-氰基乙基N,N,N’,N’-四異丙基偶磷基二亞醯胺，攪拌2小時。前述2-氰基乙基N,N,N’,N’-四異丙基偶磷基二亞醯胺之添加量在使用前述化合物5~7之系統中為0.54g(1.8mmol)，使用前述化合物8之系統則是0.19g(0.64mmol)。接著，對前述溶液添加飽和碳酸氫鈉水溶液，更以二氯甲烷抽提並回收有機層。使回收之前述有機層以無水硫酸鈉乾燥。過濾前述有機層，將所得濾液減壓濃縮，將其殘渣以二氧化矽凝膠管柱層析法(己烷：乙酸乙酯=1：1，含1%三乙胺)純化，製得化合物9~12。以下顯示各化合物之NMR結果。
DMTr-醯胺-L-脯胺醇亞醯胺(化合物9，0.60g，收率55%)
1H-NMR(CDCl3)：δ7.40-7.14(9H,m,Ar-H),6.82(4H,d,J=8.6Hz,Ar-H),3.78(6H,s,OCH3),3.68-2.93(11H,m,CH2O,POCH2,CHCH3,H-2,H-5,H-6),2.58(2H,m,CH2CN),2.27-1.72(6H,m，烷基，H-3,H-4),1.58(4H,s，烷基)，1.30(22H,s，烷基，CHCH3).
DMTr-烷基-L-脯胺醇亞醯胺(化合物10，0.71g，收率60%)
1H-NMR(CDCl3)：δ7.40-7.14(9H,m,Ar-H),6.82(4H,d,J=8.6Hz,Ar-H),3.78(6H,s,OCH3),3.70-2.86(8H,m,CH2O,POCH2,CHCH3,H-6),2.58(2H,m,CH2CN),2.06-1.79(5H,m，烷基，H-2,H-5),1.74-1.49(6H,m，烷基，H-3,H-4),1.37-1.10(16H,m，烷基，CHCH3).
DMTr-胺甲酸酯-L-脯胺醇亞醯胺(化合物11，0.67g，收率52%)
1H-NMR(CDCl3)：δ7.40-7.14(9H,m,Ar-H),6.82(4H,d,J=8.6Hz,Ar-H),4.24-3.94(2H,m,COOCH2),3.78(s,6H,OCH3),3.72-2.96(11H,m,CH2O,POCH2,CHCH3,H-2,H-5,H-6),2.58(2H,m,CH2CN),2.10-1.46(8H,m，烷基，H-3,H-4),1.34-1.10(12H,m,CHCH3).
DMTr-醯脲-L-脯胺醇亞醯胺(化合物12，0.20g，收率61%)
1H-NMR(CDCl3)：δ7.40-7.14(9H,m,Ar-H),6.82(4H,m,Ar-H),3.78(s,6H,OCH3),3.65-3.25(13H,m,CH2O,POCH2,CHCH3,H-2,CH2NH,CH2OH,H-2,H-5,H-6),2.73(2H,m,CH2CN),2.10-1.48(16H,m，烷基，H-3,H-4), 1.35-1.10(12H,m,CHCH3).
(實施例B2)
接著，依照下述式所示流程3，合成出具有L-脯胺酸之亞醯胺衍生物。
(1)DMTr-羥基醯胺胺基-L-脯胺酸(化合物11)
於冰冷下，將乙酸緩衝液(7mL)加入含有DMTr-醯胺-L-脯胺酸(化合物 6)(1.00g，2.05mmol)及5-羥基戊醛(0.33g，3.07mmol)之乙醇溶液(7mL)。於冰冷下將該混合液攪拌20分鐘後，加入氰基化硼鈉(0.77g，12.28mmol)，更於室溫下攪拌7小時。以二氯甲烷稀釋前述混合液，再以水洗淨後，更以飽和食鹽水洗淨之。接著，回收前述有機層，以硫酸鈉使其乾燥。過濾前述有機層，針對濾液，於減壓下餾除溶劑。將所得殘渣供至二氧化矽凝膠管柱層析法(展開溶劑CH2Cl2：CH3OH=98：2，含0.05%吡啶)。接著，將所得生成物供至二氧化矽凝膠管柱層析法(展開溶劑CH2Cl2：CH3OH=98：2，含0.05%吡啶)，更將所得生成物供予二氧化矽凝膠管柱層析法(展開溶劑二氯甲烷：丙酮=7：3，含0.05%吡啶)。藉此，製得無色糖漿狀之化合物11(0.49g，收率41%)。
Ms(FAB+)：m/z 575(M+)、303(DMTr+)
(2)DMTr-醯胺胺基-L-脯胺酸亞醯胺(化合物12)
將所得前述DMTr-羥基醯胺胺基-L-脯胺酸(化合物11)(0.50g、0.87mmol)與無水乙腈混合，在室溫下共沸乾燥。對所得殘留物添加四唑二異丙基銨(diisopropylammonium tetrazolide)(178mg，1.04mmol)，減壓下脫氣後充填氬氣。對前述混合物添加無水乙腈(1mL)，更加入2-氰基乙氧基-N，N，N’，N’-四異丙基偶磷基二亞醯胺(313mg，1.04mmol)之無水乙腈溶液(1mL)。於氬氣環境下將混合物於室溫下攪拌4小時。接著，以二氯甲烷稀釋前述混合物，再依序以飽和碳酸氫鈉水及飽和食鹽水洗淨。回收有機層，並以硫酸鈉乾燥後，過濾前述有機層。針對所得前述濾液，於減壓下餾除溶劑。將所得殘渣供予充填劑使用胺基二氧化矽之管柱層析法(展開溶劑己烷：丙酮=7：3，含0.05%吡啶)，製得無色糖漿狀之化合物12(0.57g，純度93%，收率79%)。前述純度係以HPLC測定(以下相同)。以下顯示化合物之NMR結果。
1H-NMR(CDCl3)：δ7.41-7.43(m,2H,Ar-H)、7.28-7.32(m,4H,Ar-H)、7.25-7.27(m,2H,Ar-H)、7.18-7.21(m,1H,Ar-H)、6.80-6.84(m,4H,Ar-H)、3.73-3.84(m,1H)、3.79(s,6H,OCH3)、3.47-3.64(m,3H)、3.12-3.26(m,2H)、3.05(t,J=6.4Hz,2H,CH2)、2.98-2.02(m,2H)、2.61(t,J=5.8Hz,2H,CH2)、2.55-2.63(m,2H)、2.27-2.42(m,1H,CH)、2.31(t,7.8Hz,2H,CH2)、2.03-2.19(m, 1H,CH)、1.40-1.90(m,8H)、1.23-1.33(m,5H)、1.14-1.20(m,12H,CH3)；P-NMR(CDCl3)：δ146.91；Ms(FAB+)：m/z 774(M+)、303(DMTr+),201(C8H19N2OP+).
(3)DMTr-羥基醯胺胺甲醯基-L-脯胺酸(化合物13)
於氬氣環境下，對已溶有DMTr-醯胺-L-脯胺酸(化合物6)(1.00g，2.05mmol)之無水乙腈溶液(10mL)，於室溫下加入已溶有1-咪唑羰氧基-8-羥基辛烷(1.12g，4.92mmol)之無水乙腈溶液(20mL)。於40~50℃下將該混合液加熱2天後，室溫下放置5天。針對前述混合液，減壓下餾除溶劑。將所得殘渣供予二氧化矽凝膠管柱層析法(展開溶劑二氯甲烷：丙酮=4：1，含0.05%吡啶)。藉此，製得無色糖漿狀之化合物13(0.68g，收率50%)。以下顯示化合物之NMR結果。
1H-NMR(CDCl3)：δ7.40-7.42(m,2H,Ar-H)、7.27-7.31(m,6H,Ar-H)、7.17-7.21(m,1H,Ar-H)、6.79-6.82(m,4H,Ar-H)、4.23-4.30(m,1H)、4.05-4.10(m,2H)、3.79(s,6H,OCH3)、3.60-3.65(m,2H)、3.32-3.55(m,2H)、3.16-3.29(m,2H),3.01-3.07(m,2H)、2.38-2.40(m,1H,CH)、1.83-1.90(m,2H)、1.57-1.69(m,8H)、1.26-1.36(m,2H)；Ms(FAB+)：m/z 602(M+)、303(DMTr+).
(4)DMTr-醯胺胺甲醯基-L-脯胺酸亞醯胺(化合物14)
將所得前述DMTr-羥基醯胺胺甲醯基-L-脯胺酸(化合物13)(0.63g，1.00mmol)與無水吡啶混合，於室溫下共沸乾燥。對所得殘留物添加四唑二異丙基銨(206mg，1.20mmol)，減壓下脫氣後充填氬氣。對前述混合物加入無水乙腈(1mL)，更加入2-氰基乙氧基-N,N,N’,N’-四異丙基偶磷基二亞醯胺(282mg，1.12mmol)之無水乙腈溶液(1mL)。於氬氣環境下將混合物於室溫下攪拌4小時。接著，以二氯甲烷稀釋前述混合物，依序以飽和碳酸氫鈉水及飽和食鹽水洗淨。回收有機層，並以硫酸鈉乾燥後，過濾前述有機層。針對所得濾液，於減壓下餾除溶劑。將所得殘渣供予充填劑使用胺基二氧化矽之管柱層析法(展開溶劑己烷：丙酮=7：3，含0.5%吡啶)，製得無色糖漿狀之化合物14(0.74g，純度100%，收率87%)。以下顯示化合物之NMR結果。
P-NMR(CDCl3)：δ147.19；Ms(FAB+)：m/z 860(M+)、303(DMTr+)，201(C8H19N2OP+).
(5)DMTr-第三丁基二甲基矽氧基醯胺醯脲-L-脯胺酸(化合物15)
於氬氣環境及冰冷下，對三光氣(1.22g，4.10mmol)加入無水四氫呋喃溶液(10mL)。於氬氣環境及冰冷下，以30分鐘對該混合液中滴定溶有DMTr-醯胺-L-脯胺酸(化合物6)(1.00g，2.05mmol)及DIEA(9.80g，75.8mmol)之無水四氫呋喃溶液(10mL)，之後，室溫下攪拌1小時。於氬氣環境及冰冷下，以45分鐘對前述混合液滴定溶有10-胺基-1-第三丁基二甲基矽氧基癸烷(2.66g，10.25mmol)及DIEA(3.20g，24.76mmol)之無水四氫呋喃溶液(20mL)。接著，於氬氣環境下將前述混合物於室溫下攪拌一夜。以乙酸乙酯(200mL)稀釋該混合液，回收有機層。將前述有機層以飽和碳酸氫鈉水洗淨後，更以飽和食鹽水洗淨。接著，回收有機層，以硫酸鈉使其乾燥。過濾前述有機層，針對濾液，於減壓下餾除溶劑。將所得殘渣供予二氧化矽凝膠管柱層析法(展開溶劑二氯甲烷：丙酮=4：1，含0.05%吡啶)。藉此，製得無色糖漿狀之化合物15(0.87g，收率55%)。
(6)DMTr-羥基醯胺醯脲-L-脯胺酸(16)
於氬氣環境下，將無水四氫呋喃二氯甲烷溶液(10mL)於室溫下加入所得前述DMTr-第三丁基二甲基矽氧基醯胺醯脲-L-脯胺酸(15)(0.87g，1.12mmol)。於氬氣環境下，於前述混合液中加入1mol/L含有氟化四丁基銨之四氫呋喃溶液(4.69mL，東京化成)，於室溫下攪拌3天。以二氯甲烷(150mL)稀釋前述混合液，再以水洗淨後，更以飽和食鹽水洗淨之。回收有機層，以硫酸鈉乾燥後，過濾前述有機層。針對所得濾液，於減壓下餾除溶劑。將所得殘渣供予二氧化矽凝膠管柱層析法(展開溶劑二氯甲烷：丙酮=1：1，含0.05%吡啶)，製得無色糖漿狀之化合物16(0.68g，收率92%)。以下顯示化合物之NMR結果。
1H-NMR(CDCl3)：δ7.41-7.43(m,2H,Ar-H)、7.27-7.31(m,4H,Ar-H)、7.19-7.26(m,2H,Ar-H)、7.19-7.21(m,1H,Ar-H)、6.80-6.83(m,4H,Ar-H)、4.34(t,2H,CH2)、3.79(s,6H,OCH3)、3.63(d,1H,J=6.4Hz,CH2)、3.61(d,1H,J=6.4Hz,CH2)、3.34-3.37(m,1H,CH)、3.16-3.27(m,5H),3.04(t,J=5.9Hz,2H, CH2)、2.38-2.45(m,1H,CH)、1.83-2.05(m,3H)、1.45-1.64(m,8H)、1.25-1.38(m,7H).
(7)DMTr-醯胺醯脲-L-脯胺酸亞醯胺(化合物17)
將所得前述DMTr-羥基醯胺醯脲-L-脯胺酸(化合物16)(0.62g，0.94mmol)與無水乙腈混合，於室溫下共沸乾燥。於所得殘留物中加入四唑二異丙基銨(192mg，1.12mmol)，減壓下脫氣後充填氬氣。對前述混合液加入無水乙腈(1mL)，更加入2-氰基乙氧基-N，N，N’，N’-四異丙基偶磷基二亞醯胺(282mg，1.12mmol)之無水乙腈溶液(1mL)。於氬氣環境下將該混合物於室溫下攪拌4小時。接著，以二氯甲烷稀釋前述混合物，再依序以飽和碳酸氫鈉水及飽和食鹽水洗淨。回收有機層，以硫酸鈉乾燥後，過濾前述有機層。針對所得前述濾液，於減壓下餾除溶劑。將所得殘渣供予充填劑使用胺基二氧化矽之管柱層析法(展開溶劑己烷：丙酮=1：1，含有0.05%吡啶)，製得無色糖漿狀之化合物17(0.77g，純度88%，收率84%)。以下顯示化合物之NMR結果。
P-NMR(CDCl3)：δ147.27；Ms(FAB+)：m/z 860(M++1)、303(DMTr+)，201(C8H19N2OP+).
(實施例B3)脯胺酸二醯胺亞醯胺之合成
為了生成含有具脯胺酸骨架之連結子的本發明核酸分子，利用前述流程3合成出L-脯胺酸二醯胺亞醯胺及D-脯胺酸二醯胺亞醯胺。
(B3-1)L-脯胺酸二醯胺亞醯胺
(1)Fmoc-羥基醯胺-L-脯胺酸(化合物4)
將前述流程3之化合物2(Fmoc-L-脯胺酸)作為起始原料。混合前述化合物2(10.00g，29.64mmol)、4-胺基-1-丁醇(3.18g，35.56mmol)及1-羥基苯并三唑(10.90g，70.72mmol)，對前述混合物，於減壓下脫氣後充填氬氣。於室溫下對前述混合物加入無水乙腈(140mL)，更添加二環己基碳二亞胺(7.34g，35.56mmol)之無水乙腈溶液(70mL)後，於氬氣環境下，於室溫下攪拌15小時。反應結束後濾別所生成之沉澱，針對所回收之濾液，於減壓下餾除溶劑。於所得殘渣中加入二氯甲烷(200mL)，以飽和碳酸氫鈉水(200mL)洗淨之。接著回收有機層，以硫酸鎂乾燥後，過濾前述有機層。針對所得 濾液，於減壓下餾除溶劑，對其殘渣添加二乙醚(200mL)而粉末化。藉由濾取產生之粉末，獲得無色粉末狀之化合物4(10.34g，收率84%)。以下顯示前述化合物之NMR結果。
1H-NMR(CDCl3)：δ7.76-7.83(m,2H,Ar-H)、7.50-7.63(m,2H,Ar-H)、7.38-7.43(m,2H,Ar-H)、7.28-7.33(m,2H,Ar-H),4.40-4.46(m,1H,CH),4.15-4.31(m,2H,CH2),3.67-3.73(m,2H,CH2)、3.35-3.52(m,2H,CH2)、3.18-3.30(m,2H,CH2)、2.20-2.50(m,4H)、1.81-2.03(m,3H)、1.47-1.54(m,2H)；Ms(FAB+)：m/z 409(M+H+).
(2)DMTr-醯胺-L-脯胺酸(化合物6)
將Fmoc-羥基醯胺-L-脯胺酸(化合物4)(7.80g，19.09mmol)與無水吡啶(5mL)混合，於室溫下共沸乾燥2次。對所得殘留物添加4，4’-二甲氧基三苯甲基氯(8.20g，24.20mmol)、DMAP(23mg、0.19mmol)及無水吡啶(39mL)。於室溫下攪拌該混合物1小時後，加入甲醇(7.8mL)，於室溫下攪拌30分鐘。以二氯甲烷(100mL)稀釋該混合物，並以飽和碳酸氫鈉水(150mL)洗淨後，分離有機層。將前述有機層以硫酸鈉乾燥後，過濾前述有機層。針對所得濾液，於減壓下餾除溶劑。對所得未純化殘渣添加無水二甲基甲醯胺(39mL)及哌啶(18.7mL，189mmol)，室溫下攪拌1小時。反應結束後，針對前述混合液，於減壓下以室溫餾除溶劑。將所得殘渣供予二氧化矽凝膠管柱層析法(商品名Wakogel C-300，展開溶劑CH2Cl2：CH3OH=9：1，含0.05%吡啶)，製得淡黃色油狀之化合物6(9.11g，收率98%)。以下顯示前述化合物之NMR結果。
1H-NMR(CDCl3)：δ7.39-7.43(m,2H,Ar-H)、7.30(d,J=8.8Hz,4H,Ar-H)、7,21(tt,1H,4.9,1.3Hz,Ar-H)、6.81(d,J=8.8Hz,4H,Ar-H)、3.78(s,6H,OCH3)、3.71(dd,H,J=6.3Hz,5.4Hz,CH)、3.21(2H,12.9,6.3Hz,2H,CH2)、3.05(t,J=6.3Hz,2H,CH2)、2.85-2.91(m,2H,CH2)、2.08-2.17(m,1H,CH)、1.85-2.00(m,3H)、1.55-1.65(m,5H)：Ms(FAB+)；m/z 489(M+H+)、303(DMTr+).
(3)DMTr-羥基二醯胺-L-脯胺酸(化合物8)
混合所得前述DMTr-醯胺-L-脯胺酸(化合物6)(6.01g，12.28mmol)、EDC(2.83g，14.74mmol)、1-羥基苯并三唑(3.98g，29.47mmol)及三乙胺(4.47g，44.21mmol)之無水二氯甲烷溶液(120mL)。更於氬氣環境下，以室溫對該混合液添加6-羥基己烷酸(1.95g，14.47mmol)，之後，於氬環境下以室溫攪拌1小時。以二氯甲烷(600mL)稀釋前述混合液，並以飽和食鹽水(800mL)洗淨三次。回收有機層，使前述有機層以硫酸鈉乾燥後，過濾前述有機層。針對所得濾液，於減壓下餾除溶劑。藉此，製得淡黃色泡狀之前述化合物8(6.29g，收率85%)。以下顯示前述化合物之NMR結果。
1H-NMR(CDCl3)：δ7.41-7.43(m,2H,Ar-H)、7.27-7.31(m,4H,Ar-H)、7.19-7.26(m,2H,Ar-H)、7.17-7.21(m,1H,Ar-H)、6.79-6.82(m,4H,Ar-H)、4.51-4.53(m,1H,CH)、3.79(s,6H,OCH3)、3.61(t,2H,J=6.4Hz,CH2)、3.50-3.55(m,1H,CH)、3.36-3.43(m,1H,CH),3.15-3.24(m,2H,CH2),3.04(t,J=6.3Hz,2H,CH2)、2.38-2.45(m,1H,CH)、2.31(t,6.8Hz,2H,CH2)、2.05-2.20(m,1H,CH)、1.92-2.00(m,1H,CH)、1.75-1.83(m,1H,CH)、1.48-1.71(m,8H)、1.35-1.44(m,2H,CH2)；Ms(FAB+)：m/z 602(M+)、303(DMTr+).
(4)DMTr-二醯胺-L-脯胺酸亞醯胺(化合物10)
將所得前述DMTr-羥基二醯胺-L-脯胺酸(化合物8)(8.55g、14.18mmol)與無水乙腈混合，於室溫下共沸乾燥3次。於所得殘留物中添加四唑二異丙基銨(2.91g，17.02mmol)，於減壓下脫氣後充填氬氣。對前述混合物加入無水乙腈(10mL)，更加入2-氰基乙氧基-N，N，N’，N’-四異丙基偶磷基二亞醯胺(5.13g，17.02mmol)之無水乙腈溶液(7mL)。於氬氣環境下，將該混合物於室溫下攪拌2小時。接著，以二氯甲烷稀釋前述混合物，並以飽和碳酸氫鈉水(200mL)洗淨3次後，以飽和食鹽水(200mL)洗淨。回收有機層並以硫酸鈉乾燥後，過濾前述有機層。針對所得前述濾液，於減壓下餾除溶劑。將所得殘渣供予充填劑使用胺基二氧化矽凝膠之管柱層析法(展開溶劑己烷：乙酸乙酯=1：3，含0.05%吡啶)，製得無色糖漿狀之化合物10(10.25g，純度92%，收率83%)。以下顯示前述化合物之NMR結果。
1H-NMR(CDCl3)：δ7.40-7.42(m,2H,Ar-H)、7.29-7.31(m,4H,Ar-H)、 7.25-7.27(m,2H,Ar-H)、7.17-7.21(m,1H,Ar-H)、6.80-6.82(m,4H,Ar-H)、4.51-4.53(m,1H,CH)、3.75-3.93(m,4H)、3.79(s,6H,OCH3)、3.45-3.60(m,4H)、3.35-3.45(m,1H,CH)、3.20-3.29(m,1H)、3.04(t,J=6.4Hz,2H,CH2)、2.62(t,J=5.8Hz,2H,CH2)、2.40-2.44(m,1H,CH)、2.31(t,7.8Hz,2H,CH2)、2.03-2.19(m,1H,CH)、1.92-2.02(m,1H,CH)、1.70-1.83(m,1H,CH)、1.51-1.71(m,8H)、1.35-1.44(m,2H,CH2)、1.18(d,J=6.8Hz,6H,CH3)、1.16(d,J=6.8Hz,6H,CH3)；P-NMR(CDCl3)Msδ147.17；Ms(FAB+)：m/z 802(M+)、303(DMTr+),201(C8H19N2OP+).
(B3-2)D-脯胺酸二醯胺亞醯胺
(1)Fmoc-羥基醯胺-D-脯胺酸(化合物3)
將前述流程3之化合物1(Fmoc-D-脯胺酸)用作起始原料。對於前述化合物1(1.5g，4.45mmol)、二環己基碳二亞胺(1.1g，5.34mmol)及1-羥基苯并三唑(1.5g，10.69mmol)之混合物，減壓下脫氣後填充氬氣。於室溫下對前述混合物添加無水乙腈(24mL)，更添加4-胺基-1-丁醇(0.48g，5.34mmol)之無水乙腈溶液(6mL)後，於氬氣環境下，於室溫下攪拌15小時。反應結束後濾別所生成之沉澱，針對所回收之濾液，於減壓下餾除溶劑。對所得殘渣加入二氯甲烷，以乙酸緩衝液(pH4.0)洗淨3次，並以飽和碳酸氫鈉水洗淨3次。接著回收有機層，以硫酸鎂乾燥後，過濾前述有機層。針對所得濾液，於減壓下餾除溶劑，於其殘渣中加入二乙醚(50mL)，使其粉末化。藉由濾取產生之粉末，獲得白色粉末狀之化合物3。以下顯示前述化合物之NMR結果。
1H-NMR(400MHz,CDCl3)：δ7.77(d,J=7.3Hz,2H)；7.58(br,2H)；7.41(t,J=7.3Hz,2H)；7.32(t,J=7.3Hz,2H)；4.25-4.43(m,4H)；3.25-3.61(m,6H)；1.57-1.92(m,8H).
MS(FAB+)：m/z 409(M+H+).
(2)DMTr-醯胺-D-脯胺酸(化合物5)
將Fmoc-羥基醯胺-D-脯胺酸(化合物3)(1.0g，2.45mmol)與無水吡啶(5mL)混合，室溫下共沸乾燥2次。對所得殘留物添加4，4’-二甲氧基三苯 甲基氯(1.05g，3.10mmol)、DMAP(3mg，0.024mmol)及無水吡啶(5mL)。於室溫下攪拌該混合物1小時後加入甲醇(1mL)，於室溫下攪拌30分鐘。以二氯甲烷稀釋該混合物，以飽和碳酸氫鈉水洗淨後，分離有機層。將前述有機層以硫酸鈉乾燥後，過濾前述有機層。針對所得濾液，於減壓下餾除溶劑。於所得未純化之殘渣中加入無水二甲基甲醯胺(5mL)及哌啶(2.4mL，24mmol)，於室溫下攪拌1小時。反應結束後，針對前述混合液，於減壓下且於室溫下餾除溶劑。將所得殘渣供予二氧化矽凝膠管柱層析法(商品名Wakogel C-300，展開溶劑CH2Cl2：CH3OH=9：1，含0.05%吡啶)，製得淡黃色油狀之化合物5(1.26g，收率96%)。以下顯示前述化合物之NMR結果。
1H-NMR(400MHz,CDCl3)：δ7.62(br,1H)；7.41-7.44(m,2H)；7.26-7.33(m,6H)；7.17-7.22(m,1H)；6.80-6.84(m,4H)；3.78(s,6H)；3.71(dd,J=8.8,5.4Hz,1H)；3.22(q,6.5Hz,2H)；3.07(t,J=6.1Hz,2H)；2.97-3.03(m,1H)；2.85-2.91(m,1H)；1.85-2.15(m,3H)；1.55-1.73(m,6H).
MS(FAB+)：m/z 489(M+H+),303(DMTr+).
(3)DMTr-羥基二醯胺-D-脯胺酸(化合物7)
混合所得前述DMTr-醯胺-D-脯胺酸(化合物5)(1.2g，2.45mmol)、EDC(566mg，2.95mmol)、1-羥基苯并三唑(796mg，5.89mmol)及三乙胺(1.2mL，8.84mmol)之無水二氯甲烷溶液(24mL)。更於氬氣環境下且於室溫下，對該混合液加入6-羥基己烷酸(390mg，2.95mmol)，之後於氬氣環境下且於室溫下攪拌1小時。以二氯甲烷稀釋前述混合液，再以飽和碳酸氫鈉水洗淨3次。回收有機層，以硫酸鈉乾燥前述有機層後，過濾前述有機層。針對所得濾液，於減壓下餾除溶劑。藉此，製得淡黃色油狀之化合物7(1.4g，收率95%)。以下顯示前述化合物之NMR結果。
1H-NMR(400MHz,CDCl3)：δ7.40-7.43(m,2H)；7.25-7.3(m,6H)；7.17-7.22(m,1H)；6.79-6.83(m,4H)；3.79(s,6H)；3.58-3.63(m,2H)；3.49-3.55(m,1H)；3.15-3.26(m,2H)；3.02-3.07(m,2H)；2.30-2.33(m,2H)；2.11-2.20(m,1H)；1.50-1.99(m,13H)；1.36-1.43(m,2H).
MS(FAB+)：m/z 602(M+),303(DMTr+).
(4)DMTr-二醯胺-D-脯胺酸亞醯胺(化合物9)
將所得前述DMTr-羥基二醯胺-D-脯胺酸(化合物7)(1.2g，1.99mmol)與無水乙腈混合，於室溫下共沸乾燥3次。對所得殘留物添加四唑二異丙基銨(410mg，2.40mmol)，減壓下脫氣並充填氬氣。對前述混合物添加無水乙腈(2.4mL)，更添加2-氰基乙氧基-N，N，N’，N’-四異丙基偶磷基二亞醯胺(722mg，2.40mmol)。於氬氣環境下且於室溫下攪拌該混合物2小時。接著，以二氯甲烷稀釋前述混合物，再以飽和碳酸氫鈉水洗淨3次後，以飽和食鹽水洗淨之。回收有機層，並以硫酸鈉乾燥後，過濾前述有機層。針對所得濾液，於減壓下餾除溶劑。將所得殘渣供予充填劑使用胺基二氧化矽凝膠之管柱層析法(展開溶劑己烷：乙酸乙酯=1：3)，製得無色油狀之化合物9(1.4g，純度95%，收率83%)。以下顯示前述化合物之NMR結果。
1H-NMR(400MHz,CDCl3)：δ7.40-7.43(m,2H)；7.25-7.32(m,6H)；7.14-7.21(m,1H)；6.80-6.83(m,4H)；3.80-3.85(m,2H)；3.79(s,6H)；3.49-3.65(m,5H)；3.02-3.06(m,2H)；2.60-2.63(m,2H)；2.29-2.33(m,2H)；1.77-1.82(m,2H)；1.56-1.68(m,8H)；1.38-1.43(m,2H)；1.15-1.29(m,18H).31P-NMR(162MHz,CDCl3)：δ146.94.
MS(FAB+)：m/z 802(M+),303(DMTr+),201(C8H19N2OP+).
(實施例B4)
為了生成含有具脯胺酸骨架之連結子的本發明核酸分子，利用下述流程4，合成出L-脯胺酸二醯胺亞醯胺B型。
【化19】
(1)Fmoc-第三丁基二甲基矽氧基醯胺-L-脯胺酸(化合物18)
混合Fmoc-羥基醯胺-L-脯胺酸(化合物4)(2.00g，30mmol)、第三丁基二甲基矽基氯(1.11g，35mmol)及咪唑(10.90g，71mmol)。對於前述混合物，於減壓下脫氣後充填氬氣。於室溫下將無水乙腈(20mL)加入前述混合物，於氬氣環境下且於室溫下攪拌整夜。反應結束後，於前述混合物中加入二氯甲烷(150mL)，以水洗淨3次，再以飽和食鹽水洗淨。回收有機層並以硫酸鎂乾燥後，過濾前述有機層。針對所得濾液，於減壓下餾除溶劑，將其殘渣供予二氧化矽凝膠管柱層析法(展開溶劑CH2Cl2：CH3OH=95：5)，製得無色糖漿狀之化合物18(2.35g，收率92%)。以下顯示前述化合物之NMR結果。
1H-NMR(CDCl3)：δ7.76-7.78(m,2H,Ar-H)、7.50-7.63(m,2H,Ar-H)、7.38-7.42(m,2H,Ar-H)、7.29-7.34(m,2H,Ar-H),4.10-4.46(m,4H,CH2),3.47-3.59(m,4H,CH2)、3.20-3.26(m,2H,CH)、1.85-1.95(m,2H)、1.42-1.55(m, 6H)、0.96(s,9H,t-Bu)、0.02(s,6H,SiCH3)；Ms(FAB+)：m/z 523(M+H+).
(2)第三丁基二甲基矽氧基醯胺-L-脯胺酸(化合物19)
對所得前述Fmoc-第三丁基二甲基矽氧基醯胺-L-脯胺酸(化合物18)(1.18g，2.5mmol)加入無水乙腈(5mL)及哌啶(2.4mL)，於室溫下攪拌1小時。反應結束後，對前述混合物加入乙腈(50mL)，濾別不溶物。針對所得濾液，於減壓下餾除溶劑，將所得殘渣供予二氧化矽凝膠管柱層析法(展開溶劑CH2Cl2：CH3OH=9：1)，製得無色糖漿狀之化合物19(0.61g，收率90%)。以下顯示前述化合物之NMR結果。
1H-NMR(CDCl3)：δ3.71(dd,1H,J=9.0Hz,5.2Hz,CH)、3.61-3.64(m,2H,CH2)、3.22-3.28(m,2H,CH2)、2.98-3.04(m,1H,CH)、2.86-2.91(m,1H,CH)、2.08-2.17(m,1H,CH)、1.86-1.93(m,1H,CH)、1.66-1.75(m,2H,CH2)、1.52-1.57(m,4H)、0.89(s,9H,t-Bu)、0.05(s,6H,SiCH3)：Ms(FAB+)；m/z 301(M+H+).
(3)第三丁基二甲基矽氧基醯胺羥基醯胺-L-脯胺酸(化合物20)
混合所得前述第三丁基二甲基矽氧基醯胺-L-脯胺酸(化合物19)(550mg，1.8mmol)、6-羥基己烷酸(300mg，2.3mmol)、EDC(434mg，2.3mmol)及1-羥基苯并三唑(695mg，4.5mmol)之無水二氯甲烷溶液(20mL)。於氬氣環境下且於室溫下，將三乙胺(689mg，6.8mmol)加入前述混合物，之後於氬氣環境且室溫下攪拌一整夜。以飽和食鹽水洗淨前述混合液。回收有機層，使前述者以硫酸鈉乾燥後，過濾前述有機層。針對所得濾液，於減壓下餾除溶劑。將所得殘渣供予二氧化矽凝膠管柱層析法(展開溶劑CH2Cl2：CH3OH=9：1)，製得無色糖漿狀之化合物20(696mg，收率92%)。以下顯示前述化合物之NMR結果。
1H-NMR(CDCl3)：δ4.54(d,1H,CH)、3.58-3.67(m,5H)、3.52-3.56(m,1H,CH),3.32-3.39(m,1H),3.20-3.25(m,2H)、2.40-2.43(m,1H,CH)、2.33(t,J=7.3Hz,2H,CH2)、2.05-2.25(m,2H)、1.93-2.03(m,1H,CH)、1.75-1.85(m,1H,CH)、1.50-1.73(m,8H)、1.37-1.46(m,2H,CH2)、0.87(s,9H,t-Bu)、0.04(s,6H,SiCH3)； Ms(FAB+)：m/z 415(M++1).
(4)DMTr-羥基二醯胺-L-脯胺酸B型(化合物21)
將所得前述第三丁基二甲基矽氧基醯胺羥基醯胺-L-脯胺酸(化合物20)(640mg，1.54mmol)與無水吡啶(1mL)混合，於室溫下共沸乾燥。於所得殘留物中加入4，4’-二甲氧基三苯甲基氯(657mg，1.85mmol)、DMAP(2mg)及無水吡啶(5mL)，室溫下攪拌4小時後，加入甲醇(1mL)並於室溫下攪拌30分鐘。以二氯甲烷稀釋前述混合物，並以飽和碳酸氫鈉水洗淨之。回收有機層並以硫酸鈉乾燥後，過濾前述有機層。針對所得濾液，於減壓下餾除溶劑。於所得殘渣中加入無水乙腈(5mL)及含有1mol/L氟化四丁基銨之四氫呋喃溶液(1.42mL，氟化四丁基銨1.42mmol)，室溫下攪拌一整夜。反應結束後，對前述混合物加入乙酸乙酯(100mL)，以水洗淨後，以飽和食鹽水洗淨。回收有機層並以硫酸鈉乾燥後，過濾前述有機層。針對所得濾液，於減壓下餾除溶劑。將所得殘渣供予二氧化矽凝膠管柱層析法(展開溶劑CH2Cl2：CH3OH=95：5，含0.05%吡啶)，製得無色糖漿狀之化合物21(680mg，收率73%)。以下顯示前述化合物之NMR結果。
1H-NMR(CDCl3)：δ7.41-7.44(m,2H,Ar-H)、7.26-7.33(m,4H,Ar-H)、7.18-7.21(m,2H,Ar-H)、7.17-7.21(m,1H,Ar-H)、6.80-6.84(m,4H,Ar-H)、4.51-4.53(d,6.8Hz,1H,CH)、3.79(s,6H,OCH3)、3.61(dd,2H,J=11Hz,5.4Hz,CH2)、3.50-3.54(m,1H,CH)、3.36-3.43(m,1H,CH),3.20-3.26(m,2H,CH2),3.05(t,J=6.4Hz,2H,CH2)、2.38-2.45(m,1H,CH)、2.30(t,J=7.8Hz,2H,CH2)、2.05-2.25(m,1H,CH)、1.92-2.00(m,1H,CH)、1.75-1.83(m,1H,CH)、1.52-1.67(m,8H)、1.35-1.45(m,2H,CH2)；Ms(FAB+)：m/z 602(M+)、303(DMTr+).
(5)DMTr-二醯胺-L-脯胺酸亞醯胺B型(化合物22)
將所得前述DMTr-羥基二醯胺-L-脯胺酸B型(化合物21)(637mg，1.06mmol)與無水乙腈混合，於室溫下共沸乾燥。對所得殘留物加入四唑二異丙基銨(201mg，1.16mmol)，於減壓下脫氣並充填氬氣。對前述混合物加入無水乙腈(1mL)，更加入2-氰基乙氧基-N，N，N’，N’-四異丙基偶磷基二亞醯胺(350mg，1.16mmol)之無水乙腈溶液(1mL)。於氬氣環境下且室溫下， 將該混合物攪拌4小時。以二氯甲烷稀釋前述混合物，再以飽和碳酸氫鈉水及飽和食鹽水洗淨。回收有機層，以硫酸鈉乾燥後，過濾前述有機層。針對所得濾液，於減壓下餾除溶劑。將所得殘渣供予充填劑使用胺基二氧化矽凝膠之管柱層析法(展開溶劑己烷：丙酮=7：3)，製得無色糖漿狀之化合物22(680mg，純度95%，收率76%)。以下顯示前述化合物之NMR結果。
1H-NMR(CDCl3)：δ7.41-7.43(m,2H,Ar-H)、7.25-7.32(m,4H,Ar-H)、7.17-7.22(m,2H,Ar-H)、6.80-6.83(m,4H,Ar-H)、4.53(d,J=7.8Hz,1H,CH)、3.75-3.93(m,3H)、3.79(s,6H,OCH3)、3.46-3.68(m,5H)、3.34-3.41(m,1H,CH)、3.10-3.31(m,1H,CH)、3.05(t,J=6.3Hz,2H,CH2)、2.62(t,J=6.3Hz,2H,CH2)、2.39-2.46(m,1H,CH)、2.29(t,7.3Hz,2H,CH2)、2.03-2.19(m,1H,CH)、1.90-2.00(m,1H,CH)、1.70-1.83(m,1H,CH)、1.51-1.71(m,8H)、1.35-1.45(m,2H,CH2)、1.18(d,J=6.4Hz,6H,CH3)、1.16(d,J=6.4Hz,6H,CH3)；P-NMR(CH3CN)δ 146.90；Ms(FAB+)：m/z 803(M++1)、303(DMTr+).
(實施例B5)
為了生成含有具脯胺酸骨架之連結子的本發明核酸分子，利用下述流程5，合成出DMTr-醯胺伸乙基氧基乙基胺基-L-脯胺酸亞醯胺(以下，稱為PEG間隔子型)。
【化20】
(1)DMTr-醯胺羥基乙氧基乙基胺基-L-脯胺酸(化合物23)
混合DMTr-醯胺-L-脯胺酸(化合物6)(1.00g，2.05mmol)、4-甲苯磺酸2-(2-羥基乙氧基)乙基酯(3.10g，12.30mmol)及碳酸鉀(0.85g，6.15mmol)之無水二甲基甲醯胺溶液(10mL)，於氬氣環境下且室溫下攪拌4天。針對前述混合物，於減壓下且室溫下餾除溶劑後，加入二氯甲烷(20mL)後過濾。濃縮濾液，將所得殘渣供予二氧化矽凝膠管柱層析法。前述二氧化矽凝膠管柱層析法之添加溶劑係首先使用含0.05%吡啶之乙酸乙酯，之後使用含0.05%吡啶之CH2Cl2與CH3OH之混合液(CH2Cl2：CH3OH=9：1)。結果，製得無色糖漿狀之化合物23(1.15g，收率97%)。以下顯示前述化合物之NMR結果。
1H-NMR(CDCl3)：δ7.41-7.45(m,2H,Ar-H)、7.27-7.31(m,6H,Ar-H)、7.17-7.21(m,1H,Ar-H)、6.79-6.82(m,4H,Ar-H)、3.79(s,6H,OCH3)、3.60-3.70(m,2H)、3.39-3.57(m,4H),3.13-3.27(m,3H),3.07-3.08(m,2H)、2.71-2.84(m,1H)、2.38-2.46(m,1H)、2.14-2.19(m,1H)、1.84-1.87(m,1H)、1.57-1.76(m,8H).
(2)DMTr-醯胺伸乙基氧基乙基胺基-L-脯胺酸亞醯胺(化合物24)
將所得前述DMTr-醯胺羥基乙氧基乙基胺基-L-脯胺酸(化合物 23)(0.63g，1.00mmol)與無水吡啶混合，室溫下共沸乾燥。對所得殘留物加入四唑二異丙基銨(206mg，1.20mmol)，減壓下脫氣後充填氬氣。對前述混合物加入無水乙腈(1mL)，更加入2-氰基乙氧基-N，N，N’，N’-四異丙基偶磷基二亞醯胺(282mg，1.12mmol)之無水乙腈溶液(1mL)。於氬氣環境下且於室溫下攪拌該混合物4小時。接著，以二氯甲烷稀釋前述混合物，並以飽和碳酸氫鈉水及飽和食鹽水洗淨。回收有機層，以硫酸鈉乾燥後，過濾前述有機層。針對所得前述濾液，於減壓下餾除溶劑。將所得殘渣供予充填劑使用胺基二氧化矽凝膠之管柱層析法(展開溶劑己烷：丙酮=7：3，含0.05%吡啶)，製得無色糖漿狀之化合物24(0.74g，純度100%，收率87%)。以下顯示前述化合物之NMR結果。
1H-NMR(CD3CN)：δ7.41-7.43(m，2H，Ar-H)、7.28-7.31(m，6H，Ar-H)、7.18-7.22(m，1H，Ar-H)、6.84-6.86(m，4H，Ar-H)、3.73-3.84(m，2H，CH2)、3.79(s，6H，OCH3)、3.47-3.64(m，7H)、3.15-3.23(m，1H)、3.11(t，J=6.4Hz，2H，CH2)、3.01(t，J=5.9Hz，2H，CH2)、2.95-2.99(m，1H)、2.58-2.63(m，2H)、2.31-2.35(m，1H，CH)、2.03-2.19(m，1H，CH)、1.48-1.78(m，10H)、1.12-1.57(m，12H，CH3)；P-NMR(CD3CN)：δ148.00；Ms(FAB+)：m/z 776(M+)、303(DMTr+)201(C8H19N2OP+).
(實施例B6)
1. 受保護脯胺醇之合成
依照以下所示流程6，合成受到二甲氧基三苯甲基保護之脯胺醇(化合物3)。
【化21】
(1)三氟乙醯基-L-脯胺醇(化合物1)
將L-脯胺醇(2.0g，20mmol)溶解於THF 20mL。另一方面，使三氟乙酸乙酯(3.0g，21mmol)溶解於THF 20mL。接著，將後者之THF溶液滴定至前者之含L-脯胺醇的THF溶液，攪拌12小時。使該反應液減壓濃縮，製得化合物1(3.7g，收率97%)。以下顯示前述化合物之NMR結果。
1H-NMR(CDCl3)：δ4.28-4,23(1.0H,m,OH),3.90-3.41(5H,H-2,H-5,H-6,m),2.27-1.77(4H,H-3,H-4,m).
(2)三氟乙醯基-DMTr-L-脯胺醇(化合物2)
將所得前述三氟乙醯基-L-脯胺醇(化合物1)(3.7g，19mmol)溶解於吡啶中，於室溫下共沸乾燥3次。使所得殘留物溶解於吡啶15mL中，在氬環境下，於冰浴中一邊攪拌一邊加入4，4’-二甲氧基三苯甲基氯(DMTr-Cl)(8.1g，24mmol)，更於室溫下反應4小時。接著，為了使過剩之DMTr-Cl淬冷，於前述反應液中更加入甲醇10mL並攪拌10分鐘。之後，於前述反應液加入二氯甲烷，洗淨飽和碳酸氫鈉水溶液與飽和食鹽水。使洗淨後之已回收有機層以硫酸鈉乾燥。過濾前述有機層，將所得濾液減壓濃縮，並將其殘渣供予二氧化矽凝膠管柱層析法(展開溶劑CH2Cl2：CH3OH=95：5，含0.1% 吡啶)，製得已純化之化合物2(8.5g，收率89%)。以下顯示前述化合物之NMR結果。
1H-NMR(CDCl3)：δ7.39-7.18(9H,m,Ar-H),6.82(4H,d,J=8.6Hz,Ar-H),3.78(6H,s,OCH3),3.70-3.41(5H,H-2,H-5,H-6,m),2.19-1.85(4H,H-3,H-4,m).
(3)DMTr-L-脯胺醇(化合物3)
使所得前述三氟乙醯基-DMTr-L-脯胺醇(化合物2)(5g，10mmol)溶解於THF 100mL。於該THF溶液中加入5%水酸化鈉水溶液100mL並攪拌。於此溶液中加入1M之氟化四正丁基胺(TBAF)溶液5mL，於室溫下攪拌12小時。以飽和碳酸氫鈉水溶液與飽和食鹽水洗淨該反應液。使洗淨後之已回收有機層以硫酸鈉乾燥。過濾前述有機層，使所得濾液減壓濃縮，製得化合物3(3.6g，收率90%)。以下顯示前述化合物之NMR結果。
1H-NMR(CDCl3)：δ7.40-7.14(9H,m,Ar-H),6.82(4H,d,J=8.6Hz,Ar-H),3.78(6H,s,OCH3),3.31(1H,m,H-6),3.07(2H,m,H-2,H-6),2.90(2H,m,H-5),1.84(3H,m,H-3,H-4),1.40(1H,m,H-3).
2. 亞醯胺衍生物之合成
使用前述「1.」所合成之受保護脯胺醇(化合物3)，利用下述流程7，合成出鍵結形式不同且具有脯胺醇之亞醯胺衍生物。
(1)DMTr-胺甲酸酯-L-脯胺醇(化合物4)
使1,8-辛二醇(9.0g，62mmol)溶解於THF 90mL，置於氬環境下。另一方面，將羰基二咪唑(2.0g，12mmol)溶解於THF 10mL中。將後者之THF溶液加入前者之THF溶液中，於室溫下攪拌1小時。以水洗淨該反應液至1,8-辛二醇之TLC點消失為止。更將洗淨後所回收之有機層以飽和食鹽水洗淨，以無水硫酸鈉使回收之有機層乾燥。過濾前述有機層，將所得濾液減壓濃縮。將其殘渣供予二氧化矽凝膠管柱層析法(展開溶劑CH2Cl2：CH3OH=95：5)，製得已純化之化合物。該化合物為1,8-辛二醇之單側末端已藉羰基二咪唑而活性化之化合物(2.3g，收率77%)。
將前述化合物0.9g溶解於乙腈10mL中，置於氬環境下。另一方面，使DMTr-L-脯胺醇(化合物3)(1.9g，4.8mmol)溶解於乙腈20mL中。將後者之乙腈溶液加入前述前者之乙腈溶液，於室溫下攪拌24小時。接著，以飽和碳酸氫鈉水溶液與飽和食鹽水洗淨該反應液，以無水硫酸鈉使回收之有機層乾燥。過濾前述有機層，將所得濾液減壓濃縮。將其殘渣供予二氧化矽凝膠管柱層析法(展開溶劑二氯甲烷：丙酮=9：1，含0.1%吡啶)，製得已純化之化合物4(脯胺醇胺甲酸酯亞醯胺)(1.5g，收率65%)。以下顯示前述化合物之NMR結果。
1H-NMR(CDCl3)：δ7.40-7.14(9H,m,Ar-H),6.82(4H,d,J=8.6Hz,Ar-H),4.24-3.94(2H,m,COOCH2),3.78(s,6H,OCH3),3.72-2.96(7H,m,alkyl,H-2,H-5,H-6),2.10-1.30(16H,m,alkyl,H-3,H-4).
FAB-MS：576[M+H]+.
(2)DMTr-醯脲-L-脯胺醇(化合物5)
於氬環境下，使三光氣(2.0g，6.7mmol)溶解於THF 10mL中，並於0℃下攪拌。另一方面，使DMTr-L-脯胺醇(化合物3)(1.3g，3.2mmol)及N，N-二異丙基乙基胺(16g，124mmol)溶解於THF 10mL中，滴定至前述三光氣之THF溶液。將該反應液於0℃下攪拌1小時，接著於室溫下攪拌2小時。之後，將8-胺基-1-辛醇(2.3g，16mmol)及N，N-二異丙基乙基胺(5.0g，38mmol)溶解於THF 30mL中。於0℃下將前述攪拌後之反應液滴定至該THF溶液中1小時，於室溫下攪拌48小時。將該反應液減壓濃縮，使其殘渣溶解於二氯甲烷。以飽和碳酸氫鈉水溶液與飽和食鹽水洗淨該溶液，並以無水硫 酸鈉使回收之有機層乾燥。過濾前述有機層，將所得濾液減壓濃縮後，將其殘渣供予逆相二氧化矽凝膠管柱層析法而純化。此時，展開溶劑使用含有0.1%吡啶之丙酮與水的混合溶劑，令前述丙酮與水之混合比例採步進式(stepwise)，具體來說，則是使丙酮：水之莫耳比依照2：8、3：7、4：6及5：5之順序變化。以二氯甲烷抽提含有目的化合物5之分液，使該有機層以無水硫酸鈉乾燥。過濾前述有機層，使所得濾液減壓濃縮，製得化合物5(脯胺醇醯脲亞醯胺)(0.9g，收率49%)。以下顯示前述化合物之NMR結果。
1H-NMR(CDCl3)：δ7.40-7.14(9H,m,Ar-H),6.82(4H,m,Ar-H),3.78(s,6H,OCH3),3.68-3.25(9H,m,CH2NH,CH2OH,H-2,H-5,H-6),1.74-1.18(16H,m,alkyl,H-3,H-4).
FAB-MS：575[M+H]+.
(3)具有脯胺醇之亞醯胺衍生物(化合物6及7)
作為經修飾脯胺醇，將所得前述化合物4(0.80g，1.4mmol)溶解於乙腈，於室溫下共沸乾燥3次。使所得殘留物溶解於乙腈1mL，置於氬環境下。對該乙腈溶液添加四唑二異丙基銨(0.24g，1.4mmol)而作為反應液。另一方面，使2-氰基乙基N,N,N’,N’-四異丙基偶磷基二亞醯胺(0.50g，1.7mmol)溶解於乙腈1mL中。將其添加至前述反應液中，於室溫下攪拌4小時。對前述反應液添加二氯甲烷，以飽和碳酸氫鈉水溶液與飽和食鹽水洗淨。以無水硫酸鈉使洗淨後之已回收有機層乾燥，過濾前述有機層，將所得濾液減壓濃縮。將其殘渣供予胺基二氧化矽凝膠管柱層析法(展開溶劑己烷：丙酮=10：1，含0.1%吡啶)，製得已純化之化合物6(DMTr-胺甲酸酯-L-脯胺醇亞醯胺)(0.90g，收率83%)。以下顯示前述化合物之NMR結果。
1H-NMR(CDCl3)：δ7.40-7.14(9H,m,Ar-H),6.82(4H,d,J=8.6Hz,Ar-H),4.24-3.94(2H,m,COOCH2),3.78(s,6H,OCH3),3.72-2.96(11H,m,CH2O,POCH2,CHCH3,H-2,H-5,H-6),2.58(2H,m,CH2CN),2.10-1.46(16H,m,alkyl,H-3,H-4),1.34-1.10(12H,m,CHCH3)。31P-NMR(CD3CN)δ 146.82.
FAB-MS：776[M+H]+.
除了使用前述化合物5取代前述化合物4來作為前述經修飾脯胺醇以外，同樣地進行處理，製得已純化之化合物7(DMTr-醯脲-L-脯胺醇亞醯 胺)(0.80g，收率74%)。以下顯示前述化合物之NMR結果。
1H-NMR(CDCl3)：δ7.40-7.14(9H,m,Ar-H),6.82(4H,m,Ar-H),3.78(s,6H,OCH3),3.65-3.25(13H,m,CH2O,POCH2,CHCH3,H-2,CH2NH,CH2OH,H-2,H-5,H-6),2.73(2H,m,CH2CN),2.10-1.48(16H,m,alkyl,H-3,H-4),1.35-1.10(12H,m,CHCH3).
31P-NMR(CD3CN)δ 146.83.
FAB-MS：775[M+H]+.
以上，參照實施形態來說明本案發明，但本案發明並非受上述實施形態所限定者。本案發明之構成及詳情可在本案發明之要旨(scope)範圍內進行業界人士可理解之各種變更。
本申請案主張以下列申請案為基礎之優先權，並在此納入其等之全部揭示內容：已於2010年7月8日提申之日本申請案特願2010-156122號、已於2010年10月13日提申之日本申請案特願2010-230808號、已於2010年12月2日提申之日本申請案特願2010-269824號、已於2010年8月3日提申之日本申請案特願2010-174915號、已於2010年10月13日提申之日本申請案特願2010-230806號以及已於2010年12月2日提申之日本申請案特願2010-269823號。
產業上之可利用性
若依本發明之單股核酸分子，可抑制基因之表現，且因非為環狀而合成容易，又，因其為單股，無需雙股之黏合步驟，而可效率良好地進行製造。由於本發明之ssNc分子係如前述般可抑制目標基因表現，舉例來說，作為醫藥品、診斷藥及農藥以及農藥、醫學、生命科學等之研究工具均甚有用。
<110> BONAC CORPORATION
<120>用以控制基因表現之單股核酸分子
<130> TF11005TW
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<170> PatentIn version 3.1
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<400> 80

Claims (23)

  1. 一種單股RNA分子，係含有1個抑制目標基因表現之抑制表現序列者，其特徵在於：從5’端側至3’端側依序含有5’端側區域(Xc)、內部區域(Z)及3’端側區域(Yc)，前述內部區域(Z)係內部5’端側區域(X)及內部3’端側區域(Y)連結而構成者，前述5’端側區域(Xc)與前述內部5’端側區域(X)互補，前述3’端側區域(Yc)與前述內部3’端側區域(Y)互補，前述5’端側區域(Xc)與前述內部5’端側區域(X)之間具有連結區域(Lx)，且前述5’端側區域(Xc)與前述內部5’端側區域(X)透過前述連結區域(Lx)而連結，前述3’端側區域(Yc)與前述內部3’端側區域(Y)之間具有連結區域(Ly)，且前述3’端側區域(Yc)與前述內部3’端側區域(Y)透過前述連結區域(Ly)而連結，前述內部區域(Z)含有前述抑制表現序列，前述內部區域(Z)之鹼基數(Z)、前述內部5’端側區域(X)之鹼基數(X)、前述內部3’端側區域(Y)之鹼基數(Y)、前述5’端側區域(Xc)之鹼基數(Xc)以及前述3’端側區域(Yc)之鹼基數(Yc)滿足下列條件：Z=X+Y；Z≧Xc+Yc；Z-(Xc+Yc)=0~10；前述內部區域(Z)之鹼基數(Z)為19個鹼基至30個鹼基，前述5’端側區域(Xc)之鹼基數(Xc)為1~7個鹼基，前述3’端側區域(Yc)之鹼基數(Yc)為1~9個鹼基。
  2. 如申請專利範圍第1項之單股RNA分子，其中前述內部5’端側區域(X)之鹼基數(X)、前述5’端側區域(Xc)之鹼基數(Xc)、前述內部3’端側區域(Y)之鹼基數(Y)以及前述3’端側區域(Yc)之鹼基數(Yc)滿足下述 (a)~(d)中之任一條件：(a)滿足下述式(3)及(4)之條件；X>Xc‧‧‧(3) Y=Yc‧‧‧(4)(b)滿足下述式(5)及(6)之條件；X=Xc‧‧‧(5) Y>Yc‧‧‧(6)(c)滿足下述式(7)及(8)之條件；X>Xc‧‧‧(7) Y>Yc‧‧‧(8)(d)滿足下述式(9)及(10)之條件；X=Xc‧‧‧(9) Y=Yc‧‧‧(10)。
  3. 如申請專利範圍第2項之單股RNA分子，其中前述(a)~(d)中，前述內部5’端側區域(X)之鹼基數(X)與前述5’端側區域(Xc)之鹼基數(Xc)的差、前述內部3’端側區域(Y)之鹼基數(Y)與前述3’端側區域(Yc)之鹼基數(Yc)的差滿足下述條件：(a)滿足下述式(11)及(12)之條件；X-Xc=1、2或3‧‧‧(11) Y-Yc=0‧‧‧(12)(b)滿足下述式(13)及(14)之條件；X-Xc=0‧‧‧(13) Y-Yc=1、2或3‧‧‧(14)(c)滿足下述式(15)及(16)之條件；X-Xc=1、2或3‧‧‧(15) Y-Yc=1、2或3‧‧‧(16)(d)滿足下述式(17)及(18)之條件；X-Xc=0‧‧‧(17) Y-Yc=0‧‧‧(18)。
  4. 如申請專利範圍第1項之單股RNA分子，其中前述5’端側區域(Xc)之鹼基數(Xc)為1~3個鹼基。
  5. 如申請專利範圍第1項之單股RNA分子，其中前述3’端側區域(Yc)之鹼基數(Yc)為1~7個鹼基。
  6. 如申請專利範圍第1項之單股RNA分子，其中前述3’端側區域(Yc)之鹼基數(Yc)為1~3個鹼基。
  7. 如申請專利範圍第1至6項中任一項之單股RNA分子，其含有至少1個經修飾之殘基。
  8. 如申請專利範圍第1至6項中任一項之單股RNA分子，其含有標記物質。
  9. 如申請專利範圍第1至6項中任一項之單股RNA分子，其含有穩定同位素。
  10. 如申請專利範圍第1至6項中任一項之單股RNA分子，其中前述連結區域(Lx)及/或前述連結區域(Ly)係由核苷酸殘基及非核苷酸殘基中之至少一者所構成。
  11. 如申請專利範圍第10項之單股RNA分子，其中前述核苷酸殘基為非經修飾核苷酸殘基及/或經修飾核苷酸殘基。
  12. 如申請專利範圍第10項之單股RNA分子，其中前述連結區域(Lx)及/或前述連結區域(Ly)係由下述(1)~(7)中之任一殘基所構成：(1)非經修飾核苷酸殘基；(2)經修飾核苷酸殘基；(3)非經修飾核苷酸殘基及經修飾核苷酸殘基；(4)非核苷酸殘基；(5)非核苷酸殘基及非經修飾核苷酸殘基；(6)非核苷酸殘基及經修飾核苷酸殘基；及(7)非核苷酸殘基、非經修飾核苷酸殘基及經修飾核苷酸殘基。
  13. 如申請專利範圍第1至6項中任一項之單股RNA分子，其中前述單股 RNA分子中，鹼基數總計為50鹼基以上。
  14. 如申請專利範圍第1至6項中任一項之單股RNA分子，其中前述基因之抑制表現係RNA干擾所致之抑制表現。
  15. 如申請專利範圍第1至6項中任一項之單股RNA分子，其中前述單股RNA分子之鹼基序列為序列編號2、7、8、13、14、29至35、37、43、44、47、48及51至80中之任一鹼基序列。
  16. 一種抑制表現用組成物，係用以抑制目標基因之表現者，其特徵在於：含有如申請專利範圍第1至15項中任一項之單股RNA分子。
  17. 一種藥學組成物，其特徵在於：含有如申請專利範圍第1至15項中任一項之單股RNA分子。
  18. 如申請專利範圍第17項之藥學組成物，其係供炎症治療用者。
  19. 一種抑制表現方法，係於活體外(in vitro)抑制目標基因之表現者，其特徵在於：使用如申請專利範圍第1至15項中任一項之單股RNA分子。
  20. 如申請專利範圍第19項之抑制表現方法，其含有：於活體外將前述單股RNA分子投予細胞、組織或器官之步驟。
  21. 如申請專利範圍第19或20項之抑制表現方法，其中前述基因之抑制表現係RNA干擾所致之抑制表現。
  22. 一種誘導表現方法，係於活體外誘導抑制目標基因表現之RNA干擾者，其特徵在於：使用如申請專利範圍第1至15項中任一項之單股RNA分子。
  23. 一種核酸分子，係用於治療疾病者，其特徵在於：前述核酸分子為如申請專利範圍第1至15項中任一項之單股RNA分子，且，前述單股核酸分子具有一抑制基因表現之序列作為前述抑制表現序列，且該基因係前述疾病之成因。
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