JP6993230B2 - キメラデコイ - Google Patents
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Description
(1) 18-O-ジメトキシトリチルヘキサエチレングリコール,1-[(2-シアノエチル)-(N,N-ジイソプロピル)]-ホスホロアミダイト{18-O-Dimethoxytritylhexaethyleneglycol,1-[(2-cyanoethyl)-(N,N-diisopropyl)]-phosphoramidite}
(商品名:Spacer Phosphoramidite 18、米国Glen Research社)
(エチレングリコール単位6個から成るスペーサー部を結合)
(2) 9-O-ジメトキシトリチルトリエチレングリコール,1-[(2-シアノエチル)-(N,N-ジイソプロピル)]-ホスホロアミダイト
{9-O-Dimethoxytrityl-triethylene glycol,1-[(2-cyanoethyl)-(N,N-diisopropyl)]-phosphoramidite}
(商品名:Spacer Phosphoramidite 9、米国Glen Research社)
(エチレングリコール単位3個から成るスペーサー部を結合)
(3) DMT-ドデカン-ジオール ホスホロアミダイト
DMT-dodecane-Diol phosphoramidite
(商品名:Spacer 12、米国ChemGenes社)
(エチレングリコール単位4個から成るスペーサー部を結合)
(1) 3-(4,4'-ジメトキシトリチルオキシ)プロピル-1-[(2-シアノエチル)-(N,N-ジイソプロピル)]-ホスホロアミダイト
{3-(4,4'-Dimethoxytrityloxy)propyl-1-[(2-cyanoethyl)-(N,N-diisopropyl)]-phosphoramidite}
(商品名:Spacer Phosphoramidite C3、米国Glen Research社)
(プロピレン鎖から成るスペーサー部を結合)
(2) DMT-ブタン-ジオール ホスホロアミダイト
(DMT-butane-Diol phosphoramidite)
(商品名:C-4 Spacer、米国ChemGenes社)
(ブチレン鎖から成るスペーサー部を結合)
(3) DMT-ヘキサン-ジオール ホスホロアミダイト
(DMT-hexane-Diol phosphoramidite)
(商品名:C-6 Spacer、米国ChemGenes社)
(ヘキシレン鎖から成るスペーサー部を結合)
(4) DMT-ノナン-ジオール ホスホロアミダイト
(DMT-nonane-Diol phosphoramidite)
(商品名:C-9 Spacer、米国ChemGenes社)
(ノニレン鎖から成るスペーサー部を結合)
(5) 12-(4,4'-ジメトキシトリチルオキシ)ドデシル-1-[(2-シアノエチル)-(N,N-ジイソプロピル)]-ホスホロアミダイト
{12-(4,4'-Dimethoxytrityloxy)dodecyl-1-[(2-cyanoethyl)-(N,N-diisopropyl)]-phosphoramidite}
(商品名:Spacer C12 CE Phosphoramidite、米国Glen Research社)
(ドデシレン鎖から成るスペーサー部を結合)
1.免疫系疾患
大動脈炎症候群(高安動脈炎)
バージャー病(ビュルガー病)
結節性動脈周囲炎
ウェゲナー肉芽腫症
アレルギー性肉芽腫性血管炎(チャーグ・ストラウス症候群)
全身性エリテマトーデス
多発性筋炎・皮膚筋炎
シェーグレン症候群
成人スティル病
2.神経・筋疾患
パーキンソン病
筋萎縮性側索硬化症(ALS)
多発性硬化症(MS)
3.呼吸器系疾患
特発性間質性肺炎
サルコイドーシス
原発性肺高血圧症
4.消化器系疾患
自己免疫性肝炎
劇症肝炎
重症急性膵炎
5.皮膚・結合組織疾患
強皮症
6.骨・関節系疾患
広範脊柱管狭窄症
7.腎・泌尿器系疾患
IgA腎症
急速進行性糸球体腎炎
1.二本鎖オリゴヌクレオチドデコイの作製
上記したNF-κB/Ets1-15mer-A(配列番号7、式[III])(実施例1)、NF-κB/Ets1-15mer-B(配列番号8、式[IV])(実施例2)、NF-κB/NF-AT-15mer-A(配列番号9、式[V])(実施例3)、NF-κB/NF-AT-15mer-B(配列番号10、式[VI])(実施例4)、NF-κB/STAT1-15mer-A(配列番号11、式[VII])(実施例5)、NF-κB/STAT1-15mer-B(配列番号12、式[VIII])(実施例6)、NF-κB/STAT6-15mer-A(配列番号6、式[II])(実施例7)、NF-κB/STAT6-15mer-B(配列番号1、式[I])(実施例8)、NF-κB/NF-IL6-15mer-A(配列番号13、式[IX])(実施例9)及びNF-κB/NF-IL6-15mer-B(配列番号14、式[X])を作製した。ヘアピン型の各デコイは、第2鎖を化学合成し、次いで、その5'末端にスペーサー(ドデシレン鎖)を結合し、さらに、スペーサーの他端に所定のヌクレオチドの3'位を結合し、さらにこのヌクレオチドに続けて常法により所定のオリゴヌクレオチドを5'側に1個ずつ結合させていくことにより合成した。ドデシレン鎖の結合は、市販の試薬(商品名:Spacer C12 CE Phosphoramidite、米国Glen Research社)を用い、その指示書にしたがって行った。
1で作製した各二本鎖オリゴヌクレオチドデコイについて、結合活性を測定した。結合活性の測定は次のようにして行った。
試験方法
市販の転写因子アッセイキット(TransAM(商品名)NF-κB p65:Cat.No.40096,:TransAM(商品名)STAT Family:Cat.No. 42296,TransAM(商品名)NFATc1:Cat.No. 40296,TransAM(商品名)C/EBP α/β:Cat.No. 44196,Active Motif, Inc社)を用い、各転写因子のコンセンサス配列が固相化されているプレートへデコイ溶液と、Jurkat 細胞(ヒトTリンパ腫由来)核抽出液あるいはHeLa細胞(ヒト子宮頸がん由来)核抽出液を添加し、反応(室温、1時間)させた。洗浄後、一次抗体(抗NF-κB p65抗体)と二次抗体(HRP-抗IgG抗体)をキット説明書に従って添加、洗浄し、比色法を用いて測定した。
各デコイ溶液の濃度値を対数に変換し、横軸を対数に変換した濃度値(0.005~400nmol/Lの濃度内で5~10点)、縦軸に各群のパーセンテージ値をプロットし、近似曲線を作成し、各反応時間におけるIC50(inhibition concentration 50%)を算出した。
試験方法
STAT6及びEst-1へのゲルシフトアッセイ法による結合確認は、市販のアッセイキット(Light Shift(商品名)Chemiluminescent EMSA kit:Cat.No. p74026,タカラバイオ)を用い,試験管内にSTAT6及びEst-1の結合配列をBiotin化プローブ配列として添加し,デコイ溶液とHeLa細胞(ヒト子宮頸がん由来)核抽出液を添加し、キット付属の試薬と共に室温、30分反応させた。得られた反応液をポリアクリルアミドゲル電気泳動後、ナイロンメンブレンに転写、UVでクロスリンクし、ブロッキング後、Stabilized Streptavidin-Horseradish Peroxidase Conjugateをキット説明書に従って添加、洗浄し、化学発光法を用いて測定した。
添加した各デコイ溶液の濃度値(1,10,100 pmol)の内,STAT6あるいはEst-1のバンドが完全に消失する濃度を有効濃度とした。
試験方法
マウスマクロファージ由来RAW264.7細胞を播種(24ウェルプレート: 4.0×104細胞/ウェル/250μL)し、37℃、5%CO2で24時間培養(10%FBS含有RPMI1640)した。各デコイ溶液 20nmol/Lを遺伝子導入用試薬(FuGENE HD Transfection Reagent : Cat.No. E2311, Promega社)により細胞に導入した。その後、LPS刺激(100ng/mL、24時間)を加えた。培養上清を回収し、市販のサイトカインELISAキット(Mouse IL-1 beta/IL-1F2 Quantikine ELISA Kit:Cat.No. MLB00C, Mouse IL-6 Quantikine ELISA Kit:Cat.No. M6000B, Mouse TNF-alpha Quantikine ELISA Kit:Cat.No. MTA00B, R&D systems社)を用い、各サイトカイン濃度を測定した。
下記の式により各デコイ配列のサイトカイン抑制率(%)を算出した。
サイトカイン抑制率(%)=100‐(デコイ添加群のサイトカイン濃度÷対照群(LPS刺激単独)のサイトカイン濃度)×100
PLGAナノ粒子への結合
上記実施例8で作製したNF-κB/STAT6-15mer-BをPLGAナノ粒子に結合した。この操作は具体的に次のようにして行った。ヘアピン型オリゴヌクレオチド合成の際に、5’末端側にアミノリンカーを付加した。一方PLGA(和光純薬工業社製)の末端のカルボキシル基は反応性の高いN-ヒドロキシスクシンイミド(NHS)エステルにし、これとオリゴヌクレオチドの末端のアミノ基とをアミド結合で結合させPLGA結合型オリゴヌクレオチドを作製した。さらに還元状態である細胞内で速やかにオリゴヌクレオチドを放出させるために、オリゴヌクレオチドとアミノ基の間にジスルフィド結合を挿入しており、これも合成機上で付加している。アミノリンカーやジスルフィド結合含有リンカーはオリゴヌクレオチド合成用の市販品を利用可能である。得られたPLGA結合型NF-κB/STAT6-15mer-Bは、PLGAおよびアセトン、エタノール、水と混合し、ポリビニルアルコールおよびキトサン、水の混合溶媒中に滴下し粒子化した。その後、溶媒留去、加圧ろ過を行い、粒子を含む溶液を得た。さらに必要な場合は凍結乾燥を行った。
動物試験1
1.マウスIBD(炎症性腸疾患)モデル
実施方法
(1) 動物モデル
C57BL/6Jマウス(雄、6週齢)に1.5 %DSS(デキストラン硫酸ナトリウム)溶液を21日間にわたって自由飲水させ、病態が完成した第7日(Day7)から治療を開始する慢性期モデルを用いた。
投与群と投与量を下記表3に示す。投与方法は、各投与物質を200 μL/匹で強制経口投与(マウスの体重が20 gの場合10 mL/kgに相当)した。投与は、飲水開始日をDay 0として、Day 7から週3回(Day 7, 9, 11, 14, 16及び18)の合計6回行った。
投与量: HSDとしての投与量(カッコ内は粒子としての投与量)
HSD 13 mer PS (C12)は、配列番号15の塩基配列を持つ二本鎖オリゴヌクレオチドをスペーサー部がドデシレン基のスペーサーによりヘアピン型にしたもの。
薬効の評価は、飲水開始時(Day 0)、Day 7、Day 14及び解剖時(Day 21)に体重測定及びDAI(疾病活性指数)を評価した。解剖時に大腸の長さを測定した。
結果を図1~図3に示す。DAIの評価では、NS-キメラ群は2週目から症状の進行の抑制を示し、HSD-キメラ群は3週目に有意なDAIの低値を示した。体重減少の程度もDAIと同様の結果であったが、NS-キメラ、NS-NF-ΚB及びHSD-キメラ群の3週目の体重は2週目より増加を示した。大腸の長さに関しては、NS-キメラ及びHSD-キメラ群では有意な短縮抑制が認められた。
実施方法
(1) 動物モデル
メスC57BL/6Jマウス(10~12週齢)にOVA (卵白アルブミン)20μg + Alum 2mgを初日(Day 0)及びDay 14に腹腔内感作した。Day 21, 22及び23に1%OVA を20min吸入することで気道に炎症を惹起し,病態モデルを作製した。
(2) 群構成
投与群と投与量を下記表4に示す。各投与物質は20 nmolでDay 18に一回のみ気管内に投与した。
薬効の評価は、Day24に気管支収縮薬であるメサコリン(3.1,6.25,12.5及び25 mg/mL)を吸入させ,気道抵抗を次のように測定した。最後のOVA曝露(Day24)から24時間後に麻酔下でMCh(メサコリン)誘発AHR(気道過敏性)を測定した。全身麻酔後のマウスに気管切開術を行い、カニューレをして、機械的人工換気(150回呼吸/分、200μlの一回換気量)を行った。神経筋反応の阻止には、臭化パンクロニウム(0.1mg/kg)を投与した。その後、侵襲的気道抵抗およびコンプライアンスをレジスタンス&コンプライアンスシステム(Buxco Electronics社)によって測定した。ベースラインの計測後、10μlのPBSまたはMCh(3.125mg/ml、6.25mg/ml、12.5mg/ml、および25mg/ml)を気管チューブ中に30秒間にわたって噴霧し、270秒間にわたって反応させた。
結果を図4に示す。AHRは喘息の主要な特徴であり、且つ、重要な治療標的であるので、本願発明者らはOVA処理マウスにおけるMChの用量依存性AHR増強に対するNFκBデコイODNおよびキメラデコイODNの効果を調査した。生理食塩水(対照群)およびスクランブルデコイODNで処理されたマウスでは、気道抵抗がMChの用量依存的に著しく増加し、2つの群の間ではMChに対する応答に差はなかった。一方、NFκBデコイODNおよびキメラデコイODNでは気道抵抗の増加を著しく抑制した。MChに対する応答はキメラデコイODNによって完全に改善され、キメラデコイODNの効果はNFκBデコイODNの単独導入の効果よりも有意に高かった(図4)。
方法
(1) 肺のアレルギー反応に対するNFκBおよび/またはSTAT6の阻害の効果
肺のアレルギー反応に対するNFκBおよび/またはSTAT6の阻害の効果を評価するため、薬品含有溶液をエアロゾル化することができるMicroSprayer(登録商標)エアロゾライザー(モデル1A-1C、Penn-Century社、ペンシルバニア州)を使用してDay18(OVA吸入の3日前)にOVA感作マウスにキメラデコイODN、NFκBデコイODN、またはスクランブルデコイODN(マウス当たり25μlの生理食塩水中の20nmol)を気管内投与した。対照マウスおよびシャムマウスは生理食塩水(マウス当たり25μl)を気管内投与した。デコイODNの投与では、キシラジン(10mg/Kg)とケタミン(100mg/Kg)の腹膜内注射によりマウスを麻酔した。
AHR測定のすぐ後に各マウスの気道内腔を0.4mLの氷冷PBSで3回洗浄した。血球計算盤を使用してBALF中の総細胞数を計数した。ディフ・クイック溶液で細胞を染色し、血球細胞の判別を行った。また、BALF中のIL-4(R&Dシステムズ社)、IL-5(サーモ・フィッシャー・サイエンティフィック社)およびIL-13(R&Dシステムズ社)の濃度をELISAにより測定した。
常法により、肺組織から核抽出物を調製した。OVA曝露後の核抽出物中のNFκBおよびSTAT6の発現はゲルシフトアッセイシステム(プロメガ社、ウィスコンシン州)で分析した。プライマーとしてNFκB結合部位を含むODN(5’-CCTTGAAGGGATTTCCCTCC-3’;センス鎖のみが示されている)またはSTAT6結合部位を含むODN(5’-GTATTTCCCAGAAAAGGAAC-3’;センス鎖のみが示されている)を3’末端で[γ-32P]ATPにより標識した。32P標識プライマー(10,000cpm)および1μgのポリデオキシイノシン-デオキシシチジン酸を含む結合混合物(10μl)を10μgの核抽出物と室温で30分間にわたってインキュベートし、その後で6%ポリアクリルアミドゲルにアプライした。また、対照として試料を過剰な(100倍の)非標識ODNと共にインキュベートしたものを用いた。ゲルを電気泳動にかけ、乾燥後、オートラジオグラフィーによって分析した。
血液をDay0(感作前)、Day21(OVA曝露前)およびDay24(最後のOVA曝露から24時間後)に採取し、ELISA(AKRIE-010、株式会社シバヤギ、日本)により血清IgEレベルを測定した。さらに、BALFの採取後に動物を殺処理し、ホモジナイズした全肺組織から全タンパク質を抽出した。その後、ELISA(EA31、オックスフォード・バイオメディカルリサーチ社、ミシガン州)によりタンパク質抽出物(50μg)中のヒスタミンレベルを測定した。
動物をDay24(BALFの採取後)に安楽死させ、肺下葉部を注意深く回収し、固定後、パラフィン包埋した。肺組織の横断切片(6μm)を作製し、ヘマトキシリン/エオシン(HE)染色とPAS染色を行った。
Day24にRNeasyミニキット(Qiagen社、メリーランド州)を用いて全RNAを肺から抽出した。SuperScript IIIファーストストランド合成システム(サーモ・フィッシャー・サイエンティフィック社)を使用して相補的DNAを作製した。Muc5ac(ムチン5AC糖タンパク)用TaqManプローブセット(Mm01276718-m1、アプライドバイオシステムズ社、カリフォルニア州)およびリアルタイムPCRマスターミックス(東洋紡株式会社、日本)を用い、Prism 7900HTリアルタイムPCRシステム(アプライドバイオシステムズ社、カリフォルニア州)を使用して定量的リアルタイムRT-PCRを行った。GAPDHの発現量を内部標準として用い、Muc5acの発現を算出した。
シャピロ・ウィルク検定を用いて正規性を検定した。2つの群の間の比較にはt検定、多群の比較には、テューキー・クラマー多重範囲検定を用いた。ノンパラメトリックの場合には、ノンパラメトリック・クラスカル・ウォリス検定を用いた。P<0.05を有意と見なした。
(1) FITC標識デコイODNの分布
気管内投与によるデコイODNの導入を確認するため、OVA感作マウスにおける蛍光イソチオシアネート(FITC)標識デコイODNの分布を評価した。FITC標識ODNをOVA吸入の3日前に投与し、蛍光がOVA曝露後に主に肺胞腔および気管支周辺領域内のリンパ球において検出され得ることが組織学的検査により示された。また、遊走マクロファージにおいてもFITC標識ODNが検出されることが免疫蛍光染色によって明らかにされた(図5)。
標的転写因子の活性化に対するキメラデコイODNの阻害効果をEMSAにより評価した。NFκBとSTAT6の両方の活性化が生理食塩水(対照)またはスクランブルデコイODNで処理したOVA感作マウスの肺の核抽出物において著しく上昇した。一方、キメラデコイODNの導入によってNFκBとSTAT6の両方の活性化が著しく阻害され、NFκBデコイODNの単独導入によってもNFκBの活性化が阻害された(図6)。
キメラデコイODNの治療効果を明らかにするため、我々は喘息の悪化の防止の分子機序を調査した。まず、我々はキメラデコイODNの抗炎症効果を評価した。OVA感作およびOVA曝露の後に全ての処理群でBALF中の総細胞数が増加した。しかしながら、NFκBデコイODNおよびキメラデコイODNで処理されたマウスでは好酸球数の著しい減少が観察された。さらに、キメラデコイODNのこの減少効果はNFκBデコイODNのものよりも有意に大きかった(図7)。
Claims (10)
- 第1の転写因子に対する第1の結合部位と、第2の転写因子に対する第2の結合部位を含み、前記第1の結合部位のセンス鎖を含む第1の鎖と前記第2の結合部位のセンス鎖を含む第2の鎖とがハイブリダイズして二本鎖を形成し、前記第1の結合部位のセンス鎖と前記第2の結合部位のセンス鎖が少なくとも部分的にハイブリダイズしている、2種類の転写因子に対して結合性を示し、サイズが13mer~15merである二本鎖オリゴヌクレオチドデコイ。
- 前記各結合部位の少なくともいずれかは、各転写因子のコンセンサス配列に対して1個の塩基置換を有する請求項1記載の二本鎖オリゴヌクレオチドデコイ。
- ヘアピン型の二本鎖である請求項1又は2記載の二本鎖オリゴヌクレオチドデコイ。
- 合計2種類の異なる転写因子に対する各結合部位を含み、該2種類の異なる転写因子が以下の(1)~(5)の組合せから選択される請求項1~3のいずれか1項に記載の二本鎖オリゴヌクレオチドデコイ。
(1) NF-κBとEts1
(2) NF-κBとNF-AT
(3) NF-κBとSTAT1
(4) NF-κBとSTAT6
(5) NF-κBとNF-IL6 - 前記2種類の異なる転写因子がNF-κBとSTAT6である請求項4記載の二本鎖オリゴヌクレオチドデコイ。
- 配列番号1、6、7、8、9、10、11、12、13、又は14で表される塩基配列とその相補鎖から成る請求項4記載の二本鎖オリゴヌクレオチドデコイ。
- 配列番号1で表される塩基配列とその相補鎖から成る請求項5記載の二本鎖オリゴヌクレオチドデコイ。
- サイズが15merである請求項1~7記載のいずれか1項に記載の二本鎖オリゴヌクレオチドデコイ。
- デコイを構成する二本鎖オリゴヌクレオチドの各ヌクレオチド間の結合の少なくとも1部にホスホロチオエート結合を含む請求項1~8のいずれか1項に記載の二本鎖オリゴヌクレオチドデコイ。
- 5'末端がリンカーを介して又は直接的にPLGAナノ粒子に結合されている請求項1~9のいずれか1項に記載の二本鎖オリゴヌクレオチドデコイ。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2015177341 | 2015-09-09 | ||
JP2015177341 | 2015-09-09 | ||
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Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
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