ES2912176T3 - Señuelo quimérico - Google Patents

Abstract

Un señuelo oligonucleotídico bicatenario que muestra afinidades de unión para dos factores de transcripción, que comprende un primer sitio de unión para un primer factor de transcripción y un segundo sitio de unión para un segundo factor de transcripción, en el que una primera cadena, que comprende la cadena en sentido de dicho primer sitio de unión, y una segunda cadena, que comprende la cadena en sentido de dicho segundo sitio de unión, se hibridan para formar una doble cadena, en donde dicha cadena en sentido del primer sitio de unión y dicha cadena en sentido del segundo sitio de unión están al menos parcialmente hibridadas; en donde el señuelo es una cadena doble en horquilla y tiene un tamaño de 13 meros a 15 meros.

Description

DESCRIPCIÓN

Señuelo quimérico

Campo técnico

La presente invención se refiere a un señuelo oligonucleotídico bicatenario (en lo sucesivo, en el presente documento denominado también "señuelo quimérico") que muestra afinidades de unión por dos factores de transcripción.

Técnica anterior

Se conocen varios señuelos oligonucleotídicos bicatenarios que muestran una afinidad de unión por un factor de transcripción (por ejemplo, los documentos de patente 1 a 6 y los documentos que no son de patente 1 y 2). Se sabe tratar o prevenir enfermedades provocadas por un factor de transcripción mediante la administración de un señuelo para el factor de transcripción para reducir la actividad del factor de transcripción de interés. La palabra "señuelo" significa "señuelo" en inglés y se refiere a aquellos que tienen una estructura que se asemeja a aquella a la que una determinada sustancia debería unirse o actuar originalmente. Un señuelo utilizado principalmente para un factor de transcripción es un oligonucleótido bicatenario que tiene la misma secuencia de ADN que la región de unión del factor de transcripción en el gen del genoma. En presencia de un señuelo compuesto por dicho un oligonucleótido, algunas de las moléculas de factor de transcripción se unen al oligonucleótido señuelo, en lugar de unirse a la región de unión del gen genómico al que debería haberse unido. Esto da como resultado una disminución en el número de moléculas de factor de transcripción que se unen a la región de unión del gen genómico al que deberían haberse unido, lo que da lugar a una disminución en la actividad del factor de transcripción. En este caso, el oligonucleótido actúa como una imitación (señuelo) de la región de unión real en el gen genómico y se une con el factor de transcripción. Por tanto, el oligonucleótido se llama señuelo.

Se conocen varios señuelos oligonucleotídicos bicatenarios que muestran actividades inhibidoras de una pluralidad de factores de transcripción diferentes (por ejemplo, el documento de patente 2). La administración de dicho señuelo proporciona la inhibición simultánea de las actividades de la pluralidad de diferentes factores de transcripción, que puede ser ventajoso para el tratamiento o prevención de enfermedades. Por ejemplo, el Documento de Patente 2 divulga un señuelo capaz de unirse a NF-KB, un factor de transcripción implicado en la inflamación, y a E2F, un factor de transcripción implicado en la proliferación celular, y describe que el señuelo inhibe simultáneamente la respuesta inflamatoria y la proliferación celular en un sitio anastomótico de un vaso sanguíneo artificial para prevenir la reestenosis del vaso sanguíneo artificial. En la invención descrita en el documento de patente 2, dos sitios de unión a factor de transcripción están dispuestos en tándem en la misma cadena con un intervalo de varias bases, de modo que su tamaño sea mayor que la suma del tamaño de cada sitio de unión y el señuelo del ejemplo es de 28 meros ("mero/s" indica el número de nucleótidos en una sola cadena que constituye una doble cadena; lo mismo se aplicará a continuación en el presente documento). De igual modo, el documento de patente 3 también describe un señuelo oligonucleotídico bicatenario que tiene dos sitios de unión a factor de transcripción, en donde los dos sitios de unión a factor de transcripción están dispuestos en tándem en la misma cadena que en el documento de patente 2 y pueden solaparse parcialmente y en donde el tamaño del señuelo es preferentemente de 20 a 40 meros.

REFERENCIAS DE LA TÉCNICA ANTERIOR

DOCUMENTOS DE PATENTE Y NO DE PATENTE

Documento de patente 1: JP 2010­ Documento no de patente 1: Ryuichi

090103 A

Documento de patente 2: WO MORISHTA, Igakuno Ayumi 2011.07.30, 2006/043722 A Vol.238, No.5, págs. 529/535

Documento de patente 3: JP 2010­

526541 A

Documento de patente 4: JP 2005­ Documento no de patente 2: Takashi MIYAKE 523703

Documento de patente 5: JP 2011 - et al., Nichiyakurishi, 2007, Vol.129, págs.

032269 A 158-162

Documento de patente 6: JP 2014­

037358 A

Sumario de la invención

Problemas a resolver por la invención

Los señuelos oligonucleotídicos bicatenarios se producen sintetizando químicamente un oligonucleótido que tiene la secuencia de bases deseada. Los ácidos oligonucleicos se sintetizan químicamente mediante la síntesis de condensación de unidades de nucleósidos, y el rendimiento es de aproximadamente el 98 % por unidad en el caso del ADN con fosforotioato. Por lo tanto, el rendimiento sintético varía según el multiplicador de la longitud de la cadena. Por ejemplo, en el caso de 20 meros, el rendimiento sintético teórico es del 68 %, pero en el caso de 60 meros, el rendimiento de la síntesis disminuye al 30 % y las impurezas también aumentan, de modo que la diferencia de rendimiento aumenta adicionalmente después de la separación y purificación. Por tanto, acortar la longitud de la cadena es un factor extremadamente importante para reducir el coste de la síntesis. Especialmente cuando el tamaño del oligonucleótido supera los 15 meros, el coste de síntesis aumenta considerablemente. Cuando los señuelos se utilizan como medicamentos, los mayores costes de fabricación aumentan de forma natural el precio de los medicamentos, aumentan la carga para los pacientes y se convierten en obstáculos para el uso generalizado. Por tanto, se desea un señuelo que tenga un tamaño pequeño.

Por lo tanto, un objetivo de la presente invención es proporcionar un señuelo oligonucleotídico bicatenario que comprende dos sitios de unión a factor de transcripción mientras mantiene su tamaño pequeño.

Medios para resolver los problemas

En un intento de permitir que un solo señuelo contenga dos sitios de unión a factor de transcripción, se ha considerado difícil proporcionar un señuelo con un tamaño pequeño, tal como 15 meros o menos, ya que cada sitio de unión es de aproximadamente 10 meros. Como resultado de estudios intensivos, los presentes inventores han descubierto que el tamaño del señuelo que comprende cada sitio de unión para dos factores de transcripción se puede reducir en gran medida colocando cada cadena en sentido de cada sitio de unión en una cadena diferente y disponiéndolas de modo que cada una de las cadenas en sentido de cada sitio de unión al menos en parte se hibriden entre sí, completando de esta manera la presente invención.

Es decir, la presente invención proporciona un señuelo oligonucleotídico bicatenario que muestra afinidades de unión para dos factores de transcripción, que comprende un primer sitio de unión para un primer factor de transcripción y un segundo sitio de unión para un segundo factor de transcripción, en donde una primera cadena que comprende la cadena en sentido del primer sitio de unión y una segunda cadena que comprende la cadena en sentido del segundo sitio de unión se hibridan para formar una doble cadena en la que la cadena en sentido del primer sitio de unión y la cadena en sentido del segundo sitio de unión están al menos parcialmente hibridadas, en donde el señuelo es una cadena doble en horquilla y tiene un tamaño de 13 meros a 15 meros.

Efectos de la invención

La presente invención proporcionó primero un señuelo oligonucleotídico bicatenario que comprende dos sitios de unión a factores de transcripción mientras mantiene su tamaño pequeño. Debido a que el señuelo de la presente invención es de tamaño pequeño, por lo que se sintetiza fácil y económicamente y, además, cuando se usa como agente farmacéutico, puede reducir el precio del medicamento, se espera que la presente invención contribuya en gran medida al tratamiento médico utilizando un señuelo.

Breve descripción de los dibujos

La figura 1 muestra los resultados de la medición del índice de actividad de la enfermedad (DAI, por su siglas en inglés) en experimentos con animales usando un modelo de ratón de enteropatía inflamatoria (IBD, por sus siglas en inglés) realizados en los ejemplos a continuación.

La figura 2 muestra los cambios dependientes del tiempo de los pesos corporales en experimentos con animales utilizando un modelo de ratón de enteropatía inflamatoria (IBD) realizados en los ejemplos a continuación.

La figura 3 muestra la comparación de las longitudes del colon en experimentos con animales usando un modelo de ratón de enteropatía inflamatoria (IBD) realizados en los ejemplos a continuación.

La figura 4 muestra los resultados de la medición de la resistencia de las vías respiratorias después de administrar cantidades crecientes de metacolina en un modelo de ratón con asma inducida por ovoalbúmina (OVA) que se trata previamente con varios señuelos, obtenidos en los ejemplos a continuación.

La figura 5 muestra la distribución del señuelo en un tejido pulmonar analizado en los ejemplos a continuación. La figura 6 representa electroferogramas que muestran las inhibiciones de las actividades de unión de NF-kB y STAT6 por cada señuelo quimérico analizado en los ejemplos a continuación.

La figura 7 muestra el número de células de varios leucocitos en un líquido de lavado broncoalveolar (BAL) después de la administración de varios señuelos medios en los ejemplos a continuación. Los cuatro histogramas que se muestran para cada señuelo en la figura muestran el número total de células, linfocitos, eosinófilos y neutrófilos en orden desde la izquierda.

La figura 8 muestra los resultados de tinción con HE de tejidos pulmonares en cada grupo de modelo de ratón de asma inducida por OVA, obtenidos en los ejemplos a continuación.

La figura 9 muestra los resultados de la inmunotinción de tejidos pulmonares que muestran la distribución de macrófagos en un modelo de ratón de asma inducida por OVA, obtenidos en los ejemplos a continuación.

La figura 10 muestra las concentraciones de interleucina 4 (IL-4), interleucina 5 (IL-5) e interleucina 13 (IL-13) en un líquido de lavado broncoalveolar (BALF) después de la administración de varios señuelos medidas en los ejemplos a continuación.

La figura 11 muestra los resultados de tinción con PAS de tejidos pulmonares en cada grupo de modelo de ratón de asma inducida por OVA, obtenidos en los ejemplos a continuación.

La figura 12 es un diagrama que compara la expresión del gen de la glicoproteína 5AC de mucina (MUC5AC) en cada grupo de modelo de ratón de asma inducida por OVA realizado en los ejemplos a continuación.

La figura 13 muestra las concentraciones de IgE en suero después de la administración de varios señuelos medidas en los ejemplos a continuación. Los tres histogramas que se muestran para cada señuelo en la figura muestran los resultados antes de la sensibilización (D0), después de la sensibilización (D21) y después de la exposición por inhalación (D24) en orden desde la izquierda.

La figura 14 muestra las concentraciones de histamina en tejido pulmonar después de la administración de varios señuelos según se mide en los ejemplos a continuación.

Modo para realizar la invención

Como se describe anteriormente, el señuelo oligonucleotídico bicatenario de la presente invención comprende un primer sitio de unión para un primer factor de transcripción y un segundo sitio de unión para un segundo factor de transcripción. Una primera cadena que comprende la cadena en sentido del primer sitio de unión y una segunda cadena que comprende la cadena en sentido del segundo sitio de unión se hibridan para formar una doble cadena. Adicionalmente, la cadena en sentido del primer sitio de unión y la cadena en sentido del segundo sitio de unión están al menos parcialmente hibridadas. Esta estructura se describirá ahora tomando como ejemplo NF-KB/STAT6-15mer-B que es un señuelo oligonucleotídico bicatenario producido específicamente en los ejemplos a continuación. Obsérvese que el extremo 5' de la secuencia de bases está escrito en el lado izquierdo a menos que se especifique lo contrario en el presente documento.

La estructura de NF-KB/STAT6-15mer-B está representada por la siguiente fórmula [I] (SEQ ID NO: 1).

primera cadena

5'GGGATTTCCTgggaa3' x

J espaciador ^ J j

3'ccctAAAGGACCCTT5' '

segunda cadena

Para el NF-KB/STAT6-15mer-B que tiene la estructura representada por la fórmula [I], el primer factor de transcripción es NF-kB y el segundo factor de transcripción es STAT6. La primera y la segunda cadena son complementarias y, por lo tanto, la segunda cadena es una cadena complementaria de la primera cadena. En la primera cadena, la secuencia GGGATTTCCT (SEQ ID NO: 2), que se designa con letras mayúsculas, es el sitio de unión para NF-kB, y en la segunda cadena, la secuencia TTCCCAGGAAA (SEQ ID NO: 3), que se designa con letras mayúsculas (esta secuencia se escribe, en la fórmula [I], con su extremo 3' a la izquierda ya que es una cadena complementaria; y así esta secuencia y la secuencia representada en la fórmula [I] son de hecho la misma aunque están escritas en direcciones opuestas), es el sitio de unión para STAT6. Las secuencias consenso de los factores de transcripción con frecuencia se representan mediante fórmulas generales. La secuencia consenso de NF-kB es GGGRHTYYHC (SEQ ID NO: 4) (en donde R representa A o G, Y representa C o T, y H representa A, C o T), y la secuencia consenso de STAT6 es TTCNNNNGa A (SEQ ID NO: 5) (en donde N representa A, G, T o C). Por tanto, el sitio de unión GGGATTTCCT para NF-kB en la primera cadena es el mismo que la secuencia consenso de NF-kB, excepto que solo una base en el extremo 3' no coincide con la secuencia consenso de NF-kB. El sitio de unión TTCCCAGg a Aa para STAT6 en la segunda cadena contiene la secuencia consenso completa de STAT6. Al describir una secuencia de bases, se describe la secuencia de bases de la cadena en sentido, aunque el sitio de unión al actor de transcripción y la secuencia consenso del mismo son bicatenarios. Por lo tanto, las secuencias de bases de los sitios de unión y las secuencias consenso descritas anteriormente son todas las secuencias de bases de las cadenas en sentido. Por lo tanto, la primera cadena contiene la cadena en sentido del sitio de unión para NF-kB, y la segunda cadena contiene la cadena en sentido del sitio de unión para STAT6. Como se deduce de la fórmula [I], la secuencia ATTTCCT en la cadena en sentido del sitio de unión para NF-kB y la secuencia AGGAAA en la cadena en sentido del sitio de unión para STAT 6 se hibridan, es decir, la cadena en sentido del primer sitio de unión y la cadena en sentido del segundo sitio de unión están al menos parcialmente hibridadas.

Por lo tanto, en el señuelo quimérico de la presente invención, las cadenas en sentido de dos sitios de unión a factor de transcripción se colocan en cadenas diferentes y están al menos parcialmente hibridadas, de modo que los sitios de unión para ambos factores de transcripción se encuentren al menos parcialmente solapados. Esto hace posible reducir en gran medida el tamaño de un señuelo en comparación con el caso en el que dos sitios de unión a factor de transcripción estén dispuestos en la misma cadena, como se describe en los documentos de patente 2 y 3. Debido a que el coste de síntesis aumenta considerablemente cuando el tamaño es de 16 meros o más, el tamaño del señuelo quimérico de la invención es de 13 meros a 15 meros.

Teniendo en cuenta la actividad de unión y la estabilidad completamente in vivo,

el tamaño más preferido es 15 meros.

Cada uno de los sitios de unión a factor de transcripción contiene preferentemente la totalidad de la secuencia consenso de cada factor de transcripción desde el punto de vista de la actividad de unión, pero en ese caso, la libertad de selección en la combinación de factores de transcripción está muy limitada. Por otra parte, tal como se describe en detalle en los ejemplos a continuación, debido a que el NF-KB/STAT6-15mer-B descrito anteriormente muestra una excelente actividad inhibidora de factores de transcripción, el sitio de unión para cada factor de transcripción puede tener una sola sustitución de base en comparación con la secuencia consenso de cada factor de transcripción (como se describe anteriormente, en NF-KB/STAT6-15mer-B, el sitio de unión para NF-kB en la primera cadena tiene una sola sustitución de base en comparación con la secuencia consenso de NF-kB). Esta sustitución de una sola base aumenta en gran medida el grado de libertad para seleccionar la combinación de factores de transcripción y hace posible emplear varias combinaciones de factores de transcripción. Aunque se pueden tolerar hasta dos sustituciones de bases, se prefiere una sola sustitución de base desde el punto de vista de la actividad de unión.

Para los dos factores de transcripción, se puede usar cualquier combinación siempre que las cadenas en sentido de los sitios de unión para ellas puedan hibridarse al menos parcialmente. Además de la combinación descrita anteriormente de NF-kB y STAT6, se prepararon señuelos en los ejemplos a continuación usando las combinaciones de, por ejemplo, NF-kB y Ets1, NF-kB y NF-AT, NF-kB y STAT1, y Nf -kB y NF-IL6. Incluso si la combinación de factores de transcripción es la misma, con frecuencia se pueden preparar dos o más señuelos que difieren en la secuencia de bases. En los ejemplos a continuación, también se preparó un señuelo que tiene la estructura representada por la siguiente fórmula [II] (NF-KB/STAT6-15mer-A) (SEQ ID NO: 6) como una combinación de NF-kB y STAT6.

primera cadena

segunda cadena

Debido a que la secuencia consenso de Ets1 es MGGAW en donde M es A o C y W es A o T), los señuelos que tienen las estructuras representadas por las siguientes fórmulas [III] y [IV] (NF-KB/Ets1-15mer-A (SEQ ID NO: 7) y NF-KB/Ets1-15mer-B (SEQ ID NO: 8 )) se prepararon como combinaciones de NF-kB y Ets1.

primera cadena

5'gGGGACTTCCTGctc3' v

I espaciador J ¡JJ ]

3'ccccTG AAG G ACgag5’ '

segunda cadena

primera cadena

5'gGGGACTTCCGGgtg3' v

] espaciador [ IV ]

3'ccccT G A A G G C C cac5' '

segunda cadena

Debido a que la secuencia consenso de NF-AT es WGGAAANHN (en donde W es A o T, N es A, G, T o C, y H es A, T, o C), los señuelos que tienen las estructuras representadas por las siguientes fórmulas [V] y [VI] (NF-kB/NF-AT-l5mer-A (SEQ ID NO: 9) y NF-KB/NF-AT-15mer-B (SEQ ID NO: 10)) se prepararon como combinaciones de NF-kB y NF-AT.

primera cadena

5'gGGGAATTTTCCtct3' x

] espaciador [ V ]

3'ccccTTAAAAGGAqa5' '

segunda cadena

primera cadena

5'gGGGGATTTTCCtct3' v

j espaciador j* y ¡ j

3’ccccCTAAAAGGAga5' '

segunda cadena

Debido a que la secuencia consenso de STAT1 es TTCNNNGAA (en donde N es A, G, T, o C), los señuelos que tienen las estructuras representadas por las siguientes fórmulas [VII] y [VIII] (NF-KB/STAT1-15mer-A (SEQ ID NO: 11) y NF-KB/STAT1-15mer-B (SEQ ID NO: 12)) se prepararon como combinaciones de NF-kB y STAT1.

primera cadena

5'GGGACTTCCAggaat3' v

] espaciador [ V I I ]

3'ccctqAAG G TCCTTa5' '

segunda cadena

primera cadena

^espaciador [ VIII ]

segunda cadena

Debido a que la secuencia consenso de NF-IL6 es TKNNGNAAK (en donde K es G o T y N es A, G, T, o C), los señuelos que tienen las estructuras representadas por las siguientes fórmulas [IX] y [X] (NF-KB/NF-IL6-15mer-A (SEQ ID NO: 13) y NF-KB/NF-IL6-15mer-B (SEQ ID NO: 14)) se prepararon como combinaciones de NF-kB y NF-IL6.

primera cadena

espaciador [ ¡X ]

segunda cadena

primera cadena

5'GGGATTCCGcaatct3' v

] espaciador [ X ] 3'cccTAAGGCGTTaga5' •

segunda cadena

Las combinaciones de factores de transcripción no se limitan a los ejemplos anteriores, y otros ejemplos incluyen, pero sin limitación, una combinación de Est-1 y STAT-1, una combinación de Est-1 y STAT-6, una combinación de Est-1 y NF-AT, una combinación de Est-1 y NF-IF6, una combinación de STAT-1 y NF-IL6, y una combinación de STAT-6 y NF-IL-6. Debido a que la secuencia consenso de cada factor de transcripción es bien conocida, un experto en la materia puede diseñar fácilmente el señuelo quimérico de la presente invención para una combinación de dos factores de transcripción seleccionados. Sin embargo, ya que el requisito anteriormente mencionado debe cumplirse, no siempre es posible diseñar el señuelo quimérico de la presente invención para cualquiera y todas las combinaciones de factores de transcripción.

El oligonucleótido que constituye el señuelo quimérico de la presente invención puede ser ADN o ARN, pero se prefiere el ADN desde el punto de vista de las actividades de unión a los factores de transcripción y la estabilidad.

Un señuelo quimérico puede ser un señuelo de doble cadena simple, o puede ser una horquilla o mancuerna (grapa) en el que uno o ambos extremos de cada cadena están unidos a través de un espaciador. Se prefieren los señuelos en horquilla y mancuerna debido a su mayor estabilidad. Al evaluar exhaustivamente las actividades de unión a los factores de transcripción y la estabilidad, el señuelo en horquilla es el más preferido. El señuelo quimérico de la presente invención es una cadena doble en horquilla.

El señuelo en horquilla tiene una estructura en la que el extremo 3' de la primera cadena y el extremo 5' de la segunda cadena están unidos a través de un espaciador, como se muestra en las fórmulas [I] a [X] descritas anteriormente. Los señuelos oligonucleotídicos bicatenarios en horquilla son bien conocidos y se describen con más detalle en, por ejemplo, el documento de patente 1. Los ejemplos del espaciador incluyen -OPO² -(OCH² CH² )n³ -OPO² O^- -OPO² -(Oc H CH² )n3 -OPO² O- y -OPO² O-(CH² )n4 -OPO² O-, preferentemente-OPO² -(OCH² CH² )n3 -OPO² O- y -OPO² O-(CH² )n⁴ -OPO² O-. En el presente caso, n³ representa un número entero de 4 a 8, preferentemente un número entero de 5 a 7, más preferentemente 6, y n⁴ representa un número entero de 3 a 12. El -OPO²O- en cada extremo del espaciador representa cada uno un enlace fosfodiéster unido a la posición 3' o 5' del azúcar del nucleótido adyacente. La porción, excluyendo -OPO²O- en ambos extremos del espaciador, puede denominarse "resto espaciador" a continuación. Los restos espaciadores de los señuelos oligonucleotídicos bicatenarios que tienen la estructura representada por las fórmulas [I] a [X] preparadas en los ejemplos a continuación son todos grupos dodecileno.

El señuelo oligonucleotídico bicatenario en horquilla se puede sintetizar, por ejemplo, sintetizando primero un oligonucleótido monocatenario al que se va a unir un espaciador en su extremo 5' mediante un método convencional; uniendo un espaciador a su extremo 5'; uniendo la posición 3' de un nucleótido previsto al otro extremo del espaciador; y uniendo adicionalmente los oligonucleótidos previstos al extremo 5' del nucleótido uno por uno mediante un método convencional. Los reactivos para introducir varios espaciadores (derivados de espaciadores) para preparar oligonucleótidos bicatenarios en horquilla están disponibles comercialmente, y los oligonucleótidos bicatenarios en horquilla se pueden preparar fácilmente utilizando estos reactivos espaciadores disponibles comercialmente según sus instrucciones. Los ejemplos de los reactivos comercialmente disponibles que se pueden usar incluyen los siguientes.

1. Reactivos para introducir un resto espaciador que comprende unidades repetidas de etilenglicol:

(1) 18-O-Dimetoxitritilhexaetilenglicol,1-[(2-cianoetil)-(N,N-diisopropil)] -fosforamidita

(nombre comercial: Espaciador Fosforamidita 18, Glen Research, EE. UU.)

(que se une a un resto espaciador compuesto por 6 unidades de etilenglicol)

(2) 9-O-Dimetoxitritil-trietilenglicol,1-[(2-cianoetil)-(N,N-diisopropil)]-fosforamidita

(nombre comercial: Espaciador Fosforamidita 9, Glen Research, EE. UU.)

(que se une a un resto espaciador compuesto por 3 unidades de etilenglicol)

(3) DMT-dodecano-diol fosforamidita

(nombre comercial: Espaciador 12, ChemGenes, EE. UU.)

(que se une a un resto espaciador compuesto por 4 unidades de etilenglicol)

2. Reactivos para introducir un resto espaciador que comprende una cadena de alquileno:

(1) 3-(4,4'-Dimetoxitritiloxi)propil-1-[(2-cianoetil)-(N,N-diisopropil)]-fosforamidita

(nombre comercial: Espaciador Fosforamidita C3, Glen Research, EE. UU.)

(que se une a un resto espaciador compuesto por una cadena de propileno)

(2) DMT-butano-diol fosforamidita

(nombre comercial: Espaciador C-4, ChemGenes, EE. UU.)

(que se une a un resto espaciador compuesto por una cadena de butileno)

(3) DMT-hexano-diol fosforamidita

(nombre comercial: Espaciador C-6, ChemGenes, EE. UU.)

(que se une a un resto espaciador compuesto por una cadena de hexileno)

(4) DMT-nonano-diol fosforamidita

(nombre comercial: Espaciador C-9, ChemGenes, EE. UU.)

(que se une a un resto espaciador compuesto por una cadena de nonileno)

(5) 12-(4,4'-Dimetoxitritiloxi)dodecil-1-[(2-cianoetil)-(N,N-diisopropil)]-fosforamidita

(nombre comercial: Espaciador C12 CE Fosforamidita, Glen Research, EE. UU.)

(que se une a un resto espaciador compuesto por una cadena de dodecileno)

En el oligonucleótido según la presente invención, para impartir la estabilidad bioquímica adecuada, la totalidad o una parte de los enlaces internucleotídicos pueden estar sujetos a una modificación para resistencia a nucleasas tal como fosforotioación. En otras palabras, en el señuelo quimérico de la presente invención, la parte oligonucleotídica es preferentemente ADN en esencia, pero los enlaces entre al menos dos nucleótidos adyacentes (y/o, en el caso de un nucleótido adyacente a un resto espaciador, un enlace entre el nucleótido y el resto espaciador) pueden someterse a una modificación para resistencia a nucleasas para aumentar la resistencia a nucleasas. La expresión "modificación para resistencia nucleasas", como se usa en el presente documento, significa una modificación que favorece que el ADN sea menos susceptible a la degradación por nucleasas que el ADN natural, y tal modificación del ADN en sí misma es bien conocida. Los ejemplos de la modificación para resistencia a nucleasas incluyen la fosforotioación (a veces denominada en el presente documento "modificación con azufre"), fosforoditioación y fosforoamidación. Entre ellas, se prefiere la modificación con azufre. La modificación con azufre significa convertir uno de dos átomos de oxígeno que no forman puentes unidos a un átomo de fósforo que constituye un enlace fosfodiéster entre nucleótidos adyacentes a un átomo de azufre como se describe anteriormente. Las técnicas para la modificación con azufre de cualquier enlace entre los propios nucleótidos adyacentes son bien conocidas. Por ejemplo, se puede realizar fácilmente utilizando un reactivo de modificación con azufre (CPRII, 1,1-dióxido de 3H-1,2-benzoditiol-3-ona) (Glen Research). También, los oligonucleótidos modificados con azufre se sintetizan comercialmente. En la presente descripción y en las reivindicaciones, una secuencia de bases incluye aquellas en las que una parte o la totalidad de los enlaces entre los nucleótidos y entre el espaciador y el nucleótido están modificados con azufre o no están modificados con azufre en absoluto, a menos que el contexto indique claramente lo contrario.

El señuelo quimérico de la presente invención se puede administrar tal cual, o también se puede administrar después de conjugarlo con una sustancia que constituye un sistema de suministro de fármacos (DDS, por sus siglas en inglés) apropiado. Los ejemplos de DDS para un oligonucleótido incluyen liposomas que contienen sustancias catiónicas, péptidos permeables a la membrana celular, polímeros que los contienen, y atelocolágeno. Estos también se pueden usar en la administración de los señuelos quiméricos de la presente invención. Además de estos, el señuelo quimérico de la presente invención también se puede conjugar con nanopartículas de PLGA (por sus siglas en inglés, copolímero de ácido poliláctico/ácido glicólico) para su administración. Las nanopartículas de PLGA son partículas que tienen un diámetro de decenas de nanómetros a cientos de nanómetros compuestas de PLGA. Las nanopartículas de PLGA se fabrican como partículas para DDS (por ejemplo, Hosokawa Micron), por lo que se puede utilizar preferentemente la tecnología comercialmente disponible. Cuando el señuelo quimérico de la presente invención se conjuga con nanopartículas de PLGA, el extremo 5' de la primera cadena del señuelo quimérico se conjuga preferentemente con nanopartículas de PLGA a través de un enlazador disulfuro y un enlazador amino. Esto se puede realizar, por ejemplo, haciendo reaccionar un éster de PLGA-NHS con el señuelo quimérico para obtener un señuelo quimérico conjugado con PLGA y convirtiéndolo en una partícula de tamaño nanométrico utilizando el efecto Marangoni, y los métodos de preparación detallados también se describen en los ejemplos a continuación. No se conoce la unión de nanopartículas de PLGA a señuelos para el DDS de señuelos oligonucleotídicos bicatenarios.

Debido a que el señuelo quimérico de la presente invención tiene sitios de unión para dos factores de transcripción, puede reducir las actividades de estos dos factores de transcripción (cabe señalar, sin embargo, que dos factores de transcripción no están unidos simultáneamente a una sola molécula señuelo). Por tanto, el señuelo quimérico de la presente invención se puede utilizar para el tratamiento y la prevención de diversas enfermedades causadas por actividades elevadas de estos dos factores de transcripción. Por lo tanto, los señuelos que tienen un sitio de unión para NF-kB se pueden usar como principio activo en agentes farmacéuticos en los que se usa un señuelo de NF-kB como principio activo. Dichos agentes farmacéuticos son reconocidos por ser eficaces para el tratamiento y prevención de diversas enfermedades que se describen a continuación:

reestenosis vascular, síndrome coronario agudo, isquemia cerebral, infarto de miocardio, lesión por reperfusión asociada a: enfermedad isquémica, dermatitis atópica, psoriasis vulgar, dermatitis de contacto, queloides, úlceras de decúbito, colitis ulcerosa, enfermedad de Crohn, nefropatía, glomeruloesclerosis, albuminuria, nefritis, insuficiencia renal, artritis reumatoide crónica, osteoartritis, degeneración de disco intervertebral, asma, enfermedad pulmonar obstructiva crónica, fibrosis quística, aneurisma de la aorta, aneurisma cerebral;

así como

1. Enfermedades del sistema inmunitario, incluyendo

Síndrome de aortitis (arteritis de Takayasu),

Enfermedad de Buerger (enfermedad de Buerger)

Poliarteritis nodosa

Ganulomatosis de Wegener

Angeítis granulomatosa alérgica (síndrome de Churg-Strauss)

Lupus eritematoso sistémico

Complejo polimiositis/dermatomiositis

Síndrome de Sjogren

Enfermedad de Still de inicio en el adulto;

2. Enfermedades neuromusculares, incluyendo

Enfermedad de Parkinson

Esclerosis lateral amiotrófica (ALS, por sus siglas en inglés)

Esclerosis múltiple (MS, por sus siglas en inglés);

3. Enfermedades respiratorias, incluyendo

Neumonía intersticial idiopática

Sarcoidosis

Hipertensión pulmonar primaria;

4. Enfermedades del aparato digestivo, incluyendo

Hepatitis autoinmunitaria

Hepatitis fulminante

Pancreatitis aguda grave;

5. Enfermedades de la piel y del tejido conjuntivo, incluyendo

Escleroderma;

6. Enfermedades de huesos y articulaciones, incluyendo

Estenosis difusa del canal espinal; y

7. Enfermedades renales y del sistema urinario, incluyendo

Nefropatía por IgA

Glomerulonefritis de progresión rápida.

De forma análoga, un señuelo que tiene un sitio de unión para STAT6 es útil para tratar y prevenir, por ejemplo, enfermedades respiratorias, tales como asma, enfermedades alérgicas tales como la rinitis alérgica y la conjuntivitis alérgica, asma atópica, dermatitis atópica, colitis ulcerosa, enfermedad de Crohn, artropatía, dolor crónico y cáncer; un señuelo que tiene un sitio de unión para Ets1 es útil para tratar y prevenir, por ejemplo, insuficiencia cardíaca isquémica, enfermedad cerebrovascular isquémica, enfermedad pulmonar isquémica, peor pronóstico después del trasplante de órganos o cirugía de órganos, lesión por reperfusión, reestenosis posterior a PTCA, nefritis, hepatitis, artritis, insuficiencia renal aguda, insuficiencia renal crónica, arteriesclerosis, reumatismo, esclerosis múltiple y cáncer; un señuelo que tiene un sitio de unión para NF-AT es útil para tratar y prevenir, por ejemplo, osteoporosis/artropatía, enfermedad autoinmunitaria, enfermedades infecciosas y cáncer; un señuelo que tiene un sitio de unión para STAT1 es útil para tratar y prevenir, por ejemplo, enfermedades respiratorias tal como la enfermedad pulmonar obstructiva crónica, fibrosis quística, asma, tos eosinofílica, bronquitis, sarcoidosis, fibrosis pulmonar, rinitis y sinusitis; y un señuelo que tiene un sitio de unión para NF-IL6 es útil para tratar y prevenir, por ejemplo, enfermedad proliferativa de células inmunitarias, psoriasis, pénfigo vulgar, síndrome de Behcet, síndrome de dificultad respiratoria aguda, cardiopatía isquémica, síndrome posdiálisis, leucemia, artritis reumatoide, síndrome de inmunodeficiencia adquirida, angeítis, histiocitosis lipídica y sepsis.

Debido a que la administración del señuelo quimérico de la presente invención puede reducir simultáneamente las actividades de dos factores de transcripción, el señuelo quimérico de la presente invención puede usarse para reducir las actividades de dos factores de transcripción cuya actividad se desea reducir de manera simultánea. Por ejemplo, se pueden combinar dos factores de transcripción eficaces para tratar o prevenir la misma enfermedad para potenciar adicionalmente el efecto terapéutico o preventivo, o se pueden combinar dos factores de transcripción funcionalmente relacionados. Para el tratamiento o la prevención de una amplia gama de enfermedades, también se pueden combinar factores de transcripción no relacionados en absoluto.

Cuando el señuelo quimérico de la presente invención se utilice para usos medicinales, la vía de administración del señuelo no está particularmente limitada, pero puede ser preferentemente la administración parenteral tal como la administración intravenosa, administración intramuscular, administración subcutánea, administración dérmica, o administración directa al órgano o tejido diana. La dosificación se selecciona apropiadamente dependiendo de, por ejemplo, la enfermedad diana, los síntomas del paciente y la vía de administración, pero normalmente se pueden administrar de 0,1 a 10.000 nmoles, preferentemente de 1 a 1.000 nmoles, y más preferentemente de 10 a 100 nmoles por día para un adulto. La formulación se puede llevar a cabo por un método convencional. Por ejemplo, en el caso de soluciones inyectables, puede ser en forma de solución en la que el señuelo quimérico de la presente invención se disuelve en solución salina fisiológica. Los aditivos comúnmente utilizados en el campo de las preparaciones farmacéuticas tales como conservantes, tampones, solubilizantes, emulsionantes, diluyentes y agentes isotonizantes pueden mezclarse adecuadamente durante la formulación. Además, la formulación puede contener otros ingredientes medicinales.

La presente invención se describirá con más detalle con referencia a los ejemplos. Para todos los señuelos en horquilla en los siguientes ejemplos, sus restos espaciadores son el grupo dodecileno. Adicionalmente, en todos los ejemplos, todos los enlaces internucleotídicos están fosforotioados.

Ejemplos 1 -10

1. Preparación de señuelo oligonucleotídico bicatenario

Se prepararon NF-KB/Ets1-15mer-A (SEQ ID NO: 7, fórmula [III]) (ejemplo 1), NF-KB/Ets1-15mer-B (SEQ ID NO: 8, fórmula [IV]) (ejemplo 2), NF-KB/NF-AT-15mer-A (SEQ ID NO: 9, fórmula [V]) (ejemplo 3), NF-KB/NF-AT-15mer-B (SEQ ID NO: 10, fórmula [VI]) (ejemplo 4), NF-KB/STAT1-15mer-A (SEQ ID NO: 11, fórmula [VII]) (ejemplo 5), NF-KB/STAT1-15mer-B (SEQ ID NO: 12, fórmula [VIII]) (ejemplo 6), NF-KB/STAT6-15mer-A (SEQ ID NO: 6, fórmula [II]) (ejemplo 7), NF-KB/STAT6-15mer-B (SEQ ID NO: 1, fórmula [I]) (ejemplo 8), NF-KB/NF-IL6-15mer-A (SEQ ID NO: 13, fórmula [IX]) (ejemplo 9) y NF-KB/NF-IL6-15mer-B (SEQ ID NO: 14, fórmula [X]) descritos anteriormente. Cada uno de los señuelos en horquilla se sintetizó mediante la síntesis química de una segunda cadena; uniendo después un espaciador (cadena de dodecileno) al extremo 5' de la misma; uniendo la posición 3' de un nucleótido previsto al otro extremo del espaciador; y uniendo además los oligonucleótidos previstos uno a uno al extremo 5' del nucleótido mediante un método convencional. La unión de la cadena de dodecileno se realizó usando un reactivo comercialmente disponible (nombre comercial: Espaciador C 12 CE Fosforamidita, Glen Research, EE. UU.) de acuerdo con sus instrucciones.

2. Ensayo de actividad de unión

Para cada uno de los señuelos oligonucleotídicos bicatenarios preparados en 1, se midió la actividad de unión. La actividad de unión se midió de la siguiente manera.

(1) Ensayo de actividad de unión

Método de ensayo

Utilizando un kit de ensayo de factor de transcripción disponible comercialmente (TransAM™ NF-kB p65: n.° de Cat. 40096: TransAM™ Familia de STAT: n.° de Cat. 42296, TransAM™ NFATc1: n.° de Cat. 40296, TransAM™ C/EBP a/p: n.° de Cat. 44196, Active Motif, Inc), la solución de señuelo y un extracto nuclear de células Jurkat (derivadas de linfoma de linfocitos T humano) o células HeLa (derivadas de cáncer de cuello uterino humano) se añadieron a una placa en la que se inmovilizó una secuencia consenso de cada factor de transcripción y después se dejó reaccionar a temperatura ambiente durante 1 hora. Después del lavado, se añadieron un anticuerpo primario (anticuerpo anti-NF-KB p65) y un anticuerpo secundario (anticuerpo HRP-anti-IgG) según las instrucciones del kit. Después del lavado, la medición se realizó mediante un método colorimétrico.

Método de evaluación

El valor de concentración de cada una de las soluciones de señuelo se convirtió en logaritmo y se preparó una curva aproximada trazando los valores de concentración convertidos en logaritmo (5 a 10 puntos dentro de un intervalo de concentración de 0,005 a 400 nmol/l) en el eje horizontal y el valor porcentual de cada uno de los grupos en el eje vertical para calcular la CI50 (concentración de inhibición al 50 %) en cada tiempo de reacción.

(2) Confirmación de unión por ensayo de cambio de gel

Método de ensayo

La confirmación de la unión a STAT 6 y Est-1 mediante el ensayo de cambio de gel se realizó utilizando un kit de ensayo disponible comercialmente (kit EMSA quimioluminiscente Light Shift™: n.° de cat. p74026, Takara Bio), cargando un tubo de prueba con secuencias de unión para STAT6 y Est-1 como secuencias de sonda biotiniladas y con la solución de señuelo y un extracto nuclear de células HeLa (derivadas de cáncer de cuello uterino humano), y dejando después que la mezcla reaccionara a temperatura ambiente durante 30 minutos con reactivos adjuntos al kit. La solución de reacción resultante se sometió a electroforesis en gel de poliacrilamida, se transfirió a una membrana de nailon, se reticuló con UV, se bloqueó, y después se le añadió conjugado de peroxidasa de rábano picanteestreptavidina estabilizada de acuerdo con las instrucciones del kit, se lavó y se sometió a quimioluminiscencia. Método de evaluación

Entre los valores de concentración (1, 10, 100 pmol) de cada solución de señuelo añadida, la concentración a la que la banda de STAT 6 o Est-1 desaparecía por completo se consideró como la concentración eficaz.

Los resultados se muestran en la tabla 1 a continuación.

T l 11

Como se muestra en la tabla 1, se confirmó que los señuelos quiméricos de la presente invención se unen a dos factores de transcripción que se unen a los dos sitios de unión que se encuentran en cada señuelo.

3. Efecto sobre la producción de citocinas

Método de ensayo

Se sembraron células RAW 264.7 derivadas de macrófagos de ratón (en una placa de 24 pocillos: a 4,0 x 104 células/pocillo/250 j l) y se cultivaron a 37 °C y CO² al 5 % durante 24 horas (en RPMI 1640 que contiene FBS al 10%). Usando un reactivo de transferencia de genes (FuGENE HD Transfection Reagent: n.° de cat. E 2311, Promega), se transfectaron 20 nmol/l de cada una de las soluciones de señuelo en las células. A continuación, las células se estimularon con LPS (100 ng/ml, durante 24 horas). Se recogió el sobrenadante del cultivo y se midió la concentración de cada citocina utilizando un kit ELISA para citocinas disponible comercialmente (Kit ELISA Quantikine para IL-1 beta/IL-IF2 de ratón: n.° de Cat. MLB00C, Kit ELISA Quantikine para IL-6 de ratón: n.° de Cat. M6000B, Kit ELISA Quantikine para TNF-alfa de ratón: n.° de Cat. MTA00B, R&D systems).

Método de evaluación

La tasa (%) de inhibición de citocinas de cada secuencia de señuelo se calculó mediante la siguiente ecuación:

Tasa de inhibición de citocinas (%) = 100 -(concentración de citocinas en un grupo con señuelo añadido/concentración de citocinas en un grupo de control (estimulación con LPS solo)) x 100

Los resultados se muestran en la Tabla 2 a continuación.

T l 21

continuación

Como se muestra en la tabla 2, se confirmó que los señuelos quiméricos de la presente invención inhibían la producción de las tres citocinas investigadas. A partir de los resultados mostrados en la tabla 2, se considera que el ejemplo 8 (NF-KB/STAT6-15mer-B) ejerce el efecto más excelente desde un punto de vista integral. Por lo tanto, en los siguientes ejemplos, se utilizó NF-KB/STAT6-15mer-B.

Ejemplo 11

Unión a nanopartículas de PLGA

Se unió NF-KB/STAT6-15mer-B preparado en el ejemplo 8 anterior a nanopartículas de PLGA. Específicamente, esta operación puede realizarse de la siguiente manera. Cuando se sintetizó el oligonucleótido en horquilla, se añadió un enlazador amino al extremo 5'. Por otra parte, el grupo carboxilo en el extremo de PLGA (fabricado por Wako Pure Chemical Industries) se convirtió en éster de N-hidroxisuccinimida (NHS) altamente reactivo, y este se acopló con el grupo amino en el extremo del oligonucleótido mediante un enlace amida para formar un oligonucleótido conjugado con PLGA. Adicionalmente, para liberar rápidamente el oligonucleótido en una célula en estado reducido, se insertó un enlace disulfuro entre el oligonucleótido y el grupo amino, cuyo enlace disulfuro también se añadió en el sintetizador. Puede usarse un producto comercialmente disponible para la síntesis de oligonucleótidos para el enlazador amino o el enlazador que contiene el enlaces disulfuro. El NF-KB/STAT6-15mer-B conjugado con PLGA resultante se mezcló con PLGA, acetona, etanol y agua y se añadió en gotas a un disolvente mixto de alcohol polivinílico, quitosano y agua para formar partículas. A continuación, el disolvente se eliminó por destilación y se filtró a presión para obtener una solución que contenía partículas. Además, se realizó liofilización cuando fue necesario.

Ejemplo 12

Estudio con animales 1

1. Modelo de ratón de IBD (enteropatía inflamatoria)

Método de implementación

(1) Modelo animal

Se utilizó un modelo en fase crónica en el que se permitió que los ratones C57BL/6J (macho, de 6 semanas de edad) bebieran de manera libre una solución de DSS (sulfato sódico de dextrano) al 1,5 % durante 21 días y el tratamiento se inició el día 7 cuando se estableció la patología.

(2) Composición del grupo

El grupo administrado y la dosis se muestran en la tabla 3 a continuación. Para el método de administración, se administraron por sonda 200 pl/ratón de cada sustancia a administrar (equivalente a 10 ml/kg cuando el peso del ratón era de 20 g). La administración se realizó seis veces en total, tres días a la semana a partir del día 7 (días 7, 9, 11, 14, 16 y 18) con la fecha de inicio de consumo establecida en el día 0.

T l 1

(3) Evaluación

Para la evaluación de fármacos, se midieron los pesos corporales al inicio del consumo (día 0), día 7, día 14 y en la disección (día 21) y se evaluó el DAI (índice de actividad de la enfermedad). La longitud del colon se midió en la disección.

3) Resultados de la prueba

Los resultados se muestran en las figuras 1 a 3. En la evaluación del DAI, el grupo con NS-quimera mostró supresión de la progresión de los síntomas a partir de la segunda semana y el grupo con HSD-quimera mostró un valor DAI significativamente más bajo en la tercera semana. Aunque el grado de pérdida de peso fue similar al de DAI, los pesos corporales del grupo con NS-quimera, NS-NF-kB y HSD-quimera en la tercera semana aumentaron con respecto a los de la segunda semana. Con respecto a la longitud del colon, se observó una supresión significativa del acortamiento en el grupo de NS-quimera y HSD-quimera.

En comparación con el grupo NS-NF-kB, el grupo HSD-quimera tuvo un mayor efecto en cualquiera de los elementos de evaluación.

2. Modelo de ratón de asma inducida por OVA

Método de implementación

(1) Modelo animal

Se sensibilizaron ratones C57BL/6J hembra (de 10 a 12 semanas de edad) por vía intraperitoneal con 20 |jg de OVA (ovoalbúmina) 2 mg de alumbre el primer día (día 0) y el día 14. Se indujo inflamación en el tracto respiratorio mediante la inhalación de OVA al 1 % durante 20 min los días 21, 22 y 23 para preparar un modelo de afección patológica.

(2) Composición del grupo

El grupo administrado y la dosis se muestran en la tabla 4 a continuación. Cada sustancia a administrar se administró por vía intratraqueal solo una vez a 20 nmoles el día 18.

(3) Evaluación

Para la evaluación de fármacos, los ratones se sometieron a inhalación de metacolina, un broncoconstrictor (3,1, 6,25, 12,5 y 25 mg/ml) el día 24, y se midió la resistencia de las vías respiratorias de la siguiente manera. La hiperreactividad de las vías respiratorias (AHR, por sus siglas en inglés) inducida por metacolina (MCh) se midió con anestesia 24 horas después de la última exposición a OVA (día 24). Los ratones se sometieron a traqueotomía con anestesia general, canulación y ventilación mecánica (150 respiraciones/minuto, volumen corriente de 200 jE ). Se administró bromuro de pancuronio (0,1 mg/kg) para inhibir la reacción neuromuscular. A continuación, se midió la resistencia y la distensibilidad de las vías respiratorias invasivas mediante el Resistance & Compliance System (Buxco Electronics). Después de la medición del valor inicial, se pulverizaron 10 j l de PBS o MCh (3,125 mg/ml, 6,25 mg/ml, 12,5 mg/ml y 25 mg/ml) en el tubo endotraqueal durante 30 segundos y se dejó reaccionar durante 270 segundos.

3) Resultados de la prueba

Los resultados se muestran en la figura 4. Debido a que la AHR es una característica principal del asma y una diana terapéutica importante, los presentes inventores investigaron el efecto de ODN señuelo de NF-kB y o Dn señuelo quimérico sobre la potenciación de AHR dependiente de la dosis inducida por MCh en ratones tratados con OVA. Para ratones tratados con solución salina fisiológica (grupo de control) y ODN señuelo cifrado, la resistencia de las vías respiratorias aumentó notablemente según la dosis de MCh y no hubo diferencias en las respuestas a MCh entre los dos grupos. Por otra parte, para ratones tratados con ODN señuelo NF-kB y ODN señuelo quimérico, el aumento de la resistencia de las vías respiratorias se inhibió notablemente. La respuesta a MCh mejoró completamente con el ODN señuelo quimérico, y el efecto de ODN señuelo quimérico fue significativamente mayor que el efecto del ODN señuelo NF-kB solo (figura 4).

3. Experimentos adicionales usando modelo de ratón de método de asma inducida por OVA

(1) Efectos de la inhibición de NF-kB y/o STAT6 sobre la reacción alérgica pulmonar

Para evaluar los efectos de la inhibición de NF-kB y/o STAT6 sobre la reacción alérgica pulmonar, se administró por vía intratraqueal ODN señuelo quimérico, ODN señuelo NF-kB u ODN señuelo revuelto (2o nmol en 25 pl de solución salina fisiológica por ratón) a ratones sensibilizados con OVA el día 18 (3 días antes de la inhalación de OVA) utilizando el aerosol MicroSprayer® (Modelo 1A-1C, Penn-Century, Pensilvania) capaz de administrar en aerosol soluciones que contienen productos químicos. Para los ratones de control y los ratones tratados de manera simulada, se administró solución salina fisiológica (25 pl por ratón) por vía intratraqueal. En la administración de ODN señuelo, los ratones se anestesiaron mediante inyección intraperitoneal de xilazina (10 mg/kg) y ketamina (100 mg/kg).

La administración intratraqueal de ODN señuelo quimérico marcado con FITC también se realizó en ratones sensibilizados con OVA 3 días antes de la inhalación de OVA, y los tejidos pulmonares se obtuvieron 1 día después de la exposición a OVA. Se prepararon secciones congeladas (5 pm) de estos tejidos pulmonares y se examinaron usando microscopía de fluorescencia.

Este protocolo experimental se aprobó por un comité local de cuidado y uso de animales. Este estudio se realizó con la supervisión de un comité de cuidado y uso de animales de conformidad con la directriz sobre experimentos con animales de la Facultad de Medicina de la Universidad de Osaka y la Ley de Bienestar y Manejo de Animales de Japón (Ley N.° 105).

(3) Análisis de lavado broncoalveolar

Inmediatamente después de la medición de AHR, la luz de las vías respiratorias de cada ratón se lavó tres veces con 0,4 ml de PBS enfriado con hielo. El número total de células en el BALF se contó utilizando un hemocitómetro. Las células se tiñeron con solución Diff-Quik para discriminar las células sanguíneas. Usando ELISA, también se midieron las concentraciones de IL-4 (R&D Systems), IL-5 (Thermo Fisher Scientific) e IL-13 (R&D Systems) en el BALF.

(4) Ensayo de cambio de movilidad de electroforesis

Se prepararon extractos nucleares a partir de tejidos pulmonares mediante un método convencional. Las expresiones de NF-kB y STAT6 en los extractos nucleares después de la exposición a OVA se analizaron utilizando un sistema de ensayo de cambio de gel (Promega, Wisconsin). Como cebador, se marcó un ODN (5'-CCTTGAAGGGATTTCCCTCC-3'; solo se muestra la cadena en sentido) que comprende un sitio de unión a NF-kB o un ODN (5'-GTATTTCCCAGAAAAGGAAC-3'; solo se muestra la cadena en sentido) que comprende un sitio de unión STAT6 con [Y-32P] ATP en el extremo 3'. Una mezcla conjugada (10 pl) que contenía cebador marcado con 32P (10.000 cpm) y 1 pg de ácido poli(desoxiinosínico-desoxicitidílico) se incubó con 10 pg del extracto nuclear durante 30 minutos a temperatura ambiente y después se aplicó a un gel de poliacrilamida al 6 %. Se usó como control una muestra incubada con un exceso (100 veces) de ODN sin marcar. Los geles se sometieron a electroforesis, se secaron y analizaron por autorradiografía.

(5) ELISA para determinar el nivel de IgE en suero y el nivel de histamina tisular

Se recogieron muestras de sangre el día 0 (antes de la sensibilización), el día 21 (antes de la exposición a OVA) y el día 24 (24 horas después de la última exposición a OVA) y los niveles de IgE en suero se midieron mediante ELISA (AKRIE-010, Shibayagi, Japón). Los animales se sacrificaron después de la recogida de BALF y la proteína total se extrajo del tejido pulmonar completo homogeneizado. Después se midió el nivel de histamina en el extracto de proteínas (50 pg) usando ELISA (EA31, Oxford Biomedical Research, Michigan).

(6) Estudios histológicos e inmunohistológicos

Los animales se sacrificaron el día 24 (después de la recogida de BALF). Se recogieron cuidadosamente los lóbulos inferiores de sus pulmones, se fijaron y después se embebieron en parafina. Se prepararon secciones transversales (6 pm) de los tejidos pulmonares y se sometieron a tinción con hematoxilina-eosina (HE) y tinción con PAS.

Utilizando el kit VECTASTAIN Elite ABC, se realizó tinción inmunohistoquímica por el método de complejo inmunoperoxidasa/avidina-biotina. El inmunocomplejo se identificó con 3,3'-diaminobencidina al 0,05 % y se realizó tinción nuclear con hematoxilina. Las secciones de pulmón congeladas (5 pm) se tiñeron con un anticuerpo monoclonal de rata contra F4/80 (1:500, Bio-Rad) y se analizaron para determinar la acumulación de macrófagos. Se usó IgG en lugar del anticuerpo primario y sirvió como control negativo. Las células teñidas de manera positiva y todas las células se contaron y analizaron estadísticamente.

(7) RT-PCR en tiempo real

El ARN total se extrajo del pulmón el día 24 utilizando el mini kit RNeasy (Qiagen, Maryland). Se usó el sistema de síntesis de primera cadena SuperScript III (Thermo Fisher Scientific) para preparar el a Dn complementario. Usando una sonda TaqMan para Muc5ac (glucoproteína mucina 5AC) (Mm01276718-ml, Applied Biosystems, California) y una mezcla maestra de PCR en tiempo real (Toyobo Co., Ltd., Japón) y utilizando un sistema de PCR en tiempo real Prism 7900HT (Applied Biosystems, California), se realizó una RT-PCR cuantitativa en tiempo real. El nivel de expresión de GAPDH se utilizó como patrón interno para calcular la expresión de Muc5ac.

(8) Análisis estadístico

La normalidad se probó mediante la prueba de Shapiro-Wilk. Se usó una prueba t para la comparación entre dos grupos, y una prueba de intervalos múltiples de Tukey-Kramer para la comparación entre múltiples grupos. En el caso de la estimación no paramétrica, se utilizó una prueba no paramétrica de Kruskal-Wallis. P < 0,05 se consideró significativo.

Resultados

(1) Distribución de ODN señuelo etiquetado con FITC

Para confirmar la introducción de ODN señuelo mediante administración intratraqueal, se evaluó la distribución de ODN señuelo marcado con isotiocianato de fluoresceína (FITC) en un ratón sensibilizado con OVA. Se administró ODN marcado con FITC 3 días antes de la inhalación de OVA y el examen histológico mostró que la fluorescencia podía detectarse principalmente en los linfocitos en el espacio alveolar y en la región peribronquial después de la exposición a OVA. La tinción inmunofluorescente reveló que también se detectaba ODN marcado con FITC en macrófagos migratorios (figura 5).

(2) Inhibiciones de las actividades de unión de NF-kB y STAT6 mediante ODN señuelo quimérico

La EMSA evaluó el efecto inhibidor del ODN señuelo quimérico sobre la activación del factor de transcripción diana. Las activaciones tanto de NF-kB como de STAT6 se elevaron notablemente en el extracto nuclear de pulmones de un ratón sensibilizado con OVA tratado con solución salina fisiológica (control) u ODN señuelo cifrado. Por otra parte, las activaciones de NF-kB y STAT6 se inhibieron notablemente mediante la introducción de ODN señuelo quimérico, y la activación de NF-kB también se inhibió mediante la introducción de ODN señuelo NF-kB solo (figura 6).

(4) Inhibiciones de la inflamación, producción de moco y secreción de histamina mediante ODN señuelo quimérico

Para aclarar el efecto terapéutico del ODN señuelo quimérico, se investigó el mecanismo molecular de prevención del empeoramiento del asma. En primer lugar, se evaluó el efecto antiinflamatorio del ODN señuelo quimérico. El número total de células en BALF aumentó en todos los grupos de tratamiento después de la sensibilización con y exposición a OVA. Sin embargo, en ratones tratados con ODN señuelo NF-kB y ODN señuelo quimérico, se observó una disminución significativa en el recuento de eosinófilos. Adicionalmente, este efecto decreciente del ODN señuelo quimérico fue significativamente mayor que el del ODN señuelo NF-kB (figura 7).

El análisis histológico por tinción con hematoxilina-eosina mostró que la infiltración inflamatoria obviamente aumenta en las regiones peribronquiales y perivasculares en los grupos de control y con ODN señuelo cifrado, pero el ODN señuelo quimérico inhibe notablemente el reclutamiento de células inflamatorias (figura 8). Asimismo, el ODN señuelo quimérico inhibió la infiltración de macrófagos, mientras que un gran número de macrófagos se infiltraron en la región peribronquial en el grupo tratado con ODN señuelo cifrado o solución salina fisiológica (figura 9). Debido a que las citocinas TH2 son un factor importante en la patogenia del asma alérgica, se investigaron adicionalmente estas citocinas en BALF. El tratamiento con señuelo quimérico mostró inhibiciones notables de las potenciaciones en la producción de IL-4, IL-5 e IL-13 en BALF. Por otra parte, El ODN señuelo NF-kB solo inhibía la secreción de IL-4 (figura 10).

Después, debido a que el aumento de la secreción de moco también es un síntoma importante del asma, se investigó la producción de moco en ratones asmáticos inducidos con OVA. En ratones de control y grupo con ODN señuelo cifrado, la tinción con PAS mostró un marcado aumento en el número de células mucosas (figura 11). Sin embargo, el tratamiento con ODN señuelo quimérico inhibió notablemente el aumento en el número de células mucosas. La producción de moco está controlada por MUC5AC. La expresión del gen MUC5AC se inhibió notablemente por los tratamientos con ODN señuelo quimérico y ODN señuelo NF-kB en comparación con las transferencias de control y de ODN señuelo cifrado (figura 12).

Por último, en este modelo se investigaron las respuestas inmunitarias relacionadas con IgE. Los niveles de IgE en suero se elevaron en todos los grupos tratados después de la sensibilización y no hubo diferencias significativas incluso después de la exposición a OVA (figura 13). Por otra parte, la cantidad de histamina en el tejido pulmonar del

Claims (9)

REIVINDICACIONES

1. Un señuelo oligonucleotídico bicatenario que muestra afinidades de unión para dos factores de transcripción, que comprende un primer sitio de unión para un primer factor de transcripción y un segundo sitio de unión para un segundo factor de transcripción,

en el que una primera cadena, que comprende la cadena en sentido de dicho primer sitio de unión, y una segunda cadena, que comprende la cadena en sentido de dicho segundo sitio de unión, se hibridan para formar una doble cadena, en donde dicha cadena en sentido del primer sitio de unión y dicha cadena en sentido del segundo sitio de unión están al menos parcialmente hibridadas;

en donde el señuelo es una cadena doble en horquilla y tiene un tamaño de 13 meros a 15 meros.

2. El señuelo según la reivindicación 1, en el que al menos uno de los sitios de unión tiene una sustitución de una sola base en la secuencia consenso de cada factor de transcripción.

3. El señuelo según las reivindicaciones 1 o 2, que comprende cada sitio de unión para un total de dos factores de transcripción diferentes, en el que los dos factores de transcripción diferentes se seleccionan de las siguientes combinaciones (1) a (5):

(1) NF-kB y Ets1

(2) NF-kB y NF-AT

(3) NF-kB y STAT1

(4) NF-kB y STAT6

(5) NF-kB y NF-IL6.

4. El señuelo según la reivindicación 3, en el que dichos dos factores de transcripción diferentes son NF-kB y STAT6.

5. El señuelo según la reivindicación 3, cuya secuencia de bases está representada por los SEQ ID NO: 1, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 o 14.

6. El señuelo según la reivindicación 4, cuya secuencia de bases está representada por el SEQ ID NO: 1.

7. El señuelo según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, que tiene un tamaño de 15 meros.

8. El señuelo según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que al menos una parte de los enlaces entre cada nucleótido en el oligonucleótido bicatenario que constituye el señuelo incluye un enlace fosforotioato.

9. El señuelo según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que el extremo 5' del señuelo está unido, a través de un enlazador o directamente, a una nanopartícula de PLGA.