ES2808862T3 - Oligonucleótidos TGF-beta modificados - Google Patents

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Abstract

Oligonucleótido que consiste en CAAAGTATTTGGTCTCC (SEQ ID NO. 46), en el que los nucleótidos en negrita son oligonucleótidos modificados con LNA, complementarios a la secuencia de ácido nucleico de TGF-beta2 de la SEQ ID NO. 1 de la Figura 2.

Description

DESCRIPCIÓN
Oligonucleótidos TGF-beta modificados
La invención está dirigida a un oligonucleótido que consiste en CAAAGTATTTGGTCTCC (SEQ ID NO. 46), en el que los nucleótidos en negrita son oligonucleótidos modificados con LNA, complementarios a la secuencia de ácido nucleico de TGF-beta2 de la SEQ ID NO. 1 de la Figura 2, y una composición farmacéutica que comprende dicho oligonucleótido para uso en un método para prevenir y/o tratar un tumor maligno y/o benigno, fibrosis, cirrosis, escleroderma o enfermedades dermatológicas relacionadas, o una enfermedad del SNC.
Antecedente técnico
El factor de crecimiento transformante beta (TGF-beta) es una proteína que controla la proliferación, la diferenciación celular y otras funciones en la mayoría de las células. Es un tipo de citocina que desempeña, entre otros, una función en la inmunidad, cáncer, enfermedades cardíacas, diabetes, síndrome de Marfan, síndrome de Loeys-Dietz, enfermedad de Parkinson y SIDA.
El TGF-beta es una proteína secretada que existe en al menos tres isoformas (TGF-beta1, TGF-beta2 y TGF-beta3) codificadas por diferentes genes pero que comparten fuertes secuencias y homologías de estructura. El TGF-beta actúa como un factor antiproliferativo en las células epiteliales normales y en las primeras etapas de la oncogénesis. Sin embargo, más adelante en el desarrollo del tumor, el TGF-beta se puede convertir en un tumor promotor a través de mecanismos que incluyen la inducción de la transición epitelial a mesenquimal (EMT), un proceso que se considera contribuye a la progresión, invasión y metástasis del tumor (véase “Glycoproteomic analysis of two mouse mammary cell lines during transforming growth factor (TGF)-beta induced epithelial to mesenchymal transition” 7th space.com.2009-01-08. Recuperado: 2009-01-29)
En las células normales (epiteliales), el TGF-beta detiene el ciclo celular en la etapa G1 (y detiene la proliferación celular), induce la diferenciación o promueve la apoptosis. Cuando una célula se transforma en una célula de cáncer, el TGF-beta ya no suprime la proliferación celular, que a menudo es el resultado de mutaciones en la ruta de señalización, y proliferan las células cancerosas. La proliferación de fibroblastos estromales también es inducida por TGF-beta. Ambas células aumentan su producción de TGF-beta. Este TGF-beta actúa sobre las células estromales circundantes, células inmunitarias, células endoteliales, células del músculo liso y el microambiente tumoral (véase Pickupet al., “The roles of TGFp in the tumour microenvironment”, Nature Reviews Cancer (2013), 13: 788-799). De este modo, promueve la angiogénesis, y al suprimir la proliferación y la activación de las células inmunitarias produce inmunosupresión.
Los ratones deficientes en TGF-beta1 mueren por inflamación cardíaca, pulmonar y gástrica, lo que sugiere que el TGF-beta tiene una función vital en la supresión de la activación y proliferación de las células inflamatorias. El Smad3 es uno de los elementos clave en las rutas de señalización corriente abajo dependientes de TGF-beta. Los ratones con deficiencia de Smad3 desarrollan infecciones crónicas de la mucosa debido al deterioro de la activación de las células T y la inmunidad de la mucosa, lo que sugiere una función clave para el TGF-beta en estos procesos. Con respecto al cáncer, la producción y secreción de TGF-beta por ciertas células cancerosas suprime las actividades de infiltración de las células inmunitarias, ayudando de esta manera al tumor a escapar de la inmunovigilancia del anfitrión. Este efecto inmunosupresor puede ser otro mecanismo importante por el cual el TGF-beta estimula el crecimiento de tumores en etapa tardía (véase Blobe GC et al., May 2000, “Role of transforming growth factor beta in human disease”, N. Engl. J. Med. 342 (18), 1350-1358). El TGF-beta también convierte las células T efectoras, que normalmente atacan el cáncer con una reacción inflamatoria (inmunitaria), en células T reguladoras (supresoras), que desactivan la reacción inflamatoria.
Adicionalmente, el TGF-beta es uno de los reguladores más potentes de la producción y depósito de matriz extracelular. Estimula la producción y afecta las propiedades adhesivas de la matriz extracelular por dos mecanismos principales. Primero, el TGF-beta estimula los fibroblastos y otras células para producir proteínas de matriz extracelular y proteínas de adhesión celular, que incluyen colágeno, fibronectina e integrinas. En segundo lugar, el TGF-beta disminuye la producción de enzimas que degradan la matriz extracelular, que incluyen la colagenasa, la heparinasa y la estromelisina, y aumenta la producción de proteínas que inhiben las enzimas que degradan la matriz extracelular, que incluyen el inhibidor del activador del plasminógeno tipo 1 y el inhibidor de tejido de metaloproteasa. El efecto neto de estos cambios es aumentar la producción de proteínas de matriz extracelular y aumentar o disminuir las propiedades adhesivas de las células de una manera específica de la célula. En muchas células cancerosas, aumenta la producción de TGF-beta, lo que aumenta la invasividad de las células al aumentar su actividad proteolítica y promover su unión a las moléculas de adhesión celular (véase Blobe GC et al., May 2000, “Role of transforming growth factor beta in human disease”, N. Engl. J. Med. 342 (18), 1350-1358).
Por lo tanto, los agentes terapéuticos que pueden influir en la expresión y actividad de TGF-beta, respectivamente, son esenciales en particular para uso en la prevención y/o el tratamiento de enfermedades ligadas a TGF-beta. Los documentos EP 1008649 y EP 0695354, por ejemplo, divulgan oligonucleótidos que se hibridan con el ARNm de TGF-beta1 y/o TGF-beta2, y que son adecuados para utilizarse en la fabricación de composiciones farmacéuticas, por ejemplo, para prevenir y/o tratar el cáncer. Ninguno de estos oligonucleótidos comprende modificaciones tales como LNA, ENA, etc.
Los documentos WO 2003/85110, WO 2005/061710 y WO 2008/138904, por ejemplo, se refieren a oligonucleótidos que comprenden modificaciones de los nucleótidos, que están dirigidos a la inhibición de HIF-1A, Bcl-2 y HER3, respectivamente, utilizables en el tratamiento del cáncer.
Los criterios para la selección de oligonucleótidos son principalmente la longitud del oligonucleótido, el porcentaje de GC, la tendencia a la formación de horquillas, la dimerización y la temperatura de fusión (Tm). En general, se prefiere una Tm alta (temperatura de fusión). Adicionalmente, los oligonucleótidos deben ser específicos para el ARNm objetivo y no se deben hibridar con ARNm no objetivo para disminuir los posibles efectos fuera del objetivo.
Por lo tanto, subsiste una gran necesidad científica y médica de agentes terapéuticos, que reduzcan o inhiban la expresión y/o actividad de TGF-beta. Particularmente, existe una gran necesidad de oligonucleótidos tales como oligonucleótidos antisentido, que interactúen específicamente y, por lo tanto, reduzcan o inhiban la expresión de TGF-beta1, TGF-beta2 y/o TGF-beta3, así como oligonucleótidos, que inhiban específicamente TGF-beta1 y TGF-beta2, o TGF-beta1 y TGF-beta3, o TGF-beta2 y TGF-beta3, sin producir efectos secundarios (graves).
Resumen de la invención
La presente invención se refiere a un oligonucleótido que consiste en CAAAGTATTTGGTCTCC (SEQ ID NO. 46), en el que los nucleótidos en negrita son oligonucleótidos modificados con LNA, complementarios a la secuencia de ácido nucleico de TGF-beta2 de la SEQ ID NO. 1 de la Figura 2.
Adicionalmente, la invención se dirige a una composición farmacéutica que comprende el oligonucleótido de la presente invención y un portador farmacéuticamente aceptable.
El oligonucleótido y la composición farmacéutica, respectivamente, son para uso en un método para prevenir y/o tratar un tumor maligno y/o benigno, fibrosis, cirrosis, escleroderma o enfermedades dermatológicas relacionadas, o una enfermedad del SNC.
El tumor por ejemplo se selecciona del grupo que consiste en tumores sólidos, tumores originados en sangre, leucemias, metástasis tumoral, hemangiomas, neuroma acústicos, neurofibromas, tracomas, granulomas piógenos, psoriasis, astrocitoma, neuroma acústico, blastoma, tumor de Ewing, craneofaringioma, ependimoma, meduloblastoma, glioma, hemangloblastoma, linfoma de Hodgkins, meduloblastoma, leucemia, mesotelioma, neuroblastoma, neurofibroma, linfoma de no Hodgkins, pinealoma, retinoblastoma, sarcoma, seminoma, tracomas, tumor de Wilm, o se selecciona del grupo de carcinoma de la vía biliar, carcinoma de vejiga, tumor cerebral, cáncer de mama, carcinoma broncogénico, carcinoma del riñón, cáncer de cuello uterino, coriocarcinoma, coroidcarcinoma, cistadenocarcinoma, carcinoma embrionario, carcinoma epitelial, cáncer de esófago, carcinoma de cuello uterino, carcinoma de colon, carcinoma colorrectal, cáncer endometrial, cáncer de vesícula biliar, cáncer gástrico, cáncer de cabeza, carcinoma de hígado, carcinoma de pulmón, carcinoma medular, cáncer de cuello, carcinoma broncogénico/pulmonar de células no pequeñas, cáncer de ovario, carcinoma de páncreas, carcinoma papilar, adenocarcinoma papilar, adenocarcinoma papilar, carcinoma de intestino delgado, carcinoma de próstata, cáncer rectal, carcinoma de células renales, retinoblastoma, cáncer de piel, carcinoma broncogénico/pulmonar de células pequeñas, carcinoma de células epidermoides, carcinoma de glándulas sebáceas, carcinoma testicular, y cáncer uterino.
Figuras
La Figura 1 presenta ejemplos de modificaciones de nucleótido.
La Figura 2 muestra la secuencia de ácidos nucleicos de ARNm TGF-beta2 de humano (NM_003238.3).
La Figura 3a) a 3c) representan la inhibición de la expresión de ARNm de TGF-beta1 y TGF-beta2 en células de glioma A172 humanas. Las células A172 se transfectaron con diferentes oligonucleótidos modificados en una dosis de 10 nM (en la presencia de un agente de transfección), y se midió la inhibición de la expresión de ARNm de TGF-beta1 (columnas blancas) y TGF-beta2 (columnas negras) 24 h después de transfección. La Figura 3a) se refiere a los resultados para los oligonucleótidos modificados ASPH01, ASPH02, ASPH03, ASPH04, ASPH05, ASPH06, ASPH07, ASPH08, ASPH09, ASPH10, ASPH11, ASPH12, ASPH13, ASPH14, ASPH15, ASPH16, ASPH17, ASPH18, ASPH19, ASPH20, ASPH21, ASPH22, ASPH24, ASPH25, ASPH26, ASPH27, ASPH29, ASPH30, ASPH31, ASPH32, ASPH33, ASPH34, ASPH35, ASPH36, ASPH37, ASPH38, ASPH39, ASPH40, ASPH41, ASPH42, ASPH43, ASPH44, ASPH45, ASPH46, ASPH47, ASPH48, ASPH49, ASPH50, ASPH51, ASPH52, ASPH53, y ASPH54; la Figura 3b) a los resultados para los oligonucleótidos modificados ASPH36, ASPH60, ASPH61, ASPH62, ASPH63, ASPH64, a Sp H65, ASPH66, ASPH67, ASPH68, ASPH69, ASPH70, ASPH71, ASPH72, ASPH73, ASPH74, ASPH75, ASPH76, ASPH77, ASPH78, ASPH79, ASPH80, ASPH81, ASPH82, ASPH83, ASPH84, ASPH85, ASPH86, ASPH87, ASPH88, ASPH89, ASPH90, ASPH91, ASPH92, ASPH93, ASPH94, ASPH95, ASPH96, ASPH97, ASPH98, ASPH99, ASPH100, ASPH101, ASPH102, ASPH103, ASPH104, ASPH105, ASPH106, ASPH107, ASPH108, ASPH109, ASPH110, ASPH111, ASPH112, ASPH113, ASPH114, ASPH115, ASPH116, ASPH117, ASPH118, y ASPH119; y la Figura 3c) a los resultados para los oligonucleótidos modificados ASPH36, ASPH71, ASPH73, ASPH120, ASPH121, ASPH122, ASPH123, ASPH124, ASPH125, ASPH126, ASPH127, ASPH128, ASPH129, ASPH130, ASPH131, ASPH132, ASPH133, ASPH134, ASPH135, ASPH136, ASPH137, ASPH138, ASPH139, ASPH140, ASPH141, ASPH142, ASPH143, ASPH145, ASPH146, ASPH147, ASPH148, ASPH149, ASPH150, ASPH151, ASPH152, ASPH153, ASPH154, ASPH155, ASPH157, ASPH158, ASPH160, ASPH161, ASPH162, ASPH163, ASPH164, ASPH165, ASPH166, ASPH167, ASPH168, ASPH169, ASPH170, ASPH171, ASPH172, ASPH173, ASPH174, ASPH175, ASPH176, ASPH177, ASPH178, ASPH179, ASPH180, ASPH181, ASPH182, y ASPH183. Los experimentos se describen en el Ejemplo 1.
La Figura 4a) a 4c) representan la inhibición de la expresión de ARNm de TGF-beta1 y TGF-beta2 en células de cáncer pancreático Panc-1 humanas. Las células Panc-1 se transfectaron con diferentes oligonucleótidos modificados en una dosis de 10 nM (en la presencia de un agente de transfección), y se midió la inhibición de la expresión de ARNm de TGF-beta1 (columnas blancas) y TGF-beta2 (columnas negras) 24 h después de transfección. La Figura 4a) se refiere a los resultados para los oligonucleótidos modificados ASPH01, ASPH02, ASPH03, ASPH04, ASPH05, ASPH06, ASPH07, ASPH08, ASPH12, ASPH14, ASPH17, ASPH18, ASPH20, ASPH21, ASPH22, ASPH24, ASPH25, ASPH26, ASPH27, ASPH29, ASPH30, ASPH31, ASPH32, ASPH33, ASPH35, ASPH36, ASPH37, ASPH38, ASPH39, ASPH40, ASPH41, ASPH42, ASPH43, ASPH44, ASPH45, ASPH46, ASPH47, ASPH48, ASPH49, ASPH50, ASPH51, y ASPH52; la Figura 4b) a los resultados para los oligonucleótidos modificados ASPH36, ASPH60, ASPH61, ASPH62, ASPH63, ASPH64, ASPH65, ASPH66, ASPH67, ASPH68, ASPH69, ASPH70, ASPH71, ASPH72, ASPH73, ASPH74, ASPH75, ASPH76, ASPH77, ASPH78, ASPH79, ASPH80, ASPH81, ASPH82, ASPH83, ASPH84, ASPH85, ASPH86, ASPH87, ASPH88, ASPH89, ASPH90, ASPH91, ASPH92, ASPH93, ASPH94, ASPH96, ASPH97, ASPH98, ASPH99, ASPH100, ASPH101, ASPH102, ASPH103, ASPH104, ASPH105, ASPH106, ASPH107, ASPH108, ASPH109, ASPH110, ASPH111, ASPH112, ASPH113, ASPH114, ASPH115, ASPH116, ASPH117, ASPH118, y ASPH119; y la Figura 4c) a los resultados para los oligonucleótidos modificados ASPH36, ASPH71, ASPH73, ASPH120, ASPH121, ASPH122, ASPH127, ASPH128, ASPH129, ASPH130, ASPH131, ASPH132, ASPH133, ASPH135, ASPH136, ASPH137, ASPH139, ASPH141, ASPH142, ASPH143, ASPH145, ASPH146, ASPH147, ASPH149, ASPH150, ASPH151, ASPH152, ASPH153, ASPH154, ASPH155, ASPH157, ASPH160, ASPH161, ASPH162, ASPH163, ASPH164, ASPH165, ASPH166, ASPH167, ASPH168, ASPH169, ASPH170, ASPH171, ASPH172, ASPH173, ASPH174, ASPH175, ASPH176, ASPH177, ASPH178, ASPH179, ASPH180, ASPH181, ASPH182, y ASPH183. Los experimentos se describen en el Ejemplo 2.
La Figura 5 muestra la inhibición de la expresión de ARNm de TGF-beta1 y TGF-beta2 en células Panc-1. Las células Panc-1 se trataron con diferentes oligonucleótidos modificados en una dosis de 3.3 pM en la ausencia de cualquier reactivo de transfección (transfección gimnótica o transfección sin asistencia o suministro gimnótico), y se midió la inhibición de la expresión de ARNm de TGF-beta1 (columnas blancas) y TGF-beta2 (columnas negras) después de 72 h. La Figura 5 presenta los resultados para los oligonucleótidos modificados ASPH17, ASPH18, ASPH22, ASPH25, ASPH33, ASPH35, ASPH36, ASPH41, ASPH42, ASPH45, ASPH46, ASPH47, ASPH48, ASPH49, ASPH65, ASPH66, ASPH67, ASPH69, ASPH71, ASPH79, ASPH80, ASPH82, ASPH88, ASPH89, ASPH90, ASPH91, ASPH98, ASPH99, ASPH102, ASPH105, ASPH111, ASPH115, ASPH119, ASPH121, ASPH139, ASPH140, ASPH146, ASPH151, ASPH153, ASPH165, ASPH171, ASPH172, ASPH176, ASPH178, ASPH180, y ASPH183. Los experimentos se describen en el Ejemplo 4.
La Figura 6 y la Figura 7 presentan la inhibición de la expresión de ARNm de TGF-beta1 (Figura 6a) y TGF-beta2 (Figura 6b) así como también la inhibición de la proteína de TGF-beta1 (Figura 7a) y TGF-beta2 (Figura 7b) en células Panc-1. Las células Panc-1 se trataron con diferentes oligonucleótidos modificados en una dosis de 10 pM a través de suministro gimnótico, es decir, en la ausencia de cualquier reactivo de transfección, y la inhibición de la proteína y expresión de ARNm de TGF-beta1 y TGF-beta2 se midió 4 días después de transfección. La Figura 6a) y la Figura 6b) muestran los resultados para los oligonucleótidos modificados a Sp H01, ASPH03, ASPH05, ASPH09, ASPH17, ASPH18, ASPH22, ASPH35, ASPH36, ASPH37, ASPH41, ASPH45, ASPH46, ASPH47, y ASPH48 sobre el nivel de ARNm (Figura 7a) y proteína (Figura 7b). Los experimentos se describen en el Ejemplo 5.
La Figura 8 representa el efecto dependiente de dosis de los oligonucleótidos modificados ASPH05 y ASPH36 sobre la expresión de ARNm de TGF-beta1 y TGF-beta2. Las células Panc-1 se trataron durante 4 días con 15 pM, 10 pM, 7.5 pM, 5 pM, 2.5 pM, 1.25 pM, o 0.625 pM de cualquier oligonucleótido modificado ASPH05 (oligonucleótido TGF-beta1 y TGF-beta2 doble) o ASPH36 (oligonucleótido TGF-beta2 selectivo) en la ausencia de un reactivo de transfección. Se midió El ARNm de TGF-beta1 (Figura 8a) o TGF-beta2 (Figura 8b) restante después de 4 días. Los experimentos se describen en el Ejemplo 6.
La Figura 9 muestra la inhibición de la expresión de ARNm de TGF-beta1 y TGF-beta2 en células de glioma SMA-560 de ratón. Las células SMA-560 se transfectaron con ASPH01, ASPH03, ASPH05, ASPH09, ASPH17, ASPH18, ASPH22, ASPH26, ASPH36, ASPH37, ASPH41, ASPH42, ASPH45, ASPH46, ASPH47, o ASPH48 en una dosis de 10 nM (en la presencia de un agente de transfección). Se determinó la inhibición de la expresión de ARNm de TGF-beta1 (columnas blancas) y TGF-beta2 (columnas negras) 24 h después de transfección. Los experimentos se describen en el Ejemplo 7.
La Figura 10 presenta datos in vivo que se refieren al tratamiento de ratones sin pelaje atímicos hembra con ASPH01, ASPH03, ASPH05, ASPH17, ASPH22, ASPH37, ASPH41, ASPH45, ASPH46, ASPH47, o ASPH48 a 14 mg/kg de peso corporal mediante inyección subcutánea durante 5 días consecutivos. 24 h después del último tratamiento, se sacrificaron los ratones y se cuantificó el ARNm de TGF-beta 2 de ratón en lisados de tejido de riñón. Los datos - que representan relación de ARNm de TGF-beta2 con GAPDH - se muestran como un diagrama de caja en el que se presentan los valores medianos y los valores mínimos y máximos (datos expresados como n=4, excepto para el grupo ASPH46 n=3). Los experimentos se describen en el Ejemplo 8.
La Figura 11 muestra la inhibición de la expresión de ARNm de TGF-beta3 en células Panc-1. Las células Panc-1 se trataron con ASPH09 en una dosis de 10 pM en la ausencia de cualquier reactivo de transfección (transfección gimnótica o transfección sin asistencia), y se midió la inhibición de la expresión de ARNm de TGF-beta3 después de 4 días. El ASPH09 es un oligonucleótido específico de pan que inhibe la expresión de TGF-beta3 así como también TGF-beta1 y TGF-beta2 (Figura 6a y 6b). El experimento se describe en el Ejemplo 9.
La Figura 12 presenta la secuencia de ácidos nucleicos de ARNm de TGF-beta1 humano (NM_000660.4).
La Figura 13 representa la inhibición de la expresión de ARNm de TGF-beta1 en células de cáncer pancreático Panc-1 humanas. Las células Panc-1 se transfectaron con diferentes oligonucleótidos modificados en una dosis de 10 nM (en la presencia de un agente de transfección), y se midió la inhibición de la expresión de ARNm de TGF-beta1 24 h después de transfección. La Figura 13 se refiere a los resultados para los oligonucleótidos modificados ASPH05, ASPH09, ASPH1000, ASPH1001, ASPH1002, ASPH1003, ASPH1004, ASPH1005, ASPH1006, ASPH 1007, ASPH1008, ASPH1009, ASPH1010, ASPH1011, ASPH1012, ASPH1013, ASPH1014, ASPH1015, ASPH1016, ASPH1017, ASPH1018, ASPH1019, ASPH1020, ASPH1021, ASPH1022, ASPH1023, ASPH1024, ASPH1026, ASPH1027, ASPH1028, ASPH1029, ASPH1030, ASPH1031, ASPH1032, ASPH1033, ASPH1034, ASPH1035,ASPH1036, ASPH 1038, ASPH1039, ASPH1040, ASPH1041, ASPH1042, ASPH1043, ASPH1044, ASPH1045, ASPH1046, ASPH1047, ASPH1048, ASPH1049, ASPH1050, ASPH1051, ASPH1052, ASPH1054, ASPH1055, ASPH1056, ASPH1057, ASPH1058, ASPH1059, ASPH1060, y ASPH1061. Los experimentos se describen en el Ejemplo 12.
La Figura 14 muestra la inhibición de la expresión de ARNm de TGF-beta1 en células de glioma SMA-560 de ratón. Las células se transfectaron con diferentes oligonucleótidos modificados en una dosis de 10 nM (en la presencia de un agente de transfección), y se midió la inhibición de la expresión de ARNm de TGF-beta1 24 h después de transfección. La Figura 14 se refiere a los resultados para los oligonucleótidos modificados ASPH09, ASPH1000, ASPH1001 ASPH1002, ASPH1003, ASPH1004, ASPH1005, ASPH1006, ASPH1007, ASPH1008, ASPH1009, ASPH1010 ASPH1011, ASPH1012, ASPH1013, ASPH1014, ASPH1015, ASPH1016, ASPH1017, ASPH1018, ASPH1019 ASPH 1020, ASPH1021, ASPH1022, ASPH1023, ASPH1024, ASPH1026, ASPH1027, ASPH1028, ASPH1029 ASPH1030, ASPH1031, ASPH1032, ASPH1033, ASPH1034, ASPH1035, ASPH1036, ASPH1037, ASPH1038 ASPH1039, ASPH1040, ASPH1041, ASPH1042, ASPH1043, ASPH1044, ASPH1045, ASPH1046, ASPH1047. ASPH1048, ASPH1049, ASPH1050, ASPH1051, ASPH1052, ASPH1053, ASPH1054, ASPH1055, ASPH1056 ASPH1057, ASPH1058, ASPH1059, ASPH1060, ASPH1061, y ASPH1062. Los experimentos se describen en el Ejemplo 13.
La Figura 15 representa la inhibición de la expresión de ARNm de TGF-beta1 y TGF-beta2 en células A172 humanas. Las células se transfectaron con diferentes oligonucleótidos modificados en una dosis de 10 nM (en la presencia de un agente de transfección), y se midió la inhibición de la expresión de ARNm de TGF-beta1 y TGF-beta224 h después de transfección. La Figura 15 se refiere a los resultados para los oligonucleótidos modificados ASPH05, ASPH09, ASPH1000 ASPH1001, ASPH1002, ASPH1004, ASPH1005 ASPH1006, ASPH1007, ASPH1008, ASPH1009, ASPH1010 ASPH1011, ASPH1012, ASPH1013, ASPH1014 ASPH1015, ASPH1016, ASPH1017, ASPH1018, ASPH1019 ASPH1020, ASPH1021, ASPH1022, ASPH1023 ASPH1024, ASPH1026, ASPH1027, ASPH1028, ASPH1029 ASPH1030, ASPH1031, ASPH1032, ASPH1033 ASPH1034, ASPH1035, ASPH1036, ASPH1038, ASPH1039 ASPH1040, ASPH1041, ASPH1042, ASPH1043 ASPH1044, ASPH1045, ASPH1046, ASPH1047, ASPH1048 ASPH1049, ASPH1050, ASPH1051, ASPH1052 ASPH1053, ASPH1054, ASPH1056, ASPH1057, ASPH1058, ASPH1059, ASPH1060, ASPH1061, y ASPH1062. Los experimentos se describen en el Ejemplo 14.
La Figura 16 muestra la inhibición de la expresión de ARNm de TGF-beta1 y TGF-beta2 en células Panc-1. Las células Panc-1 se trataron con diferentes oligonucleótidos modificados en una dosis de 3.3 pM en la ausencia de cualquier reactivo de transfección (transfección gimnótica o transfección sin asistencia o suministro gimnótico), y se midió la inhibición de la expresión de ARNm de TGF-beta1 (columnas negras) y TGF-beta2 (columnas blancas) después de 72 h. La Figura 16 se refiere a los resultados para los oligonucleótidos modificados ASPH05, ASPH09, ASPH1000, ASPH1001, ASPH1002, ASPH1004, ASPH1006, ASPH1007, ASPH1008, ASPH1009, ASPH1010, ASPH1011, ASPH1012, ASPH1013, ASPH1014, ASPH1015, ASPH1017, ASPH1018, ASPH1019, ASPH1020, ASPH1021, ASPH1022, ASPH1024, ASPH1026, ASPH1027, ASPH1028, ASPH1029, ASPH1032, ASPH1033, ASPH1034, ASPH1035, ASPH1036, ASPH1037, ASPH1038, ASPH1039, ASPH1040, ASPH1041, ASPH1042, ASPH1043, ASPH1044, ASPH1045, ASPH1046, ASPH1047, ASPH1049, ASPH1050, ASPH1051, ASPH1052, ASPH1053, ASPH1054, ASPH1055, ASPH1056, ASPH1057, ASPH1058, ASPH1059, ASPH1060, ASPH1061, y ASPH1062. Los experimentos se describen en el Ejemplo 15.
La Figura 17 representa la inhibición de la expresión de ARNm de TGF-beta1, TGF-beta2 y TGF-beta3 en células A172 humanas. Las células se transfectaron con diferentes oligonucleótidos modificados en una dosis de 10 nM (en la presencia de un agente de transfección), y se midió la inhibición de la expresión de ARNm de TGF-beta1 (columna negra), TGF-beta2 (columna blanca) y TGF-beta3 (columna rayada) 24 h después de transfección. La Figura 17 se refiere a los resultados para los oligonucleótidos modificados ASPH09, ASPH1047, ASPH1051, ASPH1059, ASPH1063, ASPH1064, ASPH1065, ASPH1066, ASPH1067, ASPH1068, ASPH1069, ASPH1070, ASPH1071, ASPH1072, ASPH1073, ASPH1074, ASPH1075, ASPH1076, ASPH1077, ASPH1078, ASPH1079, ASPH1080, ASPH1081, ASPH1082, ASPH1083, ASPH1084, ASPH1085, ASPH1086, ASPH1087, ASPH1088, ASPH1089, ASPH1090, ASPH1091, ASPH1092, ASPH1093, ASPH1094, ASPH1095, ASPH1097, ASPH1098, ASPH1099,ASPH1100, ASPH1101, ASPH1102, ASPH1103, ASPH1104, ASPH1105, ASPH1106, ASPH1107, ASPH1108, ASPH1109, ASPH1110, ASPH1111, ASPH1112, ASPH1113, ASPH114, ASPH1115, ASPH1116, ASPH1117, ASPH1118, ASPH1119, ASPH1120, ASPH1121, ASPH1122, ASPH1123, ASPH1124, ASPH1125, ASPH1126, ASPH1127, ASPH1128, ASPH1129, ASPH1130, ASPH1131, y ASPH1132. Los experimentos se describen en el Ejemplo 16.
La Figura 18a muestra la inhibición de la expresión de ARNm de TGF-beta1, TGF-beta2 y TGF-beta3 en células Panc-1 y RenCa humanas. Las células se transfectaron con diferentes oligonucleótidos modificados en una dosis de 3.3 pM en la ausencia de cualquier reactivo de transfección (transfección gimnótica o transfección sin asistencia o suministro gimnótico), y se midió la inhibición de la expresión de ARNm de TGF-beta1 (columna negra), TGF-beta2 (columna blanca) y TGF-beta3 (columna rayada) 72 h después de transfección. La Figura 18a se refiere a los resultados para los oligonucleótidos modificados ASPH1063, ASPH1064, ASPH1065, ASPH1066, ASPH1067, ASPH1068, ASPH1069, ASPH1070, ASPH1071, ASPH1072, ASPH1073, ASPH1074, ASPH1075, ASPH1076, ASPH1077, ASPH1078, ASPH1079, ASPH1080, ASPH1081, ASPH1082, ASPH1083, ASPH1084, ASPH1085, ASPH1086, ASPH1087, ASPH1088, ASPH1089, ASPH1090, ASPH1091, ASPH1092, ASPH1093, ASPH1094, ASPH1095, ASPH1097, ASPH1098, ASPH1099,ASPH1100, ASPH1101, ASPH1102, ASPH1103, ASPH1104, ASPH1105, ASPH1106, ASPH1107, ASPH1108, ASPH1109, ASPH1110, ASPH1111, ASPH1112, ASPH1113, ASPH114, ASPH1115, ASPH1116, ASPH1117, ASPH1118, ASPH1119, ASPH1120, ASPH1121, ASPH1122, ASPH1123, ASPH1124, ASPH1125, ASPH1126, ASPH1127, ASPH1128, ASPH1129, ASPH1130, ASPH1131, y ASPH1132. La Figura 18b presenta el efecto de inhibición de estos oligonucleótidos en células RenCa.
La Figura 19 presenta una alineación de secuencia de ASPH1024 y ASPH1096 con la secuencia humana de los ARNm de TGF-beta1, TGF-beta2 y TGF-beta3. Ambos oligonucleótidos son 100 % homólogos a la secuencia humana de TGF-beta1. El ASPH1024 tiene tres emparejamientos erróneos con la secuencia humana de TGF-beta2 (Figura 19a) y dos emparejamientos erróneos con la secuencia humana de TGF-beta3 (Figura 19b). El ASPH1096 tiene un emparejamiento erróneo con la secuencia humana de TGF-beta2 (Figura 19a), y un emparejamiento erróneo con la secuencia humana de TGF-beta3 (Figura 19b). Ambos oligonucleótidos muestran la inhibición de diferentes isoformas de TGF-beta humanas (TGF-beta1, TGF-beta2, y TGF-beta3). Por ejemplo, el ASPH1024 inhibe la expresión y actividad de TGF-beta1 y TGF-beta2 (véase Figura 16) y el ASpH1096 inhibe la expresión y actividad de TGF-beta1, TGF-beta2 y TGF-beta3 como se representa por ejemplo en la Figura 17. El ASPH009, que es 100 % homólogo a la secuencia humana de TGF-beta1, TGF-beta2, y TGF-beta3 se utilizó como un control.
La Figura 20 muestra una alineación de ASPH1131 y ASPH1132 con las secuencias humanas de los ARNm de TGF-beta1, TGF-beta2 y TGF-beta3. Ambos oligonucleótidos son 100 % homólogos a las secuencias humanas de TGF-beta1 y TGF-beta3. Cada uno de ASPH1131 y ASPH1132 tiene un emparejamiento erróneo con la secuencia humana de TGF-beta2. Ambos oligonucleótidos inhiben fuertemente la expresión de las tres isoformas humanas como se representa por ejemplo en la Figura 17.
La Figura 21 representa una alineación de ASPH1131 y ASPH1132 con las secuencias de murino de los ARNm de TGF-beta1, TGF-beta2 y TGF-beta3. Ambos oligonucleótidos son 100 % homólogos a las secuencias de murino de TGF-beta1 y TGF-beta3. Cada uno de ASPH1131 y ASPH1132 tiene dos emparejamientos erróneos con la secuencia de murino de TGF-beta2. Mientras que el ASPH1131 inhibe potencialmente el TGF-beta2 y TGF-beta3 de murino, el ASPH1132 suprime muy poderosamente todas las isoformas de TGF-beta de murino como se representa por ejemplo en la Figura 18b.
La Figura 22 muestra la expresión de ARNm de TGF-beta2 en el riñón de ratones portadores de carcinoma pancreático humano subcutáneo Panc-1. Los ratones se trataron con 1,3, 10, y 30 mg/kg de ASPH47 después de los esquemas de tratamiento indicados para 5 días: Q1Dx1-d6 (inyección SC única, terminación 5 días después), Q1Dx5-d6 (inyección SC diaria durante 5 días, terminación 24 horas después), y Q1Dx5-d10 (inyección SC diaria durante 5 días, terminación 5 días después). La expresión de TGF-beta 2 se detectó mediante ensayo de ADNr y se normalizó a GAPDH. Los datos - que representan relación de ARNm de TGF-beta2 con GAPDH - se muestran como un diagrama de caja en el que se presentan los valores medianos y los valores mínimos y máximos (datos expresados como n=10, excepto n=9 para vehículo y 3 mg/kg para grupos Q1Dx1 d6).
La Figura 23 representa la expresión de ARNm de TGF-beta2 en los riñones de ratones portadores de tumores de carcinoma pancreático humano Panc-1. Los ratones se trataron con inyecciones subcutáneas de varios oligonucleótidos durante 5 días consecutivos utilizando dosis de tratamiento indicadas: inyección diaria de 1, 5, 15 o 50 mg/kg de oligonucleótidos durante cinco días consecutivos. La expresión de ARNm de TGF-beta2 se detectó mediante ensayo de ADNr y se normalizó a GAPDH. Los datos - que representan relación de ARNm de TGF-beta2 con GAPDH - se muestran como un diagrama de caja en el que se presentan los valores medianos y los valores mínimos y máximos (datos expresados como n=5).
La Figura 24 presenta la expresión de ARNm de TGF-beta2 en tumores de carcinomas de células renales humanos subcutáneos 786-O. Los ratones se trataron con una inyección diaria de 50 mg/kg de oligonucleótidos durante cinco días consecutivos. La expresión de ARNm de TGF-beta2 y GAPDH se detectó mediante ADNr. Los datos - que representan relación de ARNm de TGF-beta2 con GAPDH - se muestran como un diagrama de caja en el que se presentan los valores medianos y los valores mínimos y máximos (datos expresados como n=10, excepto para el grupo ASPH71 n=9).
La Figura 25 muestra la secuencia de ácidos nucleicos de ARNm de TGF-beta3 humano (NM_003239.2).
La Figura 26 representa el efecto de inhibición de los oligonucleótidos de la presente invención sobre la expresión de proteína de TGF-beta1 y TGF-beta2. Las células Panc-1 se transfectaron con 20, 6.67, 2.22, 0.74, 0.25, 0.08 o 0.009 |jM de los oligonucleótidos modificados ASPH47 (Figura 26a), ASPH1047 (Figura 26b), ASPH1106 (Figura 26c), ASPH1132 (Figura 26d), o ASPH47 en combinación con ASPH1047 (Figura 26e). El control negativo es el oligonucleótido codificado (scrLNA) de la SEQ ID No. 145 (Figura 26f) en concentraciones de 40, 13.33, 4.44, 1.48, 0.49, 0.16, 0.05, o 0.02 jM . Los niveles de proteína de TGF-beta1 (diamantes) y TGF-beta2 (cuadrados) en sobrenadantes celulares se determinaron mediante ELISA.
La Figura 27 presenta el efecto de inhibición de los oligonucleótidos de la presente invención sobre la expresión de TGF-beta1, TGF-beta2, y TGF-beta3. Las células Panc-1 (Figura 27a) o células RenCa (Figura 27b) se transfectaron con 3.3 jM de diferentes oligonucleótidos específicos de TGF-beta en la ausencia de un agente de transfección. La expresión de ARNm de TGF-beta1 (columna negra), TGF-beta2 (columna blanca) y TGF-beta3 (columna rayada) se determinó 72 h después de transfección.
La Figura 28 representa el efecto de inhibición de los oligonucleótidos de la presente invención sobre la expresión de TGF-beta1, TGF-beta2, y TGF-beta3. Las células de glioma A172 se transfectaron con 10 nM de diferentes oligonucleótidos específicos de TGF-beta en la presencia de agente de transfección. La expresión de TGF-beta1 (columna negra), TGF-beta2 (columna blanca) y TGF-beta3 (columna rayada) ARNm se determinó 24 h después de transfección.
Las Figuras 29a y 29b presentan un análisis comparado de la concentración en plasma (29a) y renal (29b) dependiente del tiempo (perfiles PK; con valores expresados en jg/m l o jg/gr) y regulación a la baja del ARNm de TGF-p2 (perfil PD) en riñón tras la administración de un bolo subcutáneo único de 50 mg/kg de ASPH_0047 a ratones Balb/c.
La Figura 30 representa la regulación a la baja de ARNm de TGF-p2 en tumores subcutáneos establecidos (Figura 30A-D) o riñón (Figura 30E-F) en ratones inmunodeficientes después de administración repetida subcutánea de ASPH_0047 u oligonucleótido de control. La expresión de ARNm de TGF-beta2 y GAPDH se detectó por ADNr. Los resultados se expresan como la relación de ARNm de TGF-beta2/GAPDH, y cada muestra analizada individual se representa con una línea que indica los valores medianos.
La Figura 31 muestra el efecto del tratamiento sistémico de ratones Balb/c con ASPH_0047 (oligonucleótido antisentido TGF-b2 selectivo) sobre la metástasis pulmonar en el modelo de carcinoma renal Renca ortotópico y en ratón i.v. El nivel de metástasis pulmonar se determinó por el número de metástasis o en base al peso pulmonar. Los resultados se muestran como un diagrama de caja en el que se presentan los valores medianos, los cuartiles superior e inferior y los percentiles 90 y 10.
La Figura 32 presenta células de cáncer pancreático Panc-1 humanas que se trataron con 3.3 jM de los oligonucleótidos indicados en la ausencia de agente de transfección (transfección gimnótica o suministro gimnótico). La expresión de TGF-beta1 (columna negra), TGF-beta2 (columna blanca) y TGF-beta3 (columna rayada) ARNm se determinó 72 h después de transfección.
La Figura 33 representa el efecto del tratamiento sistémico de ratones Balb/c con ASPH_0047 sobre la metástasis de pulmón en el modelo de carcinoma mamario ortotópico de ratón 4T1. Los datos para cada animal individual se representan con valores medianos indicados como una línea negra en negrita.
Descripción detallada
La presente invención se dirige a un oligonucleótido, en particular oligonucleótidos antisentido, que consiste en CAAAGTATTTGGTCTCC (SEQ ID NO. 46), en los que los nucleótidos en negrita son oligonucleótidos modificados con LNA, complementarios a la secuencia de ácido nucleico de TGF-beta2 de la SEQ ID NO. 1 de la Figura 2. Los oligonucleótidos descritos adicionales comprenden o consisten en 10 a 20, más preferidos 12 a 18 nucleótidos del ácido nucleico de TGF-beta2 de acuerdo con la SEQ ID NO. 1 o del ácido nucleico de TGF-beta1 de acuerdo con la SEQ ID NO. 335, o de la secuencia de ácidos nucleicos del ácido nucleico de TGF-beta3 de acuerdo con la SEQ ID NO. 336. Se prefiere más el oligonucleótido que comprende o consiste en 12, 13, 14, 15, 16, 17, o 18 nucleótidos. Los oligonucleótidos se seleccionan preferiblemente de la región del ácido nucleico no. 1380 a 1510 (preferiblemente no.
1380 a 1450 y/o no. 1480 a 1510), 1660 a 1680, o 2390 a 2410 de la SEQ ID NO. 1. El oligonucleótido de la presente invención y descrito es un ARN o ADN de cadena sencilla o doble, que incluye ARNip, ARNmicro, apatmero o spiegelmer. Preferiblemente, el oligonucleótido es un oligonucleótido antisentido.
Un nucleótido forma el bloque de construcción de un oligonucleótido, y está compuesto, por ejemplo, de una nucleobase (base nitrogenada, por ejemplo, purina o pirimidina), un azúcar de cinco carbonos (por ejemplo, ribosa, 2-desoxirribosa, arabinosa, xilosa, lixosa, alosa, altorsa, glucosa, manosa, gulosa, idosa, galactosa, talosa o modificaciones estabilizadas de esos azúcares), y uno o más grupos fosfato. Ejemplos de grupos fosfato modificados son fosforotioato o metilfosfonato. Cada compuesto del nucleótido es modificable y se produce de forma natural o no natural. Estos últimos son, por ejemplo, ácido nucleico bloqueado (LNA), un ácido nucleico con puente de 2'-O,4'-C-etileno (ENA), óxido de polialquileno (tal como el trietilenglicol (TEG)), nucleótidos modificados con 2'-fluoro, 2'-O-metoxi y 2'-O-metilo como se describe, por ejemplo, por Freier & Altmann (Nucl. Acid Res., 1997, 25, 4429-4443) y Uhlmann (Curr. Opinion in Drug & Development (2000), 3 (2): 293-213), que se muestran en la Figura 1.
Un LNA es un nucleótido de ARN modificado, en el que la fracción de ribosa se modifica con un puente extra que conecta el oxígeno 2' y el carbono 4' (2'-4'ribonucleósido). El puente “bloquea” la ribosa en la conformación 3'-endo (Norte), que a menudo se encuentra en los dúplex en forma de A. Los nucleósidos y nucleótidos de LNA, respectivamente, comprenden, por ejemplo, las formas de tio-LNA, oxi-LNA o amino-LNA, en configuración alfa-D o beta-L, y son mezclables y combinables, respectivamente, con ADN o ARN residuos en el oligonucleótido.
Los oligonucleótidos descritos que incluyen el oligonucleótido de la presente invención, es decir, oligonucleótidos modificados, comprenden al menos un nucleótido modificado, preferiblemente LNA y/o ENA, en el extremo 5' y/o 3' del oligonucleótido. En una realización preferida, el oligonucleótido comprende 1, 2, 3 o 4 LNA o ENA en el extremo 5', y 1, 2, 3 o 4 LNA o ENA en el extremo 3'. En otra realización preferida, el oligonucleótido comprende 1, 2, 3 o 4 LNA o ENA en el extremo 5' o 3', y un óxido de polialquileno tal como TEG en el extremo 3' o 5'. Los oligonucleótidos modificados descritos y el oligonucleótido de la presente invención muestran una inhibición significativamente aumentada sobre la expresión y actividad de TGF-beta, respectivamente, lo que da como resultado una prevención y/o tratamiento mejorado de un tumor maligno o benigno, fibrosis (por ejemplo, fibrosis pulmonar idiopática, fibrosis renal, fibrosis de riñón), cirrosis (por ejemplo, cirrosis hepática), esclerodermia o enfermedades dermatológicas relacionadas, una enfermedad ocular tal como el glaucoma u opacificación capsular posterior (PCO), una enfermedad del SNC, pérdida de cabello, etc. Los oligonucleótidos descritos y el oligonucleótido de la presente invención se dirigen a enfermedades ligadas a TGF-beta ya sea por hibridación con ARNm de TGF-beta, preferiblemente TGF-beta1, TGF-beta2 o TGF-beta3, alternativamente, los ARNm de TGF-beta1, TGF-beta2 y/o TGF-beta3, es decir, TGF-beta1 y TGF-beta2, o TGF-beta1 y TGF-beta3, o TGF-beta2 y TGF-beta3, o los ARNm de TGF-beta1, TGF-beta2 y TGF-beta3, o cualquier otro efecto directo o indirecto sobre el sistema TGF-beta.
Preferiblemente se combinan dos o más oligonucleótidos, en los que el oligonucleótido de la presente invención inhibe específicamente TGF-beta1 y al menos un oligonucleótido inhibe específicamente TGF-beta2, o en los que el oligonucleótido de la presente invención inhibe específicamente TGF-beta1 y al menos un oligonucleótido inhibe específicamente TGF-beta3, o en los que al menos un oligonucleótido inhibe específicamente TGF-beta2 y al menos un oligonucleótido inhibe específicamente TGF-beta3, o en los que el oligonucleótido de la presente invención inhibe específicamente TGF-beta1, al menos un oligonucleótido inhibe específicamente TGF-beta2, y al menos un oligonucleótido inhibe específicamente TGF-beta3.
En otra realización, un oligonucleótido descrito o el oligonucleótido de la presente invención inhibe dos isoformas TGF-beta tales como TGF-beta1 y TGF-beta2, TGF-beta2 y TGF-beta3, o TGF-beta1 y TGF-beta3. Un oligonucleótido que inhibe la expresión de las tres isoformas - TGF-beta1, TGF-beta2, y TGF-beta3 - se define como oligonucleótido específico de pan.
En una realización adicional tres o más oligonucleótidos se combinan, en los que el oligonucleótido de la presente invención inhibe específicamente TGF-beta1, otro oligonucleótido inhibe específicamente TGF-beta2, y un oligonucleótido adicional inhibe específicamente TGF-beta3, y opcionalmente uno o más oligonucleótidos adicionales que inhiben TGF-beta1, TGF-beta2 o TGF-beta3.
El oligonucleótido de la presente invención tiene por ejemplo un IC50 en el rango de 0.1 a 20 pM, preferiblemente en el rango de 0.2 a 15 pM, más preferiblemente en el rango de 0.4 a 10 pM, e incluso se prefiere más en el rango de 0.5 a 5 pM.
La presente invención se refiere adicionalmente a una composición farmacéutica que comprende un oligonucleótido de acuerdo con la invención como ingrediente activo. La composición farmacéutica comprende al menos un oligonucleótido de la presente invención y opcionalmente adicionalmente un compuesto antisentido, un anticuerpo, un compuesto quimioterapéutico, un compuesto antiinflamatorio, un compuesto antiviral y/o un compuesto inmunomodulador. Los agentes aglutinantes y adyuvantes o portador farmacéuticamente aceptables comprenden opcionalmente parte de la composición farmacéutica.
En una realización, el oligonucleótido y la composición farmacéutica, respectivamente, se formulan como unidad de dosificación en forma de cápsulas, comprimidos y píldoras, etc., respectivamente, que contienen, por ejemplo, los siguientes compuestos: celulosa microcristalina, goma o gelatina como aglutinantes; almidón o lactosa como excipientes; estearatos como lubricantes, diversos agentes edulcorantes o aromatizantes. Para las cápsulas, la unidad de dosificación puede contener un portador líquido como los aceites grasos. Del mismo modo, los recubrimientos de azúcar o agentes entéricos pueden ser parte de la unidad de dosificación.
El oligonucleótido y/o la composición farmacéutica son administrables a través de diferentes rutas. Estas rutas de administración incluyen, pero no se limitan a, administración electroporación, epidérmica, impresión en la piel, intraarterial, intraarticular, intracraneal, intradérmica, intralesional, intramuscular, intranasal, intraocular, intratecal, intracameral, intraperitoneal, intraprostática, intrapulmonar, intraespinal, intratraqueal, intratumoral, intravenosa, intravesical, colocación dentro de las cavidades del cuerpo, inhalación nasal, inhalación oral, pulmonar (por ejemplo, por inhalación o insuflación de polvos o aerosoles, que incluye por nebulizador), subcutánea, subdérmica, tópica (que incluyen las membranas oftálmicas y mucosas, que incluyen el suministro vaginal y rectal) o transdérmica.
Para la administración parenteral, subcutánea, intradérmica o tópica, el oligonucleótido y/o la composición farmacéutica incluyen, por ejemplo, un diluyente estéril, tampones, reguladores de toxicidad y antibacterianos. En una realización preferida, el oligonucleótido o la composición farmacéutica se prepara con portadores que protegen contra la degradación o la eliminación inmediata del cuerpo, que incluyen implantes o microcápsulas con propiedades de liberación controlada. Para la administración intravenosa, los portadores preferidos son, por ejemplo, solución salina fisiológica o solución salina tamponada con fosfato. Un oligonucleótido y/o una composición farmacéutica que comprende dicho oligonucleótido para administración oral incluye, por ejemplo, polvo o gránulos, micropartículas, nanopartículas, suspensión o solución en agua o medios no acuosos, cápsulas, cápsulas de gel, bolsitas, comprimidos o minicomprimidos. Un oligonucleótido y/o una composición farmacéutica que comprende para administración parenteral, intratecal, intracameral o intraventricular incluye, por ejemplo, soluciones acuosas estériles que opcionalmente contienen tampón, diluyente y/u otro aditivo adecuado, tal como potenciador de la penetración, compuesto portador y/u otro portador o excipiente farmacéuticamente aceptable.
Un portador farmacéuticamente aceptable es, por ejemplo, líquido o sólido, y se selecciona teniendo en cuenta la forma de administración planificada para proporcionar el volumen, la consistencia, etc. deseados, cuando se combina con un ácido nucleico y los otros componentes de una composición farmacéutica dada. Los portadores farmacéuticamente aceptables típicos incluyen, pero no se limitan a, un agente aglutinante (por ejemplo, almidón de maíz pregelatinizado, polivinilpirrolidona o hidroxipropilmetilcelulosa, etc.); relleno (por ejemplo, lactosa y otros azúcares, celulosa microcristalina, pectina, gelatina, sulfato de calcio, etilcelulosa, poliacrilatos o fosfato de hidrógeno de calcio, etc.); lubricante (por ejemplo, estearato de magnesio, talco, sílice, dióxido de silicio coloidal, ácido esteárico, estearatos metálicos, aceites vegetales hidrogenados, almidón de maíz, polietilenglicoles, benzoato de sodio, acetato de sodio, etc.); desintegrante (por ejemplo, almidón, almidón glicolato de sodio, etc.); o agente humectante (por ejemplo, laurilsulfato de sodio, etc.). Los sistemas de suministro oral de liberación sostenida y/o recubrimientos entéricos para las formas de dosificación administradas por vía oral se describen en la patente de Estados Unidos No.
4,704,295; 4,556,552; 4,309,406; y 4,309,404. Se incluye un adyuvante bajo estas frases.
Además de utilizarse en un método de prevención y/o tratamiento de enfermedades humanas, el oligonucleótido y/o la composición farmacéutica de acuerdo con la presente invención también se utiliza en un método para prevención y/o tratamiento de otros sujetos que incluyen animales veterinarios, reptiles, pájaros, animales exóticos y animales de granja, que incluyen mamíferos, roedores y similares. Los mamíferos incluyen, por ejemplo, caballos, perros, cerdos, gatos o primates (por ejemplo, un mono, un chimpancé o un lémur). Los roedores incluyen, por ejemplo, ratas, conejos, ratones, ardillas o conejillos de india.
El oligonucleótido o la composición farmacéutica descrita o de acuerdo con la invención se utiliza en un método para prevención y/o tratamiento de muchas enfermedades diferentes, preferiblemente tumores benignos o malignos, enfermedades inmunológicas, asma bronquial, enfermedad cardíaca, fibrosis (por ejemplo, fibrosis hepática, fibrosis pulmonar idiopática, cirrosis hepática, cirrosis renal, esclerodermia), diabetes, cicatrización de heridas, trastornos del tejido conjuntivo (por ejemplo, corazón, vasos sanguíneos, huesos, articulaciones, ojos, tales como el síndrome de Marfan o Loeys-Dietz), psoriasis, enfermedades oculares (por ejemplo, glaucoma, opacificación capsular posterior (PCO) también conocida como catarata secundaria), enfermedad del SNC (por ejemplo, enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson), aterosclerosis coronaria (intervención coronaria o cirugía de revascularización coronaria (CABG) o pérdida de cabello. Un tumor se selecciona por ejemplo del grupo de tumores sólidos, tumores nacidos en sangre, leucemias, metástasis tumoral, hemangiomas, neuroma acústicos, neurofibromas, tracomas, granulomas piógenos, astrocitoma tal como astrocitoma anaplásico, neuroma acústico, blastoma, tumor de Ewing, craneofaringloma, ependimoma, meduloblastoma, glioma, glioblastoma, hemangloblastoma, linfoma de Hodgkins, meduloblastoma, leucemia, melanoma tal como melanoma primario y/o metastásico, mesotelioma, mieloma, neuroblastoma, neurofibroma, linterna de no Hodgkins, pinealoma, retinoblastoma, sarcoma, seminoma, tracomas, tumor de Wilm, carcinoma de la vía biliar, carcinoma de vejiga, tumor cerebral, cáncer de mama, carcinoma broncogénico, carcinoma del riñón, cáncer de cuello uterino, coriocarcinoma, coroidcarcinoma, cistadenocarcinoma, carcinoma embrionario, carcinoma epitelial, cáncer de esófago, carcinoma de cuello uterino, carcinoma de colon, carcinoma colorrectal, cáncer endometrial, cáncer de vesícula biliar, cáncer gástrico, cáncer de cabeza, carcinoma de hígado, carcinoma de pulmón, carcinoma medular, cáncer de cuello, carcinoma broncogénico/pulmonar de células no pequeñas, cáncer de ovario, carcinoma de páncreas, carcinoma papilar, adenocarcinoma papilar, adenocarcinoma papilar, carcinoma de intestino delgado, carcinoma de próstata, cáncer rectal, carcinoma de células renales (RCC, por ejemplo, RCC de células claras, RCC papilar, RCC cromófobo), cáncer de riñón de oncocitoma, cáncer de riñón de células de transición, retinoblastoma, cáncer de piel, carcinoma broncogénico/pulmonar de células pequeñas, carcinoma de células epidermoides, carcinoma de glándulas sebáceas, carcinoma testicular, y cáncer uterino. El oligonucleótido o la composición farmacéutica de la presente invención no solo se utilizan en un método para la prevención y/o tratamiento de un tumor, sino también en una metástasis.
Los oligonucleótidos antisentido descritos, que incluyen el oligonucleótido de la presente invención, se caracterizan porque muestran una baja toxicidad inesperada (véase, por ejemplo, Tabla 5) y, por lo tanto, son bien tolerados por diferentes organismos. Los oligonucleótidos muestran una distribución razonable en el organismo, en el que las concentraciones más altas se miden en el riñón, hígado, piel y bazo.
Numerosos oligonucleótidos descritos, que incluyen el oligonucleótido de la presente invención, son altamente eficientes en la reducción e inhibición, respectivamente, de TGF-beta, en particular la expresión de TGF-beta1, TGF-beta2 y/o TGF-beta3 debido a la selección específica de la secuencia de oligonucleótidos y la modificación del nucleótido. La siguiente Tabla 1 muestra numerosos oligonucleótidos modificados preferidos (las letras en negrita indican el nucleósido modificado). Cada oligonucleótido se define como ASPH y un número, que se define por una secuencia específica y modificación de los nucleósidos:
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La Tabla 1 muestra las secuencias de ácidos nucleicos de oligonucleótidos seleccionados que incluyen el oligonucleótido de la presente invención así como también las modificaciones de los nucleótidos, en los que l Na 4+4 significa que se modifican 4 x LNA en el extremo 5' y 3' del oligonucleótido, en los que LNA 4+3 significa que se modifican 4 x LNA en el extremo 5' y 3 x LNA en el extremo 3' del oligonucleótido, en los que LNA 3+4 significa que se modifican 3 x LNA en el extremo 5' y 4 x LNA en el extremo 3' del oligonucleótido, en los que LNA 3+3 significa que se modifican 3 x LNA en el extremo 5' y 3' del oligonucleótido, en los que LNA 3+2 significa que se modifican 3 x LNA en el extremo 5' y 2 x LNA en el extremo 3' del oligonucleótido, en los que LNA 2+3 significa que se modifican 2 x LNA en el extremo 5' y 3 x LNA en el extremo 3' del oligonucleótido, en los que LNA 2+2 significa que se modifican 2 x LNA en el extremo 5' y 3' del oligonucleótido. Alternativamente, algunos oligonucleótidos comprenden ENA 4+4, es decir, se modifican 4 x ENA en el extremo 5' y 3' del oligonucleótido, o ENA 3+3, es decir, se modifican 3 x ENA en el extremo 5' y 3' del oligonucleótido. Los oligonucleótidos adicionales comprenden 2' O-met 4+4, en los que el oligonucleótido comprende 4 x nucleótidos modificados con 2' O-metilo en el extremo 5' y 3' del oligonucleótido, o comprende 2' fluoro 4+4, en el que el oligonucleótido comprende 4 x nucleótidos modificados con 2' fluoro en el extremo 5' y 3'. Los oligonucleótidos que comprenden LNA 3+TEG comprenden 3 x LNA en el extremo 5' y un trietilenglicol (TEG) en el extremo 3' del oligonucleótido. Algunos oligonucleótidos comprenden LNA que no están dispuestos en una fila pero están separados por un nucleósido desbloqueado que tiene, por ejemplo, las secuencias 3LNA+9N+1LNA+1N+2LNA, 1LNA+1N+2LNA+8N+1LNA+1N+1LNA, 2LNA+8N+2LNA+1N+1LNA, 2LNA+9N+1LNA+1N+1LNA, 2LNA+8N+1LNA+2N+1LNA, 3LNA+8N+1LNA+1N+1LNA, 3LNA+8N+1LNA+1N+1LNA, 2LNA+9N+1LNA+1N+1LNA, o 2LNA+8N+2LNA+1N+1LNA, en las que “N” es un nucleósido sin modificación bloqueada. “ASPH” en combinación con un número se refiere a los diferentes oligonucleótidos y sus diferentes modificaciones como se describe en la Tabla 1. Estos oligonucleótidos modificados se probaron, por ejemplo, en experimentos mostrados en los siguientes ejemplos. Los oligonucleótidos antisentido de la presente invención se pueden describir de manera diferente, por ejemplo, ASPH47, ASPH0047, ASPH_47 o ASPH_0047 que se refieren al mismo oligonucleótido.
Ejemplos
En los siguientes ejemplos se hace referencia al oligonucleótido de la presente invención (ejemplos 1, 2, 3, 4, 5, 7, 8 y 30) y los oligonucleótidos descritos adicionales. El efecto de los oligonucleótidos enumerados en la Tabla 1 se ha probado en vista de la reducción e inhibición, respectivamente, de la expresión de TGF-beta1 y/o TGF-beta2. La SEQ ID NO. 144 (T-LNA: CGGCATGTCTATTTTGTA, en la que 3 x nucleótidos en el extremo 5' y 3' son LNA) y la SEQ ID NO. 145 (scr-LNA: CGTTTAGGCTATGTACTT, en la que 3 x nucleótidos en el extremo 5' y 3' son LnA) se utilizan como oligonucleótidos de control, en los que la SEQ ID NO. 145 (control negativo) es la forma codificada de la SEQ ID NO. 144 (control positivo). Las células se transfectaron en la presencia de un agente de transfección (por ejemplo, Lipofectamina), o en la ausencia de cualquier agente de transfección (que se define como transfección gimnótica o transfección sin asistencia o suministro gimnótico). En caso de suministro gimnótico la entrada del oligonucleótido en la célula solamente depende de la interacción del oligonucleótido con la célula (ningún compuesto/agente apoya la entrada). Por lo tanto, se considera que la transfección gimnótica o el suministro gimnótico reflejan mejores condiciones de las configuraciones in vivo.
Ejemplo 1
Las células de glioma A172 humanas se transfectaron con 10 nM de ASPH01, ASPH02, ASPH03, ASPH04, ASPH05, ASPH06, ASPH07, ASPH08, ASPH09, ASPH10, ASPH11, ASPH12, ASPH13, ASPH14, ASPH15, ASPH16, ASPH17, ASPH18, ASPH19, ASPH20, ASPH21, ASPH22, ASPH24, ASPH25, ASPH26, ASPH27, ASPH29, ASPH30, ASPH31, ASPH32, ASPH33, ASPH34, ASPH35, ASPH36, ASPH37, ASPH38, ASPH39, ASPH40, ASPH41, ASPH42, ASPH43, ASPH44, ASPH45, ASPH46, ASPH47, ASPH48, ASPH49, ASPH50, ASPH51, ASPH52, ASPH53, y ASPH54 (véase Figura 3a); ASPH36, ASPH60, ASPH61, ASPH62, ASPH63, ASPH64, ASPH65, ASPH66, ASPH67, ASPH68, ASPH69, ASPH70, ASPH71, ASPH72, ASPH73, ASPH74, ASPH75, ASPH76, ASPH77, ASPH78, ASPH79, ASPH80, ASPH81, ASPH82, ASPH83, ASPH84, ASPH85, ASPH86, ASPH87, ASPH88, ASPH89, ASPH90, ASPH91, ASPH92, ASPH93, ASPH94, ASPH95, ASPH96, ASPH97, ASPH98, ASPH99, ASPH100, ASPH101, ASPH102, ASPH103, ASPH104, ASPH105, ASPH106, ASPH107, ASPH108, ASPH109, ASPH110, ASPH111, ASPH112, ASPH113, ASPH114, ASPH115, ASPH116, ASPH117, ASPH118, y ASPH119 (véase Figura 3b), o ASPH36, ASPH71, ASPH73, ASPH120, ASPH121, ASPH122, ASPH123, ASPH124, ASPH125, ASPH126, ASPH127, ASPH128, ASPH129, ASPH130, ASPH131, ASPH132, ASPH133, ASPH134, ASPH135, ASPH136, ASPH137, ASPH138, ASPH139, ASPH140, ASPH141, ASPH142, ASPH143, ASPH145, ASPH146, ASPH147, ASPH148, ASPH149, ASPH150, ASPH151, ASPH152, ASPH153, ASPH154, ASPH155, ASPH157, ASPH158, ASPH160, ASPH161, ASPH162, ASPH163, ASPH164, ASPH165, ASPH166, ASPH167, ASPH168, ASPH169, ASPH170, ASPH171, ASPH172, ASPH173, ASPH174, ASPH175, ASPH176, ASPH177, ASPH178, ASPH179, ASPH180, ASPH181, ASPH182, y ASPH183 (véase Figura 3c), y los controles de la SEQ ID NO. 144 y 145, respectivamente, en la presencia de un agente de transfección. La expresión de ARNm de TGF-beta1 y TGF-beta2 se determinó 24 h después de transfección. La reducción significativa de la expresión de ARNm de TGF-beta1 y TGF-beta2 se demuestra en la Figura 3a) a 3c).
Los oligonucleótidos reactivos TGF-beta1 y TGF-beta2 dobles ASPH01, ASPH02, ASPH03, ASPH04, ASPH05, ASPH06, ASPH07, ASPH08 y ASPH09 muestran una reducción significativa de la expresión de ARNm de TGF-beta1 y TGF-beta2, mientras que los oligonucleótidos TGF-beta2 selectivos inhiben significativamente la expresión de ARNm de TGF-beta2.
Ejemplo 2
Las células de cáncer pancreático Panc-1 humanas se transfectaron con 10 nM de ASPH01, ASPH02, ASPH03, ASPH04, ASPH05, ASPH06, ASPH07, ASPH08, ASPH12, ASPH14, ASPH17, ASPH18, ASPH20, ASPH21, ASPH22, ASPH24, ASPH25, ASPH26, ASPH27, ASPH29, ASPH30, ASPH31, ASPH32, ASPH33, ASPH35, ASPH36, ASPH37, ASPH38, ASPH39, ASPH40, ASPH41, ASPH42, ASPH43, ASPH44, ASPH45, ASPH46, ASPH47, ASPH48, ASPH49, ASPH50, ASPH51, y ASPH52 (véase Figura 4a); ASPH36, ASPH60, ASPH61, ASPH62, ASPH63, ASPH64, ASPH65, ASPH66, ASPH67, ASPH68, ASPH69, ASPH70, ASPH71, ASPH72, ASPH73, ASPH74, ASPH75, ASPH76, ASPH77, ASPH78, ASPH79, ASPH80, ASPH81, ASPH82, ASPH83, ASPH84, ASPH85, ASPH86, ASPH87, ASPH88, ASPH89, ASPH90, ASPH91, ASPH92, ASPH93, ASPH94, ASPH96, ASPH97, ASPH98, ASPH99, ASPH100, ASPH101, ASPH102, ASPH103, ASPH104, ASPH105, ASPH106, ASPH107, ASPH108, ASPH109, ASPH110, ASPH111, ASPH112, ASPH113, ASPH114, ASPH115, ASPH116, ASPH117, ASPH118, y ASPH119 (véase Figura 4b), o ASPH36, ASPH71, ASPH73, ASPH120, ASPH121, ASPH122, ASPH127, ASPH128, ASPH129, ASPH130, ASPH131, ASPH132, ASPH133, ASPH135, ASPH136, ASPH137, ASPH139, ASPH141, ASPH142, ASPH143, ASPH145, ASPH146, ASPH147, ASPH149, ASPH150, ASPH151, ASPH152, ASPH153, ASPH154, ASPH155, ASPH157, ASPH160, ASPH161, ASPH162, ASPH163, ASPH164, ASPH165, ASPH166, ASPH167, ASPH168, ASPH169, ASPH170, ASPH171, ASPH172, ASPH173, ASPH174, ASPH175, ASPH176, ASPH177, ASPH178, ASPH179, ASPH180, ASPH181, ASPH182, y ASPH183 (véase Figura 4c) y los controles de la SEQ ID NO. 144 y 145, respectivamente, en la presencia de un agente de transfección. La expresión de ARNm de TGF-beta1 y TGF-beta2 se determinó 24 h después de transfección. La reducción significativa de la expresión de ARNm de TGF-beta1 y TGF-beta2 se demuestra en la Figura 4a) a 4c). Los oligonucleótidos reactivos TGF-beta1 y TGF-beta2 dobles ASPH01, ASPH02, ASPH03, ASPH04, ASPH05, ASPH06, ASPH07, y ASPH08, respectivamente, muestran de nuevo una reducción significativa de la expresión de ARNm de TGF-beta1 y TGF-beta2, mientras que los oligonucleótidos TGF-beta2 selectivos inhiben significativamente la expresión de ARNm de TGF-beta2.
Ejemplo 3
En experimentos adicionales el efecto inhibidor de cada uno de ASPH01, ASPH03, ASPH05, ASPH17, ASPH18, ASPH22, ASPH26, ASPH27, ASPH33, ASPH36, ASPH37, ASPH41, ASPH42, ASPH45, ASPH46, ASPH47, ASPH48, ASPH49, ASPH64, ASPH65, ASPH66, ASPH69, ASPH71, ASPH80, ASPH82, ASPH88, ASPH89, ASPH90, ASPH98, ASPH99, ASPH102, ASPH105, ASPH115, ASPH121, ASPH140, ASPH153, ASPH165, ASPH171, ASPH178, ASPH181, ASPH184, ASPH185, ASPH186, ASPH187, ASPH188, ASPH189, y de los controles de la SEQ ID NO.144 y SEQ ID NO. 145 se probaron en células de glioma A172 humanas. Las células A172 se transfectaron con estos oligonucleótidos modificados en dosis de 20 nM, 4 nM, 0.8 nM, 0.16 nM, y 0.04 nM, respectivamente, en la presencia de un agente de transfección. El ARNm de TGF-beta2 restante se midió 24 h después de transfección. Los valores de TGF-beta2 se normalizaron a GAPDH y se calcularon las concentraciones de oligonucleótido que resultan en 50 % de reducción de ARNm de TGF-beta2 (=valores IC50). Todos los valores IC50 se referenciaron al valor IC50 de ASPH_036 (ASPH36) que fue 0.33 nM y los resultados se muestran como la diferencia de veces del valor IC50 de ASPH_036 Tabla 2:
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Todos los oligonucleótidos modificados muestran un IC50 en un rango nanomolar a picomolar bajo, que es notablemente más bajo que el IC50 del oligonucleótido de control positivo de la SEQ ID NO. 144; el IC50 del control negativo de la SEQ ID n O. 145 no fue calculable.
Ejemplo 4
Las células de cáncer pancreático Panc-1 humanas se trataron con 3.3 pM de ASPH17, ASPH18, ASPH22, ASPH25, ASPH33, ASPH35, ASPH36, ASPH41, ASPH42, ASPH45, ASPH46, ASPH47, ASPH48, ASPH49, ASPH65, ASPH66, ASPH67, ASPH69, ASPH71, ASPH79, ASPH80, ASPH82, ASPH88, ASPH89, ASPH90, ASPH91, ASPH98, ASPH99, ASPH102, ASPH105, ASPH111, ASPH115, ASPH119, ASPH121, ASPH139, ASPH140, ASPH146, ASPH151, ASPH153, ASPH165, ASPH171, ASPH172, ASPH176, ASPH178, ASPH180, y ASPH183, respectivamente, o los controles de la SEQ ID NO. 144 y 145 en la ausencia de un agente de transfección (transfección gimnótica o suministro gimnótico). El efecto inhibidor de los oligonucleótidos modificados sobre la expresión de ARNm de TGF-beta1 y TGF-beta2, respectivamente, se determinó 72 h después del inicio del tratamiento. Bajo condiciones experimentales de suministro gimnótico, los oligonucleótidos entran en las células e inhiben fuertemente la expresión de ARNm de TGF-beta2. Los resultados de los experimentos se muestran en la Figura 5.
Ejemplo 5
En experimentos adicionales las células de cáncer pancreático Panc-1 humanas se transfectaron con 10 pM de los oligonucleótidos modificados ASPH01, ASPH03, ASPH05, ASPH09, ASPH17, ASPH18, ASPH22, ASPH35, ASPH36, ASPH37, ASPH41, ASPH45, ASPH46, ASPH47, y ASPH48, respectivamente, o los controles de la SEQ ID NO. 144 y 145 en la ausencia de un agente de transfección (transfección gimnótica o suministro gimnótico). Los oligonucleótidos se agregaron a las células durante 2 días, después que se cambió el medio, y se llevó a cabo en incubación adicional durante 2 días en medio de contenía oligonucleótido. La expresión de ARNm de TGF-beta1 (Figura 6a) y ARNm de TGF-beta2 (Figura 6b) luego se midió y se normalizó a HPRT1 (Hipoxantina-Fosforibosil-Transferasa1). Los sobrenadantes celulares se analizaron para TGF-beta1 (Figura 7a) y TGF-beta2 (Figura 7b) proteína mediante ELISA. Bajo condiciones experimentales de suministro gimnótico, oligonucleótido reactivo TGF-beta1 y TGF-beta2 doble ASPH01, ASPH03, ASPH05, y ASPH09 específico a pan inhiben significativamente la expresión de ARNm de TGF-beta1 y TGF-beta2, y proteína. Todos los otros oligonucleótidos inhiben significativamente la expresión de ARNm de TGF-beta2 y proteína.
Ejemplo 6
En otro experimento se probó la dependencia de dosis del efecto inhibidor de los oligonucleótidos modificados de la presente invención. Las células de cáncer pancreático Panc-1 humanas se trataron con ASPH05 o ASPH36 15 j M, 10 j M, 7.5 j M, 5 j M, 2.5 j M, 1.25 j M, o 0.625 j M, o los controles de la SEQ ID NO. 144 y 145, respectivamente, sin utilizar un reactivo de transfección. Los oligonucleótidos se agregaron a las células durante 2 días. Posteriormente se cambiaron los medios y se incubaron las células durante 2 días adicionales en medio de contenía oligonucleótido, después de lo cual (tiempo de tratamiento total: 4 días) se midió la expresión de ARNm de TGF-beta1 (Figura 8a) y TGF-beta2 (Figura 8b). El oligonucleótido reactivo TGF-beta1 y TGF-beta2 doble ASPH05 muestra una inhibición dependiente de dosis marcada de tanto la expresión de ARNm de TGF-beta1 como TGF-beta2, y ASPH36 inhibe específicamente la expresión de ARNm de TGF-beta2 de una manera dependiente de dosis.
Ejemplo 7
Las células de glioma SMA-560 de ratón se transfectaron con 10 nM ASPH01, ASPH03, ASPH05, ASPH09, ASPH17, ASPH18, ASPH22, ASPH26, ASPH36, ASPH37, ASPH41, ASPH42, ASPH45, ASPH46, ASPH47, o ASPH48, o los controles de la SEQ ID NO. 144 y 145, respectivamente, en la presencia de un agente de transfección. 24 h después de transfección, se determinó la inhibición de la expresión de ARNm de TGF-beta1 (columnas blancas) y TGF-beta2 (columnas negras). El ASPH09 específico a pan inhibe la expresión del ARNm de TGF-beta1 de ratón, y los otros oligonucleótidos probados inhiben fuertemente la expresión del ARNm de TGF-beta2 de ratón. Los resultados se presentan en la Figura 9.
Ejemplo 8
Se trataron ratones sin pelaje atímicos hembra (Hsd:Atímico Sin pelaje-Foxn1nu) durante 5 días consecutivos con 14 mg/kg o 50 mg/kg de oligonucleótido ASPH01, ASPH03, ASPH05, ASPH17, ASPH22, ASPH37, ASPH41, ASPH45, ASPH46, ASPH47, o ASPH48, y control de la SEQ ID NO. 145, respectivamente, o solución salina mediante inyección subcutánea. El día después del último tratamiento, se sacrificaron los ratones. El ARNm de TGF-beta2 de ratón se cuantificó en lisados de tejido de riñón. En la Figura 10, los datos - que representan relación de ARNm de TGF-beta2 con GAPDH - se muestran como un diagrama de caja en el que se presentan los valores medianos y los valores mínimos y máximos (datos expresados como n=4, excepto para el grupo ASPH46 n=3). Todos los oligonucleótidos probados inhibieron la expresión de ARNm de TGF-beta2 en el riñón de estos ratones.
Ejemplo 9
En otro experimento células de cáncer pancreático Panc-1 humanas se transfectaron con 10 j M de oligonucleótido modificado ASPH09 o el control de la SEQ ID NO. 145 en la ausencia de cualquier agente de transfección (transfección gimnótica o suministro gimnótico). Los oligonucleótidos se agregaron a las células durante 2 días, después se cambió el medio, y se llevó a cabo en incubación adicional durante 2 días en medio de contenía oligonucleótido. La expresión de ARNm de TGF-beta3 (véase Figura 11) luego se midió y se normalizó a HPRT1 (Hipoxantina-Fosforibosil-Transferasa1). Bajo condiciones experimentales de suministro gimnótico, el oligonucleótido específico de pan ASPH09 inhibe significativamente la expresión de ARNm de TGF-beta3.
Ejemplo 10
Las células de cáncer pancreático Panc-1 humanas se trataron con 10 j M, 3.3 j M, 1.1 j M, 0.37 j M, y 0.12 j M de ASPH03, ASPH36, ASPH45, ASPH47, ASPH65, ASPH69, AASPH71, ASPH80, ASPH115, ASPH 121, ASPH153, ASPH185, y ASPH189, respectivamente, en la ausencia de un agente de transfección (transfección gimnótica o suministro gimnótico). El efecto inhibidor de los oligonucleótidos modificados sobre la expresión de ARNm de TGF-beta2, se determinó 72 h después del inicio del tratamiento. Los valores de TGF-beta2 se normalizaron a GAPDH y se calcularon las concentraciones de oligonucleótido que resultan en 50 % de reducción de ARNm de TGF-beta2 (=valores IC50). Bajo condiciones experimentales de suministro gimnótico, los oligonucleótidos entran en las células e inhiben fuertemente la expresión de ARNm deTGF-beta2. Los resultados de los experimentos se muestran en la Tabla 3:
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Todos los oligonucleótidos modificados muestran un IC50 en el rango micromolar bajo o incluso submicromolar, lo que muestra que tienen una potencia muy alta incluso sin el requisito de un reactivo de transfección.
Ejemplo 11
Las células de cáncer pancreático Panc-1 humanas se trataron con 10 jiM, 3.3 jiM, 1.1 jiM, 0.37 jiM, y 0.12 jiM de ASPH47, ASPH190, a Sp H191, ASPH192, y ASPH193, respectivamente, en la ausencia de un agente de transfección (transfección gimnótica o suministro gimnótico). El efecto inhibidor de los oligonucleótidos modificados sobre la expresión de ARNm de TGF-beta2, se determinó 72 h después del inicio del tratamiento. Los valores de TGF-beta2 se normalizaron a GAPDH y se calcularon las concentraciones de oligonucleótido que resultan en 50 % de reducción de ARNm de TGF-beta2 (=valores IC50). Bajo condiciones experimentales de suministro gimnótico, los oligonucleótidos entran en las células e inhiben fuertemente la expresión de ARNm de TGF-beta2. Los resultados de los experimentos se muestran en la Tabla 4:
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Todos los oligonucleótidos modificados muestran un IC50 en el rango submicromolar a submicromolar inferior, que muestran tener una potencia extremadamente alta incluso sin el requisito de un reactivo de transfección.
Ejemplo 12
Las células de cáncer pancreático Panc-1 humanas se transfectaron con 10 nM de ASPH05, ASPH09, ASPH1000, ASPH1001, ASPH1002, ASPH1003, ASPH1004, ASPH1005, ASPH1006, ASPH 1007, ASPH1008, ASPH1009, ASPH1010, ASPH1011, ASPH1012, ASPH1013, ASPH1014, ASPH1015, ASPH1016, ASPH1017, ASPH1018, ASPH1019, ASPH1020, ASPH1021, ASPH1022, ASPH1023, ASPH1024, ASPH1026, ASPH1027, ASPH1028, ASPH1029, ASPH1030, ASPH1031, ASPH1032, ASPH1033, ASPH1034, ASPH1035,ASPH1036, ASPH 1038, ASPH1039, ASPH1040, ASPH1041, ASPH1042, ASPH1043, ASPH1044, ASPH1045, ASPH1046, ASPH1047, ASPH1048, ASPH1049, ASPH1050, ASPH1051, ASPH1052, ASPH1054, ASPH1055,ASPH1056, ASPH1057, ASPH1058, ASPH1059, ASPH1060, o ASPH1061 y el control de la SEQ ID NO. 145, respectivamente, en la presencia de un agente de transfección. La expresión de ARNm de TGF-beta1 se determinó 24 h después de transfección. La reducción significativa de la expresión de TGF-beta1 en células Panc-1 se muestra en la Figura 13.
Ejemplo 13
Las células de glioma SMA-560 de ratón se transfectaron con 10 nM de ASPH09, ASPH1000, ASPH1001, ASPH1002, ASPH1003, ASPH1004, ASPH1005, ASPH1006, ASPH1007, ASPH1008, ASPH1009, ASPH1010, ASPH1011, ASPH1012, ASPH1013, ASPH1014, ASPH1015, ASPH1016, ASPH1017, ASPH1018, ASPH1019, ASPH 1020, ASPH1021, ASPH1022, ASPH1023, ASPH1024, ASPH1026, ASPH1027, ASPH1028, ASPH1029, ASPH1030, ASPH1031, ASPH1032, ASPH1033, ASPH1034, ASPH1035, ASPH1036, ASPH1037, ASPH1038, ASPH1039, ASPH1040, ASPH1041, ASPH1042, ASPH1043, ASPH1044, ASPH 1045, ASPH1046, ASPH1047, ASPH1048, ASPH1049, ASPH1050, ASPH1051, ASPH1052, ASPH1053, ASPH1054, ASPH1055, ASPH1056, ASPH1057, ASPH1058, ASPH1059, ASPH1060, ASPH1061, o ASPH1062 y el control de la SEQ ID NO. 145, respectivamente, en la presencia de un agente de transfección. La expresión de ARNm de TGF-beta1 se determinó 24 h después de transfección. La reducción significativa de la expresión de TGF-beta1 en células SMA-560 se muestra en la Figura 14.
Ejemplo 14
En estos experimentos, las células de glioma A172 humanas se transfectaron con 10 nM de ASPH05, ASPH09, ASPH1000, ASPH1001, ASPH1002, ASPH1004, ASPH1005, ASPH1006, ASPH1007, ASPH1008, ASPH1009, ASPH1010, ASPH1011, ASPH1012, ASPH1013, ASPH1014, ASPH1015, ASPH1016, ASPH1017, ASPH1018, ASPH1019, ASPH1020, ASPH1021, ASPH1022, ASPH1023, ASPH1024, ASPH1026, ASPH1027, ASPH1028, ASPH1029, ASPH1030, ASPH1031, ASPH1032, ASPH1033, ASPH1034, ASPH1035, ASPH1036, ASPH1038, ASPH1039, ASPH1040, ASPH1041, ASPH1042, ASPH1043, ASPH1044, ASPH1045, ASPH1046, ASPH1047, ASPH1048, ASPH1049, ASPH1050, ASPH1051, ASPH1052, ASPH1053, ASPH1054, ASPH1056, ASPH1057, ASPH1058, ASPH1059, ASPH1060, ASPH1061, o ASPH1062, y el control de la SEQ ID NO. 145, respectivamente, en la presencia de un agente de transfección. La expresión de ARNm de TGF-beta1 y TGF-beta2 se determinó 24 h después de transfección. La reducción significativa de la expresión de ARNm de TGF-beta1 se muestra en la Figura 15. Los oligonucleótidos reactivos TGF-beta1 y TGF-beta2 dobles ASPH05 muestran una reducción significativa de la expresión de tanto los ARNm de TGF-beta1 como de TGF-beta2, mientras que los oligonucleótidos TGF-beta1 selectivos inhiben significativamente la expresión de ARNm de TGF-beta1.
Ejemplo 15
Las células de cáncer pancreático Panc-1 humanas se trataron con 3.3 pM de ASPH05, ASPH09, ASPH1000, ASPH1001, ASPH1002, ASPH1004, ASPH1006, ASPH1007, ASPH1008, ASPH1009, ASPH1010, ASPH1011, ASPH1012, ASPH1013, ASPH1014, ASPH1015, ASPH1017, ASPH1018, ASPH1019, ASPH1020, ASPH1021, ASPH1022, ASPH1024, ASPH1026, ASPH1027, ASPH1028, ASPH1029, ASPH1032, ASPH1033, ASPH1034, ASPH1035, ASPH1036, ASPH1037, ASPH1038, ASPH1039, ASPH1040, ASPH1041, ASPH1042, ASPH1043, ASPH1044, ASPH1045, ASPH1046, ASPH1047, ASPH1049, ASPH1050, ASPH1051, ASPH1052, ASPH1053, ASPH1054, ASPH1055, ASPH1056, ASPH1057, ASPH1058, ASPH1059, ASPH1060, ASPH1061, o ASPH1062, o el control de la SEQ ID NO. 145 en la ausencia de un agente de transfección (transfección gimnótica o suministro gimnótico). El efecto inhibidor de los oligonucleótidos modificados sobre la expresión de ARNm de TGF-beta1 y TGF-beta2, respectivamente, se determinó 72 h después del inicio del tratamiento. La reducción significativa de la expresión de ARNm de TGF-beta1 se muestra en la Figura 16. Los oligonucleótidos reactivos TGF-beta1 y TGF-beta2 dobles ASPH05 muestran una reducción significativa de la expresión de tanto los ARNm TGF-beta1 y como de TGF-beta2, mientras que los oligonucleótidos TGF-beta1 selectivos inhiben significativamente la expresión de ARNm de TGF-beta1.
Ejemplo 16
Las células de glioma A172 humanas se trataron con 10 nM (en la presencia de un agente de transfección), de ASPH09, ASPH1047, ASPH1051, ASPH1059, ASPH1063, ASPH1064, ASPH1065, ASPH1066, ASPH1067, ASPH1068, ASPH1069, ASPH1070, ASPH1071, ASPH1072, ASPH1073, ASPH1074, ASPH1075, ASPH1076, ASPH1077, ASPH1078, ASPH1079, ASPH1080, ASPH1081, ASPH1082, ASPH1083, ASPH1084, ASPH1085, ASPH1086, ASPH1087, ASPH1088, ASPH1089, ASPH1090, ASPH1091, ASPH1092, ASPH1093, ASPH1094, ASPH1095, ASPH1097, ASPH1098, ASPH1099,ASPH1100, ASPH1101, ASPH1102, ASPH1103, ASPH1104, ASPH1105, ASPH1106, ASPH1107, ASPH1108, ASPH1109, ASPH1110, ASPH1111, ASPH1112, ASPH1113, ASPH114, ASPH1115, ASPH1116, ASPH1117, ASPH1118, ASPH1119, ASPH1120, ASPH1121, ASPH1122, ASPH1123, ASPH1124, ASPH1125, ASPH1126, ASPH1127, ASPH1128, ASPH1129, ASPH1130, ASPH1131, y ASPH1132, respectivamente, o el control positivo ASPH1047. La expresión de ARNm de TGF-beta1 (columna negra), TGF-beta2 (columna blanca) y TGF-beta3 (columna rayada) se determinó 24 h después de transfección. La reducción significativa de la expresión de ARNm de TGF-beta1 se muestra en la Figura 17. Los oligonucleótidos reactivos TGF-beta1, TGF-beta2 y TGF-beta3 específicos de pan ASPH0009, ASPH1096, ASPH1131, y ASPH1132 muestran una reducción significativa de la expresión de las tres isoformas, mientas que los oligonucleótidos TGF-beta1 selectivos inhiben significativamente la expresión de ARNm de TGF-beta1.
Ejemplo 17
Se trataron células de cáncer pancreático Panc-1 humanas (Figura 18a) o células de carcinoma de células renales RenCa de ratón (Figura 18a) con 3.3 pM de ASPH09, ASPH1047, ASPH1051, ASPH1059, ASPH1063, ASPH1064, ASPH1065, ASPH1066, ASPH1067, ASPH1068, ASPH1069, ASPH1070, ASPH1071, ASPH1072, ASPH1073, ASPH1074, ASPH1075, ASPH1076, ASPH1077, ASPH1078, ASPH1079, ASPH1080, ASPH1081, ASPH1082, ASPH1083, ASPH1084, ASPH1085, ASPH1086, ASPH1087, ASPH1088, ASPH1089, ASPH1090, ASPH1091, ASPH1092, ASPH1093, ASPH1094, ASPH1095, ASPH1097, ASPH1098, ASPH1099,ASPH1100, ASPH1101, ASPH1102, ASPH1103, ASPH1104, ASPH1105, ASPH1106, ASPH1107, ASPH1108, ASPH1109, ASPH1110, ASPH1111, ASPH1112, ASPH1113, ASPH114, ASPH1115, ASPH1116, ASPH1117, ASPH1118, ASPH1119, ASPH1120, ASPH1121, ASPH1122, ASPH1123, ASPH1124, ASPH1125, ASPH1126, ASPH1127, ASPH1128, ASPH1129, ASPH1130, ASPH1131, y ASPH1132, respectivamente, o el control positivo ASPH1047 en la ausencia de un agente de transfección (transfección gimnótica o suministro gimnótico). La expresión de ARNm de TGF-beta1 (columna negra), TGF-beta2 (columna blanca) y TGF-beta3 (columna rayada) se determinó 72 h después de transfección. La reducción significativa de la expresión de ARNm de TGF-beta1 se muestra en la Figura 17. Los oligonucleótidos reactivos TGF-beta1, TGF-beta2 y TGF-beta3 específicos de pan ASPH0009, ASPH1096, ASPH1131, y ASPH1132 muestran la reducción significativa de la expresión de las tres isoformas, mientas que los oligonucleótidos TGF-beta1 selectivos inhiben significativamente la expresión de ARNm de TGF-beta1.
Ejemplo 18
Ratones portadores de tumores subcutáneos de carcinoma pancreático Panc-1 humano se trataron con 1, 3, 10, y 30 mg/kg de ASPH47 bajo varios esquemas de tratamiento: Q1Dx1-d6 (inyección SC única, terminación 5 días después), Q1Dx5- d6 (inyección SC diaria durante 5 días, terminación 24 horas después), y Q1Dx5-d10 (inyección SC diaria durante 5 días, terminación 5 días después). Hubo una regulación a la baja dependiente de la dosis de ARNm de TGF-beta2 en el riñón de estos animales. La regulación a la baja de TGF-beta2 fue persistente hasta 5 días después del último tratamiento con ASPH47, incluso después de una sola administración. La expresión de TGF-beta 2 se detectó mediante un ensayo de ADNr (ensayo de ADN ramificado, que es un método de hibridación de ácido nucleico intercalado que utiliza moléculas de ADNr para amplificar la señal del ARN objetivo capturado) y se normalizó a GAPDH. Como se muestra en la Figura 22, los datos - que representan relación de ARNm de TGF-beta2 con GAPDH - se muestran como un diagrama de caja en el que se presentan los valores medianos y los valores mínimos y máximos (datos expresados como n=10, excepto n=9 para vehículo y 3 mg/kg de grupos Q1Dx1 d6).
Ejemplo 19
Ratones portadores de tumores subcutáneos de carcinoma pancreático Panc-1 humano en ambos flancos izquierdo y derecho se trataron con una inyección subcutánea diaria de 1,5, 15 o 50 mg/kg de oligonucleótidos durante cinco días consecutivos. Los tumores se recolectaron 24 horas después del último tratamiento y se congelaron instantáneamente. La expresión de ARNm de TGF-beta en tumores se detectó mediante ensayo de ADNr. Los datos - que representan relación de ARNm de TGF-beta2 con GAPDH - se muestran como un diagrama de caja en el que se presentan los valores medianos y los valores mínimos y máximos (datos expresados como n=5). El ARNm de TGF-beta2 se reguló a la baja en tumores tratados con varios oligonucleótidos (Figura 23). No hubo regulación a la baja de ARNm de TGF-beta1 significativa en estos grupos (datos no mostrados).
Ejemplo 20
Ratones portadores de tumores subcutáneos de carcinoma de células renales 786-O humanas en ambos flancos izquierdo y derecho se trataron con una inyección diaria de 50 mg/kg de oligonucleótidos durante cinco días consecutivos. Los tumores se recolectaron 24 horas después del último tratamiento y se congelaron instantáneamente. La expresión de ARNm de TGF-beta en tumores se detectó mediante ensayo de ADNr. Hubo una regulación a la baja significativa de ARNm de TGF-beta2 en tumores tratados con ASPH05, ASPH17, ASPH26, ASPH36, ASPH45, ASPH47, ASPH71, ASPH82, ASPH98, y ASPH105 (Figura 24). Los datos - que representan relación de ARNm de TGF-beta2 con GAPDH - se muestran como un diagrama de caja en el que se presentan los valores medianos y los valores mínimos y máximos (datos expresados como n=10, excepto para grupo ASPH71 n=9).
Ejemplo 21
Las células de cáncer pancreático Panc-1 humanas se transfectaron con 20, 6.67, 2.22, 0.74, 0.25, 0.08 o 0.009 pM de los oligonucleótidos modificados ASPH47, ASPH1047, ASPH1106, ASPH1132, o ASPH47 en combinación con ASPH1047; los resultados se muestran en la Figura 26a a 26e). El control negativo es el oligonucleótido codificado (scrLNA) de la SEQ ID No. 145 (Figura 26 f). Todas las células se transfectaron en la ausencia de agente de transfección (transfección gimnótica o suministro gimnótico). Los oligonucleótidos modificados se agregaron a las células durante 3 días, que se incubaron a 37 °C. Posteriormente, el medio se intercambió con medio que contiene oligonucleótidos recientes y las células se incubaron durante 4 días más a 37 °C. Los niveles de proteína de TGF-beta1 y TGF-beta2 en los sobrenadantes celulares se determinaron por ELISA. ASPH47 inhibe específicamente la expresión de TGF-beta2 de una manera dependiente de dosis y no tiene ningún efecto inhibidor objetivo sobre TGF-beta1 (Figura 26a). El ASPH1047 inhibe específicamente la expresión de TGF-beta1 y no tiene ningún efecto inhibidor objetivo sobre TGF-beta2 (Figura 26b), o solo un ligero efecto inhibidor de TGF-beta2 a concentraciones más altas. También el ASPH1106 inhibe la expresión de TGF-beta1 de una manera dependiente de dosis (Figura 26c). El ASPH1132 específico de pan muestra una inhibición dependiente de dosis de la expresión de la proteína de TGF-beta1 y TGF-beta2 (Figura 26d). Cuando se combinan ASPH47 y ASPH1047, la expresión de ambas proteínas, TGF-beta1 y TGF-beta2, se inhibe de una manera dependiente de dosis (Figura 26e). El scrLNA de la SQE ID No. 145 no muestra ningún efecto inhibidor sobre la expresión de TGF-beta1 ni TGF-beta2, incluso si las concentraciones se duplicaron (40, 13.33, 4.44, 1.48, 0.49, 0.16, 0.05 o 0.02 pM) en comparación con las concentraciones individuales de ASPH47, ASPH1047, ASPH1106 o ASPH1132. Los resultados para TGF-beta1 se indican en diamantes, y los resultados para TGF-beta2 en cuadrados en las figuras 26a a 26f.
Ejemplo 22
Las células de cáncer pancreático Panc-1 humanas (Figura 27a) o células de carcinoma de células renales RenCa de ratón (Figura 27b) se trataron con 3.3 pM de ASPH0009, ASPH1132, ASPH2000, ASPH2001, ASPH2002, ASPH2003, ASPH2004, ASPH2005, ASPH2006, ASPH2007, ASPH2009, ASPH2010, ASPH2012, ASPH2013, ASPH2014 ASPH2015, ASPH2016, ASPH2017, ASPH2018, ASPH2019, ASPH2020, ASPH2021, ASPH2023, ASPH2024, ASPH2025, ASPH23026, ASPH2027, ASPH2028, ASPH2029, ASPH2030, ASPH2031, ASPH2032, ASPH2033, ASPH2034, ASPH2035, ASPH2036, ASPH2037, ASPH2038, ASPH2039, ASPH2040, ASPH2041, ASPH2043, ASPH2044, ASPH2045, ASPH2046, ASPH2047, ASPH2048, ASPH2049, ASPH2050, ASPH2052, ASPH2053, ASPH2054, ASPH2055, ASPH2056, ASPH2057, ASPH2060, ASPH2061, ASPH2062, ASPH2063, ASPH2064, ASPH2065, o ASPH2066 en la ausencia de un agente de transfección (transfección gimnótica o suministro gimnótico). La expresión de ARNm de TGF-beta1 (columna negra), TGF-beta2 (columna blanca) y TGF-beta3 (columna rayada) se determinó 72 h después de transfección. La reducción significativa de la expresión de ARNm de TGF-beta3 se muestra en la Figura 27a y 27b. Como se anticipó a partir de las secuencias, el oligonucleótido reactivo TGF-beta1, -beta2 y -beta3 ASPH_0009 (selectivo de pan) y As Ph_ 1132 que tiene una homología del 100 % con los ARNm de TGF-beta1 y -beta3 humanos, pero tiene un emparejamiento erróneo con TGF-beta2 muestra reducción significativa de la expresión de las tres isoformas. Los oligonucleótidos selectivos de TGF-beta3 solo inhiben significativamente la expresión de ARNm de TGF-beta3.
Ejemplo 23
Las células de glioma A172 humanas se trataron durante 24 h con 10 nM (en la presencia de un agente de transfección), de ASPH0009, ASPH1132, ASPH2000, ASPH2001, ASPH2002, ASPH2003, ASPH2004, ASPH2006, ASPH2007, ASPH2008, ASPH2009, ASPH2010, ASPH2011, ASPH2012, ASPH2013, ASPH2014, ASPH2016, ASPH2017, ASPH2018, ASPH2020, ASPH2021, ASPH2022, ASPH2023, ASPH2024, ASPH2025, ASPH2026, ASPH2027, ASPH2028, ASPH2029, ASPH2030, ASPH2031, ASPH2032, ASPH2033, ASPH2034, ASPH2035, ASPH2036, ASPH2037, ASPH2038, ASPH2039, ASPH2040, ASPH2041, ASPH2042, ASPH2043, ASPH2044, ASPH2045, ASPH2047, ASPH2049, ASPH2050, ASPH2051, ASPH2052, ASPH2053, ASPH2054, ASPH2056, ASPH2057, ASPH2058, ASPH2059, ASPH2060, ASPH2061, ASPH2062, ASPH2063, o ASPH2066. La expresión de ARNm de TGF-beta1 (columna negra), TGF-beta2 (columna blanca) y TGF-beta3 (columna rayada) luego se determinó a partir de extractos celulares mediante ensayo de ADNr. La reducción significativa de la expresión de ARNm de TGF-beta3 se muestra en la Figura 28. Como se anticipa a partir de las secuencias, el oligonucleótido reactivo TGF-beta1, -beta2 y -beta3) ASPH_0009 (selectivo de pan) y ASPH_1132 que tiene un 100 % de homología con los ARNm de TGF-beta1 y -beta3 humanos, pero tienen un emparejamiento erróneo con TGF-beta2, muestran una reducción significativa de la expresión de las tres isoformas. Los oligonucleótidos TGF-beta3 selectivos inhiben significativamente solo la expresión de ARNm de TGF-beta3.
Ejemplo 24: Regulación a la baja de ARNm objetivo en células de conejo
Las secuencias de oligonucleótidos seleccionados se alinearon con secuencias de ARNm de conejo de TGF-beta1 y 2. El ASPH_0036 (oligonucleótido antisentido selectivo de TGF-beta2, basado en la secuencia de ARNm humano) mostró 100% de homología con ARNm de TGF-beta2 de conejo, mientras que ASPH_1059 (oligonucleótido antisentido selectivo TGF-beta1, basado en la secuencia de ARNm humano) mostró una homología del 100 % con el ARNm de TGF-beta1 de conejo.
Los fibroblastos de piel Rab-9 de conejo se trataron 5 nM o 20 nM de ya sea ASPH_0036 y ASPH_1059 en la presencia de un agente de transfección durante 24 hr. La expresión de ARNm de TGF-beta1 y TGF-beta2 luego se determinó en extractos celulares mediante ensayo de ADNr. Se alcanzó la reducción significativa de la expresión de ARNm de TGF-beta1 (51 y 77 % a 5 y 20 nM, respectivamente) con ASPH_1059. Se alcanzó la reducción significativa de ARNm de TGF-beta2 (79 y 80% a 5 y 20 nM, respectivamente) con ASPH_0036.
Ejemplo 25: Biodistribución de tejidos y regulación a la baja de ARNm objetivo después de la administración sistémica de ASPH 0047 en ratones Balb/c
Los ratones Balb/C se trataron con una inyección subcutánea única de ASPH_0047 (formulada en solución salina fisiológica estéril) a 5, 20 y 50 mg/kg de peso corporal del animal. El plasma y los tejidos se recolectaron en los tiempos indicados (de 3 animales individuales), se congelaron inmediatamente y se almacenaron a -80 °C hasta el análisis con un método AEX-HPLC (plasma/tejido PK) o para la medición de niveles de ARNm de TGF-p2 y GAPDH por ensayo de ADNr. Los niveles de ARNm de TGF-p2 se expresaron en relación con el nivel de expresión de ARNm de GAPDh en las muestras correspondientes.
Los datos muestran que una sola administración de bolo subcutáneo de 50 mg/kg de ASPH_0047 dio como resultado una transferencia rápida del fármaco desde los compartimentos sanguíneos subcutáneos hasta los circulantes (Tmax de ~ 5-30 min), perfil farmacocinético bifásico en plasma, con fase de eliminación de inicio rápido (dentro de las primeras 24 horas), seguida de una larga vida media terminal (Figura 29a). Adicionalmente, se demuestra que existe una marcada acumulación de larga duración del fármaco en varios tejidos seleccionados. El órgano objetivo principal (exposición más alta/CMAx) es el riñón, luego el hígado, la piel y el bazo, y el más bajo en el cerebro (datos no mostrados). Como también se representa en la Figura 29b, ASpH_0047 permaneció en el tejido renal con dosis farmacológicas relevantes (~ 50 pg/gr, equivalentes a 10 pM) a partir de 24 h y hasta 14 días, con la consiguiente supresión duradera y marcada de expresión de ARNm de TGF -p2 en el tejido renal, con una efectiva regulación a la baja de ARNm de ~ 80 % observada durante al menos 14 días.
Ejemplo 26
A los ratones inmunodeficientes se les inyectó por vía subcutánea células de carcinoma de células renales humanas 786-O (Figura 30A), células de cáncer pancreático Panc1 (Figura 30B, C) o células de glioma SMA-560 de ratón (Figura 30D). Cuando los tumores subcutáneos alcanzaron el tamaño de 100-300 mm3 (tumores establecidos), los animales se trataron por vía subcutánea, Q1Dx5, con solución salina (Mock), oligonucleótido de control (Control; 50 mg/kg), oligonucleótidos inactivos en este contexto (por ejemplo, ASPH_0065 y ASPH_0071; 50 mg/kg) o ASPH_0047 a 50 mg/kg, o las dosis indicadas. Se recolectaron tumores (Figura 30A-D) y riñones (Figura 30E-F) 24 h después de la última administración. Los tumores/riñones se procesaron luego para la determinación de los niveles de ARNm de TGF-D2 y GAPDH mediante un ensayo de ADNr. En estos experimentos, el oligonucleótido de control era una secuencia codificada de gápmero de LNA 3 3 de 18 meros. Los resultados se expresan como una relación de ARNm de TGF-beta2/GAPDH, y cada muestra probada individual se representa con valores medianos indicados como una línea roja. Bajo las condiciones experimentales descritas (esquema y ruta de administración), las administraciones sistémicas repetidas de ASPH_0047 en ratones Balb/c condujeron a una regulación a la baja específica de secuencia de ARNm de TGF-beta 2 en tumores subcutáneos y riñones establecidos.
Ejemplo 27
Se inyectó a los ratones Balb/c células Renca de ratón en la subcápsula renal (Figura 31A, B) o i.v. (Figura 31C, D) el día 0. El tratamiento sistémico con vehículo u oligonucleótidos indicados comenzó el día 7 (Figura 31A; 50 mg/kg, s.c., dos veces por semana), el día 1 (Figura 31B; 12.5 mg/kg, s.c., dos veces por semana) durante dos semanas consecutivas, o el día 7 (Figura 31C y 31D; dosis indicadas, s.c., dos veces por semana) durante 26-27 días. El número de metástasis de pulmón se evaluó macroscópicamente, y el nivel de metástasis de pulmón se determinó por el número de metástasis (Figura 31A, C) o en función del peso pulmonar (Figura 31B, D). Los resultados se representan como diagrama de caja; con valores medianos, cuartiles superior e inferior, y percentiles 90 y 10. Bajo los diseños experimentales descritos, los ratones Balb/c tratados con ASPH_0047 mostraron un número reducido de metástasis de pulmón o un peso pulmonar reducido (el peso pulmonar se correlaciona con el grado de metástasis de pulmón) en modelos Renca RCC de ratón.
Ejemplo 28
Las células de cáncer pancreático Panc-1 humanas se trataron con 3.3 pM de los oligonucleótidos indicados en la ausencia de agente de transfección (transfección gimnótica o suministro gimnótico). La expresión de ARNm de TGF-beta1 (columna negra), TGF-beta2 (columna blanca) y TGF-beta3 (columna rayada) se determinó 72 h después de transfección. La reducción significativa de la expresión de ARNm de TGF-beta1 se muestra en la Figura 32. Los oligonucleótidos TGF-beta1 selectivos inhiben significativamente solo la expresión de ARNm de TGF-beta1 mientras que el oligonucleótido de control LNA-scr no afecta la expresión de cualquier isoforma TGF-beta.
Ejemplo 29
Los ratones Balb/c se inyectaron con células 4T1 de ratón en la almohadilla de grasa mamaria en el día 0. El tratamiento sistémico con solución salina (Mock), anticuerpo pan-TGF-beta (1D11), oligonucleótido de control (LNA-scr) o ASPH_0047 inició el día 3 (30 mg/kg, s.c., dos veces por semana) y continuó hasta D28, cuando se sacrificaron los animales. El número de metástasis de pulmón se evaluó macroscópicamente, y el nivel de metástasis de pulmón se determinó por el número de metástasis (panel izquierdo) o en base del peso pulmonar (panel derecho). Bajo el diseño experimental descrito, el tratamiento con ASpH_0047 redujo la metástasis a los pulmones, mientras que el control positivo, el anticuerpo monoclonal TGF-beta 1D11 no tuvo efecto sobre la metástasis de pulmón en este modelo.
Ejemplo 30
Se trataron ratones sin pelaje CB17 SCID o Balb/c (n = 3-5, excepto ASPH_0018 n = 1 y ASPH_0037 n = 2) con 14­ 15 mg/kg de oligonucleótidos modificados con LNA indicados durante cuatro o cinco días consecutivos. (Q1Dx4-5). Se recolectó plasma 24 h después del último tratamiento y se determinaron los niveles de ALT en plasma. Los resultados se expresan como valores medianos. Bajo esta condición experimental, solo 6/48 (12.5%) de los oligonucleótidos probados indujeron un aumento marcado en ALT en plasma (> 300 unidades/l), lo que indica toxicidad hepática. La siguiente Tabla 7 muestra la toxicidad hepática de los oligonucleótidos modificados con LNA administrados sistémicamente:
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Claims (4)

REIVINDICACIONES
1. Oligonucleótido que consiste en CAAAGTATTTGGTCTCC (SEQ ID NO. 46), en el que los nucleótidos en negrita son oligonucleótidos modificados con LNA, complementarios a la secuencia de ácido nucleico de TGF-beta2 de la SEQ ID NO. 1 de la Figura 2.
2. Composición farmacéutica que comprende el oligonucleótido de acuerdo con la reivindicación 1 y un portador farmacéuticamente aceptable.
3. Oligonucleótido de acuerdo con la reivindicación 1 o composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 2 para uso en un método para prevenir y/o tratar un tumor maligno y/o benigno, fibrosis, cirrosis, escleroderma o enfermedades dermatológicas relacionadas, o una enfermedad del SNC.
4. Oligonucleótido o composición farmacéutica para uso de acuerdo con la reivindicación 3, en el que el tumor se selecciona del grupo que consiste en tumores sólidos, tumores nacidos en sangre, leucemia, metástasis tumoral, hemangiomas, neuroma acústico, neurofibroma, tracoma, granulomas piógenos, psoriasis, astrocitoma, blastoma, tumor de Ewing, craneofaringioma, ependimoma, meduloblastoma, glioma, hemangloblastoma, linfoma de Hodgkins, mesotelioma, neuroblastoma, linfoma de no Hodgkins, pinealoma, retinoblastoma, sarcoma, seminoma, tumor de Wilm, o se selecciona del grupo de carcinoma de la vía biliar, carcinoma de vejiga, tumor cerebral, cáncer de mama, carcinoma broncogénico, carcinoma del riñón, cáncer de cuello uterino, coriocarcinoma, coroidcarcinoma, cistadenocarcinoma, carcinoma embrionario, carcinoma epitelial, cáncer de esófago, carcinoma de cuello uterino, carcinoma de colon, carcinoma colorrectal, cáncer endometrial, cáncer de vesícula biliar, cáncer gástrico, cáncer de cabeza, carcinoma de hígado, carcinoma de pulmón, carcinoma medular, cáncer de cuello, carcinoma broncogénico/pulmonar de células no pequeñas, cáncer de ovario, carcinoma de páncreas, carcinoma papilar, adenocarcinoma papilar, adenocarcinoma papilar, carcinoma de intestino delgado, carcinoma de próstata, cáncer rectal, carcinoma de células renales, retinoblastoma, cáncer de piel, carcinoma broncogénico/pulmonar de células pequeñas, carcinoma de células epidermoides, carcinoma de glándulas sebáceas, carcinoma testicular, y cáncer uterino.
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Families Citing this family (17)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2017138925A1 (en) 2016-02-09 2017-08-17 Autotelic Llc Antitumour combinations of antisense oligonucleotides and anticancer agents
KR20180103816A (ko) 2016-02-09 2018-09-19 오토텔릭 엘엘씨 췌장암을 치료하기 위한 조성물과 방법
US9758786B2 (en) 2016-02-09 2017-09-12 Autotelic, Llc Compositions and methods for treating pancreatic cancer
MA45468A (fr) * 2016-04-01 2019-02-06 Avidity Biosciences Llc Acides nucléiques myc et utilisations
MA45471A (fr) * 2016-04-01 2019-02-06 Avidity Biosciences Llc Acides nucléiques de phosphatidylinositol-3-kinase et leurs utilisations
MA45349A (fr) 2016-04-01 2019-02-06 Avidity Biosciences Llc Acides nucléiques egfr et leurs utilisations
MA45469A (fr) 2016-04-01 2019-02-06 Avidity Biosciences Llc Acides nucléiques de bêta-caténine et leurs utilisations
MA45340A (fr) * 2016-04-01 2019-02-06 Avidity Biosciences Llc Acides nucléiques du récepteur des androgènes et leurs utilisations
MA45470A (fr) * 2016-04-01 2019-02-06 Avidity Biosciences Llc Acides nucléiques kras et leurs utilisations
MA45328A (fr) 2016-04-01 2019-02-06 Avidity Biosciences Llc Compositions acide nucléique-polypeptide et utilisations de celles-ci
EP3538655A1 (en) 2016-11-11 2019-09-18 ISARNA Therapeutics GmbH Tgf-beta oligonucleotide for use in treatment of ophthalmic diseases
WO2019113393A1 (en) 2017-12-06 2019-06-13 Avidity Biosciences Llc Compositions and methods of treating muscle atrophy and myotonic dystrophy
AU2021237465A1 (en) 2020-03-19 2022-10-13 Avidity Biosciences, Inc. Compositions and methods of treating Facioscapulohumeral muscular dystrophy
WO2022060208A1 (ko) * 2020-09-21 2022-03-24 오토텔릭바이오 주식회사 안티센스 올리고뉴클레오타이드
CN113073082A (zh) * 2021-03-19 2021-07-06 广州远想生物科技有限公司 TGF-β3间充质干细胞外泌体及其制备方法和应用
US11912779B2 (en) 2021-09-16 2024-02-27 Avidity Biosciences, Inc. Compositions and methods of treating facioscapulohumeral muscular dystrophy
KR20230063290A (ko) * 2021-11-01 2023-05-09 오토텔릭바이오 주식회사 안티센스 올리고뉴클레오타이드

Family Cites Families (20)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4309406A (en) 1979-07-10 1982-01-05 American Home Products Corporation Sustained release pharmaceutical compositions
US4309404A (en) 1979-08-09 1982-01-05 American Home Products Corporation Sustained release pharmaceutical compositions
US4704295A (en) 1983-09-19 1987-11-03 Colorcon, Inc. Enteric film-coating compositions
US4556552A (en) 1983-09-19 1985-12-03 Colorcon, Inc. Enteric film-coating compositions
AU6794594A (en) 1993-04-30 1994-11-21 Biognostik Gesellschaft Fur Biomolekulare Diagnostik Mbh Antisense-oligonucleotides for the treatment of immunosuppressive effects of transforming growth factor-beta (tgf-beta )
EP1160319A3 (en) 1993-04-30 2002-03-06 BIOGNOSTIK GESELLSCHAFT FÜR BIOMOLEKULARE DIAGNOSTIK mbH Antisense-oligonucleotides for the treatment of immunosuppressive effects of transforming growth factor-beta (TGF-beta)
US20050287128A1 (en) * 2001-05-18 2005-12-29 Sirna Therapeutics, Inc. RNA interference mediated inhibition of TGF-beta and TGF-beta receptor gene expression using short interfering nucleic acid (siNA)
WO2003070197A2 (en) * 2002-02-20 2003-08-28 Sirna Therapeutics, Inc. RNA INTERFERENCE MEDIATED INHIBITION OF TGF-BETA AND TGF-BETA RECEPTOR GENE EXPRESSION USING SHORT INTERFERING NUCLEIC ACID (siNA)
US20040006030A1 (en) * 2002-07-02 2004-01-08 Isis Pharmaceuticals Inc. Antisense modulation of TGF-beta 2 expression
WO2003085110A2 (en) 2002-04-05 2003-10-16 Santaris Pharma A/S Oligomeric compounds for the modulation hif-1alpha expression
JP4476594B2 (ja) * 2003-10-17 2010-06-09 淳二 城戸 有機エレクトロルミネッセント素子
CA2550258A1 (en) 2003-12-23 2005-07-07 Santaris Pharma A/S Oligomeric compounds for the modulation of bcl-2
WO2005084712A2 (en) 2004-02-27 2005-09-15 Antisense Pharma Gmbh Use of an oligonucleotide or its active derivative for the preparation of a pharmaceutical composition for inhibiting the formation of metastases in cancer treatment
EP1568383A3 (en) * 2004-02-27 2005-11-16 Antisense Pharma GmbH Use of an oligonucleotide or its active derivative for the preparation of a pharmaceutical composition for inhibiting the formation of metastases in cancer treatment
EP1935428A1 (en) 2006-12-22 2008-06-25 Antisense Pharma GmbH Oligonucleotide-polymer conjugates
WO2008138904A2 (en) 2007-05-11 2008-11-20 Santaris Pharma A/S Rna antagonist compounds for the modulation of her3
CA2728467A1 (en) * 2008-07-15 2010-01-21 F. Hoffmann-La Roche Ag Compositions and methods for inhibiting expression of tgf-beta receptor genes
WO2011154542A1 (en) * 2010-06-11 2011-12-15 Artisense Pharma Gmbh Method for selective oligonucleotide modification
EP2453017A1 (en) 2010-11-12 2012-05-16 Antisense Pharma GmbH Oligonucleotides for use in prophylaxis and/or treatment of TGF-beta1 and TGF-beta2, TGF-beta2 and TGF-beta3, TGF-beta1 and TGF-beta3, or TGF-beta1, TGF-beta2, and TGF-beta3 mRNA overexpressing diseases
AU2013262656A1 (en) 2012-05-16 2015-01-22 Rana Therapeutics, Inc. Compositions and methods for modulating UTRN expression

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